KR20170023212A - 보체-관련 장애의 예방 및 치료를 위한 Ｃ３ｂ 항체 및 방법 - Google Patents

보체-관련 장애의 예방 및 치료를 위한 Ｃ３ｂ 항체 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 C3b에 대한 항체 및 이러한 항체를 사용하는 보체-관련 장애의 예방 및 치료에 관한 것이다.

Description

보체-관련 장애의 예방 및 치료를 위한 Ｃ３ｂ 항체 및 방법{C3B ANTIBODIES AND METHODS FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF COMPLEMENT-ASSOCIATED DISORDERS}
본 발명은 C3b에 대한 항체, 및 이러한 항체를 사용한 보체-관련 장애의 예방 및 치료에 관한 것이다.
보체 시스템은 정상적으로는 불활성의 전-효소(pro-enzyme) 형태로 존재하는 일련의 혈청 당단백질들로 구성된 복잡한 효소 캐스케이드이다. 2가지 주요 경로인 고전적 경로 및 대체적 경로가 보체를 활성화시킬 수 있고, 이들은 C3 수준에서 병합되며, 이때 2종의 유사한 C3 전환효소가 C3을 C3a 및 C3b로 절단한다.
대식세포는 세포-표면에서 발현된 확인 태그의 구조, 소위 분자 패턴에서의 미묘한 차이를 인식하는 선천적인 능력이 발달된 특화 세포이다 (문헌 [Taylor, et al., Eur J Immunol 33, 2090-2097 (2003)], [Taylor, et al., Annu Rev Immunol 23, 901-944 (2005)]). 이러한 표면 구조에 대한 직접적인 인식이 선천적 면역성의 기초적인 측면인 반면, 옵소닌작용은 일반적인 대식세포 수용체가 포식을 매개하도록 허용하여 식세포의 효율을 증가시키고 이의 인식 레퍼토리를 다양화시킨다 (문헌 [Stuart and Ezekowitz, Immunity 22, 539-550 (2005)]). 식작용의 과정은 다수의 리간드-수용체 상호작용을 수반하고, 이뮤노글로불린, 콜렉틴 및 보체 성분을 포함하는 다양한 옵소닌이 대식세포의 세포 표면 수용체와의 상호작용을 통한 병원체 내재화에 필요한 세포 활성들을 안내한다는 것이 현재 자명하다 (문헌 [Aderem and Underhill, Annu Rev Immunol 17, 593-623 (1999)], [Underhill and Ozinsky, Annu Rev Immunol 20, 825-852 (2002)]에 검토되어 있음). 배선(germline) 유전자에 의해 코딩되는 천연 이뮤노글로불린은 광범위하게 다양한 병원체를 인식할 수 있지만, 대다수의 옵소닌작용 IgG는 후천적 면역성을 통해 생성되기 때문에 Fc 수용체를 통한 효율적인 제거는 즉각적이지 않다 (문헌 [Carroll, Nat Immunol 5, 981-986 (2004)]). 한편, 보체는 병원체 표면 분자를 신속하게 인식하고, 해당 입자를 보체 수용체에 의해 흡수되도록 프라이밍(priming)시킨다 (문헌 [Brown, Infect Agents Dis 1, 63-70 (1991)]).
보체는 광범위하게 다양한 병원체를 보체 수용체가 인식하도록 옵소닌작용하는 30종이 넘는 혈청 단백질로 구성된다. 캐스케이드의 초기 촉발자에 따라, 3가지 경로가 구별될 수 있다 (문헌 [Walport, N Engl J Med 344, 1058-1066 (2001)]에 검토되어 있음). 이들 3가지 경로 모두가 중심 성분인 C3을 활성화시킨다는 공통적인 단계를 공유하지만, 인식의 특성, 및 C3 활성화를 유도하는 초기 생화학적 단계에서 상이하다. 고전적 경로는 병원체 표면에 결합된 항체에 의해 활성화되고, 이후에 이것이 C1q 보체 성분에 결합하여 궁극적으로 C3을 그의 활성 형태인 C3b로 절단하는 세린 프로테아제 캐스케이드가 시작된다. 렉틴 경로는 렉틴 단백질에 의한 탄수화물 모티프의 인식 후에 활성화된다. 현재까지, 상기 경로의 하기 3종의 구성원이 확인되어 있다: 만노스-결합 렉틴 (MBL), SIGN-R1 부류의 렉틴 및 피콜린 (문헌 [Pyz et al., Ann Med 38, 242-251 (2006)]). MBL 및 피콜린은 둘다 세린 프로테아제와 결합하고, 고전적 경로에서의 C1과 유사하게 작용하여 성분 C2 및 C4를 활성화시켜 중심 C3 단계에 이르게 한다. 대체적 경로는, 내부 C3 에스테르와 병원체 표면상의 인식 모티프의 직접적인 반응으로 인해 활성화된다는 점에서 고전적 경로 및 렉틴 경로 둘다와 대조적이다. 활성화 표면에 대한 초기 C3 결합은 대체적 경로 프로테아제 인자 B 및 인자 D의 작용을 통한 C3b 축적을 신속하게 증폭시킨다. 중요한 것은, 고전적 경로 또는 렉틴 경로에 의해 축적된 C3b도 인자 B 및 인자 D의 작용을 통한 C3b 축적을 증폭시킬 수 있다는 점이다. 보체 활성화의 3가지 경로 모두에서, 옵소닌작용의 중추적인 단계는 성분 C3의 C3b로의 전환이다. 보체 캐스케이드의 효소에 의한 C3의 절단은 티오에스테르를 친핵성 공격에 노출시켜서, C3b가 티오에스테르 도메인을 통해 항원 표면상에 공유결합으로 부착되도록 한다. 이는 보체 옵소닌작용의 초기 단계이다. 이후, 결합된 C3b의 단백질분해로 인해 상이한 수용체들에 의해 인식되는 단편들인 iC3b, C3c 및 C3dg가 생성된다 (문헌 [Ross and Medof, Adv Immunol 37, 217-267 (1985)]). C3b 축적을 추가로 증폭시키고 막 손상을 지시할 수 있는 막 공격 복합체를 포함하는 보체 캐스케이드의 후기 성분들을 활성화시키는 C3b의 능력은 이러한 절단으로 인해 사라진다. 그러나, 대식세포 식작용 수용체가 C3b 및 이의 단편을 우선적으로 인식하는데; 에스테르-결합 형성의 다능성으로 인해, C3-매개 옵소닌작용은 병원체 인식에 매우 중요하고 (문헌 [Holers et al., Immunol Today 13, 231-236 (1992)]), 이에 따라 다양한 C3 분해 생성물에 대한 수용체가 숙주 면역 반응에서 중요한 역할을 수행한다.
C3 자체는 13개의 독특한 도메인들로 구성된 복잡한 가요성 단백질이다. 상기 분자의 코어(core)는 8개의 소위 마크로글로불린 (MG) 도메인으로 구성되고, 이것들은 C3의 단단하게 패킹(packing)된 α쇄와 β쇄를 구성한다. 이 구조 내로, CUB (C1r/C1s, Uegf 및 골 형태형성 단백질(Bone morphogenetic protein)-1), 및 C3b와 병원체 표면의 공유결합을 허용하는 티오에스테르 결합을 함유하는 TED 도메인이 삽입된다. 나머지 도메인은 C3a를 함유하거나, 코어 도메인들의 링커 또는 스페이서로 작용한다. C3b 및 C3c의 구조를 C3과 비교하면, 각각의 단백질분해로 분자마다 주요 형태적 재배열이 일어나고, 이것은 TED 뿐만이 아니라 상기 분자에서 세포 수용체와 상호작용할 수 있는 추가의 새로운 표면을 노출시킨다는 것이 입증된다 (문헌 [Janssen and Gros, Mol Immunol 44, 3-10 (2007)]).
원하지 않는 보체 활성화를 방지하기 위해, 대부분의 포유동물 세포는 숙주 자체 세포 상에서의 보체 증식을 차단하는 조절인자를 가지고 있다 (문헌 [Hourcade et al. Adv Immunol 45:381 (1989)]). 이들 내재적 조절인자의 부재 하에서의 혈청 노출은 보체 분해 산물을 생성시키고, 다시 염증 및 조직 손상을 용이하게 한다 (문헌 [Oglesby et al. J Exp Med 175: 1547 (1992)] 및 [Oglesby et al., Trans Assoc. Am. Physicians 104:164 (1991)]). 따라서, 내재적 보체 조절인자가 결여된 비-세포 표면은 특히 보체 공격을 받기 쉬워, 혈청에서 가용성 보체 조절인자에 의한 보호에 완전히 의존한다. 적절한 보체 조절의 결여로 인한 제어되지 않은 보체 활성화는 다양한 만성 염증성 질환 및 변성 질환과 관련이 있다. 이 염증 캐스케이드에서 우세한 것은 C3a 및 C5a 수용체를 통해 호중구 및 염증성 대식세포의 화학유인물질 및 활성화 인자로 기능하는 보체 분해 산물 C3a 및 C5a이다 (문헌 [Mollnes et al., Trends Immunol. 23:61 (2002)]). 호중구로부터 방출되는 프로페르딘(Properdin)은 또한 AP 전환효소의 안정화를 통해 염증성 캐스케이드를 증폭시킨다 (문헌 [Lutz and Jelezarova, Mol. Immunol. 43:2 (2006)]). 보체 활성화는 면역-복합체 매개 질환, 예컨대 막증식성 사구체신염, 신독성 신염 및 관절염 (문헌 [Walport, N. Engl. J. Med. 344:1058 (2001)]; [Thurman and Holers, J. Immunol. 176:1305 (2006)]: [Banda et al., J. Immunol. 171:2109 (2003)]; [Weisman et al., Science 249:146 (1990)]; [Morgan and Harris, Mol. Immunol. 40:159 (2003)]) 뿐만 아니라, 노화-관련 황반 변성 (문헌 [Anderson et al., Am. J. Ophthalmol. 134:411 (2002)]; [Donoso et al., Surv. Ophthalmol. 51:137 (2006)]; [Gold et al., Natl. Genet. 38:458 (2006)]; [Hageman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:7227 (2005)]; [Hageman et al., Ann. Med. 38:592 (2006)]; [Hageman et al., Prog. Retin. Eye Res. 20:705 (2001)])에서 염증을 유도하는 중요한 성분인 것으로 밝혀졌다.
보체 활성화의 대부분의 조절인자는 보체 전환효소의 중추적 성분인 C3b의 수준에서 작용한다. 이들 보체 활성화의 천연 조절인자는 전형적으로 크기가 크고 (>100 kDa), 치료 시약으로 개발하기 어렵다. 따라서, C3b 차단에 의해 보체-관련 장애를 예방 및 치료하기 위한 치료제가 요망되고 있다.
<발명의 개요>
본 발명은 C3 단편의 파괴를 특이적으로 인식하며, 천연 C3은 인식하지 않는 항체의 개발에 관한 것으로, 이로부터 천연 C3이 상기 항체에 대해 "싱크(sink)"로 작용하는 것이 방지된다. 보다 구체적으로, 본 발명은 C3b 특이적 항체 및 항체 단편, 및 보체-관련 질환 치료에 있어서의 이들의 용도에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 보체 관련 장애의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 대체적 보체 경로의 선택적 억제제인 C3b 길항제를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 보체 관련 장애의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 다른 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
다른 실시양태에서, C3b 길항제는 C3의 활성 분해 산물 상의 에피토프는 인식하나 C3 상의 에피토프는 인식하지 않는 항체이다.
또 다른 실시양태에서, C3b 길항제는 C3b에 선택적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편이다.
다른 실시양태에서, 항체는 C3b에 대한 C5의 결합을 억제한다.
다른 실시양태에서, 항체는 항체 S77에 의해 인식되는 C3b 에피토프의 잔기를 포함하는 에피토프에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 본질적으로 항체 S77과 동일한 에피토프에 결합한다.
다른 실시양태에서, 항체는 항체 S77의 결합을 경쟁적으로 억제한다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 항체 S77과 접촉된 잔기를 포함하는 C3b 에피토프에 결합한다.
다른 실시양태에서, 항체는 C3b와 접촉된 항체 S77 잔기를 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 항체는 항체 S77의 중쇄 (서열 1 내지 4) 및/또는 경쇄 (서열 5 내지 8) CDR 서열을 포함하고/거나 S77 항체 또는 그의 단편이다.
다양한 실시양태에서, 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체일 수 있다.
다른 실시양태에서, 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, (scFv)2, dAb, 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자, 미니바디, 디아바디, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 방법은 임의의 보체-관련 장애, 예컨대 염증성 및 자가면역 질환, 예를 들어 류마티스성 관절염 (RA), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 허혈 및 재관류 이후의 원거리 조직 손상, 심폐 우회술 동안 보체 활성화, 피부근염, 천포창, 낭창성 신염 및 수반되는 사구체신염 및 혈관염, 심폐 바이패스, 심장마비-유도된 관상동맥 내피 기능이상, 제II형 막증식성 사구체신염, IgA 신장병, 급성 신부전증, 한랭글로불린혈증, 항인지질 증후군, 황반 변성 질환, 예컨대 노화-관련 황반 변성 (AMD), 맥락막 신혈관형성 (CNV), 포도막염, 당뇨병성 및 다른 허혈-관련 망막증, 안내염, 및 다른 안내 신혈관 질환, 예컨대 당뇨병성 황반 부종, 병리적 근시, 폰 히펠-린다우 질환 (von Hippel-Lindau disease), 안구 히스토플라스마증, 망막 중심 정맥 폐쇄 (CRVO), 각막 신혈관형성, 망막 신혈관형성 뿐만 아니라, 동종이식, 초급성 거부반응, 혈액투석, 만성 폐쇄성 폐 호흡곤란 증후군 (COPD), 천식 및 흡인성 폐렴의 예방 또는 치료를 포함한다.
특정 실시양태에서, 보체-관련 장애는 보체-관련 안구 병태, 예컨대 노화-관련 황반 변성 (AMD) 또는 맥락막 신혈관형성 (CNV)이다.
다른 측면에서, 본 발명은 C3b에 선택적으로 결합하나 C3에는 결합하지 않으며, C3b에 대한 C5의 결합을 억제하는 항-C3b 항체에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 항체는 항체 S77에 의해 인식되는 C3b 에피토프의 잔기를 포함하는 에피토프에 결합한다.
다른 실시양태에서, 항체는 본질적으로 항체 S77과 동일한 에피토프에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 항체 S77의 결합을 경쟁적으로 억제한다.
다른 실시양태에서, 항체는 항체 S77과 접촉된 잔기를 포함하는 C3b 에피토프에 결합한다.
다른 실시양태에서, 항체는 C3b와 접촉된 항체 S77 잔기를 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 항체 S77의 중쇄 (서열 1 내지 4) 및/또는 경쇄 (서열 5 내지 8) CDR 서열을 포함하거나 또는 항체 S77 또는 그의 단편이다.
다양한 실시양태에서, 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다.
항체 단편은, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, (scFv)2, dAb, 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자, 미니바디, 디아바디, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 C3b 길항제, 예컨대 C3b 항체를 제약상 허용되는 담체와 함께 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 보체-관련 장애의 치료에 사용하기 위한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 C3b 길항제 또는 C3b 항체, 또는 이러한 길항제 또는 항체를 포함하는 제약 조성물을 포함하는 용기, 및 보체-관련 장애를 치료하기 위한 상기 항체 또는 제약 조성물의 투여에 대한 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 항-C3b 항체는 보체-관련 장애의 예방 및 치료에 유용하다.
도 1. 항체 파지 라이브러리에서의 C3b 패닝 결과.
도 2. 다양한 C3b 항체 클론과의 파지 경쟁 결과.
도 3. 항체 YW144.2.43.S77 (이하, 간략하게 S77로 지칭함) Fab와 복합체를 형성한 C3b의 결정 구조. C3b의 베타 쇄는 녹색으로 표시하고, 알파 쇄는 주황색으로 표시하였다. S77의 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)는 각각 어두운 녹색 및 황색으로 표시하였다. CRIg는 C3b:CRIg 공동-결정 구조에 기초하여 C3b:Fab 복합체 상에 도킹되어 있으며, 자홍색으로 도시하였다.
도 4. 항체 S77과 C3b의 결합 상호작용의 확대도. C3b는 표면도로 도시하였으며, 청록색 리본 그림은 C3b 구조 상에 중첩된 C3을 나타낸다. S77의 HC 및 LC는 어두운 녹색 및 황색의 리본 그림으로 표시하였다. C3b의 표면은 S77에 대한 거리에 따라 채색하였다. 4.7 Å, 4.0 Å 및 3.5 Å 보다 가까운 모든 원자는 각각 황색, 주황색 및 적색으로 표시하였다. S77의 LC는 C3과 충돌함에 유의한다. 그러나, C3의 루프는 이동할 수 있을 것이다.
도 5. 항체 S77 Fab 단편의 중쇄 (서열 1 내지 4) 및 경쇄 (서열 5 내지 8)의 아미노산 서열. 적색으로 표시된 것은 C3b와 밀접하게 접촉된 잔기이다.
도 6A 및 6B. 모 항체 YW144.2.43 Fab 및 그의 친화도 성숙된 형태: 144.2.43.S77 Fab (S77 Fab)의 결합 친화도.
도 7A, 7B 및 7C. SPR 센소그램(sensogram) 및 C3 및 C3b에 대한 S77 결합 친화도.
도 8A 및 8B. S77은 C3b을 인식하나, 전구-분자 C3은 인식하지 않는다. 정제된 C3b 또는 C3은 폴리클로날 C3 항체를 사용하여 미세역가 플레이트에 포획하였다. 포획된 C3b 또는 C3에 대한 S77 (A) 또는 폴리클로날 항 C3 항체 (B)의 결합은 이차 HRPO-접합된 항체를 이용하여 결정하였다. TMB (KPL)로 발색시키고, 2N H2SO4에서 중단시키고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다.
도 9A, 9B 및 9C. IgG 항체 S77은 대체적 보체 경로를 선택적으로 억제하나, 고전적 보체 경로는 억제하지 않는다. 토끼 적혈구 및 양 적혈구를 C1q- 및 인자 B-고갈된 혈청에서 인큐베이션하고, 용혈반응을 억제제 또는 대조군 단백질 (농도는 점차 증가시킴)의 존재하에 모니터링하였다. 용혈반응은 억제제의 부재 하에서의 최대 용혈반응의 백분율로 표시하였다.
도 10. 친화도-성숙된 S77 Fab는 대체적 보체 경로를 억제한다.
도 11. C3b Fab (S77)는 C5 전환효소를 억제한다. C5 전환효소는 기재된 바와 같이 수행하였다 (문헌 [Rawal, N and Pangburn, M. J Immunol. 2001 Feb 15; 166(4):2635-42]).
도 12. IgG 항체 S77 및 그의 Fab 단편은 전환효소의 비-촉매작용적 서브유닛인 C3b에 대한 C5의 결합을 차단하여 C5 전환효소를 억제한다. C5를 억제제 (농도는 점차 증가시킴)의 존재하에 C3b로 코팅된 플레이트에 첨가하였다. C3b 다량체에 대한 C5 결합.
도 13. S77은 전환효소를 퇴화시키지 않는 반면, 인자 H를 퇴화시킨다. 퇴화 분석은 S77 또는 인자 H (양성 대조군) (농도는 점차 증가시킴)의 존재하에 플레이트-코팅된 C3 전환효소를 생성하여 수행하였다.
도 14A 및 14B. S77은 C3b에 대한 전구-인자 B의 결합을 억제하고, C3bBb 전환효소의 형성을 억제한다.
도 15A 및 15B. S77은 결합된 fBb의 존재하에 C3b에 결합할 수 있고, C3 전환효소를 퇴화시키지 않는다.
도 16A 및 16B. S77은 C3b에 대한 인자 H 결합을 억제하고, 인자 H 보조-인자 활성을 억제한다.
도 17. S77은 C3b에 대한 CR1 결합을 억제한다.
도 18a 및 18b. 항-HER2 항체 rhuMAB 4D5-8 경쇄 (서열 13) 및 중쇄 (서열 14) 가변 영역의 아미노산 서열.
보충 도 1 (도 1s). S77 Fab의 HC 및 LC와 접촉된 C3b 상의 잔기 (잔기 833 내지 839는 서열 15에 포함되고; 잔기 895 내지 899는 서열 16에 포함됨).
보충 도 2 (도 2s). C3b와 접촉된 S77 Fab 상의 잔기 (잔기 1030 내지 1033은 서열 17에 포함되고; 잔기 1098 내지 1107은 서열 18에 포함됨).
보충 도 3 (도 3s). 인간 보체 인자 C3 (서열 9) 및 마우스 보체 인자 C3 (서열 10)의 아미노산 서열.
<바람직한 실시양태의 상세한 설명>
I. 정의
용어 "C3" 및 "보체 C3"은 구별없이 사용되며, 천연 서열 C3 폴리펩티드를 나타낸다.
"천연 서열 C3"은 자연계에서 유래된 C3 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이며, 제조 방식과는 무관하다. 따라서, 천연 서열 C3은 자연계에서 단리될 수도 있고, 또는 재조합 및/또는 합성 수단을 통해 생성될 수도 있다. 용어 "천연 서열 C3"은 특히 C3의 천연 발생 변이체 형태 (예를 들어, 대체적으로 스플라이싱된 형태) 및 천연 발생 대립유전자 변이체 뿐만이 아니라 자연계에서 유래된 C3 폴리펩티드와 동일한 동일 아미노산 서열을 갖는 C3 분자의 구조적 형태 변이체까지도 포함한다. 천연 서열 C3 폴리펩티드는 특히 천연 서열 인간 C3 (보충 도 3, 서열 9; 또한 문헌 [De Bruijn and Fey, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:708-712] 참조) 및 고등 영장류 및 비-인간 포유동물을 비롯한 비-인간 동물의 폴리펩티드, 예컨대 보충 도 3, 서열 10에 나타낸 마우스 C3 서열을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "C3b"는 C3α-쇄의 아미노 말단으로부터 아나필라톡신 C3a 단편을 방출시키고 C3b 뒤에서 출발하는 C3 전환효소에 의한 절단 이후에 C3b로부터 생성된 천연 서열 C3b 폴리펩티드를 나타낸다. 용어 "천연 서열"은 C3에 관하여 정의된 것과 동일한 의미를 가지며, 특히 서열 9의 천연 서열 인간 C3b를 포함한다.
용어 "C3b 길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되며, C3의 생물학적 활성을 중화시키거나 차단하거나 부분적으로 또는 완전히 억제하거나 없애거나 감소시키거나 저해할 수 있는 임의의 분자를 포함한다. C3b 길항제는 C3b에 결합하고 C3b의 활성, 예를 들어 보체-관련 장애의 병리에 관여하는 C3b의 능력을 중화시키거나 차단하거나 부분적으로 또는 완전히 억제하거나 없애거나 감소시키거나 저해할 수 있는 항-C3b 항체 및 그의 항원-결합 단편, 다른 결합 폴리펩티드, 펩티드 및 비-펩티드 소분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원의 C3b 길항제, 예컨대 C3b 항체는 특이적으로 C3b를 인식하며, 그의 전구물질 C3은 인식하지 않는다.
