BR112015008347B1

BR112015008347B1 - Molécula de anticorpo, uso de dita molécula de anticorpo, composição para uso no tratamento de uma doença associada com betaamilóide, uso de uma composição, ácido nucleico, célula hospedeira e método para produção de uma molécula de anticorpo

Info

Publication number: BR112015008347B1
Application number: BR112015008347-1A
Authority: BR
Inventors: Maria Groves; Suzanne Gustavsson; Kina Höglund; David Lowne; Chris Lloyd; Adrian Nickson; Camiilla Niva; Sylvia Simon
Original assignee: Medimmune Limited
Priority date: 2012-10-15
Filing date: 2013-10-15
Publication date: 2023-12-26
Also published as: CN110294804A; HUE051127T2; RU2651486C2; US10662239B2; ME03751B; JP2022025078A; MX370725B; KR20210125587A; EP2906597A1; MX2015004763A; JP7301924B2; ES2802873T3; AU2020256414A1; AU2018256498B2; AU2020256414B2; PT2906597T; CN105164156A; LT2906597T; CA2888322A1; BR112015008347A2

Abstract

molécula de anticorpo isolada, uso de dita molécula de anticorpo, composição, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, métodos para produção de uma mólecula de anticorpo, para produzir um domínio de ligação de antígeno ao anticorpo para a(beta)1-42 humano e para produzir um membro de ligação que se liga a a(beta)1-42 humana. anticorpos para beta-amilóides humanos. o anticorpo liga-se seletivamente ao péptido beta-amilóide 42 humano em relação ao péptido 40. anticorpos específicos para a beta-amilóide 42, como agentes terapêuticos, para a ligação ao péptido beta-amilóide 42 e o tratamento de condições associadas com amiloidose, tal como a doença de alzheimer.

Description

Área da Invenção

[001] Esta invenção refere-se a anticorpos que se ligam ao peptídeo beta-amilóide 1-42 e seus N-terminais truncados, coletivamente referidos como peptídeos Aβn-42, em que n é 1 a 29. Refere-se a anticorpos que são seletivos na ligação para o peptídeo beta-amilóide n-42 em relação ao peptídeo beta-amilóide 1-40. A invenção também se refere à utilização de anticorpos anti-Aβn-42 para o tratamento de condições associadas com a amiloidose, incluindo a doença de Alzheimer.

Antecedentes

[002] A doença de Alzheimer (DA) é caracterizada pelo agravamento da disfunção cognitiva, afetando a memória, que debilita o funcionamento social e ocupacional do paciente. A doença degenerativa provoca a perda de células nervosas no cérebro, o que provoca dificuldades cognitivas com a linguagem e o alto funcionamento, tais como julgamento, planejamento, organização e raciocínio, o que pode levar a mudanças de personalidade. As fases finais da doença são caracterizadas por uma perda completa do funcionamento independente.

[003] Histologicamente, DA (esporádica e familiar) é definida pela presença de emaranhados neurofibrilares intracelulares (NFT's) e placas extracelulares. As placas são agregados do peptídeo β-amilóide (Aβ) derivadas da clivagem aberrante da proteína precursora de amilóide (APP), uma proteína transmembranar encontrada nos neurônios e astrócitos no cérebro. Os depósitos Aβ também são encontrados nos vasos sanguíneos de pacientes com DA.

[004] Os neurônios colinérgicos são particularmente vulneráveis para DA e o consequente declínio do neurotransmissor afeta os outros sistemas de neurotransmissores. Outros sintomas da doença incluem estresse oxidativo, inflamação e apoptose neuronal (morte celular programada). No paciente com DA, a morte celular neuronal extensiva leva ao declínio cognitivo e à eventual morte do paciente. (Younkin, 1995; Borchelt et al., 1996; Selkoe, 1999).

[005] Os tratamentos atuais são apenas sintomáticos e são vistos como minimamente eficazes, com pequenas melhoras dos sintomas por um período limitado de tempo. No entanto, acredita-se que a superprodução ou as alterações nos níveis de Aβ sejam os principais eventos na patogênese da DA esporádica e precoce. Por esta razão, Aβ tornou-se num alvo importante para o desenvolvimento de fármacos concebidos para reduzir a sua formação (Vassar et al., 1999), ou para ativar mecanismos que aceleram a sua depuração do cérebro.

[006] A hipótese cascata amilóide propõe que a produção do peptídeo Aβ afeta adversamente a função dos neurônios, levando assim à morte dos neurônios e demência na DA. Aβ é produzida a partir da proteína precursora de amilóide (APP), que é clivada sequencialmente por secretases para gerar espécies de diferentes comprimentos. O principal componente de placa é a isoforma de Aβ1-42 de 42 aminoácidos, que está envolvida na formação de oligômeros neurotóxicos e a formação de placas na patogênese de DA. Um número de isoformas de Aβ incluindo Aβ1-42, pGluAβ3-42, Aβ3-42 e 4-42 predominam no cérebro de DA, das quais a Aβ1-42 e a Aβ4-42 são as principais formas do hipocampo e do córtex de DA familiar e esporádica (Portelius et al., 2010).

[007] O terminal Aβ no resíduo 42 é um componente menor da espécie Aβ produzido por processamento de APP. Outras formas incluem Aβ1-40 e N-terminais truncados de Aβn-40. No entanto, o terminal Aβ no resíduo 42 é mais propenso a agregar e impulsiona a deposição em placas amilóides. Além de ser mais propenso a agregar, o peptídeo Aβ1-42 forma polímeros solúveis de baixo n (ou oligômeros) que foram mostrados como sendo tóxicos para os neurônios em cultura. Ao contrário dos depósitos de fibrilas conspícuas maiores, os oligômeros não são detetados em ensaios típicos de patologia. Os oligômeros com propriedades semelhantes foram isolados a partir de cérebros com DA e estes estão mais intimamente associados à progressão da doença do que as placas (Younkin, 1998; Walsh et al., 2005a; Walsh et al., 2005b).

[008] Oligômeros experimentalmente gerados aplicados a fatias de cérebro ou injetados in vivo causam falha na potenciação a longo prazo do hipocampo (LTP), que é uma forma de armazenamento de informação sináptico, bem conhecido como um paradigma para mecanismos de memória (Lambert et al., 1998;. Walsh et al., 2002;. Wang et al., 2002). Os oligômeros solúveis têm sido associados à degeneração física de sinapses (Mucke et al., 2000). A reversão de falha de memória através de anticorpos em modelos de ratos confirmou o conceito emergente que os oligômeros têm um papel importante a desempenhar na falha sináptica.

[009] A evidência genética sugere que o aumento da quantidade de Aβ1-42 e N-terminais truncados dos mesmos (Aβn-42) são produzidos em muitas, se não em todas, as condições genéticas que causam a DA familiar (Borchelt et al., 1996, Duff et al., 1996; Scheuner et al., 1996, Citron et al, 1998), apontando para a possibilidade de que a formação amilóide pode ser causada ou por aumento da geração de Aβn-42 ou pela diminuição da degradação, ou ambos (Glabe, 2000). Em particular, a DA familiar causando mutações genéticas no gene de APP e/ou no gene que codifica para o componente presenilina do complexo Y-secretase aumentou a produção de Aβ1-42 em relação ao Aβ1-40. Também foi proposto que a quantidade absoluta de peptídeos produzidos no cérebro podem ser menos importante do que a relação de peptídeos Aβ (reflectida numa proporção alterada de Aβ1-42 para Aβ1-40) para a geração de espécies tóxicas Aβ (De Strooper, 2007;. Kuperstein et al., 2010). Além disso, os modelos animais para a deposição de amilóide, ambos os ratinhos e Drosophila, sugerem que Aβ1-42 é necessária para a formação de depósitos de amilóide (Greeve et al., 2004; Iijima et al., 2004; McGowan et al., 2005).

[0010] Os resultados de um estudo de vacinação, em 2000, sugeriram possíveis novas estratégias de tratamento para a DA. O ratinho transgênico PDAPP, que sobre-expressa APP mutante humana (em que o aminoácido na posição 717 é fenilalanina em vez da normal valina), desenvolve progressivamente muitas das características neuropatológicas da DA de um modo dependente da idade e da região do cérebro. Os animais transgênicos foram imunizados com o peptídeo Aβ1-42 antes do aparecimento de neuropatologias do tipo DA (a 6 semanas de idade) ou a uma idade mais avançada (11 meses), em que a deposição de Aβ e várias alterações neuropatológicas subsequentes foram bem estabelecidas. A imunização dos animais jovens essencialmente preveniu o desenvolvimento da formação de placas, distrofia neuropática e astrogliose. O tratamento dos animais mais velhos também reduziu acentuadamente a extensão e progressão dessas neuropatologias semelhantes a DA. Foi mostrado que a imunização Aβ1-42 resultou na geração de anticorpos anti-Aβ e que as células microgliais/monocíticas Aβ imunorreativas aparecem na região das placas restantes (Schenk et al., 1999;. Schenk et al., 2000). No entanto, a abordagem de imunização ativa quando aplicada a humanos resultou em vários casos de meningoencefalite, provavelmente devido a uma resposta de células T, e foi interrompida, embora os resultados iniciais sobre a eficácia foram promissores (Orgogozo et al., 2003; Gilman et al., 2005; Pride et al., 2008).

[0011] Posteriormente, várias estratégias de vacinação passive foram investigadas. A administração periférica de anticorpos contra a Aβ foi suficiente para reduzir a carga amilóide (Bard et al., 2000). Apesar dos níveis séricos de anticorpos relativamente modestos, obtidos nestas experiências, os anticorpos administrados passivamente foram capazes de atravessar a barreira sangue-cérebro e entrar no sistema nervoso central, decorar as placas e induzir a depuração de amilóide pré-existente. Numa comparação entre um anticorpo específico de Aβ1-40, um anticorpo específico de Aβ1-42 e um anticorpo dirigido para os resíduos 1-16 de Aβ, foi mostrado que todos os anticorpos reduzem a acumulação de Aβ no cérebro do rato (Levites et al., 2006).

[0012] Mais recentemente, tem sido sugerido que a penetração do SNC é a via mais provável para a depuração eficaz de Aβ para anticorpos administrados passivamente (Golde et al., 2009). No entanto, para além dos anticorpos que são capazes de atravessar a barreira sangue-cérebro, a hipótese dissipadora foi proposta como um possível mecanismo de ação.

[0013] A hipótese dissipadora estabelece que Aβ pode ser removida do SNC indiretamente através da redução da concentração do peptídeo no plasma. Nas experiências que descrevem este facto, foi usado um anticorpo que se liga a Aβ no plasma e, consequentemente, sequestra Aβ do SNC. Tal foi realizado porque o anticorpo impede o influxo de Aβ a partir do plasma de SNC e/ou altera o equilíbrio entre o plasma e o SNC devido a uma diminuição da concentração de Aβ livre no plasma (DeMattos et al., 2001). Tem sido demonstrados que os agentes de ligação amilóides não relacionados com anticorpos também são eficazes na remoção de Aβ a partir do SNC por meio da ligação no plasma. Foi mostrado que dois agentes ligantes Aβ, gelsolina e GM1, que sequestram plasma Aβ reduzem ou previnem a amiloidose cerebral (Matsuoka et al., 2003).

[0014] No que diz respeito à segurança, uma característica patogênica na DA é angiopatia amilóide cerebral (CAA), onde há uma substituição das células do músculo liso vascular com Aβ, principalmente Aβ1-40, nas paredes das artérias cerebrais (Weller et al., 2003). Foi mostrado que o tratamento de pacientes com DA com anticorpos pan-Aβ leva a micro-hemorragias, refletindo a remoção de Aβ das paredes do vaso (Wilcock et al., 2009) que podem ser prejudiciais para os pacientes. Uma maneira de contorná-la tem sido a geração de anticorpos de-glicosilados que podem reduzir os mecanismos de depuração, contribuindo para micro-hemorragias e/ou reduzindo a taxa pela qual Aβ é depurada dos depósitos vasculares, evitando a saturação das vias de efluxo (Wilcock et al., 2006).

[0015] O direcionamento das espécies petídicas n-42β com um anticorpo específico Aβ42 teria como alvo a espécie que é o composto peptídeo chave no cérebro com DA e o controlador da formação de placa. Um anticorpo com uma especificidade primária para o monócero n-42 e um baixo número de espécies oligoméricas, não só esgotam estas espécies, mas também poderiam impedir a acumulação de outras espécies oligoméricas, mostrados como sendo tóxicos para os neurônios.

Sumário da Invenção

[0016] Esta invenção refere-se a anticorpos totalmente humanos que são específicos para Aβ1-42 e N-terminais truncados dos mesmos e se ligam a um epítopo entre os aminoácidos 29-42 do peptídeo Aβ42. Os anticorpos de acordo com esta invenção podem ser utilizados para o tratamento preventivo e/ou terapêutico de condições associadas com beta-amilóide, tais como DA, que inclui a deterioração cognitiva ligeira (MCI), devido à DA, e síndrome de Down.

[0017] A invenção refere-se à utilização de anticorpos totalmente humanos para suprimir as isoformas de um peptídeo Aβ (n-42) no plasma, cérebro e fluido cerebrospinal (CSF) para prevenir ou reverter a acumulação de deposição de isoformas Aβ n-42 dentro do cérebro e vasculatura cerebral e melhorar a cognição.

[0018] Aqui descrita encontra-se a produção de anticorpos totalmente humanos para os peptídeos Aβ n-42, que reconhecem monômeros e formas oligoméricas de baixo n (até e incluindo pentâmero) de Aβ n-42 e são epítopo mapeado para uma região que abrange os aminoácidos 17-42 no peptídeo Aβ42, mais especificamente a uma região que abrange os aminoácidos 29 a 42 no peptídeo Aβ42.

[0019] Os anticorpos de acordo com a invenção são específicos para espécies Aβ n-42 (em que n é um número inteiro na gama de 1 a 29) e, assim, pode ser esperado que reduza seletivamente o principal fator de progressão da DA. Os anticorpos de acordo com a invenção são eficazes na ligação Aβ42 (não Aβ40) no plasma humano, cérebro e fluido cerebrospinal (CSF), levando a um aumento da depuração de Aβ isoformas n-42 do cérebro. Os anticorpos de acordo com a invenção também são eficazes na redução da ligação de agregados solúveis de Aβ42 a neurônios e, portanto, a porção do anticorpo que entra no cérebro terá um efeito sobre a saúde dos neurônios.

[0020] São aqui descritos, potentes anticorpos de afinidade elevada, incluindo um anticorpo com um KD de 320 pM para o monômero. Essa elevada afinidade pode permitir a supressão eficaz de Aβ n-42 para níveis que permitam a prevenção e modificação de DA.

[0021] Os níveis de espécies solúveis Aβ40 e Aβ42 podem ser detectados no cérebro, CSF e sangue com ensaios padronizados utilizando anticorpos dirigidos contra epítopos do peptídeo Aβ. Como se mostra num rato PK:PD aqui descrito, uma supressão dependente da dose de Aβ42 livre foi observada no CSF de ratos após a administração periférica de anticorpo. Também é demonstrado um aumento dependente da dose em Aβ42 total no cérebro de ratos com efeito negligenciável sobre o peptídeo Aβ40.

[0022] Assim, são aqui descritos anticorpos que têm a capacidade de penetrar no cérebro (0,1 % do total da administração periférica no CSF) e, especificamente, suprimir as espécies-chave tóxicas Aβ42 (não Aβ40) no CSF.

[0023] A especificidade e mecanismo de ação dos anticorpos de acordo com a invenção pode permitir tanto o tratamento profilático e terapêutico de um certo número de doenças associadas a uma acumulação de amilóide, que se acumula dentro dos órgãos do corpo, incluindo diferentes fases do processo da doença DA: prodômico, DA leve e moderada, síndrome de Down, bem como a degeneração macular.

[0024] Os anticorpos de acordo com a invenção podem ter a capacidade de inversão do declínio cognitivo, tratar o declínio cognitivo e prevenir o declínio cognitivo em doentes diagnosticados com prodômico, DA leve a moderada e síndrome de Down.

[0025] Por conseguinte, um primeiro aspeto da presente invenção refere-se a membros de ligação para Aβ1-42 humano, especialmente moléculas de anticorpo.

[0026] Membros de ligação, por exemplo, moléculas de anticorpo, de acordo com a invenção podem ter qualquer ou todas as seguintes propriedades: - A ligação a Aβ1-42 monomérica humana solúvel e/ou Aβ1-42 oligomérica; - Seletividade na ligação Aβ1-42 em relação a Aβ1-40. Podem mostrar nenhuma ligação a Aβ1-40, ou a ligação pode ser desprezável. Por exemplo, moléculas de anticorpo de acordo com a invenção podem ligar-se a Aβ1-42 monomérica com uma constante de dissociação (Kd) de 500 pM ou menos. Podem não ligar-se a Aβ1-40, ou podem ligar-se a Aβ1-40 com um Kd maior do que 1 mM; - Ligação a Aβ17-42 humano. Por conseguinte, a molécula de anticorpo pode reconhecer um epítopo entre os aminoácidos 17-42 do peptídeo Aβ1-42, mais especificamente a molécula de anticorpo pode reconhecer um epítopo entre os aminoácidos 29-42 do peptídeo Aβ1-42; - A ligação ao 3piro-42 monomérico humano solúvel (piroglutamato 3) e 11piro-42 (piroglutamato 11) - Ligação a Aβ1-43 humana; e - A reação cruzada com Aβ1-42 de murino.

[0027] Um membro de ligação pode compreender um conjunto de HCDRs e/ou um conjunto de LCDRs de uma molécula de anticorpo como aqui descrito. Exemplos de moléculas de anticorpo de acordo com a invenção compreendem um domínio VH que contém um conjunto de HCDRs (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e um domínio VL que contém um conjunto de LCDRs (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), onde HCDRs e LCDRs são as HCDRs e LCDRs, respectivamente, de qualquer um dos anticorpos Abet0380, Abet0007, Abet0144, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0344, Abet0368, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 e Abet0383, ou uma versão GL dos mesmos, cujas sequências são apresentadas na listagem de sequências anexa. A correspondência entre as moléculas de anticorpo e as sequências identificadoras na listagem de sequências é indicada na Tabela 16.

[0028] Uma molécula de anticorpo para Aβ1-42 humano pode compreender (i) um domínio VH que compreende um conjunto de HCDRs: HCDR1, HCDR2 e HCDR3, intercaladas com regiões de estrutura, em que as sequências de aminoácidos do conjunto de HCDRs são como mostrados na Tabela 16 para qualquer um dos anticorpos Abet0380, Abet0007, Abet0144, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332 , Abet0342, Abet0343, Abet0344, Abet0368, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 e Abet0383 ou uma versão GL do mesmo, ou pode compreender esse conjunto de HCDRs com uma ou duas mutações de aminoácidos; e (ii) um domínio VL que compreende um conjunto de LCDRs: LCDR1, LCDR2 e LCDR3, intercaladas com regiões de estrutura, em que as sequências de aminoácidos do conjunto de LCDRs são como mostrados na Tabela 16 para qualquer um dos anticorpos Abet0380, Abet0007, Abet0144, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332 , Abet0342, Abet0343, Abet0344, Abet0368, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 e Abet0383, ou uma versão GL do mesmo, ou pode compreender esse conjunto de LCDRs com uma ou duas mutações de aminoácidos.

[0029] Uma molécula de anticorpo, de acordo com a invenção pode compreender (i) um domínio VH que compreende Abet0380 ou conjunto de HCDRs, Abet0380 GL, em que as sequências de aminoácidos HCDRs Abet0380 são HCDR1 SEQ ID NO: 525, HCDR2 SEQ ID NO: 526, e HCDR3 SEQ ID NO: 527, ou pode compreender Abet0380 ou o conjunto de HCDRs, Abet0380 GL, com uma ou duas mutações de aminoácidos, e (ii) um domínio VL que compreende Abet0380 ou conjunto de LCDRs, Abet0380 GL, em que as sequências de aminoácidos LCDRs Abet0380 são LCDR1SEQ ID NO: 534 LCDR2SEQ ID NO: 535, e LCDR3SEQ ID NO: 536, ou pode compreender Abet0380 ou o conjunto de LCDRs, Abet0380 GL, com uma ou duas mutações de aminoácidos.

[0030] A molécula de anticorpo pode compreender (i) um domínio VH que compreende um conjunto de HCDRs: HCDR1, HCDR2 e HCDR3, intercaladas com regiões de estrutura, em que as sequências de aminoácidos dos HCDRs são HCDR1SEQ ID NO: 525, HCDR2 SEQ ID NO: 526, e HCDR3 SEQ ID NO: 527, ou pode compreender o conjunto de HCDRs com uma ou mais substituições de aminoácidos, em que uma ou mais substituições selecionadas a partir das mostradas na Tabela 12 ou na Tabela 14; e (ii) um domínio VL que compreende um conjunto de LCDRs: LCDR1, LCDR2 e LCDR3, intercaladas com regiões de estrutura, em que as sequências de aminoácidos dos LCDRs são LCDR1SEQ ID NO: 534 LCDR2SEQ ID NO: 535, e LCDR3SEQ ID NO: 536, ou pode compreender o conjunto de LCDRs com uma ou mais substituições de aminoácidos, em que uma ou mais substituições selecionadas a partir das mostradas na Tabela 13 ou na Tabela 15.

[0031] O domínio VH da molécula de anticorpo pode compreender uma região FW1 no qual os resíduos de aminoácidos nas posições de Kabat 26-30 são selecionados de entre os apresentados na Tabela 14.

[0032] O domínio VH da molécula de anticorpo pode compreender regiões estruturais da cadeia pesada FW1, FW2, FW3 e FW4, em que as sequências de aminoácidos das regiões de estrutura de cadeia pesada são FW1 SEQ ID NO: FW2 SEQ ID NO: FW3 SEQ ID NO: 530, e FW4 SEQ ID NO: ou em que FW1 compreende a SEQ ID NO: 528 com uma ou mais substituições de aminoácidos, em que uma ou mais substituições em FW1 são selecionadas a partir das mostradas na Tabela 12 ou na Tabela 14.

[0033] O domínio VL da molécula de anticorpo pode compreender regiões estruturais da cadeia leve FW1, FW2, FW3 e FW4, em que as sequências de aminoácidos das regiões de estrutura de cadeia leve são FW1 SEQ ID NO: FW2 SEQ ID NO: FW3 SEQ ID NO: 539, e FW4 SEQ ID NO:

[0034] Uma molécula de anticorpo, de acordo com a invenção pode compreender (i) uma sequência de aminoácidos do domínio VH como apresentado na Tabela 16 para qualquer um dos Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 e Abet0382, ou uma versão GL dos mesmos, ou pode compreender essa sequência de aminoácidos com uma ou duas mutações de aminoácidos; e (ii) uma sequência de aminoácidos do domínio VL como apresentado na Tabela 16 para qualquer um dos Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 e Abet0382, ou uma versão GL dos mesmos, ou pode compreender essa sequência de aminoácidos com uma ou duas mutações de aminoácidos.

[0035] Uma molécula de anticorpo, de acordo com a invenção, pode compreender um domínio VH que tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 85% idêntica a SEQ ID NO: 524 e um domínio VL tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 85% idêntica a SEQ ID NO: 533, em que o domínio VH: aminoácido 26 é M, G ou S; aminoácido 27 é G, F ou D; aminoácido 28 é N, T, D ou H, aminoácido 29 é F; aminoácido 30 é N, S, K, ou P, aminoácido 31 é Y, V, R, E, ou T; aminoácido 32 é Q, Y, D, S, ou E; aminoácido 33 é T, P, I, ou V; aminoácido 34 é M; aminoácido 35 é W; aminoácido 50 é V; aminoácido 51 é I; aminoácido 52 é G; aminoácido 52a é K, S, ou A; aminoácido 53 é T, S, N, D, G, ou Q; aminoácido 54 é N, G, T, ou aminoácido 55 é E, G, N, K, ou aminoácido 56 é N, T, R, ou aminoácido 57 é I, T, K, ou V; aminoácido 58 é A, V, ou T; aminoácido 59 é Y; aminoácido 60 é A; aminoácido 61 é D; aminoácido 62 é S; aminoácido 63 é V; aminoácido 64 é K; aminoácido 65 é G; aminoácido 95 é E; aminoácido 96 é W; aminoácido 97 é M aminoácido 98 é D; aminoácido 99 é H; aminoácido 100 é S; aminoácido 100a é R; aminoácido 100b é P; aminoácido 100c é Y; aminoácido 100d é Y; aminoácido 100e é Y; aminoácido 100f é Y; aminoácido 100g é G; aminoácido 100h é M; aminoácido 101 é D; aminoácido 102 é V; e em que o domínio VL: aminoácido 24 é S; aminoácido 25 é G; aminoácido 26 é H; aminoácido 27 é N; aminoácido 28 é L, ou I; aminoácido 29 é E, ou G; aminoácido 30 é D; aminoácido 31 é K; aminoácido 32 é F, ou W; aminoácido 33 é A, ou V; aminoácido 34 é S; aminoácido 50 é R; aminoácido 51 é D; aminoácido 52 é D; aminoácido 53 é K; aminoácido 54 é R; aminoácido 55 é P; aminoácido 56 é S; aminoácido 89 é S, ou Q; aminoácido 90 é S, ou A; aminoácido 91 é Q; aminoácido 92 é D; aminoácido 93 é T, ou S; aminoácido 94 é V, ou T; aminoácido 95 é T; aminoácido 96 é R; aminoácido 97 é V.

[0036] Uma molécula de anticorpo, de acordo com a invenção, pode compreender um domínio VH que tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 85% idêntica a SEQ ID NO: 524 e um domínio VL tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 85% idêntica a SEQ ID NO: 533, em que o domínio VH: aminoácido 26 é M, G, S, V, A, N, T, ou H; aminoácido 27 é G, F, S, Y, E, D, ou P; aminoácido 28 é N, Q, H, V, E, T, A, S, D, M, ou P; aminoácido 29 é F, I, Y, S, L, ou W; aminoácido 30 é N, S, T, Q, K, H, R, G, P, E, K, A, ou aminoácido 31 é Y, H, K, E, N, T, R, V, P, M, F, I, D, ou aminoácido 32 é Q, Y, D, N, S, E, ou aminoácido 33 é T, P, I, ou V; aminoácido 34 é M, ou L; aminoácido 35 é W; aminoácido 50 é V; aminoácido 51 é I; aminoácido 52 é G; aminoácido 52a é K, S, P, A, N, G, E, D, V, ou T; aminoácido 53 é T, S, N, H, Q, D, G, ou aminoácido 54 é N, G, P, T, Q, E, M, K, ou aminoácido 55 é E, G, K, N, Q, T, H, D, ou aminoácido 56 é N, T, A, R, ou aminoácido 57 é I, T, N, S, K, F, Q, V, ou L; aminoácido 58 é A, V, S, T, ou N; aminoácido 59 é Y; aminoácido 60 é A; aminoácido 61 é D; aminoácido 62 é S, A, ou T; aminoácido 63 é V; aminoácido 64 é K; aminoácido 65 é G; aminoácido 95 é E; aminoácido 96 é W; aminoácido 97 é M aminoácido 98 é D, ou G; aminoácido 99 é H, ou R; aminoácido 100 é S; aminoácido 100a é R; aminoácido 100b é P; aminoácido 100c é Y; aminoácido 100d é Y; aminoácido 100e é Y; aminoácido 100f é Y; aminoácido 100g é G; aminoácido 100h é M, ou I; aminoácido 101 é D; aminoácido 102 é V, ou A; e em que o domínio VL: aminoácido 24 é S, ou T; aminoácido 25 é G, ou T; aminoácido 26 é H, R, ou P; aminoácido 27 é N, ou H; aminoácido 28 é L, I, V, F, ou T; aminoácido 29 é E, M, G, S, ou N; aminoácido 30 é D, A, S, G, ou H; aminoácido 31 é K, ou S; aminoácido 32 é F, ou W; aminoácido 33 é A, V, M, T, ou I; aminoácido 34 é S, T, ou A; aminoácido 50 é R; aminoácido 51 é D; aminoácido 52 é D; aminoácido 53 é K; aminoácido 54 é R; aminoácido 55 é P; aminoácido 56 é S; aminoácido 89 é S, Q, ou A; aminoácido 90 é S, A, ou T; aminoácido 91 é Q aminoácido 92 é D, ou G; aminoácido 93 é T, Q, S, N, ou K; aminoácido 94 é V, T, ou F; aminoácido 95 é T; aminoácido 96 é R; aminoácido 97 é V, S, ou A.

[0037] Uma molécula de anticorpo, de acordo com a invenção pode compreender: (i) um domínio VH tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos do domínio VH como apresentado na Tabela 16 para qualquer um dos Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 e Abet0382, ou uma versão GL dos mesmos, e (ii) um domínio VL tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos do domínio VL como apresentado na Tabela 16 para qualquer um dos Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 e Abet0382, ou uma versão GL dos mesmos.

[0038] A molécula de anticorpo pode compreender um domínio VH e um domínio VL, pelo menos, 90% idêntico ao domínio VH e domínio VL, respectivamente, de qualquer um dos Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 e Abet0382, ou uma versão GL dos mesmos.

[0039] A percentagem de identidade indicada de VH e/ou VL pode ser pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%.

[0040] A molécula de anticorpo pode compreender o domínio VH e um domínio VL de qualquer uma das Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 e Abet0382 ou uma versão GL dos mesmos GL.

[0041] Por exemplo, a molécula de anticorpo pode compreender sequência de aminoácidos do domínio VH Abet0380-GL, SEQ ID NO: 524 e a sequência de aminoácidos de domínio VL Abet0380-GL, SEQ ID NO: 533.

[0042] Uma molécula de anticorpo de acordo com a invenção pode ser uma que compete pela ligação a Aβ1-42 com: (i) uma molécula de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos do domínio VH, SEQ ID NO: 524 e uma sequência de aminoácidos do domínio VL de SEQ ID NO: 533, (ii) uma molécula de anticorpo codificado pelo ácido nucleico depositado com o número de acesso NCIMB 41890, 41891 ou 41892.

[0043] Uma molécula de anticorpo pode compreender um domínio VH e a domínio VL codificado por: (i) a sequência de ácido nucleico Abet0380-GL, depositada sob o número de acesso 41890; (ii) a sequência de ácido nucleico Abet0144-GL, depositada sob o número de acesso 41891; ou (iii) a sequência de ácido nucleico Abet0377-GL, depositada sob o número de acesso 41892.

[0044] A molécula de anticorpo pode compreender um domínio VH e um domínio VL compreendendo HCDRs e LCDRs, respectivamente, de um anticorpo depositado, acima mencionado. A molécula de anticorpo pode ser o anticorpo codificado pelo ácido nucleico depositado acima mencionado.

[0045] São também aqui descritas moléculas de ácido nucleico que codificam para membros de ligação de acordo com a invenção, as células hospedeiras contendo o ácido nucleico, e métodos de produção dos membros de ligação por expressão do ácido nucleico e recuperação do membro de ligação.

[0046] Outros aspectos da invenção referem-se a composições que compreendem uma molécula de anticorpo e um ou mais componentes adicionais, tais como um excipiente farmaceuticamente aceitável, e para tais composições para uso médico. As composições que compreendem membros de ligação de acordo com a presente invenção podem ser proporcionadas para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal.

[0047] Os membros de ligação aqui descritos podem ser utilizados em métodos de diagnóstico ou terapêuticos em seres humanos ou animais, por exemplo, seres humanos. Os membros de ligação da invenção podem ser usados para diminuir os níveis de Aβ1-42 num indivíduo e/ou para reduzir a amiloidose. Os membros de ligação podem ser usados para reduzir a amiloidose e para tratar, reduzir ou prevenir patologias associadas com a amiloidose. As condições e doenças que podem ser tratadas incluem a doença de Alzheimer, tais como DA prodrômica, ligeira ou moderada. DA tratada pela invenção pode ser a DA familiar ou esporádica. A invenção pode ser utilizada para prevenir, reduzir ou reverter a deterioração cognitiva ligeira (MCI) associada com DA. A cognição pode ser melhorada e/ou o declínio cognitivo pode ser reduzido em pacientes com DA ou pacientes com síndrome de Down. A invenção também pode ser utilizada para tratar ou prevenir a degeneração macular, a qual está relacionada com beta-amiloide (Ding et al. PNAS 108(28):E279-287 2011).

[0048] Consequentemente, num aspecto adicional, a invenção proporciona um método para redução da amiloidose, tratamento da doença de Alzheimer, melhoria da cognição ou redução do declínio cognitivo na doença de Alzheimer ou síndrome de Down e/ou tratamento da degeneração macular num indivíduo, compreendendo a administração de um membro de ligação da invenção no indivíduo.

[0049] Esses e outros aspectos da invenção serão descritos abaixo em mais detalhe.

Breve descrição dos desenhos

[0050] A Figura 1 mostra os resultados do ensaio HTRF™ de ligação direta entre o Fab Abet0007 purificado e uma série de peptídeos beta-amilóides. O clone Abet0007 (■) mostra a ligação ao peptídeo beta-amilóide 1-42 humano (Figura 1A) e ao peptídeo beta-amilóide 1-42 de murino (Figura 1C) mas não apresenta qualquer ligação a peptídeo beta-amilóide 1-40 humano (Figura 1B) ou ao peptídeo beta-amilóide 1-40 alterado (Figura 1D). O anticorpo de controle positivo (•) e o anticorpo de controle negativo (▲) foram utilizados para verificar a integridade do ensaio.

[0051] A Figura 2 mostra a inibição da formação do peptídeo beta- amilóide 1-42 humano biotinilado e o complexo IgG2 Abet0007 através de concentrações crescentes de peptídeos competidores. A formação do complexo é inibida por peptídeos 1-42 (•), 11-42 (▲), 17-42 (▼) e (1-43) ♦ beta-amilóide humanos. Não é inibido através do peptídeo beta-amilóide 1-40 (■) ou pelo peptídeo de controle negativo (o).

[0052] A Figura 3 mostra os resultados da ressonância de plasma de superfície (BIAcore) para a ligação do peptídeo beta-amilóide 1-42 humano a Abet0007 IgG2 imobilizada em concentrações de 100 nM (traçado superior), 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,2 nM e 3,1 nM (traço inferior) de peptídeo. Cada traço é ajustado a um modelo 1:1 Langmuir.

[0053] A Figura 4 mostra exemplos de imagens da coloração imuno-histoquímica in vitro de Abet0007 IgG2. (A) Um anticorpo de controle positivo mostra um forte reconhecimento da placa (pontuação = 4) em seções de cérebro humano com DA (genótipo ApoE 3/3; fase Braak 6; 20 μg/mL de anticorpo). (B) O clone Abet0007 IgG2 não mostra o reconhecimento da placa (pontuação = 0) na seção adjacente do cérebro (20 μg/mL). (C) O mesmo anticorpo de controle positivo mostra um forte reconhecimento da placa (pontuação = 4) em seções de cérebro de rato Tg2576 (ratinhos com 18 meses de idade; 20 μg/mL de anticorpo). (D) O clone Abet0007 IgG2 não mostra o reconhecimento da placa (pontuação = 0) na seção adjacente do cérebro de rato (20 μg/mL).

