CN102317316B - 人抗α突触核蛋白自身抗体 - Google Patents

人抗α突触核蛋白自身抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN102317316B
CN102317316B CN200980156871.XA CN200980156871A CN102317316B CN 102317316 B CN102317316 B CN 102317316B CN 200980156871 A CN200980156871 A CN 200980156871A CN 102317316 B CN102317316 B CN 102317316B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
synapse nucleoprotein
disease
cell
synapse
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200980156871.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN102317316A (zh
Inventor
安德里亚斯·卫霍芬
简·格林
罗杰·尼奇
克里斯多夫·霍克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitaet Zuerich
Biogen International Neuroscience GmbH
Original Assignee
Universitaet Zuerich
Panima Pharmaceuticals AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40636880&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN102317316(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Universitaet Zuerich, Panima Pharmaceuticals AG filed Critical Universitaet Zuerich
Publication of CN102317316A publication Critical patent/CN102317316A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102317316B publication Critical patent/CN102317316B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
    • A61K49/16—Antibodies; Immunoglobulins; Fragments thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2835—Movement disorders, e.g. Parkinson, Huntington, Tourette

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)

Abstract

提供了新的人α突触核蛋白特异性自身抗体及其片段、衍生物和变体，以及与之相关的方法。还公开了与α突触核蛋白特异性抗体相关的分析、试剂盒和固体支持体。所述抗体、免疫球蛋白链、及其结合片段、衍生物和变体可用于药物组合物和诊断组合物，分别用于α突触核蛋白靶向免疫治疗和诊断。

