JP2014088434A - 補体が関係している障害の予防および処置のためのｃ３ｂ抗体ならびに方法 - Google Patents

補体が関係している障害の予防および処置のためのｃ３ｂ抗体ならびに方法 Download PDF

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Abstract

【課題】Ｃ３ｂをブロックすることによって補体が関係している障害を予防し、処置するための治療薬を提供する。
【解決手段】本発明は、天然のＣ３ではなくＣ３の崩壊断片を特異的に認識し、それにより、天然のＣ３が抗体の「シンク（ｓｉｎｋ）」として作用することを回避する抗体の開発に関する。さらに具体的には、本発明はＣ３ｂ特異的抗体および抗体断片、ならびに、補体が関係している疾患の処置におけるそれらの使用に関する。本発明はまた、第二補体経路の選択的阻害剤であるＣ３ｂアンタゴニストの有効量を必要な被験体に投与する工程を含む、補体が関係している障害の予防または処置のための方法に関する。
【選択図】なし

Description

（発明の分野）
本発明は、Ｃ３ｂに対する抗体、ならびにそのような抗体を使用する補体が関係している疾患の予防と処置に関する。
（発明の背景）
補体系は、通常は不活性なプロ酵素の形態で存在する、一連の血清糖タンパク質からなる複雑な酵素のカスケードである。２つの主要な経路（古典経路と第２経路）は補体を活性化させることができ、これらはＣ３のレベルで統合され、ここでは、２つの類似しているＣ３転換酵素が、Ｃ３をＣ３ａとＣ３ｂに切断する。
マクロファージは、細胞表面で発現される識別タグの構造（いわゆる、分子パターン）の微妙な差異を認識する生まれながらの能力を示す特殊な細胞である（非特許文献１；非特許文献２）。これらの表面構造の直接の認識が先天性免疫の基本的な特徴であるが、オプソニン作用によっても、一般的なマクロファージ受容体が飲み込みを媒介することが可能になり、それにより、食細胞の効率が上がり、認識レパートリーが多様化する（非特許文献３）。食作用のプロセスには、多数のリガンド−受容体相互作用が関与しており、現在、様々なオプソニン（免疫グロブリン、コレクチン、および補体成分を含む）が、マクロファージの細胞表面受容体との相互作用による病原体のインターナリゼーションに必要な細胞活動を導くことが明らかになっている（非特許文献４；非特許文献５に概説されている）。生殖細胞系列の遺伝子によってコードされる天然の免疫グロブリンは多種多様な病原体を認識できるが、オプソニン作用のあるＩｇＧ（ｏｐｓｏｎｉｚｉｎｇ ＩｇＧ）の大部分は適応免疫によって生じ、したがって、Ｆｃ受容体による効率的なクリアランスは迅速ではない（非特許文献６）。一方、補体は病原体表面の分子を迅速に認識し、補体受容体による粒子の取り込みのきっかけをつくる（非特許文献７）。
補体は、補体受容体によって認識される多種多様な病原体をオプソニン化する３０種類を超える血清タンパク質からなる。カスケードの最初の誘因に応じて、３種類の経路に区別することができる（非特許文献８に概説されている）。３種類全てが中心的構成成分Ｃ３を活性化させる共通の工程を共有しているが、これらは認識の性質と、Ｃ３活性化を導く最初の生化学的工程により異なる。古典経路は病原体表面に結合した抗体によって活性化され、これは次いでＣ１ｑ補体成分に結合し、Ｃ３をその活性化形態であるＣ３ｂへと最終的に切断するセリン・プロテアーゼ・カスケードを開始させる。レクチン経路は、レクチンタンパク質による炭水化物モチーフの認識後に活性化される。今日までに、この経路の３つのメンバーが同定されている：マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）、レクチンのＳＩＧＮ−Ｒ１ファミリー、およびフィコリン（非特許文献９）。ＭＢＬとフィコリンはいずれもセリンプロテアーゼと関係があり、これは古典経路においてＣ１と同様に作用して、成分Ｃ２およびＣ４を活性化させて、中心的なＣ３工程を導く。第２経路は、これが、内部Ｃ３エステルの病原体表面上の認識モチーフとの直接の反応が原因で活性化される点で、古典経路およびレクチン経路のいずれとも対照的である。活性化表面への内部Ｃ３の結合によっては、第２経路のプロテアーゼであるＢ因子およびＤ因子の作用によりＣ３ｂの蓄積の迅速な増幅が導かれる。重要なことは、古典経路またはレクチン経路のいずれかにより蓄積したＣ３ｂもまた、Ｂ因子およびＤ因子の作用によりＣ３ｂの蓄積の増幅を導き得ることである。補体活性化の３つの経路の全てにおいて、オプソニン化の中枢的工程は成分Ｃ３のＣ３ｂへの変換である。補体カスケードの酵素によるＣ３の切断は、チオエステルを求核攻撃に曝し、それによりチオエステルドメインを介する抗原表面上へのＣ３ｂの共有結合を可能にする。これは、補体オプソニン作用の最初の工程である。続いて起こる結合したＣ３ｂのタンパク質分解によって、異なる受容体によって認識される断片であるｉＣ３ｂ、Ｃ３ｃ、およびＣ３ｄｇが生じる（非特許文献１０）。この切断によりＣ３ｂの蓄積をさらに増幅させるＣ３ｂの能力が消失し、直接膜を損傷させることができる補体カスケードの後期成分（膜攻撃複合体を含む）が活性化される。しかし、マクロファージの食細胞受容体はＣ３ｂとその断片を優先的に認識する。エステル結合の形成の多様性の理由から、Ｃ３に媒介されるオプソニン作用は病原体認識の中核をなし（非特許文献１１）、したがって、様々なＣ３分解産物の受容体は宿主免疫応答において重要な役割を果たす。
Ｃ３自体が、１３個の異なるドメインからなる複雑な、可撓性タンパク質である。分子のコアは８個のいわゆるマクログロブリン（ＭＧ）ドメインからなり、これらはＣ３の密集した状態のα鎖およびβ鎖を構成する。この構造にはＣＵＢ（Ｃ１ｒ／Ｃ１ｓ，Ｕｅｇｆ ａｎｄ Ｂｏｎｅ ｍｏｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）とＴＥＤドメインが挿入されており、後者には、病原体表面とのＣ３ｂの共有結合を可能にするチオエステル結合が含まれている。残りのドメインにはＣ３ａが含まれるか、または残りのドメインはコアドメインのリンカーおよびスペーサーとして作用する。Ｃ３に対するＣ３ｂとＣ３ｃの構造の比較により、この分子が、ＴＥＤだけではなく、細胞性受容体と相互作用できる分子のさらに新しい表面をも露出させる、主要な立体構造の再配置をそれぞれのタンパク質分解によって受けることが明らかである（非特許文献１２）。
望ましくない補体活性化を防ぐために、ほとんどの哺乳動物細胞には、宿主自体の細胞上での補体の増幅をブロックする調節因子が備わっている（非特許文献１３）。この内因性の調節因子が存在しない場合には、血清暴露により補体の分解産物が生じ、これは順に、炎症と組織損傷を促進する（非特許文献１４および非特許文献１５）。したがって、内因性の補体調節因子を欠いている非細胞表面は、特に補体攻撃の傾向があり、血清中の可溶性の補体調節因子による防御に完全に依存する。適切な補体調節を欠いていることが原因である制御されていない補体活性化は、様々な慢性の炎症疾患および変性疾患と関係している。この炎症カスケードにおける優先種（ｄｏｍｉｎａｎｔ）は、補体分解産物Ｃ３ａおよびＣ５ａであり、これらは、化学誘引物質として、ならびに、Ｃ３ａ受容体およびＣ５ａ受容体を介して好中球と炎症性マクロファージの活性化因子として機能する（非特許文献１６）。抗中球から放出されるプロペルジンは、ＡＰ転換酵素の安定化を通じて炎症カスケードをさらに増幅させる（非特許文献１７）。補体活性化は、以下のような免疫複合体に媒介される疾患において炎症を駆動する重要な成分であることが示されている：膜増殖性糸球体腎炎、腎毒性腎炎、および関節炎（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２）、ならびに、加齢性黄斑変性症（非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献２７）。
補体活性化のほとんどの調節因子は、補体転換酵素の中心的成分であるＣ３ｂのレベルで作用する。補体活性化のこれらの天然の調節因子は、通常は大きく（＞１００ｋＤａ）、治療薬として開発することは難しい。したがって、Ｃ３ｂをブロックすることによって補体が関係している障害を予防し、処置するための治療薬が必要である。
Ｔａｙｌｏｒら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３３，２０９０−２０９７（２００３） Ｔａｙｌｏｒら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３，９０１−９４４（２００５） Ｓｔｕａｒｔ ａｎｄ Ｅｚｅｋｏｗｉｔｚ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２２，５３９−５５０（２００５） Ａｄｅｒｅｍ ａｎｄ Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７，５９３−６２３（１９９９） Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ ａｎｄ Ｏｚｉｎｓｋｙ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０，８２５−８５２（２００２） Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５，９８１−９８６（２００４） Ｂｒｏｗｎ，Ｉｎｆｅｃｔ Ａｇｅｎｔｓ Ｄｉｓ １，６３−７０（１９９１） Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４４，１０５８−１０６６（２００１） Ｐｙｚら、Ａｎｎ Ｍｅｄ ３８，２４２−２５１（２００６） Ｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｄｏｆ，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７，２１７−２６７（１９８５） Ｈｏｌｅｒｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １３，２３１−２３６（１９９２） Ｊａｎｓｓｅｎ ａｎｄ Ｇｒｏｓ，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４，３−１０（２００７） Ｈｏｕｒｃａｄｅら、Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４５：３８１（１９８９） Ｏｇｌｅｓｂｙら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７５：１５４７（１９９２） Ｏｇｌｅｓｂｙら、Ｔｒａｎｓ Ａｓｓｏｃ．Ａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ １０４：１６４（１９９１） Ｍｏｌｌｎｅｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：６１（２００２） Ｌｕｔｚ ａｎｄ Ｊｅｌｅｚａｒｏｖａ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２（２００６） Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：１０５８（２００１） Ｔｈｕｒｍａｎ ａｎｄ Ｈｏｌｅｒｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６：１３０５（２００６） Ｂａｎｄａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：２１０９（２００３） Ｗｅｉｓｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１４６（１９９０） Ｍｏｒｇａｎ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０：１５９（２００３） Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１３４：４１１（２００２） Ｄｏｎｏｓｏら、Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．５１：１３７（２００６）；Ｇｏｌｄら、Ｎａｔｌ．Ｇｅｎｅｔ．３８：４５８（２００６） Ｈａｇｅｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：７２２７（２００５） Ｈａｇｅｍａｎら、Ａｎｎ．Ｍｅｄ．３８：５９２（２００６） Ｈａｇｅｍａｎら、Ｐｒｏｇ．Ｒｅｔｉｎ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２０：７０５（２００１）
（発明の要旨）
本発明は、天然のＣ３ではなくＣ３の崩壊断片を特異的に認識し、それにより、天然のＣ３が抗体の「シンク（ｓｉｎｋ）」として作用することを回避する抗体の開発に関する。さらに具体的には、本発明はＣ３ｂ特異的抗体および抗体断片、ならびに、補体が関係している疾患の処置におけるそれらの使用に関する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
補体が関係している障害の予防または処置のための方法であって、第二補体経路の選択的阻害剤である有効量のＣ３ｂアンタゴニストを、必要な被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目２）
前記被験体が哺乳動物である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記被験体がヒトである、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記Ｃ３ｂアンタゴニストが、Ｃ３の活性な分解産物上のエピトープを認識するが、Ｃ３上のエピトープは認識しない抗体である、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記Ｃ３ｂアンタゴニストが、Ｃ３ｂに選択的に結合する抗体または抗体断片である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記抗体がＣ５のＣ３ｂへの結合を阻害する、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記抗体が、抗体Ｓ７７によって認識されるＣ３ｂエピトープの残基を含むエピトープに結合する、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記抗体が、原則として抗体Ｓ７７と同じエピトープに結合する、項目５に記載の方法。
（項目９）
前記抗体が、抗体Ｓ７７の結合を競合的に阻害する、項目５に記載の方法。
（項目１０）
前記抗体が、抗体Ｓ７７と接触している残基を含むＣ３ｂエピトープに結合する、項目５に記載の方法。
（項目１１）
前記抗体が、Ｃ３ｂと接触している抗体Ｓ７７残基を含む抗原結合部位を含む、項目５に記載の方法。
（項目１２）
前記抗体が、抗体Ｓ７７の重鎖ＣＤＲ配列（配列番号１〜４）および／または軽鎖ＣＤＲ配列（配列番号５〜８）を含む、項目５に記載の方法。
（項目１３）
ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、項目５に記載の方法。
（項目１４）
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、直鎖抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、および抗体断片から形成された多特異的抗体からなる群より選択される、項目５に記載の方法。
（項目１５）
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、または（ｓｃＦｖ）２断片である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記補体が関係している障害が、炎症性疾患または自己免疫疾患である、項目３に記載の方法。
（項目１７）
前記補体が関係している障害が、関節リウマチ（ＲＡ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血および再潅流後の遠隔組織の損傷、心肺バイパス手術の際の補体活性化、皮膚筋炎、天疱瘡、ループス腎炎と結果としての糸球体腎炎および脈管炎、心肺バイパス手術、心臓麻痺によって誘導される冠動脈内皮機能障害、ＩＩ型膜増殖性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、急性腎不全、クリオグロブリン血症、抗リン脂質症候群、黄斑変性疾患、例えば、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病および他の虚血関連網膜症、眼内炎、および他の眼内血管新生疾患、例えば、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、網膜血管新生、ならびに、同種移植、超急性拒絶反応、血液透析、慢性閉塞性肺窮迫症候群（ＣＯＰＤ）、喘息、および誤嚥性肺炎からなる群より選択される、項目３に記載の方法。
（項目１８）
前記補体が関係している障害が補体が関係している眼の症状である、項目３に記載の方法。
（項目１９）
前記補体が関係している眼の症状が、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）または脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
Ｃ３ではなくＣ３ｂに選択的に結合して、Ｃ５のＣ３ｂへの結合を阻害する、抗Ｃ３ｂ抗体。
（項目２１）
前記抗体が、抗体Ｓ７７によって認識されるＣ３ｂエピトープの残基を含むエピトープに結合する、項目２０に記載の抗体。
（項目２２）
前記抗体が、原則として抗体Ｓ７７と同じエピトープに結合する、項目２０に記載の抗体。
（項目２３）
前記抗体が、抗体Ｓ７７の結合を競合的に阻害する、項目２０に記載の抗体。
（項目２４）
前記抗体が、抗体Ｓ７７と接触している残基を含むＣ３ｂエピトープに結合する、項目２０に記載の抗体。
（項目２５）
前記抗体が、Ｃ３ｂと接触している抗体Ｓ７７の残基を含む抗原結合部位を含む、項目２０に記載の抗体。
（項目２６）
前記抗体が、抗体Ｓ７７の重鎖ＣＤＲ配列（配列番号１〜４）および／または軽鎖ＣＤＲ配列（配列番号５〜８）を含む、項目２０に記載の抗体。
（項目２７）
ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、項目２０に記載の抗体。
（項目２８）
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、直鎖抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、および抗体断片から形成された多特異的抗体からなる群より選択される、項目２０に記載の抗体。
（項目２９）
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、または（ｓｃＦｖ）２断片である、項目２８に記載の抗体。
（項目３０）
薬学的に許容される担体との混合物中に項目２０に記載の抗体を含む、薬学的組成物。
（項目３１）
補体が関係している障害の処置に使用するための、項目３０に記載の薬学的組成物。
（項目３２）
前記補体が関係している障害が、関節リウマチ（ＲＡ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血および再潅流後の遠隔組織の損傷、心肺バイパス手術の際の補体活性化、皮膚筋炎、天疱瘡、ループス腎炎と結果としての糸球体腎炎および脈管炎、心肺バイパス手術、心臓麻痺によって誘導される冠動脈内皮機能障害、ＩＩ型膜増殖性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、急性腎不全、クリオグロブリン血症、抗リン脂質症候群、黄斑変性疾患、例えば、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病および他の虚血関連網膜症、眼内炎、および他の眼内血管新生疾患、例えば、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、網膜血管新生、ならびに、同種移植、超急性拒絶反応、血液透析、慢性閉塞性肺窮迫症候群（ＣＯＰＤ）、喘息、および誤嚥性肺炎からなる群より選択される、項目３１に記載の薬学的組成物。
（項目３３）
項目２０に記載の抗体または項目３１に記載の薬学的組成物を含む容器と、補体が関係している障害の処置のための前記抗体または薬学的組成物の投与についての説明書を含む、キット。
１つの態様においては、本発明は、第二補体経路の選択的阻害剤であるＣ３ｂアンタゴニストの有効量を必要な被験体に投与する工程を含む、補体が関係している障害の予防または処置のための方法に関する。
１つの態様においては、被験体は哺乳動物である。別の実施形態においては、被験体はヒトである。
さらなる実施形態においては、Ｃ３ｂアンタゴニストは、Ｃ３の活性な分解産物上のエピトープを認識し、Ｃ３上のエピトープは認識しない抗体である。
なおさらなる実施形態においては、Ｃ３ｂアンタゴニストは、Ｃ３ｂに選択的に結合する抗体または抗体断片である。
異なる実施形態においては、抗体はＣ５のＣ３ｂへの結合を阻害する。
別の実施形態においては、抗体は、抗体Ｓ７７によって認識されるＣ３ｂエピトープの残基を含むエピトープに結合する。
なお別の実施形態においては、抗体は、原則として抗体Ｓ７７と同じエピトープに結合する。
さらなる実施形態においては、抗体は、抗体Ｓ７７の結合を競合的に阻害する。
なおさらなる実施形態においては、抗体は、抗体Ｓ７７と接触している残基を含むＣ３ｂエピトープに結合する。
さらなる実施形態においては、抗体には、Ｃ３ｂと接触している抗体Ｓ７７の残基を含む抗原結合部位が含まれる。
好ましい実施形態においては、抗体には、抗体Ｓ７７の重鎖ＣＤＲ配列（配列番号１〜４）および／または軽鎖ＣＤＲ配列（配列番号５〜８）が含まれ、そして／あるいは、これは抗体Ｓ７７またはその断片である。
様々な実施形態においては、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であり得る。
他の実施形態においては、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、直鎖抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、または抗体断片から形成された多特異的抗体からなる群より選択される。
本発明の方法には、以下のような炎症性疾患および自己免疫疾患を含む、任意の補体が関係している障害の予防または処置が含まれる：例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血および再潅流後の遠隔組織の損傷、心肺バイパス手術の際の補体活性化、皮膚筋炎、天疱瘡、ループス腎炎と結果としての糸球体腎炎および脈管炎、心肺バイパス手術、心臓麻痺によって誘導される冠動脈内皮機能障害、ＩＩ型膜増殖性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、急性腎不全、クリオグロブリン血症、抗リン脂質症候群、黄斑変性疾患、例えば、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病および他の虚血に関係する網膜症、眼内炎、および他の眼内血管新生疾患、例えば、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、網膜血管新生、ならびに、同種移植、超急性拒絶反応、血液透析、慢性閉塞性肺窮迫症候群（ＣＯＰＤ）、喘息、および誤嚥性肺炎。
特定の実施形態においては、補体が関係している障害は、補体が関係している眼の症状（例えば、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）または脈絡膜新生血管（ＣＮＶ））である。
別の態様においては、本発明は、Ｃ３ではなくＣ３ｂに選択的に結合し、Ｃ５のＣ３ｂへの結合を阻害する、抗Ｃ３ｂ抗体に関する。
１つの実施形態においては、抗体は、抗体Ｓ７７によって認識されるＣ３ｂエピトープの残基を含むエピトープに結合する。
別の実施形態においては、抗体は、原則として抗体Ｓ７７と同じエピトープに結合する。
なお別の実施形態においては、抗体は、抗体Ｓ７７の結合を競合的に阻害する。
異なる実施形態においては、抗体は、抗体Ｓ７７と接触している残基を含むＣ３ｂエピトープに結合する。
さらなる実施形態においては、抗体には、Ｃ３ｂと接触している抗体Ｓ７７の残基を含む抗原結合部位が含まれる。
なおさらなる実施形態においては、抗体には、抗体Ｓ７７の重鎖ＣＤＲ配列（配列番号１〜４）および／または軽鎖ＣＤＲ配列（配列番号５〜８）が含まれ、これは抗体Ｓ７７またはその断片である。
様々な実施形態においては、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であり得る。
抗体断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、直鎖抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、または抗体断片から形成された多特異的抗体からなる群より選択され得る。
別の態様においては、本発明は、薬学的に許容される担体との混合物の中にＣ３ｂアンタゴニスト（例えば、Ｃ３ｂ抗体）を含む薬学的組成物に関する。
特定の実施形態においては、薬学的組成物は、補体が関係している障害の処置に使用される。
さらなる態様においては、本発明は、本発明のＣ３ｂアンタゴニストもしくはＣ３ｂ抗体、またはそのようなアンタゴニストもしくは抗体が含まれている薬学的組成物を含む容器と、補体が関係している障害の処置のための抗体もしくは薬学的組成物の投与のための説明書を含むキットに関する。
