ES2273415T3

ES2273415T3 - Anticuerpos anti-vegf.

Info

Publication number: ES2273415T3
Application number: ES98917991T
Authority: ES
Inventors: Manuel Baca; James A. Wells; Leonard G. Presta; Henry B. Lowman; Yvonne Man-Yee Chen
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1997-04-07
Filing date: 1998-04-03
Publication date: 2007-05-01
Anticipated expiration: 2018-04-03
Also published as: ATE349470T1; EP0973804A2; US20050112126A1; NZ500078A; LTPA2005005I1; TR199903123T2; NO994869L; KR100816621B1; KR20080003452A; CY2007012I2; US7060269B1; HK1023577A1; HK1084402A1; EP1787999B1; IL132240A0; CY2005008I1; CY2005008I2; NO2007014I2; EP1325932B9; LU91167I2

Abstract

Se describen anticuerpos anti-VEGF (factor de crecimiento del endotelio vascular) humanizados o sus alelos, y diversos usos de dichos anticuerpos: Los anticuerpos anti-VEGF presentan una gran afinidad para el factor de crecimiento del endotelio vascular. Inhiben la proliferación de células endoteliales in vitro inducida por VEGF, así como el crecimiento tumoral in vivo.

Description

Anticuerpos anti-VEGF.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención hace referencia en general a anticuerpos anti-VEGF y, en particular, a variantes humanizadas de los anticuerpos anti-VEGF.

Descripción de la materia relacionada

Actualmente está bien establecido que la angiogénesis está implicada en la patogénesis de una variedad de trastornos. Entre estos se incluyen los tumores sólidos, los síndromes neovasculares intraoculares tales como las retinopatías proliferativas o la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), la artritis reumatoide y la psoriasis (Folkman y col., J Biol Chem. 267:10931-10934 (1992); Klagsbrun y col., Amm. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991); y Garner A, Vascular diseases. In: Pathobiology of ocular disease. A dynamic approach. Garner A, Klintworth Gk, Eds. 2^{nd} Edition Marcel Dekker, NY, pp 1625-1710 (1994)). En el caso de los tumores sólidos, la neovascularización permite que las células tumorales adquieran una ventaja en el crecimiento y una autonomía proliferativa en comparación con las células normales. En concordancia, se ha observado una correlación entre la densidad de los microvasos en secciones tumorales y la supervivencia del paciente en el cáncer de mama así como en otros muchos tumores (Weidner y col., N Engl J Med 324:1-6 (1991); Horak y col., Lancet 340:1120-1124 (1992); y Macchiarini y col., Lancet 340:145-146 (1992)).

La búsqueda de reguladores positivos de angiogénesis ha dado lugar a muchos candidatos entre los que se incluyen, el aFGF, el bFGF, el TGF-\alpha, el TGF-\beta, el HGF, el TNF-\alpha, la angiogenina, la IL-8, etc. (Folkman y col. y Kagsbrun y col.). Entre los reguladores negativos identificados hasta el momento se incluyen la trombospondina (Good y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:6624-6628 (1990)), el fragmento N-terminal de 16 kilodaltons de la prolactina (Clapp y col., Endocrinology, 133: 1292-1299 (1993)), la angiostatina (O'Reilly y col., Cell, 79:315-328 (1994)) y la endostatina (O'Reilly y col., Cell, 88:277-285 (1996)).

El trabajo realizado en los últimos años ha establecido el papel clave del factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF)en la regulación de la angiogénesis normal y anormal (Ferrara y col., Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)). El descubrimiento de que la pérdida de incluso un solo alelo de VEGF conlleva la letalidad del embrión indica que este factor jugaría un papel irreemplazable en el desarrollo y diferenciación del sistema vascular (Ferrara y col.). Además, se ha demostrado que el VEGF es un mediador clave en la neovascularización asociada a tumores y a trastornos intraoculares (Ferrara y col.). El mRNA del VEGF se sobreexpresa en la mayoría de los tumores humanos examinados (Berkman y col., J Clin Invest 91:153-159 (1993); Brown y col., Human Pathol., 26:86-91 (1995); Brown y col., Cancer Res. 53:4727-4735 (1993); Mattern y col., Brit. J. Cancer. 73:931-934 (1996); y Dvorak y col., Am. J. Pathol. 146:1029-1039 (1995)). También está fuertemente correlacionada la concentración de VEGF en los fluidos oculares con la presencia de proliferación vascular activa de vasos sanguíneos en pacientes con retinopatía diabética y con otras retinopatías relacionadas con isquemia. (Aiello y col. N. Engl. J. Med. 331:1480-1487 (1994)). Además, estudios recientes han demostrado la localización de VEGF en las membranas neovasculares coroidales en pacientes afectados por AMD (Lopez y col., Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37:855-868 (1996)). Los anticuerpos neutralizantes anti-VEGF suprimen el crecimiento de una variedad de líneas celulares tumorales humanas en animales nude (Kim y col., Nature 362:841-844 (1993); Warren y col., J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995); Borgström y col., Cancer Res. 56:4032-4039 (1996); y Melnyk y col. Cancer Res. 56:921-924 (1996)) y también inhiben la angiogénesis intraocular en modelos de trastornos isquémicos de retina (Adamis y col., Arch. Ophthalmol. 114:66-71(1996)). Se encuentra una revisión sobre anticuerpos humanizados en Bending, Methods: Comp. Meth. Enzy., 8:83-93 (1995). La patente mundial WO92/22653 también hace referencia a la humanización de los anticuerpos. Por tanto, los anticuerpos monoclonales anti-VEGF u otros inhibidores de la acción del VEGF son candidatos prometedores para el tratamiento de tumores sólidos y de varios trastornos neovasculares intraoculares.

Resumen de la invención

Baca y col., (1997) J. Biol. Chem. 272(16), 10678-10684 describe un método de librerías de fagos para la humanización de anticuerpos anti-VEGF mediante mutagénesis aleatoria de ciertos residuos de entramado.

Esta solicitud describe variantes humanizadas del anticuerpo anti-VEGF como se define en las reivindicaciones que presenten propiedades deseables con una perspectiva terapéutica, incluyendo una fuerte afinidad de unión por el VEGF; la capacidad de inhibir la proliferación de células endoteliales inducida por el VEGF in vitro; y la capacidad de inhibir la angiogénesis inducida por el VEGF in vivo.

La variante humanizada del anticuerpo anti-VEGF preferida, aquí descrita, se une la VEGF con un valor de K_{d} no superior a alrededor de 1 x 10^{-8}M y preferentemente no superior a alrededor de 1 x 10^{-9}M. Además, la variante humanizada de un anticuerpo anti-VEGF debe tener un valor de ED50 no superior a alrededor de 5nM por la inhibición de la proliferación de células endoteliales inducida por VEGF in vitro. Las variantes humanizadas de los anticuerpos anti-VEGF particularmente interesantes aquí son aquellos que inhiben al menos alrededor de un 50% el crecimiento tumoral en el modelo de tumor in vivo A673, a la dosis de anticuerpo de 5 mg/kg.

Como se define en las reivindicaciones, la invención proporciona una variante de un anticuerpo parental anti-VEGF (en la cual el anticuerpo parental es el anticuerpo anti-VEGF humanizado F(ab)-12), en donde la variante se une al VEGF humano y comprende una sustitución aminoacídica al menos en el CDRH1 y/o en el CDRH3 del dominio variable de la cadena pesada o de la cadena ligera del anticuerpo parental anti-VEGF.

Preferentemente, la variante tiene una o más sustitución(es) en una o más región(es) hipervariables del anticuerpo anti-VEGF. Preferentemente, hay sustituciones en ambas regiones hipervariables. Se demuestra aquí que tales variantes "maduradas para su afinidad" se unen al VEGF humano más fuertemente que el anticuerpo anti-VEGF parental a partir del que se han generado, es decir, tienen un valor de K_{d} significativamente menor que el del anticuerpo anti-VEGF parental. Preferentemente, las variantes tienen un valor de ED50 para la inhibición de la proliferación de células endoteliales inducida por VEGF in vitro que es al menos aproximadamente 10 veces inferior, preferentemente al menos 20 veces inferior, y más preferentemente al menos 50 veces inferior, que el del anticuerpo anti-VEGF parental. Una variante particularmente preferida es la variante Y0317 del Ejemplo 3, que tiene un CDRH1 que comprende la secuencia aminoacídica: GYDFTHYGMN (SEC ID NO: 126) y un CDRH3 que comprende la secuencia aminoacídica: YPYYYGTSI-IWYFDV (SEC ID NO: 127). Estas regiones hipervariables y CDRH2 generalmente están presentes en una región de entramado humana, por ejemplo, resultando en un dominio variable de una cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica con el SEC ID NO NO: 116. Tales secuencias de un dominio variable de la cadena pesada opcionalmente se combinan con un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica con el SEC ID NO: 124, y preferentemente con el dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica con el SEC ID NO: 115.

Se contemplan aquí varias formas del anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF puede ser un anticuerpo de secuencia completa (por ejemplo, que presente una región Fc humana intacta) o un fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un Fab, un Fab' o un F(ab')_{2}). Además, el anticuerpo puede estar marcado con un marcaje detectable, inmovilizado en una fase sólida y/o conjugado con un compuesto heterólogo (como un agente citotóxico).

Se contemplan usos diagnósticos y terapéuticos del anticuerpo. En una aplicación diagnóstica, la invención proporciona un método para la determinación de la presencia de la proteína del VEGF que comprende la exposición de una muestra de la que se sospecha que contiene la proteína del VEGF al anticuerpo anti-VEGF y se determina la unión del anticuerpo a la muestra. Para este propósito la invención proporciona un equipo que incluye el anticuerpo y las instrucciones de uso del mismo para la detección de la proteína del VEGF.

La invención proporciona además: el ácido nucleico aislado que codifica para el anticuerpo; un vector que consta de dicho ácido nucleico, opcionalmente operativamente unido a secuencias control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector; una célula huésped que consta de dicho vector; un proceso para producir el anticuerpo que consiste en el cultivo de la célula huésped de forma que el ácido nucleico se exprese y, opcionalmente, la recuperación del anticuerpo a partir del cultivo de la célula huésped (por ejemplo, a partir del medio de cultivo de la célula huésped). La invención también proporciona una composición que consiste en el anticuerpo anti-VEGF y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición es estéril y puede ser liofilizada para el uso terapéutico. La invención también proporciona un método para el tratamiento de un mamífero que sufre de un tumor o de una anomalía de la retina, que consiste en la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo anti-VEGF al mamífero.

Descripción resumida de las figuras

Las figuras 1A y 1B representan las secuencias aminoacídicas de un dominio variable pesado (SEC ID NO: 9) y de dominio ligero (SEC ID NO: 10) del muMAbVEGF A.4.6.1, un dominio variable pesado (SEC ID NO: 7) y de un dominio ligero(SEC ID NO: 8) del F(ab)(F(ab)-12) humanizado y de las regiones de entramado consenso humanas (hum III para el subgrupo III pesado HUM III (SEC ID NO: 11); hum\kappa1 para el subgrupo I ligero \kappa (SEC ID NO: 12)). La Fig. 1A alinea las secuencias de los dominios variables pesados y la Fig. 1B alinea las secuencias de los dominios variables ligeros. Los asteriscos indican las diferencias entre los F(ab)-12 humanizados y el MAb murino o entre F(ab)-12 y la región de entramado humana. Las Regiones de Determinación de la Complementariedad (CDRs) se encuentran subrayadas.

La Fig. 2 es un diagrama de lazos del modelo de los dominios VL y VH humanizados de F(ab)-12, se muestra el dominio VL en marrón con los CDRs más oscuro. La cadena lateral del residuo L46 se muestra en amarillo. El dominio VH se muestra en morado con los CDRs en rosa. Las cadenas laterales de los residuos VH que se han cambiado del humano al murino se muestran en amarillo.

La Fig. 3 representa la inhibición de la mitogénesis inducida por el VEGF mediante los anticuerpos humanizados anti-VEGF F(ab)-12 del Ejemplo L. Se sembraron células endoteliales bovinas derivadas de capilares del córtex adrenal en placas de seis pocillos a la densidad de 6 x 10^{3} células/pocillo, tal como se describe en el Ejemplo 1. Tanto el anticuerpo muMAb VEFG A.4.6.1 como el rhuMAb VEGF (IgG1; F(ab)-12) se añadieron a las concentraciones indicadas. Al cabo de 2-3 horas, se añadió el rhVEGF165 a la concentración final de 3 ng/ml. Al cabo de cinco o seis días, se tripsinizaron las células y se contaron. Los valores que se muestran son la media de determinaciones por duplicado. La variación de la media no sobrepasa el 10%.

La Fig. 4 muestra la inhibición del crecimiento tumoral in vivo por parte de el anti-VEGF F(ab)-12 humanizado del Ejemplo 1. Las células de rabdomiosarcoma A673 se inyectaron en ratones nude BALB/c a la densidad de 2 x 10^{6} células por ratón. Al cabo 24 horas después de la inoculación de células tumorales, los animales se inyectan con un MAb control, el muMAb VEGF A4.6.1 o el rhuVEGF MAb (IgG; F(ab)-12) dos veces a la semana intraperitonealmente. La dosis del MAb control fue de 5 mg/Kg; los MAbs anti-VEGF se administraron a 0,5 o 5 mg/kg, tal como se indica (n = 10). Al cabo de cuatro semanas tras la inyección de las células tumorales, los animales se sacrificaron y los tumores se extrajeron y pesaron. *: diferencia significativa cuando se compara con el grupo control por ANOVA (p<0,05).

Las Figs. 5A y 5B muestran las secuencias aminoacídicas de los dominios variables ligero y pesado respectivamente del anticuerpo murino A4.6.1 (SEC ID NO: 10 para el VL y SEC ID NO: 9 para el VH) así como las variantes A4.6.1 humanizadas hu2.0 (SEC ID NO: 13 para el VL y SEC ID NO: 14 para el VH) y hu2.10 (SEC ID NO: 15 para el VL y SEC ID NO: 16 para el VH) del Ejemplo 2. La numeración de la secuencia se realizó según Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, Nacional Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) y las no concordancias se indican con asteriscos. (A4.6.1 murino vs hu2.0) o puntos (hu2.0 versus hu2.10). La variante hu2.0 contiene sólo las secuencias CDR (en negrita) del anticuerpo murino insertadas en una cadena ligera humana x la región de entramado consenso del subgrupo I (SEC1P NO: 12) y la región de entramado consenso del subgrupo III de la cadena pesada (SEC ID NO: 11). hu2.10 es el clon humanizado consenso obtenido a partir de experimentos de expresión en fagos descritos aquí.

La Fig. 6 muestra los residuos de entramado dirigidos para la aleatorización en el Ejemplo 2.

Fig. 7 muestra la construcción del fagémido para la expresión en superficie de las fusiones Fab-pIII en fagos. El fagémido codifica una versión humanizada del fragmento Fab para el anticuerpo A4.6.1 fusionado a una fracción de la proteína de cubierta III del gen M13. La proteína de fusión consiste en el Fab unido al extremo carboxi-terminal de la cadena pesada a un único residuo de glutamina (a partir de la supresión de un codon ámbar en supE E. coli), y se prosigue por la región C-terminal de la proteína del gen III (residuos 249-406). La transformación en F+ E. coli, seguida por la superinfección con el fago auxiliar M13KO7, produce partículas de fagémido en las que una pequeña proporción de éstos muestran una única copia de la proteína de fusión.

Las Figs. 8A-E muestran la secuencia nucleotídica (SEC ID NO: 99) para el vector del anticuerpo de expresión en fagos phMB4-19-1.6 en el Ejemplo 3 y las secuencias aminoacídicas codificadas de ese modo (SEC ID NO: 100 y 130).

Las Figs 9A y 9B muestran un alineamiento de las secuencias aminoacídicas de los dominios variables ligeros y pesados respectivamente de las variantes del anticuerpo anti-VEGF maduradas por afinidad del Ejemplo 3, comparadas con el F(ab)-12 del Ejemplo 1 (SEC ID Nos: 8 y SEC ID NO: 9 para los dominios variables ligeros y pesados, respectivamente). Los CDRs están subrayados y designados como L, cadena ligera, o H, cadena pesada, y los números 1-3). Los residuos están numerados secuencialmente en los dominios VL y VH, a diferencia del esquema de numeración de Kabat. La molécula molde, MB1.6 (SEC ID NOs: 101 y 102 para los dominios variables ligeros y pesados, respectivamente) se muestra, junto con las variantes: H2305.6 (SEC ID Nos: 103 y 104 para los dominios variables ligeros y pesados, respectivamente), Y0101 (SEC ID Nos: 105 y 106 para los dominios variables ligeros y pesados, respectivamente) y Y0192 (SEC ID Nos: 107 y 108 para los dominios variables ligeros y pesados, respectivamente). Las diferencias respecto al F(ab)-12 se muestran en recuadros sombreados.

Las Figs. 10A y 10B muestran el alineamiento de las secuencias aminoacídicas de los dominios variables ligeros y pesados respectivamente de las variantes del anticuerpo anti-VEGF maduradas por afinidad del Ejemplo 3 comparadas con el F(ab)-12 del Ejemplo 1 (SEC ID Nos: 8 y 7 para los dominos variables ligeros y pesados, respectivamente). Los CDRs están subrayados y designados como L, cadena ligera, o H, cadena pesada, y los números 1-3). Las variantes se designan como Y0243-1 (SEC ID NOs: 109 y 110 para los dominios variables ligeros y pesados, respectivamente), Y0238-3 (SEC ID NOs: 111 y 112 para los dominios variables ligeros y pesados, respectivamente), Y0313-1 (SEC ID Nos: 113 y 114 para los dominios variables ligeros y pesados, respectivamente), y Y0317 (SEC ID Nos: 115 y 116 para los dominios variables ligeros y pesados, respectivamente). Las diferencias respecto al F(ab)-12 se muestran en recuadros sombreados.

La Fig. 11 muestra el resultado del ensayo de actividad en HuVEC del Ejemplo 3 para las variantes Y0238-3, Y0192 e Y0313-1 así como el F(ab)-12 de secuencia completa del Ejemplo 1.

La Fig. 12 muestra la inhibición de la mitogénesis inducida por VEGF mediante F(ab)-12 de secuencia completa del Ejemplo 1 (rhuMAb VEGF), un fragmento Fab del F(ab)-12 del Ejemplo 1 (rhuFab VEGF), y un fragmento Fab de la variante madurada por afinidad Y0317 del Ejemplo 3 (rhuFab VEGF (madurado por afinidad)).

Descripción detalla de las realizaciones preferidas I. Definiciones

El término "VEGF humano" tal y como se usa aquí se refiere al factor de crecimiento del endotelio vascular humano de 165 aminoácidos, y los factores de crecimiento del endotelio vascular relacionados de 121 189, y 206 aminoácidos, tal y como describe Leung y col., Science 246:1306 (1989), y Houck y col., Mol. Endocrin. 5:1806 (1991) junto a las formas alélicas y procesadas naturales de aquellos factores de crecimiento.

La presente invención proporciona anticuerpos con actividad antagonista frente al VEGF que son capaces de inhibir una o más de una actividad biológica del VEGF, por ejemplo, su actividad mitogénica o angiogénica. Los antagonistas del VEGF actúan interfiriendo la unión del VEGF a un receptor celular, incapacitando o destruyendo las células que han sido activadas por el VEGF, o interfiriendo con la activación de la célula del endotelio vascular después de la unión del VEGF a un receptor celular. Todos estos puntos de intervención por parte de un antagonista del VEFG se considerarán equivalentes para los propósitos de esta invención.

El término "receptor del VEFG" o "VEGFr" tal y como se usa aquí se refiere a un receptor celular para el VEGF, habitualmente, un receptor de superficie celular encontrado en células del endotelio vascular, así como a variantes de los mismos que mantengan la capacidad de unirse al hVEGF. Un ejemplo de un receptor del VEGF es la tirosina cinasa de tipo fms (flt), un receptor transmembrana de la familia de las tirosina cinasas. DeVries y col., Science 255:989 (1992); Shibuya y col., Oncogene 5:519 (1990). El receptor flt consta de un dominio extracelular, un dominio transmembrana, y un dominio intracelular con actividad tirosina cinasa. El dominio extracelular está implicado en la unión al VEGF, mientras el dominio intracelular está implicado en la transducción de la señal. Otro ejemplo, de un receptor del VEGF es el receptor flk-1 (también llamado KDR). Matthews y col., Proc. Nat. Acad. Sci. 88:9026 (1991); Terman y col., Oncogene 6:1677 (1991); Terman y col., Biochem. Biophys. Res. Común. 187:1579 (1992). La unión del VEGF al receptor flt lleva consigo la formación de al menos dos complejos de elevado peso molecular, que tienen un peso molecular aparente de 205.000 y 300.000 Daltons. Se considera que el complejo de 300.000 Daltons es un dímero que consta de dos moléculas de receptor unidas a una única molécula de VEGF.

El término "epitopo A4.6.1" cuando se usa aquí, a menos que se indique lo contrario, se refiere a la región del VEGF humano al cual se une el anticuerpo A4.6.1 descrito en Kim y col., Growth Factors 7:53 (1992) y Kim y col., Nature 362:841 (1993).

"Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. Entre aquellos que se encuentran en la necesidad de un tratamiento se incluyen los que ya presentan el trastorno así como aquellos en los que el trastorno se va a prevenir.

"Mamífero" para los objetivos del tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deportes o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferentemente, el mamífero es un humano.

"Anticuerpos" (Abs) e "inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras los anticuerpos muestran especificidad de unión a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas de tipo anticuerpo que carecen de especificidad por el antígeno. Los polipéptidos que se incluyen en este último caso, por ejemplo, se producen en bajos niveles por el sistema linfático y en niveles más elevados por mielomas.

"Anticuerpos nativos" e "inmunoglobulinas nativas" son habitualmente glicoproteínas heterotetraméricas de alrededor de 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace covalente disulfuro, mientras el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de distintos isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera también presenta puentes disulfuro intracatenarios regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un domino variable (V_{H}) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V_{L}) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos aminoácidos en particular forman una interfaz entre los dominios variables de la cadena ligera y pesada.

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas fracciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo en particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está uniformemente distribuida a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones hipervariables tanto en los dominios variables de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las fracciones más conservadas de los dominios variables se denominan región de entramado (FR). Cada uno de los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras comprenden cuatro FRs (FR1, FR2, FR3, y FR4, respectivamente), que adaptan en gran parte una configuración de hoja \beta, conectada por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte, de la estructura de hoja en \beta. Las regiones hipervariables en cada cadena, están unidas en proximidad estrecha por los FRs y, con las regiones hipervarialbles de la otra cadena contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (véase Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^{th} Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), páginas 647-669). Los dominios constantes no están directamente implicados en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero muestran varias funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente del anticuerpo.

