CN114349863B - 一种抗cd19抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种抗CD19抗体及其制备方法和用途，所述抗CD19抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述抗CD19抗体重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR‑H1、氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR‑H2、氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR‑H3，轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR‑L1、氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR‑L2、氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR‑L3。所述抗CD19抗体能用于制备或筛选肿瘤治疗或肿瘤诊断药物中。

Description

一种抗CD19抗体及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种抗CD19抗体及其制备方法和用途。
背景技术
嵌合抗原受体（CAR）是由抗原结合域组成的合成蛋白质，通常来自抗体的可变区：单链可变片段（scFv），通过铰链和跨膜序列连接到细胞内信号模块。抗CD19嵌合抗原受体（CAR）T细胞在恶性血液病中表现出很强的活性。以CD19为靶点的临床试验使用了来自非人类单克隆抗体的单链抗体，例如：小鼠FMC63，这种非人源的抗体可能具有免疫原性，使用完全人源单链抗体可以降低CARs的免疫原性，从而提高患者的治疗效果。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种抗CD19抗体及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种抗CD19的抗体，所述抗CD19抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述抗CD19抗体具有如下技术特征中的一个或多个；
<1> 重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR-H1；
<2> 重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-H2；
<3> 重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-H3；
<4> 轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR-L1；
<5> 轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L2；
<6> 轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-L3。
优选的，所述抗CD19抗体为单链抗体。
优选的，抗CD19单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.19所示。
本发明还提供所述抗CD19抗体在制备或筛选肿瘤治疗药物中的用途、或制备肿瘤诊断药物中的用途。
本发明还提供一种分离的多肽，所述多肽包括跨膜域、胞内域和胞外域，所述胞外域包括所述抗CD19抗体。
本发明还提供一种分离的多核苷酸，编码所述抗CD19抗体的重链可变区和/或轻链可变区，或编码所述分离的多肽。
本发明还提供一种核酸构建体，所述核酸构建体含有所述分离的多核苷酸。
本发明还提供一种慢病毒载体系统，所述慢病毒载体系统包括所述的核酸构建体以及辅助质粒。
本发明还提供一种慢病毒，所述慢病毒由慢病毒载体系统经病毒包装而成。所述慢病毒可以用于感染T细胞来制备CART细胞，或用于感染NK细胞来制备CAR-NK 细胞。
本发明还提供一种T淋巴细胞，所述T淋巴细胞表达所述多肽。
如上所述，本发明的抗CD19抗体及其制备方法和用途，具有以下有益效果：更佳的细胞杀伤效果。
附图说明
图1显示为本发明的mpELISA筛选结果的吸光度读数。
图2显示为本发明的用于CAR mRNA生成的pDA CAR载体的示意图。
图3显示为本发明的用于产生CAR慢病毒的pUTCLK CAR载体的示意图。
图4-1至图4-8显示为流式细胞仪染色检测表达抗CD19 scFv-N56，-N58，-N60，-N64，-N67，-N70，-N73，-N74，-N77，-N78，-N79，-N85，-N88，-N97，-N98，-N101，-N102，-N103，-N104，-N105，-N108，-N109，-N110，-N113的CD19-CART细胞与CD19-Fc重组蛋白的结合情况。
图5显示为A549和A549-CD19的CD19的异位表达水平，其中a为散点图，b为统计图。
图6a和图6c显示为表达不同scFv的CART细胞对无CD19表达的A549肿瘤细胞的杀伤效果；图6b和图6d显示为表达不同scFv的CART细胞对过表达CD19的A549肿瘤细胞的杀伤效果。
图7-1和图7-2显示为FACS染色法检测慢病毒转导的不同CD19-CART细胞与CD19-Fc重组蛋白的结合情况。
图8显示为表达抗CD19 scFv-N79、-N105、-N109和-N113的CART细胞对过表达CD19的MOLM14、NALM6肿瘤细胞的杀伤效果。
具体实施方式
术语“抗CD19抗体”和“anti-CD19 antibody”在本文中可互换使用。CD19是一种较佳的全B细胞标记物，因为它在B细胞发育直至最终分化为浆细胞的几乎所有阶段均有表达。
本文中术语“抗体”使用其最广泛的含义，具体覆盖完整单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体（如双特异性抗体）和抗体片段，只要它们显示所需生物学活性即可。
