DE68925971T2

DE68925971T2 - Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte

Info

Publication number: DE68925971T2
Application number: DE68925971T
Authority: DE
Inventors: William Howarth; Duane Inlow; Brian Maiorella
Original assignee: Cetus Oncology Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1988-09-23
Filing date: 1989-09-13
Publication date: 1996-09-05
Anticipated expiration: 2009-09-14
Also published as: EP0435911B1; AU632065B2; JP2783294B2; AU4310189A; ATE135397T1; EP0435911A1; WO1990003430A1; DE68925971D1; JPH04501660A

Description

Diese Erfindung betrifft das allgemeine Feld der Tierzellkultur. Insbesondere betrifft die Erfindung verbesserte Medien zum Anziehen von Tierzellen und die Herstellung von natürlichen und davon abgeleiteten rekombinanten Produkten.
Bis heute wurden Anstrengungen unternommen, um Kulturbedingungen für die Maximierung des Zellkulturwachstums zu entwickeln und um auf diese Weise die resultierende Produktausbeute zu erhöhen. Frühe Arbeiten bei der Entwicklung von Tierzellkulturmedien waren auf die Formulierung solcher Medien zur Erzielung einer schnellen Zellvermehrung gerichtet (White P.R. Growth 10 (1946), 231-289, und Waymouth C., J. Natl. Cancer Inst. 53 (1974), 1443-1448). Solche Medien umfassen spezifische Nahrstoffe, insbesondere Zucker, Aminosäuren, Vitamine, Salze und in einigen Fällen Spurenmetallionen, Purine und Pyrimidine. Diese Medien werden meistens mit Tierserum ergänzt. Heute umfassen einige der am häufigsten verwendeten Basalmedien für Säugerzellkulturen Hams-F12, Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DME), RPMI-1640 und Iscove's modifiziertes DME.
Die Herstellung menschlicher monodonaler Antikörper unter Verwendung von Hybridomzellinien wird in dieser Anmeldung als Beispiel für die Expression von Produkten in der Zellkultur verwendet.
Es wurden bereits Kulturmedien beschrieben, welche speziell für serumarme und serumfreie Säugerzellkulturen zur Produktion von monodonalen Antikörpern entwickelt wurden. Ein solches serumfreies Medium wird offenbart in der Europäischen Patentveröffentlichung 076,647, veröffentlicht am 13. April 1983. Andere Medien wurden durch die Veränderung der Beträge von Zusätzen, wie Spurenelemente und Vitamine, und die Beimischung von gereinigten Proteinhormonzusätzen entwickelt. Literaturstellen für solche Medien umfassen zum Beispiel Bames D. et al., Cell 22 (1980), 649-655; Cleveland W.L. et al., J. Immunol. Meth. 56 (1983), 221-234; Iscove N. et al., J. Exp. Med. 147 (1978), 923- 933; Kawamoto T. et al., Analytical Biochemistry 130 (1983), 445-453; Kovar J. et al., Immunology Letters 7 (1984), 339-345; Murakami H. et al., Agric. Biol. Chem. 47(8) (1983), 1835-1840; Murakami H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 29 (1982), 1158-1162; Muzik H. et al., In Vitro 18 (1982), 515-524; und Wolpe S.D., "In Vitro Immunization and Growth of Hybridomas in Serum-Free Medium" in Mather J.P., Hrsg., Mammalian Ceil Culture, Plenum Press, New York (1984); Hagiwara H. et al. (1985), 117-122, in Murakami H. et al. (Hrsg.), Growth and Differentiation of Cells in Defined Environment (1985), Springer-Verlag, Berlin; Tharakan J.P. et al., J. Immunol. Meth. 94 (1986), 225-235; Cole S.P.C., J. Immunol. Meth. 97 (1987), 29-35; und McHugh Y.E., Biotechniques, Juni/Juli-Ausgabe 1983, 72-77. Komponenten, die für die meisten, wenn auch nicht für alle, dieser Medien üblich sind, umfassen Glucose in Konzentrationen von bis zu 4,5 g/l, Glutamin in Konzentrationen von 2-4 mM, Cholin im allgemeinen in einer Menge von etwa 1-4 mg/l sowie Tryptophan und andere Aminosäuren. Tryptophan liegt im allgemeinen in Konzentrationen von weniger als 20 mg/l vor. Mehrere dieser Medien enthalten auch die Wachstumsfaktoren Insulin und Transferrin.
Anstrengungen zur Steigerung der Antikörperausbeute waren hauptsächlich auf Mittel zur Optimierung des Zellwachstums und der Zelldichte gerichtet. Beispielsweise variieren Antikörpertiter von Maushybridomzellinien von Zellinie zu Zellinie sehr und liegen üblicherweise im Bereich von 10 bis 350 mg/l (Lambert K.J. et al., Dev. Indust. Microbiol. 27 (1987), 101 - 106). Die Expression menschlicher monodonaler Antikörper von Mensch- Mensch- und Mensch/Maus-Fusionszellen variiert ebenfalls sehr von Zellinie zu Zellinie und liegt üblicherweise im Bereich von 0,1 bis 25 mg/l (Hubbard R., Topics in Enzyme and Fermentation Biotechnology, Kapitel 7 (1983), 196-263; Wisemand A., Hrsg., John Wiley & Sons, New York). Diese Werte deuten auf Kulturbedingungen hin, die für das Zellwachstum optimiert wurden.
Ein anderer Versuch aus der Literatur zur Erhöhung der Produkterzeugung ist das Erzielen von hohen Zelldichten durch Zellwiederverwertungs- oder Einfangverfahren. Beispiele dieser Verfahren umfassen Hohlfaser-Reaktoren (Altshuler G.L. et al., Biotech. Bioeng. XXYIII (1986), 646-658; Keramikmatrix-Reaktoren (Marcipar A. et al., Annals. N.Y. Acad. Sci. 413 (1983), 416-420; Nature 302, 629-630); Perfusionsreaktoren (Feder J. et al., American Biotech. Laboratory III (1985), 24-36), und andere.
Während eine Vielzahl von Verfahren zur Erhöhung der Expression von Produkten aus der Zellkultur untersucht werden, steht hauptsächlich die Optimierung des Zellwachstums im Mittelpunkt. In üblichen Kulturmedien stirbt die Kultur nach dem Erreichen der maximalen Zelldichte rasch ab.
Ein anderes Beispiel aus der Literatur zeigt, daß die Herstellung des Produkts (monodonaler Antikörper), zumindest bei einigen Zellinien, weiter voranschreitet, auch wenn eine Kultur das Wachstum einstellt (Velez D. et al., J. Immunol. Meth. 86 (1986), 45- 52; Reuveny S. et al., ibid. (1986), 53-59). Arathoon W. et al., Science 232 (1986), 1390- 1395, berichten, daß ein 1000 Liter-Hybridom-Fermentationsansatz etwa 80 g eines monodonalen Antikörpers während der Wachstumsphase und weitere 170 g Antikörper während einer längeren stationären/Absterbe-Phase produziert. Birch J. et al. (Europäische Patentanmeldung Nr.87/00195, 1987) beschreiben ein Verfahren der Fed-Batchkultur, bei dem die Nährstoffe mit der Zeit zugegeben werden und die Langlebigkeit der Kultur erhöht wird. Auf diese Weise werden die Antikörper-Endtiter aus der Kultur erhöht.
Folglich erkennt man, daß ein entscheidender Bedarf für Medien besteht, die das Wachstum von Tierzellen fördern und die Erzeugung von Produkten, einschließlich Antikörper, und anderen natürlichen oder rekombinanten Proteinprodukten stimulieren, um höhere Ausbeuten zu erhalten, als mit den gegenwärtig verfügbaren Medien erzielt werden können.
Demgemäß beschreibt die hier vorliegende Erfindung einen proteinfreien Zusatz ("primärer Zusatz"), der bei Zugabe zu Standardzellkulturmedien das Zellwachstum, die Langlebigkeit der Kultur und die Expression der Produkte erhöht. Beispiele werden angeführt, welche zeigen, daß dieser Zusatz besonders bei der Produktion von Antikörpern unter Verwendung von Hybridomzellinien in einer serumfreien Kultur wirksam ist, wobei der Antikörper-Endtiter in einem Beispiel von 80 mg/l auf über 250 mg/l erhöht wird. Der primäre Zusatz ist eine bisher unbekannte zusammenwirkende Kombination von Standardmediumkomponenten, die bei Zugabe in der vorgeschriebenen Kombination vorteilhaft sind und 1) Glutamin, 2) Phospholipidvorläufer, umfassend zumindest Cholin und Ethanolamin, 3) Tryptophan und 4) für eine bestimmte Zellinie und ein herzustellendes Produkt erforderliche zusätzliche Aminosäuren umfassen. Einzeln zu Standardmedien zugefügt, zeigen diese Komponenten nur eine geringe Wirkung, jedoch sind sie besonders wirksam, wenn sie gemeinsam in der vorgeschriebenen Kombination zugegeben werden, und das Auslassen einer beliebigen der vorgeschriebenen Komponenten vermindert die gewünschte Wirkung. Mehrere der Komponenten im primären Zusatz werden in Konzentrationen zugegeben, die man bisher als unnötig oder hemmend ansah. Bei der gemeinsamen Zugabe in der vorgeschriebenen Kombination steigert der Zusatz das Zellwachstum, erhöht die Langlebigkeit der Kultur durch Halten der Zellen in einer pseudostationären Phase, wobei die Expression der Produkte aufrechterhalten wird, und erhöht so den Produkt-Endtiter erheblich.
Ein zweiter Gesichtspunkt der Erfindung ist eine Beschreibung mehrerer Zusatzkomponenten (die "Klasse I-Reagentien"), die, einzeln oder in verschiedenen Kombinationen zu dem primären Zusatz zugefügt, eine weitere Verbesserung des Kulturwachstums und/oder der Produktexpression zur Folge haben. In dieser Klasse von zusätzlichen Komponenten sind Reduktionsmittel, Spurenmetallionen und/oder Vitamine eingeschlossen.
Ein dritter erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft die Formulierung von serumfreien und serumergänzten Medien, die den Zusatz enthalten, sowie mit Lipiden ergänzte Medien, die bei der Zugabe von Mitteln zur Induktion von Streß aufgrund gelöster Stoffe verwendet werden können.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist ein Verfahren zum Anziehen von Zellen unter Verwendung der hier beschriebenen Mediumzusätze, so daß sie im Medium zu Beginn der Kultur eingeschlossen oder in einer Fed-Batch- oder einer kontinuierlichen Weise zugegeben werden können. Die erhaltenen Medien können bei verschiedenen Züchtungsverfahren angewendet werden, umfassend, aber nicht begrenzt auf Batch-, Fed-Batch-, Hemostat- und Perfusionsverfahren, und zusammen mit unterschiedlicher Zellkulturausrüstung, umfassend, aber nicht begrenzt auffeststehende Kolben, Schüttelkolben, Spinnerkolben, Rührfermenter, Airliftfermenter, Membranreaktoren (umfassend Hohlfaser, Flachmembranplatte, Außenschlaufenperfüsion), Reaktoren, wobei die Zellen auf einem festen Träger in einer immobilisierten/eingefangener Form gehalten werden, wie auf mikroporösen Kügelchen, und jede andere für das Wachstum oder die Aufrechterhaltung der gewünschten Zellinie geeignete Anordnung.
Figur 1 zeigt die Wachstumseigenschafien und die Antikörpermengen, die von D234 in dem üblichen im Handel erhältlichen Medium Ventrex HL- 1 hergestellt wurden.
Figur 2 zeigt die Wachstumseigenschaften und die Antikörpermengen, die von D234 in einer serumfreien Standardmediumzusammensetzung hergestellt wurden, welche für die in der Zellkulturliteratur beschriebenen Zusammensetzungen repräsentativ ist.
Figur 3 zeigt die Wachstumseigenschaften und die Antikörpermengen, die von D234 in mit Reagentien des primären Zusatzes ergänzten Medien hergestellt wurden.
Figur 4 zeigt die Wachstumseigenschaften und die Antikörpermengen, die von D234 in mit Reagentien des primären Zusatzes und einem Klasse I-Reagens ergänzten Medien hergestellt wurden.
Figur 5 zeigt die Wachstumseigenschaften und die Antikörpermengen, die von D234 in mit Reagentien des primären und des Klasse I-Zusatzes ergänzten Medien und in Verbindung mit einem Lipid-Zusatz hergestellt wurden.
Figur 6 zeigt das Anziehen des Hybridoms D234 in einem Fed-Batch-Verfahren mit Medien, die mit Reagentien der primären und Klasse I-Zusätze und Lipiden ergänzt wurden.
Die folgende Bezugnahme bezieht sich auf die ganze Anmeldung und wird hier zur Verständnis des Lesers angeführt. Ian Freshney (Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (1987), Alan R. Liss, NY) führt tabellarisch Zusammensetzungen von üblichen Basalmedien für die Verwendung mit Serum (Tabelle 7.5: 74-75) und übliche serumfreie Mediumzusarnrn.ensetzungen (Tabelle 7.6: 76-78) auf, die in der Literatur zur Züchtung eines großen Bereichs von Tierzellen und der Expression von Produkten daraus beschrieben wurden. Diese Tabellen sind unter Bezugnahme eingeschlossen.
Die hier beschriebene Erfindung betrifft erstens einen proteinfreien Zusatz, der mit Standardkulturmedien zur Erhöhung des Zellwachstums, der Langlebigkeit der Kultur und der Expression der Produkte vereinbar ist. Der primäre Zusatz wird bevorzugt und weist Vorteile auf, die mindestens zum Teil von einer bisher unbekannten synergistischen Wechselwirkung der verwendeten Reagentien herrühren. Iscove (Iscove N.N., Culture of Lymphocytes and Hemopoietic Cells in Serum-Free Medium, in Methods for Serum-Free Culture of Neuronal and Lymphoid Cells, 169-185) beschreibt das Standardverfahren zur Optimierung von Zellkulturmedien, wobei "die Wirkung der individuellen Verdopplung und Vervierfachung der Konzentration einer jeden Komponente untersucht wurde..". Dieses Verfahren wurde häufig auf dem Gebiet der Zellkultur angewendet, jedoch wurde die Möglichkeit nicht erkannt, daß Komponenten synergistisch wirken können und daß es erforderlich sein kann, Zusätze mehrerer Komponenten zu kombinieren, um eine gewünschte Wirkung zu sehen.
Aus einer zweiten Gruppe von Zellkulturreagentien (die Klasse I-Reagentien) gewählte Komponenten können bei der Kombination mit dem primären Zusatz zusammenwirken, wobei ein vorteilhafter Zellkulturzusatz mit besonders vorteilhaften Wirkungen auf das Zellwachstum hergestellt wird, so daß hohe Dichten erzielt werden.
Vor der ausführlichen Beschreibung der Reagensklassen und der daraus formulierbaren Mediumzusätze vereinfacht eine kurze Definition einiger der während dieser Anmeldung verwendeten technischen Begriffe das Verständnis der Natur der Erfindung.