El término "región hipervariable" cuando se usa aquí se refiere a los residuos aminoacídicos de un anticuerpo responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende residuos aminoacídicos de una "región de determinación de la complementariedad" o "CDR" (es decir, residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^{th} Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (es decir, residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Chotia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Los residuos de "entramado" o "FR" tal y como se definen aquí, son aquellos residuos de dominios variables diferentes de los residuos de la región hipervariable.

La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio único de unión al antígeno, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')_{2} que tiene dos sitios de combinación con el antígeno y todavía es capaz de unirse con el antígeno.

"Fv" es el mínimo fragmento de anticuerpo que contiene una región de reconocimiento del antígeno y de unión al mismo completas. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de una cadena pesada y de una cadena ligera en estrecha asociación no covalente. En esta configuración tres regiones hipervariables de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero V_{H}-V_{L}. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren al anticuerpo especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que consta solamente de tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión
completo.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxi-terminal del dominio CH1 de la cadena pesada incluyendo una o más cisteína(s) de la región bisagra del anticuerpo. Se designa Fab'-SH aquí al Fab' en el cual los residuo(s) cisteína de los dominios constantes contienen un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} se produjeron originariamente como parejas de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie vertebrada pueden asignarse a uno de los dos tipos claramente distintos, denominados kappa (\kappa) y lambda (\lambda), basándose en las secuencias aminoacídicas de sus dominios constantes.

Las inmunoglobulinas pueden asignarse a distintas clases dependiendo de la secuencia aminoacídica del dominio constante de sus cadenas pesadas. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y muchas de ellas pueden subdividirse además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman \alpha, \delta, \varepsilon, \gamma, y \mu respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las distintas clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.

El término "anticuerpo" tal y como se usa aquí abarca en el sentido más amplio y específicamente, anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de secuencia completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpos siempre y cuando muestren la actividad biológica deseada.

Los "fragmentos de anticuerpo" consisten en una fracción de un anticuerpo de secuencia completa, generalmente el dominio de unión o variable de dicho anticuerpo. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpos se incluyen Fab, Fab', F(ab')_{2} y fragmentos Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos de cadena simple; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

El término "anticuerpo monoclonal" tal y como se usa aquí se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos substancialmente homogénea, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se produzcan de forma natural y que pueden estar presentes en menor cantidad. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, y se dirigen contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra distintos determinantes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante del antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como aquel que se ha obtenido de una población de anticuerpos substancialmente homogénea, y no debe interpretarse como un requisito acerca de la producción del anticuerpo mediante un método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usarán según la presente invención pueden prepararse por el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y col., Nature 256:495 (1975), o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante. (véase, por ejemplo, la patente americana NO 4.816.567. Los "anticuerpos monoclonales" pueden también aislarse a partir de librerias de anticuerpos en fagos usando las técnicas descritas por ejemplo, en Clackson y col., Nature 352:624-628 (1991) y Marks y col., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991).

Los anticuerpos monoclonales aquí incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una fracción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie en particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo en particular, mientras el resto de las cadena(s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra subclase o clase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre y cuando muestren la actividad biológica deseada (patente americana U.S. 4.816.567; y Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

Las formas ``humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de la región hipervariable del receptor son sustituidos por residuos de la región hipervariable de especies no humanas (anticuerpo donante) tales como ratón, rata, conejo, o primates no humanos que presenten la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, se reemplazan residuos de la región de entramado (FR) de la inmunoglobulina humana por los residuos no humanos correspondientes. Además los anticuerpos humanizados pueden constar de residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar en mayor medida la generación. En general, el anticuerpo humanizado constará de substancialmente todos o al menos un, y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o substancialmente todas las regiones hipervariables corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o substancialmente todas las FRs son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también puede constar de al menos una fracción de una región constante de una inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones y col., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann y col, Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Strict. Biol. 2:593-596 (1992).

Los fragmentos de anticuerpos "Fv de cadena sencilla" o "sFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L} de un anticuerpo, en donde dichos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido Fv consta además de un engarce polipéptidico entre los dominios V_{H} y V_{L} que permite que sFv forme la estructura deseada para la unión del antígeno. Para tener una revisión sobre sFv véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New Cork, pp269-315 (1994).

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno, fragmentos que constan de un dominio variable de una cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de una cadena ligera (V_{L}) en la misma cadena polipeptídica (V_{H}-V_{L}). Mediante el uso de un engarce que sea suficientemente corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos se describen en mayor profundidad en, por ejemplo, la patente europea EP404.097; la patente mundial 93/11161; y Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993).

La expresión "anticuerpos lineales" cuando se usa a lo largo de esta solicitud se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata y col., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995). Brevemente, estos anticuerpos constan de un par de segmentos Fd en tándem (V_{H}-C_{H}1-V_{H}-C_{H}1) que forma un par de regiones de unión al antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.

Una "variante" del anticuerpo anti-VEGF, se refiere aquí, a una molécula que difiere en la secuencia aminoacídica respecto a una secuencia aminoacídica de un anticuerpo anti-VEGF "parental" en virtud de la adición, deleción y/o sustitución de un o más residuo(s) aminoacídicos en la secuencia del anticuerpo parental. Como se define en la reivindicación 1, la variante consta de un o más sustitución(ones) aminoacídicas en una o más región(nes) hipervariables del anticuerpo parental. Por ejemplo, la variante puede constar de al menos una, por ejemplo, de alrededor de una a alrededor de diez, y preferentemente de alrededor de dos a alrededor de cinco, sustituciones en una o más regiones hipervariables del anticuerpo parental. La variante tendrá una secuencia aminoacídica que presenta al menos una identidad en la secuencia aminoacídica de un 90% con las secuencias (SEC ID NO: 7 u 8) del dominio variable de la cadena ligera o pesada del anticuerpo parental más preferentemente al menos un 95%. La identidad u homología con respecto a esta secuencia se define aquí como el porcentaje de residuos aminoacídicos en la secuencia candidata que son idénticos con los residuos del anticuerpo parental, después del alineamiento de las secuencias y de la introducción de, si fuera necesario, para alcanzar el máximo porcentaje de identidad en la secuencia. Ninguna de las extensiones deleciones o inserciones N-terminal, C-terminal o interna en la secuencia del anticuerpo se interpretará que afecten a la identidad u homología de la secuencia. La variante retiene la capacidad de unirse al VEGF humano y presenta una afinidad de unión más fuerte que el anticuerpo parental. La variante puede tener una capacidad incrementada de inhibir la proliferación de células endoteliales inducida por el VEGF y/o un aumento de la capacidad de inhibir la angiogénesis inducida por el VEGF in vivo. Para analizar dichas propiedades, se debe comparar una forma Fab de la variante con una forma Fab del anticuerpo parental o una forma completa de la variante con una forma completa del anticuerpo parental, por ejemplo, puesto que se ha descubierto que el formato del anticuerpo anti-VEGF afecta a su actividad en los ensayos de actividad biológica tal y como se describe aquí. La variante del anticuerpo de interés particular aquí es aquella que muestra al menos alrededor de 10 veces, preferentemente al menos alrededor de 20 veces, y más preferentemente al menos alrededor de 50 veces de aumento de la actividad biológica cuando se compara con el anticuerpo parental.

El anticuerpo "parental" de la presente invención comprende secuencias aminoacídicas del dominio variable de la cadena pesada y ligera de las SEC ID NO: 7 y 8 y preferentemente, si están presentes, tiene región(ones) constantes del anticuerpo humano.

Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con el diagnóstico o los usos terapéuticos del anticuerpo, y puede incluir enzimas, hormonas, y otros solutos de naturaleza proteica o no proteica. En realizaciones preferentes, el anticuerpo se purificará (1) hasta más de un 95% en peso de anticuerpo tal y como se determina por el método de Lowry, y más preferentemente a más del 99% en peso, (2) en un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia aminoacídica N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes puesto que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos un paso de
purificación.

El término "etiquetado epitópicamente" cuando se usa aquí se refiere al anticuerpo anti-VEGF fusionado con un "etiqueta epitópica". El polipéptido de la etiqueta epitópica tiene suficientes residuos para proporcionar un epitopo contra el cual se pueda generar un anticuerpo, que todavía sea suficientemente corto como para que no interfiera con la actividad del anticuerpo anti-VEGF. La etiqueta epitópica preferentemente es suficientemente única como para que el anticuerpo generado en su contra no presente reacciones cruzadas con otros epitopos. Los polipéptidos etiqueta adecuados generalmente tienen al menos 6 residuos aminoacídicos y habitualmente entre 8-50 residuos aminoacídicos (preferentemente entre alrededor de 9-30 residuos). Entre los ejemplos se incluyen el polipéptido etiqueta flu HA y su anticuerpo 12CA5 (Field y col., Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165 (1988)); la etiqueta c-myc y los anticuerpos contra él 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 (Evan y col., Mol. Cell. Biol. 5(12):3610-3616 (1985); la etiqueta de la glicoproteína D del virus del Herpes Simples y su anticuerpo (Paborsky y col., Protein Engineering 3(6):547-553 (1990)). En ciertas realizaciones, la etiqueta epitópica es un "epitopo de unión a un receptor de rescate". Tal y como se usa aquí el término "epitopo de unión a un receptor de rescate" se refiere a un epitopo de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, o IgG_{4}) que es responsable de incrementar la vida media en el suero de la molécula de IgG
in vivo.

El término "agente citotóxico" tal y como se usa aquí se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o causa su destrucción. El término tiene la intención de incluir isótopos radioactivos (por ejemplo, I^{131}, I^{125}, Y^{90}, y Re^{186}), agentes quimioterápicos, y toxinas tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de los mismos.

Un "agente quimioterápico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Entre los ejemplos de agentes quimioterápicos se incluyen la Adriamicina, la doxorubicina, el 5-Fluorouracilo, el arabinósido de Citosina ("Ara-C"), la ciclofosfamida, el tiotepa, el Taxotere (docetaxel), el Busulfan, la Citosina, el Taxol, el Metotrexato, el Cisplatino, el Melfalan, la Vinblastina, la Bleomicina, el Etopósido, la Ifosfamida, la Mitomicina C, la Mitoxantrona, la Vincristina, la Vinorelbina, el Carboplatino, el Tenipósido, la Daunomicina, la Carminomicina, la Aminopterina, la Dactinomicina, las Mitomicinas, las Esperamicinas (véase patente americana U.S. 4.675.187), el Melfalan y otras mostazas nitrogenadas relacionadas.

El término "profármaco" tal y como se usa en esta solicitud se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacológicamente activa que es menos citotóxica para las células tumorales comparado con el fármaco parental y que es capaz de ser activado o convertido enzimáticamente en la forma parental más activa. Véase, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp.375-382, 615^{th} Meeting Belfast (1986) y Stella y col., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery" Directed Drug Delivery, Borchardt y col., (ed.), pp.247-267, Humana Press (1985). Los profármacos de esta invención incluyen, pero no se limitan a ello, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados con D-aminoácidos, profármacos glicosilados, profármacos que contienen \beta-lactámicos, opcionalmente profármacos que contienen fenoxiacetamida sustituida u opcionalmente profármacos que contienen fenilacetamida substituida, profármacos 5-fluorocitosina y otros profármacos 5-fluorouridina que pueden transformarse en la forma de fármaco libre más activa y citotóxica. Entre los ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden derivatizarse en una forma profármaco para su uso en esta invención se incluyen, pero no están limitados a ellos, aquellos agentes quimioterápicos descritos anteriormente.

El término "marcaje" cuando se usa aquí se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente al anticuerpo. El marcaje puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcajes de radioisótopos o marcajes fluorescentes) o, en el caso de un marcaje enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato que sea detectable.

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Por "fase sólida" se entiende toda aquella matriz no acuosa a la que se puede adherir el anticuerpo de la presente invención. Entre los ejemplos de fases sólidas incluidas aquí se encuentran aquellas formadas parcialmente o completamente por cristal (por ejemplo, cristal de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede incluir el pocillo de una placa de ensayo; en otros es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad). Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tales como las que se describen en la patente americana NO 4.275.149.

Un "liposoma" es una pequeña vesícula compuesta por varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensoactivos que son útiles para la liberación de un fármaco (tal como los anticuerpos anti-VEGF descritos aquí, y opcionalmente, un agente quimioterapéutico) a un mamífero. Los componentes del liposoma están dispuestos comúnmente en formación de bicapa, similar a la disposición lipídica de las membranas biológicas. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que se encuentra ordinariamente asociada en la fuente natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada no es otra más que aquella que está en la forma o situación en la que se encuentra en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico aisladas por tanto, se distinguen de la molécula de ácido nucleico en que ésta existe en las células de forma natural. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico que se encuentra en las células que ordinariamente expresan el anticuerpo en donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de la de las células de forma
natural.

La expresión "secuencias control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped en particular. Las secuencias control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación, e intensificadores de la transcripción.

Un ácido nucleico se encuentra "unido operativamente" cuando está situado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un ADN para una presecuencia o un líder secretor está unido operativamente al ADN por un polipéptido si está expresada como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o una secuencia intensificadora está unido operativamente a una secuencia codificante si éste afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si está situado de forma que facilite la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se van a engarzar son contiguas, y, en el caso de un líder secretor contiguas y en pauta de lectura. Sin embargo, los intensificadores no tienen porqué ser contiguos. El engarce se consigue por ligación en sitios de restricción adecuados. Si tales sitios no existen, se usan oligonucleótidos sintéticos adaptadores o engarces según la práctica convencional.

Tal y como se usan aquí, las expresiones "célula", "línea celular", y "cultivo celular" se usan de forma intercambiable y todas estas designaciones incluyen la progenie. Por tanto, las palabras "transformates" y "células transformadas" incluyen la célula principal primaria y los cultivos derivados a partir de ella sin tener en consideración el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie mutada que tenga la misma función o actividad biológica tal y como se analiza en la célula transformada originariamente. En donde se prevén distintas designaciones, esto estará claro a partir del contexto.

II. Modos de llevar a cabo la invención

Los ejemplos mostrados más adelante describen la producción de una variante humanizada de anticuerpos anti-VEGF con propiedades deseables desde una perspectiva terapéutica incluyendo: (a) fuerte afinidad de unión por el antígeno VEGF; (b) una capacidad para inhibir la proliferación de células endoteliales inducida por VEGF in vitro; y (c) la capacidad de inhibir la angiogénesis inducida por VEGF in vivo.

Las afinidades del anticuerpo pueden determinarse tal y como se describe en los ejemplos mostrados más adelante. Las variantes humanizadas de los anticuerpos son aquellos que se unen al VEGF humano con un valor de K_{d} no superior a 1 x 10^{-7}M; preferentemente no superior a alrededor de 1 x 10^{-8}M; y más preferentemente no superior a aproximadamente 5 x 10^{-9}M.

Aparte de anticuerpos con una fuerte afinidad de unión por el VEGF humano, también es deseable seleccionar variantes humanizadas de los anticuerpos que tienen otras propiedades beneficiosas desde el punto de vista terapéutico. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser aquel que inhiba el crecimiento de las células endoteliales en respuesta al VEGF. En una realización, el anticuerpo puede ser capaz de inhibir la proliferación de células endoteliales bovinas de capilares en respuesta a una concentración de VEGF próxima a la máxima efectiva (3 ng/ml). Preferentemente, el anticuerpo tiene una dosis efectiva 50 (ED50) para la inhibición de la proliferación de células endoteliales inducida por VEGF no superior a alrededor de 5 nM, preferentemente, no superior a alrededor de 1 nM, y más preferentemente, no superior a alrededor de 0,5 nM en este "ensayo de crecimiento de células endoteliales", es decir, a estas concentraciones el anticuerpo es capaz de inhibir en un 50% el crecimiento de células endoteliales inducido por VEGF in vitro. Un ensayo preferido de "crecimiento de células endoteliales" implica el cultivo de células endoteliales capilares derivadas de córtex adrenal bovino en presencia de medio Dulbecco's modified Eagle's (DMEM) (GIBCO) bajo en glucosa suplementado con un 10% de suero bovino, 2 mM de glutamina, y antibióticos (medio de crecimiento) esencialmente como se describe en el Ejemplo 1 mostrado más adelante. Estas células endoteliales se siembran a la densidad de 6 x 10^{3} células por pocillo en medio de crecimiento. Entonces, el anticuerpo anti-VEGF parental (control) o el anticuerpo humanizado o la variante del anticuerpo anti-VEGF se añaden a un rango de concentración que va de 1 a 5000 ng/ml. Al cabo de 2-3 h, se añade VEGF purificado a una concentración final de 3 ng/ml. Como control de especificidad, cada anticuerpo puede añadirse a las células endoteliales a la concentración de 5000 ng/ml, tanto solo como en presencia de 2 ng/ml de bFGF. Después de 5 o 6 días, las células se disocian mediante su exposición a tripsina y se cuentan en un contador Coulter (Coulter Electronics, Hialeah, FL). Los datos pueden analizarse mediante un programa de ajuste de curva de cuatro parámetros (kaleidaGraph).

La variante humanizada preferida del anticuerpo anti-VEGF puede ser también aquella que muestra una actividad de supresión de tumores in vivo. Por ejemplo, el anticuerpo puede suprimir el crecimiento de células A673 de rabdomiosarcoma humano o de células MDA-MB-435 de carcinoma de mama en ratones nude. Para los estudios de tumores in vivo, las células A673 de rabdomiosarcoma humano (ATCC; CRL 1598) o las células MDA-MB-435 (disponibles en el ATCC) se cultivan en DMEM/F12 suplementado con un 10% de suero fetal bovino, 2 mM de glutamina y antibióticos tal y como se describe en el ejemplo 1 mostrado más adelante. Se inyectan subcutáneamente en ratones nude BALB/c, de 6-10 semanas de edad, 2 x 10^{6} células tumorales en el área dorsal en un volumen de 200 \muL. Entonces los animales se tratan con el anticuerpo humanizado o la variante del anticuerpo y con un anticuerpo control que no presente actividad en este ensayo. El MAb humanizado o la variante de anticuerpo del VEGF se administran a la dosis de 0,5 y/o 5 mg/kg. Cada MAb se administra dos veces a la semana por vía intraperitoneal en un volumen de 100 \muL, empezando 24 h después de la inoculación de las células tumorales. El tamaño del tumor se determina a intervalos semanales. Cuatro semanas después de la inoculación de células tumorales, los animales se sacrifican y los tumores se extraen y pesan. El análisis estadístico puede realizarse mediante ANOVA. Preferentemente, el anticuerpo inhibe alrededor del 50-100% el crecimiento de células tumorales A673 a la dosis de 5 mg/kg en este "ensayo tumoral in vivo", preferentemente alrededor del 70-100% y más preferentemente alrededor del 80-100%.

En la realización preferida, la variante humanizada del anticuerpo es incapaz de producir una respuesta inmunogénica tras la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo a un paciente humano. Si la respuesta inmunogénica se produce, preferentemente la respuesta será tal que el anticuerpo todavía proporcione un beneficio terapéutico al paciente tratado con él.

La variante humanizada del anticuerpo también es preferentemente aquella que sea capaz de inhibir la angiogénesis inducida por el VEGF en un humano, por ejemplo, que inhiba el crecimiento de un tumor humano y/o que inhiba la angiogénesis intraocular en trastornos retinianos.

Los anticuerpos preferidos se unen al "epitopo A4.6.1" tal y como se define aquí. Para buscar anticuerpos que se unan al epitopo en el VEGF humano unido a un anticuerpo de interés (por ejemplo, aquellos que bloquean la unión del anticuerpo A4.6.1 al VEGF humano), puede realizarse un ensayo de rutina de bloqueo cruzado tal y como se describe en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). Alternativamente, puede realizarse un mapeo epitópico, por ejemplo como se describe en Champe y col., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995) para determinar si el anticuerpo puede unirse a un epitopo de interés.

Los anticuerpos de la realización preferida aquí tienen un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia aminoacídica representada por la fórmula: FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4, en donde, "FR1-4" representa las cuatro regiones de entramado y "CDRH1-3" representa las tres regiones hipervariables de un dominio pesado variable de un anticuerpo anti-VEGF. FR1-4 puede derivarse de una "secuencia consenso" (es decir, de los aminoácidos más comunes de una clase, subclase o subgrupo de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas humanas) como en los ejemplos mostrados más adelante o pueden derivarse a partir de una región de entramado de un anticuerpo humano individual o a partir de una combinación de distintas secuencias de una región de entramado. Muchas de las secuencias de una región de entramado de un anticuerpo humano están recogidas por ejemplo, en Kabat y col., supra. En una realización preferida, la FR pesada variable está proporcionada por una secuencia consenso de un subgrupo de inmunoglobulina humana como se recoge en Kabat y col., supra. Preferentemente, el subgrupo de inmunoglobulina humana es el subgrupo III de cadenas pesadas humanas (por ejemplo, como en la SEC ID
NO: 11).

La secuencia de FR pesada variable humana tiene preferentemente substituciones, por ejemplo, en donde el residuo FR humano es reemplazado por el residuo no humano correspondiente (por "el residuo no humano correspondiente" significa el residuo no humano con la misma numeración posicional de Kabat que el residuo humano de interés cuando las secuencias humana y no humana se alinean), pero la sustitución con el residuo no humano no es necesario. Por ejemplo, la sustitución de un residuo FR diferente del residuo correspondiente no humano puede seleccionarse por selección por fagos (véase el Ejemplo 2 mostrado más adelante). Los ejemplos de residuos de FR pesados variables que pueden ser sustituidos incluyen uno cualquiera o más residuos FR con la numeración: 37H, 49H, 67H, 69H, 71H, 73H, 75H, 76H, 78H, 94H (se emplea aquí la numeración de residuos de Kabat). Preferentemente, se sustituyen al menos dos, o al menos tres, o al menos cuatro de estos residuos. Una combinación particularmente preferida de sustituciones de FR es: 49H, 69H, 71H, 73H, 76H, 78H, Y 94H.

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Con respecto a las regiones hipervariables de la cadena pesada, éstas preferentemente tendrán secuencias aminoacídicas como sigue:

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: CDRH1

: GYX_{1}X_{2}X_{3}X_{4}YGX_{5}N (SEC ID NO: 117), en donde X_{1} es D, T o E, pero preferentemente es D o T; X_{2} es F, W, o Y, pero preferentemente es F; X_{3} es T, Q, G o S pero preferentemente es T; X_{4} es H o N; y X_{5} es M o I, pero preferentemente es M.