“结合”目的抗原，如CD19抗原的抗体指能够以足够亲和力结合抗原的抗体，以便该抗体可用作靶向表达该抗原的细胞的治疗剂。如果抗体是结合CD19的抗体，那么它通常优先结合CD19，而非其它抗体。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指由基本上同质的抗体群获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能的天然存在的突变外，它们通常以极少量存在。单克隆抗体是高度特异的，即针对单一抗原位点。另外，与包含针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制品不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性以外，单克隆抗体的优越性体现在可以合成它们而不受其它抗体的污染。修饰语“单克隆”指示抗体由基本上同质的抗体群获得的特征，并不解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。
本文中的单克隆抗体明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及这类抗体的片段，只要它们显示所需生物学活性即可。
“完整”抗体为包含抗原结合可变区以及轻链恒定区（C）和重链恒定区CH1、CH2和CH3的抗体。恒定区可以为天然序列恒定区（例如人天然序列恒定区）或其氨基酸序列变体。优选的是，完整抗体具有一种或多种效应器功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F（ab′）2、Fv片段、线性抗体、单链抗体（single chain Fv, scFv）。
“Fv”片段是包含完整的抗原识别和结合位点的抗体片段。此区域由一个重链的和一个轻链的可变区紧密连接的二聚体组成，该连接（如在scFv中）可以是共价的。在此构型中，每个可变区的三个CDR相互作用来限定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。
“Fab”片段包括轻链的可变区和恒定区以及重链的可变区和第一恒定区（CH1）。F（ab’）2抗体片段包含一对Fab片段，其通常在它们的羧基末端附近通过它们之间的铰链半胱氨酸来共价连接。抗体片段的其它化学偶联法也是本领域已知的。
“单链抗体”或称为“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域。通常，单链抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头(linker)，该接头使scFv形成结合抗原的理想结构。
术语“线性抗体”包含成对的串联Fd节段（VH-CH1-VH-CH1），它与互补轻链多肽一起形成成对的抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。
本文所用的术语“抗体可变区”指抗体分子的轻链和重链的部分，其包括互补决定区（CDRs：即CDR1，CDR2和CDR3）和框架区（FRs）的氨基酸序列。VH指重链的可变区。VL指轻链的可变区。根据本发明所用方法，CDRs和FRs指定的氨基酸位点可以通过Kabat等（Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health ServiceNational Institutes of Health，Bethesda，MD（1991）中描述的编号系统）来限定。
本文所用的术语“互补决定区”（CDRs：即CDR1，CDR2和CDR3）指抗体可变区的氨基酸残基，其存在对于抗原结合是必需的。每个可变区通常具有鉴定为CDR1，CDR2和CDR3的三个CDR区。每个互补决定区可包含来自Kabat所限定的“互补决定区”的氨基酸残基（即大约为轻链可变区中的残基24-34（L1），50-56（L2）和89-97（L3）以及重链可变区中的31-35（H1），50-65（H2）和95-102（H3）。
“框架区”（后文称为FR）是CDR残基之外的那些可变区残基。每个可变区通常具有FR1，FR2，FR3和FR4的四个FR。如果所述CDR根据Kabat来限定，轻链FR残基大致位于残基1-23（LCFR1），35-49（LCFR2），57-88（LCFR3），和98-107（LCFR4），并且重链FR残基大致位于重链残基的残基1-30（HCFR1），36-49（HCFR2），66-94（HCFR3），和103-113（HCFR4）。如果所述CDR包含来自高变环的氨基酸残基，轻链FR残基大致位于轻链中的残基1-25（LCFR1），33-49（LCFR2），53-90（LCFR3），和97-107（LCFR4），且重链FR残基大致位于重链残基的残基1-25（HCFR1），33-52（HCFR2），56-95（HCFR3），和102-113（HCFR4）。有些情况下，当CDR包含来自根据Kabat限定的CDR和高变环的那些氨基酸时，FR残基会相应调节。例如，当CDRH1包括氨基酸H26-H35时，重链FR1残基在位点1-25且FR2残基在位点36-49。
“T细胞抗原表位”（T cell epitope）用于本文是指单克隆抗体本身作为蛋白质抗原时可被MHC分子结合和提呈，并被T细胞抗原受体所识别的可能肽段。单克隆治疗抗体所含的这些肽段会增加患者对治疗抗体的免疫反应。这些肽段数量越多，引起免疫反应的几率越高。
非人（如啮齿类）抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白（受体抗体）中的高变区残基用具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种（供体抗体）诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的构架区（FR）残基用相应的非人残基替换。而且，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常，人源化抗体将包含基本上不少于至少一个、通常两个下述可变区，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。任选的是，人源化抗体还将包含至少部分的免疫球蛋白恒定区（Fc），通常是人免疫球蛋白的恒定区。
本发明提供一种抗CD19的抗体，所述抗CD19抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述抗CD19抗体具有如下技术特征中的一个或多个；
<1> 重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR-H1；
<2> 重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-H2；
