KR102308915B1 - 아밀로이드 베타에 대한 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 아밀로이드 베타에 대한 항체에 관한 것이다. 이 항체는 인간 아밀로이드 베타 40 펩티드에 비해 인간 아밀로이드 베타 42 펩티드에 선택적으로 결합한다. 본 발명은 아밀로이드 베타 42 펩티드에 결합하고 아밀로이드증과 관련된 질병, 예컨대, 알츠하이머병을 치료하기 위한 치료제로서 아밀로이드 베타 42에 대해 특이적인 항체에 관한 것이다.

Description

아밀로이드 베타에 대한 항체{ANTIBODIES TO AMYLOID BETA}
본 발명은 Aβn-42 펩티드(이때, n은 1 내지 29임)로서 총칭되는, 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드 및 이의 N 말단 절두체(truncates)에 결합하는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 아밀로이드 베타 1-40 펩티드에 비해 아밀로이드 베타 n-42 펩티드에 결합하는 데 있어서 선택적인 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 알츠하이머병을 포함하는, 아밀로이드증과 관련된 질병을 치료하기 위한 항-Aβn-42 항체의 용도에 관한 것이다.
알츠하이머병(AD)은 환자의 사회적 및 직업적 기능을 약화시키는, 기억에 영향을 미치는 인지 장애를 악화시키는 것을 특징으로 한다. 퇴행성 질환은 궁극적으로 성격 변화를 유발할 수 있는, 언어 및 고등 기능, 예컨대, 판단, 계획, 조직화 및 추론에서의 인지 어려움을 초래하는, 뇌 내의 신경 세포의 손실을 야기한다. 이 질환의 말기는 독립적인 기능의 완전한 손실을 특징으로 한다.
조직학적으로, AD(산발성 및 가족성)는 세포내 신경원섬유매듭(NFT) 및 세포외 플라크의 존재에 의해 정의된다. 플라크는 뇌의 신경 및 성상세포에서 발견된 경막 단백질인 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 비정상적인 절단으로부터 유도된 아밀로이드 β 펩티드(Aβ)의 응집체이다. Aβ 침착물은 AD 환자의 혈관에서도 발견된다.
콜린작동성 신경은 AD에서 특히 취약하고, 결과로서 일어나는 신경전달물질 감퇴는 다른 신경절단물질 시스템에 영향을 미친다. 상기 질환의 다른 증상은 산화 스트레스, 염증 및 신경 아폽토시스(프로그래밍된 세포 사멸)를 포함한다. AD 환자에서, 광범위한 신경 세포 사멸은 인지력 감퇴 및 환자의 궁극적인 사망을 유발한다(Younkin, 1995; Borchelt et al., 1996; Selkoe, 1999).
현행 치료는 단지 증상 치료이고 한정된 지속시간 동안 증상의 경미한 개선을 보이면서 최소한으로 효과적인 것으로서 관찰된다. 그러나, Aβ 수준에서의 과다생성 또는 변화는 산발성 및 조기 발병 AD의 발병기전에서 핵심 사건인 것으로 여겨진다. 이러한 이유로, Aβ는 그의 형성을 감소시키거나(Vassar et al., 1999) 뇌로부터의 그의 제거를 가속화하는 메커니즘을 활성화시키도록 디자인된 약물의 개발을 위한 주요 표적이 되었다.
아밀로이드 캐스케이드 가설은 Aβ 펩티드의 생성이 신경 기능에 악영향을 미침으로써 AD에서 신경 사멸 및 치매를 유발한다는 것을 제안한다. Aβ는 세크레타제(secretase)에 의해 순차적으로 절단되어 상이한 길이의 종을 생성하는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)로부터 생성된다. 주요 플라크 성분은 AD 발병기전에서 신경독성 올리고머의 형성 및 플라크 형성에 관여하는 Aβ1-42의 42 아미노산 동형체(isoform)이다. Aβ1-42, pGluAβ3-42, Aβ3-42 및 4-42를 포함하는 다수의 Aβ 동형체들이 AD 뇌에서 우세하고, 이들 중 Aβ1-42 및 Aβ4-42는 가족성 및 산발성 AD의 해마 및 피질에서 주요 형태이다(Portelius et al., 2010).
잔기 42에서 종결되는 Aβ는 APP의 프로세싱에 의해 생성된 Aβ 종의 주요 성분이다. 다른 형태는 Aβ1-40 및 N 말단 절두체 Aβn-40을 포함한다. 그러나, 잔기 42에서 종결되는 Aβ는 가장 응집하기 쉽고 아밀로이드 플라크로의 침착을 유도한다. Aβ1-42 펩티드는 보다 더 응집하기 쉽다는 것 이외에 배양물에서 신경에 독성을 나타내는 것으로 밝혀진 가용성 저급 n 중합체(또는 올리고머)를 형성한다. 보다 큰 뚜렷한 원섬유 침착물과 달리 올리고머는 전형적인 병리학 분석에서 검출되지 않는다. 유사한 성질을 갖는 올리고머들이 AD 뇌로부터 단리되었고, 이들은 플라크보다 질환 진행과 더 밀접하게 관련되어 있다(Younkin, 1998; Walsh et al., 2005a; Walsh et al., 2005b).
뇌 슬라이스에 적용되었거나 생체내에서 주입된 실험적으로 생성된 올리고머는 기억 메커니즘의 패러다임으로서 잘 공지된 시냅스 정보 저장의 한 형태인 해마 장기간 강화작용(LTP)의 실패를 야기한다(Lambert et al., 1998; Walsh et al., 2002; Wang et al., 2002). 가용성 올리고머는 시냅스의 물리적 변성에 관여한다(Mucke et al., 2000). 마우스 모델에서 항체에 의한 기억 실패의 역전은 올리고머가 시냅스 실패에서 주요한 역할을 수행한다는 최근 생겨난 개념을 확인시켜주었다.
유전적 증거는 증가된 양의 Aβ1-42 및 이의 N 말단 절두체(Aβn-42)가 가족성 AD를 야기하는 (모든 유전적 상태는 아니지만) 많은 유전적 상태에서 생성된다는 것을 암시하는데(Borchelt et al., 1996; Duff et al., 1996; Scheuner et al., 1996; Citron et al., 1998), 이것은 아밀로이드 형성이 Aβn-42의 증가된 생성 또는 감소된 분해, 또는 이들 둘 다에 의해 야기될 수 있는 가능성을 시사한다(Glabe, 2000). 구체적으로, APP 유전자, 및/또는 γ-세크레타제 복합체 성분인 프레세닐린(presenilin)을 코딩하는 유전자에서 유전적 돌연변이를 야기하는 가족성 AD는 Aβ1-40에 비해 상대적으로 Aβ1-42의 생성을 증가시켰다. 뇌 내에서 생성된 펩티드의 절대량은 독성 Aβ 종의 생성에 있어서 Aβ 펩티드의 비(변화된 Aβ1-42 대 Aβ1-40 비에서 반영됨)보다 덜 중요할 것이라는 것도 제안되었다(De Strooper, 2007; Kuperstein et al., 2010). 또한, 아밀로이드 침착의 동물 모델인 마우스 및 초파리 둘 다는 Aβ1-42가 아밀로이드 침착물의 형성을 위해 요구된다는 것을 암시한다(Greeve et al., 2004; Iijima et al., 2004; McGowan et al., 2005).
2000년 백신접종 연구로부터의 결과는 AD에 대한 가능한 신규 치료 방법을 암시하였다. 돌연변이체 인간 APP(이때, 위치 717의 아미노산이 정상 발린 대신에 페닐알라닌임)를 과다발현하는 PDAPP 형질전환 마우스는 연령 및 뇌 영역 의존적 방식으로 AD의 많은 신경병리학적 특징들을 점진적으로 발생시킨다. 형질전환 동물은 AD 유형 신경병리의 시작 전에(6주령), 또는 Aβ 침착 및 여러 후속 신경병리학적 변화가 잘 확립되었을 때인 보다 많은 연령(11개월)에서 Aβ1-42 펩티드로 면역화되었다. 어린 동물들의 면역화는 본질적으로 플라크 형성, 신경염성 위축증 및 성상세포증(astrogliosis)의 발생을 예방하였다. 노화된 동물의 치료도 이들 AD 유사 신경병리의 정도 및 진행을 현저히 감소시켰다. Aβ1-42 면역화가 항-Aβ 항체의 생성을 야기하고 Aβ 면역반응성 단핵세포/미세아교세포가 잔존 플라크의 영역에서 나타난다는 것이 밝혀졌다(Schenk et al., 1999; Schenk et al., 2000). 그러나, 인간에 적용될 때 능동 면역화 방법은 가장 가능하게는 T 세포 반응으로 인해 여러 건의 수막뇌염을 초래하였고, 효능에 대한 초기 결과가 희망적었음에도 불구하고 중단되었다(Orgogozo et al., 2003; Gilman et al., 2005; Pride et al., 2008).
이후, 여러 수동 백신접종 방법이 연구되었다. Aβ에 대한 항체의 말초 투여는 아밀로이드 존재량을 감소시키기에 충분하였다(Bard et al., 2000). 이들 실험들에서 달성된 상대적으로 적당한 항체 혈청 수준에도 불구하고, 수동적으로 투여된 항체는 혈액-뇌 장벽을 관통하여 중추신경계로 들어가 플라크를 장식하고 기존 아밀로이드의 제거를 유도할 수 있었다. Aβ1-40 특이적 항체, Aβ1-42 특이적 항체 및 Aβ의 잔기 1-16에 대해 유도된 항체 사이의 비교에서, 모든 항체들은 마우스 뇌에서 Aβ 축적을 감소시키는 것으로 밝혀졌다(Levites et al., 2006).
보다 최근에는, CNS 침투가 수동적으로 투여된 항체의 경우 효과적인 Aβ 제거에 대한 가장 가능성 있는 경로라는 것이 제안되었다(Golde et al., 2009). 그러나, 상기 항체가 혈액-뇌 장벽을 관통할 수 있다는 것 이외에, 싱크(sink) 가설이 가능한 작용 메커니즘으로서 제안되었다.
싱크 가설은 Aβ가 혈장에서 펩티드의 농도를 낮춤으로써 간접적으로 CNS로부터 제거될 수 있다고 주장한다. 이를 기술하는 실험에서, 혈장에서 Aβ에 결합하여 CNS로부터 Aβ를 격리시키는 항체가 사용되었다. 이것은 항체가 혈장으로부터 CNS로의 Aβ의 유입을 방지하고/하거나 혈장 중의 유리 Aβ 농도의 감소로 인한 혈장과 CNS 사이의 평형을 변화시키기 때문에 달성되었다(DeMattos et al., 2001). 항체와 무관한 아밀로이드 결합제도 혈장에서 결합을 통해 CNS로부터 Aβ를 제거하는 데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 혈장 Aβ를 격리시키는 2종의 Aβ 결합제인 겔솔린(gelsolin) 및 GM1은 뇌 아밀로이드증을 감소시키거나 예방하는 것으로 밝혀졌다(Matsuoka et al., 2003).
안전성과 관련하여, AD에서의 한 병원성 특징은 뇌 동맥의 벽에서 혈관 평활근 세포가 Aβ, 주로 Aβ1-40으로 교체되어 있는 뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA)이다(Weller et al., 2003). 범-Aβ 항체를 사용한 AD 환자의 치료는 환자에게 유해할 수 있는, 혈관벽으로부터의 Aβ의 제거를 반영하는 미세출혈을 유발하는 것으로 밝혀졌다(Wilcock et al., 2009). 이것을 피하는 한 방법은 미세출혈에 기여하는 제거 메커니즘을 감소시킬 수 있고/있거나 Aβ가 혈관 침착물로부터 제거되는 속도를 감소시켜 유출 경로의 포화를 방지할 수 있는 탈글리코실화된 항체를 생성하는 것이었다(Wilcock et al., 2006).
Aβ42 특이적 항체를 사용한 n-42β 펩티드 종의 표적화는 AD 뇌의 핵심 펩티드 합성물이고 플라크 형성의 유발자인 상기 종을 표적화할 것이다. n-42 단량체 및 저급 n 올리고머 종에 대한 일차 특이성을 갖는 항체는 이들 종을 고갈시킬 뿐만 아니라 신경에 독성을 나타내는 것으로 밝혀진 다른 올리고머 종의 축적도 예방할 수 있었다.
본 발명은 Aβ 1-42 및 이의 N 말단 절두체에 대한 특이성을 갖고 Aβ42 펩티드의 아미노산 29와 아미노산 42 사이의 에피토프에 결합하는 완전 인간 항체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항체는 베타 아밀로이드와 관련된 질병, 예컨대, AD(AD로 인한 경도 인지 장애(MCI)를 포함함) 및 다운증후군의 예방적 및/또는 치유적 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 뇌 및 뇌혈관구조 내에서의 Aβ n-42 동형체의 축적을 예방하거나 침착을 역전시키고 인지력을 개선하기 위해 혈장, 뇌 및 뇌척수액(CSF)에서 Aβ 펩티드(n-42)의 동형체를 억제하기 위한 완전 인간 항체의 용도에 관한 것이다.
Aβ n-42의 단량체 및 저급 n 올리고머 형태(오량체까지 포함함)를 인식하고 Aβ42 펩티드 상의 아미노산 17부터 아미노산 42까지 포괄하는 영역, 보다 구체적으로 Aβ42 펩티드 상의 아미노산 29부터 아미노산 42까지 포괄하는 영역으로 맵핑된 에피토프를 인식하는, Aβ n-42 펩티드에 대한 완전 인간 항체의 생성이 본원에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 항체는 Aβ n-42 종(이때, n은 1 내지 29의 범위 내의 정수임)에 대한 특이성을 가지므로 AD 진행의 핵심 유발자를 선택적으로 감소시킬 것으로 예상될 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 인간 혈장, 뇌 및 뇌척수액(CSF)에서 (Aβ40이 아니라) Aβ42에 결합하여 뇌로부터의 Aβ n-42 동형체의 증가된 제거를 유발하는 데 효과적이다. 본 발명에 따른 항체는 Aβ42 가용성 응집체와 신경의 결합을 감소시키는 데에도 효과적이므로, 뇌로 들어가는 상기 항체의 부분은 신경의 건강에 영향을 미칠 것이다.
단량체의 경우 320 pM의 KD를 갖는 항체를 포함하는 강력한 고친화성 항체가 본원에 기재되어 있다. 이러한 고친화성은 AD 질환 예방 및 변경을 가능하게 하는 수준까지 Aβ n-42의 효과적인 억제를 가능하게 할 수 있다.
가용성 Aβ42 및 Aβ40 종의 수준은 Aβ 펩티드 상의 에피토프에 대해 유도된 항체를 사용하는 표준화된 분석에 의해 뇌, CSF 및 혈액에서 검출될 수 있다. 본원에 기재된 래트 PK:PD에 나타낸 바와 같이, 유리 Aβ42의 용량 의존적 억제는 항체의 말초 투여 후 래트의 CSF에서 관찰되었다. Aβ40 펩티드에 대한 무시할 만한 효과와 함께 래트 뇌에서의 총 Aβ42의 용량 의존적 증가도 입증된다.
따라서, 뇌를 침투하여(CSF에서 총 말초 투여의 0.1%) 특히 CSF에서 (Aβ40이 아니라) 핵심 독성 종 Aβ42를 억제하는 능력을 갖는 항체가 본원에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 항체의 특이성 및 작용 메커니즘은 AD 질환 과정의 상이한 단계 즉, 전구 AD, 경도 AD 및 중등도의 AD, 다운증후군뿐만 아니라 황반 변성도 포함하는, 신체의 장기 내에서 축적되는 아밀로이드의 축적과 관련된 다수의 질환의 예방적 및 치유적 치료 둘 다를 가능하게 할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 전구 AD, 경도 AD, 중등도의 AD 또는 다운증후군으로 진단된 대상체에서 인지력 감퇴를 역전시키고 인지력 감퇴를 치료하고 인지력 감퇴를 예방하는 능력을 가질 수 있다.
따라서, 본 발명의 제1 양태는 인간 Aβ1-42에 대한 결합 구성원, 특히 항체 분자에 관한 것이다.
본 발명에 따른 결합 구성원, 예를 들면, 항체 분자는 하기 성질들 중 임의의 또는 모든 성질을 가질 수 있다:
- 가용성 단량체 인간 Aβ1-42 및/또는 올리고머 Aβ1-42에의 결합;
- Aβ1-40에 비해 Aβ1-42에의 결합에 대한 선택성(상기 결합 구성원은 Aβ1-40에의 결합을 보이지 않을 수 있거나, 결합이 무시할 만한 수준일 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 항체 분자는 500 pM 이하의 해리 상수(KD)로 단량체 Aβ1-42에 결합할 수 있다. 상기 결합 구성원은 Aβ1-40에 결합하지 않을 수 있거나 1 mM 초과의 KD로 Aβ1-40에 결합할 수 있다.);
- 인간 Aβ17-42에의 결합(따라서, 항체 분자는 Aβ1-42 펩티드의 아미노산 17과 아미노산 42 사이의 에피토프를 인식할 수 있고, 보다 구체적으로 항체 분자는 Aβ1-42 펩티드의 아미노산 29와 아미노산 42 사이의 에피토프를 인식할 수 있다.);
- 가용성 단량체 인간 3pyro-42(피로글루타메이트 3) 및 11pyro-42(피로글루타메이트 11)에의 결합;
- 인간 Aβ1-43에의 결합; 및
- 뮤린 Aβ1-42와의 교차반응성.
결합 구성원은 본원에 기재된 항체 분자의 HCDR 세트 및/또는 LCDR 세트를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 항체 분자의 예는 HCDR 세트(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3)를 함유하는 VH 도메인 및 LCDR 세트(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)를 함유하는 VL 도메인을 포함하고, 이때 HCDR 및 LCDR은 항체 Abet0380, Abet0007, Abet0144, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0344, Abet0368, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 및 Abet0383 중 임의의 항체, 또는 이의 GL 버전의 각각 HCDR 및 LCDR이고, 이들의 서열들은 첨부된 서열목록에 제시되어 있다. 서열목록에서 항체 분자와 서열 식별번호 사이의 상응성은 표 16에 표시되어 있다.
인간 Aβ1-42에 대한 항체 분자는
(i) 골격 영역이 사이사이에 위치하는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 HCDR 세트를 포함하거나 1개 또는 2개의 아미노산 돌연변이를 갖는 상기 HCDR 세트를 포함하는 VH 도메인으로서, 이때 상기 HCDR 세트의 아미노산 서열이 항체 Abet0380, Abet0007, Abet0144, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0344, Abet0368, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 및 Abet0383 중 임의의 항체, 또는 이의 GL 버전에 대하여 표 16에 제시된 바와 같은 것인 VH 도메인; 및
(ii) 골격 영역이 사이사이에 위치하는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 LCDR 세트를 포함하거나 1개 또는 2개의 아미노산 돌연변이를 갖는 상기 LCDR 세트를 포함하는 VL 도메인으로서, 이때 상기 LCDR 세트의 아미노산 서열이 Abet0380, Abet0007, Abet0144, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0344, Abet0368, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 및 Abet0383 중 임의의 항체, 또는 이의 GL 버전에 대해 표 16에 제시된 바와 같은 것인 VL 도메인
을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체 분자는
(i) Abet0380 또는 Abet0380 GL HCDR 세트를 포함하거나 1개 또는 2개의 아미노산 돌연변이를 갖는 Abet0380 또는 Abet0380 GL HCDR 세트를 포함하는 VH 도메인으로서, 이때 Abet0380 HCDR의 아미노산 서열이 서열 번호 525(HCDR1), 서열 번호 526(HCDR2) 및 서열 번호 527(HCDR3)인 VH 도메인; 및
(ii) Abet0380 또는 Abet0380 GL LCDR 세트를 포함하거나 1개 또는 2개의 아미노산 돌연변이를 갖는 Abet0380 또는 Abet0380 GL LCDR 세트를 포함하는 VL 도메인으로서, 이때 Abet0380 LCDR의 아미노산 서열이 서열 번호 534(LCDR1), 서열 번호 535(LCDR2) 및 서열 번호 536(LCDR3)인 VL 도메인
을 포함할 수 있다.
항체 분자는
(i) 골격 영역이 사이사이에 위치하는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 HCDR 세트를 포함하거나 표 12 또는 표 14에 제시된 아미노산 치환들로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 상기 HCDR 세트를 포함하는 VH 도메인으로서, 이때 상기 HCDR의 아미노산 서열이 서열 번호 525(HCDR1), 서열 번호 526(HCDR2) 및 서열 번호 527(HCDR3)인 VH 도메인; 및
(ii) 골격 영역이 사이사이에 위치하는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 LCDR 세트를 포함하거나 표 13 또는 표 15에 제시된 아미노산 치환들로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 상기 LCDR 세트를 포함하는 VL 도메인으로서, 이때 상기 LCDR의 아미노산 서열이 서열 번호 534(LCDR1), 서열 번호 535(LCDR2) 및 서열 번호 536(LCDR3)인 VL 도메인
을 포함할 수 있다.
항체 분자의 VH 도메인은 FW1 영역을 포함할 수 있고, 이때 카바트 위치 26 내지 30의 아미노산 잔기들은 표 14에 제시된 아미노산 잔기들로부터 선택된다.
항체 분자의 VH 도메인은 중쇄 골격 영역 FW1, FW2, FW3 및 FW4를 포함할 수 있고, 이때 중쇄 골격 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 528(FW1), 서열 번호 529(FW2), 서열 번호 530(FW3) 및 서열 번호 531(FW4)이거나, FW1은 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 528을 포함하고, 이때 FW1에서 상기 하나 이상의 치환은 표 12 또는 표 14에 제시된 아미노산 치환들로부터 선택된다.
항체 분자의 VL 도메인은 경쇄 골격 영역 FW1, FW2, FW3 및 FW4를 포함할 수 있고, 이때 경쇄 골격 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 537(FW1), 서열 번호 538(FW2), 서열 번호 539(FW3) 및 서열 번호 540(FW4)이다.
본 발명에 따른 항체 분자는
(i) Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 및 Abet0382 중 임의의 항체 또는 이의 GL 버전에 대해 표 16에 제시된 VH 도메인 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 1개 또는 2개의 아미노산 돌연변이를 갖는 상기 아미노산 서열을 포함할 수 있고;
(ii) Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 및 Abet0382 중 임의의 항체 또는 이의 GL 버전에 대해 표 16에 제시된 VL 도메인 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 1개 또는 2개의 아미노산 돌연변이를 갖는 상기 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체 분자는 서열 번호 524와 85% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인, 및 서열 번호 533과 85% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함할 수 있고, 이때 상기 VH 도메인에서 아미노산 26은 M, G 또는 S이고, 아미노산 27은 G, F 또는 D이고, 아미노산 28은 N, T, D 또는 H이고, 아미노산 29는 F이고, 아미노산 30은 N, S, K 또는 P이고, 아미노산 31은 Y, V, R, E, 또는 T이고, 아미노산 32는 Q, Y, D, S 또는 E이고, 아미노산 33은 T, P, I 또는 V이고, 아미노산 34는 M이고, 아미노산 35는 W이고, 아미노산 50은 V이고, 아미노산 51은 I이고, 아미노산 52는 G이고, 아미노산 52a는 K, S, 또는 A이고, 아미노산 53은 T, S, N, D, G 또는 Q이고, 아미노산 54는 N, G, T 또는 P이고, 아미노산 55는 E, G, N, K 또는 T이고, 아미노산 56은 N, T, R 또는 K이고, 아미노산 57은 I, T, K 또는 V이고, 아미노산 58은 A, V 또는 T이고, 아미노산 59는 Y이고, 아미노산 60은 A이고, 아미노산 61은 D이고, 아미노산 62는 S이고, 아미노산 63은 V이고, 아미노산 64는 K이고, 아미노산 65는 G이고, 아미노산 95는 E이고, 아미노산 96은 W이고, 아미노산 97은 M이고, 아미노산 98은 D이고, 아미노산 99는 H이고, 아미노산 100은 S이고, 아미노산 100a는 R이고, 아미노산 100b는 P이고, 아미노산 100c는 Y이고, 아미노산 100d는 Y이고, 아미노산 100e는 Y이고, 아미노산 100f는 Y이고, 아미노산 100g는 G이고, 아미노산 100h는 M이고, 아미노산 101은 D이고이고, 아미노산 102는 V이고; VL 도메인에서, 아미노산 24는 S이고, 아미노산 25는 G이고, 아미노산 26은 H이고, 아미노산 27은 N이고, 아미노산 28은 L 또는 I이고, 아미노산 29는 E 또는 G이고, 아미노산 30은 D이고, 아미노산 31은 K이고, 아미노산 32는 F 또는 W이고, 아미노산 33은 A 또는 V이고, 아미노산 34는 S이고, 아미노산 50은 R이고, 아미노산 51은 D이고, 아미노산 52는 D이고, 아미노산 53은 K이고, 아미노산 54는 R이고, 아미노산 55는 P이고, 아미노산 56은 S이고, 아미노산 89는 S, 또는 Q이고, 아미노산 90은 S 또는 A이고, 아미노산 91은 Q이고, 아미노산 92는 D이고, 아미노산 93은 T 또는 S이고, 아미노산 94는 V 또는 T이고, 아미노산 95는 T이고, 아미노산 96은 R이고, 아미노산 97은 V이다.
본 발명에 따른 항체 분자는 서열 번호 524와 85% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인, 및 서열 번호 533과 85% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함할 수 있고, 이때 상기 VH 도메인에서 아미노산 26은 M, G, S, V, A, N, T 또는 H이고, 아미노산 27은 G, F, S, Y, E, D 또는 P이고, 아미노산 28은 N, Q, H, V, E, T, A, S, D, M 또는 P이고, 아미노산 29는 F, I, Y, S, L 또는 W이고, 아미노산 30은 N, S, T, Q, K, H, R, G, P, E, K, A 또는 D이고, 아미노산 31은 Y, H, K, E, N, T, R, V, P, M, F, I, D 또는 W이고, 아미노산 32는 Q, Y, D, N, S, E 또는 T이고, 아미노산 33은 T, P, I 또는 V이고, 아미노산 34는 M 또는 L이고, 아미노산 35는 W이고, 아미노산 50은 V이고, 아미노산 51은 I이고, 아미노산 52는 G이고, 아미노산 52a는 K, S, P, A, N, G, E, D, V 또는 T이고, 아미노산 53은 T, S, N, H, Q, D, G 또는 E이고, 아미노산 54는 N, G, P, T, Q, E, M, K 또는 A이고, 아미노산 55는 E, G, K, N, Q, T, H, D 또는 A이고, 아미노산 56은 N, T, A, R 또는 K이고, 아미노산 57은 I, T, N, S, K, F, Q, V 또는 L이고, 아미노산 58은 A, V, S, T 또는 N이고, 아미노산 59는 Y이고, 아미노산 60은 A이고, 아미노산 61은 D이고, 아미노산 62는 S, A 또는 T이고, 아미노산 63은 V이고, 아미노산 64는 K이고, 아미노산 65는 G이고, 아미노산 95는 E이고, 아미노산 96은 W이고, 아미노산 97은 M이고, 아미노산 98은 D 또는 G이고, 아미노산 99는 H 또는 R이고, 아미노산 100은 S이고, 아미노산 100a는 R이고, 아미노산 100b는 P이고, 아미노산 100c는 Y이고, 아미노산 100d는 Y이고, 아미노산 100e는 Y이고, 아미노산 100f는 Y이고, 아미노산 100g는 G이고, 아미노산 100h는 M 또는 I이고, 아미노산 101은 D이고, 아미노산 102는 V 또는 A이고; VL 도메인에서 아미노산 24는 S 또는 T이고, 아미노산 25는 G 또는 T이고, 아미노산 26은 H, R 또는 P이고, 아미노산 27은 N 또는 H이고, 아미노산 28은 L, I, V, F 또는 T이고, 아미노산 29는 E, M, G, S 또는 N이고, 아미노산 30은 D, A, S, G 또는 H이고, 아미노산 31은 K 또는 S이고, 아미노산 32는 F 또는 W이고, 아미노산 33은 A, V, M, T 또는 I이고, 아미노산 34는 S, T 또는 A이고, 아미노산 50은 R이고, 아미노산 51은 D이고, 아미노산 52는 D이고, 아미노산 53은 K이고, 아미노산 54는 R이고, 아미노산 55는 P이고, 아미노산 56은 S이고, 아미노산 89는 S, Q 또는 A이고, 아미노산 90은 S, A 또는 T이고, 아미노산 91은 Q이고, 아미노산 92는 D 또는 G이고, 아미노산 93은 T, Q, S, N 또는 K이고, 아미노산 94는 V, T 또는 F이고, 아미노산 95는 T이고, 아미노산 96은 R이고, 아미노산 97은 V, S 또는 A이다.
본 발명에 따른 항체 분자는
(i) Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 및 Abet0382 중 임의의 항체, 또는 이의 GL 버전에 대해 표 16에 제시된 VH 도메인 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인; 및
(ii) Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 및 Abet0382 중 임의의 항체, 또는 이의 GL 버전에 대해 표 16에 제시된 VL 도메인 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인
을 포함할 수 있다.
항체 분자는 Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 및 Abet0382 중 임의의 항체, 또는 이의 GL 버전의 각각 VH 도메인 및 VL 도메인과 90% 이상 동일한 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함할 수 있다.
VH 및/또는 VL 도메인의 표시된 백분율 동일성은 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상일 수 있다.
항체 분자는 Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 및 Abet0382 중 임의의 항체, 또는 이의 GL 버전의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함할 수 있다.
예를 들면, 항체 분자는 서열 번호 524의 Abet0380-GL VH 도메인 아미노산 서열 및 서열 번호 533의 Abet0380-GL VL 도메인 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체 분자는 Aβ1-42에의 결합에 대해 하기 (i) 또는 (ii)의 항체 분자와 경쟁하는 항체 분자일 수 있다:
(i) 서열 번호 524의 VH 도메인 아미노산 서열 및 서열 번호 533의 VL 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자; 또는
(ii) 수탁 번호 NCIMB 41890, 41891 또는 41892 하에 기탁된 핵산에 의해 코딩된 항체 분자.
항체 분자는 하기 (i), (ii) 또는 (iii)의 핵산 서열에 의해 코딩된 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함할 수 있다:
(i) 수탁 번호 41890 하에 기탁된 Abet0380-GL 핵산 서열;
(ii) 수탁 번호 41891 하에 기탁된 Abet0144-GL 핵산 서열; 또는
(ii) 수탁 번호 41892 하에 기탁된 Abet0377-GL 핵산 서열.
항체 분자는 상기 언급된 기탁된 항체의 각각 HCDR 및 LCDR을 포함하는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함할 수 있다. 항체 분자는 상기 언급된 기탁된 핵산에 의해 코딩된 항체일 수 있다.
본 발명에 따른 결합 구성원을 코딩하는 핵산 분자, 핵산을 함유하는 숙주 세포, 및 상기 핵산을 발현시키고 상기 결합 구성원을 회수함으로써 상기 결합 구성원을 제조하는 방법도 본원에 기재되어 있다.
본 발명의 추가 양태는 특허청구범위의 청구항들 중 임의의 청구항에 따른 항체 분자, 및 하나 이상의 추가 성분, 예컨대, 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물, 및 의학 용도를 위한 이러한 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 결합 구성원을 포함하는 조성물은 인체 또는 동물체의 치료 방법에서 사용되기 위해 제공될 수 있다.
본원에 기재된 결합 구성원은 인간 또는 동물 대상체, 예를 들면, 인간의 진단 또는 치료 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 결합 구성원은 개체에서 Aβ1-42의 수준을 감소시키고/시키거나 아밀로이드증을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 결합 구성원은 아밀로이드증을 감소시키고 아밀로이드증과 관련된 질병을 치료하거나, 감소시키거나 예방하는 데 사용될 수 있다. 치료될 수 있는 질병 및 질환은 알츠하이머병, 예컨대, 전구 AD, 경도 AD 또는 중등도 AD를 포함한다. 본 발명에 의해 치료되는 AD는 가족성 또는 산발성 AD일 수 있다. 본 발명은 AD와 관련된 경도 인지 장애(MCI)를 예방하거나, 감소시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. AD 환자 또는 다운증후군 환자에서 인지력이 개선될 수 있고/있거나 인지력 감퇴가 완화될 수 있다. 본 발명은 아밀로이드 베타와 관련된 황반 변성을 치료하거나 예방하는 데 사용될 수도 있다(Ding et al. PNAS 108(28):E279-287, 2011).
따라서, 추가 양태에서, 본 발명은 개체에서 아밀로이드증을 감소시키고/시키거나, 알츠하이머병을 치료하고/하거나, 알츠하이머병 또는 다운증후군에서 인지력을 개선하거나 인지력 감퇴를 감소시키고/시키거나, 황반 변성을 치료하는 방법으로서, 본 발명의 결합 구성원을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 이들 양태들 및 다른 양태들은 보다 더 상세히 후술되어 있다.
도 1은 정제된 Abet0007 Fab와 일련의 아밀로이드 베타 펩티드들 사이의 직접적인 결합 HTRF™ 분석의 결과를 보여준다. Abet0007 클론(■)은 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(도 1a)와 뮤린 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(도 1c)에의 결합을 보이지만, 인간 아밀로이드 베타 1-40 펩티드(도 1b) 또는 스크램블된(scrambled) 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(도 1d)에의 결합을 보이지 않는다. 양성 대조군 항체(●) 및 음성 대조군 항체(▲)가 본 분석의 완전성을 입증하는 데 사용되었다.
도 2는 증가하는 농도의 경쟁자 펩티드에 의한 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드 및 Abet0007 IgG2 복합체의 형성의 억제를 보여준다. 복합체 형성은 인간 아밀로이드 베타 1-42(●), 11-42(▲), 17-42(▼) 및 1-43(◆) 펩티드에 의해 억제된다. 복합체 형성은 인간 아밀로이드 베타 1-40 펩티드(■) 또는 음성 대조군 펩티드(○)에 의해 억제되지 않는다.
도 3은 100 nM(상부 선), 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.2 nM 및 3.1 nM(하부 선)의 펩티드 농도에서 고정된 Abet0007 IgG2에 결합하는 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 대한 표면 플라스몬 공명(비아코어(BIAcore)) 선을 보여준다. 각각의 선은 1:1 랭뮤어 모델에 피팅된다.
도 4는 Abet0007 IgG2의 시험관내 면역조직화학적 염색으로부터의 샘플 영상을 보여준다. (도 4a) 양성 대조군 항체는 인간 AD 뇌 절편 상에서 강한 플라크 인식(점수 = 4)을 보인다(ApoE 유전형 3/3; Braak 단계 6; 20 ㎍/㎖ 항체). (도 4b) Abet0007 IgG2 리드(lead) 클론은 인접 뇌 절편 상에서 플라크 인식을 보이지 않는다(점수 = 0)(20 ㎍/㎖). (도 4c) 동일한 양성 대조군 항체는 Tg2576 마우스 뇌 절편 상에서 강한 플라크 인식(점수 = 4)을 보인다(18개월령 마우스; 20 ㎍/㎖ 항체). (도 4d) Abet0007 IgG2 리드 클론은 인접 마우스 뇌 절편 상에서 플라크 인식을 보이지 않는다(점수 = 0)(20 ㎍/㎖).
도 5는 증가하는 농도의 Abet0007 scFv(●) 및 Abet0144 scFv(▲)에 의한 인간 아밀로이드 베타 1-42 및 Abet0042 IgG 복합체의 형성의 억제를 보여준다. Abet0144 클론은 본 분석에서 Abet0007 모클론보다 유의하게 더 강력하다. 음성 대조군 항체(■)가 비교를 위해 포함된다.
도 6은 400 nM(상부 선), 200 nM, 100 nM, 50 nM 및 12.5 nM(하부 선)의 scFv 농도에서 고정된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 결합하는 정제된 Abet0144 scFv에 대한 표면 플라스몬 공명(비아코어) 선을 보여준다. 각각의 선은 1:1 랭뮤어 모델에 피팅된다.
도 7은 50 nM(상부 선), 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM, 3.13 nM 및 1.56 nM(하부 선)의 펩티드 농도에서 고정된 Abet0144-GL IgG1-TM 항체에 결합하는 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 대한 표면 플라스몬 공명(비아코어) 선을 보여준다. 각각의 선은 1:1 랭뮤어 모델에 피팅된다.
도 8은 고정된 Abet0144-GL IgG1-TM 항체에 결합하는 400 nM의 일련의 아밀로이드 베타 펩티드들에 대한 표면 플라스몬 공명(비아코어) 선을 보여준다. 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(상부 선)와 비표지된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(제2 선)에의 명확한 결합이 존재한다. 스크램블된 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드, 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-40 펩티드, 비표지된 인간 아밀로이드 베타 1-40 펩티드 또는 바이오티닐화된 인슐린에의 식별가능한 결합은 없다(평평한 선).
도 9는 증가하는 농도의 경쟁자 펩티드에 의한 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드와 Abet0144-GL IgG1-TM 사이의 복합체 형성의 억제가 측정되는 생화학적 에피토프 경쟁 분석을 이용한 Abet0144-GL IgG1-TM의 특이성 프로파일링을 보여준다. 복합체 형성은 인간 아밀로이드 베타 1-42(●), pyro 3-42(◆) 및 pyro 11-42(○) 펩티드에 의해 억제된다. 인간 아밀로이드 베타 1-40 펩티드(■), 1-16(▲) 및 12-28(▼) 펩티드 절두체, 또는 음성 대조군 펩티드(□)를 사용하였을 때 유의한 억제가 관찰되지 않는다.
