CN1245628C - 检测外周血抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测外周血抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的新方法，包括构建和制备MHC I类分子的突变体蛋白，通过体外孵育得到MHC I类分子突变体-肽复合物，将所述复合物与光交联剂化学交联，使已经交联了光交联剂的复合物与样品中所要检测的抗原特异性CTLs相互结合，在温和条件下进行光交联而将MHC I类分子突变体-肽复合物不可逆地共价结合在CTL表面的TCR上，随后用免疫荧光检测抗原特异性CTL。本发明还涉及使用所述方法的试剂盒及其应用。

Description

检测外周血抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法及试剂盒

本发明涉及分子免疫学和细胞免疫学领域，更具体地，本发明涉及体外检测抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的新方法，利用该方法的试剂盒及其应用。

细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte，CTLs)通过识别细胞表面主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)I类分子及其结合的抗原肽而杀伤靶细胞，是机体抗肿瘤、抗移植物及有效控制各种感染的重要免疫防御反应之一。抗原特异性CTLs所能识别的抗原主要是来源于内源性蛋白抗原降解后结合于MHC I类分子上的肽段。MHC I类分子是由具有高度多态性的重链及保守的轻链即β₂微球蛋白组成的异源二聚体，在所有有核的细胞中表达，在人中MHC I类分子的重链由称为人白细胞抗原(HLA)的分子组成。与MHC I类分子结合的抗原短肽在抗原递呈细胞(APC)内被加工(内源性抗原)，在细胞的内质网中结合于MHCI类分子重链的α1和α2功能区构成的肽结合槽(groove)内，β₂微球蛋白与重链通过非共价结合并起稳定MHC I类分子-肽复合物的作用，然后定位于细胞表面，抗原特异性CTLs通过其表面的αβ型T细胞受体(TCR)和MHC I类分子-肽复合物的相互作用来识别被感染的细胞，进而杀伤感染细胞。近年来对特异性CTL反应在防治爱滋病、疟疾以及抗肿瘤中的重要作用有大量报道。

生物技术产业的发展使得癌症、自身免疫性疾病和感染性疾病的新的免疫治疗方法得到了迅速的发展。疫苗免疫或免疫治疗后进行定量或定性CTL反应检测抗原及时对治疗效果进行评估，从而为临床治疗提供有力的依据。由此，迫切需要简便、易行、灵敏的方法对CTL的数量和功能进行评估。目前检测抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法主要有以下几种：①细胞毒性分析方法，即经典的⁵¹Cr释放分析法、LDA；②细胞因子检测法，例如酶联免疫印记分析方法、细胞内细胞因子染色法；③特异T淋巴细胞受体(TCR)的聚合酶链反应(PCR)；以及④可溶性MHC-肽四聚体方法。由于对某一MHC-肽复合体具有特异识别作用的CTLs在外周血淋巴细胞中的比率很低，因此检测这些低频率的特异性CTLs需要有高敏感度的方法。细胞毒性分析方法和细胞因子检测法是间接检测抗原特异性CTLs的方法，要求有大量的特异性CTLs作为效应细胞，因此需要首先在体外进行扩增，致使这两种方法周期长、敏感性低、费时费力，难以广泛应用。TCR的聚合酶链反应是一种基于PCR技术的方法，其敏感性高，但是只能应用于已知TCR基因型的特异CTLs检测，因此在很大程度上限制了该方法的应用。可溶性MHC-肽四聚体法(Altman，J.D.et al.Science 274，94-6.(1996))是目前最新的直接检测抗原特异性CTLs的方法，然而，尽管四聚体可以同时与四个TCR结合，虽然减慢了它们的解离率，却没有从根本上解决解离率快的问题。因为可溶性MHC-肽复合物单体与TCR的解离率很快，也就是说它一旦与TCR结合后在几秒钟内就又与TCR解离。在四聚体与特异性CTLs孵育后，不可避免地要进行冲洗，从而减低流式细胞仪检测背景，提高阳性检出率。冲洗本身打破了结合在细胞表面的四聚体和游离的四聚体之间的平衡，使结合在细胞表面的四聚体与TCR解离速度增加。可以设想，冲洗后随着时间的延长，结合在特异性CTL表面的四聚体将越来越少，使得流式细胞仪的检测结果灵敏度降低，阳性检出率下降。另外，此方法的操作过程仍然很复杂，构建四聚体要经过三次蛋白纯化，大大增加了蛋白的损失量，因此必须提高原核细胞的蛋白表达量以满足需求，造成实验步骤繁琐，消耗大量人力物力，影响了此法在临床检测和动物实验中的简便性和实用性。