Definitionen

Der hier verwendete Begriff "Basalmedium" umfaßt ein Nährstoffgemisch aus anorganischen Salzen, Zuckern, Aminosäuren und gegebenenfalls Vitaminen, organischen Säuren und/oder Puffern oder anderen gut bekannten Zellkulturnährstoffen. Diese Reagentien sind zur Förderung des Zellwachstums und der Zellvermehrung erforderlich. Das bevorzugte Basalmedium, das eine Komponente der vorliegenden Zellkulturmediumzusammensetzungen ist, enthält weder Serum noch Proteine. Eine große Vielzahl von im Handel erhältlichen Basalmedien sind dem Fachmann bekannt und umfassen Dulbecco's modifiziertes Eagle- Medium (DMEM), Roswell Park Memorial Institute-Medium (RPMI), Iscove's modifiziertes Dulbecco-Medium und Hams-Medium.
Der Begriff "Hybridom" bezieht sich auf eine Hybridzellinie, welche durch die Fusion einer unsterblichen Zellinie immunologischer Herkunft und einer Antikörper-produzierenden Zelle hergestellt wurde. Der Begriff umfaßt Nachkommen von Heterohybrid- Myelomfusionszellen, die das Ergebnis einer Fusion von menschlichen Zellen und einer Maus-Myelomzellinie, gefolgt von einer Fusion mit einer Plasmazelle, sind, die auf dem Fachgebiet als Triomzellinie bezeichnet werden. Zusätzlich umfaßt der Begriff praktisch jede immortalisierte Zellinie, die Antikörper produziert, wie zum Beispiel Quadromen. Milstein C. et al., Nature 537 (1983), 3053. Außerdem können die Hybridzellinien praktisch von jeder beliebigen Art abstammen, einschließlich Mensch und Maus.
Der Begriff "Mikroemulsion" bezieht sich auf ein Lipidgemisch, das im wesentlichen ohne die Hilfe von proteinähnlichen Stoffen, wie jenen in Serum, insbesondere Serumalbumin, emulgiert wurde. Im allgemeinen werden die in der PCT-Anmeldung Nr. WO-89/01027, veröffentlicht am 9. Januar 1989, beschriebenen Emulgiermittel zur Herstellung der Mikroemulsion verwendet. Diese Patentanmeldung ist hier unter Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen. Im allgemeinen werden Pluronic -Polyole als Emulgiermittel bevorzugt.
Der hier verwendete Begriff "Streß aufgrund gelöster Stoffe" bezieht sich auf die Zugabe von gelösten Stoffen in solchen Konzentrationen, daß eine wachstumshemmende Wirkung oder eine verminderte Endzelldichte erzielt wird, d.h. eine Wachstumsrate oder eine maximale Zelldichte, die geringer ist, als jene, die für ein optimales Wachstum bestimmt wurde. Jedoch ist die Ausbeute des bei dieser verminderten Wachstumsrate exprimierten Produkts verhältnismäßig größer als die Expressionsmenge, die bei der optimalen Wachstumsrate wegen einer Erhöhung der spezifischen (pro Zelle) Produktexpressionsrate oder einer Erhöhung der Langlebigkeit der Kultur erzielt wird. Im allgemeinen werden die in der PCT Anmeldung Nr. WO-89/04867, veröffentlicht am 1. Juni 1989, beschriebenen gelösten Stoffe und Verfahren angewendet. Diese Anmeldung ist hier unter Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen.
Der Begriff "pseudostationäre Phase" bezieht sich auf einen Zeitraum des Kulturwachstums, der nach der exponentiellen Wachstumsphase eintritt und wobei sich die Raten des Zellwachstums und des Absterbens entsprechen, so daß sich die Konzentration der lebensfähigen Zellen mit der Zeit nur verhältnismäßig langsam verändert (verglichen mit der exponentiellen Wachstumsphase oder der Absterbephase).
Der Begriff "Zellwachstumshormone" oder "Wachstumsfaktoren" umfaßt eine große Anzahl von entweder natürlich vorkommenden oder gentechnisch hergestellten Molekülen sowie Fragmente, Derivate oder Modifikationen davon, die das Wachstum stimulieren oder die Aufrechterhaltung der Zellen in definierten Medien fördern. Beispiele der ersteren umfassen u.a. Transferrin und Insulin. Beispiele von Wachstumsfaktoren umfassen u.a. den Nerven-Wachstumsfaktor, epidermalen Wachstumsfaktor, Fibroblasten-Wachstumsfaktor und den Endothelialzellen-Wachstumsfaktor. Es ist wichtig anzumerken, daß unterschiedliche Tierzellinien in ihren Bedürfnissen für eines oder mehrere dieser Moleküle verschieden sein können und daß die optimalen Hormone oder Wachstumsfaktoren oder ein Gemisch derselben unter Verwendung von Standardzellkulturverfahren einfach bestimmt werden können.
Die vorliegende Erfindung präsentiert Zellkulturmediumzusätze, die mit den allgemeinen Wachstums- und Aufrechterhaltungserfordernissen von Tierzellen (besonders Säugerzellen) in vitro vereinbar sind und insbesondere die Expression von mit spezifischen Zelltypen assoziierten Differenzierungseigenschaften erhöhen oder fördern, zum Beispiel eine erhöhte Produktion von monodonalen Antikörpern durch Hybridomzellinien. So wird deutlich, daß die vorliegenden Zusätze weitverbreitete Anwendungen finden, im allgemeinen für die Routinekultur von Zellen nützlich sind, sowie in jenen Fällen verwendet werden, bei denen große Mengen eines natürlichen oder rekombinanten Zellprodukts erwünscht werden, das von Zellen in Kultur produziert wird.

