CN103796679B - 抗-α突触核蛋白结合分子 - Google Patents

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Abstract

提供了抗人α‑突触核蛋白特异性结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物、与其相关的方法。还提供了结合人α‑突触核蛋白上的特异性N‑末端和C‑末端表位的抗人α‑突触核蛋白结合分子。本文描述的结合分子可用于分别针对α‑突触核蛋白靶向的免疫治疗和诊断的药物组合物和诊断组合物。

Description

抗-α突触核蛋白结合分子
通过电子方式提交的序列表的引用
与本申请一起提交的以ASCII文本文件(名称：序列表_ascii.txt；大小：23KB；创建日期：2011年6月23日)通过电子方式提交的序列表的内容通过引用整体并入本文。
发明背景
本发明整体涉及新的α-突触核蛋白(synuclein)特异性结合分子，特别是分别识别α-突触核蛋白和α-突触核蛋白的聚集形式的人类抗体及其片段、衍生物和变体。此外，本发明涉及包含此类结合分子、抗体及其模拟物的药物组合物和诊断组合物，作为鉴定血浆和CSF中α-突触核蛋白的毒性物类的诊断工具以及在用于治疗α-突触核蛋白聚集物相关疾患的被动接种策略中都是有价值的，所述α-突触核蛋白聚集物相关疾患例如帕金森病(PD)、路易体痴呆(DLB)和阿尔茨海默病(AD)的路易体变体和其它突触核蛋白病(synucleinopathic disease)。
蛋白质错折叠和聚集是许多神经变性疾病的病理方面。α-突触核蛋白的聚集物是路易体和帕金森病(PD)相关的路易突起的主要组分。天然未折叠的蛋白、α-突触核蛋白可采取不同的聚集形态，包括寡聚体、初原纤维和原纤维。已经显示小寡聚体聚合物是特别有毒的。
已经在健康人中检测到天然存在的抗α-突触核蛋白自身抗体，并且在患者中改变的水平与特定神经退行性疾患相关；参见综述Neff等，Autoimmun.Rev.7(2008)，501-507。因此，罹患帕金森病的患者中天然存在的抗体，自发地或在接种后，特别是在健康患者中，可以对α-突触核蛋白聚集起防护作用；参见例如Woulfe等，Neurology58(2002)，1435-1436和Papachroni等，J.Neurochem.101(2007)，749-756。迄今，自身抗体的治疗意义难以评估。这主要是由于缺乏其分离和随后体外鉴定的直接的实验方法。
最近，已经在血浆和CSF中细胞外报道了α-突触核蛋的寡聚体物类(El-Agnaf等，FASEB J.20(2006)，419-425)，并且PD小鼠模型中免疫研究显示，抗α-突触核蛋白的细胞外小鼠单克隆抗体可以减少细胞内α-突触核蛋白聚集物的累积(Masliah等，Neuron，46(2005)，857-868)，支持了如下想法：中和神经毒性聚集物而不干扰单聚合体α-突触核蛋白的有益功能的抗体可能是有用的治疗剂。然而，鉴于其非人来源，基于鼠的抗体在人中的治疗效用受制于人抗小鼠抗体(HAMA)应答。
Emadi等在J.Mol.Biol.368(2007)，1132-1144中描述了从基于抗α-突触核蛋白的人序列的噬菌体展示抗体文库分离单链抗体片段(scFv)，其仅结合α-突触核蛋白的寡聚体形式并且在体外抑制α-突触核蛋白的聚集和毒性。然而，尽管通过噬菌体展示产生scFv是非常简单的，但是该技术具有严重的缺点，因为如此产生的抗体具有针对自身抗原不希望的交叉反应性风险，并且缺乏由人免疫系统产生的进化优化的天然人抗体的特征。而且，由于在正常生理环境和功能上下文中与其它蛋白和/或与靶蛋白的交叉反应性，此类抗体可能不够特异性。例如，在帕金森病的情况下，也与α-突触核蛋白的生理衍生物交叉反应的抗体具有引起与生理靶结构的正常功能相关的副作用。在这方面，不希望的自身免疫疾病将被彻底诱导-也是在采用还以变体形式生理出现的蛋白结构的活性免疫实验的概念设计中难以计算的风险。
最近，Seitz等(81.Kongress der Deutschen Gesellschaft für Neurologiemit Fortbildungsakademie Hamburg.10.-13.09.2008)报道了通过亲和色谱从不同免疫球蛋白溶液和单一血液供体样品分离抗α-突触核蛋白多克隆自身抗体。然而，除了该方法提供仅有限量的希望抗体的事实以外，多克隆抗体具有仅有限的治疗应用用途，例如因为它们的异质性和被具有不希望的副作用的其它α-突触核蛋白结合分子污染的风险。同样，因为抗体组合物的变异性将影响总体特异性和反应性，多克隆抗体的诊断价值降低。对于抗蛋白抗体而言，更真实的情况是由于错折叠的聚集和沉积。
因此，需要克服上述限制并提供抗α-突触核蛋白的治疗性和诊断性人抗体。
发明概述
在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基酸4至15内的表位的分离的结合分子。在某些方面，所述结合分子竞争性抑制参考单克隆抗体NI-202.12F4与α-突触核蛋白的结合。本发明的结合分子可以是抗体或其抗原结合片段。在特定实施方案中，所述结合分子不是人单克隆抗体NI-202.12F4或其抗原结合片段、变体或衍生物。
另一实施方案提供了特异性结合α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基酸113至123内或氨基酸117至123内的表位的分离的结合分子。在某些方面，所述结合分子与参考单克隆抗体NI-202.22D11特异性结合相同的人α-突触核蛋白表位，或者竞争性抑制参考单克隆抗体NI-202.22D11与人α-突触核蛋白的结合。本发明的结合分子可以是抗体或其抗原结合片段。本发明的特定结合分子是人单克隆抗体NI-202.22D11或其抗原结合片段、变体或衍生物。
本发明还提供特异性结合人α-突触核蛋白的分离的抗体或其抗原结合片段，包含免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其中VH包括与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:20至少90%或100%同一的多肽序列。还提供了特异性结合人α-突触核蛋白的分离的抗体或其抗原结合片段，包含VH和VL，其中VL包括与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:26至少90%或100%同一的多肽序列。相似地，本发明提供特异性结合人α-突触核蛋白的分离的抗体或其抗原结合片段，包含VH和VL，其中VH和VL分别包括与参考多肽SEQ ID NO:15和SEQID NO:22、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:26至少90%或100%同一的多肽序列。
还提供了分离的多肽，包括：包含VH的分离的多肽，其中VH的CDR1区与参考重链CDR1序列SEQ ID NO:16相同或者除了少于3个保守氨基酸取代之外相同；包含VH的分离的多肽，其中VH的CDR2区与参考重链CDR2序列SEQ ID NO:17相同或者除了少于5个保守氨基酸取代之外相同；包含VH的分离的多肽，其中VH的CDR3区与参考重链CDR3序列SEQ ID NO:18相同或者除了少于5个保守氨基酸取代之外相同；包含VL的分离的多肽，其中VL的CDR1区与参考轻链CDR1序列SEQ ID NO:23相同或者除了少于5个保守氨基酸取代之外相同；包含VL的分离的多肽，其中VL的CDR2区与参考轻链CDR2序列SEQ ID NO:24相同或者除了少于3个保守氨基酸取代之外相同；和包含VL的分离的多肽，其中VL的CDR3区与参考轻链CDR3序列SEQ ID NO:25相同或者除了少于3个保守氨基酸取代之外相同。在上述多肽的每一个中，包含所述多肽的抗体或其抗原结合片段特异性结合人α-突触核蛋白。
在本发明某些实施方案中，分离的抗体或其片段优先结合人α-突触核蛋白的非线性构象表位。在其它实施方案中，分离的抗体或其片段优先结合寡聚体形式或聚集形式的人α-突触核蛋白。在其它实施方案中，分离的抗体或其片段不特异性结合人β-突触核蛋白或人γ-突触核蛋白，和/或不特异性结合鼠α-突触核蛋白。
还提供了包含上述抗体或其片段和载体的组合物。所述组合物可以是治疗性或诊断性组合物。
还提供了编码本文描述的多肽或结合分子的一种或多种分离的多核苷酸，以及用于表达此类结合分子的载体和宿主细胞。
本发明的一个具体目的是提供用于治疗或预防突触核蛋白病的方法，所述突触核蛋白病例如但不限于帕金森病(PD)、路易体痴呆(DLB)和多系统萎缩(MSA)。所述方法包括给受试者施用有效浓度的抗人α-突触核蛋白结合分子，例如抗体或抗原结合片段、变体或衍生物，其中所述抗体靶向α-突触核蛋白。
本发明的目的还有提供诊断受试者突触核蛋白病的方法，其包括评估待用本发明抗体或其片段诊断的受试者中α-突触核蛋白的水平、定位、构象或其组合，并将所述受试者中α-突触核蛋白的水平、定位、构象或其组合与来自一个或多个对照样品的一个或多个参考标准对比，其中所述受试者中α-突触核蛋白的水平、定位、构象或其组合与参考标准之间的差异或相似性指示所述受试者是否具有突触核蛋白病。
本发明的诊断方法可以通过患者样品的体外测定或者通过体内成像技术。
本发明的其它实施方案将通过随后的描述和实施例而明显。
附图简述
图1人抗体NI-202.21D11的可变区、即重链和κ轻链的氨基酸和核苷酸序列。指示了框架(FR)和互补性决定区(CDR)，CDR加下划线。由于克隆策略，重链和轻链的N-末端的氨基酸序列可能含有在FR1中的引物诱导的改变，然而，这不实质影响抗体的生物活性。为了提供共有的人抗体，最初克隆的核苷酸和氨基酸序列与数据库中有关的人种系可变区序列比对并根据该人种系可变区序列进行调节；参见例如MRC Centre for ProteinEngineering(Cambridge，UK)管理的Vbase(vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)。认为可能偏离共有种系序列并因此可归因于PCR引物的那些氨基酸以粗体显示。
图2在直接ELISA中，相对于β-、γ-突触核蛋白和鼠α-突触核蛋白，重组人NI-202.21D11选择性结合人α-突触核蛋白。将重组人α-、β-、γ-突触核蛋白和重组人和鼠His-标记的α-突触核蛋白以相等的浓度(2μg/ml)涂布于ELISA板。然后用重组人NI-202.21D11、人NI-202.12F4和pan-突触核蛋白抗体探测板。(A)重组NI-202.21D11选择性结合α-突触核蛋白，而pan-突触核蛋白抗体结合所有三种突触核蛋白，证实重组蛋白的相等涂布。(B)重组NI-202.21D11对于人相对于鼠α-突触核蛋白是选择性的。另一方面，NI-202.12F4在直接ELISA中结合人和鼠α-突触核蛋白两者。
图3重组NI-202.21D11优先结合高密度涂布的α-突触核蛋白。将重组人α-突触核蛋白以指示浓度涂布至ELISA板上并用各种浓度的NI-202.21D11通过直接ELISA探测(□20μg/ml；5μg/ml；◆1μg/ml；■0.25μg/ml；0.1μg/ml)。针对每个涂布浓度测定指示抗体效价的半数最大有效浓度(EC50)。
图4 NI-202.21D11的免疫组织化学结合分析显示来自(A)过表达人α-突触核蛋白A53T的转基因小鼠和(C)来自路易体痴呆患者的人脑组织的石蜡切片中α-突触核蛋白病变的突出染色，包括路易体和路易突起样包涵体。(B)在野生型小鼠组织中和(右下)仅二抗对照中观察到无染色。HC=海马，CTX=皮质，BS=脑柄。
图5表位作图揭示了NI-202.21D11的人α-突触核蛋白(aa117-123)内C-末端结合表位。(A)在直接ELISA中，重组NI-202.21D11结合至人α-突触核蛋白的C-末端结构域。将α-突触核蛋白截短物以相等浓度(2ug/ml)涂布至ELISA板。NI-202.21D11仅结合至截短的α-突触核蛋白aa61-140和95-140，但是不结合至截短物aa1-60、1-95。(B)肽扫描分析显示NI-202.21D11与人α-突触核蛋白的重叠肽B08(aa109-123)、B09(aa113-127)和B10(aa117-131)的结合，表明NI-202.21D11结合所需的最小序列是人α-突触核蛋白内的PVDPDNE(aa117-123)。(C)在直接ELISA中，重组NI-202.21D11显示了与人α-突触核蛋白D121G/N122S减少的结合。将重组野生型和突变的α-突触核蛋白以相等浓度(2ug/ml)涂布至ELISA板上并测试重组NI-202.21D11结合。
图6 NI-202.12F4恰恰选择性结合α-突触核蛋白的N-末端。(A)肽扫描分析显示NI-202.12F4与肽A01的结合，显示最小识别序列在α-突触核蛋白的残基1-15之内。(B)测试来自残基1-30、4-30和5-30的合成α-突触核蛋白肽在溶液ELISA中的NI-202.12F4结合。NI-202.12F4结合aa1-30和4-30，但不结合5-30。这显示NI202.12F4表位序列开始于α-突触核蛋白的残基4。(C)NI-202.12F4表位内的残基K10是NI-202.12F4针对α-突触核蛋白相对于β-突触核蛋白的选择性的关键氨基酸。通过直接ELISA测试重组野生型和突变α-和β-突触核蛋白蛋白的NI-202.12F4结合。NI-202.12F4结合野生型α-突触核蛋白和突变β-突触核蛋白M10K，但是不结合野生型β-突触核蛋白和突变α-突触核蛋白K10M。这显示残基K10负责NI-202.12F4α-突触核蛋白选择性。
发明详述
I.定义
突触核蛋白病或突触核蛋白病变是一组多样的神经退行性疾病，共有在选择性易损的神经元群和神经胶质中不溶性α-突触核蛋白聚集物构成的常见病理性损伤。这些疾患包括帕金森病(PD)、帕金森病痴呆(PDD)、路易体痴呆(DLB)、青年型全身性神经轴性营养不良(Hallervorden-Spatz病)、单纯性自主神经衰弱(PAF)、多系统萎缩(MSA)和具有1型脑铁积聚的神经变性(NBIA-I)。临床上，它们的特征是运动、认知、行为和自主功能的慢性和渐进下降，取决于损伤的分布。
帕金森病是具有未知病原学的年龄依赖性神经退行性疾病。认为散发性帕金森病由基因易损性和环境侵害的组合导致。还认为帕金森病(PD)由不同机制引发时遵循共有的病理生理途径。一个共有的节点是涉及α-突触核蛋白。该蛋白与帕金森病病变的联系已经通过鉴定家族性病例中基因的点突变和三体化、α-突触核蛋白定位至路易体、帕金森病的标志性病理特征之一和帕金森病的神经毒性模型中α-突触核蛋白表达与疾病病变之间的关联来确立。额外证据表明，α-突触核蛋白的特定形式(例如，错折叠和α-突触核蛋白结合的多巴胺)参与散发性疾病。
突触核蛋白是主要在神经组织和某些肿瘤中表达的小的可溶性蛋白。家族包括三种已知蛋白：α-突触核蛋白、β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白。所有突触核蛋白具有共同的高度保守的α-螺旋脂质结合基序，与可交换载脂蛋白的Α2类脂质结合结构域类似。突触核蛋白家族成员不存在于脊椎动物之外，尽管它们与植物‘晚期胚胎丰富’蛋白具有一定保守的结构相似性。α-和β-突触核蛋白蛋白组要存在于脑组织，其中它们主要存在于突触前末梢。γ-突触核蛋白主要存在于外周神经系统和视网膜，但是其在乳房肿瘤中的表达是肿瘤进展的标志。已经确定了突触核蛋白任何一个的正常细胞功能，尽管一些数据表明在调节膜稳定性和/或翻转中的作用。α-突触核蛋白中的突变与早期发作的帕金森病的罕见家族病例有关，并且蛋白异常聚集于帕金森病、阿尔茨海默病和几种其它神经退行性病症。有关综述参见例如George，Genome Biol.3(2002)，综述3002.1-综述3002.6，在线公开于2001年12月20日，其中表1对目前列于GenBank的突触核蛋白家族的独特成员进行分类，其公开内容在此通过引用并入。
α-突触核蛋白最初在人脑中鉴定为阿尔茨海默病(AD)斑的非β-淀粉状蛋白组分(NAC)的前体蛋白；参见例如Ueda等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.90(1993)，1282-1286。α-突触核蛋白也称为AD淀粉状蛋白的非Aβ组分(NACP)的前体，是140氨基酸的蛋白。α-突触核蛋白以其天然形式存在为随机卷曲；然而，pH的改变、分子拥挤、重金属含量和多巴胺水平都影响蛋白构象。认为构象向寡聚体、初原纤维、原纤维和聚集部分的改变调节蛋白毒性。越来越多的证据表明，与非加合蛋白相比，多巴胺加合的α-突触核蛋白具有更快的时程以形成原纤维。而且，α-突触核蛋白过表达背景中的多巴胺是毒性的。
在本说明书中，术语“α-突触核蛋白”、“α-突触核蛋白”、“a-突触核蛋白”和“aSyn”可互换使用，具体指α-突触核蛋白的天然单体形式。术语“α-突触核蛋白”还用于一般鉴定α-突触核蛋白的其它构象异构体，例如与多巴胺-醌(DAQ)结合的α-突触核蛋白和α-突触核蛋白的寡聚体或聚集物。术语“α-突触核蛋白”也用来统称α-突触核蛋白的所有类型和形式。人α-突触核蛋白的蛋白序列是MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA(SEQ ID NO:1)。α-突触核蛋白的氨基酸序列可源自文献和相关数据库；参见例如Ueda等，如上；GenBank swissprot：locus SYUA_HUMAN，登录号P37840。AD 淀粉状蛋白的非Aβ组分(NAC)源自α-突触核蛋白。α-突触核蛋白内高度疏水的结构域NAC是由至少28个氨基酸残基(残基60-87)和任选35氨基酸残基(残基61-95)组成的肽。NAC表现出形成β-折叠结构的趋势(Iwai等，Biochemistry，34(1995)10139-10145)。NAC的氨基酸序列描述于Jensen等，Biochem.J.310(1995)，91-94；GenBank登录号S56746和Ueda等，PNAS USA90(1993)，1282-11286。
解聚的α-突触核蛋白或其片段包括NAC，表示单体肽单元。解聚的α-突触核蛋白或其片段一般是可溶的，并且能够自聚集以形成可溶寡聚体。α-突触核蛋白及其片段的寡聚体通常是可溶的并且主要作为α-螺旋存在。单体α-突触核蛋白可以通过将冻干的肽超声溶解于纯DMSO中而在体外准备。离心得到的溶液以除去任何不溶粒子。聚集的α-突触核蛋白或其片段包括NAC，表示α-突触核蛋白或其片段的寡聚体，其缔合成不溶的β-折叠组装体。聚集的α-突触核蛋白或其片段包括NAC，还表示原纤维聚合物。原纤维通常是不溶的。一些抗体结合可溶的α-突触核蛋白或其片段或聚集的α-突触核蛋白或其片段。一些抗体结合α-突触核蛋白的寡聚体比结合单体形式或原纤维形式更强。一些抗体结合可溶和聚集的α-突触核蛋白或其片段，任选地也结合寡聚体形式。
本文公开的人抗α-突触核蛋白抗体特异性结合α-突触核蛋白及其表位，并且结合α-突触核蛋白的各种构象及其表位。例如，本文公开了特异性结合α-突触核蛋白、天然单体形式的α-突触核蛋白、全长和截短的α-突触核蛋白和α-突触核蛋白聚集物的抗体。如本文使用的，对“特异性结合”、“选择性结合”或“优先结合”α-突触核蛋白的抗体的提及指不结合其它无关蛋白的抗体。在一个实例中，本文公开的α-突触核蛋白抗体可以结合α-突触核蛋白或其表位并且显示高于其它蛋白约1.5倍背景的无结合。“特异性结合”或“选择性结合”α-突触核蛋白构象异构体的抗体指不结合所有构象的α-突触核蛋白的抗体，即，不结合至少一种其它α-突触核蛋白构象异构体。例如，本文公开了可以区分单体和聚集形式的α-突触核蛋白、人和小鼠α-突触核蛋白；全长α-突触核蛋白和截短形式以及人α-突触核蛋白与和γ-突触核蛋白的抗体。因为本发明的人抗α-突触核蛋白抗体已经从没有帕金森病体征并且表现出α-突触核蛋白特异性免疫应答的老年受试者群分离，本发明的抗α-突触核蛋白抗体还称为“人自身抗体”以强调那些抗体实际上由受试者表达并且已经从例如人免疫球蛋白表达展示文库分离，其迄今代表试图提供人样抗体的一种常用方法。
注意，术语“一个”或“一种”实体指该实体的一个或多个；例如，“一种抗体”被理解为代表一种或多种抗体。因此，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”可以在本文互换使用。
本文使用的术语“多肽”意欲涵盖单个“多肽”以及多个“多肽”，并且指由通过酰胺键(还称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”指两个或多个氨基酸的任何链，并且不指产物的具体长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白”、“氨基酸链”或用于指两个或多个氨基酸的链的任何其它术语包括在“多肽”定义中，并且术语“多肽”可以替代这些术语的任何一个或与这些术语的任何一个互换使用。
术语“多肽”还意欲指多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护基/封端基衍生化、蛋白裂解或被非天然存在的氨基酸修饰。多肽可源于天然生物来源或由重组技术产生，但是不一定从指定的核酸序列翻译。它可以任何方式产生，包括通过化学合成。
本发明多肽可以具有约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个或2,000个或更多个氨基酸的尺寸。多肽可以具有确定的三维结构，尽管它们不一定具有此类结构。具有确定的三维结构的多肽被称为折叠的，并且不具有确定三维结构但可采取许多不同构象的多肽被称为未折叠的。本文使用的术语糖蛋白指与至少一个糖部分偶联的蛋白，所述糖部分通过氨基酸残基例如丝氨酸残基或天冬酰胺残基的含氧或含氮侧链连接至蛋白。
“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物意欲是不在其天然环境中的多肽。不需要特定的纯化水平。例如，分离的多肽可以从其天然或自然环境去除。为本发明目的，认为在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白是分离的，是已经被分离、分级分离或通过任何适合技术部分或完全纯化的天然或重组多肽。
本发明多肽还包括前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体及其任意组合。当指本发明抗体或抗体多肽时，术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括保留相应天然结合分子、抗体或多肽的抗原结合性质的至少一些的任何多肽。除了本文其它地方讨论的具体抗体片段，本发明多肽的片段包括蛋白水解片段以及缺失片段。本发明的抗体和抗体多肽的变体包括如上所述片段，以及具有改变的氨基酸序列的多肽，所述改变由于氨基酸取代、缺失或插入。变体可以天然存在或非天然存在。非天然存在的变体可以使用本领域已知的诱变技术产生。变体多肽可以包含保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。α-突触核蛋白特异性结合分子，例如本发明的抗体和抗体多肽的衍生物是已经被改变而表现出天然多肽不存在的其它特征的多肽。实例包括融合蛋白。变体多肽在本文还可以称为“多肽类似物”。本文使用的结合分子或其片段、抗体或抗体多肽的“衍生物”指一个或多个残基通过官能侧链基团的反应被化学衍生化的本发明多肽。“衍生物”还包括含有20个标准氨基酸的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如，4-羟基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸；并且鸟氨酸可以取代赖氨酸。
