JP7436449B2 - 抗aベータ抗体、その抗原結合フラグメントおよびそれらの用途 - Google Patents
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Description
(1)配列番号:11、17または23に示した重鎖HCDR1領域のアミノ酸配列;
(2)配列番号:12、18、24または52に示した重鎖HCDR2領域のアミノ酸配列;
(3)配列番号:13、19、25または27に示した重鎖HCDR3領域のアミノ酸配列;
(4)配列番号:14または20に示した軽鎖LCDR1領域のアミノ酸配列;
(5)配列番号:15または21に示した軽鎖LCDR2領域のアミノ酸配列;および
(6)配列番号:16、22、26または53に示した軽鎖LCDR3領域のアミノ酸配列。
(i)配列番号:11、12および13のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体重鎖HCDR1、HCDR2およびHCDR3領域;
(ii)配列番号:17、18および19のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体重鎖HCDR1、HCDR2およびHCDR3領域;
(iii)配列番号:23、24および25のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体重鎖HCDR1、HCDR2およびHCDR3領域;
(iv)配列番号:17、18および27のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体重鎖HCDR1、HCDR2およびHCDR3領域;
(v)配列番号:17、52および19のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体重鎖HCDR1、HCDR2およびHCDR3領域;
(vi)配列番号:17、52および27のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体重鎖HCDR1、HCDR2およびHCDR3領域;
および/または
(vii)配列番号:14、15および16のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体軽鎖LCDR1、LCDR2およびLCDR3領域;
(viii)配列番号:20、21および22のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体軽鎖LCDR1、LCDR2およびLCDR3領域;
(viiii)配列番号:20、21および26のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体軽鎖LCDR1、LCDR2およびLCDR3領域;または
(x)配列番号:20、21および53のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体軽鎖LCDR1、LCDR2およびLCDR3領域。
A)配列番号:11のアミノ酸配列に示した重鎖HCDR1領域、配列番号:12のアミノ酸配列に示した重鎖HCDR2領域および配列番号:13のアミノ酸配列に示した重鎖HCDR3領域、ならびに配列番号:14のアミノ酸配列に示した軽鎖LCDR1領域、配列番号:15のアミノ酸配列に示した軽鎖LCDR2領域および配列番号:16のアミノ酸配列に示した軽鎖LCDR3領域を含む、抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント;
B)配列番号:17のアミノ酸配列に示した重鎖HCDR1領域、配列番号:18または52のアミノ酸配列に示した重鎖HCDR2領域および配列番号:19のアミノ酸配列に示した重鎖HCDR3領域、ならびに配列番号:20のアミノ酸配列に示した軽鎖LCDR1領域、配列番号:21のアミノ酸配列に示した軽鎖LCDR2領域および配列番号:22のアミノ酸配列に示した軽鎖LCDR3領域を含む、抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント;
C)配列番号:23のアミノ酸配列に示した重鎖HCDR1領域、配列番号:24のアミノ酸配列に示した重鎖HCDR2領域および配列番号:25のアミノ酸配列に示した重鎖HCDR3領域、ならびに配列番号:20のアミノ酸配列に示した軽鎖LCDR1領域、配列番号:21のアミノ酸配列に示した軽鎖LCDR2領域および配列番号:26または53のアミノ酸配列に示した軽鎖LCDR3領域を含む、抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント;および
D)配列番号:17のアミノ酸配列に示した重鎖HCDR1領域、配列番号:18または52のアミノ酸配列に示した重鎖HCDR2領域および配列番号:27のアミノ酸配列に示した重鎖HCDR3領域、ならびに配列番号:20のアミノ酸配列に示した軽鎖LCDR1領域、配列番号:21のアミノ酸配列に示した軽鎖LCDR2領域および配列番号:22のアミノ酸配列に示した軽鎖LCDR3領域を含む、抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
前記抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号:4、6、8もしくは10に示されるか、またはそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有する。
E)配列番号:3のアミノ酸配列に示した重鎖可変領域と配列番号:4のアミノ酸配列に示した軽鎖可変領域とを含む、抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント;
F)配列番号:5のアミノ酸配列に示した重鎖可変領域と配列番号:6のアミノ酸配列に示した軽鎖可変領域とを含む、抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント;
