CN101809034A - C3b抗体及用于预防和治疗补体相关病症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明关注针对C3b的抗体及使用此类抗体进行的对补体相关病症的预防和治疗。

Description

C3b抗体及用于预防和治疗补体相关病症的方法
发明领域
本发明关注针对C3b的抗体及使用此类抗体进行的对补体相关病症的预防和治疗。
发明背景
补体系统是由正常情况下以无活性的酶原形式存在的一系列血清糖蛋白构成的复杂酶级联。两种主要途径，即经典途径和旁路途径，能活化补体，它们在C3水平合并，其中两种类似的C3转化酶将C3切割成C3a和C3b。
巨噬细胞是已经发展出如下先天能力的专门细胞，即识别细胞表面表达的鉴定标签的结构中的微小差异，所谓的分子样式(Taylor等，Eur J Immunol33，2090-2097(2003)；Taylor等，Annu Rev Immunol 23，901-944(2005))。虽然这些表面结构的直接识别是先天免疫的一个基础方面，但是调理容许通用巨噬细胞受体介导吞食，提高效率和使吞噬细胞的识别全集多样化(Stuart和Ezekowitz，Immunity 22，539-550(2005))。吞食过程涉及多种配体-受体相互作用，而且现在清楚了多种调理素(包括免疫球蛋白、胶原凝集素、和补体成分)经由与巨噬细胞表面受体的相互作用来引导病原体内在化所需要的细胞活性(综述见Aderem和Underhill，Annu Rev Immunol 17，593-623(1999)；Underhill和Ozinsky，Annu Rev Immunol 20，825-852(2002))。虽然由种系基因编码的天然免疫球蛋白能识别极其多种病原体，但是大多数调理性IgG是经由适应性免疫生成的，因此经由Fc受体的高效清除不是立即的(Carroll，NatImmunol 5，981-986(2004))。另一方面，补体快速识别病原体表面分子并使微粒准备好由补体受体来摄取(Brown，Infect Agents Dis 1，63-70(1991))。
补体由30种以上的血清蛋白质组成，它们调理极其多种病原体，用以被补体受体所识别。取决于级联的初始触发，可区别三种途径(综述见Walport，NEnglJ Med 344，1058-1066(2001))。所有这三种途径共享活化中枢成分C3的共同步骤，但是它们依据识别的本质和导致C3活化的初始生化步骤而不同。经典途径如下活化，抗体结合至病原体表面，其继而结合C1q补体成分，引起一系列蛋白酶级联，最终将C3切割成其活性形式C3b。凝集素途径在碳水化合物基序受到凝集素蛋白质识别后被活化。至今，已经鉴定了此途径的三个成员：甘露糖结合凝集素(MBL)，SIGN-R1凝集素家族和ficolin(Pyz等，AnnMed 38，242-251(2006))。MBL和ficolin都与丝氨酸蛋白酶有关，其像经典途径中的C1那样起作用，活化成分C2和C4，导致中枢C3步骤。旁路条件与经典途径和凝集素途径二者形成对照，即它是由于内部C3酯与病原体表面上的识别基序的直接反应而被活化的。经由旁路途径蛋白酶因子B和因子D的作用，初始C3结合活化性表面导致C3b沉积的快速扩大。重要的是，经由因子B和D的作用，通过经典途径或凝集素途径任一沉积的C3b也能导致C3b沉积的扩大。在补体活化的所有三种途径中，调理作用中的关键步骤是成分C3转化成C3b。补体级联的酶对C3的切割将硫酯暴露于亲核攻击，容许C3b经由硫酯结构域共价附着到抗原表面上。这是补体调理中的初始步骤。对所结合的C3b的后续蛋白水解生成iC3b、C3c和C3dg，即受到不同受体识别的片段(Ross和Medof，Adv Immunol 37，217-267(1985))。此切割消除了C3b进一步扩大C3b沉积和活化补体级联晚期成分(包括能够指导膜破坏的膜攻击复合物)的能力。然而，巨噬细胞吞噬细胞受体优先识别C3b及其片段；由于酯键形成的通用性，C3介导的调理对于病原体识别是重要的(Holers等，Immunol Today 13，231-236(1992))，而且各种C3降解产物的受体因此在宿主免疫应答中发挥重要作用。
C3自身是由13个独特结构域组成的复杂的且柔性的蛋白质。该分子的核心由8个所谓的巨球蛋白(MG)结构域构成，它们构成了C3的紧密压缩的α和β链。插入此结构的是CUB(C1r/C1s、Uegf和骨形态生成蛋白-1)和TED结构域，后者含有容许C3b与病原体表面共价结合的硫酯键。剩余结构域含有C3a，或者作为核心结构域的接头和间隔物起作用。C3b和C3c结构与C3的比较证明了该分子在每次蛋白水解时经历重大构象重排，不仅暴露TED，而且暴露了该分子的能与细胞受体相互作用的别的新的表面(Janssen和Gros，Mol Immunol 44，3-10(2007))。
为了阻止不想要的补体活化，大多数哺乳动物细胞配备有在宿主自身细胞上阻断补体扩增的调节物(Hourcade等，Adv Immunol 45，381(1989))。在这些内在调节物缺失的情况中，血清暴露导致补体拆分产物的生成，其继而促进炎症和组织损伤(Oglesby等，J Exp Med 175，1547(1992)及Oglesby等，TransAssoc Am Physicians 104，164(1991))。因此，缺少内在补体调节物的非细胞表面尤其倾向于补体攻击，而且完全依赖于血清中可溶性补体调节物的保护。
已经由于缺少适宜的补体调控而发生的不受控制的补体活化与多种慢性炎性疾病和变性性疾病联系起来。此炎症级联中占支配地位的是补体拆分产物C3a和C5a，它们经C3a和C5a受体发挥嗜中性粒细胞和炎症巨噬细胞的化学引诱物和活化物的功能(Mollnes等，Trends Immunol 23，61(2002))。自嗜中性粒细胞释放的备解素经由AP转化酶的稳定作用进一步放大炎性级联(Lutz和Jelezarova，Mol Immunol 43，2(2006))。补体活化已经显示出是在免疫复合物介导的疾病中驱动炎症的重要成分，诸如膜性增生性肾小球肾炎、肾毒性肾炎和关节炎(Walport，N Engl J Med 344，1058(2001)；Thurman和Holers，J Immunol 176，1305(2006)；Banda等，J Immunol 171，2109(2003)；Weisman等，Science 249，146(1990)；Morgan和Harris，Mol Immunol 40，159(2003))、以及年龄相关黄斑变性(Anderson等，Am J Ophthalmol 134，411(2002)；Donoso等，Surv Ophthalmol 51，137(2006)；Gold等，Natl Genet 38，458(2006)；Hageman等，Proc Natl Acad Sci USA 102，7227(2005)；Hageman等，Ann Med 38，592(2006)；Hageman等，Prog Retin Eye Res 20，705(2001))。
补体活化的大多数调节物在C3b(补体转化酶的中心成分)水平起作用。补体活化的这些天然调节物通常尺寸较大(大于100kDa)，而且难以开发成治疗性试剂。因而，需要治疗剂，通过阻断C3b来预防和治疗补体相关病症。
发明概述
本发明关注如下抗体的开发，该抗体特异性识别C3分解片段而非天然C3，如此避免天然C3起抗体的“接收器”(sink)的作用。更具体的说，本发明关注C3b特异性抗体和抗体片段及其在治疗补体相关疾病中的用途。在一个方面，本发明关注用于预防或治疗补体相关病症的方法，包括对有需要的受试者施用有效量的C3b拮抗剂，该C3b拮抗剂是旁路补体途径的选择性抑制剂。
在一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在另一个实施方案中，所述受试者是人。
在又一个实施方案中，所述C3b拮抗剂是如下抗体，该抗体识别C3活性降解产物上的而非C3上的表位。
在还有一个实施方案中，所述C3b拮抗剂是选择性结合C3b的抗体或抗体片段。
在一个不同的实施方案中，所述抗体抑制C5结合C3b。在另一个实施方案中，所述抗体结合如下表位，该表位包括抗体S77所识别的C3b表位的残基。在还有一个实施方案中，所述抗体基本上(essentially)与抗体S77结合相同表位。
在又一个实施方案中，所述抗体竞争性抑制抗体S77的结合。
在还有一个实施方案中，所述抗体结合如下C3b表位，该C3b表位包含与抗体S77接触的残基。
在另一个实施方案中，所述抗体包含如下抗原结合位点，该抗原结合位点包含与C3b接触的抗体S77残基。
在一个优选的实施方案中，所述抗体包含抗体S77的重链CDR序列(SEQID NO 1-4)和/或轻链CDR序列(SEQ ID NO 5-8)和/或所述抗体是S77抗体或其片段。
在各种实施方案中，所述抗体可以是人的、人源化的或嵌合的。
在其它实施方案中，所述抗体片段选自下组：Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、(scFv)2、dAb、互补决定区(CDR)片段、线性抗体、单链抗体分子、微型抗体(minibodies)、双抗体、和自抗体片段形成的多特异性抗体。
本发明的方法包括预防或治疗任何补体相关病症，包括炎性和自身免疫性疾病，诸如例如类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)(RA)、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome)(ARDS)、缺血和再灌注后的远距离组织损伤(remote tissue injury after ischemia and reperfusion)、心肺旁路手术期间的补体活化(complement activation during cardiopulmonary bypass surgery)、皮肌炎(dermatomyositis)、天疱疮(pemphigus)、狼疮肾炎及所致肾小球肾炎和血管炎(lupus nephritis and resultant glomerulonephritis and vasculitis)、心肺旁路(cardiopulmonary bypass)、心脏停搏诱发的冠状内皮功能障碍(cardioplegia-induced coronary endothelial dysfunction)、II型膜性增生性肾小球肾炎(type II membranoproliferative glomerulonephritis)、IgA肾病(IgAnephropathy)、急性肾衰竭(acute renal failure)、冷球蛋白血症(cryoglobulemia)、抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome)、黄斑变性性疾病(maculardegenerative diseases)诸如年龄相关黄斑变性(age-related maculardegeneration)(AMD)、脉络膜新血管形成(choroidal neovascularization)(CNV)、葡萄膜炎(uveitis)、糖尿病性和其它缺血相关视网膜病变(diabetic and otherischemia-related retinopathies)、眼内炎(endophthalmitis)、和其它眼内新血管疾病(other intraocular neovascular diseases)诸如糖尿病性黄斑水肿(diabeticmacular edema)、病理性近视(pathological myopia)、von Hippel-Lindau病、眼的组织胞浆菌病(histoplasmosis of the eye)、视网膜中央静脉阻塞(CentralRetinal Vein Occlusion)(CRVO)、角膜新血管形成(corneal neovascularization)、视网膜新血管形成(retinal neovascularization)、以及同种异基因移植(allotransplantation)、超急性排斥反应(hyperacute rejection)、血液透析(hemodialysis)、慢性阻塞性肺病综合征(chronic occlusive pulmonary distresssyndrome)(COPD)、哮喘(asthma)、和吸入性肺炎(aspiration pneumonia)。在一个具体的实施方案中，所述补体相关病症是补体相关眼疾(complement-associated eye condition)，诸如年龄相关黄斑变性(age-relatedmacular degeneration)(AMD)或脉络膜新血管形成(choroidalneovascularization)(CNV)。
在另一个方面，本发明关注抗C3b抗体，其选择性结合C3b而非C3且抑制C5结合C3b。
在一个实施方案中，所述抗体结合如下表位，该表位包括抗体S77所识别的C3b表位的残基。
在另一个实施方案中，所述抗体基本上与抗体S77结合相同表位。在还有一个实施方案中，所述抗体竞争性抑制抗体S77的结合。
在一个不同的实施方案中，所述抗体结合如下C3b表位，该C3b表位包含与抗体S77接触的残基。
在又一个实施方案中，所述抗体包含如下抗原结合位点，该抗原结合位点包含与C3b接触的抗体S77残基。
在还有一个实施方案中，所述抗体包含抗体S77的重链CDR序列(SEQID NO 1-4)和/或轻链CDR序列(SEQ ID NO 5-8)，或者该抗体是S77抗体或其片段。
在各种实施方案中，所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。所述抗体片段可以例如选自下组：Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、(scFv)2、dAb、互补决定区(CDR)片段、线性抗体、单链抗体分子、微型抗体(minibody)、双抗体、和自抗体片段形成的多特异性抗体。
在另一个方面，本发明关注药物组合物，其包含与药学可接受载体混和的本发明的C3b拮抗剂，诸如C3b抗体。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物用于治疗补体相关病症。
在又一个方面，本发明关注试剂盒，其包含容器和说明书，所述容器中装有本发明的C3b拮抗剂或C3b抗体或包含此类拮抗剂或抗体的药物组合物，所述说明书指示施用所述抗体或药物组合物来治疗补体相关病症。
附图简述
图1。抗体噬菌体文库中的C3b淘选结果。
图2。用各种C3b抗体克隆得到的噬菌体竞争结果。
图3。与抗体YW144.2.43.S77(以下简称S77)Fab形成的复合物中C3b的晶体结构。C3b的β链以绿色标示，α链以橙色标示。S77的重链(HC)和轻链(EC)分别以暗绿色和黄色标示。根据C3b:CRIg共晶体结构，CRIg已经停靠到C3b:Fab复合物上，而且以品红显示。
图4。抗体S77与C3b的结合相互作用的特写。C3b以表面图显示，青色飘带图代表在C3b结构上重叠的C3。S77的HC和LC以暗绿色和黄色的飘带图显示。C3b的表面依照与S77的距离着色。所有比4.7
Figure GPA00001021350400061
4.0
Figure GPA00001021350400062
和3.5更靠近的原子分别着黄色、橙色和红色。注意，S77的LC与C3冲突。然而，C3的环可能能够移动。
图5。抗体S77Fab片段的重链(SEQ ID NO 1-4)和轻链(SEQ ID NO 5-8)的氨基酸序列。以红色标示的是与C3b密切接触的残基。
图6。亲本抗体YW144.2.43Fab及其亲和力成熟形式144.2.43.S77Fab(S77Fab)的结合亲和力。
图7。SPR传感图及S77对C3和C3b的结合亲和力。
图8。S77识别C3b而非原分子C3。使用多克隆C3抗体在微量滴定板中捕捉纯化的C3b或C3。使用HRPO偶联抗体测定S77(A)或多克隆抗C3抗体(B)对捕捉到的C3b或C3的结合情况。用TMB(KPL)显色，在2N H2SO4中终止，并读取450nm吸光度。
图9。IgG抗体S77选择性抑制补体的旁路途径而非经典途径。在消减了C1q和因子B的血清中温育家兔红细胞和绵羊红细胞，并在存在浓度渐增的抑制剂或对照蛋白质的情况中监测溶血情况。溶血情况表述成相对于抑制剂缺失的情况中的最大限度溶血的百分比。
图10。亲和力成熟的S77Fab抑制补体旁路途径。
图11。C3b Fab(S77)抑制C5转化酶。C5转化酶如文献所述实施(Rawal N和Pangbum M，J Immunol 2001Feb 15；166(4)：2635-42)。
图12。IgG抗体S77及其Fab片段通过阻断C5结合C3b(转化酶的非催化性亚基)来抑制C5转化酶。在存在浓度渐增的抑制剂的情况中，将C5添加至用C3b包被的板。C5结合C3b多聚体。
图13。与因子H不同，S77不分解转化酶。分解测定法是通过在存在浓度渐增的S77或因子H(阳性对照)的情况中生成板包被的C3转化酶而实施的。
图14。S77抑制原因子B(pro-factor B)结合C3b，而且抑制C3bBb转化酶的形成。
图15。S77能在存在结合的fBb的情况中结合C3b且不分解C3转化酶。
图16。S77抑制因子H结合C3b且抑制因子H辅因子活性。
图17。S77抑制CR1结合C3b。
图18A和18B。抗HER2抗体rhuMAB 4D5-8轻链可变区(SEQ ID NO：13)和重链可变区(SEQ ID NO：14)的氨基酸序列。
增图1。C3b上与S77Fab的HC和LC接触的残基(残基833-839涵盖SEQ IDNO：15；残基895-899涵盖SEQ ID NO：16)。
增图2。S77Fab上与C3b接触的残基(残基1030-1033涵盖SEQ ID NO：17；残基1098-1107涵盖SEQ ID NO：18)。
增图3。人补体因子C3(SEQ ID NO：9)和小鼠补体因子C3(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列。
发明详述
I.定义
术语“C3”和“补体C3”可互换使用，指天然序列C3多肽。
“天然序列C3”指与自自然界衍生的C3多肽具有相同氨基酸序列的多肽，无论其制备模式。如此，天然序列C3可以从自然界分离，或者可以通过重组和/或合成手段生成。术语“天然序列C3”明确涵盖C3的天然存在变体形式(例如可变剪接形式)和天然存在等位变体，以及C3分子的与自自然界衍生的C3多肽具有相同氨基酸序列的结构构象变体。天然序列C3多肽明确包括天然序列人C3(增图3，SEQ ID NO：9；还可参见De Bruijn and Fey，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：708-712)和非人动物(包括高等灵长类和其它非人哺乳类)的多肽，诸如小鼠C3序列(增图3，SEQ ID NO：10)。
术语“C3b”在本文中用于指C3转化酶切割(自C3α链的氨基末端释放过敏毒素C3a片段并留下C3b)后自C3生成的天然序列C3b多肽。术语“天然序列”与关于C3所定义的具有相同含义，而且明确包括SEQ ID NO：9的天然序列人C3b。
术语“C3b拮抗剂”以最广义使用，包括能够中和、阻断、部分或完全抑制、消除、降低或干扰C3生物学活性的任何分子。C3b拮抗剂包括但不限于抗C3b抗体及其抗原结合片段，结合C3b且能够中和、阻断、部分或完全抑制、消除、降低或干扰C3b活性(诸如C3b参与补体相关病症的病理学的能力)的其它结合性多肽、肽、和非肽小分子。本文中的C3b拮抗剂(诸如C3b抗体)特异性识别C3b而不识别前体C3。
“小分子”在本文中定义为具有低于约600，优选低于约1000道尔顿的分子量。
“有活性的”或“活性”或“生物学活性”在本发明C3b拮抗剂(诸如C3b抗体)的语境中指拮抗(部分或完全抑制)C3b生物学活性的能力。C3b拮抗剂的一种优选生物学活性是在C3b相关疾病或疾患(诸如例如补体相关病症)的状态(例如病理学)中实现可测量的改善的能力。所述活性可在体外或在体内测试中测定，包括结合测定法，使用有关动物模型，或人体临床试验。
术语“补体相关病症”在本文中以最广义使用，包括其发病机制牵涉补体系统激活异常的所有疾病和病理性状况，诸如例如补体缺陷。该术语明确包括受益于C3转变酶抑制的疾病和病理性状况。该术语另外包括受益于补体旁路抑制，包括选择性抑制的疾病和病理性状况。补体相关病症包括但不限于炎性疾病和自身免疫性疾病，诸如例如类风湿性关节炎(RA)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、缺血和再灌注后的远距离组织损伤、心肺旁路手术期间的补体活化、皮肌炎、天疱疮、狼疮肾炎及所致肾小球肾炎和血管炎、心肺旁路、心脏停搏诱发的冠状内皮功能障碍、II型膜性增生性肾小球肾炎、IgA肾病、急性肾衰竭、冷球蛋白血症、抗磷脂综合征、黄斑变性性疾病和其它补体相关眼疾，诸如年龄相关黄斑变性(AMD)、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性和其它缺血相关视网膜病变、眼内炎、和其它眼内新血管疾病，诸如糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、von Hippel-Lindau病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、以及同种异基因移植、超急性排斥反应、血液透析、慢性阻塞性肺病综合征(COPD)、哮喘、和吸入性肺炎。
术语“补体相关眼疾”在本文中以最广义使用，包括病理学涉及补体(包括经典途径和旁路途径，特别是补体旁路途径)的所有眼部疾患和疾病。此组内明确包括所有与旁路途径有关的，其发生、形成、或进展能通过抑制旁路途径来控制的眼部疾患和疾病。补体相关眼疾包括但不限于黄斑变性性疾病，诸如所有阶段的年龄相关黄斑变性(AMD)(包括干性和湿性(非渗出性和渗出性))形式，脉络膜新血管形成(CNV)，葡萄膜炎，糖尿病性视网膜病变和其它缺血相关视网膜病变，眼内炎，和其它眼内新血管疾病，诸如糖尿病性黄斑水肿，病理性近视，von Hippel-Lindau病，眼的组织胞浆菌病，视网膜中央静脉阻塞(CRVO)，角膜新血管形成，和视网膜新血管形成。一组优选的补体相关眼疾包括年龄相关黄斑变性(AMD)(包括非渗出性(湿性)和渗出性(干性或萎缩性)AMD)、脉络膜新血管形成(CNV)、糖尿病性视网膜病变(DR)、和眼内炎。
术语“炎性疾病”和“炎性病症”可互换使用，指其中哺乳动物免疫系统的成分引起、介导或以其它方式促成炎症应答(其促成在该哺乳动物中发病)的疾病和病症。还包括其中炎症应答的降低对疾病的进展具有改善效果的疾病。此定义内包括免疫介导的炎性疾病，包括自身免疫性疾病。
术语“T细胞介导的”疾病指其中T细胞直接或间接介导或以其它方式促成哺乳动物发病的疾病。T细胞介导的疾病可能与细胞介导的效应、淋巴因子介导的效应等有关，甚至与B细胞有关的效应有关(如果B细胞得到刺激的话，例如受到由T细胞分泌的淋巴因子的刺激)。