図１。Ｃ３ｂパンニングによって抗体ファージライブラリーが生じた。 図２。様々なＣ３ｂ抗体クローンを用いたファージの競合結果 図３。抗体ＹＷ１４４．２．４３．Ｓ７７（本明細書中以後、Ｓ７７と簡単に呼ぶ）Ｆａｂとの複合体におけるＣ３ｂの結晶構造。Ｃ３ｂのβ鎖を緑色で示し、α鎖をオレンジ色で示す。Ｓ７７の重鎖（ＨＣ）と軽鎖（ＬＣ）はそれぞれ、濃い緑色と黄色で示す。ＣＲＩｇは、Ｃ３ｂ：ＣＲＩｇ共晶構造をベースとするＣ３ｂ：Ｆａｂ複合体上にドッキングさせられており（ｄｏｃｋｅｄ）、赤紫色で示す。 図４。抗体Ｓ７７のＣ３ｂとの結合相互作用の接近図（ｃｌｏｓｅ ｕｐ）。Ｃ３ｂは表面表現で示し、青緑色のリボン図はＣ３ｂ構造上に重ね合わせたＣ３を示す。Ｓ７７のＨＣとＬＣは、濃い緑色と黄色でリボン図として示す。Ｃ３ｂの表面はＳ７７に対する距離にしたがって着色した。４．７Å、４．０Å、および３．５Åよりも近い全ての原子をそれぞれ、黄色、オレンジ色、および赤色に着色した。Ｓ７７のＬＣがＣ３と衝突していることに留意されたい。しかし、Ｃ３のループは動かすことができる。 図５。抗体Ｓ７７ Ｆａｂ断片の重鎖（配列番号１〜４）と軽鎖（配列番号５〜８）のアミノ酸配列。Ｃ３ｂと密接に接している残基を赤で示す。 図６Ａおよび図６Ｂは、もとの抗体ＹＷ１４４．２．４３ Ｆａｂとその親和性成熟バージョン：１４４．２．４３．Ｓ７７ Ｆａｂ（Ｓ７７ Ｆａｂ）の結合親和性を表す。 図７Ａ、図７Ｂおよび図７Ｃは、ＳＰＲセンソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）と、Ｃ３およびＣ３ｂに対するＳ７７の結合親和性を表す。 図８Ａおよび図８Ｂは、Ｓ７７はＣ３ｂを認識するが、プロ分子Ｃ３は認識しないことを示す。精製されたＣ３ｂまたはＣ３を、ポリクローナルＣ３抗体を使用してマイクロタイタープレートの中に捕捉した。Ｓ７７（Ａ）またはポリクローナル抗Ｃ３抗体（Ｂ）の補足されたＣ３ｂまたはＣ３に対する結合を、二次ＨＲＰＯ結合抗体を使用して決定した。色はＴＭＢ（ＫＰＬ）を用いて発色させ、２ＮのＨ２ＳＯ４中で停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。 図９Ａ、図９Ｂおよび図９Ｃは、ＩｇＧ抗体Ｓ７７は、補体の第２経路を選択的に阻害するが、古典経路は阻害しないことを示す。ウサギの成熟赤血球とヒツジの成熟赤血球を、Ｃ１ｑ−およびＢ因子−枯渇血清中でインキュベートし、溶血を漸増濃度の阻害剤または対照タンパク質の存在下でモニターした。溶血は、阻害剤が存在しない条件下での最大溶血に対する割合（％）として表した。 図１０。親和性成熟させられたＳ７７ Ｆａｂは、補体の第２位経路を阻害する。 図１１。Ｃ３ｂ Ｆａｂ（Ｓ７７）はＣ５転換酵素を阻害する。Ｃ５転換酵素は、記載されているように行った（Ｒａｗａｌ，Ｎ ａｎｄ Ｐａｎｇｂｕｒｎ，Ｍ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１年２月１５日；１６６（４）：２６３５−４２）。 図１２。ＩｇＧ抗体Ｓ７７とそのＦａｂ断片は、Ｃ５転換酵素を、この転換酵素の非触媒サブユニットであるＣ３ｂに対するＣ５の結合をブロックすることによって阻害する。漸増濃度の阻害剤の存在下にあるＣ５を、Ｃ３ｂでコーティングしたプレートに添加した。Ｃ５はＣ３ｂ多量体に結合する。 図１３。Ｓ７７は、Ｈ因子とは対照的に、この転換酵素を崩壊させることはない。崩壊アッセイは、漸増濃度のＳ７７またはＨ因子（ポジティブ対照）の存在下でのプレートにコーティングしたＣ３転換酵素の作製によって行った。 図１４Ａおよび図１４Ｂは、Ｓ７７は、Ｃ３ｂに対するプロＢ因子の結合を阻害し、Ｃ３ｂＢｂ転換酵素の形成を阻害することを示す。 図１５Ａおよび図１５Ｂは、Ｓ７７は結合したｆＢｂの存在下でＣ３ｂに結合することができ、Ｃ３転換酵素を崩壊させることはないことを示す。 図１６Ａおよび図１６Ｂは、Ｓ７７はＣ３ｂに対するＨ因子の結合を阻害し、Ｈ因子の補因子活性を阻害することを示す。 図１７。Ｓ７７はＣ３ｂに対するＣＲ１の結合を阻害する。 図１８Ａ。抗ＨＥＲ２抗体ｒｈｕＭＡＢ ４Ｄ５−８の軽鎖可変領域（配列番号１３）および重鎖可変領域（配列番号１４）のアミノ酸配列。 図１８Ｂ。抗ＨＥＲ２抗体ｒｈｕＭＡＢ ４Ｄ５−８の軽鎖可変領域（配列番号１３）および重鎖可変領域（配列番号１４）のアミノ酸配列。 補足図１。Ｓ７７ ＦａｂのＨＣおよびＬＣと接触しているＣ３ｂ上の残基（残基８３３〜８３９には配列番号１５が含まれる；残基８９５〜８９９には配列番号１６が含まれる）。 補足図２。Ｃ３ｂと接触しているＳ７７ Ｆａｂ上の残基（残基１０３０〜１０３３には配列番号１７が含まれる；残基１０９８〜１１０７には配列番号１８が含まれる）。 補足図３。ヒトの補体因子Ｃ３（配列番号９）とマウスの補体因子Ｃ３（配列番号１０）のアミノ酸配列。 補足図３。ヒトの補体因子Ｃ３（配列番号９）とマウスの補体因子Ｃ３（配列番号１０）のアミノ酸配列。 補足図３。ヒトの補体因子Ｃ３（配列番号９）とマウスの補体因子Ｃ３（配列番号１０）のアミノ酸配列。 補足図３。ヒトの補体因子Ｃ３（配列番号９）とマウスの補体因子Ｃ３（配列番号１０）のアミノ酸配列。 補足図３。ヒトの補体因子Ｃ３（配列番号９）とマウスの補体因子Ｃ３（配列番号１０）のアミノ酸配列。
（好ましい実施形態の詳細な説明）
１．定義
用語「Ｃ３」および「補体Ｃ３」は互換的に使用され、天然の配列のＣ３ポリペプチドをいう。
「天然の配列のＣ３」は、その調製様式にはかかわらず、自然界に由来するＣ３ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有しているポリペプチドである。したがって、天然の配列のＣ３は自然界から単離することができ、また、組み換えおよび／もしくは合成手段によって生産することもできる。用語「天然の配列のＣ３」には、具体的に、Ｃ３の自然界に存在する変異体形態（例えば、オルタナティブスプライシングされた形態）、およびＣ３の自然界に存在する対立遺伝子変異体、ならびに自然界から導かれたＣ３ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有している立体構造変異体が含まれる。天然の配列のＣ３ポリペプチドには、具体的に、天然の配列のヒトＣ３（補足図３、配列番号９；Ｄｅ Ｂｒｕｉｊｎ ａｎｄ Ｆｅｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：７０８−７１２もまた参照のこと）と、ヒト以外の動物（高等霊長類およびヒト以外の哺乳動物を含む）のポリペプチド（例えば、補足図３、配列番号１０に示されるマウスのＣ３配列）が含まれる。
用語「Ｃ３ｂ」は、Ｃ３のα鎖のアミノ末端からアナフィラトキシンＣ３ａ断片を遊離させ、Ｃ３ｂを後ろに残すＣ３転換酵素による切断の後にＣ３ｂから生じる天然の配列のＣ３ｂポリペプチドをいうように本明細書中で使用される。用語「天然の配列」は、Ｃ３に関連して定義された意味と同じ意味を有しており、これには具体的に、配列番号９の天然の配列のヒトＣ３ｂが含まれる。
用語「Ｃ３ｂアンタゴニスト」は最も広い意味で使用され、これには、Ｃ３の生物学的活性を中和する、ブロックする、部分的もしくは完全に阻害する、無効にする、低下させる、または妨害することができる任意の分子が含まれる。Ｃ３ｂアンタゴニストとしては、抗Ｃ３ｂ抗体およびその抗原結合断片、Ｃ３ｂに結合してＣ３ｂの活性（例えば、補体が関係している障害の病状に関与するＣ３ｂの能力）を中和する、ブロックする、部分的もしくは完全に阻害する、無効にする、低下させる、または妨害することができる他の結合ポリペプチド、ペプチド、および、非ペプチド低分子が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中のＣ３ｂアンタゴニスト（例えば、Ｃ３ｂ抗体）は、Ｃ３ｂを特異的に認識するがその前駆体であるＣ３を特異的に認識しない。
「低分子」は、本明細書中では、約６００ダルトンを下回る、好ましくは、約１０００ダルトンを下回る分子量を有すると定義される。
「活性である」または「活性」または「生物学的活性」は本発明のＣ３ｂアンタゴニスト（例えば、Ｃ３ｂ抗体）の状況では、Ｃ３ｂの生物学的活性をアンタゴナイズする（部分的または完全に阻害する）能力である。Ｃ３ｂアンタゴニストの好ましい生物学的活性は、例えば、補体が関係している障害のようなＣ３ｂが関係している疾患または症状の状態（例えば、病状）の測定可能な改善を達成する能力である。活性は、インビトロまたはインビボ試験（結合アッセイを含む）において、関連する動物モデルまたはヒトの臨床試験を使用して決定することができる。
用語「補体が関係している障害」は最も広い意味で使用され、これには、その病状に補体系の活性化の異常が関係している全て疾患及び病状（例えば、補体欠損症）が含まれる。この用語には、具体的に、Ｃ３転換酵素の阻害により効果がある疾患および病状が含まれる。この用語にはさらに、第二補体経路の阻害（選択的阻害を含む）により効果がある疾患および病状が含まれる。補体が関係している障害としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：炎症性疾患および自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血および再潅流後の遠隔組織の損傷，心肺バイパス手術の際の補体活性化，皮膚筋炎、天疱瘡、ループス腎炎と結果としての糸球体腎炎および脈管炎、心肺バイパス手術、心臓麻痺によって誘導される冠動脈内皮機能障害、ＩＩ型膜増殖性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、急性腎不全、クリオグロブリン血症、抗リン脂質症候群、黄斑変性疾患、ならびに他の補体が関係している眼の症状、例えば、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病および他の虚血関連網膜症、眼内炎、および他の眼内血管新生疾患、例えば、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、網膜血管新生、ならびに同種移植、超急性拒絶反応、血液透析、慢性閉塞性肺窮迫症候群（ＣＯＰＤ）、喘息、および誤嚥性肺炎。
用語「補体が関係している眼の症状」は本明細書中では最も広い意味で使用され、これには、その病状に補体（補体の古典経路と第２経路、および特に第２経路を含む）が関係している全ての眼の症状および疾患が含まれる。この、グループには具体的に、その発現、発症、または進行を第２経路の阻害によって制御することができる、第２経路が関係している全ての眼の症状および疾患が含まれる。補体が関係している眼の症状としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：黄斑変性疾患（例えば、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の全ての段階、乾性形態と湿性形態（非滲出型と滲出型）を含む）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病および他の虚血関連網膜症、眼内炎、および他の眼内血管新生疾患、例えば、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、および網膜血管新生。補体が関係している眼の症状の好ましいグループには、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）（非滲出型（湿性）ＡＭＤおよび滲出型（乾性または萎縮型）ＡＭＤを含む）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、ならびに眼内炎が含まれる。
用語「炎症性疾患」および「炎症性障害」は互換的に使用され、これらは、哺乳動物の免疫系の成分が、哺乳動物の病的状態に寄与している炎症性応答を引き起こす、媒介する、または別の方法で寄与する疾患あるいは障害を意味する。炎症性応答の軽減が疾患の進行に対して緩和作用を有する疾患もまた含まれる。この用語には、免疫媒介性の炎症性疾患（自己免疫疾患を含む）が含まれる。
用語「Ｔ細胞媒介性」疾患は、Ｔ細胞が哺乳動物の病的状態を直接または間接的に媒介するか、あるいは別の方法で寄与する疾患を意味する。Ｔ細胞媒介性疾患は、細胞媒介性の作用、リンホカイン媒介性の作用などと関係し得、さらには、Ｂ細胞が（例えば、Ｔ細胞によって分泌されたリンホカインによって）刺激される場合には、Ｂ細胞が関係している作用と関係し得る。
その一部がＴ細胞媒介性である免疫関連疾患および炎症性疾患の例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症性筋疾患（皮膚筋炎、多発筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（自己免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症）、自己免疫性血小板減少（特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介性血小板減少症）、甲状腺炎（グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、真性糖尿病、免疫媒介性腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢神経系および末梢神経系の脱髄疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱髄性多発神経障害、肝胆道疾患、例えば感染性肝炎（Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、および他の非肝炎ウイルス）、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、および硬化性胆管炎、炎症性肺疾患および繊維性肺疾患（例えば、嚢胞性線維症）、グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑および接触性皮膚炎を含む自己免疫性皮膚疾患または免疫媒介性皮膚疾患、乾癬、肺のアレルギー性疾患、例えば、好球性肺炎、特発性肺線維症、および過敏性肺炎、移植拒絶反応および移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患、アルツハイマー病、およびアテローム性動脈硬化症。
「処置」は、障害の発症を予防するか、または障害の病状を変化させる意図で行われる介入である。したがって、「処置」は、治療的処置と、予防的処置または予防対策の両方をいう。処置が必要なものには、すでに障害を有しているもの、ならびに障害が予防されるものが含まれる。免疫関連疾患の処置においては、治療薬は免疫応答の成分の応答の大きさを直接変化させる場合があり、また、他の治療薬（例えば、抗生物質、抗真菌薬、抗炎症薬、化学療法薬など）による処置に対して疾患をより敏感にする場合もある。
疾患の「病状」（例えば、補体が関係している障害）には、患者の満足できる生活状態を損なうあらゆる表現形が含まれる。これには、異常なまたは制御不可能な細胞増殖（好中球、好酸球、単球、リンパ球細胞）、抗体生産、自己抗体の生産、補体の生産、近隣細胞の正常な機能の妨害、サイトカインの放出、または異常なレベルでの他の分泌産物、任意の炎症応答もしくは免疫学的応答の抑制または激化、炎症細胞（好中球、好酸球、単球、リンパ球）の細胞空間への浸潤などが含まれるが、これらに限定されない。
用語「哺乳動物」は、本明細書中で使用される場合は、哺乳動物と分類される任意の動物をいい、これには、ヒト、高等霊長類、家畜動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｄ ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌｓ）、動物園用、競技用、またはペット用の動物（例えば、ウマ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、およびイタチなど）が含まれるがこれらに限定されない。本発明の好ましい実施形態においては、哺乳動物はヒトである。
１種類以上のさらなる治療薬「と組み合わせた」投与には、同時（併用）投与および任意の順序での連続投与が含まれる。
「治療有効量」は、例えば、補体が関係している障害のような標的である疾患または症状の状態（例えば、病状）の測定可能な改善を達成するために必要な「Ｃ３ｂアンタゴニスト」（例えば、「Ｃ３ｂ抗体」）の量である。
用語「制御配列」は、特定の宿主生物の中での動作可能であるように連結されたコード配列の発現に不可欠なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適している制御配列には、例えば、プロモーター、状況に応じてオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが公知である。
核酸は、別の核酸配列と機能的関係で配置されている場合に「動作可能であるように連結され」ている。例えば、先行配列または分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与しているプレタンパク質として発現される場合には、ポリペプチドのＤＮＡに動作可能であるように連結される。プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与える場合には、コード配列に動作可能であるように連結される。または、リボソーム結合部位が、それが翻訳を促進するように配置される場合には、コード配列に動作可能であるように連結される。一般的には、「動作可能であるように連結された」は、連結されているＤＮＡ配列が連続しており、そして分泌リーダーの場合には、連続しており、リーディングフレーム内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも連続している必要はない。連結は使いやすい制限酵素部位での連結によって行われる。そのような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来の実施方法にしたがって使用される。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は当業者によって容易に決定可能であり、一般的には、プローブの長さ、洗浄温度、および塩濃度に依存する経験的計算である。一般に、より長いプローブには、適切なアニーリングのためにより高い温度が必要であり、一方、より短いプローブには、より低い温度が必要である。ハイブリダイゼーションは一般的には、相補的な鎖がそれらの融解温度よりも低い環境に存在する時の、変性させられたＤＮＡが再度アニーリングする能力に依存する。プローブと、ハイブリダイゼーション可能な配列との間で所望される相同性の程度が高ければ高いほど、使用できる相対的な温度は高くなる。したがって、結果として、より高い相対的温度が反応条件をよりストリンジェントにする傾向があり、一方、より低い温度は反応条件のストリンジェンシーをより低くするということになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細と説明については、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照のこと。
「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシーの条件」は、本明細書中で定義される場合には以下によって特定され得る：（１）洗浄には低いイオン強度と高温（例えば、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム、５０℃）を使用する；（２）ホルムアミドのような変性剤（例えば、０．１％のウシ血清アルブミンを含む５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／７５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム、４２℃）をハイブリダイゼーションの際に使用する；または、（３）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケの精液ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％のデキストラン硫酸を４２℃で使用し、４２℃で０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で、そして５０％のホルムアミド中で５５℃で洗浄し、その後に、５５℃でＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシーの洗浄が続く。
「中程度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されているように同定することができ、これには、上記よりもストリンジェンシーの低い洗浄溶液とハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、および％ＳＤＳ）の使用が含まれる。中程度にストリンジェントな条件の一例は、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％のデキストラン硫酸、および２０ｍｇ／ｍＬの変性させて剪断したサケの精液ＤＮＡを含む溶液中で３７℃で一晩のインキュベーションであり、その後に、約３７〜５０℃での１×ＳＳＣ中でのフィルターの洗浄が続く。当業者は、プローブの長さなどの要因に適合させる必要に応じて、温度、イオン強度などを調整する方法を理解しているであろう。
用語「エピトープタグ化」は、本明細書中で使用される場合は、「タグポリペプチド」に融合させられた本発明のポリペプチドを含むキメラポリペプチドをいう。タグポリペプチドは、それに対する抗体を作製できるエピトープを提供するに十分な残基を有しているが、それに対して融合させられるポリペプチドの活性を妨害しないように十分に短い。タグポリペプチドはまた、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように極めて固有なものであることが好ましい。適切なタグポリペプチドは、一般的には、少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、通常は、約８から５０個の間のアミノ酸残基（好ましくは、約１０から２０個の間のアミノ酸残基）を有する。
用語「抗体」は最も広い意味で使用され、これには具体的に、Ｃ３の崩壊断片を認識するが、天然のＣ３は認識しない単鎖抗体（例えば、Ｃ３ｂに特異的に結合する抗Ｃ３ｂモノクローナル抗体）、ならびに多エピトープ特異性を有している抗体組成物が含まれるが、これらに限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書中で使用される場合は、実質的に均質な抗体の集団から得られた１つの抗体をいい、すなわち、個々の抗体を含む集団は、主要ではない量で存在する可能性がある自然界において起こる可能性がある変異を除いて同一である。
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書中で使用される場合は、実質的に均質な抗体の集団から得られた１つの抗体をいい、すなわち、個々の抗体を含む集団は、主要ではない量で存在する可能性がある自然界において起こる可能性がある変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、１つの抗原性部位に特異的である。さらに、伝統的な（ポリクローナル）抗体調製物（これには、通常は、異なる決定基（エピトープ）に特異的な様々な抗体が含まれている）とは対照的に、個々のモノクローナル抗体は抗原上にある１つの決定基に特異的である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られたという抗体の特性を示し、任意の特定の方法による抗体の生産が必要とは解釈されるべきではない。例えば、本発明にしたがって使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製され得、また、組み換えＤＮＡ法によっても作製され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。「モノクローナル抗体」はまた、ファージ抗体ライブラリーから、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７に記載されている技術を使用して単離される場合もある。
本明細書中でのモノクローナル抗体には、具体的には、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）が含まれる。ここでは、重鎖および／または軽鎖の一部分は、特定の種に由来するか、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属している抗体中の対応している配列と同一であるかあるいは相同であるが、それらが所望される生物学的活性を示すとの条件で、鎖（単数または複数）の残りは別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属している抗体、さらにはそのような抗体の断片中の対応している配列と同一であるかあるいは相同である（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５）。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態はキメラ抗体であり、これには、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列が含まれる。大部分については、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ここでは、レシピエントの超可変領域由来の残基がヒト以外の種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラット、ウサギ、または所望される特異性、親和性、および能力を有しているヒト以外の霊長類）の超可変領域由来の残基によって置換される。いくつかの場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応しているヒト以外の残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体には、レシピエント抗体の中にも、またドナー抗体の中にも見られない残基が含まれる場合がある。これらの改変は、抗体の性能をさらに高めるために行われる。一般的には、ヒト化抗体には、少なくとも１つ、通常は２つの可変ドメインの実質的に全体が含まれるであろう。ここでは、超可変ループ全体または実質的に全体が非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、そしてＦＲ領域全体または実質的に全体がヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体にはまた、状況に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（通常は、ヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部分も含まれるであろう。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９；およびＰｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６を参照のこと。
「種依存性抗体」は、第１の哺乳動物種に由来する抗原に対して、それが第２の哺乳動物種に由来するその抗原のホモログに対して有しているよりも強い結合親和性を有するものである。通常、種依存性抗体は、ヒト抗原に「特異的に結合する」（すなわち、約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは、約１×１０−８Ｍ以下、そして最も好ましくは、約１×１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有する）が、第２の非ヒト哺乳動物種由来のその抗原のホモログに対して結合親和性を有しており、これはヒト抗原に対するその結合親和性よりも少なくとも約５０倍、または少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍弱い。種依存性抗体は、上記で定義された様々なタイプの抗体のうちのいずれであってもよいが、ヒト化抗体またはヒト抗体が好ましい。
本明細書中で使用される場合は、「抗体突然変異体」または「抗体変異体」は、種依存性抗体のアミノ酸残基のうちの１つ以上が改変されている、種依存性抗体のアミノ酸配列変異体をいう。そのような突然変異体は、種依存性抗体と１００％未満の配列同一性または類似性を必ず有する。好ましい実施形態においては、抗体突然変異体は、種依存性抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのいずれかのアミノ酸配列と少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性または類似性、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性または類似性を有しているアミノ酸配列を有するであろう。この配列に関する同一性または類似性は、本明細書中では、配列をアラインメントし、そして必要である場合にはギャップを導入して、最大のパーセント配列同一性を得た後の、種依存性抗体残基と同一である（すなわち、同じ残基）または類似している（すなわち、共通する側鎖特性に基づく同じグループに由来するアミノ酸残基、下記を参照のこと）、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。可変ドメインの外側にある抗体配列へのＮ末端、Ｃ末端、または内部での伸張、欠失、あるいは挿入はいずれも、配列同一性または類似性に影響を与えないと解釈されるはずである。
