CN107505250A - 外周血中分选b淋巴细胞的方法、试剂盒及系统、鉴定血源性淋巴肿瘤细胞的试剂盒及系统 - Google Patents

外周血中分选b淋巴细胞的方法、试剂盒及系统、鉴定血源性淋巴肿瘤细胞的试剂盒及系统 Download PDF

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CN107505250A CN201710492563.0A CN201710492563A CN107505250A CN 107505250 A CN107505250 A CN 107505250A CN 201710492563 A CN201710492563 A CN 201710492563A CN 107505250 A CN107505250 A CN 107505250A
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Abstract

本发明公开了一种外周血中分选B淋巴细胞的方法、试剂盒及系统、鉴定血源性淋巴肿瘤细胞的试剂盒及系统。其中,该方法包括以下步骤:S1,采用红细胞密度离心分离介质将外周血细胞中的红细胞去除;以及S2,使用流式细胞分选法将B淋巴细胞从去除了红细胞的外周血细胞中分选出来。应用本发明的技术方案,能够快速、高效地将人的体液样品中的所有红细胞与血液中的其它有核白细胞包括淋巴瘤细胞进行有效分离,不会对人血液内的各种细胞(包括肿瘤细胞)产生任何影响,从而很好地保持了原有的细胞形态,以极大地便于利用流式细胞仪进行肿瘤细胞分选以及后续的鉴别与判断。

Description

外周血中分选B淋巴细胞的方法、试剂盒及系统、鉴定血源性 淋巴肿瘤细胞的试剂盒及系统
技术领域
[0001]本发明涉及生物医学技术领域,具体而言,涉及一种外周血中分选b淋巴细胞的方 法、试剂盒及系统、鉴定血源性淋巴肿瘤细胞的试剂盒及系统。
背景技术
[0002]恶性淋巴瘤是一组起源于淋巴造血系统的恶性肿瘤的总称。其中高发病率的B细 胞非霍奇金淋巴瘤类别中的弥漫性大B细胞淋巴瘤是成人最常见的恶性淋巴瘤。由于淋巴 瘤具有高度异质性,其治疗上也差别很大(如放、化疗,手术等),不同病理类型和分期的淋 巴瘤无论从治疗强度还是预后上都存在很大差别。B细胞淋巴瘤的预后和治疗取决于淋巴 瘤的具体类型以及分期分级。
[0003]在B细胞淋巴瘤病人体内有效分离血源性淋巴瘤细胞,首先必须去除血液中的大 量红细胞。目前临床或医学实验中通用的去除红细胞的方法是使用低渗裂解法裂解去除红 细胞。然而在低渗裂解过程中,伴随着红细胞的裂解,许多淋巴肿瘤细胞也受到了的损害, 使细胞形态与特性发生改变,从而严重影响了后续的一系列针对肿瘤细胞的鉴别性实验。 [0004]荧光原位杂交(Fluorescence in situ Hybridization,FISH)技术用于病理组织 中的肿瘤细胞检测已有广泛报道。其中一项主要技术应用即为使用荧光标记的染色体着丝 粒特异探针对体液中处于间期的肿瘤细胞进行染色体数目的识别(正常细胞染色体为二倍 体),以发现存在于肿瘤细胞内的非二倍体染色体,即超二倍体或多倍体染色体,从而达到 识别肿瘤细胞的目的。目前临床上偶有使用某一特定染色体探针检测淋巴瘤细胞的染色体 异倍体的报道,但染色体异常细胞可见于血小板增生引起的血中某些白细胞染色体数目异 常,或人体内自然形成的某些少量白细胞染色体数目异常,以及染色体探针非特异着色引 起的血细胞假阳性染色体数目异常,因此单独进行染色体数目异常检测判断肿瘤细胞势必 会有不可忽视的假阳性。
[0005]近来己有所报道,原癌基因在淋巴瘤上呈阳性表达的病人,其生存率明显降低。因 此,原癌基因的表达可作为判断淋巴瘤病人预后的独立指标之一。目前临床上常规开展的 原癌基因表达主要是针对病理标本使用免疫染色方法进行原癌基因蛋白表达的检测。但此 类单纯的免疫染色对于那些原癌基因不表达的肿瘤细胞,则会造成不可避免的假阴性判 别。