本发明人针对四聚体的这些缺点进行了创新，利用一种苯甲酮类光交联剂的化学试剂，使MH-C-肽复合物不可逆地与TCR结合，从而不需可溶性MHC-肽四聚体，仅用MHC-肽单体即实现了抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的简便、灵敏、结果可靠的检测。

因此，本发明的一个目的在于提供检测外周血抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的一种新方法。

本发明的另一目的在于提供一种检测外周血抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的试剂盒，该试剂盒利用本发明的方法进行检测。

本发明的再一目的在于提供本发明方法在诊断或辅助诊断及预后感染性疾病、肿瘤、同种异体移植排斥反应中的应用及在评价疫苗中的应用。

根据本发明的一个方面，本发明涉及一种检测外周血抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法，所述方法包括如下步骤：

a)构建和制备MHC I类分子的突变体蛋白，以使之能与苯甲酮类光交联剂结合而同时不改变其空间构象和与TCR结合的功能；

b)将突变体蛋白与抗原特异性肽保温形成复合物；

c)将所述复合物与苯甲酮类光交联剂在4℃避光保温过夜；

d)将步骤c)的复合物与可能含有抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的外周血淋巴细胞样品4℃保温30分钟；

e)以大于310nm波长的紫外光照射步骤d)的混合物30分钟；以及

f)免疫荧光检测以确定外周血淋巴细胞样品中抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的存在。

具体地，本发明的内容是构建和制备MHC I类分子的突变体蛋白，通过体外孵育得到MHC I类分子突变体-肽复合物，将所述复合物与光交联剂首先进行化学交联，使已经交联了光交联剂的复合物与样品中所要检测的抗原特异性CTLs相互结合，在温和条件下进行光交联而将MHC I类分子突变体-肽复合物不可逆地共价结合在CTL表面的TCR上，阻止其解离，随后用免疫荧光检测抗原特异性CTL。在本发明的一个实施方案中，MHC I类分子突变体涉及组成MHC I类分子重链的HLA-A2分子的突变。

交联剂早在二十世纪五十年代就应用于增加酶的稳定性的实验中。众所周知二硫键可以稳定蛋白分子的构象，而交联剂类似二硫键，它具有两个功能基团，与蛋白质等大分子的侧链或主链发生化学反应，形成共价键，可以被应用于分子内和分子间的交联，从而使高温下分子构象的稳定性增加。随着对细胞膜受体及其配体相互作用的研究的深入，七十年代初交联剂被应用于该研究领域。但是至本发明作出之日起，尚未有交联剂应用于检测抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的任何报道或暗示。

已知交联剂包括两种类型：化学交联剂和光交联剂。本发明方法使用的是光交联剂中的一类，即苯甲酮(BP)类光交联剂。本发明方法中所用的BP类光交联剂的例子包括但不限于苯甲酮-4-马来酰亚胺，4，4′-二马来酰亚氨基苯甲酮，4-(2-碘乙酰氨基)苯甲酮(BPIA)，苯甲酮-4-异硫氰酸酯等。在本发明的一个实施方案中，本发明方法使用苯甲酮-4-马来酰亚胺(BPM)作为光交联剂，它是BP类光交联剂的一种，有两个功能基团，一个是与巯基反应的化学反应功能基团，另一个是光反应功能基团，长度大约为1nm。与其它光交联剂相比，BP类光交联剂的稳定性更高；不象其它光交联剂必须避光操作，BP类光交联剂可以在暗光下操作，但优选是避光操作；而且BP类光交联剂不需短波紫外线照射，只要在350-360nm的长波紫外线下即可完成交联反应，从而可以防止短波紫外线对蛋白质及细胞的损伤；BP类光交联剂可以与惰性较大的C-H键反应，甚至可以在水溶液中、亲核试剂中进行反应。