术语“多核苷酸”意欲包括单一核酸以及多个核酸，并且指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包括常规磷酸二酯键或非常规键(例如，酰胺键，例如见于肽核酸(PNA))。术语“核酸”指任何一个或多个核酸区段，例如多核苷酸中存在的DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸意欲是核酸分子、DNA或RNA，其已经从其天然环境去除。例如，为本发明目的，认为编码载体中含有的抗体的重组多核苷酸是分离的。分离的多核苷酸的其它实例包括异源宿主细胞中保持的重组多核苷酸或溶液中的纯化(部分或完全)多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明多核苷酸的体内或体外RNA转录子。根据本发明的多核苷酸或核酸还包括合成产生的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调控元件，例如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
本文使用的“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸部分。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不被翻译成氨基酸，但可以认为它是编码区的部分，但任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等不是编码区的部分。本发明两个或多个编码区可以存在于单个多核苷酸构建体中，例如单个载体上，或单独多核苷酸构建体中，例如单独(不同)载体上。而且，任何载体可以含有单个编码区，或者含有两个或多个编码区，例如单个载体可以单独编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。此外，本发明载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，融合或未融合至编码结合分子、抗体或其片段、变体或衍生物的核酸。异源编码区包括但不限于专门的元件或基序，例如分泌信号肽或异源功能结构域。
在某些实施方案中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA情况下，包含编码多肽的核酸的多核苷酸可以包括与一个或多个编码区可操作地缔合的启动子和/或其它转录或翻译控制元件。可操作地缔合是基因产物例如多肽的编码区与一个或多个调控序列以使得基因产物在调控序列的影响或控制下表达的方式结合的情况。如果启动子功能的引入导致编码所需基因产物的mRNA的转录和如果两个DNA片段之间的连接性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或不干扰DNA模板转录的能力时，两个DNA片段(例如多肽编码区和与其结合的启动子)是“可操作地缔合”或“可操作连接”的。因此，如果启动子能够实现核酸的转录，则启动子区将与编码多肽的核酸可操作地缔合。启动子可以是细胞特异性启动子，其指导仅在预定细胞中的DNA的大量转录。除了启动子外的其它转录控制元件，例如增强子、操作子、阻遏子和转录终止信号可以与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。适合的启动子和其它转录控制区在本文公开。
许多转录控制区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，例如但不限于来自巨细胞病毒(与内含子-A结合的即刻早期启动子)、猿猴病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(例如劳氏肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其它转录控制区包括源自脊椎动物基因的那些，例如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β-球蛋白以及能够控制真核细胞基因表达的其它序列。其它适合的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子可诱导启动子(例如，可由干扰素或白介素诱导的启动子)。
类似地，许多翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子和源自小核糖核酸病毒的元件(特别是内核糖体进入位点，或IRES，还称为CITE序列)。
在其它实施方案中，本发明多核苷酸是RNA，例如信使RNA(mRNA)形式。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌或信号肽的其它编码区结合，所述分泌或信号肽指导由本发明多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，哺乳动物细胞分泌的蛋白具有信号肽或分泌前导序列，其在生长的蛋白链跨粗糙型内质网的排出已经开始时从成熟蛋白切割。本领域普通技术人员了解，脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有与多肽N-末端融合的信号肽，其从完整或“全长”多肽切割以产生分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或者保留指导与之可操作地缔合的多肽分泌的能力的该序列的功能衍生物。可选地，可使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以用人组织血纤维蛋白溶酶原激活子(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸酶的前导序列取代。
除非另外说明，术语“疾患”和“疾病”在本文可互换使用。
本发明上下文中使用的“结合分子”主要指抗体及其片段，但还可以指结合α-突触核蛋白的其它非抗体分子，包括但不限于激素、受体、配体、主要组织相容性复合物(MHC)分子、伴侣分子例如热休克蛋白(HSP)以及细胞细胞粘附分子例如钙粘蛋白、整联蛋白、C型凝集素、免疫球蛋白(Ig)超家族和合成结合分子的成员。因此，仅为了清楚且不限制本发明范围，下述实施方案的大部分就代表开发治疗剂和诊断剂的示例性结合分子的抗体和抗体样分子来讨论。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文可互换使用。抗体或免疫球蛋白是α-突触核蛋白结合分子，包含重链的至少可变结构域，并正常包含重链和轻链的至少可变结构域。相对充分地理解脊椎动物系统中基本的免疫球蛋白结构；参见例如Antibodies：A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版。1988)。
如下文更详细讨论的，术语“免疫球蛋白”包括各种广泛类别的多肽，其可以在生化上区分。本领域技术人员将理解，重链分类成γ、μ、α、δ、ε(γ、μ、α、δ、ε)，其中有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质是确定抗体“类别”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等是充分表征的，并且已知赋予功能特化。这些类别和同种型的每一个的修饰形式对于参考本公开内容的技术人员而言可容易辨别，并且因此在本发明范围内。所有免疫球蛋白类清楚地在本发明范围内，下述讨论一般涉及免疫球蛋白分子的IgG类。关于IgG，标准的免疫球蛋白分子包括分子量大约23,000道尔顿的两个相同的轻链多肽和分子量53,000-70,000的两个相同重链多肽。四个链通常通过二硫键以“Y”构型结合，其中轻链在“Y”口处包括重链并继续经过可变区。
轻链分类为κ或λ(κ，λ)。每个重链类别可以与κ或λ轻链结合。一般而言，轻链和重链彼此共价结合，并且当免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或基因工程宿主细胞产生时，两个重链的“尾”部分通过共价二硫键或非共价键合彼此结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的分叉端的N-末端运行至每个链的底部的C-末端。
轻链和重链都被分成结构和功能同源性区。术语“恒定”和“可变”是在功能上使用的。就这点而言，要理解，轻链(VL)和重链(VH)部分的可变结构域决定抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要的生物性质，例如分泌、经胎盘运动性、Fc受体结合、互补结合等。按照惯例，恒定区结构域的编号随它们远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。N-末端部分是可变区，并且C-末端部分是恒定区；CH3和CL结构域实际分别包含重链和轻链的羧基末端。
如上所示，可变区允许抗体选择性识别和特异性结合抗原表位。即，抗体的VL结构域和VH结构域或互补性决定区(CDR)的子集组合形成可变区，所述可变区确定三维抗原结合位点。该四级抗体结构形成存在于Y的每个臂的末端的抗原结合位点。更具体说，抗原结合位点由VH和VL链的每个上的三个CDR确定。含有足以特异性结合α-突触核蛋白的任何抗体或免疫球蛋白片段在本文可互换表示为“结合片段”或“免疫特异性片段”。
在天然存在的抗体中，抗体包含六个超变区，有时称为“互补性决定区”或“CDR”，存在于每个抗原结合结构域中，其是短的非连续氨基酸序列，当抗体在水环境中采取其三维构型时，将所述非连续氨基酸序列特别定位以形成抗原结合结构域。“CDR”侧翼具有四个相对保守的“框架”区或“FR”，其显示更少的分子内变异性。框架区主要采取β折叠构型，并且CDR形成连接β折叠结构的环，有些情况下形成β折叠结构的部分。因此，框架区作用为形成支架，所述支架通过链内非共价相互作用使CDR置于正确方向。定位的CDR形成的抗原结合结构域确定与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。该互补表面促进抗体与其同源表位的非共价结合。本领域普通技术人员容易鉴定任何给定重链或轻链可变区的分别包含CDR和框架区的氨基酸，因为它们已经被精确定义；参见“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，Kabat,Ε.等，美国健康与人类服务部，(1983)；和Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196(1987)，901-917，其通过引用整体并入本文。
当本领域使用和/或接受的术语存在两个或更多个定义时，除非明确指明相反，本文使用的术语的定义意欲包括所有此类含义。具体实例是使用术语“互补性决定区”(“CDR”)来描述重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。该具体区描述于Kabat等，美国健康与人类服务部，“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”(1983)和Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196(1987)，901-917，其通过引用并入本文，其中定义包括相互比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，指抗体或其变体的CDR的任一定义的应用预期在本文定义和使用的术语范围内。涵盖由上文引用的参考文献的每一个定义的CDR的适当的氨基酸残基列于下表1作为比较。涵盖特定CDR的精确残基数目将根据CDR的序列和尺寸而变化。根据抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可常规确定哪些残基构成抗体的人IgG亚型的特定高变区或CDR。
表1：CDR定义1
Kabat Chothia
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
1表1中所有CDR定义的编号是根据Kabat等提出的编号规定(参见下文)。
Kabat等还定义了适用于任何抗体的可变结构域序列的编号系统。本领域普通技术人员可以清楚对任何可变结构域序列指定该“Kabat编号”系统，而不依赖于超越序列本身的任何实验数据。本文使用的“Kabat编号”指由Kabat等，美国健康与人类服务部，“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)提出的编号系统。除非另外规定，对本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物具体氨基酸残基位置的编号的提及是根据Kabat编号系统。
本发明的抗体或其抗原结合片段、免疫特异性片段、变体或衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化、灵长类动物源化、鼠源化或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fv、单链Fv(ScFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、由Fab表达文库产生的片段和抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对本文公开的抗体的抗Id抗体)。ScFv分子是本领域已知的并且描述于例如美国专利5,892,019。本发明免疫球蛋白或抗体分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或免疫球蛋白分子的亚类。
在一个实施方案中，本发明抗体不是具有五价结构的IgM或其衍生物。特别地，在本发明的具体应用中，特别是治疗用途中，IgM比IgG和其它二价抗体或相应结合分子较无用，因为由于其五价结构和缺乏亲和力成熟，IgM经常显示出非特异性的交叉反应性和非常低的亲和力。
在一个实施方案中，本发明抗体不是多克隆抗体，即，其基本上由不同于从血浆免疫球蛋白样品获得的混合物的一种特定抗体物类组成。
包括单链抗体的抗体片段可以包括单独的可变区或与以下全部或一部分组合的可变区：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。本发明还包括α-突触核蛋白结合片段，还包含可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。本发明抗体或其免疫特异性片段可以来自任何动物来源，包括鸟和哺乳动物。在某些实施方案中，抗体是人、鼠、驴、兔、山羊、荷兰猪、骆驼、美洲鸵、马或鸡抗体。在另一实施方案中，可变区可以起源于海洋生物(condricthoid)(例如，来自鲨)。
一方面，本发明抗体是从人分离的人单克隆抗体。任选地，人抗体的框架区根据数据库中相关的人种系可变区序列比对和采用；参见例如MRC Centre forProteinEngineering(Cambridge，UK)管理的Vbase(vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)。例如，认为可能偏离真实种系序列的氨基酸可能归因于克隆过程中加入的PCR引物序列。与人工产生的人样抗体、例如来自噬菌体展示抗体文库或异种小鼠的单链抗体片段(scFv)相比，本发明的人单克隆抗体特征为(i)使用人免疫应答而不是动物替代物而获得，即，抗体响应于天然α-突触核蛋白在人体中以其相关构型产生，(ii)保护个体或者至少对于α-突触核蛋白的存在是重要的，和(iii)因为抗体起源于人，最大限度减小了针对自身抗原的交叉反应风险。因此，根据本发明，术语“人单克隆抗体”、“人单克隆自身抗体”、“人抗体”等用来指示起源于人的α-突触核蛋白结合分子，即，从人细胞、例如B细胞或其杂交瘤分离的，或其cDNA直接从人细胞、例如人记忆B细胞的mRNA克隆的。人抗体依然是“人”的，即使在抗体中进行氨基酸取代，例如以提高结合特征。
源于人免疫球蛋白文库或转基因一个或多个人免疫球蛋白并且不表达内源性免疫球蛋白的动物的抗体(如前所述和描述于例如Kucherlapati等的美国专利号5,939,598)被称为人样抗体以使它们区别于本发明真实的人抗体。
本文使用的术语“鼠源化抗体”或“鼠源化免疫球蛋白”指包含以下的抗体：来自本发明的人抗体的一个或多个CDR；和含有基于鼠抗体序列的氨基酸取代和/或缺失和/或插入的人框架区。提供CDR的人免疫球蛋白被称为“母体”或“受体”，并且提供框架改变的小鼠抗体被称为“供体”。恒定区不一定存在，但是如果有，它们通常与小鼠抗体恒定区基本上相同，即，至少约85-90%或约95%或更多相同。因此，在一些实施方案中，全长鼠源化人重链或轻链免疫球蛋白含有小鼠恒定区、人CDR和基本上人框架，其具有许多“鼠源化”氨基酸取代。通常，“鼠源化抗体”是包含鼠源化可变轻链和/或鼠源化可变重链的抗体。例如，鼠源化抗体将不涵盖典型的嵌合抗体，例如，因为嵌合抗体的完整可变区是非小鼠的。已经通过“鼠源化”过程“鼠源化”的修饰抗体与提供CDR的母体抗体结合相同抗原并且通常与母体抗体相比在小鼠中具有较小免疫原性。
本文使用的术语“重链部分”包括源自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链部分的多肽包含以下至少一个：CH1结构域、铰链(例如，上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域或其变体或片段。例如，用于本发明的结合多肽可以包括：包含CH1结构域的多肽链；包含CH1结构域、至少一部分铰链结构域和CH2结构域的多肽链；包含CH1结构域和CH3结构域的多肽链；包含CH1结构域、至少一部分铰链结构域和CH3结构域的多肽链，或包含CH1结构域、至少一部分铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域的多肽链。在另一实施方案中，本发明多肽包括：包含CH3结构域的多肽链。而且，用于本发明的结合多肽可能缺乏至少一部分CH2结构域(例如，CH2结构域的全部或部分)。如上所示，本领域普通技术人员将理解，可以修饰这些结构域(例如，重链部分)，使得它们的氨基酸序列与天然存在的免疫球蛋白分子不同。
在本文公开的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，多聚体的一个多肽链的重链部分与多聚体第二多肽链上的重链部分相同。可选地，本发明的含有重链部分的单体不是相同的。例如，每个单体可以含有不同的靶结合位点，形成例如双特异性抗体或双抗体。
在另一实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物由单多肽链例如scFv构成，并且将在细胞内表达(内抗体)，用于潜在的体内治疗和诊断应用。
用于本文公开的诊断和治疗方法的结合多肽的重链部分可以源自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可以包含源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链区。在另一实例中，重链部分可以包括部分源自IgG1分子且部分源自IgG3分子的铰链区。在另一实例中，重链部分可以包括部分源自IgG1分子且部分源自IgG4分子的嵌合铰链。
本文使用的术语“轻链部分”包括源自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。在一个实施方案中，轻链部分包括VL或CL结构域的至少一个。
据认为抗体的肽或多肽表位的最小尺寸是约4至5个氨基酸。肽或多肽表位优选含有至少7个、至少9个或至少约15至约30个氨基酸。因为CDR可以识别抗原肽或其四级形式的多肽，构成表位的氨基酸不一定是连续的，并且在一些情况下甚至可能不在相同肽链上。在本发明中，由本发明抗体识别的肽或多肽表位含有α-突触核蛋白的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少约15至约30个连续或不连续氨基酸的序列。如本文使用的，当称抗体结合在给定范围的氨基酸“之内”，例如结合“在α-突触核蛋白的氨基酸4至15之内”的表位时，它表示该表位涵盖所述氨基酸的完整范围或更小。换言之，对于“在α-突触核蛋白的氨基酸4至15之内”的表位，该表位可以包括4至15的完整的12个氨基酸肽链，但是也可以更小，例如氨基酸4至12、氨基酸4至10或氨基酸4至8。本领域普通技术人员还理解，所称范围之外的氨基酸可以促进构象表位的更好的结合亲和力或增加的识别，但不是结合所必需的。
在本文可互换使用的“特异性结合”或“特异性识别”，大体意思是结合分子例如抗体通过其抗原结合结构域结合表位，并且结合需要抗原结合结构域和表位之间一定的互补性。根据该定义，当抗体通过其抗原结合结构域结合表位比它结合随机无关表位更容易时，称该抗体“特异性结合”该表位。本文使用术语“特异性”来定性某些抗体结合某些表位的相对亲和力。例如，可以认为抗体“Α”具有对给定表位比抗体“B”更高的特异性，或者可以说抗体“Α”以比对相关表位“D”更高的特异性结合表位“C”。
当存在时，所有语法形式的术语抗体与抗原的“免疫结合特征”或其它结合特征指抗体的特异性、亲和力、交叉反应性和其它结合特征。
“优先结合”意思是结合分子例如抗体比它结合相关、相似、同源或类似表位更容易特异性结合一种表位。因此，“优先结合”给定表位的抗体将比相关表位更容易结合该表位，即使这种抗体可以与相关表位交叉反应。
作为非限制性实例，结合分子例如抗体以比第二表位的抗体KD更小的解离常数(KD)结合第一表位，则认为它优先结合第一表位。在另一非限制性实例中，如果抗体以比对第二表位的抗体KD小至少一个数量级的亲和力结合第一表位，则可以认为它优先结合第一抗原。在另一非限制性实例中，如果抗体以比对第二表位的抗体KD小至少两个数量级的亲和力结合第一表位，则可以认为它优先结合第一抗原。
在另一非限制性实例中，如果结合分子例如抗体以比对第二表位的抗体k(解离)小的解离速率(k(解离))结合第一表位，则可以认为它优先结合第一表位。在另一非限制性实例中，如果抗体以比对第二表位的抗体k(解离)小至少一个数量级的亲和力结合第一表位，则可以认为它优先结合第一表位。在另一非限制性实例中，如果抗体以比对第二表位的抗体k(解离)小至少两个数量级的亲和力结合第一表位，则可以认为它优先结合第一表位。
在一些实施方案中，本文公开的结合分子例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以小于或等于5×10-2sec-1、10-2sec-1、5×10-3sec-1或10-3sec-1的解离速率(k(解离))结合α-突触核蛋白或其片段或变体。在一些实施方案中，本发明抗体可以小于或等于5×10-4sec-1、10-4sec-1、5×10-5sec-1或10-5sec-15×10-6sec-1、10-6sec-1、5×10-7sec-1或10- 7sec-1的解离速率(k(解离))结合α-突触核蛋白或其片段或变体。
在一些实施方案中，本文公开的结合分子例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以大于或等于103M-1sec-1、5×103M-1sec-1、104M-1sec-1或5×104M-1sec-1的结合速率(k(结合))结合α-突触核蛋白或其片段或变体。在一些实施方案中，本发明抗体可以大于或等于105M-1sec-1、5×105M-1sec-1、106M-1sec-1或5×106M-1sec-1或107M-1sec-1的结合速率(k(结合))结合α-突触核蛋白或其片段或变体。