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: CDRH2

: WINTX_{1}TGEPTYAADFKR (SEC ID NO: 118), en donde X_{1} es Y o W, pero preferentemente es Y.

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: CDRH3

: YPX_{1}YX_{2}X_{3}X_{4}X_{3}HVNFDV (SEC ID NO: 119), en donde X_{1} es H o Y; X_{2} es Y, R, K, I, T, E, o W, pero preferentemente es Y; X_{3} es G, N, A, D, Q, E, T, K o S, pero preferentemente es G; X_{4} es S, T, K, Q, N, R, A, E, o G, pero preferentemente es S o T; y X_{5} es S o G, pero preferentemente es S.

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El dominio variable de la cadena pesada opcionalmente comprende el que se ha designado como "CDR7" aquí dentro de(es decir, formando parte de) FR3 (véase Figs. 9B y 10B), en donde CDR7 puede tener la siguiente secuencia aminoacídica:

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: CDR7

: X_{1}SX_{2}DX_{3}X_{4}X_{5}X_{6}TX_{7} (SEC ID NO: 120), en donde X_{1} es F, I, V, L, o A, pero preferentemente es F; X_{2} es A, L, V, o I, pero preferentemente es L; X_{3} es T, V o K, pero preferentemente es T; X_{4} es S o W, pero preferentemente es S; X_{5} es S, o K pero preferentemente es K; X_{6} es N, o S, pero preferentemente es S; y X_{7} es V, A, L, o I, pero preferentemente es A.

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Los anticuerpos de la realización preferida aquí tienen un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia aminoacídica representada por la fórmula: FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4, en donde "FR1-4" representa las cuatro regiones de entramado y "CDRL1-3" representa las tres regiones hipervariables de un dominio variable ligero de un anticuerpo anti-VEGF. FR1-4 puede derivarse de una "secuencia consenso" (es decir, los aminoácidos más comunes de una clase, subclase, o subgrupo de cadenas ligeras o pesadas de las inmunoglobulinas humanas) como en los ejemplos que se muestran más adelante o pueden derivarse de una región de entramado de un anticuerpo humano individual o a partir de una combinación de distintas secuencias de regiones de entramado. En una realización preferente, la FR ligera variable la proporciona una secuencia consenso de un subgrupo de una inmunoglobulina humana como se recopila en Kabat y col., supra. Preferentemente, el subgrupo de la inmunoglobulina humana es el subgrupo I de cadenas ligeras kappa humanas (por ejemplo, como en la SEC ID NO: 12).

La secuencia de FR ligera variable humana preferentemente presenta sustituciones, por ejemplo, en las que el residuo FR humano se reemplaza por el residuo correspondiente de ratón, pero la sustitución con el residuo no humano no es necesaria. Por ejemplo, la sustitución por un residuo diferente del residuo no humano correspondiente puede seleccionarse mediante selección con fagos (véase el Ejemplo 2 mostrado más adelante). Entre los residuos de FR ligeros variables ejemplares que pueden sustituirse se incluyen uno cualquiera o más de los residuos FR con número: 4L, 46L y 71L (se emplea aquí la numeración de residuos de Kabat). Preferentemente, sólo 46L se sustituye. En otra realización, se sustituyen tanto 4L como 46L.

Con respecto a las CDRs, estos presentan preferentemente las siguientes secuencias aminoacídicas:

\vskip1.000000\baselineskip

: CDRL1

: X_{1}AX_{2}X_{3}X_{4}X_{5}SNYLN (SEC ID NO: 121), en donde X_{1} es R o S, pero preferentemente es S; X_{2} es S o N, pero preferiblemente es S; X_{3} es Q o E, pero preferentemente es Q; X_{4} es Q o D, pero preferentemente es D; y X_{5} es I o L pero preferentemente es I.

\vskip1.000000\baselineskip

: CDRL2

: FTSSLHS (SEC ID NO: 122).

\newpage

: CDRL3

: QQYSX_{1}X_{2}PWT (SEC ID NO: 123), en donde X_{1} es T, A o N, pero preferentemente es T; y X_{2} es V o T, pero preferentemente es V.

Las variantes de anticuerpos anti-VEGF son las variantes de F(ab)-12 mostradas en el Ejemplo 1, tales como las formas maduradas por afinidad incluyendo las variantes Y0317, Y0313-1 e Y0238-3 del Ejemplo 3, siendo Y0317 la variante preferida. Los métodos para generar anticuerpos humanizados anti-VEGF de interés aquí se explican más detalladamente más adelante.

A. Preparación del anticuerpo

En los ejemplos mostrados más adelante se describen procedimientos para la humanización de los anticuerpos anti-VEGF no humanos y la generación de variantes de los anticuerpos anti-VEGF. Con el objetivo de humanizar un anticuerpo anti-VEGF, se prepara como material de partida el anticuerpo no humano. En donde se va a generar una variante es el anticuerpo parental el que se prepara. Se describirán en las siguientes secciones técnicas ejemplares para la generación de dicho material de partida de anticuerpos no humanos y anticuerpos parentales.

(i) Preparación del antígeno

El antígeno del VEGF que se usa para la producción de los anticuerpos puede ser, por ejemplo, el VEGF intacto o un fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento del VEGF que comprenda el "epitopo A4.6.1"). Otras formas de VEGF útiles para la generación de anticuerpos serán evidentes para los expertos en la materia. El antígeno del VEGF usado para generar el anticuerpo, es preferentemente el VEGF humano, por ejemplo, como se describe en Leung y col., Science 246:1306 (1989), y Houck y col., Mol. Endocrin. 5:1806 (1991).

(ii) Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlonales se generan preferentemente en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y de un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante a una proteína que sea inmunogénica en la especie que se va a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa, albúmina sérica, tiroglobulina bovina, o el inhibidor de la tripsina de soja usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, el éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína, la N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), el glutaraldehído, el anhídrido succínico, el SOCL_{2} o el R^{1}N=C=NR, en donde R y R^{1} son distintos grupos alquilo.

Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos, o derivados mediante la combinación, por ejemplo, de 100 \mug o 5 \mug de proteína o conjugado (para conejos o ratones respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes después los animales se inyectan con de 1/5 a 1/10 parte de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. Entre siete y 14 días después los animales se sangran y el suero se analiza para titular el anticuerpo. Los animales se inyectan hasta que el título alcanza una meseta. Preferentemente, los animales se inyectan con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un agente de entrecruzamiento diferente. Los conjugados también pueden prepararse en cultivo de células recombinante como fusiones de proteínas. También se pueden usar de manera adecuada agentes agregantes como el alumbre para aumentar la respuesta inmune.

(iii) Anticuerpos monoclonales

Se pueden preparar anticuerpos monoclonales mediante el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y col., Nature, 256:495 (1975), o puede prepararse mediante métodos de ADN recombinante (patente americana 4.816.567).

En el método del hibridoma, un ratón u otro animal huésped adecuado, tal como un hámster o un macaco, se inmuniza como se describió aquí anteriormente para generar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Alternativamente, se pueden inmunizar los linfocitos in vitro. Los linfocitos entonces se fusionan con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilénglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Las células de hibridoma así preparadas se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen del enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo de los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina, y timidita (medio HAT), sustancias que previenen el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.

Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan un nivel elevado estable de producción del anticuerpo por las células que producen el anticuerpo seleccionado, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre estas, las líneas celulares de mieloma preferidas son líneas de mieloma murino, tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOP-21 y M.C.-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles en la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Las células de mieloma humano y las de heteromieloma ratón-humano se han descrito también para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

El medio de cultivo en el que crecen las células de hibridoma se ensaya para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante ensayos de unión in vitro, tales como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA).

La afinidad de unión por el anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse por el análisis de Scatchard de Munson y col., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos con la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones pueden subclonarse mediante dilución limitante y cultivarse mediante técnicas estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). El medio de cultivo adecuado para este propósito incluye, por ejemplo, el medio D-MEM o el medio RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden crecerse in vivo en forma de ascitas de tumores en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente a partir del medio de cultivo, el fluido de ascitas, o el suero mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.

El ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales se aísla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos capaces de unirse específicamente a genes que codifican para las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como fuente preferente de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede insertarse en vectores de expresión, que se transfectan entonces en células huésped tales como células E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que de lo contrario no producen la proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. La producción recombinante de anticuerpos se describirá con más detalle más adelante.

(iv) Humanización y variantes de secuencia aminoacídica

Los ejemplos 1-2 mostrados más adelante describen procedimientos de humanización de un anticuerpo anti-VEGF. En ciertas realizaciones, puede ser deseable generar variantes de la secuencia aminoacídica de estos anticuerpos humanizados, particularmente en donde éstas mejoran la afinidad de unión u otras propiedades biológicas del anticuerpo humanizado. El ejemplo 3, describe métodos para generar variantes de la secuencia aminoacídica de un anticuerpo anti-VEGF con un aumento de la afinidad en relación con el anticuerpo parental.

Las variantes de la secuencia aminoacídica del anticuerpo anti-VEGF se preparan introduciendo cambios nucleotídicos adecuados en el ADN del anticuerpo anti-VEGF, o mediante síntesis peptídica. Tales variantes, incluyen, por ejemplo, deleciones a partir de y/o inserciones en y/o sustituciones de, residuos de las secuencias aminoacídicas de los anticuerpos anti-VEGF de los ejemplos aquí mostrados. Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución se realiza para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios aminoacídicos también pueden alterar procesos post-traduccionales del anticuerpo humanizado o de la variante del anticuerpo contra el VEGF, tales como el cambio de la numeración o posición de los sitios de glicosilación.

Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo anti-VEGF que son localizaciones preferentes para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de cribado por alanina", como describe Cunningham y Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Aquí se identifica un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados como arg, asp, his,lys, y glu) y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (más preferentemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el antígeno VEGF. Aquellas localizaciones de aminoácidos que demuestran una sensibilidad funcional a las sustituciones entonces se refinan introduciendo más sustituciones u otras variantes en, o para, los sitios de sustitución. Por tanto, mientras el sitio para la introducción de la variación de la secuencia aminoacídica está predeterminada, la naturaleza de la mutación per se necesita no estar predeterminada. Por ejemplo, para analizar la realización de una mutación en un sitio determinado, se realiza mutagénesis de rastreo con alanina o mutagénesis al azar en el codón o región diana y las variantes del VEGF expresadas se analizan para la actividad deseada. La mutagénesis de rastreo con alanina se describe en el Ejemplo 3.

Las inserciones en la secuencia aminoacídica incluyen fusiones amino- y/o carboxi-terminal con un rango de longitud de un residuo a polipéptidos que contienen un centenar o más residuos, así como inserciones en la secuencia de un único o múltiples residuos aminoacídicos. Entre los ejemplos de inserciones terminales se incluyen un anticuerpo anti-VEGF con un residuo metionil N-terminal o el anticuerpo fusionado con una etiqueta epitópica. Otras variantes por inserción de la molécula del anticuerpo anti-VEGF incluyen la fusión al extremo N- o C-terminal del anticuerpo anti-VEGF de un enzima o un polipéptido que aumenta la vida media del anticuerpo en suero (véase más adelante).

Otro tipo de variante es una variante de sustitución aminoacídica. Estas variantes tienen al menos un residuo aminoacídico en la molécula del anticuerpo anti-VEGF que se elimina para ser sustituido por un residuo diferente que se inserta en su lugar. Los sitios de mayor interés para la sustitución por mutagénesis incluyen regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de FR. Se muestran en la Tabla 1 sustituciones conservativas bajo el título de "sustituciones preferentes". Si tales sustituciones resultan en un cambio de actividad biológica, entonces, se pueden introducir cambios más sustanciales denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1, o como se describe en mayor profundidad más adelante en referencia a las clases de aminoácidos, y los productos que se analizan.

TABLA 1

1

Se consiguen sustanciales modificaciones en las propiedades biológicas del anticuerpo mediante la selección de sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del eje central del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como conformación en hoja o de hélice (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en la región diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que se presentan de forma natural se dividen en grupos en base a las propiedades comunes de las cadenas laterales:

(1): hidrofóbicas: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2): hidrofílicas neutras: cys, ser, thr;

(3): acídicas: asp; glu;

(4): básicas: asn, gln, his, lys, arg;

(5): residuos que afectan la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6): aromáticas: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservativas supondrían el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.

También puede sustituirse cualquier residuo de cisteína que no esté implicado en el mantenimiento de la conformación adecuada del anticuerpo humanizado o de la variante del anticuerpo anti-VEGF, generalmente, por una serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir un entrecruzamiento aberrante. Por el contrario, se pueden incorporar al anticuerpo enlaces cisteína para mejorar su estabilidad (particularmente, en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).

Un tipo particularmente preferido de variante substitucional implica la sustitución de una o más regiones hipervariables de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado). Generalmente, las variante(s)
resultantes seleccionadas para un mayor desarrollo tendrán unas propiedades biológicas mejoradas en relación a los anticuerpos parentales a partir de los que se generan. Un procedimiento adecuado para generar dichas variantes substitucionales es la maduración por afinidad usando una selección por fagos (véase el Ejemplo 3 aquí). Brevemente, varios sitios de las regiones hipervariables (por ejemplo, sitios 6-7) se mutan para generar todas las posibles sustituciones aminoacídicas en cada sitio. Las variantes del anticuerpo así generadas se expresan en forma monovalente a partir de partículas filamentosas de fagos como fusiones del producto del gen III del M13 empaquetado dentro de cada partícula. Las variantes seleccionadas en fagos se analizan entonces respecto a su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como aquí se describe. Con el objetivo de identificar sitios de regiones hipervariable candidatas a la modificación, se puede realizar una mutagénesis por cribado de alanina (véase el Ejemplo 3) para identificar residuos de una región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión al antígeno. Alternativamente, o además, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el VEGF humano. Tales residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos a la sustitución según las técnicas elaboradas aquí. Una vez se han generado dichas variantes, el panel de variantes se somete a un análisis tal y como se describe aquí y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes pueden seleccionarse para un desarrollo adicional.

Otro tipo de variante aminoacídica del anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del anticuerpo. Se entiende por alteración la deleción de una o más regiones que se encuentran en el anticuerpo, y o la adición de un o más sitios de glicosilación que no estaban presentes en el anticuerpo.

La glicosilación de los anticuerpos clásicamente es una N- u O-glicosilación. La N-glicosilación se refiere a la unión del grupo carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparraguina. Las secuencias tripeptídicas asparragina-X-serina y asparraguina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del grupo carbohidrato a la asparraguina de la cadena lateral. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio potencial de glicosilación. La O-glicosilación se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se consigue de forma conveniente alterando la secuencia aminoacídica de tal modo que ésta contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para los sitios de N-glicosilación). La alteración también puede realizarse por la adición de, o sustitución de, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para los sitios de O-glicosilación).

Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican para variantes del anticuerpo anti-VEGF se preparan mediante una variedad de métodos conocidos en la materia. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, el aislamiento a partir de una fuente natural (en el caso de variantes en la secuencia aminoacídica de origen natural) o la preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida), mutagénesis por PCR, y mutagénesis por inserción de un casete de una variante preparada anteriormente o de una versión no variante del anticuerpo anti-VEGF.

(v) Anticuerpos humanos

Como alternativa a la humanización, se pueden generar anticuerpos humanos. Por ejemplo, es posible actualmente producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos sin producción de inmunoglobulinas endógenas. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (J_{H}) en ratones quiméricos y en ratones con mutaciones en las líneas germinales resulta en la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógena. La transferencia de la colección de genes de inmunoglobulinas de la línea germinal humana en dicho ratón con mutaciones en la línea germinal resulta en la producción de anticuerpos humanos tras el cambio del antígeno. Véase, por ejemplo, Jakobovits y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits y col., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann y col., Year in Immuno., 7:33 (1993); y las patentes americanas 5.591.669, 5.589.369, y 5.545.807. Los anticuerpos humanos pueden derivarse también de librerías de expresión en fagos (Hoogenboom y col., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); y las patentes americanas 5.565.332 y 5.573.905). Como se describió anteriormente, los anticuerpos humanos también pueden generarse mediante células B activadas in vitro (véase patentes americanas 5.567.610 y 5.229.275).

(vi) Fragmentos de anticuerpos

En ciertas realizaciones, el anticuerpo humanizado o la variante del anticuerpo anti-VEGF es un fragmento de anticuerpo. Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivan de anticuerpos intactos vía digestión proteolítica (véase, por ejemplo, Morimoto y col., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan y col., Science 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden producirse actualmente directamente en células huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente a partir de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')_{2} (Carter y col., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). En otra realización, el F(ab')_{2} se forma usando la cremallera de leucinas GCN4 para promover el ensamblaje de la molécula de F(ab')_{2}. Según otra estrategia, los fragmentos Fv, Fab o F(ab')_{2} se pueden aislar, directamente a partir de un cultivo de células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos son conocidas por los expertos en la materia.

Anticuerpos multiespecíficos

En algunas realizaciones, puede ser deseable generar anticuerpos anti-VEGF humanizados o variantes que tengan especificidades de unión para al menos dos epitopos distintos. Los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos epitopos distintos de la proteína VEGF. Alternativamente, un brazo de anti-VEGF puede combinarse con un brazo que se une a una molécula que actúa de desencadenante que se halle en la superficie celular de leucocitos como por ejemplo una molécula de receptor de células T (por ejemplo CD2 o CD3), o receptores de Fc para IgG (Fc\gammaR), como el Fc\gammaRI (CD64), Fc\gammaRII (CD32) y Fc\gammaRIII (CD16) con el fin de focalizar los mecanismos de defensa celular para expresar VEGF. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a VEGF y un brazo que se une al agente citotóxico (por ejemplo, la saporina, el interferon-\alpha, el alcaloide vinca, la cadena A de la ricina, el metrotexato o el hapteno del isótopo radioactivo). Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos F(ab')2).

De acuerdo con otra aproximación para la generación de anticuerpos biespecíficos, la interfaz entre una pareja de moléculas de anticuerpo puede diseñarse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfaz preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas pequeñas de aminoácidos de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales mayores (por ejemplo, tirosina o triptófano). Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar al de las cadenas laterales se crean sobre la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando cadenas aminoacídicas mayores con otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Ello proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre productos finales no deseados como los homodímeros. Véase la patente internacional WO96/27011, publicada el 6 de Setiembre de 1996.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos unidos o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse con la avidina, el otro con la biotina. Los anticuerpos heteroconjugados pueden generarse mediante cualquiera de los procedimientos de unión convencionales. Los agentes de unión adecuados son bien conocidos por los expertos en la materia, y se describen en la patente americana U.S. 4.676.980, junto con diversas técnicas de unión.

Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse utilizando la unión química. Brennan y col., Science 229:81 (1985) describen un procedimiento en donde los anticuerpos intactos se cortan proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del arsenito sódico agente acomplejante del ditiol para estabilizar los ditioles próximos y prevenir la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados se convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados del Fab'-TNB se reconvierte entonces en Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmovilización de enzimas. En otra realización, los fragmentos Fab'-SH recuperados directamente de E. coli pueden acoplarse químicamente in vitro para generar anticuerpos biespecíficos. Shalaby y col., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992).

Se han descrito diversas técnicas para la generación y aislamiento de fragmentos de anticuerpos directamente del cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos mediante la utilización de cremalleras de leucina. Kostelny y col., J. Immunol. 148 (5):1547-1553 (1992). Los péptidos de cremalleras de leucinas de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos distintos mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron a la región bisagra para formar monómeros y luego se re-oxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este procedimiento también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología del "diacuerpo" descrita por Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-64448 (1993) ha proporcionado el mecanismo alternativo para la generación de fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (VL) por un engarce que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Según ello, los dominios VH y VL en un fragmento son forzados a emparejarse con los dominios complementarios VL y VH de otro fragmento, formándose así dos sitios de unión al antígeno. También se ha publicado otra estrategia para la generación de fragmentos de anticuerpo para la utilización de dímeros de cadena sencilla Fv(sFv). Véase Gruber y col., J. Immunol. 152:5368 (1994). Alternativamente, el anticuerpo biespecífico puede ser un "anticuerpo lineal" producido tal como se describe en Zapata y col., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995).

También se contemplan en la presente invención los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos. Tutt y col., J. Immunol. 147:60 (1991).

(viii) Otras modificaciones

Otras modificaciones del anticuerpo anti-VEGF humanizado o variante también se contemplan. Por ejemplo, puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, con el fin de aumentar la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cáncer, por ejemplo. Es posible introducir residuos de cisteína en la región Fc, lo que permite la formación del enlace disulfuro intracatenario en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o un aumento de la muerte celular mediada por el complemento y de la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Véase, Caron y col., J. Exp Med 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con una actividad anti-tumoral aumentada también pueden prepararse mediante la utilización de uniones heterobifuncionales tal como se describe en Wolff y col., Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, un anticuerpo puede diseñarse para que tenga regiones Fc duales y en consecuencia pueda aumentar la lisis por el complemento y las capacidades de ADCC. Véase Stevenson y col., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).

La invención también abarca los inmunoconjugados que comprenden el anticuerpo descrito aquí conjugado a un agente citotóxico como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina activa enzimáticamente de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de lo mismo), o un isotipo radiactivo (es decir, un radioconjugado).

Los agentes quimioterapéuticos de utilidad en la generación de dichos inmunoconjugados se han descrito anteriormente. Las toxinas activas enzimáticamente y los fragmentos de lo mismo que pueden utilizarse incluyen la cadena A de la difteria, los fragmentos activos de no unión de la toxina de la difteria, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modecina, la alfa-sarcina, las proteínas de Aleruritis fordii, las proteínas de la diantina, las proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAPS, el inhibidor de charantia momordica, la curcina, crotina, el inhibidor de la sapaonaria officinalis, la gelonina, la mitogelina, la restrictocina, la fenomicina, la enomicina y los tricotecenos. Están disponibles diversos radionúclidos para la producción de anticuerpos anti-VEGF radioconjugados. Ejemplos incluyen Bi^{212}, I^{131}, In^{131}, Y^{90} y Re^{186}.

Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se generan con ayuda de diversos agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales como el N-succinimidil-3-(2-piriditiol)propionato (SPDP), el iminotiolato (IT), los derivados bifuncionales de imidoésteres (como el dimetil adipimidato HCl), los ésteres activos (como el suberato disuccinimidil), los aldehídos (como el glutaraldehido), los compuestos bis-azido (como el bis(p-azidobenzoil)hexanediamina), los derivados de bis-diazonio (como el bis-(p-diazoniobenzoilo)-etilendiamina), los diisocianatos (como el tolieno 2,6-diisocianato), y los compuestos bis-activos de fluorina (comoel 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse tal como se describe en Vitetta y col., Science 238:1098. El ácido 1-isotiocianatobenzoil-3-metildietilen triaminopenta acético marcado con carbono-14 (MX-DTPA) es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de radionucleótidos con el anticuerpo. Véase la patente internacional WO 94/11026.

