CN105324394B - 人抗-tau抗体 - Google Patents

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Abstract

提供新颖的人tau特异性抗体及其片段、衍生物和变体，以及与其相关的方法。还公开与对tau具有特异性的抗体相关的测定、试剂盒和固体支持体。所述抗体、免疫球蛋白链以及其结合片段、衍生物和变体可分别用于tau靶向免疫治疗和诊断的药物和诊断组合物。

Description

人抗-TAU抗体
发明领域
本发明总体上涉及新颖的tau-特异性结合分子，特别是识别tau蛋白(包括病理性磷酸化tau和聚集形式的tau)的人抗体以及其片段、衍生物和变体。此外，本发明涉及作为用于鉴别血浆和CSF中的tau和毒性tau种类的诊断工具以及还在用于治疗神经退行性tau蛋白病(tauopathy)的被动疫苗接种策略两者中有价值的包含这些结合分子、抗体及其模拟物的药物和诊断组合物，所述tau蛋白病如阿尔茨海默氏病(AD)、肌萎缩性侧索硬化/帕金森氏病–痴呆复合征(ALS-PDC)、嗜银颗粒性痴呆(AGD)、英国类型淀粉样血管病、大脑淀粉样血管病、皮质基底节变性(CBD)、克罗伊茨费尔特-雅各布病(CJD)、拳击员痴呆、伴有钙化的弥漫性神经原纤维缠结、唐氏综合征(Down’s syndrome)、额颞叶痴呆、与染色体17相关的伴有帕金森氏病的额颞叶痴呆(FTDP-17)、额颞叶变性、格-施-莎三氏病(Gerstmann--Scheinker disease)、哈-斯二氏病(Hallervorden-Spatz disease)、包涵体肌炎、多系统萎缩、肌强直性营养不良、C型尼曼-皮克二氏病(Niemann-Pick disease typeC)(NP-C)、具有神经原纤维缠结的非关岛运动神经元病(non-Guamanian motor neurondisease with neurofibrillary tangle)、皮克氏病(PiD)、大脑炎后帕金森氏病、朊病毒蛋白大脑淀粉样血管病、进行性皮质下神经胶质增生、进行性核上性麻痹(PSP)、亚急性硬化性全大脑炎、仅缠结型痴呆、多发性梗塞性痴呆以及缺血性中风。
背景技术
蛋白质积聚、修饰和聚集是多种神经退行性疾病的病理方面。病理性修饰和聚集的tau包括过度磷酸化的tau构象异构体是tau蛋白病的不变标志并且与疾病严重程度相关。
tau是在中枢神经系统中表达的微管相关蛋白，其主要功能是使微管稳定。存在主要在成人大脑中表达的tau的六种主要同种型，其通过选择性剪接来源于单个基因。在病理条件下，tau蛋白变得过度磷酸化，从而导致微管蛋白结合的损失和微管的不稳定，接着tau在病原性神经原纤维缠结中的聚集和沉积。被统称为神经退行性tau蛋白病的与tau相关的病症是蛋白质错误折叠病症的组的一部分，包括阿尔茨海默氏病(AD)、进行性核上性麻痹、皮克氏病、皮质基底节变性、FTDP-17等。据报道tau基因中的超过40种突变与遗传性额颞叶痴呆相关，从而证明tau基因突变足以触发神经退行性变(Cairns等,Am.J.Pathol.171(2007),227-40)。转基因小鼠和细胞培养中的研究指示在AD中，tau病理学可能由病理学级联引起，其中Aβ位于tau的上游等人,Science 293(2001),1491–1495)。然而，其它发现指向双重途径模型，其中两种级联功能彼此独立(van de Nes等,Acta Neuropathol.111(2006),126-138)。靶向AD中的β-淀粉样肽的免疫疗法已经在动物模型中产生了令人鼓舞的结果并且在临床试验中显示出希望。来自少数受试者的最近尸体剖检数据表明，患有进行性AD的患者中β-淀粉样蛋白斑块的清除可能不足以停止认知退化，从而强调对于AD的另外治疗策略的需要(Holmes等,Lancet 372(2008),216-223；Boche等,ActaNeuropathol.120(2010),13-20)。随着基于Aβ的免疫疗法在转基因动物模型中的成功，主动免疫疗法的概念被扩展至tau蛋白。然而，使用tau蛋白对野生型小鼠进行主动疫苗接种被发现诱导中枢神经系统中的神经原纤维缠结、轴突损伤和单核细胞浸润的形成，伴有神经缺陷(Rosenmann等,Arch Neurol.63(2006),1459-1467)。使用磷酸化tau肽进行主动疫苗接种的转基因小鼠品系中的随后研究揭示大脑中tau聚集体的大脑水平降低并且行为障碍的进展减缓(Sigurdsson,J.Alzheimers.Dis.15(2008),157-168；Boimel等,Exp.Neurol.224(2010),472-485)。这些发现突出了潜在益处，而且突出了与靶向tau的主动免疫疗法方法相关的巨大风险。迫切需要用有效且安全的疗法解决病理性tau蛋白的新颖的治疗策略。
用源自健康人受试者的人抗体(所述抗体通过人免疫系统进化上优化和亲和力成熟)被动免疫将提供具有优异功效和安全性的较高概率的有希望的新的治疗途径。
发明概述
本发明利用健康人受试者的tau-特异性免疫应答用于分离天然抗-tau特异性人单克隆抗体。具体地说，根据本发明进行的实验从一组健康人受试者成功分离单克隆tau特异性抗体，而无神经退行性tau蛋白病的病征。
本发明因此涉及能够特异性地识别tau的人抗体、抗原结合片段和类似的抗原结合分子。“特异性地识别tau”、“对tau具有特异性的抗体”和“抗-tau抗体”具体地、通常地且共同地意指针对天然形式的tau或聚集的或病理性修饰的tau同种型的抗体。本文提供对于全长、病理性磷酸化和聚集形式选择性的人抗体。
在本发明的一个具体实施方案中，人抗体或其抗原结合片段展示出以如图7中提出的可变区VH和/或VL为特征的抗体的免疫结合特征。
抗体的抗原结合片段可以是单链Fv片段、F(ab')片段、F(ab)片段和F(ab')2片段或任何其它抗原结合片段。在下文一个具体实施方案中，抗体或其片段是人IgG同工型抗体。或者，抗体是嵌合人-鼠或鼠源化抗体，后者特别适用于诊断方法和动物研究。
此外，本发明涉及包含本发明的抗体或其活性片段、或它们的激动剂和同源分子或者可替代地拮抗剂的组合物，并且涉及使用在预防、诊断或治疗tau蛋白病中这类组合物的免疫治疗和免疫诊断方法，其中将有效量的所述组合物施用至有需要的患者。
当然，本发明分别延伸至产生具有如以下所定义的不同和独特特征的抗体的永生化人B记忆淋巴细胞和B细胞。
本发明还涉及编码本发明的抗体的免疫球蛋白链的至少一个可变区的多核苷酸。在一个实施方案中，所述可变区包含如图7中所提出的可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)。
因此，本发明还涵盖包含所述多核苷酸的载体和用其转化的宿主细胞以及其用于产生对tau具有特异性的抗体和等效结合分子的用途。用于重组产生抗体及其模拟物的手段和方法以及筛选竞争结合分子(例如抗体)的方法是本领域中已知的。然而，如本文所述，特别是关于在人中的治疗性应用，本发明的抗体在所述抗体的应用大致上不含针对对于嵌合和甚至人源化抗体另外观察到的这类抗体的免疫应答的意义上是人抗体。
此外，本文公开可用于鉴别样品中的tau的组合物和方法。所公开的抗-tau抗体可用于针对样品中tau的存在筛选人血液、CSF和尿，例如，通过使用基于ELISA的或表面适合的测定。本文公开的方法和组合物可有助于神经退行性tau蛋白病如阿尔茨海默氏病诊断，并且可用于监测疾病进展和治疗功效。
因此，本发明的具体目的是提供用于治疗、诊断或预防神经退行性tau蛋白病的方法，所述神经退行性tau蛋白病是如阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化/帕金森氏病–痴呆复合征、嗜银颗粒性痴呆、英国类型淀粉样血管病、大脑淀粉样血管病、皮质基底节变性、克罗伊茨费尔特-雅各布病、拳击员痴呆、伴有钙化的弥漫性神经原纤维缠结、唐氏综合征、额颞叶痴呆、伴有与染色体17相关的帕金森氏病的额颞叶痴呆、额颞叶变性、格-施-莎三氏病、哈-斯二氏病、包涵体肌炎、多系统萎缩、肌强直性营养不良、C型尼曼-皮克二氏病、具有神经原纤维缠结的非关岛运动神经元病、皮克氏病、大脑炎后帕金森氏病、朊病毒蛋白大脑淀粉样血管病、进行性皮质下神经胶质增生、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全大脑炎、仅缠结型痴呆、多发性梗塞性痴呆以及缺血性中风。所述方法包括向受试者施用有效浓度的人抗体或抗体衍生物，在所述受试者中所述抗体靶向tau。
本发明的其它实施方案将是从以下的描述和实施例清楚的。
附图简述
图1.人抗体NI-105.4E4(A)、NI-105.24B2(B)和NI-105.4A3(C)的可变区，即重链和λ轻链的氨基酸和核苷酸序列。指示了框架区(FR)和互补决定区(CDR)，其中CDR加下划线。由于克隆策略，在重链和轻链的N-末端处的氨基酸序列可潜在地包含FR1中的引物诱导的改变，然而所述改变大致上不会影响抗体的生物活性。为了提供共有人抗体，使原始克隆的核苷酸和氨基酸序列与数据库中的相关人种系可变区序列对准并且根据数据库中的相关人种系可变区序列进行调整；参见，例如，由MRC蛋白质工程中心(Cambridge,UK)主办的Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)。以粗线指示被认为由于PCR引物而潜在偏离共有种系序列并且因此已经在氨基酸序列中被置换的那些氨基酸。
图2.NI-105.4E4在AD大脑和表达人TauP301L的小鼠中结合神经原纤维缠结(NFT)、营养不良性神经突和神经原纤维网线。NI-105.4E4染色鉴别AD大脑中的NFT和神经原纤维网线(A)，其中在健康对照受试者的大脑中无显著结合tau(B)。在TauP301L转基因小鼠(E-I)中，NI-105.4E4强力地结合类似NFT(E、F和H)、神经原纤维网线(E和G)和营养不良性神经突(E和H)的病理性tau。此外，NI-105.4E4还鉴别在预缠结阶段(I)的tau聚集体。NI-105.4E4在表达具有Swedish和Arctic突变和TauP301L的人APP的转基因小鼠中结合NFT、营养不良性神经突和神经原纤维网线；箭头标记由通过NI-105.4E4识别的营养不良性神经突围绕的β-淀粉样蛋白斑块(J)。仅第二抗体在人AD(C)和健康对照(D)两者中均未给出信号。
图3.组织淀粉样蛋白斑块免疫反应性(TAPIR)测定。将神经原纤维缠结用抗-磷酸基-tau抗体AT100或分离自健康老年受试者的血清染色。
图4.示出NI-105.4E4和NI-105.4A3表位和通常使用的可商购的小鼠单克隆tau抗体的表位的示意性图示。人抗体NI-105.4E4靶向包含两个线性多肽的独特表位，其中一个线性多肽位于tau的微管结合结构域(R4)中，其被掩蔽在生理微管相关的tau中。Tau-12(Covance,California,U.S.A.)、HT7、AT8、AT180(Thermo Scientific,U.S.A.)；PHF1(Lewis等,Science 293(2001),1487-1491)。
图5.在腹膜内施用30mg/kg NI-105.4E4或NI-105.4A3人抗-tau抗体之后小鼠的血浆中的人IgG水平。
图6.在腹膜内施用30mg/kg NI-105.4E4或NI-105.4A3人抗-tau抗体之后小鼠的大脑匀浆中的人IgG水平。
图7.(A)NI-105.17C1、(B)NI-105.6C5、(C)NI-105.29G10、(D)NI-105.6L9、(E)NI-105.40E8、(F)NI-105.48E5、(G)NI-105.6E3、(H)NI-105.22E1、(I)NI-105.26B12、(J)NI-105.12E12、(K)NI-105.60E7、(L)NI-105.14E2、(M)NI-105.39E2、(N)NI-105.19C6和(O)NI-105.9C4人抗-tau抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列。互补决定区(CDR)加下划线。
图8.：(A)在ELISA测定中ch17C1、ch17C1(N31Q)mIgG2a和ch17C1(N31Q)mIgG1Agly与重组Tau的结合。(B)在ELISA测定中由ch17C1(N31Q)mIgG2a和ch17C1(N31Q,I48V)mIgG2a结合的重组Tau的比较。
图9.在ELISA测定中由NI-105.40E8hIgG1和NI-105.40E8(R104W)hIgG1结合的重组Tau的比较。
图10.NI-105.40E8、NI-105.48E5、NI-105.6C5和NI-105.17C1(I48V)人抗-tau抗体与AD大脑中和tau蛋白病的转基因小鼠模型的大脑中的病理性聚集的tau的结合。人抗-tau抗体与阿尔茨海默氏病(AD)的大脑中和tau蛋白病(Tg)的转基因小鼠的大脑中的病理性tau聚集体结合的代表性图像。对照组织样品获自精神健康的受试者(Ctr)或野生型小鼠大脑(Wt)。
图11.NI-105.6C5或NI-105.6E3人抗-tau抗体在TauP301L小鼠中的大脑渗透。“tg”指示来自处理的或未处理的转基因动物的代表性切片，并且“wt”指示未处理的非转基因动物。比例尺：50μm。
图12.用ch4E4(N30Q)和ch17C1(N31Q)长期处理TauP301L小鼠的作用。用商业ELISA定量大脑蛋白质提取物的可溶性和不溶性部分中的总人tau(A)、人pS199tau(B)、人pT231tau(C)和人pT181tau(D)水平。
图13.通过蛋白质印迹检测的用ch17C1(N31Q)和ch4E4(N30Q)处理的TauP301L小鼠中的可溶性和不溶性人tau。
图14.在腹膜内施用最后一个剂量之后24小时ch17C1(N31Q)和ch4E4(N30Q)处理的动物的平均血浆药物浓度。ch17C1(N31Q)和ch4E4(N30Q)的平均血浆药物浓度分别是145和200μg/ml。
图15.通过双试Y型迷宫评定用ch17C1(N31Q)和ch4E4(N30Q)处理的TauP301L小鼠中的空间工作记忆。
发明详述
I.定义
神经退行性tau蛋白病是共有包括主要由神经元和/或神经胶质细胞中的病理性过度磷酸化的tau组成的异常纤丝的细胞内聚集体的共同病理损伤的神经退行性病症的不同组。Tau蛋白病的临床特征是多种多样的，并且特征在于痴呆和/或运动综合征。丝状tau包含的进行性积聚可能引起神经元和神经胶质变性与其它沉积物如例如阿尔茨海默氏病中的β-淀粉样蛋白组合或作为唯一病原性实体，如tau基因中与同染色体17有关的额颞叶痴呆和帕金森氏病(FTDP-17)的家族形式相关的突变所示。由于其临床表现的异质性，可提供tau蛋白病疾病的潜在非穷尽列表，包括阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化/帕金森氏病-痴呆复合征、嗜银颗粒性痴呆、英国类型淀粉样血管病、大脑淀粉样血管病、皮质基底节变性、克罗伊茨费尔特-雅各布病、拳击员痴呆、伴有钙化的弥漫性神经原纤维缠结、唐氏综合征、额颞叶痴呆、与染色体17相关的伴有帕金森氏病的额颞叶痴呆、额颞叶变性、格-施-莎三氏病、哈-斯二氏病、包涵体肌炎、多系统萎缩、肌强直性营养不良、C型尼曼-皮克二氏病、具有神经原纤维缠结的非关岛运动神经元病、皮克氏病、大脑炎后帕金森氏病、朊病毒蛋白大脑淀粉样血管病、进行性皮质下神经胶质增生、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全大脑炎、仅缠结型痴呆、多发性梗塞性痴呆以及缺血性中风；参见综述，例如Lee等等，Annu.Rev.Neurosci.24(2001)，1121-1159，其中表1登记tau蛋白病的独特成员；或Sergeant等，Bioch.Biophy.Acta 1739(2005)，179-97，其中在图2中具有列表。
在本说明书中，术语“tau”可互换地用于具体地指tau的天然单体形式。术语“tau”通常还用于鉴别tau的其它构象异构体，例如tau的低聚物或聚集体。术语“tau”还用于统指所有类型和形式的tau。由于选择性剪接，在人大脑中存在6种tau同种型。这些同种型的蛋白质序列是：
352aa的同种型胎儿-tau
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381aa的同种型Tau-B
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410aa的同种型Tau-C
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383aa的同种型Tau-D
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412aa的同种型Tau-E
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441aa的同种型Tau-F
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“野生型”tau氨基酸序列由另外还被称为“hTau40”、“TauF”、“Tau-4”或“全长tau”的441aa的同种型Tau-F(SEQ ID NO：6)表示。Tau的氨基酸序列可从文献和相关数据库中检索；参见，Goedert等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)，4051-4055；Goedert等，EMBOJ.8(1989)，393-399；Goedert等，EMBO J.9(1990)，4225-4230和GenBankUniProtKB/swissprot：locus TAU_HUMAN，登录号P10636-2(胎儿-tau)和P10636-4至-8(同种型B至F)。
tau蛋白的另一个显著特征是磷酸化，磷酸化在79个潜在丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)磷酸化位点中的约30个处发生。Tau在大脑发育过程中高度磷酸化。磷酸化程度在成年期下降。一些磷酸化位点位于tau的微管结合结构域内，并且已经显示tau磷酸化的增加负调控微管的结合。例如，位于微管结合基序内或邻近微观结合基序的Ser262和Ser396在异常成对的螺旋纤丝(PHF)的tau蛋白中过度磷酸化，所述螺旋纤丝是AD患者的大脑中的神经原纤维缠结(NFT)主要组分。PHF是tau蛋白的丝状聚集体，所述tau蛋白是异常过度磷酸化的并且可用特异性抗-tau抗体染色并通过光学显微镜检测。这适用于所谓的直tau纤丝。PHF形成由彼此缠绕的具有约80nm周期性的两条纤丝组成的缠绕条带。这些病理特征通常被称为“tau-病理学”、“tau病理学(tauopathology)”或“tau-相关病理学”。关于tau蛋白病的神经病理学特征的更详细的描述，参见Lee等,Annu.Rev.Neurosci.24(2001),1121-1159和Brain.Res.Rev.35(2001),266-286，所述文献的公开内容以引用的方式并入本文。生理tau蛋白使神经元中的微管稳定。病理性磷酸化导致异常tau定位和聚集，这会引起微管不稳定和受损的细胞转运。聚集的tau在体外是神经毒性的(Khlistunova等,J.Biol.Chem.281(2006),1205-1214)。然而，确切的神经毒性种类仍不清楚，其导致神经元死亡所凭借的机制也不清楚。tau的聚集体可在许多tau蛋白病中作为神经原纤维缠结(NFT)的主要组分观察到，所述tau蛋白病如阿尔茨海默氏病(AD)、额颞叶痴呆、核上性麻痹、皮克氏病、嗜银颗粒性痴呆(AGD)、皮质基底节变性、FTDP-17、帕金森氏病、拳击员痴呆(在Gendron和Petrucelli,Mol.Neurodegener.4:13(2009)中综述)。除了这些观察结果，证据表明tau-介导的神经元死亡甚至可在不存在缠结形成的情况下发生。可溶性磷酸基-tau种类存在于CSF中(Aluise等,Biochim.Biophys.Acta.1782(2008),549–558)。Tau聚集体可以将错误折叠状态从细胞的外部传输至内部并且在共培养细胞之间传递(Frost等,J.Biol.Chem.284(2009),12845-12852)。
除了参与神经退行性tau蛋白病，在局部缺血/再灌注期间和之后在tau磷酸化中观察到的改变表明tau在神经元损伤和神经血管病症如缺血性中风的临床病理生理学中起关键作用(Zheng等,J.Cell.Biochem.109(2010),26-29)。
本文公开的人抗-tau抗体特异性地结合tau及其表位并且结合tau及其表位的各种构象。例如，本文公开特异性地结合tau、处于其全长的tau、病理性修饰的tau同种型和tau聚集体的抗体。如本文所用，提及“特异性地结合”、“选择性地结合”或“优先结合”tau的抗体是指不结合其它无关蛋白质的抗体。在一个实例中，本文公开的tau抗体能够结合tau或其表位，并且显示没有超出背景约1.5倍对其它蛋白质的结合。“特异性地结合”或“选择性地结合”tau构象异构体的抗体是指不结合tau的所有构象、即不结合至少一种其它tau构象异构体的抗体。例如，本文公开能够优先结合AD组织中的tau的聚集形式的抗体。因为本发明的人抗tau-抗体已经从展现出tau-特异性免疫应答的一组健康人受试者分离，所以本发明的tau-抗体还可被称为“人自身抗体”以便强调那些抗体确实由受试者表达并且尚未从例如人免疫球蛋白表达噬菌体文库中分离，迄今为止这代表了用于尝试提供人样抗体的一种常见方法。
应注意术语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”实体是指一个或多个所述实体；例如，“一个抗体”应理解为表示一个或多个抗体。如此，术语“一个/种(a/an))”、“一个(种)或多个(种)”以及“至少一个(种)”可在本文中互换使用。
如本文所用，术语“多肽”意图涵盖单个“多肽”以及多个“多肽”，并且是指由通过酰胺键(还被称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一个或多个链，并且不是指特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于表示两个或更多个氨基酸的一个或多个链的任何其它术语都被包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以代替或与任何这些术语互换使用。
术语“多肽”还意图表示多肽的表达后修饰产物，所述修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团衍生化、蛋白水解性裂解或被非天然存在的氨基酸修饰。多肽可以源自天然生物来源或由重组技术产生，但不必从指定核酸序列翻译。它可以任何方式产生，包括通过化学合成。
本发明的多肽可具有约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个或2,000个或更多个氨基酸的大小。多肽可具有限定的三维结构，但是它们不必具有这种结构。具有限定的三维结构的多肽被称为折叠的，并且不具有限定的三维结构、而是可采用许多不同构象的多肽被称为未折叠的。如本文所用，术语糖蛋白是指连接至至少一个碳水化合物部分的蛋白质，所述碳水化合物部分通过氨基酸残基(例如丝氨酸残基或天冬酰胺残基)的含氧或含氮侧链来连接至该蛋白质。
“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物意图为不在其天然周围环境中的多肽。不要求特定的纯化水平。例如，分离的多肽可以是从其原生或天然环境中移出的。出于本发明的目的在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是分离的，通过任何适合的技术分离、分级或者部分或实质性纯化的天然或重组多肽也被认为是分离的。
本发明的多肽还包括前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体以及其任何组合。在提及本发明的抗体或抗体多肽时，术语“片段”、“变体”、“衍生物”以及“类似物”包括保持相应天然结合分子、抗体或多肽的至少一些抗原结合特性的任何多肽。除了本文其它地方所讨论的具体抗体片段以外，本发明的多肽片段包括蛋白水解片段以及缺失片段。本发明的抗体和抗体多肽的变体包括如上所述的片段，以及还有由于氨基酸取代、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可天然存在或可以是非天然存在的。非天然存在的变体可使用本领域已知的诱变技术来产生。变体多肽可包含保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。tau特异性结合分子(例如本发明的抗体和抗体多肽)的衍生物是已经被改变以便展现在天然多肽上未发现的另外特征的多肽。实例包括融合蛋白。变体多肽在本文中还可被称为“多肽类似物”。如本文所用，结合分子或其片段、抗体或抗体多肽的“衍生物”是指具有通过官能侧基的反应化学衍生的一个或多个残基的主题多肽。“衍生物”还包括含有二十个标准氨基酸的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如，4-羟基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸；并且鸟氨酸可以取代赖氨酸。
术语“多核苷酸”意图涵盖单个核酸以及多个核酸，并且是指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，如在肽核酸(PNA)中所发现)。术语“核酸”是指多核苷酸中存在的任何一种或多种核酸区段，例如DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸意图为从其原生环境中移出的核酸分子、DNA或RNA。例如，出于本发明的目的，载体中所含有的编码抗体的重组多核苷酸被认为是分离的。分离的多核苷酸的其它实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的纯化(部分或实质性)的多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明的多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的所述分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调控元件，如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
如本文所用，“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的一部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但是它可以被认为是编码区的一部分，但任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等不是编码区的一部分。本发明的两个或更多个编码区可存在于单一多核苷酸构建体中，例如在单一载体上，或者在独立的多核苷酸构建体中，例如在独立(不同)的载体上。此外，任何载体可含有单一编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如单一载体可单独地编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。另外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区，所述异源编码区融合或未融合至编码结合分子、抗体或其片段、变体或衍生物的核酸。异源编码区包括但不限于特化的元件或基序，如分泌信号肽或异源功能性结构域。
在某些实施方案中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况下，包含编码多肽的核酸的多核苷酸通常可包含启动子和/或与一个或多个编码区可操作地缔合的其它转录或翻译控制元件。可操作的缔合是针对基因产物(例如多肽)的编码区按以下这种方式与一个或多个调控序列缔合，所述方式使得所述基因产物的表达处于所述调控序列的影响或控制之下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的键联的性质不干扰表达调控序列引导基因产物的表达的能力或不干扰DNA模板转录的能力，那么两个DNA片段(如多肽编码区和与其缔合的启动子)是“可操作地缔合”或“可操作地连接的”。因此，启动子区将与编码多肽的核酸可操作地缔合，只要启动子能够实现所述核酸的转录。启动子可以是只在预定细胞中引导DNA的实质性转录的细胞特异性启动子。除了启动子以外，其它转录控制元件例如增强子、操纵子、阻遏子以及转录终止信号可与多核苷酸可操作地缔合以便引导细胞特异性转录。本文公开了适合的启动子和其它转录控制区。
多种转录控制区是本领域的技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，如但不限于来自巨细胞病毒(立即早期启动子，与内含子-A结合)、猿猴病毒40(早期启动子)以及逆转录病毒(如劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))的启动子和增强子区段。其它转录控制区包括来源于脊椎动物基因的那些，如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素以及兔β-球蛋白，以及能够在真核细胞中控制基因表达的其它序列。其它适合的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子可诱导的启动子(例如，可由干扰素或白介素诱导的启动子)。
类似地，多种翻译控制元件是本领域的普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及来源于小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES，还被称为CITE序列)。
在其它实施方案中，本发明的多核苷酸是RNA，例如，呈信使RNA(mRNA)的形式。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可缔合有另外的编码区，所述另外的编码区编码分泌或信号肽，所述分泌或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦生长中的蛋白质链跨过粗面内质网的输出被启动，那么所述序列就从成熟蛋白质裂解。本领域的普通技术人员应意识到由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有融合至多肽的N-末端的信号肽，所述信号肽从完整或“全长”多肽裂解，以产生分泌的或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用原生信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或所述序列的保留指导与其可操作地缔合的多肽的分泌的能力的功能性衍生物。或者，可使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可被人组织纤溶酶原活化因子(TPA)或小鼠β-葡糖苷酸酶的前导序列取代。
除非另外说明，否则术语“病症”和“疾病”在本文中互换使用。
如在本发明的背景下使用的“结合分子”主要涉及抗体及其片段，但还可以指结合tau的其它非抗体分子，所述其它非抗体分子包括但不限于激素、受体、配体、主要组织相容性复合体(MHC)分子、伴侣蛋白如热休克蛋白(HSP)以及细胞-细胞粘附分子如钙粘蛋白、整合素、C型凝集素和免疫球蛋白(Ig)超家族的成员。因此，仅为了清楚起见并且不限制本发明的范围，关于代表用于开发治疗剂和诊断剂的结合分子的具体实施方案的抗体和抗体样分子讨论大多数以下实施方案。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中互换使用。抗体或免疫球蛋白是至少包含重链的可变结构域的tau结合分子，并且通常至少包含重链和轻链的可变结构域。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构是相对充分理解的；参见，例如Harlow等,Antibodies:ALaboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1988)。
如将在以下更详细地讨论，术语“免疫球蛋白”包括可在生物化学上区分的各种广泛类别的多肽。本领域的技术人员将理解重链被分类为γ(gamma)、μ(mu)、α(alpha)、δ(delta)或ε(epsilon)(γ、μ、α、δ、ε)，在它们之中具有一些子类别(例如，γ1-γ4)。这个链的本质是将抗体的“类别”分别确定为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白子类别(同种型)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等)被良好地表征并且已知赋予功能特化。鉴于本公开，熟练的技术人员易于辨别出这些类别和同种型各自的修饰型式，并且因此处于本发明的范围内。所有免疫球蛋白类别清楚地处于本发明的范围内，以下讨论将总体上涉及免疫球蛋白分子的IgG类别。关于IgG，标准免疫球蛋白分子包含分子量大约23,000道尔顿的两个相同轻链多肽和分子量53,000-70,000的两个相同重链多肽。这四条链通常由二硫键以“Y”构型连接在一起，其中轻链从“Y”的开口处开始并且一直通过可变区与重链括在一起。
轻链被分类为κ(kappa)或λ(lambda)(κ、λ)。可以用κ或λ轻链结合每种重链类别。通常，轻链和重链彼此共价键合，并且当通过杂交瘤、B细胞或遗传工程化的宿主细胞来产生免疫球蛋白时，这两条重链的“尾”部分由共价二硫键联或非共价键联彼此键合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉端处的N-末端延伸至每条链的底部处的C-末端。
轻链和重链均分成结构和功能同源性的区。就其功能使用术语“恒定的”和“可变的”。在这点上，将理解轻链部分(VL)和重链部分(VH)的可变结构域决定抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要的生物特性，如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区结构域的编号随着它们变得离抗体的抗原结合位点或氨基末端更远时增加。N-末端部分是可变区并且在C-末端部分处是恒定区；CH3结构域和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端。