如果结合分子例如抗体优先结合表位达到该抗体在一定程度上阻断参考抗体与该表位结合的程度，则称该结合分子例如抗体竞争性抑制参考抗体与给定表位的结合。竞争性抑制可以通过本领域已知的任何方法、例如竞争ELISA分析测定。作为例子，抗体可以竞争性抑制参考抗体与给定表位的结合至少90%、至少80%、至少70%、至少60%或至少50%。
本文使用的术语“亲和力”指个体表位与结合分子例如免疫球蛋白分子的CDR结合强度的量度；参见例如Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，第2版(1988)，第27-28页。本文使用的术语“亲合力”指一群免疫球蛋白与抗原之间复合的总体稳定性，即，免疫球蛋白混合物与抗原的功能结合强度；参见例如Harlow，第29-34页。亲合力与群体中个体免疫球蛋白分子与特异性表位的亲和力以及免疫球蛋白和抗原的价有关。例如，二价单克隆抗体和具有高度重复表位结构的抗原例如聚合物之间的相互作用将是高亲合力之一。抗体对抗原的亲和力或亲合力可以使用任何适当方法实验测定；参见例如Berzofsky等，“Antibody-Antigen Interactions”FundamentalImmunology，Paul,W.Ε.编辑，Raven Press New York，N Y(1984)，Kuby，JanisImmunology，W.H.Freeman and Company New York，N Y(1992)和本文描述的方法。用于测量抗体对抗原亲和力的一般技术包括ELISA、RIA和表面等离子体共振。如果在不同条件例如盐浓度、pH下测量，特定抗体-抗原相互作用的测量的亲和力可以改变。因此，亲和力和其它抗原结合参数例如KD、IC50的测量用标准化的抗体和抗原溶液和标准化缓冲液进行。
本发明结合分子例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还可以就其交叉反应性来描述或规定。本文使用的术语“交叉反应性”指针对一种抗原的抗体与第二抗原反应的能力；两种不同抗原物质相关性的量度。因此，如果抗体结合不同于诱导其形成的表位，则抗体具有交叉反应性。交叉反应性表位一般含有许多与诱导表位相同的互补结构特征，并且在一些情况下可以实际上比初始表位更适合。
例如，某些抗体具有一定程度的交叉反应性，因为它们结合相关但不相同的表位，例如与参考表位具有至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%和至少50%同一性(使用本领域已知和本文描述的方法计算)的表位。在一些实施方案中，如果抗体不结合与参考表位具有小于95%、小于90%、小于85%、小于80%、小于75%、小于70%、小于65%、小于60%、小于55%和小于50%同一性(使用本领域已知和本文描述的方法计算)的表位，则可以说该抗体具有很少或没有交叉反应性。如果抗体不结合某个表位的任何其它类似物、直向同系物或同源物，可以认为该抗体对该表位具有“高度特异性”。
本发明结合分子例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还可以就其对α-突触核蛋白的结合亲和力来描述或规定。结合亲和力包括具有小于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M的解离常数或Kd的那些。
如前所示，各种免疫球蛋白类别的恒定区的亚基结构和三维构型是公知的。本文使用的术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，并且术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(极氨基末端)恒定区结构域。CH1结构域与VH结构域相邻，并且在免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。
本文使用的术语“CH2结构域”包括使用常规编号方案(残基244至360，Kabat编号系统；和残基231-340，EU编号系统；参见Kabat EA等，同上)例如从抗体的约残基244延伸至残基360的重链分子部分。CH2结构域是独特的，因为它不与另一结构域紧密配对。而是，两个N连接的分支糖链介于完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。还充分记载了，CH3结构域从CH2结构域延伸至IgG分子的C-末端并且包括大约108个残基。
本文使用的术语“铰链区”包括CH1结构域结合至CH2结构域的重链分子部分。该铰链区包括大约25个残基并且是柔性的，因此允许两个N-末端抗原结合区独立移动。铰链区可以被细分成三个不同的结构域：上、中和下铰链结构域；参见Roux等，J.Immunol.161(1998)，4083。
本文使用的术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包括可以与第二硫醇基形成二硫键或桥的硫醇基。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接，并且两个重链在对应于使用Kabat编号系统的239和242的位置(位置226或229，EU编号系统)通过两个二硫键连接。
本文使用的术语“连接的”、“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语指两个或多个元件或组分通过任何方式结合在一起，所述方式包括化学结合或重组方式。“框内融合”指两个或多个多核苷酸开放阅读框(ORF)以维持最初ORF正确翻译阅读框的方式结合形成连续的更长的ORF。因此，重组融合蛋白是含有对应于由最初ORF编码的多肽的两个或多个区段的单一蛋白(所述区段正常在自然界中不如此结合)。尽管阅读框如此制成在整个融合区段是连续的，但所述区段可以在物理上或空间上被例如框内连接体序列分开。例如，编码免疫球蛋白可变区的CDR的多核苷酸可以框内融合但被编码至少一个免疫球蛋白框架区或其它CDR区的多核苷酸分开，只要“融合的”CDR作为连续多肽的部分而被共翻译。
本文使用的术语“表达”指基因产生生化物质例如RNA或多肽的过程。该过程包括细胞内基因的功能性存在的任何表现，包括但不限于基因敲低以及瞬时表达和稳定表达。这包括但不限于基因转录成信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其它RNA产物，以及此类mRNA翻译成多肽。如果最终需要的产物是生化物质，表达包括该生化物质和任何前体的产生。基因表达产生“基因产物”。本文使用的基因产物可以是核酸，例如通过基因转录产生的信使RNA，或者从转录子翻译的多肽。本文描述的基因产物还包括具有转录后修饰例如聚腺苷酸化的核酸或者具有翻译后修饰例如甲基化、糖基化、脂质添加、与其它蛋白亚基缔合、蛋白裂解等的多肽。
本文使用的术语“样品”指从受试者或患者获得的任何生化材料。一方面，样品可以包括血液、脑脊髓液(“CSF”)或尿。在其它方面，样品可以包括全血、血浆、从血液样品富集的B细胞和培养的细胞(例如来自受试者的B细胞)。样品还可以包括活检或组织样品，包括神经组织。在其它方面，样品可以包括全细胞和/或细胞裂解物。血液样品可以通过本领域已知的方法收集。一方面，沉淀可以通过在4℃在200μl缓冲液(20mM Tris，pH7.5，0.5%Nonidet，1mMEDTA，1mM PMSF，0.1M NaCl，IX Sigma蛋白酶抑制剂和IX Sigma磷酸酶抑制剂1和2中涡旋来重悬。悬液可以保持在冰上20分钟，伴随断续的涡旋。在约4℃，15,000x g旋转5分钟后，将小份上清液保存在约-70℃。
本文使用的术语“治疗”或“治疗”指治疗性治疗和预防性或预防性措施，其中目标是预防或减缓(减少)不希望的生理变化或疾患，例如帕金森病的发展。有益或希望的临床结果包括但不限于症状缓解、疾病程度的减少、稳定(即，不恶化)疾病状态、延迟或减缓疾病进展、缓解或减轻疾病状态和消除(部分或完全)，无论是可检测还是不可检测的。“治疗”还表示与没有接受治疗的预期存活相比延长的存活。需要治疗的那些包括患有病症或疾患的那些以及易于患有病症或疾患的那些或者其中要预防病症或疾患表现的那些。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”表示需要诊断、预后、预防或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者，例如人患者。
II.抗体
本发明整体涉及人抗α-突触核蛋白抗体及其抗原结合片段，其可以证明如针对实施例中描述的抗体所列的免疫结合特征和/或生物性质。根据本发明，对α-突触核蛋白特异性的人单克隆抗体从老年受试者群体克隆。
在根据本发明进行的实验过程中，最初尝试未能克隆α-突触核蛋白特异性抗体，但几乎总是得到假阳性克隆。这些克隆的进一步考察揭示，它们产生识别大肠杆菌蛋白的抗体。为了规避该问题，对人记忆B细胞培养物的条件培养基中的抗体平行选择对涂布的全长α-突触核蛋白单体的结合和对大肠杆菌蛋白和牛血清白蛋白(BSA)结合的缺乏。具体说，B细胞条件培养基在接受ELISA分析以选择结合人抗体的α-突触核蛋白之前用大肠杆菌蛋白预吸收。
分离特异性抗体的最初尝试集中于对α-突触核蛋白具有高血清结合活性的人受试者群，表明升高的循环α-突触核蛋白抗体血浆水平。这些尝试未能产生α-突触核蛋白特异性人记忆B细胞，并且本发明描述的抗体从对α-突触核蛋白具有低血浆反应性的受试者群分离。
通过该措施，分离了几种抗体。进一步分析选择的抗体以确定类别和轻链亚类。选择的相关抗体从记忆B细胞培养物传递信息，然后通过RT-PCR转录，克隆并组合入用于重组产生的表达载体；参见PCT公开号WO2010/069603A1。示例性抗人α-突触核蛋白抗体NI-202.12F4、NI-202.3G12和NI-202.3D8公开于PCT公开号WO2010/069603A1。
本文公开了人单克隆抗体NI-202.22D11。确定了NI-202.22D11在ΗΕΚ293或CHO细胞中的重组表达和随后鉴定其对人α-突触核蛋白的结合特异性(图2A-B)。因此，本发明一个方面涉及分离的人单克隆抗α-突触核蛋白抗体NI-202.22D11及其抗原结合片段、衍生物和变体。本发明还涉及结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中所述抗体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO14或SEQ ID NO20的VH和具有氨基酸序列SEQ ID NO22或SEQ ID NO:26的VL或其抗原结合片段、变体或衍生物。在一个实施方案中，NI-202.22D11及其变体、片段或衍生物特征为与人β突触核蛋白和γ-突触核蛋白相比特异性结合人α-突触核蛋白，并且与鼠α-突触核蛋白相比特异性结合人α-突触核蛋白。NI-202.22D11优先结合寡聚体或聚集形式的α-突触核蛋白。
在一个实施方案中，本发明涉及抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中抗体与参考抗体NI-202.22D11特异性结合α-突触核蛋白的相同表位。如实施例所描述的，在直接ELISA测定中，抗体NI-202.22D11结合含有C-末端酸性区域(氨基酸96-140)的α-突触核蛋白截短物，例如在SEQ ID NO:1的氨基酸113至123内，并且特异性结合氨基酸PVDPDNE(SEQ ID NO:1的氨基酸117-123)之内的表位。
如实施例2所示，抗体NI-202.22D11优先结合α-突触核蛋白聚集物或原纤维，超过α-突触核蛋白的单体形式。而且，抗体NI-202.22D11结合脑中α-突触核蛋白的病理形式，例如实施例3描述的免疫组织学染色所示例的α-突触核蛋白的病理聚集物。因此，本发明提供了用于诊断和治疗目的的新的人抗α-突触核蛋白抗体。
在一个实施方案中，本发明提供了结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其表现出PCT公开号WO2010/069603A1中描述的示例性NI-202.12F4抗体的精确结合性质。本发明提供了结合α-突触核蛋白的N-末端表位的结合分子，例如在SEQ ID NO:1的氨基酸4至15之内结合的结合分子。某些实施方案提供了在SEQ ID NO:1的氨基酸4至15之内结合的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，但排除包含以下的抗体或其片段、变体或衍生物：NI-202.12F4的VH(SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9)、VL(SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:14)、VHCDR1(SEQ ID NO:6)、VHCDR2(SEQ ID NO:7)、VHCDR3(SEQ IDNO：8)、VLCDR1(SEQ ID NO:11)、VLCDR2(SEQ ID NO:12)和/或VLCDR3(SEQ ID NO:13)。
本发明还提供了结合分子，例如抗体及其抗原结合片段、变体或衍生物，其包含NI-202.22D11VH和/或VL可变区的至少1、2、3、4、5或6个互补性决定区(CDR)，包括图1所示的氨基酸序列的任一个。编码上述可变区的相应的核苷酸序列列于所附序列表中。图1所示VH和/或VL区的上述氨基酸序列的示例性的一组CDR也在所附序列表中指示。然而，如下文所讨论的，本领域技术人员充分了解以下事实：附加地或可选地，可以使用其氨基酸序列与图1所列的那些有1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸差异的CDR。NI-202.22D11的VH由氨基酸序列SEQ ID NO:15和DNA序列SEQ ID NO:19表示，并且其GL校正形式表示为氨基酸序列SEQ ID NO:20和DNA序列SEQ ID NO:21。NI-202.22D11的VL由氨基酸序列SEQ ID NO:22和DNA序列SEQ ID NO:28表示，并且其GL校正形式表示为氨基酸序列SEQ ID NO:26和DNA序列SEQ ID NO:27。VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3的重链CDR氨基酸序列分别由SEQ IDNO16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18表示。VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3的轻链CDR氨基酸序列分别由SEQ ID NO23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25表示。
在一个实施方案中，本发明的结合分子例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物是包含图1所示VH和/或VL区的氨基酸序列的抗体的任何一个。可选地，本发明抗体是结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其与具有图1所示VH和/或VL区的抗体竞争结合α-突触核蛋白。那些抗体可以是人的，特别用于治疗应用。可选地，抗体是鼠的、鼠源化的和嵌合的鼠-人抗体，其特别用于诊断方法和动物研究。
如上所述，由于其在人免疫应答后产生，本发明的人单克隆抗体将识别具有特定生理相关性并且可能分别在用于产生例如小鼠单克隆抗体的免疫过程中和噬菌体展示文库的体外选择中不可及或较少免疫原性的表位。因此，本发明的人抗α-突触核蛋白抗体的表位可能是独特的。因此，本发明还整体延伸至与本发明的人单克隆抗体竞争特异性结合α-突触核蛋白的抗α-突触核蛋白抗体和α-突触核蛋白结合分子。本发明更特别涉及结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中所述抗体与参考抗体NI-202.22G11特异性结合α-突触核蛋白的相同表位。
抗体之间的竞争可以例如通过其中测试下的免疫球蛋白抑制参考抗体与共同抗原例如α突触核蛋白特异性结合的测定来确定。许多类型的竞争性结合测定是已知的，例如：固相直接或间接放射免疫分析(RIA)、固相直接或间接酶免疫分析(EIA)、夹心竞争分析；参见Stahli等，Methods in Enzymology9(1983)，242-253；固相直接生物素-亲和素EIA；参见Kirkland等，J.Immunol.137(1986)，3614-3619和Cheung等，Virology176(1990)，546-552；固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定；参见Harlow和Lane，Antibodies,ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press(1988)；使用I125标记的固相直接标记RIA；参见Morel等，Molec.Immunol.25(1988)，7-15和Moldenhauer等，Scand.J.Immunol.32(1990)，77-82。通常，此类分析涉及使用与固体表面结合的纯化的α-突触核蛋白或其聚集物或具有这些任一种的细胞，未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白，即本发明的人单克隆抗体。竞争性抑制通过测定在测试免疫球蛋白存在下与固体表面结合的标记或细胞的量来测量。通常，测试免疫球蛋白过量存在。竞争性结合测定在所附实施例中对ELISA测定所描述的条件下进行。竞争测定鉴定的抗体(竞争抗体)包括与参考抗体结合相同表位的抗体和与参考抗体结合的表位足够近以发生空间位阻的相邻表位的抗体。通常，当竞争抗体过量存在时，它将抑制参考抗体与共同抗原特异性结合的至少50%或75%。因此，本发明还涉及结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中所述抗体竞争性抑制参考抗体NI-202.22G11与α-突触核蛋白的结合。
还公开了特异性结合人α-突触核蛋白的分离的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段，包含与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:20至少80%、85%、90%、95%或100%同一的免疫球蛋白重链可变区(VH)氨基酸序列。
还公开了特异性结合人α-突触核蛋白的分离的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段，包含与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:20相同或除了1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸取代之外相同的VH氨基酸序列。
还公开了特异性结合人α-突触核蛋白的分离的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段，包含与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:26至少80%、85%、90%、95%或100%同一的免疫球蛋白轻链可变区(VL)氨基酸序列。
一些实施方案公开了特异性结合人α-突触核蛋白的分离的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段，包含与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:26相同或除了1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸取代之外相同的VL氨基酸序列。
在其它实施方案中，特异性结合人α-突触核蛋白的分离的抗体或其抗原结合片段包括与以下至少80%、85%、90%、95%或100%同一的VH和VL氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成：(a)分别是SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:22，(b)分别是SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:26，(c)分别是SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22，(d)分别是SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:26。
还公开了特异性结合人α-突触核蛋白的分离的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段，包括免疫球蛋白重链可变区(VH)、基本上由其组成或由其组成，其中重链可变区的至少1、2或全部3个VH-CDR与分别由SEQ ID NO16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18表示的图1中的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列至少80%、85%、90%或95%同一。因此，根据该实施方案，本发明的重链可变区具有与分别由SEQ ID NO16、SEQ ID NO:17和SEQ IDNO:18表示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列相关的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3多肽序列。而图1显示由Kabat系统定义的VH-CDR，其它CDR定义，例如由Chothia系统定义的VH-CDR，也包括在本发明中，并且可以容易由本领域普通技术人员使用所示序列数据来鉴定。
还公开了特异性结合人α-突触核蛋白的分离的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段，包括免疫球蛋白重链可变区(VH)、基本上由其组成或由其组成，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与分别由SEQ ID NO16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18表示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列相同的多肽序列。
还公开了特异性结合人α-突触核蛋白的分离的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段，包括免疫球蛋白重链可变区(VH)、基本上由其组成或由其组成，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与分别由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18表示的VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列相同或除了任何一个VH-CDR中1、2、3、4、5或6个氨基酸取代之外相同的多肽序列。还提供了免疫球蛋白重链可变区(VH)，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与分别由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQID NO:18表示的氨基酸序列相同或除了5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或20个总CDR取代之外相同的多肽序列。在某些实施方案中，氨基酸取代是保守的。