En otra realización, el anticuerpo puede estar conjugado a un "receptor" (como la estreptavidina) para la utilización en el premarcado del tumor en donde el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido de la eliminación del conjugado no unido de la circulación utilizando un agente aclarante y luego la administración al paciente, seguido por la eliminación del conjugado no unido de la circulación utilizando un agente aclarante y a continuación la administración de un "ligando" (por ejemplo, la avidina) que se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionúclido).

Los anticuerpos anti-VEGF aquí descritos también pueden formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en la materia, tal como se describe en Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); y las patentes americanas U.S. 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas con un tiempo de circulación aumentado se describen en la patente americana U.S. 5.013.556.

En particular, los liposomas de utilidad pueden generarse mediante el procedimiento de evaporación de fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruden a través de filtros de tamaño de poro determinado para rendir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse con los liposomas tal como se describe en Martin y col., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) mediante una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico (como la Doxorubicina) está contenido opcionalmente en el liposoma. Véase Gabizon y col., J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989).

El anticuerpo de la presente invención también puede utilizarse en ADEPT mediante conjugación del anticuerpo con una enzima activadora del profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico, véase la patente internacional WO81/01145) en un fármaco anti-cáncer. Véase por ejemplo, la patente internacional WO 88/07378 y la patente americana U.S. 4.975.278.

El componente enzimático del inmunoconjugado de utilidad en el ADPT abarca cualquier enzima capaz de actuar sobre un profármaco, convirtiéndolo así en su forma más activa, la forma citotóxica.

Las enzimas que se utilizan en el procedimiento de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, la fosfatasa alcalina para la conversión de profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; la arilsulfatasa de utilidad para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; la desaminasa citonasa de utilidad para convertir la 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anticanceroso, las 5-fluorouracil proteasas, como la protesas de Serratia, la termolisina, la subtilina, las carboxipeptidasas y las catepsinas (como las catepsinas B y L), que son de utilidad para convertir los profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; las D-alanilcarboxipeptidasas de utilidad en convertir los profármacos que contienen substituyentes de D-aminoácidos; las enzimas hidrolíticas de carbohidratos como la \beta-lactamasa de utilidad para convertir los fármacos derivatizados con \beta-lactamas en fármacos libres; y las amidasas de penicilina, como la penicilina V amidasa o la penicilina G amidas, de utilidad para convertir los fármacos derivatizados en sus nitrógenos de aminas con grupos fenoxiacetil o fenilacetil, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la materia como "abzimas", pueden utilizarse para convertir los profármacos de la invención en fármacos activos libres (véase por ejemplo, Massey, Nature 328:457-458 (1987)). Los conjugados de anticuerpos-abzima pueden prepararse tal como se describió aquí para la liberación de la abzima a una población de células tumorales.

Las enzimas de la presente invención pueden unirse de forma covalente a los anticuerpos anti-VEGF mediante técnicas bien conocidas en la materia como la utilización de reactivos de unión heterobifuncionales descritos aquí. Alternativamente, las proteínas de fusión que comprenden por lo menos la región de unión al antígeno de un anticuerpo de la invención unido por lo menos a una proteína activa funcionalmente de una enzima de la invención pueden construirse por medio de la utilización de técnicas del ADN recombinante bien conocidas en la materia (véase por ejemplo, Neuberger y col., Nature 312:604-608 (1984)).

En algunas realizaciones de la invención, puede ser deseable utilizar un fragmento de anticuerpo, en lugar de un anticuerpo intacto, para aumentar la penetración del tumor, por ejemplo. En este caso, puede ser deseable modificar el fragmento de anticuerpo con el fin de aumentar su vida media en el suero. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante incorporación de un epitopo de unión al receptor de rescate en el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, mediante mutación de la región adecuada en el fragmento del anticuerpo o mediante incorporación del epitopo en una etiqueta peptídica que a continuación se fusiona al fragmento de anticuerpo en cualquiera de sus extremos o en el medio, por ejem-
plo, mediante la síntesis de ADN o peptídica). Patente internacional WO96/32478, publicada el 17 de Octubre de 1996.

El epitopo de unión al receptor de rescate constituye generalmente en una región en donde un residuo aminoacídico cualquiera o más de uno o los dos bucles de un dominio Fc se transfieren a una posición análoga del fragmento del anticuerpo. Más preferentemente, se transfieren dos o más bucles del dominio Fc. Todavía más preferentemente, el epitopo se obtiene del dominio CH2 de la región Fc (por ejemplo, de una IgG) y se transfiere a la región CH1, CH3 o VH, o más de uno de dichas regiones. Alternativamente, el epitopo se obtiene del dominio CH2 de la región Fc y se transfiere a la región CL o la región VL, o a ambas, del fragmento de anticuerpo.

En una de las realizaciones preferidas, el epitopo de unión al receptor de rescate comprende la secuencia: PKNSSMINSNTP (SEC ID NO: 17), y opcionalmente comprende además una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en HQSLGTQ (SEC ID NO: 18), HQNLSDGK (SEC ID NO: 19), HQNISDGK (SEC ID NO: 20), VISSHLGQ (SEC ID NO: 21), en particular el epitopo es un polipéptido que contiene la(s) secuencia(s): HQNLSDGK (SEC ID NO: 19), HQNISDGK (SEC ID NO: 20), o VSSHLGQ (SEC ID NO: 21) y la secuencia: PKNSSMINSNTP (SEC ID NO: 17).

Las modificaciones covalentes del anticuerpo anti-VEGF humanizado o variante también se incluyen dentro del ámbito de la invención. Ello puede realizarse mediante síntesis química o corte enzimático o químico del anticuerpo, si es aplicable. Otros tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo se introducen en la molécula haciendo reaccionar residuos aminoacídicos del anticuerpo con un agente derivatizante orgánico que sea capaz de reaccionar con las cadenas laterales o los residuos N- o C-terminales. Ejemplos de modificaciones covalente de polipéptidos se describen en la patente americana U.S. 5.534.615.

Un tipo de modificación covalente del anticuerpo comprende la unión del anticuerpo a uno de los diversos polímeros no proteicos, por ejemplo el polietilén glicol, el polipropilén glicol, o los polioxialquilenos, de la manera indicada en la patentes americanas U.S. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.

B. Vectores, células huéspedes y procedimientos recombinantes

La invención también proporciona el ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo anti-VEGF humanizado o variante, los vectores y las células huésped que comprenden el ácido nucleico, y las técnicas recombinantes para la producción del anticuerpo.

Para la producción recombinante del anticuerpo, puede aislarse e insertarse el ácido nucleico codificnate en un vector replicable para el posterior clonaje (amplificación del ADN) o para la expresión, en otra realización, el anticuerpo puede producirse mediante recombinación homóloga, por ejemplo, tal como se describe en la patente americana U.S. 5.204.244.

El ADN que codifica el anticuerpo monoclonal se aísla rápidamente y se secuencia mediante procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante la utilización de sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Están disponibles para ello muchos vectores. Los componentes del vector incluyen generalmente, pero sin limitarse a ello, uno o más de los siguientes elementos: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento intensificador, un promotor, y una secuencia de finalización de la transcripción, por ejemplo, tal como se describe en la patente americana U.S. 5.534.615, publicada el 9 de Julio de 1996.

Las células huésped adecuadas para el clonaje o la expresión del ADN en los vectores de la presente invención son las células procariotas, levaduras, o las de eucariotas superiores descritas anteriormente. Las procariotas adecuadas para el propósito incluyen las eubacterias, como las Gram negativas o las Gram positivas, por ejemplo. Las Enterobacteriáceas como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia marcescans y Shigella, así como Bacilli como B. Subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P en la patente DD 266.710, publicada el 12 de Abril de 1989). Pseudomonas como P. aeruginosa y Streptomyces. Un huésped preferido de E. coli es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque también son adecuadas otras cepas como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) y E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos y no limitantes.

Además de las células procariotas, los microbios eucariotas como los hongos filamentosos o las levaduras son huéspedes adecuados para el clonaje o la expresión para vectores que codifican el anticuerpo anti-VEGF. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura común, es el huésped más comúnmente utilizado entre los microorganismos huésped eucariotas. Sin embargo, están disponibles otros géneros, especies y cepas de utilidad en la presente invención, como Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces como por ejemplo huéspedes de K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.241), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans y K. marxianis, yarrowia (patente europea EP 402.226); Pichia pastoris (patente europea 183.070); Candida; Trichodermia reesia (patente europea EP 244.234); Neurospora crassa; Schanniomyces como Schwannomyces occidentalis, y hongos filamentosos como Neurospora, Penicillium, Tolypcladium, y huéspedes de Aspergillus como A. nidulans y A. niger.

Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo anti-VEGF glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen las células de plantas y de insectos. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus y variantes y las correspondientes células huésped de insecto permisivas de huéspedes como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegyptii (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx morii. Una gran variedad de cepas virales para la transfección están disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y dichos virus pueden utilizarse aquí de acuerdo con la presente invención, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. Los cultivos de células de plantas como el algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco también pueden utilizarse como huéspedes.

Sin embargo, existe un gran interés en las células de vertebrados y la propagación de éstas células en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Ejemplos de líneas celulares de mamífero de utilidad son la línea de riñón de mono CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en suspensión, Graham y col., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)); las células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); las células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV 1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical (HELA, ATCC CCL 2); las células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 13329; células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather y col., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

Las células huésped se transformaron con los vectores de expresión o de clonaje descritos anteriormente para la producción de anticuerpo anti-VEGF y se cultivaron en medios nutritivos convencionales modificados de forma adecuada para la inducción de promotores, la selección de transformantes, o la amplificación de los genes que codifican las secuencias deseadas.

Las células huésped utilizadas para producir el anticuerpo anti-VEGF de la presente invención pueden cultivarse en diversos medios. Para el cultivo de células huésped, son medios adecuados el Ham F10 (Sigma), el Medio Mínimo de Eagle (MEM) (sogma), el RPMI-1640 (Sigma) y el Medio Mínimo de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma). Además, puede utilizarse como medio de cultivo para las células huésped cualquier medio de los descritos en Ham y col., Meth. Enz. 58:44 (1979); Barmes y col., Anal. Biochem. 102:255 (1980), patentes americanas U.S. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; patentes internacionales WO 90/03430; WO 87/00195; o la patente Re. Americana 30.985. Cualquiera de estos medios puede suplementarse según sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (como la insulina, la transferrina o el factor epitelial de crecimiento), sales (como el cloruro sódico, el magnesio y el fosfato), tampones (como el HEPES), nucleótidos (como la adenosina y la timidina), anticuerpos (como el fármaco GENTAMYCIN™), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos presentes generalmente a concentraciones finales del orden micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquiera de los suplementos necesarios también puede incluirse a concentraciones adecuadas que conocidas por los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, como la temperatura, el pH y similares, son las utilizadas anteriormente con las células huésped seleccionadas para la expresión, y serán evidentes para un técnico en la materia.

Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o secretarse directamente en el medio. Si los anticuerpos se producen intracelularmente, como una primera etapa, los restos celulares, bien sean de células huésped o de fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carter y col., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para el aislamiento de anticuerpos que se secreta en el espacio periplásmico de E. coli. En resumen, la pasta celular se resuspende en presencia de acetato sódico (pH 3,5), EDTA y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los restos celulares pueden eliminarse mediante centrifugación. Si el anticuerpo se secreta en el medio, en primer lugar, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión se concentran generalmente mediante la utilización de filtros de concentración de proteína disponibles comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa como el PMSF puede incluirse en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteolisis y es posible incluir antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes fortuitos.

La composición del anticuerpo preparada a partir de células puede purificarse utilizando, por ejemplo, cromatografía en gel de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinida, siendo esta última la técnica preferida. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de las especies y del isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La proteína A puede utilizarse para purificar los anticuerpos que están basados en las cadenas \gamma1, \gamma2, o \gamma4 (Lindmark y col., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para los humanos, \gamma3 (Guss y col., EMBO J. 5:1567-1575 (1986)). La matriz a la cual está unido el ligando de afinidad es comúnmente la agarosa, pero otras matrices están disponibles. Matrices estables mecánicamente como las de vidrio de poro controlado o de poli(estirenodivinil)benceno permiten velocidades de flujo mayores y tiempos de procesado más cortos que los que se pueden alcanzar con la agarosa. Si el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Dependiendo del anticuerpo a recuperar, también están disponibles otras técnicas para la purificación de proteínas como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, la precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, la cromatografía en sílice, la cromatografía en heparina, la cromatografía en SEPHAROSE™, la cromatografía con una resina de intercambio aniónico o catiónico (como una columna de ácido aspártico), el cromatoenfoque, SDS-PAGE y la precipitación con sulfato amónico.

Después de cualquier etapa(s) de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes pueden someterse a una cromatografía de interacción hidrofóbica a pH bajo mediante utilización de un tampón de elución a un pH entre 2,5-4,5, realizado preferentemente a concentraciones bajas en sal (por ejemplo, aproximadamente 0-20,25 M de sal).

C. Formulaciones farmacéuticas

Las formulaciones terapéuticas del anticuerpo se preparan para su almacenamiento mezclando el anticuerpo con el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizantes opcionales aceptables fisiológicamente (Remington Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizantes no han de ser tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones deseadas, e incluyen tampones como el fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen el ácido ascórbico y la metionina; los conservantes (como el cloruro de octadecildimetilbencil amonio; el cloruro de hexametonio; el cloruro de benzalconio, el cloruro de bencetonio; el fenol o el alcohol bencílico; los alquil parabenos como el metil o el propil paraben; el catecol; el resorcinol; el ciclohexanol; el 3-pentanol; y el m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a 10 residuos aproximadamente); las proteínas como la seroalbúmina, la gelatina o las inmunoglobulinas, los polímeros hidrofílicos como la polivinilpirrolidona; los aminoácidos como la glicina, la glutamina, la asparraguina, la histidina, la arginina, o la lisina; los monosacáridos, los disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo la glucosa, la manosa, o las dextrinas; los agentes quelantes como el EDTA; los azúcares como la sacarosa, el manitol, la trehalosa o el sorbitol; lo iones contrarrestadores formadores de sales como el sodio; los complejos de metales (por ejemplo, complejos de proteínas-Zn); los tensoactivos no iónicos como el TWEEN™, el PLURONICS™, o el polietilén glicol (PEG).

La formulación de la presente invención también puede contener más de un compuesto activo necesario para la indicación particular a tratar, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no tengan efectos adversos unos con otros (véase la Sección F de más adelante). Dichas moléculas están presentes en combinación adecuada en cantidades efectivas para el propósito determinado.

Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcapsulas de gelatina y microcápsulas de poli-metilmetacilato, respectivamente, en sistemas de administración de fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocapsulas) o en macroemulsiones. Estas técnicas están descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences 16yh edición, Osol, A. Ed. (1980).

Las formulaciones que se utilicen para las administraciones in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles.

También se pueden hacer preparaciones de liberación prolongada. Ejemplos de preparaciones de liberación prolongada incluyen matrices semipermeables de polímeros sólidos hidrofóbicos que incluyen el anticuerpo, matrices con formas determinadas como por ejemplo, películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación prolongad se incluyen los poliésteres, los hidrogeles (por ejemplo, el poli(2-hidroxietil-metaerilato) o el polivinilalcohol, los poláctidos (Patente U.S. 3.773.919), los copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma-etil-L-glutamato, el etilén-vinil acetato no degradable, los copolímeros degradables de ácido láctico y ácido glicólico como el Lupron Depot™ (microsferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico y ácido glicólico y acetato de leuprolido) y el ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras polímeros como el etilén-vinil acetato y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteína durante períodos más cortos de tiempo. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un tiempo largo, se desnaturalizan o agregan como resultado de la exposición a la humedad a 37ºC, resultando en la pérdida de su actividad biológica y en posibles cambios de su inmunogenicidad. Es posible concebir estrategias racionales para la estabilización de estos anticuerpos en función del mecanismo implicado. Por ejemplo, se descubrió que el mecanismo de agregación consiste en la formación de puentes S-S intermoleculares a través del intercambio tio-disulfuro, y por ello es posible lograr la estabilización mediante la modificación de los resiudos sulfidril, liofilizando soluciones acídicas, controlando el contenido
de humedad, utilizando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matrices específicas de polímeros.

D. Usos no terapéuticos del anticuerpo

Los anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse como agentes de purificación por afinidad. En este proceso, los anticuerpos se inmovilizan en una fase sólida como la resina Sephadex o un papel de filtro, utilizando los procedimientos bien conocidos en la materia. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene la proteína VEGF (o un fragmento de ésta) a purificar, y a continuación el soporte se lava con un solvente adecuado que extraerá todo el material que se encuentre en la muestra excepto la proteína VEGF, ya que ésta se encuentra unida al anticuerpo inmovilizado. Por último, el soporte se lava con otro solvente adecuado, como el tampón glicina, pH 5,0 que liberará la proteína VEGF del anticuerpo.

Los anticuerpos anti-VEGF pueden ser útiles en ensayos de diagnóstico de la proteína VEGF, por ejemplo la detección de su expresión en células, tejidos específicos o en suero. Estos procedimientos de diagnóstico pueden ser útiles en el diagnóstico del cáncer.

Para aplicaciones diagnósticas, el anticuerpo típicamente se marca con una porción detectable. Los numerosos marcadores que se encuentran disponibles, pueden generalmente agruparse en las siguientes categorías:

(a): Radioisótopos, como S^{35}, C^{14}, I^{125}, H^{3}, y I^{131}. El anticuerpo puede marcarse con el radioisótopo mediante las técnicas descritas en el Current Protocols in Immunology, Volúmenes 1 y 2, Coligen y col., Ed. Wiley-Interscience, New York, Pubs. (1991) por ejemplo, y la radioactividad puede cuantificarse con un contador de centelleo.

(b): Se encuentran disponibles algunos marcadores fluorescentes como quelatos raros (quelatos de europium)o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansil, Lisamina, ficoeritrina y Texas Red. Los marcadores fluorescentes pueden conjugarse con el anticuerpo mediante las técnicas descritas en el Current Protocols en Immunology, supra, por ejemplo. La fluorescencia puede cuantificarse mediante un fluorímetro.

(c): También se encuentran disponibles varios marcadores enzima-substrato y en la patente americana U.S. 4.275.149 se proporciona una revisión de algunos de ellos. La enzima generalmente cataliza una alteración química de un sustrato cromogénico que puede medirse mediante varias técnicas. Generalmente, la enzima cataliza un cambio de color en el sustrato, que puede cuantificarse espectrofotométricamente. Por otro lado, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Las técnicas para la cuantificación de un cambio en la fluorescencia se han descrito más arriba. El sustrato quimioluminiscente se excita electrónicamente por una reacción química y puede emitir luz que a su vez se cuantifica (por ejemplo utilizando un quimioluminómetro) o donar energía a un aceptor fluorescente. Ejemplos de marcadores enzimáticos, incluyen la luciferasas (por ejemplo la luciferasa de luciérnaga y la luciferasa de bacterias; pPatente americana U.S. 4.737.456), la luciferina, las 2-3-dihidrophthalazinediones, la malao deshidrogenasa, la ureasa,la peroxidasa como la peroxidasa de rábano (HRPO), la fosfatasa alcalina, la \beta-galactosidas, la glucoamilasa, lla isozima, las oxidasas de sacáridos (por ejemplo la glucosa oxidasa, la galactosa oxidasa, y la 6-fosfato glucosa deshidrogenasa), las oxidasas heterocíclicas (como la uricasa y la xantina oxidasa), la lactoperoxidasa, la microperoxidasa y similares. Las técnicas para la conjugación de enzimas con anticuerpos se describen en O'Sullivan y col., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme immunoassay, in Methods in Enzym. (ed. J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981).

Entre los ejemplos de combinaciones de enzima y sustrato se incluyen:

(i) La peroxidasa de rábano (HRPO) con peróxido de hidrógeno como sustrato, en donde el peróxido de oxígeno hidrógeno oxida a un compuesto precursor (por ejemplo la ortofenilén diamina (OPD) o el hidrocloruro de 3,3',5,5'-tetrametil benzidina (TMB));

(ii) La fosfatasa alcalina (AP) con el para-Nitrofenil fosfato como sustrato cromogénico; y

(iii) La \beta-galactosidasa (\beta-D-Gal) con un sustrato cromogénico (por ejemplo p-nitrofenil-\beta-D-galactosidasa) o sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-\beta-D galactosidasa.

Otras numerosas combinaciones enzima-sustrato se encuentran disponibles los expertos en la materia. Para una revisión general de éstos, véanse las patentes americanas U.S. 4.275.149 y 4.318.980.

Algunas veces, el marcaje se conjuga de forma indirecta con el anticuerpo. Para realizar este procedimiento, se utilizan varias técnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con la biotina y por otro lado alguna de las tres categorías de marcadores mencionadas más arriba puede conjugarse con la avidina o viceversa. La biotina se une selectivamente a la avidina y así el marcaje del anticuerpo se obtiene de forma indirecta. Alternativamente, para conseguir la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo, se conjuga el anticuerpo con un pequeño hapteno (por ejemplo la digoxina) y uno de los diferentes tipos de marcadores mencionados arriba se conjuga con el anticuerpo anti-hapteno (por ejemplo el anticuerpo anti-digoxina). De este modo se puede conseguir la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo.

En otra realización de la presente invención, el anticuerpo anti-VEGF no necesita ser marcado ya que la presencia de éste se detecta mediante un anticuerpo marcado que se une al anticuerpo anti-VEGF.

Los anticuerpos de la presente invención pueden emplearse con cualquier procedimiento de ensayo conocido, como ensayos de unión competitiva, ensayos en sándwich directo o indirecto y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

Los ensayos de unión competitiva se basan en la capacidad de un estándar marcado para competir con una muestra a analizar, analito, por su unión a una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de proteína VEGF en la muestra a analizar es inversamente proporcional a la cantidad de estándar que llega a unirse a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que llega a unirse, los anticuerpos generalmente se insolubilizan antes o después de la competición, de forma que el estándar y el analito que se encuentran unidos al anticuerpo pueden separarse del estándar y el analito que permanecen unidos.

