ES2318918B1 - Anticuerpos humanos con capacidad de union al peptido beta-amiloide y sus aplicaciones. - Google Patents
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Abstract
Anticuerpos humanos con capacidad de unión al
péptido beta-amiloide y sus aplicaciones.
La presente invención hace referencia a
anticuerpos monoclonales humanos con capacidad de unión al péptido
beta-amiloide y sus aplicaciones. En concreto hace
referencia a anticuerpos monoclonales humanos y fragmentos de los
mismos con capacidad de unión al péptido
beta-amiloide 1-42, a la obtención
de dichos anticuerpos y a uso como agentes de terapia y/o
diagnóstico en la enfermedad de Alzheimer.
Description
Anticuerpos humanos con capacidad de unión al
péptido beta-amiloide y sus aplicaciones.
La presente invención hace referencia a
anticuerpos humanos, fragmentos de los mismos o derivados con
capacidad de unión al péptido beta-amiloide
1-42, a la obtención de dichos anticuerpos y a su
uso como agentes de terapia y/o diagnóstico en la enfermedad de
Alzheimer.
La enfermedad de Alzheimer es la causa más
frecuente de demencia entre las personas ancianas. Se trata de una
alteración neurodegenerativa caracterizada fundamentalmente por la
progresiva acumulación de péptido beta-amiloide en
áreas del cerebro implicadas en funciones cognitivas, tales como la
memoria y el lenguaje. La enfermedad de Alzheimer generalmente
afecta a personas mayores, de más de 65 años de edad, aunque
también puede presentarse entre gente más joven. En la actualidad,
según los datos publicados por la Organización Mundial de la Salud
(OMS) la enfermedad de Alzheimer afecta a un 5% de hombres y un 6%
de mujeres de más de 60 años en todo el mundo. Cerca de 400.000
personas se encuentran actualmente afectadas en España, más de 8
millones en Europa y, debido al envejecimiento acelerado de la
población, está prevista la duplicación del número de enfermos hacia
el año 2020 y su triplicación en el año 2050 (Selmes van den Bril,
2003).
Numerosos estudios indican que la proteína APP
(Proteína Precursora Amiloide), cuya función normal se desconoce,
juega un papel esencial en la aparición de la enfermedad. La
presencia de placas amiloides causadas por el procesamiento anómalo
de la proteína APP constituye un evento central en la patogénesis de
la enfermedad de Alzheimer. Esta proteína es escindida de manera
secuencial mediante la acción de alfa, beta y
gama-secretasas. En un proceso patológico, la APP es
procesada de manera anómala dando como resultado péptidos
insolubles, de 40-42 aminoácidos (péptido
beta-amiloide o beta-péptidos), que
tienden a agregarse a modo de fibrillas y se depositan como placas
en las células neuronales. La acumulación de dichas placas da como
resultado la muerte celular de varios tipos de células neuronales
con el subsiguiente deterioro cerebral. No obstante, la producción
de péptido beta-amiloide a partir del procesamiento
de la proteína APP no es el único factor que influye en la
existencia de un depósito de beta-péptidos. Existen
evidencias de que factores implicados en el catabolismo y la
eliminación, así como en la agregación del péptido
beta-amiloide, son también críticos (Dodel et
al., 2002).
A pesar de que en los últimos años se han hecho
grandes progresos en cuanto al conocimiento de la etiología,
genética y fisiopatología de la enfermedad de Alzheimer, las
terapias existentes en la actualidad son de tipo paliativo. La
ausencia de fármacos que actúen evitando o bien retrasando
significativamente el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer hace
que se requieran nuevas terapias alternativas y nuevos principios
activos neuroprotectores que permitan reducir el depósito de beta-
péptidos y la respuesta inflamatoria, contribuyendo a disminuir la
progresión de la enfermedad.
El sistema inmune podría jugar un papel
importante en el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer. Estudios
de inmunoterapia activa realizados en ratones transgénicos capaces
de reproducir la enfermedad de Alzheimer humana (Janus et
al., 2000; Morgan et al., 2000; Schenk et al.,
1999) indican que tras la inmunización con péptido
beta-amiloide dichos ratones producen anticuerpos
específicos capaces de disgregar y reducir las placas amiloides
causadas por la acumulación de beta-péptidos, así
como de prevenir el desarrollo de nuevas placas y la aparición de
los síntomas asociados. La reducción en el depósito de péptido
beta-amiloide observada en dichos ensayos in
vivo, fue además acompañada de cambios cognitivos en el
animal.
Los resultados obtenidos en el modelo de ratón
motivaron, en el año 2001, el inicio de un ensayo clínico de
inmunoterapia activa mediante vacunación en humanos con péptido
beta-amiloide 1-42. Tras haber
superado la fase I del ensayo clínico sin que fueran observadas
reacciones adversas, la fase clínica IIa tuvo que suspenderse a
finales del 2002 debido a que un 6% de los individuos vacunados con
péptido beta-amiloide desarrollaron encefalitis
reactiva (Orgogozo et al.,2003; Munch and Robinson,
2002; Schenk, 2002). Los estudios post-mortem
efectuados en aquellos individuos que presentaron una respuesta
adversa inflamatoria, mostraron además de dichos cambios
encefálicos una reducción en el número de placas amiloides, así como
signos de infiltración de linfocitos T en el sistema nervioso
central. La respuesta inmune celular inducida por la administración
del péptido beta-amiloide es considerada como uno
de los factores implicados en la aparición de los efectos adversos
observados (Morgan and Gitter, 2004).
A pesar de que el ensayo clínico tuvo que ser
suspendido, los sujetos participantes en la fase IIa del ensayo
continuaron siendo monitorizados (Hock et al., 2002). La
mayoría de los individuos vacunados habían desarrollado anticuerpos
anti péptido beta-amiloide que reconocían placas
amiloides. Se observó que existía una relación inversamente
proporcional entre los niveles de anticuerpos anti
beta-amiloide en el suero de los sujetos vacunados
y la pérdida de facultades intelectuales en dichos individuos (Hock
et al., 2003), sugiriendo el papel protector de los
anticuerpos anti beta-amiloide frente a la
progresión de la enfermedad de Alzheimer. Asimismo, se detectó una
ausencia de correlación entre los niveles de anticuerpos anti
beta-amiloide presentes en suero y la aparición de
meningoencefalitis (Orgogozo et al., 2003).
Una terapia alternativa a la inmunización activa
con péptido beta-amiloide para el tratamiento y/o
prevención de la enfermedad de Alzheimer es la administración
pasiva de anticuerpos específicos anti
beta-amiloide. La inmunoterapia pasiva permite
personalizar la dosis de anticuerpo y reemplazar un anticuerpo por
otro dirigido a un epítopo distinto, así como elegir el isotipo del
anticuerpo a administrar. Otra ventaja de la administración de
anticuerpos específicos frente a la inmunización activa, es que su
efectividad no depende de que exista una respuesta inmune en el
individuo receptor, lo cuál es especialmente interesante en el caso
de individuos de edad avanzada ya que los pacientes de este grupo
de edad suelen presentar una respuesta inmune variable. Por otra
parte, la inmunoterapia pasiva permite detener o bien
reducir la dosis de anticuerpo administrada en caso de aparición de reacciones adversas (Morgan and Gitter, 2004).
reducir la dosis de anticuerpo administrada en caso de aparición de reacciones adversas (Morgan and Gitter, 2004).
Se han efectuado diversos estudios de
inmunoterapia pasiva en ratones transgénicos que reproducen la
enfermedad de Alzheimer humana (DeMattos et al., 2001, Bard
et al., 2000, Frenkel et al. 2000). En dichos estudios
se muestra como tras la administración pasiva de anticuerpos con
capacidad de unión al péptido beta amiloide existe una reducción
del número de placas amiloides, así como una disminución en la
progresión de la enfermedad. Dichos resultados sugieren que la
respuesta inmune mediada por linfocitos T no es requerida en la
eliminación de los depósitos de beta-amiloide, lo
que genera una expectativa sobre el potencial terapéutico que
ofrece el desarrollo de anticuerpos específicos anti péptido
beta-amiloide. Así pues, la administración de
anticuerpos monoclonales dirigidos frente al péptido
beta-amiloide produciría efectos positivos similares
a los obtenidos mediante inmunización activa. Y a su vez, evitaría
la aparición de efectos adversos indeseables, tales como la
encefalitis reactiva, en ausencia de una respuesta inmune mediada
por linfocitos T.
