ES2828694T3 - Anticuerpos sólo de cadena pesada frente a ANG-2 - Google Patents

Abstract

Anticuerpo sólo de cadena pesada (HCAb) con una especificidad de unión a antígeno por ANG-2, en el que este HCAb se selecciona del siguiente grupo: a) en el que el HCAb tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, b) un HCAb con una especificidad de unión a antígeno por ANG-2, en el que la región variable (VH) de HCAb tiene la secuencia de SEQ ID NO: 25.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos sólo de cadena pesada frente a ANG-2

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de las solicitudes de patente provisionales estadounidenses 62/198.518 presentada el 29 de julio de 2015 y 62/205.185 presentada el 14 de agosto de 2015.

Antecedentes

La angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de la vasculatura preexistente, es un componente principal en varias enfermedades vasculares de la retina que provocan ceguera, tales como retinopatía de la prematuridad, retinopatía diabética proliferativa, edema macular diabético y degeneración macular relacionada con la edad. La neovascularización ocular es la formación anómala o excesiva de vasos sanguíneos del ojo. Se ha mostrado que la neovascularización ocular es relevante tanto en retinopatía diabética como en degeneración macular relacionada con la edad.

La degeneración macular relacionada con la edad (AMD) es una causa principal de ceguera en la población anciana y se reconoce como formas de AMD seca y húmeda. La forma seca, o no exudativa, implica cambios tanto atróficos como hipertróficos del epitelio pigmentario retiniano (RPE). La forma seca se caracteriza por drusas maculares que son zonas pigmentadas que contienen células muertas y productos metabólicos que deforman la retina y finalmente provocan pérdida de visión aguda. Los pacientes con AMD no exudativa (forma seca) pueden progresar a AMD húmeda, o exudativa o neovascular, en la que se desarrollan membranas neovasculares coroideas (CNVM) patológicas debajo de la retina, fugas de líquido y sangre y, en última instancia, provocan una cicatriz en forma de disco cegadora en la parte central a lo largo de un intervalo de tiempo relativamente corto si no se trata. La neovascularización coroidea (CNV), el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de la red capilar coroidea a través de la superficie de contacto de membrana de Bruch/RPE al interior de la retina neural, da como resultado desprendimiento de retina, edema subretioniano e intrarretiniano y cicatrización.

La diabetes puede afectar al ojo de varias maneras. La retinopatía diabética (DR) es una complicación de la diabetes que resulta del daño a los vasos sanguíneos del tejido sensible a la luz en la parte posterior del ojo (la retina). Al principio, la retinopatía diabética puede no provocar ningún síntoma o sólo problemas leves de visión. Sin embargo, con el tiempo, la retinopatía diabética puede dar como resultado ceguera. El edema macular diabético (DME) es la inflamación de la retina en diabetes mellitus debido a fugas de líquido a partir de vasos sanguíneos dentro de la mácula.

El documento WO 2013/144266 se refiere a anticuerpos de VHH contra angiopoyetina, pero no divulga los anticuerpos específicos de la presente invención. Los documentos WO 2012/131078 y WO 2014/009465 divulgan anticuerpos biespecíficos que se unen, entre otras cosas, a Ang-2.

Sumario

En el presente documento se divulgan anticuerpos sólo de cadena pesada (HCAb) monoespecíficos que tienen especificidad por ANG-2 y anticuerpos biespecíficos que tienen especificidad por ANG-2 y PDGF o VEGF tal como se define adicionalmente en las reivindicaciones.

Por tanto, en algunas realizaciones, se divulgan anticuerpos sólo de cadena pesada (HCAb) con una especificidad de unión a antígeno por ANG-2. En determinadas realizaciones, un HCAb tiene una secuencia de aminoácidos de VH de SEQ ID NO: 25.

En aún otras realizaciones, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de HCAb comprenden SEQ ID NO: 12, 14 y 16.

También se divulgan, en realizaciones de referencia, HCAb con una especificidad de unión a antígeno por ANG-2 en los que el CD1 comprende GFTFSSYW (SEQ ID NO: 12), y en los que uno, dos, tres, cuatro o la totalidad de los aminoácidos en las posiciones 1, 3, 4, 5, 6 están sustituidos por cualquier aminoácido. En otras realizaciones, uno, dos, tres, cuatro o la totalidad de los aminoácidos en las posiciones 1, 3, 4, 5, 6 están sustituidos por un aminoácido conservativo. En aún otras realizaciones, uno, dos, tres, cuatro o la totalidad de los aminoácidos en las posiciones 1, 3, 4, 5, 6 están sustituidos por un aminoácido de la misma clase.

También se divulgan, en realizaciones de referencia, HCAb con una especificidad de unión a antígeno por ANG-2, en los que el CD2 comprende INSDGSST (SEQ ID NO: 14) y en los que uno, dos, tres, cuatro o la totalidad de los aminoácidos en las posiciones 1, 3, 6, 7 u 8 están sustituidos por cualquier aminoácido. En otras realizaciones, uno, dos, tres, cuatro o la totalidad de los aminoácidos en las posiciones 1, 3, 6, 7 u 8 están sustituidos por un aminoácido conservativo. En aún otras realizaciones, uno, dos, tres, cuatro o la totalidad de los aminoácidos en las posiciones 1, 3, 6, 7 u 8 están sustituidos por un aminoácido de la misma clase.

También se divulgan, en realizaciones de referencia, HCAb con una especificidad de unión a antígeno por ANG-2, en los que el CD3 comprende AREGYSSGGQFDY (SEQ ID NO: 16), y en los que uno, dos o la totalidad de los aminoácidos en las posiciones 1, 10 u 11 están sustituidos por cualquier aminoácido. En otras realizaciones, en los que uno, dos o la totalidad de los aminoácidos en las posiciones 1, 10 u 11 están sustituidos por un aminoácido conservativo. En aún otras realizaciones, en los que uno, dos o la totalidad de los aminoácidos en las posiciones 1, 10 u 11 están sustituidos por un aminoácido de la misma clase.