Los ensayos de sándwich implican el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a diferentes porciones imunogénicas o epitopos de la proteína a ser detectada. En un ensayo de sándwich, la muestra a analizar o analito se une a un primer anticuerpo inmovilizado a un soporte sólido, y a continuación, a un segundo anticuerpo que se une también al analito, formando por tanto un complejo insoluble de tres partes. Véase por ejemplo la patente americana US 4.376.110. El segundo anticuerpo está marcado con una porción detectable (ensayos en sándwich directo) o puede cuantificarse mediante un anticuerpo anti-inmunoglobulina que es el que está marcado con una porción detectable (ensayo de sándwich indirecto). Como ejemplo, un tipo de ensayo de sándwich es un ensayo de ELISA en el que la porción detectable es una enzima.

Para inmunohistoquímica, la muestra tumoral puede ser tejido fresco o parafina fijada con un conservante como por ejemplo la formalina.

Los anticuerpos también pueden utilizarse para ensayos diagnósticos in vivo. Generalmente el anticuerpo se marca con un radionucleido (como In^{111}, Tc^{99}, C^{14}, I^{131}, I^{125}, H^{3}, P ^{32} y S^{35}) de forma que el tumor puede localizarse mediante inmunoescintografía.

E. Equipos para el diagnóstico

Por conveniencia, el anticuerpo de la presente invención puede proporcionarse en un equipo, por ejemplo, una combinación de reactivos empaquetados en cantidades predeterminadas junto con las instrucciones para realizar el ensayo diagnóstico. Si el anticuerpo está marcado con una enzima, el equipo incluirá sustratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor del sustrato que proporcione el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, pueden incluirse otros aditivos tal como estabilizantes, tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o un tampón de lisis) y otros. Las cantidades relativas de varios reactivos pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones de reactivos en solución que sean óptimas para la sensibilidad del ensayo. En particular, los reactivos pueden proporcionarse como polvo seco, generalmente liofilizado, incluyendo excipientes que en disolución proporcionarán una solución de reactivo que tenga la concentración adecuada.

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F. Utilizaciones terapéuticas del anticuerpo

Las aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos anti-VEGF de la invención se administran a un mamífero, preferentemente un humano, en una forma de dosificación aceptable tal como se describió anteriormente, incluyendo las que pueden administrarse a un humano por vía intravenosa como un bolo o por infusión continua durante un cierto periodo de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intra-cereboroespinal, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o por inhalación. Los anticuerpos también se pueden administrar por vía intra-tumoral, peritumoral, intralesional, o perilesional para ejercer sus efectos terapéuticos local o sistémicamente. La vía intraperitoneal es de particular utilidad, por ejemplo, en el tratamiento de tumores de ovario.

Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosis adecuada del anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad a tratar, tal como se definió anteriormente, de la gravedad y del curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico responsable. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente de una sola vez o durante varios tratamientos.

Los anticuerpos anti-VEGF son útiles para el tratamiento de enfermedades y trastornos neoplásicos y no-neoplásicos. Los neoplasmas y condiciones relacionadas que son factibles de tratamiento incluyen los carcinomas de mama, los carcinomas de pulmón, los carcinomas gástricos, los carcinomas esofágicos, los carcinomas colorectales, los carcinomas de hígado, los carcinomas de ovario, los thecomas, los arrhenoblastomas, los carcinomas cervicales, el carcinoma endometrial, la hiperplasia endometrial, la endometriosis, los fibrosarcomas, el choriocarcinoma, el cáncer de cabeza y cuello, el carcinoma nasofaríngeo, los carcinomas laríngeos, el hepatoblastoma, el sarcoma de Kaposi, el melanoma, los carcinomas de piel, el hemangioma, el hemangioma cavernoso, el hemangioblastoma, los carcinomas de páncreas, el retinoblastoma, el astrocitoma, el glicoblastoma, el Schwannoma, el oligodendroglioma, el meduloblastoma, el neuroblastoma, el rhabdomiosarcoma, el sarcoma osteogénico, el leiomiosarcoma, los carcinomas de tracto urinario, los carcinomas de tiroides, el tumor de Wilm, el carcinoma de células renales, el carcinoma de próstata, la proliferación vascular anómala asociada con la facomatosis, el edema (como el asociado con los tumores de cerebro) y el síndrome de Meig.

Las condiciones no-neoplásicas que son factibles de tratamiento incluyen la artritis reumatoide, la psoriasis, la aterosclerosis, las retinopatías diabéticas y otras proliferativas incluyendo la retinopatía de prematuridad, la fibroplasia retrolental, el glaucoma neovascular, la degeneración macular relacionada con la edad, las hiperplasias del tiroides (incluyendo la enfermedad de Grave), el trasplante de tejido de córnea y otros, la inflamación de pulmón, el síndrome nefrótico, la preeclampsia, las ascitas, la efusión pericárdica (como la asociada con la pericarditis), y la efusión pleural.

La degeneración macular relacionada con la edad (AMD) es una de las causas principales de pérdida severa de visión en la gente mayor. La forma exudativa de ADM se caracteriza por la neovascularización choroidal y el desprendimiento de células epiteliales pigmentadas de la retina. Ya que la neovascularización coroidal se asocia con un empeoramiento dramático del pronóstico, se espera que los anticuerpos anti-VEGF de la presente invención sean especialmente útiles en reducir la gravedad de AMD.

Según el tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 \mug/Kg a 50 mg/Kg (por ejemplo, 0,1-20 mg/Kg) de anticuerpo es una dosis inicial candidata para la administración al paciente, si, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una dosificación diaria o semanal puede hallarse en el intervalo de aproximadamente 1 \mug/Kg a 20 \mug/Kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante unos cuantos o más días, dependiendo de la condición, el tratamiento se repite hasta lograr la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, también son útiles regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas convencionales y ensayos, incluyendo, por ejemplo, el diagnóstico por la imagen por radiografía del tumor.

Según otra realización de la invención, la eficacia del anticuerpo para prevenir o tratar la enfermedad puede mejorarse mediante la administración del anticuerpo de forma seriada o en combinación con otro agente que sea efectivo para otros propósitos, como el factor de necrosis tumoral (TNF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar la actividad angiogénica del factor de crecimiento de fibroblastos acídico o básico (FGF) o del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar las actividades coagulantes del factor tisular, la proteína C, o la proteína S (véase Esmon y col., PCT de patente internacional WO 91/01753, publicada el 21 de Febrero de 1991), un anticuerpo capaz de unirse al receptor de HER2 (véase Hudziak y col., PCT de patente internacional WO 89/06692, publicada el 27 de Julio de 1989), o uno o más agentes terapéuticos convencionales como, por ejemplo, los agentes alquilantes, los antagonistas del ácido fólico, los antimetabolitos del metabolismo de ácidos nucleicos, los anticuerpos, los análogos de pirimidina, el 5-fluorouracil, la cisplatina, los nucleósidos de purina, las aminas, los aminoácidos, los nucleósitdos de triazol, o los corticosteroides. Estos otros agentes pueden estar presentes en la composición y se administran o pueden administrarse de forma separada. También, los anticuerpos se administran de forma seriada o en combinación con tratamientos radiológicos, que implican tanto irradiación o administración de sustancias radioactivas.

En una realización, la vascularización de tumores se aborda con terapia de combinación. El anticuerpo y uno o más de los antagonistas anti-VEGF se administran a pacientes que portan el tumor a dosis eficaces terapéuticamente tal como se determina por ejemplo mediante observación del tumor o su foco metastásico, si lo hubiera. Esta terapia se continúa hasta que ya no se observan efectos benéficos o que el examen clínico demuestre la no existencia de ninguna traza de tumor ni de focos metastásicos. A continuación se administra el TNF, sólo o en combinación con un agente auxiliar como el interferón alfa, beta y gamma, el anticuerpo anti-HER'', la heregulina, la anti-heregulina, el factor D, la interleucina-1 (IL-1), la interleucina-2 (IL-2), el factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), o los agentes que promueven la coagulación microvascular en los tumores, como el anticuerpo anti-proteína C, el anticuerpo anti-proteína S, o la proteína de unión C4b (véase Esmon y col., PCT de patente internacional 91/01752, publicada el 21 de Febrero de 1991), o el calor o la radiación.

Ya que los agentes auxiliares variarán en su eficacia, es deseable comparar su impacto sobre el tumor mediante un cribado de matriz convencional. La administración de anticuerpo anti-VEGF y de TNF se repite hasta lograr el efecto deseado. Alternativamente, el anticuerpo anti-VEGF se administra junto con el TNF y, opcionalmente, con un(unos) agente(s) auxiliar(es). Algunas veces si los tumores sólidos se hallan en los límites o en localizaciones susceptibles de aislar de la circulación general, los agentes terapéuticos descritos aquí se administran al tumor u órgano aislados. En otras realizaciones, un antagonista del FGF o del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), como un anti-FGF o un anticuerpo neutralizante anti-PDGF, se administra al paciente junto con el anticuerpo anti-VEGF. El tratamiento con anticuerpos anti-VEGF puede suspenderse durante periodos de curación de heridas o de neovascularización deseable.

G. Artículos de fabricación

En otra realización de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales de utilidad para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta. Recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los recipientes pueden estar hechos de materiales como el vidrio o el plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz para el tratamiento de la condición y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón agujereable por una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en la composición es el anticuerpo anti-VEGF. La etiqueta en o asociada con el recipiente indica que la composición se utiliza para el tratamiento de la condición de elección. El artículo de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que comprende un tampón aceptable farmacéuticamente, como la solución de fosfato salina, la solución de Ringer y la solución de dextrosa. Puede ser deseable incluir además otros materiales desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e insertos del paquete con las instrucciones para su utilización.

Ejemplo 1

Este ejemplo describe la producción de anticuerpos anti-VEGF humanizados con las propiedades deseables desde un punto de vista terapéutico.

Materiales y métodos

Clonaje del MAb murino A4.6.1 y construcción de Fab quimérico ratón-humano: el anticuerpo mAB murino anti-VEGF A4.G.1 se ha descrito previamente por Kim y col., Growth Factors 7:53 (1992) y Kim y col., Nature 362:841 (1993). El RNA total se aisló de células de hibridoma productoras del Mab anti-VEGF A4.6.1 mediante la utilización de RNAsol (TEL-TEST) y se transcribió de forma inversa a cADN con cebadores Oligo-dT y el sistema SuperScript II (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD). Se sintetizaron grupos de cebadores oligonucleotídicos degenerados, basados en las secuencias aminoacídicas N-terminal de las cadenas ligera y pesadas del anticuerpo y se utilizaron como cebadores de sentido 5'. Los cebadores de sentido 3' se basaron en 4 secuencias de etnramado obtenidas del subgrupo de cadenas ligeras murinas KV y del subgrupo de cadenas pesadas II (Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Después de la amplificación con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), los fragmentos de ADN se ligaron a un vector de clonaje TA (Invitrogen, San Diego, CA). Se secuenciaron 8 clones de cada una de las cadenas pesada y ligera. Un clon con una secuencia consenso para el dominio VL de cadena ligera y uno con una secuencia consenso para el dominio VH de cadena pesada se subclonaron respectivamente en el vector pEMX1 que contenía los dominios CL y CH (Werther yc ol., J Immunol, 157:4986-4995 (1996)), generando así una quimera ratón-humana. Este F(ab) quimera del dominio VH A4.6.1 murino completo está fusionado con un dominio CH1 humano en el aminoácido SerH 13 y el dominio A4.6.1 murino completo está fusionado con el dominio CL en el aminoácido LysL107. La expresión y la purificación del F(ab) quimérico fueron idénticas a la de los F(ab)s humanizados. El F(ab) quimérico se utilizó como estándar en los ensayos de unión.

Modelos gráficos por ordenador de F(ab) murino y humanizado: las secuencias de los dominios VL y VH (Figs. 1A y 1B) se utilizaron para construir un modelo gráfico por ordenador de los dominios murinos VL-VH A4.6.1. Este modelo se utilizó para determinar qué residuos de la región de entramado deberían incorporarse en el anticuerpo humanizado. Un modelo de F(ab) humanizado también se construyó para verificar la selección correcta de los residuos de entramado murinos. La construcción de modelos se realizó tal como se describió anteriormente (Carter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. Usa 89:4285-4289 (1992) y Eigenbrot y col., J. Mol. Biol. 229:969-995 (1993)).

Construcción de F(ab)s humanizados: el plásmido pEMX1 utilizado para la mutagénesis y la expresión de F(ab)s en E. coli se ha descrito anteriormente (Werther y col., supra). En resumen, el plásmido contiene un fragmento de ADN que codifica una cadena ligera del subgrupo I K humana consenso (VLKl-CL) y una cadena pesada del subgrupo III humana consenso (VHIII-CHI) y un promotor de la fosfatasa alcalina. La utilización de las secuencias consenso para VL y VH se ha descrito previamente (Carter y col., supra).

Para construir la primera variante de F(ab) de A4.G.1 humanizado, F(ab)-1, la mutagénesis dirigida (Kunkel y col., Proc Natl Acad Sci USA 82:488-492 (1985) se realizó con un molde que contenía desoxiuridina de pEMX1. Las 6 CDRs de acuerdo con Kabat y col., supra, se cambiaron a la secuencia A4.6.1 murina. El F(ab)-1 que consistía en una región de entramado completa humana (VL K subgrupo 1 y VH subgrupo III) con las 6 secuencias CDR murinas completas. Los plásmidos para las otras variantes de F(ab) se construyeron a partir del molde del plásmido de F(ab)-1. Los plásmidos se transformaron en la cepa de E. coli XL-Blue (Stratagene, San Diego, CA) para la preparación de ADN de cadena sencilla y de doble cadena. Para cada variante, el ADN que codifica las cadenas ligeras y pesadas se secuenció completamente mediante la utilización del método dde los didesoxinucleótidos (Sequenase, U.S. Biochemical Corp., Clevelan, OH). Los plásmidos se transformaron en la cepa de E. coli 16C9, un derivado de ofMM294, se sembraron en placas con medio Luria con 50 \mug/ml de carbenicilina y se seleccionó una sola colonia para la expresión de proteínas. Esta colonia se creció en 5 ml de caldo de Luria con 100 mg/ml de carbenicilina durante 8 h a 37ºC. Se añadieron los 5 ml a 500 ml de APS-50 \mug/ml de carbenicilina y se dejó crecer durante 20 h en un frasco deflector en agitación a 30ºC. El medio AP5 consiste en: 1,5 g de glucosa, 11,0 g de Hycase SF, 0,6 g de extracto de levadura (certificado), 0,19 g de MgSO4 (anhidro), 1,07 g de NH4Cl, 3,73 g de KCl, 1,2 g de NaCl, 120 ml de trietalonamina 1M, pH 7,4 hasta 1 l de agua y luego filtrado estérilmente a través de un filtro de 0,1 mm Sealkeen. Las células se cosecharon mediante centrifugación en una botella de centrífuga de 1L a 3000xg y se eliminó el sobrenadante. Después de congelar durante 1 h, el sedimento se resuspendió en 25 ml de Tris 10 mM, EDTA 1 mM fríos con sacarosa al 20%, pH 8,0 y se añadieron 250 ml de benzamidina 0,1 M (Sigma, St Louis, MO) para inhibir la proteolisis. Después de mezclar suavemente en hielo durante 3 h, la muestra se centrifugó a 40.000xg durante 15 min. El sobrenadante se aplicó a continuación a una columna de proteína G-Sepharose CL-4B (Pharmacia, Uppsala, Suecia) (0,5 ml de volumen de lecho) equilibrada con Tris 10 mM y EDTA 1 mM, pH 7,5. La columna se lavó con 10 ml de Tris 10 mM-EDTA 1 mM, pH 7,5, y se eluyó con 3 ml de glicina 0,3 M, pH 3, o, en 1,25 ml de Tris 1 M, pH 8,0. A continuación se cambió el tampón del F(ab) por PBS con un Centricon-30 (Amicon, Beverly, MA) y se concentró a un volumen final de 0,5 ml. Se migraron geles de SDS-PAGE de todos los F(ab)s para lograr una determinada pureza y se verificó el peso molecular de cada variante mediante espectrometría de masas de electrospray.

Construcción y expresión de IgG quiméricas y humanizadas: para la generación de variantes de IgG humanas del A4.6.1 quimérico (chIgG) y humanizado (HIgG), se subclonaron los dominios adecuados de VL y VH (F(ab)-12, Tabla 2) murinos o humanizados en vectores pRK, descritos anteriormente, por separado (Eaton y col., Biochemistry 25:8343-8347 (1986)). El ADN que codifica la cadena ligera completa y la pesada completa de cada variante se verificó mediante secuenciación con didesoxinucleótidos.

Para la expresión transitoria de las variantes, los plásmidos de cadena pesada y ligera se co-transfectaron en células humanas 293 (Graham y col., J. Gen. Virol. 36:59-74 (1977)), mediante la utilización de un procedimiento de alto rendimiento (Gorman y col., ADN Prot. Eng. Tech. 2:3-10 (1990)). El medio se cambió por uno sin suero y se cosechó diariamente durante 5 días. Los anticuerpos se purificaron a partir de los sobrenadantes agrupados mediante proteína A-Sepharose CL-4B (Pharmacia). Se cambió el tampón del anticuerpo eluido por PBS con un Centricon-30 (Amicon), se concentró a 0,5 ml, se filtró estérilmente con Millex-GV (Millipore, Bedford, MA) y se almacenó a 4ºC.

Para la expresión estable de la variante de IgG1 humanizada (rhuMAb VEGF), se transfectaron células de ovario de hámster chino (CHO) con vectores dicistrónicos diseñados para coexpresar las cadenas ligera como la pesada (Lucar y col., Nucleic Acids Res, 24:1774-79 (1996)). Los plásmidos se introdujeron en células DP 12, un derivado de la línea celular CHO-K 1 DUX B 11 desarrollada por L. Chasin (Columbia, University), mediante lipofección y se seleccionaron para el crecimiento en medio sin suero-GHT (Chisholm, V. High efficiency gene transfer in mammalian cells, En : Glover, DM, Hames, BD. ADN cloning4. Mammalian systems. Oxford Univ Press, Oxford pp 1-41 (1996)). Aproximadamente, 20 clones no amplificados se eligieron aleatoriamente y se resembraron en placas de 96 pocillos. La productividad específica relativa de cada colonia se controló mediante un ELISA para cuantificar la IgG humana de longitud completa acumulada en cada pocillo al cabo de 3 días y un colorante fluorescente, Calcien AM, como un marcador del número de células viables por pocillo. Según estos resultados, se eligieron varios clones no amplificados para su posterior amplificación en presencia de concentraciones aumentadas de metrotexato. Los clones individuales que sobrevivieron a 10, 50 y 100 nM de metrotexato se eligieron y transfirieron a placas de 96 pocillos para cribar la productividad. Un clon, que presentó de forma reproducible una alta productividad específica, se propagó en frascos-T y se utilizó para inocular un cultivo a mayor escala. Después de varios pasajes, las células resuspendidas se utilizaron para inocular cultivos de producción en medio GHT sin suero y suplementado con diversas hormonas e hidrolisados de proteínas. El fluido recogido del cultivo celular que contenía rhuMAb VEGF se purificó con proteína A-Sepharose CL-4B. La pureza después de esta etapa fue del 99%. Se llevó a cabo una siguiente purificación a homogeneidad con una etapa de cromatografía de intercambio iónico. El contenido de endotoxina del anticuerpo purificado final fue de <0,10 eu/mg.

Cuantificación de F(ab) e IgG: para la cuantificación de moléculas de F(ab), se recubrieron placas de ELISA con 2 \mug/ml de Fab anti- IgG humana de cabra (Organon Teknika, Durham, NC) en tampón de carbonato a 50 mM, pH 9,6, a 4ºC durante la noche y se bloqueó con PBS-albúmina sérica bovina al 0,5% (tampón bloqueante) a temperatura ambiente durante 1 h. Los estándares (0,78-50 ng/ml de F(ab) humano) se obtuvieron de Chemicon (Temecula, CA). Diluciones seriadas de muestras en PBS con albúmina sérica bovina al 0,5%, polisorbato 20 al 0,05% (tampón de ensayo) se incubaron en las placas durante 2 h. Se detectó F8ab) mediante la utilización de F(ab) de cabra anti-IgG humana marcada con peroxidasa de rábano (Organon Teknika), seguido de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidine (Kirkegaarda & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) como el sustrato. Las placas se lavaron entre las etapas. La absorbancia se leyó a 450 nm en un lector de placas a 450 nm (Molecular Devices, Menlo Park, CA). Las curvas estándares se ajustaron con un programa de ajuste curva que utiliza 4 parámetros de regresión no lineal. Los puntos de los resultados que se hallaron en el intervalo de la curva estándar se utilizaron para calcular la concentración de F(ab) de las muestras. La concentración del anticuerpo de longitud completa se determinó mediante la utilización de Fc de cabra anti-IgG humana (Cappel, Westchester, PA) para la captura y anti-Fc humana de cabra marcado con peroxidasa de rábano para la detección. La IgG1 humana (Chemicon) se utilizó como estándar.

El ensayo de unión a VEGF: para la cuantificación de la actividad de unión a VEGF de los F(ab)s, se recubrieron placas de ELISA con 2 \mug/ml de F(ab')2 de conejo contra IgG Fc humana (Jackson ImmnoResearch, West Grove, PA) y se bloquearon con tampón de bloqueo (descrito anteriormente). El medio condicionado diluido que contenía 3 ng/ml de KDR-IgG (Park y col., J. Biol Chem 269:25646-25645 (1994)) en tampón de bloqueo se incubaron en la placa durante 1 h. Los estándares (6,9 a 440 ng/ml de F(ab) quimérico)) y dos series de muestras se incubaron con VEGF 2 nM biotinilado durante 1 h en tubos. Las soluciones de los tubos se transfirieron a las placas ELISA y se incubaron durante 1 h. Después del lavado, el VEGF biotinilado unido al KDR se detectó utilizando peroxidasa de rábano marcada con estreptavidina (Zymed, South San Francisco, CA o Sigma,St. Louis, MO) seguido por 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina como el sustrato. Las curvas de titulación se ajustaron con un programa de ajuste de curvas que utiliza 4 parámetros de regresión no lineal (KaleidaGraph, Synergy Software, Reading PA). Las concentraciones de las variantes de F(ab) que correspondían con la absorbancia del punto intermedio de absorbancia de la curva de titulación del estándar se calcularon y luego se dividieron por la concentración del estándar correspondiente a la absorbancia del punto intermedio del estándar de la curva de titulación. Los ensayos para la IgG de longitud completa fueron los mismos para F(ab)s excepto que el tampón de ensayo contenían suero humano al 105.

