CN103424294B - 一种检测猪外周血和脾脏淋巴细胞膜表面分子的样品制备试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种适用于流式细胞术检测猪外周血和脾脏淋巴细胞膜表面分子的样品制备试剂盒及其制备方法。其中，所述的制备方法将猪的外周血或脾脏获取生物样品并制成细胞粗提混悬液；将粗提液转入离心管后，加入红细胞裂解液经冰浴裂解红细胞，离心除去上清，收集沉淀细胞；用缓冲液I重悬细胞，并计数细胞；用缓冲液II重悬细胞，并加入荧光素标记的细胞膜表面抗体，冰浴30min；再用缓冲液I洗涤细胞后，将细胞悬浮于缓冲液III。本发明所制备的样品可在常温保存或长途运输以备流式细胞仪的检测，检测结果高效而稳定。
Description
技术领域
本发明涉及猪外周血和脾脏淋巴细胞膜表面分子的流式细胞检测技术，特别提供了适用于条件较差的基层猪场实验室的流式细胞样品制备方法。
背景技术
我国是猪肉生产和消费的大国。在国际上，我国生猪存栏量、屠宰量以及猪肉产量已多年占据世界首位。国家统计局数据显示，2012年我国猪肉产量5335万吨，同比增长5.6％。我国养殖业在世界有着举足轻重的地位。自80年以来，中国养猪业进入了由农户养猪向集约化和产业化转型期，养猪科学技术也取得了长足的进步。然而，养猪业也正面临着猪病和食品安全的极度困扰。
由于猪病流行日趋复杂化以及科学养猪理念的深入人心，越来越多的规模化猪场开始筹备建立兽医实验室来有效监控猪病，为猪群的保健提供技术支持。但是典型的猪场实验室只能完成大体病理学解剖，显微镜检验，血清学检验和简单的生化检测。而多数流行性疾病的诊断，疫苗免疫效果检测和饲用添加剂功效检验等尚需做细胞免疫反应相关指标的检验，该检验的常规仪器——流式细胞仪属于高端科研型仪器，绝大多数基层实验室都尚未配备，限制了细胞学检验的有效实施。
流式细胞术是一种基于荧光手段的生物学检测技术，广泛应用于细胞计数，分选和生物标记物检测。主要原理是将单细胞悬液用一定压力压入流动室，细胞呈单行排列依次通过检测区域，收集监测数据后对数据进行分析。外周血、骨髓穿刺物，组织活检物等样本等都可用流式细胞术分析。但是样本的条件控制是待检样本质量控制的最关键环节，这对于样本的采集、保存、运输和制备均提出了较高的要求。如溶血、坏死的样本均不适于流式检测。
常规流式细胞术检验前，细胞样品经过分离、染色等一系列处理后应即时或尽快上机检验。但是若将待检动物或组织冷冻保存并运输至高校或科研机构再制备细胞样品的话，不但加重了运输成本也使得检测过程复杂化，费时费力。在基层实验室先进行细胞样品的制备，并妥善保存后运送至流式检测平台可为解决这一问题提供提一条很好的策略。细胞内分子检测，可先固定细胞长期保存。但是，在染色前固定细胞的话可能会破坏膜表面蛋白分子的结构，不利于膜表面蛋白分子的检测(如T细胞表面CD3，CD4等)。而且，基层实验室无菌级别较低，所制备样品保存时间过久可能诱发细菌大量增殖而导致流式检测失败。另外，流式染色过程中，非特异性染色或染色强度较弱都对检测结果造成不利影响。由此可见，在猪场实验室的简易条件下制备高质量的细胞样本，并可将样本长途运输至检测目的地是目前猪场疾病防控管理与研发工作迫切需要解决的问题。然而目前为止，尚未见较为成熟可行的适于基层猪场流式细胞术检测样品制备的方法。