도 10은 Abet0144-GL IgG1-TM의 시험관내 면역조직화학적 염색으로부터의 샘플 영상을 보여준다. (도 10a) 양성 대조군 항체는 인간 AD 뇌 절편 상에서 강한 플라크 인식(점수 = 4)을 보인다(ApoE 유전형 3/3; 20 ㎍/㎖ 항체). (도 10b) Abet0144-GL IgG1-TM 리드 클론은 인접 뇌 절편 상에서 약간의 플라크 인식(점수 = 1.5)을 보인다(20 ㎍/㎖). (도 10c) 동일한 양성 대조군 항체는 Tg2576 마우스 뇌 절편 상에서 강한 플라크 인식(점수 = 4)을 보인다(18개월령 마우스; 20 ㎍/㎖ 항체). (도 10d) Abet0144-GL IgG1-TM 리드 클론은 인접 마우스 뇌 절편 상에서 약간의 플라크 인식(점수 = 1)을 보인다(20 ㎍/㎖).
도 11은 증가하는 농도의 정제된 경쟁자 scFv에 의한 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드 및 Abet0144-GL IgG1-TM 복합체의 형성의 억제를 보여준다(●). 가장 강력한 scFv 클론들 중 4개의 클론들, 즉 Abet0369(도 11a), Abet0377(도 11b), Abet0380(도 11c) 및 Abet0382(도 11d) 모두가 Abet0144-GL scFv 모서열에 비해 효능의 유의한 개선을 보인다(■).
도 12는 1024 nM(상부 선) 내지 63 pM(하부 선)의 펩티드 농도에서 고정된 Abet0380-GL IgG1-TM 항체에 결합하는 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 대한 표면 플라스몬 공명(비아코어) 선을 보여준다. 각각의 선은 1:1 랭뮤어 모델에 피팅된다.
도 13은 고정된 Abet0380-GL IgG1-TM 항체에 결합하는 일련의 아밀로이드 베타 펩티드들에 대한 표면 플라스몬 공명(비아코어) 선을 보여준다. 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(상부 선) 및 비표지된 뮤린 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(제2 선)에의 명확한 결합이 존재한다. 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-40 펩티드 또는 비표지된 뮤린 아밀로이드 베타 1-40 펩티드에의 식별가능한 결합은 없다(평평한 선).
도 14는 Abet0380-GL IgG1-TM의 시험관내 면역조직화학적 염색으로부터의 샘플 영상을 보여준다. (도 14a) 양성 대조군 항체는 인간 AD 뇌 절편 상에서 강한 플라크 인식(점수 = 4)을 보인다(ApoE 유전형 3/3; Braak 단계 6; 5 ㎍/㎖ 항체). (도 14b) Abet0380-GL IgG1-TM 리드 클론은 인접 뇌 절편 상에서 강한 플라크 인식(점수 = 3)을 보인다(10 ㎍/㎖). (도 14c) 동일한 양성 대조군 항체는 Tg2576 마우스 뇌 절편 상에서 강한 플라크 인식(점수 = 4)을 보인다(22개월령 마우스; 20 ㎍/㎖ 항체). (도 14d) Abet0380-GL IgG1-TM 리드 클론은 인접 마우스 뇌 절편 상에서 강한 플라크 인식(점수 = 4)을 보인다(20 ㎍/㎖).
도 15는 Abet0380-GL IgG1-TM을 사용한 Abeta 42 응집체 제조 및 검출의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. (A) 광가교연결되지 않은(비-PICUP) Aβ42 응집체의 Abet0380-GL IgG1-TM 검출. (B) 광가교연결된 Aβ42 응집체(PICUP)의 Abet0380-GL IgG1-TM 검출. 여기서, 본 발명자들은 Abet0380-GL IgG1-TM이 Aβ1-42 단량체 및 저급 n 올리고머 종(오량체까지 포함함)을 특이적으로 인식한다는 것을 입증한다.
도 16은 14일에 걸쳐 매주 반복된 용량을 제공받은 스프라그-다울리(Sprague-Dawley) 래트에서 증가하는 용량의 Abet0380-GL IgG1-TM 항체에 의해 CSF에서 유리 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 수준이 용량 의존적으로 감소하고(도 16a), 뇌 조직에서 총 아밀로이드 베타 1-42 펩티드가 증가하고(도 16b) 뇌 조직에서 총 아밀로이드 베타 1-40 펩티드의 수준이 영향받지 않는다는 것(도 16c)을 보여준다.
도 17은 말초 용량을 노화된 Tg2576 마우스에게 투여한지 168시간 후 생체내에서 Abet0380-GL IgG1-TM과 아밀로이드 베타 플라크의 결합의 면역조직화학적 분석으로부터 수득된 샘플 영상을 보여준다. 30 mg/kg으로 제공된 양성 대조군 항체는 강한 생체내 플라크 인식(도 17a)을 보인 반면, 30 mg/kg(도 17b) 또는 10 mg/kg(도 17c)으로 제공된 Abet0380-GL IgG1-TM은 임의의 생체내 플라크 장식을 보이지 않는다.
도 18은 다양한 상이한 농도(10 μM 내지 0.17 nM)의 전체 길이 인간 Abeta 펩티드, 절두체 인간 Abeta 펩티드 및 pyro 인간 Abeta 펩티드(Abeta 1-42, Abeta 1-43, Abeta 1-16, Abeta 12-28, Abeta 17-42, Abeta pyro-3-42 또는 Abeta pyro-11-42)의 패널을 사용한 경쟁 결합 실험에서 Abet0380-GL IgG1-TM의 특이성을 보여준다. 기호 설명은 다음과 같다:
Figure 112015046136268-pct00001

x-축은 Abeta 펩티드의 농도를 로그 M으로 보여주고, y-축은 % 특이적 결합을 보여준다. Abeta 1-42, Abeta 1-43, Abeta 17-42, Abeta Pyro-3-42 및 Abeta Pyro-11-42를 사용하였을 때 Abet0380-GL IgG1-TM:N 말단 바이오틴 Abeta 1-42 결합의 억제가 이 군에 대해 10-8 몰 내지 10-9 몰의 IC50 값으로 관찰되었다. Abeta 1-16 또는 Abeta 12-28을 사용하였을 때 Abet0380-GL IgG1-TM:N 말단 바이오틴 Abeta 1-42 결합의 억제가 관찰되지 않았다.
도 19는 정상 래트 PK-PD 연구에서 아밀로이드 베타 1-42를 격리시키는 항체 Abet0144-GL의 능력을 보여준다. x-축은 비히클 또는 Abet0144-GL의 농도를 보여주고(10 mg/kg 또는 40 mg/kg), y-축은 CSF 중의 총 아밀로이드 베타 1-42의 농도(pg/㎖)를 보여준다. CSF에서 유리 아밀로이드 베타 1-42는 10 mg/kg 또는 40 mg/kg의 Abet0144-GL에 의해 유의하게 변경되지 않았다(비히클과 비교되었을 때 각각 5% 및 18% 증가). CSF에서 총 아밀로이드 베타 1-42는 10 mg/kg에서 38%까지 유의하게 증가되었고 40 mg/kg에서 139%까지 유의하게 증가되었다. 뇌 조직에서 총 아밀로이드 베타 1-42도 10 mg/kg 및 40 mg/kg에서 각각 16% 및 50%까지 유의하게 증가되었다. 정상 래트에서의 이 연구로부터의 데이터는 Abet0144-GL이 CSF 및 뇌 둘 다에서 총 아밀로이드 베타 1-42 수준을 증가시키면서 CSF에서 유리 아밀로이드 베타 1-42 수준에 유의한 영향을 미치지 않았다는 것을 입증한다.
본 발명에 따른 결합 구성원은 혈장, 뇌 및 뇌척수액(CSF)에서 Aβ 펩티드 1-42 및 이의 N 말단 절두체(n-42)의 동종형에 결합함으로써 뇌 및 뇌혈관구조 내에서 Aβ n-42 동형체의 축적을 예방할 수 있거나 이러한 동형체의 침착을 역전시킬 수 있다. 본 발명에 따른 결합 구성원은 혈액 혈장 및/또는 뇌척수액(CSF)에서 가용성 Aβ1-42에 결합하여 이를 침전시킴으로써 각각 혈청 및/또는 CSF에서 Aβ1-42의 농도를 감소시킬 수 있다. 이것은 아밀로이드증과 관련된 알츠하이머병 및 다른 질병에 대한 치료 방법을 대표한다.
결합 구성원은 Aβ17-42 내의, 보다 구체적으로 Aβ29-42 내의 표적 에피토프에 대한 특이성을 갖고, 비-표적 에피토프, 예를 들면, Aβ1-40으로부터의 에피토프에 비해 상대적으로 고친화성으로 이 표적 에피토프에 결합하여 아밀로이드 플라크 형성과 관련된 주요 독성 종을 표적화한다. 예를 들면, 결합 구성원은 Aβ1-40에 대한 결합 친화성보다 10배 이상, 100배 이상, 1000배 이상 또는 10,000배 이상 더 큰 Aβ1-42에 대한 결합 친화성을 나타낼 수 있다. 따라서, 결합 구성원은 Aβ1-40에 비해 Aβ1-42에의 결합에 대한 선택성을 갖는다. 상기 언급된 바와 같이, 결합 구성원은 500 pM 이하의 해리 상수(KD)로 Aβ1-42에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 상기 결합 구성원은 Aβ1-40에의 유의한 결합을 보이지 않는다. 실시예에 기재된 바와 같이 단량체 Aβ 펩티드를 사용한 표면 플라스몬 공명을 이용하여 친화성 및 결합을 측정할 수 있다.
실시예에 기재된 바와 같이, 항체가 Aβ에의 결합에 대하여 Aβ 펩티드에 대한 기준 항체 분자와 경쟁할 수 있는지를 확인하기 위해 균질한 시간 분해 형광(HTRF™) 분석에서 Aβ에의 결합도 측정할 수 있다.
HTRF™ 분석은 가까이 근접하여 존재하는 공여자 형광단과 수용자 형광단 사이의 형광 공명 에너지 전달을 이용하는 균질한 분석 기술이다. 이러한 분석은 관심있는 분자들 중 한 분자를 공여자 형광단인 유로퓸(Eu3+) 크립테이트에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링시키고 관심있는 다른 분자를 수용자 형광단 XL665(안정한 가교연결된 알로파이코시아닌)에 커플링시킴으로써 거대분자 상호작용을 측정하는 데 이용될 수 있다. (337 nm에서) 크립테이트 분자의 여기는 620 nm에서 형광 방사를 일으킨다. 이 방사로부터의 에너지는 크립테이트에 가깝게 근접하여 존재하는 XL665로 전달되어, (665 nm에서) XL665로부터의 특이적 장기간-생존 형광의 방사를 일으킬 수 있다. (620 nm에서) 공여자 및 (665 nm에서) 수용자 둘 다의 특이적 신호가 측정되어, 분석에서 착색된 화합물의 존재를 보상하는 665/620 nm 비의 계산을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 결합 구성원은 Aβ1-42에의 결합에 대해 경쟁할 수 있으므로, HTRF™ 경쟁 분석에서 기준 항체와 Aβ1-42의 결합을 억제할 수 있으나 기준 항체와 Aβ1-40의 결합을 억제할 수는 없다. 결합 구성원은 HTRF™ 분석에서 Aβ1-42에의 결합에 대하여 Abet0144GL의 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상 또는 90% 이상의 억제를 보일 수 있다.
달리 언급되어 있지 않은 한, 결합 억제의 효능은 nM 단위의 IC50 값으로서 표현될 수 있다. 기능 분석에서, IC50은 그의 최대치의 50%까지 생물학적 반응을 감소시키는 항체 분자의 농도이다. 리간드 결합 연구에서, IC50은 최대 특이적 결합 수준의 50%까지 수용체 결합을 감소시키는 농도이다. IC50은 최대 생물학적 반응의 %를 결합 구성원 농도의 로그의 함수로서 작도하고 소프트웨어 프로그램, 예컨대, 프리즘(Prism)(그래프패드(GraphPad)) 또는 오리진(Origin)(오리진 랩스(Origin Labs))을 이용하여 S자형 함수를 데이터에 피팅시켜 IC50 값을 생성함으로써 계산될 수 있다. 효능을 측정하거나 결정하기에 적합한 분석은 당분야에서 잘 공지되어 있다.
결합 구성원은 Abet0144-GL 및 Aβ1-42를 사용한 HTRF™ 에피토프 경쟁 분석에서 5 nM 이하, 예를 들면, 2 nM 이하, 예를 들면, 1 nM 이하의 IC50을 가질 수 있다. Abet0144-GL은 서열 번호 20의 VH 도메인 및 서열 번호 29의 VL 도메인을 갖는 항체 분자이다. 이 항체 분자는 테스트할 항체 분자와 동일한 포맷, 예를 들면, scFv 또는 IgG, 예를 들면, IgG1 포맷으로 상기 분석에서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 IgG 항체 분자는 HTRF 에피토프 경쟁 분석에서 인간 Aβ1-42에의 결합에 대해 Abet0144-GL IgG와 경쟁할 수 있다. 이러한 분석에서 효능은 1 nM 미만일 수 있다.
본 발명에 따른 결합 구성원은 HTRF™ 경쟁 분석에 의해 측정될 때 Aβ1-40에 비해 Aβ1-42에 대한 특이적 결합을 보일 수 있다. 이러한 분석에서, Aβ1-40은 Aβ1-42 펩티드에 결하는 결합 구성원의 유의한 억제를 보이지 않을 수 있고(예를 들면, Aβ1-40은 이러한 분석에서 20% 미만, 예를 들면, 10% 미만 또는 5% 미만의 억제를 보일 수 있고), 바람직하게는 이러한 분석에서 유의한 억제를 보이지 않는다.
본 발명에 따른 결합 구성원은 인간 Aβ17-42 내의, 보다 구체적으로 인간 Aβ29-42 내의 에피토프를 인식하고, 다른 종, 예를 들면, 마우스 또는 래트로부터의 Aβ 내의 그들의 표적 에피토프도 인식할 수 있다. 두 종들의 Aβ1-42에 대한 결합 구성원의 교차반응성 정도를 평가하기 위해 제1종(예를 들면, 인간)으로부터의 Aβ1-42를 사용한 HTRF™ 경쟁 분석에서 계산된 결합 구성원의 효능을, 제2종(예를 들면, 마우스 Aβ1-42)으로부터의 Aβ1-42를 사용한 동일한 분석에서의 결합 구성원의 효능과 비교할 수 있다. IC50 측정에 의해 결정된 효능은 10배 이내 또는 100배 이내에 있을 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, Abet0144GL은 HTRF™ 경쟁 분석에서 기준 항체로서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 결합 구성원은 비-인간 Aβ1-42 분석보다 인간 Aβ1-42 분석에서 더 큰 효능을 가질 수 있다.
결합 구성원은 항체 골격 내에 하나 이상의 CDR, 예를 들면, CDR 세트(즉, 항체의 항원 결합 도메인)를 갖는 항체 분자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체 분자는 항체 VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 항체 분자의 VH 도메인 및 VL 도메인도 본 발명의 일부로서 제공된다. 잘 공지된 바와 같이, VH 도메인 및 VL 도메인은 상보성 결정 영역("CDR") 및 골격 영역("FW")을 포함한다. VH 도메인은 HCDR 세트를 포함하고, VL 도메인은 LCDR 세트를 포함한다. 항체 분자는 VH CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체 VH 도메인, 및/또는 VL CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함할 수 있다. VH 도메인 또는 VL 도메인은 골격을 추가로 포함할 수 있다. VH 도메인 또는 VL 도메인 골격은 전형적으로 하기 구조로 CDR이 사이사이에 위치하는 4개의 골격 영역들, 즉 FW1, FW2, FW3 및 FW4를 포함한다: FW1 - CDR1 - FW2 - CDR2 - FW3 - CDR3 - FW4.
본 발명의 양태에 따른 항체 VH 도메인 및 VL 도메인, FW 및 CDR의 예는 표 5 및 표 6, 및 본 개시내용의 일부를 형성하는 첨부된 서열목록에 나열되어 있다. 본원에 개시된 모든 VH 및 VL 서열들, CDR 서열들, CDR 세트들, HCDR 세트들 및 LCDR 세트들뿐만 아니라, 이들 요소들의 조합물도 본 발명의 양태를 대표한다. 본원에 기재된 바와 같이, "CDR 세트"는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 따라서, HCDR 세트는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 지칭하고, LCDR 세트는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 지칭한다. 달리 언급되어 있지 않은 한, "CDR 세트"는 HCDR 및 LCDR을 포함한다. 전형적으로, 본 발명의 항체 분자는 단일클론 항체이다.
다른 실시양태에서, 결합 구성원은 이하에 더 논의된 바와 같이 통상적으로 비-항체 단백질 스캐폴드 내의 하나 이상의 CDR, 예를 들면, CDR 세트에 의해 제공된, 비-항체 분자 내의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다.
Abet0007로서 명명된 모항체 분자의 단리에 이어서, CDR3의 유도된 돌연변이, 및 표 5, 표 6 및 서열목록에 제시된 CDR 세트 서열 및 골격 서열을 갖는 Abet0144-GL 생식세포주화된(germlined) 최적화된 항체 Abet0144의 선택이 본원에 기재되어 있다. 실시예에 기재된 바와 같은 다중 라이브러리의 추가 최적화 및 재조합의 광범위한 과정을 통해 Abet0144GL로부터 항체 클론의 패널을 생성하였다. 이들 추가 최적화된 클론은 Abet0380, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 및 Abet0383으로서 명명된다. 이들의 CDR 서열들 및 가변 도메인 서열들은 표 5 및 표 6에 언급되어 있고 서열목록에 기재되어 있다. 생식세포주화된 VH 및 VL 도메인 서열 Abet0380GL, Abet0377GL, Abet0343GL, Abet0369GL 및 Abet0382GL은 표 8 및 표 9에 제시되어 있다.
예를 들면, 표 5 및 6은 Abet0380이 CDR 세트를 갖고, 이때 HCDR1이 서열 번호 525(카바트 잔기 31-35)이고 HCDR2가 서열 번호 526(카바트 잔기 50-65)이고 HCDR3이 서열 번호 527(카바트 잔기 95-102)이고 LCDR1이 서열 번호 534(카바트 잔기 24-34)이고 LCDR2가 서열 번호 535(카바트 잔기 50-56)이고 LCDR3이 서열 번호 536(카바트 잔기 89-97)이라는 것을 보여준다. 다른 최적화된 항체 클론은 유사한 방식으로 표 5 및 표 6에 제시되어 있고, 본 발명의 양태로서도 제공된다.
본 발명에 따른 인간 Aβ1-42에 대한 결합 구성원은 본원에 기재된 하나 이상의 CDR, 예를 들면, CDR 세트를 포함할 수 있다. CDR 또는 CDR 세트는 Abet0380, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 또는 Abet0383 CDR 세트, 또는 이의 생식세포주화된 버전일 수 있거나, 본원에 기재된 이의 변이체일 수 있다.
일부 실시양태에서, HCDR1은 카바트 잔기 31-35로 구성된 5개 아미노산 길이를 가질 수 있고/있거나; HCDR2는 카바트 잔기 50-65로 구성된 17개 아미노산 길이를 가질 수 있고/있거나; HCDR3은 카바트 잔기 95-102로 구성된 16개 아미노산 길이를 가질 수 있고/있거나; LCDR1은 카바트 잔기 24-34로 구성된 11개 아미노산 길이를 가질 수 있고/있거나; LCDR2는 카바트 잔기 50-56으로 구성된 7개 아미노산 길이를 가질 수 있고/있거나; LCDR3은 카바트 잔기 89-97로 구성된 9개 아미노산 길이를 가질 수 있다.
결합 구성원은 표 5 및 표 6에 나열된 항체들 중 임의의 항체의 HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3, 및/또는 LCDR1, LCDR2 및/또는 LCDR3, 예를 들면, 표 5 및 표 6에 나열된 항체들 중 임의의 항체의 CDR 세트를 포함할 수 있다. 결합 구성원은 이들 항체들 중 어느 한 항체의 VH CDR 세트를 포함할 수 있다. 임의적으로, 결합 구성원은 이들 항체들 중 한 항체의 VL CDR 세트도 포함할 수 있다. VL CDR은 VH CDR과 동일한 또는 상이한 항체로부터 유래될 수 있다. 표 5에 나열된 항체들 중 임의의 항체의 HCDR 세트를 포함하는 VH 도메인 및/또는 표 6에 나열된 항체들 중 임의의 항체의 LCDR 세트를 포함하는 VL 도메인도 본원에서 제공된다.
결합 구성원은 개시된 HCDR 및/또는 LCDR 세트 내에서 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 예를 들면, 5개, 10개 또는 15개 이하의 돌연변이를 갖는, 표 5 및 표 6에 나열된 항체들 중 임의의 항체의 HCDR 및/또는 LCDR 세트를 포함할 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체 분자는 1개 또는 2개의 아미노산 돌연변이, 예를 들면, 치환을 갖는 Abet0380, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 및 Abet0383 중 어느 한 항체 또는 이의 생식세포주화된 버전으로부터의 HCDR 및/또는 LCDR 세트를 포함할 수 있다.
예를 들면, 결합 구성원은
(i) Abet0380 또는 Abet0380GL HCDR 세트(이때, Abet0380 또는 Abet0380GL HCDR의 아미노산 서열은 서열 번호 525(HCDR1), 서열 번호 526(HCDR2) 및 서열 번호 527(HCDR3)임)를 포함하거나 1개 또는 2개의 아미노산 돌연변이를 갖는 Abet0380 HCDR 세트를 포함하는 VH 도메인; 및
(ii) Abet0380 또는 Abet0380GL LCDR 세트(이때, Abet0380 또는 Abet0380GL LCDR의 아미노산 서열은 서열 번호 534(LCDR1), 서열 번호 535(LCDR2) 및 서열 번호 536(LCDR3)임)를 포함하거나 1개 또는 2개의 아미노산 돌연변이를 갖는 Abet0380 또는 Abet0380GL LCDR 세트를 포함하는 VL 도메인
을 포함할 수 있다.
돌연변이는 잠재적으로 CDR 세트 내의 임의의 잔기에서 만들어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 치환은 표 5 및 표 6에 제시된 바와 같이 Abet0144GL과 비교된 Abet0380, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 및 Abet0383 중 임의의 항체에서 치환된 위치, 또는 Abet0380과 비교된 Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 및 Abet0383 중 임의의 항체 또는 이의 생식세포주화된 버전에서 치환된 위치에서 만들어질 수 있다.
예를 들면, 하나 이상의 치환이 하기 카바트 잔기들 중 하나 이상의 카바트 잔기에서 존재할 수 있다:
VH FW1 내의 26, 27, 28, 29 또는 30;
VH CDR1 내의 31, 32, 33, 34 또는 35;
VH CDR2 내의 52a, 53, 54, 55, 56, 57, 58 또는 62;
VH CDR3 내의 98, 99, 100h 또는 102;
VL CDR1 내의 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 또는 34;
VL CDR3 내의 89, 90, 92, 93, 94 또는 97.
특정 카바트 잔기 위치에서 가능한 아미노산 치환의 예는 VH 도메인의 경우 표 12 및 표 14에 제시되어 있고 VL 도메인의 경우 표 13 및 표 15에 제시되어 있다.
전술된 바와 같이, 결합 구성원은 항체 골격 내에 하나 이상의 CDR, 예를 들면, CDR 세트를 갖는 항체 분자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 하나 이상의 CDR 또는 CDR 세트를 골격(예를 들면, 인간 골격) 내로 이식하여 항체 분자를 제공할 수 있다. 골격 영역은 인간 생식세포주 유전자 절편 서열의 골격 영역일 수 있다. 따라서, 골격은 생식세포주화될 수 있으므로, 골격 내의 하나 이상의 잔기는 가장 유사한 인간 생식세포주 골격 내의 동등한 위치에 있는 잔기와 일치하도록 변화된다. 당업자는 생식세포주화 전에 서열 면에서 항체의 골격 서열과 가장 가까운 생식세포주 절편을 선택할 수 있고, 생식세포주화가 본원에 기재된 분석에서 항원 결합 또는 효능을 유의하게 감소시키지 않는다는 것을 확인하기 위해 항체의 친화성 또는 활성을 테스트할 수 있다. 인간 생식세포주 유전자 절편 서열은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, VBASE 컴파일레이션(compilation)(VBASE, MRC 단백질 조작 센터, 영국 소재, 1997, http//mrc-cpe.cam.ac.uk)으로부터 접근될 수 있다.
본원에 기재된 결합 구성원은 인간 생식세포주 골격 내에 HCDR 세트를 포함하는 VH 도메인을 갖는 단리된 인간 항체 분자, 예를 들면, Vh3-23 DP-47일 수 있다. 따라서, VH 도메인 골격 영역 FW1, FW2 및/또는 FW3은 인간 생식세포주 유전자 절편 Vh3-23 DP-47의 골격 영역을 포함할 수 있고/있거나, 이 인간 생식세포주 유전자 절편의 골격 잔기와 일치하도록 골격 잔기를 돌연변이시킴으로써 생식세포주화될 수 있다. FW4는 인간 생식세포주 j 절편의 골격 영역을 포함할 수 있다.
VH FW1의 아미노산 서열은 서열 번호 528일 수 있다. VH FW1은 항원 결합에 기여하고/하거나 CDR1 루프의 구조적 형태에 중요할 것으로 생각되는 카바트 위치 26-30에서 일련의 잔기들을 함유한다. 예를 들면, HCDR1의 선택된 서열과 상승작용하도록 치환이 서열 번호 528 내에 포함될 수 있다. 하나 이상의 치환은 임의적으로 표 12 또는 표 14에 제시된 치환들로부터 선택될 수 있다.
VH FW2의 아미노산 서열은 서열 번호 529일 수 있다. VH FW3의 아미노산 서열은 서열 번호 530일 수 있다. VH FW4의 아미노산 서열은 서열 번호 531일 수 있다.
통상적으로, 결합 구성원은 예를 들면, 인간 생식세포주 골격, 예를 들면, V 람다 23-3 DPL-23 내에 LCDR 세트를 포함하는 VL 도메인도 갖는다. 따라서, VL 도메인 골격 영역은 인간 생식세포주 유전자 절편 V 람다 23-3 DPL-23의 골격 영역 FW1, FW2 및/또는 FW3을 포함할 수 있고/있거나, 이 인간 생식세포주 유전자 절편의 골격 잔기와 일치하도록 골격 잔기를 돌연변이시킴으로써 생식세포주화될 수 있다. FW4는 인간 생식세포주 j 절편의 골격 영역을 포함할 수 있다. VL FW1의 아미노산 서열은 서열 번호 537일 수 있다. VL FW2의 아미노산 서열은 서열 번호 538일 수 있다. VL FW3의 아미노산 서열은 서열 번호 539일 수 있다. VL FW4의 아미노산 서열은 서열 번호 540일 수 있다.
생식세포주화된 VH 또는 VL 도메인은 하나 이상의 버니어(Vernier) 잔기에서 생식세포주화될 수 있거나 생식세포주화될 수 없으나, 통상적으로 생식세포주화되지 않는다.
예를 들면, 본원에 기재된 항체 분자 또는 VH 도메인은 중쇄 골격 영역 세트 FW1(서열 번호 528), FW2(서열 번호 529), FW3(서열 번호 530) 및 FW4(서열 번호 531)를 포함할 수 있거나; 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개의 아미노산 돌연변이, 예를 들면, 치환을 갖는 상기 중쇄 골격 영역 세트를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 항체 분자 또는 VL 도메인은 경쇄 골격 영역 세트 FW1(서열 번호 537), FW2(서열 번호 538), FW3(서열 번호 539) 및 FW4(서열 번호 540)를 포함할 수 있거나; 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 아미노산 돌연변이, 예를 들면, 치환을 갖는 상기 경쇄 골격 영역 세트를 포함할 수 있다.
생식세포주화되지 않은 항체 분자는 생식세포주화된 항체 분자에 비해 동일한 CDR을 갖되 상이한 골격을 갖는다. 첨부된 서열목록에서 본원에 제시된 항체 서열들 중 Abet0144-GL, Abet0380-GL, Abet0377-GL, Abet0343-GL, Abet0369-GL 및 Abet0382-GL의 서열이 생식세포주화된다. 본원에 개시된 서열을 갖는 다른 항체 분자의 생식세포주화된 항체들은 그들의 VH 도메인 및 VL 도메인 서열들의 골격 영역들을 임의적으로 VH 도메인에서 Vh3-23 DP-47로 생식세포주화하고 VL 도메인에서 V 람다 23-3 DPL-23으로 생식세포주화함으로써 생성될 수 있다.
전형적으로, 상기 논의된 바와 같이 VH 도메인 또는 VL 도메인만이 항원에 결합하는 데 사용될 수 있지만, VH 도메인은 VL 도메인과 쌍을 형성하여 항체의 항원 결합 부위를 제공한다. 예를 들면, Abet0380-GL VH 도메인 및 VL 도메인 둘 다를 포함하는 항체의 항원 결합 부위가 형성되도록 Abet0380-GL VH 도메인(서열 번호 524)이 Abet0380-GL VL 도메인(서열 번호 533)과 쌍을 형성할 수 있다. 본원에 개시된 다른 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인에 대한 유사한 실시양태가 제공된다. 다른 실시양태에서, Abet0380-GL VH는 Abet0380-GL VL 이외의 VL 도메인과 쌍을 형성한다. 경쇄 뒤섞임(promiscuity)은 당분야에서 잘 확립되어 있다. 또한, 본원에 개시된 다른 VH 도메인 및 VL 도메인에 대한 유사한 실시양태가 본 발명에 의해 제공된다. 따라서, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0380, Abet0381, Abet0382 및 Abet0383 중 임의의 항체의 VH CDR 또는 생식세포주화된 VH 도메인 서열을 포함하는 VH 도메인은 상이한 항체로부터의 VL CDR 또는 생식세포주화된 VL 도메인을 포함하는 VL 도메인과 쌍을 형성할 수 있다(예를 들면, VH 도메인 및 VL 도메인은 Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0380, Abet0381, Abet0382 및 Abet0383으로부터 선택된 상이한 항체로부터 유래될 수 있다).
결합 구성원은
(i) Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 및 Abet0382 중 임의의 항체 또는 이의 생식세포주화된 버전에 대하여 표 16 또는 첨부된 서열목록에 제시된 VH 도메인 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 1개 또는 2개의 아미노산 돌연변이를 갖는 상기 아미노산 서열을 포함할 수 있고;
(ii) Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 및 Abet0382 중 임의의 항체 또는 이의 생식세포주화된 버전에 대하여 표 16 또는 첨부된 서열목록에 제시된 VL 도메인 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 1개 또는 2개의 아미노산 돌연변이를 갖는 상기 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
항체 분자는
(i) Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 및 Abet0382 중 임의의 항체 또는 이의 생식세포주화된 버전에 대하여 표 16에 제시된 VH 도메인 아미노산 서열과 90%, 95% 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인; 및
(ii) Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 및 Abet0382 중 임의의 항체 또는 이의 생식세포주화된 버전에 대하여 표 16에 제시된 VL 도메인 아미노산 서열과 90%, 95% 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인
을 포함할 수 있다.
항체 분자는 Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 및 Abet0382 중 임의의 항체 또는 이의 생식세포주화된 버전의 VH 도메인 및 VL 도메인과 90%, 95% 또는 98% 이상 동일한 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함할 수 있다.
결합 구성원은 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함할 수 있고, 이때
(i) VH 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 524에 제시되어 있고, VL 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 533에 제시되어 있거나;
(ii) VH 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 524에 비해 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 치환을 갖고, VL 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 533에 비해 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 치환을 갖거나;
(iii) VH 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 524에 대한 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖고, VL 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 533에 대한 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체 분자는 항체 불변 영역, 예를 들면, scFv를 결여할 수 있다.
다른 실시양태에서, 항체 분자는 항체 불변 영역을 포함할 수 있다. 항체 분자는 전체 항체, 예컨대, IgG, 즉 IgG1, IgG2 또는 IgG4일 수 있거나, 후술된 항체 단편 또는 유도체일 수 있다. 항체 분자는 다른 포맷, 예를 들면, Fc 영역 내에 YTE(Dall'Acqua et al. (2002) J. Immunology, 169: 5171-5180; Dall'Acqua et al. (2006) J Biol. Chem. 281(33):23514-24) 및/또는 TM 돌연변이(Oganesyan et al. (2008) Acta Cryst D64:700-4)를 갖는 IgG1을 가질 수도 있다.
본 발명은 변이체 Fc 영역을 갖는 본 발명의 결합 구성원을 제공하고, 이때 상기 변이체는 카바트에 기재된 EU 지수에 의해 넘버링될 때 위치 234에서 페닐알라닌(F) 잔기를 포함하고 위치 235에서 페닐알라닌(F) 잔기 또는 글루탐산(E) 잔기를 포함하고 위치 331에서 세린(S) 잔기를 포함한다. 이러한 돌연변이 조합물은 이하, 삼중 돌연변이체(TM)로서 지칭된다.
본원에 기재된 결합 구성원은 하기 수탁 번호들 중 임의의 수탁 번호의 핵산 서열 및/또는 벡터에 의해 코딩된 CDR, VH 도메인, VL 도메인, 항체의 항원 결합 부위 또는 항체 분자를 포함할 수 있다:
(i) 수탁 번호 NCIMB 41889(Abet0007);
(ii) 수탁 번호 NCIMB 41890(Abet0380-GL);
(iii) 수탁 번호 NCIMB 41891(Abet0144-GL); 및
(iv) 수탁 번호 NCIMB 41892(Abet0377-GL).
본원에 기재된 결합 구성원은 수탁 번호 NCIMB 41889, 41890, 41891 또는 41892의 핵산, 벡터 또는 세포주로부터 생성될 수 있거나 생성가능할 수 있다. 예를 들면, 결합 구성원은 수탁 번호 NCIMB 41890의 세포주의 핵산 또는 벡터의 발현에 의해 생성될 수 있다. 상기 핵산 또는 벡터는 임의의 편리한 발현 시스템에 의해 발현될 수 있다. 대안적으로, 결합 구성원은 수탁 번호 NCIMB 41889, 41890, 41891 또는 41892의 세포주에 의해 발현될 수 있다.
본 발명의 양태는 수탁 번호 41889, 41890, 41891 또는 41892의 세포주에 함유되어 있는, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산; 수탁 번호 41889, 41890, 41891 또는 41892의 세포주에 함유되어 있는, 상기 핵산을 포함하는 벡터; 및 수탁 번호 41889, 41890, 41891 또는 41892의 세포 또는 세포주도 제공한다.
본 발명에 따른 결합 구성원은 수탁 번호 41889, 41890, 41891 또는 41892 하에 기탁된 핵산에 의해 코딩된 임의의 항체 분자, 또는 첨부된 서열목록에 기재된 Abet007, Abet0380-GL, Abet0144-GL 또는 Abet0377-GL의 VH 도메인 및 VL 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자와 인간 Aβ1-42에의 결합에 대해 경쟁하는 항체의 항원 결합 부위 또는 항체 분자를 포함할 수 있다.
결합 구성원
용어 "결합 구성원"은 서로 결합하는 한 쌍의 분자들의 한 구성원을 의미한다. 결합 쌍의 구성원은 천연적으로 유도될 수 있거나, 전체적으로 또는 부분적으로 합성에 의해 생성될 수 있다. 한 쌍의 분자들의 한 구성원은 상기 한 쌍의 분자들의 다른 구성원의 특정 공간적 및 극성 구조에 결합하므로 이러한 구조에 상보적인 그의 표면 상의 영역 또는 캐비티를 갖는다. 결합 쌍의 유형의 예는 항원-항체, 바이오틴-아비딘, 호르몬-호르몬 수용체, 수용체-리간드, 및 효소-기질이다. 본 발명은 항원-항체 유형 반응에 관한 것이다.
결합 구성원은 통상적으로 항원 결합 부위를 갖는 분자를 포함한다. 예를 들면, 결합 구성원은 항원 결합 부위를 포함하는 항체 분자 또는 비-항체 단백질일 수 있다.
항원 결합 부위는 비-항체 단백질 스캐폴드, 예컨대, 피브로넥틴 또는 사이토크롬 B 등 상에서의 CDR들의 정렬(Haan & Maggos (2004) BioCentury, 12(5): A1-A6; Koide et al. (1998) Journal of Molecular Biology, 284: 1141-1151; Nygren et al. (1997) Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469)에 의해 제공될 수 있거나, 원하는 표적에 대한 결합 특이성을 부여하기 위해 단백질 스캐폴드 내의 루프의 아미노산 잔기를 무작위화시키거나 돌연변이시킴으로써 제공될 수 있다. 단백질에서 신규 결합 부위를 조작하기 위한 스캐폴드는 상기 문헌(Nygren et al.)에 상세히 검토되어 있다. 항체 모방체(mimics)에 대한 단백질 스캐폴드는 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 국제 특허출원 공보 제WO00/34784호에 개시되어 있고, 여기서 상기 특허출원의 발명자들은 하나 이상의 무작위화된 루프를 갖는 피브로넥틴 III형 도메인을 포함하는 단백질(항체 모방체)을 기술한다. 하나 이상의 CDR, 예를 들면, HCDR 세트, 또는 HCDR3 및/또는 LCDR3이 이식되기에 적합한 스캐폴드는 면역글로불린 유전자 수퍼패밀리의 임의의 도메인 구성원에 의해 제공될 수 있다. 스캐폴드는 인간 또는 비-인간 단백질일 수 있다. 비-항체 단백질 스캐폴드의 장점은 상기 스캐폴드가 적어도 일부 항체 분자들보다 더 적고/적거나 제조하기에 더 용이한 스캐폴드 분자 내의 항원 결합 부위를 제공할 수 있다는 점이다. 결합 구성원의 작은 크기는 유용한 생리학적 성질, 예컨대, 세포로 들어가거나, 조직 내로 깊이 침투하거나 다른 구조물 내의 표적에 도달하는 능력, 또는 표적 항원의 단백질 캐비티 내에서 결합하는 능력을 부여할 수 있다. 비-항체 단백질 스캐폴드 내의 항원 결합 부위의 사용은 문헌(Wess, L. In: BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, 12(42), A1-A7, 2004)에서 검토되어 있다. 전형적인 단백질은 안정한 골격 및 하나 이상의 가변 루프를 갖는 단백질이고, 이때 루프 또는 루프들의 아미노산 서열은 표적 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 생성하도록 특이적으로 또는 무작위적으로 돌연변이된다. 이러한 단백질은 사카로마이세스 아우레우스(S. aureus)의 단백질 A, 트랜스페린, 테트라넥틴, 피브로넥틴(예를 들면, 제10 피브로넥틴 III형 도메인), 리포칼린뿐만 아니라 감마 결정성 및 다른 아필린(Affilin)™ 스캐폴드(Scil 단백질)의 IgG 결합 도메인을 포함한다. 다른 방법의 예로는 사이클로타이드(cyclotide)(분자내 이황화 결합을 갖는 작은 단백질)에 기초한 합성 "마이크로바디", 마이크로단백질(버사바디(Versabodies)™, 아뮤닉스(Amunix)) 및 앤키린 반복 단백질(DARPins, 몰레큘라 파트너스(Molecular Partners))이 있다.