"소분자"는 본원에서 분자량이 약 600 달톤 미만, 바람직하게는 약 1000 달톤 미만인 것으로 정의된다.
본 발명의 C3b 길항제, 예컨대 C3b 항체와 관련하여 "활성의" 또는 "활성" 또는 "생물학적 활성"은 C3b의 생물학적 활성을 길항 (부분적으로 또는 완전히 억제)하는 능력이다. C3b 길항제의 바람직한 생물학적 활성은 C3b-관련 질환 또는 병태, 예를 들어 보체-관련 장애의 상태, 예를 들어 병리에서 측정가능한 개선을 달성하는 능력이다. 상기 활성은 관련 동물 모델을 사용한 결합 분석 또는 인간의 임상 실험을 포함하는 시험관내 또는 생체내 시험으로 결정할 수 있다.
본원에서 용어 "보체-관련 장애"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 그의 발병이 보체 시스템의 활성화의 이상, 예를 들면 보체 결핍과 관련이 있는 모든 질환 및 병리적 상태를 포함한다. 이 용어는 특히 C3 전환효소의 억제가 유익한 질환 및 병리적 상태를 포함한다. 이 용어는 또한 대체적 보체 경로의 억제 (선택적 억제 포함)가 유익한 질환 및 병리적 상태를 포함한다. 보체-관련 장애로는 염증성 질환 및 자가면역 질환, 예를 들어 류마티스성 관절염 (RA), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 허혈 및 재관류 이후의 원거리 조직 손상, 심폐 우회술 동안 보체 활성화, 피부근염, 천포창, 낭창성 신염 및 수반되는 사구체신염 및 혈관염, 심폐 바이패스, 심장마비-유도된 관상동맥 내피 기능이상, 제II형 막증식성 사구체신염, IgA 신장병, 급성 신부전증, 한랭글로불린혈증, 항인지질 증후군, 황반 변성 질환 및 다른 보체-관련 안구 병태, 예컨대 노화-관련 황반 변성 (AMD), 맥락막 신혈관형성 (CNV), 포도막염, 당뇨병성 및 다른 허혈-관련 망막증, 안내염, 및 다른 안내 신혈관 질환, 예컨대 당뇨병성 황반 부종, 병리적 근시, 폰 히펠-린다우 질환, 안구 히스토플라스마증, 망막 중심 정맥 폐쇄 (CRVO), 각막 신혈관형성, 망막 신혈관형성 뿐만 아니라 동종이식, 초급성 거부반응, 혈액투석, 만성 폐쇄성 폐 호흡곤란 증후군 (COPD), 천식 및 흡인성 폐렴이 있으나 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 용어 "보체-관련 안구 병태"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 보체의 고전적 경로 및 대체적 경로, 특히 대체적 경로를 포함하는, 보체를 수반하는 병리를 갖는 모든 안구 병태 및 질환을 포함한다. 이러한 군에 포함되는 것은 특히 그의 대체적 경로와의 연계, 발생, 발전 또는 진행이 대체적 경로의 억제에 의해 제어될 수 있는 모든 안구 병태 및 질환이다. 보체-관련 안구 병태는 황반 변성 질환, 예컨대 모든 단계의 노화-관련 황반 변성 (AMD), 예컨대 건성 및 습성 (비-삼출성 및 삼출성) 형태, 맥락막 신혈관형성 (CNV), 포도막염, 당뇨병성 및 다른 허혈-관련 망막증, 안내염, 및 다른 안내 신혈관 질환, 예컨대 당뇨병성 황반 부종, 병리적 근시, 폰 히펠-린다우병, 안구 히스토플라스마증, 망막 중심 정맥 폐쇄 (CRVO), 각막 신혈관형성 및 망막 신혈관형성을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 보체-관련 안구 병태의 바람직한 군은 노화-관련 황반 변성 (AMD), 예를 들어 비-삼출성 (습성) 및 삼출성 (건성 또는 위축성) AMD, 맥락막 신혈관형성 (CNV), 당뇨병성 망막증 (DR) 및 안내염을 포함한다.
용어 "염증성 질환" 및 "염증성 장애"는 구별없이 사용되며, 포유동물의 면역계의 성분이 포유동물에서 질병의 원인이 되는 염증성 반응을 유발하거나, 매개하거나, 또는 다르게 이의 원인이 되는 질환 또는 장애를 의미한다. 또한, 염증성 반응의 감소가 질환의 진행에 대해 개선 효과를 나타내는 질환이 포함된다. 이 용어에는 자가면역 질환을 비롯한 면역-매개 염증성 질환이 포함된다.
용어 "T-세포 매개" 질환은 T 세포가 직접 또는 간접적으로 포유동물에서의 질병을 매개하거나 또는 다르게 이의 원인이 되는 질환을 의미한다. T 세포 매개 질환은 세포 매개 효과, 림포카인 매개 효과 등, 심지어는 B 세포가 예를 들어 T에 의해 분비된 림포카인에 의해 자극된 경우에 B 세포와 관련된 효과와 관련이 있을 수 있다.
면역-관련 및 염증성 질환의 예로는 (이들 중 일부는 T 세포 매개성임) 염증성 장 질환 (IBD), 전신 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 소아 만성 관절염, 척추관절병, 전신성 경화증 (경피증), 특발성 염증성 근육병 (피부근염, 다발성근염), 쇼그렌(Sjogren) 증후군, 전신성 혈관염, 유육종증, 자가면역 용혈성 빈혈 (면역 범혈구감소증, 발작성 야간 혈색소뇨증), 자가면역 혈소판 감소증 (특발성 혈소판 감소성 자반증 , 면역-매개 혈소판 감소증), 갑상선염 (그레이브스병(Grave's disease), 하시모토(Hashimoto) 갑상선염, 소아 림프구성 갑상선염, 위축성 갑상선염), 진성 당뇨병, 면역-매개 신장 질환 (사구체신염, 간질성 신염), 중추 및 말초 신경계의 탈수초성 질환, 예컨대 다발성 경화증, 특발성 다발신경병증, 간담도 질환, 예컨대 감염성 간염 (A형, B형, C형, D형, E형 간염 및 다른 비-간치환성 바이러스 간염), 자가면역 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 경화증, 육아종성 간염, 및 경화성 담관염, 염증성 및 섬유소성 폐질환 (예를 들면, 낭포성 섬유증), 글루텐-민감성 장병증, 휘플병(Whipple's disease), 자가면역 또는 면역-매개 피부 질환, 예컨대 수포성 피부 질환, 다형성 홍반 및 접촉성 피부염, 건선, 폐의 알레르기성 질환, 예컨대 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유증 및 과민성 폐렴, 이식 관련 질환, 예컨대 이식편 거부반응, 이식편-대 숙주 질환, 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 및 아테롬성 동맥경화증이 있으나 이에 한정되지는 않는다.
"치료"는 장애의 발병을 예방하거나 이의 병리를 변경시키려는 의도로 수행되는 개입이다. 따라서, "치료"는 치유적 치료와 예방적 또는 방지적 수단 둘다를 나타낸다. 치료가 필요한 대상체에는 이미 장애에 걸린 대상체 뿐만이 아니라 장애를 예방할 대상체도 포함된다. 면역 관련 질환의 치료시에, 치료제는 면역 반응 성분의 반응 크기를 직접 변경시킬 수도 있고, 또는 그 질환이 다른 치료제, 예를 들어 항생제, 항-진균제, 소염제, 화학요법제 등의 처치에 보다 감수성이 되게 할 수도 있다.
질환, 예를 들어 보체-관련 장애의 "병리"는 환자의 복지를 악화시키는 모든 현상을 포함한다. 이것은, 비정상적이거나 제어할 수 없는 세포 (호중구, 호산구, 단핵구, 림프구)의 성장, 항체 생성, 자가-항체 생성, 보체 생성, 인접 세포의 정상적인 기능의 저해, 사이토카인 또는 다른 분비 생성물의 비정상적인 수준의 방출, 임의의 염증 또는 면역 반응의 저해 또는 악화, 염증 세포 (호중구, 호산구, 단핵구, 림프구)의 세포 공간으로의 침윤 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "포유동물"은 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 나타내며, 인간, 고등 영장류, 가축 및 축산용 동물, 동물원 동물, 경주용 동물 또는 애완용 동물, 예를 들어 말, 돼지, 소, 개, 고양이 및 흰족제비 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
1종 이상의 추가의 치료제와의 "조합" 투여는 동시 (함께) 투여하는 것 및 임의의 순서로 연속 투여하는 것을 포함한다.
"치료상 유효량"은 예를 들어 표적 질환 또는 병태, 예를 들어 보체-관련 장애의 상태, 예를 들어 병리에서 측정가능한 개선을 달성하는데 필요한 "C3b 길항제", 예컨대 "C3b 항체"의 양이다.
용어 "제어 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 나타낸다. 원핵생물에 적합한 제어 서열은, 예를 들어 프로모터, 임의로는 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 공지되어 있다.
핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전서열(presequence) 또는 분비 리더의 DNA는 해당 폴리펩티드가 그의 분비에 관여하는 전단백질로서 발현되는 경우에 상기 폴리펩티드의 DNA에 작동가능하게 연결된 것이고, 프로모터 또는 인핸서는 이것이 해당 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이며, 또는 리보솜 결합 부위는 이것이 코딩 서열의 번역을 용이하게 하도록 배치된 경우에 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 통상적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우에는 인접하고 리딩 페이스(reading phase)로 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 라이게이션을 통해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에는 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 관행에 따라 사용한다.
혼성화 반응의 "엄격도"는 당업자가 쉽게 결정할 수 있으며, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라 달라지는 실험적 계산값이다. 일반적으로, 프로브의 길이가 길수록 적당한 어닐링에 요구되는 온도가 더 높고, 프로브의 길이가 짧을수록 이에 요구되는 온도가 더 낮다. 일반적으로, 혼성화는 상보적 가닥들이 자신들의 융점보다 낮은 환경에 존재할 때 변성된 DNA가 재어닐링되는 능력에 의존적이다. 프로브와 혼성화가능한 서열 사이에서 원하는 상동성의 정도가 높을수록, 사용할 수 있는 상대적인 온도가 더 높다. 결과적으로, 상대적 온도가 높을수록 반응 조건은 더욱 엄격해지는 경향이 있는 반면에, 상대적 온도가 낮을수록 반응 조건은 덜 엄격해지는 경향이 있다. 혼성화 반응의 엄격도와 관련이 있는 추가의 세부사항 및 설명은 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley lnterscience Publishers, (1995)]을 참조한다.
본원에서 정의된 바와 같이, "엄격 조건" 또는 "고엄격 조건"은 (1) 세척시의 이온 농도가 낮고 온도가 높은 조건, 예를 들어 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1％ 나트륨 도데실 술페이트를 사용하는 조건, (2) 혼성화 동안에 42℃에서 포름아미드, 예를 들어 0.1％ 소 혈청 알부민/0.1％ 피콜(Ficoll)/0.1％ 폴리비닐피롤리돈/750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨이 함유된 50 mM 인산나트륨 완충제 (pH 6.5)를 함유하는 50％ (v/v) 포름아미드와 같은 변성제를 사용하는 조건, 또는 (3) 42℃에서 50％ 포름아미드, 5× SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1％ 피로인산나트륨, 5× 덴하르트(Denhardt's) 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/mL), 0.1％ SDS 및 10％ 황산덱스트란을 사용하고, 42℃에서 0.2× SSC (염화나트륨/시트르산나트륨)로 세척하고 55℃에서 50％ 포름아미드로 세척한 후에 55℃에서 EDTA가 함유된 0.1× SSC를 사용하여 고엄격 세척을 수행하는 조건으로 확인할 수 있다.
"중간 정도의 엄격 조건"은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기재된 바와 같이 확인할 수 있으며, 상기한 것보다 덜 엄격한 세척 용액 및 혼성화 조건 (예를 들어, 온도, 이온 농도 및 SDS의 백분율(％))을 사용하는 것을 포함한다. 중간 정도의 엄격 조건의 예는 20％ 포름아미드, 5× SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5× 덴하르트 용액, 10％ 황산덱스트란 및 20 mg/mL의 연어 정자의 전단된 변성 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후에 필터를 약 37℃ 내지 50℃에서 1× SSC로 세척하는 조건이다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 요인에 맞춰 온도, 이온 농도 등을 필요에 따라 조정하는 방법을 인지하고 있을 것이다.
본원에 사용된 용어 "에피토프 태그가 부착된"은 "태그 폴리펩티드"에 융합된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 나타낸다. 태그 폴리펩티드는 항체가 생성될 수 있는 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만 융합될 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 만큼 충분히 짧다. 또한, 태그 폴리펩티드는 자신에 대한 항체가 다른 에피토프와는 실질적으로 교차반응하지 않을 만큼 아주 독특한 것이 바람직하다. 일반적으로, 적합한 태그 폴리펩티드는 6개 이상의 아미노산 잔기를 가지며, 일반적으로는 약 8개 내지 50개의 아미노산 잔기 (바람직하게는 약 10개 내지 20개의 아미노산 잔기)를 갖는다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로는 C3의 분해 단편을 인식하지만 천연 C3은 인식하지 않는 단일 항체, 예컨대 C3b에 특이적으로 결합하는 항-C3b 모노클로날 항체, 및 폴리펩티드 특이성을 갖는 항체 조성물을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 나타내는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다.
본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원성 부위에 대해 고도로 특이적이다. 추가로, 전형적으로 여러 결정인자 (에피토프)에 대한 여러 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와는 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원상의 단일 결정인자에 대한 것이다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 특징을 실질적으로 동종인 항체들의 집단으로부터 수득된 것으로 나타내며, 임의의 특정한 방법을 통한 항체 제조가 필요하다는 의미로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al. (1975) Nature 256:495]에 최초로 기재되었던 하이브리도마 방법으로 제조될 수도 있고, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조)으로 제조될 수도 있다. 또한, "모노클로날 항체"는, 예를 들어 문헌 [Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628] 및 [Marks et al. (199I) J. Mol. Biol. 222:581-597]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수도 있다.
본원에서의 모노클로날 항체는, 구체적으로는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종에서 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이지만, 상기 쇄(들)의 나머지는 또다른 종에서 유래하거나 또다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 (이뮤노글로불린) 및 또한 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한은 이러한 항체의 단편까지도 포함한다 (미국 특허 제4,816,567호 및 문헌 [Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855]).
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린에서 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역 잔기가, 원하는 특이성, 친화도 및 수용력(capacity)을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 예에서, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에 존재하지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능이 더 증진되도록 가해진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 세부사항에 대하여는 문헌 ([Jones et al. (1986) Nature 321:522-525], [Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329] 및 [Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596])을 참조한다.
"종-의존성 항체"는 제1 포유동물 종으로부터의 항원에 대한 결합 친화도가 제2 포유동물 종으로부터의 항원 상동체에 대한 결합 친화도보다 더 강한 항체이다. 통상적으로, 종-의존성 항체는 인간 항원에 "특이적으로 결합" (즉, 결합 친화도 (Kd) 값이 약 1×10-7 M 이하, 바람직하게는 약 1×10-8 M 이하, 가장 바람직하게는 약 1×10-9 M 이하임)하지만, 제2의 비-인간 포유동물 종으로부터의 항원 상동체에 대한 결합 친화도는 인간 항원에 대한 결합 친화도보다 약 50배 이상 또는 약 500배 이상 또는 약 1,000배 이상 더 약하다. 종-의존성 항체는 상기에서 정의된 바와 같은 다양한 유형의 항체 중 임의의 것일 수 있으나, 바람직하게는 인간화 항체 또는 인간 항체이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항체 돌연변이체" 또는 "항체 변이체"는 종-의존성 항체의 1개 이상의 아미노산 잔기가 변형된, 종-의존성 항체의 아미노산 서열 변이체를 나타낸다. 이러한 돌연변이체는 종-의존성 항체와의 서열 동일성 또는 유사성이 반드시 100％ 미만이다. 바람직한 실시양태에서, 항체 돌연변이체는 종-의존성 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과 75％ 이상, 더욱 바람직하게는 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 85％ 이상, 더욱 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다. 본원에서, 상기 서열과 관련한 동일성 또는 유사성은, 서열을 정렬하고 필요에 따라서는 최대 서열 동일성(％)을 달성하기 위한 갭을 도입한 후에 후보 서열에서 종-의존성 항체 잔기와 동일한 아미노산 잔기 (즉, 동일 잔기) 또는 유사한 아미노산 잔기 (즉, 공통적인 측쇄 성질을 기초로 할 때 동일 군에 속하는 아미노산 잔기 (하기 참조))의 백분율(％)로서 정의된다. N-말단, C-말단 또는 내부의 연장, 결실, 또는 가변 도메인 바깥쪽 항체 서열로의 삽입 중 그 어느 것도 서열 동일성 또는 유사성에 영향을 미치는 것으로 해석되지 않아야 한다.
"단리된" 항체는 자연계 환경 성분으로부터 동정 및 분리 및/또는 회수된 항체이다. 자연계 환경의 오염물 성분은 상기 항체가 진단 또는 치료에 사용되는 것을 저해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법으로 결정할 때 항체의 95 중량％ 초과, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과로 정제되거나, (2) 스피닝 컵 시쿼네이터(spinning cup sequenator)를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상 잔기를 얻기에 충분한 정도로 정제되거나, 또는 (3) 쿠마시에 블루(Coomassie Blue) 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비-환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 균일한 것으로 나타날 정도로 정제된다. 단리된 항체는 재조합 세포내의 계내(in situ) 항체를 포함하는데, 이는 상기 항체의 자연계 환경의 1종 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로는, 단리된 항체는 1회 이상의 정제 단계를 통해 제조될 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항체 가변 도메인"은 상보성 결정 영역 (CDR - 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3) 및 프레임워크 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 일부를 나타낸다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 나타낸다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 나타낸다. 본 발명에서 사용되는 방법에 따라, CDR 및 FR로 할당되는 아미노산 위치는 카바트(Kabat) (문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)])에 따라 한정될 수 있다. 항체 또는 항원 결합 단편의 아미노산 넘버링도 카바트에 따른다.
본원에서 사용된 용어 "상보성 결정 영역 (CDR - 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3)"은 항체 가변 도메인에서 항원 결합에 필요한 아미노산 잔기를 나타낸다. 각각의 가변 도메인은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 식별되는 3개의 CDR 영역을 갖는다. 각각의 상보성 결정 영역은 카바트에 의해 한정되는 바와 같은 "상보성 결정 영역"으로부터의 아미노산 잔기 (즉, 경쇄 가변 도메인에서는 약 잔기 24 내지 34 (L1), 50 내지 56 (L2) 및 89 내지 97 (L3), 중쇄 가변 도메인에서는 31 내지 35 (H1), 50 내지 65 (H2) 및 95 내지 102 (H3) (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (즉, 경쇄 가변 도메인에서는 약 잔기 26 내지 32 (L1), 50 내지 52 (L2) 및 91 내지 96 (L3), 중쇄 가변 도메인에서는 26 내지 32 (H1), 53 내지 55 (H2) 및 96 내지 101 (H3) (문헌 [Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917])를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 상보성 결정 영역은 카바트에 따라 한정되는 CDR 영역과 초가변 루프 둘다로부터의 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 4D5의 중쇄 CDRH1은 아미노산 26 내지 35를 포함한다.
"프레임워크 영역" (이하, FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기 영역이다. 각각의 가변 도메인은 전형적으로 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 식별되는 4개의 FR을 갖는다. CDR이 카바트에 따라 한정되는 경우, 경쇄 FR 잔기는 약 잔기 1 내지 23 (LCFR1), 35 내지 49 (LCFR2), 57 내지 88 (LCFR3) 및 98 내지 107 (LCFR4)에 위치하고, 중쇄 FR 잔기는 중쇄 잔기에서 잔기 1 내지 30 (HCFR1), 36 내지 49 (HCFR2), 66 내지 94 (HCFR3) 및 103 내지 113 (HCFR4) 부근에 위치한다. CDR이 초가변 루프로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 경우, 경쇄 FR 잔기는 경쇄에서 잔기 1 내지 25 (LCFR1), 33 내지 49 (LCFR2), 53 내지 90 (LCFR3) 및 97 내지 107 (LCFR4) 부근에 위치하고, 중쇄 FR 잔기는 중쇄 잔기에서 잔기 1 내지 25 (HCFR1), 33 내지 52 (HCFR2), 56 내지 95 (HCFR3) 및 102 내지 113 (HCFR4) 부근에 위치한다. 일부 예에서, CDR이 카바트에 따라 한정되는 CDR과 초가변 루프로부터의 CDR 둘다로부터의 아미노산을 포함하는 경우, FR 잔기는 그에 따라 조정될 것이다. 예를 들어, CDRH1이 아미노산 H26 내지 H35를 포함하는 경우, 중쇄 FR1 잔기는 위치 1 내지 25에 존재하고, FR2 잔기는 위치 36 내지 49에 존재한다.
본원에서 사용된 "코돈 세트"는 원하는 변이체 아미노산을 코딩하는데 사용되는 여러 뉴클레오티드 트리플렛 서열 세트를 나타낸다. 코돈 세트에 의해 제공되는 뉴클레오티드 트리플렛의 모든 가능한 조합을 제시하고 원하는 군의 아미노산을 코딩하는 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트는 예를 들어 고상 합성에 의해 합성할 수 있다. 코돈 명명의 표준 형태는 IUB 코드의 형태이며, 이는 당업계에 공지되어 있고 본원에 기재되어 있다. 코돈 세트는 전형적으로 3개의 대문자 이탤릭체, 예를 들어 NNK, NNS, XYZ, DVK 등으로 표시된다. 본원에서 사용된 "비-랜덤 코돈 세트"는 이에 따라 본원에 기재한 바와 같은 아미노산 선택 기준을 부분적으로, 바람직하게는 완전히 충족시키는 선택된 아미노산을 코딩하는 코돈 세트를 나타낸다. 특정 위치에서 선택된 뉴클레오티드 "축퇴성(degeneracy)"을 갖는 올리고뉴클레오티드의 합성은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 TRIM 접근법 (문헌 [Knappek et al. (1999) J. Mol. Biol. 296:57-86], [Garrard ＆ Henner (1993) Gene 128:103])이 있다. 특정 코돈 세트를 갖는 이러한 올리고뉴클레오티드 세트는 시판되는 핵산 합성기 (예를 들어, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 사용하여 합성할 수도 있고, 또는 구입할 수도 있다 (예를 들어, 미국 메릴랜드주 록크빌 소재의 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)로부터 구입할 수 있음). 따라서, 특정 코돈 세트를 갖는 합성된 올리고뉴클레오티드의 세트는 전형적으로 전체 서열 내에서 코돈 세트에 의해 확립된 상이한 서열을 갖는 복수개의 올리고뉴클레오티드를 포함할 것이다. 본 발명에 따라 사용되는 올리고뉴클레오티드는 가변 도메인 핵산 주형에 대한 혼성화를 허용하는 서열을 가지며, 또한 예를 들어 클로닝 목적에 유용한 제한 효소 부위를 포함할 수도 있으나 반드시 그러한 것은 아니다.