发明内容
[0006]本发明旨在提供一种外周血中分选8淋巴细胞的方法、试剂盒及系统、鉴定血源性 淋巴肿瘤细胞的试剂盒及系统,以解决现有技术中周血中分选B淋巴细胞容易造成B淋巴细 胞损失的技术问题。
[0007]为了实现上述目的,根据本发明的一个方面,提供了一种从外周血中分选B淋巴细 胞的方法。该方法包括以下步骤:S1,采用红细胞密度离心分离介质将外周血细胞中的红细 胞去除;以及S2,使用流式细胞分选法将B淋巴细胞从去除了红细胞的外周血细胞中分选出 来。
[0008]进一步地,红细胞密度离心分离介质在2〇。(:下的比重为1.080〜1.081克/毫升,红 细胞密度离心分离介质包含:硫酸铁、氯化锌、硝酸铁中的一种和蔗糖。
[0009]进一步地,步骤S1具体包括:将外周血离心后去掉血浆,将得到的外周血细胞加入 到红细胞密度离心分离介质的顶层,离心,收集上层去除了红细胞的外周血细胞。
[0010]进一步地,步骤S2具体包括:将去除了红细胞的外周血细胞加入荧光标记的抗B细 胞表面标示物抗体,孵育,然后洗涤除去未结合的荧光标记的抗B细胞表面标示物抗体,使 用流式细胞仪分选得到B淋巴细胞。
[00^1]进一步地,荧光标记的抗B细胞表面标示物抗体特异性地识别下述人的B细胞表面 标示物的一种或多种 CD5、CD10、CD15、CD19、CD20、CD22、CD30、CD38、CD43、CD45、CD77、 CD79a〇
[0012]根据本发明的另一个方面,提供一种用于从外周血中分选B淋巴细胞的试剂盒。该 试剂盒包括:红细胞密度离心分离介质、缓冲液和荧光标记的抗B细胞表面标示物抗体。 [0013]进一步地,红细胞密度离心分离介质在2(TC下的比重为1.080〜1.081克/毫升,红 细胞密度离心分离介质包含硫酸铁、氯化锌、硝酸铁中的一种和蔗糖。
[0014]进一步地,焚光标记的抗B细胞表面标示物抗体特异性地识别下述人的B细胞表面 标示物的一种或多种 CD5、CD10、CD15、CD19、CD20、CD22、CD30、CD38、CD43、CD45、CD77、 CD79a〇
[0015]根据本发明的再一个方面,提供一种用于从B细胞淋巴瘤病人的外周血中分选、提 取及鉴定血源性淋巴肿瘤细胞的试剂盒。该试剂盒包括:红细胞密度离心分离介质、缓冲 液、荧光标记的抗B细胞表面标示物抗体、荧光标记的抗淋巴细胞肿瘤标示物抗体和染色体 倍体检测探针。
[0016] 进一步地,红细胞密度离心分离介质在2(TC下的比重为1.080〜1.081克/毫升,红 细胞密度离心分离介质包含硫酸铁、氯化锌、硝酸铁中的一种和蔗糖。
[0017] 进一步地,焚光标记的抗B细胞表面标示物抗体特异性地识别下述人的B细胞表面 标示物的一种或多种⑶ 5、0010、0015、0)19、0020、0022、〇030、〇038、0043、0045、0077或 CD79a〇
[0018] 进一步地,荧光标记的抗淋巴细胞肿瘤标示物抗体特异性地识别下述一种或多种 抗原:ki-67、Bcl-2、Bc;L-6、EGFR vl11、c-myc、MUM1、PAX5、0CT2或B0B1。
[0019]进一步地,染色体倍体检测探针为12号染色体着丝粒探针。
[0020]根据本发明的又一个方面,提供一种从外周血中分选B淋巴细胞的系统。该系统包 括上述任一种从外周血中分选B淋巴细胞的试剂盒。
[0021] 进一步地,系统还包括流式细胞分选仪。
[0022]根据本发明的再一个方面,提供一种用于从B细胞淋巴瘤病人的外周血中分选、提 取及鉴定血源性淋巴肿瘤细胞的系统。该系统包括上述任一种用于从B细胞淋巴瘤病人的 外周血中分选、提取及鉴定血源性淋巴肿瘤细胞的试剂盒。
[0023]进一步地,系统还包括流式细胞分选仪、半自动或全自动免疫分析仪。