还公开了特异性结合人α-突触核蛋白的分离的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段，包括免疫球蛋白轻链可变区(VL)、基本上由其组成或由其组成，其中轻链可变区的至少1、2或全部3个VL-CDR与分别由SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25表示的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列至少80%、85%、90%或95%同一。因此，根据该实施方案，本发明的轻链可变区具有与图1所示并且分别由SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25表示的多肽相关的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3多肽序列。而图1显示由Kabat系统定义的VL-CDR，其它CDR定义，例如由Chothia系统定义的VL-CDR，也包括在本发明中。
还公开了特异性结合人α-突触核蛋白的分离的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段，包括免疫球蛋白轻链可变区(VL)、基本上由其组成或由其组成，其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有与图1所示并且分别由SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25表示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3组相同的多肽序列。
还公开了特异性结合人α-突触核蛋白的分离的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段，包括免疫球蛋白轻链可变区(VL)、基本上由其组成或由其组成，其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有与分别由SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25表示的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列相同或除了任何一个VL-CDR中1、2、3、4、5或6个氨基酸取代之外相同的多肽序列。还提供了免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有与分别由SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25表示的氨基酸序列相同或除了5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个总CDR取代之外相同的多肽序列。在某些实施方案中，氨基酸取代是保守的。
可以进一步修饰免疫球蛋白或其编码cDNA。因此，在其它实施方案中，本发明方法包括产生那些的任何一个的嵌合抗体、鼠源化抗体、单链抗体、Fab片段、双特异性抗体、融合抗体、标记抗体或类似物的步骤的任何一个。相应的方法是本领域技术人员已知的，并且描述于例如Harlow和Lane“Antibodies,A Laboratory Manual”，CSH Press，Cold SpringHarbor(1988)。当所述抗体的衍生物通过噬菌体展示技术获得时，BIAcore系统中采用的表面等离子体共振可以用于增加与本文描述的抗体的任何一个结合相同表位的噬菌体抗体的效率(Schier，Human Antibody Hybridomas7(1996)，97-105；Malmborg，J.Immunol.Methods183(1995)，7-13)。嵌合抗体的产生描述于例如国际申请WO89/09622。用于产生人源化抗体的方法描述于例如欧洲申请EP-A10239400和国际申请WO90/07861。根据本发明使用的其它来源的抗体是所谓的异种抗体。在小鼠中产生异种抗体例如人样抗体的一般原理描述于例如国际申请WO91/10741、WO94/02602、WO96/34096和WO96/33735。如上所讨论的，本发明抗体除了完整抗体以外可以多种形式存在；包括例如Fv、Fab和F(ab)2以及单链，例如scFv；参见例如国际申请WO88/09344。
本发明抗体或其相应的免疫球蛋白链可以进一步使用本领域已知的常规技术修饰，例如通过使用单独或组合的氨基酸缺失、插入、取代、添加和/或重组和/或本领域已知的任何其它修饰。用于在免疫球蛋白链的氨基酸序列的DNA序列中引入此类修饰的方法是本领域技术人员公知的；参见例如Sambrook，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.和Ausubel，Current Protocols inMolecular Biology，Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.(1994)。本发明抗体的修饰包括在一个或多个组成氨基酸的化学和/或酶衍生化，包括侧链修饰、骨架修饰和N-末端和C-末端修饰，包括乙酰化、羟基化、甲基化、酰胺化和连接糖类或脂质部分、辅因子等。同样，本发明包括产生嵌合蛋白，包含与在羧基末端的异源分子例如免疫刺激配体融合的在氨基末端的所述抗体或其一些片段；关于相应的技术细节，参见例如国际申请WO00/30680。
此外，本发明涵盖包括含有如上所述结合分子的那些，例如含有所述抗体的任何一个的可变区的CDR3区，特别是重链的CDR3，因为已经频繁发现，重链CDR3(HCDR3)是具有更大程度的变异性并且主要参与抗原-抗体相互作用的区。可以容易合成或通过重组方式产生此类肽以产生根据本发明使用的结合剂。此类方法是本领域普通技术人员公知的。肽可以例如使用商业途径可获得的自动化肽合成仪合成。肽还可以通过重组技术产生，通过将表达肽的DNA整合入表达载体并用该表达载体转化细胞以产生肽。
因此，本发明涉及定向本发明的人抗α-突触核蛋白抗体并展示所述性质，即特异性识别α-突触核蛋白的任何结合分子，例如抗体或其结合片段。可以通过本文所述的ELISA和Western印记以及免疫组织化学测试此类抗体和结合分子的结合特异性和亲和力，参见例如实施例。而且，根据本发明进行的随后实验的初步结果揭示，本发明的人抗α-突触核蛋白抗体，特别是抗体NI-202.22D11，识别罹患路易体痴呆(DLB)或帕金森病(PD)的患者的人脑切片上存在的α-突触核蛋白包涵体。因此，在本发明特别的一个实施方案中，人抗体或其结合片段、衍生物或变体识别人DLB或PD脑切片上的α-突触核蛋白(参见例如图4c)。
永生B细胞或B记忆细胞可用作重排重链和轻链基因座的来源，用于随后表达和/或基因操作。重排抗体基因可以从适当的mRNA逆转录以产生cDNA。如果需要，重链恒定区可以被换成不同同种型的重链恒定区或者被完全消除。可以工程化核苷酸序列以去除不想要的基序(例如剪接位点或限制位点)，并且可以为其中要表达抗体或其片段的细胞优化密码子使用。此外，可以做出改变可变区中氨基酸的一个或多个突变以例如增加亲和力或提高稳定性。可以连接可变区以编码单链Fv区。可以连接多个Fv区以赋予超过一个靶的结合亲和力，或者可以采用嵌合重链和轻链组合。一旦可获得遗传材料，保留其结合预期靶的能力的上述类似物的设计是直接的。用于克隆抗体可变区和产生重组抗体的方法是本领域技术人员已知的并且描述于例如Gilliland等，Tissue Antigens47(1996)，1-20；Doenecke等，Leukemia11(1997)，1787-1792。
一旦获得适当的遗传材料并且按需要修饰以编码类似物，则可以将编码序列，包括最少编码重链和轻链可变区的那些，插入载体上含有的表达系统，可以将所述载体转染入标准的重组宿主细胞。可以使用许多此类宿主细胞；为了有效加工。用于该目的的典型哺乳动物细胞系包括但不限于CHO细胞、HEK293细胞或NSO细胞。
然后通过在适合宿主细胞生长和编码序列表达的培养条件下培养修饰的重组宿主进行抗体或类似物的产生。然后通过从培养物分离它们而回收抗体。可以设计表达系统以包括信号肽，以便得到的抗体被分泌入培养基；然而，细胞内产生也是可能的。
根据上文，本发明还涉及编码本发明抗体或等同结合分子、上述抗α-突触核蛋白抗体的免疫球蛋白链的一个或多个CDR、重链或轻链可变区的一个或多个或其变体的多核苷酸。
本领域技术人员容易理解，抗体的可变结构域或其任何部分可用于构建具有预期特异性和生物功能的其它多肽或抗体。因此，本发明还提供含有NI-202.22D11抗体的至少一个重链或轻链CDR或具有1、2、3、4或更多氨基酸取代的此类CDR的多肽和抗体，其可以具有与NI-202.22D11基本相同或相似的结合性质，描述于所附实施例。本领域技术人员了解该结合亲和力可以通过在CDR内或高变环内进行氨基酸取代来增强(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196(1987)，901-917)，其与Kabat定义的CDR部分重叠；参见例如Riechmann等，Nature332(1988)，323-327。因此，本发明还涉及其中所述CDR的一个或多个包括一个或多个氨基酸取代的抗体。在某些实施方案中，本发明抗体在其免疫球蛋白链的一个或两个中包括如图1所示的可变区的两个或全部三个CDR(初始或校正的)。
本领域普通技术人员知道，本发明结合分子例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以包括介导一种或多种效应功能的恒定区。例如，与抗体恒定区互补的C1成分的结合可以激活补体系统。补体激活在细胞病原体调理和裂解中是重要的。补体激活还刺激炎症反应，并且还参与自身免疫超敏性。而且，抗体通过Fc区与各种细胞上的受体结合，抗体Fc区上Fc受体结合位点结合细胞上的Fc受体(FcR)。有许多对不同类别抗体特异性的Fc受体，包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)和IgM(mu受体)。抗体与细胞表面Fc受体的结合引发许多重要且多样的生物反应，包括抗体包被粒子的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、杀伤细胞对抗体包被靶细胞的裂解(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、炎症介质的释放、胎盘转移和免疫球蛋白生产的控制。
因此，本发明某些实施方案包括抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中恒定区结构域的一个或多个的至少一部分已经缺失或以其它方式改变以提供希望的生化性质，例如减少的效应功能、非共价二聚合的能力、增加的在α-突触核蛋白聚集和沉积部位定位的能力、与大致相同的免疫原性的完整的未改变的抗体相比减少的血清半衰期或增加的血清半衰期。例如，用于本文描述的诊断和治疗方法的某些抗体是结构域缺失抗体，其包含与免疫球蛋白重链类似的多肽链，但缺少一个或多个重链结构域的至少一部分。例如，在某些抗体中，修饰抗体的恒定区的一个完整结构域将缺失，例如，CH2结构域的全部或部分将缺失。在其它实施方案中，用于本文描述的诊断和治疗方法的某些抗体具有恒定区，例如IgG重链恒定区，其被改变以消除糖基化，在本文其它地方称为非糖基化的或“agly”抗体。此类“agly”抗体可以酶法制备或者通过改造恒定区中共有糖基化位点来制备。虽然不受理论束缚，但认为“agly”抗体可以在体内具有提高的安全性和稳定性。产生具有希望的效应功能的非糖基化抗体的方法参见例如国际申请WO2005/018572，其通过引用整体并入。
在某些本文描述的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，Fc部分可以使用本领域已知的技术突变以增加效应功能。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其它方式)可以减少循环修饰抗体的Fc受体结合，从而增加α-突触核蛋白定位。在其它情况下，与本发明一致的恒定区修饰缓和补体结合并因此减少血清半衰期和结合细胞毒素的非特异性缔合。而恒定区的其它修饰可用于修饰二硫键或寡糖部分，其允许增强的定位，因为增加的抗原特异性或抗体柔性。无过度实验下，可以使用公知的免疫学技术容易地测量和定量得到的生理特征、生物利用率和修饰的其它生化作用，例如α-突触核蛋白定位、生物分布和血清半衰期。
在某些本文描述的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，Fc部分可以被突变或交换可选的蛋白序列以增加抗体的细胞摄取，例如通过增强经由Fcγ受体、LRP或Thy1受体的受体介导的抗体胞吞或通过“超级抗体技术”，据说“超级抗体技术”能使抗体穿梭进入活细胞而不伤害它们(Expert Opin.Biol.Ther.(2005)，237-241)。例如，可以使用本领域已知技术来工程化抗体结合区和细胞表面受体的同源蛋白配体或双-或多-特异性抗体与结合α-突触核蛋白以及细胞表面受体的特异性序列的融合蛋白的产生。
在某些本文描述的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，Fc部分可以被突变或交换可选蛋白序列，或者抗体可以被化学修饰以增加其血液脑屏障穿透。
可以使用本领域已知的技术从完整前体或母体抗体制备本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的修饰形式。示例性技术在本文更详细讨论。可以使用本领域已知的技术制备或生产本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。在某些实施方案中，抗体分子或其片段是“重组产生的”，即使用重组DNA技术产生。制备抗体分子或其片段的示例性技术在本文其它地方更详细讨论。
本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还包括例如通过共价连接任何类型的分子至抗体以使得共价连接不妨碍抗体特异性结合其同源表位而修饰的衍生物。例如但不限于，抗体衍生物包括已经例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护基/封端基的衍生化、蛋白裂解、与细胞配体或其它蛋白连接等修饰的抗体。许多化学修饰的任何一个可以通过已知技术进行，包括但不限于具体的化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，衍生物可以含有一个或多个非经典氨基酸。
在某些实施方案中，本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物不会在待治疗动物例如人中引起有害的免疫应答。在某些实施方案中，本发明结合分子例如抗体或其抗原结合片段源自患者，例如人患者，并且随后用于衍生它们的相同物种，例如人中，缓解或最小化有害免疫应答的发生。
去免疫也可以用于减少抗体的免疫原性。本文使用的术语“去免疫”包括改变抗体以修饰T细胞表位；参见例如国际申请WO98/52976和WO00/34317。例如，分析来自起始抗体的VH和VL序列，并且来自每个V区的人T细胞表位“图”显示相对于互补性决定区(CDR)和序列内其它关键残基的表位定位。分析来自T细胞表位图的个体T细胞表位以鉴定低风险改变最终抗体活性的可选氨基酸取代。设计了包含氨基酸取代组合的一系列可选VH和VL序列，并且随后将这些序列整合入一系列用于本文公开的诊断和治疗方法的结合多肽，例如α-突触核蛋白特异性抗体或其免疫特异性片段，然后测试其功能。通常，产生并测试12至24个变体抗体。然后将包含修饰的V和人C区的完整重链和轻链基因克隆入表达载体，并将随后质粒引入细胞系以产生完整抗体。然后将抗体在适当的生化和生物测定中比较，鉴定最佳变体。
可以使用本领域已知的多种技术制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤技术、重组技术和噬菌体展示技术或其组合。例如，可以使用杂交瘤技术产生单克隆抗体，包括本领域已知的那些和例如Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，第2版(1988)；Hammerling等，Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas Elsevier，N.Y.，563-681(1981)中教导的那些，所述参考文献通过引用整体并入。本文使用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指从单个克隆衍生的抗体，包括任何真核、原核或噬菌体克隆，而不是产生它的方法。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。在某些实施方案中，本发明抗体衍生自已经通过用EB病毒转化而永生化的人B细胞，如本文所述。
在公知的杂交瘤方法(Kohler等，Nature256(1975)，495)中，来自哺乳动物的相对短命或致命的淋巴细胞，例如本文所述衍生自人受试者的B细胞，与永生肿瘤细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)融合，因此产生永生且能够产生B细胞的遗传编码抗体的杂交瘤细胞或“杂交瘤”。通过选择、稀释和再生含有用于形成单抗体的特定基因的每个个体菌株而将得到的杂交细胞分离成单遗传菌株。它们产生对预期抗原同源的抗体，并且在提及其纯的遗传谱系时，被称为“单克隆的”。
在适合的培养基中接种并培养由此制备的杂交瘤细胞，所述培养基可以含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。本领域技术人员将理解，用于杂交瘤形成、选择和生长的试剂、细胞系和培养基可商业途径获自许多来源，并且标准化方案是完善的。一般，测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基中针对希望抗原的单克隆抗体的产生。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过本文所述体外测定例如免疫沉淀、放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定。在鉴定产生具有希望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，克隆可以通过限制稀释程序来亚克隆并通过标准方法培养；参见例如Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，pp59-103(1986)。还要理解，由亚克隆分泌的单克隆抗体可以通过常规纯化程序从培养基、腹水或血清分离，所述纯化程序例如蛋白A、羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱。
在另一实施方案中，可以通过显微操作来选择淋巴细胞并分离可变基因。例如，外周血单核细胞可以从免疫的或天然免疫哺乳动物例如人分离，并在体外培养约7天。可以选择培养物中满足选择标准的特异性IgG。可以分离来自阳性孔的细胞。可以通过FACS或者通过在补体介导的溶血空斑测定中鉴定它们来分离个体的Ig生成B细胞。可以将Ig生成B细胞显微操作进入管中，并且可以使用例如RT-PCR来扩增VH和VL基因。可以将VH和VL基因克隆入抗体表达载体并转染入细胞(例如真核细胞或原核细胞)用于表达。
可选地，可以使用技术人员公知的技术选择并培养抗体生成细胞系。此类技术描述于许多实验手册和主要出版物。就这方面而言，如下所述适用于本发明的技术描述于Current Protocols in Immunology，Coligan等编辑，Green Publishing Associates andWiley-Interscience，John Wiley and Sons，New York(1991)，其在此通过引用整体并入，包括增刊。
可以通过已知技术产生识别特异性表位的抗体片段。例如，可以重组产生或通过免疫球蛋白分子的蛋白裂解产生Fab和F(ab')2片段，使用酶例如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab')2片段)。F(ab')2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。此类片段适合用于例如免疫诊断程序，涉及将免疫球蛋白的免疫特异性部分偶联至检测试剂例如放射性同位素。
例如本文所述的完全人抗体特别适合用于人患者的治疗性治疗。本发明的人抗体例如从因为年龄而可能怀疑处于发生疾患例如帕金森病的风险的老年受试者分离，或者从具有疾患但具有异常稳定病程的患者分离。然而，尽管谨慎预期老年健康和无症状受试者将各自比年轻受试者更有规律地产生保护性抗α-突触核蛋白抗体，但年轻受试者也被用作获得本发明人抗体的来源。这对易于发生家族型突触核蛋白病但保持无症状的年轻患者尤其如此，因为他们的免疫系统和应答功能比老年人更有效。
在一个实施方案中，本发明抗体包括抗体分子的至少一个重链或轻链CDR。在另一个实施方案中，本发明抗体包括来自一个或多个抗体分子的至少两个CDR。在另一个实施方案中，本发明抗体包括来自一个或多个抗体分子的至少三个CDR。在另一个实施方案中，本发明抗体包括来自一个或多个抗体分子的至少四个CDR。在另一个实施方案中，本发明抗体包括来自一个或多个抗体分子的至少五个CDR。在另一个实施方案中，本发明抗体包括来自一个或多个抗体分子的至少六个CDR。本文描述了可包括在本发明抗体中的包含至少一个CDR的示例性抗体分子。
本发明的抗体可通过本领域已知的用于合成抗体的任何方法产生，特别是通过化学合成或通过本文描述的重组表达技术。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包含合成恒定区，其中一个或多个结构域部分或完全缺失(“结构域缺失的抗体”)。在某些实施方案中，相容的修饰抗体包含结构域缺失构建体或其中已经去除整个CH2结构域的变体(ΔCH2构建体)。对于其它实施方案，短连接肽可以取代缺失结构域以提供可变区的柔性和移动自由。结构域缺失构建体可以使用编码IgG1人恒定结构域的载体衍生，参见例如国际申请WO02/060955和WO02/096948A2。改造该载体以缺失CH2结构域并提供表达结构域缺失IgG1恒定区的合成载体。
在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物是迷你抗体。修饰可以使用本领域描述的方法进行，参见例如美国专利5,837,821或国际申请WO94/09817。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括具有几个或甚至单个氨基酸的缺失或取代的免疫球蛋白重链，只要它允许单体亚基之间的缔合。例如，CH2结构域选定区中单氨基酸的突变可能足以明显减少Fc结合，并且从而增加α-突触核蛋白定位。类似地，可以缺失控制效应功能(例如补体结合)的一个或多个恒定区结构域。恒定区的这种部分缺失可以改善抗体的选定特征(血清半衰期)，同时保留与受试者恒定区结构域缔合的其它希望功能的完整。而且，如上提及的，公开抗体的恒定区可以是合成的，通过增强得到的构建体的特征的一个或多个氨基酸的突变或取代。在这方面，可能破坏保守结合位点提供的活性(例如Fc结合)，同时基本保持修饰抗体的构型和免疫原性。其它实施方案包括向恒定区添加一个或多个氨基酸以增强希望特征例如效应功能或提供更多细胞毒素或糖类连接。在此类实施方案中，可能希望插入或复制源自选定恒定区结构域的特定序列。
