KR20100014690A - 단일클론 인간 종양-특이적 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 종양-관련 항원 NY-ESO-1을 인식하는 신규한 인간 종양-특이적 항체들, 그의 단편들, 유도체들 및 변형체들을 제공한다. 또한, 상기의 항체들 및 그의 유사체들을 포함하는 종양을 치료하기 위한 약학 조성물을 제공한다.
인간 단일클론 항체, 종양-관련 항원 NY-ESO-1
Description
본 발명은 일반적으로 신규한 종양-특이적 결합 분자들에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 종양 항원들 및 종양-관련 항원들을 각각 인식하는 인간 항체들, 그의 단편들, 유도체들 및 변이체들에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 다양한 종양들, 특히 흑색종, 유방암 및 전이를 치료하는 이러한 결합 분자들, 항체들 및 그의 유사체들을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
종양들에 대한 체액성 면역 반응들은 상대적으로 높은 빈도로 발생한다(1, 2).이러한 현상은 암 환자들의 혈청을 가지고 자가 발현 라이브러리들을 스크리닝함으로써 다양한 종양-관련 항원들(taa)을 식별하는 데 이용되었다(1). 이 taa의 일부는 환자들에서 항-종양 CTL-반응들의 유도용 T 세포 항원들로 현재 역할을 한다(3, 4).치료 전략으로서 대부분의 세포독성 면역 반응의 경우, 세포성에 대한 이 선호도는-, 지금 재고되고 있으며 또한 항체 반응들을 유도하기 위해 신규한 백신들이 설계되었다. 부분적으로, 이 개념의 변화는 trastuzumab (헤셉틴)과 bevacizumab (아바스틴) 과 같은 종양 치료용 다양한 단일클론 항체들의 최근의 성공에 의해 영향을 받은 것 같다(5).이 단일클론 항체들이 특히 추정 종양 관련의 목표들에 대해 특이적으로 유도되는 반면에, 자연발생적이거나 다른 그룹의 분자들의 백신 접종 형태로 암 환자들에서 발생한 항체들에서 그 치료 유의성은 평가하기 어렵다.이것은 대개 시험관과 인간 암의 동물 모델들에서 그들의 분리 및 후속 특성화에 대한 간단한 실험적 접근들이 부족하기 때문이다.
따라서, 상기-기술된 한계들을 극복하고 암에 관련된 항원들에 대한 치료 및 진단 항체를 제공할 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명은 종양 항원 및 종양-관련 항원(taa)에 특이한 인간 단일클론 항체들의 분리를 위해 암 환자들의 종양-특이적 면역 반응들을 이용한다. 특히, 본 발명에 따라 수행된 실험들은 NY-ESO-1 및 일부 임상 반응에 혈청 역가를 보인 흑색종 환자의 taa NY-ESO-1에 특이한 단일클론 항체를 분리하는 데 성공하였다. 종양 항원 및 taa 각각에 특이한 인간 항체를 분리하기 위해, 조직 마이크로분석법(TMA)들을 이용하는 면역조직화학검사(IHC)가 사용되었다.
본 발명은 따라서 종양-관련 항원 NY-ESO-1을 인식할 수 있는 인간 항체들, 항원-결합 단편들 및 유사한 항원 결합 분자들에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항체들을 포함하는 조성물들 및 이를 사용하는 면역치료법들과 면역진단법들에 관한 것이다.
특히 본 발명의 바람직한 양태에서, 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 도 4(서열번호: 2 및 4)에 기재된 가변 영역들 VH 및/또는 VL을 특징으로 하는 항체의 면역학적 결합 특성들을 보여준다. 대안적으로, 그 항체는 인간화되거나, 이종의, 또는 키메라 인간-설치류 항체이고, 후자는 특히 진단 방법들 및 동물 실험들에 유용하다. 항체 또는 그의 활성 단편들, 또는 효능제들 및 동족 분자들, 또는 대안적으로, 그의 길항제들을 포함하는 치료 조성물들 및 이 조성물들을 사용하여 종양을 예방, 진단 또는 치료하는 이 조성물들의 사용 방법들도 포함되었고, 유효량의 조성물이 이러한 치료가 필요한 환자에게 투여된다.
항체의 항원-결합 단편은 단쇄 Fv 단편, F(ab') 단편, F(ab) 단편, 및 F(ab')2 단편, 또는 다른 항원-결합 단편일 수 있다. 하기 구체적 양태에서, 그 항체 또는 그의 단편은 인간 IgG 동형 항체이다.
물론, 본 발명은 하기에 정의된 별개의 고유한 특성들을 가지는 항체를 생산하는 불멸화 인간 B 기억 임파구 및 B 세포 각각에 확장된다.
본 발명은 또한 본 발명 항체의 면역글로불린 사슬의 적어도 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드들에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 가변 영역은 도 4(서열 정보: 5 내지 10)에 기재된 가변 영역의 VH 및/또는 VL 의 적어도 한 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 벡터들과 그에 의해 형질전환된 숙주 세포들 및 종양, 특히 흑색종 또는 유방암을 나타내고/거나 원인이 되는 항원들에 특이한 항체 및 등가의 결합 분자들을 생산하는 그의 용도를 포함한다.
그 항체, 그의 면역글로불린 사슬(들),결합 단편들 및 상기 항체에 결합하는 항원은 종양 면역치료 및 진단을 위한 약학 및 진단 조성물들에 각각 사용될 수 있다. 그러나 상기 조성물들의 의약 제조에 대한 용도가 바람직하다.
그러므로, 원발성 유방 암종 및 전이와 같은 암 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 구체적 목표이다. 상기 방법은 유효 농도의 항체 또는 항체 유도체를 항체가 종양 조직 및 세포들을 표적화하는 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 추가 양태들은 하기의 설명 및 실시예들에서 분명해질 것이다. 또한, 필요하거나 적절한 본 발명의 설명은 2007년 3월 13일에 유럽 특허청에 출원한 출원인의 선행 유럽 특허 출원 EP 07 005 180.0의 공개에 의해 보완될 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 전반적으로 실시예들에 기재된 항체에 대해서 기재된 것처럼 면역학적 결합 특성들 및/또는 생물학적 속성들을 나타내는 항체들 및 그의 항원-결합 단편들에 관한 것이다.
여기서, 모든 그것의 문법적 형태들에서, 항원과 항체의 "면역학적 결합 특성들" 또는 다른 결합 특성들의 용어는 항체의 특이성, 친화도, 교차-반응, 및 항체의 다른 결합 특성들을 나타낸다.
물론, 본 발명은 세포주들 및 재조합 세포들도 생산하는 항체에 확장된다.
본 발명은 또한 본 발명의 결합 분자를 포함하는 진단 검사들과 키트들 및 그에 기초한 치료 방법들에 관한 것이다.
본 발명에 따른 종양-관련 항원 NY-ESO-1에 특이한 인간 항체는 2008년 1월 7일에 출원된 출원인의 공동 국제 출원 PCT/EP2008/000053 "질병-특이적 결합 분자들 및 표적들을 제공하는 방법"에 공개된 본질적으로 분자들을 결합하는 데 유용한, 진단 및 치료적으로 종양을 식별, 검증 및 생산하는 방법을 사용하여 ELISA 및 자가 종양 섹션들에서 NY-ESO-1에 양성혈청반응을 보인 흑색종 환자로부터 복제되었다. 이의 공개 내용은 참조로 여기에 통합되었다.
항체 후보들의 스크리닝은 ELISA 및 조직 마이크로분석법 기술을 사용하는 종양 조직에서 수행되었다.
획득된 조직-반응성 인간 단일클론 항체는 종양-관련 항원 LAGE-1과 또한 공유된 NY-ESO-1의 N-말단에 결합하는 것을 나타내었다; 실시예 3을 참조.
달리 정의되지 않는 한, 용어들 "암" 및 "종양" 은 여기서 상호교환적으로 사용된다.
본 발명의 범위를 제한하지 않고 단지 명확성을 주기 위해 대부분의 하기 구체예들은 본 발명에 따른 치료제 및 진단제의 개발을 위한 바람직한 결합 분자들을 의미하는 인간 항체들 및 항체-유사 분자들에 대하여 논의된다. 그러나, 본 발명에 사용된 용어 "항체" 및 그의 절편은, 호르몬들, 수용체들, 리간드들, 주 조직적합성 복합체(MHC) 분자들, 열 충격 단백질들(HSPs)과 같은 샤페론들 및 카드헤린, 인테그린, C-형 렉틴 및 면역글로불린(Ig) 상과들과 같은 세포-세포 부착 물질들을 포함하나 이에 한정되지 않는, 인간 유래 종양 (관련) 항원 NY-ESO-1에 결합하는 다른 비-항체 결합 물질들일 수도 있다.
NY-ESO-1은 원래 항체-기반초 복제 기술을 사용하여 식도암 환자에서 발견되었다 (SEREX, 하기 참조).자발적 세포성 및 체액성 면역 반응들이 NY-ESO-1 표현 종양들을 가지고 있는 환자들에서 높은 비율로 관찰될 수 있기 때문에, 최근에 NY-ESO-1이 대부분의 면역성 CT 항원을 대표할 것이라는 점을 보여준다. (Gnjatic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (2003), 8862-8867; Jager and Knuth, Breast 14 (2005), 631-635)
CT 항원들은 인간 종양 세포들 및 고환의 정원 세포들에서 선택적으로 발현된 이후로, 암 환자들의 면역 치료 접근을 위한 표적 항원들의 유망한 군을 대표한다.
그 중에서, NY-ESO-1은 강력한 면역원성을 나타내고 활성 암 면역요법에 대한 이상적 목표가 되는 흑색종 및 난소암, 유방암, 폐암 및 방광암을 가지고 있는 환자들에서 효율적인 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도한다고 알려져 있다.
종양 항원들 및 종양 관련 항원들의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열들 및 출처, 원본 등에 대한 정보를 얻기 위해서 EMBL이 주관하는 UniProtKB/Swiss-Prot와 같은 적절한 데이터베이스들을 참조. 거기서 NY-ESO-1에 대한 기재는 프라이머리 등록번호(primary accession number) P78358 하에서 발견될 수 있다.
특히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 NY-ESO-1 단백질의 아미노산 잔기들 11 내지 30을 나타내는 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열의 에피토프에 결합한다.
항체들 및 그의 유사체들의 재조합 생산하는 수단들과 방법들 및 항체들이거나 아닐수도 있는 경쟁 결합 분자들을 스크리닝하는 방법들은 당업계에 공지되어 있다; 실시예들을 또한 참조.
그러나, 여기에 기술된 것처럼, 특히 인간에 대한 의료 적용과 관련하여 상기 항체의 적용은 키메라 및 인간화된 항체들에서 관찰된 것과 달리 인간 항-설치류 항체 (HAMA) 반응이 실질적으로 없다는 점에서 본 발명의 항체는 인간 항체이다.
또한, 첨부된 실시예 3에 설명된 것처럼, 저 나노몰 범위에서 항원과의 상호작용의 평형 해리 상수(KD)를 갖는 특히 고 결합 친화도를 보이는 항체가 식별되고 클로닝되었다.
바람직하게는, 본 발명 결합 분자의 동족 항원과의 결합 친화도는 적어도 약 10-7M이고, 더 바람직하게는 적어도 10-8M이며, 특히 바람직하게는 10-9M이고 더욱더 바람직하게는 적어도 10-10M이다.
본 발명은 그들의 가변 영역, 다시 말하면 결합 도메인에 VH는 서열번호 2이고 VL은 서열번호 4인 도 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역의 VH 및/또 는 VL의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 것으로 특징될 수 있는, 인간 항-NY-ESO-1 항체 및 그의 결합 단편들을 예시한다.
도 4에 기재된 것처럼 VH 및/또는 VL 영역의 상기 아미노산 서열들의 CDR들의 전형적인 예는 서열번호 5 내지 10이다.