「単離された」抗体は、同定され、そしてその天然の環境の成分とは分離されている、および／またはそれらから回収されたものである。その天然の環境の混入している成分は、抗体の診断的または治療的使用を妨害する可能性がある物質であり、これには、酵素、ホルモン、および他のタンパク質様または非タンパク質様の溶質が含まれ得る。好ましい実施形態においては、抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって決定された場合には、抗体のうち９５重量％超まで、そして最も好ましくは９９重量％超まで、（２）スピニングカップシーケネーター（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｃｕｐ ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）の使用によってＮ末端アミノ酸配列もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、あるいは、（３）クマシーブルー染色または好ましくは銀染色を使用する、還元条件下もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一性を示すまで、精製されるであろう。抗体の天然の環境の少なくとも１つの成分は存在しないので、単離された抗体には、組換え体細胞内にあるインサイチュ抗体が含まれる。しかし通常は、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製されるであろう。
本明細書中で使用される場合は、「抗体可変ドメイン」は、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）ならびにフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖および重鎖の部分をいう。ＶＨは、重鎖の可変ドメインをいう。ＶＬは軽鎖の可変ドメインをいう。本発明で使用される方法に従うと、ＣＤＲおよびＦＲに割り当てられたアミノ酸位置はＫａｂａｔ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７および１９９１））にしたがって定義され得る。抗体または抗原結合断片のアミノ酸ナンバリングもまたＫａｂａｔのものにしたがう。
本明細書中で使用される場合は、用語「相補性決定領域」（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）は、その存在が抗原結合に不可欠である抗体可変ドメインのアミノ酸残基をいう。個々の可変ドメインは、通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として特定された３個のＣＤＲ領域を有する。個々の相補性決定領域には、Ｋａｂａｔによって定義された「相補性決定領域」に由来するアミノ酸残基が含まれ得る（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基約２４〜３４（Ｌ１）、残基約５０〜５６（Ｌ２）および残基約８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の残基約３１〜３５（Ｈ１）、残基約５０〜６５（Ｈ２）および残基約９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））由来のアミノ酸残基、ならびに／あるいは「超可変ループ」（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基約２６〜３２（Ｌ１）、残基約５０〜５２（Ｌ２）および残基約９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の残基約２６〜３２（Ｈ１）、残基約５３〜５５（Ｈ２）および残基約９６〜１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）由来の残基）。いくつかの場合には、相補性決定領域には、Ｋａｂａｔにしたがって定義されたＣＤＲ領域と超可変ループの両方に由来するアミノ酸が含まれ得る。例えば、抗体４Ｄ５の重鎖のＣＤＲＨ１にはアミノ酸２６から３５が含まれる。
「フレームワーク領域」（本明細書中以後、「ＦＲ」）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメインの残基である。個々の可変ドメインは、通常は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４として同定された４個のＦＲを有する。ＣＤＲがＫａｂａｔにしたがって定義される場合は、軽鎖ＦＲ残基は、残基約１〜２３（ＬＣＦＲ１）、約３５〜４９（ＬＣＦＲ２）、約５７〜８８（ＬＣＦＲ３）、および約９８〜１０７（ＬＣＦＲ４）に位置し、そして重鎖ＦＲ残基は、重鎖残基の中の残基約１〜３０（ＨＣＦＲ１）、約３６〜４９（ＨＣＦＲ２）、約６６〜９４（ＨＣＦＲ３）、および約１０３〜１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。ＣＤＲに超可変ループ由来のアミノ酸残基が含まれる場合は、軽鎖ＦＲ残基は、軽鎖の中の残基約１〜２５（ＬＣＦＲ１）、約３３〜４９（ＬＣＦＲ２）、約５３〜９０（ＬＣＦＲ３）、および約９７〜１０７（ＬＣＦＲ４）に位置し、重鎖ＦＲ残基は、重鎖残基の中の残基約１〜２５（ＨＣＦＲ１）、約３３〜５２（ＨＣＦＲ２）、約５６〜９５（ＨＣＦＲ３）、および約１０２〜１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。ＣＤＲに、Ｋａｂａｔによって定義されたＣＤＲと超可変ループのものの両方に由来するアミノ酸が含まれるいくつかの場合には、ＦＲ残基は、それに応じて調整されるであろう。例えば、ＣＤＲＨ１にアミノ酸Ｈ２６〜Ｈ３５が含まれる場合には、重鎖ＦＲ１残基は１〜２５位にあり、そしてＦＲ２残基は３６〜４９位にある。
本明細書中で使用される場合は、「コドンセット」は、所望される変異体アミノ酸をコードするために使用される様々なヌクレオチドトリプレット配列の１つのセットをいう。コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの可能な組み合わせの全てを提示し、そしてアミノ酸の所望されるグループをコードするであろう配列を含むオリゴヌクレオチドの１つセットは、例えば、固相合成によって合成することができる。コドン表示の標準的な形態はＩＵＢコードのコドン表示である。これは当該分野で公知であり、本明細書中に記載される。コドンセットは、通常、斜体の３つの大文字（例えば、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＤＶＫなど）によって表される。したがって、「無作為ではないコドンセット」は、本明細書中で使用される場合は、本明細書中に記載されるアミノ酸選択の基準を部分的に（好ましくは完全に）満たす選択されたアミノ酸をコードするコドンセットをいう。特定の位置に選択されたヌクレオチド「縮重」を有するオリゴヌクレオチドの合成は当該分野で周知である。例えば、ＴＲＩＭアプローチ（Ｋｎａｐｐｅｋら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６）；Ｇａｒｒａｒｄ ＆ Ｈｅｎｎｅｒ（１９９３）Ｇｅｎｅ １２８：１０３）。特定のコドンセットを有しているオリゴヌクレオチドのそのようなセットは、市販されている核酸合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手できる）を使用して合成することができるか、または商業的に入手することができる（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから）。したがって、特定のコドンセットを有している合成されたオリゴヌクレオチドの１つのセットには、通常、様々な配列を持つ複数のオリゴヌクレオチドが含まれるであろう。これらの差異は、配列全体の中にコドンセットによって確立される。本発明にしたがって使用される場合は、オリゴヌクレオチドは、可変ドメイン核酸鋳型へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、そしてまた、例えば、クローニングの目的に有用である制限酵素部位を含むことができるが、必ずしもそうである必要ではない。
用語「抗体断片」は本明細書中では最も広い意味で使用され、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、直鎖抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、ならびに抗体断片から形成された多特異的抗体が含まれるが、これらに限定されない。
「Ｆｖ」断片は、完全な抗原認識および結合部位を含む抗体断片である。この領域は、例えば、ｓｃＦｖにおいて堅く会合した（本来は共有結合であり得る）１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの２量体からなる。この立体配置においては、個々の可変ドメインの３個のＣＤＲが、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位の輪郭を提示するように相互作用する。まとめると、６個のＣＤＲまたはそれらのサブセットが抗体に抗原結合特異性を与える。しかし、１つの可変ドメイン（または抗原に特異的なＣＤＲを３個しか含まないＦｖの半分）もなお、抗原を認識して抗原に結合する能力を有しているが、通常は、完全な結合部位よりも親和性が低い。
「Ｆａｂ」断片には、軽鎖の可変ドメインおよび定常ドメインと、重鎖の可変ドメインおよび第１の定常ドメイン（ＣＨ１）が含まれる。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片には１対のＦａｂ断片が含まれ、これは通常、それらの間にあるヒンジシステインによってそれらのカルボキシ末端付近に共有結合させられる。抗体断片の他の化学的カップリングもまた当該分野で公知である。
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片には、抗体のＶＨおよびＶＬドメインが含まれる。ここでは、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖の中に存在する。一般的には、Ｆｖポリペプチドにはさらに、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーが含まれ、これによりｓｃＦｖは抗原結合のための所望される構造を形成することができる。ｓｃＦｖの概要については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，第１１３巻，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。
用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片をいう。この断片には、同じポリペプチド鎖（ＶＨおよびＶＬ）の中に、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結させられた重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が含まれる。同じ鎖上にある２つのドメインの間での対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、これらのドメインは別の鎖の相補ドメインと対合するように向けられ、２つの抗原結合部位が作製される。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８にさらに詳細に記載されている。
表現「直鎖抗体」は、Ｚａｐａｔａら（１９９５ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ，８（１０）：１０５７−１０６２）に記載されている抗体をいう。簡単に説明すると、これらの抗体には、１対のタンデムなＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）が含まれる。これは、相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒に、１対の抗原結合領域を形成する。直鎖抗体は二重特異的であっても、また、単特異的であってもよい。
本明細書中で使用される場合は、「ライブラリー」は、複数の抗体または抗体断片配列（例えば、本発明のポリペプチド）、あるいはこれらの配列をコードする核酸をいう。これらの配列は、本発明の方法にしたがってこれらの配列の中に導入される変異体アミノ酸の組み合わせが異なる。
「ファージディスプレイ」は、それによって変異体ポリペプチドが、ファージ（例えば、糸状ファージ）粒子の表面上にある外被タンパク質の少なくとも一部に対する融合タンパク質として提示される技術である。ファージディスプレイの有用性は、無作為化されたタンパク質変異体の大きなライブラリーが、高い親和性を有している標的抗原に結合するそのような配列について迅速に、かつ効率よく選別され得るという事実にある。ファージ上にあるペプチドおよびタンパク質ライブラリーのディスプレイは、特異的結合特性を有しているものについて何百万ものポリペプチドをスクリーニングするために使用されている。多価ファージディスプレイ法は、糸状ファージの遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかへの融合によって小さい無作為ペプチドおよび小さいタンパク質を提示するために使用されている。Ｗｅｌｌｓ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：３５５−３６２、および本明細書中で引用される参考文献。１価のファージディスプレイにおいては、タンパク質またはペプチドライブラリーは、遺伝子ＩＩＩまたはその一部に融合させられ、ファージ粒子が１コピーの融合タンパク質を提示するか、または融合タンパク質を全く提示しないように、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質の存在下で低レベルで発現させられる。親和性効果は多価ファージと比較して低く、結果として、選別は固有のリガンド親和性に基づき、そしてファージミドベクターが使用され、これはＤＮＡの操作を簡素化する。Ｌｏｗｍａｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３：２０５−０２１６。
「ファージミド」は、細菌の複製起点（例えば、ＣｏｌＥ１）とバクテリオファージの遺伝子間領域の１つのコピーを有しているプラスミドベクターである。ファージミドは任意の公知のバクテリオファージ（糸状バクテリオファージおよびラムダ型バクテリオファージを含む）に対して使用され得る。プラスミドにはまた、一般的には、抗生物質耐性の選択マーカーも含まれるであろう。これらのベクターの中にクローニングされたＤＮＡのセグメントは、プラスミドとして増幅させることができる。これらのベクターを保有している細胞がファージ粒子の生産に必要な全ての遺伝子とともに提供される場合には、プラスミドの複製の態様が複製サイクルを回転させるように変化して、プラスミドＤＮＡの一方の鎖の複数のコピーが生じ、ファージ粒子がパッケージされる。ファージミドは感染性ファージ粒子を形成する場合も、また非感染性ファージ粒子を形成する場合もある。この用語には、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面上に提示されるように、遺伝子融合体として異種ポリペプチド遺伝子に連結させられたファージ外被タンパク質遺伝子またはその断片を含むファージミドが含まれる。
用語「ファージベクター」は、異種遺伝子を含み、そして複製が可能なバクテリオファージの二本鎖の複製可能な形態を意味する。ファージベクターは、ファージの複製とファージ粒子の形成を可能にするファージの複製起点を有する。ファージは、Ｍ１３、ｆｌ、ｆｄ、Ｐｆ３ファージのような糸状バクテリオファージまたはそれらの誘導体、あるいは、λ、２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、８２、４２４、４３４などのようなλ型ファージまたはそれらの誘導体であることが好ましい。
本明細書中で使用される場合は、「溶媒が接近しやすい位置（ｓｏｌｖｅｎｔ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、抗体もしくは抗原結合断片の構造、構造の集合体、および／またはモデル化された構造に基づいて、分子（例えば、抗体特異的抗原）との溶媒の接近および／または接触に利用できる可能性があるとして決定される、供給源である抗体または抗原結合断片の重鎖および軽鎖の可変領域中のアミノ酸残基の位置をいう。これらの位置は、通常、ＣＤＲの中、およびタンパク質の外側に見られる。抗体または抗原結合断片の溶媒が接近しやすい位置は、本明細書中で定義される場合は、当該分野で公知の多数のアルゴリズムのうちの任意のものを使用して決定することができる。好ましくは、溶媒が接近しやすい位置は、抗体の３次元モデルから座標を使用して、好ましくは、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩプログラム（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のようなコンピュータープログラムを使用して決定される。溶媒が接近しやすい位置はまた、当該分野で公知のアルゴリズムを使用して決定することもできる（例えば、Ｌｅｅ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ（１９７１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５，３７９、およびＣｏｎｎｏｌｌｙ（１９８３）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．１６，５４８を参照のこと）。溶媒が接近しやすい位置の決定は、抗体から得られたタンパク質のモデル化および３次元構造情報に適しているソフトウェアを使用して行うことができる。これらの目的のために利用できるソフトウェアとしては、ＳＹＢＹＬ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｍｏｄｕｌｅソフトウェア（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）が挙げられる。一般的には、そして好ましくは、アルゴリズム（プログラム）に使用者がサイズパラメーターを入力する必要がある場合には、計算に使用されるプローブの「サイズ」は、約１．４オングストロームまたはそれ未満の半径に設定される。加えて、パーソナルコンピュータ用のソフトウェアを使用する溶媒が接近しやすい領域および範囲の決定方法は、Ｐａｃｉｏｓ（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１８（４）：３７７−３８６によって記載されている。
ＩＩ．詳細な説明
補体系
補体は体の防御において重要な役割を果たしており、免疫系の他の成分とともに、体への病原体の侵入から個体を防御する。しかし、適切に活性化または制御されなければ、補体もまた宿主組織に対して損傷を引き起こす可能性がある。補体の不適切な活性化は、補体が関係している疾患または障害（例えば、免疫複合体および自己免疫疾患）ならびに様々な炎症症状（補体によって媒介される炎症性の組織損傷を含む）と呼ばれる様々な疾患の病状に関与している。補体が関係している障害の病状は様々であり、これには、長期間または短期間の補体活性化、カスケード全体の活性化、複数のカスケードのうちの１つだけ（例えば、古典経路または第２経路）の活性化、カスケードのうちのいくつかの成分だけの活性化などが関与し得る。いくつかの疾患においては、補体断片の補体生物学的活性が組織損傷および疾患を生じる。したがって、補体の阻害剤は治療的有効性が高い。第２経路の選択的阻害剤は、古典経路による血液からの病原体および他の微生物のクリアランスが完全な状態のままであるので、特に有用であろう。
Ｃ３ｂ抗体と補体が関係している障害の予防および処置におけるそれらの使用
本発明は、少なくとも一部、Ｃ３の崩壊断片を特異的に認識するが、天然のＣ３は認識しない抗体の開発に基づく。具体的には、本発明は、ヒトの組み合わせ抗体ライブラリーとファージディスプレイ（ここでは、Ｃ３ｂ特異的ファージの富化は、飽和量のＣ３でのブロッキングによって行われた）を使用して開発された、Ｃ３ｂを認識し、これに特異的に結合する抗体に関する。この方法論を使用して、本発明者らは、Ｃ３の活性化形態に特異的な抗体を開発することができた。加えて、これらのヒト抗体はさらに親和性成熟させられ、それにより、インビボでの溶血アッセイにおけるそれらの効力が高くなった。Ｆａｂ断片がクローニングによって作製され、第２経路を通じて補体活性化を阻害する高い効力を保持していることが示された。Ｃ３ｂを持つ複合体の中のＦａｂ（Ｓ７７と命名された）の共構造（ｃｏ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）が解析され、Ｃ３ｂ−Ｓ７７相互作用に関与している残基がマップされた。本発明者らの知識について、これは、補体の第２経路を阻害するＣ３断片に対して選択性を有している、最初のファージから導かれた抗体である。
本発明の抗体および他のＣ３ｂ特異的アンタゴニストは、補体が関係している障害の予防および処置に有用である。補体が関係している疾患の特異的な例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：関節リウマチ（ＲＡ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血および再潅流後の遠隔組織の損傷、心肺バイパス手術の際の補体活性化、皮膚筋炎、天疱瘡、ループス腎炎と結果としての糸球体腎炎および脈管炎、心肺バイパス手術、心臓麻痺によって誘導される冠動脈内皮機能障害、ＩＩ型膜増殖性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、急性腎不全、クリオグロブリン血症、抗リン脂質症候群、黄斑変性疾患および眼内炎のような他の補体が関係している眼の症状、例えば、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病および他の虚血に関係する網膜症、ならびに、他の眼内血管新生疾患、例えば、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、網膜血管新生、ならびに、同種移植、超急性拒絶反応、血液透析、慢性閉塞性肺窮迫症候群（ＣＯＰＤ）、喘息、および誤嚥性肺炎。
補体が関係している疾患の例としての炎症症状のさらに広範囲に及ぶリストとしては、例えば以下が挙げられる：炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症性筋疾患（皮膚筋炎、多発筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（自己免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症）、自己免疫性血小板減少（特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介性血小板減少症）、甲状腺炎（グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、真性糖尿病、免疫媒介性腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢神経系および末梢神経系の脱髄疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱髄性多発神経障害、肝胆道疾患、例えば感染性肝炎（Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、および他の非肝炎ウイルス）、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、および硬化性胆管炎、炎症性肺疾患および繊維性肺疾患（例えば、嚢胞性線維症）、グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑および接触性皮膚炎を含む自己免疫性皮膚疾患または免疫媒介性皮膚疾患、乾癬、肺のアレルギー性疾患、例えば、好球性肺炎、特発性肺線維症、および過敏性肺炎、移植拒絶反応および移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患。
全身性エリテマトーデスにおいては、この疾患の中心的な媒介因子は、自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体の生産と、それに続く免疫媒介性の炎症の発生である。抗体は、組織の損傷を直接的または間接的のいずれかで媒介する。しかし、Ｔリンパ球は組織損傷に直接関与しているとは示されていない。Ｔリンパ球は、自己反応性抗体の開発に必要である。したがって、この疾患の発生はＴリンパ球依存性である。複数の臓器およびシステム（腎臓、肺、骨格筋系、皮膚粘膜、眼、中枢神経系、心臓血管系、消化器、骨髄、および血液を含む）が臨床的に影響を受ける。
関節リウマチ（ＲＡ）は慢性の全身性自己免疫性炎症疾患である。これは主に、複数の関節の滑膜に関係があり、結果としての関節軟骨の損傷を伴う。発症はＴリンパ球依存性であり、リウマチ因子（自己ＩｇＧに特異的な自己抗体）の生産と関係があり、これには、結果としての免疫複合体の形成が伴い、関節液および血液中で高レベルに達する。関節の中のこれらの複合体は、活液へのリンパ球および単球の顕著な浸潤を誘導し得、続いて、顕著な滑液の変化を誘導し得る。関節空間／液は、類似する細胞によって浸潤され、多数の好中球の追加も伴う。罹患組織は主に関節であり、多くの場合は左右対称のパターンである。しかし、関節外疾患もまた、２つの主要な形態で発生する。１つの形態は、進行性の関節疾患を伴う関節外病変と、肺線維症、脈管炎、および皮膚潰瘍の典型的な病変の発症である。関節外疾患の第２の形態は、いわゆるフェルティー症候群であり、これはＲＡ疾患の後期に、時として関節疾患が鎮静期となった後に発症し、好中球減少症、血小板減少症、および脾腫の存在が関与する。これは、梗塞、皮膚潰瘍、壊疽の形成とともに、複数の臓器において脈管炎を伴うことがある。患者はまた、罹患した関節の上に層をなしている皮下組織においてリウマチ性結節を発症することがよくある。この結節は後期において、炎症性細胞浸潤物の混合物で包囲された壊死中心を有する。ＲＡにおいて起こる可能性がある他の症状発現としては、心膜炎、胸膜炎、冠状動脈炎、肺線維症を伴う腸管肺実質炎（ｉｎｔｅｓｔｉｔｉａｌ ｐｎｅｕｍｏｎｉｔｉｓ）、乾性角結膜炎、およびリウマチ性結節が挙げられる。
若年性の慢性関節炎は慢性の特発性炎症疾患である。これは多くの場合には、１６歳未満で始まる。その表現型はＲＡといくらかの類似性がある。リウマチ因子陽性の患者の一部は、若年性のリウマチ関節炎と分類される。この疾患は３つの主要なカテゴリー：少関節性（ｐａｕｃｉａｒｔｉｃｕｌａｒ）、ポリ関節性（ｐｏｌｙａｒｔｉｃｕｌａｒ）、全身性に分類される。関節炎は重症であり得、通常は破壊性であり、関節強直症に至り成長が遅延する可能性がある。他の症状発現としては、慢性の前部ブドウ膜炎および全身性アミロイドーシスが挙げられる。
脊椎関節症は、いくらかの共通の臨床的特徴を有し、また、ＨＬＡ−Ｂ２７遺伝子産物の発現に共通の関連性がある、障害の１つのグループである。この障害には、強直性関節炎、ライター症候群（反応性関節炎）、炎症性腸疾患を伴う関節炎、乾癬を伴う脊椎炎、脊椎性関節症及び未分化脊椎関節炎の若年性発症が含まれる。他と区別する特徴には、脊髄炎を伴う／伴わない仙腸関節炎；炎症性の非対称性関節炎；ＨＬＡ−Ｂ２７（クラスＩＭＨＣのＨＬＡ−Ｂ遺伝子座の、血清学的に定義された対立遺伝子）との関連；眼球炎症、および他のリウマチ性疾患に関連した自己抗体が存在しないことが含まれる。疾患の誘導にとって鍵となる最も有力な細胞は、ＣＤ８＋のＴリンパ球であり、これはクラスＩＭＨＣ分子により提示される抗原を標的とする細胞である。ＣＤ８＋のＴ細胞は、これがまるでＭＨＣクラスＩ分子により発現された外来ペプチドであるかのように、クラスＩＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ−Ｂ２７と反応し得る。ＨＬＡ−Ｂ２７のエピトープは、細菌または他の微生物の抗原性エピトープを模倣し、それにより、ＣＤ８＋のＴ細胞応答を誘導するという仮説が立てられている。