[0024] 应用本发明的技术方案,利用红细胞密度离心分离介质可以将外周血中的红细胞 与白细胞细胞进行快速有效的分离,在无融破裂解红细胞实验步骤的情况下,在不丢失血 中B淋巴细胞的基础上,可以取得令人满意的实验结果,证明利用此方法能够快速、高效地 f人的体液样品中的所有红细胞与血液中的其它有核白细胞包括淋巴瘤细胞进行有效分 离,不会对人血液内的各种细胞(包括肿瘤细胞)产生任何影响,从而很好地保持了原有的 细胞形态,以极大地便于利用流式细胞仪进行肿瘤细胞分选以及后续的鉴别与判断。
附图说明
[0025]构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示 意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
[0026]图1示出了实施例1中B淋巴细胞分选结果示意图;
[0027]图2示出了实施例1中红细胞分离介质(即红细胞密度离心分离介质)和红细胞裂 解液在分离过程中对B淋巴细胞的影响;
[0028]图3示出了实施例1中红细胞分离介质(即红细胞密度离心分离介质)去除红细胞 后和红细胞裂解液裂解红细胞后B淋巴细胞染色细胞形态观察;以及 [0029]图4示出了实施例1中B淋巴瘤细胞鉴定结果示意图。
具体实施方式
[0030]需要说明的是,在不冲突的情况下,本申请中的实施例及实施例中的特征可以相 互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
[0031] 针对背景技术中描述的技术问题,发明人发现,如何在淋巴瘤病人标本上联合检 测原癌蛋白表达与淋巴瘤细胞的另一个显著特征-染色体异倍体拷贝数,成为需要迫切解 决的现实问题。
[0032] 为此,本发明一^面提供了利用红细胞密度离心分离介质将人血液中的红细胞与 白细胞进行快速有效分离的方法,并使用流式细胞分选法将表达了特殊标示物的B淋巴细 p从去除了红细胞的白细胞中进行分选。另一方面,本发明还提供了一种同步使用肿瘤标 示物免疫染色-荧光染色体原位杂交的整合技术用于快速、准确地鉴别淋巴肿瘤细胞的系 统,其中该系统可以将抗人B淋巴肿瘤细胞标示物免疫荧光抗体染色与FISH相结合,同步染 色以鉴定染色体是否异常及肿瘤标示物是否表达。
[0033]根据本发明一种典型的实施方式,提供一种从外周血中分选B淋巴细胞的方法。该 方法包括以下步骤:S1,采用红细胞密度离心分离介质将外周血细胞中的红细胞去除;以及 S2,使用流式细胞分选法将B淋巴细胞从去除了红细胞的外周血细胞中分选出来。
[0034]应用本^明的技术方案,利用红细胞密度离心分离介质可以将外周血中的红细胞 与白细胞细胞进行快速有效的分离,在无融破裂解红细胞实验步骤的情况下可以取得令人 满意的实验结果,证明利用此方法能够快速、高效地将人的体液样品中的所有红细胞与血 液中的其$有核白细胞包括淋巴瘤细胞进行有效分离,不会对人血液内的各种细胞(包括 肿瘤细胞)产生任何影响,从而很好地保持了原有的细胞形态,以极大地便于利用流式细胞 仪进行肿瘤细胞分选以及后续的鉴别与判断。
[0035]在后续可以使用流式细胞分选方法对去除了红细胞的白细胞进行免疫荧光染色, 并分选出特定抗体染色阳性的B细胞(白细胞中的一类细胞),继而使用肿瘤标示物免疫染 色与染色体灰光原位杂交对B细胞中的肿瘤细胞进行鉴别,从而达到对淋巴瘤病人血液样 本中的非恶性肿瘤细胞进行快速、准确的高灵敏度与高特异性的检测。
[0036]优选的,红细胞密度离心分离介质在2(TC下的比重为1.080〜1.081克/毫升,红细 胞密度离心分离介质包含硫酸铁、氯化锌、硝酸铁中的一种和蔗糖。相对于目前市场上通用 的商品化用于白细胞分离的f心介质,或使用低渗溶破法去除红细胞而言,本发明上述典 型实^方式中的红细胞密度离心分离介质的使用可极大地缩短分离红细胞的离心时间,并 将未受低渗损伤的白细胞(包括血源性淋巴肿瘤细胞)回收率从原有的4〇± 15%稳定地提 高到95〜100%以上,最大限定的确保B细胞不丢失。