<3> 重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-H3；
<4> 轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR-L1；
<5> 轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L2；
<6> 轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-L3。
在本发明某些实施方式中，所述抗CD19抗体的重链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-H2和氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-H3。
在本发明某些实施方式中，所述抗CD19抗体的轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR-L1、氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L2和氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-L3。
在本发明某些实施方式中，重链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-H2和氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-H3，轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR-L1、氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L2和氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-L3。
在本发明某些实施方式中，重链可变区和轻链可变区中还包括框架区。在本发明某些具体实施方式中，所述框架区的序列为人源单抗可变区，或为鼠源单抗可变区的框架区序列经过取代、缺失或者添加一个或多个（具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的框架区序列，该框架区序列与人源单抗可变区序列的框架区序列可以具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的同源性。
在本发明某些实施方式中，HCFR1的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示，HCFR2的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示，HCFR3的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示, HCFR4的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示。LCFR1的氨基酸序列如SEQ ID No.15所示，LCFR2的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示，LCFR3的氨基酸序列如SEQ ID No.17所示, LCFR4的氨基酸序列如SEQ ID No.18所示。
在本发明某些实施方式中，所述抗CD19抗体为单链抗体（single chain Fv,scFv）。所述抗CD19单链抗体包括VH和VL，VH和VL之间设有连接肽，所述抗CD19单链抗体自N端至C端可以依次包括 VL、连接肽和VH，所述抗CD19单链抗体自N端至C端也可以依次包括VH、连接肽和VL。所述连接肽可以是本领域中各种适用于形成scFv的连接肽，例如，所述连接肽可以是G4S3 linker，所述G4S3 linker的选择或设计可以参考文献Michel Sadelainetc，Science Translational Medicine，2013；Carl H .June etc, ScienceTranslational Medicine ,2015。
在本发明某些实施方式中，所述抗CD19单链抗体从人源噬菌体抗体展示库中通过筛选得到。所述抗CD19单链抗体的重链可变区和轻链可变区核苷酸序列分别如SEQ IDNo.7和 SEQ ID No.8所示。所述抗CD19单链抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示。
在本发明某些实施方式中，所述抗CD19单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.19所示
本发明还提供所述抗CD19抗体在制备或筛选治疗药物中的用途、或制备诊断药物中的用途。
所述治疗药物可以是以CD19抗原为作用靶标，结合或作用于所述CD19抗原，从而治疗和/或预防适应症的药物。
在本发明某些实施方式中，所述治疗药物可以是肿瘤治疗药物。所述肿瘤治疗药物可以是以肿瘤细胞表面功能性表面的CD19抗原为靶标，结合或作用于CD19抗原，从而治疗和/或预防肿瘤的药物。所述肿瘤可以是CD19表达阳性的实体瘤或血液瘤。所述实体瘤例如为肺癌。所述血液瘤包括但不限于非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、人B细胞前体白血病、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤等。
在本发明某些实施方式中，所述治疗药物为嵌合抗原受体细胞治疗药物。
所述嵌合抗原受体细胞治疗药物通常包括嵌合抗原受体细胞，所述嵌合抗原受体细胞可以是嵌合抗原受体T细胞、嵌合抗原受体NK细胞等。所述嵌合抗原受体T细胞通常包括T淋巴细胞和嵌合抗原受体。所述嵌合抗原受体NK细胞通常包括NK细胞和嵌合抗原受体。所述嵌合抗原受体包括跨膜域、胞内域和胞外域。在本发明某些实施方式中，所述胞外域包括所述抗CD19抗体，即所述嵌合抗原受体细胞可以在细胞表面表达所述抗CD19抗体，从而可以引导该细胞对表达CD19抗原的细胞(例如肿瘤细胞)进行作用的药物。所述对表达CD19抗原的细胞进行作用可以是杀伤表达CD19抗原的细胞等。
所述诊断药物具体指针对作用靶标CD19抗原，以CD19抗原作为生物标志物进行诊断的试剂。
本发明还提供一种分离的多肽，所述多肽包括跨膜域、胞内域和胞外域，所述胞外域包括所述抗CD19抗体。