항체 서열 및/또는 항원 결합 부위 이외에, 결합 구성원은 예를 들면, 펩티드 또는 폴리펩티드, 예컨대, 접혀진 도메인을 형성하거나 항원에 결합하는 능력 이외의 또 다른 기능적 특성을 분자에게 부여하는 다른 아미노산을 포함할 수 있다. 결합 구성원은 검출가능한 표지를 보유할 수 있거나, (예를 들면, 펩티드 결합 또는 링커를 통해) 독소 또는 표적화 모이어티 또는 효소에 접합될 수 있다. 예를 들면, 결합 구성원은 (예를 들면, 효소 도메인 내의) 촉매 부위뿐만 아니라 항원 결합 부위도 포함할 수 있고, 이때 항원 결합 부위는 항원에 결합하여 촉매 부위를 항원으로 표적화한다. 촉매 부위는 예를 들면, 절단으로 항원의 생물학적 기능을 억제할 수 있다.
언급된 바와 같이 CDR이 비-항체 스캐폴드에 의해 보유될 수 있지만, 본 발명의 CDR, 예를 들면, CDR3 또는 CDR 세트를 보유하기 위한 구조물은 일반적으로 CDR 또는 CDR 세트가 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 천연 생성 VH 및 VL 항체 가변 도메인의 CDR 또는 CDR 세트에 상응하는 위치에 위치하는 항체 중쇄 또는 경쇄 서열, 또는 이의 실질적인 부분일 것이다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는 문헌(Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services. 1987) 및 이의 개정판을 참고함으로써 결정될 수 있다. 다수의 학술적 및 상업적 온-라인 자원들이 이 데이터베이스를 조회하는 데 이용될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Martin, A.C.R. Accessing the Kabat Antibody Sequence Database by Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25 (1996), 130-133) 및 웹주소(http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html)에서 현재 이용가능한 관련된 온-라인 자원을 참조한다.
CDR 영역 또는 CDR은 문헌(Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington) 및 최신 개정판에 의해 정의된 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역을 표시하기 위한 것이다. 항체는 전형적으로 3개의 중쇄 CDR들 및 3개의 경쇄 CDR들을 함유한다. 용어 CDR 또는 CDR들은 항체에 의해 인식되는 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 친화성에 의한 결합을 책임지는 아미노산 잔기들의 대부분을 함유하는 이들 영역들 중 한 영역 또는 여러 영역들, 또는 심지어 이들 영역들 전부를 경우에 따라 표시하기 위해 본원에서 사용된다.
6개의 짧은 CDR 서열들 중에서 중쇄의 제3 CDR(HCDR3)은 보다 큰 크기 가변성(본질적으로 이것을 발생시키는 유전자의 배열 메커니즘으로 인한 보다 큰 다양성)을 갖는다. 상기 크기는 공지된 가장 긴 크기가 26일지라도 2개 아미노산만큼 짧을 수 있다. CDR 길이는 특정 기저 골격에 의해 수용될 수 있는 길이에 따라 달라질 수도 있다. 기능적으로, HCDR3은 항체의 특이성의 결정에 있어서 부분적으로 역할을 수행한다(Segal et al., PNAS, 71:4298-4302, 1974; Amit et al., Science, 233:747-753, 1986; Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987; Chothia et al., Nature, 342:877-883, 1989; Caton et al., J. Immunol., 144:1965-1968, 199; Sharon et al., PNAS, 87:4814-4817, 1990; Sharon et al., J. Immunol., 144:4863-4869, 1990; and Kabat et al., J. Immunol., 147:1709-1719, 1991).
항체 분자
이 용어는 천연적으로 생성된, 또는 부분적으로 또는 전체적으로 합성에 의해 생성된 면역글로불린을 의미한다. 상기 용어는 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질도 커버한다. 여기서, 본 발명이 천연 형태의 항체에 관한 것이 아니라는 점, 즉 항체들이 그들의 천연 환경에 존재하지 않지만 천연 공급원으로부터 정제에 의해 단리될 또는 수득될 수 있었거나, 유전적 재조합 또는 화학 합성에 의해 수득될 수 있었으므로 후술될 바와 같이 비-천연 아미노산을 함유할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, scFv, Fv, dAb 및 Fd와 같은 분자를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 하나 이상의 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 다양한 다른 항체 분자들(예를 들면, Fab2, Fab3, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 미니바디를 포함함)이 조작되어 있다. 항체 분자 및 이의 구축 및 사용 방법은 문헌(Holliger & Hudson, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136, 2005)에 기재되어 있다.
단일클론 항체 및 다른 항체를 수득할 수 있고, 표적 항원에 결합하는 다른 항체 또는 키메라 분자를 생성하기 위해 재조합 DNA 기술의 기법을 이용할 수 있다. 이러한 기법은 한 항체의 면역글로불린 가변 영역 또는 CDR을 코딩하는 DNA를 상이한 면역글로불린의 불변 영역, 또는 불변 영역 및 골격 영역으로 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 유럽 특허출원 제184187호, 영국 특허출원 제 2188638A호 또는 유럽 특허출원 제239400호, 및 다수의 후속 문헌을 참조한다. 항체를 생성하는 하이브리도마 또는 다른 세포를 유전적으로 돌연변이시킬 수 있거나 달리 변화시킬 수 있고, 이것은 생성된 항체의 결합 특이성을 변경시킬 수 있거나 변경시키지 않을 수 있다.
항체는 다수의 방식으로 변경될 수 있기 때문에, 용어 "항체 분자"는 요구된 특이성을 갖고/갖거나 항원에 결합하는 항체의 항원 결합 부위를 갖는 임의의 결합 구성원 또는 물질을 커버하는 것으로서 해석되어야 한다. 따라서, 이 용어는 천연적으로 생성된, 또는 전체적으로 또는 부분적으로 합성에 의해 생성된 항체 단편 및 유도체(항체의 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 포함함)를 커버한다. 따라서, (예를 들면, 또 다른 종으로부터 유래되었거나 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는) 또 다른 폴리펩티드에 융합된 항체의 항원 결합 부위 또는 균등물을 포함하는 키메라 분자가 포함된다. 키메라 항체의 클로닝 및 발현은 유럽 특허출원 제0120694호 및 제0125023호, 및 다수의 후속 문헌에 기재되어 있다.
항체 조작 분야에서 이용가능한 추가 기법은 인간 항체 및 인간화된 항체를 단리하는 것을 가능하게 하였다. 예를 들면, 문헌(Kontermann, R & Dubel, S, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; 2001, ISBN: 3540413545)에 기재된 바와 같이 인간 하이브리도마를 제조할 수 있다. 결합 구성원을 생성하는 또 다른 확립된 기법인 파지 디스플레이는 많은 공개문헌들, 예컨대, 상기 문헌(Kontermann & Dubel) 및 국제 특허출원 공보 제WO92/01047호(하기 더 논의됨), 및 미국 특허 제5969108호, 제5565332호, 제5733743호, 제5858657호, 제5871907호, 제5872215호, 제5885793호, 제5962255호, 제6140471호, 제6172197호, 제6225447호, 제6291650호, 제6492160호 및 제6521404호에 상세히 기재되어 있다.
마우스 면역 시스템의 다른 성분들을 온전한 상태로 남기면서 마우스 항체 유전자가 불활성화되어 있고 인간 항체 유전자로 기능적으로 교체되어 있는 형질전환 마우스가 인간 항체의 단리를 위해 사용될 수 있다(Mendez, M. et al. (1997) Nature Genet, 15(2): 146-156). 인간화된 항체는 당분야에서 공지된 기법, 예컨대, 국제 특허출원 공보 제WO91/09967호, 미국 특허 제5,585,089호, 유럽 특허 제592106호, 미국 특허 제565,332호 및 국제 특허출원 공보 제WO93/17105호에 개시된 기법을 이용함으로써 생성될 수 있다. 추가로, 국제 특허출원 공보 제WO2004/006955호에는 비-인간 항체의 가변 영역의 CDR 서열에 대한 정규 CDR 구조 유형을 인간 항체 서열, 예를 들면, 생식세포주 항체 유전자 절편의 라이브러리로부터의 상응하는 CDR에 대한 정규 CDR 구조 유형과 비교함으로써 인간 항체 유전자로부터 가변 영역 골격 서열을 선택하는 것에 기초한 항체의 인간화 방법이 기재되어 있다. 비-인간 CDR과 유사한 정규 CDR 구조 유형을 갖는 인간 항체 가변 영역은 인간 골격 서열의 선택에 사용되는 구성원 인간 항체 서열의 서브세트를 형성한다. 서브세트 구성원은 인간 CDR 서열과 비-인간 CDR 서열 사이의 아미노산 유사성에 의해 더 등급화될 수 있다. 국제 특허출원 공보 제WO2004/006955호의 방법에서, 선택된 서브세트 구성원 인간 골격을 사용하여 인간 CDR 서열을 비-인간 CDR 대응물로 기능적으로 교체하는 키메라 항체의 구축을 위한 골격 서열을 제공하도록 상위 등급 인간 서열을 선택하여, 비-인간 항체와 인간 항체 사이에 골격 서열을 비교할 필요 없이 높은 친화성 및 낮은 면역원성의 인간화된 항체를 제공한다. 상기 방법에 따라 제조된 키메라 항체도 개시되어 있다.
합성 항체 분자는 예를 들면, 문헌(Knappik et al. J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86) 또는 문헌(Krebs et al. Journal of Immunological Methods 254, 2001, 67-84)에 기재된 바와 같이 합성되고 적합한 발현 벡터 내에서 조립된 올리고뉴클레오타이드에 의해 생성된 유전자로부터의 발현에 의해 생성될 수 있다.
전체 항체의 단편이 결합 항원의 기능을 수행할 수 있다는 것이 밝혀져 있다. 결합 단편의 예는 (i) VL 도메인, VH 도메인, CL 도메인 및 CH1 도메인으로 구성된 Fab 단편; (ii) VH 도메인 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 도메인 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (iv) VH 도메인 또는 VL 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989); McCafferty et al. (1990) Nature, 348, 552-554; Holt et al. (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490); (v) 단리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) 단일 쇄 Fv 분자(scFv)(이때, VH 도메인과 VL 도메인은 이 2개의 도메인들이 연결되어 항원 결합 부위를 형성하게 하는 펩티드 링커에 의해 연결됨)(Bird et al., Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al., PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); (viii) 이중특이적 단일 쇄 Fv 이량체(국제 특허출원 제PCT/US92/09965호); 및 (ix) 유전자 융합에 의해 구축된 "디아바디", 다가 또는 다중특이적 단편(국제 특허출원 공보 제WO94/13804호; Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993)이다. Fv, scFv 또는 디아바디 분자는 VH 도메인과 VL 도메인을 연결하는 이황화 가교의 도입에 의해 안정화될 수 있다(Reiter, Y. et al., Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996). CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 미니바디도 제조될 수 있다(Hu, S. et al., Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996). 결합 단편의 다른 예는 중쇄 CH1 도메인의 카복실 말단에서의 소수의 잔기(항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함함)의 추가에 의해 Fab 단편과 상이한 Fab', 및 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 보유하는 Fab' 단편인 Fab'-SH이다.
문헌(Qui et al., Nat. Biotechnol. 25:921-929 2007)에는 골격 영역에 의해 연결된 2개의 CDR들만을 함유하는 항체 분자가 기재되어 있다. VH 또는 VL 도메인으로부터의 CDR3은 다른 도메인의 CDR1 또는 CDR2 루프에 연결되었다. 연결은 선택된 CDR1 또는 CDR2의 C 말단이 FR 영역을 통해 CDR3의 N 말단에 연결되는 것이었다. 상기 문헌의 저자들(Qui et al.)은 가장 적은 소수성 패치를 갖는 FR 영역을 선택하였다. 테스트된 항체에 대한 가장 우수한 조합은 VH FR2에 의해 VH CDR3에 연결된 VL CDR1(VHCDR1-VHFR2-VLCDR3)인 것으로 발견되었다. 약 3 kDa의 분자량에서 이 항체 분자들은 전체 면역글로불린(대략 150 kDa) 또는 scFv(대략 28 kDa)에 비해 개선된 조직 침투의 관점에서 장점을 제공한다.
본 발명의 항체 단편은 효소, 예를 들면, 펩신 또는 파파인에 의한 분해 및/또는 화학적 환원에 의한 이황화 가교의 절단과 같은 방법에 의해 본원에 나열된 항체들 중 임의의 항체로부터 출발하여 수득될 수 있다. 또 다른 방식에서, 본 발명에 포함된 항체 단편은 마찬가지로 당업자에게 잘 공지된 유전적 재조합 기법, 또는 예를 들면, 자동 펩티드 합성기, 예컨대, 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) 등의 회사에 의해 공급된 자동 펩티드 합성기에 의한 펩티드 합성, 또는 핵산 합성 및 발현에 의해 수득될 수 있다.
본 발명에 따른 기능성 항체 단편은 반감기가 화학적 변경, 특히 PEG화, 또는 리포좀 내로의 도입에 의해 증가되어 있는 임의의 기능성 단편을 포함한다.
dAb(도메인 항체)는 항체의 작은 단량체 항원 결합 단편, 즉 항체 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역이다. VH dAb는 낙타과 동물(예를 들면, 낙타, 라마)에 천연적으로 존재하고, 낙타과 동물을 표적 항원으로 면역화시키고 항원 특이적 B 세포를 단리하고 개별 B 세포로부터 dAb 유전자를 직접적으로 클로닝함으로써 생성될 수 있다. dAb는 세포 배양물에서도 생성될 수 있다. 그들의 작은 크기, 우수한 가용성 및 온도 안정성은 이들이 특히 생리학적으로 유용하고 선택 및 친화성 성숙에 적합하게 만든다. 낙타과 동물의 VH dAb는 "나노바디™"라는 명칭 하에 치료적 사용을 위해 개발되고 있다. 본 발명의 결합 구성원은 실질적으로 본원에 기재된 바와 같은 VH 또는 VL 도메인, 또는 실질적으로 본원에 기재된 바와 같은 CDR 세트를 포함하는 VH 또는 VL 도메인을 포함하는 dAb일 수 있다.
이중특이적 또는 이기능성 항체는 2개의 상이한 가변 영역들이 동일한 분자에서 조합되어 있는 제2세대 단일클론 항체를 형성한다(Holliger and Bohlen (1999) Cancer and Metastasis Rev. 18: 411-419). 그들의 용도는 새로운 이펙터 기능을 동원하거나 종양 세포의 표면 상의 여러 분자를 표적화하는 그들의 능력으로부터 진단 분야 및 치료 분야 둘 다에서 입증되었다. 이중특이적 항체가 사용되는 경우, 이들은 다양한 방식으로 제조될 수 있는(Holliger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechnol 4, 446-449. 1993), 예를 들면, 화학적으로 또는 하이브리드 하이브리도마로부터 제조될 수 있는 통상의 이중특이적 항체일 수 있거나, 상기 언급된 이중특이적 항체 단편들 중 임의의 이중특이적 항체 단편일 수 있다. 이들 항체들은 화학적 방법(Glennie M J et al., 1987 J. Immunol. 139, 2367-2375; Repp R. et al., 1995 J. Hemat. 377-382) 또는 체세포 방법(Staerz U. D. and Bevan M. J. 1986 PNAS 83; Suresh M. R. et al., 1986 Methods Enzymol. 121: 210-228)에 의해 수득될 수 있으나, 이종이량체화가 강제로 일어나게 하여 원하는 항체의 정제 과정을 용이하게 하는 유전공학 기법에 의해 주로 수득될 수 있다(Merchand et al., 1998 Nature Biotech. 16:677-681). 이중특이적 항체의 예로는 상이한 특이성을 갖는 2개의 항체들의 결합 도메인들이 사용될 수 있고 짧은 유연성 펩티드를 통해 직접적으로 연결될 수 있는 BiTE™ 기술의 이중특이적 항체가 있다. 이것은 2개의 항체들을 짧은 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 조합한다. 항-이디오타입 반응의 효과를 잠재적으로 감소시키도록 Fc 영역을 사용하지 않고 가변 도메인만을 사용하여 디아바디 및 scFv를 구축할 수 있다.
이중특이적 항체를 전체 IgG, 이중특이적 Fab'2, Fab'PEG, 디아바디 또는 이중특이적 scFv로서 구축할 수 있다. 또한, 당분야에서 공지된 관용적인 방법을 이용하여 2개의 이중특이적 항체들을 연결함으로써 4가 항체를 형성할 수 있다.
이중특이적 전체 항체와 대조될 때 이중특이적 디아바디도 이. 콜라이에서 용이하게 구축될 수 있고 발현될 수 있기 때문에 특히 유용할 수 있다. 파지 디스플레이(국제 특허출원 공보 제WO94/13804호)를 이용하여 라이브러리로부터 적절한 결합 특이성의 디아바디(및 많은 다른 폴리펩티드, 예컨대, 항체 단편)를 용이하게 선택할 수 있다. 디아바디의 한 아암이 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같이 아밀로이드 베타에 대해 유도된 특이성을 가지면서 일정하게 유지되어야 하는 경우, 다른 아암이 변경되어 있는 라이브러리가 제조될 수 있고 적절한 특이성의 항체가 선택될 수 있다. 이중특이적 전체 항체는 문헌(Ridgeway, J. B. B. et al., Protein Eng., 9, 616-621, 1996)에 기재된 대안적 조작 방법에 의해 제조될 수 있다.
항체를 수득하기 위해 다양한 방법들이 당분야에서 이용가능하다. 항체는 특히, 당업자에게 잘 공지된 표준 방법에 따라 수득될 수 있는 인간, 뮤린, 키메라 또는 인간화된 항체 유래의 단일클론 항체일 수 있다.
일반적으로, 특히 뮤린 유래의 단일클론 항체 또는 이의 기능성 단편의 제조에 대해서는 특히 매뉴얼 "항체"(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y., pp. 726, 1988)에 기재된 기법, 또는 문헌(Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497, 1975)에 기재된 하이브리도마로부터의 제조 기법을 참조할 수 있다.
단일클론 항체는 예를 들면, 인간 Aβ1-42, 또는 상기 단일클론 항체에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 그의 단편들 중 한 단편, 예를 들면, Aβ17-42로 면역화된 동물 세포로부터 수득될 수 있다. 적합한 단편, 및 이를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드가 본원에 기재되어 있고, Aβ1-42에 대한 항체를 생성하기 위해 동물을 면역화시키는 데 사용될 수 있다. 상기 항원 또는 이의 단편들 중 한 단편은 특히, 통상의 작업 방법, Aβ1-42 또는 이의 단편을 코딩하는 cDNA 서열 내에 함유된 핵산 서열로부터 출발하는 유전적 재조합, 또는 Aβ1-42 및/또는 이의 단편의 펩티드 서열 내에 포함된 아미노산 서열로부터 출발하는 펩티드 합성에 의해 생성될 수 있다.
단일클론 항체는 예를 들면, 인간 Aβ1-42, 또는 상기 단일클론 항체에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 이의 단편들 중 한 단편, 예를 들면, Aβ17-42가 이미 고정되어 있는 친화성 컬럼 상에서 정제될 수 있다. 보다 구체적으로, 단일클론 항체는 단백질 A 및/또는 G 상에서 크로마토그래피를 수행한 후, 잔류 단백질 오염물질뿐만 아니라 DNA 및 LPS도 그 자체로 제거하는 것을 목적으로 하는 이온 교환 크로마토그래피를 수행하거나 수행하지 않은 후, 이량체 또는 다른 다량체의 존재로 인한 잠재적인 응집체를 제거하기 위해 세파로스 겔 상에서 배제 크로마토그래피를 수행함으로써 정제될 수 있다. 한 실시양태에서, 이들 기법들 전체가 동시적으로 또는 연속적으로 이용될 수 있다.
항원 결합 부위
이 용어는 표적 항원의 전부 또는 일부에 결합하고 상보적인 분자의 일부를 의미한다. 항체 분자에서, 상기 용어는 항체의 항원 결합 부위로서 지칭되고, 표적 항원의 전부 또는 일부에 결합하고 상보적인 항체의 일부를 포함한다. 항원이 큰 경우, 항체는 에피토프로서 지칭되는, 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있다. 항체의 항원 결합 부위는 하나 이상의 항체 가변 도메인에 의해 제공될 수 있다. 항체의 항원 결합 부위는 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함할 수 있다.
국제 특허출원 공보 제WO2006/072620호에는 면역글로불린 도메인들의 베타 가닥들 사이에 확장되어 있는 구조적(비-CDR) 루프 내의 항원 결합 부위의 조작이 기재되어 있다. 항원 결합 부위는 CDR의 천연 위치와 분리되어 있는 항체 분자의 영역, 예를 들면, VH 또는 VL 도메인의 골격 영역, 또는 항체 불변 도메인, 예를 들면, CH1 및/또는 CH3에서 조작될 수 있다. 구조적 영역 내에서 조작된 항원 결합 부위는 VH 및 VL 도메인의 CDR 세트에 의해 형성된 항원 결합 부위 이외의 또는 대신의 항원 결합 부위일 수 있다. 다수의 항원 결합 부위들이 항체 분자에 존재하는 경우, 이들은 동일한 항원(표적 항원)에 결합하여 결합 구성원의 결합가를 증가시킬 수 있다. 대안적으로, 다수의 항원 결합 부위들은 상이한 항원들(표적 항원 및 하나 이상의 또 다른 항원)에 결합할 수 있고, 이것은 이펙터 기능을 추가하거나, 반감기를 연장시키거나, 항체 분자의 생체내 전달을 개선하는 데 사용될 수 있다.
단리된
이 용어는 본 발명의 결합 구성원 또는 이러한 결합 구성원을 코딩하는 핵산이 일반적으로 본 발명에 부합할 상태를 지칭한다. 따라서, 본 발명에 따른 결합 구성원, VH 및/또는 VL 도메인, 및 코딩 핵산 분자 및 벡터는 실질적으로 순수한 또는 균질한 형태로, 또는 핵산의 경우 요구된 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열 이외의 서열로부터 유래된 핵산 또는 유전자를 갖지 않거나 실질적으로 갖지 않는 형태로 예를 들면, 그들의 천연 환경으로부터 단리된 및/또는 정제된 상태로 제공될 수 있다. 단리된 구성원 및 단리된 핵산은 그들과 천연적으로 연결되어 있는 물질, 예컨대, 그들의 천연 환경 또는 그들이 제조되는 환경(예를 들면, 세포 배양물)(이러한 제조가 시험관내에서 또는 생체내에서 실시된 재조합 DNA 기술에 의한 제조인 경우)에서 그들과 함께 발견되는 다른 폴리펩티드 또는 핵산을 갖지 않을 것이거나 실질적으로 갖지 않을 것이다. 구성원 및 핵산은 희석제 또는 보조제로 제제화될 수 있고 여전히 실용적인 목적을 위해 단리될 수 있다(예를 들면, 구성원은 면역분석에서 사용되기 위해 마이크로타이터 플레이트를 코팅하는 데 사용되는 경우 통상적으로 젤라틴 또는 다른 담체와 혼합될 것이거나, 진단 또는 치료에 사용되는 경우 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희서제와 혼합될 것이다). 결합 구성원은 천연적으로 글리코실화될 수 있거나, 이종 진핵 세포(예를 들면, CHO 또는 NS0(ECACC 85110503) 세포)의 시스템에 의해 글리코실화될 수 있거나, (예를 들면, 원핵 세포에서의 발현에 의해 생성되는 경우) 글리코실화되지 않을 수 있다.
항체 분자를 포함하는 이종 제제도 본 발명의 일부를 형성한다. 예를 들면, 이러한 제제는 다양한 정도의 글리코실화 및/또는 유도체화된 아미노산, 예컨대, 피로글루탐산 잔기를 형성하기 위한 N 말단 글루탐산의 고리화와 함께 전체 길이 중쇄를 갖는 항체와 C 말단 라이신을 결여하는 중쇄를 갖는 항체의 혼합물일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "실질적으로 기재된 바와 같은"은 본원에 기재된 결합 구성원의 VH 또는 VL 도메인의 관련 CDR의 특성(들)이 본원에 기재된 서열을 갖는 특정 영역과 동일할 것이거나 매우 유사할 것임을 의미한다. 본원에 기재된 바와 같이, 하나 이상의 가변 도메인의 특정 영역(들)과 관련하여 어구 "매우 유사한"은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 아미노산 치환이 CDR 및/또는 VH 또는 VL 도메인에서 만들어질 수 있다는 것을 의미한다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 결합 구성원은 인간 Aβ1-42에 결합한다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 결합 구성원은 HTRF™ 경쟁 분석에서 친화성 및/또는 억제 효능에 대해 최적화될 수 있다. 일반적으로, 효능 최적화는 선택된 결합 구성원의 서열(통상적으로 항체의 가변 도메인 서열)을 돌연변이시켜 결합 구성원의 라이브러리를 생성한 후, 이 라이브러리를 효능에 대해 분석하고 보다 강력한 결합 구성원을 선택하는 단계를 포함한다. 따라서, 선택된 "효능-최적화된" 결합 구성원은 라이브러리의 생성에 사용된 결합 구성원보다 더 높은 효능을 갖는 경향을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 고효능 결합 구성원이 최적화 없이 수득될 수도 있다(예를 들면, 고효능 결합 구성원이 초기 스크린으로부터 직접적으로 수득될 수 있다). 분석 및 효능은 본원의 다른 부분에 보다 더 상세히 기재되어 있다. 따라서, 당업자는 고효능을 갖는 결합 구성원을 생성할 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 항원에 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 구성원을 수득하는 방법으로서, 본 발명에 따른 결합 구성원의 라이브러리를 상기 항원과 접촉시키는 단계, 및 상기 항원에 결합할 수 있는 상기 라이브러리의 하나 이상의 결합 구성원을 선택하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
라이브러리는 입자 또는 분자 복합체, 예를 들면, 복제가능한 유전적 팩키지, 예컨대, 효모, 세균 또는 박테리오파지(예를 들면, T7) 입자, 바이러스, 세포 또는 공유, 리보좀 또는 다른 시험관내 디스플레이 시스템 상에서 디스플레이될 수 있고, 이때 각각의 입자 또는 분자 복합체는 그 자신 상에서 디스플레이된 항체 VH 가변 도메인, 및 임의적으로 존재하는 경우 디스플레이된 VL 도메인을 코딩하는 핵산을 함유한다. 파지 디스플레이는 국제 특허출원 공보 제WO92/01047호, 및 예를 들면, 미국 특허 제5969108호, 제5565332호, 제5733743호, 제5858657호, 제5871907호, 제5872215호, 제5885793호, 제5962255호, 제6140471호, 제6172197호, 제6225447호, 제6291650호, 제6492160호 및 제6521404호(이들 각각은 전체적으로 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다. 리포좀 디스플레이는 문헌(Hanes J and Pluckthun A. (1997) Proc Natl Acad Sci USA. 1997 May 13;94(10):4937-42), 및 국제 특허출원 공보 제WO01/75097호 및 제WO2006/072773호(이들 각각은 전체적으로 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다.
항원에 결합할 수 있고 박테리오파지 또는 다른 라이브러리 입자 또는 분자 복합체 상에서 디스플레이된 결합 구성원의 선택 후, 상기 선택된 결합 구성원을 디스플레이하는 박테리오파지 또는 다른 입자 또는 분자 복합체로부터 핵산을 수득할 수 있다. 이러한 핵산은 상기 선택된 결합 구성원을 디스플레이하는 박테리오파지 또는 다른 입자 또는 분자 복합체로부터 수득된 핵산의 서열을 갖는 핵산으로부터의 발현에 의한 결합 구성원 또는 항체 VH 또는 VL 가변 도메인의 후속 생성에서 사용될 수 있다.
상기 선택된 결합 구성원의 항체 VH 가변 도메인의 아미노산 서열을 갖는 항체 VH 가변 도메인은 이러한 VH 도메인을 포함하는 결합 구성원과 마찬가지로 단리된 형태로 제공될 수 있다.
인간 Aβ1-42 및 Aβ1-40에 결합하는 능력뿐만 아니라, 인간 Aβ1-42에의 결합에 대해, 예를 들면, 본원에 나열된 항체들 중 임의의 항체(예를 들면, scFv 포맷 및/또는 IgG 포맷, 예를 들면, IgG2 또는 IgG1)와 경쟁하는 능력도 추가로 테스트될 수 있다. Aβ1-42를 중화시키는 능력은 본원의 다른 부분에서 더 논의되어 있는 바와 같이 테스트될 수 있다.
결합 구성원은 표 5 및 표 6에 나열된 항체들 중 임의의 항체, 예를 들면, scFv, IgG2, IgG1TM 또는 IgG1의 친화성, 또는 이보다 더 우수한 친화성으로 인간 Aβ1-42에 결합할 수 있다. 항체 결합 친화성은 표 7에 제시되어 있다. 상이한 결합 구성원의 결합 친화성 및 중화 효능은 적절한 조건 하에서 비교될 수 있다.
본원에 기재된 아미노산 서열을 갖는 변이체를 포함하고 Aβ1-42에 대한 결합 구성원에서 사용될 수 있는, 본원에 기재된 VH 및 VL 도메인 및 CDR의 변이체는 서열을 변경시키거나 돌연변이시키고 및 원하는 특성을 갖는 항원 결합 구성원을 스크리닝하는 방법에 의해 수득될 수 있다. 원하는 특성의 예로는 항원에 대한 특이성을 갖는 공지된 항체에 비해 상대적으로 증가된 항원에 대한 결합 친화성; 활성이 특정 몰비에서 항원에 대한 공지된 항체 또는 리간드와 경쟁하는 공지된 특정 경쟁 능력인 경우 상기 항원에 대한 특이성을 갖는 공지된 항체에 비해 상대적으로 증가된 항원 활성 중화; 복합체를 면역침전시키는 능력; 특정 에피토프, 즉 선형 에피토프, 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같이 펩티드 결합 스캔을 이용함으로써, 예를 들면, 선형 및/또는 구속된 입체구조에서 스크리닝된 펩티드를 사용함으로써 확인된 펩티드 서열, 또는 비-연속 잔기들에 의해 형성된 입체구조형 에피토프에 결합하는 능력; 및 인간 Aβ1-42의 새로운 생물학적 활성을 조절하는 능력이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 이러한 방법도 본원에서 제공된다.
본원에 개시된 항체 분자의 변이체는 본 발명에서 생성될 수 있고 사용될 수 있다. 다변량 데이터 분석 기법을 구조/성질-활성 관계에 적용하는 데 있어서 컴퓨터 화학의 리드를 따라(예를 들면, 문헌(Wold, et al. Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics-Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed.: B. Kowalski)); 문헌(D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holland, 1984 (ISBN 90-277-1846-6)) 참조), 잘 공지된 수학적 기법, 예컨대, 통계 회귀, 패턴 인식 및 분류를 이용하여 항체의 정량 활성-성질 관계를 유도할 수 있다(예를 들면, 문헌(Norman et al. Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience; 3rd edition (April 1998) ISBN: 0471170828); 문헌(Kandel, Abraham et al. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (May 11, 1995), ISBN: 0133418847); 문헌(Krzanowski, Wojtek. Principles of Multivariate Analysis: A User's Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22 (Paper)). Oxford University Press; (December 2000), ISBN: 0198507089); 문헌(Witten, Ian H. et al Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann; (October 11, 1999), ISBN: 1558605525); 문헌(Denison David G. T. (Editor) et al Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons; (July 2002), ISBN: 0471490369); 및 문헌(Ghose, Arup K. et al. Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery. ISBN: 0-8247-0487-8) 참조). 항체의 성질은 항체 서열, 기능적 구조 및 3차원적 구조의 실험적 및 이론적 모델(예를 들면, 가능한 접촉 잔기 또는 계산된 물리화학적 성질의 분석)로부터 유도될 수 있고, 이들 성질은 개별적으로 또는 조합으로 고려될 수 있다.
VH 도메인 및 VL 도메인으로 구성된 항체의 항원 결합 부위는 전형적으로 폴리펩티드의 6개 루프들, 즉 경쇄 가변 도메인(VL)으로부터의 3개 루프 및 중쇄 가변 도메인(VH)으로부터의 3개 루프에 의해 형성된다. 공지된 원자 구조의 항체의 분석은 항체 조합 부위의 서열과 3차원적 구조 사이의 관계를 밝혔다(Chothia C. et al. Journal Molecular Biology (1992) 227, 799-817; Al-Lazikani, et al. Journal Molecular Biology (1997) 273(4), 927-948). 이들 관계는 VH 도메인 내의 제3 영역(루프)을 제외한 결합 부위 루프가 작은 수의 주쇄 입체구조들, 즉 정규 구조들 중 하나를 갖는다는 것을 암시한다. 특정 루프에서 형성된 정규 구조는 루프 및 골격 영역 둘 다에서 그의 크기 및 핵심 부위에서의 일부 잔기의 존재에 의해 결정되는 것으로 밝혀졌다.
서열-구조 관계의 이 연구는 그의 CDR 루프의 3차원적 구조를 유지하여 결합 특이성을 유지하는 데 중요한 잔기를, 공지된 서열을 갖되 비공지된 3차원적 구조를 갖는 항체에서 예측하는 데 이용될 수 있다. 이 예측은 예측을 리드 최적화 실험으로부터의 결과물과 비교함으로써 백업될 수 있다. 구조적 방법에서, 임의의 자유롭게 입수가능한 또는 상업적인 팩키지, 예컨대, WAM(Whitelegg, N.R.u. and Rees, A.R (2000). Prot. Eng., 12, 815-824)을 사용하여 항체 분자(Chothia, et al. Science, 223,755-758 (1986))의 모델을 생성할 수 있다. 그 다음, 단백질 가시화 및 분석 소프트웨어 팩키지, 예컨대, 인사이트(Insight) II(악셀라이스 인코포레이티드(Accelrys)) 또는 딥 뷰(Deep View)(Guex, N. and Peitsch, M.C. Electrophoresis (1997) 18, 2714-2723)를 사용하여 CDR 내의 각각의 위치에서 가능한 치환을 평가할 수 있다. 그 다음, 이 정보를 이용하여 활성에 최소 또는 유리한 영향을 미칠 가능성이 있는 치환을 만들 수 있다.
CDR, 항체 VH 또는 VL 도메인 및 결합 구성원의 아미노산 서열 내에서 치환을 만드는 데 요구되는 기법은 일반적으로 당분야에서 이용가능하다. 활성에 최소 또는 유리한 영향을 미칠 것으로 예측될 수 있거나 예측될 수 없는 치환을 갖는 변이체 서열이 만들어질 수 있고 Aβ1-42에 결합하는 능력 및/또는 임의의 다른 원하는 성질에 대해 테스트될 수 있다.
본원에 구체적으로 개시된 서열을 갖는 VH 및 VL 도메인들 중 임의의 도메인의 가변 도메인 아미노산 서열 변이체가 논의된 바와 같이 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
전술된 바와 같이, 본 발명의 양태는 본원에 나열된 항체들 중 임의의 항체의 VH 도메인(이 VH 도메인의 서열은 하기 첨부된 서열목록에 제시되어 있음)에 대한 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 VH 도메인을 포함하고/하거나; 표 11에 나열된 항체들 중 임의의 항체의 VL 도메인(이 VL 도메인의 서열은 첨부된 서열목록에 제시되어 있음)에 대한 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함하는 결합 구성원, 예컨대, 항체 분자를 제공한다.
본 발명의 양태는 본원에 나열된 항체들 중 임의의 항체의 VH CDR 세트(이 VH CDR의 서열은 본원에 제시되어 있음)에 대한 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 VH CDR 세트를 갖는 VH 도메인을 포함하고/하거나; 본원에 나열된 항체들 중 임의의 항체의 VL CDR 세트(이 VL CDR의 서열은 본원에 제시되어 있음)에 대한 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 VL CDR 세트를 갖는 VL 도메인을 포함하는 결합 구성원, 예컨대, 항체 분자를 제공한다.
2개의 아미노산 서열들의 % 동일성을 계산하는 데 이용될 수 있는 알고리즘은 예를 들면, 디폴트 파라미터를 사용하는 BLAST(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410), FASTA(Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448), 또는 스미쓰-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘(Smith and Waterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197)을 포함한다.
특정 가변 도메인은 하나 이상 내지 약 15개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개 또는 2개 미만의 아미노산 서열 돌연변이(아미노산 잔기의 치환, 결실 및/또는 삽입)를 포함할 수 있다.
돌연변이는 하나 이상의 골격 영역 및/또는 하나 이상의 CDR에서 만들어질 수 있다. 돌연변이는 통상적으로 기능 상실을 초래하지 않으므로, 이로써 변경된 아미노산 서열을 포함하는 결합 구성원은 인간 Aβ1-42에 결합하는 능력을 보유할 수 있다. 상기 결합 구성원은 예를 들면, 본원에 기재된 분석에서 측정될 때 변경되지 않은 결합 구성원과 동일한 정량적 결합 및/또는 중화 능력을 보유할 수 있다. 이로써 변경된 아미노산 서열을 포함하는 결합 구성원은 인간 Aβ1-42에 결합하는 개선된 능력을 가질 수 있다.