Description

人抗α突触核蛋白自身抗体
技术领域
本发明总体上涉及新的突触核蛋白特异性结合分子，特别是分别识别α突触核蛋白和α突触核蛋白聚集形式的人抗体及其片段、衍生物和变体。此外，本发明涉及包含此类结合分子、抗体及其模拟物的药物组合物和诊断组合物，可用作鉴定血浆和CSF中α突触核蛋白毒性物类的诊断工具并且还可用于治疗与α突触核蛋白聚集物相关的病症的被动免疫接种策略，所述病症例如帕金森病(PD)、路易体痴呆(DLB)和阿尔茨海默病(AD)路易体变异型及其他突触核蛋白病。
背景技术
蛋白质错折叠和聚集是许多神经变性疾病的病理方面。α突触核蛋白的聚集物是路易体和与帕金森病(PD)相关的路易突起的主要组分。天然未折叠的蛋白α突触核蛋白可采取不同的聚集形态，包括寡聚体、初原纤维和原纤维。已经显示小寡聚体聚合物是特别有毒的。
针对α突触核蛋白的天然存在的自身抗体已经在健康人中被监测，并且在患者中改变的水平与特定神经退行性疾患相关；参见综述Neff等，Autoimmun.Rev.7(2008)，501-507。因此，罹患帕金森病的患者中天然存在的抗体，自发地或在接种后，特别是在健康患者中，可以对α突触核蛋白聚集起防护作用；参见例如Woulfe等，Neurology 58(2002)，1435-1436和Papachroni等，J.Neurochem.101(2007)，749-756。迄今，自身抗体的治疗意义难以评估。这主要是由于缺乏它们分离和随后体外鉴定的直接的实验方法。
最近，已经在血浆和CSF中细胞外报道了α突触核蛋的寡聚体物类(El-Agnaf等，FASEB J.20(2006)，419-425)，PD小鼠模型中免疫接种研究显示，针对α突触核蛋白的细胞外小鼠单克隆抗体可以减少细胞内α突触核蛋白聚集物的累积(Masliah等，Neuron，46(2005)，857-868)，支持了如下想法：中和神经毒性聚集物而不干扰单聚合体α突触核蛋白的有益功能的抗体可能是有用的治疗剂。然而，考虑到其非人来源，基于鼠的抗体在人中的治疗功用受到人抗小鼠抗体(HAMA)应答的妨碍。
Emadi等J.Mol.Biol.368(2007)，1132-1144，描述了从基于针对α突触核蛋白的人序列的噬菌体展示抗体文库分离单链抗体片段(scFv)，其仅结合α突触核蛋白的寡聚体形式并且在体外抑制α突触核蛋白的聚集和毒性。然而，尽管通过噬菌体展示产生scFv是非常简单的，但是该技术具有严重的缺点，因为如此产生的抗体具有针对自身抗原不希望的交叉反应性风险，并且缺乏由人免疫系统产生的进化优化的天然人抗体的特征。而且，此类抗体可能不够特异性，因为在正常生理环境和功能上下文中与其他蛋白和/或与靶蛋白的交叉反应性。例如，在帕金森病的情况下，与α突触核蛋白的生理衍生物也交叉反应的抗体具有引起与生理靶结构的正常功能相关的副作用。在该方面，不希望的自身免疫疾病将被彻底诱导-在采用还以变体形式生理出现的蛋白结构的活性免疫接种实验的概念设计中很难计算的风险。
最近，Seitz等(81.Kongress der Deutschen Gesellschaft für Neurologiemit Fortbildungsakademie Hamburg 10.-13.09.2008)报道了通过亲和色谱从不同免疫球蛋白溶液和但血液供体样品分离抗α突触核蛋白多克隆自身抗体。然而，除了该方法提供仅有限量的所需抗体的事实以外，多克隆抗体具有仅有限的治疗应用用途，例如因为它们的异质性和被具有不希望的副作用的其他α突触核蛋白结合分子污染的风险。同样，多克隆抗体的诊断价值被减少，因为抗体组合物的变异性将影响总体特异性和反应性。对于蛋白抗体而言，由于错折叠而聚集和沉积的主题是更真实的。
因此，需要克服上述限制并提供针对α突触核蛋白的治疗性和诊断性人抗体。
发明概述
本发明利用老年健康对照受试者和具有神经疾病的患者的α突触核蛋白特异性免疫应答，用于分离天然α突触核蛋白特异性人单克隆抗体。具体而言，根据本发明进行的实验成功地从没有帕金森病体征的老年受试者群分离对α突触核蛋白特异性的单克隆抗体。
因此，本发明涉及能够特异性识别α突触核蛋白的人抗体、抗原结合片段和类似的抗原结合分子。“特异性识别α突触核蛋白”、″对α突触核蛋白特异性的抗体″和″抗α突触核蛋白″特别地、一般地和总体上表示天然形式的α突触核蛋白或错折叠或寡聚体或聚集或翻译后修饰的α突触核蛋白的抗体。本文提供了对天然单体、全长、截断和聚集形式具有选择性的人抗体。
在本发明特别优选的实施方案中，人抗体或其抗原结合片段说明由图1所列可变区VH和/或VL鉴定的抗体的免疫结合特征。
抗体的抗原结合片段可以是单链Fv片段、F(ab′)片段、F(ab)片段和F(ab′)2片段，或任何其他抗原结合片段。在以下具体实施方案中，抗体或其片段是人IgG同种型抗体。可选地，抗体是嵌合的人-鼠或鼠源化抗体，后者特别用于诊断方法和动物研究。
而且，本发明涉及包含本发明抗体或其活性片段或其激动剂和同源分子或可选地拮抗剂的组合物，并且涉及使用此类组合物预防、诊断或治疗突触核蛋白病的免疫治疗和免疫诊断方法，其中有效量的组合物被施用给有相应需要的患者。
天然地，本发明延伸至永生的人B记忆淋巴细胞和B细胞，分别产生具有如下定义的独特特征的抗体。
本发明还涉及编码本发明抗体的免疫球蛋白链的至少可变区的多核苷酸。优选地，所述可变区包含图1所示可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)。
因此，本发明还涵盖包含所述多核苷酸的载体和用其转化的宿主细胞以及它们产生对α突触核蛋白特异性的抗体和等同结合分子的用途。重组产生抗体及其模拟物的方式和方法以及筛选竞争结合分子(可以是抗体或可以不是抗体)的方法是本领域已知的。然而，如本文所述，特别对于人的治疗性应用，本发明抗体是人抗体，意义是所述抗体的应用基本没有对于嵌合和甚至人源化抗体所观察到的HAMA应答。
而且，本文公开了可用于鉴定样品中α突触核蛋白的组合物和方法。公开的抗α突触核蛋白抗体可用于筛查人血液、CSF和尿的样品中α突触核蛋白的存在，例如通过使用基于ELISA的分析或表面适应分析。本文公开的方法和组合物可帮助诊断触核蛋白病例如帕金森病，并且可用于监测疾病进展和治疗效力。
如实施例4所说明的，本发明抗α突触核蛋白抗体能够在帕金森病转基因小鼠模型中改善运动表现和高架十字迷宫行为。这些结果证实本发明的人衍生的抗α突触核蛋白抗体的预期治疗价值。
因此，本发明的一个具体目的是提供用于治疗或预防突触核蛋白病的方法，所述突触核蛋白病例如帕金森病(PD)、帕金森病痴呆(PDD)、路易体痴呆(DLB)、阿尔茨海默病路易体变异型(LBVAD)、多系统萎缩(MSA)、单纯性自主神经衰弱(PAF)、神经退行性变与脑铁累积1型(NBIA-I)、阿尔茨海默病、皮克病、青年型全身性神经轴性营养不良(Hallervorden-Spatz病)、肌萎缩性侧索硬化、外伤性脑损伤和唐氏综合征。所述方法包括对受试者施用有效浓度的人抗体或抗体衍生物，其中抗体靶向α突触核蛋白。
本发明其他实施方案将通过随后说明和实施例而变得明显。
附图简述
图1：人抗体NI-202.3G12(A)、NI-202.12F4(B)和NI-202.3D8(C)的可变区即重链和κ/λ轻链的氨基酸序列和核苷酸序列。对于人抗体NI-202.3D8，已经克隆了两个可变轻链序列VKa1(C)和VKc1(D)，每一个可与可变重链序列VHE1(C)配对。用下划线的CDR指示构架(FR)和互补决定区(CDR)。重链结合区(JH)和轻链结合区(JK)也被指示。由于克隆策略，重链和轻链的N末端的氨基酸序列可能在FR1中含有引物诱导的改变，然而，这不实质影响抗体的生物活性。为了提供共有的人抗体，最初克隆的核苷酸和氨基酸序列根据数据库中有关的人种系可变区序列来排列和调节；参见例如MRC Centre for Protein Engineering(Cambridge，UK)管理的Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)。被认为可能偏离共有种系序列并因此可起源于PCR引物的那些氨基酸以粗体显示。
图2：重组人α突触核蛋白抗体针对不同表位。将重组全长和截断的α突触核蛋白以相等的涂布浓度(20μg/ml)涂布于ELISA板。(A)重组人α突触核蛋白抗体NI-202.3G12在直接ELISA中结合全长α突触核蛋白，但不结合α突触核蛋白截断物，指向NI-202.3G12的结构识别表位。(B)重组NI-202.12F4在直接ELISA中结合全长α突触核蛋白和含有氨基酸(aa)1-60的α突触核蛋白截断物，指向α突触核蛋白的N-末端两亲重复区内NI-202.12F4的表位。(C)LB509抗体结合C-末端α突触核蛋白片段，证实之前确定的表位(aa 115-122)。值是平均值±SEM(n＝2-3)。
图3：重组人α突触核蛋白抗体在直接ELISA中结合α突触核蛋白，但不结合β-和γ突触核蛋白。以相等涂布浓度(2μg/ml)涂布在ELISA板上的重组α-、β-和γ突触核蛋白与重组人α突触核蛋白抗体或pan突触核蛋白抗体孵育。(A)后者检测所有三种突触核蛋白，而重组人α突触核蛋白抗体(B)NI-202.3G12和(C)NI-202.12F4(C)选择性结合α突触核蛋白。值是平均值±SEM(n＝2-3)。
图4：重组人α突触核蛋白抗体NI-202.12F4在Western印迹分析中结合α突触核蛋白但不结合β-和γ突触核蛋白。重组α-、β-和γ突触核蛋白(每个750ng)经受SDS-PAGE，随后经受Western印迹分析。(A)考马斯染色揭示SDS-PAGE上相等的蛋白浓度。(B)NI-202.12F4与α突触核蛋白但不与β-和γ突触核蛋白强烈相互作用。(C)无初级抗体未检测到信号。
图5：(A)非转基因和人α-突触核蛋白转基因小鼠的脑提取物的NI-202.12F4免疫印迹分析显示对人α突触核蛋白的优先结合。野生型和人α突触核蛋白转基因小鼠的脑提取物通过与人特异性α突触核蛋白抗体LB509、人和小鼠α突触核蛋白反应性抗体克隆42和NI-202.12F4免疫印迹来分析。而克隆42检测对应于小鼠和人α突触核蛋白的突出条带，LB509和NI-202.12F4显示对人α突触核蛋白的强烈偏好。(B)脑提取物的NI-202.12F4免疫印迹分析显示对人α突触核蛋白聚集物的优先结合。健康对照受试者和路易体痴呆(DLB)患者的大脑皮层提取物以及野生型小鼠和人A30Pα突触核蛋白转基因小鼠的脑提取物通过Western印迹分析。NI-202.12F4以高灵敏度检测DLB和A30Pα突触核蛋白转基因脑提取物中α突触核蛋白聚集物的寡聚体和原纤维形式。在人和野生型小鼠组织中观察到对单体形式的α突触核蛋白的最小结合，并且在高度过表达α突触核蛋白的A30Pα突触核蛋白转基因脑提取物中的中度结合。相反，克隆42抗体以高灵敏度检测单体形式和α突触核蛋白片段并且与聚集的α突触核蛋白物类结合差。
图6：重组NI-202.12F4显示对人α突触核蛋白的野生型和疾病引起的突变体的高亲和力结合。重组野生型(●)、A53T(■)、A30P(*)和E64K(◇)人α突触核蛋白被涂布到ELISA板上(2μg/ml)并用各种浓度的NI202.12F4探测。半数最大有效浓度(EC50)对于野生型α突触核蛋白是321pM，对于A53T突变人α突触核蛋白是293pM，对于A30P突变人α突触核蛋白是228pM，并且对于E64K突变人α突触核蛋白是483pM。
图7：NI-202.12F4的免疫组织化学结合分析。NI-202.12F4显示α突触核蛋白病变的突出染色，包括路易体和路易突起样包涵体，以及体树的和突触的α突触核蛋白在表达人A53T(A)或A30Pα突触核蛋白(B)的转基因小鼠的自由浮动切片中和在帕金森病(C)和路易体痴呆(D)的人脑组织中的聚集。抗体Syn211以高灵敏度在人A30Pα突触核蛋白转基因小鼠(E)中检测生理突触的α突触核蛋白，而NI-202.12F4优先结合病理性α突触核蛋白聚集物(B)。与仅对照染色的二级抗体(G)相比较，NI-202.12F4的结合实际上不含野生型小鼠(F)的脑切片，而克隆42抗体显示小鼠α突触核蛋白蛋白(H)的突出的突触染色。
图8：重组NI-202.12F4显示对高密度涂布的α突触核蛋白的优先结合。将重组全长或截断的α突触核蛋白以指示浓度涂布在ELISA板上并用各种浓度的NI-202.12F4或Syn211抗体通过直接ELISA探测(○20μg/ml；▲2μg/ml；▼1μg/ml；◆250ng/ml；□100ng/ml重组全长或1-60α突触核蛋白的涂布浓度)。测定了指示抗体效价的半数最大有效浓度(EC50)。(A)重组NI-202.12F4对α突触核蛋白的高亲和力结合需要α突触核蛋白的高涂布密度。而以20μg/ml浓度涂布的α突触核蛋白观察到111pM EC50，EC50值随涂布浓度的降低而快速增加，说明α突触核蛋白的较低涂布浓度下亲和力的急剧损失。这些特征指向在高涂布浓度的α突触核蛋白优先形成的NI-202.12F4的构象性表位。(B)Syn211的结合不受涂布浓度的影响。在较低涂布密度下观察到商业途径获得的Syn211抗体的亲和力没有下降，EC50范围从20μg/mlα突触核蛋白涂布密度的335pm到100ng/mlα突触核蛋白涂布密度的99pM。(C)重组NI-202.12F4与包含氨基酸1-60的N-末端α突触核蛋白片段的高亲和力结合需要高涂布密度。NI-202.12F4显示当量和涂布浓度依赖性的对全长以及截断α突触核蛋白的结合，指向α突触核蛋白的氨基酸1-60内含有的NI-202.12F4的构象性表位。(D)含有覆盖α突触核蛋白的N-末端60氨基酸的重叠的20氨基酸片段的生物素化肽涂布在亲和素板上并用NI-202.12F4或检测aa 21-40内表位的pan-突触核蛋白对照抗体探测。因此，对照抗体强烈结合肽21-40和较少程度结合肽11-30和31-50。相反，观察到NI-202.12F4不结合任何测试的肽，表明没有一个N-末端片段足够作为NI-202.12F4表位，并且对于最佳结合和形成结构NI-202.12F4表位可能需要更大片段。
图9：用NI-202.12F4的慢性治疗改善α突触核蛋白A53T转基因小鼠中的运动表现。10.5个月大的α突触核蛋白A53T转基因小鼠每周用NI-202.12F4或PBS(5mg/kg；腹腔内应用)治疗。治疗两个月后在爬杆测试中评估运动表现。(A)NI-202.12F4治疗的动物需要显著更少的时间来向下转(t-转；1.7±0.3 vs.4.6±0.6 sec，p＝0.0002，双尾学生t检验)。(B)NI-202.12F4治疗的动物还使用显著更少的时间(t-总计)下降到圈养笼(7.3±0.9 vs.10.4±0.7 sec，p＝0.012，双尾学生t检验)。
图10：用NI-202.12F4对α突触核蛋白A53T转基因小鼠的长期治疗导致高架十字迷宫行为恢复。10.5个月大的α突触核蛋白A53T转基因小鼠每周腹腔内用5mg/kg NI-202.12F4或PBS治疗。两个月治疗之后，测试动物的高架十字迷宫行为。与媒介物治疗的对照动物相比，NI-202.12F4治疗动物花费显著更少的时间并覆盖开放臂中显著更小的距离，表明正常行为的恢复。
图11：用NI-202.12F4对α突触核蛋白A53T转基因小鼠的慢性治疗导致人A53Tα突触核蛋白的升高的血浆水平。血浆样品从12.5个月大的、已经用5mg/kg NI-202.12F4或PBS每周腹腔内治疗2个月的α突触核蛋白A53T转基因小鼠制备。最后一次应用之后24小时取血。(A)血浆中NI-202.12F4水平使用直接α突触核蛋白ELISA测定。(B)血浆中人A53Tα突触核蛋白水平使用人特异性α突触核蛋白夹心ELISA测定。与对照动物相比，用NI-202.12F4治疗的动物具有显著升高的人α突触核蛋白血浆水平(24.9±4.1 vs.1.9±1.2ng/ml，p＝0.0002)。
发明详述
I.定义
突触核蛋白病或突触核蛋白病变是多元组的神经退行性疾病，共有在选择性易损的神经元群和神经胶质中不溶α突触核蛋白聚集物构成的常见病理性损伤。这些疾患包括帕金森病(PD)、帕金森病痴呆(PDD)、路易体痴呆(DLB)、青年型全身性神经轴性营养不良(Hallervorden-Spatz病)、单纯性自主神经衰弱(PAF)、多系统萎缩(MSA)和神经退行性变与脑铁累积1型(NBIA-I)。临床上，它们通过运动、感知、行为和自主功能的慢性和渐进下降来鉴定，取决于损伤的分布。
帕金森病是具有未知病原学的年龄依赖性神经退行性疾病。认为散发帕金森病由基因易损性和环境侵害的组合导致。还认为帕金森病(PD)由不同机制引发时遵循共有的病理生理途径。一个共有的节点是涉及α突触核蛋白。该蛋白与帕金森病病变的联系已经通过鉴定家族性病例中基因的点突变和三体化、α突触核蛋白定位至路易体、帕金森病的标志性病理特征之一和帕金森病的神经毒性模型中α突触核蛋白表达与疾病病变之间的关联来确立。额外证据表明，α突触核蛋白的特定形式(例如，错折叠和α突触核蛋白结合的多巴胺)参与散发病。
突触核蛋白是主要在神经组织和某些肿瘤中表达的小的可溶性蛋白。家族包括三种已知蛋白：α突触核蛋白、β突触核蛋白和γ突触核蛋白。所有突触核蛋白具有共同的高度保守的α-螺旋脂质结合基序，与可交换载脂蛋白的A2类脂质结合结构域类似。突触核蛋白家族成员不存在于脊椎动物之外，尽管它们与植物′晚期胚胎丰富′蛋白具有一定保守的结构相似性。α-和β突触核蛋白蛋白组要存在于脑组织，其中它们主要存在于突触前末梢。γ突触核蛋白主要存在于外周神经系统和视网膜，但是其在乳房肿瘤中的表达是肿瘤进展的标志。已经确定了突触核蛋白任何一个的正常细胞功能，尽管一些数据表明在调节膜稳定性和/或翻转中的作用。α突触核蛋白中的突变与早期发作的帕金森病的罕见家族病例有关，蛋白异常聚集于帕金森病、阿尔茨海默病和几种其他神经退行性病症。有关综述参见例如George，Genome Biol.3(2002)，reviews3002.1-reviews3002.6，在线公开于2001年12月20日，其中表1对目前列于GenBank的突触核蛋白家族的独特成员进行分类，其公开内容在此通过引用并入。
α突触核蛋白最初在人脑中鉴定为阿尔茨海默病(AD)斑的非β淀粉状蛋白组分(NAC)的前体蛋白；参见例如Ueda等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90(1993)，1282-1286。α突触核蛋白也称为AD淀粉状蛋白的非Aβ组分(NACP)的前体，是140氨基酸的蛋白。α突触核蛋白以其天然形式存在为随机卷；然而，pH的改变、分子拥挤、重金属含量和多巴胺水平都影响蛋白构象。寡聚体、初原纤维、原纤维和聚集部分构象改变被认为调节蛋白毒性。越来越多的证据表明，与非加合蛋白相比，多巴胺加合的α突触核蛋白具有更快的时程以形成原纤维。而且，α突触核蛋白过表达背景中的多巴胺是毒性的。
在本说明书中，术语″α突触核蛋白″、″α-突触核蛋白″、″a-突触核蛋白″和″aSyn″可互换使用，具体指α突触核蛋白的天然单体形式。术语″α突触核蛋白″还用于一般鉴定α突触核蛋白的其他构象异构体，例如与多巴胺-苯醌(DAQ)结合的α突触核蛋白和α突触核蛋白的寡聚体或聚集物。术语″α突触核蛋白″也用来泛指α突触核蛋白的所有类型和形式。人α突触核蛋白的蛋白序列是MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA(SEQ ID NO：1)。α突触核蛋白的氨基酸序列可源自文献和相关数据库；参见例如Ueda等，如上；GenBank swissprot：locus SYUA_HUMAN，登录号P37840。AD淀粉状蛋白的非Aβ组分(NAC)源自α突触核蛋白。α突触核蛋白内高度疏水的结构域NAC是由至少28个氨基酸残基(残基60-87)和任选35氨基酸残基(残基61-95)组成的肽。NAC表现出形成β折叠结构的趋势(Iwai，等，Biochemistry，34(1995)10139-10145)。NAC的氨基酸序列描述于Jensen等，Biochem.J.310(1995)，91-94；GenBank登录号S56746和Ueda等，PNAS USA 90(1993)，1282-11286。
解聚的α突触核蛋白或其片段包括NAC，表示单体肽单元。解聚的α突触核蛋白或其片段一般是可溶的，并且能够自聚集形成可溶寡聚体。α突触核蛋白及其片段的寡聚体通常是可溶的并且主要作为α-螺旋存在。单体α突触核蛋白可以通过将冻干的肽超声溶解于纯DMSO中而在体外准备。得到的溶液被离心以除去任何不溶粒子。聚集的α突触核蛋白或其片段包括NAC，表示α突触核蛋白或其片段的寡聚体，其缔合成不溶的β折叠组装体。聚集的α突触核蛋白或其片段包括NAC，还表示原纤维聚合物。原纤维通常是不溶的。一些抗体结合可溶的α突触核蛋白或其片段或聚集的α突触核蛋白或其片段。一些抗体结合α突触核蛋白的寡聚体比结合单体形式或原纤维形式更强。一些抗体结合可溶和聚集的α突触核蛋白或其片段，任选地也结合寡聚体形式。
本文公开的人抗α突触核蛋白抗体特异性结合α突触核蛋白及其表位，并且结合α突触核蛋白的各种构象及其表位。例如，本文公开了特异性结合α突触核蛋白、天然单体形式的α突触核蛋白、全长和截断的α突触核蛋白和α突触核蛋白聚集物的抗体。如本文使用的，对“特异性结合”、“选择性结合”或“优先结合”α突触核蛋白或其表位的抗体的提及是指不结合其他无关蛋白的抗体。在一个实例中，本文公开的α突触核蛋白抗体可以结合α突触核蛋白或其表位并且显示高于其他蛋白约1.5倍背景的无结合。“特异性结合”或“选择性结合”α突触核蛋白构象异构体的抗体指不结合所有构象的α突触核蛋白的抗体，即，不结合至少一种其他α突触核蛋白构象异构体。例如本文公开了可以区分单体和聚集形式的α突触核蛋白、人和小鼠α突触核蛋白；全长α突触核蛋白和截断形式以及人α突触核蛋白与β-和γ突触核蛋白的抗体。因为本发明的人抗α突触核蛋白抗体已经从没有帕金森病体征并且表现出α突触核蛋白特异性免疫应答的老年受试者群分离，本发明的抗α突触核蛋白抗体还可以称为″人自身抗体″以强调，那些抗体实际上由受试者表达并且已经从例如表达人免疫球蛋白的展示文库分离，其迄今代表试图提供人样抗体的一种常用方法。
注意，术语“一个”或“一种”指一个或多个实体；例如，“一种抗体”被理解为代表一种或多种抗体。因此，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”可以在本文互换使用。
本文使用的术语“多肽”预期涵盖单个“多肽”以及多个“多肽”，并且指由通过酰胺键(还称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”指两个或多个氨基酸的任何链，并且不指产物的具体长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白”、“氨基酸链”或用于指两个或多个氨基酸的链的任何其他术语包括在“多肽”定义中，并且术语“多肽”可以替代这些术语的任何一个或与这些术语的任何一个互换使用。
术语“多肽”还预期指多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护基/封闭基衍生化、蛋白裂解或被非天然存在的氨基酸修饰。多肽可源于天然生物来源或由重组技术产生，但是不必从指定的核酸序列翻译。它可以任何方式产生，包括通过化学合成。
本发明多肽可以具有约3或更多、5或更多、10或更多、20或更多、25或更多、50或更多、75或更多、100或更多、200或更多、500或更多、1,000或更多、或2,000或更多氨基酸的尺寸。多肽可以具有确定的三维结构，尽管它们不必具有此类结构。具有确定的三维结构的多肽被称为折叠的，不具有确定三维结构但可采取许多不同构象的多肽被称为未折叠的。本文使用的术语糖蛋白指与至少一个糖部分偶联的蛋白，所述糖部分通过氨基酸残基例如丝氨酸残基或天冬酰胺残基的含氧或含氮侧链连接至蛋白。
“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物预期是不在其天然环境中的多肽。不需要特定的纯化水平。例如，分离的多肽可以从其天然或自然环境去除。为本发明目的，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白被认为是分离的，是已经被分离、分级分离或通过任何适合技术部分或完全纯化的天然或重组多肽。
本发明多肽还包括前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体及其任意组合。当指本发明抗体或抗体多肽时，术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括保留相应天然结合分子、抗体或多肽的抗原结合性质的至少一些的任何多肽。除了本文其他地方讨论的具体抗体片段，本发明的片段或多肽包括蛋白水解片段以及缺失片段。本发明的抗体和抗体多肽的变体包括如上所述片段，以及具有改变的氨基酸序列的多肽，所述改变由于氨基酸取代、缺失或插入。变体可以天然存在或非天然存在。非天然存在的变体可以使用本领域已知的诱变技术产生。变体多肽可以包含保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。α突触核蛋白特异性结合分子例如，本发明的抗体和抗体多肽的衍生物是已经被改变以表现出天然多肽不存在的其他特征的多肽。实例包括融合蛋白。变体多肽在本文还可以称为“多肽类似物”。本文使用的结合分子或其片段、抗体或抗体多肽的“衍生物”指一个或多个残基通过官能侧链基团的反应被化学衍生化的本发明多肽。“衍生物”还包括含有20个标准氨基酸的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如，4-羟基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸；鸟氨酸可以取代赖氨酸。
术语″多核苷酸″预期包括单一核酸以及多个核酸，并且指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包括常规磷酸二酯键或非常规键(例如，酰胺键，例如见于肽核酸(PNA))。术语“核酸”指任何一个或多个核酸区段，例如多核苷酸中存在的DNA或RNA片段。″分离的″核酸或多核苷酸预期是核酸分子、DNA或RNA，其已经从其天然环境去除。例如，为本发明目的，编码载体中含有的抗体的重组多核苷酸被认为是分离的。分离的多核苷酸的其他实例包括异源宿主细胞中保持的重组多核苷酸或溶液中的纯化(部分或完全)多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明多核苷酸的体内或体外RNA转录子。根据本发明的多核苷酸或核酸还包括合成产生的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调控元件，例如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
本文使用的“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸部分。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不被翻译成氨基酸，但可以认为它是编码区的部分，但任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等不是编码的部分。本发明两个或多个编码区可以存在于一个多核苷酸构建体中，例如一个载体上，或单独多核苷酸构建体中，例如单独(不同)载体上。而且，任何载体可以含有一个编码区，或者可以含有两个或多个编码区，例如一个载体可以单独编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。此外，本发明载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，融合或未融合至编码结合分子、抗体或其片段、变体或衍生物的核酸。异源编码区包括但不限于专门的元件或基序，例如分泌信号肽或异源功能结构域。
在某些实施方案中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA情况下，包含编码多肽的核酸的多核苷酸正常可以包括启动子和/或其他转录或翻译控制元件，与一个或多个编码区可操作结合。可操作结合是基因产物例如多肽的编码区与一个或多个调控序列以使得基因产物在调控序列的影响或控制下表达的方式结合。如果启动子功能的引入导致编码预期基因产物的mRNA的转录和如果两个DNA片段之间的连接性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达或干扰DNA模板转录的能力的能力时，两个DNA片段(例如多肽编码区和与其结合的启动子)是“可操作结合”或“可操作连接”的。因此，如果启动子能够实现核酸的转录，则启动子区将与编码多肽的核酸可操作结合。启动子可以是细胞特异性启动子，其指导仅在预定细胞中的DNA的大量转录。除了启动子外的其他转录控制元件，例如增强子、操作子、阻遏子和转录终止信号可以与多核苷酸可操作结合以指导细胞特异性转录。适合的启动子和其他转录控制区在本文公开。
许多转录控制区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，例如但不限于来自巨细胞病毒(与内含子-A结合的即刻早期启动子)、猿猴病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(例如劳氏肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其他转录控制区包括源自脊椎动物基因的那些，例如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β-球蛋白以及能够控制真核细胞基因表达的其他序列。其他适合的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子可诱导启动子(例如，可由干扰素或白细胞介素诱导的启动子)。
类似地，许多翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子和源自小RNA病毒的元件(特别是内核糖体进入位点，或IRES，还称为CITE序列)。
在其他实施方案中，本发明多核苷酸是RNA，例如信使RNA形式(mRNA)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌或信号肽的其他编码区结合，所述其他编码区指导由本发明多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，哺乳动物细胞分泌的蛋白具有信号肽或分泌前导序列，其在生长的蛋白链跨粗糙型内质网的排出已经开始时从成熟蛋白切割。本领域普通技术人员了解，脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有与多肽N末端融合的信号肽，其从完整或“全长”多肽切割以产生分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或者保留指导与之可操作结合的多肽分泌的能力的该序列的功能衍生物。可选地，可使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以用人组织血纤维蛋白溶酶原激活子(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸酶的前导序列取代。
除非另外说明，术语“疾患”和“疾病”在本文可互换使用。
本发明上下文中使用的“结合分子”主要指抗体及其片段，但还可以指结合α突触核蛋白的其他非抗体分子，包括但不限于激素、受体、配体、主要组织相容性复合物(MHC)分子、伴侣分子例如热休克蛋白(HSP)以及细胞细胞粘附分子例如钙粘蛋白、整联蛋白、C型凝集素和免疫球蛋白(Ig)超家族成员。因此，仅为了清楚而不限制本发明范围，下述实施方案的大部分就代表开发治疗剂和诊断剂的优选结合分子的抗体和抗体样分子来讨论。
术语″抗体″和″免疫球蛋白″在本文可互换使用。抗体或免疫球蛋白是α突触核蛋白结合分子，包含重链的至少可变结构域，正常包含重链和轻链的至少可变结构域。脊椎动物系统中基本的免疫球蛋白结构相对完好地被理解；参见例如Harlow等，抗体：A Laboratory Manual，(Cold Spring HarborLaboratory Press，2nd ed.1988).
如下文更详细讨论的，术语“免疫球蛋白”包括广泛类别的多肽，其可以被生化上区分。本领域技术人员将理解，重链被分类成gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ，μ，α，δ，ε)，其中有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质是确定抗体“类别”分别为IgG、IgM、IgA IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等被良好鉴定，并且已知孵育功能专门化。技术人员参考本公开内容容易辨别这些类别和同种型的每一个的修饰形式，因此在本发明范围内。所有免疫球蛋白类清楚地在本发明范围内，下述讨论一般涉及免疫球蛋白分子的Ig类。关于IgG，标准的免疫球蛋白分子包括分子量大约23000道尔顿的两个相同的轻链多肽和分子量53,000-70,000的两个相同重链多肽。四个链通常通过二硫键以“Y”构型结合，其中轻链在“Y”口处包括重链并经可变区。
轻链被分类为κ或λ(κ，λ)。每个重链类别可以与κ或λ轻链结合。一般而言，轻链和重链彼此共价键合，当免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或基因工程宿主细胞产生时，两个重链的“尾”部分通过共价二硫键或非共价键合彼此结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的分叉端得N末端至每个链的底部的C末端。
轻链和重链都被分入结构和功能同源性区。术语“恒定”和“可变”是功能上使用的。就这点而言，要理解，轻链(VL)和重链(VH)部分的可变结构域决定抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要的生物性质，例如分泌、经胎盘运动型、Fc受体结合、互补结合等。通过约定，恒定区结构域编号随它们远离抗原结合位点或抗体氨基末端而增加。N末端部分是可变区，C末端部分是恒定区；CH3和CL结构域实际分别包含重链和轻链的羧基末端。
如上所示，可变区允许抗体选择性识别和特异性结合抗原表位。即，抗体的VL结构域和VH结构域或互补决定区(CDR)子集组合形成可变区，确定三维抗原结合位点。该四级抗体结构形成存在于Y的每个臂的末端的抗原结合位点。更具体说，抗原结合位点由VH和VL链的每个上的三个CDR确定。含有足以特异性结合α突触核蛋白的任何抗体或免疫球蛋白片段在本文可互换表示″结合片段″或″免疫特异性片段″。
在天然存在的抗体中，抗体包含六个超变区，有时称为″互补决定区″或″CDR″，存在于每个抗原结合结构域中，其是短的非连续氨基酸序列，当抗体在水环境中采取其三维构型时，其被特别定位以形成抗原结合结构域。″CDR″侧翼具有四个相对保守的“构架”区或显示更少的分子内变异性的“FR”。构架区主要采取β折叠构型，CDR形成连接β折叠结构的环，有些情况下形成β折叠结构的部分。因此，构架区作用为形成支架，通过链内非共价相互作用使CDR置于正确方向。定位的CDR形成的抗原结合结构域确定与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。该互补表面促进抗体与其同源表位的非共价结合。本领域普通技术人员容易鉴定任何给定重链或轻链可变区的分别包含CDR和构架区的氨基酸，因为它们已经被精确定义；参见″Sequences of Proteins of Immunological Interest，″Kabat，E.，等，U.S.Department of Health and人Services，(1983)；和Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196(1987)，901-917，其在此通过引用整体并入。
当存在本领域使用和/或可接受的两个或多个术语定义时，除非明确指明相反，本文使用的术语的定义预期包括所有此类含义。具体实例是使用术语″互补决定区″(″CDR″)来描述重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。该具体区描述于Kabat等，U.S.Dept.of Health and humanServices，″Sequences of Proteins of Immunological Interest″(1983)和Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196(1987)，901-917，其在此通过引用并入，其中定义包括相互比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，指抗体或其变体的CDR的任一定义的应用预期在本文定义和使用的术语范围内。涵盖由上文引用的参考文献的每一个定义的CDR的适当的氨基酸残基列于下表1作为比较。涵盖特定CDR的精确残基数目将根据CDR的序列和尺寸而变化。本领域技术人员可常规确定哪些残基构成给定抗体的人IgG亚型的特定高变区或CDR，抗体的可变区氨基酸序列。
表1：CDR定义1
  Kabat   Chothia
  VH CDR1   31-35   26-32
  VH CDR2   50-65   52-58
  VH CDR3   95-102   95-102
  VL CDR1   24-34   26-32
  VL CDR2   50-56   50-52
  VL CDR3   89-97   91-96
1表1中所有CDR定义的编号是根据Kabat等(参见下文)提出的编号规定。
Kabat等还确定了适用于任何抗体的可变结构域序列的编号系统。本领域普通技术人员可以清楚对任何可变结构域序列指定该″Kabat编号″系统，而不依赖于超越序列本身的任何实验数据。本文使用的″Kabat编号″指由Kabat等，U.S.Dept.of Health and human Services，″Sequence ofProteins of Immunological Interest″(1983)提出的编号系统。除非另外规定，对本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物具体氨基酸残基位置的编号的提及是根据Kabat编号系统。
本发明的抗体或其抗原结合片段、免疫特异性片段、变体或衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化、灵长类动物源化、鼠源化或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、Fv、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、由Fab表达文库产生的片段和抗独特型(抗Id)抗体(包括例如对本文公开的抗体的抗Id抗体)。ScFv分子是本领域已知的并且描述于例如美国专利5,892,019。本发明免疫球蛋白或抗体分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或免疫球蛋白分子的亚类。
在一个实施方案中，本发明抗体不是具有五价结构的IgM或其衍生物。特别在本发明的具体应用中，特别是治疗用途中，IgM比IgG和其他二价抗体或相应结合分子较无用，因为由于其五价结构和缺乏亲和力成熟，IgM经常显示出非特异性的交叉反应性和非常低的亲和力。
在特别优选的实施方案中，本发明抗体不是多克隆抗体，即，其基本上由不同于从血浆免疫球蛋白样品获得的混合物的一种特定抗体物类组成。
包括单链抗体的抗体片段可以包括单独的可变区或与以下全部或一部分组合的可变区：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。本发明还包括α突触核蛋白-结合片段，还包含可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。本发明抗体或其免疫特异性片段可以来自任何动物来源，包括鸟和哺乳动物。优选地，抗体是人、鼠、驴、兔、山羊、荷兰猪、骆驼、美洲鸵、马或鸡抗体。在另一实施方案中，可变区可以起源于condricthoid(例如，来自鲨)。
一方面，本发明抗体是从人分离的人单克隆抗体。任选地，人抗体的构架区根据数据库中相关的人种系可变区序列比对和采用；参见例如MRCCentre for Protein Engineering(Cambridge，UK)管理的Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)。例如，被认为可能偏离真实种系序列的氨基酸可能是克隆过程中加入的PCR引物序列。与人工产生的人样抗体例如来自噬菌体展示抗体文库或异种小鼠的单链抗体片段(scFv)相比，本发明的人单克隆抗体特征为(i)使用人免疫应答而不是动物替代物而获得，即，抗体响应于天然α突触核蛋白在人体中以其相关构型产生，(ii)保护个体或者至少对于α突触核蛋白的存在是重要的，和(iii)因为抗体起源于人，针对自身抗原的交叉反应风险最小。因此，根据本发明，术语″人单克隆抗体″、″人单克隆自身抗体″、″人抗体″等被用来指示起源于人的α突触核蛋白结合分子，即，从人细胞例如B细胞或其杂交瘤分离的，或其cDNA直接从人细胞例如人记忆B细胞的mRNA克隆的。人抗体依然是“人”的，即使在抗体中进行氨基酸取代，例如以提高结合特征。
源于人免疫球蛋白文库或转基因一个或多个人免疫球蛋白并且不表达内源性免疫球蛋白的动物的抗体(如前所述和描述于例如Kucherlapati等的美国专利no 5,939,598)被称为人样抗体以使它们区别于本发明真实的人抗体。
本文使用的术语“鼠源化抗体”或“鼠源化免疫球蛋白”指包含以下的抗体：来自本发明的人抗体的一个或多个CDR；含有基于鼠抗体序列的氨基酸取代和/或缺失和/或插入的人构架区。提供CDR的人免疫球蛋白被称为“母体”或“受体”，提供构架改变的小鼠抗体被称为“供体”恒定区不一定存在，但是如果有，它们通常基本上与小鼠抗体恒定区相同，即，至少约85-90％、优选约95％或更多相同。因此，在一些实施方案中，全长鼠源化人重链或轻链免疫球蛋白含有小鼠恒定区、人CDR和基本上人构架，其具有许多“鼠源化”氨基酸取代。通常，″鼠源化抗体″是包含鼠源化可变轻链和/或鼠源化可变重链的抗体。例如，鼠源化抗体将不涵盖典型的嵌合抗体，例如，因为嵌合抗体的完整可变区是非小鼠的。已经通过“鼠源化”过程“鼠源化”的修饰抗体与提供CDR的母体抗体结合相同抗原并且通常与母体抗体相比在小鼠中具有较小免疫原性。
本文使用的术语″重链部分″包括源自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链部分的多肽包含以下至少一个：CH1结构域、铰链(例如，上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域或其变体或片段。例如，用于本发明的结合多肽可以包括：包含CH1结构域的多肽链；包含CH1结构域、至少一部分铰链结构域和CH2结构域的多肽链；包含CH1结构域和CH3结构域的多肽链；包含CH1结构域、至少一部分铰链结构域和CH3结构域的多肽链，或包含CH1结构域、至少一部分铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域的多肽链。在另一实施方案中，本发明多肽包括：包含CH3结构域的多肽链。而且，用于本发明的结合多肽可能缺乏至少一部分CH2结构域(例如，CH2结构域的全部或部分)。如上所示，本领域普通技术人员将理解，这些结构域(例如，重链部分)可以被修饰，使得它们的氨基酸序列与天然存在的免疫球蛋白分子不同。
在本文公开的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，多聚体的一个多肽链的重链部分与多聚体第二多肽链上的重链部分相同。可选地，本发明含有重链部分的单体不同。例如，每个单体可以含有不同的靶结合位点，形成例如双特异性抗体或双抗体。
在另一实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物由单多肽链例如scFv构成，并且将在细胞内表达(内抗体)，用于潜在的体内治疗和诊断应用。
用于本文公开的诊断和治疗方法的结合多肽的重链部分可以源自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可以包含源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链区。在另一实例中，重链部分可以包括部分源自IgG1分子且部分源自IgG3分子的铰链区。在另一实例中，重链部分可以包括部分源自IgG1分子且部分源自IgG4分子的嵌合铰链。