为了使MHC I类分子能标记上BP光交联剂，本发明人设想在不改变MHC I类分子构象及与TCR结合的功能的前提下把MHC I类分子重链的某一个氨基酸突变为半胱氨酸，从而提供一巯基以与BP类光交联剂的巯基基团反应。应理解的是，根据现有的MHC I类分子的信息，本领域技术人员能够容易地确定这种突变的位点。

在本发明方法的一个实施方案中，本发明所用的MHC I类分子中的重链为HLA-A2类分子。现有技术的大量研究表明，HLA-A2类分子的第58位氨基酸突变后，并不改变其空间构象和与TCR结合的功能，因此本发明的此实施方案中将HLA-A2的第58位氨基酸突变成半胱氨酸(即HLA-A2E58C突变体)，它的侧链提供了一个巯基，可以与BP类光交联剂进行化学交联，使HLA-A2分子标记上交联剂。当含有这种光交联剂标记的突变HLA-A2分子和抗原特异性肽的复合物与抗原特异性CTLs表面的TCR相互作用而结合时，通过光交联剂的光交联反应，其不可逆地结合到CTLs表面，随后可利用免疫荧光检测以确定抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的存在。所述的免疫荧光检测可以是本领域熟知的任何技术。优选地，在本发明的一个实施方案中，所述的检测是利用原核表达的HLA-A2融合蛋白末端6×His的单克隆抗体及荧光标记的二抗荧光染色，进行流式细胞仪检测。

本发明的方法适用于CTLs在机体内发挥重要作用的感染性疾病和肿瘤患者以及同种异体移植排斥反应的诊断或辅助诊断以及预后，例如：乙型肝炎病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、流感病毒、巨细胞病毒、人类免疫缺陷病毒-1、单纯疱疹病毒、C型肝炎病毒、EB病毒和小鼠巨细胞病毒的感染；恶性黑素瘤、乳腺癌、结肠癌、EB病毒相关的B细胞淋巴增殖性疾病、皮肤鳞状细胞癌、内眼肿瘤、宫颈癌、恶性神经胶质瘤等。本发明方法还适用于疫苗的评价。本领域技术人员熟知各种病毒和肿瘤的抗原特异性肽，从而可以容易地设计和制备用于本发明方法中与MHC I类分子形成复合物的抗原特异性肽，以便通过本发明方法鉴别抗原特异性CTL。在本发明的一个实施方案中，本发明方法用于检测乙型肝炎病毒抗原特异性CTL，所用抗原特异性肽为肽HBc_18-27(FLPSDFFPS)和肽HBs_335-343(WLSLLVPFV)。

本发明的方法是一种简便、灵敏度高的体外检测抗原特异性CTLs的新方法，该方法通过独创性的光交联反应，使MHC-肽复合物单体不可逆结合于TCR，从根本上解决解离快的问题，即使解离平衡被打破后仍然可使MHC-肽复合物不可逆地停留在CTLs表面。利用该方法能鉴定相关疾病特异性CTLs及其表位，为疫苗研制工作或基因治疗领域提供了新的工具。

因此，本发明的另一个方面涉及一种用于体外检测外周血抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的试剂盒，该试剂盒包括BP类光交联剂，MHC I类分子突变体蛋白及抗原特异性肽，以及进行检测所必需的其它辅助试剂。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

图1HLA-A2E58C突变体基因和蛋白质序列图。

图2示出根据实施例4获得的MHC-肽复合物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。其中泳道1：纯化的HLA-A2 E58C；泳道2：纯化的β₂m；泳道3：肽HIVpol(ILKEPVHGV)、HLA-A2 E58C和β₂m的重建体系；泳道4：肽HBc_18-27(FLPSDFFPS)、HLA-A2 E58C和β₂m的重建体系；泳道5：肽HBs_335-343(WLSLLVPFV)、HLA-A2 E58C和β₂m的重建体系。

