BR112020027055A2 - Anticorpo anti-abeta, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e aplicação dos mesmos - Google Patents

Abstract

anticorpo anti-abeta, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e aplicação dos mesmos. a presente invenção refere-se ao anticorpo anti-abeta murino, quimérico ou humanizado tendo uma região de cdr específica, a um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, a uma composição farmacêutica do mesmo, e ao uso dos mesmos. a presente invenção também se refere ao uso de um anticorpo anti-abeta humanizado para a preparação de fármacos para o tratamento de uma doença ou um distúrbio (tal como a doença de alzheimer) causado pela proteína beta amiloide.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “ANTICORPO ANTI-ABETA, FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DO MESMO E APLICAÇÃO DOS MESMOS”.

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção pertence ao campo da biotecnologia. Mais particularmente, a presente invenção se refere a anticorpos anti-β-amiloide e aplicações dos mesmos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] As descrições no presente documento, neste requerimento de patente, somente proporcionam informação de fundo sobre a presente invenção, e não constituem necessariamente arte anterior.

[003] β-amiloide (Amiloide-beta, amiloide-beta, Abeta, Aβ) é um polipeptídeo compreendendo 39 a 43 aminoácidos produzidos a partir da proteína precursora amiloide (APP) por proteólise por β- e γ-secretases. Pode ser produzido por uma variedade de células e é circulante no sangue, líquido cefalorraquidiano e fluido intersticial cerebral. A maioria do β-amiloide se liga a moléculas chaperonas (de companhia), e existem uns poucos em um estado livre. Aβ é neurotóxico. Não pode ser metabolizado por células quando seu conteúdo aumenta. Ao invés, será acumulado em grandes quantidades dentro das células, formando placas senis de Aβ, e consequentemente promove lesão ou morte dos neurônios. Os subtipos mais comuns de Aβ no corpo humano são Aβ1-40 e Aβ1-42, dos quais Aβ1-42 é mais tóxico e mais fácil de ser agregado para formar o núcleo da placa Aβ e desencadear efeitos neurotóxicos ("Medical Review", 2009, 15 (23): 3575-3577).

[004] A doença de Alzheimer (em inglês, Alzheimer disease, AD) foi descoberta pela primeira vez em 1906 pelo psiquiatra e neurologista alemão, Alzheimer Alois, e foi nomeada por seu nome. Também é conhecida como demência senil, e é uma doença neurodegenerativa crônica. As principais manifestações clínicas da doença de Alzheimer incluem perda gradual da memória, transtorno cognitivo, comportamento anormal, e transtorno social. Estudos descobriram que os pacientes com doença de Alzheimer têm principalmente as seguintes características patológicas: placas senis formadas por agregação de β-amiloide no córtex cerebral e no hipocampo, emaranhados neurofibrilares formados por agregação anormal da proteína Tau, e diminuição das células nervosas no córtex e no hipocampo. A deposição de Aβ não somente está relacionada com alterações degenerativas dos neurônios, mas também é capaz de ativar uma série de eventos patológicos, incluindo a ativação de astrócitos e células microgliais, a destruição da barreirta hematoencefálica e as alterações na microcirculação, e similares. É uma causa importante de degeneração neuronal em torno das placas senis no cérebro e de óbito em pacientes com doença de Alzheimer (Oh, E.S., Troncoso, J.C. & Fangmark Tucker, S.M. Neuromol Med (2008) 10: 195).

[005] A deposição de Aβ foi encontrada não somente nas placas senis da doença de Alzheimer, mas também foi encontrada em uma grande quantidade de outras doenças amiloides cerebrais, tais como a angiopatia amiloide cerebral (em inglês, CAA, também chamada de angiopatia amiloide congofílica). A deposição de Aβ encontrada na angiopatia amiloide cerebral é essencialmente composta da forma mais curta de Aβ (Aβ1-40), e também envolve uma quantidade pequena de Aβ1-42 (Wilcock et al., Journal of Neuroinflammation 1 (24):1-11 (2004)).

[006] Com base no importante papel do Aβ na patogênese da doença de Alzheimer, e na toxicidade do Aβ ser dependente de sua quantidade, grau de agregação e taxa de clearance, os pesquisadores desenvolveram continuamente vários métodos para interferir com doenças por Aβ, tentando retardar ou bloquear o progresso da doença de Alzheimer, reduzindo a produção de Aβ, prevenindo a acumulação e a deposição de Aβ e interferindo com a toxicidade do Aβ. Foi publicada uma variedade de anticorpos contra Aβ, incluindo Aducanumab (Biogen), Bapineuzumab (Janssen, Elan, Pfizer), Solanezumab (Eli Lilly), Gantenerumab (Hoffman-LaRoche), e os anticorpos anti-Aβ revelados nos Requerimentos de Patente Internacional Nos: WO1994017197A1, WO1998044955A1, WO2003016466A3, WO2003070760A3, WO2004071408A3, WO2006081171A1, WO2007108756A1, WO2008011348A3, WO2008081008A1, WO2012051498A3 e assim por diante. No entanto, a maioria dos anticorpos terminaram em fracasso, incluindo Bapineuzumab e Solanezumab, os quais produziram grandes expectativas, mas falharam em estudo clínico de Fase III. Atualmente, somente o Aducanumab ainda está em estudo clínico de Fase III, e é considerado como sendo o único novo anticorpo anti-Aβ que se mostra promissor para ser aprovado para o tratamento da doença de Alzheimer, no entanto, resultados de estudos clínicos adicionais ainda precisam confirmar se está qualificado para comercialização.

[007] Portanto, ainda existe uma necessidade urgente de desenvolver anticorpos anti-Abeta com nova estrutura para o tratamento de doenças ou distúrbios causados por β-amiloide (tais como a doença de Alzheimer).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] Os inventores desenvolveram anticorpos anti-Abeta e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com estrutura completamente nova depois de extensivos estudos experimentais. Os anticorpos anti-Abeta e fragmento de ligação ao antígeno dos mesmos são capazes de se ligarem especificamente a Abeta humano com alta afinidade, e apresentam excelente eficiência. Espera-se que sejam úteis para o tratamento ou a prevenção de doenças ou distúrbios causados por Abeta (por exemplo, a doença de Alzheimer).

[009] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a Abeta humano, o anticorpo referido compreendendo no mínimo uma região de CDR selecionada entre as seguintes sequências de aminoácidos ou tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma:

[0010] (1) a sequência de aminoácidos da região de cadeia pesada HCDR1 conforme mostrado na SEQ ID NO: 11, 17 ou 23;

[0011] (2) a sequência de aminoácidos da região de cadeia pesada HCDR2 conforme mostrado na SEQ ID NO: 12, 18, 24 ou 52;

[0012] (3) a sequência de aminoácidos da região de cadeia pesada HCDR3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 13, 19, 25 ou 27;

[0013] (4) a sequência de aminoácidos da região de cadeia leve LCDR1 conforme mostrado na SEQ ID NO: 14 ou 20;

[0014] (5) a sequência de aminoácidos da região de cadeia leve LCDR2 conforme mostrado na SEQ ID NO: 15 ou 21; e

[0015] (6) a sequência de aminoácidos da região de cadeia leve LCDR3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 16, 22, 26 ou 53.

[0016] Para a sequência de aminoácidos tendo no mínimo 85% de identidade de sequência conforme indicado acima, de modo preferencial tem no mínimo 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência; de modo mais preferencial, tem mais de 90%, mais de 95% ou mais de 99% de identidade de sequência, de modo o mais preferencial, tem no mínimo 95% de identidade de sequência. A sequência de aminoácidos acima mencionada tendo no mínimo 85% de identidade de sequência pode ser obtida por deleção, inserção ou substituição de um ou mais aminoácidos.

[0017] Em algumas modalidades, o referido anticorpo anti-Abeta se liga a fibrilas Aβ1-42 humanas e/ou monômero Aβ1-42 com uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) de cerca de 10-7M ou mesmo menos; de modo preferencial, se liga a Abeta humano com uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) de menos de cerca de 10-8M, 10-9M, ou 10-10M ou mesmo menos. O valor da KD pode ser determinado por tecnologia de Ressonância de Plasma Superficial (SPR) em instrumento Biacore T200. De modo preferencial, o referido Abeta humano é fibrilas Aβ1-42 e monômero Aβ1-42.

[0018] Em algumas modalidades preferenciais, o referido anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende regiões de HCDR1-3 ou regiões de LCDR1-3 conforme indicado em qualquer um dos ítens seguintes:

[0019] (i) as regiões de cadeia pesada do anticorpo HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme mostrado nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 11, 12 e 13, respectivamente;

[0020] (ii) as regiões de cadeia pesada do anticorpo HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme mostrado nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 17, 18 e 19, respectivamente;

[0021] (iii) as regiões de cadeia pesada do anticorpo HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme mostrado nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 23, 24 e 25, respectivamente;

[0022] (iv) as regiões de cadeia pesada do anticorpo HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme mostrado nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 17, 18 e 27, respectivamente;

[0023] (v) as regiões de cadeia pesada do anticorpo HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme mostrado nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 17, 52 e 19, respectivamente;

[0024] (vi) as regiões de cadeia pesada do anticorpo HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme mostrado nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 17, 52 e 27, respectivamente;

[0025] e/ou

[0026] (vii) as regiões de cadeia leve do anticorpo LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme mostrado nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente;

[0027] (viii) as regiões de cadeia leve do anticorpo LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme mostrado nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 20, 21 e 22, respectivamente;

[0028] (viiii) as regiões de cadeia leve do anticorpo LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme mostrado nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 20, 21 e 26, respectivamente; ou

[0029] (x) as regiões de cadeia leve do anticorpo LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme mostrado nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 20, 21 e 53, respectivamente.

[0030] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção é qualquer anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo selecionado entre os itens seguintes A a D:

[0031] A) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, tendo região de cadeia pesada HCDR1 conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, região de cadeia pesada HCDR2 conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e região de cadeia pesada HCDR3 conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, e região de cadeia leve LCDR1 conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, região de cadeia leve LCDR2 conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e região de cadeia leve LCDR3 conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16;

[0032] B) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, tendo região de cadeia pesada HCDR1 conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, região de cadeia pesada HCDR2 conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 ou 52 e região de cadeia pesada HCDR3 conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, e região de cadeia leve LCDR1 conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, região de cadeia leve LCDR2 conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e região de cadeia leve LCDR3 conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22;

[0033] C) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, tendo região de cadeia pesada HCDR1 conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, região de cadeia pesada HCDR2 conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e região de cadeia pesada HCDR3 conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, e região de cadeia leve LCDR1 conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, região de cadeia leve LCDR2 conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e região de cadeia leve LCDR3 conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 ou 53; e

[0034] D) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, tendo região de cadeia pesada HCDR1 conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, região de cadeia pesada HCDR2 conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 ou 52 e região de cadeia pesada HCDR3 conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, e região de cadeia leve LCDR1 conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, região de cadeia leve LCDR2 conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID

NO: 21 e região de cadeia leve LCDR3 conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

[0035] Em algumas modalidades, o referido anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é anticorpo murino, quimérico, humanizado, ou totalmente humano.

[0036] Em algumas modalidades, o referido anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é anticorpo murino, e a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo é mostrada na SEQ ID NO: 3, 5, 7 ou 9 ou tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma; e/ou a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo é mostrada na SEQ ID NO: 4, 6, 8 ou 10 ou tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma.

[0037] Para a sequência de aminoácidos tendo no mínimo 85% de identidade de sequência conforme indicado acima, de modo preferencial tem no mínimo 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência; de modo mais preferencial, tem mais de 90%, mais de 95% ou mais de 99% de identidade de sequência, de modo o mais preferencial, tem no mínimo 95% de identidade de sequência. A sequência de aminoácidos acima mencionada tendo no mínimo 85% de identidade de sequência pode ser obtida por deleção, inserção ou substituição de um ou mais aminoácidos. De modo preferencial, o anticorpo referido se liga a Abeta humano com uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) de cerca de 10-7M ou mesmo menos. Em algumas modalidades, o anticorpo referido se liga a Abeta humano com uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) de menos de cerca de 10-8M, 10-9M, ou 10-10M ou mesmo menos, e o valor da KD pode ser determinado por tecnologia de Ressonância de Plasma Superficial (SPR) em instrumento Biacore T200. De modo preferencial, o referido Abeta humano é fibrilas Aβ1-42 e monômero Aβ1-42.

[0038] Em algumas modalidades, o referido anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é qualquer anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo selecionado entre os itens seguintes E a H:

[0039] E) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4;

[0040] F) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e uma região variável de cadeia leve conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

[0041] G) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e

[0042] H) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

[0043] Em algumas modalidades do anticorpo anti-Abeta acima mencionado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção, o anticorpo referido é anticorpo humanizado. De modo preferencial, a sequência de região de FR do anticorpo é derivada de sequência de região de FR do anticorpo da linhagem germinativa humana ou variante da mesma. De modo preferencial, conforme requerido, a variante inclui uma ou mais deleções, inserções ou substituições de aminoácidos. De modo mais preferencial, a variante de região de FR tem até 10 uma ou mais retro mutações de aminoácidos sobre a região de framework de cadeia leve e/ou a região de framework de cadeia pesada de um anticorpo humano, respectivamente.

[0044] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 44, 46, 48 ou 50, ou tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma; e/ou a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo é mostrada na SEQ ID NO: 45, 47, 49 ou 51, ou tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma.

[0045] Para a sequência de aminoácidos tendo no mínimo 85% de identidade de sequência conforme indicado acima, de modo preferencial tem no mínimo 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência; de modo mais preferencial, tem mais de 90%, mais de 95% ou mais de 99% de identidade de sequência, de modo o mais preferencial, tem no mínimo 95% de identidade de sequência. A sequência de aminoácidos acima mencionada tendo no mínimo 85% de identidade de sequência pode ser obtida por deleção, inserção ou substituição de um ou mais aminoácidos. De modo preferencial, o anticorpo referido se liga a Abeta humano com uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) de cerca de 10-7M ou mesmo menos. Em algumas modalidades, o anticorpo referido se liga a Abeta humano com uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) de menos de cerca de 10-8M, 10-9M, ou 10−10 M ou mesmo menos, e o valor da KD pode ser determinado por tecnologia de Ressonância de Plasma Superficial (SPR) em instrumento Biacore

T200. De modo preferencial, o referido Abeta humano é fibrilas Aβ1-42 e monômero Aβ1-42.

[0046] Em algumas modalidades, o anticorpo referido é anticorpo humanizado selecionado entre qualquer anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo dos ítens seguintes a) a d):

[0047] a) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, a região variável de cadeia pesada do anticorpo tendo no mínimo 90% de identidade de sequência com aquela conforme mostrado na SEQ ID NO: 44, e a região variável de cadeia leve do anticorpo tendo no mínimo 90% de identidade de sequência com aquela conforme mostrado na SEQ ID NO: 45;

[0048] b) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, a região variável de cadeia pesada do anticorpo tendo no mínimo 90% de identidade de sequência com aquela conforme mostrado na SEQ ID NO: 46, e a região variável de cadeia leve do anticorpo tendo no mínimo 90% de identidade de sequência com aquela conforme mostrado na SEQ ID NO: 47;

[0049] c) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, a região variável de cadeia pesada do anticorpo tendo no mínimo 90% de identidade de sequência com aquela conforme mostrado na SEQ ID NO: 48, e a região variável de cadeia leve do anticorpo tendo no mínimo 90% de identidade de sequência com aquela conforme mostrado na SEQ ID NO: 49; e

[0050] d) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, a região variável de cadeia pesada do anticorpo tendo no mínimo 90% de identidade de sequência com aquela conforme mostrado na SEQ ID NO: 50, e a região variável de cadeia leve do anticorpo tendo no mínimo 90% de identidade de sequência com aquela conforme mostrado na SEQ ID NO: 51, em que a acima mencionada no mínimo 90% de identidade de sequência inclui no mínimo 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência.

[0051] Em algumas modalidades, o anticorpo referido é anticorpo humanizado compreendendo regiões variáveis conforme mostrado em qualquer um dos ítens seguintes:

[0052] a) uma região variável de cadeia pesada do anticorpo compreendendo HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 11, na SEQ ID NO: 12 e na SEQ ID NO: 13, respectivamente, e uma ou mais regiões de FR compreendendo uma ou mais retro mutações de aminoácidos selecionadas entre o grupo que consiste em 1E, 71A e 94R; e uma região variável de cadeia leve do anticorpo compreendendo LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 14, na SEQ ID NO: 15 e na SEQ ID NO: 16, respectivamente;

[0053] b) uma região variável de cadeia pesada do anticorpo compreendendo HCDR1 e HCDR3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 17 e na SEQ ID NO: 19, respectivamente, e HCDR2 conforme mostrado na SEQ ID NO: 18 ou 52, e uma ou mais regiões de FR compreendendo uma ou mais retro mutações de aminoácidos selecionadas entre o grupo que consiste em 28A e 82B T; e uma região variável de cadeia leve do anticorpo compreendendo LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 20, na SEQ ID NO: 21 e na SEQ ID NO: 22, respectivamente;

[0054] c) uma região variável de cadeia pesada do anticorpo compreendendo HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 23, na SEQ ID NO: 24 e na SEQ ID NO: 25, respectivamente; e uma região variável de cadeia leve do anticorpo compreendendo LCDR1 e LCDR2 conforme mostrado na SEQ ID NO: 20 e na SEQ ID NO: 21, respectivamente, e LCDR3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 26 ou 53, e uma ou mais regiões de FR compreendendo uma ou mais retro mutações de aminoácidos selecionadas entre o grupo que consiste em 2V e 45K; e

[0055] d) uma região variável de cadeia pesada do anticorpo compreendendo HCDR1 e HCDR3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 17 e na SEQ ID NO: 27, respectivamente, e HCDR2 conforme mostrado na SEQ ID NO: 18 ou 52; e uma região variável de cadeia leve do anticorpo compreendendo LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 20, na SEQ ID NO: 21 e na SEQ ID NO: 22, respectivamente, e uma ou mais regiões de FR compreendendo retro mutação de aminoácido de 2V.

[0056] Em algumas modalidades, o anticorpo referido é anticorpo humanizado compreendendo regiões variáveis conforme mostrado em qualquer um dos ítens seguintes:

[0057] a) uma região variável de cadeia pesada do anticorpo conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66 ou variante de região de FR da mesma; e uma região variável de cadeia leve do anticorpo conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 ou variante de região de FR da mesma;

[0058] b) uma região variável de cadeia pesada do anticorpo conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 ou variante de região de FR da mesma; e uma região variável de cadeia leve do anticorpo conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 ou variante de região de FR da mesma;

[0059] c) uma região variável de cadeia pesada do anticorpo conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70 ou variante de região de FR da mesma; e uma região variável de cadeia leve do anticorpo conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 ou variante de região de FR da mesma; e

[0060] d) uma região variável de cadeia pesada do anticorpo conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72 ou variante de região de FR da mesma; e uma região variável de cadeia leve do anticorpo conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 ou variante de região de FR da mesma; em que a variante de região de FR tem até 10 uma ou mais retro mutações de aminoácidos separadamente sobre a região de framework de cadeia leve e/ou a região de framework de cadeia pesada.

[0061] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Abeta acima mencionado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção é qualquer anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo selecionado entre os itens seguintes M a P:

[0062] M) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 e uma região variável de cadeia leve conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45;

[0063] N) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 e uma região variável de cadeia leve conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47;

[0064] O) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 e uma região variável de cadeia leve conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49;

[0065] P) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 e uma região variável de cadeia leve conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51.

[0066] Em algumas modalidades, o referido anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo adicionalmente compreende região constante.