돌연변이는 하나 이상의 아미노산 잔기를 비-천연 생성 또는 비-표준 아미노산으로 교체하는 것, 하나 이상의 아미노산 잔기를 비-천연 생성 또는 비-표준 형태로 변경시키는 것, 또는 하나 이상의 비-천연 생성 또는 비-표준 아미노산을 서열 내로 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 서열에서 변경의 수 및 위치의 예는 본원의 다른 부분에 기재되어 있다. 천연 생성 아미노산은 그들의 표준 단일 문자 코드에 의해 G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D 및 E로서 확인된 20개의 "표준" L-아미노산을 포함한다. 비-표준 아미노산은 폴리펩티드 골격 내로 도입될 수 있거나 기존 아미노산 잔기의 변경으로부터 생성될 수 있는 임의의 다른 잔기를 포함한다. 비-표준 아미노산은 천연 생성 또는 비-천연 생성 아미노산일 수 있다. 여러 천연 생성 비-표준 아미노산들, 예컨대, 4-하이드록시프롤린, 5-하이드록시라이신, 3-메틸히스티딘, N-아세틸세린 등이 당분야에서 공지되어 있다(Voet & Voet, Biochemistry, 2nd Edition, (Wiley) 1995). 그의 N-알파 위치에서 유도체화되는 아미노산 잔기는 아미노산 서열의 N 말단에만 위치할 것이다. 통상적으로 본 발명에서 아미노산은 L-아미노산이지만, D-아미노산일 수 있다. 따라서, 변경은 L-아미노산을 D-아미노산으로 변경시키거나 교체하는 것을 포함할 수 있다. 메틸화된, 아세틸화된 및/또는 인산화된 형태의 아미노산도 공지되어 있고, 본 발명에서 아미노산은 이처럼 변경될 수 있다.
본 발명의 항체 도메인 및 결합 구성원에서 아미노산 서열은 전술된 비-천연 또는 비-표준 아미노산을 포함할 수 있다. 비-표준 아미노산(예를 들면, D-아미노산)은 합성 동안에 아미노산 서열 내로 도입될 수 있거나, 아미노산 서열의 합성 후 "원래의" 표준 아미노산의 변경 또는 교체에 의해 아미노산 서열 내로 도입될 수 있다.
비-표준 및/또는 비-천연 생성 아미노산의 사용은 구조적 및 기능적 다양성을 증가시키므로, 본 발명의 결합 구성원에서 원하는 결합 및 중화 성질을 달성할 잠재력을 증가시킬 수 있다. 추가로, D-아미노산 및 유사체는 동물, 예를 들면, 인간에게 투여된 후 L-아미노산을 갖는 폴리펩티드의 생체내 분해로 인해 표준 L-아미노산에 비해 상이한 약동학적 프로파일을 갖는 것으로 밝혀졌고, 이 사실은 D-아미노산이 일부 생체내 적용에 유리하다는 것을 의미한다.
하나 이상의 선택된 VH 및/또는 VL 유전자의 무작위적 돌연변이유발을 이용하여 전체 가변 도메인 내에서 돌연변이를 발생시킴으로써 본 발명의 CDR-유도된 서열을 보유하는 신규 VH 또는 VL 영역을 생성할 수 있다. 이러한 기법은 오류-유발 PCR을 이용한 문헌(Gram et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580)의 저자에 의해 기재되었다. 일부 실시양태에서, 1개 또는 2개의 아미노산 치환이 전체 가변 도메인 또는 CDR 세트 내에서 만들어진다.
이용될 수 있는 또 다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR 영역에 대한 돌연변이유발을 유도하는 것이다. 이러한 기법은 문헌(Barbas et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813) 및 문헌(Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263:551-567)에 개시되어 있다.
모든 전술된 기법들은 당분야에서 그 자체로서 공지되어 있고, 당업자는 당분야의 관용적인 방법을 이용하여 본 발명의 결합 구성원을 제공하기 위해 이러한 기법을 이용할 수 있을 것이다.
본 발명의 추가 양태는 인간 Aβ1-42에 대한 항체의 항원 결합 부위를 수득하는 방법으로서, 본원에 기재된 VH 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산을 치환시키거나, 결실시키거나, 삽입함으로써, 상기 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VH 도메인을 제공하는 단계, 임의적으로, 이렇게 제공된 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하는 단계, 및 VH 도메인 또는 VH/VL 조합물 또는 조합물들을 테스트함으로써 임의적으로 하나 이상의 원하는 성질을 갖는, Aβ1-42에 대한 결합 구성원 또는 항체의 항원 결합 부위를 확인하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 VL 도메인은 실질적으로 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본원에 개시된 VL 도메인의 하나 이상의 서열 변이체가 하나 이상의 VH 도메인과 조합되는 유사한 방법이 이용될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 실질적으로 본원에 기재된 바와 같은 CDR 아미노산 서열은 인간 항체 가변 도메인 또는 이의 실질적인 부분 내에 CDR로서 도입될 수 있다. 실질적으로 본원에 기재된 바와 같은 HCDR3 서열들은 본 발명의 실시양태를 대표하고, 이들 각각은 인간 중쇄 가변 도메인 또는 이의 실질적인 부분 내에 HCDR3으로서 도입될 수 있다.
본 발명에서 사용된 가변 도메인은 임의의 생식세포주 또는 재배열된 인간 가변 도메인으로부터 수득될 수 있거나 유도될 수 있거나, 공지된 인간 가변 도메인의 컨센서스 또는 실제 서열에 기초한 합성 가변 도메인일 수 있다. 가변 도메인은 비-인간 항체로부터 유도될 수 있다. 재조합 DNA 기술을 이용하여 본 발명의 CDR 서열(예를 들면, CDR3)을, CDR(예를 들면, CDR3)을 결여하는 가변 도메인의 레퍼토리(repertoire) 내로 도입할 수 있다. 예를 들면, 문헌(Marks et al Bio/Technology, 1992, 10:779-783)에는 항체 가변 도메인의 레퍼토리를 제조하는 방법이 기재되어 있고, 이때 가변 도메인의 5' 말단에서 또는 5' 말단에 인접한 위치에서 유도된 컨센서스 프라이머가 인간 VH 유전자의 제3 골격 영역에 대한 컨센서스 프라이머와 함께 사용되어 CDR3을 결여하는 VH 가변 도메인의 레퍼토리를 제공한다. 상기 문헌(Marks et al.)에는 이 레퍼토리가 특정 항체의 CDR3과 어떻게 조합될 수 있는지도 기재되어 있다. 유사한 기법을 이용하여 본 발명의 CDR3-유도된 서열을, CDR3을 결여하는 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리와 셔플링시킬 수 있고, 셔플링된 완전한 VH 또는 VL 도메인을 동족 VL 또는 VH 도메인과 조합하여 본 발명의 결합 구성원을 제공할 수 있다. 그 다음, 상기 레퍼토리는 적합한 결합 구성원이 선택될 수 있도록 적합한 숙주 시스템, 예컨대, 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 국제 특허출원 공보 제WO92/01047호, 또는 문헌(Kay, B.K., Winter, J., and McCafferty, J. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, San Diego: Academic Press)을 포함하는 다수의 후속 문헌들 중 임의의 문헌의 파지 디스플레이 시스템에서 디스플레이될 수 있다. 레퍼토리는 104개 이상의 개별 구성원, 예를 들면, 105개 이상, 106개 이상, 107개 이상, 108개 이상, 109개 이상 또는 1010개 이상의 구성원으로 구성될 수 있다. 다른 적합한 숙주 시스템은 효모 디스플레이, 세균 디스플레이, T7 디스플레이, 바이러스 디스플레이, 세포 디스플레이, 리보좀 디스플레이 및 공유 디스플레이를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
인간 Aβ1-42에 대한 결합 구성원을 제조하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법이 제공된다:
(a) 교체될 CDR3을 포함하거나 CDR3 코딩 영역을 결여하는 VH 도메인을 코딩하는 핵산의 출발 레퍼토리를 제공하는 단계;
(b) 상기 레퍼토리를 VH CDR3, 예를 들면, 표 11에 제시된 VH CDR3에 대해 실질적으로 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 코딩하는 공여자 핵산과 조합하여, 상기 공여자 핵산이 레퍼토리 내의 CDR3 영역 내로 삽입되게 함으로써 VH 도메인을 코딩하는 핵산의 생성물 레퍼토리를 제공하는 단계;
(c) 상기 생성물 레퍼토리의 핵산을 발현시키는 단계;
(d) 인간 Aβ1-42에 대한 결합 구성원을 선택하는 단계; 및
(e) 상기 결합 구성원 또는 이를 코딩하는 핵산을 회수하는 단계.
또한, 본 발명의 VL CDR3이 교체될 CDR3을 포함하거나 CDR3 코딩 영역을 결여하는 VL 도메인을 코딩하는 핵산의 레퍼토리와 조합되는 유사한 방법이 이용될 수 있다.
유사하게, 하나 이상 또는 모든 3개의 CDR들이 추후에 인간 Aβ1-42에 대한 결합 구성원 또는 결합 구성원들에 대해 스크리닝되는 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리 내로 이식될 수 있다.
예를 들면, 표 5 또는 표 6에 나열된 항체들 중 하나 이상의 항체로부터의 HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3, 예를 들면, HCDR 세트가 사용될 수 있고/있거나, 본원에 나열된 항체들 중 하나 이상의 항체로부터의 LCDR1, LCDR2 및/또는 LCDR3, 예를 들면, LCDR 세트가 사용될 수 있다.
유사하게, 본원에 개시된 다른 VH 및 VL 도메인, CDR 세트 및 HCDR 세트 및/또는 LCDR 세트가 사용될 수 있다.
면역글로불린 가변 도메인의 실질적인 부분은 그들의 개재 골격 영역과 함께 3개 이상의 CDR 영역들을 포함할 수 있다. 상기 부분은 제1 골격 영역 및 제4 골격 영역 중 하나 또는 둘 다를 약 50% 이상 포함할 수도 있고, 이때 상기 50%는 제1 골격 영역의 C 말단 50% 및 제4 골격 영역의 N 말단 50%이다. 가변 도메인의 실질적인 부분의 N 말단 또는 C 말단에 위치하는 추가 잔기는 천연 생성 가변 도메인 영역과 통상적으로 관련되어 있지 않은 잔기일 수 있다. 예를 들면, 재조합 DNA 기법에 의해 수행된 본 발명의 결합 구성원의 구축은 클로닝 또는 다른 조작 단계를 용이하게 하기 위해 도입된 링커에 의해 코딩된 N 말단 또는 C 말단 잔기의 도입을 초래할 수 있다. 다른 조작 단계는 본 발명의 가변 도메인을, 항체 불변 영역, 다른 가변 도메인(예를 들면, 디아바디의 생성에서) 또는 본원의 다른 부분에서 보다 더 상세히 논의된 검출가능한/기능성 표지를 포함하는 추가 단백질 서열에 연결하기 위한 링커의 도입을 포함한다.
본 발명의 일부 양태에서 결합 구성원이 한 쌍의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함한다 하더라도, VH 또는 VL 도메인 서열에 기초한 단일 결합 도메인은 본 발명의 추가 양태를 형성한다. 단일 면역글로불린 도메인, 특히 VH 도메인이 특이적 방식으로 표적 항원에 결합할 수 있다는 것이 공지되어 있다. 예를 들면, 상기 dAb의 논의를 참조한다.
단일 결합 도메인들 중 어느 한쪽의 경우, 이들 도메인들은 Aβ1-42에 결합할 수 있는 2-도메인 결합 구성원을 형성할 수 있는 상보적 도메인을 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 이것은 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 국제 특허출원 공보 제WO92/01047호에 개시된 소위 계층적 이중 조합 방법을 이용하는 파지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 달성될 수 있고, 이때 H 또는 L 쇄 클론을 함유하는 개별 콜로니를 사용하여 다른 쇄(L 또는 H)를 코딩하는 클론의 완전한 라이브러리를 감염시키고, 생성된 2-쇄 결합 구성원을 파지 디스플레이 기법, 예컨대, 상기 참조문헌에 기재된 기법에 따라 선택한다. 이 기법은 문헌(Marks et al., Bio/Technology, 1992, 10:779-783)에도 개시되어 있다.
본 발명의 결합 구성원은 항체 불변 영역 또는 이의 부분, 예를 들면, 인간 항체 불변 영역 또는 이의 부분을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, VL 도메인은 그의 C 말단에서 인간 Cκ 또는 Cλ 쇄를 포함하는 항체 경쇄 불변 도메인에 부착될 수 있다. 유사하게, VH 도메인에 기초한 결합 구성원은 그의 C 말단에서 임의의 항체 동종형, 예를 들면, IgG, IgA, IgE 및 IgM, 및 임의의 동종형 서브클래스, 특히 IgG2, IgG1 및 IgG4로부터 유래된 면역글로불린 중쇄의 전부 또는 일부(예를 들면, CH1 도메인)에 부착될 수 있다. IgG2는 그의 이펙터 기능의 결여 때문에 일부 실시양태에서 유리할 수 있다. 다른 실시양태에서, IgG1은 그의 이펙터 기능 및 제조 용이성 때문에 유리할 수 있다. 이들 성질을 갖고 가변 영역을 안정화시키는 임의의 합성 또는 다른 불변 영역 변이체도 본 발명에서 유용할 수 있다.
결합 구성원은 검출가능한 또는 기능성 표지로 표지될 수 있다. 따라서, 결합 구성원 또는 항체 분자는 검출가능한 및/또는 정량가능한 신호를 수득하도록 면역접합체의 형태로 존재할 수 있다. 면역접합체는 검출가능한 또는 기능성 표지와 접합된 본 발명의 항체 분자를 포함할 수 있다. 본원에서 지칭된 검출가능한 표지는 형광물질, 화학발광물질(예를 들면, 호스라디쉬 퍼록시다제), 착색된 표지(예를 들면, 라텍스[청색] 또는 콜로이드성 금[적색]), 방사성 표지, 효소, 감광제 및 자기 표지를 포함하나 이들로 한정되지 않는, 신호를 생성하거나 신호를 생성하도록 유도될 수 있는 임의의 표지일 수 있다. 따라서, 형광 또는 발광, 색채, 방사성, 효소 활성, 광 흡수 또는 자기장의 변화를 검출함으로써 표면, 예를 들면, 모세관 구멍의 표면에 결합된 표지의 양을 검출할 수 있고/있거나 측정할 수 있다. 통상의 화학반응을 이용하여 검출가능한 표지를 결합 구성원에 부착시킬 수 있다. 바람직하게는, 검출가능한 표지는 예를 들면, 디지털 카메라 또는 평판 스캐너를 이용한 광학 검출에 의해 검출될 수 있는 표지이다. 광학 검출에 의해 검출될 수 있는 표지는 형광물질, 화학발광물질 및 착색된 표지를 포함한다. 광학 검출을 위해 신호를 생성할 수 있는 메커니즘은 광 흡수, 광 산란, 광 회절, 광 반사, 형광 또는 발광을 포함한다(그러나, 반드시 이들로 한정되지는 않는다).
적합한 표지는 예를 들면, 하기 표지들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다:
- 효소, 예컨대, 알칼리성 포스파타제(phosphatase), 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제(dehydrogenase)("G6PDH"), 알파-D-갈락토시다제(galactosidase), 글루코스 옥시다제(oxydase), 글루코스 아밀라제(amylase), 탄산 안하이드라제(anhydrase), 아세틸콜린에스터라제(acetylcholinesterase), 라이소자임, 말레이트 데하이드로게나제 및 퍼록시다제(peroxidase), 예를 들면, 호스라디쉬 퍼록시다제;
- 염료;
- 형광 표지 또는 형광물질, 예컨대, 플루오레세인 및 이의 유도체, 플루오로크롬(fluorochrome), 로다민(rhodamine) 화합물 및 유도체, GFP("녹색 형광 단백질"에 대한 약어 GFP), 댄실(dansyl), 움벨리페론(umbelliferone), 파이코에리쓰린(phycoerythrin), 파이코시아닌(phycocyanin), 알로파이코시아닌(allophycocyanin), o-프트알데하이드(o-phthaldehyde) 및 플루오레스카민(fluorescamine); 형광단, 예컨대, 란타나이드 크립테이트 및 킬레이트, 예를 들면, 유로퓸 등(퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 및 시스 바이오인터네이셔날(Cis Biointernational));
- 화학발광 표지 또는 화학발광물질, 예컨대, 이소루미놀, 루미놀 및 디옥세탄;
- 생체발광 표지, 예컨대, 루시퍼라제(luciferase) 및 루시페린(luciferin);
- 증감제;
- 보조효소;
- 효소 기질;
- 브롬77, 탄소14, 코발트57, 불소8, 갈륨67, 갈륨68, 수소3(삼중수소), 인듐111, 인듐113m, 요오드123m, 요오드125, 요오드126, 요오드131, 요오드133, 수은107, 수은203, 인32, 레늄99m, 레늄101, 레늄105, 루테늄95, 루테늄97, 루테늄103, 루테늄105, 스칸듐47, 셀레늄75, 황35, 테크네튬99, 테크네튬99m, 텔루륨121m, 텔루륨122m, 텔루륨125m, 툴륨165, 툴륨167, 툴륨168, 이트륨199 및 본원에서 언급된 다른 방사성 표지를 포함하나 이들로 한정되지 않는 방사성 표지;
- 염료, 촉매 또는 다른 검출가능한 기로 더 표지될 수 있는 입자, 예컨대, 라텍스 또는 탄소 입자, 금속 졸, 미결정, 리포좀, 세포 등;
- 분자, 예컨대, 바이오틴, 디곡시제닌 또는 5-브로모데옥시우리딘;
- 독소 모이어티, 예를 들면, 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소(PE, 또는 이의 세포독성 단편 또는 돌연변이체), 디프테리아(Diptheria) 독소, 또는 이의 세포독성 단편 또는 돌연변이체, 보툴리늄 독소 A, B, C, D, E 또는 F, 리신(ricin) 또는 이의 세포독성 단편, 예를 들면, 리신 A, 아브린(abrin) 또는 이의 세포독성 단편, 사포린 또는 이의 세포독성 단편, 미국자리공 항바이러스 독소 또는 이의 세포독성 단편 및 브리오딘(bryodin) 1 또는 이의 세포독성 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 독소 모이어티.
적합한 효소 및 보조효소의 예는 미국 특허 제4275149호 및 제4318980호에 개시되어 있다. 적합한 형광물질 및 화학발광물질도 미국 특허 제4275149호에 개시되어 있다. 표지는 특이적 동족 검출가능한 모이어티, 예를 들면, 표지된 아비딘 또는 스트렙타비딘에의 결합을 통해 검출될 수 있는 화학 모이어티, 예컨대, 바이오틴을 추가로 포함한다. 당분야에서 공지된 통상의 화학반응을 이용하여 검출가능한 표지를 본 발명의 항체에 부착시킬 수 있다.
면역접합체 또는 이의 기능성 단편은 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들은 직접적으로 효소 또는 형광 표지에 커플링될 수 있거나, 스페이서 기 또는 연결 기, 예컨대, 폴리알데하이드, 예컨대, 글루타르알데하이드, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌-트리아민펜타아세트산(DPTA)을 통해, 또는 커플링제, 예컨대, 치료 접합체에 대해 상기 언급된 커플링제의 존재 하에서 효소 또는 형광 표지에 커플링될 수 있다. 플루오레세인 유형의 표지를 함유하는 접합체는 이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조될 수 있다.
직접적으로 또는 상기 언급된 킬레이팅제, 예컨대, EDTA 또는 DTPA를 통해 치료 방사성 동위원소를 항체에 커플링시키는, 당분야에서 공지된 방법은 진단에서 사용될 수 있는 방사성 원소에 대해서도 이용될 수 있다. 마찬가지로 클로라민 T 방법(Hunter W. M. and Greenwood F. C. (1962) Nature 194:495)으로 나트륨125을 사용하거나, 미국 특허 제4424200호의 기법으로 테크네튬99m을 사용하거나, 미국 특허 제4479930호에 기재된 바와 같이 DTPA를 통해 부착된 테크네튬99m을 사용하여 표지부착을 수행할 수 있다.
표지가 외부 수단, 예를 들면, 시각적 검사, 전자기 방사선, 열 및 화학 시약에 의해 검출될 수 있는 신호를 생성할 수 있는 다수의 방법들이 존재한다. 표지는 본 발명의 항체에 결합하는 또 다른 결합 구성원, 또는 지지체에 결합될 수도 있다.
표지는 신호를 직접적으로 생성할 수 있으므로, 신호를 생성하는 데 추가 성분이 요구되지 않는다. 다수의 유기 분자들, 예를 들면, 형광물질들이 자외선 및 가시광선을 흡수할 수 있고, 이때 광 흡수는 에너지를 이들 분자들에게 전달하고 이들을 여기된 에너지 상태로 상승시킨다. 그 다음, 이 흡수된 에너지는 제2 파장에서의 광의 방사에 의해 소멸된다. 이 제2 파장 방사도 에너지를 표지된 수용자 분자에 전달할 수 있고, 생성된 에너지는 예를 들면, 형광 공명 에너지 전달(FRET)에 의한 광의 방사에 의해 수용자 분자로부터 소멸될 수 있다. 신호를 직접적으로 생성하는 다른 표지는 방사성 동위원소 및 염료를 포함한다.
대안적으로, 표지는 신호를 생성하기 위해 다른 성분을 필요로 할 수 있고, 신호 생성 시스템은 기질, 보조효소, 증강제, 추가 효소, 효소 생성물과 반응하는 물질, 촉매, 활성화제, 보조인자, 억제제, 스카벤저(scavenger), 금속 이온, 및 신호 생성 물질의 결합을 위해 요구된 특이적 결합 물질을 포함할 수 있는, 측정가능한 신호를 생성하는 데 요구된 모든 성분들을 포함할 것이다. 적합한 신호 생성 시스템의 상세한 논의는 미국 특허 제5185243호에서 발견될 수 있다.
본 발명의 양태는 본원에서 제공된 결합 구성원과 인간 Aβ1-42의 결합을 야기하거나 허용하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 언급된 바와 같이, 이러한 결합은 예를 들면, 결합 구성원 또는 결합 구성원을 코딩하는 핵산의 투여 후 생체내에서 일어날 수 있거나, 시험관내에서, 예를 들면, ELISA, 웨스턴 블롯팅, 면역세포화학, 면역침전, 친화성 크로마토그래피 및 생화학적 또는 세포에 기초한 분석에서 일어날 수 있다.
본 발명은 예를 들면, 바이오센서 시스템에서 본 발명에 따른 결합 구성원을 사용함으로써 예를 들면, 혈장 또는 CSF에서 직접적으로 항원의 수준을 측정하는 방법도 제공한다. 예를 들면, 인간 Aβ1-42에의 결합을 검출하고/하거나 측정하는 방법은 (i) 상기 결합 구성원을 Aβ1-42에 노출하는 단계 및 (ii) 상기 결합 구성원과 Aβ1-42의 결합을 검출하는 단계를 포함할 수 있고, 이때 결합은 본원에 기재된 임의의 방법 또는 검출가능한 표지를 사용함으로써 검출된다. Aβ1-42는 단량체 또는 올리고머 Aβ1-42, 바람직하게는 단량체 Aβ1-42일 수 있다. 이것, 및 본원에 기재된 임의의 다른 결합 검출 방법은 예를 들면, 검출가능한 표지를 시각적으로 관찰함으로써 상기 방법을 수행하는 사람에 의해 직접적으로 해석될 수 있다. 대안적으로, 이 방법, 또는 본원에 기재된 임의의 다른 결합 검출 방법은 방사선사진, 사진, 컴퓨터 인쇄물, 유동 세포측정 보고서, 그래프, 차트, 결과를 함유하는 시험관, 용기 또는 벽, 또는 방법의 결과의 임의의 다른 시각적 또는 물리적 표시의 형태로 보고서를 생성할 수 있다.
결합 구성원과 Aβ1-42의 결합의 양을 측정할 수 있다. 정량은 진단적으로 관심을 끌 수 있는 테스트 샘플 중의 항원의 양과 관련될 수 있다. Aβ1-42 결합에 대한 스크리닝 및/또는 이의 정량은 예를 들면, 본원에서 언급된 질환 또는 장애, 및/또는 비정상적인 Aβ1-42 수준 및/또는 활성을 수반하는 임의의 다른 질환 또는 장애에 대해 환자를 스크리닝하는 데 유용할 수 있다.
진단 방법은 (i) 대상체, 예를 들면, 본원에서 언급된 질병 또는 질환을 가질 것으로 의심되거나 생각되는 환자로부터 조직 또는 체액 샘플을 수득하는 단계; (ii) 상기 조직 또는 체액 샘플을 본 발명의 하나 이상의 결합 구성원에 노출시키는 단계; 및 (iii) 대조군 샘플과 비교될 때 결합된 Aβ1-42를 검출하는 단계로서, 이때 대조군과 비교될 때 Aβ1-42 결합 양의 증가가 비정상적인 수준의 Aβ1-42를 표시할 수 있는 것인 단계를 포함할 수 있다. 테스트할 조직 또는 체액 샘플은 비정상적인 Aβ1-42 수준을 함유할 것으로 의심되는 혈액, 혈청, 혈장, CSF, 소변, 생검 물질, 종양 또는 임의의 조직을 포함한다. 비정상적인 Aβ1-42 수준에 대한 양성을 나타내는 것으로 테스트된 대상체도 본원에 하기 개시된 치료 방법으로부터 이익을 얻을 수 있다.
본원에 개시된 방법에 비추어 볼 때, 당업자는 그의 선호 및 일반적인 지식에 따라 결합 구성원과 항원의 결합을 측정하는 적합한 방식을 선택할 수 있다.
샘플 중의 결합 구성원의 반응성은 임의의 적절한 수단에 의해 측정될 수 있다. 방사면역분석(RIA)이 한 가능한 수단이다. 방사성 표지된 항원은 비표지된 항원(테스트 샘플)과 혼합되고 결합 구성원에 결합하게 된다. 결합된 항원은 결합되지 않은 항원으로부터 물리적으로 분리되고, 결합 구성원에 결합된 방사성 항원의 양이 측정된다. 항원이 테스트 샘플에 보다 많을수록 보다 적은 방사성 항원이 결합 구성원에 결합할 것이다. 경쟁 결합 분석은 리포터 분자에 연결된 항원 또는 유사체를 사용함으로써 비-방사성 항원과 함께 사용될 수도 있다. 리포터 분자는 분광적으로 단리된 흡수 또는 방사 특성을 갖는 형광색소, 인 또는 레이저 염료일 수 있다. 적합한 형광색소는 플루오레세인, 로다민, 파이코에리쓰린 및 텍사스 레드, 및 란타나이드 킬레이트 또는 크립테이트를 포함한다. 적합한 발색성 염료는 디아미노벤지딘을 포함한다.
다른 리포터는 착색되거나 자성 또는 상자성을 갖는 거대분자 콜로이드성 입자 또는 미립자 물질, 예컨대, 라텍스 비드, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 신호가 시각적으로 관찰될 수 있게 하거나, 전자적으로 검출될 수 있게 하거나 다른 방식으로 기록될 수 있게 하는 생물학적 또는 화학적 활성 물질을 포함한다. 이들 분자들은 예를 들면, 색채를 발생시키거나 변화시키거나, 전기적 성질의 변화를 야기하는 반응을 촉매작용하는 효소일 수 있다. 이들은 에너지 상태들 사이의 전자 전이가 특징적인 분광 흡수 또는 방사를 초래하도록 분자적으로 여기가능한 상태일 수 있다. 이들은 바이오센서와 함께 사용되는 화학물질을 포함할 수 있다. 바이오틴/아비딘 또는 바이오틴/스트렙타비딘 및 알칼리성 포스파타제 검출 시스템이 이용될 수 있다.
개별 결합 구성원-리포터 접합체에 의해 생성된 신호는 (정상 및 테스트) 샘플에서 관련 결합 구성원 결합의 정량가능한 절대적 또는 상대적 데이터를 유도하는 데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 결합 구성원을 포함하는 키트도 본 발명의 한 양태로서 제공된다. 키트에서, 결합 구성원은 샘플에서의 그의 반응성이 예를 들면, 더 후술된 바와 같이 측정될 수 있도록 표지될 수 있다. 추가로, 결합 구성원은 고체 지지체에 부착될 수 있거나 부착되지 않을 수 있다. 키트의 성분은 일반적으로 멸균된 상태이고 밀봉된 바이알 또는 다른 용기 내에 존재한다. 키트는 결합 구성원이 유용한 진단 분석 또는 다른 방법에서 사용될 수 있다. 키트는 전술된 방법에서 사용하기 위한 것일 수 있다. 키트는 방법, 예를 들면, 본 발명에 따른 방법에서의 성분의 사용에 대한 설명서를 함유할 수 있다. 이러한 방법을 수행하는 데 도움이 되거나 이러한 방법을 수행할 수 있게 하는 보조물질이 본 발명의 키트 내에 포함될 수 있다. 보조물질은 제1 결합 구성원에 결합하고 검출가능한 표지(예를 들면, 형광 표지, 방사성 동위원소 또는 효소)에 접합되어 있는 상이한 제2 결합 구성원을 포함한다. 항체에 기초한 키트는 면역침전을 수행하기 위한 비드도 포함할 수 있다. 키트의 각각의 성분은 일반적으로 그 자신의 적합한 용기에 존재한다. 따라서, 이들 키트는 일반적으로 각각의 결합 구성원에 적합한 상이한 용기들을 포함한다. 추가로, 키트는 분석의 수행으로부터 수득된 데이터를 해석하고 분석하는 분석 및 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
본 발명은 경쟁 분석에서 항원 수준을 측정하기 위한 전술된 바와 같은 결합 구성원의 용도, 즉 경쟁 분석에서 본 발명에 의해 제공된 결합 구성원을 사용함으로써 샘플에서 항원의 수준을 측정하는 방법도 제공한다. 이것은 결합되지 않은 항원으로부터 결합된 항원의 물리적 분리가 요구되지 않는 경우일 수 있다. 결합 시 물리적 또는 광학적 변화가 일어나도록 리포터 분자를 결합 구성원에 연결하는 것도 한 가능한 방법이다. 리포터 분자는 정량될 수 있는 검출가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 생성할 수 있다. 리포터 분자의 연결은 직접적 또는 간접적 연결, 예를 들면, 펩티드 결합을 통한 공유연결, 또는 비-공유연결일 수 있다. 펩티드 결합을 통한 연결은 항체 및 리포터 분자를 코딩하는 유전자 융합체의 재조합 발현의 결과일 수 있다.
결합 구성원 사이의 경쟁은 예를 들면, ELISA 및/또는 생화학적 경쟁 분석, 예컨대, 태그부착되지 않은 하나 이상의 다른 결합 구성원의 존재 하에서 검출될 수 있는 한 결합 구성원에 특이적 리포터 분자를 태그부착하는 분석을 이용하여, 동일한 에피토프 또는 중첩 에피토프에 결합하는 결합 구성원을 확인함으로써 시험관내에서 용이하게 분석될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 용이하게 공지되어 있고 본원에 보다 더 상세히 기재되어 있다.
본 발명은 본원에서 정의된 임의의 결합 구성원, 예를 들면, 표 5 및 표 6에 나열된 항체들 중 임의의 항체, 예를 들면, IgG2, IgG1 또는 IgG1 삼중 돌연변이("TM"; Oganesyan et al. (2008) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64(Pt 6):700-4) 포맷의 상기 항체와 인간 Aβ1-42에의 결합에 대해 경쟁하는 결합 구성원으로 확장된다. 결합 구성원들 사이의 경쟁은 예를 들면, 태그부착되지 않은 다른 결합 구성원(들)의 존재 하에서 검출될 수 있는 한 결합 구성원에 특이적 리포터 분자를 태그부착하여 동일한 에피토프 또는 중첩 에피토프에 결합하는 결합 구성원을 확인함으로써 시험관내에서 용이하게 분석될 수 있다. 경쟁은 예를 들면, Aβ1-42가 플레이트에 고정되어 있고 태그부착되지 않은 또는 비표지된 하나 이상의 다른 결합 구성원과 함께 태그부착된 또는 표지된 제1 결합 구성원이 상기 플레이트에 첨가되는 ELISA를 이용함으로써 확인될 수 있다. 태그부착된 결합 구성원과 경쟁하는 태그부착되지 않은 결합 구성원의 존재는 태그부착된 결합 구성원에 의해 방사된 신호의 감소에 의해 관찰된다.
경쟁 분석은 에피토프 맵핑에서도 이용될 수 있다. 일례에서, 에피토프 맵핑은 임의적으로 최적화된 중화 및/또는 조절 특성을 가질 수 있는 결합 구성원에 의해 결합된 에피토프를 확인하는 데 이용될 수 있다. 이러한 에피토프는 선형 또는 입체구조형일 수 있다. 입체구조형 에피토프는 Aβ의 2개 이상의 상이한 단편들을 포함할 수 있고, 이때 상기 단편들은 Aβ 펩티드가 그의 3차 또는 4차 구조로 접혀 Aβ의 억제제, 예컨대, Aβ 결합 구성원에 의해 인식되는 입체구조형 에피토프를 형성할 때 서로 근접하여 위치한다. 경쟁에 대한 테스트에서 항원의 펩티드 단편, 특히 관심있는 에피토프를 포함하거나 본질적으로 이러한 에피토프로 구성된 펩티드가 사용될 수 있다. 에피토프 서열을 갖고 어느 한 말단에서 하나 이상의 아미노산을 갖는 펩티드가 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 결합 구성원은 항원에 대한 그의 결합이 주어진 서열을 갖거나 포함하는 펩티드에 의해 억제되게 할 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 결합 구성원, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산; 및 본 발명의 결합 구성원, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 제조하는 방법으로서, 상기 결합 구성원, VH 도메인 및/또는 VL 도메인의 생성을 야기하는 조건 하에서 상기 핵산을 발현시키는 단계 및 상기 결합 구성원, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 회수하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 코딩 핵산 서열의 예는 표 및 첨부된 서열목록에 기재되어 있다. 본 발명에 따른 핵산 서열은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있고, 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 문맥이 달리 요구하지 않은 한, 본원에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 대한 언급은 특정 서열을 갖는 DNA 분자를 포괄하고, T가 U로 치환되어 있는 특정 서열을 갖는 RNA 분자를 포괄한다.
본 발명은 예를 들면, 조절 요소에 작동가능하게 연결된, 전술된 바와 같은 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드, 벡터, 예컨대, 플라스미드 또는 파지 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 구축물도 제공한다.
추가 양태는 본 발명의 핵산 및/또는 벡터를 함유하거나 이러한 핵산 및/또는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 전술된 바와 같은 하나 이상의 구축물을 포함하는 재조합 숙주 세포주도 제공한다. 제공된 임의의 CDR 또는 CDR 세트, VH 도메인 또는 VL 도메인, 또는 항체의 항원 결합 부위 또는 항체 분자, 예를 들면, scFv 또는 IgG(예를 들면, IgG2, IgG1 또는 IgG1TM)를 코딩하는 핵산 서열은 코딩된 생성물을 그의 코딩 핵산 서열로부터 발현시키는 단계를 포함하는 코딩된 생성물의 제조 방법과 함께 본 발명의 한 양태를 형성한다. 발현은 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 적절한 조건 하에서 배양함으로써 편리하게 달성될 수 있다. 발현에 의한 생성 후, 임의의 적합한 기법을 이용하여 VH 또는 VL 도메인, 또는 결합 구성원을 단리할 수 있고/있거나 정제할 수 있고, 적절한 경우 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 항체 VH 가변 도메인의 제조 방법으로서, 코딩 핵산 서열로부터의 발현을 야기하는 단계를 포함하는 방법이다. 이러한 방법은 상기 항체 VH 가변 도메인의 제조를 위한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
VL 가변 도메인, 및 VH 및/또는 VL 도메인을 포함하는 결합 구성원을 제조하는 유사한 방법은 본 발명의 추가 양태로서 제공된다.
제조 방법은 생성물의 단리 및/또는 정제 단계를 포함할 수 있다. 제조 방법은 생성물을, 하나 이상의 추가 성분, 예컨대, 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물로 제제화하는 단계를 포함할 수 있다.
다양한 상이한 숙주 세포들에서 폴리펩티드를 클로닝하고 발현시키는 시스템은 잘 공지되어 있다. 적합한 숙주 세포는 세균, 포유동물 세포, 식물 세포, 사상 진균, 효모 및 바큘로바이러스 시스템, 및 형질전환 식물 및 동물을 포함한다. 원핵 세포에서의 항체 및 항체 단편의 발현은 당분야에서 잘 확립되어 있다. 검토를 위해서는 예를 들면, 문헌(Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991))을 참조한다. 통상의 세균 숙주는 이. 콜라이(E. coli)이다.
배양물 중의 진핵 세포에서의 발현도 결합 구성원의 제조 방법으로서 당업자에 의해 이용가능하다(Chadd HE and Chamow SM (2001) Current Opinion in Biotechnology 12: 188-194; Andersen DC and Krummen L (2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 117; Larrick JW and Thomas DW (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:411-418).
이종 폴리펩티드의 발현을 위해 당분야에서 이용가능한 포유동물 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 세포, NS0 마우스 골수종 세포, YB2/0 래트 골수종 세포, 인간 배아 신장 세포, 인간 배아 망막 세포 등을 포함한다.