图3示出实施例5进行的抗原特异性CTLs的流式细胞仪检测结果。其中A为非HLA-A2乙型肝炎患者PBMCs的空白对照；B为HLA-A2乙型肝炎患者PBMCs的空白对照；C为非HLA-A2乙型肝炎患者PBMCs中HBc抗原肽特异性CTLs；D为HLA-A2乙型肝炎患者PBMCs中HBc抗原肽特异性CTLs，占CD8+T淋巴细胞的4.27％；E为非HLA-A2乙型肝炎患者PBMCs中HIV非相关抗原肽特异性CTLs；F为HLA-A2乙型肝炎患者PBMCs中HIV非相关抗原肽特异性CTLs。

实施例1：HLA-A2 E58C突变体基因的克隆和β₂m cDNA序列的克隆

1、编码HLA-A2前271个氨基酸的cDNA序列和β₂微球蛋白(β₂m)cDNA序列的获得

取HLA-AB分型为A2的健康成人外周静脉血淋巴细胞，用TRIZOL试剂盒(Gibco BRL，USA)提取总RNA。利用RT-PCR技术获得HLA-A2部分cDNA序列和β₂m cDNA序列，引物如下：

HLA-A2上游引物：

5′-cccaagcttatcgaaggtcgttgcggtggaggtggatctggctctcactccatgaggtat-3′

HLA-A2下游引物：

5′-cgggatcccgggtgaggggcttgggcaaacc-3′

反应条件为：94℃变性5分钟，然后进行如下循环程序5次：

94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸2分钟；再进行如下循环程序25次：94℃变性1分钟，68℃退火和延伸2分钟，循环结束后72℃继续延伸10分钟，扩增产物为862bp。

β₂m上游引物：

5′-cg ggatccatcgaaggtcgtatccagcgtactccaaagatt-3′(含BamH I酶切位点)

β₂m下游引物：

5′-ccc aagctttcacatgtctcgatcccactt-3′(含Hind III酶切位点)

反应条件为：94℃变性5分钟，然后进行如下循环程序5次：94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟；再进行如下循环程序25次：94℃变性1分钟，68℃退火和延伸1.5分钟，循环结束后72℃继续延伸10分钟，扩增产物为326bp。

将上述PCR产物克隆到pGEM-T EASY质粒(Promega USA)中，送大连宝生物公司测序。所得HLA-A2E58C突变体基因序列如图1所示。

2、HLA-A2E58C突变体的获得

利用定点突变PCR技术，把HLA-A2的第58位氨基酸由谷氨酸E突变为半胱氨酸C。所需的两对引物分别为：

HLA-A25’端引物

5′- agatctgatcgaaggtcgtggctctcactccatgaggtat-3′(含Bgl II酶切位点(下划线)

HLA-A23’端引物

5′- gcggccgcttaaccatgatgatgatgatggtgggtgaggggcttgggcaaacc-3′(含Not I酶切位点(下划线)和6×His序列(黑体))；

上链引物

5′-gagggtccgtgctattgggacggggag-3′

下链引物

5′-gtcccaatagcacggaccctcctgctc-3′

第一步PCR的反应条件：以HLA-A25’端引物和下链引物为引物对，94℃变性5分钟，然后进行如下循环程序5次：94℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸1分钟；再进行如下循环程序20次：94℃变性30秒，68℃退火和延伸1.5分钟，循环结束后72℃继续延伸10分钟，扩增产物为202bp；以上链引物和HLA-A23’端引物为引物对，94℃变性5分钟，然后进行如下循环程序5次：94℃变性30秒，64℃退火30秒，72℃延伸1分钟；再进行如下循环程序20次：94℃变性30秒，68℃退火和延伸1.5分钟，循环结束后72℃继续延伸10分钟，扩增产物为683bp。第二步PCR的反应条件为：第一步的两种PCR产物纯化后，混合，94℃变性5分钟，然后进行如下循环程序5次：94℃变性30秒，61℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环结束后72℃继续延伸5分钟；从PCR仪中取出Eppendorf管迅速加入HLA-A25’端引物和HLA-A23’端引物各1μl，94℃变性5分钟，再进行如下循环程序25次：94℃变性30秒，68℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，循环结束后72℃继续延伸10分钟，扩增产物为864bp，克隆到pGEM-T EASY质粒中，送大连宝生物公司测序。所得HLA-A2E58C突变体蛋白质序列如图1所示。

