RU2488593C2 - Человеческое опухолеспецифическое моноклональное антитело - Google Patents
Человеческое опухолеспецифическое моноклональное антитело Download PDFInfo
- Publication number
- RU2488593C2 RU2488593C2 RU2009137784/10A RU2009137784A RU2488593C2 RU 2488593 C2 RU2488593 C2 RU 2488593C2 RU 2009137784/10 A RU2009137784/10 A RU 2009137784/10A RU 2009137784 A RU2009137784 A RU 2009137784A RU 2488593 C2 RU2488593 C2 RU 2488593C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- tumor
- seq
- binding fragment
- sequence
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 96
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 108
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 107
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 107
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 claims abstract description 94
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 claims abstract description 94
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 90
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 58
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 40
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 33
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 26
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 15
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 70
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 26
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 17
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 12
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 claims description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 6
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 claims description 3
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 claims description 3
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 claims description 3
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 3
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 claims description 2
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 claims description 2
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 claims description 2
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 claims description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 claims description 2
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000002523 lectin Substances 0.000 claims description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims description 2
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 claims description 2
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 claims 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 18
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 206010027454 Metastases to breast Diseases 0.000 abstract description 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 89
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 39
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 35
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 32
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 25
- 210000001806 memory b lymphocyte Anatomy 0.000 description 24
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 17
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 7
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 7
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 7
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- -1 without limitation Substances 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 4
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 4
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 4
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 241000208199 Buxus sempervirens Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 3
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 3
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 3
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 244000105975 Antidesma platyphyllum Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100039510 Cancer/testis antigen 2 Human genes 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000889345 Homo sapiens Cancer/testis antigen 2 Proteins 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 235000009424 haa Nutrition 0.000 description 2
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- BHELIUBJHYAEDK-OAIUPTLZSA-N Aspoxicillin Chemical compound C1([C@H](C(=O)N[C@@H]2C(N3[C@H](C(C)(C)S[C@@H]32)C(O)=O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC(=O)NC)=CC=C(O)C=C1 BHELIUBJHYAEDK-OAIUPTLZSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 102000003930 C-Type Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090000342 C-Type Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 1
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 208000017897 Carcinoma of esophagus Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 206010012559 Developmental delay Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 1
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 206010027457 Metastases to liver Diseases 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000283080 Proboscidea <mammal> Species 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 101710143177 Synaptonemal complex protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100036234 Synaptonemal complex protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 102100028644 Tenascin-R Human genes 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 229940120638 avastin Drugs 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I calcium;potassium;disodium;(2s)-2-hydroxypropanoate;dichloride;dihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].C[C@H](O)C([O-])=O BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000017455 cell-cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 description 1
- 229940021013 electrolyte solution Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 230000008921 facial expression Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000013100 final test Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N iron(II,III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 125000003473 lipid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- PUPNJSIFIXXJCH-UHFFFAOYSA-N n-(4-hydroxyphenyl)-2-(1,1,3-trioxo-1,2-benzothiazol-2-yl)acetamide Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1NC(=O)CN1S(=O)(=O)C2=CC=CC=C2C1=O PUPNJSIFIXXJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002850 nasal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- 238000012633 nuclear imaging Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 150000002895 organic esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000001814 protein method Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 108010043277 recombinant soluble CD4 Proteins 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 108010020387 tenascin R Proteins 0.000 description 1
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 1
- 230000003614 tolerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000037455 tumor specific immune response Effects 0.000 description 1
- 238000012920 two-step selection procedure Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000002747 voluntary effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0002—General or multifunctional contrast agents, e.g. chelated agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3053—Skin, nerves, brain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
Abstract
Изобретение раскрывает новые человеческие опухоль-ассоциированные антитела и их фрагменты, способные узнавать опухоль-ассоциированный антиген NY-ESO-1, содержащие в вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи CDR1, CDR2 и CDR3 с определенной последовательностью, приведенной в описании, или CDR2 и CDR3, которые отличаются одной, двумя или тремя аминокислотами от соответствующих последовательностей. Описаны полинуклеотид, кодирующий вариабельный участок иммуноглобулиновой цепи антитела, вектор для переноса и/или экспрессии полинуклеотида и клетка-хозяин для получения антитела или его связующего фрагмента. Описаны также фармацевтические композиции, содержащие такие антитела и их связывающие фрагменты, для лечения опухолей, а также набор для диагностирования раковых заболеваний, таких как первичная карцинома рака молочной железы и метастазы. Антитела по изобретению, являясь человеческими, более специфически нацелены на ткань и клетки опухоли. 11 н. и 9 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение в целом относится к новым опухолеспецифическим связывающим молекулам, в частности к человеческим антителам, а также их фрагментам, производным и вариантам, которые узнают опухолевые антигены и опухоль-ассоциированные антигены соответственно. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим такие связывающие молекулы, антителам и их мимикам для лечения различных опухолей, в частности меланомы, рака молочной железы и метастазов.
Уровень техники
Гуморальные иммунные ответы на опухоли встречаются относительно часто (1, 2). Это явление использовали для идентификации множества опухолеспецифических антигенов (taa) путем скрининга аутологичных экспрессионных библиотек с сывороткой, взятой у больного раком (1). Несколько из таких taa теперь используются в качестве T-клеточных антигенов для индукции у пациентов противоопухолевых CTL-ответов (3, 4). В настоящее время пересматривается такое предпочтительное отношение к клеточному ответу, в большинстве случаев цитотоксическому иммунному ответу, как к некой терапевтической стратегии, и разрабатываются новые вакцины с тем, чтобы индуцировать также и антительные ответы. В частности, такое изменение концепции, вероятно, произошло под влиянием недавних достижений в лечении опухоли различными моноклональными антителами, такими как трастузумаб (Герцептин) и бевацизумаб (Авастин) (5). Несмотря на то, что эти моноклональные антитела были специфически индуцированы против целевых молекул предполагаемого онкологического характера, антитела, вырабатываемые у больных раком либо спонтанно, либо путем вакцинации, относились к другому классу молекул, терапевтическое значение которых с трудом поддавалось оценке. Это происходило главным образом из-за отсутствия эффективных экспериментальных подходов для их выделения и последующей характеристики in vitro и на животных моделях человеческого рака.
Таким образом, существует потребность в преодолении вышеописанных ограничений и предоставлении терапевтического и диагностического антитела к антигенам, имеющим отношение к раку.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение использует опухолеспецифический иммунный ответ больных раком для выделения специфических человеческих моноклональных антител к опухолевым антигенам и опухоль-ассоциированным антигенам (taa). В частности, в экспериментах, выполненных по настоящему изобретению, специфические к taa NY-ESO-1 моноклональные антитела успешно выделены у страдающего меланомой пациента, в титре сыворотки которого были обнаружены NY-ESO-1, и получен частичный клинический ответ. Для выделения человеческого антитела, специфического к опухолевому антигену и taa соответственно, была применена иммуногистохимия (ИГХ) с использованием тканевых микрочипов (ТМЧ).
Таким образом, настоящее изобретение относится к человеческим антителам, антигенсвязывающим фрагментам и аналогичным связывающим антигены молекулам, которые способны узнавать опухоль-ассоциированный антиген NY-ESO-1. Кроме того, настоящее изобретение относится к композициям, включающим указанные антитела, и к иммунотерапевтическим и иммунодиагностическим способам, использующим такие же антитела.
В особо предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент проявляет иммунологические характеристики связывания антитела, характеризуемого вариабельными участками VH и/или VL, как показано на фиг.4 (SEQ ID NO:2 и 4). В качестве альтернативы антитело представляет собой гуманизированное, ксеногенное или химерное человек-мышь антитело, последнее, в частности, является полезным для диагностических способов и исследований, проводимых на животных. Также включены терапевтические композиции, включающие антитело или его активные фрагменты или агонисты и родственные молекулы, или, наоборот, антагонисты того же антитела, и способы использования таких композиций для профилактики, диагностики или лечения опухоли при помощи таких композиций; причем нуждающемуся в таком лечении пациенту вводят эффективное количество этой композиции.
Антигенсвязывающий фрагмент антитела может представлять собой одноцепочечный Fv фрагмент, F(ab') фрагмент, F(ab) фрагмент и F(ab')2 фрагмент или любой другой антигенсвязывающий фрагмент. В специфическом варианте осуществления (см. ниже) антитело или его фрагмент представляет собой человеческое антитело IgG изотипа.
Естественно, настоящее изобретение охватывает и иммортализованный человеческий В-лимфоцит памяти и B-клетку соответственно, которые продуцируют антитело, имеющее отличительные и уникальные характеристики, как определено ниже.
Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим по меньшей мере вариабельный участок иммуноглобулиновой цепи антитела по изобретению. Предпочтительно указанный вариабельный участок содержит по меньшей мере один определяющий комплементарность участок (CDR) вариабельного участка VH и/или VL, как показано на фиг.4 (SEQ ID NO:5-10).
Следовательно, настоящее изобретение также охватывает векторы, содержащие указанные полинуклеотиды и трансформированные ими клетки-хозяева, а также их использование для продуцирования антитела и эквивалентных связывающих молекул, которые являются специфическими к антигенам, характерным для опухоли и/или вызывающим развитие опухоли, в частности меланому или рак молочной железы.
Антитело, его иммуноглобулиновая цепь (цепи), связывающие фрагменты и антиген, связывающийся с указанным антителом, могут использоваться в фармацевтических и диагностических композициях для иммунотерапии и диагностики опухоли соответственно. Однако для приготовления лекарственного средства предпочтительно использовать вышеуказанные композиции.
Следовательно, конкретной задачей настоящего изобретения является предоставление способов лечения или профилактики раковых заболеваний, таких как первичная карцинома молочной железы и метастазы. Способы содержат введение пациенту эффективной концентрации антитела или производного антитела, причем данное антитело нацелено на ткань и клетки опухоли.
Другие варианты осуществления настоящего изобретения будут очевидны из нижеприведенного описания и примеров. Кроме того, описание настоящего изобретения, в случае необходимости или с точки зрения целесообразности, может быть дополнено содержанием раскрытия более ранней заявки на европейский патент EP 07005180.0, поданной в Европейское патентное ведомство 13 марта 2007.
Краткое описание чертежей
Фиг.1: Лунка 12D7 с культурой B-клеток памяти содержит NY-ESO-1-специфические антитела. Среду, кондиционированную культурами B-клеток памяти, исследовали на наличие NY-ESO-1-специфических человеческих антител следующим образом: A) При помощи ELISA отображали рекомбинантный NY-ESO-1 полной длины. B) При помощи иммуногистохимии на NY-ESO-1-положительной карциноме молочной железы (mc) и на NY-ESO-1-отрицательной контрольной ткани (ct). Показано окрашивание двух лунок (9D1, 12D7) с ELISA-положительной культурой B-клеток памяти, полученное с помощью кондиционированной среды. C) NY-ESO-1-специфическое антитело, находящееся в лунке 12D7, представляет собой подкласс IgG1, как показано окрашиванием NY-ESO-1-положительной ткани кондиционированной B-клетками средой из лунки 12D7 с культурой, затем окрашиванием подклассов IgG1-4 вторичными антителами к IgG.
Фиг.2: 4-ый номер клона рекомбинантного человеческого антитела 12D7, полученный методом одноклеточной РТ-ПЦР из культуры B-клеток памяти, специфически узнает NY-ESO-1 в ELISA и на срезах ткани. Супернатантную жидкость (СН), собранную из 293T HEK клеток, трансфицированных векторами экспрессии иммуноглобулиновых легкой и тяжелой цепей, экспрессирующих четвертый номер клона 12D7, исследовали на специфичность к NY-ESO-1: A) ELISA отображает NY-ESO-1 полной длины. Значения ELISA указаны для неразбавленного СН (1:12D7.4 СН), разбавления 1/10 (2:12D7.4 СН) и разбавления 1/100 (3:12D7.4 СН). Для сравнения также показан сигнал ELISA, полученный из плазмы пациента, у которого были выделены культуры В-клеток памяти, использованные в виде разбавления 1/100 (4). В качестве контроля показано отсутствие связывания с покрытыми NY-ESO-1 пластинами ELISA для СН, полученного при трансфекции нерелевантного рекомбинантного антитела, продуцированного таким же способом, что и 12D7.4 (5), а также отсутствие связывания клона 12D7 № 4 с покрытыми нерелевантным антигеном пластинами ELISA. B) Иммуногистохимия на NY-ESO-1-положительной карциноме молочной железы (mc) и на NY-ESO-1-отрицательной контрольной ткани (ct) показывает специфическое связывание рекомбинантного клона 12D7 № 4 с карциномой молочной железы.
Фиг.3: Характеристика человеческого моноклонального антитела Manhattan. Картирование эпитопа выполняли, используя наложение пептидов, охватывающих весь белок NY-ESO-1, нанесенный на пластину ELISA. A) Manhattan специфически связывается с пептидом, покрывающим с 11 по 30 аминокислоты на N-конце белка NY-ESO-1. B) Сыворотка пациента С1 узнает различные пептидные фрагменты на N-конце и в средней области NY-ESO-1. C) В конкурентных ELISA экспериментах с пептидом NY-ESO-111-30 определена авидность Manhattan как равная KD=10-10. D) Иммунофлуоресцентное окрашивание NY-ESO-1-положительной клеточной линии SK-MEL-37 с помощью humAb Manhattan показывает колокализацию окраски NY-ESO-1 с ядерным маркером Hoechst. Контрольный рекомбинантный ген 8-15c5 человеческого антитела, специфический к MOG, не связывается.