[0037]优选地,红细胞密度离心分离介质的比重可用任何渗透压介于260〜320m0sm/kg 出〇4116.8〜7.8的缓冲液调制而成。
[0038]根据本发明一种典型的实施方式,步骤“具体包括:将外周血离心后去掉血浆,将 得到的外周血细胞加入到红细胞密度离心分离介质的顶层,离心,收集上层去除了红细胞 的外周血细胞。即该方法无需融破裂解红细胞的步骤,该方法包括离心以去除血浆蛋白;将 离心后的所有血细胞置于红红细胞密度离心分离介质顶层再次进行离心,底层为分离的红 细胞。
[0039]根据本发明一种典型的实施方式,步骤S2具体包括:将去除了红细胞的外周血细 胞加入荧光^记的抗B细胞表面标示物抗体,孵育,然后洗涤除去未结合的荧光标记的抗b 细胞表面标示物抗体,使用流式细胞仪分选得到B淋巴细胞。
[0040]优选的,荧光标记的抗B细胞表面标示物抗体特异性地识别下述人的8细胞表面标 不物的一种或多种 CD5、CD10、CD15、CD19、CD20、CD22、CD30、CD38、CD43、CD45、CD77、CD79a。 [0041]根据本发明一种典型的g施方式,提供一种用于从外周血中分选B淋巴细胞的试 剂盒。该试剂盒包括:红细胞密度离心分离介质、缓冲液和荧光标记的抗B细胞表面标示物 抗体。
[0042]应用该试剂盒,可以配合使用流式细胞分选表达了特定细胞表面抗原的B细胞,并 对这些特殊的B细胞同步实施抗特殊肿瘤标示物抗体免疫荧光染色以及染色体荧光原位杂 交,以鉴定血源性恶性淋巴瘤肿瘤细胞。
[0043]优选的,红细胞密度离心分离介质在2(rc下的比重为1〇8〇〜1〇81克/毫升,红细 胞密度离心分离介质包含硫酸铁、氯化锌、硝酸铁中的一种和蔗糖。 ^044]优选的,荧光标记的抗B细胞表面标示物抗体特异性地识别下述人的B细胞表面标 不物的一种或多种 CD5、CD10、CD15、CD19、CD20、CD22、CD30、CD38、CD43、CD45、CD77、CD79a。 [OO45]根据本发明一种典型的实施方式,提供一种用于从B细胞淋巴瘤病人的外周血中 分选、提取及鉴定血源性淋巴肿瘤细胞的试剂盒。该试剂盒包括:红细胞密度离心分离介 质、缓冲液、荧光标记的抗B细胞表面标示物抗体、荧光标记的抗淋巴细胞肿瘤标示物抗体 和染色体倍体检测探针。该试剂盒与流式细胞分选仪,以及后续的原位同步进行的染色体 倍体检测及特殊肿瘤标示物蛋白表达检测相结合,可以有效地快速分选、提取、检测外周血 中的血源性淋巴肿瘤细胞,如弥漫性大B淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤等,对淋巴瘤的早期 诊断、治疗后的预后评估及复发监测等具有极大的现实临床意义。
[0046] ^优选的,红细胞密度离心分离介质在2(rc下的比重为丨^⑻〜^⑽丨克/毫升:红细 胞密度离心分离介质包含硫酸铁、氯化锌、硝酸铁中的一种和蔗糖。该红细胞密度离心分离 介质的使用可极大地缩短罔心时间,完全性地去除分离红细胞,并将剩余白细胞回收率从 原有的40±20%稳定地提高到95%-1〇〇%。
[0047] 优选的,荧光标记的抗8细胞表面标示物抗体特异性地识别下述人的B细胞表面标 示物的一种或多种 CD5、CD10、CD15、CD19、CD20、CD22、CD30、CD38、CD43、CD45、CD77SCD79a。
[0048] 优选的,荧光标记的抗淋巴细胞肿瘤标示物抗体特异性地识别下述一种或多种抗 原:ki-67、Bcl-2、Bcl-6、EGFRvIII、C-myc、MUMl、PAX5、0CT2^0Bl。
[0049] 用于染色体荧光原位杂交的荧光标记的探针或探针组合群可特异性地识别人B淋 巴细胞中的任何一个或多个染色体,包括但不限于12号染色体着丝粒探针。
[0050]根据本发明一种典型的实施方式,提供一种从外周血中分选B淋巴细胞的系统。该 系统包括上述任一种用于从外周血中分选B淋巴细胞的试剂盒。