实施例2：HLA-A2 E58C突变体基因和β₂m基因的原核表达及蛋白的纯化

1.原核表达质粒的构建及其在原核表达系统中的表达用Bgl II和Not I分别双酶切克隆了HLA-A2突变cDNA序列的pGEM-T EASY质粒和表达载体pET-30a(+)(Novagen，USA)，用BamH I和HindIII分别双酶切克隆了β₂mcDNA序列的pGEM-TEASY质粒和表达载体pET-30a(+)，分别利用T4DNA连接酶进行连接反应。将正确的克隆转化大肠杆菌BL21株，经37℃IPTG诱导3小时，得到HLA-A2 E58C突变体融合蛋白和β₂m融合蛋白。

2.HLA-A2E58C突变体融合蛋白和β₂m融合蛋白的纯化

利用Invitrogen公司的ProBond^TM 6×His蛋白纯化树脂根据厂商对原核表达的蛋白进行金属螯合亲和层析纯化。进行SDS-PAGE分析检测纯化结果。

实施例3：抗原特异性肽的合成

本例中以乙型肝炎病毒(HBV)的抗原特异性肽作为本发明方法中使用的抗原特异性肽。当然还可以根据检测CTL的目的选用不同的病毒或肿瘤抗原特异性肽。

HBsAg_335-343(WLSLLVPFV)和HBcAg_18-27(FLPSDFFPSV)表位已经被证明是HBV抗原特异性表位(Nayersina，R.et al.J Immunol150，4659-71.(1993))，所以本发明人选择了这两个表位作为抗原特异性肽，选择HIVpol(ILKEPVHGV)作为阴性对照。上述三个肽由军事医学科学院合成。

实施例4：MHC-肽复合物的形成

对上述原核表达的重组融合蛋白进行复性及重建HLA-A2-肽复合物，重建体系如下：

每1ml重建反应体系如下：

1M Tris-HCl(pH8.0)                100μl

2M L-精氨酸盐酸盐                 200μl

0.5M EDTA                         4μl

0.1M还原型谷光甘肽                50μl

0.1M氧化型谷光甘肽                5μl

0.1M PMSF                         5μl

原核表达的HLA-A2突变体蛋白        35μg

原核表达的β₂m蛋白               34μg

抗原特异性肽                      10μg

去离子水                          600μl

其中原核表达的HLA-A2突变体蛋白和原核表达的β₂m蛋白的配制如下：

分别取实施例2获得的HLA-A2突变体融合蛋白和β₂m融合蛋白各99μl(200μg)，加入10mM DTT 1μl，混匀待用。

把上述重建体系放入10℃水浴中孵育24小时。对重建的复合物单体进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，结果如图2。对比泳道1、2，泳道3、4和5可以很明显地看到除了HLA-A2 E58C和β₂m以外的第三条蛋白条带(箭头所示)。

实施例5：外周静脉血淋巴细胞中HBV抗原特异性CTLs的检测

本实施例以检测外周血中HBV抗原特异性CTL为例说明了本发明方法。

乙型肝炎病毒感染目前仍是威胁健康的主要原因，世界人口的5％存在着HBV的持续感染，具有发展成慢性乙型肝炎或肝细胞癌的可能性。急性乙型肝炎病人外周血中的CTLs具有多克隆、多特异性的特点，可以对HBV蛋白的多种表位产生特异的CTL反应，大多数急性乙型肝炎病人外周血中都可以检测到病毒特异的CTLs，因此本例选择了急性乙型肝炎病人作为外周静脉血的来源。另外，丙氨酸氨基转移酶(ALT)可以作为乙型肝炎病人病情的一个衡量指标，ALT越高，肝细胞的损伤越严重，CTLs的数量和活性越大，同时考虑到乙型肝炎病人数量多，本实验的病人外周静脉血样容易获得，因此本例选择ALT大于正常值20倍的急性乙型肝炎病人作为研究对象(ALT正常值＜40)，并且患者的血清HBsAg、HBeAg和IgM HBc-Ab阳性，HCV阴性，HIV检测为阴性。