Primärer Zusatz

Der erfindungsgemäße primäre Zusatz besteht aus einer Klasse von Reagentien, umfassend in Verbindung miteinander 1) Glutamin, 2) Phospholipidvorläufer, umfassend vorzugsweise Cholin und Ethanolamin, 3) Tryptophan und 4) für die einzelnen Zellinien erforderliche zusätzliche Aminosäuren.

a) Glutamin:

Im primären Zusatz ist Glutamin in einer Menge oberhalb von 5 mM und vorzugsweise in einer Menge von 8 bis 20 mM eingeschlossen. Es ist wichtig anzumerken, daß diese Konzentrationen erheblich oberhalb jenen liegen, die üblicherweise in Zellkulturmedien vorhanden sind.
Glutamin ist sowohl als Aminosäurebaustein für die Proteinsynthese als auch als primäre Energiequelle in der Zellkultur bekannt (McKeehan W.L., Glycolysis, Glutaminolyse and Cell Proliferation, Cell Biology Intro. Reports 6(7) (1982), 635-650; Reitzer L.J. et al., Evidence that Glutamin, Not Sugar, is the Major Energy Source for Cultured HeLa Cells, J. Biological Chemistry 254(B) (1979), 2669-2676; Zielke H.R. et al., Reciprocal Regulation of Glucose and Glutamine Utilization by Cultured Human Diploid Fibroblasts, J. Cell Physiol. 95, (1978), 41-48).
Die Bezugnahme auf die Zusammenfassung der tabellarisch aufgeführten üblichen Mediumzusammensetzungen bei Freshney zeigt, daß Glutamin üblicherweise in einer Konzentration von 2 oder 4 mM in mit Standardserum ergänzten und serumfreien Mediumformulierungen eingeschlossen ist. Im Gegensatz dazu enthalten die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, wie vorstehend erwähnt, erhöhte Mengen von Glutamin oberhalb von 5 mM und vorzugsweise etwa 8 bis 20 mM.
Sowohl der Glutamin-Metabolismus als auch der spontane Abbau von Glutamin (Trisch G.L. et al., Spontaneous Decomposition of Glutamine in Cell Culture Media, Experimental Cell Research 28 (1962), 360-364) führen zur Freisetzung von Ammoniumionen, was in der Literatur häufig als toxisch für entweder das Zellwachstum oder die Proteinproduktion beschrieben wird (Reuveny S. et al., Factors Affecting Cell Growth and Monoclonal Antibody Production in Stirred Reactors, J. Immunl. Methods 86 (1986), 53-59), und einige Forscher behaupteten, daß Glutamin bei der Zugabe in hohen Konzentrationen eine toxische Wirkung besitzt (indirekt durch eine erhöhte Produktion von Ammoniumionen). Einige Forscher befürworten die Verringerung der Konzentration des in der Kultur vorhandenen Glutamins durch die Anpassung der Kultur, so daß sie in Abwesenheit von Glutamin und mit Glutaminsäure als altemativem Substrat wächst (Griffiths J.B. et al., The Uptake of Amino Acids by Mouse Cells (Strn-LS) During Growth in Batch Culture and Hemostat Culture, The Influence of Cell Growth Rate, Proc. Roy. Soc. London 168 (1967), 421-438), oder durch die langsame Zugabe von Glutamin zu der Kultur im Laufe der Zeit, um eine verhältnismäßig konstante, niedrige Glutaminkonzentration aufrechtzuerhalten (Glacken M.W. et al., Reduction of Waste Product Excretion via Nutrient Control: Possible Strategies for Maximizing Product and Cell Yields on Serum in Cultures of Mammalian Cells, Biotechnol. Bioeng. 28 (1986), 1376-1389).
Auf der Grundlage der vorstehenden Diskussion erkennt man, daß das erfindungsgemäße Verfahren für Zellinien, die dem Wachstum mit Glutamat oder einem anderen Ersatz für Glutamin angepaßt wurden, weiterhin anwendbar ist, außer daß erhöhte Mengen von Glutamat oder eines anderen Ersatzstoffes anstelle von Glutamin im Zusatz verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind auch auf Zellinien anwendbar, die dem Wachstum bei niedrigen Konzentrationen von Glutamin angepaßt wurden, außer daß die erhöhte Glutaminmenge allmählich im Laufe der Zeit der Kultur zugegeben wird.
In letzter Zeit stellten einige Forscher fest, daß die Zugabe von zusätzlichem Glutamin in der Spätphase der Kultur die Langlebigkeit einiger Zellinien erhöhen kann (Reuveny S. et al., Factors Affecting Cell Growth and Monoclonal Antibody Production in Stirred Reactors, J. Immunol. Methods 86 (1986), 53-59).
Die hier genannten Erfinder stellten fest, daß zusätzliches Glutamin entweder zu Beginn der Kultur oder während dem Verlauf der Kultur zugegeben werden kann, wobei die Gesamtmenge des zugegebenen Glutamins etwa 5 bis 40 mMole und vorzugsweise etwa 8 bis 20 mMole pro Liter beträgt. Die hier genannten Erfinder nehmen an, daß Glutamin in der Spätphase der Kultur, in einer nachexponentiellen pseudostationären Wachstumsphase, eine Hauptenergiequelle für die Zellen sein kann (d.h. der Glutaminverbrauch hält an, während der Glucoseverbrauch sinken kann). Sie stellten auch fest, daß ein Glutaminzusatz erforderlich ist, der jedoch für das Erzielen der gewunschten Erhöhung der Langlebigkeit der Kultur nicht ausreichend ist. Zur Erzielung der optimalen Leistung muß Glutamin in Verbindung mit den anderen Reagentien des primären Zusatzes zugegeben werden.

b) Phospholipidvorläufer:

Der primäre Zusatz enthält auch Phospholipidvorläufer, die ausgewählt sind aus, aber nicht begrenzt auf Serin, Inosit, Cholin, Ethanolamin und Glycerin. Während diese Komponenten alle Phosphorlipidvorläufer sind, besitzen sie auch andere biochemische Funktionen, und diese Erfindung wird durch eine beliebige, vorgeschlagene Hypothese eines Wirkungsmechanismus nicht begrenzt.
Serin wird als eine essentielle Aminosäure angesehen und Inosit als essentielles Vitamin. Die meisten Zellkulturrnedien enthalten Serin und Inosit in hinreichenden Mengen entsprechend ihren Funktionen als Phospholipidvorläufer und anderen biochemischen Aufgaben.
Cholin ist als Vitamin in den meisten Medien in einer Menge von 1 bis 4 mg/l eingeschlossen. Jedoch wurde Cholin gelegentlich in höheren Konzentrationen verwendet. Zum Beispiel zum Anziehen von Zellen nicht-lymphoider Herkunft. Ham's (Ham R.G., Clonal Growth of Mammalian Cells in a Chemically Defined Synthetic Medium, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53 (1965), 288-293) umfaßt Cholin in einer Konzentration von 15 mg/l in einem serumfreien Medium für das donale Wachstum von Ovarzellen des Chinesischen Hamsters. Birch J. et al. (J. Cell Sci. 5 (1969), 135-142) schließen Cholin in einer Konzentration von 20 mg/l in einem Serum enthaltenden Medium zum Anziehen von Mausfibroblasten ein. Das Waymouth-Medium MB-752/1 (Waymouth C., Rapid Proliferation of Sublines of NCTC Clone 929 Mouse Cells in a Simple Chemically Defined Medium, J. Natl. Cancer Inst. 22 (1959), 1003-1017) zur Züchtung der L929-Mausfibroblasten-Bindegewebszellinie ist hinsichtlich der Einbeziehung von Cholin in einer Konzentration von 250 mg/l ungewöhnlich. Während Ham, Birch und Waymouth Medien zur Förderung des Zellwachstums entwickelten, untersuchten sie nicht die Herstellung von biologischen Produkten, die von in den Medien gezüchteten Zellen produziert werden. Die hier genannten Erfinder stellten fest, daß Zellen, vorzugsweise Antikörper sezemierende Zellen, in Medien mit einem Cholinzusatz bis zu einer Menge von mehr als etwa 4 mg/l und vorzugsweise bei etwa 4 bis 40 mg/l in Verbindung mit den anderen Reagentien des primären Zusatzes wachsen und maximale Antikörpermengen sezernieren. Bei diesen Konzentrationen ist Cholin nicht begrenzend und weist keine offensichtliche Toxizität auf.
Ethanolamin ist üblicherweise nicht in serumerganzten Medien eingeschlossen. Murakami (Murakami H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 29 (1982), 1158-1162) zeigt, daß Ethanolamin in einer Konzentration von 20 µM das Wachstum einer Maushybridomzellinie stimuliert. Tharakan et al., J. Immunol. Methods 94 (1986), 225-235; Cole et al., J. Immunol. Methods 97 (1987), 29-35; und Kovar et al., Immunol. Letters 2 (1984), 339-345, stellten ebenfalls fest, daß Ethanolamin das Wachstum von mehreren Maushybridomzellinien stimuliert. Keiner dieser Forscher kombinierte erhöhte Mengen von Ethanolamin mit erhöhten Mengen von Glutamin, Cholin, Tryptophan und anderen Aminosäuren, die, wie die hier genannten Erfinder feststellten, für die optimale Expression von Produkten erforderlich sind. Mehrere andere serumfreie Medien enthalten kein Ethanolamin (Chang T. et al., J. Immunol. Methods 39 (1980), 369-375) und eine Übersicht von Iscove (Iscove N.N., Culture of Lymphocytes and Hemopoietic Cells in Serum-Free Medium in Methods for Serum-Free Culture of Neuronal and Lymphoid Cell Lines (1984), 169-185, Alan R., Liss Inc., NY) weist Cholin und Inosit als essentiell aus, jedoch erwähnt nicht Ethanolamin. Die hier genannten Erfinder stellten fest, daß Ethanolamin bei der Zugabe bis zu einer Menge von etwa 1 bis 10 mg/l wirksam ist und bis zu einer Menge von mindestens 10 mg/l ohne offensichtliche Toxizität eingeschlossen werden kann.
Es ist selbstverständlich, daß Cholin und Ethanolamin in verschiedenen Formen bereitgestellt werden kann, umfassend Phosphocholin und Phosphoethanolamin oder Phosphatidylcholin und Phosphatidylethanolamin. Die relative Wirksamkeit dieser verschiedenen Formen ist abhängig von der Fähigkeit der spezifischen Zellinie die Komplex-Formen aufzunehmen (zu transportieren) und zu metabolisieren.
Die Ergänzung von Standardmedien mit Phospholipidvorläufem allein ist zur Erzielung der gewunschten maximalen Verlängerung der Kulturlanglebigkeit und der Produktherstellung nicht ausreichend. Vielmehr werden Phospholipidvorläufer beim Zusammenwirken mit den anderen Komponenten beschrieben.

c) Tryptophan:

Tryptophan ist als essentielle Aminosäure bekannt und ist in üblichen serumergänzten und serumfreien Medien in einer Menge von 2 bis 20 mg/l eingeschlossen, ausgenommen das Waymouth M8752/1-Medium für L929-Zellen, worin es in einer Menge von 40 mg/l vorhanden ist. Mehrere Forscher versuchten Medien durch den Zusatz von erhöhten Mengen einer jeden getrennt zugegebenen Aminosäure zu optimieren. Von diesen untersuchten sowohl Bams als auch Iscove (Iscove N.N., Culture of Lymphocytes and Hemopoietic Cells in Serum-Free Medium in Methods for Serum-Free Culture of Neuronal and Lymphoid Cells, 169-185) die Ergänzung von Medien mit einer jeden der Standardaminosäuren und keiner von ihnen stellte fest, daß die Zugabe von Tryptophan in einem höheren Betrag als den Standardmengen stimulierend ist. Die hier genannten Erfinder stellten fest, daß ein Tryptophan- Zusatz zur Erzielung der gewünschten Erhöhung der Langlebigkeit der Kultur und des Produkttiters wesentlich ist. Für eine optimale Wirkung wird Tryptophan in Mengen zugegeben, welche höher sind als jene, die üblicherweise in der Literatur gelehrt werden, oder in einer Menge von mehr als 20 mg/l, und kann bis zu mindestens 100 mg/l ohne toxische Wirkung zugegeben werden.
Die Ergänzung von Standardmedien mit Tryptophan allein ist zur Erzielung der gewünschten Wirkung nicht ausreichend. Vielmehr wirkt Tryptophan bei erhöhten Konzentrationen mit den anderen Komponenten des primären Zusatzes zusammen, wobei die gewünschte maximale Verlängerung des Wachstums und der Langlebigkeit der Kultur sowie der Produktherstellung erzielt wird.

d) Andere Aminosäuren:

Der empfohlene primäre Zusatz umfaßt auch eine Formulierung von Aminosäuren, von denen nachgewiesen wurde, daß sie für die Expression einer Produktform einer bestimmten Zellinie wünschenswert sind.
Aminosäuren sind die wesentlichen Bausteine für die Proteinsynthese. Die Ergänzung eines Mediums mit den vorstehend spezifizierten Komponenten stellt die Grundlage für eine Erhöhung der Langlebigkeit der Kultur und somit einen erheblich längeren Zeitraum für die Produktherstellung bereit. Unter diesen Bedingungen können Aminosäuren aufgebraucht werden, die zur Aufrechterhaltung der Zellen und der Produktsynthese erforderlich sind. Zur Maximierung des Produkt-Endtiters müssen die Mengen dieser Aminosäuren erhöht werden, damit sie nicht begrenzend werden. Die Aminosäureanalyse von verbrauchtem Medium mit Verfahren, die dem analytisch arbeitenden Chemiker bekannt sind (Speckman D.H. et al., Automatic Recording Apparatus for Use in the Chromatography of Amino Acids, Analytical Chemistry 30 (1958), 1190-1206), kann als Mittel zur Identifizierung jener Aminosäuren verwendet werden, die während der Züchtung verbraucht und ergänzt werden müssen.
Iscove (Iscove N.N., Culture of Lymphocytes and Hemopoietic Cells in Serum- Free Medium in Methods for Serum-Free Culture of Neuronal and Lymphoid Cells, 169-185) und andere untersuchten die Ergänzung von Medien mit einer jeden der Standardaminosäuren. Als typisches Beispiel in der Literatur stellte Iscove fest, daß die Zugabe von mehr als den Standardmengen aller getesteten Aminosäuren (ausgenommen Cystin) nicht stimulierend war.
Luan (Luan Y.T. et al., Strategies to Extend Longevity of Hybridomas in Culture and Promote Yield of Monoclonal Antibodies) beschreibt eine Fed-Batch-Strategie, umfassend die Zugabe eines Zusatzes mit Glutamin, essentiellen Aminosäuren (einschließlich Tryptophan), Vitaminen (einschließlich Cholin) und Serum zu verschiedenen Zeitpunkten wahrend der Züchtung einer Maushybridomzellinie. Das Medium, dem Zusätze zugefügt wurden, bestand aus mit foetalem Kälberserum angereichertes DMEM. Dieses Verfahren fülhte zu einer Erhöhung der Langlebigkeit der Kultur und einer Erhöhung des Antikörper- Endtiters. Birch (Birch J.R. et al., Animal Cell Culture, EPA-PCT/G886300383(1986)) beschreibt eine Fed-Batch-Kultur unter Zugabe eines Zusatzes mit Glucose, Glutamin, essentiellen und nicht-essentiellen Aminosäuren (einschließlich Tryptophan) während der Züchtung einer anderen Maushybridom-Zellinie. Bei dem Medium, dem die Zusätze zugefügt wurden, handelte es sich ebenfalls um mit foetalem Kälberserum angereichertes DMEM.
In Hinsicht auf Luan und Birch ist es wichtig anzumerken, daß keiner von ihnen Ethanolamin in ihren Medien einschloß, das, wie die hier genannten Erfinder feststellten, ein besonders bevorzugter Phospholipidvorläufer für das optimale Zellwachstum und die wirksame Produktherstellung ist. Während die hier genannten Erfinder feststellten, daß ihr Zusatz in einer Fed-Batch- oder einer kontinuierlichen Kultur wirksam verwendet werden kann, stellten sie außerdem fest (im Gegensatz zu Luan und Birch), daß die Einbeziehung des Zusatzes beim Beginn der Kultur ebenfalls wirksam ist (d.h. im Gegensatz zu Luan und Birch ist die Nährstoffzugabe während der Züchtung bei der Verwendung des erfindungsgemäßen Zusatzes nicht obligatorisch). Zusätzlich kann der Zusatz der Anmelder vorteilhafterweise zusammen mit serumfreien Medien verwendet werden. Abweichend von der vorliegenden Arbeit schlossen weder Luan noch Birch ein definiertes Reduktionsmittel wie MTG ein, das die hier genannten Erfindern, wie nachstehend diskutiert, als bevorzugte Ausführungsform bestimmten, die eine weitere Erhöhung der Expression der Zellprodukte bewirken kann.