También se divulgan, en realizaciones de referencia, anticuerpos humanos o humanizados que compiten por la unión a ANG-2 con las regiones VH de HCAb A33A8, A1G2, A1F8, A2B6 o A1B1.

En determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos biespecíficos que tienen una primera especificidad de unión a antígeno para ANG-2 y una segunda especificidad de unión a antígeno para VEGF. En otras realizaciones, una primera especificidad de unión a antígeno está representada por A33A8.

En aún otras realizaciones, una segunda especificidad de unión a antígeno está representada por bevacizumab, o una región VH o VL del mismo. En determinadas realizaciones, una segunda especificidad de unión a antígeno está representada por ranibizumab, o una región VH o VL del mismo.

También se divulgan, como realizaciones de referencia, anticuerpos biespecíficos que tienen una primera especificidad de unión a antígeno para ANG-2 y una segunda especificidad de unión a antígeno para PDGf . En determinadas realizaciones, una primera especificidad de unión a antígeno está representada por A33A8 o un dominio VH del mismo. En otras realizaciones, una segunda especificidad de unión a antígeno está representada por HCAb P36F3.

En el presente documento también se divulga el uso de métodos de tratamiento de trastornos oftalmológicos que comprende administrar a un sujeto que lo necesita un HCAb que tiene una región VH tal como se reivindica o un anticuerpo biespecífico divulgado tal como se reivindica.

En el presente documento también se divulga el uso de un HCAb que tiene una región VH tal como se reivindica o un anticuerpo biespecífico tal como se reivindica en la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno oftalmológico en un sujeto que lo necesita.

En algunas realizaciones, el trastorno oftalmológico se selecciona del grupo que consiste en degeneración macular seca (no exudativa) relacionada con la edad, degeneración macular húmeda (exudativa o neovascular) relacionada con la edad, neovascularización coroidea (CNV), edema macular cistoide (CME), neovascularización coroidea asociada con miopía, estrías vasculares, edema macular diabético (DME), edema macular, oclusión de la vena retiniana, angiogénesis de la córnea anómala, pterigón conjuntival, edema subretiniano o edema intrarretiniano. En algunas realizaciones, la angiogénesis de la córnea anómala es como resultado de queratitis, trasplante de córnea, queratoplastia o hipoxia.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1A representa el locus de inmunoglobulina humana en el ratón transgénico HCAb (Harbour Antibodies). La figura 1B representa la estructura de anticuerpo HCAb producida por el ratón HCAb.

La figura 2A-E representa varias formas de anticuerpos biespecíficos incluyendo VH de un único dominio (figura 2A); anticuerpos HCAb biespecíficos (figuras 2B y 2C); anticuerpo tetramérico/anticuerpos biespecíficos de VH (figura 2D); anticuerpos de Fab/VH biespecíficos (figura 2e ). El segundo domino de unión a antígeno se representa como un óvalo. Ubicaciones opcionales para el segundo dominio de unión a antígeno se indican mediante asteriscos.

La figura 3 representa la estructura de gen de HCAb humanizado divulgado en el presente documento.

La figura 4 representa la unión de afinidad de HCAb humano anti-ANG-2 A33A8 usando un sistema fortéBio OCTET® QKe equipado con puntas de biosensor de captura anti-Fc de hlgG y biosensores recubiertos con estreptavidina. Se procesaron y se analizaron los datos usando el software de análisis de datos de OCTET® 6.4.

La figura 5 representa los resultados de un ELISA de quimioluminiscencia que detecta la unión de complejos formados a partir de diluciones en serie de HCAb humano anti-ANG-2 A33A8 y ANG-2 a Tie-2.

La figura 6 representa un ensayo de unión de células completas en el que HCAb humano anti-ANG-2 A33A8 bloqueó completamente la unión de ANG-2 al receptor de Tie-2 sobreexpresado en células HEK293.

Las figuras 7A-D representan geles de PAGE teñidos con azul de Coomassie de la siguiente manera: figura 7A -A33A8 (banda central) y anticuerpo biespecífico HCAb A33A8/P36F3 (P36F3 es un HCAb específico para PDGF) del formato de la figura 2B; figura 7B - región de A33A8 sola; figura 7C - anticuerpo biespecífico A33A8/bevacizumab del formato de la figura 2D; figura 7D - anticuerpo biespecífico A33A8/ranibizumab del formato de la figura 2E.

La figura 8 representa la unión de VH de A33A8 usando el sistema fortéBio OCTET® QKe.

La figura 9 representa el análisis de perfil de unión de anticuerpo biespecífico HCAb A33A8/P36F3 (véase la figura 2B).

La figura 10 representa la unión de VH de A33A8/IgG de ranibizumab (véase la figura 2D) usando el sistema fortéBio OCTET® QKe.

La figura 11 representa gel de PAGE teñido con azul de Coomassie de un fragmento Fab biespecífico de A33A8/ranibizumab.

La figura 12 representa análisis de ELISA de competencia de HCAb anti-ANG-2.

Descripción detallada

En el presente documento se divulgan anticuerpos sólo de cadena pesada (HCAb) monoespecíficos que tienen especificidad por ANG-2 y anticuerpos biespecíficos que tienen especificidad por ANG-2 y VEGF.