如上所指示，可变区允许抗体选择性地识别和特异性地结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VL结构域和VH结构域或互补决定区(CDR)的子集组合以形成限定三维抗原结合位点的可变区。这个四级抗体结构形成存在于Y的每条臂的末端处的抗原结合位点。更确切地说，通过每条VH和VL链上的三个CDR来限定抗原结合位点。含有足以特异性地结合tau的结构的任何抗体或免疫球蛋白片段在本文可互换地指代为“结合片段”或“免疫特异性片段”。
在天然存在的抗体中，抗体包含存在于每个抗原结合结构域中的为短的、非连续的氨基酸序列的六个高变区，有时被称为“互补决定区”或“CDR”，当所述抗体在水性环境中呈现它的三维构型时，所述氨基酸序列特异性地定位以形成抗原结合结构域。“CDR”由显示较小分子间可变性的四个相对保守的“框架”区或“FR”侧接。构架区大部分采用β-折叠构象，并且CDR形成连接β-折叠结构并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分的环。因此，构架区起到形成支架的作用，所述支架提供通过链间、非共价相互作用来以正确取向定位CDR。由所定位的CDR形成的抗原结合结构域限定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这个互补表面促进抗体与其同源表位的非共价结合。分别包含CDR和构架区的氨基酸可由本领域普通技术人员针对任何给定的重链或轻链可变区来容易地加以鉴别，因为它们已经得到精确地定义；参见，"Sequences of Proteins of Immunological Interest,"Kabat,E.等,U.S.Department of Health and Human Services,(1983)；以及Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196(1987),901-917，所述文献以引用的方式整体并入本文。
在其中本领域内使用和/或接受的术语存在两种或更多种定义的情况下，如本文所用的术语的定义旨在包括所有此类意义，除非明确地相反说明。一个具体实例是使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述在重链多肽和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。这个具体区已经由Kabat等，U.S.Dept.of Health and Human Services，″Sequencesof Proteins of Immunological Interest″(1983)以及Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196(1987)，901-917描述，所述文献以引用的方式并入本文，其中定义包括当针对彼此比较时的氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义来指抗体或其变体的CDR旨在处于如本文所定义和使用的术语的范围内。涵盖如由每个以上引用的参考文献所定义的CDR的适当氨基酸残基列举在以下表1中作为比较。涵盖具体CDR的精确残基编号将取决于CDR的序列和大小而改变。在给定抗体的可变区氨基酸序列的情况下，本领域的技术人员可常规地确定哪些残基包含抗体的人IgG亚型的具体高变区或CDR。
表1：CDR定义1
Kabat Chothia
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
1表1中的所有CDR定义的编号是根据由Kabat等列举的编号惯例(参见下文)。
Kabat等还定义了适用于任何抗体的用于可变结构域序列的编号系统。本领域的普通技术人员可以明确地对任何可变结构域序列指定这种“Kabat编号”系统，而不依赖于超过序列本身的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指由Kabat等，U.S.Dept.ofHealth and Human Services，“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)所列举的编号系统。除非另外指定，否则提及本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中编号具体氨基酸残基位置是根据Kabat编号系统，然而所述Kabat编号系统是理论的并且可能不能同等适用本发明的每一抗体。在一个实施方案中，取决于第一CDR的位置，之后的CDR可在任一方向上位移。
本发明的抗体或其抗原结合片段、免疫特异性片段、变体或衍生物包括但不限于：多克隆的、单克隆的、多特异性的、人的、人源化的、灵长类动物源化的、鼠源化的或嵌合的抗体、单链抗体、表位结合片段，例如Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fv、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、由Fab表达文库产生的片段以及抗独特型(抗Id)抗体(包括例如，针对本文公开的抗体的抗-Id抗体)。ScFv分子是本领域中已知的并且例如描述于美国专利5,892,019中。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可具有任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2等)或免疫球蛋白分子的亚类。
在一个实施方案中，本发明的抗体不是具有五价结构的IgM或其衍生物。具体的，在本发明的特定应用中，尤其是治疗性使用中，IgM不如IgG和其它二价抗体或相应结合分子有用，因为IgM由于其五价结构和亲和力成熟的缺乏通常显示出非特异性交叉反应性和非常低的亲和力。
在一个具体实施方案中，本发明的抗体不是多克隆抗体，即它大致上由一种具体抗体种类而不是从血浆免疫球蛋白样品获得的混合物组成。
包括单链抗体的抗体片段可包含单独地或与以下的全部或一部分组合的一个或多个可变区：铰链区、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域。本发明还包括包含一个或多个可变区与铰链区、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域的任何组合的tau结合片段。本发明的抗体或其免疫特异性片段可来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。在一个实施方案中，抗体可以是人、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、羊驼、马或鸡抗体。在另一个实施方案中，可变区可以是软骨类动物(condricthoid)来源(例如，来自鲨鱼)。
一方面，本发明的抗体是自人分离的人单克隆抗体。任选地，根据数据库中的相关人种系可变区序列比对和采用人抗体的框架区；参见，例如由用于蛋白质工程(Cambridge,UK)的MRC中心托管的Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)。例如，被认为可能偏离真实种系序列的氨基酸可以是由于在克隆过程期间并入的PCR引物序列。与人工产生的人样抗体如来自噬菌体展示抗体文库或异种小鼠的单链抗体片段(scFv)相比，本发明的人单克隆抗体的特征在于：(i)使用人免疫应答而不是动物替代物的免疫应答获得，即，抗体响应于人体中的处于它的相关构象中的天然tau而产生；(ii)具有保护个体或至少对tau的存在重要的；以及(iii)因为抗体是具有人来源的，所以抵抗自体抗原的交叉反应性的危险被最小化。因此，根据本公开，使用术语“人单克隆抗体”、“人单克隆自身抗体”、“人抗体”以及类似的抗体来指代具有人来源的tau结合分子，即所述tau结合分子从人细胞如B细胞或其杂交瘤中分离出或所述tau结合分子的cDNA直接从人细胞(例如人记忆B细胞)的mRNA克隆。即使在抗体中进行了氨基酸取代例如以改进结合特征，但是人抗体仍然是“人的”。
将如下和例如在Kucherlapati等的美国专利号5,939,598中所描述的源自人免疫球蛋白文库或源自对一种或多种人免疫球蛋白转基因的并且不会表达内源免疫球蛋白的动物的抗体指代为人样抗体，以便使它们与本发明的真正人抗体加以区别。
例如，通常自噬菌体展示分离的人样抗体如合成和半合成抗体的重链和轻链的配对不一定反映如在原始人B细胞中发生的原始配对。因此，如现有技术中通常使用的从重组表达文库获得的Fab和scFv片段可被认为是人工的，对免疫原性和稳定性具有所有可能的相关作用。
相比之下，本发明提供来自选定人受试者的分离的亲和力成熟的抗体，所述抗体特征在于其在人中的治疗效用和耐受性。
如本文所使用，术语“鼠源化的抗体”或“鼠源化的免疫球蛋白”是指包含一个或多个CDR和人框架区的抗体，所述一个或多个CDR来自本发明的人抗体，所述人框架区包含基于小鼠抗体序列的氨基酸取代和/或缺失和/或插入。提供CDR的人免疫球蛋白被称为“亲本”或“受体”，并且提供框架变化的小鼠抗体被称为“供体”。恒定区不需要存在，但是如果它们存在，它们通常与小鼠抗体恒定区大致上相同，即至少约85％至90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多相同。因此，在一些实施方案中，全长鼠源化的人重链或轻链免疫球蛋白包含小鼠恒定区、人CDR和具有一定数目的“鼠源化”氨基酸取代的大致上人的框架。通常，“鼠源化的抗体”是包含鼠源化的可变轻链和/或鼠源化的可变重链的抗体。例如，鼠源化的抗体将不涵盖通常的嵌合抗体，例如因为嵌合抗体的整个可变区是非小鼠的。通过“鼠源化”的方法被“鼠源化”的修饰的抗体与提供CDR的亲本抗体相同的抗原结合，并且与亲本抗体相比时通常是在小鼠中免疫原性更低的。
如本文所用，术语“重链部分”包括源自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链部分的多肽包含以下中的至少一种：CH1结构域、铰链(例如，上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域或其变体或片段。例如，在本发明中使用的结合多肽可以包括：包含CH1结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分以及CH2结构域的多肽链；包含CH1结构域和CH3结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分以及CH3结构域的多肽链或包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分、CH2结构域以及CH3结构域的多肽链。在另一个实施方案中，本发明的多肽包括包含CH3结构域的多肽链。此外，在本发明中使用的结合多肽可缺乏CH2结构域的至少一部分(例如，CH2结构域的全部或部分)。如上所列举，本领域的普通技术人员将理解这些结构域(例如，重链部分)可以被修饰以使得它们的氨基酸序列与天然存在的免疫球蛋白分子不同。
在本文公开的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，多聚体的一条多肽链的重链部分是与多聚体的第二多肽链上的那些重链部分相同的。或者，本发明的含重链部分的单体是不相同的。例如，每个单体可包含形成例如双特异性抗体或双功能抗体的不同靶结合位点。
在另一个实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物由单一多肽链如scFv组成，并且将在细胞内表达(胞内抗体)以用于可能的体内治疗和诊断应用。
在本文公开的诊断和治疗方法中使用的结合多肽的重链部分可源自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可包含源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可包含部分源自IgG1分子和部分源自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可包含部分源自IgG1分子和部分源自IgG4分子的嵌合铰链。
如本文所使用，术语“轻链部分”包括源自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。在一个实施方案中，轻链部分包含VL或CL结构域中的至少一个。
针对抗体的肽或多肽表位的最小大小被认为是约四个至五个氨基酸。肽或多肽表位可包含至少七个、至少九个或在至少约15个至约30个之间的氨基酸。因为CDR可识别处于其三级形式的抗原肽或抗原多肽，所以包含表位的氨基酸不需要是连续的，并且在一些情况下可以甚至不在同一肽链上。在本发明中，被本发明的抗体识别的肽或多肽表位包含tau的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、或在约5个与约30个之间、约10个与约30个之间或约15个与约30个之间的连续或非连续氨基酸的序列。
在本文可互换使用的“特异性地结合”或“特异性地识别”通常意指结合分子例如抗体经由其抗原结合结构域与表位结合，并且结合需要在抗原结合结构域与表位之间有一些互补。根据这一定义，当抗体经由其抗原结合结构域比它将与随机、不相关的表位结合更容易地与一个表位结合时，所述抗体称为与所述表位“特异性地结合”。本领域的技术人员应当理解，抗体能够特异性地结合或特异性地识别分离的多肽，所述多肽包含对应于不连续表位的线性部分的氨基酸残基或由其组成。本文使用的术语“特异性”来限定相对亲和性，通过所述相对亲和性某一抗体与某一表位结合。例如，抗体“A”可被认为具有比抗体“B”更高的针对给定表位的特异性，或抗体“A”可被称为以比它针对相关表位“D”所具有的更高的特异性与表位“C”结合。
在存在的情况下，处于其所有语法形式的术语“免疫结合特征”或抗体与抗原的其它结合特征是指抗体的特异性、亲和力、交叉反应性和其它结合特征。
“优先结合”意指结合分子例如抗体比它将与相关的、相似的、同源的或类似的表位结合更容易地与表位特异性地结合。因此，“优先结合”给定表位的抗体将比结合相关表位更可能结合所述给定表位，即使这种抗体可能与所述相关表位交叉反应。
通过非限制性实例，如果结合分离例如抗体以比针对第二表位的抗体的KD小的解离常数(KD)结合第一表位，则所述抗体可被认为优先结合所述第一表位。在另一个非限制性实例中，如果抗体以比针对第二表位的抗体的KD小至少一个数量级的亲和力结合第一表位，则所述抗体可被认为优先结合所述第一抗原。在另一个非限制性实例中，如果抗体以比针对第二表位的抗体的KD小至少两个数量级的亲和力结合第一表位，则所述抗体可被认为优先结合所述第一表位。
在另一个非限制性实例中，如果结合分子例如抗体以比针对第二表位的抗体的k(off)小的解离速率(off rate)(k(off))结合第一表位，则所述抗体可被认为优先结合所述第一表位。在另一个非限制性实例中，如果抗体以比针对第二表位的抗体的k(off)小至少一个数量级的亲和力结合第一表位，则所述抗体可被认为优先结合所述第一表位。在另一个非限制性实例中，如果抗体以比针对第二表位的抗体的k(off)小至少两个数量级的亲和力结合第一表位，则所述抗体可被认为优先结合第一表位。
本文公开的结合分子，例如抗体或抗原结合片段、变体或衍生物可以据说以小于或等于5×10-2秒-1、10-2秒-1、5×l0-3秒-1或l0-3秒-1的解离速率(k(off))结合tau或其片段或变体。在一个实施方案中，本发明的抗体可以据说以小于或等于5×10-4秒-1、10-4秒-1、5×10-5秒-1或10-5秒-1、5×10-6秒-1、10-6秒-1、5×10-7秒-1或10-7秒-1的解离速率(k(off))结合本文tau或其片段或变体。
本文公开的结合分子，例如抗体或抗原结合片段、变体或衍生物可以据说以大于或等于103M-1秒-1、5×103M-1秒-1、104M-1秒-1或5×104M-1秒-1的缔合速率(on rate)(k(on))结合tau或其片段或变体。在一个实施方案中，本发明的抗体可以据说以大于或等于105M-1秒-1、5×105M-1秒-1、106M-1秒-1或5×106M-1秒-1或107M-1秒-1的缔合速率(k(on))结合tau或其片段或变体。
如果结合分子，例如抗体与给定表位优先结合达到在某种程度上阻断参比抗体与所述给定表位结合的程度，则所述抗体被称为竞争性地抑制参比抗体与所述给定表位的结合。可通过本领域已知的任何方法(例如，竞争性ELISA测定)来确定竞争性抑制。抗体可以据说竞争性地抑制至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％的参比抗体与给定表位的结合。本领域的技术人员理解抗体与其表位的结合还可被不是抗体的结合分子竞争性地抑制。例如，本文所述的抗体与tau例如hTau40的特异性结合可被微管竞争性地抑制。
如本文所用，术语“亲和力”是指单独表位与结合分子例如免疫球蛋白分子的CDR结合的强度的量度；参见例如，Harlow等,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,第2版(1988)第27-28页。如本文所用，术语“亲合力”是指免疫球蛋白群体与抗原之间的复合物的总体稳定性，即免疫球蛋白混合物与抗原的功能组合强度；参见例如，Harlow第29-34页。亲合力与具有特异性表位的群体中的单独免疫球蛋白分子的亲和力以及还有免疫球蛋白和抗原的化合价相关。例如，二价单克隆抗体与具有高度重复的表位结构的抗原(如聚合物)之间的相互作用将是高亲合力的一种相互作用。可使用任何适合的方法以实验方式测定抗体对抗原的亲和力或亲合力；参见例如，Berzofsky等,"Antibody-Antigen Interactions"于Fundamental Immunology,Paul,W.E.编辑,RavenPress New York,N Y(1984),Kuby,Janis Immunology,W.H.Freeman and Company NewYork,N Y(1992)以及本文所述的方法。用于测量抗体对抗原的亲和力的通用技术包括ELISA、RIA和表面等离子体共振。如果在不同条件(例如盐浓度、pH)下测量，那么特定抗体-抗原相互作用的测量亲和力可变化。因此，优选地用抗体和抗原的标准化溶液和标准化缓冲液进行对亲和力和其它抗原结合参数(例如KD、IC50)的测量。
本发明的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还可就其交叉反应性而言进行描述或规定。如本文所用，术语“交叉反应性”是指对一种抗原具有特异性的抗体与第二抗原反应的能力；为两种不同抗原物质之间的相关性量度。因此，如果抗体与除了诱导其形成的一种表位以外的表位结合，则抗体是交叉反应的。交叉反应表位通常包含许多与诱导表位相同的互补结构特征，并且在一些情况下可实际上比原物更好地适合。
例如，某些抗体具有一定程度的交叉反应性，其中它们结合相关但不相同的表位，例如与参比表位具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％以及至少50％同一性(如使用本领域中已知并且本文描述的方法所计算)的表位。如果抗体不能结合与参比表位具有小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％以及小于50％同一性(如使用本领域中已知并且本文描述的方法所计算)的表位，则抗体可以据说具有几乎没有的交叉反应性或不具有交叉反应性。如果抗体不能结合所述表位的任何其它类似物、直向同源物或同源物，则抗体可被认为对某一表位具有“高度特异性”。
本发明的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还可就其与tau的结合亲和力而言进行描述或规定。在一个实施方案中，结合亲和力包括具有小于以下的解离常数或Kd的那些：5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M。
如先前所指示，各种免疫球蛋白类别的恒定区的亚单位结构和三维构型是众所周知的。如本文所用，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，并且术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(最氨基末端)恒定区结构域。CH1结构域与VH结构域相邻并且是免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。
如本文所用，术语“CH2结构域”包括使用常规编号方案(残基244至360，Kabat编号系统；以及残基231-340，EU编号系统；参见前面引用的Kabat EA等)例如从抗体的约残基244延伸至残基360的重链分子的部分。CH2结构域的独特在于它不与另一个结构域紧密配对。而两条N-连接的支链碳水化合物链介于完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。还被充分记载的是CH3结构域从CH2结构域延伸至IgG分子的C-末端并且包含大约108个残基。
如本文所用，术语“铰链区”包括使CH1结构域与CH2结构域连接的重链分子的部分。这个铰链区包含大约25个残基并且是柔性的，从而允许两个N-末端抗原结合区独立地移动。铰链区可再分成三个相异的结构域：上、中和下铰链结构域；参见Roux等,J.Immunol.161(1998),4083。
如本文所用，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可形成二硫键或与第二个硫醇基团桥联的硫醇基团。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1区和CL区由二硫键连接并且两条重链在使用Kabat编号系统(位置226或229，EU编号系统)的对应于239和242的位置上由两个二硫键连接。
如本文所用，术语“连接的”、“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语是指通过无论什么手段(包括化学缀合或重组手段)将两种或更多种元素或组分连接在一起。“框内融合”是指以维持原始ORF的正确翻译阅读框的方式连接两个或更多个多核苷酸开放阅读框(ORF)以形成连续较长ORF。因此，重组融合蛋白是含有两个或更多个对应于由原始ORF编码的多肽的区段的单一蛋白质(所述区段在自然界中通常不这样连接)。虽然阅读框因此在整个融合区段上被致使连续，但是所述区段可被例如框内接头序列在物理上或空间上分离。例如，编码免疫球蛋白可变区的CDR的多核苷酸可框内融合，但是被编码至少一个免疫球蛋白框架区或另外的CDR区的多核苷酸分离，只要“融合的”CDR作为连续多肽的一部分来共翻译即可。
如本文所用的术语“表达”是指基因产生生物化学品例如RNA或多肽的过程。所述过程包括基因在细胞内的功能性存在的任何表现，包括但不限于基因敲除以及瞬间表达与稳定表达两者。它包括但不限于基因转录成信使RNA(mRNA)，转运RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其它RNA产物，和所述mRNA翻译成多肽。如果最终所需产物是生物化学物质，那么表达包括所述生物化学物质和任何前体的产生。基因表达产生“基因产物”。如本文所用，基因产物可以是核酸，例如由基因转录产生的信使RNA、或从转录物翻译的多肽。本文所述的基因产物还包括具有转录后修饰的核酸，所述修饰例如是聚腺苷酸化；或具有转录后修饰的多肽，所述修饰例如是甲基化、糖基化、添加脂质、与其它蛋白质亚基缔合、蛋白水解裂解等。
如本文所用，术语“样品”是指从受试者或患者获得的任何生物材料。一方面，样品可包括血液、大脑脊髓液(“CSF”)或尿液。在其它方面中，样品可包括从血液样品中富集的全血、血浆、B细胞，以及培养细胞(例如，来自受试者的B细胞)。样品还可包括活检或组织样品，包括神经组织。在其它方面中，样品可包括全细胞和/或细胞的溶解产物。可通过本领域中已知的方法来收集血液样品。一方面，可通过在4℃下、在200μl缓冲液(20mM Tris，pH7.5；0.5％Nonidet；1mM EDTA；1mM PMSF；0.1M NaCl；IX Sigma蛋白酶抑制剂以及IX Sigma磷酸酶抑制剂1和2)中涡旋来重新悬浮沉淀。可伴有间歇涡旋将悬浮液保持在冰上，持续20分钟。在约4℃下、在15,000xg下旋转5分钟之后，可将上清液的等分试样储存在约-70℃下。
如本文所用，术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”是指治疗性治疗和预防性或防止性措施，其中目的是为了防止或减缓(减轻)不希望的生理学变化或病症，如帕金森氏病的发展。有益的或所需的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分缓解还是全部缓解)，无论是可检测还是不可检测的。“治疗”还可以意指与如果没有接受治疗的预期存活期相比，延长的存活期。需要治疗的那些包括已经患有病状或病症的那些，以及易患病状或病症的那些或要预防病状或病症的表现的那些。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指希望诊断、预后、预防或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者例如人患者。
II.抗体
本发明总体上涉及人抗-tau抗体及其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明的抗体展示免疫结合特征和/或生物学特性，如针对实施例中所示的抗体所概述。根据本发明，人单克隆抗体对于从一组健康人受试者克隆的tau具有特异性。
在根据本发明进行的实验的过程中，初始尝试未能克隆tau特异性抗体，但几乎总是导致假阳性克隆。为了规避这一问题，将人记忆B细胞培养物的条件培养基中的抗体进行平行筛选以用于结合重组tau蛋白、从AD大脑中提取的PHFTau、健康对照大脑提取物和牛血清白蛋白(BSA)。仅使针对重组tau和/或PHFTau是阳性而针对对照大脑提取物或BSA不是阳性的B-细胞培养物经受抗体克隆。
分离特异性抗体的初始尝试集中于具有针对tau的高血浆结合活性的健康人受试者的组，表明循环tau抗体血浆的水平升高。出人意料地，这些尝试未能产生tau特异性人记忆B细胞并且本发明中描述的抗体是从未针对高tau血浆反应性预先选择或对tau具有低血浆反应性的健康人受试者的组分离的。
由于这种措施，可分离几种抗体。将选定抗体针对类别和轻链亚类确定进行进一步分析。来自记忆B细胞培养物的选定相关抗体消息然后通过RT-PCR转录、克隆且组合到表达载体中以用于重组体生产；参见所附实施例。人抗体在HEK293或CHO细胞中的重组表达和基于蛋白质印迹进行的所述抗体针对全长tau、其病理性修饰形式的结合特异性的随后表征以及所述抗体独特结合病理性聚集的tau首次证实已经克隆了对tau高度特异性并且识别tau蛋白的独特病理性修饰形式的人抗体。
因此，本发明总体上涉及一种分离的天然存在的人单克隆抗-tau抗体及其结合片段、衍生物和变体。在本发明的一个实施方案中，抗体能够特异地结合全长重组tau和/或在变性条件下基于蛋白质印迹自AD大脑分离的病理性聚集和/或磷酸化形式(PHFTau)。
在一个实施方案中，本发明涉及一种抗-tau抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中所述抗体与参比抗体特异性地结合相同tau表位，所述参比抗体选自由以下组成的组：NI-105.17C1、NI-105.6C5、NI-105.29G10、NI-105.6L9、NI-105.40E8、NI-105.48E5、NI-105.6E3、NI-105.22E1、NI-105.26B12、NI-105.12E12、NI-105.60E7、NI-105.14E2、NI-105.39E2、NI-105.19C6或NI-105.9C4。
另外的人抗tau抗体公开于美国专利申请公布号2012/0087861中，所述专利申请的内容以引用的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，本文所述的抗体特异性地结合包含选自由以下组成的组的氨基酸残基的表位处的tau：对应于hTau40(SEQ ID NO:6)的残基125-131、397-441、226-244、217-227、37-55、387-406、421-427、427-439、1-158、197-207、57-67、355-441、313-319、309-319和221-231的残基。在另一个实施方案中，本文所述的抗体特异性地结合包含对应于hTau40(SEQ ID NO:6)的残基37-55和387-406的氨基酸残基的表位处的tau。在一个特定实施方案中，tau是hTau40(SEQ ID NO:6)。
在一个实施方案中，本文所述的抗体结合包含tau的微管结合结构域的表位处的tau。在一个具体实施方案中，本文所述的抗体结合包含来自如图4中描绘的tau的R4区的氨基酸残基的表位处的tau。在一个实施方案中，本文所述的抗体与微管竞争特异性结合tau。在另一个实施方案中，本文所述的抗体相较于所述抗体对未与微管缔合的tau的结合亲和力相比，对微管缔合的tau的结合亲和力降低。在另一个实施方案中，本文所述的抗体不结合或大致上不结合与微管缔合的tau。在具体实施方案中，tau蛋白可以是天然的tau蛋白或重组tau蛋白。在一个具体实施方案中，tau是hTau40。
在一个实施方案中，本发明的人抗-tau抗体能够特异性地结合病理性聚集的tau并且大致上不能结合大脑组织中处于生理形式的tau。此外，本发明的人抗-tau抗体可以进一步特征在于其识别大脑中的神经原纤维缠结(NFT)、神经原纤维网线和/或营养不良性神经突中的处于预缠结阶段的tau的能力。因此，本发明提供一组具有结合特异性的人tau抗体，所述抗体因此特别适用于诊断和治疗目的。
此外或可替代地，本发明的抗-tau抗体优先识别病理性聚集的tau而非生理形式，特别是当根据实施例4和18分析时。此外或可替代地，本发明的抗-tau抗体结合人tau的致病突变体，特别是在实施例4中描述的那些。在此背景下，结合特异性可以在对于野生型tau具有约100pM至100nM的半数最大有效浓度(EC50)或约100pM至10nM的EC50的范围内。
因此，本发明的抗-tau抗体优先结合大脑中的病理性修饰形式的tau，例如tau的病理性聚集体，如通过在实施例4和18中描述的免疫组织化学染色所例示。在另一个实施方案中，本发明的抗-tau抗体优先结合重组tau和病理性修饰形式的tau，如在实施例2中通过蛋白质印迹所例示。
本发明还涉及一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中所述抗体包含与选自由以下组成的组的抗体的抗原结合结构域相同的抗原结合结构域：NI-105.17C1、NI-105.17C1(N31Q)、NI-105.6C5、NI-105.29G10、NI-105.6L9、NI-105.40E8、NI-105.48E5、NI-105.6E3、NI-105.22E1、NI-105.26B12、NI-105.12E12、NI-105.60E7、NI-105.14E2、NI-105.39E2、NI-105.19C6和NI-105.9C4。
本发明还例示了几种此类结合分子，例如抗体及其结合片段，其可以特征在于在其可变区(例如结合结构域)中包含VH和/或VL可变区的至少一个互补决定区(CDR)，所述VH和/或VL可变区包含图7中所描绘的任一氨基酸序列。编码以上鉴别的可变区的相应核苷酸序列在以下表4中列出。VH和/或VL区的上述氨基酸序列的一组示例性CDR如在图7中所描绘。然而，如以下所讨论，本领域的技术人员非常了解以下事实：此外或者可替代地，可以使用CDR，在CDR2和CDR3的情况下，所述CDR与其来自图7中所列出的那些的氨基酸序列相差一个、两个、三个或甚至更多个氨基酸。
表2.Tau特异性抗体的VH区、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR2、VL区、VL CDR2、VL CDR2和VLCDR3的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含至少一个CDR，所述CDR包含选自由SEQ IDNO:79-168和224组成的组的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR，所述CDR包含选自由SEQ ID NO:79-168和224组成的组的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3，所述VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:79-84、85-90、91-96、97-102、103-108、109-114、115-120、121-126、127-132、133-138、139-144、145-150、151-156、157-162或163-168。在一个实施方案中，本发明的抗体包含VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，所述VH CDR1、VHCDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:79、80、81、224、83和84。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含一个、两个或三个VH CDR，所述VH CDR包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:79-81、85-87、91-93、97-99、103-105、109-111、115-117、121-123、127-129、133-135、139-141、145-147、151-153、157-159和163-165；或由所述氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:79-81、85-87、91-93、97-99、103-105、109-111、115-117、121-123、127-129、133-135、139-141、145-147、151-153、157-159或163-165。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含一个、两个或三个VL CDR，所述VL CDR包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:82-84、88-90、94-96、100-102、106-108、112-114、118-120、124-126、130-132、136-138、142-144、148-150、154-156、160-162、166-168和224；或由所述氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，所述VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:82-84、88-90、94-96、100-102、106-108、112-114、118-120、124-126、130-132、136-138、142-144、148-150、154-156、160-162或166-168。在一个实施方案中，VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含氨基酸序列SEQID NO:83、84和224。