프로모터 서열을 포함하는 적절한 조절 서열, 종결자 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 적절한 경우 다른 서열을 함유하는 적합한 벡터가 선택될 수 있거나 구축될 수 있다. 벡터는 적절한 경우 플라스미드, 예를 들면, 파지미드, 또는 바이러스, 예를 들면, 파지일 수 있다(Sambrook and Russell, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press). 예를 들면, 핵산 구축물의 제조에 있어서 핵산의 조작, 돌연변이유발, 서열결정, 세포 내로의 DNA의 도입 및 유전자 발현, 및 단백질의 분석을 위한 많은 공지된 기법들 및 프로토콜들이 문헌(Ausubel et al. eds., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 4th edition 1999)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 추가 양태는 본원에 개시된 핵산을 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 이러한 숙주 세포는 시험관내에 존재할 수 있고 배양물에 존재할 수 있다. 이러한 숙주 세포는 생체내에 존재할 수 있다. 숙주 세포의 생체내 존재는 본 발명의 결합 구성원이 "인트라바디" 또는 세포내 항체로서 세포내에서 발현되게 할 수 있다. 인트라바디는 유전자 치료법을 위해 사용될 수 있다.
또 다른 양태는 본 발명의 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 도입은 임의의 이용가능한 기법을 이용할 수 있다. 진핵 세포의 경우, 적합한 기법은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란, 전기천공, 리포좀 매개 형질감염, 및 레트로바이러스 또는 다른 바이러스, 예를 들면, 백시니아 또는 바큘로바이러스(곤충 세포의 경우)를 사용한 형질도입을 포함할 수 있다. 숙주 세포, 특히 진핵 세포 내로의 핵산의 도입은 바이러스에 기초한 또는 플라스미드에 기초한 시스템을 이용할 수 있다. 플라스미드 시스템은 에피좀으로 유지될 수 있거나, 숙주 세포 또는 인공 염색체 내로 도입될 수 있다. 도입은 단일 또는 다수의 좌위에서 하나 이상의 카피의 무작위적 또는 표적화된 삽입에 의해 달성될 수 있다. 세균 세포의 경우, 적합한 기법은 염화칼슘 형질전환, 전기천공 및 박테리오파지를 사용한 형질감염을 포함할 수 있다.
도입 후, 예를 들면, 유전자의 발현을 위한 조건 하에서 숙주 세포를 배양함으로써 핵산으로부터의 발현을 야기하거나 가능하게 할 수 있다. 발현된 생성물의 정제는 당업자에게 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 핵산은 숙주 세포의 게놈(예를 들면, 염색체) 내로 삽입될 수 있다. 삽입은 표준 기법에 따라 게놈과의 재조합을 촉진하는 서열의 포함에 의해 촉진될 수 있다.
본 발명은 전술된 바와 같이 상기 결합 구성원 또는 폴리펩티드를 발현시키기 위해 발현 시스템에서 전술된 바와 같이 구축물을 사용하는 단계를 포함하는 방법도 제공한다.
본 발명에 따른 결합 구성원은 결합 구성원을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 인체 또는 동물체(예를 들면, 인간 환자)에서 질환 또는 장애의 치료(예방적 치료를 포함할 수 있음)에 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 질병은 이 질병 또는 이의 하나 이상의 증상의 예방적 치료 및 중증도의 감소, 또는 발병의 지연 또는 위험 감소를 포함하는 본원의 다른 부분에 기재되어 있다.
따라서, 본 발명은 본원에서 언급된 질병들 중 임의의 질병의 하나 이상의 증상을 치료하거나 이의 중증도를 감소시키는 방법으로서, 단독으로 또는 당분야에서 공지되어 있거나 본원에 기재되어 있는 또 다른 적절한 약제와 함께 조합 치료 요법으로 유효량의 본 발명의 하나 이상의 결합 구성원을 상기 치료 또는 감소가 필요한 환자에게 투여하여 상기 장애들 중 임의의 장애의 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
용어 "유효량"은 질환을 이미 앓고 있는 환자에서 질환 및 이의 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로서 정의된다.
특히, 본 발명은 예를 들면, 아밀로이드생성 질환의 예방 또는 치료를 위해 환자에서 유리한 치료 반응(예를 들면, CSF에서의 Aβ1-42의 감소, 플라크 존재량의 감소, 플라크 형성의 억제, 신경염성 위축증의 감소, 인지 기능의 개선, 및/또는 인지력 감퇴의 역전, 감소 또는 예방)을 발생시키는 조건 하에서 본 발명의 치료 항체를 환자에게 투여함으로써 알츠하이머병 및 다른 아밀로이드생성 질환을 치료하는 것에 관한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료"는 아밀로이드증과 관련된 질환 또는 질병, 이의 증상 또는 이에 대한 소인을 치유하거나, 치료하거나, 완화시키거나, 경감시키거나, 변경시키거나, 고치거나, 호전시키거나, 개선하거나 영향을 미칠 목적으로 아밀로이드증과 관련된 질환 또는 질병; 또는 아밀로이드증과 관련된 이러한 질환 또는 질병의 증상 또는 이러한 질환 또는 질병에 대한 소인을 갖는 환자에게 치료제를 적용하거나 투여하는 것으로서 정의된다.
본 발명은 환자의 뇌 내의 Aβ의 아밀로이드 침착물과 관련된 질환을 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 질환은 알츠하이머병, 다운증후군 및 인지 장애를 포함한다. 인지 장애는 아밀로이드생성 질환의 다른 특징과 함께 또는 이러한 특징 없이 일어날 수 있다. 본 발명은 Aβ와 관련된 질병인 황반 변성의 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 Aβ1-42 및 이의 N 말단 절두체에 특이적으로 결합하는 항체를 환자에게 유효 용량으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 인간 환자에서 알츠하이머병을 예방하거나 치료하는 데 특히 유용하다.
본 발명의 항체는 신경병리 및 일부 실시양태에서 알츠하이머병과 관련된 인지 장애를 예방하거나 호전시키기 위한 치료 요법에서 사용될 수 있다.
치료를 받을 수 있는 환자는 증상을 보이는 환자뿐만 아니라 질환의 위험을 갖지만 증상을 보이지 않는 개체도 포함한다. 알츠하이머병의 경우, 충분히 오랜 시간 동안 생존하는 경우 잠재적으로 누구나 위험을 갖는다. 본 발명의 항체는 대상체 환자의 위험의 임의의 평가 없이 대상체에게 예방적으로 투여될 수 있다. 치료를 받을 수 있는 환자는 알츠하이머병의 공지된 유전적 위험을 갖는 개체, 예를 들면, 이 질환과 혈연 관계를 갖는 개체 및 유전적 또는 생화학적 마커의 분석에 의해 확인된 위험을 갖는 개체를 포함한다. 알츠하이머병에 대한 소인의 유전적 마커는 APP 유전자 내의 돌연변이, 특히 위치 717 및 위치 670 및 671에 존재하는 돌연변이(각각 하디(Hardy) 및 스웨디쉬(Swedish) 돌연변이로서 지칭됨)를 포함한다. 위험의 다른 마커는 프레세닐린 유전자인 PS1 및 PS2; 및 AD, 고콜레스테롤혈증 또는 죽상동맥경화증의 가족력인 ApoE4 내의 돌연변이이다. 알츠하이머병을 앓고 있는 개체는 상기 질환과 관련된 특징적인 치매에 의해 진단될 수 있을 뿐만 아니라 전술된 위험 인자의 존재에 의해서도 진단될 수 있다. 다수의 진단 테스트들이 개체에서 알츠하이머병의 확인을 보조하는 데 이용될 수 있다. 이들은 CSF tau 및 Aβ1-42 수준의 측정을 포함한다. 상승된 tau 및 감소된 Aβ1-42 수준은 AD의 존재를 표시할 수 있다. 알츠하이머병을 앓고 있는 개체는 NINCDS-ADRDA 또는 DSM-IV-TR 기준에 의해 진단될 수도 있다.
무증상 환자에서, 치료는 임의의 연령(예를 들면, 10세, 20세, 30세)에서 시작될 수 있다. 일반적으로, 치료는 노후에, 예를 들면, 환자가 그의 또는 그녀의 40대, 50대, 60대 또는 70대에 도달할 때 시작된다. 치료는 환자의 남은 수명의 지속기간일 수 있는 기간에 걸친 다회 용량 투여를 포함할 수 있다. 반복 용량을 투여할 필요성은 시간의 경과에 걸쳐 항체 수준을 측정함으로써 모니터링될 수 있다.
예방을 위해, 약학 조성물 또는 약제는 알츠하이머병의 생화학적, 조직학적, 인지 장애 및/또는 거동 증상, 그의 합병증, 및 상기 질환의 발생 동안 나타나는 중간 병리학적 표현형을 포함하는, 상기 질환의 위험을 제거하거나 감소시키거나, 상기 질환의 중증도를 경감시키거나, 상기 질환의 시작을 지연시키기에 충분한 양으로 알츠하이머병에 민감하거나 다른 방식으로 알츠하이머병의 위험을 갖는 환자에게 투여된다. 치료 적용을 위해, 조성물 또는 약제는 상기 질환의 합병증 및 상기 질환의 발생에서 나타나는 중간 병리학적 표현형을 포함하는, 상기 질환의 증상(생화학적, 조직학적, 인지 장애 및/또는 거동)을 치유하거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 이러한 질환을 앓고 있는 것으로 의심되거나 이미 앓고 있는 환자에게 투여된다.
본 발명은 단독으로, 또는 당분야에서 공지되어 있거나 본원에 기재되어 있는 또 다른 적절한 약제와 함께 조합 치료 요법으로 유효량의 본 발명의 하나 이상의 결합 구성원을 치료가 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 치료 방법을 제공한다. 치료 방법은 유효량의 본원에 기재된 결합 구성원을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 이때 Aβ1-42의 수준은 혈액 혈장 및/또는 CSF에서 감소된다.
치료 방법은 (i) 본원에서 언급된 바와 같이 아밀로이드증과 관련된 질병을 갖는 환자를 확인하는 단계, 및 (ii) 유효량의 본원에 기재된 결합 구성원을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 이때 Aβ1-42의 수준은 혈액 혈장 및/또는 CSF에서 감소되고, 아밀로이드증은 감소된다. 유효량은 치료되는 특정 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시키거나 경감시킬 정도로(그러나, 반드시 상기 질환 또는 장애를 치유할 정도일 필요는 없음) Aβ1-42의 수준을 감소시키는 양이다.
본 발명은 Aβ1-42의 하나 이상의 효과를 길항하는 방법으로서, Aβ1-42의 상기 하나 이상의 효과가 길항될 정도로 유효량의 본 발명의 하나 이상의 결합 구성원과 접촉시키거나 이러한 결합 구성원을 투여하는 단계를 포함하는 방법도 제공한다.
따라서, 본 발명의 추가 양태는 제공된 결합 구성원의 투여를 포함하는 치료 방법, 이러한 결합 구성원을 포함하는 약학 조성물, 및 투여용 약제의 제조에 있어서, 예를 들면, 상기 결합 구성원을 약학적으로 허용가능한 부형제로 제제화하는 단계를 포함하는 약제 또는 약학 조성물의 제조 방법에 있어서 이러한 결합 구성원의 용도를 제공한다. 약학적으로 허용가능한 부형제는 이차 반응을 일으키지 않으면서 약학 조성물 내로 들어가고 예를 들면, 결합 구성원의 투여를 용이하게 하거나, 신체 내에서의 그의 수명 및/또는 그의 효능을 증가시키거나, 용액에서 그의 가용성을 증가시키거나, 그의 보존을 개선하는 화합물 또는 화합물들의 조합물일 수 있다. 이들 약학적으로 허용가능한 비히클은 잘 공지되어 있고 선택된 활성 화합물(들)의 성질 및 투여 방식의 함수로서 당업자에 의해 채택될 것이다.
본원에 기재된 결합 구성원은 통상적으로 이 결합 구성원 이외에 하나 이상의 성분을 포함할 수 있는 약학 조성물의 형태로 투여될 것이다. 따라서, 본 발명에 따라 사용될 본 발명에 따른 약학 조성물은 결합 구성원 이외에 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당업자에게 잘 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 독성을 나타내지 않아야 하고 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로에 의존할 것이다.
예를 들면, 정맥내 또는 피하 주사를 위한 주사가능한 제제의 경우, 활성 성분은 발열원을 함유하지 않고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 수용액의 형태로 존재할 것이다. 본원에 기재된 결합 구성원은 분자의 물리화학적 성질 및 전달 경로에 따라 액체, 반고체 또는 고체 형태로 제제화될 수 있다. 제제는 부형제 또는 부형제들의 조합물, 예를 들면, 당, 아미노산 및 계면활성제를 포함할 수 있다. 액체 제제는 광범위한 항체 농도 및 pH를 포함할 수 있다. 고체 제제는 예를 들면, 동결건조, 분무 건조, 또는 초임계 유체 기술에 의한 건조에 의해 생성될 수 있다. 치료는 주사(예를 들면, 피하 또는 정맥내 주사)에 의해 제공될 수 있다. 치료는 특히 감소하는 용량의 결합 구성원을 사용한 펄스 관주에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로는 치료의 물리화학적 특성, 질환의 특별한 고려사항, 또는 효능을 최적화하거나 부작용을 최소화할 필요에 의해 결정될 수 있다. 한 구체적인 투여 경로는 정맥내 경로이다. 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 또 다른 경로는 피하 경로이다. 무바늘 장치를 이용한 피하 주사도 유리하다.
조성물은 치료될 질병에 따라 단독으로, 또는 다른 치료와 함께 동시적으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
결합 구성원은 추가 의약 성분과 함께 조합 치료의 일부로서 사용될 수 있다. 조합 치료는 유의한 상승작용적 효과, 특히 결합 구성원과 하나 이상의 다른 약물의 조합을 제공하는 데 이용될 수 있다. 결합 구성원은 본원에 나열된 질병들 중 하나 이상의 질병의 치료를 위해 또 다른 치료제 또는 치료제들과 함께 동시적으로 또는 순차적으로, 또는 조합된 제제로서 투여될 수 있다.
결합 구성원 및 상기 추가 의약 성분들 중 하나 이상의 성분은 약제의 제조에서 사용될 수 있다. 약제는 개체에게의 별도 또는 조합 투여를 위한 약제일 수 있으므로, 결합 구성원 및 추가 성분을 조합된 제제 또는 별도의 제제로서 포함할 수 있다. 별도의 제제는 별도의 순차적인 또는 동시적인 투여를 용이하게 하는 데 사용될 수 있고, 상이한 경로, 예를 들면, 경구 투여 및 비경구 투여에 의한 성분의 투여를 가능하게 한다.
제공된 조성물은 포유동물에게 투여될 수 있다. 투여는 통상적으로 환자에게 이익을 보이기에 충분한 "치료 유효량"으로 제공된다. 이러한 이익은 적어도 하나 이상의 증상의 호전일 수 있다. 투여되는 실제량, 및 투여의 속도 및 시간 경과는 치료되는 질환의 성질 및 중증도, 치료되는 구체적인 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 조성물의 전달 부위, 결합 구성원의 유형, 투여 방법, 투여 일정 및 의사에게 공지된 다른 인자에 의존할 것이다. 치료의 처방, 예를 들면, 용량의 결정 등은 일반적인 실시자 및 다른 의사의 책임 내에 있고, 치료되는 질환의 증상의 중증도 및/또는 진행에 의존할 수 있다. 본 발명의 결합 구성원의 치료 유효량 또는 적합한 용량은 그의 시험관내 활성을 동물 모델에서의 생체내 활성과 비교함으로써 결정될 수 있다. 테스트 동물에서의 유효 용량을 인간에게 외삽하는 방법은 공지되어 있다. 정확한 용량은 항체가 진단을 위한 것인지, 예방을 위한 것인지 아니면 치료를 위한 것인지의 여부, 치료되는 면적의 크기 및 위치, 항체(예를 들면, 전체 항체, 단편 또는 디아바디)의 정확한 성질 및 항체에 부착된 임의의 검출가능한 표지 또는 다른 분자의 성질을 포함하는 다수의 인자들에 의존할 것이다. 전형적인 항체 용량은 전신 적용의 경우 100 ㎍ 내지 1 g일 것이다. 초기 보다 높은 적재 용량에 이어서 하나 이상의 보다 낮은 용량이 투여될 수 있다. 전형적으로, 항체는 전체 항체, 예를 들면, IgG1 또는 IgG1-TM 동종형일 것이다. 치료는 의사의 재량에 따라 매일, 매주 2회, 매주 또는 매월 간격으로 반복될 수 있다. 치료는 피하 투여의 경우 2주 내지 4주마다 반복될 수 있고 정맥내 투여의 경우 4주 내지 8주마다 반복될 수 있다. 치료는 주기적일 수 있고, 투여 사이의 주기는 약 2주 이상, 예를 들면, 약 3주 이상, 약 4주 이상 또는 약 매월 1회이다.
본 개시내용에 비추어 볼 때 본 발명의 다양한 추가 양태 및 실시양태가 당업자에게 자명할 것이다.
본 명세서에서 언급된 데이터베이스 참고 번호 및 수탁 번호, 특허, 특허출원 및 공개문헌을 포함하는 모든 문헌들이 모든 목적을 위해 전체적으로 본원에 참고로 도입된다.
본원에서 사용될 때 "및/또는"은 2개의 특정 특징들 또는 성분들 각각이 다른 특징 또는 성분과 함께, 또는 다른 특징 또는 성분 없이 구체적으로 개시된 것으로서 해석되어야 한다. 예를 들면, "A 및/또는 B"는 (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B 각각이 본원에 개별적으로 기재된 것처럼 이들 각각이 구체적으로 개시된 것으로서 해석되어야 한다.
문맥이 달리 명시하지 않은 한, 전술된 특징들의 설명 및 정의는 본 발명의 임의의 특정 양태 또는 실시양태로 한정되지 않고 기재된 모든 양태 및 실시양태에 동등하게 적용된다.
지금부터 본 발명의 일부 양태 및 실시양태가 첨부된 도면 및 표를 참조하면서 예를 통해 설명될 것이다.
실시예
하기 서열들은 NCIMB(영국 스코틀랜드 에이비212 9와이에이 아버딘 벅스부른 크라이브스톤 에스테이트 퍼구손 빌딩 소재)에 기탁되었다.
이. 콜라이 TOP10 세포 Abet0007 = NCIMB 41889
이. 콜라이 TOP10 세포 Abet0380-GL = NCIMB 41890
이. 콜라이 TOP10 세포 Abet0144-GL = NCIMB 41891
이. 콜라이 TOP10 세포 Abet0377-GL = NCIMB 41892
기탁일 = 2011년 11월 2일
실시예 1: 항-아밀로이드 베타 1-42 특이적 항체 생성 및 리드 선택
1.1 아밀로이드 베타 펩티드의 제제화
바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(r펩티드(rPeptide), 미국 소재; 카탈로그 번호: A1117 또는 바켐 아게(Bachem AG), 스위스 소재; 카탈로그 번호: H-5642)를 1% 수산화암모늄 용액(부피/부피)에 1 mg/㎖까지 재현탁하고 필요할 때까지 -80℃에서 분취액으로 저장하였다. 비표지된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(아나스펙(Anaspec), 미국 소재; 카탈로그 번호: 64129), 비표지된 인간 아밀로이드 베타 1-40 펩티드(r펩티드, 미국 소재; 카탈로그 번호: A1155), 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-40 펩티드(r펩티드, 미국 소재; 카탈로그 번호: A111 또는 바켐 아게, 스위스 소재; 카탈로그 번호: H-5914), 바이오티닐화된 뮤린 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(아나스펙, 미국 소재; 카탈로그 번호: 61718-01) 및 바이오티닐화된 뮤린 아밀로이드 베타 1-40 펩티드(아나스펙, 미국 소재; 카탈로그 번호: 61717)에 대해 동일한 절차를 따랐다.
1.2 선택
사상 파지 M13에 기초한 파지미드 벡터 내로 클로닝된 Fab310-람다 파지 디스플레이 라이브러리(다이악스(Dyax), 미국 소재)를 선택에 사용하였다(Hoet et al., 2005). 본질적으로 이전에 기재된 바와 같이(Hawkins et al., 1992; Vaughan et al., 1996) 합성 인간 바이오티닐화된 아밀로이드 베타 1-42(r펩티드, 미국 소재)에 대한 일련의 선택 주기를 이용하여 항-아밀로이드 베타 1-42 특이적 Fab 항체를 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리하였다. 요약하면, 제1 라운드의 용액상 선택을 위해, 둘베코의 인산염 완충 식염수(DPBS, pH 7.4) 중의 바이오티닐화된 아밀로이드 베타 1-42를, 100배 과량의 비표지된 인간 아밀로이드 베타 1-40 펩티드(아나스펙, 미국 소재)를 함유하는 마벨(Marvel)-PBS(3% 중량/부피)에서 1시간 동안 미리 항온처리된 정제된 파지 입자에 첨가하였다. 바이오티닐화된 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 결합된 파지 입자를 스트렙타비딘-커플링된 상자성 비드(인비트로겐 라이프 테크놀로지스(Invitrogen Life Technologies), 영국 소재)를 사용하여 포획하고, 약하게 결합된 파지를 PBS-트윈(0.1% 부피/부피)을 사용한 일련의 세척 주기로 제거하였다. 결합된 파지 입자를 비드로부터 용출하고 이. 콜라이 TG1 세균 내로 감염시키고 다음 라운드의 선택을 위해 레스큐하였다(Vaughan et al., 1996).
감소된 농도의 바이오티닐화된 아밀로이드 베타 1-42 항원을 사용하여 2회 후속 라운드의 선택을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다.
1.3 비정제된 Fab 단편에 대한 직접 결합 분석을 이용한 아밀로이드 베타 1-42 특이적 클론의 확인
가용성 단일 쇄 Fab 단편(sFab)을 생성하기 위해, 표준 절단 및 라이게이션 기법을 이용하여 Fab310-람다 디스플레이 카세트로부터 유전자III 테터(geneIII tether)를 제거하였다. 요약하면, 표준 DNA 정제 키트(퀴아젠(QIAgen), 영국 소재)를 사용하여 라운드 3 결과물로부터 파지미드 벡터를 단리하고, MluI 제한 분해를 이용하여 벡터로부터 유전자III 테터 서열을 제거하였다(Hoet et al., 2005). 다시 라이게이션된 벡터를 TG1 세포 내로 다시 형질전환시키고 분석을 위해 개별 콜로니를 선택하였다.
엔비전(EnVision) 플레이트 판독기(퍼킨엘머(PerkinElmer), 미국 소재)를 이용하여 균질한 시간 분해 형광(HTRF™, 시스바이오 인터네이셔날, 프랑스 소재) 결합 분석에서 주변세포질 제제로부터의 비정제된 sFab를 스크리닝하였다. 이 분석에서, 스트렙타비딘 크립테이트 및 항-6his-XL665 검출 시약(시스바이오 인터네이셔날, 프랑스 소재; 카탈로그 번호: 각각 610SAKLB 및 61HISXLB)을 사용하여 히스티딘 태그부착된 sFab와 바이오티닐화된 펩티드 사이의 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 측정함으로써 비정제된 sFab와 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 결합을 평가하였다. 50 mM MOPS 완충제(pH 7.4), 0.5 mM EDTA 및 0.5 M 수크로스에서 제조된, sFab를 함유하는 비정제된 세균 주변세포질 추출물로서 선택 결과물을 스크리닝하였다. 10 ㎕의 비정제된 sFab 샘플을 코스타(Costar)® 384웰 분석 플레이트(코닝(Corning), 미국 소재; 카탈로그 번호: 3676)에 첨가하였다. 그 후, 5 ㎕의 20 nM 합성 인간 아밀로이드 베타 1-42, 및 6 nM 스트렙타비딘 크립테이트와 20 nM 항-his-XL665의 조합 용액 5 ㎕를 첨가하였다. 테스트 sFab 샘플 대신에 음성 대조군인 비정제된 sFab를 사용하여 각각의 플레이트에 대해 비-특이적 결합 웰(음성 대조군)을 지정하였다. 인간 아밀로이드 베타 1-40 펩티드를 사용한 동시적 분석을 이용하여 교차반응성 sFab 클론을 확인하였다. 0.4 M KF(비디에이치 케미칼스(BDH Chemicals), 미국 소재; 카탈로그 번호: 103444T), 0.1% 지방산 무함유 소 혈청 알부민(시그마(Sigma), 영국 소재; 카탈로그 번호: A6003) 및 0.1% 트윈 20(부피/부피)(시그마, 영국 소재; 카탈로그 번호: P2287)을 함유하는 50 mM MOPS(pH 7.4)(시그마, 영국 소재; 카탈로그 번호: M9381)(분석 완충제)에서 모든 희석을 수행하였다. 320 nm의 여기 파장을 이용하여 엔비전 플레이트 판독기(퍼킨엘머, 미국 소재) 상에서 시간 분해 형광을 판독하고 620 nm 및 665 nm에서 방사(100개 섬광)를 측정하기 전에, 분석 플레이트를 실온에서 4시간 동안 항온처리하였다.
각각의 샘플에 대하여 % 델타 F 값을 계산함으로써 데이터를 분석하였다. % 델타 F를 하기 방정식 1에 따라 결정하였다.
방정식 1:
Figure 112015046136268-pct00002
1.4 정제된 sFab 단편의 직접 결합 분석
HTRF™ 분석 시 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에의 특이적 결합을 보인 비정제된 sFab 주변세포질 추출물에 대한 DNA 서열결정을 수행하였다(Osbourn et al., 1996; Vaughan et al., 1996). 독특한 단백질 서열을 갖는 sFab를 이. 콜라이에서 발현시키고 (본질적으로 문헌(Bannister et al., 2005)에 기재된 바와 같이) 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 1.3 단락에 기재된 HTRF™ 분석에서 일련의 정제된 sFab 희석물을 테스트하고 비정제된 sFab 주변세포질 제제를 정제된 sFab로 치환시킴으로써 각각의 정제된 sFab의 아밀로이드 베타 결합 프로파일을 확인하였다. 정제된 sFab를 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드, 바이오티닐화된 뮤린 아밀로이드 베타 1-42 펩티드 및 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-40 펩티드에의 결합에 대해 동시적으로 테스트하였다. 추가로, 임의의 비-특이적 펩티드 결합에 대해 제어하기 위해 별도의 HTRF™ 실험에서 sFab를 스크램블된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(아나스펙, 주문제작 합성)에의 결합에 대해 테스트하였다. 1.3 단락에 기재된 바와 같이 % 델타 F 값을 계산함으로써 데이터를 분석하였다.
정제된 Abet0007 sFab에 대한 예시적 결과는 도 1에 제시되어 있다. 이들 결과는 Abet0007이 인간 아밀로이드 베타 1-40 펩티드 및 스크램블된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 비해 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 특이적으로 결합한다는 것을 입증한다. 추가로, Abet0007 sFab는 뮤린 아밀로이드 베타 1-42 펩티드와 교차반응한다.
1.5 IgG2 포맷으로의 아밀로이드 베타 1-42 특이적 항체 Fab의 재포맷화
가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을, 각각 전체 인간 항체 중쇄 및 경쇄를 발현하는 벡터 내로 서브클로닝함으로써 13개의 아밀로이드 베타 1-42 특이적 클론을 Fab로부터 IgG2로 전환시켰다. 다이악스 FAB310 라이브러리 VH 도메인이 반합성 상태이고 본원에 기재된 포유동물 세포 내에서 충분한 양으로 발현하지 못하기 때문에 VH 도메인을 서브클로닝 전에 사내에서(in-house) 코돈 최적화하였다. 포유동물 세포에서 전체 길이 인간 IgG만큼 잘 발현하는 것으로 공지되어 있는, 사내 생식세포주 일치된 VH를 주형으로서 사용하여, 원래의 아미노산 서열을 보유하면서 다이악스 VH 도메인의 DNA 코돈 용법을 변경시켰다. 코돈-최적화된 가변 중쇄를, 인간 중쇄 불변 도메인 및 조절 요소를 함유하는 포유동물 발현 벡터(pEU 9.2) 내로 클로닝하여 포유동물 세포에서 전체 IgG2 중쇄를 발현시켰다. 유사하게, 가변 경쇄 도메인을 인간 람다 경쇄 불변 도메인 및 조절 요소의 발현용 포유동물 발현 벡터(pEU4.4) 내로 클로닝하여 포유동물 세포에서 전체 IgG 경쇄를 발현시켰다. 중쇄 및 경쇄의 발현용 벡터는 문헌(Persic et al., 1997)에 최초로 기재되어 있다. IgG2로서 클론을 수득하기 위해, 중쇄 및 경쇄 IgG 발현 벡터를 HEK293-EBNA(인비트로겐, 영국 소재; 카탈로그 번호: R620-07) 또는 CEP6-CHO(사내 제조됨) 포유동물 세포 내로 일시적으로 형질감염시켰고, 이때 항체가 발현되었고 배지 내로 분비되었다. 회수된 배지를 정제 전에 여과하였다. 단백질 A 크로마토그래피(바이오세프라(Biosepra)™, 폴(Pall), 미국 소재, 또는 맙셀렉트 슈어(MabSelect SuRe), 지이 헬쓰케어(GE Healthcare), 영국 소재)를 이용하여 IgG를 정제하였다. 배양물 상청액을 50 mM 트리스(pH 8.0) 및 250 mM NaCl로 미리 평형화된 적절한 단백질 A 컬럼 상에 적재하였다. 0.1 M 시트르산나트륨(pH 3.0)을 사용하여 결합된 IgG를 컬럼으로부터 용출하고 1 M 트리스 완충제(pH 10.0)를 첨가하여 용출물을 중화시켰다. NAP-10 완충제 교환 컬럼(지이 헬쓰케어, 영국 소재; 카탈로그 번호: 17-0854-02)을 이용하여 IgG를 둘베코의 PBS 내로 완충제 교환하였다. 정제된 IgG를 0.2 ㎛ 필터에 통과시키고, IgG의 아미노산 서열에 기초한 흡광계수를 이용하여 280 nm에서의 흡광도로 IgG의 농도를 측정하였다. SEC-HPLC 및 SDS-PAGE 기법을 이용하여 정제된 IgG를 응집 또는 분해에 대해 분석하였다.
1.6 아밀로이드 베타 펩티드 경쟁 HTRF™ 분석에서 리드 항체의 특이성 측정
전술된 바와 같이, 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 특이적으로 결합하는 정제된 sFab 단편을 재조합 IgG로 전환시켰다. 다른 인간 아밀로이드 베타 펩티드에의 결합에 대한 이들 IgG의 특이성을 테스트하기 위해, 경쟁 분석을 개발하였다. 이 분석에서, 비표지된 인간 아밀로이드 베타 펩티드 1-42(r펩티드, 미국 소재; 카탈로그 번호: A1165), 1-40(r펩티드, 미국 소재; 카탈로그 번호: A1155), 11-42(r펩티드, 미국 소재; 카탈로그 번호: A1063), 17-42(r펩티드, 미국 소재; 카탈로그 번호: A1058) 및 1-43(아나스펙, 미국 소재; 카탈로그 번호: 25356)을 리드 IgG 및 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 펩티드 1-42(r펩티드, 미국 소재; 카탈로그 번호: A1117)와 함께 항온처리하였다. 요약하면, 각각의 테스트 펩티드의 일련의 희석물을 0.3 nM의 테스트 IgG 및 5 nM의 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드와 조합하였다. 스트렙타비딘 크립테이트(시스바이오 인터네이셔날, 프랑스 소재; 카탈로그 번호: 610SAKLB) 및 항-인간 Fc IgG XL665(시스바이오 인터네이셔날, 프랑스 소재; 카탈로그 번호: 61HFCXLB) 검출 시약을 사용하여 IgG와 바이오티닐화된 1-42 아밀로이드 베타 사이의 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 측정하여 리드 IgG와 바이오티닐화된 1-42 펩티드의 결합의 손실을 검출함으로써 각각의 펩티드의 경쟁을 평가하였다.
50 mM MOPS(pH 7.4)(시그마, 영국 소재; 카탈로그 번호: M9381), 0.4 M KF(비디에이치 케미칼스(BDH Chemicals), 미국 소재; 카탈로그 번호: 103444T), 0.1% 지방산 무함유 소 혈청 알부민(시그마, 영국 소재; 카탈로그 번호: A6003) 및 0.1% 트윈 20(부피/부피)(시그마, 영국 소재; 카탈로그 번호: P2287)을 함유하는 분석 완충제에서 스트렙타비딘 크립테이트와 항-인간 Fc IgG XL665를 각각 7 nM 및 5 nM로 조합하였다. 5 ㎕의 이 용액을 분석 플레이트(코스타® 384웰 흑색 얕은 웰, 코닝 라이프 사이언시스(Corning Life Sciences); 카탈로그 번호: 3676)에 첨가하였다. 그레이너(Greiner) 96웰 U 바닥 플레이트(그레이너 바이오원(Greiner BioOne), 독일 소재; 카탈로그 번호: 650201)를 사용하여 아밀로이드 베타 펩티드를 분석 완충제로 연속적으로 희석하였다. 미니트랙(MiniTrak)™(퍼킨엘머, 미국 소재) 액체 취급 로봇을 이용하여 5 ㎕의 각각의 펩티드 희석물을 분석 플레이트에 이중으로 옮겼다. 테스트 IgG를 분석 완충제로 1.2 nM까지 희석하고, 5 ㎕를 분석 플레이트에 첨가하였다. 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 20 nM 용액을 분석 완충제로 제조하고, 5 ㎕의 이 용액을 분석 플레이트에 첨가하였다. 테스트 IgG를 5 ㎕의 분석 완충제로 교체함으로써 각각의 플레이트에 대해 비-특이적 결합 웰(음성 대조군)을 지정하였다. 엔비전 플레이트 판독기(퍼킨엘머, 미국 소재)를 이용하여 620 nm 및 665 nm 방사 파장에서 시간 분해 형광을 판독하기 전에, 분석 플레이트를 실온에서 4시간 동안 항온처리하였다.
각각의 샘플에 대한 % 델타 F 값을 계산함으로써 데이터를 분석하였다. % 델타 F를 방정식 1에 따라 결정하였다. 그 후, % 델타 F 값을 이용하여 % 특이적 결합을 방정식 2에 기재된 바와 같이 계산하였다.
방정식 2:
Figure 112015046136268-pct00003
Abet0007 IgG에 대한 예시적 결과는 도 2에 제시되어 있다. 이들 결과는 Abet0007 IgG가 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 결합하나 인간 아밀로이드 베타 1-40 펩티드에는 결합하지 않는다는 것을 입증한다. 이 항체는 절두된 펩티드 11-42 및 17-42, 및 인간 아밀로이드 베타 1-43 펩티드에도 결합한다.
1.7 표면 플라스몬 공명을 이용한 인간 아밀로이드 베타 1-42에 대한 리드 항체의 결합 친화성의 측정
비아코어 T-100(지이 헬쓰케어, 영국 소재) 바이오센서 기계를 이용하여 각각의 리드 항체와 합성에 의해 생성된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드 사이의 상호작용의 동력학적 파라미터를 평가하였다. 이들 실험은 본질적으로 문헌(Karlsson et al., 1991)에 기재된 바와 같이 수행되었다.
상기 바이오센서는 표면 플라스몬 공명(SPR)의 광학 효과를 이용하여 바이오센서 칩의 덱스트란 층 상에 고정된 리간드 분자 상에서 유동하는 분석물 분자의 상호작용으로부터 비롯된 표면 농도의 변화를 연구한다. 전형적으로, 지정된 농도의 분석물 종이 커플링된 리간드 상에 통과하고 임의의 결합이 국소 SPR 신호의 증가로서 검출된다(결합기). 그 후, 표면 고정된 리간드로부터의 분석물 종의 해리가 신호의 감소로서 관찰될 수 있는 시간(해리기)인 완충제 유동의 시간이 있다. 그 다음, 남은 분석물을 칩에 결합된 리간드로부터 떼어낼 수 있고 절차를 여러 상이한 분석물 농도에서 반복할 수 있다. 실험은 절대적 결합 능력뿐만 아니라 커플링된 리간드의 동력학적 프로파일도 전체 실험 동안 유의하게 변화하지 않고 실험 전체에서 사용된 일련의 대조군을 사용함으로써 모니터링될 수 있도록 디자인된다. EDTA를 함유하는 전매특허 HEPES 완충 식염수(HBS-EP+, 지이 헬스케어, 영국 소재)는 전형적으로 분석물 샘플용 희석 완충제 및 해리기 동안의 유동 완충제로서 사용된다. 실험 데이터는 SPR 신호에 직접적으로 상응하는 임의 단위인 '공명 유닛'(RU)으로서 시간의 경과에 따라 기록된다. RU는 칩 표면 상에서의 굴절 지수의 변화에 정비례하고, 이 변화는 결합된 분석물의 질량의 대략적인 측정치이다. 그 다음, 전매특허 비아에발루션(BIAevaluation) 소프트웨어를 이용하여 데이터를 프로세싱할 수 있고 결합 모델을 데이터 세트에 피팅할 수 있다. 복귀된 결합(ka, M-1 s-1) 및 해리(kd, s-1) 속도 상수는 해리(KD, M) 친화성 상수의 계산을 가능하게 한다.
항체가 아민 결합에 의해 대략 2,000 RU의 최종 표면 밀도까지 전매특허 CM5 칩 표면에 공유커플링되는 분석을 이용하여 각각의 테스트 IgG와 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드 사이의 결합 친화성을 평가하였다. 항체에 결합된 리간드를 제거하기 위해 10 mM 글리신(pH 2.0)을 40초 동안 단일 주입하여 주기 사이에 칩 표면을 재생시켰다. 이 재생은 펩티드 결합 활성의 유의한 손실을 초래하지 않았다.