本文使用的术语″轻链部分″包括源自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。优选地，轻链部分包括VL或CL结构域的至少一个。
抗体的肽或多肽表位的最小尺寸被认为是约4至5个氨基酸。肽或多肽表位优选含有至少7个、更优选至少9个和最优选至少约15至约30个氨基酸。因为CDR可以识别抗原肽或其四级形式的多肽，构成表位的氨基酸不一定是连续的，并且在一些情况下甚至可能不在相同肽链上。在本发明中，由本发明抗体识别的肽或多肽表位含有α突触核蛋白的至少4、至少5、至少6、至少7、更优选至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25或至少约15至约30个连续或不连续氨基酸的序列。
在本文可互换使用的“特异性结合”或“特异性识别”大体意思是结合分子例如抗体通过其抗原结合结构域结合表位，并且结合需要抗原结合结构域和表位之间一定的互补性。根据该定义，当抗体通过其抗原结合结构域结合表位比它结合随机无关表位更容易时，可以说抗体“特异性结合”该表位。本文使用术语“特异性”来定性某些抗体结合某些表位的相对亲和力。例如，抗体″A″可以被认为具有对给定表位比抗体“B”更高特异性，或者可以说抗体″A″以比对相关表位″D″更高的特异性结合表位″C″。
当存在时，术语抗体与抗原的″免疫结合特征″或其他结合特征的所有语法形式指抗体的特异性、亲和力、交叉反应性和其他结合特征。
″优先结合″意思是结合分子例如抗体比它结合相关、相似、同源或类似表位更容易特异性结合表位。因此，“优先结合”给定表位的抗体将比相关表位更容易结合该表位，即使这种抗体可以与相关表位交叉反应。
作为非限制性实例，结合分子例如抗体以比第二表位的抗体KD小的解离常数(KD)结合第一表位，则认为它优先结合第一表位。在另一非限制性实例中，如果抗体以比对第二表位的抗体KD小至少一个数量级的亲和力结合第一表位，则可以认为它优先结合第一抗原。在另一非限制性实例中，如果抗体以比对第二表位的抗体KD小至少两个数量级的亲和力结合第一表位，则可以认为它优先结合第一抗原。
在另一非限制性实例中，如果结合分子例如抗体以比对第二表位的抗体k(解离)小的解离速率(k(解离))结合第一表位，则可以认为它优先结合第一表位。在另一非限制性实例中，如果抗体以比对第二表位的抗体k(解离)小至少一个数量级的亲和力结合第一表位，则可以认为它优先结合第一表位。在另一非限制性实例中，如果抗体以比对第二表位的抗体k(解离)小至少两个数量级的亲和力结合第一表位，则可以认为它优先结合第一表位。
可以说本文公开的结合分子例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物以小于或等于5X10-2sec-1、10-2sec-1、5X10-3sec-1或10-3sec-1的解离速率(k(解离))结合α突触核蛋白或其片段或变体。更优选地，可以说本发明抗体以小于或等于5X10-4sec-1、10-4sec-1、5X10-5sec-1或10-5sec-1 5X10-6sec-1、10-6sec-1、5X10-7sec-1或10-7sec-1的解离速率(k(解离))结合α突触核蛋白或其片段或变体。
可以说本文公开的结合分子例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物以大于或等于103M-1sec-1、5X103M-1sec-1、104M-1sec-1或5X104M-1sec-1的结合速率(k(结合))结合α突触核蛋白或其片段或变体。更优选地，可以说本发明抗体以大于或等于105M-1sec-1、5X105M-1sec-1、106M-1sec-1或5X106M-1sec-1或107M-1sec-1的结合速率(k(结合))结合α突触核蛋白或其片段或变体。
如果结合分子例如抗体优先结合表位达到它在一定程度上阻断参考抗体与表位结合的程度，则说它竞争性抑制参考抗体与给定表位的结合。竞争性抑制可以通过本领域已知的任何方法测定，例如竞争ELISA分析。可以说抗体竞争性抑制参考抗体与给定表位的结合至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。
本文使用的术语“亲和力”指个体表位与结合分子例如免疫球蛋白分子的CDR结合强度的量度；参见例如Harlow等，抗体：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.(1988)，27-28页。本文使用的术语“亲合力”指一群免疫球蛋白和抗原之间复合物的总体稳定性，即，免疫球蛋白混合物与抗原的功能结合强度；参见例如Harlow，29-34页。亲合力与群体中个体免疫球蛋白分子与具体表位的亲和力以及免疫球蛋白和抗原的价有关。例如，二价单克隆抗体和具有高度重复表位结构的抗原例如聚合物之间的相互作用将是高亲合力之一。抗体对抗原的亲和力或亲合力可以使用任何适当方法实验测定；参见例如Berzofsky等，″Antibody-Antigen Interactions″Fundamental Immunology，Paul，W.E.，Ed.，Raven Press New York，N Y(1984)，Kuby，Janis Immunology，W.H.Freemanand Company New York，N Y(1992)和本文描述的方法。用于测量抗体对抗原亲和力的一般技术包括ELISA、RIA和表面等离子体共振。如果在不同条件例如盐浓度、pH下测量，特定抗体-抗原相互作用的测量的亲和力可以改变。因此，亲和力和其他抗原结合参数例如KD、IC50的测量优选用标准化的抗体和抗原溶液和标准化缓冲液进行。
本发明结合分子例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还就其交叉反应性被描述或规定。本文使用的术语“交叉反应性”指针对一种抗原的抗体与第二抗原反应的能力；两种不同抗原物质相关性的量度。因此，如果抗体结合不同于诱导其形成的表位，则抗体具有交叉反应性。交叉反应性表位一般含有许多与诱导表位相同的互补结构特征，并且在一些情况下可以实际上比最初表位更适合。
例如，某些抗体具有一定程度的交叉反应性，因为它们结合相关但不相同的表位，例如与参考表位具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％和至少50％同一性(使用本领域已知和本文描述的方法计算)的表位。如果抗体不结合与参考表位具有小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％和小于50％同一性(使用本领域已知和本文描述的方法计算)的表位，则可以说抗体具有很少或没有交叉反应性。如果抗体不结合某些表位的任何其他类似物、直向同系物或同源物，可以认为抗体对该表位具有“高度特异性”。
本发明结合分子例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还可以就其对α突触核蛋白的结合亲和力来描述或规定。优先的结合亲和力包括具有小于5x10-2M、10-2M、5x10-3M、10-3M、5x10-4M、10-4M、5x10-5M、10-5M、5x10-6M、10-6M、5x10-7M、10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13M、10-13M、5x10-14M、10-14M、5x10-15M或10-15M的解离常数或Kd的那些。
如前所示，各种免疫球蛋白类别的恒定区的亚基结构和三维构型是公知的。本文使用的术语″VH结构域″包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，术语″CH1结构域″包括免疫球蛋白重链的第一(最氨基末端)恒定区结构域。CH1结构域与VH结构域相邻，并且在免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。
本文使用的术语″CH2结构域″包括使用常规编号方案(残基244至360，Kabat编号系统；和残基231-340，EU编号系统；参见Kabat EA等同上)例如从抗体的约残基244延伸至残基360的重链分子部分。CH2结构域是独特的，因为它不与另一结构域紧密配对。而是，两个N连接的分支糖链介于完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。还充分记载了，CH3结构域从CH2结构域延伸至IgG分子的C末端并且包括大约108个残基。
本文使用的术语″铰链区″包括将CH1结构域结合至CH2结构域的重链分子部分。该铰链区包括大约25个残基并且是柔性的，因此允许两个N末端抗原结合区独立运动。铰链区可以被细分成三个不同的结构域：上、中和下铰链结构域；参见Roux等，J.Immunol.161(1998)，4083。
本文使用的术语″二硫键″包括两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包括可以与第二硫醇基形成二硫键或桥的硫醇基。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接，并且两个重链在对应于使用Kabat编号系统的239和242的位置(位置226或229，EU编号系统)通过两个二硫键连接。
本文使用的术语“连接的”、“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语指两个或多个元件或组分通过任何方式结合在一起，包括化学结合或重组方式。“框内融合”指两个或多个多核苷酸开放阅读框(ORF)结合形成连续的更长的ORF，以维持最初ORF正确翻译阅读框的方式。因此，重组融合蛋白是含有对应于由最初ORF编码的多肽的两个或多个区段的单一蛋白(所述区段正常在自然界中不如此结合)。尽管阅读框如此制成在整个融合区段是连续的，但区段可以是物理上或空间上被例如框内连接体序列分离的。例如，编码免疫球蛋白可变区的CDR的多核苷酸可以框内融合但被编码至少一个免疫球蛋白构架区或其他CDR区的多核苷酸分开，只要“融合的”CDR作为连续多肽的部分被共翻译。
本文使用的术语“表达”指基因产生生化物质例如RNA或多肽的过程。该过程包括细胞内基因的功能性存在的任何表现，包括但不限于基因敲低以及瞬时表达和稳定表达。这包括但不限于基因转录成信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其他RNA产物，以及此类mRNA翻译成多肽。如果最终需要的产物是生化物质，表达包括该生化物质和任何前体的产生。基因表达产生“基因产物”。本文使用的基因产物可以是核酸，例如通过基因转录产生的信使RNA，或者从转录子翻译的多肽。本文描述的基因产物还包括具有转录后修饰例如聚腺苷酸化的核酸或者具有翻译后修饰例如甲基化、糖基化、脂质添加、与其他蛋白亚基缔合、蛋白裂解等的多肽。
本文使用的术语“样品”指从受试者或患者获得的任何生化材料。一方面，样品可以包括血液、脑脊髓液(″CSF″)或尿。在其他方面，样品可以包括全血、血浆、从血浆富集的B细胞和培养的细胞(例如来自受试者的B细胞)。样品还可以包括活检或阻止样品，包括神经组织。在其他方面，样品可以包括全细胞和/或细胞裂解物。血液样品可以通过本领域已知的方法收集。一方面，沉淀可以通过在4℃在200μl缓冲液(20mM Tris，pH.7.5，0.5％Nonidet，1mM EDTA，1mM PMSF，0.1M NaCl，IX Sigma蛋白酶抑制剂和IX Sigma磷酸酶抑制剂1和2)中涡旋来重悬。悬液可以保持在冰上20分钟，伴随断续的涡旋。在约4℃15,000xg旋转5分钟后，将小份上清液保存在约-70℃。
本文使用的术语″治疗″或″治疗″指治疗性治疗和预防性或预防性措施，其中受试者被预防或减缓(减少)不希望的生理变化或疾患，例如帕金森病的发展。有益或希望的临床结果包括但不限于症状缓解、疾病程度的减少、稳定疾病状态(即，不恶化)、延迟或减缓疾病进展、缓解或减轻疾病状态和消除(部分或完全)，无论是可检测还是不可检测的。“治疗”还表示与没有接受治疗的预期存活相比延长的存活。需要治疗的那些包括患有病症或疾患的那些以及易于患有病症或疾患的那些或者其中要预防病症或疾患表现的那些。
″受试者″或″个体″或″动物″或″患者″或“哺乳动物”表示需要诊断、预后、预防或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者，例如人患者。
II.抗体
本发明总体上涉及人抗α突触核蛋白抗体及其抗原结合片段，其优选证明实施例中描述的抗体所列的免疫结合特征和/或生物性质。根据本发明，对α突触核蛋白特异性的人单克隆抗体从老年受试者群克隆。
在根据本发明进行的实验过程中，最初尝试未能克隆α突触核蛋白特异性抗体，但一直导致产生假阳性克隆。这些克隆的进一步考察揭示，它们产生识别大肠杆菌蛋白的抗体。为了防止该问题，对人记忆B细胞培养的条件培养基中的抗体平行筛选对涂布的全长α突触核蛋白单体的结合和对大肠杆菌蛋白和牛血清白蛋白(BSA)结合的缺乏。具体说，B细胞条件培养基在接受ELISA分析以筛选α突触核蛋白结合人抗体之前用大肠杆菌预吸收。
分离特异性抗体的最初尝试集中于对α突触核蛋白具有高血清结合活性的人受试者群，表明升高的循环α突触核蛋白抗体血浆水平。意料不到的是，这些尝试未能产生α突触核蛋白特异性人记忆B细胞，本发明描述的抗体从对α突触核蛋白具有低血浆反应性的受试者群分离。
由于该措施，可以分离几种抗体。选择的抗体被进一步分析以确定类别和轻链亚类。选择的相关抗体从记忆B细胞培养传递信息，然后通过RT-PCR转录，被克隆并组合入表达载体以重组产生；参见所附实施例。HEK293或CHO细胞中人抗体的重组表达和随后根据Western印迹(图4)鉴定它们对全长α突触核蛋白及其截断形式(图2)以及对β-和γ突触核蛋白(图3)的结合特异性证实，首次克隆了对α突触核蛋白高度特异性并且识别α突触核蛋白内不同表位的人抗体。
因此，本发明总体上涉及分离的天然存在的人单克隆抗α突触核蛋白抗体及其结合片段、衍生物和变体。如在实施例中证明和图3所示的，与β突触核蛋白和γ突触核蛋白相比，本发明人单克隆抗α突触核蛋白抗体优选特征在于特异性结合α突触核蛋白。有利地，抗体能够特异性结合天然单体形式和/或寡聚体或聚集形式的α突触核蛋白。此外，本发明的人抗α突触核蛋白抗体可以通过其在Western印迹中识别α突触核蛋白的能力来鉴定；参见图4。
在一个实施方案中，本发明涉及抗α突触核蛋白抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中抗体与选自由NI-202.3G12、NI-202.12F4或NI-202.3D8组成的组的参考抗体特异性结合α突触核蛋白的相同表位。如实施例所描述的，在指向NI-202.3G12的结构表位的直接ELISA分析中，抗体NI-202.3G12结合野生型(wt)α突触核蛋白，但不结合α突触核蛋白截断物；参见图2A。相反，在指向NI-202.12F4的N-末端表位的直接ELISA分析中，抗体NI-202.12F4结合含有N-末端两亲重复区(氨基酸1-60)的突触核蛋白截断物；参见图2B。此外，用抗体NI-202.3D8进行的直接ELISA分析的初步结果揭示，NI-202.3D8特异性识别α突触核蛋白的C末端，优选氨基酸96-140。
而且，不希望受最初实验观察的束缚，进一步的初步实验假设：在直接ELISA抗体分析中，抗体NI-202.3D8优先结合α突触核蛋白单体而非原纤维，而抗体NI-202.12F4和NI-202.3G12优先结合α突触核蛋白聚集物或原纤维而非α突触核蛋白的单体形式。因此，本发明提供了具有不同特异性的一组人抗α突触核蛋白抗体，其因此特别用于诊断和治疗目的。
在一个实施方案中，本发明抗体表现出实施例1至5任一个中描述的示例性NI-202.12F4抗体的结合性质。例如，在一个实施方案中，本发明的抗α突触核蛋白抗体优先识别人而非小鼠的α突触核蛋白，特别是当根据实施例3分析时。附加或可选地，本发明抗α突触核蛋白抗体优先识别α突触核蛋白的聚集或错折叠形式而非生理单体形式，特别是当根据实施例3分析时。附加或可选地，本发明抗α突触核蛋白抗体结合人α突触核蛋白的引起疾病的突变体，特别是实施例3中描述的那些。在该上下文中，结合特异性可以是对图5中示例性NI-202.12F4抗体所示的范围，即，对于野生型α突触核蛋白或其引起疾病的突变体具有约100至1000pM的半数最大有效浓度(EC50)、优选约100至500pM的EC50。
因此，本发明的抗α突触核蛋白抗体优选优先结合脑中α突触核蛋白的病理形式，例如实施例3描述的Western印迹和免疫组织学染色所示例的α突触核蛋白的病理聚集物。因此，在附加或可选实施方案中，本发明的抗α突触核蛋白抗体优先结合人α突触核蛋白的构象性表位，并且不显著结合α突触核蛋白的N末端衍生片段，该片段由氨基酸1-20；21-40；41-60；11-30；或31-50组成。
本发明还涉及抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中所述抗体包括与选自由NI-202.3G12、NI-202.12F4或NI-202.3D8组成的组的抗体相同的抗原结合结构域。
本发明还示例了几种此类结合分子，例如抗体及其结合片段，其特征可以是在其可变区例如结合结构域包括VH和/或VL可变区的至少一个互补决定区(CDR)，包括图1所示的氨基酸序列的至少一个。编码上述可变区的相应的核苷酸序列列于所附序列表中。图1所示VH和/或VL区的上述氨基酸序列的示例性的一组CDR也在所附序列表中指示。然而，如下文所讨论的，本领域技术人员了解如下事实：附加或可选地，在CDR2和CDR3的情况下，可以使用氨基酸序列与图1所列的那些有1、2、3或更多氨基酸不同的CDR。
在一个实施方案中，本发明抗体是包含图1所示VH和/或VL区的氨基酸序列的抗体的任何一个。可选地，本发明抗体是抗体或其抗原结合片段、衍生物或变体，其与具有图1所示VH和/或VL区的抗体的至少一种竞争结合α突触核蛋白。那些抗体可以是人的，特别用于治疗应用。可选地，抗体是鼠的、鼠源化的和嵌合的鼠-人抗体，其特别用于诊断方法和动物研究。
如上所述，由于其在人免疫应答后产生，本发明的人单克隆抗体将识别具有特定生理相关性并且可能分别在用于产生例如小鼠单克隆抗体的免疫过程中和体外筛选噬菌体展示文库中不可及或较少免疫原性的表位。因此，谨慎规定，本发明的人抗α突触核蛋白抗体的表位是独特的，并且不存在能够结合由本发明的人单克隆抗体识别的表位的其他抗体。因此，本发明还总体上延伸至与本发明的人单克隆抗体竞争特异性结合α突触核蛋白的抗α突触核蛋白抗体和α突触核蛋白结合分子。本发明更特别涉及抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中所述抗体与选自由NI-202.3G12、NI-202.12F4或NI-202.3D8组成的组的参考抗体特异性结合α突触核蛋白的相同表位。
抗体之间的竞争通过其中测试下的免疫球蛋白抑制参考抗体与共同抗原例如α突触核蛋白特异性结合的分析来确定。许多类型的竞争性结合分析是已知的，例如：固相直接或间接放射免疫分析(RIA)、固相直接或间接酶免疫分析(EIA)、夹心竞争分析；参见Stahli等，Methods in Enzymology9(1983)，242-253；固相直接生物素-亲和素EIA；参见Kirkland等，J.Immunol.137(1986)，3614-3619和Cheung等，Virology 176(1990)，546-552；固相直接标记分析、固相直接标记夹心分析；参见Harlow和Lane，Antibodies，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press(1988)；使用I125标记的固相直接标记RIA；参见Morel等，Molec.Immunol.25(1988)，7-15和Moldenhauer等，Scand.J.Immunol.32(1990)，77-82。通常，此类分析涉及使用与固体表面结合的纯化的α突触核蛋白或其聚集物或具有这些任一种的细胞，未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白，即本发明的人单克隆抗体。竞争性抑制通过测定在测试免疫球蛋白存在下与固体表面结合的标记或细胞的量来测量。通常，测试免疫球蛋白过量存在。优选地，竞争性结合分析在所附实施例中对ELISA分析所描述的条件下进行。竞争分析鉴定的抗体(竞争抗体)包括与参考抗体结合相同表位的抗体和与参考抗体结合的表位足够近以发生空间位阻的相邻表位的抗体。通常，当竞争抗体过量存在时，它抑制参考抗体与共同抗原特异性结合的至少50％或75％。因此，本发明还涉及抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中抗体竞争性抑制选自由NI-202.3G12、NI-202.12F4或NI-202.3D8组成的组的参考抗体与α突触核蛋白的结合。
在另一实施方案中，本发明提供了包括免疫球蛋白重链可变区(VH)、基本由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成、或由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成的分离的多肽，其中重链可变区的至少一个VH-CDR或重链可变区的至少两个VH-CDR与来自本文公开抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同。可选地，VH的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区与来自本文公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同。因此，根据该实施方案，本发明重链可变区具有与图1所示组相关的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3多肽序列。而图1显示由Kabat系统定义的VH-CDR，其他CDR定义，例如由Chothia系统定义的VH-CDR，也包括在本发明中，并且可以容易由本领域普通技术人员使用图1所示数据来鉴定。
在另一实施方案中，本发明提供了包括免疫球蛋白重链可变区(VH)、基本由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成、或由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成的分离的多肽，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与图1所示VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3组相同的多肽序列。
在另一实施方案中，本发明提供了包括免疫球蛋白重链可变区(VH)、基本由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成、或由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成的分离的多肽，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与图1所示VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3组相同的多肽序列，除了在任何一个VH-CDR中具有1、2、3、4、5或6个氨基酸取代。在某些实施方案中，氨基酸取代是保守的。
在另一实施方案中，本发明提供了包括免疫球蛋白轻链可变区(VL)、基本由免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成、或由免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成的分离的多肽，其中轻链可变区的至少一个VL-CDR或轻链可变区的至少两个VL-CDR与来自本文公开抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同。可选地，VL的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区与来自本文公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同。因此，根据该实施方案，本发明轻链可变区具有与图1所示多肽相关的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3多肽序列。而图1显示由Kabat系统定义的VL-CDR，其他CDR定义，例如由Chothia系统定义的VL-CDR，也包括在本发明中。
在另一实施方案中，本发明提供了包括免疫球蛋白轻链可变区(VL)、基本由免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成、或由免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成的分离的多肽，其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有与图1所示VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3组相同的多肽序列。
在另一实施方案中，本发明提供了包括免疫球蛋白轻链可变区(VL)、基本由免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成、或由免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成的分离的多肽，其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有与图1所示VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3组相同的多肽序列，除了在任何一个VL-CDR中具有1、2、3、4、5或6个氨基酸取代。在某些实施方案中，氨基酸取代是保守的。
免疫球蛋白或其编码cDNA可以被进一步修饰。因此，在其他实施方案中，本发明方法包括产生那些的任何一个的嵌合抗体、鼠源化抗体、单链抗体、Fab片段、双特异性抗体、融合抗体、标记抗体或类似物的步骤的任何一个。相应的方法是本领域技术人员已知的，并且描述于例如Harlow和Lane″Antibodies，A Laboratory Manual″，CSH Press，Cold SpringHarbor(1988)。当所述抗体的衍生物从噬菌体展示技术获得时，BIAcore系统中采用的表面等离子体共振可以用于增加与本文描述的抗体的任何一个结合相同表位的噬菌体抗体的效率(Schier，Human Antibody Hybridomas7(1996)，97-105；Malmborg，J.Immunol.Methods 183(1995)，7-13)。嵌合抗体的产生描述于例如国际申请WO89/09622。用于产生人源化抗体的方法描述于例如欧洲申请EP-A1 0 239 400和国际申请WO90/07861。根据本发明使用的其他抗体来源是所谓的异种抗体。在小鼠中产生异种抗体例如人样抗体的一般原理描述于例如国际申请WO91/10741、WO94/02602、WO96/34096和WO 96/33735。如上所讨论的，本发明抗体除了完整抗体以外可以多种形式存在；包括例如Fv、Fab和F(ab)2以及单链；参见例如国际申请WO88/09344。
本发明抗体或其相应的免疫球蛋白链可以进一步使用本领域已知的常规技术修饰，例如通过使用单独或组合的氨基酸缺失、插入、取代、添加和/或重组和/或本领域已知的任何其他修饰。用于在免疫球蛋白链的氨基酸序列的DNA序列中引入此类修饰的方法是本领域技术人员公知的；参见例如Sambrook，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory(1989)N.Y.和Ausubel，Current Protocols in MolecularBiology，Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.(1994)。本发明抗体的修饰包括在一个或多个组成氨基酸的化学和/或酶衍生化，包括侧链修饰、骨架修饰和N末端和C末端修饰，包括乙酰化、羟基化、甲基化、酰胺化和连接糖类或脂质部分、辅因子等。同样，本发明包括产生嵌合蛋白，包含与在羧基末端的异源分子例如免疫刺激配体融合的在氨基末端的所述抗体或其一些片段；关于相应的技术细节，参见例如国际申请WO00/30680。
此外，本发明涵盖包括含有如上所述结合分子的那些，例如含有所述抗体的任何一个的可变区的CDR3区，特别是重链的CDR3，因为已经频繁发现，重链CDR3(HCDR3)是具有更大程度的变异性和主要参与抗原-抗体相互作用的区。此类肽可以通过容易被合成或通过重组方式产生以产生根据本发明使用的结合剂。此类方法是本领域普通技术人员公知的。肽可以例如使用商业途径可获得的自动化肽合成仪合成。肽还可以通过重组技术产生，通过将表达肽的DNA整合入表达载体并将该表达载体转化入细胞以产生肽。
因此，本发明涉及朝向本发明的人抗α突触核蛋白抗体并展示所述性质，即特异性识别α突触核蛋白的任何结合分子，例如抗体或其结合片段。可以通过本文所述的ELISA和Western印记以及免疫组织化学测试此类抗体和结合分子的结合特异性和亲和力，参见例如实施例。而且，根据本发明进行的随后实验的初步结果揭示了本发明的人抗α突触核蛋白抗体，特别是抗体NI-202.12F4，识别罹患路易体痴呆(DLB)或帕金森病(PD)的患者的人脑切片上存在的α突触核蛋白包涵体。因此，在本发明特别优选的实施方案中，人抗体或其结合片段、衍生物或变体识别人DLB或PD脑切片上的α突触核蛋白。
作为从永生B细胞或B记忆细胞培养物直接获得免疫球蛋白的替代，永生细胞可用作重排重链和轻链基因座的来源，用于随后表达和/或基因操作。重排抗体基因可以从适当的mRNA逆转录以产生cDNA。如果需要，重链恒定区可以被交换为不同同种型的重链恒定区或者完全被消除。可变区可以被连接以编码单链Fv区。多个Fv区可以被连接以赋予对超过一个靶的结合亲和力或嵌合重链和轻链组合可以被采用。一旦可获得遗传材料，保留其结合预期靶的能力的如上所述的类似物的设计是直接的。用于克隆抗体可变区和产生重组抗体的方法是本领域技术人员已知的并且描述于例如Gilliland等，Tissue Antigens 47(1996)，1-20；Doenecke等，Leukemia 11(1997)，1787-1792。
一旦适当的遗传材料被获得并且按需要修饰以编码类似物，则编码序列，包括编码最少重链和轻链可变区的那些，可被插入载体上含有的表达系统，其可以被转染入标准的重组宿主细胞。可以使用许多此类宿主细胞；然而为了有效加工，哺乳动物细胞是优选的。用于该目的的典型的哺乳动物细胞系包括但不限于CHO细胞、HEK 293细胞或NSO细胞。
然后通过在适合宿主细胞生长和编码序列表达的培养条件下培养修饰的重组宿主进行抗体或类似物的产生。然后通过使它们从分离物分离而回收抗体。表达系统优选被设计为包括信号肽，以便得到的抗体被分泌入培养基；然而，细胞内产生也是可能的。
根据上文，本发明还涉及编码本发明抗体或等同结合分子的多核苷酸，在抗体情况下，优选上述抗体的免疫球蛋白链的至少可变区。通常，由多核苷酸编码的所述可变区包括所述抗体的可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)。
本领域技术人员容易理解，具有上述可变结构域的抗体的可变结构域可用于构建具有预期特异性和生物功能的其他多肽或抗体。因此，本发明还包括含有上述可变结构域的至少一个CDR和有利地具有与所附实施例描述的抗体基本相同或相似的结合性质的多肽和抗体。本领域技术人员了解该结合亲和力可以通过在CDR内或高变环内进行氨基酸取代来增强(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196(1987)，901-917)，其与Kabat定义的CDR部分重叠；参见例如Riechmann，等，Nature 332(1988)，323-327。因此，本发明还涉及其中所述CDR的一个或多个包括一个或多个、优选不超过两个氨基酸取代的抗体。优选地，本发明抗体在其免疫球蛋白链的一个或两个中包括两个或全部三个图1所示可变区的CDR。
本领域普通技术人员知道，本发明结合分子例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以包括介导一种或多种效应功能的恒定区。例如，与抗体恒定区互补的C1成分的结合可以激活补体系统。补体激活在细胞病原体调理和裂解中是重要的。补体激活还刺激炎症反应，并且还参与自身免疫超敏性。而且，抗体通过Fc与各种细胞上的受体结合，抗体Fc区上Fc受体结合位点结合细胞上的Fc受体(FcR)。有许多对不同类别抗体特异性的Fc受体，包括IgG(gamma受体)、IgE(epsilon受体)、IgA(α受体)和IgM(mu受体)。抗体与细胞表面Fc受体的结合引发许多重要且多样的生物反应，包括抗体包裹粒子的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、杀伤细胞对抗体包裹靶细胞的裂解(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、炎症介质的释放、胎盘转移和免疫球蛋白生产的控制。
因此，本发明某些实施方案包括抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中恒定区结构域的一个或多个的至少一部分已经被缺失或以其他方式改变以提供希望的生化性质，例如减少的效应功能、非共价二聚合的能力、增加的在α突触核蛋白聚集和沉积部位定位的能力、与大致相同的免疫原性的完整的未改变的抗体相比减少的血清半衰期或增加的血清半衰期。例如，用于本文描述的诊断和治疗方法的某些抗体是结构域缺失抗体，其包含与免疫球蛋白重链类似的多肽链，但缺少一个或多个重链结构域的至少一部分。例如，在某些抗体中，修饰抗体的恒定区的一个完整结构域将被缺失，例如，CH2结构域的全部或部分将被缺失。在其他实施方案中，用于本文描述的诊断和治疗方法的某些抗体具有恒定区，例如IgG重链恒定区，其被改变以消除糖基化，在本文其他地方称为非糖基化的或″agly″抗体。此类″agly″抗体可以酶法制备或者通过改造恒定区中共有糖基化位点来制备。虽然不受理论束缚，认为″agly″抗体可以在体内具有提高的安全性和稳定性。产生具有希望的效应功能的非糖基化抗体的方法参见例如国际申请WO2005/018572，其通过引用整体并入。
在某些本文描述的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，Fc部分可以使用本领域已知的技术被突变以增加效应功能。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其他方式)可以减少循环修饰抗体的Fc受体结合，从而增加α突触核蛋白定位。在其他情况下，可能是与本发明一致的恒定区修饰缓和补体结合并因此减少血清半衰期和结合细胞毒素的非特异性缔合。而恒定区的其他修饰可用于修饰二硫键或寡糖部分，其允许增强的定位，因为增加的抗原特异性或抗体柔性。修饰产生的生理特征、生物利用率和其他生化作用，例如α突触核蛋白定位、生物分布和血清半衰期，可以使用公知的免疫学技术测量和定量而无过度实验。
在某些本文描述的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，Fc部分可以被突变或交换可选的蛋白序列以增加抗体的细胞摄取，例如通过增强经由Fcγ受体、LRP或Thy1受体的受体介导的抗体胞吞或通过“超级抗体技术”，据说它能使抗体穿梭进入活细胞而不伤害它们(Expert Opin.Biol.Ther.(2005)，237-241)。例如，抗体结合区和细胞表面受体的同源蛋白配体或双-或多-特异性抗体与结合α突触核蛋白以及细胞表面受体的特异性序列的融合蛋白的产生可以使用本领域已知技术来改造。
在某些本文描述的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，Fc部分可以被改变或交换可选蛋白序列，或者抗体可以被化学修饰以增加其血液脑屏障穿透。
本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的修饰形式可以从完整前体或母体抗体制备，使用本领域已知的技术。示例性技术在本文更详细讨论。本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以使用本领域已知的技术制备或生产。在某些实施方案中，抗体分子或其片段是“重组产生的”，即使用重组DNA技术产生。制备抗体分子或其片段的示例性技术在本文其他地方更详细讨论。
本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还包括例如通过共价连接任何类型的分子至抗体以使得共价连接不防止抗体特异性结合其同源表位而修饰的衍生物。例如但不限于，抗体衍生物包括已经例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护基/封闭基的衍生化、蛋白裂解、与细胞配体或其他蛋白的键合等修饰的抗体。许多化学修饰的任何一个可以通过已知技术进行，包括但不限于具体的化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，衍生物可以含有一个或多个非经典氨基酸。
在特别优选的实施方案中，本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物将不在待治疗动物例如人中引起有害的免疫应答。在某些实施方案中，本发明结合分子例如抗体或其抗原结合片段源自患者，例如人患者，并且随后在衍生它们的相同物种，例如人中用于缓解或最小化有害免疫应答的发生。
去免疫也可以用于减少抗体的免疫原性。本文使用的术语“去免疫”包括改变抗体以修饰T细胞表位；参见例如国际申请WO98/52976和WO00/34317。例如来自起始抗体的VH和VL序列被分析，并且每个V区的人T细胞表位“图”显示相对于互补决定区(CDR)和序列内其他关键残基的表位定位。来自T细胞表位图的个体T细胞表位被分析以鉴定低风险改变最终抗体活性的可选氨基酸取代。设计了包含氨基酸取代组合的一系列可选VH和VL序列，并且这些序列随后被整合入一系列结合多肽，例如用于本文公开的诊断和治疗方法的α突触核蛋白特异性抗体或其免疫特异性片段，然后测试其功能。通常，产生并测试12至24个变体抗体。然后将包含修饰的V和人C区的完整重链和轻链基因克隆入表达载体，并将随后质粒引入细胞系以产生完整抗体。然后将抗体在适当的生化和生物分析中比较，鉴定最佳变体。
可以使用本领域已知的多种技术制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤技术、重组技术和噬菌体展示技术或其组合。例如，可以使用杂交瘤技术产生单克隆抗体，包括本领域已知的那些和Harlow等，抗体：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.(1988)；Hammerling等，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier，N.Y.，563-681(1981)中教导的那些，所述参考文献通过引用整体并入。本文使用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指从单个克隆衍生的抗体，包括任何真核、原核或噬菌体克隆，而不管产生它的方法。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。在某些实施方案中，本发明抗体衍生自已经通过用EB病毒转化而永生化的人B细胞，如本文所述。
在公知的杂交瘤方法中(Kohler等，Nature 256(1975)，495)，来自哺乳动物的相对短命或致命的淋巴细胞例如本文所述衍生自人受试者的B细胞与永生肿瘤细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)融合，因此产生永生且能够产生B细胞遗传编码抗体的杂交瘤细胞或“杂交瘤”。得到的杂交细胞通过筛选、稀释和再培养含有用于形成单抗体的特定基因的每个个体菌株而被分离成单遗传菌株。它们产生对预期抗原同源的抗体，并且在提及其纯的遗传谱系时，被称为“单克隆的”。
由此制备的杂交瘤细胞被接种并培养在适合的培养基中，所述培养基优选韩语抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。本领域技术人员将理解，用于杂交瘤形成、筛选和生长的试剂、细胞系和培养基可从许多来源商业途径获得，并且标准化方案是完善的。一般，杂交瘤细胞在其中生长的培养基被分析针对希望抗原的单克隆抗体的产生。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过本文所述体外分析例如免疫沉淀、放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA)来确定。在鉴定产生具有希望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，克隆可以通过限制稀释方法亚克隆并通过标准方法生长；参见例如Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，pp59-103(1986)。还要理解，由亚克隆分泌的单克隆抗体可以通过常规纯化方法从培养基、腹水液或血清分离，所述纯化方法例如蛋白A、羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱。
在另一实施方案中，可以通过显微操作来选择淋巴细胞并分离V基因。例如，外周血单核细胞可以从免疫的或天然免疫哺乳动物例如人分离，并在体外培养约7天。可以从培养物筛选满足筛选标准的特异性IgG。来自阳性细胞的细胞可以被分离。个体Ig产生B细胞可以通过FACS分离或通过在补体介导的溶血空斑分析中鉴定它们。Ig产生B细胞可以被显微操作进入管中，并且VH和VL基因可以使用例如RT-PCR来扩增。VH和VL基因可以被克隆入抗体表达载体并转染入细胞(例如真核细胞或原核细胞)用于表达。
可选地，抗体生成细胞系可以使用技术人员公知的技术选择并培养。此类技术描述于许多实验手册和主要出版物。就这方面而言，如下所述适用于本发明的技术描述于Current Protocols in Immunology，Coligan等，Eds.，Green Publishing Associates and Wiley-Interscience，John Wiley and Sons，New York(1991)，其在此通过引用整体并入，包括增刊。
识别特定表位的抗体片段可以通过已知技术产生。例如Fab和F(ab′)2片段可以重组产生或通过免疫球蛋白分子的蛋白裂解产生，使用酶例如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab′)2片段)。F(ab′)2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。此类片段适合用于例如免疫诊断程序，涉及将免疫球蛋白的免疫特异性部分偶联至检测试剂例如放射性同位素。
例如本文所述的完全人抗体特别适合用于人患者的治疗性治疗。本发明的人抗体例如从因为年龄而怀疑有发生疾患例如帕金森病的风险的老年受试者分离，或者从具有疾患但具有异常稳定病程的患者分离。然而，尽管谨慎预期老年健康和无症状受试者分别比年轻受试者更有规律地将产生保护性抗α突触核蛋白抗体，但年轻受试者也被用作获得本发明人抗体的来源。这对易于发生家族型突触核蛋白病但保持无症状的年轻患者尤其如此，因为他们的免疫系统和应答功能比老年人更有效。
在一个实施方案中，本发明抗体包括抗体分子的至少一个重链或轻链CDR。在另一个实施方案中，本发明抗体包括来自一个或多个抗体分子的至少两个CDR。在另一个实施方案中，本发明抗体包括来自一个或多个抗体分子的至少三个CDR。在另一个实施方案中，本发明抗体包括来自一个或多个抗体分子的至少四个CDR。在另一个实施方案中，本发明抗体包括来自一个或多个抗体分子的至少五个CDR。在另一个实施方案中，本发明抗体包括来自一个或多个抗体分子的至少六个CDR。可包括在本抗体中的包含至少一个CDR的示例性抗体分子在本文描述。