그러나, 하기에 논의되는 것처럼 당업자는 CDR2 및 CDR3의 경우에 하나, 둘, 셋 또는 그 이상의 아미노산들에 의해 서열번호 5 내지 10의 아미노산 서열이 달라지는, CDR들이 부가적 또는 대안적으로 사용될 것이라는 사실을 잘 인식하고 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 항체는 도 4에 기재된 것과 같이 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중 하나이다. 대안적으로, 본 발명의 항체는 NY-ESO-1 항원에 결합하기 위해 도 4에 기재된 VH 및/또는 VL 영역을 가지는 하나 이상의 항체들과 경쟁하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 이 항체들은 또한 설치류 항체일 수 있다, 그러나, 특히 의료 적용을 위해서는 인간화된 항체, 이종 항체 또는 키메라 인간-설치류 항체들이 바람직하다. 항체의 항원-결합 단편은, 예를 들어, 단쇄 Fv 단편(scFv), F(ab') 단편, F(ab) 단편, 또는 F(ab')2 단편일 수 있다.
따라서, 일부 적용들에서는 Fab', Fab, 또는 F(ab")2 부분들을 생성하도록 적절한 시약들로 항체를 처리함으로써 획득될 수 있는, 항체들의 가변 영역들만이 요구된다. 이러한 단편들은, 예를 들어, 방사성 동위 원소들 같은 시약들을 검출하는 면역글로불린들의 면역특이적 부분들을 커플링하는 면역진단 절차들에 사용될 수 있다.
불멸화 B 세포들 또는 B 기억 임파구들의 배양액으로부터 직접 면역글로불린들을 획득하는 대안으로서, 불멸화 세포들은 후속 발현 및/또는 유전자 조작의 재배열된 중쇄 및 경쇄 위치의 소스로서 이용될 수 있다. 재배열된 항체 유전자들은 적절한 mRNA들로부터 cDNA를 생산하기 위해 역전사될 수 있다.만약 필요하다면, 중쇄 불변 영역은 다른 동형으로 치환되거나 모두 제거될 수 있다.가변 영역들은 단쇄 Fv 영역들을 암호화하도록 연결될 수 있다. 다수의 Fv 영역들은 하나 이상의 표적 또는 키메라 중쇄 및 단쇄 조합들이 이용될 수 있는 결합능을 수행하기 위해 연결될 수 있다. 일단 유전 물질이 이용가능하다면, 목표 표적에 결합하는 능력 둘을 갖는 상기 유사체들의 설계는 간단하다.항체 가변 영역들의 클로닝 및 재조합 항체들의 생산 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어, Gilliland et al., Tissue Antigens 47 (1996), 1-20; Doenecke et al., Leukemia 11 (1997), 1787-1792에 기술되어 있다.
일단 적절한 유전물질들이 획득되고, 만약 필요하다면, 유사체를 암호화하기 위해 변경된, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들을 적어도 암호화하는 시퀀스들을 포함하는 암호화 시퀀스들은 표준 재조합 숙주 세포들에서 형질감염될 수 있는 벡터들에 포함된 발현 시스템 속으로 삽입될 수 있다.다양한 그러한 숙주 세포들은 효율적인 처리에 사용될 수 있다; 그러나, 포유동물 세포들이 바람직하다. 이 목적에 유용한 전형적인 포유동물 세포주들은 CHO 세포들, HEK 293 세포들, 또는 NSO 세포들을 포함한다. 숙주 세포들의 성장 및 암호화 서열들의 발현에 적절한 배양조건 하에서 변형된 재조합 숙주를 배양한 후에 항체 또는 유사체가 생산된다. 배양액으로부터 항체들을 분리한 후에 그들은 재생된다. 발현 시스템들은 생성된 항체들이 배지 속으로 분비되기 위해 신호 펩티드들을 포함하도록 설계되는 것이 바람직하다; 그러나, 세포내 생산도 가능하다.
또 다른 구체예에서 본 발명은 펩티드 형태 및 전사후 변형된 형태에서, 상기 기술된 본 발명의 항체에 의해 인식된 NY-ESO-1 항원에 관한 것이다; 항원은 최소 6 내지 50개의 아미노산으로 구성되고 10 내지 100개의 아미노산을 넘지 않는, 동족 에피토프를 포함하는 펩티드가 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 항체는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고 약 10 내지 30개의 아미노산으로 구성되며, 약 20개의 아미노산을 넘지 않는 것이 바람직하다. 그 분자는 번역후 변형이 없이 항원성이 될 만큼 크다. 따라서 그것은 전구체 및 번역후 변형된 형태들로 어주번트와 결합될 때 (또는 어주번트가 없을 때), 면역원으로써 유용하다. 이 항원들 및 펩티드들은 항체들이 혈청 또는 혈액과 같은 샘플에 존재하는지 측정하기 위해 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 항원은 인간의 체액성 반응을 유도할 수 있다.
상기에 따라, 본 발명은 또한, 바람직하게는 적어도 상기 항체의 면역글로불린 사슬의 항체 가변 영역의 경우에, 본 발명의 항원 또는 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 일반적으로, 그 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 상기 가변 영역은 상기 항체의 가변 영역의 VH 및/또는 VL의 상보성 결정 영역(CDR)을 하나 이상 포함한다. 당업자는 항체의 각 가변 도메인(중쇄 VH 및 경쇄 VL)은 때때로 상보성 결정 영역들 또는 네개의 상대적으로 보존된 프레임워크 영역들로 측면이 둘러싸인 "CDR들" 또는 "FR들"이라고 불리는 세개의 초가변 영역들을 포함하고 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기들에 관련된다는 것을 안다. 항체의 인간 IgG 서브타입형의 초가변영역들 또는 CDR들은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991)에 기재된 것과 같이 경쇄 가변 도메인의 24 내지 34 (Ll ), 50 내지 56 (L2) 및 89 내지 97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 31 내지 35 (Hl ), 50 내지 65 (H2) 및 95 내지 102 (H3) 잔기들로부터 아미노산 잔기들 및/또는 초가변 루프, 다시 말하면 Chothia et al., J. MoI. Biol. 196 (1987), 901-917에 기재된 것과 같이 경쇄 가변 도메인의 26 내지 32 (Ll ), 50 내지 52 (L2) 및 91 내지 96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 26 내지 32 (Hl ), 53 내지 55 (H2) 및 96 내지 101 (H3) 잔기들로부터 이 잔기들을 포함한다. 프레임워크 또는 FR 잔기들은 기타 가변 도메인 잔기들이고 초가변 영역들을 일괄한다.용어 "특이적 결합"은 선결 항원에 결합하는 항체를 나타낸다. 일반적으로, 항체는 10-7M 또는 그 이하의 해리 상수(KD)로 결합하고, 선결 항원이 아닌 비특이적 항원(예를 들어, BSA, 카세인, 또는 기타 다른 특정화된 폴리펩티드)과의 결합 해리 상수의 적어도 2배 이하의 해리 상수로 선결 항원에 결합한다. 문구들 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원 특이적 항체"는 여기서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 교환적으로 사용된다. 여기서 사용된 "매우 특이적" 결합은 특이적 표적 에피토프에 대한 항체의 상대 해리 상수를 의미한다. 다시 말하면 taa NY- ESO-1은 항체의 다른 리간드들과의 결합 해리 상수의 10배 이하이다.바람직하게는, 항체는 10-9M 또는 그 이하의 해리 상수(KD)로 그것의 동족 NY-ESO-1 항원과 결합한다.
항체의 항원에 대한 친화도 또는 결합력은 적절한 방법, 예를 들어, Berzofsky et al., "항체-항원 상호작용들" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992) 및 여기에 기술된 방법들을 사용하여 실험적으로 측정될 수 있다. 특정 항체-항원 상호작용의 측정된 친화도는 염 농도, pH와 같은 조건들을 달리하여 측정되면 달라질 수 있다.따라서, 친화도 및 KD, IC50와 같은 다른 항원-결합 파라미터들의 측정은 항체, 항원 및 표준 버퍼의 표준 용액에서 수행되는 것이 바람직하다.
당업자는 상기 가변 도메인을 가지는 항체의 가변 영역은 목표 특이성 및 생리적 기능의 폴리펩티드들 또는 항체들을 제작하는 데 사용될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 상기 가변 도메인의 하나 이상의 CDR을 포함하는, 추가 실시예들에 기재된 항체와 동등 또는 유사한 결합 속성들을 실질적으로 유리하게 갖는 폴리펩티드들 및 항체들을 또한 포함한다. 당업자는 여기에 기재된 가변 도메인들 또는 CDR들을 사용하여 유럽 특허출원들 EP 0 451 216 Al 및 EP 0 549 581 Al에 기재된 것과 같은 당업계에 공지된 방법들에 따라 항체들이 제작될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다.또한, 당업자는 CDR들 또는 Kabat이 정의한 CDR들과 부분적으로 중첩하는 초가변 루프들(Chothia and Lesk, J. MoI. Biol. 196 (1987), 901-917)내의 아미노산을 치환함으로써 결합 친화도가 향상될 수 있음을 안다. 따라서, 본 발명은 또한 하나 또는 그 이상의 상기 CDR들이 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 둘 이하의 아미노산 치환체들을 포함하는 항체에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 그것의 하나 또는 둘의 면역글로불린 사슬들에서 서열번호 5 내지 10의 가변 영역들의 CDR들을 둘 또는 셋을 포함한다.
상기 기재된 항체를 암호화하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, DNA, cDNA, RNA 또는 합성적으로 생산된 DNA 또는 RNA 또는 이 폴리뉴클레오티드들 중 하나를 단독 또는 결합하여 포함하는 재조합적으로 생산된 키메라 핵산 분자일 수 있다. 이러한 벡터들은 적절한 숙주 세포 및 적절한 조건들 하에서 상기 벡터의 선택을 허용하는 표지 유전자들과 같은 유전자들을 더 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 원핵 또는 진핵 세포들에서 발현을 담당하는 발현 조절 시퀀스들에 효과적으로 연결되어 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 발현은 폴리뉴클레오티드가 번역할 수 있는 mRNA로의 전사를 포함한다. 진핵 세포들, 바람직하게는 포유동물의 세포들에서 발현을 보장하는 조절 요소들은 당업계에 잘 알려져 있다. 그들은 대개 전사의 개시를 보장하는 조절 시퀀스들 및 선택척으로 전사체의 안정 및 전사의 종결을 보장하는 폴리-A 신호들을 포함한다. 부가적 조절 요소들은 전사 및 번역 인핸서들, 및/또는 자연적으로 관련된 또는 이종의 프로모터 영역들을 포함할 수 있다.
이런 점에서, 적어도 경쇄 및/또는 중쇄의 가변 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드들이 두 면역글로불린 사슬들 또는 단지 하나의 가변 도메인들을 암호화할 수 있다는 것을 당업자는 쉽게 이해할 것이다. 마찬가지로, 상기 폴리뉴클레오티들은 발현시 같은 프로모터에 의해 제어되거나 개별적으로 제어될 수 있다. 원핵 숙주 세포들에서 발현을 가능하게 하는 조절 요소들은, 예를 들어, 대장균의 PL, lac, trp 또는 tac 프로모터를 포함하고, 진핵 숙주 세포들에서 발현을 가능하게 하는 조절 요소들의 예는 효모의 AOXl 또는 GALl 프로모터 또는 포유동물 및 다른 동물 세포들의 CMV-, SV40- , RSV-프로모터, CMV-인핸서, SV40-인핸서 또는 글로빈 인트론이다.