Los efectos positivos ejercidos por los
anticuerpos anti beta-amiloide, observados en los
ensayos in vivo de inmunoterapia pasiva efectuados en ratones
transgénicos, motivaron la realización de diversos trabajos con el
objetivo de investigar la presencia de
auto-anticuerpos frente al péptido
beta-amiloide en humanos sanos no inmunizados y su
posible papel protector frente a la enfermedad de Alzheimer u otras
enfermedades en las que exista un depósito de péptido
beta-amiloide. Sin embargo, dichos trabajos
generaron resultados contradictorios.
Por una parte, existen artículos donde se
proporcionan datos que dan soporte a un posible papel protector de
los anticuerpos anti beta-amiloide. En uno de ellos
(Du et al., 2001), se identificó la presencia de anticuerpos
(IgG) que reconocen de manera específica el péptido
beta-amiloide en humanos no inmunizados, tanto en
suero como en líquido cefalorraquídeo. El título de anticuerpos en
el líquido cefalorraquídeo de pacientes con Alzheimer era
significativamente más bajo que el detectado en individuos control.
Asimismo, en un estudio posterior (Weksler et al., 2002)
observaron que el título de IgG anti beta-amiloide
se encontraba reducido en el suero de individuos ancianos enfermos
de Alzheimer respecto a individuos sanos de edad avanzada (> 65
años) que no presentaban una pérdida de facultades intelectuales. En
ambos trabajos se aportan evidencias a favor del potencial papel
protector de la respuesta inmune humoral específica frente al
péptido beta-amiloide en la enfermedad de
Alzheimer. No obstante, los niveles reducidos de anticuerpos anti
beta observados en dichos estudios podrían ser consecuencia de un
incremento en la concentración de beta-péptidos en
el sistema nervioso central. Así pues, la unión de los
beta-péptidos a los autoanticuerpos específicos
resultaría en una disminución aparente en la concentración de
anticuerpos anti péptido beta-amiloide (Weksler
and Goodhardt, 2002).
Por otra parte, han sido publicados estudios que
contradicen la hipótesis del posible papel protector de los
auto-anticuerpos anti beta-amiloide
presentes en suero de individuos ancianos no inmunizados. Hyman y
colaboradores (Hyman et al, 2001) no hallaron diferencias
significativas al comparar los niveles de inmunoglobulinas anti
beta-amiloide totales, en suero de pacientes
enfermos de Alzheimer, con los niveles detectados en individuos
control. En otro estudio reciente (Baril et al., 2004) se
compararon los niveles de anticuerpos específicos frente al péptido
beta-amiloide en suero de ancianos enfermos de
Alzheimer con los de individuos control del mismo rango de edad
(casos: 66-86 años, control: 63-82
años). Los individuos de ambos grupos presentaban bajos títulos de
anticuerpos anti beta-amiloide, con niveles
variables. En dicho estudio también se realizó un análisis de la
concentración en suero de IgG anti péptido
beta-amiloide 1-42 en diferentes
grupos de edad (niños: 1-10 años, jóvenes:
20-48 años y ancianos: sujetos caso y control del
estudio). Los resultados de dicho análisis muestran que no existen
diferencias estadísticamente significativas en
los niveles de inmunoglobulinas dirigidas frente al péptido beta-amiloide 1-42 entre los diferentes grupos de edad.
los niveles de inmunoglobulinas dirigidas frente al péptido beta-amiloide 1-42 entre los diferentes grupos de edad.
Así pues, la consideración del estado de la
técnica actual de manera global no permite deducir que exista una
relación directa entre la presencia de anticuerpos anti
beta-amiloide en suero de individuos sanos no
inmunizados y un factor de protección frente al Alzheimer.
En la actualidad, se acepta que el depósito de
beta-péptidos en el sistema nervioso central tiene
lugar de manera progresiva con la edad y en la enfermedad de
Alzheimer. El depósito de péptido beta-amiloide y la
formación de placas se inician 10-20 años antes de
la aparición de cualquier síntoma indicativo de pérdida de
facultades cognitivas que sugiera la presencia de demencia
(Monsonego et al., 2003; Weksler and Goodhardt,
2002). Si partimos de esta premisa, los individuos sanos de edad
avanzada seleccionados por no presentar ninguna alteración en sus
facultades intelectuales, que han formado parte como individuos
control en los estudios mencionados, es probable que presentasen
depósitos de péptido beta-amiloide y que en un
futuro hubieran desarrollado la enfermedad de Alzheimer. Así, el
hecho de que individuos de edad avanzada no presenten síntomas de
demencia no excluye que dichos ancianos en un futuro desarrollen la
enfermedad. En un estudio de cohortes realizado en voluntarios
sanos (Kawas et al., 2000) se efectuó un seguimiento de la
evolución de los individuos participantes, de manera biennal, con el
objetivo de determinar la tasa de incidencia de la enfermedad de
Alzheimer para distintos rangos de edad. En dicho estudio se
observó que la tasa de incidencia aumenta con la edad, desde un
0.08% por año para el rango de edad comprendido entre los 60 y 65
años hasta un 6.48% por año en el grupo de individuos de más de 85
años, considerando los datos de hombres y mujeres combinados,
estimándose que en aproximadamente 4.4 años la tasa de incidencia
se duplica.
Nuestro grupo de investigadores procedió a la
búsqueda e identificación de individuos sanos longevos de más de 90
años de edad que presentaran plenas facultades cognitivas y buena
salud en ausencia de síntomas de Alzheimer u otra neuropatía y que
nunca hubieran recibido ningún tipo de medicación para la
prevención o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, es
decir, se escogieron como candidatos para la obtención de
anticuerpos anti péptido beta- amiloide 1-42 un
grupo restringido de individuos los cuales han superado los años
considerados como críticos en la aparición de la enfermedad de
Alzheimer. Así pues, se seleccionaron un grupo de ancianos
nonagenarios sanos en los cuales, en ausencia de inmunización, se
analizó la presencia en suero de anticuerpos anti péptido
beta-amiloide 1-42 mediante la
realización de inmunoensayos específicos, detectándose la
existencia de anticuerpos frente al péptido
beta-amiloide 1-42.
La presente invención hace referencia a
anticuerpos monoclonales recombinantes humanos anti péptido
beta-amiloide 1-42 y a su obtención
mediante el aislamiento, clonaje y expresión de genes de
inmunoglobulinas aislados a partir de una porción representativa
del repertorio genético de inmunoglobulinas de donantes humanos
nonagenarios sanos escogidos selectivamente por poseer plenas
facultades cognitivas y no presentar síntomas de Alzheimer u otra
neuropatía.
Sorprendentemente, dos de los anticuerpos de la
invención presentan numerosas mutaciones somáticas en su secuencia
nucleotídica en comparación con los genes genómicos
correspondientes (germ line), indicando la existencia de
procesos de maduración antigénica frente al péptido
beta-amiloide 1-42. Estos hechos
indican una respuesta inmune competente frente al péptido beta y
reflejan la existencia de anticuerpos naturales anti beta amiloide,
los cuales no presentan efectos nocivos en pacientes sanos
longevos, con potencial aplicación terapéutica en la enfermedad de
Alzheimer.
La presente invención hace referencia a
anticuerpos, a fragmentos funcionales de los mismos o derivados con
capacidad de unión al péptido beta-amiloide
1-42 y a su obtención mediante técnicas de
ingeniería genética a partir del repertorio genético de
inmunoglobulinas aislado de donantes humanos sanos nonagenarios. En
particular hace referencia a anticuerpos, a fragmentos funcionales
de los mismos o derivados con capacidad de unión al péptido
beta-amiloide 1-42, a las secuencias
de ácido nucleico que codifican para dichos anticuerpos, así como a
los usos de los mismos.
Los anticuerpos per se son ampliamente
conocidos en el estado de la técnica. Los anticuerpos están
constituidos estructuralmente por dos proteínas distintas
denominadas cadena pesada (HC) y cadena ligera (LC), las cuales
están unidas mediante puentes disulfuro. Ambas poseen una región
variable (V) y una región constante (C). Las regiones variables
están implicadas en el reconocimiento del antígeno, mientras que la
región constante de la HC determina el isotipo del anticuerpo y las
propiedades funcionales del mismo. Al comparar la similitud de
secuencia de los distintos dominios de una molécula de anticuerpo,
se ha observado que la mayoría de dominios pertenecientes a
anticuerpos de la misma subclase presentan la misma secuencia.