본원에서 용어 "항체 단편"은 가장 넓은 의미로 사용되며, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, (scFv)2, dAb 및 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자, 미니바디, 디아바디, 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"Fv" 단편은 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 상기 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단히 결합된 이량체로 구성되며, 이러한 결합은 자연계, 예를 들어 scFv에서는 공유 결합일 수 있다. 이러한 형태에서는 각 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면에서 항체-결합 부위를 한정한다. 총괄하여, 6개의 CDR 또는 그의 하위세트가 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 1개의 가변 도메인 (또는 항원에 대해 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)만으로도 항원을 인식하여 결합하는 능력을 갖지만, 통상적으로 이 경우의 친화도는 전체 결합 부위보다 낮다.
"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인 및 중쇄의 가변 도메인 및 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 1쌍의 Fab 단편이 이들 사이의 힌지 시스테인에 의해 이들의 카르복시 말단 근처에서 공유 연결된 것을 포함한다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 당업계에 공지되어 있다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv에 대한 검토를 위해서는, 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 동일 폴리펩티드 쇄 (VH 및 VL)로 포함하는, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 나타낸다. 동일 쇄에 존재하는 2개 도메인 사이의 쌍 형성(pairing)을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커를 사용하기 때문에, 상기 도메인들은 또다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하여 2개의 항원-결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는, 예를 들어 EP 404,097, WO 93/11161 및 문헌 [Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448]에 더욱 상세하게 기재되어 있다.
표현 "선형 항체"는 문헌 [Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062)]에 기재된 항체를 나타낸다. 간략하게 설명하면, 이들 항체는 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 한쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한쌍의 병렬식(tandem) Fd 세그먼트 (VH-CH1-VH-CH1)를 포함한다. 선형 항체는 이중특이적일 수도 있고 단일특이적일 수도 있다.
본원에서 사용된 "라이브러리"는 복수개의 항체 또는 항체 단편 서열 (예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드), 또는 이러한 서열을 코딩하는 핵산을 나타내고, 여기서의 상기 서열은 본 발명의 방법에 따라 이러한 서열 내로 도입되는 변이체 아미노산의 조합물과는 상이하다.
"파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파지, 예를 들어 섬유상 파지 입자 표면의 외피 단백질의 적어도 일부에 융합 단백질로서 디스플레이시키는 기술이다. 파지 디스플레이의 유용성은, 랜덤화된 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 표적 항원에 고친화도로 결합하는 서열에 대해 신속하고 효율적으로 분류할 수 있다는 점에 있다. 펩티드 및 단백질 라이브러리를 파지에 디스플레이하는 것은 수백만종의 폴리펩티드를 특이적 결합 특성을 갖는 것에 대해 스크리닝하는데 사용되어 왔다. 다가 파지 디스플레이 방법은 섬유상 파지의 유전자 III 또는 유전자 VIII에 대한 융합을 통해 작은 랜덤 펩티드 및 작은 단백질을 디스플레이하는데 이용되어 왔다 (문헌 [Wells and Lowman (1992) Curr. Opin. Struct. Biol. 3:355-362] 및 상기 문헌에서 인용된 참고문헌). 1가 파지 디스플레이에서는, 단백질 또는 펩티드 라이브러리를 유전자 III 또는 그의 일부에 융합시키고, 야생형 유전자 III 단백질의 존재하에 낮은 수준으로 발현시켜서 파지 입자가 융합 단백질을 1개 카피로 디스플레이하거나 디스플레이하지 않도록 한다. 화합력(avidity) 효과는 다가 파지에 비해 감소되어 내재적 리간드 친화도를 기초로 분류되도록 하고, DNA 조작을 단순화하는 파지미드 벡터가 사용된다 (문헌 [Lowman and Wells (1991) Methods: A companion to Methods in Enzymology 3:205-0216]).
"파지미드"는 박테리아 복제 기점, 예를 들어 ColE1, 및 박테리오파지의 유전자간 영역의 1개 카피를 갖는 플라스미드 벡터이다. 파지미드는 섬유상 박테리오파지 및 람다상 박테리오파지를 포함하는 임의의 공지의 박테리오파지에 대해 사용될 수 있다. 또한, 상기 플라스미드는 일반적으로 항생제 내성에 대한 선별가능한 마커를 함유할 것이다. 이러한 벡터 내로 클로닝된 DNA 세그먼트는 플라스미드로서 증식될 수 있다. 이러한 벡터를 보유하는 세포에 파지 입자의 생성에 필요한 모든 유전자가 제공되는 경우, 상기 플라스미드의 복제 방식은 롤링 써클(rolling circle) 복제로 변경되어 플라스미드 DNA의 1개 가닥의 카피들을 생성시키고 파지 입자를 패키징한다. 파지미드는 감염성 또는 비-감염성 파지 입자를 형성할 수 있다. 상기 용어는 이종 폴리펩티드 유전자에 유전자 융합체로서 연결되어 상기 이종 폴리펩티드가 파지 입자의 표면에 디스플레이되도록 하는 파지 외피 단백질 유전자 또는 그의 단편을 함유하는 파지미드를 포함한다.
용어 "파지 벡터"는 이종 유전자를 함유하고 복제가 가능한 박테리오파지의 이중가닥 복제 형태를 의미한다. 파지 벡터는 파지 복제 및 파지 입자 형성을 허용하는 파지 복제 기점을 갖는다. 파지는 바람직하게는 섬유상 박테리오파지, 예컨대 M13, fl, fd, Pf3 파지 또는 그의 유도체, 또는 람다상 파지, 예컨대 람다, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434 등 또는 그의 유도체이다.
본원에서 사용된 "용매 접근가능한 위치"는 항체 또는 항원 결합 단편의 구조, 구조 앙상블 및/또는 모델링된 구조를 기초로 하여 결정된 공급원 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 내에서 용매 접근 및/또는 항체 특이적 항원과 같은 분자와의 접촉이 잠재적으로 가능한 아미노산 잔기의 위치를 나타낸다. 이러한 위치는 전형적으로 CDR 및 단백질의 외부에 존재한다. 본원에서 정의되는 바와 같이, 항체 또는 항원 결합 단편의 용매 접근가능한 위치는 당업계에 공지된 임의의 수많은 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다. 바람직하게는, 용매 접근가능한 위치는 바람직하게는 컴퓨터 프로그램, 예컨대 인사이트II(InsightII) 프로그램 (미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 악셀리스(Accelrys))을 사용한 항체 3차원 모델로부터의 좌표를 사용하여 결정할 수 있다. 용매 접근가능한 위치는 당업계에 공지된 알고리즘을 사용하여 결정할 수도 있다 (예를 들어, 문헌 [Lee and Richards (1971) J. Mol. Biol. 55, 379] 및 [Connolly (1983) J. Appl. Cryst. 16, 548]). 용매 접근가능한 위치의 결정은 항체로부터 얻은 단백질 모델링 및 3차원 구조 정보에 적합한 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 목적에 이용될 수 있는 소프트웨어는 SYBYL 바이오폴리머 모듈(Biopolymer Module) 소프트웨어 (트리포스 어소시에이츠(Tripos Associates))를 포함한다. 일반적이고 바람직하게는, 알고리즘 (프로그램)이 사용자 입력 크기 파라미터를 필요로 하는 경우에 계산에 사용된 프로브의 "크기"는 반경 약 1.4 옹스트롬 이하로 설정된다. 또한, 개인 컴퓨터용 소프트웨어를 사용하는 용매 접근가능한 영역 및 면적의 결정 방법은 문헌 [Pacios (1994) Comput. Chem. 18(4):377-386]에 기재되어 있다.
II. 상세한 설명
보체 시스템
보체는 신체의 방어에서 중대한 역할을 수행하며, 면역 시스템의 다른 성분들과 함께 개체를 신체로 침입하는 병원체로부터 보호한다. 그러나, 적절하게 활성화되거나 제어되지 않는다면, 보체는 또한 숙주 조직에 손상을 야기할 수도 있다. 보체의 부적절한 활성화는 보체-관련 질환 또는 장애라 지칭되는 다양한 질환, 예를 들어 면역 복합체 및 자가면역 질환, 및 다양한 염증성 병태, 예컨대 보체-매개 염증 조직 손상의 발병과 관련된다. 보체-관련 장애의 병리는 다양하며, 길거나 짧은 기간 동안의 보체 활성화, 전체 캐스케이드의 활성화, 캐스케이드 중 오직 하나 (예를 들어 고전적 또는 대체적 경로)의 활성화, 캐스케이드의 오직 일부 성분만의 활성화 등을 수반할 수 있다. 일부 질환에서, 보체 단편의 보체 생물학적 활성은 조직 손상 및 질환을 초래한다. 따라서, 보체의 억제제는 높은 치료 잠재력을 갖는다. 대체적 경로의 선택적 억제제가 특히 유용할 것이며, 이는 고전적 경로를 통해 병원체 및 다른 유기체를 혈액으로부터 제거하는 것은 손상되지 않을 것이기 때문이다.
C3b 항체 및 보체-관련 장애의 예방 및 치료에 있어서의 이들의 용도
본 발명은 적어도 부분적으로는 천연 C3이 아닌 C3의 분해 단편을 특이적으로 인식하는 항체의 개발을 기초로 한다. 특히, 본 발명은 인간 조합 항체 라이브러리 및 파지 디스플레이를 이용하여 개발된, C3b을 인식하여 이에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이며, 이 때 C3b 특이적 파지에 대한 풍부화는 포화량의 C3으로 차단하여 달성되었다. 이 방법을 이용하여, 본원 발명자들은 C3의 활성화된 형태에 특이적인 항체를 개발할 수 있었다. 또한, 이들 인간 항체는 추가로 친화도 성숙되어, 시험관내 용혈반응 분석에서 이들의 효력이 증가한다. 클로닝하여 Fab 단편을 생성하였으며, 이는 대체적 경로를 통한 보체 활성화를 억제하는데 높은 효력을 유지하는 것으로 나타났다. C3b와 복합체를 형성한 Fab (S77로 명명됨)의 공동-구조를 해석하고, C3b-S77 상호작용에 관여하는 잔기를 맵핑하였다. 본원 발명자들의 지식에 있어, 이는 보체의 대체적 경로를 억제하는 C3 단편에 대한 선택성을 갖는 첫번째 파지-유래 항체이다.
본 발명의 항체 및 다른 C3b 특이적 길항제는 보체-관련 장애의 예방 및 치료에 유용하다. 보체-관련 질환의 구체적인 예로는, 류마티스성 관절염 (RA), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 허혈 및 재관류 이후의 원거리 조직 손상, 심폐 우회술 동안 보체 활성화, 피부근염, 천포창, 낭창성 신염 및 수반되는 사구체신염 및 혈관염, 심폐 바이패스, 심장마비-유도된 관상동맥 내피 기능이상, 제II형 막증식성 사구체신염, IgA 신장병, 급성 신부전증, 한랭글로불린혈증, 항인지질 증후군, 황반 변성 질환 및 다른 보체-관련 안구 병태, 예컨대 노화-관련 황반 변성 (AMD), 맥락막 신혈관형성 (CNV), 포도막염, 당뇨병성 및 다른 허혈-관련 망막증, 안내염, 및 다른 안내 신혈관 질환, 예컨대 당뇨병성 황반 부종, 병리적 근시, 폰 히펠-린다우 질환, 안구 히스토플라스마증, 망막 중심 정맥 폐쇄 (CRVO), 각막 신혈관형성, 망막 신혈관형성, 뿐만 아니라 동종-이식, 초급성 거부반응, 혈액투석, 만성 폐쇄성 폐 호흡곤란 증후군 (COPD), 천식 및 흡인성 폐렴이 있으나 이들로 한정되지는 않는다.
보체-관련 질환의 예로서 염증성 상태의 보다 확장된 목록은, 예를 들어 염증성 장 질환 (IBD), 전신 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 소아 만성 관절염, 척추관절병, 전신성 경화증 (경피증), 특발성 염증성 근육병 (피부근염, 다발성근염), 쇼그렌 증후군, 전신성 혈관염, 유육종증, 자가면역 용혈성 빈혈 (면역 범혈구감소증, 발작성 야간 혈색소뇨증), 자가면역 혈소판 감소증 (특발성 혈소판 감소성 자반증, 면역-매개 혈소판 감소증), 갑상선염 (그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 소아 림프구성 갑상선염, 위축성 갑상선염), 진성 당뇨병, 면역-매개 신장 질환 (사구체신염, 간질성 신염), 중추 및 말초 신경계의 탈수초성 질환, 예컨대 다발성 경화증, 특발성 다발신경병증, 간담도 질환, 예컨대 감염성 간염 (A형, B형, C형, D형, E형 간염 및 다른 비-간치환성 바이러스 간염), 자가면역 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 경화증, 육아종성 간염, 및 경화성 담관염, 염증성 및 섬유소성 폐질환 (예를 들면, 낭포성 섬유증), 글루텐-민감성 장병증, 휘플병, 자가면역 또는 면역-매개 피부 질환, 예컨대 수포성 피부 질환, 다형성 홍반 및 접촉성 피부염, 건선, 폐의 알레르기성 질환, 예컨대 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유증 및 과민성 폐렴, 이식 관련 질환, 예컨대 이식편 거부반응 및 이식편-대 숙주 질환을 포함한다.
전신 홍반성 루푸스에서, 질환의 중추적 매개인자는 자체 단백질/조직에 대한 자가반응 항체의 생성 및 이후의 면역-매개 염증의 발생이다. 항체는 직접 또는 간접적으로 조직 손상을 매개한다. T 림프구가 조직 손상에 직접 관여하는 것으로 밝혀지지는 않았으나, T 림프구는 자가반응 항체의 발생에 필요하다. 이에 따라, 질환의 발생은 T 림프구 의존성이다. 신장, 폐, 근골격계, 피부점막, 안구, 중추 신경계, 심혈관계, 위장관, 골수 및 혈액을 비롯한 여러 기관 및 생체계는 임상적으로 영향을 받는다.
류마티스성 관절염 (RA)은 주로 여러 관절의 활막과 관련되며 관절 연골 손상을 수반하는 만성 전신성 자가면역 염증성 질환이다. 발병은 T 림프구 의존성이고, 자체 IgG에 대해 지시된 자가-항체, 류마티스 인자의 생성과 관련이 있으며, 관절액 및 혈액에서 높은 수준에 도달하는 면역 복합체의 형성을 수반한다. 관절 내의 이들 복합체는 림프구 및 단핵구의 활액낭으로의 현저한 침윤을 유도할 수 있으며, 이후에 현저한 활액낭 변화를 유도할 수 있다; 관절강/관절액은 다수의 호중구 첨가와 함께 유사한 세포에 의해 침윤된다. 영향을 받는 조직은 주로 관절로, 종종 대칭 패턴을 나타낸다. 그러나, 관절외 질환이 또한 2 가지 주요 형태로 발생한다. 한 가지 형태는 진행 중인 진행성 관절 질환이 있는 관절외 병변 및 폐 섬유증, 혈관염 및 피부 궤양의 전형적인 병변이 발생하는 것이다. 관절외 질환의 두번째 형태는 소위 펠티(Felty) 증후군으로, RA 질환 과정 후기, 때로는 관절 질환 진행이 중단된 후에 일어나며, 호중구감소증, 혈소판 감소증 및 비종의 존재와 관련된다. 이는 경색, 피부 궤양 및 괴저 형성과 함께 여러 기관에서 혈관염을 수반할 수 있다. 환자는 또한 영향을 받은 관절 위에 놓인 피하지방 조직에서 류마티스 결절이 발생하기도 하며, 결절 후기에는 혼합된 염증성 세포 침윤에 의해 둘러싸인 괴사 중심이 나타난다. RA에서 발생할 수 있는 다른 징후로는 심막염, 늑막염, 관상동맥염, 폐 섬유증이 있는 간질성 폐렴, 건성 각결막염 및 류마티스 결절이 있다.
소아 만성 관절염은 종종 16세 미만의 연령에서 시작되는 만성 특발성 염증성 질환이다. 그의 표현형은 RA에 일부 유사하다; 류마티스 인자 양성인 몇몇 환자는 소아 류마티스성 관절염 환자로 분류된다. 이 질환은 3 가지 주요 카테고리로 세분된다: 소수관절성, 다발관절 및 전신성. 이 관절염은 심각할 수 있으며, 전형적으로 파괴성이고, 관절 강직 및 지연된 성장을 초래한다. 다른 징후로는 만성 전방 포도막염 및 전신성 아밀로이드증을 포함할 수 있다.
척추관절병은 몇몇 공통적인 임상적 특징 및 HLA-B27 유전자 산물의 발현과의 공통된 관련성을 갖는 일군의 장애이다. 이러한 장애로는 강직성 척추염, 라이터(Reiter) 증후군 (반응성 관절염), 염증성 장 질환 관련 관절염, 건선 관련 척추염, 소아 개시 척추관절병증 및 구분되지 않은 척추관절병증이 있다. 구별되는 특징은 척추염이 있거나 또는 없는 천장골염; 염증성 비대칭 관절염; HLA-B27 (클래스 I MHC의 HLA-B 유전자좌의 혈청학적으로 지정된 대립유전자)과의 관련성; 안구 염증, 및 다른 류마티스 질환과 관련된 자가 항체의 부재를 포함한다. 질환의 유도에 핵심적으로 가장 관련이 깊은 세포는 CD8+ T 림프구로, 이는 클래스 I MHC 분자에 의해 제시된 항원을 표적으로 하는 세포이다. CD8+ T 세포는 MHC 클래스 I 분자에 의해 발현된 외래 펩티드인 것처럼 클래스 I MHC 대립유전자 HLA-B27에 대해 반응할 수 있다. HLA-B27의 에피토프가 박테리아 또는 다른 미생물 항원 에피토프를 모방할 수 있으므로 CD8+ T 세포 반응을 유도한다는 가설이 제시되었다.
전신성 경화증 (경피증)의 병인은 알려져 있지 않다. 이 질환의 특징은 피부의 경결인데, 아마도 이는 활성 염증성 과정에 의해 유도될 것이다. 경피증은 국재화되거나 또는 전신성일 수 있으며, 혈관 병변이 공통적이며 미세혈관 내의 내피 세포 손상이 전신성 경화증의 발생에 중요한 초기 사건이고, 혈관 손상은 면역 매개성일 수 있다. 면역학적 기반은 피부 병변에서 단핵 세포 침윤의 존재 및 다수의 환자에서 항-핵 항체의 존재를 암시한다. ICAM-1은 피부 병변 내의 섬유아세포의 세포 표면 상에서 상향조절되기도 하는데, 이는 이들 세포와 T 세포의 상호작용이 질환의 발병에 소정의 역할을 수행할 수 있음을 시사한다. 관련되는 다른 기관으로는 위장관 (평활근 위축 및 섬유증 - 비정상적인 연동운동/운동성 초래); 신장 (감소된 신장 피질 혈류를 수반하는, 작은 궁상 및 소엽간 동맥에 영향을 미치는 동심 내피밑 내막 증식 - 단백뇨, 고질소혈증 및 고혈압 초래); 골격근 (위축증, 간질성 섬유증, 염증); 폐 (간질성 폐렴 및 간질성 섬유증); 및 심장 (수축 밴드 괴사, 상흔/섬유증)이 있다.
피부근염, 다발성근염 및 기타를 비롯한 특발성 염증성 근육병은 근육 약화를 초래하는, 병인이 알려지지 않은 만성 근육 염증 장애이다. 근육 손상/염증은 종종 대칭적이며 진행성이다. 자가항체는 대부분의 형태와 관련이 있다. 이들 근염-특이적 자가항체는 단백질 합성에 관여하는 성분인 단백질 및 RNA의 기능에 대해 지시되어 이를 억제한다.
쇼그렌(Sjogren) 증후군은 면역-매개 염증 및 이후의 눈물샘 및 침샘의 기능 파괴로 인한 것이다. 이 질환은 염증성 결합 조직 질환과 관련이 있거나 또는 이를 수반할 수 있다. 이 질환은 Ro 및 La 항원 (이들 둘다 작은 RNA-단백질 복합체임)에 대한 자가항체 생성과 관련이 있다. 병변은 담도 경화증, 말초 또는 감각 신경병증 및 촉지 자반증을 비롯한 다른 징후 또는 관련 병태와 건성 각결막염, 구강건조증을 초래한다.
전신성 혈관염은 일차 병변에 염증 및 이후의 혈관에 대한 손상 (이는 영향을 받는 혈관에 의해 공급되는 조직에 대한 허혈/괴사/퇴화 및 몇몇 경우에 궁극적으로 말단-기관의 기능이상을 초래함)이 있는 질환을 포함한다. 혈관병증은 또한 다른 면역-염증성 매개 질환, 예컨대 류마티스성 관절염, 전신성 경화증 등에 대한 이차 병변 또는 후유증으로서, 특히 면역 복합체의 형성과 관련되기도 한 질환에서 발생할 수 있다. 원발성 전신성 혈관염 군에 속하는 질환으로는 전신성 괴사성 혈관염: 결절성 다발동맥염, 알레르기성 맥관염 및 육아종증, 다발맥관염; 베게너(Wegener) 육아종증; 림프종양 육아종증 및 거대세포 동맥염이 있다. 기타 혈관병증은 피부점막 림프절 증후군 (MLNS 또는 가와사키병(Kawasaki's disease)), 고립형 CNS 혈관염, 벨리프스병(Beliefs disease), 폐쇄성 혈전혈관염 (버거병(Buerger's disease)) 및 피부 괴사성 세정맥염을 포함한다. 열거된 대부분의 유형의 혈관염의 병원성 기전은 주로 혈관벽 내의 면역글로불린 복합체의 축적 및 이후의 ADCC, 보체 활성화 또는 이들 둘다를 통한 염증성 반응의 유도에 기인하는 것으로 여겨진다.
유육종증은 신체의 거의 모든 조직에서의 상피양세포 육아종의 존재를 특징으로 하는 병인이 알려지지 않은 병태로, 폐의 관련된 것이 가장 흔하다. 발병은 이들 세포 유형에 의해 방출된 국부 및 전신 활성 산물의 방출로부터 초래되는 이후의 만성 후유증이 나타나는 질환의 부위에서 활성화된 대식세포 및 림프구 세포의 지속성과 관련된다.
