CN110655581B

CN110655581B - 一种抗癌胚抗原的抗体及其制备方法和用途

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Publication number: CN110655581B
Application number: CN201910899960.9A
Authority: CN
Inventors: 狄升蒙; 侯莉; 茅健; 刘芳; 余学军
Original assignee: Huadao Shanghai Biological Medicine Co ltd
Current assignee: Huadao Shanghai Biological Medicine Co ltd
Priority date: 2019-09-23
Filing date: 2019-09-23
Publication date: 2021-03-09
Anticipated expiration: 2039-09-23
Also published as: CN110655581A

Abstract

本发明提供一种抗CEA抗体，所述抗CEA抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR‑H1、氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR‑H2和氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR‑H3，轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR‑L1、氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR‑L2和氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR‑L3。本发明发明人利用噬菌体展示技术对CEA scFv进行了筛选，从而获得了高亲和力的抗CEA的单链抗体。并将抗CEA的嵌合抗原受体基因通过基因工程方法导入T细胞制备CEA CAR‑T，使得CEA CAR‑T细胞特异性识别表达CEA的消化道肿瘤细胞并将其杀死，从而实现其抗肿瘤作用。

Description

一种抗癌胚抗原的抗体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种抗癌胚抗原的抗体及其制备方法和用途。

背景技术

嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞(Chimeric antigen receptor T cells,CAR-T)的概念早在1989年就已出现，但在临床试验中一直没有达到理想的效果。此后的二十多年中，科学家们不断地对此进行尝试和优化，直到2011年，CD19(B lymphocyte antigenCD19,CD19)靶向的CAR-T细胞用于复发/难治性慢性B淋巴细胞白血病的临床研究，并取得了治愈的惊人疗效。到此，CAR-T细胞在肿瘤治疗上的应用开启了新的篇章。

嵌合抗原受体是人工合成的功能类似T细胞受体的融合蛋白，主要包括信号肽、抗原识别区、铰链区、跨膜区、胞内信号区。在结合靶抗原后，嵌合抗原受体形成聚体、通过胞内信号分子活化T细胞，分泌穿孔素和颗粒酶素B等实现对靶细胞的杀伤。因此，CAR-T细胞识别靶细胞不依赖于MHC(major histocompatibility complex,MHC)，从而可避免因肿瘤细胞MHC分子下调而导致的免疫逃逸。

近年来，嵌合抗原修饰的T淋巴细胞(CAR-T)发展迅速，目前已有两款产品获美国FDA批准上市，国内也有多个产品取得药物临床试验批准。目前CAR-T领域研究的靶点绝大多数为CD19，其次为BCMA(B-cell maturation antigen,BCMA)，前者靶向急性B淋巴细胞白血病，后者靶向多发性骨髓瘤，均为血液系统恶性疾病。然而，在占所有肿瘤发病类型90％以上的实体瘤上，CAR-T细胞的治疗效果却不甚理想。这有几方面的原因，其中重要的一点是缺乏理想的靶抗原。如前所述，CD19和BCMA都是特异性的表达于肿瘤细胞，而在正常组织中或细胞上表达有限，因此是十分理想的治疗靶点。相比之下，实体瘤特异性的靶点十分缺乏，多数靶点除在肿瘤细胞上表达，还广泛表达于正常的组织中。因此，CAR-T细胞治疗带来的“On target,off tumor”副作用十分明显。

国际癌症研究中心Globocan2012中指出肿瘤发病率及死亡率升高，男性中最常见的5种肿瘤中有3种是消化系统肿瘤(结直肠癌、胃癌、肝癌)，女性中最常见的5种肿瘤中有2种是消化系统肿瘤(结直肠癌、胃癌)(Steward BW等，2014)。可见在世界范围内，消化系统肿瘤占据了重要的地位。另据报道，国内胃癌、结直肠癌的发病率分别占据第二和第四位(陈万青等，2017)。消化系统肿瘤主要包括食管癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌等，目前最有效的手段仍然是手术，对于那些缺乏手术指征的患者几乎没有特别有效的治疗手段，总体来说5年生存率依然很低，因此亟需发展新型的治疗手段用于治疗这些肿瘤。CAR-T细胞无疑是最有希望治愈消化系统肿瘤的手段之一。

癌胚抗原(Carcinoembrynio Antigen,CEA)最初发现于结肠癌和胎儿肠组织中，后被证实广泛存在于内胚叶起源的消化系统肿瘤。目前认为CEA是一种敏感的胃肠道肿瘤(如，结直肠癌、胰腺癌、胆囊癌等)生物标志物，广泛表达于癌组织，少量表达于正常表皮细胞腔面的细胞膜上(Kinugasa,T等，1998；Zhang,C.C等，2017；Pishvaian,M等，2016)，是一种理想的靶标。因此，将抗CEA的嵌合抗原受体基因通过基因工程方法导入T细胞所制备的CEA CAR-T，可使得CEA CAR-T细胞特异性识别表达CEA的消化道肿瘤细胞并将其杀死，从而实现其抗肿瘤作用，我们认为此靶向CEA的免疫治疗方法具有较大的临床转化价值。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种抗CEA的抗体及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种抗CEA的抗体，所述抗CEA抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述抗CEA抗体具有如下技术特征中的一个或多个；

<1>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR-H1；

<2>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-H2；

<3>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-H3；

<4>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR-L1；

<5>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L2；

<6>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-L3；

GYTFTSYGIS(SEQ ID No.1)

WISAYNGNTNYAQKLQG(SEQ ID No.2)

GSRAMGYYYYGMDV(SEQ ID No.3)

RASQSISTYLN(SEQ ID No.4)

GASSLQS(SEQ ID No.5)

QQSYSNPLT(SEQ ID No.6)

CDR(互补决定区，complementarity determining region)通常指抗体中在空间结构上可以与抗原决定簇形成互补的区域。抗体中的可变性通常并不均匀地分布在整个抗体的可变区中，单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区通常均具有3个超变区(hypervariable region，HVR)，这些区域在空间结构上通常可以与抗原决定簇形成互补，所以超变区也被称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)，即重链可变区通常包括三个互补决定区，即HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区通常包括三个互补决定区，即LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在本发明某些实施方式中，所述抗CEA抗体的重链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-H2和氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-H3。

