CN116813783B - 一种抗人cd28工程抗体及应用 - Google Patents

一种抗人cd28工程抗体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗人CD28工程抗体及应用，重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；重链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明所述的抗人CD28单克隆抗体的轻链可变区基因和重链可变区基因及其表达产物，两者重组后表达产生的抗CD28抗体，能够特异性结合人CD28分子。

Description

一种抗人CD28工程抗体及应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，尤其是涉及一种抗人CD28工程抗体及应用。
背景技术
CD28分子是由二硫键合的44 kDa亚基组成的同源二聚体糖蛋白。每个CD28单体含有134个细胞外氨基酸，具有单个跨膜结构域和短细胞质尾。CD28的细胞外结构域与免疫球蛋白可变区域结构域显示其同源性。CD28分子的编码基因由四个外显子组成，每个外显子分别定义其蛋白质的功能结构域。
CD28蛋白的激活对细胞可以产生重要的影响。以T细胞为例，T细胞受体（TCR）活化可以诱导CD28附近局部Ca2+浓度增加，Ca2+直接可以促进CD28的开放和信号传导。TCR，Ca2+和CD28一起形成正向反馈，显著放大T细胞信号传导，从而提高T细胞对抗原的敏感性。TCR和CD28信号的传导主要通过CD28的细胞质内41个氨基酸胞质区来发挥作用。胞质区包含富含酪氨酸为基础的活性结合域，这些结合域可以和蛋白激酶或者结合蛋白反应影响T细胞的活动。
T细胞表面的CD28与其天然配基B7（CD80）结合后，可发挥共刺激作用，作为第二信号介导T细胞的激活，促进T细胞的活化、增殖、抗凋亡基因的合成和促炎症反应，诱发T细胞分泌IL-4、IL-10等细胞因子并释放颗粒酶B。T淋巴细胞是人体攻击病原体的最主要的效应细胞，特异性T淋巴细胞的数量和活性决定人体抗病原体免疫的效果。细胞因子诱导的杀伤细胞( cytokine-induced killer cells，以下简称 CIK 细胞)是一群具有多种细胞分型的T淋巴细胞，具有增殖能力高、细胞毒性强等优点，在肿瘤的生物治疗中具有极大的应用价值。CIK 细胞由外周血单个核细胞经多种细胞因子如 IL-2、IFN-γ等刺激而获得。目前临床研究的初步结果显示，CIK 细胞对肺癌、乳腺癌、食管癌、肾癌等多种恶性肿瘤均有良好的疗效。
抗CD28单抗能促进CIK 细胞增殖并分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2等杀伤因子，从而提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。CD28抗体在肿瘤免疫、自身免疫性疾病的及抗移植排斥反应的免疫干预中也表现出良好的应用价值。无论是抗肿瘤免疫治疗还是器官移植后免疫抑制治疗，以及机会性感染的控制，共刺激分子CD28都不失为一个有用的敏感靶点。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种抗人CD28工程抗体及应用。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供了一种抗人CD28工程抗体，该工程抗体包括重链可变区与轻链可变区；
所述的重链可变区的互补决定区包括CDR1、CDR2与CDR3；所述的重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的重链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述的重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的轻链可变区的互补决定区包括CDR1、CDR2与CDR3；所述的轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述的轻链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示；所述的轻链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步，所述的重链可变区的骨架区包括FR1、FR2、FR3和FR4；所述的重链可变区的FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述的重链可变区的FR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示；所述的重链可变区的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述的重链可变区的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