Dichos dominios se denominan dominios constantes (C). CL es el
dominio constante de la cadena ligera y los dominios constantes de
la cadena pesada son CH_{1}, CH_{2} y CH_{3}. Sin embargo, un
dominio de cada una de las cadenas es variable (VH y VL). Kabat y
colaboradores (Kabat et al., 1978) observaron que la
variabilidad se encuentra concentrada en 3 regiones de los dos
dominios variables. Dichas regiones hipervariables o CDRs
(Complementary-Determining Regions)
interaccionan de manera tridimensional para dar lugar al sitio de
unión al antígeno, el cuál contiene seis regiones CDR, tres del
dominio VH y tres del dominio VL. Distintos autores han observado
que el CDR3 de la cadena pesada (HCDR3) es la región que presenta un
mayor grado de variabilidad y una participación predominante en la
interacción antígeno-anticuerpo.
Los genes que codifican las cadenas HC y LC
están localizados en distintos cromosomas, formando en cada caso
familias multigénicas. Los genes que codifican las regiones
variables y constantes de las HC y LC se hallan separados en el
genoma, por consiguiente para su expresión es necesario que se
produzca primero la recombinación somática de los mismos (Tonegawa,
1983). La región variable de la cadena pesada es codificada por
tres segmentos génicos: Variabilidad (V), Diversidad (D) y Unión
(J) mientras que la región variable de la cadena ligera se compone
por dos segmentos génicos: V y J. Cada uno de estos segmentos
consta de un número variable de genes que se agrupan en familias
según su grado de homología (Williams and Winter, 1993;
Zachau, 1993). Los segmentos de la región constante de las cadenas
pesadas y ligeras se hallan próximos a los segmentos J y son
incorporados al complejo V(D)J mediante splicing del
ARN (Early et al. 1980). La existencia de múltiples copias
de cada uno de los segmentos génicos que componen las HC y las LC,
así como las diversas posibilidades de combinación entre ellos,
contribuyen a generar la diversidad del repertorio de
anticuerpos.
La recombinación somática de los segmentos
V(D)J ocurre durante el proceso de maduración de los
linfocitos B. Tanto la adición de nucleótidos N por la enzima
desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT), como delecciones
causadas por exonucleasas o la inserción de elementos
palindrómicos, generados durante la resolución de los productos
recombinantes, contribuyen a la variabilidad de la región
determinante de complementariedad (HCDR3). Dicha región está
implicada de manera directa en el reconocimiento antigénico y
contribuye a la diversidad del repertorio de inmunoglobulinas.
Posteriormente, el repertorio de anticuerpos es diversificado
durante la respuesta antigénica del linfocito maduro mediante
mutación somática. Este proceso implica la introducción de
mutaciones puntuales en los genes de las regiones variables de
ambas cadenas HC y LC generando variables intraclonales. Las
mutaciones más frecuentes son transiciones, que conllevan
sustituciones en la secuencia de aminoácidos dando como resultado
la aparición de nuevas variantes de la inmunoglobulina original.
Comienza entonces, un proceso selectivo dirigido por antígeno que
va enriqueciendo poblaciones de linfocitos B con inmunoglobulinas de
mayor afinidad (y quizás también de mejor cinética). Este fenómeno
es lo que se conoce como maduración de la afinidad. En los clones
seleccionados, el análisis de las mutaciones somáticas de las
cadenas variables de las inmunoglobulinas muestra que, en general,
los cambios tienden a concentrarse en las regiones determinantes de
complementariedad (Foote and Milstein, 1991).
En el marco de la presente invención, se
entiende como repertorio genético de inmunoglobulinas el conjunto
de segmentos génicos de inmunoglobulinas que una vez reordenados
codifican para la síntesis de anticuerpos.
Un primer aspecto de la invención hace
referencia a un procedimiento de obtención de anticuerpos,
fragmentos de los mismos o derivados con capacidad de unión al
péptido beta-amiloide 1-42, mediante
técnicas de ingeniería genética a partir del repertorio genético de
inmunoglobulinas aislado de donantes humanos sanos
nonagenarios.
Los anticuerpos de origen murino presentan
problemas para pasar a fase clínica ya que los anticuerpos de ratón
son inmunogénicos en humanos y normalmente desencadenan una
respuesta inmune generando anticuerpos humanos anti anticuerpos de
ratón (HAMA). Dichas inmunoglobulinas reconocen los anticuerpos
terapéuticos e impedirán que éstos alcancen su diana, además pueden
desencadenar una reacción de hipersensibilidad de tipo III (George
and Urch, 2000). Los anticuerpos de la presente invención
son anticuerpos recombinantes de origen humano, minimizando las
posibilidades de que se produzca rechazo por parte del sistema
inmune del individuo receptor.
Un aspecto preferido de la invención, hace
referencia al clonaje y expresión del repertorio genético de
inmunoglobulinas aislado de donantes humanos nonagenarios sanos
escogidos selectivamente por poseer plenas facultades cognitivas y
no presentar síntomas de Alzheimer u otra neuropatía, en cuyo suero
se detectó la presencia de anticuerpos anti péptido
beta-amiloide 1-42.
Existen distintas estrategias para la producción
de anticuerpos monoclonales. La tecnología de los hibridomas
(Kennet, McKearn and Bechtol, 1980) supuso una revolución
para la investigación en inmunología, permitiendo la producción de
anticuerpos consecuencia de la actividad de síntesis de un único
clon de linfocitos B. Los recientes avances en ingeniería genética
han facilitado en gran medida la producción, identificación y
conjugación de fragmentos de anticuerpos recombinantes. Un aspecto
aún más preferido de la invención hace referencia a la construcción
de una librería que contenga el repertorio genético de
inmunoglobulinas aislado de donantes humanos nonagenarios sanos
escogidos selectivamente por poseer plenas facultades cognitivas y
no presentar síntomas de Alzheimer u otra neuropatía, en cuyo suero
se detectó la presencia de anticuerpos anti péptido
beta-amiloide 1-42. Dicha librería
de genes de anticuerpos debe, preferiblemente, ser ampliamente
representativa del repertorio genético de inmunoglobulinas y puede
ser obtenida, por ejemplo, mediante amplificación por PCR del cDNA
de linfocitos B. Preferiblemente, el método de selección de esta
librería debe tener una eficiencia comparable a la del sistema
inmune, lo que se puede conseguir exponiendo en la superficie de
microorganismos los anticuerpos producidos (Little et al.,
1994). Algunos ejemplos de microorganismos que pueden ser empleados
son: fagos filamentosos como M13 (McCafferty et al., 1990),
bacterias como E. coli (Fuchs et al., 1991) o
levaduras (Boder and Wittrup, 1997). En la estrategia de
presentación en superficie existe un vínculo físico entre la
capacidad de unión al antígeno y el gen que codifica para dicho
anticuerpo. El anticuerpo presentado en la superficie celular o de
la cápside viral es codificado en el material genético del clon
seleccionado, de forma que la afinidad por el antígeno permite
aislar el microorganismo portador del gen del anticuerpo de interés.
En el marco de la presente invención, se entiende como anticuerpo
de interés aquel anticuerpo con capacidad de unión al péptido
beta-amiloide 1-42. Otra estrategia
de presentación al antígeno de los anticuerpos de la librería es el
Ribosome Display (Hanes J and Pluckthun A., 1997),
en el que el DNA es transcrito a mRNA, el cuál es purificado y
traducido in vitro. La traducción in vitro del mRNA es
diseñada de tal manera que se impide la disociación del complejo
mRNA-ribosoma-péptido. Así pues,
dichos complejos serán utilizados para la selección por afinidad
frente al antígeno de aquellos clones que codifican el anticuerpo
de interés.
El proceso de selección antigénica consiste en
la identificación de aquellos clones que presentan afinidad por el
antígeno y el posterior enriquecimiento de la librería en dichos
clones, mediante amplificación en E. coli u otro organismo
adecuado. Dicha selección ("Bio-panning")
puede realizarse mediante distintas estrategias que incluyen, pero
no se limitan a: la selección mediante el uso de antígenos
inmovilizados por métodos tales como ELISA, inmunotubos, columnas
de afinidad o chips de sensores BIAcore; la selección mediante el
uso de antígenos en solución, como por ejemplo: antígenos
biotinilados y la selección por marcadores expresados en la
superficie celular, tanto en monocapas de células adherentes como en
células en suspensión. Generalmente, en el proceso de selección
antigénica es necesario realizar varios ciclos de selección. Tras
la selección antigénica de las librerías construidas, es habitual
llevar a cabo la obtención de clones de anticuerpos específicos
contra las moléculas selectoras. La evaluación de su especificidad
antigénica puede, por ejemplo, realizarse mediante inmunoensayo
enzimático.