根据一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、157或163的VH CDR1；SEQID NO:80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158或164的VH CDR2；或SEQID NO:81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147、153、159或165的VH CDR3。根据另一个实施方案中，抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166或224的VL CDR1；SEQ ID NO:83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149、155、161或167的VL CDR2；或SEQ ID NO:84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162或168的VL CDR3。在另一个实施方案中，抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、157或163的VH CDR1；SEQ ID NO:80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158或164的VH CDR2；或SEQ ID NO:81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147、153、159或165的VH CDR3，并且还包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166或224的VL CDR1；SEQ ID NO:83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149、155、161或167的VL CDR2；或SEQ ID NO:84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162或168的VL CDR3。
根据一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、157或163的VH CDR1；SEQID NO:80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158或164的VH CDR2；和SEQID NO:81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147、153、159或165的VH CDR3。根据另一个实施方案中，抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166或224的VL CDR1；SEQ ID NO:83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149、155、161或167的VL CDR2；和SEQ ID NO:84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162或168的VL CDR3。在另一个实施方案中，抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、157或163的VH CDR1；SEQ ID NO:80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158或164的VH CDR2；和SEQ ID NO:81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147、153、159或165的VH CDR3，并且还包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166或224的VL CDR1；SEQ ID NO:83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149、155、161或167的VL CDR2；和SEQ ID NO:84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162或168的VL CDR3。
在一个实施方案中，本发明的抗体可包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:79的VH CDR1、SEQ ID NO:80的VH CDR2和SEQ ID NO:81的VH CDR3，并且还可包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:82的VL CDR1、SEQ ID NO:83的VL CDR2和SEQID NO:84的VL CDR3。
在一个实施方案中，本发明的抗体可包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:79的VH CDR1、SEQ ID NO:80的VH CDR2和SEQ ID NO:81的VH CDR3，并且还可包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:224的VL CDR1、SEQ ID NO:83的VL CDR2和SEQID NO:84的VL CDR3。
在一个实施方案中，本发明的抗体可包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:85的VH CDR1、SEQ ID NO:86的VH CDR2和SEQ ID NO:87的VH CDR3，并且还可包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:88的VL CDR1、SEQ ID NO:89的VL CDR2和SEQID NO:90的VL CDR3。
在一个实施方案中，本发明的抗体可包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:91的VH CDR1、SEQ ID NO:92的VH CDR2和SEQ ID NO:93的VH CDR3，并且还可包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:94的VL CDR1、SEQ ID NO:95的VL CDR2和SEQID NO:96的VL CDR3。
在一个实施方案中，本发明的抗体可包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:97的VH CDR1、SEQ ID NO:98的VH CDR2和SEQ ID NO:99的VH CDR3，并且还可包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:100的VL CDR1、SEQ ID NO:101的VL CDR2和SEQID NO:102的VL CDR3。
在一个实施方案中，本发明的抗体可包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:103的VH CDR1、SEQ ID NO:104的VH CDR2和SEQ ID NO:105的VH CDR3，并且还可包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:106的VL CDR1、SEQ ID NO:107的VL CDR2和SEQ ID NO:108的VL CDR3。
在一个实施方案中，本发明的抗体可包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:109的VH CDR1、SEQ ID NO:110的VH CDR2和SEQ ID NO:111的VH CDR3，并且还可包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:112的VL CDR1、SEQ ID NO:113的VL CDR2和SEQ ID NO:114的VL CDR3。
在一个实施方案中，本发明的抗体可包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:115的VH CDR1、SEQ ID NO:116的VH CDR2和SEQ ID NO:117的VH CDR3，并且还可包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:118的VL CDR1、SEQ ID NO:119的VL CDR2和SEQ ID NO:120的VL CDR3。
在一个实施方案中，本发明的抗体可包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:121的VH CDR1、SEQ ID NO:122的VH CDR2和SEQ ID NO:123的VH CDR3，并且还可包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:124的VL CDR1、SEQ ID NO:125的VL CDR2和SEQ ID NO:126的VL CDR3。
在一个实施方案中，本发明的抗体可包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:127的VH CDR1、SEQ ID NO:128的VH CDR2和SEQ ID NO:129的VH CDR3，并且还可包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:130的VL CDR1、SEQ ID NO:131的VL CDR2和SEQ ID NO:132的VL CDR3。
在一个实施方案中，本发明的抗体可包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:133的VH CDR1、SEQ ID NO:134的VH CDR2和SEQ ID NO:135的VH CDR3，并且还可包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:136的VL CDR1、SEQ ID NO:137的VL CDR2和SEQ ID NO:138的VL CDR3。
在一个实施方案中，本发明的抗体可包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:139的VH CDR1、SEQ ID NO:140的VH CDR2和SEQ ID NO:141的VH CDR3，并且还可包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:142的VL CDR1、SEQ ID NO:143的VL CDR2和SEQ ID NO:144的VL CDR3。
在一个实施方案中，本发明的抗体可包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:145的VH CDR1、SEQ ID NO:146的VH CDR2和SEQ ID NO:147的VH CDR3，并且还可包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:148的VL CDR1、SEQ ID NO:149的VL CDR2和SEQ ID NO:150的VL CDR3。
在一个实施方案中，本发明的抗体可包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:151的VH CDR1、SEQ ID NO:152的VH CDR2和SEQ ID NO:153的VH CDR3，并且还可包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:154的VL CDR1、SEQ ID NO:155的VL CDR2和SEQ ID NO:156的VL CDR3。
在一个实施方案中，本发明的抗体可包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:157的VH CDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2和SEQ ID NO:159的VH CDR3，并且还可包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:160的VL CDR1、SEQ ID NO:161的VL CDR2和SEQ ID NO:162的VL CDR3。
在一个实施方案中，本发明的抗体可包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:163的VH CDR1、SEQ ID NO:164的VH CDR2和SEQ ID NO:165的VH CDR3，并且还可包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:166的VL CDR1、SEQ ID NO:167的VL CDR2和SEQ ID NO:168的VL CDR3。
在一个实施方案中，本发明的抗体是包含如图7和表3中描绘的VH和/或VL区的氨基酸序列的抗体中的任一种。在一个实施方案中，本发明的抗体特征在于保存如存在于人B细胞中的重链和轻链的同源配对。
表3：tau特异性抗体的VH和VL区的氨基酸序列。BG–在种系化(germlining)之前
在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区(VH)，所述重链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:44、45、47、48、50、52、54、56、58、60、62、65、67、69、71、73、75、76和220；或由所述氨基酸序列组成。在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:46、49、51、53、55、57、59、61、63、64、66、68、70、72、74、77、78、221和222；或由所述氨基酸序列组成。在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区(VH)，所述重链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:44、45、47、48、50、52、54、56、58、60、62、65、67、69、71、73、75、76和220；或由所述氨基酸序列组成，并且还包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:46、49、51、53、55、57、59、61、63、64、66、68、70、72、74、77、78、221和222；或由所述氨基酸序列组成。在一个具体实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:46的VL；或SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:221的VL；或SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:222的VL；或SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:49的VL；或SEQ ID NO:50的VH和SEQ ID NO:51的VL；或SEQ ID NO:52的VH和SEQ ID NO:53的VL；或SEQ ID NO:54的VH和SEQ ID NO:55的VL；或SEQ ID NO:220的VH和SEQ ID NO:55的VL；或SEQ ID NO:56的VH和SEQ ID NO:57的VL；或SEQ ID NO:58的VH和SEQ ID NO:59的VL；或SEQ ID NO:60的VH和SEQ ID NO:61的VL；或SEQ ID NO:62的VH和SEQ ID NO:64的VL；或SEQ ID NO:65的VH和SEQ ID NO:66的VL；或SEQ ID NO:67的VH和SEQ ID NO:68的VL；或SEQID NO:69的VH和SEQ ID NO:70的VL；或SEQ ID NO:71的VH和SEQ ID NO:72的VL；或SEQ IDNO:73的VH和SEQ ID NO:74的VL；或SEQ ID NO:76的VH和SEQ ID NO:78的VL；或SEQ ID NO:44的VH和SEQ ID NO:46的VL；或SEQ ID NO:47的VH和SEQ ID NO:49的VL；或SEQ ID NO:62的VH和SEQ ID NO:63的VL；或SEQ ID NO:75的VH和SEQ ID NO:77的VL。
或者，本发明的抗体是抗体或其抗原结合片段、衍生物或变体，所述抗体与具有如图7和表3中描绘的VH和/或VL区的抗体中的至少一个竞争结合tau，例如像hTau40。在一个实施方案中，本发明的抗体与NI-105.17C1、NI-105.6C5、NI-105.29G10、NI-105.6L9、NI-105.40E8、NI-105.48E5、NI-105.6E3、NI-105.22E1、NI-105.26B12、NI-105.12E12、NI-105.60E7、NI-105.14E2、NI-105.39E2、NI-105.19C6或NI-105.9C4竞争特异性结合hTau40。那些抗体也可以是人的，特别是用于治疗性应用。或者，抗体是鼠、鼠源化和嵌合鼠-人抗体，所述抗体特别适用于诊断方法和动物研究。
在一个实施方案中，本发明的抗体由所培养的单个或寡克隆B细胞的培养物和所述培养物的上清液提供，所述培养物或上清液含有由所述B细胞产生的抗体，针对其中的抗tau抗体的存在和亲和力对所述抗体进行筛选。筛选方法包括以下步骤：灵敏组织淀粉样蛋白斑块免疫反应性(TAPIR)测定，如描述于国际申请WO2004/095031中，其公开内容以引用的方式并入本文；对大脑切片针对结合PHFTau进行筛选；针对源自由SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列的tau的肽的结合进行筛选，其中在所述序列的氨基酸Ser-202和Thr-205上、氨基酸Thr-231上和/或氨基酸Ser-396和Ser-404上具有磷酸基团；针对由SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列的重组人tau的结合进行筛选，并且分离检测到结合的抗体或产生所述抗体的细胞。
如上所述，由于其在人免疫应答时产生，本发明的人单克隆抗体将识别表位，所述表位具有特定病理相关性并且在用于分别产生例如小鼠单克隆抗体和体外筛选噬菌体展示文库的免疫方法的情况下可能不能接近或免疫原性较小。因此，谨慎地规定，本发明的人抗-tau抗体的表位是独特的并且不存在能够结合由本发明的人单克隆抗体识别的表位的其它抗体。因此，本发明总体上还扩展至与本发明的人单克隆抗体竞争特异性结合tau的抗-tau抗体和tau结合分子。本发明更具体地涉及一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中所述抗体与参比抗体特异性地结合相同tau表位，所述参比抗体选自由以下组成的组：NI-105.17C1、NI-105.6C5、NI-105.29G10、NI-105.6L9、NI-105.40E8、NI-105.48E5、NI-105.6E3、NI-105.22E1、NI-105.26B12、NI-105.12E12、NI-105.60E7、NI-105.14E2、NI-105.39E2、NI-105.19C6或NI-105.9C4。
通过某一测定来测定抗体之间的竞争，其中所测试的免疫球蛋白抑制参比抗体与共同抗原(如tau)的特异性结合。已知众多类型的竞争性结合测定，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心式竞争测定；参见Stahli等,Methods in Enzymology 9(1983),242-253；固相直接生物素-亲和素EIA；参见Kirkland等,J.Immunol.137(1986),3614-3619和Cheung等,Virology 176(1990),546-552；固相直接标记测定、固相直接标记夹心式测定；参见Harlow和Lane,Antibodies,A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Press(1988)；使用I125标记的固相直接标记RIA；参见Morel等,Molec.Immunol.25(1988),7-15和Moldenhauer等,Scand.J.Immunol.32(1990),77-82。通常，这种测定涉及使用与固体表面结合的纯化tau或其聚集体，或带有这些未标记的测试免疫球蛋白和标记的参比免疫球蛋白(即本发明的人单克隆抗体)中的任一者的细胞。竞争性抑制是通过测定在测试免疫球蛋白存在下与固体表面或细胞结合的标记的量来测量。通常，测试免疫球蛋白过量存在。在一个实施方案中，在如针对所附实施例中的ELISA测定所描述的条件下进行竞争性结合测定。通过竞争测定鉴别的抗体(竞争性抗体)包括与参比抗体结合相同表位的抗体以及结合与由参比抗体结合的表位足够接近的邻近表位以产生空间位阻的抗体。通常，当竞争性抗体过量存在时，其将使参比抗体与共同抗原的特异性结合抑制至少50或75％。因此，本发明还涉及一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中所述抗体竞争性地抑制选自由以下组成的组的参比抗体结合tau：NI-105.17C1、NI-105.6C5、NI-105.29G10、NI-105.6L9、NI-105.40E8、NI-105.48E5、NI-105.6E3、NI-105.22E1、NI-105.26B12、NI-105.12E12、NI-105.60E7、NI-105.14E2、NI-105.39E2、NI-105.19C6或NI-105.9C4。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白重链可变区(VH)、基本上由或由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成，其中所述重链可变区的至少一个VH-CDR或所述重链可变区的至少两个VH-CDR与来自本文所公开的抗体的参比重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。或者，所述VH的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区与来自本文所公开的抗体的参比重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。因此，根据此实施方案，本发明的重链可变区具有与图7中所示的组相关的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3多肽序列。虽然图7示出由Kabat系统定义的VH-CDR，但其它CDR定义，例如由Chothia系统定义的VH-CDR也包括在本发明中，并且可容易地由本领域的普通技术人员使用图7中呈现数据来鉴别。在一个实施方案中，参比VH CDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、157或163；参比VH CDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158或164；并且参比VH CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147、153、159或165。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白重链可变区(VH)、基本上由或由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与图7中所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3组相同的多肽序列。在一个实施方案中，VH CDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、157或163；VH CDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158或164；并且VH CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147、153、159或165。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白重链可变区(VH)、基本上由或由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与图7中所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3组相同的多肽序列，除了任一个VH-CDR中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸取代。在某些实施方案中，所述氨基酸取代是保守的。在一个实施方案中，VH CDR1的氨基酸序列是SEQ IDNO:79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、157或163；VH CDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158或164；并且VHCDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147、153、159或165。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)、基本上由或由免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成，其中所述轻链可变区的至少一个VL-CDR或所述轻链可变区的至少两个VL-CDR与来自本文所公开的抗体的参比轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。或者，所述VL的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区与来自本文所公开的抗体的参比轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。因此，根据此实施方案，本发明的轻链可变区具有与图7中所示的多肽相关的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3多肽序列。虽然图7示出由Kabat系统定义的VL-CDR，但其它CDR定义，例如由Chothia系统定义的VL-CDR也包括在本发明中。在一个实施方案中，参比VL CDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166或224；参比VL CDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149、155、161或167；并且参比VL CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162或168。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)、基本上由或由免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成，其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有与图7中所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3组相同的多肽序列。在一个实施方案中，VL CDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166或224；VL CDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149、155、161或167；并且VL CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162或168。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)、基本上由或由免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成，其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有与图7中所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3组相同的多肽序列，除了任一个VL-CDR中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸取代。在某些实施方案中，所述氨基酸取代是保守的。在一个实施方案中，VL CDR1的氨基酸序列是SEQ IDNO:82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166或224；VL CDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149、155、161或167；并且VL CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162或168。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白重链可变区(VH)、基本上由或由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成，所述免疫球蛋白重链可变区与图7和表3中所示的参比重链可变区相同。在一个实施方案中，参比重链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:44、45、47、48、50、52、54、56、58、60、62、65、67、69、71、73、75、76或220。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白重链可变区(VH)、基本上由或由免疫球蛋白重链可变区组成，所述免疫球蛋白重链可变区具有与图7和表3中所示的参比重链可变区(VH)序列相同的多肽序列，除了一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸取代。在某些实施方案中，所述氨基酸取代是保守的。在一个实施方案中，参比重链可变区序列的氨基酸序列包含SEQ ID NO:44、45、47、48、50、52、54、56、58、60、62、65、67、69、71、73、75、76或220。
根据一个实施方案，本发明提供一种分离的多肽，所述多肽包含与来自本文所公开的抗体的参比轻链可变区(VL)氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的免疫球蛋白轻链可变区(VL)，主要由其组成或由其组成。因此，根据此实施方案，本发明的轻链可变区具有与图7和表3中所示的轻链可变区相关的多肽序列。在一个实施方案中，参比轻链可变区(VL)的氨基酸序列包含SEQ ID NO:46、49、51、53、55、57、59、61、63、64、66、68、70、72、74、77、78、221或222。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)、基本上由或由免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成，所述免疫球蛋白轻链可变区与图7和表3中所示的参比轻链可变区相同。在一个实施方案中，参比轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:46、49、51、53、55、57、59、61、63、64、66、68、70、72、74、77、78、221或222。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)、基本上由或由免疫球蛋白轻链可变区组成，所述免疫球蛋白轻链可变区具有与图7和表3中所示的参比轻链可变区(VL)序列相同的多肽序列，除了一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸取代。在某些实施方案中，所述氨基酸取代是保守的。在一个实施方案中，参比轻链可变区序列的氨基酸序列包含SEQ ID NO:46、49、51、53、55、57、59、61、63、64、66、68、70、72、74、77、78、221或222。