전사의 개시를 담당하는 요소들에 비해서 이러한 조절 요소들은 SV40-poly-A 사이트 또는 tk-poly-A 사이트, 폴리뉴클레오티드의 다운스트림과 같은, 전사 종결 신호들을 포함할 수 있다. 또한, 사용된 발현 시스템에 따라서 폴리펩티드를 세포 구획에 운송하거나 그것을 배지속으로 분비할 수 리더 시퀀스들은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 암호화 시퀀스에 추가될 수 있고 이는 당업계에 잘 알려져 있다. 리더 시퀀스(들)은 번역, 개시 및 종결 시퀀스들과 적절한 상으로 조합되어 있다. 바람직하게는, 리더 시퀀스는 번역된 단백질 또는 그의 부분을 원형질막 주위 공간 또는 세포밖 매체로 분비할 수 있다. 선택적으로, 이종 시퀀스는 발현된 재조합 생성 물질의 안정화 또는 단순 정제와 같은 바람직한 특성들을 주는 동정 펩티드의 C- 또는 N-말단을 포함하는 융합 단백질을 암호화할 수 있다. 본 발명에서, 적합한 발현 벡터들은 Okayama-Berg cDNA 발현 벡터 pcDVl (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3 (Invitrogen), 또는 pSPORTl (GIBCO BRL)과 같은 것이 당업계에 알려졌다.
바람직하게는, 그 발현 조절 시퀀스들은 진핵 숙주 세포들을 형질 전환 또는 형질 감염시킬 수 있는 벡터들의 진핵 프로모터 시스템들일 것이다. 그러나 원핵 숙주들의 조절 시퀀스들도 사용될 수 있다. 일단 벡터가 적당한 숙주속으로 통합되면, 숙주는 뉴클레오티드 시퀀스들의 고수준 발현에 적합한 조건들 하에서 유지되고, 바람직하게는, 면역글로불린 경쇄들, 중쇄들, 경/중쇄 다이머들 또는 완전 항체들, 결합 단편들 또는 기타 면역글로불린 형태들의 회수 및 정제가 따라올 수 있다; Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N. Y., (1979)을 참조.
또한, 본 발명은 항원 또는 바람직하게는 본 발명 항체의 면역글로불린 사슬의 가변 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 선택적으로 본 발명의 항체의 다른 면역글로불린 사슬의 가변 구역을 암호화하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 결합하는 것을 포함하는 유전공학에 전통적으로 사용된 벡터들, 특히 플라즈미드들, 코스미드들, 바이러스들 및 박테리오파지들에 관한 것이다 바람직하게는, 상기 벡터는 발현 벡터 및/또는 유전자 전달 또는 표적화 벡터이다. 레트로 바이러스들, 우두 바이러스, 아데노 연관 바이러스, 헤르페스 바이러스들, 또는 소 파필로마 바이러스와 같은 바이러스들로부터 유래된 발현벡터들은 본 발명의 폴리뉴클레오티드들 또는 벡터들을 표적 세포군으로 운반하는데 사용될 수 있다. 당업계에 잘 알려진 방법들이 재조합 바이러스 벡터들을 제작하는데 사용될 수 있다; 예를 들어, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y. 및 Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1994)에 기재된 기술들을 참조. 대안적으로, 본 발명의 폴리펩티드들 또는 벡터들은 표적 세포들로 운반하기 위해 리포솜 안으로 재건될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드들을 포함하는 벡터들(예를 들어, 면역글로불린 사슬들의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인(들)을 암호화하는 시퀀스들 및 발현 조절 시퀀스들)은 세포 숙주의 유형에 따라 다양한 공지된 방법들에 의해 숙주 세포 속으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 염화 칼슘 트랜스펙션은 주로 원핵세포들에 이용된다. 반면에 인산 칼슘 처리 또는 전기천공법은 다른 세포 숙주들에 이용될 수 있다; 상기 Sambrook, 참조.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로 형질전환된 숙주 세포들에 관한 것이다. 상기 숙주세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 숙주 세포에 존재하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 숙주 세포의 유전체 속으로 통합되거나 염색체밖에 있을 수 있다. 그 숙주 세포는 박테리아, 곤충, 진균, 식물, 동물, 또는 인간 세포와 같은 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 바람직한 진균 세포들은, 예를 들어, 사카로미세스 속의 진균, 특히 사카로미세스 세레비시아 종의 세포들이다. 용어 "원핵"은 본 발명 항체 또는 상응하는 면역글로불린 사슬들을 발현시키기 위해 DNA 또는 RNA 분자들로 형질 전환되거나 형질 감염될 수 있는 모든 박테리아를 포함하는 의미이다. 원핵 숙주들은 예를 들어, 대장균, 살모넬라균, Serratia marcescens 및 고초균과 같은 그람 음성 및 그람 양성 박테리아를 포함할 수 있다. 용어 "진핵"은 효모, 고등 식물, 곤충 및 바람직하게는 포유동물 세포들, 더 바람직하게는 HEK 293, NSO 및 CHO 세포들을 포함하는 의미이다. 재조합 생산 절차에 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 항체들 또는 면역글로불린 사슬들은 글리코실화되거나 비-글리코실화될 수 있다. 본 발명의 항체들 또는 상응하는 면역글로불린 사슬들은 또한 시작 메치오닌 아미노산 잔기도 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 숙주를 형질전환하거나 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 또한, 융합되고 기능적으로 연결된 유전자들을 준비하고 그들을 예를 들어, 포유동물 세포들 및 박테리아에서 발현시키는 방법들은 당업계에 잘 알려져 있다.(Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989) 여기에 기재된 유전자 제작 및 방법은 진핵 또는 원핵 숙주들에서 본 발명의 항체 또는 상응하는 면역글로불린 사슬들의 발현에 이용될 수 있다. 일반적으로, 삽입된 폴리뉴클레오티드의 효율적인 전사를 촉진하는 프로모터 시퀀스들을 포함하는 발현 벡터들은 숙주와 관련하여 이용된다. 그 발현벡터는 일반적으로 복제의 기원, 프로모터, 종결자, 및 형질전환 세포들의 표현형 선택을 제공할 수 있는 특정 유전자를 포함한다. 면역글로불린을 발현 및 분비하기 위한 DNA 시퀀스들 및 숙주 세포들에 대한 적합한 소스 세포들은 American Type Culture Collection ("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas," Fifth edition (1985) Rockville, Maryland, U.S.A., 여기에 레퍼런스로 삽입)와 같은 다수의 출처들로부터 획득될 수 있다. 또한, 본 발명의 세포들을 포함하는 형질전환 동물들, 바람직하게는 포유동물들은 본 발명 항체의 대규모 생산에 사용될 수 있다.
따라서, 추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항원 또는 항체 또는 그의 결합 단편 또는 면역글로불린 사슬(들)을 생산하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 하기 단계를 포함한다.
(a) 상기 기재된 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 항원, 항체 또는 그의 결합 단편 또는 면역글로불린 사슬(들)을 배양액으로부터 분리하는 단계.
형질전환된 숙주는 발효기들에서 성장하고 최적 세포 성장을 달성하기 위해 당업계에 공지된 기술들에 따라 배양될 수 있다. 일단 발현되면, 본 발명의 전체 항체들, 그의 다이머들, 개별의 경쇄들 및 중쇄들, 또는 다른 면역글로불린 형태들은 황산 암모늄 침강법, 친화도 컬럼들, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동법등(Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, N. Y. (1982)를 참조하라)을 포함하는 당업계의 표준 절차들에 따라 정제될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그의 상응하는 면역글로불린 사슬(들)은 그 후 성장 배지, 세포 용해물, 또는 세포막 단편들로부터 분리될 수 있다. 예를 들어 본 발명 항체의 불변 영역에 대한 단클론 또는 다클론 항체들의 사용에 관여하는 것과 같은 면역 분리들 및 분취용 크로마토그래피 분리들과 같은 전통적인 수단들에 의해 본 발명의 면역글로불린 사슬들 또는 재조합적으로 발현된 본 발명의 항체들의 분리 및 정제가 가능할 수도 있다. 본 발명의 항체들이 약물 표적화 및 영상 적용들과 같은 다른 부분들에 더 관련될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 커플링은 부착 또는 커플링 산물의 사이트에 항체 또는 항원의 발현이 DNA 수준에서 본 발명의 항체 또는 항원에 설계된 후에 화학적으로 수행될 수 있다. 그 DNA들은 그 후 적합한 숙주 시스템에서 발현되고, 발현된 단백질들은, 필요한 경우, 회수되고 재생된다.
실질적으로 적어도 약 90 내지 95%의 동질성을 갖는 순수한 면역글로불린들이 바람직하고, 의약 용도들을 위해서는, 98 내지 99% 또는 그 이상의 동질성이 더 바람직하다. 원하는 부분적으로 또는 바람직한 동질성을 갖도록 정제되면, 항체들은 그 후에 의료적으로(체외투여를 포함한다) 사용되거나 분석 절차들을 개발하고 수행하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로 유전자변형된 세포들을 포함하는 본 발명의 항체 또는 그의 상응하는 면역글로불린 사슬(들)을 발현할 수 있는 세포들을 생산하는 방법을 또한 포함한다. 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 세포들은, 예를 들어, 본 발명 항체와 항원과의 상호작용을 테스트하는 데 사용될 수 있다.
상기 언급된 것과 같이, 면역글로불린 또는 그의 암호화 cDNA들은 더 변형될 수 있다. 그러므로, 추가 양태에서 본 발명의 방법은 키메라 항체, 인간화된 항체, 단쇄 항체, Fab-단편, 이중 특이성을 지닌 항체, 융합 항체, 표지 항체 또는 그들의 유사체를 생산하는 단계(들) 중 하나를 포함한다. 상응하는 방법들은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988에 기술되어 있다. 상기 항체들의 유도체들이 파지 디스플레이 기술에 의해 획득될 때, BIAcore 시스템에 사용된 표면 플라즈몬 공명이 여기 기재된 항체와 같은 에피토프에 결합하는 파지 항체들의 효율성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.(Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). 키메라 항체들의 생산은, 예를 들어, 국제 출원 WO89/09622에 기재되어 있다. 인간화된 항체들의 생산 방법들은, 예를 들어, 유럽 출원 EP-Al 0 239 400 및 국제 출원 WO90/07861에 기재되어 있다. 본 발명에 따라 이용되는 항체들의 추가 소스들은 이종 항체들이라고 불린다. 쥐에서 인간항체들과 같은 이종 항체들의 생산에 대한 일반적 원칙은, 예를 들어, 국제 출원들 WO91/10741, WO94/02602, WO96/34096 및 WO 96/33735에 기재되어 있다. 상기 설명된 것과 같이, 본 발명의 항체는 예를 들어, Fv, Fab ,F(ab)2 를 포함하는 완전한 항체들 외에, 다양한 형태들 및 단쇄들로 존재할 수 있다; 국제 출원 WO88/09344를 참조.
본 발명의 항체들 또는 그들의 상응하는 면역글로불린 사슬(들)은 당업계에 공지된 종래 기술들, 예를 들어, 아미노산 삭제(들), 삽입(들), 치환(들), 추가(들), 및/또는 재조합(들) 및/또는 단독 또는 복합적으로 당업계에 공지된 기타 다른 변형법을 사용하여 더 변형될 수 있다. 면역글로불린 사슬의 아미노산 서열의 기초가 되는 DNA 서열에 이러한 변형들을 도입하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다; 예를 들어 Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y. 및 Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1994)를 참조. 본 발명 항체의 변형들은 측쇄 변형들, 골격 변형, 및 아세틸화, 하이드록실화, 메틸화, 아미노화를 포함하느 N- 및 C-말단 변형들,탄수화물 또는 지질 부분들, 보조인자 및 그 유사체의 부착을 포함하는 하나 또는 그 이상의 구성 아미노산들에서 화학 및/또는 효소 유도체들을 포함한다. 마찬가지로, 본 발명은 카르복시 말단에서 면역촉진 리간드 같은 이종 분자와 융합된 상기 항체 또는 그의 일부 단편을 아미노 말단에 포함하는 키메라 단백질들의 생산을 포함한다; 예를 들어, 상응하는 기술적 세부사항들은 국제 출원 WO00/30680을 참조.