[0067] Em algumas modalidades, a região constante de cadeia pesada de anticorpo é região constante de IgG1 humana, de modo preferencial, a região constante de cadeia pesada da sequência de aminoácidos do anticorpo é conforme mostrado na SEQ ID NO: 42 ou tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma; e a região constante de cadeia leve do anticorpo é selecionada entre região constante kappa humana, e de modo o mais preferencial, a região constante de cadeia leve da sequência de aminoácidos do anticorpo é conforme mostrado na SEQ ID NO: 43 ou tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma.

[0068] Para a sequência de aminoácidos tendo no mínimo 85% de identidade de sequência conforme indicado acima, de modo preferencial tem no mínimo 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência; de modo mais preferencial, tem mais de 90%, mais de 95% ou mais de 99% de identidade de sequência, de modo o mais preferencial, tem no mínimo 95% de identidade de sequência. A sequência de aminoácidos acima mencionada tendo no mínimo 85% de identidade de sequência pode ser obtida por deleção, inserção ou substituição de um ou mais aminoácidos.

[0069] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de cadeia pesada do anticorpo anti-Abeta é conforme mostrado na SEQ ID

NO: 30, 34, 38 ou 40, ou tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma, e/ou a sequência de aminoácidos de cadeia leve do anticorpo é mostrada na SEQ ID NO: 31, 35, 39 ou 41, ou tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma.

[0070] Para a sequência de aminoácidos tendo no mínimo 85% de identidade de sequência conforme indicado acima, de modo preferencial tem no mínimo 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência; de modo mais preferencial, tem mais de 90%, mais de 95% ou mais de 99% de identidade de sequência, de modo o mais preferencial, tem no mínimo 95% de identidade de sequência. A sequência de aminoácidos acima mencionada tendo no mínimo 85% de identidade de sequência pode ser obtida por deleção, inserção ou substituição de um ou mais aminoácidos. De modo preferencial, o anticorpo referido se liga a Abeta humano com uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) de cerca de 10-7M ou mesmo menos. Em algumas modalidades, o anticorpo referido se liga a Abeta humano com uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) de menos de cerca de 10-8M, 10-9M, ou 10-10 M ou mesmo menos, e o valor da KD pode ser determinado por tecnologia de Ressonância de Plasma Superficial (SPR) em instrumento Biacore T200. De modo preferencial, o referido Abeta humano é fibrilas Aβ1-42 e monômero Aβ1-42.

[0071] Em algumas modalidades, o referido anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é qualquer anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo selecionado entre os itens seguintes Q a T:

[0072] Q) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma cadeia pesada conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 e uma cadeia leve conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 31;

[0073] R) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma cadeia pesada conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 e uma cadeia leve conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35;

[0074] S) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma cadeia pesada conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 e uma cadeia leve conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; e

[0075] T) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma cadeia pesada conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 e uma cadeia leve conforme mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41.

[0076] Em algumas modalidades, o fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção é selecionado entre o grupo que consiste em Fab, Fab', F(ab')2, scFv, diabody, dsFv e fragmento de ligação ao antígeno de peptídeo compreendendo CDR.

[0077] Em algumas modalidades, é proporcionado um anticorpo anti-Abeta que compete com o anticorpo acima mencionado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para ligação ao Abeta humano, ou que compete com o anticorpo acima mencionado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para ligação ao epítope do mesmo antígeno Abeta.

[0078] Em algumas modalidades, a presente invenção também proporciona uma molécula de ácido nucleico codificando qualquer anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme descrito acima.

[0079] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico é qualquer molécula de ácido nucleico selecionada entre os ítens seguintes U a Z:

[0080] U) uma molécula de ácido nucleico, a qual compreende sequência de nucleotídeos conforme mostrado na SEQ ID NO: 52 ou sequência de nucleotídeos tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma, e/ou compreende sequência de nucleotídeos conforme mostrado na SEQ ID NO: 53 ou sequência de nucleotídeos tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma;

[0081] V) uma molécula de ácido nucleico, a qual compreende sequência de nucleotídeos conforme mostrado na SEQ ID NO: 54 ou sequência de nucleotídeos tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma, e/ou compreende sequência de nucleotídeos conforme mostrado na SEQ ID NO: 55 ou sequência de nucleotídeos tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma;

[0082] W) uma molécula de ácido nucleico, a qual compreende sequência de nucleotídeos conforme mostrado na SEQ ID NO: 56 ou sequência de nucleotídeos tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma, e/ou compreende sequência de nucleotídeos conforme mostrado na SEQ ID NO: 57 ou sequência de nucleotídeos tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma; e

[0083] Z) uma molécula de ácido nucleico, a qual compreende sequência de nucleotídeos conforme mostrado na SEQ ID NO: 58 ou sequência de nucleotídeos tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma, e/ou compreende sequência de nucleotídeos conforme mostrado na SEQ ID NO: 59 ou sequência de nucleotídeos tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma.

[0084] Em um aspecto, a presente invenção também proporciona um vetor recombinante, o qual compreende a molécula de ácido nucleico acima mencionada.

[0085] Em um aspecto, a presente invenção também proporciona uma célula hospedeira obtida por transformação do vetor recombinante acima mencionado; a célula hospedeira é selecionada entre o grupo que consiste em células procarióticas e células eucarióticas, de modo preferencial células eucarióticas, de modo mais preferencial células de mamífero, incluindo células CHO (linhagem de células de ovário de hamster chinês) e NS0.

[0086] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para preparação do anticorpo anti-Abeta acima mencionado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, incluindo as etapas de cultura da célula hospedeira acima mencionada em meio de cultura, e em seguida purificação e recuperação do anticorpo.

[0087] Em outro aspecto, a presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica, compreendendo o anticorpo anti-Abeta acima mencionado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e um ou mais veículos, excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.

[0088] Em outro aspecto, a presente invenção também proporciona o uso do anticorpo anti-Abeta acima mencionado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou da composição farmacêutica acima mencionada na preparação de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de uma doença ou um distúrbio causado por Abeta.

[0089] Em outro aspecto, a presente invenção também proporciona um método para tratamento ou prevenção de uma doença ou um distúrbio causado por Abeta, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-Abeta acima mencionado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou da composição farmacêutica acima mencionada, a um paciente tendo a doença ou distúrbio.

[0090] Em outro aspecto, a presente invenção também proporciona o anticorpo anti-Abeta acima mencionado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou a composição farmacêutica acima mencionada para uso como um medicamento para o tratamento de doenças ou distúrbios mediados por Abeta.

[0091] Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio acima mencionado é uma doença neurodegenerativa selecionada entre o grupo que consiste em doença de Alzheimer, transtorno cognitivo leve, demência frontotemporal, doença de corpos de Lewy, doença de Parkinson, doença de Pick, doença de Bevac, angiopatia amiloide congofílica, angiopatia amiloide cerebral, síndrome de Down, demência por múltiplos enfartes, doença de Huntington, doença de Creutzfeldt-Jakob, síndrome de demência associada ao HIV, depressão, transtorno de ansiedade, fobia, parelisia de Bell, epilepsia, encefalite, esclerose múltipla, transtorno neuromuscular, transtorno neurotumoral, tumor cerebral, transtorno neurovascular devido a derrame, distúrbios neuroimunes, doença otológica neuropática, neurotrauma devido a lesão da medula espinhal, dor devido a dor neuropática, transtorno neuro pediátrico e neuropsiquiátrico, transtorno do sono, síndrome de Tourette, transtorno cognitivo leve, demência vascular, demência por múltiplos enfartes, fibrose cística, doença de Gaucher e discinesia diversa e doenças do sistema nervoso central. Em algumas modalidades, a doença é doença de Alzheimer.

[0092] Em algumas modalidades, a presente invenção também proporciona um método para tratamento ou prevenção de doença de Alzheimer, compreendendo a administração, a um paciente, de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-Abeta acima mencionado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou da composição farmacêutica acima mencionada.

[0093] Os anticorpos anti-Abeta ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da presente invenção apresentam boa eficiência tanto em testes bioquímicos quanto em ensaios farmacodinâmicos in vivo. Por exemplo, em um ensaio de detecção de afinidade, os anticorpos anti-Abeta da presente invenção (HAB-2401, HAB-5101, HAB-3601 e HAB-9001) apresentam uma afinidade para fibrilas Aβ1-42 de menos de 10-8M, mesmo menos de 10-10M, e uma afinidade para monômero Aβ1-42 de menos de 10-7M a 10-8M. Especialmente, o anticorpo HAB-9001 apresenta uma afinidade quase 100 vezes mais forte do que o Aducanumab, conhecido atualmente como o anticorpo anti-Abeta mais excelente.

[0094] Além disso, em um ensaio do efeito dos anticorpos sobre o bloqueio da agregação dos monômeros Aβ1-42 em fibrilas Aβ1-42, os resultados mostram que os anticorpos HAB-2401, HAB-5101 e HAB-9001 da presente invenção pode inibir de modo eficaz a agregação do monômero Aβ1-42 em fibrilas Aβ1-42, ao passo que o Aducanumab não pode.

[0095] Em um teste bioquímico, os resultados mostram que os anticorpos anti-Abeta HAB-2401 e HAB-3601 da presente invenção têm efeitos sobre a proteção dos neurônios primários de ratos e podem promotver a fagocitose de fibrilas Aβ por células microgliais primárias.

[0096] Além disso, em um ensaio farmacodinâmico em animal, os resultados mostram que os anticorpos HAB-2401, HAB-5101 e HAB-9001 da presente invenção podem melhorar significativamente a memória espacial e a competência cognitiva de camundongos com Alzheimer 5×FAD. Além disso, os anticorpos da presente invenção têm menor impacto sobre a liberação de citocinas (tais como TNFα, IFN-γ, IL1β, IL2, IL6, IL12p70, IL4, IL10, MCP-1 e KC) no tecido cerebral, quando comparados com o anticorpo positivo Aducanumab, indicando que os anticorpos da presente invenção são controláveis em termos de riscos de segurança. Espera-se que os anticorpos anti-Abeta da presente invenção sejam úteis no futuro para o tratamento ou a prevenção de doenças ou distúrbios causados por Abeta (tais como a doença de Alzheimer).

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0097] A Figura 1 apresenta um ensaio de fluorescência da tioflavina (ThT), mostrando os resultados experimentais do efeito de bloqueio de anticorpos anti-Abeta sobre a agregação de monômeros Aβ1-42 em fibrilas Aβ1-42;

[0098] A Figura 2 apresenta um ensaio da proteção sobre neurônios corticais primários, mostrando os resultados experimentais do efeito de proteção dos anticorpos anti-Abeta sobre neurônios primários de rato;

[0099] A Figura 3 apresenta um ensaio de fagocitose de BV2, mostrando os resultados experimentais dos anticorpos anti-Abeta, os quais promovem fagocitose de fibrilas Aβ por células BV2;

[00100] A Figura 4 mostra os resultados experimentais do efeito dos anticorpos anti-Abeta sobre a fagocitose de fibrilas Aβ por células microgliais primárias de rato;

[00101] A Figura 5 é uma fotografia representativa para classificar a capacidade dos camundongos para fazer um ninho;

[00102] A Figura 6 apresenta um experimento de nidificação, o gráfico de barras mostrando o efeito dos anticorpos anti-Abeta em melhorar o comportamento social de camundongos transgênicos 5×FAD;

[00103] A Figura 7 apresenta um experimento de nidificação, o diagrama de dispersão mostrando o efeito dos anticorpos anti-Abeta em melhorar o comportamento social de camundongos transgênicos 5×FAD;

[00104] A Figura 8 mostra um diagrama esquemático do labirinto de água. O círculo sólido e o círculo pontilhado representam a localização da plataforma e da zona da plataforma, respectivamente.

[00105] A Figura 9 apresenta curvas de aprendizado para o experimento de labirinto de água; mostrando os resultados das curvas do treinamento da plataforma escondida e aprendizado. ANOVA Two way se refere a análise de duas vias da variância. Os resultados da análise são como se segue:

[00106] ANOVA Two way: WT vs. Veículo: # p<0,05; ###: p<0,001;

[00107] Amab vs Veículo: :p<0,05; : p<0,01; :P<0,001;

[00108] HAB-5101-Ch vs. Veículo: ^: p<0,05;

[00109] HAB-2401-Ch vs. Veículo: :p<0,05; : p<0,01;

[00110] HAB-9001-Ch vs. Veículo:*:p<0,05; **: p<0,01; ***: P<0,001.

[00111] As Figuras 10A a 10G apresentam os resultados do experimento de labirinto de água: o eixo horizontal mostra os grupos de administração do fármaco; a Figura 10A mostra os resultados do tempo de latência para chegar na plataforma, a Figura 10B mostra os resultados do tempo de latência para chegar na zona da plataforma, a Figura 10C mostra os resultados da contagem do cruzamento da plataforma, a Figura 10D mostra os resultados da contagem do cruzamento da zona da plataforma, a Figura 10E mostra os resultados da duração sobre a plataforma, a Figura 10F mostra os resultados da duração na zona da plataforma, e a Figura 10G mostra os resultados do índice de cruzamento da plataforma (índice de cruzamento = a contagem para cruzamento da região alvo - (a soma da contagem para cruzamento das regiões correspondenets nos outros três quadrantes)/3), as legendas das figuras 10B a 10G são as mesmas que as da figura 10A (vide a legenda na Figura 10A para detalhes). ANOVA One way se refere a análise one-way da variância (O mesmo para as figuras 12 e 13), v.s. veículo, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001; não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos;

[00112] As Figuras 11A a 11D apresentam os resultados do ensaio ELISA de deposição de Aβ. A Figura 11A mostra o conteúdo de Aβ1-40 insolúvel presente no hipocampo, a Figura 11B mostra o conteúdo de Aβ1-42 insolúvel presente no hipocampo (a legenda da Figura 11B é a mesma que a da Figura 11A, vide a Figura 11A para detalhes), a Figura 11C mostra o conteúdo de Aβ1-40 insolúvel presente no córtex, e a Figura 11D mostra o conteúdo de Aβ1-42 insolúvel presente no córtex (a legenda da Figura 11D é a mesma que a da Figura 11C, vide a Figura 11C para detalhes);

[00113] A Figura 12 é um gráfico mostrando Aβ no hipocampo, indicando os resultados da detecção por IHC da deposição de Aβ (córtex). ANOVA One way, v.s. veículo ***p<0,001;

[00114] A Figura 13 mostra Aβ no córtex, indicando os resultados da detecção por IHC da deposição de Aβ (hipocampo);

[00115] A Figura 14A mostra o efeito de anticorpos anti-Abeta sobre a liberação de citocina, TNFα no tecido cerebral;

[00116] A Figura 14B mostra o efeito de anticorpos anti-Abeta sobre a liberação de citocina, IFN-γ no tecido cerebral;

[00117] A Figura 14C mostra o efeito de anticorpos anti-Abeta sobre a liberação de MCP-1 no tecido cerebral;

[00118] A Figura 14D mostra o efeito de anticorpos anti-Abeta sobre a liberação de KC no tecido cerebral;

[00119] A Figura 15A mostra o efeito de anticorpos anti-Abeta sobre a liberação de citocina, IL1β no tecido cerebral;

[00120] A Figura 15B mostra o efeito de anticorpos anti-Abeta sobre a liberação de citocina, IL2 no tecido cerebral;

[00121] A Figura 15C mostra o efeito de anticorpos anti-Abeta sobre a liberação de citocina, IL6 no tecido cerebral;

[00122] A Figura 15D mostra o efeito de anticorpos anti-Abeta sobre a liberação de citocina, IL12p70 no tecido cerebral;

[00123] A Figura 15E mostra o efeito de anticorpos anti-Abeta sobre a liberação de citocina, IL4 no tecido cerebral;

[00124] A Figura 15F mostra o efeito de anticorpos anti-Abeta sobre a liberação de citocina, IL10 no tecido cerebral. Terminologia

[00125] De modo a entender mais facilmente a presente invenção, alguns termos técnicos e científicos são especificamente definidos abaixo. A menos que explicitamente definido de modo diverso no presente documento, neste requerimento de patente, todos os outros termos técnicos e científicos usados no presente documento, neste requerimento de patente, têm o significado comumente entendido pelos versados na arte à qual pertence esta invenção.

[00126] Os códigos de três letras e os códigos de uma letra para os aminoácidos usados na presente invenção são conforme descrito em J. Biol. Chem, 243, p3558 (1968).

[00127] Na presente invenção, "um XXX" se refere a uma ou mais das substâncias; por exemplo, "um anticorpo anti-Abeta" deve ser entendido como um ou mais anticorpos se ligando especificamente a Abeta. Portanto, os termos "um", "um ou mais" e "no mínimo um" podem ser usados de modo intercambiável no presente documento, neste requerimento de patente.

[00128] Os termos "amiloide β", "β-amiloide", "Aβ" e "Abeta" podem ser usados de modo intercambiável no presente documento, neste requerimento de patente, e se referem a um segmento gerado por clivagem da Proteína Precursora Amiloide (APP) usando β-secretase 1 (BACE1), ou qualquer modificação ou qualquer equivalente funcional da mesma, incluindo, mas não limitado a Aβ1-40 e Aβ1-42. É de conhecimento geral que Aβ está presente sob a forma de monômeros, os quais são combinados para formar oligômeros e estrutura de protofibrilas. A estrutura e sequências de similares peptídeos Aβ são de conhecimento geral dos versados na arte, e os métodos para produção dos peptídeos ou para extração dos peptídeos do cérebro e de outros tecidos também são de conhecimento geral (por exemplo, Glenner and Wong, Biochem Biophys Res. Comm. 129:885 -890 (1984)). Além disso, peptídeos Aβ também estão disponíveis comercialmente. Como exemplos da sequência de aminoácidos de Aβ humano, a SEQ ID NO: 1 representa a sequência de aminoácidos de Aβ1-40 e a SEQ ID NO: 2 representa a sequência de aminoácidos de Aβ1-42.

[00129] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, "anticorpo" se refere a imunoglobulina, uma estrutura de quatro cadeias peptídicas conectadas juntas por ligação de dissulfeto entre duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas. Uma ou mais regiões constantes de cadeia pesada de imunoglobulinas diferent apresentam diferentes composições e disposição de aminoácidos, portanto apresentam antigenicidade diferente. Por conseguinte, as imunoglobulinas podem ser divididas em cinco tipos, ou nomeados como isótipos de imunoglobulina, a saber IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, correspondentes à cadeia pesada µ, δ, γ, α e ε, respectivamente De acordo com sua composição de aminoácidos da região de articulação e o número e localização das ligações de dissulfeto de cadeia pesada, o mesmo tipo de Ig pode ser adicionalmente dividido em diferentes sub-tipos, por exemplo, IgG pode ser dividido em IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Cadeia leve pode ser dividida em cadeia κ ou λ com base em uma ou mais regiões constantes diferentes. Cada um dos cinco tipos de Ig pode ter cadeia κ ou λ.

[00130] Na presente invenção, a cadeia leve do anticorpo pode compreender adicionalmente região constante de cadeia leve, a qual compreende cadeia κ, λ humana ou murina ou variante das mesmas; a cadeia pesada do anticorpo pode compreender adicionalmente região constante de cadeia pesada, a qual compreende IgG1, IgG 2, IgG 3, IgG 4 humana ou murina ou variante da mesma.