[0054] A Figura 5 mostra a inibição da formação de beta-amilóide humana 1-42 e do complexo Abet0042 IgG através de concentrações crescentes de Abet0007 scFv (•) e Abet0144 scFv (▲). Neste ensaio, o clone Abet0144 é significativamente mais potente do que o clone progenitor Abet0007. Um anticorpo de controle negativo (■) é incluído para comparação.

[0055] A Figura 6 mostra os resultados da ressonância de plasma de superfície (BIAcore) para a ligação de Abet0144 scFv purificado ao peptídeo beta-amilóide 1-42 humano imobilizado em concentrações de 400 nM (traçado superior), 200 nM, 100 nM, 50 nM e 12,5 nM (traço inferior) de SCFv. Cada traço é ajustado a um modelo 1:1 Langmuir.

[0056] A Figura 7 mostra os resultados da ressonância de plasma de superfície (BIAcore) para a ligação do peptídeo beta-amilóide 1-42 humano ao anticorpo Abet0144-GL IgG1-TM imobilizado em concentrações de 50 nM (traçado superior), 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM, 3,13 nM e 1,56 nM (traço inferior) de peptídeo. Cada traço é ajustado a um modelo 1:1 Langmuir.

[0057] A Figura 8 mostra os resultados da ressonância de plasma de superfície (BIAcore) para a ligação de uma série de peptídeos beta-amilóides a 400 nM ao anticorpo imobilizado Abet0144 GL IgG1-TM. Não é clara a ligação ao peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado humano (top trace) e ao peptídeo beta-amilóide 1-42 humano não marcado (segundo traço). Não há nenhuma ligação discernível ao peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado alterado humano, peptídeo beta-amilóide 1-40 biotinilado humano, peptídeo beta-amilóide 1-40 humano não marcado ou insulina-biotinilada (linhas planas).

[0058] A Figura 9 apresenta a especificidade de perfilagem de Abet0144 GL-IgG1-TM usando um ensaio de competição bioquímica do epítopo, em que é medida a inibição da formação de um complexo entre peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado humano e Abet0144 GL-IgG1-TM por concentrações crescentes de peptídeos competidores. A formação do complexo é inibida por peptídeos 1-42 (•), piro 3-42 (♦) e piro 11-42 (o) beta-amilóide humanos. Nenhuma inibição significativa é observada com o peptídeo beta-amilóide 1-40 humano (■), 1-16 (▲) e peptídeos truncados 12-28 (▼) ou com o peptídeo de controle negativo (□).

[0059] A Figura 10 mostra exemplos de imagens da coloração imuno-histoquímica in vitro de Abet0144-GL IgG1-TM. (A) Um anticorpo de controle positivo mostra um forte reconhecimento da placa (pontuação = 4) em seções de cérebro humano com DA (genótipo ApoE 3/3; 20 μg/mL de anticorpo). (B) O clone Abet0144-GL IgG1-TM mostra algum reconhecimento da placa (pontuação = 1,5) na seção adjacente do cérebro (20 μg/mL). (C) O mesmo anticorpo de controle positivo mostra um forte reconhecimento da placa (pontuação = 4) em seções de cérebro de rato Tg2576 (ratinhos com 18 meses de idade; 20 μg/mL de anticorpo). (D) O clone Abet0144-GL IgG1-TM mostra algum reconhecimento da placa (pontuação = 1) na seção adjacente de cérebro de rato (20 μg/mL).

[0060] A Figura 11 mostra a inibição da formação do peptídeo beta-amilóide 1-42 humano e o complexo Abet0144-GL IgG1-TM através de concentrações crescentes de scFv competidor purificado (•). Quatro dos mais potentes clones scFv, Abet0369 (Figura 11A), Abet0377 (Figura 11b), Abet0380 (Figura 11C) e Abet0382 (Figura 11D) todos mostram melhora significativa na potência em relação à sequência parental Abet0144-GL scFv (■).

[0061] A Figura 12 mostra os resultados da ressonância de plasma de superfície (BIAcore) para a ligação do peptídeo beta-amilóide 1-42 humano ao anticorpo Abet0380-GL IgG1-TM imobilizado em concentrações de 1024 nM (traçado superior) a 63 pM (traço inferior) de peptídeo. Cada traço é ajustado a um modelo 1:1 Langmuir.

[0062] A Figura 13 mostra os resultados da ressonância de plasma de superfície (BIAcore) para a ligação de uma série de peptídeos beta-amilóides ao anticorpo imobilizado Abet0380-GL IgG1-TM. Não é clara a ligação ao peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado humano (top trace) e ao peptídeo beta-amilóide 1-42 de murino não marcado (segundo traço). Não há nenhuma ligação discernível ao peptídeo beta-amilóide 1-40 biotinilado humano ou peptídeo beta-amilóide 1-40 humano não marcado de murino (linhas planas).

[0063] A Figura 14 mostra exemplos de imagens da coloração imuno-histoquímica in vitro de Abet0380-GL IgG1-TM. (A) Um anticorpo de controle positivo mostra um forte reconhecimento da placa (pontuação = 4) em seções de cérebro humano com DA (genótipo ApoE 3/3; fase Braak 6; 5 μg/mL de anticorpo). (B) O clone Abet0380-GL IgG1-TM mostra forte reconhecimento da placa (pontuação = 3) na seção adjacente do cérebro (10 μg/mL). (C) O mesmo anticorpo de controle positivo mostra um forte reconhecimento da placa (pontuação = 4) em seções de cérebro de rato Tg2576 (ratinhos com 22 meses de idade; 20 μg/mL de anticorpo). (D) O clone Abet0380-GL IgG1-TM mostra algum reconhecimento da placa (pontuação = 4) na seção adjacente de cérebro de rato (20 μg/mL).

[0064] A Figura 15 mostra a análise por Western Blot da preparação de agregados Abeta 42 e de detecção utilizando o Abet0380-GL IgG1TM. (A) detecção de Abet0380-GL IgG1TM no agregado Aβ42 não-foto reticulado (não PICUP). (B) detecção de Abet0380-GL IgG1TM no agregado Aβ42 foto-reticulado (PICUP). Aqui demonstramos que Abet0380-GL IgG1TM reconhece especificamente o monômero Aβ1-42 e espécies de oligômeros de baixo n até e incluindo pentâmero.

[0065] A Figura 16 mostra a redução dependente da dose do nível do peptídeo beta-amilóide 1-42 livre no CSF (A), o aumento do peptídeo beta-amilóide 1-42 total no tecido cerebral (B) e os níveis não afetados do peptídeo beta-amilóide 1-40 total no tecido cerebral (C) por doses crescentes de anticorpo Abet0380-GL IgG1-TM em ratos Sprague-Dawley, recebendo repetidas doses semanais ao longo de 14 dias.

[0066] A Figura 17 mostra exemplos de imagens a partir da análise imuno-histoquímica da ligação de Abet0380 GL-IgG1-TM a placas beta-amilóides in vivo, 168 horas após a dose periférica a ratinhos velhos Tg2576. Um anticorpo de controle positivo dado a 30 mg/kg mostra um forte reconhecimento da placa in vivo (A), enquanto que Abet0380-GL IgG1-TM dado a 30(B) ou 10(C) mg/kg não mostra qualquer decoração da placa in vivo.

[0067] A Figura 18 mostra a especificidade de Abet0380 GL-IgG1- TM em experiências de ligação de competição com uma gama de diferentes concentrações (10 uM até 0,17nM) de um painel de peptídeos Abeta humanos de comprimento completo, truncado e piro (AAbeta 1-42, Abeta 1-43, Abeta 1-16, Abeta 12-28, Abeta 17-42, Abeta piro-3-42 ou Abeta piro-11-42). Chave:

[0068] O eixo x representa a concentração do peptídeo Abeta em log M, o eixo y mostra a % da ligação específica. A inibição de Abet0380-GL IgG1-TM: A ligação terminal N Biotina Abeta 1-42 foi observada com Abeta 1-42, Abeta 1-43, Abeta 17-42, Abeta piro-3-42 & Abeta piro-11-42 com os valores de IC50 entre 10-8 a 10-9 molar para este grupo. A inibição de Abet0380-GL IgG1-TM: A ligação do terminal N Biotina Abeta 1-42 foi observada com Abeta 1-16 ou Abeta 12-28.

[0069] A Figura 19 mostra a capacidade do anticorpo Abet0144-GL para sequestrar beta-amilóide 1-42 num estudo com rato normal PK-PD. O eixo x mostra o veículo ou a concentração de Abet0144-GL (10 mg/kg, ou 40 mg/kg), o eixo y mostra a concentração de beta-amilóide 1-42 total em CSF em pg/mL. Beta-amilóide 1-42 livre em CSF não foi significativamente alterado por 10 ou 40 mg/kg de Abet0144-GL (5 e 18% de aumento, respectivamente, quando comparado com o veículo). Beta-amilóide 1-42 total em CSF foi significativamente aumentado em 38% a 10 mg/kg e 139% a 40 mg/kg. Beta-amilóide 1-42 total em tecido cerebral foi também significativamente aumentado de 16% e 50% a 10 e 40 mg/kg, respectivamente. Os dados deste estudo em ratos normais demonstram que Abet0144-GL não teve um efeito significativo sobre os níveis de beta-amilóide 1-42 livre no CSF, no entanto, aumentou os níveis de beta-amilóide 1-42 total em ambos CSF e cérebro.

Descrição Detalhada

[0070] pela ligação de isoformas de um peptídeo Aβ 1-42 e seus truncados N-terminal (n-42) no plasma, cérebro e fluido cerebrospinal (CSF), um membro de ligação de acordo com a presente invenção pode prevenir a acumulação ou reverter a deposição de isoformas Aβ n-42 dentro do cérebro e vasculatura cerebral. Membros de ligação de acordo com a presente invenção podem ligar-se e precipitar Aβ1-42 solúvel no plasma sanguíneo e/ou no líquido cefalorraquidiano (CSF), reduzindo assim a concentração de Aβ1-42 no soro e/ou CSF, respectivamente. Tal representa uma abordagem terapêutica para a doença de Alzheimer e outras condições associadas com a amiloidose.

[0071] Os membros de ligação são específicos para o epítopo alvo em Aβ17-42, mais especificamente, em Aβ29-42, e ligam-se a este epítopo alvo com elevada afinidade em relação aos epítopos não-alvo, por exemplo, epítopos de Aβ1-40, fazendo assim o direcionamento para as principais espécies tóxicas ligadas com formação de placas amilóides. Por exemplo, um membro de ligação pode apresentar uma afinidade de ligação para Aβ1-42 que é pelo menos 10 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 1.000 vezes ou pelo menos 10.000 vezes maior do que para Aβ1-40. Assim, o elemento de ligação é seletivo para a ligação Aβ1-42 em relação a Aβ1-40. Como referido acima, o membro de ligação pode ligar-se a Aβ1-42 com uma constante de dissociação (Kd) de 500 pM ou menos. De preferência, não apresenta qualquer ligação significativa para Aβ1-40. A afinidade e ligação podem ser determinadas por ressonância de plasma de superfície utilizando um peptídeo monomérico Aβ, tal como descrito nos Exemplos.

[0072] A ligação a Aβ pode também ser medida através de um ensaio fluorescência resolvida no tempo homólogo (HTRFTM), para determinar se o anticorpo é capaz de competir para a ligação a Aβ com uma molécula de anticorpo de referência ao peptídeo Aβ, tal como descrito nos Exemplos.

[0073] Um ensaio HTRFTM é uma tecnologia de ensaio homogê neo que utiliza a transferência de energia de ressonância de fluorescência entre um fluoróforo dador e o aceitador que estão em estreita proximidade. Tais ensaios podem ser utilizados para medir as interações macromoleculares por direto ou indireto acoplamento a uma das moléculas de interesse para um fluoróforo dador, európio (Eu3+) criptato, e acoplando a outra molécula de interesse para um fluoróforo aceitador XL665 (aloficocianina reticulada estável). A excitação da molécula criptato (a 337 nm) resulta na emissão de fluorescência a 620 nm. A energia desta emissão pode ser transferida para XL665 em estreita proximidade com o criptato, resultando na emissão de fluorescência de uma longa duração específica (a 665 nm) a partir de XL665. Os sinais específicos de ambos o dador (a 620 nm) e o receptor (a 665 nm) são medidos, permitindo o cálculo de uma proporção 665/620 nm que compensa a presença de compostos corados no ensaio.

[0074] Um membro de ligação de acordo com a presente invenção pode competir pela ligação a Aβ1-42 e assim inibir a ligação do anticorpo de referência num ensaio de competição HTFRTM com Aβ1-42, mas não com Aβ1-40. Um membro de ligação pode apresentar, pelo menos, 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85% ou pelo menos 90% de inibição de Abet0144GL para a ligação a Aβ1-42 num ensaio HTRFTM.

[0075] A potência de inibição da ligação pode ser expressa como um valor de IC50, em nM a não ser que referido de outro modo. Em ensaios funcionais, o IC50 é a concentração de uma molécula de anticorpo que reduz uma resposta biológica em 50% de seu máximo. Em estudos de ligação por ligante, IC50 é a concentração que reduz a ligação de receptor em 50% do nível de ligação específica máximo. IC50 pode ser calculado por plotagem % de respostas biológicas máximas como uma função do log da concentração de membro de ligação e com o uso de um programa de software, tal como Prism (GraphPad) ou Origin (Origin Labs) para ajustar uma função sigmoide aos dados para gerar os valores de IC50. Os ensaios adequados para medir o determinar o potencial são bem conhecidos na técnica.

[0076] Um membro de ligação pode ter um IC50 de 5 nM ou menos, por exemplo, 2 nM ou menos, por exemplo 1 nm ou menos, em ensaio de competição de epitopo HTRFTM com Abet0144-GL e Aβ1-42. Abet0144-GL é uma molécula de anticorpo tendo um domínio VH de SEQ ID NO: 20) e domínio VL SEQ ID NO: 29. Pode ser usado no ensaio, no mesmo formato que a molécula de anticorpo a ser testada, por exemplo, em scFv ou IgG, por exemplo, formato IgG1. Assim, as moléculas de anticorpo IgG de acordo com a invenção podem competir com Abet0144-GL IgG para a ligação a Aβ1-42 humano num ensaio de competição de epítopo HTRF. A potência em tal ensaio pode ser inferior a 1 nM.

[0077] Um membro de ligação de acordo com a invenção pode apresentar ligação específica para o Aβ1-42 em relação a Aβ1-40, como determinado por um ensaio de competição HTRFTM. Num tal ensaio, Aβ1-40 pode não mostrar uma inibição significativa do membro de ligação à ligação ao peptídeo Aβ1-42, por exemplo, pode mostrar menos do que 20%, por exemplo menos do que 10% ou menos do que 5%, a inibição em tal ensaio, e de preferência não mostra inibição significativa em tal ensaio.

[0078] Os membros de ligação de acordo com a invenção reconhece um epítopo em Aβ17-42 humano, mais especificamente em Aβ29-42 humano e pode também reconhecer o seu epítopo alvo em Aβ a partir de outras espécies, por exemplo, camundongo ou rato. O potencial de um membro de ligação conforme calculado em um ensaio de competição HTRFTM utilizando Aβ1-42 de uma primeira espécie (por exemplo, humana) pode ser comparado ao potencial do membro de ligação no mesmo ensaio usando Aβ1-42 de uma segunda espécie (por exemplo, Aβ1-42 de camundongo), a fim de aceder à extensão de reatividade cruzada do membro de ligação para Aβ1-42 das duas espécies. A potência, conforme determinado por medições de IC50, pode ser 10 vezes, ou cerca de 100 vezes. Como observado acima, Abet0144GL pode ser utilizado como anticorpo de referência no ensaio de competição HTRFTM. Os membros de ligação aqui descritos podem ter uma potência maior em um ensaio de Aβ1-42 humano do que em um ensaio de Aβ1-42 não humano.

[0079] Um membro de ligação pode compreender uma molécula de anticorpo que tem uma ou mais CDRs, por exemplo, um conjunto de CDRs, no interior de um arcabouço de anticorpo (isto é, um domínio de ligação de anticorpo e antígeno). Por exemplo, um molécula de anticorpo pode compreender um domínio VH e/ou VL de anticorpo. Os domínios VH e VL de moléculas de anticorpo são também fornecidos como parte da invenção. Conforme é bem conhecido, os domínios VH e VL compreendem regiões de determinação de complementariedade, (“CDRs”), e regiões de arcabouço (“FWs”). Um domínio VH compreende um conjunto de HCDRs e um domínio VL compreende um conjunto de LCDRs. Uma molécula de anticorpo pode compreender um domínio VH de anticorpo que compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 VH e/ou um domínio VL de anticorpo que compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 VL. Os domínios VH ou VL podem ainda compreender um arcabouço. Um arcabouço de domínio VH ou VL tipicamente compreende quatro regiões de arcabouço, FW1, FW2, FW3 e FW4, que são intercaladas com CDRs na seguinte estrutura: FW1 - CDR1 - FW2 - CDR2 - FW3 - CDR3 - FW4.

[0080] Os exemplos de domínios VH e VL de anticorpo, FWs e CDRs de acordo com os aspectos da invenção são listados nas Tabelas 5 e 6 e a listagem de sequências anexa que forma parte da presente revelação. Todas as sequências VH e VL, sequências de CDR, conjuntos de CDRs, conjuntos de HCDRs e conjuntos de LCDRs reveladas no presente documento, assim como combinações desses elementos, representam os aspectos da invenção. Conforme descrito no presente documento, um "conjunto de CDRs” compreende CDR1, CDR2 e CDR3. Assim, um conjunto de HCDRs refere-se a HCDR1, HCDR2 e HCDR3 e um conjunto de LCDRs refere-se a LCDR1, LCDR2 e LCDR3. A não ser que determinado de outro modo, um "conjunto de CDRs" inclui HCDRs e LCDRs. Tipicamente as moléculas de anticorpo da invenção são anticorpos monoclonais.

[0081] Em outras modalidades, um membro de ligação pode compreender um sítio de ligação de antígeno dentro de uma molécula de não anticorpo, normalmente fornecido por uma ou mais CDRs, por exemplo, um conjunto de CDRs em uma armação de proteína não anticorpo, conforme discutido mais abaixo.

[0082] O isolamento de uma molécula de anticorpo progenitora designada Abet0007, seguida de mutação direta com CDR3 e seleção com um anticorpo otimizado Abet0144, de linha germinal para Abet0144-GL com um conjunto de sequências de CDR e sequências de arcabouço conforme mostrado nas Tabelas 5, 6 e a listagem de sequências, é aqui descrito. Através de um amplo processo de otimização e recombinação de várias bibliotecas como descrito nos exemplos, um painel de clones de anticorpos foi gerado a partir Abet0144GL. Estes seguintes clones otimizados são designados por Abet0380, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 e Abet0383. As suas sequências CDR e sequências de domínios variáveis são referenciadas nas Tabelas 5 e 6 e consta na listagem de sequências. As sequências dos domínios VH e VL da linha germinal Abet0380GL, Abet0377GL, Abet0343GL, Abet0369GL e Abet0382GL são mostradas na Tabela 8 e na Tabela 9.

[0083] Por exemplo, as tabelas 5 e 6 mostram que o Abet0380 tem um conjunto de CDRs, em que HCDR1 é SEQ ID NO: 525 (resíduo de Kabats 31 a 35), HCDR2 é SEQ ID NO: 526 (resíduo de Kabats 50 a 65), HCDR3 é SEQ ID NO: 527 (resíduo de Kabats 95 a 102), LCDR1 é SEQ ID NO: 534 (resíduo de Kabats 24 a 34), LCDR2 é SEQ ID NO: 535 (resíduo de Kabats 50 a 56) e LCDR3 é SEQ ID NO: 536 (resíduo de Kabats 89 a 97). Os clones de anticorpos otimizados são mostrados nas Tabelas 5 e 6 de uma maneira similar e também são fornecidos como aspectos da invenção.

[0084] Um membro de ligação para Aβ1-42 humano de acordo com a invenção pode compreender um ou mais CDRs, tal como aqui descrito, por exemplo, um conjunto de CDRs. O CDR ou conjunto de CDRs podem ser Abet0380, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 e Abet0383 conjunto de CDRs, ou uma sua versão da linha germinal ou pode ser sua variante com aqui descrito.

[0085] Em algumas modalidades; HCDR1 pode ter 5 aminoácidos de comprimento, que consistem em resíduos de Kabat 31 a 35; HCDR2 pode ter 17 aminoácidos de comprimento, que consistem em resíduos de Kabat 50 a 65; HCDR3 pode ter 16 aminoácidos de comprimento, que consistem em resíduos de Kabat 95 a 102; LCDR1 pode ter 11 aminoácidos de comprimento, que consistem em resíduos de Kabat 24 a 34; LCDR2 pode ter 7 aminoácidos de comprimento, que consistem em resíduos de Kabat 50 a 56; e/ou LCDR3 pode ter 9 aminoácidos de comprimento, que consistem em resíduos de Kabat 89 a 97.

[0086] Os membros de ligação podem compreender HCDR1, HCDR2 e/ou HCDR3 e/ou LCDR1, LCDR2 e/ou LCDR3 de qualquer um dos anticorpos listados nas Tabelas 5 e 6, por exemplo, um conjunto de CDRs de qualquer um dos anticorpos listados nas Tabelas 5 ou 6. O membro de ligação pode compreender um conjunto de CDRs de VH de um desses anticorpos. Opcionalmente, pode também compreender um conjunto de CDRs de VL de um desses anticorpos. CDRs de VL podem ser do mesmo anticorpo ou de um anticorpo diferente como CDRs de VH. Um domínio VH que compreende um conjunto de HCDRs de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 5 e/ou um domínio VL que compreende um conjunto de LCDRs de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 6 são aqui também fornecidos.

[0087] Um membro de ligação pode compreender um conjunto de H e/ou L CDRs dos anticorpos listados nas Tabelas 5 e 6 progenitor com uma ou mais mutações de aminoácidos, por exemplo, até 5, 10, ou 15 mutações, dentro do conjunto revelado de H e/ou L CDRs. Uma mutação pode ser uma substituição, deleção ou inserção de aminoácidos. Por exemplo, uma molécula de anticorpo da invenção pode compreender o conjunto de H e/ou L CDRs de qualquer uma das Abet0380, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 e Abet0383, ou uma sua versão da linha germinal, com mutações de um ou dois aminoácidos, por exemplo, substituições.

[0088] Por exemplo, o membro de ligação pode compreender um domínio VH que compreende Abet0380 ou conjunto de HCDRs, Abet0380GL, em que as sequências de aminoácidos Abet0380 ou Abet0380GL HCDRs são HCDR1SEQ ID NO: 525, HCDR2 SEQ ID NO: 526, e HCDR3 SEQ ID NO: 527, ou pode compreender conjunto de HCDRs Abet0380 com uma ou duas mutações de aminoácidos, e (ii) um domínio VL que compreende Abet0380 ou conjunto de LCDRs, Abet0380 GL, em que as sequências de Abet0380 ou Abet0380GL LCDRs são LCDR1SEQ ID NO: LCDR2SEQ ID NO: 535, LCDR3SEQ ID NO: ou compreende Abet0380 ou o conjunto de LCDRs, Abet0380GL, com uma ou duas mutações de aminoácidos.

[0089] As mutações podem ser potencialmente feitas em qualquer resíduo dentro do conjunto de CDRs. Em algumas modalidades, as substituições podem ser feitas nas posições substituídos em qualquer um dos Abet0380, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 e Abet0383 em comparação com Abet0144GL, ou nas posições substituídos em qualquer um dos Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 e Abet0383 comparado com Abet0380, ou suas versões de linha germinalos, como mostrado nas Tabelas 5 e 6.

[0090] Por exemplo, uma ou mais substituições podem ser em um ou mais dos seguintes resíduos de Kabat: 26, 27, 28, 29 ou 30 em VH FW1; 31, 32, 33, 34 ou 35 em VH CDR1; 52a, 53, 54, 55, 56, 57, 58 ou 62 em VH CDR2; 98, 99, 100h ou 102 em VH CDR3; 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 em VL CDR1; 89, 90, 92, 93, 94 ou 97 em VL CDR3.

[0091] Exemplos de possíveis substituições de aminoácidos, em particular, em posições de resíduos de Kabat, são mostrados nas Tabelas 12 e 14 para o domínio VH e Tabelas 13 e 15 para o domínio VL.

[0092] Conforme descrito acima, um membro de ligação pode compreender uma molécula de anticorpo que tem uma ou mais CDRs, por exemplo, um conjunto de CDRs, no interior de um arcabouço de anticorpo. Por exemplo, uma ou mais CDRs ou um conjunto de CDRs de um anticorpo pode ser enxertada em um arcabouço (por exemplo, arcabouço humano) para fornecer uma molécula de anticorpo. As regiões de arcabouço podem ser de sequências de segmento de gene de linhagem germinativa humana. Assim, o arcabouço pode ser com linhagem germinativa, assim um ou mais resíduos dentro do arcabouço são alterados para corresponder aos resíduos na posição equivalente no arcabouço de linhagem germinativa humano mais similar. Uma pessoa versada pode selecionar um segmento de linhagem germinativa que está mais próximo na sequência de arcabouço do anticorpo antes da linhagem germinativa e testar a afinidade e atividade dos anticorpos para confirmar que a linhagem germinativa não reduz significativamente a ligação de antígeno ou potencial nos ensaios descritos no presente documento. As sequências de segmento de gene de linhagem germinativa são conhecidas por aqueles versados na técnica e podem ser acessadas, por exemplo, a partir da compilação VBASE (VBASE, MRC Centre of Protein Engineering, UK, 1997, http//mrc-cpe.cam.ac.uk).

[0093] Um membro de ligação conforme descrito no presente documento pode ser uma molécula de anticorpo humana isolada que tem um domínio VH que compreende um conjunto de HCDRs em um arcabouço de linhagem germinativa humano, por exemplo, Vh3-23 DP-47. Assim, as regiões de arcabouço de domínio VH FW1, FW2 e/ou FW3 podem compreender regiões de arcabouço de segmento de gene de linhagem germinativa humano Vh3-23 DP-47 e/ou pode ser com linhagem germinativa por mutação de resíduos de arcabouço para corresponder aos resíduos de arcabouço desse segmento de gene de linhagem germinativa humano. FW4 pode compreender uma região de arcabouço de segmento j de linhagem germinativa humano.

[0094] A sequência de aminoácidos de FW1 de VH pode ser a SEQ ID NO: 528. VH FW1 contém uma série de resíduos nas posições Kabat 26-30 que se crê contribuir para a ligação ao antigênio e/ou serem importantes para a conformação estrutural do laço CDR1. As substituições podem ser incluídas na SEQ ID NO: 528, por exemplo uma sinergia com a sequência selecionada de HCDR1. Uma ou mais substituições podem ser selecionados facultativamente entre os indicados na Tabela 12 ou tabela 14.

[0095] A sequência de aminoácidos de VH FW2 pode ser SEQ ID NO: 529. A sequência de aminoácidos de VH FW3 pode ser SEQ ID NO: 530. A sequência de aminoácidos de VH FW4 pode ser SEQ ID NO: 531.

[0096] Normalmente, o membro de ligação tem também um domínio VL que compreende um conjunto de LCDRs, por exemplo, em um arcabouço de linhagem germinativa humano, por exemplo, V lambda 23-3 DPL-23. Assim, as regiões de arcabouço de domínio VL podem compreender as regiões de arcabouço FW1, FW2 e/ou FW3 de segmento de gene de linhagem germinativa humano V lambda 23-3 DPL-23 e/ou pode ser com linhagem germinativa por mutação de resíduos de arcabouço para corresponder aos resíduos de arcabouço desse segmento de gene de linhagem germinativa humano. FW4 pode compreender uma região de arcabouço de segmento j de linhagem germinativa humano. A sequência de aminoácidos de VL FW1 pode ser a SEQ ID NO: 537. A sequência de aminoácidos de VL FW2 pode ser SEQ ID NO: 538. A sequência de aminoácidos de VL FW3 pode ser SEQ ID NO: 539. A sequência de aminoácidos de VL FW4 pode ser SEQ ID NO: 540.

[0097] Um domínio VH ou VL com linhagem germinativa pode ou não ser com linhagem germinativa m um ou mais resíduos de Vernier, mas normalmente não.

[0098] Por exemplo, uma molécula de anticorpo ou um domínio VH conforme descrito no presente documento pode compreender o seguinte conjunto de regiões de arcabouço de cadeia pesada: FW1 SEQ ID NO: FW2 SEQ ID NO: FW3 SEQ ID NO: FW4 SEQ ID NO: ou pode compreender o dito conjunto de regiões de arcabouço de cadeia pesada com 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 mutações de aminoácidos, por exemplo, substituições.

[0099] Uma molécula de anticorpo ou um domínio VL conforme descrito no presente documento pode compreender o seguinte conjunto de regiões de arcabouço de cadeia leve: FW1 SEQ ID NO: FW2 SEQ ID NO: FW3 SEQ ID NO: FW4 SEQ ID NO: ou pode compreender o dito conjunto de regiões de arcabouço de cadeia leve com 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 mutações de aminoácidos, por exemplo, substituições.

[00100] Uma molécula de anticorpo sem linhagem germinativa tem as mesmas CDRs, mas diferentes arcabouços, em comparação a uma molécula de anticorpo com linhagem germinativa. Das sequências de anticorpos aqui mostradas, na listagem de sequências anexa, as sequências de Abet0144-GL, Abet0380-GL, Abet0377-GL, Abet0343-GL, Abet0369-GL, e Abet0382-GL são de linhagem germinativa. Anticorpos de linhagem germinativa de outras moléculas de anticorpo cujas sequências são aqui descritos, podem ser produzidos regiões estruturais de linha germinativa das suas sequências dos domínios VH e VL, opcionalmente para VH3-23 DP-47 no domínio VH e V de lambda 23-3 DPL-23 no domínio VL.

[00101] Tipicamente, um domínio VH é pareado com um domínio VL para fornecer um sítio de ligação de anticorpo e antígeno, embora, conforme discutido acima, um domínio VH ou VL sozinho pode ser usado para ligar o antígeno. Por exemplo, o domínio VH de Abet0380-GL (SEQ ID NO: 524) pode ser pareado com o domínio VL de Abet0380-GL (SEQ ID NO:533), de modo que um sítio de ligação de anticorpo e antígeno seja formado que compreende ambos os domínios VH e VL de Abet0380-GL. As modalidades análogas são fornecidas para os domínios VH e VL dos anticorpos revelados no presente documento. Em outras modalidades, o domínio VH de Abet0380-GL é pareado com um domínio VL outro que o VL de Abet0380-GL. A promiscuidade da cadeia leve está bem estabelecida na técnica. Novamente, modalidades análogas são proporcionadas pela invenção para os domínios VH e VL revelados no presente documento. Assim, um domínio VH compreendendo VH CDRs ou a sequência do dominio VH da linha germinal de qualquer um de Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0380, Abet0381, Abet0382 e Abet0383 pode ser emparelhado com um domínio VL compreendendo VL CDR ou VL da linha germinal de um anticorpo diferente, por exemplo os domínios VH e VL podem ser de anticorpos diferentes, selecionados a partir de Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0380, Abet0381, Abet0382 e Abet0383.

[00102] Um membro de ligação pode compreender (i) uma sequência de aminoácidos do domínio VH como apresentado na Tabela 16 ou na lista de sequências anexa, para qualquer um dos Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 e Abet0382, ou uma versão da linha germinal dos mesmos, ou compreendendo essa sequência de aminoácidos com uma ou duas mutações de aminoácidos; e (ii) uma sequência de aminoácidos do domínio VL como apresentado na Tabela 16 para qualquer um dos Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 e Abet0382, ou uma versão da linha germinal dos mesmos, ou compreende essa sequência de aminoácidos com uma ou duas mutações de aminoácidos.

[00103] Uma molécula de anticorpo pode compreender: (i) um domínio VH tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, 95% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos do domínio VH como apresentado na Tabela 16 para qualquer um dos Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 e Abet0382, ou uma versão da linha germinal dos mesmos, e (ii) um domínio VL tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 %, 95 % ou 98 % idêntica à sequência de aminoácidos do domínio VL como apresentado na Tabela 16 para qualquer um dos Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 e Abet0382, ou uma versão linha germinal dos mesmos.

[00104] Compreende um domínio VH e um domínio VL, pelo menos, 0 %, 95 % ou 98 % idêntico ao domínio VH e domínio VL, respectivamente, de qualquer um dos Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 e Abet0382, ou uma versão da linha germinal dos mesmos.

[00105] Um membro de ligação pode compreender um domínio VH e a domínio VL em que; (i) a sequência de aminoácidos de domínio VH é mostrada na SEQ ID NO: 524 e a sequência de aminoácidos de domínio VL é mostrada na SEQ ID NO: 533. (ii) a sequência de aminoácidos do domínio VH tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições de aminoácidos em comparação com a SEQ ID NO: 524 e a sequência de aminoácidos de domínio VL tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições de aminoácidos em comparação com SEQ ID NO: 533; ou (iii) a sequência de aminoácidos de domínio VH tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 524 e a sequência de aminoácidos de domínio VL tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 533.

[00106] Em algumas modalidades, uma molécula de anticorpo pode carecer de regiões constantes de anticorpo, por exemplo, um scFv.

[00107] Em outras modalidades, uma molécula de anticorpo pode compreender uma região constante de anticorpo. Uma molécula de anticorpo pode ser um anticorpo inteiro tal como uma IgG, isto é, uma IgG1, IgG2, ou IgG4, ou pode ser um fragmento ou derivado de anticorpo conforme descrito abaixo. As moléculas de anticorpo podem ter também outros formatos, por exemplo, IgG1 com YTE (Dall’Acqua et al. (2002) J. Immunology, 169: 5.171 - 5.180; Dall’Acqua et al. (2006) J Biol. Chem. 281(33):23514-24) e/ou mutações de TM (Oganesyan et al. (2008) Acta Cryst D64:700 a 4) na região Fc.

[00108] A invenção proporciona um membro de ligação da presente invenção com uma região Fc variante, em que a variante compreende um resíduo de fenilalanina (F) na posição 234, um resíduo de fenilalanina (F) ou um resíduo de ácido glutâmico (E) na posição 235 e um residuo de serina (S) na posição 331, tal como numerados pelo índice UE como definido em Kabat. Tais combinações de mutação são a seguir referidas como o mutante triplo (TM).

[00109] Um membro de ligação conforme descrito no presente documento pode compreender uma CDR, domínio VH, domínio VL, sítio de ligação de anticorpo e antígeno ou molécula de anticorpo que é codificado pelas sequências de ácidos nucleicos e/ou o vetor de qualquer de: (i) número acesso do depósito NCIMB 41889 (Abet0007); (ii) número acesso do depósito NCIMB 41890 (Abet0380-GL); (iii) número acesso do depósito NCIMB 41891 (Abet0144-GL); (iv) número acesso do depósito NCIMB 41892 (Abet0377-GL).