本发明还提供包括本文所述抗体分子(例如VH区和/或VL区)的变体(包括衍生物)、基本上由其组成或由其组成的抗体，所述抗体或其片段免疫特异性结合α-突触核蛋白。本领域技术人员已知的标准技术可用于在编码抗体的核酸序列中引入突变，包括但不限于定点诱变和PCR介导的诱变，其导致氨基酸取代。相对于参考VH区、VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL区、VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3，变体(包括衍生物)可以编码少于50个氨基酸取代、少于40个氨基酸取代、少于30个氨基酸取代、少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代或少于2个氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似电荷的侧链的氨基酸残基取代的氨基酸残基。具有相似电荷的侧链的氨基酸残基家族已经在本领域定义。这些家族包括具有如下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。可选地，突变可以沿编码序列的全部或部分随机引入，例如通过饱和诱变，并且得到的突变体可以根据生物活性选择以鉴定保留活性(例如结合α-突触核蛋白的能力)的突变体。
例如，可能在抗体分子的仅框架区或仅CDR区中引入突变。引入的突变可以是沉默或中性错义突变，例如，对抗体结合抗原的能力没有或很少影响，实际上一些此类突变无论如何不改变氨基酸序列。这些类型的突变可用于优化密码子使用，或者提高杂交瘤的抗体生成。编码本发明抗体的密码子优化的编码区在本文其它地方公开。可选地，非中性错义突变可以改变抗体结合抗原的能力。大部分沉默和中性错义突变的位置可能在框架区中，而大部分非中性错义突变的位置可能在CDR中，尽管这不是绝对要求。本领域技术人员能够设计并测试具有希望性质的突变分子，所述希望性质例如没有抗原结合活性的改变或者结合活性的改变(例如抗原结合活性的提高或抗体特异性的改变)。诱变之后，可以常规表达编码的蛋白，并且可以使用本文描述的技术确定或者通过本领域已知的常规修饰技术确定编码蛋白的功能和/或生物活性(例如，免疫特异性结合α-突触核蛋白的至少一个表位的能力)。
III.编码抗体的多核苷酸
编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以由可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA的任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸构成。例如，编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以由单链和双链DNA、是单链和双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA、和是单链和双链区的混合物的RNA、包含可以是单链或更通常双链或单链和双链区的混合物的DNA和RNA的杂合分子构成。此外，编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以由包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区构成。编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸还可以包含一个或多个修饰碱基或为稳定性或其它原因而修饰的DNA或RNA骨架。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化碱基和不常见的碱基，例如肌苷。可以对DNA和RNA进行许多修饰；因此，“多核苷酸”包括化学、酶学或代谢修饰的形式。
编码衍生自免疫球蛋白(例如免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的多肽的非天然变体的分离的多核苷酸可以通过在免疫球蛋白核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失以便将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入编码的蛋白来产生。突变可以通过标准技术引入，例如定点诱变和PCR介导的诱变。保守氨基酸取代在一个或多个非必需氨基酸残基进行。
如公知的，RNA可以通过标准技术从初始B细胞、杂交瘤细胞或其它转化的细胞分离，所述标准技术例如异硫氰酸胍提取和沉淀，随后离心或色谱。需要时，mRNA可以通过标准技术从总RNA分离，所述标准技术例如寡聚dT纤维素色谱。适合的技术是本领域熟知的。在一个实施方案中，可以根据公知的方法，使用反转录酶和DNA聚合物，同时或单独制备编码抗体轻链和重链的cDNA。PCR可以由共有恒定区引物或更特异性引物开始，基于公开的重链和轻链DNA和氨基酸序列。如上讨论的，PCR还可以用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这种情况下，可以通过共有引物或更大的同源探针，例如人恒定区探针选择文库。
DNA，通常是质粒DNA，可以使用本领域已知的技术从细胞分离，根据标准的公知技术限制作图并测序，所述公知技术在例如前述有关重组DNA技术的参考文献中详细列出。当然，DNA可以是根据本发明在分离过程或随后分析的任何点合成的。
一个实施方案提供了分离的多核苷酸，包括编码与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:20至少80%、85%、90%、95%或100%同一的免疫球蛋白重链可变区(VH)氨基酸序列的核酸、基本上由其组成或由其组成。
另一实施方案提供了分离的多核苷酸，包括编码与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:20相同或除了1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸取代之外相同的VH氨基酸序列的核酸、基本上由其组成或由其组成。
另一实施方案提供了分离的多核苷酸，包括编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸，基本上由其组成或由其组成，其中重链可变区的至少1、2或全部3个CDR与分别由SEQ IDNO16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18表示的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列至少80%、85%、90%或95%同一。因此，该实施方案提供了编码本发明重链可变区的分离的多核苷酸，所述重链可变区具有与分别由SEQ ID NO16、SEQ ID NO:17和SEQ IDNO:18表示那些相关的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列，如图1所示。
在另一实施方案中，本发明提供了分离的多核苷酸，包括编码免疫球蛋白轻链可变区(VH)的核酸，基本上由其组成或由其组成，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与分别由SEQ ID NO16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18表示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3组相同的多肽序列，如图1所示。
另一实施方案提供了特异性或优先结合人α-突触核蛋白的分离的结合分子，例如包括由所述多核苷酸编码的VH的抗体或其抗原结合片段。
另一实施方案提供了分离的多核苷酸，包括编码与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:26至少80%、85%、90%、95%或100%同一的免疫球蛋白轻链可变区(VL)氨基酸序列的核酸、基本上由其组成或由其组成。
另一实施方案提供了分离的多核苷酸，包括编码与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:26相同或除了1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸取代之外相同的VL氨基酸序列的核酸，基本上由其组成或由其组成。
另一实施方案提供了分离的多核苷酸，包括编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸、基本上由其组成或由其组成，其中轻链可变区的至少1、2或全部3个VL-CDR与分别由SEQID NO23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25表示的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列至少80%、85%、90%或95%同一。因此，该实施方案提供了编码本发明轻链可变区的分离的多核苷酸，所述轻链可变区具有与分别由SEQ ID NO23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25表示的那些相关的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列，如图1所示。
在另一实施方案中，本发明提供了分离的多核苷酸，包括编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸、基本上由其组成或由其组成，其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有与分别由SEQ ID NO16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18表示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3组相同的多肽序列，如图1所示。
另一实施方案提供了特异性或优先结合人α-突触核蛋白的分离的结合分子，例如包括由所述多核苷酸编码的VL的抗体或其抗原结合片段。
如本领域已知的，两个多肽或两个多核苷酸之间的“序列同一性”通过比较一个多肽或多核苷酸的氨基酸或核酸序列与第二多肽或多核苷酸的序列来确定。当在本文讨论时，可以使用本领域已知的方法和计算机程序/软件，例如但不限于BESTFIT程序(Wisconsin序列分析包，针对Unix第8版，Genetics Computer Group，UniversityResearch Park，575Science Drive，Madison，WI53711)，来确定任何特定多肽是否与另一多肽至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%同一。BESTFIT利用Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics2(1981)，482-489的局部同源性算法，来发现两个序列之间最佳的同源性区段。当使用BESTFIT或任何其它序列比对程序确定特定序列是否与根据本发明的参考序列例如95%同一时，当然设置参数以使得针对参考多肽序列全长计算同一性百分比，并且允许参考序列中氨基酸总数的最多5%的同源性空位。
在本发明的一个实施方案中，多核苷酸包括具有SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21所示VH或SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28所示VL的多核苷酸序列的核酸、基本上由其组成或由其组成。就这方面而言，本领域技术人员容易理解，编码轻链和/或重链的至少可变结构域的多核苷酸可以编码两个免疫球蛋白链或仅一个的可变结构域。
本发明还包括本文其它地方描述的本发明的多核苷酸的片段。此外，编码本文描述的融合多核苷酸、Fab片段和其它衍生物的多核苷酸也包括在本发明内。
多核苷酸可以通过本领域已知的任何方法产生或生产。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，编码抗体的多核苷酸可以由化学合成的寡核苷酸组装，例如描述于Kutmeier等，BioTechniques17(1994)，242，简言之，其包括合成含有编码抗体的序列的部分的重叠的寡核苷酸，退火并连接这些寡核苷酸，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
可选地，编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以从适合来源的核酸产生。如果含有编码特定抗体的核酸的克隆不可获得，但抗体分子的序列是已知的，则编码抗体的核酸可以化学合成或获自适合的来源(例如，抗体cDNA文库，或从表达α-突触核蛋白特异性抗体的任何组织或细胞例如被选择表达抗体的杂交瘤细胞产生的cDNA文库，或从表达α-突触核蛋白特异性抗体的任何组织或细胞例如被选择表达抗体的杂交瘤细胞分离的核酸、例如polyA+RNA)，通过使用可杂交至序列的3'和5'端的合成引物的PCR扩增，或通过使用对特定基因序列特异性的寡核苷酸探针克隆以鉴定例如来自cDNA文库的编码抗体的cDNA克隆。使用本领域公知的任何方法，可以将通过PCR产生的扩增的核酸克隆入可复制的克隆载体。
一旦确定抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的核苷酸序列和相应的氨基酸序列，其核苷酸序列可以使用本领域已知用于操纵核苷酸序列的方法例如重组DNA技术、定点诱变、PCR等来操纵(参见例如描述于以下的技术：Sambrook等，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)和Ausubel等编辑，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY(1998)，两者通过引用整体并入本文)，以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸取代、缺失和/或插入。
IV.抗体多肽的表达
下述对分离的遗传材料的操作提供本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，编码所述抗体的多核苷酸通常插入表达载体以引入宿主细胞，所述宿主细胞可以用于产生希望量的抗体。本文描述了与靶分子结合的抗体或其片段、衍生物或类似物例如抗体的重链或轻链的重组表达。一旦获得编码本发明抗体分子或抗体重链或轻链或其部分(例如，含有重链或轻链可变结构域)的多核苷酸，用于产生抗体分子的载体可通过重组DNA技术产生，使用本领域公知的技术。因此，本文描述了通过表达含有抗体编码核苷酸序列的多核苷酸制备抗体的方法。本领域技术人员公知的方法可用于构建含有抗体编码序列和适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供包含与启动子可操作连接的编码本发明抗体分子或其重链或轻链或重链或轻链可变结构域的核苷酸序列的可复制载体。此类载体可包括编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(参见，例如国际申请WO86/05807和WO89/01036；和美国专利号5,122,464)，并且可将抗体的可变结构域克隆入此类用于表达整个重链或轻链的载体。
术语“载体”或“表达载体”在本文用来表示根据本发明使用的载体，用作在宿主细胞中引入并表达希望基因的媒介物。如本领域技术人员已知的，此类载体可容易地选自由质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒组成的组。一般而言，与本发明相容的载体将包含选择标记、促进希望基因克隆和进入真核或原核细胞和/或在其中复制的能力的适当的限制位点。为了本发明目的，可以采用许多表达载体系统。例如，一类载体利用从动物病毒衍生的DNA元件，所述动物病毒例如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒。其它包括具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统的使用。此外，已经将DNA整合入其染色体的细胞可以通过引入一种或多种允许选择转染的宿主细胞的标志来选择。所述标志可以提供营养缺陷型宿主的原养型、杀菌剂抗性(例如，抗生素)或对重金属例如铜的抗性。选择性标记基因可以直接连接至待表达的DNA序列，或者通过共转染而引入相同细胞。mRNA的最佳合成可能还需要其它元件。这些元件可以包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。
在某些实施方案中，将克隆的可变区基因与上述重链和轻链恒定区基因(例如，人的)一起插入表达载体。在一个实施方案中，这使用Biogen IDEC,Inc.的专有表达载体来实现，所述表达载体称为NEOSPLA，公开于美国专利号6,159,730。该载体含有巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β球蛋白主要启动子、SV40复制起点、牛生长激素聚腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和前导序列。已经发现该载体在加入可变区和恒定区基因、转染入CHO细胞、随后在含有G418的培养基中选择并氨甲喋呤扩增之后导致非常高水平的抗体表达。当然，能够在真核细胞中引起表达的任何表达载体可用于本发明。适合的载体的实例包括但不限于质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1和pZeoSV2(可获自Invitrogen，San Diego，CA)和质粒pCI(可获自Promega，Madison，WI)。一般而言，从大量转化细胞选择表达适当高水平免疫球蛋白重链和轻链的那些是可例如由机器系统进行的常规实验。载体系统还教导于美国专利号5,736,137和5,658,570，其通过引用整体并入本文。该系统提供高表达水平，例如>30pg/细胞/天。其它示例性载体系统公开于例如美国专利号6,413,777。
在其它实施方案中，本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以使用多顺反子构建体表达，所述多顺反子构建体例如公开于美国专利申请公开号2003-0157641A1的那些并整体并入本文。在这些表达系统中，感兴趣的多基因产物例如抗体的重链和轻链可以从单个多顺反子构建体产生。这些系统有利地利用内部核糖体进入位点(IRES)以提供相对高水平的抗体。相容的IRES序列公开于美国专利号6,193,980，其也并入本文。本领域技术人员将理解，此类表达系统可用于有效产生本申请公开的所有范围的抗体。
更一般地，一旦制备了编码抗体的单体亚基的载体或DNA序列，可以将表达载体引入适当的宿主细胞。质粒引入宿主细胞可以通过本领域技术人员已知的各种技术来实现。这些包括但不限于转染(包括使用例如Fugene或脂质体的脂质转染)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、用包封DNA的细胞融合、显微注射和完整病毒感染。通常，质粒引入宿主是通过标准磷酸钙共沉淀方法。具有表达构建体的宿主细胞在适合产生轻链和重链的条件下生长，并且测定重链和/或轻链蛋白合成。示例性测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)或荧光激活的细胞分选测定(FACS)、免疫组织化学等。
表达载体通过常规技术转移到宿主细胞，然后将转染的细胞通过常规技术培养产生用于本文描述的方法的抗体。因此，本发明包括含有编码与异源启动子可操作连接的本发明抗体或其重链或轻链的多核苷酸的宿主细胞。为了表达双链抗体，编码重链和轻链两者的载体可以插入宿主细胞以表达完整的免疫球蛋白分子，如下详细描述。
可以用本发明的两个表达载体共转染宿主细胞，第一载体编码重链衍生的多肽，并且第二载体编码轻链衍生的多肽。两个载体可以含有相同的选择性标记，能够实现重链和轻链多肽的相等表达。可选地，可以使用编码重链和轻链多肽两者的单个载体。在这种情况下，轻链有利地放置在重链之前以避免过量的毒性游离重链；参见Proudfoot，Nature322(1986)，52；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77(1980)，2197。重链和轻链的编码序列可以包括cDNA或基因组DNA。
本文使用的“宿主细胞”指含有使用重组DNA技术构建并且编码至少一种异源基因的载体的细胞。在描述从重组宿主分离抗体的过程中，除非另外清楚指明，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用以表示抗体来源。换言之，从“细胞”回收多肽可以表示来自离心沉淀的完整细胞或者来自含有培养基和悬浮细胞两者的细胞培养物。
多种宿主表达载体系统可用于表达用于本文描述方法的抗体分子。此类宿主表达系统代表可以产生并随后纯化感兴趣的编码序列的媒介物，但也代表当用适当核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达本发明抗体分子的细胞。这些包括但不限于用含有抗体编码序列的重组细菌噬菌体DNA、质粒DNA或黏粒DNA表达载体转化的微生物，例如细菌(例如大肠杆菌、枯草杆菌)；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，毕赤酵母)；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或具有含有衍生自哺乳动物细胞基因组(例如，金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的启动子的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、NSO、BLK、293、3T3细胞)。特别用于表达完整重组抗体分子的细菌细胞例如大肠杆菌或真核细胞用于表达重组抗体分子。例如，与诸如来自人巨细胞病毒的主要即刻早期基因启动子元件的载体结合的哺乳动物细胞例如中国仓鼠(CHO)细胞是有效的抗体表达系统；参见例如，Foecking等，Gene45(1986)，101；Cockett等，Bio/Technology8(1990)，2。
用于蛋白表达的宿主细胞系经常是哺乳动物来源；本领域技术人员具备确定最适合希望基因产物在其中表达的特定宿主细胞系的能力。示例性宿主细胞系包括但不限于CHO(中国仓鼠卵巢)、DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR-)、HELA(人宫颈癌)、CVI(猴肾细胞系)、COS(具有SV40T抗原的CVI的衍生物)、VERY、BHK(幼仑鼠肾)、MDCK、WI38、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾细胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)和293(人肾)。宿主细胞系通常可获自商业服务、美国组织培养物保藏中心(AmericanTissue Culture Collection)或公开的文献。