Las angiopoyetinas humanas 1 y 2 (ANG-1 y ANG-2 (UniProtKB - 015123 (ANGP2_HUMAN]; SEQ ID NO: 1; alternativamente abreviadas como ANGPT2 o ANG2)) se descubrieron como ligandos para Tie, una familia de tirosina cinasas que se expresa de manera selectiva dentro del endotelio vascular. Hay cuatro miembros definitivos de la familia de angiopoyetinas. Las angiopoyetinas 3 y 4 (ANG-3 y ANG-4) pueden representar homólogos con amplia divergencia del mismo locus genético en ratón y humano. ANG-1 y ANG-2 se identificaron originalmente en experimentos de cultivo tisular como agonista y antagonista, respectivamente. Todas las angiopoyetinas conocidas se unen principalmente a Tie-2. ANG-1 respalda la supervivencia de células endoteliales (EC) y fomenta la integridad del endotelio, mientras que ANG-2 tenía el efecto opuesto y fomentó la desestabilización de vasos sanguíneos y regresión en ausencia de los factores de supervivencia VEGF o factor de crecimiento de fibroblastos básico. Sin embargo, muchos estudios de la función de ANG-2 han sugerido una situación más compleja. ANG-2 podría ser un regulador complejo de la remodelación vascular que desempeña un papel tanto en el brote de vasos como en la regresión de vasos. Soportando tales papeles para ANG-2, el análisis de expresión revela que ANG-2 se induce rápidamente, junto con VEGF, en entornos de adultos de brote angiogénico, mientras que ANG-2 se induce en ausencia de VEGF en entornos de regresión vascular. De manera compatible con un papel dependiente de contexto, ANG-2 se une específicamente al mismo receptor específico endotelial, Tie-2, que se activa mediante ANG-1, pero tiene efectos dependientes del contexto sobre su activación.

ANG-1 y ANG-2 tienen efectos similares en ensayos de angiogénesis de la córnea, actuando de manera sinérgica con VEGF para fomentar el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. A alta concentración, ANG-2 actúa como factor de supervivencia de apoptosis para células endoteliales durante apoptosis por privación de suero mediante Tie-2 a través de activación la ruta de PI-3 cinasa y Akt.

Se piensa que el papel de ANG-1 se conserva en el adulto, en el que se expresa de manera amplia y constitutiva. En cambio, la expresión de ANG-2 está principalmente limitada a sitios de remodelación vascular en los que se piensa que bloquea la estabilización constitutiva o función de maduración de ANG-1, permitiendo que los vasos reviertan a, y permanezcan en, un estado plástico que puede ser más sensible a señales de brote.

ANG-2 se expresa durante el desarrollo en sitios en los que está produciéndose remodelación de vasos sanguíneos. En individuos adultos, la expresión de ANG-2 está restringida a sitios de remodelación vascular así como en tumores altamente vascularizados. ANG-2 se requiere para la angiogénesis posnatal. La regresión programada por el desarrollo de la vasculatura hialoidea en el ojo no se produce en ratones con desactivación de ANG-2 y sus vasos sanguíneos retinianos no logran brotar a partir de la arteria retiniana central. La deleción de ANG-2 da como resultado profundos defectos en el patrón y la función de la vasculatura linfática. El rescate genético con ANG-1 corrige los defectos linfáticos, pero no los de angiogénesis.

Por tanto, en el presente documento se divulgan anticuerpos HCAb monoespecíficos y biespecíficos frente a ANG-2 y su uso en métodos de tratamiento de trastornos oftalmológicos que usan los anticuerpos divulgados, todo tal como se define adicionalmente en las reivindicaciones.

En la técnica se conocen bien anticuerpos para el tratamiento de enfermedades. Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a una proteína monomérica o multimérica que comprende una o más cadenas de polipéptido que comprenden sitios de unión a antígeno. Un anticuerpo se une específicamente a un antígeno y puede ser capaz de modular la actividad biológica del antígeno. Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” puede incluir “anticuerpo de longitud completa” y “fragmentos de anticuerpo”. Los términos “sitio de unión” o “sitio de unión a antígeno” tal como se usan en el presente documento designan la(s) región/regiones de una molécula de anticuerpo a la que se une realmente un ligando. El término “sitio de unión a antígeno” comprende un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) y un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL).

La especificidad de anticuerpo se refiere al reconocimiento selectivo del anticuerpo para un epítopo particular de un antígeno. Los anticuerpos naturales, por ejemplo, son monoespecíficos. El término anticuerpo “monoespecífico” tal como se usa en el presente documento designa un anticuerpo que tiene uno o más sitios de unión, cada uno de los cuales se une al mismo epítopo del mismo antígeno. Los anticuerpos monovalentes, monoespecíficos, divulgados en el presente documento son específicos para ANG-2.

“Anticuerpos biespecíficos” se refieren a anticuerpos que tienen dos especificidades de unión a antígeno diferentes. Los anticuerpos biespecíficos divulgados en el presente documento son específicos para ANG-2 y VEGF.

El término “valente” tal como se usa en el presente documento designa la presencia de un número especificado de sitios de unión en una molécula de anticuerpo. Como tales, los términos “bivalente”, “tetravalente” y “hexavalente” designan la presencia de dos sitios de unión, cuatro sitios de unión y seis sitios de unión, respectivamente, en una molécula de anticuerpo. Los anticuerpos biespecíficos divulgados en el presente documento son “bivalentes”. Sin embargo, los anticuerpos bivalentes monoespecíficos están dentro del alcance de la presente divulgación en los que los dos sitios de unión a antígeno se unen al mismo antígeno. Los sitios de unión a antígeno de anticuerpos bivalentes monoespecíficos pueden unirse o bien al mismo epítopo o bien a epítopos diferentes en el antígeno.

Por “anticuerpo de longitud completa” en el presente documento quiere decirse la estructura que constituye la forma biológica natural de un anticuerpo, incluyendo regiones variables y constantes. Por ejemplo, en la mayoría de los mamíferos, incluyendo humanos y ratones, el anticuerpo de longitud completa de la clase IgG es un tetrámero y consiste en dos pares idénticos de dos cadenas de inmunoglobulina, teniendo cada par una cadena ligera y una pesada, comprendiendo cada cadena ligera dominios de inmunoglobulina VL y CL, y comprendiendo cada cadena pesada dominios de inmunoglobulina VH, CH1, CH2 y CH3. En algunos mamíferos, por ejemplo en camellos y llamas, los anticuerpos de IgG consisten únicamente en dos cadenas pesadas (HCAb), comprendiendo cada cadena pesada un dominio variable unido a la región de Fc (dominios CH2 y CH3).

