CN109293739B

CN109293739B - 一种a3超家族通用肿瘤抗原多肽及其应用

Info

Publication number: CN109293739B
Application number: CN201810069230.1A
Authority: CN
Inventors: 刘军; 高福; 张永丽
Original assignee: Wenzhou Medical University; National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: Wenzhou Medical University; National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2018-01-24
Filing date: 2018-01-24
Publication date: 2021-03-30
Anticipated expiration: 2038-01-24
Also published as: CN109293739A

Abstract

本发明公开了一种A3超家族通用肿瘤抗原多肽及其应用，属于免疫检测领域。本发明提供了针对七种不同人群MHC型别共同识别的抗原表位TRP‑2多肽，并制备相应的七种四聚体，有效地增加多肽‑MHC与特异性T细胞表面TCR的亲和力，可以作为T细胞评价的有效工具。同时本发明提供了四聚体筛选特异性T细胞的方法，同时提供了寻找不同人群共有的T细胞受体的新思路，我们可以运用该肿瘤抗原表位筛选不同肿瘤患者共有的特异性T细胞受体，以用于肿瘤免疫治疗的相关研究。

Description

一种A3超家族通用肿瘤抗原多肽及其应用

技术领域

本发明涉及一种A3超家族通用肿瘤抗原多肽及其应用，属于免疫检测领域。

背景技术

肿瘤至今仍是人类死亡的主要原因，现阶段治疗肿瘤的手段，除了传统的手术治疗，放疗，化疗，细胞免疫疗法也成为极具前景的治疗方法。肿瘤细胞免疫治疗通过增强或功能性改造免疫细胞，特别是T细胞，杀伤肿瘤细胞。在肿瘤免疫过程中，T细胞扮演着重要的角色，T细胞通过识别肿瘤抗原介导细胞免疫反应。近年来，T细胞受体疗法在肿瘤免疫治疗发挥着重要的作用，在临床试验中也取得一定的进展，但在目前研究来看，还是有很多问题，任重而道远。

目前临床研究主要是HLA-A2肿瘤人群，免疫治疗的靶点较单一，具有人群的局限性。传统方法通过分离肿瘤组织里浸润的T细胞，然后体外进行浸润T细胞克隆培养，这一过程周期较长，样本不易获取，并且局限于实体肿瘤。针对TRP2肿瘤抗原用于肿瘤免疫研究也很少。并且现有的用于肿瘤免疫的T细胞受体并不适用大多数肿瘤，局限于对某一种人群某种肿瘤有特异性识别作用，因而不具有普适性。

HLA-A3超家族人群，包括HLA-A*0301、HLA-A*1101、HLA-A*3101、HLA-A*3303、HLA-A*6801、HLA-A*3001、HLA-A*3003七种型别的人群，这七种人群在中国占有60％比例，人群基数大。因此对这些人群研究有着十分重要的意义。同时现有技术中提供的肿瘤抗原多肽表位不能适用于这些人群，这就需要提供这些人群的肿瘤抗原多肽表位，用于肿瘤免疫治疗的研究，从而寻找通用广谱的T细胞受体，解决现有技术中的不足。

发明内容

本发明提供了一种肿瘤抗原表位多肽用于七种型别人群研究，通过四聚体技术和单细胞测序技术获取特异性T细胞受体，能够用于临床肿瘤免疫治疗研究。

本发明的第一个目的是提供一种特异性多肽的应用，所述多肽氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括筛选肿瘤特异性TCR、肿瘤免疫检测或制备药物。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是指：将SEQ ID NO.1所示的特异性多肽体外刺激HLA-A3超家族人群肿瘤抗原表位的T细胞，筛选获得T细胞受体。

本发明的第二个目的是提供所述特异性多肽在筛选肿瘤特异性TCR中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述TCR包含α链和β链，编码所述TCR的α链的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示；编码所述TCR的β链的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第三个目的是提供对肿瘤抗原特异性结合的T细胞的高度特异性和高度灵敏性的多肽-MHC四聚体，所述多肽-MHC四聚体由生物素化的MHC-I与SEQ ID NO.1所示的特异性多肽结合。