또한, 본 발명은 중쇄 CDR3 (HCDR3)은 항원-항체 반응에서 고도의 다양성 및 우세한 관여성(participation)을 가지는 영역이라는 것이 자주 관찰되었기 때문에 상기 기재된 결합 분자를 포함하는, 예를 들어 상기 항체들 중 하나의 가변 영역의 CDR3 영역, 특히 중쇄의 CDR3을 포함하는, 작은 펩티드들을 포함한다. 이러한 펩티드들은 본 발명에 따른 유용한 결합제를 생산하는 재조합 방법들에 의해 쉽게 합성되거나 생산될 수 있다. 이러한 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 펩티드들은 예를 들어, 상업적으로 사용되는 자동 펩티드 합성장치를 사용하여 합성될 수 있다. 펩티드들은 펩티드를 생산하기 위해 펩티드를 발현하는 DNA를 발현 벡터 속으로 통합하고 그 세포들을 그 발현 벡터로 형질전환함으로써 재조합 기술들에 의해 생산될 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 기재된 방법들에 따라 얻을 수 있고 상기 기재된 특성들을 나타내고, 다시 말하면 NY-ESO-1을 특이적으로 인식하고, 의료 용도를 위하여 환자의 면역원성이 없기 위해 실질적인 인간 프레임워크를 바람직하게는 유지하는 결합 분자, 항체 또는 결합 단편에 관한 것이다.
본 발명의 추가 양태에서, 항체, 면역글로불린 사슬 또는 그의 결합 단편 또는 항원은 검출가능하게 표지되어 있다. 표지 시약들은 직접적 또는 간접적으로 본 발명의 항체들 또는 항원들에 결합될 수 있다. 간접적 커플링의 한 예는 스페이서 모이어티를 사용하는 것이다. 또한, 본 발명의 항체들은 공유결합 또는 비-공유 결합으로 연결된 상기 도메인, 추가 도메인을 구성할 수 있다. 결합은 당업계에 공지되고 상기 기재된 방법들에 따라 유전자 융합을 기초로 하거나 예를 들어, 국제출원 WO94/04686에 기재된 화학적 교차 결합에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 항체를 포함하는 융합 단백질 안에 존재하는 부가적 도메인은 바람직하게는 유연한 링커에 의해 연결될 수 있고, 상기 부가적 도메인의 C-말단과 본 발명 항체의 N-말단 사이 또는 그 반대의 거리를 연결하기에 충분한 길이의 복합, 친수성, 펩티드 결합된 아미노산들을 포함하는 폴리펩티드 링커에 의해 유리하게 연결될 수 있다. 치료적 또는 진단적 활성제는 다양한 수단들에 의해 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 연결될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 펩티드 결합들과 같은 공유 방법들에 의해 치료적 또는 진단적 활성제에 연결된 본 발명 항체의 가변 영역을 포함하는 단쇄 융합 단백질들을 포함한다. 추가 실시예들은 부가 분자들에 공유적 또는 비-공유적으로 연결된 항원-결합 단편을 최소한 포함하는 분자들을 포함한다. 하기 비-한정 예시 리스트안에 있는 것들을 포함한다. Traunecker, Int. J. Cancer Surp. SuDP 7 (1992), 51-52 에는 CD3를 목적으로 하는 Fv 영역이 수용성 CD4 또는 OVCA 및 IL-7과 같은 다른 리간드들에 연결된 이중특이 시약 janusin이 기재되었다. 마찬가지로, 본 발명 항체의 가변 영역들은 Fv 분자들로 제작될 수 있고 인용 문헌에 기재된 것과 같은 대체 리간드들에 연결될 수 있다. Higgins, J. Infect Disease 166 (1992), 198-202에는 GP 120의 V3 영역의 특정 시퀀스에 지시되는 항체에 교차-연결된 OKT3으로 구성된 이종-접합 항체가 기재되었다. 이러한 이종-접합 항체들은 또한 본 발명 항체 안에 포함된 가변 영역들을 최소한 사용하여 제작될 수 있다. 특정 항체들의 추가 실시예들은 Fanger, Cancer Treat. Res. 68 (1993), 181- 194 and by Fanger, Crit. Rev. Immunol. 12 (1992), 101-124에 기재된 것들을 포함한다. 기존 항체들을 포함하는 면역독소들인 접합체들은 당업계에 잘 설명되어 있다. 그 독소들은 종래 커플링 기술들에 의해 항체에 결합되거나 단백질 독소 부분들을 포함하는 면역독소들은 융합 단백질들로서 생산될 수 있다. 본 발명의 항체들은 이러한 면역독소들을 얻는 유사한 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 면역독소들의 예시는 Byers, Seminars Cell. Biol. 2 (1991), 59-70 and by Fanger, Immunol. Today 12 (1991), 51-54.에 기재되어 있다. 상기 융합 단백질은 분해성 링커 또는 프로티나제들에 대한 절단 부위를 더 추가할 수 있다. 이 스페이서 모이어티들은, 교대로, 불용성이거나 수용성일 수 있고 (Diener et al., Science 231 (1986), 148) 표적 부위에 항원으로부터 약물을 방출할 수 있도록 선택될 수 있다. 면역요법에 대한 본 발명 항체들 및 항원들과 결합될 수 있는 치료제들의 예들은 약물들, 방사성 동위원소들, 렉틴들, 및 독소들이다. 본 발명 항체들 및 항원들에 결합될 수 있는 약물들은 미토마이신 C, 다우노루비신, 및 빈블라스틴과 같은 약물들과 같은 화합물들을 포함한다. 예를 들어, 종양 면역치료를 위한 방사성 동위원소에 연결된 본 발명의 항체들 또는 항원들을 사용하는 데 있어, 어떤 이소토프들은 백혈구 분산, 안정성 및 방출과 같은 이러한 요인들에 따라 다른 것들보다 더 바람직할 것이다. 자가면역 반응에 따라, 일부 에미터들은 다른것들보다 더 바람직할 것이다. 일반적으로, 면역치료에서는 방사성 동위원소들을 방출하는 α 및 β 입자가 바람직하다. 212Bi와 같은 단 범위, 고 에너지 α 에미터들이 바람직하다. 치료 목적들을 위한 본 발명 항체들 또는 항원들에 연결될 수 있는 방사성 동위워소들의 예들은 125I, 131I, 90Y, 67Cu, 212Bi, 212At, 211Pb, 47Sc, 109Pd 및 188Re 이다. 본 발명의 항체 또는 항원에 결합할 수 있는 다른 치료제들 및 생체외 및 생체내 치료 프로토콜들은 당업자에게 공지되거나 쉽게 확인될 수 있다. 적절한 경우 당업자는 단백질 물질 자체 대신에 상기 항체들, 항원들 또는 상응하는 벡터들을 암호화하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 사용할 수 있다.
그러므로, 여기서 동정된 항체 및 결합 도메인의 생물학적 활성은 그들이 병든 세포 및 조직 각각의 적절한 표면 구조들을 발현하는 세포들에 약물 위치화를 위한 잠재적 후보들이 될 만큼 충분한 친화도를 갖고 있음을 설명한다. 세포들에 대한 이 표적화 및 결합은 치료 또는 진단 활성제들의 배달 및 유전자 치료/유전자 배달에 유용할 것이다. 본 발명의 항체를 가지는 분자들/입자들은 NY-ESO-1 항원을 발현하는 세포들/조직들에 특이적으로 결합할 것이고, 따라서 진단 또는 치료 용도를 가질 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 항원은 표지 (예를 들어, 형광, 방사능, 효소, 핵 자기, 중금속) 될 수 있고 시험관 내에서의 분석들과 같은 "면역화학"을 포함하는 생체내 또는 시험관 내에서 특정 표적들을 탐지하는 방법에 사용될 수 있다. 생체 내에서 그들은 NY-ESO-1 항원을 발현하는 조직들, 세포들, 또는 다른 물질들을 검출하는 핵 의학 영상 기술들과 유사한 방법에 사용될 것이다. 따라서, 추가 양태에서 본 발명은 종양의 치료 및/또는 진단제를 생체내에서 검출 또는 표적화하는 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 항체 또는 그의 결합 단편의 용도에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은 본 발명의 상기 기재된 항체 또는 결합 단편 또는 항원 또는 그의 키메라 유도체, 또는 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포를 포함하는 조성물들에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 용어 "화학 유도체"는 정상적으로 기본 분자의 일 부분이 아닌 부가적 화학적 모이어티들을 포함하는 분자를 의미한다. 이러한 모이어티들은 기본 분자의 용해도, 반감기, 흡수 등을 향상시킬 수 있다. 또한 모이어티들은 기본 분자의 바람직하지않은 부작용들을 감소시키거나 기본 분자의 독성을 감소시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 조성물의 의도하는 용도에 따라 인터루킨들 또는 인터페론들과 같은 항-종양 약물을 더 포함할 수 있다. 따라서, 특히 바람직한 양태에서 본 발명은 종양의 진행을 치료 또는 예방, 종양 관련 증상들의 개선, 종양이 존재하는 대상체를 진단 또는 스크리닝 또는 대상체의 종양 발생에 대한 위험도를 측정하기 위한 약학 또는 진단 조성물을 제조를 위한 본 발명의 항체 또는 결합 단편 또는 그것 중 하나의 실질적으로 같은 결합 특이도들을 가지는 결합 분자, 본 발명의 항원, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포의 용도에 관한 것이다. 상기 약학 조성물은 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 비강내, 비경구적 또는 에어로졸로서 투여되도록 설계될 수 있다; 또한 하기(infra)를 참조.
따라서, 한 구체예에서 본 발명은 종양 관련 증상들을 개선, 종양이 존재하는 대상체를 진단 또는 스크리닝 또는 대상체의 종양 발생에 대한 위험도를 측정하기 위해 대상체에서 종양의 진행을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 상기 대상체에게 유효량의 본 발명 상기 항체들, 항원들, 폴리뉴클레오티드들, 벡터들 또는 세포들을 투여하는 것을 포함한다. 특히, 본 발명에 따른 치료 및 진단적 적용들은 흑색종 및 유방암을 포함하고, 원발성 유방 암종 및/또는 전이를 포함하는 종양을 표적화하는 용도에 가장 적합하다. 달리 정의되지 않으면, 용어들 "종양", "암", "암종" 등은 여기서 교환적으로 사용된다.
따라서, 본 발명은 특히 종양 관련 질병을 진단 및/또는 치료하기 위해, 상기 인간 항체의 CDR을 하나 이상 포함하는 종양 항원 결합 분자의 용도를 포함한다. 바람직하게는, 상기 결합 분자는 본 발명의 항체 또는 그의 면역글로불린 사슬이다.
또한, 본 발명은 상기 기재된 항체들 중 하나의 항-유전형(idiotypic) 항체들에 관한 것이다. 이들은 항원 결합 부위 근처의 항체의 가변 영역에 위치한 고유한 항원성 펩티드 시퀀스에 결합하는 항체들 또는 다른 결합 분자들이다. 다른 양태에서 본 발명은 본 발명의 상기 기재된 항체들, 항원-결합 단편들, 폴리뉴클레오티드들, 벡터들 또는 세포들을 포함하는 진단 조성물 및 선택적으로 면역 또는 핵산 기반 진단 방법들에 사용된 통상적으로 사용된 시약과 같은 검출용 적절한 수단들에 관한 것이다. 본 발명의 항체들은, 예를 들어, 그들이 액체 상으로 이용되거나 고체상 담체에 결합할 수 있는 면역분석법들의 사용에 적합하다. 본 발명의 항체를 이용할 수 있는 면역분석법들의 예들은 직접 또는 간접 형태의 경쟁적 및 비-경잭적 면역분석법들이다. 이러한 면역분석법들의 예들은 방사선면역측정법(RIA), 샌드위치(면역계수법), 유세포분석 및 웨스턴 블랏 분석이다. 본 발명의 항원들과 항체들은 다수의 담체들에 연결될 수 있고 그에 특이적으로 연결된 세포들을 분리하는 데 유용하다. 잘 알려진 담체들의 예들은 유리, 폴리스티렌, 폴리염화비닐, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 덱스트란, 나일론, 아밀로스들, 천연 및 변형 셀룰로오스들, 폴리아크릴아미드들, 아가로즈들, 및 자철광을 포함한다.