[00131] Cerca de 110 sequências de aminoácidos adjacentes ao terminal N das cadeias pesadas e leves do anticorpo são altamente variáveis, conhecidas como região variável (região Fv), incluindo região variável de cadeia leve (VL) e região variável de cadeia pesada (VH); o resto das sequências de aminoácidos próximas ao terminal C são relativamente estáveis, conhecidas como região constante. A região variável inclui três regiões hipervariáveis (HVRs) e quatro regiões de framework relativamente conservadas (FRs). As três regiões hipervariáveis, as quais determinam a especificidade do anticorpo também são conhecidas como regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Cada região variável de cadeia leve (VL) e cada região variável de cadeia pesada (VH) consiste em três regiões de CDR e quatro regiões de FR, com ordem sequencial do terminal amino para o terminal carboxila na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, e FR4. As três regiões de CDR da cadeia leve se referem a LCDR1, LCDR2, e LCDR3, e as três regiões de CDR da cadeia pesada se referem a HCDR1, HCDR2, e HCDR3. O número e a posição dos resíduos de aminoácidos de CDR do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento, neste requerimento de patente, estão de acordo com os critérios de numeração Kabat conhecidos e/ou os critérios de numeração Chothia ((1983) U.S. Dept. of Health e Human Services, “Sequence of Proteins of Immunological Interest”.).

[00132] Os anticorpos da presente invenção incluem anticorpos murinos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, de modo preferencial anticorpos humanizados.

[00133] O termo "anticorpo murino" descrito na presente invenção se refere a anticorpo monoclonal de ligação a Abeta humano preparado de acordo com o conhecimento e as habilidades no campo. Durante a preparação, o sujeito do teste pode ser injetado com antígeno Abeta, e em seguida um hibridoma expressando o anticorpo, o qual possui a sequência desejada ou características funcionais desejadas é isolado. Em uma modalidade da presente invenção, o anticorpo contra Abeta murino ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo adicionalmente compreende região constante de cadeia leve de cadeia κ, λ murina ou variante da mesma, e/ou adicionalmente compreende região constante de cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 murina ou variante da mesma.

[00134] O termo "anticorpo quimérico" conforme descrito no presente documento, neste requerimento de patente, é um anticorpo por fusão da região variágle de anticorpo murino junto com a região constante de anticorpo humano, e o anticorpo quimérico pode aliviar a resposta imune induzida pelo anticorpo murino. De modo a estabelecer um anticorpo quimérico, primeiro, um hibridoma secretando anticorpo monoclonal murino específico é estabelecido e gene de região variável é clonado a partir do hibridoma murino. Em seguida gene de região constante é clonado a partir do anticorpo humano de acordo com a necessidade. O gene de região variável murina é conectado ao gene de região constante humana para formar um gene quimérico, o qual pode ser em seguida inserido em um vetor de expressão. Finalmente a molécula de anticorpo quimérico vai ser expressa em sistema eucariótico ou procariótico. Em uma modalidade da presente invenção, a cadeia leve do anticorpo quimérico adicionalmente compreende uma região constante de cadeia leve derivada de cadeia κ, λ humana ou variante da mesma. A cadeia pesada do anticorpo quimérico adicionalmente compreende uma região constante de cadeia pesada derivada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humanas ou variante da mesma, de modo preferencial compreende uma região constante de cadeia pesada derivada de IgG1, IgG2 ou IgG4 humanas, ou variante de IgG1, IgG2 ou IgG4 com uma ou mais mutações de aminoácidos, tais como uma ou mais mutações YTE ou uma ou mais mutações de volta.

[00135] O “anticorpo humanizado” conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, também conhecido como anticorpo enxertado com CDR, se refere a um anticorpo gerado por enxerto de sequências de CDR murinas dentro das estruturas de região variável do anticorpo humano, isto é, um anticorpo produzido em diferentes tipos de sequências de estrutura de anticorpo da linhagem germinativa humana.

Anticorpo humanizado pode conquistar respostas heterólogas induzidas por anticorpo quimérico, o qual carrega um grande número de componentes de proteínas murinas.

As sequências de estrutura referidas podem ser obtidas do banco de dados de DNA públicos cobrindo sequências genéticas de anticorpos da linhagem germinativa ou referências publicadas.

Por exemplo, sequências de DNA da linhagem germinativa de genes de região variável de cadeias pesadas e leves haumanas podem ser encontradas no banco de dados de sequências da linhagem germinativa humana "VBase" (www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), bem como em Kabat, EA, et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.

De modo a evitar uma diminuição na atividade causada pela diminuição na imunogenicidade, as sequências de estrutura na região variável do anticorpo humano podem ser submetidas a mínimas mutações reversas ou uma ou mais mutações de volta para manter a ativitade.

O anticorpo humanizado da presente invenção também compreende anticorpo humanizado no qual a maturação por afinidade de CDR é realizdaa por display de fago.

Em uma modalidade da presente invenção, a sequência de CDR do anticorpo humanizado Abeta é selecionada entre SEQ ID NO: 11 a 27. Para a estrutura de região variável do anticorpo humano, depois de desenho e seleção, a sequência de região de FR de cadeia pesada do anticorpo é selecionada entre regiões FR1, FR2, FR3 e JH6 da linhagem germinativa humana IGHV1-24*01 e hjh6.3, IGHV3-30*01 e hjh6.3 ou IGHV2-70D*04 e hjh6.1, ou sequência mutante das mesmas; a sequência de região de FR de cadeia leve é selecionada entre regiões FR1, FR2, FR3 e JK4, JK2 da linhagem germinativa humana IGKV1-27*01 e hjk4.1, IGKV1-39*01 e hjk4.1, IGKV2-40*01 e hjk4.1, IGKV2-40*01 e hjk2.1, ou sequência mutante das mesmas.

[00136] O enxerto de CDR pode resultar na diminuição da afinidade do anticorpo anti Abeta resultante ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ao antígeno devido aos resíduos de framework contactados com o antígeno. As interções referidas podem resultar de mutações altamente somáticas. Portanto, ainda pode ser necessário enxertar os aminoácidos do framework doador ao framework do anticorpo humanizado. Os resíduos de aminoácidos envolvidos em ligação ao antígeno derivados de anticorpo não anti-Abeta humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo podem ser identificados verificando a sequência e a estrutura da região variável de anticorpo monoclonal murino. Os resíduos de aminoácidos que são diferentes entre o framework da CDR doadora e as linhagens germinativas podem ser considerados como sendo relacionados. Se não for possível determinar a linhagem germinativa mais intimamente relacionada, a sequência pode ser comparada com a sequência comum partilhada por subtipos ou a sequência murina com alta percentagem de similaridade. Imagina-se que raros resíiduos de framework sejam o resultado de uma alta mutação em células somáticas, e tenha um papel importante em ligação.

[00137] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, "fragmento de ligação ao antígeno" ou "fragmento funcional" se refere a um ou mais fragmentos de anticorpo retendo a capacidade de ligação ao antígeno. Foi demonstrado que fragmentos de um anticorpo de comprimento total podem ser usados para realizar função de ligação a um antígeno específico. Exemplos de fragmentos de ligação incluídos no termo "fragmento de ligação ao antígeno" incluem (i) fragmento Fab, um fragmento monovalente composto dos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ligação de dissulfeto na região de articulação; (iii) fragmento Fd, consistindo em domínios VH e CH1; (iv) fragmento Fv, consistindo em domínios VH e VL de um-ramo; (v) fragmento de domínio único ou dAb (Ward et al. (1989) Nature341: 544-546) composto do domínio VH; e (vi) região determinante de complementaridade separada (CDR) ou (vii) combinação de duas ou mais CDRs separadas opcionalmente ligadas por um encadeador sintético. Além disso, o domínio VL e o domínio VH do fragmento Fv são codificados por dois genes separados, No entanto, podem ser encadeados por um emcadeador sintético usando m,étodos recombinantes, para gerar uma única cadeia de proteína na qual é formado um molecular monovalente por pareamento dos domínios VL e VH (referido como Fv de cadeia única (scFv); vide, por exemplo, Bird et al. (1988): 423-426; Science 242 e Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883). Os anticorpos de cadeia única referidos também se destinam a serem incluídos no termo “fragmento de ligação ao antígeno”. Os anticorpos referidos são obtidos usando técnicas convencionais de conhecimento no campo, e triados para fragmentos funcionais usando o mesmo método que para um anticorpo intacto. Porções de ligação ao antígeno podem ser produzidas por tecnologia de DNA recombinante ou por disrupção enzimática ou química de uma imunoglobulina intacta. Os anticorpos podem estar sob a forma de diferentes isótipos, por exemplo, anticorpo IgG (por exemplo, subtipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE ou IgM.

[00138] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, Fab é um fragmento de anticorpo obtido por tratamento de uma molécula de anticorpo IgG com uma papaína (a qual cliva o resíduo de aminoácido na posição 224 da cadeia H). O fragmento Fab tem um peso molecular de cerca de 50.000 e tem atividade de ligação ao antígeno, na qual cerca de metade do lado N-terminal da cadeia H e toda a cadeia L são ligadas juntas através de uma ligação de dissulfeto. O Fab da presente invenção pode ser produzido por tratamento do anticorpo monoclonal da presente invenção (o qual especificamente reconhece Abeta humano e se liga à região extracelular ou à estrutura tridimensional da mesma) com papaína. Além disso, o Fab pode ser produzido por inserção de DNA codificando Fab do anticorpo dentro de um vetor de expressão procariótica ou vetor de expressão eucariótica e introduzomdo o vetor em um procariota ou eucariota para expressar o Fab.

[00139] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, F(ab')2 é um fragmento de anticorpo tendo peso molecular de cerca de 100.000 e tendo atividade de ligação ao antígeno e compreendendo duas regiões Fab as quais são ligadas na região de articulação, pode ser be produzido por digestão da parte a jusante das duas ligações de dissulfeto na região de articulação de IgG com pepsina. O F(ab') 2 da presente invenção pode ser produzido por tratamento do anticorpo monoclonal da presente invenção (o qual reconhece especificamente Abeta humano e se liga à região extracelular ou estrutura tridimensional do mesmo) com pepsina. Além disso, o F(ab')2 pode ser produzido por ligação do Fab' descrito abaixo através de ligação tioéter ou ligação de dissulfeto.

[00140] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, Fab' é um fragmento de anticorpo tendo um peso molecular de cerca de 50.000 e tendo atividade de ligação ao antígeno. Fab' é obtido por clivagem de uma ligação de dissulfeto na região de articulação do F(ab')2 acima mencionado. O Fab' da presente invenção pode ser produzido por tratamento do F(ab')2 da presente invenção (o qual reconhece especificamente Abeta e se liga à região extracelular ou estrutura tridimensional do mesmo) com um agente redutor, tal como ditiotreitol. Além disso, o Fab’ pode ser produzido por inserção de DNA codificando Fab’ do anticorpo em um vetor de expressão procariótica ou vetor de expressão eucariótica e introduzindo o vetor em um procariota ou eucariota para expressar o Fab’.

[00141] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, "anticorpo de cadeia única", "Fv de cadeia única" ou "scFv" se refere a uma molécula compreendendo domínio variável (ou região; VH) de cadeia pesada do anticorpo conectada ao domínio variável (ou região; VL) de cadeia leve do anticorpo por um encadeador. As moléculas de scFv referidas têm estrutura geral de NH2-VL-encadeador-VH-COOH ou NH2-VH-encadeador-VL-COOH. Um encadeador adequado na arte anterior consiste em sequência de aminoácidos GGGGS repetida ou variante da mesma, por exemplo, variante com 1 a 4 repetições (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). Outros encadeadores que podem ser usados na presente invenção são descritos por Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al.(2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 e Roovers et al. (2001), Cancer Immunol. O scFv da presente invenção pode ser produzido pelas seguintes etapas: obternção de cDNAs codificando VH e VL do anticorpo monoclonal da presente invenção o qual reconhece especificamente Abeta humano e se liga à regtião extracelular ou estrutura tridimensional da mesma, construção de DNA codificando scFv, inserção do DNA em um vetor de vetor de expressão procariótica ou vetor de expressão eucariótica, e em seguida introdução do vetor de expressão em um procariota ou eucariota para expressar o scFv.

[00142] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, diabody é um fragmento de anticorpo em que o scFv é dimerizado, e é um fragmento de anticorpo tendo atividade de ligação ao antígeno divalente. Na atividade de ligação ao antígeno divalente, os dois antígenos podem ser os mesmos ou diferentes. O diabody da presente invenção pode ser produzido pelas seguintes etapas: obtenção de cDNAs codificando VH e VL do anticorpo monoclonal da presente invenção o qual reconhece especificamente Abeta humano e se liga à região extracelular ou estrutura tridimensional do mesmo, construção de DNA codificando scFv de modo que o comprimento do peptídeo encadeador é de 8 resíduos de aminoácidos ou menos, inserção do DNA em um vetor de expressão procariótica ou vetor de expressão eucariótica, e em seguida introdução do vetor de expressão em um procariota ou eucariota para expressar o diabody.

[00143] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, dsFv é obtido por substituição de um resíduo de aminoácido em cada de VH e VL com resíduo de cisteína, e em seguida conectando os polipeptídeos substituídos por meio de uma ligação de dissulfeto entre os dois resíduos de cisteína. Os resíduos de aminoácido a serem substituídos com um resíduo de cisteína podem ser selecionados com base na previsão da estrutura tridimensional do anticorpo de acordo com métodos conhecidos (Protein Engineering, 7, 697 (1994)). O dsFv da presente invenção pode ser produzidos pelas seguintes etapas: obtenção de cDNAs codificando VH e VL do anticorpo monoclonal da presente invenção o qual reconhece especificamente Abeta humano e se liga à região extracelular ou estrutura tridimensional do mesmo, construção de DNA codificando dsFv, inserção do DNA em um vetor de expressão procariótica ou vetor de expressão eucariótica, e em seguida introdução do vetor de expressão em um procariota ou eucariota para expressar o dsFv.

[00144] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, peptídeo contendo CDR é construído a partir de uma ou mais regiões de CDR VH ou VL. Peptídeos compreendendo várias CDRs podem ser conectados diretamente ou através de encadeador peptídico adequado. O peptídeo contendo CDR da presente invenção pode ser produzido pelas seguintes etapas: construção de DNA codificando VH e VL do anticorpo monoclonal da presente invenção o qual reconhece especificamente Abeta humano e se liga à região extracelular ou estrutura tridimensional do mesmo, inserção do DNA em um vetor de expressão procariótica ou vetor de expressão eucariótica, e em seguida introdução do vetor de expressão em um procariota ou eucariota para expressar o peptídeo. O peptídeo contendo CDR também pode ser produzido por um método de síntese química tal como o método Fmoc ou o método tBoc.

[00145] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, "CDR" se refere a uma das seis regiões hipervariáveis presentes no domínio variável do anticorpo que contribui principalmente para ligação ao antígeno. Uma das definições mais comumente usadas dos 6 CDRs é proporcionada por Kabat EA et al. ((1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242). Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, a definição de Kabat para CDR é aplicada para CDR1, CDR2, e CDR3 do domínio variável de cadeia leve (CDR L1, CDR L2, CDR L3 ou L1, L2, L3), e CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia pesada (CDR H2, CDR H3 ou H2, H3).

[00146] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, "framework de anticorpo” se refere a uma parte do domínio variável, quer VL ou VH, a qual serve como um andaime para os loops de ligação ao antígeno (CDRs) deste domínio variável. Essencialmente, é um domínio variável sem CDRs.

[00147] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, "epítope” ou "determinante antigênico" ou "epítope de antígeno” se refere a um sítio sobre um antígeno ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo se liga especificamente (por exemplo, um sítio específico sobre molécula Abeta). Epítopes tipicamente incluem no mínimo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos contíguos ou não contíguos ou em uma única conformação terciária. (Vide, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, ed. G. E. Morris (1996)).

[00148] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, "se ligam especificamente a", "se ligam seletivamente a", "se liga seletivamente a" ou "se liga especificamente a" se refere à ligação de um anticorpo a um epítope predeterminado sobre um antígeno. Tipicamente, o anticorpo se liga com uma afinidade (KD) de menos de cerca de 10-7 M, por exemplo, menos de cerca de 10-8 M, 10-9 M ou 10-10 M ou mesmo menos.

[00149] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, "KD"ou “Kd” se refere à constante de equilíbrio de dissociação para interação anticorpo-antígeno particular. Tipicamente, o anticorpo da presente invenção se liga a Abeta humano com uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) de menos de cerca de 10-7M, por exemplo, menos de cerca de 10-8M, 10-9M ou 10-10M ou mesmo menos, por exemplo, conforme determinado por tecnologia de Ressonância de Plasma Superficial (SPR) em instrumento Biacore T200.

[00150] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, "ligação competitiva" e "se liga competitivamente a" se refere a um anticorpo reconhecendo e ligando ao mesmo epítope (também chamado de um determinante antigênico) ou uma parte do mesmo epítope sobre Abeta humano que a dos monoclonal anticorpos monoclonais da presente invenção. Um anticorpo se ligando ao mesmo epítope que os anticorpos monoclonais da presente invenção se refere a um anticorpo que reconhece e se liga à sequência de aminoácidos de Abeta humano a qual é reconhecida pelos anticorpos monoclonais da presente invenção.

[00151] Quando o termo "competição" é usado no contexto de proteínas de ligação ao antígeno (por exemplo, proteínas de ligação ao antígeno neutralizantes ou anticorpos neutralizantes) que competem pelo mesmo epítope, significa que ocorre competição entre as proteínas de ligação ao antígeno, o que é determinado pelos testes em que uma proteína de ligação ao antígeno a ser testada (por exemplo, um anticorpo ou fragmento imunologicamente funcional do mesmo) previne ou inibe (por exemplo, reduz) a ligação específica de uma proteína de ligação ao antígeno de referência (por exemplo, um ligante ou anticorpo de referência) a um antígeno comum (por exemplo, um antígeno PD-L1 ou fragmento do mesmo). Estão disponíveis numerosos tipos de testes de ligação competitiva para determinar se uma proteína de ligação ao antígeno compete com outra. Estes testes são, por exemplo, radioimunoensaio (RIA) direto ou indireto de fase sólida, imunoensaio enzimático (EIA) direto ou indireto de fase sólida, ensaio de competição de sanduíche (vide, por exemplo, Stahli et al, 1983, Methods in Enzymology 9: 242-253); imunoensaio enzimático de biotina-avidina direto de fase sólida (vide, por exemplo, Kirkland et al, 1986, J. Immunol. 137: 3614-3619), ensaio de marcação direta de fase sólida, ensaio de sanduíche de marcação direta de fase sólida (vide, por exemplo, Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); radioimunoensaio de marcação direta de fase sólida com marcador de I-125 (vide, por exemplo, Morel et al, 1988, Molec. Immunol. 25: 7-15); imunoensaio enzimático de biotina-avidina direto de fase sólida (vide, por exemplo, Cheung, et al, 1990, Virology 176: 546-552); e radioimunoensaio de marcação direta (Moldenhauer et al, 1990, Scand. J. Immunol. 32: 77-82). Tipicamente, o ensaio envolve o uso de um antígeno purificado capaz de ligação a uma superfície sólida ou célula carregada tanto com uma proteína de ligação ao antígeno de teste não marcada quanto uma proteína de ligação ao antígeno de referência marcada. Inibição competitiva é determinada medindo a quantidade de marcador ligado à superfície sólida ou à célula na presença da proteína de ligação ao antígeno de teste. Geralmente, a proteína de ligação ao antígeno de teste está presente em excesso. Proteínas de ligação ao antígeno identificadas por ensaio competitivo (competindo com a proteína de ligação ao antígeno) incluem: proteínas de ligação ao antígeno que se ligam ao mesmo epítope que a proteína de ligação ao antígeno de referência; e proteínas de ligação ao antígeno que se ligam a um epítope que está suficientemente próximo ao epítope ao qual a proteína de ligação ao antígeno de referência se liga, onde os dois epítopes interferem espacialmente um com o outro para impedir a ligação. São proporcionados detalhes adicionais relativos a métodos para determinar ligação competitiva nos Exemplos no presente documento, neste requerimento de patente. Tipicamente, quando uma proteína de ligação ao antígeno competitiva está presente em excesso, vai inibir (por exemplo, reduzir) no mínimo 40 a 45%, 45 a 50%, 50 a 55%, 55 a 60%, 60 a 65%, 65 a 70%, 70 a 75% ou 75% ou ainda mais da ligação específica da proteína de ligação ao antígeno de referência ao antígeno comum. Em alguns casos, a ligação é inibida por no mínimo 80 a 85%, 85 a 90%, 90 a 95%, 95 a 97%, ou 97% ou ainda mais.