Las unidades estructurales de anticuerpos naturales comprenden normalmente un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto normalmente por dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, teniendo cada par una cadena “ligera” (que tiene normalmente un peso molecular de aproximadamente 25 kDa) y una “pesada” (que tiene normalmente un peso molecular de aproximadamente 50-70 kDa). Cada una de las cadenas ligeras y pesadas está compuesta por dos regiones diferenciadas, denominadas regiones variable y constante. Para la clase IgG de inmunoglobulinas, la cadena pesada está compuesta por cuatro dominios de inmunoglobulina unidos desde el extremo N hasta el C en el orden VH-CH1-CH2-CH3, que hacen referencia al dominio variable de cadena pesada, dominio constante 1 de cadena pesada, dominio constante 2 de cadena pesada y dominio constante 3 de cadena pesada, respectivamente (también denominados VH-Cy1-Cy2-Cy3, que hacen referencia al dominio variable de cadena pesada, dominio gamma 1 constante, dominio gamma 2 constante y dominio gamma 3 constante, respectivamente). La cadena ligera de IgG está compuesta por dos dominios de inmunoglobulina unidos desde el extremo N hasta el C en el orden VL-CL, que hace referencia al dominio variable de cadena ligera y al dominio constante de cadena ligera, respectivamente. Las regiones constantes muestran menos diversidad de secuencia y son responsables de la unión a varias proteínas naturales para provocar importantes acontecimientos bioquímicos.

La región variable de un anticuerpo contiene los determinantes de unión a antígeno de la molécula y, por tanto, determina la especificidad de un anticuerpo por su antígeno diana. La región variable se denomina así porque es la más distinta en cuanto a la secuencia con respecto a otros anticuerpos dentro de la misma clase. En la región variable, se agrupan tres bucles para cada uno de los dominios V de la cadena pesada y cadena ligera para formar un sitio de unión a antígeno. Cada uno de los bucles se denomina región determinante de la complementariedad (denominada a continuación en el presente documento “CDR”), en la que la variación en la secuencia de aminoácidos es la más significativa. Hay seis CDR en total, tres para cada una de la cadena pesada y ligera, designadas CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, Cd R2 de VL y CDR3 de VL. La región variable fuera de las CDR se denomina región de entramado (FR). Aunque no es tan diversa como las CDR, se produce variabilidad de secuencia en la región FR entre diferentes anticuerpos. En conjunto, esta arquitectura característica de anticuerpos proporciona un armazón estable (la región FR) en el cual puede explorarse una diversidad de unión a antígeno sustancial (las CDR) mediante el sistema inmunitario para obtener especificidad por una amplia gama de antígenos.

Los genes que codifican para el locus de inmunoglobulina comprenden múltiples secuencias de región V junto con secuencias de nucleótidos más cortas denominadas “D” y “J” y es la combinación de las secuencias de nucleótidos V, D y J lo que da lugar a la diversidad de VH.

Los anticuerpos se agrupan en clases, también denominadas isotipos, tal como se determina genéticamente por la región constante. Las cadenas ligeras constantes humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa (Ck) y lambda (CX). Las cadenas pesadas se clasifican como mu (|i), delta (8), gamma (y), alfa (a) o épsilon (g), y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. La clase IgG es la más habitualmente usada para fines terapéuticos. En humanos, esta clase comprende las subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En ratones, esta clase comprende las subclases IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3. IgM tiene subclases, incluyendo, pero sin limitarse a, IgM1 e IgM2. IgA tiene varias subclases, incluyendo, pero sin limitarse a, IgA1 e IgA2. Por tanto, “ isotipo” tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquiera de las clases o subclases de inmunoglobulinas definidas por las características químicas y antigénicas de sus regiones constantes. Los isotipos de inmunoglobulina humana conocidos son IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD e IgE. Los anticuerpos HCAb y anticuerpos biespecíficos divulgados pueden tener regiones constantes que comprenden la totalidad, o una parte, de los isotipos descritos anteriormente.

También están dentro del alcance de la presente divulgación fragmentos de anticuerpo incluyendo, pero sin limitarse a, (i) un fragmento Fab que comprende dominios VL, CL, VH y CH1, (ii) un fragmento Fd que comprende dominios VH y CH1, (iii) un fragmento Fv que comprende dominios VL y VH de un único anticuerpo; (iv) un fragmento dAb que comprende una única región variable, (v) regiones CDR aisladas, (vi) fragmento F(ab')² , un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos, y (vii) una molécula Fv de cadena sencilla (scFv), en la que un dominio VH y un dominio VL están unidos mediante ligador peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión a antígeno. En determinadas realizaciones, se producen anticuerpos mediante técnicas de ADN recombinante. En realizaciones adicionales, se producen anticuerpos mediante escisión enzimática o química de anticuerpos que se producen de manera natural.