本发明的第四个目的是提供所述多肽-MHC四聚体的制备方法，包括如下步骤：(1)用大肠杆菌表达MHC轻链和MHC重链；(2)稀释复性，制备多肽/MHC复合物；(3)制备生物素化的多肽/MHC复合物；(4)与带标记的链亲和素反应。

在本发明的一种实施方式中，所述MHC重链C端连接生物素。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)是在BirA酶的催化下与D-biotin结合。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)是按照摩尔比5：1的比例与带标记的链亲和素反应。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：利用大肠杆菌表达MHC轻链及C端连接生物素的MHC重链，利用稀释复性的方法制备多肽/MHC复合物，用superdex200纯化，然后再BirA酶的催化下与D-biotin结合，形成生物素化的多肽/MHC复合物，再与带标记的链亲和素按照摩尔比5：1的比例反应，得到多肽/MHC复合物。

本发明的第五个目的是提供一种筛选获得所述TCR的方法。

本发明还所述多肽-MHC四聚体的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括：体外分选特异性T细胞，结合单细胞测序技术分离特异性TCR、特异性TCR功能分析以用于临床免疫治疗。

在本发明的一种实施方式中，所述特异性是指通过MHC四聚体只能识别针对HLA-A3超家族人群肿瘤抗原表位的T细胞受体，而无关表位多肽不能。

本发明的第六个目的是提供所述肿瘤特异性多肽在制备药物方面的应用。

本发明的第七个目的是提供含有所述特异性多肽的药物组合物。

有益效果：本发明用七种MHC型别的四聚体分析七种型别人群的外周血T淋巴细胞并体外分选的针对肿瘤抗原TRP2特异性T细胞，流式分析显示，七种不同MHC性别样本分别用七种四聚体染色，阳性细胞比例分别为0.21、0.31、1.06、0.25、1.54；阴性对照组分别为0.051、0.081、0.020、0.031、0.072、；HLA-A0301高出对照组4倍，HLA-A1101高出对照组3.8倍，HLA-A3101明显高出对照组50倍，HLA-A3303高于对照组8倍，HLA-A6801高于对照组21倍，HLA-A3001高于对照组15倍，HLA-A3003高于对照组5.3倍，可以作为肿瘤患者T细胞功能评价的有效工具。

