CN110294804B - 针对β淀粉样蛋白的抗体 - Google Patents

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Abstract

针对人β淀粉样蛋白的抗体。相对于人β淀粉样蛋白40肽，抗体更选择性地结合人β淀粉样蛋白42肽。特异性针对β淀粉样蛋白42、作为用于结合β淀粉样蛋白42肽并治疗与淀粉样变性相关联的病况例如阿尔茨海默病的治疗剂的抗体。

Description

针对β淀粉样蛋白的抗体
发明领域
本发明涉及结合至人β淀粉样蛋白1-42肽和其N-末端截短体的抗体，统称为Aβn-42肽，其中n是1至29。它涉及如下抗体，相对于β淀粉样蛋白1-40肽，所述抗体更选择地结合至β淀粉样蛋白n-42肽。本发明也涉及抗-Aβn-42抗体用于治疗与淀粉样变性相关联的病况(包括阿尔茨海默病)的用途。
背景
阿尔茨海默病(AD)表征为认知损害恶化、记忆受到影响，使患者的社会和职业功能衰弱。退行性疾病导致大脑内神经细胞的损失，这带来了在语言和更高功能例如判断、规划、组织和推理上的认知困难，这最终可导致人格变化。该疾病的末期表征为独立发挥功能的完全丧失。
组织学上，AD(散发性和家族性)是由细胞内神经原纤维缠结(NFT)和细胞外斑块的存在定义的。斑块是从淀粉样前体蛋白(APP)的异常裂解衍生的淀粉样β蛋白肽(Aβ)的聚集体，该淀粉样前体蛋白是在大脑中神经元和星形胶质细胞中发现的跨膜蛋白。在AD患者的血管中也发现了Aβ沉积。
胆碱能神经元在AD中特别易受伤害，并且随之而来的神经递质衰退影响了其他神经递质系统。该疾病的其他症状包括氧化应激、炎症和神经元凋亡(程序性细胞死亡)。在AD患者中，广泛的神经元细胞死亡导致认知衰退和患者的最终死亡(尤金(Younkin)，1995；博尔柯尔特(Borchelt)等人，1996；塞克(Selkoe)，1999)。
目前的治疗仅是对症的并被视为最小有效的，其中伴随症状轻微的改善持续有限的时间段。然而，Aβ水平的产生过剩或改变被认为是散发和早发AD的发病机理中的关键事件。出于这个原因，Aβ已经成为开发旨在减少其形成(瓦萨(Vassar)等人，1999)、或旨在激活加速其从大脑中清除的机制的药物的主要靶标。
淀粉样蛋白级联假说提出Aβ肽的产生不利地影响神经元功能，从而导致AD中的神经细胞死亡和痴呆。Aβ是从淀粉样前体蛋白(APP)产生，该前体蛋白被分泌酶顺序地裂解而产生不同长度的种类。主斑块成分是Aβ1-42的42个氨基酸同工型，其参与在AD病理中的神经毒性寡聚体的形成和斑块形成。Aβ的包括Aβ1-42、pGluAβ3-42、Aβ3-42和4-42的多个同工型在AD大脑中占主导地位，其中Aβ1-42和Aβ4-42在家族性和散发性AD(朴特柳斯(Portelius)等人，2010)的海马体和皮层中是主要形式。
终止于残基42的Aβ是通过加工APP产生的Aβ种类的很小一部分。其他形式包括Aβ1-40和N-末端截短体Aβn-40。然而，终止于残基42的Aβ是最容易聚集并促使沉积为淀粉样蛋白斑。除了更易于聚集，该Aβ1-42肽还可形成可溶的低n聚合物(或寡聚体)，这些聚合物已显示对培养中的神经元是有毒的。不像更大的显著的原纤维沉积物，寡聚体在典型病理学测定中是检测不到的。已从AD脑中分离出具有类似性质的寡聚体，并且这些与疾病进展(与斑块相比)是更密切地相关联的(尤金(Younkin)，1998；沃尔什(Walsh)等人，2005a；沃尔什(Walsh)等人，2005b)。
实验地产生的施加到脑切片或注入体内的寡聚体导致海马长时程增强(LTP)的障碍，该海马长时程增强是作为记忆机制范例而熟知的一种突触信息存储形式(兰伯特(Lambert)等人，1998；沃尔什(Walsh)等人，2002；王(Wang)等人，2002)。可溶寡聚体已参与到突触的物理变性中(穆克(Mucke)等人，2000)。在小鼠模型中由抗体进行的记忆障碍逆转已证实了以下新兴概念，寡聚体在突触障碍中发挥主要作用。
遗传证据表明，在许多(如果不是全部)导致家族性AD(博尔柯尔特(Borchelt)等人，1996；达夫(Duff)等人，1996；斯彻尤利尔(Scheuner)等人，1996；西特伦(Citron)等人，1998)的遗传状况下产生增加量的Aβ1-42和其N-末端截短体(Aβn-42)，表明以下可能性，淀粉状蛋白形成可能是由Aβn-42产生的增加或降解的减少或二者导致(格拉贝(Glabe)，2000)。具体而言，导致APP基因和/或编码该γ分泌酶复合体成分早老蛋白的基因发生遗传突变的家族性AD增加了Aβ1-42(相对于Aβ1-40)的产生。还已经提出，对于毒性Aβ种类的产生，在大脑中产生的肽的绝对量可能没有Aβ肽的比率(反映为改变的Aβ1-42与Aβ-40的比率)那么重要(德斯特鲁(De Strooper)，2007；库珀斯汀(Kuperstein)等人，2010)。此外，淀粉样蛋白沉积的动物模型(小鼠和果蝇两者)表明需要Aβ1-42以形成淀粉样蛋白沉积物(格雷夫(Greeve)等人，2004；饭岛(Iijima)等人，2004；麦高恩(McGowan)等人，2005)。
来自2000年的疫苗接种研究的结果表明了对于AD来说可能的新的治疗策略。过度表达突变体人APP(其中位置717处的氨基酸是苯丙氨酸而不是正常的缬氨酸)的PDAPP转基因小鼠以年龄和大脑区域依赖性方式逐步显露了AD的许多神经病理学标志。当充分确立Aβ沉积和随后的一些神经病理学变化时，在AD型神经病理学发作之前(在6周龄)或在更大的年龄(11个月)，将转基因动物用Aβ1-42肽进行免疫。对年幼动物的免疫接种基本上防止了斑块形成、神经炎性营养不良和星形胶质细胞增生的发展。对年长动物的治疗也显着地降低了这些AD样神经病理的程度和进展。显示了Aβ1-42免疫接种导致抗-Aβ抗体的产生并且Aβ免疫反应性单核细胞/小胶质细胞出现在剩余斑块的区域中(申克(Schenk)等人，1999；申克(Schenk)等人，2000)。然而，主动免疫接种途径当施加到人体时导致一些脑膜脑炎案例，这最可能归因于T细胞应答，并且尽管在功效上的初步结果是有希望但仍被中断(奥格戈佐(Orgogozo)等人，2003；吉尔曼(Gilman)等人，2005；普赖德(Pride)等人，2008)。
在此之后，研究了一些被动免疫接种策略。针对Aβ的抗体的外周给药足以减轻淀粉样蛋白负担(巴德(Bard)等人，2000)。尽管在这些实验中实现相对适度的抗体血清水平，被动给予的抗体能够穿过血脑屏障并进入中枢神经系统，修饰斑块并诱发已存在的淀粉样蛋白的清除。在Aβ1-40特异性抗体、Aβ1-42特异性抗体与针对Aβ的残基1-16的抗体之间的比较中，所有抗体显示降低了Aβ在小鼠大脑中的聚积(列维捷斯(Levites)等人，2006)。
新近已经提出，CNS渗透是对于被动给予抗体的有效Aβ清除的最可能路径(戈尔德(Golde)等人，2009)。然而，除了能够穿过血脑屏障的抗体，下沉假说也被提出作为可能的作用机制。
下沉假说认为可以间接通过降低血浆中的肽的浓度从CNS中去除Aβ。在描述这点的实验中，使用了能在血浆中结合Aβ并且从而将Aβ与CNS隔绝的抗体。这可以实现，是因为血浆中游离Aβ浓度的降低使得该抗体阻止了来自血浆的Aβ流入CNS，和/或而改变了血浆和CNS之间的平衡(德马托斯(DeMattos)等人，2001)。与抗体无关的淀粉样蛋白结合剂也显示在通过血浆中的结合而从CNS去除Aβ中是有效的。显示隔绝血浆Aβ的两种Aβ结合剂，即凝溶胶蛋白和GM1，减少或阻止了大脑淀粉样变性(松冈(Matsuoka)等人，2003)。
关于安全性，AD中一个发病特征是大脑淀粉样血管病(CAA)，在该病中，在脑动脉的壁上血管平滑肌细胞被Aβ(主要是Aβ1-40)替代(韦勒(Weller)等人，2003)。用泛Aβ抗体治疗AD患者已经显示出导致微出血，反映出从血管壁(威尔科克(Wilcock)等人，2009)去除Aβ可能对患者有害。规避这一点的一个方式是产生去糖基化的抗体，这可能减少促成微出血的清除机制，和/或降低Aβ从血管沉积物中清除的速率，阻止流出途径的饱和(威尔科克(Wilcock)等人，2006)。
用Aβ42特异性抗体靶向所述n-42β肽种类将靶向作为AD大脑中关键的肽复合体和斑块形成的驱动物的种类。对n-42单体和低n寡聚体种类具有首要特异性的抗体不仅会消耗这些种类，而且还可以阻止其他显示对神经元有毒性的寡聚体种类的积累。
发明概述
本发明涉及特异性针对Aβ1-42及其N-末端截短体并结合至该Aβ42肽的氨基酸29-42之间的表位的完全人抗体。根据本发明的抗体可用于对与β淀粉样蛋白相关联的病况例如AD，包括归因于AD和唐氏综合征的轻度认知功能障碍(MCI)的预防性和/或治疗性治疗。
本发明涉及使用完全人抗体以抑制血浆、脑和脑脊液(CSF)中的Aβ肽(n-42)的同工型，以阻止大脑和脑血管内Aβn-42同工型的聚积或逆转其沉积并改善认知。
此处描述了针对Aβn-42肽的完全人抗体的产生，该完全人抗体识别Aβn-42的单体和低n寡聚形式(高达并且包括五聚体)并且是映射到Aβ42肽上包含氨基酸17-42的区域、更具体地映射到Aβ42肽上包含氨基酸29至42的区域的表位。
根据本发明的抗体特异性针对Aβn-42种类(其中n是从1至29的范围中的整数)并因此可被预期选择性地减少AD进展中的关键驱动物。根据本发明的抗体在结合人血浆、大脑和脑脊液(CSF)中的Aβ42(非Aβ40)中是有效的，导致从大脑对Aβn-42同工型的清除增加。根据本发明的抗体在减少Aβ42可溶聚集体向神经元的结合中也是有效的，并因此进入大脑的抗体的部分将对这些神经元的健康产生影响。
此处所述的是高效、高亲和力的抗体，包括针对单体具有320pM的KD的抗体。此种高亲和力可以使得能够有效地将Aβn-42抑制到使得能够预防和修饰AD疾病的水平。
可在大脑、CSF和血液中以标准化的测定，使用针对Aβ肽上的表位的抗体来检测可溶的Aβ42和Aβ40种类的水平。如此处所述的大鼠PK:PD中所示的，在外周给予抗体后的大鼠的CSF中观察到游离Aβ42的剂量依赖性抑制。还证明了大鼠大脑中的总Aβ42的剂量依赖性增加，对Aβ40肽的影响可忽略不计。
因此，此处描述了具有渗透大脑(CSF中总外周给药的0.1％)的能力并且可特异性地抑制CSF中关键的有毒种类Aβ42(非Aβ40)的抗体。
根据本发明的抗体的特异性和作用机制可以使得能够预防性和治疗性治疗多种与在体内器官内聚积的淀粉样蛋白的堆积关联的疾病，包括AD疾病进程的不同阶段：前驱的、温和的和中等的AD，唐氏综合征连同黄斑变性。
根据本发明的抗体在诊断患有前驱的、温和的至中等的AD和唐氏综合征的受试者中可具有逆转认知减退、治疗认知减退和预防认知减退的能力。
因而，本发明的第一方面涉及针对人Aβ1-42的结合成员，尤其是抗体分子。
结合成员，例如抗体分子，根据本发明可具有以下特性的任一个或全部：
-结合至可溶的单体人Aβ1-42和/或寡聚Aβ1-42；
-相对于Aβ1-40，更选择性地结合Aβ1-42。它们可显示未结合至Aβ1-40，或结合可以是忽略不计的。例如，根据本发明的抗体分子可以按500pM或更少的解离常数(KD)结合单体Aβ1-42。它们可不结合Aβ1-40，或可以按大于1mM的KD结合Aβ1-40；
-结合至人Aβ17-42。因而，该抗体分子可识别Aβ1-42肽的氨基酸17-42之间的表位，更具体地该抗体分子可识别Aβ1-42肽的氨基酸29-42之间的表位；
-结合至可溶的单体人3焦-42(焦谷氨酸盐3)和11焦-42(焦谷氨酸盐11)
-结合至人Aβ1-43；并且
-与鼠Aβ1-42具有交叉反应性。
结合成员可包括如此处所述的抗体分子的一组HCDR和/或一组LCDR。根据本发明的抗体分子的实例包括包含一组HCDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)的VH域和包含一组LCDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的VL域，其中这些HCDR和LCDR分别是作为以下各项中任一项的HCDR和LCDR：抗体Abet0380、Abet0007、Abet0144、Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0344、Abet0368、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0381、Abet0382和Abet0383，或其GL形式，其序列示于所附的序列表中。这些抗体分子和序列表中序列标识符之间的对应在表16中示出。
针对人Aβ1-42的抗体分子可包括
(i)VH域，该VH域包括穿插有框架区的一组HCDR：HCDR1，HCDR2和HCDR3，其中该组HCDR的氨基酸序列是如表16中针对以下中任一项所示的：抗体Abet0380、Abet0007、Abet0144、Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0344、Abet0368、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0381、Abet0382和Abet0383，或其GL形式，
或可包括具有一个或两个氨基酸突变的那组HCDR；以及
(ii)VL域，该VL域包括穿插有框架区的一组LCDR：LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中该组LCDR的氨基酸序列是如表16中针对以下中任一项所示的：抗体Abet0380、Abet0007、Abet0144、Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0344、Abet0368、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0381、Abet0382和Abet0383，或其GL形式，
或可包括具有一个或两个氨基酸突变的那组LCDR。
根据本发明所述的抗体分子可包括
(i)包括Abet0380或Abet0380 GL组的HCDR的VH域，其中该Abet0380 HCDR的氨基酸序列是
HCDR1 SEQ ID NO：525，
HCDR2 SEQ ID NO：526，以及
HCDR3 SEQ ID NO：527，
或可包括具有一个或两个氨基酸突变的Abet0380或Abet0380 GL组的HCDR，以及
(ii)包括Abet0380或Abet0380 GL组的LCDR的VL域，其中该Abet0380 LCDR的氨基酸序列是
LCDR1 SEQ ID NO：534
LCDR2 SEQ ID NO：535，以及
LCDR3 SEQ ID NO：536，
或可包括具有一个或两个氨基酸突变的Abet0380或Abet0380 GL组的LCDR。
该抗体分子可包括
(i)VH域，该VH域包括穿插有框架区的一组HCDR：HCDR1，HCDR2和HCDR3，其中该HCDR的氨基酸序列是
HCDR1 SEQ ID NO：525，
HCDR2 SEQ ID NO：526，以及
HCDR3 SEQ ID NO：527，
或可包括具有一个或多个氨基酸取代的那组HCDR，其中该一个或多个取代是选自表12或表14中所示的那些；
以及
(ii)VL域，该VL域包括穿插有框架区的一组LCDR：LCDR1，LCDR2和LCDR3，其中该LCDR的氨基酸序列是
LCDR1 SEQ ID NO：534
LCDR2 SEQ ID NO：535，以及
LCDR3 SEQ ID NO：536，
或可包括具有一个或多个氨基酸取代的那组LCDR，其中该一个或多个取代是选自表13或表15中所示的那些。
该抗体分子的VH域可包括如下FW1域，其中在卡巴特位置26-30处的氨基酸残基选自表14中所示的那些。
该抗体分子的VH域可包括重链框架区FW1、FW2、FW3和FW4，其中该重链框架区的氨基酸序列是
FW1 SEQ ID NO：528
FW2 SEQ ID NO：529
FW3 SEQ ID NO：530，以及
FW4 SEQ ID NO：531
或其中FW1包括具有一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO：528，其中FW1中的一个或多个取代是选自表12或表14中所示的那些。
该抗体分子的VL域可包括轻链框架区FW1、FW2、FW3和FW4，其中该轻链框架区的氨基酸序列是
FW1 SEQ ID NO：537
FW2 SEQ ID NO：538
FW3 SEQ ID NO：539，以及
FW4 SEQ ID NO：540。
根据本发明所述的抗体分子可包括
(i)如表16中针对以下中任一项所示的VH域氨基酸序列：Abet0380、Abet0343、Abet0369、Abet0377和Abet0382，或其GL形式，
或可包括具有一个或两个氨基酸突变的那个氨基酸序列；以及
(ii)如表16中针对以下中任一项所示的VL域氨基酸序列：Abet0380、Abet0343、Abet0369、Abet0377和Abet0382，或其GL形式，
或可包括具有一个或两个氨基酸突变的那个氨基酸序列。
根据本发明的抗体分子可包括具有与SEQ ID NO：524至少85％的一致的氨基酸序列的VH域和具有与SEQ ID NO：533至少85％一致的氨基酸序列的VL域，其中在该VH域中：
氨基酸26是M、G或S；
氨基酸27是G、F或D；
氨基酸28是N、T、D或H，
氨基酸29是F
氨基酸30是N、S、K、或P；
氨基酸31是Y、V、R、E、或T；
氨基酸32是Q、Y、D、S、或E；
氨基酸33是T、P、I、或V；
氨基酸34是M；
氨基酸35是W；
氨基酸50是V；
氨基酸51是I；
氨基酸52是G；
氨基酸52a是K、S、或A；
氨基酸53是T、S、N、D、G、或Q；
氨基酸54是N、G、T、或P；
氨基酸55是E、G、N、K、或T；
氨基酸56是N、T、R、或K；
氨基酸57是I、T、K、或V；
氨基酸58是A、V、或T；
氨基酸59是Y；
氨基酸60是A；
氨基酸61是D；
氨基酸62是S；
氨基酸63是V；
氨基酸64是K；
氨基酸65是G；
氨基酸95是E；
氨基酸96是W；
氨基酸97是M
氨基酸98是D；
氨基酸99是H；
氨基酸100是S；
氨基酸100a是R；
氨基酸100b是P；
氨基酸100c是Y；
氨基酸100d是Y；
氨基酸100e是Y；
氨基酸100f是Y；
氨基酸100g是G；
氨基酸100h是M；
氨基酸101是D；
氨基酸102是V；
并且其中在该VL域中：
氨基酸24是S；
氨基酸25是G；
氨基酸26是H；
氨基酸27是N；
氨基酸28是L、或I；
氨基酸29是E、或G；
氨基酸30是D；
氨基酸31是K；
氨基酸32是F、或W；
氨基酸33是A、或V；
氨基酸34是S；
氨基酸50是R；
氨基酸51是D；
氨基酸52是D；
氨基酸53是K；
氨基酸54是R；
氨基酸55是P；
氨基酸56是S；
氨基酸89是S、或Q；
氨基酸90是S、或A；
氨基酸91是Q；
氨基酸92是D；
氨基酸93是T、或S；
氨基酸94是V、或T；
氨基酸95是T；
氨基酸96是R；
氨基酸97是V。
根据本发明的抗体分子可包括具有与SEQ ID NO：524至少85％的一致的氨基酸序列的VH域和具有与SEQ ID NO：533至少85％一致的氨基酸序列的VL域，其中在该VH域中：
氨基酸26是M、G、S、V、A、N、T、或H；
氨基酸27是G、F、S、Y、E、D、或P；
氨基酸28是N、Q、H、V、E、T、A、S、D、M、或P；
氨基酸29是F、I、Y、S、L、或W；
氨基酸30是N、S、T、Q、K、H、R、G、P、E、K、A、或D；
氨基酸31是Y、H、K、E、N、T、R、V、P、M、F、I、D、或W；
氨基酸32是Q、Y、D、N、S、E、或T；
氨基酸33是T、P、I、或V；
氨基酸34是M、或L；
氨基酸35是W；
氨基酸50是V；
氨基酸51是I；
氨基酸52是G；
氨基酸52a是K、S、P、A、N、G、E、D、V、或T；
氨基酸53是T、S、N、H、Q、D、G、或E；
氨基酸54是N、G、P、T、Q、E、M、K、或A；
氨基酸55是E、G、K、N、Q、T、H、D、或A；
氨基酸56是N、T、A、R、或K；
氨基酸57是I、T、N、S、K、F、Q、V、或L；
氨基酸58是A、V、S、T、或N；
氨基酸59是Y；
氨基酸60是A；
氨基酸61是D；
氨基酸62是S、A、或T；
氨基酸63是V；
氨基酸64是K；
氨基酸65是G；
氨基酸95是E；
氨基酸96是W；
氨基酸97是M
氨基酸98是D、或G；
氨基酸99是H、或R；
氨基酸100是S；
氨基酸100a是R；
氨基酸100b是P；
氨基酸100c是Y；
氨基酸100d是Y；
氨基酸100e是Y；
氨基酸100f是Y；
氨基酸100g是G；
氨基酸100h是M、或I；
氨基酸101是D；
氨基酸102是V、或A；
并且其中在该VL域中：
氨基酸24是S、或T；
氨基酸25是G、或T；
氨基酸26是H、R、或P；
氨基酸27是N、或H；
氨基酸28是L、I、V、F、或T；
氨基酸29是E、M、G、S、或N；
氨基酸30是D、A、S、G、或H；
氨基酸31是K、或S；
氨基酸32是F、或W；
氨基酸33是A、V、M、T、或I；
氨基酸34是S、T、或A；
氨基酸50是R；
氨基酸51是D；
氨基酸52是D；
氨基酸53是K；
氨基酸54是R；
氨基酸55是P；
氨基酸56是S；
氨基酸89是S、Q、或A；
氨基酸90是S、A、或T；
氨基酸91是Q
氨基酸92是D、或G；
氨基酸93是T、Q、S、N、或K；
氨基酸94是V、T、或F；
氨基酸95是T；
氨基酸96是R；
氨基酸97是V、S、或A。
根据本发明所述的抗体分子可包括：
(i)VH域，该VH域具有与表16中针对以下中任一项所示的VH域氨基酸序列至少90％一致的氨基酸序列：Abet0380、Abet0343、Abet0369、Abet0377和Abet0382，或其GL形式；以及
(ii)VL域，该VL域具有与表16中针对以下中任一项所示的VL域氨基酸序列至少90％一致的氨基酸序列：Abet0380、Abet0343、Abet0369、Abet0377和Abet0382，或其GL形式。
该抗体分子可包括分别与Abet0380、Abet0343、Abet0369、Abet0377和Abet0382，或其GL形式中任一项的VH域和VL域至少90％一致的VH域和VL域。
所指明的该VH和/或VL域的百分比一致性可以是至少95％，至少98％或至少99％。
该抗体分子可包括Abet0380、Abet0343、Abet0369、Abet0377和Abet0382，或其GL形式中任一项的VH域和VL域。
例如，该抗体分子可包括Abet0380-GL VH域氨基酸序列SEQ ID NO：524以及Abet0380-GL VL域氨基酸序列SEQ ID NO：533。
根据本发明的抗体分子可以是与以下各项竞争结合至Aβ1-42的一种抗体分子：
(i)包括VH域氨基酸序列SEQ ID NO：524以及VL域氨基酸序列SEQ ID NO：533的抗体分子，
(ii)由保藏在登录号NCIMB 41890、41891或41892下的核酸编码的抗体分子。
抗体分子可包括由以下项编码的VH域和VL域：
(i)保藏在登录号41890下的Abet0380-GL核酸序列；
(ii)保藏在登录号41891下的Abet0144-GL核酸序列；或
(ii)保藏在登录号41892下的Abet0377-GL核酸序列。
该抗体分子可包括分别包括上述保藏的抗体的HCDR和LCDR的VH域和VL域。该抗体分子可以是由上述保藏的核酸分子编码的抗体。
此处还描述了编码根据本发明的结合成员的核酸分子、包含该核酸分子的宿主细胞、以及通过表达该核酸分子而产生该结合成员和回收该结合成员的方法。
本发明的另外的方面涉及包括根据以上权利要求中任一项所述抗体分子和一种或多种另外的组分(例如药学上可接受的赋形剂)的组合物，并且涉及此类用于医学用途的组合物。包括根据本发明的结合成员的组合物可被提供以在治疗人或或动物体的方法中使用。
在此描述的结合成员可用于对人或动物受试者，例如人进行诊断或治疗的方法。本发明的结合成员可被用于降低个体中Aβ1-42的水平和/或减少淀粉样变性。结合成员可用于减少淀粉样变性以及治疗、减少或预防与淀粉样变性相关联的病况。可被治疗的病况和疾病包括阿尔茨海默病，例如前驱的、温和的或中等的AD。通过本发明治疗的AD可以是家族性的或散发性的AD。本发明可被用于预防、减少或逆转与AD相关联的轻度认知功能障碍(MCI)。在AD患者或唐氏综合征患者中认知可被改善和/或认知减退可被减弱。本发明可也被用于治疗或预防黄斑变性，黄斑变性与β淀粉样蛋白关联(丁(Ding)等人PNAS 108(28):E279-287 2011)。
因而，在另一个方面，本发明提供了一种减少个体中淀粉样变性、治疗阿尔茨海默病、改善认知或减少阿尔茨海默病或唐氏综合征中的认知减退、和/或治疗黄斑变性的方法，包括向该个体给予本发明的结合成员。
下文进一步详细地描述本发明的这些和其他方面。
附图简述
图1示出经纯化的Abet0007Fab和一系列的β淀粉样蛋白肽之间的直接结合HTRFTM测定的结果。Abet0007克隆(■)示出结合至人β淀粉样蛋白1-42肽(图1A)和鼠β淀粉样蛋白1-42肽，但示出未结合至人β淀粉样蛋白1-40肽(图1B)或乱序的人β淀粉样蛋白1-42肽。使用阳性对照抗体(●)和阴性对照抗体(▲)以证实该测定的完整性。
图2示出通过增加竞争者肽的浓度来抑制生物素化的人β淀粉样蛋白1-42肽和Abet0007 IgG2复合体的形成。复合体形成被人β淀粉样蛋白1-42(●)、11-42(▲)、17-42(▼)和1-43(◆)肽抑制。它未被人β淀粉样蛋白1-40肽(■)或阴性对照肽(○)抑制。
图3示出针对人β淀粉样蛋白1-42肽以100nM(上部轨迹)、50nM、25nM、12.5nM、6.2nM和3.1nM(底部轨迹)肽的浓度结合至固定化的Abet0007 IgG2的表面等离子体共振(BIAcore)轨迹。每个轨迹拟合一个1:1朗缪尔(Langmuir)模型。
图4示出来自Abet0007 IgG2的体外免疫组织化学染色的样品图像。(A)阳性对照抗体在人AD大脑切片(ApoE基因型3/3；布拉克(Braak)阶段6；20μg/ml抗体)上显示强的斑块识别(分数＝4)。(B)Abet0007 IgG2前导克隆在邻近的大脑切片(20μg/ml)上未示出斑块识别(分数＝0)。(C)相同的阳性对照抗体在Tg2576小鼠大脑切片(18个月大的小鼠；20μg/ml抗体)上显示强的斑块识别(分数＝4)。(D)Abet0007 IgG2前导克隆在邻近的小鼠大脑切片(20μg/ml)上未示出斑块识别(分数＝0)。
图5示出通过增加Abet0007 scFv(●)和Abet0144 scFv(▲)的浓度来抑制人β淀粉样蛋白1-42和Abet0042 IgG复合体的形成。在此测定中，Abet0144克隆比Abet0007亲本克隆显著更有效。包括阴性对照抗体(■)以用于对比。
图6示出针对经纯化的Abet0144 scFv以400nM(上部轨迹)、200nM、100nM、50nM和12.5nM(底部轨迹)scFv的浓度结合至固定化的人β淀粉样蛋白1-42肽的表面等离子体共振(BIAcore)轨迹。每个轨迹拟合一个1:1朗缪尔(Langmuir)模型。
图7示出针对人β淀粉样蛋白1-42肽以50nM(上部轨迹)、25nM、12.5nM、6.25nM、3.13nM和1.56nM(底部轨迹)肽的浓度结合至固定化的Abet0144-GL IgG1-TM抗体的表面等离子体共振(BIAcore)轨迹。每个轨迹拟合一个1:1朗缪尔(Langmuir)模型。
图8示出针对一系列β淀粉样蛋白肽以400nM结合至固定化的Abet0144-GL IgG1-TM抗体的表面等离子体共振(BIAcore)轨迹。存在向生物素化的人β淀粉样蛋白1-42肽(上部轨迹)和未标记的人β淀粉样蛋白1-42肽(第二轨迹)的明确结合。不存在向乱序生物素化的人β淀粉样蛋白1-42肽、生物素化的人β淀粉样蛋白1-40肽、未标记的人β淀粉样蛋白1-40肽或生物素化的胰岛素(平线)的可辨别结合。
图9示出使用生物化学表位竞争测定进行的Abet0144-GL IgG1-TM的特异性分析，其中测量到通过增加竞争者肽的浓度抑制了生物素化的人β淀粉样蛋白1-42肽和Abet0144-GL IgG1-TM之间的复合体的形成。复合体形成被人β淀粉样蛋白1-42(●)、焦3-42(◆)和焦11-42(○)肽抑制。在人β淀粉样蛋白1-40肽(■)、1-16(▲)和12-28(▼)肽截短体或阴性对照肽(□)上未观察到显著抑制。
图10示出来自Abet0144-GL IgG1-TM的体外免疫组织化学染色的样品图像。(A)阳性对照抗体在人AD大脑切片(ApoE基因型3/3；20μg/ml抗体)上显示强的斑块识别(分数＝4)。(B)Abet0144-GL IgG1-TM前导克隆在邻近的大脑切片(20μg/ml)上显示一些斑块识别(分数＝1.5)。(C)相同的阳性对照抗体在Tg2576小鼠大脑切片(18个月大的小鼠；20μg/ml抗体)上显示强的斑块识别(分数＝4)。(D)Abet0144-GL IgG1-TM前导克隆在邻近的小鼠大脑切片(20μg/ml)上显示一些斑块识别(分数＝1)。
图11示出通过增加经纯化的竞争者scFv(●)的浓度来抑制人β淀粉样蛋白1-42肽和Abet0144-GL IgG1-TM复合体的形成。最有效的scFv克隆中的四个，即Abet0369(图11A)、Abet0377(图11B)、Abet0380(图11C)和Abet0382(图11D)都显示与亲本Abet0144-GL scFv序列(■)相比在效力上的更显著改善。
图12示出针对人β淀粉样蛋白1-42肽以从1024nM(上部轨迹)至63pM(底部轨迹)肽的浓度结合至固定化的Abet0380-GL IgG1-TM抗体的表面等离子体共振(BIAcore)轨迹。每个轨迹拟合一个1:1朗缪尔(Langmuir)模型。
图13示出针对一系列β淀粉样蛋白肽结合至固定化的Abet0380-GL IgG1-TM抗体的表面等离子体共振(BIAcore)轨迹。存在向生物素化的人β淀粉样蛋白1-42肽(上部轨迹)和未标记的鼠β淀粉样蛋白1-42肽(第二轨迹)的明确结合。不存向生物素化的人β淀粉样蛋白1-40肽或未标记的鼠β淀粉样蛋白1-40肽(平线)的可辨别结合。
图14示出来自Abet0380-GL IgG1-TM的体外免疫组织化学染色的样品图像。(A)阳性对照抗体在人AD大脑切片(ApoE基因型3/3，布拉克(Braak)阶段6；5μg/ml抗体)上显示强的斑块识别(分数＝4)。(B)Abet0380-GL IgG1-TM前导克隆在邻近的大脑切片(10μg/ml)上显示强的斑块识别(分数＝3)。(C)相同的阳性对照抗体在Tg2576小鼠大脑切片(22个月大的小鼠；20μg/ml抗体)上显示强的斑块识别(分数＝4)。(D)Abet0380-GL IgG1-TM前导克隆在邻近的小鼠大脑切片(20μg/ml)上显示强的斑块识别(分数＝4)。
图15示出使用Abet0380-GL IgG1TM制备和检测Aβ42聚集体的蛋白质印迹分析。(A)非光交联的(非PICUP)Aβ42聚集体的Abet0380-GL IgG1TM检测。(B)光交联的Aβ42聚集体(PICUP)的Abet0380-GL IgG1TM检测。此处，我们证明了，Abet0380-GL IgG1TM特异性地识别Aβ1-42单体和低n寡聚体种类(高达并且包括五聚体)。
图16示出通过在经14天接受每周重复剂量的斯普拉-道来氏大鼠中增加Abet0380-GL IgG1-TM抗体的剂量，CSF(A)中游离β淀粉样蛋白1-42肽的水平剂量依赖性地减少，大脑组织(B)中总β淀粉样蛋白1-42肽增加，并且大脑组织(C)中总β淀粉样蛋白1-40肽的水平未受影响。
图17示出在对年老的Tg2576小鼠外周给药之后168小时，来自Abet0380-GL IgG1-TM与β淀粉样蛋白斑的体内结合的免疫组织化学分析的样品图像。以30mg/kg给予阳性对照抗体显示强的体内斑块识别(A)，而以30(B)或10(C)mg/kg给予的Abet0380-GL IgG1-TM未显示任何体内斑块修饰。
图18显示在以不同浓度范围(10uM下至0.17nM)的一组全长、截短和焦人Aβ肽(pyro human Abeta peptide)(Aβ1-42、Aβ1-43、Aβ1-16、Aβ12-28、Aβ17-42、Aβ焦-3-42、或Aβ焦-11-42)进行的竞争结合实验中Abet0380-GL IgG1-TM的特异性。关键：
Figure SMS_1
x轴以log M显示Aβ肽的浓度，y轴显示％特异性结合。在采用Aβ1-42、Aβ1-43、Aβ17-42、Aβ焦-3-42&Aβ焦-11-42的情况下观察到Abet0380-GL IgG1-TM：N-末端生物素Aβ1-42结合受到抑制，针对此组具有从10-8至10-9摩尔范围的IC50值。在采用Aβ1-16或Aβ12-28的情况下观察到Abet0380-GL IgG1-TM：N-末端生物素Aβ1-42结合未受到抑制。