[0051]优选的,系统还包括流式细胞分选仪。
[0052]根据本发明一种典型的实施方式,提供一种用于从B细胞淋巴瘤病人的外周血中 分选、提取及鉴定血源性淋巴肿瘤细胞的系统。该系统还包括上述任一种用于从B细胞淋巴 瘤病人的外周血中分选、提取及鉴定血源性淋巴肿瘤细胞的试剂盒。优选的,系统还包括流 式细胞分选仪、半自动或全自动免疫分析仪。
[0053]应用该系统,使用流式细胞技术分选血液肿瘤(血癌)病人体内表达了特定标示物 的一类特殊细胞群,并结合同步实施的肿瘤细胞标示物免疫荧光染色,及染色体荧光原位 杂父技术,可以达到快速高效地分离、鉴定血液B细胞淋巴瘤病人体内的肿瘤细胞的目的, 此类肿瘤细胞可以用于临床疗效评估。
[0054]根据本发明一种典型的实施方式,使用流式细胞分选仪从人的外周血中分选淋巴 B细胞的方法,其中该方法无需融破裂解红细胞的步骤,去除红细胞后,向剩余白细胞加入 荧光标记的抗B细胞表面标示物抗体。经流式细胞分选出B细胞后,使用特殊细胞固定剂(型 号:HC-01R4;厂家:Cytelligen Inc_,San 0丨68〇^,1^)将3细胞固定于玻片表面。
[0055]下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果,本发明中未明确写明操作步骤 的,可以采用现有技术的手段实现。
[0056] 实施例1
[0057]从B细胞淋巴瘤病人血液中快速分选并鉴别肿瘤细胞
[0058]将米集的6.0-7.5毫升抗凝血室温离心5分钟(85〇xg)。去掉上清血浆后,将血液加 入到10毫升红细胞密度离心分离介质顶层,室温离心丨2分钟(65〇xg)以分离红细胞。收集上 层有核白细胞细胞,加入5微升(lmg/ml)荧光标记的抗B细胞表面标示物抗体后,室温避光 孵育50分钟。洗涤2次(l5〇〇x g/6分钟),除去未结合的荧光抗体。使用流式细胞仪分选、收 集免疫荧光染色阳性的B细胞(收集荧光强度最强的细胞,cut-0ff:最高界值2%以上的所 有细胞)。将得到的阳性细胞涂片与包被的载玻片上,干燥。B淋巴细胞分选结果如图1所示。 实验过程中,由于避免使用红细胞裂解液,故血中的B淋巴细胞得以完整保留,以便后续的 iFISH分析。
[0059]对比实验:将采集的6 • 〇-7_5毫升抗凝血室温离心5分钟(850xg)。去掉上清血浆 后,向血细胞中加入40ml 0.85%氯化铵,室温旋转8分钟,以低渗裂解红细胞。离心uoox g/6分钟收据白细胞(包括B淋巴细胞)。加入5微升(lmg/ml)荧光标记的抗B细胞表面标示物 抗体后,室温避光孵育50分钟。洗涤2次(1500x g/6分钟),除去未结合的荧光抗体后,使用 流式细胞仪分选、收集免疫荧光染色阳性的B细胞(收集荧光强度最强的细胞,cut-off:最 高界值2%以上的所有细胞)。将得到的阳性细胞涂片与包被的载玻片上,干燥。
[0060] 对比实验结果显示,如图2所示,红细胞裂解液裂解红细胞后,采集到的B淋巴细胞 染色强度明显减弱,且数量减少(蓝色,向右偏移少,前度弱;红色,向右偏移多,染色强)。取 得的细胞显微镜下观察显示,如图3所示,使用离心介质去除红细胞后,B淋巴细胞经CD20染 色后,细胞量而完整,而使用红细胞裂解液裂解红细胞后的B淋巴细胞经CD20染色后,细胞 暗淡且不完整,呈点状(另一个细胞DAPI细胞核染色为阳性,但CD20不着色,不是B淋巴细 胞),说明红细胞裂解液对白细胞(包括B淋巴细胞)有损伤作用,不适于对病人血中的B淋巴 细胞做全面分析。
[0061] 12号染色体FISH实验鉴别表达不同肿瘤标示物的B淋巴细胞瘤细胞