在本发明某些实施方式中，所述抗CEA抗体的轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR-L1、氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L2和氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-L3。

在本发明某些实施方式中，重链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-H2和氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-H3，轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR-L1、氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L2和氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-L3。

在本发明某些实施方式中，所述抗CEA抗体为单链抗体(single chain Fv,scFv)。单链抗体通常可以为包括抗体的V_H(重链可变区)和V_L(轻链可变区)的多肽链。通常来说，单链抗体还可以包括连接肽(linker)，连接肽通常位于V_H和V_L之间，以使scFv形成能与抗原结合的期望结构。例如，所述抗CEA抗体可以包括V_H和V_L，V_H和V_L之间可以设有连接肽，所述单链抗CEA抗体自N端至C端可以依次包括V_L、连接肽和V_H，所述抗CEA单链抗体自N端至C端也可以依次包括V_H、连接肽和V_L。所述连接肽可以是本领域中各种适用于形成scFv的连接肽，例如，所述连接肽可以是G4S3 linker，所述G4S3 linker的选择或设计可以参考文献MichelSadelain etc，Science Translational Medicine，2013；Carl H.June etc,ScienceTranslational Medicine,2015。

在本发明某些实施方式中，所述抗CEA抗体从天然人源噬菌体抗体库中通过筛选得到，其重链可变区和轻链可变区核苷酸序列分别如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，重链可变区和轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示：

SEQ ID No.7

V_L:

gccatccagttgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcacctatttaaattggtatcagcagaaaccggggaaagcccctaagctcctgatctatggtgcatctagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagagttacagtaacccgctcactttcggcggagggaccaaggtggaggtcaaa

SEQ ID No.8

V_H:

atggcccaggtccagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccagctatggtatcagctgggtgcggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggatcagcgcttacaatggtaacacaaactatgcacagaagctccagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagcgggagtcgagctatgggctactactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca

SEQ ID No.9：

V_L:

AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSNPLTFGGGTKVEVK

SEQ ID No.10：

V_H:

MAQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCASGSRAMGYYYYGMDVWGQGTTVTVSS

(SEQ ID No.9和10下划线部分依次为CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)

在本发明某些实施方式中，重链可变区和轻链可变区中还可以包括框架区，所述框架区可以位于互补决定区之间，也可以位于互补决定区的两端。在本发明某些具体实施方式中，所述框架区的序列为人源单抗可变区，或为鼠源单抗可变区的框架区序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的框架区序列，该框架区序列与人源单抗可变区序列的框架区序列可以具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的同源性。

本发明另一方面提供一种分离的多核苷酸，编码所述抗CEA抗体的重链可变区和/或轻链可变区或全长氨基酸。

本发明另一方面提供所述抗CEA抗体在制备或筛选治疗药物中的用途、或制备诊断药物中的用途。

所述治疗药物可以是以CEA抗原为作用靶标，结合或作用于所述CEA抗原，从而治疗和/或预防适应症的药物。

在本发明某些实施方式中，所述治疗药物可以是肿瘤治疗药物。所述肿瘤治疗药物可以是以肿瘤细胞表面功能性表面的CEA抗原为靶标，结合或作用于CEA抗原，从而治疗和/或预防肿瘤的药物。所述肿瘤可以是胃癌、肺癌、食管癌、肠癌、胰腺癌等CEA表达阳性的肿瘤。

在本发明某些实施方式中，所述治疗药物为嵌合抗原受体细胞治疗药物。

所述嵌合抗原受体细胞治疗药物通常包括嵌合抗原受体细胞，所述嵌合抗原受体细胞可以是嵌合抗原受体T细胞、嵌合抗原受体NK细胞等，所述嵌合抗原受体T细胞通常包括T淋巴细胞，其还包括嵌合抗原受体。所述嵌合抗原受体NK细胞通常包括NK细胞，其还包括嵌合抗原受体。所述嵌合抗原受体包括跨膜域、胞内域和胞外域。在本发明某些实施方式中，所述胞外域包括所述抗CEA抗体，即所述嵌合抗原受体细胞可以在细胞表面表达所述抗CEA抗体，从而可以引导该细胞对表达CEA抗原的细胞(例如肿瘤细胞)进行作用的药物。所述对表达CEA抗原的细胞进行作用可以是杀伤表达CEA抗原的细胞等。

所述诊断药物具体指针对作用靶标CEA抗原，以CEA抗原作为生物标志物进行诊断的试剂。

本发明另一方面提供一种分离的多肽，所述多肽包括跨膜域、胞内域和胞外域，所述胞外域包括所述抗CEA抗体。

在本发明某些实施方式中，所述多肽为嵌合抗原受体。

在本发明某些实施方式中，所述跨膜域可以包括CD8α、CD28、DAP 10等蛋白分子的跨膜结构域。例如，所述CD8α的氨基酸序列可以包括如下所示序列：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC。

再例如，CD8α的序列可参照NM_001145873，CD28的序列可参照NM_006139，DAP10的序列可参照NM_014266。

在本发明某些实施方式中，所述胞内域可以包括共刺激结构域和/或信号结构域，例如，所述胞内域可以包括4-1BB、CD28、OX40、ICOS、CD3 zeta、DAP 10等蛋白分子的信号转导结构域。再例如，所述4-1BB的氨基酸序列包括如下所示：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

所述CD3 zeta的氨基酸序列包括如下所示：

RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

再例如，4-1BB的序列可参照NM_001561，CD28的序列可参照NM_006139，OX40的序列可参照NM_003327，ICOS的序列可参照NM_012092，CD3 zeta的序列可参照NM_198053、DAP10的序列可参照NM_014266。在本发明一具体实施方式中，所述胞内域自N端至C端依次包括4-1BB和CD3 zeta。