此外，可以选择调节插入序列表达或以所需的特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞品系。蛋白产物的此类修饰(例如，糖基化)和加工(例如，裂解)可能对于蛋白功能是重要的。不同的宿主细胞具有蛋白和基因产物的翻译后加工和修饰的特征和特定机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统来保证所表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此，可以使用具有适当加工初级转录物、糖基化和磷酸化基因产物的细胞器的真核宿主细胞。
为了长期高收率产生重组蛋白，使用稳定表达。例如，可以工程化稳定表达抗体分子的细胞系。可以用由适当表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和选择性标志来转化宿主细胞，而不是使用含有病毒复制起点的表达载体。在引入外源DNA之后，允许工程化细胞在富集培养基中生长例如1-2天，然后转至选择性培养基。重组质粒中的选择性标志赋予选择抗性并允许细胞将质粒稳定整合入其染色体并生长形成集落，转而可以将该集落克隆并扩增成细胞系。该方法可以有利地用于工程化稳定表达抗体分子的细胞系。
可以使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，Cell11(1977)，223)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska&Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA48(1992)，202)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等，Cell22(1980)，817)基因，可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。而且，抗代谢物抗性可用作选择下述基因的基础：dhfr，其赋予氨甲喋呤抗性(Wigler等，Natl.Acad.Sci.USA77(1980)，357；O'Hare等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78(1981)，1527)；gpt，其赋予霉酚酸抗性(Mulligan&Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78(1981)，2072)；neo，其赋予氨基糖苷G-418抗性，Goldspiel等，Clinical Pharmacy12(1993)，488-505；Wu和Wu，Biotherapy3(1991)，87-95；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32(1993)，573-596；Mulligan，Science260(1993)，926-932；和Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62(1993)，191-217；TIB TECH11(1993)，155-215；和hygro，其赋予潮霉素抗性(Santerre等，Gene30(1984)，147。可以使用的重组DNA技术领域公知的方法描述于Ausubel等(编辑)，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer andExpression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)；和Dracopoli等(编辑)，Current Protocols in Human Genetics，John Wiley & Sons，NY(1994)，第12和13章；Colberre-Garapin等，J.Mol.Biol.150：1(1981)，其通过引用整体并入本文。
抗体分子表达水平可以通过载体扩增来增加，综述参见Belibington和Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for the expressionof cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，Academic Press，New York，第3卷。(1987)。当表达抗体的载体系统中的标志可扩增时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的增加将增加标志基因的拷贝数。因为扩增区与抗体基因连接，抗体的产生也增加；参见Crouse等，Mol.Cell.Biol.3(1983)，257。
体外生产允许放大产生大量希望的多肽。组织培养条件下哺乳动物细胞培养技术是本领域已知的，并且包括例如在气升式反应器或连续搅拌反应器中的均质悬浮培养，或例如在中空纤维中、微囊中、琼脂糖微珠或陶瓷柱上的固定或捕获的细胞培养。如果必要和/或需要，多肽溶液可通过常规色谱方法例如凝胶过滤、离子交换色谱、DEAE纤维素色谱或免疫-亲和色谱来纯化，例如在合成铰链区多肽的优先生物合成之后，或在本文描述的HIC色谱步骤之前或之后。
编码本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的基因还可以在非哺乳动物细胞例如细菌或昆虫或酵母或植物细胞中表达。容易摄取核酸的细菌包括以下成员：肠杆菌，例如大肠杆菌或沙门氏菌株；芽孢杆菌，例如枯草杆菌；肺炎球菌；链球菌和流感杆菌。还要理解，当在细菌中表达时，异源多肽通常变成包涵体的部分。必须将异源多肽分离、纯化并然后组装成功能分子。当需要抗体的四价形式时，则亚基自组装成四价抗体；参见例如国际申请WO02/096948。
在细菌系统中，许多表达载体可有利地根据被表达的抗体分子的预期用途来选择。例如，当产生大量此类蛋白时，为了产生抗体分子的药物组合物，可以使用指导容易纯化的融合蛋白产物高水平表达的载体。此类载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，EMBO J.2(1983)，1791)，其中抗体编码序列可以单独连接入载体，与lacZ编码区框内连接，使得产生融合蛋白；pIN载体(Inouye & Inouye，Nucleic Acids Res.13(1985)，3101-3109；Van Heeke & Schuster，J.Biol.Chem.24(1989)，5503-5509)；等。pGEX载体还可用于表达外源多肽，作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。一般而言，此类融合蛋白是可溶的，并且可容易地通过吸附和结合至谷胱甘肽琼脂糖珠、随后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而从裂解细胞纯化。设计pGEX载体以包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点，使得克隆的靶基因产物可以从GST部分释放。
除了原核生物，还可以使用真核微生物。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常见的面包酵母是最常用的真核微生物，但许多其它菌株也是常用的，例如毕赤酵母(Pichia pastoris)。对于在酵母中表达，常用例如质粒YRp7(Stinchcomb等，Nature282(1979)，39；Kingsman等，Gene7(1979)，141；Tschemper等，Gene10(1980)，157)。该质粒已经含有提供缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变菌株的选择标记的TRP1基因，所述突变菌株例如ATCC号44076或PEP4-1(Jones，Genetics85(1977)，12)。作为酵母宿主细胞基因组的特征的trpl损伤的存在则提供通过在缺乏色氨酸下生长来检测转化的有效环境。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)通常用作表达外源基因的载体。病毒在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可以将抗体编码序列单独克隆入病毒的非必需区(例如，多角体蛋白基因)并置于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制下。
本发明抗体分子一经重组表达，本发明完整抗体、其二聚体、单独轻链和重链或其它免疫球蛋白形式可以根据本领域标准程序纯化，所述标准程序包括例如通过色谱(例如，离子交换、亲和、特别是通过蛋白A后对特定抗原的亲和、和分筛柱色谱)、离心、差异溶解性，例如硫酸铵沉淀，或通过沉淀蛋白的任何其它标准技术；参见例如Scopes，“ProteinPurification”，Springer Verlag，N.Y.(1982)。可选地，增加本发明抗体亲和力的方法公开于美国专利公布2002-0123057A1。
V.融合蛋白和结合物
在某些实施方案中，抗体多肽包括正常不与抗体结合的氨基酸序列或一个或多个部分。示例性修饰在下文更详细描述。例如，在一些实施方案中，本发明的单链fv抗体片段可以包括柔性连接体序列，或者可以被修饰以添加功能性部分(例如，PEG、药物、毒素或标记，例如荧光、放射性、酶、核磁、重金属等)。
在某些实施方案中，本发明抗体多肽可以包括融合蛋白、基本上由其组成或由其组成。融合蛋白是嵌合分子，包括例如免疫球蛋白α-突触核蛋白结合结构域，具有至少一个靶结合位点和至少一个异源部分，即，自然界中正常不与其连接的部分。氨基酸序列可以正常存在于在融合多肽中在一起的单独蛋白中，或者它们可以正常存在于同一蛋白但在融合多肽中处于新的排列。融合蛋白可以例如通过化学合成或者通过产生并翻译其中肽区以希望的关系编码的多核苷酸来产生。
应用于多核苷酸或多肽的术语“异源的”表示多核苷酸或多肽衍生自与其相比较的其它实体不同的实体。例如，本文使用的待融合至抗体或其抗原结合片段、变体或类似物的“异源多肽”衍生自相同物种的非免疫球蛋白多肽或不同物种的免疫球蛋白或非免疫球蛋白多肽。
如在本文其它地方更详细讨论的，本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可进一步重组融合至异源多肽的N-末端或C-末端，或者可以化学结合(包括共价和非共价结合)至多肽或其它组合物。例如，抗体可重组融合或结合至在检测测定中用作标记的分子和效应分子例如异源多肽、药物、放射性核素或毒素；参见例如国际申请WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；美国专利号5,314,995；和欧洲专利申请EP0396387。
本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以由通过肽键或修饰的肽键彼此结合的氨基酸组成，即肽电子等排体，并且可以含有不同于20种基因编码氨基酸的氨基酸。抗体可以通过天然过程修饰，例如翻译后加工，或者通过本领域公知的化学修饰技术修饰。此类修饰充分描述于基础课本和更详细的专论以及许多研究文献中。修饰可以发生在抗体任何地方，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端，或者在诸如糖类的部分上。将理解，相同类型的修饰可以相同或不同程度存在于给定抗体的几个位置。而且，给定抗体可以含有许多类型的修饰。抗体可以例如由于泛素化而是分支的，并且它们可以是环状的，具有或没有分支。环状的、分支的和分支环状的抗体可以源自天然翻译后加工，或者可以通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、核黄素的共价连接、血红素的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸形成、焦谷氨酸酯形成、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋作用、硒酸化、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸添加至蛋白例如精氨酰化和泛素化；参见例如Proteins-Structure AndMolecular Properties，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York第2版，(1993)；Posttranslational Covalent Modification Of Proteins，B.C.Johnson编辑，Academic Press，New York，第1-12页(1983)；Seifter等，Meth.Enzymol.182(1990)，626-646；Rattan等，Ann.NY Acad.Sci.663(1992)，48-62)。
本发明还提供包含抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物和异源多肽的融合蛋白。在一个实施方案中，本发明融合蛋白包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：具有本发明抗体或其片段或变体的VH区的任何一个或多个的氨基酸序列或本发明抗体的VL区的任何一个或多个的氨基酸序列的多肽，和异源多肽序列。在另一实施方案中，用于本文公开的诊断和治疗方法的融合蛋白包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：具有抗体或其片段、变体或衍生物的VH-CDR的任何一个、两个、三个的氨基酸序列或抗体或其片段、变体或衍生物的VL-CDR的任何一个、两个、三个的氨基酸序列的多肽，和异源多肽序列。在一个实施方案中，融合蛋白包括具有本发明抗体或其片段、衍生物或变体的VH-CDR3的氨基酸序列的多肽和异源多肽序列，所述融合蛋白特异性结合α-突触核蛋白。在另一实施方案中，融合蛋白包括具有本发明抗体的至少一个VH区的氨基酸序列和本发明抗体或其片段、衍生物或变体的至少一个VL区的氨基酸序列的多肽，和异源多肽序列。在一些实施方案中，融合蛋白的VH和VL区对应于特异性结合α-突触核蛋白的单一来源抗体(或scFv或Fab片段)。在另一实施方案中，用于本文公开的诊断和治疗方法的融合蛋白包括具有抗体的VH CDR的任何一个、两个、三个或多个的氨基酸序列和抗体的VL CDR的任何一个、两个、三个或多个的氨基酸序列的多肽，和异源多肽序列。在某些实施方案中，VH-CDR或VL-CDR的两个、三个、四个、五个、六个或多个对应于本发明单一来源的抗体(或scFv或Fab片段)。编码这些融合蛋白的核酸分子也包括在本发明中。
文献中报道的示例性融合蛋白包括T细胞受体的融合体(Gascoigne等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84(1987)，2936-2940；CD4(Capon等，Nature337(1989)，525-531；Traunecker等，Nature339(1989)，68-70；Zettmeissl等，DNA Cell Biol.USA9(1990)，347-353；和Byrn等，Nature344(1990)，667-670)；L-选择蛋白(归巢受体)(Watson等，J.Cell.Biol.110(1990)，2221-2229；和Watson等，Nature349(1991)，164-167)；CD44(Aruffo等，Cell61(1990)，1303-1313)；CD28和B7(Linsley等，J.Exp.Med.173(1991)，721-730)；CTLA-4(Lisley等，J.Exp.Med.174(1991)，561-569)；CD22(Stamenkovic等，Cell66(1991)，1133-1144)；TNF受体(Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88(1991)，10535-10539；Lesslauer等，Eur.J.Immunol.27(1991)，2883-2886；和Peppel等，J.Exp.Med.174(1991)，1483-1489(1991)；和IgE受体a(Ridgway和Gorman，J.Cell.Biol.115(1991)，摘要号1448)。
如本文其它地方讨论的，本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可融合至异源多肽以增加多肽的体内半衰期或用于使用本领域已知方法的免疫测定。例如，在一个实施方案中，PEG可结合至本发明抗体以增加其体内半衰期；参见例如Leong等，Cytokine16(2001)，106-119；Adv.in Drug Deliv.Rev.54(2002)，531；或者Weir等，Biochem.Soc.Transactions30(2002)，512。
而且，本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可融合至标志序列，例如促进其纯化或检测的肽。在某些实施方案中，标志氨基酸序列是六组氨酸肽(HIS)，例如pQE载体中提供的标签(QIAGEN,Inc.，9259Eton Avenue，Chatsworth，Calif.，91311)以及其它，其中许多是可商业获得的。如Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)，821-824中所述，例如，六组氨酸提供融合蛋白的常规纯化。用于纯化的其它肽标签包括但不限于“HA”标签，其对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等，Cell37(1984)，767)和“flag”标签。
融合蛋白可使用本领域公知方法制备；参见例如美国专利号5，5,116,964和5,225,538。融合进行的准确位点可以通过经验选择以优化融合蛋白的分泌或结合特征。然后将编码融合蛋白的DNA转染入宿主细胞以表达。
本发明抗体可以非结合形式使用，或者可以结合至许多分子的至少一个，例如，以改善分子的治疗性质，促进靶检测，或用于患者的成像或治疗。当进行纯化时，本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以在纯化之前或之后标记或结合。具体说，本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以结合至治疗剂、前药、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药剂或PEG。
现有技术已经广泛描述了作为包括常规抗体的免疫毒素的结合物。毒素可以通过常规偶联技术偶联至抗体，或者含有蛋白毒素部分的免疫毒素可以作为融合蛋白产生。本发明抗体可以相应方式使用以获得此类免疫毒素。此类免疫毒素的示例描述于Byers，Seminars Cell.Biol.2(1991)，59-70和Fanger，Immunol.Today12(1991)，51-54。
本领域技术人员将理解，结合物还可以使用许多技术组装，取决于待结合的选定剂。例如，与生物素的结合物例如通过使α-突触核蛋白结合多肽与激活的生物素酯例如生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯反应来制备。类似地，具有荧光标志的结合物可以在例如本文所列那些偶联剂存在下制备，或者通过与异硫氰酸酯、例如异硫氰酸荧光素反应来制备。本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的结合物以类似方式制备。
本发明还包括与诊断剂或治疗剂结合的本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。抗体可以在诊断上使用以例如证明神经疾病的存在，指示患神经疾病的风险，监测神经疾病的发展或进展，所述神经疾病即突触核蛋白病，作为临床测试程序的部分以例如确定给定治疗和/或预防方案的效力。可以通过使抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物与可检测物质偶联来促进检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属(利用各种正电子发射断层扫描仪)和非放射性顺磁金属离子；参见例如美国专利号4,741,900，关于可结合至根据本发明用作诊断剂的抗体的金属离子。适合的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；适合的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括荧光素酶、荧光素和水母素；并且适合的放射性材料的实例包括125I、131I、111In或99Tc。
抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还可通过将之与化学发光化合物偶联来可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程中产生的发光的存在来确定化学发光标签抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺、异鲁米诺、热性吖啶鎓酯(theromatic acridinium ester)、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
其中可检测地标记抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的方式之一是通过将其与酶连接并在酶免疫测定(EIA)中使用连接的产物(Voller,A.，“The Enzyme LinkedImmunosorbent Assay(ELISA)”Microbiological Associates Quarterly Publication，Walkersville,Md.，Diagnostic Horizons2(1978)，1-7)；Voller等，J.Clin.Pathol.31(1978)，507-520；Butler，Meth.Enzymol.73(1981)，482-523；Maggio,E.(编辑)，EnzymeImmunoassay，CRC Press，Boca Raton，Fla.，(1980)；Ishikawa，E.等(编辑)，EnzymeImmunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo(1981)。与抗体结合的酶将与适当的底物、例如生色底物以产生可通过例如分光光度、荧光或通过视觉方式检测的化学部分的方式反应。可用于可检测地标记抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌性核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油膦酸酯脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。此外，检测可以通过比色方法实现，所述比色方法采用酶的生色底物。检测还可以通过与类似制备的标准品相比较的底物的酶促反应程度的视觉比较来实现。