发明内容
为了解决上述基层猪场流式细胞术分析样品的制备方法问题，本发明的目的是提供了一种适用于利用流式细胞术进行猪外周血和脾脏淋巴细胞膜表面抗原检测的样品制备方法，实现检测样品的长途运输和保存，检测结果高效而稳定。
为实现上述目的，本发明首先提供一种适用于流式细胞术检测猪外周血和脾脏淋巴细胞膜表面分子的样品制备试剂盒，包括缓冲液I、缓冲液II和缓冲液III，所述缓冲液I为含100-800U/ml青霉素，100-800μg/ml链霉素，1-8μg/ml两性霉素B的PBS缓冲液，pH值为7.2-7.4；所述缓冲液II为含2mM EDTA,0.2％-0.6％BSA，100-800U/ml青霉素，100-800μg/ml链霉素，1-8μg/ml两性霉素B的PBS缓冲液，pH值为7.2-7.4；所述缓冲液III为含0.1％NaN3，1％-5％多聚甲醛的PBS缓冲液，pH值为7.2-7.4。
在本发明一个优选的实施方案中，所述缓冲液I为含500U/ml青霉素，500μg/ml链霉素，5μg/ml两性霉素B的PBS缓冲液，pH值为7.2-7.4；所述缓冲液II为含2mM EDTA,0.5％BSA，500U/ml青霉素，500μg/ml链霉素，5μg/ml两性霉素B的PBS缓冲液，pH值为7.2-7.4；所述缓冲液III为含0.1％NaN3，2％多聚甲醛的PBS缓冲液，pH值为7.2-7.4。
进一步地，本发明的试剂盒还可优选包括红细胞裂解液，所述红细胞裂解液主要成分为：0.16M NH4Cl，0.13mM EDTA，12mM NaHCO3，pH值为7.2。
进一步地，本发明还提供一种利用所述的试剂盒进行猪外周血和脾脏淋巴细胞膜表面抗原流式细胞术检测的样品制备方法，其包括采集猪外周血和猪脾脏组织，制备淋巴细胞单细胞悬液，裂解红细胞后用抗体染色后固定，直至用流式细胞仪进行检测。
在本发明一个具体实施方案中，所述的制备方法，为将猪的外周血或脾脏获取生物样品并制成细胞粗提混悬液；将粗提液转入离心管后，加入红细胞裂解液经冰浴裂解红细胞，离心除去上清，收集沉淀细胞；用缓冲液I重悬细胞，并计数细胞；用缓冲液II重悬细胞，并加入荧光素标记的细胞膜表面抗体，冰浴30min；再用缓冲液I洗涤细胞后，将细胞悬浮于缓冲液III，以备流式细胞仪的检测。
在本发明一个优选的实施方案中，所述的制备方法具体包括如下步骤：
1)细胞粗提悬液制备：利用EDTA抗凝真空采血管采集猪外周血即为血细胞粗提液；剪取脾脏组织约0.5cm3放入平皿中，除去被膜和结缔组织，在200目尼龙膜上研磨脾脏使磨碎的细胞通过尼龙网悬浮于2ml缓冲液I，即为脾脏细胞粗提悬液；
2)向上述粗提液中加入3倍体积的红细胞裂解液，颠倒混匀；
3)冰上孵育5分钟,其间混匀两次；
4)450×g离心5分钟收集沉淀细胞，小心吸弃上清液；
5)向细胞沉淀中加入两倍体积红细胞裂解液，裂解残余红细胞；
6)重复步骤3和4；
7)用缓冲液I缓冲液重悬细胞，并以450×g离心5分钟洗涤细胞，并用血平板计数细胞；
8)用缓冲液II重悬细胞(106个细胞/100μl)，并加入荧光素标记的细胞膜表面抗体，混匀后冰浴30min；