在本发明某些实施方式中，所述多肽自N端至C端依次包括所述抗CEA单链抗体、跨膜域、胞内域。在本发明一些具体实施方式中，所述多肽自N端至C端依次包括抗CEA单链抗体、CD8α跨膜区、4-1BB共刺激结构域、CD3 zeta信号结构域。在本发明一具体实施方式中，所述多肽自N端至C端依次包括所述抗CEA单链抗体、CD28跨膜区、CD28共刺激结构域、CD3zeta信号结构域。在本发明另一具体实施方式中，所述多肽自N端至C端依次包括所述抗CEA单链抗体、CD8α跨膜区、OX40共刺激结构域、CD3 zeta信号结构域。在本发明另一具体实施方式中，所述多肽自N端至C端依次包括所述抗CEA单链抗体、CD8α跨膜区、ICOS共刺激结构域、CD3 zeta信号结构域。在本发明另一具体实施方式中，所述多肽自N端至C端依次包括所述抗CEA单链抗体、CD8α跨膜区、4-1BB共刺激结构域、CD3zeta。在本发明另一具体实施方式中，所述多肽自N端至C端依次包括所述抗CEA单链抗体、CD28跨膜区、CD28共刺激结构域、OX40共刺激结构域、CD3 zeta信号结构域。

本发明另一方面提供一种T淋巴细胞，所述T淋巴细胞表达膜结合的所述多肽。

在本发明某些实施方式中，所述多肽为嵌合抗原受体。

所述T淋巴细胞通常可以表达所述多肽，其通常可以结合于CEA抗原，更具体可以通过包含所述抗CEA抗体的胞外域结合于CEA抗原，当所述多肽结合于所述CEA抗原时，所述T淋巴细胞通常可以活化和/或刺激从而得以增殖。在本发明某些实施方式中，所述胞外域包括所述抗CEA抗体，即所述嵌合抗原受体T细胞可以在T淋巴细胞表面表达所述抗CEA抗体，从而可以引导T淋巴细胞对表达CEA抗原的细胞(例如肿瘤细胞)进行作用的，所述作用可以是杀伤表达CEA抗原的细胞等。

本发明另一方面提供一种NK细胞，所述NK细胞表达膜结合的所述多肽。

在本发明某些实施方式中，所述多肽为嵌合抗原受体。

所述NK细胞通常可以表达所述多肽，并通常可以结合于CEA抗原，更具体可以通过包含所述抗CEA抗体的胞外域结合于CEA抗原，当所述多肽结合于所述抗原时，所述NK细胞通常可活化和/或刺激从而得以增殖。在本发明某些实施方式中，所述胞外域包括所述抗CEA抗体，即所述嵌合抗原受体NK细胞可以在NK细胞表面表达所述抗CEA抗体，从而可以引导NK细胞对表达CEA抗原的细胞(例如肿瘤细胞)进行作用的，所述作用可以是杀伤表达CEA抗原的细胞等。

本发明另一方面提供所述分离的多肽、T淋巴细胞、NK细胞在制备或筛选治疗药物中的用途、或制备诊断药物中的用途。

所述治疗或诊断药物可以是以CEA抗原为作用靶标，结合或作用于所述CEA抗原，从而治疗和/或预防适应症的药物。

在本发明某些实施方式中，所述治疗药物可以是肿瘤治疗药物。所述肿瘤治疗药物可以是以肿瘤细胞表面功能性表达的CEA抗原为靶标，结合或作用于CEA抗原，从而治疗和/或预防肿瘤的药物。所述肿瘤可以是胃癌、肺癌、胰腺癌、肠癌等CEA表达阳性的肿瘤。

本发明另一方面提供一种诊断试剂盒，包含诊断有效剂量的所述抗CEA抗体或其免疫偶联物。有效量通常指能够提供诊断效益的量。

所述诊断试剂盒通常可以针对作用靶标CEA抗原，以CEA抗原作为生物标志物进行诊断。所述诊断试剂盒还可以包括抗CEA抗体的标记物，所述抗CEA抗体的标记物通常可以用于标记抗CEA抗体，可选用的标记物的种类包括但不限于荧光标记物、放射性标记物、酶标标记物、化学发光性标记物等中的一种或多种的组合。根据试剂盒的检测原理，所述试剂盒通常还可包含检测所需的一种或多种试剂。此外，所述试剂盒中还可根据需要包括：容器、对照物(阴性或阳性对照)、缓冲剂、助剂等，本领域技术人员可根据具体情况对其进行选择。

本发明发明人利用噬菌体展示技术从全人源抗体库中筛选出了抗CEA抗体1A6可特异性的结合CEA抗原。此外，本发明发明人进一步将此单链抗体改造成嵌合抗原受体，例如利用表达抗CEA嵌合抗原受体的T细胞、NK细胞用于表达CEA的消化系统肿瘤的治疗，从而验证了改造的嵌合抗原受体能够提高对肿瘤细胞的杀伤能力。

附图说明

图1显示为ELISA检测CEA抗原生物素化结果。

图2显示为ELISA检测1A6-scFv-mIgG1单链抗体与CEA抗原的结合。

图3显示为Biacore检测1A6-scFv-mIgG1单链抗体的亲和力。

图4显示为FACS检测1A6 scFv-mIgG1单链抗体识别细胞表面的CEA抗原。

图5显示为检测1A6单链抗体对抗原的结合特异性。

图6显示为表达1A6 scFv的嵌合抗原受体结构示意图。

图7显示为T淋巴细胞嵌合抗原受体表达率。

图8(a)和图8(b)显示为FACS检测T细胞和1A6 CAR-T细胞表型。

图9显示为1A6 CAR-T细胞对CEA阳性的肿瘤细胞杀伤效果。

图10显示为pRRL.EF1α-1A6 CAR-WPRE慢病毒载体质粒图谱。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