免疫相关和炎性疾病的例子(其中有些是T细胞介导的)包括但不限于炎性肠病(IBD)、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼年型慢性关节炎、脊椎关节病、系统性硬化(硬皮病)、特发性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、斯耶格伦氏(Sjogren)综合征、系统性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症、阵发性夜间血红蛋白尿)、自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)、甲状腺炎(格雷夫斯氏(Graves)病、桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎、幼年型淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)、糖尿病、免疫介导的肾病(肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎)、中枢和周围神经系统的脱髓鞘病诸如多发性硬化、特发性多神经病、肝胆病诸如传染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、和硬化性胆管炎、炎性和纤维化肺病(例如囊性纤维化病)、麸胶敏感性肠病、惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫性或免疫介导的皮肤病包括大疱性皮肤病、多形红斑和接触性皮炎、银屑病、肺的变应性疾病诸如嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化和超敏感性肺炎、移植相关疾病包括移植物排斥、移植物抗宿主疾病、阿耳茨海默氏(Alzheimer)病、和动脉粥样硬化。
“治疗”或“处理”指旨在预防病症发展或改变病症病理而实施的干预。因而，“治疗”或“处理”指治疗性处理及预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者包括早就患有病症的受试者以及要预防病症的受试者。在免疫相关疾病的治疗中，治疗剂可直接改变免疫应答的成分的应答程度，或者使得疾病对其它治疗剂(例如抗生素、抗真菌剂、抗炎剂、化疗剂等)的治疗更敏感。
疾病(诸如补体相关病症)的“病理”或“病理学”包括所有危及患者康乐的现象。这包括但不限于异常的或不可控的细胞生长(嗜中性细胞、嗜酸性细胞、单核细胞、淋巴细胞)、抗体生成、自身抗体生成、补体生成、对邻近细胞正常机能的干扰、细胞因子或其它分泌产物的异常水平释放、任何炎性或免疫学应答的抑制或恶化、炎症细胞(嗜中性细胞、嗜酸性细胞、单核细胞、淋巴细胞)浸润入细胞间隙(cellular spaces)等。
如本文中所使用的，术语“哺乳动物”指归为哺乳类的任何动物，包括但不限于人，高等灵长类，家畜和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如马、猪、牛、犬、猫和雪貂等。在一个优选的实施方案中，哺乳动物指人。
与一种或多种其它治疗剂“联合/组合”施用包括同时(共同)施用和任何次序的序贯施用。
“治疗有效量”指在目标疾病或疾患(诸如例如补体相关病症)的状态(例如病理学)中实现可测量的改善所需要的“C3b拮抗剂”诸如“C3b抗体”量。
术语“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。
若一段核酸与另一段核酸序列处于功能性相互关系中，则它是“可操作连接的”。例如，若前序列(presequence)或分泌前导(secretory leader)的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质(preprotein)，则它与该多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。一般而言，“可操作连接的”意味着相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导的情况中意味着相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接可以通过在方便的限制性位点处的连接来实现。若没有此类位点，则依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
杂交反应的“严格性”可以由本领域普通技术人员容易地确定，而且通常根据探针长度、洗涤温度、和盐浓度凭经验计算。一般而言，较长的探针要求较高的温度以正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间的期望同源性程度越高，可使用的相对温度也越高。结果是，推断出较高相对温度会趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较不严格。关于杂交反应严格性的其它细节和解释，参见Ausubel等，《CurrentProtocols in Molecular Biology》，Wiley Interscience Publishers，1995。
“严格条件”或“高严格性条件”，如本文中所定义的，可如下鉴定：(1)采用低离子强度和高温进行清洗，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，于50℃；(2)在杂交过程中采用变性剂，诸如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺及0.1％牛血清清蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5及750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，于42℃；或(3)采用50％甲酰胺，5x SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)，0.1％焦磷酸钠，5x Denhardt氏溶液，超声处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，和10％硫酸右旋糖苷，于42℃，及于42℃在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50％甲酰胺中清洗，于55℃，接着于55℃在含EDTA的0.1x SSC中进行高严格性清洗。
“中等严格条件”可以如Sambrook等，《Molecular Cloning：A LaboratoryManual》，New York，Cold Spring Harbor Press，1989中所述鉴定，包括使用比上文所述较不严格的清洗溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％SDS)。中等严格条件的一个例子是于37℃在含20％甲酰胺，5x SSC(150mMNaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH 7.6)，5x Denhardt氏溶液，10％硫酸右旋糖苷，和20mg/ml变性的经剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育过夜，接着于约37-50℃在1x SSC中清洗滤膜。技术人员会认识到如何在必要时调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。
术语“表位标记的”或“带表位标签的”在用于本文时指包含本发明多肽且其与“标签多肽”融合的嵌合多肽。标签多肽具有足够残基以提供表位而可制备针对其的抗体，但又足够短使得其不干扰与其融合的多肽的活性。标签多肽还优选是相当独特的，使得其抗体基本上不与其它表位发生交叉反应。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基，通常在约8个和约50个氨基酸残基之间(优选在约10个和约20个氨基酸残基之间)。
术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖但不限于识别C3分解片段而非天然C3的单一抗体诸如特异性结合C3b的抗C3b单克隆抗体，和具有多表位特异性的抗体组合物。术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变形式外。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变形式外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。此外，与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，有待依照本发明使用的单克隆抗体可以通过首次由Kohler等(1975)Nature 256：495记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法来制备(参见例如美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”也可以使用例如Clackson等(1991)Nature 352：624-628及Marks等(1991)J.Mol.Biol.222：581-597中记载的技术从噬菌体抗体库分离。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567；及Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855)。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常，人源化抗体会包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体任选还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等(1988)Nature 332：323-329；及Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。
“物种依赖性抗体”指对来自第一哺乳动物物种的抗原具有强于对该抗原来自第二哺乳动物物种的同系物的结合亲和力的抗体。通常，物种依赖性抗体“特异性结合”人类抗原(即具有不超过约1×10-7M、优选不超过约1×10-8M、和最优选不超过约1×10-9M的结合亲和力(Kd))，但是对该抗原来自第二非人哺乳动物物种的同系物具有比其对人类抗原的结合亲和力弱至少约50倍、或至少约500倍、或至少约1000倍的结合亲和力。物种依赖性抗体可以是上文定义的各种类型抗体，但是优选人源化抗体或人抗体。
在用于本文时，“抗体突变体”或“抗体变体”指物种依赖性抗体的氨基酸序列变体，其中物种依赖性抗体的一个或多个氨基酸残基发生了修饰。此类突变体与物种依赖性抗体必然具有小于100％的序列同一性或相似性。在一个优选的实施方案中，抗体突变体所具有的氨基酸序列与物种依赖性抗体的重链或轻链可变域的氨基酸序列具有至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％的氨基酸序列同一性或相似性。关于此序列的同一性或相似性在本文中定义为在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，候选序列中与物种依赖性抗体残基相同(即相同残基)或相似(即根据共同侧链特性来自同一组的氨基酸残基，见下文)的氨基酸残基的百分比。N-末端、C-末端、或内部的延伸、删除、或插入可变域以外的抗体序列都不应视为影响序列同一性或相似性。
“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95％，最优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或优选的银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常会通过至少一个纯化步骤来制备。
在用于本文时，“抗体可变域”指抗体分子的轻链和重链中包含互补决定区(CDR；即CDR1、CDR2、和CDR3)和框架区(FR)氨基酸序列的那部分。VH指重链可变域。VL指轻链可变域。依照本发明所使用的方法，归为CDR和FR的氨基酸位置可以依照Kabat(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.，1987和1991))来限定。抗体或抗原结合片段的氨基酸编号方式也依照Kabat。
在用于本文时，术语“互补决定区(CDR；即CDR1、CDR2、和CDR3)指抗体可变域中其存在是抗原结合所必需的氨基酸残基。每个可变域通常具有三个CDR，鉴定为CDR1、CDR2和CDR3。每个互补决定区可以包含来自如Kabat定义的“互补决定区”的氨基酸残基(即大约是轻链可变域的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变域的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))和/或来自“高变环”的残基(即大约是轻链可变域的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变域的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)。在有些情况中，互补决定区可以包含来自依照Kabat定义的CDR和来自高变环二者的氨基酸。例如，抗体4D5重链的CDRH1包含氨基酸26-35。
“框架区”(以下的FR)指可变域中CDR残基以外的残基。每个可变域通常具有四个FR，鉴定为FR1、FR2、FR3和FR4。如果CDR是依照Kabat定义的，那么轻链FR残基位于大约轻链残基1-23(LCFR1)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)、和98-107(LCFR4)，而重链FR残基位于大约重链残基1-30(HCFR1)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)、和103-113(HCFR4)。如果CDR包含来自高变环的氨基酸残基，那么轻链FR残基位于大约轻链残基1-25(LCFR1)、33-49(LCFR2)、53-90(LCFR3)、和97-107(LCFR4)，而重链FR残基位于大约重链残基1-25(HCFR1)、33-52(HCFR2)、56-95(HCFR3)、和102-113(HCFR4)。在有些情况中，在CDR包含来自依照Kabat定义的CDR和来自高变环二者的氨基酸时，FR残基会做相应的调整。例如，当CDRH1包含氨基酸H26-H35时，重链FR1残基位于第1-25位，而FR2残基位于第36-49位。
在用于本文时，“密码子集”指用于编码期望变异氨基酸的一套不同核苷酸三联体序列。可以通过例如固相合成来合成一套寡核苷酸，其包括呈现由密码子集提供的核苷酸三联体的所有可能组合并编码期望氨基酸组的序列。一种标准形式的密码子命名是IUB代码，其是本领域已知的且在本文中有记载。密码子集通常以3个斜体大写字母表示，例如NNK、NNS、XYZ、DVK等等。如此，“非随机密码子集”在用于本文时指编码部分、优选完全满足本文所述氨基酸选择标准的选定氨基酸的密码子集。在某些位置具有选定核苷酸“简并性”的寡核苷酸的合成是本领域众所周知的，例如TRIM法(Knappek等(1999)J.Mol.Biol.296：57-86；Garrard和Henner(1993)Gene 128：103)。此类具有某些密码子集的寡核苷酸集可以使用商品化核酸合成仪来合成(可购自例如Applied Biosystems，Foster City，CA)，或者可以通过商业途径获得(例如购自Life Technologies，Rockville，MD)。因此，一套具有特定密码子集的合成寡核苷酸通常会包括具有不同序列(在整个序列中由密码子集建立的差异)的多种寡核苷酸。寡核苷酸，在依照本发明使用时，具有容许与可变域核酸模板杂交的序列，而且还可以但非必须包含可用于例如克隆目的的限制酶位点。
术语“抗体片段”在本文中以最广义使用，包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、(scFv)2、dAb、和互补决定区(CDR)片段、线性抗体、单链抗体分子、微型抗体、双抗体、和自抗体片段形成的多特异性抗体。
“Fv”片段是包含完整抗原识别和结合位点的抗体片段。该区域由紧密结合(该结合的本质可以是共价的，例如在scFv中)的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。正是在这种构造中，每个可变域的三个CDR相互作用而在VH-VL二聚体表面上限定了抗原结合位点。六个CDR或其子集一起赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是通常亲和力低于完整结合位点。
“Fab”片段包含轻链的可变域和恒定域及重链的可变域和第一恒定域(CH1)。F(ab′)2抗体片段包含一对Fab片段，它们一般在它们羧基末端附近通过它们之间的铰链半胱氨酸共价连接。本领域还知道抗体片段的其它化学偶联形式。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。一般而言，Fv多肽在VH与VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见Pluckthun，于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页，1994。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(VH及VL)中包含相连接的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448。
表述“线性抗体”指Zapata等(1995)Protein Eng，8(10)：1057-1062中所描述的抗体。简言之，这些抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，该区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的，或者是单特异性的。
在用于本文时，“文库”或“库”指众多抗体或抗体片段序列(例如本发明的多肽)，或者编码这些序列的核酸，即根据本发明方法导入这些序列中的、变异氨基酸组合方面不同的序列。
“噬菌体展示”是一种将变异多肽作为与外壳蛋白至少一部分的融合蛋白展示在噬菌体(例如丝状噬菌体)颗粒表面上的技术。噬菌体展示的效用在于能对随机化蛋白质变体的大型文库快速且高效分选那些以高亲和力与靶抗原结合的序列的实情。肽和蛋白质文库在噬菌体上的展示已经用于对数以百万计的多肽筛选那些具有特异性结合特性的多肽。多价噬菌体展示法已经用于展示小随机肽和小蛋白质，其通过与丝状噬菌体的基因III或基因VIII融合来实现。Wells和Lowman(1992)Curr.Opin.Struct.Biol.3：355-362，及其中引用的参考文献。在单价噬菌体展示中，将蛋白质或肽文库与基因III或其一部分融合，并在存在野生型基因III蛋白时以低水平表达，使得噬菌体颗粒展示一个拷贝的融合蛋白或者不展示融合蛋白。亲合效应(avidity effect)相对于多价噬菌体得到了降低，使得分选基于内在的配体亲和力，而且使用噬菌粒载体，这简化了DNA操作。Lowman和Wells(1991)Methods：A companion toMethods in Enzymology 3：205-0216。
“噬菌粒”是具有细菌复制起点(例如Co1El)和噬菌体基因间区的质粒载体拷贝。噬菌粒可利用任何已知噬菌体，包括丝状噬菌体和λ类噬菌体。质粒一般也会包含抗生素抗性的选择标志。克隆入这些载体的DNA区段可以像质粒一起而扩增。在给携带这些载体的细胞提供生成噬菌体颗粒所必需的所有基因时，质粒的复制模式变成滚环复制，以生成质粒DNA的一条链的拷贝，并包装噬菌体颗粒。噬菌粒可形成感染性或非感染性噬菌体颗粒。此术语包括如下的噬菌粒，它们包含与异源多肽基因连接成基因融合物的噬菌体外壳蛋白基因或其片段，使得异源多肽展示在噬菌体颗粒的表面上。
术语“噬菌体载体”指包含异源基因且能够复制的双链复制型噬菌体。噬菌体载体具有容许噬菌体复制和噬菌体颗粒形成的噬菌体复制起点。噬菌体优选是丝状噬菌体，诸如M13、f1、fd、Pf3噬菌体或其衍生物，或者是λ类噬菌体，诸如λ、21、
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82、424、434等或其衍生物。
在用于本文时，“溶剂可及位置”指源抗体或抗原结合片段重链和轻链可变区中根据抗体或抗原结合片段的结构、结构系综(ensemble)和/或建模结构确定为潜在地可被溶剂触及和/或与分子(诸如抗体特异性抗原)接触的氨基酸残基位置。这些位置通常发现于CDR中和蛋白质外部上。如本文所定义的抗体或抗原结合片段的溶剂可及位置可使用本领域已知的多种算法之任一种来确定。优选的是，溶剂可及位置是使用来自抗体三维模型的坐标而确定的，优选使用计算法程序，诸如InsightII程序(Accelrys，San Diego，CA)。溶剂可及位置还可以使用本领域已知的算法来确定(例如Lee和Richards(1971)J.Mol.Biol.55，379及Connolly(1983)J.Appl.Cryst.16，548)。溶剂可及位置的确定可使用适于蛋白质建模的软件和自抗体得到的三维结构信息来进行。可用于这些目的的软件包括SYBYL Biopolymer Module软件(TriposAssociates)。一般和优选的是，若算法(程序)要求用户输入大小参数，计算中所使用的探针的“大小”设为半径大约1.4埃或更小。另外，Pacios(1994)Comput.Chem.18(4)：377-386记载了使用供个人计算机用的软件确定溶剂可及区域和面积的方法。
II.详述
补体系统
补体在身体的防御中发挥至关重要的作用，而且与免疫系统的其它成分一起保护个体免于病原体侵入身体。然而，如果没有受到正确的活化或控制，那么补体也能引起对宿主组织的损伤。补体的不当活化涉及多种疾病(称作补体相关疾病或病症，诸如免疫复合物和自身免疫性疾病)和多种炎症状况(包括补体介导的炎性组织损伤)的发病机理。各种补体相关病症的病理有所不同，而且可涉及时间或长或短的补体活化，整个级联、只有级联之一(例如经典途径或旁路途径)、只有级联的一些成分、等的活化。在有些疾病中，补体片段的补体生物学活性导致组织损伤和疾病。因而，补体的抑制剂具有高度的治疗潜力。旁路途径的选择性抑制剂会是特别有用的，因为经由经典路径自血液中清除病原体和其它生物体会保持完整。
C3b抗体及其在预防和治疗补体相关病症中的用途
本发明(至少部分)基于特异性识别C3分解片段而非天然C3的抗体的开发。具体而言，本发明关注使用人组合抗体文库和噬菌体展示开发得到的识别且特异性结合C3b的抗体，其中对C3b特异性噬菌体的富集是通过用饱和量的C3进行封闭而实现的。使用此方法学，我们能够开发出对活化形式的C3特异性的抗体。另外，这些人抗体进行了进一步的亲和力成熟，如此提高它们在体外溶血测定法中的效力。通过克隆生成了Fab片段并显示出保留抑制经由旁路途径的补体活化的高效力。解析出了与C3b的复合物中Fab(称作S77)的共结构，并定位了参与C3b-S77相互作用的残基。就我们所知，这是第一种具有对C3片段的选择性、抑制补体旁路途径的噬菌体衍生抗体。