本发明的抗体可通过本领域已知的用于合成抗体的任何方法产生，特别是通过化学合成或优选通过本文描述的重组表达技术。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包含合成恒定区，其中一个或多个结构域被部分或完全缺失(″结构域缺失的抗体″)。在某些实施方案中，相容的修饰抗体包含结构域缺失构建体或其中完整CH2结构域已被去除的变体(ΔCH2构建体)。对于其他实施方案，短连接肽可以取代缺失结构域以提供可变区的柔性和运动自由。本领域技术人员将理解，此类构建体因为CH2结构域在抗体代谢率方面的调节性质而特别优选。结构域缺失构建体可以使用编码IgG1人恒定结构域的载体衍生，参见例如国际申请WO02/060955和WO02/096948A2。该载体被改造以缺失CH2结构域并提供表达结构域缺失IgG1恒定区的合成载体。
在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物是迷你抗体。修饰可以使用本领域描述的方法进行，参见例如美国专利5,837,821或国际申请WO 94/09817。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括具有几个甚至单个氨基酸的缺失或取代的免疫球蛋白重链，只要它允许单体亚基之间的缔合。例如，CH2结构域选定区中单氨基酸的突变可能足以明显减少Fc结合，从而增加α突触核蛋白定位。类似地，可能希望仅缺失控制待调节效应功能(例如补体结合)的一个或多个恒定区结构域的部分。恒定区的这种部分缺失可以改善抗体的选定特征(血清半衰期)，同时保留与受试者恒定区结构域缔合的其他希望功能不变。而且，如上提及的，公开抗体的恒定区可以是合成的，通过增强得到的构建体的特征的一个或多个氨基酸的突变或取代。在这方面，可能破坏保守结合位点提供的活性(例如Fc结合)，同时基本保持修饰抗体的构型和免疫原性。其他实施方案包括向恒定区添加一个或多个氨基酸以增强希望特征例如效应功能或提供更多细胞毒素或糖类连接。在此类实施方案中，可能希望插入或复制源自选定恒定区结构域的特定序列。
本发明还提供包括本文所述抗体分子(例如VH区和/或VL区)、基本由本文所述抗体分子(例如VH区和/或VL区)组成、或由本文所述抗体分子(例如VH区和/或VL区)组成的抗体，所述抗体或其片段免疫特异性结合α突触核蛋白。本领域技术人员已知的标准技术可用于在编码抗体的核酸序列中引入突变，包括但不限于定点诱变和PCR介导的诱变，其导致氨基酸取代。优选地，变体(包括衍生物)编码相对于参考VH区、VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL区、VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3少于50氨基酸取代、少于40氨基酸取代、少于30氨基酸取代、少于25氨基酸取代、少于20氨基酸取代、少于15氨基酸取代、少于10氨基酸取代、少于5氨基酸取代、少于4氨基酸取代、少于3氨基酸取代、或少于2氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似电荷的侧链的氨基酸残基取代的氨基酸取代。具有相似电荷的侧链的氨基酸残基家族已经在本领域定义。这些家族包括具有如下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。可选地，突变可以沿编码序列的全部或部分随机引入，例如通过饱和诱变，并且得到的突变体可以根据生物活性筛选以鉴定保留活性(例如结合α突触核蛋白的能力)的突变体。
例如，可能在抗体分子的仅构架区或仅CDR区中引入突变。引入的突变可以是沉默或中性错义突变，例如，对抗体结合抗原的能力没有或很少影响，实际上一些此类突变无论如何不改变氨基酸序列。这些类型的突变可用于优化密码子使用，或者提高杂交瘤的抗体生成。编码本发明抗体的密码子优化的编码区在本文其他地方公开。可选地，非中性错义突变可以改变抗体结合抗原的能力。最沉默和中性错义突变的位置可能在构架区中，而最非中性错义突变的位置可能在CDR中，尽管这不是绝对要求。本领域技术人员能够设计并测试具有希望性质的突变分子，所述希望性质例如没有抗原结合活性的改变或者结合活性的改变(例如抗原结合活性的提高或抗体特异性的改变)。诱变之后，编码的蛋白可以被常规表达，并且编码蛋白的功能和/或生物活性(例如，免疫特异性结合α突触核蛋白的至少一个表位的能力)可以使用本文描述的技术确定或者通过本领域已知的常规修饰技术确定。
III.编码抗体的多核苷酸
编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以由可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA的任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸构成。例如，编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以由单链和双链DNA、是单链和双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA、和是单链和双链区的混合物的RNA、包含可以是单链或更通常双链或单链和双链区的混合物的DNR和RNA的杂合分子构成。此外，编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以由包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区构成。编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸还可以包含一个或多个修饰碱基或为稳定性或其他原因而修饰的DNR或RNA骨架。″修饰的″碱基包括例如三苯甲基化碱基和不常见的碱基，例如肌苷。可以对DNA和RNA进行许多修饰；因此，″多核苷酸″包括化学、酶学或代谢修饰的形式。
编码衍生自免疫球蛋白(例如免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的多肽的非天然变体的分离的多核苷酸可以通过在免疫球蛋白核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失而使得一个或多个氨基酸取代、添加或缺失被引入编码蛋白来产生。突变可以通过标准技术引入，例如定点诱变和PCR介导的诱变。优选地，保守氨基酸取代在一个或多个非必需氨基酸残基进行。
如公知的，RNA可以通过标准技术从原始B细胞、杂交瘤细胞或其他转化的细胞分离，例如异硫氰酸胍提取和沉淀，随后离心或色谱。需要时，mRNA可以通过标准技术从总RNA分离，例如寡聚dT纤维素色谱。适合的技术是本领域熟知的。在一个实施方案中，编码抗体轻链和重链的cDNA可以同时或单独制备，使用反转录酶和DNR聚合物，根据公知的方法。PCR可以由共有恒定区引物或更特异性引物开始，基于公开的重链和轻链DNA和氨基酸序列。如上讨论的，PCR还可以用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这种情况下，可以通过共有引物或更大的同源探针，例如人恒定区探针筛选文库。
DNA，通常是质粒DNA，可以使用本领域已知的技术从细胞分离，并根据标准的公知技术限制作图并测序，所述公知技术在例如前述有关重组DNA技术的参考文献中详细列出。当然，根据本发明，DNA可以是合成的，在分离过程或随后分析的任何点。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的多核苷酸，包括编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸、基本由编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸组成、或由编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸组成，其中重链可变区的CDR的至少一个或重链可变区的VH-CDR的至少两个与来自本文公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同。可选地，VH的VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3区与来自本文公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同。因此，根据该实施方案，本发明重链可变区具有与图1所示多肽序列相关的VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3多肽序列。
在另一实施方案中，本发明提供了分离的多核苷酸，包括编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸、基本由编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸组成、或由编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸组成，其中轻链可变区的CDR的至少一个或轻链可变区的VL-CDR的至少两个与来自本文公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同。可选地，VL的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3区与来自本文公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同。因此，根据该实施方案，本发明轻链可变区具有与图1所示多肽序列相关的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3多肽序列。
在另一实施方案中，本发明提供了分离的多核苷酸，包括编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸、基本由编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的组成、或由编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸组成，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与图1和所附序列表所示VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3组相同的多肽序列。
如本领域已知的，两个多肽或两个多核苷酸之间的“序列同一性”通过比较一个多肽或多核苷酸的氨基酸或核酸序列与第二多肽或多核苷酸的序列来确定。当在本文讨论时，任何特定多肽与另一多肽是至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％相同可以使用本领域已知的方法和计算机程序/软件来确定，例如但不限于BESTFIT程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)。BESTFIT利用Smith and Waterman，Advances inApplied Mathematics 2(1981)，482-489的局部同源性算法，来发现两个序列之间最佳的同源性区段。当使用BESTFIT或任何其他序列比对程序确定特定序列与根据本发明的参考序列是否例如95％相同时，参数被当然设置为使得同一性百分比在参考多肽序列全长计算，并且允许参考序列中氨基酸总数的最多5％同源性空位。
在本发明的一个优选实施方案中，多核苷酸包括具有SEQ ID NO：2，5，8，11，14，17或20所列抗α突触核蛋白抗体的VH或VL区的多核苷酸序列的核酸、基本由具有SEQ ID NO：2，5，8，11，14，17或20所列抗α突触核蛋白抗体的VH或VL区的多核苷酸序列的核酸组成、或由具有SEQ ID NO：2，5，8，11，14，17或20所列抗α突触核蛋白抗体的VH或VL区的多核苷酸序列的核酸组成。就这方面而言，本领域技术人员容易理解，编码轻链和/或重链的至少可变结构域的多核苷酸可以编码两个免疫球蛋白链或仅一个的可变结构域。
本发明还包括本文其他地方描述的本发明的多核苷酸的片段。此外，编码本文描述的融合多核苷酸、Fab片段和其他衍生物的多核苷酸也包括在本发明内。
多核苷酸可以通过本领域已知的任何方法产生或生产。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，编码抗体的多核苷酸可以由化学合成的寡核苷酸组装，例如描述于Kutmeier等，BioTechniques 17(1994)，242，简言之，其包括合成含有编码抗体的序列的部分的重叠的寡核苷酸，退火并连接那些寡核苷酸，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
可选地，编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以从适合来源的核酸产生。如果含有编码特定抗体的核酸的克隆不可获得，但抗体分子的序列是已知的，则编码抗体的核酸可以化学合成或获自适合的来源(例如，抗体cDNA文库，或从表达α突触核蛋白特异性抗体的任何组织或细胞例如被选择表达抗体的杂交瘤细胞产生的cDNA文库，或从表达α突触核蛋白特异性抗体的任何组织或细胞例如被选择表达抗体的杂交瘤细胞分离的核酸、优选多聚A+RNA)，通过PCR扩增，使用可杂交至序列的3′和5′末端的合成引物，或通过使用对特定基因序列特异性的寡核苷酸探针克隆以从cDNA文库鉴定例如编码抗体的cDNA克隆。通过PCR产生的扩增的核酸然后可以被克隆入可复制的克隆载体，使用本领域公知的任何方法。
一旦确定抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的核苷酸序列和相应的氨基酸序列，其核苷酸序列可以使用本领域已知用于操纵核苷酸序列的方法例如重组DNA技术、定点诱变、PCR等来操纵(参见例如描述于以下的技术：Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)和Ausubel等，eds.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY(1998)，两者在此通过引用整体并入)，以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸取代、缺失和/或插入。
IV.抗体多肽的表达
下述对分离的遗传材料的操作提供本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，编码所述抗体的多核苷酸通常插入表达载体以引入宿主细胞，所述宿主细胞可以用于产生希望量的抗体。
本文描述了与靶分子结合的抗体或其片段、衍生物或类似物例如抗体的重链或轻链的重组表达。一旦获得编码本发明抗体分子或抗体重链或轻链或其部分(优选含有重链或轻链可变结构域)的多核苷酸，用于产生抗体分子的载体可通过重组DNA技术产生，使用本领域公知的技术。因此，本文描述了通过表达含有抗体编码核苷酸序列的多核苷酸制备抗体的方法。本领域技术人员公知的方法可用于构建含有抗体编码序列和适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供包含与启动子可操作连接的编码本发明抗体分子或其重链或轻链或重链或轻链可变结构域的核苷酸序列的可复制载体。此类载体可包括编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(参见，例如国际申请WO 86/05807和WO 89/01036；和美国专利no.5,122,464)，并且抗体的可变结构域可被克隆入此类用于表达整个重链或轻链的载体。
术语“载体”或“表达载体”在本文用来表示根据本发明使用的载体，用作在宿主细胞中引入并表达希望基因的运载体。如本领域技术人员已知的，此类载体可容易地选自由质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒组成的组。一般而言，与本发明相容的载体将包含选择标记、促进希望基因克隆和进入真核或原核细胞和/或在其中复制的能力的适当的限制位点。为了本发明目的，可以采用许多表达载体系统。例如，一类载体利用从动物病毒衍生的DNA元件，所述动物病毒例如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒。其他包括具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。此外，已经将DNA整合入其染色体的细胞可以通过引入一种或多种允许筛选转染的宿主细胞的标志来选择。所述标志可以提供营养缺陷型宿主的原养型、杀菌剂抗性(例如，抗生素)或重金属例如铜抗性。选择性标记基因可以直接连接至待表达的DNA序列，或者通过公转染被引入同一细胞。mRNA的最佳合成可能还需要其他元件。这些元件可以包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。
在特别优选的实施方案中，克隆的可变区基因与上述重链和轻链恒定区基因(优选人的)一起被插入表达载体。在一个实施方案中，这使用Biogen IDEC，Inc.的专有表达载体来实现，称为NEOSPLA，公开于美国专利no.6,159,730。该载体含有巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β球蛋白主要启动子、SV40复制起点、牛生长激素聚腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和前导序列。已经发现该载体在加入可变区和恒定区基因、转染入CHO细胞、随后在含有G418的培养基中选择并氨甲喋呤扩增之后导致非常高水平的抗体表达。当然，能够在真核细胞中引起表达的任何表达载体可用于本发明。适合的载体的实例包括但不限于质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1和pZeoSV2(可获自Invitrogen，San Diego，CA)和质粒pCI(可获自Promega，Madison，WI)。一般而言，从大量转化细胞筛选表达适当高水平免疫球蛋白重链和轻链的那些是可例如由机械系统进行的常规实验。载体系统还教导于美国专利号5,736,137和5,658,570，其通过引用整体并入本文。该系统提供高表达水平，例如＞30pg/细胞/天。其他示例性载体系统公开于例如美国专利号6,413,777。
在其他优选实施方案中，本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以使用多顺反子构建体表达，所述多顺反子构建体例如公开于美国专利申请公布号2003-0157641 A1的那些并在此整体并入本文。在这些表达系统中，感兴趣的多基因产物例如抗体的重链和轻链可以从单个多顺反子构建体产生。这些系统有利地利用内部核糖体进入位点(IRES)以提供相对高水平的抗体。相容的IRES序列公开于美国专利号6,193,980，其也在此并入。本领域技术人员将理解，此类表达系统可用于有效产生本申请公开的所有范围的抗体。
更一般地，一旦制备了编码抗体的单体亚基的载体或DNA序列，表达载体可以被引入适当的宿主细胞。质粒引入宿主细胞可以通过本领域技术人员已知的各种技术来实现。这些包括但不限于转染(包括使用例如Fugene或脂质体的脂质转染)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、用包封DNA的细胞融合、未注射和完整病毒感染。通常，质粒引入宿主细胞是通过标准磷酸钙共沉淀方法。具有表达构建体的宿主细胞在适合产生轻链和重链的条件下生长，并且分析重链和/或轻链蛋白合成。示例性分析技术包括酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)或荧光激活的细胞分选分析(FACS)、免疫组织化学等。
表达载体通过常规技术转移到宿主细胞，然后将转染的细胞通过常规技术培养产生用于本文描述的方法的抗体。因此，本发明包括含有编码与异源启动子可操作连接的本发明抗体或其重链或轻链的多核苷酸的宿主细胞。在优选实施方案中，为了表达双链抗体，编码重链和轻链的载体可以在宿主细胞中共表达，以表达完整的免疫球蛋白分子，如下详细描述。
宿主细胞可以用本发明的两个表达载体共转染，第一载体编码重链衍生的多肽，第二载体编码轻链衍生的多肽。两个载体可以含有相同的选择性标记，能够实现重链和轻链多肽的相等表达。可选地，可以使用编码重链和轻链多肽两者的单个载体。在这种情况下，轻链有利地放置在重链之前以避免过量的毒性自由重链；参见Proudfoot，Nature 322(1986)，52；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)，2197。重链和轻链的编码序列可以包括cDNA或基因组DNA。
本文使用的″宿主细胞″指含有使用重组DNA技术构建并且编码至少一种异源基因的载体的细胞。在描述从重组宿主分离抗体的过程中，除非另外清楚指明，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用以表示抗体来源。换言之，从“细胞”回收多肽可以表示从离心沉淀的完整细胞或者从含有培养基和悬浮细胞两者的细胞培养物。
多种宿主表达载体系统可用于表达用于本文描述方法的抗体分子。此类宿主表达系统代表可以产生并随后纯化感兴趣的编码序列的媒介物，但还代表当被适当核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达本发明抗体分子的的细胞。这些包括但不限于用含有抗体编码序列的重组细菌噬菌体DNA、质粒DNA或黏粒DNA表达载体转染的微生物例如细菌(例如大肠杆菌、枯草杆菌)；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，毕赤酵母)；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或具有含有衍生自哺乳动物细胞基因组(例如，金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的启动子的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、NSO、BLK、293、3T3细胞)。优选细菌细胞例如大肠杆菌、更优选特别用于表达完整重组抗体分子的真核细胞被用于表达重组抗体分子。例如，与诸如来自人巨细胞病毒的主要即刻早期基因启动子元件的载体结合的哺乳动物细胞例如中国仓鼠(CHO)细胞是有效的抗体表达系统；参见例如，Foecking等，Gene 45(1986)，101；Cockett等，Bio/Technology 8(1990)，2。
用于蛋白表达的宿主细胞系经常是哺乳动物来源；本领域技术人员具备优先确定最适合希望基因产物在其中表达的特定宿主细胞系的能力。示例性宿主细胞系包括但不限于CHO(中国仓鼠卵巢)、DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR-)、HELA(人宫颈癌)、CVI(猴肾细胞系)、COS(具有SV40T抗原的CVI的衍生物)、VERY、BHK(幼仑鼠肾)、MDCK、WI38、R1610(总过仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾细胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)和293(人肾)。CHO和293细胞是特别优选的。宿主细胞系通常可获自商业服务商美国组织培养中心(American Tissue Culture Collection)或公开的文献。
此外，可以选择调节插入序列表达或以所需的特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞品系。蛋白产物的此类修饰(例如，糖基化)和加工(例如，裂解)可能对于蛋白功能是重要的。不同的宿主细胞具有蛋白和基因产物的翻译后加工和修饰的特征和特定机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统来保证所表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此，可以使用具有适当加工初级转录物、糖基化和磷酸化基因产物的细胞器的真核宿主细胞。
为了长期高收率产生重组蛋白，稳定表达是优选的。例如，可以工程化稳定表达抗体分子的细胞系。除了使用含有病毒复制起点的表达载体，宿主细胞可以用由适当表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和选择性标志。在引入外源DNA之后，可以允许工程化细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转至选择性培养基。重组质粒中的选择性标志赋予筛选抗性并允许细胞将质粒稳定整合入其染色体并生长形成基因座，该基因座转而可以被克隆并扩增入细胞系。该方法可以有利地用于工程化稳定表达抗体分子的细胞系。
可以使用许多筛选系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，Cell 11(1977)，223)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska &Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48(1992)，202)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等，Cell 22(1980)，817)基因可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。而且，抗代谢物抗性可用作下述基因筛选的基础：dhfr，其赋予氨甲喋呤抗性(Wigler等，Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)，357；O′Hare等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981)，1527)；gpt，其赋予霉酚酸抗性(Mulligan & Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981)，2072)；neo，其赋予氨基糖苷G-418抗性，Goldspiel等，Clinical Pharmacy 12(1993)，488-505；Wu and Wu，Biotherapy3(1991)，87-95；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32(1993)，573-596；Mulligan，Science 260(1993)，926-932；和Morgan and Anderson，Ann.Rev.Biochem.62(1993)，191-217；TIB TECH 11(1993)，155-215；和hygro，其赋予潮霉素抗性(Santerre等，Gene 30(1984)，147。可以使用的重组DNA技术领域公知的方法描述于Ausubel等(eds.)，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer andExpression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)；和12章和13章，Dracopoli等(eds)，Current Protocols in人Genetics，John Wiley & Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin等，J.Mol.Biol.150：1(1981)，其在此通过引用整体并入。
抗体分子表达水平可以通过载体扩增来增加，综述参见Bebbingtonand Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for theexpression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，AcademicPress，New York，Vol.3.(1987)。当表达抗体的载体系统中的标志可扩增时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的增加将增加标志基因的拷贝数。因为扩增区与抗体基因连接，抗体的产生也增加；参见Crouse等，Mol.Cell.Biol.3(1983)，257。
体外生产允许放大产生大量希望的多肽。组织培养条件下哺乳动物细胞培养技术是本领域已知的，并且包括例如在气浮反应器或连续搅拌反应器中的同源悬浮培养，或例如在中空纤维中、微囊中、琼脂糖微珠或陶瓷筒上的固定或捕获的细胞培养。如果必要和/或需要，多肽溶液可通过常规色谱方法例如凝胶过滤、离子交换色谱、DEAE纤维素色谱或(免疫-)亲和色谱来纯化，例如在合成铰链区多肽优先生物合成之后，或在本文描述的HIC色谱步骤之前或随后。
编码本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的基因还可以在非哺乳动物细胞中表达，例如细菌或昆虫或酵母或植物细胞中。容易摄取核酸的细菌包括以下成员：肠杆菌，例如大肠杆菌或沙门氏菌株；芽孢杆菌，例如枯草杆菌；肺炎球菌；链球菌和流感杆菌。还理解，当在细菌中表达时，异源多肽通常变成包涵体的部分。异源多肽必须被分离、纯化、然后组装成功能分子。当需要抗体的四价形式时，则亚基自组装成四价抗体；参见例如国际申请WO02/096948。
在细菌系统中，许多表达载体可有利地根据被表达抗体分子的预期用途来选择。例如，当大量此类蛋白被产生时，为了产生抗体分子的药物组合物，指导容易纯化的融合蛋白产物高水平表达的载体可能是需要的。此类载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，EMBO J.2(1983)，1791)，其中抗体编码序列可以单独连接入载体，与lacZ编码区框内连接，使得产生融合蛋白；pIN载体(Inouye & Inouye，Nucleic Acids Res.13(1985)，3101-3109；Van Heeke & Schuster，J.Biol.Chem.24(1989)，5503-5509)；等。pGEX载体还可用于表达外源多肽，作为与谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白。一般而言，此类融合蛋白是可溶的，并且可通过吸附和结合至谷胱甘肽琼脂糖珠、随后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而从裂解细胞中纯化。pGEX载体被设计为包括凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位点，使得克隆的靶基因产物可以从GST部分释放。
除了原核生物，还可以使用真核微生物。酿酒酵母或常见的面包酵母是最常用的真核微生物，但许多其他菌株也是常用的，例如毕赤酵母。对于在酵母中表达，常用例如质粒YRp7(Stinchcomb等，Nature 282(1979)，39；Kingsman等，Gene 7(1979)，141；Tschemper等，Gene 10(1980)，157)。该质粒已经含有提供缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变菌株的选择标记的TRP1基因，所述突变菌株例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，Genetics85(1977)，12)。作为酵母宿主细胞基因组的特征的trp1损伤的存在则提供通过在缺乏色氨酸下生长来检测转化的有效环境。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)通常用作表达外源基因的载体。病毒在草地夜蛾细胞中生长。抗体编码序列可以被单独克隆入病毒的非必需区(例如，多角体蛋白基因)并置于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制下。
本发明抗体分子一经重组表达，本发明完整抗体、其二聚体、单独轻链和重链或其他免疫球蛋白形式可以根据本领域标准程序纯化，包括例如通过色谱(例如，离子交换、亲和力、特别是通过蛋白A后对特定抗原的亲和力、和分筛柱色谱)、离心、差异溶解度，例如硫酸铵沉淀，或通过沉淀蛋白的任何其他标准技术；参见例如Scopes，″Protein Purification″，Springer Verlag，N.Y.(1982)。可选地，增加本发明抗体亲和力的优选方法公开于美国专利公布2002-0123057 A1。
V.融合蛋白和结合物
在某些实施方案中，抗体多肽包括正常不与抗体结合的氨基酸序列或一个或多个部分。示例性修饰在下文更详细描述。例如，本发明的单链fv抗体片段可以包括柔性连接体序列，或者可以被修饰以添加功能性部分(例如，PEG、药物、毒素或标记，例如荧光、放射性、酶、核磁、重金属等)。
本发明抗体多肽可以包括融合蛋白、基本由融合蛋白组成、或由融合蛋白组成。融合蛋白是嵌合分子，包括例如免疫球蛋白α突触核蛋白结合结构域，具有至少一个靶结合位点和至少一个异源部分，即，自然界中正常不与其连接的部分。氨基酸序列可以正常存在于在融合多肽中在一起的单独蛋白中，或者它们可以正常存在于同一蛋白但在融合多肽中处于新的排列。融合蛋白可以例如通过化学合成或者通过产生并翻译其中肽区以希望的关系编码的多核苷酸来产生。
应用于多核苷酸或多肽的术语“异源的”表示多核苷酸或多肽衍生自与其相比较的其他实体不同的实体。例如，本文使用的待融合至抗体或其抗原结合片段、变体或类似物的“异源多肽”衍生自相同物类的非免疫球蛋白多肽或不同物类的免疫球蛋白或非免疫球蛋白多肽。
如在本文其他地方更详细讨论的，本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可进一步重组融合至异源多肽的N末端或C末端，或者可以化学结合(包括共价和非共价结合)至多肽或其他组合物。例如，抗体可重组融合或结合至在检测分析中用作标记的分子和效应分子例如异源多肽、药物放射性核素或毒素；参见例如国际申请WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；美国专利号5,314,995；和欧洲专利申请EP 0 396 387。
本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以由通过肽键或修饰的肽键彼此结合的氨基酸组成，即肽同配体，并且可以含有不同于20种基因编码氨基酸的氨基酸。抗体可以通过天然过程修饰，例如翻译后加工，或者通过本领域公知的化学修饰技术修饰。此类修饰充分描述于基础课本和更详细的专论以及许多研究文献中。修饰可以发生在抗体任何部位，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端，或者在诸如糖类的部分上。将理解，相同类型的修饰可以相同或不同程度存在于给定抗体的几个位置。而且，给定抗体可以含有许多类型的修饰。抗体可以是分支的，例如由于遍在蛋白化，并且它们可以是环状的，具有或没有分支。环状的、分支的和分支环状的抗体可以源自天然翻译后加工，或者可以通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、核黄素的共价连接、血红素的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸形成、焦谷氨酸酯形成、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋作用、硒酸化、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸添加至蛋白例如精氨酰化和遍在蛋白化；参见例如Proteins-Structure And Molecular Properties，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York 2nd Ed.，(1993)；PosttranslationalCovalent Modification Of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，NewYork，pgs.1-12(1983)；Seifter等，Meth.Enzymol.182(1990)，626-646；Rattan等，Ann.NY Acad.Sci.663(1992)，48-62)。
本发明还提供包含抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物和异源多肽的融合蛋白。在一个实施方案中，本发明融合蛋白包括以下、基本由以下组成、或由以下组成：具有本发明抗体或其片段或变体的VH区的任何一个或多个的氨基酸序列或本发明抗体的VL区的任何一个或多个的氨基酸序列的多肽，和异源多肽序列。在另一实施方案中，用于本文公开的诊断和治疗方法的融合蛋白包括以下、基本由以下组成、或由以下组成：具有抗体或其片段、变体或衍生物的VH-CDR的任何一个、两个、三个的氨基酸序列或抗体或其片段、变体或衍生物的VL-CDR的任何一个、两个、三个的氨基酸序列的多肽，和异源多肽序列。在一个实施方案中，融合蛋白包括具有本发明抗体或其片段、衍生物或变体的VH-CDR3的氨基酸序列的多肽和异源多肽序列，所述融合蛋白特异性结合α突触核蛋白。在另一实施方案中，融合蛋白包括具有本发明抗体的至少一个VH区的氨基酸序列和本发明抗体或其片段、衍生物或变体的至少一个VL区的氨基酸序列的多肽，和异源多肽序列。优选地，融合蛋白的VH和VL区对应于特异性结合α突触核蛋白的单一来源抗体(或scFv或Fab片段)。在另一实施方案中，用于本文公开的诊断和治疗方法的融合蛋白包括具有抗体的VHCDR的任何一个、两个、三个或多个的氨基酸序列和抗体的VL CDR的任何一个、两个、三个或多个的氨基酸序列的多肽，和异源多肽序列。优选地，VH-CDR或VL-CDR的两个、三个、四个、五个、六个或多个对应于本发明单一来源的抗体(或scFv或Fab片段)。编码这些融合蛋白的核酸分子也包括在本发明中。
文献中报道的示例性融合蛋白包括T细胞受体的融合体(Gascoigne等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987)，2936-2940；CD4(Capon等，Nature337(1989)，525-531；Traunecker等，Nature 339(1989)，68-70；Zettmeissl等，DNA Cell Biol.USA 9(1990)，347-353；和Byrn等，Nature 344(1990)，667-670)；L-selectin(homing receptor)(Watson等，J.Cell.Biol.110(1990)，2221-2229；和Watson等，Nature 349(1991)，164-167)；CD44(Aruffo等，Cell61(1990)，1303-1313)；CD28和B7(Linsley等，J.Exp.Med.173(1991)，721-730)；CTLA-4(Lisley等，J.Exp.Med.174(1991)，561-569)；CD22(Stamenkovic等，Cell 66(1991)，1133-1144)；TNF受体(Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)，10535-10539；Lesslauer等，Eur.J.Immunol.27(1991)，2883-2886；和Peppel等，J.Exp.Med.174(1991)，1483-1489(1991)；和IgE受体a(Ridgway and Gorman，J.Cell.Biol.115(1991)，Abstract No.1448)。
如本文其他地方讨论的，本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可融合至异源多肽以增加多肽的体内半衰期或用于施用本领域已知方法的免疫分析。例如，在一个实施方案中，PEG可结合至本发明抗体以增加其体内半衰期；参见例如Leong等，Cytokine 16(2001)，106-119；Adv.inDrug Deliv.Rev.54(2002)，531；或者Weir等，Biochem.Soc.Transactions30(2002)，512。
而且，本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可融合至标志序列，例如促进其纯化或检测的肽。在优选实施方案中，标志氨基酸序列是六组氨酸肽(HIS)，例如pQE载体中提供的标签(QIAGEN，Inc.，9259 EtonAvenue，Chatsworth，Calif.，91311)以及其他，其中许多是可商业获得的。如Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)，821-824中所述，例如，六组氨酸提供融合蛋白的常规纯化。用于纯化的其他肽标签包括但不限于″HA″标签，其对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等，Cell 37(1984)，767)和″flag″标签。
融合蛋白可使用本领域公知方法制备；参见例如美国专利号5,116,964和5,225,538。融合进行的准确位点可以通过经验选择以优化融合蛋白的分泌或结合特征。编码融合蛋白的DNA然后被转染入宿主细胞以表达。
本发明抗体可以非结合形式使用，或者可以结合至许多分子的至少一个，例如，以改善分子的治疗性质，促进靶检测，或患者的成像或治疗。本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以在纯化之前或之后标记或结合，此时进行纯化。具体说，本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以结合至治疗剂、前药、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药剂或PEG。
是包括常规抗体的免疫毒素的结合物已经在现有技术中广泛描述。毒素可以通过常规偶联技术偶联至抗体，或者含有蛋白毒素部分的免疫毒素可以作为融合蛋白产生。本发明抗体可以相应方式使用以获得此类免疫毒素。此类免疫毒素的示例描述于Byers，Seminars Cell.Biol.2(1991)，59-70和Fanger，Immunol.Today 12(1991)，51-54。
本领域技术人员将理解，结合物还可以使用许多技术组装，取决于待结合的选定剂。例如，具有生物素的结合物例如通过使α突触核蛋白结合多肽与激活的生物素酯例如生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯反应来制备。类似地，具有荧光标志的结合物可以在例如本文所列那些偶联剂存在下制备，或者通过与异硫氰酸酯、优选异硫氰酸荧光素反应来制备。本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的结合物以类似方式制备。
本发明还包括与诊断剂或治疗剂结合的本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。抗体可以在诊断上使用以例如证明神经疾病的存在，指示患神经疾病的风险，监测神经疾病的发展或进展，所述神经疾病即突触核蛋白病，作为临床测试程序的部分以例如确定给定治疗和/或预防方案的效力。监测可以通过使抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物与可检测物质偶联来促进。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属(利用各种正电子发射断层扫描仪)和非放射性顺磁金属离子；参见例如美国专利号4,741,900，关于可结合至根据本发明的用作诊断剂的抗体的金属离子。适合的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；适合的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括荧光素酶、荧光素和水母素；并且适合的放射性材料的实例包括125I、131I、111In或99Tc。
抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还可通过将之与化学发光化合物偶联来标记。化学发光标签抗体的存在则通过检测在化学反应过程中产生的发光的存在来确定。特别有用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺、异鲁米诺、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
其中抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可被可检测地标记的方式之一是通过将其与酶连接并在酶免疫分析(EIA)中使用连接的产物(Voller，A.，″The EnzymeLinked Immunosorbent Assay(ELISA)″MicrobiologicalAssociates Quarterly Publication，Walkersville，Md.，Diagnostic Horizons2(1978)，1-7)；Voller等，J.Clin.Pathol.31(1978)，507-520；Butler，Meth.Enzymol.73(1981)，482-523；Maggio，E.(ed.)，Enzyme Immunoassay，CRCPress，Boca Raton，Fla.，(1980)；Ishikawa，E.等，(eds.)，Enzyme Immunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo(1981)。与抗体结合的酶将与适当的底物、优选生色底物反应，以产生可被检测的化学部分的方式，例如通过分光光度、荧光或通过视觉方式。可用于可检测地标记抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌性核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油膦酸酯脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。此外，检测可以通过比色方法实现，所述比色方法采用酶的生色底物。检测可以通过与类似制备的标准品的底物的酶促反应程度的视觉比较来实现。
检测还可使用许多其他免疫分析的任何一种来实现。例如，通过放射性标记抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，这可能通过使用放射性免疫分析(RIA)来检测抗体(参见例如Weintraub，B.，Principles ofRadioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand AssayTechniques，The Endocrine Society，(March，1986))，其在此通过引用并入)。放射性同位素可以通过包括但不限于γ计数器、闪烁计数器或放射自显影仪的工具来检测。
抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还可以使用荧光发射金属例如152Eu或镧系其他元素来可检测地标记。这些金属可以使用诸如二乙烯三胺戊酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金属螯合基团连接至抗体。
用于将各种部分结合至抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的技术是公知的，参见例如Arnon等，″Monoclonal Antibodies For ImmunotargetingOf Drugs In Cancer Therapy″，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.(1985)；Hellstrom等，″Antibodies For Drug Delivery″，Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson等(eds.)，Marcel Dekker，Inc.，pp.623-53(1987)；Thorpe，″Antibody CarriersOf Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review″，Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等(eds.)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibodies In Cancer Therapy″，Monoclonal Antibodies ForCancer Detection And Therapy，Baldwin等(eds.)，Academic Press pp.303-16(1985)，和Thorpe等，″The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.62(1982)，119-158。
如提到的，在某些实施方案中，增强结合分子例如结合多肽，例如抗体或其免疫特异性片段稳定性或效力的部分可以被结合。例如，在一个实施方案中，PEG可以结合至本发明结合分子以增加其体内半衰期。Leong等，Cytokine 16(2001)，106；Adv.in Drug Deliv.Rev.54(2002)，531；或Weir等，Biochem.Soc.Transactions 30(2002)，512。
VI.组合物和使用方法
本发明涉及包含本发明前述α突触核蛋白结合分子例如抗体或其抗原结合片段或其衍生物或变体、或本发明多核苷酸、载体或细胞的组合物。本发明组合物还可以包括药学上可接受的载体。而且，根据药物组合无的预期用途，本发明药物组合物还可以包括诸如白细胞介素或干扰素的物质。例如，为了用于治疗帕金森病，其他物质可以选自由小有机分子抗α突触核蛋白抗体及其组合组成的组。因此，在特别优选的实施方案中，本发明涉及本发明α突触核蛋白结合分子例如抗体或其抗原结合片段或具有与其任何一个基本相同的结合特异性的结合分子、本发明多核苷酸、载体或细胞在制备用于预防性和治疗性治疗突触核蛋白病、监测突触核蛋白病进展或受试者对突触核蛋白病响应或用于确定受试者发展突触核蛋白病的风险的药物或诊断组合物中的用途。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及治疗特征分别为α突触核蛋白在脑和中枢神经系统中异常累积和/或沉积的神经疾患的方法，所述方法包括给需要其的受试者施用治疗有效量的本发明前述α突触核蛋白结合分子、抗体、多核苷酸、载体或细胞的任何一种。术语“神经疾患”包括但不限于突触核蛋白病，例如帕金森病(PD)、帕金森病痴呆(PDD)、路易体痴呆(DLB)、阿尔茨海默病路易体变异型(LBVAD)、多系统萎缩(MSA)、单纯性自主神经衰弱(PAF)、神经退行性变与脑铁累积1型(NBIA-I)、阿尔茨海默病、皮克病、青年型全身性神经轴性营养不良(Hallervorden-Spatz病)、肌萎缩性侧索硬化、外伤性脑损伤和唐氏综合征以及其他运动疾患和一般中枢神经系统(CNS)疾病。除非另外说明，术语神经退行性、神经或神经精神在本文可互换使用。
本发明治疗方法的特定优势在于如下事实：本发明抗体衍生自没有帕金森病体征的老年受试者的B细胞或B记忆细胞，因此可能预防临床表现的突触核蛋白病，或能够减少临床表现疾病发生的风险，或者能够延迟临床表现疾病的发生或进展。通常，本发明抗体也已经成功经历了体细胞成熟，即，通过抗体可变区的体细胞变异优化高亲和力结合靶α突触核蛋白分子的选择性和有效性。
此类细胞在例如人体内未借助相关或其他生理蛋白或细胞结构在自身免疫或变态反应意义上活化的知识也具有很大的医学意义，因为这意味着成功活过临床试验期的机会大增。可以说，在预防性或治疗性抗体在至少一个人受试者中临床前和临床研究之前，已经证明了效力、可接受性和耐受性。因此，可以预期，本发明的人抗α突触核蛋白抗体，其作为治疗剂的靶结构特异性效力及其降低的副反应可能性显著增加了其临床成功概率。
本发明还分别提供了药物和诊断包或试剂盒，包括填充有一种或多种上述成分的一个或多个容器，所述成分例如抗α突触核蛋白抗体或其结合片段、衍生物或变体、本发明的多核苷酸、载体或细胞。与此类容器结合的可以是管理药物或生物制品生产、使用或销售的政府机构规定形式的通告，所述通告反映生产、使用或销售管理机构批准用于人施用。此外或可选地，试剂盒包括用于适当诊断分析的试剂和/或说明书。当然，本发明组合物例如试剂盒特别适合伴有α突触核蛋白存在的疾患的风险评估、诊断、预防和治疗，并且特别适合治疗帕金森病(PD)、帕金森病痴呆(PDD)、路易体痴呆(DLB)和阿尔茨海默病路易体变异型(LBVAD)。
本发明药物组合物可根据本领域公知方法配制；参见例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(2000)by the University of Sciences inPhiladelphia，ISBN 0-683-306472。适合的药物载体的实例是本领域公知的，并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液，例如油/水乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。包含此类载体的组合物可以通过公知的常规方法配制。这些药物组合物可以适合的剂施用给受试者。适合组合物的施用可以通过不同方式实现，例如通过静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻内、局部或皮内施用或者脊髓或脑递送。气溶胶制剂例如鼻喷雾制剂包括活性剂与防腐剂和等渗剂的纯化的水溶液或其他溶液。此类制剂被优选调节至与鼻粘膜相容的pH和等渗状态。用于直肠或阴道施用的制剂可以作为栓剂与适合载体提供。
而且，本发明还包括目前在头颅中钻小孔以施用本发明药物的标准(但幸运地不常见)程序，在优选方面，本发明结合分子、特别是抗体或基于抗体的药物可以穿过血脑屏障，这允许静脉内或口服施用。
制剂方案将由主治医师和临床因素确定。医学领域已知，任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者尺寸、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别和施用时间和途径、健康状况和共时施用的其他药物。典型的剂量可以是例如范围0.001至1000μg(该范围内用于表达或抑制表达的核酸)；然而，低于或高于该示例范围的剂量被预见，特别是考虑前述因素。一般而言，剂量可以是如下范围：例如，宿主体重的约0.0001至100mg/kg、更通常0.01至5mg/kg(例如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内，优选至少1mg/kg。介于上述范围的剂量也将在本发明范围内。受试者可以每天、隔天、每周或根据经验分析确定的任何其他时间表来施用这种剂量。示例性的治疗需要经延长的时段例如至少六个月施用多剂量。额外示例性治疗方案需要每两周一次或每月一次或每3至6个月一次施用。示例性剂量时间表包括连续日1-10mg/kg或15mg/kg，隔日30mg/kg，或每周60mg/kg。在一些方法中，具有不同结合特异性的两种或多种单克隆抗体被同时施用，这种情况下，施用的每种抗体的剂量落入所示范围内。可以通过周期评估来检测过程。胃肠外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油、和可注射有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇溶液/水溶液、乳液或悬液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物包括氯化钠溶液、Ringer右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸化Ringer或固定油。静脉内媒介物包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于Ringer右旋糖的那些)等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。而且，本发明药物组合物还可以包含诸如多巴胺或精神药物的物质，取决于药物组合物的预期用途。
而且，在本发明一个优选实施方案中，药物组合物可以配制为疫苗，例如，如果本发明药物组合物包含用于被动免疫的抗α突触核蛋白抗体或其结合片段、衍生物或变体。如背景章节提到的，α突触核蛋白的寡聚体物类已经在血浆和CSF中细胞外报道(El-Agnaf等，FASEB J.20(2006)，419-425)，并且小鼠帕金森病模型的被动免疫研究显示，针对α突触核蛋白的细胞外小鼠单克隆抗体可以减少细胞内α突触核蛋白聚集物的累积(Masliah等，Neuron，46(2005)，857-868)。因此，谨慎预期，本发明的人抗α突触核蛋白抗体和等同的α突触核蛋白结合分子特别用作疫苗，用于预防或缓解突触核蛋白病，例如PD、DLB和LBVAD。
在一个实施方案中，利用本发明抗体的重组Fab(rFab)和单链片段(scFv)可能是有益的，其可能更容易穿过细胞膜。例如，Robert等，Protein Eng.Des.Sel.(2008)Oct 16；S1741-0134，之前在线公开，描述了使用单克隆抗体WO-2的嵌合重组Fab(rFab)和单链片段(scFv)，其识别Aβ的N末端区的表位。工程化片段能够(i)预防淀粉样蛋白纤维化，(ii)解聚预先形成的Aβ1-42原纤维，和(iii)体外抑制Aβ1-42寡聚体介导的神经毒性，与完整IgG分子一样有效。使用缺乏效应功能的小Fab和scFv工程化抗体形式的预测优点包括更有效穿过血脑屏障和最小化引起炎症副反应的风险。而且，除了scFv和单结构域抗体保留全长抗体的结合特异性外，它们可以被表达为单基因，并且在哺乳动物细胞内表达为内部抗体，具有改变其靶的折叠、相互作用、修饰或亚细胞定位的潜力；综述参见例如Miller and Messer，Molecular Therapy 12(2005)，394-401。
在不同方法中，Muller等，Expert Opin.Biol.Ther.(2005)，237-241描述了所谓“超级抗体技术”的技术平台，据称它能使抗体穿梭进入活细胞而不损害它们。此类细胞穿过抗体打开了新的诊断和治疗窗口。为这些抗体创造了术语′TransMab′。
在进一步实施方案中，用于治疗突触核蛋白病的其他神经保护剂的共施用或顺序施用可能是需要的。在一个实施方案中，其他药剂包含在本发明药物组合物中。可用于治疗受试者的神经保护剂的实例包括但不限于乙酰胆碱酯酶抑制剂、谷氨酸受体拮抗剂、激酶抑制剂、HDAC抑制剂、抗炎剂、双丙戊酸钠或其任意组合。可伴随本发明药物组合物使用的其他神经保护剂的实例在现有技术中描述；参见例如国际申请WO2007/011907。在一个实施方案中，其他药剂是多巴胺或多巴胺受体激动剂。
在本发明进一步的实施方案中，本发明α突触核蛋白结合分子，特别是抗体还可以与用于治疗突触核蛋白病的神经移植物移植疗法或干细胞疗法共施用，或者在用于治疗突触核蛋白病的神经移植物移植疗法或干细胞疗法之前或之后施用。此类使用胚胎中脑神经元移植物的方法已经在帕金森病患者中进行，目的是替代在疾病中损失的神经元并恢复纹状体中多巴胺能神经传递。在移植后11-16年，发现抑制的神经元含有路易体和路易突起。α突触核蛋白病变从宿主到移植组织的这种扩散可以通过共施用本发明α突触核蛋白结合分子、特别是抗体来预防。
治疗有效剂量或量指足以缓解症状或病症的活性成分的量。此类化合物的治疗效力和毒性可以通过细胞培养或实验动物中标准药物程序确定，例如ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)和LD50(对50％群体致死的剂量)。治疗作用和毒性作用之间的剂量比是治疗指数，其可以表示为LD50/ED50。优选地，组合物中治疗剂以足以恢复或保留PD、DLB或其他突触核蛋白病情况下正常行为和/或认知性质的量存在。
根据前文，显然，本发明涵盖包含上述抗体的至少一个CDR的α突触核蛋白结合分子的任何用途，特别是用于诊断和/或治疗上述突触核蛋白病，特别是帕金森病。优选地，所述结合分子是本发明抗体或其免疫球蛋白链。此外，本发明涉及前文描述的提到的抗体的任何一个的抗独特型抗体。这些是与位于抗体可变区上抗原结合位点附近的独特抗原性肽序列的抗体或其他结合分子，并且用于例如检测受试者样品中的抗α突触核蛋白抗体。
在另一实施方案中，本发明涉及包含上述本发明α突触核蛋白结合分子、抗体、抗原结合片段、多核苷酸、载体或细胞的任何一个和任选地适合检测的工具例如常规用于基于免疫或核酸的诊断方法的试剂的诊断组合物。本发明抗体例如适合用于免疫分析，其中它们可以液相使用或结合至固相载体。可利用本发明抗体的免疫分析的实例是直接或间接形式的竞争性和非竞争性免疫分析。此类免疫分析的实例是放射性免疫分析(RIA)、夹心(免疫计量分析)、流式细胞术和Western印迹分析。本发明抗原和抗体可结合至许多不同的载体并用于分离与其特异性结合的细胞。公知载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁石。为本发明目的，载体的性质可以是可溶的或不溶的。存在许多本领域技术人员已知的不同标记和标记方法。可用于本发明的标记类型的实例包括酶、放射性同位素、胶态金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物；还参见上文讨论的实施方案。
作为进一步实施方案，本发明α突触核蛋白结合分子、特别是抗体可用于诊断个体疾患的方法，通过从测试个体获得体液样品，其可以是血液样品、淋巴样品或任何其他体液样品，并使所述体液样品与本发明抗体在能够形成抗体-抗原复合物的条件下接触。然后通过本领域已知的方法测定此类复合物的水平，显著高于在对照样品中形成的复合物的水平，指示在测试个体中的疾病。以相同方式，还可使用本发明抗体结合的特定抗原。因此，本发明涉及包括本发明结合分子例如抗体或其抗原结合片段的体外免疫分析。
该上下文中，本发明还涉及为此目的特别涉及的工具。例如，可以使用基于抗体的阵列，其例如载有特异性识别α突触核蛋白的本发明抗体或等同抗原结合分子。微阵列免疫分析的设计概述于Kusnezow等，Mol.CellProteomics 5(2006)，1681-1696。因此，本发明还涉及载有根据本发明鉴定的α突触核蛋白结合分子的微阵列。
在一个实施方案中，本发明涉及诊断受试者中突触核蛋白病的方法，该方法包括：
(a)评估使用本发明抗体、其α突触核蛋白结合片段或与其任何一个具有基本相同的结合特异性的α突触核蛋白结合分子诊断的受试者样品中α突触核蛋白水平；和
(b)比较所述α突触核蛋白水平与指示一个或多个对照受试者中α突触核蛋白水平的参考标准，
其中所述α突触核蛋白水平与参考标准之间的差异或相似性指示受试者具有帕金森病。
被诊断的受试者可以是无疾病症状或临床前的。优选地，对照受试者具有突触核蛋白病，例如PD、DLB或LBVAD，其中α突触核蛋白水平与参考标准之间的相似性指示待诊断受试者具有突触核蛋白病。可选地或附加地，作为第二对照的对照受试者不具有突触核蛋白病，其中α突触核蛋白水平与参考标准之间的差异指示待诊断受试者具有突触核蛋白病。优选地，待诊断受试者和对照受试者是年龄匹配的。待分析样品可以是怀疑含有α突触核蛋白的任何体液，例如血液、CSF或尿样品。
α突触核蛋白的水平可以通过本领域已知的任何适合方法评估，包括例如，通过选自Western印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)、荧光激活的细胞分选分析(FACS)、二维凝胶电泳、质谱(MS)、基质辅助的激光解吸/电离-飞行时间-质谱(MALDI-TOF)、表面增强的激光解吸/电离-飞行时间(SELDI-TOF)、高效液相色谱(HPLC)、快速蛋白液相色谱(FPLC)、多维液相色谱(LC)随后串联质谱(MS/MS)和激光密度测定的一种或多种技术分析α突触核蛋白。优选地，所述α突触核蛋白的体内成像包括正电子发射断层照相(PET)、单光子发射断层照相(SPECT)、近红外(NIR)光学成像或磁共振成像(MRI)。
使用可根据本发明适应的抗体和相关工具诊断突触核蛋白病例如帕金森病或路易体病、监测突触核蛋白病进展和监测突触核蛋白病治疗的方法还描述于国际申请WO2007/011907。类似地，基于抗体的检测α突触核蛋白的方法描述于国际申请WO99/50300、WO2005/047860、WO2007/021255和WO2008/103472，所有的公开内容在此通过引用并入。那些方法可以如描述应用，但是使用本发明的α突触核蛋白特异性抗体、结合片段、衍生物或变体。
这些和其他实施方案通过本发明说明书和实施例来公开和涵盖。关于根据本发明使用的材料、方法、用途和化合物的任何一个的其他文献可以从公用文献和数据库检索，使用例如电子设备。例如，可以使用公用数据库″Medline″，其由National Center for Biotechnology Information和/或National Library of Medicine at the National Institutes of Health管理。其他数据库和网址例如是European Molecular Biology Laboratory(EMBL)的一部分的European Bioinformatics Institute(EBI)的那些也是本领域技术人员已知的，并且也可使用因特网搜索引擎获得。生物技术专利信息的概况和用于回溯检索和最新文献通告的相关专利信息来源的考察见Berks，TIBTECH12(1994)，352-364。
上述公开大体上描述了本发明。除非另外说明，本文使用的术语以2000年修订并在2003年再版的Oxford Dictionary of Biochemistry andMolecular Biology，Oxford University Press，1997，ISBN 0 19 850673 2中提供的定义给出。几个文件在本说明书正文通篇引用。完整的文献标引见权利要求书之前的说明书结尾处。所有引用的参考文献(包括本申请通篇引用的参考文献、授权专利、公开的专利申请以及生产商的说明书、使用说明等)的内容在此明确通过引用并入；然而，不承认所引用的任何文件实际上是本发明的在先技术。
可以参考下述具体实施例获得更全面的理解，这些实施例在本文仅为示例说明的目的提供，并且不是要限制本发明的范围。
实施例
以下实施例进一步描述了本发明，但不应该解释为以任何方式限制本发明范围。下述实施例1和2的实验就克隆的抗体NI-202.3G12、NI-202.12F4和NI-202.3D8示例说明和描述，即，含有在构架1Ig可变区的每个N末端引物诱导的突变，并且不被调整至人可变重链和轻链的种系(GL)序列；参见图1。然而，NI-202系列的其他抗体，特别是具有调整的GL序列的那些抗体结构上类似，并因此可预期提供相当的结果。这些抗体被表示为人IgG1分子。实施例3和4的实验就抗体NI-202.12F4来示例说明和描述，在Ig可变区的N末端具有引物诱导的突变，被调整至人可变重链和轻链的种系(GL)序列；参见图。该抗体被表示为嵌合分子，其中调整的人可变结构域融合至小鼠IgG2a恒定区以允许在转基因小鼠模型中的长期给药研究，不诱导小鼠抗人免疫应答。
材料和方法
常规方法例如本文使用的那些的详细描述参见所引用的文献。除非下文另外指出，α突触核蛋白特异性B细胞的鉴定和表现出感兴趣的特异性的α突触核蛋白抗体的分子克隆及其重组表达和功能鉴定已经或可以如国际申请PCT/EP2008/000053(公布为WO2008/081008)的实施例和补充方法章节中所述来进行，其公开内容在此通过引用整体并入。
抗原纯化
重组His-α突触核蛋白通过在大肠杆菌中重组表达，随后使用热诱导沉淀、镍亲和色谱、阴离子交换色谱和尺寸排阻色谱纯化来获得。
例如，包含在T7启动子控制下的编码α突触核蛋白的cDNA的DNA构建体用于转化适当的大肠杆菌菌株，例如BL21(DE3)，并且200ml细胞培养物的表达通过添加1mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)被诱导。细胞在37℃诱导4小时后收获，然后重悬于20ml 50mM Tris，150mMNaCl pH 8，随后超声处理。煮沸15分钟后，收集热抗性的17000g上清液。从模拟大肠杆菌收集类似的热抗性17000g上清液。在来自表达His标签α突触核蛋白的大肠杆菌的热抗性17000g上清液(20ml)被调整至50mMTris，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8之后，将它载至HisTrap HP 1ml(GELife Science)柱，并用30-500mM咪唑梯度洗脱HIS-α突触核蛋白。收集含有HIS-α突触核蛋白的级分，然后用50mM Tris pH 8稀释1∶10。稀释的收集的级分应用至HiTrap Q HP 1ml(GE Life Science)柱，结合的蛋白以30-1000mM NaCl梯度洗脱。最后，含有HIS-α突触核蛋白的洗脱液使用高效凝胶过滤(Superdex 200 10/300 GL)进一步纯化。该纯化过程产生如通过SDS-PAGE和考马斯染色评估的大约99％的纯度级别的HIS-α突触核蛋白。纯化的蛋白的浓度已经使用BCA分析(Pierce)测定。
α突触核蛋白抗体筛选
96孔半面积微板(Corning)用在涂布缓冲液(PBS pH 9.6)中2μg/ml的标准浓度的纯化的HIS-α突触核蛋白或α突触核蛋白(rPeptide)在4℃涂布过夜。板用PBS-T pH 7.6洗涤，非特异性结合位点在RT下用含有2％BSA的PBS-T(Sigma，Buchs，Switzerland)封闭1小时。B细胞条件培养基在RT下用1％BSA中10％热抗性大肠杆菌蛋白预吸收1小时。该预吸收步骤已经在之前几次ELISA筛选尝试之后进行，所述ELISA筛选未成功鉴定人α突触核蛋白特异性抗体。因此，幸运地，结果是ELISA板用热抗性大肠杆菌蛋白的预吸收排除筛选假阳性命中，例如纯化的重组α突触核蛋白样品中可能存在的粘抗体和针对大肠杆菌蛋白污染物的抗体。然后将预吸收介质从记忆B细胞培养板转移至ELISA板并在RT孵育2小时。ELISA板在PBS-T中洗涤，然后与辣根过氧化物酶(HRP)结合的驴抗人IgG(Fcγ片段特异性的)多克隆抗体孵育。用PBS-T洗涤之后，人抗体的结合通过在标准比色分析中测量HRP活性来确定。
α实触核蛋白抗体的分子克隆
含有记忆B细胞的样品获自＞60岁的自愿者。所有自愿者共同缺乏任何帕金森病体征。收集选择的记忆B细胞培养物的活B细胞，并制备mRNA。然后使用所有人可变重链和轻链家族的Ig-构架1特异性引物作为5’引物和所有人J区段(重链和κ轻链)和C区段(λ轻链)的特异性引物作为3’引物获得免疫球蛋白重链和轻链序列(Marks等，Mol.Biol.222(1991)，581-597；de Haard等，J.Biol.Chem.26(1999)，18218-18230)。
通过在重组表达完整抗体后ELISA再筛选，进行具有预期特异性的抗体克隆的鉴定。完整人IgG1抗体或嵌合IgG2a抗体的重组表达在将可变重链和轻链序列以“正确读码框”插入表达载体后实现，所述表达载体在5’-末端和3’-末端互补可变区序列与编码前导肽的序列与编码适当恒定区结构域的序列。为此，引物含有限制位点，被设计为有利于可变重链和轻链序列克隆入抗体表达载体。重链免疫球蛋白通过将免疫球蛋白重链RT-PCR产物框内插入重链表达载体来表达，所述重链表达载体带有信号肽和人免疫球蛋白γ1或小鼠免疫球蛋白γ2a的恒定结构域。κ轻链免疫球蛋白通过将NI-202.3D8的κ轻链RT-PCR产物框内插入轻链表达载体来表达，所述轻链表达载体提供信号肽和人κ轻链免疫球蛋白的恒定结构域。NI-202.12F4和NI-202.3G12λ轻链免疫球蛋白通过将λ轻链RT-PCR产物框内插入λ轻链表达载体来表达，所述λ轻链表达载体提供信号肽和人或小鼠λ轻链免疫球蛋白的恒定结构域。
功能性重组单克隆抗体在Ig重链表达载体和κ或λIg轻链表达载体共转染入HEK293或CHO细胞(或人或小鼠来源的任何其他适当受体细胞系)后获得。重组人单克隆抗体随后使用标准蛋白A柱纯化从条件培养基纯化。重组人单克隆抗体可以使用瞬时或稳定转染的细胞不限量产生。产生重组人单克隆抗体的细胞系可以使用Ig表达载体直接建立，或者通过将Ig可变区再克隆入不同表达载体来建立。还可以从这些Ig可变区产生衍生物例如F(ab)、F(ab)2和scFv。
抗体
兔多克隆pan突触核蛋白抗体(Abcam)、小鼠单克隆LB509α突触核蛋白特异性抗体(Invitrogen)、抗体Syn211(Sigma)和克隆42(BD Biosciences)根据生产商方案使用。重组人α突触核蛋白抗体NI202.3G12、NI202.12F4和NI-202.3D8是本发明抗体。它们在HEK293或CHO细胞中表达，然后条件培养基直接用于随后应用，除非另外说明。在实施例3至5中，使用本发明纯化的重组抗体。
直接ELISA
抗原以在PBS pH 9.6中所示浓度在4℃涂布在96孔半面积微板(Corning)上过夜。板用PBS-T pH 7.6洗涤，非特异性结合位点在RT下用含有2％BSA的PBS-T(Sigma)封闭1小时。然后将探针(初级抗体)转移至孔并在RT孵育2小时。在PBS-T pH 7.6中洗涤之后，孔与辣根过氧化物酶(HRP)结合的多克隆抗人(对于重组人抗体)、抗兔(对于pan突触核蛋白抗体)或抗小鼠(对于LB509或Syn211)二级抗体RT孵育1小时。在PBS-T中剧烈洗涤之后，通过在标准比色分析中测量HRP活性来确定探针结合，使用3，3′，5，5′-四甲基联苯-4，4′-二胺(Sigma)作为生色底物。
Western印迹和考马斯蛋白染色
为了评估人和小鼠α突触核蛋白的结合，使用Dounce匀浆器野生型或α突触核蛋白转基因小鼠的冷冻菌株在PBS中匀化(10ml/g湿重)。提取液以100’000g旋转，上清液是指定的可溶性级分。可溶性级分或重组蛋白(750ng)与上样染料混合，在65℃加热10分钟，每泳道上样0.75μg，在4-20％Tris-甘氨酸SDS-PAGE上分离。凝胶在0.025％考马斯亮蓝R250(Fluka)溶液中染色，或者电印迹至硝酸纤维素转移膜。然后将印迹与初级抗体孵育2小时。使用与HRP结合的二级抗人抗体揭示初级抗体的结合。使用ECL加Western印迹检测试剂(GE Healthcare)对印迹显色。
为了评估与α突触核蛋白单体和聚集物的结合，在含有0.5％TritonX100的PBS中制备脑提取液，随后在1000g离心5分钟。上清液通过4-12％Bis-Tris NuPAGE凝胶电泳分离并通过WB分析。
爬杆测试
小鼠在最活跃的黑暗期开始时测试。杆由木棍制成，长度50cm，宽度1cm，覆盖布以促进攀爬。杆的底部放入小鼠圈养笼。小鼠被放在杆的顶部，记录向下定向时间和下爬至圈养笼的时间，5次试验，间隔30分钟。分析最佳表现的试验。
抬高十字迷宫测试
小鼠在最活跃的黑暗期开始时测试。测试在暗光(40lux)下进行。抬高十字迷宫由两个开放臂和两个闭合臂组成(臂长：30cm；宽度5cm)。开放臂具有1cm小边缘，并且闭合臂边缘是15cm壁。任务开始时，小鼠被放入抬高十字迷宫中央，面向开放臂。在探索迷宫的同时，视频追踪小鼠5分钟。测量并分析开放臂和闭合臂中花费的时间和覆盖距离。
转基因小鼠
B6；C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J(Giasson等，Neuron.34(2002)，521-533)转基因α突触核蛋白小鼠和相应的野生型小鼠被保持在标准圈养条件下，转换的12h∶12h光/暗循环，自由获取食物和水。平衡治疗组的年龄和性别。
小鼠血浆中NI-202.12F4和α突触核蛋白水平的测定
使用直接α突触核蛋白ELISA测定NI-202.12F4血浆水平，使用已知浓度的重组NI-202.12F4作为标准。为了测定血浆中的人α突触核蛋白水平，应用夹心ELISA(Invitrogen，USA)。
实施例1：鉴定具有不同表位特异性的人α突触核蛋白特异性抗体
α突触核蛋白是140氨基酸(aa)长的天然未折叠蛋白，由三个结构域构成。这些是N末端两亲重复区(1-60aa)、中央区(61-95aa)和酸性C-末端区(96-140)。为了进一步理解重组人α突触核蛋白抗体的特异性，确定了α突触核蛋白含有识别序列的结构域。α突触核蛋白截断物1-60aa、1-95aa、61-140aa和96-140aa以等浓度涂布至ELISA板，然后探测重组人α突触核蛋白自身抗体NI-202.3G12和NI-202.12F4对这些截断物的结合。
有趣的是，NI-202.3G12仅结合涂布的全长α突触核蛋白，但不结合四种测试截断物的任何一种(图2A)。这表明NI-202.3G12的识别表位是不同于线性一级识别序列的结构基序。
另一方面，NI-202.12F4结合含有aa 1-60的α突触核蛋白片段1-60(图2B)，但不结合包含氨基酸61-140或96-140的N末端阶段片段。这显示其表位位于N末端内。显然，选择性结合病理包涵体中α突触核蛋白的小鼠单克隆抗体的鉴定揭示，其表位刚好在N末端区内(Waxman等，ActaNeuropathol.116(2008)，37-46。
此外，使用抗体NI-202.3D8进行的直接ELISA分析的初步结果揭示，NI-202.3D8特异性识别α突触核蛋白的C末端，特别是氨基酸96-140。C-末端结构域内关键氨基酸125-140的缺失改变具有路易体病(LBD)的痴呆患者脑中以及转基因动物模型中α突触核蛋白的聚集，存在丰富的C-末端α突触核蛋白片段累积。这些研究表明，能够识别C末端区的抗体可以具有潜在的治疗效应；参见Masliah等，Neuron，46(2005)，857-868。
为了排除包含C-末端α突触核蛋白的截断物不有效涂布至ELISA板，进行小鼠单克隆抗体α突触核蛋白抗体LB509的表位作图(Baba等，Am.J.Pathol.152(1998)，879-884)。LB509结合C末端表位(Jakes等，NeuroscienceLetters 269(1999)，13-16)。如图2C所示，该研究证实了LB509的C末端表位，并因此证实C-末端α突触核蛋白片段的有效涂布。结论，根据本发明进行的实验中重组人α突触核蛋白抗体的表位作图显示，这些抗体针对不同表位，包括构象性表位和N末端和C末端中潜在病理结构。
实施例2：人抗体对α突触核蛋白特异性
α-、β-和γ突触核蛋白是主要在神经系统、骨骼肌和心脏中表达的高度同源蛋白。然而，仅异常的α突触核蛋白与广谱CNS疾病有关，而β突触核蛋白被标明是α突触核蛋白聚集的抑制剂，并且可以保护中枢神经系统免受α突触核蛋白的神经毒性作用。因此，针对病理性α突触核蛋白变体的(治疗性)抗体优先不与β-和γ突触核蛋白交叉反应。为了支持重组人抗α突触核蛋白抗体的特异性和潜在治疗用途，在直接ELISA分析中并通过Western印迹(WB)探测候选抗体对α-、β-和γ突触核蛋白的结合。首先，重组α-、β-和γ突触核蛋白已经以相等的涂布浓度(2μg/ml)被涂布至ELISA板，然后与pan突触核蛋白对照抗体或重组人α突触核蛋白抗体孵育。pan突触核蛋白抗体与涂布至ELISA板的所有三种突触核蛋白蛋白反应(图3A)。然后，探测重组人α突触核蛋白抗体的特异性α突触核蛋白结合。NI-202.3G12和NI-202.12F4与涂布的α突触核蛋白反应，但不与β-和γ突触核蛋白反应(图3A和3B)。
类似地，还使用WB分析考察了重组抗体的特异性。考马斯蛋白染色证实，等浓度的所有三种突触核蛋白被应用至SDS PAGE分析(图4A)。WB分析则显示，NI-202.12F4选择性结合α突触核蛋白(图4B)，而没有初级抗体，没有检测到信号(图4C)。NI-202.3G12对WB上α突触核蛋白的结合是不可检测的。这符合不同于NI-202.3G12的线性识别序列的结构表位。这些发现证明，本发明描述的重组人α突触核蛋白抗体可以是高度特异性的。
所有随后实验用NI-202.12F4小鼠嵌合抗体进行。
实施例3：抗体NI-202.12F4的结合特异性
偏好聚集的α突触核蛋白物类的对人α突触核蛋白的特异性结合
为了评估NI-202.12F4对人和小鼠α突触核蛋白的结合，从野生型和α突触核蛋白A53T转基因小鼠制备脑提取物，通过Western印迹分析抗体结合。NI-202.12F4检测人A53Tα突触核蛋白转基因小鼠脑提取物中对应于α突触核蛋白的突出条带，而该条带在野生型小鼠提取物中实际上不存在(图5A)，表明对人α突触核蛋白而非小鼠α突触核蛋白的特异性结合。使用商业途径可获得的针对人α突触核蛋白特异性表位的LB509抗体获得类似的结果(Jakes等，Neuroscience Letters 269(1999)，13-16)。相反，据报道，商业途径可获得的抗体克隆42(van der Putten等，J.Neurosci.20(2000)，6021-6029)结合两物种的α突触核蛋白，检测到人以及小鼠α突触核蛋白。这些数据表明，NI-202.12F4优先结合人α突触核蛋白。
为了评估NI-202.12F4与人α突触核蛋白病理形式以及病理聚集物的结合，制备来自健康对照受试者和路易体痴呆(DLB)患者的大脑皮层提取物以及来自野生型小鼠和人A30Pα突触核蛋白转基因小鼠的脑提取物(Kahle等J.Neurosci.20(2000)，6365-73)，通过SDS凝胶电泳分离，并通过Western印迹分析。NI-202.12F4以高灵敏度检测突出的弥散条带，反映了在DLB和A30Pα突触核蛋白转基因脑提取物中而非健康对照和野生型对照提取物中α突触核蛋白聚集物的寡聚体和原纤维形式(图5B)。相反，在人或野生型小鼠组织中发现发现α突触核蛋白单体形式的最小结合，以及在高度表达α突触核蛋白的A30Pα突触核蛋白转基因脑提取物中的中度结合。相反，克隆42抗体显示在Western印迹分析中相反的结合模式和对聚集的α突触核蛋白物类差的结合，Western印迹以高灵敏度检测单体形式和α突触核蛋白片段。这些结果表明，NI-202.12F4优先结合α突触核蛋白的病理性聚集物，例如病理性α突触核蛋白单体的寡聚体和原纤维。
NI-202.12F4以高亲和力结合野生型以及引起疾病的人α突触核蛋白 变体
使用直接α突触核蛋白ELISA测定野生型以及引起疾病的人α突触核蛋白变体的半数最大有效浓度(EC50)。对于人α突触核蛋白的野生型以及A30P、E46K和A53T变体形式发现高亲和力结合(图6)。
重组NI-202.12F4优先结合脑中α突触核蛋白的病理形式
NI-202.12F4对α突触核蛋白的结合还通过对α突触核蛋白转基因小鼠和神经病理证实的帕金森病或路易体痴呆患者的脑切片的免疫组织化学染色进一步鉴定。NI-202.12F4显示α突触核蛋白病理的突出染色，α突触核蛋白病理包括路易体和路易突起样包涵体以及小体树的和突触的α突触核蛋白在表达人A53T(图7A)或A30Pα突触核蛋白(图7B)的转基因小鼠的自由浮动切片中和在帕金森病和路易体痴呆(图7C，D)的人脑组织中的聚集。与还高灵敏度检测生理突触的α突触核蛋白的商业途径可获得的Syn211抗体(Giasson等，J.Neurosci.Res.59(2000)，528-33)不同(图7E)，NI-202.12F4优先结合α突触核蛋白的病理聚集物，如人A30Pα突触核蛋白转基因小鼠的免疫组织化学染色所示例(图7B)。NI-202.12F4的结合实际上在野生型小鼠脑切片上不存在(图7F)，与仅对照染色的二级抗体(图7G)相当，证实对人而非小鼠α突触核蛋白的优先结合，如Western印迹分析中所观察的(图5)。相反，被报道结合人以及小鼠来源的α突触核蛋白的商业途径可获得的克隆42抗体(van der Putten等，J.Neurosci.20(2000)，6021-6029)显示野生型小鼠脑切片中小鼠α突触核蛋白蛋白的突出的突触染色(图7H)。
NI-202.12F4显示以高涂布浓度优先结合人α突触核蛋白，指向构象 性表位
使用直接α突触核蛋白ELISA测定低和高涂布浓度的重组α突触核蛋白的指示抗体效价的半数最大有效浓度(EC50)。对于高涂布密度的α突触核蛋白(20μg/ml)，发现具有～100pM的EC50的重组NI-202.12F4的高亲和力结合。在低涂布浓度的α突触核蛋白时，发现亲和力急剧下降，因此，EC50接近100倍的增加(图8A)。相反，针对α突触核蛋白C末端内线性表位的商业途径可获得的Syn211抗体(Giasson等，J.Neurosci.Res.59(2000)，528-33)，显示α突触核蛋白低涂布密度时结合亲和力不下降(图8B)。这些发现表明，NI-202.12F4优先靶向在高浓度α突触核蛋白形成的α突触核蛋白的结构表位。结果与NI-202.12F4的免疫组织化学结合特征一致，NI-202.12F4表明对α突触核蛋白聚集物例如α突触核蛋白原纤维或寡聚体的病理构象的偏好。如对全长α突触核蛋白所观察到的，NI-202.12F4对截断的α突触核蛋白1-60的结合显示对涂布浓度的等同依赖，指向在α突触核蛋白的氨基酸1-60内获得的构象性表位(图8C)。然而，不排除α突触核蛋白的氨基酸60-140可影响N末端表位的形成。显然，含有A53T突变的人α突触核蛋白的N-末端氨基酸1-60与小鼠α突触核蛋白的N末端100％相同。因此，所观察到的相对于小鼠直向同源物的对人α突触核蛋白的偏好可能是由于突触核蛋白的C-末端部分对优选的在N末端的NI-202.12F4表位的可及性或形成的影响。使用较小的α突触核蛋白的N末端衍生片段(氨基酸1-20；21-40；41-60；11-30；31-50)的表位作图研究揭示，NI-202.12F4抗体对任何肽无结合，表明这些区不足以结合NI-202.12F4(图8D)。
实施例4：针对α-突触核蛋白的重组人衍生抗体改善帕金森病转基因小鼠模型的运动性能和高架十字迷宫行为
为了评估NI-202.12F4治疗的药理作用，10.5个月大的过表达人A53Tα突触核蛋白转基因的转基因小鼠(Giasson等，Neuron 34(2002)，521-533)每周用5mg/kg重组嵌合NI-202.12F4抗体或媒介物对照腹腔内治疗共4个月。2个月治疗之后，在爬杆测试中评价运动性能。与媒介物治疗组相比，NI-202.12F4治疗的小鼠显示运动性能的显著改善，杆上转向时间显著减少(T转向；p＜0.001；n＝17-19动物每组)以及下行至圈养笼的总时间(T总；p＜0.05；n＝17-19动物每组)，如图9所示。在第二个行为测试中，分析对抬高十字迷宫表现的治疗作用。之前报道α突触核蛋白A53T转基因小鼠表现出受损的高架十字迷宫行为，在开放臂中花费比野生型对照更多的时间(George等，Exp.Neurol.，210(2008)，788-92)。如图10所示，NI-202.12F4的长期治疗导致α突触核蛋白A53T转基因动物的高架十字迷宫行为的显著改善。与媒介物治疗动物相比，抗体治疗小鼠在开放臂中花费显著更少的时间并覆盖显著更短的距离(p＜0.05；n＝17-19只动物每组)，而两组的活性水平相当。这些结果说明，用NI-202.12F4抗体的慢性治疗导致运动性能的显著改善，并减少了帕金森病α突触核蛋白转基因小鼠模型的异常高架十字迷宫行为。
实施例5：NI-202.12F4抗体增加帕金森病突触核蛋白转基因小鼠模型中的血浆突触核蛋白水平
10.5个月大的转基因A53Tα突触核蛋白转基因小鼠每周用5mg/kg嵌合NI-202.12F4或PBS腹腔内治疗2个月，最后一次注射之后，制备血浆样品，通过ELISA测定治疗抗体和人α突触核蛋白的血浆浓度(图11)。与媒介物治疗动物相比，人α突触核蛋白的血浆水平被显著减少超过10倍(NI-202.12F4治疗组是25±4.1ng/ml，而PBS组是1.9±1.2ng/ml，p＝0.0002)，说明NI-202.12F4治疗后对α突触核蛋白的药效学调节。A30Pα突触核蛋白转基因小鼠中急性抗体治疗后发现类似作用。因为在A53T和A30Pα突触核蛋白转基因模型中，人α突触核蛋白主要在脑中表达，循环人α突触核蛋白的增加可能由于NI-202.12F4介导的α突触核蛋白从脑至外周血的净流出。