免疫球蛋白或其编码cDNA可进行进一步修饰。因此，在另一个实施方案中，本发明的方法包括产生嵌合抗体、鼠源化抗体、单链抗体、Fab片段、双特异性抗体、融合抗体、标记的抗体或那些抗体中的任一者的类似物的任一步骤。相应方法是本领域的技术人员已知的并且描述于例如Harlow和Lane"Antibodies,A Laboratory Manual",CSH Press,ColdSpring Harbor(1988)中。当所述抗体的衍生物是通过噬菌体展示技术获得时，如在BIAcore系统中采用的表面等离子体共振可以用于增加与本文所述的抗体中的任一者结合相同表位的噬菌体抗体的效率(Schier,Human Antibodies Hybridomas 7(1996),97-105；Malmborg,J.Immunol.Methods 183(1995),7-13)。嵌合抗体的产生描述于例如国际申请WO89/09622中。用于产生人源化抗体的方法描述于例如欧洲申请EP-A1 0 239 400和国际申请WO90/07861中。根据本发明待使用的抗体的另一来源是所谓的异种抗体。用于在小鼠中产生异种抗体如人样抗体的一般原理描述于例如国际申请WO91/10741、WO94/02602、WO96/34096和WO 96/33735中。如上所论述，除完全抗体之外，本发明的抗体也可以多种形式存在；包括例如Fv、Fab和F(ab)2以及呈单链形式；参见例如国际申请WO88/09344。
可使用本领域中已知的常规技术，例如通过单独或组合使用氨基酸缺失、插入、取代、添加和/或重组和/或本领域中已知的任何其它修饰来进一步修饰本发明抗体或其相应免疫球蛋白链。用于在潜伏在免疫球蛋白链的氨基酸序列下的DNA序列中引入所述修饰的方法是本领域的技术人员熟知的；参见例如Sambrook,Molecular Cloning A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.和Ausubel,Current Protocols inMolecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1994)。对本发明抗体的修饰包括在一个或多个组成性氨基酸处进行化学和/或酶促衍生，包括侧链修饰、主链修饰以及N末端和C末端修饰，包括乙酰化、羟基化、甲基化、酰胺化和连接碳水化合物或脂质部分、辅因子等。同样，本发明涵盖产生包含在氨基末端处的融合于在羧基末端处的异源分子(如免疫刺激性配体)的所述抗体或其某一片段的嵌合蛋白质；关于相应技术细节，参见例如国际申请WO00/30680。
另外，本发明涵盖肽，包括含有如上所述的结合分子，例如含有任一提及的抗体的可变区的CDR3区的那些，所述CDR3区特别是重链的CDR3，因为已常常观察到，重链CDR3(HCDR3)是具有较大可变度且主要参与抗原-抗体相互作用的区域。所述肽可容易地合成或通过重组手段产生以产生根据本发明适用的结合剂。所述方法是本领域的普通技术人员熟知的。可例如使用可商购的自动肽合成仪来合成肽。肽也可利用重组技术，通过将表达肽的DNA并入表达载体中且用所述表达载体转化细胞以产生肽来产生。
因此，本发明涉及任何结合分子，例如，抗体或其结合片段，所述抗体或其结合片段针对本发明的人抗-tau抗体并且展示所提及的特性，即特异性地识别tau。所述抗体和结合分子可针对其结合特异性和亲和力通过如本文所述的ELISA和蛋白质印迹以及免疫组织化学(参见，例如实施例)进行测试。此外，根据本发明的进行的随后实验的初步结果揭示，在一个实施方案中，本发明的人抗-tau抗体主要结合类似另外患有阿尔茨海默氏病(AD)的患者的人大脑切片上存在的神经原纤维缠结(NFT)、神经原纤维网线的病理性聚集的tau。因此，在本发明的一个特别优选的实施方案中，人抗体或其结合片段、衍生物或变体识别人AD大脑切片上的tau。
作为从永生化B细胞或B记忆细胞的培养物直接获得免疫球蛋白的一种替代方案，永生化细胞可用作重排重链和轻链基因座的来源，以用于随后的表达和/或遗传操作。重排抗体基因可从适当的mRNA逆转录以产生cDNA。如果需要，重链恒定区可交换不同同种型的重链恒定区或完全消除。所述可变区可连接以编码单链Fv区。多个Fv区可连接以赋予对多于一个靶标的结合能力或可采用嵌合重链和轻链组合。一旦遗传材料可获得，保留其结合所需靶标能力的如上所述的类似物的设计是简单明了的。用于克隆抗体可变区和产生重组抗体的方法是本领域的技术人员已知的并且描述于例如，Gilliland等,Tissue Antigens47(1996),1-20；Doenecke等,Leukemia 11(1997),1787-1792中。
一旦适当的遗传材料获得并且如果需要进行修饰以编码类似物，编码序列(包括至少编码重链和轻链的可变区的那些)可被插入到包含在载体上的表达系统中，所述载体可被转染至标准重组宿主细胞中。可使用各种各样的此类宿主细胞；然而为了有效加工，可考虑哺乳动物细胞。适用于此目的典型哺乳动物细胞系包括但不限于，CHO细胞、HEK 293细胞或NSO细胞。
然后通过在适合于宿主细胞的生长和编码序列的表达的培养条件下培养修饰的重组宿主来进行抗体或类似物的产生。然后通过将抗体与培养物分离来回收所述抗体。表达系统被设计成包括信号肽以使得所得到的抗体被分泌至培养基中；然而，细胞内生产也是可能的。
根据上述，本发明还涉及一种编码本发明的抗体或等效结合分子的多核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸编码上述抗体的免疫球蛋白链的至少一个可变区。通常，由多核苷酸编码的所述可变区包含所述抗体的可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)。
本领域的技术人员将容易地理解，具有上述可变结构域的抗体的可变结构域可用于构建具有所需特异性和生物功能的其它多肽或抗体。因此，本发明还涵盖包含上述可变结构域的至少一个CDR且有利地具有与所附实例中所述的抗体大致上相同或类似的结合特性的多肽和抗体。本领域的技术人员了解结合亲和力可通过在CDR内或在部分与如由Kabat定义的CDR重叠的高变环内(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196(1987),901-917)进行氨基酸取代来增强；参见例如Riechmann等,Nature 332(1988),323-327。因此，本发明还涉及一个或多个提及的CDR包含一个或多个或不超过两个氨基酸取代的抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体在其一个或两个免疫球蛋白链中包含如图1中所列出的可变区的两个或全部三个CDR。
如本领域的普通技术人员所已知，结合分子例如本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可包含介导一种或多种效应子功能的恒定区。例如，补体的C1组分与抗体恒定区的结合可活化补体系统。活化补体对细胞病原体的调理作用和溶解很重要。补体的活化还刺激炎症应答并且还可涉及在自身免疫性超敏反应中。此外，抗体经由Fc区结合不同细胞上的受体，其中所述抗体Fc区上的Fc受体位点结合细胞上的Fc受体(FcR)。存在许多对于不同类别的抗体具有特异性的Fc受体，包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合触发许多重要的和多种的生物反应，包括抗体包覆的颗粒的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、杀伤细胞对抗体包覆的靶细胞的溶解(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、炎症介质的释放、胎盘转移以及免疫球蛋白产生的控制。
因此，本发明的某些实施方案包括抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中一个或多个恒定区结构域的至少一部分缺失或以另外的方式改变以提供所需的生物化学特性，如当与具有大约相同免疫原性的完整、未改变的抗体进行比较时，减少的效应子功能、非共价二聚的能力、在tau聚集和沉积的位点处定位的能力增加、减少的血清半衰期或增加的血清半衰期。例如，用于在本文描述的诊断和治疗方法中使用的某些抗体是结构域缺失抗体，所述抗体包含与免疫球蛋白重链类似的多肽链，但是缺乏一个或多个重链结构域的至少一部分。例如，在某些抗体中，所修饰抗体的恒定区的一个完整结构域将缺失，例如，CH2结构域的全部或一部分将缺失。在其它实施方案中，用于在本文描述的诊断和治疗方法中使用的某些抗体具有恒定区，例如IgG重链恒定区，所述恒定区被改变以消除糖基化，在本文其它地方被称为无糖基化或“agly”抗体。此类“agly”抗体可通过酶法制备以及通过工程化恒定区中的共有糖基化位点来制备。虽然不受理论束缚，但据信“agly”抗体可具有改进的体内安全性和稳定性特征。产生具有所需的效应子功能的无糖基化抗体的方法见于例如国际申请WO2005/018572中，所述申请以引用的方式整体并入。
在本文所述的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，Fc部分可使用本领域中已知的技术来突变以便降低效应子功能。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其它方式)可减少循环修饰的抗体的Fc受体结合，从而增加tau定位。在其它情况下，可以是，与本发明一致地，恒定区修饰减弱补体结合并且因此减少缀合的细胞毒素的血清半衰期和非特异性缔合。另外，恒定区的其它修饰可用于修饰二硫键联或寡糖部分，所述二硫键联或寡糖部分由于增加的抗原特异性或抗体柔性而允许增强的定位。所述修饰的所得生理学特征、生物利用率和其它生物化学作用，如tau定位、生物分布和血清半衰期可无过度实验的情况下使用熟知的免疫技术来容易地测量并且定量。
在本文所述的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，Fc部分可被突变或交换替代蛋白质序列以增加抗体的细胞摄取，例如通过增强抗体经由Fcγ受体、LRP或Thy1受体的受体介导的内吞作用或通过“超级抗体技术”，所述技术据说使抗体能够穿梭到活细胞中而不损害它们(Expert Opin.Biol.Ther.(2005),237-241)。例如，可使用本领域中已知的技术工程化抗体结合区的融合蛋白、细胞表面受体的同源蛋白配体或具有结合tau以及细胞表面受体的特异性序列的双或多特异性抗体的产生。
在本文所述的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，Fc部分可被突变或交换替代蛋白序列或抗体可进行化学修饰以增加其血大脑屏障穿透。
修饰形式的本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可使用在本领域中已知的技术由完整前体或母体抗体来制备。示例性技术在本文中更详细地讨论。本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可使用本领域中已知的技术来制备或制造。在某些实施方案中，抗体分子或其片段是“重组产生的”，即使用重组DNA技术来产生。用于制备抗体分子或其片段的示例性技术在本文其它地方更详细地讨论。
本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还包括例如，通过任何类型的分子与抗体的共价连接修饰的衍生物，以使得共价连接不阻止抗体特异性地结合其同源表位。例如，但不作为限制，抗体衍生物包括已进行修饰的抗体，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解裂解、与细胞配体或其它蛋白的键联等。多种化学修饰中的任一种可通过已知技术进行，所述技术包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，所述衍生物可含有一种或多种非经典氨基酸。
在具体实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物将不会在待治疗的动物例如人体内引起有害免疫应答。在某些实施方案中，结合分子，例如本发明的抗体或其抗原结合片段来源于患者(例如人患者)，并且随后用于它们所来源的相同物种(例如人)中，从而减轻或最小化有害免疫应答的发生。
去免疫也可用于降低抗体的免疫原性。如本文所用，术语“去免疫”包括改变抗体以修饰T细胞表位；参见，例如国际申请WO98/52976和WO00/34317。例如，对来自起始抗体的VH和VL序列进行分析，并且来自每个V区的人T细胞表位“图谱”显示表位相对于互补决定区(CDR)和序列内的其它关键残基的位置。对来自T细胞表位图谱的单独T细胞表位进行分析以便鉴别具有改变最终抗体的活性的低风险的替代氨基酸取代。一系列替代VH和VL序列被设计成包含氨基酸取代的组合，并且这些序列随后并入一系列结合多肽中，例如用于在本文公开的诊断和治疗方法中使用的tau特异性抗体或其免疫特异性片段，然后对这些序列进行功能测试。通常，产生并且测试12与24个之间的变体抗体。然后，将包含修饰的V和人C区的完整重链和轻链基因克隆至表达载体中并且将后续质粒引入细胞系中以用于产生完整抗体。然后在适当的生物化学和生物测定中比较抗体，并且鉴别最佳变体。
单克隆抗体可使用本领域中已知的多种技术(包括使用杂交瘤、重组体和噬菌体展示技术或其组合)来制备。例如，单克隆抗体可使用杂交瘤技术，包括本领域中已知和例如以下文献中教示的技术来产生：Harlow等,Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,第2版(1988)；Hammerling等,Monoclonal Antibodiesand T-Cell Hybridomas Elsevier,N.Y.,563-681(1981)，所述参考文献以引用的方式整体并入。如本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指来源于单一克隆的抗体，包括任何真核生物、原核生物或噬菌体克隆，而不是指产生所述抗体的方法。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。在某些实施方案中，本发明的抗体来源于通过用埃-巴二氏病毒转化永生化的人B细胞，如本文所述。
在熟知的杂交瘤方法(Kohler等,Nature 256(1975),495)中，使来自哺乳动物的相对短寿命的或非永生的淋巴细胞(例如来源于如本文所述的人受试者的B细胞)与永生肿瘤细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)融合，因此产生杂交细胞或“杂交瘤”，所述杂交细胞或杂交瘤是永生的并且能够产生B细胞的遗传编码的抗体。将所得到的杂交体通过选择、稀释和再生长分离成单个遗传株，其中每个单个株包含用于形成单个抗体的特异性基因。它们产生针对所需抗原同源的抗体，并且鉴于其纯遗传家系被称为“单克隆”。
接种因此制备的杂交瘤细胞，并且使其在含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质的适合培养基中生长。本领域的技术人员将理解，用于杂交瘤的形成、选择和生长的试剂、细胞系和培养基可从多个来源商购，并且已确立标准化方案。一般来说，测定杂交瘤细胞生长所处的培养基中针对所需抗原的单克隆抗体的产生。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过如本文所述的体外测定如免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定。在鉴别产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，可通过限制稀释工序对克隆进行亚克隆并且通过标准方法进行生长；参见例如，Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,第59-103页(1986)。将进一步理解，由亚克隆分泌的单克隆抗体可通过常规纯化程序(例如像蛋白质A、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、渗析或亲和色谱法)自培养基、腹水或血清分离。
在另一个实施方案中，可通过显微操纵选择淋巴细胞并且分离可变基因。例如，可从免疫的或天然免疫哺乳动物(例如人)分离外周血单核细胞并且在体外培养约7天。针对符合筛选标准的特异性IgG对所述培养物进行筛选。可分离来自阳性孔的细胞。单个产生Ig的B细胞可通过FACS或通过在补体介导的溶血空斑测定中鉴别它们来分离。产生Ig的B细胞可显微操纵到管中，并且VH和VL基因可使用例如，RT-PCR进行扩增。可将VH和VL基因克隆至抗体表达载体中并且转染至细胞(例如，真核或原核细胞)中以用于表达。
或者，可使用本领域的熟练技术人员熟知的技术选择并培养产生抗体的细胞系。这类技术描述于多种实验室手册和主要出版物中。在此方面，如以下所描述适合用于在本发明中使用的技术描述于Current Protocols in Immunology,Coligan等,编辑.,GreenPublishing Associates and Wiley-Interscience,John Wiley and Sons,New York(1991)中，所述文献以引用的方式整体并入本文，包括增刊。
可通过已知技术产生识别特定表位的抗体片段。例如，可重组或通过使用酶(如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab')2片段))对免疫球蛋白分子进行蛋白水解裂解来产生Fab和F(ab')2片段。F(ab')2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。此类片段足以用于例如在涉及偶联免疫球蛋白的免疫特异性部分以检测试剂如放射性同位素的免疫诊断程序中使用。
如本文所述的人抗体特别理想用于人患者中的治疗性使用。本发明的人抗体是例如分离自健康人受试者，所述受试者由于他们的年龄可能被怀疑处于发展tau蛋白病病症例如阿尔茨海默氏病的风险；或具有病症但具有不寻常的稳定疾病过程的患者。然而，尽管审慎预期老年健康和无症状受试者将对应地比更年轻的受试者更规律地发展保护性抗-tau抗体，可使用后者以及用于获得本发明的人抗体的来源。这对于更年轻的患者来说是特别真实的，所述患者易于发展家族形式的tau蛋白病疾病但保持无症状，因为他们的免疫系统比老年人的免疫系统更有效地起作用。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含抗体分子的至少一个重链或轻链CDR。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少两个CDR。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少三个CDR。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少四个CDR。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少五个CDR。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少六个CDR。本文描述包含可包括在主题抗体中的至少一个CDR的示例性抗体分子。
本发明的抗体可通过本领域中已知用于合成抗体的任何方法，特别是通过化学合成或者通过如本文所述的重组表达技术来产生。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包含合成恒定区，其中一个或多个结构域部分或全部缺失(“结构域缺失抗体”)。在某些实施方案中，相容性修饰的抗体将包含结构域缺失的构建体或变体，其中整个CH2结构域已经被去除(ΔCH2构建体)。对于其它实施方案，较短连接肽可取代缺失结构域以提供可变区的移动灵活性和自由度。本领域的技术人员将理解，所述构建体是特别优选的，这是由于CH2结构域对抗体的分解代谢率的调控特性。结构域缺失的构建体可使用编码IgG1人恒定区的载体衍生，参见例如，国际申请WO02/060955和WO02/096948A2。所述载体被工程化以缺失CH2结构域并且提供表达结构域缺失的IgG1恒定区的合成载体。
在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物是微抗体。微抗体可使用本领域中描述的方法来制备，参见例如美国专利5,837,821或国际申请WO 94/09817。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包含具有一些或甚至单个氨基酸的缺失或取代的免疫球蛋白重链，只要其允许单体亚基之间的缔合。例如，在CH2结构域的选定区域中的单个氨基酸的突变可能足以实质上减少Fc结合并且因此增加tau定位。类似地，可能需要仅仅缺失控制待调节的效应子功能(例如，补体结合)的一个或多个恒定区结构域的那一部分。恒定区的这类部分缺失可改进抗体的选定特征(血清半衰期)，同时使与所述恒定区结构域完整相关联的其它所需的功能保持不变。此外，正如以上所提到的，所公开的抗体的恒定区可通过增强所得到的构建体的特性的一个或多个氨基酸的突变或取代来合成。在此方面，可能破坏由保守结合位点(例如Fc结合)提供的活性，同时基本上保持所修饰的抗体的构型和免疫原性特性。而其它实施方案包括将一个或多个氨基酸添加至恒定区以增强所需的特征，如效应子功能或提供更多细胞毒素或碳水化合物附着。在这类实施方案中，可能希望插入或复制衍生自选定恒定区结构域的特异性序列。
本发明还提供抗体，所述抗体包含本文描述的抗体分子(例如VH区和/或VL区)的变体(包括衍生物)，主要由其组成或由其组成，所述抗体或其片段免疫特异性地结合tau。可使用本领域的技术人员已知的标准技术在编码抗体的核苷酸序列中引入突变，所述突变包括但不限于导致氨基酸取代的定点诱变和PCR介导的诱变。在一个实施方案中，相对于参比VH区、VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL区、VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3，变体(包括衍生物)编码少于50个氨基酸取代、少于40个氨基酸取代、少于30个氨基酸取代、少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代或少于2个氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有带类似电荷的侧链的氨基酸残基替代的一种保守性氨基酸取代。具有带类似电荷的侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。或者，可如通过饱和诱变沿着所有或部分的编码序列随机引入突变，并且可筛选所产生的突变体的生物活性以鉴别保留活性(例如，结合tau的能力)的突变体。
例如，可能仅在抗体分子的构架区或仅在CDR区中引入突变。引入的突变可以是沉默或中性错义突变，例如对抗体结合抗原的能力不具有作用或几乎不具有作用，确实一些这类突变无论如何不会改变氨基酸序列。这些类型的突变可适用于优化密码子使用，或改进杂交瘤的抗体产生。编码本发明的抗体的密码子优化的编码区在本文其它地方公开。或者，非中性错义突变可改变抗体结合抗原的能力。大多数沉默和中性错义突变的位置可能是在框架区中，而大多数非中性错义突变的位置可能是在CDR中，但这并非绝对要求本领域的技术人员将能够设计且测试具有所需特性的突变分子，所述特性如抗原结合活性不改变或结合活性改变(例如，抗原结合活性改进或抗体特异性变化)。诱变之后，通常可表达编码的蛋白质，并且编码的蛋白质的功能和/或生物活性(例如，免疫特异性地结合tau的至少一个表位的能力)可使用本文所描述的技术或通过通常本领域中已知的修饰技术来确定。
tau结合剂，例如但不限于，本发明的tau结合抗体可特征在于使用任何体内或体外神经退行性tau蛋白病模型。本领域的技术人员容易地理解，本发明的tau结合剂(例如，抗体)可特征在于神经退行性tau蛋白病的小鼠模型。例如，但不限于，针对tau蛋白病的以下三种不同动物模型中的任一种可用于表征和验证本发明的tau抗体(以及其具有结合特异性的分子)。
1.转基因TauP301L小鼠(系183)：在鼠Thy1.2启动子下表达具有P301L突变的人Tau40(这些转基因动物的产生描述于等,J.Biol.Chem.276(2001),529-534和国际申请WO 2003/017918中，其公开内容以引用的方式并入本文)
2.在鼠PrP启动子下表达具有P301L突变的最短4R人tau同种型的JNPL3小鼠(可从Taconic,Hudson,NY,U.S.A获得)。
3.在鼠PrP启动子下表达具有P301S突变的人tau的P301STau(系PS19)小鼠(可从Jackson Laboratory,Bar Harbor,Maine,U.S.A获得)。
本领域的技术人员理解，神经退行性tau蛋白病的实验模型可用于预防性情况或它可用于治疗性情况中。在预防性情况下，动物的给药在神经退行性tau蛋白病或其症状的发作之前开始。在预防性情况下，本发明的tau结合剂(例如，抗体)针对其预防、减少或延迟神经退行性tau蛋白病或其症状的发作的能力进行评价。在治疗性情况下，动物的给药在神经退行性tau蛋白病或其症状的发作之后开始。在治疗性情况下，本发明的tau结合剂(例如，抗体)针对其治疗、减少或减轻神经退行性tau蛋白病或其症状的能力进行评价。神经退行性tau蛋白病的症状包括但不限于，实验对象的神经元、大脑、脊髓、大脑脊液或血清中的病理性tau沉积物的积聚、神经原纤维缠结(NFT)、过度磷酸化的tau多肽、不溶性tau部分。本领域的技术人员理解，在神经退行性tau蛋白病的任何动物模型中阳性预防性或治疗性结果指示具体tau结合剂(例如，抗体)可在不同于实验模型生物体的受试者中用于预防性或治疗性目的，例如，它可用于治疗有需要的人受试者中的神经退行性tau蛋白病。
在一个实施方案中，本发明的tau结合剂(如抗体)可被施用至tau蛋白病小鼠模型和相应的对照野生型小鼠。所施用的抗体可以是本发明的鼠源化抗体或本发明的抗体的人-鼠嵌合体。tau结合剂(如抗体)可通过本领域中已知的任何方式施用，例如，通过腹膜内、颅内、肌内、静脉内、皮下、口服和气雾剂施用。实验动物可被给予一个、两个、三个、四个、五个或更多个剂量的tau结合剂(例如，抗体)或对照组合物，如PBS。在一个实施方案中，实验动物将被施用一个或两个剂量的tau结合剂(例如，抗体)。参见，例如实施例9。在另一个实施方案中，所述动物在几周或几个月内被长期给予tau结合剂(例如，抗体)。参见，例如实施例10。本领域的技术人员可容易地设计适合于实验目的的给药方案，例如，用于急性研究的给药方案、用于慢性研究的给药方案、用于毒性研究的给药方案、用于预防性或治疗性研究的给药方案。tau结合剂(例如，抗体)在实验动物的特定组织隔室，例如但不限于血清、血液、大脑脊髓液、大脑组织中的存在可使用本领域的熟知方法来建立。参见，例如实施例9和10。在一个实施方案中，本发明的tau结合剂(例如，抗体)能够穿透血大脑屏障。本领域的技术人员理解，通过调整tau结合剂(例如，抗体)剂量和给药频率，可在实验动物中维持所需的tau结合剂(例如，抗体)浓度。本发明的tau结合剂(例如，抗体)在tau蛋白病模型中的任何作用可通过比较所治疗的动物和对照动物中tau的水平、生物化学特征或分布来评定。在一个实例中，神经原纤维缠结(NFT)使用Gallyas的银浸渍技术或通过用单克隆小鼠抗体AT100和AT180免疫染色来进行检查，其识别NFT中病理性磷酸化的tau。可测定抗体治疗小鼠和对照动物中的大脑和脊髓中的Gallyas-阳性神经元和/或AT100、AT180标记的神经元的数量或频率以评估抗体治疗的作用。在一个实施方案中，本发明的抗体能够降低动物模型中的大脑或脊髓中的神经原纤维缠结的水平、量或浓度。所述抗体可使神经原纤维缠结的水平、量或浓度降低至少约5％、10％、20％、30％、50％、70％、90％或更多。在另一个实施方案中，本发明的抗体能够使动物模型中的大脑或脊髓中Gallyas-阳性神经元的数目或频率降低例如至少约5％、10％、20％、30％、50％、70％、90％或更多。在另一个实施方案中，本发明的抗体能够使动物模型中的大脑或脊髓中AT100或AT180抗体阳性神经元的数目或频率降低例如至少约5％、10％、20％、30％、50％、70％、90％或更多。本发明的抗体的作用还可通过检查在抗体施用之后tau的分布和生物化学特性来评定。在一个实施方案中，本发明的抗体能够使动物模型的大脑或脊髓中tau蛋白的量或浓度降低例如至少约5％、10％、20％、30％、50％、70％、90％或更多。在另一个实施方案中，本发明的抗体能够使动物模型的大脑或脊髓中不溶性tau蛋白的量或浓度降低例如至少约5％、10％、20％、30％、50％、70％、90％或更多。不溶性tau部分可例如像在实施例10或Goedert M,Spillantini MG,Cairns NJ,Crowther RA.Neuron 8,159(1992)中所描述来制备。生物样品中tau蛋白的量可通过技术人员已知的任何方法来测定，例如，如实施例10中所描述。在另一实施方案中，本发明的抗体能够使动物模型中的大脑或脊髓中过度磷酸化tau蛋白的量或浓度降低例如至少约5％、10％、20％、30％、50％、70％、90％或更多。可使用对病理性过度磷酸化形式的tau如AT100或AT180具有特异性的抗体来检测过度磷酸化的tau。本发明的抗体还可使动物模型的血液、血清或大脑脊液中的tau浓度改变，例如降低或增加例如至少约5％、10％、20％、30％、50％、70％、90％或更多。在一个实施方案中，相较于在治疗之前存在的水平、数目、频率、量或浓度或相较于在未治疗/对照治疗的受试者中存在的水平、数目、频率、量或浓度，％降低或增加是相对的。
在一个实施方案中，本发明的抗体可预防或延迟受试者中的神经退行性tau蛋白病的至少一种症状的发作。在一个实施方案中，本发明的抗体可减少或消除受试者中的神经退行性tau蛋白病的至少一种症状的发作。所述症状可以是受试者的大脑或脊髓中病理性tau沉积物、过度磷酸化的tau沉积物、不溶性tau沉积物、神经原纤维、神经原纤维、预缠结磷光体tau聚集体、神经元内神经原纤维缠结或神经元外神经原纤维缠结的形成。参见例如Augustinack等,Acta Neuropathol 103:26-35(2002)。所述症状还可以是血清、血液、尿液或大脑脊液中tau的存在或者升高的浓度或量，其中升高的浓度量是与健康受试者相比较。所述症状可以是神经学症状，例如，改变的条件性味觉厌恶、改变的情境性恐惧条件反射、记忆障碍、运动功能损失。在一个实施方案中，使用双试Y型迷宫任务评定记忆障碍。在具体实施方案中，基本上如实施例10中所描述进行双试Y型迷宫任务。在一个实施方案中，至少一种症状被降低至少约5％、10％、15％、20％、30％、50％、70％或90％。在另一个实施方案中，与对照受试者相比，双试Y型迷宫任务率在抗体治疗患者中显著更高。在一个具体实施方案中，双试Y型迷宫任务率增加至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在另一个实施方案中，双试Y型迷宫任务率是至少约2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或20倍更高。本发明还提供一种预防或延迟有需要的受试者中神经退行性tau蛋白病的至少一种症状的发作的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本文所述的tau抗体。本发明还提供一种减少或消除有需要的受试者中神经退行性tau蛋白病的至少一种症状的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本文所述的tau抗体。在一个实施方案中，受试者是实验生物体，如但不限于转基因小鼠。在一个实施方案中，受试者是人。
III.编码抗体的多核苷酸
编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可由可为未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA的任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸组成。例如，编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可由以下各项组成：单链和双链DNA、为单链区与双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA、以及为单链区与双链区的混合物的RNA、包含可以是单链或更典型地是双链或单链区与双链区的混合物的DNA和RNA的杂交分子。此外，编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可由包含RNA或DNA或RNA与DNA两者的三链区组成。编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸还可含有一个或多个修饰的碱基或出于稳定性或其它原因而修饰的DNA或RNA主链。“修饰”的碱基包括例如三苯甲基化碱基和不常见碱基如肌苷。可对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包涵化学、酶促或代谢修饰形式。
可通过以下方式产生编码来源于免疫球蛋白(例如，免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的多肽的非天然变体的分离的多核苷酸：将一个或多个核苷酸取代、添加或缺失引入免疫球蛋白的核苷酸序列以使得将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入到所编码的蛋白质之中。可通过标准技术(如定点诱变和PCR介导的诱变)来引入突变。在一个实施方案中，在一个或多个非必需氨基酸残基处进行保守性氨基酸取代。
如所熟知的，RNA可通过标准技术从原始B细胞、杂交瘤细胞或从其它转化的细胞分离，所述技术如异硫氰酸胍提取和沉淀、接着离心或色谱法。在需要时，mRNA可通过标准技术如寡聚脱氧胸苷酸纤维素(oligo dT cellulose)上色谱法从总RNA上分离。适合的技术是在本领域中熟悉的。在一个实施方案中，编码抗体的轻链和重链的cDNA可根据熟知方法使用逆转录酶和DNA聚合酶来同时或单独地制备。PCR可通过共有恒定区引物或通过更具有特异性的引物基于公开的重链和轻链DNA和氨基酸序列来起始。如以上所讨论，PCR还可用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这种情况下，文库可通过共有引物或较大同源性探针(如人恒定区探针)来筛选。