检测还可使用许多其它免疫测定的任何一种来实现。例如，通过放射性标记抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，可能通过使用放射性免疫测定(RIA)来检测抗体(参见例如Weintraub,B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course onRadioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，(1986年3月))，其通过引用并入本文)。放射性同位素可以通过包括但不限于γ计数器、闪烁计数器或放射自显影仪的工具来检测。
抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还可以使用荧光发射金属例如152Eu或镧系其它元素来可检测地标记。这些金属可以使用诸如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金属螯合基团连接至抗体。
用于将各种部分结合至抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的技术是公知的，参见例如Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy”，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(编辑)，pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.(1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，ControlledDrug Delivery(第2版)，Robinson等(编辑)，Marcel Dekker,Inc.，pp.623-53(1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，Monoclonal Antibodies'84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等(编辑)，pp.475-506(1985)；“Analysis,Results,AndFuture Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibodies In Cancer Therapy”，MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(编辑)，Academic Presspp.303-16(1985)，和Thorpe等，“The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.62(1982)，119-158。
如提到的，在某些实施方案中，可以结合增强结合分子例如结合多肽、例如抗体或其免疫特异性片段稳定性或效力的部分。例如，在一个实施方案中，PEG可以结合至本发明结合分子以增加其体内半衰期。Leong等，Cytokine16(2001)，106；Adv.in DrugDeliv.Rev.54(2002)，531；或Weir等，Biochem.Soc.Transactions30(2002)，512。
VI.组合物和使用方法
本发明涉及包含本发明前述α-突触核蛋白结合分子例如抗体或其抗原结合片段或其衍生物或变体或本发明多核苷酸、载体或细胞的组合物。本发明组合物还可以包括药学上可接受的载体。而且，根据药物组合物的预期用途，本发明药物组合物还可以包括诸如白介素或干扰素的物质。例如，为了用于治疗帕金森病，其它物质可以选自由小有机分子、抗α-突触核蛋白抗体及其组合组成的组。因此，在一个实施方案中，本发明涉及本发明α-突触核蛋白结合分子例如抗体或其抗原结合片段或具有与其任何一个基本相同的结合特异性的结合分子、本发明多核苷酸、载体或细胞在制备用于预防性和治疗性治疗突触核蛋白病、监测突触核蛋白病进展或受试者对突触核蛋白病响应或用于确定受试者发展突触核蛋白病的风险的药物或诊断组合物中的用途。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及治疗特征为α-突触核蛋白分别在脑和中枢神经系统中异常累积和/或沉积的神经疾患的方法，所述方法包括给有相应需要的受试者施用治疗有效量的本发明α-突触核蛋白结合分子、抗体、多核苷酸、载体或细胞。在某些实施方案中，递送NI-202.22D11或其片段、变体或衍生物。术语“神经疾患”包括但不限于突触核蛋白病，例如帕金森病(PD)、路易体痴呆(DLB)和多系统萎缩(MSA)。除非另外说明，术语神经退行性、神经病的或神经精神病的在本文可互换使用。
本发明治疗方法的特定优点在于如下事实：本发明抗体衍生自没有帕金森病体征的老年受试者的B细胞或B记忆细胞，并因此可能预防临床表现的突触核蛋白病，或可能减少临床表现疾病发生的风险，或者可能延迟临床表现疾病的发生或进展。通常，本发明抗体也已经成功经历了体细胞成熟，即，通过抗体可变区的体细胞变异优化对靶α-突触核蛋白分子高亲和力结合的选择性和有效性。
此类细胞在例如人体内未借助相关或其它生理蛋白或细胞结构在自身免疫或变态反应意义上活化的知识也具有很大的医学意义，因为这意味着成功活过临床试验期的机会大增。可以说，在预防性或治疗性抗体在至少一个人受试者中临床前和临床研究之前，已经证明了效力、可接受性和耐受性。因此，可以预期，本发明的人抗α-突触核蛋白抗体，其作为治疗剂的靶结构特异性效力及其降低的副作用可能性显著增加了其临床成功概率。
本发明还分别提供了药物和诊断包或试剂盒，包括填充有一种或多种上述成分的一个或多个容器，所述成分例如抗α-突触核蛋白抗体或其结合片段、衍生物或变体、本发明的多核苷酸、载体或细胞。与此类容器结合的可以是管理药物或生物制品生产、使用或销售的政府机构规定形式的通告，所述通告反映生产、使用或销售管理机构批准用于人施用。此外或可选地，试剂盒包括用于适当诊断测定的试剂和/或说明书。当然，本发明组合物例如试剂盒特别适合伴有α-突触核蛋白存在的疾患的风险评估、诊断、预防和治疗，并且特别适合治疗帕金森病(PD)、路易体痴呆(DLB)和多系统萎缩(MSA)。
本发明药物组合物可根据本领域公知方法配制；参见例如Remington：TheScience and Practice of Pharmacy(2000)，the University of Sciences inPhiladelphia，ISBN0-683-306472。适合的药物载体的实例是本领域公知的，并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液，例如油/水乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。包含此类载体的组合物可以通过公知的常规方法配制。这些药物组合物可以适合的剂施用给受试者。适合组合物的施用可以通过不同方式实现，例如通过静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻内、局部或皮内施用或者脊髓或脑递送。气溶胶制剂例如鼻喷雾制剂包括活性剂与防腐剂和等渗剂的纯化的水溶液或其它溶液。调节此类制剂至与鼻粘膜相容的pH和等渗状态。用于直肠或阴道施用的制剂可以作为栓剂与适合载体提供。
而且，本发明包括在头颅中钻小孔以施用本发明药物的目前标准(但幸好不常见)程序，在一个方面，本发明结合分子、特别是抗体或基于抗体的药物可以穿过血脑屏障，这允许静脉内或口服施用。
剂量方案将由主治医师和临床因素确定。医学领域已知，任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者尺寸、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别和施用时间和途径、健康状况和共时施用的其它药物。胃肠外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油、和可注射有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇溶液/水溶液、乳液或悬液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸化林格氏或固定油。静脉内媒介物包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏右旋糖的那些)等。还可以存在防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。而且，本发明药物组合物还可以包含诸如多巴胺或精神药物的物质，取决于药物组合物的预期用途。
而且，药物组合物可以配制为疫苗，例如，如果本发明药物组合物包含用于被动免疫的抗α-突触核蛋白抗体或其结合片段、衍生物或变体。如背景章节提到的，已经报道α-突触核蛋白的寡聚体物类细胞外存在于血浆和CSF中(El-Agnaf等，FASEB J.20(2006)，419–425)，并且小鼠帕金森病模型的被动免疫研究显示，针对α-突触核蛋白的细胞外小鼠单克隆抗体可以减少细胞内α-突触核蛋白聚集物的累积(Masliah等，Neuron，46(2005)，857-868)。因此，谨慎预期，本发明的人抗α-突触核蛋白抗体和等同的α-突触核蛋白结合分子特别用作疫苗，用于预防或缓解突触核蛋白病，例如PD、DLB和MSA。
在一个实施方案中，利用本发明抗体的重组Fab(rFab)和单链片段(scFv)是有益的，其可更容易穿过细胞膜。例如，Robert等，Protein Eng.Des.Sel.(2008)8月16日；S1741-0134，之前在线公开，描述了使用单克隆抗体WO-2的嵌合重组Fab(rFab)和单链片段(scFv)，其识别Αβ的N-末端区的表位。工程化片段能够(i)预防淀粉样蛋白纤维化，(ii)解聚预先形成的Αβ1-42原纤维，和(iii)与完整IgG分子一样有效地体外抑制Αβ1-42寡聚体介导的神经毒性。使用缺乏效应功能的小Fab和scFv工程化抗体形式的预测优点包括更有效穿过血脑屏障并最小化引起炎症副反应的风险。而且，除了scFv和单结构域抗体保留全长抗体的结合特异性外，它们可以被表达为单基因，并且在哺乳动物细胞内表达为内部抗体，具有改变其靶的折叠、相互作用、修饰或亚细胞定位的潜力；综述参见例如Miller和Messer，Molecular Therapy12(2005)，394-401。
在不同方法中，Muller等，Expert Opin.Biol.Ther.(2005)，237-241描述了所谓“SuperAntibody Technology(超级抗体技术)”的技术平台，据称它能使抗体穿梭进入活细胞而不损害它们。此类细胞穿过抗体打开了新的诊断和治疗窗口。为这些抗体创造了术语‘TransMab’。
另一实施方案包括用于治疗突触核蛋白病的其它神经保护剂的共施用或顺序施用。在一个实施方案中，其它药剂包含在本发明药物组合物中。可用于治疗受试者的神经保护剂的实例包括但不限于乙酰胆碱酯酶抑制剂、谷氨酸受体拮抗剂、激酶抑制剂、HDAC抑制剂、抗炎剂、双丙戊酸钠或其任意组合。可伴随本发明药物组合物使用的其它神经保护剂的实例在现有技术中描述；参见例如国际申请WO2007/011907。在一个实施方案中，其它药剂是多巴胺或多巴胺受体激动剂。
在本发明进一步的实施方案中，本发明α-突触核蛋白结合分子，特别是抗体还可以与用于治疗突触核蛋白病的神经移植物移植疗法或干细胞疗法共施用，或者在用于治疗突触核蛋白病的神经移植物移植疗法或干细胞疗法之前或之后施用。此类使用胚胎中脑神经元移植物的方法已经在帕金森病患者中进行，目的是替代在疾病中损失的神经元并恢复纹状体中多巴胺能神经传递。在移植后11-16年，发现移植的神经元含有路易体和路易突起。α-突触核蛋白病变从宿主到移植组织的这种扩散可以通过共施用本发明α-突触核蛋白结合分子、特别是抗体来预防。
治疗有效剂量或量指足以缓解症状或病症的活性成分的量。此类化合物的治疗效力和毒性可以通过细胞培养或实验动物中标准药物程序确定，例如ED50(在50%群体中治疗有效的剂量)和LD50(对50%群体致死的剂量)。治疗作用和毒性作用之间的剂量比是治疗指数，其可以表示为LD50/ED50。在某些实施方案中，在PD、DLB或其它突触核蛋白病情况下，组合物中治疗剂以足以恢复或保持正常行为和/或认知性质的量存在。
根据前文，显然，本发明涵盖包含NI-202.22D11或其片段、变体或衍生物的至少一个CDR的α-突触核蛋白结合分子的任何用途，特别是用于诊断和/或治疗上述突触核蛋白病。结合分子可以是本发明抗体或其免疫球蛋白链。此外，本发明涉及本文描述的提到的抗体的任何一个的抗独特型抗体。这些是与位于抗体可变区上抗原结合位点附近的独特抗原性肽序列的抗体或其它结合分子，并且用于例如检测受试者样品中的抗α-突触核蛋白抗体。
在另一实施方案中，本发明涉及包含上述本发明α-突触核蛋白结合分子、抗体、抗原结合片段、多核苷酸、载体或细胞的任何一个和任选地适合检测的工具例如常规用于基于免疫或核酸的诊断方法的试剂的诊断组合物。本发明抗体例如适合用于免疫测定，其中它们可以液相使用或结合至固相载体。可利用本发明抗体的免疫测定的实例是直接或间接形式的竞争性和非竞争性免疫测定。此类免疫测定的实例是放射性免疫测定(RIA)、夹心(免疫计量测定)、流式细胞术和Western印迹分析。本发明抗原和抗体可结合至许多不同的载体并用于分离与其特异性结合的细胞。公知载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁石。为本发明目的，载体的性质可以是可溶的或不溶的。存在许多本领域技术人员已知的不同标记和标记方法。可用于本发明的标记类型的实例包括酶、放射性同位素、胶态金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物；还参见上文讨论的实施方案。
作为进一步实施方案，本发明α-突触核蛋白结合分子、特别是抗体可用于诊断个体疾患的方法，通过从测试个体获得体液样品，其可以是血液样品、淋巴样品或任何其它体液样品，并使所述体液样品与本发明抗体在能够形成抗体-抗原复合物的条件下接触。然后通过本领域已知的方法测定此类复合物的水平，显著高于在对照样品中形成的复合物的水平指示在测试个体中的疾病。以相同方式，还可使用本发明抗体结合的特定抗原。因此，本发明涉及包括本发明结合分子例如抗体或其抗原结合片段的体外免疫测定。
该上下文中，本发明还涉及为此目的特别设计的工具。例如，可以使用基于抗体的阵列，其例如载有特异性识别α-突触核蛋白的本发明抗体或等同抗原结合分子。微阵列免疫测定的设计概述于Kusnezow等，Mol.Cell Proteomics5(2006)，1681-1696。因此，本发明还涉及载有根据本发明鉴定的α-突触核蛋白结合分子的微阵列。
在一个实施方案中，本发明涉及诊断受试者中突触核蛋白病的方法，该方法包括：
(a)使用本发明任何一个的抗体或其片段评估待诊断受试者中α-突触核蛋白的水平、定位、构象或其组合，和
(b)将所述受试者中α-突触核蛋白的水平、定位、构象或其组合与源自一个或多个对照样品的一个或多个参考标准相比较，
其中所述受试者中α-突触核蛋白的水平、定位、构象或其组合与参考标准之间的差异或相似性指示受试者是否具有突触核蛋白病。
被诊断的受试者可以是无疾病症状或临床前的。参考标准可以源自具有突触核蛋白病例如PD、DLB或MSA的患者，其中待诊断受试者中的α-突触核蛋白水平、定位、构象或其组合与参考标准之间的相似性指示待诊断受试者具有突触核蛋白病。可选地或附加地，参考标准源自不具有突触核蛋白病的受试者。在某些实施方案中，待诊断受试者和参考标准是年龄匹配的。分析可以在体内进行，或者通过从待诊断受试者分离的样品，例如怀疑含有α突触核蛋白的任何体液，例如血液、CSF或尿样品
α-突触核蛋白的水平、定位和/或构象可以通过本领域已知的任何适合方法评估，包括例如，通过选自Western印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、荧光激活的细胞分选(FACS)、二维凝胶电泳、质谱(MS)、基质辅助的激光解吸/电离-飞行时间-MS(MALDI-TOF)、表面增强的激光解吸/电离-飞行时间(SELDI-TOF)、高效液相色谱(HPLC)、快速蛋白液相色谱(FPLC)、多维液相色谱(LC)随后串联质谱(MS/MS)和激光密度测定法的一种或多种技术分析α-突触核蛋白。α-突触核蛋白的体内成像可以包括正电子发射断层照相(PET)、单光子发射断层照相(SPECT)、近红外(NIR)光学成像或磁共振成像(MRI)。
使用可根据本发明适应的抗体和相关工具诊断突触核蛋白病例如PD、DLB或MSA，监测突触核蛋白病进展，和监测突触核蛋白病治疗的方法还描述于国际申请WO2007/011907。类似地，基于抗体的检测α-突触核蛋白的方法描述于国际申请WO99/50300、WO2005/047860、WO2007/021255和WO2008/103472，所有的公开内容通过引用并入本文。那些方法可以如描述应用，但是使用本发明的α-突触核蛋白特异性抗体、结合片段、衍生物或变体。
这些和其它实施方案通过本发明说明书和实施例来公开和涵盖。关于根据本发明使用的材料、方法、用途和化合物的任何一个的其它文献可以从公共图书馆和数据库检索，使用例如电子设备。例如，可以使用公共数据库“Medline”，由美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)和/或美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)的美国国家医学图书馆(National Library ofMedicine)管理。其它数据库和网址例如作为欧洲分子生物学实验所(European MolecularBiology Laboratory,EMBL)的一部分的欧洲生物信息研究所(European BioinformaticsInstitute,EBI)的那些也是本领域技术人员已知的，并且也可使用因特网搜索引擎获得。生物技术专利信息的概况和用于回溯检索和最新文献通告的相关专利信息来源的概述参见Berks，TIBTECH12(1994)，352-364。
上述公开大体上描述了本发明。除非另外说明，本文使用的术语以2000年修订并在2003年再版的Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology，OxfordUniversity Press，1997，ISBN0 19 850673 2中提供的定义给出。几个文件在本说明书正文通篇引用。所有引用的参考文献(包括本申请通篇引用的参考文献、授权专利、公开的专利申请以及生产商的说明书、使用说明等)的内容在此明确通过引用并入；然而，不承认所引用的任何文件实际上是本发明的在先技术。
可以参考下述具体实施例获得更全面的理解，这些实施例在本文仅为示例说明的目的提供，并且不是要限制本发明的范围。
实施例
以下实施例进一步示例说明了本发明，但不应该解释为以任何方式限制本发明范围。以下实施例1和2的实验就克隆的抗体NI-202.3G12、NI-202.12F4和NI-202.3D8示例说明和描述，即，含有在框架1Ig可变区的每个N-末端引物诱导的突变，并且未调整至人可变重链和轻链的种系(GL)序列；参见图1。然而，NI-202系列的其它抗体，特别是具有调整的GL序列的那些抗体结构上类似，并因此可预期提供相当的结果。这些抗体被表示为人IgG1分子。实施例3和4的实验就抗体NI-202.12F4来示例说明和描述，在Ig可变区的N-末端具有引物诱导的突变，调整至人可变重链和轻链的种系(GL)序列；参见图1。该抗体被表示为嵌合分子，其中调整的人可变结构域融合至小鼠IgG2a恒定区以允许在转基因小鼠模型中的长期给药研究，不诱导小鼠抗人免疫应答。
材料和方法
常规方法例如本文使用的那些的详细描述参见所引用的文献。除非下文另外指出，α-突触核蛋白特异性B细胞的鉴定和表现出感兴趣的特异性的α-突触核蛋白抗体的分子克隆及其重组表达和功能表征已经或可以如国际申请PCT/EP2008/000053(公布为WO2008/081008)和PCT/EP2009/009186(公布为WO2010/069603)的实施例和补充方法章节中所描述的来进行，其公开内容通过引用整体并入本文。
抗原纯化
通过在大肠杆菌中重组表达，随后使用热诱导沉淀、镍亲和色谱、阴离子交换色谱和尺寸排阻色谱纯化来获得重组His-α-突触核蛋白。
例如，包含在Τ7启动子控制下的编码α-突触核蛋白的cDNA的DNA构建体用于转化适当的大肠杆菌菌株，例如BL21(DE3)，并且通过添加1mM异丙基β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)来诱导200ml细胞培养物的表达。在37℃诱导4小时后收获细胞，然后重悬于20ml50mM Tris、150mM NaCl pH8，随后超声处理。沸腾15分钟后，收集热抗性的17000g上清液。从模拟大肠杆菌收集类似的热抗性17000g上清液。在调整来自表达His标签α-突触核蛋白的大肠杆菌的热抗性17000g上清液(20ml)至50mM Tris、300mM NaCl、20mM咪唑、pH8之后，将它载至HisTrap HP1ml(GE Life Science)柱，并用30-500mM咪唑梯度洗脱HIS-α-突触核蛋白。收集含有HIS-α-突触核蛋白的级分，然后用50mM Tris pH8稀释1：10。将稀释的收集的级分应用至HiTrap Q HP1ml(GE Life Science)柱，并以30-1000mM NaCl梯度洗脱结合的蛋白。最后，使用高效凝胶过滤(Superdex20010/300GL)进一步纯化含有HIS-α-突触核蛋白的洗脱液。该纯化过程产生如通过SDS-PAGE和考马斯染色评估的大约99%的纯度级别的HIS-α-突触核蛋白。已使用BCA分析(Pierce)测定了纯化的蛋白的浓度。
α-突触核蛋白抗体筛选
在4℃，用在涂布缓冲液(PBS pH9.6)中2μg/ml的标准浓度的纯化的HIS-α-突触核蛋白或α-突触核蛋白(rPeptide)涂布96孔半面积微板(Corning)过夜。用PBS-T pH7.6洗涤板，并在RT下用含有2%BSA的PBS-T(Sigma，Buchs，Switzerland)封闭非特异性结合位点1小时。在RT下用1%BSA中10%热抗性大肠杆菌蛋白预吸收B细胞条件培养基1小时。在之前几次ELISA筛选尝试未能成功鉴定人α-突触核蛋白特异性抗体之后发展了该预吸收步骤。因此，幸运地，结果是ELISA板用热抗性大肠杆菌蛋白的预吸收排除筛选假阳性命中，例如粘抗体和针对纯化的重组α-突触核蛋白样品中可能存在的大肠杆菌蛋白污染的抗体。然后将预吸收的培养基从记忆B细胞培养板转移至ELISA板并在RT孵育2小时。在PBS-T中洗涤ELISA板，然后与辣根过氧化物酶(HRP)结合的驴抗人IgG(Fcγ片段特异性的)多克隆抗体孵育。用PBS-T洗涤之后，通过在标准比色测定中测量HRP活性来确定人抗体的结合。
α-实触核蛋白抗体的分子克隆
含有记忆B细胞的样品获自>60岁的志愿者。所有志愿者共同缺乏任何帕金森病体征。收集选择的记忆B细胞培养物的活B细胞，并制备mRNA。然后使用所有人可变重链和轻链家族的Ig-框架1特异性引物作为5’引物和所有人J区段(重链和κ轻链)和C区段(λ轻链)的特异性引物作为3’引物获得免疫球蛋白重链和轻链序列(Marks等，Mol.Biol.222(1991)，581-597；de Haard等，J.Biol.Chem.26(1999)，18218-18230)。