[00152] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, "molécula de ácido nucleico" se refere a moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de cadeia única ou de cadeia dupla, mas de modo preferencial é DNA de cadeia dupla. Um ácido nucleico é "encadeado operacionalmente" quando é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor ou reforçador é encadeado operacionalmente a uma sequência codificante se afetar a transcrição da sequência.

[00153] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, "vetor" se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucléico ao qual tenha sido encadeado. Em uma modalidade, o vetor é um "plasmídeo," o qual se refere a um loop de DNA de cadeia dupla circular no qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Em outra modalidade, o vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados dentro do genoma viral. Os vetores revelados no presente documento, neste requerimento de patente, são capazes de auto-replicação na célula hospedeira dentro da qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem de replicação bacteriana e vetores epissomais de mamíferos), ou podem ser integrados dentro do genoma de uma célula hospedeira depois de introdução dentro da célula hospedeira, e deste modo são replicados junto com o genoma hospedeiro (por exemplo, vetores não epissomais de mamíferos).

[00154] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, "célula hospedeira" se refere a uma célula dentro da qual foi introduzido um vetor de expressão. Células hospedeiras podem incluir células bacterianas, microbianas, de plantas ou animais. Bactérias que são suscetíveis a serem transformadas incluem membros de enterobacteriaceae, tais como cepas de Salmonella ou Escherichia coli ou; Bacillaceae ta como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus e Haemophilus influenzae. Microorganismos adequados incluem Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris. Linhagens de células hospedeiras de animais adequadas incluem células CHO (linhagem de células de ovário de hamster chinês) e NS0.

[00155] Métodos para produção e purificação de anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno são de conhecimento geral na arte, por exemplo, A Laboratory Manual for Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, chapters 5-8 and 15. Por exemplo, camundongos podem ser imunizados com Abeta humano ou fragmentos do mesmo, e os anticorpos resultantes podem ser em seguida renaturados, purificados, e seqüenciados para sequências de aminoácidos, usando métodos convencionais de conhecimento geral na arte. Fragmentos de ligação ao antígeno também podem ser preparados por métodos convencionais. Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção são manipulados para conterem uma ou mais regiões de framework humanas e CDRs derivadas de anticorpo não humano. Sequências da linhagem germinativa de FR humana podem ser obtidas da ImMunoGeneTics (IMGT) através de seu website http://imgt.cines.fr, ou a The Immunoglobulin Facts Book, 2001, ISBN 012441351, por alinhamento contra banco de dados genéticos de linhagem germinativa variável de anticorpos humanos IMGT e usando o software MOE.

[00156] Os anticorpos manipulados ou fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção podem er preparados e purificados usando métodos conhecidos. Por exemplo, sequências de cDNA codificando uma cadeia pesada e uma cadeia leve podem ser clonadas e manipuladas dentro d eum vetor de expressão GS. Os vetores expressando imunoglobulina recombinante podem ser então transfectadsa de modo estável dentro de células CHO. Como um método mais recomendado e de conhecimento geral na arte, sistemas de expressão de mamífero vão resultar em glicosilação, tipicamente em sítios N-terminal altamente conservados na região Fc. Foram obtidos clones estáveis expressando um anticorpo se ligando especificamente a TIM-3 humano. Clones positivos podem ser expandidos em meio de cultura livre de soro em biorreatores para produção de anticorpos. Meio de cultura, no qual um anticorpo tenha sido secretado, pode ser purificado por técnicas convencionais. Por exemplo, pode ser realizada purificação sobre coluna Sepharose FF de Proteína A ou G que tenha sido modificada com tampão. Os componentes de ligação inespecífica são lavados. O anticorpo ligado é elutriado por gradiente de pH e fragmentos de anticorpos são detectados por SDS-PAGE, e em seguida reunidos. Os anticorpos podem ser filtrados e concentrados usando técnicas comuns. Agregados solúveis e multímeros podem ser removidos de maneira eficaz por técnicas comuns, tais como exclusão de tamanho ou permuta de íons. O produto resultante é em seguida congelado imediatamente, por exemplo, a -70°C, ou pode ser liofilizado.

[00157] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, “mutação” inclui mas não está limitada a “mutação de volta”, “modificação conservadora” ou “substituição ou reposição conservadora”. Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, "modificação conservadora" ou "substituição ou reposição conservadora" se refere a substituições de outros aminoácidos tendo características similares (por exemplo, carga, tamanho de cadeia lateral, hidrofobicidade / hidrofilicidade, conformação da espinha dorsal e rigidez, etc.) para os aminoácidos em uma proteína, de tal modo que as modificações podem ocorrer frequentemente sem alterar a atividade biológica da proteína. Os versados na arte reconhecem que, em geral, substituição de aminoácido único em regiões não essenciais de um polipeptídeo não alteram substancialmente a atividade biológica (vide, por exemplo, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)). Além disso,

substituições de aminoácidos estruturalmente ou funcionalmente similares são menos prováveis de romper a atividade biológica.

[00158] A "sequência mutada" mencionada na presente invenção se refere à sequência de nucleotídeos e à sequência de aminoácidos tendo várias percentagens de identidade de sequência com as da presente invenção, depois de modificar a sequência de nucleotídeos e a sequência de aminoácidos da presente invenção por substituição, inserção ou deleção apropriada. A identidade de sequência descrita na presente invenção pode ser de no mínimo 85%, 90% ou 95%, de modo preferencial no mínimo 95%. Exemplos não limitantes incluem 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%. Pode ser realizada comparação de sequências e determinação da percentagem de identidade entre duas sequências usando o algoritmo BLASTN/BLASTP com configurações default disponíveis no website do National Center For Biotechnology Institute.

[00159] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, "homologia” ou “identidade” ou “consistência” se refere a similaridade de sequência entre duas sequências de polinucleotídeos ou entre duas sequências de polipeptídeos. Quando uma posição em ambas as duas sequências a serem comparadas está ocupada pela mesma base ou subunidade monomérica de aminoácido, por exemplo, se uma posição em cada uma de duas moléculas de DNA for ocupada por adenina, então as moléculas são homólogas naquela posição. A percentagem de homologia entre duas sequências é uma função do número de posições correspondentes ou homólogas partilhadas pelas duas sequências dividido pelo número de posições a serem comparadas e em seguida multiplicado por 100. Por exemplo, se 6 em 10 posições em duas sequências são correspondentes ou homólogas quando as sequências são alinhadas otimamente, então as duas sequências têm 60% de homologia; se 95 de 100 posições em duas sequências são correspondidas ou homólogas, então as duas sequências têm 95% de homologia. De modo geral, a comparação é realizada quando duas sequências são alinhadas para proporcionar máxima percentagem de homologia.

[00160] O "exógeno" mencionado na presente invenção se refere a substâncias produzidas fora de organismos, células, ou seres humanos de acordo com as circunstâncias. "Endógeno" se refere a substâncias produzidas em células, organismos, ou corpos humanos de acordo com as circunstâncias.

[00161] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, "célula," "linhagem celular," e "cultura celular" são usadas de modo intercambiável e todas as designações referidas incluem progênie. Portanto, as palavras "transformante" e "célula transformada" incluem as células do sujeito primário e culturas derivadas a partir das mesmas independente do número de passagens. Também deve ser entendido que toda a progênie não pode ser precisamente idêntica em conteúdo de DNA, devido a mutações deliberadas ou aleatórias. São incluídas progênies mutantes que tenham a mesma função ou atividade biológica que as nas células originalmente transformadas. Onde se destinam a designações distintas, será claramente entendido a partir do contexto.

[00162] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, "reação de cadeia polimerase" ou "PCR" se refere a um procedimento ou técnica no qual quantidades mínimas de uma porção específica de ácido nucleico, RNA e/ou DNA, são amplificadas conforme descrito, por exemplo, na Pat. U.S. No.

4.683.195. De modo geral, precisa estar disponível informação de sequência nas extremidades da região de interesse ou além da região de interesse, de tal modo que possam ser designados primers de oligonucleotídeos; estes primers vão ser idênticos ou similares em sequência a cadeias opostas do modelo a ser amplificado. Os nucleotídeos do terminal 5’ dos dois primers podem coincidir com as extremidades do material amplificado. Pode ser usado PCR para amplificar sequências de RNA específicas, sequências de DNA específicas de DNA genômico total, e cDNA transcrito a partir de RNA celular total, bacteriófago ou sequências de plasmídeos, etc. Vide de modo geral Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.). O teste de PCR usado na presente invenção é considerado como sendo um, mas não o único, exemplo de método de reação de polimerase para amplificar uma amostra de ácido nucleico de teste. O método compreende o uso de sequências de ácido nucleico conhecidas como primers e polimerase de ácido nucleico para amplificar ou gerar uma porção específica de ácido nucleico.

[00163] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, "composição farmacêutica" se refere a uma mistura contendo um ou mais compostoa de acordo com a presente invenção ou um sal fisiologicamente / farmaceuticamente aceitável ou pró-droga do mesmo e outros componentes químicos, tais como veículos e excipientes fisiologicamente / farmaceuticamente aceitáveis. A composição farmacêutica visa promover a administração a um organismo, facilitar a absorção do ingrediente ativo e deste modo exercer um efeito biológico.

[00164] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, "tratar" significa administrar internamente ou externamente um agente terapêutico, tal como uma composição contendo qualquer um dos composto de ligação da presente invenção, a um paciente tendo um ou mais sintomas de doença para a qual o agente tem atividade terapêutica conhecida. Tipicamente, o agente é administrado em uma quantidade efetiva para aliviar um ou mais sintomas de doença no paciente ou população a ser tratado, quer induzindo a regressão ou inibindo a progressão de similar(s) sintoma(s) por qualquer grau clinicamente mensurável. A quantidade de um agente terapêutico que é eficaz para aliviar qualquer sintoma de doença particular (também referida como a "quantidade terapeuticamente eficaz") pode variar de acordo com vários fatores, tais como o estado de doença, a idade, e o peso corporal do paciente, e a capacidade do fármaco para provocar uma respota desejada no paciente. Se um sintoma de doença foi aliviado, pode ser avaliado por qualquer medida clínica tipicamente usada por médicos ou outros prestadores de cuidados de saúde versados para avaliar a gravidade ou o estado de progressão daquele sintoma. Apesar de uma modalidade da presente invenção (por exemplo, um método de tratamento ou artigo de manufatura) poder não ser eficaz em aliviar um ou mais dos sintomas da doença alvo em todos os pacientes, deve aliviar um ou mais dos sintomas da doença alvo em um número estatisticamente importante de pacientes, conforme determinado por qualquer teste estatístico conhecido na arte, tal como o t-teste de Student, o teste qui-quadrado, o U-teste de acordo com Mann e Whitney, o teste de Kruskal-Wallis (H-teste), o teste de Jonckheere-Terpstra e o teste de Wilcoxon.

[00165] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, "quantidade eficaz" engloba uma quantidade suficiente para melhorar ou prevenir um sintoma ou sinal da condição médica. Quantidade eficaz também significa uma quantidade suficiente para permitir ou facilitar o diagnóstico. Uma quantidade eficaz para um paciente ou sujeito veterinário em particular pode variar dependende de fatores tais como a condição sendo tratada, a condição de saúde geral do paciente, a via e dose de administração e a gravidade dos efeitos colaterais. Uma quantidade eficaz pode ser a máxima dose ou protocolo de dosagem que evita efeitos colaterais ou efeitos tóxicos importantes.

[00166] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, "administração” ou "tratamento," conforme se aplica a um animal, ser humano, sujeito experimental, célula, tecido, órgão, ou fluido biológico, se refere a contatar um agente exógeno farmacêutico, terapêutico, de diagnóstico, ou composição com o animal, ser humano, sujeito, célula, tecido, órgão, ou fluido biológico. "Administração" ou "tratamento" pode se referir, por exemplo, a métodos terapêuticos, farmacocinéticos, de diagnóstico, de pesquisa, e experimentais. O tratamento de uma célula engloba contatar um reagente com a célula, bem como contatar um reagente com um fluido, onde o fluido está em contato com a célula. "Administração" ou "tratamento" também significa tratamentos in vitro ou ex vivo, por exemplo, de uma célula, com um reagente, de diagnóstico, composição de ligação, ou com outra célula. "Tratamento", conforme se aplica a um sujeito humano, veterinário, ou de pesquisa, se refere a tratamento terapêutico, profilático ou medidas de prevenção, aplicações de pesquisa e diagnóstico.

[00167] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, “doença ou distúrbio causado por Abeta” se refere a uma doença ou um distúrbio causado por ou associado com β-amiloide, incluindo mas não limitado a doenças e distúrbios causados pela presença ou atividade de β-amiloide consistindo em monômeros Abeta, ou protofibrilas, ou polímeros, ou qualquer combinação dos mesmos, por exemplo, doença neurodegenerativa (por exemplo,: doença de Alzheimer, transtorno cognitivo leve, demência frontotemporal, doença de corpos de Lewy, doença de Parkinson, doença de Pick, doença de Bevac, etc.), várias doenças dos olhos causadas por deposição de β-amiloide (por exemplo, degeneração macular, neuropatia ótica associada à drusa, glaucoma, catarata, etc.).

[00168] Conforme usado no presente documento, neste requerimento de patente, "doenças neurodegenerativas" incluem, mas não estão limitadas a: doença de Alzheimer, transtorno cognitivo leve, demência frontotemporal, doença de corpos de Lewy, doença de Parkinson, doença de Pick, doença de Bevac, angiopatia amiloide congofílica, angiopatia amiloide cerebral, síndrome de Down, demência por múltiplos enfartes, doença de Huntington, doença de Creutzfeldt-Jakob, síndrome de demência associada ao HIV, depressão, transtorno de ansiedade, fobia, parelisia de Bell, epilepsia, encefalite, esclerose múltipla, transtorno neuromuscular, transtorno neurotumoral, tumor cerebral, distúrbio neurovascular incluindo derrame, distúrbios neuroimunes, doença otológica neuropática, neurotrauma incluindo lesão da medula espinhal, dor incluindo dor neuropática, transtorno neuro pediátrico e neuropsiquiátrico, transtorno do sono, síndrome de Tourette, transtorno cognitivo leve, demência vascular, demência por múltiplos enfartes, fibrose cística, doença de Gaucher e discinesia diversa e doenças do sistema nervoso central.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00169] Os exemplos que se seguem são proporcionados para descrever adicionalmente a presente invenção, mas não se destinam a limitar o âmbito da invenção. Métodos experimentais para os quais as condições específicas não são indicadas nos exemplos da presente invenção geralmente são realizados de acordo com condições convencionais, tais como Sambrook et al., Antibodies, Molecular Cloning, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; ou de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante. Reagentes para os quais as origens não são especificamente indicadas são reagentes disponíveis comercialmente. Exemplo 1. Preparação de antígeno Abeta

[00170] Os antígenos Abeta usados nos exemplos e nos exemplos de teste da presente invenção foram sintetizados pela GL Biochem, GenScript ou Sigma, e em seguida preparados in vitro (vide a Tabela 1 para detalhes). Os antígenos Abeta para uso em imunização foram protofibrilas Aβ 1-42 e Aβ1-40 KLH; Os antígenos Abeta para uso em triagem foram fibrilas Aβ1-40-BSA, suspensão em DMSO de Aβ1-40, suspensão em DMSO de Aβ1-42-biotina, protofibrilas Aβ1-42 e fibrilas Aβ1-42; antígenos Abeta para uso em detecção foram monômero Aβ1-42 e fibrilas Aβ1-42.

[00171] A sequência de aminoácidos de Aβ1-40 é mostrada em (SEQ ID NO: 1): ;

[00172] A sequência de aminoácidos de Aβ1-42 é mostrada em (SEQ ID NO: 2): .

[00173] Aβ1-40 KLH e Aβ1-40-BSA se referem ao polipeptídeo Aβ1-40 sintetizado acoplado com KLH (Hemocianina de Lapa) e BSA (Albumina do Soro Bovino), respectivamente, em que o Aβ1-40 usado foi incorporado com aminoácido Cys no terminal N para a conveniência de acoplamento e detecção;

[00174] Protofibrilas Aβ1-42 se refere ao polipeptídeo Aβ1-42 preparado sob a forma de protofibrilas in vitro.

[00175] Fibrilas Aβ1-40-BSA se refere ao polipeptídeo Aβ1-42 acoplado com albumina do soro bovino preparado sob a forma de fibrilas in vitro.

[00176] Suspensão em DMSO de Aβ1-40 se refere a uma solução clara preparada dissolvendo diretamente o polipeptídeo Aβ1-42 em DMSO (dimetil sulfóxido).

[00177] Suspensão em DMSO de Aβ1-42-biotina se refere a uma solução clara preparada dissolvendo diretamente o polipeptídeo

Aβ1-42 marcado com biotina em DMSO (dimetil sulfóxido).

[00178] Fibrilas Aβ1-42 se refere ao polipeptídeo Aβ1-42 preparado sob a forma de fibrilas in vitro.

[00179] Monômero Aβ1-42 se refere ao monômero Aβ1-42. Tabela 1. Antígenos Abeta para uso em imunização, triagem e detecção, e seu método de preparação correspondente Uso Polipeptídeo Fornecedor e Método de preparação Número do catálogo Imunização protofibrilas GL Biochem Pó de peptídeo Aβ foi dissolvido em 10 mM de Aβ1-42 180231 NaOH (pH>10), agitado por 2 min, adicionado com 10×PBS no volume de um décimo do volume de NaOH para obter uma concentração final de 443 µM. A solução referida foi incubada a 37°C de um dia para o outro, e em seguida diluída com PBS até 50 µM para resultar em protofibrilas Aβ1-42. Aβ 1-40 KLH GL Biochem O polipeptídeo foi diretamente dissolvido em PBS KLH-SH-CV-41 para resultar em 1 mg/ml de solução turva. 479311 Triagem de fibrilas GL Biochem O pó de Aβ1-40-BSA sintetizado foi dissolvido em Hibridoma Aβ1-40-BSA BSA-SH-CV-41 DMSO a 0,5 mg/10 µl, e em seguida foi diluído 479311 com 434 µl de água desionizada. O Aβ resultante foi colocado a 37 °C por 10 dias para resultar em fibrilas Aβ1-40-BSA. suspensão de GL Biochem DV-40 Polipeptídeo foi diretamente dissolvido em DMSO Aβ1-40 DMSO 82357 a 1 mg/ml. suspensão de GL Biochem Polipeptídeo foi diretamente dissolvido em DMSO Aβ1-42-biotina Bio-DA-42 212574 a 1 mg/ml.

DMSO fibrilas Aβ1-42 GL Biochem O pó de Aβ1-42 sintetizado foi dissolvido em P160217-SY18023 DMSO a 0,5 mg/10 µl, e em seguida foi diluído 1 com 434 µl de água desionizada. O Aβ resultante foi colocado a 37°C por 10 dias para resultar em fibrilas Aβ1-42. protofibrilas GL Biochem O método de preparação foi o mesmo que o para Aβ1-42 180231 protofibrilas Aβ1-42 para uso em imunização.