Por anticuerpo “humanizado” tal como se usa en el presente documento quiere decirse un anticuerpo que comprende una región de entramado (FR) humana y una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) a partir de un anticuerpo no humano (habitualmente de ratón o rata). El anticuerpo no humano que proporciona las CDR se denomina “donador” y la inmunoglobulina humana que proporciona el entramado se denomina “aceptor”. En determinadas realizaciones, la humanización se basa principalmente en el injerto de CDR de donador en entramados de VL y VH de aceptor (humanos). Esta estrategia se denomina “ injerto de CDR”. Con frecuencia se requiere la “retromutación” de residuos de entramado de aceptor seleccionados para dar los residuos de donador correspondientes para recuperar la afinidad que se pierde en el constructo injertado inicial. De manera óptima, el anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, normalmente la de una inmunoglobulina humana, y por tanto comprenderá normalmente una región Fc humana. La humanización u otros métodos de reducción de la inmunogenicidad de regiones variables de anticuerpos no humanos pueden incluir métodos de rebarnizado. En una realización, pueden emplearse métodos basados en selección para humanizar y/o madurar por afinidad regiones variables de anticuerpos, es decir, para aumentar la afinidad de la región variable por su antígeno diana. Otros métodos de humanización pueden implicar el injerto sólo de partes de las CDR, incluyendo, pero sin limitarse a, métodos descritos en el documento US 6.797.492. Pueden emplearse métodos basados en estructura para la humanización y maduración por afinidad, por ejemplo tal como se describe en el documento US 7.117.096.

En diversas realizaciones en el presente documento, los anticuerpos son anticuerpos sólo de cadena pesada (HCAb), tal como se define en las reivindicaciones. Los camélidos (camellos, dromedarios y llamas) contienen, además de anticuerpos de cadena pesada y ligera normales (2 cadenas ligeras y 2 cadenas pesadas en un anticuerpo), anticuerpos de cadena sencilla (que sólo contienen cadenas pesadas) (véase la figura 1B). Estos se codifican por un conjunto diferenciado de segmentos de VH denominados genes de VHH. VH y VHH están entremezclados en el genoma (es decir, aparecen mezclados entre sí). La identificación de un segmento D idéntico en un ADNc de VH y de VHH sugiere el uso común del segmento D para VH y VHH. A los anticuerpos que contienen VHH naturales les falta el dominio CH1 entero de la región constante de la cadena pesada. El exón que codifica para el dominio CH1 está presente en el genoma, pero se elimina mediante corte debido a la pérdida de una secuencia aceptora de corte y empalme funcional en el lado de 5' del exón de CH1. Como resultado, la región VDJ se somete a corte y empalme en el exón de CH2. Cuando se recombina un VHH en tales regiones constantes (CH2, CH3), se produce un anticuerpo que actúa como anticuerpo de cadena sencilla (es decir, un anticuerpo de dos cadenas pesadas sin una interacción de cadenas ligeras). La unión de un antígeno es diferente de la observada con un anticuerpo convencional, pero se logra una alta afinidad de la misma manera, es decir, mediante hipermutación de la región variable y selección de las células que expresan tales anticuerpos de alta afinidad.

En una realización a modo de ejemplo, los HCAb divulgados se producen inmunizando un ratón transgénico en el que se ha eliminado la expresión de anticuerpo murino endógeno y se han introducido transgenes humanos (véase la figura 1A). Se divulgan ratones HCAb en los documentos US8.883.150, US8.921.524, US8.921.522, US8.507.748, US8.502.014, US2014/0356908, US2014/0033335, US2014/0037616, US2014/0356908, US2013/0344057, US2013/0323235, US2011/0118444 y US2009/0307787, todos los cuales se incorporan en el presente documento como referencia en cuanto a todo lo que divulgan con respecto a anticuerpos sólo de cadena pesada y su producción en ratones transgénicos. Se inmunizan ratones HCAb y se fusionan las células de bazo sensibilizadas resultantes con unas células de mieloma murino para formar hibridomas. Después, puede convertirse e1 HCAb resultante en completamente humano sustituyendo las regiones CH2 y CH3 murinas por secuencias humanas.

En el presente documento también se divulgan anticuerpos bifuncionales en los que se unen dos dominios de unión a antígeno en una única molécula biespecífica. Los anticuerpos bifuncionales pueden adoptar muchas formas incluyendo (i) fragmentos Fv biespecíficos (figura 2A); (ii) HCAb de una primera especificidad que tiene asociado con el mismo un segundo dominio VH que tiene una segunda especificidad (figura 2B y 2C); (iii) anticuerpos monoclonales tetraméricos con una primera especificidad que tienen asociado con los mismos un segundo dominio VH que tiene una segunda especificidad, en los que el segundo dominio VH está asociado con un primer dominio VH (figura 2D); y (iv) fragmentos Fab (VH-CH1/VL/CL) de una primera especificidad que tienen asociado con los mismos un segundo dominio VH con una segunda especificidad (figura 2E-2F). Se representan fragmentos Fab a modo de ejemplo en la figura 2E en la que la segunda secuencia de VH que tiene la segunda especificidad está asociada con el extremo C-terminal o el extremo N-terminal del primer dominio VH, o el extremo C-terminal o el extremo N-terminal del primer dominio CH1 o el primer dominio CL. En realizaciones adicionales también representadas en la figura 2E, pueden asociarse secuencias de VH que tienen una segunda y/o una tercera especificidad con el extremo C-terminal o el extremo N-terminal del primer dominio VH, o el extremo C-terminal o el extremo N-terminal del primer dominio CH1 o el primer dominio CL.

Los anticuerpos biespecíficos pueden incluir secuencias de ligador que unen una secuencia de un anticuerpo específico de ANG-2, tal como A33A8, a una región VH con una segunda especificidad que permite un plegamiento apropiado de las secuencias para generar los perfiles de unión a antígeno y conformación tridimensional deseados. Los ligadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, EPKSCD (SEQ ID NO: 2), ASTKGP (SEQ ID NO: 3), y (GGGGS)ⁿ (SEQ ID NO: 4), en el que n es un número entero entre 0 y 8. En una realización, n es 1.

Los anticuerpos biespecíficos divulgados en el presente documento son bivalentes, comprendiendo una primera especificidad para ANG-2 y una segunda especificidad que es un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Dentro del alcance de la presente divulgación se encuentran anticuerpos biespecíficos en los que la primera especificidad y la segunda especificidad son independientemente ANG-2 o VEGF, con la única limitación de que las especificidades primera y segunda no pueden ser la misma.