자가면역 용혈성 빈혈, 면역 범혈구감소증 및 발작성 야간 혈색소뇨증을 비롯한 자가면역 용혈성 빈혈은 적혈구 세포 (몇몇 경우에는 혈소판을 비롯한 다른 혈액 세포)의 표면 상에 발현된 항원과 반응하는 항체의 생성으로 인한 것이며, 보체 매개된 용해 및/또는 ADCC/Fc-수용체-매개된 기전을 통한 상기 항체 코팅된 세포의 제거를 반영한다.
혈소판 감소성 자반증을 비롯한 자가면역 혈소판 감소증, 및 다른 임상 세팅에서의 면역-매개 혈소판 감소증에서, 혈소판 파괴/제거는 항체 또는 보체가 혈소판에 부착된 후에 보체 용해, ADCC 또는 FC-수용체 매개 기전에 의해 제거된 결과로서 일어난다.
그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 소아 림프구성 갑상선염 및 위축성 갑상선염을 비롯한 갑상선염은 갑상선 샘에 존재하며 이에 특이적이기도 한 단백질과 반응하는 항체의 생성과 함께 갑상선 항원에 대한 자가면역 반응의 결과이다. 자발성 모델: 래트 (BUF 및 BB 래트) 및 닭 (비만 닭 종류); 유도성 모델: 티로글로불린, 갑상선 마이크로좀 항원 (갑상선 퍼록시다제)이 있는 동물의 면역화를 비롯한 실험 모델이 존재한다.
제I형 진성 당뇨병 또는 인슐린-의존성 당뇨병은 췌도 β 세포의 자가면역 파괴로 인한 것이며, 이러한 파괴는 자가-항체 및 자가-반응 T 세포에 의해 매개된다. 인슐린 또는 인슐린 수용체에 대한 항체는 또한 인슐린-비-반응성의 표현형을 생성할 수 있다.
사구체신염 및 간질성 신염을 비롯한 면역 매개 신장 질환은 직접적으로는 자가반응 항체 또는 신장 항원에 대한 T 세포의 생성의 결과로서 또는 간접적으로는 다른 비-신장 항원에 대해 반응성인 신장 내의 항체 및/또는 면역 복합체 축적의 결과로서, 신장 조직에 대한 항체 또는 T 림프구 매개 손상에 의한 것이다. 이에 따라, 면역 복합체 형성을 초래하는 다른 면역-매개 질환은 또한 간접적인 휴우증으로서 면역 매개 신장 질환을 유도할 수도 있다. 직접적 및 간접적 면역 기전은 둘다 수반되는 기관 기능 손상 및 몇몇 경우에는 신부전증으로의 진행과 함께 신장 조직에서 병변 발생을 생성/유도하는 염증성 반응을 일으킨다. 체액성 및 세포성 면역 기전은 둘다 병변 발생과 관련이 있을 수 있다.
다발성 경화증; 특발성 탈수초성 다발신경병증 또는 길랑-바레(Guillain-Barr) 증후군; 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증을 비롯한 중추 및 말초 신경계의 탈수초성 질환은 자가면역 기반을 갖는 것으로 여겨지며, 희소돌기아교세포 또는 수초에 대해 직접적으로 유발된 손상의 결과로 신경 탈수초화를 초래한다. MS에는 질환 유도 및 진행이 T 림프구에 의존성임을 시사하는 증거가 존재한다. 다발성 경화증은 T 림프구-의존성인 탈수초성 질환이며, 재발-완화 과정 또는 만성 진행성 과정을 갖는다. 병인은 알려져 있지 않으나, 바이러스 감염, 유전적 소질 및 자가면역성이 모두 기여한다. 병변은 주로 T 림프구 매개된 소교 세포 및 침윤성 대식세포의 침윤을 함유하고, CD4+T 림프구는 병변에서 우세한 세포형이다. 희소돌기아교세포 세포 사멸 및 이후의 탈수초화 기전은 알려져 있지 않으나, 아마도 T 림프구가 주도할 것이다.
호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유증 및 과민성 폐렴을 비롯한 염증성 및 섬유소성 폐질환은 조절에서 벗어난 면역-염증성 반응과 관련될 수 있다. 이러한 반응의 억제가 치료상 유익할 것이다.
수포성 피부 질환, 다형성 홍반 및 접촉성 피부염을 비롯한 자가면역 또는 면역-매개 피부 질환은 자가-항체에 의해 매개되며, 그의 발생은 T 림프구-의존성이다.
건선은 T 림프구-매개 염증성 질환이다. 병변은 T 림프구, 대식세포 및 항원 처리 세포, 및 몇몇 호중구의 침윤을 함유한다. 알레르기성 질환, 예컨대 천식; 알레르기성 비염; 아토피성 피부염; 음식 과민증 및 두드러기 등이 T 림프구 의존성이다. 이들 질환은 대부분 T 림프구 매개 염증, IgE 매개-염증 또는 이들 둘의 조합에 의해 매개된다.
이식 관련 질환, 예컨대 이식편 거부반응 및 이식편-대-숙주-질환 (GVHD) 등은 T 림프구-의존성이며, T 림프구 기능 억제가 개선된다.
C3b 항체와 같은 본 발명의 C3b 길항제는 또한 보체-관련 안구 병태 (보체의 고전적 및 대체적 경로, 특히 대체적 경로를 포함하는, 보체를 수반하는 병리를 갖는 모든 안구 병태 및 질환), 예컨대 황반 변성 질환, 예를 들어 모든 단계의 노화-관련 황반 변성 (AMD), 예컨대 건성 및 습성 (비-삼출성 및 삼출성) 형태, 맥락막 신혈관형성 (CNV), 포도막염, 당뇨병성 및 다른 허혈-관련 망막증, 안내염, 및 다른 안내 신혈관 질환, 예컨대 당뇨병성 황반 부종, 병리적 근시, 폰 히펠-린다우병, 안구 히스토플라스마증, 망막 중심 정맥 폐쇄 (CRVO), 각막 신혈관형성 및 망막 신혈관형성의 예방 및 치료에 유용하다. 보체-관련 안구 병태의 바람직한 군은 노화-관련 황반 변성 (AMD), 예를 들어 비-삼출성 (습성) 및 삼출성 (건성 또는 위축성) AMD, 맥락막 신혈관형성 (CNV), 당뇨병성 망막증 (DR) 및 안내염을 포함한다.
AMD는 황반의 노화-관련 변성으로, 60세 초과의 개체에서 비가역적인 시각 기능장애의 첫번째 원인이다. AMD는 비-삼출성 (건성) 및 삼출성 (습성) AMD의 2가지 유형이 존재한다. 건성 또는 비-삼출성 형태는 중심 망막 (황반) 하부의 망막 색소 상피 (RPE)에서의 위축성 및 비후성 변화 및 또한 RPE에서의 침착 (결정체)을 수반한다. 비-삼출성 AMD를 갖는 환자는 AMD의 습성 또는 삼출성 형태로 진행될 수 있는데, 여기서는 맥락막 신혈관형성 막 (CNVM)이라 불리는 비정상적인 혈관이 망막 하부에 발생하여 유체 및 혈액을 누출시키고 결국에는 망막 내 및 망막 하부에 실명을 유발하는 원판상 반흔을 야기한다. 일반적으로 삼출성 AMD의 전구 형태인 비-삼출성 AMD가 보다 통상적이다. 비-삼출성 AMD의 형태는 다양하다: 경성 결정체, 연성 결정체, RPE 지도형 위축, 및 색소 응집이 존재할 수 있다. 보체 성분은 AMD에서 초기에 RPE에 침착되며, 결정체의 주요 구성성분이다.
구체적으로, 본 발명은 카테고리 3 및 카테고리 4 AMD를 포함하는 고위험도 AMD의 치료에 관한 것이다. 카테고리 3 AMD는 양눈에서 진행성 AMD가 없거나, 적어도 한쪽 눈이 20/32 또는 그보다 더 양호한 시력을 가지며 1개 이상의 대형 드루즈 (예를 들어 125 ㎛)를 갖거나, 또는 넓은 범위에 걸쳐 (결정체 면적으로 결정함) 중간 크기의 결정체가 존재하거나, 또는 황반의 중심부를 포함하지 않는 지도형 위축 (GA)이 있거나, 또는 이들의 임의의 조합을 특징으로 한다. 카테고리 3 AMD (여전히 "건성" AMD로 간주됨)는 맥락막 신혈관형성 (CNV)으로 전환될 위험도가 높다.
카테고리 4 고위험도 AMD ("습성" AMD로 분류됨)는 지표가 되는 눈(index eye)에서 시력이 20/32 또는 그보다 더 양호하고 진행성 AMD가 없는 것 (황반의 중심부를 포함하거나 맥락막 신혈관형성의 특징을 포함하는 GA)을 특징으로 한다. 다른쪽 눈은 진행성 AMD를 특징으로 하거나, 또는 AMD 황반병증에 기여할 수 있는 20/32 미만의 시력을 특징으로 한다. 전형적으로, 고위험도 AMD는 치료하지 않을 경우에 카테고리 1 또는 2 (고위험도가 아님) AMD의 진행률보다 약 10배 내지 30배 더 빠른 속도로 맥락막 신혈관형성 (CNV)이 신속하게 진행된다.
C3b 길항제는 또한 AMD (특히, 카테고리 3 또는 카테고리 4 AMD)가 CNV로 진행하는 것을 예방하고/하거나 질환에 걸리지 않거나 정도가 덜한 다른쪽 눈에서 AMD 또는 CNV의 발병/진행을 예방하는데 특별한 유용성을 갖는다. 이와 관련하여, 용어 "예방"은 가장 넓은 의미로 사용되어, 질환의 완전하거나 부분적인 차단 및 그의 진행의 저속화 및 또한 질환의 보다 심각한 형태의 발병의 지연을 포함한다. 고위험도 (카테고리 4) AMD 또는 CMV가 발병하거나 이러한 AMD 또는 CMV로 진행되는 것에 대한 위험도가 높은 환자에게는 본 발명의 이러한 측면이 특히 유익하다.
보체 인자 H (CFH) 다형성이 개체의 AMD 및/또는 CNV 발병 위험성과 연관이 있다는 것은 공지되어 있다. CFH에서의 돌연변이는 보체를 활성화시킬 수 있고, 이는 이후에 AMD/CNV를 초래할 수 있다. 최근에는, 보체 인자 H (CFH) 다형성이 AMD 기여 위험도의 50％에 해당한다는 보고가 있었다 (문헌 [Klein et al., Science 308:385-9 (2005)]). CFH에서의 통상적인 반수체형 (HF1/CFH)이 개체를 노화-관련 황반 변성에 걸리기 쉽게 하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Hageman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102(2):7227-7232 (2005)]). AMD는 상염색체-우세 형질로 분리되었고, 마커 D1S466 및 D1S413 사이의 염색체 1q25-q31 (최대 라드 스코어(lod score) 약 3.20) (문헌 [Klein et al., Arch Opthalmol. 116(8):1082-9 (1998)], [Majewski et al., Am. J. Hum. Genet. 73(3):540-50 (2003)], [Seddon et al., Am. J. Hum. Genet. 73(4):780-90 (2003)], [Weeks et al., Am. J. Ophthalmol. 132(5):682-92 (2001)], [Iyengar et al., Am. J. Hum. Genet. 74(1):20-39 (2004)]), 마커 D12S1391 및 D2S1384 사이의 염색체 2q3/2q32 (최대 라드 스코어 2.32/2.03) [Seddon et al., 상기 문헌], 마커 D12S1300 및 D12S1763 사이의 3p13 (최대 라드 스코어 2.19) ([Majewski et al., 상기 문헌], [Schick et al., Am. J. Hum. Genet. 72(6):1412-24 (2003)]), 마커 D6S1056 및 DS249 사이의 6q14 (최대 라드 스코어 3.59/3.17) (문헌 [Kniazeva et al., Am. J. Ophthlmol. 130(2):197-202 (2000)]), 마커 D9S934에서의 9q33 (최대 라드 스코어 2.06) [Mejwski et al., 상기 문헌], 마커 D10S1230에서의 10q26 (최대 라드 스코어 3.06) ([Majewski et al., 상기 문헌], [Iyengar et al., 상기 문헌], [Kenealy et al., Mol. Vis. 10:57-61 (2004)]), 마커 D17S928에서의 17q25 (최대 라드 스코어 3.16) [Weeks et al., 상기 문헌] 및 마커 D22S1045에서의 22q12 (최대 라드 스코어 2.0) [Seddon et al., 상기 문헌]에 질환 유전자좌 맵핑을 갖는다. 따라서, 유전자 스크리닝은 질환이 보다 심각한 형태로 진행되는 것, 예를 들어 AMD가 CNV로 진행되는 것을 예방하는 것을 포함하는 예방적 치료에 특히 적합한 후보인 환자를 찾는데 있어서 중요한 부분이다.
C3b 항체의 제조 및 선별
본원 발명은 C3b는 인식하지만 그의 비활성 전구물질 C3은 인식하지 않는 항체의 생성 및 그의 용도를 포함한다. 항체를 생성하는 예시적인 방법은 하기 섹션에 보다 상세하게 기재되어 있다.
항-C3b 항체는 포유동물 종으로부터 유래된 C3b 폴리펩티드를 사용하여 선별된다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 인간 C3b이다. 그러나, 뮤린 C3b와 같은 다른 종으로부터의 C3b 폴리펩티드가 표적 항원으로 사용될 수도 있다. 다양한 포유동물 종으로부터의 C3b 항원은 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 다른 실시양태에서, 항원은 재조합 방식으로 생성되거나, 당업계에 공지된 다른 합성 방법을 이용하여 제조된다.
통상적으로, 선별된 항체는 C3b 항원에 대하여 충분히 강력한 결합 친화도를 가질 것이다. 예를 들어, 상기 항체는 인간 C3b에 약 5 nM 이하, 바람직하게는 약 2 nM 이하, 더욱 바람직하게는 약 500 pM 이하의 Kd 값으로 결합할 수 있다. 항체 친화도는 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 기재의 분석 (예를 들어, 실시예에 기재한 바와 같은 BIAcore 분석), 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA) 및 경쟁 분석 (예를 들어 RIA)으로 결정할 수 있다.
또한, 항체를 다른 생물학적 활성 분석에 사용하여 예를 들어 치료제로서의 그의 효과를 평가할 수도 있다. 이러한 분석은 당업계에 공지되어 있으며, 표적 항원 및 항체의 의도된 용도에 따라 달라진다. 예로는, HUVEC 억제 분석 (하기 실시예에 기재한 바와 같음), 및 대체적 경로를 선택적으로 차단하고 1종 이상의 보체-관련 장애의 예방 및/또는 치료에서 활성을 나타내는 항체를 확인하기 위한 하기 시험관내 및 생체내 분석이 있다.
관심 항원의 특정 에피토프에 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해서, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 것과 같은 통상의 교차-차단 분석을 수행할 수 있다. 대체적으로, 예를 들어 문헌 [Champe et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:1388-1394]에 기재된 것과 같은 에피토프 맵핑을 수행하여 항체가 관심 에피토프에 결합하는지 여부를 결정할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항-C3b 항체는 독특한 파지 디스플레이 접근법을 사용하여 선별된다. 상기 접근법은 단일 프레임워크 주형을 기초로 하는 합성 항체 파지 라이브러리의 생성, 가변 도메인 내의 충분한 다양성의 디자인, 다양화된 가변 도메인을 갖는 폴리펩티드의 디스플레이, 표적 C3b 항원에 대해 높은 친화도를 갖는 후보 항체의 선별을 수반한다. C3b를 선택적으로 차단하지만 C3은 차단하지 않는 항체를 코딩하는 C3b 특이적 파지에 대한 풍부화를, 예를 들면 아래 실시예에 기재된 바와 같이 포화량의 C3으로 차단시켜 달성할 수 있다.
파지 디스플레이 방법의 세부사항은 예를 들어 2003년 12월 11일자로 공개된 WO 03/102157에서 확인할 수 있다.
한 측면에서, 항체 라이브러리는 항체 가변 도메인에 존재하는 1개 이상의 CDR 내에서 용매 접근가능하고/하거나 고도로 다양한 위치를 돌연변이화시켜 생성될 수 있다. 본원에서 제공되는 방법을 이용하여 일부 또는 모든 CDR을 돌연변이화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 내의 위치를 돌연변이화시켜 단일 라이브러리를 형성시키거나, CDRL3 및 CDRH3 내의 위치를 돌연변이화시켜 단일 라이브러리를 형성시키거나, 또는 CDRL3 및 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 내의 위치를 돌연변이화시켜 단일 라이브러리를 형성시킴으로써 다양한 항체 라이브러리를 생성하는 것이 바람직할 수 있다.
예를 들어, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 용매 접근가능하고/하거나 고도로 다양한 위치에 돌연변이를 갖는 항체 가변 도메인의 라이브러리가 생성될 수 있다. CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 내에 돌연변이를 갖는 또다른 라이브러리가 생성될 수 있다. 또한, 이러한 라이브러리들이 서로와 함께 사용되어 원하는 친화도의 결합제를 생성할 수도 있다. 예를 들어, 표적 항원과의 결합에 대한 중쇄 라이브러리의 1회 이상의 선별 후에, 결합제의 친화도를 증가시키기 위한 추가의 선별을 위해서 경쇄 라이브러리가 중쇄 결합제의 집단 내로 교체될 수 있다.
바람직하게는, 중쇄 서열 가변 영역의 CDRH3 영역에서 원래의 아미노산을 변이체 아미노산으로 치환하여 라이브러리를 생성한다. 이로써 생성된 라이브러리는 서열 다양성이 주로 중쇄 서열의 CDRH3 영역 내에 존재하는 복수개의 항체 서열을 함유할 수 있다.
한 측면에서, 인간화 항체 4D5 서열, 또는 인간화 항체 4D5 서열의 프레임워크 아미노산의 서열과 관련한 라이브러리를 생성한다. 바람직하게는, 중쇄의 적어도 잔기 95 내지 100a를 DVK 코돈 세트에 의해 코딩되는 아미노산으로 치환하여 라이브러리를 생성하고, 여기서의 DVK 코돈 세트는 이러한 위치의 모든 개개에 대한 변이체 아미노산의 세트를 코딩하는데 사용된다. 이러한 치환을 생성하는데 유용한 올리고뉴클레오티드 세트의 예는 서열 (DVK)7을 포함한다. 일부 실시양태에서, 잔기 95 내지 100a를 DVK 및 NNK 코돈 세트 둘다에 의해 코딩되는 아미노산으로 치환하여 라이브러리를 생성한다. 이러한 치환을 생성하는데 유용한 올리고뉴클레오티드 세트의 예는 서열 (DVK)6(NNK)를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 적어도 잔기 95 내지 100a를 DVK 및 NNK 코돈 세트 둘다에 의해 코딩되는 아미노산으로 치환하여 라이브러리를 생성한다. 이러한 치환을 생성하는데 유용한 올리고뉴클레오티드 세트의 예는 서열 (DVK)5(NNK)를 포함한다. 이러한 치환을 생성하는데 유용한 올리고뉴클레오티드 세트의 또다른 예는 서열 (NNK)6을 포함한다. 적합한 올리고뉴클레오티드 서열의 다른 예는 본원에 기재된 기준에 따라 당업자가 결정할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 여러가지 CDRH3 디자인을 이용하여 고친화도 결합제를 단리하고 다양한 에피토프에 대한 결합제를 단리한다. 이러한 라이브러리에서 생성되는 CDRH3의 길이 범위는 11개 내지 13개 아미노산이지만, 이와 상이한 길이가 생성될 수도 있다. NNK, DVK 및 NVK 코돈 세트 뿐만이 아니라 N 및/또는 C-말단에서의 더욱 제한된 다양성을 사용함으로써 H3 다양성이 확장될 수 있다.
CDRH1 및 CDRH2에서도 다양성이 생성될 수 있다. CDR-H1 및 H2 다양성의 디자인은 이전의 디자인보다 천연 다양성에 더욱 밀접하게 매치되는 다양성에 초점을 맞추는 변형과 함께 기재된 바와 같은 천연 항체 레퍼토리를 모방하는 표적화 전략을 따른다.
CDRH3에서의 다양성을 위해, H3의 길이가 상이한 다수의 라이브러리들을 따로 구축한 후에 조합하여 표적 항원에 대한 결합제를 선별할 수 있다. 이전에 기재된 바 있고 본원에서 하기하는 바와 같은 고체 지지체 선별 및 용액 분류 방법을 이용하여 다수의 라이브러리들을 풀링(pooling)하고 분류할 수 있다. 다중 분류 전략을 이용할 수 있다. 예를 들어, 한 변형법은 고체에 결합된 표적에 대한 분류 및 이후 융합 폴리펩티드에 존재할 수 있는 태그 (예를 들어, 항-gD 태그)에 대한 분류, 및 이후 고체에 결합된 표적에 대한 또다른 분류를 수반한다. 대체적으로, 라이브러리를 우선 고체 표면에 결합된 표적에 대해 분류할 수 있고, 이후에는 용출된 결합제를 용액 상 결합을 이용하고 표적 항원의 농도를 감소시키면서 분류한다. 여러가지 분류 방법들의 조합을 이용하는 것은 고도로 발현된 서열만 선별되는 것을 최소화하고, 수많은 상이한 고친화도 클론의 선별을 제공한다.
표적 C3b 항원에 대한 고친화도 결합제를 라이브러리로부터 단리할 수 있다. H1/H2 영역에서의 다양성 제한은 동의성을 약 104배 내지 105배 감소시키고, 더 많은 H3 다양성의 허용은 더 고친화도의 결합제를 제공한다. CDRH3에서의 다양성 유형이 상이한 라이브러리들의 이용 (예를 들어, DVK 또는 NVT의 이용)은 표적 항원의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 결합제의 단리를 제공한다.
또다른 실시양태에서, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 영역에서 다양성을 갖는 라이브러리(들)이 생성된다. 이러한 실시양태에서, 다양한 길이의 H3 영역을 사용하고 주로 코돈 세트 XYZ 및 NNK 또는 NNS를 사용하여 CDRH3에서의 다양성을 생성한다. 개개의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 라이브러리를 형성하고 풀링할 수도 있고, 또는 올리고뉴클레오티드들을 풀링하여 라이브러리의 서브세트를 형성할 수도 있다. 이러한 실시양태의 라이브러리를 고체에 결합된 표적에 대해 분류할 수 있다. 다수의 분류로부터 단리된 클론을 ELISA 분석을 이용하여 특이성 및 친화도에 대해 스크리닝할 수 있다. 특이성을 위해서, 원하는 표적 항원 뿐만이 아니라 다른 비-표적 항원에 대해서도 클론을 스크리닝할 수 있다. 이후, 표적 C3b 항원에 대한 결합제를 용액 결합 경쟁 ELISA 분석 또는 스팟(spot) 경쟁 분석을 통해 친화도에 대해 스크리닝할 수 있다. 상기 기재한 바와 같이 제조된 XYZ 코돈 세트를 사용하여, 라이브러리로부터 고친화도 결합제를 단리할 수 있다. 이러한 결합제는 세포 배양에서 높은 수율의 항체 또는 항원 결합 단편으로서 쉽게 생성될 수 있다.