Фиг.4: Аминокислотные и нуклеотидные последовательности вариабельного участка, т.е. тяжелой цепи и легкой каппа цепи антитела 12D7. Определяющие комплементарность участки (CDR) подчеркнуты.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение в целом относится к антителам и его антигенсвязывающим фрагментам, которые проявляют иммунологические характеристики связывания и/или биологические свойства, как в общих чертах показано для продемонстрированного в примерах антитела. В местах упоминания термина "иммунологические характеристики связывания" или других характеристик связывания антитела с антигеном, во всех его грамматических формах, имеется в виду специфичность, аффинность, кросс-реактивность и другие характеристики связывания антитела. Естественно, настоящее изобретение охватывает антитело, продуцирующее клеточные линии, а также рекомбинантные клетки. Настоящее изобретение также относится к диагностическому анализу и наборам, которые содержат связывающую молекулу по настоящему изобретению, и к основанным на этом терапевтическим способам.
Согласно настоящему изобретению человеческое антитело, специфическое к опухоль-ассоциированному антигену NY-ESO-1, клонировали от страдающего меланомой пациента, который имел сероположительную реакцию на NY-ESO-1 в способе ELISA и на аутологичных срезах опухоли, с помощью способов идентификации, проверки на достоверность и продуцирования диагностически и терапевтически полезных опухоль-ассоциированных молекул, по существу как раскрыто в совместно рассматриваемой международной заявке на патент PCT/EP2008/000053 "Method of providing disease-specific binding molecules and targets", поданной 7 января 2008, содержание которой включено в данное описание в виде ссылки. Скрининг антител-кандидатов выполняли на опухолевой ткани при помощи ELISA, используя адаптированный метод тканевых микрочипов. Было показано, что полученное реагирующее с тканью человеческое моноклональное антитело связывается с N-концом NY-ESO-1, который также присутствует в опухоль-ассоциированном антигене LAGE-1; см. пример 3.
Если не утверждается иное, термины "рак" и "опухоль" в настоящем описании являются взаимозаменяемыми.
Только с целью пояснения, но без ограничения объема настоящего изобретения, большинство из нижеприведенных вариантов осуществления описано относительно человеческих антител и антителоподобных молекул, которые представляют собой предпочтительные связывающие молекулы для разработки терапевтических и диагностических агентов по настоящему изобретению. Однако следует понимать, что в контексте настоящего изобретения термин "антитело" и его фрагмент также может относиться к другим, не являющимся антителами, связывающим молекулам, которые связываются с человеческим опухолевым (опухоль-ассоциированным) антигеном NY-ESO-1, включая без ограничений гормоны, рецепторы, лиганды, молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГС), шапероны, такие как белки теплового шока (HSP), а также молекулы адгезии клетка-клетка, такие как представители кадгерина, интегрина, лектина C-типа и суперсемейства иммуноглобулинов (Ig).
NY-ESO-1 первоначально был идентифицирован у пациента, страдающего раком пищевода, с помощью технологии, основанной на клонировании антител (SEREX, см. ниже). Недавно было показано, что NY-ESO-1 может представлять собой наиболее иммуногенный СТ антиген, поскольку спонтанные клеточный и гуморальный иммунные ответы можно наблюдать у высокого процента пациентов с опухолями, экспрессирующими NY-ESO-1, (Gnjatic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (2003), 8862-8867; Jager and Knuth, Breast 14 (2005), 631-635).
Поскольку CT антигены экспрессируются селективно в опухолевых клетках и в сперматогонии яичка человека, они являются перспективной группой целевых антигенов для иммуннотерапевтического метода лечения больных раком. Среди них NY-ESO-1, по-видимому, является очень иммуногенным, и известно, что он индуцирует эффективные гуморальный и клеточный иммунные ответы у пациентов с меланомой и раком яичника, молочной железы, легкого, а также раком мочевого пузыря, что делает его идеальной мишенью для активной иммунотерапии рака. Информацию относительно нуклеотидной и аминокислотной последовательностей, а также их природы, первичных источников и т.д., опухолевых антигенов и опухоль-ассоциированных антигенов можно найти в соответствующих базах данных, таких как UniProtKB/Swiss-Prot, представленных EMBL, в которой NY-ESO-1 может быть найден под первичным инвентарным номером P78358.
В конкретном предпочтительном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению связывается с эпитопом, определенным аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO:11, представляющей собой аминокислотные остатки 11-30 белка NY-ESO-1.
Средства и способы рекомбинантного продуцирования антител и их мимиков, а также способы скрининга для сравнения связывающих молекул, которые могут быть или могут не быть антителами, известны в данной области техники; см. также Примеры. Однако, как раскрыто в настоящем описании, в частности относительно терапевтических применений к человеку, антитело по настоящему изобретению представляет собой человеческое антитело в том смысле, что применение указанного антитела по существу не дает реакции на человеческое анти-мышиное антитело (HAMA), наблюдаемой в ином случае для химерных и даже гуманизированных антител.
Кроме того, как показано в нижеприведенном примере 3, было идентифицировано и клонировано антитело, которое, в частности, продемонстрировало высокую аффинность связывания при взаимодействии с его родственным антигеном с константой равновесия диссоциации (KD), находящейся ниже наномолярного диапазона. Предпочтительно аффинность связывания связывающей молекулы по настоящему изобретению с его родственным антигеном составляет по меньшей мере 10-7 M, более предпочтительно по меньшей мере 10-8 M, особенно предпочтительно 10-9 M и наиболее предпочтительно по меньшей мере 10-10 M.
В настоящем изобретении в качестве примера описано человеческое анти-NY-ESO-1 антитело и его связывающие фрагменты, которые могут быть охарактеризованы содержанием в их вариабельном участке, т.е. связывающем домене, по меньшей мере одного определяющего комплементарность участка (CDR) вариабельного участка VH и/или VL, содержащего аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.4 (VH) (SEQ ID NO:2) и (VL) (SEQ ID NO:4). Приведенный в качестве примера набор CDR вышеупомянутых аминокислотных последовательностей участка VH и/или VL, как изображено на фиг.4, дано в SEQ ID NO:5-10. Однако, как обсуждается ниже, специалист в данной области техники хорошо знает, что в качестве дополнения или альтернативы можно использовать CDR, аминокислотные последовательности которых отличаются от приведенных в SEQ ID NO:5-10 одной, двумя, тремя или даже большим количеством аминокислот в случае CDR2 и CDR3.
В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению представляет собой любое одно из антител, содержащих аминокислотную последовательность участка VH и/или VL, как изображено на фиг.4. В качестве альтернативы антитело по настоящему изобретению представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который конкурирует за связывание с антигеном NY-ESO-1 с по меньшей мере одним из антител, имеющих участок VH и/или VL, как изображено на фиг.4. Такие антитела могут быть мышиными, а также, однако, гуманизированными, ксеногенными или предпочтительно химерными человек-мышь антителами, в частности для применения в терапии. Антигенсвязывающий фрагмент антитела может представлять собой, например, одноцепочечный Fv фрагмент (scFv), F(ab') фрагмент, F(ab) фрагмент или F(ab')2 фрагмент.
Таким образом, для некоторых применений необходимы только вариабельные участки антител, которые могут быть получены обработкой антитела подходящими реагентами для получения Fab', Fab или F(ab")2 частей. Такие фрагменты достаточны для использования, например, в иммуннодиагностических процедурах, включающих связывание иммунноспецифических частей иммуноглобулинов с детектирующими реагентами, такими как радиоизотопы.
В качестве альтернативы, для получения иммуноглобулинов непосредственно из культуры иммортализованных B-клеток или B-клеток памяти, иммортализованные клетки можно использовать в качестве источника реорганизации локусов тяжелой цепи и легкой цепи для последующей экспрессии и/или генетической манипуляции. Гены реорганизованного антитела можно подвергнуть обратной транскрипции от соответствующих мРНК, для того чтобы получить кДНК. При необходимости константный участок тяжелой цепи может быть заменен участком другого изотипа или полностью удален. Для кодирования одноцепочечных участков Fv вариабельные участки могут быть соединены. Для обеспечения способности связываться с более чем одной мишенью может быть соединено множество участков Fv или могут быть использованы химерные комбинации тяжелой и легкой цепей. После получения генетического материала несложно разработать аналоги, как описано выше, которые сохраняют обе способности связываться с желаемой мишенью. Способы клонирования вариабельных участков антитела и создания рекомбинантных антител известны специалисту в данной области техники и описаны, например, у Gilliland et al., Tissue Antigenes 47 (1996), 1-20; Doenecke et al., Leukemia 11 (1997), 1787-1792.
После получения соответствующего генетического материала и при необходимости модификации для кодирования аналога, кодирующие последовательности, включая те, которые кодируют как минимум вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, могут быть вставлены в системы экспрессии, включенные в векторы, которые могут быть трансфицированы в стандартные рекомбинантные клетки-хозяева. Можно использовать множество таких клеток-хозяев; однако, для эффективной обработки предпочтительны клетки млекопитающих. Для этой цели можно использовать обычные клеточные линии млекопитающих, включая клетки CHO, клетки HEK 293 или клетки NSO. Затем проводят продуцирование антитела или аналога путем культивирования измененного рекомбинантного хозяина в условиях культивирования, соответствующих росту клеток-хозяев и экспрессии кодирующих последовательностей. Затем антитела извлекают, выделяя их из культуры. Системы экспрессии предпочтительно разрабатывают таким образом, чтобы были включены сигнальные пептиды, для того чтобы полученные антитела секретировались в среду; однако также возможно внутриклеточное продуцирование.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к антигену NY-ESO-1, который распознается описанным выше антителом по настоящему изобретению, как в виде пептида, так и в посттрансляционном модифицированном виде; причем антиген предпочтительно является пептидом, состоящим из по меньшей мере 6-50 и предпочтительно не более чем 10-100 аминокислот в длину, который содержит родственный эпитоп. Наиболее предпочтительно, антиген по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11 и состоит примерно из 10-30 аминокислот и предпочтительно не более чем примерно 20 аминокислот в длину. Молекула является достаточно большой, чтобы быть аллергенной без какой-либо посттрансляционной модификации, и, следовательно, она полезна как иммуноген в комбинации с адъювантом (или без него) как в виде предшественника, так и в посттрансляционном модифицированном виде. Эти антигены и пептиды можно использовать для определения того, имеются или нет антитела в образце, таком как сыворотка или кровь. Предпочтительно антиген по настоящему изобретению способен вызвать у человека гуморальный ответ.
Согласно вышесказанному, настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, кодирующему антиген или связывающую молекулу по настоящему изобретению, в случае антитела, предпочтительно по меньшей мере к вариабельному участку иммуноглобулиновой цепи описанного выше антитела. Как правило, указанный кодируемый полинуклеотидом вариабельный участок содержит по меньшей мере один определяющий комплементарность участок (CDR) вариабельного участка VH и/или VL упомянутого антитела. Специалист в данной области техники знает, что каждый вариабельный домен (тяжелой цепи VH и легкой цепи VL) антитела содержит три гипервариабельных участка, иногда называемых определяющими комплементарность участками или "CDR", фланкированными четырьмя относительно консервативными каркасными участками или "FR", и относящихся к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание антигена. Гипервариабельные участки или CDR IgG подтипа человеческих антител содержат следующие аминокислотные остатки: 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) остатки вариабельного домена легкой цепи и 31-35 (Н1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) остатки вариабельного домена тяжелой цепи, как описано у Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991), и/или аминокислотные остатки гипервариабельной петли, т.е. 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) остатки вариабельного участка легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) остатки вариабельного участка тяжелой цепи, как описано у Chothia et al., J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917. Каркас или FR остатки представляют собой аминокислотные остатки вариабельного участка, которые отличаются от разделяющих их гипервариабельных участков. Термин "специфическое связывание" относится к связыванию антитела с заданным антигеном. Как правило, антитело связывается с константой диссоциации (KD), равной 10-7 или меньше, и связывается с заданным антигеном с KD, значение которой по меньшей мере в два раза ниже значения его KD связывания с неспецифическим антигеном (например, BSA, казеином или любым другим определенным полипептидом), отличающимся от заданного антигена. Фразы "антитело, которое узнает антиген" и "антитело, специфическое к антигену", в настоящем описании используются наряду с термином "антитело, которое специфически связывается с антигеном". "Высокоспецифическое" связывание в настоящем описании означает, что относительная KD антитела для специфического целевого эпитопа, т.е. taa NY-ESO-1, по меньшей мере в 10 раз ниже KD связывания этого антитела с другими лигандами. Предпочтительно антитело связывается со своим родственным антигеном NY-ESO-1 с константой диссоциации (KD), равной 10-9 M или меньше.
Аффинность или авидность антитела к антигену может быть определена экспериментально с помощью любого из подходящих способов, см., например, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, NY (1984), Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company New York, NY (1992), и способов, описанных в настоящем описании. Измеренная аффинность конкретного антитело-антиген взаимодействия может меняться при измерении в различных условиях, например, концентрации соли, pH. Таким образом, измерение аффинности и других антигенсвязывающих параметров, например, KD, IC50, предпочтительно проводят в стандартизованных растворах антитела и антигена и стандартизованном буфере.