Un segundo aspecto de la presente invención se
refiere a un anticuerpo, fragmento funcional del mismo o derivado
con capacidad de unión al péptido beta-amiloide
1-42.
Un aspecto preferido de la invención se refiere
a un anticuerpo, fragmento funcional del mismo o derivado con
capacidad de unión al péptido beta-amiloide
1-42 obtenido mediante técnicas de ingeniería
genética a partir del repertorio genético de inmunoglobulinas
aislado de donantes humanos nonagenarios sanos.
\newpage
En el marco de la presente invención, se
entiende como fragmento funcional de anticuerpo aquellos fragmentos
de anticuerpo que pueden ser obtenidos mediante la tecnología del
ADN recombinante y conservan la capacidad de unión al antígeno.
Como fragmentos funcionales de anticuerpo se incluyen fragmentos de
una molécula de anticuerpo IgG tales como Fab, Fab' y
F(ab')_{2}. También se incluyen fragmentos Fv y derivados
de éstos tales como scFv (single-chain Fv) y dsFv
(disulfide-stabilized Fv), que han sido modificados
para aumentar la estabilidad del fragmento Fv recombinante. La
unión de dos moléculas distintas de scFv dará lugar a scFv
biespecíficos. Otros fragmentos funcionales muy similares a los
scFv biespecíficos, son los denominados diabodies. Los diabodies
son fragmentos de anticuerpos que consisten en dos cadenas
asociadas, donde cada una de las cadenas comprende un dominio
variable de la cadena ligera o pesada unida a un espaciador.
Cambios en la longitud de dicho espaciador dirigen la formación de
diabodies, triabodies o tetrabodies. Asimismo, han sido también
descritos otros fragmentos funcionales basados en fragmentos scFv,
tales como los minibodies, los cuales son fragmentos de anticuerpo
bivalentes formados por la unión de dos moléculas del péptido de
fusión scFv-CH_{3}. Se entienden también como
fragmentos funcionales de anticuerpo, fragmentos Fd like
(Chamow and Ashkenazy, 1999), domain antibodies
(Holt et al., 2003) y otros fragmentos de anticuerpo
obtenidos por ingeniería genética que por sí solos sean capaces de
interaccionar con el antígeno.
En el marco de la presente invención, se
entiende como derivado cualquier molécula que comprenda un
anticuerpo o un fragmento funcional del mismo en su estructura. Por
ejemplo: inmunoconjugados, entendiendo como tales moléculas
formadas por un anticuerpo o un fragmento funcional de anticuerpo y
una molécula efectora.
Una realización particular de la presente
invención se refiere a un anticuerpo, fragmento funcional del mismo
o derivado con capacidad de unión al péptido beta- amiloide
1-42 que comprende una o más de las secuencias
seleccionadas de entre el grupo constituido por: la secuencia
aminoacídica definida en la SEQ ID NO 2 que corresponde a la
cadena pesada del anticuerpo AD38 (Figura 8), la secuencia
aminoacídica definida en la SEQ ID NO 4 que corresponde a la cadena
ligera de AD38 (Figura 9) o secuencias homólogas a éstas.
El anticuerpo AD38 de la presente invención se
encuentra definido en la secuencia nucleotídica SEQ ID NO 9, cuya
secuencia aminoacídica correspondiente viene definida en la SEQ ID
NO 10, en adelante nos referiremos a dicho anticuerpo como
AD38.
En el marco de la presente invención se entiende
como secuencias homólogas aquellas secuencias aminoacídicas que
presentan un grado de similitud de al menos un 80% con las
secuencias aminoacídicas de los anticuerpos de la presente
invención. Preferentemente, aquellas que presentan un grado de
similitud de al menos un 85%. Más preferentemente, aquellas que
presenten un grado de similitud de al menos un 90% con las
secuencias aminoacídicas de los anticuerpos de la presente invención
y aún más preferentemente aquellas secuencias aminoacídicas que
presenten un grado de similitud de al menos un 95%. Los algoritmos
para el análisis de secuencias son conocidos en el estado de la
técnica, como por ejemplo BLAST, descrito en Altschul et al.,
1990.
En una realización particular preferida, el
anticuerpo, fragmento funcional del mismo o derivado con capacidad
de unión al péptido beta-amiloide
1-42 comprende al menos una cadena pesada y una
cadena ligera, donde la cadena pesada comprende la secuencia
aminoacídica definida en la SEQ ID NO 2 y la cadena ligera comprende
la secuencia aminoacídica definida en la SEQ ID NO 4.
En una realización particular aún más preferida
se hace referencia a un fragmento funcional de anticuerpo con
capacidad de unión al péptido beta-amiloide 1- 42
que comprende al menos una cadena pesada y una cadena ligera, donde
la cadena pesada consiste en la secuencia aminoacídica definida en
la SEQ ID NO 2 y la cadena ligera consiste en la secuencia
aminoacídica definida en la SEQ ID NO 4. Como por ejemplo, el
anticuerpo recombinante de cadena sencilla (scFv) AD38 (SEQ ID NO
10).
Otra realización particular de la presente
invención se refiere a un anticuerpo, fragmento funcional del mismo
o derivado con capacidad de unión al péptido beta- amiloide
1-42 que comprende una o más de las secuencias
seleccionadas de entre el grupo constituido por: la secuencia
aminoacídica definida en la SEQ ID NO 6 que corresponde a la cadena
pesada del anticuerpo AD64 (Figura 10); la secuencia aminoacídica
definida en la SEQ ID NO 8 que corresponde a la cadena ligera de
AD64 (Figura 11) o secuencias homólogas a éstas.
El anticuerpo AD64 de la presente invención se
encuentra definido en la secuencia nucleotídica SEQ ID NO 11, cuya
secuencia aminoacídica correspondiente viene definida en la SEQ ID
NO 12, en adelante nos referiremos a dicho anticuerpo como
AD64.
En una realización particular preferida, el
anticuerpo, fragmento funcional del mismo o derivado con capacidad
de unión al péptido beta-amiloide
1-42, comprende al menos una cadena pesada y una
cadena ligera, donde la cadena pesada comprende la secuencia SEQ ID
NO 6 y la cadena ligera comprende la secuencia SEQ ID NO 8.
En una realización particular aún más preferida
se hace referencia a un fragmento funcional de anticuerpo con
capacidad de unión al péptido beta-amiloide
1-42 que comprende al menos una cadena pesada y una
cadena ligera, donde la cadena pesada consiste en la secuencia
aminoacídica definida en la SEQ ID NO 6 y la cadena ligera consiste
en la secuencia aminoacídica definida en la SEQ ID NO 8. Como por
ejemplo, el anticuerpo recombinante de cadena sencilla (scFv) AD64
(SEQ ID NO 12).
Otra realización particular hace referencia a un
anticuerpo, fragmento funcional del mismo o derivado con capacidad
de unión al péptido beta-amiloide
1-42, obtenido mediante estrategias de maduración
de la afinidad a partir de los anticuerpos de la presente
invención. Dichas estrategias de maduración de la afinidad, incluyen
pero no se limitan a: chain shuffling (Marks et al.,
1992), introducción de mutaciones dirigida (Balint and
Larrick, 1993) o estrategias de mutación al azar.
En el marco de la presente invención se entiende
como fragmento scFv un polipéptido recombinante en el que las
secuencias de los dominios variables de las cadenas ligera y pesada
(VL y VH) de un anticuerpo han sido enlazadas mediante una
secuencia artificial. Así, por ejemplo, el extremo
C-terminal de la secuencia de VH es enlazado con el
extremo N-terminal de la secuencia de VL mediante un
péptido de unión. La disposición de los dominios variables influirá
sobre las características del scFv. Los fragmentos scFv presentan
una serie de ventajas respecto a anticuerpos intactos y a otros
fragmentos funcionales de anticuerpo:
- a.
- Los fragmentos scFv carecen de la región Fc y por tanto se evita la unión no deseada del anticuerpo a células que presentan unión a Fc, tales como las células del sistema retículo-endotelial, así como la fijación del complemento. La ausencia de la región Fc supone una ventaja en determinadas aplicaciones tales como inmunoterapia dirigida e imagen molecular.
- b.
- Debido a su bajo peso molecular los fragmentos scFv presentan una rápida biodistribución, accediendo a los tejidos con mayor facilidad que los anticuerpos intactos y otros fragmentos funcionales.
- c.
- La eliminación plasmática de los fragmentos scFv es más rápida que la observada en fragmentos Fab y en anticuerpos intactos. Gracias a la mayor tasa de eliminación de los scFv, los inmunocomplejos formados por scFv conjugados con principios activos o radionucleótidos, presentan una menor toxicidad.