G)配列番号:7のアミノ酸配列に示した重鎖可変領域と配列番号:8のアミノ酸配列に示した軽鎖可変領域とを含む、抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント;および
H)配列番号:9のアミノ酸配列に示した重鎖可変領域と配列番号:10のアミノ酸配列に示した軽鎖可変領域とを含む、抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
前記抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号:45、47、49または51に示されるか、またはそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有する。
a)抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、当該抗体の重鎖可変領域は、配列番号:44に示した重鎖可変領域に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、当該抗体の軽鎖可変領域は、配列番号:45に示した軽鎖可変領域に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント;
b)抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、当該抗体の重鎖可変領域は、配列番号:46に示した重鎖可変領域に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、当該抗体の軽鎖可変領域は、配列番号:47に示した軽鎖可変領域に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント;
c)抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、当該抗体の重鎖可変領域は、配列番号:48に示した重鎖可変領域に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、当該抗体の軽鎖可変領域は、配列番号:49に示した軽鎖可変領域に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント;および
d)抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、当該抗体の重鎖可変領域は、配列番号:50に示した重鎖可変領域に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、当該抗体の軽鎖可変領域は、配列番号:51に示した軽鎖可変領域に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。ここで、上記の少なくとも90%の配列同一性には、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性が含まれる。
a)配列番号:11、配列番号:12および配列番号:13にそれぞれ示したHCDR1、HCDR2およびHCDR3、ならびに1E、71Aおよび94Rからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸復帰突然変異を含有するFR領域を含む抗体重鎖可変領域;および、配列番号:14、配列番号:15および配列番号:16にそれぞれ示したLCDR1、LCDR2およびLCDR3を含む抗体軽鎖可変領域;
b)配列番号:17および配列番号:19にそれぞれ示したHCDR1およびHCDR3と配列番号:18または52に示したHCDR2、ならびに28Aおよび82B Tからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸復帰突然変異を含有するFR領域を含む抗体重鎖可変領域;および、配列番号:20、配列番号:21および配列番号:22にそれぞれ示したLCDR1、LCDR2およびLCDR3を含む抗体軽鎖可変領域;
c)配列番号:23、配列番号:24および配列番号:25にそれぞれ示したHCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む抗体重鎖可変領域;および、配列番号:20および配列番号:21にそれぞれ示したLCDR1およびLCDR2と配列番号:26または53に示したLCDR3、ならびに2Vおよび45Kからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸復帰突然変異を含有するFR領域を含む抗体軽鎖可変領域;および
d)配列番号:17および配列番号:27にそれぞれ示したHCDR1およびHCDR3と配列番号:18または52に示したHCDR2とを含む抗体重鎖可変領域;および、配列番号:20、配列番号:21および配列番号:22にそれぞれ示したLCDR1、LCDR2およびLCDR3、ならびに2Vのアミノ酸復帰突然変異を含有するFR領域を含む抗体軽鎖可変領域。
a)配列番号:66のアミノ酸配列に示した抗体重鎖可変領域またはそのFR領域バリアント;および、配列番号:67のアミノ酸配列に示した抗体軽鎖可変領域またはそのFR領域バリアント;
b)配列番号:68のアミノ酸配列に示した抗体重鎖可変領域またはそのFR領域バリアント;および、配列番号:69のアミノ酸配列に示した抗体軽鎖可変領域またはそのFR領域バリアント;
c)配列番号:70のアミノ酸配列に示した抗体重鎖可変領域またはそのFR領域バリアント;および、配列番号:71のアミノ酸配列に示した抗体軽鎖可変領域またはそのFR領域バリアント;および
d)配列番号:72のアミノ酸配列に示した抗体重鎖可変領域またはそのFR領域バリアント;および、配列番号:73のアミノ酸配列に示した抗体軽鎖可変領域またはそのFR領域バリアント;ここで、前記FR領域バリアントは、軽鎖フレームワーク領域および/または重鎖フレームワーク領域に別々に最大10個のアミノ酸復帰変異を有する。