Claims (17)

1.一种单克隆抗α突触核蛋白抗体或其α突触核蛋白结合片段，其包括：
a）SEQ ID NO:9的残基31-35的VH-CDR1氨基酸序列；
b）SEQ ID NO:9的残基50-68的VH-CDR2氨基酸序列；
c）SEQ ID NO:9的残基101-102的VH-CDR3氨基酸序列；
d）SEQ ID NO:12的残基23-33的VL-CDR1氨基酸序列；
e）SEQ ID NO:12的残基49-55的VL-CDR2氨基酸序列；
f）SEQ ID NO:12的残基88-98的VL-CDR3氨基酸序列。
2.权利要求1所述的抗体或其α突触核蛋白结合片段，其包括VH区和VL区，其中所述VH区包括选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO:9和10。
3.权利要求1所述的抗体或其α突触核蛋白结合片段，其包括VH区和VL区，其中所述VL区包括选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO:12和13。
4.权利要求1所述的抗体或其α突触核蛋白结合片段，其包括VH区和VL区，其中所述抗体是包含SEQ ID NO:9或10所示的VH区以及SEQ ID NO:12或13所示的VL区的单克隆抗体的变体。
5.一种单克隆抗α突触核蛋白抗体或其α突触核蛋白结合片段，其包括SEQ ID NO:9或10所示的VH区和SEQ ID NO:12或13所示的VL区。
6.一种多核苷酸，其编码权利要求1所述的抗体或其α突触核蛋白结合片段。
7.一种载体，包含权利要求6所述的多核苷酸。
8.一种宿主细胞，包含权利要求7所述的载体。
9.一种用于制备抗α突触核蛋白抗体或其片段的方法，所述方法包括：
(a)培养权利要求8所述的细胞；和
(b)从培养物分离所述抗体或其片段。
10.一种抗α突触核蛋白抗体或其α突触核蛋白结合片段，其由权利要求6所述的多核苷酸编码或者可通过权利要求9所述的方法获得。
11.权利要求1-5任一项所述的抗体或其α突触核蛋白结合片段，其：
(i)被可检测地标记，其中所述可检测标记选自由酶、放射性同位素、荧光团和重金属组成的组；或
(ii)与药物连接。
12.一种组合物，包含权利要求1-5和11任一项所述的抗体或其α突触核蛋白结合片段、权利要求6所述的多核苷酸、权利要求7所述的载体或权利要求8所述的细胞，其中所述组合物：
(i)是药物组合物，还包含药学上可接受的载体；或
(ii)是诊断组合物，还包含基于免疫或核酸的诊断试剂。
13.权利要求1至5和11任一项所述的抗α突触核蛋白抗体或其α突触核蛋白结合片段作为制备用于治疗或预防在受试者中的突触核蛋白病的药物的应用，其中所述突触核蛋白病选自：帕金森病(PD)、帕金森病痴呆(PDD)、路易体痴呆(DLB)、阿尔茨海默病路易体变异型(LBV AD)、多系统萎缩(MSA)、单纯性自主神经衰弱(PAF)、神经退行性变与脑铁累积1型(NBIA-I)、阿尔茨海默病、皮克病、青年型全身性神经轴性营养不良(Hallervorden-Spatz病)、肌萎缩性侧索硬化、外伤性脑损伤和唐氏综合征。
14.权利要求1至5和11任一项所述的抗α突触核蛋白抗体或其α突触核蛋白结合片段在制备用于诊断或监测受试者中突触核蛋白病进展的药物或诊断试剂中的用途，所述诊断或监测包括以下步骤：
(a)用所述抗体或其α突触核蛋白结合片段评估待诊断受试者样品中的α突触核蛋白水平；和
(b)将所述α突触核蛋白水平与参考标准相比较，所述参考标准指示一个或多个对照受试者中α突触核蛋白的水平，
其中所述α突触核蛋白水平与所述参考标准之间的差异或相似性指示所述受试者具有突触核蛋白病，
其中所述突触核蛋白病选自：帕金森病(PD)、帕金森病痴呆(PDD)、路易体痴呆(DLB)、阿尔茨海默病路易体变异型(LBV AD)、多系统萎缩(MSA)、单纯性自主神经衰弱(PAF)、神经退行性变与脑铁累积1型(NBIA-I)、阿尔茨海默病、皮克病、青年型全身性神经轴性营养不良(Hallervorden-Spatz病)、肌萎缩性侧索硬化、外伤性脑损伤和唐氏综合征。
15.一种用于诊断突触核蛋白病的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1至5和11任一项所述的抗体或其α突触核蛋白结合片段、权利要求6所述的多核苷酸、权利要求7所述的载体或权利要求8所述的细胞，以及试剂和/或使用说明书。
16.一种组合物，包含连接治疗剂或诊断剂的权利要求1至5和11任一项所述的抗体或其α突触核蛋白结合片段、以用于体内检测或靶向人体或动物体内α突触核蛋白的治疗剂和/或诊断剂，其中α突触核蛋白通过正电子发射断层照相(PET)、单光子发射断层照相(SPECT)、近红外(NIR)光学成像、磁共振成像(MRI)或其组合来检测。
17.权利要求1至5和11任一项所述的抗α突触核蛋白抗体或其α突触核蛋白结合片段在制备用于监测受试者中突触核蛋白病进展或对突触核蛋白病治疗的响应的药物或诊断试剂中的用途，其中所述突触核蛋白病选自：帕金森病(PD)、帕金森病痴呆(PDD)、路易体痴呆(DLB)、阿尔茨海默病路易体变异型(LBV AD)、多系统萎缩(MSA)、单纯性自主神经衰弱(PAF)、神经退行性变与脑铁累积1型(NBIA-I)、阿尔茨海默病、皮克病、青年型全身性神经轴性营养不良(Hallervorden-Spatz病)、肌萎缩性侧索硬化、外伤性脑损伤和唐氏综合征。
CN200980156871.XA 2008-12-19 2009-12-21 人抗α突触核蛋白自身抗体 Active CN102317316B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13925308P 2008-12-19 2008-12-19
EP08022188 2008-12-19
EP08022188.0 2008-12-19
US61/139,253 2008-12-19
PCT/EP2009/009186 WO2010069603A1 (en) 2008-12-19 2009-12-21 Human anti-alpha-synuclein autoantibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102317316A CN102317316A (zh) 2012-01-11
CN102317316B true CN102317316B (zh) 2014-08-13