所述的轻链可变区的骨架区包括FR1、FR2、FR3和FR4；所述的轻链可变区的FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述的轻链可变区的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述的轻链可变区的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述的轻链可变区的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
进一步，所述的工程抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
本发明还提供了一种核酸分子，该核酸分子编码所述的抗人CD28工程抗体。
进一步，所述的核酸分子编码所述的抗人CD28工程抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
本发明还提供了一种表达载体，其特征在于：该表达载体包含所述的核酸分子。
本发明还提供了一种抗人CD28工程抗体的应用，所述的抗人CD28工程抗体在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
进一步，所述的肿瘤为肺癌、乳腺癌、食管癌或肾癌中的至少一种。
本发明还提供了一种免疫检测试剂盒，该试剂盒含有所述的抗人CD28工程抗体和/或所述的表达载体。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
本发明所述的抗人CD28工程抗体通过促进CIK 细胞的增殖来杀伤肿瘤细胞，可用于治疗肺癌、乳腺癌、食管癌、肾癌。
本发明所述的抗人CD28单克隆抗体的轻链可变区基因和重链可变区基因及其表达产物，两者重组后表达产生的抗CD28抗体，能够特异性结合人CD28分子。
附图说明
图1为本发明实施例3所述的抗人CD28工程抗体的纯化电泳图；
图2为本发明实施例4所述的抗人CD28工程抗体的活性检测图；
图3为本发明实施例6所述的抗人CD28-FITC工程抗体的活性检测图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1 小鼠抗人CD28抗体的轻重链可变区基因克隆
1、RNA提取 ：采用Trizol一步法，（1）取杂交瘤细胞约1×106个，加入1ml Trizol，吹打混匀，室温静置 10 分钟；（2）加入 0.2ml 氯仿，剧烈振荡 15 秒，室温静置 2-3 分钟；（3）12000rpm，4℃，离心 15 分钟；（4）取上清，加入 0.5ml 异丙醇室温静置 15 分钟；（5）12000rpm，4℃，离心15 分钟；（6）弃上清，加入 1ml 75％的乙醇洗，7500rpm，4℃，离心5 分钟；（7）弃上清，沉淀晾干，加入 30μLDEPC 水溶解；
2、逆转录为 cDNA(40μl) ：使用TransScript All-in-one First-Strand cDNASynthesis SuperMix for qPCR试剂盒进行逆转录反应，取总RNA 1.0 μg，TransScriptAll-in-one SuperMix for qPCR 4μl，gDNA remover 4μl，DEPC水补充至20μl，反应42℃，15min后，85℃孵育5min，于20℃保存；
3、PCR 扩增CD28抗体的轻重链可变区基因
轻链可变区基因PCR扩增反应体系(50μl) ：设计通用简并引物：上游引物5’-GACATT GTG CTC ACC CAG WCT SMH-3’（SEQ ID NO:19），下游引物5’-CCG TTAGAT CTC CARBTT KGT SCS-3’ （SEQ ID NO:20）；以cDNA 为模板，高保真 pfu DNA 聚合酶扩增；PCR 循环程序为 94℃ 5 分钟 ；94℃ 30 秒，55℃ 30秒，72℃ 30 秒，共 30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 分钟；
重链可变区基因 PCR 扩增反应体系 (50μl) ：上游引物 5’-CAG GTS MARCTGCAGSAG TCW GG-3’（SEQ ID NO:21）；下游引物 5’-TGA GGA GAC KGT GAC HGT GGT SCC-3’（SEQ ID NO:22）；以 cDNA 为模板，高保真 pfu DNA 聚合酶扩增；PCR 循环程序为 94℃ 5分钟 ；94℃，30 秒，55℃，30 秒，72℃，30 秒，共 35 个循环 ；最后 72℃延伸 10 分钟；
4、测序载体的构建 ：pClone007 Blunt Simple Vector Kit购自擎科生物；将轻重链可变区基因PCR 产物回收，与 pClone007 Blunt Simple Vector载体连接后，按常规方法氯化钙转化，以 100μg/ml 氨苄浓度筛选阳性克隆，送测序，该基因完全符合蛋白数据库中抗体所具有的若干保守的框架氨基酸的特点，该序列为抗体基因序列。分别命名为pClone007-VH及pClone007-VL。
实施例2 工程抗体表达载体pcDNA3.4-H和pcDNA3.4-L的构建