实施例1

天然人源噬菌体抗体库的淘选与ELISA初步筛选

噬菌体抗体库的淘选

准备3只EP管进行磁珠封闭和管壁封闭(A：1ml PBS，2％Blotting-GradeBlocker，50μl链霉抗生物素蛋白磁珠，100μl噬菌体文库；B：1ml PBS，2％Blotting-GradeBlocker，100μl链霉抗生物素蛋白磁珠；C：1ml PBS，2％Blotting-Grade Blocker)室温静置1-2h。丢弃C管中的溶液和A管中的磁珠，收集A管中的噬菌体并加入到C管中，同时加入生物素标记的抗原CEA(终浓度20μg/ml)，室温孵育2h。收集B管中的磁珠并丢弃溶液，加入C管中的混合物后置于试管旋转摇床旋转孵育15min。将EP管置于磁力架上静置30s，使得磁珠吸附于管壁。丢弃上清液，并以此加入MPBST(PBS+2％Blotting-Grade Blocker+0.05％Tween20)，PBST(PBS+0.05％Tween20),MPBS(PBS+2％Blotting-Grade Blocker)以及PBS进行淘洗。每次淘洗置于旋转摇床孵育2min，每种洗液淘洗5遍。使用1ml胰酶(10μg/ml)37℃孵育30min洗脱噬菌体，通过磁力架吸附去除磁珠后，侵染4ml新鲜培养的TG1菌液(A600≈0.6)，37℃孵育30min。取100μl细菌悬液进行梯度稀释后均匀涂抹于2×YT/氨苄青霉素/葡萄糖琼脂平板上以便进行淘选产物容量的计算。剩余菌液经过离心后使用适当体积的2×YT培养液重悬，涂抹于带有筛选抗性的平板上进行过夜培养。使用适量的液体培养液从平板上刮取细菌，离心收集菌体后用适量的含有40％甘油的2×YT培养液进行重悬后分装。所有细菌保存在-80℃。计算梯度稀释平板上的菌落数，根据其稀释倍数计算淘选产物的容量，同时随机挑取50个克隆进行测序分析。

噬菌体包装

取50μl冻存的上一轮淘选菌液加入到50ml培养液置于150ml培养瓶中37℃振荡(250rpm)培养至A600＝0.6，起始菌液A600应当小于0.05。按照1:500的比例加入辅助噬菌体M13K07，该混合物首先37℃静置30min，之后37℃振荡(250rpm)培养30min。4500rpm离心10min收集菌体，并用相同体积含有氨苄青霉素和卡那霉素的2x YT培养基重悬，30℃振荡(250rpm)培养4h。4500rpm离心10min去除菌体收集上清并加入1/4体积的PEG溶液(20％聚乙二醇，2.5M NaCl)以沉淀噬菌体过夜。4,000rpm 4℃离心30min收集噬菌体后，用1ml PBS溶液重悬并转移至15ml离心管中。再次4,000rpm离心10min以去除细菌碎片等杂质，收集上清。上清与等体积60％甘油混合后分装至1.5ml EP管中并保存于-80℃。

为了得到更多可能结合CEA抗原的抗体，从不同时期建立的两个抗体库容量均大于10¹⁰的天然人源噬菌体展示抗体库(

library 1和

library 2)，将作为抗CEAscFv抗体筛选的主要抗体来源。为了避免淘选过程中抗原表位被破坏，利用亲和素磁珠进行噬菌体抗体筛选的液相淘选方案将作为抗体库淘选方法。CEA抗原通过N-羟基琥珀酰亚胺生物素进行生物素化反应，ELISA检测结果显示CEA抗原成功进行生物素化，结果如图1所示。

使用生物素化的CEA抗原进行了3轮淘选。每一轮淘选产物通过其产量高于对照两个数量级以及随机挑选的50个克隆分析序列富集程度进行质量控制。结果显示进行3轮淘选之后，淘选产物的产量得到明显的增长，并且高于对照4个数量级。测序结果分析显示多条序列得到明显的富集。为了避免丢失序列的多样性，初步的ELISA筛选将从第2轮和第3轮的淘选产物中进行。阳性克隆从淘选产物中随机挑选出来并进行诱导表达，表达上清通过ELISA方法检测其CEA抗原结合能力，筛选出CEA结合阳性的克隆。

ELISA检测方法：

将所用抗原使用包被液稀释到适当浓度(1μg/ml到0.001μg/ml)，每孔加入100μl置于4℃包被过夜(为避免蒸发,板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中)。PBST(含0.05％吐温-20)洗板3次后，使用封闭液(1％BSA溶于含0.05％吐温-20的PBST)室温孵育2h进行封闭。加入100μl待检测样品(可根据实验需要进行梯度稀释)室温孵育1h。PBST(含0.05％吐温-20)洗板3次后，加入HRP标记二抗(1/5000稀释)100ul，室温孵育1h。PBST(含0.05％吐温-20)洗板3次后，加入100μl TMB显色液室温避光孵育10min，之后加入100μl 2mol/L H₂SO₄终止反应。使用酶标仪450nm波长进行读数并分析结果。为保证每次ELISA操作的规范进行，每个96孔板中均需设立阴性和阳性对照。通过阴性和阳性对照在正常范围内的读值判断实验结果的可靠性。

实施例2

FACS筛选候选克隆

按照标准细胞培养方案进行细胞培养，使用胰酶消化细胞制备单细胞悬液。离心(300g，5min)去除培养液后用Flow溶液重悬细胞至2*10⁶cell/ml。圆底96孔板中每孔加入2*10⁵个细胞的细胞悬液。300g离心5min后去除上清，用100μl周质蛋白提取物重悬细胞，并在4℃孵育1h。300g离心5min后去除上清，Flow溶液重悬细胞，重复3次以去除周质蛋白提取物。使用封闭液稀释anti-myc抗体至2μg/ml，每孔100μl重悬细胞，4℃孵育1h。Flow Buffer清洗细胞3次后加入Alexa-488anti-mouse抗体100μl重悬细胞，4℃孵育1h。Flow Buffer清洗细胞3次后使用200μl Flow Buffer重悬细胞并上流式细胞仪检测。

人结肠癌细胞系SW620表面低表达CEA，利用SW620细胞系构建了稳定表达CEA的SW620-CEA细胞系(购自上海吉凯基因)作为细胞水平检测的阳性对照，而不表达CEA抗原的293T细胞系作为阴性对照。