- d.
- Debido a su menor tamaño, la retención de complejos antígeno-anticuerpo de fragmentos scFv en el glomérulo renal es menor a la observada en fragmentos Fab y en anticuerpos intactos.
- e.
- Los fragmentos scFv son fragmentos funcionales altamente versátiles ya que son fácilmente modificados mediante ingeniería genética. A partir de un fragmento scFv es posible generar otros fragmentos funcionales.
Otra realización particular hace referencia a un
anticuerpo, fragmento de anticuerpo o derivado que comprenda parte
de cualquiera de las secuencias aminoacídicas definidas en las
secuencias SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8 o
combinaciones, de parte o la totalidad de la secuencia de éstas, el
cuál mantenga la capacidad de unión al péptido
beta-amiloide 1-42.
En una realización particular preferida se
entienden como parte de cualquiera de las secuencias aminoacídicas
definidas en las secuencias SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6 y
SEQ ID NO 8, los CDR1, CDR2 o CDR3 del dominio variable de la
cadena pesada del anticuerpo AD38 definidos en la Figura 8, los
CDR1, CDR2 o CDR3 del dominio variable de la cadena ligera del
anticuerpo AD38 definidos en la Figura 9, los CDR1, CDR2 o CDR3 del
dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo AD64 definidos
en la Figura 10, así como los CDR1, CDR2 o CDR3 del dominio
variable de la cadena ligera del anticuerpo AD64 definidos en la
Figura 11.
Un tercer aspecto de la invención hace
referencia a una molécula de ácido nucleico que codifica la
secuencia aminoacídica del dominio variable de la cadena ligera o
de la cadena pesada de un anticuerpo con capacidad de unión al
péptido beta-amiloide 1-42 de la
presente invención, así como a variantes de dicha molécula de ácido
nucléico.
En el marco de la presente invención, se
entiende como variantes de una molécula de ácido nucleico
secuencias substancialmente similares. Secuencias substancialmente
similares incluyen secuencias nucleotídicas que debido a la
degeneración del código genético codifican la secuencia aminoacídica
del dominio variable de la cadena ligera o de la cadena pesada de
un anticuerpo de la presente invención. Los aminoácidos son
codificados por tripletes constituidos por tres nucleótidos,
también denominados codones. La mayoría de aminoácidos son
codificados por más de un triplete. A este hecho se le denomina
degeneración del código genético. Así, uno o más tripletes pueden
ser reemplazados por otros tripletes, pero dicha secuencia
nucleotídica continuará codificando para un mismo aminoácido.
Secuencias substancialmente similares también
incluyen secuencias nucleotídicas que codifican variantes de los
anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la invención. Estas
secuencias nucleotídicas homólogas a una secuencia nucleotídica
particular de la presente invención tendrán al menos un 40%, 50%,
60%, 70% de identidad con dicha secuencia. Preferiblemente, al
menos un 75%, 80%, 85%, 90% de identidad con dicha secuencia. Aún
más preferiblemente, tendrá una similitud de secuencia de un 95%,
96%, 97%, 98%, 99% o mayor.
Un aspecto preferido de la invención hace
referencia a una molécula de ácido nucleico que comprende
cualquiera de las secuencias nucleotídicas mostradas en la SEQ ID
NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5 o SEQ ID NO 7; o cualquier
combinación de éstas.
Un cuarto aspecto de la invención hace
referencia a un vector que comprende una molécula de ácido nucleico
de acuerdo con la presente invención. Dicho vector incluye pero no
se limita a: plásmidos, cósmidos y vectores virales. Dichos
vectores, preferentemente contienen una o más regiones reguladoras,
tales como promotores, secuencias señal de terminación y secreción
que permitan que las moléculas de ácido nucleico de la presente
invención sean expresadas como una proteína. Aún más
preferentemente, dicho vector es un vector viral que puede
utilizarse para infectar células in vitro o in vivo.
Dicho vector puede ser utilizado en terapia génica.
Un quinto aspecto de la invención hace
referencia a una célula hospedadora que contenga al menos un vector
que comprenda una molécula de ácido nucleico de la presente
invención. Dichas células hospedadoras son células conocidas por
cualquier experto en la materia, éstas incluyen pero no se limitan
a: células de mamífero, células de levaduras y células procariotas
como Escherichia coli.
Un sexto aspecto de la invención hace referencia
al uso de un anticuerpo, fragmento del mismo o derivado de la
presente invención, para la elaboración de una composición
farmacéutica.
Un aspecto preferido de la invención hace
referencia a una composición farmacéutica que contenga un
anticuerpo, fragmento del mismo o derivado, de la presente
invención.
Un aspecto más preferido de la invención hace
referencia a una composición farmacéutica que contenga un
anticuerpo, fragmento del mismo o derivado, de la presente
invención, para su uso en el tratamiento o prevención de la
enfermedad de Alzheimer.
Un séptimo aspecto de la invención hace
referencia al uso de un anticuerpo, fragmento del mismo o derivado
de la presente invención, para la detección del péptido
beta-amiloide 1-42 in vitro.
Resulta de particular interés el uso de anticuerpos como reactivos
de afinidad. La producción de anticuerpos monoclonales específicos
resultará evidente para cualquier experto medio en la materia. El
uso de anticuerpos específicos en técnicas de inmunodetección in
vitro es asimismo ampliamente conocido. Dichas técnicas
incluyen pero no se limitan a: ELISA, Western Blot,
inmunofluorescencia, inmunohistoquímica o citometría de flujo.
Un octavo aspecto de la invención hace
referencia al uso de un anticuerpo, fragmento del mismo o derivado
de la presente invención, para la detección del péptido
beta-amiloide 1-42 in vivo.
La detección in vivo del péptido
beta-amiloide 1-42 puede llevarse a
cabo mediante técnicas de imagen molecular. Anticuerpos
monoclonales marcados constituyen contrastes específicos,
detectables en función de la presencia de unión a su ligando
(Weissleder, 2002). Las técnicas de imagen molecular permiten
realizar estudios de detección específica in vivo. En
experimentación animal permite estudiar la evolución de una
patología o el efecto de un fármaco en el mismo animal sin que sea
necesario sacrificarlo. En los seres humanos permite el estudio
farmacológico o de la patología en diferentes tejidos de forma no
invasiva y prácticamente indolora. El uso de un anticuerpo marcado
que se una específicamente al péptido beta-amiloide
1-42 permitiría detectar de forma muy temprana
(antes de la aparición de los síntomas clínicos característicos de
la enfermedad de Alzheimer) la presencia de depósitos de péptido
beta-amiloide 1-42, así como el
estudio de la evolución de la enfermedad en el tiempo y de la
eficiencia del tratamiento.
Un noveno aspecto de la invención hace
referencia al uso de un anticuerpo, fragmento del mismo o derivado
de la presente invención, para la identificación de un compuesto
capaz de competir con dicho anticuerpo, fragmento o derivado por la
unión al péptido beta amiloide 1-42.
En un aspecto preferido de la invención, dicho
compuesto capaz de competir con el anticuerpo, fragmento o derivado
de la presente invención es un péptido o un peptoide. En el marco
de la presente invención, se entiende como peptoide a un compuesto
análogo a un péptido en el que los enlaces peptídicos han sido
reemplazados por enlaces pseudopeptídicos, como por ejemplo: Carba
[psi] (CH2-CH2), Depsi [psi] (CO-O),
Hidroxietileno [psi] (CHOH-CH2), Cetometileno [psi]
(CH-CH2), Metilen-oxy
CH2-O-, Reducido CH2-NH, Tiometileno
CH2-S-, Tiopéptido CS-NH,
N-modificado -NRCO-.
En un aspecto aún más preferido de la invención,
dicho compuesto capaz de competir con el anticuerpo, fragmento o
derivado de la presente invención es un mimotopo. En el marco de la
presente invención, se entiende como mimotopo a una molécula
peptídica cuya estructura imita la del epítopo reconocido por los
anticuerpos, fragmentos o derivados de la presente invención. La
secuencia aminoacídica de dicho mimotopo no tiene porque guardar
similitud de secuencia con el epítopo, no obstante el mimotopo
adoptará una conformación que imita la del epítopo (Steward et
al.,
1995).
1995).
En un aspecto especialmente preferido de la
invención, dicho compuesto capaz de competir con el anticuerpo,
fragmento o derivado de la presente invención es un péptido
sintético basado en la secuencia de la región CDR3 de la cadena
pesada de los anticuerpos de la presente invención.