M)配列番号:44のアミノ酸配列に示した重鎖可変領域と、配列番号:45のアミノ酸配列に示した軽鎖可変領域とを含む、抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント;
N)配列番号:46のアミノ酸配列に示した重鎖可変領域と、配列番号:47のアミノ酸配列に示した軽鎖可変領域とを含む、抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント;
O)配列番号:48のアミノ酸配列に示した重鎖可変領域と、配列番号:49のアミノ酸配列に示した軽鎖可変領域とを含む、抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント;
P)配列番号:50のアミノ酸配列に示した重鎖可変領域と、配列番号:51のアミノ酸配列に示した軽鎖可変領域とを含む、抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
前記抗体の軽鎖アミノ酸配列は、配列番号:31、35、39または41に示されるか、またはそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有する。
Q)配列番号:30のアミノ酸配列に示した重鎖と配列番号:31のアミノ酸配列に示した軽鎖とを含む、抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント;
R)配列番号:34のアミノ酸配列に示した重鎖と配列番号:35のアミノ酸配列に示した軽鎖とを含む、抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント;
S)配列番号:38のアミノ酸配列に示した重鎖と配列番号:39のアミノ酸配列に示した軽鎖とを含む、抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント;および
T)配列番号:40のアミノ酸配列に示した重鎖と配列番号:41のアミノ酸配列に示した軽鎖とを含む、抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
U)配列番号:52に示したヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、かつ/または、配列番号:53に示したヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸分子;
V)配列番号:54に示したヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、かつ/または、配列番号:55に示したヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸分子;
W)配列番号:56に示したヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、かつ/または、配列番号:57に示したヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸分子;および
Z)配列番号:58に示したヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、かつ/または、配列番号:59に示したヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
[図9]水迷路実験の学習曲線を示す図である;隠れたプラットフォーム訓練および学習の曲線の結果を示している。二元ANOVAは二元配置分散分析を指す;分析結果は以下のとおりである:
本開示をより容易に理解するために、特定の技術的および科学的用語を以下に具体的に定義する。本明細書で明示的に定義されない限り、本明細書で使用される他のすべての技術的および科学的用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解される意味を有する。
本開示の実施例および試験例で使用されるAベータ抗原は、GL Biochem、GenScriptまたはSigmaによって合成され、その後in vitroで調製された(詳細については表1を参照)。免疫化に使用するためのAベータ抗原は、Aβ1-42プロトフィブリルおよびAβ1-40KLHであった;スクリーニングに使用するためのAベータ抗原は、Aβ1-40-BSAフィブリル、Aβ1-40DMSO懸濁液、Aβ1-42-ビオチンDMSO懸濁液、Aβ1-42プロトフィブリルおよびAβ1-42フィブリルであった;検出に使用するためのAベータ抗原は、Aβ1-42モノマーおよびAβ1-42フィブリルであった。
1.免疫化
抗ヒトAベータモノクローナル抗体は、マウスを免疫化することによって生成された。SJL白色マウス、雌、6~8週齢を実験に使用した(Beijing Vital River Experimental Animal Technology株式会社、動物生産ライセンス番号:SCXK(北京)2012-0001)。給餌環境:SPFレベル。購入後、マウスを温度20~25℃、湿度40~60%、12/12時間の明/暗サイクルで1週間、実験室環境に保管した。次に、以下のスキームに従ってマウスを免疫した。免疫化のための抗原は、Aβ1-40-KLHおよびAβ1-42プロトフィブリルであった。
ハイブリドーマ細胞は、最適化されたPEGを介した融合手順を使用して、脾臓リンパ球を骨髄腫Sp2/0細胞(ATCC(登録商標)CRL-8287(商標))と融合させることによって得られた。融合したハイブリドーマ細胞を0.5~1×106/mlの密度で完全培地(20%FBS、1×HAT、1×OPIを含むDMEM培地)に再懸濁し、100μl/ウェルで96ウェルプレートに播種し、37℃および5%CO2で3~4日間インキュベートし、100μl/ウェルのHAT完全培地を補充し、ピン状のクローン(pin-like clones)が形成されるまで3~4日間培養した。上清を除去し、200μl/ウェルのHT完全培地(20%FBS、1×HTおよび1×OPIを含むRPMI-1640培地)を添加し、37℃、5%CO2で3日間インキュベートした後、ELISA検出に供した。