CEA抗原为多种癌细胞表面表达的蛋白，因此第一轮检测筛选得到的结合SW620细胞表面CEA抗原的scFv外，能否结合其他表达CEA抗原的癌细胞将成为第二轮细胞水平检测的目标。选择人胰腺癌细胞(BxPC-3cell)和人胃癌细胞(NCI-N87 cell)进行检测。第一轮及第二轮FACS检测候选克隆结合肿瘤细胞表面CEA能力结果分别如表1-1和表1-2所示，候选克隆与SW620/CEA和BxPC-3细胞有不同程度的结合。

表1-1

表1-2

实施例3

Off-rate ranking候选克隆

抗体亲和力取决于抗体可变区和抗原的适配程度，一般通过亲和力进行评估。解离常数(Koff)一般是影响抗体亲和力的主要动力学机制，因此通过测定解离速率可以初步的比较抗体亲和力的高低。同时Koff是非浓度依赖的，因此无需纯化抗体即可测定Koff。通过Octet Red测定候选克隆的Koff并进行排序有助于进一步挑选克隆进行后续的分析。按照标准操作流程制备细菌周质提取物。链霉亲和素SA生物传感器上固化生物素标记抗原(5μg/ml)，周质提取物使用1×kinetic缓冲液进行2倍稀释，抗原和scFv抗体结合时间为300s，解离时间为300s。SA生物传感器通过10mM的甘氨酸溶液进行再生。所有样品按照Kdis值进行排序。结果显示，1A6单链抗体的Koff值为8.61E-04。

实施例4

scFv-mIgG1单链抗体表达、纯化以及抗体亲和力测定

为了进一步对筛选得到的抗体进行鉴定，需要通过哺乳动物细胞中表达抗体。因此，首先构建了带有小鼠Fc标签表达scFv的质粒载体，方法如下。

1.PCR扩增1A6 scFv，体系如表3所示，引物如表2所示，PCR反应条件如表4，酶切后的载体用

PCR纯化试剂盒进行纯化。风干的DNA溶解到45μl水中，检测DNA的浓度。

表2

表3

表4

2.Over-lap PCR:PCR反应体系为50μl，如表5所示。PCR反应条件如表6所示，胶回收并纯化产物。

表5

试剂	体积
		10×reaction buffer	5.0μl
Fragment-1	3.0μl
		Fragment-2	3.0μl
Fragment-3	3.0μl
		pfx DNA polymerase	1.0μl
Add ddH2O	to 48μl.

表6

3.Pcp-Stuffer-mcg2a-FC(来源于上海睿智化学)克隆载体线性化

1)第一步酶切，酶切体系如表7所示，酶切后的载体用

PCR纯化试剂盒进行纯化。

表7

2)第二步酶切，酶切体系如表8所示，酶切后的载体用

PCR纯化试剂盒进行纯化。

表8

3)同源重组，体系如表9所示

表9

同源重组后，取10μL加入DH5α感受态细胞中，于冰上冷藏5min，置于42℃水浴锅热激90s，在冰上冷却3min加入500μL LB培养基于37℃220rpm复苏30min，取200μL涂于含100ug/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养箱倒置过夜培养。挑选单克隆测序鉴定。测序结果符合预期，成功构建了带有小鼠Fc标签表达scFv的质粒载体。

在质粒转染前约24h，传代293细胞，使细胞密度约为2.4×10⁶cells/ml。细胞密度为4.1-4.8×10⁶cells/ml，活率>95％时，取0.5mg表达质粒scFV-mIgG1用PEI法转染293细胞，37℃、130rpm、8％CO₂摇床培养7天，将细胞培养产物离心后取上清，再用Sartopore 2(Sartorius)过滤除去细胞碎片，收集过滤后的澄清液。使用5ml MabSelect SuRe纯化收集目的抗体，再使用Superdex 200进一步纯化去除聚体。把收集到的目的抗体用CentrifugalFilter Units 15ml 10K离心浓缩，后经Millex-GP Filter Unit 0.22μm Sterile过滤。用NanoDrop 2000测定A280的方法定量，SEC-HPLC测定抗体纯度，结果如表10所示。结果显示克隆New-3rd-1A6-scFv-mIgG1(简写为New-3rd-1A6或1A6-scFv-mIgG1)的抗体纯度为98.74％。通过ELISA鉴定，1A6-scFv-mIgG1单链抗体可与CEA抗原结合，结果如图2所示。

另外，将纯化后的1A6-scFv-mIgG1单链抗体通过Biacore进行亲和力的测定。Biacore是基于表面等离子共振(surface Plasmon resonance,SPR)开发的生物分析传感技术，可检测跟踪溶液中的分子与固定在芯片表面的分子结合、解离的整个变化过程，以传感图的形式进行记录，并提供动力学和亲和力数据。测定过程中，将抗体固化到芯片表面，流动相为含有抗原的溶液。测定结果如表11和图3所示。1A6-scFv-mIgG1单链抗体的KD值为1.04E-07。

表10

表11

实施例5

1A6 scFv-mIgG1单链抗体流式测定

将293T(CEA-)、SW620-CEA(CEA+)、BxPC3(CEA+)三株肿瘤细胞与纯化的1A6-scFv-mIgG1抗体在冰浴下孵育30min，然后用APC标记的羊抗鼠IgG抗体孵育30min，采用流式细胞仪检测，结果如图4所示，该单链抗体可识别细胞表面的CEA抗原。

实施例6

1A6 scFv-mIgG1单链抗体的特异性测定

为研究1A6 scFv-mIgG1单链抗体的结合特异性，采用膜蛋白质阵列高通量筛选技术检测了1A6单链抗体与5300多种膜蛋白的结合。结果如图5显示，在受检的膜蛋白中，1A6单链抗体只能够结合目的蛋白。

高通量筛选步骤如下：首先，优化1A6 scfv的浓度，以使其在只表达目的蛋白或空白载体的HEK 293T细胞上的背景反应活性减到最低。然后，用该浓度的1A6 scfv与5300多种不同的人源膜蛋白进行孵育，其中，每种人源膜蛋白均单独表达于384孔板单一孔中的HEK-293T细胞上，然后通过流式细胞仪一一检测。结果显示，目的蛋白是唯一一个可被1A6scfv识别的蛋白。