Ensayo de Biosensor BIAcore™: La unión a VEGF de los F(ab)s humanizados y quiméricos se comparó utilizando el biosensro BIAcore™ (Karlsson y col., Methods: A comparison to Methods in Enzymology 6:97-108 (1994)). Las concentraciones de F(ab)s se determinaron mediante análisis de aminoácidos cuantitativo. El VEGF se acopló a un chip biosensor CM-5 a través de grupos amino primarios de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pharmacia). Se cuantificaron las cinéticas de las velocidades de disociación mediante saturación del chip con F(ab) (35 \mul de F(ab) 2 \muM a una velocidad de flujo de 20 \mul/min) y luego pasando al tampón (PBS-0:polisorbato 20 al 0,5%). Los puntos de los resultados desde 0-4500 s se utilizaron para el análisis de las cinéticas de velocidades de disociación. La constante de la velocidad de disociación (Koff) se obtuvo a partir de la pendiente del gráfico de ln/RO/R) versus el tiempo, en donde RO es la señal a t=o y R es la señal en cada punto de tiempo.

Las cinéticas de asociación se cuantificaron utilizando diluciones seriadas de dos veces de F(ab) (0,0625-2 mM). La pendiente, Ks, se obtuvo a partir del gráfico de ln(-dR/dt) versus el tiempo para cada concentración de F(ab) utilizando el programa de evaluación de cinéticas del BIAcore™ tal como se describe en el manual del Biosensor de Pharmacia. R es la señal en el tiempo t. Los resultados entre 80 y 168, 148, 128, 114, 102, y 92 s se utilizaron para 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5, 1, y 2 mM de F(ab) respectivamente. La constante de la velocidad de asociación (Kon) se obtuvo a partir de la pendiente del gráfico de Ks versus la concentración de F(ab). Al término de cada ciclo, se extrajo el F(ab) no unido mediante inyección de 5 \mul de HCl 50 mM a una velocidad de flujo de 20 \mul/min hasta regenerar el chip.

Ensayo de crecimiento de células endoteliales: las células endoteliales de capilares derivados del córtex adrenal bovino se cultivaron en presencia de medio Eagle modificado por Dulbecco y bajo en glucosa (DMEM) (GIBCO) suplementado con suero de ternera al 10%, glutamina 2 mM; y antibióticos (medio de crecimiento), esencialmente tal como se describió previamente (Leung y col., Science 246:1306-1309 (1989)). Para los ensayos mitogénicos, las células endoteliales se sembraron a una densidad de 6x10^{3} células por pocillo, en placas de 6 pocillos en medio de crecimiento. A continuación se añadió muMAb VEGF A4.6.1 o rhuMAb VEGF a concentraciones dentro de un intervalo de 1 a 5000 ng/ml. Al cabo de 2-3 h, se añadió rhVEGF 165 expresado en E. coli y purificado a una concentración final de 3 ng/ml. Para un control de especificidad, cada anticuerpo se añadió a las células endoteliales a la concentración de 5000 ng/ml, bien sólo o en presencia de 2 ng/ml de bGFG. Después de 5 o 6 días, las células se disociaron mediante tratamiento con tripsina y se contaron con un contador Coulter (Coulter Electronics, Hialeah, FL). La variación de la media no excedió el 10%. Los resultados se analizaron mediante un programa de ajuste de curva con 4 parámetros (KaleidaGraph).

Estudios de tumores in vivo: las células de rabdomiosarcoma humano A673 (ATCC CRL 1598) se cultivaron tal como se describió previamente en DMEM/F12 suplementado con suero bovino fetal al 10%, glutamina 2 mM y antibióticos (Kim y col., Nature 362:841-844 (1993) y Borgström y col., Cancer Res 56:4032-4039 (1996)). Se inyectaron ratones nude hembras BALB/c, de 6-10 semanas de edad, con 2 x 10^{6} células tumorales subcutáneamente en el área dorsal en un volumen de 200 \mul. A continuación, los animales se trataron con muMAb VEGF A4.6.1, rhuMAb VEGF o un MAb control dirigido contra la proteína gp 120 (Kim y col., Nature, 362:841-844 (1993)). Ambos MAbs anti-VEGF se administraron a las dosis de 0,5 y 5 mg/Kg; el MAb control se administró a la dosis de 5 mg/Kg. Cada MAb se administró dos veces por semana intraperitonealmente en un volumen de 100 \mul, iniciándose 24 h después de la inoculación de las células tumorales. Cada grupo consistió de 10 ratones. El tamaño del tumor se determinó a intervalos semanales. Cuatro semanas después de la inoculación de las células tumorales, se practicó la eutanasia a los animales y se extrajeron los tumores y se pesaron. Los análisis estadísticos se realizaron mediante ANOVA.

Resultados

Humanización: la secuencia consenso para el subgrupo III de cadena pesada humana y del subgrupo KI de cadena ligera se utilizaron como la región de entramado para la humanización (Kabat y col., supra) (Figs. 1A y 1B). Esta región de entramado se ha utilizado satisfactoriamente en la humanización de otros anticuerpos murinos (Werther y col., supra; Carter y col., supra; Presta y col., J.Immunol, 151:2623-2632 (1993); y Elgenbrot y col., Proteins 18:49-62 (1994)). CDR-H1 incluidos los residuos H26-H35. Las otras CDRs fueron de según Rabat y col., supra. Todos las variantes humanizadas se generaron inicialmente y se cribaron para la unión como F(ab)s expresados en E. coli. Los rendimientos típicos de frascos de agitación de 500 ml fueron de 0,1-0,4 mg de F(ab).

El F(ab) quimérico se utilizó como el estándar en los ensayos de unión. En la variante inicial, F(ab)-1, los residuos de CDR se transfirieron del anticuerpo murino a la región de entramado humana, y según los modelos de los F(ab)s murinos y humanizados, el residuo de posición H49 (Ala en humanos) se cambió al murino Gly. Además, los F(ab)s que consistían de la cadena pesada quimérica/F(ab)-1 cadena ligera F(ab)-2 y F(ab)-1 cadena pesada/(F(ab)-3) cadena ligera quimérica se generaron y analizaron para la unión. El F(ab)-1 presentó una afinidad de unión superior a 1000 veces reducido de F(ab) quimérico (Tabla 2). Comparación de las afinidades de unión de F(ab)-2 y F(ab)-3 sugiere que los residuos de la región de entramado en el dominio VH de F(ab)-1 necesitaban alterarse para aumentar la unión.

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TABLA 2 Unión de variantes anti-VEGF F(ab) humanizadas con VEGF

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El cambio de los residuos humanos H71 y H73 a sus parejas murinas en F(ab)-4 mejoró la unión en 4 veces (Tabla 2). La inspección de los modelos de los F(ab)s murionos y humanizados sugirió que el residuo L46, enterrado en la interfaz VL-VH e interaccionando con CDR-H3 (Fig. 2), puede también desempeñar un papel en la determinación de la conformación de CDR-H3 y/o afectar la relación de los dominios VL y VH. Cuando el residuo murino Val se cambió por el humano Leu en posición L46 (F(ab)-5), la afinidad de unión aumentó casi 4 veces (Tabla 2). Otros 3 residuos de la región de entramado se evaluaron basándose en los modelos moleculares: H49, H69 y H78. La posición H69 puede afectar la conformación de CDR-H2 mientras que la posición H78 puede afectar la conformación de CDR-H1 (Figura 2). Cuando cada residuo se cambió individualmente del humano al murino, la unión mejoró por dos en cada caso (F(ab)-6 y F(ab)-7, Tabla 2). Cuando ambos se cambiaron simultáneamente, la mejora en la unión fue de 8 veces (F(ab)-8, Tabla 2). El residuo H49 fue originalmente incluido como el murino Gly; cuando se cambió al consenso humano Ala, la unión se redujo 15 veces (F(ab)-9, Tabla 2).

En F(ab)-10 y F(ab)-11 dos residuos en el bucle 3 de la región de entramado, se cambiaron a sus homólogos: murinos ASnH76 a Ser (F(ab)-10) Lys H75 a Ala murina (F(ab)-11). Ambos ejercieron una pequeña mejoría en la unión (Tabla 2). Por último, en la posición H94 las secuencias humanas y murinas tienen a menudo una Arg (Rabat y col., supra). En F(ab)-12, esta Arg se reemplazó por la Lys rara hallada en el anticuerpo murino (Fig. 1A) y ello resultó en la unión que fue inferior a 2 veces la del F(ab) quimérico (Tabla 2). El F(ab)-12 también se comparó con el F(ab) quimérico utilizando el sistema de BIAcore™ (Pharmacia). Mediante esta técnica, la Kd del F(ab)-12 humanizado fue 2 veces más débil que la del F(ab) quimérico debido a una K_{on} más lenta y una Ko_{ff} más rápida (Tabla 3).

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TABLA 3 Unión de variantes de anti-VEGF F(ab) a VEGF mediante el sistema de BIAcore™

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Los mAbs de secuencia completa se construyeron fusionando los dominios VL y VH del F(ab) y del variante F(ab)-12 con los dominios constantes de la cadena ligera \kappa humana y la cadena pesada de IgG1 humana. La IgG1-12 (F(ab)-12 fusionado con la IgG1 humana) presentó unión 1,7 veces más débil que la IgG1 quimérica (Tabla 4). Tanto la IgG1-12 como la IgG1 quimérica se unieron ligeramente menos bien que el mAb A4.6.1 murino original (Tabla 4).

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TABLA 4 Unión de variantes anti-VEGF IgG a VEGF^{a}

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Estudios biológicos: se comparó la capacidad de inhibir la proliferación de células endoteliales capilares bovinas de rhuMAb VEGF y muMAb VEGF A4.6.1 en respuesta a una concentración efectiva máxima de VEGF (3 ng/ml). Tal como se muestra en la Figura 3, los dos MAbs fueron esencialmente equivalentes, tanto en potencia como en eficacia. Los valores de ED50 fueron respectivamente de 50 \pm 5 ng/ml y 48 \pm 8 ng/ml (\sim0,3 nM). En ambos casos se logró una inhibición del 90% a la concentración de 500 ng/ml (\sim3 nM). NI el muMAb VEGF A4.6.1 ni el rhuMAb VEGF ejercieron ningún efecto sobre la proliferación basal o la estimulada con bFGF de células endoteliales capilares, confirmando que la inhibición es específica para VEGF.

Para determinar si dicha equivalencia se aplica también a un sistema in vivo, los dos anticuerpos se compararon por su capacidad para suprimir el crecimiento de células de rabdomiosarcoma A673 en ratones nude. Estudios anteriores han demostrado que muMAb VEGF A4.6.a tiene un efecto dramáticamente inhibidor en este modelo tumoral (Kim y col., Nature 362:841-844 (1993) y Borgström y col., Cancer Res 56:4032-4039 (1996)). Tal como se muestra en la Figura 4, en las dos dosis analizadas (0,5 y 5 mg/Kg), los dos anticuerpos suprimieron de forma marcada el crecimiento tumoral según se valoró mediante mediciones del peso durante 4 semanas después de la inoculación. Las disminuciones en el peso del tumor comparadas con el grupo control fueron respectivamente del 85% y del 93% en cada dosis en los animales tratados con muMAb VEGF A4.6.1 versus el 90% y del 95% en los tratados con rhuMAb VEGF. Resultados similares se obtuvieron con la línea celular de carcinoma de mama MDA-MB 435.

Ejemplo 2 Antecedentes

En este ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF murino A4.6.1 descrito anteriormente se humanizó de cambiando forma aleatoria un pequeño grupo de residuos de la región de entramado y mediante expresión monovalente de la librería resultante de las moléculas de anticuerpo sobre la superficie del fago filamentoso con el fin de identificar las secuencias de entramado de alta afinidad mediante selección por afinidad.

Materiales y métodos

Construcción del vector fagémido anti-VEGF, pMB4-19: el mAb A4.6.1 anti-VEGF murino se describió anteriormente en el Ejemplo 1. La primera variante de Fa de A4.6.1 humanizada A4.6.1, hu2.0, se construyó mediante mutagénesis dirigida utilizando un molde que contenía desoxiuridina del plásmido pAK2 (Carter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:4285-4289 (1992)) que codifica una cadena ligera VL\kappal-C\kappa_{l} humana y el fragmento Fd de cadena pesada VHIII-C_{H}l\gamma_{1.} Las secuencias CDR A4.6.1 trasplantadas se eligieron de acuerdo con la definición de Kabat y col., supra, excepto para CDR-H1 que incluía residuos 26-35. La secuencia codificante de Fab se subclonó en el vector fagémido phGHamg3 (Bass y col., Proteins 8:309-314 (1990) y Lowman y col., Biochemistry 30:10832-10838 (1991)). Esta construcción, pMB4-19, codifica el A4.6.1 Fab humanizado inicial, hu2.0, con el extremo C-terminal de la cadena pesada fusionado precisamente con la porción carboxilo de la proteína de la cubierta del gen III de M13. El pMB4-19 es similar en la construcción a pDH 188, un plásmido descrito previamente para la expresión monovalente de fragmentos Fab (Garrard y col., Biotechnology 9: 1373-1377 (1991)). Diferencias notables entre pMB4-19 y pDH188 incluyen un segmento del gen III de M13 más corto (codones 249-406) y la utilización de un codón de parada ámbar inmediatamente después del fragmento Fd de cadena pesada del anticuerpo. Esto permite tanto la secreción de la cadena pesada como de las fusiones de cadena pesada-gen III en cepas supresoras supE de
E. coli.

Expresión y purificación del fragmento A4.6.1 humanizado: E. coli 34B8, cepa no supresora, se transformó con el fagémido pMB19, o con variantes de lo mismo. Se crecieron colonias aisladas toda la noche a 37ºC en 5 ml de medio 2YT con carbenicilina 50 \mug/ml. Estos cultivos se diluyeron en 200 ml de medio AP5 (Chang y col., Gene 55:189-196 (1987)) que contenía carbenicilina 20 \mug/ml y se incubaron durante 26 h a 30ºC. Las células se sedimentaron a 4000xg y se congelaron a -20ºC durante al menos 2 h. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 5 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 7,6) que contenía EDTA 1 mM, se agitó a 4ºC durante 90 minutos y luego se centrifugó a 10.000xg durante 15 min. El sobrenadante se aplicó a 1 ml de proteína G estreptococal-columna de Sepharose (Pharmacia) y se lavó con 10 ml de MES 10 mM (pH 5,5). El fragmento Fab unido se eluyó con 2,5 ml de ácido acético 100 mM e inmediatamente se neutralizó con 0,75 ml de Tris-HCl, pH 8,0. Se cambió el tampón de las preparaciones Fab por PBS y se concentró con concentradores Centricon-30 (Amicon). Los rendimientos típicos de Fab fueron de \sim1 mg/ml de cultivo después de la purificación con proteína G. Las muestras de Fab purificadas se caracterizaron por espectrometría de masas de electrospray y las concentraciones se determinaron mediante análisis de aminoácidos.

Construcción de la librería de fagémidos de Fab anti-VEGF: la librería de fagémidos de A4.6.1 humanizada se construyó mediante mutagénesis dirigida de acuerdo con el procedimiento de kunkel y col., Methods Enzymol. 204:125-139 (1991)). Un derivado de pMB4-19 que contenía tripletes de parada TAA en los codones de VH 24, 37, 67 y 93 se preparó para utilizar como el molde de la mutagénesis (todas las secuencias se numeraron de acuerdo con Kabat y col., supra). Esta modificación se realizó para prevenir la consiguiente contaminación por secuencias de tipo salvaje. Los codones dirigidos para la aleatorización fueron el 4 y el 71 (cadena ligera) y el 24, 37, 67, 71, 73, 75, 76, 78, 93 y 94 (cadena pesada).

Con el fin de aleatorizar los codones de cadena pesada 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78, 93 y 94 con un solo oligonucleótido mutagénico, dos de lo oligonucleótidos de 126-mer se preensamblaron en primer lugar a partir de fragmentos de 60 y 66-mer mediante ligación enzimática asistida por molde. Específicamente, 1,5 nmol del oligonucleótido 5'-fosforilado 503-1 (5'-GAT TTC AA CGT CGT NYT ACT WTT TCT AGA GAC AAC TCC AAA AAC ACA BYT TAC CTG CAG ATG AAC-3' (SEC ID NO: 22)) o 503-2 (5'-GAT TTC AAA CGT CGT NYT ACT WTT TCT TTA GAC ACC TCC GCA AGC ACA BYT TAC CTG CAG ATG AAC-3' (SEC ID NO: 23)) se combinaron con 1,5 nmol de 503-3 (5'-AGC CTG CGC GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT DYA ARG TAC CCC CAC TAT TAT GG-3' (SEC ID NO: 24)) (codones aleatorizados subrayados; N=A/G/T/C; W=A/T; B=G/T/C; D=G/A/T; R=A/G; Y=C/T). Luego, 1,5 nmol del oligonucleótido molde (5'-CTC AGC GCGCAG GCT GTT CAT CTG CAG GTA-3' (SEC ID NO. 25)), con la secuencia complementaria a los extremos 5' de 503-1/2 y el extremo 3' de 503-3, se añadió para hibridar con cada extremo de la ligación. Se añadieron la Taq ligasa (ligasa termoestable de New England Biolabs) y el tampón, la reacción se prolongó durante 40 rondas de ciclos térmicos (95ºC, 1,25 min, 50ºC, 5 min) para reciclar el oligonucleótido molde entre las uniones ligadas y las no ligadas. El producto de oligonucleótidos de 126-mer se purificó en un gel de urea al 6%/poliacrilamida y TBE y se extrajo del gel con tampón. Los dos productos de 126 mer se combinaron en igual proporción, se precipitaron con etanol y por último se solubilizaron en Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM. El producto de oligonucleótidos de 126-mer mezclado se denominó 504-01.

La aleatorización de codones de región de entramado seleccionados (VL4, 71; VH24, 37, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 93, 94) se efectuó en dos etapas. En primer lugar, la aleatorización de VL se logró preparando tres derivados adicionales del molde de pMB4-19 modificado. Los codones de la región de entramado 4 y 7 en la cadena ligera se reemplazaron individualmente o por parejas utilizando dos oligonucleótidos mutagénicos 5'-GCT GAT ATC TTG ACC CAG TCC CCG-3' (SEC ID NO: 26), y 5'-TCT GGG ACG GAT TAC ACT CTG ACC ATC-3' (SEC ID NO: 27). El molde que contiene desouridina se preparó a partir de cada uno de los nuevos derivados. Junto con el molde original, estas cuatro construcciones codificaban para cada una de las cuatro combinaciones posibles de secuencia de región de entramado de cadena ligera (Tabla 5).

Los oligonucleótidos 504-1, una mezcla de los dos oligoncleótidos de 126-mer (véase más arriba), y 5'-CGT TTG TCC TGT GCA RYT TCT GGGC TAT ACC TTC ACC AA TAT GGT ATG AAC TGG RTC CGTCAG GCC CCG GGT AAG-3' (SEC ID NO: 28) se utilizaron para aleatorizar los codones de entramado de cadena pesada utilizando cada uno de los cuatro moldes ya descritos. Las cuatro librerías se estimaron en >1,2 x 10^{8}, aproximadamente 1.500 veces superior al número máximo de secuencias de ADN en la librería.

Se han desarrollado diversos sistemas para la expresión funcional de fragmentos de anticuerpo en la superficie del fago filamentoso. Winter y col., Ann. Rev. Immunol., 12, 433 (1994). Estos incluyen la expresión de fragmentos Fab o de Fv de cadena sencilla (scFv) como fusiones con las proteínas de la cubierta del gen III o del gen VIII del bacteriófago M13. El sistema seleccionado aquí es similar al descrito por Garrard y col., Biothechn, 9, 1373 (1991) en el que un fragmento Fab se expresa de forma monovalente como una fusión del gen III (Figura 7). Este sistema tiene dos características notables. En particular, al contrario que scFvs, los fragmentos Fv no tienen tendencia a formar especies diméricas, la presencia de las cuales puede prevenir la selección de los agentes de unión más fuertes debido a efectos de avidez. Adicionalmente, la monovalencia de la proteína expresada elimina un segunda fuente potencial de los efectos de avidez que pudieran resultar de la presencia de copias múltiples de una proteína en cada partícula fagémida. Bass y Wells, Proteins 8:309 (1990) y Lowman y col., Biochemistry 30:1083.2 (1991).

Las partículas de fagémido que expresan los fragmentos Fab A4.6.1 se propagaron en células XL-1 Blue E. coli. En resumen, las céululas que contienen la construcción pMB4-19 aleatoriazada se crecieron durante la noche a 37ºC en 25 ml de medio 2YT que contenía carbenicilina 50 \mug/ml y aproximadamente 10^{10} fagos auxilizares M13KO7 (Vieira & Messing Methods Enzymol. 153:3-11 (1987)). Las preparaciones madre de fagémidos de sobrenadantes de cultivos mediante precipitación con una solución salina de polietilén glicol, y se resuspendieron en 100 \mul de PBS (\sim10^{14} fagémido/ml).

La selección de variantes de Fab A4.6.1 humanizados: VEGF_{121} purificado (100 \mul a 10 \mug/ml en PBS) se colocó como recubrimiento en un pocillo de una placa de microtitulación a 4ºC durante la noche. La solución de recubrimiento se descartó y este pocillo, además del pocillo no recubierto, se bloqueó con leche descremada al 6% durante 1 h y se lavó con PBS que contenía TWEEN20™ al 0,05% (detergente). Luego, se añadieron a cada pocillo 10 \mul de solución madre de fagémido, diluida a 100 \mul con Tris 20 mM (pH 7,5) con BSA al 1% y TWEEN20™ al 0,05%. Al cabo de 2 h se lavaron las células y se eluyeron los fagos unidos con 100 \mul de glicina 0,1 M (pH 2,0), y se neutralizó con 25 \mul de Tris 1 M pH 8,0. Una alicuota de esto se utilizó para titular el número de fagos eluidos. Los fagos restantes eluidos del pocillo recubierto con VEGF se propagaron para utilizar en el siguiente ciclo de selección. Se realizaron un total de 8 ciclos de selección al cabo de los cuales se seleccionaron 20 clones individuales y se secuenciaron (Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467 (1977)).