Las figuras 1A-1D ilustran los
resultados obtenidos en los ensayos ELISA realizados utilizando
como tapiz el péptido beta-amiloide
1-42 a una concentración de 5 \mug/ml y anti
IgG+IgM+IgA-HRP como anticuerpo secundario, para
detectar la existencia de anticuerpos anti péptido
beta-amiloide 1-42 en el suero de
los donantes Vj2, Vj3, Vj4 y Vj5. En el eje X se muestran las
diluciones seriadas de suero ensayadas y en el eje Y la densidad
óptica a 450 nm.
Las figuras 2A y 2B ilustran los resultados
obtenidos en los ensayos ELISA utilizando como tapiz el péptido
beta-amiloide 1-42 a una
concentración de (1 \mug/ml) y anti IgG (H+L)-HRP
como anticuerpo secundario, frente a distintas diluciones de los
sueros Vj2 y Vj5. En el eje X se muestran las diluciones seriadas de
suero ensayadas y en el eje Y la densidad óptica a 492 nm. La
figura 2A muestra la curva de titulación del suero del donante Vj2
y la figura 2B la curva de titulación del suero del donante Vj5.
Las figuras 3A y 3B muestran la fotografía de
una electroforesis en gel de agarosa al 2% de los productos de PCR
obtenidos en la primera amplificación del repertorio genético de
inmunoglobulinas humanas para la construcción de una librería de
fragmentos de anticuerpos (Fab).En la figura 3A se muestran las
cadenas pesadas gamma 1 y en la figura 3B las cadenas kappa. La
figura 3C muestra la fotografía de una electroforesis en gel de
agarosa al 2% de los productos de PCR obtenidos en la segunda
amplificación utilizando como molde los productos de PCR purificados
de la primera amplificación.
Las figuras 4A y 4B muestran la fotografía de
una electroforesis en gel de agarosa al 2% de los productos de PCR
obtenidos en la primera amplificación del repertorio genético de
inmunoglobulinas humanas para la construcción de una librería de
fragmentos de cadena sencilla (scFv). En la figura 4A se muestran
las cadenas kappa y en la figura 4B las cadenas pesadas gamma. La
figura 4C muestra la fotografía de una electroforesis en gel de
agarosa al 2% de los productos de PCR obtenidos en la segunda
amplificación, realizada por triplicado, utilizando como molde los
productos de PCR purificados de la primera amplificación.
La figura 5 muestra las secuencias HCDR3 de
varios clones escogidos al azar de la librería de fragmentos de
anticuerpo (Fab) y de la librería de fragmentos de anticuerpo de
cadena sencilla (scFv), los cuales han sido secuenciados con el
objetivo de comprobar la diversidad de las librerías obtenidas.
La figura 6 muestra el grado de enriquecimiento
obtenido en el paso de selección antigénica de la librería de
fragmentos de cadena sencilla frente al péptido amiloide beta
1-42 inmovilizado en fase sólida (ELISA). La gráfica
representa el progreso de cada ciclo de selección como porcentaje
de anticuerpos eluídos en cada ronda (CFU eluídas/ml); el grado de
enriquecimiento final (x 3,9) se determinó considerando el control
negativo (c-).
Las figuras 7A y 7B muestran el perfil de unión
de los anticuerpos recombinantes AD38 y AD64, respectivamente,
mediante inmunoensayo específico (ELISA) frente al péptido
beta-amiloide 1-42.
La figura 8 muestra la secuencia nucleotídica de
la cadena pesada del anticuerpo recombinante AD38 y su
correspondiente secuencia aminoacídica, destacándose las regiones
hipervariables o CDRs.
La figura 9 muestra la secuencia nucleotídica de
la cadena ligera del anticuerpo recombinante AD38 y su
correspondiente secuencia aminoacídica, destacándose las regiones
hipervariables o CDRs.
La figura 10 muestra la secuencia nucleotídica
de la cadena pesada del anticuerpo recombinante AD64 y su
correspondiente secuencia aminoacídica, destacándose las regiones
hipervariables o CDRs.
La figura 11 muestra la secuencia nucleotídica
de la cadena ligera del anticuerpo recombinante AD64 y su
correspondiente secuencia aminoacídica, destacándose las regiones
hipervariables o CDRs.
Los siguientes Ejemplos y las Figuras se
proporcionan a modo de ilustración, y no tienen el propósito de
limitar la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se seleccionó un grupo de 4 individuos sanos
longevos de edades comprendidas entre 90-102 años,
para la obtención de librerías de anticuerpos o fragmentos de
anticuerpos recombinantes humanos. Dichos donantes sanos no
inmunizados (Vj2, Vj3, Vj4 y Vj5) fueron escogidos como candidatos
óptimos para la obtención de anticuerpos frente al péptido beta
amiloide 1-42 por poseer plenas facultades
cognitivas y buena salud sin presentar síntomas de Alzheimer u otra
neuropatía sin haber recibido medicación alguna para la prevención o
tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
La detección de anticuerpos naturales
anti-beta amiloide en el suero de los donantes, se
examinó mediante un ensayo de inmunodetección específico que permite
detectar reactividad frente al péptido
beta-amiloide 1-42.
Se desarrolló un ensayo de inmunodetección
enzimática (ELISA) especifica para identificar anticuerpos
naturales anti péptido beta-amiloide
1-42 en suero humano, que incluyó la optimización
de las diluciones de trabajo de los anticuerpos comerciales así
como la puesta a punto de la detección de anticuerpos contra el
péptido beta amiloide 1-42. Se evaluó un anticuerpo
comercial de ratón anti beta-amiloide
1-42 (Pharmingen), mediante un inmunoensayo en
placa, utilizando como tapiz el péptido
beta-amiloide 1-42 humano
(Pharmingen) a 5 \mug/ml. Posteriormente, se determinó la
concentración de trabajo del anticuerpo secundario a utilizar. Para
ello se realizaron varios ensayos utilizando los anticuerpos
secundarios: anti-hFab-HRP
(Pierce), anti IgG+IgM+IgA-HRP (Pierce); anti IgG
(H+L)-HRP (Pierce), anti IgM (Pharmingen), anti
MIgl-biotina (Pharmingen). Se concluyó que tan sólo
dos de los anticuerpos secundarios probados reunían las
características idóneas para nuestro propósito: el anticuerpo anti
IgG+IgM+IgA-HRP (Pierce) y anti IgG (H+L) HRP
(Pierce).
Una vez optimizadas las concentraciones de
trabajo del anticuerpo comercial anti-beta
1-42 y del anticuerpo secundario, se procedió a
detectar la existencia de anticuerpos anti péptido
beta-amiloide 1-42 en el suero de
los donantes. Para ello se realizó un ELISA utilizando como tapiz
el péptido beta-amiloide 1-42
(Pharmingen) a una concentración de 5 \mug/ml y se incubaron
varias diluciones de los sueros. El anticuerpo secundario utilizado
fue anti IgG+IgM+IgA-HRP (Pierce). Los resultados se
muestran en las Figuras 1A-1D. A la vista de estos
resultados se comprobó la reactividad frente al péptido
beta-amiloide 1-42 (1 \mug/ml) de
los sueros Vj2 y Vj5 mediante diluciones. Como anticuerpo
secundario fue utilizado el anticuerpo anti IgG
(H+L)-HRP (Pierce). En las Figuras 2A y 2B se puede
observar como estos dos sueros titulan frente al péptido
beta-amiloide 1-42, siendo el suero
del donante Vj2 el que presentó un mayor título de anticuerpos anti
beta-amiloide. En base a los resultados obtenidos
en los ensayos de detección de anticuerpos así como en el historial
clínico, se escogió el donante Vj2 como candidato óptimo para el
aislamiento del repertorio genético de inmunoglobulinas y la
construcción de librerías para la selección de anticuerpos frente a
la enfermedad de Alzheimer.
\vskip1.000000\baselineskip
Los linfocitos de sangre periférica (entre 0.1 y
2.10^{8} células) del donante seleccionado (Vj2) fueron obtenidos
mediante centrifugación en gradiente de densidad
Ficoll-Hypaque. El material genético (ARNm) fue
extraído utilizando el producto comercial
Tri-Reagent siguiendo el protocolo que aconseja el
fabricante. La integridad y pureza del material extraído se analizó
mediante geles de agarosa/formaldehido de alta resolución y
analíticamente utilizando el método Bio-Sizing, para
su cuantificación. Tras comprobar la integridad de cada muestra, el
material resultante se considero satisfactorio en términos de
calidad e integridad y se almacenó a -80ºC para su posterior
procesamiento en alícuotas apropiadas para ser utilizado como molde
para la amplificación de todas la familias genéticas de los genes
de inmunoglobulinas. Las muestras obtenidas fueron utilizadas para
la construcción de las siguientes librerías:
\sqbullet Librería de fragmentos de
anticuerpos (Fab)
\sqbullet Librería de anticuerpos de cadena
sencilla (scFv).