实施例7

表达1A6 scFv的嵌合抗原受体的慢病毒载体制备

首先构建携带1A6 scFv嵌合抗原受体的慢病毒载体pRRL.EF1α-1A6 CAR-WPRE，载体图谱如图10所示。采用如下方法依次合成含信号肽、1A6 scFv、CD8α铰链区、跨膜区和免疫受体酪氨酸活化基序的嵌合抗原受体序列，结果如图6所示。

1.按照表12配制PCR反应体系，扩增1A6的scFv片段，使用引物如下：

BamH-1A6 VL-F ctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggccatccagttgaccc(SEQ ID No.17)

1A6 VH-CD8αhinge-R cggcgctggcgtcgtggttgaggagacggtgaccgt(SEQ ID No.18)

配制结束后按照表13所示的PCR程序进行反应。

表12

试剂	体积(μL)
		10x buffer	5
2mM dNTP	5
		25mM MgSO<sub>4</sub>	3
10μM primer F 1A6-F	1
		10μM primer R 1A6-R	1
Template DNA 1A6	1
		PCR grade water	33
KOD-Plus-Neo	1

以上试剂来源于TOYOBO Inc.。

表13

2.按照表14配制PCR反应体系，在scFv片段前加CD8α信号肽，使用引物如下：BamH-CD8αsig-F：gctgcaggtcgactctagaggatcccgccaccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgc(SEQ ID No.19)

1A6 VHCD8αhinge-R：cggcgctggcgtcgtggttgaggagacggtgaccgt(同SEQ IDNo.18)

配制结束后按照表13所示的PCR程序进行PCR反应。反应结束后，PCR产物行1％琼脂糖凝胶电泳，回收780bp左右的片段，紫外吸收法定量。

表14

试剂	体积(μL)
		10x buffer	5
2mM dNTP	5
		25mM MgSO<sub>4</sub>	3
10μM primer F BamH-CD8αsig-F	1
		10μM primer R 1A6-R	1
Template DNA scFv片段PCR反应液	4
		PCR grade water	30
KOD-Plus-Neo	1

3.按照表15配制PCR反应体系，扩增CD8αhinge-TM-41BB-CD3Z片段，使用引物如下：

CD8αH-F accacgacgccagcgccgcgac(SEQ ID No.20)

Vector-R tcgataagcttgatatcg(SEQ ID No.21)

配制结束后按照表13所示的PCR程序进行PCR反应。PCR结束后行1％琼脂糖凝胶电泳，回收780bp左右的片段，紫外吸收法定量。

表15

试剂	体积(μL)
		10x buffer	5
2mM dNTP	5
		25mM MgSO<sub>4</sub>	3
10μM primer F CD8αH-F	1
		10μM primer R Vector-R	1
Template DNA	1
		PCR grade water	33
KOD-Plus-Neo	1

试剂来源于TOYOBO Inc.。

4.将5μg实验室构建的HD CD19 CAR质粒进行BamHI和EcoRI双酶切，37℃水浴反应2h后，回收载体。

将上述3个片段和步骤4得到的载体用重组酶连接，重组反应体系如表16所示，配制结束后37℃水浴反应0.5h，按常规方法转化至大肠杆菌stbl3感受态细胞。从固体培养基上挑选单克隆，过夜培养，进行PCR鉴定，PCR结束后挑选阳性克隆进一步测序鉴定，测序结果符合预期。PCR反应物配制如表17所示，PCR程序如表18所示。

表16

试剂	体积
		HD CD19 CAR	184.54ng
CD8αsingal 1A6 scFv	31.32ng
		CD8αhinge-TM-41BB-CD3Z	29.72ng
5x CE buffer	2μL
		Exnase<sup>TM</sup> II	1μL
PCR grade water	Up to 10μL
		Total	10μL

表17

试剂	体积(μL)
		Taq PCR Master Mix	10
10μM F Seq-trEF1a-F	1
		10μM R Vector-R	1
Template DNA菌液	1
		PCR grade water	7
Total	20

表18

信号肽的氨基酸序列为：MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID No.22)

1A6 scFv的氨基酸序列为：

AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSNPLTFGGGTKVEVKGGGGSGGGGSGGGGSMAQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCASGSRAMGYYYYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID No.23)

CD8α铰链区和跨膜区的氨基酸序列为：

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID No.24)

免疫受体酪氨酸活化基序的氨基酸序列为：

RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID No.25)

CEA CAR的核苷酸序列为：

atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggccatccagttgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcacctatttaaattggtatcagcagaaaccggggaaagcccctaagctcctgatctatggtgcatctagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagagttacagtaacccgctcactttcggcggagggaccaaggtggaggtcaaaggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgatggcccaggtccagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccagctatggtatcagctgggtgcggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggatcagcgcttacaatggtaacacaaactatgcacagaagctccagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagcgggagtcgagctatgggctactactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc(SEQ ID No.26)

将获得的信号肽-1A6、CD8α铰链区、跨膜区和免疫受体酪氨酸活化基序两个基因片段经琼脂糖凝胶电泳分离后用琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒进行回收、纯化、定量；用限制性内切酶BamHI和EcoRI(购自NEB公司)切慢病毒表达载体pRRL.EF1α-CEACAR-WPRE，按说明书进行操作。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后用琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒进行回收、纯化、定量；然后将两条目的片段与载体用重组酶克隆到慢病毒载体中，并进行测序验证，测序结果符合预期。

实施例8

慢病毒的包装

(1)以1.6×10⁷细胞数接种293T细胞于15cm培养皿中，37℃，5％CO₂培养过夜准备包装病毒，培养基为含DMEM，添加10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)；

(2)将慢病毒载体30μg pRRL.EF1α-1A6 CAR-WPRE、12.5μg辅助质粒gag/pol与10μg包膜质粒VSVg(辅助质粒gag/pol和包膜质粒VSVg均来自上海吉凯基因)溶入2000μL无血清DMEM培养液，混匀；