附图说明

图1为TRP2-A0301四聚体生物素化效率检测；M，Marker；A，链亲和素；B，MHC和链亲和素；C，MHC；

图2为TRP2-A1101四聚体生物素化效率检测；M，Marker；A，链亲和素；B，MHC和链亲和素；C，MHC；

图3为TRP2-A3101四聚体生物素化效率检测；M，Marker；A，链亲和素；B，MHC和链亲和素；C，MHC；

图4为TRP2-A3303四聚体生物素化效率检测：；M，Marker；A，链亲和素；B，MHC和链亲和素；C，MHC；

图5为TRP2-A6801四聚体生物素化效率检测；M，Marker；A，链亲和素；B，MHC和链亲和素；C，MHC；

图6为TRP2-A3001四聚体生物素化效率检测；M，Marker；A，链亲和素；B，MHC和链亲和素；C，MHC；

图7为TRP2-A3003四聚体生物素化效率检测；M，Marker；A，链亲和素；B，MHC和链亲和素；C，MHC；

图8为对照例四聚体生物素化效率检测；M，Marker；A，链亲和素；B，MHC和链亲和素；C，MHC；

图9为HLA-A0301流式分析结果代表图；

图10为HLA-A1101流式分析结果代表图；

图11为HLA-A3101流式分析结果代表图；

图12为HLA-A3303流式分析结果代表图；

图13为HLA-A6801流式分析结果代表图；

图14为HLA-A3001流式分析结果代表图；

图15为HLA-A3003流式分析结果代表图。

具体实施方式

实施例1：MHC-四聚体的制备

1、多肽/MHC复合物的制备：

1)分别在HLA-A*0301(Genbank登录号L77702.1)、HLA-A*1101(Genbank登录号AF165065.1)、HLA-A*3101(Genbank登录号M84375.1)、HLA-A*3303(Genbank登录号U09740.1)、HLA-A*6801(Genbank登录号U41057.1)、HLA-A*3001(Genbank登录号KC701037.1)、HLA-A*3003(Genbank登录号LT575555.1)C端添加能够连接生物素的氨基酸序列GGGLNDIFEAQKIEWHE，分别与pET28a载体连接，组成各自质粒。将B2m基因(Genbank登录号为AAA39668.1)与载体连接，构建重组载体pET21a-B2m，并将质粒分别转化到大肠杆菌BL21中；

2)将携带步骤1的质粒的大肠杆菌BL21在37℃条件下加入1mmol/L IPTG诱导蛋白表达，将菌体超声破碎，高速离心后将沉淀溶解在溶解buffer(6mol/L盐酸胍，10％甘油，50mmol/LTris pH8.0，100mmol/LNaCl，10mmol/L EDTA)中；

3)将序列如SEQ ID NO.1所示的多肽和重链、轻链用稀释复性的方法在复性Buffer(100mmol/LTris pH 8.0，400mmol/L精氨酸，2mmol/L EDTA)中同时复性，使其形成MHC复合物。

4)多肽/MHC复合物纯化：使用超滤杯使复性后样品通过10kDa滤膜浓缩样品，并通过浓缩换液为Exchange Buffer(20mmol/L Tris-HCl，50mmol/L NaCl,pH8.0)；浓缩至50mL后，将样品转至50mL浓缩管后4℃离心4000rpm 20min,将上清转移到超滤管中浓缩到约0.5ml，离心12000rpm 10min，将上清转移到新的1.5mlEP管，过superdex200分子筛进行多肽/MHC复合物纯化，在收集管中提前加入2ul预冷的蛋白酶抑制剂(2mg/ml)。

2、多肽/MHC分子的生物素化

1)将经过分子筛纯化后的多肽/MHC复合物蛋白样品(200-300mAU)收集于超滤浓缩管中，浓缩至约300μL，在BirA酶的催化下与D-biotin反应，4℃孵育过夜。

2)将生物素化后的蛋白样品离心后过superdex200分子筛进行生物素化后的复合物纯化，以去除多余的生物素。

3)将纯化的多肽/MHC复合物浓缩到2mg/ml，取样进行Gel shift试验验证生物素化效果。

样品制备：

A.2μL链亲和素Streptavidin+8μL分子筛Buffer。

B.8μL生物素化后多肽/MHC样品+2μL链亲和素Streptavidin(20mg/ml)；

C.8μL生物素化后多肽/MHC样品+2μL分子筛buffer；

将上述三支样品置冰上孵育1h后进行SDS-PAGE鉴定，结果如图1所示。

生物素化后的MHC能够与Streptavidin结合成为大分子，从而使得其在SDS-PAGE中的条带滞后，通过比较(C-B)/C的MHC含量的比值可以判断生物素化的效果，既有多少比例的MHC得到较好的生物素化，图1～7结果显示，实验的生物素化效应约为90％。

3、生物素化的MHC分子四聚化：

将生物素化后的MHC分子浓缩到1mg/ml，按照链亲和素与多肽/MHC复合物的摩尔比1:5将生物素化后的MHC分子四聚化，链亲和素为带荧光标记的链亲和素，将带荧光标记的链亲和素分10次加入，置4℃避光孵育过夜。第二天，将四聚体化的MHC分子浓缩，并用PBS(pH8.0)换液三次，置4℃避光保存。

按上述相同步骤制备TRP-2-A*0301四聚体，TRP-2-A*1101四聚体，TRP-2-A*3101四聚体，TRP-2-A*3303四聚体，TRP-2-A*6801四聚体，TRP-2-A*3001四聚体，TRP-2-A*3003四聚体。对照例1