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de ARNm se sintetizó ADN complementario
de cadena simple (ADNc) mediante la reacción de la transcriptasa
reversa, empleándose como cebadores octámeros de deoxitimina
(oligo-dt) (Pharmacia). El material fue alicuotado y
se utilizó como molde para amplificar por PCR los fragmentos
correspondientes a las cadenas pesadas (HC) de las inmunoglobulinas
IgG1, así como las cadenas ligeras (LC) kappa. La amplificación por
PCR se realizó utilizando protocolos convencionales y de manera
independiente. Los diferentes fragmentos de las IgG1 fueron
obtenidos independientemente, utilizando como cebadores diversos
oligonucleótidos de cadena simple, representativos de todas las
familias de genes variables (VH), en conjunción con el cebador
específico C\gamma1 del primer dominio constante (CH1) de la
cadena gamma-1. Las cadenas ligeras (LC) kappa
fueron amplificadas de manera similar, empleando cebadores
representativos de cada familia VK, junto con cebadores específicos
de la región constante kappa (CK). Todos los cebadores, además de
contener secuencias específicas para la amplificación de los genes
variables o constantes, incluyen dianas específicas de restricción
no presentes en los genes a fin de facilitar su clonado. Para cada
pareja de cebadores la temperatura de apareamiento (Ta) empleada
fue optimizada, en experimentos previos, a fin de lograr una
amplificación de aproximadamente el 95% de los genes de cada familia
VH y VK.
Para cada familia amplificada, los productos de
PCR (HC o LC) fueron aislados de geles de Agarosa 2%, purificados,
cuantificados y combinados de manera proporcional, para obtener el
repertorio final (Figuras 3A y 3B). Este material fue empleado como
molde en una segunda amplificación por PCR utilizando
oligonucleótidos externos, con el fin de extender los productos,
facilitar la posterior digestión con enzimas de restricción e
incrementar su eficiencia de clonado. Los resultados se ilustran en
la Figura 3C. Una vez amplificados, los productos de cada
repertorio (HC-G1 y LC-kappa) fueron
purificados independientemente. Los repertorios VH fueron digeridos
con las enzimas de restricción XhoI y SpeI y fueron purificados de
geles de agarosa por Quiackick. El repertorio
LC-kappa fue digerido con SacI y XbaI y purificado
de la misma manera.
Adicionalmente, el mismo material de partida fue
utilizado para obtener un repertorio de fragmentos de anticuerpos
de cadena sencilla (scFv), mediante el empleo de cebadores
específicos. El abordaje utilizado permite obtener del mismo
donante dos librerías de anticuerpos: una en formato Fab (fragmentos
de anticuerpo) y otra en formato scFv. Dichos fragmentos de cadena
sencilla se componen de segmentos VH fusionados mediante un linker
flexible (G_{4}S_{2}) a la región variable de las cadenas
ligeras. Todas las amplificaciones fueron optimizadas previamente
hasta lograr un rendimiento del 90-100%. Los
resultados se ilustran en las Figuras 4A y 4B. Una vez realizadas
las amplificaciones, se procedió a extraer y purificar de geles
preparativos las bandas positivas representativas de cada familia,
posteriormente el material fue fusionado mediante PCR overlap para
su amplificación conjunta utilizándose para ello los cebadores
RSC-F y RSC-B (Figura 4C).
Finalmente las bandas obtenidas fueron digeridas y purificadas.
\vskip1.000000\baselineskip
La librería de fragmentos Fab se construyó
mediante clonado y ensamblaje, empleando los repertorios
gamma-1 combinados con la totalidad de las cadenas
ligeras kappa en formato de Fab, utilizando el vector fagémido
pComb3 XX. Este vector permite el clonado de las CL en los sitios
de restricción SacI-Xba I y de las HC en los sitios
de restricción XhoI–SpeI. Las librerías se construyeron de manera
secuencial. Primero se realizó el clonado del repertorio
correspondiente a las cadenas ligeras y posteriormente el de las
cadenas pesadas.
La preparación del vector pComb3 XX SacI/XbaI
fue optimizada en experimentos pilotos, hasta obtener un alto nivel
de ligación de las CL (>1x10^{8} colonias
transformantes/\mug de ADN) y una baja eficiencia de religación
(<1%) en ausencia de insertos, antes de proceder al clonado del
repertorio LC-kappa. Posteriormente, todo el
producto de ligación fue utilizado para transformar mediante
electroporación bacterias E. coli altamente competentes
(Eficiencia > 5.10^{9} transformantes/\mug de ADN). Tras el
crecimiento bacteriano todo el cultivo bacteriano fue centrifugado
a baja velocidad y tratado convenientemente para extraer el ADN
fagémido. El ADN fue purificado, cuantificado y sometido a digestión
con las enzimas de restricción XhoI y SpeI. El vector resultante
fue cuantificado y utilizado para el clonado de los repertorios
HC-IgG1. Tras precipitación, los productos de la
ligación fueron transformados de manera independiente, mediante
electroporación en E. coli y el ensamblaje final se realizó
mediante la infección con fago M13 helper para constituir
una librería de expresión de anticuerpos del repertorio
kappa-IgG1 de 1x 10^{7} anticuerpos.
\vskip1.000000\baselineskip
La librería de fragmentos de anticuerpo de
cadena sencilla (scFv) del mismo donante (Vj2) fue construida
mediante el clonaje de secuencias de fragmentos simples de las
regiones variables de las inmunoglobulinas correspondientes a los
repertorios Gamma y Kappa solapadas mediante un linker flexible
G_{4}S_{2}. Tras la digestión enzimática, los repertorios
fueron clonados en el vector pComB3XX. El tamaño obtenido fue de 5
x 10^{6} clones independientes.
\vskip1.000000\baselineskip
De cada librería se extrajo el material genético
de 15-20 clones productores de anticuerpos. La
secuenciación al azar del segmento HCDR3, indicó que las librerías
se componen de una amplia diversidad, tanto en el tamaño de los
CDR3 HC (6-21 aminoácidos de largo), como en su
secuencia. Como ejemplo, la Figura 5 muestra las secuencias HCDR3
de varios clones escogidos al azar de la librería de fragmentos de
anticuerpo (Fab) y de la librería de fragmentos de anticuerpo de
cadena sencilla (scFv).
Se han obtenido librerías de anticuerpos humanos
que incluyen dos formatos (Fab y scFv). Dichas librerías
representan una amplia colección de anticuerpos humanos y
constituyen una herramienta altamente útil en la búsqueda de
anticuerpos específicos dirigidos frente al péptido
beta-amiloide 1-42.
La selección antigénica contra el péptido beta
amiloide 1-42 de la librería de fragmentos de
cadena sencilla (scFv) se llevó a cabo mediante un inmunoensayo
frente al péptido amiloide beta 1-42 inmovilizado en
fase sólida (ELISA), utilizando BSA como control negativo (c-). En
cada ciclo, la librería de fragmentos scFv fue amplificada hasta
10^{13} clones/ml y seleccionada en las condiciones previamente
determinadas incrementándose la astringencia de los lavados en cada
ronda de selección. Previamente se optimizaron las concentraciones
de péptido a utilizar en la selección contra el péptido amiloide
1-42 en fase sólida. En el proceso de selección
antigénica se obtuvo un grado de selección significativo tal y como
se ilustra en la Figura 6.
Tras la selección antigénica de la librería de
fragmentos de cadena sencilla, la identificación de clones de
anticuerpos específicos frente al péptido beta amiloide se llevó a
cabo mediante la transfección del material genético de los
anticuerpos obtenidos en bacterias apropiadas para la expresión de
moléculas scFv solubles.
En el procedimiento de selección antigénica, del
total de clones obtenidos en el último ciclo de selección, se
escogieron clones al azar y se ordenaron en placas de cultivo
master. La producción de anticuerpos en los clones bacterianos fue
optimizada mediante ensayos piloto para obtener una máxima
expresión. Tras la determinación de las condiciones óptimas se
analizaron 235 clones escogidos al azar del master. Cada clon
bacteriano fue crecido en condiciones óptimas de cultivo para la
producción de anticuerpos y finalmente estos fueron extraídos del
sobrenadante para su caracterización.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras la identificación de anticuerpos humanos
específicos, se procedió a la caracterización genética, estructural
y funcional de dichos anticuerpos.