Determinación de las afinidades de unión de VEGF: las constantes de asociación (Kon) y disoaciación (Koff) para la unión de variantes de Fab A4.6.a humanizados con VEGF121 se cuantificaron mediante resonancia de plasmón de superficie (Karlsson y col., J Immun. Methods 145:229-240 (1991)) en un instrumento BIAcore™ de Pharmacia. El VEGF_{121} se inmovilizó covalentemente en el chip biosensor mediante grupos amino primarios. La unión de variantes de Fab A4.6.1 se cuantificó haciendo pasar soluciones de Fab en PBS/TWEEN20™ al 0,05% sobre el chip a una velocidad de flujo a 20 \mul/min. Después de cada cuantificación de la unión, el Fab residual se desenganchó del ligando inmovilizado mediante lavado con 5 \mul de HCl 50 mM acuoso a 3 \mul/min. Los perfiles de unión se analizaron mediante regresión no lineal con un modelo de unión monovalente (BIAevaluation software v2.0; Pharmacia).

Resultados

Se realizó una construcción de A4.6.1 humanizado: un fragmento Fab A4.6.1 humanizado (hu2.0, figs. 5A y 5B), en la que las CDRs de A4.6.1 se injertaron en una región de entramado V_{L}\kappaI-V_{H}III. Los otros residuos en hu2.0 se mantuvieron como la secuencia humana. La unión de esta variante a VEGF fue tan débil que no fue detectable. Basándose en la afinidad relativa de otras variantes A4.6.1 humanizadas de unión débil, el Kd para la unión de hu2.0 se estimó a > 7 \muM. Esto contrasta con una afinidad de 1,6 nM para una construcción Fab quimérica que consiste en los dominios VL y VH de dominios constantes A4.6.1 murinos y humanos. Por ello, la unión de hu2.0 a VEGF se redujo en al menos 4000 veces en relación con la quimera.

Diseño de la librería de anticuerpos: el grupo de la región de entramado cambia a la secuencia de entramado humana que se muestra en la Tabla 5 y en la Fig. 6.

TABLA 5 Residuos clave de la región de entramado para la unión al antígeno y seleccionados para la aleatorización

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Una preocupación en el diseño de la librería de fagémidos A4.6.1 humanizada fue que los residuos seleccionados para la aleatorización estaban ampliamente distribuidos a través de las secuencias VL y VH. Las limitaciones en la longitud de los oligonucleótidos seintéticos requieren que la aleatorización simultánea de todas estas posiciones de entramado puedan únicamente lograrse a través de la utilización de oligonucleótidos múltiples. Sin embargo, como el número total de oligonucleótidos aumenta, la eficiencia de la mutagénesis disminuye (por ejemplo, la proporción de mutantes obtenidos que incorporan la secuencia derivada de todos los oligonucleótidos mutagénicos). Para paliar este problema, se incorporaron dos características en la construcción de la librería. La primera fue preparar cuatro moldes distintos de mutagénesis que codificaban pra cada una de las posibles combinaciones de entramado VL. Esto fue sencillo de realizar debido a la diversidad limitada de la región de entramado de cadena ligera (sólo 4 secuencias distintas), pero fue beneficioso en limitar la necesidad para dos oligonucleótidos de la estrategia de mutagénesis. En segundo lugar, dos oligonucleótidos de 126 bases se preensamblaron a partir de fragmentos sintéticos pequeños. Ello hizo posible la aleatorización de los codones de VH 67, 69, 71, 73, 75, 76, 93 y 94 con un solo oligonucleótido largo, en lugar de dos más cortos. La estrategia de mutagénesis por aleatorización utilizó únicamente dos oligonucleótidos simultáneamente con cuatro moldes distintos.

Selección de los Fabs de A4.6.1 humanizados de unión fuerte: las variantes de la librería de fagémidos de Fab A4.6.1 humanizado se seleccionaron según la unión a VEGF. El enriquecimiento de fagémidos funcionales, tal como se cuantificó por comparación de títulos para los fagos eluidos de un pocillo de una placa recubierta con VEGF versus una no recubierta, aumentó hasta la ronda séptima del panel de afinidad. Después de una ronda adicional de selección, se secuenciaron 20 clones para identificar los residuos de entramado preferidos seleccionados en cada posición aleatorizada. Estos resultados, se resumen en la Tabla 6, demostraron un consenso fuerte entre los clones seleccionados. Diez de los 20 clones tuvieron la misma secuencia de ADN, denominada hu2.10. De las 13 posiciones de la región de entramado, 8 substituciones se seleccionaron en hu2.10 (VL 71:VH 37, 71, 73, 75, 76, 78 y 94). Los residuos VH 37 (Ile) y 79 (Val) se seleccionaron por no pertenecer ni a la secuencia VHIII humana ni la murina A4.6.1. Este resultado sugiere que algunas posiciones de entramado pueden beneficiarse de extender la diversidad más allá de las secuencias de entramado diana humanas o murinas.

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TABLA 6 Secuencias seleccionadas a partir de la librería de fagémidos Fab A4.6.1 humanizados

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Hubo otras cuatro secuencias únicas aminoacídicas entre los 10 clones restantes analizados: hu2.1, hu2.2, hu2.6 y hu2.7. Todos estos clones, además de hu2.10, contenían las substituciones de entramado idénticas en las posiciones VH 37 (Ile), 78 (Val) y 94 (Lys), pero retenían la secuencia consenso de VHIII en las posiciones 24 y 93. Los cuatro clones habían perdido la secuencia codificante de la cadena ligera y no se unían a VEGF cuando se analizaron en un ensayo ELISA de fagos (Cunningham y col., EMBO J., 13:2508-251 (1994)). Dichos artefactos pueden a menudo minimizarse reduciendo el número de ciclos de selección o mediante propagación de las librerías en medio
sólido.

Expresión y afinidad de unión de variantes de A4.6.1 humanizadas: las variantes de fagos seleccionados hu2.1, hu2.2, hu2.6, hu2.7 y hu2.10 se expresaron en E. coli usando frascos de cultivo para agitación y los fragmentos Fab se purificaron a partir de extractos periplásmicos por cromatografía de afinidad con proteína G. Los rendimientos recuperados de Fab para estos cinco clones estuvieron en el intervalo de 0,2 (hu2.6) a 1,7 mg/L (hu2.1). La afinidad de cada una de estas variantes para el antígeno (VEGF) se cuantificó mediante resonancia de plasmón de superficie en un aparato BIAcore (Tabla 7). El análisis de estos resultados de unión demostró que el clon consenso hu2.10 poseía la mayor afinidad por VEGF de las cinco variantes analizadas. Por ello, la librería de fagémidos Fab se seleccionó enriquecida para el clon con mayor unión. La Kd calculada para hu2.10 fue de 55 nM, al menos 125 veces más fuerte que para hu2.0 que no contiene cambios en la región de entramado (KD>7 \muM). Las cuatro otras variantes seleccionadas presentaron todas una unión menor con VEGF, llegando a una KD de 360 nM para la más débil (hu2.7). La KD para hu2.6, 67 nM, fue más débil marginalmente que la hu2.0 y sólo una copia de este clon se halló entre los 20 clones secuenciados. Ello debió ser debido a un nivel inferior de expresión, como es el caso cuando se expresa el Fab soluble de esta variante. Sin embargo, a pesar de la tasa de expresión más baja, esta variante es útil como anticuerpo humanizado.

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TABLA 7 Afinidad de unión a VEGF de las variantes de Fab A4.6.1 humanizadas

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Mejora adicional de la variante humanizada hu2.1: A pesar de la importante mejora en la actividad antigénica sobre la variante humanizada inicial, la unión de de hu2.10 a VEGF fue todavía 35 veces más débil que el fragmento de Fab quimérico que contenía los dominios VL y VH A4.6.1 murinos. La diferencia considerable sugirió que una posterior optimización de la región de entramado humanizada puede ser posible a través de mutaciones adicionales. De los residuos Vernier identificados por Foote & Winter J. Mol. Biol. 224:487-499 (1992), sólo los residuos VL 46 y VH 48 fueron distintos en A4.6.1 respecto a la región de entramado VL\kappaI-VHIII (Figs. 5A y 5B) pero no se aleatorizaron en nuestra librería de fagémidos. Un modelo molecular del fragmento A4.6.1 humanizado mostró que VL 46 se localiza en la interfaz VK-VH y podría influenciar la conformación de CDR-H3. Además, este aminoácido es casi siempre la leucina en la mayoría de entramados VL\kappa (Kabat y col., supra), pero es la valina en A4.6.a. Según ello, se realizó una sustitución de Leu>Val en esta posición en el contexto de hu2.10. El análisis de la cinética de unión para esta nueva variante, hu2.10V, indicó una mejora de 6 veces en la KD por la unión a VEGF, lo que demostraba la importancia de la valina en esta posición VL 46 en el anticuerpo A4.6.1. La KD para hu2. 10V (9,3 nM) se halló entre 6 veces la de la quimera. En contraste con VL 46, no se observó ninguna mejora en la afinidad de unión de hu2.10 para el reemplazamiento de VH 2 o VH 48 con el correspondiente residuo de A4.6.1 murino.

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Ejemplo 3

En este ejemplo, la aleatorización de CDR, la maduración por afinidad por la expresión de fagos Fab monovalentes, y la combinación acumulativa de mutaciones se utilizaron para mejorar la afinidad de un anticuerpo anti-VEGF humanizado.

Construcción del anticuerpo humanizado pY0101: el vector de anticuerpo expresado en fagos phMB4-19-1.6 (véase las Figs. 8A-E) se utilizó como un parental. EN esta construcción, el anti-VEGF se expresó como un fragmento Fab con su cadena pesada fusionada con el extremo N-terminal de la g3p truncada. Tanto las cadenas ligeras como las pesadas se hallan bajo el control del promotor phoA con una secuencia cadena arriba para la secreción en el periplasma. Las mutaciones puntuales fuera de las regiones CDR se generaron mediante mutagénesis dirigida para mejorar la afinidad para VEGF con los oligonucleótidos HL-242, HL-245, HL-246, HL-254, HL-256 y HL-257 tal como se muestra en la Tabla 8 de más abajo.

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TABLA 8 Oligos para mutaciones dirigidas

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La variante resultante se denominó Y010 (Figs. 9A y 9B).

Construcción de la primera generación de librerías de anticuerpos de fagos: para prevenir la contaminación por secuencias de tipo salvaje con el codón de parada TAA en los sitios seleccionados para la aleatorización se prepararon y utilizaron para la construcción de librerías por mutagénesis dirigida con oligonucleótidos utilizando el codón NNS degenerado (en donde N es una mezcla igual de A, G, C y T, mientras que S es una mezcla igual de G y C) para la mutagénesis por saturación. VL1 y VH3 se eligieron como candidatos potenciales para aumentar las afinidad (Figs. 9A y B). Dentro de las CDRs, se construyeron dos librerías a partir del molde pY101. VL1 se mutó utilizando oligonucléotidos de molde-parada HL248 y HL-249 (Tabla 9) y los oligonucleótidos de la librería HL-258 y HL-259 (Tabla 10). De forma similar, se construyeron tres librerías para VH3 utilizando oligonucleótidos molde de parada HL-250, HL-251, y HL-252 (Tabla 9), y los oligonucleótidos de la librería HL-261, y HL-262 (Tabla 10). La construcción de la librería se resume en las Tablas 9 y 10 de más abajo.

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TABLA 9 Oligos molde para la mutagénesis

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TABLA 10 Oligos aleatorios para la construcción de la librería

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Los productos de las reacciones de mutagénesis aleatoria se electroporaron en células XLI-Blue E. coli (Stratagene) y se amplificaron mediante crecimiento durante 15-16 h con el fago auxliar M13K07. La complejidad de cada librería, desde 2 x 10^{7} a 1,5 x 10^{8} se estimó basándose en el plaqueo de la transformación inicial en placas con
carbenicilina.

Selecciones por afinidad iniciales: para cada ronda de selección, aproximadamente 10^{9}-10^{10} fagos se cribaron para la unión a las placas (Nunc Maxisorp 96-pocillos) recubiertas con 2 \mug/ml de VEGF (recombinante; versión de residuos 9-109) en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6 se bloquearon con leche instantánea en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6. Al cabo de 1-2 horas de unión a temperatura ambiente, en presencia de albúmina de suero bovina y TWEEN20™ en PBS, la solución de fagos se eliminó y la placa se lavó diez veces con PBS/TWEEN™ (TWEEN20™ al 0,05% en tampón PBS). Típicamente, para seleccionar las variantes por su afinidad aumentada con velocidades de disociación menores, se incubaron las placas con tampón de PBS/TWEEN™ durante un periodo de tiempo que se prolongó progresivamente para cada ronda de selección (desde el minuto 0 para la primera ronda, a las 3 h para la ronda novena de selección). Después de retirar el tampón PBS/TWEEN™, los fagos restantes se eluyeron con HCl 0,1 M e inmediatamente se neutralizaron con 1/3 volúmenes de Tris 1 M, pH 8,0. Los fagos eluidos se propagaron mediante infección de células XL1-Blue E. coli (Stratagene) para el ciclo de selección
siguiente.

Los resultados de secuenciación demostraron que ambas librerías VL1, incluso después de 8/9 rondas de selección, permanecían varios tipos de residuos tolerantes en los sitios de aleatorización. En cambio, las librerías VH3 retuvieron sólo los residuos de tipo salvaje o tenían sustituciones muy conservadas. Esto sugiere que VL fue más expuesta al solvente y permanece fuera de la interfaz de unión. Por el contrario, VH3 no mostró sustituciones de cadenas laterales dramáticamente distintas, y en consecuencia debe estar más implicada íntimamente en la unión con el
antígeno.

Ensayo de fagos-ELISA de afinidades de unión: de cada una de estas librerías, se analizaron clones representativos (los representativos por las secuencias abundantes) por sus afinidades relativas a las del clon parental pY101 en un ensayo ELISA de fagos. En un ensayo de dicho tipo, en primer lugar, los fagos se diluyeron seriadamente para determinar un título de saturación funcional que se mantuvo constante y se utilizó para incubar con diversas concentraciones de VEGF (iniciándose a 200 nM hasta 0 nM) en solución. La mezcla se transfirió a una placa recubierta con VEGF (2 \mug/ml) y se bloqueó con leche instantánea al 5%, y se permitió equilibrarse durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, la solución de fagos se extrajo y los fagos que permanecían unidos se detectaron con una solución de anticuerpos de conejo anti-fagos mezclada con un anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano. Al cabo de 1hora a temperatura ambiente, la placa se reveló con un sustrato cromogénico, o-fenilendiamina (Sigma). La reacción se paró con adición de ½ volumen de H_{2}SO_{4} 2,5 M. La densidad óptica a 492 nm se cuantificó con un lector de placas por espectrofotometría.

Aunque todos los clones de estas 5 librerías mostraron afinidades débiles o similares que la de tipo salvaje pY0101 en el ensayo ELISA de fagos, una variante particular (pY0192) de la librería HL-258 demostró una ventaja aparente (aproximadamente 10 veces) en el nivel de expresión de fagos respecto a pY0101. Este clon contenía mutaciones S24R, S26N, Q27E, D28Q y 129L en la región VL (Fig. 9A). Además, esta variante se halló que tenía una mutación espuria, M34I, en VH. Esta variante no mostró ninguna diferencia significativa en la afinidad de unión a VEGF comparada con la variante pY0101. Para mejorar el nivel de expresión de Fab sobre los fagos, y la proporción señal-ruido de fondo en los ensayos ELISA de fagoss, las sustituciones correspondientes en pY192 en VL1 se incorporaron en la base del molde para la construcción de los mutantes CDR-Ala y la segunda generación de librerías
anti-VEGF.

Cribado por Ala de las CDRs anti-VEGF: Para determinar las energías aportadas por cada aminoácido en las regiones CDR y así seleccionar mejor los residuos diana para la aleatorización, las regiones CDR se cribaron mediante sustituyendo por alanina en cada uno de los residuos. Cada mutante Ala se construyó utilizando la mutagénesis dirigida con un oligonucleótido sintético que codifica la sustitución por alanina específica. Si Ala era el residuo de tipo salvaje, entonces se sustituyó por Ser para analizar el efecto de una sustitución de cadena lateral. Los clones de fagos con una sola mutación Ala se purificaron y analizaron en el ELISA de fagos tal como se describió anteriormente. Los resultados del cribado por Ala demostraron que la sustitución por Ala en varias posiciones puede tener un efecto, desde 2 a > 150 veces de reducción, sobre la afinidad de unión al antígeno comparada con pY0192. Además, se confirmó una observación previa de que VH3, pero no VL1, estaba implicado en la unión al antígeno. Los resultados del cribado por Ala de CDR se resumen en la Tabla 11 siguiente.

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TABLA 11 Afinidades VEGF relativas de las variantes Fab del cribado de Ala

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15

16

Todas las variantes en el contexto de pY0192 ("wt", véanse lasY109A Figs. 9A-B). Las IC50s se determinaron en un ensayo de coF110Ampetición ELISA.

Los efectos diana de las sustituciones Ala se muestran en las CDRs H1, H2 y H3, incluyendo Y27A (reducción de afinidad de 34 vces), N31A, Y32A, W50A, N52A, Y99A, S106A y W108A (cada uno, reducción de >150 veces); N35A (reducción de 66 veces), P100A (reducción de 38 veces) y F110A (reducción de 25 veces). Por el contrario, sólo una sustitución VL tubo un gran impacto sobre la afinidad de unión, W96A (reducción >150 veces). Estos resultados apuntan a tres VH-CDRs como los determinantes energéticos de la unión de Fab a VEGF, con alguna contribución de VL3.

Diseño de librerías de mutación CDR de segunda generación: dos librerías adicionales con residuos aleatorizados existentes en el anti-VEGF versión Y0192 se diseñaron basándose en la estructura cristalina. En VH2, los residuos 52-55 se aleatorizaron porque se hallan dentro de la interfaz de unión con VEGF. Una región adicional de Fab, denominada "CDR" (véase la Fig. 10B), también se utilizó como diana para aleatorización debido a la presencia de varios residuos en dicho bucle, que aunque no contactaban con VEGF, sí lo hacían con los bucles VH del anticuerpo. Estos sitios potenciales representados para una mejora de afinidad a través de secundarios ejercen su acción sobre los residuos interfaz. Los residuos L72, T74 y S77 se aleatorizaron en esta librería CDR7.

También basándose en la estructura cristalina, una de las librerías CDR originales se reconstruyó para re-analizar el potencial de maduración por afinidad en el VH1 CDR. Los residuos 27, 28 y 30-32 se aleatorizaron utilizando Y0192 como base.

Selecciones de segunda generación de librerías anti-VEGF: Según los resultados del cribado por Ala así como la estructura cristalina del complejo anticuerpo (F(ab)-12)-antígeno, se construyeron un total de 17 librerías utilizando el pY0192 como molde y los oligonucleótidos molde de parada (que codifican un codón de parada en las dianas seleccionadas para la aleatorización) YC-80, YC-100, YC-102, HL263 y HL-264 (Tabla 9 anterior). Los oligonucleótidos de aleatorización correspondientes (que utilizan NNS en los sitios seleccionados para la aleatorización) fueron YC81, YC-101, YC-103, HL-265 y HL-266 (Tabla 10 anterior). Los transformantes resultantes rindieron librerías de una complejidad de 6 x 10^{7} a 5 x 10^{8}, lo que sugiere que las librerías cubrían todas las variantes posibles. Las librerías de fagos se seleccionaron durante 7-8 rondas en las condiciones descritas en la Tabla 12 de más abajo.

TABLA 12 Condiciones para las selecciones secundarias de las variantes de Fab

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El tampón ELISA contenía albúmina sérica bovona la 0,5% y TWEEN 20™ al 0,05% en PBS. El VEGF se incluyó en el tampón de incubación para minimizar la reunión de del VEGF de recubrimiento colocado en la superficie de la placa. La selección de estas librerías produjo un enriquecimiento de fagos durante 7 a 8 rondas de selección.

Ensayos ELISA de fagos de los clones de segunda generación: después de 8 rondas de selección, 10 a 20 clones de cada librería se aislaron a partir de las placas que contenían carbenicilina con las colonias de E. coli (XL1) que habían sido infectadas con un grupo de fagos eluidos. Las colonias se aislaron y crecieron con los fagos auxiliares para obtener ADN de cadena sencilla para secuenciar. Las sustituciones CDR seleccionadas para una unión más favorable con VEGF se dedujeron a partir de las secuencias de ADN de los clones de fagémidos. Una muestra de clones seleccionados se muestra en la Tabla 13 siguiente.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 13 Secuencias de proteínas de las variantes anti-VEGF de las librerías de fagos de segunda generación

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20

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La secuencia de la región aleatorizada sólo se muestra tal como se dedujo de la secuencia del ADN.

Cuando se analizó un número de clones junto con el clon parental pY0192 en el ensayo ELISA de fagos, ninguno mostró una mejora diferente sobre el clon parental. Ello puede explicarse por la escala de tiempo en la que se realizó el ensayo (< 3 horas).

Con el fin de cuantificar la mejora en la unión del antígeno sobre el clon parental, se transformaron varios ADN de variantes anti-VEGF en la cepa 34B8 de E. coli, expresada como Fab, y se purificaron haciendo pasar el contenido del choque periplásmico por una columna de proteína G (Pharmacia) tal como se describió en el Ejemplo 2 anterior.

Las variantes de combinación: para mejorar la afinidad de unión a VEGF, se combinaron las mutaciones halladas en la expresión de fagos en CDRs distintas para crear mutantes de CDR múltiples. En particular, se combinaron las mutaciones identificadas en la mayoría de las variantes de fagos mejorados en afinidad de las librerías VH1, VH2 y VH3 (Tabla 4) con el fin de analizar su contribución a la afinidad de unión.

TABLA 14 Combinación de variantes anti-VEGF de CDR

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Las mutaciones de los vectores parentales indicados se combinaron con las de la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos para rendir las variantes de la combinación indicada.

La versión Y0137 es equivalente a Y0313-1 excepto que la mutación base en VL1 se eliminó y su secuencia se revertió a la de pY0101. Los efectos de mutar H101Y y S105T se analizaron construyendo un mutante de reversión a partir de Y0238-3.

Análisis de BIAcore. Las afinidades de unión a VEGF de los fragmentos Fab se calcularon a partir de las constantes de la tasa de disociación con un sistema de resonancia de plasmón de superficie BIAcore-2000™ (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). Un chip biosensor se activó para el acoplamiento covalente de VEGf utilizando el N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida hidrocloruro (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). Se cambió el tampón del VEGF por el de acetato sódico 20 mM, pH 4,8 y se diluyó a aproximadamente 50 \mug/ml. Una alícuota (35 \mul) se inyectó a una velocidad de flujo de 2 \mul/min para lograr aproximadamente 700-1400 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Por último, se inyectó etanolamina 1 M como agente bloqueante.