Для специалиста в данной области техники очевидно, что вариабельный домен антитела с вышеописанным вариабельным участком можно использовать для создания других полипептидов или антител с нужной специфичностью и биологической функцией. Таким образом, настоящее изобретение также охватывает полипептиды и антитела, содержащие по меньшей мере один CDR вышеописанного вариабельного домена, который преимущественно имеет по существу такие же или аналогичные связывающие свойства, что и описанное в прилагаемых примерах антитело. Для специалиста в данной области техники очевидно, что раскрытые в настоящем описании антитела могут быть сконструированы с помощью вариабельных доменов или CDR согласно известным в данной области способам, например, как описано в европейских заявках на патент EP 0451216 А1 и EP 0549581 А1. Более того, специалисту в данной области техники известно, что аффинность связывания может быть увеличена с помощью аминокислотных замен внутри CDR или гипервариабельных петель (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917), которые частично перекрываются с CDR, как определено у Kabat. Таким образом, настоящее изобретение также относится к антителам, у которых один или несколько упомянутых CDR имеют одну или несколько, предпочтительно не более двух, аминокислотных замен. Предпочтительно антитело по изобретению содержит в одной или обеих иммуноглобулиновых цепях два или все три CDR вариабельных участка, как приведено в SEQ ID NO:5-10.
Полинуклеотид по изобретению, кодирующий вышеуказанное антитело, может представлять собой, например, ДНК, кДНК, РНК или искусственно продуцированную ДНК или РНК, или рекомбинантно продуцированную химерную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую любой из таких полинуклеотидов, либо отдельно, либо в комбинации. Предпочтительно указанный полинуклеотид представляет собой часть вектора. Такие векторы могут содержать дополнительные гены, такие как маркерные гены, которые позволяют выбрать указанный вектор в подходящей клетке-хозяине и в подходящих условиях.
Предпочтительно полинуклеотид по изобретению необязательно соединен с управляющими экспрессией последовательностями, обеспечивающими экспрессию в прокариотических или эукариотических клетках. Экспрессия указанного полинуклеотида включает транскрипцию полинуклеотида в транслируемой мРНК. Регуляторные элементы, гарантирующие экспрессию в эукариотических клетках, предпочтительно клетках млекопитающих, известны специалистам в данной области техники. Они обычно включают регуляторные последовательности, гарантирующие инициацию транскрипции, и необязательно поли-A сигналы, гарантирующие терминацию транскрипции и стабилизацию транскрипта. Дополнительные регуляторные элементы могут включать транскрипционные, а также трансляционные энхансеры и/или естественно ассоциированные или гетерологичные участки промотора.
В связи с этим, для специалиста в данной области техники очевидно, что полинуклеотиды, кодирующие по меньшей мере вариабельный домен легкой и/или тяжелой цепи, могут кодировать вариабельные домены обеих или только одной иммуноглобулиновой цепи. Аналогично, для осуществления экспрессии указанные полинуклеотиды могут находиться под контролем одного и того же промотора или могут управляться отдельно. Возможные регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию в прокариотических клетках-хозяевах, содержат, например, PL, lac, trp или tac промотор для E. coli, а примерами регуляторных элементов, обеспечивающих экспрессию в эукариотических клетках-хозяевах, являются AOX1 или GAL1 промотор для дрожжей или CMV-, SV40-, RSV-промотор, CMV-энхансер, SV40-энхансер или глобиновый интрон для клеток млекопитающих и других животных.
Помимо элементов, которые ответственны за инициацию транскрипции, такие регуляторные элементы также могут содержать сигналы терминации транскрипции, такие как SV40-поли-A участок или tk-поли-A участок, по ходу транскрипции полинуклеотида. Кроме того, в зависимости от используемой экспрессионной системы к кодирующей последовательности полинуклеотида по изобретению могут быть добавлены лидерные последовательности, которые способны направлять полипептид к клеточному компартменту или его секрецию в среде и хорошо известны в данной области техники. Лидерная последовательность (последовательности) собирается в соответствующую фазу с помощью последовательностей трансляции, инициации и терминации, и предпочтительно лидерная последовательность способна направлять секрецию транслируемого белка или его части в периплазматическое пространство или внеклеточную среду. Гетерологичная последовательность необязательно может кодировать слитый белок, содержащий C- или N-терминальный сигнальный пептид, обеспечивающий желательные характеристики, например, стабилизацию или упрощенную очистку экспрессированного рекомбинантного продукта. В этом контексте в данной области техники известны подходящие векторы экспрессии, например вектор экспрессии кДНК Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen) или pSPORT1 (GIBCO BRL).
Предпочтительно управляющие экспрессией последовательности могут представлять собой эукариотические промоторные системы в векторах, способных к трансформации или трансфекции эукариотической клетки-хозяина, но также могут использоваться управляющие последовательности для прокариотических хозяев. После введения вектора в соответствующего хозяина хозяин содержится в условиях, подходящих для обеспечения высокого уровня экспрессии нуклеотидных последовательностей, и при желании затем возможны сбор и очистка иммуноглобулиновых легких цепей, тяжелых цепей, димеров легкая/тяжелая цепь или интактных антител, связывающих фрагментов или других форм иммуноглобулина; см. Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N.Y., (1979).
Кроме того, настоящее изобретение относится к обычно используемым в генной инженерии векторам, в частности плазмидам, космидам, вирусам и бактериофагам, которые содержат полинуклеотид, кодирующий антиген или предпочтительно вариабельный домен иммуноглобулиновой цепи антитела по изобретению; необязательно в комбинации с полинуклеотидом по изобретению, который кодирует вариабельный домен другой иммуноглобулиновой цепи антитела по изобретению. Предпочтительно указанный вектор представляет собой вектор экспрессии и/или вектор для переноса генов или целевой вектор. Для доставки полинуклеотидов или вектора по изобретению в целевую клеточную популяцию можно использовать векторы экспрессии, полученные из вирусов, таких как ретровирусы, вирус осповакцины, аденоассоциированный вирус, вирусы герпеса или вирус бычьей папилломы. Для создания рекомбинантных вирусных векторов можно использовать способы, известные специалистам в данной области техники; см., например, методы, описанные у Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. и у Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994). В качестве альтернативы полинуклеотиды и векторы по изобретению могут быть реконструированы в липосомы для доставки в целевые клетки. Векторы, содержащие полинуклеотиды по изобретению (например, последовательности, кодирующие тяжелый и/или легкий вариабельный домен (домены) иммуноглобулиновых цепей, и управляющие экспрессией последовательности), могут быть трансфицированы в клетку-хозяина известными способами, которые меняются в зависимости от типа клеточного хозяина. Например, для прокариотических клеток обычно используется трансфекция с использованием хлорида кальция, тогда как для других клеточных хозяев можно использовать обработку фосфатом кальция или электропорацию; см. Sambrook, выше.
Кроме того, настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, трансформированным полинуклеотидом или вектором по изобретению. Указанная клетка-хозяин может быть прокариотической или эукариотической клеткой. Полинуклеотид или вектор по изобретению, находящийся в клетке-хозяине, либо может быть интегрирован в геном клетки-хозяина, либо может поддерживаться экстрахромосомно. Клетка-хозяин может быть любой прокариотической или эукариотической клеткой, такой как бактериальная клетка, клетка насекомого, грибка, растения, животного или человека. Предпочтительные грибковые клетки представляют собой, например, клетки из рода Saccharomyces, в частности клетки вида S. cerevisiae. Термин "прокариотический" означает, что включены все бактерии, которые могут быть трансформированы или трансфицированы с помощью молекул ДНК или РНК для экспрессии антитела по изобретению или соответствующих иммуноглобулиновых цепей. Прокариотические хозяева могут включать грамотрицательные, а также грамположительные бактерии, такие как, например, E.coli, S.typhimurium, Serratia marcescens и Bacillus subtilis. Термин "эукариотический" означает, что включены клетки дрожжей, высших растений, насекомых и, предпочтительно, млекопитающих, наиболее предпочтительно клетки HEK 293, NSO и CHO. В зависимости от хозяина, используемого в процедуре рекомбинантного продуцирования, антитела или иммуноглобулиновые цепи, кодируемые полинуклеотидом по настоящему изобретению, могут быть гликозилированными или могут быть негликозилированными. Антитела по изобретению или соответствующие иммуноглобулиновые цепи также могут включать исходный аминокислотный остаток метионина. Полинуклеотид по изобретению можно использовать для трансформации или трансфекции хозяина с помощью любого способа, хорошо известного специалистам в данной области техники. Кроме того, способы получения слитых, необязательно соединенных генов и их экспрессии, например, в клетках млекопитающих и бактерий, известны в данной области техники (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Описанные там генетические конструкции и способы можно использовать для экспрессии антитела по изобретению или соответствующих иммуноглобулиновых цепей в эукариотических или прокариотических хозяевах. В общем случае в отношении хозяина используются векторы экспрессии, содержащие промоторные последовательности, которые облегчают эффективную транскрипцию введенного полинуклеотида. Вектор экспрессии обычно содержит точку начала репликации, промотор и терминатор, а также специфические гены, которые способны обеспечить фенотипическую селекцию трансформированных клеток. Подходящие исходные клетки для последовательностей ДНК и клетки-хозяева для экспрессии и секреции иммуноглобулина можно получить из многих источников, таких как американская коллекция типов культур (American Type Culture Collection) ("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas", Fifth edition (1985) Rockville, Maryland, USA, включенный в настоящее описание в виде ссылки). Кроме того, для крупномасштабного продуцирования антитела по изобретению можно использовать трансгенных животных, предпочтительно млекопитающих, содержащих клетки по изобретению.
Таким образом, в другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу продуцирования антигена по настоящему изобретению, или антитела или его связывающего фрагмента или иммуноглобулиновой цепи (цепей), где указанный способ включает:
(а) культивирование клетки, как описано выше; и
(b) выделение из культуры указанного антигена, антитела или его связывающего фрагмента или иммуноглобулиновой цепи (цепей).
Трансформированные хозяева могут быть выращены в ферментаторах и культивированы согласно известным в данной области способам для достижения оптимального клеточного роста. После экспрессии целые антитела, их димеры, отдельно легкие и тяжелые цепи или другие формы иммуноглобулина по настоящему изобретению могут быть очищены согласно стандартным процедурам, описанным в данной области техники, включая осаждение сульфатом аммония, аффинную хроматографию, колоночную хроматографию, гель-электрофорез и т.п.; см. Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, NY (1982). Затем антитело или его соответствующая иммуноглобулиновая цепь (цепи) по изобретению может быть выделено из среды роста, клеточных лизатов или фракций клеточных мембран. Выделение и очистка, например, рекомбинантно экспрессированных антител или иммуноглобулиновых цепей по изобретению, могут представлять собой любые обычные средства, такие как, например, разделение при помощи препаративной хроматографии и иммунологическое разделение, такое как разделение с использованием моноклональных или поликлональных антител, направленных, например, против константного участка антитела по изобретению. Для специалиста в данной области техники очевидно, что антитела по изобретению могут быть дополнительно сцеплены с другими агентами, например, для нацеливания лекарственного вещества и применения визуализации. Такое сцепление с участком прикрепления можно выполнить химическим способом после экспрессии антитела или антигена, или продукт сцепления может быть создан в антителе или антигене по изобретению на уровне ДНК. Затем ДНК экспрессируют в подходящей системе хозяина и экспрессированные белки собирают и при необходимости восстанавливают их нативную форму.
Для фармацевтического использования предпочтительными являются по существу чистые иммуноглобулины с по меньшей мере примерно 90%-95% гомогенностью, и наиболее предпочтительными - с 98-99% гомогенностью. Затем, после очистки, частично или до гомогенности, по желанию, антитела можно использовать для терапии (включая экстрокорпоральной) или при разработке и выполнении процедур анализа.
Настоящее изобретение также включает способ получения клеток, способных к экспрессии антитела по изобретению или его иммуноглобулиновую цепь (цепи), включающий получение клеток с полинуклеотидом или вектором по изобретению при помощи генной инженерии. Полученные способом по изобретению клетки можно использовать, например, для оценки взаимодействия антитела по изобретению с его антигеном.
Как упомянуто выше, иммуноглобулин или кодирующие его кДНК могут быть дополнительно модифицированы. Таким образом, в другом варианте осуществления способ по настоящему изобретению включает любой один из этапа (этапов) продуцирования химерного антитела, гуманизированного антитела, одноцепочечного антитела, Fab-фрагмента, биспецифического антитела, слитого антитела, меченого антитела или аналог любого из них. Соответствующие способы известны специалисту в данной области и описаны, например, у Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. При получении производных указанных антител методом фагового дисплея можно использовать поверхностный плазмонный резонанс, используемый в системе BIAcore, для увеличения эффективности фаговых антител, которые связываются с тем же эпитопом, что и любое одно из раскрытых в настоящем описании антител (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). Продуцирование химерных антител описано, например, в международной заявке на патент WO89/09622. Способы продуцирования гуманизированных антител описаны, например, в европейской заявке на патент EP-A1 0239400 и международной заявке WO90/07861. Дополнительные источники антител, предназначенных для использования по настоящему изобретению, представляют собой так называемые ксеногенные антитела. Общий принцип продуцирования ксеногенных антител, таких как человеческие антитела в мышах, описан, например, в международных заявках на патент WO91/10741, WO94/02602, WO96/34096 и WO 96/33735. Как обсуждалось выше, антитело по изобретению может существовать во множестве форм помимо полных антител, включая, например, Fv, Fab и F(ab)2, а также единичные цепи; см., например, международную заявку на патент WO88/09344.