1.突变的HLA-A2-肽复合物和BPM进行化学交联

取0.2μl的BPM(20mM)直接加入1ml实施例4的重建反应体系中，4℃过夜，避光；之后10μl 10mM的DTT加入1ml重建体系中，终止反应；4℃透析过夜，透析液的配制(500ml)如下：

1M Tris-HCl(PH8.0)            50ml

0.5M EDTA                     2ml

0.1M PMSF                     2.5ml

加去离子水至500ml。

2.乙肝病人单核细胞的分离及HLA分型

(1)取急性乙型肝炎患者(ALT＞800)外周静脉5ml，以肝素抗凝，轻摇1分钟后，室温放置1小时；将抗凝血用RPMI1640培养基1∶1的体积混匀；将稀释血悬于5ml的淋巴细胞分层液(购于鼎国生物技术公司)的界面上，1800rpm离心20分钟；用吸管将分离出的中间层细胞取出放入另一已加入RPMI1640不完全培养基的试管中，充分混匀后，1500rpm离心10分钟；弃上清，用RPMI 1640不完全培养基混匀后，1000rpm离心10分钟，重复一次；调细胞数至2×10⁶/ml，备用。

(2)用HLA-AB分型板(购自中日友好医院临检所)分型：

将上述已经分离好的1μl淋巴细胞加在HLA-AB分型板上，室温孵育30分钟；加5μl ABC补体于HLA血清板中，室温孵育60分钟；加2μl 5％伊红染色5分钟；加5μl甲醛溶液固定，2小时后读结果。

3.外周静脉血抗原特异性CTLs的检测

(1)取HLA分型为A2的急性乙肝病人外周静脉血单核细胞，用无血清RPMI 1640洗一次，计数，调至2×10⁶个/ml；每个反应加0.5ml的细胞(1×10⁶个)，再迅速加入1ml上述用BPM化学交联的复合物(其中含有相应的HLA-A2为35μg)，混匀，4℃孵育30分钟。上述步骤皆需要避光。用手提紫外灯(UVGL-25)的长波段(大于310nm)照射，以减少细胞和蛋白的损伤，紫外照射(距离约1cm)30分钟，PBS冲洗至少二次。

(2)免疫荧光染色：

每个样本加入1μg 6×His单克隆抗体(Qiagen USA)，4℃，30分钟；PBS至少冲洗二次；加入15μl FITC标记的羊抗小鼠IgG二抗(中山生物技术公司)，4℃避光30分钟；PBS至少冲洗二次；每个样本加入20μl PE(藻红素)标记的小鼠抗人CD8IgG(购于晶美生物公司)，4℃避光30分钟；PBS至少冲洗二次；用含有0.15M氯化钠的1％多聚甲醛固定；流式细胞仪(型号：库尔特XLB49333)分析。

图3是两位急性乙型肝炎患者(非HLA-A2和HLA-A2)外周静脉血的流式细胞仪检测结果，图中示出非HLA-A2患者的HBc抗原肽特异性CTLs的数量为0，HIV非相关抗原肽特异性CTLs的数量为0；而HLA-A2患者的HBc抗原肽特异性CTLs的数量为4.27％，HIV非相关抗原肽特异性CTLs的数量为0。表明本发明方法既简便又灵敏性高。

在本实施例中用HLA-A2E58C突变体-肽复合物检测了19例HLA分型为A2的急性乙型肝炎患者、1例非HLA-A2的急性乙型肝炎患者(ALT＞800)和3例HLA-A2型慢性乙型肝炎患者(以上患者HIV感染皆为阴性)。发现19例HLA分型为A2的急性肝炎患者中13例患者的外周血存在HBcAg_18-27或HBsAg_335-343抗原肽特异性CTLs，占外周血单核细胞中CD8+T淋巴细胞的2.75％-31.61％，同时还检测了这些患者的HIVpol(ILKEPVHGV)抗原肽特异性CTLs，结果为阴性，这说明本发明方法的假阳性率低，也就是说BPM在与TCR上的C-H键发生光交联时的非特异性交联发生的几率低，只有在MHC-肽复合物特异地结合在TCR上，BPM与TCR上的C-H键很接近(1nm)时，才能在光的激发下发生光交联反应，这一结果与本发明人的预测和一些文献报道相一致，因此在本发明中应用光交联剂可以避免假阳性的发生；1例非HLA-A₂的急性乙型肝炎患者和3例HLA-A₂的慢性乙型肝炎患者的HBcAg_18-27抗原肽特异性CTLs检测结果也为阴性，与相关文献报道一致，以上结果均证明本发明的方法是可行的。