本发明的抗体和其它C3b特异性拮抗剂在补体相关病症的预防和治疗中是有用的。补体相关疾病的具体例子包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、缺血和再灌注后的远距离组织损伤、心肺旁路手术期间的补体活化、皮肌炎、天疱疮、狼疮肾炎及所致肾小球肾炎和血管炎、心肺旁路、心脏停搏诱发的冠状内皮功能障碍、II型膜性增生性肾小球肾炎、IgA肾病、急性肾衰竭、冷球蛋白血症、抗磷脂综合征、黄斑变性性疾病和其它补体相关眼疾，诸如年龄相关黄斑变性(AMD)、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性和其它缺血相关视网膜病变、眼内炎、和其它眼内新血管疾病诸如糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、von Hippel-Lindau病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、以及同种异基因移植、超急性排斥反应、血液透析、慢性阻塞性肺病综合征(COPD)、哮喘、和吸入性肺炎。
作为补体相关疾病的例子的炎性病症的一个更加广泛的列表包括例如炎性肠病(IBD)、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼年型慢性关节炎、脊椎关节病、系统性硬化(硬皮病)、特发性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、斯耶格伦氏
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综合征、系统性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症、阵发性夜间血红蛋白尿)、自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)、甲状腺炎(格雷夫斯氏(Graves)病、桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎、幼年型淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)、糖尿病、免疫介导的肾病(肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎)、中枢和周围神经系统的脱髓鞘病诸如多发性硬化、特发性多神经病、肝胆病诸如传染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎和硬化性胆管炎、炎性和纤维化肺病(例如囊性纤维化病)、麸胶敏感性肠病、惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介导的皮肤病包括大疱性皮肤病、多形红斑和接触性皮炎、银屑病、肺的变应性疾病诸如嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化和超敏感性肺炎、移植相关疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主病。
在系统性红斑狼疮中，疾病的主要介质是生成针对自身蛋白质/组织的自身反应性抗体及随后产生免疫介导的炎症。抗体或是直接或是间接介导组织损伤。尽管T淋巴细胞未显示出直接参与组织损伤，然而T淋巴细胞是产生自身反应性抗体所要求的。疾病的发生因此依赖T淋巴细胞。多个器官和系统在临床上受到影响，包括肾、肺、肌肉骨骼系统、粘膜皮肤、眼、中枢神经系统、心血管系统、胃肠道、骨髓和血液。
类风湿性关节炎(RA)是一种慢性系统性自身免疫性炎性疾病，主要涉及多个关节的滑膜，由此导致对关节软骨的损伤。发病机制依赖T淋巴细胞，而且与类风湿因子，针对自身IgG的自身抗体的生成有关，由此导致免疫复合物的形成，其在关节液和血液中达到高水平。关节中的这些复合物可诱发显著的淋巴细胞和单核细胞浸润到滑膜中及随后显著的滑膜变化；关节腔/液受到类似细胞的浸润及添加许多嗜中性粒细胞。受影响的组织主要是关节，常常是对称样式。然而，关节外疾病也存在两种主要形式。一种形式是形成关节外损伤，伴有正在进行的渐进性关节病和肺纤维化、血管炎和皮肤溃疡的典型损伤。关节外疾病的第二种形式是所谓的费尔提氏(Felty)综合征，它发生在RA病程晚期，有时在关节病已经沉寂后，且涉及出现嗜中性粒细胞减少症、血小板减少症和脾肿大。这可伴随着多个器官中的血管炎及梗塞、皮肤溃疡和坏疽的形成。患者还常常在受影响关节上面的皮下组织中形成类风湿性结节；晚期的结节具有由混合的炎性细胞浸润物包围的坏死中心。可在RA中出现的其它表现包括：心包炎、胸膜炎、冠状动脉炎、伴有肺纤维化的间质性肺炎、干燥性角膜结膜炎和类风湿性结节。
幼年型慢性关节炎是一种慢性特发性炎性疾病，常常开始于16岁之前。其表型与RA有些相似；类风湿因子阳性的一些患者归入幼年型类风湿性关节炎。疾病细分为三种主要类别：少数关节的、多关节的和系统性的。关节炎可以是严重的，通常是破坏性的，并导致关节僵硬和生长迟缓。其它表现可包括慢性前葡萄膜炎和系统性淀粉样变。
脊椎关节病是具有一些普遍临床特征且普遍与HLA-B27基因产物表达有关的一组病症。这些病症包括：强直性脊柱炎、莱特尔氏(Reiter)综合征(反应性关节炎)、与炎性肠病有关的关节炎、与银屑病相关的脊椎炎、幼发型脊椎关节病及无差别(undifferentiated)脊椎关节病。区别性特征包括具有或没有脊椎炎的骶髂关节炎；炎性不对称关节炎；与HLA-B27有关(血清学上定义的MHC I型HLA-B基因座的等位基因)；眼的炎症；及与其它类风湿性疾病有关的自身抗体的缺乏。对于诱发疾病来说关键的最相关细胞是CD8+T淋巴细胞，靶向由MHC I型分子呈递的抗原的细胞。CD8+T细胞可与MHC I型等位基因HLA-B27反应，就像它是由MHC I型分子表达的外来肽。已有假设，HLA-B27的表位可能模拟细菌或其它微生物的抗原性表位，如此诱导CD8+T细胞应答。
系统性硬化(硬皮病)的病因学未知。疾病的特点是皮肤硬化；这可能是由活动性炎性过程诱导的。硬皮病可以是局部的或系统性的；血管损伤是普遍的，而且微血管系统中的内皮细胞损伤是系统性硬化形成中的早期且重要的事件；血管损伤可能由免疫介导。皮肤损伤中存在单个核细胞浸润物及在许多患者中存在抗核抗体暗示免疫学基础。ICAM-1常常在皮肤损伤中成纤维细胞的细胞表面上调，提示T细胞与这些细胞相互作用可能在疾病的发病机理中起作用。牵涉的其它器官包括：胃肠道：平滑肌萎缩和纤维化，导致异常蠕动/运动；肾：同中心内皮下内膜增生，影响小弓形和叶间动脉，从而降低肾皮质血流，导致蛋白尿、氮血症和高血压；骨骼肌：萎缩、间质性纤维化；炎症；肺：间质性肺炎和间质性纤维化；及心：收缩带坏死、疤痕化/纤维化。
特发性炎性肌病，包括皮肌炎、多肌炎和其它，是导致肌肉软弱的未知病因的慢性肌肉炎性病症。肌肉损伤/炎症常常是对称的和渐进的。自身抗体与大多数形式有关。这些肌炎特异性自身抗体针对并抑制参与蛋白质合成的成分、蛋白质和RNA的功能。
斯耶格伦氏
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综合征是由免疫介导的炎症及随后泪腺和唾液腺功能破坏引起的。该病可能与炎性结缔组织疾病有关或伴随着炎性结缔组织疾病。该病与针对Ro和La抗原的自身抗体生成有关，这两种抗原都是小RNA-蛋白质复合物。损害导致干燥性角膜结膜炎、口干燥、及其它表现或关联，包括胆汁性肝硬化、外周或感觉神经病、和可触知的紫癜。
系统性血管炎包括这样的疾病，其中原发性损伤是炎症，后续对血管的损伤导致由受影响血管供应的组织缺血/坏死/变性，且在有些情况中最终导致终端器官功能障碍。血管炎病还可作为其它免疫-炎症介导疾病诸如类风湿性关节炎、系统性硬化等的继发损伤或后遗症发生，特别是在也与免疫复合物形成有关的疾病中。原发性系统性血管炎组中的疾病包括：系统性坏死性血管炎：结节性多动脉炎、过敏性血管炎和肉芽肿病、多脉管炎；韦格纳氏(Wegener)肉芽肿病；淋巴瘤样肉芽肿病；和巨细胞性动脉炎。各种各样的血管炎病包括：粘膜与皮肤淋巴结综合征(MLNS或川畸氏(Kawasaki)病)、分离的CNS血管炎、贝切特氏(Behet)病、血栓闭塞性血管炎(伯格氏(Buerger)病)和皮肤坏死性小静脉炎。所列大多数类型的血管炎的发病机理认为主要是由于免疫球蛋白复合物在血管壁中沉积及随后经ADCC、补体活化或者两者诱导的炎性应答。
结节病是病因学未知，特征在于几乎机体任何组织中都存在上皮样肉芽肿的疾患；最常见的是牵涉肺。发病机理牵涉患病部位持续存在活化的巨噬细胞和淋巴样细胞及随后由这些细胞类型释放局部和系统性活性产物而导致的慢性后遗症。
自身免疫性溶血性贫血，包括自身免疫性溶血性贫血、免疫性全血细胞减少症和阵发性夜间血红蛋白尿，是由于生成与红细胞(在有些情况中还有其它血细胞，包括血小板)表面表达的抗原反应的抗体的结果，是经补体介导的溶解和/或ADCC/Fc受体介导的机制清除那些抗体包被细胞的反映。
在自身免疫性血小板减少症，包括血小板减少性紫癜，和其它临床背景中免疫介导的血小板减少症中，由于抗体或补体附着于血小板及随后经补体溶解、ADCC或Fc受体介导的机制进行消除而发生血小板破坏/消除。
甲状腺炎，包括格雷夫斯氏(Graves)病、桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎、幼年型淋巴细胞性甲状腺炎和萎缩性甲状腺炎，是由于针对甲状腺抗原的自身免疫应答及产生与存在于甲状腺中且通常对甲状腺特异的蛋白质反应的抗体。现有的实验模型包括自发性模型：大鼠(BUF和BB大鼠)和鸡(肥胖鸡品系)；诱导型模型：用甲状腺球蛋白、甲状腺微粒体抗原(甲状腺过氧化物酶)免疫动物。
I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病是胰岛β细胞的自身免疫性破坏；该破坏由自身抗体和自身反应性T细胞介导。针对胰岛素或胰岛素受体的抗体也可产生胰岛素不响应的表型。
免疫介导的肾病，包括肾小球肾炎和肾小管间质性肾炎，是由于抗体或T淋巴细胞介导的对肾组织的损伤，或是直接由于生成针对肾抗原的自身反应性抗体或T细胞，或是间接由于针对其它非肾抗原有反应性的抗体和/或免疫复合物在肾中沉积。如此，导致免疫复合物形成的其它免疫介导的疾病也可诱导免疫介导的肾病作为间接后遗症。直接和间接的免疫机制都导致炎性应答，该应答在肾组织中产生/诱导损伤形成，导致器官功能受损，在有些情况中发展成肾衰竭。体液和细胞两种免疫机制都可参与损伤的发病机理。
中枢和周围神经系统的脱髓鞘病，包括多发性硬化；特发性脱髓鞘多神经病或格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征；和慢性炎性脱髓鞘多神经病，认为具有自身免疫基础，而且由于对少突胶质细胞或对髓鳞脂直接造成损害而导致神经脱髓鞘。在MS中，有证据提示该病的诱导和进展依赖T淋巴细胞。多发性硬化是依赖T淋巴细胞的脱髓鞘病，而且具有复发-缓和过程或漫长的渐进过程。病因未知；然而，病毒感染、遗传素因、环境和自身免疫性都会起作用。损伤含有主要由T淋巴细胞介导的浸润物、小胶质细胞和浸润的巨噬细胞；CD4+T淋巴细胞是损伤处的主要细胞类型。少突胶质细胞死亡和随后脱髓鞘的机理未知，但是可能是由T淋巴细胞驱动的。
炎性和纤维化肺病，包括嗜曙红细胞性肺炎；特发性肺纤维化和超敏感性肺炎，可能涉及不受调控的免疫-炎症应答。抑制该应答会具有治疗益处。
自身免疫或免疫介导的皮肤病，包括大疱性皮肤病、多形性红斑和接触性皮炎，由自身抗体介导，其发生依赖T淋巴细胞。
银屑病是T淋巴细胞介导的炎性疾病。损伤含有T淋巴细胞、巨噬细胞和抗原加工细胞，及一些嗜中性粒细胞的浸润物。
变应性疾病，包括哮喘；变应性鼻炎；特应性皮炎；食物超敏感性；和荨麻疹，依赖T淋巴细胞。这些疾病主要由T淋巴细胞诱导的炎症、IgE介导的炎症或二者组合介导。
移植相关疾病，包括移植物排斥和移植物抗宿主病(GVHD)，依赖T淋巴细胞；抑制T淋巴细胞功能具有改善作用。
本发明的C3b拮抗剂诸如C3b抗体对于补体相关眼疾(病理牵涉补体(包括经典途径和旁路途径，特别是补体旁路途径)的所有眼疾和眼病)的预防和治疗也是有用的，诸如例如黄斑变性性疾病，诸如所有阶段的年龄相关黄斑变性(AMD)(包括干性和湿性(非渗出性和渗出性)形式)，脉络膜新血管形成(CNV)，葡萄膜炎，糖尿病性和其它缺血相关视网膜病变，眼内炎，和其它眼内新血管疾病，诸如糖尿病性黄斑水肿，病理性近视，vonHippel-Lindau病，眼的组织胞浆菌病，视网膜中央静脉阻塞(CRVO)，角膜新血管形成，和视网膜新血管形成。一组优选的补体相关眼疾包括年龄相关黄斑变性(AMD)(包括渗出性(湿性)和非渗出性(干性或萎缩性)AMD)、脉络膜新血管形成(CNV)、糖尿病性视网膜病变(DR)、和眼内炎。
AMD，即年龄相关黄斑变性，是60岁以上个体中不可逆的视功能障碍的首要原因。有两类AMD，即非渗出性(干性)和渗出性(湿性)AMD。干性或渗出性形式涉及中央视网膜(黄斑)下面的视网膜色素上皮(RPE)的萎缩性和肥大性变化，以及RPE上的沉积物(玻璃疣)。非渗出性AMD患者可发展成湿性或渗出性AMD，其中称作脉络膜新血管膜(CNVM)的异常血管在视网膜下面形成，渗漏液体和血液，并最终在视网膜中和在视网膜下引起失明性盘状瘢痕。非渗出性AMD(通常是渗出性AMD的前身)更加常见。非渗出性AMD的表现有所不同；可存在硬玻璃疣、软玻璃疣、RPE地理性萎缩、和色素聚团。补体成分在AMD早期在RPE上沉积，而且是玻璃疣的主要组分。
本发明具体关注高危(high risk)AMD的治疗，包括第3类和第4类AMD。第3类AMD的特征在于双眼都不存在晚期AMD，至少一只眼具有20/32或更好的视力及至少一粒大的玻璃疣(例如125μm)、广泛的(通过玻璃疣面积来测量)中间体玻璃疣、或不牵涉黄斑中心的地理性萎缩(GA)、或这些的任意组合。第3类AMD(仍视为“干性”AMD)有高风险转化成脉络膜新血管形成(CNV)。
第4类高危AMD(分类为“湿性”AMD)的特征在于视力为20/32或更好及指标眼(index eye)中没有晚期AMD(牵涉黄斑中心的GA或脉络膜新血管形成的特征)。对侧眼的特征在于晚期AMD，或视力低于20/32，这可归于AMD黄斑病变。典型的是，如果不治疗的话，高危AMD迅速进展成脉络膜新血管形成(CNV)，其速率比第1类或第2类(非高危)AMD的进展速率高大约10-30倍。
C3b拮抗剂还可用于预防AMD(特别是第3类或第4类AMD)进展成CNV，和/或在未受影响的或受影响较小的对侧眼中预防AMD或CNV的发生/进展。在此语境中，术语“预防”以最广义使用，包括完全或部分阻断和减缓疾病的进展，以及延迟疾病更严重形式的发作。处于发生或进展成高危(第4类)AMD或CMV高风险的患者尤其受益于本发明的这个方面。
已知补体因子H(CFH)多态性与个体发生AMD和/或CNV的风险有关。CFH中的突变能活化补体，继而可导致AMD/CNV。最近有报告，补体因子H(CFH)多态性占到AMD可归因风险的50％(Klein et al.，Science 308：385-9(2005))。已经发现，CFH中的一种常见单体型(HF1/CFH)使个体易患年龄相关黄斑变性(Hageman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，102(2)：7227-7232(2005))。已经将AMD分离成常染色体显性性状，疾病基因座定位至染色体1q25-q31，在标志物D1S466与D1S413之间，最大优势对数计分(maximum lode score)为约3.20(Klein et al.，Arch Opthalmol.116(8)：1082-9(1998)；Majewski et al.，Am.J.Hum.Genet.73(3)：540-50(2003)；Seddon et al.，Am.J.Hum.Genet.73(4)：780-90(2003)；Weeks et al.，Am.J.Ophthalmol.132(5)：682-92(2001)；Iyengar et al.，Am.J.Hum.Genet.74(1)：20-39(2004))；染色体2q3/2q32，在标志物D12S1391与D2S1384之间，最大优势对数计分为2.32/2.03(Seddon et al.，supra)；3p13，在标志物D12S1300与D12S1763之间，最大优势对数计分为2.19(Majewski et al.，supra；Schick et al.，Am.J.Hum.Genet.72(6)：1412-24(2003))；6q14，在标志物D6S1056与DS249之间，最大优势对数计分为3.59/3.17(Kniazeva et al.，Am.J.Ophthlmol.130(2)：197-202(2000))；9q33，在标志物D9S934处，最大优势对数计分为2.06(Mejwski et al.，supra)；10q26，在标志物D10S1230处，最大优势对数计分为3.06(Majewski et al.，supra；Iyengar et al.，supra；Kenealy et al.，Mol.Vis.10：57-61(2004))；17q25，在标志物D17S928处，最大优势对数计分为3.16(Weeks et al.，supra)；和22q12，在标志物D22S1045处，最大优势对数计分为2.0(Seddon et al.，supra)。因而，遗传筛选是鉴定对于预防性治疗(包括预防疾病进展成更严重的形式，诸如从AMD进展成CNV)而言是特别好的候选者的患者的一个重要部分。
C3b抗体的制备和选择
本发明包括识别C3b而非其无活性前体C3的抗体的生产和应用。产生抗体的示例性方法在以下章节中有更详细的描述。
用衍生自哺乳动物物种的C3b多肽选出抗C3b抗体。所述多肽优选是人C3b。然而，来自其它物种的C3b多肽，诸如小鼠C3b，也可用作靶抗原。来自各种哺乳动物物种的C3b抗原可分离自天然来源。在其它实施方案中，抗原是重组生产的或者是利用本领域已知的其它合成方法而制备的。
所选的抗体通常会具有足够强的针对C3b抗原的结合亲和力。例如，所述抗体结合人C3b的Kd值可不超过约5nM，优选不超过约2nM，而更优选不超过约500pM。例如，抗体亲和力可由基于表面等离振子共振的测定法(如实施例所述的BIAcore测定法)；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争测定法(如RIA的)来测定。
而且，抗体可进行其它生物学活性测定法，如，用以评估其作为治疗剂的有效性。此类测定法是本领域已知的，而且依赖于靶抗原和抗体的预定用途。实例包括HUVEC抑制测定法(如下文实施例所述的)；及下文关于鉴定选择性阻断旁路途径并在至少一种补体相关病症的预防和/或治疗中显示活性的抗体描述的体外和体内测定法。
为了筛选结合感兴趣抗原上的特定表位的抗体，可进行常规的交叉阻断测定法，诸如如Antibodis，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Ed Harlow和David Lane(1988)所述的。另外，可进行表位作图，例如如Champe等(1995)J.Biol.Chem.270：1388-1394所述的，来确定抗体是否结合感兴趣表位。
在一个优选的实施方案中，利用独特的噬菌体展示法来选择抗C3b抗体。该方法包括产生基于单个框架模板的合成人抗体噬菌体文库，设计可变域内的足够的多样性，展示具有多样化可变域的多肽，并选择对靶C3b抗原具有高亲和力的候选抗体。对编码选择性阻断C3b而非C3的C3b特异性噬菌体的富集可通过例如用饱和量的C3封闭来实现，如下文实施例中所描述的。
噬菌体展示方法的详情可在例如2003年12月11日公布的WO03/102157中找到。
在一个方面，抗体文库可通过在抗体可变域的至少一个CDR中突变溶剂可及的和/或高度多变的位置来产生。一些或所有CDR可用本文提供的方法来突变。在一些实施方案中，优选突变CDRH1、CDRH2和CDRH3中的位置以形成单个文库或突变CDRL3和CDRH3中的位置以形成单个文库或突变CDRL3和CDRH1、CDRH2和CDRH3中的位置以形成单个文库，由此产生多样的抗体文库。
例如，可产生这样的抗体可变域文库，其在CDRH1、CDRH2和CDRH3中溶剂可及的和/或高度多变的位置上有突变。可产生这样的另一种文库，其在CDRL1、CDRL2和CDRL3中有突变。这些文库也可互相组合使用以产生具有期望亲和力的结合物。例如，在对重链文库进行一轮或多轮对靶抗原结合的选择后，可将轻链文库替换入重链结合物群中，用以在进一步轮次的选择中提高结合物的亲和力。
文库优选通过用重链序列可变区CDRH3区中的变异氨基酸替代原始氨基酸来产生。所得文库可包含多种抗体序列，其中序列多样性主要位于重链序列的CDRH3区中。
在一个方面，所述文库在人源化抗体4D5序列、或人源化抗体4D5序列的框架氨基酸序列的背景中产生。所述文库优选通过用DVK密码子集编码的氨基酸至少替代重链残基95-100a来产生，其中DVK密码子集用于编码这些位置中每一个位置的变异氨基酸集。可用于产生这些替代的寡核苷酸集的一个例子包含序列(DVK)7。在一些实施方案中，文库通过用DVK和NNK两种密码子集编码的氨基酸替代残基95-100a来产生。可用于产生这些替代的寡核苷酸集的一个例子包含序列(DVK)6(NNK)。在另一个实施方案中，文库通过用DVK和NNK两种密码子集编码的氨基酸替代残基95-100a来产生。可用于产生这些替代的寡核苷酸集的一个例子包含序列(DVK)5(NNK)。可用于产生这些替代的寡核苷酸集的另一个例子包含序列(NNK)6。根据本文所述标准，本领域技术人员能确定合适寡核苷酸序列的其它例子。
在另一个实施方案中，利用不同的CDRH3设计来分离高亲和力结合物和分离针对各种表位的结合物。该文库中产生的CDRH3的长度范围是11至13个氨基酸，尽管也可产生不同于此的长度。通过使用NNK、DVK和NVK密码子集能拓展H3多样性，以及在N和/或C-末端处的较有限的多样性。
CDRH1和CDRH2中也可产生多样性。CDR-H1和H2多样性的设计遵循目标为模拟所述带有如下修饰的天然抗体全集的策略，所述修饰使多样性较前述设计更紧密地与天然多样性相匹配。
对于CDRH3中的样性，可分开构建多个文库，它们具有不同长度的H3，然后组合起来以选择针对靶抗原的结合物。合并多个文库并用前述和本文下述的固体支持物选择和溶液分选法来选择。可采用多种分选策略。例如，一种变化涉及在结合至固相的靶物上分选，接着分选可能在融合多肽上存在的标签(例如抗gD标签)，接着再一次在结合至固相的靶物上分选。或者，文库可首先在结合至固相表面的靶物上选择，然后用靶抗原浓度逐渐减低的溶液相结合来分选所洗脱的结合物。利用不同分选方法的组合能实现最低限度地只选择高度表达的序列并能实现选择许多不同的高亲和力克隆。
针对靶C3b抗原的高亲和力结合物可自文库分离。限制H1/H2区中的多样性将简并性降低约104至105倍，而且允许更多H3多样性能得到更多高亲和力结合物。利用在CDRH3中具有不同类型多样性(例如利用DVK或NVT)的文库能实现分离可与靶抗原的不同表位结合的结合物。
在另一个实施方案中，产生在CDRH1、CDRH2和CDRH3区中具有多样性的一个或多个文库。在该实施方案中，用各种长度的H3区并主要用密码子集XYZ和NNK或NNS来产生CDRH3中的多样性。用各寡核苷酸形成文库并合并，或者合并寡核苷酸来形成文库子集。该实施方案的文库可针对结合至固相的靶物进行分选。分离自多次分选的克隆可利用ELISA测定法来筛选特异性和亲和力。对于特异性，克隆可以针对期望靶抗原以及其它非靶抗原进行筛选。然后，在溶液结合竞争ELISA测定法或点竞争测定法中对那些针对靶C3b抗原的结合物筛选亲和力。可以用如上所述制备的XYZ密码子集自文库分离高亲和力结合物。可容易地在细胞培养中以高产率将这些结合物制备成抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，可能希望产生在CDRH3区长度方面具有更大多样性的文库。例如，可能希望产生CDRH3区的范围为约7至19个氨基酸的文库。