具体实施方式同实施例1，区别在于，将生物素化的过程中，调整蛋白酶抑制剂添加量，结果显示，未加蛋白酶抑制剂和将步骤1纯化的蛋白样品浓度高于300mAU会影响生物素化效率，如图8所示，生物素化效率明显降低(生物素化效应约为1％)。

实施例2：获取特异性TCR序列

1、将分离人外周血PBMC用体外肿瘤抗原多肽刺激9天，第10天进行流式检测。结果如图7-11所示。通过流式分析HLA-A0301实验组(特异性多肽免疫后，下同)阳性率为0.21％，比对照组提高了4倍；HLA-A1101实验组阳性率为0.31％，比对照组提高了3.8倍；HLA-A3101实验组阳性率为1.06％，比对照组提高了50倍；HLA-A3303实验组阳性率为0.25％，比对照组提高了8倍；HLA-A6801实验组阳性率为1.54，比对照组提高了21倍；HLA-A3001实验组阳性率为0.57％，比对照组提高了15倍；HLA-A3003实验组阳性率为0.27％，比对照组提高了5.3倍。

2、四聚体染色。用FACS buffer洗2遍,将培养的细胞按1x10^6/每孔转至96孔板，加入1μL PE-Tetramer避光室温孵育20min后，再加入抗体各2ul(FITC-CD8，APC-CD3，PerCp–CD4)避光4℃孵育30min。

3、洗涤。用200μL FACS buffer离心，洗2遍；

4、用流式细胞仪进行流式分选，在单细胞分选模式下，将阳性细胞分选至96孔板。分选前在96孔板内加入2μL oligo-dT primer(10uM),4μL细胞裂解液(0.2％TritonX-100和2U/μLRNase inhibitor),1μL dNTP Mix(10uM/each),分选完，孵育72℃3min,42℃2min，然后立即置于冰上。

5、反转录PCR。准备所有反转录混合物，如下表所示。

混匀，加入上步的96孔板内，总体积20μL，涡旋离心避免气泡。在PCR ThermalCycler进行反应，具体反应条件如下：

6、RACE巢式PCR

(1)预扩增。将上述反应产物加入，与下述试剂混匀，进行扩增。

(2)具体反应条件如下：

扩增结束后将产物稀释50倍。

(3)第一轮PCR。将上述稀释后的产物加入下述反应体系，分别进行α、β扩增。

(4)混匀，顺离，放入PCR扩增仪，反应条件如下:

将反应产物各稀释30倍后，进行下轮PCR。

(5)第二轮PCR。将上述稀释产物加入下述反应体系中，分别进行α、β扩增

(6)混匀，顺离，避免产生气泡，放入PCR扩增仪，反应条件如下

7、产物凝胶电泳分析。配制1％琼脂糖核酸胶，将产物全部进行琼脂糖凝胶电泳。

8、目的片段测序。

(1)目的片段胶回收，目的条带α、β分别为500bp,将目的条带切胶回收，具体操作按照康为世纪微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行。

(2)回收产物克隆，克隆体系按照pEASY-Blunt Zero Cloning kit推荐反应体系进行克隆，轻轻混合，室温(20℃-37℃)反应10分钟。然后加上述连接产物于50ulTrans1-T1感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴20-30分钟。42℃热激30s,立即置于冰上2分钟，加入250ul平衡至室温的LB培养基，200rpm,37℃培养1小时。取200ul菌液涂氨苄平板，37℃培养过夜。

(3)阳性克隆测序。挑选单克隆用PCR方法鉴定阳性克隆，然后测序。用M13ForwardPrimer,M13Reverse Primer引物测序，进行序列分析。

(4)序列分析。所有序列在http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest进行分析。结果显示，α链和β链的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。分析五种型别四聚体筛选所得到的T细胞受体，发现有五种型别都有同种T细胞受体，将其命名为TCR-1，T细胞受体由两条链组成，分别是α链和β链，该α链包括可变区V即V13-1，链接区J即J15；该β链包括可变区V，即V7-9,链接区；J即J2-3,多样区，D即D2；结果显示，α链和β链的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，温州医科大学