9)向上述液体中加缓冲液I至1ml，以450×g离心5分钟洗涤细胞；
10)用缓冲液III悬浮细胞(106个细胞/100μl)，所制备样品可在常温保存或长途运输以备流式细胞仪的检测。
其中，检测的对象包括猪的血液、脾脏所提取的细胞，适用的抗原分子主要为细胞表面分子；获取组织脏器采用解剖方法，解剖工具可以为手术刀，手术剪和手术镊。
本发明具有如下优点：
1.本发明的方法简便易行，所用均为实验室常规试剂材料和仪器，适用于条件较为简易的基层猪场实验室。
2.本发明所制备的细胞样品，可在常温下保存和运输，流式细胞术检测结果高效而稳定。有效延长了样品保存期限，样品保存10天时检测结果依然稳定，克服了基层试验场流式检测技术的瓶颈。
3.本发明各步骤所用试剂均含抗菌或防腐成分，有效克服了在无菌级别较低的实验室环境中制备细胞容易造成的污染问题。
4.本发明在缓冲液II中含有助染剂及封闭剂，有效增强特异性着色，抑制抗原抗体的非特异性结合，提高了制备样品的质量。
5.应用范围广。本发明适用于基层猪场条件下猪外周血和脾脏淋巴细胞表面抗原的流式细胞术检测样品制备。可应用包括CD3，CD4，CD8，CD25，CD69等膜表面分子的检测。
附图说明
图1所示为猪外周血淋巴细胞样品制备后当天和10天后检测结果。
图2所示为猪脾脏淋巴细胞样品制备后当天和10天后检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
利用本发明方法，进行猪外周血淋巴细胞CD3，CD8分子表达检测样品的制备。
所用试剂盒包括缓冲液I、缓冲液II和缓冲液III，所述缓冲液I为：含500U/ml青霉素，500μg/ml链霉素，5μg/ml两性霉素B的PBS缓冲液，pH值为7.4；所述缓冲液II为含2mMEDTA,0.5％BSA，500U/ml青霉素，500μg/ml链霉素，5μg/ml两性霉素B的PBS缓冲液，pH值为7.4；所述缓冲液III为含0.1％NaN3，2％多聚甲醛的PBS缓冲液，pH值为7.4。
本实施例还用到红细胞裂解液，主要成分为：0.16M NH4Cl，0.13mM EDTA，12mMNaHCO3，pH值为7.2。
具体步骤为：
1)利用EDTA抗凝真空采血管采集2ml猪前腔静脉血，并转入15ml离心管；
2)加入6ml的红细胞裂解液，颠倒混匀；
3)冰上孵育5分钟,其间轻轻混匀两次；
4)450×g离心5分钟收集沉淀细胞，小心吸弃上清液；
5)向细胞沉淀中加入两倍体积4ml红细胞裂解液，颠倒混匀；
6)冰上孵育5分钟,其间轻轻混匀两次；
7)450×g离心5分钟收集沉淀细胞，小心吸弃上清液；
8)用缓冲液I重悬细胞，并以450×g离心5分钟洗涤细胞，并用血平板计数细胞；
9)用缓冲液II重悬细胞(106个细胞/100μl)，并加入细胞膜表面抗体R-PE标记的鼠抗猪CD3ε(SouthernBiotech Cat.No.4510-09)和SPRD标记的鼠抗猪CD8α(SouthernBiotech Cat.No.4520-13)，冰浴30min；
10)向上述液体中加缓冲液I至1ml，以450×g离心5分钟洗涤细胞；
11)用缓冲液III悬浮细胞(106个细胞/100μl)，所制备样品可在常温保存或长途运输以备流式细胞仪的检测.