Uso Polipeptídeo Fornecedor e Método de preparação Número do catálogo Ensaio de monômero GenScript O pó de polipeptídeo Aβ1-42 sintetizado foi ThT Aβ1-42 RP10017 dissolvido em tampão pré-arrefecido (2×PBS e 10 mM de NaOH, pH>10, misturado em uma proporção de 1:1 (em volume / volume)) em uma concentração final de 1 mg/ml. Ensaio de fibrilas Aβ1-42 GL Biochem O pó de Aβ1-42 sintetizado foi dissolvido em proteção P160427-SY50740 DMSO a 0,5 mg/10 µl, e em seguida foi diluído neuronal 8 com 434 µl de água desionizada. O Aβ resultante Ensaio de P160802-SY18023 foi colocado a 37 °C por 10 dias para resultar em fagocitose de 1 fibrilas Aβ1-42. BV2 Ensaio de P160802-SY18023 fagocitose de 1 microglia Biacore monômero Sigma O pó de polipeptídeo Aβ1-42 foi dissolvido em Aβ1-42 A 9810 DMSO em uma concentração final de 2 mg/ml. fibrilas Aβ1-42 GL Biochem, O pó de Aβ1-42 sintetizado foi dissolvido em P160217-SY18023 DMSO a 0,5 mg/10 µl, e em seguida foi diluído 1e com 434 µl de água desionizada. O Aβ resultante P160802-SY18023 foi colocado a 37 °C por 10 dias para resultar em 1 fibrilas Aβ1-42.

Exemplo 2. Preparação de anticorpo monoclonal de hibridoma anti-Abeta humano

1. Imunização

[00180] Anicorpos monoclonais anti-Abeta humano foram produzidos por imunização de camundongos. Camundongos brancos SJL, fêmeas, de 6 a 8 semanas de idade foram usados para o experimento (Beijing Vital River Experimental Animal Technology Co., Ltd., animal production license number: SCXK (Pequim) 2012-0001). Ambiente de alimentação: nível de SPF. Depois dos camundongos terem sido adquiridos, foram mantidos no ambiente laboratorial por 1 semana, em um ciclo de 12/12 horas de iluminação / escuridão, em uma temperatura de 20 a 25 °C; umidade de 40 a 60%. Em seguida, os camundongos foram imunizados de acordo com os seguintes esquemas. Os antígenos para imunização foram Aβ1-40-K LH e Aβ1-42 protofibrilas.

[00181] Esquema de Imunização 1: O adjuvante usado para imunização foi QuickAntib ody-Mouse3W (Beijing Kangbiquan Biotechnology Co., Ltd. Cat No. KX0210042. A proporção de antígeno para adjuvante (QuickAntibody-Mouse3W) foi de 1:1, 10 μg / camundongo / tempo. O antígeno e o adjuvante foram misturados completamente e usados para inoculação nos dias 0, 7, 14, 21, 28, 35 e

42. No dia 0, os camundongos foram injetados por via intramuscular (IM) na perna traseira com 10 μg/ camundongo do antígeno misto. A primeira imunização foi repetida nos dias 7, 14, 21, 28, 35 e 42, e os camundongos foram injetados de maneira similar por via intramuscular (IM) na perna traseira com 10 μg/ camundongo do antígeno misto. Amostras de sangue foram coletadas nos dias 19, 40 e 55, e o título de anticorpo no soro dos camundongos foi determinado pelo método ELISA. Depois da sétima à oitava imunização, camundongos com um alto título sérico de anticorpos tendendo para o platô foram selecionados para fusão de esplenócitos. Três dias antes da fusão de esplenócitos, solução de antígeno preparada com salina foi injetada por via intraperitoneal (IP), 20 μg/ camundongo, para imunização de reforço.

[00182] Esquema de Imunização 2: O adjuvante usado para imunização foi QuickAntib ody-Mouse5W (Beijing Kangbiquan Biotechnology Co., Ltd. Cat No. KX021004). A proporção de antígeno para adjuvante (QuickAntibody-Mouse5W) foi de 1:1, 25 μg / camundongo / tempo (para a primeira imunização) e 25 μg / camundongo / tempo (para imunização de reforço). O antígeno e o adjuvante foram misturados completamente e usados para inoculação nos dias 0, 14, 28, 42 e 56. No dia 0, os camundongos foram injetados por via intramuscular (IM) na perna traseira com 25 μg/ camundongo do antígeno misto. A primeira imunização foi repetida nos dias 14, 28, 42 e 56, e os camundongos foram injetados de maneira similar por via intramuscular (IM) na perna traseira com 25 μg/ camundongo do antígeno misto. Amostras de sangue foram coletadas nos dias 20 e 49, e o título de anticorpo no soro dos camundongos foi determinado pelo método ELISA. Depois da quinta imunização, camundongos com um alto título sérico de anticorpos tendendo para o platô foram selecionados para fusão de esplenócitos. Três dias antes da fusão de esplenócitos, solução de antígeno preparada com salina foi injetada por via intraperitoneal (IP), 50 μg/ camundongo, para imunização de reforço.

2. Fusão de esplenócitos

[00183] Células de hibridoma foram obtidas por fusão de linfócitos esplênicos com células de mieloma Sp2/0 (ATCC® CRL-8287TM) usando um procedimento de fusão mediado por PEG otimizado. As células de hibridoma fundidas foram ressuspensas em meio completo (meio DMEM compreendendo 20% de FBS, 1×HAT, 1×OPI) em uma densidade de 0,5-1×106/ml, semeada em uma placa de 96 cavidades com 100 μl/ cavidade, incubadas a 37°C e 5% de CO2 por 3 a 4 dias, suplementadas com 100 μl/ cavidade de meio completo HAT, e cultivadas por 3 a 4 dias até formar clones similares a alfinete. O sobrenadante foi removido, adicionado com 200 μl/ cavidade de meio completo HT (meio RPMI-1640 compreendendo 20% de FBS, 1×HT e 1×OPI), incubado a 37°C, 5% de CO2 por 3 dias e em seguida submetido a detecção por ELISA.

3. Triagem de células de hibridoma

[00184] 10 a 11 dias depois de fusão, de acordo com a densidade de crescimento celular, ensaio de ligação ELISA (também conhecido como ensaio imunossorvente ligado a enzima) foi realizado sobre o sobrenadante da cultura de clones com várias formas de polipeptídeo Aβ para triagem preliminar, para classificar os subtipos dos clones de hibridoma resultantes. Fibrilas Aβ1-40-BSA, suspensão em DMSO de Aβ1-42 biotina e suspensão em DMSO de Aβ1-40 foram usadas para triagem de células de hibridoma com Aβ1-40-KLH como um imunogênio; e protofibrilas Aβ1-42, fibrilas Aβ1-42 e suspensão em DMSO de Aβ1-42-biotina foram usadas para triagem de células de hibridoma com protofibrilas Aβ1-42 como um imunogênio. Para cavidades positivas, o meio foi trocado e expandido para placa de 24 cavidades de acordo com a densidade celular. As linhagens celulares transferidas em uma placa de 24 cavidades foram testadas de novo e em seguida sub-clonadas pela primeira vez. Algumas das células positivas triadas na primeira sub-clonagem foram preservadas, e usadas para a segunda sub-clonagem. Algumas das células positivas triadas na segunda sub-clonagem foram preservadas, e usadas para expressão de proteína. Células de hibridoma capazes de ligação especificamente ao polipeptídeo Aβ resultaram de múltiplas fusões. Depois do ensaio de fluorescência de tioflavina (também referido como ThT), ensaio de proteção neuronal e ensaio de fagocitose de macrófagos, foram obtidos os clones de hibridoma mAb-2401, mAb-3601, mAb-5101 e mAb-9001 e foram usados para preparação de anticorpos com cultura celular livre de soro. Os anticorpos resultantes foram purificados de acordo com o exemplo de purificação e os anticorpos purificados foram usados nos exemplos de teste.

4. Purificação de anticorpos de hibridoma e anticorpos recombinantes

[00185] As amostras de sobrenadante expresso por células foram centrifugadas em alta velocidade para remover impurezas, e o sobrenadante expresso por hibridoma foi purificado por coluna de

Proteína G e o sobrenadante expresso por anticorpos recombinantes foi purificado por coluna de Proteína A. A coluna foi lavada com PBS (pH 7,4) até a leitura A280 cair até a linha basal. As proteínas alvo foram elutriadas com 100 mM de ácido acético, pH 3,0, e neutralizadas com 1M de Tris-HCl, pH 8,0. As amostras elutriadas foram adequadamente concentradfas e em seguida adicionalmente purificadas com chromatografia por gel Superdex200 (GE) pré-equilibrada com PBS para remover agregados. Os picos de monômeros foram coletados e divididos em alíquoteas para uso.

5. Sequenciamento dos clones do hibridoma positivo

[00186] Os procedimentos de clonagem das sequências do hibridoma positivo foram como se segue. Foram coletadas células de hibridoma em fase de crescimento logarítmico. Os RNAs foram extraídos com Trizol (Invitrogen, Cat No. 15596-018) de acordo com as instruções do kit e foram transcritos reversamente com o kit de transcrição reversa PrimeScript™ (PrimeScript™ Reverse Transcription kit, Takara, Cat No. 2680A). Os cDNAs resultantes foram amplificados por PCR usando Ig de camundongo-Primer Set (Novagen, TB326 Rev. B 0503), e sequenciados por uma empresa. As sequências de aminoácidos do anticorpo de camundongo da região variável de cadeia pesada (VH) e da região variável de cadeia leve (VL) de clones de hibridoma mAb-2401, mAb-3601, mAb-5101 e mAb-9001 foram determinadas como se segue:

[00187] Nota: As sequências de aminoácidos de regiões variáveis dos anticorpos acima são representadas como FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Os caracteres em itálico indicam sequências de FR e os caracteres sublinhados indicam sequências de CDR.

[00188] As sequências de aminoácidos das regiões de CDR dos anticorpos mAb-2401, mAb-3601, mAb-5101 e mAb-9001 foram mostradas na Tabela 2.

[00189] Tabela 2: Sequências de aminoácidos de regiões de CDR de cadeia pesada e de cadeia leve de anticorpos Anti-Abeta Anticorpo Cadeia pesada Cadeia leve

NTYMH KSSQSLLNSGNQKNYLT HCDR1 LCDR1 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 14

RIDPTNGNTKYAPKFKD WASTRES mAb-2401 HCDR2 LCDR2 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 15

RVYYYDSTYNY QNDYNYPLT HCDR3 LCDR3 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 16

Anticorpo Cadeia pesada Cadeia leve

TFGMGVG RSSQSIVHSNGNTYLE HCDR1 LCDR1 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 20

HIWWDDDKYYNPALKS KVSNRFS mAb-3601 HCDR2 LCDR2 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 21

RPLGSYDYFDY FQGSRVPLT HCDR3 LCDR3 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 22

TSGMGVS RSSQSIVHSNGNTYLE HCDR1 LCDR1 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 20

HIYWDDVSLYNPSLKS KVSNRFS mAb-5101 HCDR2 LCDR2 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 21

RRIITVVDAMDY CQGSRVPPT HCDR3 LCDR3 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26

TFGMGVG RSSQSIVHSNGNTYLE HCDR1 LCDR1 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 20

HIWWDDDKYYNPALKS KVSNRFS mAb-9001 HCDR2 LCDR2 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 21

RGFHLGSRGDYFDH FQGSRVPLT HCDR3 LCDR3 SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 22 Exemplo 3. Humanização de anticorpos monoclonais de hibridoma anti-Abeta humano

[00190] A estrutura canônica foi determinada de acordo com a sequência de região variável de cadeia leve e sequência de região variável de cadeia pesada de anticorpo de camundongo. Entre sequências da linhagem germinativa humana com a mesma estrutura, as sequências mais similares às regiões de não CDR (regiões de framework) de camundongo foram selecionadas como modelos para humanização. Em seguida, as regiões de CDR de anticorpo murino foram enxertadas sobre os modelos selecionados para humanização para substituir as regiões de CDR humanas. Foram feitas mutações de volta ou mutações pontuais sobre algumas sequências de regiões de FR conforme requerido. As regiões variáveis foram em seguida combinadas com uma ou mais regiões constantes humanas (tais como região constante de IgG1 humana) para resultar em anticorpos anti-Abeta humanizados.

1. Humanização de mAb-2401

[00191] Os modelos para humanização de cadeia pesada do anticorpo mAb-2401 foram IGHV1-24*01 e hjh6.3. Isto é, foram selecionadas as regiões de FR1, FR2 e FR3 de cadeia pesada da linhagem germinativa humana IGHV1-24, e a região JH6 de hjh6.3 foi selecionada como região de FR4. Os modelos para cadeia leve foram IGKV1-27*01 e hjk4.1. Isto é, foram selecionadas FR1, FR2, e FR3 de cadeia leve da linhagem germinativa humana IGKV1-27, e a região JK4 de hjk4.1 foi selecionada como região de FR4.

[00192] A sequência de aminoácidos do modelo de cadeia pesada da linhagem germinativa humana (IGHV1-24*01) foi mostrada na (SEQ ID NO: 28):

[00193] A sequência de aminoácidos do modelo de cadeia leve da linhagem germinativa humana (IGKV1-27*01) foi mostrada na (SEQ ID NO: 29):

[00194] As regiões variáveis de cadeias pesada e leve humanizadas foram como se segue:

[00195] VH enxertado em HAB-2401 (SEQ ID NO: 66):

[00196] VL enxertado em HAB-2401 (SEQ ID NO: 67):

[00197] As regiões de CDR de anticorpos murinos foram enxertadas sobre o modelo de humanização selecionado para substituir as regiões de CDR de modelo humano, e foram feitas mutações de volta sobre cadeia pesada na posição 1, 72 e 98 (numeração da sequência natural, correspondente à posição 1, 71 e 94 respectivamente de acordo com a Numeração Kabat) (Q1E, E72A e T98R; Q1E, E71A, T94R de acordo com a numeração Kabat), e em seguida combinadas com a região constante de IgG1 humana para resultar no anticorpo humanizado HAB-2401.

[00198] A sequência de aminoácidos de cadeia pesada de HAB-2401 foi mostrada na (SEQ ID NO: 30):

[00199] A sequência de aminoácidos de cadeia leve de HAB-2401 foi mostrada na (SEQ ID NO: 31):

[00200] Nota: Nas sequências de aminoácidos de cadeias leve e pesada HAB-2401 acima, caracteres em itálico indicam sequência de FR, caracteres sublinhados indicam sequência de CDR, e caracteres duplamente sublinhados indicam sequência de região constante.

2. Humanização de mAb-3601

[00201] Os modelos para humanização de mAb-3601 cadeia pesada do anticorpo foram IGHV3-30*01 e hjh6.3. Isto é, foram selecionadas as regiões de FR1, FR2 e FR3 de cadeia pesada da linhagem germinativa humana IGHV3-30, e a região JH6 de hjh6.3 foi selecionada como região de FR4. Os modelos para cadeia leve foram IGKV1-39*01/hjk4.1. Isto é, foram selecionadas FR1, FR2, e FR3 de cadeia leve da linhagem germinativa humana IGKV1-39, e a região JK4 de hjk4.1 foi selecionada como região de FR4.

[00202] A sequência de aminoácidos do modelo de cadeia pesada da linhagem germinativa humana (IGHV3-30*01) foi mostrada na (SEQ ID NO: 32):

[00203] A sequência de aminoácidos do modelo de cadeia leve da linhagem germinativa humana (IGKV1-39*01) foi mostrada na (SEQ ID NO: 33):

[00204] As regiões variáveis de cadeias pesada e leve humanizadas foram como se segue:

[00205] VH enxertado em HAB-3601 (SEQ ID NO: 68):

[00206] VL enxertado em HAB-3601 (SEQ ID NO: 69):

[00207] As regiões de CDR de anticorpos murinos foram enxertadas sobre o modelo de humanização selecionado para substituir as regiões de CDR humanas do modelo, foram feitas mutações de volta sobre cadeia pesada na posição 28 e 86 (numeração da sequência natural, correspondente à posição 28 e 82B respectivamente de acordo com a Numeração Kabat) (T28A e S86T; T28A e S82B T de acordo com a numeração Kabat), foi feita mutação pontual sobre cadeia pesada na posição 58 (numeração da sequência natural) (D58N) para eliminar potencial isomerização de ácido aspártico, e em seguida combinada com a região constante de IgG1 humana para resultar no anticorpo humanizado HAB-3601.

[00208] A sequência de aminoácidos de cadeia pesada de HAB-3601 foi mostrada na (SEQ ID NO: 34):

[00209] A sequência de aminoácidos de cadeia leve de HAB-3601 foi mostrada na (SEQ ID NO: 35):

[00210] Nota: Nas sequências de aminoácidos de cadeias leve e pesada HAB-3601 acima, caracteres em itálico indicam sequência de FR, caracteres sublinhados indicam sequência de CDR, e caracteres duplamente sublinhados indicam sequência de região constante.

3. Humanização de mAb-5101

[00211] Os modelos para humanização de cadeia pesada do anticorpo mAb-5101 foram IGHV2-70D*04 e hjh6.1. Isto é, foram selecionadas FR1, FR2 e FR3 de cadeia pesada da linhagem germinativa humana IgHV2-70D, e a região JH6 de hjh6.1 foi selecionada como região de FR4. Os modelos para cadeia leve foram IGKV2-40*01 e hjk4.1. Isto é, foram selecionadas FR1, FR2, e FR3 de cadeia leve da linhagem germinativa humana IGKV2-40, e a região JK4 de hjk4.1 foi selecionada como região de FR4.

[00212] A sequência de aminoácidos do modelo de cadeia pesada da linhagem germinativa humana (IGHV2-70D*04) foi mostrada na (SEQ ID NO: 36):

[00213] A sequência de aminoácidos do modelo de cadeia leve da linhagem germinativa humana (IGKV2-40*01) foi mostrada na (SEQ ID NO: 37):

[00214] As regiões variáveis humanizadas foram como se segue:

[00215] VH enxertado em HAB-5101 (SEQ ID NO: 70): VL enxertado em HAB-5101 (SEQ ID NO: 71):

[00216] As regiões de CDR de anticorpos murinos foram enxertadas sobre o modelo de humanização selecionado para substituir as regiões de CDR humanas do modelo, foram feitas mutações de volta sobre a cadeia leve na posição 2 e 50 (numeração da sequência natural, correspondente à posição 2 e 45 respectivamente de acordo com a Numeração Kabat) (I2V e Q50K; I2V e Q45K de acordo com a numeração Kabat), foi feita mutação pontual sobre a cadeia leve na posição 94 (numeração da sequência natural) (C94S) para eliminar potencial incompatibilidade de ligação de dissulfeto, e em seguida combinada com a região constante de IgG1 humana para resultar no anticorpo humanizado HAB-5101.

[00217] A sequência de aminoácidos de cadeia pesada de HAB-5101 foi mostrada na (SEQ ID NO: 38):

[00218] A sequência de aminoácidos de cadeia leve de HAB-5101 foi mostrada na (SEQ ID NO: 39):

[00219] Nota: Nas sequências de aminoácidos de cadeias leve e pesada HAB-5101 acima, caracteres em itálico indicam sequência de FR, caracteres sublinhados indicam sequência de CDR, e caracteres duplamente sublinhados indicam sequência de região constante.

4. Humanização de mAb-9001

[00220] Os modelos para humanização de cadeia pesada do anticorpo mAb-9001 foram IGHV2-70D*04 e hjh6.1. Isto é, foram selecionadas FR1, FR2 e FR3 de cadeia pesada da linhagem germinativa humana IGHV2-70, e a região JH6 de hjh6.1 foi selecionada como região de FR4. Os modelos para cadeia leve foram IGKV2-40*01 e hjk2.1. Isto é, foram selecionadas FR1, FR2, e FR3 de cadeia leve da linhagem germinativa humana IGKV2-40, e a região JK2 de hjk2.1 foi selecionada como região de FR4.