DNA、通常质粒DNA可使用本领域中已知的技术从细胞中分离，根据例如在关于重组DNA技术的前述参考文献中详细阐明的标准、熟知技术来限制性标绘并且测序。当然，DNA可根据本发明在分离过程或后续分析期间的任何点合成。
在一个实施方案中，本发明提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码免疫球蛋白重链可变区(VH)、基本上由或由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成，其中所述重链可变区的至少一个CDR或所述重链可变区的至少两个VH-CDR与来自本文所公开的抗体的参比重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。或者，所述VH的VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3区与来自本文所公开的抗体的参比重链VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。因此，根据此实施方案，本发明的重链可变区具有与图7中所示的多肽序列相关的VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3多肽序列。在一个实施方案中，参比VH CDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、157或163；参比VHCDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158或164；并且参比VH CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147、153、159或165。
在一个实施方案中，本发明提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸、基本上由或由编码免疫球蛋白重链可变区组成，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与图7中所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3组相同的多肽序列，除了任一个VH-CDR中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸取代。在某些实施方案中，所述氨基酸取代是保守的。在一个实施方案中，VH CDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、157或163；VHCDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158或164；并且VH CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147、153、159或165。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸、基本上由或由编码免疫球蛋白轻链可变区的核酸组成，其中所述轻链可变区的至少一个VL-CDR或所述轻链可变区的至少两个VL-CDR与来自本文所公开的抗体的参比轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。或者，所述VL的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3区与来自本文所公开的抗体的参比轻链VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。因此，根据此实施方案，本发明的轻链可变区具有与图7中所示的多肽序列相关的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3多肽序列。在一个实施方案中，参比VLCDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166或224；参比VL CDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149、155、161或167；并且参比VL CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162或168。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸、基本上由或由编码免疫球蛋白轻链可变区的核酸组成，其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有与图7中所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3组相同的多肽序列，除了任一个VL-CDR中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸取代。在某些实施方案中，所述氨基酸取代是保守的。在一个实施方案中，VLCDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166或224；VL CDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149、155、161或167；并且VL CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162或168。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸、基本上由或由编码免疫球蛋白重链可变区的核酸组成，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与图7中所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3组相同的多肽序列。在一个实施方案中，VH CDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、157或163；VH CDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158或164；并且VH CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147、153、159或165。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸、基本上由或由编码免疫球蛋白轻链可变区的核酸组成，其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有与图7中所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3组相同的多肽序列。在一个实施方案中，VL CDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166或224；VL CDR2的氨基酸序列是SEQ IDNO:83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149、155、161或167；并且VL CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162或168。
如本领域中所已知，通过比较一个多肽或多核苷酸的氨基酸或核酸序列与第二多肽或多核苷酸的氨基酸或核酸序列来确定两个多肽或两个多核苷酸之间的“序列同一性”。当在本文中论述时，任何具体多肽是否与另一个多肽至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％相同可使用本领域中已知的方法和计算机程序/软件来确定，如但不限于BESTFIT程序(威斯康星序列分析程序包，第8版用于Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI53711)。BESTFIT使用Smith和Waterman的局部同源性算法(Advances in AppliedMathematics 2(1981),482-489)，以找到两个序列之间的最佳同源性片段。当使用BESTFIT或任何其它序列比对程序来确定具体序列是否与根据本发明的参比序列例如95％相同时，当然设定了参数以使得在参比多肽序列的全长上计算同一性的百分比并且允许多达参比序列中的氨基酸的总数的5％的同源性空位。
在本发明的一个实施方案中，所述多核苷酸包含具有如表4中描绘的抗-tau抗体的VH或VL区的多核苷酸序列的核酸，或主要由其组成或由其组成。在此方面，本领域的技术人员将容易地了解至少编码轻链和/或重链的可变结构域的多核苷酸可编码两个或仅一个免疫球蛋白链的可变结构域。
表4：tau特异性抗体的VH和VL区的核苷酸序列。BG–在种系化之前
在一个实施方案中，本发明提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码免疫球蛋白重链可变区的核酸。主要由其组成或由其组成，所述重链可变区与参比重链VH至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或95％相同。在一个实施方案中，参比重链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:44、45、47、48、50、52、54、56、58、60、62、65、67、69、71、73、75、76或220。
在一个实施方案中，本发明提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码免疫球蛋白轻链可变区的核酸、主要其组成或由其组成，所述轻链可变区与参比轻链VL至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或95％相同。在一个实施方案中，参比轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:46、49、51、53、55、57、59、61、63、64、66、68、70、72、74、77、78、221或222。
本发明还包括本发明的多核苷酸的片段，如其它地方所描述。另外，本发明还考虑编码如本文所描述的融合多核苷酸、Fab片段以及其它衍生物的多核苷酸。
多核苷酸可通过在本领域中已知的任何方法来产生或制造。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，那么编码所述抗体的多核苷酸可从化学合成的寡核苷酸组装(例如如Kutmeier等,BioTechniques 17(1994),242中所描述)，简单地说，这涉及合成含有编码所述抗体的序列的部分的重叠寡核苷酸，退火并且连接那些寡核苷酸，并且然后通过PCR来扩增所连接的寡核苷酸。
或者，编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可从来自适合来源的核酸产生。如果包含编码特定抗体的核酸的克隆是不可获得的，但是抗体分子的序列是已知的，则编码所述抗体的核酸可化学合成，或使用可杂交至序列的3'和5'端的合成引物通过PCR扩增、或者通过使用对于特定基因序列具有特异性的寡核苷酸探针来进行克隆，以便例如从cDNA文库鉴别编码所述抗体的cDNA克隆而从适合来源(例如，抗体cDNA文库、或自表达所述tau特异性抗体的任何组织或细胞如被选择来表达抗体的杂交瘤细胞产生的cDNA文库或者从它们分离的核酸，优选多聚A+RNA)获得。然后可使用本领域中熟知的任何方法将通过PCR产生的扩增核酸克隆到可复制的克隆载体中。
一旦确定了抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的核苷酸序列和相应氨基酸序列，就可使用本领域中熟知的用于操纵核苷酸序列的方法来操纵其核苷酸序列，所述方法例如重组DNA技术、定点诱变、PCR等(参见，例如以下文献中所描述的技术：Sambrook等,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)和Ausubel等,编著,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,NY(1998)，所述文献以引用的方式整体并入本文)，以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如以产生氨基酸取代、缺失和/或插入。
IV.抗体多肽的表达
在操纵所分离的遗传物质以提供本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物之后，通常将编码所述抗体的多核苷酸插入表达载体中以用于引入至宿主细胞中，所述宿主细胞可用于产生所需数量的抗体。本文描述抗体或其片段、衍生物或类似物(例如结合靶分子的抗体的重链或轻链)的重组表达。一旦获得了编码本发明的抗体分子或抗体的重链或轻链或其一部分(优选地含有重链或轻链可变结构域)的多核苷酸，用于产生抗体分子的载体可通过重组DNA技术使用本领域中熟知的技术来产生。因此，本文描述用于通过表达含有编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可使用本领域中的技术人员熟知的方法来构建含有编码抗体的序列和适当转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供可复制载体，所述载体包含编码本发明的抗体分子或其重链或轻链、或重链或轻链可变结构域的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接至启动子。所述载体可包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(参见例如，国际申请WO 86/05807和WO 89/01036；和美国专利号5,122,464)，并且可将抗体的可变结构域克隆至所述载体中以便表达整个重链或轻链。
术语“载体”或“表达载体”在本文中用于指根据本发明使用的载体，其用作媒介物以便将所需基因引入宿主细胞并且在其中表达的媒介物。如本领域的技术人员已知，此类载体可容易地选自由质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒组成的组。一般来说，与本发明相容的载体将包含选择标记、有利于所需基因克隆的适当限制性位点，以及进入真核或原核细胞和/或在其中复制的能力。出于本发明的目的，可利用多种表达载体系统。例如，一类载体利用来源于动物病毒的DNA元件，所述动物病毒如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒。其它病毒涉及使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。另外，已经将DNA整合到染色体中的细胞可通过引入一个或多个标记来选择，所述一种或多种标记允许选择所转染的宿主细胞。标记可提供针对营养缺陷型宿主的原营养、杀生物剂抗性(例如抗生素)或对于重金属如铜的抗性。可选择的标记基因可直接连接至待表达的DNA序列，或通过共转化引入同一细胞中。mRNA的最优合成还可能需要另外的元件。这些元件可以包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子以及终止信号。
在具体实施方案中，克隆的可变区基因沿着重链和轻链恒定区基因(例如，人重链和轻链恒定区基因)插入表达载体中，如上面所讨论。在一个实施方案中，这使用BiogenIDEC,Inc.的专利表达载体实现，所述载体被称为NEOSPLA，在美国专利号6,159,730中公开。所述载体包含巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β珠蛋白主要启动子、SV40复制起点、牛生长激素多腺苷酸序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和前导序列。已经发现所述载体在并入可变和恒定区基因、在CHO细胞中转染、然后在含有G418的培养基中选择以及氨甲喋呤扩增时，会产生非常高的抗体表达水平。当然，能够在真核细胞中引出表达的任何表达载体均可用于本发明。适合载体的实例包括但不限于质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1和pZeoSV2(可购自Invitrogen,San Diego,CA)以及质粒pCI(可购自Promega,Madison,WI)。一般来说，如果免疫球蛋白重链和轻链是可通过例如机器人系统进行的常规实验，则筛选大量转化细胞中适当高水平表达的细胞。载体系统也在美国专利号5,736,137和5,658,570中教导，其各自以引用的方式整体并入本文。所述系统提供高表达水平，例如，>30pg/细胞/天。其它示例性载体系统在例如美国专利号6,413,777中公开。
在其它实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可使用多顺反子构建体，如美国专利申请公布号2003-0157641A1中公开的那些构建体来表达，所述专利整体并入本文。在这些表达系统中，多个目标基因产物，如抗体的重链和轻链可从单个多顺反子构建体制备。这些系统有利地使用内部核糖体进入位点(IRES)以提供相对较高的抗体水平。相容性IRES序列在美国专利号6,193,980中公开，其也并入本文。本领域的技术人员将了解，此类表达系统可用于有效地产生本申请中公开的全范围的抗体。
更一般地说，一旦已制备编码抗体的单体亚基的载体或DNA序列，表达载体即可引入适当的宿主细胞。将质粒引入宿主细胞可通过本领域的技术人员熟知的各种技术实现。这些技术包括但不限于转染(包括使用例如或lipofectamine的脂转染)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、用包膜DNA进行的细胞融合、显微注射以及用完整病毒感染。通常，质粒引入宿主通过标准磷酸钙共沉淀法进行。携带表达构建体的宿主细胞在适于产生轻链和重链的条件下生长，并且测定重链和/或轻链蛋白合成。示例性测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)或荧光活化细胞分选仪分析(FACS)、免疫组织化学等。
表达载体通过常规技术转移至宿主细胞，并且然后通过常规技术培养转染的细胞，以产生用于在本文所述的方法中使用的抗体。因此，本发明包括含有编码本发明的抗体或其重链或轻链的多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸可操作地连接至异源启动子。在表达双链抗体的具体实施方案中，编码重链和轻链二者的载体可在宿主细胞中共表达，以用于表达整个免疫球蛋白分子，如下面所详述。
宿主细胞可用本发明的两个表达载体共转染，第一载体编码重链来源多肽的并且第二载体编码轻链来源多肽。两个载体可包含相同的可选择标记，它能够使重链和轻链多肽等量表达。或者，可使用编码重链和轻链多肽二者的单个载体。在这种情况下，轻链有利地设置于重链之前，以避免无毒性重链的过量；参见Proudfoot,Nature 322(1986),52；Kohler,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980),2197。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
如本文所用，“宿主细胞”是指携带使用重组DNA技术构建并且编码至少一种异源基因的载体的细胞。在从重组宿主分离抗体的过程的描述中，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用来指代抗体的来源，除非另外清楚地指明。换句话说，从“细胞”回收多肽可以指从旋转沉降的全细胞或从含有培养基和悬浮细胞二者的细胞培养物回收。
多种宿主表达载体系统可用于表达适用于本文所述方法的抗体分子。此类宿主表达系统代表目标编码序列可通过其产生并且随后纯化的媒介物，而且还代表当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达本发明的抗体分子的细胞。这些包括但不限于微生物，如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘质粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如酵母(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV)感染或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或具有含有源自哺乳动物细胞的基因组(例如金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(例如腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子)的启动子的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、NSO、BLK、293、3T3细胞)。在一个实施方案中，细菌细胞如大肠杆菌、并且更优选地真核细胞(尤其是用于表达完整重组抗体分子的真核细胞细胞)可用于重组抗体分子的表达。例如，与载体(如来自人巨细胞病毒的主要中早期基因启动子元件)结合的哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)是抗体的有效表达系统；参见例如，Foecking等,Gene 45(1986),101；Cockett等,Bio/Technology 8(1990),2。
用于蛋白质表达的宿主细胞系经常具有哺乳动物来源；本领域技术人员被认为能够确定最适合于有待在其中表达的所希望的基因产物的具体宿主细胞系。示例性宿主细胞系包括但不限于CHO(中国仓鼠卵巢)、DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR缺陷型)、HELA(人宫颈癌)、CVI(猴肾细胞系)、COS(具有SV40T抗原的CVI的衍生物)、VERY、BHK(幼仓鼠肾)、MDCK、WI38、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾细胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)以及293(人肾)。在具体实施方案中，宿主细胞系是CHO或293细胞。宿主细胞系通常得自商业服务机构(美国组织培养物保藏中心)或来自公开的文献。
此外，可选择调节插入序列的表达，或以所需的特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的此类修饰(例如，糖基化)和加工(例如，裂解)对于蛋白质的功能来说可为重要的。不同宿主细胞具有翻译后加工和修饰蛋白质和基因产物的特征性和特定机制。可选择适当细胞系或宿主系统以确保所表达的外源蛋白质的正确修饰和加工。为此，可使用具有用于初级转录物的正确加工、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机器(cellular machinery)的真核宿主细胞。
对于重组蛋白的长期高产量产生，优选使用稳定表达。例如，可工程化稳定表达抗体分子的细胞系。代替使用含有病毒复制起点的表达载体，宿主细胞可以使用由适当表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)和可选择标记来控制的DNA来转化。在引入外源DNA后，可允许工程化的细胞在富集培养基中生长1-2天，并且然后切换至选择性培养基。重组质粒中的可选择标记赋予选择抗性并允许细胞将质粒稳定整合到其染色体中，并且生长以形成基因座，细胞转而可进行克隆并扩增成细胞系。此方法可有利地用于工程化稳定表达抗体分子的细胞系。
可使用多种选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等,Cell 11(1977),223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska和Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48(1992),202)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等,Cell 22(1980),817)基因可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞中。同样，抗代谢物抗性可用作选择如下基因的基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler等,Natl.Acad.Sci.USA 77(1980),357；O'Hare等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981),1527)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan和Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981),2072)；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Goldspiel等,Clinical Pharmacy 12(1993),488-505；Wu和Wu,Biotherapy 3(1991),87-95；Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32(1993),573-596；Mulligan,Science 260(1993),926-932；以及Morgan和Anderson,Ann.Rev.Biochem.62(1993),191-217；TIB TECH11(1993),155-215)；以及hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等,Gene 30(1984),147)。可使用的重组DNA技术的本领域通常已知的方法描述于以下文献中：Ausubel等(编著),Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,NY(1993)；Kriegler,Gene Transfer and Expression,ALaboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)；和Dracopoli等(编著),CurrentProtocols in Human Genetics,John Wiley&Sons,NY(1994)中第12章和第13章；Colberre-Garapin等,J.Mol.Biol.150:1(1981)，所述参考文献以引用的方式整体并入本文。
可通过载体扩增增加抗体分子的表达水平，关于综述，参见Bebbington和Hentschel,The use of vectors based on gene amplification for the expressionof cloned genes in mammalian cells in DNA cloning,Academic Press,New York,第3卷.(1987)。当表达抗体的载体系统中的标记是可扩增的时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂的水平增加将使标记基因的拷贝数增加。因为所扩增的区域与抗体基因相关联，所以抗体的产生也将增加；参见Crouse等,Mol.Cell.Biol.3(1983),257。
体外产生允许按比例扩大以产生大量所需多肽。在组织培养条件下的哺乳动物细胞培养技术是本领域中已知的，并且包括均匀悬浮培养，例如在气升式反应器或连续搅拌反应器中，或固定化或截留细胞培养，例如在中空纤维、微胶囊中、琼脂糖微珠或陶瓷滤芯上。如果必要和/或需要，多肽溶液可通过常规色谱法(例如凝胶过滤、离子交换色谱法、DEAE-纤维素色谱法或(免疫)亲和色谱法)纯化，例如在合成铰链区多肽的优先生物合成之后或在本文所述的HIC色谱法步骤之前或之后。
编码本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的基因也可在非哺乳动物细胞如细菌或昆虫或酵母或植物细胞中表达。容易吸收核酸的细菌包括以下成员：肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如大肠杆菌或沙门氏菌属(Salmonella)菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)，如枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis)；肺炎球菌属(Pneumococcus)；链球菌属(Streptococcus)以及流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。还将认识到，当在细菌中表达时，异源多肽通常成为包涵体的部分。异源多肽必须分离、纯化并且然后组装成功能分子。当需要四价形式的抗体时，然后将亚基自组装成四价抗体；参见例如，国际申请WO02/096948。
在细菌系统中，取决于所表达的抗体分子的预期用途，可有利地选择许多表达载体。例如，当待产生大量所述蛋白质以产生抗体分子的药物组合物时，指导表达高含量的易于纯化的融合蛋白产物的载体可为合乎需要的。所述载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等,EMBO J.2(1983),1791)，其中抗体编码序列可单独地与lacZ编码区同框连接至载体中以便产生融合蛋白；pIN载体(Inouye和Inouye,Nucleic Acids Res.13(1985),3101-3109；Van Heeke&Schuster,J.Biol.Chem.24(1989),5503-5509)等。pGEX载体也可用于表达作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白的外源多肽。一般而言，所述融合蛋白是可溶性的，并且可易于通过吸附和结合于谷胱甘肽-琼脂糖珠粒的基质，随后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而从溶解细胞纯化。pGEX载体被设计成包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点以使得可从GST部分释放克隆的靶基因产物。
除了原核生物以外，也可使用真核微生物。酿酒酵母或常见面包酵母是在真核微生物中最常使用的，但是许多其它菌株通常可利用，例如巴斯德毕赤酵母。对于在酵母属中表达，通常使用例如质粒YRp7(Stinchcomb等,Nature 282(1979),39；Kingsman等,Gene 7(1979),141；Tschemper等,Gene 10(1980),157)。此质粒已包含TRPl基因，所述基因提供缺乏在色氨酸中生长的能力的突变酵母菌株的选择性标记，所述菌株例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones,Genetics85(1977),12)。然后，作为酵母宿主细胞基因组的特征的trpl损害的存在提供通过在缺乏色氨酸中生长来检测转化的有效环境。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicanuclear polyhedrosis virus，AcNPV)通常用作表达外源基因的载体。病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可将抗体编码序列单独地克隆至病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)中并且置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
一旦已经重组表达了本发明的抗体分子，本发明的完整抗体、其二聚体、单个轻链和重链或其它免疫球蛋白形式可根据本领域的标准工序纯化，包括例如通过色谱法(例如，离子交换、亲和尤其是在蛋白质A之后的特定抗原的亲和、以及大小分级柱色谱法(sizingcolumn chromatography))、离心、差别溶解度如硫酸铵沉淀，或通过任何其它蛋白质纯化的标准技术进行；参见例如，Scopes,"Protein Purification",Springer Verlag,N.Y.(1982)。或者，用于增加本发明抗体亲和力的另一种方法在美国专利公布2002-0123057 A1中公开。
V.融合蛋白和缀合物
在某些实施方案中，抗体多肽包含氨基酸序列或通常与抗体不相关的一个或多个部分。示例性修饰在下文中更详细地描述。例如，本发明的单链Fv抗体片段可包含柔性接头序列，或可修饰以添加功能部分(例如，PEG、药物、毒素或标记如荧光标记、放射性标记、酶标记、核磁标记、重金属标记等)。
本发明的抗体多肽可包含融合蛋白、基本上由其组成或由其组成。融合蛋白是包含例如具有至少一个靶结合位点和至少一个异源部分(即，本质上未天然与其连接的部分)的免疫球蛋白tau结合结构域的嵌合分子。氨基酸序列通常可存在于结合在融合多肽中的分离蛋白质中，或它们通常可存在于相同的蛋白质中，但在融合多肽中以新型排列布置。可例如通过化学合成，或通过产生和翻译其中肽区域以所需关系编码的多核苷酸来产生融合蛋白。
如应用于多核苷酸或多肽的术语“异源”意指多核苷酸或多肽来源于实体，所述实体的其余部分与其比较为不同。例如，如本文所用，与抗体或其抗原结合片段、变体或类似物融合的“异源多肽”来源于相同物种的非免疫球蛋白多肽，或不同物种的免疫球蛋白或非免疫球蛋白多肽。