Антитела по настоящему изобретению или их соответствующая иммуноглобулиновая цепь (цепи) могут быть дополнительно модифицированы с помощью обычных способов, известных в данной области техники, например, при помощи известных в данной области делеции (делеций), инсерции (инсерций), замены (замен), добавления (добавлений) и/или перекомбинации (перекомбинаций) и/или любой другой модификации (модификаций) аминокислот, либо по отдельности, либо в комбинации. Способы введения таких модификаций в последовательность ДНК, лежащей в основе аминокислотной последовательности иммуноглобулиновой цепи, известны специалисту в данной области техники; см., например, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) NY и Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY (1994). Модификации антитела по изобретению включают химическую и/или ферментативную дериватизацию одной или нескольких составляющих аминокислот, включая модификации побочных цепей, модификации главной цепи и N- и C-терминальные модификации, в том числе ацилирование, гидроксилирование, метилирование, амидирование и прикрепление углеводородных или липидных фрагментов, кофакторов и т.п. Аналогично настоящее изобретение охватывает продуцирование химерных белков, которые содержат описанное антитело или какой-либо его фрагмент на аминоконце, слитый на карбоксильном конце с гетерологичной молекулой, такой как иммунностимуляторный лиганд; см., например, международную заявку на патент WO00/30680 для уточнения соответствующих технических деталей.
Более того, настоящее изобретение охватывает небольшие пептиды, включая те пептиды, которые содержат связывающую молекулу, как описано выше, например, содержащие участок CDR3 вариабельного участка любого одного из упомянутых антител, в частности CDR3 тяжелой цепи, поскольку часто отмечалось, что тяжелая цепь CDR3 (HCDR3) является участком с большей степенью изменчивости и имеет преобладающее участие в антиген-антитело взаимодействии. Такие пептиды могут быть легко синтезированы или продуцированы с помощью рекомбинантных средств для получения связывающего агента, используемого согласно изобретению. Специалистам в данной области техники известны такие способы. Пептиды могут быть синтезированы, например, с помощью автоматизированных синтезаторов пептидов, которые являются коммерчески доступными. Пептиды могут быть продуцированы рекомбинантными методами путем введения экспрессирующей пептид ДНК в вектор экспрессии и трансформации клетки с помощью этого вектора экспрессии для продуцирования пептида.
Следовательно, настоящее изобретение относится к любой связывающей молекуле, антителу или связывающему фрагменту, которые можно получить согласно вышеописанным средствам и которые проявляют упомянутые свойства, т.е. которые специфично узнают NY-ESO-1, и у которых с целью терапевтического использования предпочтительно сохранена по существу свойственная человеку структура с тем, чтобы исключить иммуногенную реакцию у пациента.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело, его иммуноглобулиновая цепь или связывающий фрагмент или антиген является детектируемо меченным. Метящие агенты могут быть сцеплены либо непосредственно, либо опосредованно с антителами или антигенами по изобретению. Одним из примеров опосредованного сцепления является сцепление с помощью спейсера. Кроме того, антитела по настоящему изобретению могут содержать дополнительный домен, причем указанный домен соединен ковалентными или нековалентными связями. Связывание может быть основано на генетическом слиянии согласно способам, известным в данной области техники и описанным выше, или может быть выполнено, например, с помощью химического поперечного связывания, как описано, например, в международной заявке на патент WO94/04686. Дополнительный домен, находящийся в слитом белке, содержащем антитело по изобретению, предпочтительно может быть связан с помощью гибкого линкера, преимущественно полипептидного линкера, причем указанный полипептидный линкер содержит в длину большое количество гидрофильных связанных в пептид аминокислот, достаточное для того, чтобы охватить расстояние от C-терминального конца указанного дополнительного домена до N-терминального конца антитела по изобретению и наоборот. Терапевтически или диагностически активный агент может быть сцеплен с антителом по изобретению или его антигенсвязывающим фрагментом с помощью различных средств. Такое сцепление включает, например, одноцепочечные слитые белки, содержащие вариабельные участки антитела по изобретению, сцепленные с помощью способов образования ковалентных связей, таких как пептидные связи, с терапевтически или диагностически активным агентом. Дополнительные примеры включают молекулы, которые содержат по меньшей мере антигенсвязывающий фрагмент, ковалентно или нековалентно связанный с дополнительными молекулами, такие молекулы даны в нижеприведенном неограничивающем иллюстративном списке. Traunecker, Int. J. Cancer. SuDP 7 (1992), 51-52, описывает биспецифический реагент Janusin, у которого участок Fv, направленный на CD3, сцеплен с растворимым CD4 или с другими лигандами, такими как OVCA и IL-7. Аналогично вариабельные участки антитела по изобретению могут быть сконструированы в молекулах Fv и сцеплены с альтернативными лигандами, такими как проиллюстрировано в приведенной статье. Higgins, J.Infect Disease 166 (1992), 198-202, описал гетероконъюгированное антитело, составленное из OKT3, поперечно-связанного с антителом, направленным на специфическую последовательность на участке V3 у GP120. Такие гетероконъюгированные антитела также могут быть сконструированы с помощью способов по изобретению с использованием по меньшей мере вариабельных участков, содержащихся в антителе. Дополнительные примеры специфических антител включают антитела, описанные у Fanger, Cancer Treat. Res. 68 (1993), 181-194 и Fanger, Crit. Rev. Immunol. 12 (1992), 101-124. Конъюгаты, которые являются иммунотоксинами, в том числе обычные антитела, широко описаны в данной области техники. Токсины могут быть сцеплены с антителами с помощью обычных способов сцепления, либо иммунотоксины, содержащие части белкового токсина, могут быть продуцированы в виде слитых белков. Для получения таких иммунотоксинов можно соответствующим образом использовать антитела по настоящему изобретению. Иллюстративные примеры таких иммунотоксинов описаны у Byers, Seminars Crll. Biol. 2 (1991), 59-70 и у Fanger, Immunol. Today 12 (1991), 51-54.
Вышеописанный слитый белок также может содержать расщепляемый линкер или расщепляемый протеиназами участок. Эти спейсерные фрагменты, в свою очередь, могут быть либо нерастворимыми, либо растворимыми (Diener et al., Science 231 (1986), 148) и могут быть выбраны для получения возможности освобождения лекарственного вещества от антигена в целевом участке. Примерами используемых в иммунотерапии терапевтических агентов, которые могут быть сцеплены с антителами и антигенами по настоящему изобретению, являются лекарственные вещества, радиоизотопы, лектины и токсины. Лекарственные вещества, с которыми могут быть конъюгированы антитела и антигены по настоящему изобретению, включают соединения, которые относятся к классическим лекарственным веществам, таким как митоцин C, даунорубицин и винбластин. При использовании конъюгированных с радиоизотопами антител или антигенов по изобретению для, например, иммунотерапии опухоли, некоторые изотопы могут быть более предпочтительны по сравнению с другими в зависимости от таких факторов как распределение лейкоцитов, а также стабильность и излучение. В зависимости от аутоиммунного ответа некоторые источники излучения могут быть предпочтительнее других. В общем, в иммунотерапии предпочтительными являются радиоизотопы, испускающие α- и β-частицы. Предпочтительными являются короткий диапазон, высокоэнергетические источники излучения, такие как 212Bi. Примерами радиоизотопов, которые могут быть связаны с антителами или антигенами по изобретению для терапевтических целей, являются 125I,131I, 90Y, 67Cu, 212Bi, 212At, 211Pb, 47Sc, 109Pd и 188Re. Другие терапевтические агенты, которые могут быть связаны с антителом или антигеном по изобретению, а также ex vivo и in vivo терапевтические протоколы, известны или могут быть легко определены специалистами в данной области техники. Везде, где является уместным, специалист в данной области техники может использовать полинуклеотид по изобретению, кодирующий любое одно из вышеописанных антител, антигенов или соответствующих векторов вместо белкового вещества как такового.
Следовательно, относительно биологической активности антитела и связывающего домена, идентифицированных в настоящем описании, предполагается, что они обладают достаточной аффинностью, чтобы быть потенциальными кандидатами для локализации лекарственного вещества в клетках, экспрессирующих соответствующие поверхностные структуры больных клеток и тканей соответственно. Такое нацеливание и связывание с клетками могло бы быть полезным для доставки терапевтически или диагностически активных агентов и генотерапии/доставки генов. Молекулы/частицы с антителом по изобретению могут быть специфически связаны с клетками/тканями, экспрессирующими антиген NY-ESO-1, и, следовательно, могут использоваться для терапии или диагностики. Таким образом, антитело или антиген по настоящему изобретению может быть меченым (например, флуоресцентно, радиоактивно, ферментативно, с помощью ядерно-магнитного резонанса, тяжелого металла) и использоваться для детектирования специфических мишеней in vivo или in vitro, включая "иммунохимию", как анализ in vitro. Их можно использовать in vivo способом, аналогичным методам визуализации в ядерной медицине, для детектирования тканей, клеток или другого материала, экспрессирующего антиген NY-ESO-1. Таким образом, в другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к использованию антитела по настоящему изобретению или его связывающему фрагменту для приготовления композиции для детектирования или нацеливания на опухоль in vivo терапевтического и/или диагностического агента.
Кроме того, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим вышеуказанное антитело или его связывающий фрагмент или антиген по настоящему изобретению или химические производные, или полинуклеотид, вектор или клетку по изобретению. Композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Термин "химическое производное" описывает молекулу, которая содержит дополнительные химические группы, которые обычно не являются частью основной молекулы. Такие группы могут улучшать растворимость, период полураспада, абсорбцию и т.д. основной молекулы. В качестве альтернативы группы могут уменьшать нежелательные побочные эффекты основной молекулы или снижать токсичность основной молекулы. Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать противоопухолевые агенты, такие как интерлейкины или интерфероны, в зависимости от назначения фармацевтической композиции. Следовательно, в конкретном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к использованию антитела или связывающего фрагмента по настоящему изобретению или связывающей молекулы с по существу такой же связывающей специфичностью, антигена, полинуклеотида, вектора или клетки по настоящему изобретению с целью изготовления фармацевтической или диагностической композиции для лечения или профилактики прогрессирования опухоли; для ослабления симптомов, ассоциированных с опухолью; для диагностики или скрининга пациента на наличие опухоли или для определения у пациента риска развития опухоли. Указанная фармацевтическая композиция может быть разработана для введения внутривенно, внутримышечно, подкожно, интраперитонеально, интраназально, парентерально или в виде аэрозоля; см. также ниже.
Следовательно, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики прогрессирования опухоли у пациента, для ослабления симптомов, ассоциированных с опухолью, для диагностики или скрининга субъекта на наличие опухоли или для определения у пациента риска развития опухоли, причем способ включает введение указанному пациенту эффективного количества любого из вышеописанных антител, антигенов, полинуклеотидов, векторов или клеток по настоящему изобретению. В частности, терапевтические и диагностические применения по настоящему изобретению включают меланому и рак молочной железы и являются наиболее подходящими для нацеливания на опухоль, содержащую первичную карциному молочной железы и/или метастазы. Если не указано иное, термины "опухоль", "рак", "карцинома" и т.п. в настоящем описании являются взаимозаменяемыми.
Следовательно, настоящее изобретение охватывает любое использование опухолевой антигенсвязывающей молекулы, содержащей по меньшей мере один CDR вышеописанного человеческого антитела, в частности, для диагностирования и/или лечения связанного с опухолью нарушения. Предпочтительно указанная связывающая молекула представляет собой антитело по настоящему изобретению или его иммуноглобулиновую цепь. Кроме того, настоящее изобретение относится к анти-идиотипическим антителам любого из вышеописанных антител. Они представляют собой антитела или другие связывающие молекулы, которые связываются с уникальной антигенной пептидной последовательностью, расположенной в вариабельном участке антитела рядом с антигенсвязывающим участком.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к диагностической композиции, содержащей любое одно из вышеописанных антител, антигенсвязывающих фрагментов, полинуклеотидов, векторов или клеток по изобретению и необязательно подходящих средств детектирования, таких как реагенты, обычно используемые в способах иммуннодиагностики или диагностики на основе нуклеиновых кислот. Антитела по изобретению являются подходящими, например, для использования в иммуноанализе, при котором они могут быть использованы в жидкой фазе или могут быть связаны с твердофазным носителем. Примерами иммуноанализа, в которых можно использовать антитело по изобретению, являются либо прямой, либо опосредованный, конкурентный и неконкурентный иммуноанализ. Примеры такого иммуноанализа представляют собой радиоиммуноанализ (RIA), сэндвич-анализ (количественный иммуноанализ), поточную цитометрию и вестерн-блот анализ. Антигены и антитела по изобретению могут быть связаны со многими различными носителями и могут использоваться для выделения специфически связанных с ними клеток. Примеры хорошо известных носителей включают стекло, полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, полиэтилен, поликарбонат, декстран, нейлон, амилозу, природную и модифицированную целлюлозу, полиакриламид, агарозу и магнетит. Для целей, предусмотренных изобретением, носители могут быть либо растворимыми, либо нерастворимыми. Существует множество различных меток и способов мечения, известных специалистам в данной области техники. Примеры типов меток, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают ферменты, радиоизотопы, коллоидные металлы, флуоресцентные вещества, хемилюминесцентные вещества и биолюминисцентные вещества; см. также вышеописанные варианты осуществления.