急性乙型肝炎病人外周血中的CTLs具有多克隆、多特异性的特点，由于患者的个体差异，可以对HBV蛋白的多种表位产生特异的CTL反应，本实施例中HBc特异性CTLs为阴性的患者可能具有HBV蛋白其它表位特异的CTLs，本发明人检测了其中一例患者的HBs抗原特异性的CTLs，结果发现HBs抗原特异性的CTLs占外周血单核细胞中CD8+T淋巴细胞的3.22％，进一步证明了本发明的可行性。

实施例6：本发明方法与细胞内细胞因子检测法的比较

细胞内细胞因子检测方法是一个比较新的应用流式细胞仪的单细胞检测技术(Prussin，C.& Metcalfe，D.D.J.Immunol.Med.188，117-128(1995))，细胞在体外受到某种刺激(抗原特异性肽或离子霉素)开始产生细胞因子，用BFA(Brefeldin A)等细胞内运输阻断剂阻断细胞因子在高尔基体内的运输，使细胞因子不能分泌到细胞外，在细胞内蓄积，利用其特异性抗体可以发现分泌该细胞因子的特异性细胞，同时也可以检测该种细胞表面的特异性蛋白。因此根据细胞毒性T细胞分泌IFNγ的特点，利用细胞内细胞因子检测方法作为本发明的对照。步骤如下：

1)取两个15ml的离心管，分别标记为刺激组和非刺激组，向每个离心管中加入0.5ml肝素抗凝血。刺激组加入5μl CD28/CD49d单克隆抗体(终浓度为1μg/ml)和2.5μl抗原特异性肽(前文提及的抗原特异性肽)(抗原特异性肽溶于DMSO中，浓度为2mg/ml，分装成5μl一管，冻存于-80℃，每1ml血加入5μl使终浓度为10μg/ml)；非刺激组只加5μl CD28/CD49d单克隆抗体(终浓度为1μg/ml)。轻柔混匀，置37℃孵育2小时；

2)取BFA储存液，用无菌PBS按1∶10的比例稀释，向刺激组和非刺激组各加入10μl稀释液，混匀，37℃孵育4小时；

3)各加50μl EDTA溶液，剧烈震荡，室温孵育15分，再次震荡10秒；

4)取4个5ml的离心管，分别标记为刺激空白管、刺激样本管、非刺激空白管和非刺激样本管，每管加入上述经抗原肽刺激的血样200μl；

5)各加2ml 1×BD FACS裂解溶液，混匀，室温孵育10分；

6)各加2ml冲洗缓冲液(用1×PBS配制0.5％BSA和0.1％叠氮钠)，500g室温离心5分钟；

7)弃上清，加入0.5ml 1×BD FACS通透化溶液2，震荡使细胞重悬，室温孵育10分钟；

8)各加入2ml冲洗缓冲液，500g室温离心5分钟；

9)弃上清，向刺激样本管和非刺激样本管各加入20μl FITC标记的抗人INF-γ单克隆抗体和20μl PE标记的CD8单克隆抗体，向刺激空白管和非刺激空白管各加入上述抗体的同型抗体或用PBS代替，室温避光孵育30分钟；