La familia de VEGF en mamíferos está compuesta por cinco miembros: VEFG-A, factor de crecimiento placentario (PGF), VEGFB, VEGF-C y VEGF-D. Todos los miembros de la familia de VEGF estimulan respuestas celulares mediante unión a receptores de tirosina cinasa (los VEGFR) en la superficie celular, haciendo que se dimericen y se activen mediante transfosforilación, aunque en sitios, momentos y grados diferentes. Los receptores de VEGF tienen una porción extracelular que consiste en 7 dominios de tipo inmunoglobulina, una única región de extensión transmembrana y una porción intracelular que contiene un dominio de tirosina cinasa dividido. VEGF-A se une a VEGFR-1 (Flt-1) y VEGFR-2 (KDR/Flk-1). v Eg FR-2 parece mediar en casi todas las respuestas celulares conocidas a VEGF. La función de VEGFR-1 está menos definida, aunque se piensa que modula la señalización de VEGFR-2. Otra función de VEGFR-1 puede ser actuar como receptor simulado/señuelo, secuestrando VEGF a partir de la unión a VEGFR-2 (esto parece ser particularmente importante durante la vasculogénesis en el embrión). VEGF-C y VEGF-D, pero no VEGF-A, son ligandos para un tercer receptor (VEGFR-3/Flt4), que media en la linfangiogénesis. El receptor (VEGFR-3) es el sitio de unión de muchos ligandos (VEGF-C y VEGF-D), que media en la acción y función perpetuas de ligandos sobre células diana. VEGF-C estimula la linfangiogénesis (mediante VEGFR-3) y la angiogénesis mediante VEGFR-2. VEGF-A es una secuencia de 232 aminoácidos (UniProtKB - P15692).

PDGF desempeña un papel significativo en la formación de vasos sanguíneos (angiogénesis), el crecimiento de vasos sanguíneos a partir de tejido de vasos sanguíneos ya existente. PDGF es un potente mitógeno para células de origen mesenquimatoso, incluyendo fibroblastos, células de músculo liso y células de la glía. PDGF es una glicoproteína dimérica que compuesta por dos subunidades A (AA) o dos B (BB), o una combinación de las dos (AB). La subunidad A es una secuencia de 211 aminoácidos (UniProtKB - P04085) y la subunidad B es una secuencia de 241 aminoácidos (UniProtKB - P01127). Por tanto, en diversas realizaciones, se divulga un anticuerpo que tiene especificidad por PDGF-AA, PDGF-BB y/o PDGF-AB, o un fragmento del mismo. Tanto en ratones como en humanos, la red de señalización de PDGF consiste en cuatro ligandos, PDGFA-D, y dos receptores, PDGFRalfa y PDGFRbeta (tirosina cinasas receptoras). Todos los PDGF funcionan como homodímeros secretados con unión disulfuro, pero sólo PDGFA y B pueden formar heterodímeros funcionales.

Por tanto, en el presente documento se divulgan HCAb específicos para ANG-2 y anticuerpos biespecíficos específicos tanto para ANG-2 como para VEGF. En otras realizaciones, el anticuerpo biespecífico para ANG-2/VEGF es un anticuerpo biespecífico formado a partir del anticuerpo HCAb humano anti-ANG-2 A33A8 divulgado en el presente documento y las regiones VH y/o VL de cualquier anticuerpo humano o humanizado específico para VEGF. Los anticuerpos específicos para VEGF pueden incluir, pero no se limitan a, los anticuerpos divulgados en los documentos US7.297.334, US6.884.879 US8.945.552, WO1998045331, US20150175689 y US20090142343. Anticuerpos humanizados anti-VEGF a modo de ejemplo son bevacizumab y ranibizumab.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo biespecífico para ANG-2/VEGF es un anticuerpo biespecífico formado a partir del anticuerpo HCAb humano anti-ANG-2 A33A8 divulgado en el presente documento y la región VH y/o VL de bevacizumab (AVASTIN®, Genentech). La secuencia de aminoácidos de bevacizumab se divulga en el documento US7.297.334. En determinadas realizaciones, la secuencia de VH de bevacizumab es EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTS KSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 5) y la secuencia de VL de bevacizumab es DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQ PEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 6).

En determinadas realizaciones, el anticuerpo biespecífico para ANG-2/VEGF es un anticuerpo biespecífico formado por el anticuerpo HCAb humano anti-ANG-2 A33A8 divulgado en el presente documento y las regiones de VH y/o VL de ranibizumab (LUCENTIS®, Genentech). La secuencia de aminoácidos de ranibizumab se divulga en el documento US6.884.879. En determinadas realizaciones, la secuencia de VH de ranibizumab es EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTS KSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 7) y la secuencia de VL de ranibizumab es DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQ PEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 8).

También se describen como ejemplos de referencia variantes de secuencias de aminoácidos de los anticuerpos monoespecíficos o biespecíficos humanos anti-ANG-2 que se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN de anticuerpo o mediante síntesis peptídica. Tales variantes incluyen, por ejemplo, deleciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos de los ejemplos en el presente documento. Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución se realiza para llegar al constructo final, siempre que el constructo final presente las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar procesos postraduccionales de los anticuerpos humanizados o variantes, tales como cambio del número o la posición de sitios de glicosilación.

Un método útil para la identificación de determinados residuos o regiones de los anticuerpos que son ubicaciones preferidas para mutagénesis se denomina “mutagénesis por barrido con alanina”. Se identifica un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se sustituyen por un aminoácido neutro o con carga negativa (lo más preferiblemente alanina o polialanina) para afectar a la interacción de los aminoácidos con antígeno. Después, aquellas ubicaciones de aminoácido que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan introduciendo variantes adicionales u otras en, o para, los sitios de sustitución. Por tanto, aunque el sitio para la introducción de una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación en sí misma no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se lleva a cabo mutagénesis por barrido con alanina o aleatoria en el codón o la región diana y se examinan las variantes de anticuerpo expresadas para determinar la actividad deseada.