图19显示在标准大鼠PK-PD研究中抗体Abet0144-GL隔绝β淀粉样蛋白1-42的能力。x轴示出运载体或Abet0144-GL(10mg/kg，或40mg/kg)的浓度，y轴示出CSF中以pg/ml计的总β淀粉样蛋白1-42的浓度。CSF中的游离β淀粉样蛋白1-42未被10或40mg/kg的Abet0144-GL显著改变(当与运载体对比时分别是5％和18％增加)。CSF中的总β淀粉样蛋白1-42被显著增加，10mg/kg的情况下增加38％并且40mg/kg的情况下增加139％。大脑组织中的总β淀粉样蛋白1-42也被显著增加，在10和40mg/kg的情况下分别增加16％和50％。在标准大鼠中来自此研究的数据证明，Abet0144-GL在增加了CSF和大脑中的总β淀粉样蛋白1-42水平的同时，对CSF中的游离β淀粉样蛋白1-42水平不具有显著影响。
详细说明
通过结合血浆、大脑和脑脊液(CSF)中的Aβ肽1-42及其N-末端截短体(n-42)的同工型，根据本发明的结合成员可阻止Aβn-42同工型在大脑和脑血管内的聚积或逆转其沉积。根据本发明的结合成员可结合并沉淀血液血浆和/或脑脊液(CSF)中的可溶Aβ1-42，从而分别降低Aβ1-42在血清和/或CSF中的浓度。这代表了针对阿尔茨海默病和其他与淀粉样变性相关联的病况的治疗途径。
结合成员对Aβ17-42内、更具体地为Aβ29-42内的靶标表位是具有特异性的，并以相对于非靶标表位(例如来自Aβ1-40的表位)的高亲和力结合此靶标表位，从而靶标于与淀粉样蛋白斑形成关联的主要毒性种类。例如，结合成员可显示针对Aβ1-42的结合亲和力，比针对Aβ1-40的大至少10倍、至少100倍、至少1000倍或至少10,000倍。因此，相对于Aβ1-40，该结合成员更选择性地结合Aβ1-42。如上所述，该结合成员可以按500pM或更少的解离常数(KD)结合Aβ1-42。优选地，未显示与Aβ1-40的显著结合。如在实例中所述，可使用表面等离子体共振使用单体Aβ肽确定亲和力和结合。
也可在均相时间分辨荧光(HTRFTM)测定中测量与Aβ的结合，以确定该抗体是否能够与至Aβ肽的参照抗体分子竞争结合至Aβ，如在实例中所述。
HTRFTM测定是均相测定技术，其利用了极为靠近的供体和受体荧光团之间的荧光共振能量转移。通过直接或间接地将感兴趣区分子中的一种偶联至受体荧光团即铕(Eu3+)穴状化合物并将感兴趣的其他分子偶联至受体荧光团XL665(稳定交联的别藻蓝素)，此类测定可用于测量大分子的相互作用。该穴状化合物分子的激发(在337nm处)导致620nm处的荧光发射。来自此次发射的能量可被转移至极为靠近该穴状化合物的XL665，导致从该XL665发射出特异的历时长久的荧光(在665nm处)。测量供体(620nm处)和受体(665nm处)两者的特异信号，允许计算665/620nm比率，该计算补偿该测定中有色化合物的存在。
根据本发明的结合成员可竞争结合至Aβ1-42，并因此在HTFRTM竞争测定中，抑制参照抗体与Aβ1-42的结合，但不抑制与Aβ1-40的结合。在HTRFTM测定中，针对结合至Aβ1-42，结合成员可显示对Abet0144GL的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％抑制。
除非另外说明，否则结合抑制效力可表达为以nM计的IC50值。在功能性测定中，IC50是抗体分子的浓度，此浓度将生物应答降低了其最大值的50％。在配体结合研究中，IC50是将受体结合降低了最大特异性结合水平的50％的浓度。可计算IC50，方法是作为结合成员浓度的对数的函数对最大生物应答的％作图，并且使用软件程序，例如棱镜(GraphPad)或Origin(Origin Labs)来将S形函数拟合至数据以便产生IC50值。用于测量或确定效力的合适测定在本领域中是熟知的。
在采用Abet0144-GL和Aβ1-42的HTRFTM表位竞争测定中，结合成员可具有5nM或更少，例如2nM或更少，例如1nM或更少的IC50。Abet0144-GL是具有VH域SEQ ID NO：20和VL域SEQ ID NO：29的抗体分子。在该测定中可以按照与待测试的抗体分子相同的形式使用它，例如以scFv或IgG，例如IgG1形式。因此，在HTRF表位竞争测定中，根据本发明的IgG抗体分子可与Abet0144-GL IgG竞争以结合至人Aβ1-42。这样的测定中的效力可少于1nM。
根据本发明的结合成员可显示相对于Aβ1-40，更特异性低结合Aβ1-42，如通过HTRFTM竞争测定确定的。在这样的测定中，Aβ1-40可以不显示对该结合成员结合至该Aβ1-42肽的显著抑制，例如在这样的测定中，它可以显示少于20％，例如少于10％或少于5％的抑制，并且优选地，在这样的测定中，不显示显著抑制。
根据本发明的结合成员识别人Aβ17-42内、更具体地人Aβ29-42内的表位，并且也可识别它们在来自其他物种(例如小鼠或大鼠)的Aβ中的靶标表位。如在使用来自第一物种(例如人)的Aβ1-42的HTRFTM竞争测定中计算的结合成员的效力可与在使用来自第二物种的Aβ1-42(例如小鼠Aβ1-42)的相同测定中的该结合成员的效力相比，以便评估该结合成员对于两个物种的Aβ1-42的交叉反应性的程度。效力，如通过IC50测量确定的，可在10倍以内或100倍以内。如上所注，Abet0144GL可在HTRFTM竞争测定中被用作参照抗体。与在非人Aβ1-42测定中相比，在此描述的结合成员在人Aβ1-42测定中具有更大的效力。
结合成员可包括一种抗体分子，该抗体分子具有处于抗体框架(即抗体抗原-结合域)内的一个或多个CDR，例如一组CDR。例如，抗体分子可包括抗体VH和/或VL域。抗体分子的VH和VL域也作为本发明的一部分来提供。众所周知，VH域和VL域包括互补决定区(“CDR”)和框架区(“FW”)。VH域包括一组HCDR并且VL域包括一组LCDR。抗体分子可包括含有VHCDR1、CDR2和CDR3的抗体VH域和/或含有VL CDR1、CDR2和CDR3的抗体VL域。VH或VL域可进一步包括框架。VH或VL域框架典型地包括四个框架区，FW1、FW2、FW3和FW4，它们在以下结构中穿插有CDR：FW1-CDR1-FW2-CDR2-FW3-CDR3-FW4。
根据本发明的多个方面的抗体VH和VL域、FW以及CDR的实例在表5和6以及形成本披露的一部分的附加序列表中列出。在此披露的所有VH和VL序列、CDR序列、CDR的集合、HCDR的集合和LCDR的集合、以及这些元件的组合代表本发明的多个方面。如此处所述的，一“组CDR”包括CDR1，CDR2和CDR3。因此，一组HCDR是指HCDR1、HCDR2以及HCDR3，并且一组LCDR是指LCDR1、LCDR2以及LCDR3。除非另行说明，一“组CDR”包含HCDR和LCDR。典型地本发明的抗体分子为单克隆抗体。
在其他实施例中，结合成员可包括处于非抗体分子内的一个抗原结合位点，该抗原结合位点通常由非抗体蛋白质支架中的一个或多个CDR例如一组CDR来提供，如以下进一步讨论。
在此描述了指定为Abet0007的亲本抗体分子的分离，随后为CDR3的定向突变以及优化抗体Abet0144的选择，该优化抗体种系化为Abet0144-GL并具有如表5、6和序列表中所示的一组CDR序列和框架序列。通过如实例中所述的多个文库的进一步优化和重组的大量的过程，从Abet0144GL生成了一组抗体克隆。这些进一步优化的克隆指定为Abet0380、Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0381、Abet0382和Abet0383。它们的CDR序列和可变域序列在表5和6中提及并且阐明于序列表中。种系化的VH和VL域序列Abet0380GL、Abet0377GL、Abet0343GL、Abet0369GL和Abet0382GL示于表8和表9中。
例如，表5和表6显示Abet0380具有一组CDR，其中HCDR1为SEQ ID NO：525(卡巴特残基31-35)，HCDR2为SEQ ID NO：526(卡巴特残基50-65)，HCDR3为SEQ ID NO：527(卡巴特残基95-102)，LCDR1为SEQ ID NO：534(卡巴特残基24-34)，LCDR2为SEQ ID NO：535(卡巴特残基50-56)并且LCDR3为SEQ ID NO：536(卡巴特残基89-97)。其他优化抗体克隆以类似方式展示于表5和表6中并且也作为本发明的方面来提供。
根据本发明的对于人Aβ1-42的结合成员可包括在此描述的一个或多个CDR，例如一组CDR。该CDR或该组CDR可以是Abet0380、Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0381、Abet0382和Abet0383CDR组或其种系化形式，或可以是如此处所述的其突变体。
在一些实施例中；
HCDR1可为5个氨基酸长，由卡巴特残基31-35组成；
HCDR2可为17个氨基酸长，由卡巴特残基50-65组成；
HCDR3可为16个氨基酸长，由卡巴特残基95-102组成；
LCDR1可为11个氨基酸长，由卡巴特残基24-34组成；
LCDR2可为7个氨基酸长，由卡巴特残基50-56组成；且/或
LCDR3可为9个氨基酸长，由卡巴特残基89-97组成。
结合成员可包括表5和表6中列出的任何抗体的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3和/或LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，例如表5或6中列出的任何抗体的一组CDR。结合成员可包括这些抗体中的任何一个的一组VH CDR。任选地，它还可包括这些抗体中的一个的一组VL CDR。VLCDR可来自与VH CDR相同或不同的抗体。还在此提供了包含表5中列出的任何抗体的一组HCDR的一个VH域，和/或包含表6中列出的任何抗体的一组LCDR的一个VL域。
结合成员可包括表5和6中列出的任何抗体的一组H和/或L CDR，其中在所披露的该组H和/或L CDR内具有一个或多个氨基酸突变，例如多达5、10或15个突变。该突变可以是氨基酸取代、缺失或插入。例如，本发明的抗体分子可包括来自于Abet0380、Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0381、Abet0382和Abet0383，或其具有一个或两个氨基酸突变(例如取代)的种系化形式的H和/或L CDR。
例如，该结合成员可包括
VH域，该VH域包括Abet0380或Abet0380GL组的HCDR，其中该Abet0380或Abet0380GL HCDR的氨基酸序列是
HCDR1 SEQ ID NO：525，
HCDR2 SEQ ID NO：526，以及
HCDR3 SEQ ID NO：527，
或包括具有一个或两个氨基酸突变的Abet0380组的HCDR，以及
(ii)VL域，该VL域包括Abet0380或Abet0380GL组的LCDR，其中该Abet0380或Abet0380GL LCDR的氨基酸序列是
LCDR1 SEQ ID NO：534
LCDR2 SEQ ID NO：535，以及
LCDR3 SEQ ID NO：536，
或包括具有一个或两个氨基酸突变的Abet0380或Abet0380GL组的LCDR。
突变可潜在地在该组CDR内的任何残基处形成。在一些实施例中，取代可以在以下项任一个中与Abet0144GL相比被取代的位置处进行：Abet0380、Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0381、Abet0382和Abet0383，或在以下项任一个中与Abet0380相比被取代的位置处进行：Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0381、Abet0382和Abet0383，或其种系化形式，如在表5和6中所示。
例如，该一个或多个取代可在以下卡巴特残基中的一个或多个处：
VH FW1中26、27、28、29或30；
VH CDR1中31、32、33、34或35；
VH CDR2中52a、53、54、55、56、57、58或62；
VH CDR3中98、99、100h或102；
VL CDR1中24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34；
VL CDR3中89、90、92、93、94或97。
在具体卡巴特残基位置处的可能的氨基酸取代的实例针对VH域的示于表12和14，并且针对VL域的示于表13和15。
如上所述，结合成员可包括抗体分子，该分离抗体分子在抗体框架内具有一个或多个CDR，例如一组CDR。例如，一个或多个CDR或一组CDR抗体可枝接至框架(例如人框架)中以便提供抗体分子。框架区可为人种系基因节段序列。因此，框架可为种系的，其中框架内的一个或多个残基改变以便匹配最相似人种系框架中的相等位置处的残基。本领域技术人员可在种系化之前选择在序列上与抗体的框架序列最接近的种系节段并且在在此描述的测定中测试抗体的亲和力或活性以便证实种系化不显著减少抗原结合或效力。人种系基因节段序列为本领域技术人员已知的并且可例如从VBASE编译(VBASE，MRC蛋白质工程中心，UK，1997，http//mrc-cpe.cam.ac.uk)获得。
在此描述的结合成员可为分离人抗体分子，该分离抗体分子具有包含人种系框架中的一组HCDR的VH域，例如Vh3-23DP-47。因此，VH域框架区FW1、FW2和/或FW3可包括人种系基因节段Vh3-23DP-47的框架区和/或可种系化，方法是使框架残基突变以便匹配此人种系基因节段的框架残基。FW4可包括人种系j节段的框架区。
VH FW1的氨基酸序列可以是SEQ ID NO：528。VH FW1包含卡巴特位置26-30处的一系列残基，这些残基被认为有助于抗原结合和/或对CDR1环的结构构象是重要的。取代可包括在SEQ ID NO：528中，例如以便与所选择的HCDR1序列协同作用。该一个或多个取代可任选地选自表12或表14中所示的那些。
VH FW2的氨基酸序列可以是SEQ ID NO：529。VH FW3的氨基酸序列可以是SEQ IDNO：530。VH FW4的氨基酸序列可以是SEQ ID NO：531。
正常地结合成员也具有包括例如人种系框架中的一组LCDR的VL域，例如Vλ23-3DPL-23。因此，VL域框架区可包括人种系基因节段Vλ23-3DPL-23的框架区FW1、FW2和/或FW3，和/或可通过使框架残基突变以匹配此人种系基因节段的框架残基而种系化。FW4可包括人种系j节段的框架区。VL FW1的氨基酸序列可以是SEQ ID NO：537。VL FW2的氨基酸序列可以是SEQ ID NO：538。VL FW3的氨基酸序列可以是SEQ ID NO：539。VL FW4的氨基酸序列可以是SEQ ID NO：540。
种系化VH或VL域可在一个或多个游标残基处种系化或可未种系化，但是通常未种系化。
例如，在此描述的抗体分子或VH域可包括以下重链框架区集合：
FW1 SEQ ID NO：528；
FW2 SEQ ID NO：529；
FW3 SEQ ID NO：530；
FW4 SEQ ID NO：531；
或可包括具有1、2、3、4、5、6或7个氨基酸突变例如取代的所述重链框架区集合。
在此描述的抗体分子或VL域可包括以下轻链框架区集合：
FW1 SEQ ID NO：537；
FW2 SEQ ID NO：538；
FW3 SEQ ID NO：539；
FW4 SEQ ID NO：540；
或可包括具有1、2、3、4、5或6个氨基酸突变例如取代的所述轻链框架区集合。
与种系化抗体分子相比，非种系化抗体分子具有相同的CDR，但具有不同的框架。在此于附加序列表中显示的抗体序列中，Abet0144-GL、Abet0380-GL、Abet0377-GL、Abet0343-GL、Abet0369-GL、以及Abet0382-GL的序列是种系化的。其他的其序列在此被披露的抗体分子的种系化抗体可通过种系化它们的VH和VL域序列的框架区，可任选地在VH域中种系化为Vh3-23DP-47并且在VL域中种系化为Vλ23-3DPL-23。
典型地，VH域与VL域配对以便提供抗体抗原结合位点，但是如以上讨论，VH或VL域可单独用于结合抗原。例如，Abet0380-GL VH域(SEQ ID NO：524)可与Abet0380-GL VL域(SEQ ID NO：533)配对，以使得形成包含Abet0380-GL VH和VL域的抗体抗原结合位点。提供在此披露的其他抗体的VH和VL域的类似实施例。在其他实施例中，Abet0380-GL VH与除Abet0380-GL VL以外的VL域配对。轻链混杂在本领域中为沿用已久的。另外，本发明提供在此披露的其他VH和VL域的类似实施例。因此，包括VH CDR的VH域或Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0380、Abet0381、Abet0382和Abet0383中任一项的种系化VH域序列可与包括VL CDR的VL域或来自不同抗体的种系化VL域配对，例如该VH和VL域可以是来自选自以下各项的不同抗体：Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0380、Abet0381、Abet0382和Abet0383。
结合成员可包括
(i)如表16或附加序列表中针对以下中任一项所示的VH域氨基酸序列：Abet0380、Abet0343、Abet0369、Abet0377和Abet0382，或其种系化形式，
或包括具有一个或两个氨基酸突变的那个氨基酸序列；以及
(ii)如表16或附加序列表中针对以下中任一项所示的VL域氨基酸序列：Abet0380、Abet0343、Abet0369、Abet0377和Abet0382，或其种系化形式，
或包括具有一个或两个氨基酸突变的那个氨基酸序列。
抗体分子可包括：
(i)VH域，该VH域具有与表16中针对以下中任一项所示的VH域氨基酸序列至少90％、95％或98％一致的氨基酸序列：Abet0380、Abet0343、Abet0369、Abet0377和Abet0382，或其种系化形式；以及
(ii)VL域，该VL域具有与表16中针对以下中任一项所示的VL域氨基酸序列至少90％、95％或98％一致的氨基酸序列：Abet0380、Abet0343、Abet0369、Abet0377和Abet0382，或其种系化形式。
它可包括分别与Abet0380、Abet0343、Abet0369、Abet0377和Abet0382，或其种系化形式中任一项的VH域和VL域至少90％、95％或98％一致的VH域和VL域。
结合成员可包括VH域和VL域，其中
(i)VH域氨基酸序列展示于SEQ ID NO：524中并且VL域氨基酸序列展示于SEQ IDNO：533中。
(ii)与SEQ ID NO：524比较，VH域氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代，并且与SEQ ID NO：533比较，VL域氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代；或
(iii)VH域氨基酸序列具有与SEQ ID NO：524的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列一致性，并且VL域氨基酸序列具有与SEQ ID NO：533的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列一致性。
在一些实施例中，抗体分子可缺乏抗体恒定区，例如scFv。
在其他实施例中，抗体分子可包括抗体恒定区。抗体分子可为完整抗体例如IgG，即IgG1、IgG2或IgG4，或可为如下所述的抗体片段或衍生物。抗体分子还可具有其他形式，例如具有YTE的IgG1(达尔阿夸(Dall’Acqua)等人(2002)免疫学杂志(J.Immunology)，169:5171-5180；达尔阿夸(Dall’Acqua)等人(2006)生物化学杂志(J Biol.Chem.)281(33):23514-24)和/或Fc区域中的TM突变(奥根尼斯杨(Oganesyan)等人(2008)晶体学报(ActaCryst)D64:700-4)。
本发明提供了本发明的具有变体Fc区的结合成员，其中该变体包括位置234处的苯丙氨酸(F)残基、位置235处的苯丙氨酸(F)残基或谷氨酸(E)残基和位置331处的丝氨酸(S)残基，如由EU索引编号的如以卡巴特提出的。此种突变组合在下文称作三重突变体(TM)。
在此描述的结合成员可包括CDR、VH域、VL域、抗体-抗原结合位点或由核酸序列编码的抗体分子和/或以下项中任一个的载体：
(i)保藏登录号NCIMB 41889(Abet0007)；
(ii)保藏登录号NCIMB 41890(Abet0380-GL)；
(iii)保藏登录号NCIMB 41891(Abet0144-GL)；
(iv)保藏登录号NCIMB 41892(Abet0377-GL)。
在此描述的结合成员可由保藏登录号NCIMB 41889、41890、41891或41892的核酸、载体或细胞系来产生或可产生。例如，结合成员可由保藏登录号NCIMB 41890的细胞系的核酸或载体的表达来产生。核酸或载体可表达于任何便利的表达系统。或者，结合成员可由保藏登录号NCIMB 41889、41890、41891或41892的细胞系来表达。
本发明的多个方面还提供编码VH和/或VL域的核酸，该核酸包含于登录号41889、41890、41891或41892的细胞系中；包含所述核酸的载体，该载体包含于登录号41889、41890、41891或41892的细胞系中；以及登录号41889、41890、41891或41892的细胞或细胞系。
根据本发明的结合成员可包括抗体抗原结合位点或与由保藏在登录号41889、41890、41891或41892下的核酸分子编码的任何抗体分子，或与包括如在附加序列表中列出的Abet007、Abet0380-GL、Abet0144-GL或Abet0377-GL的VH域和VL域氨基酸序列的抗体分子竞争结合至人Aβ1-42的抗体分子。
结合成员
术语结合成员描述彼此结合的一对分子的一个成员。结合对的成员可天然地衍生或全部或部分地合成产生。分子对的一个成员在其表面上具有一个区域、或腔穴，该区域或腔穴结合至分子对的另一个成员的特定空间和极性组织并且由此与其互补。结合对的类型的实例为抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物。本发明涉及抗原-抗体类型反应。
结合成员通常包括具有抗原结合位点的分子。例如，结合成员可以是抗体分子或包括抗原结合位点的非抗体蛋白。
抗原结合位点可通过以下方式来提供：在非抗体蛋白支架(例如纤连蛋白或细胞色素B等)上排列CDR[哈恩(Haan)&麦格思(Maggos)(2004)生物世纪(BioCentury)，12(5)：A1-A6；小出(Koide)等人(1998)分子生物学杂志，284:1141-1151；尼格伦(Nygren)等人(1997)结构生物学新见(Current Opinion in Structural Biology)，7：463-469i]，或通过使蛋白支架内的环的氨基酸残基随机化或突变以便赋予对所希望的靶标的结合特异性。用于工程化蛋白质中的新颖结合位点的支架已经由尼格伦等人详细地评论[上文]。抗体模拟物的蛋白质支架披露于WO 00/34784中，将该文件通过引用以其全文结合在此，其中发明人描述了包括具有至少一个随机环的纤连蛋白类型III域的蛋白质(抗体模拟物)。其中枝接一个或多个CDR，例如一组HCDR或HCDR3和/或LCDR3的合适支架可由免疫球蛋白基因超家族的任何域成员来提供。支架可为人或非人蛋白质。非抗体蛋白支架的优势是它可在支架分子中提供比至少一些抗体分子更小且/或更容易制造的抗原结合位点。结合成员的小尺寸可赋予有用的生理性质，例如能够进入细胞，穿透组织深处或到达其他结构内的靶标，或结合于靶标抗原的蛋白腔穴内。非抗体蛋白支架中的抗原结合位点的用途评述于韦斯(Wess)，2004[韦斯，L.于：生物世纪，伯恩斯坦生物商业报告(The Bernstein Report onBioBusiness)，12(42)，A1-A7，2004]中。典型的为具有稳定骨架和一个或多个可变环的蛋白质，其中该一个或多个环的氨基酸序列特定或随机地突变以便产生结合靶标抗原的抗原结合位点。这些蛋白质包括来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的IgG结合域、运铁蛋白、四连接素、纤连蛋白(例如第10个纤连蛋白类型III域)、脂笼蛋白以及γ结晶和其他AffilinTM支架(Scil蛋白质)。其他途径的实例包括基于具有分子内二硫键、微蛋白质(VersabodiesTM，Amunix)和锚蛋白重复蛋白(DARPins，分子伴侣)的环肽-小蛋白质的合成“微体”。
除了抗体序列和/或抗原结合位点以外，结合成员还可包含其他氨基酸，例如形成肽或多肽，例如折叠域，或赋予分子除了结合抗原能力以外的另一种功能特性。结合成员可带有可检测标志，或可轭合至毒素或靶向部分或酶(例如经由肽键或接头)。例如，结合成员可包括催化位点(例如酶域)以及抗原结合位点，其中抗原结合位点结合至抗原并且因而将催化位点靶向至抗原。催化位点可例如通过裂解来抑制抗原的生物功能。
虽然，如所提及，CDR可由非抗体支架承载，但是承载本发明的CDR例如CDR3、或一组CDR的结构总体上为抗体重链或轻链序列或其实质性部分，其中CDR或CDR集合位于与由重新排列的免疫球蛋白基因编码的天然产生的VH和VL抗体可变域的CDR或CDR集合对应的位置处。免疫球蛋白可变域的结构和位置可参考卡巴特等1987[卡巴特，E.A.等人，免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)第4版，USDepartment of Health and Human Services.1987]和其更新来确定。许多学术和商业网上资源可用于查询此数据库。例如，参见马丁，A.C.R.(马丁(Martin)，A.C.R.)通过计算机来访问卡巴特抗体序列数据库蛋白质：结构、功能和遗传学(Accessing the KabatAntibody Sequence Database by Computer PROTEINS：Structure，Function andGenetics)，25(1996)130-133和当前在以下网址处的相关网上资源：http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html。
CDR区域或CDR用来指示如卡巴特等人1991[卡巴特E.A.等人(1991)免疫学关注的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)第5版，美国卫生和人服务部(US Department of Health and Human Services)，公共服务，NIH，华盛顿]和后来版本所定义的免疫球蛋白的重链和轻链的高变区域。抗体通常含有3个重链CDR和3个轻链CDR。术语CDR或CDR在此用于根据情况来指示这些区域中的一个或这些区域中的几个或甚至全部，这些区域含有负责通过抗体的亲和力来结合抗原或其所识别的表位的大部分氨基酸残基。
在六个短CDR序列之中，重链的第三个CDR(HCDR3)具有较大尺寸变化性(较大变异性基本上归因于产生变异的基因的排列机制)。它可短至2个氨基酸，但是已知的最长尺寸是26。CDR长度还可根据可由特定潜在框架容纳的长度而变化。在功能上，HCDR3部分地在确定抗体的特异性中发挥作用(西格尔(Segal)等人，PNAS，71:4298-4302，1974；艾米特(Amit)等人，科学(Science)，233:747-753，1986；乔西亚(Chothia)等人，分子生物学杂志，196:901-917，1987；乔西亚(Chothia)等人，自然，342:877-883，1989；卡顿(Caton)等人，免疫学杂志，144:1965-1968，199；莎伦(Sharon)等人，PNAS，87:4814-4817，1990；莎伦等人，免疫学杂志，144:4863-4869，1990；以及卡巴特等人，免疫学杂志，147:1709-1719，1991)。
抗体分子
它描述了免疫球蛋白，不论天然的还是部分或全部合成产生的。该术语也涵盖包含抗体抗原结合位点的任何多肽或蛋白。在此必须了解本发明不涉及自然形式的抗体，也就是说其不处于其自然环境中而是其已经能够通过从自然来源纯化来分离或获得，或通过基因重组，或通过化学合成来获得，并且其然后可含有非自然的氨基酸，如稍后所描述。包括抗体抗原结合位点的抗体片段包括但不限于以下分子：例如Fab、Fab’、Fab’-SH、scFv、Fv、dAb和Fd。包括一个或多个抗体抗原结合位点的各种其他抗体分子已经经过工程化，包括例如Fab2、Fab3、双抗体、三抗体、四抗体和小体。抗体分子和其构建和使用方法描述于霍利格尔&哈得孙(Holliger&Hudson)，自然生物技术(Nature Biotechnology)23(9):1126-1136 2005。
可采用单克隆和其他抗体并且使用重组DNA技术的技术来产生结合靶标抗原的其他抗体或嵌合分子。此类技术可涉及将编码抗体的免疫球蛋白可变区或CDR的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区，或恒定区加框架区中。参见例如EP-A-184187、GB 2188638 A或EP-A-239400和大量后续文献。杂交瘤细胞或产生抗体的其他细胞可经受基因突变或其他变化，这些基因突变或其他变化可以或不可以改变所产生的抗体的结合特异性。
鉴于可以用多种方式修饰抗体，术语“抗体分子”应被理解为涵盖具有带有所需特异性的抗体抗原结合位点的和/或结合至抗原的任一结合成员或物质。因此，此术语涵盖抗体片段和衍生物，包括包含了抗体抗原结合位点的任何多肽，不论天然的还是全部或部分合成的。因此包括嵌合分子，该分离抗体分子包含融合至另一个多肽(例如源自另一个物种或属于另一个抗体类别或子类)的抗体抗原结合位点或同等物。嵌合抗体的克隆和表达描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023，和大量后续文献中。
可在抗体工程化领域中获得的其他技术已经使得有可能分离人抗体和人源化抗体。例如，人杂交瘤细胞可如以下描述来产生：科特曼&迪贝尔(Kontermann&Dubel)[科特曼，R&迪贝尔，S，抗体工程化(AntibodyEngineering)，纽约施普林格出版公司(Springer-Verlag New York)，LLC；2001，ISBN:3540413545]。噬菌体展示，另一种用于产生结合成员的既定技术已经在许多公开物中详细描述，例如科特曼&迪贝尔[上述]和WO 92/01047(以下进一步讨论)，和美国专利US 5969108、US 5565332、US 5733743、US 5858657、US5871907、US 5872215、US 5885793、US 5962255、US 6140471、US 6172197、US 6225447、US6291650、US 6492160、US 6521404。
其中小鼠抗体基因经过钝化并且在功能上被人抗体基因替代而保持小鼠免疫系统的其他完整组件的转基因小鼠可用于分离人抗体[门德斯(Mendez)，M.等人(1997)自然遗传学(Nature Genet)，15(2):146–156]。人源化抗体可使用在本领域中已知的技术来产生，例如那些在例如WO 91/09967、US 5,585,089、EP 592106、US 565,332和WO 93/17105中披露的技术。此外，WO 2004/006955描述了通过将非人抗体的可变区的CDR序列的典型CDR结构类型与来自人抗体序列(例如种系抗体基因区段)的文库的相应CDR的典型CDR结构类型进行比较，基于对来自人抗体基因的可变区框架序列的选择来人源化抗体的方法。具有与非人CDR类似的典型CDR结构类型的人抗体可变区形成用于选择人框架序列的成员人抗体序列的子集。子集成员可进一步通过人CDR序列与非人CDR序列之间的氨基酸相似性来排序。在WO 2004/006955的方法中，选择最高级人序列以便提供用于构建嵌合抗体的框架序列，该嵌合抗体使用所选择的子集成员人框架在功能上以非人CDR对应物来替代人CDR序列，从而提供高亲和力和低免疫原性的人源化抗体而不需要在非人与人抗体之间比较框架序列。还披露了根据该方法产生的嵌合抗体。
合成抗体分子可通过从基因表达来产生，这些基因借助于在合适表达载体内合成并且组装的寡核苷酸来产生，例如如以下所描述：克纳皮克(Knappik)等人[克纳皮克等人分子生物学杂志(2000)296，57-86]或克雷布斯(Krebs)等人[克雷布斯等人免疫学方法杂志(Journal of Immunological Methods)254 2001 67–84]。