[00221] A sequência de aminoácidos do modelo de cadeia pesada da linhagem germinativa humana (IGHV2-70D*04) foi mostrada na (SEQ ID NO: 36):

[00222] A sequência de aminoácidos do modelo de cadeia leve da linhagem germinativa humana (IGKV2-40*01) foi mostrada na (SEQ ID NO: 37):

[00223] As regiões variáveis humanizadas foram como se segue:

[00224] VH enxertado em HAB-9001 (SEQ ID NO: 72):

[00225] VL enxertado em HAB-9001 (SEQ ID NO: 73):

[00226] As regiões de CDR de anticorpos murinos foram enxertadas sobre o modelo de humanização selecionado para substituir as regiões de CDR humanas do modelo, foi feita mutação de volta sobre a cadeia leve na posição 2 (numeração da sequência natural, correspondente à posição 2 de acordo com a Numeração Kabat) (I2V), foi feita mutação pontual sobre cadeia pesada na posição 58 (numeração da sequência natural) (D58N) para eliminar potencial isomerização de ácido aspártico, e em seguida combinada com a região constante de IgG1 humana para resultar no anticorpo humanizado HAB-9001.

[00227] A sequência de aminoácidos de cadeia pesada de HAB-9001 foi mostrada na (SEQ ID NO: 40):

[00228] A sequência de aminoácidos de cadeia leve de HAB-9001 foi mostrada na (SEQ ID NO: 41):

[00229] Nota: Nas sequências de aminoácidos de cadeias leve e pesada HAB-9001 acima, caracteres em itálico indicam sequência de FR, caracteres sublinhados indicam sequência de CDR, e caracteres duplamente sublinhados indicam sequência de região constante.

[00230] Além disso, com respeito às sequências de região constante do anticorpo HAB-2401, HAB-3601, HAB-5101 e HAB-9001, a sequência de aminoácidos da região constante de cadeia pesada foi mostrada na SEQ ID NO: 42, a sequência de aminoácidos da região constante de cadeia leve foi mostrada na SEQ ID NO: 43, as sequências de aminoácidos de regiões variáveis e sequências de aminoácidos de comprimento total foram mostradas na tabela que se segue:

[00231] Tabela 3: Sequências de aminoácidos de cadeia pesada e de cadeia leve de anticorpos Anti-Abeta humanizados Anticorpo Cadeia pesada Cadeia leve Sequência de Sequência de SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 45 região variável (VH) região variável (VL) HAB-2401 Sequência de Sequência de comprimento total SEQ ID NO: 30 comprimento total SEQ ID NO: 31 (H) (L) Sequência de Sequência de SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO: 47 região variável (VH) região variável (VL) HAB-3601 Sequência de Sequência de comprimento total SEQ ID NO: 34 comprimento total SEQ ID NO: 35 (H) (L) Sequência de Sequência de HAB-5101 SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 49 região variável (VH) região variável (VL)

Anticorpo Cadeia pesada Cadeia leve Sequência de Sequência de comprimento total SEQ ID NO: 38 comprimento total SEQ ID NO: 39 (H) (L) Sequência de Sequência de SEQ ID NO: 50 SEQ ID NO: 51 região variável (VH) região variável (VL) HAB-9001 Sequência de Sequência de comprimento total SEQ ID NO: 40 comprimento total SEQ ID NO: 41 (H) (L) HCDR1 SEQ ID NO: 11 LCDR1 SEQ ID NO: 14 HAB-2401 HCDR2 SEQ ID NO: 12 LCDR2 SEQ ID NO: 15 HCDR3 SEQ ID NO: 13 LCDR3 SEQ ID NO: 16 HCDR1 SEQ ID NO: 17 LCDR1 SEQ ID NO: 20 HAB-3601 HCDR2 SEQ ID NO: 52 LCDR2 SEQ ID NO: 21 HCDR3 SEQ ID NO: 19 LCDR3 SEQ ID NO: 22 HCDR1 SEQ ID NO: 23 LCDR1 SEQ ID NO: 20 HAB-5101 HCDR2 SEQ ID NO: 24 LCDR2 SEQ ID NO: 21 HCDR3 SEQ ID NO: 25 LCDR3 SEQ ID NO: 53 HCDR1 SEQ ID NO: 17 LCDR1 SEQ ID NO: 20 HAB-9001 HCDR2 SEQ ID NO: 52 LCDR2 SEQ ID NO: 21 HCDR3 SEQ ID NO: 27 LCDR3 SEQ ID NO: 22 Exemplo 4. Preparação de anticorpos humanizados

1. Clonagem molecular de anticorpos humanizados

[00232] Foi realizada otimização de codon contra as sequências de anticorpos humanizados projetadas para resultar nas sequências genéticas codificantes preferenciais de codons humano. Fragmento genético VH/VK de cada anticorpo foi construído com os primers de PCR projetados, e em seguida foi introduzido dentro do vetor de expressão pHr (abrigando um peptídeo de sinal e fragmento genético de região constante (CH1-FC/CL)) por recombinação homóloga para construir um plasmídeo expressando comprimento total de anticorpo humanizado VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr. Os clones corretos foram verificados por sequenciamento, em que, para HAB-2401, a sequência de nucleotídeos codificando a cadeia pesada foi mostrada na SEQ ID

NO: 54, a sequência de nucleotídeos codificando a cadeia leve foi mostrada na SEQ ID NO: 55; para HAB-3601, a sequência de nucleotídeos codificando a cadeia pesada foi mostrada na SEQ ID NO: 56, a sequência de nucleotídeos codificando a cadeia leve foi mostrada na SEQ ID NO: 57; para HAB-5101, a sequência de nucleotídeos codificando a cadeia pesada foi mostrada na SEQ ID NO: 58, a sequência de nucleotídeos codificando a cadeia leve foi mostrada na SEQ ID NO: 59; e para HAB-9001, a sequência de nucleotídeos codificando a cadeia pesada foi mostrada na SEQ ID NO: 60, a sequência de nucleotídeos codificando a cadeia leve foi mostrada na SEQ ID NO: 61.

[00233] 2. Expressão e purificação de anticorpos humanizados

[00234] Células HEK293E foram transfectadas com os plasmídeos expressando cadeias pesada e leve de anticorpo respectivamente em uma proporção de 1:1,5. 6 dias depois da transfecção, o sobrenadante da expressão foi coletado, centrifugado em alta velocidade para remover as impurezas, e purificado com coluna de Proteína A. A coluna foi lavada com PBS até a leitura de A280 cair para a linha basal. As proteínas alvo foram elutriadas com 100 mM de ácido acético, pH 3,0, e neutralizadas com 1 M de Tris-HCl, pH 8,0. As amostras elutriadas foram adequadamente concentradas e em seguida adicionalmente purificadas com cromatografia de gel Superdex200 (GE) pré-equilibrada com PBS para remover agregados. Os picos de monômeros foram coletados e divididos em alíquotas para uso.

[00235] O desempenho e o efeito da presente invenção foram verificados pelos seguintes testes bioquímicos ou por teste farmacológico in vivo: Exemplo de Teste 1. Afinidade de anticorpos anti Abeta detectada por ensaio BIAcore

[00236] A afinidade de um anticorpo para fibrilas Aβ1-42 foi detectada por meio do método de acoplamento amino. Fibrilas Aβ1-42 foram acopladas a chip biossensor CM5 (200 RU), e em seguida as moléculas de anticorpo foram deixadas para escoar através da superfície do chip. Os sinais de reação foram detectados em tempo real com o instrumento Biacore T200 para gerar uma curva de ligação e dissociação. Ao final de cada ciclo experimental, depois da dissociação ter sido completada, o chip biosensor foi lavado e regenerado com 10 mM de Glicina-HCl (pH 1,5). O anticorpo positivo, Aducanumab, foi preparado de acordo com a informação de sequência sobre Aducanumab liberada pela OMS (vide WHO Drug Information, Vol. 28, No. 3, 2014), e o método de preparação foi descrito no Exemplo 4 da presente invenção.

[00237] A afinidade de um anticorpo para o monômero Aβ1-42 foi detectada capturando o anticorpo sobre o chip. IgG foi capturada por afinidade sobre chip biossensor de Proteína A, e em seguida o antígeno monômero Aβ1-42 foi deixado para escoar sobre a superfície do chip. Os sinais de reação foram detectados em tempo real com o instrumento Biacore T200 para gerar uma curva de ligação e dissociação. Ao final de cada ciclo experimental, depois da dissociação ter sido completada, o chip biosensor foi lavado e regenerado com 10 mM de Glicina-HCl (pH 1,5).

[00238] Os resultados experimentais foram mostrados na Tabela 4. HAB-2401, HAB-5101, HAB-3601 e HAB-9001 têm afinidade para fibrilas Aβ1-42 variando de 10-8 a 10-10M, dos quais HAB-9001 tem a maior afinidade, a qual é 2 ordens de magnitude mais forte do que a do Aducanumab. HAB-2401, HAB-5101, HAB-3601 e HAB-9001 têm afinidade para monômero Aβ1-42 variando de 10-7 a 10-8M, dos quais HAB-9001 tem a maior afinidade, a qual é 2 ordens de magnitude mais forte do que a do Aducanumab. Todos os quatro anticorpos de teste têm afinidade mais forte do que a do anticorpo positivo, Aducanumab.

Tabela 4. Afinidade dos anticorpos para fibrilas Aβ1-42 e monômero Aβ1-42 Afinidade (M) Anticorpo fibrilas Aβ1-42 monômero Aβ1-42 Aducanumab 7,52E-08 3,20E-06 HAB-2401 1,17E-08 2,29E-07 HAB-5101 1,22E-09 3,33E-07 HAB-3601 5,45E-08 2,62E-07 HAB-9001 2,13E-10 2,79E-08 Exemplo de Teste 2: Efeito de anticorpos Anti-Abeta sobre o bloqueio da agregação de monômero Aβ1-42 em fibrilas Aβ1-42

[00239] O efeito de anticorpos Anti-Abeta sobre inibição da agregação de monômero Aβ1-42 em fibrilas Aβ1-42 foi detectado por ensaio de ThT. ThT (Tioflavina T, tioflavina) é um tipo de corante fluorescente e tipicamente é usado para identificação in vitro de fibrilas Aβ, uma vez que os sinais de fluorescência no comprimento de ondas de excitação de 450 nm e comprimento de ondas de emissão de 482 nm serão significativamente reforçados já que combina com proteína rica em β-sheet (tal como depósito de Aβ amiloide). Os procedimentos experimentais específicos do ensaio de ThT foram indicados como se segue. 0,5 mg de Aβ1-42 humano (GenScript, CAT no. RP10017) foi adicionado em 250 μl de NaOH a 10 mM, completamente dissolvido e em seguida adicionado em um volume igual de 2×PBS pré-resfriado para neutralização. Solução de monômero Aβ1-42 com uma concentração de 1 mg/ml foi preparada e diluída com ddH2O para 0,25 mg/ml. Monômero Aβ1-42 (10 μl/ cavidade, 0,25 mg/ml) foi misturado com 20 μM de ThT (sigma, CAT no. T3516) e adicionado em uma placa de 384 cavidades preta (Corning, CAT no. 4514), e uma cavidade sem adição do monômero Aβ1-42 serviu como controle negativo. Em seguida, anticorpos diluídos em gradientes (iniciando a partir de 1 mg/ml, diluição de gradiente de 2 vezes, 10 μl/ cavidade) foram adicionados dentro da mistura acima, incubados a 37°C por 24 h. Os sinais de fluorescência foram lidos em comprimento de ondas de excitação de 440 nm e comprimento de ondas de emissão de 485 nm usando a leitora de microplacas FlexStation3 (Molecular devices).

[00240] Os resultados experimentais foram mostrados na Figura 1. Todos os HAB-2401, HAB-5101 e HAB-9001 podem inibir de maneira eficaz a agregação de monômeros Aβ1-42 em fibrilas Aβ1-42. Ao passo que HAB-3601 e Aducanumab não têm a função referida. Exemplo de Teste 3. Proteção de anticorpos anti-Abeta sobre neurônios primários de rato

[00241] O córtex cerebral foi dissecado de ratos fetais SD com idade gestacional de 16 a 18 dias, digerido com tripsina (Gibco, CAT no. 25200-072), pipetado e filtrado para dentro de uma suspensão celular única, centrifugado, e contado. As células foram diluídas com meio DMEM (Gibco, CAT no. 10564-029) contendo 10% de FBS (Gibco, CAT no. 10099-141) para 1E4 por cavidade (1 × 104/ cavidade), e laminadas em placa de 96 cavidades (Corning, CAT no. 3903) revestidas com PDL (Poli-D-lisina, polilisina) (Sigma, CAT no. P0899). Depois de incubar de um dia para o outro em uma incubadora (37°C, 5% de CO2), o meio foi trocado com Neurobasal (Gibco, CAT no. 21103049) + 2% de B27 (Gibco, CAT no. 17504044), e metade do meio foi trocada a cada 3 a 4 dias. No dia 8, 10 μM de fibrilas Aβ1-42 (GL biochem, CAT no. 53819) e várias concentrações de anticorpos de teste foram adicionados. Depois de incubar por 3 dias, 30 μl/ cavidade de Cell Titer-Glo (Promega, CAT no. G7571) foi adicionado, e a placa foi lida com uma leitora de microplacas (PerkinElmer, Vector3) com um método de quimiluminescência.

[00242] Os resultados experimentais foram mostrados na Figura 2.

HAB-2401, HAB-5101, HAB-3601, HAB-9001 e o anticorpo positivo Aducanumab podem proteger células neuronais primárias da toxicidade de fibrilas Aβ, e foi observado um efeito dependente da dose nas faixa de concentração de 10 a 100 μg/ml. Exemplo de Teste 4. Anticorpos Anti-Abeta promovem a fagocitose de fibrilas Aβ por células BV2

[00243] Células BV2 na fase de crescimento logarítmico (FuDan IBS Cell Center, FH0366) foram coletadas e digeridas com tripsina, centrifugadas a 800 rpm por 5 min. A densidade celular em uma placa de 24 cavidades foi ajustada com RPMI 1640 (contendo 10% de FBS) até 1,2×105 células / cavidade / 500 μl, agitada completamente atgé formar uma única camada de células, e colocada em uma incubadora a 37°C, 5% de CO2 de um dia para o outro. 16 horas depois, 100 μl de anticorpo anti Abeta diluído em gradientes ou controle negativo (um anticorpo anti-trombina contra alvo irrelevante foi usado como controle negativo, e o anticorpo anti-trombina foi produzido de acordo com o Método de Preparação para H1601-008 (Preparation Method for H1601-008) conforme descrito no Requerimento de Patente Internacional No. WO2017133673A1) foi misturado completamente com 10 μM de fibrilas Abeta marcadas com fluorescência (diluídas com 100 μl de meio básico F-12K), incubado a 37°C por uma hora, adicionado em uma placa de 24 cavidades com 500 μl de meio removido, e incubado a 37°C, 5% de CO2 por 1 hora. O sobrenadante foi removido, e as células foram delicadamente lavadas três vezes com PBS pré-arrefecido a 4°C. E em seguida 0,25% de Tripsina-EDTA pré-arrefecido (1×) foi adicionado a 200 μl / cavidade e colocado a 4°C por 20 minutos. A tripsina foi neutralizada com meio F-12K contendo 10% de FBS e centrifugada, e em seguida as células foram lavadas três vezes com PBS pré-arrefecido, 100 μl de células foram coletadas e aplicadas sobre Citômetro de Fluxo para leitura da intensidade de fluorescência FITC.

[00244] Os resultados experimentais foram mostrados na Figura 3. Tanto HAB-2401 quanto HAB-3601 podem promover a fagocitose de fibrilas Aβ por células BV2, assim como o anticorpo positivo Aducanumab. Foi observado um efeito dependente da dose na faixa de concentração de 0,03 a 0,3 μg/ml. Exemplo de Teste 5. Efeito de anticorpos anti-Abeta sobre a fagocitose de fibrilas Aβ por microglia primária de rato

[00245] O córtex cerebral foi dissecado do reato SD neonatal, triturado e filtrado para resultar em uma suspensão celular. As células foram ressuspensas em DMEM contendo 20% de FBS (Gibco, CAT no. 10099-141), transferidas para dentro de um frasco de cultura T75 (Corning, CAT no. 3473) pré-revestidas com PDL (Sigma, CAT no. P0899) e colocadas em uma incubadora (37°C, 5% de CO2). O meio foi trocado uma vez a cada 3 dias. No dia 8, o frasco de cultura foi colocado em um shaker e agitado a 200 rpm por 1 hora. O sobrenadante foi coletado, centrifugado, contado, diluído para 5E4/ cavidade (5 ×104/ cavidade) com meio DMEM/F12 (GE, CAT no. SH30023.01) contendo 10% de FBS, e laminado em uma placa de 24 cavidades. 6 horas depois, o meio foi trocado para meio DMEM/F12 livre de soro e incubado de um dia para o outro. No dia 9, várias concentrações de anticorpos ou controle negativo (um anticorpo anti-trombina contra alvo irrelevante foi usado como controle negativo, e o anticorpo anti-trombina foi produzido de acordo com o método de preparação para H1601-008 (Preparation Method for H1601-008) conforme descrito no requerimento de patente internacional No. WO2017133673A1) foi misturado com 10 μM de Abeta 1-42 marcado com FITC (Thermo, CAT no. A30006) (GL biochem, CAT no. 53819) respectivamente, incubado a 37 °C por 30 minutos, e centrifugado para lavar o excesso de anticorpos. A mistura de anticorpo e Abeta foi adicionada às células e incubada a 37°C por 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS (Hyclone, CAT no. SH30256.01), e adicionado com tripsina (Gibco, CAT no. 25200-072), colocado em um refrigerador a 4 °C por 10 minutos para digerir as células. E em seguida foi adicionado soro para terminar a reação, as células foram coletadas depois de remover o sobrenadante por centrifugação, PBS pré-arrefecido foi adicionado e o sobrenadante foi removido por centrifugação, e as células foram lavadas duas vezes com PBS. A intensidade de fluorescência FITC foi lida por citômetro de fluxo (BD, Verse).

[00246] Os resultados experimentais foram mostrados na Figura 4. No experimento de fagocitose pela microglia primária do rato, HAB-2401 e HAB-3601 podem promover a fagocitose de fibrilas Aβ por microglia primária, assim como o anticorpo positivo Aducanumab. Foi observado um efeito dependente da dose na faixa de concentração de 0,03 a 0,3 μg/ml. Exemplo de Teste 6. Teste farmacológico in vivo de anticorpos anti-Aβ

[00247] Foi usado um modelo de Alzheimer em camundongo 5×FAD (Cinco mutações Familiares AD) para avaliar a eficácia in vivo de anticorpos anti-Aβ. Cinco mutações genéticas familiares dos genes APP e PS1, incluindo três mutações sobre o gene APP (a saber mutação Sueca (K670N, M671L), mutação Florida (I716V) e mutação London (V717I)) e duas mutações sobre o gene PS1 (a saber M146L e L286V) foram superexpressas em camundongos 5×FAD. Portanto, comparados com camundongos selvagens (WT), camundongos 5×FAD apresentaram deficiências óbvias na função cognitiva e na memória e tiveram importante depósito de placas Aβ no tecido cerebral. Este exemplo de teste foi projetado para avaliar a eficiência dos anticorpos de teste em melhorar a competência cognitiva do camundongo e reduzir a deposição de placas Aβ testando a melhora do comportamento do camundongo, incluindo a capacidade de construção de ninho, e a memória espacial (memória espacial no labirinto de água de morris), bem como testando as alterações no conteúdo de placas de Aβ no tecido cerebral.