在本发明某些实施方式中，所述多肽为嵌合抗原受体。
在本发明某些实施方式中，所述跨膜域可以包括CD8α、CD28、DAP 10等蛋白分子的跨膜结构域。
例如，CD8α的氨基酸序列如SEQ ID No.20所示。CD8α的核苷酸序列如SEQ IDNo.21所示。再例如，CD8α的序列可参照NM_001145873，CD28的序列可参照NM_006139，DAP10的序列可参照NM_014266。
在本发明某些实施方式中，所述胞内域可以包括共刺激结构域和/或信号结构域，例如，所述胞内域可以包括4-1BB、CD28、OX40、ICOS、CD3 zeta、DAP 10等蛋白分子的信号转导结构域。例如4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID No.22所示。4-1BB的核苷酸序列如SEQ IDNo.23所示。CD3 zeta的氨基酸序列如SEQ ID No.24所示。4-1BB的核苷酸序列如SEQ IDNo.25所示。再例如，4-1BB的序列可参照NM_001561，CD28的序列可参照NM_006139，OX40的序列可参照NM_003327，ICOS的序列可参照NM_012092，CD3 zeta的序列可参照NM_198053、DAP 10的序列可参照NM_014266。在本发明一具体实施方式中，所述胞内域自N端至C端依次包括4-1BB和CD3 zeta。
在本发明某些实施方式中，所述胞外域还包括铰链区，所述铰链区选自CD8。CD8的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示。CD8的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。
在本发明某些实施方式中，所述胞外域还包括信号肽（signal peptide，SP），所述信号肽选自CD8 SP。CD8 SP的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示。CD8 SP的核苷酸序列如SEQID NO.29所示。
在本发明某些实施方式中，所述多肽自N端至C端依次包括所述抗CD19单链抗体、跨膜域、胞内域。在本发明一些具体实施方式中，所述多肽自N端至C端依次包括抗CD19单链抗体、CD8α跨膜区、4-1BB共刺激结构域、CD3 zeta信号结构域。在本发明一具体实施方式中，所述多肽自N端至C端依次包括所述抗CD19单链抗体、CD28跨膜区、CD28共刺激结构域、CD3 zeta信号结构域。在本发明另一具体实施方式中，所述多肽自N端至C端依次包括所述抗CD19单链抗体、CD8α跨膜区、OX40共刺激结构域、CD3 zeta信号结构域。在本发明另一具体实施方式中，所述多肽自N端至C端依次包括所述抗CD19单链抗体、CD8α跨膜区、ICOS共刺激结构域、CD3 zeta信号结构域。在本发明另一具体实施方式中，所述多肽自N端至C端依次包括所述抗CD19单链抗体、CD8α跨膜区、4-1BB共刺激结构域、CD3 zeta。在本发明另一具体实施方式中，所述多肽自N端至C端依次包括所述抗CD19单链抗体、CD28跨膜区、CD28共刺激结构域、OX40共刺激结构域、CD3 zeta信号结构域。
本发明还提供一种分离的多核苷酸，编码所述抗CD19抗体的重链可变区和/或轻链可变区，或编码所述分离的多肽。
本发明还提供一种核酸构建体，所述核酸构建体含有所述分离的多核苷酸。
术语“核酸构建体”是指可以被引入靶细胞或组织中的人工构建的核酸区段。所述核酸构建体为病毒载体或非病毒载体。所述核酸构建体可以为慢病毒载体或腺相关病毒载体，慢病毒载体或腺相关病毒载体包括载体骨架即空载体与表达框架。
在一些实施方式中，所述核酸构建体为慢病毒载体。所述慢病毒载体中载体骨架可以现有技术中的载体骨架。
本发明还提供一种慢病毒载体系统，所述慢病毒载体系统包括所述的核酸构建体以及辅助质粒。
更进一步的，所述辅助质粒中包括必需的病毒包装组件，所述辅助质粒可以包括包装质粒和衣壳质粒。
进一步的，所述慢病毒载体系统还包括宿主细胞。所述宿主细胞携带慢病毒载体。所述宿主细胞可以选自本领域各种可适用的宿主细胞，只要不对本发明的发明目的产生限制即可。具体的可适用的细胞可以为生产慢病毒的细胞，例如可以为293T细胞。
本发明还提供一种慢病毒，所述慢病毒由慢病毒载体系统经病毒包装而成。所述慢病毒可以用于感染T细胞来制备CART细胞，或用于感染NK细胞来制备CAR-NK 细胞。
本发明还提供一种T淋巴细胞，所述T淋巴细胞表达所述多肽。
在本发明某些实施方式中，所述多肽为嵌合抗原受体。
所述T淋巴细胞通常可以表达所述多肽，其通常可以结合于CD19抗原，更具体可以通过包含所述抗CD19抗体的胞外域结合于CD19抗原，当所述多肽结合于所述CD19抗原时，所述T淋巴细胞通常可以活化和/或刺激从而得以增殖。在本发明某些实施方式中，所述胞外域包括所述抗CD19抗体，即所述嵌合抗原受体T细胞可以在T淋巴细胞表面表达所述抗CD19抗体，从而可以引导T淋巴细胞对表达CD19抗原的细胞(例如肿瘤细胞)进行作用的，所述作用可以是杀伤表达CD19抗原的细胞等。
本发明还提供一种NK细胞，所述NK细胞表达所述多肽。
在本发明某些实施方式中，所述多肽为嵌合抗原受体。
所述NK细胞通常可以表达所述多肽，并通常可以结合于CD19抗原，更具体可以通过包含所述抗CD19抗体的胞外域结合于CD19抗原，当所述多肽结合于所述抗原时，所述NK细胞通常可活化和/或刺激从而得以增殖。在本发明某些实施方式中，所述胞外域包括所述抗CD19抗体，即所述嵌合抗原受体NK细胞可以在NK细胞表面表达所述抗CD19抗体，从而可以引导NK细胞对表达CD19抗原的细胞(例如肿瘤细胞)进行作用的，所述作用可以是杀伤表达CD19抗原的细胞等。
本发明还提供所述分离的多肽、T淋巴细胞、NK细胞在制备或筛选治疗药物中的用途、或制备诊断药物中的用途。
所述治疗或诊断药物可以是以CD19抗原为作用靶标，结合或作用于所述CD19抗原，从而治疗和/或预防适应症的药物。
在本发明某些实施方式中，所述治疗药物可以是肿瘤治疗药物。所述肿瘤治疗药物可以是以肿瘤细胞表面功能性表达的CD19抗原为靶标，结合或作用于CD19抗原，从而治疗和/或预防肿瘤的药物。所述肿瘤可以是肺癌等CD19表达阳性的肿瘤。
本发明还提供一种诊断试剂盒，包含诊断有效剂量的所述抗CD19抗体或其免疫偶联物。有效量通常指能够提供诊断效益的量。