[00110] Um membro de ligação como aqui descrito, pode ser produzido através do ácido nucleico, vector ou linha celular dos números de acesso dos depósitos NCIMB 41889, 41890, 41891 ou 41892. Por exemplo, um membro de ligação pode ser produzido por expressão do ácido nucleico ou vector da linha de células do número de acesso do depósito NCIMB 41890. O ácido nucleico ou vector pode ser expresso em qualquer sistema de expressão conveniente. Alternativamente, o membro de ligação pode ser expresso pela linha celular de número de acesso de depósito NCIMB 41889, 41890, 41891 ou 41892.

[00111] Os aspectos da invenção também fornece ácido nucleico que codifica para os domínios VH e/ou VL, que está contido na linha celular de número de acesso NCIMB 41889, 41890, 41891 ou 41892; um vetor que compreende o dito ácido nucleico, que está contido na linha celular de número de acesso 41889, 41890, 41891 ou 41892; e as células ou linha celular de número de acesso 41889, 41890, 41891 ou 41892.

[00112] Um membro de ligação de acordo com a presente invenção pode compreender um local de ligação ao antigênio de um anticorpo ou molécula de anticorpo que compete pela ligação a Aβ1-42 humano com qualquer molécula de anticorpo codificada pelo ácido nucleico depositado com o número de acesso 41889, 41890, 41891 or 41892, ou com uma molécula de anticorpo que compreende as sequências de aminoácidos do domínio VH e VL de Abet007, Abet0380-GL, Abet0144-GL ou Abet0377-GL, tal como estabelecido na listagem de sequências anexada.

Membro de ligação

[00113] O termo membro de ligação descreve um membro de um par de moléculas que se ligam entre si. Os membros de um par de ligações pode ser derivado naturalmente ou completa ou parcialmente produzido de modo sintético. Um membro do par de moléculas tem um área em sua superfície ou uma cavidade que se liga e é, assim, complementar a uma organização espacial e polar particular do outro membro do par de moléculas. Os exemplos de tipos de pares de ligação são antígeno-anticorpo, biotina-avidina, hormônio-receptor de hormônio, receptor-ligante, enzima-substrato. A presente invenção refere-se às reações do tipo antígeno-anticorpo.

[00114] Um membro de ligação normalmente compreende uma molécula que tem um sítio de ligação de antígeno. Por exemplo, um membro de ligação pode ser uma molécula de anticorpo ou uma proteína de não anticorpo que compreende um sítio de ligação de antígeno.

[00115] Um sítio de ligação de antígeno pode ser fornecido por meio de disposição de CDRs em suporte de proteína não anticorpo, tal como fibronectina ou citocromo B etc. [Haan & Maggos (2004) BioCentury, 12(5): A1-A6; Koide et al. (1998) Journal of Molecular Biology, 284: 1141-1151; Nygren et al. (1997) Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469], ou por radomização ou mutação dos resíduos de aminoácido de um laço dentro de uma armação de proteína para conferir especificidade de ligação para um alvo desejado. Os suportes para modificar os locais de ligação inovadores em proteínas foram analisadas em detalhes por Nygren et al. [supra]. As armações proteicas para miméticos de anticorpo são reveladas em WO00/34784, que é incorporada ao presente a título de referência em sua totalidade, em que os inventores descrevem proteínas (miméticos de anticorpo) que incluem um domínio de fibronectina tipo III que tem pelo menos um laço randomizado. Uma armação adequada em que se enxerta uma ou mais CDRs, por exemplo, um conjunto de HCDRs ou uma HCDR3 e/ou LCDR3, pode ser fornecida por qualquer membro de domínio da superfamília de gene de imunoglobulina. A armação pode ser uma proteína humana ou não humana. Uma vantagem de uma armação proteica de não anticorpo é que a mesma pode fornecer um sítio de ligação de antígeno em uma molécula de armação que é menor e/ou mais fácil de fabricar do que pelo menos algumas moléculas de anticorpo. O tamanho pequeno de um membro de ligação pode conferir propriedades fisiológicas úteis, tal como uma capacidade de entrar em células, penetrar profundamente nos tecidos ou alcançar alvos dentro de outras estruturas ou se ligar no interior de cavidades proteicas do antígeno alvo. O uso de sítios de ligação de antígeno em armações proteicas de não anticorpo é analisado em Wess, 2004 [Wess, L. Em: BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, 12(42), A1-A7, 2004]. São típicas as proteínas que têm uma armação principal estável e um ou mais laços variáveis, em que a sequência de aminoácidos do laço ou laços é específica e aleatoriamente transformada para criar um sítio de ligação de antígeno que liga o antígeno alvo. Tais proteínas incluem os domínios de ligação de IgG de proteína A de S. aureus, transferrina, tetranectina, fibronectina (por exemplo, 10° domínio de fibronectina tipo III), lipocalinas assim como armações gama-cristalinas e outras armações Affilin™ (Scil Proteins). Os exemplos de outras abordagens incluem "Microcorpos" sintéticos à base de ciclotídeos - proteínas pequenas que têm ligações de dissulfeto intramolecular, Microproteínas (Versabodies™, Amunix) e proteínas de repetição de anquirina (DARPins, Molecular Partners).

[00116] Adicionalmente às sequências de anticorpos e/ou um sítio de ligação de antígeno, um membro de ligação pode compreender outros aminoácidos, por exemplo, formando um peptídeo ou polipeptídeo, tal como um domínio dobrado, ou conferem à molécula outra característica funcional adicionalmente à capacidade de ligar o antígeno. Os membros de ligação podem conter uma identificação detectável ou podem ser conjugados a uma toxina ou uma porção química alvo ou enzima (por exemplo, por meio de uma ligação de peptidila ou ligante). Por exemplo, um membro de ligação pode compreender um sítio catalítico (por exemplo, em um domínio de enzima) assim como um sítio de ligação de antígeno, em que o sítio de ligação de antígeno se liga ao antígeno e assim alveja o sítio catalítico ao antígeno. O sítio catalítico pode inibir a função biológica do antígeno, por exemplo, por clivagem.

[00117] Ainda que, conforme citado, as CDRs possam ser transportadas por estruturas de não anticorpo, a armação para transportar uma CDR, por exemplo, CDR3, ou um conjunto de CDRs da invenção será em geral uma sequência de cadeia pesada ou leve de anticorpos ou porção substancial da mesma em que a CDR ou conjunto de CDRs está localizada em um local correspondente à CDR ou conjunto de CDRs de domínios variáveis de anticorpo VH e VL de ocorrência natural codificados por genes imunoglobulina redispostos. As estruturas e locais de domínios variáveis de imunoglobulina podem ser determinados por referência a Kabat, et al., 1987 [Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4a Edição. US Department of Health and Human Services. 1987] e atualizações do mesmo. Inúmeros recursos on-line acadêmicos e comerciais estão disponíveis para consultar essa base de dados. Por exemplo, ver Martin, A.C.R. Accessing the Kabat Antibody Sequence Database by Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25 (1996), 130 a 133 e o recurso on-line associado, atualmente no endereço da web de http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html.

[00118] Por região CDR ou CDR, pretende-se indicar as regiões hipervariáveis das cadeias pesadas e leves da imunoglobulina, conforme definido por Kabat et al. 1991 [Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edição. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington] e edições posteriores. Um anticorpo tipicamente contém 3 CDRs de cadeia pesada e 3 CDRs de cadeia leve. O termo CDR ou CDRs é usado aqui a fim de indicar, de acordo com o caso, uma ou diversas dessas regiões, ou mesmo essas regiões inteiras que contêm a maior parte dos resíduos de aminoácido responsáveis pela ligação por afinidade do anticorpo para o antígeno ou o epitopo que o mesmo reconhece.

[00119] Entre as seis sequências de CDR curtas, a terceira CDR da cadeia pesada (HCDR3) tem variabilidade de tamanho maior (diversidade maior essencialmente devido aos mecanismos de disposição dos genes que gera a mesma). Pode ser tão curto como 2 aminoácidos embora o tamanho maior conhecido seja 26. O comprimento de CDR pode também variar de acordo com o comprimento que pode ser acomodado pela estrutura subjacente específica. Funcionalmente, HCDR3 desempenha um papel em parte da determinação da especificidade do anticorpo (Segal et al., PNAS, 71:4298-4302, 1974; Amit et al., Science, 233:747-753, 1986; Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987; Chothia et al., Nature, 342:877- 883, 1989; Caton et al., J. Immunol., 144:1965-1968, 199; Sharon et al., PNAS, 87:4814-4817, 1990; Sharon et al., J. Immunol., 144:4863-4869, 1990; e Kabat et al., J. Immunol., 147:1709-1719, 1991).

Molécula de anticorpo

[00120] Este descreve uma imunoglobulina quer seja natural ou parcial ou inteiramente produzida de modo sintético. O termo também inclui qualquer polipeptídeo ou proteína que compreende um sítio de ligação de antígeno e anticorpo. Deve-se entender aqui que a invenção não se refere aos anticorpos na forma natural, o que quer dizer que não estão em seu ambiente natural, mas que foram capazes de ser isolados ou obtidos por purificação de fontes naturais ou de outra forma obtidos por recombinação genética ou por síntese química e que podem conter aminoácidos não naturais conforme será descrito adiante. Os fragmentos de anticorpo que compreendem um sítio de ligação de antígeno e anticorpo incluem, mas sem limitações, moléculas tais como Fab, Fab’, Fab’-SH, scFv, Fv, dAb e Fd. Várias outras moléculas de anticorpo incluindo um ou mais sítios de ligação de antígeno e anticorpo foram modificadas, incluindo, por exemplo, Fab2, Fab3, diacorpos, triacorpos, tetracorpos e minicorpos. As moléculas de anticorpo e métodos para sua construção e uso são descritas em Holliger & Hudson, Nature Biotechnology 23(9):1.126 a 1.136 2005.

[00121] É possível tomar anticorpos monoclonais ou outros e usar técnicas de tecnologia de DNA recombinante para produzir outros anticorpos ou moléculas quiméricas que ligam o antígeno alvo. Tais técnicas podem envolver introduzir DNA que codifica a região variável de imunoglobulina ou as CDRs de um anticorpo às regiões constantes ou regiões constantes mais regiões de arcabouço, de uma imunoglobulina diferente. Consulte, por exemplo, EP-A-184187, GB 2188638A ou EP-A-239400, e um corpo maior da literatura subsequente. Um hibridoma ou outra célula que produz um anticorpo pode ser submetido à mutação genética ou outras mudanças, que podem ou não alterar a especificidade de ligação de anticorpos produzidos.

[00122] Como os anticorpos podem ser modificados de inúmeras formas, o termo "molécula de anticorpo" deve ser entendido como incluindo qualquer membro de ligação ou substância que tem um sítio de ligação de antígeno e anticorpo com a especificidade necessária e/ou ligação ao antígeno. Assim, esse termo inclui fragmentos e derivados de anticorpo, incluindo qualquer polipeptídeo que compreende um sítio de ligação de antígeno e anticorpo, seja natural ou inteira ou parcialmente sintético. As moléculas quiméricas que compreende um sítio de ligação de antígeno e anticorpo, ou equivalente, fundido a outro polipeptídeo (por exemplo, derivado de outra espécie ou pertencente a outra classe ou subclasse de anticorpo) estão, então, incluídos. A clonagem e expressão de anticorpos quiméricos são descritas em EP-A-0120694 e EP-A-0125023 e um corpo grande da literatura subsequente.

[00123] Técnicas adicionais disponíveis na técnica de modificação de anticorpo têm tornado possível isolar anticorpos humanos e humanizados. Por exemplo, hibridomas humanos pode ser produzidos conforme descrito por Kontermann & Dubel [Kontermann, R & Dubel, S, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; 2001, ISBN: 3540413545]. A exibição de fago, outra técnica estabelecida para gerar membros de ligação, tem sido descrita em detalhes em muitas publicações, tal como Kontermann & Dubel [supra] e WO92/01047 (discutida mais abaixo) e Patente n° US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160, US6521404.

[00124] Os camundongos transgênicos, em que os genes de anticorpo de camundongo são inativados e substituídos funcionalmente por genes de anticorpo humano enquanto outros componentes do sistema imunológico do camundongo são deixados intactos, podem ser usados para isolar os anticorpos humanos [Mendez, M. et al. (1997) Nature Genet, 15(2): 146-156]. Os anticorpos humanizados podem ser produzidos utilizando técnicas conhecidas na técnica, tais como os revelados em, por exemplo, WO91/09967, US 5585089, EP592106, US565332 e WO93/17105. Ainda, WO2004/006955 descreve métodos para humanizar anticorpos, com base na seleção de sequências de arcabouço de região variável de genes de anticorpo humano por comparação de tipos estruturais de CDR canônicos para sequências de CDR da região variável de um anticorpo não humano aos tipos estruturais de CDR canônicos para CDRs correspondentes de uma biblioteca de sequências de anticorpo humano, por exemplo, segmentos de gene de anticorpo de linhagem germinativa. As regiões variáveis de anticorpo humano que têm tipos estruturais de CDR canônicos similares às CDRs não humanas de um subconjunto de sequências de anticorpo humano de membro a partir das quais se selecionam as sequências de arcabouço humano. Os membros do subconjunto podem ser ainda classificados por similaridade de aminoácido entre as sequências de CDR humanas e não humanas. No método de WO2004/006955, as sequências humanas de classificação superior são selecionadas para fornecer as sequências de arcabouço para construir um anticorpo quimérico que substitui funcionalmente as sequências de CDR humanas pelas contrapartes de CDR não humanas com o uso dos arcabouços humanos de membro de subconjunto selecionados, assim fornecendo um anticorpo humanizado de alta afinidade e baixa imunogenicidade sem a necessidade de comparar sequências de arcabouço entre os anticorpos não humanos e humanos. Os anticorpos quiméricos produzidos de acordo com o método também são revelados.

[00125] As moléculas de anticorpo sintéticas podem ser criadas por expressão de genes gerados por meio de oligossacarídeos sintetizados e montados no interior de vetores de expressão adequados, por exemplo, conforme descrito por Knappik et al. [Knappik et al. J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86] ou Krebs et al. [Krebs et al. Journal of Immunological Methods 254 2001 67 a 84].

[00126] Mostrou-se que os fragmentos de um anticorpo inteiro podem realizar a função de antígenos de ligação. Exemplos de fragmentos de ligação são (i) o fragmento Fab que consiste em VL, VH, CL e CH1; (ii) o fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; (iii) o fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único anticorpo; (iv) o fragmento dAb [Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989); McCafferty et al. (1990) Nature, 348, 552-554; Holt et al. (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490], que consiste em um domínio VH ou um domínio VL; (v) regiões CDR isoladas; (vi) fragmentos F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados (vii) moléculas Fv de cadeia simples (scFv), em que um domínio VH e um domínio VL estão ligados por um ligante peptídico que permite que os dois domínios se associem para formar um local de ligação ao antigênio [Bird et al, Science, 242, 423-426., 1988; Huston et al, PNAS EUA, 85, 5879-5883, 1988]; (viii) dímeros de cadeia única Fv biespecíficos (PCT/US92/09965) e (ix) "diacorpos", fragmentos multivalentes ou multiespecíficos construídos por fusão de genes (WO94/13804; Holliger, P. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993). As moléculas de Fv, scFv ou diacorpo podem ser estabilizadas pela incorporação de pondes de dissulfeto que ligam os domínios VH e VL [Reiter, Y. et al, Nature Biotech, 14, 1239 a 1245, 1996]. Os minicorpos que compreendem um scFv unido a um domínio CH3 pode ser também produzidos [Hu, S. et al, Cancer Res., 56, 3055 a 3061, 1996]. Outros exemplos de fragmentos de ligação são Fab’, que difere dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carboxila do domínio CH1 de cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação de anticorpo e Fab’-SH, que é um fragmento Fab’ em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes contém um grupo tiol livre.

[00127] Qui et al. [Qui et al., Nat. Biotechnol. 25:921 a 929 2007] descreveu moléculas de anticorpo que contêm apenas duas CDRs ligadas por uma região de arcabouço. CDR3 do domínio VH ou VL foi ligada ao laço de CDR1 ou CDR2 do outro domínio. A ligação foi através do terminal C da CDR1 ou CDR2 selecionada ao terminal N da CDR3, por meio de uma região FR. Qui et al. selecionou a região FR que tem menos emplastros hidrofóbicos. A melhor combinação para o anticorpo testada foi encontrada como sendo CDR1 de VL ligada por FR2 de VH à CDR3 de VH (VHCDR1-VHFR2-VLCDR3). A um peso molecular de cerca de 3 kDa, essas moléculas de anticorpo oferecem outras vantagens em termos de penetração de tecido melhorada em comparação às imunoglobulinas completas (aproximadamente 150 kDa) ou scFv (aproximadamente 28 kDa).

[00128] Os fragmentos de anticorpo da invenção podem ser obtidos iniciando a partir de qualquer um dos anticorpos listados no presente documento, por métodos tal como digestão por enzimas, por exemplo, pepsina ou papaína e/ou por clivagem das pontes de dissulfeto por redução química. De outra maneira, os fragmentos de anticorpo compreendidos na presente invenção podem ser obtidos por técnicas de recombinação genética, também bem conhecida pelo versados na técnica, ou de outro modo por síntese de peptídeo por meio de, por exemplo, sintetizadores de peptídeo automáticos, tais como aqueles fornecidos pela empresa Applied Biosystems, etc., ou por síntese e expressão de ácido nucleico.

[00129] Os fragmentos de anticorpo funcionais de acordo com a presente invenção incluem qualquer fragmento funcional cuja vida útil é aumentada por uma modificação química, especialmente por PEGilação, ou por incorporação de um lipossomo.

[00130] Um dAb (anticorpo de domínio) é um pequeno fragmento monomérico de ligação ao antigênio de um anticorpo, isto é, a região variável de uma cadeia pesada ou leve do anticorpo. VH dAbs ocorrem naturalmente em camelídeos (por exemplo, camelo, lama) e pode ser produzido através da imunização de um dos camelídeos com um antigênio alvo, isolamento de células B específicas do antigênio e clonagem direta de genes de dAb a partir de células B individuais. dAbs são também ser produzido em cultura de células. Seu tamanho pequeno, solubilidade boa e estabilidade de temperatura tornam os mesmos particularmente úteis de modo fisiológico e adequados para a seleção e maturação de afinidade. Os dAbs de VH de camelídeo estão sendo desenvolvidos para uso terapêutico sob o nome "nanobodies™". Um membro de ligação da presente invenção pode ser um dAb que compreende um domínio VH ou VL substancialmente conforme representado no presente documento, ou um domínio VH ou VL que compreende um conjunto de CDRs substancialmente conforme representado no presente documento.

[00131] Os anticorpos biespecíficos ou bifuncionais formam uma segunda geração de anticorpos monoclonais em que duas regiões variáveis diferentes são combinadas na mesma molécula [Holliger e Bohlen (1999) Cancer and metastasis Rev. 18: 411-419]. Seu uso tem sido demonstrado tanto no campo diagnóstico quanto no campo de terapia de sua capacidade de recrutar novas funções efetoras ou alvejar diversas moléculas na superfície de células tumorosas. Onde os anticorpos biespecíficos são para ser utilizados, estes podem ser anticorpos biespecíficos convencionais, que podem ser fabricados através de uma variedade de formas [Holliger, P. e Winter G. Current Opinion Biotechnol 4, 446-449. 1993], por exemplo, preparados quimicamente ou a partir de hibridomas híbridos, ou podem ser quaisquer fragmentos de anticorpos biespecíficos mencionados acima. Estes anticorpos podem ser obtidos por métodos químicos [Glennie MJ et al., 1987 J. Immunol. 139, 2367-2375; Repp R. et al., 1995 J. Hemat. 377-382] ou métodos somáticos [Staerz U. D. e Bevan M. J. 1986 PNAS 83; Suresh M. R. et al., 1986 Methods Enzymol. 121: 210 a 228], igual e preferencialmente por técnicas de modificação genética que permitem que a heterodimerização seja forçada e assim facilite o processo de purificação do anticorpo procurado [Merchand et al., 1998 Nature Biotech. 16:677-681]. Os exemplos de anticorpo biespecíficos incluem aqueles da tecnologia BiTETM em que os domínios de ligação de dois anticorpos com especificidade diferente podem ser usados e diretamente ligados por meio de peptídeos flexíveis curtos. Isso combina dois anticorpos em uma cadeia de polipeptídeo única curta. Os diacorpos e scFv podem ser construídos sem uma região Fc, com o uso apenas de domínios variáveis, potencialmente reduzindo os efeitos de reação anti-idiotípica.

[00132] Os anticorpos biespecíficos podem ser construídos como IgG inteira, Fab'2 biespecífico, como Fab'PEG, como diacorpos ou de outro como scFv biespecpifico. Ademais, dois anticorpos biespecíficos podem ser ligados com o uso de métodos de rotina conhecidos na técnica para formar anticorpos tetravalentes.

[00133] Os diacorpos biespecíficos, contrariamente aos anticorpos biespecíficos inteiros, podem também ser particularmente úteis pois podem ser prontamente construídos e expressos em E. coli. Os diacorpos (e muitos outros polipeptídeos, tais como fragmentos de anticorpos) de especificidades de ligação apropriadas podem ser prontamente selecionados utilizando exibição em fagos (WO94/13804) a partir de bibliotecas. Se um braço do diacorpo for mantido constante, por exemplo, com uma especificidade direcionada contra beta-amilóide como aqui descrito, então uma biblioteca pode ser produzida em que o outro braço é variado e um anticorpo de especificidade apropriada selecionada. Os anticorpos inteiros biespecíficos podem ser produzidos por métodos de modificação alternativos conforme descrito em Ridgeway et al., 1996 [Ridgeway, J. B. B. et al, Protein Eng., 9, 616 a 621, 1996].

[00134] Vários métodos para a obtenção de anticorpos estão disponíveis na técnica. Os anticorpos podem ser anticorpos monoclo-nais, especialmente de origem humana, murina, quimérica e humanizada, que podem ser obtidos de acordo com os métodos padrão bem conhecidos por um versado na técnica.

[00135] Em geral, para a preparação de anticorpos monoclonais ou seus fragmentos funcionais, especialmente de origem murina, é possível referir-se a técnicas que são descritas particularmente no manual "Antibodies” [Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y., página 726, 1988] ou à técnica de preparação de hibridomas descrita por Kohler e Milstein [Kohler e Milstein, Nature, 256:495 a 497, 1975].

[00136] Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos, por exemplo, de uma célula animal imunizada com Aβ1-42 ou um de seus fragmentos que contêm o epítopo reconhecido pelos ditos anticorpos monoclonais, por exemplo, Aβ17-42. Os fragmentos adequados e peptídeos ou polipeptídeos compreendendo os mesmos são aqui descritos, e podem ser utilizados para imunizar animais para produzir anticorpos contra Aβ1-42. O referido antigênio, ou um dos seus fragmentos, pode ser produzido especialmente de acordo com os métodos habituais de trabalho, por recombinação genética a partir de uma sequência de ácido nucleico contida na sequência de cDNA que codifica para Aβ1-42 ou um seu fragmento, por síntese de peptídeos a partir de uma sequência de aminoácidos compreendidos na sequência peptídica do Aβ1-42 e/ou um seu fragmento.

[00137] Os anticorpos monoclonais podem, por exemplo, ser purificados em uma coluna de afinidade em que Aβ1-42 ou um de seus fragmentos que contém o epítopo reconhecido pelos ditos anticorpos monoclonais, por exemplo, Aβ17-42, foi previamente imobilizado. Mais particularmente, os anticorpos monoclonais podem ser purificados por cromatografia em proteína A e/ou G, seguida ou não seguida por cromatografia de troca de íon com o objetivo de eliminar os contaminantes de proteína residuais assim como o DNA e o LPS, no próprio, seguida ou não seguida por cromatografia de exclusão em gel Sepharose a fim de eliminar os agregados potenciais devidos à presença de dímeros ou de outros multímeros. Em uma modalidade, todas essas técnicas podem ser usadas simultânea ou sucessivamente. Sítio de ligação de antígeno

[00138] Este descreve a parte de uma molécula que se liga a e é complementar a todo ou parte do antígeno alvo. Em uma molécula de anticorpo, o mesmo é referido como o sítio de ligação de antígeno e anticorpo e compreende a parte do anticorpo que se liga a e é complementar a todo ou parte do antígeno alvo. Nos casos em que um antígeno é grande, um anticorpo pode apenas de ligar a uma parte particular do antígeno, em que a parte é designada um epítopo. Um sítio de ligação de antígeno e anticorpo pode ser fornecido por um ou mais domínios variáveis de anticorpo. Um sítio de ligação de antígeno e anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e região variável de cadeia pesada de anticorpo (VH).

[00139] O documento WO 2006/072620 descreve a modificação de sítios de ligação de antígeno em laços estruturais (não CDR) que se estendem entre os filamentos beta de domínios de imunoglobulina. Um sítio de ligação de antígeno pode ser modificado em uma região de uma molécula de anticorpo separada do local natural das CDRs, por exemplo, em uma região de arcabouço de um domínio VH ou VL, ou em um domínio constante de anticorpo, por exemplo, CH1 e/ou CH3. Um sítio de ligação de antígeno modificado em uma região estrutural pode ser adicional a, ou ao invés de, um sítio de ligação de antígeno formado por conjuntos de CDRs de um domínio VH e VL. Nos casos em que múltiplos sítios de ligação de antígeno estão presente em uma molécula de anticorpo, os mesmos podem ligar o mesmo antígeno (antígeno alvo), assim aumentado a valência do membro de ligação. Alternativamente, múltiplos sítios de ligação de antígeno podem ligar diferentes antígenos (o antígeno alvo e um ou mais outros antígenos) e esse pode ser usado para adicionar funções efetoras, prolongar a vida útil ou melhorar a entrega in vivo da molécula de anticorpo. Isolado

[00140] Este refere-se ao estado em que os membros de ligação da invenção, ou ácido nucleico que codifica tais membros de ligação, estarão em geral em concordância com a presente invenção. Assim, os membros de ligação, domínios VH e/ou VL, e vetores e moléculas de ácido nucleico codificadoras de acordo com a presente invenção podem ser fornecidos isolados e/ou purificados, por exemplo, a partir de seu ambiente natural, na forma substancialmente pura ou homogênea, ou, no caso de ácido nucleico, livre ou substancialmente livre de ácido nucleico ou genes de origem outra que a sequência que codifica um polipeptídeo com a função exigida. Os membros isolados e ácido nucleico isolado serão livres ou substancialmente livres de material com o qual os mesmos estão naturalmente associados, tais como outros polipeptídeos ou ácidos nucleicos com os quais são encontrados em seu ambiente natural ou o ambiente em que os mesmos são preparados (por exemplo, cultura celular) quando tal preparação é por tecnologia de DNA recombinante praticada in vitro ou in vivo. Os membros e ácido nucleico podem ser formulados com diluentes ou adjuvantes e ainda para propósitos práticos serem isolados - por exemplo, os membros serão normalmente misturados com gelatina ou outros carreadores se usados para revestir placas de microtitulação para uso em imunoensaios ou serão misturados com carreadores farmaceuticamente aceitáveis ou diluentes quando usados na diagnose ou terapia. Os membros de ligação podem ser glicosilados, ou naturalmente ou por sistemas de células eucariontes heterólogos (por exemplo, células de CHO ou NS0 (ECACC 85110503), ou podem ser (por exemplo, se produzidos por expressão em uma célula procarionte) não glicosilado.

[00141] As preparações heterogêneas que compreendem moléculas de anticorpo também formam parte da invenção. Por exemplo, tais preparações podem ser misturas de anticorpos com cadeias pesadas e cadeias leves de comprimento completo que carecem da lisina de C-terminal, com vários graus de glicosilação e/ou com aminoácidos derivados, tal como ciclização de uma ácido glutâmico de N-terminal para formar um resíduo de ácido piroglutâmico.

[00142] Conforme usada no presente documento, a frase "substancialmente conforme definido" refere-se à(s) característica(s) das CDRs relevantes do domínio VH ou VL de membros de ligação descrito no presente documento que serão ou idênticas ou altamente similares às regiões especificadas daquela sequência que é representada no presente documento. Conforme descrito no presente documento, a frase "altamente similar" com relação à(s) região(ões) especificada(s) de um ou mais domínios variáveis, contempla-se que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 substituições de aminoácido podem ser feitas na CDR e/ou domínio VH ou VL.

[00143] Como notado acima, um membro de ligação de acordo com a presente invenção se liga a Aβ1-42 humano. Tal como aqui descrito, os membros de ligação da presente invenção podem ser optimizados para a afinidade e/ou para a potência de inibição num ensaio de competição HTRFTM. Em geral, a otimização de potencial envolve realizar mutação da sequência de um membro de ligação selecionado (normalmente a sequência de domínio variável de um anticorpo) para gerar uma biblioteca de membros de ligação, que são então avaliado por potencial e os membros de libação mais fortes são selecionados. Assim, os membros de ligação “otimizados por potencial” selecionados tendem a ter um potencial mais alto que o membro de ligação a partir do qual a biblioteca foi gerada. Todavia, membros de ligação de potencial alto podem ser também obtidos sem otimização, por exemplo, um membro de ligação de potencial alto pode ser obtido diretamente de uma triagem inicial. Os ensaios e as potências são descritos em mais pormenor noutra parte deste documento. A pessoa versada pode, assim, gerar membros de ligação tendo uma elevada potência.

[00144] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método para obter um ou mais membros de ligação que podem ligar o antígeno, sendo que o método inclui colocar em contato uma biblioteca de membros de ligação de acordo com a invenção e o dito antígeno e selecionar um ou mais membros de ligação da biblioteca que pode ligar o dito antígeno.

[00145] A biblioteca pode ser exibida em partículas ou complexos moleculares, por exemplo, pacotes genéticos replicáveis, tais como partículas de levedura, bactéria ou bacteriófago (por exemplo, T7), sistemas de exibição de vírus, células ou covalentes, de ribossomo ou outros sistemas de exibição in vitro, sendo que cada partícula ou complexo molecular contém ácido nucleico que codifica o domínio variável VH de anticorpo exibido no mesmo e opcionalmente também um domínio VL exibido se presente. A exibição de fago é descrita em WO92/01047 e, por exemplo, as patente n° US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160 e US6521404, cada uma das quais é incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade. A exibição de ribossomo é descrita em Hanes J e Plückthun A. (1997) Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 May 13;94(10):4.937 a 42; WO01/75097 e WO2006/072773, cada um dos quais é incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00146] Após a seleção de membros de ligação que podem ligar o antígeno e exibidos em bacteriófago ou outras partículas de biblioteca ou complexos moleculares, o ácido nucleico pode ser tomado de um bacteriófago ou outra partícula ou complexo molecular que exibe um dito membro de ligação selecionado. Tal ácido nucleico pode ser usado na produção subsequente de um membro de ligação ou um domínio variável VH ou VL de anticorpo por expressão de ácido nucleico com a sequência de ácido nucleico tomada de um bacteriófago ou outra partícula ou complexo molecular que exibe um dito membro de ligação selecionado.

[00147] Um domínio variável VH de anticorpo com a sequência de aminoácidos de um domínio variável VH de anticorpo de um dito membro de ligação selecionado pode ser fornecido de forma isolada, assim como um membro de ligação que compreende tal domínio VH.

[00148] A capacidade para se ligarem a Aβ1-42 e Aβ1-40 humano pode ser testada adicionalmente, também a capacidade para competir com, por exemplo, qualquer um dos anticorpos, tal como aqui enumerados (por exemplo, em formato scFv e/ou formato de IgG, por exemplo, IgG2 ou IgG1) para a ligação a Aβ1-42. A capacidade para neutralizar Aβ1-42 pode ser testada, como será aqui discutido mais adiante.

[00149] Um membro de ligação pode ligar-se a Aβ1-42 humano com a afinidade de qualquer um dos anticorpos listados nas Tabelas 5 e 6, por exemplo, scFv, IgG2, IgG1TM ou IgG1, ou com uma afinidade que é melhor. As afinidades de ligação de anticorpo são mostradas na Tabela 7. A afinidade de ligação e potencial de neutralização de diferentes membros de ligação pode ser comparada sob condições apropriadas.

[00150] As variantes dos domínios VH e VL e CDRs descritas no presente documento, incluindo aquelas para as quais as sequências de aminoácidos são representadas no presente documento, e que podem ser empregadas nos membros de ligação para Aβ1-42 podem ser obtidas por meio de métodos de alteração ou mutação de sequência e triagem por membros de ligação de antígeno com as características desejadas. Exemplos de características desejadas incluem, mas não estão limitadas a: aumento da afinidade de ligação para o antigênio em relação a anticorpos conhecidos, que são específicos para o antigênio, o aumento da neutralização de uma atividade de antigênio em relação aos anticorpos conhecidos, que são específicos para o antigênio, se a atividade é conhecida capacidade competitiva especifica com um anticorpo ou um ligando conhecido para o antigênio, numa razão molar específica, a capacidade para imunoprecipitar complexos, a capacidade para se ligar a um epítopo especifico: um epítopo linear, por exemplo, sequência de peptídeo identificado utilizando varrimento de ligação peptídeo, tal como aqui descrito, por exemplo, , utilizando peptídeos exibidos em conformação linear e/ou restrita, ou um epítopo conformacional, formado por resíduos não-contínuos; e capacidade para modular uma nova atividade biológica de Aβ1-42 humano. Tais métodos também são fornecidos no presente documento.

[00151] Variantes de moléculas de anticorpo reveladas no presente documento podem ser produzidas e usadas na presente invenção. Seguindo a liderança da química computacional na aplicação de técnicas de análise de dados multivariados para as relações entre atividade e propriedade/estrutura [consulte, por exemplo, Wold, et al. Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics-Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed.: B. Kowalski); D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holanda, 1984 (ISBN 90-277-1846-6] relações quantitativas entre atividade e propriedade de anticorpos podem ser derivadas com o uso de técnicas matemáticas bem conhecidas, tal como regressão estatística, reconhecimento de padrão e classificação [consulte, por exemplo, Norman et al. Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience; 3a edição (Abril de 1998) ISBN: 0471170828; Kandel, Abraham et al. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (11 de maio de 1995), ISBN: 0133418847; Krzanowski, Wojtek. Principles of Multivariate Analysis: A User’s Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22 (Paper)). Oxford University Press; (dezembro de 2000), ISBN: 0198507089; Witten, Ian H. et al Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann; (11 de outubro de 1999), ISBN: 1558605525; Denison David G. T. (Editor) et al Bayesian Methods for Nonlinear Classification e Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons; (julho 2002), ISBN: 0471490369; Ghose, Arup K. et al. Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery. ISBN: 0:-8247-0487, -8). As propriedades de anticorpos podem ser derivadas de modelos empíricos e teóricos (por exemplo, análise de prováveis resíduos de contato ou propriedades fisioquími-cas calculadas) de sequência de anticorpos, estruturas funcionais e tridimensionais e essas propriedades podem ser consideradas individualmente e em combinação.