<120> 一种A3超家族通用肿瘤抗原多肽及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Leu Leu Gly Pro Gly Arg Pro Tyr Arg

1 5

<210> 2

<211> 817

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgacatcca ttcgagctgt atttatattc ctgtggctgc agctggactt ggtgaatgga 60

gagaatgtgg agcagcatcc ttcaaccctg agtgtccagg agggagacag cgctgttatc 120

aagtgtactt attcagacag tgcctcaaac tacttccctt ggtataagca agaacttgga 180

aaaggacctc agcttattat agacattcgt tcaaatgtgg gcgaaaagaa agaccaacga 240

attgctgtta cattgaacaa gacagccaaa catttctccc tgcacatcac agagacccaa 300

cctgaagact cggctgtcta cttctgtgca gcaagccggg tacagggaac tgctctgatc 360

tttgggaagg gaaccacctt atcagtgagt tccaaatatc cagaaccctg accctgccgt 420

gtaccagctg agagactcta aatccagtga caagtctgtc tgcctattca ccgattttga 480

ttctcaaaca aatgtgtcac aaagtaagga ttctgatgtg tatatcacag acaaatgcgt 540

gctagacatg aggtctatgg acttcaagag caacagtgct gtggcctgga gcaacaaatc 600

tgactttgca tgtgcaaacg ccttcaacaa cagcattatt ccagaagaca ccttcttccc 660

cagcccagaa agttcctgtg atgtcaagct ggtcgagaaa agctttgaaa cagatacgaa 720

cctaaacttt caaaacctgt cagtgattgg gttccgaatc ctcctcctga aagtggccgg 780

gtttaatctg ctcatgacgc tgcggctgtg gtccagc 817

<210> 3

<211> 918

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggccctgt gtctcctggg ggcagatcac gcagatactg gagtctccca ggaccccaga 60

cacaagatca caaagagggg acagaatgta actttcaggt gtgatccaat ttctgaacac 120

aaccgccttt attggtaccg acagaccctg gggcagggcc cagagtttct gacttacttc 180

cagaatgaag ctcaactaga aaaatcaagg ctgctcagtg atcggttctc tgcagagagg 240

cctaagggat ctttctccac cttggagatc cagcgcacag agcaggggga ctcggccatg 300

tatctctgtg ccagcagctc cgaagaggac ttccccacag atacgcagta ttttggccca 360

ggcacccggc tgacagtgct cgaggacctg aaaaacgtgt tcccacccga ggtcgctgtg 420

tttgagccat cagaagcaga gatctcccac acccaaaagg ccacactggt gtgcctggcc 480

acaggcttct accccgacca cgtggagctg agctggtggg tgaatgggaa ggaggtgcac 540

agtggggtct gcacagaccc gcagcccctc aaggagcagc ccgccctcaa tgactccaga 600

tactgcctga gcagccgcct gagggtctcg gccaccttct ggcagaaccc ccgcaaccac 660

ttccgctgtc aagtccagtt ctacgggctc tcggagaatg acgagtggac ccaggatagg 720

gccaaacctg tcacccagat cgtcagcgcc gaggcctggg gtagagcaga ctgtggcttc 780

acctccgagt cttaccagca aggggtcctg tctgccacca tcctctatga gatcttgcta 840

gggaaggcca ccttgtatgc cgtgctggtc agtgccctcg tgctgatggc catggtcaag 900

agaaaggatt ccagaggc 918

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His

1 5 10 15

Glu

Claims

1.应用SEQ ID NO.1所示特异性多肽筛选获得的T细胞受体，其特征在于，包含α链和β链，编码所述TCR的α链的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示；编码所述TCR的β链的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示。

2.权利要求1所述的TCR在制备用于肿瘤免疫治疗的药物方面的应用。

3.含有权利要求1所述的TCR的药物组合物。