Para las cuantificaciones de cinéticas, se inyectaron diluciones seriadas de Fab en tampón PBS-TWEEN™
(TWEEN20™ en tampón salino fosfato) a 25ºC a una velocidad de flujo de 10 \mul/min. Se calcularon las tasas de asociación y disociación con protocolos estándarees (Karlsson y col., J. Immun. Methods 145:229-240 (1991)). Las constantes de disociación en equilibrio Ks de las cuantificaciones de resonancia por plasmón de superficie (SPR) se calcularon como Koff/Kon. Los resultados se muestran en la Tabla 15 siguiente.

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23

Los resultados del BIAcore™ en la Tabla 15 muestran que diversas variantes han mejorado la afinidad sobre Y0192. Por ejemplo, una variante de CDRH1, Y0243-1, mostró un incremento en la afinidad de 4,1 veces, con las mutaciones T28D y N31H. La variante Y0238-3 mostró al menos una mejora de 14 veces en la afinidad de unión sobre Y0192. Ambas mutaciones CDRH3 contribuyen a una afinidad mejorada de Y0238-3 porque la reversión de T105 a S (variante Y0313-3) reduce la afinidad de Y0238-3 desde 0,15 nM a 0,65 nM (véase la Tabla 15). El mayor incremento en la afinidad relativa de Y0192 se observó para Y0313-1, que contenía mutaciones CDRH3 combinadas con mutaciones CDRH1.

Ensayo de células de inhibición de VEGF: se analizaron varias versiones del anticuerpo anti-VEGF A4.6.1 para su capacidad para antagonizar el VEGF (recombinante; versión 1-165) en la inducción del crecimiento de HuVECs (células endoteliales de la vena umbilical). Las placas de 96 pocillos se sembraron con 1000 HuVECs por pocillo y se crecieron en medio de ensayo (F12:DMEM 50:50 suplementado con suero bovino fetal al 1,5%) durante 24 h. La concentración del VEGF utilizada para inducir las células se determinó en primer lugar mediante titulación para la cantidad de VEGF que puede estimular el 80% de síntesis de ADN. El medio de ensayo fresco contenía cantidades fijas de VEGS (0,2 nM concentración final), y concentraciones en aumento de anti-VEGF o Mab cuando se añadían. Al cabo de 40 h de incubación, se cuantificó la síntesis del ADN mediante incorporación de timidina tritiada. Se añadió a las células 0,5 \muCi por pocillo de timidina-[H3] durante 24 horas y se cosechó para realizar la cuenta, con un contador gamma TopCount.

Los resultados (Fig. 11) muestran que la forma de IgG de secuencia completa de F(ab)-12 era significativamente más potente en la inhibición de la actividad de VEGF que la forma de Fab (aquí se utilizó Y0192). Sin embargo, ambas variantes Y0238-3 y Y0313-1 mostraron incluso una inhibición más potente de la actividad de VEGF que la de Y0192 Fab o F(ab)-12 Mab. La comparación de las formas Fab, variante Y0313-1 pareció unas >30 veces más potentes que la de tipo salvaje. Se debería remarcar que la cantidad de VEGF (0,2 nM) utilizada en este ensayo es potencialmente limitante para la determinación de un IC50 más adecuado para el mutante. Por ejemplo, si la afinidad de unión (Kd) del mutante es de hecho <0,2 nM, la IC50 en este experimento parecerá superior que en las condiciones de una concentración de VEGF inferior. El resultado en consecuencia apoya la conclusión de que la variante de afinidad mejorada es al menos 30 veces mejor en afinidad por el VEGF, y que efectivamente bloquea la actividad VEGF in vitro. Ya que la variante Y0317 difiere de la Y0313-1 únicamente en la reversión de la secuencia VL-1 a la de tipo salvaje (Fig. 10A), se prevé que Y0317 tendrá una actividad similar a la Y0313-1.

La variante Y0317 (Fab) y la variante humanizada F(ab)-12 del ejemplo 1 (secuencia completa y Fab) se compararon para su capacidad para inhibir la proliferación de células endoteliales bovinas en respuesta a una concentración efectiva casi máxima de VEGF utilizando el ensayo descrito en el Ejemplo 1. Tal como se muestra en la Figura 12, Y0317 fue mucho más efectiva en la inhibición de la proliferación de células endoteliales capilares bovinas que la secuencia completa y las formas Fab de F(ab)-12 en este ensayo. El Fab madurado por afinidad Y0317 demostró un valor ED50 en este ensayo que fue de al menos 20 veces inferior que el Fab F(ab)-12.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i): SOLICITANTE: Genentech, Inc.

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(ii): TITULO DE LA INVENCIÓN: ANTICUERPOS ANTI-VEGF

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 130

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(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A): DIRECCIÓN: FLEHR HOHBACH TEST ALBRITTON & HERBERT LLP

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(B): CALLE: Four Embarcadero Center, Ste., 3400

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: San Francisco

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(D): ESTADO: CA

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(E): PAIS: USA

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(F): CODIGO POSTAL: 94111

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO MEDIO: disco blando

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: pc-dos/ms-dos

\vskip0.500000\baselineskip

(D): PROGRAMA: PatentIn Release # 1.0, version # 1.30

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(vi): FECHA ACTUAL DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE LA SOLICITUD: PCT/US98/06604

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE SOLICITUD: 1998-ABRIL-03

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(C): CLASIFICACIÓN

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(vii): FECHA PREVIA DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE LA SOLICITUD: US 08/833.504

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE SOLICITUD: 1997-ABRIL-07

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FECHA PREVIA DE LA SOLICITUD:

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(A): NÚMERO DE LA SOLICITUD: US 08/908.469

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(B): FECHA DE SOLICITUD: 1997-AGOSTO-06

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(viii): INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE DE PATENTES:

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(A): NOMBRE: Vance, Dolly A

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 39.054

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(C): NÚMERO DE REFERENCIA/ARCHIVO: FP-65358/WHD/DAV

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (415) 781-1989

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: (415) 398-3249

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn}

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys}

\sac{Arg}

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5

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\sa{Phe Thr Ser Ser Leu His Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6

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\sa{Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 123 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 108 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 123 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9

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26

\newpage

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 108 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10

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27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 113 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 108 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 13

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 123 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 14

\vskip1.000000\baselineskip

31

32

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 15

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 123 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 16

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 17

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Lys Asn Ser Ser Met Ile Ser Asn Thr Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 18

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Gln Ser Leu Thr Gly Thr Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 19

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Gln Asn Leu Ser Asp Gly Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 20

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Gln Asn Ile Ser Asp Gly Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 21

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Ile Ser Ser His Leu Gly Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 67 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 22

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 66 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 23

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 60 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCCTGCGCG CTGAGGACAC TGCCGTCTAT TACTGTDYAA RGTACCCCCA CTATTATGGG

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCAGCGCGC AGGCTGTTCA TCTGCAGGTA

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTGATATCC AGTTGACCCA TGCCCCG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTGGGACGG ATTACACTCT GACCATC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 75 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 28

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATATCCAGT TGACCCAGTC CCCG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTCCGAAAG TACTGATTTA C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 54 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTCGTTTCA CTTTTTCTGC AGACACCTCC AGCAACACAG TATACCTGCA GATG

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTATTACTGT GCAAAGTACC CCCAC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGACGGATT TCACTCTGAC CATC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTATGAACT GGGTCCGTCA GGCCCC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 57 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTCGTTTCA CTTTTTCTTT AGACACCTCC AAAAGCACAG CATACCTGCA GATGAAC

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 53 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGTCACCAT CACCTGCTAA GCATAATAAT AATAAAGCAA CTATTTAAAC TGG

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 52 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGCAAGTCA GGATATTTAA TAATAATAAT AATGGTATCA ACAGAAACCA GG

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCTATTACT GTGCAAAGTA ATAACACTAA TAAGGGAGCA GCCACTGG

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 49 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTACCCCCA CTATTATTAA TAATAATAAT GGTATTTCGA CGTCTGGGG

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 53 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACTATTATG GGAGCAGCCA CTAATAATAA TAAGTCTGGG TCAAGGAACC CTG

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 53 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCTGTGCAG CTTCTGCTA ATAATTCTAA TAATAAGGTA TGAACTGGGT CCG

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 52 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATGGGTTG GATGGATTAA CTAATAATAA GGTTAACCGA CCTATCGTGC GG

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 49 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGTGCAAAG TACCCGTAAT ATTAATAATA ATAACACTGG TATTTCGAC

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTTTCACTT TTTCTTAAGA CTAATCCAAA TAAACAGCAT ACCTGCAG

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 46 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATGGGTTG GATGGATTTA ATAATAATAA GGTGAACCGA CCTATG

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 53 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGTCACCAT CACCTGCNNS GCANNSNNSN NSNNSAGCAA CTATTTAAAC TGG

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 52 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGCAAGTCA GGATATTNNS NNSNNSNNSN NSTGGTATCA ACAGAAACCA GG

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCTATTACT GTGCAAAGNN SNNSCACNNS NNSGGGAGCA GCCACTGG

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 49 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTACCCCCA CTATTATNNS NNSNNSNNST GGTATTTCGA CGTCTGGGG

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 54 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACTATTATG GGAGCAGCCA CNNSNNSNNS NNSGTCTGGG GTCAAGGAAC CCTG

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 53 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCTGTGCAG CTTCTGGCNN SNNSTTCNNS NNSNNSGGTA TGAACTGGGT CCG

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 52 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATGGGTTG GATGGATTAA CNNSNNSNNS GGTNNSCCGA CCTATGCTGC GG

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 49 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGTGCAAAG TACCCGNNST ATNNSNNSNN SNNSCACTGG TATTTCGAC

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTTTCACTT TTTCTNNSGA CNNSTCCAAA NNSACAGCAT ACCTGCAG

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 47 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATGGGTTG GATGGATTNN NSNNSNNSNN SGGTGAACCG ACCTATG

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 56

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 57

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Ile Asn Lys Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 58

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 59

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Asn Gln Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 60

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Ile Ala Lys Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 61

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Asp Asn Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 62:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 62

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Trp Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 63

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gln Asn Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 64

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gln Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 65:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 65

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Asn Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 66:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 66

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Lys Asn Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 67:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 67

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Ile Glu Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 68:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 68

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Asn Ala Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 69:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 69

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Thr Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 70:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 70

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Glu Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 71:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 71

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gln Arg Gly His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 72:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 72

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Thr Gly Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 73:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 73

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Thr Asn Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 74:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 74

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Lys Gly Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 75:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 75

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Thr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 76:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 76

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Ser Gly Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 77:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 77

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Thr Asn Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 78:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 78

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Asn Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 79:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 79

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Lys Glu Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 80:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 80

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Asp Ala Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 81:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 81

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gln Lys Gly His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 82:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 82

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Lys Gly Gly Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 83:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 83

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Gly Ala Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 84:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 84

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gly Glu Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 85:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 85

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Ser Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 86:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 86

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr Gly Met Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 87:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 87

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Glu Phe Gln His Tyr Gly Met Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 88:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 88

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Glu Phe Thr His Tyr Gly Met Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 89:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 89

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Asp Phe Gly His Tyr Gly Met Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 90:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 90

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Asp Phe Ser His Tyr Gly Met Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 91:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 91

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Glu Phe Ser His Tyr Gly Met Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 92:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 92

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Ser Val Asp Val Ser Lys Ser Thr Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 93:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 93

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Ser Leu Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 94:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 94

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Ser Leu Asp Val Trp Lys Ser Thr Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 95:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 95

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Ser Ile Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 96:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCAAAGTACC CGTACTATTA TGGGACGAGC CACTGGTATT TC

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 97:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCACCATCA CCTGCAGCGC AAGTCAGGAT ATTAGCAACT ATTTAAAC

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 98:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGTACTATT ATGGGAGCAG CCACTGGTAT TTC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 99:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6072 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE:CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 390..1101

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBR/CLAVE: mat_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 459

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NOMBR/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): LOCALIZACIÓN: 1185..2423

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(E): NOMBR/CLAVE: mat_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(F): LOCALIZACIÓN: 1254

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 99

38

39

40

41

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 100:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 413 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 100

43

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 101:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 110 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 101

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 102:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 119 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 102

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 103:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 110 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 103

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 104:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 118 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 104

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 105:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 110 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 105

\vskip1.000000\baselineskip

49

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 106:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 118 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 106

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2)INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 107:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 110 aminoácid

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 107

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 108:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 118 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 108

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 109:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 110 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 109

\vskip1.000000\baselineskip

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 110:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 118 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 110

\vskip1.000000\baselineskip

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 111:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 110 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 111

\vskip1.000000\baselineskip

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 112:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 118 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 112

\vskip1.000000\baselineskip

56

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 113:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 110 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 113

\vskip1.000000\baselineskip

57

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 114:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 118 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 114

58

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 115:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 110 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 115

\vskip1.000000\baselineskip

59

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 116:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 118 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 116

\vskip1.000000\baselineskip

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 117:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 3

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 3 representa cualquiera de los aminoácidos ácido aspártico, treonina o ácido glutámico".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(D): LOCALIZACIÓN: 4

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 4 representa cualquiera de los aminoácidos fenilalanina, triptófano o tirosina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(E): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(F): LOCALIZACIÓN: 5

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 5 representa cualquiera de los aminoácidos treonina, glutamina o glicina o serina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(G): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(H): LOCALIZACIÓN: 6

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 6 representa histidina, o asparraguina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(I): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(J): LOCALIZACIÓN: 9

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 9 representa metionina o isoleucina".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 117

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 118:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(K): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(L): LOCALIZACIÓN: 5

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 5 representa tirosina o triptófano".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 7

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 7 representa cualquiera de los aminoácidos serina, treonina, lisina, glutamina, asparraguina, arginina, ácido glutámico o glicina".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 118

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Ile Asn Thr Xaa Thr Gly Gly Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys}

\sac{Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 119:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 3

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 3 representa histidina o tirosina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 5

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 5 representa cualquiera de los aminoácidos tirosina, arginina, lisina, isoleucina, treonina, ácido glutámico o triptófano".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 6

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 6 representa cualquiera de los aminoácidos glicina, arginina, alanina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutámico, treonina, leucina o serina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(E): LOCALIZACIÓN: 7

\vskip0.500000\baselineskip

(F): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 7 representa cualquiera de los aminoácidos serina, treonina, lisina, glutamina, asparraguina, arginina, ácido glutámico o glicina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 8

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 8 representa cualquiera de los aminoácidos serina, o glicina".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 119

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa His Trp Tyr Phe Asp Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 120:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(E): LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(F): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 1 representa cualquiera de los aminoácidos fenilalanina, isoleucina, valina, leucina o alanina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(D): LOCALIZACIÓN: 3

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 3 representa cualquiera de los aminoácidos alanina, leucina, valina o isoleucina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 5

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 5 representa cualquiera de los aminoácidos treonina, valina o lisina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 6

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 6 representa cualquiera de los aminoácidos serina, o triptófano".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 7

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 7 representa serina o lisina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 8

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 8 representa asparraguina o serina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 10

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 10 representa cualquiera de los aminoácidos valina, alanina, leucina o isoleucina".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 120

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Ser Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 121:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 1 representa cualquiera de los aminoácidos arginina o serina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 3

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 3 representa cualquiera de los aminoácidos serina o asparraguina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 4

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 4 glutamina o ácido glutámico".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 5

\newpage

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 5 representa cualquiera de los aminoácidos glutamina o ácido aspártico".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 6

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 6 representa isoleucina o leucina".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 121

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Asn Tyr Leu Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 122:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 122

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Thr Ser Ser Leu His Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 123:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 5

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 5 representa cualquiera de los aminoácidos treonina, alanina o asparraguina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 6

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 6 representa cualquiera de los aminoácidos valina o treonina".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 123

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Tyr Ser Xaa Xaa Pro Trp Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 124:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 108 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 4

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 4 representa cualquiera de los aminoácidos metionina o leucina".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 124:

61

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 125:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 123 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 28

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 28 representa cualquiera de los aminoácidos treonina, o ácido aspártico".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 31

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 31 representa cualquiera de los aminoácidos asparraguina o histidina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 101

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 101 representa cualquiera de los aminoácidos tirosina o histidina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 105

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 105 representa cualquiera de los aminoácidos serina o treonina".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 125

62

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 126:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 126

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr Gly Met Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 127:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 127

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 128:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(D): LOCALIZACIÓN: 3

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 3 representa cualquiera de los aminoácidos treonina o ácido aspártico".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(D): LOCALIZACIÓN: 6

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 6 representa cualquiera de los aminoácidos asparraguina o histidina".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 128

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Xaa Phe Thr Xaa Tyr Gly Met Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 129:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(E): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(F): LOCALIZACIÓN: 3

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 3 representa cualquiera de los aminoácidos tirosina o histidina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(E): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(F): LOCALIZACIÓN: 7

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota="la X en posición 7 representa cualquiera de los aminoácidos serina o treonina".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 129

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Xaa Tyr Tyr Gly Xaa Ser His Trp Tyr Phe Asp Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 130:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 237 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 130

63

Claims

1. Variante de un anticuerpo anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) parental, en donde dicho anticuerpo anti-VEGF parental tiene un dominio de cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica de la SEC ID NO: 7 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica de la SEC ID NO: 8, en donde:

(i): dicha variante se une al VEGF humano con una afinidad de unión más fuerte que la parental y comprende una sustitución aminoacídica en al menos la región hipervariable CDRH1 y/o la región hipervariable CDRH3 del dominio variable de cadena pesada de dicho anticuerpo parental.

(ii): La variante tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende las siguientes secuencias aminoacídicas de región hipervariable:

: CDRH1: GYX_{1}X_{2}X_{3}X_{4}YGX_{5}N (SEC ID NO: 117), en donde X_{1} es D, T o E, X_{2} es F, W, o Y, X_{3} es T, Q, G o S, X_{4} es H o N y X_{5} es M o I; y

: CDRH3: YPX_{1}YX_{2}X_{3}X_{4}X_{5}HWYFDV (SEC ID NO: 119): en donde X_{1} es H o Y, X_{2} es Y, R, K, I, T, E o W, X_{3} es G, N, A, D, Q, E, T, K o S, X_{4} es S, T, K, Q, N, R, A o E, o G y X_{5} es S o G, y

(iii): la variante tiene una secuencia aminoacídica con al menos un 90% de identidad de secuencia aminoacídica con el dominio variable de cadena ligera o pesada del anticuerpo parental de la SEC ID NO: 7 o la SEC ID NO: 8.

2. Variante de anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende sustituciones tanto en CDRH1 como en CDRH3 del dominio variable de cadena pesada.

3. Variante de anticuerpo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, la cual se une con el VEGF humano con un valor de K_{d} no inferior a aproximadamente 1x10^{-8}M.

4. Variante de anticuerpo según la reivindicación 3, la cual se une al VEGF humano con un valor de K_{d} no inferior a aproximadamente 5x10^{-9}M.

5. Variante de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, la cual tiene un valor ED_{50} para inhibir la proliferación inducida por VEGF de las células endoteliales in vitro que es inferior a 10 veces la del anticuerpo parental mencionado.

6. Variante de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el nivel de identidad es de por lo menos un 95%.

7. Variante de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un dominio variable de cadena pesada que incluye la secuencia aminoacídica de la región hipervariable CDRH2:

WINTX_{1}TGEPTYAADFKR (SEC ID NO: 118), en donde X_{1} es Y o W.

8. Variante de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que contiene el dominio variable de cadena pesada que comprende las siguientes secuencias aminoacídicas de región hipervariable:

CDRH1: GYX_{1}FTX_{2}YGMN (SEC ID NO: 128), en donde X_{1} es T o D y X_{2} es N o H;

CDRH2: WINTYTGEPTYAADFKR (SEC ID NO: 2); y

CDRH3: YPX_{1}YYGX_{2}SHWYFDV (SEC ID NO: 129), en donde X_{1} es Y o H y X_{2} es S o T.

9. Variante de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde CDRH1 tiene la secuencia aminoacídica GYDFTHYGMN (SEC ID NO: 126).

10. Variante de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde CDRH3 tiene la secuencia aminoacídica YPYYYGTSHWYFDV (SE ID NO: 127).

11. Variante de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene el dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias aminoacídicas de región hipervariable siguientes:

CDRL1: X_{1}AX_{2}X_{3}X_{4}X_{5}SNYLN (SEC ID NO: 121), en donde X_{1} es R o S, X_{2} es S o N, X_{3} es Q o E, X_{4} es Q o D y X_{5} es I o L;

CDRL2: FTSSLHS (SEC ID NO: 122);

CDRL3: QQYSX_{1}X_{2}PWT (SEC ID NO: 123), en donde X_{1} es T, A o N y X_{2} es V o T.

12. Variante de anticuerpo según la reivindicación 11, en donde: en CDRL1, X_{1} es S, X_{2} es S, X_{3} es Q, X_{4} es D y X_{5} es I; y en CDRL3, X_{1} es T y X_{2} es V.

13. Variante de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia aminoacídica de SEC ID NO: 116.

14. Variante de anticuerpo según la reivindicación 13, en donde el dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia aminoacídica;

DIQX_{1}TQSPSSLSASVGDRVTITCASASQSISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTD
FTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTTFGQGTKVEIKR (SEC ID NO: 124),

En donde, X1 es M o L.

15. Variante de anticuerpo según la reivindicación 14, en donde el dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia aminoacídica de SEC ID NO: 115.

16. Variante de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, la cual es un anticuerpo de secuencia completa.

17. Variante de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 16, la cual es una IgG humana.

18. Variante de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, la cual es un fragmento de anticuerpo.

19. Variante de anticuerpo según la reivindicación 18, la cual es un Fab o Fab'.

20. Variante de anticuerpo según la reivindicación 18, la cual es un F(ab')2.

21. Composición que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un vehículo aceptable farmacéuticamente.

22. Ácido nucleico que codifica el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.

23. Vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 22.

24. Célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 23.

25. Proceso de producción de un anticuerpo anti-VEGF que comprende el cultivo de una célula huésped según la reivindicación 24 con el fin de expresar el ácido nucleico.

26. Proceso según la reivindicación 25 que además comprende la recuperación del anticuerpo anti-VEGF a partir del cultivo de células huésped.

27. Medicamento que comprende un anticuerpo anti-VEGF humanizado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 para utilizar en la inhibición de la angiogénesis inducida por VEGF en un mamífero, en donde dicho medicamento puede administrarse en una cantidad efectiva terapéuticamente al mamífero.

28. Medicamento según la reivindicación 27, en donde el mamífero es un humano.

29. Medicamento según la reivindicación 27 o la 28, en donde el mamífero tiene un tumor.

30. Medicamento según la reivindicación 27 o la 28, en donde el mamífero tiene un trastorno de la retina.