已经显示完整抗体的片段可执行结合抗原的功能。结合片段的实例是(i)由VL、VH、CL和CH1域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1域组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH域组成的Fv片段；(iv)由VH或VL域组成的dAb片段[沃德(Ward)，E.S.等人，自然341，544-546(1989)；麦考夫迪(McCafferty)等人(1990)自然，348，552-554；霍尔特(Holt)等人(2003)生物技术趋势(Trends in Biotechnology)21，484-490]；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，即包括两个连接的Fab片段的二价片段(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH域和VL域被一个肽接头连接，该肽接头允许这两个域相关联以形成抗原结合位点[伯德(Bird)等人，科学，242，423-426，1988；休斯顿(Huston)等人，PNAS USA，85，5879-5883，1988]；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US 92/09965)以及(ix)“双体”，通过基因融合构建的多价的或多特异性的片段(WO 94/13804；霍利格尔(Holliger)，P.等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90 6444-6448，1993)。Fv、scFv或双体分子可通过并入连接VH和VL域的二硫桥键来稳定[赖特尔Y.(Reiter，Y.)等人，自然生物技术，14，1239-1245，1996]。还可产生包含连接至CH3域的scFv的小体[胡，S.(Hu，S.)等人，癌症研究(CancerRes.)，56，3055-3061，1996]。结合片段的其他实例是Fab’，它与Fab片段的不同之处在于重链CH1域的羧基末端添加少许残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸，以及Fab’-SH，它是其中恒定域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基的Fab’片段。
基(Qui)等人[基等人，自然生物技术25:921-929 2007]描述仅含有两个通过框架区域连接的CDR的抗体分子。来自VH或VL域的CDR3连接至其他域的CDR1或CDR2环。连接是通过所选择的CDR1或CDR2的C末端至CDR3的N末端，经过FR区域。基(Qui)等选择具有最少疏水性小片的FR区域。所测试抗体的最好的组合发现为通过VH FR2连接至VH CDR3的VL CDR1(VHCDR1-VHFR2-VLCDR3)。与完整免疫球蛋白(大约150kDa)或scFv(大约28kDa)比较，在约3kDa的分子量下，这些抗体分子提供在经过改善的组织渗透方面的优势。
本发明的抗体片段可从在此列出的任何抗体开始来获得，方法例如为通过例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的酶来消化和/或通过化学还原来裂解二硫桥键。在另一个方式中，包括于本发明中的抗体片段可通过同样为本领域技术人员熟知的基因重组技术或通过借助于例如自动肽合成器，例如由应用生物系统公司等供应的那些合成器的肽合成，或通过核酸合成和表达来获得。
根据本发明的功能抗体片段包括其半衰期通过化学修饰，尤其通过聚乙二醇化，或通过并入脂质体中来增加的任何功能片段。
dAb(域抗体)为抗体的小单体抗原结合片段，即抗体重链或轻链的可变区。VHdAbs天然地出现于骆驼科(例如骆驼、美洲驼)中并且可通过用靶标抗原来免疫接种骆驼科，分离抗原特异性B细胞并且直接克隆来自个别B细胞的dAb基因而产生。dAb也可在细胞培养物中产生。它们的小尺寸、良好溶解性和温度稳定性使其尤其在生理上适用并且适合于选择和亲和力成熟。开发骆驼科VH dAb在名称“nanobodiesTM”下用于治疗用途。本发明的结合成员可以是dAb，它包括基本上如在此列出的VH或VL域，或包括包含了基本上如在此列出的一组CDR的VH或VL域。
双特异性或双功能抗体形成第二代单克隆抗体，其中两个不同可变区组合于同一分子中[霍利格尔和波伦(Bohlen)(1999)癌症与转移综述(Cancer and Metastasis Rev.)18:411-419]。其用途已经在诊断领域和治疗领域中得到证明，这是由于其能够募集新的效应子功能或将多种分子靶向输送于肿瘤细胞的表面上。当使用双特异性抗体时，这些抗体可为可以各种方法来制造的常规双特异性抗体[霍利格尔，P.和温特G.(Winter G.)生物技术新见(Current Opinion Biotechnol)4，446-449 1993]，例如以化学方法来制备或来自杂种杂交瘤细胞，或可为以上提到的任何双特异性抗体片段。这些抗体可通过化学方法[格伦尼M J(Glennie M J)等人，1987免疫学杂志139，2367-2375；利普R.(Repp R.)等人，1995血液学杂志(J.Hemat.)377-382]或体细胞方法[施特茨U.D.(Staerz U.D.)和贝文M.J.(Bevan M.J.)1986 PNAS 83；苏雷什M.R.(Suresh M.R.)等人，1986酶学方法(MethodsEnzymol.)121：210-228]来获得但是同样地并且优选地通过遗传工程技术来获得，这允许强迫进行异源二聚化，由此促进所寻求的抗体的纯化过程[梅尔昌德(Merchand)等人，1998自然生物技术16:677-681]。双特异性抗体的实例包括BiTETM技术的那些抗体，其中具有不同特异性的两个抗体的结合域可使用并且经由短柔性肽来直接连接。这将两个抗体组合于短单一多肽链上。可以仅使用可变域来构建没有Fc区的双体和scFv，从而潜在地减少抗-独特型反应的影响。
双特异性抗体可构建为整个IgG、双特异性Fab'2、Fab'PEG、双抗体或另外构建为双特异性scFv。此外，两个双特异性抗体可使用在本领域中已知用于形成四价抗体的常规方法来连接。
与双特异性完整抗体形成对照，双特异性双体也可以是尤其有用的，因为这些双特异性双体可容易地构建并且表达于大肠杆菌中。具有合适结合特异性的双抗体(和许多其他多肽，例如抗体片段)可使用噬菌体展示(WO 94/13804)来从文库中容易地选择。如果双体的一个臂保持恒定，例如，具有针对如此处所述的β淀粉样蛋白的特异性，那么可产生其中另一个臂可变化的文库并且选择合适特异性的抗体。双特异性完整抗体可通过替代工程化方法来产生，如里奇韦(Ridgeway)等人，1996[里奇韦J.B.B.(Ridgeway，J.B.B.)等人，蛋白质工程化(Protein Eng.)，9，616-621，1996]中所描述。
在本领域中可利用获得抗体的各种方法。抗体可以是尤其为人、鼠科、嵌合或人源化来源的单克隆抗体，这些单克隆抗体可根据本领域技术人员熟知的标准方法来获得。
通常，为了制备单克隆抗体或其功能性片段，尤其是鼠起源的，可能参考具体在操作手册“抗体”[哈洛(Harlow)和莱恩(Lane)，抗体：实验室操作手册，冷泉港实验室，冷泉港N.Y.，第726页，1988]中描述的技术或指制备由科勒(
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)和米尔斯坦(Milstein)[科勒和米尔斯坦，自然，256:495-497，1975]所述的杂交瘤的技术。
单克隆抗体可例如从一种动物细胞获得，该动物细胞用人Aβ1-42，或其含有由所述单克隆抗体识别的表位的片段之一例如Aβ17-42来免疫。合适片段和包含它们的肽或多肽描述于此，并且可用于使动物免疫以便产生针对Aβ1-42的抗体。所述抗原或其片段之一可尤其根据通常的工作方法来产生，以被包括在编码Aβ1-42或其片段的cDNA序列中的核酸序列开始通过基因重组，从被包括在Aβ1-42的肽序列和/或其片段中的氨基酸序列开始通过肽合成。
单克隆抗体可例如在亲和柱上纯化，人Aβ1-42或其含有由所述单克隆抗体识别的表位的片段之一(例如Aβ17-42)在先前已经固定于该柱上。更具体地说，单克隆抗体可通过蛋白A和/或G上的色谱法来纯化，随后进行或随后不进行旨在消除残留蛋白污染物以及DNA和LPS的离子交换色谱，其本身随后进行或随后不进行琼脂糖凝胶上的排阻色谱法以便消除由于存在二聚体或其他多聚体而引起的潜在聚集体。在一个实施例中，全部这些技术可同时或连续地使用。
抗原结合位点
这描述了结合至并且与靶标抗原的全部或一部分互补的分子部分。在抗体分子中，它被称为抗体抗原结合位点，并且包括结合至并且与靶标抗原的全部或一部分互补的分子部分。当抗原较大时，抗体可只结合至抗原的特定部分，此部分称为表位。抗体抗原结合位点可由一个或多个抗体可变域来提供。抗体抗原结合位点可包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
WO 2006/072620描述了在免疫球蛋白域的β链之间伸长的结构(非-CDR)环中的抗原结合位点的工程化。抗原结合位点可工程化于与CDR的天然位置分开的抗体分子区域中，例如在VH或VL域的框架区域中，或在抗体恒定域例如CH1和/或CH3中。工程化于结构区域中的抗原结合位点可附加于或代替由VH和VL域的CDR集合形成的抗原结合位点。当多个抗原结合位点存在于抗体分子中时，它们可结合同一抗原(靶标抗原)，从而增加结合成员的效力。或者，多个抗原结合位点可结合不同抗原(靶标抗原和一个或多个其他抗原)，并且这可用于增加效应子功能、延长半衰期或改善抗体分子的体内输送。
分离
这是指本发明的结合成员，或编码这些结合成员的核酸总体上根据本发明的状态。因此，根据本发明的结合成员、VH和/或VL域和编码核酸分子和载体可在以下状态下提供：例如从其自然环境中分离和/或纯化、呈大致上纯或均质形式，或在核酸的情况下，不含或大致上不含除编码具有所需功能的多肽的序列以外的来源核酸或基因。分离成员和分离核酸不含或大致上不含在天然状态下与其相关联的材料，例如在其天然环境下，或在此制备是通过在体外或在体内实施的重组DNA技术时在其制备环境(例如细胞培养物)中与其一起存在的其他多肽或核酸。成员和核酸可与稀释剂或佐剂一起配制并且仍然出于实际目的来分离—例如如果用于涂布在免疫测定中使用的微量滴定板，则成员通常与明胶或其他载体混合、或在用于诊断或治疗时，与药学上可接受的载体或稀释剂混合。结合成员可在天然状态下或通过异源真核细胞系统(例如CHO或NS0(ECACC 85110503)细胞来糖基化，或它们可以是(例如如果通过在原核细胞中表达来产生)未糖基化的。
包含抗体分子的异质制剂也形成本发明的一部分。例如，这些制剂可为抗体与全长重链和没有C-末端赖氨酸的重链的混合物，具有不同程度的糖基化和/或具有衍生的氨基酸，例如N-末端谷氨酸的环化以便形成焦谷氨酸残基。
如此处使用的，短语“基本上如列出的”是指此处所述的结合成员的VH或VL域的相关CDR的特征与此处列出的序列的指定区可以是相同的或高度相似的。如此处所述的，术语相对于一个或多个可变域的指定区“高度相似”，考虑了可在该CDR和/或VH或VL域中进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸取代。
如上所注，根据本发明的结合成员结合人Aβ1-42。如此处所述的，在HTRFTM竞争测定中，可针对亲和力和/或抑制效力来优化本发明的结合成员。总体上，效力优化涉及使所选择的结合成员的序列(通常抗体的可变域序列)突变以便产生结合成员的文库，然后测定效力并且选择更有效的结合成员。以此选择的“效力优化的”结合成员趋向于比该文库自其产生的结合成员具有更高的效力。然而，高效力结合成员还可在不优化的情况下获得，例如高效力结合成员可通过初始筛选来直接获得。检定和效力在此在别处更详细地描述。普通技术人员可因此产生具有高效力的结合成员。
另一个方面，本发明提供了一种获得能够结合抗原的一种或多种结合成员的方法，该方法包括使根据本发明的结合成员的文库与所述抗原接触，并且选择该文库的能够结合所述抗原的一个或多个结合成员。
文库可展示于颗粒或分子复合体上，例如可复制遗传包，例如酵母、细菌或噬菌体(例如T7)颗粒、病毒、细胞或共价、核糖体或其他体外展示系统，每个颗粒或分子复合体含有编码展示于其上的抗体VH可变域的核酸，以及编码任选地也展示的VL域的核酸，如果存在的话。噬菌体展示描述于WO 92/01047和例如美国专利US 5969108、US 5565332、US5733743、US 5858657、US 5871907、US 5872215、US 5885793、US 5962255、US 6140471、US6172197、US 6225447、US 6291650、US 6492160和US 6521404，其每一个以其全部内容通过引用结合在此。核糖体展示描述于黑尼斯J(Hanes J)和普吕克通A.(Plückthun A.)(1997)美国国家科学院院刊1997年5月13；94(10):4937-42；WO 01/75097和WO 2006/072773，其每一个以其全部内容通过引用结合在此。
在选择能够结合抗原的结合成员并且展示于噬菌体或其他文库颗粒或分子复合体上之后，核酸可从展示所述选定结合成员的噬菌体或其他颗粒或分子复合体来获得。这类核酸可用于随后通过从核酸表达来产生结合成员或抗体VH或VL可变域，核酸序列从展示所述选定结合成员的噬菌体或其他颗粒或分子复合体来获得。
所述选定结合成员的抗体VH可变域的氨基酸序列的抗体VH可变域可以分离形式来提供，此提供方式可与包含这种VH域的结合成员一样。
可进一步测试结合人Aβ1-42和Aβ1-40的能力，以及与例如如在此列出的任何抗体(例如呈scFv形式和/或IgG形式，例如IgG2或IgG1)竞争结合至人Aβ1-42的能力。可如在此在别处进一步讨论来测试中和Aβ1-42的能力。
结合成员能以表5和6中列出的任何抗体例如scFv、IgG2、IgG1TM或IgG1的亲和力，或以更好的亲和力来结合人Aβ1-42。抗体结合亲和力展示于表7。不同结合成员的结合亲和力和中和效力可在合适条件下比较。
在此描述的VH和VL域和CDR的变体，包括其氨基酸序列在此阐明、并且可用于Aβ1-42的结合成员中的那些变体可通过序列改变或突变并且筛选具有所需特性的抗原结合成员的方法来获得。所希望的特征的实例包括但不限于：相对于对抗原具有特异性的已知抗体而言对抗原的结合亲和力增加，相对于对抗原具有特异性的已知抗体而言对抗原活性(如果活性已知)的中和增加，在特定摩尔比率下与已知抗体或配体针对抗原的特定竞争力、免疫沉淀复合体的竞争力、结合至特定表位(线性表位，例如使用如此处所述的肽-结合扫描鉴别的肽序列，例如使用以线性和/或受限构象筛选的肽，或由非连续的残基形成的构象的表位)的能力；以及调节人Aβ1-42的新的生物活性的能力。这些方法也在此提供。
在此披露的抗体分子的变体可被产生并且用于本发明中。遵循计算化学在将多元数据分析技术应用于结构/性质-活性关系中的指引[参见例如伍德(Wold)等在化学中的多元数据分析。化学计量学–化学中的数学和统计学(Multivariate data analysis inchemistry.Chemometrics-Mathematics and Statistics in Chemistry)(编：B.科瓦尔斯基(B.Kowalski))；雷代尔出版公司(D.Reidel Publishing Company)，荷兰多德雷赫特(Dordrecht，Holland)，1984(ISBN 90-277-1846-6]，可使用熟知数学技术例如统计回归、模式识别和分类来产生抗体的定量活性-性质关系[参见例如诺曼(Norman)等人应用回归分析(Applied Regression Analysis)Wiley-Interscience；第3版(1998年4月)ISBN：0471170828；坎德尔(Kandel)，亚伯拉罕(Abraham)等人群集分析中的计算机辅助推理(Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis)Prentice Hall PTR(1995年5月11日)，ISBN：0133418847；克扎诺夫斯基(Krzanowski)，佛伊泰克(Wojtek)多元分析原则：用户观点(Principles of Multivariate Analysis：A User’s Perspective)(牛津统计科学系列(Oxford Statistical Science Series)，第22期(论文))牛津大学出版社(OxfordUniversity Press)；(2000年12月)，ISBN：0198507089；威滕(Witten)，伊恩H.(Ian H.)等数据挖掘技术：实用机器学习工具和Java实施技术(Data Mining：Practical MachineLearning Tools and Techniques with Java Implementations)Morgan Kaufmann；(1999年10月11日)，ISBN：1558605525；丹尼森(Denison)戴维G.T.(David G.T.)(编辑)等非线性分类和回归的贝叶斯方法(Bayesian Methods for Nonlinear Classification andRegression)(概率统计威利系列(Wiley Series in Probability and Statistics))约翰威利出版有限公司(John Wiley&Sons))(2002年7月)，ISBN：0471490369；高斯(Ghose)，阿勒普K.(Arup K.)等人药物发现中的组合厍设计和评估原则、软件、工具以及应用(Combinatorial Library Design and Evaluation Principles，Software，Tools，andApplications in Drug Discovery)ISBN：0-8247-0487-8]。抗体的性质可从抗体序列、功能和三维结构的经验和理论模型(例如，分析可能接触残基或计算物理化学性质)来得到并且这些性质可个别地和组合地考虑。
主要由VH域和VL域组成的抗体抗原结合位点通常由六个多肽环形成：三个来自轻链可变域(VL)并且三个来自重链可变域(VH)。已知原子结构的抗体的分析已经阐明抗体组合位点的序列与三维结构之间的关系[乔西亚C.(Chothia C.)等人分子生物学杂志(1992)227，799-817；奥拉兹卡尼(Al-Lazikani)等人分子生物学杂志(1997)273(4)，927-948]。这些关系暗示，除了VH域中的第三区域(环)，结合位点环具有少量主链构象之一：典型结构。在特定环中形成的典型结构已被证明由其尺寸和在环和框架区中的关键位点存在某些残基来确定。
序列-结构关系的此研究可用于预测具有已知序列，但是具有未知三维结构的抗体中的那些残基，这对于维持其CDR环的三维结构并且由此保持结合特异性为至关重要的。这些预测可通过将预测与来自前导优化实验的输出进行比较来获得支持。在结构方法中，可使用任何可自由获得或商业包，例如WAM[怀特勒格N.R.u.(Whitelegg，N.R.u.)和里斯A.R(Rees，A.R)(2000)蛋白质工程化，12，815-824]来建立抗体分子的模型[乔西亚等人科学，223，755-758(1986)]。然后，蛋白可视化和分析软体包，例如Insight II(Accelrys公司)或Deep View[盖(Guex，N.)和派奇M.C.(Peitsch，M.C.)电泳(Electrophoresis)(1997)18，2714-2723]可用于评估CDR中的每个位置处的可能取代。然后，此信息可用于产生可能的取代从而对于活性具有最小或有利效应。
产生在CDR、抗体VH或VL域和结合成员的氨基酸序列之内的取代所需的技术总体上在本领域中是可获得的。可产生具有取代的变体序列，可预测或不可预测这些取代对于活性具有最小或有利效应，并且针对结合Aβ1-42的能力和/或针对任何其他所希望的特性来对这些变体序列进行测试。
其序列确切地披露于此的任何VH和VL域的可变域氨基酸序列变体可根据本发明来使用，如所讨论。
如上所述，本发明的多个方面提供结合成员，例如抗体分子，该分离抗体分子所包含的VH域与VH域序列展示于以下附加序列表中的在此列出的任何抗体的VH域具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列一致性；和/或其所包含的VL域与VL域序列展示于附加序列表中的表11中列出的任何抗体的VL域具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列一致性。
本发明的多个方面提供结合成员，例如抗体分子，该分离抗体分子包含的VH域所具有的一组VH CDR与VH CDR序列在此展示的任何在此列出的抗体的VH CDR集合具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列一致性；和/或其包含的VL域所具有的一组VLCDR与VLCDR序列在此展示的任何在此列出的抗体的VL CDR集合具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列一致性。
可用于计算两个氨基酸序列的一致性％的算法包括例如BLAST[阿特休尔(Altschul)等人(1990)分子生物学杂志215:405-410]、FASTA[皮尔森(Pearson)和李普曼(Lipman)(1988)PNAS USA 85:2444-2448]或Smith-Waterman算法[史密斯(Smith)和华特曼(Waterman)(1981)分子生物学杂志147:195-197]，例如使用默认参数。
特定可变域可包括一个或多个氨基酸序列突变(氨基酸残基的取代、缺失和/或插入)，并且小于约15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个。
可在一个或多个框架区和/或一个或多个CDR中产生突变。突变通常不产生功能损失，因此包含如此改变的氨基酸序列的结合成员可保持结合人Aβ1-42的能力。它可保持与未产生改变的结合成员相同的定量结合和/或中和能力，例如在此描述的测定中测量。包含如此改变的氨基酸序列的结合成员可具有改进的结合人Aβ1-42的能力。
突变可包括以非天然存在的或非标准的氨基酸替代一个或多个氨基酸残基、将一个或多个氨基酸残基修饰成非天然存在的或非标准的形式，或将一个或多个非天然存在的或非标准的氨基酸插入至序列中。本发明的序列中的改变的数量和位置的实例在此在别处描述。天然存在的氨基酸包括20个“标准”L-氨基酸，通过它们的标准单个字母代码被识别为G、A、V、L、I、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、E。非标准氨基酸包括可并入多肽骨架中或由现有氨基酸残基的修饰来产生的任何其他残基。非标准氨基酸可以是天然存在或非天然存在的。几个天然产生的非标准氨基酸本领域中已知的，例如4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、3-甲基组氨酸、N-乙酰丝氨酸等人[富特&富特(Voet&Voet)，生物化学(Biochemistry)，第2版，(威利公司(Wiley))1995]。这些在它们的N-α位衍生的氨基酸残基将仅位于氨基酸序列的N端。正常地在本发明中氨基酸为L-氨基酸，但是它可为D-氨基酸。因此，改变可包括将L-氨基酸以D-氨基酸来修饰，或用它来替代。甲基化、乙酰化和/或磷酸化形式的氨基酸也是已知的，并且本发明中的氨基酸可经受这种修饰。
本发明的抗体域和结合成员中的氨基酸序列可包括如上所述的非天然的或非标准的氨基酸。在合成期间非标准氨基酸(例如D-氨基酸)可被并入氨基酸序列中，或在该氨基酸序列合成之后通过“原始”标准氨基酸的修饰或替代来并入。
使用非标准和/或非天然存在的氨基酸增加结构和功能多样性，并且因而可增加在本发明的结合成员中实现所希望的结合以及中和特性的潜力。另外，D-氨基酸和类似物已被证明与标准L-氨基酸相比具有不同的药代动力学概况，这是由于具有L-氨基酸的多肽在给予动物例如人之后在体内降解，从而意味着D-氨基酸有利于一些体内应用。
可产生承载本发明的CDR衍生序列的新颖VH或VL区域，方法是使用一个或多个选定VH和/或VL基因的随机诱变以便产生整个可变域内的突变。这类技术由格兰(Gram)等人描述[格兰等人，1992，美国国家科学院院刊，89:3576-3580]，使用容易出错的PCR。在一些实施例中，一个或两个氨基酸取代在整个可变域或CDR集合内产生。
可使用的另一个方法是将诱变引导至VH或VL基因的CDR区域。这些技术由巴巴斯(Barbas)等人[巴巴斯等人，1994，美国国家科学院院刊，91:3809-3813]和希尔(Schier)等人[希尔等人，1996，分子生物学杂志263:551-567]披露。
所有上述技术在本领域中为本身已知的并且本领域技术人员能够使用这些技术以便使用本领域中的常规方法来提供本发明的结合成员。
另一个方面本发明提供了一种获得人Aβ1-42的抗体抗原结合位点的方法，该方法包括：经由将一个或多个氨基酸取代、缺失或插入于在此阐明的VH域的氨基酸序列中来提供作为VH域的氨基酸序列变体的VH域，任选地将由此提供的VH域与一个或多个VL域组合，以及测试VH域或一种或多种VH/VL组合以便识别针对Aβ1-42并且任选地具有一个或多个所需性质的结合成员或抗体抗原结合位点。所述VL域可具有基本上如在此列出的氨基酸序列。可使用类似方法，其中在此披露的VL域的一个或多个序列变体与一个或多个VH域组合。
如以上提及，大致上如在此阐明的CDR氨基酸序列可作为CDR并入人抗体可变域或其实质性部分中。大致上如在此阐明的HCDR3序列代表本发明的实施例并且这些序列中的每一个可作为HCDR3并入人重链可变域或其实质性部分中。
用于本发明的可变域可从任何种系或重新排列的人可变域获得或得到，或可以是基于已知人可变域的共有序列或实际序列的合成可变域。可变域可从非人抗体得到。可使用重组DNA技术将本发明的CDR序列(例如CDR3)引入缺乏CDR(例如CDR3)的可变域谱系中。例如，玛尔柯斯(Marks)等人[玛尔柯斯等人生物技术(Bio/Technology)，1992，10:779-783]描述了产生抗体可变域谱系的方法，其中定向于或相邻于可变域区域的5'末端的共同引物与人VH基因的第三框架区域的共同引物相结合使用以便提供缺乏CDR3的VH可变域的谱系。玛尔柯斯等人进一步描述此谱系可与特定抗体的CDR3组合的方法。使用类似技术，本发明的CDR3衍生序列可与缺乏CDR3的VH或VL域的谱系进行改组，并且经改组的完整的VH或VL域可以与同源VL或VH域组合，从而提供本发明的结合成员。然后，谱系可展示于合适宿主系统中，例如以其全部内容通过引用结合在此的WO 92/01047，或任何后续大量文献，包括凯、温特&麦卡弗蒂(Kay，Winter&McCafferty)[凯，B.K.(Kay，B.K.)，温特，J.(Winter，J.)和麦卡弗蒂，J.(McCafferty，J.)(1996)肽和蛋白质的噬菌体展示：实验室手册(PhageDisplay of Peptides and Proteins：A Laboratory Manual)，圣地亚哥：学术出版社(SanDiego：Academic Press)]的噬菌体展示系统，以使得可选择合适结合成员。谱系可由104个个别成员以上的任何成员组成，例如至少105、至少106、至少107、至少108、至少109或至少1010个成员或更多个。其他合适宿主系统包括但不限于酵母展示、细菌展示、T7展示、病毒展示、细胞展示、核糖体展示和共价展示。
提供了一种制备针对人Aβ1-42的结合成员的方法，该方法包括：
(a)提供编码VH域的核酸的起始谱系，该VH域包括有待替代的CDR3或缺乏CDR3编码区域；
(b)将所述谱系与编码基本上如在此对于VH CDR3(例如表11示出的VH CDR3)阐明的氨基酸序列的供体核酸组合，这样使得所述供体核酸插入谱系中的CDR3区域中，以便提供编码VH域的核酸的产物谱系；
(c)表达所述产物谱系的核酸；
(d)选择针对人Aβ1-42的结合成员；并且
(e)回收所述结合成员或编码它的核酸。
另外，可使用其中将本发明的VL CDR3与编码VL域的核酸的谱系组合的类似方法，该VL域包括有待替代的CDR3或缺乏CDR3编码区域。
类似地，一个或多个或所有三个CDR可枝接至VH或VL域的谱系中，然后针对人Aβ1-42的一个或多个结合成员对其进行筛选。
例如，可使用来自表5或表6列出的一个或多个抗体的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，例如一组HCDR，和/或可使用来自在此列出的一个或多个抗体的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，例如LCDR集合。
类似地，可使用在此披露的其他VH和VL域、CDR集合和HCDR集合和/或LCDR集合。
免疫球蛋白可变域的实质性部分可包括至少三个CDR区域，连同介入其间的框架区。部分还可包括第一和第四框架区中一个或两个的至少约50％，该50％为第一框架区域的C-末端50％和第四框架区域的N-末端50％。可变域的实质性部分的N-末端或C-末端的另外残基可以是通常不与天然存在的可变域区域相关联的那些残基。例如，通过重组DNA技术产生的本发明的结合成员的构建可导致由所引入的接头编码的N-或C-末端残基的引入以便促进克隆或其他操纵步骤。其他操纵步骤包括引入将本发明的可变域连接至包括抗体恒定区的其他蛋白序列的连接物、其他可变域(例如在产生双抗体中)或可检测/功能性标志，如在此在别处更详细地讨论。
虽然在本发明的一些方面，结合成员包括一对VH和VL域，但是基于VH或VL域序列的单一结合域形成本发明的另外方面。已知单一免疫球蛋白域，尤其VH域，能够以特异性方式结合靶标抗原。例如，参见上述dAbs的讨论。
在任一单一结合域的情况下，这些域可用于筛选能够形成能结合Aβ1-42的两域结合成员的互补域。这可通过噬菌体展示筛选方法使用如在以其全部内容通过引用结合在此的WO 92/01047中披露的所谓分级双重组合方法来获得，其中含有H或L链克隆的个别集落用于感染编码另一种链(L或H)的克隆的完整文库，并且根据噬菌体展示技术，例如在所述参考文献中描述的那些技术来选择所得两链结合成员。此技术也披露于玛尔柯斯(Marks)等人生物技术，1992，10:779-783中。
本发明的结合成员可进一步包括抗体恒定区或其部分，例如人抗体恒定区或其部分。例如，VL域可在其C-末端连接至抗体轻链恒定域，包括人Cκ或Cλ链。类似地，基于VH域的结合成员可在其C-末端连接至源自任何抗体同工型(例如IgG、IgA、IgE和IgM和任何同工型子类，尤其是IgG2、IgG1和IgG4)的免疫球蛋白重链的全部或一部分(例如CH1域)。IgG2由于其缺乏效子应功能而在一些实施例中可以是有利的。在其他实施例中，IgG1因其效应子功能和易于制造可以是有利的。具有这些性质并且使可变区稳定的任何合成或其他恒定区变体在本发明中也是有用的。
结合成员可用可检测或功能标志来加标志。因此，结合成员或抗体分子可以按免疫轭合物形式存在以便获得可检测且/或可定量的信号。免疫轭合物可包括与可检测或功能标志轭合的本发明的抗体分子。如本文提到的可检测标志可为产生或可诱导产生信号的任何标志，包括但不限于荧光剂、化学发光剂(例如辣根过氧物酶)、有色标志(例如乳胶[蓝色]或胶体金[红色])、放射性同位素标志、酶、感光剂和磁性标志。因此，结合于表面，例如毛细管孔的表面的标志的量可通过检测荧光或发光、颜色、放射性、酶的活性、吸光率或磁场变化来检测和/或测量。可检测标志可使用常规化学来连接至结合成员。优选地，可检测标志为可通过光学解调，例如以数字摄像机或平台式扫描仪来检测的标志。可通过光学解调来检测的标志包括荧光剂、化学发光剂和有色标志。可藉以产生信号以便光学检测的机制包括(但不一定限于)：光吸收、光散射、光衍射、光反射、荧光或发光。
合适标志包括作为说明而非限制地，
-酶，例如碱性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(“G6PDH”)、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸酶和过氧物酶，例如辣根过氧化物酶；
-染料；
-荧光标签或荧光剂，例如荧光素及其衍生物、荧色物、若丹明化合物和衍生物、GFP(针对“绿色荧光蛋白”的GFP)、丹酰、伞形花内酯、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝素、邻苯二醛、以及荧光胺；荧光素，例如镧系元素穴状化合物和螯合物，例如铕等(珀金埃尔默和Cis生物科技)，