所述诊断试剂盒通常可以针对作用靶标CD19抗原，以CD19抗原作为生物标志物进行诊断。所述诊断试剂盒还可以包括抗CD19抗体的标记物，所述抗CD19抗体的标记物通常可以用于标记抗CD19抗体，可选用的标记物的种类包括但不限于荧光标记物、放射性标记物、酶标标记物、化学发光性标记物等中的一种或多种的组合。根据试剂盒的检测原理，所述试剂盒通常还可包含检测所需的一种或多种试剂。此外，所述试剂盒中还可根据需要包括：容器、对照物(阴性或阳性对照)、缓冲剂、助剂等，本领域技术人员可根据具体情况对其进行选择。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1：抗CD19抗体制备
按照以下步骤，使用全人源抗体噬菌体展示库制备抗CD19抗体：
(1) 噬菌体展示文库的表达和纯化：新鲜解冻的M13K07辅助噬菌体感染TG1噬菌体展示文库培养基，多重感染率为20:1（噬菌体与细胞比率），并通过IPTG过夜诱导；随后用PEG/NaCl沉淀法纯化噬菌体文库，测定噬菌体效价。噬菌体储存在4℃下，随即进行scFv选择。
(2) scFv噬菌体的选择：第一轮选择，Maxisorp平板涂有溶解于1×PBS中的20μg/ml CD19-6His蛋白质，并在4℃下培养过夜。（对于后续几轮选择，较低的蛋白质浓度用于更严格的选择，包括第二轮生物淘洗中的2μg/ml，第三轮生物淘洗中的0.5μg/ml。）然后用PBS洗涤平板三次，向每个孔中加入封闭缓冲液（5%牛奶+1%BSA，1×PBS）。在室温下培养2小时后，丢弃封闭缓冲液，添加噬菌体溶液，用副膜密封平板，轻轻摇动培养2小时。在第一轮选择中，用PBST将板清洗10次。（对于接下来的几轮，通过增加更多的清洗周期来提高清洗的严格性：第二轮20个周期，第三轮30个周期）。然后使用1mL酸洗脱缓冲液（pH 2.2）洗脱抗原结合的scFv噬菌体，中和，接种在15mL对数期TG1培养基（OD600=0.5）中，在37°C下静置30min，摇动30min，将其接种在2×YTGA琼脂板上，并在30℃下培养过夜以供后续选择。
(3) mpELISA筛选：经过三轮筛选，筛选出480个阳性菌落，进行单克隆噬菌体ELISA（mpELISA）筛选。噬菌体上清液由单个细菌克隆产生，并测试其与CD19-Fc蛋白的结合。上清液与涂有2μg/ml CD19-6His蛋白的预封闭Maxisorp板孵育。三次洗涤后，加入100μl/孔在封闭缓冲液（5%牛奶+1%BSA在1×PBS中）中稀释1:5000的HRP结合抗M13抗体，并在室温下培养60分钟。在用PBST洗涤平板5次后，加入100μl/孔TMB底物溶液并培养10-30分钟，直到出现蓝色。通过添加50µl/孔的停止溶液（2N H2SO4）停止反应。在微孔板读取器中，在450 nm处读取吸光度。图1显示了mpELISA筛选结果的吸光度读数。如图1所示，阳性菌落（450 nm吸光度≥ 0.5）产生能够结合CD19-6His蛋白的抗CD19抗体，其中包括scFv-N56、-N58、-N60、-N64、-N67、-N70、-N73、-N74、-N77、-N78、-N79、-N85、-N88、-N97、-N98、-N101、-N102、-N103、-N104、-N105、-N108、-N109、-N110和-N113。
(4) 克隆和序列分析：根据ELISA结果选择阳性克隆，并将其用作scFv序列PCR克隆的模板（正向引物序列如SEQ ID NO.30所示：tgcagctggcacgacaggtttc，反向引物序列如SEQ ID NO.31所示：cgtcagactgtagcacgtt）。然后用sanger测序法对PCR产物进行测序（正向引物序列如SEQ ID NO.32所示：aacaattgaattcaggagga，反向引物序列如SEQ ID NO.33所示：cctcctaagaagcgtagtc）。通过abysis网站分析scFv的CDR区域(http://abysis.org/)，如SEQ ID NO.1-6所示。
实施例 2：CD19 CAR的制备
抗CD19 CAR的 mRNA载体的构建：
首先，用Xba1和Sal1酶消化pDA载体，并用凝胶纯化法纯化。通过PCR扩增（使用的上游引物和下游引物序列分别如SEQ ID NO.34和35所示）CD8 signal peptide（即CD8SP）、scFv片段和CAR片段（包括CD8铰链、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3 zeta信号结构域，并通过凝胶纯化法纯化。用本领域人员熟知的方法将CD8 SP连接至pDA载体上，用Gibson组装法将scFv片段、CAR片段（从铰链结构域到CD3-zeta结构域，序列如SEQ IDNO.20~ SEQ ID NO.27所示）和pDA载体连接，并转化到感受态细胞。通过sanger测序确认具有正确结构，并选择其进行进一步实验。图2提供了用于CAR mRNA生成的pDA CAR载体的示意图。
构建产生抗CD19 CAR的慢病毒载体：
用Xba1和Sal1酶消化pUTCLK载体，并用凝胶纯化法纯化。pDA-CAR载体的抗CD19-CAR片段用Xba1和Sal1酶消化，并用凝胶纯化法纯化。将scFv片段、CAR片段（从铰链结构域到CD3 zeta结构域）和pUTCLK载体连接并转化到有感受态细胞。通过sanger测序确认具有正确结构（氨基酸序列如SEQ ID No.36所示），并选择其进行进一步实验。图3提供了用于产生CAR慢病毒的pUTCLK CAR载体的示意图。
通过Spe1酶切将pDA-CAR质粒线性化：
使用PCR净化试剂盒纯化线性化载体，并用不含RNase的水洗脱。DNA浓度通过Nanodrop分光光度计测量，并通过DNA琼脂糖凝胶电泳进行检查。然后，按照制造商的方案（Thermofisher，目录号：AM13455）进行体外转录（IVT）。简而言之，将1µg模板DNA、NTP/ARCA缓冲液、T7缓冲液、GTP、T7酶和无RNase 的水，以20µl体积添加到0.2 ml PCR管中，并在37℃下培养3小时。3小时后，每个反应添加2µl DNase，并在37℃下培养15分钟。按照制造商的建议执行拖尾程序。使用RNasy试剂盒（Qiagen）纯化IVT mRNA，通过nanodrop测量RNA浓度，并通过运行PAGE凝胶检查。
将pUTCLK-CAR质粒用于制备CAR慢病毒：
使用pMDLg/pRRE（Addgene#12251）、pRSV Rev（Addgene#12253）、pMD2.G（Addgene#12259）包装质粒和CAR编码质粒pUTCLK-CAR质粒瞬时转染HEK293T细胞产生慢病毒。
实施例3：肿瘤细胞系和原代人淋巴细胞