自这些实施方案的文库分离的高亲和力结合物可容易地在细菌和真核细胞培养中以高产率产生。可设计载体以容易地去除如下序列诸如gD标签、病毒外壳蛋白成分序列，和/或添加恒定区序列来实现高产率地产生全长抗体或抗原结合片段。
可以将CDRH3中有突变的文库与包含变异型式的其它CDR(例如CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1和/或CDRH2)的文库组合。如此，例如，在一个实施方案中，将CDRH3文库与CDRL3文库组合，所述CDRL3文库用预先确定的密码子集在第28、29、30、31、和/或32位有变异氨基酸的人源化4D5抗体序列的背景中产生。在另一个实施方案中，将CDRH3有突变的文库与包含变异CDRH1和/或CDRH2重链可变域的文库组合。在一个实施方案中，CDRH1文库用第28、30、31、32和33位有变异氨基酸的人源化抗体4D5序列产生。CDRH2文库可用预先确定的密码子集用第50、52、53、54、56和58位有变异氨基酸的人源化抗体4D5序列产生。
可进一步修饰自噬菌体文库产生的抗C3b抗体以产生抗体突变体，所述突变体具有比亲本抗体改善了的物理、化学和/或生物学特性。若所使用的测定法是生物学活性测定法，则优选抗体突变体在所选测定法中的生物学活性比亲本抗体在该测定法中的生物学活性好至少约10倍，优选好至少约20倍，更优选好至少约50倍，有时好至少约100倍或200倍。例如，优选抗C3b抗体突变体针对C3b的结合亲和力比亲本抗C3b抗体(诸如抗体S77)的结合亲和力强至少约10倍，优选强至少约20倍，更优选强至少约50倍，有时强至少约100倍或200倍。
为了产生抗体突变体，将一处或多处氨基酸改变(例如替代)引入亲本抗体的一个或多个高变区。或者/另外，可将框架区残基的一处或多处改变(例如替代)引入亲本抗体，这些改变导致抗体突变体针对来自第二哺乳动物物种的抗原的结合亲和力有所改善。要修饰的框架区残基的实例包括那些直接非共价结合抗原的(Amit等(1986)Science 233：747-753)；与CDR相互作用的/影响CDR构象的(Chothia等(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)；和/或参与VL-VH界面的(EP 239 400B1)。在某些实施方案中，对一个或多个此类框架区残基的修饰导致抗体针对来自第二哺乳动物物种的抗原的结合亲和力有所增强。例如，在本发明的该实施方案中，可改变约1个至约5个框架残基。有时，这可足以产生适合在临床前试验中使用的抗体突变体，甚至其中没有高变区残基被改变。然而，通常，抗体突变体会包含别的高变区改变。
所改变的高变区残基可以是随机改变的，尤其是在亲本抗体的起始结合亲和力使得此类随机产生的抗体突变体能被容易地筛选出来的情况中。
用于生成此类抗体突变体的一种有用方法称作“丙氨酸扫描诱变”(Cunningham and Wells(1989)Science 244：1081-1085)。这里，一个或多个高变区残基用丙氨酸或多丙氨酸残基替代，以影响氨基酸与来自第二哺乳动物物种的抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它突变，推敲那些对替代展现出功能敏感性的高变区残基。如此，虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但是突变本身的性质不需要预先决定。如本文所述对如此生成的丙氨酸突变体筛选它们的生物学活性。
通常，从保守替代诸如下文显示在标题“优选替代”下的那些开始。如果此类替代导致生物学活性(例如结合亲和力)的改变，那么可以引入下表中称为“例示替代”的更实质性改变，或如下文中关于氨基酸种类的进一步描述，并筛选产物。下表中列出了优选的替代。
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Figure GPA00001021350400301
对抗体生物学特性的甚至更实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的替代来实现：(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。基于共同的侧链特性，将天然存在残基如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
(2)中性、亲水性的：cys、ser、thr、asn、gln；
(3)酸性的：asp、glu；
(4)碱性的：his、lys、arg；
(5)影响链取向的残基：gly、pro；及
(6)芳香族的：trp、tyr、phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的一个成员替换另一个类别的。
在另一个实施方案中，利用噬菌体展示(见上)，对为修饰而选择的位点进行亲和力成熟。
编码氨基酸序列突变体的核酸分子通过本领域已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于对早先制备的突变或非突变型式的亲本抗体的寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变、和盒式诱变。制备突变体的优选方法是定点诱变(参见例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488)。
在某些实施方案中，抗体突变体仅有单个高变区残基被替代。在其它实施方案中，有亲本抗体的两个或更多个高变区残基被替代，例如约2个至约10个高变区替代。
通常，生物学特性得到改善的抗体突变体所具有的氨基酸序列与亲本抗体重链或轻链任一可变域的氨基酸序列有至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，和最优选至少95％的氨基酸序列同一性或相似性。关于此序列的同一性或相似性在本文中定义为在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，候选序列中与亲本抗体残基相同(即相同残基)或相似(即根据共同侧链特性来自同一组的氨基酸残基，见上文)的氨基酸残基的百分比。N-末端、C-末端、或内部的延伸、删除、或插入可变域以外的抗体序列都不应视为影响序列同一性或相似性。
产生抗体突变体后，测定该分子相对于亲本抗体的生物学活性。如上所示，这可包括测定抗体的结合亲和力和/或其它生物学活性。在本发明的一个优选实施方案中，制备一组抗体突变体并筛选针对抗原(诸如C3b或其片段)的结合亲和力。任选将该初始筛选中选出的一个或多个抗体突变体进行一种或多种其它生物学活性测定法以确证结合亲和力增强的抗体突变体是真正有用的，例如可用于临床前研究。
这样选出的抗体突变体可进一步修饰，这常常取决于抗体的预期用途。此类修饰可包括进一步改变氨基酸序列，融合异源多肽和/或共价修饰，诸如下文所详述的那些。对于氨基酸序列改变，示例性的修饰上文有详述。例如，也可替代任何不涉及保持抗体突变体正确构象的半胱氨酸残基，一般替代为丝氨酸，用以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反地，可向抗体中添加半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是在抗体是抗体片段，诸如Fv片段时)。另一类氨基酸突变体具有改变的糖基化样式。这可通过删除抗体中发现的一个或多个碳水化合物模块和/或增加不存在于抗体中的一个或多个糖基化位点来实现。抗体糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸，是碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，多肽中存在这些三肽序列之任一产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖之一附着于羟基氨基酸(最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸)。在抗体上增加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使之包含一个或多个上述的三肽序列来方便地实现(用于N-连接的糖基化位点)。也可在原始抗体序列中通过添加、或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来产生改变(用于O-连接的糖基化位点)。
下文实施例中提供了通过噬菌体展示进行的C3b抗体制备、选择、富集和亲和力成熟的进一步详情。
C3b抗体的重组生产
本发明的抗C3b抗体可使用易于得到的技术和材料而重组生产。
为了重组生产抗C3b抗体，分离编码它的核酸，并插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。编码抗体的DNA易于使用常规规程分离或合成(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的DNA特异性结合的寡核苷酸探针)。可以获得许多载体。载体构件通常包括但不限于下列一项或多项：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。
(1)信号序列构件
本发明的抗体不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽而重组生产，所述异源多肽优选是成熟蛋白质或多肽的N-末端处的信号序列或具有特异性切割位点的其它多肽。所选择的异源信号序列优选是受到宿主细胞识别并加工(即受到信号肽酶切割)的。对于不识别和加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞，所述信号序列用例如选自碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列取代。为了酵母分泌，天然信号序列可以用例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括糖酵母属和克鲁维氏酵母属α因子前导序列)、酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母葡萄糖淀粉酶前导序列、或WO 90/13646中记载的信号取代。在哺乳动物细胞表达中，可以利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导，例如单纯疱疹gD信号。将此类前体区(precursor region)的DNA以符合读码框的方式与编码抗体的DNA连接。
(2)复制起点构件
表达和克隆载体都包含使载体能够在一种或多种所选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这种序列是使载体能够不依赖于宿主染色体DNA而复制的序列，包括复制起点或自主复制序列。众所周知多种细菌、酵母和病毒的此类序列。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件(SV40起点的使用通常可能只是因为它包含早期启动子)。
(3)选择基因构件
表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补足营养缺陷型的缺陷；或(c)提供不能自复合培养基获得的必需营养物，例如用于芽孢杆菌的编码D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个例子利用药物来阻滞宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，如此幸免于选择方案。此类显性选择的例子使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个例子是那些能够鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II(优选灵长类金属硫蛋白基因)、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx)(DHFR的一种竞争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
或者，可以通过细胞在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中的生长来选择经编码抗体、野生型DHFR蛋白质、和另一种选择标志诸如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参阅美国专利No.4,965,199。
适用于酵母的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb et al.(1979)Nature 282：39)。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株，例如ATCC No.44076或PEP4-1提供了选择标志。Jones(1977)Genetics 85：12。酵母宿主细胞基因组中存在trp1损伤随之提供了用于通过在缺少色氨酸时的生长来检测转化的有效环境。类似的，用携带Leu2基因的已知质粒补足Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)。
此外，衍生自1.6μm环状质粒pKD1的载体可用于转化克鲁维氏酵母属酵母。或者，报导了用于在乳酸克鲁维氏酵母中大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统。Van den Berg(1990)Bio/Technology 8：135。还披露了用于由克鲁维氏酵母属的工业用菌株分泌成熟重组人血清清蛋白的稳定多拷贝表达载体。Fleer et al.(1991)Bio/Technology 9：968-975。
(4)启动子构件
表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，而且它与抗体核酸可操作连接。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac启动子。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还会包含与编码抗体的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游大约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处找到的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3′端添加聚腺苷酸尾的信号。将所有这些序列合适的插入真核表达载体。
适用于酵母宿主的启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。
作为具有通过生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步记载于EP 73,657。酵母增强子也可以有利的与酵母启动子一起使用。
在哺乳动物宿主细胞中由载体转录抗体受到例如从病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和最优选的猿病毒40(SV40)基因组，从异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，及从热休克启动子获得的启动子的控制，倘若此类启动子与宿主细胞系统相容的话。
方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIIIE限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利No.4,419,446中披露了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利No.4,601,978中记载了该系统的一种改良。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参见Reyes et al.(1982)Nature 297：598-601。或者，可以使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
(5)增强子元件构件
常常通过将增强子序列插入载体来提高高等真核细胞对编码本发明抗体的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常会使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv(1982)Nature297：17-18。可以将增强子剪接到载体中，位于抗体编码序列的5′或3′位置，但是优选位于启动子的5′位点。
(6)转录终止构件
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还会包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA的5′端和偶尔的3′端非翻译区获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO 94/11026及其中披露的表达载体。
(7)宿主细胞的选择和转化
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核生物细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌/大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446)，尽管其它菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些例子是例示性的，而不是限制性的。
在原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。啤酒糖酵母/酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常用的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。然而，通常可获得许多其它属、种和菌株且可用于本发明，诸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，诸如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
适于表达糖基化抗体的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾Spodoptera frugiperda(毛虫)、埃及伊蚊Aedes aegypti(蚊子)、白纹伊蚊Aedes albopictus(蚊子)、黑腹果蝇Drosophila melanogaster(果蝇)和家蚕Bombyx mori等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖Autographa californica NPV的L-1变体和家蚕Bombyx mori NPV的Bm-5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。还可利用棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物作为宿主。
然而，脊椎动物细胞得到最多关注，而且培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规规程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham et al.(1977)J.Gen Virol.36：59)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub etal.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4，Mather(1980)Biol.Reprod.23：243-251)；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather et al.(1982)Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。
用上文所述用于生产抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当更改的常规营养培养基中进行培养。
(8)培养宿主细胞
可以在多种培养基中培养用于生产本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham et al.(1979)Meth.Enz.58：44；Barnes et al.(1980)Anal.Biochem.102：255；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件，诸如温度、pH等，就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。
(9)抗体的纯化
在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，通过例如离心或超滤除去宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter et al.(1992)Bio/Technology 10：163-167记载了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的规程。简单的说，在存在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)时使细胞糊融化约30分钟。可通过离心除去细胞碎片。如果将抗体分泌到培养基中，那么一般首先使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或MilliporePellicon超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化自细胞制备的抗体组合物，优选的纯化技术是亲和层析。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark et al.(1983)，J.Immunol.Meth.62：1-13)。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss et al.(1986)EMBO J.5：1567-1575)。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀。
在任何预备性纯化步骤后，包含感兴趣抗体和污染物的混合物可进行低pH疏水相互作用层析，使用pH大约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度进行(例如大约0-0.25M盐)。
用于鉴定C3b抗体和其它C3b拮抗剂的筛选测定法和动物模型