全身性硬化症（強皮症）の病因は明らかではない。この疾患の顕著な特徴は、皮膚のしこりであり、これは活動性の炎症プロセスによって誘導されるようである。強皮症は、局所的である場合も、また、全身性である場合もあり、血管に病変が生じるのが一般的であり、また、微小血管中の内皮細胞の損傷は、全身性強皮症の発症において早期に起こる重要な事象である。血管の損傷には免疫媒介性である場合がある。皮下の病変部への単核細胞の浸潤の存在、および多くの患者における抗−核抗体の存在により、免疫学的根拠が示唆される。ＩＣＡＭ−１は、多くの場合は、皮膚の病変部にある線維芽細胞の細胞表面上でアップレギュレートされ、これはこれらの細胞とのＴ細胞の相互作用がこの疾患の病因において役割を果たしている可能性があることを示唆している。関与している他の臓器としては以下が挙げられる：消化器管：異常な蠕動運動／運動性を生じる平滑筋萎縮症および線維症；腎臓：小さい弓状動脈および小葉間動脈に影響を及ぼして、腎皮質の血流の減少を生じさせる同心性の内皮下内膜増殖は、蛋白尿症、高窒素血症、および高血圧を生じる；骨格筋：萎縮症、間質性線維症；炎症；肺：間質性肺炎および間質性線維症；ならびに心臓：収縮体壊死、瘢痕化／線維症。
特発性炎症性筋疾患（皮膚筋炎、多発性筋炎などを含む）は、これらは病因が不明である慢性の筋肉の炎症であり、これは筋力低下を生じる。筋肉の損傷／炎症は、多くの場合は、対称的であり、進行性である。自己抗体がほとんどの形態と関連している。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質の合成に関与している成分であるタンパク質およびＲＮＡに特異的であり、それらを阻害する。
シェーグレン症候群は、免疫媒介性の炎症と、それに続いて起こる涙腺と唾液腺の機能破壊が原因である。この疾患は、炎症性の結合組織疾患と関係がある場合も、また、炎症性の結合組織疾患を伴う場合もある。この疾患には、Ｒｏ抗原およびＬａ抗原に対する自己抗体の産生が伴うが、これらはいずれも、小型のＲＮＡ−タンパク質複合体である。病変により乾性角結膜炎、口腔乾燥症が、他の症状発現または関連（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（胆汁性肝硬変（ｂｉｌａｒｙ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、末梢または知覚の神経障害、および触知できる紫斑を含む）を伴って起こる。
全身性血管炎には、一次病変部が炎症とその後の血管の損傷であり、罹患した血管により供給される組織の虚血／壊死／変性を起こし、一部の症例においては最終的には末端の臓器の機能不全を起こす疾患である。血管炎はまた、リウマチ性関節炎、全身性硬化症などの他の免疫−炎症媒介性疾患、特に免役複合体の形成とも関係がある疾患において、二次病変または続発症として発症する。一次的な全身性血管炎のグループの疾患としては、以下が挙げられる：全身性壊死化血管炎：結節性多発性血管炎、アレルギー性脈管炎および肉芽腫症、多発性血管症；ウェゲナー肉芽種症；リンパ腫様肉芽種症；および巨細胞血管炎。混合型の血管炎としては以下が挙げられる：粘膜皮膚リンパ節症候群（ＭＬＮＳ、または川崎病）、分離性（ｉｓｏｌａｔｅｄ）ＣＮＳ血管炎、ベーチェット病、閉塞性血栓性血管炎（バージャー病）、および皮膚壊死性細静脈炎（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｎｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇ ｖｅｎｕｌｉｔｉｓ）。列挙された血管炎のタイプのほとんどの病原性機構は、主として免疫グロブリン複合体の血管壁への沈着、それに続くＡＤＣＣ、補体活性化またはその両方のいずれかによる炎症反応の誘導が原因であると考えられる。
サルコイドーシスは病因が不明の状態であり、これは、体中のほぼ全ての組織に類上皮細胞肉芽腫が存在することを特徴とする。肺が関係することが最も一般的である。病因には、活性化されたマクロファージおよびリンパ系細胞が、疾患の部位に長く存在することが関係しており、これには続いて、これらの細胞タイプから放出された局所的または全身的な活性物質の放出の結果である慢性の続発症が伴う。
自己免疫性溶血性貧血（自己免疫性溶血性貧血、免疫性全白血球減少症、および発作性夜間血色素尿症を含む）は、赤血球（および一部の場合には、同様に血小板が含まれている他の血液細胞）の表面に発現された抗原と反応する抗体の生産の結果であり、補体媒介性の溶解および／またはＡＤＣＣ／Ｆｃ受容体に媒介される機構によりこれらの抗体でコーディングされた細胞の除去の反映である。
自己免疫性血小板減少症（血小板減少性紫斑病、他の臨床的状況での免疫媒介性血小板減少症を含む）においては、血小板の破壊／除去が、血小板への抗体または補体へのいずれかの付着、それに続く補体の溶解、ＡＤＣＣまたはＦＣ受容体に媒介される機構による除去の結果として起こる。
甲状腺炎（グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、および萎縮性甲状腺炎を含む）は、甲状腺の中に存在し、甲状腺に特異的なタンパク質と反応する抗体の産生を伴う、甲状腺抗原に対する自己免疫応答の結果である。実験モデルが存在しており、これには自発的なモデル：ラット（ＢＵＦおよびＢＢラット）およびニワトリ（肥満ニワトリ）；誘導性モデル：サイログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原（甲状腺ペルオキシダーゼ）のいずれかでの動物の免疫化が含まれる。
Ｉ型の真性糖尿病またはインスリン依存性糖尿病は、膵島β細胞の自己免疫破壊である。この破壊は自己抗体および自己反応性Ｔ細胞によって媒介される。インスリンに対する抗体またはインスリン受容体もまた、インスリン非応答性の表現型を生じ得る。
免疫媒介性の腎臓病（腎炎および細管間質性腎炎を含む）は、腎抗原に対する自己反応性抗体またはＴ細胞の産生の結果としての直接的であるか、あるいは、他の非腎臓抗原に対して反応性である抗体および／または免疫複合体の腎臓の中での沈着の結果としての間接的であるかのいずれかである、抗体またはＴリンパ球に媒介される腎組織の傷害の結果である。従って、免疫複合体の形成を生じる他の免疫媒介性疾患によってはまた、間接的な続発症として免疫媒介性の腎疾患が誘導される可能性がある。直接的および間接的な免疫機構のいずれによっても、腎組織中に病変部の発生を生じる／誘導する炎症応答が生じ、これには結果として、臓器の機能不全が伴い、腎不全へと進行する場合もある。体液性の免疫機構と細胞性の免疫機構はいずれも、病変の発生に関与し得る。
中枢および末梢の神経系の脱髄疾患（多発性硬化症；多発性脱髄性神経障害またはギラン−バレー症候群；および慢性の炎症性脱髄性神経障害を含む）は、自己免疫を主原因があると考えられ、乏突起膠細胞またはミエリンに生じた損傷の結果として、直接、神経の脱髄を生じる。ＭＳにおいては、疾患の誘導および進行がＴリンパ球に依存することを示唆する証拠がある。多発性硬化症は、Ｔリンパ球依存性であり、また回帰性−弛張性（ｒｅｌａｐｓｉｎｇ−ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ）の経過、もしくは慢性の進行性の経過のいずれかをとる脱髄性疾患である。病因は不明である。しかし、ウイルス感染、遺伝的素因、環境、および自己免疫の全てが寄与している。病変部には主としてＴリンパ球媒介性の小グリア細胞の浸潤および浸潤性マクロファージが含まれる。ＣＤ４＋Ｔリンパ球は病変部における優性な細胞種である。乏突起膠細胞の細胞死の機構とそれに続く脱髄の機構は明らかではないが、Ｔリンパ球によって駆動されるようである。
炎症性および繊維性の肺疾患（好酸球性肺炎、特発性肺線維症、および過敏性肺炎を含む）は、制御されていない免疫−炎症応答が関与している可能性がある。この応答の阻害は治療的に有効であろう。
自己免疫または免疫媒介性の皮膚疾患（水疱性皮膚疾患、多形性紅斑、および接触皮膚炎を含む）は、その生産がＴリンパ球依存性である自己抗体によって媒介される。
乾癬はＴリンパ球媒介性の炎症性疾患である。病原部にはＴリンパ球、マクロファージおよび抗原プロセシング細胞、ならびにいくらかの好中球の浸潤物が含まれる。アレルギー疾患（喘息；アレルギー性鼻炎；アトピー性皮膚炎；食品過敏症；およびじん麻疹を含む）はＴリンパ球依存性である。これらの疾患は主としてＴリンパ球に誘導される炎症、ＩｇＥ媒介性の炎症、またはこれらの両方によって媒介される。
移植関連疾患（移植片拒絶、および移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を含む）は、Ｔリンパ球依存性であり、Ｔリンパ球機能の阻害により緩和される。
本発明のＣ３ｂアンタゴニスト（例えば、Ｃ３ｂ抗体）はまた、例えば以下のような、補体が関係している眼の症状（その病状に補体の古典経路と第２経路、および特に第２経路を含む）が関係している全ての眼の症状および疾患）の予防ならびに処置にも有用である：黄斑変性疾患（例えば、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の全ての段階、乾性形態と湿性形態（非滲出型と滲出型）を含む）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病および他の虚血関連網膜症、眼内炎、および他の眼内血管新生疾患、例えば、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、ならびに網膜血管新生。補体が関係している眼の症状の好ましいグループには、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）（非滲出型（湿性）ＡＭＤおよび滲出型（乾性または萎縮型）ＡＭＤを含む）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、ならびに眼内炎が含まれる。
ＡＭＤは、黄斑の加齢性の変性である。これは、６０歳を超えた個体における不可逆的な視力障害の主原因である。ＡＭＤには２種類のタイプ：非滲出性（乾性）ＡＭＤと滲出性（湿性）ＡＭＤがある。乾性、すなわち、非滲出性の形態には、中心網膜（黄斑）の基部にある網膜色素上皮（ＲＰＥ）の萎縮性変化および肥大性変化、ならびにＲＰＥ上への沈着（ドルーゼン）が含まれる。非滲出性ＡＭＤの患者は、ＡＭＤの湿性（すなわち、滲出型）形態へと進行する可能性があり、ここでは、脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶＭ）と呼ばれる異常な血管が網膜の下に生じ、体液と血液が漏出し、最終的には網膜の中と下に失明にいたる円盤状の瘢痕が生じる。非滲出性ＡＭＤ（これは、通常は滲出型ＡＭＤの前兆である）がより多く見られる。非滲出性ＡＭＤの症状は様々である；堅いドルーゼン、柔らかいドルーゼン、ＲＰＥジオグラフィックアトロフィー（ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ａｔｒｏｐｈｙ）、および色素クランピング（ｐｉｇｍｅｎｔ ｃｌｕｍｐｉｎｇ）が存在する可能性がある。補体成分はＡＭＤの初期にＲＰＥ上に沈着し、これはドルーゼンの主要な構成成分である。
本発明は特に、カテゴリー３およびカテゴリー４のＡＭＤを含むハイリスクＡＭＤの処置に関する。カテゴリー３のＡＭＤは、いずれの眼にも進行したＡＭＤは存在しないこと、少なくとも一方の眼が２０／３２以上の視力を有しているおり、少なくとも１つの大きなドルーゼン（例えば、１２５μｍ）、広範囲に及ぶ（ドルーゼンの面積によって測定される場合）中間部のドルーゼン（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｄｒｕｓｅｎ）、またはジオグラフィックアトロフィー（ＧＡ）（これには黄斑の中心部は含まれない）、あるいはこれらの任意の組み合わせを伴うことを特徴とする。カテゴリー３のＡＭＤ（これは、まだ「乾性」ＡＭＤと考えられる）は脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）に転化するリスクが高い。
カテゴリー４のハイリスクＡＭＤ（「湿性」ＡＭＤと分類される）は、２０／３２以上の視力と、指標となる眼には進行していない（ｎｏ ａｄｖａｎｃｅｄ）ＡＭＤが存在する（ＧＡに黄斑の中心または脈絡膜新生血管の特徴が含まれている）ことを特徴とする。もう一方の（ｆｅｌｌｏｗ）眼は、進行したＡＭＤ、またはＡＭＤ黄斑変性症が原因である２０／３２未満の視力を特徴とする。通常、ハイリスクＡＭＤは、処置しなければ、迅速に脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）へと、カテゴリー１または２（ハイリスクではない）のＡＭＤの進行速度の約１０〜３０倍の速度で進行する。
Ｃ３ｂアンタゴニストはまた、ＣＮＶへのＡＭＤ（特に、カテゴリー３またはカテゴリー４のＡＭＤ）の進行の予防、および／あるいは、罹患していないかもしくは罹患の程度の低いもう一方の眼のＡＭＤまたはＣＮＶの発症／進行の予防に有用性が見出されている。この状況では、用語「予防」は、疾患の進行の完全なまたは部分的なブロックおよび進行速度を遅らせること、ならびに、疾患のより重篤な形態の発症（ｕｎｓｅｔ）を遅らせることを含むように、最も広い意味で使用される。ハイリスク（カテゴリー４）のＡＭＤまたはＣＭＶを発症するか、またはそれへと進行するリスクが高い患者は、本発明のこの態様によって特に利点が得られる。
補体Ｈ因子（ＣＦＨ）多形がＡＭＤおよび／またはＣＮＶを発症する個体のリスクと関係があることは公知である。ＣＦＨの中での突然変異は補体を活性化させる可能性があり、これは次いで、ＡＭＤ／ＣＮＶに至る場合がある。補体Ｈ因子（ＣＦＨ）多形がＡＭＤの寄与リスクの５０％を占めることが最近報告されている（Ｋｌｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０８：３８５−９（２００５））。ＣＦＨの一般的なハプロタイプ（ＨＦ１／ＣＦＨ）は、個体を加齢黄斑変性にかかりやすくする素因であることが明らかになっている（Ｈａｇｅｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２（２）：７２２７−７２３２（２００５））。ＡＭＤは常染色体優性形質として分離されており、マーカーＤ１Ｓ４６６とＤ１Ｓ４１３との間の染色体１ｑ２５−ｑ３１に、約３．２０の最大ロッドスコアで（Ｋｌｅｉｎら、Ａｒｃｈ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．１１６（８）：１０８２−９（１９９８）；Ｍａｊｅｗｓｋｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７３（３）：５４０−５０（２００３）；Ｓｅｄｄｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７３（４）：７８０−９０（２００３）；Ｗｅｅｋｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１３２（５）：６８２−９２（２００１）；Ｉｙｅｎｇａｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７４（１）：２０−３９（２００４））；マーカーＤ１２Ｓ１３９１とＤ２Ｓ１３８４との間の染色体２ｑ３／２ｑ３２に、２．３２／２．０３の最大ロッドスコアで（Ｓｅｄｄｏｎら、前出）；マーカーＤ１２Ｓ１３００とＤ１２Ｓ１７６３との間の３ｐ１３に、２．１９の最大ロッドスコアで（Ｍａｊｅｗｓｋｉら、前出；Ｓｃｈｉｃｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７２（６）：１４１２−２４（２００３））；マーカーＤ６Ｓ１０５６とＤＳ２４９との間の６ｑ１４に、３．５９／３．１７の最大ロッドスコアで（Ｋｎｉａｚｅｖａら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈｌｍｏｌ．１３０（２）：１９７−２０２（２０００））；マーカーＤ９Ｓ９３４にある９ｑ３３に、２．０６の最大ロッドスコアで（Ｍｅｊｗｓｋｉら、前出）；マーカーＤ１０Ｓ１２３０にある１０ｑ２６に、３．０６最大ロッドスコアで（Ｍａｊｅｗｓｋｉら、前出；Ｉｙｅｎｇａｒら、前出；Ｋｅｎｅａｌｙら、Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．１０：５７−６１（２００４）；マーカーＤ１７Ｓ９２８にある１７ｑ２５に、３．１６の最大ロッドスコアで（Ｗｅｅｋｓら、前出）；そして、マーカーＤ２２Ｓ１０４５にある２２ｑ１２に、２．０の最大ロッドスコアで（Ｓｅｄｄｏｎら、前出）疾患遺伝子マッピングされている。したがって、遺伝子スクリーニングは予防的処置（より重篤な形態への（例えば、ＡＭＤからＣＮＶへの）疾患の進行の予防を含む）のための特に良好な候補である患者を同定する重要な部分である。
Ｃ３ｂ抗体の調製および選択
本明細書中の本発明には、Ｃ３ｂを認識するが、その不活性な前駆体であるＣ３は認識しない抗体の生産と使用が含まれる。抗体の例示的な作製方法が以下のセクションにさらに詳細に記載される。
抗Ｃ３ｂ抗体は、哺乳動物種由来のＣ３ｂポリペプチドを使用して選択される。ポリペプチドがヒトＣ３ｂであることが好ましい。しかし、他の種に由来するＣ３ｂポリペプチド（例えば、マウスＣ３ｂ）もまた標的抗原として使用できる。様々な哺乳動物種に由来するＣ３ｂ抗原を天然の供給源から単離することができる。他の実施形態においては、抗原は組み換えによって生産されるか、または、当該分野で公知の他の合成方法を使用して作成される。
選択された抗体は、通常は、Ｃ３ｂ抗原に対して十分に強い結合親和性を有するであろう。例えば、抗体は、約５ｎＭ以下、好ましくは約２ｎＭ以下、そしてより好ましくは約５００ｐＭ以下のＫｄ値でヒトＣ３ｂに結合し得る。抗体親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ（例えば、実施例に記載されるＢＩＡｃｏｒｅアッセイ）；酵素結合免疫中着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；および競合アッセイ（例えば、ＲＩＡ’ｓ）によって決定され得る。
また、抗体は、例えば、治療薬としてのその有効性を評価するために、他の生物学的活性のアッセイにも供され得る。そのようなアッセイは当該分野で公知であり、標的抗原と抗体について意図される用途に応じて様々である。例としては、ＨＵＶＥＣ阻害アッセイ（以下の実施例に記載される）；ならびに、第２経路を選択的にブロックし、少なくとも１つの補体が関係している障害の予防および／または処置において活性を示す抗体の同定について以下に記載されるインビトロおよびインビボでのアッセイが挙げられる。
目的の抗原上の特定のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするためには、日常的に行われているクロスブロッキング（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）アッセイ（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ編（１９８８）に記載されているアッセイ）を行うことができる。あるいは、エピトープマッピング（例えば、Ｃｈａｍｐｅら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４に記載されている）を、抗体が目的のエピトープに結合するかどうかを決定するために行うことができる。
好ましい実施形態においては、本発明の抗Ｃ３ｂ抗体は特有のファージディスプレイアプローチを使用して選択される。このアプローチには単一のフレームワーク鋳型に基づく合成のヒト抗体ファージライブラリーの作製、可変ドメインの中での十分な多様性の設計、多様化させられた可変ドメインを有しているポリペプチドのディスプレイ、および標的Ｃ３ｂ抗原に対して高い親和性を有している候補抗体の選択が含まれる。Ｃ３ｂを選択的にブロックするが、Ｃ３はブロックしない抗体をコードするＣ３ｂ特異的ファージの富化は、例えば、以下の実施例に記載されるように、飽和量のＣ３でブロックすることによって行うことができる。
ファージディスプレイ方法の詳細は、例えば、２００３年１２月１１日に公開されたＷＯ０３／１０２１５７に見ることができる。
１つの態様においては、抗体ライブラリーは、抗体可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲの中にある溶媒が接近しやすい位置および／または多様性に富む位置を突然変異させることによって作製することができる。ＣＤＲのいくつかまたは全てを、本明細書中に提供される方法を使用して突然変異させることができる。いくつかの実施形態においては、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３中の複数の位置を突然変異させて１つのライブラリーを形成させることによって、または、ＣＤＲＬ３およびＣＤＲＨ３中の複数の位置を突然変異させて１つのライブラリーを形成させること、または、ＣＤＲＬ３とＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３の中の複数の位置を突然変異させて１つのライブラリーを形成させることにより、多様性抗体ライブラリーを作製することが好ましい場合がある。
例えば、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３の溶媒が接近しやすい位置および／または多様性に富む位置の中に複数の突然変異を有している抗体可変ドメインのライブラリーを作製することができる。ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３の中に複数の突然変異を有している別のライブラリーを作製することができる。これらのライブラリーはまた、所望される親和性のバインダーを作製するために、互いに組み合わせて使用することもできる。例えば、標的抗原に対する結合についての重鎖ライブラリーの１回以上の選択の後、軽鎖ライブラリーを、バインダーの親和性を増大させるためのさらなる回の選択のために、重鎖バインダーの集団の中に入れることができる。
好ましくは、ライブラリーは、重鎖配列の可変領域のＣＤＲＨ３領域中での、変異体アミノ酸でのもとのアミノ酸の置換によって作製される。得られるライブラリーには複数の抗体配列が含まれ得る。ここでは、配列多様性は、主に、重鎖配列のＣＤＲＨ３領域の中にある。
１つの態様においては、ライブラリーは、ヒト化抗体４Ｄ５配列、またはヒト化抗体４Ｄ５配列のフレームワークアミノ酸の配列の状況において作製される。好ましくは、ライブラリーは、ＤＶＫコドンセットによってコードされるアミノ酸での重鎖の少なくとも残基９５〜１００ａの置換によって作製される。ここでは、ＤＶＫコドンセットは、これらの位置の全ての変異体アミノ酸の１つのセットをコードするために使用される。これらの置換の作製に有用なオリゴヌクレオチドセットの一例には、配列（ＤＶＫ）７が含まれる。いくつかの実施形態においては、ライブラリーは、ＤＶＫコドンセットとＮＮＫコドンセットの両方によってコードされるアミノ酸での残基９５〜１００ａの置換によって作製される。これらの置換の作製に有用なオリゴヌクレオチドセットの例には、配列（ＤＶＫ）６（ＮＮＫ）が含まれる。別の実施形態においては、ライブラリーは、ＤＶＫコドンセットとＮＮＫコドンセットコドンセットの両方によってコードされるアミノ酸での、少なくとも残基９５〜１００ａの置換によって作製される。これらの置換の作製に有用なオリゴヌクレオチドセットの一例には、配列（ＤＶＫ）５（ＮＮＫ）が含まれる。これらの置換の作製に有用なオリゴヌクレオチドセットの別の例には配列（ＮＮＫ）６が含まれる。適切なオリゴヌクレオチド配列の他の例は、本明細書中に記載される基準にしたがって当業者によって決定され得る。
別の実施形態においては、様々なＣＤＲＨ３のデザインが、高親和性バインダーを単離するため、そして様々なエピトープに対するバインダーを単離するために利用される。このライブラリーの中で作製されたＣＤＲＨ３の長さの範囲は１１から１３アミノ酸であるが、これとは異なる長さもまた作製され得る。Ｈ３多様性は、ＮＮＫ、ＤＶＫ、およびＮＶＫコドンセット、ならびに、Ｎ末端および／またはＣ末端でのより限定された多様性を使用することにより拡大させることができる。
多様性はまたＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２の中に作製することもできる。ＣＤＲ−Ｈ１およびＨ２の多様性の設計は、以前のデザインよりも自然界での多様性にさらにきっちりと適合する多様性に焦点を合わせた改変を用いて、記載されるような天然の抗体レパートリーを模倣するための標的化のストラテジーにしたがう。
ＣＤＲＨ３の中での多様性については、様々なＨ３の長さを有している複数のライブラリーを別々に構築し、その後、標的抗原に対するバインダーについて選択するために合わせて１つにすることができる。複数のライブラリーは、プールすることができ、以前に記載されており、そして本明細書中に記載されるように、固体支持体選択と溶液選別方法を使用して選別することができる。複数の選別方法論が使用される場合もある。例えば、１つのバリエーションには、固体に結合させられた標的についての選別、それに続く、融合ポリペプチド上に存在し得るタグ（例えば、抗ｇＤタグ）についての選別、その後の、固体に結合させられた標的についての別の選別が含まれる。あるいは、ライブラリーは、固体表面に結合させられた標的について最初に選別され得、溶離させられたバインダーが、その後、標的抗原の濃度を低下させつつ、溶液相の結合を使用して選別される。様々な選別方法の組み合わせを利用することにより、高度に発現された配列だけの選択の最小化が提供され、そして多数の様々な高親和性クローンの選択が提供される。
標的Ｃ３ｂ抗原に対する高親和性バインダーをライブラリーから単離することができる。Ｈ１／Ｈ２領域の中の多様性を限定することにより、縮重性は約１０４倍から１０５倍減少し、より高親和性のバインダーを提供するためのさらなるＨ３多様性が可能となる。ＣＤＲＨ３の中に様々なタイプの多様性を有しているライブラリーを利用する（例えば、ＤＶＫまたはＮＶＴを利用する）ことにより、標的抗原の様々なエピトープに結合し得るバインダーの単離が提供される。
別の実施形態においては、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３領域の中に多様性を有しているライブラリー（単数または複数）が作製される。この実施形態においては、ＣＤＲＨ３の中の多様性は、様々な長さのＨ３領域を使用し、そして主要なコドンセットＸＹＺおよびＮＮＫまたはＮＮＳを使用して作製される。複数のライブラリーが個々のオリゴヌクレオチドを使用して形成され得、プールされ得るか、またはオリゴヌクレオチドは、ライブラリーのサブセットを形成させるためにプールされ得る。この実施形態の複数のライブラリーは、固体に結合させられた標的に対して選別することができる。複数回の選別によって単離されたクローンは、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して特異性および親和性についてスクリーニングすることができる。特異性については、クローンは所望される標的抗原ならびに他の非標的抗原に対してスクリーニングすることができる。標的Ｃ３ｂ抗原に対するこれらのバインダーは、その後、溶液結合競合ＥＬＩＳＡアッセイまたはスポット競合アッセイにおいて親和性についてスクリーニングすることができる。高親和性バインダーは、上記に記載されたように調製されたＸＹＺコドンセットを利用してライブラリーから単離することができる。これらのバインダーは、細胞培養物中に高収率で抗体または抗原結合断片として容易に生じさせることができる。
いくつかの実施形態においては、ＣＤＲＨ３領域の長さ関してより大きな多様性を有しているライブラリーを作製することが所望され得る。例えば、約７から１９アミノ酸までの範囲のＣＤＲＨ３領域を有しているライブラリーを作製することが所望され得る。
これらの実施形態のライブラリーから単離された高親和性バインダーは、細菌および真核生物細胞培養物の中で高収率で容易に生産される。ベクターは、ｇＤタグ、ウイルス外被タンパク質成分配列のような配列を容易に除去し、そして／または高収率での全長抗体または抗原結合断片の生産がもたらされるように定常領域配列の中に加えられるように設計され得る。