[0062]将载玻片微斜,使用真空泵吸头沿标本框外围吸弃混合液。沿标本框内侧一角轻 柔滴加200yl室温预热的1 X FR3溶液后,立即吸弃溶液,共重复2次。沿标本框内侧一角轻柔 滴加200yl室温预热的缓冲液,室温静置2分钟,吸弃溶液。将玻片插入已预热至37°C的染色 缸中静置15分钟。取出玻片,使用微型吹风机将玻片轻柔吹至完全干燥后,立即滴加探针: 于标本框中央滴加lOyl探针后,每张玻片使用250yl封片胶(Rubber Cement)封住盖玻片四 边边缘后,直接放入杂交仪杂交:变性76°C,5分钟;杂交37°C,1小时。杂交完毕,取出玻片。 用手轻按盖玻片一角,使用镊子撕去Rubber Cement后,揭掉盖玻片。沿载玻片标本框内侧 一角轻柔滴加200W1配制好的抗体混合液,室温避光孵育2小时。切忌使玻片千燥。吸弃抗体 后,沿标本框内侧一角轻柔滴加2〇〇yl抗体洗涤液,立即吸弃,共重复2次。立即在荧光显微 镜下观察或于4°C避光保存。为避免FISH信号及抗体染色荧光减弱,标本应在一周内完成检 测。在荧光显微镜上反复观察标本会使荧光淬灭,在第一次读片时储存细胞图片。
[0063] 具体地,在本实施例中,所述独特的红细胞密度离心分离介质在2(TC温度下比重 范围优选介于1.080〜1.081克/毫升(gr/ml或gr/cm3),这一特定范围内的密度适于将几乎 所有红细胞与白细胞进行分离。红细胞密度离心分离介质的比重可用任何渗透压介于260 〜32〇111〇3111/1^112〇、?116.8〜7.8的磷酸盐缓冲液调制而成。
[0064]红细胞密度离心分离介质配置:使用蔗糖及磷酸盐缓冲液配置成比重为1.06gr/ ml的液体200毫升,再向其中滴加浓度为15%的盐溶液硫酸铁(在其他实施例中可以是含硫 酸铁、氯化锌、硝酸铁中的一种溶液磷酸盐缓冲液),使用密度仪进行监测,达到1.080〜 1.081克/毫升为止。
[0065]基于所述红细胞密度离心分离介质的离心在普通的商品化的离心管内进行。
[0066]其中,本实施例中,用于抗人B细胞的单克隆抗体可特异性地识别CD20。同步进行 12号染色体FISH+抗淋巴瘤细胞肿瘤标示物的抗体染色,特殊单克隆抗体为ki-67。
[0067] iFISH显示,如图4所示,B淋巴细胞与供分选的CD20抗体相结合,可有效应用于B淋 巴细胞的流式细胞分选。进一步的实验证明,其中的有些细胞为12号染色体异倍体(非二倍 体),且表达相关肿瘤标示物Ki-67,为B淋巴瘤细胞。具体的细胞核被DAPI染色(蓝色),显示 分离的细胞完整。所有4个细胞均被抗CD20抗体染色(黄色),提示分离的细胞为B细胞,且纯 度很纯。4个B细胞当中,有3个Ki-67阳性(兰青色),且染色体为非二倍体(橙色),提示此3个 细胞为B淋巴瘤细胞。最后的是多通道合成图像。
[0068]从以上的描述中,可以看出,本发明上述的实施例实现了如下技术效果:综合检测 体系的建立,可极大地提高判断病人预后的准确性与特异性,在临床上有着无可估量的应 用价值。 n
[0069]以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技 术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修 改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (17)

1. 一种从外周血中分选B淋巴细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤: S1,采用红细胞密度离心分离介质将外周血细胞中的红细胞去除;以及 S2,使用流式细胞分选法将B淋巴细胞从去除了红细胞的外周血细胞中分选出来。
2. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述红细胞密度离心分离介质在2(rc下的 比重为1 • 080〜1 • 081克/毫升,所述红细胞密度离心分离介质包含:硫酸铁、氯化锌、硝酸铁 中的一种和蔗糖。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤^具体包括:将所述外周血离心 后去掉血浆,将得到的外周血细胞加入到所述红细胞密度离心分离介质的顶层,离心,收集 上层去除了红细胞的外周血细胞。