-化学发光标志或化学发光剂，例如异鲁米诺、鲁米诺和二氧杂环丁烷类；
-生物-发光标志，例如荧光素酶和荧光素；
-敏化剂；
-辅酶；
-酶底物；
-放射性示踪标记，包括但不限于，溴77、碳14、钴57、氟8、镓67、镓68、氢3(氚)、铟111、铟113m、碘123m、碘125、碘126、碘131、碘133、汞107、汞203、磷32、铼99m、铼101、铼105、钌95、钌97、钌103、钌105、钪47、硒75、硫35、锝99、锝99m、碲121m、碲122m、碲125m、铥165、铥167、铥168、钇199和此处提到的其他放射性示踪标记；
颗粒，例如乳胶或碳颗粒；金属溶胶；雏晶；脂质体；细胞等，它们可以用染料、催化剂或其他可检测基团来进一步加标志；
分子，例如生物素、地高辛或5-溴脱氧尿苷；
毒素部分，例如选自以下群组的毒素部分：假单胞菌外毒素(PE或其细胞毒性片段或突变型)、白喉毒素或其细胞毒性片段或突变型、肉毒杆菌毒素A、B、C、D、E或F、蓖麻毒素或其细胞毒性片段例如蓖麻毒素A、相思豆毒素或其细胞毒性片段、皂素或其细胞毒性片段、美洲商陆抗病毒毒素或其细胞毒性片段、以及异株腹泻毒蛋白1或其细胞毒性片段。
合适酶和辅酶的实例披露于US 4275149，和US 4318980中。合适荧光剂和化学发光剂也披露于US 4275149中。标志进一步包括化学部分，例如可经由结合至具体同源可检测部分来检测的生物素，例如加标志的抗生物素蛋白或链霉亲和素。可检测标志可使用在本领域中已知的常规化学来连接至本发明抗体。
免疫轭合物或其功能片段可通过本领域技术人员已知的方法来制备。其可直接或经由间隔基团或连接基团来连接至酶或荧光标志，该间隔基团或连接基团例如聚醛如戊二醛、乙二胺四醋酸(EDTA)、二乙烯-三胺五醋酸(DPTA)或在连接剂的存在下，例如以上关于治疗轭合物所提到的那些连接剂。含有荧光素类型的标志的轭合物可通过与异硫氰酸酯反应来制备。
在本领域中已知用于直接或经由以上提到的螯合剂例如EDTA、DTPA将治疗放射性同位素连接至抗体的方法也可用于可在诊断使用中的放射性元素。同样可通过氯胺T方法来执行用钠125加标志[亨特W.M.(Hunter W.M.)和格林伍德F.C.(Greenwood F.C.)(1962)自然194:495]或另外通过US 4424200的技术用锝99m加标志或如US 4479930描述经由DTPA来附接。
存在标志可藉以产生信号的许多方法，该信号可通过外部手段，例如肉眼检查、电磁辐射、热和化学试剂来检测。标志还可结合至结合本发明抗体的另一个结合成员，或结合至支撑物。
标志可直接产生信号，并且因此不需要另外组分来产生信号。许多有机分子，例如荧光剂，能够吸收紫外线和可见光，其中光吸收将能量转移至这些分子并且将其提高至激发能量状态。然后，此吸收能量通过第二波长下的光发射来耗散。此第二波长发射也可将能量转移至加标志的受体分子，并且所得能量通过光发射例如荧光共振能量转移(FRET)而从受体分子耗散。直接产生信号的其他标志包括放射性同位素和染料。
或者，标志可需要其他组分来产生信号，并且然后信号产生系统包括产生可测量信号所需要的所有组分，这些组分可包括底物、辅酶、增强剂、另外酶、与以下各项反应的物质：酶产物、催化剂、活化剂、辅助因子、抑制剂、清除剂、金属离子，以及用于结合信号产生物质所需要的具体结合物质。合适信号产生系统的详细讨论可发现于US 5185243中。
本发明的一个方面提供了包含引起或允许如在此提供的结合成员结合至人Aβ1-42的方法。如提及，这种结合可在体内，例如在给予结合成员，或编码结合成员的核酸之后发生，或它可在体外发生，例如在ELISA、蛋白质印迹、免疫细胞化学、免疫沉淀反应、亲和色谱和生化或基于细胞的测定中。
本发明也提供例如在生物传感器系统中使用根据本发明的结合成员来直接测量抗原水平(例如，血浆或CSF中)。例如，检测和/或测量与人Aβ1-42的结合的方法可包括(i)将所述结合成员暴露于Aβ1-42和(ii)检测所述结合成员与Aβ1-42的结合，其中结合是使用在此描述的任何方法或可检测标志来检测。Aβ1-42可以是单体或寡聚Aβ1-42，优选单体Aβ1-42。在此所述的此和任何其他结合检测方法可直接由执行方法的个人，例如通过在视觉上观察可检测标志来解释。或者，此方法，或在此描述的任何其他结合检测方法可产生呈以下形式的报告：自动射线摄影、照片、计算机打印输出、流式细胞术报告、曲线图、图表、含有结果的试管或容器或孔或方法结果的任何其他视觉或实体表达。
可确定结合成员与Aβ1-42结合的量。定量可与试样中的抗原的量相关，它可以具有诊断重要性。筛选Aβ1-42结合和/或其定量可适用于例如针对在此提到的疾病或病症和/或涉及异常Aβ1-42水平和/或活性的任何其他疾病或病症来对患者进行筛选。
诊断方法可包括(i)从受试者(例如疑似或认为患有此处所述的病况或疾病的患者)获得组织或液体样品，(ii)使所述组织或液体样品暴露于本发明的一种或多种结合成员；并且(iii)与对照样品比较来检测结合的Aβ1-42，其中与对照比较Aβ1-42结合量的增加可指示Aβ1-42的异常水平。待测试的组织或液体样品包括血液、血清、血浆、CSF、尿、活检材料、肿瘤或疑似含有异常Aβ1-42水平的任何组织。对于异常Aβ1-42水平或活性测试为阳性的受试者还可受益于在此稍后披露的治疗方法。
本领域技术人员能够鉴于在此披露的方法，根据其偏好和常识来选择测定结合成员与抗原结合的合适方式。
样品中的结合成员的反应性可通过任何合适手段来确定。放射免疫检定(RIA)为一个可能。放射性标志抗原与无标志的抗原(试样)混合并且允许结合至结合成员。将结合抗原与未结合抗原在实体上分离并且确定结合至结合成员的放射性抗原的量。试样中的抗原越多，结合至结合成员的放射性抗原越少。竞争结合测定还可用于非放射性的抗原，使用连接至报道分子的抗原或类似物。报道分子可为具有光谱分离吸收或发射特性的荧光色素、磷光体或激光染料。合适荧光染料包括荧光素、若丹明、藻红蛋白和得克萨斯红，以及镧系元素螯合物或穴状化合物。合适发色染料包括二氨基联苯胺。
其他报道物包括大分子胶状颗粒或颗粒材料，例如有色、磁性或顺磁性的乳胶珠粒，以及可直接或间接地导致在视觉上观察、以电子方式检测或以其他方式记录可检测信号的生物学或化学活性剂。这些分子可为催化反应的酶，这些反应使颜色显现或改变或引起例如电性质变化。其可为分子可激发的，这样使得能量状态之间的电子跃迁产生特有光谱吸收或发射。其可包括结合生物传感器使用的化学实体。可使用生物素/抗生物素蛋白或生物素/链霉亲和素和碱性磷酸酶检测系统。
个别结合成员-报道物轭合物产生的信号可用于得出样品(正常和测试)中的相关结合成员结合的可定量的绝对或相对数据。
包含在此描述的结合成员的试剂盒也作为本发明的一个方面来提供。在试剂盒中，结合成员可加标志以便允许确定其在样品中的反应性，例如如以下进一步描述。此外，结合成员可连接或可不连接至固体支撑物。试剂盒的组件总体上为无菌的并且处于密封小瓶或其他容器中。试剂盒可用于诊断分析或结合成员适用的其他方法中。试剂盒可用于如上所述的方法。试剂盒可含有在方法，例如根据本发明的方法中使用组件的说明书。帮助或实现执行这种方法的辅助材料可包括于本发明的试剂盒中。辅助材料包括第二、不同的结合成员，该第二、不同的结合成员结合至第一结合成员并且轭合至可检测标志(例如，荧光标志、放射性同位素或酶)。基于抗体的试剂盒还可包括用于进行免疫沉淀反应的珠粒。试剂盒的每个组件总体上在其自己的合适容器中。因此，这些试剂盒总体上包括适合于每个结合成员的独特容器。此外，试剂盒可包括执行测定的说明书和解释并且分析由执行测定所产生的数据的方法。
本发明也提供如上述的结合成员在竞争测定中测量抗原水平的用途，也就是说使用如本发明提供的结合成员在竞争测定中测量样品中的抗原水平的方法。在此情况下，不需要结合与未结合抗原的实体分离。将报道分子连接至结合成员以使得在结合时发生物理或光学变化为一个可能。报道分子可直接或间接地产生可检测信号，这些可检测信号可以是可定量的。报道分子的键合可直接或间接地、共价例如经由肽键或非共价地。经由肽键的键合可为编码抗体和报道分子的基因融合的重组表达的结果。
结合成员之间的竞争可容易地在体外来测定，例如使用ELISA和/或通过生化竞争测定，例如将具体报道分子标记于可在一个或多个其他无标记结合成员的存在下检测的一个结合成员的生化竞争测定，使得能够识别结合相同表位或重叠表位的结合成员。这些方法容易为本领域普通技术人员所知，并且在此更详细地描述。
本发明延伸至与在此定义的任何结合成员竞争结合至人Aβ1-42的结合成员，例如表5和6中列出的任何抗体，例如呈IgG2、IgG1或IgG1三重突变(“TM”；奥加涅相(Oganesyan)等人(2008)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.64(Pt 6):700-4)形式。结合成员之间的竞争可容易地在体外测定，方法例如为将具体报道分子标记至可在其他无标记结合成员的存在下加以检测的一个结合成员，以便能够识别结合相同表位或重叠表位的结合成员。竞争可例如使用ELISA来确定，其中Aβ1-42固定至板并且第一加标记或加标志的结合成员与一个或多个其他无标记或未加标志的结合成员添加至板。与标记结合成员竞争的无标记结合成员的存在是通过标记结合成员发出的信号的减少来观察。
竞争测定也可用于表位作图。在一个实例中，表位作图可用于识别由任选地可具有优化的中和和/或调节特征的结合成员所结合的表位。这类表位可为线性或构象的。构象表位可包括Aβ的至少两个不同片段，其中当Aβ肽在其三级或四级结构中折叠时，所述片段彼此邻近定位以便形成由Aβ的抑制剂(例如Aβ结合成员)识别的构象表位。在竞争测试中，可使用抗原的肽片段，尤其包括或基本上由所感兴趣的表位组成的肽。可使用具有表位序列加上任一末端处的一个或多个氨基酸的肽。根据本发明的结合成员可使得其与抗原的结合由具有或包括给定序列的肽来抑制。
在其他方面，本发明提供包括编码根据本发明的结合成员、VH域和/或VL域的序列的分离核酸，和制备本发明的结合成员、VH域和/或VL域的方法，这些方法包括在引起产生所述结合成员、VH域和/或VL域的条件下表达所述核酸，并且将其回收。表格和附加序列表中列出了编码核酸序列的实例。根据本发明的核酸序列可包括DNA或RNA并且可全部或部分合成。提及如在此阐明的核苷酸序列涵盖具有规定序列的DNA分子，并且涵盖具有规定序列的RNA分子，其中U取代T，除非上下文另外要求。
本发明也提供呈包括如上述的至少一个多核苷酸(例如可操作地连接到调控元件的多核苷酸)的质粒、载体(例如质粒或噬菌体载体)、转录或表达盒形式的构建体。
另一个方面提供含有本发明的核酸和/或载体或以其转化的宿主细胞。本发明也提供包括如上述的一种或多种构建体的重组宿主细胞系。所提供的编码任何CDR或CDR集合或VH域或VL域或抗体抗原结合位点或抗体分子例如scFv或IgG(例如IgG2、IgG1或IgG1TM)的核酸序列与产生编码产物的方法一起形成本发明的一个方面，该方法包括从其编码核酸序列来表达。表达可通过在合适条件下培养含有核酸的重组宿主细胞来便利地获得。在通过表达来产生之后，VH或VL域、或结合成员可使用任何合适技术来分离和/或纯化，然后视情况使用。
因而，本发明的另一个方面是产生抗体VH可变域的方法，该方法包括导致从编码核酸序列来表达。这类方法可包括在产生所述抗体VH可变域的条件下培养宿主细胞。
产生VL可变域和包含VH和/或VL域的结合成员的类似方法作为本发明的另一个方面来提供。
产生方法可包括分离和/或纯化产物的步骤。产生方法可包括将产物配制成包括至少一种另外组分(例如药学上可接受的赋形剂)的组合物。
在各种不同的宿主细胞中克隆并且表达多肽的系统为熟知的。合适宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、丝状真菌、酵母和杆状病毒系统以及转基因植物和动物。在原核细胞中表达抗体和抗体片段在本领域中为沿用已久的。关于评论，参见例如普吕克通(Plückthun)[普吕克通，A.生物技术(Bio/Technology)9:545-551(1991)]。常见细菌宿主为大肠杆菌。
在培养物中的真核细胞中的表达也可由本领域技术人员用作产生结合成员的选择方案[查德HE(Chadd HE)和查莫(Chamow)SM(2001)生物技术新见12:188-194；安徒生DC(Andersen DC)和克鲁曼L(Krummen L)(2002)生物技术新见13:117；拉里克JW(LarrickJW)和托马斯DW(Thomas)DW(2001)生物技术新见12:411-418]。
可在本领域中用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NS0小鼠黑素瘤细胞、YB2/0大鼠骨髓瘤细胞、人胚胎肾细胞、人胚胎视网膜细胞和许多其他细胞。
可选择或构建合适载体，它们含有合适调控序列，包括启动子序列、终止子序列、多聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因以及视情况的其他序列。载体可视情况为质粒如噬菌粒，或病毒如噬菌体[萨姆布鲁克(Sambrook)和拉塞尔(Russell)，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：a Laboratory Manual)：第3版，2001，冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)]。例如在制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA引入细胞中和基因表达以及分析蛋白质中用于操纵核酸的许多已知技术和方案详细描述于奥苏伯尔(Ausubel)等人[奥苏伯尔等人编，分子生物学短方案：分子生物学当前方案方法的概要(Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from CurrentProtocols in Molecular Biology)，约翰威利出版有限公司，第4版1999]。
本发明的另一个方面提供含有如在此披露的核酸的宿主细胞。这类宿主细胞可在体外并且可在培养物中。这类宿主细胞可在体内。该宿主细胞在体内存在可允许本发明的结合成员细胞内表达为“胞内抗体”或细胞内抗体。胞内抗体可用于基因疗法。
另一个方面提供包含将本发明的核酸引入宿主细胞中的方法。引入可使用任何可获得的技术。对于真核细胞，合适技术可包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、使用逆转录病毒或其他病毒例如牛痘的脂质体介导转染和转换，或对于昆虫细胞，使用杆状病毒。将核酸引入宿主细胞，尤其真核细胞中可使用病毒或基于质粒的系统。质粒系统可保持游离或可并入宿主细胞或人工染色体中。并入可通过将一个或多个副本随机或靶向整合至单一或多个基因座来完成。对于细菌细胞，合适技术可包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体来转染。
在引入之后可例如通过在表达基因的条件下培养宿主细胞来导致或允许从核酸中表达。表达产物的纯化可通过本领域技术人员已知的方法来获得。
本发明的核酸可整合至宿主细胞的基因组(例如染色体)中。整合可根据标准技术通过将促进与基因组重组的序列包含在内来促成。
本发明还提供一种方法，该方法包括将如上所述的构建体用于表达系统中以便表达如上述的结合成员或多肽。
根据本发明的结合成员可用于治疗(可包括预防性治疗)人或动物体(例如人患者)的疾病或障碍的方法，该方法包括将该结合成员给予至该患者。根据本发明的可治疗的病况是在本文中别处描述的，包括预防性治疗和降低病况的严重程度或其症状中的一个或多个，或延缓或降低发作风险。
因此，本发明提供治疗或降低在此提到的任何病况的至少一个症状的严重程度的方法，该方法包括将有效量的一种或多种本发明结合成员单独或在具有在本领域中已知或在此描述的另一种合适药物的组合治疗方案中给予有需要的患者，从而降低任何上述病症的至少一个症状的严重程度。
术语“有效剂量”此处被定义为足以在已患有该疾病的患者中治愈或至少部分地抑制该疾病或其并发症的量。
本发明尤其是针对阿尔茨海默病和其他淀粉样蛋白源的疾病的治疗，该治疗是通过将本发明的治疗抗体给予处于病况下的患者进行的，例如用于预防或治疗淀粉样蛋白源的疾病，所述治疗抗体在患者中产生有益的治疗反应(例如在患者体内减少CSF中的Aβ1-42，减少斑块负荷，抑制斑块的形成，减少神经炎性营养不良，改善认知功能，和/或去除、减少或预防认知减退)。
如此处所述的，“治疗”并定义为将一种治疗剂施用或给予患者，该患者患有与淀粉样变性相关联的疾病或病况、或有向着与淀粉样变性相关联的此类疾病或病况的症状或易染病体质，其目的是治愈、愈合、减缓、缓解、改变、补救、减轻、改善或影响该疾病、病况、其症状或向着所述疾病、病况的易染病体质。
本发明提供了预防或治疗患者大脑中Aβ的淀粉样蛋白沉积物相关联的疾病的方法。此类疾病包括阿尔茨海默病、唐氏综合征和认知损伤。认知损伤可伴随或不伴随淀粉样蛋白源的疾病的其他特征发生。本发明提供了黄斑变性(与Aβ关联的病况)的治疗方法。本发明的方法可涉及向患者给予有效剂量的、特异性地结合至1–42Aβ及其N-末端截短体的抗体。此类方法对预防或治疗人患者中的阿尔茨海默病是特别有用的。
本发明的抗体可用在用于预防或减轻一些患者中的神经病理以及与阿尔茨海默病相关联的认知损伤的治疗方案中。
易于进行治疗的患者包括显示症状的患者以及还有处于疾病的风险下但未显示症状的个体。对于阿尔茨海默病，潜在的任何人都处于风险下，如果他或她生活足够长的一段时间的话。可在对受试患者的风险未进行任何评估的情况下，预防性地将本发明的抗体给予受试者。易于进行治疗的患者包括具有已知的阿尔茨海默病遗传风险的个体，例如具有患有此疾病的血亲的个体和具有通过遗传或生物化学标记物分析确定的风险的那些。向着阿尔茨海默病的易染病体质的遗传标记包括APP基因中的突变，特别是位置717以及位置670和671处的突变，分别称作哈迪(Hardy)和瑞典(Swedish)突变。风险的其他标记物是早老蛋白基因中的突变PS1和PS2、以及ApoE4(AD的家族史)、血胆脂醇过多或动脉粥样硬化。患有阿尔茨海默病的个体可通过与该疾病相关联的特征性痴呆来诊断，以及通过上述的风险因子的存在来诊断。可利用多个诊断测试来帮助鉴别个体中的阿尔茨海默病。这些包括测量CSFτ和Aβ1-42水平。升高的τ和降低的Aβ1-42水平可表示AD的存在。患有阿尔茨海默病的个体还可以通过NINCDS-ADRDA或DSM-IV-TR标准来诊断。
在无症状的患者中，治疗可以在任何年龄(例如10、20、30)开始。通通常，治疗在晚年展开，例如当患者达到他或她的40岁、50岁、60岁或70岁时。治疗可涉及经一段时间的多个剂量，其可持续该患者的余下生命期限。可随着时间的推移通过测量抗体水平来监测给予重复剂量的需要。
对于预防，向易感于阿尔茨海默病或另外处于阿尔茨海默病的风险下的患者以足以消除或减少该疾病(包括该疾病的生物化学、组织学、认知损伤和/或行为症状、在该疾病的发展期间存在的并发症和中间病理性表现型)的风险、降低其严重度、或延迟其发作的量给予药物组合物或药剂。对于治疗应用，向疑似或已经患有这样的疾病的患者以足以治愈、或至少部分阻止该疾病(生物化学、组织学、认知损伤和/或行为症状)的症状(包括在该疾病的发展中存在的并发症和中间病理性表现型)的量给予药物组合物或药剂。
本发明提供治疗个体的方法，该方法包括将有效量的一种或多种本发明结合成员单独或在与本领域中已知或在此描述的另一种合适药物的组合治疗方案中给予至有需要的个体。治疗方法可包括将有效量的在此描述的结合成员给予至有需要的患者，其中血浆和/或CSF中Aβ1-42的水平降低。
治疗方法可包括(i)鉴别患有如此处所述的与淀粉样变性相关联的病况的患者并(ii)向该患者给予有效量的此处所述的结合成员，其中在血浆和/或CSF Aβ1-42的水平降低并且淀粉样变性减少。有效量是降低Aβ1-42的水平以便减少或减轻所治疗的特定疾病或病症的至少一个症状的严重程度，但是不一定治愈疾病或病症的量。
本发明还提供拮抗Aβ1-42的至少一个影响的方法，该方法包括接触或给予有效量的一种或多种本发明结合成员，这样使得Aβ1-42的所述至少一个影响受到拮抗。
因此，本发明的另外方面提供包含给予如所提供的结合成员的治疗方法、包含这种结合成员的药用组合物，和这种结合成员在制造用于给予的药物中，例如在制造药物或药用组合物的方法中的用途，包含将结合成员与药学上可接受的赋形剂一起配制。药学上可接受的赋形剂可为进入药用组合物中的化合物或化合物组合，该化合物或化合物组合不招致次级反应并且允许例如促进结合成员的给予、增加其寿命和/或其在体内的疗效、增加其在溶液中的溶解性或另外改善其保存。这些药学上可接受的媒介物为熟知的并且由本领域技术人员随着所选择的活性化合物的性质和给予模式而变化来调适。
在此描述的结合成员通常以药用组合物形式给予，该组合物可包括至少一种除了结合成员以外的组分。因此根据本发明，以及根据本发明来使用的药用组合物可包括除了结合成员以外的药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员的熟知的其他材料。这些材料应无毒并且不应干扰活性成分的功效。载体或其他材料的确切性质将取决于给药途径。
对于可注射配制品，例如用于静脉内或皮下注射，活性成分将呈胃肠外可接受的水溶液形式，该溶液不含热原质并且具有适合的pH、等渗性以及稳定性。在此描述的结合成员可取决于分子的物理化学性质和输送途径而以液体、半固体或固体形式来配制。配制品可包括赋形剂或赋形剂的组合，例如：糖、氨基酸和表面活性剂。液体配制品可包括宽范围的抗体浓度和pH。固体配制品可通过冻干、喷雾干燥或经由例如超临界流体技术而干燥来产生。治疗可以通过注射(例如皮下、或静脉内)给予。治疗可通过脉冲输注，尤其以下降剂量的结合成员来给予。给予途径可通过治疗的物理化学特性、对于疾病的特殊考虑因素或优化疗效或最小化副作用的要求来确定。一个特定给予途径为静脉内。给予本发明的药用组合物的另一个途径为皮下。使用无针装置的皮下注射也是有利的。
取决于所治疗的病症，组合物可单独或与其他治疗组合，同时或顺序地给予。
结合成员可结合另外医药组分来用作组合疗法的一部分。组合治疗可用于提供显著协同效应，尤其是结合成员与一种或多种其他药物的组合。结合成员可同时或依序或作为具有另一种治疗剂或药剂的组合制剂来给予，以便治疗在此列出的一种或多种病状。
结合成员和一种或多种上述另外医药组分可用于制造药物。药物可单独或组合给予个体，并且相应地可包括呈组合制剂形式或单独制剂形式的结合成员和另外组分。单独制剂可用于促进单独和依序或同时给予，并且允许通过不同途径例如口服和肠胃外给予来给予组分。
所提供的组合物可给予哺乳动物。正常地，给药是以“治疗有效量”进行的，这个量足以向患者显示益处。这种益处可至少是至少一个症状的改善。所给予的实际量，以及给予速率和时间过程取决于所治疗疾病的性质和严重程度、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病状、病症的原因、组合物的输送位点、结合成员的类型、给予方法、给予排程以及开业医生已知的其他因素。治疗处方，例如关于剂量的决定等在普通医生和其他医师的责任范围内并且可取决于症状严重程度和/或所治疗的疾病的进展。本发明的结合成员的治疗有效量或合适剂量可通过在动物模型中比较其体外活性和体内活性来确定。将测试动物中的有效剂量外推至人的方法是已知的。确切剂量取决于许多因素，包括是否抗体用于诊断、预防或治疗，所治疗的区域的大小和位置，抗体的确切性质(例如完整抗体、片段或双体)和任何可检测标志或连接至抗体的其他分子的性质。对于全身应用，典型抗体剂量在100μg至1g范围内。可给予初始较高负载剂量，随后一个或多个较低剂量。典型地，抗体为完整抗体，例如IgG1或IgG1-TM同工型。在医师判别下，治疗可以按每日、每周两次、每周或每月的间隔来重复。治疗可每两至四周用于皮下给予并且每四至八周用于静脉内给予。治疗可为周期性的，并且给予之间的周期为约两周或更长、例如约三周或更长、约四周或更长或约每月一次。
本发明的各种另外方面和实施例鉴于本披露为本领域技术人员显而易知的。
本说明书提到的所有文件，包括数据库参考和登录号、专利、专利申请以及公开物出于所有目的以其全部内容通过引用结合在此。
在此使用时，“和/或”应被当做在有或没有另一者的情况下，两个指定的特征或组分中的每一个的特定披露。例如，“A和/或B”被看作是(i)A、(ii)B以及(iii)A和B中的每种的特定披露，就好像在此各自单独陈述一样。
除非上下文另外规定，否则以上阐明的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施例并且相等地适用于所描述的所有方面和实施例。
本发明的某些方面和实施例现在举例并且参照附图和表来说明。
实例
以下序列已经在NCIMB，弗格森大厦，克莱伯斯通庄园，贝克斯伯恩，阿伯丁，AB219YA，苏格兰，英国(Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen，Scotland，AB21 9YA，UK)中保藏：
大肠杆菌TOP10细胞Abet0007＝NCIMB 41889
大肠杆菌TOP10细胞Abet0380-GL＝NCIMB 41890
大肠杆菌TOP10细胞Abet0144-GL＝NCIMB 41891
大肠杆菌TOP10细胞Abet0377-GL＝NCIMB 41892
保藏时间＝2011年11月2日
实例1.抗-β淀粉样蛋白1-42特异性抗体产生和前导选择
1.1 β淀粉样蛋白肽的形成
将生物素化的人β淀粉样蛋白1-42肽(r肽，USA；目录号：A1117或巴亨公司(Bachem)AG，瑞士；目录号：H-5642)重悬浮至1mg/ml于1％氢氧化铵溶液(v/v)中，并以等分试样储存在-80℃下直至需要的时候。针对以下项进行相同的程序：未标记的人β淀粉样蛋白1-42肽(Anaspec，USA；目录号：64129)、未标记的人β淀粉样蛋白1-40肽(r肽，USA；目录号：A1155)、生物素化的人β淀粉样蛋白1-40肽(r肽，USA；目录号：A111或巴亨公司AG，瑞士；目录号：H-5914)、生物素化的鼠β淀粉样蛋白1-42肽(Anaspec，USA；目录号：61718-01)和生物素化的鼠β淀粉样蛋白1-40肽(Anaspec，USA；目录号：61717)。
1.2选择
将克隆到基于该丝状噬菌体M13的噬菌粒载体中的Fab310-λ噬菌体展示文库(Dyax，USA)用于选择(霍特(Hoet)等人，2005)。使用合成人生物素化的β淀粉样蛋白1-42(r肽，USA)上的一系列选择周期将抗-β淀粉样蛋白1-42特异性Fab抗体从噬菌体展示文库分离，基本上如前所述(霍金斯(Hawkins)等人，1992；沃恩(Vaughan)等人，1996)。简而言之，对于第一回合溶液相选择，将杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS，pH 7.4)中的生物素化的淀粉样蛋白-β1-42添加到经纯化的噬菌体颗粒中，这些噬菌体颗粒已在包含100倍过量的未标记的人β淀粉样蛋白1-40肽(Anaspec，USA)的马弗尔(Marvel)-PBS(3％w/v)中预孵育1小时。使用链霉亲和素偶联的顺磁珠粒(英杰生命科技公司(Invitrogen LifeTechnologies)，UK)捕获结合至生物素化的β淀粉样蛋白1-42肽的噬菌体颗粒，并且通过一系列使用PBS-Tween(0.1％v/v)进行的洗涤周期将弱结合的噬菌体去除。将结合的噬菌体颗粒从这些珠粒洗脱，感染至大肠杆菌TG1细菌中并且进行挽救以用于下一回合选择(沃恩(Vaughan)等人，1996)。如前所述进行随后两回合选择，但降低生物素化的β淀粉样蛋白1-42抗原的浓度。
1.3使用对未经纯化的Fab片段的定向结合测定鉴别β淀粉样蛋白1-42特异性克隆
为了产生可溶的单链Fab片段(sFab)，将基因III绳链使用标准裂解和连接技术从Fab310-λ展示盒去除。简单地说，使用标准DNA纯化试剂盒(凯杰(QIAgen)，UK)从该回合3输出来分离这些噬菌粒载体，并使用MluI限制消化(霍特(Hoet)等人，2005)从该载体去除基因III绳链序列。将重连接的载体转化回TG1细胞中，并选取个别菌落用于分析。
来自周质制剂的未经纯化sFab在均相时间分辨荧光(HTRFTM，CisBio国际，法国)结合测定中使用EnVision板读取器(珀金埃尔默，USA)来筛选。在此测定中，通过使用链霉亲和素穴状化合物和抗-6his-XL665检测试剂(CisBio国际，法国；目录号：分别是610SAKLB和61HISXLB)测量组氨酸标记的sFab和生物素化的肽之间的荧光共振能量转移(FRET)来评估未经纯化的sFab至人β淀粉样蛋白1-42肽的结合。选择输出被筛选为含有sFab的未纯化细菌周质提取物，这些提取物在50mM MOPS缓冲液pH 7.4、0.5mM EDTA和0.5M蔗糖中制备。将十微升未纯化sFab样品添加至
Figure SMS_3
384孔测定板(康宁公司(Corning)，USA；目录号：3676)。随后添加5μl的20nM合成人β淀粉样蛋白1-42以及5μl的6nM链霉亲和素穴状化合物和20nM抗-his-XL665的组合溶液。通过使用阴性对照未经纯化的sFab代替测试sFab样品针对每个板定义非特异性结合孔(阴性对照)。使用人β淀粉样蛋白1-40肽并行测定确定交叉反应的sFab克隆。在50mM MOPS pH 7.4(西格玛，UK；目录号：M9381)中进行所有稀释，其包含0.4M KF(BDH化学品，USA；目录号：103444T)，0.1％无脂肪酸的牛血清白蛋白(西格玛，UK；目录号：A6003)和0.1％Tween 20(v/v)(西格玛，UK；目录号：P2287)(测定缓冲液)。将测定板在室温下孵育4小时，然后于EnVision板读取器(珀金埃尔默，USA)使用320nm激发波长和在620nm和665nm测量发射下读取时间分辨荧光(100闪光)。
将数据通过计算每个样品的％ΔF值来分析。％ΔF是根据方程1来确定。
方程1：
Figure SMS_4
1.4经纯化的sFab片段的直接结合测定
使通过HTRFTM测定显示特异性结合至人β淀粉样蛋白1-42肽的未经纯化的sFab周质提取物经受DNA测序(奥斯本(Osbourn)等人，1996；沃恩(Vaughan)等人，1996)。在大肠杆菌中表达具有独特的蛋白质序列的sFab并且通过亲和色谱法(基本上如描述的(班尼斯特(Bannister)等人，2006))纯化。通过在1.3部分中描述的HTRFTM测定中测试纯化sFab的稀释系列，用纯化sFab来替代未纯化sFab周质制剂，确定每个纯化的sFab的β淀粉样蛋白结合特征曲线。同时针对结合至生物素化的人β淀粉样蛋白1-42肽、生物素化的鼠β淀粉样蛋白1-42肽和生物素化的人β淀粉样蛋白1-40肽测试经纯化的sFab。另外，在单独的HTRFTM实验中，针对结合至乱序人β淀粉样蛋白1-42肽(Anaspec，委托合成)测试sFab，以控制任何非特异性肽结合。数据通过如1.3部分中描述计算％ΔF值来分析。
纯化的Abet0007 sFab的实例结果示于图1中。这些结果证明Abet0007特异性结合至人β淀粉样蛋白1-42肽，超过人β淀粉样蛋白1-40肽和乱序人β淀粉样蛋白1-42肽。此外，Abet0007 sFab与鼠β淀粉样蛋白1-42肽是可交叉反应的。
1.5将β淀粉样蛋白1-42特异性抗体Fabs重新改变形式为IgG2形式
将13个β淀粉样蛋白1-42特异性克隆由Fab转换为IgG2，方法是将可变重链(VH)和可变轻链(VL)域亚克隆至分别表达完整人抗体重链和轻链的载体中。在亚克隆之前VH域被密码子内部优化，因为该Dyax FAB310文库VH域是半合成的并且未能在此处所述的哺乳动物细胞内以足够的量表达。已知在哺乳动物细胞中如全长人IgG一样好地表达的内部种系匹配的VH被用作模板，以改变该Dyax VH域的DNA密码子使用，同时保留起始氨基酸序列。将密码子优化的可变重链克隆至含有人重链恒定域和调控元件的哺乳动物表达载体(pEU9.2)中以便在哺乳动物细胞中表达完整IgG2重链。类似地，将可变轻链域克隆至用于表达人λ轻链恒定域和调控元件的哺乳动物表达载体(pEU 4.4)中以便在哺乳动物细胞中表达完整IgG轻链。用于表达重链和轻链的载体最初描述于佩尔思科(Persic)等人(佩尔思科(Persic)等人，1997)。为了获得作为IgG2的克隆，重链和轻链IgG表达载体瞬时转染至HEK293-EBNA(英杰，UK；目录号：R620-07)或CEP6-CHO(内部生产)哺乳动物细胞中，其中抗体表达并且分泌至培养基中。将收获的培养基在纯化之前进行过滤。将这些IgG使用蛋白质A色谱法(BiosepraTM，帕尔(Pall)，USA或MabSelect SuRe，GE医疗集团，UK)纯化。将培养上清液装载到预平衡于50mM Tris pH 8.0，250mM NaCl的适当的蛋白质A柱上。使用0.1M柠檬酸钠pH 3.0将结合的IgG从该柱洗脱，并且将该洗脱物通过添加1M Tris缓冲液(pH 10.0)进行中和。将这些IgG使用NAP-10缓冲液交换柱(GE医疗集团，UK；目录号：17-0854-02)缓冲交换到杜尔贝科氏PBS中。使经纯化的IgG穿过0.2微米滤器，并使用基于该IgG的氨基酸序列的消光系数通过280nm处的吸光度确定IgG的浓度。使用SEC-HPLC和SDS-PAGE技术，对经纯化的IgG针对聚集或降解进行分析。