본 발명 목적들을 위한 담체의 성질은 수용성이거나 불용성일 수 있다. 당업자에게 공지된 많은 다양한 표지들 및 표지 방법들이 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 표지 유형들의 예들은 효소들, 방사성 동위원소들, 금속 콜로이드, 형광 화합물들, 및 생물발광 화합물들을 포함한다; 또한 상기 구체예들을 참조.
추가 구체예에 의해, 본 발명의 결합 항체들은 시험 개체로부터 혈액 샘플, 림프 샘플 또는 기타 다른 체액 샘플을 획득하고 항체-항원 복합체들의 형성을 가능하게 하는 조건들하에서 체액 샘플을 본 발명의 항체와 접함으로써 개체에서 종양을 진단하는 방법에 또한 사용될 수 있다. 이러한 복합체들의 레벨은 그 후 당업계에 공지된 방법들에 의해 측정되고, 대조군 샘플에서 형성된 것보다 현저히 높은 레벨은 시험 개체에서 종양을 나타낸다. 같은 방식으로, 본 발명 항체들과 결합된 특정 항원도 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 항원을 포함하는 시험관 내의 면역분석법에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 구체예는 특히 암, 흑색종 및 유방암의 측정에 관한 것이다. 상기 방법들은 NY-ESO-1에 대한 분석을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명은 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체들에 대한 상기 환자로부터 채취된 샘플을 분석하고, 획득된 값을 상기 환자로부터 채취된 이전 샘플을 분석하여 획득된 이전 값과 비교하는 것을 포함하는-그들 사이의 차이는 상기 암 상태의 단계의 변화를 나타내고, 종양 (관련) 항원 NY-ESO-1을 나타내는 종양 환자에서 암 상태의 단계, 예를 들어, 암 발병의 완화, 진행을 결정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 상응하는 방법은 국제 출원 WOO 1/07917에 공개되었다. 또한 이러한 방법은 본 발명의 항체와 함께 수행될 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 항체로 NY-ESO-1 단백질 존재를 분석하여 NY-ESO-1 발현에 대한 상기 샘플을 분석하는 것을 포함하고, 여기서 NY-ESO-1 발현은 상기 샘플에서 암 세포의 존재의 표지자인, 샘플에 있는 암 세포들, 예를 들어, 유방암 세포들을 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 적용될 수 있는 유사한 방법은 SCP-I, NY-ESO-1 및 SSX-2에 대한 미국 특허 No. 6,338,947에 기재되었다.
본 명세서에서, 본 발명은 또한 이 목적을 위해 특별히 설계된 방법들에 관한 것이다. 예를 들어, 암, 특히 전이로 고통받는 종양 환자들에 존재할 수 있는 자가항체들을 측정하기 위해 본 발명의 항원 또는 항체들 또는 본 발명의 등가의 항원-결합 분자들을 장착한 단백질- 또는 항체-기초 분석이 사용될 수 있다. 마이크로분석 면역분석들의 설계는 Kusnezow et al., MoI. Cell Proteomics 5 (2006), 1681-1696에 요약되어 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 항원을 장착한 마이크로분석들에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 상기 기술된 성분들, 다시 말하면 본 발명의 항체 또는 그의 결합 단편, 항원, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약학 및 진단 팩 또는 키트 각각을 제공한다. 약학 또는 생물학적 제품들의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관의 소정 양식에 있는 게시물은 이러한 용기(들)과 관련될 수 있다. 이 게시물은 인간 투약에 대한 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 기관의 승인을 나타낸다. 추가적으로 또는 대안적으로 키트는 적절한 진단 분석들에서 사용 시약들 및/또는 지침들을 포함한다. 그 조성물, 다시 말하면 본 발명의 키트는 물론 종양-관련 항원 NY-ESO의 존재를 수반하는 질병의 진단, 예방 및 치료에 특히 적합하고, 특히 상기 종양들의 치료에 적용가능하다.
용어들 "치료", "치료"등은 여기서 일반적으로 바람직한 약학 및/또는 생물학적 효과를 획득함을 의미한다. 상기 효과는 질병 또는 그의 증상을 완전 또는 부분적으로 예방한다는 측면에서 예방적이고/거나 질병 및/또는 그에 기인한 부정적 효과를 부분 또는 완전히 치료한다는 측면에서 치료적일 수 있다. 여기서 사용된 용어 "치료"는 포유동물, 특히 인간에서 질병의 모든 치료를 포함하고, (a) 아직 병에 걸렸다고 진단되지는 않았지만 병에 걸리기 쉬운 대상체에서 발생한 질병을 예방; (b) 질병을 억제, 다시 말하면 그의 진행을 저지; 또는 (c) 질병을 완화, 다시 말하면 질병의 퇴행을 야기를 포함한다. 또한, 용어 "대상체" 또는 "환자"는 이상, 장애 또는 질병의 치료가 필요한 포유동물, 바람직하게는 인간을 나타낸다.
본 발명의 약학 조성물들은 당업계에 잘 알려진 방법들에 따라 조제될 수 있다; 선례 Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) by the University of Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683-306472를 참조. 적합한 약제학적 담체들은 당업계에 잘 알려져 있고 phosphate buffered saline 용액들, 물, 기름/물 유제들, 다양한 형태들의 습윤제들, 멸균 용액들 등과 같은 유제들을 포함한다. 이러한 담체들을 포함하는 조성물들은 잘 알려진 기존의 방법들에 의해 제형화될 수 있다. 이 약학 조성물들은 적당한 용량으로 대상체에 투여될 수 있다. 적절한 조성물들은 다양한 방법들, 예를 들어, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 국소적 또는 피내로 투여될 수 있다. 비강 스프레이 제형들과 같은 에어로졸 제형들은 활성제의 정제 수용액들 또는 다른 용액들과 보존제들 및 등장화제들을 포함한다. 이러한 제형들은 비강 점막들과 융화되는 pH 및 등장 상태로 조절되는 것이 바람직하다. 직장 또는 질 투여 제형들은 적당한 담체와 함께 좌약으로 투여될 수 있다.
투여용량은 주치의 및 임상 인자들에 의해 결정될 것이다. 의료계에 잘 알려진 것처럼, 환자에 대한 투여용량들은 환자의 키, 체표면적, 나이, 투여될 특정 화합물, 성, 투여 시간 및 루트, 일반 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물들을 포함하는 많은 인자들에 달려있다. 일반적 복용량은, 예를 들어, 0.001에서 1000㎍ 범위일 수 있다(또는 이 범위에서 발현 또는 발현 억제를 위한 핵산의); 그러나, 특히 상기 인자들을 고려하여 이 모범 범위 이하 또는 이상의 범위를 상상할 수 있다. 일반적으로, 약학 조성물의 정기투여 처방은 일일 1㎍에서 10mg 범위이내이어야 한다. 만약 처방이 연속 주입이면, 그것은 분 및 체중 kg당 각각에 또한 1㎍에서 10mg 범위이내이어야 한다. 진행은 주기적 평가에 의해 측정될 수 있다. 경구투여를 위한 혼합제는 무균 수성 또는 비-수성 용액들, 현탁액제, 및 유제들을 포함한다. 비-수성 용매들의 예들은 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 올리브 오일과 같은 식물성 오일들, 및 에틸올레이트(ethyl oleate)와 같은 주사가능한 유기 에스테르들이다. 수성 담체들은 식염수 및 완충제를 포함하는 물, 알코올/수성 용액들, 유제들, 또는 좌제들을 포함한다. 비경구 용액들은 염화나트륨 용액, 링거 포도당, 포도당 및 염화나트륨, 유산화 링거, 또는 불휘발성유들을 포함한다. 정맥주사용 용액들은 체액 및 영약 보충액들, 전해질 보충액들 (링커 포도당과 같은)등을 포함한다. 방부제들 및 기타 첨가제들, 예를 들어, 항균제들, 항산화제들, 킬레이트제들, 및 불활성 가스등도 첨가될 것이다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 조성물의 사용목적에 따라, 항-종양제들 및 세포독성약물들과 같은 약품들을 더 포함할 수 있다. 게다가, 약학 조성물은 본 발명의 조성물이 수동면역에 대한 본 발명의 항체 또는 능동면역에 대한 동족 항원을 포함한다면, 또한, 예를 들어, 백신으로 제형화될 수 있다. NY-ESO-1 같은 종양 관련 항원들을 사용하는 암 치료를 위한 백신 제형들은 국제출원 WO2005/105139에 기재되어 있다. 또한, 다른 제제들의 공동-투여 또는 순차 투여가 바람직할 수 있다.
치료적 유효량은 증상들 또는 상태를 개선시키기 충분한 활성 성분의 양을 나타낸다. 이러한 화합물들의 치료 효과 및 독성은 세포 배약액들 또는 실험동물들에서 표준 약학 절차들, 예를 들면, ED50(개체의 50%에서 치료적 유효량)및 LD50(개체의 50%에서 치사량)에 의해 측정될 수 있다. 치료 및 독성 효과들 사이의 용량비는 치료지수이고, 그것은 비율 LD50/ED50로 표현될 수 있다. 바람직하게는, 조성물내의 치료제는 전이 및 세포의 신생물성장을 예방하기에 충분한 양으로 존재한다.
본 발명에 따른 약학 조성물들은 바람직하게는 종양들 및 흑색종, 원발성 유방암, 간세포암종 및 전이를 포함하나 이에 한정되지 않는 암의 치료에 사용될 수 있다.
이들과 다른 구체예들이 본 발명의 설명 및 실시예들에 공개되고 포함된다. 본 발명에 따라 사용되는 물질들, 방법들, 용도들 및 화합물들에 관한 추가 문헌들은 표본전자장치를 사용하여 공공도서관 및 데이터베이스에서 검색될 수 있다. 예를 들어 국립보건원에서 국립 생명 공학 센터 및/또는 국립 의학 도서관에 의해 운영되는 공용 데이터베이스 "메드라인"이 사용될 수 있다. 유럽 분자 생물학 연구소(EMBL)의 일부인, 유럽 생물 정보학 연구소(EBI)의 것들과 같은 추가 데이터베이스들 및 웹 주소들은 당업자에게 공지되어 있고 또한 인터넷 검색 엔진들을 사용하여 얻을 수 있다. 생명공학에 대한 특허 정보의 개요 및 소급적 문헌조사 및 최신 정보에 유용한 특허정보의 관련 소스들의 조사는 Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364에 주어진다.
상기 공개는 일반적으로 본 발명을 설명한다. 달리 정의되지 않는 한, 여기에 사용된 용어는 옥스포드 대학이 1997년 출판하고 2000년 개정하고 2003년 재판한 생화학 및 분자 생물학의 옥스퍼드 사전에서 제공된 정의로 주어진다. 여러 문헌들이 이 명세서를 통해 언급되었다. 전체 참고 문헌들은 청구항들 바로 앞에있는 명세서의 끝부분에서 찾을 수 있다. 모든 인용 문헌들의 내용들(이 출원인 및 제조업자의 명세서들, 지침, 등을 통해 인용된 참고 문헌들, 발행된 특허, 발행된 특허 명세서를 포함하는)은 참조에 통합되었다; 그러나, 어떤 인용 문헌이 실제로 본 발명의 선행 기술이라는 언급은 없다.
이해목적으로 제공되고 본 발명의 범위를 제한하지 않는 하기의 구체적 실시예들을 참조함으로써 보다 완벽한 이해를 얻을 수 있다.