10)各加入2ml冲洗缓冲液，500g室温离心5分钟；

11)弃上清，加入200μl 1％多聚甲醛重悬细胞，4℃避光保存，FACS检测。

本实施例中分别用本发明的方法和细胞内细胞因子检测方法检测了5例HLA分型为A2的急性乙型肝炎患者的外周静脉血，结果发现利用上述两种方法分别检测出4例患者的外周静脉血单核CD8+T淋巴细胞中存在着HBc特异性CTLs，一例患者HBc特异性CTLs为阴性，两种方法的检测结果一致，进一步说明本发明的可行性。本发明人还发现利用本发明检测出的HBc特异性CTLs占外周静脉血单核CD8+T淋巴细胞的百分数普遍高于细胞内细胞因子检测方法的百分数，因此本发明人认为本发明的新方法的灵敏性比细胞内细胞因子检测方法高。由于细胞内细胞因子检测方法要在体外刺激被检测的细胞使其产生细胞因子，一些细胞虽然在机体内环境中具有分泌细胞因子的能力，但是在体外的模拟环境中很快会失去功能，最终走向凋亡，所以目前功能性细胞毒性T淋巴细胞检测方法都受到这一条件的制约而使检测结果偏低，然而本发明中的新方法是以细胞毒性T淋巴细胞的表型结构为基础，检测CTLs表面的蛋白分子和MHC-肽复合体的一种表型分析方法，因此被检测的CTLs不会受外界环境的影响，不存在检测结果偏低的问题，从而使结果更接近真实值。

Claims (15)

1、一种检测外周血抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法，所述方法包括如下步骤：

a)构建和制备MHC I类分子的突变体蛋白，其中所述MHC I类分子的重链为HLA-A2分子，其突变体为HLA-A2第58位氨基酸突变为半胱氨酸，以使之能与苯甲酮类光交联剂结合而同时不改变其空间构象及与TCR结合的功能；

b)将突变体蛋白与抗原特异性肽保温形成复合物；

c)将所述复合物与苯甲酮类光交联剂在4℃避光保温过夜；

d)将步骤c)的复合物与可能含有抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的外周血淋巴细胞样品4℃保温30分钟；

e)以大于310nm波长的紫外光照射步骤d)的混合物30分钟；以及

f)免疫荧光检测步骤e)的混合物以确定外周血淋巴细胞样品中抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的存在。

2、权利要求1的方法，其中所述的苯甲酮类光交联剂选自苯甲酮-4-马来酰亚胺，4，4′-二马来酰亚氨基苯甲酮，4-(2-碘乙酰氨基)苯甲酮，苯甲酮-4-异硫氰酸酯。

3、权利要求2的方法，其中所述的苯甲酮类光交联剂为苯甲酮-4-马来酰亚胺。

4、权利要求1的方法，其中免疫荧光检测为流式细胞检测法。

5、权利要求1的方法，其用于检测病毒、细菌或寄生虫感染性疾病、肿瘤或同种异体移植排斥反应中产生的细胞毒性T淋巴细胞反应。

6、权利要求1的方法，其用于评价疫苗。

7、权利要求1的方法，其用于检测外周血中乙型肝炎病毒抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞。

8、权利要求7的方法，其中所用抗原特异性肽为序列为FLPSDFFPS的肽HBc_18-27和序列为WLSLLVPFV的肽HBs_335-343。

9、一种用于体外检测外周血抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的试剂盒，该试剂盒包括苯甲酮类光交联剂，MHC I类分子突变体蛋白及抗原特异性肽，以及进行检测所必需的其它辅助试剂，其中所述MHC I类分子的重链为HLA-A2分子，其突变体为HLA-A2第58位氨基酸突变为半胱氨酸。

10、权利要求9的试剂盒，其中所述的苯甲酮类光交联剂选自苯甲酮-4-马来酰亚胺，4，4′-二马来酰亚氨基苯甲酮，4-(2-碘乙酰氨基)苯甲酮，苯甲酮-4-异硫氰酸酯。

11、权利要求10的试剂盒，其中所述的苯甲酮类光交联剂为苯甲酮-4-马来酰亚胺。

12、权利要求9的试剂盒，其用于检测病毒、细菌或寄生虫感染性疾病、肿瘤或同种异体移植排斥反应中产生的细胞毒性T淋巴细胞反应。

13、权利要求9的试剂盒，其用于评价疫苗。

14、权利要求9的试剂盒，其用于检测外周血中乙型肝炎病毒抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞。

15、权利要求14的试剂盒，其中所含的抗原特异性肽为序列为FLPSDFFPS的肽HBc_18-27和序列为WLSLLVPFV的肽HBs_335-343。

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