(3)将157.5μg PEI(1μg/μL)溶解于2000μL的无血清DMEM培养液中，轻轻混匀(或1000rpm涡旋5秒钟)，室温孵育5min；

(4)转染复合物的形成：将PEI混合液加入DNA混合液中，加入后立即涡旋混合或轻轻混匀，室温下孵育20min；

(5)将转染复合物4mL滴加入含25mL DMEM培养基的15cm培养皿中，4-5h小时后，更换新鲜培养基；

(6)48h后，收集病毒液上清。

实施例9

慢病毒浓缩

将病毒上清用0.45μm滤膜过滤后收集到50mL离心管中，加入1/4的PEG-NaCl病毒浓缩液，上下颠倒混匀，4℃放置过夜；4℃，3500rpm，离心30min；去上清，加入适量的RPMI1640培养基(含10％FBS)，溶解重悬病毒沉淀；浓缩后的慢病毒悬液分装成50μL每份，保存在成品管中，储存在-80℃。

实施例10

慢病毒滴度检测

将500μL K562细胞(1×10⁵个细胞)接种细胞于24孔培养板；浓缩后的慢病毒分别以1μL、0.2μL和0.04μL添加到细胞悬液中，并添加polybrene至终浓度5μg/mL；37℃，5％CO₂培养过夜后，更换新鲜培养基；感染72h后，收集细胞，400g离心5min，弃上清，PBS+2％FBS溶液洗一次；按1:50稀释比例加入FITC标记的羊抗人Fab抗体，冰上孵育30min；加入1mL PBS+2％FBS溶液清洗两次后，加入适量体积的PBS+2％FBS溶液重悬细胞，采用流式细胞仪检测；取阳性率为5～20％的细胞样品为宜，计算滴度(TU/mL)＝细胞数量(10⁵)×阳性率/病毒体积(mL)。

实施例11

慢病毒转导T淋巴细胞

T淋巴细胞活化：用PBS将抗人CD3抗体和抗人CD28抗体稀释，终浓度分别为1μg/mL和0.5μg/mL，包被孔板，4℃冰箱静置过夜；弃去孔板中的抗体包被液，1mL PBS洗两次；用T细胞培养基(X-VIVO+10％FBS+IL-2(300U/mL))将人PBMC调整至密度为1×10⁶/mL，然后接种到CD3和CD28抗体包被的孔板中活化48h；收集活化的T细胞，调整细胞密度为1×10⁶/mL，按照感染复数(multiplicity of infection，MOI)＝10加入慢病毒，添加polybrene至终浓度为5μg/mL；于37℃、5％CO₂环境中培养过夜后更换新鲜培养基。每2-3天进行传代。

实施例12

淋巴细胞嵌合抗原受体表达

1.

1)感染5天后，取3×10⁵的T细胞，4℃、400g离心5min，弃上清，PBS+2％FBS清洗一次；

2)加50μL PBS+2％FBS重悬细胞，加入1μL FITC标记的羊抗人Fab抗体，冰上孵育30min；PBS+2％FBS清洗两次后，加入300μL PBS+2％FBS重悬细胞，采用流式细胞仪检测感染效率；结果如图7显示，CAR阳性细胞比例为45.7％。

2.

2)加50μL PBS+2％FBS重悬细胞，加入1μL FITC标记的Anti-CD3 Ab、Percp-Cy5.5标记的Anti-CD4 Ab和PE-Cy7标记的Anti-CD8 Ab，冰上孵育30min；PBS+2％FBS清洗两次后，加入300μL PBS+2％FBS重悬细胞，采用流式细胞仪检测细胞表型；结果如图8a显示，未转染的T细胞中CD3+细胞比例超过99％，CD3+CD4+细胞比例为24.6％，CD3+CD8+细胞比例为73.8％；1A6 CAR-T细胞中，如图8b显示，CD3+细胞比例超过99.5％，CD3+CD4+细胞比例为33.3％，CD3+CD8+细胞比例为68.1％。

实施例13

CAR-T细胞的体外毒性实验

1.靶细胞接种

293T(CEA-)、SW620-CEA、BxPC3(CEA+)作为靶细胞，调整靶细胞浓度为1×10⁵/mL，取100μL接种到96well板；

2.效应细胞接种：

1A6 CAR-T以及对照T细胞为效应细胞；按效靶比0.3:1、1:1和3:1向96孔板中加入CAR-T细胞及对照T细胞；

3.各组均设3个复孔，取3个复孔的平均值。其中各实验组和各对照组如下：

各实验组：各靶细胞+CAR-T；

对照组1：靶细胞最大释放LDH；

对照组2：靶细胞自发释放LDH；

对照组3：效应细胞自发释放LDH；

4.检测方法：

效应细胞与靶细胞共培养18h后，采用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司)进行。该方法是基于比色法的检测方法，通过检测乳酸脱氢酶(LDH)的含量反映细胞的裂解程度。LDH是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来，其释放方式与⁵¹Cr在放射性分析中的释放方式基本相同。释放出的LDH培养基上清中，可通过偶联酶反应来检测，在酶反应中LDH可使一种四唑盐(INT)转化为红色的甲臜(formazan)。生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。具体参照CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书。

5.细胞毒性计算公式为：

结果如图9所示，1A6 CAR-T细胞对CEA阳性的肿瘤细胞具有杀伤活性，而对CEA阴性细胞无杀伤作用。

综上所述，本发明筛选出可特异性结合CEA抗原的1A6抗体，并以1A6scFv为基础构建可特异性杀伤CEA阳性肿瘤细胞的CAR-T细胞。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 华道（上海）生物医药有限公司