12)样品制备当天和10天后，上流式细胞仪检测结果显示CD3阳性T细胞中的CD8阳性细胞比例仍保持在52％左右(见图1)。(第0天：22.2％/(22.2％+20.5％)＝52.0％,第10天：21.1/(21.1％+18.8％)＝52.9％)。
实施例2
利用本发明方法，进行猪脾脏淋巴细胞CD3，CD4分子表达检测样品的制备。
所用试剂盒包括缓冲液I、缓冲液II和缓冲液III，所述缓冲液I为：含100U/ml青霉素，800μg/ml链霉素，5μg/ml两性霉素B的PBS缓冲液，pH值为7.4；所述缓冲液II为含2mMEDTA,0.4％BSA，300U/ml青霉素，600μg/ml链霉素，7μg/ml两性霉素B的PBS缓冲液，pH值为7.4；所述缓冲液III为含0.1％NaN3，5％多聚甲醛的PBS缓冲液，pH值为7.4。
本实施例还用到红细胞裂解液，主要成分为：0.16M NH4Cl，0.13mM EDTA，12mMNaHCO3，pH值为7.2。
具体步骤为：
1)剪取脾脏组织约0.5cm3放入平皿中，除去被膜和结缔组织，在200目尼龙膜上研磨脾脏使磨碎的细胞通过尼龙网悬浮于2ml缓冲液I，将细胞悬液转移至15ml离心管；
2)加入6ml的红细胞裂解液，颠倒混匀；
3)冰上孵育5分钟,其间轻轻混匀两次；
4)450×g离心5分钟收集沉淀细胞，小心吸弃上清液；
5)向细胞沉淀中加入两倍体积4ml红细胞裂解液，颠倒混匀；
6)冰上孵育5分钟,其间轻轻混匀两次；
7)450×g离心5分钟收集沉淀细胞，小心吸弃上清液；
8)用缓冲液I重悬细胞，并以450×g离心5分钟洗涤细胞，并用血平板计数细胞；
9)用缓冲液II重悬细胞(106个细胞/100μl)，并加入细胞膜表面抗体R-PE标记的鼠抗猪CD3ε(SouthernBiotech Cat.No.4510-09)和FITC标记的鼠抗猪CD4α(SouthernBiotech Cat.No.4515-02)，冰浴30min；
10)向上述液体中加缓冲液I至1ml，以450×g离心5分钟洗涤细胞；
11)用缓冲液III悬浮细胞(106个细胞/100μl)，所制备样品可在常温保存或长途运输以备流式细胞仪的检测.
12)样品制备当天和10天后，上流式细胞仪检测结果显示CD3阳性T细胞中的CD4阳性细胞比例仍保持在38％左右(见图2)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种适用于流式细胞术检测猪外周血和脾脏淋巴细胞膜表面分子的样品制备试剂盒，包括缓冲液I、缓冲液II和缓冲液III，所述缓冲液I为含100-800U/ml青霉素，100-800μg/ml链霉素，1-8μg/ml两性霉素B的PBS缓冲液，pH值为7.2-7.4；所述缓冲液II为含2mMEDTA,0.2％-0.6％BSA，100-800U/ml青霉素，100-800μg/ml链霉素，1-8μg/ml两性霉素B的PBS缓冲液，pH值为7.2-7.4；所述缓冲液III为含0.1％NaN3，1％-5％多聚甲醛的PBS缓冲液，pH值为7.2-7.4。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液I为含500U/ml青霉素，500μg/ml链霉素，5μg/ml两性霉素B的PBS缓冲液，pH值为7.2-7.4；所述缓冲液II为含2mM EDTA,0.5％BSA，500U/ml青霉素，500μg/ml链霉素，5μg/ml两性霉素B的PBS缓冲液，pH值为7.2-7.4；所述缓冲液III为含0.1％NaN3，2％多聚甲醛的PBS缓冲液，pH值为7.2-7.4。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，还包括红细胞裂解液，所述红细胞裂解液主要成分为：0.16M NH4Cl，0.13mM EDTA，12mM NaHCO3，pH值为7.2。
4.一种利用权利要求1～3任一项所述的试剂盒进行猪外周血和脾脏淋巴细胞膜表面抗原流式细胞术检测的样品制备方法，其包括采集猪外周血和猪脾脏组织，制备淋巴细胞单细胞悬液，裂解红细胞后用抗体染色进行固定，直至用流式细胞仪进行检测。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：将猪的外周血或脾脏获取生物样品并制成细胞粗提混悬液；将粗提液转入离心管后，加入红细胞裂解液经冰浴裂解红细胞，离心除去上清，收集沉淀细胞；用缓冲液I重悬细胞，并计数细胞；用缓冲液II重悬细胞，并加入荧光素标记的细胞膜表面抗体，冰浴30min；再用缓冲液I洗涤细胞后，将细胞悬浮于缓冲液III，以备流式细胞仪的检测。
6.权利要求1～3任一项所述的试剂盒在细胞表面分子检测中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的细胞表面分子选自CD3，CD4，CD8，CD25和/或CD69。
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