可以在多种基于体外和体内测定法中对C3b抗体和其它C3b拮抗剂评估它们选择性抑制旁路补体途径及预防和治疗补体相关病症的能力。
实施例中描述了体外测定法，诸如结合测定法和竞争性结合测定法、溶血测定法。
可以在有关动物模型中测试本文中C3b拮抗剂诸如C3b抗体的体内治疗活性。如此，例如，重组(转基因)动物模型可使用用于生成转基因动物的标准技术通过将感兴趣基因的编码部分导入感兴趣动物的基因组来改造。可充当转基因操作对象的动物包括但不限于小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、绵羊、山羊、猪和非人灵长类，例如狒狒、黑猩猩和其它猴。本领域已知的用于将转基因导入此类动物中的技术包括原核显微注射(pronucleic microinjection)(Hoppe和Wanger，美国专利No.4,873,191)；逆转录病毒介导的基因转移进入种系中(例如Van der Putten等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：6148-615(1985))；胚胎干细胞中的基因寻靶(Thompson等，Cell，56：313-321(1989))；胚胎电穿孔(Lo，Mol.Cel.Biol.，3：1803-1814(1983))；精子介导的基因转移(Lavitrano等，Cell，57：717-73(1989))。综述参见例如美国专利No.4,736,866。
为了本发明的目的，转基因动物包括那些只在其部分细胞中携带转基因的动物(“镶嵌动物”)。转基因可作为单一转基因或者串联物例如头-头或头-尾串联物整合。通过遵循例如Lasko等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：6232-636(1992)的技术，还可能将转基因选择性导入特定细胞类型中。
转基因在转基因动物中的表达可通过标准技术来监测。例如，Southern印迹分析或PCR扩增可用于验证转基因的整合。然后可使用诸如原位杂交、Northern印迹分析、PCR、或免疫细胞化学的技术分析mRNA表达水平。
动物可进一步检验免疫病病理学的征候，例如通过组织学检验以测定免疫细胞进入特定组织中的浸润。
重组(转基因)动物模型可使用用于生成转基因动物的标准技术通过将感兴趣基因的编码部分导入感兴趣动物的基因组来改造。可充当转基因操作对象的动物包括但不限于小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、绵羊、山羊、猪和非人灵长类，例如狒狒、黑猩猩和其它猴。本领域已知的用于将转基因导入此类动物中的技术包括原核显微注射(pronucleic microinjection)(Hoppe和Wanger，美国专利No.4,873,191)；逆转录病毒介导的基因转移进入种系中(例如Vander Putten等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：6148-615(1985))；胚胎干细胞中的基因寻靶(Thompson等，Cell，56：313-321(1989))；胚胎电穿孔(Lo，Mol.Cel.Biol.，3：1803-1814(1983))；精子介导的基因转移(Lavitrano等，Cell，57：717-73(1989))。综述参见例如美国专利No.4,736,866。
在预防和/或治疗关节炎中的功效可在例如胶原诱发的关节炎模型(Terato et al.Brit.J.Rheum.35：828-838(1966))中评估。潜在的关节炎预防剂/治疗剂还可在通过静脉内注射四种单克隆抗体的混合物诱发的抗体介导的关节炎模型中筛选，如Terato et al.，J.Immunol.148：2103-8(1992)；及Terato et al.，Autoimmunity 22：137-47(1995)所述。用于预防和/或治疗关节炎的候选物还可在转基因动物模型中研究，诸如例如TNF-α转基因小鼠(Taconic)。这些动物表达人肿瘤坏死因子(TNF-α)，一种已经与人的类风湿性关节炎发病机制联系起来的细胞因子。TNF-α在这些小鼠中的表达导致前爪和后爪的严重慢性关节炎，提供了简单的炎性关节炎小鼠模型。
最近几年，还已开发出银屑病动物模型。如此，无皮脂(Asebia)(ab)、皮肤薄且易剥落(fsn)、和慢性增殖性皮炎(cpd)是具有银屑病样皮肤改变的自发性小鼠突变。皮肤过表达细胞因子，诸如干扰素-γ、白介素-1α、角质形成细胞生长因子、转化生长因子-α、干扰素-6、血管内皮生长因子或骨形态发生蛋白-6的转基因小鼠也可用于在体内研究银屑病和鉴定治疗银屑病的治疗剂。银屑病样损伤还描述于与PL/J品系回交的β2-整联蛋白亚效等位基因小鼠和β1-整联蛋白转基因小鼠、用CD4+/CD45RBhiT淋巴细胞重建的scid/scid小鼠、以及HLA-B27/hβ2m转基因大鼠。还知道使用人皮肤移植到免疫缺陷小鼠上的异种移植模型。如此，本发明的抗体和其它C3b拮抗剂可在Schon，M.P.et al，Nat.Med.3：183(1997)所述scid/scid小鼠模型中测试，其中小鼠展示与银屑病类似的组织病理学皮肤损伤。另一种合适的模型是如Nickoloff，B.J.et al.，Am.J.Path.146：580(1995)所述制备的人皮肤/scid小鼠嵌合物。更多详情参见例如Schon，M.P.，J Invest Dermatology 112：405-410(1999)。
已经记载了一种哮喘模型，其中通过用卵清蛋白使动物致敏，然后用通过气雾剂投递的相同蛋白质攻击动物而诱导抗原诱发的气道高反应性、肺嗜曙红细胞增多和炎症。数种动物模型(豚鼠、大鼠、非人灵长类)在用气雾剂抗原攻击后显示与人的特应性哮喘相似的症状。小鼠模型具有人哮喘的许多特征。测试CRIg和CRIg激动剂在治疗哮喘中的活性和效力的合适规程记载于Wolyniec，W.W.等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，18：777(1998)及其引用的参考文献。
接触超敏感性是细胞介导的免疫功能的一种简单的体内测定法。在此规程中，使表皮细胞暴露于外源半抗原，它引起迟发型超敏感性反应，对此测量和定量。接触敏感性牵涉初始敏化阶段，随后是引发阶段。引发阶段在表皮细胞遭遇它们先前已经接触过的抗原时发生。发生肿胀和炎症，使之成为人过敏性接触性皮炎的卓越模型。一种合适的规程详细记载于《CurrentProtocols in Immunology》，J.E.Cologan，A.M.Kruisbeek，D.H.Marglies，E.M.Shevach，和W.Strober编，John Wiley & Sons，Inc.，单元4.2(1994)。还可参见Grabbe，S.和Schwarz，T，Immun.Today，19(1)：37-44(1998)。
移植物抗宿主病在将有免疫能力的细胞移植到免疫抑制或耐受患者中时发生。供体细胞识别并应答宿主抗原。应答可从危及生命的严重炎症至腹泻和体重减轻的轻微病例变化。移植物抗宿主病模型提供了评估针对MHC抗原和次要移植物抗原的T细胞反应性的手段。一种合适的规程详细记载于《Current Protocols in Immunology》，见上文，单元4.3。
皮肤同种异体移植物排斥的动物模型是测试T细胞介导体内组织破坏的手段，这是T细胞在抗病毒和抗肿瘤免疫中的作用的指标和测量方法。最常用的和公认的模型使用鼠尾部皮肤移植物。重复实验显示了皮肤同种异体移植物排斥是由T细胞、辅助T细胞和杀伤-效应T细胞而非抗体介导的。Auchincloss，H.Jr.和Sachs，D.H.，《Fundamental Immunology》，第2版，W.E.Paul编，Raven Press，NY，1989，889-992。一种合适的规程详细记载于《CurrentProtocols in Immunology》，见上文，单元4.4。可用于测试CRIg和CRIg激动剂的其它移植物排斥模型有同种异基因心脏移植物模型，记载于Tanabe，M.等，Transplantation，58：23(1994)及Tinubu，S.A.等，J.Immunol.，4330-4338(1994)。
迟发型超敏感性的动物模型同样提供了细胞介导的免疫功能的测定法。迟发型超敏感性反应是T细胞介导的体内免疫应答，特征为在抗原攻击后一段时间流逝后才达到峰值的炎症。这些反应也在组织特异性自身免疫病中发生，诸如多发性硬化(MS)和实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE，MS的一种模型)。一种合适的规程详细记载于《Current Protocols in Immunology》，见上文，单元4.5。
EAE是T细胞介导的自身免疫病，特征为T细胞和单个核细胞炎症和随后中枢神经系统中轴突的脱髓鞘。EAE通常认为是人MS的相关动物模型。Bolton，C.，Multiple Sclerosis，1：143(1995)。急性的和复发-缓和型的这两种模型都已开发。CRIg及其激动剂和拮抗剂可针对免疫介导的脱髓鞘病测试T细胞刺激性或抑制性活性，使用《Current Protocols in Immunology》，见上文，单元15.1和15.2中所述方案。还可参见髓磷脂疾病的模型，其中将少突胶质细胞或施旺(Schwann)细胞移植到中枢神经系统中，如Duncan，I.D.等，Molec.Med.Today，554-561(1997)所述。
心肌缺血-再灌注的模型可在小鼠或大鼠中进行。将动物切开气管并用小型动物通风机换气。将聚乙烯导管置于颈内动脉和颈外静脉中供测量平均动脉血压。通过用6-O缝合线结扎左前降支动脉(LAD)来启动心肌缺血再灌注。缺血是通过扎紧围绕LAD的可逆结扎以完全闭塞血管而产生的。30分钟后除去结扎，并对心灌注4小时。CRIg和CRIg激动剂的功效可通过测量心脏梗塞大小、心肌氨酸激酶活性、髓过氧化物酶活性和使用抗C3抗体的免疫组织化学来测试。
糖尿病性视网膜病变的一种模型牵涉用链唑霉素(streptozotocin)处理小鼠或大鼠。可对CRIg和CRIg激动剂测试它们对视网膜和玻璃体腔微静脉膨胀(venule dilatation)、视网膜内微血管异常和新血管形成的影响。
膜性增生性肾小球肾炎的一种模型可如下确立：将雌性小鼠i.p.免疫CFA中的0.5mg对照家兔IgG(第-7天)。七天后(第0天)，经尾静脉i.v.注射1mg家兔抗小鼠肾小球基底膜(GBM)抗体。通过ELISA测量抗家兔IgG抗体在血清中的升高。自代谢笼中的小鼠收集24小时尿样，并通过在血液尿素氮之外测量尿蛋白来评估小鼠肾功能。
年龄相关黄斑变性(AMD)的动物模型由在Ccl-2或Ccr-2基因中具有无效突变的小鼠组成。这些小鼠形成AMD的主要特征，包括视网膜色素上皮(RPE)中脂褐素的积累和视网膜色素上皮(RPE)下玻璃疣、光感受器萎缩和脉络膜新血管形成(CNV)。这些特征在6月龄后形成。可以对CRIg和CRIg拮抗剂测试玻璃疣形成、光感受器萎缩和脉络膜新血管形成。
CNV可在激光诱发的脉络膜新血管形成的多种模型中测试。如此，例如，可在大鼠和猕猴中通过导致脉络膜新血管形成的强烈激光光凝固而诱导CNV。此状况的进展和治疗可例如通过荧光素血管造影术，组织病理学和免疫组织化学评估，及治疗前和治疗后以不同时间间隔自动物采集的血清的药动学、溶血、抗体筛选和补体活化测定法来评估。预防性施用的功效可通过类似方法来监测，包括通过荧光素血管造影术监测血管渗漏、激光烧伤部位对补体沉积的抑制、眼检查、眼摄影术、收集玻璃体和视网膜组织、等等。下文实施例提供了更多详情。
治疗方法
为了预防、治疗或降低补体相关病症的严重程度，本发明化合物的适宜剂量会取决于如上定义的待治疗病症的类型、病症的严重程度和进程、药剂是为了预防还是治疗目的施用的、先前的疗法、患者的临床史和对化合物的响应、及主治医师的判断。一次性或通过一系列治疗将化合物合适地施用于患者。优选的是，希望在人体测试前首先在体外，然后在有用的动物模型中测定本发明药物组合物的剂量-响应曲线。
例如，根据疾病的类型和严重程度，施用于患者的初始候选剂量是约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)抗C3b抗体或其它C3b拮抗剂，例如或是通过一次或多次分开施药或是通过连续输注。根据上述因素，典型日剂量的范围可以是约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于持续数天或更长的重复施药，根据状况，持续治疗直至疾病症状发生期望的抑制。然而，其它剂量方案也可能是有用的。这种疗法的进程易于通过常规技术和测定法来监测。
补体相关眼疾，诸如AMD或CNV的治疗功效可以通过评估眼内疾病时常用的多种终点来测量。例如，可评估视觉损失。视觉损失可通过但不限于例如下述各项来测量：测量最好矫正视力/视敏度(BCVA)自基线到预期时间点的均值变化(例如其中BCVA基于早期治疗糖尿病性视网膜病变研究(ETDRS)视力表和测试距离4米的评估)；测量在预期时间点与基线相比视力损失小于15个字母的受试者比例；测量在预期时间点与基线相比视力获得超过或等于15个字母的受试者比例；测量在预期时间点Snellen视力相当于20/2000或更差的受试者比例；测量NEI视觉功能问卷(Visual FunctioningQuestionnaire)；测量预期时间点CNV的大小和CNV渗漏的量，例如通过荧光素血管造影术评估；等。眼部评估可通过下述各项来进行，例如包括但不限于例如实施眼部检查，测量眼内压，评估视力(visual scuity)，测量裂隙灯压，评估眼内炎症，等。
药物组合物
可以以药物组合物的形式施用本发明的C3b抗体和其它C3b拮抗剂来治疗补体相关病症。
通过将具有期望纯度的活性分子与任选的药学可接受载体、赋形剂或稳定剂(《Remington′s Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编，1980)混合来制备本发明C3b抗体或其它拮抗剂的治疗用配制剂，供贮存，以冻干剂型或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂、或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖、二糖、和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
脂转染或脂质体也可用于将多肽、抗体、或抗体片段投递入细胞中。在使用抗体片段的情况中，优选特异性结合靶蛋白质的结合域的最小片段。例如，基于抗体的可变区序列，可设计保留结合靶蛋白质序列的能力的肽分子。此类肽可化学合成和/或通过重组DNA技术生成(参见例如Marasco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7889-7893(1993))。
活性分子还可包载入例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶状药物投递系统(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗滴乳状液。此类技术披露于《Remington′s Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编，1980。
要用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易地通过使用无菌滤膜过滤来实现。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)、及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化抗体在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换而形成分子间S-S键，那么可通过修饰巯基、自酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定化。
用于预防或治疗眼病或眼疾的本发明化合物通常通过眼部、眼内、和/或玻璃体内注射来施用。也可使用其它施用方法，包括但不限于表面、胃肠外、皮下、腹膜内、肺内、鼻内、和病变内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。
用于眼部、眼内或玻璃体内施用的配制剂可通过本领域已知方法和使用本领域已知成分来制备。有效治疗的一项主要要求是适当渗透穿过眼。与眼前部的疾病(在这种情况中药物可以表面投递)不同，视网膜疾病要求更加位点特异性的办法。滴眼剂和软膏剂很少渗透眼后部，而且血眼屏障妨碍系统性施用的药物渗透到眼组织中。因而，为了治疗视网膜疾病，诸如AMD和CNV而选择的药物投递方法通常是直接玻璃体内注射。玻璃体内注射通常要重复进行，时间间隔取决于患者的状况及所投递药物的特性和半衰期。为了眼内(例如玻璃体内)渗透，通常优选较小的分子。
提供下文实施例仅仅为了例示目的，而非意图以任何方式限制本发明的范围。
除非另有说明，实施例中提及的商品化试剂依照制造商的说明书使用。下文实施例和整篇说明书中以ATCC编号鉴别的那些细胞的来源是美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209)。
抗体氨基酸序列内的氨基酸残基是依照Kabat编号的(Kabat等，Sequences of proteins of immunological interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。使用的是单字母氨基酸缩写。使用IUB代码来代表DNA简并性(N＝A/C/G/T，D＝A/G/T，V＝A/C/G，B＝C/G/T， H＝A/C/T，K＝G/T，M＝A/C，R＝A/G，S＝G/C，W＝A/T，Y＝C/T)。
实施例1：自编码起始抗体高变区的噬菌体衍生的抗体
使用
Figure GPA00001021350400461
抗HER2抗体rhuMAB 4D5-8(Genentech，Inc.)VL和VH域的核酸序列(图18A和18B)作为起始序列来进行对HVR的诱变和对结合人C3b的结合的噬菌体选择。抗体4D5是对称作Her-2(erbB2)的癌症相关抗原特异性的人源化抗体。该抗体包括具有共有框架区的可变域，其中少数位置在提高人源化抗体亲和力的过程期间恢复成小鼠序列。人源化抗体4D5的序列和晶体结构已经记载于美国专利No.6,054,297，Carter et al.，PNAS89：4285(1992)，晶体结构显示于Carter等，J.Mol.Biol.229：969(1993)并在www/ncbi/nih/gov/structure/mmdb(MMDB#s-990-992)，通过述及明确将其完整内容收入本文。
Figure GPA00001021350400462
和VH域包含共有人κI VL域和人亚组III共有VH域变体。该变异VH域具有3处相对于人共有序列的变化：R71A，N73T和L78A。
用于此项工作的噬菌粒是单价Fab-g3展示载体(pV0350-2B)，其具有2个在phoA启动子控制下的可读框，基本上如Lee等，J.Mol.Biol.(2004)，340(5)：1073-93所记载的。第一可读框由stII信号序列融合至受体轻链VL和CH1域组成，而第二可读框由stII信号序列融合至受体重链VH和CH1域接着是截短的次要噬菌体外壳蛋白P3组成。参见Lee等，见上文。
通过重链HVR诱变生成的抗体
通过对huMAb 4D5-8(
Figure GPA00001021350400463
抗HER2抗体，Genentech，Inc.)重链HVR-H1、H2、和H3的诱变和针对人C3b融合蛋白的选择，生成Fab克隆YW144.2.43。在HVR-H1，Kabat位置26(G)、27(F)、28(T)、29(I)、34(I)、和35(H)保持不变，而改变位置30-33的氨基酸。在HVR-H2中，Kabat位置51(I)、52a(P)、55(G)、57(T)、59(Y)、60(A)、61(D)、62(S)、63(V)、64(K)、和65(G)保持不变，而改变位置49、50、52、53、54、56、和58。在HVR-H3中，Kabat位置93(A)和102(Y)保持不变，而改变位置94-100、100a-h、和101。YW144.2.43的轻链是改良的huMAb 4D5-8序列(在位置30、66和91处有修改)，其HVR在噬菌体选择期间没有改变。使用标准诱变技术，通过选定氨基酸位置的诱变，将序列多样性引入每个高变区。
噬菌体文库的生成
将为每个高变区设计的随机化寡核苷酸集合在六个20μl反应体系中分别磷酸化，所述20μlμl反应体系含有660ng寡核苷酸、50mM Tris pH7.5、10mM MgCl2、1mM ATP、20mM DTT、和5U多核苷酸激酶，于37℃温育1小时。然后将六个磷酸化寡核苷酸集合与20μg Kunkel模板在50mM TrispH7.5、10mM MgCl2中组合，终体积500μl，导致多核苷酸对模板的比率为3。将混合物退火，90℃4分钟，50℃5分钟，然后在冰上冷却。用QIAQU1CKTMPCR纯化试剂盒(Qiagen试剂盒28106)除去过量的、未退火的寡核苷酸，其中使用改良的方案以防止退火DNA的过度变性。向500μl退火混合物中添加150μl PB，并在2个硅土柱之间拆分混合物。用750μl PE清洗每个柱并额外旋转以干燥柱后，用110μl 10mM Tris、1mM EDTApH8洗脱每个柱。然后通过添加1μl100mM ATP、10μl 25mM dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP每种25mM)、15μl 100mM DTT、25μl 10X TM缓冲液(0.5M Tris pH7.5、0.1MMgCl2)、2400U T4连接酶、和30U T7聚合酶于室温3小时来补平经退火和清洁的模板(220μl)。
在Tris-乙酸盐-EDTA/琼脂糖凝胶(Sidhu et al.，Methods in Enzymology328：333-363(2000))上分析补平产物。通常可见三条带：底部的带是正确补平和连接的产物，中间的带是补平但未连接的产物，而顶部的带是链置换产物。顶部的带是由T7聚合酶的内在副活性生成的，而且难以避免(Lechner elal.，J.Biol.Chem.258：11174-11184(1983))；然而，此带的转化效率比底部的带低30倍，通常对文库贡献很小。中间的带是由于缺乏最终连接反应所需要的5′磷酸根；此带高效转化，而且主要给出野生型序列。
然后纯化补平产物并电穿孔入SS320细胞并在存在M13/KO7辅助噬菌体的情况中扩增，如Sidhu et al.，Methods in Enzymology 328：333-363(2000)所记载的。库容量范围为1-2×109个独立克隆。对来自初始文库的随机克隆测序以评估文库质量。
噬菌体选择