ＣＤＲＨ３の中に突然変異を有しているライブラリーは、他のＣＤＲの変異体バージョン（例えば、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、および／またはＣＤＲＨ２）を含むライブラリーと組み合わせることができる。したがって、例えば、１つの実施形態においては、ＣＤＲＨ３ライブラリーは、予め決定されたコドンセットを使用して２８、２９、３０、３１、および／または３２位に変異体アミノ酸を有しているヒト化４Ｄ５抗体配列の状況において作製されたＣＤＲＬ３ライブラリーと組み合わせられる。別の実施形態においては、ＣＤＲＨ３に突然変異を有しているライブラリーは、変異体ＣＤＲＨ１および／またはＣＤＲＨ２重鎖可変ドメインを含むライブラリーと組み合わせることができる。１つの実施形態においては、ＣＤＲＨ１ライブラリーは、２８、３０、３１、３２、および３３位に変異体アミノ酸を有しているヒト化抗体４Ｄ５配列を用いて作製される。ＣＤＲＨ２ライブラリーは、予め決定されたコドンセットを使用して５０、５２、５３、５４、５６、および５８位に変異体アミノ酸を有しているヒト化抗体４Ｄ５の配列を用いて作製され得る。
ファージライブラリーから作製された抗Ｃ３ｂ抗体は、もとの抗体を上回る改善された物理的、化学的、および／または生物学的特性を有する抗体突然変異体が作製されるようにさらに改変することができる。使用されるアッセイが生物学的活性のアッセイである場合には、抗体突然変異体は、好ましくは、選択されたアッセイにおいて生物学的活性を有し、これはそのアッセイにおけるもとの抗体の生物学的活性よりも、少なくとも約１０倍大きい、好ましくは少なくとも約２０倍大きい、より好ましくは少なくとも約５０倍大きい、そして多くの場合は少なくとも約１００倍または２００倍大きい。例えば、抗Ｃ３ｂ抗体突然変異体は、好ましくは、Ｃ３ｂに対して結合親和性を有し、これは、もとの抗Ｃ３ｂ抗体（例えば、抗体Ｓ７７）の結合親和性よりも少なくとも約１０倍強い、好ましくは少なくとも約２０倍強い、より好ましくは、少なくとも約５０倍強い、そして多くの場合は少なくとも約１００倍または２００倍強い。
抗体突然変異体を作製するためには、１つ以上のアミノ酸の変更（例えば、置換）が、もとの抗体の１つ以上の超可変領域の中に導入される。あるいは、または加えて、フレームワーク領域残基の１つ以上の変更（例えば、置換）がもとの抗体の中に導入され得、ここでは、これらは第２の哺乳動物種に由来する抗原に対する抗体突然変異体の結合親和性の改善を生じる。改変されるフレームワーク領域残基の例としては、抗原に直接非共有結合するもの（Ａｍｉｔら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：７４７−７５３）；ＣＤＲの立体構造と相互作用する／立体構造に影響を与えるもの（Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）；および／またはＶＬ−ＶＨ界面に関与するもの（ＥＰ ２３９ ４００Ｂ１）が挙げられる。特定の実施形態においては、１つ以上のそのようなフレームワーク領域残基の改変は、第２の哺乳動物種に由来する抗原に対する抗体の結合親和性の増強を生じる。例えば、約１個から約５個のフレームワーク残基が本発明のこの実施形態において変化させられ得る。多くの場合には、これは、超可変領域残基がいずれも変化させられていない場合でもなお、前臨床試験での使用に適している抗体突然変異体を得るために十分であり得る。しかし、通常は、抗体突然変異体にはさらなる超可変領域の変更（単数または複数）が含まれるであろう。
変更される超可変領域残基は無作為に変化させることができ、特に、もとの抗体の最初の結合親和性がそのような無作為に生産された抗体突然変異体である場合には、容易にスクリーニングできる。
そのような抗体突然変異体を作製するための１つの有用な手順は「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）。ここでは、１つ以上の超可変領域残基（単数または複数）が、第２の哺乳動物種に由来する抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を与えるアラニンまたはポリアラニン残基（単数または複数）によって置換される。置換に対して機能的感度を示しているこれらの超可変領域残基（単数または複数）は、その後、置換部位に、もしくは置換部位についてさらなるまたは他の突然変異を導入することによって詳細に調べられる。したがって、アミノ酸配列のバリエーションを導入するための部位は予め決定されるが、突然変異自体の性質は予め決定される必要はない。この方法で生産されたａｌａ突然変異体は、本明細書中に記載されるようにそれらの生物学的活性についてスクリーニングされる。
通常、当業者は、「好ましい置換基」の表題で以下に示されるような保存的置換を用いて開始するであろう。そのような置換が生物学的活性（例えば、結合親和性）の変化を生じる場合には、以下の表において、またはアミノ酸のクラスに関して以下にさらに記載されるように「例示的な置換基」と命名されたさらなる実質的変化が導入され、そして生成物がスクリーニングされる。好ましい置換は以下の表に列挙される。
抗体の生物学的特性のなおさらに実質的な改変は、（ａ）置換の領域内にあるポリペプチド骨格の構造（例えば、シートまたはヘリックス構造）、（ｂ）標的部位にある分子の電荷または疎水性、あるいは（ｃ）側鎖のかさを維持することに対するそれらの作用が有意に異なる置換基を選択することによって行われる。自然界に存在している残基は共通する側鎖特性に基づいて複数のグループに分類される。
疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ａｓｎ、ｇｌｎ；
酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
鎖の方向性に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
非保存的置換には、別のクラスをこれらのクラスのうちの１つのメンバーで交換することを必然的に伴うであろう。
別の実施形態においては、改変のために選択された部位はファージディスプレイを使用して親和性成熟させられる（上記を参照のこと）。
アミノ酸配列突然変異体をコードする核酸分子は、当該分野で公知の様々な方法によって調製される。これらの方法としては、もとの抗体の以前に調製された突然変異体または非突然変異体バージョンの、オリゴヌクレオチド媒介性（または部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、およびカセット突然変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない。突然変異を作製するための好ましい方法は部位特異的突然変異誘発である（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８を参照のこと）。
特定の実施形態においては、抗体突然変異体は、置換された超可変領域残基を１つだけ有するであろう。他の実施形態においては、もとの抗体の超可変領域残基のうちの２つ以上が置換されているであろう（例えば、約２個から約１０個までの超可変領域の置換）。
通常は、改善された生物学的特性を有している抗体突然変異体は、もとの抗体の重鎖または軽鎖のいずれかの可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性または類似性を有しているアミノ酸配列を有するであろう。この配列に関する同一性または類似性は、本明細書中では、配列をアラインメントし、そして必要である場合にはギャップを導入して、最大のパーセント配列同一性を得た後の、もとの抗体残基と同一である（すなわち、同じ残基）または類似している（すなわち、共通する側鎖特性に基づく同じグループに由来するアミノ酸残基、上記を参照のこと）、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。可変ドメインの外側にある抗体配列へのＮ末端、Ｃ末端、または内部伸張、欠失、あるいは挿入はいずれも、配列同一性または類似性に影響を与えないと解釈されるべきである。
抗体突然変異体の生産後、もとの抗体と比較したその分子の生物学的活性が決定される。上記のように、これには、抗体の結合親和性および／または他の生物学的活性の決定が含まれ得る。本発明の好ましい実施形態においては、抗体変異体のパネルが調製され、そして抗原（例えば、Ｃ３ｂ）またはその断片に対する結合親和性についてスクリーニングされる。この最初のスクリーニングによって選択された抗体突然変異体のうちの１つ以上が、状況に応じて、結合親和性が増大したこの抗体突然変異体（単数または複数）が実際に（例えば、前臨床試験に）有用であることを確認するために、１つ以上のさらなる生物学的活性のアッセイに供される。
そのように選択された抗体突然変異体（単数または複数）は、多くの場合には、抗体の意図される用途に応じたさらなる改変に供され得る。そのような改変としては、アミノ酸配列のさらなる変更、異種ポリペプチド（単数または複数）に対する融合、および／または以下に詳細に述べられるもののような共有結合による改変を挙げることができる。アミノ酸配列の変更に関しては、例示的な改変は上記で詳細に述べられる。例えば、抗体突然変異体の適切な立体構造の維持には関与していない任意のシステイン残基もまた、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防ぐために、通常はセリンで置換され得る。逆に、システイン結合（単数または複数）は、その安定性を改善するために抗体に付加され得る（特に、抗体がＦｖ断片のような抗体断片である場合）。アミノ酸突然変異体の別のタイプは、変更されたグリコシル化パターンを有する。これは、抗体の中に見られる１つ以上の炭水化物部分を欠失させること、および／または抗体の中には存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することによって行われ得る。抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖に対する炭水化物部分の結合をいう。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンとアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に対する炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在することにより、潜在的グリコシル化部位が作製される。Ｏ結合グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的には、セリンまたはスレオニン）に対する結合をいうが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた使用され得る。抗体に対するグリコシル化部位の付加は、１つ以上の上記トリペプチド配列を含むようにアミノ酸配列を変更することによって便利に行われる（Ｎ結合グリコシル化部位について）。変更はまた、もとの抗体の配列に対する１つ以上のセリンもしくはスレオニン残基の付加またはそれらによる置換によっても行われ得る（Ｏ結合グリコシル化部位について）。
ファージディスプレイによるＣ３ｂ抗体の調製、選択、富化、および親和性成熟のさらなる詳細は以下の実施例に提供される。
Ｃ３ｂ抗体の組み換え生産
本発明の抗Ｃ３ｂ抗体は、容易に入手できる技術と材料を使用して組み換えによって生産することができる。
抗Ｃ３抗体の組み換え生産のためには、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のため、または発現のために複製可能ベクターに挿入される。抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡに特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離または合成される。多くのベクターを利用できる。一般的には、ベクター成分には、以下のうちの１つ以上が含まれるがこれらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロオーター、および転写終結配列。
（ｉ）シグナル配列成分
本発明の抗体は、組み換えによって直接生産できるだけではなく、異種ポリペプチド（これは、好ましくは、シグナル配列、または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有している他のポリペプチドである）を持つ融合ポリペプチドとしても生産できる。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞により認識され、そしてプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。本来の抗体シグナル配列を認識せず、プロセシングしない原核生物宿主細胞については、シグナル配列列は、選択された原核生物シグナル配列（例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーのグループに由来する）よって置換される。酵母からの分泌については、本来のシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓのα因子リーダーを含む）、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー、あるいは、ＷＯ９０／１３６４６に記載されているシグナルによって置換され得る。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列、ならびにウイルスの分泌リーダー（例えば、単純ヘルペスｇＤシグナル）を利用できる。そのような先行領域のＤＮＡは、抗体をコードするＤＮＡに対してリーディングフレーム内になるように連結される。
（ｉｉ）複製起点成分
発現ベクターとクローニングベクターにはいずれも、１つ以上の選択された宿主細胞の中でのベクターの複製を可能にする核酸配列が含まれる。一般的には、クローニングベクターにおいては、この配列は宿主の染色体ＤＮＡとは無関係にベクターが複製することを可能にするものであり、これには複製起点または自律複製配列が含まれる。そのような配列は、様々な細菌、酵母、およびウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製起点がほとんどのグラム陰性細菌に適しており、２μプラスミド起点が酵母に適しており、そして様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）が哺乳動物細胞中のクローニングベクターに有用である。一般的には、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターには必要ない（ＳＶ４０起点は通常、これに初期プロモーターが含まれるので、単独で使用され得る）。
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現ベクターとクローニングベクターには選択遺伝子が含まれる場合があり、これは選択マーカーとも呼ばれる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリン）に対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要求性欠損を補うタンパク質、あるいは（ｃ）複合培地からは利用できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする（例えば、ＢａｃｉｌｌｉについてはＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。
選択方式の一例では、宿主細胞の増殖を停止させる薬物が利用される。異種遺伝子でうまく形質転換されたこれらの細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、それにより、選択レジュメを生き残る。そのような優性選択の例では、薬物であるネオマイシン、マイコフェノール酸、およびハイグロマイシンが使用される。
哺乳動物細胞に適している選択マーカーの別の例は抗体核酸を取り込むための細胞成分（例えば、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩ、好ましくは、霊長類のメタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなど）の同定を可能にするものである。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合アンタゴニストであるメトトレキセート（Ｍｔｘ）を含む培養培地中で全ての形質転換体を培養することによって最初に同定される。適切な宿主細胞は、野生型ＤＨＦＲが使用される場合には、ＤＨＦＲ活性が欠損しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。
あるいは、抗体である野生型ＤＨＦＲタンパク質をコードするＤＮＡ配列で形質転換されたか、または別の選択マーカー（例えば、アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ））と一緒に同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、選択マーカーについての選択試薬（例えば、アミノグリコシド性抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８）を含む培地の中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４，９６５，１９９号を参照のこと。
酵母において使用される適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７の中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２８２：３９）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力が欠失している酵母の突然変異株（例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１）についての選択マーカーを提供する。Ｊｏｎｅｓ（１９７７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８５：１２。それにより、酵母の宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１損傷の存在は、トリプトファンが存在しない条件下での増殖により形質転換体を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を保有している公知のプラスミドによって補われる。
加えて、１．６μｍの環状プラスミドｐＫＤ１に由来するベクターは、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ酵母の形質転換に使用できる。あるいは、組み換え体ウシキモシンの大規模生産のための発現システムが、Ｋ．ｌａｃｔｉｓについて報告されている。Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１３５。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの産業用株による成熟組み換え体ヒト血清アルブミンの分泌のための安定な多コピーの発現ベクターもまた開示されている。Ｆｌｅｅｒら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９６８−９７５。
（ｉｖ）プロモーター成分
発現ベクターとクローニングベクターには、通常、宿主生物によって認識され、そして抗体核酸に対して動作可能であるように連結された１つのプロモーターが含まれる。原核細胞宿主とともに使用される適当なプロモーターとしては、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかし、他の公知の細菌プロモーターも適している。細菌系で使用されるプロモーターにはまた、抗体をコードするＤＮＡに対して動作可能であるように連結されたシャイン−ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含まれるであろう。
真核生物細胞についてのプロモーター配列も知られている。事実上全ての真核生物遺伝子が、転写が開始される部位からおよそ２５から３０塩基上流に位置する、ＡＴを多く含む領域を有する。多くの遺伝子の転写開始部位から７０から８０塩基上流に見られる別の配列は、１つのＣＮＣＡＡＴ領域（式中、Ｎどの核酸でもよい）である。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端には、コード配列の３’末端にポリＡテイルを付加するためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て、真核生物発現ベクターに適切に挿入される。
酵母宿主とともに使用される適切なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモーター、または他の解糖酵素（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼ）のためのプロモーターが挙げられる。
増殖条件によって制御される転写のさらなる利点を有している誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデハイドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関係がある分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースとガラクトースの利用に関与している酵素のプロモーター領域である。酵母発現に使用される適当なベクターとプロモーターは、ＥＰ７３，６５７にさらに記載されている。酵母エンハンサーもまた酵母プロモーターとともに好都合に使用される。
哺乳動物の宿主細胞の中でのベクターからの抗体の転写は、例えば、ウイルス（例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、ニワトリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスそして最も好ましくは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０））のゲノムから得られるプロモーターによって、異種哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター）によって、熱ショックプロモーターによって、そのようなプロモーターが宿主細胞系と適合するとの条件で制御される。
ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点もまた含むＳＶ４０制限酵素断片として簡単に得られる。ヒトのサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限酵素処理断片として簡単に得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを使用して哺乳動物宿主の中でＤＮＡを発現させるための系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の改変は米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下での、マウス細胞中でのヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現については、Ｒｅｙｅｓら（１９８２），Ｎａｔｕｒｅ ２９７：５９８−６０１もまた参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復をプロモーターとして使用できる。
（ｖ）エンハンサーエレメント成分
本発明の抗体をコードするＤＮＡの高等真核生物細胞による転写は、多くの場合、そのベクターの中にエンハンサー配列を挿入することによって増大させられる。哺乳動物の遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、インシュリン）に由来する多くのエンハンサー配列が、現在知られている。しかし、典型的には、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用されるであろう。例として、複製起点の後期側（ｌａｔｅ ｓｉｄｅ）（１００〜２７０ｂｐ）にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物のプロモーターの活性化のためのエンハンスエレメントについては、Ｙａｎｉｖ（１９８２），Ｎａｔｕｒｅ，２９７：１７−１８もまた参照のこと。このエンハンサーはベクターの中で、抗体をコードする配列に対して５’位置または３’位置でスプライシングされ得るが、プロモーターから５’の位置に配置されることが好ましい。
（ｖｉ）転写終結成分
真核生物宿主細胞において使用される発現ベクター（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞）には、転写の終結のため、そしてｍＲＮＡの安定化のために必要な配列もまた含まれるであろう。そのような配列は、通常、真核生物もしくはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’非翻訳領域、場合によっては、３’非翻訳領域から得ることができる。これらの領域には、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分の中にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントが含まれる。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６および本明細書中に開示される発現ベクターを参照のこと。
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択と形質転換
本明細書中のベクター中でのＤＮＡのクローニングまたは発現に適している宿主細胞は、上記に記載された原核生物細胞、酵母細胞、または高等真核生物細胞である。この目的に適している原核生物としては、グラム陰性微生物またはグラム陽性微生物のような真正細菌、例えば、腸内細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、およびＳｈｉｇｅｌｌａ、およびＢａｃｉｌｌｉ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ ２６６，７１０に開示されているＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ４１Ｐ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。１つの好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主はＥ．ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）であるが、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）、およびＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５）のような他の株も適している。これらの例は限定でなく例示である。
原核生物細胞に加えて、真核微生物（例えば、糸状菌または酵母）が抗体をコードするベクターに適しているクローニングまたは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（すなわち、一般的なパン酵母）は、下等真核生物宿主微生物のうちで最も一般的に使用されている。しかし、以下のような多数の他の属、種、および株も一般に利用することができ、本明細書中で有用である：Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ，Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ、ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ １８３，０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；ならびに、糸状菌（例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主（例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ．ｎｉｇｅｒ））。