細胞増殖密度に応じて融合の10~11日後に、予備スクリーニングのために、さまざまな形態のAβポリペプチドを用いてELISA結合アッセイ(酵素免疫測定法としても知られる)をクローン培養上清に対して実施し、得られたハイブリドーマクローンのサブタイプを分類した。免疫原としてAβ1-40-KLHを用いたハイブリドーマ細胞をスクリーニングするために、Aβ1-40-BSAフィブリル、Aβ1-42ビオチンDMSO懸濁液およびAβ1-40DMSO懸濁液を使用した;免疫原としてAβ1-42プロトフィブリルを用いたハイブリドーマ細胞をスクリーニングするために、Aβ1-42プロトフィブリル、Aβ1-42フィブリルおよびAβ1-42-ビオチンDMSO懸濁液を使用した。陽性ウェルについては、細胞密度に応じて培地を交換し、24ウェルプレートに拡張した。24ウェルプレートに移した細胞株を再度試験した後、初めてサブクローニングした。最初のサブクローニングでスクリーニングした陽性細胞のいくつかを保存し、2回目のサブクローニングのために使用した。2回目のサブクローニングでスクリーニングした陽性細胞のいくつかを保存し、タンパク質発現のために使用した。Aβポリペプチドに特異的に結合することができるハイブリドーマ細胞は、複数の融合から生じた。チオフラビン(ThTとも呼ばれる)蛍光アッセイ、神経保護アッセイ、マクロファージ食作用アッセイの後、ハイブリドーマクローンmAb-2401、mAb-3601、mAb-5101およびmAb-9001が得られ、無血清細胞培養による抗体の調製に使用された。得られた抗体を精製例に従って精製し、精製した抗体を試験例で使用した。
細胞によって発現された上清サンプルを高速遠心分離して不純物を除去し、ハイブリドーマによって発現された上清をプロテインGカラムで精製し、組換え抗体によって発現された上清をプロテインAカラムで精製した。A280の読み取り値がベースラインに低下するまで、カラムをPBS(pH7.4)で洗浄した。標的タンパク質を100mM酢酸、pH3.0で溶出し、1M Tris-HCl、pH8.0で中和した。溶出したサンプルを適切に濃縮してから、PBSで事前に平衡化したゲルクロマトグラフィーSuperdex200(GE)でさらに精製して、凝集体を除去した。モノマーのピークを収集し、使用のために分注した。
陽性ハイブリドーマ由来の配列をクローニングする手順は以下のとおりであった。対数増殖期のハイブリドーマ細胞を採取した。キットの指示に従ってTrizol(Invitrogen、カタログ番号15596-018)を用いてRNAを抽出し、PrimeScrip(商標)Reverse Transcription kit(Takara、カタログ番号2680A)を用いて逆転写した。得られたcDNAをマウスIg-Primer Set(Novagen、TB326 Rev. B 0503)を用いたPCRによって増幅し、会社によって配列決定した。ハイブリドーマクローンmAb-2401、mAb-3601、mAb-5101およびmAb-9001のマウス抗体重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)のアミノ酸配列は、以下のように決定された:
カノニカル構造(canonical structure)は、マウス抗体の軽鎖可変領域配列および重鎖可変領域配列に従って決定された。同じ構造を有するヒト生殖細胞系列配列の中で、マウスの非CDR領域(フレームワーク領域)に最も類似した配列が、ヒト化のためのテンプレートとして選択された。次に、マウス抗体のCDR領域を、選択されたヒト化のためのテンプレートに移植して、ヒトのCDR領域を置換した。必要に応じて、一部のFR領域配列で復帰突然変異または点突然変異が行われた。次に、可変領域をヒト定常領域(ヒトIgG1定常領域など)と組み合わせて、ヒト化抗Aベータ抗体を作製した。
mAb-2401抗体重鎖のヒト化のためのテンプレートは、IGHV1-24*01およびhjh6.3であった。すなわち、ヒト生殖細胞系列重鎖IGHV1-24からFR1、FR2およびFR3領域が選択され、hjh6.3のJH6領域がFR4領域として選択された。軽鎖のためのテンプレートはIGKV1-27*01およびhjk4.1であった。すなわち、ヒト生殖細胞系列軽鎖IGKV1-27からFR1、FR2およびFR3が選択され、hjk4.1のJK4領域がFR4領域として選択された。
HAB-2401の移植されたVH(配列番号:66):
mAb-3601抗体重鎖のヒト化のためのテンプレートは、IGHV3-30*01およびhjh6.3であった。すなわち、ヒト生殖細胞系列重鎖IGHV3-30からFR1、FR2およびFR3領域が選択され、hjh6.3のJH6領域がFR4領域として選択された。軽鎖のためのテンプレートはIGKV1-39*01/hjk4.1であった。すなわち、ヒト生殖細胞系列軽鎖IGKV1-39からFR1、FR2およびFR3が選択され、hjk4.1のJK4領域がFR4領域として選択された。
HAB-3601の移植されたVH(配列番号:68):
HAB-3601の移植されたVL(配列番号:69):
mAb-5101抗体重鎖のヒト化のためのテンプレートは、IGHV2-70D*04およびhjh6.1であった。すなわち、ヒト生殖細胞系列重鎖IGHV2-70DからFR1、FR2およびFR3が選択され、hjh6.1のJH6領域がFR4領域として選択された。軽鎖のためのテンプレートはIGKV2-40*01およびhjk4.1であった。すなわち、ヒト生殖細胞系列軽鎖IGKV2-40からFR1、FR2およびFR3が選択され、hjk4.1のJK4領域がFR4領域として選択された。
HAB-5101の移植されたVH(配列番号:70):
HAB-5101の移植されたVL(配列番号:71):