如在本文别处更详细地讨论，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还可重组融合至异源多肽的N-或C-末端，或化学缀合(包括共价和非共价缀合)至多肽或其它组合物。例如，抗体可重组融合或缀合至在检测测定中用作标记的分子，和效应分子，如异源多肽、药物、放射性核素或毒素；参见例如，国际申请WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；美国专利号5,314,995；以及欧洲专利申请EP 0 396 387。
本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可由通过肽键或修饰肽键彼此键合的氨基酸，即肽同电子排列体组成，并且可包含除20个基因编码的氨基酸之外的氨基酸。抗体可通过天然过程(如翻译后加工)或通过本领域熟知的化学改性技术修饰。此类修饰在基础教科书中，并且在更详细的专题论文以及大量研究文献中详细地描述。修饰可发生在抗体的任何部分，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端，或如碳水化合物的部分上。应当理解，相同类型的修饰可以相同或不同的程度存在于给定抗体中的若干位点。此外，给定抗体可包含多种类型的修饰。抗体可以是支链的，例如作为泛素化的结果；并且它们可以是含有或不含支链的环状。环状、支链和支链环状抗体可来源于翻译后天然过程或可通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、核黄素(flavin)的共价连接、血红素(heme)部分的共价连接原、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸添加至蛋白质(如精氨酸化)和泛素化；参见例如Proteins-Structure And Molecular Properties,T.E.Creighton,W.H.Freemanand Company,New York第2版,(1993)；Posttranslational Covalent Modification OfProteins,B.C.Johnson,编辑,Academic Press,New York,第1-12页(1983)；Seifter等,Meth.Enzymol.182(1990),626-646；Rattan等,Ann.NY Acad.Sci.663(1992),48-62)。
本发明还提供包含抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物以及异源多肽的融合蛋白。在一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含以下，基本上以下组成或由以下组成具有任何一个或多个本发明的抗体的VH区的氨基酸序列或任何一个或多个本发明的抗体的VL区的氨基酸序列或其片段或变体以及异源多肽序列的多肽。在另一个实施方案中，适用于本文所公开的诊断和治疗方法的融合蛋白包含以下，基本上以下组成或由以下组成：具有抗体的任何一个、两个、三个VH-CDR的氨基酸序列或其片段、变体或衍生物或抗体的任何一个、两个、三个VL-CDR的氨基酸序列或其片段、变体或衍生物、和异源多肽序列的多肽。在一个实施方案中，融合蛋白包含具有本发明的抗体的VH-CDR3的氨基酸序列或其片段、衍生物或变体以及异源多肽序列的多肽，所述融合蛋白特异性结合tau。在另一个实施方案中，融合蛋白包含具有本发明的抗体的至少一个VH区的氨基酸序列和本发明的抗体的至少一个VL区的氨基酸序列或其片段、衍生物或变体以及异源多肽序列的多肽。在一个实施方案中，融合蛋白的VH和VL区对应于特异性结合tau的单源抗体(或scFv或Fab片段)。在又一个实施方案中，适用于本文所公开的诊断和治疗方法的融合蛋白包含具有抗体的任何一个、两个、三个或更多个VH CDR的氨基酸序列和抗体的任何一个、两个、三个或更多个VL CDR的氨基酸序列或其片段或变体以及异源多肽序列的多肽。在一个实施方案中，两个、三个、四个、五个、六个或更多个VH-CDR或VL-CDR对应于本发明的单源抗体(或scFv或Fab片段)。本发明还涵盖编码这些融合蛋白的核酸分子。
在文献中报道的示例性融合蛋白包括T细胞受体(Gascoigne等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987),2936-2940；CD4(Capon等,Nature 337(1989),525-531；Traunecker等,Nature 339(1989),68-70；Zettmeissl等,DNA Cell Biol.USA 9(1990),347-353；以及Byrn等,Nature 344(1990),667-670)；L-选择蛋白(归巢受体)(Watson等,J.Cell.Biol.110(1990),2221-2229；和Watson等,Nature 349(1991),164-167)；CD44(Aruffo等,Cell 61(1990),1303-1313)；CD28和B7(Linsley等,J.Exp.Med.173(1991),721-730)；CTLA-4(Lisley等,J.Exp.Med.174(1991),561-569)；CD22(Stamenkovic等,Cell 66(1991),1133-1144)；TNF受体(Ashkenazi等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991),10535-10539；Lesslauer等,Eur.J.Immunol.27(1991),2883-2886；以及Peppel等,J.Exp.Med.174(1991),1483-1489(1991)；以及IgE受体a(Ridgway和Gorman,J.Cell.Biol.115(1991),Abstract No.1448)的融合。
如本文别处所讨论，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可融合至异源多肽，以增加多肽的体内半衰期，或用于使用本领域中已知的方法进行的免疫测定。例如，在一个实施方案中，PEG可缀合至本发明的抗体，以增加其体内半衰期；参见例如，Leong等,Cytokine 16(2001),106-119；Adv.in Drug Deliv.Rev.54(2002),531；或Weir等,Biochem.Soc.Transactions 30(2002),512。
此外，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可融合至标记序列如肽，以促进其纯化或检测。在具体实施方案中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽(HIS)，如pQE载体(QIAGEN,Inc.,9259Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311)中所提供的标签，其中许多标记序列都可商购获得。如Gentz等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989),821-824中所述，例如，六组氨酸了融合蛋白的简便纯化。适用于纯化的其它肽标签包括但不限于“HA”标签，其对应于来源于流感血球凝集素蛋白的表位(Wilson等,Cell 37(1984),767)；和“flag”标签。
融合蛋白可使用本领域熟知的方法制备；参见例如美国专利号5,116,964和5,225,538。融合发生的精确位点可根据经验选择，以优化融合蛋白的分泌或结合特征。然后，将编码融合蛋白的DNA转染至宿主细胞中用于表达。
本发明的抗体可以非缀合形式使用，或可缀合至多个分子中的至少一个，例如以改进分子的治疗特性、促进靶标检测或患者的成像或治疗。当进行纯化时，可在纯化之前或之后标记或缀合本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。具体地说，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可缀合至治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物学应答调节剂、药剂或PEG。
作为包括常规抗体的免疫毒素的缀合物已在本领域中广泛描述。毒素可通过常规偶联技术偶联至抗体，或含有蛋白毒素部分的免疫毒素可产生为融合蛋白。本发明的抗体可以相应的方式使用，以获得此类免疫毒素。此类免疫毒素的例证是由Byers,SeminarsCell.Biol.2(1991),59-70和Fanger,Immunol.Today 12(1991),51-54所描述的那些。
本领域的技术人员将了解，取决于所选择的待缀合的试剂，缀合物也可使用多种技术组装。例如，含生物素的缀合物例如通过使tau结合多肽与生物素的活化酯如生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯反应来制备。类似地，含荧光标记的缀合物可在偶联剂(例如本文所列的那些偶联剂)的存在下制备，或通过与异硫氰酸酯或荧光素-异硫氰酸酯的反应来制备。本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的缀合物以类似的方式制备。
本发明还涵盖与诊断或治疗剂缀合的本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。抗体可诊断性地使用，以便例如证明神经疾病的存在、指示患上神经疾病的风险、监测神经疾病(即tau蛋白病)的发展或进展作为临床测试程序的一部分以便例如测定给定治疗和/或预防方案的功效。检测可通过将抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物偶联至可检测物质来促进。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、使用各种正电子发射断层摄影术的正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子；关于金属离子参见例如，美国专利号4,741,900，所述离子可缀合至抗体，以用于根据本发明的诊断。适合的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、半乳醣苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合辅基络合物的实例包括链霉抗生素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适合荧光物质的实例包括伞酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光物质的实例包括鲁米诺；生物发光物质的实例包括荧光素酶、荧光素和水母素；并且适合的放射性物质的实例包括125I、131I、111In或99Tc。
抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物也可通过将其偶联至化学发光化合物来可检测地标记。然后，通过检测化学反应过程期间产生的发光的存在来确定化学发光标记抗体的存在。尤其有用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。
其中抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可被检测地标记的一种方式是将其连接至酶并且在酶免疫测定(EIA)中使用连接产物(Voller,A.,"The Enzyme LinkedImmunosorbent Assay(ELISA)"Microbiological Associates Quarterly Publication,Walkersville,Md.,Diagnostic Horizons 2(1978),1-7)；Voller等,J.Clin.Pathol.31(1978),507-520；Butler,Meth.Enzymol.73(1981),482-523；Maggio,E.(编辑),EnzymeImmunoassay,CRC Press,Boca Raton,Fla.,(1980)；Ishikawa,E.等,(编辑),EnzymeImmunoassay,Kgaku Shoin,Tokyo(1981)。结合至抗体的酶将与适当的底物、优选地显色底物反应，以便以这种方式产生可例如通过分光光度法、荧光或通过可视方式检测的化学部分。可用于可检测地标记抗体的酶包括但不限于包括苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。此外，检测可通过比色法实现，其利用了酶的显色底物。检测也可通过底物的酶反应程度与类似制备的标准品的可视比较实现。
检测也可使用任何多种其它免疫测定实现。例如，通过放射性标记抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，有可能通过使用放射性免疫测定(RIA)检测抗体(参见例如，Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Course onRadioligand Assay Techniques,The Endocrine Society,(March,1986))，所述参考文献以引用的方式并入本文)。放射性同位素可通过包括但不限于γ射线计数器、闪烁计数器或放射自显影的方法检测。
抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物也可使用荧光发射金属，如152Eu或其它镧系元素可检测地标记。这些金属可使用如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金属螯合基团连接至抗体。
用于将各种部分缀合至抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的技术是熟知的，参见例如，Arnon等,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy"，于Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等(编辑),第243-56页(Alan R.Liss,Inc.(1985)；Hellstrom等,"Antibodies For Drug Delivery"，于Controlled Drug Delivery(第2版),Robinson等(编辑),Marcel Dekker,Inc.,第623-53页(1987)；Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:AReview"，于Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等(编辑),第475-506页(1985)；"Analysis,Results,And Future ProspectiveOf The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy"，于Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等(编辑),Academic Press第303-16页(1985)；以及Thorpe等,"The Preparation And CytotoxicProperties Of Antibody-Toxin Conjugates",Immunol.Rev.62(1982),119-158。
如上所述，在某些实施方案中，可缀合增强结合分子的稳定性或功效的部分，例如，结合多肽如抗体或其免疫特异性片段。例如，在一个实施方案中，PEG可缀合至本发明的结合分子，以增加它们的体内半衰期。Leong等,Cytokine 16(2001),106；Adv.in DrugDeliv.Rev.54(2002),531；或Weir等,Biochem.Soc.Transactions 30(2002),512。
VI.组合物和使用方法
本发明涉及包含前述tau结合分子，如本发明的抗体或其抗原结合片段或衍生物或其变体或本发明的多核苷酸、载体或细胞的组合物。本发明的组合物还可包含药学上可接受的载体。此外，取决于药物组合物的预期用途，本发明的药物组合物还可包含如白介素或干扰素的药剂。对于用于tau蛋白病例如阿尔茨海默氏病的治疗，另外药剂可选自由有机小分子、抗tau抗体以及其组合组成的组。因此，在具体实施方案中，本发明涉及tau结合分子，例如本发明的抗体或其抗原结合片段或具有其任何一者基本上相同的结合特异性的结合分子、本发明的多核苷酸、载体或细胞用于制备预防性和治疗性治疗tau蛋白病的药物组合物或诊断组合物、监测受试者中tau蛋白病的进展或对tau蛋白病治疗的响应或确定受试者发展tau蛋白病的风险的用途。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗神经病症的方法，所述神经病症特征在于tau分别在大脑和中枢神经系统中的异常积聚和/或沉积，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的前述tau结合分子、抗体、多核苷酸、载体或细胞中的任何一者。术语“神经病症”包括但不限于tau蛋白病，如阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化/帕金森氏病–痴呆复合征、嗜银颗粒性痴呆、英国类型淀粉样血管病、大脑淀粉样血管病、皮质基底节变性、克罗伊茨费尔特-雅各布病、拳击员痴呆、伴有钙化的弥漫性神经原纤维缠结、唐氏综合征、额颞叶痴呆、伴有与染色体17相关的帕金森氏病的额颞叶痴呆、额颞叶变性、格-施-莎三氏病、哈-斯二氏病、包涵体肌炎、多系统萎缩、肌强直性营养不良、C型尼曼-皮克二氏病、具有神经原纤维缠结的非关岛运动神经元病、皮克氏病、大脑炎后帕金森氏病、朊病毒蛋白大脑淀粉样血管病、进行性皮质下神经胶质增生、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全大脑炎、仅缠结型痴呆、多发性梗塞性痴呆以及缺血性中风。除非另外指明，否则术语神经退行性、神经病或神经精神病在本文中可互换使用。
本发明治疗方法的特定优点基于如下事实：本发明的抗体来源于无tau蛋白病症状的健康人受试者的B细胞或B记忆细胞，并且因此在一定可能性上能够预防临床上明显的tau蛋白病，或降低临床上明显的疾病发生的风险，或延迟临床上明显的疾病的发作或进展。通常，本发明的抗体也已经成功经历了体细胞成熟，即针对通过抗体可变区的体细胞变异方式高亲和力结合靶tau分子的选择性和有效性的优化。
从自免疫或过敏性反应的意义上说，此类体内细胞，如人体中的细胞未通过相关的或其它生理蛋白或细胞结构的方式活化的认识也具有重大医学重要性，因为这意味着成功经历临床测试阶段的可能性显著增加。可以说，在至少一个人受试者中，在预防性或治疗性抗体的临床前和临床开发之前已显示出效率、可接受性和耐药性。因此，可以预期本发明的人抗tau抗体，作为治疗剂的靶标结构特异性效率及其副作用可能性的降低，均显著增加了其临床成功可能性。
本发明还分别提供药物和诊断包装或试剂盒，其包括一个或多个填充有一种或多种上述成分的容器，所述成分例如本发明的抗tau抗体、其结合片段、衍生物或变体、多核苷酸、载体或细胞。与所述容器相伴的可为由管制医药或生物产品的制造、使用或销售的政府机构开具的呈一定形式的报告书，所述报告书反映由制造、使用或销售的机构核准供人施用。此外或或者，试剂盒包括用于适当诊断测定中的试剂和/或说明书。当然，本发明的组合物，例如试剂盒尤其适用于tau的存在伴随的病症的风险评定、诊断、预防和治疗，并且具体地适用于阿尔茨海默氏病(AD)、肌萎缩性侧索硬化/帕金森氏病–痴呆复合征(ALS-PDC)、嗜银颗粒性痴呆(AGD)、英国类型淀粉样血管病、大脑淀粉样血管病、皮质基底节变性(CBD)、克罗伊茨费尔特-雅各布病(CJD)、拳击员痴呆、伴有钙化的弥漫性神经原纤维缠结、唐氏综合征、额颞叶痴呆、与染色体17相关的伴有帕金森氏病的额颞叶痴呆(FTDP-17)、额颞叶变性、格-施-莎三氏病、哈-斯二氏病、包涵体肌炎、多系统萎缩、肌强直性营养不良、C型尼曼-皮克二氏病(NP-C)、具有神经原纤维缠结的非关岛运动神经元病、皮克氏病(PiD)、大脑炎后帕金森氏病、朊病毒蛋白大脑淀粉样血管病、进行性皮质下神经胶质增生、进行性核上性麻痹(PSP)、亚急性硬化性全大脑炎、仅缠结型痴呆、多发性梗塞性痴呆以及缺血性中风。
本发明的药物组合物可根据本领域熟知的方法配制；参见例如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy(2000)by the University of Sciences inPhiladelphia,ISBN 0-683-306472。适合药物载体的实例是本领域中熟知的并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂(如油/水乳剂)、各种类型的湿润剂、无菌溶液等。包含此类载体的组合物可通过熟知的常规方法配制。这些药物组合物可以适合的剂量施用至受试者。适合组合物的施用可通过不同的方式实现，例如，通过静脉内、腹膜内、皮下、肌内、鼻内、局部或真皮内施用或脊髓或大脑递送。如经鼻喷雾制剂的气雾剂制剂包括活性剂与防腐剂和等渗剂的纯净水溶液或其它溶液。将此类制剂调节至与鼻粘膜相容的PH和等渗状态。用于经直肠或经阴道施用的制剂可呈现为具有适合载体的栓剂。
此外，鉴于本发明包括在颅骨上钻出小孔以施用本发明的药物的现在标准(虽然幸运的是，不常见)的程序，在一个方面，本发明的结合分子，尤其是抗体或基于抗体的药物可跨过血大脑屏障，从而允许静脉内施用或口服施用。
给药方案将由主治医师和临床因素确定。如在医学领域中众所周知，用于任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者的大小、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况以及目前正在施用的其它药物。通常的剂量可在，例如0.001至1000μg的范围内(或用于在此范围内表达或抑制表达的核酸)；然而，还设想了低于或高于此示例性范围的剂量，尤其考虑了前述因素。通常，剂量可以例如在宿主体重的约0.0001至100mg/kg，并且更通常在0.01至5mg/kg(例如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)的范围内。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1至10mg/kg的范围内或至少1mg/kg。介于以上范围中间的剂量也旨在处于本发明的范围内。受试者可每日、隔日、每周或根据由经验分析确定的任何其它计划表施用此类剂量。示例性治疗需要在长期，例如至少六个月内施用多个剂量。另外的示例性治疗方案需要每两周施用一次或每月一次或每3至6个月一次。示例性剂量计划表包括连续日1至10mg/kg或15mg/kg、隔日30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中，具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体同时施用，在这种情况下每种施用的抗体的剂量处于所指示的范围内。可通过定期评估来监测进展。用于肠胃外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、混悬液以及乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)以及可注射有机酯(如油酸乙酯)。水性载体包括水、酒精/水溶液、乳液或混悬液，包括盐水和缓冲培养基。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏溶液或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏葡萄糖的那些补充剂)等。也可存在防腐剂和其它添加剂，例如像抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，取决于药物组合物的预期用途，本发明的药物组合物还可包含如多巴胺或精神药理学药物的药剂。
此外，在本发明的具体实施方案中，例如如果本发明的药物组合物包含用于被动免疫的抗tau抗体或其结合片段、衍生物或变体，则药物组合物可配制为疫苗。如在发明背景部分中所提及，磷酸化tau种类据报道处于细胞外的血浆和CSF中(Aluise等,Biochim.Biophys.Acta.1782(2008),549–558)，并且在使用磷酸化tau肽进行主动疫苗接种的转基因小鼠品系中的研究揭示，大脑中tau聚集体的水平降低，并且行为障碍的进展减缓(Sigurdsson,J.Alzheimers Dis.15(2008),157-168；Boimel等,Exp Neurol.224(2010),472-485)。因此，期望用本发明的人抗tau抗体和等效tau结合分子被动免疫将帮助避免如已在发明背景部分中讨论的主动免疫治疗概念的多种副作用是明智的。因此，本发明的现有抗tau抗体及其等效物将尤其适用作预防或改善tau蛋白病，如AD、ALS-PDC、AGD、CBD、CJD、FTD、FTDP-17、NP-C、PiD、PSP或前述其它tau蛋白病的疫苗。
在一个实施方案中，使用本发明的抗体的重组双特异性或多特异性构建体可以是有利的。参考文献参见Fischer和Léger,Pathobiology74(2007),3-14。此类双特异性分子可设计为靶向具有一个结合臂和另一个病理实体，如Αβ或α-突触核蛋白的tau或具有第二结合臂的不同病理构象的tau。或者，第二结合臂可设计为靶向存在于血大脑屏障处的蛋白质，以促进抗体渗入大脑。
在一个实施方案中，使用本发明的抗体的重组Fab(rFab)和单链片段(scFv)可以是有利的，它们更容易渗入细胞膜。例如，Robert等,Protein Eng.Des.Sel.(2008)10月16日；S1741-0134(在线提前发表)描述了单克隆抗体WO-2的嵌合重组Fab(rFab)和单链片段(scFv)的使用，其识别Αβ的N-末端区中的表位。工程化的片段能够(i)防止淀粉样蛋白原纤维化，(ii)解聚预成型Αβ1-42原纤维以及(iii)抑制Αβ1-42寡聚物介导的体外神经毒性，其效率与完整IgG分子相同。使用缺乏效应子功能的小Fab和scFv工程化抗体形式的感知优势包括更有效地跨过血大脑屏障，并且使触发炎性副反应的风险最小化。此外，除scFv和单结构域抗体保留全长抗体的结合特异性之外，它们也可以单基因表达，并且在哺乳动物细胞内以胞内抗体表达，具有用于改变其靶标的折叠、相互作用、修饰或亚细胞定位的潜力；综述参见例如，Miller和Messer,Molecular Therapy 12(2005),394–401。
在不同的方法中，Muller等，Expert Opin.Biol.Ther.(2005),237-241描述了所谓的“超级抗体技术”平台，其据说能够使抗体穿梭至活细胞而不伤害它们。此类细胞穿透抗体开辟了新的诊断和治疗窗口。术语“TransMabs”即为这些抗体而创造的。
在另一实施方案中，用于治疗tau蛋白病的其它抗体的共施用或连续施用可为期望的。在一个实施方案中，另外抗体包含在本发明的药物组合物中。可用于治疗受试者的抗体的实例包括但不限于靶向β-淀粉样蛋白、α-突触核蛋白、TDP-43和SOD-1的抗体。
在另一实施方案中，用于治疗tau蛋白病的其它神经保护剂的共施用或连续施用可为期望的。在一个实施方案中，另外药剂包含在本发明的药物组合物中。可用于治疗受试者的神经保护剂的实例包括但不限于乙酰胆碱酯酶抑制剂、谷氨酸能受体拮抗剂、激酶抑制剂、HDAC抑制剂、抗炎剂、双丙戊酸钠或其任何组合。可伴随着本发明的药物组合物使用的其它神经保护剂的实例在本领域中描述；参见例如，国际申请WO2007/011907。在一个实施方案中，另外药剂是多巴胺或多巴胺受体激动剂。
治疗有效剂量或量是指足以改善症状或病状的活性成分的量。此类化合物的治疗功效和毒性可通过细胞培养或实验动物中的标准制药程序测定，例如，ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)和LD50(50％群体的致死剂量)。治疗作用和毒性作用之间的剂量比是治疗指数，并且可以比率LD50/ED50表示。在一个实施方案中，在AD、ALS-PDC、AGD、CBD、CJD、FTD、FTDP-17、NP-C、PiD、PSP或上述其它tau蛋白病的情况下，组合物中的治疗剂以足以恢复或保持正常行为和/或认知特性的量存在。
从前面可以看出，本发明明显涵盖包含上述抗体的至少一个CDR的tau结合分子的任何用途，具体地说用于诊断和/或治疗上述tau蛋白病，尤其是阿尔茨海默氏病。在一个实施方案中，所述结合分子是本发明的抗体或其免疫球蛋白链。此外，本发明涉及上文所述抗体中任何一者的抗独特型抗体。这些抗体是结合位于抗原结合位点附近的抗体的可变区上的独特抗原肽序列的抗体或其它结合分子，并且适用于例如受试者样品中抗tau抗体的检测。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明的上述tau结合分子、抗体、抗原结合片段、多核苷酸、载体或细胞中的任何一者的诊断组合物，以及任选地适合的检测方法，如常规用于免疫或基于核酸的诊断方法的试剂。本发明的抗体例如适用于免疫测定，其中它们可用于液相或结合至固相载体。可利用本发明抗体的免疫测定的实例是呈直接或间接形式的竞争性和非竞争性免疫测定。所述免疫测定的实例是放射免疫测定(RIA)、夹心式免疫测定(免疫计量测定)、流动式细胞测量术和蛋白质印迹测定。本发明的抗原和抗体可结合至多种不同的载体，并且用于分离与其特异性结合的细胞。熟知载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。出于本发明的目的，载体的性质可以是可溶性的或不溶性的。存在为本领域普通技术人员所知的许多不同的标记和标记方法。可用于本发明的标记类型的实例包括酶、放射性同位素、胶态金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物；也可参见上文讨论的实施方案。
通过另外的实施方案，tau结合分子、具体地说本发明的抗体也可用于个体中病症的诊断方法，所述方法通过如下步骤进行：获得来自测试个体的体液样品，所述样品可以是血液样品、淋巴样品或任何其它体液样品；并且在能够形成抗体-抗原复合物的条件下使所述体液样品接触本发明的抗体。然后通过本领域中已知的方法确定此类复合物的水平，水平显著高于对照样品中形成的水平指示所测试的个体中的疾病。以同样的方式，也可使用由本发明的抗体结合的特异性抗原。因此，本发明涉及包括结合分子，如本发明的抗体或其抗原结合片段的体外免疫测定。
在此方面，本发明还涉及为此目的而特别设计的方法。例如，可使用基于抗体的阵列，所述阵列例如负载有特异性识别tau的本发明的抗体或等效抗原结合分子。微阵列免疫测定的设计被概述在Kusnezow等,Mol.Cell Proteomics 5(2006),1681-1696中。因此，本发明还涉及负载有根据本发明鉴别的tau结合分子的微阵列。
在一个实施方案中，本发明涉及一种诊断受试者中的tau蛋白病的方法，所述方法包括确定来自受试者的样品中tau和/或病理性修饰的和/或聚集的tau的存在，所述受试者待用本发明的至少一种抗体、其tau结合片段或与其任何一者具有基本上相同的结合特异性的tau结合分子诊断，其中病理性修饰的和/或聚集的tau的存在指示神经退行性tau蛋白病，并且与生理tau形式的水平相比，病理性修饰的和/或聚集的tau的水平增加指示所述受试者中神经退行性tau蛋白病的进展。
待诊断受试者的疾病可以是无症状的或临床前的。在一个实施方案中，对照受试者患有tau蛋白病，例如AD、ALS-PDC、AGD、CBD、CJD、FTD、FTDP-17、NP-C、PiD、PSP或前述其它tau蛋白病，其中病理性修饰的和/或聚集的tau的水平与参考标准品之间的相似性指示待诊断的受试者患有tau蛋白病。或者或除此之外，作为第二对照，对照受试者不患有tau蛋白病，其中tau和/或病理性修饰的和/或聚集的tau的水平与参考标准品之间的差异指示待诊断的受试者患有tau蛋白病。在一个实施方案中，待诊断的受试者和对照受试者的年龄匹配。待分析的样品可以是任何被怀疑包含病理性修饰的和/或聚集的tau的体液，例如血液、CSF或尿液样品。
Tau和/或病理性修饰的和/或聚集的tau的水平可通过本领域中已知的任何适合方法评定，所述方法包括例如通过一种或多种选自以下的技术分析tau蛋白质印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、荧光活化细胞分选仪分析(FACS)、双向凝胶电泳、质谱分析(MS)、基质辅助激光解吸/电离-飞行时间-MS(MALD1-T0F)、表面增强的激光解吸电离-飞行时间(SELD1-T0F)、高效液相色谱(HPLC)、快速蛋白液相色谱(FPLC)、多维液相色谱(LC)然后串联质谱(MS/MS)以及激光密度测定法。在一个实施方案中，所述tau的体内成像包括正电子发射断层摄影(PET)、单光子发射断层摄影(SPECT)、近红外(NIR)光学成像或磁共振成像(MRI)。
可根据本发明修改的使用抗体诊断tau蛋白病如阿尔茨海默氏病、监测tau蛋白病进展并且监测tau蛋白病治疗的方法和相关方法描述于国际申请WO93/08302、WO94/13795、WO95/17429、WO96/04309、WO2002/062851和WO2004/016655中。类似地，基于抗体的tau检测方法描述于国际申请WO2005/080986中，所述申请的公开内容以引用的方式整体并入本文。那些方法可如所描述，但与本发明的tau特异性抗体、结合片段、衍生物或变体一起应用。
在另一方面，本发明还涉及具有由本发明任何抗体特异性识别的tau表位的肽。在一个实施方案中，此类肽包含以下，或由以下组成或主要由以下组成：选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6残基125-131、397-441、226-244、217-227、37-55、387-406、421-427、427-439、1-158、197-207、57-67、355-441、313-319、309-319、221-231及其任何组合以及其修饰的序列，其中一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个氨基酸被取代、缺失和/或添加的，其中所述肽由本发明的任何抗体识别。