1.6 β淀粉样蛋白肽竞争HTRFTM测定中前导抗体的特异性确定
如上所述，将特异性地结合至该β淀粉样蛋白1-42肽的经纯化的sFab片段转化为重组的IgG。为了测试这些IgG结合至其他人β淀粉样蛋白肽的特异性，开展竞争测定。在此测定中，将未标记的人β淀粉样蛋白肽1-42(r肽，USA；目录号：A1165)、1-40(r肽，USA；目录号：A1155)、11-42(r肽，USA；目录号：A1063)、17-42(r肽，USA；目录号：A1058)和1-43(Anaspec，USA；目录号：25356)用前导IgG和生物素化的人β淀粉样蛋白肽1-42(r肽，USA；目录号：A1117)进行孵育。简单地说，将每种测试肽的稀释系列与0.3nM测试IgG和5nM生物素化的人β淀粉样蛋白1-42肽组合。通过检测该前导IgG结合至该生物素化的1-42肽的损失，通过使用链霉亲和素穴状化合物(CisBio国际，法国；目录号：610SAKLB)和抗-人Fc IgGXL665(CisBio国际，法国；目录号：61HFCXLB)检测试剂测量该IgG和生物素化的1-42β淀粉样蛋白之间的荧光共振能量转移(FRET)来评估每种肽的竞争。
在包含50mM MOPS pH 7.4(西格玛，UK；目录号：M9381)、0.4M KF(BDH化学品，USA；目录号：103444T)、0.1％无脂肪酸的牛血清白蛋白(西格玛，UK；目录号：A6003)和0.1％Tween 20(v/v)(西格玛，UK；目录号：P2287)的测定缓冲液中分别以7nM和5nM合并链霉亲和素穴状化合物和抗-人Fc IgG XL665。将5μl此溶液添加到该测定板(
Figure SMS_5
384孔黑色浅孔，康宁生命科技；目录号：3676)中。使用葛莱娜(Greiner)96孔U底板(葛莱娜BioOne，德国；目录号：650201)，将β淀粉样蛋白肽在测定缓冲液中连续稀释。使用MiniTrakTM(珀金埃尔默，USA)液体处理机器人，将5μl的每种肽稀释物以双份转移到该测定板中。在测定缓冲液中将测试IgG稀释到1.2nM并将5μl添加到该测定板中。在测定缓冲液中制备生物素化的人β淀粉样蛋白1-42肽的20nM溶液，并将5μl的此溶液添加到该测定板中。通过用5μl测定缓冲液替代该测试IgG，针对每个板定义非特异性结合孔(阴性对照)。测定板在室温下孵育4小时，然后使用EnVision板读取器(珀金埃尔默，USA)在620nm和665nm发射波长下读取时间分辨荧光。
将数据通过计算每个样品的％ΔF值来分析。％ΔF是根据方程1来确定。％ΔF值随后用于计算％特异性结合，如方程2描述。
方程2：
Figure SMS_6
Abet0007 IgG的实例结果示于图2中。这些结果证明Abet0007 IgG结合至人β淀粉样蛋白1-42肽，而不是人β淀粉样蛋白1-40肽。该抗体也结合到截短的肽11-42和17-42以及结合到人β淀粉样蛋白1-43肽。
1.7使用表面等离子体共振确定前导抗体与人β淀粉样蛋白1-42的结合亲和力
BIAcore T-100(GE医疗集团，UK)生物传感器仪器用于评估每一前导抗体与合成产生的人β淀粉样蛋白1-42肽之间相互作用的动力学参数。这些实验基本上如卡尔松(Karlsson)等人(卡尔松(Karlsson)等人，1991)描述的来执行。
生物传感器使用表面等离子体共振(SPR)的光学效应来研究在固定在生物传感器芯片的葡聚糖层的配体分子上流过的分析物分子的相互作用所产生的表面浓度的变化。典型地，界定浓度的分析物质在连接配体上通过并且任何结合随着局部SPR信号的增加(缔合相)来检测到。在这之后为缓冲液流动期，在此期间分析物质与表面固定配体的解离可随着信号的减少(解离相)而观察到。然后，可将剩余分析物从芯片结合配体上剥离并且程序在多种不同分析物浓度下重复。实验被设计成使得连接配体的绝对结合能力和动力学概况在整个实验期间都不显著改变和可使用在整个实验中使用的一系列对照来监测。含有EDTA(HBS-EP+；GE医疗集团，UK)的专有HEPES缓冲盐水通常用作分析物样品的稀释缓冲液并且在解离相期间作为流动缓冲液。随着时间的推移将实验数据记录为‘谐振单元’(RU)，该谐振单元是直接对应于SPR信号。RU与芯片表面上的折射率的变化成正比例，该折射率进而为所结合分析物的质量的近似测量。然后，专有BIAevaluation软体包可用于处理数据并且针对数据集拟合结合模型。返回的缔合(ka，M-1s-1)和解离(kd，s-1)速率常数允许计算解离(KD，M)亲和力常数。
每一测试IgG与人β淀粉样蛋白1-42肽之间的结合亲和力使用以下测定来估计，该测定中抗体通过胺键共价地连接至专有CM5芯片表面至近似2,000RU的最终表面密度。芯片表面在周期之间通过以下方式再生：单一40秒注射10mM甘氨酸pH 2.0以便去除结合至抗体的配体。再生不会导致肽结合活性的显著损失。
使一系列稀释的合成的人β淀粉样蛋白1-42肽(1.6–100nM)依序通过抗体表面持续足够量的时间以便观察可置信地拟合至适当结合模型的传感图。将空白参考流动池数据从每个IgG数据集减去并且零浓度缓冲液空白从主要数据集双重参考减去以便减少任何缓冲液假象的影响或非特异性结合影响。然后使用BIAevaluation软件将适当的结合模型同时拟合至来自每个分析物滴定的数据。
使用计算的Chi2值评估数据的有效性，其可接受值是低于2RU2。使用残差，其偏差小于2RU是可接受的，估算拟合的全部成功数。
Abet0007 IgG2的实例结果示于图3中。平均结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和解离常数(KD)分别是1.6x 105M-1s-1、7.4x 10-2s-1和473nM。这些参数衍生自对数据的1:1朗缪尔拟合。
1.8通过从人血浆消耗β淀粉样蛋白肽进行的前导抗体的功能性表征
在血浆消耗测定中测试这些前导抗体以研究它们从人血浆免疫沉淀人β淀粉样蛋白1-42肽的能力。使用此测定以提供针对每种抗体的功能性效力的证据。简而言之，将人血浆样品用每种测试IgG孵育3小时，之后去除该抗体和任何结合的配体。在免疫沉淀之前和之后使用标准技术测定这些人血浆样品的β淀粉样蛋白1-42肽含量，并使用这些值来确定该抗体的效力。也针对β淀粉样蛋白1-40肽中的任何消耗测定这些血浆样品，以评估该前导抗体的特异性。
根据制造商说明，分别使每种测试抗体共价连接至
Figure SMS_7
M-270羧酸磁珠(英杰生命技术，UK；目录号：143-05D)。针对每种测试IgG，将100μl的Dyna珠粒用100μl的25mM MES，pH 5(西格玛，UK；目录号：M5287)洗涤两次，以使用磁体将这些珠粒从该悬浮液中分离。临使用前，将EDC(皮尔斯(Pierce)，赛默科技，USA；目录号：22981)溶解于冷的25mMMES，pH 5中至50mg/ml的最终浓度。类似地，在25mM MES，pH 5中制备NHS(皮尔斯，赛默科技；目录号：24500)的50mg/ml溶液。将50μl的NHS溶液和50μl EDC溶液添加到经洗涤的Dyna珠粒中，将其良好混合并在室温下伴随缓慢-倾斜旋转(slow-tilt rotation)孵育30分钟。使用磁体以使这些珠粒聚集并去除上清液。将这些珠粒用100μl的25mM MES，pH 5洗涤两次。将每种测试IgG在总体积100μl的25mM MES，pH 5中稀释到0.6mg/ml。将这些经洗涤的珠粒重悬于该配体溶液中并在室温下伴随缓慢倾斜旋转孵育至少30分钟。随后使用磁体使这些珠粒聚集并用100μl的50mM Tris缓冲液，pH 7.4(西格玛，UK)洗涤一次。然后将这些珠粒重悬于100μl的马弗尔-PBS(3％w/v)中并在4℃孵育过夜。将这些珠粒用杜尔贝科氏PBS(100μl)洗涤两次并重悬于PBS(100μl)。
在瑞典南泰利耶(
Figure SMS_8
)的阿斯利康卫生所(AstraZeneca HealthClinic)从匿名供体分离EDTA-血浆样品。从每个供体采集大约100ml血液，并将其汇集到两个50ml管中。添加EDTA至5mM的最终体积以阻止凝血，并在4℃使这些管在4,000x g旋转10分钟。收集上清液(血浆)，等分到1ml管中并在-80℃储存直至被需要。如下所述针对β淀粉样蛋白1-42肽和β淀粉样蛋白1-40肽含量测定这些样品。
在4℃，伴随着缓慢倾斜旋转，将每组抗体包被的珠粒用1ml等分试样的EDTA-血浆分别孵育3小时，并且然后使用磁体使这些珠粒聚集。从这些珠粒仔细去除上清液，并如下所述针对β淀粉样蛋白1-42肽和β淀粉样蛋白1-40肽进行测定。
根据制造商说明，使用来自英杰(UK；目录号：KHB3482)的Aβ40人ELISA试剂盒分析这些血浆样品的β淀粉样蛋白1-40肽含量。简而言之，使用人β淀粉样蛋白1-40标准产生从1ng/ml下至7.81pg/ml的稀释系列。使用包含1片蛋白酶抑制剂片(罗氏(Roche)，UK；目录号：11697498001)/50ml稀释液的标准稀释缓冲液进行稀释。然后将50μl的每种稀释物添加到预包被有针对该β淀粉样蛋白肽的N末端有特异性的专有单克隆抗体的不同微量滴定孔中。将EDTA-血浆样品在4℃和2,000x g下离心10分钟，并将50μl的每种样品上清液添加到与这些标准相同的微量滴定板中的单独的孔中。然后将50μl的特异性地识别β淀粉样蛋白1-40肽的C末端的专有Hu Aβ检测抗体添加到每个微量滴定孔中。该板用板封覆盖并在室温下伴随摇动孵育3小时。将板用400μl的洗涤缓冲液洗涤四次，在每次洗涤中允许该板浸泡15-30秒。然后将板倒置并拍干(tapped dry)。将100μl的专有抗-兔IgG HRP轭合物添加到每个孔中，并将该板用板封覆，并将样品在室温下孵育30分钟。再次将该用400μl洗涤缓冲液洗涤四次，在每次洗涤中允许该板浸泡15-30秒。然后将板倒置并拍干。向每个孔中添加100μL的专有的稳定化生色团并且将该板在室温下在黑暗中孵育20分钟。随后向每个孔中添加100μl专有终止液。在添加该终止液2小时内读出每个孔在450nm处的吸光度。从该人β淀粉样蛋白1-40稀释系列产生标准曲线，并将其用以确定这些测试EDTA-血浆样品中的人β淀粉样蛋白1-40的浓度。
基本根据制造商说明，使用来自仪诺遗传公司(Innogenetics)(比利时；目录号：80177)的
Figure SMS_9
β-淀粉样蛋白(1-42)试剂盒分析这些血浆样品的β淀粉样蛋白1-42肽含量。简而言之，使用人β淀粉样蛋白1-42标准产生从1ng/ml下至7.81pg/ml的稀释系列。然后将100μl的每种稀释物添加到预包被有特异于该人β淀粉样蛋白1-42肽的C末端的专有单克隆抗体的不同微量滴定孔中。将EDTA-血浆样品在4℃和2,000x g下离心10分钟，并将100μl的每种样品上清液添加到与这些标准相同的微量滴定板中的单独的孔中。该板用板封覆盖并在室温下伴随摇动孵育3小时。将该板用400μl的洗涤缓冲液洗涤五次，并且然后倒置并拍干。向每个孔中添加100μl的识别该β淀粉样蛋白肽的N末端的专有轭合物1(C1HS)。该板用板封覆盖并在室温下将这些样品孵育1小时。再次将该板用400μl的洗涤缓冲液洗涤五次，并且然后倒置并拍干。然后向每个孔中添加100μl的结合至该生物素化的C1HS抗体的轭合物2(C2)，即链霉亲和素-HRP轭合物。该板用板封覆盖并在室温下孵育30分钟。将该板用400μl的洗涤缓冲液洗涤五次，并且然后倒置并拍干。向每个孔中添加100μl的专有基质溶液，将该板在室温下孵育30分钟，并且然后向每个孔中添加100μl的停止液。在添加该终止液15分钟内读出每个孔在450nm处的吸光度。从该人β淀粉样蛋白1-42稀释系列产生标准曲线，并将其用以确定这些测试EDTA-血浆样品中的人β淀粉样蛋白1-42的浓度。
在一个实验中，该Abet0007 IgG2抗体将血浆中人β淀粉样蛋白1-42肽的水平从80.47pg ml-1减少至60.56pg ml-1(减少25％)。在第二个实验中，该水平从197.43pg ml-1减少至154.45pg ml-1(减少22％)。
1.9使用体外免疫组织化学鉴别对天然β淀粉样蛋白具有低亲和力的前导克隆
将这些前导抗体针对其结合至β淀粉样蛋白的能力进行测试，目的是鉴别对β淀粉样蛋白肽的天然形式具有低亲和力的前导克隆。简而言之，在人阿尔茨海默病大脑切片和Tg2576小鼠大脑切片上筛选这些前导抗体以鉴别体外结合至天然淀粉样蛋白的抗-β淀粉样蛋白1-42抗体。
Tg2576小鼠是过度表达针对人淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的基因的转基因小鼠。该基因具有γ分泌酶裂解位点(Lys670Asn和Met671Leu)中的两个点突变，其导致在该小鼠的皮层和海马中在大约9个月的年龄开始形成β淀粉样蛋白斑。
从患有严重阿尔茨海默病的两个个体(分别是ApoE基因型3/3，布拉克阶段6和ApoE基因型4/3，布拉克阶段5)的前额皮质(额下回)分离人大脑组织。作为对照，从一个非痴呆个体(ApoE基因型3/3，布拉克阶段1)分离等价组织。所有这三份组织都是由荷兰大脑库(NBB)提供的。在使用前通过苏木精和伊红染色验证切片的质量。从15个月(2只小鼠)、18个月(6只小鼠)和22个月(2只小鼠)龄的Tg2576小鼠分离小鼠大脑组织。
针对免疫组织化学，通过首先去除石蜡支持基质制备石蜡包埋的大脑切片(宽度为4-6μm)。用二甲苯(5分钟x 2)、纯乙醇(3分钟x 2)、95％乙醇(3分钟x 2)、70％乙醇(3分钟x 2)、90％甲酸(西格玛奥德里奇，UK；目录号：06440；10分钟)、自来水(20分钟x 3)和PBS(5分钟x 2)洗涤各切片。然后将这些切片在微波炉中在100℃在迪瓦(Diva)Decloaker溶液(生物保健医疗公司(Biocare Medical)，USA；目录号：DV2004G1)中煮沸20分钟。随后在水浴中将这些样品冷却至40℃并且然后用蒸馏水(5分钟)和PBS(5分钟x 3)洗涤。
在2、5和20μg ml-1的浓度测试这些前导IgG2抗体。使用以1/400稀释的兔抗-人二级抗体(达科(Dako)，丹麦；目录号：A0482)，随后OmniMap抗-兔HRP轭合物抗体(温塔娜医疗系统(Ventana Medical Systems)，USA；目录号：760-4311)测试这些IgG的结合。使用ChromoMap DAB试剂盒(温塔娜医疗系统，USA；目录号：760-159)测试信号。根据标准协议，使用基准自动制片系统(BenchMark automated slide preparation system)(温塔娜医疗系统，USA)进行这些染色步骤。
以盲选方式在至少20-40x光学放大下由两个不同的人下进行染色的评分。使用从0(无斑块染色)高至4(强烈的斑块染色)的分数指定体外斑块结合。
Abet0007 IgG2在人阿尔茨海默病大脑或小鼠Tg2576大脑中都显示无斑块染色(分数＝0)。相比之下，阳性对照抗体在相同条件下在相邻的切片上产生了4的分数。图4中呈现了代表性图像。
实例2.通过互补性决定区域3(CDR3)的定向突变而对Abet0007的抗体优化
2.1 Abet0007亲本克隆向scFv形式的转化
在亲和力优化的制备中，将亲本克隆从IgG2形式转化到单链可变片段(scFv)形式。在添加特异性克隆位点和柔性接头区域的情况下，将密码子优化的可变重(VH)和可变轻(VL)域分别从各自的IgG载体扩增。然后进行重组PCR以产生完整的scFv构建体，基本如沃恩(Vaughan)等人所述，将其克隆到pCantab10.5噬菌粒载体中(沃恩(Vaughan)等人，1996)。该pCantab10.5载体是pCantab6载体的修饰形式，其包含另外的限制性位点以便添加除标准His和myc标签之外的标签。
2.2通过定向诱变优化Abet0007
前导抗体(Abet0007)使用定向诱变方法采用基于亲和力的噬菌体展示选择来针对对于人β淀粉样蛋白1-42肽的改进的亲和力来优化。源自Abet0007的较大scFv-噬菌体文库通过可变重链(VH)和可变的轻(VL)链互补决定区3(CDR3)的寡核苷酸定向诱变使用如克拉克森(Clackson)和洛曼(Lowman)(2004)实用方法(A Practical Approach)，牛津大学出版社描述的标准分子生物学技术来建立。
文库经受基于亲和力的噬菌体展示选择以便丰富具有针对人β淀粉样蛋白1-42肽的更高亲和力的变体。这些选择基本上如先前描述的(霍金斯(Hawkins)等人，1992；希尔(Schier)等人，1996；汤普森(Thompson)等人，1996)来执行。简而言之，将scFv噬菌体颗粒与溶液中的生物素化的人β淀粉样蛋白1-42肽(rPeptide，USA；目录号：A1117)一起孵育。然后，遵循制造商建议将结合至抗原的ScFv-噬菌体捕获于链霉亲和素包被的顺磁性珠粒(
Figure SMS_10
M280，英杰公司生命科学，UK)。然后，将所选择的scFv-噬菌体颗粒如先前描述(奥斯本(Osbourn)等人，1996)挽救，并且将选择过程在递减浓度的生物素化的人β淀粉样蛋白1-42抗原存在下进行重复(在3回合中200nM至2nM)。
2.3使用直接结合测定来识别改进的克隆
从来自2.2节中描述的定向诱变方法的选择回合2和3中随机选择一千七百六十个scFv。基本如在1.3节中所述，使用定向结合测定筛选这些克隆。简而言之，将来自周质制剂的未经纯化的scFv针对与生物素化的人β淀粉样蛋白1-42肽的增加的结合进行测试，并使用HTRFTM技术用链霉亲和素穴状化合物和抗-6his-XL665检测试剂进行检测。
在50mM MOPS缓冲液pH 7.4(包括0.5mM EDTA和0.5M蔗糖)中制备来自周质制剂的未经纯化的scFv，并且随后在包含50mM MOPS pH 7.4(西格玛，UK；目录号：M9381)、0.4M氟化钾(BDH化学品，USA；目录号：103444T)、0.1％无脂肪酸的牛血清白蛋白(西格玛，UK；目录号：A6003)和0.1％Tween 20(v/v)(西格玛，UK；目录号：P2287)的测定缓冲液中使用葛莱娜384孔V底板(葛莱娜BioOne，德国；目录号：781280)稀释到1％。使用MiniTrakTM(珀金埃尔默，USA)液体处理机器人，将5μl的经稀释的scFv样品转移到测定板(
Figure SMS_11
384孔黑色浅孔，康宁生命科技；目录号：3676)中。然后向每个孔中添加5μl的测定缓冲液。在测定缓冲液中制备生物素化的人β淀粉样蛋白1-42肽(r肽，USA；目录号：A1117)的20nM溶液，并将5μl的此溶液添加到该测定板中。将链霉亲和素穴状化合物(Cisbio国际，法国；目录号：610SAKLB)和抗-His6-XL665(Cisbio国际，法国；目录号：61HISXLB)检测试剂在测定缓冲液中组合，以给出浓度7nM的链霉亲和素穴状化合物和60nM抗-His6-XL665，并且然后将5μl的这种检测混合物添加到这些测定板的所有孔中。通过用5μl测定缓冲液替代scFv样品，针对每个板定义非特异性结合孔(阴性对照)。测定板在室温下封闭并且孵育2.5小时，然后使用EnVision板读取器(珀金埃尔默，USA)在620nm和665nm发射波长下读取时间分辨荧光。如前所述(1.3节)进行数据分析，并将％ΔF值用以和相邻孔中的测定信号进行对比“命中物”被定义为产生大于针对Abet0007 scFv观察到的信号的％ΔF的scFv样品。
2.4使用表位竞争测定来证实改进的克隆
使显示比Abet0007亲本克隆更高地结合至人β淀粉样蛋白1-42肽的克隆经受DNA测序(奥斯本(Osbourn)等人，1996；沃恩(Vaughan)等人，1996)。在大肠杆菌中表达具有独特的蛋白质序列的scFv并且通过亲和色谱法纯化，随后缓冲液交换。然后在针对称作基准抗体的Abet0042的表位竞争测定中测试这些scFv的结合亲和力，Abet0042具有与Abet0007相似的针对人β淀粉样蛋白1-42肽的亲和力。在此竞争测定中，Abet0042 IgG针对这些测试scFv样品竞争结合至生物素化的人β淀粉样蛋白1-42肽。如前所述(1.6节)使用HTRFTM技术，检测Abet0042 IgG与生物素化的人β淀粉样蛋白1-42肽的结合。简而言之，向Abet0042IgG、生物素化的β淀粉样蛋白1-42肽、链霉亲和素穴状化合物和抗-人Fc IgG XL665的混合物中添加一个稀释系列的经纯化的scFv。在室温下孵育两小时之后读取时间分辨荧光。
在包含50mM MOPS缓冲液pH 7.4(西格玛，UK；目录号：M9381)、0.4M氟化钾(BDH化学品，USA；目录号：103444T)、0.1％无脂肪酸的牛血清白蛋白(西格玛，UK；目录号：A6003)和0.1％Tween 20(西格玛，UK；目录号：P2287)的测定缓冲液中使用葛莱娜96孔U底板(葛莱娜BioOne，德国；目录号：650201)连续稀释经纯化的scFv。使用MiniTrakTM(珀金埃尔默，USA)液体处理机器人，将scFv的5μl的每种稀释物一式二份转移到测定板(
Figure SMS_12
384孔黑色浅孔，康宁生命科技；目录号：3676)中。在测定缓冲液中制备生物素化的β淀粉样蛋白1-42肽(r肽，USA；目录号：A1117)的20nM溶液，并将5μl的生物素化的肽溶液添加到该测定板中，以给出最终测定体积20μl的最终浓度5nM的肽。将这些测定板密封并在室温下孵育1小时。在测定缓冲液中分别以7nM和20nM合并链霉亲和素穴状化合物和抗-人Fc IgGXL665，并且向该测定板中添加5μl的此溶液。在测定缓冲液中将Abet0042 IgG稀释到2.4nM，并且将5μl添加到该测定板中，以产生最终的0.6nM浓度IgG。通过用5μl测定缓冲液替代Abet0042 IgG，针对每个板定义非特异性结合孔(阴性对照)。测定板在室温下封闭并且孵育2小时，然后使用EnVision板读取器(珀金埃尔默，USA)在620nm和665nm发射波长下读取时间分辨荧光。
将数据通过计算每个样品的％ΔF值和％特异性结合来分析。％ΔF是根据方程1来确定，并且％特异性结合是使用方程2来计算。IC50值使用棱镜(GraphPad软件，USA)通过使用如方程3所描述的四参数逻辑斯谛方程的曲线拟合来确定。
方程3：
Figure SMS_13
其中Y是特异性结合并且X为浓度的对数。
实例结果示于图5中。原始前导，即Abet0007，具有159nM的IC50，而最改进的克隆，即Abet0144，具有5.5nM的IC50值。
2.5通过表面等离子体共振进行的对经纯化的scFv形式中的亲和力改进的克隆的动力学分析
使用表面等离子体共振来分析经纯化的scFv克隆，相对于亲本序列Abet0007，该经纯化的scFv克隆在HTRFTM表位竞争测定(2.4节)中显示针对人β淀粉样蛋白1-42肽更显著改进的结合亲和力。简而言之，BIAcore T-100(通用电气医疗集团，UK)生物传感器仪器用于评估每一纯化的scFv与人工合成的人β淀粉样蛋白1-42肽之间相互作用的动力学参数。这些实验基本上如卡尔松(Karlsson)等人(卡尔松(Karlsson)等人，1991)描述的来执行。更多细节，参见1.7节。
每一测试scFv与人β淀粉样蛋白1-42之间的结合亲和力是使用测定来估计，所述测定中生物素化的合成的人β淀粉样蛋白1-42肽(rPeptide，USA；目录号：A1117)通过生物素/链霉亲和素相互作用非共价地结合至专用SA传感器芯片至近似700RU的最终表面密度。芯片表面在周期之间通过以下方式再生：单一20秒注射10mM甘氨酸pH 2.0以便去除结合至肽的scFv。再生不会导致肽结合能力的显著损失。
使一系列稀释的每一纯化的scFv(12.5–400nM)依序通过肽表面持续足够量的时间以便观察可置信地拟合至适当结合模型的传感图。将零浓度缓冲液空白从主要数据集减去以便减少任何缓冲液假象的影响或非特异性结合影响。然后使用BIAevaluation软件将适当的结合模型同时拟合至来自每个分析物滴定的数据。
使用计算的Chi2值评估数据的有效性，其可接受值是低于4RU2。使用残差，其偏差小于20RU是可接受的，估算拟合的全部成功数。
Abet0144scFv的实例结果示于图6中。结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和解离常数(KD)分别是2.01x 105M-1s-1、6.66x 10-3s-1和33.2nM。这些参数衍生自对数据的1:1朗缪尔拟合。
2.6亲和力改进的scFv重新改变为人IgG1-TM形式
该IgG1-TM抗体形式是包含下铰链和CH2常数域内三个单氨基酸取代(三重突变体：TM)的人IgG1同工型(奥根尼斯杨(Oganesyan)等人，2008)。当引入人IgG1分子的下铰链和CH2域中时，该三重突变L234F/L235E/P331S(‘TM’)引起在它们与人CD64、CD32A、CD16和C1q的结合上的意义深远的降低。使用这些TM突变以产生具有非常低效应子功能的人同工型。通过将可变重链(VH)和可变轻链(VL)域亚克隆至分别表达完整人抗体重链和轻链的载体中，将ScFv重新变为IgG1-TM形式。将可变重链克隆至含有人重链恒定域和调控元件的哺乳动物表达载体(pEU 1.4)中以便在哺乳动物细胞中表达完整IgG1-TM重链。同样地，将可变轻链域克隆至用于表达人λ轻链恒定域和调控元件的哺乳动物表达载体(pEU 4.4)中以便在哺乳动物细胞中表达完整IgG轻链。基本如在1.5节中所述，表达并纯化IgG抗体。
2.7种系化
将亲和力优化的β淀粉样蛋白1-42肽特异性抗体的VH和VL域的氨基酸序列与VBASE数据库(汤姆林森(Tomlinson)等人，1992)中的已知人种系序列进行比对，并且通过序列相似性鉴别最接近的种系。针对优化抗体谱系的VH域，它是Vh3-23(DP-47)，并且针对VL域，是Vλ3-3r(DPL-23)。
种系化过程由以下组成：将VH和VL域中的框架残基回复至最接近的种系序列以便完全匹配人抗体。对于Abet0144，在VH域中没有残基需要变化(表1)，但在VL域的框架中发生了总数为5的变化。这些变化发生在卡巴特位置1、2、3、40和81处(表2)。游标(Vernier)残基(富特(Foote)等人，1992)未被种系化，除了轻链序列中的残基2是与侧翼残基1和3同时种系化。这些氨基酸残基的种系化使用标准定位诱变技术以合适诱变引物来执行，如由克拉克逊(Clackson)和洛曼(Lowman)(克拉克逊(Clackson)等人，2004)所述的。
Figure SMS_14
表1：Abet0144和Abet0144-GL克隆与到VH3-23(DP47)种系的序列比对。高亮了不同于种系的残基。通过圆(●)表示游标残基。在VH域中未作变化以种系化Abet0144克隆。
Figure SMS_15
表2：Abet0144和Abet0144-GL克隆与Vλ3-3R(DPL-23)种系的序列比对。高亮了不同于种系的残基。通过圆(●)表示游标残基。在VL域中作出了五处变化以种系化Abet0144克隆。将游标2残基与残基1和3同时回复为种系。回复此残基不会影响抗体效力。
2.8使用表面等离子体共振确定亲和力优化的IgG的结合动力学
使用表面等离子体共振来分析亲和力优化的IgG(2.6节)及其种系化相对物(2.7节)的结合动力学。简而言之，使用BIAcore T-100(通用电气医疗集团，UK)生物传感器仪器来评估每一测试IgG与合成产生的人β淀粉样蛋白1-42肽之间相互作用的动力学参数。这些实验基本上如卡尔松(Karlsson)等人描述的来执行(卡尔松(Karlsson)等人，1991)。更多细节，参见1.7节。
每一测试IgG与人β淀粉样蛋白1-42之间的结合亲和力使用测定来估计，所述测定中抗体通过胺键共价地连接至专有CM3芯片表面至近似2,000RU的最终表面密度。芯片表面在周期之间通过以下方式再生：单一40秒注射10mM甘氨酸pH 2.0以便去除结合至抗体的配体。再生不会导致肽结合能力的显著损失。
使一系列稀释的合成的人β淀粉样蛋白1-42肽(1.6–50nM)依序通过抗体表面持续足够量的时间以便观察可置信地拟合至适当结合模型的传感图。将空白参考流动池数据从每个IgG数据集减去并且零浓度缓冲液空白从主要数据集双重参考减去以便减少任何缓冲液假象的影响或非特异性结合影响。然后使用BIAevaluation软件将适当的结合模型同时拟合至来自每个分析物滴定的数据。
使用计算的Chi2值评估数据的有效性，其可接受值是低于2RU2。使用残差，其偏差小于2RU是可接受的，估算拟合的全部成功数。
Abet0144-GL(种系化)IgG1-TM的实例结果示于图7中。结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和解离常数(KD)分别是2.08x 105M-1s-1、1.97x 10-3s-1和9.50nM。这些参数衍生自对数据的1:1朗缪尔拟合。
2.9使用表面等离子体共振进行的亲和力优化的IgG的特异性分析
使用表面等离子体共振来验证这些亲和力优化的IgG针对人β淀粉样蛋白1-42肽的特异性。简而言之，BIAcore T-100(通用电气医疗集团，UK)生物传感器仪器用于评估每一测试IgG与一系列的小肽(包括合成产生的人β淀粉样蛋白1-42和人β淀粉样蛋白1-40)之间相互作用的动力学参数。这些实验基本上如卡尔松(Karlsson)等人(卡尔松(Karlsson)等人，1991)描述的来执行。更多细节，参见1.7节。
每一测试IgG与每一肽之间的结合亲和力使用测定来估计，所述测定中抗体通过胺键共价地连接至专有CM3芯片表面至近似2,000RU的最终表面密度。芯片表面在周期之间通过以下方式再生：单一40秒注射10mM甘氨酸pH 2.0以便去除结合至抗体的配体。再生不会导致肽结合能力的显著损失。
顺序地，使每种测试肽在400nM通过该抗体表面持续足够量的时间以便观察传感图，该传感图未显示结合或可置信地拟合至适当结合模型。将空白参考流动池数据从每个IgG数据集减去并且零浓度缓冲液空白从主要数据集双重参考减去以便减少任何缓冲液假象的影响或非特异性结合影响。
Abet0144-GL(种系化)IgG1-TM的实例结果示于图8中。两种肽(生物素化的人β淀粉样蛋白1-42(r肽，USA；目录号：A1117)和未标记的人β淀粉样蛋白1-42(r肽，USA；目录号：A1165))显示与该抗体的强结合，而三种肽(生物素化的乱序人β淀粉样蛋白1-42(Anaspec，USA；委托合成)，生物素化的人β淀粉样蛋白1-40(r肽，USA；目录号：A1111)和未标记的人β淀粉样蛋白1-40(Anaspec，USA；目录号：24236))未显示结合至该抗体。
2.10以生物化学表位竞争测定形式进行Abet0144-GL IgG1-TM的特异性分析
为了测试Abet0144-GL IgG1-TM结合至其他人β淀粉样蛋白肽的特异性，开展竞争测定。在此测定中，在固定浓度(0.28nM)的Abet0144-GL IgG1-TM的存在下，将固定浓度(1.5nM)的生物素化的人β淀粉样蛋白1-42肽(r肽，USA；目录号：A1117)与一个范围的不同浓度的未标记的人β淀粉样蛋白肽(包括1-42、1-40、1-16、12-28、焦3-42、焦11-42和乱序1-42(Anaspec目录号分别是：20276、24236、24226、24230、29907、29903和25383)一起进行孵育。使用时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)，通过检测对Abet0144-GL IgG1-TM结合至生物素化的人β淀粉样蛋白1-42肽的抑制来评估肽竞争。这里涉及使用铕穴状化合物标记的抗-人Fc IgG(CisBio国际，法国；目录号：61HFCKLB)和XL665标记的链霉亲和素(CisBio国际，法国；目录号：611SAXLB)TR-FRET检测试剂。