확신을 가지면서 적절한 결합 모델에 피팅될 수 있는 센서그램을 관찰하기에 충분한 시간 동안 합성 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 일련의 희석물들(1.6 내지 100 nM)을 항체 표면 상에 순차적으로 통과시켰다. 임의의 완충제의 인위적 결과 또는 비-특이적 결합 효과의 영향을 감소시키기 위해 각각의 IgG 데이터 세트로부터 블랭크 기준 유동 셀 데이터를 공제하였고 주요 데이터 세트로부터 제로 농도 완충제 블랭크를 이중 기준 공제하였다. 그 다음, 비아에발루션 소프트웨어를 이용하여 적절한 결합 모델을 각각의 분석물 적정으로부터의 데이터에 동시적으로 피팅하였다.
계산된 Chi2 값을 이용하여 데이터의 유효성을 평가하였고, 이때 허용가능한 값은 2 RU2 미만이다. 잔차를 이용하여 피팅의 전체 성공을 평가하였고, 이때 2 RU 미만의 편차가 허용가능하다.
Abet0007 IgG2에 대한 예시적 결과는 도 3에 제시되어 있다. 평균 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd) 및 해리 상수(KD)는 각각 1.6 x 105 M-1 s-1, 7.4 x 10-2 s-1 및 473 nM이다. 이들 파라미터들은 데이터에의 1:1 랭뮤어 피팅으로부터 유도되었다.
1.8 인간 혈장으로부터의 아밀로이드 베타 펩티드의 고갈에 의한 리드 항체의 기능적 특징규명
인간 혈액 혈장으로부터 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드를 면역침전시키는 리드 항체의 능력을 조사하기 위해 리드 항체를 혈장 고갈 분석에서 테스트하였다. 이 분석을 이용하여 각각의 항체에 대한 기능적 효능의 증거를 제공하였다. 요약하면, 인간 혈장 샘플을 3시간 동안 각각의 테스트 IgG와 함께 항온처리한 후, 항체 및 임의의 결합된 리간드를 제거하였다. 면역침전 전 및 후에 표준 기법을 이용하여 인간 혈장 샘플의 아밀로이드 베타 1-42 펩티드 함량을 분석하고, 이들 값을 이용하여 항체의 효능을 측정하였다. 혈장 샘플을 아밀로이드 베타 1-40 펩티드의 임의의 고갈에 대해서도 분석하여 리드 항체의 특이성을 평가하였다.
제조자의 설명서에 따라 각각의 테스트 항체를 다이나비드(Dynabeads)® M-270 카복실산 자기 비드(인비트로겐 라이프 테크놀로지스(Invitrogen Life Technologies), 영국 소재; 카탈로그 번호: 143-05D)에 별도로 공유연결하였다. 각각의 테스트 IgG에 대해, 자석을 이용하여 100 ㎕의 다이나비드를 100 ㎕의 25 mM MES(pH 5)(시그마, 영국 소재; 카탈로그 번호: M5287)로 2회 세척하여 현탁액으로부터 상기 비드를 분리하였다. 사용 직전에, EDC(피어스, 써모 사이언티픽((Pierce, Thermo Scientific), 미국 소재; 카탈로그 번호: 22981)를 냉각된 25 mM MES(pH 5)에 50 mg/㎖의 최종 농도까지 용해시켰다. 50 mg/㎖의 NHS 용액(피어스, 써모 사이언티픽; 카탈로그 번호: 24500)을 25 mM MES(pH 5)로 유사하게 제조하였다. 50 ㎕의 NHS 용액 및 50 ㎕의 EDC 용액을 세척된 다이나비드에 첨가하고, 이 다이나비드를 잘 혼합하고 30분 동안 실온에서 느리게 경사 회전시키면서 항온처리하였다. 자석을 이용하여 상기 비드를 펠렛화하고 상청액을 제거하였다. 비드를 100 ㎕의 25 mM MES(pH 5)로 2회 세척하였다. 각각의 테스트 IgG를 총 부피 100 ㎕의 25 mM MES(pH 5)로 0.6 mg/㎖까지 희석하였다. 세척된 비드를 리간드 용액에 재현탁하고 느리게 경사 회전시키면서 실온에서 30분 이상 동안 항온처리하였다. 그 후, 자석을 이용하여 비드를 펠렛화하고 100 ㎕의 50 mM 트리스 완충제(pH 7.4)(시그마, 영국 소재)로 1회 세척하였다. 그 다음, 비드를 100 ㎕의 마벨-PBS(3% 중량/부피)에 재현탁하고 4℃에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 상기 비드를 둘베코의 PBS(100 ㎕)로 2회 세척하고 PBS(100 ㎕)에 재현탁하였다.
EDTA-혈장 샘플을 스웨덴 쇠데르텔리에에 소재하는 아스트라제네카 헬쓰 클리닉(AstraZeneca Health Clinic)에서 익명의 공여자로부터 단리하였다. 대략 100 ㎖의 혈액을 각각의 공여자로부터 채취하고, 이것을 2개의 50 ㎖ 튜브 내에 모았다. EDTA를 5 mM의 최종 농도까지 첨가하여 응고를 방지하고, 튜브를 4℃에서 10분 동안 4,000 x g에서 원심분리하였다. 상청액(혈장)을 채취하여 1 ㎖ 튜브 내에 분취하고 필요할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 샘플을 후술된 바와 같이 아밀로이드 베타 1-42 펩티드 및 아밀로이드 베타 1-40 펩티드 함량에 대해 분석하였다.
항체로 코팅된 비드의 각각의 세트를 느리게 경사 회전시키면서 4℃에서 3시간 동안 EDTA-혈장의 1 ㎖ 분취액과 함께 별도로 항온처리한 후, 자석을 이용하여 상기 비드를 펠렛화하였다. 상청액을 상기 비드로부터 조심스럽게 제거하고 후술된 바와 같이 아밀로이드 베타 1-42 펩티드 및 아밀로이드 베타 1-40 펩티드에 대해 분석하였다.
인비트로겐(영국 소재; 카탈로그 번호: KHB3482)으로부터의 Aβ 40 인간 ELISA 키트를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 혈장 샘플의 아밀로이드 베타 1-40 펩티드 함량의 분석을 수행하였다. 요약하면, 인간 아밀로이드 베타 1-40 표준물을 사용하여 1 ng/㎖부터 7.81 pg/㎖까지 일련의 희석물을 생성하였다. 50 ㎖ 희석제 당 1개의 단백질분해효소 억제제 정제(로슈(Roche), 영국 소재; 카탈로그 번호: 11697498001)를 함유하는 표준 희석 완충제를 사용하여 희석물을 만들었다. 그 다음, 50 ㎕의 각각의 희석물을 아밀로이드 베타 펩티드의 N 말단에 대한 특이성을 갖는 전매특허 단일클론 항체로 미리 코팅된 상이한 마이크로타이터 웰에 첨가하였다. EDTA-혈장 샘플을 4℃ 및 2,000 x g에서 10분 동안 원심분리하고 50 ㎕의 각각의 샘플 상청액을 표준물과 동일한 마이크로타이터 플레이트 내의 별도의 웰에 첨가하였다. 그 다음, 50 ㎕의 전매특허 Hu Aβ 검출 항체(아밀로이드 베타 1-40 펩티드의 C 말단을 특이적으로 인식함)를 각각의 마이크로타이터 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 플레이트 밀봉제로 덮고 진탕하면서 실온에서 3시간 동안 항온처리하였다. 각각의 세척 동안 상기 플레이트가 15초 내지 30초 동안 침지되게 하면서 상기 플레이트를 400 ㎕의 세척 완충제로 4회 세척하였다. 그 다음, 상기 플레이트를 거꾸로 뒤집고 가볍게 두드려서 건조하였다. 100 ㎕의 전매특허 항-토끼 IgG HRP 접합체를 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 플레이트 밀봉제로 덮고 샘플을 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 다시, 각각의 세척 동안 상기 플레이트가 15초 내지 30초 동안 침지되게 하면서 상기 플레이트를 400 ㎕의 세척 완충제로 4회 세척하였다. 그 다음, 상기 플레이트를 거꾸로 뒤집고 가볍게 두드려서 건조하였다. 100 ㎕의 전매특허 안정화된 발색체를 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 실온에서 20분 동안 암실 내에서 항온처리하였다. 그 후, 100 ㎕의 전매특허 정지 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 정지 용액을 첨가한지 2시간 이내에 각각의 웰의 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. 일련의 인간 아밀로이드 베타 1-40 희석물들로부터 표준 곡선을 생성하고, 이것을 사용하여 테스트 EDTA-혈장 샘플에서 인간 아밀로이드 베타 1-40의 농도를 측정하였다.
이노제네틱스(Innogenetics)(벨기에 소재; 카탈로그 번호: 80177)로부터의 이노테스트(INNOTEST)® β-아밀로이드(1-42) 키트를 본질적으로 제조자의 설명서에 따라 사용하여 혈장 샘플의 아밀로이드 베타 1-42 펩티드 함량의 분석을 수행하였다. 요약하면, 인간 아밀로이드 베타 1-42 표준물을 사용하여 1 ng/㎖부터 7.81 pg/㎖까지 일련의 희석물을 생성하였다. 그 다음, 100 ㎕의 각각의 희석물을 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 C 말단에 대한 특이성을 갖는 전매특허 단일클론 항체로 미리 코팅된 상이한 마이크로타이터 웰에 첨가하였다. EDTA-혈장 샘플을 4℃ 및 2,000 x g에서 10분 동안 원심분리하고 100 ㎕의 각각의 샘플 상청액을 표준물과 동일한 마이크로타이터 플레이트 내의 별도의 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 플레이트 밀봉제로 덮고 진탕하면서 실온에서 3시간 동안 항온처리하였다. 상기 플레이트를 400 ㎕의 세척 완충제로 5회 세척한 후, 거꾸로 뒤집고 가볍게 두드려서 건조하였다. 100 ㎕의 전매특허 접합체 1(C1HS)(아밀로이드 베타 펩티드의 N 말단을 인식함)을 각각의 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 플레이트 밀봉제로 덮고 샘플을 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 다시, 상기 플레이트를 400 ㎕의 세척 완충제로 5회 세척한 후, 거꾸로 뒤집고 가볍게 두드려서 건조하였다. 그 다음, 100 ㎕의 접합체 2(C2)(바이오티닐화된 C1HS 항체에 결합하는 스트렙타비딘-HRP 접합체)를 각각의 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 플레이트 밀봉제로 덮고 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 상기 플레이트를 400 ㎕의 세척 완충제로 5회 세척한 후, 거꾸로 뒤집고 가볍게 두드려서 건조하였다. 100 ㎕의 전매특허 기질 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 30분 동안 항온처리한 후, 100 ㎕의 정지 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 정지 용액을 첨가한지 15분 이내에 각각의 웰의 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. 일련의 인간 아밀로이드 베타 1-42 희석물들로부터 표준 곡선을 생성하고, 이것을 사용하여 테스트 EDTA-혈장 샘플에서 인간 아밀로이드 베타 1-42의 농도를 측정하였다.
한 실험에서, Abet0007 IgG2 항체는 혈장 중의 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 수준을 80.47 pg/㎖부터 60.56 pg/㎖까지 감소시켰다(25% 감소). 제2 실험에서, 상기 수준은 197.43 pg/㎖부터 154.45 pg/㎖까지 감소되었다(22% 감소).
1.9 시험관내 면역조직화학을 이용한 천연 아밀로이드 베타에 대한 낮은 친화성을 갖는 리드 클론의 확인
천연 형태의 아밀로이드 베타 펩티드에 대한 낮은 친화성을 갖는 리드 클론을 확인할 목적으로 아밀로이드 베타에 결합하는 리드 항체의 능력을 테스트하였다. 요약하면, 리드 항체를 인간 알츠하이머병 뇌 절편 및 Tg2576 마우스 뇌 절편 상에서 스크리닝하여 시험관내에서 천연 아밀로이드에 결합된 항-아밀로이드 베타 1-42 항체를 확인하였다.
Tg2576 마우스는 인간 아밀로이드 전구체 단백질(APP)에 대한 유전자를 과다발현하는 형질전환 마우스이다. 이 유전자는 대략 9개월의 연령에서 시작되는, 마우스의 피질 및 해마에서의 아밀로이드 베타 플라크의 형성을 유발하는 2개의 점 돌연변이(Lys670Asn 및 Met671Leu)를 감마-세크레타제 절단 부위 내에 보유한다.
중증 알츠하이머병을 갖는 2명의 개체들(각각 ApoE 유전자형 3/3, Braak 단계 6 및 ApoE 유전자형 4/3, Braak 단계 5)의 전두 피질(하전두회)로부터 인간 뇌 조직을 단리하였다. 대조군으로서, 동등한 조직을 1명의 비-치매 개체(ApoE 유전형 3/3, Braak 단계 1)로부터 단리하였다. 모든 3개의 조직들은 네덜란드 뇌 은행(NBB)에 의해 공급되었다. 사용 전에 절편의 품질을 해마톡실린/에오신 염색으로 검증하였다. 15개월령의 Tg2576 마우스(2마리의 마우스), 18개월령의 Tg2576 마우스(6마리의 마우스) 및 22개월령의 Tg2576 마우스(2마리의 마우스)로부터 마우스 뇌 조직을 단리하였다.
먼저 파라핀 지지체 매트릭스를 제거함으로써 면역조직화학을 위해 4 내지 6 ㎛ 폭의 파라핀-포매된 뇌 절편을 제조하였다. 절편을 자일렌(5분, 2회), 무수 에탄올(3분, 2회), 95% 에탄올(3분, 2회), 70% 에탄올(3분, 2회), 90% 포름산(시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 영국 소재; 카탈로그 번호: 06440; 10분), 수돗물(20분, 3회) 및 PBS(5분, 2회)로 세척하였다. 그 다음, 절편을 100℃에서 20분 동안 마이크로파 오븐 내의 디바 데클로아커(Diva Decloaker) 용액(바이오케어 메디칼(Biocare Medical), 미국 소재; 카탈로그 번호: DV2004 G1)에서 끓였다. 그 다음, 샘플을 수조에서 40℃까지 냉각시킨 후, 증류수(5분) 및 PBS(5분, 3회)로 세척하였다.
리드 IgG 항체를 2 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖ 및 20 ㎍/㎖의 농도로 테스트하였다. 토끼 항-인간 이차 항체(다코(Dako), 덴마크 소재; 카탈로그 번호: A0482)를 1/400의 희석물로 사용한 후, 옴니맵(OmniMap) 항-토끼 HRP 접합체 항체(벤타나 메디칼 시스템스(Ventana Medical Systems), 미국 소재; 카탈로그 번호: 760-4311)를 사용하여 이들 IgG의 결합을 검출하였다. 크로모맵(ChromoMap) DAB 키트(벤타나 메디칼 시스템스, 미국 소재; 카탈로그 번호: 760-159)를 사용하여 신호를 검출하였다. 벤치마크(BenchMark) 자동화 슬라이드 제조 시스템(벤타나 메디칼 시스템스, 미국 소재)을 표준 프로토콜에 따라 사용하여 이들 염색 단계를 수행하였다.
염색의 점수화는 20배 내지 40배 광학 확대율 하에서 2명 이상의 상이한 사람들에 의해 맹검 방식으로 수행되었다. 0(플라크의 염색 부재)부터 4(플라크의 강한 염색)까지의 등급을 이용하여 시험관내 플라크 결합을 표시하였다.
Abet0007 IgG2는 인간 알츠하이머병 뇌 또는 마우스 Tg2576 뇌에서 플라크의 염색을 보이지 않았다(점수 = 0). 대조적으로, 양성 대조군 항체는 동일한 조건 하에서 인접 절편 상에서 4의 점수를 생성하였다. 대표적인 영상은 도 4에 제시되어 있다.
실시예 2. 상보성 결정 영역 3(CDR3)의 지정된 돌연변이를 통한 Abet0007의 항체 최적화
2.1 scFv 포맷으로의 Abet0007 모클론의 전환
친화성 최적화를 준비하기 위해 모클론을 IgG2 포맷으로부터 단일 쇄 가변 단편(scFv) 포맷으로 전환하였다. 코돈-최적화된 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인들을 특이적 클로닝 부위 및 유연성 링커 영역이 추가된 그들 각각의 IgG 벡터로부터 별도로 증폭하였다. 그 다음, 재조합 PCR을 본질적으로 문헌(Vaughan et al., 1996)에 기재된 바와 같이 수행하여 완전한 scFv 구축물을 생성하였고, 이 구축물을 pCantab10.5 파지미드 벡터 내로 클로닝하였다. pCantab10.5 벡터는 표준 His 및 myc 태그 이외의 태그의 추가를 용이하게 하기 위해 추가 제한 부위를 함유하는 pCantab6 벡터의 변경된 버전이다.
2.2 표적화된 돌연변이유발에 의한 Abet0007의 최적화
친화성에 기초한 파지 디스플레이 선택과 함께 표적화된 돌연변이유발 방법을 이용하여 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 대한 개선된 친화성을 위해 리드 항체(Abet0007)를 최적화하였다. 문헌(Clackson and Lowman (2004) A Practical Approach, Oxford University Press)에 기재된 바와 같이 표준 분자생물학 기법을 이용하여 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 상보성 결정 영역 3(CDR3)의 올리고뉴클레오타이드-지정된 돌연변이유발을 수행함으로써 Abet0007로부터 유도된 큰 scFv-파지 라이브러리를 생성하였다.
인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 대한 보다 높은 친화성을 갖는 변이체를 풍부하게 하기 위해 상기 라이브러리에 대한 친화성에 기초한 파지 디스플레이 선택을 수행하였다. 상기 선택은 본질적으로 이전에 기재된 바와 같이 수행되었다(Hawkins et al., 1992; Schier et al., 1996; Thompson et al., 1996). 요약하면, scFv 파지 입자를 용액에서 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(r펩티드, 미국 소재; 카탈로그 번호: A1117)와 함께 항온처리하였다. 그 다음, 항원에 결합된 scFv-파지를 제조자의 권고에 따라 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드(다이나비드® M280, 인비트로겐 라이프 사이언시스, 영국 소재) 상에서 포획하였다. 그 다음, 선택된 scFv-파지 입자를 이전에 기재된 바와 같이 레스큐하고(Osbourn et al., 1996), 감소하는 농도(3 라운드에 걸쳐 200 nM부터 2 nM까지)의 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42 항원의 존재 하에서 선택 과정을 반복하였다.
2.3 직접 결합 분석을 이용한 개선된 클론의 확인
2.2 단락에 기재된 표적화된 돌연변이유발 방법으로부터 1760개의 scFv를 선택 라운드 2 및 3으로부터 무작위적으로 선택하였다. 본질적으로 단락 1.3에 기재된 바와 같이 직접 결합 분석을 이용하여 이들 클론들을 스크리닝하였다. 요약하면, 주변세포질 제제로부터의 비정제된 scFv를 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에의 증가된 결합에 대해 테스트하고 스트렙타비딘 크립테이트 및 항-6his-XL665 검출 시약과 함께 HTRF™ 기술을 이용하여 검출하였다.
0.5 mM EDTA 및 0.5 M 수크로스를 포함하는 50 mM MOPS 완충제(pH 7.4)로 주변세포질 제제로부터의 비정제된 scFv를 제조한 후, 그레이너 384웰 V 바닥 플레이트(그레이너 바이오원, 독일 소재; 카탈로그 번호: 781280)를 사용하여 50 mM MOPS(pH 7.4)(시그마, 영국 소재; 카탈로그 번호: M9381), 0.4 M 불화칼륨(비디에이치 케미칼스(BDH Chemicals), 미국 소재; 카탈로그 번호: 103444T), 0.1% 지방산 무함유 소 혈청 알부민(시그마, 영국 소재; 카탈로그 번호: A6003) 및 0.1% 트윈 20(부피/부피)(시그마, 영국 소재; 카탈로그 번호: P2287)을 함유하는 분석 완충제로 1%까지 희석하였다. 미니트랙™(퍼킨엘머, 미국 소재) 액체 취급 로봇을 이용하여 5 ㎕의 희석된 scFv 샘플을 분석 플레이트(코스타® 384웰 흑색 얕은 웰, 코닝 라이프 사이언시스; 카탈로그 번호: 3676)로 옮겼다. 그 다음, 5 ㎕의 분석 완충제를 각각의 웰에 첨가하였다. 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(r펩티드, 미국 소재; 카탈로그 번호: A1117)의 20 nM 용액을 분석 완충제로 제조하고, 5 ㎕의 이 용액을 분석 플레이트에 첨가하였다. 스트렙타비딘 크립테이트(시스바이오 인터네이셔날, 프랑스 소재; 카탈로그 번호: 610SAKLB)와 항-His6-XL665(시스바이오 인터네이셔날, 프랑스 소재; 카탈로그 번호: 61HISXLB) 검출 시약을 분석 완충제에서 조합하여 7 nM 농도의 스트렙타비딘 크립테이트 및 60 nM 농도의 항-His6-XL665를 제공한 후, 5 ㎕의 이 검출 칵테일을 분석 플레이트의 모든 웰들에 첨가하였다. scFv 샘플을 5 ㎕의 분석 완충제로 교체함으로써 각각의 플레이트에 대해 비-특이적 결합 웰(음성 대조군)을 지정하였다. 엔비전 플레이트 판독기(퍼킨엘머, 미국 소재)를 이용하여 620 nm 및 665 nm 방사 파장에서 시간 분해 형광을 판독하기 전에, 분석 플레이트를 밀봉하고 실온에서 2.5시간 동안 항온처리하였다. 데이터 분석을 이전에 기재된 바와 같이(1.3 단락) 수행하고 % 델타 F 값을 이용하여 인접 웰들에서 분석 신호를 비교하였다. "히트(hit)"는 Abet0007 scFv에 대해 관찰된 신호보다 더 큰 % 델타 F를 생성한 scFv 샘플로서 정의되었다.
2.4 에피토프 경쟁 분석을 이용한 개선된 클론의 확인
Abet0007 모클론보다 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에의 더 높은 결합을 나타낸 클론에 대한 DNA 서열결정을 수행하였다(Osbourn et al., 1996; Vaughan et al., 1996). 독특한 단백질 서열을 갖는 scFv를 이. 콜라이에서 발현시키고 친화성 크로마토그래피에 이어서 완충제 교환으로 정제하였다. 그 다음, 이들 scFv의 결합 친화성을 Abet0042로서 지칭되는 벤치마크 항체(인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 대해 Abet0007과 유사한 친화성을 가짐)에 대한 에피토프 경쟁 분석에서 테스트하였다. 이 경쟁 분석에서, 테스트 scFv 샘플은 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에의 결합에 대해 Abet0042 IgG와 경쟁한다. 이전에 기재된 바와 같이(1.6 단락) HTRF™ 기술을 이용하여 Abet0042 IgG와 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 결합을 검출한다. 요약하면, 정제된 scFv의 일련의 희석물을 Abet0042 IgG, 바이오티닐화된 아밀로이드 베타 1-42 펩티드, 스트렙타비딘 크립테이트 및 항-인간 Fc IgG XL665의 혼합물에 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 항온처리한 후 시간 분해 형광을 판독하였다.
그레이너 96웰 U 바닥 플레이트(그레이너 바이오원, 독일 소재; 카탈로그 번호: 650201)를 사용하여 50 mM MOPS 완충제(pH 7.4)(시그마, 영국 소재; 카탈로그 번호: M9381), 0.4 M 불화칼륨(비디에이치 케미칼스, 미국 소재; 카탈로그 번호: 103444T), 0.1% 지방산 무함유 소 혈청 알부민(시그마, 영국 소재; 카탈로그 번호: A6003) 및 0.1% 트윈 20(시그마, 영국 소재; 카탈로그 번호: P2287)을 함유하는 분석 완충제로 정제된 scFv를 연속적으로 희석하였다. 미니트랙™(퍼킨엘머, 미국 소재) 액체 취급 로봇을 이용하여 5 ㎕의 각각의 scFv 희석물을 분석 플레이트(코스타® 384웰 흑색 얕은 웰, 코닝 라이프 사이언시스; 카탈로그 번호: 3676)로 이중으로 옮겼다. 바이오티닐화된 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(r펩티드, 미국 소재; 카탈로그 번호: A1117)의 20 nM 용액을 분석 완충제로 제조하고, 5 ㎕의 바이오티닐화된 펩티드 용액을 분석 플레이트에 첨가하여 20 ㎕의 최종 분석 부피로 최종 5 nM 농도의 펩티드를 제공하였다. 분석 플레이트를 밀봉하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 스트렙타비딘 크립테이트와 항-인간 Fc IgG XL665를 분석 완충제에서 각각 7 nM 및 20 nM로 조합하고, 5 ㎕의 이 용액을 분석 플레이트에 첨가하였다. Abet0042 IgG를 분석 완충제로 2.4 nM까지 희석하고, 5 ㎕를 분석 플레이트에 첨가하여 0.6 nM의 최종 IgG 농도를 생성하였다. Abet0042 IgG를 5 ㎕의 분석 완충제로 교체함으로써 각각의 플레이트에 대해 비-특이적 결합 웰(음성 대조군)을 지정하였다. 엔비전 플레이트 판독기(퍼킨엘머, 미국 소재)를 이용하여 620 nm 및 665 nm 방사 파장에서 시간 분해 형광을 판독하기 전에, 분석 플레이트를 밀봉하고 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다.
각각의 샘플에 대한 % 델타 F 값 및 % 특이적 결합을 계산함으로써 데이터를 분석하였다. % 델타 F를 방정식 1에 따라 결정하고, % 특이적 결합을 방정식 2를 이용하여 계산하였다. 방정식 3에 기재된 바와 같은 4 파라미터 로지스틱 방정식을 이용하여 곡선 피팅함으로써 프리즘(그래프패드 소프트웨어, 미국 소재)을 이용하여 IC50 값을 결정하였다.
방정식 3:
Figure 112015046136268-pct00004
상기 식에서, Y는 특이적 결합이고, X는 농도의 로그이다.
예시적 결과는 도 5에 제시되어 있다. 원래의 리드 클론인 Abet0007은 159 nM의 IC50을 갖는 반면, 가장 개선된 클론인 Abet0144는 5.5 nM의 IC50 값을 갖는다.
2.5 표면 플라스몬 공명에 의한 정제된 scFv 포맷의 친화성 개선된 클론의 동력학적 프로파일링
표면 플라스몬 공명을 이용하여 HTRF™ 에피토프 경쟁 분석(2.4 단락)에서 모서열인 Abet0007에 비해 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 대한 결합 친화성의 유의한 개선을 보인 정제된 scFv 클론을 분석하였다. 요약하면, 비아코어 T-100(지이 헬쓰케어, 영국 소재) 바이오센서 기계를 이용하여 각각의 정제된 scFv와 합성에 의해 생성된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드 사이의 상호작용의 동력학적 파라미터를 평가하였다. 이들 실험은 본질적으로 문헌(Karlsson et al., 1991)에 기재된 바와 같이 수행되었다. 더 상세한 사항에 대해서는 1.7 단락을 참조한다.
바이오티닐화된 합성 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(r펩티드, 미국 소재; 카탈로그 번호: A1117)가 바이오틴/스트렙타비딘 상호작용을 통해 대략 700 RU의 최종 표면 밀도까지 전매특허 SA 센서 칩에 비-공유결합되는 분석을 이용하여 각각의 테스트 scFv와 인간 아밀로이드 베타 1-42 사이의 결합 친화성을 평가하였다. 펩티드에 결합된 scFv를 제거하기 위해 10 mM 글리신(pH 2.0)을 20초 동안 단일 주입하여 주기 사이에 칩 표면을 재생시켰다. 이 재생은 펩티드 결합 능력의 유의한 손실을 초래하지 않았다.
확신을 가지면서 적절한 결합 모델에 피팅될 수 있는 센서그램을 관찰하기에 충분한 시간 동안 각각의 정제된 scFv의 일련의 희석물들(12.5 내지 400 nM)을 펩티드 표면 상에 순차적으로 통과시켰다. 임의의 완충제의 인위적 결과 또는 비-특이적 결합 효과의 영향을 감소시키기 위해 주요 데이터 세트로부터 제로 농도 완충제 블랭크를 공제하였다. 그 다음, 비아에발루션 소프트웨어를 이용하여 적절한 결합 모델을 각각의 분석물 적정으로부터의 데이터에 동시적으로 피팅하였다.
계산된 Chi2 값을 이용하여 데이터의 유효성을 평가하였고, 이때 허용가능한 값은 4 RU2 미만이다. 잔차를 이용하여 피팅의 전체 성공을 평가하였고, 이때 20 RU 미만의 편차가 허용가능하다.
Abet0144 scFv에 대한 예시적 결과는 도 6에 제시되어 있다. 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd) 및 해리 상수(KD)는 각각 2.01 x 105 M-1 s-1, 6.66 x 10-3 s-1 및 33.2 nM이다. 이들 파라미터들은 데이터에의 1:1 랭뮤어 피팅으로부터 유도되었다.
2.6 인간 IgG1-TM으로의 친화성 개선된 scFv의 재포맷화
IgG1-TM 항체 포맷은 보다 낮은 힌지 및 CH2 불변 도메인 내에 3개의 단일 아미노산 치환(삼중 돌연변이체: TM)을 함유하는 인간 IgG1 동종형이다(Oganesyan et al., 2008). 삼중 돌연변이 L234F/L235E/P331S('TM')은 인간 IgG1 분자의 보다 낮은 힌지 및 CH2 도메인 내로 도입되었을 때 상기 분자와 인간 CD64, CD32A, CD16 및 C1q의 결합에 있어서 상당한 감소를 야기한다. 이들 TM 돌연변이를 사용하여 매우 낮은 이펙터 기능을 갖는 인간 동종형을 생성한다. 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인들을, 각각 전체 인간 항체 중쇄 및 경쇄를 발현하는 벡터 내로 서브클로닝함으로써 scFv를 IgG1-TM으로 재포맷화하였다. 가변 중쇄를, 인간 중쇄 불변 도메인 및 조절 요소를 함유하는 포유동물 발현 벡터(pEU 1.4) 내로 클로닝하여 포유동물 세포에서 전체 IgG1-TM 중쇄를 발현시켰다. 유사하게, 가변 경쇄 도메인을 인간 람다 경쇄 불변 도메인 및 조절 요소의 발현용 포유동물 발현 벡터(pEU 4.4) 내로 클로닝하여 포유동물 세포에서 전체 IgG 경쇄를 발현시켰다. IgG 항체를 본질적으로 1.5 단락에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다.
2.7 생식세포주화
친화성 최적화 아밀로이드 베타 1-42 펩티드 특이적 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인의 아미노산 서열을 VBASE 데이터베이스(Tomlinson et al., 1992) 내의 공지된 인간 생식세포주 서열과 정렬하고, 가장 유사한 생식세포주를 서열 유사성으로 확인하였다. 최적화된 항체 계통의 VH 도메인의 경우 이것은 Vh3-23(DP-47)이었고 VL 도메인의 경우 이것은 Vλ3-3r(DPL-23)이었다.
생식세포주화 과정은 VH 도메인 및 VL 도메인 내의 골격 잔기를 가장 유사한 생식세포주 서열로 복귀시켜 인간 항체들을 동일하게 일치시키는 것으로 구성되었다. Abet0144의 경우, VH 도메인에서 변화를 요구하는 잔기는 없었으나(표 1), 총 5개의 변화가 VL 도메인의 골격 내에서 만들어졌다. 이들 변화는 카바트 위치 1, 2, 3, 40 및 81(표 2)에서 일어났다. 플랭킹 잔기 1 및 3과 동일한 시간에 생식세포주화된 경쇄 서열 내의 잔기 2를 제외한 버니어 잔기(Foote et al., 1992)는 생식세포주화되지 않았다. 클락손(Clackson) 및 로우만(Lowman)의 문헌(Clackson et al., 2004)에 기재된 바와 같이 적절한 돌연변이유발성 프라이머와 함께 표준 부위 지정된 돌연변이유발 기법을 이용하여 이들 아미노산 잔기들의 생식세포주화를 수행하였다.
Figure 112015046136268-pct00005
Figure 112015046136268-pct00006
2.8 표면 플라스몬 공명을 이용한 친화성 최적화 IgG의 결합 동력학의 측정
표면 플라스몬 공명을 이용하여 친화성 최적화 IgG(2.6 단락) 및 그의 생식세포주화된 대응물(2.7 단락)의 결합 동력학을 분석하였다. 요약하면, 비아코어 T-100(지이 헬쓰케어, 영국 소재) 바이오센서 기계를 이용하여 각각의 테스트 IgG와 합성에 의해 생성된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드 사이의 상호작용의 동력학적 파라미터를 평가하였다. 이들 실험은 본질적으로 문헌(Karlsson et al., 1991)에 기재된 바와 같이 수행되었다. 더 상세한 사항에 대해서는 1.7 단락을 참조한다.
항체가 아민 결합에 의해 대략 2,000 RU의 최종 표면 밀도까지 전매특허 CM3 칩 표면에 공유커플링되는 분석을 이용하여 각각의 테스트 IgG와 인간 아밀로이드 베타 1-42 사이의 결합 친화성을 평가하였다. 항체에 결합된 리간드를 제거하기 위해 10 mM 글리신(pH 2.0)을 40초 동안 단일 주입하여 주기 사이에 칩 표면을 재생시켰다. 이 재생은 펩티드 결합 능력의 유의한 손실을 초래하지 않았다.
확신을 가지면서 적절한 결합 모델에 피팅될 수 있는 센서그램을 관찰하기에 충분한 시간 동안 합성 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 일련의 희석물들(1.6 내지 50 nM)을 항체 표면 상에 순차적으로 통과시켰다. 임의의 완충제의 인위적 결과 또는 비-특이적 결합 효과의 영향을 감소시키기 위해 각각의 IgG 데이터 세트로부터 블랭크 기준 유동 셀 데이터를 공제하였고 주요 데이터 세트로부터 제로 농도 완충제 블랭크를 이중 기준 공제하였다. 그 다음, 비아에발루션 소프트웨어를 이용하여 적절한 결합 모델을 각각의 분석물 적정으로부터의 데이터에 동시적으로 피팅하였다.
계산된 Chi2 값을 이용하여 데이터의 유효성을 평가하였고, 이때 허용가능한 값은 2 RU2 미만이다. 잔차를 이용하여 피팅의 전체 성공을 평가하였고, 이때 2 RU 미만의 편차가 허용가능하다.
Abet0144-GL(생식세포주화된) IgG1-TM에 대한 예시적 결과는 도 7에 제시되어 있다. 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd) 및 해리 상수(KD)는 각각 2.08 x 105 M-1 s-1, 1.97 x 10-3 s-1 및 9.50 nM이다. 이들 파라미터들은 데이터에의 1:1 랭뮤어 피팅으로부터 유도되었다.
2.9 표면 플라스몬 공명을 이용한 친화성 최적화 IgG의 특이성 프로파일링
표면 플라스몬 공명을 이용하여 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 대한 친화성 최적화 IgG의 특이성을 검증하였다. 요약하면, 비아코어 T-100(지이 헬쓰케어, 영국 소재) 바이오센서 기계를 이용하여 각각의 테스트 IgG와 다양한 작은 펩티드들(합성에 의해 생성된 인간 아밀로이드 베타 1-42 및 인간 아밀로이드 베타 1-40을 포함함) 사이의 상호작용의 동력학적 파라미터를 평가하였다. 이들 실험은 본질적으로 문헌(Karlsson et al., 1991)에 기재된 바와 같이 수행되었다. 더 상세한 사항에 대해서는 1.7 단락을 참조한다.
항체가 아민 결합에 의해 대략 2,000 RU의 최종 표면 밀도까지 전매특허 CM3 칩 표면에 공유커플링되는 분석을 이용하여 각각의 테스트 IgG와 각각의 펩티드 사이의 결합 친화성을 평가하였다. 항체에 결합된 리간드를 제거하기 위해 10 mM 글리신(pH 2.0)을 40초 동안 단일 주입하여 주기 사이에 칩 표면을 재생시켰다. 이 재생은 펩티드 결합 능력의 유의한 손실을 초래하지 않았다.
확신을 가지면서 결합을 보이지 않거나 적절한 결합 모델에 피팅될 수 있는 센서그램을 관찰하기에 충분한 시간 동안 400 nM의 각각의 테스트 펩티드를 항체 표면 상에 순차적으로 통과시켰다. 임의의 완충제의 인위적 결과 또는 비-특이적 결합 효과의 영향을 감소시키기 위해 각각의 IgG 데이터 세트로부터 블랭크 기준 유동 셀 데이터를 공제하였고 주요 데이터 세트로부터 제로 농도 완충제 블랭크를 이중 기준 공제하였다.
Abet0144-GL(생식세포주화된) IgG1-TM에 대한 예시적 결과는 도 8에 제시되어 있다. 2개의 펩티드들(바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42(r펩티드, 미국 소재; 카탈로그 번호: A1117) 및 비표지된 인간 아밀로이드 베타 1-42(r펩티드, 미국 소재; 카탈로그 번호: A1165))은 항체에의 강한 결합을 보인 반면, 3개의 펩티드들(바이오티닐화된 스크램블된 인간 아밀로이드 베타 1-42(아나스펙, 미국 소재; 주문제작 합성), 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-40(r펩티드, 미국 소재; 카탈로그 번호: A1111) 및 비표지된 인간 아밀로이드 베타 1-40(아나스펙, 미국 소재; 카탈로그 번호: 24236))은 항체에의 결합을 보이지 않았다.