일부 실시양태에서, CDRH3 영역 길이에서의 다양성이 더 큰 라이브러리를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 약 7개 내지 19개 아미노산 범위의 CDRH3 영역이 있는 라이브러리를 생성하는 것이 바람직할 수 있다.
이러한 실시양태의 라이브러리로부터 단리된 고친화도 결합제는 박테리아 및 진핵 세포 배양에서 높은 수율로 쉽게 생성된다. gD 태그, 바이러스 외피 단백질 성분 서열과 같은 서열을 쉽게 제거하고/하거나 불변 영역 서열을 포함하도록 벡터를 디자인하여 전장 항체 또는 항원 결합 단편을 높은 수율로 생성할 수 있다.
CDRH3 내에 돌연변이가 있는 라이브러리가 다른 CDR, 예를 들어 CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1 및/또는 CDRH2의 변이체 버전을 함유하는 라이브러리와 조합될 수 있다. 따라서, 예를 들어 한 실시양태에서는, CDRH3 라이브러리가 소정의 코돈 세트를 사용하여 위치 28, 29, 30, 31 및/또는 32에 변이체 아미노산이 있는 인간화 4D5 항체 서열과 관련하여 생성된 CDRL3 라이브러리와 조합된다. 또다른 실시양태에서, CDRH3에 대한 돌연변이가 있는 라이브러리가 변이체 CDRH1 및/또는 CDRH2 중쇄 가변 도메인을 포함하는 라이브러리와 조합될 수 있다. 한 실시양태에서, 위치 28, 30, 31, 32 및 33에 변이체 아미노산이 있는 인간화 항체 4D5 서열을 갖는 CDRH1 라이브러리가 생성된다. 소정의 코돈 세트를 사용하여 위치 50, 52, 53, 54, 56 및 58에 변이체 아미노산이 있는 인간화 항체 4D5의 서열을 갖는 CDRH2 라이브러리가 생성될 수 있다.
파지 라이브러리로부터 생성된 항-C3b 항체를 추가로 변형시켜, 모 항체에 비해 물리적, 화학적 및/또는 생물학적 성질이 개선된 항체 돌연변이체를 생성시킬 수 있다. 이용된 분석법이 생물학적 활성 분석법인 경우, 항체 돌연변이체는 선택된 분석법에서의 생물학적 활성이 그 분석법에서의 모 항체의 생물학적 활성보다 약 10배 이상 더 양호하고, 바람직하게는 약 20배 이상 더 양호하며, 더욱 바람직하게는 약 50배 이상 더 양호하고, 종종 약 100배 또는 200배 이상 더 양호한 것이 바람직하다. 예를 들어, 항-C3b 항체 돌연변이체는 C3b에 대한 결합 친화도가 모 항-C3b 항체, 예컨대 항체 S77의 결합 친화도보다 약 10배 이상 더 강하고, 바람직하게는 약 20배 이상 더 강하며, 더욱 바람직하게는 약 50배 이상 더 강하고, 종종 약 100배 또는 200배 이상 더 강한 것이 바람직하다.
항체 돌연변이체를 생성하기 위해서 1개 이상의 아미노산 변경 (예를 들어 치환)이 모 항체의 1개 이상의 초가변 영역에 도입된다. 대체적으로 또는 추가로, 프레임워크 영역 잔기 중 1개 이상의 변경 (예를 들어 치환)이 모 항체에 도입될 수 있고, 이는 제2 포유동물 종으로부터의 항원에 대한 항체 돌연변이체의 결합 친화도를 개선시킨다. 변형시킬 프레임워크 영역 잔기의 예는 항원에 비-공유결합적으로 직접 결합하는 것 (문헌 [Amit et al. (1986) Science 233:747-753]), CDR과 상호작용하거나 그의 형태에 영향을 주는 것 (문헌 [Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917]), 및/또는 VL - VH 계면에 참여하는 것 (EP 239 400 B1)들을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이러한 프레임워크 영역 잔기 중 1개 이상의 변형은 제2 포유동물 종으로부터의 항원에 대한 항체의 결합 친화도를 강화시킨다. 예를 들어, 약 1개 내지 약 5개의 프레임워크 잔기가 본 발명의 이러한 실시양태에서 변경될 수 있다. 때때로, 이는, 초가변 영역 잔기 중 그 어느 것도 변경되지 않은 경우라 하더라도 임상전 실험에 사용하기에 적힙한 항체 돌연변이체를 생성시키는데 충분할 수 있다. 그러나, 일반적으로, 항체 돌연변이체는 추가의 초가변 영역 변경(들)을 포함할 것이다.
변경되는 초가변 영역 잔기는, 특히 모 항체의 출발 결합 친화도가 이러한 랜덤하게 생성된 항체 돌연변이체가 쉽게 스크리닝될 수 있도록 하는 경우에 랜덤하게 변화될 수 있다.
이러한 항체 돌연변이체를 생성시키는데 유용한 절차 중 하나는 "알라닌-스캐닝 돌연변이유발"이라 불린다 (문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science 244:1081-1085]). 여기서는 초가변 영역 잔기(들) 중 1개 이상을 알라닌 또는 폴리알라닌 잔기(들)로 대체하여, 제2 포유동물 종으로부터의 항원과 상기 아미노산의 상호작용에 영향을 미친다. 이후, 치환 부위에서 또는 치환 부위에 대해 추가의 또는 다른 돌연변이를 도입하여, 치환에 대해 기능적 감수성을 나타내는 초가변 영역 잔기(들)을 정립한다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입할 부위는 예정되어 있지만, 돌연변이 그 자체의 특징이 예정될 필요는 없다. 이러한 방식으로 생성된 ala-돌연변이체를 본원에 기재된 바와 같이 이의 생물학적 활성에 대해 스크리닝한다.
일반적으로, 보존적 치환, 예컨대 하기 표에서 "바람직한 치환"이라는 표제하에 제시된 것들로 치환이 시작될 것이다. 이러한 치환으로 인해 생물학적 활성 (예를 들어 결합 친화도)이 변화되면, 이후에는 하기 표에서 "예시적 치환"이라 표시하거나 아미노산 클래스와 관련하여 하기에 추가로 기재하는 바와 같은 더욱 실질적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝한다. 바람직한 치환을 하기 표에 나열한다:
Figure pat00001
항체의 생물학적 성질에 있어서의 훨씬 더욱 실질적인 변형은, (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 주쇄의 구조를 예를 들어 시트 또는 나선 형태로 유지하거나, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성을 유지하거나, 또는 (c) 측쇄의 벌크(bulk)를 유지하는데 미치는 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택하여 수행된다. 천연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 성질에 따라 하기와 같은 군으로 나뉜다:
(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile,
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr, asn, gin,
(3) 산성: asp, glu,
(4) 염기성: his, lys, arg,
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro, 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 이들 클래스 중 하나의 구성원을 다른 클래스로 교환하는 것이다.
또다른 실시양태에서, 변형을 위해 선택된 부위를 파지 디스플레이 (상기 참조)를 사용하여 친화도 성숙시킨다.
아미노산 서열 돌연변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조된다. 이러한 방법은 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위-지정) 돌연변이유발법, PCR 돌연변이유발법, 및 모 항체의 앞서 제조된 돌연변이체 또는 비-돌연변이체 버전의 카세트 돌연변이유발법을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 돌연변이체를 제조하는 바람직한 방법은 부위-지정 돌연변이유발법이다 (예를 들어, 문헌 [Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488] 참조).
특정 실시양태에서, 항체 돌연변이체에서 단일 초가변 영역 잔기만이 치환될 것이다. 또다른 실시양태에서, 모 항체의 초가변 영역 잔기 중 2개 이상이 치환될 것이고, 예를 들어 약 2개 내지 약 10개의 초가변 영역 치환이 있을 것이다.
통상적으로, 생물학적 성질이 개선된 항체 돌연변이체는 모 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성이 75％ 이상, 더욱 바람직하게는 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 85％ 이상, 더욱 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상인 아미노산 서열을 가질 것이다. 본원에서, 이러한 서열에 관한 동일성 또는 유사성은, 서열을 정렬하고 필요에 따라서는 최대 서열 동일성(％)을 달성하기 위한 갭을 도입한 후에 후보 서열에서 모 항체 잔기와 동일한 아미노산 잔기 (즉, 동일 잔기) 또는 유사한 아미노산 잔기 (즉, 공통적인 측쇄 성질을 기초로 할 때 동일 군에 속하는 아미노산 잔기 (상기 참조))의 백분율(％)로서 정의된다. N-말단, C-말단 또는 내부의 연장, 결실, 또는 가변 도메인 바깥쪽 항체 서열로의 삽입 중 그 어느 것도 서열 동일성 또는 유사성에 영향을 미치는 것으로 해석되지 않아야 한다.
항체 돌연변이체의 생성 후, 이러한 분자의 생물학적 활성을 모 항체와 비교하여 결정한다. 상기 언급된 바와 같이, 이는 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 활성을 결정하는 것을 수반할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 항체 돌연변이체들의 패널을 제조하여, C3b와 같은 항원 또는 이의 단편에 대한 결합 친화도에 대해 스크리닝한다. 이러한 초기 스크리닝으로부터 선별된 1종 이상의 항체 돌연변이체에 1종 이상의 추가의 생물학적 활성 분석법을 임의로 적용하여, 결합 친화도가 강화된 항체 돌연변이체(들)이 예를 들어 임상전 연구에서 실제로 유용한지 여부를 확인한다.
이와 같이 하여 선별된 항체 돌연변이체(들)에 종종 항체의 의도된 용도에 따라 추가의 변형을 적용할 수 있다. 이러한 변형은 아미노산 서열의 추가의 변경, 이종 폴리펩티드(들)에 대한 융합 및/또는 공유 변형, 예컨대 하기 상술하는 것들을 포함할 수 있다. 아미노산 서열 변경과 관련하여, 예시적인 변형이 상기에 상술되어 있다. 예를 들어, 항체 돌연변이체의 적절한 형태를 유지하는데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기가 또한 일반적으로는 세린으로 치환되어, 분자의 산화 안정성을 개선시키고 이상(aberrant) 가교를 방지할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)이 항체에 부가되어 이의 안정성을 개선시킬 수 있다 (특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우). 아미노산 돌연변이체의 또다른 유형에서는 글리코실화 패턴이 변경된다. 이는 항체에 존재하는 1개 이상의 탄수화물 부분을 결실시키고/시키거나 항체에 존재하지 않는 1개 이상의 글리코실화 부위를 부가함으로써 달성될 수 있다. 항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 탄수화물 부분이 아스파라진 잔기의 측쇄에 부착된 것을 나타낸다. 트리펩티드 서열 아스파라진-X-세린 및 아스파라진-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 부분을 아스파라진 측쇄에 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이러한 트리펩티드 서열 중 하나가 폴리펩티드에 존재하면 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나가 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착된 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신이 이용될 수도 있다. 항체로의 글리코실화 부위의 부가는, 상기한 트리펩티드 서열을 1개 이상 함유하도록 아미노산 서열을 변경시켜서 편리하게 달성된다 (N-연결 글리코실화 부위의 경우). 변경은 원래 항체의 서열에 대한 1개 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 달성될 수도 있다 (O-연결 글리코실화 부위의 경우).
파지 디스플레이에 의한 C3b 항체의 제조, 선별, 풍부화 및 친화도 성숙에 대한 추가의 상세한 내용은 아래 실시예에 제공된다.
C3b 항체의 재조합 생성
본 발명의 항-C3b 항체는 쉽게 이용가능한 기술 및 물질을 사용하여 재조합 방식으로 생성될 수 있다.
항-C3b 항체의 재조합 생성을 위해서, 이것을 코딩하는 핵산을 단리하여 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능한 벡터로 삽입한다. 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 이용 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용)하여 쉽게 단리 또는 합성된다. 여러 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 다음 중 1종 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 1종 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열.
(i) 신호 서열 성분
본 발명의 항체는 재조합 방식으로 직접 생성될 수도 있고, 또한 바람직하게는 신호 서열, 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드인 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합 방식으로 생성될 수 있다. 바람직하게는, 선택된 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단됨)되는 것이다. 천연 항체 신호 서열을 인식하고 프로세싱하지 못하는 원핵 숙주 세포의 경우에는, 상기 신호 서열이 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열-안정성 장독소 II 리더의 군에서 선택된 원핵 신호 서열로 치환된다. 효모 분비를 위해서는, 천연 신호 서열이 예를 들어 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) α-인자 리더를 포함함) 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 WO 90/13646에 기재된 신호로 치환될 수 있다. 포유동물 세포 발현시에는 포유동물 신호 서열 뿐만이 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 포진 gD 신호를 이용할 수도 있다. 이러한 전구체 영역을 위한 DNA는 항체를 코딩하는 DNA에 리딩 프레임에 맞게 라이게이션된다.
(ii) 복제 기점 성분
발현 벡터와 클로닝 벡터는 둘다 벡터가 1종 이상의 선택된 숙주 세포 내에서 복제할 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서는 상기 서열이 벡터가 숙주의 염색체 DNA와 독립적으로 복제될 수 있게 하는 것이고, 복제 기점 또는 자율 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람(Gram)-음성 박테리아에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 접합하며, 여러 바이러스 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)의 기점은 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 포유동물 발현 벡터에는 복제 기점 성분이 필요하지 않다 (SV40 기점이 전형적으로 사용될 수 있는데, 이는 이것이 단지 조기 프로모터를 함유하기 때문임).
(iii) 선별 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선별가능한 마커라고도 불리는 선별 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 단백질을 코딩하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보충하는 단백질을 코딩하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요 영양분을 공급하는 단백질을 코딩 (예를 들어, 바실러스(Bacilli)의 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자)한다.
선별법의 일례는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 사용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생성하기 때문에 이러한 선별에서 생존한다. 이러한 우세 선별의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 하이그로마이신을 사용한다.
포유동물 세포에 적합한 선별가능한 마커의 또다른 예는 항체 핵산, 예를 들어 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등을 흡수하는데 감응성인 세포를 확인할 수 있게 하는 것이다.
예를 들어, DHFR 선별 유전자로 형질전환된 세포는 우선 모든 형질전환체를 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지 중에서 배양하여 확인된다. 야생형 DHFR이 사용되는 경우에 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포주이다.
대체적으로, 항체, 야생형 DHFR 단백질, 및 또다른 선별가능한 마커, 예컨대 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환 또는 동시 형질전환된 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 선별가능한 마커에 대한 선별제, 예를 들어 아미노글로코시드 항생제, 예를 들어 카나마이신, 네오마이신 또는 G418을 함유하는 배지 중에서의 세포 성장으로 선별될 수 있다. 미국 특허 제4,965,199호를 참조한다.
효모에서 사용하기에 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (문헌 [Stinchcomb et al. (1979) Nature 282:39]). trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 없는 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC 44076 또는 PEP4-1을 위한 선별 마커를 제공한다 (문헌 [Jones (1977) Genetics 85:12]). 효모 숙주 세포 게놈에 trp1 손상이 존재하는 경우에는 트립토판 없이 성장시켜서 형질전환을 검출하는데 효과적인 환경이 제공된다. 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 보유하는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.
추가로, 1.6 ㎛ 원형 플라스미드 pKD1로부터 유래된 벡터는 클루이베로마이세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 대체적으로, 재조합 송아지 카이모신의 대규모 생성을 위한 발현 시스템이 케이. 락티스(K. lactis)에 대하여 보고되었다 (문헌 [Van den Berg (1990) Bio/Technology 8:135]). 클루이베로마이세스의 산업적 균주에 의해 성숙 재조합 인간 혈청 알부민이 분비되게 하는 안정적인 다수-카피 발현 벡터도 개시된 바 있다 (문헌 [Fleer et al. (1991) Bio/Technology 9:968-975]).
(iv) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 항체 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예컨대 tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지의 박테리아 프로모터가 적합하다. 박테리아 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한 항체를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno, S.D.) 서열도 함유한다.
진핵생물을 위한 프로모터 서열이 공지되어 있다. 실제로 모든 진핵 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25개 내지 30개 염기 상류에 위치한 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 출발부로부터 70개 내지 80개 염기 상류에 존재하는 또다른 서열은 CNCAAT 영역 (여기서, N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있음)이다. 대부분의 진핵 유전자의 3' 말단에는 폴리 A 테일이 코딩 서열의 3' 말단에 부가되도록 하는 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 존재한다. 이러한 서열 모두가 진핵 발현 벡터에 적합하게 삽입된다.
효모 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 전사가 제어된다는 추가의 이점을 갖는 유도가능한 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련이 있는 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 사용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다. 효모 인핸서는 또한 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 항체 전사는, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 가장 바람직하게는 시미안 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터, 열-충격 프로모터로부터 수득된 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용가능한 경우에는 이러한 프로모터에 의해 제어된다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점도 함유하는 SV40 제한 단편으로 편리하게 수득된다. 인간 사이토메갈로바이러스의 극초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 소 유두종 바이러스를 벡터로 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현시키는 시스템은 미국 특허 제4,419,446호에 개시되어 있다. 상기 시스템에 대한 변형은 미국 특허 제4,601,978호에 기재되어 있다. 또한, 마우스 세포에서 단순 포진 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어를 받는 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 대하여는 문헌 [Reyes et al. (1982) Nature 297:598-601]을 참조한다. 대체적으로, 라우스 육종 바이러스 장쇄 말단 반복부가 프로모터로 사용될 수도 있다.
(v) 인핸서 요소 성분
본 발명의 항체를 코딩하는 DNA의 고등 진핵생물에 의한 전사는 인핸서 서열을 벡터에 삽입하면 종종 증가된다. 현재, 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린)로부터의 많은 인핸서 서열이 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로는 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 이것의 예는, 복제 기점의 뒤쪽 (bp 100 내지 270)에 존재하는 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 뒤쪽에 존재하는 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 요소에 대하여는 문헌 [Yaniv (1982) Nature 297:17-18]을 참조한다. 인핸서는 항체-코딩 서열에 대한 위치 5' 또는 3'에서 벡터로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터의 부위 5'에 위치한다.
(vi) 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에서 사용되는 발현 벡터는 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열도 함유할 것이다. 이러한 서열은 일반적으로 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3' 비-번역 영역으로부터 이용가능하다. 이들 영역은 항체를 코딩하는 mRNA의 비-번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로 전사된 뉴클레오티드 세그먼트를 함유한다. 한 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO 94/11026 및 그에 개시된 발현 벡터를 참조한다.
(vii) 숙주 세포의 선별 및 형질전환
본원에서 벡터의 DNA를 클로닝하거나 발현시키는데 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모, 또는 상기한 고등 진핵 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물은 진정박테리아, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 장내박테리아(Enterobacteriaceae), 예컨대 에쉐리키아(Escherichia), 예컨대 에쉐리키아 콜라이(E. coli), 엔테로박테르(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 쉬겔라(Shigella) 뿐만이 아니라 바실러스, 예컨대 바실러스 섭틸리스(B. subtilis) 및 바실러스 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710에 개시된 바실러스 리케니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대 슈도모나스 아에루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 한 바람직한 에쉐리키아 콜라이 클로닝 숙주는 에쉐리키아 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 에쉐리키아 콜라이 B, 에쉐리키아 콜라이 X1776 (ATCC 31,537) 및 에쉐리키아 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)과 같은 다른 숙주도 적절하다. 이러한 예들은 제한적인 것이 아니라 예시적이다.
원핵생물 뿐만이 아니라, 진핵 미생물, 예컨대 섬유상 진균 또는 효모 역시 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상적인 제빵 효모가 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스 숙주, 예를 들어 클루이베로마이세스 락티스(K. lactis), 클루이베로마이세스 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), 클루이베로마이세스 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 클루이베로마이세스 위케라미이(K. wickeramii) (ATCC 24,178), 클루이베로마이세스 왈티이(K. waltii) (ATCC 56,500), 클루이베로마이세스 드라소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 클루이베로마이세스 테르모톨레란스(K. thermotolerans) 및 클루이베로마이세스 마르크시아누스(K. marxianus); 야로위아(Yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레시아(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈완니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들어 슈완니오마이세스 옥시덴탈리스(Schanniomyces occidentalis); 및 섬유상 진균, 예를 들어 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주, 예를 들어 아스페르길루스 니둘란스(A. nidulans) 및 아스페르길루스 니게르(A. niger)와 같은 수많은 다른 속, 종 및 균주가 통상적으로 이용가능하고 본원에서 유용하다.
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 수많은 바쿨로바이러스 균주 및 변이체, 및 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (모충), 아에데스 아에깁티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스테르(Drosophila melanogaster) (과일파리) 및 봄바익스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 상응하는 증식허용성 곤충 숙주 세포가 확인되어 있다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄바익스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 입수가능하며, 이러한 바이러스들은, 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해서 본 발명에 따라 본원에서의 바이러스로 사용될 수 있다. 목화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물 또한 숙주로서 사용될 수 있다.
그러나, 척추동물 세포에 가장 관심이 있고, 척추동물 세포의 배양 (조직 배양)에 의한 증식은 일상적인 절차가 되어 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 배아 신장 세포주 (293 세포 또는 현탁 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포 (문헌 [Graham et al. (1977) J. Gen Virol. 36:59]), 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10), 차이니스 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, 문헌 [Urlaub et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216]), 마우스 세르톨리(sertoli) 세포 (TM4, 문헌 [Mather (1980) Biol. Reprod. 23:243-251]), 원숭이 신장 세포 (CV1, ATCC CCL 70), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587), 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2), 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34), 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442), 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065), 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL 51), TRI 세포 (문헌 [Mather et al. (1982) Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68]), MRC 5 세포, FS4 세포, 및 인간 간세포암 세포주 (Hep G2)이다.
숙주 세포를 항체 생성을 위한 상기 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환하고, 적절하다면 프로모터 유도, 형질전환체 선별 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자의 증폭을 위해 변형시킨 통상적인 영양 배지에서 배양한다.
(viii) 숙주 세포의 배양
본 발명의 항체를 생성하는데 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 시판되는 배지, 예컨대 햄(Ham) F10 (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM (Minimal Essential Medium)) (시그마), RPMI-1640 (시그마), 및 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)) (시그마)가 숙주 세포 배양에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al. (1979) Meth. Em. 58:44], [Barnes et al. (1980) Anal. Biochem. 102:255], 미국 특허 제4,767,704호, 동 제4,657,866호, 동 제4,927,762호, 동 제4,560,655호 또는 동 제5,122,469호, WO 90/03430, WO 87/00195 또는 미국 특허 Re.30,985에 기재된 배지 중 임의의 것을 숙주 세포를 위한 배양 배지로 사용할 수 있다. 임의의 이러한 배지에는 필요에 따라 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예를 들어 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예를 들어 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예를 들어 HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들어 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어 젠타마이신(GENTAMYCIN)™ 약물), 미량 원소 (일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지 공급원이 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물이 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수도 있다. 온도, pH 등의 배양 조건은 발현을 위해 선택한 숙주 세포와 함께 기존에 사용된 것들이고, 당업자에게 명백할 것이다.