В другом варианте осуществления связывающие антитела по настоящему изобретению также можно использовать в способе диагностики опухоли у пациента путем получения от тестируемого пациента образца жидкости тела, который может представлять собой образец крови, образец лимфы или образец любой другой жидкости тела, и приведения образца жидкости тела в контакт с антителом по настоящему изобретению в условиях, дающих возможность для образования комплексов антитело-антиген. Затем известными в данной области способами определяют уровень образования таких комплексов, причем уровень, значительно превышающий уровень в контрольном образце, указывает на наличие опухоли у тестируемого пациента. Таким же образом также можно использовать специфический антиген, связанный с антителами по изобретению. Таким образом, настоящее изобретение относится к иммуноанализу in vitro, содержащему антитело или антиген по изобретению. Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к определению рака, меланомы и, в частности, рака молочной железы. Способы включают анализ на NY-ESO-1.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу определения статуса ракового состояния, например регрессии, прогрессирования развития рака у пациента с опухолью, экспрессирующей опухолевый (ассоциированный) антиген NY-ESO-1, при этом способ включает анализ образца, взятого у указанного пациента, на антитела, которые специфически связываются с указанным антигеном, и сравнение полученного значения с предшествующим значением, полученным после анализа предшествующего образца, взятого у указанного пациента; причем любое различие между этими значениями является показателем изменения статуса указанного ракового состояния. Соответствующий способ, который можно использовать по настоящему изобретению, раскрыт в международной заявке на патент WO01/07917. В качестве альтернативы такой способ может быть выполнен с антителом по настоящему изобретению.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу определения раковых клеток, например клеток рака молочной железы в образце, при этом способ содержит анализ указанного образца относительно экспрессии NY-ESO-1 путем анализа на наличие белка NY-ESO-1 с помощью антитела по настоящему изобретению, при этом экспрессия NY-ESO-1 является показателем наличия раковых клеток в указанном образце. Подобный способ, который может быть адаптирован согласно настоящему изобретению, описан в патенте США № 6338947 для SCP-1, NY-ESO-1 и SSX-2.
В этом контексте настоящее изобретение также относится к специально разработанным для этой цели средствам. Например, можно использовать белковые или антительные чипы, в которых находятся, например, либо антигены по настоящему изобретению для детектирования аутоантител, которые могут быть у пациентов с опухолью, в частности метастазами, либо антитела или эквивалентные антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению. Разработка иммуноанализа на основе микрочипов кратко описана у Kusnezow et al., Mol. Cell Proteomics 5 (2006), 1681-1696. Следовательно, настоящее изобретение также относится к микрочипам, загруженным антителом или антигеном по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение также предоставляет соответственно фармацевтический и диагностический комплект или набор, содержащий один или несколько контейнеров, заполненных одним или несколькими вышеописанными компонентами, т.е. антителом или его связывающим фрагментом, антигеном, полинуклеотидом, вектором или клеткой по настоящему изобретению. Вместе с таким контейнером (контейнерами) может находиться уведомление, имеющее форму, установленную правительственным агентством, регулирующим производство, использование или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, причем в данном уведомлении отражено одобрение по производству, использованию или продаже для применения человеком. Дополнительно или в качестве альтернативы набор содержит реагенты и/или инструкции по использованию в соответствующем диагностическом анализе. Композиция, т.е. набор по настоящему изобретению, естественно, является особенно подходящим для диагностики, профилактики и лечения нарушения, которое связано с наличием опухоль-ассоциированного антигена NY-ESO, в частности, данный набор применим для лечения опухолей, как упомянуто выше.
Термины "лечение", "лечащий" и т.п., используемые в настоящем описании, в общем означают получение желательного фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим в терминах предотвращения заболевания или проявления его симптомов полностью или частично и/или может быть терапевтическим в терминах частичного или полного излечения болезни и/или подавления отрицательного воздействия, свойственного заболеванию. В настоящем описании термин "лечение" охватывает любое лечение заболевания у млекопитающего, в частности человека, и включает: (a) предупреждение возникновения заболевания у субъекта, который может быть предрасположен к данному заболеванию, но еще не диагностирован, как имеющий данное заболевание; (b) подавление развития заболевания, т.е. задержка его развития; или (c) ослабление заболевания, т.е. регрессия заболевания. Кроме того, термин "субъект" или "пациент" относится к млекопитающему, предпочтительно человеку, нуждающемуся в лечении состояния, нарушения или заболевания.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть приготовлены согласно способам, известным в данной области техники; см., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) by the University of Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683-306472. Примеры подходящих фармацевтических носителей известны в данной области техники и включают забуференные фосфатом солевые растворы, воду, эмульсии, такие как эмульсии масло/вода, различные типы увлажняющих агентов, стерильные растворы и т.д. Композиции, содержащие такие носители, могут быть составлены обычными хорошо известными способами. Пациенту можно вводить подходящую дозу этих фармацевтических композиций. Введение подходящих композиций можно выполнять различными способами, например внутривенно, интраперитонеально, подкожно, внутримышечно, локально или внутрикожно. Составы аэрозоля, такие как составы назального спрея, включают очищенные водные или другие растворы активного агента с консервантами и изотоническими агентами. В таких составах предпочтительно регулируют pH и изотоническое состояние таким образом, чтобы оно было совместимо со слизистой носа. Составы для ректального или вагинального введения могут быть представлены в виде свечи с подходящим носителем.
Режим дозирования определяется лечащим врачом и клиническими факторами. Как известно в области медицины, подбор дозы для любого пациента зависит от многих факторов, включая размер пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное вводимое соединение, пол, время и способ введения, общее состояние здоровья и одновременно вводимые другие лекарственные вещества. Обычная доза может находиться, например, в диапазоне от 0,001 до 1000 мкг (либо нуклеиновой кислоты для осуществления экспрессии, либо для подавления экспрессии в данном диапазоне); однако предполагаются дозы ниже или выше приведенного в качестве примера данного диапазона, особенно учитывая вышеупомянутые факторы. Как правило, при регулярном введении фармацевтической композиции режим дозирования должен находиться в диапазоне от 1 мкг до 10 мг в сутки. При непрерывной инфузии режим дозирования также должен находиться в диапазоне от 1 мкг до 10 мг на килограмм веса тела в минуту соответственно. Улучшение можно отслеживать с помощью проведения периодических тестов. Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примеры неводных растворителей представляют собой пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые сложные органические эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, растворы спирт/вода, эмульсии или суспензии, включая солевой раствор и забуференные среды. Носители для парентерального введения включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактированный раствор Рингера или фиксированные масла. Носители для внутривенного введения включают жидкость и питательные добавки, электролитные растворы (такие как раствор на основе декстрозы Рингера) и т.п. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например антимикробные агенты, антиоксиданты, хелатирующие агенты и инертные газы и т.п. Кроме того, фармацевтическая композиция по изобретению может содержать дополнительные агенты, такие как противоопухолевые агенты и цитостатические средства, в зависимости от назначения фармацевтической композиции. Кроме того, фармацевтическая композиция также может быть составлена в виде вакцины, например, если фармацевтическая композиция по изобретению содержит антитело по настоящему изобретению для пассивной иммунизации или родственный антиген для активной иммунизации. Составы вакцины для лечения рака, использующие опухоль-ассоциированные антигены, такие как NY-ESO-1, описаны, например, в международной заявке на патент WO2005/105139. Кроме того, может быть желательным совместное или последовательное введение других агентов.
Терапевтически эффективная доза или количество относится к количеству активного компонента, достаточному для ослабления симптомов или улучшения состояния. Терапевтическая эффективность и токсичность таких соединений может быть определена с помощью стандартных фармацевтических процедур в клеточных культурах или на экспериментальных животных, например, ED50 (терапевтически эффективная доза для 50% населения) и LD50 (смертельная доза для 50% населения). Отношение терапевтически эффективной дозы к дозе с токсическим эффектом представляет собой терапевтический индекс и может быть выражен в виде отношения LD50/ED50.
Предпочтительно терапевтический агент в композиции присутствует в количестве, достаточном для предупреждения метастазов и роста неопластических клеток.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению предпочтительно можно использовать для лечения опухолей и рака, включая, без ограничения, меланому, первичный рак молочной железы, гепатоцеллюлярную карциному и метастазы.
Эти и другие варианты осуществления раскрыты и охвачены описанием и примерами настоящего изобретения. Дополнительную литературу относительно любого одного из материалов, способов, применений и соединений, предназначенных для использования по настоящему изобретению, можно найти в публичных библиотеках и базах данных, используя, например, электронные устройства. Например, может быть использована находящаяся в общем доступе база данных "Medline", которая предоставлена национальным информационным центром по биотехнологии (National Center for Biotechnology Information) и/или национальной библиотекой по медицине при национальных институтах здоровья (National Library of Medicine at the National Institutes of Health). Другие базы данных и веб-адреса, такие как европейский институт биоинформатики (European Bioinformatics Institute) (EBI), который является частью европейской лаборатории по молекулярной биологии (European Molecular Biology Laboratory) (EMBL), известны специалистам в данной области и также могут быть получены с помощью поисковых систем Интернета. Обзор патентной информации по биотехнологии и оценка соответствующих источников патентной информации, полезных для ретроспективного поиска и понимания текущего состояния, приведен у Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.
Вышеупомянутое раскрытие, в общем, описывает настоящее изобретение. Если не указано иное, для термина, как он используется в настоящем описании, приведено определение, предусмотренное Оксфордским Словарем по Биохимии и Молекулярной Биологии (Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology), Oxford University Press, 1997, revised 2000 and reprinted 2003, ISBN 0 19 850673 2. В тексте настоящего описания приведены ссылки на некоторые из документов. Полные библиографические данные можно найти в конце описания, сразу перед формулой изобретения. Содержание всех приведенных источников (включая литературные ссылки, изданные патенты, опубликованные заявки на патент, приведенные в виде ссылки в данной заявке, и описания, инструкции изготовителя и т.д.) включены в данное описание в виде ссылки; однако это не следует рассматривать как признание того, что любой приведенный в виде ссылки документ действительно является предшествующим уровнем техники по отношению к настоящему изобретению.
Более полное понимание можно получить благодаря нижеприведенным примерам, которые включены в настоящее описание только с целью иллюстрации, а не ограничения объема настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
Изобретение проиллюстрировано в нижеприведенных примерах, которые не следует рассматривать как ограничивающие каким-либо образом объем изобретения. Подробное описание обычных способов, используемых в настоящем описании, могут быть найдены в приведенной в ссылках литературе; см. также "The Merck Manual of Diagnosis and Therapy" Seventeenth Ed. ed by Beers and Berkow (Merck & Co., 2003 Inc.).
При применении настоящего изобретения на практике были использованы, если не указано иное, обычные методы клеточной биологии, культуры клеток, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, которые хорошо известны специалисту в данной области. Для дальнейшей разработки общих методов, используемых при применении настоящего изобретения на практике, можно обратиться к стандартным учебникам и обзорам по клеточной биологии и культуре тканей; см. также ссылки, приведенные в примерах. Общие способы, применяемые в молекулярной и клеточной биохимии, могут быть найдены в таких стандартных учебниках как: Molecular Cloning: A laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); DNA Cloning, Volumes I and II (Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (Hames and Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (Freshney and Alan, Liss, Inc., 1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller and Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (Ausubel et al., eds.); and Recombinant DNA Methodology (Wu, ed., Academic Press). Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller and Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al., eds.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (Weir and Blackwell, eds., 1986). Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Non-viral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplitt & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (Lefkovits ed., Academic Press 1997); and Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998). Реагенты, векторы клонирования и наборы для генетической манипуляции, указанные в настоящем описании, можно приобрести у поставщиков, таких как BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich и ClonTech. Обычные методы по сбору клеточных культур и сред приведены в Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8 (1997), 148); Serum-free Media (Kitano, Biotechnology 17 (1991), 73); Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991), 375); and Suspension Culture of Mammalian Cells (Birch et al., Bioprocess Technol. 19 (1990), 251); Extracting information from cDNA arrays, Herzel et al., CHAOS 11 (2001), 98-107.
Дополнительные способы
Материал пациента
Опухолевый материал, а также нормальную ткань замораживали в жидком азоте без проведения обычного гистологического анализа. Сыворотку и кровь для выделения B-клеток памяти получали от пациента С1 в соответствии с согласием, основанным на полученной информации, которое одобрено местным комитетом по этике и подписано пациентом.