mAb-9001抗体重鎖のヒト化のためのテンプレートは、IGHV2-70D*04およびhjh6.1であった。すなわち、ヒト生殖細胞系列重鎖IGHV2-70からFR1、FR2およびFR3が選択され、hjh6.1のJH6領域がFR4領域として選択された。軽鎖のためのテンプレートはIGKV2-40*01およびhjk2.1であった。すなわち、ヒト生殖細胞系列軽鎖IGKV2-40からFR1、FR2およびFR3が選択され、hjk2.1のJK2領域がFR4領域として選択された。
HAB-9001の移植されたVH(配列番号:72):
HAB-9001の移植されたVL(配列番号:73):
1.ヒト化抗体の分子クローニング
設計されたヒト化抗体配列に対してコドン最適化を実施して、ヒトコドン優先コーディング遺伝子配列を得た。各抗体のVH/VK遺伝子フラグメントは、設計されたPCRプライマーを用いて構築され、その後、相同組換えによって(シグナルペプチドと定常領域遺伝子(CH1-FC/CL)フラグメントを含む)発現ベクターpHrに導入され、全長のヒト化抗体を発現するプラスミドVH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHrが構築された。正しいクローンを配列決定によって確認し、HAB-2401については、重鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号:54に示し、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号:55に示した;HAB-3601については、重鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号:56に示し、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号:57に示した;HAB-5101については、重鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号:58に示し、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号:59に示した;および、HAB-9001については、重鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号:60に示し、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号:61に示した。
HEK293E細胞に、抗体の重鎖および軽鎖をそれぞれ1:1.5の比率で発現するプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの6日後、発現上清を回収し、高速遠心分離して不純物を除去し、プロテインAカラムで精製した。A280の読み取り値がベースラインに低下するまで、カラムをPBSで洗浄した。標的タンパク質を100mM酢酸、pH3.0で溶出し、1M Tris-HCl、pH8.0で中和した。溶出したサンプルを適切に濃縮してから、PBSで事前に平衡化したゲルクロマトグラフィーSuperdex200(GE)でさらに精製して、凝集体を除去した。モノマーのピークを収集し、使用のために分注した。
Aβ1-42フィブリルに対する抗体の親和性は、アミノカップリングの方法によって検出された。Aβ1-42フィブリルをCM5バイオセンシングチップ(200 RU)に結合させた後、抗体分子を該チップの表面に流した。反応シグナルはBiacore T200装置でリアルタイムに検出され、結合および解離曲線を生成した。各実験サイクルの終わりに、解離が完了した後、バイオセンサーチップを洗浄し、10mMグリシン-HCl(pH1.5)で再生した。陽性抗体であるアデュカヌマブは、WHOが発表したアデュカヌマブの配列情報に従って調製し(WHO医薬品情報、Vol.28、No.3、2014年を参照)、その調製方法を本開示の実施例4に記載した。
Aβ1-42モノマーのAβ1-42フィブリルへの凝集の阻害に対する抗Aベータ抗体の効果は、ThTアッセイによって検出された。ThT(チオフラビンT、チオフラビン)は蛍光色素の一種であり、(Aベータ沈着物のような)βシートに富むタンパク質と結合すると、励起波長450nmおよび発光波長482nmでの蛍光シグナルが大幅に増強されるため、通常、Aβフィブリルのin vitro同定に使用される。ThTアッセイの具体的な実験手順を以下に示した。0.5mgのヒトAβ1-42(GenScript、カタログ番号RP10017)を250μlの10mM NaOHに加え、完全に溶解してから、中和のために等量の予冷した2×PBSに加えた。1mg/mlの濃度のAβ1-42モノマー溶液を調製し、ddH2Oで0.25mg/mlに希釈した。Aβ1-42モノマー(10μl/ウェル、0.25mg/ml)を20μMのThT(sigma、カタログ番号T3516)と混合し、黒色の384ウェルプレート(Corning、カタログ番号4514)に添加し、またAβ1-42モノマーを添加していないウェルをネガティブコントロールとして使用した。次に、段階希釈した抗体(1mg/mlから開始して2倍ずつ段階希釈、10μl/ウェル)を上記の混合物に添加し、37℃で24時間インキュベートした。FlexStation3マイクロプレートリーダー(Molecular devices)を使用して、440nmの励起波長と485nmの発光波長で蛍光シグナルを読み取った。