根据轻、重链可变区序列及构建载体pcDNA3.4的序列，设计并合成了用于扩增重链可变区的引物（PDH-F和PDH-R）、用于扩增轻链可变区的引物（PDL-F和PDL-R）、用于扩增重链载体的引物（ZTH-F和ZTH-R）和用于扩增轻链载体的引物（ZTL-F和ZTL-R）。
PDH-F：
5’-TTCCAGGTTCCACTGGTGACAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTG-3’（SEQ ID NO:23）
PDH-R：
5’-GATGGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGACTGTGAGAATGGTGC-3’（SEQ ID NO:24）
PDL-F：
5’-TTCCAGGTTCCACTGGTGACGACATCCAGATGACTCAGTCTCCA-3’（SEQ ID NO:25）
PDL-R：
5’-ACAGTTGGTGCAGCATCAGCCCGTTTGATTTCCAGCTTGG-3’（SEQ ID NO:26）
ZTH-F：
5’-GCCAAAACGACACCCCCA-3’（SEQ ID NO:27）
ZTH-R：
5’-GTCACCAGTGGAACCTGGAACC-3’（SEQ ID NO:28）
ZTL-F：
5’-GCTGATGCTGCACCAACTGTAT-3’（SEQ ID NO:29）
ZTL-R：
5’-GTCACCAGTGGAACCTGGAACC-3’（SEQ ID NO:30）
轻链可变区基因PCR扩增反应体系(50μl) ：上游引物PDL-F；下游引物PDL-R；以pClone007-VL为模板，高保真 pfu DNA 聚合酶扩增；PCR 循环程序为 94℃ 5 分钟 ；94℃30 秒，58℃ 60秒，72℃ 30 秒，共 30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 分钟。
重链可变区基因PCR扩增反应体系(50μl) ：上游引物PDH-F；下游引物PDH-R；以pClone007-VH为模板，高保真 pfu DNA 聚合酶扩增；PCR 循环程序为 94℃ 5 分钟 ；94℃30 秒，58℃ 60秒，72℃ 30 秒，共 30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 分钟。
轻链线性化载体的扩增：上游引物ZTL-F；下游引物ZTL-R；以pcDNA-CD15-L(合成序列，含鼠IgG1恒定区核苷酸序列)为模板，高保真 pfu DNA 聚合酶扩增；PCR 循环程序为94℃ 5 分钟 ；94℃ 30 秒，58℃ 60秒，72℃ 4 min，共 30 个循环 ；最后 72℃延伸 10分钟；
将PCR产物分别回收，将回收轻链可变区PCR产物和重链可变区PCR产物分别与回收线性化载体产物使用重组酶进行重组，重组后转化DH5α克隆菌株，并挑取单菌落扩大培养，送样测序，测序正确的克隆用于转染CHO细胞。
重链线性化载体的扩增：上游引物ZTH-F；下游引物ZTH-R；以pcDNA-CD15-H(合成序列，含鼠IgG1恒定区核苷酸序列)为模板，高保真 pfu DNA 聚合酶扩增；PCR 循环程序为94℃ 5 分钟 ；94℃ 30 秒，58℃ 60秒，72℃ 4 min，共 30 个循环 ；最后 72℃延伸 10分钟；
将PCR产物分别回收，将回收轻链可变区PCR产物和重链可变区PCR产物分别与回收线性化载体产物使用重组酶进行重组，重组后转化DH5α克隆菌株，并挑取单菌落扩大培养，送样测序，测序正确的克隆用于转染CHO细胞。
实施例3 抗人CD28工程抗体的表达、纯化
1、工程抗体 CD28抗体的表达：将准备好的CHO细胞从培养箱中取出，准备两支15ml 无菌离心管，在其中一支中加入 5ml SPM培养基 和 100μg 无菌质粒 DNA(含轻链表达载体和重链表达载体)，轻轻吹打混匀；取另一支离心管，加入 5ml SPM 和 320μl转染试剂，轻轻吹打混匀；将含有转染试剂的离心管中所有液体转移至含质粒的离心管中，轻轻吹打混匀；室温下静置5分钟制备出质粒-载体复合物；从恒温摇床中取出细胞，边摇边加入制备好的质粒-载体复合物，放回 CO2恒温摇床中震荡培养；第1天和第5天补加辅料，第12天收获细胞上清；
2、抗人CD28工程抗体的纯化：将上步收集的细胞上清使用Protein A亲和柱进行纯化，PBS平衡柱子后，上样，使用pH值为3.0的甘氨酸进行洗脱，洗脱纯抗使用G25柱置换溶液，将溶液置换为PBS，取样进行电泳测试，结果如图1所示，然后分装后于-20℃冻存。
实施例 4 抗人CD28工程抗体的活性测定
正常人外周血检测：每管加入正常人抗凝外周血 100μl，加入不同量的工程抗体CD28，室温避光孵育 30分钟；加入 2ml 溶血素室温避光反应 10 分钟后 1000 转/分钟离心 5 分钟，弃上清；加入 2ml 冷 PBS 缓冲液，重悬，1000 转/分钟离心 5 分钟，弃上清；再加入 0.5μg APC 标记的鼠二抗，室温避光孵育 30 分钟；加入 2ml 冷 PBS 缓冲液，重悬，1000 转/分钟离心 5 分钟，弃上清；加入配套抗体CD45-PerCP，反应20分钟，加入 2ml冷 PBS 缓冲液，重悬，1000 转/分钟离心 5 分钟，弃上清；加入 250μl PBS 缓冲液，流式细胞仪检测，结果如图2所示，CD28与淋巴细胞结合后，加入荧光二抗，可检测到荧光信号，说明CD28工程抗体可与淋巴细胞表面的CD28结合，活性正常，并且随着抗体量加入的减少，平均荧光强度降低。