[00152] Um sítio de ligação ao antigênio de um anticorpo composto por um domínio VH e um domínio VL é tipicamente formado por seis laços de polipeptídeo: três a partir do domínio de cadeia leve variável (VL) e três do domínio de cadeia pesada variável (VH). A análise de anticorpos de estrutura atômica conhecida tem relações elucidadas entre a sequência e a estrutura tridimensional de sítios de combinação de anticorpo [Chothia C. et al. Journal Molecular Biology (1992) 227, 799 a 817; Al-Lazikani, et al. Journal Molecular Biology (1997) 273(4), 927-948]. Essas relações implicam que, exceto pela terceira região (laço) nos domínios VH, os laços de sítio de ligação têm um de um pequeno número de conformações de cadeia principal: estruturas canônicas. A estrutura canônica formada em um laço particular mostrou ser determinada por seu tamanho e a presença de certos resíduos em sítios principais tanto no laço quanto em regiões de arcabouço.

[00153] Esse estudo de relação entre sequência e estrutura pode ser usado para previsão daqueles resíduos em um anticorpo de sequência conhecida, mas de uma estrutura tridimensional não conhecida, que são importantes na manutenção da estrutura tridimensional de seus laços de CDR e, portanto, mantêm especificidade de ligação. Essas previsões podem ser apoiadas por comparação das previsões à saída de experimentos de otimização principais. Em uma abordagem estrutural, um modelo pode ser criado da molécula de anticorpo [Chothia, et al. Science, 223,755 a 758 (1986)] com o uso de qualquer pacote livremente disponível ou comercial, tal como WAM [Whitelegg, N.R.u. e Rees, A.R (2000). Prot. Eng., 12, 815-824]. Um pacote de software para a visualização de proteínas e análise, tal como Insight II (Accelrys, Inc.) ou Deep View [Guex, N. and Peitsch, M.C. Electrophoresis (1997) 18, 27142723] pode então ser utilizado para avaliar as possíveis substituições em cada posição nas sequências CDR. Essas informações podem ser então usadas para fazer substituições que provavelmente têm um efeito mínimo ou benéfico sobre a atividade.

[00154] As técnicas necessárias para fazer substituições nas sequências de aminoácidos de CDR, anticorpo domínios VH ou VL e membros de ligação, estão geralmente disponíveis na técnica. As sequências variantes podem ser construídas com substituições que podem ou não ser previstas para ter um efeito mínimo ou benéfico sobre a atividade, e testadas quanto à capacidade para se ligarem a Aβ1-42 e/ou para qualquer outra propriedade desejada.

[00155] As variantes de sequência de aminoácidos de domínio variável de qualquer um dos domínios VH e VL cujas sequências são especificamente reveladas no presente documento podem ser empregadas em concordância com a presente invenção, conforme discutido.

[00156] Conforme descrito acima, os aspectos da invenção fornecem um membro de ligação, tal como uma molécula de anticorpo, que compreende um domínio VH que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com um domínio VH de qualquer um dos anticorpos listados no presente documento, para o qual as sequências de domínio VH são mostradas na listagem de sequências anexa abaixo; e/ou que compreende um domínio VL que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com um domínio VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 11, para o qual as sequências de domínio VL são mostradas na listagem de sequências anexa.

[00157] Os aspectos da invenção fornecem um membro de ligação, tal como uma molécula de anticorpo, que compreende um domínio VH que tem um conjunto de CDRs de VH que têm pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com o conjunto de CDRs de VH de qualquer um dos anticorpos listados no presente documento, para o qual as sequências de CDR de VH são mostradas no presente documento; e/ou que compreende um domínio VL que tem um conjunto de CDRs de VL que têm pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com o conjunto de CDRs de VL de qualquer um dos anticorpos listados no presente documento, para o qual as sequências de CDR de VL são mostradas no presente documento.

[00158] Os algoritmos que podem ser usados para calcular a % de identidade de duas sequências de aminoácidos incluem, por exemplo, BLAST [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405 a 410], FASTA [Pearson e Lipman (1988) PNAS USA 85: 2.444 a 2.448], ou o algoritmo de Smith-Waterman [Smith e Waterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195 a 197], por exemplo, que empregam parâmetros padrão.

[00159] Os domínios variáveis particulares podem incluir uma ou mais mutações de sequências de aminoácidos (substituição, deleção e/ou inserção de um resíduo de aminoácido) e menos que cerca de 15 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2.

[00160] As mutações podem ser feitas em uma ou mais regiões de arcabouço e/ou uma ou mais CDRs. As mutações, normalmente, não resultam na perda de função, de modo que um membro de ligação compreendendo uma sequência de aminoácidos assim alterada podem reter uma capacidade de se ligar a Aβ1-42 humano. Pode reter a mesma afinidade quantitativa de ligação ou capacidade de neutralização como um membro de ligação, em que a alteração não é realizada, por exemplo, como medido em um ensaio aqui descrito. O membro de ligação que compreende uma sequência de aminoácidos assim alterada pode ter uma capacidade melhorada de ligar a Aβ1-42 humano.

[00161] A mutação pode compreender substituir um ou mais resíduos de aminoácido com um aminoácido não padrão ou de ocorrência não natural, modificar um ou mais resíduos de aminoácido em uma forma não padrão e de ocorrência não natural ou inserir um ou mais aminoácidos não padrão ou de ocorrência não natural na sequência. Os exemplos de números e localizações de alterações em sequências da invenção são descritos em outras partes no presente documento. Os aminoácidos de ocorrência natural incluem os 20 l-aminoácidos "padrão" identificados como G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E por seus códigos de letra única padrão. Os aminoácidos não padrão incluem qualquer outro resíduo que pode ser incorporado em uma estrutura principal de polipeptídeo ou resultam da modificação de um resíduo de aminoácido existente. Os aminoácidos não padrão podem ser de ocorrência natural ou de ocorrência não natural. Diversos aminoácidos não padrão de ocorrência natural são conhecidos na técnica, tal como 4-hidroxiprolina, 5-hidroxilisina, 3-metilhistidina, N-acetilserina, etc. [Voet & Voet, Biochemistry, 2a Edição, (Wiley) 1995]. Esses resíduos de aminoácido que são derivados em sua posição N-alfa estarão apenas localizados no terminal N de uma sequência de aminoácidos. Normalmente, na presente invenção um aminoácido é um l-aminoácido, mas pode ser um d-aminoácido. A alteração pode, então, compreender a modificação de um l-aminoácido em, ou substituir o mesmo por, um d-aminoácido. As formas metiladas, acetiladas e/ou fosforiladas de aminoácidos são também conhecidas e os aminoácidos na presente invenção podem ser submetidos a tal modificação.

[00162] As sequências de aminoácidos nos domínios de anticorpo e os membros de ligação da invenção podem compreender aminoácidos não naturais ou não padrão descritos acima. Os aminoácidos não padrão (por exemplo, d-aminoácidos) podem ser incorporados em uma sequência de aminoácidos durante a síntese, ou por modificação ou substituição dos aminoácidos padrão "originais" após a síntese da sequência de aminoácidos.

[00163] O uso de aminoácidos não padrão e/ou de ocorrência não natural aumenta a diversidade estrutural e funcional e pode assim aumentar o potencial para atingir as propriedades de neutralização e ligação em um membro de ligação da invenção. Adicionalmente, d-aminoácidos e análogos têm mostrado ter perfis de farmacocinética diferentes em comparação aos l-aminoácidos padrão, devido à degradação in vivo de polipeptídeos que têm l-aminoácidos após a administração a um animal, por exemplo, um humano, que significa que os d-aminoácidos são vantajosos para algumas aplicações in vivo.

[00164] As regiões VH ou VL inovadoras que contêm sequências derivadas de CDR da invenção podem ser geradas com o uso de mutagênese aleatória de um ou mais genes VH e/ou VL selecionados para gerar mutações no interior do domínio variável inteiro. Tal técnica é descrita por Gram et al. [Gram et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580], que utilizou um PCR propenso a erros. Em algumas modalidades, uma ou duas substituições de aminoácidos são feitas no interior de um domínio variável inteiro ou conjunto de CDRs.

[00165] Outro método que pode ser usado é para direcionar a mutagênese nas regiões CDR de genes VH ou VL. Tais técnicas são reveladas por Barbas et al. [Barbas et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813] e Schier et al. [Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263:551-567].

[00166] Todas as técnicas descritas acima são conhecidas como tal na técnica e a pessoa versada será capaz de usar tais técnicas para fornecer membros de ligação da invenção com o uso de metodologia de rotina na técnica.

[00167] Um aspecto adicional da invenção fornece um método para obter um sítio de ligação de antígeno e o anticorpo para Aβ1-42 humano, sendo que o método compreender fornecer por meio de substituição, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácidos de um domínio VH representado no presente documento um domínio VH que é uma variante de sequência de aminoácidos do domínio VH, opcionalmente combinar o domínio VH assim dotado de um ou mais domínios VL e testar o domínio VH ou combinação ou combinações de VH/VL para identificar um membro de ligação ou um sítio de ligação de antígeno e o anticorpo para Aβ1-42 e opcionalmente com uma ou mais propriedades desejadas. O referido domínio VL pode ter uma sequência de aminoácidos que é substancialmente conforme representada no presente documento. Um método análogo pode ser empregado em que uma ou mais variantes de sequência de um domínio VL reveladas no presente documento são combinadas com um ou mais domínios VH.

[00168] Conforme citado acima, uma sequência de aminoácidos CDR substancialmente conforme representada no presente documento pode ser incorporada como uma CDR em um domínio variável de anticorpo humano ou uma porção substancial do mesmo. As sequências de HCDR3 substancialmente conforme apresentadas no presente documento representam modalidades da presente invenção e cada uma dessas pode ser incorporada como uma HCDR3 em um domínio variável de cadeia pesada humano ou uma porção substancial do mesmo.

[00169] Os domínios variáveis empregados na invenção podem ser obtidos ou derivados de qualquer linhagem germinativa ou domínio variável humano disposto novamente ou podem ser um domínio variável sintético com base nas sequências consenso ou real de domínios variáveis humanos conhecidos. Um domínio variável pode ser derivado de um anticorpo não humano. Uma sequência de CDR da invenção (por exemplo, CDR3) pode ser introduzida em um repertório de domínios variáveis que carecem de uma CDR (por exemplo, CDR3), com o uso de uma tecnologia de DNA recombinante. Por exemplo, Marks et al. [Marks et al Bio/Technology, 1992, 10:779 a 783] descrevem métodos para produzir repertórios de domínios variáveis de anticorpo em que os iniciadores consenso direcionados em ou adjacentes à extremidade 5' da área de domínio variável são usados em conjunto com iniciadores consenso à terceira região de arcabouço de genes VH humanos para fornecer um repertório de domínios variáveis VH que carecem de uma CDR3. Marks et al. descreve ainda como esse repertório pode ser combinado com uma CDR3 de um anticorpo particular. Com o uso de técnicas análogas, as sequências derivadas de CDR3 da presente invenção podem ser embaralhadas com repertórios de domínios VH ou VL que carecem de uma CDR3 e os domínios VH ou VL completos embaralhados combinados com um domínio VL ou VH cognato para fornecer membros de ligação da invenção. O repertório pode ser então exibido em um sistema hospedeiro adequado, tal como o sistema de exibição de fago de WO92/01047, que é incorporado ao presente a título de referência em sua totalidade ou qualquer um de um corpo grande subsequente de literatura, incluindo Kay, Winter & McCafferty [Kay, B.K., Winter, J., e McCafferty, J. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, San Diego: Academic Press], de modo que os membros de ligação adequados podem ser selecionados. Um repertório pode consistir em qualquer dentre 104 membros individuais para cima, por exemplo, pelo menos 105, pelo menos 106, pelo menos 107, pelo menos 108, pelo menos 109 ou pelo menos 1010 membros ou mais. Outros sistemas hospedeiros adequados incluem, mas sem limitações, exibição de levedura, exibição bacterina, exibição de T7, exibição viral, exibição celular, exibição de ribossomo e exibição covalente.

[00170]É fornecido um método para preparar um membro de ligação para Aβ1-42, em que o método compreende: (a) fornecer um repertório de partida de ácidos nucleicos que codificam um domínio VH que ou incluem uma CDR3 a ser substituída ou carecem de uma região de codificação de CDR3; (b) combinar o dito repertório com um ácido nucleico doador que codifica uma sequência de aminoácidos substancialmente conforme representada no presente documento para uma CDR3 de VH, por exemplo, uma CDR3 de VH mostrada na Tabela 11, de modo que o dito ácido nucleico doador seja inserido na região de CDR3 no repertório, de modo a fornecer um repertório de produto de ácidos nucleicos que codificam um domínio VH; (c) expressar os ácidos nucleicos do dito repertório de produto; (d) selecionar o membro de ligação para Aβ1-42 humano; e (e) recuperar o dito membro de ligação ou ácido nucleico que codifica para o mesmo.

[00171] Novamente, um método análogo pode ser empregado em que uma CDR3 de VL da invenção é combinado com um repertório de ácidos nucleicos que codificam um domínio VL que ou incluem uma CDR3 a ser substituída ou carecem de uma região de codificação de CDR3.

[00172] Similarmente, uma ou mais, ou todas as três CDRs podem ser enxertadas em um repertório de domínios VH ou VL que são então triados por um membro de ligação ou membros de ligação para Aβ1-42 humano.

[00173] Por exemplo, uma HCDR1, HCDR2 e/ou HCDR3, por exemplo, uma conjunto de HCDRs, de um ou mais dos anticorpos listados na Tabela 5 ou Tabela 6 pode ser empregada e/ou uma LCDR1, LCDR2 e/ou LCDR3, por exemplo, conjunto de LCDRs, de um ou mais dos anticorpos listados no presente documento pode ser empregada.

[00174] Similarmente, outros domínios VH e V, conjuntos de CDRs e conjuntos de HCDRs e/ou conjuntos de LCDRs revelados no presente documento podem ser empregados.

[00175] Uma porção substancial de um domínio variável de imunoglobulina pode compreender pelo menos as três regiões CDR, juntamente com suas regiões de arcabouço de intervenção. A porção pode também incluir pelo menos cerca de 50 % de qualquer uma ou ambas as primeira e quarta regiões de arcabouço, sendo que os 50 % são os 50 % de C-terminal da primeira região de arcabouço e os 50 % de N-terminal da quarta região de arcabouço. Os resíduos adicionais na extremidade de N-terminal ou C-terminal da parte substancial do domínio variável podem ser aqueles não normalmente associados às regiões de domínio variável de ocorrência natural. Por exemplo, a construção de membros de ligação da presente invenção feita por técnicas de DNA recombinante pode resultar na introdução de resíduos de N- ou C-terminal codificados por ligantes introduzidos para facilitar a clonagem ou outras etapas de manipulação. Outras etapas de manipulação incluem a introdução de ligantes para unir domínios variáveis da invenção às sequências de proteína adicionais incluindo regiões constante de anticorpo, outros domínios variáveis (por exemplo, na produção de diacorpos) ou identificações detectáveis/fun-cionais conforme discutido em mais detalhes em outra parte no presente documento.

[00176] Embora em alguns aspectos da invenção, os membros de ligação compreendem um par de domínios VH e VL, os domínios de ligação única com base em qualquer uma das sequências de domínio VH ou VL formam aspectos adicionais da invenção. Sabe-se que os domínios de imunoglobulina única, especialmente os domínios VH, são capazes de ligar antígenos alvo de uma maneira específica. Por exemplo, consulte a discussão de dAbs acima.

[00177] No caso de qualquer um dos domínios de ligação única, esses domínios podem ser usados para triagem de domínios complementares capazes de formar um membro de ligação de dois domínios capaz de se ligar Aβ1-42. Tal pode ser atingido por métodos de triagem de exibição de fago que usam a assim chamada abordagem combinada dupla hierárquica, conforme descrito em WO92/01047, incorporado ao presente a título de referência em sua totalidade, em que uma colônia individual que contém um clone de cadeia ou H ou L é usada para infectar uma biblioteca completa de clones que codificam a outra cadeia (L ou H) e o membro de ligação de duas cadeias resultante é selecionado em concordância com as técnicas de exibição de fago, tal como aquelas descritas nessa referência. Essa técnica é também revelada em Marks et al Bio/Technology, 1992, 10:779 a 783.

[00178] Os membros de ligação da presente invenção podem ainda compreender regiões constantes de anticorpo ou partes das mesmas, por exemplo, regiões constantes de anticorpo humano ou partes das mesmas. Por exemplo, um domínio VL pode ser ligado a sua extremidade de C-terminal aos domínios constantes de cadeia leve de anticorpo incluindo cadeias Ck ou Cà humanas. Similarmente, um membro de ligação com base em um domínio VH pode ser ligado em sua extremidade de C-terminal a toda ou parte (por exemplo, um domínio CH1) de uma cadeia pesada de imunoglobulina derivada de qualquer isotipo de anticorpo, por exemplo, IgG, IgA, IgE e IgM e qualquer uma das subclasses de isotipo, particularmente IgG2, IgG1 e IgG4. IgG2 pode ser vantajosa em algumas modalidades devido a sua falta de funções efetoras. Em outras modalidades, IgG1 pode ser vantajosa devido a sua função efetora e facilidade de fabricação. Qualquer variante de região constante sintética ou outra que tem essas propriedades e estabiliza as regiões variáveis pode ser também útil na presente invenção.

[00179] Os membros de ligação podem ser identificados com uma identificação detectável ou funcional. Assim, um membro de ligação ou molécula de anticorpo pode estar presente na forma de um imunoconju-gado de modo a obter um sinal detectável e/ou quantificável. Um imunoconjugado pode compreender uma molécula de anticorpo da invenção conjugada com uma identificação detectável ou funcional. Uma identificação detectável conforme referida no presente documento pode ser qualquer identificação que produz ou pode ser induzida para produzir um sinal, incluindo, sem limitação, fluorescentes, quemilumi-nescentes (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre), identificações coloridas (por exemplo, látex [azul] ou ouro coloidal [vermelho]), radioidentificações, enzimas, fotossensibilizadores e identificações magnéticas. A quantidade de identificação ligada a uma superfície, por exemplo, uma superfície de um furo capilar, pode ser, portanto, detectada e/ou medida por detecção da fluorescência ou luminescência, cor, radioatividade, atividade enzimática, absorvância da luz ou mudanças no campo magnético. As identificações detectáveis podem ser ligadas aos membros de ligação com o uso de química convencional. Preferencialmente, uma identificação detectável é uma identificação detectável por interrogação óptica, por exemplo, com uma câmara digital ou digitalizador de mesa. As identificações podem ser detectadas por interrogação óptica incluem fluorescentes, quemilumi-nescentes e identificações coloridas. O mecanismo através do qual um sinal pode ser gerado por detecção óptica inclui (mas não está necessariamente limitado a): a absorção de luz, dispersão de luz, difração de luz, reflexão da luz, fluorescência ou luminescência.

[00180] As identificações adequadas incluem, como forma de ilustração e não limitação, - enzimas, tal como alcalina fosfatase, glicose-6-fosfato desidrogenase ("G6PDH"), alfa-D-galactosidase, glicose oxidase, glicose amilase, carbônico anidrase, acetilcolinaesterase, lisozima, malato desidrogenase e peroxidase, por exemplo, peroxidase de rábano silvestre; - corantes; - identificações fluorescentes ou fluorescentes, tal como fluoresceína e seus derivados, fluorocromo, compostos e derivados de rodamina, GFP (GFP para "Proteína Fluorescente Verde”), dansila, umbeliferona, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeído e fluorescamina; fluoroforos tais como criptatos de lantanida e quelatos, por exemplo, Európio, etc. (Perkin Elmer e Cis Biointernational), - identificações quimioluminescentes ou quemilumines-centes, tal como isoluminol, luminol e os dioxetanos. - identificações bioluminescentes, tal como luciferase e luciferina; - sensibilizantes; - coenzimas; - substratos de enzima; - radioidentificações incluindo, mas sem limitações bromo77, carbono14, cobalto57, flúor8, gálio67, gálio68, hidrogênio3 (trítio), índio111, índio113m, iodo123m, iodo125, iodo126, iodo131, iodo133, mercúrio107, mercúrio203, fósforo32, rênio99m, rênio101, rênio105, rutênio95, rutênio97, rutênio103 , rutênio105, escândio47, selênio75, enxofre35, tecnécio99, tecnécio99m, telúrio121m, telúrio122m, telúrio125m, túlio165, túlio167, túlio168, ítrio199 e outros radioidentificadores mencionados no presente documento; - partículas, tais como partículas de látex ou carbono; metal sol; cristalita; lipossomos; células, etc., que podem ser ainda identificadas com um corante, catalisador ou outro grupo detectável; - moléculas tais como biotina, digoxigenina ou 5-bromodeoxiuridina; - porções químicas de toxina, tal como, por exemplo, uma porção química de toxina selecionada de um grupo de exotoxina de Pseudomonas (PE ou um fragmento citotóxico ou mutante do mesmo), toxina de Diptheria ou um fragmento citotóxico ou mutante do mesmo, uma toxina botulínica A, B, C, D, E ou F, ricina ou um fragmento citotóxico ou mutante do mesmo, por exemplo, ricina A, abrina ou um fragmento citotóxico das mesmas, saporina ou um fragmento citotóxico da mesma, toxina antiviral de pokeweed ou um fragmento citotóxico da mesma e briodina 1 ou um fragmento citotóxico da mesma.

[00181] Os exemplos de enzimas e coenzimas adequadas são reveladas em US4275149, e US4318980. Fluorescentes e quimiofluorescentes adequados são também revelados em US4275149. As identificações incluem ainda porções químicas, tal como biotina que pode ser detectada por meio de ligação a uma porção química detectável cognata específica, por exemplo, avidina ou estreptavidina identificada. As identificações detectáveis podem ser ligadas a anticorpos da invenção com o uso de substância química convencional na técnica.

[00182] Os imunoconjugados ou os seus fragmentos funcionais podem ser preparados por métodos conhecidos pela pessoa versada na técnica. Os mesmos podem ser acoplados a enzimas ou a identificações fluorescentes diretamente ou pelo intermediário de um grupo espaçador ou de um grupo de ligação, tal como um polialdeído, como glutaraldeído, ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA), ácido dietileno-triaminepentaacético (DPTA) ou na presença de agente de acoplamento, tal como aqueles mencionados acima para os conjugados terapêuticos. Os conjugados que contêm identificações do tipo fluoresceína podem ser preparados por reação com um isotiocianato.

[00183] Os métodos conhecidos na técnica para acoplamento dos radioisótopos terapêuticos aos anticorpos ou diretamente ou por meio de um agente de quelação, tal como EDTA, DTPA mencionada acima pode ser também usado para os radioelementos que podem ser usados na diagnose. É igualmente possível realizar identificação com sódio125 pelo método de cloramina T [Hunter W. M. e Greenwood F. C. (1962) Nature 194:495] ou de outro modo com tecnécio99m pela técnica de US4424200 ou ligado por meio de DTPA conforme descrito em US4479930.

[00184] Há inúmeros métodos pelos quais a identificação pode produzir um sinal detectável por meios externos, por exemplo, por exame visual, radiação eletromagnética, calor e reagentes químicos. A identificação pode ser também ligada a outro membro de ligação que liga o anticorpo da invenção ou a um suporte.

[00185] A identificação pode produzir diretamente um sinal e, portanto, componentes adicionais não são necessários para produzir um sinal. Inúmeras moléculas orgânicas, por exemplo, fluorescentes, são capazes de absorver luz ultravioleta e visível, em que a absorção de luz transfere energia para essas moléculas e eleva as mesmas a um estado de energia excitado. Essa energia absorvida é então dissipada por emissão de luz em um segundo comprimento de onda. Essa emissão de segundo comprimento de onda pode também transferir energia a uma molécula aceitante identificada e a energia resultante dissipada da molécula aceitante por emissão de luz, por exemplo, transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET). Outras identificações que produzem diretamente um sinal incluem isótopos radioativos e corantes.

[00186] Alternativamente, a identificação pode precisar de outros componentes para produzir um sinal e o sistema de produção de sinal poderia então incluir todos os componentes necessários para produzir um sinal mensurável, que pode incluir substratos, coenzimas, acentuadores, enzimas adicionais, substâncias que reagem com produtos enzimáticos, catalisadores, ativadores, cofatores, inibidores, sequestrantes, íons metálicos e uma substância de ligação específica para ligação de substâncias de geração de sinal. Uma discussão detalhada de sistemas de produção de sinal adequados podem ser encontrados em US5185243.

[00187] Um aspecto da invenção proporciona um método que compreende provocar ou permitir a ligação de um membro de ligação tal como aqui proporcionado para Aβ1-42. Como se observa, tal ligação pode ocorrer in vivo, por exemplo, após a administração de um membro de ligação ou ácido nucleico que codifica para um membro de ligação, ou pode ocorrer in vitro, por exemplo em ELISA, Western blotting, imunocitoquímica, imunoprecipitação, cromatografia de afinidade e os ensaios bioquímicos ou à base de células.

[00188] A presente invenção também fornece a medição de níveis de antígeno diretamente, por exemplo, em plasma ou CSF, por emprego de um membro de ligação de acordo com a invenção, por exemplo, em um sistema de biossensor. Por exemplo, um método para detectar e/ou medir a ligação a Aβ1-42 humano pode compreender (i) expor o dito membro de ligação a Aβ1-42 e (ii) detectar a ligação do dito membro de ligação a Aβ1-42, em que a ligação é detectada com o uso de qualquer método ou identificação detectável descrito no presente documento. Aβ1-42 pode ser monomérico ou oligomérico, preferencialmente Aβ1-42 monomérico. Esse e qualquer outro método de detecção de ligação descrito no presente documento pode ser interpretado diretamente pela pessoa que realiza o método, por exemplo, por observação visual de uma identificação detectável. Alternativamente, esse método, ou qualquer outro método de detecção de ligação descrito no presente documento, pode produzir um relatório na forma de uma autorradiografia, uma fotografia, uma impressão de computador, um relatório de citometria de fluxo, um gráfico, um diagrama, um tubo ou recipiente de teste ou poço que contém o resultado ou qualquer outra representação visual ou física de um resultado do método.

[00189] A quantidade de ligação do membro de ligação a Aβ1-42 pode ser determinada. A quantificação pode estar relacionada à quantidade do antígeno em uma amostra de teste, que pode ser de interesse diagnóstico. A triagem por ligação a Aβ1-42 e/ou a quantificação da mesma pode ser útil, por exemplo, na triagem de pacientes por doenças ou distúrbios referidos no presente documento e/ou qualquer outra doença ou distúrbio que envolve níveis e/ou atividade de Aβ1-42 anormal.

[00190] Um método de diagnóstico pode compreender: (i) obtenção de uma amostra de tecido ou de fluido a partir de um sujeito, por exemplo, um paciente que se suspeita ou se acredite sofrer de uma condição ou doença aqui mencionada, (ii) exposição da referida amostra de tecido ou de fluido a um ou mais membros de ligação da presente invenção; e (iii) detectar Aβ1-42 ligado em comparação com uma amostra de controle, em que um aumento na quantidade de Aβ1-42 ligado, em comparação com o controle pode indicar um nível anormal de Aβ1-42. Amostras de tecidos ou de fluidos a serem testados incluem sangue, soro, plasma, CSF, urina, material de biopsia, tumores ou qualquer tecido que se suspeita de conter níveis de Aβ1-42 anormais. Os indivíduos que testaram positivo para níveis ou atividade de Aβ1-42 anormais podem também se beneficiar dos métodos de tratamento revelados adiante no presente documento.

[00191] Aqueles versados na técnica são capazes de escolher um modo adequado para determinar a ligação do membro de ligação a um antígeno de acordo com sua preferência e conhecimento geral, à luz dos métodos revelados no presente documento.

[00192] As reatividades dos membros de ligação em uma amostra podem ser determinadas por qualquer meio apropriado. Radioimuno-ensaio (RIA) é uma possibilidade. O antígeno com identificação radioativa é misturado com antígeno não identificado (a amostra de teste) e permitido se ligar ao membro de ligação. O antígeno ligado é fisicamente separado do antígeno não ligado e a quantidade de antígeno radioativo ligado ao membro de ligação determinada. Quanto mais antígeno há na amostra de teste, menor antígeno radioativo se ligará ao membro de ligação. Um ensaio de ligação competitiva pode ser também usados com o antígeno não reativo, com o uso de antígeno ou um análogo ligado a uma molécula repórter. A molécula repórter pode ser um fluorocromo, fosfor ou corante de laser com características de emissão ou absorção isoladas espectralmente. Os fluorocromos adequados incluem fluoresceína, rodamina, ficoeritrina e Texas Red e quelatos ou criptatos de lantanida. Os corantes cromogê-nicos adequados incluem diaminobenzidina.

[00193] Outros repórteres incluem partículas coloidais macromole-culares ou material particulado, tal como microesferas de látex que são coloridas, magnéticas ou paramagnéticas, e agentes biologicamente ou quimicamente ativos que podem fazer direta ou indiretamente com que sinais detectáveis sejam visualmente observados, eletronicamente detectados ou de outro modo registrados. Essas moléculas podem ser enzimas, que catalisam reações que desenvolvem ou mudam as cores ou provocam mudanças nas propriedades elétricas, por exemplo. As mesmas podem ser excitáveis em nível molecular, de modo que as transições eletrônicas entre os estados de energia resultem em absorções ou emissões espectrais características. As mesmas incluem entidades químicas usadas em conjunto com biossensores. Sistemas de detecção de Biotina/avidina ou biotina/estreptavidina e alcalina fosfatase podem ser empregados.

[00194] Os sinais gerados por conjugados de membro de ligação-repórteres individuais podem ser usados para derivar dados absolutos ou relativos quantificáveis da ligação de membro de ligação relevante nas amostras (normal e teste).

[00195] Um kit que compreende um membro de ligação conforme descrito no presente documento é também fornecido como um aspecto da presente invenção. No kit, o membro de ligação pode ser identificado para permitir que sua reatividade em uma amostra seja determinada, por exemplo, conforme descrito adicionalmente abaixo. Ademais, o membro de ligação pode ou não ser ligado a um suporte sólido. Os componentes de um kit são em geral estéreis e estão em frascos vedados ou outros recipientes. Os kits podem ser empregados em análise diagnóstica ou outros métodos para os quais os membros de ligação são úteis. Um kit pode ser para uso em um método descrito acima. Um kit pode conter instruções para uso dos componentes em um método, por exemplo, um método em concordância com a presente invenção. Materiais de apoio para auxiliar em ou possibilitar a realização de tal método podem ser incluídos dentro de um kit da invenção. Os materiais de apoio incluem um segundo membro de ligação diferente, que se liga ao primeiro membro de ligação e é conjugado a uma identificação detectável (por exemplo, uma identificação fluorescente, isótopo radioativo ou enzima). Os kits à base de anticorpo pode também compreender microesferas para conduzir uma imunoprecipitação. Cada componente dos kits está em geral em seu próprio recipiente adequado. Assim, esses kits em geral compreendem recipientes distintos adequados para cada membro de ligação. Ademais, os kits podem compreender instruções para realizar o ensaio e métodos para interpretar e analisar os dados resultantes do desempenho do ensaio.

[00196] A presente invenção também fornece o uso de um membro de ligação conforme o anterior para medir os níveis de antígeno em um ensaio de competição, ou seja, um método para medir o nível de antígeno em uma amostra por emprego de um membro de ligação conforme fornecido pelo presente invenção em um ensaio de competição. Isso pode ocorrer nos casos em que a separação física de antígeno ligado de não ligado não é necessária. A ligação de uma molécula repórter ao membro de ligação de modo que uma mudança física o óptica ocorra na ligação é uma possibilidade. A molécula repórter pode gerar direta ou indiretamente sinais detectáveis, que podem ser quantificáveis. A ligação de moléculas repórter pode ser direta ou indireta, covalente, por exemplo, por meio de uma ligação de peptídeo, ou não covalente. A ligação por meio de uma ligação de peptídeo pode ser um resultado de expressão recombinante de uma fusão de gene que codifica anticorpo e molécula repórter.

[00197] A competição entre os membros de ligação pode ser avaliada facilmente in vitro, por exemplo, com o uso de ELISA e/ou por um ensaio de competição bioquímico tal como uma que etiqueta uma molécula repórter específica a um membro de ligação que pode ser detectado na presença de um ou mais outros membros de ligação não etiquetados, para possibilitar a identificação de membros de ligação que ligam o mesmo epítopo ou um epítopo de sobreposição. Tais métodos são bem conhecidos por um versado na técnica e são descritos em mais detalhes no presente documento.

[00198] A presente invenção se estende a um membro de ligação que compete pela ligação a Aβ1-42 humano com qualquer membro de ligação definido no presente documento, por exemplo, qualquer um dos anticorpos listados nas Tabelas 5 e 6, por exemplo, em formato IgG2, IgG1 ou mutação tripla de IgG1 ("TM"; Oganesyan et al. (2008) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64(Pt 6):700-4). A competição entre os membros de ligação pode ser avaliada facilmente in vitro, por exemplo, por etiquetamento de uma molécula repórter específica a um membro de ligação que pode ser detectado na presença de outro(s) membro(s) de ligação não etiquetado(s), para possibilitar a identificação de membros de ligação que ligam o mesmo epítopo ou um epítopo de sobreposição. A competição pode ser determinada, por exemplo, com o uso de ELISA em que Aβ1-42 é imobilizada em uma placa e um primeiro membro de ligação etiquetado ou identificado juntamente com um ou mais outros membros de ligação não etiquetados ou não identificados é adicionada à placa. A presença de um membro de ligação não etiquetado que compete com o membro de ligação etiquetado é observada por uma diminuição no sinal emitido pelo membro de ligação etiquetado.

[00199] Os ensaios de competição podem ser também usados em mapeamento de epítopo. Em uma ocorrência, o mapeamento de epítopo pode ser usado para identificar o epítopo ligado a a um membro de ligação que opcionalmente pode ter características de neutralização e/ou modulação otimizadas. Tal epítopo pode ser linear ou conformacional. Um epítopo conformacional pode compreender, pelo menos, dois fragmentos diferentes de Aβ, em que os referidos fragmentos são posicionados na proximidade uns dos outros quando o peptídeo Aβ é dobrado na sua estrutura terciária ou quaternária para formar um epítopo conformacional que é reconhecido por um inibidor de Aβ, tal como um membro de ligação Aβ. No teste da competição de um fragmento peptídico do antigênio pode ser empregue, em especial um peptídeo incluindo ou consistindo essencialmente de um epítopo de interesse. Um peptídeo que tem a sequência de epítopo mais um ou mais aminoácidos em qualquer extremidade pode ser usado. Os membros de ligação de acordo com a presente invenção podem ser tais que sua ligação para antígeno seja inibida por um peptídeo com ou incluindo a sequência dada.