2.10 생화학적 에피토프 경쟁 분석 포맷에서 Abet0144-GL IgG1-TM의 특이성 프로파일링
다른 인간 아밀로이드 베타 펩티드에의 결합에 대한 Abet0144-GL IgG1-TM의 특이성을 테스트하기 위해, 경쟁 분석을 개발하였다. 이 분석에서, 고정된 농도(0.28 nM)의 Abet0144-GL IgG1-TM의 존재 하에서 고정된 농도(1.5 nM)의 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(r펩티드, 미국 소재; 카탈로그 번호: A1117)를 다양한 상이한 농도의 비표지된 인간 아밀로이드 베타 펩티드들(1-42, 1-40, 1-16, 12-28, pyro 3-42, pyro 11-42 및 스크램블된 1-42(아나스펙 카탈로그 번호: 각각 20276, 24236, 24226, 24230, 29907, 29903 및 25383)를 포함함)과 함께 항온처리하였다. 시간 분해 형광 공명 에너지 전달(TR-FRET)을 이용하여 Abet0144-GL IgG1-TM과 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 결합의 억제를 검출함으로써 펩티드 경쟁을 평가하였다. 이것은 유로퓸 크립테이트로 표지된 항-인간 Fc IgG(시스바이오 인터네이셔날, 프랑스 소재; 카탈로그 번호: 61HFCKLB) 및 XL665로 표지된 스트렙타비딘(시스바이오 인터네이셔날, 프랑스 소재; 카탈로그 번호: 611SAXLB) TR-FRET 검출 시약의 사용을 수반한다.
실험을 코스타 384웰 얕은 바닥 마이크로타이터 플레이트에서 셋업하였다. 1.5 nM의 최종 분석 농도를 제공하기 위해 5 ㎕/웰의 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42(6 nM)를 (음성 결합 분석 대조군 웰을 제외한) 분석 플레이트의 모든 웰들에 첨가하였다. 5 ㎕의 분석 완충제만을 음성 결합 분석 대조군 웰에 첨가하였다. 10 μM의 최고 최종 분석 펩티드 농도를 제공하기 위해 40 μM의 최고 농도에서 출발하는 각각의 테스트 펩티드의 이중 11점 1:3 연속 적정을 준비하였다. 그 다음, 웰 당 5 ㎕의 각각의 테스트 펩티드 연속 희석물을 384웰 분석 플레이트로 옮겼다. 5 ㎕의 분석 완충제만을 총 결합 분석 대조군 웰 및 음성 결합 분석 대조군 웰에 첨가하였다. Abet0144-GL IgG1-TM을 희석하여 1.12 nM의 작업 용액을 제공하였다. 0.28 nM의 최종 분석 Abet0144-GL-IgG1-TM 농도를 생성하기 위해 웰 당 5 ㎕의 이 용액을 384웰 분석 플레이트의 모든 웰들에 첨가하였다. 마지막으로, 유로퓸 크립테이트로 표지된 항-인간 Fc(2.4 nM) 및 XL665로 표지된 스트렙타비딘(60 nM)을 함유하는 조합된 용액을 제조하였다. 유로퓸 크립테이트로 표지된 항-인간 Fc 및 XL665로 표지된 스트렙타비딘의 최종 농도가 각각 0.6 nM 및 15 nM이도록 웰 당 5 ㎕의 이 용액을 384웰 분석 플레이트의 모든 웰들에 첨가하였다. 최종 분석 부피는 20 ㎕이었고 각각의 개별 분석 성분은 요구된 최종 분석 농도의 4배 농도로 5 ㎕ 첨가물로서 첨가되었다는 것을 주목한다. 모든 시약들을, 50 mM MOPS(pH 7.4)(시그마, 영국 소재; 카탈로그 번호: M9381), 0.4 M KF(비디에이치 케미칼스, 미국 소재; 카탈로그 번호: 103444T), 0.1% 지방산 무함유 소 혈청 알부민(시그마, 영국 소재; 카탈로그 번호: A6003) 및 0.1% 트윈 20(부피/부피)(시그마, 영국 소재; 카탈로그 번호: P2287)을 함유하는 분석 완충제로 희석하였다.
엔비전 플레이트 판독기(퍼킨엘머, 미국 소재)를 이용하여 620 nm 및 665 nm 방사 파장에서 시간 분해 형광을 판독하기 전에, 분석 플레이트를 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. 각각의 샘플에 대한 % 델타 F 값을 계산함으로써 데이터를 분석하였다. % 델타 F를 방정식 1에 따라 결정하였다.
방정식 1:
Figure 112015046136268-pct00007
% 델타 F 값을 이용하여 % 특이적 결합을 방정식 2에 기재된 바와 같이 계산하였다.
방정식 2:
Figure 112015046136268-pct00008
Abet0144-GL IgG1-TM에 대한 예시적 결과는 도 9에 제시되어 있다. 이들 결과는 Abet0144-GL IgG1-TM이 인간 아밀로이드 베타 1-42, pyro 3-42 및 pyro 11-42 펩티드에 결합하나 인간 아밀로이드 베타 1-40 펩티드 또는 펩티드 절두체 1-16 및 12-28에는 결합하지 않는다는 것을 입증한다.
2.11 인간 혈장으로부터의 아밀로이드 베타 펩티드의 고갈에 의한 리드 항체의 기능적 특징규명
인간 혈액 혈장으로부터 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드를 면역침전시키는 리드 항체의 능력을 조사하기 위해 리드 항체를 혈장 고갈 분석에서 테스트하였다. 이 분석을 이용하여 각각의 항체에 대한 기능적 효능의 증거를 제공하였다. 이 분석은 정확히 1.8 단락에 기재된 바와 같이 수행되었다.
한 실험에서, Abet0144-GL IgG1-TM 항체는 혈장 중의 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 수준을 13.54 pg/㎖부터 9.86 pg/㎖까지 감소시켰다(27% 감소). 제2 실험에서, 상기 수준은 40.06 pg/㎖부터 34.65 pg/㎖까지 감소되었다(14% 감소).
2.12 시험관내 면역조직화학을 이용한 아밀로이드 베타에 대한 천연 결합을 갖는 개선된 클론의 확인
천연 아밀로이드 베타 펩티드를 인식하는 리드 클론을 확인할 목적으로 아밀로이드 베타에 결합하는 친화성 최적화 IgG의 능력을 테스트하였다. 요약하면, 인간 알츠하이머병 뇌 절편 및 Tg2576 마우스 뇌 절편 상에서 리드 항체를 스크리닝하여 시험관내에서 천연 아밀로이드에 결합된 항-아밀로이드 베타 1-42 항체를 확인하였다. 실험은 본질적으로 1.9 단락에 기재된 바와 같이 수행되었다.
이들 실험에서, 중증 알츠하이머병을 갖는 2명의 개체들(여성, ApoE 4/3, 86세; 여성, ApoE 3/3, 67세)의 전두 피질 및 해마로부터 인간 뇌 조직을 단리하였다. 18개월령의 Tg2576 마우스(6마리의 마우스)로부터 마우스 뇌 조직을 단리하였다. 항체를 2 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖ 및 20 ㎍/㎖의 농도로 테스트하였다.
한 실험에서, Abet0144-GL IgG1-TM 항체는 확산성 플라크(DP) 또는 뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA) 플라크를 염색하지 않았다(점수 = 0). 그러나, 상기 항체는 Tg2576 뇌 절편 상에서 1의 점수로 코어 플라크(CP)를 염색하였고 인간 AD 뇌 절편 상에서 1.5의 점수로 코어 플라크(CP)를 염색하였다. 대조적으로, 양성 대조군 항체는 동일한 조건 하에서 인접 절편들 상에서 모든 플라크들(CP, DP, CAA)에 대해 3 내지 4의 점수를 생성하였다. 대표적인 영상은 도 10에 제시되어 있다.
실시예 3. 플랭킹 버니어 잔기를 포함하는 모든 6개의 CDR들의 돌연변이를 통한 Abet0144-GL의 항체 최적화
3.1 리보좀 디스플레이에 적합한 scFv 포맷으로의 Abet0144-GL 모클론의 전환
친화성 최적화를 준비하기 위해 모클론을 IgG1-TM 포맷으로부터 단일 쇄 가변 단편(scFv) 포맷으로 전환시켰다. 코돈-최적화된 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인들을 특이적 클로닝 부위 및 유연성 링커 영역이 추가된 그들 각각의 IgG 벡터로부터 별도로 증폭하였다. 그 다음, 재조합 PCR을 수행하여 완전한 scFv 구축물을 생성하였고, 이 구축물을 리보좀 디스플레이에 필요한 구조적 특징을 함유하는 변경된 pUC 벡터(pUC-RD) 내로 클로닝하였다. 이들 특징은 엑소뉴클레아제(exonuclease)에 의한 mRNA 전사체의 분해를 방지하기 위한 5' 및 3' 줄기 루프, 리보좀과 mRNA 전사체의 결합을 촉진하기 위한 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열, 및 번역된 scFv 분자가 리보좀에 부착된 상태를 여전히 유지하면서 접혀지게 하는 유전자III 스페이서를 포함한다(Groves et al., 2005).
3.2 표적화된 돌연변이유발에 의한 Abet0144-GL의 최적화
친화성에 기초한 리보좀 디스플레이 선택과 함께 표적화된 돌연변이유발 방법을 이용하여 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 대한 개선된 친화성을 위해 리드 항체(Abet0144-GL)를 더 최적화하였다. 클락손(Clackson) 및 로우만(Lowman)의 문헌(Clackson et al., 2004)에 기재된 바와 같이 표준 분자생물학 기법을 이용하여 모든 6개의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 상보성 결정 영역들(CDR들)의 올리고뉴클레오타이드-지정된 돌연변이유발을 수행함으로써 Abet0144-GL로부터 유도된 큰 scFv-리보좀 라이브러리를 생성하였다. 각각의 CDR로부터의 돌연변이된 서열을 별도의 라이브러리로서 친화성-최적화하였다. VHCDR1 앞의 5개 버니어 잔기들(카바트 잔기 26부터 30까지)도 표적화된 돌연변이유발을 이용하여 무작위화하고 이들 서열들을 조합하고 남은 VHCDR1 라이브러리로 성숙시켰다. 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 대한 보다 높은 친화성을 갖는 변이체를 풍부하게 하기 위해 모든 라이브러리들에 대해 친화성에 기초한 리보좀 디스플레이 선택을 수행하였다. 상기 선택은 본질적으로 이전에 기재된 바와 같이 수행되었다(Hanes et al., 2000).
요약하면, Abet0144-GL 리드 클론의 6개 표적화된 돌연변이유발 라이브러리들(하나가 각각의 CDR을 커버함)을 mRNA로 별도로 전사하였다. 정지된 번역 과정을 이용하여 mRNA-리보좀-scFv 삼차 복합체를 형성하였다(Hanes et al., 1997). 그 다음, 이들 복합체들에 대해 감소하는 농도(100 nM부터 10 nM까지)의 합성 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(바켐, 독일 소재, 카탈로그 번호: H-5642)의 존재 하에서 항온처리된 4 라운드의 선택을 수행하여 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 대한 보다 높은 친화성을 갖는 변이체를 선택하였다. 그 다음, 항원에 결합된 이들 복합체들을 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드(다이나비드™, 인비트로겐, 영국 소재; 카탈로그 번호: 112-05D) 상에서 포획하고 비-특이적 리보좀 복합체를 세척하여 제거하였다. 그 후, mRNA를 결합된 리보좀 복합체로부터 단리하고 cDNA로 역전사하고 PCR로 증폭하였다. 이 DNA를 다음 라운드의 선택을 위해 사용하였다.
4 라운드의 친화성 성숙 후, 스크리닝 목적으로 각각의 선택 결과물을 클로닝하였다. 본질적으로 문헌(McCafferty et al., 1994)에 기재된 바와 같이 리보좀 디스플레이 구축물의 NotI/NcoI 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease)(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs), 미국 소재; 카탈로그 번호: R0189L, R0193L) 분해를 수행한 후, T4 DNA 리가제(ligase)(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 미국 소재; 카탈로그 번호: M0202L)를 사용하여 NotI/NcoI로 분해된 pCANTAB6 내로 라이게이션시킴으로써 리보좀 디스플레이에 의해 단리된 scFv를 파지미드 벡터 pCANTAB6 내로 클로닝하였다.
3.3 에피토프 경쟁 분석을 이용한 개선된 클론의 확인
3.2 단락에 기재된 표적화된 돌연변이유발 방법의 선택 라운드 3 및 4로부터 무작위적으로 선택된 2024개의 scFv를 세균에서 발현시켜 비정제된 주변세포질 scFv를 생성하였다. HTRF™ 플랫폼을 이용하여 경쟁 포맷 분석에서 Abet0144-GL IgG1-TM과 동일한 에피토프를 통해 합성 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 결합할 수 있는 scFv를 밝혔다. 구체적으로, 단일 농도의 각각의 비정제된 주변세포질 테스트 scFv의 존재 하에서 스트렙타비딘 크립테이트(바이오티닐화된 아밀로이드 베타 1-42 펩티드와 관련됨)와 항-인간 Fc XL665(Abet0144-GL IgG1-TM과 관련됨) 사이의 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 측정하였다. scFv에 의한 펩티드 상의 Abet0144-GL IgG1-TM 에피토프의 성공적인 점유는 형광 플레이트 판독기 상에서 측정될 때 FRET의 감소를 초래하였다.
경쟁자 펩티드의 부재 하에서 Abet0144-GL IgG1-TM과 합성 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 결합을 분석함으로써 '총' 결합 신호를 측정하였다. 테스트 scFv 샘플의 존재 하에서 Abet0144-GL IgG1-TM과 합성 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 결합을 분석함으로써 '샘플' 신호를 유도하였다. 마지막으로, 검출 시약 칵테일 단독에 의해 매개된 형광을 분석함으로써 '크립테이트 블랭크' 신호를 측정하였다.
50 mM MOPS(pH 7.4), 0.5 mM EDTA 및 0.5 M 수크로스로 구성된 샘플 완충제 중의 비정제된 주변세포질 scFv를 공급하였다. 프로파일링을 위해, scFv 샘플을 384웰 V-바닥 플레이트에서 50 mM MOPS(pH 7.4), 0.4 M 불화칼륨, 0.1% 지방산 무함유 소 혈청 알부민 및 0.1% 트윈 20(부피/부피)으로 구성된 분석 완충제로 원래의 저장 농도의 50%까지 희석하였다. 액체 취급 로봇을 이용하여 5 ㎕의 각각의 새로 희석된 scFv를 흑색 얕은 고체 바닥 비-결합 384웰 분석 플레이트의 '샘플' 웰로 옮겼다. 남은 시약(분석 완충제에서 제조됨)을 하기 순서로 멀티채널 피펫으로 분석 플레이트에 첨가하였다: 5 ㎕의 샘플 완충제('총' 및 '크립테이트 블랭크' 웰), 10 ㎕의 분석 완충제('크립테이트 블랭크' 웰), 5 ㎕의 2 nM Abet0144-GL IgG1-TM('샘플' 및 '총' 웰), 5 ㎕의 5 nM 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드('샘플' 및 '총' 웰), 및 6 nM 스트렙타비딘 크립테이트 및 60 nM 항-His6-XL665로 구성된 5 ㎕의 검출 칵테일(모든 웰). 형광 플레이트 판독기 상에서 620 nm 및 665 nm 방사 파장에서 시간 분해 형광을 측정하기 전에, 분석 플레이트를 밀봉한 다음 실온의 암실에서 3시간 동안 항온처리하였다.
각각의 샘플에 대한 % 델타 F 값을 계산함으로써 데이터를 분석하였다. % 델타 F를 방정식 4에 따라 결정하였다.
방정식 4:
Figure 112015046136268-pct00009
그 후, 델타 F 값을 이용하여 표준화된 결합 값을 방정식 5에 기재된 바와 같이 계산하였다.
방정식 5:
Figure 112015046136268-pct00010
Abet0144-GL IgG1-TM과 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 결합의 유의한 억제를 나타내는 비정제된 주변세포질 scFv에 대해 DNA 서열결정을 수행하였다(Osbourn et al., 1996; Vaughan et al., 1996). 독특한 단백질 서열을 갖는 것으로 발견된 scFv를 이. 콜라이에서 발현시키고 친화성 크로마토그래피에 이어서 완충제 교환으로 정제하였다.
전술된 에피토프 경쟁 분석에서 일련의 scFv 희석물들(전형적으로 4 pM 내지 1200 nM)을 테스트함으로써 각각의 정제된 scFv의 효능을 측정하였다. 각각의 샘플에 대한 % 델타 F 및 % 총 결합 값을 계산함으로써 데이터를 다시 분석하였다. 추가로, 각각의 농도의 정제된 scFv에 대한 % 억제 값도 방정식 6에 기재된 바와 같이 계산하였다:
방정식 6:
Figure 112015046136268-pct00011
과학적 그래프작성 소프트웨어를 이용하여 % 억제에 대해 scFv 샘플 농도를 작도하고, 임의의 농도 의존적 반응을 비-선형 회귀 곡선으로 피팅하였다. -1의 값으로 구속된 힐-기울기를 이용하여 이들 분석으로부터 IC50 값을 수득하였다. 이 라운드의 선택으로부터 수득된 가장 강력한 클론인 Abet0286은 1.8 nM의 IC50을 가졌고 VLCDR1 표적화된 돌연변이유발 라이브러리로부터 유래되었다.
시약/장치 공급원: MOPS(시그마, 영국 소재; 카탈로그 번호: M9381), 불화칼륨(비디에이치 케미칼스, 미국 소재; 카탈로그 번호: A6003), 지방산 무함유 소 혈청 알부민(시그마, 영국 소재; 카탈로그 번호: A6003), 트윈 20(시그마, 영국 소재; 카탈로그 번호: P2287), Abet0144-GL IgG1-TM(사내 제조됨), 바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(r펩티드, 미국 소재; 카탈로그 번호: A1117), 스트렙타비딘 크립테이트(시스바이오, 프랑스 소재; 카탈로그 번호: 610SAKLB), 항-His6-XL665(시스바이오, 프랑스 소재; 카탈로그 번호: 61HISXLB), 384웰 분석 플레이트(코닝, 코스타 라이프 사이언시스; 카탈로그 번호: 3676), 384웰 희석 플레이트(그레이너 바이오원, 독일 소재; 카탈로그 번호: 781280), 액체 취급 로봇(미니트랙™, 퍼킨엘머, 미국 소재), 형광 플레이트 판독기(엔비전™, 퍼킨엘머, 미국 소재), HTRF 기술(시스바이오 인터네이셔날, 프랑스 소재), 그래프작성/통계 소프트웨어(프리즘, 그래프패드, 미국 소재).
3.4 "이원" 라이브러리를 생성하기 위한 성공적인 선택 결과물들의 재조합, 및 이들의 후속 친화성 최적화
3.3 단락에 기재된 에피토프 경쟁 분석을 이용하여, 특정 scFv-리보좀 라이브러리가 처음 4 라운드의 선택에 걸쳐 친화성 성숙되었는지를 판단하였다. 라이브러리들 중 2개의 라이브러리, 즉 VHCDR3 표적화된 돌연변이유발 라이브러리 및 VLCDR2 표적화된 돌연변이유발 라이브러리는 Abet0144-GL 모클론에 비해 개선을 보이지 않았고 더 프로세싱되지 않았다.
(VHCDR1, VHCDR2, VLCDR1 및 VLCDR3을 커버하는) 남은 4개의 표적화된 돌연변이유발 라이브러리는 친화성 개선을 보였고 쌍별 방식으로 재조합되어 6개의 CDR들 중 2개의 CDR들이 돌연변이되어 있는 6개의 "이원" 재조합 라이브러리를 생성하였다. 예를 들면, VHCDR1을 커버하는 친화성 성숙된 라이브러리는 친화성 성숙된 VHCDR2 라이브러리와 무작위적으로 재조합되어 VH1:VH2 라이브러리를 생성하였다. 남은 라이브러리들은 VH1:VL1, VH1:VL3, VH2:VL1, VH2:VL3 및 VL1:VL3으로서 생성되었다. 각각의 재조합 라이브러리의 서브세트를 이전에 기재된 바와 같이(3.2 단락) 클로닝하고 서열결정하여 각각의 라이브러리의 완전성을 검증하였다.
그 다음, 감소하는 농도(라운드 5 및 6에 대해 각각 5 nM 및 2 nM)의 바이오티닐화된 합성 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 존재 하에서 선택을 이전에 기재된 바와 같이(3.2 단락) 계속 수행하였다. 앞서와 같이, 스크리닝 목적으로 각각의 선택 결과물을 클로닝하였다(3.2 단락).
선택 라운드 5 및 6으로부터 무작위적으로 선택된 1936개의 scFv를 3.3 단락에 기재된 바와 같이 에피토프 경쟁 분석에서 스크리닝하였다. 이들 클론들의 효능의 증가로 인해, 비정제된 scFv를 먼저 25%까지 희석한 후 분석 플레이트에 첨가하였다. 앞서와 같이, 유의한 억제 성질을 보인 클론에 대해 DNA 서열결정을 수행하고, 독특한 클론을 생성하고 정제된 scFv로서 분석하였다(3.3 단락). 이들 선택으로부터 수득된 가장 강력한 클론인 Abet0303은 0.84 nM의 효능을 가졌고, VH1:VH2 재조합 라이브러리로부터 유래되었다.
3.5 "삼원" 라이브러리를 생성하기 위한 이원 선택 결과물들의 재조합, 및 이들의 후속 친화성 최적화
3.3 단락에 기재된 에피토프 경쟁 분석을 이용하여, 각각의 이원 라이브러리가 이전 2 라운드의 선택(5 및 6)에 걸쳐 친화성 성숙되었는지를 판단하였다. 모든 라이브러리들은 친화성 개선을 보였으므로, 추가 친화성 성숙을 위해 고려되었다.
6개의 이원 라이브러리들(3.4 단락)은 쌍별 방식으로 성공적인 라운드 4 결과물(3.2 단락)과 재조합되어 6개의 CDR들 중 3개의 CDR들이 돌연변이되어 있는 4개의 "삼원" 재조합 라이브러리를 형성하였다. 예를 들면, VH2:VL3 이원 라이브러리(라운드 6 결과물)는 VHCDR1 표적화된 돌연변이유발 라이브러리(라운드 4 결과물)와 재조합되어 VH1:VH2:VL3 라이브러리를 생성하였다. VH1:VH2 이원 라이브러리(라운드 6 결과물)와 VLCDR3 표적화된 돌연변이유발 라이브러리(라운드 4 결과물)를 조합하여 유사한 구축물도 생성하였다. 이들 2개의 개별 라이브러리들을 모아 VH1:VH2:VL3 삼원 라이브러리를 생성하였다.
함께 최적화된 CDR들 사이의 상승작용을 파괴하지 않도록 주의를 기울였다. 예를 들면, VH1:VL3 이원 라이브러리는 VHCDR2 표적화된 돌연변이유발 라이브러리와 재조합되지 않았는데, 이는 이 조작이 함께 최적화된 VHCDR1 서열과 VLCDR3 서열 사이의 상승작용을 파괴할 것이기 때문이다. 모든 삼원 라이브러리들 및 이들의 유도의 완전한 목록은 표 3에 제공되어 있다. 각각의 재조합 라이브러리의 서브세트를 이전에 기재된 바와 같이(3.2 단락) 클로닝하고 서열결정하여 각각의 라이브러리의 완전성을 검증하였다.
Figure 112015046136268-pct00012
그 다음, 감소하는 농도(라운드 7 및 8에 대해 각각 500 pM 및 200 pM)의 바이오티닐화된 합성 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 존재 하에서 선택을 이전에 기재된 바와 같이(3.2 단락) 계속 수행하였다. 앞서와 같이, 스크리닝 목적으로 각각의 선택 결과물을 클로닝하였다(3.2 단락).
선택 라운드 7 및 8로부터 무작위적으로 선택된 1408개의 scFv를 3.3 단락에 기재된 바와 같이 에피토프 경쟁 분석에서 스크리닝하였다. "이원" 스크리닝과 마찬가지로, 비정제된 scFv를 먼저 25%까지 희석한 후 분석 플레이트에 첨가하였다. 앞서와 같이, 유의한 억제 성질을 보인 클론에 대해 DNA 서열결정을 수행하고 독특한 클론을 생성하고 정제된 scFv로서 분석하였다(3.3 단락). 이들 선택으로부터 수득된 가장 강력한 클론인 Abet0343은 0.48 nM의 효능을 가졌고 VH1:VH2:VL3 재조합 라이브러리로부터 유래되었다.
3.6 "사원" 라이브러리를 생성하기 위한 삼원 선택 결과물들의 재조합, 및 이들의 후속 친화성 최적화
3.3 단락에 기재된 에피토프 경쟁 분석을 이용하여, 각각의 삼원 라이브러리가 이전 2 라운드의 선택(7 및 8)에 걸쳐 친화성 성숙되었는지를 판단하였다. 모든 라이브러리들은 친화성 개선을 보였으므로, 추가 친화성 성숙을 위해 고려되었다.
VH1:VH2:VL1 삼원 라이브러리(라운드 8 결과물)는 VLCDR3 표적화된 돌연변이유발 라이브러리(라운드 4 결과물)와 재조합되었고, VH2:VL1:VL3 삼원 라이브러리(라운드 8 결과물)는 VHCDR1 표적화된 돌연변이유발 라이브러리(라운드 4 결과물)와 재조합되었다. 별도로, VH1:VH2 라이브러리(라운드 6 결과물)는 VL1:VL3 이원 라이브러리(라운드 6 결과물)와 재조합되었다. 그 다음, 이들 3개의 개별 라이브러리들을 모아 6개의 CDR들 중 4개의 CDR들이 돌연변이되어 있는 단일 "사원" 라이브러리인 VH1:VH2:VL1:VL3을 생성하였다.
함께 최적화된 CDR들 사이의 상승작용을 파괴하지 않도록 주의를 기울였다. 예를 들면, VH1:VL2:VL3 삼원 라이브러리는 VLCDR1 표적화된 돌연변이유발 라이브러리와 재조합되지 않았는데, 이는 이 조작이 함께 최적화된 VHCDR1/VHCDR2 서열과 VLCDR3 서열 사이의 상승작용을 파괴할 것이기 때문이다. 각각의 재조합 라이브러리의 서브세트를 이전에 기재된 바와 같이(3.2 단락) 클로닝하고 서열결정하여 각각의 라이브러리의 완전성을 검증하였다.
그 다음, 감소하는 농도(라운드 9 내지 11에 대해 50 pM 내지 10 pM)의 바이오티닐화된 합성 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 존재 하에서 선택을 이전에 기재된 바와 같이(3.2 단락) 계속 수행하였다. 앞서와 같이, 스크리닝 목적으로 각각의 선택 결과물을 클로닝하였다(3.2 단락).
선택 라운드 9 내지 11로부터 무작위적으로 선택된 1672개의 scFv를 3.3 단락에 기재된 바와 같이 에피토프 경쟁 분석에서 스크리닝하였다. 이들 클론들의 효능의 증가로 인해, 비정제된 scFv를 먼저 3.13%까지 희석한 후 분석 플레이트에 첨가하였다. 앞서와 같이, 유의한 억제 성질을 보인 클론에 대해 DNA 서열결정을 수행하고 독특한 클론을 생성하고 정제된 scFv로서 분석하였다(3.3 단락). 이들 선택으로부터 수득된 가장 강력한 클론인 Abet0377은 0.32 nM의 효능을 가졌다(n=2 데이터). 샘플 억제 곡선은 도 11에 제시되어 있고, 가장 높은 효능 클론들 중 24개의 클론들에 대한 데이터는 표 4에 제시되어 있다. 상응하는 단백질 서열은 표 5 및 표 6에 나열되어 있다.
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Figure 112015046136268-pct00014
Figure 112015046136268-pct00015
3.7 표면 플라스몬 공명에 의한 정제된 scFv 포맷의 친화성 개선된 클론의 동력학적 프로파일링
표면 플라스몬 공명을 이용하여 HTRF™ 에피토프 경쟁 분석에서 모서열인 Abet0144-GL에 비해 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 대한 결합 친화성의 유의한 개선을 보인 정제된 scFv 클론을 분석하였다(3.3 내지 3.6 단락). 요약하면, 프로테온(ProteOn) 단백질 상호작용 어레이 시스템(바이오라드(BioRad), 미국 소재)을 이용하여 각각의 정제된 scFv와 합성에 의해 생성된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드 사이의 상호작용의 동력학적 파라미터를 평가하였다. 이들 실험은 본질적으로 문헌(Karlsson et al., 1991)에 기재된 바와 같이 수행되었다. 더 상세한 사항에 대해서는 1.7 단락을 참조한다.
바이오티닐화된 합성 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(r펩티드, 미국 소재; 카탈로그 번호: A1117)가 5개의 상이한 표면 밀도에서 바이오틴/스트렙타비딘 상호작용을 통해 전매특허 스트렙타비딘 칩(NTA 176-5021)에 비-공유결합되는 분석을 이용하여 각각의 테스트 scFv와 인간 아밀로이드 베타 1-42 사이의 결합 친화성을 평가하였다. 펩티드에 결합된 scFv를 제거하기 위해 10 mM 글리신(pH 2.0)을 60초 동안 단일 주입하여 주기 사이에 칩 표면을 재생시켰다. 이 재생은 scFv 결합 능력의 유의한 손실을 초래하지 않았다.
확신을 가지면서 적절한 결합 모델에 피팅될 수 있는 센서그램을 관찰하기에 충분한 시간 동안 100 nM 내지 200 nM의 각각의 scFv를 펩티드 표면 상에 순차적으로 통과시켰다. 임의의 완충제의 인위적 결과 또는 비-특이적 결합 효과의 영향을 감소시키기 위해 주요 데이터 세트로부터 무관한 scFv 블랭크를 공제하였다. 그 다음, 적절한 결합 모델을 데이터에 피팅하였다.
Abet0380 scFv의 경우, 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd) 및 해리 상수(KD)는 각각 1.93 x 105 M-1 s-1, 2.85 x 10-5 s-1 및 148 pM이다. 이들 파라미터를 데이터에의 1:1 랭뮤어 피팅으로부터 유도하였다.
Figure 112015046136268-pct00016
3.8 인간 IgG1-TM으로의 친화성 개선된 scFv의 재포맷화
IgG1-TM 항체 포맷은 2.6 단락에 논의되어 있다. 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인들을, 각각 전체 인간 항체 중쇄 및 경쇄를 발현하는 벡터 내로 서브클로닝함으로써 scFv를 IgG1-TM으로 재포맷화하였다. 가변 중쇄를, 인간 중쇄 불변 도메인 및 조절 요소를 함유하는 포유동물 발현 벡터(pEU 1.4) 내로 클로닝하여 포유동물 세포에서 전체 IgG1-TM 중쇄를 발현시켰다. 유사하게, 가변 경쇄 도메인을, 인간 람다 경쇄 불변 도메인 및 조절 요소의 발현용 포유동물 발현 벡터(pEU 4.4) 내로 클로닝하여 포유동물 세포에서 전체 IgG 경쇄를 발현시켰다.
IgG로서 항체를 수득하기 위해, 중쇄 및 경쇄 IgG 발현 벡터를 HEK293-EBNA 포유동물 세포(인비트로겐, 영국 소재; 카탈로그 번호: R620-07) 내로 일시적으로 형질감염시켰고, 이때 IgG가 발현되었고 배지 내로 분비되었다. 회수물을 모으고 정제 전에 여과하였다. 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 IgG를 정제하였다. 배양물 상청액을 적절한 세라믹 단백질 A 컬럼(바이오세프라 - 폴, 미국 소재) 상에 적재하고 50 mM 트리스-HCl(pH 8.0) 및 250 mM NaCl로 세척하였다. 0.1 M 시트르산나트륨(pH 3.0)을 사용하여 컬럼으로부터 결합된 IgG를 용출하고 트리스-HCl(pH 9.0)을 첨가하여 중화시켰다. NAP-10 완충제 교환 컬럼(지이 헬쓰케어, 영국 소재; 카탈로그 번호: 17-0854-02)을 이용하여 용출된 물질을 PBS 내로 완충제 교환하고 정제된 IgG를 0.2 ㎛ 필터에 통과시켰다. IgG의 아미노산 서열에 기초한 흡광계수를 이용하여 IgG의 농도를 분광광도법으로 측정하였다. SEC-HPLC 및 SDS-PAGE를 이용하여 정제된 IgG를 응집 또는 분해에 대해 분석하였다.
3.9 생식세포주화
가장 강력한 IgG들 중 5개의 IgG들을 그들의 상응하는 scFv의 실험적 특징규명에 기초하여 생식세포주화를 위해 선택하였다. 클론 Abet0343, Abet0369, Abet0377, Abet0380 및 Abet0382의 정제된 scFv는 모두 에피토프 경쟁 분석에 의해 측정되었을 때 750 pM 미만의 IC50 값을 나타내었고(표 4), 이들 모두가 표면 플라스몬 공명에 의해 측정되었을 때 250 pM 미만의 실험적 해리 상수를 가졌다(표 7).
생식세포주화 과정은 VH 도메인 및 VL 도메인 내의 골격 잔기를 가장 유사한 생식세포주 서열로 복귀시켜 인간 항체들을 동일하게 일치시키는 것으로 구성되었다. 이것은 최적화된 항체 계통의 VH 도메인의 경우 Vh3-23(DP-47)이었고 VL 도메인의 경우 Vλ3-3r(DPL-23)이었다. Abet0380의 경우, 1개의 잔기가 카바트 위치 43에서 VH 도메인 내에서의 변화를 요구하였고(표 8) 1개의 잔기가 카바트 위치 81에서 VL 도메인 내에서의 변화를 요구하였다(표 9). 남은 4개의 서열들은 2개 내지 5개의 변화를 요구하였다(표 8 및 표 9). 플랭킹 잔기 1 및 3과 동일한 시간에 생식세포주화된 Abet0343의 경쇄 서열 내의 잔기 2를 제외한 버니어 잔기(Foote et al., 1992)는 생식세포주화되지 않았다. 클락손(Clackson) 및 로우만(Lowman)의 문헌(Clackson et al., 2004)에 기재된 바와 같이 적절한 돌연변이유발성 프라이머와 함께 표준 부위 지정된 돌연변이유발 기법을 이용하여 이들 아미노산 잔기들의 생식세포주화를 수행하였다.
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Figure 112015046136268-pct00018
3.10 표면 플라스몬 공명을 이용한 친화성 최적화 IgG의 결합 동력학의 측정
표면 플라스몬 공명을 이용하여 친화성 최적화 IgG(3.8 단락) 및 그의 생식세포주화된 대응물(3.9 단락)의 결합 동력학을 분석하였다. 요약하면, 비아코어 T-100(지이 헬쓰케어, 영국 소재) 바이오센서 기계를 이용하여 각각의 테스트 IgG와 합성에 의해 생성된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드 사이의 상호작용의 동력학적 파라미터를 평가하였다. 이들 실험은 본질적으로 문헌(Karlsson et al., 1991)에 기재된 바와 같이 수행되었다. 더 상세한 사항에 대해서는 1.7 단락을 참조한다.
각각의 항체가 전매특허 CM5 칩에 스스로 아민 결합된 단백질 G 표면에 의해 비-공유적으로 포획되는 분석을 이용하여 각각의 테스트 IgG와 인간 아밀로이드 베타 1-42 사이의 결합 친화성을 평가하였다. 리간드 및 결합된 항체를 제거하기 위해 10 mM 글리신(pH 2.0)을 40초 동안 쌍으로 주입하여 주기 사이에 칩 표면을 재생시켰다. 그 다음, 각각의 펩티드 주입을 위해 테스트 항체를 재적용하였다.
확신을 가지면서 적절한 결합 모델에 피팅될 수 있는 센서그램을 관찰하기에 충분한 시간 동안 합성 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 일련의 희석물들(0.063 nM 내지 1024 nM)을 항체 표면 상에 순차적으로 통과시켰다. 각각의 IgG 데이터 세트로부터 블랭크 기준 유동 셀 데이터를 공제하였고 주요 데이터 세트로부터 제로 농도 항체 단독 완충제 블랭크를 이중 기준 공제하였다. 그 다음, 비아에발루션 소프트웨어를 이용하여 적절한 결합 모델을 각각의 분석물 적정으로부터의 데이터에 동시적으로 피팅하였다.
계산된 Chi2 값을 이용하여 데이터의 유효성을 평가하였고, 이때 허용가능한 값은 2 RU2 미만이다. 잔차를 이용하여 피팅의 전체 성공을 평가하였고, 이때 2 RU 미만의 편차가 허용가능하다.
Abet0380-GL(생식세포주화된) IgG1-TM에 대한 예시적 결과는 도 12에 제시되어 있다. 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd) 및 해리 상수(KD)는 각각 9.52 x 105 M-1 s-1, 3.07 x 10-4 s-1 및 322 nM이다. 이들 파라미터들은 데이터에의 1:1 랭뮤어 피팅으로부터 유도되었다.
3.11 표면 플라스몬 공명을 이용한 친화성 최적화 IgG의 특이성 프로파일링
표면 플라스몬 공명을 이용하여 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 대한 친화성 최적화 IgG의 특이성을 검증하였다. 요약하면, 비아코어 2000(지이 헬쓰케어, 영국 소재) 바이오센서 기계를 이용하여 각각의 테스트 IgG와 다양한 작은 펩티드들(합성에 의해 생성된 인간 아밀로이드 베타 1-42 및 인간 아밀로이드 베타 1-40을 포함함) 사이의 상호작용의 동력학적 파라미터를 평가하였다. 이들 실험은 본질적으로 문헌(Karlsson et al., 1991)에 기재된 바와 같이 수행되었다. 더 상세한 사항에 대해서는 1.7 단락을 참조한다.
항체가 전매특허 CM5 칩에 스스로 아민 결합된 단백질 G 표면에 의해 비-공유적으로 포획되는 분석을 이용하여 각각의 테스트 IgG와 각각의 펩티드 사이의 상호작용을 평가하였다. 5 적용 단일 주기 방법을 이용하여 항체와 펩티드 사이의 상호작용을 관찰하였다. 리간드 및 결합된 항체를 제거하기 위해 10 mM 글리신(pH 2.0)을 40초 동안 쌍으로 주입하여 주기 사이에 칩 표면을 재생시켰다. 그 다음, 각각의 펩티드 주입 주기를 위해 테스트 항체를 재적용하였다.