[00248] Camundongos 5×FAD foram proporcionados pela Shanghai ChemPartner Co., Ltd. Camundongos de três meses de idade foram selecionados e mantidos em uma temperatura ambiente de 23 ± 2°C, com ciclo de 12/12 horas de iluminação / escuridão, com alimento e água ad libitum. Os anticorpos de teste estavam todos na forma quimérica humana-camundongo, isto é, a uma ou mais regiões constantes das cadeias pesadas e leves foram substituídas com uma ou mais regiões constantes de camundongo para evitar ADA (anticorpo anti-fármaco) causado por administração de longo termo dos anticorpos. Seis grupos (n = 15 em cada grupo) foram incluídos no experimento, 4 grupos de anticorpos a serem testado, um grupo de Aducanumab como controle positivo e um grupo de PBS como controle negativo. HAB-2401 e HAB-3601 estavam na forma quimérica mIgG1, ao passo que HAB-5101, HAB-9001 e Aducanumab estavam na forma quimérica mIgG2a, e foram referidos como HAB-2401-Ch, HAB-3601-Ch, HAB-5101-Ch, HAB-9001-Ch e Aducanumab-Ch, respectivamente. HAB-2401-Ch e HAB-3601-Ch foram produzidos por fusão da região variável de cadeia pesada e da região variável de cadeia leve de HAB-2401 e HAB-3601 à região constante de cadeia pesada de mIgG1 (a sequência de aminoácidos da região constante de cadeia pesada de mIgG1 foi mostrada na SEQ ID NO: 62) e a região constante de cadeia leve de mIgG1 (a sequência de aminoácidos da região constante de cadeia leve de mIgG1 foi mostrada na SEQ ID NO: 63), respectivamente; HAB-5101-Ch, HAB-9001-Ch e Aducanumab -Ch foram produzidos por fusão da região variável de cadeia pesada e da região variável de cadeia leve de HAB-5101, HAB-9001 e Aducanumab à região constante de cadeia pesada de mIgG2a (a sequência de aminoácidos da região constante de cadeia pesada de mIgG2a foi mostrada na SEQ ID NO: 64) e a região constante de cadeia leve de mIgG2a (a sequência de aminoácidos da região constante de cadeia leve de mIgG2a foi mostrada na SEQ ID NO: 65), respectivamente. O método para preparação do anticorpo foi descrito no Exemplo 4 desta invenção. O anticorpo foi administrado i.p. com 15 mpk (mg/kg, miligrama por quilograma de peso corporal) uma vez por semana, e a administração foi realizada às 13:00 às 16:00, por 12 semanas no total.

[00249] A todos os camundongos 5×FAD foi dada uma injeção adicional do anticorpo correspondente depois do teste comportamental (Exemplo de Teste 8). Os camundongos foram divididos em três lotes, 5 camundongos em cada grupo. As amostras foram colhidas em 24 h, 72 h e 7 dias depois da dose adicional, de modo a detectar quantitativamente o conteúdo de anticorpos penetrando na barreira hematoencefálica em diferentes pontos do tempo depois do tratamento com anticorpo. Ao passo que, com respeito à detecção de depósito de Aβ (Exemplo de Teste 9) e citocinas (Exemplo de Teste 10), para os grupos do mesmo anticorpo, todas as amostras colhidas em vários pontos do tempo depois da dose adicional foram reunidas juntas para processamento dos dados. Exemplo de Teste 7. Testando a capacidade do camundongo para construção de ninho

[00250] A construção de ninho é instintiva nos camundongos, e tipicamente é usada como um método experimental para medir o comportamento social do camundongo. Foi reportado que camundongos transgênicos superexpressando APP, tais como Tg2576, APPswe/PS1, 3 × Tg-AD, 5 × FAD (Transl Psychiatry. 2015 May 5;5:e562), apresentaram deficiência na capacidade de construção de ninho em graus variáveis. Este exemplo de teste é para avaliar o efeito dos anticorpos de teste sobre a melhora do comportamento social de camundongos transgênicos 5×FAD pontuando a capacidade de construção de ninho dos camundongos com múltiplos parâmetros.

[00251] Os procedimentos específicos de construção de ninho dos camundongos foram descritos abaixo. A cerca de 16:00 no primeiro dia do experimento, um pedaço de algodão comprimido foi colocado em cada gaiola, e cada camundongo foi mantido em uma gaiola separada. O algodão comprimido foi pesado antes de colocar na gaiola (Peso 1), e o ambiente de reprodução permaneceu inalterado. Às 10 horas da manhã do dia seguinte, os camundongos foram retirados e retornados para as gaiolas originais. O formato do ninho e a posição dos pedaços de algodão foram mantidos inalterados. Primeiro, uma câmera digital foi usada para tirar retratos dos ninhos feitos pelos camundongos (uma visão frontal e uma visão lateral para refletir o verdadeiro formato e altura do ninho). O algodão que não tivesse sido rasgado em pedaços foi apanhado e pesado (Peso 2). A percentagem de algodão deixado foi calculada. Com base nas fotografias, de acordo com o formato, a altura do ninho e o grau no qual o algodão foi rasgado, a pontuação média para cada animal foi obtida a partir de três pontuações independentes proporcionadas em parelelo, de acordo com os critérios de pontuação, as pontuações podem ser ajustadas adequadamente com base na situação específica. Os critérios de pontuação foram mostrados na Tabela 5: Tabela 5. Critérios de pontuação para a capacidade de construção de ninho dos camundongos O formato, a altura do ninho e o grau no qual o algodão foi rasgado Classificação O pedaço de algodão permaneceu quase intacto (o algodão deixado foi 1 acima de 90%), conforme mostrado na Figura 5; Uma pequena parte do pedaço de algodão foi rasgada em pesaços, a 2 maior parte do pedaço de algodão permaneceu intacta, e a quantidade do

O formato, a altura do ninho e o grau no qual o algodão foi rasgado Classificação algodão deixado foi entre 50% a 90%, conforme mostrado na Figura 5; A maior parte do pedaço de algodão foi rasgada em pedaços (50% a 3 90%), no entanto, os pedaços do algodão não foram reunidos no canto da gaiola para formar um formato preliminar do ninho; ao invés, os pedaços de algodão foram espalhados sobre o fundo da gaiola, conforme mostrado na Figura 5; A maioria dos pedaços de algodão rasgados (mais de 90%) foram 4 reunidos no canto da gaiola e basicamente formam o formato de um ninho, mas a altura do ninho não excedeu 50% da altura do corpo do camundongo, conforme mostrado na Figura 5; O algodão foi quase completamente rasgado (mais de 90% foi rasgado), 5 em um formato de um poço em forma de cratera, e a altura do ninho excedeu 50% da altura do corpo do camundongo, conforme mostrado na Figura 5.

[00252] Fotografias de cada animal foram analisadas usando a ferramenta Lasso no pacote de software Photoshop CS4 para calcular a proporção da área de ninho (percentagem da área de ninhyo para a área total dos pedaços de algodão espalhados). A pontuação abrangente dos três parâmetros (pontuação cúbica) foi calculada de acordo com a fórmula abaixo:

[00253] Pontuação abrangente dos três parâmetros = Percentagem de algodão que sobrou × Percentagem da área de ninho × Pontuação média

[00254] Os resultados do teste foram mostrados na Figura 6 e na Figura 7. Houve alguma diferença entre Veículo (controle de solvente em branco) e WT (selvagem), a qual reflete a janela experimental do teste. Enquanto os grupos Aducanumab-Ch, HAB-2401-Ch e HAB-9001-Ch apresentaram alguma tendência a melhora em comparação com o grupo de veículo. Exemplo de Teste 8 Teste comportamental do labirinto de água (Labirinto de água de Morris)

[00255] O experimento do labirinto de água é um teste comportamental usado comumente no campo da neurobiologia para avaliar o aprendizado espacial e a capacidade de memória dos roedores. Em um experimento similar, foram usadas dicas espaciais em torno da piscina para guiar os roedores para encontrar e lembrar a plataforma de fuga escondida sob a água na piscina por treinamentos.

[00256] O labirinto de água de Morris consistiu em uma piscina circular de plástico branco, não-tóxico e incolor com um diâmetro de 120 cm e uma altura de 50 cm e uma plataforma de perspex transparente. A plataforma tinha 31 cm de altura, e a superfície superior da plataforma tinha um diâmetro de 8,5 cm. A piscina foi preenchida com água até a superfície da água estar 1 cm acima da plataforma. A piscina foi dividida igualmente em quatro quadrantes, NE, SE, SO e NO, e N, NE, E, SE, S, SO, O e NO foram marcados em oito pontos dividindo igualmente o círculo externo da piscina redonda. A plataforma foi localizada no centro do quadrante SO, com 30 cm de distância até o centro do círculo e 30 cm de distância até a parede da piscina (um diagrama esquemático do labirinto de água foi mostrado na Figura 8). O dispositivo de câmera instalado foi conectado ao computador e ao monitor. A piscina redonda foi colocada em um laboratório bem iluminado. Dicas visuais óbvias foram decoradas nos marcadores NE, SE, SO e NO. Antes do experimento, uma quantidade apropriada de partículas de plástico branco foi borrifada na água para fazer com que cubra uniformemente a superfície da água, e a temperatura da água foi mantida em 23,0 ± 2,0°C. A água foi trocada a cada 5 dias.

[00257] Foram incluídos os seguintes módulos no experimento de labirinto de água: treinamento de bandeira, plataforma escondida e teste de sonda.

8.1. Treinamento de bandeira

[00258] Foi colocada uma bandeira acima da água sobre a plataforma para orientar os animais. Cada animal experimental foi posto dentro da água (virado para a parede da piscina) no ponto N, e foram iniciados rastreamento de vídeo e registro ao mesmo tempo, por 60 segundos. Se o animal não tivesse conseguido abordar a plataforma dentro de 60 segundos, seria guiado manualmente até a plataforma e deixado para permanecer por 20 segundos antes de ser removido do labirinto; se o animal tiver encontrado a plataforma dentro de 60 segundos mas tiver permanecido sobre a plataforma por menos de 20 segundos, depois do treinamento de 60 segundos ter terminado, seria forçado a permanecer sobre a plataforma por 20 segundos antes de ser removido do labirinto; se o animal tiver encontrado a plataforma dentro de 60 segundos e permanecido sobre a plataforma por 20 segundos, seria removido do labirinto. Depois do treinamento, cada animal foi seco com uma toalha e devolvido para a gaiola. Depois de todos os animais terem sido treinados, foi reiniciada uma nova rodada do mesmo treinamento. Deste modo, cada animal foi treinado 4 vezes dentro de um dia.

8.2. Plataforma escondida

[00259] A plataforma foi escondida cerca de 1 cm abaixo da superfície da água. Os animais foram treinados 4 vezes ao dia por um total de 12 dias. A localização na qual os camundongos foram postos dentro da água foi mostrada na Figura 8. Durante cada treinamento, os animais foram colocados virados para a parede da piscina, e foram iniciados rastreamento de vídeo e registro ao mesmo tempo. Cada treinamento teve uma duração de 60 segundos. Se o animal não tiver conseguido encontrar a plataforma dentro de 60 segundos, seria guiado manualmente até a plataforma e deixado para permanecer por 15 segundos antes de ser removido do labirinto; se o animal tiver encontrado a plataforma dentro de 60 segundos mas tiver permanecido sobre a plataforma por menos de 15 segundos, depois do treinamento de 60 segundos ter terminado, seria forçado a permanecer sobre a plataforma por 15 segundos antes de ser removido do labirinto; se o animal tiver encontrado a plataforma dentro de 60 segundos e permanecido sobre a plataforma por 15 segundos, seria removido do labirinto. Depois do treinamento, cada animal foi seco com uma toalha e devolvido para a gaiola. Depois de todos os animais terem sido treinados, foi reiniciada uma nova rodada de treinamento, com diferente localização na qual o animal fo posto dentro da água.

8.3 Teste de sonda

[00260] 24 horas depois do último treinamento no dia 12, a plataforma sob a água foi removida para o teste de sonda. O animal foi posto dentro da água (virado para a parede da piscina) no ponto NE, e foram iniciados rastreamento de vídeo e registro ao mesmo tempo. 60 segundos depois, o rastreamento foi encerrado. O animal foi removido da piscina, seco com uma toalha e devolvido para a gaiola. O rastro do animal foi analisado com o com software Noldus Ethovision.

8.4. Resultados do experimento de labirinto de água

[00261] A curva de aprendizado do treinamento da plataforma escondida foi mostrada na Figura 9. Os resultados mostraram que entre o grupo de veículo de camundongo 5×FAD Tg (controle de solvente em branco) e o grupo selvagem (WT), foi observada uma diferença significativa no dia 6, e foram observadas diferenças muito significativas no dia 10 e no dia 11 do treinamento da plataforma escondida, e a diferença referida tendeu a ser estável, indicando que existe diferença na capacidade de memória espacial entre camundongos transgênicos 5×FAD e camundongos selvagens no teste comportamental. A diferença referida é a base do teste dos fármacos de teste; a partir do dia 1, o grupo de fármaco de controle positivo Aducanumab-Ch sempre apresentou tempo de latência mais curto para a plataforma do que o grupo de veículo, no dia 11, foi observada uma diferença significativa, indicando que Aducanumab-Ch apresentou excelente eficácia neste experimento; De modo similar ao grupo de Aducanumab-Ch, HAB-2401-Ch, HAB-5101-Ch e HAB-9001-Ch apresentaram diferença significativa no dia 11 e 12, indicando que, como Aducanumab-Ch, os três fármacos podem melhorar significativamente a memória espacial e a competência cognitiva dos camundongos.

[00262] No testes de Sonda (Probe test), foram avaliados vários parâmetros experimentais, incluindo latência até plataforma, latência até zona da plataforma, contagem do cruzamento da plataforma ou a zona da plataforma, duração sobre a plataforma e duração sobre a zona da plataforma e índice ACI.

[00263] Os resultados da latência até a plataforma foram mostrados na Figura 10A. Houve uma certa diferença entre o grupo WT e o grupo de veículo, o qual é uma janela experimental. (Para o grupo WT, a latência para a plataforma no teste de sonda foi mais longa do que a latência no treinamento de bandeira, o que pode ser causado pela variação experimental, porque somente foi realizado um teste no teste de sonda, ao passo que foram realizados quatro testes no treinamento de bandeira). Os resultados de HAB-2401-Ch, HAB-5101-Ch e HAB-9001-ch foram comparáveis ao do grupo de Aducanumab-Ch, e apresentaram uma duração mais curta do que o grupo de veículo.

[00264] Os resultados da latência até a zona da plataforma foram mostrados na Figura 10B. O grupo WT apresentou uma diferença significativa de cerca de três vezes quando comparado com o grupo de veículo. O grupo de Aducanumab-Ch apresentou uma diferença significativa quando comparado com o grupo de veículo, apesar de que o resultado do grupo de Aducanumab-Ch ter sido próximo ao do grupo WT, indicando que as moléculas positivas podem melhorar significativamente a memória de camundongos 5×FAD. Todos os quatro anticorpos de teste apresentaram diferenças significativas quando comparados com o grupo de Veículo, entre os quais HAB-9001-Ch apresentou uma eficácia ainda melhor do que o Aducanumab-Ch.

[00265] Os resultados experimentais da contagem do cruzamento da plataforma ou a zona da plataforma foram mostrados na Figura 10C e na Figura 10D, os resultados experimentais da duração sobre a plataforma e da duração sobre a zona da plataforma foram mostrados na Figura 10E e na Figura 10F, e os resultados experimentais do índice ACI foram mostrados na Figura 10G. No teste de sonda, a plataforma foi removida, e a memória dos camundongoss da plataforma é teoricamente correlacionada positivamente com estes parâmetros. Quanto a estes cinco parâmetros, houve uma certa diferença entre o grupo WT e o grupo de veículo, indicando a janela experimental dos resultados experimentais. Comparado com o grupo de veículo, Aducanumab-Ch apresentou tendência de melhora. Comparado como grupo de veículo, HAB-2401-Ch, HAB-5101-Ch e HAB-9001-Ch todos apresentaram diferentes graus de melhora, e HAB-9001-Ch apresentou a melhor performance.

[00266] Em resumo, no teste de sonda, comparado com o grupo de veículo, HAB-2401-Ch, HAB-5101-Ch e HAB-9001-Ch apresentaram diferentes graus de melhora na latência até a plataforma, na latência até a zona da plataforma, na duração sobre a plataforma, na duração sobre a zona da plataforma, na contagem do cruzamento da plataforma, na contagem do cruzamento da zona da plataforma e no índice ACI, sugerindo que estes três anticorpos de teste podem melhorar significativamente a memória espacial e a competência cognitiva do modelo de camundongos com Alzheimer 5×FAD. Exemplo de Teste 9. Detecção de depósito de Aβ

[00267] Todas as amostras foram tiradas dos camundongos usados para o teste comportamental (Exemplo de Teste 8). Cada camundongo foi perfundido com PBS (pH 7,4) e o cérebro foi coletado. O hemisfério esquerdo foi imerso em 4% de PFA imediatamente e fixado por 72 horas, e o hemisfério direito foi dissecado sobre gelo para coletar o córtex frontal e o hipocampo, pesados separadamente, em seguida foram rapidamente congelados em nitrogênio líquido, e armazenados em um refrigerador a -80°C para processamento de amostras subsequente.

[00268] Os procedimentos específicos de homogenização do hemisfério direito foram como se segue: o tecido de teste foi pesado e transferido para dentro de um tubo de homogenização, e adicionado com 10 vezes o volume de lisado de dietilamina (50 mM de NaCl, 0,2% de DEA contendo inibidores da protease). Isto é, 10 mg de tecido foi adicionado a 100 μl de solução de lise, homogenizado com um homogenizador, e ultrassonicado em água gelada por 15 a 20 segundos. O homogenado foi transferido para dentro de um tubo de centrífuga, centrifugado a 100.000 × g a 4°C por 30 min. O sobrenadante resultante contendo Aβ solúvel foi coletado e armazenado a -80°C. 10 vezes o volume de solução de lise de cloridreto de guanidina (5M de GuHCl em PBS) foi adicionado dentro do tubo de centrífuga, o pélete foi ressuspenso e sonicado em água gelada por 15 a 20 segundos. A amostra foi centrifugada a 100.000 × g a 4°C por 30 min. O sobrenadante resultante contendo Aβ insolúvel foi coletado e armazenado a -80°C.

[00269] O depósito de Aβ no homogenado do tecido cerebral foi detectado pelo método ELISA (Human Amyloid beta (aa1-40) Quantikine ELISA Kit: R&D systems, DAB140B; Human Amyloid beta (aa1-42) Quantikine ELISA Kit: R&D systems, DAB142). Primeiro, os componentes insolúveis no homogenado cerebral (isto é, a amostra a ser testda) e padrão foram diluídos com diluente; a placa pré-revestida foi lavada com tampão de lavagem; o padrão e amostras diluídos foram adicionados; a placa foi selada e incubada a 4°C por 2 horas; a placa foi lavada com tampão de lavagem por 3 a 4 vezes; anticorpo secundário pré-arrefecido foi adicionado; a placa foi selada e incubada a 4 °C por 2 horas; a placa foi lavada 3 a 4 vezes com tampão de lavagem; solução cromogênica de substrato foi adicionada e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos; solução de parada foi adicionada e a OD450 foi lida em leitora de microplacas.

[00270] Os resultados do teste ELISA foram mostrados na Figura 11A-11D, O grupo de Veículo (controle de solvente em branco) apresentou importante depósito de Aβ1-40 e Aβ1-42 comparado com o grupo WT, indicando que o depósito de Aβ foi superexpresso em tecido cerebral de camundongo 5 × FAD. Comparado com o grupo de veículo, foi observada uma tendência de reduzido Aβ1-40 e Aβ1-42 em Aducanumab-Ch. Entre os quatro anticorpos testados, HAB-3601-Ch teve a melhor performance e teve uma tendência de redução de Aβ1-40 insolúvel (Aβ1-40 insolúvel no hipocampo) e Aβ1-42 insolúvel (Aβ1-42 insolúvel no hipocampo) comparado com o veículo.