在胎週数16~18日のSD胎児ラットから大脳皮質を解剖し、トリプシン(Gibco、カタログ番号25200-072)で消化し、ピペッティングおよびろ過して単細胞懸濁液にし、遠心分離して、カウントした。10%FBS(Gibco、カタログ番号10099-141)を含むDMEM(Gibco、カタログ番号10564-029)で細胞を1ウェルあたり1E4(1×104/ウェル)に希釈し、PDL(ポリ-D-リジン、ポリリジン)(Sigma、カタログ番号P0899)でコーティングした96ウェルプレート(Corning、カタログ番号3903)に播種した。インキュベーター(37℃、5%CO2)で一晩インキュベートした後、培地をNeurobasal(Gibco、カタログ番号21103049)+2%B27(Gibco、カタログ番号17504044)と交換し、培地の半分を3~4日ごとに交換した。8日目に、10μMのAβ1-42フィブリル(GL biochem、カタログ番号53819)およびさまざまな濃度の試験抗体を添加した。3日間インキュベートした後、30μl/ウェルのCell Titer-Glo(Promega、カタログ番号G7571)を添加し、化学発光法を用いてマイクロプレートリーダー(PerkinElmer、Vector3)でプレートを読み取った。
対数増殖期のBV2細胞(FuDan IBS Cell Center、FH0366)を採取し、トリプシンで消化し、800rpmで5分間遠心分離した。24ウェルプレートにおける細胞密度をRPMI1640(10%FBSを含む)で1.2×105細胞/ウェル/500μlに調整し、単層の細胞が形成されるまで十分に振とうし、37℃、5%CO2のインキュベーターに一晩入れた。16時間後、100μlの段階希釈Aベータ抗体またはネガティブコントロール(無関係な標的に対する抗トロンビン抗体をネガティブコントロールとして使用し、該抗トロンビン抗体はWO2017133673A1に記載されているH1601-008の調製方法に従って製造した)を(100μlのF-12K基本培地で希釈した)10μMの蛍光標識Aベータフィブリルと完全に混合し、37℃で1時間インキュベートし、500μlの培地を除去した24ウェルプレートに加え、37℃、5%CO2で1時間インキュベートした。上清を除去し、細胞を4℃に予冷したPBSで3回穏やかに洗浄した。次に、0.25%の予冷したトリプシン-EDTA(1×)を200μl/ウェルで添加し、4℃で20分間置いた。10%FBSを含むF-12K培地でトリプシンを中和し、遠心分離した後、細胞を予冷したPBSで3回洗浄し、100μlの細胞を収集してフローサイトメーターにアプライし、FITC蛍光強度を読み取った。
大脳皮質を新生児SDラットから解剖し、粉砕し、ろ過して細胞懸濁液を得た。20%FBSを含有するDMEM(Gibco、カタログ番号10099-141)に細胞を再懸濁し、PDL(Sigma、カタログ番号P0899)でプレコートされたT75培養フラスコ(Corning、カタログ番号3473)に移し、インキュベーターに入れた(37℃、5%CO2)。培地は3日に1回交換した。8日目に、培養フラスコをシェーカー上に置き、200rpmで1時間振とうした。上清を収集し、遠心分離し、カウントし、10%FBSを含有するDMEM/F12(GE、カタログ番号SH30023.01)培地で5E4/ウェル(5×104/ウェル)に希釈し、24ウェルプレートにプレーティングした。6時間後、培地を無血清DMEM/F12培地に交換し、一晩インキュベートした。9日目に、さまざまな濃度の抗体またはネガティブコントロール(無関係な標的に対する抗トロンビン抗体をネガティブコントロールとして使用し、該抗トロンビン抗体は、WO2017133673A1に記載されているH1601-008の調製方法に従って産生された)をそれぞれ10μMのFITC標識(Thermo、カタログ番号A30006)Aベータ1-42(GL biochem、カタログ番号53819)と混合し、37℃で30分間インキュベートし、余分な抗体を洗い流すために遠心分離した。抗体とAベータの混合物を細胞に添加し、37℃で30分間インキュベートした。細胞をPBS(Hyclone、カタログ番号SH30256.01)で2回洗浄し、トリプシン(Gibco、カタログ番号25200-072)を加え、細胞を消化するために4℃の冷蔵庫に10分間入れた。その後、血清を加えて反応を停止し、遠心分離により上清を除去した後、細胞を回収し、予冷しておいたPBSを加え、遠心分離により上清を除去し、細胞をPBSで2回洗浄した。FITC蛍光強度をフローサイトメーター(BD、Verse)で読み取った。
5×FAD(5つの家族性AD突然変異((Five Familial AD mutations))アルツハイマー病マウスモデルを使用して、抗Aβ抗体のinvivoでの有効性を評価した。APP遺伝子の3つの突然変異(すなわち、スウェーデン突然変異(K670N、M671L)、フロリダ突然変異(I716V)およびロンドン突然変異(V717I))とPS1遺伝子の2つの突然変異(すなわち、M146LおよびL286V)とを含む、APPおよびPS1遺伝子の5つの家族性遺伝子突然変異)を5×FADマウスで過剰発現させた。したがって、野生型マウス(WT)と比較して、5×FADマウスは認知機能および記憶に明らかな障害を示し、脳組織における有意なAβ斑沈着を示した。この試験例は、巣作り能力および空間記憶(モリス水迷路における空間記憶)を含むマウスの行動の改善を試験することによって、ならびに脳組織におけるAβ斑の含有量の変化を試験することによって、マウスの認知能力を改善し、Aβ斑沈着を減少させる試験抗体の効率を評価するために設計された。
巣作りはマウスの本能であり、通常、マウスの社会的行動を測定するための実験的方法として使用される。Tg2576、APPswe/PS1、3×Tg-AD、5×FAD(Transl Psychiatry. 2015年5月5日;5:e562)などのAPPを過剰発現するトランスジェニックマウスは、さまざまな程度で巣作りの能力に障害を示したことが報告されている。この試験例は、複数のパラメーターを用いてマウスの巣作り能力をスコアリングすることにより、5×FADトランスジェニックマウスの社会的行動の改善に対する試験抗体の効果を評価する。
水迷路実験は、げっ歯類の空間学習と記憶能力を評価するために神経生物学の分野で一般的に使用される行動試験である。そのような実験では、げっ歯類がトレーニングによってプールの水の下に隠れた脱出プラットフォームを見つけて覚えるように導くために、スイミングプールの周りの空間的な手がかりが使用された。