(ix) 항체 정제
재조합 기술을 사용하는 경우, 항체는 세포 내에서 생성되거나, 원형질막주위 공간 내에서 생성되거나, 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생성되는 경우에는 첫번째 단계로서 숙주 세포 또는 용해된 단편인 입상물질 잔해물을 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다. 문헌 [Carter et al. (1992) Bio/Technology 10:163-167]은 에쉐리키아 콜라이의 원형질막주위 공간으로 분비된 항체를 단리하는 절차를 기재한다. 간략하게 설명하면, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재하에 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 잔해물은 원심분리로 제거할 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우에는 이러한 발현 시스템으로부터의 상등액을 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 장치로 우선 농축하는 것이 일반적이다. 단백질분해를 억제하기 위해 PMSF와 같은 프로테아제 억제제가 임의의 이전 단계에서 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해서 항생제가 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물을, 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있고, 친화도 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화도 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형(isotype)에 따라 달라진다. 단백질 A를 사용하면 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기초로 하여 항체를 정제할 수 있다 (문헌 [Lindmark et al. (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13]). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 권장된다 (문헌 [Guss et al. (1986) EMBO J. 5:1567-1575]). 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 거의 대부분 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정적인 매트릭스, 예컨대 제어형 다공성 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 유속을 더 빠르게 하고 처리 시간을 더 짧게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우에는 베이커본드(Bakerbond) ABX™ 수지 (미국 뉴저지주 필립스버그 소재의 제이. 티. 베이커(J. T. Baker))가 정제에 유용하다. 회수될 항체에 따라 다른 단백질 정제 기술, 예컨대 이온-교환 컬럼에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카에서의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스(SEPHAROSE)™에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어 폴리아스파르트산 컬럼)에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전을 이용할 수도 있다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물로 pH 약 2.5 내지 4.5 사이의 용출 완충제를 사용하는, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어 약 0 내지 0.25 M 염)에서 수행되는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피를 실시할 수 있다.
C3b 항체 및 다른 C3b 길항제를 확인하기 위한 스크리닝 분석 및 동물 모델
C3b 항체 및 다른 C3b 길항제는 다양한 시험관내 및 생체내 분석에서 이들이 대체적 보체 경로를 선택적으로 억제하는 능력 및 보체-관련 장애를 예방 및 치료하는 능력에 대해 평가될 수 있다.
시험관내 분석, 예컨대 결합 및 경쟁 결합 분석, 용혈반응 분석은 실시예에 기재되어 있다.
본원의 C3b 길항제, 예컨대 C3b 항체의 치료 활성은 관련 동물 모델에서 시험할 수 있다. 따라서, 예를 들어 재조합 (트랜스제닉) 동물 모델은 트랜스제닉 동물을 생성하는 표준 기술을 이용하여 관심 유전자의 코딩 부분을 관심 동물의 게놈 내로 도입하여 유전자조작될 수 있다. 트랜스제닉 조작에 대한 표적으로 기능할 수 있는 동물은 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 양, 염소, 돼지, 및 비-인간 영장류, 예를 들어 개코원숭이, 침팬지 및 기타 원숭이를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 트랜스진(transgene)을 이러한 동물로 도입하는 당업계 공지의 기술은 전핵 미세주입(pronucleic microinjection) (미국 특허 제4,873,191호 (Hoppe and Wanger)); 배선으로의 레트로바이러스-매개 유전자 전달 (예를 들어, 문헌 [Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 (1985)]); 배아 줄기 세포에서의 유전자 표적화 (문헌 [Thompson et al., Cell 56, 313-321 (1989)]); 배아의 전기천공 (문헌 [Lo, Mol. Cell. Biol. 3, 1803-1814 (1983)]); 정자-매개 유전자 전달 (문헌 [Lavitrano et al., Cell 57, 717-73 (1989)])을 포함한다. 검토를 위해서는 예를 들어 미국 특허 제4,736,866호를 참조한다.
본 발명의 목적상, 트랜스제닉 동물은 오직 세포 일부에만 트랜스진을 보유하는 동물 ("모자이크 동물")을 포함한다. 트랜스진은 단일 트랜스진으로 통합될 수도 있고, 또는 콘카타머(concatamer), 예를 들어 헤드-헤드 또는 헤드-테일 병렬식으로 통합될 수도 있다. 특정 세포 유형으로의 트랜스진의 선택적 도입은 또한 예를 들어 문헌 [Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 623-636 (1992)]의 기술에 따라서도 가능하다.
트랜스제닉 동물에서 트랜스진의 발현은 표준 기술로 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 써던 블롯 분석 또는 PCR 증폭을 이용하여 트랜스진의 통합을 입증할 수 있다. 이후, mRNA 발현 수준을 계내 혼성화, 노던 블롯 분석, PCR 또는 면역세포화학과 같은 기술을 이용하여 분석할 수 있다.
동물을 예를 들어 면역 세포의 특정 조직으로의 침윤을 결정하기 위한 조직학적 검사를 통해 면역 질환 병리의 징후에 대해 추가로 검사할 수 있다.
재조합 (트랜스제닉) 동물 모델은 트랜스제닉 동물 생성을 위한 표준 기술을 이용하여 대상 유전자의 코딩 부분을 대상 동물의 게놈에 도입시켜 조작할 수 있다. 트랜스제닉 조작에서 표적으로 제공될 수 있는 동물로는 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 양, 염소, 돼지 및 비-인간 영장류, 예를 들면 개코원숭이, 침팬지 및 기타 원숭이가 있으나 이에 한정되지는 않는다. 이러한 동물에 트랜스진을 동입하기 위한 당업계 공지의 기술로는 전핵 미량주사법 (호프(Hoppe) 및 웬저(Wanger)의 미국 특허 제4,873,191호); 배선 세포로의 레트로바이러스-매개된 유전자 전달 (예를 들면, 문헌 [Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 [1985]]); 배아 줄기 세포에서의 유전자 표적화 (문헌 [Thompson et al., Cell 56, 313-321 [1989]]); 배아의 전기천공법 (문헌 [Lo, Mol. Cell. Biol. 3, 1803-1814 [1983]]); 정자-매개된 유전자 전달 (문헌 [Lavitrano et al., Cell 57, 717-73 [1989]])이 있다. 검토를 위해, 예를 들어 미국 특허 제4,736,866호를 참조한다.
관절염의 예방 및/또는 치료에 있어서의 효능은, 예를 들어 콜라겐-유도된 관절염 모델에서 평가할 수 있다 (문헌 [Terato et al. Brit. J. Rheum. 35:828-838 (1966)]). 잠재적인 관절염 예방/요법이 또한 문헌 [Terato et al., J. Immunol. 148:2103-8 (1992)] 및 [Terato et al., Autoimmunity 22:137-47 (1995)]에 기재된 바와 같이, 4가지 모노클로날 항체의 칵테일의 정맥내 주사로 유도된 항체-매개 관절염 모델에서 스크리닝될 수 있다. 관절염의 예방 및/또는 치료를 위한 후보물질은 또한 트랜스제닉 동물 모델, 예를 들어 TNF-α 트랜스제닉 마우스 (타코닉; Taconic)에서 연구될 수 있다. 이들 동물은 인간 종양 괴사 인자 (TNF-α), 인간 류마티스성 관절염의 발병에 관여하는 사이토킨을 발현한다. 이들 마우스에서의 TNF-α 발현은 앞발 및 뒷발이 중증의 만성 관절염을 초래하며, 염증성 관절염의 단순한 마우스 모델을 제공한다.
최근 몇 년 동안, 건선의 동물 모델이 또한 개발되었다. 이에 따라 아세비아(Asebia) (ab), 플레이크성(flaky) 피부 (fsn) 및 만성 증식성 피부염 (cpd)은 건선-유사 피부 변형이 있는 자발성 마우스 돌연변이이다. 사이토킨, 예컨대 인터페론-γ, 인터루킨-1α, 각질형성세포 성장 인자, 형질전환 성장 인자-α, 인터페론-6, 혈관 내피 성장 인자, 또는 골 형태형성 단백질-6의 피부 과발현이 나타나는 트랜스제닉 마우스가 또한 생체내 건선 연구에 사용되어 건선 치료를 위한 요법을 확인할 수 있다. 건선-유사 병변은 또한 PL/J 종에 역-교배된 β2-인테그린 과다-형태 마우스, 및 CD4+/CD45RBhi T 림프구로 재구성된 scid/scid 마우스, β1-인테그린 트랜스제닉 마우스 뿐만 아니라, HLA-B27/hβ2m 트랜스제닉 래트에서 설명되었다. 면역결핍 마우스에 이식된 인간 피부를 사용하는 이종이식 모델이 또한 공지되어 있다. 따라서, 본 발명의 항체 및 다른 C3b 길항제는 문헌 [Schon, M. P. et al., Nat. Med. (1997) 3:183]에 기재된 scid/scid 마우스 모델에서 시험할 수 있으며, 여기서 상기 마우스는 건선과 닮은 조직병리학적 피부 병변을 입증한다. 다른 적합한 모델은 문헌 [Nickoloff, B. J. et al., Am. J. Path. (1995) 146:580]에 기재된 바와 같이 제조된 인간 피부/scid 마우스 키메라이다. 보다 자세한 내용은, 예를 들어 문헌 [Schon, M.P., J Invest Dermatology 112:405-410 (1999)]을 참조한다.
항원-유도된 기도 과민성, 폐 호산구증가증 및 염증이 동물을 오브알부민으로 감작화시킨 후에 이 동물을 에어로졸에 의해 전달된 동일한 단백질로 챌린징(challenging)함으로써 유도되는 천식 모델이 설명되어 있다. 여러 동물 모델 (기니아 피그, 래트, 비-인간 영장류)은 에어로졸 항원으로 챌린징시 인간에서 아토피성 천식과 유사한 징후를 나타내었다. 뮤린 모델은 많은 인간 천식 특징을 나타낸다. 천식 치료에서의 활성 및 효과에 대해 CRIg 및 CRIg 길항제를 시험하는데 적합한 절차는 문헌 [Wolyniec, W. W. et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. (1998) 18:777] 및 이에 인용된 참고 문헌에 기재되어 있다.
접촉 과민성은 세포 매개 면역 기능의 생체내 분석으로 간단하게 분석한다. 이 과정에서, 상피 세포는 측정되어 정량화된 지연형 과민성 반응을 일으키는 외인성 합텐(hapten)에 노출시킨다. 접촉 민감성은 초기 감작화 단계에 이어 도출 단계를 포함한다. 도출 단계는 상피 세포가 이전에 접촉했던 적이 있는 항원과 만날 때 유발된다. 여기서 종창 및 염증도 일어나는데, 이로써 인간 알레르기성 접촉성 피부염의 우수한 모델이 된다. 적합한 절차는 문헌 [Current Protocols in Immunology, Eds. J. E. Cologan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, John Wiley ＆ Sons, Inc., 1994, unit 4.2.] (또한 [Grabbe, S. and Schwarz, T, Immun. Today 19(1):37-44 (1998)] 참조)에 상세하게 기재되어 있다.
이식편-대-숙주 질환은 면역적격 세포가 면역억제된 또는 내성 환자에게 이식되었을 때 발생한다. 공여자 세포는 숙주 항원을 인식하여 이에 반응한다. 이 반응은 생명을 위협하는 심각한 염증으로부터 경미한 경우의 설사 및 체중 감소까지 다양할 수 있다. 이식편-대-숙주 질환 모델은 MHC 항원 및 소수의 이식 항원에 대한 T 세포 반응성을 평가하는 수단을 제공한다. 적합한 절차는 [Current Protocols in Immunology, 상기 문헌, unit 4.3]에 상세하게 기재되어 있다.
피부 동종이식편 거부반응에 대한 동물 모델은 지시적인 생체내 조직 파괴를 매개하는 T 세포의 능력을 시험하는 수단이며, 항-바이러스 및 종양 면역성에 있어 이들의 역할의 척도이다. 가장 흔히 허용되는 모델은 뮤린 테일-피부 이식편을 사용한다. 반복된 실험에서 피부 동종이식편 거부반응은 T 세포, 헬퍼 T 세포 및 킬러-이펙터 T 세포에 의해 매개되며, 항체에 의해 매개되지 않는 것으로 나타났다 (문헌 [Auchincloss, H. Jr. and Sachs, D. H., Fundamental Immunology, 2nd ed., W. E. Paul ed., Raven Press, NY, 1989, 889-992]). 적합한 절차는 [Current Protocols in Immunology, 상기 문헌, unit 4.4]에 상세하게 기재되어 있다. CRIg 및 CRIg 효능제를 시험하는데 이용될 수 있는 다른 이식 거부반응 모델은, 문헌 [Tanabe, M. et al., Transplantation (1994) 58:23] 및 [Tinubu, S. A. et al., J. Immunol. (1994) 4330-4338]에 기재된 동종 심장 이식 모델이다.
지연형 과민성에 대한 동물 모델은 또한 세포 매개 면역 기능의 분석을 제공한다. 지연형 과민성 반응은 항원으로 챌린징한 후에 소정의 기간이 지난 후에도 최대치에 도달하지 않은 염증을 특징으로 하는 생체내 면역 반응에서 T-세포 매개된다. 이러한 반응은 또한 조직 특이적 자가면역 질환, 예컨대 다발성 경화증 (MS) 및 실험적 자가면역성 뇌척수염 (EAE, MS에 대한 모델)에서 발생한다. 적합한 절차는 [Current Protocols in Immunology, 상기 문헌, unit 4.5]에 상세하게 기재되어 있다.
EAE는 T 세포 및 단핵 세포 염증 및 이후의 중추 신경계의 액손의 탈수초화를 특징으로 하는 T 세포 매개-자가면역 질환이다. EAE는 일반적으로 인간의 MS에 대한 관련 동물 모델로 여겨진다 (문헌 [Bolton, C, Multiple Sclerosis (1995) 1:143]). 급성 및 재발-완화 모델이 둘다 개발되었다. CRIg 및 그의 효능제 및 길항제는 [Current Protocols in Immunology, 상기 문헌, units 15.1 and 15.2]에 기재된 프로토콜을 이용하여 면역 매개 탈수초성 질환에 대한 T 세포 자극 또는 억제 활성에 대해 평가할 수 있다. 또한, 문헌 [Duncan, I. D. et al., Molec. Med. Today (1997) 554-561]에 기재된 바와 같은, 희소돌기아교세포 또는 슈반(Schwann) 세포가 중추 신경계에 이식된 수초 질환에 대한 모델을 참조한다.
심근 허혈-재관류 모델은 마우스 또는 래트에서 만들 수 있다. 동물을 기관절개하고, 작은 동물용 산소 호흡기로 산소를 공급한다. 폴리에틸렌 카테터를 평균 동맥 혈압 측정을 위해 내경 동맥 및 외경 정맥에 설치한다. 심근 허혈 재관류는 좌전하행동맥 (LAD)를 6-O 봉합으로 묶어 개시시킨다. 허혈은 LAD 주위를 양면 봉합사로 단단히 조여 혈관을 완전히 막아 발생시킨다. 봉합사를 30 분 후에 제거하고, 심장을 4 시간 동안 재관류시킨다. CRIg 및 CRIg 효능제는 항 C3 항체를 사용하여 심장 경색 크기, 심장 크레아틴 키나제 활성, 마이엘로퍼록시다제 활성 및 면역조직화학을 측정함으로써 이들의 효능에 대해 시험할 수 있다.
당뇨병성 망막증의 모델은 스트렙토조토신이 있는 마우스 또는 래트의 치료와 관련이 있다. CRIg 및 CRIg 효능제는 소정맥 확장, 망막내 미세혈관 이상, 및 망막 및 유리체강의 신혈관형성에 대한 이들의 효과에 대해 시험할 수 있다.
막증식성 사구체신염에 대한 모델은 다음과 같이 세워질 수 있다: 암컷 마우스를 CFA에서 0.5 mg 대조군 토끼 IgG로 복강내 면역화시킨다 (제-7일). 7일 후에 (제0일), 1 mg의 토끼 항-마우스 사구체 기저막 (GBM) 항체를 테일 정맥을 통해 정맥내 주사한다. 혈청에서 항-토끼 IgG 항체의 상승을 ELISA로 측정한다. 대사 사육 우리에서 마우스로부터 24-h 소변 샘플을 수집하고, 혈중 요소 질소 이외에도 뇨 단백질을 측정하여 마우스 신장 기능을 평가한다.
노화-관련 황반 변성 (AMD)의 동물 모델은 Ccl-2 또는 Ccr-2 유전자에서 널(null) 돌연변이를 갖는 마우스로 이루어진다. 이들 마우스에서는 망막 색소 상피 (RPE) 내의 리포푸신 및 그 아래의 결정체 축적, 광수용체 위축증 및 맥락막 신혈관형성 (CNV)을 비롯한 AMD의 중요한 특징이 발생한다. 이들 특징은 생후 6개월을 지나 발생한다. CRIg 및 CRIg 효능제는 결정체 형성, 광수용체 위축증 및 맥락막 신혈관형성에 대해 시험할 수 있다.
CNV는 레이저-유도된 맥락막 신혈관형성의 다양한 모델에서 시험할 수 있다. 따라서, 예를 들어 CNV는 맥락막 신혈관형성을 초래하는 강한 레이저 광응고에 의해 래트 및 사이노몰거스(cynomolgus) 원숭이에서 유도할 수 있다. 상기 병태의 진행 및 치료는, 예를 들어 상이한 시간 간격으로 치료 전과 후에 동물로부터 수집한 혈청의 약동학, 조혈 반응, 항체 스크리닝 및 보체 활성화 분석, 및 형광 혈관조영술, 조직병리학 및 면역조직화학 평가에 의해 평가할 수 있다. 예방적 투여의 효능은 형광 혈관조영술에 의해 혈관 누수, 레이저 화상 부위에서 보체 축적 억제 모니터링, 눈 검사, 대안 사진촬영, 유리체 및 망막 조직의 수확 등을 비롯한 유사한 방법에 의해 모니터링할 수 있다. 보다 상세한 내용은 아래 실시예에 제공되어 있다.
치료 방법
중증의 보체-관련 장애의 예방, 치료 또는 경감을 위해, 본 발명의 화합물의 적절한 투여량은 치료될 장애의 유형 (상기 정의된 바와 같음), 장애의 중증도 및 과정, 제제가 예방 목적으로 투여되는지 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 이전 치료, 환자의 임상 병력 및 화합물에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 화합물은 환자에게 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 적합하게 투여된다. 바람직하게는, 투여량-반응 곡선 및 본 발명의 제약 조성물을 우선 인간에서 시험하기 전에 시험관내에서, 이후에 유용한 동물 모델에서 결정하는 것이 바람직할 수 있다.
예를 들어, 질환의 유형 및 중증도에 따라, 항-C3b 항체 또는 다른 C3b 길항제 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들면, 0.1 내지 20 mg/kg)가 환자에게 투여하기 위한 처음 후보 투여량이며, 이는 예를 들어 1회 이상의 독립적인 투여에서나 또는 연속적 주입에서나 동일하다. 통상적인 일일 투여량은 상기 언급된 요인에 따라 약 1 ㎍/kg에서 100 mg/kg 또는 그 이상으로 달라질 수 있다. 병태에 따라 수일 이상 동안 반복하여 투여하는 경우, 치료는 목적하는 질환 징후의 억제가 일어날 때까지 지속된다. 그러나, 다른 투여 처방이 유용할 수도 있다. 상기 치료의 진행은 통상적인 기술 및 분석에 의해 쉽게 모니터링된다.
보체-관련 안구 병태, 예컨대 AMD 또는 CNV의 치료 효능은 안내 질환을 평가하는데 흔히 사용되는 다양한 종말점에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 시력 상실이 평가될 수 있다. 시력 상실은, 예를 들면 기준 시점에서 원하는 시점까지 (예를 들면, BCVA가 초기 처치 당뇨병성 망막증 연구 (ETDRS) 시력 차트 및 4 미터의 시험 거리에서의 평가에 기초하는 경우) 최상의 교정 시력 (BCVA)의 평균 변화를 측정하거나, 기준에 비해 원하는 시점에서 15개 미만의 문자를 잃는 시력을 갖는 대상체의 비율을 측정하거나, 기준에 비해 원하는 시점에서 15개 이상의 문자를 얻는 시력을 갖는 대상체의 비율을 측정하거나, 원하는 시점에 20/2000 또는 이보다 나쁜 스넬렌(Snellen) 시력을 갖는 대상체의 비율을 측정하거나, NEI 시각적 기능 설문 평가(Visual Functioning Questionnaire)를 수행하거나, 원하는 시점에, 예를 들면 형광 혈관조영술로 CNV의 크기 및 CNV 누출량을 측정하여 (이에 한정되지는 않음) 평가될 수 있다. 예를 들면, 눈 검사 수행, 안압 측정, 시력 평가, 세극등 압력 측정, 안내 염증 평가 등을 비롯한 눈 평가를 수행할 수 있다.
제약 조성물
본 발명의 C3b 항체 및 다른 C3b 길항제는 보체-관련 장애의 치료를 위해 제약 조성물의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 C3b 항체 또는 다른 길항제의 치료 제제는, 원하는 정도의 순도를 갖는 활성 분자를 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합함으로써 동결건조 제제 또는 수용액제 형태로 보관하도록 제조된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비-독성이고, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충제; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기)의 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
또한, 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편을 세포로 전달하는데 리포펙션(lipofection) 또는 리포좀이 사용될 수도 있다. 항체 단편이 사용되는 경우에는 표적 단백질의 결합 단백질에 특이적으로 결합하는 최소의 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변 영역 서열을 기초로 하여 표적 단백질 서열과의 결합 능력을 보유하는 펩티드 분자를 디자인할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성되고/되거나 재조합 DNA 기술로 생성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)] 참조).
콜로이드상 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 미세에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 거대에멀젼 중에 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합을 이용하여 제조된 미세캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미세캡슐에 활성 분자를 포획할 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
지속 방출형 제제가 제조될 수 있다. 지속 방출형 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반-투과가능한 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 미세캡슐의 형태이다. 지속 방출형 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 γ에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 분해가능하지 않은 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해가능한 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미소구) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 넘는 기간에 걸쳐서 분자를 방출할 수 있지만, 특정 히드로겔은 더 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 항체가 체내에 오랫동안 남아 있는 경우에는 이것들이 37℃의 습도에 노출되기 때문에 변성되거나 응집되어 생물학적 활성이 손실되고 면역원성에 변화가 있을 수 있다. 관련 메카니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진 경우의 안정화는, 술피드릴 잔기를 변형시키고 산성 용액으로부터 동결건조하고 수분 함량을 제어하고 적절한 첨가제를 사용하며 특정 중합체 매트릭스 조성물을 개발하여 달성될 수 있다.