Las inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxilo-terminales cuya longitud oscila desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones dentro de la secuencia de un único o múltiples residuos de aminoácido. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo anti-ANG-2 con un residuo metionilo N-terminal el anticuerpo fusionado a una etiqueta de epítopo. Otras variantes de inserción de las moléculas de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C-terminal del anticuerpo de una enzima o un polipéptido, lo cual aumenta la semivida en suero del anticuerpo.

Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. En estas variantes se elimina al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo y se inserta un residuo diferente en su lugar. Los sitios de mayor interés para mutagénesis por sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones en FR. En la tabla 1 se muestran sustituciones conservativas bajo el título de “sustituciones preferidas” (un aminoácido mostrado en esta columna, cuando sustituye al aminoácido mostrado en la columna de residuo original, se denomina “aminoácido conservativo”). Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces pueden introducirse cambios más sustanciales, denominados “sustituciones a modo de ejemplo” en la tabla 1, o tal como se describe adicionalmente a continuación con referencia a clases de aminoácidos, y examinarse los productos.

Tabla 1

Se logran modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo seleccionando sustituciones que difieren significativamente en cuanto a su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto polipeptídico en la zona de sustitución, por ejemplo, como conformación en láminas o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que se producen de manera natural se dividen en grupos basándose en propiedades de cadena lateral comunes:

(1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr;

(3) ácidos: Asp, Glu;

(4) básicos: Asn, Gin, His, Lys, Arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de cadena: Gly, Pro; y

(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservativas conllevarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

También puede sustituirse cualquier residuo de cisteína que no participe en el mantenimiento de la conformación apropiada de los anticuerpos anti-ANG-2 monoespecíficos o biespecíficos, generalmente por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir la reticulación aberrante. A la inversa, puede(n) añadirse enlace(s) de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).

Otro tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para el desarrollo adicional tendrán propiedades biológicas mejoradas con respecto al anticuerpo original a partir del cual se generan. Una manera conveniente de generar tales variantes de sustitución es la maduración por afinidad usando presentación en fagos. En resumen, se mutan varios sitios de región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones de amino en cada sitio. Las variantes de anticuerpo así generadas se presentan de una manera monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones con el producto del gen INI de M13 empaquetado dentro de cada partícula. Después se examinan las variantes presentadas en fagos para determinar su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) tal como se divulga en el presente documento. Con el fin de identificar sitios candidatos de región hipervariable para la modificación, puede realizarse mutagénesis por barrido con alanina con residuos de región hipervariable identificados que contribuyen significativamente a la unión a antígeno. Alternativamente, o además, puede resultar beneficioso analizar una estructura de cristal del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y ANG-2 humana. Tales residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para la sustitución según las técnicas elaboradas en el presente documento. Una vez generadas tales variantes, se somete el panel de variantes a examen tal como se describe en el presente documento y pueden seleccionarse anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para su desarrollo adicional.

Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del anticuerpo. Por alteración quiere decirse deleción de uno o más restos de hidrato de carbono encontrados en el anticuerpo, y/o adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo.

La glicosilación de anticuerpos está normalmente o bien unida a N o bien unida a O. Unida a N se refiere a la unión del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para unión enzimática del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un posible sitio de glicosilación. La glicosilación unida a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-aceilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, lo más habitualmente serina o treonina, aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se logra de manera conveniente alterando la secuencia de aminoácidos de tal manera que contiene una o más de las secuencias tripeptídicas anteriormente descritas (para sitios de glicosilación unida a N). La alteración también puede realizarse mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación unida a O).

Moléculas de ácido nucleico que codifican para variantes de secuencias de aminoácidos de los anticuerpos anti-ANG-2 monoespecíficos o biespecíficos se preparan mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, aislamiento a partir de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos que se producen de manera natural) o preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis por PCR y mutagénesis por casete de una variante anteriormente preparada o una versión no variante de un anticuerpo anti-ANG-2.

Se contemplan otras modificaciones de los anticuerpos anti-ANG-2 monoespecíficos o biespecíficos. Por ejemplo, puede ser deseable modificar los anticuerpos con respecto a la función efectora, para potenciar la eficacia del anticuerpo en el tratamiento de enfermedad, por ejemplo. Por ejemplo, puede(n) introducirse residuo(s) de cisteína en la región Fc, permitiendo de ese modo la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener capacidad de internalización mejorada y/o destrucción celular mediada por el complemento aumentada y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). También pueden prepararse anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral potenciada usando agentes de reticulación heterobifuncionales. Alternativamente, puede modificarse por ingeniería un anticuerpo que tiene regiones Fc dobles y de ese modo puede tener capacidades de ADCC y lisis de complemento potenciadas.

En el presente documento también se divulgan inmunoconjugados que comprenden el anticuerpo descrito en el presente documento conjugado con un agente citotóxico tal como un agente quimioterápico, toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma) o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).

Se han descrito agentes quimioterápicos útiles en la generación de tales inmunoconjugados. Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen cadena A de difteria, fragmentos activos no de unión de toxina difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, toxinas botulínicas, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Están disponibles una variedad de radionúclidos para la producción de anticuerpos anti-ANG-2 monoespecíficos o biespecíficos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 186Re.

Se realizan conjugados del anticuerpo y agente citotóxico usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como 3-(2-piridilditiol)propionato de N-succinimidilo (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis(pazidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazonibenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolieno) y compuestos de bis-flúor activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen-triaminapentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante a modo de ejemplo para la conjugación de radionucleótido a un anticuerpo.