Family

ID=40636880

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980156871.XA Active CN102317316B (zh) 2008-12-19 2009-12-21 人抗α突触核蛋白自身抗体

Country Status (26)

Country Link
US (4) US8940276B2 (zh)
EP (3) EP2949666B1 (zh)
JP (2) JP5810413B2 (zh)
KR (1) KR101781228B1 (zh)
CN (1) CN102317316B (zh)
AU (1) AU2009328505B2 (zh)
BR (1) BRPI0923157B1 (zh)
CA (1) CA2746778C (zh)
CY (2) CY1116584T1 (zh)
DK (2) DK2370466T3 (zh)
EA (1) EA030826B1 (zh)
ES (1) ES2544569T3 (zh)
HK (2) HK1156638A1 (zh)
HR (1) HRP20150831T1 (zh)
HU (1) HUE025150T2 (zh)
IL (1) IL213482A (zh)
MX (1) MX2011006422A (zh)
NZ (1) NZ593964A (zh)
PH (1) PH12016500658A1 (zh)
PL (2) PL2370466T3 (zh)
PT (1) PT2370466E (zh)
RS (1) RS54259B1 (zh)
SG (1) SG172121A1 (zh)
SI (2) SI2949666T1 (zh)
SM (1) SMT201500186B (zh)
WO (1) WO2010069603A1 (zh)

Families Citing this family (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL199534A (en) 2007-01-05 2013-01-31 Univ Zuerich An isolated human antibody capable of detecting a neoepitope in a disease-related protein, a polynucleotide encoding an antibody, a vector containing the polynucleotide, a host cell containing the polynucleotide or vector, a preparation containing the antibody and related methods and uses.
JP2011502966A (ja) * 2007-10-31 2011-01-27 アルセレス ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ドーパミントランスポーターレベルを評価することによるレビー小体型認知症の診断およびレビー小体型認知症の処置のモニタリングのための方法
PT2282758T (pt) 2008-04-29 2019-02-12 Bioarctic Ab Anticorpos e vacinas para uso em métodos terapêuticos e diagnósticos para perturbações relacionadas com a alfa-sinucleína
CN102317316B (zh) 2008-12-19 2014-08-13 帕尼玛制药股份公司 人抗α突触核蛋白自身抗体
AT508638B1 (de) * 2009-08-21 2011-08-15 Affiris Ag Verwendung von peptiden und polypeptiden zur behandlung und/oder prävention von synukleinopathien
WO2012061785A2 (en) * 2010-11-05 2012-05-10 Brandeis University Ice inhibiting compounds and uses thereof
BR112013033258B1 (pt) 2011-06-23 2022-09-20 University Of Zurich Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a alfasinucleína, composição e seus usos
CA3112082A1 (en) 2011-10-28 2013-05-02 University Of Zurich Tdp-43 specific binding molecules
PL2771031T3 (pl) * 2011-10-28 2018-09-28 Prothena Biosciences Limited Co. Humanizowane przeciwciała rozpoznające alfa-synukleinę
CN104040342A (zh) * 2011-11-02 2014-09-10 生物国际强制戒毒协会国际神经系统科学公司 抗α-共核蛋白抗体诊断脑中的α-共核蛋白的升高水平的用途
WO2013098419A1 (en) 2011-12-28 2013-07-04 Immunoqure Ag Method of providing monoclonal auto-antibodies with desired specificity
WO2013112945A1 (en) 2012-01-27 2013-08-01 Neotope Biosciences Limited Humanized antibodies that recognize alpha-synuclein
KR20140018691A (ko) * 2012-08-03 2014-02-13 가천대학교 산학협력단 시누클레인병증의 진단 방법 및 이를 위한 진단 키트
UA118441C2 (uk) 2012-10-08 2019-01-25 Протена Біосаєнсиз Лімітед Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн
US9534044B2 (en) 2013-02-28 2017-01-03 United Arab Emirates University Alpha-synuclein antibodies and uses thereof
EP2787349A1 (en) 2013-04-03 2014-10-08 Affiris AG Method for detecting proteinopathy-specific antibodies in a biological sample
EP2787348A1 (en) 2013-04-03 2014-10-08 Affiris AG Method for detecting aSyn-specific antibodies in a biological sample
US10513555B2 (en) 2013-07-04 2019-12-24 Prothena Biosciences Limited Antibody formulations and methods
TWI708058B (zh) * 2013-10-24 2020-10-21 美商納諾索米克斯公司 阿茲海默症及其他神經退化性疾病之生物標記及診斷方法
EP3071597B1 (en) 2013-11-21 2020-07-29 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use
CA2944402A1 (en) 2014-04-08 2015-10-15 Prothena Biosciences Limited Blood-brain barrier shuttles containing antibodies recognizing alpha-synuclein
KR102643395B1 (ko) 2014-07-29 2024-03-11 뉴리뮨 홀딩 아게 인간-유래의 항-헌팅틴(htt) 항체 및 그의 용도
CN107074938A (zh) * 2014-10-16 2017-08-18 豪夫迈·罗氏有限公司 抗‑α‑突触核蛋白抗体和使用方法
MA41115A (fr) 2014-12-02 2017-10-10 Biogen Int Neuroscience Gmbh Procédé de traitement de la maladie d'alzheimer
EP3091087A1 (en) 2015-05-08 2016-11-09 Fundació Institut d'Investigació en Ciències de la Salut Germans Trias i Pujol Method for in vitro diagnosis of synucleinopathies using alpha-synuclein gene transcripts
JP5908149B1 (ja) * 2015-06-30 2016-04-26 グリー株式会社 ゲームプログラム、ゲーム制御方法、およびゲームコンピュータ
GB201512203D0 (en) 2015-07-13 2015-08-19 Lundbeck & Co As H Agents,uses and methods
DK3430397T3 (da) 2016-03-14 2022-05-02 Biogen Int Neuroscience Gmbh Antistofafhængig cellemedieret fagocytoseassay til pålidelig måling af optagelse af aggregerede proteiner
MY188183A (en) 2016-06-02 2021-11-24 Medimmune Ltd Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof
US20190330318A1 (en) 2016-07-25 2019-10-31 Biogen Ma Inc. Anti-hspa5 (grp78) antibodies and uses thereof
JP2019536471A (ja) 2016-09-27 2019-12-19 セロ・セラピューティクス・インコーポレイテッドＣＥＲＯ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． キメラエンガルフメント受容体分子
CN106568969B (zh) * 2016-10-19 2017-09-26 首都医科大学 一种丝氨酸129位磷酸化alpha‑突触核蛋白聚集体的ELISA检测方法
EP3551228A4 (en) * 2016-12-12 2020-08-12 The Michael J. Fox Foundation For Parkinson's Research ANTIBODIES FOR HUMAN ALPHA SYNUCLEIN
WO2018109058A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 H. Lundbeck A/S Agents, uses and methods
WO2018112362A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Biogen Ma Inc. Stabilized proteolytically activated growth differentiation factor 11
WO2018128454A1 (ko) * 2017-01-06 2018-07-12 에이비엘바이오 주식회사 항 α-SYN 항체 및 그 용도
MX2019008029A (es) * 2017-01-06 2019-12-11 Abl Bio Inc Anticuerpo anti-alfa-sinucleina y su uso.
KR102573778B1 (ko) * 2017-02-17 2023-08-31 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 알파-시뉴클레인에 대한 항체 및 그의 용도
JOP20190227A1 (ar) * 2017-03-31 2019-09-30 Biogen Int Neuroscience Gmbh تركيبات وطرق لعلاج اعتلالات السينوكلين
KR101896182B1 (ko) 2017-06-15 2018-09-07 재단법인대구경북과학기술원 알파-시누클레인 응집체 매개 세포독성을 억제하는 방법
SG11201912195TA (en) * 2017-06-16 2020-01-30 United Neuroscience Peptide immunogens from the c-terminal end of alpha-synuclein protein and formulations thereof for treatment of synucleinopathies
CN111225923B (zh) 2017-08-02 2024-09-24 思瑞麦科生物科技公司 结合活性α突触核蛋白的抗体
IL272773B2 (en) 2017-08-22 2024-06-01 Biogen Ma Inc Pharmaceutical preparations containing anti-amyloid cell antibodies
AU2018341244A1 (en) 2017-09-26 2020-03-05 Cero Therapeutics, Inc. Chimeric engulfment receptor molecules and methods of use
AU2017434556A1 (en) 2017-09-28 2020-04-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Dosing regimes for treatment of synucleinopathies
CA3082559A1 (en) * 2017-11-17 2019-05-23 Abl Bio Inc. Antibodies to .alpha.-synuclein and uses thereof
US12071483B1 (en) 2017-12-14 2024-08-27 Abl Bio Inc. Bispecific antibody to alpha-synuclein/insulin-like growth factor 1 receptor and use thereof
GB201720975D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Ucb Biopharma Sprl Anti-alpha synuclein antibodies
GB201720970D0 (en) * 2017-12-15 2018-01-31 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
MX2020006119A (es) 2017-12-21 2020-08-24 Hoffmann La Roche Anticuerpos de union a hla-a2/wt1.
US11447775B2 (en) * 2018-01-12 2022-09-20 Bristol-Myers Squibb Company Antisense oligonucleotides targeting alpha-synuclein and uses thereof
WO2019191332A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Cero Therapeutics, Inc. Chimeric engulfment receptors and uses thereof for neurodegenerative diseases
EP3814375A4 (en) 2018-06-27 2022-07-13 Mor Research Applications Ltd. ANTIBODIES FOR THE TREATMENT OF SYNUKLEINOPATHIES AND NERVOUS INFLAMMATION
WO2020009482A1 (ko) * 2018-07-03 2020-01-09 에이비엘바이오 주식회사 항 알파-시누클레인 항체 및 그 용도
EP3833435A4 (en) 2018-08-09 2022-05-11 F. Hoffmann-La Roche AG DETERMINATION OF PARKINSON'S DISEASE
MX2021004772A (es) 2018-10-29 2021-08-16 Biogen Ma Inc Variantes de fc5 humanizado y estabilizado para mejorar el transporte de la barrera hematoencefalica.
WO2020097155A1 (en) * 2018-11-06 2020-05-14 Alsatech, Inc. Cell-based gene therapy for neurodegenerative diseases
US11542322B2 (en) 2019-02-13 2023-01-03 Iowa State University Research Foundation, Inc. Nano-theranostics for Parkinson's disease
JP7480180B2 (ja) * 2019-04-30 2024-05-09 チェイス セラピューティクス コーポレイション アルファ－シヌクレインアッセイ
KR102143189B1 (ko) * 2019-05-08 2020-08-11 주식회사 피플바이오 파킨슨병의 진단 방법 및 이를 위한 진단 키트
CA3159964A1 (en) * 2019-12-04 2021-06-10 Ac Immune Sa Novel molecules for therapy and diagnosis
NL2025332B1 (en) * 2020-04-10 2021-10-26 Syngle Therapeutics B V Novel alpha-synuclein binding antibodies, or antigen binding portions thereof.
CR20220531A (es) 2020-04-24 2022-11-28 Hoffmann La Roche Modulacion de enzimas y vías con compuestos de sulfhidrilo y sus derivados
AU2021298222A1 (en) * 2020-06-26 2022-12-15 Bioarctic Ab α-synuclein protofibril-binding antibodies
US12084491B2 (en) 2020-09-10 2024-09-10 Prothena Biosciences Limited Treatment of Parkinson's disease
CN112920274A (zh) * 2021-03-17 2021-06-08 江苏贝格尔生物医药有限公司 一种检测alpha-synuclein蛋白的鼠单克隆抗体及其应用
WO2023099788A1 (en) 2021-12-03 2023-06-08 Neurimmune Ag Novel potency assay for antibody-based drugs and useful means therefor
CN117645665B (zh) * 2024-01-29 2024-05-07 北京热景生物技术股份有限公司 一种针对α-突触核蛋白的抗体及其制备方法和应用