使用人C3b蛋白质作为选择抗原。将人C3b以PBS中的10μg/ml包被到MaxiSorp微量滴定板(Nunc)上并于4℃温育过夜。对于第1轮选择，使用12个孔的靶物。将孔用噬菌体封闭缓冲液(1％BSA、.05％Tween 20、PBS)于室温封闭1小时。自冷冻的甘油原种PEG沉淀噬菌体文库，重悬于噬菌体封闭缓冲液，并于室温温育1小时。然后将噬菌体文库添加至经封闭的抗原板，于室温温育过夜。结合过夜后，通过用清洗缓冲液(PBS、05％Tween 20)清洗，自抗原板洗去未结合的/非特异性的噬菌体。通过将孔与50mM HCl、0.5M KCl一起温育30分钟，洗脱结合的噬菌体。使用XL-1Blue细胞和M13/KO7辅助噬菌体扩增噬菌体，并在2YT、50μg/ml羧苄青霉素、50μg/ml卡那霉素、10μg/ml四环素中于30℃培养36小时。然后使用改良的PEG沉淀方案(Monaci，P.，Cortese，R.，Screening phage libraries with sera，于Phagedisplay-A practical approach，Clackson和Lowman编，2004，第193-215页)回收扩增的噬菌体。比较自靶物包被孔洗脱的噬菌体的滴度与自非靶物包被孔回收的噬菌体的滴度以评估富集情况。进行了四轮噬菌体选择，其中靶物孔的数目在第2轮降至4个，在第3轮和第4轮降至2个。使用酪蛋白封闭缓冲液(Pierce)作为第2轮和第4轮中抗原板和噬菌体的封闭剂。第2-4轮选择使用3-4小时的噬菌体-抗原结合期并提高清洗严格性。在人C3b淘选的情况中，还在第2-4轮选择中在噬菌体-抗原温育期间添加人C3(大于1μM)作为针对也能结合人C3的噬菌体抗体的反选择(counter select)。选择了人噬菌体克隆YW144.2.43。C3b淘选显示于图1。C3b结合特征是如实施例3中所述测定的。
实施例2：通过HVR H1、H2、H3和L3变异生成的抗体
通过huMAb 4D5-8(
Figure GPA00001021350400481
抗HER2抗体，Genentech，Inc.)重链可变域和huMAb 4D5-8改良轻链可变域的HVR-H1、H2、H3和L3诱变，生成了克隆YW144.2.43。在HVR-H1中，Kabat位置26(G)、28(T)、29(F)、30(S)、31(S)、和35(S)保持不变，而改变位置27和32-34的氨基酸。在HVR-H2中，Kabat位置49(S)、51(I)、55(G)、57(T)、59(Y)、60(A)、61(D)、62(S)、63(V)、64(K)、和65(G)保持不变，而改变位置50、52、52a、53、54、56、和58。在HVR-H3中，Kabat位置93(A)、94(R)、100f-g(删除)保持不变，而改变位置95-100、100a-e、100h、和102。在HVR-L3中，Kabat位置89(Q)、90(Q)、95(P)和97(T)保持不变，而改变位置91-94和96。HVR-L1的序列保持不变，为RASQSISSYLA(SEQ ID NO：11)，而HVR-L2的序列保持不变，为GASSRAS(SEQ ID NO：12)。使用标准诱变技术，通过选定氨基酸位置的诱变，将序列多样性引入每个高变区。抗C3v抗体克隆被选择并测序。
YW144.2.43的亲和力成熟
为了改进抗C3b抗体YW144.2.43的亲和力，在YW144.2.43的背景中生成了三个噬菌体展示文库，每个靶向多个HVR进行软随机化突变，如Lee等，J.Mol.Biol.(2004)，340(5)：1073-93所记载的。为了避免来自模板的潜在高背景重新选择YW144.2.43，在生成每个文库之前将终止密码子引入要突变的HVR。使用溶液分选法来增强基于亲和力的噬菌体选择过程的效率。通过操作生物素化靶物浓度、降低噬菌体捕捉时间以降低背景、及添加未生物素化靶物以消除具有较快解离速率的克隆，能熟练地选择高亲和力克隆(Lee等，J.Mol.Biol.(2004)，340(5)：1073-93)。自第一轮选择，观察到富集(靶物依赖性噬菌体捕捉)，提示每个文库中存在具有对人C3b的合理高亲和力的大量克隆。在后续轮次中提高选择严格性。5轮选择后，分析来自每个文库的克隆。在靶向六个HVR中每一个的文库中都观察到新的序列。通过噬菌体ELISA筛选选定克隆，然后表达成IgG蛋白质，并使用BiacoreTM结合分析来表征它们的亲和力。
使用固体/溶液分选法分选亲和力成熟抗体的噬菌体文库。通过混和500μl PBS中的3.6mg/ml人C3b和10μl 1M磷酸钾pH 8与20μl 4mMSulfo-NHS-LC-生物素(Pierce)，将人C3b生物素化。对于第1轮选择，将生物素化C3b以PBS中的10μg/ml包被到MaxiSorp微量滴定板(Nunc)上并于4℃温育过夜。对于第1轮选择，使用16孔靶物。将孔用SuperBlock(Pierce)于室温封闭1小时。将成熟噬菌体文库在SuperBlock缓冲液中稀释，并于室温温育1小时。然后将噬菌体文库添加至经过封闭的抗原板，并于室温温育2小时。结合后，通过用清洗缓冲液(PBS，05％Tween20)清洗，自抗原板除去未结合的/非特异性结合的噬菌体。通过将孔与50mM HCl、0.5M KCl一起温育30分钟，洗脱结合的噬菌体。使用XL-1Blue细胞和M13/KO7辅助噬菌体扩增噬菌体，并在2YT、50μg/ml羧苄青霉素、50μg/ml卡那霉素、10μg/ml四环素中于30℃培养36小时。然后使用改良的PEG沉淀方案(Monaci，P.，Cortese，R.，见上文)回收扩增的噬菌体。比较自靶物包被孔洗脱的噬菌体的滴度与自非靶物包被孔回收的噬菌体的滴度以评估富集情况。对于第2-5轮选择，执行溶液分选方案。将微量滴定孔用PBS中的10μg/ml中性亲合素于4℃包被过夜，然后用SuperBlock(Pierce)封闭1小时。将回收的噬菌体文库重悬在SuperBlock中，并与50nM b-Robo4-His混和1小时。在中性亲合素包被孔上捕捉结合至b-C3b的噬菌体30分钟，并用清洗缓冲液洗去未结合的噬菌体。用50mM HCl、500mM KCl洗脱噬菌体30分钟，中和，并在XL1 Blue细胞(Stratagene)中在存在KO7辅助噬菌体(New England Biolabs)的情况中扩增。类似地实施后续轮次的分选，只是有如下例外：在第2轮中，b-C3b终浓度为50nM；在第3轮中，b-C3b终浓度为25nM；在第4轮中，b-C3b终浓度为5nM；而在第5轮中，b-C3b终浓度为.5nM，而且在中性亲合素捕捉前向混合物添加50nM未生物素化C3b达1小时。
选择了数个亲和力成熟的克隆来进行对人C3b的结合和测序。亲和力成熟抗体YW144.2.43.S77(简称S77)的重链和轻链Fab片段的氨基酸序列显示于图5。
实施例3：选定抗C3b抗体克隆的表征
噬菌体ELISA-实施噬菌体竞争结合测定法来测定噬菌体展示Fab对C3b的大致结合亲和力(作为噬菌体IC50来测定)。如下实施测定法。如上所述使用改良的PEG沉淀方案自每个克隆生成纯化的噬菌体上清液。将纯化的噬菌体上清液在噬菌体封闭缓冲液中连续稀释，然后在经C3b(1μg/ml)包被的板上温育15分钟。将板用清洗缓冲液清洗并与辣根过氧化物酶/抗M13抗体偶联物(在PBS缓冲液中1∶5000稀释)(Amersham Pharmacia Biotech)一起温育30分钟。将板清洗，用四甲基联苯胺(TMB)底物(Kirkegaard and PerryLaboratories)显色，并用.1N H2SO4淬灭。以分光光度法于450nm测量吸光度以测定给出饱和信号大约50％的噬菌体浓度。在含有两倍连续稀释的C3b蛋白质(自350nM C3b至5nM C3b)的噬菌体封闭缓冲液中稀释固定的、亚饱和浓度的噬菌体。将混合物在温和摇动中于室温温育1小时，转移至经C3b(1μg/ml)包被的板，并将板温育20分钟。将板清洗并如上所述处理。作为IC50值(定义为阻断50％的噬菌体结合至固定化抗原的抗原浓度)来评估结合亲和力。C3b噬菌体竞争结果显示于图2。
IgG生成和亲和力测定-为了表达IgG蛋白质来进行亲和力表征，在噬菌体展示载体中在重链与g3之间引入终止密码子。将克隆转化入大肠杆菌34B8细胞并在AP5培养基中于30℃培养(Presta等，Cancer Res.57：4593-4599(1997))。通过离心收获细胞，重悬于10mM Tris，1mM EDTApH8，并用微量流化仪破碎。用蛋白G亲和测序纯化Fab。
使用
Figure GPA00001021350400511
系统(Biacore，Inc.，Piscataway，NJ)，通过表面等离振子共振测量，测定噬菌体衍生的抗C3b抗体YW144.2.43及其亲和力成熟变体YW144.2.43S77(Fab片段)对人C3b和C3的结合亲和力。所测试的抗体Fab片段是YW144.2.43和YW144.2.43S7。简言之，将羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，Biacore Inc.)的流动室1和2用0.2M N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸化物(EDC)和0.05M N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以流速5μl/in活化7分钟。流动室1不进行包被，作为阴性对照。将这些活化的芯片用抗C3b Fab包被，即用10mM乙酸钠pH4.8稀释至5μg/ml，之后以5μl/min的流速注射，以实现大约50个响应单位(RU)的偶联抗体。接着，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。为了动力学测量，于25℃以35μl/min的流速注射在含0.05％Tween 20的PBS中两倍连续稀释的人C3b或C3可溶性抗原(C3b为大约100nM至大约3nM，C3为约1μM至50nM)。每次注射后，使用20mM HCl再生芯片。通过减去来自空白流动室的RU来校准结合响应。使用简单一对一Langmuir结合模型(BIAevaluation软件，3.2版)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)作为比率k解离/k结合来计算。结合亲和力显示于图6和7。
在另一项实验中，在微量滴定板中使用多克隆C3抗体捕捉纯化的C3b或C3。使用偶联有HRPO的二抗测定S77(A)或多克隆抗C3抗体(B)对被捕捉的C3b或C3的结合。用TMB(KPL)显色，在2N H2SO4中终止，并于450nm读取吸光度。
用于测试抗C3b抗体S77的特异性的C3b ELISA。将25μl在PBS中稀释的捕捉抗体(YW144.2.45.S77亲和力成熟的xC3/C3b(Genentech)2μg/ml)添加至微量滴定板的孔，并于4℃温育过夜。将板用清洗缓冲液(PBS/0.05％Tween20(20倍原液；Media Prep；产品目录A3355))清洗3次。将50μl封闭缓冲液添加至孔，将板在温和摇动中于室温温育1-3小时，并用清洗缓冲液清洗3次。在Magic缓冲液(1X PBS pH7.4、0.5％BSA、0.05％Tween 20、0.2％BgG、15PPM Proclin(Media Prep；产品目录A3381))+0.35M NaCl中制备标准品原液(C3b，Complement Technology Inc.；产品目录A114，以100倍保存于-20℃)。Magic缓冲液+0.35M NaCl还用于制备供分析用的样品。将25μl标准品/样品添加至指定的孔。将样品在温和摇动中于室温温育约2小时(+/-0.5小时)，并用清洗缓冲液清洗3次。将板翻转180度，并重复清洗步骤。将检测抗体(过氧化物酶偶联的山羊F(ab′)2抗人C3(Protos Immunoresearch；产品目录765))在测定稀释剂中1∶7000稀释，并在板上在温和摇动中于室温温育1-2小时。将板用清洗缓冲液清洗3次，并翻转180度，重复清洗步骤。制备50/50TMB溶液。将ELISA板用清洗缓冲液清洗3次。将板翻转180度，并重复清洗步骤。将25μl TMB添加至孔。于室温显色。显色时间：两种板都是10分钟。通过添加25μl 1.0M磷酸至孔来终止显色。对板读取OD读数(450/630nm)。结果显示于图8小图A。
与上文所述用于测试S77的特异性的C3b ELISA测定法类似地实施作为C3检测的阳性对照使用的总C3，只是使用针对人C3(Cappel 55033)的山羊IgG级分作为捕捉抗体。结果显示于图8小图B。
如图8所示，S77识别C3b，但不识别原分子(pro-molecule)C3。
实施例4：C3b抗体特异性抑制补体旁路途径
溶血测定法-为了测定旁路途径活性，将家兔红细胞(Er，ColoradoScrum)在GVB中清洗3次并重悬至2×109/ml。将50μl抑制剂和20μl Er悬浮液与GVB/0.1M EGTA/0.1M MgCl21∶1混和。通过添加经C1q消减的人血清(Quidel；30μl，在GVB中1∶3稀释)来启动补体活化。于室温温育30分钟后，添加200μl GVB/10mM EDTA以终止反应并将样品以500g离心5分钟。通过测量412nm吸光度来测定200μl上清液中的溶血情况。数据表述成相对于在缺乏抑制剂的情况中诱发的溶血的％。为了测定CRIg对经典补体途径的影响，遵循相似的规程，只是用经IgM包被的绵羊红细胞(E-IgM，CompTech)代替Er，而且在GVB++中在因子B缺陷的人血清中实施测定法。
如图9和10所示，亲和力成熟的C3b抗体S77特异性抑制旁路补体途径，不抑制经典途径。
实施例5：C3b抗体抑制C5结合C5转化酶
C5竞争测定法-通过与PBS中的3μg/ml C3b一起于4℃温育过夜，将C3b包被到微量滴定板上。将板用PBS中的1％BSA封闭，并与渐增浓度的抗体一起温育，所述抗体在20mM Tris/20mM Ca/20mM Mg/150mM NaCl/0.05％Tween/1％BSA中与0.4μM C5混和。如下检测C5结合，即与抗人C5抗体(克隆7D12，Genentech)一起于室温温育30分钟，接着与1∶5000驴抗小鼠HRP(Jackson)一起温育。
如图11和12所示，亲和力成熟的C3b抗体S77抑制C5转化酶。
实施例6：C3b抗体不展示分解活性
分解加速活性-将微量滴定板用PBS中的3μg/ml C3b包被过夜。将板在PBST(PBS/0.1％-Tween)中清洗2次，用含有4％BSA的PBST于37℃封闭2小时。将板在含有400ng/ml因子B、25ng/ml因子D、和2mM NiCl2、25mM NaCl、0.05％Tween 20和4％BSA的Veronal缓冲液中于室温温育2小时，接着与PBST中的因子H或S77一起温育15分钟。如下检测因子Bb，即顺序地与PBST中1∶5,000稀释的山羊抗人因子B多克隆抗体(Kent)一起及与PBST中1∶5,000稀释的偶联有HRPO(Caltag)驴抗山羊抗体一起温育1小时。用TMB(KPL)显色，在2N H2SO4中终止，并于450nm读取吸光度。如下测量关于因子I介导的C3b切割的辅因子活性，将0.8μM C3b和80nM因子I与80nM因子H或不同浓度的S77一起在30ml GVB中温育。将混合物于37℃温育60分钟，并通过凝胶电泳分析样品，如关于C3转化酶测定法所描述的。
如图13所示，S77不展示分解加速活性。
实施例7：C77抑制原因子B结合C3b和C3bBb转化酶形成
方案
将MaxiSorp板用PBS中的3μg/ml C3b(PUR13420)于室温包被4小时(20μl/孔)。用100μl PBS 0.1％Tween(PBST)(BioTek EL405洗板仪)实施6次清洗。将板用4％BSA/0.05％Tween/PBS于室温封闭2小时，接着将封闭液倒到水槽中。添加20μl AP转化酶缓冲液，室温2小时，接着用PBST清洗6次。添加20μl抗体，室温45分钟，并将孔用PBST清洗6次。为了检测因子B/Bb，将孔与1∶7000山羊抗fB(Kent Labs)一起于室温温育30分钟。为了检测S77和CR1，将PBST添加至孔，然后用PBST清洗6次，与PBST++中的1∶7,000驴抗山羊IgG-HRPO(Jackson)一起温育30分钟。与PBST++中的1∶100抗6x-His(SEQ ID NO：19)(R&D)一起温育30分钟后，用PBST清洗6次。用20μl TMB底物实施显色，并用10μl 2N硫酸终止反应。于450nm读板。
“AP转化酶缓冲液”：4％BSA，0.1％Tween 20，2mM NiCl2，25mM NaCl，25ng/mL因子D，400ng/ml因子B(CompTech)。
遵循上述方案，将C3b包被到微量滴定板上。添加S77、对照Fab或CR1片段(LHRA-C)，接着在1小时后添加因子B。用HRPO偶联的二抗检测因子B对C3b的结合，并于450nm读取吸光度。结果显示于图14小图A。
类似地，遵循上述方案，将C3b包被微量滴定板上，接着添加S77、对照Fab或CR1片段(LHRA-C)。通过添加因子D和因子B来生成C3转化酶。使用识别因子Bb的一抗和偶联有HRPO的二抗来检测转化酶形成。用TMB(KPL)显色，在2N H2SO4中终止，并于450nm读取吸光度。结果显示于图14小图B。
如图14所示，抗体S77抑制原因子B结合C3B，而且抑制C3bBb转化酶形成。
实施例8：S77在存在所结合的fBb的情况中结合C3b且不分解C3转化酶
使用实施例7中所描述的方案，在微量滴定板上包被C3b。通过添加因子D和因子B来生成C3转化酶。将S77、对照Fab或CR1片段(LHRA-C)添加至板，并用偶联有HRPO的二抗测定这些分子的结合。结果显示于图15小图A。
类似地，遵循实施例7中所描述的方案，用3μg/ml C3b包被微量滴定板。将板与因子B和因子D一起温育，接着与CR1(LHRA-C)、S77或对照Fab一起温育。用山羊抗人因子B和偶联有HRPO的驴抗山羊抗体检测因子Bb。用TMB(KPL)显色，在2N H2SO4中终止，并于450nm读取吸光度。结果显示于图15小图B。
图15所示结果显示了S77能在存在所结合的fBb的情况中结合C3b且不分解C3转化酶。
实施例9：S77抑制因子H结合C3b且抑制因子H辅因子活性
方案1(图15小图1)-将MaxiSorp板用PBS中的3μg/ml C3b(PUR13420)于室温包被3小时(20μl/孔)。将板用100μl PBS 0.1％Tween(PBST)清洗6次(BioTek EL405洗板仪)，并用4％BSA/0.05％Tween/PBS于室温封闭2小时。将板与封闭抗体20μl一起于室温在摇动中温育30分钟，接着与0.33μM fH(CompTech)一起于室温温育1小时并添加10μl 1μM fH。将板在洗板仪(BioTekEL405)中用PBST清洗6次，与1∶7000驴抗小鼠IgG(H+L)-HRPO(Jackson)一起温育30分钟，并在洗板仪(BioTek EL405)中用PBST清洗6次。用20μl TMB底物进行显色。用10μl 2N硫酸终止反应，并于450nm读板。
方案2(图15小图B)-所有稀释在GVB++(1mM MgCl，0.15mM CaCl)中进行。在Eppendorf管中添加10μl1.6μM C3b(最终0.4μM C3b)。添加10μl抗C3b Fab、对照Fab或CR1。于室温温育20分钟。添加10μl 0.08μM fI(最终20nM fI)。于37℃温育60分钟。添加40μl Laemmeli氏缓冲液+2-bME，煮沸3分钟。在8％Invitrogen胶上运行，25μl/孔，125mV，1.5小时。用H2O清洗凝胶，3次，每次5分钟。于室温在摇动中用Simply Blue(Invitrogen)染色60分钟。用ddH2O清洗3次，每次5分钟。在摇床上在剧烈摇动中用ddH2O清洗过夜，盖上塑料。试剂：C3b PUR13240，fI来自Complement Technologies，fH来自Complement Technologies，GVB++来自BioWhittaker。
如上所述，将板用C3b包被。在存在浓度渐增的对照Fab或S77的情况中添加因子H。使用抗因子H抗体和偶联有HRPO的抗小鼠二抗测定因子H对C3b的结合。用TMB(KPL)显色，在2N H2SO4中终止，并于450nm读取吸光度。结果显示于图16小图A。
如下测量关于因子I介导的C3b切割的辅因子活性，即将0.8μM C3b和80nM因子I与80nM因子H或不同浓度的S77在30ml GVB中一起温育。将混合物于37℃温育60分钟，并通过凝胶电泳分析样品，如关于C3转化酶测定法所描述的。结果显示于图16小图B。
如图16所示，抗体S77抑制因子H结合C3b，而且还抑制因子H的辅因子活性。
实施例10：S77抑制CR1结合C3b
方案-将MaxiSorp板用PBS中的3μg/ml C3b(PUR13420)于4℃包被过夜(100μl/孔)。用100μl PBS 0.1％Tween(PBST)清洗3次(BioTek EL405洗板仪)。用4％BSA/0.1％Tween/PBS于室温封闭2小时。与20μl封闭抗体一起于室温在摇动中温育30分钟。与50nM CR1LHR-AC一起于室温温育1小时。在洗板仪(BioTek EL405)中用PBST清洗3次。与PBST中的1∶10mIgG1抗hCD35-FITC(Pharmingen)一起于室温温育45分钟。在洗板仪(BioTek EL405)中用PBST清洗3次。与1∶7000驴抗小鼠IgG-HRPO(Jackson)一起温育30分钟。在洗板仪(BioTek EL405)中用PBST清洗6次。用20ul TMB底物显色。用10μl 2N硫酸终止反应。于450nm读板。
如图17所示，抗体S77抑制CR1结合C3b。
实施例11：结晶和数据细化
使用蒸气扩散法实施悬滴实验，其中使用由1∶1比率的蛋白质溶液和储水池溶液组成的2μl液滴。蛋白质溶液在25mM Tris、50mM NaCl pH7.5中含有浓度为10mg/ml的C3b:S7714复合物，储水池为0.1M Hepes pH7.2中的10％PEG 4000、0.2M MgCl2。两周后出现晶体。在闪冻前在补充有20％甘油的储水池溶液中温育晶体。以高级光源(Advanced Light Source，Berkeley)的梁线(beam line)5.0.1自单一冷冻晶体收集数据，，并使用程序DENZO和SCALEPACK加工数据。晶体属于空间群C2，晶胞参数为a＝216.4
Figure GPA00001021350400561
b＝180.4
Figure GPA00001021350400562
c＝154.6
Figure GPA00001021350400563
而β＝115.73
Figure GPA00001021350400564
及2个复合物，每个复合物由不对称单元中一个C3b分子结合至一个Fab分子而构成。使用程序Phaser及C3b、Fab片段恒定域、和可变域的座标，通过分子替换来解析结构。使用程序O手工调整模型，并用程序REFMAC实施细化，其中使用严格的2倍非晶体学对称限制。细化模型的R和Rfree分别为22.5％和29.0％。
C3b在与抗体S77的复合物中的晶体结构显示于图3。图4I是抗体S77与C3b的结合相互作用的特写。利用结晶数据，C77Fab重链序列内与C3b密切接触的残基以红色显示。
另外，增图1列出了C3b上与S77接触的残基。增图2列出了与C3b接触的Fab S77残基。
靶向C3b(一种对补体活化而言重要的成分)提供了有力的办法，在C3和C5转化酶两个水平抑制补体级联。在上文实施例中所描述的研究中，采用噬菌体技术来生成选择性识别C3b而非其原分子C3的抗体。C3b在与特异性抗体(S77)的复合物中的晶体结构指示该抗体识别C3被切割成C3b后暴露的MG7域上的表位。S77阻断因子B和C5结合C3b，导致对旁路而非经典补体途径C3和C5转化酶的有力抑制。另外，S77抑制fH结合和辅因子活性，以及CR1结合C3b，指示S77对C3b MG7域的结合位点是调控补体活化的热点。总之，此项研究的结果阐明了补体活化的分子基础和旁路途径C3和C5转化酶水平的抑制的分子基础，而且证明了噬菌体展示和其它展示技术用于生成具有有希望的治疗潜力的选择性抗体的效用。
认为前述书面说明足以使本领域技术人员能够实践本发明。根据上面的描述，除了本文所显示和描述的，本发明的多种修饰对于本领域技术人员是显而易见的，而且在所附权利要求的范围内。
序列表
<110>健泰科生物技术公司(GENENTECH，INC.)