グリコシル化抗体の発現に適している宿主細胞は多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株と変異体、そして以下のような宿主に由来する対応する許容される昆虫宿主細胞が同定されている：Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（毛虫）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ハエ）、およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ。トランスフェクションのための様々なウイルス株（例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶのＬ−１変異体およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶのＢｍ−５株）は公に入手することができ、そのようなウイルスは本発明に従って本明細書中でウイルスとして、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、使用され得る。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペツニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養物もまた宿主として利用できる。
しかし、最大の関心は脊椎動物細胞に向けられており、培養物（組織培養物）中での脊椎動物細胞の増殖は日常的に行われている作業となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は以下である：ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児腎臓細胞株（２９３、または懸濁培養中での増殖についてサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ（１９８０）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頚管腫瘍細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら（１９８２）Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞、およびヒト肝ガン細胞株（Ｈｅｐ Ｇ２）。
宿主細胞は、抗体生産のために上記の発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導するため、形質転換体を選択するため、または所望される配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に改変された通常の栄養培地の中で培養される。
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を生産するために使用される宿主細胞は様々な培地中で培養され得る。Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１０（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびＤｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）のような商業的に入手することができる培地は、宿主細胞の培養に適している。加えて、Ｈａｍら（１９９７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓら（１９８０），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０２：２５５；米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同４，５６０，６５５号；または同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；あるいは、再発行米国特許第３０，９８５号に記載されている培地のうちの任意のものが、宿主細胞用の培養培地として使用され得る。これらの培地にはいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標））薬物）、微量元素（最終濃度がマイクロモルの範囲で通常存在する無機化合物として定義される）、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源が補充され得る。いずれの他の必要な添加物も、当業者に公知であろう適当な濃度で含められ得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞について以前に使用された条件であり、当業者には明らかであろう。
（ｉｘ）抗体精製
組み換え技術を使用する場合には、抗体を、細胞内で、ペリプラズム空間で生産させることができ、また、培地中に直接分泌させることもできる。抗体が細胞内で生産される場合には、最初の工程として、特定の破片（宿主細胞または溶解させられた断片のいずれか）が、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７には、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間に分泌される抗体を単離するための手順が記載されている。簡単に説明すると、細胞ペーストが酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間かけて解凍される。細胞の破片は遠心分離によって除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合は、そのような発現システムに由来する上清は、通常は、市販されているタンパク質濃縮フィルター（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット）を使用して最初に濃縮される。ＰＭＳＦのようなプロテアーゼ阻害剤を、タンパク質分解を阻害するために上記工程のいずれかに含めることができ、抗生物質は、付随する混入物質の増殖を防ぐために含めることができる。
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適性は、抗体の中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびイソ型に依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖をベースとする抗体を精製するために使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３）。プロテインＧは、全てのマウスイソ型およびヒトγ３に推奨される（Ｇｕｓｓら（１９８６）ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７１５７５）。親和性リガンドがそれに対して結合させられるマトリックスは、最も多くの場合にはアガロースであるが、他のマトリックスを利用することもできる。機械的に安定なマトリックス（例えば、多孔質ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼン））は、アガロースを用いて得ることができるよりも早い流速と短い処理時間を可能にする。抗体にＣＨ３ドメインが含まれる場合は、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が精製に有用である。タンパク質精製のための他の技術（例えば、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）上でのクロマトグラフィー、クロマト分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿）もまた、回収される抗体に応じて利用することができる。
任意の予備的な精製工程（単数または複数）の後、目的の抗体と混入物質を含む混合物は、好ましくは、低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で行われる、約２．５〜４．５のｐＨの溶離緩衝液を使用する低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供され得る。
Ｃ３ｂ抗体と他のＣ３ｂアンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイと動物モデル
Ｃ３ｂ抗体と他のＣ３ｂアンタゴニストは、第二補体経路を選択的に阻害し、補体が関係している障害を予防および処置するそれらの能力について、様々なインビトロおよびインビボアッセイにおいて評価することができる。
インビトロアッセイ（例えば、結合アッセイおよび競合結合アッセイ、溶血（ｈｅｍｏｌｙｔｉｘｃ）アッセイ）が実施例に記載される。
本明細書中のＣ３ｂアンタゴニスト（例えば、Ｃ３ｂ抗体）のインビボでの治療活性は、関連する動物モデルにおいて試験することができる。したがって、例えば、組み換え体（トランスジェニック）動物モデルを、トランスジェニック動物を作製するための標準的な技術を使用して、目的の動物のゲノムの中に目的の遺伝子のコード部分を導入することによって操作することができる。トランスジェニック操作の標的となり得る動物としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、およびヒト以外の霊長類（例えば、ヒヒ、チンパンジー、および他のサル）が挙げられるが、これらに限定されない。そのような動物にトランスジーンを導入するための当該分野で公知の技術としては、前核へのマイクロインジェクション（ｐｒｏｎｕｃｌｅｉｃ ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（Ｈｏｐｐｅ ａｎｄ Ｗａｎｇｅｒ，米国特許第４，８７３，１９１号）；生殖細胞系列へのレトロウイルスを介した遺伝子導入（例えば、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，６１４８−６１５［１９８５］）；胚性幹細胞の中での遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ５６，３１３−３２１［１９８９］）；胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，１８０３−１８１４［１９８３］）；精液を介した遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ ５７，７１７−７３［１９８９］）が挙げられる。概要については、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号を参照のこと。
本発明の目的については、トランスジェニック動物には、それらの細胞の一部にのみトランスジーンを持つ動物（「モザイク動物」）が含まれる。トランスジーンは、単一のトランスジーンとして、またはコンカタマー（例えば、頭−頭、または頭−尾のタンデム）中のいずれかとして組み込まれ得る。特定の細胞タイプへのトランスジーンの選択的導入もまた、例えば、Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，６２３−６３６（１９９２）の技術にしたがって可能である。
トランスジェニック動物中でのトランスジーンの発現は標準的な技術によってモニターすることができる。例えば、サザンブロット分析またはＰＣＲ増幅をトランスジーンの組み込みを確認するために使用することができる。その後、ｍＲＮＡの発現レベルを、インサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、または免疫細胞化学技術のような技術を使用して分析することができる。
動物はさらに、免疫疾患の病状の兆候について、例えば、特異的組織への免疫細胞の浸潤を決定するための組織学的試験によって試験され得る。
組み換え（トランスジェニック）動物モデルは、トランスジェニック動物を作製するための標準的技術を使用して、目的の動物のゲノムに目的の遺伝子のコード部分を導入することによって操作することができる。トランスジェニック操作のための標的となり得る動物としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、およびヒト以外の霊長類（例えば、ヒヒ、チンパンジー、および他のサル）が挙げられるが、これらに限定されない。導入遺伝子をこのような動物に導入するための当該分野で公知の技術としては、前核へのマイクロインジェクション（Ｈｏｐｐｅ ａｎｄ Ｗａｎｇｅｒ，米国特許第４，８７３，１９１号）；生殖細胞系列へのレトロウイルスを介した遺伝子導入（例えば、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，６１４８−６１５［１９８５］）；胚性幹細胞の中での遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ５６，３１３−３２１［１９８９］）；胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，１８０３−１８１４［１９８３］）；精液を介した遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ ５７，７１７−７３［１９８９］）が挙げられる。概要については、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号を参照のこと。
例えば、関節炎の予防および／または処置における効力は、コラーゲン誘導性関節炎モデル（Ｔｅｒａｔｏら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍ．３５：８２８〜８３８（１９６６））において評価することができる。関節炎の予防／治療の有効性はまた、Ｔｅｒａｔｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２１０３〜８（１９９２）およびＴｅｒａｔｏら、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ２２：１３７〜４７（１９９５）によって記載されているように、４つのモノクローナル抗体のカクテルの静脈内注射によって誘導された抗体媒介性関節炎のモデルにおいてもスクリーニングすることができる。関節炎の予防および／または治療についての候補は、トランスジェニック動物モデル（例えば、ＴＮＦ−αトランスジェニックマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ））において研究することもできる。これらの動物は、ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、ヒトの関節リウマチの病因と関係があるサイトカインを発現する。これらのマウス中のＴＮＦ−αの発現は、前脚および後足の重度の慢性関節炎を生じ、炎症性関節炎のシンプルなマウスモデルを提供する。
近年、乾癬の動物モデルも開発されている。Ａｓｅｂｉａ（ａｂ）、フレーク状の皮膚（ｆｓｎ）、および慢性増殖性皮膚炎（ｃｐｄ）は、乾癬様の皮膚の変化を有している自発的なマウス突然変異体である。サイトカイン（例えば、インターフェロン−γ、インターロイキン−１α、ケラチノサイト増殖因子、トランスフォーミング増殖因子−α、インターフェロン−６、血管内皮増殖因子、または骨形態形成タンパク質−６）の皮膚での過剰発現を有しているトランスジェニックマウスもまた、インビボで乾癬を研究するため、および乾癬の処置のための治療薬を同定するために使用することができる。乾癬様の病変はまた、ＰＬ／Ｊ株に戻し交配されたβ２−インテグリンの発現量が低下したマウス（β２−ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ ｍｉｃｅ）、およびβ１−インテグリントランスジェニックマウス、ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＢｈｉＴリンパ球で再構成されたｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウス、ならびに、ＨＬＡ−Ｂ２７／ｈβ２ｍトランスジェニックラットにおいても記載されている。免疫不全マウスに移植されたヒトの皮膚を使用する異種移植モデルもまた知られている。このように、本発明の抗体および他のＣ３ｂアンタゴニストは、Ｓｃｈｏｎ．Ｍ．Ｐ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（１９９７）３：１８３に記載されているｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスモデルにおいて試験することができる。ここでは、マウスは、乾癬に類似する組織病理学的皮膚病変を示す。別の適切なモデルは、Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ．Ｂ．Ｊ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．（１９９５）１４６：５８０に記載されているように調製されたヒト皮膚／ｓｃｉｄマウスキメラである。さらなる詳細については、例えば、Ｓｃｈｏｎ，Ｍ．Ｐ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ １１２：４０５−４１０（１９９９）を参照のこと。
喘息のモデルが記載されている。ここでは、抗原誘導性の、気道過剰反応、肺好酸球増加症、および炎症が、動物をオボアルブミンで感作させ、次にエアロゾルによって送達された同じタンパク質で動物をチャレンジすることによって誘導される。いくつかの動物モデル（モルモット、ラット、ヒト以外の霊長類）は、エアロゾル抗原でチャレンジされると、ヒトのアトピー性喘息と類似する症状を示す。マウスのモデルは、ヒトの喘息の特徴の多くを有している。喘息の処置における活性と有効性についてＣＲＩｇおよびＣＲＩｇアゴニストを試験するための適切な方法は、Ｗｏｌｙｎｉｅｃ，Ｗ．Ｗ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８）１８：７７７、およびその中の参考文献に記載されている。
接触過敏症は、細胞媒介性免疫機能のシンプルなインビボアッセイである。この手法では、上皮細胞が、遅延型過敏症反応を引き起こす外来性ハプテンに対して暴露させられ、遅延型過敏症反応が測定され、定量される。接触過敏症には初期感作期が含まれ、その後に誘発期が続く。この誘発期は、上皮細胞が以前に接触した抗原に遭遇すると起こる。腫れと炎症が起こり、それにより、これはヒトのアレルギー性接触皮膚炎の優れたモデルとなる。適切な手法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｏｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ、およびＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４，ｕｎｉｔ ４．２に詳細に記載されている。Ｇｒａｂｂｅ，Ｓ．ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｔ，Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ １９（１）：３７−４４（１９９８）もまた参照のこと。
移植片対宿主病は、免疫担当細胞が免疫抑制されている患者または免疫寛容である患者に移植された場合に起こる。ドナー細胞は宿主抗原を認識し、これに対して応答する。この応答は、生命を脅かす重篤な炎症から下痢や体重減少の穏やかな症例まで様々であり得る。移植片対宿主病モデルは、ＭＨＣ抗原および微量の移植抗原に対するＴ細胞の反応性を評価する手段を提供する。適切な手法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（前出）ｕｎｉｔ ４．３に詳細に記載されている。
皮膚同種移植片拒絶の動物モデルは、Ｔ細胞がインビボで組織破壊を媒介する能力を試験する手段であり、これは、抗ウイルスおよび腫瘍免疫性におけるそれらの役割の指標であり、尺度である。最も一般的であり、許容されるモデルでは、マウスの尾の皮膚移植が使用される。反復実験により、皮膚同種移植片拒絶は、Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、およびキラーエフェクターＴ細胞によって媒介され、抗体には媒介されないことが示されている。Ａｕｃｈｉｎｃｌｏｓｓ，Ｈ．Ｊｒ．ａｎｄ Ｓａｃｈｓ，Ｄ．Ｈ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９，８８９−９９２。適切な手法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（前出）ｕｎｉｔ ４．４に詳細に記載されている。ＣＲＩｇおよびＣＲＩｇアゴニストの試験に使用できる他の移植片拒絶モデルは、Ｔａｎａｂｅ，Ｍ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９９４）５８：２３およびＴｉｎｕｂｕ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）４３３０−４３３８に記載されている同種心臓移植モデルである。
遅延型過敏症の動物モデルは、同様に細胞媒介性の免疫機能のアッセイ法を提供する。遅延型の過敏症反応は、抗原でのチャレンジ後に一定の時間が経過するまではピークに達しない炎症を特徴とするＴ細胞媒介性のインビボ免疫応答である。これらの反応はまた、組織特異的自己免疫疾患、例えば多発性硬化症（ＭＳ）および実験用の自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ、ＭＳのモデル）も生じる。適切な手法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（前出）ｕｎｉｔ ４．５に詳細に記載されている。
ＥＡＥは、Ｔ細胞と単核細胞の炎症、およびそれに続いて起こる中枢神経系の軸索の脱髄を特徴とするＴ細胞媒介性の自己免疫疾患である。ＥＡＥは、一般的には、ヒトのＭＳについての関連する動物モデルであると考えられる。Ｂｏｌｔｏｎ，Ｃ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（１９９５）１：１４３。急性寛解モデルおよび再発性寛解モデルの両方が開発されている。ＣＲＩｇとそのアゴニストおよびアンタゴニストは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（前出）ｕｎｉｔ １５．１および１５．２に記載されているプロトコールを使用して、免疫媒介性の脱髄疾患に対するＴ細胞刺激性活性または阻害活性について試験することができる。Ｄｕｎｃａｎ，Ｉ．Ｄ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ（１９９７）５５４−５６１に記載されているような、乏突起膠細胞またはＳｃｈｗａｎｎ細胞が中枢神経系に移植されるミエリン疾患のモデルも参照のこと。
心筋虚血−再潅流のモデルは、マウスまたはラットにおいて行うことができる。動物は気管切開され、小動物用の人工呼吸器で酸素が供給される。ポリエチレンカテーテルが、平均動脈血圧の測定のために、内頚動脈と外頸静脈に挿入される。心筋虚血再潅流は左下行前動脈（ＬＡＤ）を６−Ｏ縫合糸で結紮することによって開始される。虚血は、完全に血管を閉塞させるようにＬＡＤを取り囲む可逆性の結紮をきつくすることによって生じさせられる。縫合糸が３０分後に取り除かれ、心臓が４時間潅流される。ＣＲＩｇとＣＲＩｇアゴニストは、心筋梗塞の大きさ、心臓のクレアチンキナーゼ活性、ミエロペルオキシダーゼ活性、および抗Ｃ３抗体を使用する免疫組織化学を測定することによって、それらの効力について試験することができる。
糖尿病性網膜症のモデルには、ストレプトゾトシンでのマウスまたはラットの処置が含まれる。ＣＲＩｇとＣＲＩｇアゴニストは、眼窩の拡張（ｖｅｎｕｌｅ ｄｉｌａｔａｔｉｏｎ）、網膜内細小血管異常、および網膜と硝子体腔の新生血管に対するそれらの影響について試験することができる。
膜増殖性糸球体腎炎のモデルは以下のように確立させることができる：雌のマウスは、ＣＦＡ中の０．５ｍｇの対照であるウサギＩｇＧでｉ．ｐ．免疫化される（−７日）。７日後（０日）、１ｍｇのウサギ抗マウス糸球体基底膜（ＧＢＭ）抗体が尾静脈からｉ．ｖ．注射される。血清中の抗ウサギＩｇＧ抗体の上昇がＥＬＩＳＡによって測定される。２４時間の尿試料が代謝ケージの中のマウスから採取され、マウスの腎機能が、血中尿素窒素に加えて尿タンパク質の測定によって評価される。
加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の動物モデルは、Ｃｃｌ−２またはＣｃｒ−２遺伝子にヌル変異を有しているマウスからなる。これらのマウスはＡＭＤの基本的な特徴を発症し、これには、リポフスシンの蓄積、および網膜色素上皮（ＲＰＥ）の真下にあるドルーゼン、光受容体アトロフィー、および脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）が含まれる。これらの特徴は、６ヶ月の年齢を過ぎて発症する。ＣＲＩｇとＣＲＩｇアゴニストは、ドルーゼンの形成、光受容体アトロフィー、および脈絡膜新生血管について試験することができる。
ＣＮＶは、レーザーで誘導された脈絡膜新生血管の様々なモデルにおいて試験することができる。したがって、例えば、ＣＮＶは、脈絡膜新生血管を生じる強いレーザー照射（ｌａｓｅｒ ｐｈｏｔｏｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）によって、ラットおよびカニクイザルにおいて誘導することができる。この症状の進行と処置は、例えば、蛍光眼底血管造影法、組織病理学的および免疫組織化学的評価によって、ならびに、様々な時間の間隔で、処置の前後に動物から回収された血清についての薬物動態、溶血、抗体スクリーニング、および補体活性化アッセイによって評価することができる。予防的投与の効力は、蛍光眼底血管造影による血管の漏出のモニタリング、レーザーによる火傷の部位での補体の沈着の阻害、検眼、眼底撮影（ｏｃｕｌａｒ ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｙ）、硝子体と網膜組織の回収などを含む類似する方法によってモニターすることができる。さらなる詳細は以下の実施例に提供される。
処置方法
補体が関係している障害の予防、処置、またはその重篤度の軽減のための本発明の化合物の適切な投与量は、上記で定義されたような処置される障害のタイプ、障害の重篤度およ経過、薬剤が予防目的で投与されるのかまたは治療目的で投与されるのか、以前に行われた治療、患者の臨床病歴および化合物に対する応答、ならびに主治医の判断に応じて様々であろう。化合物は、一回の処置で、または一連の処置によって、患者に適切に投与される。好ましくは、インビトロで、その後、ヒトでの試験の前に有用な動物モデルにおいて、用量応答曲線と本発明の薬学的組成物を決定することが所望される。
例えば、疾患のタイプと重篤度に応じて、例えば、１回以上の分けられた投与によって、または持続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ）の抗Ｃ３ｂ抗体または他のＣ３ｂアンタゴニストが、患者に投与される最初の候補用量である。典型的な１日量は、上記の要因に応じて約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以上の範囲であろう。症状に応じた数日間以上にわたる反復投与については、処置は、症状に応じて疾患の兆候の所望される抑制が生じるまで維持される。しかし、他の投与レジュメが有効である可能性もある。この治療の進行は、従来技術およびアッセイによって容易にモニターされる。