在科斯塔尔(Costar)384孔浅底微量滴定板中进行实验。向该测定板的所有孔(除了阴性结合测定对照孔)中添加5ul/孔的生物素化的人β淀粉样蛋白1-42(6nM)，以给出1.5nM的最终测定浓度。仅将5ul的测定缓冲液添加到这些阴性结合测定对照孔中制备重复11点1:3连续滴定或每种测试肽以40uM的最高浓度开始，以给出10uM的最终测定肽最高浓度。然后将5ul/孔的每种测试肽连续稀释物转移到该384孔测定板上。仅将5ul的测定缓冲液添加到总的和这些阴性结合测定对照孔中。稀释Abet0144-GL IgG1-TM以给出1.12nM的工作液。向该384孔测定板的所有孔中添加5ul/孔的此溶液，以得到0.28nM的最终测定Abet0144-GL-IgG1-TM浓度。最终，制备合并的溶液，包含铕穴状化合物标记的抗-人Fc(2.4nM)和XL665标记的链霉亲和素(60nM)。向该384孔测定板的所有孔中添加5ul/孔的此溶液，以使得铕穴状化合物标记的抗-人Fc和XL665标记的链霉亲和素的最终浓度分别为0.6nM和15nM。注意到，最终测定体积是20ul并且添加每种个别测定组分，为所需要的最终测试浓度的四倍的5ul添加。在包含50mM MOPS pH 7.4(西格玛，UK；目录号：M9381)、0.4MKF(BDH化学品，USA；目录号：103444T)，0.1％无脂肪酸的牛血清白蛋白(西格玛，UK；目录号：A6003)和0.1％Tween 20(v/v)(西格玛，UK；目录号：P2287)的测定缓冲液中稀释所有试剂。
测定板在室温下孵育2小时，然后使用EnVision板读取器(珀金埃尔默，USA)在620nm和665nm发射波长下读取时间分辨荧光。将数据通过计算每个样品的％ΔF值来分析。％ΔF是根据方程1来确定。
方程1：
Figure SMS_16
％ΔF值用于计算％特异性结合，如方程2描述。
方程2：
Figure SMS_17
Abet0144-GL IgG1-TM的实例结果示于图9中。这些结果证明Abet0144-GL IgG1-TM结合至人β淀粉样蛋白1-42、焦3-42和焦11-42肽，但不结合至人β淀粉样蛋白1-40肽或肽截短体1-16和12-28。
2.11通过从人血浆消耗β淀粉样蛋白肽进行的前导抗体的功能性表征
在血浆消耗测定中测试这些前导抗体以研究它们从人血浆免疫沉淀人β淀粉样蛋白1-42肽的能力。使用此测定以提供针对每种抗体的功能性效力的证据。精确地如在1.8节中所述的进行这些测定。
在一个实验中，该Abet0144-GL IgG1-TM抗体将血浆中人β淀粉样蛋白1-42肽的水平从13.54pg ml-1减少至9.86pg ml-1(减少27％)。在第二个实验中，该水平从40.06pgml-1减少至34.65pg ml-1(减少14％)。
2.12使用体外免疫组织化学鉴别对β淀粉样蛋白具有天然结合的改进的克隆
将这些亲和力优化的IgG针对其结合至β淀粉样蛋白的能力进行测试，目标是鉴别识别天然β淀粉样蛋白肽的前导克隆。简而言之，在人阿尔茨海默病大脑切片和Tg2576小鼠大脑切片上筛选这些前导抗体以鉴别体外结合至天然淀粉样蛋白的抗-β淀粉样蛋白1-42抗体。基本如在1.9节中所述的进行这些实验。
在这些实验中，从患有严重阿尔茨海默病的两个个体(雌性，ApoE 4/3，86岁；雌性，ApoE 3/3，67岁)的前额皮质和海马分离人大脑组织。从18个月(6只小鼠)龄的Tg2576小鼠分离小鼠大脑组织。在2、5和20μg ml-1的浓度测试抗体。
在一个实验中，该Abet0144-GL IgG1-TM抗体不会为弥漫性斑块(DP)或大脑淀粉样蛋白血管病(CAA)斑块着色(分数＝0)。然而，它在Tg2576大脑切片上以1的分数并且在人AD大脑切片上以1.5的分数为核斑块(CP)染色。相比之下，阳性对照抗体在相同条件下在相邻的切片上在所有斑块(CP、DP、CAA)上产生3-4的分数。图10中显示了代表性图像。
实例3.通过所有六个包括侧翼游标残基的CDR的突变进行的Abet0144-GL的抗体 优化
3.1 Abet0144-GL亲本克隆向与核糖体展示相容的scFv形式的转化
在针对亲和力优化的制备中，将亲本克隆从IgG1-TM形式转化到单链可变片段(scFv)形式。在添加特异性克隆位点和柔性接头区域的情况下，将密码子优化的可变重(VH)和可变轻(VL)域分别从各自的IgG载体扩增。然后进行重组PCR以产生完整的scFv构建体，将其克隆到包含核糖体展示所需的结构性特征的修饰的pUC载体(pUC-RD)中。这些特征包括：5’和3’茎环，以阻止该mRNA转录物被外切酶降解；Shine-Dalgarno序列，以促进核糖体结合至该mRNA转录物；以及在仍然附接至该核糖体的同时允许翻译的scFv分子折叠的基因III间隔区(格罗夫斯(Groves)等人，2005)。
3.2通过定向诱变优化Abet0144-GL
将前导抗体(Abet0144-GL)进一步使用定向诱变方法采用基于亲和力的核糖体展示选择来针对对于人β淀粉样蛋白1-42肽的改进的亲和力来优化。将源自Abet0144-GL的较大scFv-核糖体文库通过所有六个可变重链(VH)和可变的轻(VL)链互补决定区(CDR)的寡核苷酸定向诱变使用如克拉克森(Clackson)和洛曼(Lowman)(克拉克森等人，2004)描述的标准分子生物学技术来建立。将来自每个CDR的突变序列经亲和力优化为单独的文库。使用定向诱变随机化VHCDR1(卡巴特残基26-30)之前的五个游标残基，并且合并这些序列，并将其用剩下的VHCDR1文库成熟化。所有文库经受基于亲和力的核糖体展示选择以便丰富具有针对人β淀粉样蛋白1-42肽的更高亲和力的变体。这些选择基本上如先前描述的(黑尼斯(Hanes)等人，2000)来执行。
简而言之，分别地将该Abet0144-GL前导克隆的六个定向诱变文库(一种覆盖每个CDR)转录到mRNA中。使用停滞翻译过程，形成mRNA-核糖体-scFv三级复合体(黑尼斯(Hanes)等人，1997)。然后，这些复合体经受在递减浓度的合成的生物素化的人β淀粉样蛋白1-42肽(巴亨公司，德国；目录号：H-5642)(100nM至10nM)存在下孵育的四回合选择以便选择具有对于人β淀粉样蛋白1-42肽的更高亲和力的变体。然后将结合到抗原的那些复合体捕获到链霉亲和素包被的顺磁珠粒(DynabeadsTM，英杰，UK；目录号：112-05D)上并洗涤掉非特异性的核糖体复合体。随后将mRNA从结合的核糖体复合体上分离，逆转录至cDNA并将它们通过PCR扩增。此DNA用于下一回合选择。
在四回合的亲和力突变之后，将每个选择输出克隆出来用于筛选目的。将通过核糖体展示分离的ScFv克隆到噬菌粒载体pCANTAB6通过该核糖体展示构建体(新英格兰生物实验室(New England BioLabs)，USA；目录号：R0189L，R0193L)的NotI/NcoI限制性内切核酸酶消化，随后使用T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室，USA；目录号：M0202L)连接到NotI/NcoI消化的pCANTAB6中，基本如麦卡弗蒂(McCafferty)等人所述的(麦卡弗蒂(McCafferty)等人，1994)。
3.3使用表位竞争测定来鉴别改进的克隆
使随机选自3.2节中描述的定向诱变方法的选择回合3和4的二千零二十四个scFv在细菌中表达，以产生未经纯化的周质的scFv。在竞争形式测定中，使用HTRFTM平台阐明能够通过与Abet0144-GL IgG1-TM相同的表位结合合成的人β淀粉样蛋白1-42肽的那些scFv。特别地，在单一浓度的每个未经纯化的周质测试scFv的存在下，在链霉亲和素穴状化合物(与生物素化的β淀粉样蛋白1-42肽相关联)和抗-人Fc XL665(与Abet0144-GL IgG1-TM相关联)之间测量荧光共振能量转移(FRET)。通过scFv成功占用该肽上的Abet0144-GL IgG1-TM表位导致FRET上的减少，如在荧光板读取器上测量的。
通过分析在不存在竞争者肽的情况下Abet0144-GL IgG1-TM与合成的人β淀粉样蛋白1-42肽的结合来确定‘总’结合信号。‘样品’信号源自对在存在测试scFv样品的情况下进行的Abet0144-GL IgG1-TM与合成的人β淀粉样蛋白1-42肽的结合的分析。最终，通过分析仅由该检测试剂混合物介导的荧光确定‘穴状化合物空白’信号。
在由50mM MOPS，pH 7.4、0.5mM EDTA和0.5M蔗糖组成的样品缓冲液中提供未经纯化的周质的scFv。为了性能分析，将scFv样品在384-孔V-底板中在测定缓冲液中稀释到原始母液浓度的50％，该测定缓冲液由50mM MOPS，pH 7.4、0.4M氟化钾、0.1％无脂肪酸的牛血清白蛋白和0.1％Tween 20(v/v)组成。使用液体处理机器人，将5μl的每种新稀释的scFv转移到黑色浅实底非结合384-孔测定板的‘样品’孔中。将剩下的试剂(在测定缓冲液中制备的)通过多通道吸管按以下顺序添加到该测定板中：5μl样品缓冲液(至‘总’和‘穴状化合物空白’孔)、10μl测定缓冲液(至‘穴状化合物空白’孔)、5μl 2nM Abet0144-GL IgG1-TM(至‘样品’和‘总’孔)、5μl 5nM生物素化的人β淀粉样蛋白1-42肽(至‘样品’和‘总’孔)、以及5μl检测混合物(由6nM链霉亲和素穴状化合物和60nM抗-His6-XL665组成)(至所有孔)。密封测定板并且然后将其在室温下在黑暗中孵育3小时，之后在荧光板读取器上在620和665nm发射波长下测量时间分辨荧光。
将数据通过计算每个样品的％ΔF值来分析。％ΔF是根据方程4来确定。
方程4：
Figure SMS_18
ΔF值随后用于计算归一化结合值，如方程5描述。
方程5：
Figure SMS_19
使证明显著抑制Abet0144-GL IgG1-TM结合至β淀粉样蛋白1-42肽的未经纯化的周质的scFv经受DNA测序(奥斯本(Osbourn)等人，1996；沃恩(Vaughan)等人，1996)。将发现具有独特的蛋白质序列的scFv表达于大肠杆菌中，并且通过亲和色谱法纯化，随后缓冲液交换。
在上述的表位竞争测定中通过测试稀释系列的scFv(典型地4pM-1200nM)确定每种经纯化的scFv的效力。通过计算每个样品的％ΔF值和％总结合值再次分析数据。此外，还如在方程6中所述的计算每个浓度的经纯化的scFv的％抑制值：
方程6：
％抑制＝100-％总结合
使用科学绘图软件针对％抑制绘制ScFv样品浓度的图，并且使任何浓度依赖性反应拟合于非线性回归曲线。从具有局限于值-1的斜率的这些分析物获得IC50值。来自此回合选择的最高效克隆，Abet0286，具有1.8nM的IC50并且来自VLCDR1定向诱变文库。
试剂/设备来源：MOPS(西格玛，UK；目录号：M9381)、氟化钾(BDH化学品，USA；目录号：A6003)、无脂肪酸的牛血清白蛋白(西格玛，UK；目录号：A6003)、Tween 20(西格玛，UK；目录号：P2287)、Abet0144-GL IgG1-TM(内部产生)、生物素化的人β淀粉样蛋白1-42肽(r肽，USA；目录号：A1117)、链霉亲和素穴状化合物(Cisbio，法国；目录号：610SAKLB)、抗-His6-XL665(Cisbio，法国；目录号：61HISXLB)、384孔测定板(康宁，科斯塔尔生命科学(Costar Life Sciences)；目录号：3676)、384孔稀释板(葛莱娜BioOne，德国；目录号：781280)、液体处理机器人(MiniTrakTM，珀金埃尔默，USA)、荧光板读取器(EnvisionTM，珀金埃尔默，USA)、HTRF技术(Cisbio国际，法国)、绘图/统计软件(棱镜(Prism)，GraphpadUSA)。
3.4成功选择输出以产生“二元”文库的重组及其随后的亲和力优化
使用3.3节中所述的表位竞争测定来判断特定的scFv-核糖体文库是否已经经过第一个四回合的选择被亲和力成熟化。这些文库中的两个，VHCDR3和VLCDR2定向诱变文库，显示没有比亲本Abet0144-GL克隆有改进并且未进一步研究。
剩下的四个定向诱变文库,(涵盖VHCDR1、VHCDR2、VLCDR1和VLCDR3)，已显示亲和力改进并且以分对的方式组合以产生六个“二元”重组文库，其中这六个CDR的两个是突变的。例如，涵盖VHCDR1的亲和力突变的文库随机与亲和力突变的VHCDR2文库组合以产生VH1：VH2文库。剩下的文库产生为：VH1：VL1，VH1：VL3，VH2：VL1，VH2：VL3和VL1：VL3。如前所述(3.2节)克隆出亚组的每个重组文库，并送去测序以验证每个文库的完整性。
然后如前所述(3.2节)在递减浓度的生物素化的合成的人β淀粉样蛋白1-42肽(针对回合5和6分别是5nM和2nM)的存在下，继续进行选择。如之前一样，将每个选择输出克隆出来用于筛选目的(3.2节)。
如3.3节中所述的表位竞争测定中，筛选随机选自选择回合5和6的一千九百三十六个scFv。归因于这些克隆的效力增加，首先将未经纯化的scFv稀释到25％，之后添加到这些测定板。如前所述，将显示显著抑制特性的克隆送去进行DNA测序，并且产生独特的克隆并且作为纯化的scFv进行分析(3.3节)。来自这些选择的最有效的克隆，Abet0303，具有0.84nM的效力并且来自该VH1：VH2重组文库。
3.5二元选择输出以产生“三元”文库的重组及其随后的亲和力优化
使用3.3节中所述的表位竞争测定来判断每个二元文库是否已经经过前两回合(5和6)的选择被亲和力成熟化。所有文库已显示亲和力改进并因此考虑进一步的亲和力成熟。
将这六个二元文库(3.4节)以分对的方式与成功回合的4输出(3.2节)重组，以形成四个“三元”重组文库，其中这六个CDR中的三个是突变的。例如，将该VH2：VL3二元文库(回合6输出)与VHCDR1定向诱变文库(回合4输出)重组以产生VH1：VH2：VL3文库。还通过将VH1：VH2二元文库(回合6输出)与VLCDR3定向诱变文库(回合4输出)合并建立相似的构建体。汇集这两个个体文库以建立VH1：VH2：VL3三元文库。
注意不要破坏未被共优化的CDR之间的协同。例如，未将VH1：VL3二元文库与VHCDR2定向诱变文库重组，因为此操作将破坏该共优化的VHCDR1和VLCDR3序列之间的协同。表3中给出了所有三元文库及其衍生的完整清单。如前所述(3.2节)克隆出亚组的每个重组文库，并送去测序以验证每个文库的完整性。
Figure SMS_20
表3：在第二前导优化活动的回合7和8期间成熟的四个三元文库的描述。每个文库包括两个构成文库，即产生自回合6输出二元文库和回合4输出定向诱变文库的随机分对重组。
然后如前所述(3.2节)在递减浓度的生物素化的合成的人β淀粉样蛋白1-42肽(针对回合500和8分别是7pM和200pM)的存在下，继续进行选择。如之前一样，将每个选择输出克隆出来用于筛选目的(3.2节)。
如3.3节中所述的表位竞争测定中，筛选随机选自选择回合7和8的一千四百零八个scFv。至于“二元”筛选，首先将未经纯化的scFv稀释到25％，之后添加到这些测定板。如前所述，将显示显著抑制特性的克隆送去进行DNA测序，并且产生独特的克隆并且作为纯化的scFv进行分析(3.3节)。来自这些选择的最有效的克隆，Abet0343，具有0.48nM的效力并且来自该VH1：VH2：VL3重组文库。
3.6三元选择输出以产生“四元”文库的重组及其随后的亲和力优化
使用3.3节中所述的表位竞争测定来判断每个三元文库是否已经经过前两回合(7和8)的选择被亲和力成熟化。所有文库已显示亲和力改进并因此考虑进一步的亲和力成熟。
将VH1：VH2：VL1三元文库(回合8输出)与VLCDR3定向诱变文库(回合4输出)重组，并且将VH2：VL1：VL3三元文库(回合8输出)与VHCDR1定向诱变文库(回合4输出)重组。分别将VH1：VH2二元文库(回合6输出)与VL1：VL3二元文库(回合6输出)重组。然后汇集这三个个体文库以建立单个“四元”文库，VH1：VH2：VL1：VL3，其中这六个CDR的四个是突变的。
注意不要破坏未被共优化的CDR之间的协同。例如，未将VH1：VL2：VL3三元文库与VLCDR1定向诱变文库重组，因为此操作将破坏该共优化的VHCDR1/VHCDR2和VLCDR3序列之间的协同。如前所述(3.2节)克隆出亚组的每个重组文库，并送去测序以验证每个文库的完整性。
然后如前所述(3.2节)在递减浓度的生物素化的合成的人β淀粉样蛋白1-42肽(50pM至10pM持续回合9至11)的存在下，继续进行选择。如之前一样，将每个选择输出克隆出来用于筛选目的(3.2节)。
如3.3节中所述的表位竞争测定中，筛选随机选自选择回合9至11的一千六百七十二个scFv。归因于这些克隆的效力增加，首先将未经纯化的scFv稀释到3.13％，之后添加到这些测定板。如前所述，将显示显著抑制特性的克隆送去进行DNA测序，并且产生独特的克隆并且作为纯化的scFv进行分析(3.3节)。来自这些选择的最有效的克隆，Abet0377，具有0.32nM的效力(n＝2数据)。样品抑制曲线示于图11中，并且针对24个最高效力克隆的数据示于表4中。相应的蛋白质序列列于表5和6中。
Figure SMS_21
/>
Figure SMS_22
表4：当在Abet0144-GL HTRFTM表位竞争测定中评价时针对优化的scFv克隆的实例效力数据。当超过一次进行该测定时，提供了IC50值的决定范围。
表5(参见以下)：此处所述的优化的非种系化克隆的VH域的序列比对。高亮了来自亲本序列(Abet0144-GL)的变化。该根据卡巴特编号系统指定残基。
表6(参见以下)：此处所述的优化的非种系化克隆的VL域的序列比对。高亮了来自亲本序列(Abet0144-GL)的变化。该根据卡巴特编号系统指定残。注意，Abet0378具有在VL序列位置91处存在琥珀终止密码子“B”，在优化过程中作为来自谷氨酰胺的变化引入。在大肠杆菌菌株TG1中作为scFv片段产生用于表达，其中该琥珀终止密码子被读为谷氨酰胺。
Figure SMS_23
/>
Figure SMS_24
3.7通过表面等离子体共振进行的对经纯化的scFv形式中的亲和力改进的克隆的动力学分析
使用表面等离子体共振来分析经纯化的scFv克隆，相对于亲本序列Abet0144-GL，该经纯化的scFv克隆在HTRFTM表位竞争测定(3.3-3.6节)中显示针对人β淀粉样蛋白1-42肽更显著改进的结合亲和力。简而言之，使用ProteOn蛋白质相互作用阵列系统(BioRad，USA)来评估每一经纯化的scFv与合成产生的人β淀粉样蛋白1-42肽之间相互作用的动力学参数。这些实验基本上如卡尔松(Karlsson)等人描述的来执行(卡尔松(Karlsson)等人，1991)。更多细节，参见1.7节。
每一测试scFv与人β淀粉样蛋白1-42之间的结合亲和力使用测定来估计，其中在五个不同的表面密度下，生物素化的人工合成的β淀粉样蛋白1-42肽(rPeptide，USA；目录号：A1117)通过非共价地结合至生物素/链霉亲和素相互作用专用链霉亲和素芯片(NTA176-5021)。芯片表面在周期之间通过以下方式再生：单一60秒注射10mM甘氨酸pH 2.0以便去除结合至肽的scFv。再生不产生scFv结合能力的显著损失。
使100-200nM的每一scFv依序通过肽表面持续足够量的时间以便观察可置信地拟合至适当结合模型的传感图。将无关的scFv空白从主要数据集减去以便减少任何缓冲液假象的影响或非特异性结合影响。然后将适当的结合模型拟合至该数据。
至于Abet0380scFv，结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和解离常数(KD)分别是1.93x 105M-1s-1、2.85x 10-5s-1和148pM。这些参数衍生自对数据的1:1朗缪尔拟合。
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Figure SMS_26
表7：针对结合至合成的生物素化的人β淀粉样蛋白1-42肽的优化的scFv克隆的实例动力学数据，如通过表面等离子体共振确定的。
3.8亲和力改进的scFv重新改变为人IgG1-TM形式
IgG1-TM抗体形式是在2.6节中讨论的。通过将可变重链(VH)和可变轻链(VL)域亚克隆至分别表达完整人抗体重链和轻链的载体中，将ScFv重新变为IgG1-TM形式。将可变重链克隆至含有人重链恒定域和调控元件的哺乳动物表达载体(pEU 1.4)中以便在哺乳动物细胞中表达完整IgG1-TM重链。同样地，将可变轻链域克隆至用于表达人λ轻链恒定域和调控元件的哺乳动物表达载体(pEU 4.4)中以便在哺乳动物细胞中表达完整IgG轻链。
为了获得作为IgG的抗体，重链和轻链IgG表达载体瞬时转染至HEK293-EBNA哺乳动物细胞(英杰，UK；目录号R620-07)中，其中这些IgG表达并且分泌至培养基中。将收获物进行汇集并过滤，之后进行纯化。将IgG使用蛋白质A色谱法来纯化。将培养上清液装载到适当的陶瓷蛋白质A柱(BioSepra-Pall，USA)上，并用50mM Tris-HCl pH 8.0，250mM NaCl洗涤。将结合的IgG从使用0.1M柠檬酸钠pH 3.0从该柱洗脱，并且将其通过添加Tris-HCl(pH9.0)中和。将洗脱的材料使用NAP-10缓冲液交换柱(GE医疗集团，UK；目录号：17-0854-02)缓冲液交换到PBS并使该经纯化的IgG经过0.2μm过滤器。使用基于IgG的氨基酸序列的消光系数分光光度计地确定IgG的浓度。使用SEC-HPLC并通过SDS-PAGE，对经纯化的IgG针对聚集或降解进行分析。
3.9种系化
基于其相应的scFv的实验表征，选择最高效的IgG中的五个用于种系化。克隆Abet0343、Abet0369、Abet0377、Abet0380和Abet0382的经纯化的scFv都展现了少于750pM的IC50值，如通过表位竞争测定确定的(表4)，并且都具有少于250pM的实验解离常数，如表7通过表面等离子体共振确定的。
种系化过程由以下组成：将VH和VL域中的框架残基回复至最接近的种系序列以便完全匹配人抗体。针对优化抗体谱系的VH域，它是Vh3-23(DP-47)，并且针对VL域，是Vλ3-3r(DPL-23)。至于Abet0380，VH域中卡巴特位置43处需要改变1个残基(表8)并且VL域中卡巴特位置81处需要改变1个残基(表9)。剩下的四个序列需要二和五个之间的改变(表8和9)。游标残基(富特(Foote)等人，1992)未被种系化，除了Abet0343的轻链序列中的残基2是与侧翼残基1和3同时种系化。这些氨基酸残基的种系化使用标准定位诱变技术以合适诱变引物来执行，如由克拉克逊(Clackson)和洛曼(Lowman)(克拉克逊(Clackson)等人，2004)所述的。
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3.10使用表面等离子体共振确定亲和力优化的IgG的结合动力学
使用表面等离子体共振来分析亲和力优化的IgG(3.8节)及其种系化相对物(3.9节)的结合动力学。简而言之，BIAcore T-100(通用电气医疗集团，UK)生物传感器仪器用于评估每一测试IgG与合成产生的人β淀粉样蛋白1-42肽之间相互作用的动力学参数。这些实验基本上如卡尔松(Karlsson)等人描述的来执行(卡尔松(Karlsson)等人，1991)。更多细节，参见1.7节。
使用如下测定来估计每一测试IgG与人β淀粉样蛋白1-42之间的结合亲和力，所述测定中通过经自身的胺连接至专有CM5芯片的蛋白质G表面非共价地捕获每个抗体。芯片表面在周期之间通过以下方式再生：成对40秒注射10mM甘氨酸pH 2.0以去除配体和结合的抗体。然后对于每个肽注射应用测试抗体。
使一系列稀释的合成的人β淀粉样蛋白1-42肽(0.063–1024nM)依序通过抗体表面持续足够量的时间以便观察可置信地拟合至适当结合模型的传感图。将空白参考流动池数据从每个IgG数据集减去并且零浓度的仅有抗体的缓冲液空白从主要数据集双重参考减去。然后使用BIAevaluation软件将适当的结合模型同时拟合至来自每个分析物滴定的数据。
使用计算的Chi2值评估数据的有效性，其可接受值是低于2RU2。使用残差，其偏差小于2RU是可接受的，估算拟合的全部成功数。
Abet0380-GL(种系化)IgG1-TM的实例结果示于图12中。结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和解离常数(KD)分别是9.52x 105M-1s-1、3.07x 10-4s-1和322pM。这些参数衍生自对数据的1:1朗缪尔拟合。
3.11使用表面等离子体共振进行的亲和力优化的IgG的特异性分析
使用表面等离子体共振来验证这些亲和力优化的IgG针对人β淀粉样蛋白1-42肽的特异性。简而言之，BIAcore2000(通用电气医疗集团，UK)生物传感器仪器用于评估每一测试IgG与一系列的小肽(包括合成产生的人β淀粉样蛋白1-42和人β淀粉样蛋白1-40)之间相互作用的动力学参数。这些实验基本上如卡尔松(Karlsson)等人描述的来执行(卡尔松(Karlsson)等人，1991)。更多细节，参见1.7节。
使用如下测定来估计每一测试IgG与每种肽之间的相互作用，所述测定中通过经自身的胺连接至专有CM5芯片的蛋白质G表面非共价地捕获该抗体。使用5应用单周期方法观察到抗体和肽之间的相互作用。芯片表面在周期之间通过以下方式再生：成对40秒注射10mM甘氨酸pH 2.0以去除配体和结合的抗体。然后对于每个肽注射周期应用测试抗体。
顺序地，使每种测试肽(在64和1024nM之间)通过该抗体表面持续足够量的时间以便观察传感图，该传感图未显示结合或可置信地拟合至适当结合模型。将空白参考流动池数据从每个IgG数据集减去并且零浓度的仅有抗体的缓冲液空白从主要数据集双重参考减去。
Abet0380-GL(种系化)IgG1-TM的实例结果示于图13中。两种肽(生物素化的人β淀粉样蛋白1-42,(r肽，USA；目录号：A1117)和未标记的鼠β淀粉样蛋白1-42(r肽，USA；目录号：A1008)显示与该抗体的强结合，而两种肽生物素化的人β淀粉样蛋白1-40(r肽，USA；目录号：A1111)和未标记的鼠β淀粉样蛋白1-40(r肽，USA；目录号：A1007)未显示结合至该抗体。3.12使用体外免疫组织化学分析得到最高效IgG针对天然β淀粉样蛋白的亲和力
将最高效IgG针对其结合至β淀粉样蛋白的能力进行测试，目的是评估这些克隆对β淀粉样蛋白肽的天然形式的亲和力。简而言之，在人阿尔茨海默病大脑切片和Tg2576小鼠大脑切片上筛选这些前导抗体以鉴别体外结合至淀粉样蛋白斑的抗-β淀粉样蛋白1-42抗体。基本如在1.9节中所述的进行这些实验。
在这些实验中，从患有严重阿尔茨海默病的两个个体(ApoE基因型3/3，布拉克阶段6和ApoE基因型4/3，布拉克阶段5)的前额皮质分离人大脑组织。作为对照，从一个非痴呆个体(ApoE基因型3/3，布拉克阶段1)分离等价组织。从15个月(2只小鼠)和22个月(2只小鼠)龄的Tg2576小鼠分离小鼠大脑组织。在2、5、10和20μg ml-1的浓度测试抗体。
在一个实验中，Abet0380-GL IgG1-TM抗体在Tg2576大脑切片上以4的分数并且在人AD大脑切片上以3的分数为核斑块(CP)染色。它也为弥漫性斑块(DP)和大脑淀粉样蛋白血管病(CAA)斑块着色，但至更小的程度。相比之下，阳性对照抗体在相同条件下在相邻的切片上在所有斑块(CP、DP、CAA)上产生3-4的分数。图14中显示了代表性图像。
3.13通过蛋白质印迹证明Abet0380-GL IgG1-TM Aβ42识别特性
为了在SDS-PAGE之前交联Aβ42寡聚体，如下进行PICUP(肽的光诱导的交联)。通过将2μl的母液(在10mM)添加到18μl的1xPBS中建立Ru(Bpy)的1mM溶液。此外，通过将2μl的母液(在200mM)添加到18μl的20xPBS中建立过硫酸铵(APS)的20mM溶液。将未使用的母液立即速冻在干冰上并送回-80℃冰柜。在暗室中，将5μl的Ru(Bpy)添加到80ul的聚集体(净10uM样品)中，随后添加5μl的APS。在暗室中将样品用灯照射10秒。立即添加30ul的(4x)LDS样品缓冲液。
然后对交联的(PICUP)和未交联的Aβ1-42聚集体进行SDS-PAGE。将溶液在热块中在70℃下孵育10分钟。同时，通过合并5μl的魔法标记XP蛋白质印记标准品、5μl的诺维克斯夏普(Novex Sharp)预染蛋白质标准品建立标记物。在十分钟孵育之后，将样品加上标记物装载到具有MES运行缓冲液的NuPAGE诺维克斯4％-12％双-Tris凝胶(1.0mm，15孔，15μl/孔)上。在200V下使该凝胶跑35分钟。
然后使用来自英杰的iBlot机器，在20V，将该凝胶印迹到PVDF膜上持续7分钟(程序P3)。
一旦印记完成，拆解该凝胶堆积物，并且然后将该PVDF膜在50ml的4％MPBST(4％马弗尔于PBST中)中进行封闭在室温下伴随温和旋转持续一小时。然后用解剖刀切割印记用于用单独的抗体进行探针检测。用第一抗体溶液(2ug/ml于10ml的3％MPBST中)孵育1小时。
接着，将该膜用PBST洗涤5次，每次5分钟，并且然后在二级抗体溶液(1μl抗-人Fc特异性-HRP轭合物于10ml PBST中)中在室温下孵育1小时。将该膜用PBST洗涤3次并用PBS洗涤2次，每次5分钟。
在最终洗涤中，允许该化学-发光SuperSignal West Dura底物(赛默科技；34075)加温至室温。将600ul的这2种溶液的每种合并。从该PVDF膜倾析PBS，并且然后使用移液管用混合的Dura试剂覆盖该膜。允许该反应进行～5分钟(在此期间建立VerscDoc成像系统)并且然后以30秒曝光照相(使用转换滤器加强)。图15中显示了代表性图像。
实例4.证明Abet0380-GL IgG1-TM抗体体内特异性功能应答的研究
4.1通过体内游离β淀粉样蛋白1-42肽的减少对Abet0380-GL IgG1-TM进行功能性表征
通过以5ml/kg的25mM组氨酸、7％蔗糖、0.02％p80表面活性剂，pH 6.0的给药运载体静脉内注射，使八周大的雄性白化体哈伦斯普拉-道来(Harlan Sprague-Dawley)大鼠(n＝8-12)接受单剂量的Abet0380-GL IgG1-TM抗体。给药溶液就在给药前制备。在指定的时间麻醉动物并从小脑延髓池吸出脑脊液(CSF)。在取样的20分钟内将CSF样品在4℃下在大约3000x g离心10分钟以去除细胞或碎片。然后将样品冰冻在干冰上并存储在-70℃用于随后的分析。
通过断头处死动物，切开大脑组织，并从二乙胺(DEA；Fluka，西格玛，UK；目录号：31729)中的大脑组织中提取β淀粉样蛋白肽。简而言之，将冷冻的大脑组织在0.2％DEA和50mM NaCl(默克公司(Merck)，USA；目录号：1.06404.1000)中均质。将脑匀浆在133,000x g下离心1小时。将回收的上清液用2M Tris-HCl(
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-盐酸盐；西格玛，UK；目录号：93363)中和至pH 8.0并在-70℃下储存直至分析。根据相关指南和瑞典农业委员会提供的规章进行动物实验。道德许可是由专攻动物实验的伦理委员会：斯德哥尔摩索迪拉动物研究伦理委员会提供的。
使用免疫沉淀测量大鼠CSF中的游离β淀粉样蛋白1-42肽以去除Abet0380-GL结合的β淀粉样蛋白1-42肽，随后通过来自英杰的商业ELISA试剂盒进行分析。简而言之，将蛋白质A珠粒(
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蛋白质A；英杰，UK；目录号：100-02D)的溶液添加到96孔无缘板(聚丙烯0.2ml；VWR国际，UK；目录号：10732-4828)并用TBST(50mM TBS；西格玛，UK；目录号：T6664plus 0.1％Tween20)洗涤两次，使用磁体(DynaMagTM 96 side；英杰，UK；目录号：123.31D)将这些珠粒从该溶液中分离。向每个孔中添加解冻的大鼠CSF样品(40μl)并伴随着倾斜旋转在40℃孵育1小时。然后使用该磁体使这些珠粒聚集并将30μl的免疫沉淀的CSF样品转移到来自已经添加了70μl的标准稀释缓冲液(补充以蛋白酶抑制剂；罗氏，UK；目录号：11836153001)的ELISA试剂盒(小鼠β淀粉样蛋白(1-42)比色ELISA试剂盒；英杰，UK；目录号：KMB3441)的96孔板中。向该板中一式两份添加校准用标准样品，并伴随摇动将该板在室温下孵育2小时。将该板用400μl的洗涤缓冲液洗涤4次，将100μl的检测抗体溶液添加到每个孔中，并伴随摇动将该板在室温下孵育1小时。再次将该板用400μl的洗涤缓冲液洗涤4次，将100μl的二级抗体工作液添加到每个孔中，并伴随摇动将该板在室温下孵育30分钟。最终将该板用400μl的洗涤缓冲液洗涤4次，将100μl的稳定化生色团添加到每个孔中，并将该板在室温下在黑暗中孵育30分钟。为了停止该反应，向每个孔中添加100μl的停止溶液，并在2小时内读取该板在450nm的吸光度。分析单CSF样品并使用棱镜4(GraphPad，USA)对log转化的数据以单向ANOVA进行数据分析，不针对多个比较进行调整。