도 1: 기억 B 세포 배양 웰 12D7은 NY-ESO-1에 특이한 항체들을 포함한다.
기억 B 세포를 배양한 배지는 NY-ESO-1-특이 인간 항체들의 존재 하에서 A)전장 재조합 NY-ESO-1을 나타내는 ELISA에서 B) NY-ESO-1-양성 유방 암종(mc) 및 NY-ESO-1-음성 대조군 조직(ct)의 면역화학검사에서 분석되었다. ELISA-양성 기억 B 세포 배양 웰들(9Dl, 12D7)의 배양 배지를 염색된 것을 보여 준다. C) 웰 12D7에 포함된 NY-ESO-1-특이 항체는 IgG 서브클래스 IgGl-4에 대한 이차 항체들에 의하여 수반되는 배양 웰 12D7에서 NY-ESO-1-양성 조직과 B 세포 배양 배지와의 염색에 의 해 나타낸 것과 같이 IgGl 서브클래스이다.
도 2: 배양된 기억 B 세포들의 단세포 RT-PCR에 의해 얻은 재조합 인간 항체 12D7 클론 번호 4는 ELISA 및 조직 섹션들에서 NY-ESO-1을 특이적으로 인식한다. 클론 12D7 4번을 발현하는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 발현 벡터들로 형질감염된 293T HEK 세포들로부터 얻은 상층액(SN)을 A) 전장 NY-ESO-1을 나타내는 ELISA에서 NY-ESO-1에 대한 특이도를 테스트하였다. ELISA 값들은 희석하지 않은 SN (1:12D7.4 SN), 1/10 희석 (2:12D7.4 SN) 및 1/100 희석 (3:12D7.4 SN)에 대한 것이다. 비교를 위해, 1/100으로 희석하여 사용된 환자의 혈장으로부터 유래한 기억 B 세포 배양액으로부터 얻은 ELISA 시그널을 또한 보여준다(4). 대조군으로서, 12D7.4와 같은 방법으로 생산된 비관련성 재조합 항체의 형질감염에 대하여 얻은 SN의 NY-ESO-1 코팅된 ELISA 플레이트에 대한 결합 부존재 및 비관령성 항원으로 코팅된 ELISA 플레이트에 대한 12D7 클론 4번의 결합 부존재를 보여준다(5). B) NY-ESO-1-양성 유방 암종(mc) 및 NY-ESO-1-음성 대조군 조직(ct)의 면역화학검사는 재조합 12D7 4번의 유방 암종에 대한 특이적 결합을 보여준다.
도 3: 인간 단일클론 항체 Manhattan의 특성들. 에피토프 맵핑은 ELISA 플레이트들 상에 코팅된 전체 NY-ESO-1 단백질을 스패닝하는 중복 펩티드들을 사용하여 수행되었다. A) Manhattan은 NY-ESO-1 단백질의 N-말단에서 아미노산 11을 30에 스패닝하는 펩티드에 특이적으로 결합한다. B) 환자 Cl의 혈청은 NY-ESO-1의 N-말단 및 중간-영역에서 다양한 펩티드 단편들을 인식한다. C) NY-ESO-1의 11 내지 30 개의 펩티드에 대한 경쟁 ELISA 실험들을 통해 Manhattan의 결합력은 KD=IO-10으로 측정된다. D) 인간 단일클론 항체 Manhattan으로 NY-ESO-1-양성 세포주 SK-MEL-37의 면역형광염색은 핵 마커 Hoechst로 NY-ESO-1 염색의 코-로칼라이제이션을 보여준다. MOG에 특이한 대조군 항체 인간 재조합 8-15c5는 결합하지 않는다.
도 4: 가변 영역, 이를테면 항체 12D7의 중쇄 및 kappa 경쇄의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열들. 상보성 결정 영역들(CDRs)은 아래에 설명된다.
본 실시예들은 본 발명을 더 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않는다. 여기에 사용된 것과 같은, 종래 방법들에 대한 상세한 설명들은 인용 문헌에서 찾을 수 있다; Beers 및 Berkow의 17번째 판 "The Merck Manual of Diagnosis and Therapy"(Merck & Co., Inc. 2003)를 또한 참조.
본 발명의 실행은 다른 표시가 없으면, 당업계의 기술에 해당하는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 종래 기술들을 사용한다. 이 발명의 실행에 유용한 일반 기술들을 더욱 정교화하기 위해, 실행자는 세포 생물학 및 조직 배양에 대한 표준 교과서 및 리뷰들을 참조할 수 있다; 실시예들에 인용된 참고문헌들을 또한 참고. 분자 및 세포 생화학의 일반 방법들은 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); DNA Cloning, Volumes I and II (Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (Hames and Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (Freshney and Alan, Liss, Inc., 1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller and Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (Ausubel et al., eds.); and Recombinant DNA Methodology (Wu, ed., Academic Press). Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller and Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, VoIs. 154 and 155 (Wu et al., eds.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (Weir and Blackwell, eds., 1986). Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Non-viral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplitt & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (Lefkovits ed., Academic Press 1997); and Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998). 본 기재에 관한 유전자 조작을 위한 키트, 시약, 및 클로닝 벡터는 BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich, 및 ClonTech과 같은 상업적인 벤더로부터 구입하였다. 세포 배양 및 배지 선택의 일반적인 기술은 Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8 (1997), 148); Serum-free Media (Kitano, Biotechnology 17 (1991), 73); Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991), 375); 및 Suspension Culture of Mammalian Cells (Birch et al., Bioprocess Technol. 19 (1990), 251); Extracting information from cDNA arrays, Herzel et al., CHAOS 11 (2001), 98-107 같은 표준 교과서들에서 발견할 수 있다.
보충 방법들
환자 물질
종양 물질 및 정기조직병리학적 분석에 필요하지 않은 정상조직은 액체 질소로 얼려졌다. 기억 B 세포들의 분리를 위한 혈청 및 혈액은 환자 C1으로부터 지역 윤리위원회의 승인을 받고 환자가 서명한 동의서에 의거하여 수집되었다.
기억 B 세포 배양
기억 B 세포들은 2단계 선정 절차에 의해 인간 말초 혈액 림프구들로부터 분리되었다. pan B 세포 마커 CD22가 MACS 기술(Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany)을 사용하는 B 세포들의 양성 선택에 사용되었다. PBL은 MACS-결합 항 인간 CD22 단일클론항체들, phycoerythrin-결합 단일클론항체들, 항 인간 IgD 및 APC-결합 항체들, 항 인간 IgM, IgA, CD3, CD8, CD56 (Becton Dickinson, Basel, Switzerland)을 사용하여 표지되었다. Pan B 세포들은 midi MACS 장치 및 LS 컬럼들 (Miltenyi)을 사용하는 CD22-양성 세포의 양성 선정에 의해 분리되었고 그 후 MoFIo cell sorter (DakoCytomation, Fort Collins, USA)를 사용하는 phycoerythrin- 및 APC-음성 세포들의 선정이 수반되었다. CD22-양성 IgM-, IgD-, IgA-음성 B 세포들은 그후 B95-8 세포들로부터 얻은 상층액을 포함하는 EBV와 함께 CpG 2006 (6, 15)의 존재하에 10% 소태아혈청과 혼합된 RPMI 1640을 포함하는 B 세포-배지에서 배양되었다. 세포들은 자발적 기증자들로부터 제조된 30.000 irradiated feeder PBL 위의 B 세포 배지에 용기당 50세포들로 시드되었다.
배양 2주 후 B 세포 배양 배지는 NY-ESO-l-특이 항체들의 존재하에 ELISA 및 NY-ESO-l-양성 자가 및 비-자가 조직 섹션에 의해 스크린되었다.
ELISA
96 웰 스트립 웰 마이크로플레이트들 (Corning, NY, USA)은 1㎍/㎖ 재조합 NY-ESO-1 단백질을 각 용기에 25㎕를 넣어 4℃에서 하룻밤동안 PBS에서 반응시켜 코팅되었다. PBS-T로 플레이트를 씻고 5% 우유 분말(Rapilait, Migros, Switzerland)을 포함하는 PBS와 4℃에서 하룻밤동안 차단했다. B 세포 배양 배지, 환자 혈청 및 재조합 항체 혼합물들은 실온에서 2시간동안 배양되었다.인간 항체들과 NY-ESO-1의 결합은 당나귀 항-인간 IgG-HRP 이차 항체(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Cambridgeshire, UK)를 사용하여 측정되었고 그 후 TMB 기질 용액(TMB, Sigma, Buchs, Switzerland)을 사용하여 HRP 활성을 측정하였다.
에피토프 매핑 ELISA
전체 NY-ESO-1 단백질을 각 인접 펩티드들(Peptides&Elephants, Nuthetal, Germany)에 의해 공유된 10 aa 오버랩들로 스패닝하는 20mer 펩티드들은 Maxisorp ELISA 플레이트들(Nunc, Rochester, NY)을 코팅하는데 사용되었다. 인간 재조합 항체 Manhattan 또는 환자 혈청(PBS와 1:500으로 희석된)은 양고추냉이 과산화효소-결합 염소 항-인간 IgG+IgM(Jackson ImmunoResearch)을 사용하여 측정되었다.
경쟁적 ELISA
포화 실험들은 인간 단일클론 항체 Manhattan과 NY-ESO-1 11 내지 30 펩티드의 half-maximal 결합 농도를 1x10-9M 또는 0.15㎍/㎖로 확인했다.
경쟁 실험들에서, 증가한 농도의 NY-ESO-1 11 내지 30 펩티드는 0.15㎍/㎖의 농도로 Manhattan과 혼합되었고 혼합물은 그후 NY-ESO-1 11 내지 30으로 코팅된 ELISA 플레이트들에 옮겨졌다.
면역조직화학검사
지름이 0.6mm인 종양 조직들의 실린더들은 NY-ESO-1-양성 종양 조직 및 건강한 대조군 조직이 삽입된 파라핀으로부터 펀치되었다.종양 조직 및 건강한 대조군 조직의 실린더의 형성된 쌍들은 B 세포 배양 플레이트들 및 종래의 멀티채널피펫들의 마이크로타이터에 호환될 수 있는 차원인 2x4 그리드의 각 위치에 배치되었다.
면역조직화학검사는 포르말린-고정, 파라핀-포매된 조직에서 수행되었다.
열-기초 항원 회복법을 모든 슬라이드들에 적용했다. 다클론 토끼 항-인간 IgG (Dako, Baar, Switzerland)를 실온에서 30분간 사용시에 비-특정 형광은 차단되었고 그 후 1% 저지방 우유(Rapilait, Migros, Switzerland)에서 10분 동안 이차 차단이 이루어졌다. 1차 항체 또는 B 세포 배양 배지는 4℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 인간 항체들과 NY-ESO-1의 결합은 인간 IgG에 결합된 cy3-결합 이차 항체들(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Soham, UK)을 사용하여 측정되었다. 비오틴이 부착된 재조합 인간 항체 Manhattan의 염색은 Cy3- 또는 HRP-결합 스트렙트아비딘(Sigma, Buchs, Switzerland)을 사용하여 측정되었다. NY-ESO-1 항원의 양성 대조군으로서 쥐 항-NY-ESO-1 단일클론 항체(Zymed, South San Francisco, USA)가 사용되었다.
면역형광의 분석은 도립형광현미경(Leica, Heerbrugg, Switzerland)을 사용하여 수행되었다.