<120>C3b抗体及用于预防和治疗补体相关病症的方法
<130>39766-0250PCT
<140>未指定
<141>附随
<150>61/055,068
<151>2008-05-21
<150>60/933,721
<151>2007-06-07
<160>19
<170>PatentIn Ver.3.3
<210>1
<211>44
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的SS7
     重链区
<400>1
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
  1               5                  10                  15
Ala Tyr Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
             20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
         35                  40
<210>2
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的SS7
     重链区
<400>2
Gly Phe Ser Phe Thr Ser Ser Ser Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
  1               5                  10                  15
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Leu
             20                  25
<210>3
<211>48
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的SS7
     重链区
<400>3
Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Phe Asn Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
  1               5                  10                  15
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
             20                  25                  30
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
         35                  40                  45
<210>4
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的SS7
     重链区
<400>4
Asn Ala Leu Tyr Gly Ser Gly Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
  1               5                  10                  15
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
             20                  25
<210>5
<211>42
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的S77
     轻链区
<400>5
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
  1               5                  10                  15
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
             20                  25                  30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
         35                  40
<210>6
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的S77
     轻链区
<400>6
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
  1               5                  10                  15
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
             20                  25
<210>7
<211>39
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的S77
     轻链区
<400>7
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
  1               5                  10                  15
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
             20                  25                  30
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
         35
<210>8
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的S77
     轻链区
<400>8
Gln Gln Ser Tyr Ala Thr Leu Pro Thr Phe Glu Gln Gly Thr Lys Val
  1               5                  10                  15
Glu Ile Lys
<210>9
<211>1641
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>9
Ser Pro Met Tyr Ser Ile Ile Thr Pro Asn Ile Leu Arg Leu Glu Ser
  1               5                  10                  15
Glu Glu Thr Met Val Leu Glu Ala His Asp Ala Gln Gly Asp Val Pro
             20                  25                  30
Val Thr Val Thr Val His Asp Phe Pro Gly Lys Lys Leu Val Leu Ser
         35                  40                  45
Ser Glu Lys Thr Val Leu Thr Pro Ala Thr Asn His Met Gly Asn Val
     50                  55                  60
Thr Phe Thr Ile Pro Ala Asn Arg Glu Phe Lys Ser Glu Lys Gly Arg
 65                  70                  75                  80
Asn Lys Phe Val Thr Val Gln Ala Thr Phe Gly Thr Gln Val Val Glu
                 85                  90                  95
Lys Val Val Leu Val Ser Leu Gln Ser Gly Tyr Leu Phe Ile Gln Thr
            100                 105                 110
Asp Lys Thr Ile Tyr Thr Pro Gly Ser Thr Val Leu Tyr Arg Ile Phe
        115                 120                 125
Thr Val Asn His Lys Leu Leu Pro Val Gly Arg Thr Val Met Val Asn
    130                 135                 140
Ile Glu Asn Pro Glu Gly Ile Pro Val Lys Gln Asp Ser Leu Ser Ser
145                 150                 155                 160
Gln Asn Gln Leu Gly Val Leu Pro Leu Ser Trp Asp Ile Pro Glu Leu
                165                 170                 175
Val Asn Met Gly Gln Trp Lys Ile Arg Ala Tyr Tyr Glu Asn Ser Pro
            180                 185                 190
Gln Gln Val Phe Ser Thr Glu Phe Glu Val Lys Glu Tyr Val Leu Pro
        195                 200                 205
Ser Phe Glu Val Ile Val Glu Pro Thr Glu Lys Phe Tyr Tyr Ile Tyr
    210                 215                 220
Asn Glu Lys Gly Leu Glu Val Thr Ile Thr Ala Arg Phe Leu Tyr Gly
225                 230                 235                 240
Lys Lys Val Glu Gly Thr Ala Phe Val Ile Phe Gly Ile Gln Asp Gly
                245                 250                 255
Glu Gln Arg Ile Ser Leu Pro Glu Ser Leu Lys Arg Ile Pro Ile Glu
            260                 265                 270
Asp Gly Ser Gly Glu Val Val Leu Ser Arg Lys Val Leu Leu Asp Gly 
        275                 280                 285
Val Gln Asn Leu Arg Ala Glu Asp Leu Val Gly Lys Ser Leu Tyr Val
    290                 295                 300
Ser Ala Thr Val Ile Leu His Ser Gly Ser Asp Met Val Gln Ala Glu
305                 310                 315                 320
Arg Ser Gly Ile Pro Ile Val Thr Ser Pro Tyr Gln Ile His Phe Thr
                325                 330                 335
Lys Thr Pro Lys Tyr Phe Lys Pro Gly Met Pro Phe Asp Leu Met Val
            340                 345                 350
Phe Val Thr Asn Pro Asp Gly Ser Pro Ala Tyr Arg Val Pro Ala Val
        355                 360                 365
Ala Val Gln Gly Glu Asp Thr Val Gln Ser Leu Thr Gln Gly Asp Gly
    370                 375                 380
Val Ala Lys Leu Ser Ile Asn Thr His Pro Ser Gln Lys Pro Leu Ser
385                 390                 395                 400
Ile Thr Val Arg Thr Lys Lys Gln Glu Leu Ser Glu Ala Glu Gln Ala
                405                 410                 415
Thr Arg Thr Met Gln Ala Leu Pro Tyr Ser Thr Val Gly Asn Ser Asn
            420                 425                 430
Asn Tyr Leu His Leu Ser Val Leu Arg Thr Glu Leu Arg Pro Gly Glu
        435                 440                 445
Thr Leu Asn Val Asn Phe Leu Leu Arg Met Asp Arg Ala His Glu Ala
    450                 455                 460
Lys Ile Arg Tyr Tyr Thr Tyr Leu Ile Met Asn Lys Gly Arg Leu Leu
465                 470                 475                 480
Lys Ala Gly Arg Gln Val Arg Glu Pro Gly Gln Asp Leu Val Val Leu
                485                 490                 495
Pro Leu Ser Ile Thr Thr Asp Phe Ile Pro Ser Phe Arg Leu Val Ala
            500                 505                 510
Tyr Tyr Thr Leu Ile Gly Ala Ser Gly Gln Arg Glu Val Val Ala Asp
        515                 520                 525
Ser Val Trp Val Asp Val Lys Asp Ser Cys Val Gly Ser Leu Val Val
    530                 535                 540
Lys Ser Gly Gln Ser Glu Asp Arg Gln Pro Val Pro Gly Gln Gln Met
545                 550                 555                 560
Thr Leu Lys Ile Glu Gly Asp His Gly Ala Arg Val Val Leu Val Ala
                565                 570                 575
Val Asp Lys Gly Val Phe Val Leu Asn Lys Lys Asn Lys Leu Thr Gln
            580                 585                 590
Ser Lys Ile Trp Asp Val Val Glu Lys Ala Asp Ile Gly Cys Thr Pro
        595                 600                 605
Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Ala Gly Val Phe Ser Asp Ala Gly Leu Thr
    610                 615                 620
Phe Thr Ser Ser Ser Gly Gln Gln Thr Ala Gln Arg Ala Glu Leu Gln
625                 630                 635                 640
Cys Pro Gln Pro Ala Ala Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Leu Thr Glu
                645                 650                 655
Lys Arg Met Asp Lys Val Gly Lys Tyr Pro Lys Glu Leu Arg Lys Cys
            660                 665                 670
Cys Glu Asp Gly Met Arg Glu Asn Pro Met Arg Phe Ser Cys Gln Arg
        675                 680                 685
Arg Thr Arg Phe Ile Ser Leu Gly Glu Ala Cys Lys Lys Val Phe Leu
    690                 695                 700
Asp Cys Cys Asn Tyr Ile Thr Glu Leu Arg Arg Gln His Ala Arg Ala
705                 710                 715                 720
Ser His Leu Gly Leu Ala Arg Ser Asn Leu Asp Glu Asp Ile Ile Ala
                725                 730                 735
Glu Glu Asn Ile Val Ser Arg Ser Glu Phe Pro Glu Ser Trp Leu Trp
            740                 745                 750
Asn Val Glu Asp Leu Lys Glu Pro Pro Lys Asn Gly Ile Ser Thr Lys
        755                 760                 765
Leu Asn Asn Ile Phe Leu Lys Asp Ser Ile Thr Thr Trp Glu Ile Leu
    770                 775                 780
Ala Val Ser Met Ser Asp Lys Lys Gly Ile Cys Val Ala Asp Pro Phe
785                 790                 795                 800
Glu Val Thr Val Met Gln Asp Phe Phe Ile Asp Leu Arg Leu Pro Tyr
                805                 810                 815
Ser Val Val Arg Asn Glu Gln Val Glu Ile Arg Ala Val Leu Tyr Asn
            820                 825                 830
Tyr Arg Gln Asn Gln Glu Leu Lys Val Arg Val Glu Leu Leu His Asn
        835                 840                 845
Pro Ala Phe Cys Ser Leu Ala Thr Thr Lys Arg Arg His Gln Gln Thr
    850                 855                 860
Val Thr Ile Pro Pro Lys Ser Ser Leu Ser Val Pro Tyr Val Ile Val
865                 870                 875                 880
Pro Leu Lys Thr Gly Leu Gln Glu Val Glu Val Lys Ala Ala Val Tyr
                885                 890                 895
His His Phe Ile Ser Asp Gly Val Arg Lys Ser Leu Lys Val Val Pro
            900                 905                 910
Glu Gly Ile Arg Met Asn Lys Thr Val Ala Val Arg Thr Leu Asp Pro
        915                 920                 925
Glu Arg Leu Gly Arg Glu Gly Val Gln Lys Glu Asp Ile Pro Pro Ala
    930                 935                 940
Asp Leu Ser Asp Gln Val Pro Asp Thr Glu Ser Glu Thr Arg Ile Leu
945                 950                 955                 960
Leu Gln Gly Thr Pro Val Ala Gln Met Thr Glu Asp Ala Val Asp Ala
                965                 970                 975
Glu Arg Leu Lys His Leu Ile Val Thr Pro Ser Gly Cys Gly Glu Gln
            980                 985                 990
Asn Met Ile Gly Met Thr Pro Thr Val Ile Ala Val His Tyr Leu Asp
        995                1000                1005
Glu Thr Glu Gln Trp Glu Lys Phe Gly Leu Glu Lys Arg Gln Gly Ala
   1010                1015                1020
Leu Glu Leu Ile Lys Lys Gly Tyr Thr Gln Gln Leu Ala Phe Arg Gln
1025               1030                1035                1040
Pro Ser Ser Ala Phe Ala Ala Phe Val Lys Arg Ala Pro Ser Thr Trp
               1045                1050                1055
Leu Thr Ala Tyr Val Val Lys Val Phe Ser Leu Ala Val Asn Leu Ile
           1060                1065                1070
Ala Ile Asp Ser Gln Val Leu Cys Gly Ala Val Lys Trp Leu Ile Leu
       1075                1080                1085
Glu Lys Gln Lys Pro Asp Gly Val Phe Gln Glu Asp Ala Pro Val Ile
   1090                1095                1100
His Gln Glu Met Ile Gly Gly Leu Arg Asn Asn Asn Glu Lys Asp Met
1105               1110                1115                1120
Ala Leu Thr Ala Phe Val Leu Ile Ser Leu Gln Glu Ala Lys Asp Ile
               1125                1130                1135
Cys Glu Glu Gln Val Asn Ser Leu Pro Gly Ser Ile Thr Lys Ala Gly
           1140                1145                1150
Asp Phe Leu Glu Ala Asn Tyr Met Asn Leu Gln Arg Ser Tyr Thr Val
       1155                1160                1165
Ala Ile Ala Gly Tyr Ala Leu Ala Gln Met Gly Arg Leu Lys Gly Pro
   1170                1175                1180
Leu Leu Asn Lys Phe Leu Thr Thr Ala Lys Asp Lys Asn Arg Trp Glu
1185               1190                1195                1200
Asp Pro Gly Lys Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala Thr Ser Tyr Ala Leu
               1205                1210                1215
Leu Ala Leu Leu Gln Leu Lys Asp Phe Asp Phe Val Pro Pro Val Val
           1220                1225                1230
Arg Trp Leu Asn Glu Gln Arg Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Ser Thr
       1235                1240                1245
Gln Ala Thr Phe Met Val Phe Gln Ala Leu Ala Gln Tyr Gln Lys Asp
   1250                1255                1260
Ala Pro Asp His Gln Glu Leu Asn Leu Asp Val Ser Leu Gln Leu Pro
1265               1270                1275                1280
Ser Arg Ser Ser Lys Ile Thr His Arg Ile His Trp Glu Ser Ala Ser
               1285                1290                1295
Leu Leu Arg Ser Glu Glu Thr Lys Glu Asn Glu Gly Phe Thr Val Thr
            1300               1305                1310
Ala Glu Gly Lys Gly Gln Gly Thr Leu Ser Val Val Thr Met Tyr His
        1315               1320                1325
Ala Lys Ala Lys Asp Gln Leu Thr Cys Asn Lys Phe Asp Leu Lys Val
   1330                1335                1340
Thr Ile Lys Pro Ala Pro Glu Thr Glu Lys Arg Pro Gln Asp Ala Lys
1345               1350                1355                1360
Asn Thr Met Ile Leu Glu Ile Cys Thr Arg Tyr Arg Gly Asp Gln Asp
               1365                1370                1375
Ala Thr Met Ser Ile Leu Asp Ile Ser Met Met Thr Gly Phe Ala Pro
           1380                1385                1390
Asp Thr Asp Asp Leu Lys Gln Leu Ala Asn Gly Val Asp Arg Tyr Ile
       1395                1400                1405
Ser Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Ala Phe Ser Asp Arg Asn Thr Leu Ile
   1410                1415                1420
Ile Tyr Leu Asp Lys Val Ser His Ser Glu Asp Asp Cys Leu Ala Phe
1425               1430                1435                1440
Lys Val His Gln Tyr Phe Asn Val Glu Leu Ile Gln Pro Gly Ala Val
               1445                1450                1455
Lys Val Tyr Ala Tyr Tyr Asn Leu Glu Glu Ser Cys Thr Arg Phe Tyr
           1460                1465                1470
His Pro Glu Lys Glu Asp Gly Lys Leu Asn Lys Leu Cys Arg Asp Glu
       1475                1480                1485
Leu Cys Arg Cys Ala Glu Glu Cys Phe Ile Gln Lys Ser Asp Asp Lys
   1490                1495                1500
Val Thr Leu Glu Glu Arg Leu Asp Lys Ala Cys Glu Pro Gly Val Asp
1505               1510                1515                1520
Tyr Val Tyr Lys Thr Arg Leu Val Lys Val Gln Leu Ser Asn Asp Phe
               1525                1530                1535
Asp Glu Tyr Ile Met Ala Ile Glu Gln Thr Ile Lys Ser Gly Ser Asp
           1540                1545                1550
Glu Val Gln Val Gly Gln Gln Arg Thr Phe Ile Ser Pro Ile Lys Cys
       1555                1560                1565
Arg Glu Ala Leu Lys Leu Glu Glu Lys Lys His Tyr Leu Met Trp Gly
   1570                1575                1580
Leu Ser Ser Asp Phe Trp Gly Glu Lys Pro Asn Leu Ser Tyr Ile Ile
1585               1590                1595                1600
Gly Lys Asp Thr Trp Val Glu His Trp Pro Glu Glu Asp Glu Cys Gln
               1605                1610                1615
Asp Glu Glu Asn Gln Lys Gln Cys Gln Asp Leu Gly Ala Phe Thr Glu
           1620                1625                1630
Ser Met Val Val Phe Gly Cys Pro Asn
       1635                1640
<210>10
<211>1639
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>10
Ile Pro Met Tyr Ser Ile Ile Thr Pro Asn Val Leu Arg Leu Glu Ser
  1               5                  10                  15
Glu Glu Thr Ile Val Leu Glu Ala His Asp Ala Gln Gly Asp Ile Pro
             20                  25                  30
Val Thr Val Thr Val Gln Asp Phe Leu Lys Arg Gln Val Leu Thr Ser
         35                  40                  45
Glu Lys Thr Val Leu Thr Gly Ala Ser Gly His Leu Arg Ser Val Ser
     50                  55                  60
Ile Lys Ile Pro Ala Ser Lys Glu Phe Asn Ser Asp Lys Glu Gly His
 65                  70                  75                  80
Lys Tyr Val Thr Val Val Ala Asn Phe Gly Glu Thr Val Val Glu Lys
                 85                  90                  95
Ala Val Met Val Ser Phe Gln Ser Gly Tyr Leu Phe Ile Gln Thr Asp
            100                 105                 110
Lys Thr Ile Tyr Thr Pro Gly Ser Thr Val Leu Tyr Arg Ile Phe Thr
        115                 120                 125
Val Asp Asn Asn Leu Leu Pro Val Gly Lys Thr Val Val Ile Leu Ile
    130                 135                 140
Glu Thr Pro Asp Gly Ile Pro Val Lys Arg Asp Ile Leu Ser Ser Asn
145                 150                 155                 160
Asn Gln His Gly Ile Leu Pro Leu Ser Trp Asn Ile Pro Glu Leu Val
                165                 170                 175
Asn Met Gly Gln Trp Lys Ile Arg Ala Phe Tyr Glu His Ala Pro Lys
            180                 185                 190
Gln Ile Phe Ser Ala Glu Phe Glu Val Lys Glu Tyr Val Leu Pro Ser
        195                 200                 205
Phe Glu Val Arg Val Glu Pro Thr Glu Thr Phe Tyr Tyr Ile Asp Asp
    210                 215                 220
Pro Asn Gly Leu Glu Val Ser Ile Ile Ala Lys Phe Leu Tyr Gly Lys
225                 230                 235                 240
Asn Val Asp Gly Thr Ala Phe Val Ile Phe Gly Val Gln Asp Gly Asp
                245                 250                 255
Lys Lys Ile Ser Leu Ala His Ser Leu Thr Arg Val Val Ile Glu Asp
            260                 265                 270
Gly Val Gly Asp Ala Val Leu Thr Arg Lys Val Leu Met Glu Gly Val
        275                 280                 285
Arg Pro Ser Asn Ala Asp Ala Leu Val Gly Lys Ser Leu Tyr Val Ser
    290                 295                 300
Val Thr Val Ile Leu His Ser Gly Ser Asp Met Val Glu Ala Glu Arg
305                 310                 315                 320
Ser Gly Ile Pro Ile Val Thr Ser Pro Tyr Gln Ile His Phe Thr Lys