[00200] Em aspectos adicionais, a invenção fornece um ácido nucleico isolado que compreende uma sequência que codifica um membro de ligação, domínio VH e/ou domínio VL de acordo com a presente invenção e métodos para preparar um membro de ligação, um domínio VH e/ou um domínio VL da invenção, que compreende expressar o dito ácido nucleico sob condições para ocasionar a produção do dito membro de ligação, domínio VH e/ou domínio VL e recuperar o mesmo. Exemplos de sequências de ácidos nucleicos codificadoras encontram-se nas Tabelas e listagem de sequências em anexo. As sequências de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção podem compreender ADN ou ARN e podem ser inteira ou parcialmente sintéticas. A referência a uma sequência de nucleotídeos conforme representada no presente documento inclui uma molécula de ADN com a sequência especificada e inclui uma molécula de ARN com a sequência especificada em que U é substituída por T, a não ser que o contexto exija de outra forma.

[00201] A presente invenção também proporciona construções na forma de plasmídeos, vectores, tais como um plasmídeo ou um vector fágico, transcrição ou cassetes de expressão que compreendem pelo menos um polinucleótido, como acima, por exemplo, operacionalmente ligado a um elemento regulador.

[00202] Um aspecto adicional fornece uma célula hospedeira que contém ou é transformada com ácidos nucleicos e/ou vetores da invenção. A presente invenção também fornece uma linhagem celular hospedeira recombinante que compreende um ou mais construtos conforme o anterior. Uma sequência de ácidos nucleicos que codifica qualquer CDR ou conjunto de CDRs ou domínio VH ou domínio VL ou sítio de ligação de antígeno e anticorpo ou molécula de anticorpo, por exemplo, scFv ou IgG (por exemplo, IgG2, IgG1 ou IgG1TM) conforme fornecido, forma um aspecto da presente invenção, juntamente com um método para produção do produto codificado, em que o método compreende a expressão de sequências de ácidos nucleicos de codificação dos mesmos. A expressão pode ser convenientemente atingida por cultivo de células hospedeiras recombinantes que contêm o ácido nucleico sob condições apropriadas. Após a produção por expressão, um domínio VH ou VL ou membro de ligação pode ser isolado e/ou purificado com o uso que qualquer técnica adequada, então usados conforme apropriado.

[00203] Por conseguinte, outro aspecto fornece um método para produção de um domínio variável VH de anticorpo, sendo que o método inclui provocar a expressão de sequências de ácidos nucleicos de codificação. Tal método pode compreender cultivar células hospedeiras sob condições para a produção do dito domínio variável VH de anticorpo.

[00204] Métodos análogos para a produção de domínios variáveis VL e membros de ligação que compreendem um domínio VH e/ou VL são fornecidos como aspectos adicionais da presente invenção.

[00205] Um método para produção pode compreender uma etapa de isolamento e/ou purificação do produto. Um método para produção pode compreender formular o produto em uma composição que inclui pelo menos um componente adicional, tal como um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00206] Os sistemas para clonagem e expressão de um polipep-tídeo em uma variedade de células hospedeiras diferentes são bem conhecidos. As células hospedeiras adequadas incluem bactérias, células mamíferas, células vegetais, fungos filamentosos, sistemas de baculovírus e levedura e animais e plantas transgênicas. A expressão de fragmentos de anticorpos e antigênios em células procariotas está bem estabelecido na técnica. Para uma análise, consulte, por exemplo Plückthun [Plückthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)]. Um hospedeiro bacteriano comum é E. coli.

[00207] A expressão em células eucariontes em cultura está também disponíveis àqueles versados na técnica como uma opção para a produção de um membro de ligação [Chadd HE e Chamow SM (2001) Current Opinion in Biotechnology 12: 188 a 194; Andersen DC e Krummen L (2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 117; Larrick JW e Thomas DW (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:411 a 418].

[00208]As linhagens celulares mamíferas disponíveis na técnica para a expressão de um polipeptídeo heterólogo incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, células de rim de hamster filhote, células de melanoma de camundongo NS0, células de mieloma de rato YB2/0, células de rim embrionário humano, células de retina embrionária humana e muitas outras.

[00209] Os vetores adequados podem ser encolhidos ou construídos, contendo sequências reguladoras apropriadas, incluindo sequências promotoras, sequências terminadoras, sequências de poliadenilação, sequências acentuadoras, genes marcadores e outras sequências conforme apropriado. Os vetores podem ser plasmídeo, por exemplo, fagomídeo ou virais, por exemplo, fago, conforme apropriado [Sambrook e Russell, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3a edição, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press]. Muitas técnicas e protocolos conhecidos para manipulação de ácido nucleico, por exemplo, na preparação de construtos de ácido nucleico, mutagênese, sequenciamento, introdução de DNA em células e expressão de gene e análise de proteínas são descritos em detalhes em Ausubel et al. [Ausubel et al. eds., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 4a edição 1999].

[00210] Um aspecto adicional da presente invenção fornece uma célula hospedeira que contém ácido nucleico conforme aqui revelado. Tal célula hospedeira pode estar in vitro e pode estar em cultura. Tal célula hospedeira pode estar in vivo. A presença in vivo da célula hospedeira pode permitir a expressão intracelular dos membros de ligação da presente invenção como “intracorpos” ou anticorpos intracelular. Os intracorpos podem ser usados para terapia gênica.

[00211] Outro aspecto fornece um método que compreende introduzir ácido nucleico da invenção em uma célula hospedeira. A introdução pode empregar qualquer técnica disponível. Para células eucariontes, as técnicas adequadas podem incluir transfecção de fosfato de cálcio, DEAE-Dextrano, eletroporação, transfecção mediada por lipossomo e transdução com o uso de retrovírus ou outro vírus, por exemplo, Vaccinia ou, para células de inseto, Baculovírus. A introdução de ácido nucleico na célula hospedeira, particularmente uma célula eucarionte, pode usar um sistema à base de plasmídeo ou viral. O sistema de plasmídeo pode ser mantido por epissomo ou pode ser incorporado na célula hospedeira ou em um cromossomo artificial. A incorporação pode ser por integração ou aleatória ou alvejada de uma ou mais cópias em locais únicos ou múltiplos. Para células bacterianas, as técnicas adequadas podem incluir transformação de cloreto de cálcio, eletroporação e transfecção com o uso de bacteriófago.

[00212] A introdução pode ser seguida por provocação ou permissão de expressão do ácido nucleico, por exemplo, por cultivo de células hospedeiras sob condições para expressão do gene. A purificação do produto expresso pode ser atingida por métodos conhecidos por um versado na técnica.

[00213] O ácido nucleico da invenção pode ser integrado no genoma (por exemplo, cromossomo) da célula hospedeira. A integração pode ser promovida por inclusão de sequências que promovem a recombinação com o genoma, em concordância com técnicas padrão.

[00214] A presente invenção também fornece um método que compreende usar um construto conforme determinado acima em um sistema de expressão a fim de expressar um membro de ligação ou polipeptídeo conforme o anterior.

[00215] Os membros de ligação de acordo com a invenção podem ser usados no tratamento (que pode incluir tratamento profilático) de uma doença ou distúrbio no corpo humano ou animal (por exemplo, em um paciente humano), que compreende a administração do membro de ligação ao paciente. As condições tratáveis de acordo coma invenção são descritas em outra parte do documento, incluindo o tratamento preventivo e redução da severidade da condição ou um ou mais de seus sintomas, ou atrasar ou reduzir o risco de início.

[00216] Dessa forma, a invenção fornece um método para tratar ou reduzir a severidade de pelo menos um sintoma de qualquer uma das condições aqui mencionadas, que compreende administrar em um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um ou mais membros de ligação da presente invenção sozinhos ou em um regime terapêutico combinado com outro medicamento apropriado conhecido na técnica ou descrito no presente documento de modo que a severidade de pelo menos um sintoma de qualquer um dos distúrbios acima é reduzida.

[00217] O termo "dose eficaz" é definido como uma quantidade suficiente para curar ou pelo menos deter parcialmente a doença e as suas complicações em um paciente que já sofre da doença.

[00218] A presente invenção é dirigida, inter alia, para o tratamento da doença de Alzheimer e outras doenças amiloidogênicas, por administração de anticorpo terapêutico da invenção a um paciente em condições que geram uma resposta terapêutica benéfica no paciente (por exemplo, uma redução de Aβ1-42 no CSF, uma redução da carga da placa, inibição da formação de placas, redução da distrofia de neuritos, melhoria na função cognitiva, e/ou inversão, redução ou prevenção do declínio cognitivo) no paciente, por exemplo, para a prevenção ou tratamento de uma doença amiloidogênica.

[00219] Tal como aqui utilizado, "tratamento" é definido como a aplicação ou administração de um agente terapêutico a um paciente, que sofre de uma doença ou condição associada com amiloidose; ou um sintoma de, ou predisposição para uma tal doença ou condição associada com amiloidose, com a finalidade de curar, sarar, aliviar, atenuar, alterar, remediar, melhorar ou afectar a doença, condição, seus sintomas ou a predisposição para esta.

[00220] A invenção proporciona métodos para prevenir ou tratar uma doença associada com depósitos de amilóides de Aβ no cérebro de um paciente. Tais doenças incluem a doença de Alzheimer, síndrome de Down, e comprometimento cognitivo. A deterioração cognitiva pode ocorrer com ou sem outras características de uma doença amiloidogênica. A invenção proporciona métodos de tratamento de degeneração macular, uma condição que é associada com Aβ. Os métodos da invenção podem envolver a administração de uma dose eficaz a um paciente de um anticorpo que se liga especificamente a 1-42 Aβ e seus truncados N-terminal. Tais métodos são particularmente úteis para a prevenção ou o tratamento da doença de Alzheimer em pacientes humanos.

[00221] Os anticorpos da invenção podem ser utilizados em regimes terapêuticos para prevenir ou melhorar a neuropatologia e, nalguns doentes, a deterioração cognitiva associada com a doença de Alzheimer.

[00222] Os pacientes passíveis de tratamento incluem pacientes que apresentam sintomas e também os indivíduos em risco de doença, mas que não apresentem sintomas. Para a doença de Alzheimer, qualquer pessoa está, potencialmente, em risco se ele ou ela vive por um tempo suficientemente longo. Os anticorpos da invenção podem ser administrados de forma profilática a um sujeito, sem qualquer avaliação do risco do paciente. Os pacientes receptivos ao tratamento incluem indivíduos que têm um risco genético conhecido da doença de Alzheimer, por exemplo, indivíduos que têm parentes de sangue com esta doença, e aqueles cujo risco é determinado por análise de marcadores genéticos ou bioquímicos. Os marcadores genéticos de predisposição para a doença de Alzheimer incluem mutações no gene APP, em particular mutações na posição 717 e posição 670 e 671 referida como mutações Hardy e Swedish, respectivamente. Outros marcadores de risco são as mutações nos genes da presenilina, PS1 e PS2, e ApoE4, uma história familiar de DA, hipercolesterolemia ou aterosclerose. Os indivíduos que sofrem de doença de Alzheimer podem ser diagnosticada pela característica de demência associada com a doença, bem como pela presença dos factores de risco descritos acima. Um número de testes de diagnóstico estão disponíveis para auxiliar na identificação da doença de Alzheimer num indivíduo. Estes incluem a medição dos níveis de CSF tau e Aβ1-42. Níveis elevados de tau e baixos de Aβ1-42 podem significar a presença de DA. Os indivíduos que sofrem de doença de Alzheimer, também podem ser diagnosticados por critérios NINCDS-ADRDA ou DSM-IV-TR.

[00223] Em pacientes assintomáticos, o tratamento pode começar em qualquer idade (por exemplo, 10, 20, 30). Geralmente, o tratamento é iniciado numa fase mais tarde da vida, por exemplo, quando um paciente chega às idades de 40, 50, 60 ou 70. O tratamento pode envolver doses múltiplas ao longo de um período de tempo, que pode ser durante o tempo de vida restante do paciente. A necessidade para a administração de doses repetidas pode ser monitorizada por medição dos níveis de anticorpos ao longo do tempo.

[00224] Para a profilaxia, as composições farmacêuticas ou os medicamentos são administrados a um paciente susceptível a, ou de outra forma em risco de, doença de Alzheimer, numa quantidade suficiente para eliminar ou reduzir o risco, diminuir a gravidade, ou atrasar o início da doença, incluindo bioquímica, histológica, deterioração cognitiva e/ou sintomas comportamentais da doença, suas complicações e fenótipos patológicos intermédios apresentados durante o desenvolvimento da doença. Para aplicações terapêuticas, as composições ou medicamentos são administrados a um paciente suspeito de, ou que já sofre de uma tal doença, numa quantidade suficiente para curar, ou pelo menos deter parcialmente, os sintomas da doença (bioquímica, histológica, deterioração cognitiva e/ou comportamentais), incluindo as suas complicações patológicas e fenótipos intermediários no desenvolvimento da doença.

[00225] A invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo que compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade de um ou mais membros de ligação da presente invenção sozinho ou em um regime terapêutico combinado com outro medicamento apropriado na técnica ou descrito no presente documento. Um método de tratamento pode compreender a administração de uma quantidade eficaz de um membro de ligação aqui descrito a um paciente em necessidade do mesmo, em que os níveis de Aβ1-42 são diminuídos no plasma sanguíneo e/ou CSF.

[00226] Um método de tratamento pode compreender (i) identificação de um paciente com uma patologia associada com amiloidose, tal como aqui mencionado, e (ii) a administração de uma quantidade eficaz de um membro de ligação aqui descrito ao paciente, em que os níveis de Aβ1-42 são reduzidos no sangue no plasma e/ou CSF e a amiloidose é reduzida. Uma quantidade eficaz é uma quantidade que diminui o nível de Aβ1-42, de modo a diminuir ou reduzir a severidade de pelo menos um sintoma da doença ou distúrbio particular que é tratado, mas não necessariamente cura a doença ou distúrbio.

[00227] A invenção também fornece um método de antagonizar pelo menos um efeito de Aβ1-42 que compreende colocar em contato com ou administrar uma quantidade eficaz de um ou mais membros de ligação da presente invenção de modo que o dito pelo menos um efeito de Aβ1-42 seja antagonizado.

[00228] Dessa forma, aspectos adicionais da invenção fornecem métodos de tratamento que compreendem a administração de um membro de ligação conforme fornecido, composições farmacêuticas que compreendem tal membro de ligação e uso de tal membro de ligação na fabricação de um medicamento para a administração, por exemplo, em um método para produzir um medicamento ou composição farmacêutica que compreende formular o membro de ligação com um excipiente farmaceuticamente aceitável. Um excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser um composto ou uma combinação de compostos que entram em uma composição farmacêutica que não provoca reações secundárias e que permite, por exemplo, a facilitação da administração do membro de ligação, um aumento em sua vida útil e/ou em sua eficácia no corpo, um aumento em sua solubilidade na solução ou de outro modo um aprimoramento em sua conservação. Esses veículos farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos e serão adaptados pela pessoa versada na técnica como uma função da natureza e do modo de administração do(s) composto(s) ativo(s) escolhido(s).

[00229] Os membros de ligação conforme descrito no presente documento serão usualmente administrados na forma de uma composição farmacêutica, que pode compreender pelo menos um componente adicionalmente ao membro de ligação. Assim, as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, e para utilização de acordo com a presente invenção, podem compreender, em adição ao membro de ligação, um excipiente, transportador, tampão, estabili-zante ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis, bem conhecidos pelos peritos na técnica. Tais materiais devem ser não tóxicos e não devem interferir com a eficácia do ingrediente ativo. A natureza exata do transportador ou outro material dependerá da via de administração.

[00230] Para formulações injetáveis, por exemplo, injeção intravenosa ou subcutânea, o ingrediente ativo será na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável que é livre de pirogênio e tem um pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Os membros de ligação conforme descrito no presente documento podem ser formulados nas formas líquida, semissólida ou sólida dependendo das propriedades físico-químicas da molécula e a via de entrega. As formulações podem incluir excipientes, ou combinações de excipientes, por exemplo: açúcares, aminoácidos e surfactantes. As formulações líquidas podem incluir uma ampla faixa de concentrações de anticorpo e pH. As formulações sólidas podem ser produzidas por liofilização, secagem por aspersão ou secagem por tecnologia de fluido supercrítica, por exemplo. O tratamento pode ser dado por injeção (por exemplo, via subcutânea ou via intravenosa). O tratamento pode ser administrado pela infusão de pulso, particularmente com doses decrescentes do membro de ligação. A via de administração pode ser determinada pelas características físico-químicas do tratamento, por considerações especiais para a doença ou pela necessidade de otimizar a eficácia ou minimizar os efeitos colaterais. Uma via particular de administração é a intravenosa. Outra via de administrar as composições farmacêuticas da presente invenção é a subcutânea. A injeção subcutânea com o uso de um dispositivo sem agulha é também vantajosa.

[00231] Um composição pode ser administrada sozinha ou em combinação com outros tratamentos, ou simultânea ou sequencialmente dependendo da condição a ser tratada.

[00232] Um membro de ligação pode ser usado como parte de uma terapia de combinação em conjunto com um componente medicinal adicional. Os tratamentos de combinação podem ser usados para fornecer efeitos sinergéticos significantes, particularmente a combinação de um membro de ligação com um ou mais outros fármacos. Um membro de ligação pode ser administrado concorrente ou sequencialmente ou como uma preparação combinada com outro agente ou agentes terapêuticos, para o tratamento de uma ou mais das condições listadas no presente documento.

[00233] Um membro de ligação e um ou mais dos componentes medicinais adicionais acima podem ser usados na fabricação de um medicamento. O medicamento pode ser para administração separada ou combinada a um indivíduo e, dessa forma, pode compreender o membro de ligação e o componente adicional como uma preparação combinada ou como preparações separadas. As preparações separadas podem ser usadas para facilitar a administração separada e sequencial ou simultânea e permitir a administração dos componentes por diferentes vias, por exemplo, administração oral e parenteral.

[00234] As composições fornecidas podem ser administradas a mamíferos. A administração é normalmente em uma “quantidade terapeuticamente eficaz”, isso sendo suficiente para mostrar benefício a um paciente. Tal benefício pode ser pelo menos melhora de pelo menos um sintoma. A quantidade real administrada e a taxa e curso de tempo de administração dependerão da natureza e severidade do que é tratado, do mamífero particular que é tradado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o sítio de entrega da composição, o tipo de membro de ligação, o método de administração, a programação de administração e outros fatores conhecidos por praticantes de medicina. A prescrição de tratamento, por exemplo, decisões sobre a dosagem, etc, faz parte da responsabilidade de praticantes de medicina e outros doutores médicos e pode depender da severidade dos sintomas e/ou progressão de uma doença que é tratada. Uma quantidade terapeuticamente eficaz ou dose adequada de um membro de ligação da invenção pode ser determinada por comparação de sua atividade in vitro e atividade in vivo em um modelo animal. Os métodos para extrapolação de dosagens eficazes em animais de teste para humanos são conhecidos. A dose precisa dependerá de inúmeros fatores, incluindo se o anticorpo é para diagnose, prevenção ou para tratamento, o tamanho e o local da área a ser tratada, a natureza precisa do anticorpo (por exemplo, anticorpo inteiro, fragmento ou diacorpo) e a natureza de qualquer identificação detectável ou outra molécula ligada ao anticorpo. Uma dose de anticorpo típica estará na faixa de 100 μg a 1 g para aplicações sistêmicas. Uma dose de carregamento mais alto inicial, seguida por uma ou mais doses menores pode ser administrada. Tipicamente, o anticorpo será um anticorpo inteiro, por exemplo, o isotipo IgG1 ou IgG1-TM. Os tratamentos podem ser repetidos em intervalos diários, duas vezes por semana, semanais ou mensais na discrição do médico. Os tratamentos podem ser a cada duas a quatro semanas para administração subcutânea e a cada quatro a oito semanas para administração intravenosa. O tratamento pode ser periódico e o período entre administrações é de cerca de duas semanas ou mais, por exemplo, cerca de três semanas ou mais, cerca de quatro semanas ou mais ou cerca de uma vez por mês.

[00235] Vários aspectos e modalidades adicionais da presente invenção serão aparentes àqueles versados na técnica em vista da presente revelação.

[00236] Todos os documentos, incluindo referências de base de dados e números de acesso, patentes, pedidos e publicações de patente, mencionados nesse relatório descritivo são incorporados ao presente a título de referência em sua totalidade para todos os fins.

[00237]"e/ou", quando usado aqui, deve ser tomado como uma divulgação específica de cada uma das duas características ou componentes especificados com ou sem o outro. Por exemplo, “A e/ou B” é tomado como revelação específica de cada um dentre (i) A, (ii) B e (iii) A e B, apenas como se cada um fosse representado individualmente no presente documento.

[00238] A não ser que o contexto determine de outro modo, as descrições e definições dos recursos representados acima não são limitadas a qualquer aspecto ou modalidade particular da invenção e se aplicam igualmente a todos os aspectos e modalidades que são descritos.

[00239] Certos aspectos e modalidades da invenção serão agora ilustrados por meio de exemplo e com referência às figuras e tabelas anexas.

Exemplos

[00240] As sequências seguintes foram depositadas com NCIMB, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA. Escócia, Reino Unido: E. coli TOP10 células Abet0007 = NCIMB 41889 E. coli TOP10 células Abet0380-GL = NCIMB 41890 E. coli TOP10 células Abet0144-GL = NCIMB 41891 E. coli TOP10 células Abet0377-GL = NCIMB 41892 Data de depósito = 02 de novembro de 2011

Exemplo 1 Geração de anticorpos específicos anti-amilóide beta 1-42 e seleção do principal 1.1 Formulação de peptídeos beta-amilóide

[00241] O peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado humano (rPeptide, EUA; cat: A1117 ou Bachem AG, Suíça; cat: H-5642) foi ressuspenso em 1 mg/mL em solução de hidróxido de amônio a 1% (v/v) e armazenado em alíquotas a -80° C até serem necessárias. Idêntico procedimento foi seguido para o peptídeo amilóide beta 1-42 não marcado (Anaspec, EUA; cat: 64129), peptídeo amilóide beta 1-40 não marcado (rPeptide, EUA; cat: A1155), peptídeo amilóide beta 1-40 biotinilado (rPeptide, EUA; cat: A111 ou Bachem AG, Suíça; cat: H-5914), peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado de murino (Anaspec, EUA; cat: 61718-01) e peptídeo beta-amilóide 1-40 biotinilado de murino (Anaspec, EUA; cat: 61717).

1.2 Seleções

[00242] A biblioteca de exibição de fagos Fab310-Lambda (Dyax, EUA) clonado num vector de fagemídeo com base no fago filamentoso M13 foi usado para a seleção (Hoet et al., 2005). Anticorpos Fab específicos anti-amilóide beta 1-42 foram isolados a partir das bibliotecas de apresentação de fagos utilizando uma série de ciclos de seleção em beta-amilóide 1-42 biotinilado humano sintético (rPeptide, EUA) essencialmente como anteriormente descrito (Hawkins et al., 1992, Vaughan et al., 1996). Em resumo, para o primeiro ciclo de seleções em fase de solução, beta-amilóide 1-42 biotinilado em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS, pH 7,4) foi adicionado às partículas de fago purificadas que tinham sido pré-incubadas durante 1 hora em Marvel-PBS (3% p/v) contendo um excesso de 100 vezes de peptídeo beta-amilóide 1-40 humano não marcado (Anaspec, EUA). Partículas de fago que se ligavam ao peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado foram capturadas usando esferas paramagnéticas de estreptavidina acopladas (Invitrogen Life Technologies, UK) e o fago fracamente ligado foi removido por uma série de ciclos de lavagem com PBS-Tween (0,1% v/v). As partículas de fagos ligadas foram eluídas das esferas, infectadas em bactérias E. coli TG1 e resgatados para a próxima rodada de seleção (Vaughan et al., 1996). Dois ciclos de seleção subsequentes foram realizados como anteriormente descrito, mas com uma concentração reduzida de antigênio beta-amilóide 1-42 biotinilado.

1.3 Identificação de clones específicos de beta-amilóide 1-42 usando um ensaio de ligação direta em fragmentos Fab não purificados

[00243] Para produzir fragmentos Fab de cadeia simples solúveis (sFab) o gene III foi retirado da cassete que contém Fab310-Lambda usando técnicas de clivagem e de ligação padrão. Resumidamente, os vectores de fagemídeo foram isolados a partir do resultado do ciclo 3 utilizando kits de purificação de ADN padrão (QIAgen, UK) e a sequência do gene III foi removida a partir do vector utilizando uma digestão de restrição MluI (Hoet et al., 2005). Os vetores religados foram transformados novamente em células TG1 e as colônias individuais foram escolhidas para análise.

[00244] sFab não purificado de preparações periplásmicas foram triados em um ensaio de ligação de receptor e ligante de fluorescência resolvida no tempo homogêneo (HTRF™, CisBio International, França) com o uso de um leitor de placa EnVision (PerkinElmer, EUA). Neste ensaio, a ligação de sFab não purificado ao peptídeo beta-amilóide 142 humano foi avaliada através da medição da transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) entre sFab etiquetada com histidina e o peptídeo biotinilado utilizando criptato de estreptavidina e reagentes de detecção anti-6His-XL665 (CisBio Internacional, França; cat: 610SAKLB e 61HISXLB respectivamente). Os resultados da seleção foram testados como extractos periplasmáticos bacterianas impuros contendo sFab, preparado em 50 mM de MOPS pH 7,4, 0,5 mM de EDTA e 0,5 M de sacarose. Dez microlitros de amostras sFab não purificadas foram adicionados a uma placa de ensaio de 384 poços Costar® (Corning, EUA; cat: 3676). Tal foi seguido pela adição de 5 μL de 20 nM beta-amilóide 1-42 humano sintético e 5 μL de uma solução combinada de 6 nMcriptato de estreptavidina e 20 nM anti-his-XL665. Os poços de ligação não específica (controles negativos) foram definidos para cada placa utilizando um controle negativo de sFab não purificada em vez da amostra de sFab. Clones sFab de reatividade cruzada foram identificados utilizando um ensaio concorrente com o peptídeo beta-amilóide 1-40. Todas as diluições foram realizadas em 50 mM de MOPS pH 7,4 (Sigma, Reino Unido; cat: M9381) contendo 0,4 M KF (BDH Chemicals, EUA; cat: 103444T), 0,1% soro de albumina bovina livre de ácidos gordos (Sigma, UK; cat: A6003) e 0,1% Tween 20 (v/v) (Sigma, UK; cat: P2287) (tampão de ensaio). As placas de ensaio foram incubadas durante 4 horas à temperatura ambiente antes da leitura da fluorescência resolvida por tempo de leitura num leitor de placas EnVision (Perkin Elmer, EUA) utilizando um comprimento de onda de excitação de 320 nm e medindo a emissão a 620 nm e 665 nm (100 flashes).

[00245] Os dados foram analisados por cálculo da % de valores de Delta F para cada amostra. Delta F foi determinado de acordo com a equação 1. Equação 1:

1.4 Ensaio de ligação direta de fragmentos sFab purificados

[00246] Extratos de sFab de periplasma não purificado que apresentaram ligação específica ao peptídeo beta-amilóide 1-42 humano por ensaio de HTRF™ foram submetidos a sequenciação de ADN (Osbourn et al, 1996; Vaughan et al, 1996). Os sFab com sequências proteicas únicas foram expressos em E. coli e purificados por cromatografia de afinidade (essencialmente como descrito (Bannister et al., 2006)). O perfil de ligação de beta-amiloide de cada sFab purificado foi determinado por testagem de uma série de diluições do sFab purificado no ensaio HTRF™ descrito na seção 1.3, substituição da preparação periplástica de sFab não purificado com o sFab purificado. Os sFab purificados foram testados simultaneamente para a ligação ao peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado humano, peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado de murino e peptídeo beta-amilóide 1-40 biotinilado humano. Adicionalmente, sFab foram testados quanto à ligação a peptídeo beta-amilóide 1-42 humano alterado (Anaspec, síntese por encomenda) numa experiência de HTRF™ em separado, a fim de controlar de qualquer peptídeo de ligação não específica. Os dados foram analisados por cálculo dos valores de % de Delta F conforme descrito na seção 1.3.

[00247] Exemplos de resultados para Abet0007 sFab purificado são mostrados na Figura 1. Estes resultados demonstram que Abet0007 liga-se especificamente ao peptídeo beta-amilóide 1-42 humano em relação ao peptídeo beta-amilóide 1-40 humano e peptídeo beta-amilóide 1-42 alterado humano. Adicionalmente, Abet0007 sFab tem reatividade cruzada com o peptídeo beta-amilóide 1-42 de murino.

1.5 Reformatação do anticorpo Fabs especifico para beta-amilóide 142 para o formato IgG2

[00248] Treze clones específicos beta-amilóide 1-42 clones foram convertidos a partir de Fab de IgG2 por sub-clonagem da cadeia pesada variável (VH) e da cadeia leve variável (VL) em vectores que expressam as cadeias pesadas e leves, respectivamente, do anticorpo humano total. Os domínios VH foram optimizados em termos do codão, internamente antes da sub-clonagem ma vez que os domínios VH biblioteca Dyax FAB310 são semi-sintéticos e não conseguiram expressar quantidades suficientes de células de mamíferos aqui descritos. Uma linha germinal in-house correspondente a VH, que é conhecida por expressar bem como um IgG humano de comprimento total em células de mamífero, foi usado como um modelo para alterar a utilização de codões do ADN dos domínios VH Dyax enquanto retém a sequência de aminoácidos inicial. O codão optimizado das cadeias pesadas variáveis foram clonados em um vetor de expressão de mamífero (pEU9.2) contendo os domínios constantes de cadeia pesada humanos e elementos reguladores para expressar a cadeia pesada de IgG2 inteira em células de mamíferos. Similarmente, a cadeia leve variável foi clonada em um vetor de expressão mamífero (pEU4.4) para a expressão dos domínios constantes de cadeia leve lambda humanos e elementos reguladores para expressar a cadeia leve inteira de IgG em células de mamíferos. Os vectores para a expressão de cadeias pesadas e cadeias leves foram originalmente descritos em Persic et al. (Persic et al., 1997). Para obter clones como IgG2, os vectores de expressão das cadeias pesadas e leves de IgG foram transientemente transfectados em células HEK293-EBNA (Invitrogen, UK; cat: R620-07) ou células de mamífero CEP6-CHO (produzido in-house) em que o anticorpo foi expresso e segregado para o meio. O meio colhido foi filtrado antes da purificação. As IgG foram purificadas utilizando Cromatografia de Proteína A (Biosepra™, Pall, EUA ou MabSelect SuRe, GE Healthcare, Reino Unido). Os sobrenadantes da cultura foram carregados numa coluna de Proteína A adequada pré-equilibrada com Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 250 mM. A IgG ligada foi eluída da coluna usando 0,1 M de citrato de sódio (pH 3,0) e o eluato foi neutralizado pela adição de 1 M Tris-HCl (pH 10,0). As IgG foram sujeitas a uma troca de tampão para PBS Dulbecco utilizando colunas de troca de tampão NAP-10 (GE Healthcare, Reino Unido; cat: 17-0854-02). As IgG purificadas foram passadas através de um filtro de 0,2 micrômetros e a concentração de IgG foi determinada por absorvância a 280 nm, utilizando um coeficiente de extinção com base na sequência de aminoácidos de IgG. As IgG purificadas foram analisadas para a agregação ou a degradação utilizando técnicas de SEC-HPLC e SDS-PAGE.

1.6 Determinação da especificidade dos anticorpos líderes em um ensaio de competição do peptídeo beta-amilóide HTRF™

[00249] Como descrito acima, os fragmentos purificados sFab que se ligam especificamente ao peptídeo beta-amilóide 1-42 foram convertidos para IgG recombinante. Para testar a especificidade destas IgGs para a ligação a outros peptídeos beta-amilóides humanos, um ensaio de competição foi desenvolvido. Neste ensaio, os peptídeos beta-amilóides 1-42 humanos não marcados (rPeptídeo, USA; cat: A1165), 1-40 (rPeptídeo, EUA; cat: A1155), 11-42 (rPeptídeo, EUA; cat: A1063), 17-42 (rPeptídeo, EUA; cat: A1058) e 143 (Anaspec, EUA; cat: 25356) foram incubados com IgG líder e peptídeo beta-amilóide 1-42 humano biotinilado (rPeptídeo, USA; cat: A1117). Resumidamente, uma série de diluições de cada peptídeo de teste foi combinado com 0,3 nM de IgG de teste e 5 nM peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado humano. A competição de cada peptídeo foi avaliada através da detecção da perda de ligação da IgG líder ao peptídeo 1-42 biotinilado através da medição da transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) entre IgG e beta-amilóide 1-42 biotinilado, usando criptato de estreptavidina (CisBio Internacional, França; cat: 610SAKLB) e reagentes de detecção de Fc IgG anti-humana XL665 (CisBio Internacional, França; cat: 61HFCXLB).

[00250] Criptato de estreptavidina e Fc IgG anti-humana XL665 foram combinados em 7 nM e 5 nM, respectivamente, em tampão de ensaio contendo 50 mM de MOPS pH 7,4 (Sigma, Reino Unido; cat: M9381), 0,4 M KF (BDH Chemicals, EUA; cat: 103444T), 0,1% soro de albumina bovina livre de ácidos gordos (Sigma, UK; cat: A6003) e 0,1% Tween 20 (v/v) (Sigma, UK; cat: P2287). 5 μL desta solução foram adicionados à placa de ensaio (poços pretos 384 Costar®, Corning Life Sciences; cat: 3676). Peptídeos beta-amilóides foram diluídos em série em tampão de ensaio usando uma placa de 96 poços de fundo em U Greiner (Greiner BioOne, Alemanha; cat: 650201). 5 μL de cada diluição de peptídeos foram transferidos em duplicado à placa de ensaio utilizando um robot de manuseamento líquido MiniTrak™ (PerkinElmer, EUA). IgG de teste foi diluída para 1,2 nM em tampão de ensaio e 5 μL foram adicionadas à placa de ensaio. Uma solução de beta-amilóide 1-42 biotinilado humana 20 nM foi preparada em tampão de ensaio e 5 μL desta solução foram adicionados a placas de ensaio. Os poços de ligação não específica (controles negativos) foram definidos para cada placa, substituindo a IgG de teste por 5 μL de tampão de ensaio. As placas de ensaio foram incubadas por 4 horas à temperatura ambiente, antes da fluorescência resolvida por tempo de leitura a comprimentos de onda de emissão de 620 nm e 665 nm com o uso de um leitor de placa EnVision (Perkin Elmer, EUA).

[00251] Os dados foram analisados por cálculo da % de valores de Delta F para cada amostra. Delta F foi determinado de acordo com a equação 1. Os valores de % de Delta F foram subsequentemente usados para calcular a % de ligação específica conforme descrito na equação 2. Equação 2:

[00252] Exemplos de resultados para Abet0007 IgG são mostrados na Figura 2. Estes resultados demonstram que Abet0007 IgG liga-se ao peptídeo beta-amilóide 1-42 humano mas não ao peptídeo beta-amilóide 1-40 humano. Este anticorpo liga-se também aos peptídeos 11-42 e 17-42 truncados e ao peptídeo beta-amilóide 1-43 humano.

1.7 Determinação das afinidades de ligação dos anticorpos líderes a beta-amilóide 1-42 humano usando ressonância de plasma de superfície

[00253] O instrumento biossensor BIAcore T-100 (GE Healthcare, Reino Unido) foi utilizado para avaliar os parâmetros cinéticos da interação entre cada um dos anticorpos líderes e peptídeo beta-amilóide 1-42 humano produzido sinteticamente. Estas experiências foram realizadas essencialmente como descrito por Karlsson et al. (Karlsson et al., 1991).

[00254] O biossensor usa os efeitos ópticos de ressonância de plásmon de superfície (SPR) para estudar mudanças na concentração superficial resultante da interação de uma molécula de analito que flui por uma molécula ligante que é imobilizada na camada de dextrano de um chip de biossensor. Tipicamente, uma concentração definida da espécie de analito é passada pelo ligante acoplado e qualquer ligação é detectada como um aumento no sinal SPR local (fase de associação). Tal é seguido por um período de fluxo de tampão, durante o qual a dissociação da espécie de analito do ligante imobilizado em superfície pode ser observada como uma diminuição no sinal (fase de dissociação). O analito remanescente pode ser então extirpado do ligante ligado por chip e o procedimento repetido em diversas concentrações de analito diferentes. O experimento é projetado de modo que nem a capacidade de ligação absoluta nem o perfil cinético do ligante acoplado mudem significantemente durante o experimento inteiro e podem ser monitorados com o uso de uma série de controles empregados por todo o experimento. Uma salina tamponada HEPES do proprietário que contém EDTA (HBS-EP+, GE Healthcare, Reino Unido) é tipicamente usada como o tampão de diluente para as amostras de analito e como o tampão de fluxo durante a fase de dissociação. Os dados experimentais são registrados ao longo do tempo como ‘Unidade de Ressonância (RUs), que são unidades arbitrárias que correspondem diretamente ao sinal SPR. As RUs são diretamente proporcionais às mudanças no índice refrativo na superfície de chip, que, por sua vez, é uma medida aproximada da massa de ligação de analito. O pacote de software BIAevaluation do proprietário pode ser então usado para processar dados e ajustar modelos de ligação aos conjuntos de dados. As constantes de taxa de associação (ka, M-1 s-1) e dissociação (kd, s-1) retornadas permitem o cálculo de constantes de afinidade de dissociação (KD; M).

[00255] A afinidade de ligação entre cada IgG de teste e peptídeo beta-amilóide 1-42 humano foi estimada com o uso de ensaios em que o anticorpo foi acoplado de modo covalente por ligação de amina a uma superfície de CM5 chip do proprietário a uma densidade superficial final de aproximadamente 2.000 RU. A superfície de chip foi regenerada entre os ciclos por uma única injeção de 40 segundos de Glicina a 10mM pH2 para remover o ligando ligado ao anticorpo. A regeneração não resultou em uma perda significante da atividade de ligação do peptídeo.

[00256] Uma série de diluições do peptídeo beta-amilóide 1-42 humano sintético (1,6 a 100 nM) foram sequencialmente passadas pela superfície de anticorpo para uma quantidade suficiente de tempo para observar sensorgramas que poderiam ser ajustados a um modelo de ligação com segurança. Os dados de célula de fluxo de referência brutos foram subtraídos de cada conjunto de dados de IgG e um bloco bruto de tampão de concentração zero foi referência dupla subtraída do conjunto de dados principais para reduzir o impacto de quaisquer artefatos de tampão ou efeitos de ligação não específica. Um modelo de ligação apropriado foi então ajustado simultaneamente aos dados de cada titulação de analito com o uso do software BIAevaluation.

[00257] A validade dos dados foi avaliada utilizando o valor Chi2 calculado, com um valor aceitável sendo sob 2 RU2. O sucesso global do ajuste foi estimado utilizando os resíduos, com um desvio de menos de 2 RUs como sendo aceitável.

[00258] Exemplos de resultados para Abet0007 IgG2 são mostrados na Figura 3. A média da constante de velocidade de associação (ka) e constante de velocidade de dissociação (kd) e constante de dissociação (KD) são de 1.6 x 105 M-1 s-1, 7.4 x 10-2 s-1 e 473 nM, respectivamente. Estes parâmetros foram obtidos a partir de 1:1 de Langmuir ajuste aos dados.

1.8 Caracterização funcional de anticorpos líderes pela depleção de peptídeos beta-amilóide a partir de plasma humano

[00259]Os anticorpos líderes foram testados num ensaio de depleção de plasma para investigar a sua capacidade para imunoprecipitar o peptídeo beta-amilóide 1-42 humano a partir do plasma de sangue humano. Este ensaio foi utilizado para providenciar evidencias a eficácia funcional para cada anticorpo. Resumidamente, as amostras de plasma humano foram incubadas com cada IgG de teste, durante 3 horas, sendo que após os anticorpos e todos os ligandos ligados foram removidos. O conteúdo de peptídeo beta-amilóide 1-42 das amostras de plasma humano foi ensaiado utilizando técnicas convencionais antes e após imunoprecipitação, e estes valores foram utilizados para determinar a eficácia do anticorpo. As amostras de plasma foram também analisadas para a depleção de qualquer peptídeo beta-amilóide 1-40 para avaliar a especificidade dos anticorpos líderes.

[00260] Cada anticorpo de teste foi, separadamente, ligado covalentemente a esefreas magnéticas de ácido carboxílico Dynabeads® M-270 (Invitrogen Life Technologies, Reino Unido; cat: 143-05D) de acordo com as instruções do fabricante. Para cada IgG de teste de 100 μL de Dynabeads foram lavadas duas vezes com 100 μL de 25 mM de MES, pH 5 (Sigma, Reino Unido; cat: M5287) utilizando um magneto para separar as esferas a partir da suspensão. Imediatamente antes da utilização, EDC (Pierce, Thermo Scientific, EUA; cat: 22981) foi dissolvida em MES 25 mM frio, pH 5 a uma concentração final de 50 mg/mL. Uma solução de 50 mg/mL de NHS (Pierce, Thermo Scientific; cat: 24500) foi preparado de forma semelhante em MES 25 mM, pH 5. 50 μL de solução NHS de 50 μL de solução EDC foram adicionados a Dynabeads lavadas, que foram bem misturadas e incubadas com rotação de inclinação lenta à temperatura ambiente durante 30 minutos. Um magneto foi usado para sedimentar as esferas e o sobrenadante foi removido. As esferas foram lavadas duas vezes com 100 μL de 25 mM de MES, pH 5. Cada IgG de teste foi diluído para 0,6 mg/mL num volume total de 100 μL de 25 mM de MES, pH 5. As esferas lavadas foram ressuspensas em solução de ligando e foram incubadas durante pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente com rotação de lenta inclinação. As pérolas foram subsequentemente peletizadas utilizando um magneto e lavadas uma vez com 100 μL de tampão Tris 50 mM, pH 7,4 (Sigma, Reino Unido). As pérolas foram então ressuspensas em 100 μL de Marvel-PBS (3% p/v) e incubadas durante a noite a 4 °C. As esferas foram lavadas duas vezes com PBS de Dulbecco (100 μL) e ressuspensas em PBS (100 μL).

[00261] As amostras de plasma EDTA foram isoladas de doadores anônimos na Clínica AstraZeneca Health em Sõdertalje, na Suécia. Cerca de 100 mL de sangue foram coletados de cada doador e foram colocados em dois tubos de 50 mL. Adicionou-se EDTA para uma concentração final de 5 mM para evitar a coagulação, e os tubos foram centrifugados a 4000 xg durante 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante (plasma) foi recolhido, dividido em alíquotas em tubos de 1 mL e estas foram armazenadas a -80 °C até serem necessárias. As amostras foram ensaiadas tanto para o conteudo do peptídeo beta-amilóide 1-42 e peptídeo beta-amilóide 1-40, tal como descrito abaixo.

[00262] Cada conjunto de esferas revestidas com anticorpo foram incubados separadamente com uma alíquota de 1 mL de plasma-EDTA, durante 3 horas a 4 °C com rotação lenta de inclinação, e as esferas foram, em seguida, sedimentadas utilizando um magneto. O sobrena-dante foi cuidadosamente removido das esferas e foi testado para ambos os peptídeos beta-amilóide 1-42 e 1-40, tal como descrito abaixo.

[00263] A análise do conteúdo de peptídeo beta-amilóide 1-40 das amostras de plasma foi realizada utilizando o kit ELISA de Aβ 40 humano da Invitrogen (Reino Unido; cat: KHB3482) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, um beta-amilóide 1-40 padrão humano foi utilizado para criar uma série de diluições de 1 ng/mL até 7,81 pg/mL. As diluições foram feitas usando tampão de diluição padrão contendo um inibidor da protease 1 (Roche, Reini Unido; cat: 1697498001) por 50 mL de diluente. 50 μl de cada diluição foi então adicionada a diferentes poços de microtitulação pré-revestidos com um anticorpo monoclonal, do proprietário, específico para o N-terminal do peptídeo beta-amilóide. As amostras de plasma-EDTA foram centrifugadas durante 10 minutos a 4 °C e 2000 xg e 50 μL de sobrenadante de cada amostra foram adicionados a um poço separado na mesma placa de microtitulação, de acordo com as normas. 50 μl de anticorpo de detecção Hu Aβ, do proprietário, o qual reconhece especificamente o C-terminal do peptídeo beta-amilóide 140, foram então adicionados a cada poço de microtitulação. A placa foi coberta com um selo de placa e incubaram-se durante 3 horas à temperatura ambiente com agitação. A placa foi lavada quatro vezes com 400 μl de tampão de lavagem, permitindo que a placa fique de molho durante 15-30 segundos durante cada lavagem. A placa foi então invertida e roscada seca. 100 μL de IgG HRP anti-coelho conjugado, do proprietário, foram adicionados a cada poço, a placa foi coberta com um selo de placa, e as amostras foram incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente. Novamente, a placa foi lavada quatro vezes com 400 μl de tampão de lavagem, permitindo que a placa fique de molho durante 15-30 segundos durante cada lavagem. A placa foi então invertida e roscada seca. 100 μL de cromogénio estabilizado, do proprietário, foram adicionados a cada poço e a placa foi incubada no escuro durante 20 minutos à temperatura ambiente. Tal foi seguido pela adição de 100 μL de solução de paragem, do proprietário, a cada poço. A absorvância de cada poço foi lida a 450 nm dentro de 2 horas após a adição da solução de paragem. Uma curva padrão foi produzida a partir das série de diluições de beta-amilóide 1-40 humano, e este foi utilizado para determinar a concentração de beta-amilóide 1-40 humano nas amostras de teste de plasma-EDTA.

[00264] A análise do conteúdo de peptídeo beta-amilóide 1-42 das amostras de plasma foi realizada utilizando o kit INNOTEST® β-Amyloid(1-42) da Innogenetics (Belgium; cat: 80177) essencialmente de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, um beta-amilóide 1-42 padrão humano foi utilizado para criar uma série de diluições de 1 ng/mL até 7,81 pg/mL. 100 μl de cada diluição foi então adicionada a diferentes poços de microtitulação pré-revestidos com um anticorpo monoclonal do proprietário específico para o -terminal do peptídeo beta-amilóide 1-42 humano. As amostras de plasma-EDTA foram centrifugadas durante 10 minutos a 4 °C e 2000 xg e 100 μL de sobrenadante de cada amostra foram adicionados a um poço separado na mesma placa de microtitulação, de acordo com as normas. A placa foi coberta com um selo de placa e incubaram-se durante 3 horas à temperatura ambiente com agitação. A placa foi lavada cinco vezes com 400 μL de tampão de lavagem e, em seguida, foi invertida e roscada seca. 100 μl de conjugado 1 (C1HS) do proprietário, que reconhece a extremidade N-terminal do peptídeo beta-amilóide, foram adicionados a cada poço. A placa foi coberta com um selo de placa e as amostras foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação. A placa foi lavada cinco vezes com 400 μL de tampão de lavagem e, em seguida, foi invertida e roscada seca. 100 μL de conjugado 2 (C2), um conjugado de estreptavidina-HRP que se liga ao anticorpo C1HS biotinilado, foram então adicionados a cada poço. A placa foi coberta com um selo de placa e incubaram-se durante 30 minutos à temperatura ambiente. A placa foi lavada cinco vezes com 400 μL de tampão de lavagem e, em seguida, foi invertida e roscada seca. 100 μL de solução de substrato do proprietário foram adicionados a cada poço, a placa foi incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente, e, em seguida, 100 μL de solução de paragem foram adicionados a cada poço. A absorvância de cada poço foi lida a 450 nm dentro de 15 minutos após a adição da solução de paragem. Uma curva padrão foi produzida a partir das série de diluições de beta-amilóide 1-42 humano, e este foi utilizado para determinar a concentração de beta-amilóide 1-42 humano nas amostras de teste de plasma-EDTA.

[00265] Numa experiência, o anticorpo IgG2 Abet0007 reduziu os níveis do peptídeo beta-amilóide 1-42 humano no plasma de 80,47 pg mL-1 a 60,56 pg mL-1 (uma redução de 25%). Em uma segunda experiência, os níveis foram reduzidos de 197,43 pg mL-1 a 154,45 pg mL-1 (uma redução de 22%). 1.9 Identificação de clones líderes com baixa afinidade pelo beta-amilóide nativo usando imunohistoquímica in vitro

[00266] Os anticorpos de líderes foram testados quanto à sua capacidade de se ligarem a beta-amilóide, com o objetivo de identificar clones líderes com baixa afinidade para formas nativas do peptídeo beta-amilóide. Resumidamente, os anticorpos de chumbo foram rastreados em seções cerebrais da doença de Alzheimer humano e seções cerebrais Tg2576 de rato para identificar anticorpos anti-beta-amilóide que se ligam ao amilóide nativo in vitro.

[00267] Ratinhos Tg2576 são ratinhos transgênicos que sobre-expressam o gene para a proteína precursora amilóide humano (APP). Este gene possui duas mutações pontuais no local de clivagem gama-secretase (Lys670Asn e Met671Leu) que conduz à formação de placas de beta-amilóide no córtex e no hipocampo dos ratos, a partir de uma idade de aproximadamente 9 meses.

[00268] O tecido cerebral humano foi isolado a partir do córtex frontal (giro frontal inferior) de dois indivíduos com doença de Alzheimer grave (ApoE genótipo 3/3, fase Braak 6 e ApoE genótipo 4/3, fase Braak 5, respectivamente). Como controlo, o tecido equivalente foi isolado a partir de um indivíduo não-demência (ApoE genótipo 3/3, fase Braak 1). Todos os três tecidos foram fornecidos pelo Banco da Holanda de cérebro (NBB). A qualidade das seções foi verificada por coloração com hematoxilina/eosina antes da utilização. O tecido cerebral do rato foi isolado de ratinhos Tg2576 com idade média de 15 meses (2 ratinhos), 18 meses (6 ratinhos) e 22 meses (2 ratinhos).

[00269] Seções de cérebro embebidas em parafina, de 4-6 μm de largura, foram preparadas para imuno-histoquímica, removendo primeiro a matriz de suporte de parafina. As seções foram lavadas com xileno (5 minutos x2), etanol absoluto (3 minutos x2), etanol a 95% (3 minutos x2), etanol a 70% (3 minutos x2), ácido fórmico a 90% (Sigma Aldrich, Reino Unido; cat: 06440; 10 minutos), água da torneira (20 minutos x3) e PBS (5 minutos x2). As seções foram então cozidos em solução Diva Decloaker (Biocare Medical, EUA; cat: DV2004 G1) em um forno de microondas durante 20 minutos a 100 °C. As amostras foram, subsequentemente, arrefecidas a 40 °C em um banho de água e, em seguida, lavadas com água destilada (5 minutos) e PBS (5 min x3).

[00270] Os anticorpos IgG2 líderes foram testados em concentrações de 2, 5 e 20 μg mL-1. A ligação destes IgG foi detectada utilizando um anticorpo secundário de coelho anti-humano (Dako, Dinamarca; cat: A0482) a 1 em 400 de diluição, seguido pelo anticorpo anti-coelho conjugado com HRP OmniMap (Ventana Medical Systems, EUA; cat: 760-4311). O sinal foi detectado utilizando o kit de ChromoMap DAB (Ventana Medical Systems, EUA; cat: 760-159). Estes passos de coloração foram realizados utilizando um sistema automatizado de preparação da lâmina BenchMark (Ventana Medical Systems, EUA) de acordo com protocolos padrão.

[00271] A maior pontuação da coloração foi realizada de forma cega, pelo menos, duas pessoas diferentes sob 20-40x de ampliação ótica. A placa de ligação in vitro foi designada utilizando uma escala de 0 (sem coloração das placas) até 4 (coloração intensa de placas).

[00272] Abet0007 IgG2 não apresentaram coloração de placas em ambos os cérebros humanos da doença de Alzheimer ou o cérebro do rato Tg2576 (pontuação = 0). Em contraste, um anticorpo de controle positivo produziu uma pontuação de 4 em seções adjacentes sob as mesmas condições. As imagnes representativas são apresentadas na Figura 4.

Exemplo 2 Anticorpo de optimização Abet0007 através de mutação dirigida a regiões determinantes de complementaridade 3 (CDR3) 2.1 Conversão do clone parental Abet0007 para o formato scFv

[00273] O clone parental foi convertido do formato IgG2 para o formato do fragmento de cadeia simples variável (scFv), em preparação para a otimização de afinidade. Os codões optimizados das cadeias pesadas variáveis (VH) e leves variáveis (VL) foram amplificados separadamente a partir dos respectivos vectores de IgG com a adição de locais de clonagem específicos e uma região ligante flexível. PCR recombinatório foi então realizado para gerar uma construção scFv completa, a qual foi clonada no vector de fagemídeo pCantab10.5, essencialmente como descrito em Vaughan et al. (Vaughan et al., 1996). O vector pCantab10.5 é uma versão modificada do vector pCANTAB6 que contém locais de restrição adicionais para facilitar a adição de outros marcadores do que os marcadores His e myc padrão.

2.2 Optimização da Abet0007 por mutagênese dirigida

[00274] O anticorpo líder (Abet0007) foi optimizado para uma afinidade melhorada para beta-amilóide humano 1-42 utilizando uma abordagem de mutagênese dirigida com seleções de exibição em fagos baseada em afinidade. Bibliotecas de scFv-fago grandes derivadas de Abet0007 foram criadas por mutagênese direcionada por oligonucleotídeo das regiões de determinação de complementariedade 3 (CDR3) de cadela pesada variável (VH) e leve variável (VL) com o uso de técnicas de biologia molecular padrão conforme descrito por Clackson e Lowman ((2004) A Practical Approach, 2004. Oxford University Press).

[00275] As bibliotecas foram submetidas a seleções de exibição em fagos baseada em afinidade, a fim de enriquecer para as variantes com maior afinidade para o peptídeo beta-amilóide 1-42 humano. As seleções foram realizadas essencialmente como descrito anteriormente (Hawkins et al., 1992,. Schier et al., 1996, Thompson et al, 1996). Em resumo, as partículas de fago de scFv foram incubadas com peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado humano (rPeptide, EUA; cat: A1117) em solução. O scFv-fago que se ligou ao antigênio foi então capturado em esferas paramagnéticas revestidas com estreptavidina (Dynabeads® M280, Invitrogen Life Sciences, Reino Unido) seguindo as recomendações do fabricante. As partículas de scFv-fago selecionadas foram então resgatadas conforme descrito previamente (Osbourn et al., 1996) e o processo de seleção foi repetido na presença de concentrações decrescentes de antigênio beta-amilóide 1-42 biotinilado.(200 nM a 2 pM por 3 ciclos).

2.3 Identificação de clones melhorados com o uso de um ensaio de ligação direta

[00276] Mil setecentos e sessenta scFv foram selecionados aleatoriamente a partir de ciclos de seleção 2 e 3 a partir da abordagem de mutagênese dirigida descrita na seção 2.2. Estes clones foram rastreados utilizando um ensaio de ligação direta, essencialmente como descrito na seção 1.3. Resumidamente, scFv não purificado a partir de preparações periplasmáticas foram testados quanto à ligação aumentada para o peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado humano e detectado utilizando tecnologia de HTRF™ com reagentes de detecção criptato estreptavidina e anti-6His-XL665.

[00277] scFv não purificado a partir de preparações periplasmáticas foram preparados em tampão MOPS 50 mM pH 7,4 incluindo 0,5 mM de EDTA e 0,5 M de sacarose e foram subsequentemente diluídas para 1% em tampão de ensaio contendo 50 mM de MOPS pH 7,4 (Sigma, Reino Unido; cat: M9381), 0,4 M fluoreto de potássio (BDH Chemicals, EUA; cat: 103444T), 0,1% soro de albumina bovina livre de ácidos gordos (Sigma, UK; cat: A6003) e 0,1% Tween 20 (v/v) (Sigma, UK; cat: P2287) usando uma placa de 384 poços de fundo em V Greiner (Greiner BioOne, Alemanha; cat: 781280). 5 μL da amostra de scFv diluida foram transferidos para a placa de ensaio (384 poços pretos Costar®, Corning Life Sciences; cat: 3676) usando um robot de manuseamento líquido MiniTrak™ (PerkinElmer, EUA). 5 μL de tampão de ensaio foi então adicionados a cada poço. Uma solução 20 nM de peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado humano (rPeptide, EUA; cat: 1117) foi preparada em tampão de ensaio e 5 μL desta solução foram adicionados a placas de ensaio. Os reagentes de detecção criptato de estreptavidina (Cisbio Internacional, França; cat: 610SAKLB) e anti-His6-XL665 (Cisbio Internacional, França; cat: 61HISXLB) foram combinados em tampão de ensaio para se obter concentrações de 7 nM criptato de estreptavidina e 60 nM anti-His6-XL665 e, em seguida, 5 μL deste cocktail de detecção foram adicionados a todos os poços das placas de ensaio. Os poços de ligação não específica (controles negativos) foram definidos para cada placa, substituindo a amostra de scFv por 5 μL de tampão de ensaio. As placas de ensaio foram seladas e incubadas por 2,5 horas à temperatura ambiente, antes da fluorescência solucionada por tempo de leitura a comprimentos de onda de emissão de 620 nm e 665 nm com o uso de um leitor de placa EnVision (Perkin Elmer, Boston, MA). A análise dos dados foi realizada como previamente descrito (seção 1.3) e os valores de % Delta F foram utilizados para comparar os sinais de ensaio em poços adjacentes. Um "hit" foi definido como uma amostra de scFv que gerou um valor de % Delta F maior do que o sinal observado para Abet0007 scFv.

2.4 Confirmação de clones melhorados com o uso de um ensaio de competição de epítopo

[00278] Clones que exibem uma maior ligação para o peptídeo beta-amilóide 1-42 humano em relação a ao clone Abet0007 parental foram submetidos a sequenciação de ADN (Osbourn et al, 1996; Vaughan et al, 1996). Os scFb com sequências proteicas únicas foram expressos em E. coli e purificados por cromatografia de afinidade seguida de troca de tampão. As afinidades de ligação destes scFv foram então testados num ensaio de competição de epítopo contra um anticorpo de referência designado Abet0042, que tem uma afinidade semelhante para o peptídeo beta-amilóide 1-42 humano como Abet0007. Neste ensaio de competição, a ligação de Abet0042 IgG a peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado humano competiu contra as amostras de teste de scFv. A ligação de Abet0042 IgG a peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado humano é detectada utilizando a tecnologia HTRF™ como anteriormente descrito (seção 1.6). Resumidamente, uma série de diluições de scFv purificados é adicionada a uma mistura de Abet0042 IgG, peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado, criptato de estreptavidina e IgG XL665 Fc anti-humano. A fluorescência solucionada por tempo foi lida após duas horas de incubação à temperatura ambiente.

[00279] ScFv purificado foi diluído em série em tampão de ensaio contendo 50 mM de MOPS, pH 7,4 (Sigma, Reino Unido; cat: M9381), 0,4 M fluoreto de potássio (BDH Chemicals, EUA; cat: 103444T), 0,1% soro de albumina bovina livre de ácidos gordos (Sigma, UK; cat: A6003) e 0,1% Tween 20 (Sigma, UK; cat: P2287) usando uma placa de 96 poços de fundo em U Greiner (Greiner BioOne, Alemanha; cat: 650201). 5 μL de cada diluição de scFv foram transferidos para a placa de ensaio (poços pretos 384 Costar®, Corning Life Sciences; cat: 3676) usando um robot de manuseamento líquido MiniTrak™ (PerkinElmer, EUA). Uma solução 20 nM do peptídeo amilóide beta 1-42 biotinilado (rPeptide, EUA; cat: A1117) foi preparada em tampão de ensaio e 5 μL de solução de peptídeo biotinilado foram adicionados a placas de ensaio, para obter a concentração final de 5 nM peptídeo no volume de ensaio final de 20 μL. As placas de ensaio foram seladas e incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora. Criptato de estreptavidina e Fc IgG anti-humana XL665 foram combinados em 7 nM e 20 nM, respectivamente, em tampão de ensaio e 5 μL desta solução fora, adicionados à placa de ensaio. Abet0042IgG foi diluída para 2,4 nM em tampão de ensaio e 5 μL foram adicionadas à placa de ensaio para obter uma concentração final de IgG de 0,6 nM. Os poços de ligação não específica (controles negativos) foram definidos para cada placa, substituindo a Abet0042 IgG por 5 μL de tampão de ensaio. As placas de ensaio foram seladas e incubadas por 2 horas à temperatura ambiente, antes da fluorescência solucionada por tempo de leitura a comprimentos de onda de emissão de 620 nm e 665 nm com o uso de um leitor de placa EnVision (Perkin Elmer, Boston, MA).

[00280] Os dados foram analisados por cálculo da % de valores de Delta F e a % de ligação especifica para cada amostra. % Delta F foi determinada de acordo com a Equação 1 e a % de ligação especifica foi calculada usando a Equação 2. Os valores de IC50 foram determinados com o uso de Prism (GraphPad software, EUA) por ajuste de curva com o uso de uma equação logística de quatro parâmetros, como descrito na Equação 3. Equação 3:

[00281] Onde Y é a ligação especifica e X é o algoritmo da concentração.

[00282] Exemeplos de resultados são mostrados na Figura 5. O líder original, Abet0007, tem um IC50 de 159 nM, enquanto a maioria do clone melhorado, Abet0144, tem um valor de IC50 de 5,5 nM.

2.5 Perfis cinéticos dos clones de afinidade melhorada em formato scFv purificada por ressonância de plasma de superfície

[00283] A ressonância de plasma de superfície foi utilizada para analisar os clones scFv purificados que mostraram melhora significativa na afinidade de ligação para peptídeo beta-amilóide 142 humano em relação à sequência parental, Abet0007, no ensaio de competição epítopo HTRF™ (seção 2.4). Em resumo, o instrumento biossensor BIAcore T-100 (GE Healthcare, Reino Unido) foi utilizado para avaliar os parâmetros cinéticos da interação entre cada scFv purificado e peptídeo beta-amilóide 1-42 humano produzido sinteticamente. Estas experiências foram realizadas essencialmente como descrito por Karlsson et al. (Karlsson et al., 1991). Para mais detalhes ver seção 1.7.

[00284] A afinidade de ligação entre cada scFv de teste e beta-amilóide 1-42 humano foi estimada utilizando ensaios nos quais o peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado humano sintético (rPeptide, EUA; cat: A1117) foi ligado de forma não covalente através de uma interação biotina/estreptavidina a um chip sensor SA do proprietário para uma densidade final de superfície de, aproximadamente, 700 RU. A superfície de chip foi regenerada entre os ciclos por uma única injeção de 20 segundos de Glicina a 10mM pH2 para remover o scFV ligado ao peptídeo. A regeneração não resultou em uma perda significante de ativação de ligação do peptídeo.

[00285] Uma série de diluições de cada scFv purificado (12,5 a 400 nM) foi sequencialmente passada pela superfície do peptídeo para uma quantidade suficiente de tempo para observar sensorgramas que poderiam ser ajustados a um modelo de ligação de 1:1 com segurança. Um branco de tampão a concentração zero foi subtraído do conjunto principal de dados para reduzir o impacto de quaisquer artefatos tampão ou os efeitos de ligação não específica. Um modelo de ligação apropriado foi então ajustado simultaneamente aos dados de cada titulação de analito com o uso do software BIAevaluation.

[00286] A validade dos dados foi avaliada utilizando o valor Chi2 calculado, com um valor aceitável sendo sob 4 RU2. O sucesso global do ajuste foi estimado utilizando os resíduos, com um desvio de menos de 20 RUs como sendo aceitável.

[00287] Exemplos de resultados para Abet0114 scFv são mostrados na Figura 6. A constante de velocidade de associação (ka) e constante de velocidade de dissociação (kd) e constante de dissociação (KD) são de 2.01 x 105 M-1 s-1, 6.66 x 10-3 s-1 e 33,2 nM, respectivamente. Estes parâmetros foram obtidos a partir de 1:1 de Langmuir ajuste aos dados.

2.6 Reformatação de afinidade melhorada de scFv a IgG1-TM humano

[00288] O formato anticorpo IgG1-TM é um isótipo IgG1 humano contendo três únicas substituições de aminoácidos (Triplo Mutantes: TM) dentro da dobradiça inferior e CH2 domínio constante (Oganesyan et al., 2008). Quando introduzido na dobradiça inferior e domínio CH2 de moléculas de IgG1 humanos, a mutação tripla L234F/L235E/P331S ("TM") provoca uma diminuição profunda na sua ligação a CD64, CD32A, CD16 e C1q humano. Estas mutações de TM são usadas para criar um isotipo humano com muito baixa função efectora. scFv foram reformados em IgG1-TM por subclonagem dos domínios de cadeia pesada variável (VH) e cadeia leve variável (VL) em vetores que expressam as cadeias pesadas e leves de anticorpo humano inteiras respectivamente. A cadeia pesada variável foram clonados em um vetor de expressão de mamífero (pEU 1.4) contendo os domínios constantes de cadeia pesada humanos e elementos reguladores para expressar a cadeia pesada de IgG1-TM inteira em células de mamíferos. Similarmente, a cadeia leve variável foi clonada em um vetor de expressão mamífero (pEU 4.4) para a expressão dos domínios constantes de cadeia leve lambda humanos e elementos reguladores para expressar a cadeia leve inteira de IgG em células de mamíferos. Anticorpos IgG são expressos e purificados essencialmente como descrito na seção 1.5

2.7 Regresso à linha germinativa

[00289] As sequências de aminoácidos dos domínios VH e VL de anticorpos especificos do peptídeo beta-amilóide 1-42 de afinidade otimizada foram alinhadas às sequências de linhagem germinativa humanas conhecidas na base de dados VBASE (Tomlinson et al., 1992) e a linhagem germinativa mais próxima foi identificada por similaridade de sequência. Para os domínios VH da linhagem de anticorpo optimizado, tal foi Vh3-23 (DP-47) e para os domínios VL foi VÀ3-3r (DPL-23).

[00290] O processo de linhagem germinativa consistiu em reverter os resíduos de arcabouço em domínios VH e VL à sequência de linhagem germinativa mais próxima para correlacionar identicamente os anticorpos humanos. Para Abet0144, não é necessário alterar os resíduos no domínio VH (Tabela 1), mas um total de cinco alterações foram feitas no âmbito do domínio VL. Estas alterações ocorreram nas posições Kabat 1, 2, 3, 40 e 81 (Tabela 2). Os resíduos de Vernier (Foote et al., 1992), não foram sujeitos ao regresso à linha germinativa, com excepção do resíduo 2 na sequência da cadeia leve que foi sujeito ao regresso à linha germinativa, ao mesmo tempo que os resíduos que flanqueiam 1 e 3. O regresso à linha germinativa destes resíduos de aminoácidos foi realizado utilizando técnicas padrão de mutagênese dirigida local com os iniciadores mutagénicos adequadas como descrito por Lowman e Clackson (Clackson et al., 2004).Tabela 1: Um alinhamento de sequências dos clones Abet0144 e Abet0144-GL à linha germinatica VH3-23 (DP47). Os resíduos que são diferentes da linha germinativa estão realçados. Os resíduos de Vernier são indicados por círculos (●). Não foram feitas alterações no domínio VH à linha germinal do clone Abet0144.Tabela 2: Um alinhamento de sequências dos clones Abet0144 e Abet0144-GL à linha germinatica Vλ3-3R (DPL-23). Os resíduos que são diferentes da linha germinativa estão realçados. Os resíduos de Vernier são indicados por círculos (●). Cinco alterações foram feitas no domínio VL à linha germinal do clone Abet0144. O resíduo Vernier 2 foi revertido à linha germinal, ao mesmo tempo que os resíduos 1 e 3. Reverter esse resíduo não causou impacto na potência do anticorpo.

2.8 Determinação da cinética de ligação de IgG otimizado por afinidade usando ressonância de plasma de superfície

[00291] Ressonância de plasma de superfície foi utilizada para analisar a cinética de ligação dos IgGs otimizados por afinidade (seção 2.6) e os seus homólogos sujeitos a regresso à linha germinal (seção 2.7). Em resumo, o instrumento biossensor BIAcore T-100 (GE Healthcare, Reino Unido) foi utilizado para avaliar os parâmetros cinéticos da interação entre cada IgG de teste e peptídeo beta-amilóide 1-42 humano produzido sinteticamente. Estas experiências foram realizadas essencialmente como descrito por Karlsson et al. (Karlsson et al., 1991). Para mais detalhes ver seção 1.7.

[00292] A afinidade de ligação entre cada IgG teste e peptídeo beta-amilóide 1-42 humano foi estimada com o uso de ensaios em que o anticorpo foi acoplado de modo covalente por ligação de amina a uma superfície de CM3 chip a uma densidade superficial final de aproximadamente 2.000 RU. A superfície de chip foi regenerada entre os ciclos por uma única injeção de 40 segundos de Glicina a 10mM pH2 para remover o ligando ligado ao anticorpo. A regeneração não resultou em uma perda significante de capacidade de ligação do peptídeo.

[00293] Uma série de diluições do peptídeo beta-amilóide 1-42 humano sintético (1,6 a 50 nM) foram sequencialmente passadas pela superfície de anticorpo para uma quantidade suficiente de tempo para observar sensorgramas que poderiam ser ajustados a um modelo de ligação com segurança. Os dados de célula de fluxo de referência brutos foram subtraídos de cada conjunto de dados de IgG e um bloco bruto de tampão de concentração zero foi referência dupla subtraída do conjunto de dados principais para reduzir quaisquer artefatos de tampão ou (efeitos de ligação não específica (mínimo). Um modelo de ligação apropriado foi então ajustado simultaneamente aos dados de cada titulação de analito com o uso do software BIAevaluation.

[00294] A validade dos dados foi avaliada utilizando o valor Chi2 calculado, com um valor aceitável sendo sob 2 RU2. O sucesso global do ajuste foi estimado utilizando os resíduos, com um desvio de menos de 2 RUs como sendo aceitável.