단세포-RT-PCR
기억 B 세포 배양액으로부터 얻은 단세포들을 PCR 시험관들에 넣었다. cDNA는 면역글로불린 G 중쇄, κ-경쇄 및γ-경쇄의 불변영역들에 특이한 프라이머들을 사용하여 제작되었다. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역들의 PCR 증폭은 표준 프로토콜들(7, 16)에 따라 수행되었다. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역들은 세미 네스티드 PCR을 사용하여 증폭되었다. 1차 라운드 PCR은 IgG 불변 영역에 특이한 프라이머들 및 중쇄 및 경쇄 Ig 가변 영역 족들(7)의 보존된 프레임워크 1 영역들에 특이적인 프라이머들을 사용하여 수행되었다. 그 후에, IgG 불변 영역에 특이한 내부 프라이머들 및 제한 영역들을 포함한 중쇄 및 경쇄 Ig 가변 영역 족들 의 프레임워크 1에 특이한 프라이머들을 사용하는 세미 네스티드 PCR이 (8)에 설명된 것처럼 사용되었다. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 PCR 생산물들은 IgGl, IgKappa 또는 IgLambda의 불변 영역을 포함하는 벡터들안에서 복제되었다.
항체 생산 및 정제
293 -T 인간 배아 신장 세포들은 10% 초-저 IgG FCS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 1% L-글루타민(Invitrogen, Basel, Switzerland)이 포함된 DMEM에서 배양되었다. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 혈장 DNA로 공동-형질감염은 표준 인산칼슘 침전법에 의해 수행되었다. 그 후 그 세포들은 1% Nutridoma SP (Roche, Rotkreuz, Switzerland)를 포함하는 무혈청 D-MEM에서 배양되었다. 8일후에 배양액에서 상층액을 모으고 고속 단백질 액체 크로마토 그래피(FPLC) (Amersham Biosciences, Upsala, Sweden)를 사용하여 protein G column (Amersham Biosciences, Upsala, Sweden)에서 IgG를 정제했다. 정제된 Manhattan 항체는 제조자 지시사항들(SIGMA, Buchs, Switzerland)에 따라 비오틴화되었다.
면역형광 SK-MEL-37 종양 세포들
SK-MEL-37 세포들을 현미경 슬라이드위에서 생육하고, 포름알데히드로 고정되고, 실온에서 10분 동안 1% Triton X-100으로 투과하였다. 1시간 동안 10% 염소 혈청과 차단후에 RT 세포들은 1㎍/㎖의 Manhattan 또는 음성 대조군 항체(재조합 형태의 인간 Fc 영역으로 발현된 hu8-18c5 (17))와 PBS/ 1% 염소 혈청/ 2% Triton X-100에서 4℃에서 하룻밤동안 배양되었다. 결합 항체들은 염소 항-인간 IgG Alexa Fluor(R) 546 (1 :300, Molecular Probes, Leiden, Netherland)와 1시간 동안 염색 함으로써 시각화되었다.RT. Microscopy는 Leica SP 5 현미경을 사용하여 수행되었다.
실시예 1: 흑색종 환자의 PBL로부터 NY-ESO-1-특이 B 세포들의 동정
흑색종 환자는 ELISA 및 생검으로 얻은 림프절 절편들에서 taa NY-ESO-1에 대한 혈청역가로 선정되었다. 전장 NY-ESO-1을 발현하는 재조합 우두 바이러스로 백신접종 후에 간에서 두 NY-ESO-1-양성 전이의 퇴행이 입증된 부분 임상 반응이 관찰되었다. 50㎖ 말초 혈액이 환자로부터 채혈되었고 Ig-전환 기억 B 세포들을 나타내는 표면 IgM/IgD 이중-음성 B 세포들이 불멸화 후에 변경된 Epstein Barr 바이러스 형질전환 프로토콜(6)을 사용하여 분리되고 배양되었다. 100.000개의 기억 B 세포들을 획득하였고 이를 96개의 웰 마이크로타이터 템플레이트에 웰 당 50개의 세포비율로 심었다. 배양 3주 후에 증식한 클론들이 배양 웰에서 관찰되었고 B 세포를 배양한 배지는 NY-ESO-1에 특이적인 항체들의 존재하에 검사되었다. 처음 스크리닝시에 재조합 전장 NY-ESO-1을 항원으로 사용하는 ELISA가 수행되었다. ELISA 신호들은 그들이 배경신호를 3배만큼 초과하면 양성으로 평가되었다. 총 2000개의 웰 중에서 9개의 ELISA-양성 기억 B 세포 배양 웰들이 동정되었다. ELISA를 사용하여 얻은 신호 대 노이즈 비의 예는 도 1A에 도시되었다. 그 후에 ELISA-양성 배양액들은 NY-ESO-1-양성 종양 조직을 사용하여 면역화학검사법으로 검사되었다 NY-ESO-1-양성 유방 암종 및 대조군으로서 건강한 유방 조직의 8쌍의 tissue rod으로 구성된 조직이 유리 슬라이드 위에 놓여졌다. 이 검사의 축소화 때문에 15㎕의 B 세포 배양 배지는 이 검사를 수행하기에 충분하다. 일부 기억 B 세포 배양 배지와 음성 대조군 배지를 단일 슬라이드위에서 비교하는 능력은 형광염색의 평가를 용이하게 하였다.
이 조직 검정에서 9개의 ELISA-양성 B 세포 배양액들의 평가는 한 배양액이 다른 8개의 배양액들에 비해 더 높은 염색 강도를 가짐을 확인했다. 이것은 도 1B에 도시되었고, 조직-반응성 배양액 12D7에서 획득한 면역형광과 조직-반응성이 아니라고 평가된 9Dl에서 획득한 면역형광이 비교되었다.
NY-ESO-1-특이적 항체에 대한 IgG-서브클래스 정보가 분자적 클로닝 단계에서 상실되었기 때문에 서브클래스-특이적인 이차 항체들 항 인간 IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4와 함께 NY-ESO-1-양성 조직 절편을 가지고 면역화학검사법을 사용하는 단계에서 결정하였다. 도 1C에서 보이는 것처럼, NY-ESO-1에 대한 조직 염색은 오직 이차 항체 항 IgGl에서 관찰된다.
실시예 2: 배양된 기억 B 세포들에 의해 분비된 NY-ESO-1-특이적 항체의 분자적 클로닝
식별된 항원-특이 EBV-형질전환된 인간 기억 B 세포들의 세포복제의 전 시도들은 성공적이지 못했다. 그러므로, 본 발명에 따라 상기 염색 패턴에 관여하는 항체 클론을 분리하기 위해서 웰 12D7로부터 채취된 단일 소팅 세포들의 RT-PCR에 기초한 분자 클로닝 전략에 착수했다.32개의 세포들이 채취되었고 단일세포들로서 PCR 시험관에 직접적으로 놓여졌다.
cDNA 합성 후에, 인간 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변 영역들은 nested PCR 방법(7)을 사용하여 증폭되었다. 32개의 소팅 세포들 중 16개의 중쇄 및 kappa 경쇄 서열들을 얻었다. lambda 경쇄 가변 서열들에 대한 PCR은 세포들 중 어느 것도 생성물을 주지 못했다. 시퀀스 분석은 그들의 상대 풍부성에 따라 넘버일된 4개의 독특한 항체 클론들을 동정했다. 클론 1은 16개의 세포중 8, 클론 2는 4개의 세포, 클론 3과 4는 각각 2개의 세포들에서 발견되었다.
그 후에 이 4개의 클론들 중 하나가 재조합 항체로 발현될 때 B 세포 배양 웰 12D7의 조건화된 배지에서 관찰된 것과 유사한 NY-ESO-1 염색을 야기하는지 결정되었다. 그 때문에, 중쇄 및 경쇄 가변 시퀀스들은 인간 IgGl 중쇄 및 인간 kappa 경쇄(8)의 불변 영역들을 제공하는 항체 발현 벡터들 속으로 클로닝되었다.웰 12D7의 배양 배지에서 동정된 NY-ESO-1-특이적 항체가 이 서브클래스가 됨이 측정되었기 때문에 IgGl의 불변 영역들이 사용되었다 (도.l C).
재조합 항체들을 ELISA 및 NY-ESO-1-양성 조직 섹션들에서 재-스크리닝함으로써 네 개의 클론들의 기능 분석이 수행되었다. 이를 위해서, 네 개의 클론들의 중쇄 및 상응하는 경쇄 발현 벡터들은 293 HEK 세포들로 형질감염되었고 그 형질감염된 세포들의 상층액은 ELISA 및 면역조직화학검사법으로 직접적으로 테스트되었다. 모든 네개의 상층액들은 항-인간-IgG-ELISA로 테스트되었을 때 기능적 IgGl을 생산했다. 클론 1 내지 3은 ELISA에서 NY-ESO-1에 대한 결합을 보이지 않은 반면, 클론 4는 마지막 1/100의 희석 테스트까지 양성이었다 (도.2 A). 이 클론은 또한 NY-ESO-1-양성 조직 섹션들을 사용하는 면역조직화학검사에서 특이적인 염색을 보여주었다 (도.2 B).
이것은 오리지날 NY-ESO-1-특이적 항체의 면역글로불린 가변 영역들의 시퀀 스들이 환자에서 발현될때 재생됨을 확증한다. 단순성을 위해서 12D7 4번은 "Manhattan"으로 명명되었고 일시적으로 형질감염된 HEK 세포들로부터 획득된 단백질 G 정제 물질을 사용하여 추가적인 특성화를 위해 사용되었다.
실시예 3: NY-ESO-1 특이 인간 단일클론 항체 Manhattan은 펩티드 NY-ESO-1 11 내지 30과 10
-10
의 해리상수로 결합한다.
NY-ESO-1에 대한 Manhattan에 의해 인식되는 에피토프를 동정하기 위해 ELISA를 전체 NY-ESO-1 단백질을 스패닝하는 오버래핑 펩티드들을 사용하여 수행되었다. 도 3A에 도시된 것처럼, Manhattan은 NY-ESO-1 단백질로부터 아미노산 11 내지 30을 나타내는 펩티드에 결합하나 아미노산 1 내지 20 또는 21 내지 40을 스패닝하는 두개의 인접 펩티드에는 결합하지 않는다. 이것은 Manhattan에 의해 인식되는 에피토프가 NY-ESO-1의 아미노산 20 근처의 이 두개의 펩티드들의 접합부에 있다는 것을 암시한다. 다른 것들 중에서 이 에피토프는 또한 환자 Cl의 혈청에 포함된 항체들에의해 인식되었다 (도. 3B).
Manhattan의 결합력은 플레이트 결합 펩티드와 경쟁하는 증가된 농도의 수용성 NY-ESO-1 11 내지 30 펩티드를 사용하여 경쟁 ELISA에 의해 측정되었다. 도 3C에 도시된 것처럼, Manhattan과 그의 동족 펩티드의 상호작용의 항원-결합 평형 해리 상수(KD)는 나노몰보다 더 낮은 범위에 있다. 인간 단일클론 항체 Manhattan에 대한 마지막 검사로서 NY-ESO-1-양성 세포주 SK-MEL-37에 대한 면역형광 분석이 수 행되었다 (9). 이 세포주와 Manhattan의 염색은 핵 마커 Hoechst으로부터 얻은 염색과 동일-위치한 핵 시그널을 나타낸다.
결론
상기 실험들은 인간 대상체들의 말초 혈액 림프구들(PBLs)로부터 직접적으로 유래한 항체들의 동정 및 분자적 클로닝을 위한 일반적인 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 흑색종 환자로부터 종양-관련 항원 NY-ESO-1에 대한 인간 단일클론 항체를 분리함으로써 입증될 수 있었다. NY-ESO-1 양성 조직에 대한 면역조직화학검사 및 ELISA에서 양성인 단기 불멸화 인간 기억 B 세포들의 배양액에서 분비된 항체들의 스크리닝으로부터 시작하여서 동정되었다. 이 일차 스크린 다음에 일차 스크리닝에서 검출된 항체를 분비하는 B 세포들의 단일 클론을 동정 및 분리하는 목적의 분자적 클로닝 단계가 수반된다.단일-세포 RT-PCR 후의 시퀀스 분석에 의해 밝혀진 것처럼 웰 12D7에서 단지 4 다른 클론들의 존재는 처음 심어진 50개의 세포들중에서 단지 소수 만이 불멸화되고 생존했다는 것을 암시한다.