안구 질환 또는 상태를 예방하거나 치료하기 위한 본 발명의 화합물은 전형적으로 안구, 안내 및/또는 유리체내 주사로 투여된다. 국소, 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 비내 및 병소내 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 투여 방법도 사용될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다.
안구, 안내 또는 유리체내 투여용 제제는 당업계 공지의 방법으로 당업계 공지의 성분을 사용하여 제조될 수 있다. 효율적인 치료에 있어서의 주요 필요조건은 눈으로의 적당한 침투이다. 약물이 국소 전달될 수 있는 눈의 전방부 질환과는 달리, 망막 질환은 보다 부위-특이적인 접근법이 요구된다. 점안제 및 안연고제는 눈의 후방부에 거의 침투하지 못하며, 혈액-안구 장벽이 전신 투여된 약물이 안구 조직으로 침투하는 것을 방해한다. 따라서, 통상적으로 AMD 및 CNV와 같은 망막 질환 치료를 위한 약물 전달의 방법으로 선택되는 것은 직접적인 유리체내 주사이다. 유리체내 주사는 일반적으로 환자의 상태, 및 전달되는 약물의 성질 및 반감기에 따라 간격을 두고 반복된다. 안내 (예를 들어 유리체내) 투과를 위해서는 일반적으로 분자 크기가 작을 수록 바람직하다.
하기하는 실시예는 단지 예시하기 위한 목적으로만 제공되며, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하려는 것이 아니다.
<실시예>
하기 실시예에서 언급되는 시판 시약은 달리 나타내지 않는다면 제조업체의 지시에 따라 사용하였다. 하기 실시예 및 본 명세서 전반에서 ATCC 관리 번호로 표시한 세포의 공급원은 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 블러버드 10801 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)이다.
항체 아미노산 서열내의 아미노산 잔기는 카바트(Kabat) (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)])에 따라 넘버링하였다. 단일 문자 아미노산 약어가 사용되었다. DNA 축퇴성은 IUB 코드 (N = A/C/G/T, D = A/G/T, V = A/C/G, B = C/G/T, H = A/C/T, K = G/T, M = A/C, R = A/G, S = G/C, W = A/T, Y = C/T)를 사용하여 나타내었다.
실시예 1
출발 항체의 파지 코딩 초가변 영역으로부터 유래된 항체
HERCEPTIN® 항-HER2 항체 rhuMAB 4D5-8 (제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.))의 VL 및 VH 도메인의 핵산 서열 (도 18a 및 18b)을 HVR의 돌연변이유발 및 인간 C3b에 대한 결합을 위한 파지 선별에 출발 서열로 사용하였다. 항체 4D5는 Her-2 (erbB2)로 알려져 있는 암-관련 항원에 특이적인 인간화 항체이다. 항체는 컨센서스 프레임워크 영역을 갖는 가변 도메인을 포함하는데, 여기서 몇몇 위치는 인간화 항체의 친화도가 증가하는 과정 동안 마우스 서열로 되돌아갔다. 인간화 항체 4D5의 서열 및 결정 구조는 미국 특허 제6,054,297호, 문헌 [Carter et al., PNAS 89:4285 (1992)]에 기재되어 있으며, 상기 결정 구조는 문헌 [Carter et al., J. Mol. Biol. 229:969 (1993)] 및 온라인 사이트 www/ncbi/nih/gov/structure/mmdb(MMDB#s-990-992) (그의 전체 개시문이 상기 거명을 통해 본원에 참고로 포함됨)에 도시되어 있다.
HERCEPTIN® VL 및 VH 도메인은 컨센서스 인간 κI VL 도메인 및 인간 하위군 III 컨센서스 VH 도메인 변이체를 포함한다. 변이체 VH 도메인은 인간 컨센서스로부터 3개의 변화를 갖는다: R71A, N73T 및 L78A.
이 작업에 사용되는 파지미드는 phoA 프로모터의 제어하의 2개의 오픈 리딩 프레임을 갖는 1가의 Fab-g3 디스플레이 벡터 (pV0350-2B)이다 (본래 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93]에 기재되어 있음). 제1 오픈 리딩 프레임은 VL 및 CH1 도메인 억셉터 경쇄에 융합된 stII 신호 서열로 구성되고, 제2 오픈 리딩 프레임은 말단절단된 소수 파지 외피 단백질 P3에 연결된 억셉터 중쇄의 VH 및 CH1 도메인에 융합된 stII 신호 서열로 구성된다 (Lee et al., 상기 문헌 참조).
중쇄 HVR의 돌연변이유발에 의해 생성된 항체
Fab 클론 YW 144.2.43을 huMAb 4D5-8 (HERCEPTIN® 항-HER2 항체, 제넨테크, Inc.) 중쇄의 HVR-H1, H2 및 H3의 돌연변이유발 및 인간 C3b 융합 단백질에 대한 선별에 의해 생성하였다. HVR-H1에서, 카바트 위치 26 (G), 27 (F), 28 (T), 29 (I), 34 (I) 및 35 (H)는 변하지 않고 유지되었으며, 위치 30 내지 33의 아미노산은 변하였다. HVR-H2에서, 카바트 위치 51 (I), 52a (P), 55 (G), 57 (T), 59 (Y), 60 (A), 61 (D), 62 (S), 63 (V), 64 (K) 및 65 (G)는 변하지 않고 유지되었으며, 위치 49, 50, 52, 53, 54, 56 및 58은 변하였다. HVR-H3에서, 카바트 위치 93 (A) 및 102 (Y)는 변하지 않고 유지되었으며, 위치 94 내지 100, 100a-h 및 101은 변하였다. YW 144.2.43의 경쇄는 변형된 huMAb 4D5-8 서열 (위치 30, 66 및 91에서 변형됨)이며, 그의 HVR은 파지 선별 동안 변하지 않았다. 서열 다양성은 표준 돌연변이유발 기술을 이용하는 선별된 아미노산 위치의 돌연변이유발에 의해 각각의 초가변 영역에 도입시켰다.
파지 라이브러리의 생성
각각의 초가변 영역에 대해 고안된 랜덤화된 올리고뉴클레오티드 풀을 올리고뉴클레오티드 660 ng, 50 mM Tris (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 20 mM DTT 및 5 U 폴리뉴클레오티드 키나제를 함유하는 6개 20 ㎕ 반응물에서 1 시간 동안 37℃에서 독립적으로 인산화시켰다. 이어서, 6개 인산화된 올리고뉴클레오티드 풀을 50 mM Tris (pH 7.5), 10 mM MgCl2 중 쿤켈(Kunkel) 주형 20 ㎍과 500 ㎕의 최종 부피로 주형에 대한 올리고뉴클레오티드의 비가 3이 되도록 합하였다. 혼합물을 90℃에서 4 분 동안, 50℃에서 5 분 동안 어닐링시킨 후에, 얼음 상에서 냉각시켰다. 잉여량의 어닐링되지 않은 올리고뉴클레오티드를 어닐링된 DNA의 과도한 변성을 방지하기 위해 변형된 프로토콜을 이용하여 QIAQU1ICK™ PCR 정제 키트 (키아젠(Qiagen) 키트 28106)로 제거하였다. 500 ㎕의 어닐링된 혼합물에 150 ㎕의 PB를 첨가하고, 이 혼합물을 2개의 실리카 컬럼 사이에 분배하였다. 각각의 컬럼을 750 ㎕의 PE로 세척한 후에, 별도의 회전으로 컬럼을 건조시키고, 각각의 컬럼을 110 ㎕의 10 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 8)로 용출하였다. 이어서, 어닐링되고 정화된 주형 (220 ㎕)을, 1 ㎕의 100 mM ATP, 10 ㎕의 25 mM dNTP (각각 25 mM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), 15 ㎕의 100 mM DTT, 25 ㎕의 10× TM 완충액 (0.5 M Tris (pH 7.5), 0.1 M MgCl2), 2400 U T4 리가제 및 30 U T7 폴리머라제를 첨가하여 3 시간 동안 실온에서 충전시켰다.
충전 산물을 Tris-아세테이트-EDTA/아가로스 겔 상에서 분석하였다 (문헌 [Sidhu et al., Methods in Enzymology 328:333-363 (2000)]). 일반적으로 3개의 밴드가 관찰가능하다: 하부 밴드는 정확하게 충전되고 라이게이션된 산물이고, 중간 밴드는 충전되었으나 라이게이션되지 않은 산물이고, 상부 밴드는 가닥 치환된 산물이다. 상부 밴드는 T7 폴리머라제의 고유한 측면 활성에 의해 생성되어 방지하기 어려우나 (문헌 [Lechner et al., J. Biol Chem. 258: 11174-11184 (1983)]); 이 밴드는 하부 밴드보다 30배 더 적은 효율로 전환되며, 일반적으로 라이브러리에 거의 기여하지 못한다. 중간 밴드는 최종 라이게이션 반응에 있어 5' 포스페이트의 부재로 인한 것이며, 이 밴드는 효율적으로 전환되어 주로 야생형 서열을 제공한다.
이어서, 충전 산물을 정제하고, SS320 세포로 전기천공시키고, M13/KO7 헬퍼 파지의 존재하에 증식시켰다 (문헌 [Sidhu et al., Methods in Enzymology 328:333-363 (2000)]에 기재된 바와 같음). 라이브러리 크기는 1×109개 내지 2×109개 독립적인 클론 범위였다. 최초의 라이브러리로부터의 랜덤 클론을 서열분석하여 라이브러리의 품질을 평가하였다.
파지 선별
인간 C3b 단백질을 선별 항원으로 사용하였다. 인간 C3b를 MaxiSorp 미세역가 플레이트 (넌크(Nunc)) 상에 PBS 중 10 ㎍/ml로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 선별 제1 라운드에 12개 웰의 표적이 사용되었다. 웰을 파지 차단 완충액 (1％ BSA, 0.05％ Tween 20, PBS)을 사용하여 실온에서 1 시간 동안 차단시켰다. 파지 라이브러리는 냉동된 글리세롤 저장액의 PEG 침전물이었으며, 이를 파지 차단 완충액에 다시 현탁시키고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 파지 라이브러리를 실온에서 밤새 인큐베이션된 차단된 항원 플레이트에 첨가하였다. 밤새 결합시킨 후에, 결합하지 않은/비-특이적 파지를 세척 완충액 (PBS, 0.05％ Tween20)으로 세척하여 항원 플레이트로부터 제거하였다. 결합된 파지는, 웰을 50 mM HCl, 0.5 M KCl과 30 분 동안 인큐베이션하여 용출하였다. XL-1 블루 세포 및 M13/KO7 헬퍼 파지를 사용하여 파지를 증폭시키고, 2YT, 50 ㎍/ml 카르바네실린, 50 ㎍/ml 카나마이신, 10 ug/ml 테트라사이클린 중에서 36 시간 동안 30℃에서 성장시켰다. 이어서, 증폭된 파지를 변형된 PEG 침전 프로토콜을 이용하여 회수하였다 (문헌 [Monaci, P., Cortese, R., Screening phage libraries with sera, In: Phage Display - A practical approach, Clackson and Lowman, eds., 2004, pp. 193-215]). 표적 코팅된 웰로부터 용출된 파지의 역가를 비-표적 코팅된 웰로부터 회수된 파지의 역가와 비교하여 풍부도를 평가하였다. 표적 웰의 수를 4개 (라운드 2) 및 2개 (라운드 3 및 4)로 감소시켜 4개 라운드의 파지 선별을 완수하였다. 카제인 차단 완충액 (피어스(Pierce))을 라운드 2 및 4에서 항원 플레이트 및 파지에 대한 차단 시약으로 사용하였다. 선별 라운드 2 내지 4에서는 3 내지 4 시간의 파지-항원 결합 기간 및 증가된 세척 엄격도가 이용되었다. 인간 C3b 패닝의 경우, 파지-항원 인큐베이션 동안 선별 라운드 2 내지 4에서 인간 C3에도 결합할 수 있는 파지 항체에 대한 역-선별로서 인간 C3도 첨가하였다 (> 1 μM). 인간 파지 클론 YW144.2.43를 선별하였다. C3b 패닝 결과를 도 1에 나타내었다. C3b 결합 특성은 실시예 3에 개시된 바와 같이 결정하였다.
실시예 2
HVR H1, H2, H3 및 L3의 변이에 의해 생성된 항체
클론 YW144.2.43을 huMAb4D5-8 (HERCEPTIN® 항-HER2 항체, 제넨테크, 인크.) 중쇄 가변 도메인 및 huMAb 4D5-8 변형된 경쇄 가변 도메인의 HVR-H1, H2, H3 및 L3의 돌연변이유발에 의해 생성하였다. HVR-H1에서, 카바트 위치 26 (G), 28 (T), 29 (F), 30 (S), 31 (S) 및 35 (S)는 변하지 않고 유지되었으며, 위치 27, 32 내지 34의 아미노산은 변하였다. HVR-H2에서, 카바트 위치 49 (S), 51 (I), 55 (G), 57 (T), 59 (Y), 60 (A), 61 (D). 62 (S), 63 (V), 64 (K) 및 65 (G)는 변하지 않고 유지되었으며, 위치 50, 52, 52a, 53, 54, 56 및 58은 변하였다. HVR-H3에서, 카바트 위치 93 (A), 94 (R), 100f-g (결실)는 변하지 않고 유지되었으며, 위치 95 내지 100, 100a-e, 100h 및 102는 변하였다. HVR-L3에서, 카바트 위치 89 (Q), 90 (Q), 95 (P) 및 97 (T)은 변하지 않고 유지되었으며, 위치 91 내지 94 및 96은 변하였다. HVR-L1의 서열은 RASQSISSYLA (서열 11)로 변하지 않고 유지되었으며, HVR-L2의 서열은 GASSRAS (서열 12)로 변하지 않고 유지되었다. 서열 다양성은 표준 돌연변이유발 기술을 이용하는 선별된 아미노산 위치의 돌연변이유발에 의해 각각의 초가변 영역에 도입시켰다. 항-C3v 항체 클론을 선별하여, 서열분석하였다.
YW144.2.43의 친화도 성숙
항-C3b 항체 YW144.2.43의 친화도를 개선시키기 위해, 3개의 파지 디스플레이 라이브러리를 YW144.2.43 백그라운드에서 생성시켰으며, 이들은 각각 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93]에 기재된 바와 같은 소프트 랜덤화 돌연변이유발을 위한 여러 HVR를 표적으로 한다. 주형의 잠재적인 높은 백그라운드로부터 YW144.2.43의 재선별을 방지하기 위해, 정지 코돈을 돌연변이화될 HVR에 도입시킨 후에 각각의 라이브러리를 생성시켰다. 용액 분류 방법을 이용하여 친화도-기반의 파지 선별 과정의 효율성을 향상시켰다. 비오티닐화된 표적 농도를 조작하여 보다 낮은 백그라운드에 대한 파지 포획 시간을 감소시키고, 비오티닐화되지 않은 표적을 첨가하여 보다 빠른 오프 속도를 갖는 클론을 제거함으로써, 고친화도 클론을 능숙하게 선별할 수 있다 (문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93]). 선별 제1 라운드로부터, 풍부함 (표적 의존성 파지 포획)이 관찰되었으며, 이는 많은 클론이 인간 C3b에 대해 상당히 높은 친화도를 갖는 각각의 라이브러이에 존재함을 시사한다. 이후의 라운드에서는 선별 엄격도를 증가시켰다. 5개 라운드의 선별 과정 이후에, 각각의 라이브러리로부터의 클론을 분석하였다. 6개의 HVR 각각을 표적으로 하는 라이브러리에서 새로운 서열이 관찰되었다. 선별된 클론을 파지 ELISA에 의해 스크리닝한 후에, IgG 단백질로서 발현시키고, 이들의 친화도를 Biacore™ 결합 분석을 이용하여 특성화하였다.
친화도 성숙된 클론의 파지 라이브러리를 고체/용액 분류 방법을 이용하여 분류하였다. PBS 중 3.6 mg/ml 인간 C3b 500 ㎕ 및 1M 인산칼륨 (pH 8) 10 ㎕를 4 mM 술포-NHS-LC-비오틴 (피어스) 20 ㎕와 혼합하여 인간 C3b를 비오티닐화시켰다. 선별 제1 라운드에서, 비오티닐화된 C3b를 PBS 중 10 ㎍/ml로 MaxiSorp 미세역가 플레이트 (넌크) 상에 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 선별 제1 라운드에서, 16개 웰의 표적을 사용하였다. SuperBlock (피어스)을 사용하여 웰을 실온에서 1 시간 동안 차단시켰다. 성숙 파지 라이브러리를 SuperBlock 완충액에 희석시키고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 파지 라이브러리를 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션된 차단된 항원 플레이트에 첨가하였다. 결합시킨 후에, 결합되지 않은/비-특이적 파지를 세척 완충액 (PBS, 0.05％ Tween20)으로 세척하여 항원 플레이트로부터 제거하였다. 웰을 50 mM HCl, 0.5 M KCl과 30 분 동안 인큐베이션하여 결합된 파지를 용출하였다. XL-1 블루 세포 및 M13/KO7 헬퍼 파지를 이용하여 파지를 증폭시키고, 2YT, 50 ㎍/ml 카르바네실린, 50 ug/ml 카나마이신, 10 ug/ml 테트라사이클린 중에서 36 시간 동안 30℃에서 성장시켰다. 이어서, 증폭된 파지를 변형된 PEG 침전 프로토콜을 이용하여 회수하였다 (Monaci, P., Cortese, R., 상기 문헌). 표적 코팅된 웰로부터 용출된 파지의 역가를 비-표적 코팅된 웰로부터 회수된 파지의 역가와 비교하여 풍부도를 평가하였다. 선별 라운드 2 내지 5에서는, 용액 분류 프로토콜이 이용되었다. 미세역가 웰을 PBS 중 10 ㎍/ml 뉴트라비딘으로 밤새 4℃에서 코팅한 후에, SuperBlock (피어스)을 사용하여 1 시간 동안 차단시켰다. 회수된 파지 라이브러리를 SuperBlock에 현탁시켜 50 nM b-Robo4-His와 1 시간 동안 혼합하였다. b-C3b에 결합된 파지를 30 분 동안 뉴트라비딘 코팅된 웰에 포획하고, 결합되지 않은 파지를 세척 완충액으로 세척 제거하였다. 파지를 50 mM HCl, 500 mM KCl을 사용하여 30 분 동안 용출하고, 중화시키고, KO7 헬퍼 파지 (뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))의 존재하에 XL1 블루 세포 (스트라타진(Stratagene))에서 증식시켰다. 이후의 분류 라운드는 다음을 제외하고는 유사하게 수행하였다: 2 라운드에서 최종 b-C3b 농도는 50 nM이고, 라운드 3에서 최종 b-C3b 농도는 25 nM이고, 라운드 4에서 최종 b-C3b 농도는 5 nM이고, 라운드 5에서 최종 b-C3b 농도는 0.5 nM이며, 뉴트라비딘 상에서의 포획 1 시간 전에 50 nM의 비오티닐화되지 않은 C3b를 혼합물에 첨가한다.
여러 친화도 성숙된 클론을 인간 C3b에 대한 결합에 대해 선별하여 서열분석하였다. 친화도 성숙된 항체 YW144.2.43.S77 (간략하게, S77)의 중쇄 및 경쇄 Fab 단편의 아미노산 서열을 도 5에 나타내었다.
실시예 3
선별된 항-C3b 항체 클론의 특성화
파지 ELISA - 파지 경쟁 결합 분석을 수행하여 C3b에 대한 파지-디스플레이된 Fab의 대략적인 결합 친화도 (파지 IC50으로 결정됨)를 결정하였다. 분석은 다음과 같이 수행하였다. 상기 기재된 바와 같은 변형된 PEG 침전 프로토콜을 이용하여 각각의 클론으로부터의 정제된 파지 상층액을 생성하였다. 정제된 파지 상층액을 파지 차단 완충액에 연속적으로 희석시킨 후에, C3b (1 ㎍/ml)로 코팅된 플레이트 상에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 세척하고, 서양고추냉이 퍼록시다제/항-M13 항체 접합체 (PBS 완충액에 1:5000으로 희석) (아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech))와 30 분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질 (키르케가드 및 페리 레보러토리즈 (Kirkegaard and Perry Laboratories))로 발색시키고, 0.1 N HSO4로 켄칭하였다. 450 nm에서 분광광도법에 의해 흡광도를 측정하여 포화시 신호의 약 50％를 제공하는 파지 농도를 결정하였다. 포화 농도 아래의 고정된 파지를 350 nM C3b 내지 5 nM C3b 범위의 C3b 단백질의 2-배 연속 희석액을 함유하는 파지 차단 완충액에 희석하였다. 혼합물을 부드럽게 진탕시키면서 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, C3b (1 ㎍/ml)로 코팅된 플레이트로 옮기고, 이 플레이트를 20 분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 위와 같이 처리하였다. 결합 친화도를 IC50 값 (고정시킨 항원에 대한 파지 결합의 50％를 차단하는 항원의 농도로 정의됨)으로 추정하였다. C3b 파지 경쟁 결과는 도 2에 나타내었다.
IgG 생성 및 친화도 결정 - 친화도 특성화를 위한 IgG 단백질을 발현시키기 위해, 정지 코돈을 파지 디스플레이 벡터의 중쇄와 g3 사이에 도입시켰다. 클론을 이. 콜라이(E.coli) 34B8 세포에 형질전환시키고, AP5 배지에서 30℃에서 성장시켰다 (문헌 [Presta et al. Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997)]). 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 10 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 8)에 현탁시키고, 마이크로플루이다이저(microfluidizer)를 이용하여 개방-파괴시켰다. Fab를 단백질 G 친화도 크로마토그래피로 정제하였다.