Family Cites Families (134)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
GB2183662B (en) 1985-04-01 1989-01-25 Celltech Ltd Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
DE3856559T2 (de) 1987-05-21 2004-04-29 Micromet Ag Multifunktionelle Proteine mit vorbestimmter Zielsetzung
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
AU631545B2 (en) 1988-04-15 1992-12-03 Protein Design Labs, Inc. Il-2 receptor-specific chimeric antibodies
WO1989012624A2 (en) 1988-06-14 1989-12-28 Cetus Corporation Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
ZA902949B (en) 1989-05-05 1992-02-26 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
JP3068180B2 (ja) 1990-01-12 2000-07-24 アブジェニックス インコーポレイテッド 異種抗体の生成
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
WO1991014438A1 (en) 1990-03-20 1991-10-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region
EP1149913A1 (en) 1990-11-09 2001-10-31 GILLIES, Stephen D. Cytokine immunoconjugates
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
FR2686087A1 (fr) 1992-01-13 1993-07-16 Inst Nat Sante Rech Med Nouvel antigene lymphocytaire, anticorps correspondant et leurs applications.
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
EP0627932B1 (en) 1992-11-04 2002-05-08 City Of Hope Antibody construct
EP0669986B1 (en) 1992-11-13 2003-04-09 Idec Pharmaceuticals Corporation Fully impaired consensus kozac sequences for mammalian expression
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5676950A (en) 1994-10-28 1997-10-14 University Of Florida Enterically administered recombinant poxvirus vaccines
AU721898B2 (en) 1994-11-18 2000-07-20 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for treatment of multiple sclerosis using peptide analogues at position 91 of human myelin basic protein
DE69637481T2 (de) 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
GB9524973D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Lynxvale Ltd Viral vectors
PL191251B1 (pl) 1997-03-14 2006-04-28 Idec Pharma Corp Sposób wprowadzania żądanego DNA w docelowe miejsce w genomie ssaka i układ wektorów
US8173127B2 (en) 1997-04-09 2012-05-08 Intellect Neurosciences, Inc. Specific antibodies to amyloid beta peptide, pharmaceutical compositions and methods of use thereof
US20020086847A1 (en) 1997-04-09 2002-07-04 Mindset Biopharmaceuticals (Usa) Recombinant antibodies specific for beta-amyloid ends, DNA encoding and methods of use thereof
ATE402717T1 (de) 1997-04-09 2008-08-15 Intellect Neurosciences Inc Für die termini des beta-amyloids spezifische, rekombinante antikörper, dafür kodierende dna und verfahren zu ihrer verwendung
JP2002512624A (ja) 1997-05-21 2002-04-23 バイオベーション リミテッド 非免疫原性タンパク質の製造方法
US6703015B1 (en) 1999-09-03 2004-03-09 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Filamentous bacteriophage displaying an β-amyloid epitope
US6743427B1 (en) 1997-12-02 2004-06-01 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6750324B1 (en) 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
US7179892B2 (en) 2000-12-06 2007-02-20 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20080050367A1 (en) 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US6913745B1 (en) 1997-12-02 2005-07-05 Neuralab Limited Passive immunization of Alzheimer's disease
US6761888B1 (en) 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US6710226B1 (en) 1997-12-02 2004-03-23 Neuralab Limited Transgenic mouse assay to determine the effect of Aβ antibodies and Aβ Fragments on alzheimer's disease characteristics
US7462605B2 (en) 1998-01-23 2008-12-09 Celmed Oncology (Usa), Inc. Phosphoramidate compounds and methods of use
WO1999050300A1 (en) 1998-03-30 1999-10-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of identifying, diagnosing and treating synuclein positive neurodegenerative disorders
AU1631700A (en) 1998-11-23 2000-06-13 Idec Pharmaceuticals Corporation Tumor antigen-specific antibody-gp39 chimeric protein constructs
EP1051432B1 (en) 1998-12-08 2007-01-24 Biovation Limited Method for reducing immunogenicity of proteins
US6787637B1 (en) 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
UA81216C2 (en) 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
CA2274414A1 (en) 1999-06-11 2000-12-11 Universite Laval Dietary fish protein for use in restoring normal insulin function insulin-resistant individuals
DE60044057D1 (de) 1999-09-03 2010-05-06 Univ Ramot Verbindungen, zusammensetzungen und verfahren zur behandlung oder vorsorge von alzheimer erkrankung
US6187309B1 (en) 1999-09-14 2001-02-13 Milkaus Laboratory, Inc. Method for treatment of symptoms of central nervous system disorders
US6294171B2 (en) 1999-09-14 2001-09-25 Milkhaus Laboratory, Inc. Methods for treating disease states comprising administration of low levels of antibodies
US6436401B1 (en) 1999-09-14 2002-08-20 Milkhaus Laboratory, Inc. Methods for alleviating symptoms associated with diabetes and diabetic neuropathy comprising administration of low levels of antibodies
US6713058B2 (en) 1999-09-14 2004-03-30 Milkhaus Laboratory, Inc. Methods for alleviating symptoms associated with neuropathic conditions comprising administration of low levels of antibodies
NZ523105A (en) 2000-06-22 2004-07-30 Genentech Inc Agonist anti-trk-C monoclonal antibodies
EP2082749A3 (en) 2000-07-07 2010-06-30 Bioarctic Neuroscience AB Prevention and treatment of Alzheimer's disease
WO2002102855A2 (en) 2000-11-17 2002-12-27 University Of Rochester In vitro methods of producing and identifying immunoglobulin molecules in eukaryotic cells
TWI255272B (en) 2000-12-06 2006-05-21 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
NZ545176A (en) 2001-01-29 2008-05-30 Biogen Idec Inc Modified antibodies reactive with CD20 and methods of use
WO2002096948A2 (en) 2001-01-29 2002-12-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
ITPV20010007U1 (it) 2001-07-19 2003-01-19 Maruscia Food Specialties Comp Contenitore per profilattico nuovo e usato
EP1944040B1 (en) 2001-08-17 2012-08-01 Washington University Assay method for Alzheimer's disease
US7414111B2 (en) 2001-09-19 2008-08-19 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Engineered templates and their use in single primer amplification
US20030157641A1 (en) 2001-11-16 2003-08-21 Idec Pharmaceuticals Corporation Polycistronic expression of antibodies
GB0203446D0 (en) 2002-02-14 2002-04-03 Univ Lancaster Detection and/or monitoring of synuclein-related diseases
MY139983A (en) 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20110200609A1 (en) 2002-09-12 2011-08-18 The Regents Of The University Of California Monoclonal antibodies specific for pathological amyloid aggregates common to amyloids formed from proteins of differing sequence
TW200509968A (en) 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
US20080014194A1 (en) 2003-10-31 2008-01-17 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease
US8506959B2 (en) 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
EP1571211B1 (en) 2002-11-22 2010-01-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibodies against lesional tissues
AU2003276107A1 (en) 2003-04-24 2004-11-19 Universitat Zurich Method of monitoring immunotherapy
TWI374893B (en) 2003-05-30 2012-10-21 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
WO2005018424A2 (en) 2003-08-18 2005-03-03 Research Foundation For Mental Hygiene, Inc. Antibodies specific for fibrillar amyloid and a procedure to detect fibrillar amyloid deposits
WO2005018572A2 (en) 2003-08-22 2005-03-03 Biogen Idec Ma Inc. Improved antibodies having altered effector function and methods for making the same
CA2538220A1 (en) 2003-09-09 2005-03-24 Takeda Pharmaceutical Company Limited Use of antibody
US7674599B2 (en) 2003-11-08 2010-03-09 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of using antibodies to detect alpha-synuclein in fluid samples
JP4851348B2 (ja) 2004-02-23 2012-01-11 イーライ リリー アンド カンパニー 抗Ａβ抗体
WO2005105998A1 (ja) 2004-04-27 2005-11-10 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute ヒト抗アミロイドβペプチド抗体およびその抗体フラグメント
EP1766396B1 (en) 2004-06-07 2010-08-11 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. Method of passive immunization against disease or disorder characterized by amyloid aggregation with diminished risk of neuroinflammation
SE0401601D0 (sv) 2004-06-21 2004-06-21 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril specific antibodies and uses thereof
EA013752B1 (ru) 2004-08-09 2010-06-30 Элан Фармасьютикалз, Инк. Предупреждение и лечение синуклеинопатических и амилоидогенных заболеваний
WO2006050041A2 (en) 2004-10-28 2006-05-11 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Methods for reducing or inhibiting brain inflammation or for promoting neurogenesis
WO2006066171A1 (en) 2004-12-15 2006-06-22 Neuralab Limited Amyloid βετα antibodies for use in improving cognition
TW200636066A (en) 2004-12-15 2006-10-16 Elan Pharm Inc Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
AU2006222193B2 (en) 2005-03-05 2011-11-17 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Screening method, process for purifying of non-diffusible A-beta oligomers, selective antibodies against said non-diffusible A-beta oligomers and a process for manufacturing of said antibodies
JP2006265189A (ja) 2005-03-24 2006-10-05 Kyoto Univ βアミロイドペプチド、及びそれを用いたアルツハイマー病治療薬又は予防薬のスクリーニング方法
ES2318918B1 (es) 2005-04-01 2010-02-16 Biotherapix Molecular Medicines, S.L.U. Anticuerpos humanos con capacidad de union al peptido beta-amiloide y sus aplicaciones.
WO2006116192A2 (en) 2005-04-21 2006-11-02 Medarex, Inc. Irta-1 antibodies and their uses
PE20061323A1 (es) 2005-04-29 2007-02-09 Rinat Neuroscience Corp Anticuerpos dirigidos contra el peptido amiloide beta y metodos que utilizan los mismos
ITMI20050912A1 (it) 2005-05-19 2006-11-20 Erregierre Spa Processo di preparazione di acidi 3-a-ya(b)-diidrossi-6-a(b)-alchil-5b-colanici
CA2657953A1 (en) 2005-07-19 2007-01-25 University Of Rochester Alpha-synuclein antibodies and methods related thereto
WO2007021255A1 (en) 2005-08-09 2007-02-22 Elan Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to alpha-synuclein
WO2008020864A2 (en) 2005-11-14 2008-02-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Imaging correlates of neurogenesis with mri
CA2630964A1 (en) 2005-11-22 2007-05-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Antibody treatment of alzheimer's and related diseases
CN101528770A (zh) 2005-11-30 2009-09-09 艾博特公司 制备重组形式的人β-淀粉样蛋白的方法和这些蛋白质的应用
PT1954718E (pt) 2005-11-30 2014-12-16 Abbvie Inc Anticorpos anti-globulómeros aβ, suas porções de ligação ao antigénio, correspondentes hibridomas, ácidos nucleicos, vectores, células hospedeiras, métodos de produção dos ditos anticorpos, composições compreendendo os ditos anticorpos, usos dos ditos anticorpos e métodos para uso dos ditos anticorpos
DK1976877T4 (en) 2005-11-30 2017-01-16 Abbvie Inc Monoclonal antibodies to amyloid beta protein and uses thereof
KR20150098683A (ko) 2005-12-12 2015-08-28 에이씨 이뮨 에스.에이. 치료적 특성을 갖는 베타 1-42 특이적인 단일클론성 항체
US8784810B2 (en) 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
IL199534A (en) 2007-01-05 2013-01-31 Univ Zuerich An isolated human antibody capable of detecting a neoepitope in a disease-related protein, a polynucleotide encoding an antibody, a vector containing the polynucleotide, a host cell containing the polynucleotide or vector, a preparation containing the antibody and related methods and uses.
HUE033325T2 (en) 2007-01-05 2017-11-28 Univ Zuerich Anti-beta-amyloid binder antibodies and their use
DK3067066T3 (da) 2007-02-23 2019-05-20 Prothena Biosciences Ltd Forebyggelse og behandling af synukleinopatisk og amyloidogenisk sygdom
HUE035762T2 (en) 2007-03-13 2018-05-28 Univ Zuerich Monoclonal Human Tumor-Specific Antibody
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
MX2009011127A (es) 2007-04-18 2010-03-10 Janssen Alzheimer Immunotherap Metodo de prevencion y tratamiento de angiopatia amiloide cerebral.
WO2008148884A1 (en) 2007-06-08 2008-12-11 Universite De La Mediterranee Compositions and methods for treating pancreatic tumors
PT2182983E (pt) 2007-07-27 2014-09-01 Janssen Alzheimer Immunotherap Tratamento de doenças amiloidogénicas com anticorpos anti-abeta humanizados
EP2185160B1 (en) 2007-08-31 2019-02-13 Neurimmune Holding AG Method of providing patient specific immune response in amyloidoses and protein aggregation disorders
EP2527369A3 (en) 2007-09-13 2012-12-19 University Of Zurich Prorektorat Forschung Monoclonal amyloid beta (abeta)-specific antibody and uses thereof
SG187477A1 (en) 2007-09-26 2013-02-28 U3 Pharma Gmbh Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor antigen binding proteins
AU2008312802A1 (en) 2007-10-19 2009-04-23 Immunas Pharma, Inc. Antibody capable of specifically binding to abeta oligomer, and use thereof
GB0720912D0 (en) 2007-10-25 2007-12-05 Univ Cardiff Monoclonal Anitbody for APP
EA201070539A1 (ru) 2007-10-29 2010-10-29 Энсэрм (Энститю Насьональ Де Ля Санте Э Де Ля Решерш Медикаль) НОВЫЕ АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К β-АМИЛОИДНЫМ ПЕПТИДАМ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ИЛИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
MY158903A (en) 2007-11-16 2016-11-30 Univ Rockefeller Antibodies specific for the protofibril form of beta-amyloid protein
WO2009085200A2 (en) 2007-12-21 2009-07-09 Amgen Inc. Anti-amyloid antibodies and uses thereof
AT506535B1 (de) 2008-02-22 2010-04-15 Affiris Forschungs & Entwicklungs Gmbh Vaccine enthaltend alpha-synuclein-mimotope auf basis von peptiden
PT2282758T (pt) 2008-04-29 2019-02-12 Bioarctic Ab Anticorpos e vacinas para uso em métodos terapêuticos e diagnósticos para perturbações relacionadas com a alfa-sinucleína
EP2321348A2 (en) 2008-07-09 2011-05-18 University of Zürich Method of promoting neurogenesis
AU2009294414A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Medimmune Llc Antibodies directed to CD105 and uses thereof
EP2365804B1 (en) 2008-11-13 2015-05-06 Modgene, Llc Reduction of amyloid-beta load in non-brain tissue
CN102317316B (zh) 2008-12-19 2014-08-13 帕尼玛制药股份公司 人抗α突触核蛋白自身抗体
US20100256596A1 (en) 2009-04-07 2010-10-07 Cabochon Aesthetics, Inc. Fiber growth promoting implants for reducing the appearance of cellulite
ES2641612T3 (es) 2009-04-17 2017-11-10 Immunas Pharma, Inc. Anticuerpos que se unen específicamente a oligómeros de beta A y uso de los mismos
CN102574915B (zh) 2009-08-06 2014-10-22 伊缪纳斯制药株式会社 特异性结合Aβ寡聚体的抗体及其用途
JP5599454B2 (ja) 2009-08-06 2014-10-01 イムナス・ファーマ株式会社 Ａβオリゴマーに特異的に結合する抗体およびその利用
KR20120092105A (ko) 2009-09-02 2012-08-20 이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니 개선된 발유성을 갖는 폴리에스테르 필름
BR112013033258B1 (pt) 2011-06-23 2022-09-20 University Of Zurich Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a alfasinucleína, composição e seus usos
CN104040342A (zh) 2011-11-02 2014-09-10 生物国际强制戒毒协会国际神经系统科学公司 抗α-共核蛋白抗体诊断脑中的α-共核蛋白的升高水平的用途
ITRM20120383A1 (it) 2012-03-20 2013-09-21 Uni Degli Studi Di Milano B Icocca Metodo e kit per la rivelazione di anticorpi.
JOP20190227A1 (ar) 2017-03-31 2019-09-30 Biogen Int Neuroscience Gmbh تركيبات وطرق لعلاج اعتلالات السينوكلين

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
+--synuclein in pathological inclusions..《ACTA NEUROPATHOLOGICA》.2008,第116卷(第1期),37-46.
Autoantibodies to alpha-synuclein in inherited Parkinson"s disease.;PAPACHRONI KATERINA K ET AL;《JOURNAL OF NEUROCHEMISTRY》;20070531;第101卷(第3期);749-756 *
Characterization of antibodies that selectively detect Î+--synuclein in pathological inclusions.;ELISA A WAXMAN ET AL.;《ACTA NEUROPATHOLOGICA》;20080415;第116卷(第1期);37-46 *
ELISA A WAXMAN ET AL..Characterization of antibodies that selectively detect &Icirc
EMADI SHARAREH ET AL..Inhibiting aggregation of alpha-synuclein with human single chain antibody fragments..《BIOCHEMISTRY》.2004,第43卷(第10期),2871-2878.
Immunotherapy and naturally occurring autoantibodies in neurodegenerative disorders.;NEFF FRAUKE ET AL;《AUTOIMMUNITY REVIEWS》;20080630;第7卷(第6期);501-507 *
Inhibiting aggregation of alpha-synuclein with human single chain antibody fragments.;EMADI SHARAREH ET AL.;《BIOCHEMISTRY》;20040316;第43卷(第10期);2871-2878 *
NEFF FRAUKE ET AL.Immunotherapy and naturally occurring autoantibodies in neurodegenerative disorders..《AUTOIMMUNITY REVIEWS》.2008,第7卷(第6期),501-507.
PAPACHRONI KATERINA K ET AL.Autoantibodies to alpha-synuclein in inherited Parkinson"s disease..《JOURNAL OF NEUROCHEMISTRY》.2007,第101卷(第3期),749-756.

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010069603A1 (en) 2010-06-24
HK1217722A1 (zh) 2017-01-20
EA030826B1 (ru) 2018-10-31
CY1116584T1 (el) 2017-03-15
SG172121A1 (en) 2011-07-28
SI2949666T1 (sl) 2019-03-29
ES2544569T3 (es) 2015-09-01
CA2746778C (en) 2019-04-23
EP2370466A1 (en) 2011-10-05
EP2949666A1 (en) 2015-12-02
DK2370466T3 (en) 2015-08-03
CN102317316A (zh) 2012-01-11
SMT201500186B (it) 2015-10-30
NZ593964A (en) 2012-12-21
HRP20150831T1 (hr) 2015-10-09
JP2014221835A (ja) 2014-11-27
JP2012512634A (ja) 2012-06-07
IL213482A (en) 2017-05-29
AU2009328505A1 (en) 2011-07-28
DK2949666T3 (en) 2019-03-25
RS54259B1 (en) 2016-02-29
PH12016500658B1 (en) 2018-01-08
HK1156638A1 (zh) 2012-06-15
MX2011006422A (es) 2011-09-15
JP5810413B2 (ja) 2015-11-11
EP2370466B8 (en) 2015-06-24
EP2370466B1 (en) 2015-05-06
US20110300077A1 (en) 2011-12-08
PT2370466E (pt) 2015-09-21
US20160244515A1 (en) 2016-08-25
EP2949666B1 (en) 2018-12-19
BRPI0923157B1 (pt) 2021-12-28
US8940276B2 (en) 2015-01-27
IL213482A0 (en) 2011-07-31
CY1121536T1 (el) 2020-05-29
EA201190041A1 (ru) 2012-02-28
KR20110110200A (ko) 2011-10-06
CA2746778A1 (en) 2010-06-24
PH12016500658A1 (en) 2018-01-08
HUE025150T2 (en) 2016-01-28
AU2009328505A2 (en) 2011-08-11
US20150232542A1 (en) 2015-08-20
AU2009328505B2 (en) 2014-11-27
US9896504B2 (en) 2018-02-20
EP3521309A1 (en) 2019-08-07
US10703808B2 (en) 2020-07-07
US20180371065A1 (en) 2018-12-27
KR101781228B1 (ko) 2017-09-22
BRPI0923157A2 (pt) 2018-10-23
PL2370466T3 (pl) 2015-12-31
PL2949666T3 (pl) 2019-07-31
SI2370466T1 (sl) 2015-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102317316B (zh) 人抗α突触核蛋白自身抗体
CN103796679B (zh) 抗-α突触核蛋白结合分子
CN105324394B (zh) 人抗-tau抗体
CN104159918B (zh) Tdp-43特异性结合分子
US10882902B2 (en) Human islet amyloid polypeptide (hIAPP) specific antibodies and uses thereof
CN103380145B (zh) 人类抗-sod1抗体
CN103339146B (zh) 人抗tau抗体
CN103408661B (zh) 提供疾患特异性结合分子和靶的方法
JP2021087432A (ja) トランスサイレチン（ｔｔｒ）アミロイドーシスに対する抗体療法及びそのためのヒト由来抗体
CN104936980B (zh) 用于治疗和预防多瘤病毒相关的疾病的重组人抗体
US11542322B2 (en) Nano-theranostics for Parkinson's disease
NZ618914B2 (en) Anti-alpha synuclein binding molecules

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant