JP6343615B2 - アミロイドβに対する抗体 - Google Patents

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Description

本発明は、ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドと結合する抗体と、集合的にＡβｎ−４２ペプチド（式中、ｎは１〜２９である）と称される、そのＮ末端切断型とに関する。これは、アミロイドβ１−４０ペプチドよりも、アミロイドβｎ−４２ペプチドとの結合について、選択的である抗体に関する。本発明はまた、アルツハイマー病をはじめとする、アミロイドーシスに伴う病状を治療するための抗Ａβｎ−４２抗体の使用にも関する。
アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知機能障害の悪化によって特徴付けられ、記憶に影響を及ぼして、患者の社会的および職業的機能を減退させる。変性疾患は、脳内の神経細胞の損失を引き起こし、それは言語と、判断、計画、秩序立て、および推論などの高次機能とに認知的困難をもたらし、それは最終的に人格変化につながり得る。疾患の末期は、独立機能の完全な喪失によって特徴付けられる。
組織学的には、（散発性および家族性）ＡＤは、細胞内神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）および細胞外プラークの存在によって定義される。プラークは、脳内ニューロンおよび星状細胞に見られる膜貫通タンパク質である、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の異常な切断に由来する、アミロイドβペプチド（Ａβ）の凝集物である。Ａβ沈着はまた、ＡＤ患者の血管内にも見られる。
コリン作動性ニューロンは、ＡＤにおいて特に易損性であり、結果的な神経伝達物質の低下は、その他の神経伝達物質系に影響を及ぼす。疾患のその他の症状としては、酸化的ストレス、炎症、およびニューロンアポトーシス（プログラム細胞死）が挙げられる。ＡＤ患者では、広範な神経細胞死が、認知低下と、最終的な患者の死をもたらす（Ｙｏｕｎｋｉｎ，１９９５；Ｂｏｒｃｈｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｓｅｌｋｏｅ，１９９９）。
現行の治療法は対症療法のみであり、症状は限定的持続期間内で軽微に改善され、最小限度に効果的であると見なされる。しかしＡβの過剰生成またはレベル変化は、散発性および早発性ＡＤの発病において重要な事象であると考えられる。この理由から、Ａβは、その形成を低下させるように（Ｖａｓｓａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９）、または脳からのそのクリアランスを加速させる機構を活性化するように、デザインされた治療薬開発の主要な対象になっている。
アミロイドカスケード仮説は、Ａβペプチドの生成が、ニューロン機能に悪影響を及ぼし、その結果、ＡＤにおけるニューロン死および認知症をもたらすことを提案する。Ａβは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から生成され、それはセクレターゼによって順次切断されて、異なる長さの化学種を生じる。主なプラーク成分は、Ａβ１−４２の４２個のアミノ酸イソ型であり、それはＡＤ発病において、神経毒性オリゴマーの形成とプラーク形成とに関与する。ＡＤ脳内では、Ａβ１−４２、ｐＧｌｕＡβ３−４２、Ａβ３−４２、および４−４２をはじめとするＡβのいくつかのイソ型が優勢であり、その内、Ａβ１−４２およびＡβ４−４２が、家族性および散発性ＡＤの海馬および皮質中の主要形態である（Ｐｏｒｔｅｌｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
残基４２で終結するＡβはＡβ種の微量成分であり、ＡＰＰのプロセッシングによって生じる。その他の形態としては、Ａβ１−４０およびＮ末端切断型Ａβｎ−４０が挙げられる。しかし残基４２で終結するＡβが最も凝集し易く、アミロイドプラークへの沈着を駆動する。より凝集し易いことに加えて、Ａβ１−４２ペプチドは、可溶性低ｎポリマー（またはオリゴマー）を形成し、それは培養中でニューロンにとって有毒なことが示されている。より大型で目立つ原線維沈着とは異なり、オリゴマーは典型的な病理学アッセイ中で検出されない。同様の特性を有するオリゴマーがＡＤ脳から単離されており、これらは、プラークよりもさらに、疾患進行と密接に関連している（Ｙｏｕｎｋｉｎ，１９９８；Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００５ａ；Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００５ｂ）。
脳切片に塗布されまたは生体内注入された、実験的に生成されたオリゴマーは、記憶機構のパラダイムとして周知であるシナプスの情報保存形態である、海馬長期増強（ＬＴＰ）の破損を引き起こす（Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２）。可溶性オリゴマーは、シナプスの物理的な変性に関与する（Ｍｕｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０００）。マウスモデルにおける抗体による記憶破損の回復は、オリゴマーがシナプスの破損に主要な役割を果たしているという、新しい概念を確認した。
遺伝的証拠は、増大した量のＡβ１−４２とそのＮ末端切断型（Ａβｎ−４２）が、家族性ＡＤを引き起こす遺伝的病状の全てでないにせよ、多数で生成されることを示唆し（Ｂｏｒｃｈｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｄｕｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｓｃｈｅｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｃｉｔｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、アミロイド形成が、Ａβｎ−４２の生成増大、または分解低下、または双方のいずれかによって、引き起される可能性が示唆される（Ｇｌａｂｅ，２０００）。特に、ＡＰＰ遺伝子に、および／またはγ−セクレターゼ複合体成分であるプレセニリンをコードする遺伝子に、遺伝子変異を引き起こす家族性ＡＤは、Ａβ１−４０と比較してＡβ１−４２の生成を増大させた。脳内で生成されるペプチドの絶対量は、Ａβペプチドの比率（Ａβ１−４２対Ａβ１−４０比の変化に反映される）程には、有毒Ａβ種の生成に重要でないかもしれないこともまた提案されている（Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒ，２００７；Ｋｕｐｅｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。さらにマウスおよびショウジョウバエの双方におけるアミロイド沈着の動物モデルは、Ａβ１−４２がアミロイド沈着の形成に必要であることを示唆する（Ｇｒｅｅｖｅ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｉｉｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，２００４；ＭｃＧｏｗａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
２０００年のワクチン接種研究の結果は、ＡＤに対する可能な新しい治療ストラテジーを示唆した。（その中で７１７位のアミノ酸が、正常なバリンでなくフェニルアラニンになっている）変異ヒトＡＰＰを過剰発現するＰＤＡＰＰ遺伝子組換えマウスは、年齢および脳領域依存的様式で、ＡＤの神経病理学的特徴の多くを漸次発症する。ＡＤ型神経病理発生前（６週齢）、またはＡβ沈着と引き続く神経病理学的変化のいくつかが確立される高齢（１１ヶ月齢）のどちらかで、遺伝子組換え動物をＡβ１−４２ペプチドで免疫化した。若年動物の免疫化は、プラーク形成、神経突起ジストロフィー、およびアストログリオーシスの発生を本質的に予防した。高齢動物の処置もまた、これらのＡＤ様神経病理の程度と進行を有意に低下させた。Ａβ１−４２免疫化は、抗Ａβ抗体の生成をもたらし、残りのプラークの領域内には、Ａβ免疫反応性の単球／小グリア細胞が出現することが示された（Ｓｃｈｅｎｋ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｓｃｈｅｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０００）。しかし能動免疫化アプローチは、ヒトに応用すると、Ｔ細胞応答に起因する可能性が高い数例の髄膜脳炎をもたらし、効能に関する初期結果は有望であったが中断された（Ｏｒｇｏｇｏｚｏ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｐｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００８）。
これに続いて、いくつかの受動ワクチン接種ストラテジーが検討された。Ａβに対する抗体の末梢投与は、アミロイド負荷を低下させるのに十分であった（Ｂａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０００）。これらの実験では、比較的軽微な抗体血清レベルが達成されたにもかかわらず、受動的に投与された抗体は、血液脳関門を通過して中枢神経系に入り、プラークを修飾して、既存のアミロイドのクリアランスを誘導できた。Ａβ１−４０特異的抗体、Ａβ１−４２特異的抗体、およびＡβの残基１−１６に対する抗体間の比較では、全ての抗体が、マウス脳内でＡβ蓄積の低下を示した（Ｌｅｖｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
より最近では、受動的に投与される抗体にとって、ＣＮＳ浸透が、効果的Ａβクリアランスにとって最も期待できる経路であることが示唆されている（Ｇｏｌｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００９）。しかし抗体が血液脳関門を通過できるのに加えて、シンク仮説が可能な作用機序として提案された。
シンク仮説は、血漿中のペプチド濃度の低下によって、ＣＮＳからＡβを間接的に除去し得るとする。これを説明する実験では、血漿中でＡβと結合し、その結果、ＣＮＳからＡβを隔離する抗体が使用された。これは、抗体が血漿からＣＮＳへのＡβ流入を妨げ、および／または血漿中の遊離Ａβ濃度が低下するために、血漿とＣＮＳ間の平衡が変化することで達成された（ＤｅＭａｔｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）。抗体と無関係のアミロイド結合剤もまた、血漿中の結合を通じて、ＣＮＳからＡβを除去するのに効果的であることが示された。血漿Ａβを隔離する２種のＡβ結合剤であるゲルゾリンおよびＧＭ１が、脳アミロイドーシスを軽減させ、または予防することが示された（Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
安全性に関しては、ＡＤの１つの病原性特徴は、主にＡβ１−４０であるＡβが、脳動脈膜層内で血管平滑筋細胞を置き換える、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）である（Ｗｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＡＤ患者のｐａｎ−Ａβ抗体による治療は、血管壁からのＡβの除去を反映する微小出血をもたらすことが示されており（Ｗｉｌｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００９）、これは患者にとって有害であり得る。これを回避する一方法は、微小出血に寄与するクリアランス機構を低下させ、および／またはＡβが血管沈着から除去される速度を低下させることもある、脱グリコシル化抗体を作成して、流出経路の飽和を予防することである（Ｗｉｌｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
Ａβ４２特異的抗体によるｎ−４２βペプチド種の標的化は、ＡＤ脳内の主要ペプチド複合体でありプラーク形成の駆動機構である、化学種を標的化するであろう。ｎ−４２モノマーおよび低ｎオリゴマー種に対する一次特異性がある抗体は、これらの化学種を枯渇させるだけでなく、ニューロン毒性を示すその他のオリゴマー種の蓄積もまた、予防し得るであろう。
本発明は、Ａβ１−４２およびそのＮ末端切断型に対して特異的であり、Ａβ４２ペプチドのアミノ酸２９〜４２間のエピトープと結合する、完全ヒト型抗体に関する。本発明による抗体は、ＡＤに起因する軽度認知機能障害（ＭＣＩ）をはじめとするＡＤ、およびダウン症候群などの、βアミロイドに伴う病状の予防および／または治療処置のために使用してもよい。
本発明は、血漿、脳、および脳脊髄液（ＣＳＦ）中で、Ａβペプチド（ｎ−４２）のイソ型を抑制し、脳および脳血管系内で、Ａβｎ−４２イソ型の蓄積を予防しまたは沈着を逆転させる、認知力を改善する完全ヒト型抗体の使用に関する。
本明細書に記載されるのは、Ａβｎ−４２ペプチドに対する完全ヒト型抗体の生成であり、それはＡβｎ−４２のモノマーおよび低ｎオリゴマー（五量体以下）の形態を認識して、Ａβ４２ペプチドのアミノ酸１７〜４２を包含する領域、より具体的にはＡβ４２ペプチドのアミノ酸２９〜４２を包含する領域にエピトープマッピングされる。
本発明による抗体は、Ａβｎ−４２種（式中、ｎは１〜２９の範囲の整数である）に対して特異的であり、したがってＡＤ進行の主要駆動機構を選択的に低下させることを予測し得る。本発明による抗体は、ヒト血漿中、脳内、および脳脊髄液（ＣＳＦ）中で、（Ａβ４０でなく）Ａβ４２と効果的に結合し、脳からのＡβｎ−４２イソ型のクリアランス増大をもたらす。本発明による抗体は、ニューロンに対するＡβ４２可溶性凝集体の結合を低下させるのにもまた効果的であり、したがって脳に入った抗体の部分は、ニューロンの健康に対して効果的であろう。
本明細書に記載されるのは、モノマーに対するＫＤが３２０ｐＭである抗体をはじめとする、強力な高親和性抗体である。このような高親和性は、ＡＤ疾患の予防と改善が可能になるレベルまで、Ａβｎ−４２を効果的に抑制できるようにしてもよい。
可溶性Ａβ４２およびＡβ４０種のレベルは、Ａβペプチド上のエピトープに対する抗体を使用して、標準化アッセイによって、脳内、ＣＳＦ中、および血液中で検出し得る。本明細書に記載されるラットＰＫ：ＰＤで示されるように、遊離Ａβ４２の用量依存的抑制が、抗体の末梢投与後のラットＣＳＦ中で観察された。ラットの脳内でもまた、Ａβ４０ペプチドにはほとんど影響しない、全Ａβ４２の用量依存的増大が実証された。
したがって本明細書に記載されるのは、脳内に侵入する能力（全末梢投与の０．１％がＣＳＦ内にある）を有して、ＣＳＦ中で（Ａβ４０ではなく）主要有毒種Ａβ４２を特異的に抑制する抗体である。
本発明による抗体の特異性および作用機序は、前駆性、軽度、および中等度ＡＤのＡＤ疾患経過における異なる段階、ダウン症候群ならびに黄斑変性をはじめとする、体内の臓器内で蓄積するアミロイドの増大と関連づけられるいくつかの疾患の予防および治療処置の双方を可能にしてもよい。
本発明による抗体は、前駆性、軽度から中等度のＡＤ、およびダウン症候群と診断された対象において、認知低下を逆転させ、認知低下を治療し、認知低下を予防する能力を有してもよい。
したがって本発明の第１の態様は、特に抗体分子である、ヒトＡβ１−４２の結合メンバーに関する。
例えば抗体分子である本発明による結合メンバーは、以下の特性のいずれかまたは全てを有してもよい：
− 可溶性単量体ヒトＡβ１−４２および／またはオリゴマーＡβ１−４２への結合；
− Ａβ１−４０よりもＡβ１−４２との結合に対する選択性。それらはＡβ１−４０との結合を示さなくてもよく、または結合は微々たるものであってもよい。例えば本発明による抗体分子は、５００ｐＭ以下の解離定数（ＫD）で、単量体Ａβ１−４２と結合してもよい。それらはＡβ１−４０と結合しなくてもよく、または１ｍＭを超えるＫDでＡβ１−４０と結合してもよい；
− ヒトＡβ１７−４２への結合。したがって抗体分子は、Ａβ１−４２ペプチドのアミノ酸１７〜４２間のエピトープを認識してもよく、より具体的には、抗体分子は、Ａβ１−４２ペプチドのアミノ酸２９〜４２間のエピトープを認識してもよい；
− 可溶性単量体ヒト３ピロ−４２（ピログルタミン酸３）および１１ピロ−４２（ピログルタミン酸１１）への結合；
− ヒトＡβ１−４３への結合；および
− マウスＡβ１−４２との交差反応性。
結合メンバーは、本明細書に記載される抗体分子のＨＣＤＲセットおよび／またはＬＣＤＲセットを含んでなってもよい。本発明による抗体分子の例は、ＨＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）セットを含有するＶＨ領域と、ＬＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）セットを含有するＶＬ領域とを含んでなり、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲはそれぞれ、その配列が添付の配列表に示される、抗体Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０００７、Ａｂｅｔ０１４４、Ａｂｅｔ０３１９、Ａｂｅｔ０３２１ｂ、Ａｂｅｔ０３２２ｂ、Ａｂｅｔ０３２３ｂ、Ａｂｅｔ０３２８、Ａｂｅｔ０３２９、Ａｂｅｔ０３３２、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３４４、Ａｂｅｔ０３６８、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７０、Ａｂｅｔ０３７１、Ａｂｅｔ０３７２、Ａｂｅｔ０３７３、Ａｂｅｔ０３７４、Ａｂｅｔ０３７７、Ａｂｅｔ０３７８、Ａｂｅｔ０３７９、Ａｂｅｔ０３８１、Ａｂｅｔ０３８２、およびＡｂｅｔ０３８３、またはそのＧＬバージョンのいずれかのＨＣＤＲおよびＬＣＤＲである。配列表中の抗体分子と配列識別子間の対応は、表１６に示される。
ヒトＡβ１−４２の抗体分子は、
（ｉ）ＨＣＤＲセットのアミノ酸配列が、抗体Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０００７、Ａｂｅｔ０１４４、Ａｂｅｔ０３１９、Ａｂｅｔ０３２１ｂ、Ａｂｅｔ０３２２ｂ、Ａｂｅｔ０３２３ｂ、Ａｂｅｔ０３２８、Ａｂｅｔ０３２９、Ａｂｅｔ０３３２、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３４４、Ａｂｅｔ０３６８、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７０、Ａｂｅｔ０３７１、Ａｂｅｔ０３７２、Ａｂｅｔ０３７３、Ａｂｅｔ０３７４、Ａｂｅｔ０３７７、Ａｂｅｔ０３７８、Ａｂｅｔ０３７９、Ａｂｅｔ０３８１、Ａｂｅｔ０３８２、およびＡｂｅｔ０３８３、またはそのＧＬバージョンのいずれかについて表１６に示される通りである、フレームワーク領域が散在するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３のＨＣＤＲセットを含んでなり、または１つまたは２つのアミノ酸変異があるそのＨＣＤＲセットを含んでなってもよい、ＶＨ領域、および
（ｉｉ）ＬＣＤＲセットのアミノ酸配列が、抗体Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０００７、Ａｂｅｔ０１４４、Ａｂｅｔ０３１９、Ａｂｅｔ０３２１ｂ、Ａｂｅｔ０３２２ｂ、Ａｂｅｔ０３２３ｂ、Ａｂｅｔ０３２８、Ａｂｅｔ０３２９、Ａｂｅｔ０３３２、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３４４、Ａｂｅｔ０３６８、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７０、Ａｂｅｔ０３７１、Ａｂｅｔ０３７２、Ａｂｅｔ０３７３、Ａｂｅｔ０３７４、Ａｂｅｔ０３７７、Ａｂｅｔ０３７８、Ａｂｅｔ０３７９、Ａｂｅｔ０３８１、Ａｂｅｔ０３８２、およびＡｂｅｔ０３８３、またはそのＧＬバージョンのいずれかについて、表１６に示される通りである、フレームワーク領域が散在するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のＬＣＤＲセットを含んでなり、または１つまたは２つのアミノ酸変異があるそのＬＣＤＲセットを含んでなってもよい、ＶＬ領域
を含んでなってもよい。
本発明による抗体分子は、
（ｉ）Ａｂｅｔ０３８０のＨＣＤＲのアミノ酸配列が、
ＨＣＤＲ１配列番号５２５、
ＨＣＤＲ２配列番号５２６、および
ＨＣＤＲ３配列番号５２７である、Ａｂｅｔ０３８０またはＡｂｅｔ０３８０ ＧＬのＨＣＤＲセットを含んでなり、
または１つまたは２つのアミノ酸変異があるＡｂｅｔ０３８０またはＡｂｅｔ０３８０ ＧＬのＨＣＤセットを含んでなってもよい、ＶＨ領域、および
（ｉｉ）Ａｂｅｔ０３８０のＬＣＤＲのアミノ酸配列が、
ＬＣＤＲ１配列番号５３４
ＬＣＤＲ２配列番号５３５、および
ＬＣＤＲ３配列番号５３６である、Ａｂｅｔ０３８０またはＡｂｅｔ０３８０ ＧＬのＬＣＤＲセットを含んでなり、
または１つまたは２つのアミノ酸変異があるＡｂｅｔ０３８０またはＡｂｅｔ０３８０ ＧＬのＬＣＤＲセットを含んでなってもよい、ＶＬ領域
を含んでなってもよい。
抗体分子は、
（ｉ）ＨＣＤＲのアミノ酸配列が、
ＨＣＤＲ１配列番号５２５、
ＨＣＤＲ２配列番号５２６、および
ＨＣＤＲ３配列番号５２７であり、フレームワーク領域が散在する、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３のＨＣＤＲセットを含んでなり、
または１つまたは複数のアミノ酸置換があるＨＣＤＲセットを含んでなり、前記１つまたは複数の置換が表１２または表１４に示されるものから選択されるＨＣＤＲセットを含んでなってもよい、ＶＨ領域、および
（ｉｉ）ＬＣＤＲのアミノ酸配列が、
ＬＣＤＲ１配列番号５３４、
ＬＣＤＲ２配列番号５３５、および
ＬＣＤＲ３配列番号５３６であり、フレームワーク領域が散在する、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のＬＣＤＲセットを含んでなり、
または１つまたは複数のアミノ酸置換があるＬＣＤＲセットを含んでなり、前記１つまたは複数の置換が表１３または表１５に示されるものから選択されるＬＣＤＲセットを含んでなってもよい、ＶＬ領域
を含んでなってもよい。
抗体分子のＶＨ領域は、その中でＫａｂａｔ位置２６〜３０のアミノ酸残基が表１４に示されるものから選択される、ＦＷ１領域を含んでなってもよい。
抗体分子のＶＨ領域は、重鎖フレームワーク領域ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３、およびＦＷ４を含んでなってもよく、重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列は、
ＦＷ１配列番号５２８、
ＦＷ２配列番号５２９、
ＦＷ３配列番号５３０、および
ＦＷ４配列番号５３１であり、
またはＦＷ１は、表１２または表１４に示されるものから選択される１つまたは複数のアミノ酸置換がある、配列番号５２８を含んでなる。
抗体分子のＶＬ領域は、軽鎖フレームワーク領域ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３、およびＦＷ４を含んでなってもよく、軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列は、
ＦＷ１配列番号５３７
ＦＷ２配列番号５３８
ＦＷ３配列番号５３９、および
ＦＷ４配列番号５４０である。
本発明による抗体分子は、
（ｉ）Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７、およびＡｂｅｔ０３８２、またはそのＧＬバージョンのいずれかについて、表１６に示される通りであり、
または１つまたは２つのアミノ酸変異があるそのアミノ酸配列を含んでなってもよい、ＶＨ領域アミノ酸配列、および
（ｉｉ）Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７、およびＡｂｅｔ０３８２、またはそのＧＬバージョンのいずれかについて、表１６に示される通りであり、
または１つまたは２つのアミノ酸変異があるそのアミノ酸配列を含んでなってもよい、ＶＬ領域アミノ酸配列
を含んでなってもよい。
本発明による抗体分子は、配列番号５２４と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨ領域と、配列番号５３３と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬ領域とを含んでなってもよく、ＶＨ領域内では、
アミノ酸２６はＭ、ＧまたはＳであり；
アミノ酸２７はＧ、ＦまたはＤであり；
アミノ酸２８はＮ、Ｔ、ＤまたはＨであり；
アミノ酸２９はＦであり；
アミノ酸３０はＮ、Ｓ、Ｋ、またはＰであり；
アミノ酸３１はＹ、Ｖ、Ｒ、Ｅ、またはＴであり；
アミノ酸３２はＱ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、またはＥであり；
アミノ酸３３はＴ、Ｐ、Ｉ、またはＶであり；
アミノ酸３４はＭであり；
アミノ酸３５はＷであり；
アミノ酸５０はＶであり；
アミノ酸５１はＩであり；
アミノ酸５２はＧであり；
アミノ酸５２ａはＫ、Ｓ、またはＡであり；
アミノ酸５３はＴ、Ｓ、Ｎ、Ｄ、Ｇ、またはＱであり；
アミノ酸５４はＮ、Ｇ、Ｔ、またはＰであり；
アミノ酸５５はＥ、Ｇ、Ｎ、Ｋ、またはＴであり；
アミノ酸５６はＮ、Ｔ、Ｒ、またはＫであり；
アミノ酸５７はＩ、Ｔ、Ｋ、またはＶであり；
アミノ酸５８はＡ、Ｖ、またはＴであり；
アミノ酸５９はＹであり；
アミノ酸６０はＡであり；
アミノ酸６１はＤであり；
アミノ酸６２はＳであり；
アミノ酸６３はＶであり；
アミノ酸６４はＫであり；
アミノ酸６５はＧであり；
アミノ酸９５はＥであり；
アミノ酸９６はＷであり；
アミノ酸９７はＭであり；
アミノ酸９８はＤであり；
アミノ酸９９はＨであり；
アミノ酸１００はＳであり；
アミノ酸１００ａはＲであり；
アミノ酸１００ｂはＰであり；
アミノ酸１００ｃはＹであり；
アミノ酸１００ｄはＹであり；
アミノ酸１００ｅはＹであり；
アミノ酸１００ｆはＹであり；
アミノ酸１００ｇはＧであり；
アミノ酸１００ｈはＭであり；
アミノ酸１０１はＤであり；
アミノ酸１０２はＶであり；
および式中、ＶＬ領域内では：
アミノ酸２４はＳであり；
アミノ酸２５はＧであり；
アミノ酸２６はＨであり；
アミノ酸２７はＮであり；
アミノ酸２８はＬ、またはＩであり；
アミノ酸２９はＥ、またはＧであり；
アミノ酸３０はＤであり；
アミノ酸３１はＫであり；
アミノ酸３２はＦ、またはＷであり；
アミノ酸３３はＡ、またはＶであり；
アミノ酸３４はＳであり；
アミノ酸５０はＲであり；
アミノ酸５１はＤであり；
アミノ酸５２はＤであり；
アミノ酸５３はＫであり；
アミノ酸５４はＲであり；
アミノ酸５５はＰであり；
アミノ酸５６はＳであり；
アミノ酸８９はＳ、またはＱであり；
アミノ酸９０はＳ、またはＡであり；
アミノ酸９１はＱであり；
アミノ酸９２はＤであり；
アミノ酸９３はＴ、またはＳであり；
アミノ酸９４はＶ、またはＴであり；
アミノ酸９５はＴであり；
アミノ酸９６はＲであり；
アミノ酸９７はＶである。
本発明による抗体分子は、配列番号５２４と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨ領域と、配列番号５３３と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬ領域とを含んでなってもよく、式中、ＶＨ領域内では：
アミノ酸２６はＭ、Ｇ、Ｓ、Ｖ、Ａ、Ｎ、Ｔ、またはＨであり；
アミノ酸２７はＧ、Ｆ、Ｓ、Ｙ、Ｅ、Ｄ、またはＰであり；
アミノ酸２８はＮ、Ｑ、Ｈ、Ｖ、Ｅ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｄ、Ｍ、またはＰであり；
アミノ酸２９はＦ、Ｉ、Ｙ、Ｓ、Ｌ、またはＷであり；
アミノ酸３０はＮ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｋ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｐ、Ｅ、Ｋ、Ａ、またはＤであり；
アミノ酸３１はＹ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｎ、Ｔ、Ｒ、Ｖ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｉ、Ｄ、またはＷであり；
アミノ酸３２はＱ、Ｙ、Ｄ、Ｎ、Ｓ、Ｅ、またはＴであり；
アミノ酸３３はＴ、Ｐ、Ｉ、またはＶであり；
アミノ酸３４はＭ、またはＬであり；
アミノ酸３５はＷであり；
アミノ酸５０はＶであり；
アミノ酸５１はＩであり；
アミノ酸５２はＧであり；
アミノ酸５２ａはＫ、Ｓ、Ｐ、Ａ、Ｎ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｖ、またはＴであり；
アミノ酸５３はＴ、Ｓ、Ｎ、Ｈ、Ｑ、Ｄ、Ｇ、またはＥであり；
アミノ酸５４はＮ、Ｇ、Ｐ、Ｔ、Ｑ、Ｅ、Ｍ、Ｋ、またはＡであり；
アミノ酸５５はＥ、Ｇ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｈ、Ｄ、またはＡであり；
アミノ酸５６はＮ、Ｔ、Ａ、Ｒ、またはＫであり；
アミノ酸５７はＩ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ｆ、Ｑ、Ｖ、またはＬであり；
アミノ酸５８はＡ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、またはＮであり；
アミノ酸５９はＹであり；
アミノ酸６０はＡであり；
アミノ酸６１はＤであり；
アミノ酸６２はＳ、Ａ、またはＴであり；
アミノ酸６３はＶであり；
アミノ酸６４はＫであり；
アミノ酸６５はＧであり；
アミノ酸９５はＥであり；
アミノ酸９６はＷであり；
アミノ酸９７はＭであり；
アミノ酸９８はＤ、またはＧであり；
アミノ酸９９はＨ、またはＲであり；
アミノ酸１００はＳであり；
アミノ酸１００ａはＲであり；
アミノ酸１００ｂはＰであり；
アミノ酸１００ｃはＹであり；
アミノ酸１００ｄはＹであり；
アミノ酸１００ｅはＹであり；
アミノ酸１００ｆはＹであり；
アミノ酸１００ｇはＧであり；
アミノ酸１００ｈはＭ、またはＩであり；
アミノ酸１０１はＤであり；
アミノ酸１０２はＶ、またはＡであり；
および式中、ＶＬ領域内では：
アミノ酸２４はＳ、またはＴであり；
アミノ酸２５はＧ、またはＴであり；
アミノ酸２６はＨ、Ｒ、またはＰであり；
アミノ酸２７はＮ、またはＨであり；
アミノ酸２８はＬ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、またはＴであり；
アミノ酸２９はＥ、Ｍ、Ｇ、Ｓ、またはＮであり；
アミノ酸３０はＤ、Ａ、Ｓ、Ｇ、またはＨであり；
アミノ酸３１はＫ、またはＳであり；
アミノ酸３２はＦ、またはＷであり；
アミノ酸３３はＡ、Ｖ、Ｍ、Ｔ、またはＩであり；
アミノ酸３４はＳ、Ｔ、またはＡであり；
アミノ酸５０はＲであり；
アミノ酸５１はＤであり；
アミノ酸５２はＤであり；
アミノ酸５３はＫであり；
アミノ酸５４はＲであり；
アミノ酸５５はＰであり；
アミノ酸５６はＳであり；
アミノ酸８９はＳ、Ｑ、またはＡであり；
アミノ酸９０はＳ、Ａ、またはＴであり；
アミノ酸９１はＱであり；
アミノ酸９２はＤ、またはＧであり；
アミノ酸９３はＴ、Ｑ、Ｓ、Ｎ、またはＫであり；
アミノ酸９４はＶ、Ｔ、またはＦであり；
アミノ酸９５はＴであり；
アミノ酸９６はＲであり；
アミノ酸９７はＶ、Ｓ、またはＡである。
本発明による抗体分子は、
（ｉ）Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７、およびＡｂｅｔ０３８２、またはそのＧＬバージョンのいずれかについて表１６に示されるＶＨ領域アミノ酸配列と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨ領域；および
（ｉｉ）Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７、およびＡｂｅｔ０３８２、またはそのＧＬバージョンのいずれかについて、表１６に示されるＶＬ領域アミノ酸配列と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬ領域
を含んでなってもよい。
抗体分子は、Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７、およびＡｂｅｔ０３８２、またはそのＧＬバージョンのいずれかのＶＨ領域およびＶＬ領域と、それぞれ少なくとも９０％同一であるＶＨ領域およびＶＬ領域を含んでなってもよい。
示されるＶＨおよび／またはＶＬ領域の百分率同一性は、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であってもよい。
抗体分子は、Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７、およびＡｂｅｔ０３８２またはそのＧＬバージョンのいずれかのＶＨ領域およびＶＬ領域を含んでなってもよい。
例えば抗体分子は、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＶＨ領域アミノ酸配列番号５２４と、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＶＬ領域アミノ酸配列番号５３３とを含んでなってもよい。
本発明による抗体分子は、Ａβ１−４２との結合について、
（ｉ）ＶＨ領域アミノ酸配列番号５２４およびＶＬ領域アミノ酸配列番号５３３を含んでなる抗体分子、
（ｉｉ）ＮＣＩＭＢ ４１８９０、４１８９１または４１８９２の受入番号の下に寄託された核酸によってコードされる抗体分子
と競合するものであってもよい。
抗体分子は、
（ｉ）受入番号４１８９０の下に寄託されたＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ核酸配列；
（ｉｉ）受入番号４１８９１の下に寄託されたＡｂｅｔ０１４４−ＧＬ核酸配列；または
（ｉｉ）受入番号４１８９２の下に寄託されたＡｂｅｔ０３７７−ＧＬ核酸配列
によってコードされる、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含んでなってもよい。
抗体分子は、上述の寄託された抗体のＨＣＤＲおよびＬＣＤＲをそれぞれ含んでなる、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含んでなってもよい。抗体分子は、上述の寄託された核酸によってコードされる抗体であってもよい。
本発明による結合メンバーをコードする核酸分子と、該核酸を含有する宿主細胞と、該核酸の発現と結合メンバーの回収によって結合メンバーを生成する方法ともまた、本明細書に記載される。
本発明のさらなる態様は、先行する請求項のいずれか一項に記載の抗体分子と、薬学的に許容可能な賦形剤などの１つまたは複数の追加的な成分を含んでなる組成物と、医療用途のためのこのような組成物とに関する。本発明による結合メンバーを含んでなる組成物は、人体または動物体の治療法で使用するために提供されてもよい。
本明細書に記載される結合メンバーは、例えばヒトである、ヒトまたは動物対象を診断または治療する方法で使用してもよい。本発明の結合メンバーを使用して、個体において、Ａβ１−４２レベルを低下させおよび／またはアミロイドーシスを緩和してもよい。結合メンバーを使用して、アミロイドーシスを緩和して、アミロイドーシスに伴う病状を治療し、緩和し、予防してもよい。治療されてもよい病状および疾患としては、前駆性、軽度、または中等度ＡＤなどのアルツハイマー病が挙げられる。本発明によって治療されるＡＤは、家族性または散発性ＡＤであってもよい。本発明を使用して、ＡＤに伴う軽度認知機能障害（ＭＣＩ）を予防し、緩和しまたは逆転させてもよい。ＡＤ患者またはダウン症候群患者において、認知力が改善されてもよく、および／または認知低下が緩和されてもよい。本発明はまた、アミロイドβと関係がある黄斑変性を治療または予防するために使用してもよい（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １０８（２８）：Ｅ２７９−２８７ ２０１１）。
したがってさらなる態様では、本発明は、本発明の結合メンバーを個体に投与するステップを含んでなる、個体において、アミロイドーシスを低下させ、アルツハイマー病を治療し、アルツハイマー病またはダウン症候群において認知力を改善しまたは認知低下を低減し、および／または黄斑変性を治療する方法を提供する。
これらのおよびその他の本発明の態様は、下により詳細に記載される。
精製Ａｂｅｔ０００７ Ｆａｂと一連のアミロイドβペプチド間の直接結合ＨＴＲＦ（商標）アッセイの結果を示す。Ａｂｅｔ０００７クローン（黒四角）は、ヒトアミロイドβ１−４２ペプチド（図１Ａ）およびマウスアミロイドβ１−４２ペプチド（図１Ｃ）への結合を示すが、ヒトアミロイドβ１−４０ペプチド（図１Ｂ）またはスクランブルされたヒトアミロイドβ１−４２ペプチド（図１Ｄ）への結合は示さない。陽性対照抗体（黒丸）および陰性対照抗体（黒三角）を使用して、アッセイの完全性を確認した。 競合ペプチドの濃度増大による、ビオチン化ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドとＡｂｅｔ０００７ ＩｇＧ２との複合体形成の阻害を示す。複合体形成は、ヒトアミロイドβ１−４２（黒丸）、１１−４２（黒三角、１７−４２（黒逆三角）、および１−４３（黒菱形）ペプチドによって阻害される。これは、ヒトアミロイドβ１−４０ペプチド（黒四角）または陰性対照ペプチド（白丸）によって阻害されない。 １００ｎＭ（最上部トレース）、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２ｎＭ、および３．１ｎＭ（最下部トレース）のペプチド濃度で、固定化Ａｂｅｔ０００７ ＩｇＧ２と結合する、ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドの表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）トレースを示す。各トレースは、１：１ラングミュアモデルに適合される。 Ａｂｅｔ０００７ ＩｇＧ２の試験管内免疫組織化学染色からのサンプル画像を示す。（Ａ）陽性対照抗体は、ヒトＡＤ脳切片（ＡｐｏＥ遺伝子型３／３、Ｂｒａａｋ段階６；２０μｇ／ｍｌ抗体）上で、強力なプラーク認識（スコア＝４）を示す。（Ｂ）Ａｂｅｔ０００７ ＩｇＧ２リードクローンは、隣接する脳切片（２０μｇ／ｍｌ）上でプラーク認識を示さない（スコア＝０）。（Ｃ）同一陽性対照抗体は、Ｔｇ２５７６マウス脳セクション（１８ヶ月齢マウス；２０μｇ／ｍｌ抗体）上で、強力なプラーク認識（スコア＝４）を示す。（Ｄ）Ａｂｅｔ０００７ ＩｇＧ２リードクローンは、隣接するマウス脳切片（２０μｇ／ｍｌ）上でプラーク認識を示さない（スコア＝０）。 図４−１の続きである。 Ａｂｅｔ０００７ ｓｃＦｖ（黒丸）およびＡｂｅｔ０１４４ ｓｃＦｖ（黒三角）の濃度増大による、ヒトアミロイドβ１−４２とＡｂｅｔ００４２ ＩｇＧとの複合体形成の阻害を示す。このアッセイ中で、Ａｂｅｔ０１４４クローンは、Ａｂｅｔ０００７親クローンよりも有意により強力である。陰性対照抗体（黒四角）が、比較のために含まれる。 ４００ｎＭ（最上部トレース）、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、および１２．５ｎＭ（最下部トレース）のｓｃＦｖ濃度で、固定化ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドと結合する、精製Ａｂｅｔ０１４４ ｓｃＦｖの表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）トレースを示す。各トレースは、１：１ラングミュアモデルに適合される。 ５０ｎＭ（最上部トレース）、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１３ｎＭ、および１．５６ｎＭ（最下部トレース）のペプチド濃度で、固定化Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ抗体と結合する、ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドの表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）トレースを示す。各トレースは、１：１ラングミュアモデルに適合される。 ４００ｎＭで、固定化Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ抗体と結合する、一連のアミロイドβペプチドの表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）トレースを示す。ビオチン化ヒトアミロイドβ１−４２ペプチド（最上部トレース）および未標識ヒトアミロイドβ１−４２ペプチド（２番目のトレース）に対する、明らかな結合がある。スクランブルされたビオチン化ヒトアミロイドβ１−４２ペプチド、ビオチン化ヒトアミロイドβ１−４０ペプチド、未標識ヒトアミロイドβ１−４０ペプチド、またはビオチン化インスリンに対する識別可能な結合はない（平坦な線）。 その中で、競合ペプチドの濃度増大による、ビオチン化ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドとＡｂｅｔ０１４４−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭとの間の複合体形成の阻害が測定される、生化学的エピトープ競合アッセイを使用した、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭの特異性プロファイリングを示す。複合体形成は、ヒトアミロイドβ１−４２（黒丸）、ピロ３−４２（黒菱形）、およびピロ１１−４２（白丸）ペプチドによって阻害される。ヒトアミロイドβ１−４０ペプチド（黒四角）、１−１６（黒三角）、および１２−２８（黒逆三角）ペプチド切断型または陰性対照ペプチド（白四角）による有意な阻害は、観察されない。 Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭの試験管内免疫組織化学染色からのサンプル画像を示す。（Ａ）陽性対照抗体は、ヒトＡＤ脳切片（ＡｐｏＥ遺伝子型３／３；２０μｇ／ｍｌ抗体）上で、強力なプラーク認識（スコア＝４）を示す。（Ｂ）Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭリードクローンは、隣接する脳切片（２０μｇ／ｍｌ）上で、いくらかのプラーク認識（スコア＝１．５）を示す。（Ｃ）同一陽性対照抗体は、Ｔｇ２５７６マウス脳セクション（１８ヶ月齢マウス；２０μｇ／ｍｌ抗体）上で、強力なプラーク認識（スコア＝４）を示す。（Ｄ）Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭリードクローンは、隣接するマウス脳切片（２０μｇ／ｍｌ）上で、いくらかのプラーク認識（スコア＝１）を示す。 図１０−１の続きである。 精製競合ｓｃＦｖ（黒丸）の濃度増大による、ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドとＡｂｅｔ０１４４−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭとの複合体形成の阻害を示す。４つの最も強力なｓｃＦｖクローン、Ａｂｅｔ０３６９（図１１Ａ）、Ａｂｅｔ０３７７（図１１Ｂ）、Ａｂｅｔ０３８０（図１１Ｃ）、およびＡｂｅｔ０３８２（図１１Ｄ）は全て、親Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬのｓｃＦｖ配列（黒四角）と比較して、効力に有意な改善を示す。 図１１−１の続きである。 １０２４ｎＭ（最上部トレース）から６３ｐＭ（最下部トレース）のペプチド濃度で、固定化Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ抗体と結合する、ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドの表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）トレースを示す。各トレースは、１：１ラングミュアモデルに適合される。 固定化Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ抗体に対する一連のアミロイドβペプチド結合について、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）トレースを示す。ビオチン化ヒトアミロイドβ１−４２ペプチド（最上部トレース）および未標識マウスアミロイドβ１−４２ペプチド（２番目のトレース）に対する、明らかな結合がある。ビオチン化ヒトアミロイドβ１−４０ペプチドまたは未標識マウスアミロイドβ１−４０ペプチド（平坦な線）に対する、識別可能な結合はない。 Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭの試験管内免疫組織化学染色からのサンプル画像を示す。（Ａ）陽性対照抗体は、ヒトＡＤ脳切片（ＡｐｏＥ遺伝子型３／３、Ｂｒａａｋ段階６；５μｇ／ｍｌ抗体）上で、強力なプラーク認識（スコア＝４）を示す。（Ｂ）Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭリードクローンは、隣接する脳切片（１０μｇ／ｍｌ）上で、強力なプラーク認識（スコア＝３）を示す。（Ｃ）同一陽性対照抗体は、Ｔｇ２５７６マウス脳セクション（２２ヶ月齢マウス；２０μｇ／ｍｌ抗体）上で、強力なプラーク認識（スコア＝４）を示す。（Ｄ）Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭリードクローンは、隣接するマウス脳切片（２０μｇ／ｍｌ）上で強力なプラーク認識（スコア＝４）を示す。 図１４−１の続きである。 Ａβ４２凝集体調製物のウエスタンブロット分析、およびＡｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１ＴＭを使用した検出を示す。（Ａ）非光架橋（非ＰＩＣＵＰ）Ａβ４２凝集体のＡｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１ＴＭ検出。（Ｂ）光架橋Ａβ４２凝集体（ＰＩＣＵＰ）のＡｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１ＴＭ検出。ここで我々は、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１ＴＭが、Ａβ１−４２モノマーおよび五量体以下の低ｎオリゴマー種を特異的に認識することを実証する。 １４日間にわたり反復する毎週の用量を投与された、スプラーグドーリー系ラットにおける、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ抗体用量の増大による、（Ａ）ＣＳＦ中の遊離アミロイドβ１−４２ペプチドレベルの用量依存的低下、（Ｂ）脳組織内の全アミロイドβ１−４２ペプチドの増大、および（Ｃ）影響を受けない脳組織内の全アミロイドβ１−４０ペプチドレベルを示す。 老化Ｔｇ２５７６マウスへの末梢投与の１６８時間後の生体内における、アミロイドβプラークに対するＡｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭの結合の免疫組織化学的分析からのサンプル画像を示す。（Ａ）３０ｍｇ／ｋｇで投与された陽性対照抗体が強力な生体内プラーク認識を示す一方で、（Ｂ）３０または（Ｃ）１０ｍｇ／ｋｇで投与されたＡｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭは、いかなる生体内プラーク修飾も示さない。 一連の異なる濃度（１０μＭ〜０．１７ｎＭ）の完全長、切断型、およびピロヒトＡβペプチド（Ａβ１−４２、Ａβ１−４３、Ａβ１−１６、Ａβ１２−２８、Ａβ１７−４２、Ａβピロ−３−４２、またはＡβピロ−１１−４２）のパネルの競合結合実験における、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭの特異性を示す。凡例：−黒丸− Ａβ１−４２、 −白三角− Ａβ１−４３、 黒逆三角 Ａβ１−１６、 黒菱形 Ａβ１２−２８、 −白菱形− Ａβ１７−４２、 ―白三角― Ａβピロ−３−４２、 −白丸− Ａβピロ１１−４２、 白菱形 ビヒクル１（ＤＭＳＯ）、 ※ ビヒクル１（ＮＨ４ＯＨ）。 ｘ軸はＡβペプチドの濃度をｌｏｇＭで示し、ｙ軸は％特異的結合を示す。１０-8〜１０-9のモル濃度範囲のＩＣ50値のＡβ１−４２、Ａβ１−４３、Ａβ１７−４２、Ａβピロ−３−４２、およびＡβピロ−１１−４２による、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ：Ｎ末端ビオチンＡβ１−４２結合の阻害が、このグループで観察された。Ａβ１−１６またはＡβ１２−２８による、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ：Ｎ末端ビオチンＡβ１−４２結合の阻害は観察されなかった。 正常ラットＰＫ−ＰＤ研究において、抗体Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬがアミロイドβ１−４２を隔離する能力を示す。ｘ軸は、ビヒクルまたはＡｂｅｔ０１４４−ＧＬ（１０ｍｇ／ｋｇ、または４０ｍｇ／ｋｇ）の濃度を示し、ｙ軸は、ＣＳＦ中の全アミロイドβ１−４２の濃度をｐｇ／ｍｌで示す。ＣＳＦ中の遊離アミロイドβ１−４２は、１０または４０ｍｇ／ｋｇのＡｂｅｔ０１４４−ＧＬのどちらによっても有意に変化しなかった（ビヒクルと比較してそれぞれ５および１８％の増大）。ＣＳＦ中の全アミロイドβ１−４２は、１０ｍｇ／ｋｇで３８％、４０ｍｇ／ｋｇで１３９％有意に増大した。脳組織内の全アミロイドβ１−４２もまた、１０および４０ｍｇ／ｋｇで、それぞれ１６％および５０％有意に増大した。正常ラットにおけるこの研究からのデータは、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬが、ＣＳＦ中の遊離アミロイドβ１−４２レベルに対して有意な効果を有しない一方で、ＣＳＦおよび脳の双方において全アミロイドβ１−４２レベルを増大させることを実証する。
血漿中、脳内、および脳脊髄液（ＣＳＦ）中で、Ａβペプチド１−４２のイソ型およびそのＮ末端切断型（ｎ−４２）と結合することで、本発明による結合メンバーは、脳および脳血管系内における、Ａβｎ−４２のイソ型の蓄積を予防し、または沈着を逆転させてもよい。本発明による結合メンバーは、血漿および／または脳脊髄液（ＣＳＦ）中の可溶性Ａβ１−４２と結合して沈殿させ、その結果、血清および／またはＣＳＦ中のＡβ１−４２濃度をそれぞれ低下させてもよい。これは、アルツハイマー病およびその他のアミロイドーシスに伴う病状の治療的アプローチに相当する。
結合メンバーは、Ａβ１７−４２内、より具体的にはＡβ２９−４２内の標的エピトープに対して特異的であり、例えばＡβ１−４０からのエピトープなどの非標的エピトープと比較して、高親和性でこの標的エピトープと結合し、その結果、アミロイドプラーク形成と関連づけられている主要有毒化学種を標的にする。例えば結合メンバーは、Ａβ１−４０に対するよりも、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍または少なくとも１０，０００倍高い、Ａβ１−４２への結合親和性を示してもよい。したがって結合メンバーは、Ａβ１−４０よりもＡβ１−４２との結合に対して選択的である。上述のように、結合メンバーは、５００ｐＭ以下の解離定数（ＫD）でＡβ１−４２と結合してもよい。好ましくは、それはＡβ１−４０に対する顕著な結合を示さない。親和性および結合は、実施例に記載されるように、単量体Ａβペプチドを使用した表面プラズモン共鳴を使用して測定し得る。
Ａβへの結合はまた、実施例に記載されるように、均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ（商標））アッセイ中で測定して、抗体がＡβとの結合について、Ａβペプチドに対する参照抗体分子と競合できるかどうかを判定し得る。
ＨＴＲＦ（商標）アッセイは、近傍にある供与体と受容体フルオロフォア間の蛍光共鳴エネルギー転移を利用する、均一アッセイ技術である。このようなアッセイを使用して、対象分子の１つを供与体フルオロフォアであるユウロピウム（Ｅｕ３＋）クリプテートに、直接または間接的にカップリングさせ、別の対象分子を受容体フルオロフォアＸＬ６６５（安定架橋したアロフィコシアニン）にカップリングさせることで、高分子の相互作用を測定し得る。クリプテート分子の（３３７ｎｍにおける）励起は、６２０ｎｍにおける蛍光放射をもたらす。この発光からのエネルギーは、クリプテート近傍のＸＬ６６５に移転され、ＸＬ６６５から（６６５ｎｍにおける）特異的長寿命蛍光発光をもたらし得る。アッセイ中の着色化合物の存在を補正する６６５／６２０ｎｍ比を計算できるように、（６２０ｎｍにおける）供与体および（６６５ｎｍにおける）受容体の双方の特異的シグナルが測定される。
本発明による結合メンバーは、ＨＴＦＲ（商標）競合アッセイ中で、Ａβ１−４２との結合についてＡβ１−４２と競合し、したがって参照抗体の結合を阻害してもよいが、Ａβ１−４０とは競合しない。結合メンバーは、ＨＴＲＦ（商標）アッセイ中で、Ａβ１−４２との結合について、Ａｂｅｔ０１４４ＧＬの少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％の阻害を示してもよい。
結合阻害の効力は、特に断りのない限り、ｎＭ単位でＩＣ50値として表されてもよい。機能アッセイにおいて、ＩＣ50は、生物学的応答をその最大値の５０％に低下させる、抗体分子の濃度である。リガンド結合試験において、ＩＣ50は、受容体結合を最大特異的結合レベルの５０％に低下させる濃度である。ＩＣ50は、結合メンバー濃度の関数として、最大生物学的応答の％をプロットし、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）またはＯｒｉｇｉｎ（Ｏｒｉｇｉｎ Ｌａｂｓ）などのソフトウェアプログラムを使用して、シグモイド関数をデータに適合させ、ＩＣ50値を得ることで、計算してもよい。効力を測定または判定するための適切なアッセイは、当該技術分野で周知である。
結合メンバーは、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬおよびＡβ１−４２を用いたＨＴＲＦ（商標）エピトープ競合アッセイ中で、例えば２ｎＭ以下、例えば１ｎＭ以下などの５ｎＭ以下のＩＣ50を有してもよい。Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬは、ＶＨ領域配列番号２０およびＶＬ領域配列番号２９を有する抗体分子である。それは、例えばｓｃＦｖまたはＩｇＧ、例えばＩｇＧ１形態などの試験される抗体分子と同一形態で、アッセイ中で使用してもよい。したがって本発明によるＩｇＧ抗体分子は、ＨＴＲＦエピトープ競合アッセイ中で、ヒトＡβ１−４２との結合についてＡｂｅｔ０１４４−ＧＬ ＩｇＧと競合してもよい。このようなアッセイにおける効力は、１ｎＭ未満であってもよい。
本発明による結合メンバーは、ＨＴＲＦ（商標）競合アッセイによる判定で、Ａβ１−４０よりもＡβ１−４２に対する特異的結合を示してもよい。Ａβ１−４０は、このようなアッセイ中で、Ａβ１−４２ペプチドと結合する結合メンバーの有意な阻害を示さなくてもよく、例えばそれは、このようなアッセイ中で、例えば１０％未満または５％未満などの２０％未満の阻害を示してもよく、好ましくはこのようなアッセイ中で、有意な阻害を示さない。
本発明による結合メンバーは、ヒトＡβ１７−４２内、より具体的にはヒトＡβ２９−４２内のエピトープを認識し、例えばマウスまたはラットなどのその他の種からのＡβ中のそれらの標的エピトープもまた、認識してもよい。２つの種のＡβ１−４２に対する結合メンバーの交差反応性の程度を評価するために、第１の種（例えばヒト）からのＡβ１−４２を使用したＨＴＲＦ（商標）競合アッセイ中で計算された結合メンバーの効力を、第２の種からのＡβ１−４２（例えばマウスＡβ１−４２）を使用した同一アッセイ中の結合メンバーの効力と比較してもよい。ＩＣ50測定値によって判定された効力は、１０倍以内または１００倍以内であってもよい。上述のように、Ａｂｅｔ０１４４ＧＬは、ＨＴＲＦ（商標）競合アッセイ中で参照抗体として使用されてもよい。本明細書に記載される結合メンバーは、非ヒトＡβ１−４２アッセイ中よりもヒトＡβ１−４２アッセイ中で、より大きな効力を有してもよい。
結合メンバーは、抗体フレームワーク（すなわち抗体抗原結合領域）内で、例えばＣＤＲセットなどの１つまたは複数のＣＤＲを有する抗体分子を含んでなってもよい。例えば抗体分子は、抗体ＶＨおよび／またはＶＬ領域を含んでなってもよい。抗体分子のＶＨおよびＶＬ領域もまた、本発明の一部として提供される。周知のように、ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）、およびフレームワーク領域（「ＦＷ」）を含んでなる。ＶＨドメインはＨＣＤＲセットを含んでなり、ＶＬドメインはＬＣＤＲセットを含んでなる。抗体分子は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる抗体ＶＨ領域、および／またはＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる抗体ＶＬ領域を含んでなってもよい。ＶＨまたはＶＬ領域は、フレームワークをさらに含んでなってもよい。ＶＨまたはＶＬ領域フレームワークは、典型的に、ＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＣＤＲ２−ＦＷ３−ＣＤＲ３−ＦＷ４の構造でＣＤＲが散在する、ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３、およびＦＷ４の４つのフレームワーク領域を含んでなる。
本発明の態様による抗体ＶＨおよびＶＬ領域、ＦＷおよびＣＤＲの例は、表５および６、および本開示の一部を構成する添付の配列表に列挙される。本明細書で開示される全てのＶＨおよびＶＬ配列、ＣＤＲ配列、ＣＤＲセット、ＨＣＤＲセット、およびＬＣＤＲセット、ならびにこれらの要素の組み合わせは、本発明の態様に相当する。本明細書に記載される「ＣＤＲセット」は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。したがって、ＨＣＤＲセットはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を指し、ＬＣＤＲセットはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を指す。特に断りのない限り、「ＣＤＲセット」は、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを含む。典型的に、本発明の抗体分子は、モノクローナル抗体である。
別の実施形態では、結合メンバーは、下でさらに考察されるように、例えば非抗体タンパク質スキャフォールド中のＣＤＲセットなどの、常態では１つまたは複数のＣＤＲによって提供される、非抗体分子内の抗原結合部位を含んでなってもよい。
Ａｂｅｔ０００７と称される親抗体分子の単離と、それに続くＣＤＲ３の定方向突然変異と、表５、６、および配列表に示されるＣＤＲ配列およびフレームワーク配列セットによってＡｂｅｔ０１４４−ＧＬに生殖系列化された、最適化抗体Ａｂｅｔ０１４４の選択とが、本明細書に記載される。実施例に記載されるように、複数ライブラリーのさらなる最適化および組換えの大規模なプロセスを通じて、抗体クローンパネルをＡｂｅｔ０１４４ＧＬから作成した。これらのさらに最適化されたクローンは、Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３１９、Ａｂｅｔ０３２１ｂ、Ａｂｅｔ０３２２ｂ、Ａｂｅｔ０３２３ｂ、Ａｂｅｔ０３２８、Ａｂｅｔ０３２９、Ａｂｅｔ０３３２、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７０、Ａｂｅｔ０３７１、Ａｂｅｔ０３７２、Ａｂｅｔ０３７３、Ａｂｅｔ０３７４、Ａｂｅｔ０３７７、Ａｂｅｔ０３７８、Ａｂｅｔ０３７９、Ａｂｅｔ０３８１、Ａｂｅｔ０３８２、およびＡｂｅｔ０３８３と称される。これらのＣＤＲ配列および可変領域配列は、表５および６で参照され、配列表に記載される。生殖系列化されたＶＨおよびＶＬ領域配列である、Ａｂｅｔ０３８０ＧＬ、Ａｂｅｔ０３７７ＧＬ、Ａｂｅｔ０３４３ＧＬ、Ａｂｅｔ０３６９ＧＬ、およびＡｂｅｔ０３８２ＧＬは、表８および表９に示される。
例えば表５および６は、Ａｂｅｔ０３８０が、その中でＨＣＤＲ１が配列番号５２５（Ｋａｂａｔ残基３１〜３５）であり、ＨＣＤＲ２が配列番号５２６（Ｋａｂａｔ残基５０〜６５）であり、ＨＣＤＲ３が配列番号５２７（Ｋａｂａｔ残基９５〜１０２）であり、ＬＣＤＲ１が配列番号５３４（Ｋａｂａｔ残基２４〜３４）であり、ＬＣＤＲ２が配列番号５３５（Ｋａｂａｔ残基５０〜５６）であり、ＬＣＤＲ３が配列番号５３６（Ｋａｂａｔ残基８９〜９７）である、ＣＤＲセットを有することを示す。その他の最適化抗体クローンは、表５および６に同様に示され、本発明の態様としてもまた提供される。
本発明によるヒトＡβ１−４２の結合メンバーは、例えばＣＤＲセットなどの本明細書に記載される１つまたは複数のＣＤＲを含んでなってもよい。ＣＤＲまたはＣＤＲセットは、Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３１９、Ａｂｅｔ０３２１ｂ、Ａｂｅｔ０３２２ｂ、Ａｂｅｔ０３２３ｂ、Ａｂｅｔ０３２８、Ａｂｅｔ０３２９、Ａｂｅｔ０３３２、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７０、Ａｂｅｔ０３７１、Ａｂｅｔ０３７２、Ａｂｅｔ０３７３、Ａｂｅｔ０３７４、Ａｂｅｔ０３７７、Ａｂｅｔ０３７８、Ａｂｅｔ０３７９、Ａｂｅｔ０３８１、Ａｂｅｔ０３８２、およびＡｂｅｔ０３８３、またはその生殖系列化バージョンのＣＤＲセットであってもよく、または本明細書に記載されるようなその変種であってもよい。
いくつかの実施形態では；
ＨＣＤＲ１は、Ｋａｂａｔ残基３１〜３５からなる５アミノ酸長であってもよく；
ＨＣＤＲ２は、Ｋａｂａｔ残基５０〜６５からなる１７アミノ酸長であってもよく；
ＨＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ残基９５〜１０２からなる１６アミノ酸長であってもよく；
ＬＣＤＲ１は、Ｋａｂａｔ残基２４〜３４からなる１１アミノ酸長であってもよく；
ＬＣＤＲ２は、Ｋａｂａｔ残基５０〜５６からなる７アミノ酸長であってもよく；および／または
ＬＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ残基８９〜９７からなる９アミノ酸長であってもよい。
結合メンバーは、例えば表５または６に列挙される抗体のいずれかのＣＤＲセットなどの、表５および６に列挙される抗体のいずれかのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３および／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／またはＬＣＤＲ３を含んでなってもよい。結合メンバーは、これらの抗体のいずれか１つのＶＨ ＣＤＲセットを含んでなってもよい。任意選択的に、それはまた、これらの抗体のＶＬ ＣＤＲセットを含んでなってもよい。ＶＬ ＣＤＲは、ＶＨ ＣＤＲと同じまたは異なる抗体に由来してもよい。表５に列挙される抗体のいずれかのＨＣＤＲセットを含んでなるＶＨ領域、および／または表６に列挙される抗体のいずれかのＬＣＤＲセットを含んでなるＶＬ領域もまた、本明細書で提供される。
結合メンバーは、開示されるＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲセット内に、例えば最大で５、１０または１５個の変異である、１つまたは複数のアミノ酸変異がある、表５および６に列挙される抗体のいずれかのＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲセットを含んでなってもよい。変異は、アミノ酸置換、欠失または挿入であってもよい。例えば本発明の抗体分子は、例えば置換である１つまたは２つのアミノ酸変異がある、Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３１９、Ａｂｅｔ０３２１ｂ、Ａｂｅｔ０３２２ｂ、Ａｂｅｔ０３２３ｂ、Ａｂｅｔ０３２８、Ａｂｅｔ０３２９、Ａｂｅｔ０３３２、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７０、Ａｂｅｔ０３７１、Ａｂｅｔ０３７２、Ａｂｅｔ０３７３、Ａｂｅｔ０３７４、Ａｂｅｔ０３７７、Ａｂｅｔ０３７８、Ａｂｅｔ０３７９、Ａｂｅｔ０３８１、Ａｂｅｔ０３８２、およびＡｂｅｔ０３８３、またはその生殖系列化バージョンのいずれか１つからのＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲセットを含んでなってもよい。
例えば結合メンバーは、
Ａｂｅｔ０３８０またはＡｂｅｔ０３８０ＧＬのＨＣＤＲのアミノ酸配列が、
ＨＣＤＲ１配列番号５２５、
ＨＣＤＲ２配列番号５２６、および
ＨＣＤＲ３配列番号５２７である、
Ａｂｅｔ０３８０またはＡｂｅｔ０３８０ＧＬのＨＣＤＲセットを含んでなり、
または１つまたは２つのアミノ酸変異があるＡｂｅｔ０３８０のＨＣＤＲセットを含んでなる、ＶＨ領域、および
（ｉｉ）Ａｂｅｔ０３８０またはＡｂｅｔ０３８０ＧＬのＬＣＤＲのアミノ酸配列が、
ＬＣＤＲ１配列番号５３４、
ＬＣＤＲ２配列番号５３５、および
ＬＣＤＲ３配列番号５３６である、
Ａｂｅｔ０３８０またはＡｂｅｔ０３８０ＧＬのＬＣＤＲセットを含んでなり、
または１つまたは２つのアミノ酸変異がある、Ａｂｅｔ０３８０またはＡｂｅｔ０３８０ＧＬのＬＣＤＲセットを含んでなる、ＶＬ領域
を含んでなってもよい。
変異は、ＣＤＲセット内のあらゆる残基で潜在的に生じてもよい。いくつかの実施形態では、置換は、表５および６に示される通りのＡｂｅｔ０３８０またはその生殖系列化バージョンと比較して、Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３１９、Ａｂｅｔ０３２１ｂ、Ａｂｅｔ０３２２ｂ、Ａｂｅｔ０３２３ｂ、Ａｂｅｔ０３２８、Ａｂｅｔ０３２９、Ａｂｅｔ０３３２、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７０、Ａｂｅｔ０３７１、Ａｂｅｔ０３７２、Ａｂｅｔ０３７３、Ａｂｅｔ０３７４、Ａｂｅｔ０３７７、Ａｂｅｔ０３７８、Ａｂｅｔ０３７９、Ａｂｅｔ０３８１、Ａｂｅｔ０３８２およびＡｂｅｔ０３８３と比較してＡｂｅｔ０１４４ＧＬ、Ａｂｅｔ０３１９、Ａｂｅｔ０３２１ｂ、Ａｂｅｔ０３２２ｂ、Ａｂｅｔ０３２３ｂ、Ａｂｅｔ０３２８、Ａｂｅｔ０３２９、Ａｂｅｔ０３３２、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７０、Ａｂｅｔ０３７１、Ａｂｅｔ０３７２、Ａｂｅｔ０３７３、Ａｂｅｔ０３７４、Ａｂｅｔ０３７７、Ａｂｅｔ０３７８、Ａｂｅｔ０３７９、Ａｂｅｔ０３８１、Ａｂｅｔ０３８２、およびＡｂｅｔ０３８３のいずれかの中で置換される位置において起きてもよい。
例えば、１つまたは複数の置換は、
ＶＨ ＦＷ１中の２６、２７、２８、２９または３０；
ＶＨ ＣＤＲ１中の３１、３２、３３、３４または３５；
ＶＨ ＣＤＲ２中の５２ａ、５３、５４、５５、５６、５７、５８または６２；
ＶＨ ＣＤＲ３中の９８、９９、１００ｈまたは１０２；
ＶＬ ＣＤＲ１中の２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４；
ＶＬ ＣＤＲ３中の８９、９０、９２、９３、９４または９７
のＫａｂａｔ残基の１つまたは複数であってもよい。
特定のＫａｂａｔ残基位置における可能なアミノ酸置換の例は、ＶＨ領域については表１２および１４、ＶＬ領域については表１３および１５に示される。
上述したように、結合メンバーは、抗体フレームワーク内に、例えばＣＤＲセットなどの１つまたは複数のＣＤＲを有する抗体分子を含んでなってもよい。例えば、抗体の１つまたは複数のＣＤＲまたはＣＤＲセットをフレームワーク（例えばヒトフレームワーク）内にグラフトして、抗体分子を提供してもよい。フレームワーク領域は、ヒト生殖細胞系遺伝子断片配列のものであってもよい。したがってフレームワークは生殖系列化させてもよく、それによって、フレームワーク内の１つまたは複数の残基が、最も良く似たヒト生殖細胞系フレームワーク内の対応する位置の残基と一致するように変化する。当業者は、配列が、生殖系列化前の抗体のフレームワーク配列に最も近い生殖細胞系断片を選択して、抗体の親和性または活性を試験し、本明細書に記載されるアッセイ中で、生殖系列化が抗原結合または効力を有意に低下させないことを確認し得る。ヒト生殖細胞系遺伝子断片配列は、当業者に知られており、例えばＶＢＡＳＥデータベース（ＶＢＡＳＥ，ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＵＫ，１９９７，ｈｔｔｐ／／ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ）からアクセスし得る。
本明細書に記載される結合メンバーは、例えばＶｈ３−２３ＤＰ−４７などのヒト生殖細胞系フレームワークのＨＣＤＲセットを含んでなるＶＨ領域を有する、単離ヒト抗体分子であってもよい。したがってＶＨ領域フレームワーク領域ＦＷ１、ＦＷ２および／またはＦＷ３は、ヒト生殖細胞系遺伝子断片Ｖｈ３−２３ＤＰ−４７のフレームワーク領域を含んでなってもよく、および／またはフレームワーク残基を変異させて、このヒト生殖細胞系遺伝子断片のフレームワーク残基を一致させることで生殖系列化してもよい。ＦＷ４は、ヒト生殖細胞系連結部分のフレームワーク領域を含んでなってもよい。
ＶＨ ＦＷ１のアミノ酸配列は、配列番号５２８であってもよい。ＶＨ ＦＷ１は、抗原結合に寄与するおよび／またはＣＤＲ１ループの立体構造に重要であると考えられる、ひと続きの残基をＫａｂａｔ位置２６〜３０に含有する。置換は、配列番号５２８に含まれて、例えば選択されたＨＣＤＲ１配列と相乗作用してもよい。１つまたは複数の置換は、任意選択的に、表１２または表１４に示されるものから選択されてもよい。
ＶＨ ＦＷ２のアミノ酸配列は、配列番号５２９であってもよい。ＶＨ ＦＷ３のアミノ酸配列は、配列番号５３０であってもよい。ＶＨ ＦＷ４のアミノ酸配列は、配列番号５３１であってもよい。
常態では結合メンバーはまた、例えばＶλ２３−３ ＤＰＬ−２３などのヒト生殖細胞系フレームワーク内に、ＬＣＤＲセットを含んでなるＶＬ領域も有する。したがってＶＬ領域フレームワーク領域ＦＷ１、ＦＷ２および／またはＦＷ３は、ヒト生殖細胞系遺伝子断片Ｖλ２３−３ ＤＰＬ−２３のフレームワーク領域を含んでなってもよく、および／またはフレームワーク残基を変異させて、このヒト生殖細胞系遺伝子断片のフレームワーク残基を一致させることで生殖系列化してもよい。ＦＷ４は、ヒト生殖細胞系連結部分のフレームワーク領域を含んでなってもよい。ＶＬ ＦＷ１のアミノ酸配列は、配列番号５３７であってもよい。ＶＬ ＦＷ２のアミノ酸配列は、配列番号５３８であってもよい。ＶＬ ＦＷ３のアミノ酸配列は、配列番号５３９であってもよい。ＶＨ ＦＷ４のアミノ酸配列は、配列番号５４０であってもよい。
生殖系列化ＶＨまたはＶＬ領域は、１つまたは複数のベルニエ残基において、生殖系列化されてもよく、またはされなくてもよいが、常態では生殖系列化されない。
例えば本明細書に記載される抗体分子またはＶＨ領域は、
ＦＷ１配列番号５２８；
ＦＷ２配列番号５２９；
ＦＷ３配列番号５３０；
ＦＷ４配列番号５３１
の重鎖フレームワーク領域セットを含んでなってもよく、
または例えば置換である、１、２、３、４、５、６または７個のアミノ酸変異がある、重鎖フレームワーク領域の前記セットを含んでなってもよい。
本明細書に記載される抗体分子またはＶＬ領域は、
ＦＷ１配列番号５３７；
ＦＷ２配列番号５３８；
ＦＷ３配列番号５３９；
ＦＷ４配列番号５４０
の軽鎖フレームワーク領域セットを含んでなってもよく、
または例えば置換である、１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸変異がある、前記セット軽鎖フレームワーク領域を含んでなってもよい。
非生殖系列化抗体分子は、生殖系列化抗体分子と比較して、同一ＣＤＲを有するが、異なるフレームワークを有する。本明細書の添付の配列表に示される抗体配列の内、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬ、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ、Ａｂｅｔ０３７７−ＧＬ、Ａｂｅｔ０３４３−ＧＬ、Ａｂｅｔ０３６９−ＧＬ、およびＡｂｅｔ０３８２−ＧＬ配列は、生殖系列化されている。その配列が本明細書で開示されるその他の抗体分子の生殖系列化抗体は、任意選択的に、ＶＨ領域内ではＶｈ３−２３ＤＰ−４７に、ＶＬ領域内ではＶλ２３−３ＤＰＬ−２３に、それらのＶＨおよびＶＬ領域配列のフレームワーク領域を生殖系列化することで生成されてもよい。
典型的に、ＶＨドメインをＶＬドメインと対合させて、抗体抗原結合部位を提供するが、上で考察されるように、ＶＨまたはＶＬドメインのみを使用して、抗原と結合させてもよい。例えば、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＶＨおよびＶＬ領域の双方を含んでなる抗体抗原結合部位が形成されるように、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＶＨ領域（配列番号５２４）をＡｂｅｔ０３８０−ＧＬのＶＬ領域（配列番号５３３）と対合させてもよい。本明細書で開示されるその他の抗体のＶＨおよびＶＬ領域について、類似実施形態が提供される。別の実施形態では、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＶＨは、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＶＬ以外のＶＬ領域と対合される。軽鎖乱交雑は、当該技術分野で確立されている。この場合もやはり、本明細書で開示されるその他のＶＨおよびＶＬ領域について、本発明によって類似実施形態が提供される。したがって、Ａｂｅｔ０３１９、Ａｂｅｔ０３２１ｂ、Ａｂｅｔ０３２２ｂ、Ａｂｅｔ０３２３ｂ、Ａｂｅｔ０３２８、Ａｂｅｔ０３２９、Ａｂｅｔ０３３２、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７０、Ａｂｅｔ０３７１、Ａｂｅｔ０３７２、Ａｂｅｔ０３７３、Ａｂｅｔ０３７４、Ａｂｅｔ０３７７、Ａｂｅｔ０３７８、Ａｂｅｔ０３７９、Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３８１、Ａｂｅｔ０３８２、およびＡｂｅｔ０３８３のいずれかのＶＨ ＣＤＲまたは生殖系列化ＶＨ領域配列を含んでなるＶＨ領域と、異なる抗体からのＶＬ ＣＤＲまたは生殖系列化ＶＬ領域を含んでなるＶＬ領域とを対合させてもよく、例えばＶＨおよびＶＬ領域は、Ａｂｅｔ０３１９、Ａｂｅｔ０３２１ｂ、Ａｂｅｔ０３２２ｂ、Ａｂｅｔ０３２３ｂ、Ａｂｅｔ０３２８、Ａｂｅｔ０３２９、Ａｂｅｔ０３３２、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７０、Ａｂｅｔ０３７１、Ａｂｅｔ０３７２、Ａｂｅｔ０３７３、Ａｂｅｔ０３７４、Ａｂｅｔ０３７７、Ａｂｅｔ０３７８、Ａｂｅｔ０３７９、Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３８１、Ａｂｅｔ０３８２、およびＡｂｅｔ０３８３から選択される異なる抗体に由来してもよい。
結合メンバーは、
（ｉ）Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７、およびＡｂｅｔ０３８２、またはその生殖系列化バージョンのいずれかについて、表１６または添付の配列表に示される通りであり、または１つまたは２つのアミノ酸変異があるそのアミノ酸配列を含んでなる、ＶＨ領域アミノ酸配列、および
（ｉｉ）Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７、およびＡｂｅｔ０３８２、またはその生殖系列化バージョンのいずれかについて、表１６または添付の配列表に示される通りであり、または１つまたは２つのアミノ酸変異があるそのアミノ酸配列を含んでなる、ＶＬ領域アミノ酸配列
を含んでなってもよい。
抗体分子は、
（ｉ）Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７、およびＡｂｅｔ０３８２、またはその生殖系列化バージョンのいずれかについて、表１６に示されるＶＨ領域アミノ酸配列と、少なくとも９０％、９５％または９８％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨ領域；および
（ｉｉ）Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７、およびＡｂｅｔ０３８２、またはその生殖系列化バージョンのいずれかについて、表１６に示されるＶＬ領域アミノ酸配列と、少なくとも９０％、９５％または９８％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬ領域
を含んでなってもよい。
それは、Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７、およびＡｂｅｔ０３８２、またはその生殖系列化バージョンのいずれかのＶＨ領域およびＶＬ領域と、それぞれ少なくとも９０％、９５％または９８％同一であるＶＨ領域およびＶＬ領域を含んでなってもよい。
結合メンバーは、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含んでなってもよく、その中で、
（ｉ）ＶＨ領域アミノ酸配列は配列番号５２４で示され、ＶＬ領域アミノ酸配列は配列番号５３３で示され；
（ｉｉ）ＶＨ領域アミノ酸配列は、配列番号５２４と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を有し、ＶＬ領域アミノ酸配列は、配列番号５３３と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を有し；または
（ｉｉｉ）ＶＨ領域アミノ酸配列は、配列番号５２４と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有し、ＶＬ領域アミノ酸配列は、配列番号５３３と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、抗体分子は、例えばｓｃＦｖなどのように抗体定常領域を欠いていてもよい。
別の実施形態では、抗体分子は、抗体定常領域を含んでなってもよい。抗体分子は、ＩｇＧなどの全抗体、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４であってもよく、または下述されるような抗体断片または誘導体であってもよい。抗体分子はまた、例えば、ＹＴＥがあるＩｇＧ１（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６９：５１７１−５１８０；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（３３）：２３５１４−２４）、および／またはＦｃ領域内のＴＭ変異（Ｏｇａｎｅｓｙａｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ Ｄ６４：７００−４）などのその他の構成を有し得る。
本発明は、変種Ｆｃ領域がある本発明の結合メンバーを提供し、変種は、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによる番号付けで、２３４位のフェニルアラニン（Ｆ）残基、２３５位のフェニルアラニン（Ｆ）残基またはグルタミン酸（Ｅ）残基、および３３１位のセリン（Ｓ）残基を含んでなる。このような変異の組み合わせは、以下、三重変異（ＴＭ）と称される。
本明細書に記載される結合メンバーは、
（ｉ）寄託受入番号ＮＣＩＭＢ ４１８８９（Ａｂｅｔ０００７）；
（ｉｉ）寄託受入番号ＮＣＩＭＢ ４１８９０（Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ）；
（ｉｉｉ）寄託受入番号ＮＣＩＭＢ ４１８９１（Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬ）；
（ｉｖ）寄託受入番号ＮＣＩＭＢ ４１８９２（Ａｂｅｔ０３７７−ＧＬ）
のいずれかの核酸配列および／またはベクターによってコードされる、ＣＤＲ、ＶＨ領域、ＶＬ領域、抗体−抗原結合部位または抗体分子を含んでなってもよい。
本明細書に記載される結合メンバーは、寄託受入番号ＮＣＩＭＢ ４１８８９、４１８９０、４１８９１または４１８９２の核酸、ベクターまたは細胞系から生成され、または生成可能であってもよい。例えば結合メンバーは、寄託受入番号ＮＣＩＭＢ ４１８９０の細胞系の核酸またはベクターの発現によって生成されてもよい。核酸またはベクターは、あらゆる都合良い発現系によって発現されてもよい。代案としては、結合メンバーは、寄託受入番号ＮＣＩＭＢ ４１８８９、４１８９０、４１８９１または４１８９２の細胞系によって発現されてもよい。
本発明の態様はまた、受入番号４１８８９、４１８９０、４１８９１または４１８９２の細胞系に含有される、ＶＨおよび／またはＶＬ領域をコードする核酸；受入番号４１８８９、４１８９０、４１８９１または４１８９２の細胞系に含有される、前記核酸を含んでなるベクター；および受入番号４１８８９、４１８９０、４１８９１または４１８９２の細胞または細胞系も提供する。
本発明による結合メンバーは、４１８８９、４１８９０、４１８９１または４１８９２の受入番号の下に寄託された核酸によってコードされるあらゆる抗体分子と、または添付の配列表に記載されるＡｂｅｔ００７、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬまたはＡｂｅｔ０３７７−ＧＬのＶＨ領域およびＶＬ領域アミノ酸配列を含んでなる抗体分子と、ヒトＡβ１−４２との結合について競合する抗体抗原結合部位または抗体分子を含んでなってもよい。
結合メンバー
結合メンバーという用語は、互いに結合する一対の分子の一方のメンバーを表現する。結合対のメンバーは、天然由来であっても、または完全にまたは部分的に合成的に生成されてもよい。対の分子の一方のメンバーは、その表面に領域または窩洞を有し、それは対の分子の他方のメンバーの特定の空間的および極性機構と結合し、したがってそれと相補的である。結合対のタイプの例は、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、酵素−基質である。本発明は、抗原−抗体タイプの反応に関する。
結合メンバーは、常態では、抗原結合部位を有する分子を含んでなる。例えば結合メンバーは、抗原結合部位を含んでなる抗体分子または非抗体タンパク質であってもよい。
抗原結合部位は、フィブロネクチンまたはチトクロームＢなどなどの非抗体タンパク質スキャフォールド上へのＣＤＲ配置の手段によって［Ｈａａｎ ＆ Ｍａｇｇｏｓ（２００４）ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，１２（５）：Ａ１−Ａ６；Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２８４：１１４１−１１５１；Ｎｙｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７：４６３−４６９ｉ］、または所望の標的に対する結合特異性を与える、タンパク質スキャフォールド内のループのアミノ酸残基のランダム化または変異によって、提供されてもよい。タンパク質内で新規結合部位を設計するためのスキャフォールドは、Ｎｙｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．［前出］によって詳細に概説されている。抗体模倣体のタンパク質スキャフォールドは、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、国際公開第００／３４７８４号パンフレットで開示され、その中で発明者らは、少なくとも１つの無作為化ループを有するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含むタンパク質（抗体模倣体）について記述する。その中に、例えばＨＣＤＲまたはＨＣＤＲ３および／またはＬＣＤＲ３セットなどの１つまたは複数のＣＤＲがグラフトされる適切なスキャフォールドは、あらゆる免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの領域メンバーによって提供されてもよい。スキャフォールドは、ヒトまたは非ヒトタンパク質であってもよい。非抗体タンパク質スキャフォールドの利点は、それが、少なくともいくつかの抗体分子よりも小さく、および／または製造がより容易である抗原結合部位をスキャフォールド分子内に提供してもよいことである。結合メンバーの小さなサイズは、細胞に入り込む、組織に深く浸透する、またはその他の構造内の標的に到達する、または標的抗原のタンパク質内窩洞と結合する能力などの有用な生理学的特性を与えてもよい。非抗体タンパク質スキャフォールド中の抗原結合部位の使用は、Ｗｅｓｓ，２００４［Ｗｅｓｓ，Ｌ．Ｉｎ：ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，Ｔｈｅ Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ＢｉｏＢｕｓｉｎｅｓｓ，１２（４２），Ａ１−Ａ７，２００４］でレビューされる。典型的なのは、安定骨格と、１つまたは複数の可変ループとを有するタンパク質であり、その中では、ループまたはループ群のアミノ酸配列が特異的にまたは無作為に変異して、標的抗原と結合する抗原結合部位を作り出す。このようなタンパク質としては、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）からのプロテインＡのＩｇＧ−結合領域、トランスフェリン、テトラネクチン、フィブロネクチン（例えば第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン）、リポカリン、ならびにγ結晶性およびその他のＡｆｆｉｌｉｎ（商標）スキャフォールド（Ｓｃｉｌタンパク質）が挙げられる。その他のアプローチの例としては、分子内ジスルフィド結合を有するサイクロチド−小型タンパク質をベースとした合成「Ｍｉｃｒｏｂｏｄｉｅｓ」、Ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｖｅｒｓａｂｏｄｉｅｓ（商標）、Ａｍｕｎｉｘ）、およびアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ）が挙げられる。
抗体配列および／または抗原結合部位に加えて、結合メンバーは、例えば折り畳み領域などのペプチドまたはポリペプチドを形成する、または抗原結合能力に加えて別の機能特性を分子に与える、その他のアミノ酸を含んでなってもよい。結合メンバーは、検出可能な標識を保有してもよく、または（例えばペプチジル結合またはリンカーを介して）、毒素または標的部分または酵素に共役してもよい。例えば結合メンバーは、（例えば酵素ドメイン内に）触媒部位ならびに抗原結合部位を含んでなってもよく、その中では抗原結合部位が抗原と結合し、したがって触媒部位が抗原の標的になる。触媒部位は、例えば切断によって抗原の生物学的機能を阻害してもよい。
言及されたように、ＣＤＲは非抗体スキャフォールドによって保有され得るが、例えばＣＤＲ３などのＣＤＲ、または本発明のＣＤＲセットを保有するための構造は、一般に抗体重鎖または軽鎖配列、またはその実質的部分であり、その中でＣＤＲまたはＣＤＲセットは、再配列免疫グロブリン遺伝子によってコードされる、天然起源ＶＨおよびＶＬ抗体可変領域のＣＤＲまたはＣＤＲセットに対応する位置にある。免疫グロブリン可変領域の構造および位置は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，１９８７［Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．１９８７］と、その最新情報を参照して判定してもよい。このデータベースをクエリーするために、いくつかの学術的および商業的オンライン情報源が利用できる。例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．Ｒ．Ａｃｃｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｋａｂａｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ｂｙ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ＰＲＯＴＥＩＮＳ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２５（１９９６），１３０−１３３、および目下ウェブアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ｓｉｍｋａｂ．ｈｔｍｌにある関連オンライン情報源を参照されたい。
ＣＤＲ領域またはＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．１９９１［Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ］と、その後の版によって定義される、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域を示すことが意図される。抗体は、典型的に、３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲを含有する。ＣＤＲまたはＣＤＲ群という用語は、本明細書において、場合に応じて、それが認識する抗原またはエピトープに対する抗体親和性による結合に関与するアミノ酸残基の大部分を含有する、これらの領域の１つ、またはこれらの領域のいくつか、または全体さえ示すために使用される。
６本の短いＣＤＲ配列中で、重鎖（ＨＣＤＲ３）の３番目のＣＤＲは、より大きなサイズ変動性（それが生成する遺伝子配置機構に本質的に起因する、より大きな多様性）を有する。それは２アミノ酸程度に短くてもよいが、既知の最大サイズは２６である。ＣＤＲ長はまた、特定の下層のフレームワークが収容し得る長さ次第で、異なってもよい。機能的に、ＨＣＤＲ３は、抗体特異性の決定においてある程度の役割を果たす（Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，７１：４２９８−４３０２，１９７４；Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：７４７−７５３，１９８６；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７，１９８７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８８３，１９８９；Ｃａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４：１９６５−１９６８，１９９；Ｓｈａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，８７：４８１４−４８１７，１９９０；Ｓｈａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４：４８６３−４８６９，１９９０；ａｎｄ Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：１７０９−１７１９，１９９１）。
抗体分子
これは、天然であるか、または部分的にまたは完全に合成的に製造されたかどうかに関わりなく、免疫グロブリンを表現する。用語はまた、抗体抗原結合部位を含んでなる、あらゆるポリペプチドまたはタンパク質を包含する。本明細書中では、本発明は、天然形態の抗体に関するものでないことが、理解されるべきであり、すなわちそれらはそれらの天然環境中にないが、それらは天然原料からの精製によって単離または入手され得て、さもなければ遺伝子組換えによって、または化学合成によって入手され得て、次にそれらは、後述するように非天然アミノ酸を含有し得る。抗体抗原結合部位を含んでなる抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、およびＦｄなどの分子が挙げられるが、これに限定されるものではない。例えばＦａｂ2、Ｆａｂ3、二特異性抗体、三特異性抗体、四特異性抗体、およびミニ抗体をはじめとする、１つまたは複数の抗体抗原結合部位を含む、様々なその他の抗体分子が、改変されている。抗体分子とそれらの構築および利用方法は、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ＆ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（９）：１１２６−１１３６ ２００５に記載される。
モノクローナルおよびその他の抗体を使用して、組換えＤＮＡ技術を利用し、標的抗原と結合するその他の抗体またはキメラ分子を生成することが可能である。このような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡ、またはＣＤＲを、異なる免疫グロブリンの定常領域に、または定常領域とフレームワーク領域に導入することを伴ってもよい。例えば、欧州特許出願公開第Ａ−１８４１８７号明細書、英国特許第２１８８６３８Ａ号明細書または欧州特許出願公開第Ａ−２３９４００号明細書、および膨大な量の後続の文献を参照されたい。抗体を産生するハイブリドーマまたはその他の細胞は、遺伝子変異またはその他の変化を受けてもよく、それは生成する抗体の結合特異性を変化させてもさせなくてもよい。
抗体は、いくつかの方法で修飾し得て、「抗体分子」という用語は、要求される抗原特異性および／または結合がある抗体抗原結合部位を有する、あらゆる結合メンバーまたは物質を包含すると解釈されるべきである。したがってこの用語は、天然、または完全にまたは部分的に合成されたかどうかに関わりなく、抗体抗原結合部位を含んでなるあらゆるポリペプチドをはじめとする、抗体断片と誘導体を包含する。したがって別のポリペプチド（例えば別の種に由来するまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する）に融合した、抗体抗原結合部位、または同等物を含んでなるキメラ分子も包含される。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、欧州特許出願公開第Ａ−０１２０６９４号明細書および欧州特許出願公開第Ａ−０１２５０２３号明細書、および後続の膨大な量の文献に記載される。
抗体工学技術分野で利用できるさらなる技術によって、ヒトおよびヒト化抗体の単離が可能になった。例えばヒトハイブリドーマは、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＆ Ｄｕｂｅｌ［Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ ＆ Ｄｕｂｅｌ，Ｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＬＬＣ；２００１，ＩＳＢＮ：３５４０４１３５４５］によって記載されるようにして生成し得る。結合メンバーを生成する別の確立された技術であるファージディスプレイが、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＆ Ｄｕｂｅｌ［前出］および国際公開第９２／０１０４７号パンフレット（下でさらに考察される）、および米国特許第５９６９１０８号明細書、米国特許第５５６５３３２号明細書、米国特許第５７３３７４３号明細書、米国特許第５８５８６５７号明細書、米国特許第５８７１９０７号明細書、米国特許第５８７２２１５号明細書、米国特許第５８８５７９３号明細書、米国特許第５９６２２５５号明細書、米国特許第６１４０４７１号明細書、米国特許第６１７２１９７号明細書、米国特許第６２２５４４７号明細書、米国特許第６２９１６５０号明細書、米国特許第６４９２１６０号明細書、米国特許第６５２１４０４号明細書などの多数の文献で詳述される。
マウス免疫系のその他の構成要素をそのままにしながら、その中でマウス抗体遺伝子が不活性化されて、ヒト抗体遺伝子で機能的に置換されている遺伝子組換えマウスを、ヒト抗体を単離するために使用し得る［Ｍｅｎｄｅｚ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ，１５（２）：１４６−１５６］。ヒト化抗体は、例えば国際公開第９１／０９９６７号パンフレット、米国特許第５，５８５，０８９号明細書、欧州特許第５９２１０６号明細書、米国特許第５６５，３３２号明細書、および国際公開第９３／１７１０５号パンフレットで開示されるものなどの当該技術分野で公知の技術を使用して、生成し得る。さらに、国際公開第２００４／００６９５５号パンフレットは、非ヒト抗体可変領域ＣＤＲ配列のカノニカルＣＤＲ構造タイプを、例えば生殖細胞系抗体遺伝子断片などのヒト抗体配列ライブラリーからの対応するＣＤＲのカノニカルＣＤＲ構造タイプと比較することで、ヒト抗体遺伝子からの可変領域フレームワーク配列を選択することに基づいて、抗体をヒト化する方法を記載する。非ヒトＣＤＲと類似したカノニカルＣＤＲ構造タイプを有するヒト抗体可変領域は、それからヒトフレームワーク配列が選択される、ヒト抗体配列のサブセットメンバーを形成する。サブセットメンバーは、ヒトＣＤＲ配列と非ヒトＣＤＲ配列間のアミノ酸類似性によって、さらに格付けされてもよい。国際公開第２００４／００６９５５号パンフレットの方法では、最高位のヒト配列が選択されて、選択サブセットメンバーヒトフレームワークを使用して、ヒトＣＤＲ配列を非ヒトＣＤＲ相当物で機能的に置き換えるキメラ抗体を構築するためのフレームワーク配列が提供され、それによって非ヒトおよびヒト抗体間でフレームワーク配列を比較する必要性なしに、高親和性および低免疫原性のヒト化抗体が提供される。方法に従って作成されたキメラ抗体もまた、開示される。
合成抗体分子は、例えばＫｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．［Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）２９６，５７−８６］または Ｋｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ．［Ｋｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５４ ２００１ ６７−８４］によって記載されるように、適切な発現ベクター中で合成され組み立てられたオリゴヌクレオチドの手段によって生成された、遺伝子からの発現によって作り出されてもよい。
全抗体の断片が、抗原結合機能を果たし得ることが示されている。結合断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）ＶＨまたはＶＬ領域からなるｄＡｂ断片［Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４−５４６（１９８９）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８，５５２−５５４；Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１，４８４−４９０］；（ｖ）単離ＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの結合したＦａｂ断片を含んでなる二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｖｉｉ）その中で、２つの領域が結合して抗原結合部位を形成できるようにするペプチドリンカーによって、ＶＨ領域およびＶＬ領域が結合する、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）［Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３，１９８８］；（ｖｉｉｉ）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５号明細書）；および（ｉｘ）遺伝子融合によって構築される、「二特異性抗体」、多価または多特異性断片（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０ ６４４４−６４４８，１９９３）である。Ｆｖ、ｓｃＦｖまたは二特異性抗体分子は、ＶＨおよびＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組み込みによって、安定化されてもよい［Ｒｅｉｔｅｒ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４，１２３９−１２４５，１９９６］。ＣＨ３ドメインに連結するｓｃＦｖを含んでなるミニ抗体もまた、作成されてもよい［Ｈｕ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６，３０５５−３０６１，１９９６］。その他の結合断片の例は、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインをはじめとする、少数の残基の重鎖ＣＨ１領域のカルボキシル末端への付加があることで、Ｆａｂ断片と異なるＦａｂ’、およびその中で、定常領域のシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片である、Ｆａｂ’−ＳＨである。
Ｑｕｉ ｅｔ ａｌ．［Ｑｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：９２１−９２９ ２００７］は、フレームワーク領域によって結合する２つのＣＤＲのみを含有する抗体分子を記述した。ＶＨまたはＶＬ領域からのＣＤＲ３は、別の領域のＣＤＲ１またはＣＤＲ２ループと結合された。結合は、ＦＲ領域を介して、選択されたＣＤＲ１またはＣＤＲ２のＣ末端から、ＣＤＲ３のＮ末端を経由した。Ｑｕｉ ｅｔ ａｌ．は、疎水性パッチが最も少ないＦＲ領域を選択した。試験された抗体の最適の組み合わせは、ＶＨ ＦＲ２を介してＶＨ ＣＤＲ３に結合するＶＬ ＣＤＲ１であることが分かった（ＶＨＣＤＲ１−ＶＨＦＲ２−ＶＬＣＤＲ３）。分子量が３ｋＤａ前後であるこれらの抗体分子は、完全な免疫グロブリン（およそ１５０ｋＤａ）またはｓｃＦｖ（およそ２８ｋＤａ）と比較して、組織浸透改善の観点から利点を提供する。
本発明の抗体断片は、例えばペプシンまたはパパインなどの酵素による消化、および／または化学的還元によるジスルフィド架橋切断などの方法によって、本明細書で列挙される抗体のいずれかから出発して得られ得る。別の様式では、本発明を構成する抗体断片は、当業者に同様に良く知られている遺伝子組換え技術によって、さもなければ例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社などによって提供されるものなどの自動ペプチド合成機の手段によるペプチド合成によって、または核酸合成と発現によって得られ得る。
本発明による機能性抗体断片としては、その半減期が、特にＰＥＧ化である化学修飾によって、またはリポソーム中への組み込みによって増大される、あらゆる機能性断片が挙げられる。
ｄＡｂ（ドメイン抗体）は、抗体の小型単量体抗原結合断片、すなわち抗体重鎖または軽鎖の可変領域である。ＶＨ ｄＡｂは、ラクダ科動物（例えばラクダ、ラマ）において自然発生し、標的抗原を用いてラクダ科動を免疫化して、抗原特異的Ｂ細胞を単離し、個々のＢ細胞からのｄＡｂ遺伝子を直接クローニングすることで生成されてもよい。ｄＡｂはまた、細胞培養中で生成可能である。それらの小さなサイズ、良好な溶解度、および温度安定性によって、それらは特に生理学的に有用であり、選択および親和性成熟に適する。ラクダ科動物ＶＨ ｄＡｂは、「ナノボディ（商標）」の名称の下に、治療用途のために開発されている。本発明の結合メンバーは、実質的に本明細書で示される通りのＶＨまたはＶＬドメイン、または実質的に本明細書で示される通りのＣＤＲセットを含んでなるＶＨまたはＶＬドメインを含んでなる、ｄＡｂであってもよい。
二重特異性または二機能性抗体はモノクローナル抗体の第２世代を構成し、その中では、２つの異なる可変領域が同一分子内に組み合わされる［Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｂｏｈｌｅｎ（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．１８：４１１−４１９］。新しいエフェクター機能を動員し、または腫瘍細胞表面のいくつかの分子を標的化するそれらの能力から、それらの使用は、診断分野および治療分野の双方で実証されている。二重特異性抗体が使用される場合、これらは多様な方法で製造し得る従来の二重特異性抗体であってもよく［Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ４，４４６−４４９．１９９３］、例えば、化学的に調製され、または雑種ハイブリドーマに由来し、または上述の二重特異性抗体断片のいずれかであってもよい。これらの抗体は、化学的方法［Ｇｌｅｎｎｉｅ Ｍ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９８７ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９，２３６７−２３７５；Ｒｅｐｐ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｊ．Ｈｅｍａｔ．３７７−３８２］、または体細胞方法［Ｓｔａｅｒｚ Ｕ．Ｄ．ａｎｄ Ｂｅｖａｎ Ｍ．Ｊ．１９８６ ＰＮＡＳ ８３；Ｓｕｒｅｓｈ Ｍ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，１９８６ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：２１０−２２８］によって得られ得るが、同様に、そして好ましくは、ヘテロ二量体化を強制させ、したがって求める抗体の精製過程を促進する、遺伝子工学技術によって得られ得る［Ｍｅｒｃｈａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７−６８１］。二重特異性抗体の例としては、その中で特異性の異なる２つの抗体の結合ドメインを使用して、短い可撓性ペプチドを介して直接結合させ得る、ＢｉＴＥ（商標）技術によるものが挙げられる。これは、２つの抗体を短い単一ポリペプチド鎖上で組み合わせる。二特異性抗体およびｓｃＦｖは、可変ドメインのみを使用して、Ｆｃ領域なしで構築して、抗イディオタイプ反応の影響を潜在的に低下させ得る。
二特異性抗体は、全ＩｇＧとして、二重特異性Ｆａｂ’２として、Ｆａｂ’ＰＥＧとして、二特異性抗体として、さもなければ二重特異性ｓｃＦｖとして、構築し得る。さらに、当該技術分野で公知の通例の方法を使用して、２つの二重特異性抗体を結合させ、四価の抗体を生成し得る。
二重特異性全抗体とは対照的に、二重特異性二特異性抗体はまた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で容易に構築して発現させ得ることから、特に有用であってもよい。適切な結合特異性がある二特異性抗体（および抗体断片などの多数のその他のポリペプチド）は、ライブラリーからのファージディスプレイ（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット）を使用して、容易に選択し得る。例えば、本明細書に記載されるアミロイドβに対する特異性があるように、二特異性抗体の１つのアームが一定に保たれる場合、別のアームが変動するライブラリーを作成して、適切な特異性がある抗体を選択し得る。二重特異性全抗体は、Ｒｉｄｇｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６［Ｒｉｄｇｅｗａｙ，Ｊ．Ｂ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，９，６１６−６２１，１９９６］に記載されるような代案の設計方法によって、作成してもよい。
抗体を得るために、様々な方法が当該技術分野で利用できる。抗体は、特に、ヒト、マウス、キメラまたはヒト化起源のモノクローナル抗体であってもよく、それは当業者に良く知られている標準法に従って得られ得る。
一般に、特にマウス起源のモノクローナル抗体またはそれらの機能性断片の調製では、特にマニュアル「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」［Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．７２６，１９８８］に記載される技術、またはＫｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ［Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，１９７５］によって記載される、ハイブリドーマからの調製技術を参照することが可能である。
モノクローナル抗体は、例えばヒトＡβ１−４２によって、または例えばＡβ１７−４２などの前記モノクローナル抗体によって認識されるエピトープを含有するその断片の１つによって、免疫化された動物細胞から得られ得る。適切な断片およびそれらを構成するペプチドまたはポリペプチドは、本明細書に記載され、それらを使用して動物を免疫化して、Ａβ１−４２に対する抗体を生成してもよい。前記抗原、またはその断片の１つは、特に、通常の作業方法に従って、Ａβ１−４２またはその断片をコードするｃＤＮＡ配列中に含有される核酸配列から出発する遺伝子組換えによって、Ａβ１−４２のペプチド配列および／またはその断片に含まれるアミノ酸配列から出発するペプチド合成によって、生成し得る。
モノクローナル抗体は、例えば、その上に、ヒトＡβ１−４２が、または例えばＡβ１７−４２などの前記モノクローナル抗体によって認識されるエピトープを含有するその断片の１つが、あらかじめ固定化されている、アフィニティカラム上で精製し得る。より具体的には、モノクローナル抗体は、プロテインＡおよび／またはＧ上のクロマトグラフィーによって精製され得て、残留タンパク質汚染物質ならびにＤＮＡおよびＬＰＳの排除を目的とするイオン交換クロマトグラフィーがそれに続き、または続かず、二量体またはその他の多量体の存在に起因する可能な凝集体を排除するためのセファロースゲル上の排除クロマトグラフィーが、それにそれ自体に続き、または続かない。一実施形態では、これらの全技術を一斉に、または連続的に使用し得る。
抗原結合部位
これは、標的抗原の全部または一部と結合する相補的な分子の部分を表現する。抗体分子中では、それは抗体抗原結合部位と称され、標的抗原の全部または一部と結合する相補的な抗体の一部を含んでなる。抗原が大型である場合、抗体は抗原の特定部分のみと結合してもよく、その部分はエピトープと称される。抗体抗原結合部位は、１つまたは複数の抗体可変ドメインによって提供されてもよい。抗体抗原結合部位は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでなってもよい。
国際公開第２００６／０７２６２０号パンフレットは、免疫グロブリン領域のβ鎖間に延長する、構造（非ＣＤＲ）ループ内の抗原結合部位の改変を記載する。抗原結合部位は、例えばＶＨまたはＶＬ領域のフレームワーク領域内、または例えばＣＨ１および／またはＣＨ３などの抗体定常領域内など、ＣＤＲの自然な位置から離れた抗体分子の領域内で改変されてもよい。構造領域内の抗原結合部位の改変は、ＶＨおよびＶＬ領域のＣＤＲセットによって形成される抗原結合部位に追加的であっても、またはその代わりであってもよい。抗体分子中に複数抗原結合部位が存在する場合、それらは、同一抗原（標的抗原）と結合して、それによって結合メンバーの原子価を増大させてもよい。代案としては、複数抗原結合部位は、異なる抗原（標的抗原および１つまたは複数の別の抗原）と結合してもよく、これを使用して抗体分子にエフェクター機能を追加して、半減期を延長しまたは生体内送達を改善してもよい。
単離
これは、その中で本発明の結合メンバー、またはこのような結合メンバーをコードする核酸が、一般的に、本発明に従っている状態を指す。したがって本発明による結合メンバー、ＶＨおよび／またはＶＬ領域、およびコード核酸分子およびベクターは、例えばそれらの天然環境から単離および／または精製されて、実質的に純粋または均質形態で提供されてもよく、または核酸の場合は、必要な機能があるポリペプチドをコードする配列以外の起源の核酸または遺伝子を含まず、または実質的に含まずに提供されてもよい。単離メンバーおよび単離核酸は、天然環境内で、またはこのような調製品が生体外または生体内で実施される組換えＤＮＡ技術による場合は、その中でそれらが調製される環境（例えば細胞培養物）内で、それらと共に見られる、その他のポリペプチドまたは核酸などの、それらが天然に結合している物質を含まず、または実質的に含まないであろう。メンバーおよび核酸は、希釈剤またはアジュバントと配合され、なおも実用的目的のために単離されてもよく、例えば、免疫測定法で使用されるマイクロタイタープレートの被覆に使用される場合、常態ではメンバーはゼラチンまたはその他の担体と混合され、または診断または治療で使用される場合は、薬学的に許容可能な担体または希釈剤と混合されるであろう。結合メンバーは、自然に、あるいは異種真核生物細胞系（例えばＣＨＯまたはＮＳ０（ＥＣＡＣＣ ８５１１０５０３））細胞によって、グリコシル化されていてもよく、または（例えば原核細胞中の発現によって生成される場合）それらはグリコシル化されていなくてもよい。
抗体分子を含んでなる異成分からなる調製物もまた、本発明の一部を構成する。例えばこのような調製物は、様々な程度のグリコシル化がある、および／またはピログルタミン酸残基を生じるＮ末端グルタミン酸の環化などの誘導体化アミノ酸がある、完全長重鎖およびＣ末端リジン欠損重鎖がある、抗体の混合物であってもよい。
本明細書の用法では、「実質的に記載されるような」という語句は、本明細書に記載される結合メンバーのＶＨまたはＶＬ領域の該当するＣＤＲの特性を指し、本明細書にその配列が示される特定の領域と同一であり、または高度に類似している。１つまたは複数の可変領域の特定領域に関する「高度に類似している」という語句は、本明細書の用法では、ＣＤＲおよび／またはＶＨまたはＶＬ領域に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸置換があってもよいことが熟慮される。
上述のように、本発明による結合メンバーは、ヒトＡβ１−４２と結合する。本明細書に記載されるように、本発明の結合メンバーは、ＨＴＲＦ（商標）競合アッセイにおける親和性および／または阻害効力について、最適化されてもよい。一般に、効力最適化は、選択された結合メンバーの配列（常態では抗体の可変領域配列）を変異させて、結合メンバーライブラリーを作成し、次にそれを効力についてアッセイし、より強力な結合メンバーを選択することを伴う。したがって選択された「効力最適化」結合メンバーは、それからライブラリーが作り出された結合メンバーよりも、さらに高い効力を有する傾向がある。それでもなお、高効力結合メンバーはまた、最適化なしに得られてもよく、例えば高効力結合メンバーは、最初のスクリーニングから直接得られてもよい。アッセイおよび効力については、本明細書の他の箇所でより詳細に記載される。したがって当業者は、高い効力を有する結合メンバーを生成し得る。
さらなる態様では、本発明は、本発明による結合メンバーのライブラリーと前記抗原とを接触させるステップと、前記抗原と結合できるライブラリーの１つまたは複数の結合メンバーを選択するステップとを含む、抗原と結合できる１つまたは複数の結合メンバーを得る方法を提供する。
ライブラリーは、例えば、酵母、細菌またはバクテリオファージ（例えばＴ７）粒子、ウイルス、細胞または共有結合、リボソームまたはその他の試験管内提示システムなどの、複製可能な遺伝子パッケージなどの、粒子または分子複合体上に提示されてもよく、各粒子または分子複合体は、その上に提示される抗体ＶＨ可変領域をコードし、存在する場合は、任意選択的に、提示されるＶＬ領域もまたコードする、核酸を含有する。ファージディスプレイは、国際公開第９２／０１０４７号パンフレットと、例えば米国特許第５９６９１０８号明細書、米国特許第５５６５３３２号明細書、米国特許第５７３３７４３号明細書、米国特許第５８５８６５７号明細書、米国特許第５８７１９０７号明細書、米国特許第５８７２２１５号明細書、米国特許第５８８５７９３号明細書、米国特許第５９６２２５５号明細書、米国特許第６１４０４７１号明細書、米国特許第６１７２１９７号明細書、米国特許第６２２５４４７号明細書、米国特許第６２９１６５０号明細書、米国特許第６４９２１６０号明細書、および米国特許第６５２１４０４号明細書に記載され、これらのそれぞれは、その全体が本明細書に参考として援用される。リボソームディスプレイは、Ｈａｎｅｓ Ｊ ａｎｄ Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ Ａ．（１９９７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９７ Ｍａｙ １３；９４（１０）：４９３７−４２；国際公開第０１／７５０９７号パンフレットおよび国際公開第２００６／０７２７７３号パンフレットに記載され、これらのそれぞれは、その全体が本明細書に参考として援用される。
抗原と結合できて、バクテリオファージまたはその他のライブラリー粒子または分子複合体上に提示される結合メンバーの選択に続いて、前記選択結合メンバーを提示する、バクテリオファージまたはその他の粒子または分子複合体から、核酸を採取してもよい。このような核酸は、前記選択結合メンバーを提示する、バクテリオファージまたはその他の粒子または分子複合体から採取された核酸の配列がある核酸からの発現による、結合メンバーまたは抗体ＶＨまたはＶＬ可変領域の引き続く生成で使用されてもよい。
前記選択結合メンバーの抗体ＶＨ可変領域のアミノ酸配列がある抗体ＶＨ可変領域は、単離形態で提供されてもよく、このようなＶＨ領域を含んでなる結合メンバーについても同様である。
ヒトＡβ１−４２およびＡβ１−４０と結合する能力をさらに試験してもよく、また例えば本明細書で列挙される抗体のいずれかと（例えばＩｇＧ２またはＩｇＧ１などのｓｃＦｖ形態および／またはＩｇＧ形態の）、ヒトＡβ１−４２結合について競合する能力もさらに試験してもよい。本明細書の他の箇所でさらに考察されるように、Ａβ１−４２を中和する能力を試験してもよい。
結合メンバーは、例えば、ｓｃＦｖ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ１ＴＭまたはＩｇＧ１などの表５および６に列挙される抗体のいずれかの親和性で、またはより良い親和性で、ヒトＡβ１−４２と結合してもよい。抗体結合親和性は、表７に示される。異なる結合メンバーの結合親和性および中和効力は、適切な条件下で比較し得る。
アミノ酸配列が本明細書で示されて、Ａβ１−４２に対する結合メンバー中で用い得るものをはじめとする、本明細書に記載されるＶＨおよびＶＬ領域およびＣＤＲの変種は、配列改変または変異、および所望の特性がある抗原結合メンバーのスクリーニング法の手段で、得られ得る。所望の特性の例としては、抗原に対して特異的な既知の抗体と比較して増大した抗原への結合親和性活性；活性が、特定モル比における抗原に対する既知の抗体またはリガンドとの既知の特定の競合的能力であれば、抗原に対して特異的な既知の抗体と比較して増大した抗原活性中和；複合体を免疫沈降させる能力；例えば直鎖および／または束縛型立体配座中で、または非連続残基によって形成される立体構造エピトープ中で、スクリーニングされたペプチドを使用する、例えば本明細書に記載されるペプチド結合スキャンを使用して同定されたペプチド配列などの直鎖エピトープである、特定エピトープと結合する能力；およびヒトＡβ１−４２の新しい生物学的活性を調節する能力が挙げられるが、これに限定されるものではない。このような方法もまた、本明細書で提供される。
本明細書で開示される抗体分子の変種を生成して、本発明で使用してもよい。構造／特性−活性関係性に対する、多変量データ解析技術の施用における計算機化学の指標に従って［例えば、Ｗｏｌｄ，ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ−Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｅｄ．：Ｂ．Ｋｏｗａｌｓｋｉ）；Ｄ．Ｒｅｉｄｅｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｈｏｌｌａｎｄ，１９８４（ＩＳＢＮ ９０−２７７−１８４６−６］を参照されたい］、統計学的回帰、パターン認識および分類などの周知の数学的技術を使用して、抗体の定量的活性−特性関係性を誘導し得る［例えば、Ｎｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｐｒｉｌ １９９８）ＩＳＢＮ：０４７１１７０８２８；Ｋａｎｄｅｌ，Ａｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｒｅａｓｏｎｉｎｇ ｉｎ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ ＰＴＲ，（Ｍａｙ １１，１９９５），ＩＳＢＮ：０１３３４１８８４７；Ｋｒｚａｎｏｗｓｋｉ，Ｗｏｊｔｅｋ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｏ ２２（Ｐａｐｅｒ））．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０００），ＩＳＢＮ：０１９８５０７０８９；Ｗｉｔｔｅｎ，Ｉａｎ Ｈ．ｅｔ ａｌ Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｔｏｏｌｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｗｉｔｈ Ｊａｖａ Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ．Ｍｏｒｇａｎ Ｋａｕｆｍａｎｎ；（Ｏｃｔｏｂｅｒ １１，１９９９），ＩＳＢＮ：１５５８６０５５２５；Ｄｅｎｉｓｏｎ Ｄａｖｉｄ Ｇ．Ｔ．（Ｅｄｉｔｏｒ）ｅｔ ａｌ Ｂａｙｅｓｉａｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；（Ｊｕｌｙ ２００２），ＩＳＢＮ：０４７１４９０３６９；Ｇｈｏｓｅ，Ａｒｕｐ Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｔｏｏｌｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．ＩＳＢＮ：０−８２４７−０４８７−８を参照されたい］。抗体の特性は、抗体配列、機能および三次元構造の経験的および理論的モデル（例えば期待できる接触残基の分析または計算された物理化学的特性）から誘導され得て、これらの特性は、個々にそして組み合わせて考察し得る。
ＶＨドメインおよびＶＬドメインから構成される抗体抗原結合部位は、典型的に、軽鎖可変領域（ＶＬ）からの３つ、重鎖可変領域（ＶＨ）からの３つの６つのポリペプチドのループによって形成される。既知の原子構造の解析は、抗体の配列と抗体結合部位の三次元構造との間の関係性を解明している［Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９２）２２７，７９９−８１７；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７）２７３（４），９２７−９４８］。これらの関係性は、結合部位ループが、ＶＨドメイン中の第３の領域（ループ）を除いて、少数の主鎖立体構造の１つであるカノニカル構造を有することを暗示する。特定のループ中で成形されるカノニカル構造は、そのサイズと、ループおよびフレームワーク領域双方の中の主要部位における、特定残基の存在によって定まることが示されている。
この配列−構造関係性の研究は、配列は知られているが三次元構造は未知の抗体において、そのＣＤＲループ中で三次元構造を維持し、ひいては結合特異性を維持するのに重要な残基を予測するために使用し得る。これらの予測は、予測をリード最適化実験からの結果と比較することで、裏付け得る。構造的アプローチでは、あらゆる自由に利用できる、またはＷＡＭ［Ｗｈｉｔｅｌｅｇｇ，Ｎ．Ｒ．ｕ．およびＲｅｅｓ，Ａ．Ｒ（２０００）．Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．，１２，８１５−８２４］などの市販のパッケージを使用して、抗体分子のモデルを作成し得る［Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２３，７５５−７５８（１９８６）］。次にＩｎｓｉｇｈｔ ＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．）またはＤｅｅｐ Ｖｉｅｗ［Ｇｕｅｘ，Ｎ．ａｎｄ Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｍ．Ｃ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（１９９７）１８，２７１４−２７２３］などのタンパク質の視覚化および分析ソフトウェアパッケージを使用して、ＣＤＲ中の各位置における可能な置換を評価してもよい。次にこの情報を使用して、活性に対して、最小のまたは有益な効果を有することが期待できる、置換を行ってもよい。
ＣＤＲ、抗体ＶＨまたはＶＬドメイン、および結合メンバーのアミノ酸配列内の置換に要求される技術は、一般に当該技術分野で利用できる。変異配列は、活性に対して、最小のまたは有益な効果を有することが予測されてもされなくてもよい置換によって作成してもよく、Ａβ１−４２と結合する能力について、および／またはあらゆるその他の所望の特性について、試験される。
考察されるように、その配列が本明細書で具体的に開示される、ＶＨおよびＶＬドメインのいずれかの可変領域アミノ酸配列変異を本発明に従って用いてもよい。
上述したように、本発明の態様は、そのＶＨ領域配列が下の添付の配列表に示される、本明細書で列挙される抗体のいずれかのＶＨ領域と、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する、ＶＨ領域を含んでなり；および／またはそのＶＬ領域配列が添付の配列表に示される、表１１で列挙される抗体のいずれかのＶＬ領域と、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する、ＶＬ領域を含んでなる、抗体分子などの結合メンバーを提供する。
本発明の態様は、そのＶＨ ＣＤＲ配列が本明細書で示される、本明細書で列挙される抗体のいずれかのＶＨ ＣＤＲセットと、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨ ＣＤＲセットを有する、ＶＨ領域を含んでなり；および／またはそのＶＬ ＣＤＲ配列が本明細書で示される、本明細書で列挙される抗体のいずれかのＶＬ ＣＤＲセットと、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬ ＣＤＲセットを有する、ＶＬ領域を含んでなる、抗体分子などの結合メンバーを提供する。
２つのアミノ酸配列の％同一性を計算するのに使用し得るアルゴリズムとしては、例えばデフォルトパラメータを用いる、例えばＢＬＡＳＴ［Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０５−４１０］、ＦＡＳＴＡ［Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８］、またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム［Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７］が挙げられる。
特定の可変領域は、１つまたは複数のアミノ酸配列変異（アミノ酸残基の置換、欠失、および／または挿入）、および約１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３または２未満を含んでもよい。
変異は、１つまたは複数のフレームワーク領域および／または１つまたは複数のＣＤＲ中にあってもよい。変異は、常態では、機能喪失をもたらさないので、このように改変されたアミノ酸配列を含んでなる結合メンバーは、ヒトＡβ１−４２と結合する能力を維持してもよい。それは、例えば本明細書に記載されるアッセイによる評価で、その中で変化が起きない結合メンバーと同じ定量的結合および／または中和能力を維持してもよい。このように改変されたアミノ酸配列を含んでなる結合メンバーは、ヒトＡβ１−４２と結合する改善された能力を有してもよい。
変異は、非天然または非標準アミノ酸による１つまたは複数のアミノ酸残基の置換、１つまたは複数のアミノ酸残基の非天然または非標準形態への修飾、または１つまたは複数の非天然または非標準アミノ酸の配列中への挿入を含んでなってもよい。本発明の配列中の改変の数および位置の例は、本明細書の他の箇所に記載される。天然アミノ酸としては、それらの標準一文字コードによって、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｃ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅと識別される、２０個の「標準」Ｌアミノ酸が挙げられる。非標準アミノ酸としては、ポリペプチド主鎖に組み込まれてもよい、または既存のアミノ酸残基の改変から得られる、あらゆるその他の残基が挙げられる。非標準アミノ酸は、天然または非天然であってもよい。４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン、３−メチルヒスチジン、Ｎ−アセチルセリンなどのいくつかの天然非標準アミノ酸が、当該技術分野で公知である［Ｖｏｅｔ ＆ Ｖｏｅｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｗｉｌｅｙ）１９９５］。それらのＮ−α位置で誘導体化されたアミノ酸残は、アミノ酸配列のＮ末端のみに位置するであろう。常態では、本発明では、アミノ酸はＬアミノ酸であるが、それはＤアミノ酸であってもよい。したがって改変は、Ｌアミノ酸のＤアミノ酸への修飾、またはＤアミノ酸によるその置換を含んでなってもよい。アミノ酸のメチル化、アセチル化および／またはリン酸化形態もまた知られており、本発明のアミノ酸は、このような改変を受けてもよい。
本発明の抗体ドメインおよび結合メンバー中のアミノ酸配列は、上記の非天然または非標準アミノ酸を含んでなってもよい。非標準アミノ酸（例えばＤアミノ酸）は、合成中に、またはアミノ酸配列の合成後に、「元の」標準アミノ酸の修飾または置換によって、アミノ酸配列に組み込まれてもよい。
非標準および／または非天然アミノ酸の使用は、構造的および機能的多様性を増大させ、したがって本発明の結合メンバー中で、所望の結合および中和特性を達成する可能性を増大させ得る。さらにＤアミノ酸および類似体は、標準Ｌアミノ酸と比較して、異なる薬物動態プロファイルを有することが示されており、Ｌアミノ酸を有するポリペプチドは、例えばヒトなどの動物に投与した後に生体内分解されることから、Ｄアミノ酸がいくつかの生体内用途に有利であることが示唆される。
本発明のＣＤＲ由来配列を保有する新規ＶＨまたはＶＬ領域は、全可変領域内に変異を生じる、１つまたは複数の選択ＶＨおよび／またはＶＬ遺伝子のランダム変異誘発を使用して、作成してもよい。このような技術は、誤りがちなＰＣＲを使用した［Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０］によって記載される。いくつかの実施形態では、全可変領域またはＣＤＲセット内で、１つまたは２つのアミノ酸置換を生じさせる。
使用してもよい別の方法は、ＶＨまたはＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域で変異誘発することである。このような技術は、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．［Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１：３８０９−３８１３］、およびＳｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．［Ｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−５６７］によって開示される。
上記の全ての技術は、当該技術分野でそれ自体が知られており、当業者は、当該技術分野の日常的手順を使用して、本発明の結合メンバーを提供するために、このような技術を利用できるであろう。
本発明のさらなる態様は、本明細書で示されるＶＨ領域のアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、または挿入の手段によって、ＶＨ領域のアミノ酸配列変種であるＶＨ領域を提供するステップと、任意選択的にＶＨ領域を組み合わせ、したがって１つまたは複数のＶＬ領域を提供するステップと、ＶＨ領域またはＶＨ／ＶＬ組み合わせまたは組み合わせ群を試験して、任意選択的に１つまたは複数の所望の特性がある、Ａβ１−４２の結合メンバーまたは抗体抗原結合部位を同定するステップとを含んでなる、ヒトＡβ１−４２の抗体抗原結合部位を得る方法を提供する。前記ＶＬドメインは、実質的に本明細書で示される通りのアミノ酸配列を有してもよい。その中で、本明細書で開示されるＶＬドメインの１つまたは複数の配列変異体が、１つまたは複数のＶＨドメインと組み合わされる、類似方法を用いてもよい。
上述のように、実質的に本明細書で示される通りのＣＤＲアミノ酸配列は、ヒト抗体可変領域またはその実質的部分に、ＣＤＲとして組み込まれてもよい。実質的に本明細書で示される通りのＨＣＤＲ３配列は、本発明の実施形態に相当し、これらのそれぞれは、ヒト重鎖可変領域またはその実質的部分に、ＨＣＤＲ３として組み込まれてもよい。
本発明で用いられる可変ドメインは、あらゆる生殖細胞系または再構成型ヒト可変領域から得られ、またはそれから誘導されてもよく、または既知のヒト可変ドメインのコンセンサス配列または実際の配列に基づく、合成可変領域であってもよい。可変領域は、非ヒト抗体に由来し得る。本発明のＣＤＲ配列（例えばＣＤＲ３）は、組換えＤＮＡ技術を使用して、ＣＤＲ（例えばＣＤＲ３）を欠く可変ドメインのレパートリーに導入されてもよい。例えば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．［Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０：７７９−７８３］は、その中で、可変領域の５’末端方向のまたはそれに隣接するコンセンサスプライマーが、ヒトＶＨ遺伝子の第３のフレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーと併せて使用されて、ＣＤＲ３を欠くＶＨ可変ドメインのレパートリーを提供する、抗体可変ドメインのレパートリーを生成する方法を説明する。Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．は、このレパートリーが、特定の抗体ＣＤＲ３とどのように組み合わされてもよいかをさらに説明する。類似技術を使用して、ＣＤＲ３を欠くＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーと共に、本発明のＣＤＲ３由来配列をシャッフルし、シャッフルされた完全なＶＨまたはＶＬドメインを同族のＶＬまたはＶＨドメインと組み合わせて、本発明の結合メンバーを提供してもよい。次にレパートリーは、適切な結合メンバーが選択されてもよいように、その内容全体を参照によって本明細書に援用する国際公開第９２／０１０４７号パンフレットの、またはＫａｙ，Ｗｉｎｔｅｒ ＆ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ［Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．（１９９６）Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ］をはじめとする、引き続く膨大な量の文献のいずれかの、ファージディスプレイシステムなどの適切な宿主システム内で提示されてもよい。レパートリーは、例えば、少なくとも１０5、少なくとも１０6、少なくとも１０7、少なくとも１０8、少なくとも１０9または少なくとも１０10個以上のメンバーなどの１０4個以上の個々のメンバーからなってもよい。その他の適切な宿主システムとしては、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、Ｔ７ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、細胞ディスプレイ、リボソームディスプレイ、および共有結合ディスプレイが挙げられるが、これに限定されるものではない。
ヒトＡβ１−４２の結合メンバーを調製する方法が提供され、その方法は、
（ａ）置換されるＣＤＲ３を含みまたはＣＤＲ３コード領域を欠く、ＶＨ領域をコードする核酸の出発レパートリーを提供するステップと；
（ｂ）ＶＨ領域をコードする核酸の生成物レパートリーを提供するように、ドナー核酸がレパートリー中のＣＤＲ３領域内に挿入されるように、前記レパートリーと、例えば表１１に示されるＶＨ ＣＤＲ３などのＶＨ ＣＤＲ３について実質的に本明細書で示される通りのアミノ酸配列をコードする前記ドナー核酸とを組み合わせるステップと；
（ｃ）前記生成物レパートリーの核酸を発現するステップと；
（ｄ）ヒトＡβ１−４２の結合メンバーを選択するステップと；
（ｅ）前記結合メンバーまたはそれをコードする核酸を回収するステップと
を含んでなる。
この場合も、その中で本発明のＶＬ ＣＤＲ３と、置換されるＣＤＲ３を含みまたはＣＤＲ３をコードする領域を欠くＶＬ領域をコードする核酸のレパートリーとを組み合せる、類似方法を用いてもよい。
同様に、１つまたは複数の、または３つの全てのＣＤＲが、ＶＨまたはＶＬ領域のレパートリー中にグラフトされてもよく、次にそれをヒトＡβ１−４２の結合メンバーまたは結合メンバー群について、スクリーニングする。
例えばＨＣＤＲセットなどの、表５または表６に列挙される抗体の１つまたは複数からのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３を用いてもよく、および／または例えばＬＣＤＲセットなどの、本明細書で列挙される抗体の１つまたは複数からのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／またはＬＣＤＲ３を用いてもよい。
同様に、本明細書で開示される、その他のＶＨおよびＶＬ領域、ＣＤＲセットおよびＨＣＤＲセットおよび／またはＬＣＤＲセットを用いてもよい。
免疫グロブリン可変領域のかなりの部分は、それらの介在性フレームワーク領域と共に、少なくとも３つのＣＤＲ領域を含んでなってもよい。この部分はまた、第１のおよび第４のフレームワーク領域のどちらかまたは双方の少なくとも約５０％を含んでもよく、５０％は、第１のフレームワーク領域のＣ末端５０％、および第４のフレームワーク領域のＮ末端５０％である。可変領域のかなりの部分のＮ末端またはＣ末端の追加的な残基は、常態では、天然可変領域と結合しないものであってもよい。例えば、組換えＤＮＡ技術によって作成される本発明の結合メンバーの構築は、クローニングまたはその他の操作段階を容易にするために導入されるリンカーによってコードされる、ＮまたはＣ末端残基の導入をもたらしてもよい。その他の操作ステップとしては、抗体定常領域、その他の可変領域（例えば二特異性抗体の生成における）、または本明細書の他の箇所でより詳細に考察されるような検出可能／機能性標識をはじめとする、さらなるタンパク質配列に本発明の可変領域を連結する、リンカーの導入が挙げられる。
本発明のいくつかの態様では、結合メンバーは、１対のＶＨおよびＶＬ領域を含んでなるが、ＶＨまたはＶＬ領域配列のどちらかをベースにした単一結合領域が、さらなる本発明の態様を構成する。単一免疫グロブリン領域、特にＶＨ領域は、標的抗原と特異的様式で結合できることが知られている。例えば、上のｄＡｂの考察を参照されたい。
単一結合領域のどちらかの場合は、これらの領域を使用して、Ａβ１−４２と結合できる２領域結合メンバーを形成できる、相補的領域をスクリーニングしてもよい。これは、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、国際公開第９２／０１０４７号パンフレットで開示される通りの、いわゆる階層的な二重コンビナトリアルアプローチを使用して、ファージディスプレイスクリーニング法によって達成されてもよく、その中では、ＨまたはＬ鎖クローンのどちらかを含有する個々のコロニーを使用して、別の鎖（ＬまたはＨ）をコードするクローンの完全なライブラリーを感染させ、参考文献に記載されるものなどのファージディスプレイ技術に従って、得られた二重鎖結合メンバーを選択する。この技術はまた、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０：７７９−７８３でも開示される。
本発明の結合メンバーは、例えばヒト抗体定常領域またはその部分である、抗体定常領域またはその部分をさらに含んでなってもよい。例えばＶＬドメインは、そのＣ末端で、ヒトＣκまたはＣλ鎖をはじめとする、抗体軽鎖定常領域に付着してもよい。同様に、ＶＨドメインベースの結合メンバーは、そのＣ末端で、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＭ、そしてアイソタイプサブクラスのいずれかであり、特にＩｇＧ２、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ４である、あらゆる抗体アイソタイプに由来する、免疫グロブリン重鎖の全部または一部（例えばＣＨ１ドメイン）に付着してもよい。ＩｇＧ２は、そのエフェクター機能の欠如のために、いくつかの実施形態において有利であってもよい。別の実施形態では、ＩｇＧ１は、そのエフェクター機能と製造の容易さのために有利であってもよい。これらの特性を有して可変領域を安定化する、あらゆる合成またはその他の定常領域変種もまた、本発明で有用であってもよい。
結合メンバーは、検出可能なまたは機能性標識で標識されてもよい。したがって結合メンバーまたは抗体分子は、検出可能なおよび／または数量化できるシグナルが得られるように、免疫複合体の形態で存在し得る。免疫複合体は、検出可能なまたは機能性標識と共役する、本発明の抗体分子を含んでなってもよい。本明細書で言及されるような検出可能な標識は、蛍光物質、化学発光物質（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）、着色標識（例えばラテックス［青］またはコロイド金［赤］）、放射性標識、酵素、光増感剤、および磁性標識をはじめとするが、これに限定されるものではない、シグナルを生じる、または生じるように誘導し得る、あらゆる標識であってもよい。したがって、例えば毛細血管孔表面などの表面に結合する標識の量は、蛍光またはルミネセンス、色、放射能、酵素活性、吸光度または磁界変化を検出することで、検出および／または測定されてもよい。検出可能な標識は、従来の化学反応を使用して、結合メンバーに付着させてもよい。好ましくは、検出可能な標識は、例えばデジタル式カメラまたは平床式スキャナを用いた、光学的照合によって検出可能な標識である。光学的照合によって検出され得る標識としては、蛍光物質、化学発光物質、および着色標識が挙げられる。それによって、光学的検出のためのシグナルが生じ得る機序としては、光吸収、光散乱、光回析、光反射、蛍光またはルミネセンスが挙げられる（が、必ずしもこれに限定されるものではない）。
限定を意図しない、適切な標識の例としては、
− アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（「Ｇ６ＰＤＨ」）、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、および例えば西洋ワサビペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼなどの酵素；
− 染料；
− フルオレセインおよびその誘導体、蛍光色素、ローダミン化合物および誘導体、ＧＦＰ（ＧＦＰは「緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を指す）、ダンシル、ウンベリフェロン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、およびフルオレスカミンなどの蛍光性標識または蛍光物質；例えばユウロピウム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ａｎｄ Ｃｉｓ Ｂｉｏｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）などのランタニドクリプテートおよびキレートなどのフルオロフォア；
− イソルミノール、ルミノール、およびジオキセタンなどの化学発光標識または化学発光物質；
− ルシフェラーゼおよびルシフェリンなどの生物ルミネセンス標識；
− 増感剤；
− 補酵素；
− 酵素基質；
− 臭素77、炭素14、コバルト57、フッ素8、ガリウム67、ガリウム68、水素3（トリチウム）、インジウム111、インジウム113m、ヨウ素123m、ヨウ素125、ヨウ素126、ヨウ素131、ヨウ素133、水銀107、水銀203、亜リン酸32、レニウム99m、レニウム101、レニウム105、ルテニウム95、ルテニウム97、ルテニウム103、ルテニウム105、スカンジウム47、セレン75、イオウ35、テクネチウム99、テクネチウム99m、テルル121m、テルル122m、テルル125m、ツリウム165、ツリウム167、ツリウム168、イットリウム199、および本明細書で言及されるその他の放射性標識をはじめとするが、これに限定されるものではない放射性標識；
− 染料、触媒またはその他の検出可能な基で、さらに標識されてもよい、ラテックスまたは炭素粒子などの粒子；金属ゾル；微結晶；リポソーム；細胞など；
− ビオチン、ジゴキシゲニンまたは５−ブロモデオキシウリジンなどの分子；
− 例えば、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌体外毒素（ＰＥまたはその細胞毒性断片また変異体）、ジフテリア毒素またはその細胞毒性断片または変異体、ボツリヌス毒素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥまたはＦ、リシンまたは例えばリシンＡなどのその細胞毒性断片、アブリンまたはその細胞毒性断片、サポリンまたはその細胞毒性断片、アメリカヤマゴボウ抗ウイルス毒素またはその細胞毒性断片、およびブリオジン１またはその細胞毒性断片の群から選択される、毒素部分などの毒素部分
が挙げられる。
適切な酵素および補酵素の例は、米国特許第４２７５１４９号明細書、および米国特許第４３１８９８０号明細書で開示される。適切な蛍光物質および化学発光物質もまた、米国特許第４２７５１４９号明細書で開示される。標識としては、例えば標識アビジンまたはストレプトアビジンなどの、特異的同族検出可能部分への結合を通じて検出されてもよい、ビオチンなどの化学的部分がさらに挙げられる。検出可能な標識は、当該技術分野で公知の従来の化学反応を使用して、本発明の抗体に付着させてもよい。
免疫複合体またはそれらの機能性断片は、当業者に知られている方法によって調製し得る。それらは、酵素または蛍光性標識と直接、またはグルタルアルデヒドのようなポリアルデヒド、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）などのスペーサー基または連結基を介して、または治療用複合体について上述したものなどのカップリング剤の存在下で、共役し得る。フルオレセインタイプの標識を含有する複合体は、イソチオシアネートとの反応によって調製し得る。
直接に、または上述のＥＤＴＡ、ＤＴＰＡなどのキレート化剤を通じて、抗体を治療用放射性同位体に共役させる、当該技術分野で公知の方法もまた、診断で使用し得る放射性元素のために使用してもよい。同様に、クロラミンＴ法［Ｈｕｎｔｅｒ Ｗ．Ｍ．ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ Ｆ．Ｃ．（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ １９４：４９５］によってナトリウム125で標識し、さもなければ米国特許第４４２４２００号明細書の技術によってテクネチウム99mで標識し、または米国特許第４４７９９３０号明細書に記載されるように、ＤＴＰＡを介して付着させることもまた可能である。
それによって標識が、例えば、目視検査、電磁放射、加熱、および化学試薬などの外的手段によって、検出可能なシグナルを生じ得る数多くの方法がある。標識はまた、本発明の抗体と結合する別の結合メンバーと、または担体と、結合し得る。
標識はシグナルを直接生じ得て、したがってシグナルを生じるために追加的な成分を必要としない。例えば蛍光物質などの数多くの有機分子は、紫外線および可視光を吸収でき、光吸収がこれらの分子にエネルギーを移動して、それらを励起エネルギー状態に上昇させる。次にこの吸収されたエネルギーは、第２の波長における発光によって消散される。この第２の波長放出はまた、標識受容体分子にエネルギーを移動してもよく、結果として、例えば蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）などの発光によって、受容体分子からエネルギーが消散する。シグナルを直接生じるその他の標識としては、放射性同位体および染料が挙げられる。
代案としては、標識は、シグナルを生じるためにその他の成分を必要としてもよく、シグナル生成システムは、基質、補酵素、増強剤、追加的酵素、酵素産物と反応する物質、触媒、活性化剤、補助因子、阻害剤、スカベンジャー、金属イオン、およびシグナル物質の結合生成に必要な特異的結合物質をはじめとする、測定可能なシグナルを生じるのに必要な全ての成分を含む。適切なシグナル生成システムの詳細な考察は、米国特許第５１８５２４３号明細書にある。
本発明の一態様は、本明細書で提供される結合メンバーのヒトＡβ１−４２への結合を引き起こし、または可能にするステップを含んでなる方法を提供する。言及されたように、このような結合は、例えば結合メンバー、または結合メンバーをコードする核酸の投与に続いて、生体内で起きてもよく、またはそれは例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、免疫細胞化学、免疫沈降法、アフィニティクロマトグラフィー、および生化学的または細胞ベースのアッセイなどのように、試験管内で起きてもよい。
本発明は、例えばバイオセンサー装置内で、本発明による結合メンバーを用いて、例えば血漿またはＣＳＦ中で、抗原レベルを直接測定する方法もまた提供する。例えば、ヒトＡβ１−４２への結合を検出および／または測定する方法は、（ｉ）前記結合メンバーをＡβ１−４２に曝露するステップと、（ｉｉ）前記結合メンバーのＡβ１−４２への結合を検出するステップとを含んでなってもよく、結合は、本明細書に記載されるあらゆる方法または検出可能な標識を使用して、検出される。Ａβ１−４２は、単量体またはオリゴマーＡβ１−４２であってもよく、好ましくは単量体Ａβ１−４２である。これと、本明細書に記載されるあらゆるその他の結合検出法は、例えば検出可能な標識を視覚的に観察することで、方法の実施者によって直接解釈されてもよい。代案としては、この方法、または本明細書に記載されるあらゆるその他の結合検出法は、オートラジオグラフ、写真、コンピュータ印刷出力、フローサイトメトリー報告、グラフ、チャート、結果を含有する試験管または容器またはウェル、または方法の結果のあらゆるその他の視覚的または物理的描写の形態の報告を生じてもよい。
Ａβ１−４２に対する結合メンバーの結合量を判定してもよい。定量化は、診断の関心対象であってもよい、試験サンプル中の抗原の量に関してもよい。Ａβ１−４２結合のスクリーニングおよび／またはその定量化は、例えば、本明細書で言及される疾患または障害、および／または異常なＡβ１−４２レベルおよび／または活性に伴うあらゆるその他の疾患または障害について、患者をスクリーニングするのに有用であってもよい。
診断方法は、（ｉ）例えば、本明細書で言及される病状または疾患が疑われるまたは有すると考えられる患者などの対象から、組織または液状サンプル得るステップと；（ｉｉ）前記組織または液状サンプルを１つまたは複数の本発明の結合メンバーに曝露させるステップと；（ｉｉｉ）対照サンプルと比較して、結合したＡβ１−４２を検出するステップとを含んでなってもよく、対照と比較して増大したＡβ１−４２の結合量は、異常なＡβ１−４２レベルを示唆してもよい。試験される組織または液状サンプルとしては、血液、血清、血漿、ＣＳＦ、尿、生検材料、腫瘍、または異常なＡβ１−４２レベルを含有することが疑われるあらゆる組織が挙げられる。異常なＡβ１−４２レベルまたは活性について陽性と試験された対象はまた、本明細書の後方で開示される治療法から利益を受けてもよい。
当業者は、本明細書で開示される方法に照らして、彼らの好みと一般知識によって、結合メンバーの抗原への結合を判定する適切な様式を選択できる。
サンプル中の結合メンバーの反応性は、あらゆる適切な手段によって判定してもよい。放射免疫測定法（ＲＩＡ）が、１つの可能性である。放射性標識抗原を未標識抗原（試験サンプル）と混合して、結合メンバーを結合させる。結合抗原を非結合抗原から物理的に分離して、結合メンバーと結合した放射性抗原の量を判定する。試験サンプル中の抗原の量が多いほど、より少ない放射性抗原が結合メンバーと結合する。レポーター分子と結合した抗原または類似体を使用する、非放射性抗原による競合的結合アッセイもまた使用してもよい。レポーター分子は、分光的に単離される吸光または発光特性がある、蛍光色素、リン光体またはレーザー染料であってもよい。適切な蛍光色素としては、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリンおよびＴｅｘａｓ Ｒｅｄ、およびランタニドキレートまたはクリプテートが挙げられる。適切な発色性染料としては、ジアミノベンジジンが挙げられる。
その他のレポーターとしては、視覚的に観察され、電子的に検出され、または別の様式で記録される、検出可能なシグナルを直接または間接的に生じ得る、着色された磁性または常磁性のラテックスビーズなどの高分子のコロイド粒子または微粒子物質と、生物学的または化学的活性薬剤とが挙げられる。これらの分子は、例えば、色を生じまたは変化させ、または電気的特性の変化を引き起こす反応を触媒する酵素であってもよい。これらは、エネルギー状態間の電子遷移が、特徴的なスペクトル吸収または放出をもたらすように、分子的に励起可能であってもよい。これらとしては、バイオセンサーと併せて使用される化学実体が挙げられる。ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンおよびアルカリホスファターゼ検出システムを用いてもよい。
個々の結合メンバー・レポーター複合体によって生じるシグナルを使用して、（標準および試験）サンプル中で結合する、該当する結合メンバーの数量化できる絶対的または相対的データを誘導してもよい。
本明細書に記載される結合メンバーを含んでなるキットもまた、本発明の態様として提供される。キット中では、例えば下でさらに詳しく説明するように、結合メンバーを標識して、サンプル中のその反応性を判定できるようにしてもよい。さらに結合メンバーは、固体担体に付着していてもまたはしていなくてもよい。キットの構成要素は、一般に無菌であり、バイアルまたはその他の容器内に密封される。キットは、結合メンバーがそれに対して有用な診断分析またはその他の方法で用いてもよい。キットは、上述の方法で使用してもよい。キットは、例えば、本発明による方法などの方法における、構成要素の使用説明書を含有してもよい。このような方法の実施を助けまたは可能にする補助的材料を、本発明のキットに含めてもよい。補助的材料としては、第１の結合メンバーと結合して検出可能な標識（例えば、蛍光標識、放射性同位体または酵素）と共役する、第２の異なる結合メンバーが挙げられる。抗体ベースのキットは、免疫沈降法を実施するためのビーズもまた含んでなってもよい。キットの各構成要素は、一般にそれ自身の適切な容器内にある。したがってこれらのキットは、一般に、各結合メンバーに適した別個の容器を含んでなる。さらにキットは、アッセイを実施して、アッセイ実施から得られるデータを解釈して分析する方法のための使用説明書を含んでなってもよい。
本発明は、競合アッセイ中で抗原レベルを測定するための上記のような結合メンバーの使用、すなわち競合アッセイ中で、本発明によって提供されるような結合メンバーを用いて、サンプル中の抗原レベルを測定する方法もまた提供する。これは、結合抗原の非結合抗原からの物理的な分離が必要ない場合であってもよい。結合に物理的または光学的変化が起きるように、レポーター分子と結合メンバーを結合することは、１つの可能性である。レポーター分子は、数量化できてもよい検出可能なシグナルを、直接または間接的に生じてもよい。レポーター分子の結合は、直接的または間接的、例えばペプチド結合を介した共有結合的、または非共有結合的であってもよい。ペプチド結合を介した結合は、抗体およびレポーター分子をコードする遺伝子融合の組換え発現の結果であってもよい。
結合メンバー間の競合は、試験管内で容易に、例えば、ＥＬＩＳＡを使用してアッセイされ、および／または１つの結合メンバーを特異的レポーター分子で標識付けして、それが１つまたは複数のその他の非標識結合メンバーの存在下で検出され得て、同一エピトープまたは重複エピトープと結合する結合メンバーを同定できるようにするものなどの生化学的競合アッセイによって、アッセイされてもよい。このような方法は、当業者に容易に理解され、本明細書でより詳細に記載される。
本発明は、例えば表５および６に列挙される抗体のいずれかなどの本明細書で定義されるあらゆる結合メンバーと、ヒトＡβ１−４２に対する結合について競合する、例えば、ＩｇＧ２、ＩｇＧ１またはＩｇＧ１三重変異（「ＴＭ」；Ｏｇａｎｅｓｙａｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６４（Ｐｔ ６）：７００−４）形態にある結合メンバーにまで及ぶ。結合メンバー間の競合は、例えば、１つの結合メンバーを特異的レポーター分子で標識付けして、それがその他の非標識結合メンバーの存在下で検出され得て、同一エピトープまたは重複エピトープと結合する結合メンバーを同定できるようにすることで、試験管内で容易にアッセイされてもよい。競合は、例えばＥＬＩＳＡを使用して判定してもよく、その中では、Ａβ１−４２をプレートに固定化し、１つまたは複数のその他の非タグ付けまたは非標識結合メンバーと共に、第１のタグ付けまたは標識結合メンバーをプレートに添加する。標識結合メンバーと競合する非標識結合メンバーの存在は、標識結合メンバーによって放出されるシグナルの低下によって観察される。
競合アッセイはまた、エピトープマッピングで使用し得る。一例では、エピトープマッピングを使用して、任意選択的に最適化された中和および／または調節特性を有してもよい結合メンバーが結合する、エピトープを同定してもよい。このようなエピトープは、直鎖または立体構造であり得る。立体構造エピトープは、Ａβの少なくとも２つの異なる断片を含んでなり得て、Ａβペプチドがその三次または四次構造に折り畳まれて、Ａβ結合メンバーなどのＡβ阻害剤によって認識される立体構造エピトープを形成する場合、前記断片は互いに近接して配置される。競合に関する試験では、特に対象エピトープを含みまたはそれから本質的になるペプチドである、抗原のペプチド断片を用いてもよい。どちらかの末端に、エピトープ配列と１つまたは複数のアミノ酸とを有するペプチドを使用してもよい。本発明による結合メンバーは、抗原に対するそれらの結合が、所与の配列がありまたはそれを含む、ペプチドによって阻害されるようであってもよい。
さらなる態様では、本発明は、本発明による結合メンバー、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域をコードする配列を含んでなる単離核酸を提供し、前記結合メンバー、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域の生成をもたらす条件下で前記核酸を発現するステップと、それを回収するステップとを含んでなる、本発明の結合メンバー、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域を調製する方法を提供する。コード核酸配列の例は、表および添付の配列表に記載される。本発明による核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでなってもよく、完全にまたは部分的に合成であってもよい。本明細書で示されるヌクレオチド配列への言及は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、指定される配列があるＤＮＡ分子を包含し、その中でＵがＴを置換する指定される配列があるＲＮＡ分子を包含する。
本発明は、例えば調節因子と作動可能に連結する、上記のような少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでなる、プラスミドまたはファージベクター、転写または発現カセットなどのプラスミド、ベクターの形態のコンストラクトもまた提供する。
さらなる態様は、本発明の核酸および／またはベクターを含有する、またはそれによって形質転換された、宿主細胞を提供する。本発明は、上記のような１つまたは複数のコンストラクトを含んでなる、組換え宿主細胞系もまた提供する。例えば、提供されるようなｓｃＦｖまたはＩｇＧ（例えばＩｇＧ２、ＩｇＧ１またはＩｇＧ１ＴＭ）などの、あらゆるＣＤＲまたはＣＤＲセットまたはＶＨ領域またはＶＬ領域または抗体抗原結合部位または抗体分子をコードする核酸配列は、コードされた生成物を生成する方法と共に、本発明の態様を構成し、その方法は、そのコード核酸配列から生成物を発現させるステップを含んでなる。発現は、好都合には、適切な条件下で、核酸を含有する組換え宿主細胞を培養することで、達成されてもよい。発現による生成に続いて、ＶＨまたはＶＬ領域、または結合メンバーをあらゆる適切な技術を使用して単離および／または精製し、次に必要に応じて使用してもよい。
したがって本発明の別の態様は、コード核酸配列からの発現を引き起こすステップを含む、抗体ＶＨ可変領域を生成する方法である。このような方法は、前記抗体ＶＨ可変領域を生成する条件下で、宿主細胞を培養するステップを含んでなってもよい。
ＶＨおよび／またはＶＬ領域を含んでなるＶＬ可変領域および結合メンバーを生成する類似方法が、本発明のさらなる態様として提供される。
生成する方法は、生成物を単離および／または精製するステップを含んでなってもよい。生成する方法は、生成物を、薬学的に許容可能な賦形剤などの少なくとも１つの追加的な成分を含む組成物に調合するステップを含んでなってもよい。
多様な異なる宿主細胞中でクローニングして、ポリペプチドを発現するシステムは、周知である。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳類細胞、植物細胞、糸状菌、酵母およびバキュロウイルスシステム、および遺伝子組換え植物および動物が挙げられる。原核生物細胞中の抗体および抗体断片の発現は、当該技術分野で確立されている。レビューについては、例えばＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ［Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５４５−５５１（１９９１）］を参照されたい。一般的な細菌宿主は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
当業者は、結合メンバーを生成するオプションとして、培養中の真核生物細胞中における発現もまた利用できる［Ｃｈａｄｄ ＨＥ ａｎｄ Ｃｈａｍｏｗ ＳＭ（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：１８８−１９４；Ａｎｄｅｒｓｅｎ ＤＣ ａｎｄ Ｋｒｕｍｍｅｎ Ｌ（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：１１７；Ｌａｒｒｉｃｋ ＪＷ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ ＤＷ（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：４１１−４１８］。
異種ポリペプチドの発現のために、当該技術分野で利用できる哺乳類細胞系としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、幼若ハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウス黒色腫細胞、ＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞、ヒト胚性腎臓細胞、ヒト胚性網膜細胞、およびその他多数が挙げられる。
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、増強剤配列、マーカー遺伝子、およびその他の配列をはじめとする、適切な制御配列を含有する適切なベクターを、必要に応じて選択または構築し得る。ベクターは、必要に応じて、例えばファージミドなどのプラスミド、またはファージなどのウイルスであってもよい［Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ］。例えば、核酸コンストラクトの調製、変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡ挿入、および遺伝子発現、そしてタンパク質分析における、核酸操作のための多くの既知の技術およびプロトコルは、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．［Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ １９９９］で詳述される。
本発明のさらなる態様は、本明細書で開示される通りの核酸を含有する宿主細胞を提供する。このような宿主細胞は、試験管内にあってもよく、培養中にあってもよい。このような宿主細胞は、生体内にあってもよい。生体内の宿主細胞の存在は、「細胞内抗体」または細胞内部抗体としての、本発明の結合メンバーの細胞内発現を可能にしてもよい。細胞内抗体は、遺伝子治療のために使用してもよい。
別の態様は、本発明の核酸を宿主細胞に導入するステップを含んでなる方法を提供する。導入は、あらゆる利用できる技術を用いてもよい。真核生物細胞では、適切な技術としては、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔、リポソーム媒介形質移入、および例えばワクシニアなどのレトロウイルスまたはその他のウイルスを使用する、または昆虫細胞ではバキュロウイルスを使用する、形質導入が挙げられる。特に真核細胞である宿主細胞内への核酸の導入では、ウイルスまたはプラスミドベースのシステムを使用してもよい。プラスミドシステムは、エピソームに保持されてもよく、または宿主細胞に、または人工染色体に組み込まれてもよい。組み込みは、単一または複数遺伝子座における、１つまたは複数のコピーの無作為または標的組み込みであってもよい。細菌細胞では、適切な技術としては、塩化カルシウム形質転換、電気穿孔、およびバクテリオファージを使用する形質移入が挙げられる。
導入には、例えば遺伝子が発現する条件下で宿主細胞を培養することで、核酸からの発現を引き起こしまたは可能にすることが続いてもよい。発現生成物の精製は、当業者に知られている方法によって達成されもよい。
本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば染色体）に組み込まれてもよい。組み込みは、標準的な技術に従って、ゲノムとの組換えを促進する配列の包含によって促進されてもよい。
本発明は、上記のような結合メンバーまたはポリペプチドを発現するために、発現系において上述のようなコンストラクトを使用するステップを含んでなる方法もまた提供する。
本発明による結合メンバーは、結合メンバーを患者に投与するステップを含んでなる、人体または動物体における（例えばヒト患者における）、疾患または障害の（予防的治療を含んでもよい）治療で使用してもよい。本発明による治療可能な病状は、本明細書の他の箇所に記載され、予防的治療、および病状またはその症状の１つまたは複数の重症度の低下、または発症リスクの遅延または低下が挙げられる。
したがって本発明は、上の障害のいずれかの少なくとも１つの症状の重症度が低下するように、本発明の１つまたは複数の結合メンバーの有効量を単独で、または当該技術分野で公知のまたは本明細書に記載される別の適切な薬剤との併用治療計画で、それを必要とする患者に投与するステップを含んでなる、本明細書で言及される病状のいずれかの少なくとも１つの症状を治療し、または重症度を低下させる方法を提供する。
「有効用量」という用語は、既に疾患に罹患している患者において、疾患およびその合併症を治癒させ、または少なくとも部分的に阻止するのに十分な量と定義される。
本発明は、特に、例えばアミロイド形成疾患を予防または治療するための、患者において有益な治療反応（例えばＣＳＦ中のＡβ１−４２低下、プラーク負荷低下、プラーク形成阻害、神経突起ジストロフィー低減、認知機能改善、および／または認知低下の回復、低減または予防）を生じる条件下で、本発明の治療用抗体を患者に投与することによる、患者におけるアルツハイマー病およびその他のアミロイド形成疾患の治療を対象とする。
本明細書の用法では、「治療」は、疾患、病状、その症状、またはそれに対する素因を治癒させ、回復させ、軽減し、緩和し、変化させ、矯正し、向上させ、改善し、またはそれに影響を及ぼす目的での、アミロイドーシスに伴う疾患または病状があり；またはアミロイドーシスに伴うこのような疾患または病状の症状またはそれに対する素因がある患者への治療薬の適用または投与と定義される。
本発明は、患者の脳内のＡβのアミロイド沈着に伴う疾患を、予防または治療する方法を提供する。このような疾患としては、アルツハイマー病、ダウン症候群、および認知機能障害が挙げられる。認知機能障害は、その他のアミロイド形成疾患の特徴の有無にかかわらず起こり得る。本発明は、Ａβと関係がある病状である、黄斑変性を治療する方法を提供する。本発明の方法は、患者に、１−４２ ＡβおよびそのＮ末端切断型に特異的に結合する抗体の有効用量を投与するステップを伴ってもよい。このような方法は、ヒト患者においてアルツハイマー病を予防または治療するのに、特に有用である。
本発明の抗体は、神経病理、患者によってはアルツハイマー病に伴う認知機能障害を予防または改善するための治療計画で、使用してもよい。
治療の対象となる患者としては、症状を示す患者が挙げられ、疾患のリスクがあるが症状を示していない個体もまた挙げられる。個体が十分に長期間生存すれば、誰でも潜在的にアルツハイマー病のリスクがある。本発明の抗体は、対象患者のいかなるリスクアセスメントもなしに、対象に予防的に投与し得る。治療の対象となる患者としては、例えばこの疾患がある血縁関係を有する個体、およびそのリスクが遺伝子または生化学的マーカーの解析によって判定された個体などのアルツハイマー病の既知の遺伝的リスクを有する個体が挙げられる。アルツハイマー病に対する素因の遺伝子マーカーとしては、ＡＰＰ遺伝子の変異、特にそれぞれＨａｒｄｙおよびＳｗｅｄｉｓｈ変異と称される、７１７位、および６７０と６７１位における変異が挙げられる。その他のリスクマーカーは、プレセニリン遺伝子変異ＰＳ１およびＰＳ２、およびＡｐｏＥ４、ＡＤの家族歴、高コレステロール血症またはアテローム性動脈硬化である。アルツハイマー病を患っている個体は、疾患に伴う特徴的な認知症によって、ならびに上述の危険因子の存在によって、診断され得る。個体におけるアルツハイマー病の同定を助ける、いくつかの診断試験が利用できる。これらとしては、ＣＳＦτおよびＡβ１−４２レベルの測定が挙げられるτレベルの上昇およびＡβ１−４２レベルの減少は、ＡＤの存在を示すこともある。アルツハイマー病を患っている個体はまた、ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡまたはＤＳＭ−ＩＶ−ＴＲ基準によっても診断し得る。
無症候性患者では、治療は、あらゆる年齢（例えば、１０、２０、３０歳）で開始し得る。一般に、治療は、例えば患者が４０代、５０代、６０代または７０代に達した時点などの生涯のより後の時点で開始される。治療は、患者の残存寿命の期間であってもよい一定時間にわたる、複数回投与を伴ってもよい。反復投与に対する必要性は、経時的な抗体レベル測定によってモニターし得る。
予防法では、アルツハイマー病に罹患しやすく、またはそうでなければそのリスクがある患者に、生化学的障害、組織学的障害、認知機能障害および／または疾患の行動上の症状、その合併症、および疾患進行中に提示される中間病理学的表現型をはじめとする、疾患のリスクを排除しまたは低下させ、重症度を軽減し、または発端を遅延させるのに十分な量で、医薬組成物または薬剤が投与される。治療用途では、このような疾患が疑われまたは既に罹患している患者に、その合併症、および疾患進行中に提示される中間病理学的表現型をはじめとする、疾患の（生化学的、組織学的、認知機能障害および／または行動上の）症状を治癒させ、または少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で、組成物または薬剤が投与される。
本発明は、本発明の１つまたは複数の結合メンバーの有効量を単独で、または当該技術分野で公知のまたは本明細書に記載される別の適切な薬剤との併用治療計画で、それを必要とする個体に投与するステップを含んでなる、個体を治療する方法を提供する。治療法は、それを必要とする患者に、本明細書に記載される結合メンバーの有効量を投与するステップを含んでなってもよく、Ａβ１−４２レベルが、血漿および／またはＣＳＦ中で低下する。
治療法は、（ｉ）本明細書で言及されるようなアミロイドーシスに伴う病状を有する患者を同定するステップと、（ｉｉ）本明細書に記載される結合メンバーの有効量を患者に投与するステップとを含んでなってもよく、Ａβ１−４２のレベルは、血漿中および／またはＣＳＦ中で低下し、アミロイドーシスが軽減される。有効量は、治療される特定の疾患または障害の少なくとも１つの症状の重症度を低下させまたは軽減するように、Ａβ１−４２のレベルを低下させる量であるが、必ずしも疾患または障害を治癒させない量である。
本発明は、前記Ａβ１−４２の少なくとも１つの効果と拮抗させるように、本発明の１つまたは複数の結合メンバーの有効量と接触させ、またはそれを投与するステップを含んでなる、Ａβ１−４２の少なくとも１つの効果と拮抗させる方法もまた提供する。
したがって本発明のさらなる態様は、提供される結合メンバーを投与するステップ含んでなる治療法と、このような結合メンバーを含んでなる医薬組成物と、例えば結合メンバーを薬学的に許容可能な賦形剤と共に調合するステップを含んでなる、薬剤または医薬組成物を製造する方法における、投与するための薬剤の製造における、このような結合メンバーの使用とを提供する。薬学的に許容可能な賦形剤は、二次反応を誘発することなく医薬組成物に入り、例えば結合メンバーの投与を容易にして、その寿命および／またはその体内効能を増大させ、溶液中のその溶解度を増大させ、さもなければその保存を改善する、化合物または化合物の組み合わせであってもよい。これらの薬学的に許容可能なビヒクルは周知であり、選択される活性化合物の性質と投与様式に応じて、当業者によって適応されるであろう。
本明細書に記載されるような結合メンバーは、通常は、結合メンバーに加えて少なくとも１つの成分を含んでなってもよい、医薬組成物の形態で投与されるであろう。したがって本発明によって利用するための本発明による医薬組成物は、結合メンバーに加えて、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝液、安定剤または当業者に良く知られているその他の材料を含んでなってもよい。このような材料は無毒であるべきで、活性成分の有効性に干渉してはならない。担体またはその他の材料の正確な性質は、投与経路に左右されるであろう。
例えば静脈内または皮下注射などの注射用製剤では、活性成分は、発熱性物質を含まず、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する、非経口的に許容可能な水溶液の形態であろう。本明細書に記載されるような本発明の結合メンバーは、分子の物理化学的特性と送達経路に応じて、液体、半固体または固体形態で調合されてもよい。配合物は、例えば、糖類、アミノ酸、および界面活性剤などの賦形剤、または賦形剤の組み合わせを含んでもよい。液体配合物は、広範囲に及ぶ抗体濃度とｐＨを含んでもよい。固体配合物は、例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥、または超臨界流体技術による乾燥によって製造されてもよい。治療薬は、注射によって投与されてもよい（例えば皮下または静脈内。治療薬は、パルス点滴によって、特に結合メンバーの用量を漸減させて、投与してもよい。投与経路は、治療薬の物理化学的特性によって、疾患に特別の配慮をして、または効能最適化または副作用最小化の要求事項によって、決定し得る。特定の一投与経路は、静脈内である。本発明の医薬組成物の別の投与経路は、皮下である。無針装置を使用する皮下注射もまた、有利である。
組成物は、治療される病状に応じて、単独で、またはその他の治療と組み合わせて、同時または逐次のいずれかで、投与してもよい。
結合メンバーは、追加的な医療用成分と共に、併用療法の一部として使用してもよい。特に結合メンバーと、１つまたは複数のその他の治療薬との組み合わせである、組み合わせ治療法を使用して、顕著な相乗効果を提供してもよい。結合メンバーは、本明細書で列挙される１つまたは複数の病状の治療のために、同時または順次に、または別の治療薬または治療薬群との併用製剤として、投与してもよい。
結合メンバーおよび上記追加的な医療用成分の１つまたは複数は、薬剤の製造で使用してもよい。薬剤は、個体に別々にまたは組み合わせて投与されてもよく、それに応じて、結合メンバーおよび追加的な成分を、併用製剤として、または別の調製物として含んでなってもよい。別の調製物を使用して、別々のおよび逐次または同時投与を容易にし、例えば経口および非経口投与などの異なる経路による、成分の投与を可能にしてもよい。
提供される組成物は、哺乳類に投与してもよい。投与は、常態では「治療有効量」であり、これは患者に便益を示すのに十分である。このような便益は、少なくとも１つの症状の少なくとも改善であってもよい。実際の投与量、および投与の速度と経時変化は、治療されるものの性質および重症度、治療される特定の哺乳類、個々の患者の臨床病状、障害の原因、組成物の送達部位、結合メンバーのタイプ、投与法、投与計画、および医学的施術者に知られているその他の要因に左右されるであろう。治療の処方、例えば用量などの決定は、一般開業医、およびその他の医者の任務の範囲内であり、治療される疾患の症状の重症度および／または進行に左右されてもよい。本発明の結合メンバーの治療有効量または適切用量は、動物モデルにおいて、生体外活性と生体内活性を比較することで判定され得る。試験動物における有効投与量をヒトに外挿する方法が知られている。正確な用量は、抗体が診断用、予防または治療用であるかどうか、治療領域の大きさと位置、抗体の正確な性質（例えば全抗体、断片または二特異性抗体）、抗体に付着するあらゆる検出可能な標識またはその他の分子の性質をはじめとする、いくつかの要素に左右される。全身的用途では、典型的な抗体使用量は、１００μｇ〜１ｇの範囲であろう。最初のより高い初回負荷量と、それに続く１つまたは複数のより低い用量を投与してもよい。典型的に、抗体は、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ１−ＴＭアイソタイプなどの全抗体であろう。治療は、医師の自由裁量で毎日、週２回、毎週または毎月間隔で繰り返してもよい。治療法は、皮下投与では２〜４週間毎、静脈内投与では４〜８週間毎であってもよい。治療は周期的であってもよく、投与間隔は、例えば、約３週間以上、約４週間以上、または約１ヶ月毎など、約２週間以上である。
本発明の様々なさらなる態様および実施形態は、当業者には本開示を考慮すれば明らかであろう。
本明細書で言及される、データベース参照および受入番号、特許、特許出願および公開をはじめとする全ての文献は、あらゆる目的のために、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。
本明細書で使用される「および／または」は、他方の有無にかかわらず、２つの指定された特徴または成分のそれぞれの特定の開示と見なされるべきである。例えば「Ａおよび／またはＢ」は、あたかもそれぞれが本明細書で個々に示されるように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、および（ｉｉｉ）ＡおよびＢ、それぞれの特定の開示と見なされる。
文脈が別途指示しない限り、上で示される特徴の説明および定義は、本発明のいかなる特定の実施形態または態様にも限定されず、記載される全ての態様および実施形態に等しく適用される。
一例として、特定の本発明の態様および実施形態を添付の図および表を参照して、ここで例証する。
以下の配列が、ＮＣＩＭＢ，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２１ ９ＹＡ．Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫに寄託された：
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞Ａｂｅｔ０００７＝ＮＣＩＭＢ ４１８８９
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ＝ＮＣＩＭＢ ４１８９０
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬ＝ＮＣＩＭＢ ４１８９１
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞Ａｂｅｔ０３７７−ＧＬ＝ＮＣＩＭＢ ４１８９２
寄託日＝２０１１年１１月２日
実施例１．抗アミロイドβ１−４２特異的抗体生成およびリード選択
１．１ アミロイドβペプチドの調合
ビオチン化ヒトアミロイドβ１−４２ペプチド（ｒＰｅｐｔｉｄｅ，ＵＳＡ；カタログ番号Ａ１１１７またはＢａｃｈｅｍ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；カタログ番号Ｈ−５６４２）を１％水酸化アンモニウム溶液（ｖ／ｖ）中で１ｍｇ／ｍｌに再懸濁して、必要になるまで、アリコートで−８０℃で保存した。未標識ヒトアミロイドβ１−４２ペプチド（Ａｎａｓｐｅｃ，ＵＳＡ；カタログ番号６４１２９）、未標識ヒトアミロイドβ１−４０ペプチド（ｒＰｅｐｔｉｄｅ，ＵＳＡ；カタログ番号Ａ１１５５）、ビオチン化ヒトアミロイドβ１−４０ペプチド（ｒＰｅｐｔｉｄｅ，ＵＳＡ；カタログ番号Ａ１１１またはＢａｃｈｅｍ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；カタログ番号Ｈ−５９１４）、ビオチン化マウスアミロイドβ１−４２ペプチド（Ａｎａｓｐｅｃ，ＵＳＡ；カタログ番号６１７１８−０１）、およびビオチン化マウスアミロイドβ１−４０ペプチド（Ａｎａｓｐｅｃ，ＵＳＡ；カタログ番号６１７１７）についても、同一手順に従った。
１．２ 選択
繊維状ファージＭ１３ベースのファージミドベクターにクローン化されたＦａｂ３１０−λファージディスプレイライブラリー（Ｄｙａｘ，ＵＳＡ）を、選択のために使用した（Ｈｏｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００５）。基本的に、以前記載されているようにして、合成ヒトビオチン化アミロイドβ１−４２（ｒＰｅｐｔｉｄｅ，ＵＳＡ）上で一連の選択サイクルを使用して、ファージディスプレイライブラリーから抗アミロイドβ１−４２特異的Ｆａｂ抗体を単離した（Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。手短に述べると、溶液相選択の第１ラウンドでは、１００倍過剰の未標識ヒトアミロイドβ１−４０ペプチド（Ａｎａｓｐｅｃ，ＵＳＡ）を含有するＭａｒｖｅｌ−ＰＢＳ（３％ｗ／ｖ）中で１時間プレインキュベートした精製ファージ粒子に、ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４）中のビオチン化アミロイドβ１−４２を添加した。ストレプトアビジン共役常磁性ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ）を使用して、ビオチン化アミロイドβ１−４２ペプチドと結合したファージ粒子を捕捉し、ＰＢＳ−ツイーン（０．１％ｖ／ｖ）を使用した一連の洗浄サイクルによって、弱く結合したファージを除去した。ビーズから結合ファージ粒子を溶出し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１細菌に感染させて、次の選択ラウンドでレスキューした（Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。前述の通りであるが、ビオチン化アミロイドβ１−４２抗原の濃度を低下させて、引き続く２回の選択ラウンドを実施した。
１．３ 未精製Ｆａｂ断片上の直接結合アッセイを使用したアミロイドβ１−４２特異的クローンの同定
可溶性一本鎖Ｆａｂ断片（ｓＦａｂ）を生成するために、標準切断およびライゲーション技術を使用して、Ｆａｂ３１０−λディスプレイカセットから遺伝子ＩＩＩテザーを除去した。簡単に述べると、標準ＤＮＡ精製キット（ＱＩＡｇｅｎ，ＵＫ）を使用して、ラウンド３の結果からファージミドベクターを単離し、ＭｌｕＩ制限消化を使用して、ベクターから遺伝子ＩＩＩテザー配列を除去した（Ｈｏｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００５）。再ライゲートしたベクターをＴＧ１細胞に形質転換して戻し、分析のために個々のコロニーを選択した。
ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＵＳＡ）を使用して、均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ（商標）、ＣｉｓＢｉｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，フランス）結合アッセイ中で、ペリプラズム調製物からの未精製ｓＦａｂをスクリーニングした。このアッセイでは、ストレプトアビジンクリプテートおよび抗６ｈｉｓ−ＸＬ６６５検出試薬（ＣｉｓＢｉｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，フランス；それぞれカタログ番号６１０ＳＡＫＬＢおよび６１ＨＩＳＸＬＢ）を使用して、ヒスチジン標識ｓＦａｂとビオチン化ペプチド間の蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の測定によって、未精製ｓＦａｂとヒトアミロイドβ１−４２ペプチドの結合を評価した。選択結果は、５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７．４と、０．５ｍＭのＥＤＴＡと、０．５Ｍのスクロースとの中で調製されたｓＦａｂを含有する未精製細菌ペリプラズム抽出物として、スクリーニングした。１０μＬの未精製ｓＦａｂサンプルをＣｏｓｔａｒ（登録商標）３８４ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ；カタログ番号３６７６）に添加した。５μｌの２０ｎＭ合成ヒトアミロイドβ１−４２、および５μｌの６ｎＭストレプトアビジンクリプテートと２０ｎＭ抗ｈｉｓ−ＸＬ６６５との混合溶液の添加が、それに続いた。非特異的結合ウェル（陰性対照）は、試験ｓＦａｂサンプルの代わりに陰性対照未精製ｓＦａｂを使用して、各プレートについて規定された。ヒトアミロイドβ１−４０ペプチドの同時アッセイを使用して、ｓＦａｂクローンの交差反応性を同定した。全ての希釈は、０．４ＭのＫＦ（ＢＤＨ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵＳＡ；カタログ番号１０３４４４Ｔ）、０．１％の脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ；カタログ番号Ａ６００３）、および０．１％のツイーン２０（ｖ／ｖ）（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ；カタログ番号Ｐ２２８７）（アッセイ緩衝液）を含有する５０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ；カタログ番号Ｍ９３８１）中で実施した。３２０ｎｍの励起波長、および６２０ｎｍおよび６６５ｎｍにおける測定（１００回のフラッシュ）を使用して、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＵＳＡ）上で時間分解蛍光を読み取る前に、アッセイプレートを室温で４時間インキュベートした。
各サンプルについて％ΔＦ値を計算することで、データを解析した。％ΔＦは、式１に従って求めた。
Figure 0006343615
１．４ 精製ｓＦａｂ断片の直接結合アッセイ
ＨＴＲＦ（商標）アッセイでヒトアミロイドβ１−４２ペプチドに対する特異的結合を示した未精製ｓＦａｂぺリプラズム抽出物に、ＤＮＡ配列決定を実施した（Ｏｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。（基本的に、（Ｂａｎｎｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）に記載されるようにして）独自のタンパク質配列があるｓＦａｂを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させ、アフィニティクロマトグラフィーによって精製した。各精製ｓＦａｂのアミロイドβ結合プロファイルは、セクション１．３に記載されるＨＴＲＦ（商標）アッセイ中で、未精製ｓＦａｂペリプラズム調製物を精製ｓＦａｂで置き換えて、精製ｓＦａｂの希釈系列を試験することで判定された。精製ｓＦａｂは、ビオチン化ヒトアミロイドβ１−４２ペプチド、ビオチン化マウスアミロイドβ１−４２ペプチド、およびビオチン化ヒトアミロイドβ１−４０ペプチドへの結合について、同時に試験した。さらにｓＦａｂは、あらゆる非特異的ペプチド結合について調節するために、別のＨＴＲＦ（商標）実験で、スクランブルされたヒトアミロイドβ１−４２ペプチド（Ａｎａｓｐｅｃ、カスタム合成）に対する結合について試験した。セクション１．３に記載されるように％ΔＦ値を計算することで、データを解析した。
精製Ａｂｅｔ０００７ ｓＦａｂに関する例証的結果は、図１に示される。これらの結果は、Ａｂｅｔ０００７が、ヒトアミロイドβ１−４０ペプチドおよびスクランブルされたヒトアミロイドβ１−４２ペプチドよりも、ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドに特異的に結合することを実証する。さらにＡｂｅｔ０００７ ｓＦａｂは、マウスアミロイドβ１−４２ペプチドと交差反応性である。
１．５ アミロイドβ１−４２特異的抗体ＦａｂのＩｇＧ２形態への再構成
ヒト抗体重鎖および軽鎖全体をそれぞれ発現するベクターに、可変重鎖（ＶH）および可変軽鎖（ＶL）領域をサブクローニングすることで、１３個のアミロイドβ１−４２特異的クローンをＦａｂからＩｇＧ２に変換した。Ｄｙａｘ ＦＡＢ３１０ライブラリーＶH領域は半合成であり、本明細書に記載される哺乳類細胞内では十分な量を発現できなかったので、サブクローニング前に、ＶH領域を社内でコドン最適化した。哺乳類細胞内で完全長ヒトＩｇＧとして良好に発現することが分かっている、社内で生殖細胞系適合させたＶHをテンプレートとして使用して、元のアミノ酸配列を保ちながら、Ｄｙａｘ ＶＨ領域のＤＮＡコドン使用頻度を変化させた。ヒト重鎖定常領域および調節因子を含有する哺乳類発現ベクター（ｐＥＵ９．２）に、コドン最適化可変重鎖をクローン化して、哺乳類細胞内でＩｇＧ２重鎖全体を発現させた。同様に、ヒトλ軽鎖定常領域および調節因子の発現のための哺乳類発現ベクター（ｐＥＵ４．４）に、可変軽鎖領域をクローン化して、哺乳類細胞内でＩｇＧ軽鎖全体を発現させた。重鎖および軽鎖の発現のためのベクターは、最初にＰｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．（Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９７）に記載された。ＩｇＧ２としてクローンを得るために、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＫ；カタログ番号Ｒ６２０−０７）またはＣＥＰ６−ＣＨＯ（社内で生成された）哺乳類細胞内に、重鎖および軽鎖ＩｇＧ発現ベクターを一過性に形質移入して、抗体を発現させて培地内に分泌させた。収集した培地は、精製前に濾過した。プロテインＡクロマトグラフィー（Ｂｉｏｓｅｐｒａ（商標）、Ｐａｌｌ，ＵＳＡ；またはＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）を使用して、ＩｇＧを精製した。５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、２５０ｍＭのＮａＣｌ中で前もって平衡化した適切なプロテインＡカラムに、培養上清を装填した。０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０を使用して、結合ＩｇＧをカラムから溶出し、溶出液を１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ１０．０）の添加によって中和した。ＮＡＰ−１０緩衝液交換カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ；カタログ番号１７−０８５４−０２）を使用して、ＩｇＧをダルベッコのＰＢＳで緩衝液交換した。精製ＩｇＧを０．２マイクロメートルフィルターに通過させ、ＩｇＧのアミノ酸配列に基づく吸光係数を使用して、２８０ｎｍにおける吸光度によってＩｇＧの濃度を判定した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ技術を使用して、精製ＩｇＧを凝集または分解について分析した。
１．６ アミロイドβペプチド競合ＨＴＲＦ（商標）アッセイにおけるリード抗体の特異性判定
上述したように、アミロイドβ１−４２ペプチドに特異的に結合する精製ｓＦａｂ断片を組換えＩｇＧに変換した。その他のヒトアミロイドβペプチドとの結合に対するこれらのＩｇＧの特異性を試験するために、競合アッセイを開発した。このアッセイでは、リードＩｇＧおよびビオチン化ヒトアミロイドβペプチド１−４２（ｒＰｅｐｔｉｄｅ，ＵＳＡ；カタログ番号Ａ１１１７）と共に、未標識ヒトアミロイドβペプチド１−４２（ｒＰｅｐｔｉｄｅ，ＵＳＡ；カタログ番号Ａ１１６５）、１−４０（ｒＰｅｐｔｉｄｅ，ＵＳＡ；カタログ番号Ａ１１５５）、１１−４２（ｒＰｅｐｔｉｄｅ，ＵＳＡ；カタログ番号Ａ１０６３）、１７−４２（ｒＰｅｐｔｉｄｅ，ＵＳＡ；カタログ番号Ａ１０５８）、および１−４３（Ａｎａｓｐｅｃ，ＵＳＡ；カタログ番号２５３５６）をインキュベートした。簡単に述べると、各試験ペプチドの希釈系列と、０．３ｎＭの試験ＩｇＧおよび５ｎＭのビオチン化ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドとを合わせた。ストレプトアビジンクリプテート（ＣｉｓＢｉｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，フランス；カタログ番号６１０ＳＡＫＬＢ）および抗ヒトＦｃ ＩｇＧ ＸＬ６６５（ＣｉｓＢｉｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，フランス；カタログ番号６１ＨＦＣＸＬＢ）検出試薬を使用して、ＩｇＧとビオチン化１−４２アミロイドβ間の蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を測定することで、ビオチン化１−４２ペプチドへのリードＩｇＧ結合の損失を検出することで、各ペプチドの競合を評価した。
５０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ；カタログ番号Ｍ９３８１）、０．４ＭのＫＦ（ＢＤＨ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵＳＡ；カタログ番号１０３４４４Ｔ）、０．１％の脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ；カタログ番号Ａ６００３）、および０．１％のツイーン２０（ｖ／ｖ）（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ；カタログ番号Ｐ２２８７）を含有するアッセイ緩衝液中で、ストレプトアビジンクリプテートおよび抗ヒトＦｃ ＩｇＧ ＸＬ６６５をそれぞれ７ｎＭおよび５ｎＭで合わせた。５μｌのこの溶液をアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）３８４ウェル黒色浅型ウェル、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号３６７６）に添加した。アミロイドβペプチドは、Ｇｒｅｉｎｅｒ ９６ウェルＵ底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＢｉｏＯｎｅ，ドイツ；カタログ番号６５０２０１）を使用して、アッセイ緩衝液中で連続希釈した。ＭｉｎｉＴｒａｋ（商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＵＳＡ）液体取り扱いロボットを使用して、５μｌの各ペプチド希釈液を二連でアッセイプレートに移した。試験ＩｇＧをアッセイ緩衝液中で１．２ｎＭに希釈して、５μｌをアッセイプレートに添加した。アッセイ緩衝液中で、ビオチン化ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドの２０ｎＭ溶液を調製し、５μｌのこの溶液をアッセイプレートに添加した。非特異的結合ウェル（陰性対照）は、試験ＩｇＧを５μｌのアッセイ緩衝液で置き換えることで、各プレートについて規定された。ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＵＳＡ）を使用して、６２０ｎｍおよび６６５ｎｍの放射波長で時間分解蛍光を読み取る前に、アッセイプレートを室温で４時間インキュベートした。
各サンプルについて％ΔＦ値を計算することで、データを解析した。％ΔＦは、式１に従って求めた。引き続いて％ΔＦ値を使用し、式２に記載されるようにして％特異的結合を計算した。
Figure 0006343615
Ａｂｅｔ０００７ ＩｇＧに関する例証的結果は、図２に示される。これらの結果は、Ａｂｅｔ０００７ ＩｇＧがヒトアミロイドβ１−４２ペプチドと結合するが、ヒトアミロイドβ１−４０ペプチドとは結合しないことを実証する。この抗体はまた、トランケート型ペプチド１１−４２および１７−４２と、そしてヒトアミロイドβ１−４３ペプチドとも結合する。
１．７ 表面プラズモン共鳴を使用したヒトアミロイドβ１−４２に対するリード抗体の結合親和性の判定
ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ−１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）バイオセンサー装置を使用して、各リード抗体と、合成的に生成されたヒトアミロイドβ１−４２ペプチドとの間の相互作用の動態学パラメータを評価した。これらの実験は、基本的に、Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）に記載されるようにして実施した。
バイオセンサーは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学効果を使用して、バイオセンサーチップのデキストラン層上に固定化されたリガンド分子の表面を流れる検体分子の相互作用に起因する、表面濃度の変化を試験する。典型的に、規定濃度の検体化学種を結合リガンド上に通過させ、あらゆる結合は、局所性ＳＰＲシグナルの増大（結合期）として検出される。これに緩衝液フロー期が続き、その間に、表面固定化リガンドからの検体化学種の分離が、シグナル低下として観察され得る（分離期）。次にチップ結合リガンドから残留検体を剥離し得て、いくつかの異なる検体濃度で手順が繰り返される。実験は、実験全体にわたり、結合リガンドの絶対結合能または動態プロファイルのいずれもが顕著に変化せず、実験全体を通じて用いられる一連の対照を使用してモニターし得るようにデザインされる。ＥＤＴＡ（ＨＢＳ−ＥＰ＋、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）を含有する独自仕様のＨＥＰＥＳ緩衝食塩水が、検体サンプルのための希釈緩衝液として、および分離期におけるフロー緩衝液として典型的に使用される。実験データは、ＳＰＲシグナルに直接対応する任意の単位である「共鳴単位」（ＲＵ）として、経時的に記録される。ＲＵは、検体結合質量の近似測定値である、チップ表面上の屈折率変化に正比例する。次に独自仕様のＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアパッケージを使用してデータを処理し、結合モデルをデータセットに適合させ得る。戻り結合（ｋａ、Ｍ-1ｓ-1）および分離（ｋｄ、ｓ-1）速度定数は、分離（ＫD、Ｍ）親和定数の計算を可能にする。
アミン結合によって、抗体が独自仕様のＣＭ５チップ表面とおよそ２，０００ＲＵの最終表面密度で共有結合するアッセイを使用して、各試験ＩｇＧとヒトアミロイドβ１−４２ペプチドとの間の結合親和性を推定した。１０ｍＭのグリシン、ｐＨ２．０の単回４０秒間注入によって、抗体結合リガンドを除去し、サイクルとサイクルの間にチップ表面を再生した。再生は、ペプチド結合活性の顕著な損失をもたらさなかった。
信頼度をもって適切な結合モデルと適合させ得るセンサーグラムの観察に十分な時間にわたり、合成ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドの一連の希釈液（１．６〜１００ｎＭ）を抗体表面に順次通過させた。空試験参照フローセルデータを各ＩｇＧデータセットから減算し、ゼロ濃度緩衝液空試験を主要データセットから二重参照減算して、あらゆる緩衝液アーチファクトまたは非特異的結合効果の影響を軽減した。次にＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、各検体滴定からのデータに、適切な結合モデルを同時に適合させた。
２ＲＵ2未満を許容値として、計算されたカイ二乗値を使用して、データの妥当性を評価した。２ＲＵ未満の偏差を許容可能として、残差を使用して、適合の全体的な成功を推定した。
Ａｂｅｔ０００７ ＩｇＧ２に関する例証的結果は、図３に示される。平均結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、および解離定数（ＫD）は、それぞれ１．６×１０5Ｍ-1ｓ-1、７．４×１０-2ｓ-1、および４７３ｎＭである。これらのパラメータは、データへの１：１ラングミュア適合から誘導された。
１．８ ヒト血漿からのアミロイドβペプチド枯渇によるリード抗体の機能特性評価
血漿枯渇アッセイでリード抗体を試験して、ヒト血漿からヒトアミロイドβ１−４２ペプチドを免疫沈降させる、それらの能力を調べた。このアッセイを使用して、各抗体の機能的効力の証拠を提供した。簡単に述べると、ヒト血漿サンプルを各試験ＩｇＧと共に３時間インキュベートし、その後、抗体およびあらゆる結合リガンドを除去した。免疫沈降法の前後に、標準的な技術を使用してヒト血漿サンプルのアミロイドβ１−４２ペプチド含有量をアッセイし、これらの値を使用して抗体の効力を判定した。血漿サンプルはまた、アミロイドβ１−４０ペプチドのあらゆる枯渇についてもアッセイし、リード抗体の特異性を評価した。
製造会社の使用説明書に従って、各試験抗体をＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０カルボン酸磁性ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ；カタログ番号１４３−０５Ｄ）と、別々に共有結合させた。各試験ＩｇＧ毎に、１００μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓを、磁石を使用して１００μｌの２５ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ；カタログ番号Ｍ５２８７）で２回洗浄し、懸濁液からビーズを分離した。使用直前に、ＥＤＣ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ；カタログ番号２２９８１）を、冷２５ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５に、５０ｍｇ／ｍｌの最終濃度で溶解した。ＮＨＳ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号２４５００）の５０ｍｇ／ｍｌ溶液を２５ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５内で同様に調製した。５．５０μｌのＮＨＳ溶液および５０μｌのＥＤＣ溶液を添加してＤｙｎａｂｅａｄｓを洗浄し、それを良く混合して、室温で３０分間、緩慢に傾斜回転させてインキュベートした。磁石を使用してビーズをペレット化し、上清を除去した。１００μｌの２５ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５で、ビーズを２回洗浄した。総容積１００μｌの２５ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５の中で、各試験ＩｇＧを０．６ｍｇ／ｍｌに希釈した。洗浄したビーズをリガンド溶液に再懸濁して、室温で少なくとも３０分間、緩慢に傾斜回転させてインキュベートした。引き続いて、磁石を使用してビーズをペレット化し、１００μｌの５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）で１回洗浄した。次にビーズを１００μｌのＭａｒｖｅｌ−ＰＢＳ（３％ｗ／ｖ）に再懸濁して、４℃で一晩インキュベートした。ダルベッコのＰＢＳ（１００μｌ）でビーズを２回洗浄し、ＰＢＳ（１００μｌ）に再懸濁した。
スウェーデン国セーデルテリエのＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｌｉｎｉｃにおいて、匿名ドナーからＥＤＴＡ血漿サンプルを単離した。各ドナーからおよそ１００ｍｌの血液を採取して、これを２本の５０ｍｌ試験管に貯留した。ＥＤＴＡを５ｍＭの最終濃度に添加して、凝固を防止し、試験管を４℃、４，０００×ｇで、１０分間遠心沈殿させた。上清（血漿）を収集して１ｍｌ試験管内で等分し、必要になるまで−８０℃で保存した。下述するように、アミロイドβ１−４２ペプチドおよびアミロイドβ１−４０ペプチド含量の双方について、サンプルをアッセイした。
ＥＤＴＡ血漿の１ｍｌアリコートと共に、各抗体セット被覆ビーズを別々に、４℃で３時間、緩慢に傾斜回転させてインキュベートし、次に磁石を使用してビーズをペレット化した。上清を注意深くビーズから除去して、下述するように、アミロイドβ１−４２ペプチドおよびアミロイドβ１−４０ペプチドの双方についてアッセイした。
製造会社の使用説明書に従って、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＵＫ；カタログ番号ＫＨＢ３４８２）からのＡβ４０ヒトＥＬＩＳＡキットを使用して、血漿サンプルのアミロイドβ１−４０ペプチド含有量の分析を実施した。簡単に述べると、ヒトアミロイドβ１−４０標準物質を使用して、１ｎｇ／ｍｌ〜７．８１ｐｇ／ｍｌの希釈系列を作成した。５０ｍｌの希釈剤あたり１個のプロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｒｏｃｈｅ，ＵＫ；カタログ番号１１６９７４９８００１）を含有する、標準希釈緩衝液を使用して、希釈液を作成した。次に、アミロイドβペプチドのＮ末端に対して特異的な独自仕様のモノクローナル抗体でプレコートされた異なるマイクロタイターウェルに、５０μｌの各希釈液を添加した。ＥＤＴＡ血漿サンプルを４℃および２，０００×ｇで１０分間遠心分離して、５０μｌの各サンプル上清を標準物質と同じマイクロタイタープレートの別のウェルに添加した。次に、アミロイドβ１−４０ペプチドのＣ末端を特異的に認識する、５０μｌの独自仕様のＨｕ Ａβ検出抗体を各マイクロタイターウェルに添加した。プレートをプレートシールで覆って、室温で振盪しながら３時間インキュベートした。４００μｌの洗浄緩衝液でプレートを４回洗浄して、各洗浄中にプレートを１５〜３０秒間浸漬した。次にプレートを反転させ、軽く叩いて乾燥した。１００μｌの独自仕様の抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ抱合体を各ウェルに添加して、プレートをプレートシールで覆い、サンプルを室温で３０分間インキュベートした。再度、４００μｌの洗浄緩衝液でプレートを４回洗浄して、各洗浄中にプレートを１５〜３０秒間浸漬した。次にプレートを反転させ、軽く叩いて乾燥した。１００μｌの独自仕様の安定化色素原を各ウェルに添加して、プレートを室温で２０分間、暗所でインキュベートした。各ウェルへの１００μｌの独自仕様の停止液の添加が、それに続いた。停止液添加の２時間以内に、各ウェルの吸光度を４５０ｎｍで読み取った。標準曲線をヒトアミロイドβ１−４０希釈系列から作成し、これを使用して、試験ＥＤＴＡ血漿サンプル中のヒトアミロイドβ１−４０の濃度を判定した。
基本的に、製造会社の使用説明書に従って、Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｂｅｌｇｉｕｍ；カタログ番号８０１７７）からのＩＮＮＯＴＥＳＴ（登録商標）β−アミロイド(1-42)キットを使用して、血漿サンプルのアミロイドβ１−４２ペプチド含有量の分析を実施した。簡単に述べると、ヒトアミロイドβ１−４２標準物質を使用して、１ｎｇ／ｍｌ〜７．８１ｐｇ／ｍｌの希釈系列を作成した。次に、ヒトアミロイドβペプチドのＣ末端に対して特異的な独自仕様のモノクローナル抗体でプレコートされた異なるマイクロタイターウェルに、１００μｌの各希釈液を添加した。ＥＤＴＡ血漿サンプルを４℃および２，０００×ｇで１０分間遠心分離して、１００μｌの各サンプル上清を標準物質と同じマイクロタイタープレートの別のウェルに添加した。プレートをプレートシールで覆って、室温で振盪しながら３時間インキュベートした。４００μｌの洗浄緩衝液でプレートを５回洗浄し、次に反転させて、軽く叩いて乾燥させた。アミロイドβペプチドのＮ末端を認識する１００μｌの独自仕様の抱合体１（Ｃ１ＨＳ）を各ウェルに添加した。プレートをプレートシールで覆って、サンプルを室温で１時間インキュベートした。再度、４００μｌの洗浄緩衝液でプレートを５回洗浄し、次に反転させて、軽く叩いて乾燥させた。次にビオチン化Ｃ１ＨＳ抗体と結合するストレプトアビジン−ＨＲＰ抱合体である、１００μｌの抱合体２（Ｃ２）を各ウェルに添加した。プレートをプレートシールで覆って、室温で３０分間インキュベートした。４００μｌの洗浄緩衝液でプレートを５回洗浄し、次に反転させて、軽く叩いて乾燥させた。１００μｌの独自仕様の基質溶液を各ウェルに添加して、プレートを室温で３０分間インキュベートし、次に１００μｌの停止液を各ウェルに添加した。停止液添加の１５時間以内に、各ウェルの吸光度を４５０ｎｍで読み取った。標準曲線をヒトアミロイドβ１−４２希釈系列から生成し、これを使用して、試験ＥＤＴＡ血漿サンプル中のヒトアミロイドβ１−４２の濃度を判定した。
一実験では、Ａｂｅｔ０００７ ＩｇＧ２抗体は、血漿中のヒトアミロイドβ１−４２ペプチドのレベルを８０．４７ｐｇ・ｍｌ−１から６０．５６ｐｇ・ｍｌ−１に低下させた（２５％の低下）。第２の実験では、レベルは、１９７．４３ｐｇ・ｍｌ−１から１５４．４５ｐｇ・ｍｌ−１に低下した（２２％の低下）。
１．９ 試験管内免疫組織化学を使用した天然アミロイドβに対する親和性が低いリードクローンの識別
アミロイドβペプチドの天然形態に対する親和性が低いリードクローンを同定する目的で、アミロイドβと結合するそれらの能力について、リード抗体を試験した。簡単に述べると、ヒトアルツハイマー病脳切片およびＴｇ２５７６マウス脳切片上で、リード抗体をスクリーニングして、試験管内で天然アミロイドと結合する抗アミロイドβ１−４２抗体を同定した。
Ｔｇ２５７６マウスは、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の遺伝子を過剰発現する遺伝子組換えマウスである。この遺伝子は、γセクレターゼ切断部位に２つの点変異（Ｌｙｓ６７０ＡｓｎおよびＭｅｔ６７１Ｌｅｕ）を保有し、それはおよそ９ヶ月齢に始まって、マウス皮質および海馬内にアミロイドβプラークの形成をもたらす。
ヒト脳組織は、重度のアルツハイマー病がある２人の個人（それぞれＡｐｏＥ遺伝子型３／３、Ｂｒａａｋ段階６；およびＡｐｏＥ遺伝子型４／３、Ｂｒａａｋ段階５）の正面皮質（下前頭回）から単離した。対照として、対応する組織を１人の非認知症個人（ＡｐｏＥ遺伝子型３／３、Ｂｒａａｋ段階１）から単離した。３種の全ての組織は、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋ（ＮＢＢ）によって提供された。使用前にヘマトキシリン／エオジン染色によって、切片の質を確認した。マウス脳組織は、１５ヶ月（２匹）、１８ヶ月（６匹）、および２２ヶ月（２匹）齢のＴｇ２５７６マウスから単離した。
最初にパラフィン支持マトリックスを除去することで、幅４〜６μｍのパラフィン包埋脳切片を免疫組織化学的検査のために調製した。切片をキシレン（５分間×２）、無水エタノール（３分間×２）、９５％エタノール（３分間×２）、７０％エタノール（３分間×２）、９０％ギ酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ；カタログ番号０６４４０；１０分間）、水道水（２０分間×３）、およびＰＢＳ（５分間×２）で洗浄した。次に切片を電子レンジ内のＤｉｖａ Ｄｅｃｌｏａｋｅｒ溶液（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ，ＵＳＡ；カタログ番号ＤＶ２００４Ｇ１）中で、１００℃で２０分間煮沸した。引き続いてサンプルを水浴内で４０℃に冷却し、次に蒸留水（５分間）およびＰＢＳ（５分間×３）で洗浄した。
リードＩｇＧ２抗体は、２、５、および２０μｇ・ｍｌ-1濃度で試験した。４００倍希釈のウサギ抗ヒト二次抗体（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ；カタログ番号Ａ０４８２）と、それに続くＯｍｎｉＭａｐ抗ウサギＨＲＰ抱合体抗体（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ；カタログ番号７６０−４３１１）とを使用して、これらのＩｇＧの結合を検出した。ＣｈｒｏｍｏＭａｐ ＤＡＢキット（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ；カタログ番号７６０−１５９）を使用して、シグナルを検出した。これらの染色ステップは、標準プロトコルに従って、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ自動スライド調製システム（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を使用して実施した。
２０〜４０倍の光学的倍率下で、少なくとも２人の異なる人々によって、盲検化様式で染色のスコア付けを実施した。試験管内プラーク結合は、０（プラーク染色なし）から最大で４（プラークの強い染色）の尺度を使用して示された。
Ａｂｅｔ０００７ ＩｇＧ２は、ヒトアルツハイマー病脳またはマウスＴｇ２５７６脳のいずれにおいても、プラークの染色を示さなかった（スコア＝０）。対照的に、陽性対照抗体は、同一条件下において、隣接する切片上で４のスコアを生じた。典型的な画像は、図４に提示される。
実施例２．相補性決定領域３（ＣＤＲ３）の定方向突然変異を通じたＡｂｅｔ０００７の抗体最適化
２．１ Ａｂｅｔ０００７親クローンのｓｃＦｖ形態への変換
親和性最適化のための調製において、親クローンをＩｇＧ２形態から一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）形態に変換した。それらのそれぞれのＩｇＧベクターから、コドン最適化可変重鎖（ＶH）および可変軽鎖（ＶL）領域を別々に増幅し、特異的クローニング部位および可撓性リンカー領域を付加した。次に再コンビナトリアルＰＣＲを実施して、完全なｓｃＦｖコンストラクトを生成し、基本的に、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）に記載されるようにして、それをｐＣａｎｔａｂ１０．５ファージミドベクターにクローン化した。ｐＣａｎｔａｂ１０．５ベクターは、ｐＣａｎｔａｂ６ベクターの修正バージョンであり、それは追加的な制限酵素認識部位を含有して、標準Ｈｉｓおよびｍｙｃタグ以外のタグの付加を容易にする。
２．２ 標的変異誘発によるＡｂｅｔ０００７の最適化
親和性ベースのファージディスプレイ選択による標的変異誘発アプローチを使用して、ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドに対する改善された親和性のために、リード抗体（Ａｂｅｔ０００７）を最適化した。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎ（（２００４）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）によって記載されるような標準分子生物学的技術を使用して、可変重鎖（ＶH）および可変軽鎖（ＶL）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）のオリゴヌクレオチド指定変異誘発によって、Ａｂｅｔ０００７に由来する大型ｓｃＦｖ−ファージライブラリーを作成した。
ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドに対するより高い親和性がある変種を濃縮するために、親和性ベースのファージディスプレイ選択をライブラリーに対して実施した。選択は、基本的に、以前記載されるようにして実施した（Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。手短に述べると、溶液中でビオチン化ヒトアミロイドβ１−４２ペプチド（ｒＰｅｐｔｉｄｅ，ＵＳＡ；カタログ番号Ａ１１１７）と共に、ｓｃＦｖファージ粒子をインキュベートした。次に、製造会社の推奨に従って、抗原と結合するＳｃＦｖ−ファージをストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ２８０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＫ）上に捕捉した。次に選択されたｓｃＦｖ−ファージ粒子を以前記載されたようにして（Ｏｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）レスキューし、低下するビオチン化ヒトアミロイドβ１−４２抗原濃度（３ラウンドにわたる２００ｎＭから２ｎＭ）の存在下で、選択過程を繰り返した。
２．３ 直接結合アッセイを使用した改良クローンの識別
セクション２．２．に記載される標的変異誘発アプローチからの選択ラウンド２および３から、１７６０個のｓｃＦｖを無作為に選択した。基本的に、セクション１．３に記載されるように、直接結合アッセイを使用して、これらのクローンをスクリーニングした。簡単に述べると、ビオチン化ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドの結合増大について、ペリプラズム調製物からの未精製ｓｃＦｖを試験して、ストレプトアビジンクリプテートおよび抗６ｈｉｓ−ＸＬ６６５検出試薬と共に、ＨＴＲＦ（商標）技術を使用して検出した。
０．５ｍＭのＥＤＴＡおよび０．５Ｍのスクロースを含む５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７．４中で、ペリプラズム調製物から未精製ｓｃＦｖを調製して、その後、Ｇｒｅｉｎｅｒ ３８４ウェルＶ底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＢｉｏＯｎｅ，ドイツ；カタログ番号７８１２８０）を使用して、５０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ；カタログ番号Ｍ９３８１）、０．４Ｍのフッ化カリウム（ＢＤＨ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵＳＡ；カタログ番号１０３４４４Ｔ）、０．１％の脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ；カタログ番号Ａ６００３）、および０．１％のツイーン２０（ｖ／ｖ）（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ；カタログ番号Ｐ２２８７）を含有するアッセイ緩衝液中で１％に希釈した。ＭｉｎｉＴｒａｋ（商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＵＳＡ）液体取り扱いロボットを使用して、５μｌの希釈ｓｃＦｖサンプルをアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）３８４ウェル黒色浅型ウェル、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号３６７６）に移した。次に、５μｌのアッセイ緩衝液を各ウェルに添加した。アッセイ緩衝液中で、ビオチン化ヒトアミロイドβ１−４２ペプチド（ｒＰｅｐｔｉｄｅ，ＵＳＡ；カタログ番号Ａ１１１７）の２０ｎＭ溶液を調製し、５μｌのこの溶液をアッセイプレートに添加した。アッセイ緩衝液中でストレプトアビジンクリプテート（Ｃｉｓｂｉｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，フランス；カタログ番号６１０ＳＡＫＬＢ）および抗Ｈｉｓ６−ＸＬ６６５（ＣｉｓＢｉｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，フランス；カタログ番号６１ＨＩＳＸＬＢ）検出試薬を併用して、７ｎＭのストレプトアビジンクリプテートおよび６０ｎＭの抗Ｈｉｓ６−ＸＬ６６５の濃度を得て、次に５μｌのこの検出カクテルをアッセイプレートの全てのウェルに添加した。非特異的結合ウェル（陰性対照）は、ｓｃＦｖサンプルを５μｌのアッセイ緩衝液で置き換えることで、各プレートについて規定された。ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＵＳＡ）を使用して、６２０ｎｍおよび６６５ｎｍの放射波長で時間分解蛍光を読み取る前に、アッセイプレートを密封し、室温で２．５時間インキュベートした。先に記載されるようにして（セクション１．３）データ解析を実施し、％ΔＦ値を使用して、隣接するウェル内のアッセイシグナルを比較した。「ヒット」は、Ａｂｅｔ０００７ ｓｃＦｖについて観察されたシグナルよりも大きな％ΔＦを生じたｓｃＦｖサンプルと定義された。
２．４ エピトープ競合アッセイを使用した改良クローンの確認
ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドに対して、Ａｂｅｔ０００７親クローンよりも高い結合を示したクローンに、ＤＮＡ配列決定を実施した（Ｏｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。独自のタンパク質配列があるｓｃＦｖを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させて、アフィニティクロマトグラフィーと、それに続く緩衝液交換によって精製した。次に、ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドに対してＡｂｅｔ０００７と同様の親和性を有する、Ａｂｅｔ００４２と称されるベンチマーク抗体に対するエピトープ競合アッセイ中で、これらのｓｃＦｖの結合親和性を試験した。この競合アッセイでは、ビオチン化ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドに対するＡｂｅｔ００４２ ＩｇＧの結合が、試験ｓｃＦｖサンプルに対して競合した。ビオチン化ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドに対するＡｂｅｔ００４２ ＩｇＧの結合は、先に記載されるようにして（セクション１．６）、ＨＴＲＦ（商標）技術を使用して検出される。簡単に述べると、Ａｂｅｔ００４２ ＩｇＧ、ビオチン化アミロイドβ１−４２ペプチド、ストレプトアビジンクリプテート、および抗ヒトＦｃ ＩｇＧ ＸＬ６６５の混合物に、精製ｓｃＦｖの希釈系列を添加した。室温における２時間のインキュベーション後、時間分解蛍光を読み取った。
Ｇｒｅｉｎｅｒ ９６ウェルＵ底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＢｉｏＯｎｅ，ドイツ；カタログ番号６５０２０１）を使用して、５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ；カタログ番号Ｍ９３８１）、０．４Ｍのフッ化カリウム（ＢＤＨ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵＳＡ；カタログ番号１０３４４４Ｔ）、０．１％の脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ；カタログ番号Ａ６００３）、および０．１％のツイーン２０（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ；カタログ番号Ｐ２２８７）を含有するアッセイ緩衝液中で、精製ｓｃＦｖを連続希釈した。ＭｉｎｉＴｒａｋ（商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＵＳＡ）液体取り扱いロボットを使用して、５μｌの各ｓｃＦｖ希釈液をアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）３８４ウェル黒色浅型ウェル、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号３６７６）に、二連で移した。アッセイ緩衝液中で、ビオチン化アミロイドβ１−４２ペプチド（ｒＰｅｐｔｉｄｅ，ＵＳＡ；カタログ番号Ａ１１１７）の２０ｎＭ溶液を調製し、５μｌのビオチン化ペプチド溶液をアッセイプレートに添加して、２０μｌの最終アッセイ容積中で５ｎＭペプチドの最終濃度を得た。アッセイプレートを密封して、室温で１時間インキュベートした。それぞれ７ｎＭおよび２０ｎＭのストレプトアビジンクリプテートおよび抗ヒトＦｃ ＩｇＧ ＸＬ６６５をアッセイ緩衝液中で合わせて、この溶液の５μｌをアッセイプレートに添加した。Ａｂｅｔ００４２ ＩｇＧをアッセイ緩衝液中で２．４ｎＭに希釈し、５μｌをアッセイプレートに添加して、０．６ｎＭの最終ＩｇＧ濃度を得た。非特異的結合ウェル（陰性対照）は、Ａｂｅｔ００４２ ＩｇＧを５μｌのアッセイ緩衝液で置き換えることで、各プレートについて規定された。ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＵＳＡ）を使用して、６２０ｎｍおよび６６５ｎｍの放射波長で時間分解蛍光を読み取る前に、アッセイプレートを密封して、室温で２時間インキュベートした。
各サンプルについて、％ΔＦ値および％特異的結合を計算することで、データを解析した。％ΔＦは式１に従って求め、％特異的結合は式２を使用して計算した。式３に記載されるような、４パラメータロジスティック式を使用する曲線適合によって、Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＵＳＡ）を使用して、ＩＣ50値を求めた。
Figure 0006343615
 式中、Ｙは特異的結合であり、Ｘは濃度の対数である。
例証的結果は、図５に示される。元のリードであるＡｂｅｔ０００７が１５９ｎＭのＩＣ50を有する一方で、最も改良されたクローンであるＡｂｅｔ０１４４は５．５ｎＭのＩＣ50値を有する。
２．５ 表面プラズモン共鳴による精製ｓｃＦｖ形態の親和性改善クローンの動態プロファイリング
ＨＴＲＦ（商標）エピトープ競合アッセイ（セクション２．４）において、表面プラズモン共鳴を使用して、親配列であるＡｂｅｔ０００７と比較して、ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドへの結合親和性に有意な改善を示した精製ｓｃＦｖクローンを分析した。簡単に述べると、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ−１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）バイオセンサー装置を使用して、各精製ｓｃＦｖと、合成的に生成されたヒトアミロイドβ１−４２ペプチドとの間の相互作用の動態学パラメータを評価した。これらの実験は、基本的に、Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）に記載されるようにして実施した。さらなる詳細は、セクション１．７を参照されたい。
ビオチン化合成ヒトアミロイドβ１−４２ペプチド（ｒＰｅｐｔｉｄｅ，ＵＳＡ；カタログ番号Ａ１１１７）が、ビオチン／ストレプトアビジン相互作用を介して、独自仕様のＳＡセンサーチップとおよそ７００ＲＵの最終表面密度で非共有結合するアッセイを使用して、各試験ｓｃＦｖとヒトアミロイドβ１−４２の間の結合親和性を推定した。１０ｍＭのグリシン、ｐＨ２．０の単回２０秒間注入によってペプチド結合ｓｃＦｖを除去し、サイクルとサイクルの間にチップ表面を再生した。再生は、ペプチド結合能力の顕著な損失をもたらさなかった。
信頼度をもって適切な結合モデルと適合させ得るセンサーグラムを観察するのに十分な時間にわたり、各精製ｓｃＦｖの一連の希釈液（１２．５〜４００ｎＭ）をペプチド表面に順次通過させた。ゼロ濃度緩衝液空試験を主要データセットから減算して、あらゆる緩衝液アーチファクトまたは非特異的結合効果の影響を軽減した。次にＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、各検体滴定からのデータに、適切な結合モデルを同時に適合させた。
４ＲＵ2未満を許容値として、計算されたカイ二乗値を使用して、データの妥当性を評価した。２０ＲＵ未満の偏差を許容可能として、残差を使用して、適合の全体的な成功を推定した。
Ａｂｅｔ０１４４ ｓｃＦｖに関する例証的結果は、図６に示される。結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、および解離定数（ＫD）は、それぞれ２．０１×１０5Ｍ-1ｓ-1、６．６６×１０-3ｓ-1、および３３．２ｎＭである。これらのパラメータは、データへの１：１ラングミュア適合から誘導された。
２．６ 親和性改善ｓｃＦｖのヒトＩｇＧ１−ＴＭへの再構成
ＩｇＧ１−ＴＭ抗体形態は、下側ヒンジおよびＣＨ２定常領域内に３つの単一アミノ酸置換（三重変異：ＴＭ）を含有するヒトＩｇＧ１アイソタイプである（Ｏｇａｎｅｓｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）。ヒトＩｇＧ１分子の下側ヒンジおよびＣH２領域に導入すると、三重変異Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ（「ＴＭ」）は、ヒトＣＤ６４、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ１６、およびＣ１ｑに対するそれらの結合に、著明な低下を引き起こす。これらのＴＭ変異を使用して、エフェクター機能が非常に低いヒトアイソタイプを作成した。それぞれヒト抗体重鎖および軽鎖全体を発現する、可変重鎖（ＶH）および可変軽鎖（ＶL）領域をベクターにサブクローニングすることで、ＳｃＦｖをＩｇＧ１−ＴＭに再構成した。ヒト重鎖定常領域と調節因子を含有する哺乳類発現ベクター（ｐＥＵ１．４）に、可変重鎖をクローン化して、哺乳類細胞内でＩｇＧ１−ＴＭ重鎖全体を発現させた。同様に、ヒトλ軽鎖定常領域および調節因子の発現のための哺乳類発現ベクター（ｐＥＵ４．４）に、可変軽鎖領域をクローン化して、哺乳類細胞内でＩｇＧ軽鎖全体を発現させた。基本的に、セクション１．５に記載されるようにして、ＩｇＧ抗体を発現させて精製した。
２．７ 生殖系列化
親和性最適化アミロイドβ１−４２ペプチド特異的抗体のＶHおよびＶL領域のアミノ酸配列と、ＶＢＡＳＥデータベース（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）中の既知のヒト生殖細胞系配列を配列比較して、配列類似性によって最も近い生殖細胞系を同定した。最適化抗体系統のＶH領域では、これはＶｈ３−２３（ＤＰ−４７）であり、ＶL領域では、これはＶλ３−３ｒ（ＤＰＬ−２３）であった。
生殖系列化過程は、ＶHおよびＶL領域内のフレームワーク残基を最も近い生殖細胞系配列に復帰させて、ヒト抗体に完全に同じく一致させることからなった。Ａｂｅｔ０１４４では、ＶH領域の変更が必要な残基はなかったが（表１）、ＶL領域のフレームワークには、合計５つの変更を加えた。これらの変更は、Ｋａｂａｔ位置１、２、３、４０、および８１に加えた（表２）。側面に位置する残基１および３と同時に生殖系列化された軽鎖配列中の残基２を除いて、ベルニエ残基（Ｆｏｏｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２）は生殖系列化されなかった。これらのアミノ酸残基の生殖系列化は、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎ（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）によって記載されるような適切な変異原性プライマーを用いて、標準部位特異的変異誘発技術を使用して実施された。
Figure 0006343615
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２．８ 表面プラズモン共鳴を使用した親和性最適化ＩｇＧの結合動態の判定
表面プラズモン共鳴を使用して、親和性最適化ＩｇＧ（セクション２．６）およびそれらの生殖系列化相当物（セクション２．７）の結合動態を解析した。簡単に述べると、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ−１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）バイオセンサー装置を使用して、各試験ＩｇＧと、合成的に生成されたヒトアミロイドβ１−４２ペプチドとの間の相互作用の動態学パラメータを評価した。これらの実験は、基本的に、Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）に記載されるようにして実施した。さらなる詳細は、セクション１．７を参照されたい。
抗体がアミン結合によって、独自仕様のＣＭ３チップ表面とおよそ２，０００ＲＵの最終表面密度で共有結合するアッセイを使用して、各試験ＩｇＧとヒトアミロイドβ１−４２の間の結合親和性を推定した。１０ｍＭのグリシン、ｐＨ２．０の単回４０秒間注入によって抗体結合リガンドを除去し、サイクルとサイクルの間にチップ表面を再生した。再生は、ペプチド結合能力の顕著な損失をもたらさなかった。
信頼度をもって適切な結合モデルと適合させ得るセンサーグラムの観察に十分な時間にわたり、合成ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドの一連の希釈液（１．６〜５０ｎＭ）を抗体表面に順次通過させた。空試験参照フローセルデータを各ＩｇＧデータセットから減算し、ゼロ濃度緩衝液空試験を主要データセットから二重参照減算して、あらゆる緩衝液アーチファクトまたは非特異的結合効果の影響を軽減した。次にＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、各検体滴定からのデータに、適切な結合モデルを同時に適合させた。
２ＲＵ２未満を許容値として、計算されたカイ二乗値を使用して、データの妥当性を評価した。２ＲＵ未満の偏差を許容可能として、残差を使用して、適合の全体的な成功を推定した。
Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬ（生殖系列化）ＩｇＧ１−ＴＭに関する例証的結果は、図７に示される。結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、および解離定数（ＫD）は、それぞれ２．０８×１０5Ｍ-1ｓ-1、１．９７×１０-3ｓ-1、および９．５０ｎＭである。これらのパラメータは、データへの１：１ラングミュア適合から誘導された。
２．９ 表面プラズモン共鳴を使用した親和性最適化ＩｇＧの特異性プロファイリング
表面プラズモン共鳴を使用して、ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドの親和性最適化ＩｇＧの特異性を確認した。簡単に述べると、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ−１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）バイオセンサー装置を使用して、各試験ＩｇＧと、合成的に生成されたヒトアミロイドβ１−４２およびヒトアミロイドβ１−４０をはじめとする一連の小型ペプチドとの間の相互作用の動態学パラメータを評価した。これらの実験は、基本的に、Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）に記載されるようにして実施した。さらなる詳細は、セクション１．７を参照されたい。
抗体がアミン結合によって、独自仕様のＣＭ３チップ表面とおよそ２，０００ＲＵの最終表面密度で共有結合するアッセイを使用して、各試験ＩｇＧと各ペプチドの間の結合親和性を推定した。１０ｍＭのグリシン、ｐＨ２．０の単回４０秒間注入によって抗体結合リガンドを除去し、サイクルとサイクルの間にチップ表面を再生した。再生は、ペプチド結合能力の顕著な損失をもたらさなかった。
結合を示さない、または信頼度をもって適切な結合モデルと適合させ得る、のどちらかであるセンサーグラムを観察するのに十分な時間にわたり、４００ｎＭの各試験ペプチドを抗体表面に順次通過させた。空試験参照フローセルデータを各ＩｇＧデータセットから減算し、ゼロ濃度緩衝液空試験を主要データセットから二重参照減算して、あらゆる緩衝液アーチファクトまたは非特異的結合効果の影響を軽減した。
Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬ（生殖系列化）ＩｇＧ１−ＴＭに関する例証的結果は、図８に示される。２つのペプチド（ビオチン化ヒトアミロイドβ１−４２、（ｒＰｅｐｔｉｄｅ，ＵＳＡ；カタログ番号Ａ１１１７）および未標識ヒトアミロイドβ１−４２（ｒＰｅｐｔｉｄｅ，ＵＳＡ；カタログ番号Ａ１１６５））が抗体への強力な結合を示した一方で、３つのペプチド（ビオチン化スクランブルされたヒトアミロイドβ１−４２（Ａｎａｓｐｅｃ，ＵＳＡ；カスタム合成）、ビオチン化ヒトアミロイドβ１−４０（ｒＰｅｐｔｉｄｅ，ＵＳＡ；カタログ番号Ａ１１１１）、および未標識ヒトアミロイドβ１−４０（Ａｎａｓｐｅｃ，ＵＳＡ；カタログ番号２４２３６））は、抗体への結合を示さなかった。
２．１０ 生化学的エピトープ競合アッセイ形式におけるＡｂｅｔ０１４４−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭの特異性プロファイリング
その他のヒトアミロイドβペプチドへの結合に対するＡｂｅｔ０１４４−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭの特異性を試験するために、競合アッセイを開発した。このアッセイでは、固定濃度（０．２８ｎＭ）のＡｂｅｔ０１４４−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭの存在下で、異なる濃度範囲の１−４２、１−４０、１−１６、１２−２８、ピロ３−４２、ピロ１１−４２、およびスクランブルされた１−４２（それぞれＡｎａｓｐｅｃカタログ番号２０２７６、２４２３６、２４２２６、２４２３０、２９９０７、２９９０３、および２５３８３）をはじめとする、未標識ヒトアミロイドβペプチドと共に、固定濃度（１．５ｎＭ）のビオチン化ヒトアミロイドβ１−４２ペプチド（ｒＰｅｐｔｉｄｅ，ＵＳＡ；カタログ番号Ａ１１１７）をインキュベートした。ペプチド競合は、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）を使用して、ビオチン化ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドへのＡｂｅｔ０１４４−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭの結合阻害の検出によって評価した。これは、ユウロピウムクリプテート標識ヒトＦｃ ＩｇＧ（ＣｉｓＢｉｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，フランス；カタログ番号６１ＨＦＣＫＬＢ）、およびＸＬ６６５標識ストレプトアビジン（ＣｉｓＢｉｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，フランス；カタログ番号６１１ＳＡＸＬＢ）ＴＲ−ＦＲＥＴ検出試薬の使用を伴った。
実験は、Ｃｏｓｔａｒ ３８４ウェル浅底マイクロタイタープレート内で準備した。１．５ｎＭの最終アッセイ濃度を得るために、（陰性結合アッセイ対照ウェルを除く）アッセイプレートの全てのウェルに、５μｌ／ウェルのビオチン化ヒトアミロイドβ１−４２（６ｎＭ）を添加した。陰性結合アッセイ対照ウェルには、５μｌのアッセイ緩衝液のみを添加した。１０μＭの最大最終アッセイペプチド濃度を得るために、二連の１１点１：３連続滴定を調製し、または各試験ペプチドを４０μＭの最大濃度で開始した。次にウェルあたり５μｌの各試験ペプチドの連続希釈液を３８４ウェルアッセイプレートに移した。総合および陰性結合アッセイ対照ウェルには、５μｌのアッセイ緩衝液のみを添加した。Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭを希釈して、１．１２ｎＭの使用液を得た。０．２８ｎＭのＡｂｅｔ０１４４−ＧＬ−ＩｇＧ１−ＴＭの最終アッセイ濃度をもたらすために、ウェルあたり５μｌのこの溶液を３８４ウェルアッセイプレートの全てのウェルに添加した。最後に、ユウロピウムクリプテート標識抗ヒトＦｃ（２．４ｎＭ）およびＸＬ６６５標識ストレプトアビジン（６０ｎＭ）を含有する混合溶液を調製した。ユウロピウムクリプテート標識抗ヒトＦｃおよびＸＬ６６５標識ストレプトアビジンが、それぞれ０．６ｎＭおよび１５ｎＭの最終濃度になるように、ウェルあたり５μｌのこの溶液を３８４ウェルアッセイプレートの全てのウェルに添加した。最終アッセイ容積が２０μｌであり、個々のアッセイ成分が、５μｌの添加として、必要な最終アッセイ濃度の４倍で添加されたことに留意されたい。全ての試薬は、５０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ；カタログ番号Ｍ９３８１）、０．４ＭのＫＦ（ＢＤＨ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵＳＡ；カタログ番号１０３４４４Ｔ）、０．１％の脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ；カタログ番号Ａ６００３）、および０．１％のツイーン２０（ｖ／ｖ）（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ；カタログ番号Ｐ２２８７）を含有するアッセイ緩衝液中で希釈した。
ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＵＳＡ）を使用して、６２０ｎｍおよび６６５ｎｍの放射波長で時間分解蛍光を読み取る前に、アッセイプレートを室温で２時間インキュベートした。各サンプルについて％ΔＦ値を計算することで、データを解析した。％ΔＦは、式１に従って求めた。
Figure 0006343615
％ΔＦ値を使用して、式２に記載されるようにして％特異的結合を計算した。
Figure 0006343615
Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭに関する例証的結果は、図９に示される。これらの結果は、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭが、ヒトアミロイドβ１−４２、ピロ３−４２およびピロ１１−４２ペプチドと結合するが、ヒトアミロイドβ１−４０ペプチドまたはペプチド切断型１−１６および１２−２８と結合しないことを実証する。
２．１１ ヒト血漿からのアミロイドβペプチド枯渇によるリード抗体の機能特性評価
血漿枯渇アッセイでリード抗体を試験して、ヒト血漿からヒトアミロイドβ１−４２ペプチドを免疫沈降させるそれらの能力を調べた。このアッセイを使用して、各抗体の機能的効力の証拠を提供した。アッセイは、正確にセクション１．８に記載されるようにして、実施した。
一実験では、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ抗体は、血漿中のヒトアミロイドβ１−４２ペプチドのレベルを１３．５４ｐｇ・ｍｌ−１から９．８６ｐｇ・ｍｌ−１に低下させた（２７％の低下）。第２の実験では、レベルは、４０．０６ｐｇ・ｍｌ−１から３４．６５ｐｇ・ｍｌ−１に低下した（１４％の低下）。
２．１２ 試験管内免疫組織化学を使用したアミロイドβに対する天然結合がある改良クローンの同定
天然アミロイドβペプチドを認識するリードクローンを同定する目的で、アミロイドβと結合する能力について、親和性最適化ＩｇＧを試験した。簡単に述べると、ヒトアルツハイマー病脳切片およびＴｇ２５７６マウス脳切片上で、リード抗体をスクリーニングして、試験管内で天然アミロイドと結合する抗アミロイドβ１−４２抗体を同定した。実験は、基本的に、セクション１．９に記載されるようにして実施した。
これらの実験では、２人の重度のアルツハイマー病がある個人（女性、ＡｐｏＥ４／３、８６歳；女性、ＡｐｏＥ３／３、６７歳）の前頭皮質および海馬から、ヒト脳組織を単離した。マウス脳組織は、１８ヶ月齢のＴｇ２５７６マウス（６匹）から単離した。抗体は、２、５、および２０ｕｇｍｌ-1の濃度で試験した。
一実験では、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ抗体は、びまん性プラーク（ＤＰ）または脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）プラーク（スコア＝０）を染色しなかった。しかし、それは、Ｔｇ２５７６脳切片上では１のスコアで、ヒトＡＤ脳切片上では１．５のスコアで、コアプラーク（ＣＰ）を染色した。対照的に、陽性対照抗体は，同一条件下において、隣接する切片上の全てのプラーク（ＣＰ、ＤＰ、ＣＡＡ）上で、３〜４のスコアを生じた。典型的な画像は、図１０に示される。
実施例３．側面に位置するベルニエ残基をはじめとする全ての６個のＣＤＲの変異を通じたＡｂｅｔ０１４４−ＧＬの抗体最適化
３．１ リボソームディスプレイと適合性のｓｃＦｖ形態へのＡｂｅｔ０１４４−ＧＬ親クローンの変換
親和性最適化のための調製において、親クローンをＩｇＧ１−ＴＭ形態から一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）形態に変換した。それらのそれぞれのＩｇＧベクターから、コドン最適化可変重鎖（ＶH）および可変軽鎖（ＶL）領域を別々に増幅して、特異的クローニング部位および可撓性リンカー領域を付加した。次に再コンビナトリアルＰＣＲを実施して、完全なｓｃＦｖコンストラクトを生成し、それをリボソームディスプレイに必要な構造的特徴を含有する修飾ｐＵＣベクター（ｐＵＣ−ＲＤ）にクローン化した。これらの特徴としては、エキソヌクレアーゼによるｍＲＮＡ転写物の分解を防止する５’および３’ステムループ、ｍＲＮＡ転写物へのリボソーム結合を促進するシャイン・ダルガノ配列、および翻訳ｓｃＦｖ分子がリボソームに付着したままで折り畳みできるようにする遺伝子ＩＩＩスペーサーが挙げられる（Ｇｒｏｖｅｓｅｔａｌ．，２００５）。
３．２ 標的変異誘発によるＡｂｅｔ０１４４−ＧＬ最適化
親和性ベースのリボソームディスプレイ選択による標的変異誘発アプローチを使用して、ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドに対する改善された親和性のために、リード抗体（Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬ）をさらに最適化した。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎ（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）によって記載されるような標準分子生物学的技術を使用して、全ての６個の可変重鎖（ＶH）および可変軽鎖（ＶL）相補性決定領域（ＣＤＲ）のオリゴヌクレオチド指定変異誘発によって、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬに由来する大型ｓｃＦｖ−リボソームライブラリーを作成した。各ＣＤＲからの変異配列は、別個のライブラリーとして親和性最適化した。ＶHＣＤＲ１（Ｋａｂａｔ残基２６−３０）に先行する５個のベルニエ残基もまた、標的変異誘発を使用して無作為化し、これらの配列を残りのＶHＣＤＲ１ライブラリーと組み合わせて成熟させた。ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドに対するより高い親和性がある変種を濃縮するために、親和性ベースのリボソームディスプレイ選択を全てのライブラリーに実施した。選択は、基本的に、以前記載されるようにして実施した（Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
手短に述べると、各ＣＤＲをカバーする、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬリードクローンの６個の標的変異誘発ライブラリーを別々にｍＲＮＡに転写した。停止した翻訳プロセスを使用して、ｍＲＮＡ−リボソーム−ｓｃＦｖ三次複合体を形成した（Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。次に、これらの複合体に、低下する合成ビオチン化ヒトアミロイドβ１−４２ペプチド（Ｂａｃｈｅｍ，ドイツ；カタログ番号Ｈ−５６４２）濃度（１００ｎＭから１０ｎＭ）の存在下でインキュベートする４ラウンドの選択を実施して、ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドに対するより高い親和性がある変種を選択した。次に抗原と結合する複合体をストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＫ；カタログ番号１１２−０５Ｄ）上に捕捉して、非特異的リボソーム複合体を洗い流した。引き続いてｍＲＮＡを結合リボソーム複合体から単離して、ｃＤＮＡに逆転写し、次にＰＣＲによって増幅した。このＤＮＡを次の選択ラウンドのために使用した。
４ラウンドの親和性の成熟後、各選択の結果をスクリーニング目的でクローン化した。基本的に、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４）によって記載されるようにして、リボソームディスプレイによって単離されたＳｃＦｖをリボソームディスプレイコンストラクト（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，ＵＳＡ；カタログ番号Ｒ０１８９Ｌ、Ｒ０１９３Ｌ）のＮｏｔＩ／ＮｃｏＩ制限エンドヌクレアーゼ消化によって、ファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ６にクローン化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，ＵＳＡ；カタログ番号Ｍ０２０２Ｌ）を使用した、ＮｏｔＩ／ＮｃｏＩ消化ｐＣＡＮＴＡＢ６中へのライゲーションがそれに続いた。
３．３ エピトープ競合アッセイを使用した改良クローンの同定
セクション３．２に記載される標的変異誘発アプローチの選択ラウンド３および４から無作為に選択された２０２４個のｓｃＦｖを細菌中で発現させ、未精製ペリプラズムｓｃＦｖを生成した。ＨＴＲＦ（商標）プラットフォームを使用して、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭと同じエピトープを介して合成ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドと結合できるｓｃＦｖを、競合形式アッセイで解明した。具体的には、単一濃度の各未精製ペリプラズム試験ｓｃＦｖの存在下で、ストレプトアビジンクリプテート（ビオチン化アミロイドβ１−４２ペプチドと結合する）および抗ヒトＦｃＸＬ６６５（Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭと結合する）の間で、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を測定した。ｓｃＦｖによる、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭエピトープのペプチド上の成功裏の占有は、蛍光プレートリーダー上の評価でＦＲＥＴの低下をもたらした。
競合ペプチド不在下における、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭの合成ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドへの結合を分析することで、「総合」結合シグナルを判定した。「サンプル」シグナルは、試験ｓｃＦｖサンプルの存在下における、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭの合成ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドへの結合の分析から誘導された。最後に、検出試薬カクテルのみによって媒介される蛍光を分析することで、「クリプテート空試験」シグナルを判定した。
未精製ペリプラズムｓｃＦｖは、５０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．４、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、および０．５Ｍのスクロースからなる、サンプル緩衝液中で提供された。プロファイリングのために、３８４ウェルＶ字底プレート内で、５０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．４、０．４Ｍのフッ化カリウム、０．１％の脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン、および０．１％のツイーン２０（ｖ／ｖ）からなるアッセイ緩衝液中で、ｓｃＦｖサンプルを元の原液濃度の５０％に希釈した。液体取り扱いロボットを使用して、５μｌの各新規希釈ｓｃＦｖを黒色浅型中実底非結合３８４ウェルアッセイプレートの「サンプル」ウェルに移した。５μｌのサンプル緩衝液（「総合」および「クリプテート空試験」ウェル）、１０μｌのアッセイ緩衝液（「クリプテート空試験」ウェル）、５μｌの２ｎＭ Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ（「サンプル」および「総合」ウェル）、５μｌの５ｎＭビオチン化ヒトアミロイドβ１−４２ペプチド（「サンプル」および「総合」ウェル）、および６ｎＭストレプトアビジンクリプテートおよび６０ｎＭ抗Ｈｉｓ６−ＸＬ６６５からなる５μｌの検出カクテル（全てのウェル）の順で、多重チャネルピペットによって、残りの試薬（アッセイ緩衝液中で調製された）をアッセイプレートに添加した。アッセイプレートを密封して、次に、蛍光プレートリーダー上で６２０および６６５ｎｍ放射波長で時間分解蛍光を測定する前に、室温で３時間、暗所でインキュベートした。
各サンプルについて％ΔＦ値を計算することで、データを解析した。％ΔＦは、式４に従って求めた。
Figure 0006343615
引き続いて式５に記載されるようにして、％ΔＦ値を使用して、正規化した結合値を計算した。
Figure 0006343615
アミロイドβ１−４２ペプチドに対するＡｂｅｔ０１４４−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ結合の有意な阻害を示す未精製ペリプラズムｓｃＦｖに、ＤＮＡ配列決定を実施した（Ｏｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。独自のタンパク質配列を有することが分かったｓｃＦｖを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させて、アフィニティクロマトグラフィーとそれに続く緩衝液交換によって精製した。
各精製ｓｃＦｖの効力は、上述のエピトープ競合アッセイ中で、ｓｃＦｖの希釈系列（典型的に４ｐＭ〜１２００ｎＭ）を試験することで判定した。各サンプルについて％ΔＦおよび％全結合量値計算することで、データを再度解析した。さらに式６に記載されるようにして、精製ｓｃＦｖの各濃度の％阻害値もまた計算した。
式６：
％阻害＝１００−％全結合量
科学的グラフ化ソフトウェアを使用して、％阻害と対比してＳｃＦｖサンプル濃度をプロットし、あらゆる濃度依存性応答を非直線回帰曲線に適合させた。−１の値に拘束されるヒル勾配によって、これらの分析からＩＣ50値を得た。この選択ラウンドからの最も強力なクローンであるＡｂｅｔ０２８６は、１．８ｎＭのＩＣ50を有して、ＶLＣＤＲ１標的変異誘発ライブラリーに由来した。
試薬／機器供給元：ＭＯＰＳ（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ；カタログ番号Ｍ９３８１）、フッ化カリウム（ＢＤＨ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵＳＡ；カタログ番号Ａ６００３）、脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ；カタログ番号Ａ６００３）、ツイーン２０（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ；カタログ番号Ｐ２２８７）、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ（社内製造）、ビオチン化ヒトアミロイドβ１−４２ペプチド（ｒｐｅｐｔｉｄｅ，ＵＳＡ；カタログ番号Ａ１１１７）、ストレプトアビジンクリプテート（Ｃｉｓｂｉｏ，フランス；カタログ番号６１０ＳＡＫＬＢ）、抗Ｈｉｓ６−ＸＬ６６５（Ｃｉｓｂｉｏ，フランス；カタログ番号６１ＨＩＳＸＬＢ）、３８４ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｓｔａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号３６７６）、３８４ウェル希釈プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＢｉｏＯｎｅ，ドイツ；カタログ番号７８１２８０）、液体取り扱いロボット（ＭｉｎｉＴｒａｋ（商標），Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＵＳＡ）、蛍光プレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（商標）、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＵＳＡ）、ＨＴＲＦ技術（Ｃｉｓｂｉｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，フランス）、グラフ化／統計学的ソフトウェア（Ｐｒｉｓｍ、Ｇｒａｐｈｐａｄ ＵＳＡ）。
３．４ 「二成分」ライブラリーを作成するための成功裏の選択結果の組換え、および引き続くそれらの親和性最適化
セクション３．３に記載されるエピトープ競合アッセイを使用して、最初の４ラウンドの選択中に、特定のｓｃＦｖ−リボソームライブラリーが親和性成熟しているかどうかを判定した。ＶHＣＤＲ３およびＶLＣＤＲ２標的変異誘発ライブラリーの２つのライブラリーは、親Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬクローンと比べて改善を示さず、さらに開発されなかった。
残りの４つの標的変異誘発ライブラリー（ＶHＣＤＲ１、ＶHＣＤＲ２、ＶLＣＤＲ１、およびＶLＣＤＲ３を包含する）は親和性改善を示し、ペアワイズ様式で遺伝子組換えして、その中で６個のＣＤＲの内２個が変異している６つの「二成分」組換えライブラリーを作成した。例えば、ＶHＣＤＲ１を包含する親和性成熟ライブラリーを親和性成熟ＶHＣＤＲ２ライブラリーと無作為に遺伝子組換えして、ＶH１：ＶH２ライブラリーを作成した。残りのライブラリーは、ＶH１：ＶL１、ＶH１：ＶL３、ＶH２：ＶL１、ＶH２：ＶL３、およびＶL１：ＶL３として作成した。各組換えライブラリーのサブセットを前述のように（セクション３．２）クローン化して、配列決定のために送付し、各ライブラリーの完全性を確認した。
次に前述のように（セクション３．２）、低下するビオチン化合成ヒトアミロイドβ１−４２ペプチド濃度（ラウンド５および６で、それぞれ５ｎＭおよび２ｎＭ）の存在下で、選択を継続した。前述したのと同様に、スクリーニング目的で、各選択結果をクローン化した（セクション３．２）。
セクション３．３に記載されるようなエピトープ競合アッセイ中で、選択ラウンド５および６から無作為に選択された１９３６個のｓｃＦｖをスクリーニングした。これらのクローンの効力は増大していたため、未精製ｓｃＦｖをアッセイプレートへの添加前に、最初に２５％に希釈した。以前のように、有意な阻害特性を示したクローンをＤＮＡ配列決定のために送付して、独自のクローンを生成し、精製ｓｃＦｖとして分析した（セクション３．３）。これらの選択からの最も強力なクローンであるＡｂｅｔ０３０３は、０．８４ｎＭの効力を有して、ＶH１：ＶH２組換えライブラリーに由来した。
３．５ 「三成分」ライブラリーを作成するための二成分選択結果の組換えおよび引き続くそれらの親和性最適化
セクション３．３に記載されるエピトープ競合アッセイを使用して、各二成分ライブラリーが、先の２ラウンドの選択（５および６）よりも親和性成熟しているかどうかを判定した。全てのライブラリーは親和性改善を示し、したがってさらに親和性成熟していると見なされた。
６つの二成分ライブラリー（セクション３．４）を成功裏のラウンド４結果（セクション３．２）でペアワイズ様式で遺伝子組換えし、その中で６個のＣＤＲの内３個が変異している、４つの「三成分」組換えライブラリーを形成した。例えば、ＶH２：ＶL３二成分ライブラリー（６ラウンド結果）をＶHＣＤＲ１標的変異誘発ライブラリー（４ラウンド結果）で遺伝子組換えして、ＶH１：ＶH２：ＶL３ライブラリーを作成した。同様のコンストラクトはまた、ＶH１：ＶH２二成分ライブラリー（６ラウンド結果）と、ＶLＣＤＲ３標的変異誘発ライブラリー（４ラウンド結果）を組み合わせることによっても作成された。これらの２つの個々のライブラリーをプールして、ＶH１：ＶH２：ＶL３三成分ライブラリーを作成した。
同時最適化されたＣＤＲ間の相乗作用を破壊しないように注意した。この操作が、同時最適化されたＶHＣＤＲ１配列とＶLＣＤＲ３配列の間の相乗作用を破壊するであろうことから、例えばＶH１：ＶL３二成分ライブラリーは、ＶHＣＤＲ２標的変異誘発ライブラリーで遺伝子組換えしなかった。全ての三成分ライブラリーと、それらの派生物の完全な一覧を表３に記載する。各組換えライブラリーの一部を前述のように（セクション３．２）クローン化して、配列決定のために送付して、各ライブラリーの完全性を確認した。
Figure 0006343615
次に選択を前述のように（セクション３．２）、低下するビオチン化合成ヒトアミロイドβ１−４２ペプチド濃度の存在下で継続した（ラウンド７および８で、それぞれ５００ｐＭおよび２００ｐＭ）。前述したのと同様に、スクリーニング目的で、各選択結果をクローン化した（セクション３．２）。
セクション３．３に記載されるようなエピトープ競合アッセイ中で、選択ラウンド７および８から無作為に選択された１４０８個のｓｃＦｖをスクリーニングした。「二成分」スクリーニングと同様に、アッセイプレートへの添加前に、未精製ｓｃＦｖを最初に２５％に希釈した。以前のように、有意な阻害特性を示したクローンをＤＮＡ配列決定のために送付して、独自のクローンを生成し、精製ｓｃＦｖとして分析した（セクション３．３）。これらの選択からの最も強力なクローンであるＡｂｅｔ０３４３は、０．４８ｎＭの効力を有して、ＶH１：ＶH２：ＶL３組換えライブラリーに由来した。
３．６ 「四成分」ライブラリーを作成するための三成分選択結果の組換え、および引き続くそれらの親和性最適化
セクション３．３に記載されるエピトープ競合アッセイを使用して、各三成分ライブラリーが、先の２ラウンドの選択（７および８）よりも親和性成熟しているかどうかを判定した。全てのライブラリーは、親和性改善を示し、したがってさらに親和性成熟していると見なされた。
ＶH１：ＶH２：ＶL１三成分ライブラリー（ラウンド８結果）をＶLＣＤＲ３標的変異誘発ライブラリー（４ラウンド結果）で遺伝子組換し、ＶH２：ＶL１：ＶL３三成分ライブラリー（ラウンド８結果）をＶHＣＤＲ１標的変異誘発ライブラリー（４ラウンド結果）で遺伝子組換えした。別途、ＶH１：ＶH２二成分ライブラリー（６ラウンド結果）をＶL１：ＶL３二成分ライブラリー（６ラウンド結果）で遺伝子組換えした。次にこれらの３つの個々のライブラリーをプールして、その中で６個のＣＤＲの内４個が変異している、単一「四成分」ライブラリーＶH１：ＶH２：ＶL１：ＶL３を作成した。
同時最適化されたＣＤＲ間の相乗作用を破壊しないように注意した。この操作が、同時最適化されたＶHＣＤＲ１／ＶHＣＤＲ２配列とＶLＣＤＲ３配列の間の相乗作用を破壊するであろうことから、例えばＶH１：ＶL２：ＶL３三成分ライブラリーは、ＶLＣＤＲ１標的変異誘発ライブラリーで遺伝子組換えしなかった。各組換えライブラリーの一部を前述のように（セクション３．２）クローン化して、配列決定のために送付して、各ライブラリーの完全性を確認した。
次に選択を前述のように（セクション３．２）、低下するビオチン化合成ヒトアミロイドβ１−４２ペプチド濃度（ラウンド９および１１でそれぞれ５０ｐＭおよび１０ｐＭ）の存在下で継続した。前述したのと同様に、スクリーニング目的で、各選択結果をクローン化した（セクション３．２）。
セクション３．３に記載されるようなエピトープ競合アッセイ中で、選択ラウンド９〜１１から無作為に選択された１６７２個のｓｃＦｖをスクリーニングした。これらのクローンの効力は増大していたため、未精製ｓｃＦｖをアッセイプレートへの添加前に、最初に３．１３％に希釈した。以前のように、有意な阻害特性を示したクローンをＤＮＡ配列決定のために送付して、独自のクローンを生成し、精製ｓｃＦｖとして分析した（セクション３．３）。これらの選択からの最も強力なクローンであるＡｂｅｔ０３７７は、０．３２ｎＭの効力を有した（ｎ＝２データ）。サンプル阻害曲線は図１１に示され、２４個の最大効力クローンのデータは表４に示される。対応するタンパク質配列は、表５および６に列挙される。
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表５（下記参照）：本明細書に記載される最適化非生殖系列化クローンのＶＨ領域の配列アラインメント。親配列（Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬ）からの変化が強調表示されている。残基はＫａｂａｔ番号付与体系に準じて命名される。
表６（下記参照）：本明細書に記載される最適化非生殖系列化クローンのＶＬ領域の配列アラインメント。親配列（Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬ）からの変化が強調表示されている。残基はＫａｂａｔ番号付与体系に準じて命名される。Ａｂｅｔ０３７８が、最適化中にグルタミンからの変化として取り込まれてＶＬ配列内の９１位に存在する、ａｍｂｅｒ停止コドン「Ｂ」を有することに留意されたい。抗体は、発現のために使用された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１株中でｓｃＦｖ断片として産生され、その中では、ａｍｂｅｒ停止コドンはグルタミンとして読み取られる。
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３．７ 表面プラズモン共鳴による精製ｓｃＦｖ形態の親和性改良クローンの動態プロファイリング
ＨＴＲＦ（商標）エピトープ競合アッセイ（セクション３．３〜３．６）において、表面プラズモン共鳴を使用して、親配列であるＡｂｅｔ０１４４−ＧＬと比較して、ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドへの結合親和性に有意な改善を示した精製ｓｃＦｖクローンを分析した。簡単に述べると、ＰｒｏｔｅＯｎタンパク質相互作用アレイシステム（ＢｉｏＲａｄ，ＵＳＡ）を使用して、各精製ｓｃＦｖと、合成的に生成されたヒトアミロイドβ１−４２ペプチドの間の相互作用の動態学パラメータを評価した。これらの実験は、基本的に、Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）に記載されるようにして実施した。さらなる詳細は、セクション１．７を参照されたい。
ビオチン化合成ヒトアミロイドβ１−４２ペプチド（ｒＰｅｐｔｉｄｅ，ＵＳＡ；カタログ番号Ａ１１１７）が、ビオチン／ストレプトアビジン相互作用を介して、独自仕様のストレプトアビジンチップ（ＮＴＡ１７６−５０２１）と５つの異なる表面密度で非共有結合するアッセイを使用して、各試験ｓｃＦｖとヒトアミロイドβ１−４２の間の結合親和性を推定した。１０ｍＭのグリシン、ｐＨ２．０の単回６０秒間注入によってペプチド結合ｓｃＦｖを除去し、サイクルとサイクルの間にチップ表面を再生した。再生は、ｓｃＦｖ結合能力の顕著な損失をもたらさなかった。
信頼度をもって適切な結合モデルと適合させ得るセンサーグラムを観察するのに十分な時間にわたり、１００〜２００ｎＭの各ｓｃＦｖをペプチド表面に順次通過させた。不適切なｓｃＦｖ空試験を主要データセットから減算して、あらゆる緩衝液アーチファクトまたは非特異的結合効果の影響を軽減した。次に適切な結合モデルをデータに適合させた。
Ａｂｅｔ０３８０のｓｃＦｖでは、結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、および解離定数（ＫD）は、それぞれ１．９３×１０5Ｍ-1ｓ-1、２．８５×１０-5ｓ-1、および１４８ｐＭである。これらのパラメータは、データへの１：１ラングミュア適合から誘導された。
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３．８ 親和性改善ｓｃＦｖのヒトＩｇＧ１−ＴＭへの再構成
ＩｇＧ１−ＴＭ抗体形態は、セクション２．６で考察される。それぞれヒト抗体重鎖および軽鎖全体を発現する、可変重鎖（ＶH）および可変軽鎖（ＶL）領域をベクターにサブクローニングすることで、ＳｃＦｖをＩｇＧ１−ＴＭに再構成した。ヒト重鎖定常領域と調節因子を含有する哺乳類発現ベクター（ｐＥＵ１．４）に、可変重鎖をクローン化して、哺乳類細胞内でＩｇＧ１−ＴＭ重鎖全体を発現した。同様に、ヒトλ軽鎖定常領域および調節因子の発現のための哺乳類発現ベクター（ｐＥＵ４．４）に、可変軽鎖領域をクローン化して、哺乳類細胞内でＩｇＧ軽鎖全体を発現した。
抗体をＩｇＧとして得るために、重鎖および軽鎖ＩｇＧ発現ベクターをＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ哺乳類細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＫ；カタログ番号Ｒ６２０−０７）に一過性に形質移入して、ＩｇＧを発現させ培地中に分泌させた。採集物を貯留して、精製前に濾過した。プロテインＡクロマトグラフィーを使用して、ＩｇＧを精製した。培養上清を適切なセラミックプロテインＡカラム（ＢｉｏＳｅｐｒａ−Ｐａｌｌ，ＵＳＡ）に装填し、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５０ｍＭのＮａＣｌで洗浄した。結合ＩｇＧは、０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）を使用してカラムから溶出し、トリスＨＣｌ（ｐＨ９．０）の添加によって中和した。溶出した物質は、ＮＡＰ−１０緩衝液交換カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ；カタログ番号１７−０８５４−０２）を使用して、ＰＢＳで緩衝液交換して、精製ＩｇＧを０．２μｍフィルターに通過させた。ＩｇＧの濃度は、ＩｇＧのアミノ酸配列に基づく吸光係数を使用して、分光光度法で測定した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣを使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥ技術によって、精製ＩｇＧを凝集または分解について分析した。
３．９ 生殖系列化
それらの対応するｓｃＦｖの実験的特性評価に基づいて、生殖系列化のために、最も強力なＩｇＧの内５つを選択した。クローンＡｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７、Ａｂｅｔ０３８０、およびＡｂｅｔ０３８２の精製ｓｃＦｖは全て、エピトープ競合アッセイによる測定で、７５０ｐＭ未満のＩＣ50値を示し（表４）、全て、表面プラズモン共鳴による測定で２５０ｐＭ未満の実験的解離定数を有した、表７。
生殖系列化過程は、ＶHおよびＶL領域内のフレームワーク残基を最も近い生殖細胞系配列に復帰させて、ヒト抗体に完全に同じように一致させることからなった。最適化抗体系統のＶH領域では、これはＶｈ３−２３（ＤＰ−４７）であり、ＶL領域では、これはＶλ３−３ｒ（ＤＰＬ−２３）であった。Ａｂｅｔ０３８０では、Ｋａｂａｔ位置４３において、ＶH領域内の１つの残基の変更が必要であり（表８）、Ｋａｂａｔ位置８１において、ＶL領域内の１つの残基の変更が必要であった（表９）。残りの４つの配列では、２〜５個の変更が必要であった（表８および９）。側面に位置する残基１および３と同時に生殖系列化されたＡｂｅｔ０３４３の軽鎖配列中の残基２を除いて、ベルニエ残基（Ｆｏｏｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２）は生殖系列化されなかった。これらのアミノ酸残基の生殖系列化は、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎ（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）によって記載されるような適切な変異原性プライマーを用いて、標準部位特異的変異誘発技術を使用して実施された。
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３．１０ 表面プラズモン共鳴を使用した親和性最適化ＩｇＧの結合動態の判定
表面プラズモン共鳴を使用して、親和性最適化ＩｇＧ（セクション３．８）およびそれらの生殖系列化相当物（セクション３．９）の結合動態を解析した。簡単に述べると、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ−１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）バイオセンサー装置を使用して、各試験ＩｇＧと、合成的に生成されたヒトアミロイドβ１−４２ペプチドの間の相互作用の動態学パラメータを評価した。これらの実験は、基本的に、Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）に記載されるようにして実施した。さらなる詳細は、セクション１．７を参照されたい。
それ自体が独自仕様のＣＭ５チップとアミン結合するプロテインＧ表面によって、各抗体が非共有結合的に捕捉されるアッセイを使用して、各試験ＩｇＧとヒトアミロイドβ１−４２の間の結合親和性を推定した。対の１０ｍＭグリシンｐＨ２．０の４０秒間注入によって、リガンドおよび結合抗体除去し、サイクルとサイクルの間にチップ表面を再生した。次に各ペプチド注入毎に、試験抗体を再適用した。
信頼度をもって適切な結合モデルと適合させ得るセンサーグラムの観察に十分な時間にわたり、合成ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドの一連の希釈液（０．０６３〜１０２４ｎＭ）を抗体表面に順次通過させた。空試験参照フローセルデータを各ＩｇＧデータセットから減算し、ゼロ濃度抗体のみの緩衝液空試験を主要データセットから二重参照減算した。次にＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、各検体滴定からのデータに、適切な結合モデルを同時に適合させた。
２ＲＵ2未満を許容値として、計算されたカイ二乗値を使用して、データの妥当性を評価した。２ＲＵ未満の偏差を許容可能として、残差を使用して、適合の全体的な成功を推定した。
Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ（生殖系列化）ＩｇＧ１−ＴＭに関する例証的結果は、図１２に示される。結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、および解離定数（ＫD）は、それぞれ９．５２×１０5Ｍ-1ｓ-1、３．０７×１０-4ｓ-1、および３２２ｐＭである。これらのパラメータは、データへの１：１ラングミュア適合から誘導された。
３．１１ 表面プラズモン共鳴を使用した親和性最適化ＩｇＧの特異性プロファイリング
表面プラズモン共鳴を使用して、ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドの親和性最適化ＩｇＧの特異性を確認した。簡単に述べると、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）バイオセンサー装置を使用して、各試験ＩｇＧと、合成的に生成されたヒトアミロイドβ１−４２およびヒトアミロイドβ１−４０をはじめとする一連の小型ペプチドとの間の相互作用の動態学パラメータを評価した。これらの実験は、基本的に、Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）に記載されるようにして実施した。さらなる詳細は、セクション１．７を参照されたい。
それ自体が独自仕様のＣＭ５チップとアミン結合するプロテインＧ表面によって、抗体が非共有結合的に捕捉されるアッセイを使用して、各試験ＩｇＧと各ペプチドの間の相互作用を推定した。抗体とペプチドの間の相互作用は、５回の単一サイクルアプローチを使用して観察した。対の１０ｍＭグリシン、ｐＨ２．０の４０秒間注入によって、リガンドおよび結合抗体除去し、サイクルとサイクルの間にチップ表面を再生した。次に各ペプチド注入サイクル毎に、試験抗体を再適用した。
結合を示さない、または信頼度をもって適切な結合モデルと適合させ得る、のどちらかであるセンサーグラムを観察するのに十分な時間にわたり、各試験ペプチド（６４〜１０２４ｎＭ）を抗体表面に順次通過させた。空試験参照フローセルデータを各ＩｇＧデータセットから減算し、ゼロ濃度抗体のみの緩衝液空試験を主要データセットから二重参照減算した。
Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ（生殖系列化）ＩｇＧ１−ＴＭに関する例証的結果は、図１３に示される。２つのペプチド（ビオチン化ヒトアミロイドβ１−４２、（ｒＰｅｐｔｉｄｅ，ＵＳＡ；カタログ番号Ａ１１１７）および未標識マウスアミロイドβ１−４２（ｒＰｅｐｔｉｄｅ，ＵＳＡ；カタログ番号Ａ１００８）が抗体に対する強力な結合を示した一方で、２つのｏペプチドビオチン化ヒトアミロイドβ１−４０（ｒＰｅｐｔｉｄｅ，ＵＳＡ；カタログ番号Ａ１１１１）および未標識マウスアミロイドβ１−４０（ｒＰｅｐｔｉｄｅ，ＵＳＡ；カタログ番号Ａ１００７）は、抗体への結合を示さなかった。
３．１２ 試験管内免疫組織化学を使用した天然アミロイドβに対する最も強力なＩｇＧの親和性
アミロイドβペプチドの天然形態に対するこれらのクローンの親和性を推定する目的で、最も強力なＩｇＧをアミロイドβと結合するそれらの能力について試験した。簡単に述べると、ヒトアルツハイマー病脳切片およびＴｇ２５７６マウス脳切片上で、リード抗体をスクリーニングして、試験管内でアミロイドプラークと結合する抗アミロイドβ１−４２抗体を同定した。実験は、基本的に、セクション１．９に記載されるようにして実施した。
これらの実験では、２人の重度のアルツハイマー病がある個人（ＡｐｏＥ遺伝子型３／３、Ｂｒａａｋ段階６；およびＡｐｏＥ遺伝子型４／３、Ｂｒａａｋ段階５）の前頭皮質からヒト脳組織を単離した。対照として、対応する組織を１人の非認知症個人（ＡｐｏＥ遺伝子型３／３、Ｂｒａａｋ段階１）から単離した。マウス脳組織は、１５ヶ月（２匹）および２２ヶ月（２匹）齢のＴｇ２５７６マウスから単離した。抗体は、２、５、１０，および２０μｇ・ｍｌ-1の濃度で試験した。
一実験では、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ抗体は、Ｔｇ２５７６脳切片では４のスコアで、ヒトＡＤ脳切片では３のスコアで、コアプラーク（ＣＰ）を染色した。それはまた、びまん性プラーク（ＤＰ）および脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）プラークも染色したが、程度はより少なかった。対照的に、陽性対照抗体は、同一条件下において、隣接する切片上の全てのプラーク（ＣＰ、ＤＰ、ＣＡＡ）上で、３〜４のスコアを生じた。典型的な画像は、図１４に示される。
３．１３ ウエスタンブロットによってＡｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭのＡβ４２認識プロファイルを実証する
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ前にＡβ４２オリゴマーを架橋させるために、ＰＩＣＵＰ（ペプチドの光誘起架橋）を以下のように実施した。２μｌの原液（１０ｍＭ濃度）を１８μｌの１×ＰＢＳに添加して、１ｍＭのＲｕ（Ｂｐｙ）溶液を作成した。さらに、２μｌの原液（ａｔ２００ｍＭ）を１８μｌの１×ＰＢＳに添加して、２０ｍＭの過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）溶液を作成した。未使用原液は、ドライアイス上で即座にスナップ凍結し、−８０℃の冷凍庫に戻した。暗室で、５μｌのＲｕ（Ｂｐｙ）を８０μｌの凝集体（無希釈の１０μＭサンプル）に添加し、５μｌのＡＰＳがそれに続いた。暗室内で、サンプルをランプで１０秒間照射した。３０μｌの（４×）ＬＤＳサンプル緩衝液を即座に添加した。
次に架橋（ＰＩＣＵＰ）および非架橋Ａβ１−４２凝集体上で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。溶液を７０℃の熱ブロック上で、１０分間インキュベートした。その間に、５μｌのＭａｇｉｃ Ｍａｒｋ ＸＰ Ｗｅｓｔｅｒｎタンパク質標準物質、５μｌのＮｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ染色済タンパク質標準物質を組み合わせて、マーカーを作成した。１０分間のインキュベーション後、マーカー添加サンプルをＭＥＳ泳動用緩衝液と共に、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４〜１２％ビス−トリスゲル（１．０ｍｍ、１５ウェル、ウェルあたり１５μｌ）に装填した。ゲルを２００Ｖで、３５分間泳動した。
次にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｉＢｌｏｔ装置を使用して、ゲルをＰＶＤＦ膜上に、２０Ｖで７分間ブロットした（プログラムＰ３）。
ひとたびブロッティングが完結したら、ゲルスタックを分解し、次に室温で穏やかに回転させて、ＰＶＤＦ膜を５０ｍｌの４％ＭＰＢＳＴ（ＰＢＳＴ中の４％Ｍａｒｖｅｌ）中で１時間ブロックした。次にブロットを外科用メスで切断して、個々の抗体を探索した。これを一次抗体溶液（１０ｍｌの３％ＭＰＢＳＴ中の２μｇ／ｍｌ）と共に、１時間インキュベーションした。
次に膜をそれぞれ５分間にわたりＰＢＳＴで５回洗浄し、次に二次抗体溶液（１０ｍｌのＰＢＳＴ中の１μｌの抗ヒトＦｃ特異的ＨＲＰ抱合体）中で、室温で１時間インキュベートした。膜をそれぞれ５分間にわたりＰＢＳＴで３回、およびＰＢＳで２回洗浄した。
最後の洗浄中に、化学発光ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；３４０７５）が室温になるまで放置した。それぞれ６００μｌの２つの溶液を合わせた。ＰＢＳをＰＶＤＦ膜からデカントし、次にピペットを使用して、混合硬膜試薬で膜を覆った。反応を約５分間進行させ（その間にＶｅｒｓｃＤｏｃ造影システムを準備した）、次に（変換フィルターを使用する増強と共に）３０秒間の露光で画像を撮影した。典型的な画像を図１５に示す。
実施例４．生体内におけるＡｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ抗体の特異的機能応答を示す試験
４．１ 生体内遊離アミロイドβ１−４２ペプチドの低下によるＡｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭの機能特性評価
２５ｍＭのヒスチジン、７％のスクロース、０．０２％のｐ８０界面活性剤、ｐＨ６．０の投薬ビヒクルを用いた静脈注射によって、８週齢オスアルビノハーランスプラーグドーリー系ラット（ｎ＝８〜１２）に、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ抗体を５ｍｌ／ｋｇで単回投与した。投与液は、投薬直前に作成した。示される時点で動物を麻酔して、大槽から脳脊髄液（ＣＳＦ）を吸引した。試料採取の２０分間以内に、ＣＳＦサンプルを４℃でおよそ３０００×ｇで１０分間遠心分離して、細胞または壊死組織片を除去した。次に引き続く分析のために、サンプルをドライアイス上で凍結し、−７０℃で保存した。
動物を断頭によって殺処分し、脳組織を解剖して、ジエチルアミン（ＤＥＡ；Ｆｌｕｋａ，Ｓｉｇｍａ，ＵＫ；カタログ番号３１７２９）中で脳組織から、アミロイドβペプチドを抽出した。簡単に述べると、凍結脳組織を０．２％のＤＥＡおよび５０ｍＭのＮａＣｌ（Ｍｅｒｃｋ，ＵＳＡ；カタログ番号１．０６４０４．１０００）中で均質化した。脳ホモジネートを１３３，０００×ｇで１時間、超遠心分離した。回収された上清は、２ＭトリスＨＣｌ（ＴＲＩＺＭＡ（登録商標）塩酸塩；Ｓｉｇｍａ，ＵＫ；カタログ番号９３３６３）でｐＨ８．０に中和して、分析するまで−７０℃で保存した。動物実験は、スウェーデン農業庁（Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）によって提供される、該当するガイドラインおよび規制に従って実施された。倫理的認可は、動物実験専門の倫理委員会である、ストックホルム・セドラ（Ｓｏｅｄｒａ）動物実験倫理委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｂｏａｒｄ）によって提供された。
ラットＣＳＦ中の遊離アミロイドβ１−４２ペプチドの測定は、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ結合アミロイドβ１−４２ペプチドを除去する免疫沈降法と、それに続くＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られる市販のＥＬＩＳＡキットによる分析を使用して実施した。簡単に述べると、プロテインＡビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）プロテインＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＫ；カタログ番号１００−０２Ｄ）の溶液を９６ウェルノンスカートプレート（ポリプロピレン０．２ｍｌ；ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＵＫ；カタログ番号１０７３２−４８２８）に添加して、磁石（ＤｙｎａＭａｇ（商標）９６面；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＫ；カタログ番号１２３．３１Ｄ）を使用して、ＴＢＳＴ（５０ｍＭのＴＢＳ；Ｓｉｇｍａ，ＵＫ；カタログ番号Ｔ６６６４、０．１％のＴｗｅｅｎ２０添加）で２回洗浄し、溶液からビーズを分離した。解凍ラットＣＳＦサンプル（４０μｌ）を各ウェルに添加して、４０℃で１時間、傾斜回転させてインキュベートした。次に、磁石を使用してビーズをペレット化し、７０μｌの標準希釈緩衝液（プロテアーゼ阻害剤添加；Ｒｏｃｈｅ，ＵＫ；カタログ番号１１８３６１５３００１）を既に添加した、ＥＬＩＳＡキット（マウスアミロイドβ（１−４２）比色分析ＥＬＩＳＡキット；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＫ；カタログ番号ＫＭＢ３４４１）からの９６ウェルプレートに、３０μｌの免疫沈降ＣＳＦサンプルを移した。較正基準サンプルを二連でプレートに添加して、プレートを室温で振盪しながら２時間インキュベートした。プレートを４００μｌの洗浄緩衝液で４回洗浄し、１００μｌの検出抗体溶液を各ウェルに添加して、プレートを室温で振盪しながら１時間インキュベートした。再度プレートを４００μｌの洗浄緩衝液で４回洗浄し、１００μｌの二次抗体使用液を各ウェルに添加して、プレートを室温で振盪しながら３０分間インキュベートした。最後に、プレートを４００μｌの洗浄液緩衝液で４回洗浄し、１００μｌの安定化色素原を各ウェルに添加して、プレートを室温で３０分間、暗所でインキュベートした。反応を停止させるために１００μｌの停止液を各ウェルに添加して、４５０ｎｍの吸光度で、プレートを２時間以内に読み取った。単一ＣＳＦサンプルを分析して、多重比較のための調整なしの対数変換データ一上の一方向ＡＮＯＶＡによるＰｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ，ＵＳＡ）を使用して、データ解析を実施した。
ラット脳ホモジネート中の全（遊離およびＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ結合）アミロイドβ１−４２ペプチドの測定は、マウスアミロイドβ（１−４２）比色分析ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＫ；カタログ番号ＫＭＢ３４４１）の修正法を使用して実施した。キットの検出抗体を過剰なＡｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ抗体で置き換え、二次抗体を抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ抱合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ＵＫ；カタログ番号１０９−０３５−０９８）で置き換えた。簡単に述べると、サンプル希釈剤（プロテアーゼ阻害剤添加；Ｒｏｃｈｅ，ＵＫ；カタログ番号１１８３６１５３００１）で１：２に希釈した５０μｌの解凍脳ホモジネート、および標準サンプルを９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに二連で添加した。過剰なＡｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ抗体（５０μｌ、４μｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加して、次にプレートを室温で３時間インキュベートした。プレートを４００μｌの洗浄緩衝液で４回洗浄し、１００μｌの二次抗体使用液を各ウェルに添加して、プレートを室温で振盪しながら３０分間インキュベートした。最後に、プレートを４００μｌの洗浄液緩衝液で４回洗浄し、１００μｌの安定化色素原を各ウェルに添加して、プレートを室温で１５分間、暗所でインキュベートした。反応を停止させるために１００μｌの停止液を各ウェルに添加して、４５０ｎｍの吸光度で、プレートを２時間以内に読み取った。多重比較のための調整なしの対数変換データ一上の一方向ＡＮＯＶＡによるＰｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ，ＵＳＡ）を使用して、データ解析を実施した。
ラット脳ホモジネート中の全アミロイドβ１−４０ペプチドの測定は、マウスアミロイドβ（１−４０）比色分析ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＫ；カタログ番号ＫＭＢ３４８１）を使用して実施した。簡単に述べると、サンプル希釈剤（プロテアーゼ阻害剤添加；Ｒｏｃｈｅ，ＵＫ；カタログ番号１１８３６１５３００１）で希釈した５０μｌの解凍脳ホモジネート、および標準サンプルを９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに二連で添加した。５０μｌの検出抗体溶液を各ウェルに添加して、プレートを室温で３時間インキュベートした。プレートを４００μｌの洗浄緩衝液で４回洗浄し、１００μｌの二次抗体使用液を各ウェルに添加して、プレートを室温で振盪しながら３０分間インキュベートした。最後に、４００μｌの洗浄液緩衝液でプレートを４回洗浄し、１００μｌの安定化色素原を各ウェルに添加して、プレートを室温で３０分間、暗所でインキュベートした。反応を停止させるために１００μｌの停止液を各ウェルに添加して、４５０ｎｍの吸光度で、プレートを２時間以内に読み取った。多重比較のための調整なしの対数変換データ一上の一方向ＡＮＯＶＡによるＰｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ，ＵＳＡ）を使用して、データ解析を実施した。
４．２ 生体内遊離アミロイドβ１−４２ペプチドの低下によるＡｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭの機能特性評価
２０ｍｇ／ｋｇでのＡｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ抗体の単回投与は、セクション４．１に記載されるアッセイにおける投与の７２または１６８時間後に、ラット中で、定量化限界まで、ＣＳＦの遊離アミロイドβ１−４２ペプチドレベルを低下させた（データ示さず）。生体内におけるＡｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ抗体の効果をさらに調べるために、０．２５、０．５、１、５または１０ｍｇ／ｋｇの週間用量で、ラットに１４日間にわたり投与した。２回目の投与１６８時間後に、動物を安楽死させて、ＣＳＦ中の遊離アミロイドβ１−４２ペプチド、ならびに脳組織内の全アミロイドβ１−４２または１−４０ペプチドのレベルを測定した。
ＣＳＦ中の遊離アミロイドβ１−４２の用量依存性低下が実証された（図１６Ａ）。５および１０ｍｇ／ｋｇの２つの最大用量は、使用されたアッセイの定量化限界までアミロイドβ１−４２ペプチドを低下させた一方で、０．５および１ｍｇ／ｋｇの用量は、ビヒクル対照と比較して、アミロイドβ１−４２ペプチドをそれぞれ４７％および６１％に有意に低下させた。最低用量である０．２５ｍｇ／ｋｇは、ＣＳＦ中の遊離アミロイドβ１−４２ペプチドに１４％の低下を与えたが、統計的有意性には到達できなかった。Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ抗体によるアミロイドβ１−４２ペプチド隔離のために、全アミロイドβ１−４２ペプチドの用量依存的増大が、脳組織内で実証された（図１６Ｂ）。しかし脳組織内の全アミロイドβ１−４０ペプチドのレベルは影響を受けず（図１６Ｃ）、したがってアミロイドβ１−４２ペプチドに対するＡｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭの特異性が実証された。要約すると、ラット研究からの上の結果は、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ抗体が、０．５〜１ｍｇ／ｋｇのＥＤ50で、ＣＳＦ中の遊離アミロイドβ１−４２ペプチドのレベルを低下させることを示した。
４．３ Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１ＴＭの機能特性評価−生体内における非プラーク結合の実証−老化Ｔｇ２５７６マウスへの末梢投与の１６８時間後に生体内におけるアミロイドβプラークへのＡｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭの結合不在
単回末梢投与後に、老化Ｔｇ２５７６マウス中でアミロイドβプラークと結合する能力について、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭを試験した。動物実験は、スウェーデン農業庁によって提供される、該当するガイドラインおよび規制に従って実施された。倫理的認可は、動物実験専門の倫理委員会である、ストックホルム・セドラ動物実験倫理委員会によって提供された。
２５ｍＭのヒスチジン、７％のスクロース、０．０２％のｐ８０界面活性剤、ｐＨ６．０の投薬ビヒクルを用いた静脈注射によって、１７ヶ月齢メスＴｇ２５７６マウス（ｎ＝５）に、ビヒクル、３０ｍｇ／ｋｇの陽性対照抗体、あるいは１０または３０ｍｇ／ｋｇのＡｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ抗体を５ｍＬ／ｋｇで単回投与した。投与の１６８時間後に動物を深く麻酔して、室温ＰＢＳと、それに続く冷（４℃）リン酸緩衝４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で灌流した。次に動物を断頭によって殺処分し、脳を解剖して、ＰＦＡ中において４℃で７２時間浸漬固定した。０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで固定液を交換し、さらに処理するまで組織を４℃で保存した。
脳切片上で免疫組織化学的検査を実施して、生体内におけるアミロイドβプラークへのＡｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭの結合程度を評価した。簡単に述べると、セクション１．９に記載されるようにして、パラフィン包埋した脳切片を免疫組織化学的検査のために調製した。脳実質内に沈着したＡｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭまたは陽性対照抗体の検出は、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓからのウサギ−抗マウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２特異的二次抗体を使用して実施した。ＯｍｎｉＭａｐ検出システム（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を使用して、Ｖｅｎｔａｎａロボット上で染色を実施した。生体外添加では、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭまたは陽性対照抗体を過剰に注入して、連続組織切片を試験管内で染色した。二次抗体および色素原は、上記と同一であった。
染色の点数化は、１０倍の光学的倍率下で、盲検化様式で実施した。修飾プラークの分布が認められた。０（プラークの染色なし）からの最大４（プラークの強い修飾）の相対的強度尺度に従って、プラーク標識の強度を点数化した。
Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭは、生体内において、１０または３０ｍｇ／ｋｇの末梢投与の１６８時間後に、アミロイドβプラークまたは脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）を修飾しなかった。陽性対照抗体は、強から弱の生体内プラーク修飾を実証した。全ての動物において、コアプラーク、びまん性プラーク、およびＣＡＡで、部分的および限局性分散パターンが明白であった。典型的な画像は、図１７に示される。同一動物からの脳組織への、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭおよび陽性対照抗体の生体外添加は、先に実証された、注射された抗体の生体外プラーク結合能力を確認した（図示せず）。
実施例５．抗Ａβ１−４２配列
例証的抗体ＶＨ領域、ＶＬ領域、個々のＣＤＲ配列、ＨＣＤＲセット、ＬＣＤＲセット、およびフレームワーク領域をはじめとする抗体分子の例配列は、添付の配列表に列挙される。
表７に列挙される２４個の最適化クローンの配列を比較した。表１０および１１は、それぞれＶＨ領域とＶＬ領域の間の％配列同一性を示す。
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実施例６．競合結合実験におけるＡｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭの特異性
Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭの特異性を競合結合実験で検査した。手短に述べると、異なる濃度範囲（１０μＭ〜０．１７ｎＭ）の完全長、切断型、およびピロヒトＡβペプチド（Ａβ１−４２、Ａβ１−４３、Ａβ１−１６、Ａβ１２−２８、Ａβ１７−４２、Ａβピロ−３−４２、またはＡβピロ−１１−４２）のパネルを用いて、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ（０．５ｎＭ）を（室温で１時間）インキュベートした。
Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭとＡβペプチドＮ末端ビオチンの間のインキュベーションに続いて、Ａβ１−４２（１．５ｎＭ）を添加し、ユウロピウムクリプテート標識抗ヒトＦｃ抗体（０．８ｎＭ）（ＣｉｓＢｉｏカタログ番号６１ＨＦＣＫＬＢ）およびストレプトアビジン−ＸＬent!（５ｎＭ）（ＣｉｓＢｉｏカタログ番号６１１ＳＡＸＬＢ）がそれに続いた。次に、標準均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）読み取りプロトコルを使用して、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上で読み取る前に、アッセイを室温でさらに２時間インキュベートした。次に競合不在下で、ユウロピウムクリプテート供与体とＸＬ665受容体フルオロフォアの近接に起因する、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）を通じて、（それぞれ、ストレプトアビジン−ＸＬent!およびおよびユウロピウムクリプテート標識抗ヒトＦｃ抗体との複合体中の）Ｎ末端ビオチンＡβ１−４２とＡｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭの相互作用を評価し得た。したがって試験ペプチドによる、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ：Ｎ末端ビオチンＡβ１−４２相互作用の競合は、アッセイシグナルの低下をもたらした。結果は、％特異的結合として発現され、１００％特異的結合は、ストレプトアビジン−ＸＬent!（５ｎＭ）、Ｎ末端ビオチンＡβ１−４２（１．５ｎＭ）、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ（０．５ｎＭ）＆ユウロピウムクリプテート標識抗ヒトＦｃ抗体（０．８ｎＭ）を含有するウェルから得られた。０％特異的結合は、その中でＡｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭが省かれているウェルから得られた。
最終アッセイ容積は２０μｌであり、全ての試薬は、ＭＯＰＳ、ｐＨ７．４（５０ｍＭ）、フッ化カリウム（０．４Ｍ）、ツイーン２０（０．１％）、および脂肪酸非含有ＢＳＡ（０．１％）を含んでなるアッセイ緩衝液中で調製した。アッセイは、低容量３８４ウェル黒色アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３６７６）内で実施した。
要約すると、１０-8〜１０-9のモル濃度範囲のＩＣ50値のＡβ１−４２、Ａβ１−４３、Ａβ１７−４２、Ａβピロ−３−４２、およびＡβピロ−１１−４２による、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１−ＴＭ：Ｎ末端ビオチンＡβ１−４２結合の阻害が、このグループで観察された。Ａβ１−１６またはＡβ１２−２８による、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬのＩｇＧ１２−ＴＭ：Ｎ末端ビオチンＡβ１−４２結合の阻害は観察されなかった（図１８）。
実施例７．正常ラットＰＫ−ＰＤ研究におけるアミロイドβ１−４２を隔離する抗体Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬの能力
正常ラット中のＰＫ−ＰＤ研究において、アミロイドβ１−４２を隔離する抗体Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬの能力を調べた。ラットに、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬ（１０または４０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルを２週間にわたり毎週（０および７日目に）静脈内投与して、２回目の投与後に殺処分した。遊離および全アミロイドβ１−４２測定のためにＣＳＦを採取し、全アミロイドβ１−４２測定のために脳を採取した。上述のアッセイを使用して、遊離および全アミロイドβ１−４２レベルを評価した。
図１９に示されるように、ＣＳＦ中の遊離アミロイドβ１−４２は、１０または４０ｍｇ／ｋｇのＡｂｅｔ０１４４−ＧＬのいずれも有意に変化させなかった（ビヒクルと比較してそれぞれ５および１８％の増大；図１９）。ＣＳＦ中の全アミロイドβ１−４２は、１０ｍｇ／ｋｇで３８％、４０ｍｇ／ｋｇで１３９％有意に増大した。脳組織内の全アミロイドβ１−４２もまた、１０および４０ｍｇ／ｋｇで、それぞれ１６％および５０％有意に増大した。要約すると、正常ラットにおけるこの研究からのデータは、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬが、ＣＳＦ中の遊離アミロイドβ１−４２レベルに対して顕著な効果を有しない一方で、ＣＳＦおよび脳の双方において全アミロイドβ１−４２レベルを増大させることを実証した。これは、標的に対する数１０ｎＭ範囲の親和性がある抗体について、予測されるプロファイルであった。
参考文献
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Ｇｌａｂｅ，Ｃ．（２０００）．Ｄｏｅｓ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｉｌｔ ｔｈｅ ｓｃａｌｅｓ ｏｆ ａｍｙｌｏｉｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｖｅｒｓｕｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ？ Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６，１３３−１３４．
Ｇｏｌｄｅ，Ｔ．Ｅ．，Ｄａｓ，Ｐ．ａｎｄ Ｌｅｖｉｔｅｓ，Ｙ．（２００９）．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ａｂ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．ＣＮＳ ＆ Ｎｅｕｒｏ．Ｄｉｓ．−Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ８，３１−４９
Ｇｒｅｅｖｅ，Ｉ．，Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ，Ｄ．，Ｔｓｃｈａｐｅ，Ｊ．Ａ．，Ｂｅｙｎ，Ａ．，Ｂｒｅｌｌｉｎｇｅｒ，Ｃ．，Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｍ．，Ｎｉｔｓｃｈ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｒｅｉｆｅｇｅｒｓｔｅ，Ｒ．（２００４）．Ａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ−ａｍｙｌｏｉｄ ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４，３８９９−３９０６．
Ｇｒｏｖｅｓ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ Ｏｓｂｏｕｒｎ，Ｊ．Ｋ．（２００５）．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５，１２５−１３５．
Ｈａｎｅｓ，Ｊ．，Ｊｅｒｍｕｔｕｓ，Ｌ．ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（２０００）．Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｖｏｌｖｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２８，４０４−４３０．
Ｈａｎｅｓ，Ｊ．ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（１９９７）．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４，４９３７−４９４２．
Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｒ．Ｅ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．（１９９２）．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ．Ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６，８８９−８９６．
Ｈｏｅｔ，Ｒ．Ｍ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｅ．Ｈ．，Ｋｅｎｔ，Ｒ．Ｂ．，Ｒｏｏｋｅｙ，Ｋ．，Ｓｃｈｏｏｎｂｒｏｏｄｔ，Ｓ．，Ｈｏｇａｎ，Ｓ．，Ｒｅｍ，Ｌ．，Ｆｒａｎｓ，Ｎ．，Ｄａｕｋａｎｄｔ，Ｍ．，Ｐｉｅｔｅｒｓ，Ｈ．，ｖａｎ Ｈｅｇｅｌｓｏｍ，Ｒ．，Ｎｅｅｒ，Ｎ．Ｃ．，Ｎａｓｔｒｉ，Ｈ．Ｇ．，Ｒｏｎｄｏｎ，Ｉ．Ｊ．，Ｌｅｅｄｓ，Ｊ．Ａ．，Ｈｕｆｔｏｎ，Ｓ．Ｅ．，Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｋａｓｈｉｎ，Ｉ．，Ｄｅｖｌｉｎ，Ｍ．，Ｋｕａｎｇ，Ｇ．，Ｓｔｅｕｋｅｒｓ，Ｍ．，Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ，Ｍ．，Ｎｉｘｏｎ，Ａ．Ｅ．，Ｓｅｘｔｏｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ａｎｄ Ｌａｄｎｅｒ，Ｒ．Ｃ．（２００５）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｄｏｎｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ−ｒｅｇｉｏｎ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，３４４−３４８．
Ｉｉｊｉｍａ，Ｋ．，Ｌｉｕ，Ｈ．Ｐ．，Ｃｈｉａｎｇ，Ａ．Ｓ．，Ｈｅａｒｎ，Ｓ．Ａ．，Ｋｏｎｓｏｌａｋｉ，Ｍ．ａｎｄ Ｚｈｏｎｇ，Ｙ．（２００４）．Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ａｂｅｔａ４０ ａｎｄ Ａｂｅｔａ４２ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ：ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１，６６２３−６６２８．
Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．，Ｍｉｃｈａｅｌｓｓｏｎ，Ａ．ａｎｄ Ｍａｔｔｓｓｏｎ，Ｌ．（１９９１）．Ｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ａ ｎｅｗ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４５，２２９−２４０．
Ｋｕｐｅｒｓｔｅｉｎ，Ｉ．，Ｂｒｏｅｒｓｅｎ，Ｋ．，Ｂｅｎｉｌｏｖａ，Ｉ．，Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ．，Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ，Ｗ．，Ｄｅｂｕｌｐａｅｐ，Ｍ．，Ｖａｎｄｅｒｓｔｅｅｎ，Ａ．，Ｓｅｇｅｒｓ−Ｎｏｌｔｅｎ，Ｉ．，Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｗｅｒｆ，Ｋ．，Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ，Ｖ．，Ｂｒａｅｋｅｎ，Ｄ．，Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ，Ｇ．，Ｂａｒｔｉｃ，Ｃ．，Ｄ’Ｈｏｏｇｅ，Ｒ．，Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｉ．Ｃ．，Ｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｆ．，Ｓｃｈｙｍｋｏｗｉｔｚ，Ｊ．ａｎｄ Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒ，Ｂ．（２０１０）．Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ Ａｂｅｔａ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｓｍａｌｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ａｂｅｔａ４２ ｔｏ Ａｂｅｔａ４０ ｒａｔｉｏ．ＥＭＢＯ Ｊ．２９，３４０８−３４２０．
Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐ．，Ｂａｒｌｏｗ，Ａ．Ｋ．，Ｃｈｒｏｍｙ，Ｂ．Ａ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｃ．，Ｆｒｅｅｄ，Ｒ．，Ｌｉｏｓａｔｏｓ，Ｍ．，Ｍｏｒｇａｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｒｏｚｏｖｓｋｙ，Ｉ．，Ｔｒｏｍｍｅｒ，Ｂ．，Ｖｉｏｌａ，Ｋ．Ｌ．，Ｗａｌｓ，Ｐ．，Ｚｈａｎｇ，Ｃ．，Ｆｉｎｃｈ，Ｃ．Ｅ．，Ｋｒａｆｆｔ，Ｇ．Ａ．ａｎｄ Ｋｌｅｉｎ，Ｗ．Ｌ．（１９９８）．Ｄｉｆｆｕｓｉｂｌｅ，ｎｏｎｆｉｂｒｉｌｌａｒ ｌｉｇａｎｄｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ａｂｅｔａ１−４２ ａｒｅ ｐｏｔｅｎｔ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５，６４４８−６４５３．
Ｌｅｖｉｔｅｓ，Ｙ．，Ｄａｓ，Ｐ．，Ｐｒｉｃｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｒｏｃｈｅｔｔｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｋｏｓｔｕｒａ，Ｌ．Ａ．，ＭｃＧｏｗａｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍ．Ｐ．ａｎｄ Ｇｏｌｄｅ，Ｔ．Ｅ．（２００６）．Ａｎｔｉ−Ａｂｅｔａ４２−ａｎｄ ａｎｔｉ−Ａｂｅｔａ４０−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍＡｂｓ ａｔｔｅｎｕａｔｅ ａｍｙｌｏｉｄ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ａｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６，１９３−２０１．
Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｙ．，Ｓａｉｔｏ，Ｍ．，ＬａＦｒａｎｃｏｉｓ，Ｊ．，Ｓａｉｔｏ，Ｍ．，Ｇａｙｎｏｒ，Ｋ．，Ｏｌｍ，Ｖ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｃａｓｅｙ，Ｅ．，Ｌｕ，Ｙ．，Ｓｈｉｒａｔｏｒｉ，Ｃ．，Ｌｅｍｅｒｅ，Ｃ．ａｎｄ Ｄｕｆｆ，Ｋ．（２００３）．Ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｇｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔｏ ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３，２９−３３．
ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．，Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｋ．Ｊ．，Ｅａｒｎｓｈａｗ，Ｊ．，Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｌｉｎｋ，Ｊ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．ａｎｄ Ｋｅｎｔｅｎ，Ｊ．（１９９４）．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｔｈａｔ ｂｉｎｄ ａ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ−ｓｔａｔｅ ａｎａｌｏｇ ｂｙ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４７，１５７−１７１；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ １７１−１５３．
ＭｃＧｏｗａｎ，Ｅ．，Ｐｉｃｋｆｏｒｄ，Ｆ．，Ｋｉｍ，Ｊ．，Ｏｎｓｔｅａｄ，Ｌ．，Ｅｒｉｋｓｅｎ，Ｊ．，Ｙｕ，Ｃ．，Ｓｋｉｐｐｅｒ，Ｌ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍ．Ｐ．，Ｂｅａｒｄ，Ｊ．，Ｄａｓ，Ｐ．，Ｊａｎｓｅｎ，Ｋ．，Ｄｅｌｕｃｉａ，Ｍ．，Ｌｉｎ，Ｗ．Ｌ．，Ｄｏｌｉｏｓ，Ｇ．，Ｗａｎｇ，Ｒ．，Ｅｃｋｍａｎ，Ｃ．Ｂ．，Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．，Ｈｕｔｔｏｎ，Ｍ．，Ｈａｒｄｙ，Ｊ．ａｎｄ Ｇｏｌｄｅ，Ｔ．（２００５）．Ａｂｅｔａ４２ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ａｍｙｌｏｉｄ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｎｅｕｒｏｎ ４７，１９１−１９９．
Ｍｕｃｋｅ，Ｌ．，Ｍａｓｌｉａｈ，Ｅ．，Ｙｕ，Ｇ．Ｑ．，Ｍａｌｌｏｒｙ，Ｍ．，Ｒｏｃｋｅｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｔａｔｓｕｎｏ，Ｇ．，Ｈｕ，Ｋ．，Ｋｈｏｌｏｄｅｎｋｏ，Ｄ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄ，Ｋ．ａｎｄ ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ，Ｌ．（２０００）．Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｂｅｔａ １−４２ ｉｎ ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ｈｕｍａｎ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ：ｓｙｎａｐｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０，４０５０−４０５８．
Ｏｇａｎｅｓｙａｎ，Ｖ．，Ｇａｏ，Ｃ．，Ｓｈｉｒｉｎｉａｎ，Ｌ．，Ｗｕ，Ｈ．ａｎｄ Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．（２００８）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ Ｆｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｆｏｒ ｌａｃｋ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６４，７００−７０４．
Ｏｒｇｏｇｏｚｏ，Ｊ．Ｍ．，Ｇｉｌｍａｎ，Ｓ．，Ｄａｒｔｉｇｕｅｓ，Ｊ．Ｆ．，Ｌａｕｒｅｎｔ，Ｂ．，Ｐｕｅｌ，Ｍ．，Ｋｉｒｂｙ，Ｌ．Ｃ．，Ｊｏｕａｎｎｙ，Ｐ．，Ｄｕｂｏｉｓ，Ｂ．，Ｅｉｓｎｅｒ，Ｌ．，Ｆｌｉｔｍａｎ，Ｓ．，Ｍｉｃｈｅｌ，Ｂ．Ｆ．，Ｂｏａｄａ，Ｍ．，Ｆｒａｎｋ，Ａ．ａｎｄ Ｈｏｃｋ，Ｃ．（２００３）．Ｓｕｂａｃｕｔｅ ｍｅｎｉｎｇｏｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｉｎ ａ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＡＤ ａｆｔｅｒ Ａｂｅｔａ４２ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ６１，４６−５４．
Ｏｓｂｏｕｒｎ，Ｊ．Ｋ．，Ｆｉｅｌｄ，Ａ．，Ｗｉｌｔｏｎ，Ｊ．，Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ，Ｅ．，Ｅａｒｎｓｈａｗ，Ｊ．Ｃ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ｔ．，Ａｌｌｅｎ，Ｄ．ａｎｄ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．（１９９６）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐａｎｅｌ ｏｆ ｒｅｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｃＦｖ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ＣＥＡ．Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２，１８１−１９６．
Ｐｅｒｓｉｃ，Ｌ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．，Ｗｉｌｔｏｎ，Ｊ．，Ｃａｔｔａｎｅｏ，Ａ．，Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ａ．ａｎｄ Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．（１９９７）．Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｒ ｔｈｅｉｒ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｆｔｅｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｇｅｎｅ １８７，９−１８．
Ｐｏｒｔｅｌｉｕｓ，Ｅ．，Ｂｏｇｄａｎｏｖｉｃ，Ｎ．，Ｇｕｓｔａｖｓｓｏｎ，Ｍ．Ｋ．，Ｖｏｌｋｍａｎｎ，Ｉ．，Ｂｒｉｎｋｍａｌｍ，Ｇ．，Ｚｅｔｔｅｒｂｅｒｇ，Ｈ．，Ｗｉｎｂｌａｄ，Ｂ．ａｎｄ Ｂｌｅｎｎｏｗ，Ｋ．（２０１０）．Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ ｉｓｏｆｏｒｍ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｉｎ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｎｄ ｓｐｏｒａｄｉｃ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１２０，１８５−１９３．
Ｐｒｉｄｅ，Ｍ．，Ｓｅｕｂｅｒｔ，Ｐ．，Ｇｒｕｎｄｍａｎ，Ｍ．，Ｈａｇｅｎ，Ｍ．，Ｅｌｄｒｉｄｇｅ，Ｊ．ａｎｄ Ｂｌａｃｋ，Ｒ．Ｓ．（２００８）．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｉｎｔｏ ＡＮ１７９２−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｅｎｉｎｇｏｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ．Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ．Ｄｉｓ．５，１９４−１９６．
Ｓｃｈｅｎｋ，Ｄ．，Ｂａｒｂｏｕｒ，Ｒ．，Ｄｕｎｎ，Ｗ．，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｇ．，Ｇｒａｊｅｄａ，Ｈ．，Ｇｕｉｄｏ，Ｔ．，Ｈｕ，Ｋ．，Ｈｕａｎｇ，Ｊ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄ，Ｋ．，Ｋｈａｎ，Ｋ．，Ｋｈｏｌｏｄｅｎｋｏ，Ｄ．，Ｌｅｅ，Ｍ．，Ｌｉａｏ，Ｚ．，Ｌｉｅｂｅｒｂｕｒｇ，Ｉ．，Ｍｏｔｔｅｒ，Ｒ．，Ｍｕｔｔｅｒ，Ｌ．，Ｓｏｒｉａｎｏ，Ｆ．，Ｓｈｏｐｐ，Ｇ．，Ｖａｓｑｕｅｚ，Ｎ．，Ｖａｎｄｅｖｅｒｔ，Ｃ．，Ｗａｌｋｅｒ，Ｓ．，Ｗｏｇｕｌｉｓ，Ｍ．，Ｙｅｄｎｏｃｋ，Ｔ．，Ｇａｍｅｓ，Ｄ．ａｎｄ Ｓｅｕｂｅｒｔ，Ｐ．（１９９９）．Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ−ｄｉｓｅａｓｅ−ｌｉｋｅ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ｔｈｅ ＰＤＡＰＰ ｍｏｕｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４００，１７３−１７７．
Ｓｃｈｅｎｋ，Ｄ．Ｂ．，Ｓｅｕｂｅｒｔ，Ｐ．，Ｌｉｅｂｅｒｂｕｒｇ，Ｉ．ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，Ｊ．（２０００）．ｂｅｔａ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ：ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｎｅｗ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．５７，９３４−９３６．
Ｓｃｈｅｕｎｅｒ，Ｄ．，Ｅｃｋｍａｎ，Ｃ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｍ．，Ｓｏｎｇ，Ｘ．，Ｃｉｔｒｏｎ，Ｍ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｎ．，Ｂｉｒｄ，Ｔ．Ｄ．，Ｈａｒｄｙ，Ｊ．，Ｈｕｔｔｏｎ，Ｍ．，Ｋｕｋｕｌｌ，Ｗ．，Ｌａｒｓｏｎ，Ｅ．，Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄ，Ｅ．，Ｖｉｉｔａｎｅｎ，Ｍ．，Ｐｅｓｋｉｎｄ，Ｅ．，Ｐｏｏｒｋａｊ，Ｐ．，Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．，Ｔａｎｚｉ，Ｒ．，Ｗａｓｃｏ，Ｗ．，Ｌａｎｎｆｅｌｔ，Ｌ．，Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．ａｎｄ Ｙｏｕｎｋｉｎ，Ｓ．（１９９６）．Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｎｉｌｅ ｐｌａｑｕｅｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｙ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ １ ａｎｄ ２ ａｎｄ ＡＰＰ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｆａｍｉｌｉａｌ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２，８６４−８７０．
Ｓｃｈｉｅｒ，Ｒ．，Ｂｙｅ，Ｊ．，Ａｐｅｌｌ，Ｇ．，ＭｃＣａｌｌ，Ａ．，Ａｄａｍｓ，Ｇ．Ｐ．，Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ，Ｍ．，Ｗｅｉｎｅｒ，Ｌ．Ｍ．ａｎｄ Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．（１９９６）．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−ｃ−ｅｒｂＢ−２ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｕｓｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｄｒｉｖｅｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５，２８−４３．
Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．（１９９９）．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎｔｏ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ ３９９，Ａ２３−３１．
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．，Ｐｏｐｅ，Ｔ．，Ｔｕｎｇ，Ｊ．Ｓ．，Ｃｈａｎ，Ｃ．，Ｈｏｌｌｉｓ，Ｇ．，Ｍａｒｋ，Ｇ．ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９９６）．Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｌｏｏｐ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ：ｕｓｅ ｏｆ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｂｒｏａｄｅｎ ｓｔｒａｉｎ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５６，７７−８８．
Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．，Ｗａｌｔｅｒ，Ｇ．，Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｌｌｅｗｅｌｙｎ，Ｍ．Ｂ．ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．（１９９２）．Ｔｈｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ＶＨ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ａｂｏｕｔ ｆｉｆｔｙ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ＶＨ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｌｏｏｐｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７，７７６−７９８．
Ｖａｓｓａｒ，Ｒ．，Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｂ．Ｄ．，Ｂａｂｕ−Ｋｈａｎ，Ｓ．，Ｋａｈｎ，Ｓ．，Ｍｅｎｄｉａｚ，Ｅ．Ａ．，Ｄｅｎｉｓ，Ｐ．，Ｔｅｐｌｏｗ，Ｄ．Ｂ．，Ｒｏｓｓ，Ｓ．，Ａｍａｒａｎｔｅ，Ｐ．，Ｌｏｅｌｏｆｆ，Ｒ．，Ｌｕｏ，Ｙ．，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｓ．，Ｆｕｌｌｅｒ，Ｊ．，Ｅｄｅｎｓｏｎ，Ｓ．，Ｌｉｌｅ，Ｊ．，Ｊａｒｏｓｉｎｓｋｉ，Ｍ．Ａ．，Ｂｉｅｒｅ，Ａ．Ｌ．，Ｃｕｒｒａｎ，Ｅ．，Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｔ．，Ｌｏｕｉｓ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｆ．，Ｔｒｅａｎｏｒ，Ｊ．，Ｒｏｇｅｒｓ，Ｇ．ａｎｄ Ｃｉｔｒｏｎ，Ｍ．（１９９９）．Ｂｅｔａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ａｓｐａｒｔｉｃ ｐｒｏｔｅａｓｅ ＢＡＣＥ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６，７３５−７４１．
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Ｗａｌｓｈ，Ｄ．Ｍ．，Ｋｌｙｕｂｉｎ，Ｉ．，Ｓｈａｎｋａｒ，Ｇ．Ｍ．，Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｍ．，Ｆａｄｅｅｖａ，Ｊ．Ｖ．，Ｂｅｔｔｓ，Ｖ．，Ｐｏｄｌｉｓｎｙ，Ｍ．Ｂ．，Ｃｌｅａｒｙ，Ｊ．Ｐ．，Ａｓｈｅ，Ｋ．Ｈ．，Ｒｏｗａｎ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．（２００５ａ）．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ ｏｆ Ａｂｅｔａ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ａｖｅｎｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３３，１０８７−１０９０．
Ｗａｌｓｈ，Ｄ．Ｍ．，Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｍ．，Ｐｏｄｌｉｓｎｙ，Ｍ．Ｂ．，Ｓｈａｎｋａｒ，Ｇ．Ｍ．，Ｆａｄｅｅｖａ，Ｊ．Ｖ．，Ｅｌ Ａｇｎａｆ，Ｏ．，Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．（２００５ｂ）．Ｃｅｒｔａｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ−ｐｅｐｔｉｄｅ（Ａｂｅｔａ）ｆｉｂｒｉｌｌｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｌｏｃｋ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ Ａｂｅｔａ ａｎｄ ｔｈｅｒｅｂｙ ｒｅｓｃｕｅ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５，２４５５−２４６２．
Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｗ．，Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，Ｊ．Ｆ．，Ｋｕｏ，Ｈ．，Ｒｉｓｔｉｃ，Ｈ．，Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐ．，Ｃｈｒｏｍｙ，Ｂ．，Ｖｉｏｌａ，Ｋ．Ｌ．，Ｋｌｅｉｎ，Ｗ．Ｌ．，Ｓｔｉｎｅ，Ｗ．Ｂ．，Ｋｒａｆｆｔ，Ｇ．Ａ．ａｎｄ Ｔｒｏｍｍｅｒ，Ｂ．Ｌ．（２００２）．Ｓｏｌｕｂｌｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ ｏｆ ｂｅｔａ ａｍｙｌｏｉｄ（１−４２）ｉｎｈｉｂｉｔ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒａｔ ｄｅｎｔａｔｅ ｇｙｒｕｓ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．９２４，１３３−１４０．
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Ｗｉｌｃｏｃｋ，Ｄ．Ｍ．，Ａｌａｍｅｄ，Ｊ．，Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｌ，Ｐ．Ｅ．，Ｇｒｉｍｍ，Ｊ．，Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ａ．，Ｐｏｎｓ，Ｊ．，Ｒｏｎａｎ，Ｖ．，Ｓｙｍｍｏｎｄｓ，Ｋ．，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｍ．Ｎ．ａｎｄ Ｍｏｒｇａｎ，Ｄ．（２００６）．Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉ−ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｅｌｉｍｉｎａｔｅ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｅｆｉｃｉｔｓ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅ ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ｗｉｔｈ ｍｉｎｉｍａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ａｇｅｄ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２６，５３４０−５３４６．
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Claims (23)

  1. ヒトアミロイドβ１−４０ペプチド（Ａβ１−４０）に比べて、ヒトアミロイドβ１−４２ペプチド（Ａβ１−４２）との結合について選択的である単離抗体分子であって、
    （ｉ）ＨＣＤＲのアミノ酸配列が、
    ＨＣＤＲ１配列番号５２５、
    ＨＣＤＲ２配列番号５２６、および
    ＨＣＤＲ３配列番号５２７である、
    フレームワーク領域が散在するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３のＨＣＤＲセットを含んでなるＶＨ領域、ならびに
    （ｉｉ）ＬＣＤＲのアミノ酸配列が、
    ＬＣＤＲ１配列番号５３４
    ＬＣＤＲ２配列番号５３５、および
    ＬＣＤＲ３配列番号５３６である、フレームワーク領域が散在するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のＬＣＤＲセットを含んでなるＶＬ領域
    を含んでなる、抗体分子。
  2. 前記ＶＨ領域が、重鎖フレームワーク領域ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３、およびＦＷ４を含んでなり、前記重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列が、
    ＦＷ１配列番号５２８
    ＦＷ２配列番号５２９
    ＦＷ３配列番号５３０、および
    ＦＷ４配列番号５３１である、
    請求項１に記載の単離抗体分子。
  3. 前記ＶＬ領域が、軽鎖フレームワーク領域ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３、およびＦＷ４を含んでなり、前記軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列が、
    ＦＷ１配列番号５３７
    ＦＷ２配列番号５３８
    ＦＷ３配列番号５３９、および
    ＦＷ４配列番号５４０である、請求項１または２に記載の単離抗体分子。
  4. ａ）配列番号５２４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるＶＨ領域、およびｂ）配列番号５３３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるＶＬ領域を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離抗体分子。
  5. ＶＨ領域アミノ酸配列番号５２４およびＶＬ領域アミノ酸配列番号５３３を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離抗体分子。
  6. 可溶性単量体ヒトＡβ１−４２および低ｎオリゴマー（五量体以下）ヒトＡβ１−４２と結合できる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離抗体分子。
  7. ５００ｐＭ以下の解離定数（Ｋ D ）で、単量体Ａβ１−４２と結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離抗体分子。
  8. Ａβ１−４０と結合しないか、または１ｍＭを超えるＫ D でＡβ１−４０と結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離抗体分子。
  9. アミロイドベータ１７−４２ペプチド（Ａβ１７−４２）、およびアミロイドベータ２９−４２ペプチド（Ａβ２９−４２）と結合する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離抗体分子。
  10. ３ピロ−４２アミロイドベータペプチドおよび１１ピロ−４２アミロイドベータペプチドと結合する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離抗体分子。
  11. アミロイドベータ１−４３ペプチド（Ａβ１−４３）と結合する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離抗体分子。
  12. ヒトＩｇＧである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離抗体分子。
  13. ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ２である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離抗体分子。
  14. ヒトＩｇＧ１−ＴＭ、ＩｇＧ１−ＹＴＥまたはＩｇＧ１−ＴＭ−ＹＴＥである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離抗体分子。
  15. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の有効量の抗体分子と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる、アミロイドベータに伴う疾患の治療で使用するための組成物。
  16. 人体または動物体の治療のための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の有効量の抗体分子を含んでなる組成物。
  17. アミロイドーシスの低下、アルツハイマー病の治療、アルツハイマー病またはダウン症候群患者における認知力の改善または認知低下の低減のための、請求項１６に記載の組成物。
  18. 個体における黄斑変性の治療のための、請求項１６に記載の組成物。
  19. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体分子をコードする、単離核酸。
  20. 請求項１９に記載の核酸で試験管内で形質転換された、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体分子を生産するための、宿主細胞。
  21. 前記抗体分子を生成する条件下で、請求項２０に記載の宿主細胞を培養するステップを含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体分子を生成する方法。
  22. 前記抗体分子を単離および／または精製するステップをさらに含んでなる、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記抗体分子を少なくとも１つの追加的な成分を含んでなる組成物に調合するステップをさらに含んでなる、請求項２２に記載の方法。
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