使用小鼠β淀粉样蛋白(1-42)比色ELISA试剂盒(英杰，UK；目录号：KMB3441)的修饰进行对大鼠大脑匀浆中的总(游离的和Abet0380-GL结合的)β淀粉样蛋白1-42肽的测量。将该试剂盒检测抗体通过过多的Abet0380-GL IgG1-TM抗体替代并且将该二级抗体通过抗-人IgG HRP-轭合物抗体(杰克逊免疫研究(Jackson ImmunoResearch)，UK；目录号：109-035-098)替代。简而言之，将50μl的解冻的大脑匀浆在样品稀释液(补充以蛋白酶抑制剂；罗氏，UK；目录号：11836153001)中1：2稀释的并向该96孔ELISA板中一式两份添加标准样品。向每个孔中添加过多的Abet0380-GL IgG1-TM抗体(50μl，4μg/ml)，并且然后将该板在室温下孵育3小时。将该板用400μl的洗涤缓冲液洗涤4次，将100μl的二级抗体工作液添加到每个孔中，并将该板在室温下孵育30分钟。最终将该板用400μl的洗涤缓冲液洗涤4次，将100μl的稳定化生色团添加到每个孔中，并将该板在室温下在黑暗中孵育15分钟。为了停止该反应，向每个孔中添加100μl的停止溶液，并在2小时内读取该板在450nm的吸光度。使用棱镜4(GraphPad，USA)对log转化的数据以单向ANOVA进行数据分析，不针对多个比较进行调整。
使用小鼠β淀粉样蛋白(1-40)比色ELISA试剂盒(英杰，UK；目录号：KMB3481)进行对大鼠大脑匀浆中的总β淀粉样蛋白1-40肽的测量。简而言之，将50μl的解冻的大脑匀浆和标准样品在样品稀释液(补充以蛋白酶抑制剂；罗氏，UK；目录号：11836153001)中稀释，将其一式两份添加到该96孔ELISA板中。向每个孔中添加50μL的检测抗体溶液并且将该板在室温下孵育3小时。将该板用400μl的洗涤缓冲液洗涤4次，将100μl的二级抗体工作液添加到每个孔中，并将该板在室温下孵育30分钟。最终将该板用400μl的洗涤缓冲液洗涤4次，将100μl的稳定化生色团添加到每个孔中，并将该板在室温下在黑暗中孵育30分钟。为了停止该反应，向每个孔中添加100μl的停止溶液，并在2小时内读取该板在450nm的吸光度。使用棱镜4(GraphPad，USA)对log转化的数据以单向ANOVA进行数据分析，不针对多个比较进行调整。
4.2通过体内游离β淀粉样蛋白1-42肽的减少对Abet0380-GL IgG1-TM进行功能性表征
在4.1节中所述测定中给药之后，20mg/kg的单剂量的Abet0380-GL IgG1-TM抗体将大鼠中的游离β淀粉样蛋白1-42肽的CSF水平减少到72或168小时处的定量限(数据未显示)。为了进一步研究体内Abet0380-GL IgG1-TM抗体的影响，经14天向大鼠给予0.25、0.5，1、5或10mg/kg的每周剂量。在第二次给药之后168小时将动物安乐死，以测量CSF中的游离β淀粉样蛋白1-42肽的水平以及大脑组织中总β淀粉样蛋白1-42或1-40肽的水平。
在CSF证明了游离β淀粉样蛋白1-42的剂量依赖性降低(图16A)。5和10mg/kg的两个最高剂量将β淀粉样蛋白1-42肽减少到该测定中使用的定量限，而当与运载体对照对比时，0.5和1mg/kg的剂量将β淀粉样蛋白1-42肽分别显著减少47％和61％。最低剂量0.25mg/kg给出了CSF中游离β淀粉样蛋白1-42肽的14％减少，但未能达到统计显著性。归因于Abet0380-GL IgG1-TM抗体对β淀粉样蛋白1-42肽的隔离，在大脑组织证明了总β淀粉样蛋白1-42肽的剂量依赖性增加(图16B)。然而，大脑组织中总β淀粉样蛋白1-40肽的水平未受影响(图16C)，因此证明了Abet0380-GL IgG1-TM对β淀粉样蛋白1-42肽的特异性。总之，以上来自大鼠研究的结果显示，该Abet0380-GL IgG1-TM抗体减少了CSF中游离β淀粉样蛋白1-42肽的水平，ED50在0.5和1mg/kg之间。
4.3 Abet0380-GL IgG1TM的功能性表征-证明在向年老的Tg2576小鼠外周给药之后168小时无体内斑块结合-体内Abet0380-GL IgG1-TM未结合至β淀粉样蛋白斑块
在单次外周给药之后，将Abet0380-GL IgG1-TM针对其结合至年老的Tg2576小鼠中β淀粉样蛋白斑块的能力进行测试。根据相关指南和瑞典农业委员会提供的规章进行动物实验。道德许可是由专攻动物实验的伦理委员会：斯德哥尔摩索迪拉动物研究伦理委员会提供的。
使十七个月大的雌性Tg2576小鼠(n＝5)接受单剂量的运载体，以5mL/kg的25mM组氨酸、7％蔗糖、0.02％p80表面活性剂，pH 6.0给药运载体通过静脉内注射给予30mg/kg的阳性对照抗体或10或30mg/kg的Abet0380-GL IgG1-TM抗体。在给药后168小时，深度麻醉动物并在室温灌注PBS，随后灌注(4℃)磷酸盐缓冲的4％多聚蚁醛(PFA)。然后通过断头处死动物，并且切开大脑，并在PFA中在4℃沉浸固定72小时。将固定剂交换到包含0.1％叠氮化钠的PBS中并将组织在4℃储存直至进一步处理。
在大脑切片上进行免疫组织化学分析以评价Abet0380-GL IgG1-TM体内结合至β淀粉样蛋白斑块的程度。简而言之，如1.9节中所述，制备石蜡包埋的大脑切片用于免疫组织化学分析。使用来自宜佰康(Epitomics)的兔-抗-小鼠IgG1和IgG2-特异性二级抗体检测大脑实质内沉积的Abet0380-GL IgG1-TM或阳性对照抗体。在温塔娜机器人上，使用OmniMap检测系统(温塔娜医疗系统，USA)进行染色。为了体外强化，将连续的组织切片在体外用过量注射的Abet0380-GL IgG1-TM或阳性对照抗体染色。二级抗体和染色体基因与以上相同。
以盲选方式在10x光学放大下进行染色的评分。标注修饰的斑块的分布。使用从0(无斑块染色)高至4(强烈的斑块修饰)的相对强度分数对斑块标记的强度进行评分。
Abet0380-GL IgG1-TM在10或30mg/kg外周给药之后168小时不会修饰体内β淀粉样蛋白斑块或大脑淀粉样蛋白血管病(CAA)。该阳性对照抗体证明了强至低的体内斑块修饰。部分和聚集的分布模式是明显的，在所有动物中具有核斑块、弥漫性斑块和CAA。图17中显示了代表性图像。用Abet0380-GL IgG1-TM和该阳性对照抗体对来自相同动物的大脑组织的体外强化证实了先前证明的所注射抗体的体外斑块结合能力(未显示)。
实例5.抗-Aβ1-42序列
抗体分子的序列的实例在附加序列表中列出，包括实例抗体VH域、VL域、单独的CDR序列、HCDR组、LCDR组、以及框架区。
对比了表7中列出的24个优化的克隆的序列。表10和11分别显示VH和VL域之间的％序列一致性。
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表12：VH CDR和游标残基内每个位置的残基的实例。
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表13：VLCDR残基内每个位置的残基的实例。
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表14：24个优化克隆中的VH CDR和FW1中观察到的取代
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表15：24个优化克隆中的VL CDR中观察到的取代
表16：此处提到的抗体序列和此文件的末尾处的序列表中的序列之间的对应性。
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实例6：竞争结合实验中Abet0380-GL IgG1-TM的特异性
在竞争结合实验中检查Abet0380-GL IgG1-TM的特异性。简而言之，用处于不同浓度范围(10uM下至0.17nM)的一组全长、截短和焦人Aβ肽(Aβ1-42、Aβ1-43、Aβ1-16、Aβ12-28、Aβ17-42、Aβ焦-3-42、或Aβ焦-11-42)孵育Abet0380-GL IgG1-TM(0.5nM)(在室温下1小时)。
在Abet0380-GL IgG1-TM和这些Aβ肽之间的孵育之后，添加N-末端生物素Aβ1-42(1.5nM)，随后添加铕穴状化合物标记的抗-人Fc抗体(0.8nM)(CisBio目录号61HFCKLB)和链霉亲和素-XLent！(5nM)(CisBio目录号611SAXLB)。然后在室温下将该测定孵育另外2小时，之后使用标准均相时间分辨荧光(HTRF)读数方案在Envision板读取器(珀金埃尔默)上读数。在不存在竞争的情况下，然后归因于该铕穴状化合物供体和XL665受体荧光团，可以通过时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)测量N-末端生物素Aβ1-42与Abet0380-GL IgG1-TM(分别于具有链霉亲和素-XLent！和铕穴状化合物标记的抗-人Fc抗体的复合体中)之间的相互作用。测试肽对Abet0380-GL IgG1-TM：N-末端生物素Aβ1-42相互作用形成的竞争因此导致测定信号的减少。结果表示为％特异性结合，其中100％特异性结合源自于包含链霉亲和素-XLent！(5nM)、N-末端生物素Aβ1-42(1.5nM)、Abet0380-GL IgG1-TM(0.5nM)&铕穴状化合物标记的抗-人Fc抗体(0.8nM)的孔。0％特异性结合源自于其中去掉了Abet0380-GLIgG1-TM的孔。
最终测定体积是20μl并且所有试剂是在包括MOPS pH 7.4(50mM)、氟化钾(0.4M)、tween 20(0.1％)&无脂肪酸BSA(0.1％)的测定缓冲液中制备的。该测定在低容积384孔黑色板(科斯塔尔3676)中进行。
总之，在采用Aβ1-42、Aβ1-43、Aβ17-42、Aβ焦-3-42&Aβ焦-11-42的情况下观察到Abet0380-GL IgG1-TM：N-末端生物素Aβ1-42结合受到抑制，针对此组具有从10-8至10-9摩尔变化的IC50值。在采用Aβ1-16或Aβ12-28的情况下观察到Abet0380-GL IgG1-TM：N-末端生物素Aβ1-42结合未受到抑制(图18)。
实例7：在标准大鼠PK-PD研究中抗体Abet0144-GL隔绝β淀粉样蛋白1-42的能力
在标准大鼠PK-PD研究中研究了抗体Abet0144-GL隔绝β淀粉样蛋白1-42的能力。向大鼠每周静脉内给予Abet0144-GL(10或40mg/kg)或运载体持续2周(在第0和7天)，并在第二次给药之后一周将其处死。在CSF上采集游离和总β淀粉样蛋白1-42的样品，并且在大脑上采集总β淀粉样蛋白1-42测量的样品。使用上述测定测量游离和总β淀粉样蛋白1-42水平。
如在图19中所述，CSF中的游离β淀粉样蛋白1-42未被10或40mg/kg的Abet0144-GL显著改变(当与运载体对比时分别是5％和18％增加)(图19)。CSF中的总β淀粉样蛋白1-42被显著增加，10mg/kg的情况下增加38％并且40mg/kg的情况下增加139％。大脑组织中的总β淀粉样蛋白1-42也被显著增加，在10和40mg/kg的情况下分别增加16％和50％。总之，在标准大鼠中来自此研究的数据证明，Abet0144-GL在增加了CSF和大脑中的总β淀粉样蛋白1-42水平的同时，对CSF中的游离β淀粉样蛋白1-42水平不具有显著影响。这是从对几十nM的范围的靶标的具有亲和力的抗体预期的特征曲线。
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Gly
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Gly
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<223> Abet0323b
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Gly
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5 10 15
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Gly
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ccagggaaag ggctggagtg ggtctcagtt attggtgtgg ggaccaagaa catcgcctac 180
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ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagagtgg 300
atggaccact cccgccccta ctactactac ggtatggacg tctggggaca ggggaccctg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 344
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0377
<400> 344
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Glu Gln
20 25 30
Thr Leu Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Gly Val Gly Thr Lys Asn Ile Ala Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 345
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0377
<400> 345
Glu Gln Thr Leu Trp
5
<210> 346
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0377
<400> 346
Val Ile Gly Val Gly Thr Lys Asn Ile Ala Tyr Ala Asp Thr Val Lys
5 10 15
Gly
<210> 347
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0377
<400> 347
Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
5 10 15
<210> 348
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0377
<400> 348
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn
20 25 30
<210> 349
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0377
<400> 349
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
5 10
<210> 350
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0377
<400> 350
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 351
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0377
<400> 351
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 352
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> Abet0377
<400> 352
tcgtacgagt tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc caggacagac ggccagcatc 60
acctgctctg gacataacac cgagcacaag tggatctcgt ggtatcaaca gaagccaggc 120
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gatgaggctg actattactg ttcgtcccag gacacggtga ctcgagtgtt cggcggaggg 300
accaagctga ccgtccta 318
<210> 353
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0377
<400> 353
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly His Asn Thr Glu His Lys Trp Ile
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Ala Thr
50 55 60
Asn Ser Gly His Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Thr
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Gln Asp Thr Val Thr Arg Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
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<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0377
<400> 354
Ser Gly His Asn Thr Glu His Lys Trp Ile Ser
5 10
<210> 355
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0377
<400> 355
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser
5
<210> 356
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0377
<400> 356
Ser Ser Gln Asp Thr Val Thr Arg Val
5
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<211> 22
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0377
<400> 357
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys
20
<210> 358
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0377
<400> 358
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
5 10 15
<210> 359
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0377
<400> 359
Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Ala Thr Asn Ser Gly His Thr Ala Thr
5 10 15
Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Thr Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 360
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0377
<400> 360
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
5 10
<210> 361
<211> 375
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> Abet0378
<400> 361
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cccctttgag accgacatca tgtggtgggt ccgccaggct 120
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ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagagtgg 300
atggaccact cccgccccta ctactactac ggtatggacg tctgggggca ggggaccctg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 362
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0378
<400> 362
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Glu Thr Asp
20 25 30
Ile Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Gly Thr Asn Thr Asp Asn Val Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0378
<400> 363
Thr Asp Ile Met Trp
5
<210> 364
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0378
<400> 364
Val Ile Gly Thr Asn Thr Asp Asn Val Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys
5 10 15
Gly
<210> 365
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0378
<400> 365
Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
5 10 15
<210> 366
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0378
<400> 366
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Glu
20 25 30
<210> 367
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0378
<400> 367
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
5 10
<210> 368
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0378
<400> 368
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 369
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0378
<400> 369
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 370
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> Abet0378
<400> 370
tcgtacgagt tgacccagcc accctcagtg tccgtgtccc caggacagac ggccagcatc 60
acctgctctg gacataactt ggaagataaa tttgcttcct ggtatcaaca gaagccaggc 120
cagtcccctg tcctggtcat ctatcgagat gacaagcggc cctcagggat ccctgagcga 180
ttctctgcct ccaactctgg gcacactgcc actctgacca tcagcgggac ccaggctacg 240
gatgaggctg actattactg ctcgtcctag gacacggtga ctcgggtgtt cggcggaggg 300
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<210> 371
<211> 89
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0378 VL蛋白质序列的氨基酸1-89
<400> 371
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser
50 55 60
Asn Ser Gly His Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Thr
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser
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<210> 372
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0378
<400> 372
Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala Ser
5 10
<210> 373
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0378
<400> 373
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser
5
<210> 374
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0378轻链CDR3蛋白质序列的氨基酸4-9
<400> 374
Asp Thr Val Thr Arg Val
5
<210> 375
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0378
<400> 375
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys
20
<210> 376
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0378
<400> 376
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
5 10 15
<210> 377
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0378
<400> 377
Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser Asn Ser Gly His Thr Ala Thr
5 10 15
Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Thr Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 378
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0378
<400> 378
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
5 10
<210> 379
<211> 375
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> Abet0379
<400> 379
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<211> 125
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0379
<400> 380
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ala Glu Thr
20 25 30
Pro Leu Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Arg Leu Glu Trp Val
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65 70 75 80
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100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0379
<400> 381
Glu Thr Pro Leu Trp
5
<210> 382
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0379
<400> 382
Val Ile Gly Ser Asn Gln Asn Lys Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys
5 10 15
Gly
<210> 383
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0379
<400> 383
Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
5 10 15
<210> 384
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0379
<400> 384
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ala
20 25 30
<210> 385
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0379
<400> 385
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Arg Leu Glu Trp Val Ser
5 10
<210> 386
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0379
<400> 386
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr Leu Gln
5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 387
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0379
<400> 387
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 388
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> Abet0379
<400> 388
cagagcgtct tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc caggacagac ggccagcatc 60
acctgctctg gacataactt ggaagataaa tttgcttcct ggtatcaaca gaagtcaggc 120
cagtcccctg tcctggtcat ctatcgagat gacaagcggc cctcagggat ccctgagcga 180
ttctctgcct ccaactccgg gcacactgcc actctgacca tcagcgggac ccaggctacg 240
gatggggctg actattactg tgcgacccag gacaacttca ctcgagtgtt cggcggaggg 300
accaagctga ccgtccta 318
<210> 389
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0379
<400> 389