動物をガイドするために、水面上のフラグがプラットフォームに置かれた。各実験動物をNポイントで水に入れ(プールの壁に向けて)、60秒間のビデオの追跡および記録を同時に開始した。動物が60秒以内にプラットフォームに乗ることができなかった場合は、動物は手動でプラットフォームにガイドされ、迷路から外される前に20秒間留まることを許される;動物が60秒以内にプラットフォームを見つけたが、プラットフォームに20秒未満留まった場合は、60秒の訓練が終了した後、動物は迷路から外される前に20秒間プラットフォームに強制的に留まらされる;動物が60秒以内にプラットフォームを見つけ、20秒間プラットフォームに留まった場合、動物は迷路から外される。訓練後、各動物をタオルで乾かし、ケージに戻した。すべての動物を訓練した後、同じ訓練の新しいラウンドを再開した。このようにして、各動物は1日で4回訓練された。
プラットフォームは水面下約1cmに隠れていた。動物は1日4回、合計12日間訓練された。マウスを水中に入れた場所を図8に示した。各訓練中、動物はプールの壁に面して配置され、ビデオの追跡および記録が同時に開始された。各訓練は60秒間続いた。動物が60秒以内にプラットフォームに見つけることができなかった場合は、動物は手動でプラットフォームにガイドされ、迷路から外される前に15秒間留まることを許される;動物が60秒以内にプラットフォームを見つけたが、プラットフォームに15秒未満留まった場合は、60秒の訓練が終了した後、動物は迷路から外される前に15秒間プラットフォームに強制的に留まらされる;動物が60秒以内にプラットフォームを見つけ、15秒間プラットフォームに留まった場合、動物は迷路から外される。訓練後、各動物をタオルで乾かし、ケージに戻した。すべての動物を訓練した後、動物を水中に入れる場所を変えて、訓練の新しいラウンドを再開した。
12日目の最後の訓練から24時間後、プローブ試験のために水中のプラットフォームを除去した。実験動物をNEポイントで水に入れ(プールの壁に向けて)、ビデオの追跡および記録を同時に開始した。60秒後、追跡は終了した。動物をプールから取り出し、タオルで乾かし、ケージに戻した。動物の軌跡は、Noldus Ethovisionソフトウェアで分析された。
隠れたプラットフォーム訓練の学習曲線を図9に示した。結果は、5×FAD Tgマウスビヒクル(溶媒ブランクコントロール)群とWT群との間で、6日目に有意差が観察され、隠れたプラットフォーム訓練の10日目と11日目に非常に有意な差が観察されたことを示し、そのような差は安定する傾向があり、行動試験において5×FADトランスジェニックマウスと野生型マウスとの間で空間記憶能力に差があることを示している。このような差は、試験薬の試験の基礎である;1日目から、ポジティブコントロール薬アデュカヌマブ-Chの群は常にビヒクル群よりもプラットフォームまでの潜時が短く、11日目に有意差が観察され、アデュカヌマブ-Chがこの実験で優れた有効性を示したことを示している;アデュカヌマブ-Ch群と同様に、HAB-2401-Ch、HAB-5101-ChおよびHAB-9001-Chは、11日目と12日目に有意差を示し、アデュカヌマブ-Chと同様に、これら3つの薬剤がマウスの空間記憶と認知能力を大幅に改善できることを示している。
すべてのサンプルは、行動試験(試験例8)に使用したマウスから採取された。各マウスをPBS(pH7.4)で灌流させ、脳を採取した。左半球を直ちに4%PFAに浸し、72時間固定し、右半球を氷上で解剖して前頭皮質と海馬を収集し、別々に秤量し、液体窒素で急速凍結し、その後のサンプル処理のために-80℃の冷蔵庫に保管した。
この試験例で使用したサンプルは、試験例9の脳ホモジネートからの可溶性成分であり、使用した検出方法は、高感度エレクトロケミルミネッセンスアナライザーMSD(メソスケールディスカバリー)であった。具体的な実験手順は、製品マニュアル(U-PLEX Biomarker Group(マウス)Multiplexアッセイキット:MSD、N05235A-1)に記載されている。簡単に説明すると、各サイトカインについてのビオチン化捕捉抗体をU-PLEXの各リンカーに結合させ、室温で30分間反応させた後、反応を停止させた;調製したU-PLEX結合抗体溶液を混合してU-PLEXプレートにコーティングし、室温で振とうしながら1時間または4℃で一晩インキュベートした;スタンダードと試験サンプル(即ち、脳組織ホモジネート中の可溶性成分)は、マニュアルに従って希釈された;コーティングされたプレートをPBSTまたは1×MSD洗浄バッファー(1×MSD洗浄試薬)で3回洗浄し、25μlのサンプル希釈液、25μlの希釈したスタンダードおよび試験対象サンプルを添加し、プレートを密封して振とうしながら室温で1時間インキュベートした。コーティングしたプレートをPBSTまたは1×MSD洗浄バッファーで3回洗浄し、50μlの希釈した検出抗体混合物を加え、プレートを密封し、室温で1時間振とうしながらインキュベートした。コーティングされたプレートをPBSTまたは1×MSD洗浄バッファーで3回洗浄し、次に2×Readバッファー試薬を添加した。最後に、プレートをMSD機器で読み取った。
Claims (19)
- 抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、当該抗Aベータ抗体はヒトAベータに特異的に結合し、かつ抗体重鎖HCDR1、HCDR2およびHCDR3領域と抗体軽鎖LCDR1、LCDR2およびLCDR3領域とを含み、
前記HCDR1は配列番号:17に示され、前記HCDR2は配列番号:18または52に示され、前記HCDR3は配列番号:27に示され、前記LCDR1は配列番号:20に示され、前記LCDR2は配列番号:21に示され、前記LCDR3は配列番号:22に示される、抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体は、マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項1に記載の抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体はマウス抗体であり、前記抗体は、配列番号:9に示されるか、またはそれに対して少なくとも95%の配列同一性を有する重鎖可変領域;および/または