Культура B-клеток памяти
B-клетки памяти выделяли из человеческих лимфоцитов периферической крови с помощью двухстадийной процедуры селекции. Для положительной селекции B-клеток с помощью метода MACS (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany) использовали маркер CD22 для пан-B-клеток. PBL метили, используя MACS-конъюгированные mAb против человеческого CD22, фикоэритрин-конъюгированные mAb против человеческого IgD и APC-конъюгированные антитела против человеческих IgM, IgA, CD3, CD8, CD56 (Becton Dickinson, Basel, Switzerland). Пан-B-клетки выделяли с помощью положительной селекции CD22-положительной клетки, используя устройство midi MACS и колонки LS (Miltenyi), затем проводили селекцию фикоэритрин- и APC-отрицательных клеток, используя сортер клеток MoFlo (DakoCytomation, Fort Collins, USA). После этого CD22-положительные IgM-, IgD-, IgA-отрицательные B-клетки инкубировали с EBV, содержащим супернатант, полученный из клеток B95-8 в присутствии CpG 2006 (6, 15), в B-клеточной среде, содержащей RPMI 1640, дополненную 10% эмбриональной телячьей сывороткой. Клетки высевали по 50 клеток на лунку в B-клеточной среде на 30000 облученных фидерных PBL, полученных от добровольных доноров.
Через 2 недели культивирования кондиционированную среду культуры B-клеток памяти сканировали на наличие NY-ESO-1-специфических антител методом ELISA и на срезах NY-ESO-1-положительных аутологичных и неаутологичных тканей.
ELISA
96-луночные микропланшеты (Corning, NY, USA) покрывали 1 мкг/мл рекомбинантным белком NY-ESO-1 в PBS в количестве 25 мкл на лунку в течение ночи при 4°C. Планшеты промывали PBS-T и блокировали в течение ночи при 4°C с помощью PBS, содержащим 5% молочный порошок (Rapilait, Migros, Switzerland). Кондиционированную B-клеточную среду, сыворотку пациента и препараты рекомбинантных антител инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Связывание человеческих антител с NY-ESO-1 определяли с помощью вторичных ослиных анти-человеческих IgG-HRP антител (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Cambridgeshire, UK) с последующим измерением активности HRP, используя раствор TMB субстрата (TMB, Sigma, Buchs, Switzerland).
ELISA эпитопное картирование
20-мерные пептиды, охватывающие весь белок NY-ESO-1 с перекрытиями 10aa, общими для смежных пептидов (Peptides & Elephants, Nuthetal, Germany), использовали для покрытия планшет Maxisorp ELISA (Nunc, Rochester, NY). Человеческое рекомбинантное антитело Manhattan или сыворотку пациента (растворенную в PBS 1:500) детектировали, используя конъюгированный с пероксидазой хрена козлиный анти-человеческий IgG+IgM (Jackson ImmunoResearch).
Конкурентный ELISA
В экспериментах по насыщению была установлена полумаксимальная концентрация, характерная для связывания человеческого моноклонального антитела Manhattan с пептидом NY-ESO-111-30, равная 1x10-9 М или 0,15 мкг/мл. В экспериментах по конкуренции увеличивающиеся концентрации пептида NY-ESO-111-30 смешивали с Manhattan с концентрацией 0,15 мкг/мл и затем смесь переносили на покрытые NY-ESO-111-30 планшеты ELISA.
Иммуногистохимия
Цилиндры опухолевых тканей, имеющих размеры 0,6 мм в диаметре, получали выдавливанием из залитой парафином NY-ESO-1-положительной опухолевой ткани и здоровой контрольной ткани. Пары, образованные из цилиндров опухолевой ткани и здоровой контрольной ткани, помещали в каждую позицию сетки 2x4, размеры которой были совместимы с форматом микротитровальных планшетов с B-клеточной культурой и обычных многоканальных пипеток.
Иммуногистохимию выполняли на фиксированной формалином, залитой парафином ткани. Антиген на всех предметных стеклах выявляли путем нагревания. Неспецифическую флуоресценцию блокировали с помощью многоклональных кроличьих анти-человеческих IgG (Dako, Baar, Switzerland) в течение 30 минут при комнатной температуре, затем второй раз блокировали 1% обезжиренным молоком в течение 10 мин (Rapilait, Migros, Switzerland). Первичное антитело или кондиционированную B-клеточную среду инкубировали в течение ночи при 4°C. Связывание человеческих антител с NY-ESO-1 выявляли с помощью Cy3-конъюгированных вторичных антител к человеческому IgG (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Soham, UK). Окрашивание биотинилированного рекомбинантного человеческого антитела Manhattan выявляли с помощью Cy3- или HRP-конъюгированного стрептавидина (Sigma, Buchs, Switzerland). В качестве положительного контроля на наличие антигена NY-ESO-1 использовали мышиное моноклональное антитело к NY-ESO-1 (Zymed, South, San Francisco, USA).
Анализ иммунофлуоресценции выполняли на инвертированном флюоресцентном микроскопе (Leica, Heerbrugg, Switzerland).
Одноклеточная РТ-ПЦР
Единичные клетки, полученные из культуры B-клеток памяти, помещали в ПЦР трубки. Подготовили кДНК, используя праймеры, специфичные для константных участков тяжелой, κ-легкой и γ-легкой цепей иммуноглобулина G. ПЦР амплификацию вариабельных участков иммуноглобулиновых тяжелой и легкой цепей выполняли согласно стандартным протокам (7, 16). Вариабельные участки иммуноглобулиновых тяжелой и легкой цепей амплифицировали, используя метод полугнездовой ПЦР. Первый раунд ПЦР выполняли с праймерами, специфичными для константного участка IgG и пулами праймеров, специфичных для участков консервативной структуры 1 семейства вариабельных участков тяжелой и легкой цепей Ig (7). Затем использовали полугнездовую ПЦР с гнездовыми праймерами, специфичными для константного участка IgG, и праймерами, специфичными для структуры 1 семейства вариабельных участков тяжелой и легкой цепей Ig, которые содержали сайты рестрикции, как описано (8). Продукты ПЦР тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина клонировали в векторы, содержащие константные участки IgG1, IgKappa или IgLambda.
Получение и очистка антител
Человеческие эмбриональные почечные клетки 293-T культивировали в DMEM с добавлением 10% FCS со сверхнизким содержанием IgG, 1% раствора пенициллин-стрептомицина и 1% раствора L-глутамина (Invitrogen, Basel, Switzerland). Котрансфекцию тяжелой и легкой цепями иммуноглобулина, кодирующими плазмидную ДНК, выполняли стандартным способом преципитации фосфатом кальция. Затем клетки культивировали в D-МЕМ (без сыворотки) с добавлением 1% Nutridoma SP (Roche, Rotkreuz, Switzerland). Супернатанты собирали через 8 дней культивирования и IgG очищали на колонке G протеина (Amersham Biosciences, Upsala, Sweden) с помощью быстрой жидкостной хроматографии протеинов (FPLC) (Amersham Biosciences, Upsala, Sweden). Очищенное антитело Manhatten биотинилировали, следуя указаниям инструкции изготовителя (SIGMA, Buchs, Switzerland).
Иммунофлуоресцентный анализ опухолевых клеток SK-MEL-37
Клетки SK-MEL-37 выращивали на предметном стекле микроскопа, фиксировали формальдегидом и пермеабилизовали 1% Тритоном X-100 в течение 10 минут при комнатной температуре. После блокирования 10% козьей сывороткой в течение 1 ч при комнатной температуре клетки инкубировали с Manhatten с концентрацией 1 мкг/мл или отрицательными контрольными антителами (hu8-18c5 (17) экспрессировали в виде рекомбинантов с человеческой Fc областью) в PBS с добавлением 1% козьей сыворотки и 0,2% Тритон X-100 в течение ночи при 4°С. Связанные антитела визуализировали окрашиванием, используя козьи анти-человеческие IgG Alexa Fluor® 546 (1:300, Molecular Probes, Leiden, Netherland) в течение 1 ч при комнатной температуре. Микроскопический анализ выполняли с помощью микроскопа Leica SP 5.
Пример 1: Идентификация NY-ESO-1-специфических B-клеток из PBL меланомы пациента
Меланому пациента отбирали с помощью титра сывороточных антител к taa NY-ESO-1 в ELISA и на срезах аутологичных лимфоузлов, полученных при биопсии. После вакцинации рекомбинантным вакцинным вирусом, экспрессирующим NY-ESO-1 полной длины, наблюдали частичный клинический ответ, продемонстрированный регрессией двух NY-ESO-1-положительных метастазов в печени. У пациента брали 50 мл периферической крови, выделяли и культивировали поверхностные B-клетки, отрицательные как в отношении IgM, так и IgD, представляющие собой Ig-переключенные B-клетки памяти после иммортализации с помощью модифицированного протокола трансформации вируса Epstein Bar (6). 100000 B-клеток памяти получали и засевали в 96-луночные микротитровальные планшеты по 50 клеток на лунку. Через 3 недели культивирования в лунках с культурой наблюдали выращенные клоны. Кондиционированную B-клеточными культурами среду исследовали на наличие антител, специфических к NY-ESO-1. В качестве первого скрининга выполняли ELISA с использованием рекомбинантного NY-ESO-1 полной длины в качестве антигена. Сигналы ELISA считали положительными, если они превышали фоновый сигнал в три раза. Из 2000 лунок идентифицировали 9 лунок с ELISA-положительными культурами B-клеток памяти. Пример отношения сигнала к шуму, полученный с помощью ELISA, изображен на фиг.1A. Затем ELISA-положительные культуры анализировали с помощью иммуногистохимии, используя NY-ESO-1-положительную опухолевую ткань. Установка для скрининга тканей состояла из 8 пар палочек тканей NY-ESO-1-положительных опухолей молочной железы и здоровой ткани молочной железы в качестве контроля, расположенных на предметных стеклах. Благодаря значительно уменьшенным размерам, используемым в этом анализе, для его проведения было достаточно 15 мкл кондиционированной B-клеточной среды. Возможность сравнивать кондиционированную среду нескольких культур B-клеток памяти с отрицательными контролями на одном предметном стекле облегчала проведение оценки флуоресцентного окрашивания.
В результате оценки 9-ти ELISA-положительных B-клеточных культур в данном анализе тканей идентифицировали одну культуру, которая имела более высокую интенсивность окраски по сравнению с окраской других 8 культур. Это показано на фиг.1B, где дается сравнение иммунофлуоресценции, полученной для реагирующей с тканью культуры 12D7, с иммунофлуоресценцией, полученной для лунки 9D1, которая была отнесена к нереагирующей с тканью.
Поскольку информация о реакции IgG-подкласса на NY-ESO-1-специфическое антитело была потеряна на этапе молекулярного клонирования, она была определена на данном этапе с помощью иммуногистохимии с использованием срезов NY-ESO-1-положительной ткани в комбинации с подкласс-специфическими вторичными антителами к человеческим IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Как показано на фиг.1C, окрашивание ткани для NY-ESO-1 наблюдается только со вторичным антителом к IgG1.
Пример 2: Молекулярное клонирование NY-ESO-1-специфического антитела, секретируемого культивированными B-клетками памяти
Предыдущие попытки клеточного клонирования идентифицированных антиген-специфических EBV-трансформированных человеческих B-клеток памяти не были успешными. Поэтому согласно настоящему изобретению была использована стратегия молекулярного клонирования, основанная на РТ-ПЦР единичных отсортированных клеток, взятых из лунки 12D7, для выделения клона антител, обуславливающего вышеописанный паттерн окраски. Были взяты 32 клетки и помещены в виде единичных клеток непосредственно в ПЦР трубки.
После синтеза кДНК вариабельные участки тяжелой и легкой цепей человеческого иммуноглобулина амплифицировали, используя гнездовую ПЦР (7). С помощью 16 из 32 отсортированных клеток были получены последовательности тяжелой и каппа-легкой цепей. Для последовательностей вариабельных участков лямбда легкой цепи не был получен продукт ПЦР ни с одной из клеток. В результате анализа последовательностей было идентифицировано 4 разных клона антител, которые были пронумерованы согласно их относительной численности. Клон 1 был обнаружен в восьми из 16 клеток, клон 2 - в четырех клетках, и каждый из клонов 3 и 4 - в двух клетках.
Затем определяли, дал ли один из этих четырех клонов, при экспрессии в виде рекомбинантного антитела, аналогичное NY-ESO-1 окрашивание, которое наблюдалось в кондиционированной среде из лунки 12D7 с B-клеточной культурой. Для этого последовательности вариабельных участков тяжелой и легкой цепей клонировали в векторы экспрессии антитела, которые обеспечивали константные участки тяжелой цепи и каппа легкой цепи человеческого IgG1 (8). Использовали константные участки IgG1, поскольку было определено, что NY-ESO-1-специфическое антитело, идентифицированное в кондиционированной среде лунки 12D7, относится к этому подклассу (фиг.1C).
Функциональный анализ четырех клонов выполняли с помощью повторного скрининга рекомбинантных антител методом ELISA и на срезах NY-ESO-1-положительной ткани. Для этого векторы экспрессии тяжелой цепи и соответствующей легкой цепи четырех клонов были трансфицированы в клетки 293 HEK, и супернатантную жидкость трансфицированных клеток анализировали непосредственно с помощью ELISA и иммуногистохимии. Все четыре супернатантные жидкости продуцировали функциональный IgG1, как показано с помощью анти-человеческого-IgG-ELISA. Хотя в ELISA клоны 1-3 не показали никакого связывания с NY-ESO-1, клон номер 4 был положительным вплоть до последнего тестового разбавления (1/100) (фиг.2A). Этот клон также показал специфическое окрашивание на иммуногистохимии с использованием срезов NY-ESO-1-положительной ткани (фиг.2B).