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser
50 55 60
Asn Ser Gly His Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Thr
65 70 75 80
Asp Gly Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Gln Asp Asn Phe Thr Arg Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 390
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0379
<400> 390
Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala Ser
5 10
<210> 391
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0379
<400> 391
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser
5
<210> 392
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0379
<400> 392
Ala Thr Gln Asp Asn Phe Thr Arg Val
5
<210> 393
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0379
<400> 393
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys
20
<210> 394
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0379
<400> 394
Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
5 10 15
<210> 395
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0379
<400> 395
Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser Asn Ser Gly His Thr Ala Thr
5 10 15
Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Thr Asp Gly Ala Asp Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 396
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0379
<400> 396
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
5 10
<210> 397
<211> 375
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> Abet0380
<400> 397
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctatggg caacttcaac taccagacta tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccagggaggg ggctggagtg ggtctcagtt attggtaaga ccaacgagaa catcgcctac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagagtgg 300
atggaccact cccgccccta ctactactac ggtatggacg tctgggggca ggggaccctg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 398
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0380
<400> 398
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Met Gly Asn Phe Asn Tyr Gln
20 25 30
Thr Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Gly Lys Thr Asn Glu Asn Ile Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 399
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0380
<400> 399
Tyr Gln Thr Met Trp
5
<210> 400
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0380
<400> 400
Val Ile Gly Lys Thr Asn Glu Asn Ile Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys
5 10 15
Gly
<210> 401
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0380
<400> 401
Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
5 10 15
<210> 402
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0380
<400> 402
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Met Gly Asn Phe Asn
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<210> 403
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<223> Abet0380
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Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
5 10 15
<210> 521
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0377-GL
<400> 521
Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser Asn Ser Gly His Thr Ala Thr
5 10 15
Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 522
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0377-GL
<400> 522
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
5 10
<210> 523
<211> 375
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> Abet0380-GL
<400> 523
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctatggg caacttcaac taccagacta tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt attggtaaga ccaacgagaa catcgcctac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagagtgg 300
atggaccact cccgccccta ctactactac ggtatggacg tctgggggca ggggaccctg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 524
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0380-GL
<400> 524
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Met Gly Asn Phe Asn Tyr Gln
20 25 30
Thr Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Gly Lys Thr Asn Glu Asn Ile Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 525
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0380-GL
<400> 525
Tyr Gln Thr Met Trp
5
<210> 526
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0380-GL
<400> 526
Val Ile Gly Lys Thr Asn Glu Asn Ile Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys
5 10 15
Gly
<210> 527
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0380-GL
<400> 527
Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
5 10 15
<210> 528
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0380-GL
<400> 528
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Met Gly Asn Phe Asn
20 25 30
<210> 529
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0380-GL
<400> 529
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
5 10
<210> 530
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0380-GL
<400> 530
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 531
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0380-GL
<400> 531
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 532
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> Abet0380-GL
<400> 532
tcgtacgagt tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc caggacagac ggccagcatc 60
acctgctctg gacataactt ggaagataaa tttgcttcct ggtatcaaca gaagccaggc 120
cagtcccctg tcctggtcat ctatcgagat gacaagcggc cctcagggat ccctgagcga 180
ttctctgcct ccaactctgg gcacactgcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240
gatgaggctg actattactg ttcgtcccag gacacggtga ctcgagtgtt cggcggaggg 300
accaagctga ccgtccta 318
<210> 533
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0380-GL
<400> 533
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser
50 55 60
Asn Ser Gly His Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Gln Asp Thr Val Thr Arg Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 534
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0380-GL
<400> 534
Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala Ser
5 10
<210> 535
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0380-GL
<400> 535
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser
5
<210> 536
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0380-GL
<400> 536
Ser Ser Gln Asp Thr Val Thr Arg Val
5
<210> 537
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0380-GL
<400> 537
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys
20
<210> 538
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0380-GL
<400> 538
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
5 10 15
<210> 539
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0380-GL
<400> 539
Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser Asn Ser Gly His Thr Ala Thr
5 10 15
Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 540
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0380-GL
<400> 540
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
5 10
<210> 541
<211> 375
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 541
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgaggctc 60
tcctgtgcag cctctggatt ccactttacc aactccatca tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt attggtagcg aggcgcaccg cgtcacgtac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagagtgg 300
atggaccact cccgccccta ctactactac ggtatggacg tctgggggca ggggaccctg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 542
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 542
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe His Phe Thr Asn Ser
20 25 30
Ile Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Gly Ser Glu Ala His Arg Val Thr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 543
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 543
Asn Ser Ile Met Trp
5
<210> 544
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 544
Val Ile Gly Ser Glu Ala His Arg Val Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
5 10 15
Gly
<210> 545
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 545
Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
5 10 15
<210> 546
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 546
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe His Phe Thr
20 25 30
<210> 547
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 547
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
5 10
<210> 548
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 548
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 549
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 549
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 550
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 550
tcgtacgagt tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc caggacagac ggccagcatc 60
acctgctctg gacataactt ggaagataaa tttgcttcct ggtatcaaca gaagccaggc 120
cagtcccctg tcctggtcat ctatcgagat gacaagcggc cctcagggat ccctgagcga 180
ttctctgcct ccaactctgg gcacactgcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240
gatgaggctg actattactg ttcgtcccag gacacggtga ctcgagtgtt cggcggaggg 300
accaagctga ccgtccta 318
<210> 551
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 551
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser
50 55 60
Asn Ser Gly His Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Gln Asp Thr Val Thr Arg Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 552
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 552
Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala Ser
5 10
<210> 553
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 553
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser
5
<210> 554
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 554
Ser Ser Gln Asp Thr Val Thr Arg Val
5
<210> 555
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 555
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys
20
<210> 556
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 556
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
5 10 15
<210> 557
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 557
Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser Asn Ser Gly His Thr Ala Thr
5 10 15
Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 558
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 558
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
5 10
<210> 559
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人
<400> 559
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 560
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人
<400> 560
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 561
<211> 40
<212> PRT
<213> 智人
<400> 561
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
35 40
<210> 562
<211> 40
<212> PRT
<213> 智人
<400> 562
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
35 40
<210> 563
<211> 42
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 563
Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 564
<211> 42
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 564
Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 565
<211> 42
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 565
Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 566
<211> 40
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 566
Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
35 40
<210> 567
<211> 40
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 567
Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
35 40
<210> 568
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 生物素化的乱序β淀粉样蛋白1-42肽
<400> 568
Ala Ile Ala Glu Gly Asp Ser His Val Leu Lys Glu Gly Ala Tyr Met
1 5 10 15
Glu Ile Phe Asp Val Gln Gly His Val Phe Gly Gly Leu Ile Phe Arg
20 25 30
Val Val Asp Leu Gly Ser His Asn Val Ala
35 40
<210> 569
<211> 43
<212> PRT
<213> 智人
<400> 569
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr
35 40
<210> 570
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 570
Lys Lys Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile
1 5 10 15
Ala
<210> 571
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 571
Lys Lys Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
1 5 10 15
<210> 572
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 572
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
<210> 573
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 573
Glu Val Arg His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu
1 5 10
<210> 574
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 574
Val Arg His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn
1 5 10 15
Lys
<210> 575
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 575
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
1 5 10 15
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
20 25
<210> 576
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 576
Glu Val Arg His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser
1 5 10 15
Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
20 25 30
<210> 577
<211> 40
<212> PRT
<213> 智人
<400> 577
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val
1 5 10 15
Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu
20 25 30
Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 578
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Abet0378 VL 蛋白质序列的氨基酸91-106
<400> 578
Asp Thr Val Thr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
1 5 10 15

Claims (16)

1.相对于人β淀粉样蛋白1-40肽（Aβ1-40），更选择性地结合人β淀粉样蛋白1-42肽（Aβ1-42）的分离的抗体分子，其中所述抗体分子包括
(i)VH域，该VH域包括以下HCDR：
HCDR1 SEQ ID NO：525，
HCDR2 SEQ ID NO：526，以及
HCDR3 SEQ ID NO：527，和
(ii)VL域，该VL域包括以下LCDR：
LCDR1 SEQ ID NO：534
LCDR2 SEQ ID NO：535，以及
LCDR3 SEQ ID NO：536；和
其中VL域在对应SEQ ID NO:533的80位的氨基酸位点是甲硫氨酸。
2. 如权利要求1所述的分离的抗体分子，其中VH域在对应SEQ ID NO:524的43位的氨基酸位点是赖氨酸。
3.如权利要求1或2所述的抗体分子，其中该抗体分子以500 pM的解离常数（KD）结合可溶性单体人Aβ1-42。
4. 如权利要求1或2所述的抗体分子，其中该抗体分子以500 pM的解离常数（KD）结合高达五聚体的人Aβ1-42。
5.如权利要求1或2所述的抗体分子，其中该抗体分子不结合Aβ1-40或以大于1 mM的KD结合Aβ1-40。
6.如权利要求1或2所述的分离的抗体分子，其中该抗体分子是单克隆抗体。
7.如权利要求1或2所述的抗体分子，其中所述抗体分子是scFv。
8.如权利要求1或2所述的抗体分子，其中所述抗体分子是Fab。
9.包括可接受量的如权利要求1-8中任一项所述的抗体分子和药学上可接受的赋形剂的组合物，所述组合物用于治疗与β淀粉样蛋白相关联的病况。
10.如权利要求9所述的组合物，该组合物用于治疗阿尔茨海默病；改善认知或减少阿尔茨海默病或唐氏综合征患者中的认知减退。
11.如权利要求9所述的组合物，该组合物用于治疗淀粉样变性。
12.对如权利要求1所述的抗体分子进行编码的分离的核酸。
13.在体外用如权利要求12所述的核酸转化的宿主细胞，用于产生权利要求1所述的抗体。
14.产生如权利要求1至8中任一项所述的抗体分子的方法，该方法包括在用于产生该抗体分子的条件下培养如权利要求13所述的宿主细胞。
15.如权利要求14所述的方法，进一步包括对该抗体分子进行分离和/或纯化。
16.如权利要求14所述的方法，进一步包括将该抗体分子配制成包含至少一种另外组分的一种组合物。
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