                325                 330                 335
Thr Pro Lys Phe Phe Lys Pro Ala Met Pro Phe Asp Leu Met Val Phe
                340                 345                 350
Val Thr Asn Pro Asp Gly Ser Pro Ala Ser Lys Val Leu Val Val Thr
            355                 360                 365
Gln Gly Ser Asn Ala Lys Ala Leu Thr Gln Asp Asp Gly Val Ala Lys
        370                 375                 380
Leu Ser Ile Asn Thr Pro Asn Ser Arg Gln Pro Leu Thr Ile Thr Val
385                 390                 395                 400
Arg Thr Lys Lys Asp Thr Leu Pro Glu Ser Arg Gln Ala Thr Lys Thr
                405                 410                 415
Met Glu Ala His Pro Tyr Ser Thr Met His Asn Ser Asn Asn Tyr Leu
            420                 425                 430
His Leu Ser Val Ser Arg Met Glu Leu Lys Pro Gly Asp Asn Leu Asn
        435                 440                 445
Val Asn Phe His Leu Arg Thr Asp Pro Gly His Glu Ala Lys Ile Arg
    450                 455                 460
Tyr Tyr Thr Tyr Leu Val Met Asn Lys Gly Lys Leu Leu Lys Ala Gly
465                 470                 475                 480
Arg Gln Val Arg Glu Pro Gly Gln Asp Leu Val Val Leu Ser Leu Pro
                485                 490                 495
Ile Thr Pro Glu Phe Ile Pro Ser Phe Arg Leu Val Ala Tyr Tyr Thr
            500                 505                 510
Leu Ile Gly Ala Ser Gly Gln Arg Glu Val Val Ala Asp Ser Val Trp
        515                 520                 525
Val Asp Val Lys Asp Ser Cys Ile Gly Thr Leu Val Val Lys Gly Asp
    530                 535                 540
Pro Arg Asp Asn His Leu Ala Pro Gly Gln Gln Thr Thr Leu Arg Ile
545                 550                 555                 560
Glu Gly Asn Gln Gly Ala Arg Val Gly Leu Val Ala Val Asp Lys Gly
                565                 570                 575
Val Phe Val Leu Asn Lys Lys Asn Lys Leu Thr Gln Ser Lys Ile Trp
            580                 585                 590
Asp Val Val Glu Lys Ala Asp Ile Gly Cys Thr Pro Gly Ser Gly Lys
        595                 600                 605
Asn Tyr Ala Gly Val Phe Met Asp Ala Gly Leu Ala Phe Lys Thr Ser
    610                 615                 620
Gln Gly Leu Gln Thr Glu Gln Arg Ala Asp Leu Glu Cys Thr Lys Pro
625                 630                 635                 640
Ala Ala Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Leu Met Glu Arg Arg Met Asp
                645                 650                 655
Lys Ala Gly Gln Tyr Thr Asp Lys Gly Leu Arg Lys Cys Cys Glu Asp
            660                 665                 670
Gly Met Arg Asp Ile Pro Met Arg Tyr Ser Cys Gln Arg Arg Ala Arg
        675                 680                 685
Leu Ile Thr Gln Gly Glu Asn Cys Ile Lys Ala Phe Ile Asp Cys Cys
    690                 695                 700
Asn His Ile Thr Lys Leu Arg Glu Gln His Arg Arg Asp His Val Leu
705                 710                 715                 720
Gly Leu Ala Arg Ser Glu Leu Glu Glu Asp Ile Ile Pro Glu Glu Asp
                725                 730                 735
Ile Ile Ser Arg Ser His Phe Pro Gln Ser Trp Leu Trp Thr Ile Glu
            740                 745                 750
Glu Leu Lys Glu Pro Glu Lys Asn Gly Ile Ser Thr Lys Val Met Asn
        755                 760                 765
Ile Phe Leu Lys Asp Ser Ile Thr Thr Trp Glu Ile Leu Ala Val Ser
    770                 775                 780
Leu Ser Asp Lys Lys Gly Ile Cys Val Ala Asp Pro Tyr Glu Ile Arg
785                 790                 795                 800
Val Met Gln Asp Phe Phe Ile Asp Leu Arg Leu Pro Tyr Ser Val Val
                805                 810                 815
Arg Asn Glu Gln Val Glu Ile Arg Ala Val Leu Phe Asn Tyr Arg Glu
            820                 825                 830
Gln Glu Glu Leu Lys Val Arg Val Glu Leu Leu His Asn Pro Ala Phe
        835                 840                 845
Cys Ser Met Ala Thr Ala Lys Asn Arg Tyr Phe Gln Thr Ile Lys Ile
    850                 855                 860
Pro Pro Lys Ser Ser Val Ala Val Pro Tyr Val Ile Val Pro Leu Lys
865                 870                 875                 880
Ile Gly Gln Gln Glu Val Glu Val Lys Ala Ala Val Phe Asn His Phe
                885                 890                 895
Ile Ser Asp Gly Val Lys Lys Thr Leu Lys Val Val Pro Glu Gly Met
            900                 905                 910
Arg Ile Asn Lys Thr Val Ala Ile His Thr Leu Asp Pro Glu Lys Leu
        915                 920                 925
Gly Gln Gly Gly Val Gln Lys Val Asp Val Pro Ala Ala Asp Leu Ser
    930                 935                 940
Asp Gln Val Pro Asp Thr Asp Ser Glu Thr Arg Ile Ile Leu Gln Gly
945                 950                 955                 960
Ser Pro Val Val Gln Met Ala Glu Asp Ala Val Asp Gly Glu Arg Leu
                965                 970                 975
Lys His Leu Ile Val Thr Pro Ala Gly Cys Gly Glu Gln Asn Met Ile
            980                 985                 990
Gly Met Thr Pro Thr Val Ile Ala Val His Tyr Leu Asp Gln Thr Glu
        995                1000                1005
Gln Trp Glu Lys Phe Gly Ile Glu Lys Arg Gln Glu Ala Leu Glu Leu
   1010                1015                1020
Ile Lys Lys Gly Tyr Thr Gln Gln Leu Ala Phe Lys Gln Pro Ser Ser
1025               1030                1035                1040
Ala Tyr Ala Ala Phe Asn Asn Arg Pro Pro Ser Thr Trp Leu Thr Ala
               1045                1050                1055
Tyr Val Val Lys Val Phe Ser Leu Ala Ala Asn Leu Ile Ala Ile Asp
           1060                1065                1070
Ser His Val Leu Cys Gly Ala Val Lys Trp Leu Ile Leu Glu Lys Gln
       1075                1080                1085
Lys Pro Asp Gly Val Phe Gln Glu Asp Gly Pro Val Ile His Gln Glu
   1090                1095                1100
Met Ile Gly Gly Phe Arg Asn Ala Lys Glu Ala Asp Val Ser Leu Thr
1105               1110                1115                1120
Ala Phe Val Leu Ile Ala Leu Gln Glu Ala Arg Asp Ile Cys Glu Gly
               1125                1130                1135
Gln Val Asn Ser Leu Pro Gly Ser Ile Asn Lys Ala Gly Glu Tyr Ile
           1140                1145                1150
Glu Ala Ser Tyr Met Asn Leu Gln Arg Pro Tyr Thr Val Ala Ile Ala
       1155                1160                1165
Gly Tyr Ala Leu Ala Leu Met Asn Lys Leu Glu Glu Pro Tyr Leu Gly
   1170                1175                1180
Lys Phe Leu Asn Thr Ala Lys Asp Arg Asn Arg Trp Glu Glu Pro Asp
1185               1190                1195                1200
Gln Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala Thr Ser Tyr Ala Leu Leu Ala Leu
               1205                1210                1215
Leu Leu Leu Lys Asp Phe Asp Ser Val Pro Pro Val Val Arg Trp Leu
           1220                1225                1230
Asn Glu Gln Arg Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Ala Thr
       1235                1240                1245
Phe Met Val Phe Gln Ala Leu Ala Gln Tyr Gln Thr Asp Val Pro Asp
   1250                1255                1260
His Lys Asp Leu Asn Met Asp Val Ser Phe His Leu Pro Ser Arg Ser
1265               1270                1275                1280
Ser Ala Thr Thr Phe Arg Leu Leu Trp Glu Asn Gly Asn Leu Leu Arg
               1285                1290                1295
Ser Glu Glu Thr Lys Gln Asn Glu Ala Phe Ser Leu Thr Ala Lys Gly
           1300                1305                1310
Lys Gly Arg Gly Thr Leu Ser Val Val Ala Val Tyr His Ala Lys Leu
       1315                1320                1325
Lys Ser Lys Val Thr Cys Lys Lys Phe Asp Leu Arg Val Ser Ile Arg
   1330                1335                1340
Pro Ala Pro Glu Thr Ala Lys Lys Pro Glu Glu Ala Lys Asn Thr Met
1345               1350                1355                1360
Phe Leu Glu Ile Cys Thr Lys Tyr Leu Gly Asp Val Asp Ala Thr Met
               1365                1370                1375
Ser Ile Leu Asp Ile Ser Met Met Thr Gly Phe Ala Pro Asp Thr Lys
           1380                1385                1390
Asp Leu Glu Leu Leu Ala Ser Gly Val Asp Arg Tyr Ile Ser Lys Tyr
       1395                1400                1405
Glu Met Asn Lys Ala Phe Ser Asn Lys Asn Thr Leu Ile Ile Tyr Leu
   1410                1415                1420
Glu Lys Ile Ser His Thr Glu Glu Asp Cys Leu Thr Phe Lys Val His
1425               1430                1435                1440
Gln Tyr Phe Asn Val Gly Leu Ile Gln Pro Gly Ser Val Lys Val Tyr
               1445                1450                1455
Ser Tyr Tyr Asn Leu Glu Glu Ser Cys Thr Arg Phe Tyr His Pro Glu
           1460                1465                1470
Lys Asp Asp Gly Met Leu Ser Lys Leu Cys His Ser Glu Met Cys Arg
       1475                1480                1485
Cys Ala Glu Glu Asn Cys Phe Met Gln Gln Ser Gln Glu Lys Ile Asn
    1490                1495                1500
Leu Asn Val Arg Leu Asp Lys Ala Cys Glu Pro Gly Val Asp Tyr Val
1505               1510                1515                1520
Tyr Lys Thr Glu Leu Thr Asn Ile Lys Leu Leu Asp Asp Phe Asp Glu
               1525                1530                1535
Tyr Thr Met Thr Ile Gln Gln Val Ile Lys Ser Gly Ser Asp Glu Val
           1540                1545                1550
Gln Ala Gly Gln Gln Arg Lys Phe Ile Ser His Ile Lys Cys Arg Asn
       1555                1560                1565
Ala Leu Lys Leu Gln Lys Gly Lys Lys Tyr Leu Met Trp Gly Leu Ser
   1570                1575                1580
Ser Asp Leu Trp Gly Glu Lys Pro Asn Thr Ser Tyr Ile Ile Gly Lys
1585               1590                1595                1600
Asp Thr Trp Val Glu His Trp Pro Glu Ala Glu Glu Cys Gln Asp Gln
               1605                1610                1615
Lys Tyr Gln Lys Gln Cys Glu Glu Leu Gly Ala Phe Thr Glu Ser Met
           1620                1625                1630
Val Val Tyr Gly Cys Pro Asn
       1635
<210>11
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的
     肽
<400>11
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ala
  1               5                  10
<210>12
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的
     肽
<400>12
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser
  1               5
<210>13
<211>214
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
             20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
         35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
                 85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>14
<211>449
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
  1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
             20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                  40                  45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
        115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
    130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
                165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
            180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Asp
        195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
    210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
                245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
            260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
        275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
    290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
                325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
            340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
        355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
    370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
                405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
            420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
        435                 440                 445
Gly
<210>15
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的
     肽
<400>15
Arg Gln Asn Gln Glu Leu Lys
  1               5
<210>16
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的
     肽
<400>16
Tyr His His Phe Ile
  1               5
<210>17
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的
     肽
<400>17
Thr Ser Ser Ser
  1
<210>18
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的
     肽
<400>18
Arg Asn Ala Leu Tyr Gly Ser Gly Gly Tyr
  1               5                  10
<210>19
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的6x
     His标签
<400>19
His His His His His His
  1               5
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种C3b抗体或其片段，其是旁路补体途径的选择性抑制剂，抑制C5与C3b的结合，用于预防或治疗受试者的补体相关病症。
2.权利要求1的抗体，其中所述受试者是哺乳动物。
3.权利要求2的抗体，其中所述受试者是人。
4.权利要求3的抗体，其中所述C3b抗体识别C3活性降解产物上的而非C3上的表位。
5.权利要求4的抗体，其中所述C3b抗体选择性结合C3b。
6.权利要求5的抗体，其中所述抗体结合包括抗体S77所识别的C3b表位的残基的表位。
7.权利要求5的抗体，其中所述抗体基本上与抗体S77结合相同表位。
8.权利要求5的抗体，其中所述抗体竞争性抑制抗体S77的结合。
9.权利要求5的抗体，其中所述抗体结合包含与抗体S77接触的残基的C3b表位。
10.权利要求5的抗体，其中所述抗体包含抗原结合位点，该抗原结合位点含有与C3b接触的抗体S77残基。
11.权利要求5的抗体，其中所述抗体包含抗体S77的重链CDR序列(SEQ IDNO 1-4)和/或轻链CDR序列(SEQ ID NO 5-8)。
12.权利要求5的抗体，其是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
13.权利要求5的抗体，其中所述抗体片段选自下组：Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、(scFv)2、dAb、互补决定区(CDR)片段、线性抗体、单链抗体分子、微型抗体、双抗体、和自抗体片段形成的多特异性抗体。
14.权利要求13的抗体，其中所述抗体片段是Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、或(scFv)2片段。
15.权利要求3的抗体，其中所述补体相关病症是炎性疾病或自身免疫性疾病。
16.权利要求3的抗体，其中所述补体相关病症选自下组：类风湿性关节炎(RA)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、缺血和再灌注后的远距离组织损伤、心肺旁路手术期间的补体活化、皮肌炎、天疱疮、狼疮肾炎及所致肾小球肾炎和血管炎、心肺旁路、心脏停搏诱发的冠状内皮功能障碍、II型膜性增生性肾小球肾炎、IgA肾病、急性肾衰竭、冷球蛋白血症、抗磷脂综合征、黄斑变性性疾病诸如年龄相关黄斑变性(AMD)、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性和其它缺血相关视网膜病变、眼内炎、和其它眼内新血管疾病诸如糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、vonHippel-Lindau病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、以及同种异基因移植、超急性排斥反应、血液透析、慢性阻塞性肺病综合征(COPD)、哮喘、和吸入性肺炎。
17.权利要求3的抗体，其中所述补体相关病症是补体相关眼病症。
18.权利要求17的抗体，其中所述补体相关眼疾是年龄相关黄斑变性(AMD)或脉络膜新血管形成(CNV)。
19.一种抗C3b抗体，其选择性结合C3b而非C3且抑制C5结合C3b。
20.权利要求19的抗体，其中所述抗体结合包括抗体S77所识别的C3b表位的残基的表位。
21.权利要求19的抗体，其中所述抗体基本上与抗体S77结合相同表位。
22.权利要求19的抗体，其中所述抗体竞争性抑制抗体S77的结合。
23.权利要求19的抗体，其中所述抗体结合包含与抗体S77接触的残基的C3b表位。
24.权利要求19的抗体，其中所述抗体包含抗原结合位点，该抗原结合位点包含与C3b接触的抗体S77残基。
25.权利要求19的抗体，其中所述抗体包含抗体S77的重链CDR序列(SEQID NO 1-4)和/或轻链CDR序列(SEQ ID NO 5-8)。
26.权利要求19的抗体，其是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
27.权利要求19的抗体，其中所述抗体片段选自下组：Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、(scFv)2、dAb、互补决定区(CDR)片段、线性抗体、单链抗体分子、微型抗体、双抗体、和自抗体片段形成的多特异性抗体。
28.权利要求27的抗体，其中所述抗体片段是Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、或(scFv)2片段。
29.一种药物组合物，其包含与药学可接受载体混和的权利要求19-28任一项所述的抗体或抗体片段。
30.权利要求29的药物组合物，其用于治疗补体相关病症。
31.权利要求30的药物组合物，其中所述补体相关病症选自下组：类风湿性关节炎(RA)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、缺血和再灌注后的远距离组织损伤、心肺旁路手术期间的补体活化、皮肌炎、天疱疮、狼疮肾炎及所致肾小球肾炎和血管炎、心肺旁路、心脏停搏诱发的冠状内皮功能障碍、II型膜性增生性肾小球肾炎、IgA肾病、急性肾衰竭、冷球蛋白血症、抗磷脂综合征、黄斑变性性疾病诸如年龄相关黄斑变性(AMD)、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性和其它缺血相关视网膜病变、眼内炎、和其它眼内新血管疾病诸如糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、von Hippel-Lindau病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、以及同种异基因移植、超急性排斥反应、血液透析、慢性阻塞性肺病综合征(COPD)、哮喘、和吸入性肺炎。
32.一种试剂盒，其包含容器和说明书，所述容器中装有权利要求19的抗体或抗体片段，或权利要求30的药物组合物，所述说明书指示施用所述抗体或药物组合物来治疗补体相关病症。

Claims (33)

1.一种用于预防或治疗补体相关病症的方法，包括对有需要的受试者施用有效量的C3b拮抗剂，该C3b拮抗剂是旁路补体途径的选择性抑制剂。
2.权利要求1的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
3.权利要求2的方法，其中所述受试者是人。
4.权利要求3的方法，其中所述C3b拮抗剂是识别C3活性降解产物上的而非C3上的表位的抗体。
5.权利要求4的方法，其中所述C3b拮抗剂是选择性结合C3b的抗体或抗体片段。
6.权利要求5的方法，其中所述抗体抑制C5结合C3b。
7.权利要求5的方法，其中所述抗体结合包括抗体S77所识别的C3b表位的残基的表位。
8.权利要求5的方法，其中所述抗体基本上与抗体S77结合相同表位。
9.权利要求5的方法，其中所述抗体竞争性抑制抗体S77的结合。
10.权利要求5的方法，其中所述抗体结合包含与抗体S77接触的残基的C3b表位。
11.权利要求5的方法，其中所述抗体包含抗原结合位点，该抗原结合位点含有与C3b接触的抗体S77残基。
12.权利要求5的方法，其中所述抗体包含抗体S77的重链CDR序列(SEQ IDNO 1-4)和/或轻链CDR序列(SEQ ID NO 5-8)。
13.权利要求5的方法，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
14.权利要求5的方法，其中所述抗体片段选自下组：Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、(scFv)2、dAb、互补决定区(CDR)片段、线性抗体、单链抗体分子、微型抗体、双抗体、和自抗体片段形成的多特异性抗体。
15.权利要求14的方法，其中所述抗体片段是Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、或(scFv)2片段。
16.权利要求3的方法，其中所述补体相关病症是炎性疾病或自身免疫性疾病。
17.权利要求3的方法，其中所述补体相关病症选自下组：类风湿性关节炎(RA)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、缺血和再灌注后的远距离组织损伤、心肺旁路手术期间的补体活化、皮肌炎、天疱疮、狼疮肾炎及所致肾小球肾炎和血管炎、心肺旁路、心脏停搏诱发的冠状内皮功能障碍、II型膜性增生性肾小球肾炎、IgA肾病、急性肾衰竭、冷球蛋白血症、抗磷脂综合征、黄斑变性性疾病诸如年龄相关黄斑变性(AMD)、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性和其它缺血相关视网膜病变、眼内炎、和其它眼内新血管疾病诸如糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、vonHippel-Lindau病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、以及同种异基因移植、超急性排斥反应、血液透析、慢性阻塞性肺病综合征(COPD)、哮喘、和吸入性肺炎。
18.权利要求3的方法，其中所述补体相关病症是补体相关眼疾。
19.权利要求18的方法，其中所述补体相关眼疾是年龄相关黄斑变性(AMD)或脉络膜新血管形成(CNV)。
20.一种抗C3b抗体，其选择性结合C3b而非C3且抑制C5结合C3b。
21.权利要求20的抗体，其中所述抗体结合包括抗体S77所识别的C3b表位的残基的表位。
22.权利要求20的抗体，其中所述抗体基本上与抗体S77结合相同表位。
23.权利要求20的抗体，其中所述抗体竞争性抑制抗体S77的结合。
24.权利要求20的抗体，其中所述抗体结合包含与抗体S77接触的残基的C3b表位。
25.权利要求20的抗体，其中所述抗体包含抗原结合位点，该抗原结合位点包含与C3b接触的抗体S77残基。
26.权利要求20的抗体，其中所述抗体包含抗体S77的重链CDR序列(SEQID NO 1-4)和/或轻链CDR序列(SEQ ID NO 5-8)。
27.权利要求20的抗体，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
28.权利要求20的抗体，其中所述抗体片段选自下组：Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、(scFv)2、dAb、互补决定区(CDR)片段、线性抗体、单链抗体分子、微型抗体、双抗体、和自抗体片段形成的多特异性抗体。
29.权利要求28的抗体，其中所述抗体片段是Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、或(scFv)2片段。
30.一种药物组合物，其包含与药学可接受载体混和的权利要求20的抗体。
31.权利要求30的药物组合物，其用于治疗补体相关病症。
32.权利要求31的药物组合物，其中所述补体相关病症选自下组：类风湿性关节炎(RA)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、缺血和再灌注后的远距离组织损伤、心肺旁路手术期间的补体活化、皮肌炎、天疱疮、狼疮肾炎及所致肾小球肾炎和血管炎、心肺旁路、心脏停搏诱发的冠状内皮功能障碍、II型膜性增生性肾小球肾炎、IgA肾病、急性肾衰竭、冷球蛋白血症、抗磷脂综合征、黄斑变性性疾病诸如年龄相关黄斑变性(AMD)、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性和其它缺血相关视网膜病变、眼内炎、和其它眼内新血管疾病诸如糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、von Hippel-Lindau病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、以及同种异基因移植、超急性排斥反应、血液透析、慢性阻塞性肺病综合征(COPD)、哮喘、和吸入性肺炎。
33.一种试剂盒，其包含容器和说明书，所述容器中装有权利要求20的抗体或权利要求31的药物组合物，所述说明书指示施用所述抗体或药物组合物来治疗补体相关病症。
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