확신을 가지면서 결합을 보이지 않거나 적절한 결합 모델에 피팅될 수 있는 센서그램을 관찰하기에 충분한 시간 동안 각각의 테스트 펩티드(64 nM 내지 1024 nM)를 항체 표면 상에 순차적으로 통과시켰다. 각각의 IgG 데이터 세트로부터 블랭크 기준 유동 셀 데이터를 공제하였고 주요 데이터 세트로부터 제로 농도 항체 단독 완충제 블랭크를 이중 기준 공제하였다.
Abet0380-GL(생식세포주화된) IgG1-TM에 대한 예시적 결과는 도 13에 제시되어 있다. 2개의 펩티드들(바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42(r펩티드, 미국 소재; 카탈로그 번호: A1117) 및 비표지된 뮤린 아밀로이드 베타 1-42(r펩티드, 미국 소재; 카탈로그 번호: A1008))은 항체에의 강한 결합을 보인 반면, 2개의 펩티드들(바이오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-40(r펩티드, 미국 소재; 카탈로그 번호: A1111) 및 비표지된 뮤린 아밀로이드 베타 1-40(r펩티드, 미국 소재; 카탈로그 번호: A1007))은 항체에의 결합을 보이지 않았다.
3.12 시험관내 면역조직화학을 이용하였을 때 천연 아밀로이드 베타에 대한 가장 강력한 IgG의 친화성
천연 형태의 아밀로이드 베타 펩티드에 대한 이들 클론들의 친화성을 평가할 목적으로 가장 강력한 IgG들을 아밀로이드 베타에 결합하는 그들의 능력에 대해 테스트하였다. 요약하면, 리드 항체들을 인간 알츠하이머병 뇌 절편 및 Tg2576 마우스 뇌 절편 상에서 스크리닝하여 시험관내에서 아밀로이드 플라크에 결합된 항-아밀로이드 베타 1-42 항체를 확인하였다. 실험은 본질적으로 1.9 단락에 기재된 바와 같이 수행되었다.
이들 실험에서, 중증 알츠하이머병을 갖는 2명의 개체들(ApoE 유전자형 3/3, Braak 단계 6 및 ApoE 유전자형 4/3, Braak 단계 5)의 전두 피질로부터 인간 뇌 조직을 단리하였다. 대조군으로서, 1명의 비-치매 개체(ApoE 유전형 3/3, Braak 단계 1)로부터 동등한 조직을 단리하였다. 15개월령의 Tg2576 마우스(2마리의 마우스) 및 22개월령의 Tg2576 마우스(2마리의 마우스)로부터 마우스 뇌 조직을 단리하였다. 항체를 2 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 및 20 ㎍/㎖의 농도로 테스트하였다.
한 실험에서, Abet0380-GL IgG1-TM 항체는 Tg2576 뇌 절편 상에서 4의 점수로 코어 플라크(CP)를 염색하였고 인간 AD 뇌 절편 상에서 3의 점수로 코어 플라크(CP)를 염색하였다. 또한, 상기 항체는 확산성 플라크(DP) 또는 뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA) 플라크를 보다 더 약한 정도로 염색하였다. 대조적으로, 양성 대조군 항체는 동일한 조건 하에서 인접 절편들 상에서 모든 플라크들(CP, DP, CAA)에 대해 3 내지 4의 점수를 생성하였다. 대표적인 영상은 도 14에 제시되어 있다.
3.13 웨스턴 블롯에 의한 Abet0380-GL IgG1-TM Abeta42 인식 프로파일의 입증
SDS-PAGE 전에 Aβ42 올리고머를 가교연결하기 위해, PICUP(펩티드의 광-유도된 가교연결)를 다음과 같이 수행하였다. 2 ㎕의 원액(10 mM)을 18 ㎕의 1xPBS에 첨가하여 1 mM의 Ru(Bpy) 용액을 생성하였다. 추가로, 2 ㎕의 원액(200 mM)을 18 ㎕의 1xPBS에 첨가하여 20 mM의 과황산암모늄 용액(APS)을 생성하였다. 사용되지 않은 원액을 드라이 아이스 상에서 즉시 급속 동결시키고 -80℃ 냉동기에 다시 넣었다. 암실에서 5 ㎕의 Ru(Bpy)를 80 ㎕의 응집체(순수한 10 μM 샘플)에 첨가한 후, 5 ㎕의 APS를 첨가하였다. 샘플을 10초 동안 암실에서 램프로 방사선조사하였다. 30 ㎕의 (4x) LDS 샘플 완충제를 즉시 첨가하였다.
그 다음, 가교연결된(PICUP) Aβ1-42 및 비-가교연결된 Aβ1-42 응집체에 대해 SDS-PAGE를 수행하였다. 용액을 10분 동안 70℃에서 가열 블록 내에서 항온처리하였다. 한편, 5 ㎕의 매직 마크(Magic Mark) XP 웨스턴 단백질 표준물과 5 ㎕의 노벡스 샤프(Novex Sharp) 미리 염색된 단백질 표준물을 조합하여 마커를 생성하였다. 10분 동안 항온처리한 후, MES 런닝 완충제와 함께 샘플 및 마커를 NuPAGE 노벡스 4-12% 비스-트리스 겔(1.0 mm, 15웰, 웰 당 15 ㎕) 상에 적재하였다. 겔을 35분 동안 200 V에서 런닝시켰다.
그 다음, 인비트로겐의 iBlot 기계를 이용하여 겔을 20V에서 7분 동안(프로그램 P3) PVDF 막 상으로 블롯팅하였다.
일단 블롯팅이 완결되면, 겔 적층체를 해체한 후, PVDF 막을 약하게 회전시키면서 실온에서 1시간 동안 50 ㎖의 4% MPBST(PBST 중의 4% 마벨(Marvel))에서 차단하였다. 그 다음, 개별 항체로 프로빙하기 위해 블롯을 메스로 절단하였다. 이것은 일차 항체 용액(10 ㎖의 3% MPBST 중의 2 ㎍/㎖)과의 1시간 항온처리이었다.
그 다음, 막을 PBST로 5회(각각 5분) 세척한 후, 실온에서 1시간 동안 이차 항체 용액(10 ㎖의 PBST 중의 1 ㎕ 항-인간 Fc 특이적 - HRP 접합체)에서 항온처리하였다. 막을 PBST로 3회(각각 5분) 세척하고 PBS로 2회(각각 5분) 세척하였다.
최종 세척 동안 화학발광 수퍼시그날 웨스트 듀라(SuperSignal West Dura) 기질(써모 사이언티픽; 34075)을 실온까지 가온하였다. 각각 600 ㎕의 2개 용액들을 조합하였다. PVDF 막으로부터 PBS를 따라낸 후, 피펫을 이용하여 상기 막을 혼합된 듀라 시약으로 덮었다. 반응이 약 5분(이 시간 동안 버스크독(VerscDoc) 영상화 시스템이 셋업되었음) 동안 진행되게 한 후, (변환 필터를 이용하여 증강시키면서) 영상을 30초 노출로 촬영하였다. 대표적인 영상이 도 15에 제시되어 있다.
실시예 4. 생체내에서 Abet0380-GL IgG1-TM 항체의 특이적 기능적 반응을 입증하는 연구
4.1 생체내에서 유리 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 감소에 의한 Abet0380-GL IgG1-TM의 기능적 특징규명
8주령의 수컷 알비노 할란 스프라그-다울리 래트(n = 8 내지 12)는 25 mM 히스티딘, 7% 수크로스 및 0.02% p80 계면활성제로 구성된 5 ㎖/kg의 투약 비히클(pH 6.0)의 정맥내 주사에 의해 단회 용량의 Abet0380-GL IgG1-TM 항체를 제공받았다. 투약 용액을 투약 직전에 제조하였다. 동물을 표시된 시간에 마취시키고 뇌척수액(CSF)을 대수조(cisterna magna)로부터 흡입하였다. 세포 또는 잔해(debris)를 제거하기 위한 20분의 샘플링 이내에 4℃에서 대략 3000 x g에서 10분 동안 CSF 샘플을 원심분리하였다. 그 다음, 샘플을 드라이 아이스 상에서 동결시키고 후속 분석을 위해 -70℃에서 저장하였다.
동물을 참수하여 희생시키고, 뇌 조직을 해부하고, 디에틸아민(DEA; 플루카(Fluka), 시그마, 영국 소재; 카탈로그 번호: 31729)으로 뇌 조직으로부터 아밀로이드 베타 펩티드를 추출하였다. 요약하면, 동결된 뇌 조직을 0.2% DEA 및 50 mM NaCl(머크(Merck), 미국 소재; 카탈로그 번호: 1.06404.1000)에서 균질화하였다. 뇌 균질화물을 1시간 동안 133,000 x g에서 한외원심분리하였다. 회수된 상청액을 2 M 트리스-HCl(트리즈마(TRIZMA)®-하이드로클로라이드; 시그마, 영국 소재; 카탈로그 번호: 93363)로 pH 8.0까지 중화시키고 분석할 때까지 -70℃에서 저장하였다. 동물 실험은 스웨덴 농무부에 의해 제공된 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었다. 윤리적 허가는 동물 실험에서 전문화된 윤리위원회(스톡홀름 소드라 동물 연구 윤리위원회)에 의해 제공되었다.
Abet0380-GL에 결합된 아밀로이드 베타 1-42 펩티드를 제거하기 위한 면역침전에 이어서 인비트로겐으로부터 입수된 시판되는 ELISA 키트에 의한 분석을 이용하여 래트 CSF에서 유리 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 측정을 수행하였다. 요약하면, 단백질 A 비드의 용액(다이나비드® 단백질 A; 인비트로겐, 영국 소재; 카탈로그 번호: 100-02D)을 96웰 비-스커트(non-skirted) 플레이트(폴리프로필렌 0.2 ㎖; 브이더블유알 인터네이셔날(VWR International), 영국 소재; 카탈로그 번호: 10732-4828)에 첨가하고 자석(다이나마그(DynaMag)™ 96 면; 인비트로겐, 영국 소재; 카탈로그 번호: 123.31D)을 이용하여 TBST(50 mM TBS; 시그마, 영국 소재; 카탈로그 번호: T6664 및 0.1% 트윈 20)로 2회 세척함으로써 상기 용액으로부터 상기 비드를 분리하였다. 해동된 래트 CSF 샘플(40 ㎕)을 각각의 웰에 첨가하고 1시간 동안 경사 회전시키면서 40℃에서 항온처리하였다. 그 다음, 자석을 사용하여 비드를 펠렛화하고, 30 ㎕의 면역침전된 CSF 샘플을 70 ㎕의 표준 희석제 완충제(단백질분해효소 억제제로 보충됨; 로슈, 영국 소재; 카탈로그 번호: 11836153001)가 이미 첨가된 ELISA 키트(마우스 아밀로이드 베타 (1-42) 비색 ELISA 키트; 인비트로겐, 영국 소재; 카탈로그 번호: KMB3441)의 96웰 플레이트로 옮겼다. 보정 표준 샘플을 플레이트에 이중으로 첨가하고 플레이트를 진탕하면서 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 400 ㎕의 세척 완충제로 4회 세척하고, 100 ㎕의 검출 항체 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 다시, 플레이트를 400 ㎕의 세척 완충제로 4회 세척하고, 100 ㎕의 이차 항체 작업 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 진탕하면서 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 마지막으로, 플레이트를 400 ㎕의 세척 완충제로 4회 세척하고, 100 ㎕의 안정화된 발색체를 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 암실 내에서 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 반응을 정지시키기 위해, 100 ㎕의 정지 용액을 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 450 nm의 흡광도에서 2시간 이내에 판독하였다. 단일 CSF 샘플을 분석하고 다중 비교를 위한 조절 없이 로그 변환된 데이터에 대한 일원 ANOVA와 함께 프리즘 4(그래프패드, 미국 소재)를 이용하여 데이터 분석을 수행하였다.
마우스 아밀로이드 베타 (1-42) 비색 ELISA 키트(인비트로겐, 영국 소재; 카탈로그 번호: KMB3441)를 변경시켜 사용하여 래트 뇌 균질화물에서 총 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(자유 아밀로이드 베타 1-42 펩티드 및 Abet0380-GL에 결합된 아밀로이드 베타 1-42 펩티드)의 측정을 수행하였다. 키트 검출 항체를 과량의 Abet0380-GL IgG1-TM 항체로 교체하고 이차 항체를 항-인간 IgG HRP-접합체 항체(잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), 영국 소재; 카탈로그 번호: 109-035-098)로 교체하였다. 요약하면, 샘플 희석제(단백질분해효소 억제제로 보충됨; 로슈, 영국 소재; 카탈로그 번호: 11836153001)에 1:2로 희석된 50 ㎕의 해동된 뇌 균질화물 및 표준 샘플을 96웰 ELISA 플레이트에 이중으로 첨가하였다. 과량의 Abet0380-GL IgG1-TM 항체(50 ㎕, 4 ㎍/㎖)를 각각의 웰에 첨가한 후, 플레이트를 실온에서 3시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 400 ㎕의 세척 완충제로 4회 세척하고, 100 ㎕의 이차 항체 작업 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 마지막으로, 플레이트를 400 ㎕의 세척 완충제로 4회 세척하고, 100 ㎕의 안정화된 발색체를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 암실 내에서 실온에서 15분 동안 항온처리하였다. 반응을 정지시키기 위해, 100 ㎕의 정지 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 450 nm의 흡광도에서 2시간 이내에 판독하였다. 다중 비교를 위한 조절 없이 로그 변환된 데이터에 대한 일원 ANOVA와 함께 프리즘 4(그래프패드, 미국 소재)를 이용하여 데이터 분석을 수행하였다.
마우스 아밀로이드 베타 (1-40) 비색 ELISA 키트(인비트로겐, 영국 소재; 카탈로그 번호: KMB3481)를 사용하여 래트 뇌 균질화물에서 총 아밀로이드 베타 1-40 펩티드의 측정을 수행하였다. 요약하면, 샘플 희석제(단백질분해효소 억제제로 보충됨; 로슈, 영국 소재; 카탈로그 번호: 11836153001)에 희석된 50 ㎕의 해동된 뇌 균질화물 및 표준 샘플을 96웰 ELISA 플레이트에 이중으로 첨가하였다. 50 ㎕의 검출 항체 용액을 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 실온에서 3시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 400 ㎕의 세척 완충제로 4회 세척하고, 100 ㎕의 이차 항체 작업 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 마지막으로, 플레이트를 400 ㎕의 세척 완충제로 4회 세척하고, 100 ㎕의 안정화된 발색체를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 암실 내에서 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 반응을 정지시키기 위해, 100 ㎕의 정지 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 450 nm의 흡광도에서 2시간 이내에 판독하였다. 다중 비교를 위한 조절 없이 로그 변환된 데이터에 대한 일원 ANOVA와 함께 프리즘 4(그래프패드, 미국 소재)를 이용하여 데이터 분석을 수행하였다.
4.2 생체내에서 유리 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 감소에 의한 Abet0380-GL IgG1-TM의 기능적 특징규명
20 mg/kg의 단회 용량의 Abet0380-GL IgG1-TM 항체는 4.1 단락에 기재된 분석에서 용량 투여 후 72시간 또는 168시간에서 래트 내의 유리 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 CSF 수준을 정량 한계까지 감소시켰다(데이터는 제시되어 있지 않음). 생체내에서 Abet0380-GL IgG1-TM 항체의 효과를 더 조사하기 위해, 14일에 걸쳐 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 5 mg/kg 또는 10 mg/kg의 매주 용량을 래트에게 투여하였다. CSF 중의 유리 아밀로이드 베타 1-42 펩티드 및 뇌 조직 내의 총 아밀로이드 베타 1-42 또는 1-40 펩티드의 수준을 측정하기 위해 제2 용량의 투여 후 168시간에서 동물을 안락사시켰다.
자유 아밀로이드 베타 1-42의 용량 의존적 감소가 CSF에서 입증되었다(도 16a). 2개의 가장 높은 용량인 5 mg/kg 및 10 mg/kg은 이용된 분석에서 아밀로이드 베타 1-42 펩티드를 정량 한계까지 감소시킨 반면, 0.5 mg/kg 및 1 mg/kg의 용량은 비히클 대조군과 비교될 때 아밀로이드 베타 1-42 펩티드를 각각 47% 및 61%까지 유의하게 감소시켰다. 가장 낮은 용량인 0.25 mg/kg은 CSF에서 유리 아밀로이드 베타 1-42 펩티드를 14%까지 감소시켰지만, 통계적 유의성에 도달하지 못하였다. Abet0380-GL IgG1-TM 항체에 의한 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 격리로 인해 총 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 용량 의존적 증가가 뇌 조직에서 입증되었다(도 16b). 그러나, 뇌 조직에서 총 아밀로이드 베타 1-40 펩티드의 수준은 영향받지 않았으므로(도 16c), 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 대한 Abet0380-GL IgG1-TM의 특이성을 입증한다. 요약하면, 래트 연구로부터 수득된 상기 결과는 Abet0380-GL IgG1-TM 항체가 0.5 mg/kg 내지 1 mg/kg의 ED50으로 CSF에서 유리 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 수준을 감소시켰다는 것을 보여주었다.
4.3 Abet0380-GL IgG1-TM의 기능적 특징규명 - 생체내에서 비-플라크 결합증 - 말초 용량을 노화된 Tg2576 마우스에게 투여한 후 168시간에서 생체내에서 Abet0380-GL IgG1-TM과 아밀로이드 베타 플라크의 결합 부재의 입증
단회 말초 용량 투여 후 노화된 Tg2576 마우스에서 아밀로이드 베타 플라크에 결합하는 Abet0380-GL IgG1-TM의 능력을 테스트하였다. 동물 실험은 스웨덴 농무부에 의해 제공된 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었다. 윤리적 허가는 동물 실험에서 전문화된 윤리위원회(스톡홀름 소드라 동물 연구 윤리위원회)에 의해 제공되었다.
17개월령의 암컷 Tg2576 마우스(n=5)는 25 mM 히스티딘, 7% 수크로스 및 0.02% p80 계면활성제로 구성된 5 ㎖/kg의 투약 비히클(pH 6.0)의 정맥내 주사에 의해 단회 용량의 비히클, 30 mg/kg의 양성 대조군 항체, 또는 10 mg/kg 또는 30 mg/kg의 Abet0380-GL IgG1-TM 항체를 제공받았다. 용량 투여 후 168시간에서, 동물을 깊이 마취시키고 실온의 PBS에 이어서 냉각된(4℃) 인산염 완충 4% 파라포름알데하이드(PFA)를 관주하였다. 그 다음, 동물을 참수하여 희생시키고 뇌를 해부하고 72시간 동안 4℃에서 PFA 중에 침지시켜 고정시켰다. 고정제를 0.1% 나트륨 아지드 함유 PBS로 교환하고, 조직을 추가 프로세싱할 때까지 4℃에서 저장하였다.
생체내에서 Abet0380-GL IgG1-TM과 아밀로이드 베타 플라크의 결합 정도를 평가하기 위해 뇌 절편에 대한 면역조직화학을 수행하였다. 요약하면, 1.9 단락에 기재된 바와 같이 면역조직화학을 위해 파라핀-포매된 뇌 절편을 준비하였다. 에피토믹스(Epitomics)로부터 입수된 토끼 항-마우스 IgG1 및 IgG2 특이적 이차 항체를 사용하여 뇌 실질 내에서 침착된 Abet0380-GL IgG1-TM 또는 양성 대조군 항체의 검출을 수행하였다. 옴니맵 검출 시스템(벤타나 메디칼 시스템스, 미국 소재)을 사용하여 벤타나 로봇 상에서 염색을 수행하였다. 생체외에서의 스파이킹(spiking)을 위해, 결합 조직 절편을 주사된 과량의 Abet0380-GL IgG1-TM 또는 양성 대조군 항체로 시험관내에서 염색하였다. 이차 항체 및 발색체는 전술된 바와 동일하였다.
염색의 점수화를 10배 광학 확대율 하에서 맹검 방식으로 수행하였다. 장식된 플라크의 분포가 인지되었다. 플라크 표지부착의 강도를 0(플라크의 염색 부재)부터 4(플라크의 강한 장식)까지 상대적 강도 등급에 따라 점수화하였다.
Abet0380-GL IgG1-TM은 말초 용량인 10 mg/kg 또는 30 mg/kg의 투여 후 168시간에서 생체내에서 아밀로이드 베타 플라크 또는 뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA)을 장식하지 않았다. 양성 대조군 항체는 강한 내지 약한 생체내 플라크 장식을 나타내었다. 모든 동물들에서 코어 플라크, 확산성 플라크 및 CAA와 함께 부분적 및 국소적 분포 패턴이 뚜렷이 보였다. 대표적인 영상이 도 17에 제시되어 있다. Abet0380-GL IgG1-TM 및 양성 대조군 항체를 사용한 동일한 동물로부터의 뇌 조직의 생체외 스파이킹은 이전에 입증된 주사된 항체의 생체외 플라크 결합 능력을 확인시켜주었다(데이터는 제시되어 있지 않음).
실시예 5. 항-Aβ1-42 서열
예시적 항체 VH 도메인, VL 도메인, 개별 CDR 서열, HCDR 세트, LCDR 세트 및 골격 영역을 포함하는 항체 분자의 서열의 예가 첨부된 서열목록에 나열되어 있다.
표 7에 나열된 24개의 최적화된 클론들의 서열들이 비교되었다. 표 10 및 표 11은 각각 VH 도메인과 VL 도메인 사이의 % 서열 동일성을 보여준다.
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실시예 6: 경쟁 결합 실험에서 Abet0380-GL IgG1-TM의 특이성
Abet0380-GL IgG1-TM의 특이성을 경쟁 결합 실험에서 조사하였다. 요약하면, Abet0380-GL IgG1-TM(0.5 nM)을 다양한 상이한 농도(10 μM 내지 0.17 nM)의 전체 길이 인간 Abeta 펩티드, 절두체 인간 Abeta 펩티드 및 pyro 인간 Abeta 펩티드(Abeta 1-42, Abeta 1-43, Abeta 1-16, Abeta 12-28, Abeta 17-42, Abeta pyro-3-42 또는 Abeta pyro-11-42)의 패널과 함께 (실온에서 1시간 동안) 항온처리하였다.
Abet0380-GL IgG1-TM과 Abeta 펩티드의 항온처리 후, N 말단 바이오틴 Abeta 1-42(1.5 nM)를 첨가한 다음, 유로퓸 크립테이트로 표지된 항-인간 Fc 항체(0.8 nM)(시스바이오, 카탈로그 번호 61HFCKLB) 및 스트렙타비딘-XLent!(5 nM)(시스바이오, 카탈로그 번호 611SAXLB)을 첨가하였다. 그 다음, 표준 균질한 시간 분해 형광(HTRF) 판독 프로토콜을 이용하여 엔비전 플레이트 판독기(퍼킨엘머) 상에서 판독하기 전에, 분석을 실온에서 추가 2시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 경쟁의 부재 하에서, (각각 스트렙타비딘-XLent! 및 유로퓸 크립테이트로 표지된 항-인간 Fc 항체와의 복합체에서) N 말단 바이오틴 Abeta 1-42와 Abet0380-GL IgG1-TM의 상호작용을, 유로퓸 크립테이트 공여자 형광단과 XL665 수용체 형광단의 근접성으로 인한 시간 분해 형광 공명 에너지 전달(TR-FRET)을 통해 측정할 수 있었다. 따라서, 테스트 펩티드에 의한 Abet0380-GL IgG1-TM:N 말단 바이오틴 Abeta 1-42 상호작용의 경쟁은 분석 신호의 감소를 초래하였다. 결과는 % 특이적 결합으로서 표현되었고, 이때 100% 특이적 결합은 스트렙타비딘-XLent!(5 nM), N 말단 바이오틴 Abeta 1-42(1.5 nM), Abet0380-GL IgG1-TM(0.5 nM) 및 유로퓸 크립테이트로 표지된 항-인간 Fc 항체(0.8 nM)를 함유하는 웰로부터 유도되었다. 0% 특이적 결합은 Abet0380-GL IgG1-TM이 누락되어 있는 웰로부터 유도되었다.
최종 분석 부피는 20 ㎕이었고, MOPS(pH 7.4)(50 mM), 불화칼륨(0.4 M), 트윈 20(0.1%) 및 지방산 무함유 BSA(0.1%)를 포함하는 분석 완충제에서 모든 시약들을 제조하였다. 분석을 낮은 부피 384웰 흑색 분석 플레이트(코스타 3676)에서 수행하였다.
요약하면, Abeta 1-42, Abeta 1-43, Abeta 17-42, Abeta Pyro-3-42 및 Abeta Pyro-11-42를 사용하였을 때 Abet0380-GL IgG1-TM:N 말단 바이오틴 Abeta 1-42 결합의 억제가 관찰되었고, 이때 IC50 값은 이 군의 경우 10-8 몰 내지 10-9 몰이었다. Abeta 1-16 또는 Abeta 12-28을 사용하였을 때에는 Abet0380-GL IgG1-TM:N 말단 바이오틴 Abeta 1-42 결합의 억제가 관찰되지 않았다(도 18).
실시예 7: 정상 래트 PK-PD 연구에서 아밀로이드 베타 1-42를 격리시키는 항체 Abet0144-GL의 능력
아밀로이드 베타 1-42를 격리시키는 항체 Abet0144-GL의 능력을 정상 래트에서의 PK-PD 연구에서 조사하였다. Abet0144-GL(10 mg/kg 또는 40 mg/kg) 또는 비히클을 2주 동안 주마다(0일째 날 및 7일째 날) 래트에게 정맥내로 투여하고, 이차 용량을 투여한지 1주일 후 희생시켰다. 유리 아밀로이드 베타 1-42 및 총 아밀로이드 베타 1-42 측정을 위해 CSF를 샘플링하고 총 아밀로이드 베타 1-42 측정을 위해 뇌를 샘플링하였다. 전술된 분석을 이용하여 유리 아밀로이드 베타 1-42 및 총 아밀로이드 베타 1-42 수준을 측정하였다.
도 19에 제시된 바와 같이, CSF에서 유리 아밀로이드 베타 1-42는 10 mg/kg 또는 40 mg/kg의 Abet0144-GL에 의해 유의하게 변경되지 않았다(비히클과 비교되었을 때 각각 5% 및 18% 증가; 도 19). CSF에서 총 아밀로이드 베타 1-42는 10 mg/kg에서 38%까지 유의하게 증가되었고 40 mg/kg에서 139%까지 유의하게 증가되었다. 뇌 조직에서 총 아밀로이드 베타 1-42도 10 mg/kg 및 40 mg/kg에서 각각 16% 및 50%까지 유의하게 증가되었다. 요약하면, 정상 래트에서 본 연구로부터 수득된 데이터는 Abet0144-GL이 CSF 및 뇌 둘 다에서 총 아밀로이드 베타 1-42 수준을 증가시키면서 CSF에서 유리 아밀로이드 베타 1-42 수준에 유의한 영향을 미치지 않았다는 것을 입증하였다. 이것은 수십 nM 범위의 표적에 대한 친화성을 갖는 항체로부터 예상될 프로파일이었다.
참고문헌
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Figure 112015046136268-pct00040
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다른 참고문헌들은 본문에 포함되어 있다.
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NCIMB LTD NCIMB41889 20111102 NCIMB LTD NCIMB41890 20111102 NCIMB LTD NCIMB41891 20111102 NCIMB LTD NCIMB41892 20111102
<110> MedImmune Limited <120> Antibodies to Amyloid Beta <130> ABETA-100WO1 <140> US 61/713996 <141> 2012-10-15 <150> PCT/EP2013/071567 <151> 2013-10-15 <160> 578 <170> Medimmune Ltd patent software March 2010 release. Output verified by USPTO Checker version 4.4.0. <210> 1 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Abet0007 <400> 1 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc gtttatacta tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt attggttcta gtggtggtac gacagtttac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaaggg 300 cagcagctgg tacgccccta ctactactac ggtatggacg tctgggggca ggggaccctg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 2 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abet0007 <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr 20 25 30 Thr Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Gly Ser Ser Gly Gly Thr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 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gatgaggctg actattactg tcaggcgcag gacagtacca ctcgagtgtt cggcggaggg 300 accaagctga ccgtccta 318 <210> 29 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abet0144-GL <400> 29 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser 50 55 60 Asn Ser Gly His Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Gln Asp Ser Thr Thr Arg Val 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abet0144-GL <400> 30 Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala Ser 5 10 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abet0144-GL <400> 31 Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abet0144-GL <400> 32 Gln Ala Gln Asp Ser 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attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagagtgg 300 atggaccact cccgccccta ctactactac ggtatggacg tctgggggca ggggaccctg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 92 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abet0323b <400> 92 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Ser Thr Phe Gln Glu Asp 20 25 30 Thr Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Gly Pro Asn Pro Lys Asn Asn Ala Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 93 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abet0323b <400> 93 Glu Asp Thr Met Trp 5 <210> 94 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> 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sapiens <220> <223> Abet0323b <400> 100 tcgtacgagt tgactcagcc accctcagta tccgtgtccc caggacagac ggccagcatc 60 acctgctctg gacataactt ggaagataaa tttgcttcct ggtatcaaca gaagccaggc 120 cagtcccctg tcctggtcat ctatcgagat gacaagcggc cctctggggt ccctgagcga 180 ttctctgcct ccaactctgg gcacactgcc actctgacca tcagcgggac ccaggctacg 240 gatgaggctg actattactg ttcgtcccag gacacggtga ctcgagtgtt cggcggaggg 300 accaagctga tcgtccta 318 <210> 101 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abet0323b <400> 101 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser 50 55 60 Asn Ser Gly His Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Thr 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Gln Asp Thr Val Thr Arg Val 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Ile Val Leu 100 105 <210> 102 <211> 11 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gcacactgcc actctgacca tcagcgggac ccaggctacg 240 gatgaggctg actattactg ttcgtcccag gacacggtga ctcgagtgtt cggcggaggg 300 accaagctga ccgtccta 318 <210> 191 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abet0343 <400> 191 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser 50 55 60 Asn Ser Gly His Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Thr 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Gln Asp Thr Val Thr Arg Val 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 192 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abet0343 <400> 192 Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala Ser 5 10 <210> 193 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abet0343 <400> 193 Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser 5 <210> 194 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> 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acgagacccg gaaggcctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagggaca attccaagaa caggctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagagtgg 300 atggaccact cccgccccta ctactactac ggtatggacg tctgggggca ggggaccctg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 200 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abet0344 <400> 200 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr 20 25 30 Thr Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Gly Gly Asn Glu Thr Arg Lys Ala Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Arg Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 201 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abet0344 <400> 201 Val 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sapiens <220> <223> Abet0344 <400> 216 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 5 10 <210> 217 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Abet0368 <400> 217 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttagtacagc cgggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cgactttggg ccgagcccta tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt attggtaagg acacccagaa cagcacgtac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagga cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgaa agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagagtgg 300 atggaccact cccgccccta ctactactac ggtatggacg tctgggggca ggggaccctg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 218 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abet0368 <400> 218 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Gly Pro Ser 20 25 30 Pro Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Gly Lys Asp Thr Gln Asn Ser Thr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile 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120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtc attggtgaga ccccggagag gcaggcctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagag cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagagtgg 300 atggaccact cccgccccta ctactactac ggtatggacg tctgggggca ggggaccctg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 254 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abet0370 <400> 254 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe His Phe Pro Met Ser 20 25 30 Ala Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Gly Glu Thr Pro Glu Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 255 <211> 5 <212> PRT <213> 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Leu Glu Asp Lys Phe Ala Ser 5 10 <210> 553 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abet0382-GL <400> 553 Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser 5 <210> 554 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abet0382-GL <400> 554 Ser Ser Gln Asp Thr Val Thr Arg Val 5 <210> 555 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abet0382-GL <400> 555 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys 20 <210> 556 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abet0382-GL <400> 556 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 5 10 15 <210> 557 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abet0382-GL <400> 557 Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser Asn Ser Gly His Thr Ala Thr 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 558 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abet0382-GL <400> 558 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 5 10 <210> 559 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 559 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 560 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 560 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 561 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 561 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 35 40 <210> 562 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 562 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 35 40 <210> 563 <211> 42 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 563 Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 564 <211> 42 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 564 Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 565 <211> 42 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 565 Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 566 <211> 40 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 566 Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 35 40 <210> 567 <211> 40 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 567 Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 35 40 <210> 568 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Biotinylated Scrambled Amyloid Beta 1-42 peptide <400> 568 Ala Ile Ala Glu Gly Asp Ser His Val Leu Lys Glu Gly Ala Tyr Met 1 5 10 15 Glu Ile Phe Asp Val Gln Gly His Val Phe Gly Gly Leu Ile Phe Arg 20 25 30 Val Val Asp Leu Gly Ser His Asn Val Ala 35 40 <210> 569 <211> 43 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 569 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr 35 40 <210> 570 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 570 Lys Lys Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile 1 5 10 15 Ala <210> 571 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 571 Lys Lys Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 1 5 10 15 <210> 572 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 572 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 <210> 573 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 573 Glu Val Arg His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu 1 5 10 <210> 574 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 574 Val Arg His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn 1 5 10 15 Lys <210> 575 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 575 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 1 5 10 15 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 20 25 <210> 576 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 576 Glu Val Arg His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser 1 5 10 15 Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 20 25 30 <210> 577 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 577 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val 1 5 10 15 Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu 20 25 30 Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 578 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Amino acids 91-106 of Abet0378 VL protein sequence <400> 578 Asp Thr Val Thr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 1 5 10 15

Claims (40)

  1. 인간 아밀로이드 베타 1-40 펩티드(Aβ1-40)에 비해 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(Aβ1-42)에의 결합에 대해 선택적인 단리된 항체 분자로서,
    (i) 골격 영역이 사이사이에 위치하는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 HCDR 세트를 포함하는 VH 도메인으로서, 상기 HCDR의 아미노산 서열은
    HCDR1 서열 번호 525,
    HCDR2 서열 번호 526, 및
    HCDR3 서열 번호 527인 VH 도메인, 및
    (ii) 골격 영역이 사이사이에 위치하는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 LCDR 세트를 포함하는 VL 도메인으로서, 상기 LCDR의 아미노산 서열은
    LCDR1 서열 번호 534,
    LCDR2 서열 번호 535, 및
    LCDR3 서열 번호 536인 VL 도메인
    을 포함하는 단리된 항체 분자.
  2. 제1항에 있어서, VH 도메인이 중쇄 골격 영역 FW1, FW2, FW3 및 FW4를 포함하고, 상기 중쇄 골격 영역의 아미노산 서열은
    FW1 서열 번호 528,
    FW2 서열 번호 529,
    FW3 서열 번호 530, 및
    FW4 서열 번호 531인 단리된 항체 분자.
  3. 제1항에 있어서, VL 도메인이 경쇄 골격 영역 FW1, FW2, FW3 및 FW4를 포함하고, 상기 경쇄 골격 영역의 아미노산 서열은
    FW1 서열 번호 537,
    FW2 서열 번호 538,
    FW3 서열 번호 539, 및
    FW4 서열 번호 540인 단리된 항체 분자.
  4. 제1항에 있어서, 서열 번호 524의 VH 도메인 아미노산 서열 및 서열 번호 533의 VL 도메인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 분자.
  5. 제1항에 있어서, 가용성 단량체 인간 Aβ1-42 및 저급 n 올리고머(오량체 이하) 인간 Aβ1-42에 결합할 수 있는 단리된 항체 분자.
  6. 제1항에 있어서, 500 pM 이하의 해리 상수(KD)로 단량체 Aβ1-42에 결합하는 단리된 항체 분자.
  7. 제1항에 있어서, Aβ1-40에 결합하지 않거나 1 mM 초과의 KD로 Aβ1-40에 결합하는 단리된 항체 분자.
  8. 제1항에 있어서, 아밀로이드 베타 17-42 펩티드(Aβ17-42) 및 아밀로이드 베타 29-42 펩티드(Aβ29-42)에 결합하는 단리된 항체 분자.
  9. 제1항에 있어서, 3-피로-42 아밀로이드 베타 펩티드 및 11-피로-42 아밀로이드 베타 펩티드에 결합하는 단리된 항체 분자.
  10. 제1항에 있어서, 아밀로이드 베타 1-43 펩티드(Aβ1-43)에 결합하는 단리된 항체 분자.
  11. 제1항에 있어서, 인간 IgG인 단리된 항체 분자.
  12. 제1항에 있어서, 인간 IgG1 또는 인간 IgG2인 단리된 항체 분자.
  13. 제1항에 있어서, 인간 IgG1-TM, IgG1-YTE 또는 IgG1-TM-YTE인 단리된 항체 분자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, VL 도메인이 서열 번호 533의 위치 80에 상응하는 아미노산 위치에서 메티오닌을 갖는 단리된 항체 분자.
  15. 제14항에 있어서, VH 도메인이 서열 번호 524의 위치 43에 상응하는 아미노산 위치에서 라이신을 갖는 단리된 항체 분자.
  16. 허용가능한 양의 제15항에 따른 항체 분자 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 알츠하이머병 또는 다운증후군 환자에서의 인지력 감퇴 또는 개체에서의 황반 변성을 감소시키기 위한 조성물.
  17. 허용가능한 양의 제15항에 따른 항체 분자를 포함하는, 아밀로이드증을 감소시키거나 알츠하이머병을 치료하기 위한 조성물.
  18. 제15항에 따른 항체 분자를 코딩하는 단리된 핵산.
  19. 제15항에 따른 항체 분자를 코딩하는 핵산으로 시험관 내에서 형질전환된 숙주 세포.
  20. 제15항에 따른 항체 분자의 제조 방법으로서, 상기 항체 분자의 제조를 위한 조건 하에서, 제15항에 따른 항체 분자를 코딩하는 핵산으로 시험관 내에서 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 제조 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 항체 분자를 단리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 항체 분자를, 하나 이상의 추가 성분을 포함하는 조성물로 제제화하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
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