配列番号:10に示されるか、またはそれに対して少なくとも95%の配列同一性を有する軽鎖可変領域
を含む、請求項2に記載の抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体は、配列番号:9に示した重鎖可変領域と配列番号:10に示した軽鎖可変領域とを含む、請求項3に記載の抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体は、配列番号:50に示されるか、またはそれに対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変領域と、配列番号:51に示されるか、またはそれに対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む、請求項2に記載の抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体は定常領域を含む、請求項1に記載の抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記定常領域は重鎖定常領域と軽鎖定常領域を含み、前記重鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号:42に示したとおりであるか、またはそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有し、かつ前記軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号:43に示したとおりであるか、またはそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有する、請求項6に記載の抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体は、配列番号:40に示されるか、またはそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有する重鎖、および/または、配列番号:41に示されるか、またはそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有する軽鎖を含む、請求項6に記載の抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体は、配列番号:40に示した重鎖と配列番号:41に示した軽鎖とを含む、請求項6に記載の抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 請求項1に記載の抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗原結合フラグメントは、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、ダイアボディ、dsFv、および請求項1に記載のCDRを含むペプチドの抗原結合フラグメントからなる群から選択される、抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 請求項1~10のいずれか一項に記載の抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする、核酸分子。
- 請求項11に記載の核酸分子を含む、組換えベクター。
- 請求項12に記載の組換えベクターを含む宿主細胞であって、前記宿主細胞は、原核細胞および真核細胞からなる群から選択される、宿主細胞。
- 真核細胞である、請求項13に記載の宿主細胞。
- 前記真核細胞は哺乳動物細胞である、請求項14に記載の宿主細胞。
- 以下のステップを含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメントを調製する方法:培養培地中で請求項13~15のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養するステップと、その後に前記抗体を精製および回収するステップ。
- 以下を含む医薬組成物:
請求項1~10のいずれか一項に記載の抗Aベータ抗体またはその抗原結合フラグメント、および
1つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤。 - Aベータ媒介性の疾患または障害の治療または予防のための薬剤の調製における、請求項1~10のいずれか一項に記載の抗Aベータ抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは請求項17に記載の医薬組成物の使用。
- 前記疾患は、アルツハイマー病、軽度認知障害、前頭側頭型認知症、レビー小体病、パーキンソン病、ピック病、ベバック病(Bevac’s disease)、コンゴ親和性アミロイド血管症、脳アミロイド血管症、ダウン症、多発性梗塞性認知症、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、エイズ認知症症候群、うつ病、不安障害、恐怖症、ベル麻痺、てんかん、脳炎、多発性硬化症、神経筋障害、神経腫瘍障害、脳腫瘍、脳卒中による神経血管障害、神経免疫障害、神経障害性耳科学疾患、脊髄損傷による神経外傷、神経障害性疼痛による痛み、小児の神経および神経精神障害、睡眠障害、トゥレット症候群、軽度認知障害、血管性認知症、多発性梗塞性認知症、嚢胞性線維症、ゴーシェ病、ならびにその他の中枢神経系の運動障害および疾患からなる群から選択される神経変性疾患である、請求項18に記載の使用。
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