Klasse I-Reagentien

Die Reagentien des primären Zusatzes können mit zusätzlichen Reagentien zur Herstellung von Medien mit vorteilhafteren Zellwachstums- und Produktexpressionseigenschaften kombiniert werden. Klasse I-Reagentien umfassen, sind aber nicht begrenzt auf, Reduktionsmittel, Spurenmetallionen und/oder Vitamine. Die Komponenten der Klasse I-Reagentien können einzeln oder in Verbindung mit dem vollständigen Reagentiensatz des primären Zusatzes zugefügt werden. Die Verwendung dieser zusätzlichen Klasse I-Reagentien variiert abhängig von der Zellinie und der Basalmediumzusammensetzung.

a) Reduktionsmittel:

Der Metabolismus von Glutathion und verwandten Sulfhydrylverbindungen wurde von Meister besprochen (Meister A., Selecitve Modification of Gluthatione Metabolism, Science 220 (1983), 472-477). Yamane (Yamane I. et al., Effects of Sulfhydryl Groups and Oxygen Tension on the Cell Proliferating Activity of Bovine Serum Albumin in Culture, Cell Structure and Function 2 (1982), 133-143) zeigt, daß die Zugabe von Reduktionsmitteln Kulturen vor einer mit einem hohen Sauerstoffdruck assoziierten Schädigung schützen kann.
Einige serumergänzte Medien (wie RPMI- 1640) enthalten zugesetztes Glutathion (GH) in einer Menge von 1 bis 15 mg/l. Andere Reduktionsmittel sind in serumergänzten Medien im allgemeinen nicht eingeschlossen. Beispielsweise sind β-Mercaptoethanol (β-ME) und Monothioglycerin (MTG) üblicherweise nicht in Zellkulturmedien und in keinem der, wie vorstehend erwähnt, von Freshney tabellarisch aufgeführten Medien eingeschlossen. Im Gegensatz dazu ist Glutathion oder Dithiothreit (DTT) in serumfreiem MCDB-110-Medium eingeschlossen, jedoch sind sie in mehreren anderen serumfreien Formulierungen nicht vorhanden (CDB-170, MCDB-153, WAJC, HITES, etc.). Serumfreies Iscove-Medium enthält kein GH oder DTT.
Es ist wichtig anzumerken, daß, obwohl es Berichte über Medien mit Reduktionsmitteln gibt, keines dieser Medien alle Reagentien des primären Zusatzes enthält. Beispielsweise empfiehlt Iscove (Iscove N.N., Culture oflymphocytes and Hemopoietic Cells in Serum-Free Medium in Methods for Serum-Free Culture of Neuronal and Lymphoid Cells, 169-185) die Ergänzung seines IMDM-Mediums mit entweder β-ME (5 x 10&supmin;&sup5; M) oder MTG (7,5 x 10&supmin;&sup5; M). Das Iscove-Medium enthält jedoch kein Ethanolamin oder die erhöhten Mengen von Glutamin, Tryptophan und anderen Aminosäuren, die für die synergistische Wirkung erforderlich ist, welche für das Zellwachstum und die Expression von Produkten beobachtet wurde, die auf die Reagentien des primären Zusatzes zurückzuführen ist. Ferner ergänzte Kawamoto (Kawamoto T., Anal. Biochem. 130 (1983), 445-453) ein Basalmedium mit mehreren Komponenten, umfassend Ethanolamin (10 µM) und β-ME (10 µM). Die Medien von Kawamoto enthalten jedoch nicht die erhöhten Mengen von Glutamin, Tryptophan und anderen Aminosäuren, die für die synergistische Wirkung erforderlich sind. Kovar (Kovar J. et al., Immunol. Letters 7 (1984), 339-345) entwickelte ebenfalls ein serumfreies Medium mit Ethanolamin (20 µM), jedoch enthält dieses Medium wieder geringe Mengen von Glutamin, Tryptophan und anderen Aminosäuren und fülrte nicht zu der Synergie, die von den hier genannten Erfindern beobachtet wurde. Kovar (Kovar J. et al., Serum-Free Medium for Hybridoma and Parental Myeloma Cell Cultivation: A Novel Composition of Growth Supporting Substances) testete β-Mercaptoethanol als mögliche Komponente in seinem mit Ethanolamin ergänzten serumfreien Medium auf RPMI-1640-Basis. Dieses Medium enthielt keine erhöhten Mengen von Glutamin, Tryptophan, anderen Aminosäuren oder Cholin, welche die von den hier genannten Erfindern nachgewiesene optimale synergistische Wirkung begünstigen. In Abwesenheit dieser Komponenten stellten Kovar und Frank fest, daß β-ME nicht nützlich ist und entfernten es aus ihrer Endformulierung.
Die hier genannten Erfinder stellten fest, daß die Ergänzung von Kulturmedien mit einem (einer) Reduktionsmittel/Sulfydrylverbindung eine Erhöhung der Langlebigkeit der Kultur und des Produkttiters zur Folge haben kann. Jedoch ist eine solche Ergänzung nur maximal wirksam, wenn sie in Verbindung mit dem vollständigen primären Zusatz erfolgt. Verwendete Reduktionsmittel/Sulfydrylverbindungen umfassen β-Mercaptoethanol, Monothioglycerin (MTG), Dithiothreit, Glutathion, Thioglykolat und Cystin. Stärker bevorzugt werden Thiolmoleküle, die eine oder mehrere Hydroxylgruppen aulweisen, wie β-ME (β-Mercaptoethanol), MTG (Monothioglycerin) und DTT (Dithiothreit). Besonders bevorzugt werden Monothiolverbindungen dieser Klasse, wie β-ME und MTG. Diese sind in Konzentrationen oberhalb von 0,1 mg/l wirksam und bis zu mindestens 10 mg/l nicht toxisch. Eine bevorzugte Konzentration ist 0,5 bis 5 mg/l.

b) Metallionen:

Metallionen sind für die Tierzellkultur wesentlich und in üblichen Medien als Komponenten von Salz- und Spurenelementgemischen oder als Komponenten von nicht definierten Zusätzen wie Serum eingeschlossen (Higuchi K., "Cultivation of Animal Cells in Chemically Defined Media - A Review", Advan. Appl. Microbiol. 16, 111-136). In mit den Reagentien des primären Zusatzes ergänzten Medien können hohe Zelldichten erzielt werden, so daß die Verfügbarkeit bestimmter Metallionen begrenzend werden kann, falls sie nur in den Mengen eingeschlossen sind, die in Standardmedien, welche zur Förderung von geringeren Zelldichten entwickelt wurden, zugesetzt werden. Deshalb sind in einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform auch Metallionen, die für eine bestimmte Zellinie notwendig sind, in dem Zusatz eingeschlossen. Bei den hohen Konzentrationen, die erforderlich sein können, kann die begrenzte Löslichkeit einiger Metallionen die maximale Konzentration limitieren, die mit einer vorteilhaften Wirkung zugegeben werden kann. Deshalb umfaßt eine weitere bevorzugte Ausführungsform die Ergänzung erforderlicher Metallionen zusammen mit einem geeigneten Chelatbildner. Der Chelatbildner darf in den zugesetzten Konzentrationen nicht toxisch sein und muß die benötigten Metallionen in einer reversiblen Weise binden, so daß sie in einer hinreichende Konzentration in Lösung gehalten werden können, jedoch an die Zellen in aktiver Form verteilt werden.
Die Analyse von verbrauchtem Medium unter Anwendung von Verfahren, die dem analytisch arbeitenden Chemiker gut bekannt sind ("Flame Photometry", Kapitel 11 in Willard et al., Instrumental Methods of Analysis (1965), Van Nostrand Co.) kann als Mittel zur Identifizierung jener Metallionen angewendet werden, die verbraucht und ergänzt werden müssen. Einige Metallionen, die ergänzt werden müssen, umfassen, sind aber nicht begrenzt auf, Calcium, Magnesium, Molybdän, Kobalt, Kupfer, Mangan, Zink, Selen und Eisen. Eine ausführlichere Liste wird von Hamilton und Ham angegeben (Hamilton W. et al., Clonal Growth of Chinese Hamster Cell Lines in Protein-Free Media, In Vitro 13(9) (1977), 537- 547).
Verschiedene Metallchelatoren wurden in der Zellkultur verwendet. Naturliche Proteine, welche diese Wirkung aufweisen können, umfassen Transferrin und Ferritin, besonders zur Komplexierung von Eisen, und Albumin, zur Komplexierung einer Vielzahl von mehrwertigen Metallionen. Einige andere Chelatoren, die besonders zur Komplexierung von Eisen verwendet wurden, umfassen Pyridoxylisonicotinoylhydrazon, Cholincitrat, Citrat (Brehm T. et al., Species Specificity of Iron Delivery in Hybridomas, In Vitro Cell Develop. Biol. 24(5) (1988), Kapitel III, 413-419) und Acetylacetonat (Rasmussen L. et al., Utilization of Iron Complexes in an Animal Cell, J. Cellular Physiol. 112 (1985), 155-158). Die hier genannten Erfinder stellten fest, daß Citrat in einer Konzentration von etwa 1 bis 10 mM ein wirksamer Chelator ist, der mehrere mehrwertige Metallionen ergänzen kann. Ergänzend hierzu sind eine Vielzahl von anderen organischen Säuren wirksame Chelatoren, wie Apfelsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure und α-Ketoglutarsäure.