实施例 5 抗人CD28工程抗体的FITC标记
制备溶于pH值为 9.5的碳酸盐缓冲液的待标记抗体溶液，浓度≥2mg/ml；用无水DMSO溶解FITC配制成10mg/ml的溶液；按1mg抗体加入60μg FITC溶液的比例加入所需FITC，混匀，25℃生化培养箱内避光反应90min；反应结束，通过G25层析柱对标记抗体进行纯化，去除游离FITC，收集标记好的CD28-FITC溶液，用于流式检测。
实施例 6 抗人CD28-FITC工程抗体的活性测定
正常人外周血检测：每管加入正常人抗凝外周血 100μl，加入不同量的工程抗体CD28-FITC（1.0μg、0.5μg、0.25、0.13μg、0.06μg、0.03μg），再加入抗体CD45-PerCP，室温避光孵育 30 分钟；加入 2ml 溶血素室温避光反应 10 分钟后 1000 转/分钟离心 5 分钟，弃上清；加入 2ml 冷 PBS 缓冲液，1000 转/分钟离心 5 分钟，弃上清；加入 300μl PBS缓冲液，流式细胞仪检测，结果如图3所示，CD28-PE与淋巴细胞结合后，可检测到荧光信号，说明CD28-PE工程抗体可与淋巴细胞表面的CD28结合，活性正常，并且随着抗体量加入的减少，平均荧光强度降低。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种抗人CD28工程抗体，其特征在于：该工程抗体包括重链可变区与轻链可变区；
所述的重链可变区的互补决定区包括CDR1、CDR2与CDR3；所述的重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的重链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的轻链可变区的互补决定区包括CDR1、CDR2与CDR3；所述的轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述的轻链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述的轻链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的抗人CD28工程抗体，其特征在于：所述的重链可变区的骨架区包括FR1、FR2、FR3和FR4；所述的重链可变区的FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述的重链可变区的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述的重链可变区的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述的重链可变区的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
所述的轻链可变区的骨架区包括FR1、FR2、FR3和FR4；所述的轻链可变区的FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述的轻链可变区的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述的轻链可变区的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述的轻链可变区的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
3.根据权利要求1所述的抗人CD28工程抗体，其特征在于：所述的工程抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
4.一种核酸分子，其特征在于：该核酸分子编码权利要求1-3中任一项所述的抗人CD28工程抗体。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于：所述的核酸分子编码所述的抗人CD28工程抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
6.一种表达载体，其特征在于：该表达载体包含权利要求4或5所述的核酸分子。
7.权利要求1-3中任一项所述的抗人CD28工程抗体的应用，其特征在于：所述的抗人CD28工程抗体在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的抗人CD28工程抗体的应用，其特征在于：所述的肿瘤为肺癌、乳腺癌、食管癌或肾癌中的至少一种。
9.一种免疫检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求1-3中任一项所述的抗人CD28工程抗体和/或权利要求6所述的表达载体。
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