在本发明的一个实施方案中，所述肽可用于诊断受试者的神经退行性tau蛋白病，所述诊断包括如下步骤：确定结合所述受试者的生物样品中的肽的抗体的存在，用于通过测量识别本发明的上述肽的抗体水平来诊断所述受试者中的tau蛋白病，以及比较测量值与存在于可比年龄和性别的健康受试者中的水平。对本发明的所述肽具有特异性的测量抗体的水平升高将指示诊断所述受试者中的tau蛋白病。本发明的肽可分别配制于阵列、试剂盒和组合物中，如上文所述。
本发明的说明书和实施例中公开和涵盖了这些和其它实施方案。关于根据本发明采用的材料、方法、用途和化合物中的任何一者的其它文献可从公用图书馆和数据库，使用例如电子设备检索。例如，可利用公用数据库"Medline"，所述数据库由位于美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)的国家生物技术信息中心(NationalCenterfor Biotechnology Information)和/或国家医学图书馆(National LibraryofMedicine)主办。其它数据库和网址是本领域技术人员已知的，也可使用互联网搜索引擎获得，如作为欧洲分子生物学实验室(European Molecular Biology Laboratory)(EMBL)一部分的欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute)(EBI)。生物技术的专利信息的概述以及用于回溯检索和最新情报通报的专利信息的相关资源概况在Berks,TIBTECH 12(1994),352-364中给出。
上述公开内容总体上描述了本发明。除非另外指明，本文所用的术语以OxfordDictionary of Biochemistry and Molecular Biology,Oxford University Press,1997，2000年修订并且2003年再版，ISBN 0 19 850673 2中提供的定义给出。本说明书的正文中引用了多个文献。全部文献引文可见于说明书的末尾，紧接着权利要求之前。所有引用的参考文献的内容(包括本申请通篇引用的参考文献、授权专利、公布专利申请以及制造商说明书、说明等)据此明确地以引用的方式并入；然而，并非承认任何引用的文档均实际上是关于本发明的现有技术。
可通过参考以下具体实施例获得更完整的理解，本文提供的实施例仅出于说明目的，并且不旨在限制本发明的范围。
实施例
以下的实施例进一步说明本发明，但不应以任何方式解释为限制本发明的范围。以下实施例中的实验是关于如所克隆的抗体NI-105.4E4、NI-105.24B2和NI-105.4A3进行说明和描述，即在未调整至人可变重链和轻链的种系(GL)序列情况下的框架1(FR1)Ig-可变区；参见图1。
材料和方法
常规方法(如本文采用的那些)的详述可以在所引用的参考文献中找到；还参见Beers和Berkow编辑的"The Merck Manual of Diagnosis and Therapy"第17版(Merck&Co.,Inc.2003)和美国专利申请公布号2012/0087861，其内容以引用的方式整体并入本文。
本发明的实践将采用(除非另外指出)细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA以及免疫学的常规技术，所述技术处于本领域的技能之内。对于适用于实践本发明的通用技术的进一步详细描述，执业医师可参考细胞生物学和组织培养的标准教科书和综述；还参见在实施例中引用的参考文献。分子与细胞生物化学的一般方法可以在此类标准教科书中找到，如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版(Sambrook等,Harbor Laboratory Press 2001)；Short Protocols in MolecularBiology,第4版(Ausubel等编辑,John Wiley&Sons 1999)；DNA Cloning,第I和II卷(Glover编辑,1985)；Oligonucleotide Synthesis(Gait编辑,1984)；Nucleic AcidHybridization(Hames和Higgins编辑1984)；Transcription And Translation(Hames和Higgins编辑1984)；Culture Of Animal Cells(Freshney和Alan,Liss,Inc.,1987)；GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells(Miller和Calos,编辑)；Current Protocols inMolecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology,第3版(Ausubel等,编辑)；以及Recombinant DNA Methodology(Wu,编辑,Academic Press)。Gene TransferVectors For Mammalian Cells(Miller和Calos,编辑,1987,Cold Spring HarborLaboratory)；Methods In Enzymology,第154和155卷(Wu等,编辑)；Immobilized CellsAnd Enzymes(IRL Press,1986)；Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker,编辑,Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,第I-IV卷(Weir和Blackwell,编辑,1986)。Protein Methods(Bollag等,John Wiley&Sons 1996)；Non-viral Vectors for Gene Therapy(Wagner等编辑,Academic Press 1999)；ViralVectors (Kaplitt和Loewy编辑,Academic Press 1995)；Immunology Methods Manual(Lefkovits编辑,Academic Press 1997)；以及Cell and Tissue Culture:LaboratoryProcedures in Biotechnology(Doyle&Griffiths,John Wiley&Sons 1998)。用于本公开中提及的遗传操作的试剂、克隆载体和试剂盒可购自商业销售商如BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich和ClonTech。细胞培养和培养基收集的通用技术在以下中概述：Large Scale Mammalian Cell Culture(Hu等,Curr.Opin.Biotechnol.8(1997),148)；Serum-free Media(Kitano,Biotechnology 17(1991),73)；Large Scale Mammalian CellCulture(Curr.Opin.Biotechnol.2(1991),375)；以及Suspension Culture of MammalianCells(Birch等,Bioprocess Technol.19(1990),251)；Extracting information fromcDNA arrays,Herzel等,CHAOS 11(2001),98-107。
鉴别tau特异性B细胞和克隆对应抗体的方法
除非以下另外指出，否则已经或可以如在公布为WO2008/081008的国际申请PCT/EP2008/000053的实施例和补充方法部分中所描述进行tau特异性B细胞的鉴定和展现出目标特异性以及其重组表达和功能特征的抗tau抗体的分子克隆，所述国际申请的公开内容以引用的方式整体并入本文。还参见美国专利申请公布号2012/0087861，所述专利申请的内容以引用的方式整体并入本文。在本申请中提供用于tau特异性B细胞的鉴别和展现出目标特异性以及其重组表达和功能特征的tau抗体的分子克隆的一种新颖方法。如上所述，在本发明的一个实施方案中，将单个或寡克隆B细胞的培养物进行培养，并且将含有由所述B细胞产生的抗体的培养物上清液针对其中的新抗tau抗体的存在和亲和力进行筛选。筛选方法包括以下步骤：灵敏组织淀粉样蛋白斑块免疫反应性(TAPIR)测定，如描述于国际申请WO2004/095031中，其公开内容以引用的方式并入本文，并且在图3中示出；对大脑提取物针对结合PHFTau进行筛选，如描述于实施例2中；针对源自由SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列的tau的肽的结合进行筛选，其中在所述序列的氨基酸Ser-202和Thr-205上、氨基酸Thr-231上和/或氨基酸Ser-396和Ser-404上具有磷酸基团，如在实施例3中类似地描述，其中由于针对抗体NI-105.4E4的表位确认实验而使用非磷酸化肽；针对由SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列的全长tau的结合进行筛选，并且分离检测到结合的抗体或产生所述抗体的细胞，如在国际专利WO2008/081008中所描述和如在实施例1中所描述。
抗原的纯化
重组人Tau40购自rPeptide(Bogart,GA,USA)。PHFTau是从AD大脑提取的。
按照Goedert等的方法(Goedert等,Neuron 8(1992),159-168)在修改情况下进行含有病理性磷酸化的tau纤丝的成对螺旋纤丝(PHFTau)的分离。将1克AD大脑组织切成5mm片，除去所有可见血管。将组织用40ml冰冷洗涤溶液(100mM Tris pH 7.4、6mM EGTA、1mMNa3VO4和1mM NaF)洗涤三次，接着用20ml溶解缓冲液(10mM Tris pH 7.4、0.8M NaCl、1mMEGTA、1x蛋白酶抑制剂混合物、1mM Na3VO4、1mM NaF、1mM AEBSF、10％蔗糖)匀化。将匀浆在4℃下在20’000xg下离心20分钟。通过添加N-月桂酰基肌氨酸盐(Sigma,Switzerland)至1％(w/v)收集上清液。在37℃下在振荡下孵育两小时之后，然后将上清液在4℃下在100’000xg下离心一小时。收集沉淀并且再悬浮于PBS中。在用蛋白质A磁珠清除可能污染的免疫球蛋白之后，将PHFTau悬浮液在使用之前在-80℃下储存。相应地制备来自健康对照人大脑组织的对照提取物。
人tau抗体筛选
ELISA：
在4℃下将96孔半区域微板(Corning)以于碳酸盐ELISA涂覆缓冲液(pH 9.6)中1μg/ml的标准浓度用重组Tau蛋白(rPeptide,Bogart,USA)涂覆过夜。对于PHFTau扫描，在4℃下将96孔Immobilizer微板(Nunc,Denmark)以于碳酸盐ELISA涂覆缓冲液(pH 9.6)中的1:100稀释液用从人AD大脑提取的PHFTau涂覆过夜。将板在PBS-T pH 7.6中洗涤并且将非特异性结合位点用含有2％BSA(Sigma,Buchs,Switzerland)的PBS-T在室温下封闭2小时。将B细胞条件培养基从记忆B细胞培养板转移至ELISA板并且在室温下孵育一小时。将ELISA板在PBS-T中洗涤并且然后与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的驴抗人IgG(Fcγ片段特异性)多克隆抗体(Jackson ImmunoResearch,Newmarket,UK)一起孵育。在用PBS-T洗涤之后，通过在标准比色测定中测量HRP活性来测定人抗体的结合。
多阵列 微板筛选
将标准96孔10-点MULTI-SPOT板(Meso Scale Discovery,USA)用30μg/ml rTau(rPeptide)、PHFTau大脑提取物和PBS中的健康对照大脑提取物涂覆。将非特异性结合位点用含有3％BSA的PBS-T在室温下封闭1小时，接着与B细胞条件培养基一起在室温下孵育1小时。将板在PBS-T中洗涤并且然后与SULFO-标签缀合的抗人多克隆抗体(Meso ScaleDiscovery,USA)一起孵育。在用PBS-T洗涤之后，使用SECTOR成像仪6000(Meso ScaleDiscovery,USA)通过电化学发光测量来检测抗体的结合。
tau抗体的分子克隆
含有记忆B细胞的样品获自健康人受试者。收获选定记忆B细胞培养物的存活B细胞并且制备mRNA。然后使用巢式PCR方法获得免疫球蛋白重链和轻链序列。
代表人免疫球蛋白种系谱系的所有序列家族的引物的组合用于扩增前导肽、V-区段和J-区段。在5’-端使用前导肽特异性引物并且在3’-端使用恒定区特异性引物进行第一轮扩增(Smith等,Nat Protoc.4(2009),372-384)。对于重链和κ轻链，在5’-端使用V-区段特异性引物并且在3’-端使用J-区段特异性引物进行第二轮扩增。对于λ轻链，在5’-端使用V-区段特异性引物并且在3’-端使用C-区特异性引物进行第二轮扩增(Marks等,Mol.Biol.222(1991),581-597；de Haard等,J.Biol.Chem.26(1999),18218-18230)。
在完全抗体的重组表达之后通过ELISA再筛选进行具有所需特异性的抗体克隆的鉴别。在将“正确阅读框”中的可变重链和轻链序列插入至表达载体中之后实现完全人IgG1抗体或嵌合IgG2a抗体的重组表达，所述表达载体使所述可变区序列在5’-端与编码前导肽的序列互补并且在3’-端与编码适当恒定结构域的序列互补。为此，所述引物含有被设计成有助于可变重链和轻链序列克隆至抗体表达载体中的限制性位点。通过将免疫球蛋白重链RT-PCR产物框内插入至携带信号肽和人免疫球蛋白γ1或小鼠免疫球蛋白γ2a的恒定结构域的重链表达载体中来表达重链免疫球蛋白。通过将κ轻链RT-PCR产物框内插入至提供信号肽和人κ轻链免疫球蛋白的恒定结构域的轻链表达载体中来表达κ轻链免疫球蛋白。通过将λ轻链RT-PCR产物框内插入至提供信号肽和人或小鼠λ轻链免疫球蛋白的恒定结构域的λ轻链表达载体中来表达λ轻链免疫球蛋白。
当共转染至Ig重链表达载体和κ或λIg轻链表达载体的HEK293或CHO细胞(或人或小鼠来源的任何其它适当的受体细胞系)中时获得功能重组的单克隆抗体。随后使用标准蛋白质A柱纯化从条件培养基纯化重组人单克隆抗体。可使用瞬时地或稳定地转染的细胞产生不限数量的重组人单克隆抗体。可通过直接使用Ig表达载体或通过将Ig可变区再克隆至不同表达载体中来建立产生重组人单克隆抗体的细胞系。衍生物如F(ab)、F(ab)2和scFv也可从这些Ig可变区产生。
抗体
根据制造商的方案使用小鼠单克隆抗人tau抗体Tau12(Covance,California,U.S.A.)和小鼠单克隆tau抗体AT180(Thermo Scientific,U.S.A.)。重组人tau抗体NI-105.4E4、NI-105.24B2和NI-105.4A3描述于美国专利申请公布号2012/0087861中，所述专利申请的内容以引用的方式整体并入本文。重组人tau抗体NI-105.17C1、NI-105.17C1(N31Q)、NI-105.6C5、NI-105.29G10、NI-105.6L9、NI-105.40E8、NI-105.48E5、NI-105.6E3、NI-105.22E1、NI-105.26B12、NI-105.12E12、NI-105.60E7、NI-105.14E2、NI-105.39E2、NI-105.19C6和NI-105.9C4是本发明的抗体。它们在HEK293或CHO细胞中表达，从条件培养基纯化并且除非另外指明否则直接用于随后应用中。
直接ELISA
在4℃下将96孔微板(Costar,Corning,USA)用于碳酸盐ELISA涂覆缓冲液(50mM,pH9.6)中稀释至1μg/ml浓度的重组Tau蛋白(hTau40,rPeptide,Bogart,USA)涂覆过夜。将非特异性结合位点用含有2％BSA(Sigma,Buchs,Switzerland)和0.5％Tween 20的PBS在室温下封闭2小时。使用HRP缀合的山羊抗人IgG Fcγ(Jackson immunoResearch,Newmarket,UK)测定本发明的人抗体的结合，接着在标准比色测定中测量HRP活性。使用GraphPadPrism软件(San Diego,USA)通过非线性回归估计EC50值。
蛋白质印迹蛋白质染色
将PHFTau和重组hTau40通过梯度SDS-PAGE(NuPAGE 4-12％；Invitrogen,Basel,Switzerland)，接着在硝酸纤维素膜上电印迹来解析。在室温下用2％BSA封闭非特异性结合位点一小时之后，将印迹与第一人抗tau抗体或Tau12(小鼠单克隆抗体，Covance,California,U.S.A.)一起孵育过夜，接着与HRP-缀合的山羊抗人IgGFcγ(对于人第一抗体)或HRP-缀合的山羊抗小鼠IgG第二抗体一起孵育。
将印迹使用ECL和ImageQuant 350检测(GE Healthcare,Otelfingen,Switzerland)显色。
来自AD大脑的PHFTau提取物
按照Goedert等的方法(Goedert等,Neuron 8(1992),159-168)在修改情况下进行含有病理性磷酸化的tau纤丝的成对螺旋纤丝(PHFTau)的分离。将1克AD大脑组织切成5mm片，除去所有可见血管。将组织用40ml冰冷洗涤溶液(100mM Tris pH 7.4、6mM EGTA、1mMNa3VO4和1mM NaF)洗涤三次，接着用20ml溶解缓冲液(10mM Tris pH 7.4、0.8M NaCl、1mMEGTA、1x蛋白酶抑制剂混合物、1mM Na3VO4、1mM NaF、1mM AEBSF、10％蔗糖)匀化。将匀浆在4℃下在20’000xg下离心20分钟。通过添加N-月桂酰基肌氨酸盐(Sigma,Switzerland)至1％(w/v)收集上清液。在37℃下在振荡下孵育两小时之后，然后将上清液在4℃下在100’000xg下离心一小时。收集沉淀并且再悬浮于PBS中。在用蛋白质A磁珠清除可能污染的免疫球蛋白之后，将PHFTau悬浮液在使用之前在-80℃下储存。相应地制备来自健康对照人大脑组织的对照提取物。
Tau肽合成
通过Schafer-N(Copenhagen,Denmark)合成包含通过Pepspot标绘鉴别的NI-105.4E4的表位(氨基酸337-343)的对应于hTau40的氨基酸333-346的肽(333GGGQVEVKSEKLDF346)。将另外半胱氨酸添加至C末端以允许共价结合Immobilizer微板(Nunc,Denmark)。相应地合成对应于人tau的氨基酸226-239(226VAVVRpTPPKSPSSA239)(可商购的小鼠单克隆tau抗体AT180(Thermo Scientific,USA)的同源表位)的第二肽并且用作对照。
转基因小鼠
针对tau蛋白病的三种不同的动物模型用于验证本发明的tau抗体(以及其具有结合特异性的分子)。
1.转基因TauP301L小鼠(系183)：在鼠Thy1.2启动子下表达具有P301L突变的人Tau40(这些转基因动物的产生描述于等,J.Biol.Chem.276(2001),529-534和国际申请WO 2003/017918中，其公开内容以引用的方式并入本文)
2.在鼠PrP启动子下表达具有P301L突变的最短4R人tau同种型的JNPL3小鼠(可从Taconic,Hudson,NY,U.S.A获得)。
3.在鼠PrP启动子下表达具有P301S突变的人tau的P301STau(系PS19)小鼠(可从Jackson Laboratory,Bar Harbor,Maine,U.S.A获得)。
在具有自由获得食物和水的反转12h:12h光照/黑暗循环的标准居住条件下保持tau蛋白病小鼠模型和相应的野生型小鼠。均衡治疗组的年龄和性别。
实施例1
人tau抗体的靶标和结合特异性的验证
为了验证tau作为分离抗体的识别靶标，如上所述进行直接ELISA测定。对于示例性重组人NI-105.4A3抗体，将96孔微板(Costar,Corning,USA)用稀释至3μg/ml浓度的重组人Tau(hTau40,rPeptide,Bogart,USA)或用于碳酸盐ELISA涂覆缓冲液(pH 9.6)中的BSA涂覆并且测试抗体的结合有效性。通过ELISA示例性NI-105.4A3抗体特异性地结合人tau。对于BSA未观察到结合。
对于示例性抗体NI-105.4E4和NI-105.24B2的半数最大有效浓度(EC50)的测定，在不同抗体浓度的情况下进行另外的直接ELISA实验。将96孔微板(Costar,Corning,USA)用于碳酸盐ELISA涂覆缓冲液中稀释至1μg/ml(对于使用NI-105.4E4抗体的测定)或3μg/ml(对于使用NI-105.24B2抗体的测定)浓度的重组人tau(hTau40,rPeptide,Bogart,USA)涂覆并且测试抗体的结合有效性。使用GraphPad Prism软件通过非线性回归估计EC50值。重组人源性抗体NI-105.4E4在2.4nM EC50下在低纳摩尔范围中以高亲和力结合hTau40。NI-105.24B2在6.6nM EC50下在低纳摩尔范围中以高亲和力结合hTau40。
还使用直接ELISA实验测定示例性抗体NI-105.4A3的半数最大有效浓度(EC50)。将ELISA板用重组人tau(hTau40,1ug/ml)、PHFTau(1:100)和对照制剂(1:100)涂覆，并且在不同抗体浓度的情况下进行孵育。NI-105.4A3在1.4nM EC50下在低纳摩尔范围中以高亲和力结合rTau。NI-105.4A3在1.2nM EC50下在低纳摩尔范围中以高亲和力结合PHFTau。
实施例2
重组tau与从AD大脑提取的病理性tau的重组人抗体结合分析
为了确定NI-105.4E4和NI-105.24B2与从AD大脑提取的病理性tau种类的结合能力，如上文所详细描述进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。将印迹与第一抗体NI-105.4E4(人)、NI-105.24B2(人)或Tau12(小鼠单克隆抗体，Covance,California,U.S.A.)一起孵育过夜，接着与HRP缀合的山羊抗人IgGFcγ(对于人抗体)或HRP缀合的山羊抗小鼠IgG第二抗体一起孵育。
在蛋白质印迹上，重组抗体NI-105.4E4和NI-105.24B2识别hTau40以及从AD大脑提取的病理性修饰的PHFTau。对照抗体Tau12也识别两种tau种类。
另外，如以上实施例1中所论述，使用PHFTau在直接ELISA实验中测定示例性抗体NI-105.4A3的半数最大有效浓度(EC50)。NI-105.4A3在1.2nM EC50下在低纳摩尔范围中以高亲和力结合PHFTau。
实施例3
hTau40上NI-105.4E4和NI-105.4A3结合表位的标绘
将覆盖全长hTau40(氨基酸1-441)、在两个相邻肽之间具有11个氨基酸重叠的118个肽序列的肽阵列点样在硝酸纤维素膜(JPTPeptide Technologies GmbH,Berlin,Germany)上。根据制造商的说明书进行抗体的免疫标记以及膜再生。为了排除检测抗体的非特异性结合，将膜首先用HRP缀合的山羊抗人IgG探测，省略第一抗体。在再生之后，将膜用100nM重组NI-105.4E4抗体探测。使用ECL和ImageQuant 350检测仪(GE Healthcare,Otelfingen,Switzerland)检测结合的抗体。
当仅与检测抗体相比较时，两组相邻的肽点(肽83、84和85；肽96和97)由NI105.4E4特异性地鉴别。由这两组肽覆盖的序列对应于hTau40的氨基酸329-351和387-397。这些数据表明NI-105.4E4识别包含两个线性序列的不连续表位：一个在R4微管结合结构域内并且另一个在C-末端结构域中。
由肽83-85共享的序列包含hTau40的氨基酸残基337-343。Pepspot(JPT)数据表明NI-105.4E4识别包含人tau的氨基酸337-343的hTau中的表位。此区域位于tau的微管结合结构域内并且在所有神经元人tau同种型以及其它物种(包括小鼠和大鼠)中是保守性的。
随着此结构域以生理微管相关tau结合微管，NI-105.4E4预期优先靶向从微管分离的tau的病理相关库。
为了确定NI-105.4E4结合肽内的关键残基，进行丙氨酸扫描，以使每个残基被丙氨酸每一次一个地取代。原始序列中的丙氨酸残基(A384和A390)被取代为脯氨酸和甘氨酸。点35-50和51-68是原始肽(点35和点51)以及其丙氨酸取代的变体。丙氨酸扫描表明V339、E342、D387、E391和K395对于NI-105.4E4结合是必要的。
已经通过测试NI-105.4E4与tau肽的结合进行了另外实验。直接ELISA显示，NI-105.4E4特异性地识别对应于hTau40的氨基酸333-346的多肽，所述多肽包含通过Pepspot标绘鉴别的氨基酸残基337-343。未观察到N1-105.4E4与覆盖AT180表位的对照肽的交叉反应性。反之亦然，AT180识别其包含肽的同源表位，但不能结合N1-105.4E4特异性肽。物种特异性第二抗体不结合任何肽。同时，涂覆肽的直接ELISA确认，N1-105.4E4特异性识别包含通过Pepspot标绘鉴别的人tau的氨基酸残基337-343的肽。
为了大致标绘hTau40上的N1-105.4A3结合表位，产生了四种tau结构域多肽(Tau结构域I、结构域II、结构域III和结构域IV)。将使用(Invitrogen)合成的、编码每个具有N-末端6xHis标签的Tau结构域的DNA片段克隆至pRSET-A表达载体(Invitrogen)中，转染至大肠杆菌BL21(DE3)(New England Biolabs)中。His标记的Tau结构域的表达通过0.5mM IPTG诱导六小时，然后用溶菌酶和超声处理溶解细菌。在用Ni-NTA Superflow柱(Qiagen)进一步纯化前煮沸溶解物五分钟。将洗脱的His标记的Tau结构域涂覆在ELISA板上，或负载于聚丙烯酰胺凝胶上以用于蛋白质印迹。这些序列重叠的tau结构域多肽覆盖hTau40的全长。将纯化的tau结构域涂覆在ELISA板上，并且测试NI-105.4A3的结合。NI-105.4A3仅结合tau结构域I和全长hTau40，从而指示表位在hTau40的N-末端部分(aa1-136)内。蛋白质印迹确认了NI-105.4A3与tau结构域I的特异性结合。用PepSpot(JPT)技术进行的NI-105.4A3表位标绘鉴别了人Tau40的氨基酸Q35-Q49。为了确定用于NI-105.4A3结合的表位内的关键残基，进行丙氨酸扫描以使每个残基被丙氨酸每次一个地取代。原始序列(A41)中的丙氨酸残基被甘氨酸或脯氨酸取代。丙氨酸扫描显示，D40、A41和K44是NI-105.4A3结合的关键残基。
实施例4
AD大脑组织和人tau转基因小鼠中NI-105.4E4与tau的生理形式以及病理性聚集体结合的评定
由过度磷酸化tau纤丝组成的神经原纤维缠结(NFT)是AD的神经病理学标志。过度磷酸化tau纤丝也是营养不良性神经突和神经原纤维网线的主要组分，它们二者是AD中的普遍神经病理特征。含有小鼠中家族P301L tau突变的人tau的过量表达诱导了六个月龄时的NFT形成(Gotz等,2001a)。
为了评定重组人tau抗体与tau的生理形式以及病理性聚集体的结合，在AD大脑组织和TauP301L转基因小鼠中用本发明的示例性NI-105.4E4抗体进行免疫组织染色。
在室温下在深麻醉下给小鼠灌注20ml 100mM TrisCl/6mM EGTA(pH7.4)。取出大脑，并且浸入PBS中的4％PFA(pH 7.4)中，在4℃下固定过夜，然后包埋于石蜡中。对于人组织，使用来自AD和健康对照受试者大脑组织的石蜡块。按照标准方案进行DAB染色。作为阳性对照，使用小鼠单克隆抗体Tau-12(Covance,California,U.S.A.)。还包括不含第一抗体的HRP缀合的检测抗体。
重组人抗体NI-105.4E4鉴别AD大脑中的多种NFT和神经原纤维网线(图2A)，它们在健康对照大脑中不存在(图2B)。单独第二抗体不会给出AD(图2C)和对照大脑(图2D)二者中的信号。在P301L tau转基因小鼠大脑中，NI-105.4E4强烈结合类似于NFT的病理性tau(图2E、2F和2H)、神经原纤维网线(图2E和2G)以及营养不良性神经突(图2E和2H)。此外，NI-105.4E4在预缠结阶段还鉴别tau聚集体(图2I)。在过量表达人P301L tau和含瑞典和北极突变的人APP二者的转基因小鼠的大脑中，NI-105.4E4特异性地结合β-淀粉样蛋白斑块周围的营养不良性神经突(图2J)。
实施例5
本发明抗体的体内测试
如上文已经描述，在使用磷酸化tau肽进行主动疫苗接种的转基因小鼠品系中的研究揭示，大脑中tau聚集体的大脑水平降低和行为障碍的进展减缓(Sigurdsson,J.Alzheimers.Dis.15(2008),157-168；Boimel等,Exp.Neurol.224(2010),472-485)。然而，主动疫苗接种不是特用于人的，因为预期大部分老年群体是疫苗接种的非应答者。此外，与tau引导的免疫应答相关的潜在副作用可能难以控制。由于其对病理性tau种类的类似结合特异性，可合理预期本发明的tau结合分子实现tau聚集体的大脑水平的类似下降，如上文针对小鼠抗体所描述。然而，由于人免疫系统内的进化优化和亲和力成熟，本发明的抗体提供了有价值的治疗工具，因为它们从具有优异安全特征和缺乏免疫原性的高度可能性的健康人受试者分离。这些预期治疗作用的确认可由如在上述使用小鼠抗体的实验中所描述的测试方法提供。具体地说，待筛选的抗体可通过多种可能的途径施用至动物，如腹膜内抗体注射、颅内注射、心室内大脑灌注，并且测试治疗作用。上述施用可能性中的任一者也可在β淀粉样蛋白制剂前大脑注射至tau转基因小鼠的大脑之后用于评估对β淀粉样蛋白诱导的tau蛋白病的治疗作用。
治疗作用的评估可通过组织化学方法进行，其包括Gallyas阳性细胞计数的定量、总人tau染色、磷酸化tau的大脑载荷量和/或大脑可溶性和不溶性tau的生物化学测定、以及连续大脑提取时的磷酸化tau水平。此外，可进行治疗小鼠的行为测试，例如，条件性味觉厌恶或情境性恐惧条件反射，以用于确认本发明抗体的治疗作用(Pennanen,Genes BrainBehav.5(2006),369-79,Pennanen Neurobiol Dis.15(2004),500-9.)。
实施例6
具有小鼠IgG2a恒定结构域的抗体NI-105.4E4和NI-105.4A3的嵌合
为了产生用于慢性治疗研究的免疫原性降低的抗体，使用重组DNA技术产生抗体NI-105.4E4和NI-105.4A3的小鼠嵌合型式。选择小鼠IgG2a/λ同种型用于这些嵌合抗体，以便产生以高亲和力结合至小鼠Fc-γ受体的分子，并且因此所述同种型能够诱导免疫效应子应答。嵌合NI-105.4E4(“ch4E4”)和嵌合NI-105.4A3(“ch4A3”)重链和轻链构建体的氨基酸序列在以下示出。
表5：嵌合NI-105.4E4(ch4E4)和嵌合NI-105.4A3(ch4A3)的氨基酸序列
实施例7
从ch4E4重链(小鼠IgG2a)去除共有N-连接的糖基化位点
在NI-105.4E4重链的CDR1区中鉴别共有N-连接的糖基化位点。在哺乳动物(CHO)细胞表达之后，预测的N-糖基化位点(Asn-30)被聚糖完全占据，如通过质谱法所证明。为了消除此区域中的N-糖基化并且降低产物异质性，将ch4E4的重链的Asn-30改变为Gln(表4)。当从CHO细胞产生并且纯化时，修饰的抗体以相对于原始糖基化抗体约4倍更高的表观结合亲和力结合重组tau。
表6：成熟ch4E4(N30Q)重链(小鼠IgG2a)的氨基酸序列。取代的Gln残基以粗体、下划线表示。
实施例8
非糖基化嵌合NI-105.4E4(N30Q)(ch4E4(N30Q)mIgG1Agly)的产生
产生种系化NI-105.4E4的小鼠嵌合非糖基化变体(“ch4E4(N30Q)IgG1-Agly”)，以评估抗体效应子功能与活性之间的关系。对于重链(SEQ ID 214)，将NI-105.4E4(N30Q)(SEQ ID NO:43)的可变结构域融合至含有Asn至Gln突变的小鼠IgGl重链恒定区，以消除共有Fc糖基化位点。重链可变区包含N30Q改变，以消除CDR1中的共有N-糖基化位点(实施例7)。轻链是上述ch4E4λ轻链(SEQ ID 21)。
实施例9
人4Ε4和4Α3的急性大脑渗透研究
通过瞬时转染CHO细胞来产生人NI-105.4E4和NI-105.4A3，并且通过亲和纯化法进行纯化。控制内毒素水平，并且所有均低于1EU/mg。在第1天和第4天用30mg/kg NI-105.4E4(n＝7)、4A3(n＝7)抗体或等体积的PBS(n＝7)腹膜内注射TauP301L小鼠。在第5天，在麻醉下用含有1单位/ml肝素的PBS灌注小鼠。收集血液、大脑和脊髓用于分析。将大脑右半球冷冻在-80℃下，将大脑左半球和脊髓后固定于10％中和福尔马林中，在4℃下放置两天，然后包埋于石蜡块中，并且切片。将血浆以等分部分储存在-80℃下。
大脑蛋白质提取：对冷冻的右半球称重，并在5体积(5mL/g的湿润组织)的含有50mM NaCl、0.2％二乙胺、蛋白酶抑制剂(Roche Diagnostics GmbH)以及磷酸酶抑制剂(Roche Diagnostics GmbH)的溶液中进行均化。然后将样品转移至聚碳酸酯管，并且再加入5体积均化溶液，并保持在冰上30分钟。然后，在100,000g、4℃下离心30分钟之后收集可溶性级分。将此可溶性级分用于人IgG测定。将沉淀重悬浮于3体积的含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的PBS中。在16,000g、4℃下离心30分钟之后，将上清液和沉淀分别储存在-80℃下，以用于进一步不溶性tau提取。用改性十二烷基肌氨酸钠提取法(Goedert M,SpillantiniMG,Cairns NJ,Crowther RA.Neuron 8,159(1992))进一步提取沉淀。
人IgG特异性夹心ELISA：将50mM碳酸盐ELISA涂覆缓冲液(pH9.6)中的2μg/ml的山羊抗人IgG Fab(Jackson)用作捕获抗体。以30μl/孔用捕获抗体涂覆半区域96孔微板，在4℃下过夜。然后用含有0.1％Tween 20的PBS洗涤板4次，然后与50μl/孔含有2％BSA的PBS一起在室温下孵育一小时。将大脑提取物、血浆样品和抗体标准品(4A3)的可溶性级分稀释于含有2％BSA和0.1％Tween 20的PBS中。将30μl稀释样品加入每个孔中，并且在室温下孵育一小时。然后用200μl/孔含有0.1％Tween 20的PBS洗涤板四次，然后与HRP缀合的驴抗人Fcγ(Jackson，以1:10,000稀释于含有2％BSA和0.1％Tween 20的PBS中)在室温下孵育一小时。然后用200μl/孔含有0.1％Tween 20的PBS洗涤板四次，然后加入20μl/孔TMB(1:20于10mM柠檬酸盐溶液(pH＝4.1)中)。然后通过向每孔加入10μl 1M H2SO4来终止反应。从NI-105.4A3的连续稀释液获得抗体标准曲线。根据标准计算血浆和大脑样品中的抗体浓度。然后，将大脑的人IgG水平转换为μg抗体/克新鲜大脑组织(假设为1g/10ml)，如图6中所指示。