인간 C3b 및 C3에 대한 파지-유래된 항-C3b 항체 YW144.2.43 및 그의 친화도 성숙된 변이체 YW144.2.43S77 (Fab 단편)의 결합 친화도를 BIACORE® 3000 시스템 (비아코어, 인크.(Biacore, Inc.), 미국 뉴저지 피스카타웨이 소재)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 측정에 의해 결정하였다. 시험된 항체 Fab 단편은 YW144.2.43 및 YW144.2.43S7이었다. 요컨대, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.) 상의 유동 세포 1 및 2를 0.2 M N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 0.05 M N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 7 분 동안 5 ㎕/in의 유속으로 활성화시켰다. 유동 세포 하나는 음성 대조군으로서 코팅하지 않은 채로 두었다. 이들 활성화된 칩을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)으로 5 ㎍/ml까지 희석시켜 항-C3b Fab로 코팅한 후에, 5 ㎕/분의 유속으로 주입하여 대략 50 반응 단위 (RU)의 커플링된 항체를 얻었다. 이어서, 1M 에탄올아민을 주입하여 반응하지 않는 군을 차단시켰다. 동역학적 측정을 위해, 인간 C3b 또는 C3 가용성 항원 (C3b에 대해 대략 100 nM 내지 대략 3 nM, C3에 대해 약 1 μM 내지 50 nM)의 2-배 연속 희석액을 PBS 중에서 0.05％ Tween 20과 35 ㎕/분의 유속으로 25℃에서 주입하였다. 각각의 주입 이후에, 20 mM HCl을 사용하여 칩을 재생시켰다. 블랭크 유동 세포로부터 RU를 감하여 결합 반응을 보정하였다. 회합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 간단한 일대일(one-to-one) 랑그뮈어(Langmuir) 결합 모델 (BIA평가 소프트웨어 버젼 3.2)을 이용하여 계산하였다. 평형 해리 상수 (KD)는 k해리/k회합 비로 계산하였다. 결합 친화도를 도 6 및 7에 나타내었다.
다른 실험에서, 정제된 C3b 또는 C3을 폴리클로날 C3 항체를 사용하여 미세역가 플레이트에 포획하였다. 포획된 C3b 또는 C3에 대한 S77 (A) 또는 폴리클로날 항 C3 항체 (B)의 결합을 2차 HRPO-접합된 항체를 사용하여 결정하였다. TMB (KPL)로 발색시키고, 2N H2SO4에서 중단시키고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다.
항 C3b 항체 S77의 특이성을 시험하기 위한 C3b ELISA. PBS에 희석시킨 포획 항체 (YW144.2.45.S77 친화도 성숙된 xC3/C3b (제넨테크) 2 ㎍/ml) 25 ㎕를 미세역가 플레이트의 웰에 첨가하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충액 (PBS/0.05％ Tween 20 (20× 저장액; 메디아 프렙(Media Prep); Cat. A3355))으로 세척(3×)하였다. 차단 완충액 50 ㎕를 웰에 첨가하고, 플레이트를 부드럽게 교반하면서 (실온) 1 내지 3 시간 동안 인큐베이션하고, 세척 완충액으로 세척(3×)하였다. 표준 저장액 (C3b, 컴플리먼트 테크놀로지 인크.(Complement Technology Inc.); Cat. A114, -20℃에서 100×로 보관)을 Magic 완충액 (1× PBS (pH 7.4), 0.5％ BSA, 0.05％ Tween 20, 0.2％ BgG, 15PPM 프로클린(Proclin) (메디아 프렙; Cat. A3381)) + 0.35M NaCl로 제조하였다. Magic 완충액 및 O.35 M NaCl이 또한 분석용 샘플을 제조하는데 사용되었다. 표준/샘플 25 ㎕를 지정된 웰에 첨가하였다. 샘플을 부드럽게 교반하면서 실온에서 약 2 시간 (+/- 0.5 시간) 동안 인큐베이션하고, 세척 완충액으로 세척(3×)하였다. 플레이트를 180도 돌리고, 세척 단계를 반복하였다. 검출 항체 (퍼록시다제 접합체 염소 F(ab')2 항-인간 C3 (프로토스 이뮤노리서치(Protos Immunoresearch); Cat. 765))를 분석 희석제로 1:7K 희석하고, 부드럽게 교반하면서 실온에서 1 내지 2 시간 동안 플레이트 상에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 세척(3×)하고, 18도 돌려서 세척 단계를 반복하였다. 50/50 TMB 용액을 제조하였다. ELISA 플레이트를 세척 완충액으로 세척(3×)하였다. 플레이트를 180도 돌리고, 세척 단계를 반복하였다. TMB 25 ㎕를 웰에 첨가하였다. 실온에서 발색시켰다. 발색 시간: 두 플레이트에서 10 분. 1.0 M 인산 25 ㎕를 웰에 첨가하여 발색을 중단시켰다. 플레이트를 OD 판독하였다 (450/630 nm). 그 결과를 도 8, 패널 A에 나타내었다.
C3 검출에 양성 대조군으로 사용된 총 C3은 인간 C3에 대한 염소 IgG 분획 (Cappel 55033)이 포획 항체로 사용되는 것을 제외하고는 S77의 특이성 시험에 이용된 상기 C3b ELISA 분석과 유사하게 분석하였다. 그 결과를 도 8, 패널 B에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, S77은 C3b을 인식하지만, 전구-분자 C3은 인식하지 않는다.
실시예 4
C3b 항체는 보체의 대체적 경로를 특이적으로 억제한다
용혈반응 분석 - 대체적 경로 활성을 결정하기 위해, 토끼 적혈구 (Er, 콜로라도 세럼(Colorado Serum))를 GVB로 세척(3×)하고, 2×109/ml로 재현탁시켰다. 억제제 (50 ㎕) 및 Er 현탁액 20 ㎕를 GVB/0.1M EGTA/0.1M MgCl2와 1:1 혼합하였다. C1q-고갈된 인간 혈청 (퀴이딜(Quidel); 30 ul, GVB로 1:3 희석)을 첨가하여 보체 활성화를 개시하였다. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션한 후에, GVB/10 mM EDTA 200 ㎕를 첨가하여 반응을 중단시키고, 샘플을 500 g에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상층액 200 ㎕에서 412 nm에서의 흡광도를 측정하여 용혈반응을 결정하였다. 데이타를 억제제의 부재하에 유도된 용혈반응의 백분율(％)로 표시하였다. 고전적 보체 경로에 대한 CRIg의 영향을 결정하기 위해, Er을 IgM-코팅된 양 적혈구 (E-IgM, 컴테크(CompTech))로 대체하는 것을 제외하고는 유사한 절차를 수행하였으며, GVB++ 중 인자 B 결핍 인간 혈청에서 분석을 수행하였다.
도 9 및 10에 나타낸 바와 같이, 친화도 성숙된 C3b 항체 S77은 대체적 보체 경로를 특이적으로 억제하였고, 고전적 경로는 억제하지 않았다.
실시예 5
C3b 항체는 C5 전환효소에 대한 C5 결합을 억제한다
C5 경쟁 분석 - C3b를 PBS 중 3 ㎍/ml C3b와 4℃에서 밤새 인큐베이션하여 미세역가 플레이트에 코팅하였다. 플레이트를 PBS 중 1％ BSA로 차단시키고, 20 mM Tris/20 mM Ca/20 mM Mg/150 mM NaCl/0.05％ Tween/1％ BSA 중 0.4 uM C5와 혼합된 항체의 농도를 증가시키면서 인큐베이션하였다. C5 결합을, 항-인간 C5 항체 (클론 7D12, 제넨테크)와 실온에서 30 분 동안 인큐베이션한 후에 1:5000 당나귀-항-마우스 HRP (잭슨(Jackson))와 인큐베이션하여 검출하였다.
도 11 및 12에 나타낸 바와 같이, 친화도 성숙된 C3b 항체 S77은 C5 전환효소를 억제하였다.
실시예 6
C3b 항체는 퇴화 활성을 나타내지 않는다
퇴화 가속 활성 - 미세역가 플레이트를 PBS 중 3 ㎍/ml C3b로 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBST (PBS/0.1％-Tween)로 2회 세척하고, 4％ BSA를 함유하는 PBST로 2 시간 동안 37℃에서 차단시켰다. 플레이트를 400 ng/ml의 인자 B, 25 ng/ml의 인자 D, 및 2 mM NiCl2, 25 mM NaCl, 0.05％ Tween 20 및 4％ BSA를 함유하는 베로날(veronal) 완충액에서 2 시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후에, PBST에서 인자 H 또는 S77과 15 분 동안 인큐베이션하였다. 인자 Bb를, PBST 중 염소 항-인간 인자 B 폴리클로날 항체 (켄트(Kent))의 1:5,000 희석액 및 PBST 중 HRPO에 접합된 당나귀 항-염소 항체 (칼태그(Caltag))의 1:5,000 희석액과 순차적으로 1 시간 동안 인큐베이션하여 검출하였다. TMB (KPL)로 발색시키고, 2N H2SO4에서 중단시키고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. C3b의 인자 I-매개된 절단에 대한 보조-인자 활성을 GVB 30 ml에서 0.8 μM C3b 및 80 nM 인자 I과 80 nM 인자 H 또는 다양한 농도의 S77을 인큐베이션하여 측정하였다. 혼합물을 60 분 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 샘플을 C3 전환효소 분석에 대해 기재된 바와 같은 겔-전기영동법으로 분석하였다.
도 13에 나타낸 바와 같이, S77은 퇴화 가속 활성을 나타내지 않는다.
실시예 7
C77은 C3b에 대한 전구-인자 B의 결합 및 C3bBb 전환효소의 형성을 억제한다
프로토콜
MaxiSorp 플레이트를 PBS (20 ㎕/웰) 중 3 ㎍/ml C3b (PUR13420)로 실온에서 4 시간 동안 코팅하였다. 100 ㎕의 PBS 0.1％ Tween (PBST) (BioTek EL405 세척기)로 세척(6×)하였다. 플레이트를 4％ BSA/0.05％ Tween/PBS로 실온에서 2 시간 동안 차단한 후에, 덩어리를 흔들어 계수대로 털어냈다. AP 전환효소 완충액 20 ㎕를 실온에서 2 시간 동안 첨가한 후에, PBST로 세척(6×)하였다. Ab 20 ㎕를 실온에서 45 분 동안 첨가하고, 웰을 PBST로 세척(6×)하였다. 인자 B/Bb의 검출을 위해, 웰을 1:7000 염소-항-fB (켄트 랩스)와 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. S77 및 CR1의 검출을 위해, PBST를 웰에 첨가하고, 이어서 PBST로 세척(6×)하고, PBST++에서 1:7,000 당나귀-항-염소 IgG-HRPO (잭슨)와 30 분 동안 인큐베이션하였다. PBST++ 중 1:100 항-6×-His (서열 19) (R＆D)와 실온에서 30 분 동안 인큐베이션한 후에 PBST로 세척(6×)하였다. TMB 기질 20 ㎕로 발색시키고, 2N 황산 10 ㎕로 반응을 중단시켰다. 플레이트를 450 nm에서 판독하였다.
"AP 전환효소 완충액": 4％ BSA 0.1％ Tween 20 2 mM NiCl2 25 mM NaCl 25 ng/mL 인자 D 400 ng/ml 인자 B (컴테크).
상기 프로토콜에 따라, C3b를 미세역가 플레이트에 코팅하였다. S77, 대조군 Fab 또는 CR1 단편 (LHRA-C)을 첨가하고 1 시간 후에 인자 B를 첨가하였다. C3b에 대한 인자 B의 결합을 HRPO-접합된 2차 항체로 검출하고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. 그 결과를 도 14, 패널 A에 나타내었다.
마찬가지로, 상기 프로토콜에 따라, C3b를 미세역가 플레이트 상에 코팅한 후에 S77, 대조군 Fab 또는 CR1 단편 (LHRA-C)을 첨가하였다. 인자 D 및 인자 B를 첨가하여 C3 전환효소를 생성하였다. 전환효소 형성을 인자 Bb를 인식하는 일차 항체 및 이차 HRPO-접합된 항체를 사용하여 결정하였다. TMB (KPL)로 발색시키고, 2N H2SO4로 중단시키고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. 그 결과를 도 14, 패널 B에 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 항체 S77은 C3B에 대한 전구-인자 B의 결합을 억제하고, C3bBb 전환효소의 형성을 억제한다.
실시예 8
S77은 결합된 fBb의 존재하에 C3b에 결합하고, C3 전환효소를 퇴화시키지 않는다
실시예 7에 기재된 프로토콜을 이용하여, C3b를 미세역가 플레이트 상에 코팅하였다. 인자 D 및 인자 B를 첨가하여 C3 전환효소를 생성하였다. S77, 대조군 Fab 또는 CR1 단편 (LHRA-C)을 플레이트에 첨가하고, 이들 분자의 결합을 HRPO에 접합된 이차 항체로 결정하였다. 그 결과를 도 15, 패널 A에 나타내었다.
마찬가지로, 실시예 7에 기재된 프로토콜에 따라, 미세역가 플레이트를 3 ㎍/ml C3b로 코팅하였다. 플레이트를 인자 B 및 인자 D와 인큐베이션한 후에 CR1 (LHRA-C), S77 또는 대조군 Fab와 인큐베이션하였다. 인자 Bb를 염소 항-인간 인자 B 및 HRPO에 접합된 당나귀 항-염소 항체로 검출하였다. TMB (KPL)로 발색시키고, 2N H2SO4로 중단시키고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. 그 결과를 도 15, 패널 B에 나타내었다.
도 15에 열거된 결과는 S77이 결합된 fBb의 존재하에 C3b에 결합할 수 있으며, C3 전환효소를 퇴화시키지 않음을 보여준다.
실시예 9
S77은 C3b에 대한 인자 H 결합을 억제하고, 인자 H 보조-인자 활성을 억제한다
프로토콜 1 (도 15, 패널 A) - MaxiSorp 플레이트를 PBS (20 ㎕/웰) 중 3 ㎍/ml C3b (PUR13420)로 실온에서 3 시간 동안 코팅한다. 플레이트를 PBS 0.1％ Tween (PBST) (BioTek EL405 세척기) 100 ㎕로 세척(6×)하고, 4％ BSA/0.05％ Tween/PBS로 실온에서 2 시간 동안 차단시킨다. 플레이트를 진탕 차단 Ab 20 ㎕와 실온에서 30 분 동안 인큐베이션한 후에, 0.33 μM fH (컴테크)와 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, 1 μM fH 10 ㎕를 첨가한다. 플레이트를 플레이트 세척기 (BioTek EL405)에서 PBST로 세척(6×)하고, 1:7000 당나귀-항-마우스 IgG (H+L) - HRPO (잭슨)와 30 분 동안 인큐베이션하고, 플레이트 세척기 (BioTek EL405)에서 PBST로 세척(6×)한다. TMB 기질 20 ㎕로 발색시킨다. 2N 황산 10 ㎕로 반응을 중단시키고, 플레이트를 450 nm에서 판독한다.
프로토콜 2 (도 15, 패널 B) - 모든 희석은 GVB++ (1 mM MgCl, 0.15 mM CaCl)에서 수행한다. 에펜도르프 튜브에 1.6 uM C3b 10 ㎕ (최종 0.4 uM C3b)를 첨가한다. 항-C3b Fab, 대조군 Fab 또는 CR1 10 ㎕를 첨가한다. 20 분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 0.08 uM fI 10 ㎕ (최종 20 nM fI)를 첨가한다. 60 분 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 라엠멜리(Laemmeli) 완충액 + 2-bME 40 ㎕를 첨가하고, 3 분 동안 비등시킨다. 8％ 인비트로젠(Invitrogen) 겔, 25 ㎕/웰, 125 mV에서 1.5 시간 동안 전개시킨다. 겔을 H2O로 5 분 동안 세척(3×)한다. 심플리 블루(Simply Blue) (인비트로젠)로 교반하면서 실온에서 60 분 동안 염색시킨다. ddH2O로 5 분 동안 세척(3×)한다. 교반기 상의 큰 베이킹 접시에서 밤새 ddH2O로 세척하고, 플라스틱으로 덮는다. 시약: C3b PUR13240, 컴플리멘트 테크놀로지스로부터의 fI, 컴플리멘트 테크놀로지스로부터의 fH, 바이오위태커(BioWhittaker)로부터의 GVB++.
상기 기재된 바와 같이, 플레이트를 C3b로 코팅하였다. 인자 H를 대조군 Fab 또는 S77 (농도가 점차 증가함)의 존재하에 첨가하였다. C3b에 대한 인자 H의 결합을 항 인자 H 항체 및 이차 HRPO-접합된 항 마우스 항체를 이용하여 결정하였다. TMB (KPL)로 발색시키고, 2N H2SO4로 중단시키고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. 그 결과를 도 16, 패널 A에 나타내었다.
인자 I-매개된 C3b 절단에 대한 보조-인자 활성을, GVB 30 ml 중에서 0.8 μM C3b 및 80 nM 인자 I를 80 nM 인자 H 또는 다양한 농도의 S77과 인큐베이션하여 측정하였다. 혼합물을 60 분 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 샘플을 C3 전환효소 분석에 대해 기재된 바와 같은 겔-전기영동법으로 분석하였다. 그 결과를 도 16, 패널 B에 나타내었다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 항체 S77은 C3b에 대한 인자 H 결합을 억제하며, 또한 인자 H 보조-인자 활성을 억제한다.
실시예 10
S77은 C3b에 대한 CR1 결합을 억제한다
프로토콜 - MaxiSorp 플레이트를 PBS (100 ㎕/웰) 중 3 ㎍/ml C3b (PUR13420)로 밤새 4℃에서 코팅한다. PBS 0.1％ Tween (PBST) (BioTek EL405 세척기) 100 ㎕로 세척(3×)한다. 4％ BSA/0.1％ Tween/PBS로 실온에서 2 시간 동안 차단시킨다. 진탕 차단 Ab 20 ㎕와 실온에서 30 분 동안 인큐베이션한다. 50 nM CR1 LHR-AC와 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한다. 플레이트 세척기 (BioTek EL405)에서 PBST로 세척(3×)한다. PBST 중 1:10 mIgG1 항-hCD35-FITC (파밍겐(Pharmingen))와 실온에서 45 분 동안 인큐베이션한다. 플레이트 세척기 (BioTek EL405)에서 PBST로 세척(3×)한다. 1:7000 당나귀 항-마우스 IgG-HRPO (잭슨)로 30 분 동안 인큐베이션한다. 플레이트 세척기 (BioTek EL405)에서 PBST로 세척(6×)한다. TMB 기질 20 ㎕로 발색시킨다. 2N 황산 10 ㎕로 반응을 중단시킨다. 플레이트를 450 nm에서 판독한다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 항체 S77은 C3b에 대한 CR1 결합을 억제한다.
실시예 11
결정화 및 데이타 정밀화
1:1 비의 단백질 용액 및 저장 용액으로 이루어진 액적 2 ㎕로 증기-확산 방법을 이용하여 현적(Hanging-drop) 실험을 수행하였다. 단백질 용액은 25 mM Tris, 50 mM NaCl (pH 7.5) 중 10 mg/ml 농도의 C3b:S7714 복합체를 함유하고, 저장 용액은 0.1 M Hepes (pH 7.2) 중 10％ PEG 4000, 0.2 M MgCl2를 함유한다. 2주 후에 결정이 나타났다. 결정을 20％ 글리세롤이 보충된 저장 용액에서 인큐베이션한 후에 즉각 냉동시켰다. 어드밴스드 라이트 소스(Advanced Light Source) (버켈리(Berkeley))의 빔 라인(beam line) 5.0.1에서 단일 냉동 결정으로부터 데이타를 수집하고, 프로그램 DENZO 및 SCALEPACK를 이용하여 처리하였다. 결정은 공간군 C2에 속하고, 그의 격자 파라미터는 a = 216.4 Å, b = 180.4 Å, c = 154.6 Å 및 β = 115.73 Å이며, 2개의 복합체가 존재하는데, 이는 각각 비대칭 단위에서 하나의 Fab 분자에 결합된 하나의 C3b 분자로 구성된다. 프로그램 Phaser 및 Fab 단편의 가변 도메인, 불변 도메인 및 C3b의 좌표를 이용하여 분자 치환에 의해 구조를 해석하였다. 모델을 프로그램 O를 이용하여 수동적으로 조정하고, 치밀한 2-폴드 비-결정학적 대칭 제한을 이용하여 프로그램 REFMAC로 정밀화시켰다. 정밀화된 모델의 R 및 Rfree는 각각 22.5％ 및 29.0％였다.
항체 S77과 복합체를 형성한 C3b의 결정 구조를 도 3에 나타내었다. 도 4I는 항체 S77과 C3b의 결합 상호작용의 확대도이다. 결정화 데이타를 이용하여, C3b와 밀접하게 접촉된 C77 Fab 중쇄 서열 내의 잔기를 적색으로 나타내었다.
또한, 보충 도 1 (도 s1)은 S77과 접촉된 C3b 상의 잔기를 열거하고 있다. 보충 도 2(도 s2)는 C3b와 접촉된 Fab S77 잔기를 열거하고 있다.
보체 활성화에 중요한 성분이 C3b 표적화는 C3 및 C5 전환효소 둘다의 수준에서 보체 캐스케이드를 억제하는데 강력한 접근법을 제공한다. 상기 실시예에 기재된 연구에서, 파지 기술을 이용하여 C3b를 선택적으로 인식하나 그의 전구-분자 C3은 인식하지 않는 항체를 생성하였다. 특이적 항체 (S77)의 Fab 단편과 복합체를 형성한 C3b의 결정 구조는 이 항체가 C3b에 대한 C3의 절단에 따라 노출된 MG7 도메인 상의 에피토프를 인식함을 나타낸다. S77은 C3b에 대한 인자 B 및 C5의 결합을 차단하여, 대체적 보체 경로의 C3 및 C5 전환효소를 강력하게 억제하였으나, 고전적 보체 경로에서는 억제되지 않았다. 또한, S77은 fH 결합 및 보조인자 활성 뿐만 아니라 C3b에 대한 CR1 결합을 억제하였으며, 이는 C3b MG7 도메인에 대한 S77의 결합 부위가 보체 활성화의 조절에 중요한 지점임을 나타낸다. 이와 함께, 본 연구의 결과는 대체적 경로의 C3 및 C5 전환효소 수준에서의 보체 활성화 및 억제에 대한 분자적 근거를 설명하고, 유망한 치료적 잠재성을 갖는 선택적 항체를 제조하는데 있어 파지 디스플레이, 및 다른 디스플레이 기술의 유용성을 입증한다.
전술한 명세서는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있게 하는데 충분하다고 여겨진다. 전술한 설명으로부터 본원에 나타내고 기재한 것 이외에 본 발명에 대한 다양한 변형이 당업자에게는 명확할 것이고, 이는 첨부하는 특허청구범위에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. VAN LOOKEREN CAMPAGNE, Menno <120> C3B ANTIBODIES AND METHODS FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF COMPLEMENT-ASSOCIATED DISORDERS <130> 39766-0250PCT <140> Not yet Assigned <141> Herewith <150> 61/055,068 <151> 2008-05-21 <150> 60/933,721 <151> 2007-06-07 <160> 19 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic SS7 heavy chain region <400> 1 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala Tyr Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 35 40 <210> 2 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic SS7 heavy chain region <400> 2 Gly Phe Ser Phe Thr Ser Ser Ser Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro 1 5 10 15 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Leu 20 25 <210> 3 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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  1. 인간에 대한 치료방법.
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