c) Vitamine:

Vitamine sind für Tierzellen in der Kultur essentiell und im allgemeinen in Zellkulturmedien eingeschlossen (Higuchi K., Cultivation of Animal Cells in Chemically Defined Media - A Review, Seiten 111-136 in Advan. Appl. Microbiol. 16 (1973), 111) In mit der primären Zusatzzusammensetzung ergänzten Medien können hohe Zelldichten erzielt werden, so daß die Verfügbarkeit bestimmter Vitamine begrenzend werden kann, falls sie nur in den Mengen eingeschlossen sind, welche in zur Förderung von geringen Zelldichten entwickelten Standardmedien zugesetzt sind. Deshalb können in einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäße Ausführungsform auch Vitamine im Zusatz eingeschlossen sein, die für eine bestimmte Zellinie notwendig sind. Vitamine, die begrenzend werden können, umfassen, sind aber nicht begrenzt auf, p-Aminobenzoesäure, Biotin, Folsäure, Folinsäure, Nicotinamid, Pantothenat, Pyridoxin, Riboflavin, Flavinadenindinucleotid, Ascorbinsäure, Thiamin und Vitamin B12.
Nach der allgemeinen Beschreibung der erfindungsgemaßen Mediumzusätze werden mehrere mit ihrer Anwendung verbundene Begrenzungen sowie deren Umgehung diskutiert.
Erstens, obwohl es einfach ist, die Klassen von Reagentien zu definieren, die ohne weiteres mit einem Kulturmedium kombiniert werden können, mit dem Zellen gefüttert werden, ohne das die Notwendigkeit besteht, die Zellen später während des Züchtungszeitraums erneut zu füttern, erkennt der Fachmann, daß ähnliche vorteilhafte Wirkungen durch die Zugabe der einzelnen Reagentien zum Kulturmedium während des Züchtungszeitraums erzielt werden können, um ihre Konzentrationen bei den durch die Zusätze bereitgestellten Mengen zu halten. Dies wird besonders in Hinsicht auf Glutamin deutlich, das in Verbindung mit den anderen Reagentien des primären Zusatzes zugegeben werden kann, oder ausgelassen und einzeln zugegeben und bei der gewünschten Menge gehalten werden kann.
Zweitens, variieren die Konzentrationen der in den verschiedenen Zusätzen verwendeten Reagentien über die angegebenen Bereiche und sind eine Funktion sowohl der Zellkulturmedien, denen die Zusätze zugegeben werden, als auch des speziellen gezüchteten Zelltyps. Die optimalen Konzentrationen der Reagentien können vom Fachmann einfach bestimmt werden.
Drittens, mit Ausnahme der Reagentien des primären Zusatzes, die alle in den Zusätzen für einen maximalen Zellkulturvorteil vorhanden sein müssen, muß nur eines der Klasse I-Reagentien für vorteilhafte Ergebnisse vorhanden sein.
Viertens wird deutlich, daß das Basalmedium, dem der Zusatz zugefügt wird, zur Erzielung optimaler Ergebnisse für die Zellinie von Interesse geeignet sein muß, wobei Schlüsselnährstoffe in hinreichenden Mengen zur Erhöhung des Zellwachstums oder der Expression von Produkten verfügbar sind. So kann es zum Beispiel erforderlich sein, die Glucosemenge (oder einer anderen Energiequelle) im Basalmedium zu erhöhen oder Glucose (oder eine andere Energiequelle) während des Verlaufs der Kultur zuzugeben, falls nachgewiesen wird, daß diese wesentliche Energiequelle verbraucht und so das Zellwachstum oder die Expression der Produkte begrenzt wird.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, begrenzen sie jedoch in keiner Weise. Zum Beispiel veranschaulichen Hybridomen und Antikörper Zellinien, die in mit den vorliegenden Zusammensetzungen ergänzten Medien erfolgreich gezüchtet und geerntet werden können. Jedoch sind solche Medien nicht auf das Anziehen von Hybridomen oder die Ernte von Antikörpern begrenzt, sie können jedoch vielmehr zum Anziehen einer Vielzahl von Zellen verwendet werden, die eine großen Bereich von Produkten herstellen.

Beispiel 1

Repräsentative kommerzielle Mediumformulierung

Ventrex HL-1 ist ein Medium, das für im Handel erhältliche Medien zur Zellkultur gemäß dem Stand des Fachgebiets repräsentativ ist. Die Produktliteratur gibt an, daß dieses Medium "zur Verwendung bei der Kultur von Hybridomen und lymphoiden Zellen entwickelt wurde". Es wird behauptet, daß das Medium für das Anziehen von vielen transformierten und etablierten Zellinien vorteilhaft ist und insbesondere zur Herstellung von monodonalen Antikörpern aus Maus- und Mensch-Hybridomen. Eine Liste von 55 Zellinien, die in diesem Medium erfolgreich gezüchtet wurden, wird in Current Concepts 1(1), 5, veröffentlicht von Ventrex, 217 Read St., Portland, Maine, aufgeführt.
Figur 1 zeigt das Wachstum und die Produktexpression der Hybridomzellinie D234, die einen monodonalen menschlichen Antikörper in HL-1-Medium produziert. Die maximale Dichte lebensfähiger Zellen von 1,3 x 10&sup6; Zellen/ml wird nach 120 Stunden erreicht und die Kultur stirbt danach schnell ab. Die maximale Gesamtzelldichte beträgt 2 x 10&sup6; Zellen/ml. Der Antikörper-Endtiter beträgt 70 mg/l.
Das Hybridom D234 ist bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer HB-8598 hinterlegt.
Das Hybridom produziert einen IGM-Antikörper, der mit ELISA-Standardverfahren getestet wurde.

Beispiel 2

Serumfreie Hybridom-Mediumformulierung

Tabelle I, Spalte 1, zeigt eine übliche serumfreie Mediumformulierung (50% RPMI, 50% DME, Rinderinsulin (5 mg/l), menschliches Transferrrin (5 mg/l), Seien (5 µg/l), 0,1% Pluronic -Polyol (F68)). Dieses Medium entspricht mehreren in der Literatur angeführten Zusammensetzungen.
Figur 2 gibt das Wachstum und die Produktexpression durch das D234-Hybridom im Medium von Tabelle 1, Spalte 1 an. Das Wachstum und die Produktexpression entsprechen dem (der) im kommerziell erhältlichen HL-1-Medium. Die maximale Dichte lebensfähiger Zellen beträgt 1,3 x 10&sup6; Zellen/ml. Der Antikörper-Endtiter beträgt 80 mg/l.

Beispiel 3

Medium mit primärem Zusatz, Zugabe von Glutamin vor und während des Züchtungszeitraums

Tabelle 1, Spalte 4, zeigt eine Zusammensetzung, wobei das Standardmedium mit den Reagentien des primären Zusatzes ergänzt wurde (8 mM Glutamin, 140 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Cholin, 10 mg/l Ethanolamin und andere Aminosäuren in einer erhöhten Konzentration, die üblicherweise etwa der 3fachen Konzentration im Basalmedium entspricht). In ersten Untersuchungen wurde festgestellt, daß die Glucosemenge im Basalmedium aufgebraucht und das Wachstum und die Langlebigkeit der Kultur begrenzt werden könnte. Deshalb wurde ergänzend zur Einbeziehung in das Basalmedium zusätzliche Glucose während des Verlaufs des Züchtungszeitraums zugegeben. Außerdem wurde Glutamin zusätzlich zur Einbeziehung in den primären Zusatz in das Medium zu Beginn der Kultur auch am Tag 4, 8 und 12 zugegeben, so daß die Gesamtmenge des ergänzten Glutamins 20 mMol pro Liter der Kultur entsprach.
Figur 3 zeigt das Wachstum und die Produktexpression von D234 in dem ergänzten Medium. Die maximale Dichte lebensfähiger Zellen von 1,2 x 10&sup6; Zellen/ml wird nach 120 Stunden erreicht, danach wird die Kultur in einer pseudostationären Phase gehalten, wobei das Zellwachstum den Zelltod etwa ausgleicht, so daß die Konzentration der lebensfähigen Zellen über einen Zeitraum von 100 Stunden nur langsam abnimmt. Die Gesamtzelldichte erhöht sich weiter auf 2,5 x 10&sup6; Zellen/ml. Die Zellen exprimieren das Produkt während der pseudostationären Phase weiter und es wird ein Endtiter von 290 mg menschlichem Antikörper pro Liter erzielt.