Los anticuerpos obtenidos de la selección de la
librería de anticuerpos de fragmentos de cadena sencilla fueron
analizados mediante inmunoensayo específico frente al péptido
beta-amiloide 1-42 y BSA. Se
obtuvieron un total de 5 anticuerpos recombinantes que presentaron
reactividad específica contra el péptido beta amiloide
1-42 y el resto presentó reactividad contra beta
amiloide 1-42 y BSA. Dos de dichos anticuerpos
recombinantes, AD38 y AD64, presentaron mejores perfiles de unión al
péptido beta amiloide 1-42. Estos fueron
purificados a mediana escala (0,5-1 mg/l) y
evaluados a diferentes concentraciones en inmunoensayo frente al
péptido 1-42. Los resultados obtenidos se resumen
en las Figuras 7A y 7B, en las cuales se observa que ambos
anticuerpos reconocen específicamente la diana uniéndose de manera
dosis dependiente.
La caracterización genética se llevó a cabo
mediante la determinación de las secuencias de nucleótidos de forma
automática. La lectura y edición fue realizada utilizando el
programa SegEd (Applied Biosystems) y el análisis posterior fue
realizado utilizando GCG (University of Wisconsin Genetic Computer
Group-Madison, WI) y Analize (MacMolly ®Tetra Sof
Gen GmbH (version 3.10)). La identidad de los genes VH, DH, JH y
VK, JK fue determinada utilizando FASTA (GenBank), Blast e IgBlast
(NCBI) en conjunción con MacMolly (Aling y Complign) y DNAPLOT
(Versión 2.0.1) aplicados localmente a la base de datos de
anticuerpos humanos VBASE (Tomlinson et al., MRC Centre for
Protein Engineering, UK) (Tomlinson, 1992). El índice de mutaciones
de reemplazo y silentes (R:S) observadas en las HC y LC, después de
la comparación con los correspondientes genes genómicos (germ
line), fue calculado manualmente. Los índices R:S teóricos o
inherentes para cada gen germinal, fueron calculados
individualmente para cada codón y región utilizando el programa
InhSusCalc v1.0.
Una vez conocidas las secuencias nucleotídicas
de los fragmentos de anticuerpos scFv AD38 (SEQ ID NO 9) y AD64
(SEQ ID NO 11), se identificaron dichos anticuerpos recombinantes
como únicos. Sus cadenas pesadas derivaron de la familia génica
VHIII y las cadenas ligeras de las familias génicas VKIII y VKII. En
la Tabla 1 se muestra la derivación genética y las secuencias de los
segmentos CDR3 (Complementary-Determining
Region-3) de los anticuerpos recombinantes AD38 y
AD64; y en la Tabla 2 se muestran los índices R:S. En ambos
anticuerpos se observaron numerosas mutaciones somáticas en
comparación con sus genes genómicos correspondientes (germ
line), indicando la existencia de procesos de maduración
antigénica frente al péptido beta-amiloide
1-42.
Tanto el análisis funcional realizado como las
características genéticas halladas tras la secuenciación indican
que los anticuerpos AD38 y AD64 son específicos, presentan
características de maduración antigénica y reflejan parte de una
respuesta inmune competente frente al péptido beta amiloide. Este
hecho, los hace excelentes candidatos para una posterior evaluación
funcional con el fin de determinar su utilidad como agentes
diagnósticos, terapéuticos o de imagen.
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unión al péptido beta-amiloide y sus
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 366
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(366)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio variable de la cadena pesada
del anticuerpo recombinante AD38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.800000\baselineskip
-
15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 122
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 327
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(327)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio variable de la cadena ligera
del anticuerpo recombinante AD38
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 360
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(360)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio variable de la cadena pesada
del anticuerpo recombinante AD64
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 336
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(336)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio variable de la cadena ligera
del anticuerpo recombinante AD64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 714
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(714)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Anticuerpo recombinante de cadena
sencilla AD38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 238
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 717
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(717)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Anticuerpo recombinante de cadena
sencilla AD64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 239
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (19)
1. Anticuerpo, fragmento funcional del mismo o
derivado con capacidad de unión al péptido
beta-amiloide 1-42 que comprende una
o más de las secuencias seleccionadas de entre el grupo constituido
por:
\sqbullet SEQ ID NO 2
\sqbullet SEQ ID NO 4
\sqbullet Secuencias homólogas a SEQ ID NO 2
o SEQ ID NO 4.
2. Anticuerpo, fragmento funcional del mismo o
derivado con capacidad de unión al péptido
beta-amiloide 1-42, según la
reivindicación anterior, que comprende al menos una cadena pesada y
una cadena ligera, en el que la cadena pesada comprende la
secuencia SEQ ID NO 2 y la cadena ligera comprende la secuencia SEQ
ID NO 4.
3. Anticuerpo, fragmento funcional del mismo o
derivado con capacidad de unión al péptido
beta-amiloide 1-42 que comprende una
o más de las secuencias seleccionadas de entre el grupo constituido
por:
\sqbullet SEQ ID NO 6
\sqbullet SEQ ID NO 8
\sqbullet Secuencias homólogas a SEQ ID NO 6
o SEQ ID NO 8.
4. Anticuerpo, fragmento funcional del mismo o
derivado con capacidad de unión al péptido
beta-amiloide 1-42, según la
reivindicación anterior, que comprende al menos una cadena pesada y
una cadena ligera, en el que la cadena pesada comprende la
secuencia SEQ ID NO 6 y la cadena ligera comprende la secuencia SEQ
ID NO 8.
5. Anticuerpo, fragmento funcional del mismo o
derivado con capacidad de unión al péptido
beta-amiloide 1-42, obtenido
mediante estrategias de maduración de la afinidad a partir de los
anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Fragmento funcional de anticuerpo, según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicho fragmento es
un scFv.
7. Anticuerpo, fragmento de anticuerpo o
derivado que comprenda parte de cualquiera de las secuencias
definidas en la reivindicación 2 o combinaciones de éstas con
capacidad de unión al péptido beta-amiloide
1-42.
8. Anticuerpo, fragmento de anticuerpo o
derivado que comprenda parte de cualquiera de las secuencias
definidas en la reivindicación 4 o combinaciones de éstas con
capacidad de unión al péptido beta-amiloide
1-42.
9. Anticuerpo, fragmento de anticuerpo o
derivado que comprenda parte de cualquiera de las secuencias
definidas en la reivindicación 6 o combinaciones de éstas con
capacidad de unión al péptido beta-amiloide
1-42.
10. Molécula de ácido nucleico seleccionada
entre:
- a.
- una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento funcional del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9;
- b.
- una molécula de ácido nucleico cuya secuencia de nucleótidos difiera de las secuencias definidas en (a) debido a la degeneración del código genético; y
- c.
- una molécula de ácido nucleico homóloga a las secuencias definidas en (a).
11. Molécula de ácido nucleico, según la
reivindicación anterior, que comprende cualquiera de las secuencias
nucleotídicas SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5 o SEQ ID NO 7,
o combinaciones de éstas.
12. Vector que comprende una molécula de ácido
nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 10 ó 11.
13. Célula hospedadora que contiene un vector,
según la reivindicación anterior.
14. Uso de un anticuerpo, fragmento del mismo o
derivado, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la
elaboración de una composición farmacéutica.
15. Composición farmacéutica, según la
reivindicación anterior, para su uso en el tratamiento o prevención
de la enfermedad de Alzheimer.
16. Procedimiento de obtención de anticuerpos o
fragmentos funcionales de los mismos con capacidad de unión al
péptido beta-amiloide 1-42 a partir
del repertorio genético de inmunoglobulinas aislado de donantes
sanos nonagenarios que comprende clonar y expresar dicho repertorio
genético de inmunoglobulinas en los vectores y células adecuadas
para la clonación y expresión de dicho repertorio y seleccionar
aquellos que presentan afinidad por el péptido
beta-amiloide 1-42.
17. Uso de un anticuerpo, fragmento del mismo o
derivado, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la
detección del péptido beta-amiloide
1-42 in vitro.
18. Uso de un anticuerpo, fragmento del mismo o
derivado, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la
detección del péptido beta-amiloide
1-42 in vivo.
19. Uso de un anticuerpo, fragmento del mismo o
derivado, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la
identificación de un compuesto capaz de competir con dicho
anticuerpo, fragmento o derivado por la unión al péptido beta
amiloide 1-42.
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