在所有NI-105.4E4和NI-105.4A3处理小鼠的血浆中检测到高水平的人IgG。相比之下，PBS处理小鼠的血浆中未检测到人IgG(图5)。在4E4和4A3处理小鼠的大脑匀浆中检测到显著量的人IgG(图6)。
实施例10
用嵌合NI-105.4E4和NI-105.4A3进行慢性研究
含有原始人抗体的可变结构域和小鼠IgG2a的恒定区的嵌合NI-105.4E4和NI-105.4A3可通过瞬时转染CHO细胞来产生，并且通过亲和纯化法进行纯化。将控制每批抗体中的内毒素水平，并且保持低于1Eu/mg。7.5至8月龄的性别平衡的TauP301L小鼠将被腹膜内注射10mg/kg、3mg/kg的抗体溶液或等体积的PBS对照。每个处理组将具有20至25只小鼠。处理将每周进行一次持续26周。或者，处理将每周进行两次持续13周。每两周监测体重。处理期结束时，在麻醉下灌注小鼠。收集大脑、脊髓和血液。可将一半大脑和脊髓后固定于10％福尔马林中持续三天，然后包埋于石蜡块中。从这些组织块切下的4-6μm厚切片可用于免疫组织化学研究。将另一半大脑称重，并且速冻于-80℃下，以用于生物化学分析。
药物作用将通过比较处理样品和对照样品中神经原纤维缠结(NFT)的水平和具有不同溶解度特征的tau的水平来评估。NFT可通过Gallyas银浸渍(F Gallyas ActaMorphol.Acad.Sci.Hung 19.1(1971))或通过用单克隆小鼠抗体AT100和AT180的免疫染色进行可视化，所述抗体识别NFT中的病理性磷酸化tau。可测定抗体治疗小鼠和对照动物中的大脑和脊髓中的Gallyas-阳性神经元和/或AT100、AT180标记的神经元的数量或频率以评估抗体治疗的作用。
可溶性和不溶性tau可根据本文所述的大脑蛋白质提取方案提取。或者，可溶性和不溶性tau可用改性十二烷基肌氨酸钠提取法(Goedert M,Spillantini MG,Cairns NJ,Crowther RA.Neuron8,159(1992))提取。简言之，将冷冻的大脑在由10mM Tris·HCl(pH7.4)、0.8M NaCl、1mM EGTA、1mM Na3VO4、1mM NaF、1mM AEBSF、蛋白酶抑制剂(RocheDiagnostics GmbH)和磷酸酶抑制剂(Roche Diagnostics GmbH)组成的10体积(wt/vol)的10％蔗糖匀浆缓冲液中进行均化。将匀浆在20,000g下旋转20分钟，并且保留上清液。将沉淀在10体积的均化缓冲液中进行均化，并且再次离心。上清液可合并在一起，并且加入N-月桂酰肌氨酸(Sigma)达到1％(wt/vol)最终浓度，并且在37℃和300rpm旋转下孵育1.5小时，然后在100,000g下离心1小时。上清液作为十二烷基肌氨酸钠可溶性级分收集，并且将1g大脑组织的沉淀重悬浮于0.2ml 50mM Tris·HCl(pH 7.4)中，作为PHF级分。
可溶性和不溶性tau的水平用可商购的Tau ELISA试剂盒(Invitrogen)测量。此外，大脑蛋白质提取物用4％至12％Bis-TrisSDS-PAGE分离，然后用Tau12(人tau)、AT8(pS202/pT205)、AT100(pT212/pS214)、AT180(pT231)和Ε178(pS396)抗体进行免疫印迹。将通过测量每个样品对已知数量tau标准品的积分密度进行半定量分析。
此外，行为测试可如上述实施例5中所示进行。例如，抗体处理的TauP301L小鼠中工作记忆的改善可使用双试Y型迷宫任务来测试(例如，Pennanen,Genes Brain Behav.5(2006),369-79，其以引用的方式整体并入本文)。迷宫的三臂(arm)是22cm长、5cm宽和15cm深。将黑色和白色抽象线索(abstractive clue)置于迷宫周围的黑幕上。在黑暗期期间，实验在6勒克斯的环境光水平下进行。每个实验包括培训期和观察期。在培训期期间，小鼠被分配至三臂中的两个(起始臂和第二臂)，它们可在4分钟内自由探索，不能进入第三臂(新臂)。然后将小鼠从迷宫中移除，并保留在固定笼中1.5至5分钟，同时迷宫用70％乙醇完全清洗，以除去任何嗅觉线索。然后，将小鼠再次放回迷宫中，以观察所有三个可进入的臂4分钟。记录进入的顺序、进入每个臂的编号以及在每个臂中耗费的时间。由此计算在第三新臂中耗费的时间与在其它两个臂(起始臂和第二臂)中耗费时间的平均值的比率，并且比较tau蛋白病小鼠模型和相应的对照野生型小鼠中的不同处理组。啮齿动物通常优选地用于研究迷宫的新臂，而不是返回之前到达的臂。抗体的作用可针对恢复此偏好来监测，由于其病症相关工作记忆障碍，所述监测通过处理的tau蛋白病模型小鼠与未处理小鼠的无差别行为的比较来进行。因此，接近1的比率指示工作记忆被破坏。高比率指示工作记忆较好。TauP301L小鼠中工作记忆的破坏被认为是由于人tau的过量表达导致的tau蛋白病引起的。因此，与对照TauP301L小鼠相比，抗tau抗体处理的TauP301L小鼠中观察到的显著较高的比率指示，抗tau抗体对tau蛋白病具有治疗作用。
实施例11
人抗-tau抗体的鉴别。
根据本文所述的方法分离重组人tau抗体NI-105.17C1、NI-105.6C5、NI-105.29G10、NI-105.6L9、NI-105.40E8、NI-105.48E5、NI-105.6E3、NI-105.22E1、NI-105.26B12、NI-105.12E12、NI-105.60E7、NI-105.14E2、NI-105.39E2、NI-105.19C6和NI-105.9C4。如以上所述验证这些人tau抗体的靶标和结合特异性。发现的总结在表5中提供。将所使用的所有抗体(除NI-105.17C1外)进行种系化。
表7.人抗tau抗体的体外表征。
*：通过PepSPOT、tau片段蛋白质印迹和ELISA、tau-肽ELISA以及丙氨酸扫描的组合方法来鉴别hTau40上的结合区。
**：根据PepSPOTs和直接ELISA通过比较抗体与rTau、PHFTau、通过牛小肠磷酸酶脱磷酸的PHFTau、通过GSK3β或GSK3β/CDK5/p35体外磷酸化的rTau以及磷酸化的tau肽的结合来验证抗体结合是否需要tau蛋白上的某一氨基酸处的磷酸化。
实施例12
具有小鼠IgG2a恒定结构域的人抗体的嵌合。
为了产生用于慢性治疗研究的免疫原性降低的抗体，使用重组DNA技术产生抗体NI-105.17C1(“ch17C1”)、NI-105.6C5(“ch6C5”)、NI-105.40E8(“ch40E8”)和NI-105.6E3(“ch6E3”)的小鼠嵌合型式。选择小鼠IgG2a/λ同种型用于这些嵌合抗体，以便产生以高亲和力结合至小鼠Fc-γ受体的分子，并且因此所述同种型能够诱导免疫效应子应答。ch17C1、ch6C5、ch40E8、ch40E8(R104W)和ch6E3重链和轻链构建体的氨基酸序列在以下示出。
ch17C1重链(小鼠IgG2a) SEQ ID NO:203
ch17C1轻链(小鼠λ) SEQ ID NO:204
ch6C5重链(小鼠IgG2a) SEQ ID NO:205
ch6C5轻链(小鼠λ) SEQ ID NO:206
ch40E8重链(小鼠IgG2a) SEQ ID NO:207
ch40E8(R104W)重链(小鼠IgG2a) SEQ ID NO:208
ch40E8轻链(λ) SEQ ID NO:209
ch6E3重链(小鼠IgG2a) SEQ ID NO:210
ch6E3轻链(小鼠κ) SEQ ID NO:211
实施例13
NI-105.17C1轻链中的CDR糖基化位点的消除。
在NI-105.17C1轻链的CDR1区中鉴别共有N-连接的糖基化位点。在哺乳动物(CHO)细胞表达之后，预测的N-糖基化位点(Asn-31)被聚糖完全占据，如通过质谱法所证明。为了消除此区域中的N-糖基化并且改进产物异质性，将ch17C1的轻链的Asn-31改变为Gln(参见以下序列)。当从CHO细胞产生并且纯化时，修饰的抗体(ch17C1(N31Q)mIgG2a)以相对于原始糖基化抗体类似的表观结合亲和力结合重组tau(参见图8A)。NI-105.17C1(N31Q)轻链可变区包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列。
ch17C1(N31Q)轻链(小鼠λ) SEQ ID NO:212
人NI-105.17C1(N31Q)VL SEQ ID NO:221
实施例14
具有降低的效应子功能的抗体的产生。
产生含有重链Fc结构域中的共有N-糖基化位点内的突变的抗体变体。被指定为“Agly”的这些变体被设计来产生具有降低的免疫效应子功能的抗tau抗体。在以下提供tau抗体的Agly变体的氨基酸序列。
ch4A3-mIgG1-Agly重链 SEQ ID NO:213
ch4E4(N30Q)-mIgG1-Agly重链 SEQ ID NO:214
ch6C5-mIgG1-Agly重链 SEQ ID NO:215
ch17C1-mIgG1-Agly重链 SEQ ID NO:216
实施例15
ch17C1-mIgG2a和ch17C1-mIgG1-Agly的结合活性的比较。
针对ch17C1Agly评定抗体效应子功能与活性之间的关系(图8A)。ch17C1抗体包含ch17C1重链(SEQ ID NO:203)和ch17C1轻链(SEQ ID NO:204)。ch17C1(N31Q)mIgG2a抗体包含ch17C1重链(SEQ ID NO:203)和ch17C1(N31Q)轻链(SEQ ID NO:212)，其在CDR1中并入N31Q突变以消除CDR糖基化位点。ch17C1(N31Q)mIgG1Agly抗体包含ch17C1-mIgG1-Agly重链(SEQ ID NO:216)，其中17C1的可变结构域融合至含有在位置294(Kabat残基297)处的Asn至Gln突变的小鼠IgG1重链以消除共有Fc糖基化位点；以及ch17C1(N31Q)轻链(SEQ IDNO:212)。当从CHO细胞产生并且纯化时，ch17C1(N31Q)mIgG1 Agly以相对于原始糖基化抗体类似的表观结合亲和力结合重组tau(参见图8A)。
实施例16
17C1轻链的位置48处的缬氨酸与异亮氨酸的比较。
在产生种系化抗体NI-105.17C1的小鼠嵌合IgG2a型式的过程中，轻链的残基48也从缬氨酸变为异亮氨酸。为了证实这种取代不会影响NI-105.17C1的结合亲和力，制备在位置48处具有缬氨酸的NI-105.17C1的小鼠嵌合IgG2a型式。当从CHO细胞产生并且纯化时，ch17C1(N31Q,I48V)mIgG2a抗体以相对于ch17C1(N31Q)mIgG2a类似的表观结合亲和力结合重组tau(参见图8B)。ch17C1(N31Q)mIgG2a抗体包含ch17C1重链(SEQ ID NO:203)和ch17C1(N31Q,I48V)轻链(SEQ ID NO:217)。
ch17C1(N31Q,I48V)轻链(小鼠λ) SEQ ID NO:217
人NI-105.17C1(N31Q,I48V)VL SEQ ID NO:222
实施例17
NI-105.40E8的位置104处的Arg与Trp的比较
抗体NI-105.40E8(其对于在人成对螺旋纤丝(PHF)中发现的磷酸化型式的tau具有选择性)包含NI-105.40E8VH的位置104处的不寻常精氨酸残基。通常人免疫球蛋白谱系内的此位置被色氨酸残基占据。产生一种形式的NI-105.40E8重链，NI-105.40E8(R104W)-hIgG1，其中残基Arg104被色氨酸置换。当从CHO细胞产生并且纯化时，NI-105.40E8(R104W)-hIgG1抗体以相对于NI-105.40E8-hIgG1类似的表观结合亲和力结合人PHF tau(参见图9)。所述两种抗体的轻链是相同的。
人NI-105.40E8(R104W)-hIgG1，重链 SEQ ID NO:218
人NI-105.40E8轻链(人λ) SEQ ID NO:219
人NI-105.40E8(R104W)VH SEQ ID NO:220
实施例18
人抗tau抗体结合AD大脑中和tau蛋白病的转基因小鼠模型的大脑中的病理性聚集的tau。
将从阿尔茨海默氏病患者和对照患者以及从tau蛋白病的转基因小鼠模型的大脑和野生型对照获得的大脑组织样品用本文提供的种系化的人抗tau抗体染色。在图10中示出结合阿尔茨海默氏病(AD)的大脑中和tau蛋白病(Tg)的转基因小鼠的大脑中的病理性tau聚集体的种系化人NI-105.40E8、NI-105.48E5、NI-105.6C5和NI-105.17C1抗tau抗体的代表性图像。这些抗体都不结合精神健康的受试者(Ctr)或野生型小鼠大脑(Wt)中的正常tau。这些抗体之间的不同图案反映其在表位特异性和结合亲和力方面的差异。
实施例19
抗体在TauP301L小鼠中的大脑渗透。
动物和抗体处理：通过瞬时转染CHO细胞并且使用标准方法纯化来产生人NI-105.6C5、NI-105.40E8和NI-105.6E3抗tau抗体。不具有与小鼠抗原的交叉反应性的人源化抗体用作同种型对照(hIgG1)。在第一实验中，将一半的所注射的NI-105.6C5、NI-105.6E3和hIgG1抗体以1:3的近似抗体:Cy3比例用Cy3(GE Healthcare,PA13105)标记。Cy3标记不会改变抗体结合，如通过ELISA和用TauP301L大脑免疫染色所证实(数据未示出)。在第二实验中，使用未标记的NI-105.6C5和NI-105.40E8抗tau抗体。
18-22个月龄的TauP301L小鼠通过腹膜内注射在七天内接受两个剂量的30mg/kgNI-105.6C5、NI-105.6E3或人IgG1同种型对照hIgG1。在第二次给药后第一天、八天和22天的时间点从每个处理组的三只小鼠收集组织样品。在第二实验中，TauP301L小鼠在七天内两次腹膜内注射30mg/kg h40E8和h6C5，并且在第二次注射之后第一天从那些小鼠收集组织样品。
对于组织样品收集，将小鼠用氯胺酮/塞拉嗪深度麻醉，之后通过右心房收集血液。然后通过小大脑延髓池穿刺收集CSF。在通过左心室用含有10UI/ml肝素的冰冷PBS灌注2分钟并且用10％中和福尔马林灌注五分钟之后，随后收集大脑和脊髓。在于30％蔗糖中浸没48小时之后，在4℃下将大脑固定在10％中和福尔马林中持续另外3小时。然后将大脑冷冻在干冰中并且随后切成30μm厚的冠状切片系列。在使用之前，将所述切片系列在-20℃下储存在含有于具有0.025％叠氮化钠的50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)中的1M葡萄糖、37.5％乙二醇的防冻溶液中。将脊髓后固定在10％中和福尔马林中持续两天并且包埋在石蜡块中。
免疫组织化学：将30μm厚度的冠状切片通过游离漂浮染色用生物素化的驴抗人IgG(H+L)探测。将游离漂浮切片在Tris-Triton pH7.4(50mM Tris、150mM NaCl、0.05％Triton X-100)中洗涤，在1％H2O2PBS中孵育30分钟，并且与含有于具有另外0.2％TritonX-100的Tris-Triton中的2％正常山羊和马血清的封闭溶液在室温下孵育1小时。然后在4℃下在100rpm搅拌下将所述切片与生物素化的驴抗人(H+L)(Jackson ImmunoresearchLabs,709-065-149)以1:200在封闭溶液中孵育16小时以检测神经元人IgG。使用Vectastain Elite ABC试剂盒(Vector Laboratories,PK6100,1:100)通过过氧化物酶显色反应来使组织结合的生物素化抗体可视化。用冰冷PBS终止酶反应并且将所述切片在PBS中洗涤3次。然后将切片安装在载玻片上并且空气干燥过夜，之后将它们用苏木精明矾溶液复染色以可视化细胞核(Carl Roth GmbH+Co.,T865.1)。在脱水步骤之后，将载玻片用盖玻片覆盖，之后用Olympus dotSlide 2.1虚拟显微镜系统扫描。
在TauP301L小鼠的大脑中检测到人抗体，所述TauP301L小鼠已经通过腹膜内注射接受了人抗tau抗体或hIgG1对照抗体，但在无抗体处理的TauP301L和野生型小鼠中未检测到(图11)。然而，仅在NI-105.6C5、NI-105.6E3和NI-105.40E8抗tau抗体处理的小鼠的海马中观察到神经元染色，但在hIgG1处理的小鼠中未观察到。使用抗tau抗体的神经元染色在注射后一天容易地可检测，在注射后八天不太明显，并且在注射后22天不可检测(数据未示出)。TauP301L小鼠在海马结构中产生高水平的转基因人tau，并且海马是发展神经原纤维缠结的最早区域之一。因此，外周注射的抗tau抗体不仅进入大脑，而且可能进入包含高水平tau的神经元。
实施例20
使用ch4E4(N30Q)和ch17C1(N31Q)慢性处理TauP301L小鼠的作用。
动物和抗体处理：通过瞬时转染CHO细胞并且使用标准方法纯化来产生含有人抗体的可变结构域和小鼠IgG2a的恒定区的嵌合NI-105.4E4(N30Q)(“ch4E4(N30Q)”)和嵌合NI-105.17C1(N31Q)(“ch17C1(N31Q)”)。
7.5至8月龄的性别平衡的TauP301L小鼠通过腹膜内注射每周给予10mg/kgch17C1(N31Q)(n＝20)、10mg/kg ch4E4(N30Q)(n＝20)或等体积的PBS(n＝20)。每两周监测体重。未观察到显著体重损失。来自PBS组的两只小鼠和来自ch17C1(N31Q)处理组的一只小鼠过早死亡。在第25次处理后一天麻醉小鼠以用于组织收集。通过眼窝窦收集血液。在通过左心室用含有10UI/ml肝素的冰冷PBS灌注2分钟之后，随后收集大脑和脊髓。然后将左半大脑称重、在干冰中深度冷冻并且在使用前储存在-80℃下。将右半大脑和脊髓在4℃下后固定于中和10％福尔马林中持续两天，随后在PBS中进一步储存，之后加工成石蜡包埋的大脑和脊髓块。
大脑蛋白质提取：随后基于溶解性顺序地提取大脑蛋白。首先将左半大脑在10倍w/v的含有0.2％二乙胺、1X蛋白酶抑制剂(Roche Diagnostics GmbH)和1X磷酸酶抑制剂(Roche Diagnostics GmbH)的50mM NaCl中进行均化。在冰上孵育30分钟之后，将匀浆在100,000g、4℃下离心30分钟。随后，收集上清液并且定义为可溶性级分。将剩余的沉淀在12倍w/v的含有10mM Tris 7.4、0.8M NaCl、1mM EGTA、1X磷酸酶抑制剂、1X蛋白酶抑制剂、1mMNa3VO4、1mM NaF和1mM AEBSF的10％蔗糖溶解缓冲液中进行均化。在冰上孵育30分钟之后，将匀浆在20,500g、4℃下离心20分钟。小心地收集95％的上清液以用于十二烷基肌氨酸钠提取。将沉淀储存在-80℃下。将N-月桂酰肌氨酸添加至上清液(1％(w/v)最终浓度)。在于37℃、220rpm搅拌下孵育1小时之后，将溶液在100,000g、4℃下离心一小时。收集上清液并且定义为十二烷基肌氨酸钠可溶性级分。将沉淀在室温下静置干燥30分钟，然后溶解于50mM Tris pH 7.4(20％v/w初始大脑重量)中并且定义为PHF不溶性级分，将其储存在-80℃下直到使用。
ELISA测量人总tau并且按照制造商的方案用商业ELISA试剂盒(LifeTechnologies)量化三种大脑蛋白质级分中的磷酸化tau。检测总人tau、在苏氨酸231处磷酸化的人tau(pT231 tau)、在丝氨酸199处磷酸化的人tau(pS199tau)以及在苏氨酸181处磷酸化的人tau(pT181)。将可溶性级分的样品基于用BCA蛋白质测定(Pierce)测量的总蛋白质含量用50mM Tris(pH7.4)标准化至1mg/ml。制备等分部分的标准化样品以用于ELISA测量和蛋白质印迹。为了制备用于ELISA的溶解的PHF可溶性级分，将10μl PHFTau与10μl8M盐酸胍在室温下孵育一小时，之后添加180μl 50mM Tris 7.4。按照标准方案进行ELISA测量。将通过ELISA测量的每个样品中的tau水平标准化至初始大脑重量以用于最终分析。
使用夹心ELISA测量终点血浆药物水平。简言之，将于100nM碳酸盐ELISA涂覆缓冲液(pH9.6)中的3μg/ml rTau(rPeptide)(SEQ ID NO:6)在Costar半区域ELISA板中在4℃下孵育过夜。将板用PBS中的3％BSA在室温下封闭一小时。将血浆样品在含有0.1％的PBS中的3％BSA中稀释至1:200、1:400和1:800。ch17C1(N31Q)和ch4E4(N30Q)的连续稀释液用于产生标准曲线。在孵育一小时之后，将板用含有0.1％的PBS洗涤4次，接着与驴抗小鼠IgGFcγ-HRP(1:10,000)孵育一小时。在洗涤之后，通过标准比色测定进一步测定结合的抗体。用GraphPad Prism 5通过S形曲线拟合产生标准曲线。
蛋白质印迹：将三种级分的蛋白质样品在70℃下在4XLDS样品缓冲液(Life Technologies)中加热10分钟并且将来自每种样品的等量的总蛋白质在4％-12％(w/v)凝胶上电泳。在将蛋白质半干燥转移至PVDF膜之后，将膜封闭在含有于TBS中的0.1％Tween-20的3％BSA中并且随后用不同的抗tau抗体在4℃下探测过夜。然后将过氧化物酶缀合的第二抗体在用TBST洗涤4次之后在室温下孵育1小时。随后，通过增强化学发光(ECL)(Pierce)检测结合的抗体。用美国国家卫生研究院ImageJ程序进行免疫印迹的光密度测定分析。
双试Y型迷宫：使用双试Y型迷宫测试针对短期空间记忆对小鼠进行测试。迷宫的臂是35cm长、5cm宽和10cm深。将抽象线索置于迷宫周围的幕上。实验在6勒克斯的环境光水平下进行。在暴露期期间，小鼠被分配至两个臂(起始臂和第二臂)，它们可在4分钟内自由探索，不能进入第三臂(新臂)，由与迷宫相同的材料制成的门封闭。然后将小鼠从迷宫中移除，并保留在固定笼中2分钟，同时迷宫用50％乙醇清洗。在测试期期间，将小鼠放置在起始臂的末端，并且允许在4分钟期间自由探索所有三个臂。用TSE videoMot2软件针对视频跟踪和动物行为的分析(TSE Systems,Bad Homburg,Germany)记录测试期。记录臂进入的编号以及在新臂中耗费的时间。计算臂进入的数目和在训练期期间打开的其它两个臂中花费的时间的平均值。计算进入新臂的臂进入的数目(或在新臂中耗费的时间)与其它两个臂的平均值的比率。不具有空间工作记忆缺陷的野生型对照动物通常在此测试中将具有1.5与2之间的比率。Pennanen等,Genes Brain Behav 5(5):369-79(2006)。
数据分析：将ELISA数据进行对数转换以满足用于双向方差分析的正态假设。当p<0.05时，差异被认为是显著性的。
ch4E4(N30Q)显著减少TauP301L小鼠中的可溶性人tau：通过ELISA量化大脑蛋白质提取物的DEA可溶性级分、十二烷基肌氨酸钠可溶性级分和不溶性级分中的人tau水平。大多数人tau在DEA可溶性级分中发现(数据未示出)。与PBS处理的小鼠相比，总人tau(hTau)在来自ch17C1(N31Q)和ch4E4(N30Q)处理的小鼠的DEA可溶性级分中减少(在ch17C1(N31Q)中平均减少29％并且在ch4E4(N30Q)中平均减少37％，图12A)。还在DEA可溶性级分中观察到磷酸化tau(pT231,pS199和pT181)的减少(分别图12B、12C和12D)。之前已经观察到在雌性TauP301L小鼠中比在其雄性同伴中更低的人tau表达。因此，为了准确地分析数据，使用双向ANOVA，其中性别和处理作为两个变量。在所有可溶性人tau测量(总人tau、pS199、pT181和pT231人tau)中在p<0.01的情况下证实了性别作用。在性别与处理之间不存在相互作用(在所有可溶性人tau测量中0.49<p<0.91)。重要地，在DEA可溶性人tau中存在显著处理作用(对于hTau、pS199和pT231，p<0.05，并且对于pT181，p＝0.06)。处理作用主要由ch4E4(N30Q)驱动。当与PBS对照比较时，ch4E4(N30Q)显著减少hTau(p<0.05)、pS199(p<0.01)、pT231(p<0.01)和pT181(p<0.05)。使用十二烷基肌氨酸钠级分的ELISA测量显示动物之间的高可变性，并且未观察到显著性别作用。在十二烷基肌氨酸钠不溶性级分中未观察到显著处理作用。类似地，通过ELISA在十二烷基肌氨酸钠可溶性级分中未观察到显著处理作用。
使用人tau特异性单克隆抗体Tau12的蛋白质印迹显示全长人tau，如在62kDa下的单个条带，作为DEA可溶性级分中的主要tau免疫反应组分。在大多数用ch4E4(N30Q)和ch17C1(N31Q)处理的小鼠中观察到全长人tau的明显减少。在十二烷基肌氨酸钠不溶性几分钟，观察到64kDa条带和几个其它更高分子量条带，以及可能对应于人tau片段的更小分子量条带。光密度测定分析显示单独动物之间的高度可变性，这阻止了任何定量比较。然而，在ch17C1(N31Q)和ch4E4(N30Q)处理的小鼠中通过Tau12检测的十二烷基不溶性级分中的所有人tau蛋白中存在总体定性减少(图13中所示的代表性蛋白质印迹)。
血浆药物水平：将小鼠通过腹膜内注射每周用10mg/kg的ch17C1(N31Q)和ch4E4(N30Q)处理。为了评定药物暴露，在最后一次处理之后24小时收集血浆样品。使用rTau作为捕获剂用ELISA测量血浆药物水平。ch17C1(N31Q)和ch4E4(N30Q)的平均血浆水平分别是200μg/ml和145μg/ml，从而表明两种抗体具有良好血液暴露(图14)。
抗体处理和空间记忆：早期研究表明TauP301L小鼠中空间参照记忆的缺陷，所述缺陷是海马依赖性的(Pennanen等,Genes Brain Behav 5(5):369-79(2006))。双试Y型迷宫被报道为用于检测tau转基因小鼠中的短期空间记忆缺陷的灵敏测试(Troquier等,CurrAlzheimer Res.9(4):397-405(2012))。在暴露期期间，所有组相等地探索迷宫，从而在每个可用臂中花费类似量的时间(数据未示出)。比较所移动的距离，未发现差异。在测试期期间，PBS处理的TauP301L小鼠在新臂中进行了与在暴露期期间探索的其它两个臂的平均值几乎相等数目的进入(比率＝1.18)，从而表明PBS处理的TauP301L小鼠的较差空间工作记忆。ch17C1(N31Q)和ch4E4(N30Q)处理的小鼠均显示相对于其它两个臂对新臂的偏好，并且它们对新臂进行了比其它两个臂的平均值更多的访问(对于ch17C1(N31Q)，比率＝1.50；并且对于ch4E4(N30Q)，比率＝1.30)。在图15中示出ch17C1(N31Q)和ch4E4(N30Q)处理的TauP301L小鼠中新臂进入比率与PBS处理组的新臂进入比率的比较。
本发明不限于所描述的具体实施方案的范围，所述具体实施方案旨在作为本发明的单独方面的单一说明，并且功能上等效的任何组合物或方法处于本发明的范围内。确实，除了本文示出和描述的那些之外，根据以上描述和所附附图，本发明的各种修改将对于本领域技术人员而言变得显而易见。此类修改旨在处于所附权利要求书的范围内。

Claims (26)

1.一种抗tau抗体或其tau结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包括VH互补决定区(CDR)1、VH互补决定区(CDR)2和VH互补决定区(CDR)3，以及所述VL包括VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其中：
VHCDR1是由SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列组成，VHCDR2是由SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列组成，和VHCDR3是由SEQ ID NO:87所示的氨基酸序列组成；和VLCDR1是由SEQ IDNO:88所示的氨基酸序列组成，VLCDR2是由SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列组成，和VLCDR3是由SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列组成。
2.如权利要求1所述的抗tau抗体或其tau结合片段，其中：
(a)VH由SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列组成，和VL由SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列组成；或
(b)VH由SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列组成，和VL由SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列组成。
3.如权利要求1或2所述的抗tau抗体或其tau结合片段，其中所述抗tau抗体或其tau结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、单链Fv(scFv)、单链抗体或二硫键连接的Fv(sdFv)。
4.如权利要求1或2所述的抗tau抗体或其tau结合片段，其中所述抗tau抗体或其tau结合片段包含人IgG1重链恒定区。
5.如权利要求1或2所述的抗tau抗体或其tau结合片段，其中所述抗tau抗体或其tau结合片段包含人类λ轻链恒定区。
6.如权利要求4所述的抗tau抗体或其tau结合片段，其中所述抗tau抗体或其tau结合片段包含人类λ轻链恒定区。
7.如权利要求1或2所述的抗tau抗体或其tau结合片段，其中所述抗tau抗体或其tau结合片段包含聚乙二醇或可检测标记，所述可检测标记选自酶、放射性同位素、荧光化合物、化学发光化合物、生物发光化合物和重金属。
8.如权利要求3所述的抗tau抗体或其tau结合片段，其中所述抗tau抗体或其tau结合片段包含聚乙二醇或可检测标记，所述可检测标记选自酶、放射性同位素、荧光化合物、化学发光化合物、生物发光化合物和重金属。
9.如权利要求4所述的抗tau抗体或其tau结合片段，其中所述抗tau抗体或其tau结合片段包含聚乙二醇或可检测标记，所述可检测标记选自酶、放射性同位素、荧光化合物、化学发光化合物、生物发光化合物和重金属。
10.如权利要求5所述的抗tau抗体或其tau结合片段，其中所述抗tau抗体或其tau结合片段包含聚乙二醇或可检测标记，所述可检测标记选自酶、放射性同位素、荧光化合物、化学发光化合物、生物发光化合物和重金属。
11.如权利要求6所述的抗tau抗体或其tau结合片段，其中所述抗tau抗体或其tau结合片段包含聚乙二醇或可检测标记，所述可检测标记选自酶、放射性同位素、荧光化合物、化学发光化合物、生物发光化合物和重金属。
12.一种药物组合物，其包含如权利要求1-11中任一项所述的抗-tau抗体或其tau结合片段以及药学上可接受的载体。
13.分离的多核苷酸或多种多核苷酸，其包含编码如权利要求1-6中任一项所述的抗-tau抗体或其tau结合片段的核苷酸序列或多种核苷酸序列。
14.如权利要求13所述的多核苷酸或多种多核苷酸，其包含SEQ ID NO:173和/或SEQID NO:174所示的核酸序列。
15.表达载体或多种表达载体，其包含如权利要求13或14所述的多核苷酸或多种多核苷酸。
16.分离的宿主细胞，其包含如权利要求15所述的表达载体或多种表达载体或者如权利要求13或14所述的多核苷酸或多种多核苷酸。
17.制备抗-tau抗体或其tau结合片段的方法，所述方法包括：
培养在细胞培养物中的如权利要求16所述的宿主细胞；以及
使所述抗-tau抗体或其tau结合片段与所述细胞培养物分离。
18.如权利要求17所述的方法，进一步包括将所述抗-tau抗体或其tau结合片段配制成适用于施用至人受试者的无菌药物组合物。
19.如权利要求1至11中任一项所述的抗tau抗体或其tau结合片段或者如权利要求12所述的药物组合物在制备用于治疗神经退行性tau蛋白病的药物中的用途。
20.如权利要求1至11中任一项所述的抗tau抗体或其tau结合片段或者如权利要求12所述的药物组合物在制备用于治疗有需要的人受试者的中枢神经系统中的tau的异常积聚或沉积的药物中的用途。
21.如权利要求19所述的用途，其中所述神经退行性tau蛋白病选自由以下组成的组：阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化/帕金森氏病–痴呆复合征、嗜银颗粒性痴呆、英国类型淀粉样血管病、大脑淀粉样血管病、皮质基底节变性、克罗伊茨费尔特-雅各布病、拳击员痴呆、伴有钙化的弥漫性神经原纤维缠结、唐氏综合征、额颞叶痴呆、伴有与染色体17相关的帕金森氏病的额颞叶痴呆、额颞叶变性、格-施-莎三氏病、哈-斯二氏病、包涵体肌炎、多系统萎缩、肌强直性营养不良、C型尼曼-皮克二氏病、具有神经原纤维缠结的非关岛运动神经元病、皮克氏病、大脑炎后帕金森氏病、朊病毒蛋白大脑淀粉样血管病、进行性皮质下神经胶质增生、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全大脑炎、仅缠结型痴呆、多发性梗塞性痴呆以及缺血性中风。
22.如权利要求19所述的用途，其中所述神经退行性tau蛋白病是阿尔茨海默氏病。
23.如权利要求19所述的用途，其中所述神经退行性tau蛋白病是伴有与染色体17相关的帕金森氏病的额颞叶痴呆。
24.如权利要求19所述的用途，其中所述神经退行性tau蛋白病是额颞叶变性。
25.用于体内诊断有需要的人受试者中的神经退行性tau蛋白病的包含如权利要求1-11中任一项所述的抗-tau抗体或其tau结合片段的组合物。
26.如权利要求1-11中任一项所述的抗-tau抗体或其tau结合片段在制备在体外监测神经退行性tau蛋白病进展的方法中使用的诊断试剂中的用途，其中所述方法包括：
(a)用所述的抗tau抗体或其tau结合片段测量获自人受试者的样品中的病理性修饰的或聚集的tau的水平；以及
(b)将修饰的或聚集的tau的水平与参考标准品进行比较，所述参考标准品指示一个或多个对照受试者中所述病理性修饰的或聚集的tau的水平，
其中病理性修饰的或聚集的tau和所述参考标准品的水平之间的差异性或相似性指示所述人受试者患有神经退行性tau蛋白病。
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