재조합 후보 항체들의 후속 이차 스크린은 환자 PBL로부터 유래된 배양된 기억 B 세포들에 의해 생산된 오리지날 항체와 같이 동일한 염색 패턴을 가지고 있는 단일 단일클론 항체를 동정하였다. 그러므로, 항체는 그것이 원래 환자에서 발현되었을 때 성공적으로 회수될 수 있었다. 이 항체 "Manhattan"은 NY-ESO-1과 taa LAGE-1 사이에서 공유된 아미노산 위치 20근처의 N-말단 에피토프를 인식한다 (9). 이 에피토프는 또한 환자에서 발현한 항체의 genuine copy인 Manhattan의 경향을 지지하는 환자 Cl의 혈청에 의해 인식된다.
지금까지 Manhattan은 NY-ESO-1에 대한 첫번째 인간 단일클론 항체이고 또한 종양 항원 및 종양 관련 항원 각각에 대한 첫번째 환자-유래 친화력 성숙 항체가 될 것이다.
본 발명의 이 신규한 방법은 유전자 불안정 및 낮은 클로닝 효율성과 같은 B 세포들의 EBV-형질전환에 대한 내재적 어려움의 일부를 우회한다 (6, 10). EBV-불멸화된 기억 B 세포들로부터 인간 단일클론 항체들의 분리가 이전 연구에서 성공적으로 수행되었던 반면에(6), 본 발명의 상기 방법 전에 시도되었던 NY-ESO-1 특이 항체들을 EBV-형질전환 및 세포 클로닝 기술들을 사용하여 같은 환자로부터 분리하는 전 시도들이 세포 스크리닝에서 동정된 상당한 숫자의 기억 B 세포 배양액에도 불구하고 실패했다는 것을 언급하는 것은 주목할만하다.
본 발명의 두번째 목적은 조직-반응성을 가지는 종양-관련 항원 NY-ESO-1에 대한 항체를 분리하는 것이다. 이것은 환자의 혈청이 생검으로 얻은 NY-ESO-1-양성 자가 조직과 반응하는 항체들을 포함한다는 관찰에서 시작되었다. 그 때문에 기억 B 세포 배양액들을 스크리닝하기 위해서 마이크로어레이 기술이 채택되었다. 이것은 고전적 방법인 면역조직화학검사법과 비교할 때 몇가지 이점들이 있다.
첫째, 수개의 샘플들을 분석 및 비교하는 수개의 복제 위치의 하나의 단 슬라이드에 대한 유용성 둘째, 음성 조직에 인접한 양성 조직에 위치할 가능성은 크게 그 민감성이 개량, 기억 B 세포 배양 배지를 가지는 배양은 종종 매우 약한 염색을 초래하므로 그 특징은 중요
셋째, 기억 B 세포 배양액의 양은 일반적으로 200㎕보다 적으므로 또한 결정적 요인이 되는 배양 배지를 이 분석의 소형화는 훨씬 적게 필요로 한다. 환자의 혈청 및 인간 단일클론 항체 Manhattan이 고정 조직 절편들을 인식한다는 관찰은 NY-ESO-1-양성 세포들을 제거하기 위해 세포 수준에서 작용하는 항체 유도된 면역 효과기 기전의 유도를 통하여 적어도 직접 치료 역할에 대한 생체내 상황과 관련없을수도 있다. NY-ESO-1은 세포내 항원(11)으로 기재되었고 이 연구에서 핵, 적어도 세포주 SK-Me-37에 위치하는 것으로 보여진다. 이 내용에서, 비오틴화된 Manhattan를 사용한 살아있는 SK-Me-37에 대한 표면 염색은 음성이다. Manhattan의 분리는 환자-유래 종양-특이적 항체들의 치료 중요성을 평가하는 중요한 단계를 구성한다.
이러한 항체들이 치료 효과들을 나타내는 것을 설명하는 몇가지 가설들이 있다.
첫째, 그것은 미래 백신 프로토콜에 대한 어쥬번트로서 작용한다. Manhattan과 NY-ESO-1의 공동투여로 형성된 면역 복합체들은 세포 면역 반응들의 유도를 증가시킬수 있었다 (12).
두번째 가능성은 종양환자들에서 이 종류의 항체들의 병태생리학적 역할이다.NY-ESO-1은 자주 환자의 나쁜 예후와 관련된 체액성 반응들을 유도한다 (13). 이것은 종양이 자람에 따라 항원의 양이 증가된 것에 기인하는 단순한 상관관계일수 있는 반면에, 이 B 세포 반응의 면역허용 역활을 또한 가정할 수 있다. 이 가설에 의하면, 괴사성 또는 예정세포사멸성(apoptotic) 종양 세포들에 의하여 분비되는 자유 항원은 강력한 B 세포 반응을 유도할 수 있고, 그 후 그 B 세포들은 면역 복합체들의 Fc-수용체-매개성 흡수의 결과로써 항원을 제공할 수 있다 (14). B 세포들이 약한 APC일 수 있기 때문에, 이 제공은 NY-ESO-1-반응성 T 세포들의 내성을 유도할 수 있고 그 결과 종양 거부반응을 예방할 수 있다. F(ab)가 Fc-수용체들과 결합하지 않고 여전히 항원을 포획하기 때문에 종양 진행의 초기 단계에서, 재조합 Manhattan F(ab)들의 투여는 B 세포들에 의한 항원의 흡수를 방해할 수 있다. 이것은 또한 NY-ESO-1-특이적 T 세포들에서 내서 내성 유도를 예방할 수 있다.
참고문헌들
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<160> 11
<170> KopatentIn 1.71
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<212> DNA
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tcctgtgcag cctctggatt cagctttatt gattatggca tgagttgggt ccgccaagtt 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtcgctggc atgaattgga gcggcgataa aaaaggtcat 180
gcggagtctg tgaagggccg attcatcatt tccagagaca acgccaagaa caccctgtat 240
ctagaaatga gcagcctaag agtcgaagac acggccctgt atttttgtgc gagaggggag 300
tatagcaatc ggttcgaccc ccggggccgg ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ile Asp Tyr
20 25 30
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Pro Gly Gly Asn
20
Claims (28)
- 종양-관련 항원 NY-ESO-1을 인식할 수 있는 인간 항체 또는 그의 결합 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 결합 단편은 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 가지는 에피토프에 결합하는 인간 항체 또는 그의 결합 단편.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 결합 단편은 단쇄 Fv 단편 (scFv), F(ab') 단편, F(ab) 단편, F(ab')2 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 인간 항체 또는 그의 결합 단편.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 결합 단편은 그의 가변 영역에 도 4에 도시한 (VH)의 아미노산 서열(서열번호 2)과 (VL)의 아미노산 서열(서열번호 4)을 포함하는 가변 영역의 VH 및/또는 VL의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 인간 항체 또는 그의 결합 단편.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 결합 단편은 도4에 도시된 것과 같은 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열을 포함하는 인간 항체 또는 그의 결합 단편.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 결합 단편은 적어도 약 10-9M의 결합 친화력을 가지는 것을 특징으로 하는 인간 항체 또는 그의 결합 단편.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체에 의해 인식되는 아미노산의 길이가 50개를 넘지 않는 항원.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 결합 단편의 적어도 면역글로불린 사슬의 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
- 선택적으로 상기 항체의 다른 쪽 면역글로불린 사슬의 가변 영역을 암호화하는 제8항의 폴리뉴클레오티드와 결합하는, 제8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 제8항의 폴리뉴클레오티드 또는 제9항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- (a) 제10항의 세포를 배양하는 단계; 및(b) 배양액에서 상기 항체 또는 그의 결합 단편 또는 면역글로불린 사슬(들)을 분리하는 단계를 포함하는, 항체 또는 그의 결합 단편 또는 면역글로불린 사슬(들)을 제조하는 방법.
- 제8항의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되거나 제11항의 방법에 의해 획득할 수 있는 항체, 그의 면역글로불린 사슬 또는 결합 단편.
- 제1항 내지 제6항 또는 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 결합 단편은 검출가능하게 표지되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 결합 단편.
- 제13항에 있어서, 검출가능한 표지는 효소, 방사성 동위 원소, 형광물질 및 중금속으로 구성된 군으로부터 선택되는 항체 또는 결합 단편.
- 제1항 내지 제6항 또는 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 결합 단편은 약에 부착되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 결합 단편.
- 제1항 내지 제6항 또는 제12항 내지 제15항 중 어느 하나의 항체 또는 결합 단편, 제7항의 항원, 제8항의 폴리뉴클레오티드, 제9항의 벡터 또는 제10항의 세포를 포함하는 조성물.
- 제16항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 약학 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제17항에 있어서, 상기 약학 조성물은 종양들의 치료에 유용한 부가제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항 내지 제6항 또는 제12항 내지 제15항 중 어느 하나의 항체 또는 결합 단편, 제7항의 항원, 제8항의 폴리뉴클레오티드, 제9항의 벡터 또는 제10항의 세포; 및 선택적으로 면역 또는 핵산 기반 진단방법에서 통상적으로 사용되는 시약들을 포함하는 진단 조성물.
- 종양의 진행을 치료 또는 예방하기 위한 약학 또는 진단 조성물의 제조; 종양과 관련된 증상들을 개선; 종양이 존재하는 대상체를 진단 또는 스크리닝 또는 대상체의 종양 발생의 위험도를 측정하기 위한, 제1항 내지 제6항 또는 제12항 내지 제15항 중 어느 하나의 항체 또는 결합 단편 또는 그것 중 하나의 실질적으로 등가의 결합 특이성들을 가지는 항체 또는 유전자형 항체(idiotypic antibody), 제7항의 항원, 제8항의 폴리뉴클레오티드, 제9항의 벡터 또는 제10항의 세포의 용도.
- 제20항에 있어서, 상기 약학 조성물은 정맥 내, 근육내, 피하, 복강내 투여 또는 에어로졸로 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제1항 내지 제6항 또는 제12항 내지 제15항 중 어느 하나의 항체 또는 결합 단편 또는 그 중 하나의 실질적으로 등가의 결합 특이성들을 가지는 항체 또는 그 유전자형 항체, 제7항의 항원, 제8항의 폴리뉴클레오티드, 제9항의 벡터 또는 제10항의 세포의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 종양과 관련된 증상들을 개선; 종양이 존재하는 대상체를 진단 또는 스크리닝 또는 대상체의 종양 발생의 위험도를 측정하기 위한, 대상체에서 종양의 진행을 치료 또는 예방하는 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 항체는 정맥 내, 근육 내, 피하, 복강내 투여 또는 에어로졸로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제6항 또는 제12항 내지 제15항의 항체 또는 그 결합 단편 또는 상응하는 항-유전자형 항체의 CDR을 하나 이상 포함하는 치료적 유효량의 종양 항원 결합 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 종양과 관련된 질병을 진단 및/또는 치료하는 방법.
- 제20항 또는 제21항 또는 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양은 원발성 유방 암종 및/또는 전이를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도 또는 방법.
- 제1항 내지 제6항 또는 제12항 내지 제15항 중 어느 하나의 항체 또는 결합 단편, 제7항의 항원, 제8항의 폴리뉴클레오티드, 제9항의 벡터 또는 제10항의 세포, 선택적으로 시약들 및/또는 사용 지침들을 포함하는, 종양의 진단을 위한 키트.
- 종양에 대한 치료 및/또는 진단 시약을 생체내에서 감지 또는 타게팅하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항체의 CDR을 하나 이상 포함하는 종양 항원 결합 분자의 용도.
- 실시예 2에 기재된 배양된 기억 B 세포들에 의해 분비된 NY-ESO-1-특이적 항체를 분자적 클로닝하는 방법.
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