肿瘤细胞系，包括A549-CBG（人肺癌细胞）、NALM6-CBG（人B细胞前体白血病细胞）、MOLM14-CBG（人白血病细胞），在添加10%FCS的RPMI-1640培养基中培养。用抗CD3/CD28Dynabeads（Life Technologies）刺激正常供体的原代淋巴细胞，并在R10培养基（RPMI-1640中添加10%FCS、青霉素链霉素（100x）、HEPES（100x）、丙酮酸钠（100x）、谷氨酰胺（100x）、NEAA（100x）中培养。T细胞在刺激后第10天在90%FCS和10%DMSO的溶液中冷冻保存，1E8细胞/瓶。
实施例4：电穿孔法制备CD19 CART以及过表达CD19的A549细胞
通过电穿孔法将CD19 mRNA导入A549肿瘤细胞制备CD19过表达的A549肿瘤细胞，将CD19 CAR mRNA导入T细胞制备CD19 CART细胞，步骤如下：收集A549肿瘤细胞和T细胞，用Opti-MEM培养基洗涤3次。用Opti-MEM培养基重新悬浮细胞颗粒，并将细胞浓度调整为1×107/ml。将10µg RNA等分到1.5 ml EP管中，添加100µl T细胞或A549细胞，并充分混合。将与RNA混合的100µl细胞添加到BTX电穿孔杯中，敲打以避免气泡。使用BTX机在以下参数下进行电穿孔：对于T细胞：500电压，0.7 ms；对于A549肿瘤细胞：300电压，0.5ms。然后将细胞转移到预热培养基中并在37℃下培养。
流式细胞仪（FACS）染色检测制备的CD19-CART细胞与CD19-Fc重组蛋白（购自ACROBiosystems）的结合情况：收集转染CAR 10天后的T细胞，用5μg/ml CD19-Fc 蛋白与其接触，在4℃下反应30分钟。洗涤2次后，加PE-anti human Fc 抗体。在4℃染30min，PBS洗一次，重悬，用流式细胞仪检测结合情况。如图4-1至4-8所示，不同抗CD19scFv与CD19 Fc重组蛋白的结合情况。无CAR分子的T细胞作为对照（“无EP”）。
如图5所示，表征A549和A549-CD19的CD19的异位表达水平。
实施例5：体外细胞毒性试验检测电穿孔法制备的CD19-CART细胞对肿瘤细胞的细胞毒性及杀伤效果
用不同量的肿瘤抗原电穿孔的EGFP-A549细胞以3000个细胞/100µl/孔接种在平底96孔板上。将CART细胞稀释至适当浓度，以100µl/孔与不同E/T比（如10:1、3:1）的肿瘤细胞一起接种，将共培养板置于IncuCyte S3机中，并设置扫描参数。扫描3天后，分析总绿色物体积分强度（GCU xµm²/孔），以计算杀伤效率。
如图6a、6c所示，表达抗CD19 scFv-N60，-N108的CART细胞有效地阻止无CD19表达的A549细胞的生长，表明这种基于scFv的CART细胞对肿瘤细胞具有相当高的细胞毒性；如图6b、6d所示，表达抗CD19 scFv-N64、-N77、-N79、-N85、-N104、-N105、-N109和-N113的CART细胞对过表达CD19的A549肿瘤细胞（电穿孔10µg CD19 mRNA）显示出有效的杀伤效果。
实施例6：CD19 CAR慢病毒转导T细胞及细胞毒性、杀伤效果检测
用抗CD3/CD28 Dynabeads（Life Technologies）激活原代人T细胞，并在100U IL2的R10培养基中培养。T细胞激活24小时后，将CD19 CAR慢病毒以MOI=3:1的比例添加到T细胞中。T细胞在100U IL2 R10培养基中培养。第5天，去除Dynabeads。第10天，在90% FCS和10% DMSO溶液中刺激后，将T细胞冷冻保存，1e7细胞/瓶。
FACS染色法检测慢病毒转导的CD19-CART细胞与CD19-Fc重组蛋白的结合。如图7-1和图7-2所示为不同抗CD19 scFv与CD19 Fc重组蛋白结合情况。不含CAR分子的T细胞作为对照（“UTD”）。
体外细胞毒性试验检测CD19-CART细胞对肿瘤细胞的细胞毒性及杀伤效果：
EGFP-NALM6细胞（CD19阳性）和EGFP-MOLM14细胞（CD19阴性），以10000个细胞/100µl/孔接种在聚鸟氨酸预涂的平底96孔板上。将CART细胞稀释至适当浓度，以100µl/孔与不同E/T比（如3:1、1:1）的肿瘤细胞一起接种，将共培养板置于IncuCyte S3机中，并设置扫描参数。扫描3天后，分析总绿色物体积分强度（GCU xµm²/井），以计算杀伤效率。
如图8所示，表达抗CD19 scFv-N79、-N105、-N109和-N113的CART细胞对过表达CD19的NALM6肿瘤细胞显示出有效的杀伤作用。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海优替济生生物医药有限公司
<120> 一种抗CD19抗体及其制备方法和用途
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Thr Ser Tyr Tyr Trp Gly
1 5
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ile Val Gly Met Thr Thr Ala Thr Pro Phe Arg Ser Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaggtgcagc tggtggagtc gggcccagga atggtgaagg cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctctggtga ctccatcagc ggtacttctt actactgggg ctggatccgc 120
cagcccccag ggaagggtct ggagtggatt gggagtatct attacagtgg gaccacctac 180
tacgacccgt ccctcaagag tcgagtcgcc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc 240
tccctgaagg tgacctctgt gaccgccgcg gacacggccg tgtattactg tgtgagaatt 300
gtggggatga ctacggcgac tccttttcgg agtatggacg tctggggcca agggaccacg 360
gtcactgtct cctca 375
<210> 8
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ctccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 9