補体が関係している眼の症状（例えば、ＡＭＤまたはＣＮＶ）の処置の有効性は、眼内疾患の評価において一般的に使用されている様々な評価項目によって測定することができる。例えば、視力低下を評価することができる。視力低下は、例えば、ベースラインから所望される時点までの最も正確な視力（ＢＣＶＡ）の平均変化による測定（例えば、ＢＣＶＡはＥａｒｌｙ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ Ｓｔｕｄｙ（ＥＴＤＲＳ）視力チャートと、４メートルの試験距離での評価に基づく）、ベースラインと比較して所望される時点で視力において１５文字未満の視力低下がある被験体の割合の測定、ベースラインと比較して所望される時点で１５文字以上の視力を取り戻した（ｇａｉｎ）被験体の割合の測定、所望される時点で２０／２０００またはそれよりもさらに悪いＳｎｅｌｌｅｎ視力を有している被験体の割合の測定、ＮＥＩ Ｖｉｓｕａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅの測定、所望される時点でのＣＮＶの大きさとＣＮＶの漏出量の測定（例えば、フルオレセイン血管造影法による）などによって評価することができるが、これらに限定されない。例えば、眼の検査を行うこと、眼内圧を測定すること、視力を評価すること、スリットランプ圧（ｓｌｉｔｌａｍｐ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を測定すること、眼内の炎症を評価することなどを含むがこれらに限定されない、眼の評価を行うことができる。
薬学的組成物
本発明のＣ３ｂ抗体および他のＣ３ｂアンタゴニストは、薬学的組成物の形態で、補体が関係している障害の処置のために投与することができる。
本発明のＣ３ｂ抗体および他のアンタゴニストの治療用処方物は、所望される純度を有している活性分子を、状況に応じた薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編［１９８０］）と混合することによって、凍結乾燥させられた処方物または水溶液の形態で、保存用に調製される。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、そしてこれらとしては、以下が挙げられる：緩衝剤（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸）；抗酸化物質（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）：低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン）；単糖類、二糖類および他の炭化水素（例えば、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖類（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール）；塩を形成する対イオン（例えば、ナトリウム）；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／あるいは非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））。
リポフェクションまたはリポソームもまた、ポリペプチド、抗体、または抗体断片を細胞に送達するために使用することができる。抗体断片が使用される場合は、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さい断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持しているペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチドは化学合成することができ、そして／または組み換えＤＮＡ技術によって生産することができる（例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，７８８９−７８９３［１９９３］を参照のこと）。
活性分子はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）の中に、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）の中に、あるいは、マイクロエマルジョンの中に捕捉させることもできる。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示されている。
インビボでの投与に使用される処方物は滅菌されていなければならない。これは、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に行われる。
徐放調製物が調製され得る。徐放調製物の適切な例としては、抗体を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。このマトリックスは成型されたもの（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。徐放マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニルコポリマー、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グルコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア））、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グルコール酸のようなポリマーは１００日を越えて分子を放出することができるが、特定のヒドロゲルはより短い期間にわたりタンパク質を放出する。カプセル化された抗体が体内に長期間留まる場合には、これらは、３７℃で水分に曝された結果として変性または凝集する可能性があり、それにより生物学的活性の消滅が生じ、そして免疫原性が変化する可能性がある。合理的な方法論は、関係がある機構に応じた安定化のために考案することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換による分子内Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見された場合には、安定化は、スルフヒドリル残基を改変し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含有量を制御し、適切な添加剤を使用し、そして特異的なポリマーマトリックス組成物を生じさせることによって行われ得る。
眼の疾患もしくは症状の予防または処置のための本発明の化合物は、通常は、眼への注射、眼内注射、および／または硝子体内注射によって投与される。他の投与方法もまた使用され、これには、局所投与、非経口投与、皮下投与、腹腔内投与、肺内投与、鼻腔内投与、および病変内投与が含まれるが、これらに限定されない。非経口での注入には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または皮下投与が含まれる。
眼への投与、眼内投与、または硝子体内投与のための処方物は、当該分野で公知の方法によって、そして当該分野で公知の成分を使用して調製することができる。有効な処置の主要な要件は、眼からの適切な浸透である。薬物を局所的に送達することができる眼の前部の疾患とは異なり、網膜の疾患にはより部位特異的なアプローチが必要である。点眼薬および眼用軟膏はまれにしか眼の裏側に浸透せず、血液−眼バリアは、全身投与された薬物の眼組織への浸透の妨げとなる。したがって、通常は、網膜の疾患（例えば、ＡＭＤおよびＣＮＶ）を処置するための薬物送達に選択される方法は、直接の硝子体内注射である。硝子体内注射は、通常は、患者の症状、および送達される薬物の特性と半減期に応じた間隔で繰り返される。眼内（例えば、硝子体内）への浸透のためには、通常は、より小さな大きさの分子が好ましい。
以下の実施例は、説明の目的だけのために提供され、いかなる方法においても本発明の範囲を限定するようには意図されない。
実施例において言及される市販されている試薬は、他の場所に明記されない限りは、製造業者の説明書にしたがって使用した。以下の実施例の中、および明細書全体を通じてＡＴＣＣ登録番号によって特定されたこれらの細胞の供給源は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９である。
抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））にしたがってナンバリングされる。一文字のアミノ酸省略形が使用される。ＤＮＡの縮重はＩＵＢコードを使用して表される（Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｄ＝Ａ／Ｇ／Ｔ、Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ、Ｂ＝Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｈ＝Ａ／Ｃ／Ｔ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ）。
（実施例１）
出発抗体の超可変領域をコードするファージから誘導された抗体
ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）抗ＨＥＲ２抗体ｒｈｕＭＡＢ ４Ｄ５−８（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）のＶＬドメインとＶＨドメインの核酸配列（図１８Ａおよび１８Ｂ）を、ＨＶＲの突然変異誘発と、ヒトＣ３ｂに対する結合についてのファージ選択のための出発配列として使用した。抗体４Ｄ５は、Ｈｅｒ−２（ｅｒｂＢ２）として公知のガン関連抗原に特異的なヒト化抗体である。この抗体には、コンセンサスフレームワーク領域を有している可変ドメインが含まれており、ここでは、ヒト化抗体の親和性を増大させるプロセスの間に、マウス配列に対して数個の位置が反転させられている。ヒト化抗体４Ｄ５の配列と結晶構造は米国特許第６，０５４，２９７号、Ｃａｒｔｅｒら、ＰＮＡＳ ８９：４２８５（１９９２）に記載されており、結晶構造は、Ｃａｒｔｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２９：９６９（１９９３）、およびｗｗｗ／ｎｃｂｉ／ｎｉｈ／ｇｏｖ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｍｍｄｂ（ＭＭＤＢ＃ｓ−９９０−９９２）にオンライン上に示されている。これらの開示全体が引用により明らかに本明細書中に組み込まれる。
ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）のＶＬドメインとＶＨドメインには、コンセンサスなヒトκＩ ＶＬドメインと、ヒトのサブグループＩＩＩのコンセンサスＶＨドメインの変異体が含まれる。変異体ＶＨドメインは、ヒトのコンセンサスから３つが変化している：Ｒ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ、およびＬ７８Ａ。
この研究に使用したファージミドは、原則として、Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４），３４０（５）：１０７３−９３に記載されたとおりである、ｐｈｏＡプロモーターの制御下に２つのオープンリーディングフレームを有している１価のＦａｂ−ｇ３ディスプレイベクター（ｐＶ０３５０−２Ｂ）である。第１のオープンリーディングフレームは、ＶＬに融合させられたｓｔＩＩシグナル配列とＣＨ１ドメインアクセプター軽鎖からなり、そして第２のオープンリーディングフレームは、ＶＨに融合させられたｓｔＩＩシグナル配列とアクセプター重鎖のＣＨ１ドメイン、それに続く短縮型のマイナーファージ外被タンパク質Ｐ３からなる。Ｌｅｅら（前出）を参照のこと。
重鎖ＨＶＲの突然変異誘発によって作製された抗体
ＦａｂクローンＹＷ１４４．２．４３を、ｈｕＭＡｂ ４Ｄ５−８（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）抗ＨＥＲ２抗体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）重鎖のＨＶＲ−Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３の突然変異誘発と、ヒトＣ３ｂ融合タンパク質に対する選択によって作製した。ＨＶＲ−Ｈ１の中では、Ｋａｂａｔ位置２６（Ｇ）、２７（Ｆ）、２８（Ｔ）、２９（Ｉ）、３４（Ｉ）、および３５（Ｈ）を一定にし、３０〜３３位のアミノ酸を変化させた。ＨＶＲ−Ｈ２の中では、Ｋａｂａｔ位置５１（Ｉ）、５２ａ（Ｐ）、５５（Ｇ）、５７（Ｔ）、５９（Ｙ）、６０（Ａ）、６１（Ｄ）、６２（Ｓ）、６３（Ｖ）、６４（Ｋ）、および６５（Ｇ）を一定にし、位置４９、５０、５２、５３、５４、５６、および５８を変化させた。ＨＶＲ−Ｈ３においては、Ｋａｂａｔ位置９３（Ａ）と１０２（Ｙ）を一定にし、位置９４〜１００、１００ａ〜ｈ、および１０１を変化させた。ＹＷ１４４．２．４３の軽鎖は改変されたｈｕＭＡｂ ４Ｄ５−８配列（位置３０、６６、および９１で改変された）であり、そのＨＶＲは、ファージ選択の間には変化させなかった。配列多様性を、標準的な突然変異誘発技術を使用して、選択したアミノ酸位置の突然変異誘発によってそれぞれの超可変領域に導入した。
ファージライブラリーの作製
それぞれの超可変領域について設計した無作為化したオリゴヌクレオチドのプールを、６６０ｎｇのオリゴヌクレオチド、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＡＴＰ、２０ｍＭのＤＴＴ、および５Ｕのポリヌクレオチドキナーゼを含む６個の２０μｌの反応の中で、別々に、３７℃で１時間リン酸化させた。次いで、６つのリン酸化させたオリゴヌクレオチドのプールを、５００μｌの最終容量の中で、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２中の２０μｇのＫｕｎｋｅｌ鋳型と混合して、鋳型に対するオリゴヌクレオチドの比を３とした。この混合物を９０℃で４分間、５０℃で５分間アニーリングさせ、その後、氷上で冷却した。過剰量のアニーリングしなかったオリゴヌクレオチドをＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎキット２８１０６）を用いて、アニーリングしたＤＮＡの過度の変性を防ぐように改変されたプロトコールを使用して除去した。５００μｌのアニーリングした混合物に対して、１５０μｌのＰＢを添加し、混合物を２つのシリカカラムに分けた。７５０μｌのＰＥでのそれぞれのカラムの洗浄と、カラムを乾燥させるためのさらなる回転の後、個々のカラムを、１１０μｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）で溶離させた。アニーリングさせ、洗浄した（ｃｌｅａｎｅｄ−ｕｐ）鋳型（２２０μｌ）を、その後、１μｌの１００ｍＭのＡＴＰ、１０μｌの２５ｍＭのｄＮＴＰ（それぞれ２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）、１５μｌの１００ｍＭのＤＴＴ、２５μｌの１０×ＴＭ緩衝液（０．５ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ＭのＭｇＣｌ２）、２４００ＵのＴ４リガーゼ、および３０ＵのＴ７ポリメラーゼを添加することによって、室温で３時間かけてフィルイン（ｆｉｌｌｅｄ ｉｎ）した。
フィルイン産物をＴｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ−ＥＤＴＡ／アガロースゲル上で分析した（Ｓｉｄｈｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３２８：３３３−３６３（２０００））。通常は３つのバンドを見ることができた：下部のバンドは、正確にフィルインされ、連結された産物であり、中央のバンドはフィルインされたが連結されていない産物であり、そして上部のバンドは鎖置換された産物である。上部のバンドは、Ｔ７ポリメラーゼの強い副活性（ｓｉｄｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）によって生じ、回避することは難しい（Ｌｅｃｈｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１１１７４−１１１８４（１９８３））。しかし、このバンドは、下部のバンドよりも変換される効率が３０倍小さく、通常は、ライブラリーにはほとんど寄与しない。中央のバンドは、最終的な連結反応のための５’リン酸が存在しないことが原因である。このバンドの変換は効率的であり、主に野生型配列を生じる。
その後、フィルイン産物を精製し、ＳＳ３２０細胞にエレクトロポレーションし、Ｓｉｄｈｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３２８：３３３−３６３（２０００）に記載されているように、Ｍ１３／ＫＯ７へルパーファージの存在下で増殖させた。ライブラリーの大きさは、１〜２×１０９の個別のクローンの範囲である。最初のライブラリーに由来する無作為なクローンを、ライブラリーの質を評価するために配列決定した。
ファージ選択
ヒトＣ３ｂタンパク質を選択抗原として使用した。ヒトＣ３ｂを、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌで、ＭａｘｉＳｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）上にコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。第１回目の選択には、１２ウェルの標的を使用した。ウェルを、室温で１時間、ファージブロッキング緩衝液（Ｐｈａｇｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）（１％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０、ＰＢＳ）を使用してブロックした。ファージライブラリーを凍結させたグリセロールストックからＰＥＧで沈殿させ、ファージブロッキング緩衝液中に再度懸濁させ、室温で１時間インキュベートした。その後、ファージライブラリーを、室温で一晩インキュベートしたブロックした抗原プレートに対して添加した。一晩の結合後、結合していない／非特異的ファージを、洗浄緩衝液（Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ）（ＰＢＳ、０５％のＴｗｅｅｎ２０）での洗浄によって抗原プレートから除去した。結合したファージは、ウェルを５０ｍＭのＨＣｌ、０．５ＭのＫＣｌとともに３０分間インキュベートすることによって溶離させた。ファージを、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞とＭ１３／ＫＯ７ヘルパーファージを使用して増幅させ、２ＹＴ、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、１０ｕｇ／ｍｌのテトラサイクリン中で３０℃で３６時間増殖させた。増幅させたファージを、その後、改変されたＰＥＧ沈殿プロトコール（Ｍｏｎａｃｉ，Ｐ．，Ｃｏｒｔｅｓｅ，Ｒ．，Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐｈａｇｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｗｉｔｈ ｓｅｒａ：Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ−Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｌａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎ編，２００４，１９３−２１５頁）を使用して回収した。標的をコーティングしたウェルから溶離したファージの力価を、富化を評価するために、標的をコーティングしなかったウェルから回収したファージの力価に対して比較した。４回のファージ選択を、標的ウェルの数を４（２回）から２（３回目と４回目）に減らしながら完了した。カゼインブロッキング緩衝液（Ｃａｓｅｉｎ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）（Ｐｉｅｒｃｅ）を、２回目と４回目の抗原プレートおよびファージ用のブロッキング試薬として使用した。２〜４回目の選択では、３〜４時間のファージ−抗原結合時間と、高い洗浄ストリンジェンシーを使用した。ヒトＣ３ｂのパンニングの場合には、ヒトＣ３もまた、ヒトＣ３にも結合できるファージ抗体に対する対抗選択として、２〜４回目の選択においてファージ−抗原インキュベーションの間に添加した（＞１μＭ）。ヒトファージクローンＹＷ１４４．２．４３を選択した。Ｃ３ｂパンニングの結果を図１に示す。Ｃ３ｂの結合特性は、実施例３に開示するように決定した。
（実施例２）
ＨＶＲ Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＬ３のバリエーションによって作製した抗体
クローンＹＷ１４４．２．４３を、ｈｕＭＡｂ ４Ｄ５−８（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）抗ＨＥＲ２抗体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．）重鎖可変ドメインとｈｕＭＡｂ ４Ｄ５−８改変軽鎖可変ドメインのＨＶＲ−Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＬ３の突然変異誘発によって作製した。ＨＶＲ−Ｈ１においては、Ｋａｂａｔ位置２６（Ｇ）、２８（Ｔ）、２９（Ｆ）、３０（Ｓ）、３１（Ｓ）、および３５（Ｓ）は一定にし、位置２７、３２〜３４のアミノ酸を変化させた。ＨＶＲ−Ｈ２においては、Ｋａｂａｔ位置４９（Ｓ）、５１（Ｉ）、５５（Ｇ）、５７（Ｔ）、５９（Ｙ）、６０（Ａ）、６１（Ｄ）、６２（Ｓ）、６３（Ｖ）、６４（Ｋ）、および６５（Ｇ）は一定にし、位置５０、５２、５２ａ、５３、５４、５６、および５８を変化させた。ＨＶＲ−Ｈ３においては、Ｋａｂａｔ位置９３（Ａ）、９４（Ｒ）、１００ｆ〜ｇ（欠失）は一定にし、位置９５〜１００、１００ａ〜ｅ、１００ｈ、および１０２を変化させた。ＨＶＲ−Ｌ３においては、Ｋａｂａｔ位置８９（Ｑ）、９０（Ｑ）、９５（Ｐ）、および９７（Ｔ）を一定にし、位置９１〜９４、および９６を変化させた。ＨＶＲ−Ｌ１の配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡ（配列番号１１）として一定にし、ＨＶＲ−Ｌ２の配列は、ＧＡＳＳＲＡＳ（配列番号１２）として一定にした。配列多様性を、標準的な突然変異誘発技術を使用して選択したアミノ酸位置を突然変異誘発させることによって、個々の超可変領域の中に導入した。抗Ｃ３ｖ抗体クローンを選択し、配列決定した。
ＹＷ１４４．２．４３の親和性成熟
抗Ｃ３ｂ抗体ＹＷ１４４．２．４３の親和性を改善するために、ＹＷ１４４．２．４３の骨格において３種類のファージディスプレイライブラリーを作製し、これらはそれぞれ、Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４），３４０（５）：１０７３−９３に記載されているように、ソフト無作為化突然変異誘発（ｓｏｆｔ ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）のための多数のＨＶＲを標的化する。鋳型について可能性のある高いバックグラウンドからのＹＷ１４４．２．４３の再選択を回避するために、終結コドンをＨＶＲに導入して、それぞれのライブラリーを作製する前に変異させた。ソリューションソーティング法（ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｏｒｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）を使用して、親和性に基づくファージ選択プロセスの効率を高めた。ビオチニル化した標的の濃度を操作し、よりバックグラウンドが低くなるまでのファージ捕捉時間を短くし、そしてより早い除去速度でクローンを排除するためにビオチニル化されていない標的を添加することにより、高親和性クローンをうまく選択することができる。Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４），３４０（５）：１０７３−９３。１回目の選択により、富化（標的依存性のファージ捕捉）が観察され、このことは、ヒトＣ３ｂに対して適度に高い親和性を有している多数のクローンがそれぞれのライブラリーの中に存在することを示唆している。選択のストリンジェンシーはその後の回では高めた。５回の選択の後、それぞれのライブラリーに由来するクローンを分析した。６個のＨＶＲのそれぞれを標的化する新しい配列がライブラリーの中で観察された。選択したクローンをファージＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、その後、ＩｇＧタンパク質として発現させ、そしてそれらの親和性をＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）結合分析によって特性決定した。
親和性成熟させたクローンのファージライブラリーを、固体／液体選別法を使用して選別した。ヒトＣ３ｂを、ＰＢＳ中の５００μｌの３．６ｍｇ／ｍｌのヒトＣ３ｂと１０μｌの１Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ８）を、２０μｌの４ｍＭのＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）と混合することによってビオチニル化させた。１回目の選択のために、ビオチニル化したＣ３ｂを、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌで、ＭａｘｉＳｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）上にコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。１回目の選択には、１６ウェルの標的を使用した。ウェルを、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して室温で１時間ブロックした。成熟ファージライブラリーをＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ緩衝液中に希釈し、室温で１時間インキュベートした。その後、ファージライブラリーを、室温で２時間インキュベートしたブロックされた抗原プレートに添加した。結合後、結合していない／非特異的ファージを、洗浄緩衝液（Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ）（ＰＢＳ、０５％のＴｗｅｅｎ２０）での洗浄によって抗原プレートから除去した。結合したファージは、ウェルを５０ｍＭのＨＣｌ、０．５ＭのＫＣｌとともに３０分間インキュベートすることによって溶離させた。ファージを、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞とＭ１３／ＫＯ７ヘルパーファージを使用して増幅させ、２ＹＴ、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、１０ｕｇ／ｍｌのテトラサイクリン中で３０℃で３６時間増殖させた。増幅させたファージを、その後、改変されたＰＥＧ沈殿プロトコール（Ｍｏｎａｃｉ，Ｐ．，Ｃｏｒｔｅｓｅ，Ｒ．，前出）を使用して回収した。標的をコーティングしたウェルから溶離したファージの力価を、富化を測定するために、標的をコーティングしなかったウェルから回収したファージの力価に対して比較した。２〜５回目の選択のために、溶液選別プロトコール（ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｏｒｔｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を実行した。マイクロタイターウェルを、ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌのニュートラアビジンで４℃で一晩コーティングし、その後、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して１時間ブロックした。回収したファージライブラリーをＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ中に懸濁し、これを５０ｎＭのｂ−Ｒｏｂｏ４−Ｈｉｓとともに１時間混合した。ｂ−Ｃ３ｂに結合したファージをニュートラアビジンをコーティングしたウェル上に３０分間捕捉し、結合していないファージを洗浄緩衝液で洗い流した。ファージを、５０ｍＭのＨＣｌ、５００ｍＭのＫＣｌを使用して３０分間溶離させ、中和し、ＫＯ７ヘルパーファージ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下でＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で増殖させた。次の回の選別は、以下を除いて同様に行った：２回目では、最終ｂ−Ｃ３ｂ濃度を５０ｎＭとし、３回目では最終ｂ−Ｃ３ｂ濃度を２５ｎＭとし、４回目では、最終ｂ−Ｃ３ｂ濃度を５ｎＭとし、そして５回目では、最終ｂ−Ｃ３ｂ濃度を０．５ｎＭとして、５０ｎＭの非ビオチニル化Ｃ３ｂを、ニュートラアビジン上への捕捉のために１時間前に混合物に対して添加した。