通过在重组表达完整抗体后ELISA再筛选，进行具有预期特异性的抗体克隆的鉴定。在将可变重链和轻链序列以“正确读码框”插入表达载体后实现完整人IgG1抗体或嵌合IgG2a抗体的重组表达，所述表达载体使可变区序列5’-端与编码前导肽的序列互补并使可变区序列3’-端与编码适当恒定区结构域的序列互补。为此，引物含有被设计为利于可变重链和轻链序列克隆入抗体表达载体的限制位点。通过将免疫球蛋白重链RT-PCR产物框内插入带有信号肽和人免疫球蛋白γ1或小鼠免疫球蛋白γ2a的恒定结构域的重链表达载体来表达重链免疫球蛋白。通过将NI-202.3D8的κ轻链RT-PCR产物框内插入提供信号肽和人κ轻链免疫球蛋白的恒定结构域的轻链表达载体来表达κ轻链免疫球蛋白。通过将λ轻链RT-PCR产物框内插入提供信号肽和人或小鼠λ轻链免疫球蛋白的恒定结构域的λ轻链表达载体来表达NI-202.12F4和NI-202.3G12κ轻链免疫球蛋白。
在Ig重链表达载体和κ或λIg轻链表达载体共转染入ΗΕΚ293或CHO细胞(或人或小鼠来源的任何其它适当受体细胞系)后获得功能性重组单克隆抗体。随后使用标准蛋白A柱纯化从条件培养基纯化重组人单克隆抗体。重组人单克隆抗体可以使用瞬时或稳定转染的细胞不限量产生。
抗体
pan突触核蛋白抗体Syn211(Sigma)根据生产商方案使用。重组人α-突触核蛋白抗体NI202.22G11和NI202.12F4是本发明抗体。它们在HEK293或CHO细胞中表达，然后条件培养基直接用于随后应用，除非另外说明。
直接ELISA
将抗原以在PBS pH9.6中所示浓度涂布在96孔半面积微板(Corning)上，4℃下过夜。用PBS-T pH7.6洗涤板，并在RT下用含有2%BSA的PBS-T(Sigma)封闭非特异性结合位点1小时。然后将探针(第一抗体)转移至孔并在RT孵育2小时。在PBS-T pH7.6中洗涤之后，孔与辣根过氧化物酶(HRP)结合的多克隆抗人(对于重组人抗体)、抗兔(对于pan突触核蛋白抗体)或抗小鼠(对于LB509或Syn211)二级抗体RT孵育1小时。在PBS-T中剧烈洗涤之后，通过在标准比色测定中测量HRP活性来确定探针结合，使用3,3',5,5'-四甲基联苯-4,4'-二胺(Sigma)作为生色底物。
表位作图的肽扫描
将人α-突触核蛋白的完整序列合成为重叠的肽，具有15个氨基酸(aa)的长度和11aa的重叠，通过柔性连接体偶联至纤维素膜(JPT，Berlin，Germany)。在甲醇中冲洗包含总计33个肽的膜，然后用Rotiblock(Roth，Karlsruhe，Germany)封闭。将膜与在封闭溶液中稀释的指示抗体孵育，然后与辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗孵育1小时。在孵育之间，用PBS-T洗涤(3x)膜5min。然后使用ECL加Western印迹检测试剂(GE Healthcare)使膜显色。
溶液ELISA
在4℃下，将在碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)中稀释的NI-202.12F4(2μg/ml)涂布至ELISA板。然后用2%BSA PBS-T封闭板，并随后用PBS-T洗涤。添加指示的生物素酰化的α-突触核蛋白肽，孵育2小时之后，用PBS-T洗涤板。与HRP标记的链霉亲和素孵育1小时之后，通过在标准比色测定中测量HRP活性来确定结合。
实施例1：人源α-突触核蛋白抗体NI-202.21D11对于人α-突触核蛋白是选择性的
α-、β-和γ-突触核蛋白是主要在神经系统、骨骼肌和心脏中表达的高度同源蛋白。α-突触核蛋白与广谱CNS疾病强关联，而β-突触核蛋白可能是神经保护蛋白。因此，本发明提供了不与β-和γ-突触核蛋白交叉反应的针对病理性α-突触核蛋白变体的治疗性体。为了支持NI-202.21D11的潜在治疗用途，在直接ELISA中测试抗体与α-、β-和γ-突触核蛋白的结合。以相等浓度将重组α-、β-和γ-突触核蛋白涂布至ELISA板，然后与重组NI-202.21D11或对照pan突触核蛋白抗体孵育。pan-突触核蛋白抗体检测所有三种突触核蛋白蛋白，但是NI-202.21D11展现出对α-突触核蛋白的选择性结合(图2a)。
人和小鼠α-突触核蛋白是高度保守的蛋白。为了探测重组NI-202.21D11是否相对于鼠α-突触核蛋白优先结合人α-突触核蛋白，将重组His标记的人或鼠α-突触核蛋白以相等浓度涂布至ELISA板，然后测试NI-202.21D11和NI-202.12F4结合(图2b)。在该直接ELISA中，NI-202.21D11仅检测人α-突触核蛋白，而NI-202.12F4检测人和鼠α-突触核蛋白(参见PCT公开号WO2010/069603A1)。这些发现一起证明NI-202.21D11对于人α-突触核蛋白是高度选择性的。
实施例2：NI-202.21D11显示对指向构象表位的高涂布浓度的人a-突触核蛋白的优先结合
使用直接α-突触核蛋白ELISA确定针对低和高涂布浓度的重组α-突触核蛋白的、指示NI-202.21D11的效价的半数最大有效浓度(EC50)。对于高涂布浓度的α-突触核蛋白(20μg/ml)，发现重组NI-202.21D11以～200pM的EC50的高亲和力结合。在较低浓度α-突触核蛋白下，发现亲和力急剧下降(图3)。这些特征与可商业获得的抗体syn211形成强烈对比，抗体syn211还检测α-突触核蛋白的C-末端结构域中的表位。该发现表明，NI-202.21D11偏好在高密度条件下形成或暴露的表位，例如高分子量种类的α-突触核蛋白中发现的那些。
实施例3：重组NI-202.22D11结合脑中的病理性α-突触核蛋白种类。
通过来自α-突触核蛋白转基因小鼠和来自具有神经病理上确认的突触核蛋白病(路易体痴呆)的患者的脑切片的免疫组织化学染色进一步鉴定了NI-202.21D11与人α-突触核蛋白的结合。NI-202.21D11显示了在来自过表达人α-突触核蛋白A53T的转基因小鼠的脑组织的蛋白酶K处理的石蜡切片上路易体和路易突起样包涵体的显著染色(图4a)。在来自野生型的脑切片中没有检测到NI202-21D11染色，支持了NI-202.21D11对人α-突触核蛋白是特异性的(图4b)。NI-202.21D11还检测了具有路易体痴呆的患者的人脑组织中的病理性α-突触核蛋白(图4c)。这些结果显示，人源抗体NI-202.21D11检测脑中的病理性α-突触核蛋白。
实施例4：人源α-突触核蛋白特异性抗体NI-202.22D11表位对人α-突触核蛋白的C-末端结构域内表位的作图。
α-突触核蛋白是140个氨基酸(aa)长的天然未折叠蛋白，其由三个结构域构成。这些事N-末端两亲性重复区域(aa1-60)、中心区域(aa61-95)和酸性C-末端区域(aa96-140)。(A)为了获得对NI-202.21D11结合结构域的初始理解，在直接ELISA中测试重组α-突触核蛋白截短物的NI-202.21D11结合。将来自残基1-60、1-95、61-140和96-140的重组α-突触核蛋白截短物涂布至ELISA板上，然后与重组NI-202.21D11孵育。仅发现NI-202.21D11对α-突触核蛋白截短物61-140和96-140的结合，证明NI-202.21D11结合α-突触核蛋白的C-末端酸性结构域(图5a)。
为了更详细理解NI-202.21D11的识别序列，测试了NI-202.21D11对覆盖整个人α-突触核蛋白氨基酸序列的重叠的线性15-聚体肽的结合。相邻肽共享11个残基的重叠，并且将肽C-末端印至纤维素支持膜。NI-202.21D11结合至三个重叠肽，即人α-突触核蛋白的残基109-123(B08)、113-127(B09)和117-131(B10)(图5b)。该结果表明，α-突触核蛋白的C-末端内NI-202.21D11结合所需的最小识别序列是PVDPDNE(117-123)。值得注意的是，NI-202.21D11结合略小于肽B08和B09的肽B10。因此，a-突触核蛋白内的残基113-117可以影响NI-202.21D11结合。
在直接ELISA中发现几乎没有NI-202.21D11与小鼠α-突触核蛋白的结合(图2B)。NI-202.21D11的确定的表位序列(PVDPDNE)与相应鼠序列(PVDPGSE)的序列比对表明，D121和N122是NI-202.21D11对于人与鼠α-突触核蛋白的选择性的关键氨基酸。为了证实D121/N122的关键作用，产生了重组突变的人α-突触核蛋白D121G/N122S并在直接ELISA中测试NI202.21D11结合。如图5c所示，与野生型人α-突触核蛋白相比，NI-202.21D11显示几乎不与人α-突触核蛋白D121G/N122S结合。使用对照pan-突触核蛋白抗体作为突触核蛋白相等涂布的标准化对照。
这些结果显示，NI-202.21D11是检测人α-突触核蛋白内C-末端表位(残基117-123)的人源α-突触核蛋白抗体，并且氨基酸D121/N122促成人与鼠α-突触核蛋白选择性。
实施例5：NI-202.12F4检测α-突触核蛋白4-15内的表位，并且α-突触核蛋白中的K10是NI-202.12F4的α-突触核蛋白选择性的关键氨基酸
为了更详细理解NI-202.12F4的识别序列(表位)，通过免疫印迹测试覆盖完整人α-突触核蛋白氨基酸序列的重叠的线性15-聚体肽的NI-202.12F4结合。相邻肽共享11个残基的重叠，并且将肽C-末端印至纤维素支持膜。NI-202.12F4仅结合至最N端肽(A01)，显示该表位在残基1-15内(图6a)。因为NI-202.12F4不结合肽(A02)残基5-20，该表位开始于残基1和5之间。为了确定表位的确切起始残基，在溶液结合ELISA中测试合成α-突触核蛋白肽的NI-202.12F4结合。首先为了验证溶液结合ELISA，测试合成肽α-突触核蛋白1-30和5-30的NI-202.12F4结合。NI-202.12F4结合α-突触核蛋白1-30但不结合5-30，验证了通过证实表位起始于残基1和5之间的测定(图6b)。接下来，测试α-突触核蛋白4-30的NI-202.12F4结合，如图6b所示，NI-202.12F4结合α-突触核蛋白4-30。这些结果显示，NI-202.12F4表位起始于残基4。
NI-202.12F4选择性结合至α-突触核蛋白但不结合β-和γ-突触核蛋白。含有NI-202.12F4表位的序列(α-突触核蛋白4-15)与相应的β-突触核蛋白序列的序列比对显示，这些序列仅一个氨基酸差异。α-突触核蛋白中位置10的赖氨酸被β-突触核蛋白中的蛋氨酸替代。因此，NI202.12F4应该结合β-突触核蛋白M10K但不结合α-突触核蛋白K10M。为了实验证实，在直接ELISA中测试了重组野生型和K10Mα-突触核蛋白以及野生型和M10Kβ-突触核蛋白的NI-202.12F4结合。如预测的，NI202.12F4仅结合野生型α-突触核蛋白和β-突触核蛋白M10K，但不结合野生型β-突触核蛋白和α-突触核蛋白K10M(图6c)。pan-突触核蛋白抗体结合所有四种重组蛋白，同样地充分证明相等涂布至ELISA板。
这些实验一起表明，NI202.12F4的表位位于α-突触核蛋白的残基4-15。该表位起始于残基4并终止于残基11-15之间。α-突触核蛋白中位置10的赖氨酸负责NI-202.12F4对α-突触核蛋白相对于β-突触核蛋白的特异性。

Claims (68)

1.分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其与SEQ ID NO:1相结合并包含免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其中所述免疫球蛋白重链可变区(VH)包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述免疫球蛋白轻链可变区(VL)包含VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3；
其中所述VH的CDR1由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成、所述VH的CDR2由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成和所述VH的CDR3由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成；以及
其中所述VL的CDR1由SEQ ID NO:23的氨基酸序列组成、所述VL的CDR2由SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成和所述VL的CDR3由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成。
2.如权利要求1所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其中所述VH由SEQ ID NO:15组成。
3.如权利要求1所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其中所述VL由SEQ ID NO:22组成。
4.权利要求1所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其中所述VH由SEQID NO:15组成以及其中所述VL由SEQ ID NO:22组成。
5.权利要求1所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其中所述VH由SEQID NO:15组成以及其中所述VL由SEQ ID NO:26组成。
6.权利要求1所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其中所述VH由SEQID NO:20组成以及其中所述VL由SEQ ID NO:22组成。
7.权利要求1所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其中所述VH由SEQID NO:20组成以及其中所述VL由SEQ ID NO:26组成。
8.一种包含VH的分离的多肽，其中所述VH的所述CDR1、CDR2和CDR3区分别与参考重链CDR1、CDR2和CDR3序列SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18相同，并且其中包含所述VH的抗体或其抗原结合片段特异性结合SEQ ID NO:1。
9.如权利要求8所述的多肽，还包括与其融合的异源多肽。
10.如权利要求8或9所述的多肽，其中所述多肽与选自由以下组成的组的物质结合：肽、蛋白、病毒、脂质和聚乙二醇。
11.如权利要求8或9所述的多肽，其中所述多肽缀合于治疗剂。
12.如权利要求8或9所述的多肽，其中所述多肽缀合于酶。
13.如权利要求8或9所述的多肽，其中所述多肽缀合于生物反应调节剂。
14.如权利要求8或9所述的多肽，其中所述多肽缀合于聚乙二醇。
15.如权利要求8或9所述的多肽，其中所述多肽缀合于前药。
16.如权利要求1-7中任一项所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其进一步包含与所述VH融合的信号肽。
17.如权利要求1-7中任一项所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其进一步包含与所述VL融合的信号肽。
18.如权利要求1-7中任一项所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其进一步包含与所述VH融合的CH1结构域。
19.如权利要求1-7中任一项所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其进一步包含与所述VH融合的CH2结构域。
20.如权利要求1-7中任一项所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其进一步包含与所述VH融合的CH3结构域。
21.如权利要求1-7中任一项所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其进一步包含与所述VH融合的铰链区。
22.如权利要求1-7中任一项所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其进一步包含与所述VL融合的CK结构域。
23.如权利要求1-7中任一项所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其进一步包含与所述VL融合的CL结构域。
24.如权利要求1-7中任一项所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其是人源化的。
25.如权利要求1-7中任一项所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其是嵌合的。
26.如权利要求1-7中任一项所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其是完全人的。
27.如权利要求1-7中任一项所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其是Fab片段。
28.如权利要求1-7中任一项所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其是Fab'片段。
29.如权利要求1-7中任一项所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其是F(ab)2片段。
30.如权利要求1-7中任一项所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其是单链Fv片段。
31.如权利要求1-7中任一项所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其是单链抗体。
32.如权利要求1-7中任一项所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其进一步包含与其融合的异源多肽。
33.如权利要求1-7中任一项所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体与选自由以下组成的组的物质结合：肽、蛋白、病毒、脂质和聚乙二醇。
34.如权利要求1-7任一项所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其缀合于治疗剂。
35.如权利要求1-7任一项所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其缀合于酶。
36.如权利要求1-7任一项所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其缀合于生物反应调节剂。
37.如权利要求1-7任一项所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其缀合于聚乙二醇。
38.如权利要求1-7任一项所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其缀合于前药。
39.一种药物组合物，其包含如权利要求1-7中任一项所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段和载体。
40.如权利要求39所述的组合物，其是诊断组合物。
41.一种分离的多核苷酸，其包含编码权利要求8或9所述的多肽或权利要求1-7中任一项所述的分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段的核酸。
42.如权利要求41所述的分离的多核苷酸，其还包含异源多核苷酸。
43.如权利要求42所述的分离的多核苷酸，其中所述异源多核苷酸编码异源多肽。
44.一种组合物，其包含权利要求41所述的分离的多核苷酸。
45.一种组合物，其包含VH编码多核苷酸和VL编码多核苷酸，其中所述VH编码多核苷酸和所述VL编码多核苷酸分别编码氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:22,
b)SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:26,
c)SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22,或
d)SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:26；
其中所述VH和VL编码多核苷酸一起编码特异性结合人α-突触核蛋白SEQ ID NO:1的抗体或其抗原结合片段。
46.如权利要求45所述的组合物，其中所述VH编码多核苷酸由SEQ ID NO:19或SEQ IDNO:21的核酸序列组成，并且所述VL编码多核苷酸由SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28的核酸序列组成。
47.一种载体，其包含权利要求41所述的多核苷酸。
48.如权利要求47所述的载体，其中所述多核苷酸与启动子可操作地缔合。
49.如权利要求48所述的载体，其中所述多核苷酸从与其可操作地缔合的单个启动子共转录，但是单独翻译。
50.如权利要求49所述的载体，还包含置于所述多核苷酸之间的IRES序列。
51.如权利要求48所述的载体，其中所述多核苷酸单独转录，各自与单独启动子可操作地缔合。
52.如权利要求51所述的载体，其中所述单独启动子是相同启动子的拷贝。
53.如权利要求51所述的载体，其中所述单独启动子是不相同的。
54.一种组合物，其包含权利要求47所述的载体。
55.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求41的多核苷酸。
56.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求47的载体。
57.一种产生抗人α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段的方法，其包括培养权利要求55所述的宿主细胞，并回收所述抗体或其片段。
58.一种产生抗人α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段的方法，其包括培养权利要求56所述的宿主细胞，并回收所述抗体或其片段。
59.一种抗人α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，其由权利要求57所述的方法产生。
60.权利要求1-7中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段或权利要求8或9所述的多肽在制备用于预防或治疗受试者的突触核蛋白病的药剂中的用途。
61.权利要求41所述的多肽在制备用于预防或治疗受试者的突触核蛋白病的药剂中的用途。
62.权利要求59所述的分离的抗体或其抗原结合片段在制备用于预防或治疗受试者的突触核蛋白病的药剂中的用途。
63.权利要求1-7中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段在制备用于：
(a)评估受试者中α-突触核蛋白的水平、定位、构象或其组合的诊断制剂中的用途。
64.如权利要求60所述的用途，其中所述突触核蛋白病是帕金森病(PD)、路易体痴呆(DLB)、多系统萎缩(MSA)或其组合。
65.如权利要求64所述的用途，其中所述受试者是哺乳动物。
66.如权利要求65所述的用途，其中所述哺乳动物是人。
67.如权利要求63所述的用途，其中所述受试者中α-突触核蛋白的水平、定位、构象或其组合通过体内成像测量。
68.如权利要求67所述的用途，其中所述体内成像包括正电子发射断层照相(PET)、单光子发射断层照相(SPECT)、近红外(NIR)光学成像或磁共振成像(MRI)。
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