4. 根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤S2具体包括:将去除了红细胞的 外周血细胞加入荧光标记的抗B细胞表面标示物抗体,孵育,然后洗涤除去未结合的所述荧 光标记的抗B细胞表面标示物抗体,使用流式细胞仪分选得到所述B淋巴细胞。
5. 根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述荧光标记的抗B细胞表面标示物抗体 特异性地识别下述人的B细胞表面标示物的一种或多种CD5、CD10、CD15、CD19、CD20、CD22、 CD30、CD38、CD43、CD45、CD77、CD79a。
6.—种用于从外周血中分选B淋巴细胞的试剂盒,其特征在于,包括:红细胞密度离心 分离介质、缓冲液和荧光标记的抗B细胞表面标示物抗体。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述红细胞密度离心分离介质在2〇r下 的比重为1.〇8〇〜1.081克/毫升,所述红细胞密度离心分离介质包含硫酸铁、氯化锌、硝酸 铁中的一种和蔗糖。
8.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述荧光标记的抗B细胞表面标示物抗 体特异性地识别下述人的B细胞表面标示物的一种或多种CD5、CD10、CD15、CD19、CD20、 CD22、CD30、CD38、CD43、CD45、CD77、CD79a。
9. 一种用于从B细胞淋巴瘤病人的外周血中分选、提取及鉴定血源性淋巴肿瘤细胞的 试剂盒,其特征在于,包括:红细胞密度离心分离介质、缓冲液、荧光标记的抗B细胞表面标 示物抗体、荧光标记的抗淋巴细胞肿瘤标示物抗体和染色体倍体检测探针。
10. 根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述红细胞密度离心分离介质在20°C 下的比重为1.080〜1.081克/毫升,所述红细胞密度离心分离介质包含硫酸铁、氯化锌、硝 酸铁中的一种和蔗糖。
11. 根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述荧光标记的抗B细胞表面标示物抗 体特异性地识别下述人的B细胞表面标示物的一种或多种CD5、CD10、CD15、CD19、CD20、 CD22、CD30、CD38、CD43、CD45、CD77 或 CD79a。
12. 根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述荧光标记的抗淋巴细胞肿瘤标示 物抗体特异性地识别下述一种或多种抗原:ki-67、Bcl-2、Bcl-6、EGFR vIII、C-myc、MUMl、 PAX5、0CT2或B0B1。
13. 根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述染色体倍体检测探针为12号染色 体着丝粒探针。
14. 一种从外周血中分选B淋巴细胞的系统,其特征在于,包括如权利要求6至8中任一 项所述的试剂盒。
15. 根据权利要求14所述的系统,其特征在于,所述系统还包括流式细胞分选仪。
16. —种用于从b细胞淋巴瘤病人的外周血中分选、提取及鉴定血源性淋巴肿瘤细胞的 系统,其特征在于,包括如权利要求9至13中任一项所述的试剂盒。
17. 根据权利要求ie所述的系统,其特征在于,所述系统还包括流式细胞分选仪、半自 动或全自动免疫分析仪。
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