[00271] Os procedimentos para coloração imunohistoquímica do tecido do hemisfério esquerdo foram como se segue. Desidratação do cérebro isolado: o cérebro foi fixado com 4% de PFA por 72 horas, em seguida foi posto em solução de sacarose a 30% para desidratação, foi colocado em um refrigerador a 4°C de um dia para o outro, e o procedimento de desidratação foi repetido uma vez; os tecidos foram embebidos: isopentano foi colocado em gelo seco por uns poucos minutos para fazer com que o líquido em isopentano atingisse -70°C; o tecido cerebral foi seco com papel mata-borrão e posto em isopentano para ser congelado por ums poucos segundos depois da porção redundante ter sido removida, e em seguida o tecido cerebral foi retirado do isopentano, seco e embebido na caixa de incorporação com OTC (Agente de incorporação), e em seguida a caixa de incorporação foi colocada sobre gelo seco para fazer com que o OTC solidificasse.

O tecido cerebral incorporado foi armazenado no refrigerador a -80°C; Seccionamento: o tecido cerebral foi cortado em uma seção sagital em um criostato, 20 μm por fatia; inativação de peroxidase endógena: a fatia cerebral foi enxaguada 3 vezes em PBS, 5 minutos de cada vez, incubada com 0,3% de H2O2 (preparada com PBS) por 10 minutos; permeabilização: a fatia cerebral foi enxaguada 3 vezes em PBS, 5 minutos de cada vez, incubada com TBST (TBS contendo 0,25% de Triton X -100) 3 vezes, 5 min minutos de cada vez; bloqueio: incubada com 0,3% de Triton X-100 e 5% de BSA em PBS por 1 hora; incubação com o anticorpo primário: o anticorpo primário 3D6 foi diluído com 2% de BSA em TBST para a concentração de elaboração de 10 μg/ml, e a fatia cerebral foi posta dentro da solução de elaboração do anticorpo primário e incubada de um dia para o outro a 4°C; incubação com o anticorpo secundário: a fatia cerebral foi enxaguada em TBST três vezes, 5 minutos de cada vez, o anticorpo secundário foi diluído com TBST contendo 2% de BSA para obter a concentração de elaboração de 5 μg/ml, a fatia cerebral foi incubada na solução de elaboração do anticorpo secundário por 1 hora; foi desenvolvida cor: a fatia cerebral foi enxaguada em TBST 3 vezes, 5 minutos a cada vez, e posta dentro da solução de desenvolvimento de cor no escuro por 5 minutos, e em seguida imersa em água pura duas vezes para parar a reação de desenvolvimento; montagem: a fatia cerebral foi posta dentro e fora de PBS, seca, imersa em água pura para remover o sal, seca, e fixada com concentrações de gradiente de etanol (75%, 95%, etanol absolute), montada com resina, e seca; varredura e análise quantitativa: a fatia foi escaneada com scanner digital de fatia (Hamamatsu Nanozoomer S210) para gerar as imagens de varredura da fatia.

Para cada fotografia de fatia cerebral, as regiões do córtex e do hipocampo foram primeiramente indicadas de acordo com a coordenada cerebral do camundongo, e em seguida as áreas de sinal positivo para Aβ foram indicadas por software BIOTOPIX™ Analysis system. Finalmente, a proporção de sinais positivos foi calculada para o córtex e o hipocampo, respectivamente. Isto é, a proporção de sinais positivos para Aβ no córtex = a área de sinais positivos para Aβ no córtex / área total do córtex; a proporção de sinais positivos para Aβ no hipocampo = a área de sinais positivos para Aβ no hipocampo / área total do hipocampo.

[00272] Os resultados experimentais da detecção por IHC foram mostrados na Figura 12 e na Figura 13. Comparado com o grupo WT, o grupo de veículo apresentou óbvio depósito de Aβ1-40 e Aβ1-42, o qual é consistente com o ensaio ELISA. Comparado com o grupo de veículo, HAB-3601-Ch, HAB-9001-Ch e Aducanumab-Ch podem reduzir significativamente o depósito de Aβ, sugerindo que HAB-3601-Ch e HAB-9001-Ch podem reduzir significativamente o depósito de Aβ, assim como Aducanumab-Ch. Exemplo de Teste 10. Efeito dos anticorpos sobre a liberação de citocinas no tecido cerebral

[00273] As amostras usadas neste exemplo de teste foram o componente solúvel do homogenado cerebral no Exemplo de Teste 9, e o método de detecção a ser usado foi um analisador de eletroquimiluminescência MSD altamente sensível (Meso Scale Discovery). Procedimentos experimentais específicos foram descritos no manual do produto (U-PLEX Biomarker Group (mouse) Multiplex assays kit: MSD, N05235A-1). Em resumo, anticorpo de captura biotinilado para cada citocina foi ligado a cada encadeador de U-PLEX, reagido em temperatura ambiente por 30 minutos, e em seguida a reação foi terminada; as soluções de anticorpos encadeadas a U-PLEX preparadas foram misturadas e revestidas sobre placa de U-PLEX, incubadas em temperatura ambiente com agitação por uma hora ou 4°C de um dia para o outro; o padrão e as amostras de teste (isto é, os componentes solúveis no homogenado de tecido cerebral) foram diluídas de acordo com o manual; a placa revestida roi lavada com PBST ou 1×MSD tampão de lavagem (1x reagente de lavagem MSD) por 3 vezes, adicionado com 25 μl de diluente de amostra, e 25 μl de padrão diluído e amostras a serem testadas, e a placa foi selada e incubada em temperatura ambiente com agitação por 1 hora. A placa revestida foi lavada com PBST ou 1×MSD tampão de lavagem 3 vezes, adicionado com 50 μl da mistura de anticorpo de detecção diluído, e a placa foi selada e incubada com agitação em temperatura ambiente por 1 hora. A placa revestida foi lavada 3 vezes com PBST ou 1×MSD tampão de lavagem, e em seguida adicionada com reagente de tampão 2×Read. Finalmente, a placa foi lida no instrumento MSD.

[00274] Os resultados experimentais foram mostrados na Figura 14A à Figura 14D e na Figura 15A à Figura 15F. Os níveis de todas as citocinas tais como TNFα, IFN-γ, IL1 β, IL2, IL6, IL12p70, IL4, IL10, MCP-1 e KC foram muito baixos e quase atingiram o limite inferior do método de detecção. Houve diferenças óbvias entre camundongos individuais, portanto, não houve diferenças significativas entre os grupos. Em resumo, os quatro grupos de anticorpos de teste não apresentaram maior nível de citocinas quando comparados com o controle positivo Aducanumab, indicando que os anticorpos de teste são seguros.

Claims (22)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-Abeta se liga especificamente a Abeta humano e compreende regiões de cadeia pesada do anticorpo HCDR1, HCDR2 e HCDR3 e regiões de cadeia leve do anticorpo LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que: a) a sequência de aminoácidos da região de cadeia pesada HCDR1 é conforme mostrado na SEQ ID NO: 11, 17 ou 23; b) a sequência de aminoácidos da região de cadeia pesada HCDR2 é conforme mostrado na SEQ ID NO: 12, 18, 24 ou 52; c) a sequência de aminoácidos da região de cadeia pesada HCDR3 é conforme mostrado na SEQ ID NO: 13, 19, 25 ou 27; d) a sequência de aminoácidos da região de cadeia leve LCDR1 é conforme mostrado na SEQ ID NO: 14 ou 20; e) a sequência de aminoácidos da região de cadeia leve LCDR2 é conforme mostrado na SEQ ID NO: 15 ou 21; e f) a sequência de aminoácidos da região de cadeia leve LCDR3 é conforme mostrado na SEQ ID NO: 16, 22, 26 ou 53.

2. Anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende regiões de cadeia pesada do anticorpo HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e regiões de cadeia leve do anticorpo LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que: i) as sequências de aminoácidos das regiões de cadeia pesada do anticorpo HCDR1, HCDR2 e HCDR3 são conforme mostrados nas SEQ ID NOs: 11, 12 e 13, respectivamente; ou ii) as sequências de aminoácidos das regiões de cadeia pesada do anticorpo HCDR1, HCDR2 e HCDR3 são conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 17, 18 e 19, respectivamente; ou iii) as sequências de aminoácidos das regiões de cadeia pesada do anticorpo HCDR1, HCDR2 e HCDR3 são conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 23, 24 e 25, respectivamente; ou iv) as sequências de aminoácidos das regiões de cadeia pesada do anticorpo HCDR1, HCDR2 e HCDR3 são conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 17, 18 e 27, respectivamente; ou v) as sequências de aminoácidos das regiões de cadeia pesada do anticorpo HCDR1, HCDR2 e HCDR3 são conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 17, 52 e 19, respectivamente; ou vi) as sequências de aminoácidos das regiões de cadeia pesada do anticorpo HCDR1, HCDR2 e HCDR3 são conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 17, 52 e 27, respectivamente; e em que: vii) as sequências de aminoácidos das regiões de cadeia leve do anticorpo LCDR1, LCDR2 e LCDR3 são conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente; ou viii) as sequências de aminoácidos das regiões de cadeia leve do anticorpo LCDR1, LCDR2 e LCDR3 são conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 20, 21 e 22, respectivamente; ou viiii) as sequências de aminoácidos das regiões de cadeia leve do anticorpo LCDR1, LCDR2 e LCDR3 são conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 20, 21 e 26 respectivamente; ou x) as sequências de aminoácidos das regiões de cadeia leve do anticorpo LCDR1, LCDR2 e LCDR3 são conforme mostrados nas SEQ ID NOs: 20, 21 e 53, respectivamente.

3. Anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é qualquer anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo selecionado entre os itens seguintes A a D: A) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo compreende cadeia pesada HCDR1 conforme mostrado na SEQ ID NO: 11, HCDR2 conforme mostrado na SEQ ID NO: 12 e HCDR3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 13, e LCDR1 conforme mostrado na SEQ ID NO: 14, LCDR2 conforme mostrado na SEQ ID NO: 15, e LCDR3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 16; B) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo compreende cadeia pesada HCDR1 conforme mostrado na SEQ ID NO: 17, HCDR2 conforme mostrado na SEQ ID NO: 18 ou 52, e HCDR3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 19, e LCDR1 conforme mostrado na SEQ ID NO: 20, LCDR2 conforme mostrado na SEQ ID NO: 21, e LCDR3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 22; C) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo compreende cadeia pesada HCDR1 conforme mostrado na SEQ ID NO: 23, HCDR2 conforme mostrado na SEQ ID NO: 24 e HCDR3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 25, e LCDR1 conforme mostrado na SEQ ID NO: 20, LCDR2 conforme mostrado na SEQ ID NO: 21, e LCDR3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 26 ou 53; e D) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo compreende cadeia pesada HCDR1 conforme mostrado na SEQ ID NO: 17, HCDR2 conforme mostrado na SEQ ID NO: 18 ou 52, e HCDR3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 27, e LCDR1 conforme mostrado na SEQ ID NO: 20, LCDR2 conforme mostrado na SEQ ID NO: 21, e LCDR3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 22.

4. Anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo murino,

quimérico ou humanizado.

5. Anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo murino, e o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada conforme mostrado na SEQ ID NO: 3, 5, 7 ou 9, ou tendo no mínimo 95% de identidade de sequência com a mesma; e/ou uma região variável de cadeia leve conforme mostrado na SEQ ID NO: 4, 6, 8 ou 10, ou tendo no mínimo 95% de identidade de sequência com a mesma.

6. Anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que é qualquer anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo selecionado entre os itens seguintes E a H: E) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada conforme mostrado na SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve conforme mostrado na SEQ ID NO: 4; F) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada conforme mostrado na SEQ ID NO: 5 e uma região variável de cadeia leve conforme mostrado na SEQ ID NO: 6; G) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada conforme mostrado na SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve conforme mostrado na SEQ ID NO: 8; e H) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada conforme mostrado na SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve conforme mostrado na SEQ ID NO: 10.

7. Anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado, e a sequência de região de FR do anticorpo compreende região de FR da linhagem germinativa humana ou variante da mesma, a variante de região de FR tem até 10 uma ou mais retro mutações de aminoácidos sobre a região de framework de cadeia leve e/ou a região de framework de cadeia pesada de um anticorpo humano, respectivamente.

8. Anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é qualquer anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo selecionado entre os itens seguintes a) a d): a) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada conforme mostrado na SEQ ID NO: 44 ou tendo no mínimo 90% de identidade de sequência com a mesma, e uma região variável de cadeia leve conforme mostrado na SEQ ID NO: 45 ou tendo no mínimo 90% de identidade de sequência com a mesma; b) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada conforme mostrado na SEQ ID NO: 46 ou tendo no mínimo 90% de identidade de sequência com a mesma, e uma região variável de cadeia leve conforme mostrado na SEQ ID NO: 47 ou tendo no mínimo 90% de identidade de sequência com a mesma; c) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada conforme mostrado na SEQ ID NO: 48 ou tendo no mínimo 90% de identidade de sequência com a mesma, e uma região variável de cadeia leve conforme mostrado na SEQ ID NO: 49 ou tendo no mínimo 90% de identidade de sequência com a mesma; e d) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada conforme mostrado na SEQ ID NO: 50 ou tendo no mínimo 90% de identidade de sequência com a mesma, e uma região variável de cadeia leve conforme mostrado na SEQ ID NO: 51 ou tendo no mínimo 90% de identidade de sequência com a mesma.

9. Anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado e compreende regiões variáveis conforme mostrado em qualquer um dos seguintes: a) uma região variável de cadeia pesada do anticorpo compreendendo HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 11, na SEQ ID NO: 12 e na SEQ ID NO: 13, respectivamente, e uma ou mais regiões de FR compreendendo uma ou mais retro mutações de aminoácidos selecionadas entre o grupo que consiste em 1E, 71A e 94R; e uma região variável de cadeia leve do anticorpo compreendendo LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 14, na SEQ ID NO: 15 e na SEQ ID NO: 16, respectivamente; b) uma região variável de cadeia pesada do anticorpo compreendendo HCDR1 e HCDR3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 17 e na SEQ ID NO: 19, respectivamente, e HCDR2 conforme mostrado na SEQ ID NO: 18 ou 52, e uma ou mais regiões de FR compreendendo uma ou mais retro mutações de aminoácidos selecionadas entre o grupo que consiste em 28A e 82B T; e uma região variável de cadeia leve do anticorpo compreendendo LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 20, na SEQ ID NO: 21 e na SEQ ID NO: 22, respectivamente; c) uma região variável de cadeia pesada do anticorpo compreendendo HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme mostrado na

SEQ ID NO: 23, na SEQ ID NO: 24 e na SEQ ID NO: 25, respectivamente; e uma região variável de cadeia leve do anticorpo compreendendo LCDR1 e LCDR2 conforme mostrado na SEQ ID NO: 20 e na SEQ ID NO: 21, respectivamente, e LCDR3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 26 ou 53; e uma ou mais regiões de FR compreendendo uma ou mais retro mutações de aminoácidos selecionadas entre o grupo que consiste em 2V e 45K; ou d) uma região variável de cadeia pesada do anticorpo compreendendo HCDR1 e HCDR3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 17 e na SEQ ID NO: 27, respectivamente, e HCDR2 conforme mostrado na SEQ ID NO: 18 ou 52; e uma região variável de cadeia leve do anticorpo compreendendo LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 20, na SEQ ID NO: 21 e na SEQ ID NO: 22, respectivamente, e uma ou mais regiões de FR compreendendo retro mutação de aminoácido de 2V.

10. Anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma ou mais regiões constantes; de modo preferencial, a região constante de cadeia pesada da sequência de aminoácidos do anticorpo é conforme mostrado na SEQ ID NO: 42 ou tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma, e a região constante de cadeia leve da sequência de aminoácidos do anticorpo é conforme mostrado na SEQ ID NO: 43 ou tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma.

11. Anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia pesada conforme mostrado na SEQ ID NO: 30, 34, 38 ou 40, ou tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma, e/ou uma cadeia leve conforme mostrado na SEQ ID NO: 31, 35, 39 ou 41, ou tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma.

12. Anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que é qualquer anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo selecionado entre os itens seguintes Q a T: Q) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada conforme mostrado na SEQ ID NO: 30 e uma cadeia leve conforme mostrado na SEQ ID NO: 31; R) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada conforme mostrado na SEQ ID NO: 34 e uma cadeia leve conforme mostrado na SEQ ID NO: 35; S) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada conforme mostrado na SEQ ID NO: 38 e uma cadeia leve conforme mostrado na SEQ ID NO: 39; e T) um anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada conforme mostrado na SEQ ID NO: 40 e uma cadeia leve conforme mostrado na SEQ ID NO: 41.

13. Anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação ao antígeno é selecionado entre o grupo que consiste em Fab, Fab', F(ab')2, scFv, diabody, dsFv e fragmento de ligação ao antígeno de peptídeo compreendendo CDR.

14. Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que se liga competitivamente a Abeta humano com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.

15. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica o anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

16. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que é qualquer molécula de ácido nucleico selecionada entre os ítens seguintes U a Z: U) uma molécula de ácido nucleico, a qual compreende sequência de nucleotídeos conforme mostrado na SEQ ID NO: 52 ou sequência de nucleotídeos tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma, e/ou compreende sequência de nucleotídeos conforme mostrado na SEQ ID NO: 53 ou sequência de nucleotídeos tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma; V) uma molécula de ácido nucleico, a qual compreende sequência de nucleotídeos conforme mostrado na SEQ ID NO: 54 ou sequência de nucleotídeos tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma, e/ou compreende sequência de nucleotídeos conforme mostrado na SEQ ID NO: 55 ou sequência de nucleotídeos tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma; W) uma molécula de ácido nucleico, a qual compreende sequência de nucleotídeos conforme mostrado na SEQ ID NO: 56 ou sequência de nucleotídeos tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma, e/ou compreende sequência de nucleotídeos conforme mostrado na SEQ ID NO: 57 ou sequência de nucleotídeos tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma; e Z) uma molécula de ácido nucleico, a qual compreende sequência de nucleotídeos conforme mostrado na SEQ ID NO: 58 ou sequência de nucleotídeos tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma, e/ou compreende sequência de nucleotídeos conforme mostrado na SEQ ID NO: 59 ou sequência de nucleotídeos tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a mesma.

17. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 15 ou 16.

18. Célula hospedeira obtida por transformação do vetor recombinante como definido na reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é selecionada entre o grupo que consiste em célula procariótica e célula eucariótica, de modo preferencial célula eucariótica, de modo mais preferencial célula de mamífero.

19. Método para preparação do anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende etapas de: cultura da célula hospedeira como definida na reivindicação 18 em um meio de cultura, e em seguida purificação e recuperação do anticorpo.

20. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: o anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, e um ou mais veículos, excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.

21. Uso do anticorpo anti-Abeta ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14 ou da composição farmacêutica como definida na reivindicação 20 caracterizado/a pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de doença ou distúrbio mediado por Abeta.

22. Uso de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a doença é uma doença neurodegenerativa selecionada entre o grupo que consiste em doença de Alzheimer, transtorno cognitivo leve, demência frontotemporal, doença de corpos de Lewy, doença de Parkinson, doença de Pick, doença de Bevac, angiopatia amiloide congofílica, angiopatia amiloide cerebral, síndrome de Down, demência por múltiplos enfartes, doença de Huntington, doença de Creutzfeldt-Jakob, síndrome de demência associada ao HIV, depressão, transtorno de ansiedade, fobia, parelisia de Bell, epilepsia, encefalite, esclerose múltipla, transtorno neuromuscular, transtorno neurotumoral, tumor cerebral, transtorno neurovascular devido a derrame, distúrbios neuroimunes, doença otológica neuropática, neurotrauma devido a lesão da medula espinhal, dor devido a dor neuropática, transtorno neuro pediátrico e neuropsiquiátrico, transtorno do sono, síndrome de Tourette, transtorno cognitivo leve, demência vascular, demência por múltiplos enfartes, fibrose cística, doença de Gaucher e discinesia diversa e doenças do sistema nervoso central.