[00295] Exemplos de resultados para Abet0144-GL (linha germinal) IgG1-TM são mostrados na Figura 7. A média da constante de velocidade de associação (ka) e constante de velocidade de dissociação (kd) e constante de dissociação (KD) são de 2.08 x 105 M1 s-1, 1.97 x 10-3 s-1 e 9,50 nM, respectivamente. Estes parâmetros foram obtidos a partir de 1:1 de Langmuir ajuste aos dados.

2.9 Perfis de especificidade de IgGs com afinidade otimizada usando Ressonância de plasma de superfície

[00296]Ressonância de plasma de superfície foi utilizada para verificar a especificidade das IgGs de afinidade optimizada para o peptídeo beta-amilóide 1-42 humano. Em resumo, o instrumento biossensor BIAcore T-100 (GE Healthcare, Reino Unido) foi utilizado para avaliar os parâmetros cinéticos da interação entre IgG de teste e uma série de pequenos peptídeos, incluindo peptídeo beta-amilóide 142 humano produzido sinteticamente e beta-amilóide 1-40 humano. Estas experiências foram realizadas essencialmente como descrito por Karlsson et al. (Karlsson et al., 1991). Para mais detalhes ver seção 1.7.

[00297] A afinidade de ligação entre cada IgG de teste e cada peptídeo foi estimada com o uso de ensaios em que o anticorpo foi acoplado de modo covalente por ligação de amina a uma superfície de CM3 chip patenteado a uma densidade superficial final de aproximadamente 2.000 RU. A superfície de chip foi regenerada entre os ciclos por uma única injeção de 40 segundos de Glicina a 10mM pH2 para remover o ligando ligado ao anticorpo. A regeneração não resultou em uma perda significante de capacidade de ligação do peptídeo.

[00298]Cada peptídeo de teste 400 nM) foi sequencialmente passada pelo superfície do anticorpo para uma quantidade suficiente de tempo para observar sensorgramas que mostraram nenhuma ligação ou poderiam ser ajustados a um modelo de ligação com segurança. Os dados de célula de fluxo do branco de referência foram subtraídos de cada conjunto de dados de IgG e um brnco de tampão de concentração zero foi de referência dupla subtraída do conjunto de dados principais para reduzir o impacto de quaisquer artefatos de tampão ou efeitos de ligação não específica.

[00299] Exemplos de resultados para Abet0144-GL (linha germinal) IgG1-TM são mostrados na Figura 8. Dois peptídeos (beta-amilóide 142 biotinilado humano (rPeptide, EUA; cat: A1117) e beta-amilóides 142 humanos não marcados (rPeptídeo, USA; cat: A1165)) mostraram uma ligação forte ao anticorpo, enquanto que os três peptídeos (peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado alterado humano (Anaspec, EUA; síntese habitual), beta-amilóide 1-40 biotinilado humano (rPeptide, EUA; cat: A1111) e peptídeo beta-amilóide 1-40 humano não marcado (rPeptídeo, USA; cat: 24236)) não mostrou qualquer ligação ao anticorpo.

2.10 Perfil de especificidade de Abet0144-GL IgG1-TM em ensaio de competição formato epítopo bioquímico

[00300] Para testar a especificidade de Abet0144-GL IgG1-TM para a ligação a outros peptídeos beta-amilóides humanos, um ensaio de competição foi desenvolvido. Neste ensaio, uma concentração fixa (1,5 nM) de peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado humano (rPeptide, EUA; cat: A1117) foi incubada com uma gama de diferentes concentrações de peptídeos beta-amilóide humanos não marcados incluindo 1-42, 1-40, 116, 12-28, 3-42 piro, 11-42 piro e 1-42 alterado (Anaspec cat: 20276, 24236, 24226, 24230, 29907, 29903 e 25383, respectivamente) na presença de uma concentração fixa (0,28 nM) de Abet0144-GL IgG1-TM. A competição dos peptídeos foi avaliada por detecção da inibição da ligação de Abet0144-GL IgG1-TM a peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado humano usando transferência de energia por ressonância de fluorescência (TR-FRET). Tal envolveu o uso de reagentes de detecção TR-FRET criptato de európio marcado com Fc IgG anti-humano (CisBio Internacional, França; cat: 61HFCKLB) e estreptavidina marcada com XL665 (CisBio Internacional, França; cat: 611SAXLB).

[00301] Os experimentos foram instalados em placas de microtitulação Costar 384 de fundo bem raso. 5 uL/poço de beta-amilóide 1-42 biotinilado humano (6 nM) foram adicionados a todos os poços da placa de ensaio (excepto os poços do ensaio de controle de ligação negativo), a fim de se obter uma concentração final de ensaio de 1,5 nM. 5 uL de tampão de ensaio apenas foi adicionado aos poços do ensaio de controle de ligação negativo. Um duplicado 11 ponto 1:3 da série de titulação foi preparado ou cada peptídeo de teste a partir de uma concentração superior de 40 uM, a fim de se obter uma concentração de peptídeo no ensaio final de 10 uM. 5 ul por poço de cada diluição em série de peptídeo de teste foi em seguida transferida para a placa de ensaio de 384 poços. 5 ul de tampão de ensaio apenas foi adicionado ao total e poços do ensaio de controle de ligação negativo. Abet0144-GL IgG1-TM foi diluída para dar uma solução de trabalho a 1,12 nM. 5 ul por poço desta solução foi adicionado a todos os poços da placa de ensaio de 384 poços, de modo a resultar em uma concentração de ensaio finalde Abet0144-GL-IgG1-TM de 0.28nM. Finalmente, uma solução combinada foi preparada contendo criptato de európio marcado com Fc anti-humano (2,4 nM) e XL665 marcado com estreptavidina (60 nM). 5 ul por poço desta solução foi adicionado a todos os poços da placa de ensaio de 384 poços de tal modo que as concentrações finais de Fc anti-humano marcado com criptato de európio e XL665 marcada com estreptavidina eram 0,6 nM e 15 nM, respectivamente. Note-se que o volume de ensaio final foi de 20 ul e que cada componente do ensaio individual foi adicionado como um suplemento em 5 ul quatro vezes a concentração de ensaio final desejada. Todos os reagentes foram diluidos num ensaio de tampão contendo 50 mM de MOPS pH 7,4 (Sigma, Reino Unido; cat: M9381), 0,4 M KF (BDH Chemicals, EUA; cat: 103444T), 0,1% soro de albumina bovina livre de ácidos gordos (Sigma, UK; cat: A6003) e 0,1% Tween 20 (v/v) (Sigma, UK; cat: P2287).

[00302] As placas de ensaio foram incubadas por 2 horas à temperatura ambiente, antes da fluorescência resolvida por tempo de leitura a comprimentos de onda de emissão de 620 nm e 665 nm com o uso de um leitor de placa EnVision (Perkin Elmer, EUA). Os dados foram analisados por cálculo dos valores de % Delta F para cada amostra. Delta F foi determinado de acordo com a equação 1. Equação 1: Os valores de % de Delta F foram usados para calcular a % de ligação específica conforme descrito na equação 2. Equação 2:

[00303] Exemplos de resultados para Abet0144-GL IgG1-TM são mostrados na Figura 9. Estes resultados demonstram que Abet0144-GL IgG1-TM se liga a peptídeos beta-amilóide humano 1-42, 3-42 piro e piro 11-42, mas não se liga ao peptídeo beta-amilóide 1-40 humano ou ao peptídeo 1-16 e 12-28 truncados.

2.11 Caracterização funcional de anticorpos líderes pela depleção de peptídeos beta-amilóide a partir de plasma humano

[00304]Os anticorpos líderes foram testados num ensaio de depleção de plasma para investigar a sua capacidade para imunoprecipitar o peptídeo beta-amilóide 1-42 humano a partir do plasma de sangue humano. Este ensaio foi utilizado para providenciar evidencias a eficácia funcional para cada anticorpo. O ensaio foi realizado exatamente conforme descrito na seção 1.8.

[00305] Numa experiência, o anticorpo Abet0144-GL IgG1-TM reduziu os níveis do peptídeo beta-amilóide 1-42 humano no plasma de 13,54 pg mL-1 a 9,86 pg mL-1 (uma redução de 27%). Em uma segunda experiência, os níveis foram reduzidos de 40,06 pg mL-1 a 34,65 pg mL-1 (uma redução de 14%).

2.12 Identificação de clones melhorados com ligação nativa para beta-amilóide usando imunohistoquímica in vitro

[00306] IgGs de afinidade optimizada foram testados quanto à sua capacidade de se ligarem a beta-amilóide, com o objetivo de identificar clones líderes os quais reconhecem formas nativas do peptídeo beta-amilóide. Resumidamente, os anticorpos de chumbo foram rastreados em seções cerebrais da doença de Alzheimer humano e seções cerebrais Tg2576 de rato para identificar anticorpos anti-beta-amilóide que se ligam ao amilóide nativo in vitro. Estas experiências foram realizadas essencialmente como descrito na seção 1.9.

[00307] Nestas experiências, o tecido cerebral humano foi isolado a partir do córtex frontal e do hipocampo de dois indivíduos com Doença de Alzheimer grave (sexo feminino, ApoE 4/3, 86 anos: sexo feminino, ApoE 3/3, 67 anos). O tecido cerebral do rato foi isolado de ratinhos Tg2576 com idade de 18 meses (6 ratinhos). Os anticorpos foram testados em concentrações de 2, 5 e 20 μg mL-1.

[00308] Em um experimento, o anticorpo Abet0144-GL IgG1-TM não manchou as placas difusas (DP) ou placas de angiopatia amilóide cerebral (CAA) (pontuação = 0). No entanto, manchou as placas centrais (PB) com uma pontuação de 1 em seções do cérebro Tg2576, e uma pontuação de 1,5 em seções de cérebro AD humano. Em contraste, um anticorpo de controle positivo produziu uma pontuação de 3-4 em todas as placas (CP, DP, CAA) nas seções adjacentes sob as mesmas condições. As imagens representativas são mostradas na Figura 10.

Exemplo 3 Optimização de anticorpo Abet0144-GL através de mutação de todas as seis CDR incluindo flanqueamento de resíduos de Vernier 3.1 Conversão do clone parental Abet0144-GL para o formato compatível scFv com apresentação de ribossoma

[00309] O clone parental foi convertido do formato IgG1-TM para o formato do fragmento de cadeia simples variável (scFv), em preparação para a otimização de afinidade. Os codões optimizados das cadeias pesadas variáveis (VH) e leves variáveis (VL) foram amplificados separadamente a partir dos respectivos vectores de IgG com a adição de locais de clonagem específicos e uma região ligante flexível. PCR recombinatório foi então realizado para gerar uma construção scFv completa, a qual foi clonada no vector modificado pUC (pUC-RD), contendo as características estruturais necessárias para a apresentação de ribossoma. Estas características incluem laços 5 'e 3' para evitar a degradação do mARN transcrito por exonucleases, uma sequência de Shine-Dalgarno para promover a ligação ao ribossoma ao mARN transcrito, e um espaçador geneIII que permite o enrolamento da molécula de scFv traduzida, enquanto ainda permanece ligado ao ribossoma (Groves et al., 2005).

3.2 Optimização de Abet0144-GL por mutagênese dirigida

[00310] O anticorpo líder (Abet0144-GL) foi ainda optimizado para uma afinidade melhorada para beta-amilóide humano 1-42 utilizando uma abordagem de mutagênese dirigida com seleções de exibição em ribossomas baseada em afinidade. Bibliotecas de scFv-ribossomas grandes derivadas de Abet0144-GL foram criadas por mutagênese direcionada por oligonucleotídio de todas as seis regiões de determinação de complementariedade (CDR) de cadela pesada variável (VH) e leve (VL) com o uso de técnicas de biologia molecular padrão conforme descrito por Clackson e Lowman (Clackson et al., 2004). As sequências mutadas de cada CDR foram optimizadas na afinidade como uma biblioteca separada. Os cinco resíduos Vernier anteriores a VHCDR1 (resíduos Kabat 26-30) também foram randomizados usando mutagênese dirigida e estas sequências foram combinadas e maturadas com a restante biblioteca VHCDR1. Todas as bibliotecas foram submetidas a seleções de exibição em ribossomas baseadas na afinidade, a fim de enriquecer para as variantes com maior afinidade para o peptídeo beta-amilóide 1-42 humano. As seleções foram realizadas essencialmente como descrito anteriormente (Hanes et al., 2000).

[00311] Em breve, as seis bibliotecas mutagênese dirigida do clone líder Abet0144-GL, cada um para cada CDR, foram transcritas separadamente em mARN. Com o uso de um processo de tradução apagada, os complexos terciários de mRNA-ribossomo-scFv foram formados (Hanes et al. 1997). Estes complexos foram então submetidos a quatro ciclos de seleção, incubados na presença de concentrações decrescentes de beta-amilóide 1-42 biotinilado humano sintético (Bachem, Alemanha; cat: H-5642) (100 nM a 10 nM) para selecionar variantes com maior afinidade para o beta-amilóide 1-42 humano. Esses complexos que se ligam ao antigênio foram então capturados em esferas paramagnéticas revestidas com estreptavidina (Dynabeads™, Invitrogen, UK; cat: 112-05D) e complexos de ribossomo não específicos foram lavados e o mARN foi subsequentemente isolado dos complexos ribossômicos ligados, transcritos inversamente a cDNA e então amplificados por PCR. Este ADN foi usado no próximo ciclo de seleção.

[00312] Depois de quatro ciclos de maturação de afinidade, cada resultado da seleção foi clonado para fins de triagem. ScFv isolados por apresentação de ribossoma foram clonados no vector fagemídeo pCANTAB6 por digestão com endonucleases de restrição NotI/Ncol da construção de apresentação de ribossoma (New England Biolabs, EUA; cat: R0189L, R0193L) seguido por ligação no pCANTAB6 digerido NotI/Ncol usando a ligase ADN T4 (New England Biolabs, EUA; cat: M0202L) essencialmente como descrito em McCafferty et al. (McCafferty et al., 1994).

3.3 Identificação de clones melhorados com o uso de um ensaio de competição de epítopo

[00313] Dois mil e vinte e quatro scFv selecionados aleatoriamente a partir de ciclos de seleção 3 e 4 a partir da abordagem de mutagênese dirigida descrita na seção 3.2 foram expressas em bactérias para produzir scFv periplasmático não purificado. Estes scFv capazes de se ligarem peptídeo beta-amilóide 1-42 humano sintético através do mesmo epítopo como Abet0144-GL IgG1-TM foram elucidados em um ensaio de formato de competição, usando a plataforma de HTRF™. Especificamente, a transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) é medida entre criptato de estreptavidina (associada com o peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado) e Fc XL665 anti-humano (associada com Abet0144-GL IgG1-TM) na presença de uma concentração única de cada scFv de teste periplasmático não purificado. Uma ocupação bem sucedida do epítopo Abet0144-GL IgG1-TM no peptídeo por scFv resultou numa redução no FRET, como medido num leitor de placas de fluorescência.

[00314] Um sinal de ligação "Total" foi determinado através da análise da ligação de Abet0144-GL IgG1-TM ao peptídeo beta-amilóide 1-42 humano sintético na ausência do peptídeo competidor. Os sinais "amostra" foram derivados a partir da análise da ligação de Abet0144-GL IgG1-TM ao peptídeo beta-amilóide 1-42 humano sintético na presença de uma amostra de scFv de teste. Finalmente, um sinal 'criptato em branco' foi determinado por análise de fluorescência mediada por apenas o cocktail de reagente de detecção.

[00315] scFv periplasmático não purificado foram fornecidos em tampão amostra consistindo em 50 mM de MOPS, pH 7,4, EDTA 0,5 mM, e 0,5 M de sacarose. Para o perfil, as amostras de scFv foram diluídas em uma placa de 384 poços de fundo em V para 50% da concentração original estoque em tampão de ensaio, consistindo em 50 mM de MOPS, pH 7,4, 0,4 M de fluoreto de potássio, 0,1% de albumina de soro bovino livre de ácidos gordos e 0,1% de Tween 20 (v/v). 5 μL de cada scFv recém-diluído foram transferidos para os poços "amostra" de uma placa de ensaio de 384 poços de fundo preto, raso, sólido e não ligante, usando um robot de manuseamento líquido. Os restantes reagentes (preparados em tampão de ensaio) foram adicionados à placa de ensaio, com uma pipeta multicanal na seguinte ordem: 5 μL de tampão amostra (para os poços 'Total' e 'criptato em branco'), 10 μL de tampão de ensaio (para os poços 'criptato em branco'), 5 μL 2 nM Abet0144-GL IgG1-TM (para os poços 'amostra' e 'total'), 5 μL 5 nM peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado humano (para os poços 'amostra' e 'total') e 5 μL de cocktail de detecção, que consiste em 6 nM criptato de estreptavidina e 60 nM anti-His6-XL665 (para todos os poços). As placas de ensaio foram seladas e, em seguida, incubadas durante 3 horas à temperatura ambiente, no escuro, antes de se medir a fluorescência resolvida no tempo a comprimentos de onda de emissão 620 e 665 nm, em um leitor de placas de fluorescência.

[00316] Os dados foram analisados por cálculo da % de valores de Delta F para cada amostra. Delta F foi determinado de acordo com a equação 4. Equação 4:

[00317] Os valores de % de Delta F foram subsequentemente usados para calcular valores de ligação normalizados conforme descrito na equação 5. Equação 5:

[00318] scFv periplasmáticos não purificados demonstrando uma inibição significativa da ligação de Abet0144-GL IgG1-TMs ao peptídeo beta-amilóide 1-42 humano, foram submetidos a sequenciação de ADN (Osbourn et al, 1996; Vaughan et al, 1996). Os scFb que têm sequências proteicas únicas foram expressos em E. coli e purificados por cromatografia de afinidade seguida de troca de tampão.

[00319] A potência de cada scFv purificado foi determinada testando uma série de diluições do scFv (tipicamente 4 - 1200 nM) no ensaio de competição de epítopo descrito acima. Os dados foram novamente analisados por cálculo da % de valores Delta F e % da ligação total para cada amostra. Além disso, um valor de % de inibição para cada concentração de scFv purificado também foi calculado como descrito na Equação 6: Equação 6:

[00320] Concentração da amostra scFv foi representada graficamente contra a % de Inibição usando o software de gráficos científicos, e todas as respostas dependentes da concentração foram ajustadas com curvas de regressão não-linear. Os valores de IC50 foram obtidos a partir destas análises com Hill-slopes restritas a um valor de -1. O clone mais potente deste ciclo de seleções, Abet0286, teve um IC50 de 1,8 nM e veio da biblioteca mutagênese dirigida VLCDR1.

[00321] Fontes Reagente/Equipamento MOPS (Sigma, Reino Unido; cat: M9381), fluoreto de potássio (BDH Chemicals, EUA; cat: A6003), albumina de soro bovino livre de ácidos gordos (Sigma, Reino Unido; cat: A6003) e Tween 20 (Sigma, Reino Unido; cat: P2287), Abet0144-GL IgG1-TM (produzido in-house), peptídeo beta-amilóide 142 biotinilado humano (rPeptide, EUA; cat: A1117), Criptato de estreptavidina (Cisbio, França; cat: 610SAKLB), anti-His6-XL665 (Cisbio, França; cat: 61HISXLB), placas de ensaio de 384 poços (Corning, Costar Life Sciences; cat: 3676), placas de ensaio de 384 poços (Greiner BioOne, Alemanha; cat: 781.280), robot de manuseamento líquido (MiniTrak™, Perkin Elmer, EUA), leitor de fluorescência de placas (Envision™, Perkin Elmer, EUA), tecnologia HTRF (Cisbio International, França), software de representação gráfica/estatístico (Prism, Graphpad EUA).

3.4 Recombinação de resultados de seleção bem sucedida para produzir bibliotecas "binárias", e sua subsequente otimização de afinidade

[00322] O ensaio de competição de epítopo descrito na seção 3.3 foi usado para julgar se uma biblioteca scFv-ribossomo em particular tinha sido amadurecida em termos de afinidade ao longo dos quatro primeiros ciclos de seleção. Duas das bibliotecas, bibliotecas mutagênese dirigida VHCDR3 e VLCDR2, não mostraram melhorias em relação ao clone parental Abet0144-GL e não foram progrediram mais.

[00323] As restantes quatro bibliotecas mutagênese dirigida, (que abrangem VHCDR1, VHCDR2, VLCDR1 e VLCDR3), tinham mostrado melhorias na afinidade e foram recombinadas em forma de pares para produzir seis bibliotecas de recombinação "binárias" em que dois dos seis CDRs foram mutados. Por exemplo, a biblioteca de afinidade maturada cobrindo o VHCDR1 foi recombinada aleatoriamente com a biblioteca VHCDR2 de afinidade maturada para gerar uma bibliotecaVH1:VH2. As bibliotecas remanescentes foram produzidas como: VH1:VL1, VH1:VL3, VH2:VL1, VH2:VL3 e VL1:VL3. Um subconjunto de cada biblioteca de recombinação foi clonado como anteriormente descrito (Seção 3.2) e foi enviado para a sequenciação para verificar a integridade de cada biblioteca.

[00324] As seleções foram, então, continuadas como descrito anteriormente (seção 3.2), na presença de concentrações decrescentes de peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado humano sintético (5 nM e 2 nM para os ciclos 5 e 6, respectivamente). Como antes, cada resultado da seleção foi clonadopara fins de rastreio (seção 3.2).

[00325] Mil novecentos e trinta e seis scFv selecionados aleatoriamente a partir de ciclos de seleção 5 e 6 foram rastreados num ensaio de competição do epítopo como descrito na seção 3.3. Devido ao aumento na potência destes clones, os scFv não purificados foram primeiro diluídos a 25% antes da adição às placas de ensaio. Como anteriormente, os clones que apresentaram propriedades inibidoras significativas foram enviados para o sequenciamento de ADN, e clones únicos foram produzidos e analisados como scFv purificado (seção 3.3). O clone mais potente destas seleções, Abet0303, teve uma potência de 0,84 nM e veio da biblioteca recombinatória VH1:VH2.

3.5 Recombinação de resultados de seleção binária para produzir bibliotecas "ternárias", e sua subsequente otimização de afinidade

[00326] O ensaio de competição de epítopo descrito na seção 3.3 foi usado para julgar se uma biblioteca binária tinha sido amadurecida em termos de afinidade ao longo dos dois anteriores ciclos de seleção. Todas as bibliotecas tinham mostrado melhorias na afinidade e, portanto, foram consideradas para posterior maturação de afinidade.

[00327] As seis bibliotecas binárias (seção 3.4) foram recombinadas com os resultados do ciclo 4 bem sucedido (seção 3.2) em uma forma de pares para formar quatro bibliotecas de recombinação "ternárias", em que três dos seis CDRs foram mutados. Por exemplo, a biblioteca binária VH2:VL3 (resultado do ciclo 6) foi recombinada com a biblioteca de mutagênese dirigida VHCDR1 (resultado do ciclo 4) para gerar uma biblioteca VH1:VH2:VL3. Construções semelhantes também foram criadas pela combinação da biblioteca binária VH1:VH2 (resultado do ciclo 6) com a biblioteca de mutagênese dirigida VLCDR3 (resultado do ciclo 4). Estas duas bibliotecas individuais foram combinadas para criar a biblioteca ternária VH1:VH2:VL3.

[00328] Foi tomado cuidado para não destruir a sinergia entre CDRs que tinha sido co-otimizada. Por exemplo, a biblioteca binária VH1:VL3 não foi recombinada com a biblioteca de mutagênese dirigida VHCDR2 uma vez que essa manipulação teria destruído a sinergia entre as sequências VHCDR1 e VLCDR3 co-otimizada. Uma lista completa de todas as bibliotecas ternárias e suas derivações é dada na Tabela 3. Um subconjunto de cada biblioteca de recombinação foi clonado como anteriormente descrito (Seção 3.2) e foi enviado para a sequenciação para verificar a integridade de cada biblioteca. Tabela 3: Uma descrição das quatro bibliotecas ternárias que foram maturadas durante os ciclos 7 e 8 da segunda campanha de Optimização do líder. Cada biblioteca compreende duas bibliotecas constituintes, geradas a partir de uma recombinação de pares aleatórios de um resultado do ciclo 6 da biblioteca binária e um resultado do ciclo 4 da biblioteca de mutagênese dirigida.

[00329] As seleções foram, então, continuadas como descrito anteriormente (seção 3.2), na presença de concentrações decrescentes de peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado humano sintético (500 pM e 200 pM para os ciclos 7 e 8, respectivamente). Como antes, cada resultado da seleção foi clonadopara fins de rastreio (seção 3.2).

[00330] Mil quatrocentos e oito scFv selecionados aleatoriamente a partir de ciclos de seleção 7 e 8 foram rastreados num ensaio de competição do epítopo como descrito na seção 3.3. Como no rastreamento "binário", os scFv não purificados foram primeiro diluídos a 25% antes da adição às placas de ensaio. Como anteriormente, os clones que apresentaram propriedades inibidoras significativas foram enviados para o sequenciamento de ADN, e clones únicos foram produzidos e analisados como scFv purificado (seção 3.3). O clone mais potente destas seleções, Abet0343, teve uma potência de 0,48 nM e veio da biblioteca recombinatória VH1:VH2:VL3.

3.6 Recombinação de resultados de seleção ternária para produzir bibliotecas "quaternárias", e sua subsequente otimização de afinidade

[00331] O ensaio de competição de epítopo descrito na seção 3.3 foi usado para julgar se uma biblioteca ternária tinha sido amadurecida em termos de afinidade ao longo dos dois anteriores ciclos de seleção (7 e 8). Todas as bibliotecas tinham mostrado melhorias na afinidade e, portanto, foram consideradas para posterior maturação de afinidade.

[00332] A biblioteca ternária VH1:VH2:VL1 (resultado do ciclo 8) foi recombinada com a biblioteca de mutagênese dirigida (resultado do ciclo 4) e a biblioteca ternária VH2:VL1:VL3 (resultado do ciclo 8) foi recombinada com a biblioteca de mutagênese dirigida VHCDR1 (resultado do ciclo 4). Separadamente, a biblioteca binária VH1:VH2 (resultado do ciclo 6) foi recombinada com a biblioteca binária VL1:VL3 (resultado do ciclo 6). Estas três bibliotecas individuais foram então reunidas para criar uma única biblioteca "quaternária", VH1:VH2:VL1:VL3, em que quatro dos seis CDR foram mutados.

[00333] Foi tomado cuidado para não destruir a sinergia entre CDRs que tinha sido co-otimizada. Por exemplo, a biblioteca ternária VH1:VL2:VL3 não foi recombinada com a biblioteca de mutagênese dirigida VLCDR1 uma vez que essa manipulação teria destruído a sinergia entre as sequências VHCDR1/VHCDR2 e VLCDR3 co-otimizada. Um subconjunto de cada biblioteca de recombinação foi clonado como anteriormente descrito (Seção 3.2) e foi enviado para a sequenciação para verificar a integridade de cada biblioteca.

[00334] As seleções foram, então, continuadas como descrito anteriormente (seção 3.2), na presença de concentrações decrescentes de peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado humano sintético (50 pM e 10 pM para os ciclos 9 e 11). Como antes, cada resultado da seleção foi clonadopara fins de rastreio (seção 3.2).

[00335] Mil seiscentos e setenta e dois scFv selecionados aleatoriamente a partir de ciclos de seleção 9 e 11 foram rastreados num ensaio de competição do epítopo como descrito na seção 3.3. Devido ao aumento na potência destes clones, os scFv não purificados foram primeiro diluídos a 3,13% antes da adição às placas de ensaio. Como anteriormente, os clones que apresentaram propriedades inibidoras significativas foram enviados para o sequenciamento de ADN, e clones únicos foram produzidos e analisados como scFv purificado (seção 3.3). O clone mais potente destas seleções, Abet0377, tinha uma potência de 0,32 nM (dados n = 2). As curvas de inibição das amostras são ilustrados na Figura 11 e os dados para 24 dos clones de potência mais elevadas estão apresentados na Tabela 4. As sequências de proteínas correspondentes são listadas nas Tabelas 5 e 6.Tabela 4: Exemplos de dados de potência para os clones de scFv optimizados quando avaliado no ensaio de competição de epítopo Abet0144-GL HTRF™. Quando o ensaio foi realizado mais do que uma vez, o intervalo de valores absolutos de IC50 é fornecido. Tabela 5 (ver abaixo): Alinhamento de sequências dos domínios VH dos clones optimizados não de linha germinal aqui descrito. As alterações da sequência parental (Abet0144-GL) estão destacadas. Os resíduos são designados de acordo com o sistema de numeração Kabat. Tabela 6 (ver abaixo): Alinhamento de sequências dos domínios VL de cclones optimizados não de linha germinal aqui descrito. As alterações da sequência parental (Abet0144-GL) estão destacadas. Os resíduos são designados de acordo com o sistema de numeração Kabat. Notese que Abet0378 tem um codão "B" de terminação âmbar presente na sequência de VL na posição 91, que foi introduzido como uma mudança de glutamina durante a optimização. O anticorpo foi produzido como um fragmento de scFv na estirpe TG1 de E. coli utilizada para a expressão em que o codão de terminação âmbar é lido como glutamina.

3.7 Perfis cinéticos dos clones de afinidade melhorada em formato scFv purificada por ressonância de plasma de superfície

[00336] A ressonância de plasma de superfície foi utilizada para analisar os clones scFv purificados que mostraram melhora significativa na afinidade de ligação para peptídeo beta-amilóide 1-42 humano em relação à sequência parental, Abet0144-GL, no ensaio de competição epítopo HTRF™ (seções 3.3-3.6). Em resumo, o sistema de matriz de interação proteína ProteOn (BioRad, EUA) foi utilizado para avaliar os parâmetros cinéticos da interação entre cada scFv purificado e peptídeo beta-amilóide 1-42 humano produzido sinteticamente. Estas experiências foram realizadas essencialmente como descrito por Karlsson et al. (Karlsson et al., 1991). Para mais detalhes ver seção 1.7.

[00337] A afinidade de ligação entre cada scFv de teste e beta-amilóide 1-42 humano foi estimada utilizando ensaios nos quais o peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado humano sintético (rPeptide, EUA; cat: A1117) foi ligado de forma não covalente através de uma interação biotina/estreptavidina a um chip de estreptavidina (NTA 1765021), em cinco densidades superficiais diferentes. A superfície de chip foi regenerada entre os ciclos por uma única injeção de 60 segundos de Glicina a 10mM pH2 para remover o scFV ligado ao peptídeo. A regeneração não resultou em uma perda significante da atividade de ligação de scFv.

[00338] Cada scFv a 100 - 200 nM) foi sequencialmente passada pela superficie do peptídeo para uma quantidade suficiente de tempo para observar sensorgramas que poderiam ser ajustados a um modelo de ligação de 1:1 com segurança. Um branco de scFv irrelevante foi subtraído do conjunto principal de dados para reduzir o impacto de quaisquer artefatos tampão ou os efeitos de ligação não específica. Um modelo apropriado de ligação foi, em seguida, ajustado aos dados.

[00339] Para Abet0380 scFv, a constante de velocidade de associação (ka) e constante de velocidade de dissociação (kd) e constante de dissociação (KD) são de 1.93 x 105 M-1 s-1, 2.85 x 10-5 s-1 e 148 pM, respectivamente. Estes parâmetros foram obtidos a partir de 1:1 de Langmuir para ajuste aos dados.Tabela 7: Exemplos de dados cinéticos da ligação de clones de scFvotimizados ao peptídeo beta-amilóide 1-42 biotinilado humano sintético, conforme determinado por essonância de plasma de superfície.

3.8 Reformatação de afinidade melhorada de scFv a IgG1-TM humano

[00340] O formato anticorpo IgG1-TM é discutido na seção 2.6. scFv foram reformados em IgG1-TM por subclonagem dos domínios de cadeia pesada variável (VH) e cadeia leve variável (VL) em vetores que expressam as cadeias pesadas e leves de anticorpo humano inteiras respectivamente. A cadeia pesada variável foram clonados em um vetor de expressão de mamífero (pEU 1.4) contendo os domínios constantes de cadeia pesada humanos e elementos reguladores para expressar a cadeia pesada de IgG1-TM inteira em células de mamíferos. Similarmente, a cadeia leve variável foi clonada em um vetor de expressão mamífero (pEU 4.4) para a expressão dos domínios constantes de cadeia leve lambda humanos e elementos reguladores para expressar a cadeia leve inteira de IgG em células de mamíferos.

[00341] Para obter anticorpos como IgG, os vectores de expressão das cadeias pesadas e leves de IgG foram transientemente transfectados em células de mamífero HEK293-EBNA (Invitrogen, Reino Unido; cat: R620-07) onde IgGs foram expressas e secretadas para o meio. As colheitas foram reunidas e filtradas antes da purificação. A IgG foi purificada com o uso de cromatografia Proteína A . Os sobrenadantes da cultura foram carregados numa coluna de cerâmica de Proteína A (BioSepra – Pall, EUA) e lavada com Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 250 mM. A IgG ligada foi eluída da coluna usando 0,1 M de citrato de sódio (pH 3,0) e foi neutralizada pela adição de Tris-HCl (pH 9,0). O material eluido foi sujeito a uma troca de tampão para PBS utilizando colunas de troca de tampão NAP-10 (GE Healthcare, Reino Unido; cat: 17-0854-02) e as IgGs purificadas foram passadas através de um filtro de 0,2 μm. A concentração de IgG foi determinada espectrofotometricamente usando um coeficiente de extinção com base na sequência de aminoácidos da IgG. As IgGs purificadas foram analisadas para a agregação ou a degradação utilizando SEC-HPLC e SDS-PAGE.

3.9 Regresso à linha germinativa

[00342] Cinco das IgGs mais potentes foram selecionadas para processo de linhagem germinativa, com base em uma caracterização experimental da sua correspondente scFv. scFv purificadas dos clones Abet0343, Abet0369, Abet0377, Abet0380, Abet0382 exibiram valores de IC50 de menos do que 750 pM, como determinado pelo ensaio de competição de epítopo (Tabela 4), e todos tinham uma constante de dissociação experimental inferior a 250 pM, tal como determinado por ressonância de plasma de superfíciee, Tabela 7.

[00343] O processo de linhagem germinativa consistiu em reverter os resíduos de arcabouço em domínios VH e VL à sequência de linhagem germinativa mais próxima para correlacionar identicamente os anticorpos humanos. Para os domínios VH da linhagem de anticorpo optimizado, tal foi Vh3-23 (DP-47) e para os domínios VL foi Vλ3-3r (DPL-23). Para Abet0380, o resíduo 1 necessário para mudar no domínio VH da posição Kabat 43 (Tabela 8) e resíduo 1 necessário para a mudança no domínio VL da posição Kabat 81 (Tabela 9). As quatro restantes sequências necessárias entre dois e cinco alterações (Tabelas 8 e 9). Os resíduos de Vernier (Foote et al., 1992), não foram sujeitos ao regresso à linha germinativa, com excepção do resíduo 2 na sequência da cadeia leve de Abet0343, que foi sujeito ao regresso à linha germinativa, ao mesmo tempo que os resíduos que flanqueiam 1 e 3. O regresso à linha germinativa destes resíduos de aminoácidos foi realizado utilizando técnicas padrão de mutagênese dirigida local com os iniciadores mutagénicos adequadas como descrito por Lowman e Clackson (Clackson et al., 2004).Tabela 8: Alinhamento de sequências dos domínios VH dos cinco clones selecionados para processo de linhagem germinativa. Os dois resíduos que foram revertidos para linha germinal são indicados por caixas sombreadas. As posições dos resíduos de Vernier são indicados por círculos (●).Tabela 9: Alinhamento de sequências dos domínios VL de cinco clones selecionados para processo de linhagem germinativa. Os treze resíduos que foram revertidos para linha germinal são indicados por caixas sombreadas. As posições dos resíduos Vernier são indicados por círculos (●). O resíduo Vernier 2 em Abet0343 foi revertido a linha germinal, ao mesmo tempo que os resíduos 1 e 3. Reverter esse resíduo não causou impacto na potência do anticorpo.

3.10 Determinação da cinética de ligação de IgG otimizado por afinidade usando ressonância de plasma de superfície

[00344] Ressonância de plasma de superfície foi utilizada para analisar a cinética de ligação dos IgGs otimizados por afinidade (seção 3.8) e os seus homólogos sujeitos a regresso à linha germinal (seção 3.9). O instrumento biossensor BIAcore T-100 (GE Healthcare, Reino Unido) foi utilizado para avaliar os parâmetros cinéticos da interação entre cada um dos anticorpos líderes e peptídeo beta-amilóide 1-42 humano produzido sinteticamente. Estas experiências foram realizadas essencialmente como descrito por Karlsson et al. (Karlsson et al., 1991). Para mais detalhes ver seção 1.7.

[00345] A afinidade de ligação entre cada IgG de teste e peptídeo beta-amilóide 1-42 humano foi estimada com o uso de ensaios em que cada anticorpo foi capturado de modo não covalente por superficie de proteina G que foi ligada via amina a uma superfície de CM5 chip. A superfície de chip foi regenerada entre os ciclos por uma injeção pareada de 40 segundos de Glicina a 10mM pH 2.0 para remover o ligando e ligar o anticorpo. O anticorpo teste foi então reaplicado por cada injeção de peptídeo.

[00346] Uma série de diluições do peptídeo beta-amilóide 1-42 humano sintético (0,063 a 1024 nM) foram sequencialmente passadas pela superfície de anticorpo para uma quantidade suficiente de tempo para observar sensorgramas que poderiam ser ajustados a um modelo de ligação com segurança. Os dados de célula de fluxo do branco de referência foram subtraídos de cada conjunto de dados de IgG e um branco de tampão de concentração zero apenas anticorpo foi de referência dupla do conjunto de dados principais. Um modelo de ligação apropriado foi então ajustado simultaneamente aos dados de cada titulação de analito com o uso do software BIAevaluation.

[00347] A validade dos dados foi avaliada utilizando o valor Chi2 calculado, com um valor aceitável sendo sob 2 RU2. O sucesso global do ajuste foi estimado utilizando os resíduos, com um desvio de menos de 2 RUs como sendo aceitável.

[00348] Exemplos de resultados para Abet0380-GL (regresso à linha germinativa) IgG1-TM são mostrados na Figura 12. A média da constante de velocidade de associação (ka) e constante de velocidade de dissociação (kd) e constante de dissociação (KD) são de 9.52 x 105 M-1 s-1, 3.07 x 10-4 s-1 e 322 pM, respectivamente. Estes parâmetros foram obtidos a partir de 1:1 de Langmuir ajuste aos dados.

3.11 Perfis de especificidade de IgGs com afinidade otimizada usando Ressonância de plasma de superfície

[00349] Ressonância de plasma de superfície foi utilizada para verificar a especificidade das IgGs de afinidade optimizada para o peptídeo beta-amilóide 1-42 humano. Em resumo, o instrumento biossensor BIAcore2000 (GE Healthcare, Reino Unido) foi utilizado para avaliar os parâmetros cinéticos da interação entre IgG de teste e uma série de pequenos peptídeos, incluindo peptídeo beta-amilóide 1-42 humano produzido sinteticamente e beta-amilóide 1-40 humano. Estas experiências foram realizadas essencialmente como descrito por Karlsson et al. (Karlsson et al., 1991). Para mais detalhes ver seção 1.7.

[00350] A interação entre cada IgG de teste e cada peptídeo foi estimada com o uso de ensaios em que o anticorpo foi capturado de modo não covalente por superficie de proteina G que foi ligada via amina a uma superfície de CM5 chip do proprietário. A interação entre o anticorpo e o peptídeo foi observada usando uma abordagem de ciclo único aplicação 5. A superfície de chip foi regenerada entre os ciclos por uma injeção pareada de 40 segundos de Glicina a 10mM pH 2.0 para remover o ligando e ligar o anticorpo. O anticorpo teste foi então reaplicado por cada ciclo de injeção de peptídeo.

[00351] Cada peptídeo de teste (entre 64 e 1024 nM) foi sequencialmente passada pelo superfície do anticorpo para uma quantidade suficiente de tempo para observar sensorgramas que mostraram nenhuma ligação ou poderiam ser ajustados a um modelo de ligação com segurança. Os dados de célula de fluxo do branco de referência foram subtraídos de cada conjunto de dados de IgG e um branco de tampão de concentração zero apenas anticorpo foi de referência dupla do conjunto de dados principais.

[00352] Exemplos de resultados para Abet0380-GL (regresso à linha germinativa) IgG1-TM são mostrados na Figura 13. Dois peptídeos (beta-amilóide 1-42 biotinilado humano (rPeptide, EUA; cat: A1117) e peptídeo beta-amilóide 1-42 humano não marcado (rPeptídeo, EUA; cat: A1008) mostraram uma ligação forte ao anticorpo, enquanto que dois peptídeos beta-amilóide humano biotinilado 1-40 (rPeptide, EUA; cat: A1111) e peptídeo beta-amilóide 1-40 humano não marcado (rPeptídeo, EUA; cat: A1007) não mostrou qualquer ligação ao anticorpo.

3.12 Afinidade IgGs mais potentes para beta-amilóide nativo usando imunohistoquímica in vitro

[00353] As IgGs mais potentes foram testadas quanto à sua capacidade de se ligarem a beta-amilóide, com o objetivo de estimar a afinidade desses clones para as formas nativas do peptídeo beta-amilóide. Resumidamente, os anticorpos de chumbo foram rastreados em seções cerebrais da doença de Alzheimer humano e seções cerebrais Tg2576 de rato para identificar anticorpos anti-beta-amilóide 1-42 que se ligam a placas amilóide in vitro. Estas experiências foram realizadas essencialmente como descrito na seção 1.9.

[00354] Nestas experiências, o tecido cerebral humano foi isolado a partir do córtex frontal e do hipocampo de dois indivíduos com Doença de Alzheimer grave (ApoE genótipo 3/3, fase Braak 6 e ApoE genótipo 4/3, fase Braak 5). Como controle, o tecido equivalente foi isolado a partir de um indivíduo não-demência (ApoE genótipo 3/3, fase Braak 1). O tecido cerebral do rato foi isolado de ratinhos Tg2576 com idade média de 15 meses (2 ratinhos) e 22 meses (2 ratinhos). Os anticorpos foram testados em concentrações de 2, 5 e 20 μg mL-1.

[00355] Em um experimento, o anticorpo Abet0380-GL IgG1-TM manchou as placas centrais (CP) com uma pontuação de 4 em seções do cérebro Tg2576, e uma pontuação de 3 em seções de cérebro AD humano. Também manchou placas difusas (DP) e placas de angiopatia amilóide cerebral (CAA), mas em menor grau. Em contraste, um anticorpo de controle positivo produziu uma pontuação de 3-4 em todas as placas (CP, DP, CAA) nas seções adjacentes sob as mesmas condições. As imagens representativas são apresentadas na Figura 14.

3.13 Demonstração do reconhecimento do perfil Abet0380-GL IgG1-TM Abeta42 por western blot

[00356] Para reticular os oligômeros Aβ42 antes de SDS-PAGE, foi realizada PICUP (reticulação foto-induzida de peptídeos) como se segue. Uma solução 1 mM de Ru (Bpy) foi criada através da adição de 2 μL de estoque (a 10 mM) a 18 μL de IxPBS. Em adição, uma solução de 20 mM de persulfato de amônio (APS) foi criada através da adição de 2 μL de estoque (a 200 mM) a 18 μL de 1xPBS. Estoque não utilizado foi imediatamente congelado em gelo seco e colocado no congelador -80 °C. Em uma sala escura, 5 μL de Ru (Bpy) foi adicionado a 80 uL do agregado (amostra pura 10 uM), seguida de 5 μL de APS. As amostras foram irradiadas com uma lâmpada na sala escura por 10 seg. 30 uls de tampão (4x) da amostra LDS foi adicionado imediatamente.

[00357] SDS-PAGE foi depois realizado no agregado Aβ1-42 reticulado (PICUP) e não-reticulado. As soluções foram incubadas num bloco quente a 70 °C durante 10 minutos. Enquanto isso, foi criado um marcador combinando 5 μL de Magic Mark XP Western Protein Standard, 5 μL de Novex Sharp Pre-stained Protein Standard. Após a incubação durante dez minutos, as amostras e um marcador foram carregados num gel Bis-Tris NuPAGE Novex 4-12% (1,0 mm, 15 poços, de 15 μL por poço) com tampão de corrida MES. Os géis foram corridos a 200 V durante 35 minutos.

[00358] O gel foi em seguida transferido para uma membrana PVDF utilizando uma máquina iBlot da Invitrogen, durante 7 minutos a 20V (programa P3).

[00359] Quando o blotting estava completo, a pilha de géis foi desmontada e a membrana PVDF foi então bloqueada em 50 mL de 4% MPBST (4% Marvel em PBST) durante uma hora à temperatura ambiente com rotação suave. As transferências foram então cortadas com um bisturi para sondagem com anticorpos individuais. Foi uma incubação de 1 hora com a solução de anticorpo primário (2 ug/mL em 10 mL de 3% MPBST).

[00360] Em seguida, a membrana foi lavada 5x com PBST, 5 minutos cada, e foi, em seguida, incubada em solução de anticorpo secundário (1μL do conjugado específico para HRP Fc anti-humano em 10 mL de PBST) durante 1 hora à temperatura ambiente. A membrana foi lavada 3x com PBST e 2x com PBS, 5 minutos cada.

[00361] Durante as lavagens finais, o substrato SuperSignal West Dura quimio-luminescente (Thermo Scientific; 34075) foi deixado a aquecer à temperatura ambiente. 600 uL de cada uma das duas soluções foram combinadas. O PBS foi decantado a partir da membrana PVDF, e em seguida uma pipeta foi utilizada para cobrir a membrana com os reagentes misturados Dura. A reação foi deixada prosseguir durante ~5 minutos (tempo durante o qual o sistema de imagem VerscDoc foi preparado) e, em seguida, uma imagem foi tirada com a exposição de 30 seg (com realce utilizando o filtro transform). A imagem representativa são apresentadas na Figura 15.

Exemplo 4 Estudos que demonstram uma resposta funcional específica do anticorpo Abet0380-GL IgG1-TM in vivo 4.1 Caracterização funcional de Abet0380-GL IgG1-TM pela redução do peptídeo beta-amilóide 1-42 livre in vivo

[00362] Ratos machos albinos Harlan Sprague-Dawley com oito semanas de idade (n = 8-12) receberam uma única dose de anticorpo Abet0380-GL IgG1-TM por injeção intravenosa com um veículo de dosagem de histidina 25 mM, 7% de sacarose, 0,02% de surfactante p80, pH 6,0 a 5 mL/kg. Soluções de dosagem foram feitas pouco antes da dosagem. Os animais foram anestesiados no momento indicado e o líquido cefalorraquidiano (LCR) foi aspirado da cisterna magna. As amostras de CSF foram centrifugadas durante 10 minutos a aproximadamente 3000x g a 4 °C durante 20 minutos da amostragem para remover as células e detritos. As amostras foram então congeladas em gelo seco e armazenadas a -70 °C para análise subsequente.

[00363] Os animais foram sacrificados por decapitação, o tecido cerebral foi dissecado e os peptídeos beta-amilóides foram extraídos a partir de tecido cerebral em dietilamina (DEA; Fluka, Sigma, Reino Unido; cat: 31729). Resumidamente, tecido cerebral congelado foi homogeneizado em 0,2% de DEA e 50 mM de NaCl (Merck, EUA; cat: 1.06404.1000). Homogenatos cerebrais foram ultracentrifugados a 133.000 x g, durante 1 hora. Os sobrenadantes recuperados foram neutralizados a pH 8,0 com 2 M de Tris-HCl (TRIZMA®-hidrocloreto, Sigma, Reino Unido; cat: 93.363) e armazenados a -70 °C até análise. Experimentações em animais foram realizadas de acordo com as diretrizes e regulamentos pertinentes fornecidos pelo Conselho Sueco de Agricultura. A permissão ética foi fornecida por um conselho ético especializado em experimentações com animais: Conselho de Ética de Pesquisa Animal de Estocolmo Sodra.

[00364] A medição do peptídeo beta-amilóide beta 1-42 livre no CSF do rato foi conduzida usando imunoprecipitação para remover Abet0380-GL ligado ao peptídeo beta-amilóide beta 1-42, seguida de análise com um kit ELISA comercial obtido a partir de Invitrogen. Resumidamente, uma solução de esferas de proteína A (proteína A Dynabeads®; Invitrogen, Reino Unido; cat: 100-02D) foi adicionada a uma placa de 96 poços não-contornada (polipropileno de 0,2 mL; VWR International, Reino Unido; cat: 10732-4828) e lavou-se duas vezes com TBST (50 mM TBS; Sigma, Reino Unido; cat: T6664 com 0,1% de Tween 20), usando uma magneto (DynaMag™ 96 lateral; Invitrogen, Reino Unido; cat: 123.31D) para separar as esferas da solução. As amostras de CSF dos ratos descongeladas (40 μL) foram adicionados a cada poço e incubou-se a 40 °C com rotação com inclinação durante 1 hora. As esferas foram então sedimentadas utilizando o magneto e 30 μL de amostras de CSF imunoprecipitadas foram transferidos para uma placa de 96 poços a partir do kit de ELISA (kit de ELISA colorimétrico beta-amilóide (1-42) rato; Invitrogen, Reino Unido; cat: KMB3441) com 70 μL do tampão diluente padrão já adicionado (suplementado com inibidor de protease; Roche, Reino Unido; cat: 11836153001). As amostras padrão de calibração foram adicionadas à placa em duplicado e a placa foi incubada durante 2 horas à temperatura ambiente com agitação. A placa foi lavada quatro vezes com 400 μL de tampão de lavagem, 100 μL de solução de anticorpo de detecção foi adicionado a cada poço e a placa foi incubada durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação. Mais uma vez, a placa foi lavada 4 vezes com 400 μL de tampão de lavagem, 100 μL de solução de de trabalho de anticorpo secundário foi adicionado a cada poço e a placa foi incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente com agitação. Mais uma vez, a placa foi lavada 4 vezes com 400 μL de tampão de lavagem, 100 μL de solução de de trabalho de anticorpo secundário foi adicionado a cada poço e a placa foi incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente com agitação. Para parar a reação, a 100 μL de solução de paragem foi adicionado a cada poço e foi realizada a leitura da placa em 2 horas a uma absorvância de 450 nm. As amostras de CSF individuais foram analisadas e a análise dos dados foi realizada utilizando Prism 4 (GraphPad, EUA) com ANOVA uma-via em dados transformados em log sem ajuste para comparações múltiplas.

[00365] A medição do total (livre e Abet0380-GL ligado) do peptídeo beta-amilóide 1-42 em homogeneizados de cérebro de rato foi realizada utilizando o kit ELISA colorimétrico com modificações de beta-amilóide (1-42) (Invitrogen, Reino Unido; cat: KMB3441). O kit de anticorpo de detecção foi substituído por um excesso de anticorpo Abet0380-GL IgG1-TM e o anticorpo secundário por um anticorpo IgG HRP-conjugado anti-humano (Jackson ImmunoResearch, Reino Unido; cat: 109-035-098). Resumidamente, os homogeneizados de cérebro descongelados de 50 μL foram diluídos 1:2 em diluente de amostra (suplementado com inibidor de protease; Roche, Reino Unido; cat: 11836153001) e amostras-padrão foram adicionadas em duplicado à placa de ELISA de 96 poços. Um excesso de anticorpo Abet0380-GL IgG1-TM (50 μL, 4 μL/mL) foi adicionado a cada poço e a placa foi então incubada durante 3 horas à temperatura ambiente. A placa foi lavada 4 vezes com 400 μL de tampão de lavagem, 100 μL de solução de de trabalho de anticorpo secundário foi adicionado a cada poço e a placa foi incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente. Finalmente, a placa foi lavada 4 vezes com 400 μL de tampão de lavagem, 100 μL de cromogênio estabilizado foi adicionado a cada poço e a placa foi incubada durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Para parar a reação, a 100 μL de solução de paragem foi adicionado a cada poço e foi realizada a leitura da placa em 2 horas a uma absorvância de 450 nm. A análise dos dados foi realizada utilizando Prism 4 (GraphPad, EUA) com ANOVA uma-via em dados transformados em log sem ajuste para comparações múltiplas.

[00366] A medição do total do peptídeo beta-amilóide 1-40 em homogeneizados de cérebro de rato foi realizada utilizando o kit ELISA colorimétrico com beta-amilóide (1-40) (Invitrogen, Reino Unido; cat: KMB3481). Resumidamente, os homogeneizados de cérebro descongelados de 50 μL e amostras padrão foram diluídos em diluente de amostra (suplementado com inibidor de protease; Roche, Reino Unido; cat: 11836153001) e foram adicionados em duplicado à placa de ELISA de 96 poços. 50 μL de solução de anticorpo de detecção foram adicionados a cada poço e a placa foi incubada durante 3 horas à temperatura ambiente. A placa foi lavada 4 vezes com 400 μL de tampão de lavagem, 100 μL de solução de de trabalho de anticorpo secundário foi adicionado a cada poço e a placa foi incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente. Finalmente, a placa foi lavada 4 vezes com 400 μL de tampão de lavagem, 100 μL de cromogénio estabilizado foi adicionado a cada poço e a placa foi incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Para parar a reação, a 100 μL de solução de paragem foi adicionado a cada poço e foi realizada a leitura da placa em 2 horas a uma absorvância de 450 nm. A análise dos dados foi realizada utilizando Prism 4 (GraphPad, EUA) com ANOVA uma-via em dados transformados em log sem ajuste para comparações múltiplas.

4.2 Caracterização funcional de Abet0380-GL IgG1-TM pela redução do peptídeo beta-amilóide 1-42 livre in vivo

[00367] Uma única dose do anticorpo Abet0380-GL IgG1-TM a 20 mg/kg reduziu o nível CSF do peptídeo beta-amilóide 1-42 livre em ratos até o limite de quantificação em 72 ou 168 horas após a dose no ensaio descrito na seção 4.1 (dados não apresentados). Para investigar adicionalmente o efeito do anticorpo Abet0380-GL IgG1-TM in vivo, os ratos receberam doses semanais de 0,25, 0,5, 1, 5 ou 10 mg/kg ao longo de 14 dias. Os animais foram sacrificados 168 horas após a segunda dose para medir os níveis de peptídeo beta-amilóide 1-42 livre em CSF, bem como peptídeos beta-amilóide 1-42 ou 1-40 totais no tecido cerebral.

[00368] Uma diminuição dependente da dose do beta-amilóide 1-42 livre foi demonstrada em CSF (Figura 16A). As duas maiores doses de 5 e 10 mg/kg reduziram o peptídeo beta-amilóide 1-42 ao limite de quantificação do ensaio utilizado, enquanto que as doses de 0,5 e 1 mg/kg reduziram significativamente o peptídeo beta-amilóide 1-42 por 47% e 61 %, respectivamente, quando comparado com o veículo de controle. A dose mais baixa, de 0,25 mg/kg, originou uma redução de 14% peptídeo beta-amilóide 1-42 no CSF, mas não atingiu significância estatística. Devido ao sequestro do peptídeo beta-amilóide 1-42 pelo anticorpo Abet0380-GL IgG1-TM, um aumento dependente da dose do peptídeo beta-amilóide 1-42 total foi demonstrado no tecido cerebral (Figura 16B). No entanto, o nível do total do peptídeo beta-amilóide em tecido cerebral não foi afectado (Figura 16C), demonstrando assim a especificidade do Abet0380-GL IgG1-TM para o peptídeo beta-amilóide 1-42. Em resumo, os resultados anteriores a partir de estudos com ratos mostraram que o anticorpo Abet0380-GL IgG1-TM reduziu o nível de peptídeo beta-amilóide 1-42 no CSF com um valor ED50 compreendido entre 0,5 e 1 mg/kg.

4.3 Caracterização funcional de Abet0380-GL IgG1-TM -demonstração de não ligação a placa in vivo - nenhuma ligação de Abet0380-GL IgG1-TM para placas beta-amilóides in vivo 168 horas após a dose periférica em ratinhos idosos Tg2576

[00369] Abet0380-GL IgG1-TM foi testado quanto à sua capacidade para se ligarem a placas de beta-amilóide em ratinhos idosos Tg2576 após uma dose única periférica. Experimentações em animais foram realizadas de acordo com as diretrizes e regulamentos pertinentes fornecidos pelo Conselho Sueco de Agricultura. A permissão ética foi fornecida por um conselho ético especializado em experimentações com animais: Conselho de Ética de Pesquisa Animal de Estocolmo Sodra.

[00370] Ratinhos fêmeas Tg2576 de dezassete meses de idade (n = 5) receberam uma única dose de veículo, um anticorpo de controle positivo a 30 mg/kg ou o anticorpo Abet0380-GL IgG1-TM a 10 ou 30 mg/kg por injeção intravenosa com uma dosagem de veículo de histidina 25 mM, 7% de sacarose, 0,02% de tensioativo P80, pH 6,0 a 5 mL/kg. Às 168 horas após a dose, os animais foram profundamente anestesiados e perfundidos com PBS à temperatura ambiente seguido de paraformaldeído (PFA) 4% tamponado com fosfato frio (4 °C). Os animais foram então sacrificados por decapitação e os cérebros foram dissecados e fixados em imersões de PFA a 4 °C durante 72 horas. O fixador foi trocado para PBS contendo azida de sódio a 0,1% e os tecidos foram armazenados a 4 °C até serem processados.

[00371]A imunohistoquímica foi realizada em seções do cérebro para avaliar o grau de ligação de Abet0380-GL IgG1-TM a placas beta-amilóide in vivo. Resumidamente, as seções de cérebro embebidas em parafina foram preparadas para imunohistoquímica, tal como descrito na seção 1.9. A detecção de Abet0380-GL IgG1-TM ou o anticorpo de controle positivo depositado dentro do parênquima cerebral foi realizado utilizando um anticorpo IgG1 coelho-nati-arto e anticorpo secundário IgG2-especifico a partir de Epitomics. A coloração foi realizada com o robô Ventana, utilizando o sistema de detecção OmniMap (Ventana Medical Systems, EUA). Para cravação ex vivo, seções consecutivos de tecidos foram corados in vitro com injeção de Abet0380-GL IgG1-TM ou anticorpo controle positivo em excesso. Anticorpos secundários e cromogenes foram os mesmos que acima.

[00372] A maior pontuação da coloração foi realizada de forma cega, sob 10x de ampliação ótica. A distribuição das placas decorada foi anotada A intensidade de marcação da placa foi classificada de acordo com uma escala relativa de intensidade de 0 (nenhuma coloração das placas) até 4 (intensa deoração das placas).

[00373] Abet0380-GL IgG1-TM não decora nas placas beta- amilóides ou angiopatia amilóide cerebral (CAA) in vivo 168 horas após a dose periférica de 10 ou 30 mg/kg. O anticorpo de controle positivo apresentou intensa a baixa decoração da placa in vivo. Um padrão de distribuição parcial e focal foi evidente, com placas de núcleo, placas difusas e CAA em todos os animais. As imagens representativas são mostradas na Figura 17. A cravação ex vivo do tecido de cérebro a partir dos mesmos animais com Abet0380-GL IgG1-TM e o anticorpo de controlo positivo confirmou a capacidade de ligação à placa dos anticorpos injetados, anteriormente demonstrada ex vivo (não mostrado).

Exemplo 5 Sequências Anti-A 01-42

[00374] Exemplos de sequências de moléculas de anticorpo estão listados na listagem das sequências anexa, incluindo exemplos de anticorpos VH domínios, VL domínios, sequências de CDR individuais, conjuntos de HCDRs, conjuntos de LCDRs, e regiões estruturais.

[00375] As sequências dos 24 clones optimizados listados na Tabela 7 foram comparados. Tabelas 10 e 11 mostram a % de identidade de sequência entre domínios VH e VL, respectivamente. Tabela 10: A identidade da sequência ao longo de toda a sequência Vh (resíduos de Kabat 1^113) de vinte e quatro não sujeitos a processo de linha germinal e os cinco anticorpos sujeitos a processo de linha germinal, aqui descritos. Todas as sequências estão dentro de 86,4% do clone líder Abet0380-GL (valores realçados). Tabela 11: A identidade da sequência ao longo de toda a sequência Vl (resíduos de Kabat 1 ^ 107) de vinte e quatro não sujeitos a processo de linha germinal e os cinco anticorpos sujeitos a processo de linha germinal, aqui descritos. Todas as sequências estão dentro de 88,7% do clone líder Abet0380-GL (valores realçados).Tabela 12: Exemplos de resíduos em cada posição em VH CDRs e resíduos Vernier.Tabela 13: Exemplos de resíduos em cada posição em VL CDRs.Tabela 14: Substituições observadas em VH CDRs e FW1 em 24 clones otimizadosTabela 15: Substituições observadas em VL CDRs em 24 clones otimizados Tabela 16: Correspondência entre as sequências de anticorpos aqui mencionadas e as sequências na Listagem de Sequências no final deste documento.

Exemplo 6: Especificidade da Abet0380-GL IgG1-TM em experiências de competição de ligação

[00376] A especificidade de Abet0380-GL IgG1-TM foi analisada em experiências de competição de ligação. Em resumo, Abet0380-GL IgG1-TM (0,5 nM) foi incubado (1 h à temperatura ambiente) com uma gama de diferentes concentrações (10 uM até 0,17 nM) de um painel de peptídeos Abeta humanos de comprimento completo, truncado e piro (Abeta 1-42, Abeta 1-43, Abeta 1-16, Abeta 12-28, Abeta 17-42, Abeta piro-3-42 ou Abeta piro-11-42).

[00377] Após a incubação entre Abet0380-GL IgG1-TM e os peptídeos Abeta foi adicionado Abeta 1-42 biotina N-terminal (1,5 nM) seguido por um anticorpo Fc anti-humano marcado com criptato de európio (0,8 Nm) (Cat CisBio. No. 61HFCKLB) e streptavidin-XLent! (5 nM) (CisBio Cat. No. 611SAXLB). O ensaio foi então incubado durante mais 2 horas à temperatura ambiente antes da leitura num leitor de placas Envision (PerkinElmer) utilizando um ensaio fluorescência resolvida no tempo homólogo padrão (HTRF) ler protocolo. Na ausência de competição, a interação da Abeta 1-42 biotina N-terminal com Abet0380-GL IgG1-TM (em complexo com streptavidin-XLent! e anticorpo Fc anti-humano marcado com criptato de európio, respectivamente) pode então ser medida através de transferência de energia por ressonância de fluorescência (TR-FRET) devido à proximidade do dador criptato de európio e aceitadores fluoróforos XL665. Competição de Abet0380-GL IgG1-TM: A interação de Abeta 142 biotina N-terminal por peptídeos de teste, por conseguinte, resultou numa redução de sinal de ensaio. Os resultados foram expressos como % de ligação específica em que 100% de ligação específica foi obtida a partir de poços contendo streptavidin-XLent! (5 nM), Abeta 1-42 biotina N-terminal (1,5 nM), Abet0380-GL IgG1-TM (0,5 nM) eanticorpo Fc anti-humano marcado com criptato de európio (0,8 Nm). 0% de ligação específica foi obtida em poços em que Abet0380-GL IgG1-TM foi omitido.

[00378] O volume final do ensaio foi de 20 μL e todos os reagentes foram preparados em tampão de ensaio compreendendo MOPS pH 7,4 (50 mM), fluoreto de potássio (0,4 M), Tween 20 (0,1%) e BSA sem ácidos gordos (0,1%). O ensaio foi realizado em placas de ensaio pretas de 384 poços de baixo volume (Costar 3676).

[00379] Em resumo, a inibição de Abet0380-GL IgG1-TM: a ligação terminal N Biotina Abeta 1-42 foi observada com Abeta 1-42, Abeta 143, Abeta 17-42, Abeta piro-3-42 & Abeta piro-11-42 com os valores de IC50 entre 10-8 a 10-9 molar para este grupo. A inibição de Abet0380-GL IgG1-TM: a ligação do terminal N Biotina Abeta 1-42 foi observada com Abeta 1-16 ou Abeta 12-28 (Figura 18).

Exemplo 7: Capacidade do anticorpo Abet0144-GL para sequestrar beta-amilóide 1-42 num estudo normal com rato PK-PD.

[00380] A capacidade do anticorpo Abet0144-GL para sequestrar beta-amilóide 1-42 foi investigada num estudo PK-PD em ratos normais. Os ratos foram administrados por via intravenosa com Abet0144-GL (10 ou 40 mg/kg) ou veículo por semana durante 2 semanas (nos dias 0 e 7), e sacrificados uma semana após a segunda dose. CSF foi amostrado para beta-amilóide 1-42 livre ou total, e o cérebro foi amostrado para medição de beta-amilóide 1-42 total. Os níveis de beta-amilóide 1-42 livre e total foram medidos através dos ensaios descritos acima.

[00381] Como mostrado na Figura 19, beta-amilóide 1-42 livre em CSF não foi significativamente alterado por 10 ou 40 mg/kg de Abet0144-GL (5 e 18% de aumento, respectivamente, quando comparado com o veículo, Figura 19). Beta-amilóide 1-42 total em CSF foi significativamente aumentado em 38% a 10 mg/kg e 139% a 40 mg/kg. Beta-amilóide 1-42 total em tecido cerebral foi também significativamente aumentado de 16% e 50% a 10 e 40 mg/kg, respectivamente. Em resumo, os dados deste estudo em ratos normais demonstraram que Abet0144-GL não teve um efeito significativo sobre os níveis de beta-amilóide 1-42 livre no CSF, no entanto, aumentou os níveis de beta-amilóide 1-42 total em ambos CSF e cérebro. Este foi o perfil que seria esperado a partir de um anticorpo com uma afinidade para o alvo na casa das dezenas de gama nM. Referências Bannister, D., Wilson, A., Prowse, L., Walsh, M., Holgate, R., Jermutus, L. e Wilkinson, T. (2006). 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[00382] Outras referências estão incluídas no texto.

Claims

1. Molécula de anticorpo caracterizada pelo fato de que é seletiva para a ligação ao peptídeo beta-amilóide 1-42 humano (Aβ1-42) em relação ao peptídeo beta-amilóide 1-40 humano (Aβ1-40), compreendeendo (i) um domínio VH que compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3, intercaladas com regiões de estrutura, em que as sequências de aminoácidos dos HCDRs são HCDR1 SEQ ID NO: HCDR2 SEQ ID NO: 526, HCDR3 SEQ ID NO: e (ii) um domínio VL que compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3, intercaladas com regiões de estrutura, em que as sequências de aminoácidos dos LCDRs são LCDR1 SEQ ID NO: 534 LCDR2 SEQ ID NO: 535, e LCDR3 SEQ ID NO: 536.

2. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o domínio VH compreende regiões estruturais da cadeia pesada FW1, FW2, FW3 e FW4, em que as sequências de aminoácidos das regiões estruturais de cadeia pesada são: FW1 SEQ ID NO: FW2 SEQ ID NO: FW3 SEQ ID NO: 530, e FW4 SEQ ID NO:

3. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o domínio VL compreende regiões estruturais da cadeia leve FW1, FW2, FW3 e FW4, em que as sequências de aminoácidos das regiões de estrutura de cadeia leve são: FW1 SEQ ID NO: FW2 SEQ ID NO: FW3 SEQ ID NO: 539, e FW4 SEQ ID NO:

4. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos do domínio VH de SEQ ID NO: 524 e a sequência de aminoácidos do domínio VL de SEQ ID NO: 533.

5. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a molécula de anticorpo é capaz de ligar Aβ1-42 humano monomérico solúvel e formas oligoméricas de baixo n de (até pentâmero) Aβ1-42 humano.

6. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a molécula de anticorpo se liga a Aβ1-42 monomérico com uma constante de dissociação (KD) de 500 pM ou menor.

7. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a molécula de anticorpo tanto não liga Aβ1-40 ou se liga a Aβ1-40 com um KD maior que 1 mM.

8. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a molécula de anticorpo se liga a peptídeo beta-amilóide 17-42 (Aβ17-42) e peptídeo beta-amilóide 29-42 humano (Aβ29-42).

9. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a molécula de anticorpo se liga a peptídeo beta-amilóide 3-pyro-42 e peptídeo beta-amiloide 11-pyro-42.

10. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a molécula de anticorpo se liga a peptídeo beta-amilóide 1-43 (Aβ1-43).

11. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a molécula de anticorpo é uma IgG humana.

12. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a molécula de anticorpo é uma IgG1 ou uma IgG2 humana.

13. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que a molécula de anticorpo é uma IgG1-TM, IgG1-YTE ou IgG1-TM-YTE humana.

14. Composição para uso no tratamento de uma doença associada com beta-amilóide, caracterizada pelo fato de que a composição compreende uma molécula de anticorpo como definida em qualquer uma das reivindicações anteriores e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

15. Uso de uma composição compreendendo uma quantidade efetiva de uma molécula de anticorpo como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de ser na preparação de um medicamento para redução da amiloidose, tratamento da doença de Alzheimer, melhoria da cognição ou redução do declínio cognitivo em um paciente com doença de Alzheimer ou síndrome de Down, ou tratamento da degeneração macular num indivíduo.

16. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de ácido nucleico do domínio VH SEQ ID NO: 523 e a sequência de ácido nucleico do domínio VL SEQ ID NO: 532.

17. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de ser transformada in vitro com o ácido nucleico como definido na reivindicação 16 para a produção de uma molécula de anticorpo conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que a célula hospedeira é uma bactéria, fungo filamentoso, levedura ou baculovirus.

18. Método para produção de uma molécula de anticorpo como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que compreende a cultura de células hospedeiras como definidas na reivindicação 17 sob condições para a produção da molécula de anticorpo.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende o isolamento e/ou purificação da molécula de anticorpo.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a formulação da molécula de anticorpo em uma composição que compreende pelo menos um componente adicional.