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Met Val Lys Ala Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Gly Thr
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Ala Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Val Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Ile Val Gly Met Thr Thr Ala Thr Pro Phe Arg Ser Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Met Val Lys Ala Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser
20 25 30
<210> 12
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 13
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Arg Val Ala Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys
1 5 10 15
Val Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg
20 25 30
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 15
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 17
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 19
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Met Val Lys Ala Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys
130 135 140
Ala Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Gly Thr Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp
145 150 155 160
Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr
165 170 175
Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Ala
180 185 190
Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Val Thr Ser
195 200 205
Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Ile Val Gly
210 215 220
Met Thr Thr Ala Thr Pro Phe Arg Ser Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 20
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 21
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 22
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 23
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 24
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 25
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgacg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 26
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 27
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 28
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 29
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tgcagctggc acgacaggtt tc 22
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
cgtcagactg tagcacgtt 19
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aacaattgaa ttcaggagga 20
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cctcctaaga agcgtagtc 19
<210> 34
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cacgccgcca ggccggccat ccagttgacc cagt 34
<210> 35
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cgctggcgtc gtggttgagg agacagtgac cgtg 34
<210> 36
<211> 491
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
100 105 110
Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
130 135 140
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Met Val Lys Ala Ser Glu Thr
145 150 155 160
Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Gly Thr Ser
165 170 175
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Pro Ser Leu
195 200 205
Lys Ser Arg Val Ala Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
210 215 220
Leu Lys Val Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Val Arg Ile Val Gly Met Thr Thr Ala Thr Pro Phe Arg Ser Met Asp
245 250 255
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
275 280 285
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
290 295 300
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
305 310 315 320
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
325 330 335
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
340 345 350
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
355 360 365
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
370 375 380
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
385 390 395 400
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
405 410 415
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
420 425 430
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
435 440 445
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
450 455 460
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
465 470 475 480
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490

Claims (13)

1.一种抗CD19抗体，其特征在于，所述抗CD19抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述抗CD19抗体具有如下技术特征：
<1> 重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR-H1；
<2> 重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-H2；
<3> 重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-H3；
<4> 轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR-L1；
<5> 轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L2；
<6> 轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-L3。
2.根据权利要求1所述的抗CD19抗体，其特征在于，所述抗CD19抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示。
3.根据权利要求1所述的抗CD19抗体，其特征在于，所述抗CD19抗体为单链抗体。
4.根据权利要求3所述的抗CD19抗体，其特征在于，抗CD19单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.19所示。
5.权利要求1-4任一所述的抗CD19抗体在制备或筛选肿瘤治疗药物中的用途、或制备肿瘤诊断药物中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述肿瘤治疗药物为嵌合抗原受体细胞治疗药物。
7.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽包括跨膜域、胞内域和胞外域，所述胞外域包括权利要求1-4任一所述的抗CD19抗体。
8.根据权利要求7所述的分离的多肽，其特征在于，所述多肽还包括如下特征中的一项或多项：
所述多肽为嵌合抗原受体；
所述跨膜域选自CD8α、CD28、DAP 10；
所述胞内域包括共刺激结构域和/或信号结构域；
所述多肽自N端至C端依次包括所述抗CD19抗体、跨膜域、胞内域。
9.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1-4任一所述的抗CD19抗体的重链可变区和/或轻链可变区，或编码权利要求7或8所述的多肽。
10.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体含有权利要求9所述的分离的多核苷酸。
11.一种慢病毒载体系统，其特征在于，所述慢病毒载体系统包括权利要求10所述的核酸构建体以及辅助质粒。
12.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒由权利要求11所述的慢病毒载体系统经病毒包装而成。
13.一种T淋巴细胞，其特征在于，所述T淋巴细胞表达有权利要求7或8所述的多肽。
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