Beispiel 4

Medium mit primärem Zusatz, Zugabe von Glutamin nur zu Beginn des Züchtungszeitraums

D234 wurde in einem Medium und unter Bedingungen gezüchtet, welche jenen in Beispiel 3 entsprechen, mit dem Unterschied, daß Glutamin in dem primären Zusatz eingeschlossen wurde, um die Konzentration von Glutamin auf 20 mM zu Beginn der Kultur einzustellen und Glutamin wurde danach nicht mehr zugegeben. Das Wachstum und die Produktexpression entsprachen jenem(r) von Beispiel 3.

Beispiel 5

Medium mit primärem Zusatz und Klasse I-Reagens

Tabelle I, Spalte 2, zeigt eine Zusammensetzung, wobei das Standardmedium mit den Reagentien des primären Zusatzes sowie mit Monothioglycerin (ein Klasse I-Reagens) in einer Konzentration von 10 mg/l ergänzt wurde. Glucose und Glutamin wurden wie in Beispiel 3 ergänzt.
Figur 4 zeigt das Wachstum und die Produktexpression von D234 in dem ergänzten Medium. Die maximale Dichte lebensfähiger Zellen von 1,9 x 10&sup6; Zellen/ml wird nach 120 Stunden erreicht. Danach wird die Kultur in einer pseudostationären Phase gehalten, wobei die Zellwachstumsrate etwa die Zellabsterberate ausgleicht, so daß die Konzentration der lebensfähigen Zellen während eines Zeitraums von weiteren 150 Stunden nur langsam abnimmt. Die Gesamtzelldichte erhöht sich auf 3,8 x 10&sup6; Zellen/ml. Die Zellen exprimieren das Produkt während des Zeitraums der pseudostationären Phase weiter und es wird ein Endtiter von 230 mg menschlichem Antikörper pro Liter erzielt.

Beispiel 6

Verwendung des Zusatzes in Verbindung mit einer Lipidemulsion

Tabelle I, Spalte 3, zeigt eine Zusammensetzung, worin das übliche Zellkulturmedium mit den Reagentien des primären Zusatzes (8 mM Glutamin, 28 mg/l Tryptophan, 22,8 mg/l Cholin, 0,8 mg/l Ethanolamin und andere Aminosäuren, die üblicherweise etwa in der 3fachen Konzentration des Basalmediums zugesetzt werden) und mit Klasse I-Reagentien (1 mg/l Monothioglycerin, Vitamin B12 und Spurenelemente, umfassend Molybdän, Kobalt, Kupfer, Zink und Eisen) ergänzt wurde. Ergänzend hierzu enthält das Medium Lipide (Linolsäure, Tween 80, Lecithin, Cholesterin und Vitamin E). Zusätzlich wurden Glucose und Glutamin während des Züchtungszeitraums zugegeben, wie in Beispiel 3 beschrieben.
Figur 5 zeigt das Wachstum und die Produktexpression von D234 in dem ergänzten Medium. Die maximale Dichte lebensfähiger Zellen von 1,7 x 10&sup6; Zellen/ml wird nach 80 Stunden erreicht. Danach wird die Kultur in einer pseudostationären Phase gehalten, während der das Wachstum etwa 50% der maximalen Wachstumsrate der exponentiellen Phase entspricht, welche die Absterberate etwa ausgleicht, so daß die Konzentration der lebensfähigen Zellen während eines Zeitraums von weiteren 150 Stunden nur langsam abnimmt. Die Gesamtzelldichte erhöht sich weiter auf 3,5 x 10&sup6; Zellen/ml. Die Zellen exprimieren das Produkt über den Zeitraum der pseudostationären Phase weiter und es wird ein Endtiter von 275 mg menschlichem Antikörper pro Liter erzielt.

Beispiel 7

Verwendung des Zusatzes in der Fed-Batchkultur

Der erfindungsgemäße Zusatz kann vorteilhafierweise in einer Fed-Batchkultur sowie in einer einfachen Batchkultur verwendet werden. Tabelle I, Spalte 5, zeigt das mit Reagentien des primären Zusatzes und Klasse I-Reagentien sowie mit Lipiden ergänzte Standardmedium. Dieses Medium entspricht dem von Beispiel 6 (Tabelle I, Spalte 3).
Dieses Medium wurde zum Anziehen von D234 in einem Fed-Batch-Verfahren verwendet. Nach 120 Stunden wurde ein weiterer Zusatz zugegeben, wie in Tabelle II aufgeführt. Nach 220 Stunden wurde die Kultur mit weiteren 5 mMol Glutamin pro Liter der Kultur ergänzt.
Figur 6 zeigt das Wachstum und die Produktexpression von D234 in der ergänzten Fed-Batchkultur. Die maximale Dichte lebensfähiger Zellen von 1,8 x 10&sup6; Zellen/ml wird nach 130 Stunden erreicht. Danach wird die Kultur in einer pseudostationären Phase gehalten, während der das Wachstum bei etwa 20% der maximalen Wachstumsrate der exponentiellen Phase anhält, was die Absterberate etwa ausgleicht, so daß die Konzentration der lebensfähigen Zellen über einen Zeitraum von weiteren 190 Stunden nur langsam abnimmt.
Die Gesamtzelldichte erhöht sich weiter auf 3,7 x 10&sup6; Zellen/ml. Die Zellen exprimieren das Produkt während des Zeitraums der pseudostationären Phase und es wird ein Endtiter von 470 mg menschlichem Antikörper pro Liter erzielt.
Andere Fütterungsstrategien wurden ebenfalls untersucht, wobei die Nährstoffe bis zu einer entsprechenden Gesamtendkonzentration wie in der vorstehenden Probe zugegeben werden, jedoch in unterschiedlichen Abfolgen. Die Unterteilung der Zusatzzugabe in beinahe gleiche tägliche Zugaben nach 190 Stunden führt zu ähnlichen Ergebnissen, wie vorstehend beschrieben. Eine langsame kontinuierliche Fütterung ergibt ebenfalls ähnliche Ergebnisse.
Aus der Beschreibung der Erfindung wird ersichtlich, daß diese in keiner anderen Weise als durch den Schutzumfang der beigefügten Patentansprüche begrenzt wird. Tabelle I (mg/l) Glucose Glutathion Na-Pyruvat Phenolrot p-Aminobenzoesäure Biotin Ca-Pantothenat Tabelle I (mg/l) Fortsetzung Folsäure Nicotinamid Pyridoxal Pyridoxin Riboflavin Thiamin Vitamin Cholinchlorid Inosit Ethanolamin Glycerin Glutamin Pluronic-Polyol Insulin Tabelle I (mg/l) Fortsetzung Transferrin Niacin Hydroxypolin Beta-Alanin Tabelle I (mg/l) Fortsetzung Apfelsäure alpha-Ketoglutarsäure Bernsteinsäure Fumarsäure D-Serin Saccharose Maltose Ethanol Tween Lecithin Linolsäure Cholesterin alpha-Tocopherolacetat Tabelle I (mg/l) Fortsetzung Monothioglycerin Glucosecritrat Tabelle I (mg/l) Fortsetzung ASP-SÄURE CYSTIN GLUT.-SÄURE Tabelle I (mg/l) Fortsetzung MET PHENYLALA PRO THREO TYRO Tabelle II Glucose Glutathion HEPES Na-Pyruvat Phenolrot p-Aminobenzoesäure Biotin Ca-Pantothenat Folsäure Nicotinamid Pyridoxal-HCl Pyridoxin-HCl Riboflavin Thiamin-HCl Vitamin Cholinchlorid Inosit Ethanolamin Tabelle II Fortsetzung Glycerin Glutamin Pluronic-Polyol Insulin Transferrin Niacin Hydroxyprolin Beta-Alanin Apfelsäure alpha-Ketoglutarsäure Bernsteinsäure Fumarsäure D-Serin Tabelle II Fortsetzung Saccharose Maltose Ethanol Tween Lecithin Linolsäure Cholesterin alpha-Tocopherolacetat Monothioglycerin Glucose Tabelle II Fortsetzung ASP-SÄURE CYSTIN GLUT. -SAURE ISOLEU PHENALALA THREO

Claims

1. Zusammensetzung, umfassend

einen primären Zusatz, umfassend:

(a) ein erstes Reagenz, ausgewählt aus Glutamin und Glutamat;

(b) Phospholipidvorläufer, umfassend zumindest Cholin und Ethanolamin, wobei die Phospholipidvorläufer gegebenenfalls in Komplex-Form zugesetzt werden; und

(c) Aminosäuren;

und umfassend die folgenden Reagentien der Klasse I: (i) ein Reduktionsmittel, (ii) Metallionen, (iii) einen Metallahelator und (iv) Vitamine,

wobei die primären Zusatzkomponenten und die Klasse I- Reagentien in Mengen zugesetzt werden, die Zellen in Kultur für einen ausgedehnten Zeitraum in einer pseudostationären Wachstumsphase wirksam aufrechterhalten.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Phospholipidvorläufer weiterhin Serin, Inosit und/oder Glycerin umfassen, und/oder wobei die Phospholipidvorläufer in Komplex-Form zugesetzt werden und Phosphoethanolamin, Phosphocholin, Phosphatidylcholin und/oder Phosphatidylethanolamin umfassen.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei:

(a) die Aminosäuren Tryptophan in einer Konzentration umfassen, die bei Zugabe zu Kulturmedien mehr als etwa 20 mg/l, aber weniger als etwa 200 mg/l beträgt; und/oder

(b) Glutamin oder Glutamat in einer Konzentration vorhanden ist, die bei Zugabe zu Kulturmedien oberhalb von etwa 5 mM, aber unterhalb von etwa 40 mM liegt; und/oder

(c) Cholin in einer Konzentration vorhanden ist, die bei Zugabe zu Kulturmedien größer als etwa 4 mg/l ist; und/oder

(d) Ethanolamin in einer Konzentration vorhanden ist, die größer als etwa 1 mg/l, aber geringer als etwa 100 mg/l ist.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei ein Reduktionsmittel in einer Konzentration eingeschlossen ist, die größer als etwa 0,1 mg/l und geringer als etwa 100 mg/l ist, und/oder ausgewählt ist aus β-Mercaptoethanol, Monothioglycerin und Dithiothreit.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die weiterhin ein oder mehrere der folgenden Merkmale umfaßt:

(a) die Metallionen sind ausgewählt aus Eisen, Calcium, Mangan, Molybdän, Kobalt, Kupfer, Zink und Selen,

(b) die Metallionen sind ausgewählt aus Eisen, Calcium, Mangan, Molybdän, Kobalt, Kupfer, Zink und Selen, und der Chelator ist ausgewählt aus Transferrin, Ferritin, Albumin, Pyridoxylisonicetinoylhydrazon, Cholincitrat und Citrat, wobei jedes beliebige Citrat vorzugsweise im Medium in einer Konzentration von etwa 1 bis 10 mM eingeschlossen ist,

(c) die Vitamine sind ausgewählt aus p-Aminobenzoesäure, Biotin, Folsäure, Folinsäure, Nicotinamid, Panthothenat, Pyridoxin, Riboflavin, Flavinadenindinucleotid, Ascorbinsäure, Thiamin und Vitamin B12.

6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, und weiterhin umfassend Wachstumshormone, Wachstumsfaktoren oder Serum.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, auch eine Lipidemulsion umfassend.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei die Lipidemulsion eine Fettsäure, ein nicht-ionisches Detergens, ein Phospholipid, ein Antioxidans und Cholesterin umfaßt.

9. Medium zum Anziehen von Zellen, umfassend ein Basalmedium, einen primären Zusatz, umfassend

(a) ein erstes Reagens, ausgewählt aus Glutamin und Glutamat;

(b) Phospholipidvorläufer, umfassend zumindest Ethanolamin und Cholin, wobei die Phospholipidvorläufer gegebenenfalls in Komplex-Form zugesetzt werden; und

(c) Aminosäuren

und Klasse I-Reagentien, umfassend:

(a) ein Reduktionsmittel,

(b) Metallionen,

(c) einen Metallchelator und

(d) Vitamine;

und Glucose, wobei die Komponenten des primären Zusatzes, der Klasse I-Reagentien und Glucose in Beträgen vorhanden sind, die die Zellen in Kultur für ausgedehnte Zeiträume in einer pseudostationären Wachstumsphase wirksam aufrechterhalten.

10. Medium nach Anspruch 9, wobei die Phospholipidvorläufer in Komplex-Form zugesetzt werden, ausgewählt aus Phosphoethanolamin, Phosphocholin und Phosphatidylethanolamin.

11. Medium nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, wobei das Reduktionsmittel Monothioglycerin ist.

12. Medium nach einem der Ansprüche 9 bis 11, das weiterhin ein Pluronic -Polyol umfaßt.

13. Medium nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei das Basalmedium frei von Serum und Proteinen ist.

14. Medium nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die Metallionen Calcium, Kobalt, Kupfer, Eisen, Mangan, Magnesium, Molybdän, Seien und Zink umfassen.

15. Medium nach einem der Ansprüche 9 bis 14, wobei der Metallchelator Citrat ist.

16. Medium nach einem der Ansprüche 9 bis 15, wobei die Vitamine Nicotinamid und Pyridoxin umfassen und gegebenenfalls Biotin, Panthothenat, Folsäure, Riboflavin, Thiamin und Vitamin B12.

17. Primärer Zusatz für ein Zellkulturmedium, umfassend Glutamin oder Glutamat, Aminosäuren und Phospholipidvor läufer, wobei die Phospholipidvorläufer gegebenenfalls in Komplex-Form in Mengen zugesetzt werden, die Zellen in Kultur für ausgedehnte Zeiträume in einer pseudostationären Wachstumsphase wirksam aufrechterhalten, und wobei:

(a) die Aminosäuren Tryptophan in einer Konzentration umfassen, die bei Zugabe zu Kulturmedien mehr als etwa 20 mg/l, aber weniger als etwa 200 mg/l beträgt;

(b) Glutamin oder Glutamat in einer Konzentration vorhanden ist, die bei Zugabe zu Kulturmedien oberhalb von etwa 5 mM, aber unterhalb von etwa 40 mM liegt;

(c) Cholin in einer Konzentration vorhanden ist, die bei Zugabe zu Kulturmedien größer als etwa 4 mg/l ist; und

(d) Ethanolamin in einer Konzentration vorhanden ist, die größer als etwa 1 mg/l, aber weniger als etwa 100 mg/l ist.

18. Primärer Zusatz nach Anspruch 17, der weiterhin das (die) Merkmal(e) nach einem oder beiden Ansprüche 2 und 16 umfaßt.

19. Zusatz zu einem Zellkulturmedium, umfassend einen primären Zusatz nach Anspruch 17 oder Anspruch 18 und Klasse I-Reagentien, wobei die Klasse I-Reagentien in wirksamen Mengen vorhanden sind, die gemeinsam mit dem primären Zusatz wirken, zum Halten von Zellen in einer pseudostationären Phase, und umfassend ein Reduktionsmittel, Spurenmetallionen und Vitamine.

20. Zusatz nach Anspruch 19, der weiterhin das (die) Merkmal(e) nach einem oder mehreren der Ansprüche 4 bis 8 oder 10 bis 15 umfaßt.

21. Verfahren zum Anziehen von Zellen, gegebenenfalls von Antikörper-sezernierenden Zellen, umfassend das Inkontaktbringen der Zellen mit einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 8.

22. Verfahren zum Anziehen von Zellen, umfassend das Inkontaktbringen der Zellen mit Zellkulturmedium, wobei Komponenten einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, ein Medium nach einem der Ansprüche 9 bis 16, ein primärer Zusatz nach Anspruch 17 oder Anspruch 18 oder ein Zusatz zu einem Zellkulturmedium nach Anspruch 19 oder Anspruch 20 einzeln oder in Kombination zu dem Zellkulturmedium über den Zeitraum der Zellkultur zur Aufrechterhaltung der Zellen in einer pseudostationären Wachstumsphase zugefügt werden.

23. Verwendung zum Anziehen von Zellen und zur Herstellung von Biochemikalien davon von:

(i) einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10;

(ii) einem Medium nach einem der Ansprüche 9 bis 16;

(iii) einem primären Zusatz nach Anspruch 17 oder Anspruch 18; oder

(iv) einem Zusatz zu einem Zellkulturmedium nach Anspruch 19 oder Anspruch 20;

wobei die Komponenten der Zusammensetzung, des Mediums oder des Zusatzes gegebenenfalls einzeln oder in Kombination zu dem Zellkulturmedium über den Zeitraum der Zellkultur zur Aufrechterhaltung der Zellen in einer pseudostationären Wachstumsphase hinzugefügt werden.

24. Verfahren zur Herstellung einer Biochemikalie, umfassend

(i) die Züchtung von Zellen in einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, oder

(ii) das Hinzufügen von Komponenten einer Zusammensetzung, eines Mediums oder eines Zusatzes nach Anspruch 20(i), 20(ii), 20(iii) oder 20(iv) zu dem Kulturmedium, wobei die Komponenten gegebenenfalls einzeln oder in Kombination zu dem Zellkulturmedium zur Aufrechterhaltung der Zellen in einer pseudostationären Wachstumsphase hinzugefügt werden.