<120> 一种抗癌胚抗原的抗体及其制备方法和用途

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Ser

1 5 10

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Ser Arg Ala Met Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Gln Ser Tyr Ser Asn Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc acctatttaa attggtatca gcagaaaccg 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatggt gcatctagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta acccgctcac tttcggcgga 300

gggaccaagg tggaggtcaa a 321

<210> 8

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggcccagg tccagctggt gcagtctgga gctgaggtga agaagcctgg ggcctcagtg 60

aaggtctcct gcaaggcttc tggttacacc tttaccagct atggtatcag ctgggtgcgg 120

caggcccctg gacaagggct tgagtggatg ggatggatca gcgcttacaa tggtaacaca 180

aactatgcac agaagctcca gggcagagtc accatgacca cagacacatc cacgagcaca 240

gcctacatgg agctgaggag cctgagatct gacgacacgg ccgtgtatta ctgtgcgagc 300

gggagtcgag ctatgggcta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360

gtcaccgtct cctca 375

<210> 9

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Asn Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Val Lys

100 105

<210> 10

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

1 5 10 15

Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

20 25 30

Ser Tyr Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln

50 55 60

Lys Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Ser Gly Ser Arg Ala Met Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cttgtcgcga ttcttaaggg tgtccagtgc gccatccagt tgacccagtc 50

<210> 12

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgatccgcca ccgccagagc cacctccgcc tgaaccgcct ccacctttga cctccacctt 60

<210> 13

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcgatggc ccaggtccag 60

<210> 14

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atatgcaagg cttacaacca caatctgagg agacggtgac cgtggtccct 50

<210> 15

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agggaccacg gtcaccgtct cctcagattg tggttgtaag ccttgcatat 50

<210> 16

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ccggccttgc cggcctcgag cggccgctta tttaccagga gagtgggaga 50

<210> 17

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctgccgctgg ccttgctgct ccacgccgcc aggccggcca tccagttgac cc 52

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cggcgctggc gtcgtggttg aggagacggt gaccgt 36

<210> 19

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gctgcaggtc gactctagag gatcccgcca ccatggcctt accagtgacc gccttgctcc 60

tgccgctggc cttgc 75

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

accacgacgc cagcgccgcg ac 22

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tcgataagct tgatatcg 18

<210> 22

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 23

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Asn Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Val Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Gln Val Gln Leu

115 120 125

Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val

130 135 140

Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Ser Trp

145 150 155 160

Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser

165 170 175

Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly Arg Val

180 185 190

Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg

195 200 205

Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Ser

210 215 220

Arg Ala Met Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 24

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

35 40 45

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

50 55 60

Ile Thr Leu Tyr Cys

65

<210> 25

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 26

<211> 1473

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggccatcc agttgaccca gtctccatcc tccctgtctg catctgtagg agacagagtc 120

accatcactt gccgggcaag tcagagcatt agcacctatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccggggaaag cccctaagct cctgatctat ggtgcatcta gtttgcaaag tggggtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa 300

cctgaagatt ttgcaactta ctactgtcaa cagagttaca gtaacccgct cactttcggc 360

ggagggacca aggtggaggt caaaggtgga ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt 420

ggcggatcga tggcccaggt ccagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggg 480

gcctcagtga aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta tggtatcagc 540

tgggtgcggc aggcccctgg acaagggctt gagtggatgg gatggatcag cgcttacaat 600

ggtaacacaa actatgcaca gaagctccag ggcagagtca ccatgaccac agacacatcc 660

acgagcacag cctacatgga gctgaggagc ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac 720

tgtgcgagcg ggagtcgagc tatgggctac tactactacg gtatggacgt ctggggccaa 780

gggaccacgg tcaccgtctc ctcaaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840

cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900

ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960

gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg caaacggggc 1020

agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1080

gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 1140

gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtacaagc agggccagaa ccagctctat 1200

aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1260

gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1320

ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1380

aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1440

gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgc 1473

Claims

1.一种抗CEA抗体，所述抗CEA抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述抗CEA抗体具有如下技术特征：

<1>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR-H1；

<2>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-H2；

<3>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-H3；

<4>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR-L1；

<5>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L2；

<6>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-L3。

2.根据权利要求1所述的一种抗CEA抗体，其特征在于，所述抗CEA抗体的重链可变区的氨基酸序列包括：

a)如SEQ ID No.9所示的氨基酸序列；

和所述抗CEA抗体的轻链可变区的氨基酸序列包括

b)如SEQ ID No.10所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的一种抗CEA抗体，其特征在于，所述抗CEA抗体为单链抗体，和/或单克隆抗体。

4.一种分离的多核苷酸，编码如权利要求1-2任一权利要求所述的抗CEA抗体的重链可变区和/或轻链可变区或全长氨基酸。

5.一种构建体，含有如权利要求4所述的分离的多核苷酸。

6.一种抗体的表达系统，所述表达系统含有如权利要求5所述的构建体或基因组中整合有外源的如权利要求4所述的多核苷酸。

7.如权利要求1-2任一权利要求所述的抗CEA抗体的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述抗体的条件下，培养如权利要求6所述的抗体的表达系统，从而表达出所述的抗体，纯化分离出所述的抗体。

8.如权利要求1-2任一权利要求所述的抗CEA抗体在制备治疗抗肿瘤药物中的用途、或制备诊断抗肿瘤药物中的用途。

9.一种分离的多肽，所述多肽包括胞外域、跨膜域和胞内域，所述胞外域包括如权利要求1-2任一权利要求所述抗CEA抗体和铰链区，所述铰链区选自CD8α，所述跨膜域选自CD8α、CD28、DAP 10，所述胞内域包括共刺激结构域和/或信号结构域；所述信号结构域选自免疫受体酪氨酸活化基序；所述多肽为嵌合抗原受体。

10.如权利要求9所述的多肽，其特征在于，所述多肽自N端至C端依次包括所述抗CEA抗体、铰链区、跨膜域、胞内域。

11.一种细胞，所述细胞含膜结合的如权利要求9-10任一权利要求所述的多肽，所述细胞为T淋巴细胞和/或NK细胞；

和/或，当所述多肽结合于CEA抗原时，所述T淋巴细胞和/或NK细胞可以被活化和/或刺激从而增殖；

和/或，所述T淋巴细胞和/或NK细胞表面表达所述抗CEA抗体。

12.一种诊断试剂盒，包含诊断有效剂量的如权利要求1-2任一权利要求所述的抗CEA抗体和/或其免疫偶联物。