Этот факт послужил основой для подтверждения того, что была выделена последовательность вариабельных участков иммуноглобулина исходного NY-ESO-1-специфического антитела в том виде, в каком он встречается у пациента. Для простоты клон 12D7 № 4 был назван "Manhattan" и использован для дальнейшей характеристики с помощью очищенного материала G белка, полученного из временно трансфицированных клеток HEK.
Пример 3: NY-ESO-1-специфическое моноклональное человеческое антитело Manhattan связывается с пептидом NY-ESO-111-30 с KD, равным 10-10
Для идентификации эпитопа узнаваемого Manhattan выполняли NY-ESO-1 ELISA, используя перекрывающиеся пептиды, полностью охватывающие белок NY-ESO-1. Как показано на фиг.3A, Manhattan связывается с пептидом, представляющим 11-30 аминокислоты белка NY-ESO-1, но не с двумя смежными пептидами, которые охватывают 1-20 или 21-40 аминокислоты. Предполагается, что эпитоп, узнаваемый Manhattan, находится в месте соединении этих двух пептидов около 20-ой аминокислоты NY-ESO-1. Антитела, находящиеся в сыворотке пациента С1, также узнавали этот эпитоп среди прочих (фиг.3B).
Авидность Manhattan определяли конкурентным ELISA, используя увеличивающиеся концентрации растворимого пептида NY-ESO-111-30 для получения конкуренции за связанный с пластиной пептид. Как показано на фиг.3C, константа равновесной диссоциации связывания антигена (KD) для взаимодействия Manhattan с его родственным пептидом была ниже наномолярного диапазона.
В качестве заключительного теста, использованного при характеристике человеческого моноклонального антитела Manhattan, выполняли иммунофлуоресцентный анализ NY-ESO-1-положительной клеточной линии SK-MEL-37 (9). Окрашивание этой клеточной линии с помощью Manhattan привело к ядерному сигналу, который был локализован совместно с окрашиванием, полученным с помощью ядерного красителя Hoechst.
Заключение
Вышеописанные эксперименты предоставляют общий способ идентификации и молекулярного клонирования антител непосредственно из лимфоцитов периферической крови (PBL) человека. Способ по настоящему изобретению может быть подтвержден выделением из страдающего меланомой пациента человеческого моноклонального антитела к опухоль-ассоциированному антигену NY-ESO-1. Начиная со скрининга антител, секретируемых культурами иммортализованных человеческих B-клеток памяти с непродолжительным сроком жизни, были идентифицированы культуры, которые были положительны в ELISA и в иммуногистохимии на срезах NY-ESO-1-положительной ткани. После такого первичного скрининга следовал этап молекулярного клонирования, целью которого была идентификация и выделение одного клона B-клеток, который секретировал антитело, детектированное в первичном скрининге. Наличие только 4 различных клонов в лунке 12D7, как было обнаружено в результате анализа последовательности после одноклеточной РТ ПЦР, предполагает, что изначально из 50 засеянных клеток только немногие были иммортализованы и выжили.
В результате последующего вторичного сканирования рекомбинантных антител-кандидатов было идентифицировано единственное моноклональное антитело с идентичным исходному антителу паттерном окрашивания, которое было продуцировано культивированными B-клетками памяти, полученными от PBL пациента. Таким образом, можно успешно выделить антитело в том исходном виде, как оно встречается у пациента. Это антитело, названное "Manhattan", узнает N-терминальный эпитоп в районе 20-ой аминокислоты, которая является общей для NY-ESO-1 и taa LAGE-1 (9). Этот эпитоп также узнается сывороткой пациента С1, подтверждающей название Manhattan, как являющегося подлинной копией антитела, которое встречается у пациента.
Поскольку на сегодняшний день Manhattan является первым человеческим моноклональным антителом к NY-ESO-1, он также может быть первым выделенным у пациента антителом с зрелой аффинностью к опухолевому антигену и taa соответственно.
Этот новый способ по настоящему изобретению обходит некоторые трудности, свойственные EBV-трансформации B-клеток, такие как генетическая нестабильность и плохая эффективность клонирования (6, 10). Хотя в предыдущем исследовании (6) было успешно осуществлено выделение человеческих моноклональных антител из EBV-иммортализованных B-клеток памяти, следует упомянуть о том, что и ранее до вышеописанного способа по настоящему изобретению неудачно предпринимались попытки по выделению NY-ESO-1-специфических антител от такого же пациента с использованием EBV-трансформации и метода клеточного клонирования, несмотря на значительное количество культур B-клеток памяти, идентифицированных с помощью клеточного скрининга.
Вторым объектом настоящего изобретения является выделение антитела к реагирующему с тканью опухоль-ассоциированному антигену NY-ESO-1. Это было мотивировано обнаружением того, что сыворотка пациента содержала антитела, которые реагировали с NY-ESO-1-положительной аутологичной тканью, взятой при биопсии. Для этой цели метод микрочипов был адаптирован для скрининга культур B-клеток памяти. Это имело несколько преимуществ по сравнению с классическими способами иммуногистохимии. Во-первых, доступность на одном предметном стекле нескольких реплик-позиций, что позволяет произвести оценку и сравнение нескольких образцов. Во-вторых, возможность размещения положительной ткани рядом с отрицательной тканью значительно улучшает чувствительность анализа, признак которого является крайне важным, поскольку инкубация с кондиционированной средой культуры B-клеток памяти часто давала очень слабое окрашивание. В-третьих, при таком значительно уменьшенном формате анализа необходимо намного меньшее количество кондиционированной среды, что также является важным фактором, поскольку общий культуральный объем культур B-клеток памяти был меньше 200 мкл.
Обнаружение того, что сыворотка пациента и человеческое моноклональное антитело Manhattan узнает срезы фиксированной ткани, может не соответствовать ситуации in vivo по меньшей мере относительно непосредственной терапевтической роли посредством индукции антитела, индуцируемого механизмом иммунного эффектора, действующим на клеточном уровне, для очистки NY-ESO-1-положительных клеток. NY-ESO-1 был описан как внутриклеточный антиген (11), и в этом исследовании было показано, что он локализован в ядре, по меньшей мере для клеточной линии SK-Me-37. В этом контексте поверхностное окрашивание живых SK-Me-37 с помощью биотинилированных Manhattan было отрицательным.
Выделение Manhattan является основным этапом для оценки терапевтического значения опухолеспецифических антител, полученных от пациента. Имеется несколько возможных сценариев, согласно которым такое антитело могло бы опосредовать терапевтические эффекты. Во-первых, оно может служить в качестве адъюванта для будущих протоколов производства вакцины. Иммунные комплексы, образуемые при совместном введении Manhattan и NY-ESO-1, могут привести к увеличенной индукции клеточного иммунного ответа (12).
Вторая возможность относится к патофизиологической роли этого класса антител у пациентов с опухолью. NY-ESO-1 часто индуцирует гуморальный ответ, который коррелирует с плохим прогнозом для пациента (13). Хотя это может быть простой корреляцией из-за увеличенного количества антигена в результате роста опухоли, также может быть вероятной толерогенная роль такого B-клеточного ответа. Согласно этому сценарию свободный антиген, секретируемый некротическими или апоптическими клетками опухоли, может индуцировать сильный B-клеточный ответ, затем B-клетки могут представить антиген как результат Fc-рецептор-опосредованного захвата иммунных комплексов (14). Поскольку B-клетки могут быть бедны APC, это представление может привести к индукции толерантности NY-ESO-1-реактивных T-клеток и таким образом предотвратить отторжение опухоли. Введение рекомбинантных Manhattan F(ab) на ранней стадии прогрессирования опухоли может нарушить захват антигена B-клетками, так как F(ab) не связаны Fc-рецепторами, которые все еще могут захватывать антиген. Это, в свою очередь, может предотвратить индукцию толерантности в отношении NY-ESO-1-специфических T-клеток.
ССЫЛКИ
Claims (20)
1. Антитело человека, гуманизированное антитело, антитело мыши, ксеногенное или химерное антитело человек-мышь или его связывающий фрагмент, которое способно узнавать опухоль-ассоциированный антиген NY-ESO-1, содержащее CDR1 с последовательностью SEQ ID NO:5, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO:6 и CDR3 с последовательностью SEQ ID NO:7 в вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 с последовательностью SEQ ID NO:8, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO:9 и CDR3 с последовательностью SEQ ID NO:10 в вариабельной области легкой цепи, или CDR2 и CDR3, которые отличаются одной, двумя или тремя аминокислотами от последовательностей SEQ ID NO:6, 7, 9 или 10.
2. Антитело или связывающий фрагмент по п.1, которое связывается с эпитопом, определенным аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO:11.
3. Антитело или связывающий фрагмент по п.1, выбранное из группы, состоящей из одноцепочечного фрагмента Fv (scFv), фрагмента F(ab′), фрагмента F(ab) и фрагмента F(ab′)2.
4. Антитело или связывающий фрагмент по п.1, содержащее аминокислотную последовательность участка VH (SEQ ID NO:2) и VL (SEQ ID NO:4), как изображено на фиг.4.
5. Антитело или связывающий фрагмент по п.1, имеющее аффинность связывания, равную по меньшей мере примерно 10-9 М.
6. Полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере вариабельный участок иммуноглобулиновой цепи антитела или связывающий фрагмент по любому из пп.1-5.
7. Вектор для переноса и/или экспрессии полинуклеотида, кодирующего по меньшей мере вариабельную область иммуноглобулиновой цепи антитела или связывающий фрагмент по любому из пп.1-5, содержащий полинуклеотид по п.6, необязательно в комбинации с полинуклеотидом по п.6, который кодирует вариабельный участок другой иммуноглобулиновой цепи указанного антитела.
8. Клетка-хозяин для получения антитела или связывающего фрагмента по любому из пп.1-5, содержащая полинуклеотид по п.6 или вектор по п.7.
9. Способ получения антитела или его связывающего фрагмента или иммуноглобулиновой цепи (цепей), где указанный способ включает:
(a) культивирование клетки по п.8; и
(b) выделение из культуры указанного антитела или его связывающего фрагмента или иммуноглобулиновой цепи (цепей).
(a) культивирование клетки по п.8; и
(b) выделение из культуры указанного антитела или его связывающего фрагмента или иммуноглобулиновой цепи (цепей).
10. Антитело человека, гуманизированное антитело, антитело мыши, ксеногенное или химерное антитело человек-мышь или его связывающий фрагмент, которое способно узнавать опухоль-ассоциированный антиген NY-ESO-1 и которое является детектируемо меченым, содержащее CDR1 с последовательностью SEQ ID NO:5, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO:6 и CDR3 с последовательностью SEQ ID NO:7 в вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 с последовательностью SEQ ID NO:8, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO:9 и CDR3 с последовательностью SEQ ID NO:10 в вариабельной области легкой цепи, или CDR2 и CDR3, которые отличаются одной, двумя или тремя аминокислотами от последовательностей SEQ ID NO:6, 7, 9 или 10.
11. Антитело или связывающий фрагмент по п.10, в котором детектируемую метку выбирают из группы, состоящей из фермента, радиоизотопа, флуорофора и тяжелого металла.
12. Антитело человека, гуманизированное антитело, антитело мыши, ксеногенное или химерное антитело человек-мышь или его связывающий фрагмент, которое способно узнавать опухоль-ассоциированный антиген NY-ESO-1 и которое присоединено к терапевтическому агенту, содержащее в своей вариабельной области CDR1 с последовательностью SEQ ID NO:5, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO:6 и CDR3 с последовательностью SEQ ID NO:7 в вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 с последовательностью SEQ ID NO:8, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO:9 и CDR3 с последовательностью SEQ ID NO:10 в вариабельной области легкой цепи, или CDR2 и CDR3, которые отличаются одной, двумя или тремя аминокислотами от последовательностей SEQ ID NO:6, 7, 9 или 10, где терапевтическое средство должно быть выбрано из группы, состоящей из митомицина С, даунорубицина, винбластина, радиоизотопов, лектинов и токсинов.
13. Композиция для лечения или профилактики прогрессирования опухоли; для улучшения симптомов, связанных с опухолью; для диагностики или скрининга индивида на наличие опухоли или для определения риска развития опухли у индивида, содержащая антитело или связывающий фрагмент по любому из пп.1-5 или 10-12, полинуклеотид по п.6, вектор по п.7 или клетку по п.8 в эффективном количестве.
14. Композиция по п.13, которая представляет собой фармацевтическую композицию и дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.
15. Композиция по п.14, дополнительно содержащая дополнительный агент, полезный для лечения опухолей.
16. Применение антитела или связывающего фрагмента по любому из пп.1-5, 10-12, полинуклеотида по п.6, вектора по п.7 или клетки по п.8 для приготовления фармацевтической или диагностической композиции для лечения или профилактики прогрессирования опухоли, для ослабления ассоциированных с опухолью симптомов, для диагностирования или скрининга субъекта на наличие опухоли или для определения у данного субъекта риска развития опухоли.