いくつかの親和性成熟クローンを、ヒトＣ３ｂに対する結合について選択し、配列決定した。親和性成熟抗体ＹＷ１４４．２．４３．Ｓ７７（簡単には、Ｓ７７）の重鎖Ｆａｂ断片と軽鎖Ｆａｂ断片のアミノ酸配列を図５に示す。
（実施例３）
選択した抗Ｃ３ｂ抗体クローンの特性決定
ファージＥＬＩＳＡ−ファージ競合結合アッセイを、ファージディスプレイされるＦａｂのＣ３ｂに対する適切な結合親和性（ファージＩＣ５０と決定した）を決定するために行った。アッセイは以下のように行った。個々のクローンに由来する精製したファージ上清を、上記に記載した改変されたＰＥＧ沈殿プロトコールを使用して行った。精製したファージ上清を、ファージブロッキング緩衝液中に段階稀釈し、その後、Ｃ３ｂ（１μｇ／ｍｌ）でコーティングしたプレート上で１５分間インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液で洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ／抗Ｍ１３抗体結合体（ＰＢＳ緩衝液中に１：５０００に稀釈した）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともに３０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で発色させ、０．１ＮのＨＳＯ４でクエンチした。吸光度を４５０ｎｍで分光光度法によって測定して、飽和状態のシグナルの約５０％を生じるファージ濃度を決定した。固定した飽和濃度未満のファージを、３５０ｎＭのＣ３ｂから５ｎＭのＣ３ｂまでのＣ３ｂタンパク質の２倍の段階稀釈物を含むファージブロッキング緩衝液中に稀釈した。混合物を、室温で穏やかに震盪させながら１時間インキュベートし、Ｃ３ｂ（１μｇ／ｍｌ）でコーティングしたプレートに移し、プレートを２０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、上記のように処理した。結合親和性をＩＣ５０値（固定化した抗原に対するファージの結合の５０％をブロックした抗原の濃度と定義した）として概算した。Ｃ３ｂファージの競合結果を図２に示す。
ＩｇＧの生産と親和性の決定−親和性の特性決定のためにＩｇＧタンパク質を発現させるために、停止コドンを、ファージディスプレイベクターの中の重鎖とｇ３との間に導入した。クローンをＥ． ｃｏｌｉ ３４Ｂ８細胞に形質転換し、ＡＰ５培地中で３０℃で増殖させた（Ｐｒｅｓｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７））。細胞を遠心分離によって回収し、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）中に懸濁し、マイクロフルイダイザーを使用して崩壊させた。ＦａｂをプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
ファージ由来の抗Ｃ３ｂ抗体ＹＷ１４４．２．４３とその親和性成熟させた変異体ＹＷ１４４．２．４３Ｓ７７（Ｆａｂ断片）の、ヒトＣ３ｂおよびＣ３に対する結合親和性を、表面プラズモン共鳴の測定によって、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００システム（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用して決定した。試験した抗体Ｆａｂ断片は、ＹＷ１４４．２．４３とＹＷ１４４．２．４３Ｓ７であった。簡単に説明すると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）上のフローセル１と２を、０．２ＭのＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）と０．０５ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で、５μｌ／ｉｎの流速で７分間活性化させた。フローセルの１つは、ネガティブ対照としてコーティングしないままとした。これらの活性化したチップを、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌにする稀釈によって抗Ｃ３ｂ Ｆａｂでコーティングし、その後、５μｌ／分の流速で注入して、およそ５０の反応単位（ＲＵ）のカップリング抗体を得た。次に、１Ｍのエタノールアミンを、未反応基をブロックするために注入した。速度論の測定のために、ヒトＣ３ｂまたはＣ３可溶性抗原の２倍の段階稀釈物（Ｃ３ｂについてはおよそ１００ｎＭからおよそ３ｎＭ、Ｃ３については、約１μＭから５０ｎＭ）を、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ中に、２５℃、３５μｌ／分の流速で注入した。それぞれの注入後、チップを２０ｍＭのＨＣｌを使用して再生させた。結合応答をブランクであるフローセルによるＲＵを減算することによって補正した。会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を、シンプルな１対１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して計算した。平行解離定数（ＫＤ）は、比ｋ解離／ｋ会合として計算した。結合親和性を図６および７に示す。
別の実験では、精製したＣ３ｂまたはＣ３を、ポリクローナルＣ３抗体を使用してマイクロタイタープレート上に捕捉した。Ｓ７７（Ａ）またはポリクローナル抗Ｃ３抗体（Ｂ）の捕捉したＣ３ｂまたはＣ３に対する結合を、二次ＨＲＰＯ結合抗体を使用して決定した。色をＴＭＢ（ＫＰＬ）を用いて発色させ、２ＮのＨ２ＳＯ４中で停止させ、そして吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
抗Ｃ３ｂ抗体Ｓ７７の特異性を試験するためのＣ３ｂ ＥＬＩＳＡ。ＰＢＳ中に稀釈した２５μＬの捕捉抗体（ＹＷ１４４．２．４５．Ｓ７７親和性成熟ｘＣ３／Ｃ３ｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、２μｇ／ｍｌ）を、マイクロタイタープレートのウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０（２０×ストック；Ｍｅｄｉａ Ｐｒｅｐ；Ｃａｔ．Ａ３３５５））で３回洗浄した。５０μＬのブロック緩衝液をウェルに添加し、プレートを穏やかに攪拌しながら１〜３時間インキュベートし（室温）、洗浄緩衝液で３回洗浄した。標準ストック（Ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｔｏｃｋ）（Ｃ３ｂ，Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．；Ｃａｔ．Ａ１１４、１００×で、−２０℃で保存した）を、マジック緩衝液（Ｍａｇｉｃ Ｂｕｆｆｅｒ）（１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．５％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０、０．２％のＢｇＧ、１５ＰＰＭのＰｒｏｃｌｉｎ（Ｍｅｄｉａ Ｐｒｅｐ；Ｃａｔ．Ａ３３８１））＋０．３５ＭのＮａＣｌ中に調製した。マジック緩衝液＋０．３５ＭのＮａＣｌはまた、分析用の試料の調製にも使用した。２５μｌの標準物／試料を指定したウェルに添加した。試料を室温で約２時間（＋／−０．５時間）、穏やかに攪拌しながらインキュベートし、洗浄緩衝液で３回洗浄した。プレートを１８０℃に変化させ、洗浄工程を繰り返した。検出抗体（ペルオキシダーゼ結合ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＣ３（Ｐｒｏｔｏｓ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｃａｔ．７６５）を、アッセイ希釈液（Ａｓｓａｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ）中に１：７Ｋ稀釈し、穏やかに攪拌しながら室温で１〜２時間、プレート上でインキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、洗浄工程を繰り返しながら１８０℃に変化させた。５０／５０ ＴＭＢ溶液を作製した。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。プレートを１８０℃に変化させ、洗浄工程を繰り返した。２５μＬのＴＭＢをウェルに添加した。色を室温で発色させた。発色時間：両方のプレートについて１０分間。発色は、２５μＬの１．０Ｍのリン酸をウェルに添加することによって停止させた。プレートのＯＤ読み取り値を得た（４５０／６３０ｎｍ）。結果を、図８、パネルＡに示す。
Ｃ３の検出のためのポジティブ対照として使用したＣ３は全て、ヒトＣ３に対するヤギＩｇＧ画分（Ｃａｐｐｅｌ ５５０３３）を捕捉抗体として使用したことを除き、Ｓ７７の特異性を試験するために使用した上記に記載したＣ３ｂ ＥＬＩＳＡアッセイと同様に行った。結果を図８、パネルＢに示す。
図８に示すように、Ｓ７７はＣ３ｂを認識するが、プロ分子Ｃ３は認識しない。
（実施例４）
Ｃ３ｂ抗体は第二補体経路を特異的に阻害する
溶血アッセイ−第２経路の活性を決定するために、ウサギの成熟赤血球（Ｅｒ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｅｒｕｍ）をＧＶＢ中で３回洗浄し、２×１０９／ｍｌになるように再懸濁した。阻害剤（５０μｌ）と２０μｌのＥｒ懸濁液を、ＧＶＢ／０．１ＭのＥＧＴＡ／０．１ＭのＭｇＣｌ２と１：１で混合した。補体活性化を、Ｃ１ｑを枯渇させたヒト血清（Ｑｕｉｄｅｌ；ＧＶＢ中に１：３に稀釈した３０ｕｌ）の添加によって開始させた。室温で３０分間のインキュベーションの後、２００μｌのＧＶＢ／１０ｍＭのＥＤＴＡを添加して反応を停止させ、試料を５００ｇで５分間遠心分離した。溶血を、４１２ｎｍで吸光度を測定することによって２００μｌの上清中で決定した。データは、阻害剤が存在しない条件で誘導された溶血に対する割合として表した。補体の古典経路に対するＣＲＩｇの影響を決定するために、ＥｒをＩｇＭをコーティングしたヒツジ成熟赤血球（Ｅ−ＩｇＭ，ＣｏｍｐＴｅｃｈ）に置き換え、アッセイを、ＧＶＢ＋＋中のＢ因子欠損ヒト血清中で行ったことを除いて、同様の手順にしたがった。
図９および１０に示すように、親和性成熟させたＣ３ｂ抗体Ｓ７７は、第二補体経路を特異的に阻害し、古典経路は阻害しない。
（実施例５）
Ｃ３ｂ抗体はＣ５転換酵素に対するＣ５の結合を阻害する。
Ｃ５競合アッセイ−Ｃ３ｂをＰＢＳ中の３μｇ／ｍｌのＣ３ｂとともに、４℃で一晩のインキュベーションによってマイクロタイター上にコーティングした。プレートを、ＰＢＳ中の１％のＢＳＡでブロックし、２０ｍＭのＴｒｉｓ／２０ｍＭのＣａ／２０ｍＭのＭｇ／１５０ｍＭのＮａＣｌ／０．０５％のＴｗｅｅｎ／１％のＢＳＡ中の０．４ｕＭのＣ５と混合した漸増濃度の抗体とともにインキュベートした。Ｃ５結合を、抗ヒトＣ５抗体（クローン７Ｄ１２，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）との、室温で３０分間、続いて、１：５０００のロバ抗マウスＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ）とのインキュベーションによって検出した。
図１１および１２に示すように、親和性成熟させたＣ３ｂ抗体Ｓ７７は、Ｃ５転換酵素を阻害する。
（実施例６）
Ｃ３ｂ抗体は崩壊活性を示さない
崩壊加速活性−マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中の３μｇ／ｍｌのＣ３ｂで一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．１％−Ｔｗｅｅｎ）中で２回洗浄し、４％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで、３７℃で２時間ブロックした。プレートを、４００ｎｇ／ｍｌのＢ因子、２５ｎｇ／ｍｌのＤ因子、および２ｍＭのＮｉＣｌ２、２５ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０、および４％のＢＳＡを含むベロナール緩衝液中で、室温で２時間インキュベートし、続いて、ＰＢＳＴ中のＨ因子またはＳ７７とともに１５分間インキュベートした。Ｂｂ因子を、ＰＢＳＴ中のヤギ抗ヒトＢ因子ポリクローナル抗体の１：５，０００希釈物（Ｋｅｎｔ）と、ＰＢＳＴ中のＨＲＰＯに結合させたロバ抗ヤギ抗体の１：５，０００希釈物（Ｃａｌｔａｇ）とともに、連続して１時間インキュベーションして検出した。色をＴＭＢ（ＫＰＬ）を用いて発色させ、２ＮのＨ２ＳＯ４中で停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。Ｃ３ｂのＩ因子に媒介される切断についての補因子活性を、０．８μＭのＣ３ｂと８０ｎＭのＩ因子を、８０ｎＭのＨ因子または様々な濃度のＳ７７とともに、３０ｍｌのＧＶＢ中でインキュベーションすることによって測定した。混合物を３７℃で６０分間インキュベートし、試料を、Ｃ３転換酵素アッセイについて記載したようにゲル電気泳動によって分析した。
図１３に示すように、Ｓ７７は、崩壊加速活性を示さない。
（実施例７）
Ｃ７７はＣ３ｂに対するプロＢ因子の結合とＣ３ｂＢｂ転換酵素の形成を阻害する
プロトコール
ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを、ＰＢＳ中の３μｇ／ｍｌのＣ３ｂ（ＰＵＲ１３４２０）（２０μｌ／ウェル）で、室温で４時間コーティングした。洗浄は、１００μｌのＰＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）（ＢｉｏＴｅｋ ＥＬ４０５洗浄液）を用いて６回行った。プレートを、４％のＢＳＡ／０．０５％のＴｗｅｅｎ／ＰＢＳで、室温で２時間ブロックし、その後、シンクにブロックを沈めた。２０μｌのＡＰ転換酵素緩衝液を室温で２時間かけて添加し、その後、６×ＰＢＳＴで洗浄した。２０μｌのＡｂｓを室温で４５分間かけて添加し、ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄した。Ｂ／Ｂｂ因子の検出のために、ウェルを、１：７０００のヤギ抗ｆＢ（Ｋｅｎｔ Ｌａｂｓ）とともに室温で３０分間インキュベートした。Ｓ７７およびＣＲ１の検出のために、ＰＢＳＴをウェルに添加し、これをその後、ＰＢＳＴで６回洗浄し、ＰＢＳＴ＋＋中の１：７，０００のロバ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰＯ（Ｊａｃｋｓｏｎ）とともに３０分間インキュベートした。ＰＢＳＴ＋＋中の１：１００の抗６×−Ｈｉｓ（配列番号１９）（Ｒ＆Ｄ）との室温で３０分間のインキュベーションに続き、ＰＢＳＴで６回洗浄した。発色を、２０μｌのＴＭＢ基質を用いて行い、反応を１０μｌの２Ｎの硫酸を用いて停止させた。プレートを４５０ｎｍで読み取った。
「ＡＰ転換酵素緩衝液」：４％のＢＳＡ、０．１％のＴｗｅｅｎ ２０、２ｍＭのＮｉＣｌ２、２５ｍＭのＮａＣｌ、２５ｎｇ／ｍｌのＤ因子、４００ｎｇ／ｍｌのＢ因子（ＣｏｍｐＴｅｃｈ）。
上記プロトコールに続いて、Ｃ３ｂをマイクロタイタープレート上にコーティングした。Ｓ７７、対照Ｆａｂ、またはＣＲ１断片（ＬＨＲＡ−Ｃ）を、Ｂ因子の添加後１時間で添加した。Ｃ３ｂに対するＢ因子の結合を、ＨＲＰＯ結合二次抗体を用いて検出し、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。結果を図１４、パネルＡに示す。
同様に、上記プロトコールにしたがって、Ｃ３ｂをマイクロタイタープレート上にコーティングし、続いてＳ７７、対照Ｆａｂ、またはＣＲ１断片（ＬＨＲＡ−Ｃ）を添加した。Ｃ３転換酵素を、Ｄ因子およびＢ因子の添加によって作製させた。転換酵素の形成は、Ｂｂ因子を認識する一次抗体と、二次ＨＲＰＯ結合抗体を使用して決定した。色をＴＭＢ（ＫＰＬ）で発色させ、２ＮのＨ２ＳＯ４中で停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。結果を図１４、パネルＢに示す。
図１４に示すように、抗体Ｓ７７は、Ｃ３Ｂに対するプロＢ因子の結合を阻害し、Ｃ３ｂＢｂ転換酵素の形成を阻害する。
（実施例８）
Ｓ７７は、結合したｆＢｂの存在下ではＣ３ｂに結合し、Ｃ３転換酵素を崩壊させない
実施例７に記載したプロトコールを使用して、Ｃ３ｂをマイクロタイタープレート上にコーティングした。Ｃ３転換酵素を、Ｄ因子とＢ因子の添加によって作製させた。Ｓ７７、対照Ｆａｂ、またはＣＲ１断片（ＬＨＲＡ−Ｃ）をプレートに添加し、これらの分子の結合を、ＨＰＲＯに結合させた二次抗体を用いて決定した。結果を、図１５、パネルＡに示す。
同様に、実施例７に記載したプロトコールにしたがって、マイクロタイタープレートを３μｇ／ｍｌのＣ３ｂでコーティングした。プレートをＢ因子およびＤ因子とともにインキュベートし、続いて、ＣＲ１（ＬＨＲＡ−Ｃ）、Ｓ７７、または対照Ｆａｂとともにインキュベートした。Ｂｂ因子を、ヤギ抗ヒトＢ因子と、ＨＲＰＯに結合させたロバ抗ヤギ抗体で検出した。色をＴＭＢ（ＫＰＬ）を用いて発色させ、２ＮのＨ２ＳＯ４中で停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。結果を、図１５、パネルＢに示す。
図１５に示した結果は、Ｓ７７は、結合したｆＢｂの存在下でＣ３ｂに結合することができ、Ｃ３転換酵素を崩壊させないことを示している。
（実施例９）
Ｓ７７はＣ３ｂに対するＨ因子の結合を阻害し、Ｈ因子の補因子活性を阻害する。
プロトコール１（図１５、パネルＡ）−ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを、ＰＢＳ中の３μｇ／ｍｌのＣ３ｂ（ＰＵＲ１３４２０）（２０μｌ／ｗｅｌｌ）で、室温で３時間コーティングした。プレートを１００μｌのＰＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）（ＢｉｏＴｅｋ ＥＬ４０５洗浄液）で６回洗浄し、４％のＢＳＡ／０．０５％のＴｗｅｅｎ／ＰＢＳで、室温で２時間ブロックした。プレートを、震盪させながらブロッキングＡｂｓ（２０μｌ）とともに、室温で３０分間インキュベートし、続いて、０．３３μＭのｆＨ（ＣｏｍｐＴｅｃｈ）とともに室温で１時間のインキュベーション、１０μｌの１μＭのｆＨの添加を行った。プレートをプレート洗浄装置（ＢｉｏＴｅｋ ＥＬ４０５）中で、ＰＢＳＴで６回洗浄し、１：７０００のロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰＯ（Ｊａｃｋｓｏｎ）とともに３０分間インキュベートし、プレート洗浄装置（ＢｉｏＴｅｋ ＥＬ４０５）中で、ＰＢＳＴで６回洗浄した。発色を、２０μｌのＴＭＢ基質を用いて行った。反応を１０μｌの２Ｎの硫酸で停止させ、プレートを４５０ｎｍで読み取った。
プロトコール２（図１５、パネルＢ）−全ての稀釈はＧＶＢ＋＋（１ｍＭのＭｇＣｌ、０．１５ｍＭのＣａＣｌ）中で行った。エッペンドルフチューブに、１０μｌの１．６ｕＭのＣ３ｂ（最終０．４ｕＭのＣ３ｂ）を添加した。１０μｌの抗Ｃ３ｂ Ｆａｂ、対照Ｆａｂ、またはＣＲ１を添加した。室温で２０分間インキュベートした。１０μｌの０．０８ｕＭのｆｌを添加した（最終的には２０ｎＭのｆｌ）。３７℃で６０分間インキュベートした。４０μｌのＬａｅｍｍｅｌｉ’ｓ緩衝液＋２−ｂＭＥを添加し、３分間沸騰させた。８％のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎゲル上で、２５μｌ／ウェル、１２５ｍＶで１．５時間泳動した。ゲルを５分間を３回、Ｈ２Ｏで洗浄した。室温で揺らしながら、Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で６０分間染色した。５分間を３回、ｄｄＨ２Ｏで洗浄した。プラスチックで蓋をした震盪装置上の大きな耐熱皿の中で、ｄｄＨ２Ｏで一晩洗浄した。試薬：Ｃ３ｂ ＰＵＲ１３２４０、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるｆｌ、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるｆＨ、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒによるＧＶＢ＋＋。
上記のように、プレートをＣ３ｂでコーティングした。Ｈ因子を、漸増濃度の対象ＦａｂまたはＳ７７の存在下で添加した。Ｃ３ｂに対するＨ因子の結合を、抗Ｈ因子抗体と、二次ＨＲＰＯ結合抗マウス抗体を使用して決定した。色をＴＭＢ（ＫＰＬ）を用いて発色させ、２ＮのＨ２ＳＯ４中で停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。結果を、図１６、パネルＡに示す。
Ｉ因子に媒介されるＣ３ｂの切断についての補因子活性を、０．８μＭのＣ３ｂおよび８０ｎＭのＩ因子を、８０ｎＭのＨ因子または様々な濃度のＳ７７とともに、３０ｍｌのＧＶＢ中でインキュベーションすることによって測定した。混合物を３７℃で６０分間インキュベートし、試料を、Ｃ３転換酵素アッセイについて記載したように、ゲル電気泳動によって分析した。結果を、図１６、パネルＢに示す。
図１６に示すように、抗体Ｓ７７は、Ｃ３ｂに対するＨ因子の結合を阻害し、Ｈ因子の補因子活性もまた阻害する。
（実施例１０）
Ｓ７７はＣ３ｂに対するＣＲ１の結合を阻害する
プロトコール−ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを、ＰＢＳ中の３μｇ／ｍｌのＣ３ｂ（ＰＵＲ１３４２０）で、４℃で一晩コーティングした（１００μｌ／ウェル）。１００μｌのＰＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）（ＢｉｏＴｅｋ ＥＬ４０５洗浄液）で３回洗浄した。４％のＢＳＡ／０．１％のＴｗｅｅｎ／ＰＢＳで、室温で２時間ブロックした。震盪させながらブロッキングＡｂｓ（２０μｌ）とともに、室温で３０分間インキュベートした。５０ｎＭのＣＲ１ ＬＨＲ−ＡＣとともに、室温で１時間インキュベートした。プレート洗浄装置（ＢｉｏＴｅｋ ＥＬ４０５）の中で、ＰＢＳＴで３回洗浄した。ＰＢＳＴ中の１：１０のｍｌｇＧ１抗ｈＣＤ３５−ＦＩＴＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とともに、室温で４５分間インキュベートした。プレート洗浄装置（ＢｉｏＴｅｋ ＥＬ４０５）の中でＰＢＳＴで３回洗浄した。１：７０００のロバ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰＯ（Ｊａｃｋｓｏｎ）とともに３０分間インキュベートした。プレート洗浄装置（ＢｉｏＴｅｋ ＥＬ４０５）の中でＰＢＳＴで６回洗浄した。２０μｌのＴＭＢ基質を用いて発色させた。反応を１０μｌの２Ｎの硫酸で停止させた。４５０ｎｍでプレートを読み取った。
図１７に示すように、抗体Ｓ７７は、Ｃ３ｂに対するＣＲ１の結合を阻害する。
（実施例１１）
結晶化とデータの洗練
Ｈａｎｇｉｎｇ−ｄｒｏｐ実験を、蒸気拡散法を使用して、１：１の比のタンパク質溶液とレザーバー溶液からなる２μｌの液滴を用いて行った。タンパク質溶液には、２５ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）中にＣ３ｂ：Ｓ７７１４複合体が、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で含まれており、レザーバーには、１０％のＰＥＧ４０００、０．２ＭのＭｇＣｌ２が０．１ＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．２）中に含まれている。結晶は２週間後に現れた。結晶を、２０％のグリセロールを補充したレザーバー溶液中でインキュベートし、その後、瞬間凍結させた。データを、単一の凍結した結晶から、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）のビームライン５．０．１で収集し、プログラムＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫを使用して処理した。結晶は、ａ＝２１６．４Å、ｂ＝１８０．４Å、ｃ＝１５４．６Å、およびβ＝１１５．７３Åのセルパラメーターを持つ空間群Ｃ２に属し、それぞれが非対称単位の中の１つのＦａｂ分子に結合させられた１つのＣ３ｂ分子からなる２つのｃｏｍｐｌｅｘｅｓを持つ。この構造を、プログラムＰｈａｓｅｒと、Ｃ３ｂ、定常ドメイン、およびＦａｂ断片の可変ドメインの座標を使用して分子置換によって解析した。モデルは、プログラムＯを使用して手作業で調整し、洗練を、プログラムＲＥＦＭＡＣを用いて、詰まった２倍非結晶性対称拘束（ｔｉｇｈｔ ２−ｆｏｌｄ ｎｏｎ−ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｙｍｍｅｔｒｙ ｒｅｓｔｒａｉｎｔｓ）を使用して行った。洗練されたモデルのＲおよびＲｆｒｅｅは、それぞれ、２２．５％および２９．０％であった。
抗体Ｓ７７との複合体におけるＣ３ｂの結晶構造を図３に示す。図４Ｉａは、Ｃ３ｂとの抗体Ｓ７７の結合相互作用の接近図である。結晶データを利用して、Ｃ３ｂと密接に接しているＣ７７ Ｆａｂ重鎖配列中の残基を赤色で示す。
加えて、補足図１には、Ｓ７７と接しているＣ３ｂ上の残基を列挙する。補足図２には、Ｃ３ｂと接触しているＦａｂ Ｓ７７残基を列挙する。
標的化Ｃ３ｂ（補体活性化の中心的成分）は、Ｃ３転換酵素とＣ５転換酵素の両方のレベルで補体カスケードを阻害するための強力なアプローチを提供する。上記実施例に記載した研究においては、ファージ技術を使用して、Ｃ３ｂを選択的に認識し、そのプロ分子であるＣ３は認識しない抗体を作製した。特異的抗体（Ｓ７７）のＦａｂ断片との複合体におけるＣ３ｂの結晶構造は、この抗体がＣ３のＣ３ｂへの切断後に露出させられたＭＧ７ドメイン上のエピトープを認識することを示している。Ｓ７７はＢ因子およびＣ５のＣ３ｂに対する結合をブロックし、それにより、補体の古典経路ではなく第２経路の、Ｃ３転換酵素およびＣ５転換酵素の強力な阻害を生じる。加えて、Ｓ７７はｆＨ結合と補因子活性、ならびに、Ｃ３ｂに対するＣＲ１の結合を阻害し、このことは、Ｓ７７のＣ３ｂ ＭＧ７ドメインに対する結合部位が、補体活性化の調節のホットスポットであることを示している。まとめると、本研究の結果は、第２経路のＣ３転換酵素およびＣ５転換酵素のレベルでの補体活性化および阻害についての分子機構を説明しており、治療可能性が期待される選択的抗体を作製するための、ファージディスプレイおよび他のディスプレイ技術の有用性を明らかにしている。
上記の説明は、当業者が本発明を実施できるように十分であるとみなされる。本明細書中に示され、記載されたものに加えて、本発明の様々な改変が、上記の記載から当業者には明らかであり、添付の特許請求の範囲に含まれる。

Claims (1)

  1. 明細書に記載の発明。
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