17. Применение по п.16, в котором указанную фармацевтическую композицию вводят внутривенно, внутримышечно, подкожно, интраперитонеально, интраназально или в виде аэрозоля.
18. Применение по п.16 или 17, где указанная опухоль содержит первичную карциному молочной железы и/или метастазы.
19. Набор для диагностирования опухоли, где указанный набор содержит по меньшей мере два компонента, выбранных из группы, состоящей из антитела или связывающего фрагмента по любому из пп.1-5, 10-12, полинуклеотида по п.6, вектора по п.7 или клетки по п.8, необязательно, реагентов, обычно используемых в иммуно- и диагностических способах, основанных на нуклеиновой кислоте, и/или инструкции по применению.
20. Применение молекулы, связывающей опухолевый антиген, содержащей антитело или связывающий фрагмент по любому из пп.1-5 для детектирования или нацеливания на опухоль терапевтического и/или диагностического агента in vivo.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP07005180.0 | 2007-03-13 | ||
EP07005180 | 2007-03-13 | ||
PCT/EP2008/002021 WO2008110372A1 (en) | 2007-03-13 | 2008-03-13 | Monoclonal human tumor-specific antibody |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2009137784A RU2009137784A (ru) | 2011-04-20 |
RU2488593C2 true RU2488593C2 (ru) | 2013-07-27 |
Family
ID=39627674
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2009137784/10A RU2488593C2 (ru) | 2007-03-13 | 2008-03-13 | Человеческое опухолеспецифическое моноклональное антитело |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8519106B2 (ru) |
EP (4) | EP3159355A1 (ru) |
JP (2) | JP2010520760A (ru) |
KR (1) | KR101570702B1 (ru) |
CN (1) | CN101652388B (ru) |
AU (1) | AU2008225994B9 (ru) |
BR (1) | BRPI0808940B8 (ru) |
CA (1) | CA2680914C (ru) |
DK (1) | DK2457928T3 (ru) |
ES (2) | ES2637214T3 (ru) |
HU (1) | HUE035762T2 (ru) |
IL (1) | IL200615A (ru) |
MX (1) | MX2009009926A (ru) |
NZ (1) | NZ579520A (ru) |
PL (2) | PL2134746T3 (ru) |
PT (1) | PT2457928T (ru) |
RU (1) | RU2488593C2 (ru) |
WO (2) | WO2008110373A1 (ru) |
ZA (1) | ZA200905874B (ru) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL199534A (en) | 2007-01-05 | 2013-01-31 | Univ Zuerich | An isolated human antibody capable of detecting a neoepitope in a disease-related protein, a polynucleotide encoding an antibody, a vector containing the polynucleotide, a host cell containing the polynucleotide or vector, a preparation containing the antibody and related methods and uses. |
EP2186827A1 (en) | 2008-11-14 | 2010-05-19 | HS LifeSciences Ltd. | Surrogate marker directed cDNA cloning of selectively induced mRNAs |
AU2009328505B2 (en) | 2008-12-19 | 2014-11-27 | Panima Pharmaceuticals Ag | Human anti-alpha-synuclein autoantibodies |
EP2501724B1 (en) * | 2009-11-18 | 2015-11-18 | MannKind Corporation | Monoclonal antibodies and diagnostic uses thereof |
JP6055312B2 (ja) * | 2010-03-10 | 2017-01-11 | ゲンマブ エー/エス | C−metに対するモノクローナル抗体 |
JP5828909B2 (ja) * | 2011-01-10 | 2015-12-09 | シーティー アトランティック リミテッド | 腫瘍関連抗原結合抗体を含む併用療法 |
TR201815563T4 (tr) | 2011-06-23 | 2018-11-21 | Biogen Int Neuroscience Gmbh | Anti-alfa sinüklein bağlayıcı moleküller. |
SI2797952T1 (sl) | 2011-12-28 | 2019-07-31 | Immunoqure Ag | Postopek za pripravo monoklonskih avto-protiteles z želeno specifičnostjo |
US10131709B2 (en) | 2011-12-28 | 2018-11-20 | Immunoqure Ag | Nucleic acid molecules encoding monoclonal antibodies specific for IL-22 |
CN103382223B (zh) * | 2012-04-01 | 2015-06-10 | 上海益杰生物技术有限公司 | 针对表皮生长因子受体隐蔽表位和t细胞抗原的多功能抗体多肽 |
EP3527584B8 (en) * | 2012-05-22 | 2020-12-16 | The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Medical use of cells comprising anti-ny-eso-1 t cell receptors |
WO2015001047A1 (en) | 2013-07-03 | 2015-01-08 | Immunoqure Ag | Method of providing anti-human cytokine antibodies for pharmaceutical use |
GB201413665D0 (en) | 2014-07-03 | 2014-09-17 | Transimmune Ag And Yale University | Method for obtaining globally activated monocytes |
MA41115A (fr) | 2014-12-02 | 2017-10-10 | Biogen Int Neuroscience Gmbh | Procédé de traitement de la maladie d'alzheimer |
PT3672631T (pt) | 2017-08-22 | 2023-05-23 | Biogen Ma Inc | Composições farmacêuticas contendo anticorpos anti-betaamiloide |
US11866785B2 (en) | 2017-10-27 | 2024-01-09 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Tumor specific antibodies and T-cell receptors and methods of identifying the same |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000020460A1 (en) * | 1998-10-05 | 2000-04-13 | Ludwig Institute For Cancer Research | Methods for producing human tumor antigen specific antibodies |
Family Cites Families (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
DE3856559T2 (de) | 1987-05-21 | 2004-04-29 | Micromet Ag | Multifunktionelle Proteine mit vorbestimmter Zielsetzung |
US6252052B1 (en) * | 1996-10-03 | 2001-06-26 | Cornell Research Foundation, Inc | Antibodies which bind to NY-ESO-1 cancer associated proteins, and hybridomas which produce these antibodies |
US6723832B1 (en) * | 1996-10-03 | 2004-04-20 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated peptides corresponding to amino acid sequences of NY-ESO-1, which bind to MHC Class I and MHC Class II molecules, and uses thereof |
JPH02503867A (ja) | 1988-04-15 | 1990-11-15 | プロテイン デザイン ラブズ インコーポレーテッド | Il‐2レセプター特異的キメラ抗体 |
IL162181A (en) | 1988-12-28 | 2006-04-10 | Pdl Biopharma Inc | A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same |
DE69133566T2 (de) | 1990-01-12 | 2007-12-06 | Amgen Fremont Inc. | Bildung von xenogenen Antikörpern |
GB9020282D0 (en) | 1990-09-17 | 1990-10-31 | Gorman Scott D | Altered antibodies and their preparation |
EP0652950B1 (en) | 1992-07-24 | 2007-12-19 | Amgen Fremont Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
ES2123062T3 (es) | 1992-08-21 | 1999-01-01 | Biogen Inc | Polipeptidos de transporte derivados de la proteina tat. |
ATE390933T1 (de) | 1995-04-27 | 2008-04-15 | Amgen Fremont Inc | Aus immunisierten xenomäusen stammende menschliche antikörper gegen il-8 |
AU2466895A (en) | 1995-04-28 | 1996-11-18 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US6251603B1 (en) | 1996-10-03 | 2001-06-26 | Ludwig Institute For Cancer Research | Method for determining status of a cancerous condition by determining antibodies to NY-ESO-1 in a patient sample |
US20030236209A1 (en) * | 1998-03-18 | 2003-12-25 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer |
US7579160B2 (en) | 1998-03-18 | 2009-08-25 | Corixa Corporation | Methods for the detection of cervical cancer |
US6140050A (en) | 1998-06-26 | 2000-10-31 | Ludwig Institute For Cancer Research | Methods for determining breast cancer and melanoma by assaying for a plurality of antigens associated therewith |
AU1631700A (en) | 1998-11-23 | 2000-06-13 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Tumor antigen-specific antibody-gp39 chimeric protein constructs |
DE19903525A1 (de) | 1999-01-29 | 2000-08-03 | Mewa Recycling Maschinen Und A | Zerlegungseinrichtung für Altgeräte |
AU2003284427A1 (en) * | 2002-11-22 | 2004-06-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody against lesion tissue |
ES2374068T3 (es) * | 2002-12-03 | 2012-02-13 | Ucb Pharma, S.A. | Ensayo para identificar células productoras de anticuerpos. |
WO2004068931A2 (en) * | 2003-02-07 | 2004-08-19 | Protein Design Labs Inc. | Amphiregulin antibodies and their use to treat cancer and psoriasis |
US9469678B2 (en) * | 2003-03-04 | 2016-10-18 | Ludwig Institute For Cancer Research | NY-ESO-1 peptides which bind to class II molecules and uses thereof |
WO2005000870A2 (en) | 2003-05-30 | 2005-01-06 | Ludwig Institute Of Cancer Research | Isolated ny-eso-1 peptides which bind to hla class ii molecules and uses thereof |
GB0409940D0 (en) | 2004-05-04 | 2004-06-09 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
CA2567623C (en) * | 2004-05-26 | 2012-04-03 | Fraunhofer-Gesellschaft Zur Foerderung Der Angewandten Forschung E.V. | Isolation of allergen-specific immunoglobulin genes from human b-cells of atopic subjects |
GB0412973D0 (en) * | 2004-06-10 | 2004-07-14 | Celltech R&D Ltd | Identification of antibody producing cells |
DE102006027224B3 (de) | 2006-06-12 | 2008-01-03 | Repower Systems Ag | Windenergieanlage mit einer autarken Energieversorgung für eine Blattverstelleinrichtung |
PT2099826E (pt) | 2007-01-05 | 2014-01-09 | Univ Zuerich | Anticorpo anti-beta-amilóide e suas utilizações |
-
2008
- 2008-03-13 CA CA2680914A patent/CA2680914C/en active Active
- 2008-03-13 JP JP2009553077A patent/JP2010520760A/ja active Pending
- 2008-03-13 HU HUE12151047A patent/HUE035762T2/en unknown
- 2008-03-13 MX MX2009009926A patent/MX2009009926A/es active IP Right Grant
- 2008-03-13 BR BRPI0808940A patent/BRPI0808940B8/pt active IP Right Grant
- 2008-03-13 DK DK12151047.3T patent/DK2457928T3/en active
- 2008-03-13 EP EP16189942.2A patent/EP3159355A1/en not_active Ceased
- 2008-03-13 CN CN2008800082682A patent/CN101652388B/zh active Active
- 2008-03-13 WO PCT/EP2008/002022 patent/WO2008110373A1/en active Application Filing
- 2008-03-13 KR KR1020097020424A patent/KR101570702B1/ko active IP Right Grant
- 2008-03-13 PL PL08716518T patent/PL2134746T3/pl unknown
- 2008-03-13 WO PCT/EP2008/002021 patent/WO2008110372A1/en active Application Filing
- 2008-03-13 AU AU2008225994A patent/AU2008225994B9/en active Active
- 2008-03-13 ES ES12151047.3T patent/ES2637214T3/es active Active
- 2008-03-13 US US12/530,764 patent/US8519106B2/en active Active
- 2008-03-13 ES ES08716518.9T patent/ES2523194T3/es active Active
- 2008-03-13 EP EP08716518.9A patent/EP2134746B1/en active Active
- 2008-03-13 EP EP08716519.7A patent/EP2125888B1/en active Active
- 2008-03-13 PL PL12151047T patent/PL2457928T3/pl unknown
- 2008-03-13 US US12/450,101 patent/US20110123447A1/en not_active Abandoned
- 2008-03-13 NZ NZ579520A patent/NZ579520A/en unknown
- 2008-03-13 EP EP12151047.3A patent/EP2457928B1/en active Active
- 2008-03-13 RU RU2009137784/10A patent/RU2488593C2/ru active
- 2008-03-13 PT PT121510473T patent/PT2457928T/pt unknown
-
2009
- 2009-08-25 ZA ZA200905874A patent/ZA200905874B/xx unknown
- 2009-08-27 IL IL200615A patent/IL200615A/en active IP Right Grant
-
2013
- 2013-05-02 JP JP2013096890A patent/JP5797687B2/ja active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000020460A1 (en) * | 1998-10-05 | 2000-04-13 | Ludwig Institute For Cancer Research | Methods for producing human tumor antigen specific antibodies |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
РОЙТ А. и др. Иммунология. - М.: Мир, 2000, с.110, 111, 151, 152. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2488593C2 (ru) | Человеческое опухолеспецифическое моноклональное антитело | |
ES2881484T3 (es) | Anticuerpos anti-PD-1 | |
JP5631733B2 (ja) | 抗EpCAM抗体およびその使用 | |
WO2007110648A1 (en) | Agonist antibodies against tshr | |
CN112533955A (zh) | 抗b7-h3抗体 | |
JP6486914B2 (ja) | ヒト抗il−32抗体 | |
TWI839556B (zh) | 抗bcma抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 | |
WO2021213245A1 (zh) | 抗体或其抗原结合片段、其制备方法及医药用途 | |
EP4079758A1 (en) | Semg2 antibody and use thereof | |
RU2819660C2 (ru) | Антитело к BCMA, его антигенсвязывающий фрагмент и их медицинское применение | |
WO2024188341A1 (zh) | 特异性结合Claudin18.2的抗体及其制法和应用 | |
CN117285628A (zh) | 抗vista抗体及其应用 |