En otra realización, puede conjugarse un anticuerpo a un “receptor” (tal como estreptavidina) para su utilización en el direccionamiento previo en el que se administra el conjugado de anticuerpo-receptor al paciente, seguido por la retirada de conjugado no unido a partir de la circulación usando un agente de aclaración y después administración de un “ligando” (por ejemplo, avidina) que se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionúclido).

Los anticuerpos anti-ANG-2 monoespecíficos o biespecíficos divulgados en el presente documento también pueden formularse en liposomas. Se preparan liposomas que contienen el anticuerpo mediante métodos conocidos en la técnica, tal como se describe en los documentos US4.485.045, US4.544.545 y US5.013.556. Pueden generarse liposomas particularmente útiles mediante el método de evaporación en fase inversa con una composición de lípido que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Se extruyen liposomas a través de filtros de tamaño de poro definido para proporcionar liposomas con el diámetro deseado. Pueden conjugarse fragmentos Fab' de los anticuerpos con los liposomas mediante una reacción de intercambio de disulfuro.

También se incluyen modificaciones covalentes de los anticuerpos anti-ANG-2 monoespecíficos o biespecíficos dentro del alcance de esta divulgación. Pueden realizarse mediante síntesis química o mediante escisión enzimática o química del anticuerpo, si resulta aplicable. Otros tipos de modificaciones covalentes de los anticuerpos se introducen en la molécula haciendo reaccionar residuos de aminoácido seleccionados como diana del anticuerpo con un agente de derivatización orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas secundarias seleccionadas o los residuos N o C-terminales. Se describen modificaciones covalentes a modo de ejemplo de polipéptidos en el documento US5.534.615, específicamente incorporado en el presente documento como referencia en cuanto a todo lo que divulga con respecto a modificaciones covalentes de polipéptidos. Un tipo a modo de ejemplo de modificación covalente del anticuerpo comprende unir el anticuerpo a uno de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera expuesta en los documentos US4.640.835, US4.496.689, US4.301.144, US4.670.417, US4.791.192 o US4.179.337.

Los anticuerpos monoespecíficos y biespecíficos divulgados en el presente documento pueden producirse mediante medios recombinantes. Por tanto, en el presente documento se divulgan ácidos nucleicos que codifican para los anticuerpos, vectores de expresión que contienen ácidos nucleicos que codifican para los anticuerpos y células que comprenden el ácido nucleico que codifica para los anticuerpos. En el estado de la técnica se conocen ampliamente métodos para la producción recombinante y comprenden expresión de proteína en células procariotas y eucariotas con posterior aislamiento del anticuerpo y habitualmente purificación hasta una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la expresión de los anticuerpos tal como se mencionó anteriormente en una célula huésped, se insertan ácidos nucleicos que codifican para las secuencias de anticuerpo en vectores de expresión mediante métodos convencionales. Se realiza la expresión en células huésped procariotas o eucariotas apropiadas tales como células CHO, células NS0, células SP2/0, células HEK293, células COS, células PER.C6, levadura o células E. coli, y se recupera el anticuerpo a partir de las células (sobrenadante o células después de la lisis).

Por consiguiente, determinadas realizaciones divulgadas en el presente documento incluyen un método para la preparación de un anticuerpo monoespecífico o biespecífico, que comprende las etapas de a) transformar una célula huésped con al menos un vector de expresión que comprende moléculas de ácido nucleico que codifican para el anticuerpo; b) cultivar la célula huésped en condiciones que permiten la síntesis de la molécula de anticuerpo; y c) recuperar dicha molécula de anticuerpo a partir del cultivo.

Los anticuerpos se separan de manera adecuada a partir del medio de cultivo mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía con hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

Tal como se usan en el presente documento, las expresiones “célula”, “línea celular” y “cultivo celular” se usan de manera intercambiable y todas de tales designaciones incluyen la progenie. Por tanto, los términos “transformantes” y “células transformadas” incluyen la célula objeto primaria y cultivos derivados a partir de la misma, independientemente del número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en cuanto al contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Se incluye la progenie variante que tiene la misma función o actividad biológica que la que se examina para detectar en la célula originalmente transformada. Cuando se pretendan designaciones diferentes, quedará claro a partir del contexto.

El término “transformación” tal como se usa en el presente documento se refiere a un procedimiento de transferencia de un vector/ácido nucleico al interior de una célula huésped. Si se usan células sin barreras de paredes celulares formidables como células huésped, puede llevarse a cabo la transfección, por ejemplo, mediante el método de precipitación de fosfato de calcio. Sin embargo, también pueden usarse otros métodos para introducir ADN en células tales como mediante inyección nuclear o mediante fusión de protoplastos. Si se usan células procariotas o células que contienen construcciones de pared celular sustanciales, por ejemplo un método de transfección es el tratamiento con calcio usando cloruro de calcio.

Tal como se usa en el presente documento, “expresión” se refiere al procedimiento mediante el cual se transcribe un ácido nucleico para dar ARNm y/o al procedimiento mediante el cual se traduce posteriormente el ARNm transcrito (también denominado transcrito) para dar péptidos, polipéptidos o proteínas. Los transcritos y los polipéptidos codificados se denominan colectivamente producto génico. Si el polinucleótido se deriva a partir de ADN genómico, la expresión en una célula eucariota puede incluir el corte y empalme del ARNm.

Un “vector” es una molécula de ácido nucleico, en particular autorreplicante, que transfiere una molécula de ácido nucleico insertada al interior de y/o entre células huésped. El término incluye vectores que funcionan principalmente para la inserción de ADN o ARN al interior de una célula (por ejemplo, integración cromosómica), replicación de vectores que funcionan principalmente para la replicación de ADN o ARN, y vectores de expresión que funcionan para la transcripción y/o traducción del ADN o ARN. También se incluyen vectores que proporcionan más de una de las funciones tal como se describen.

Un “vector de expresión” es un polinucleótido que, cuando se introduce en una célula huésped apropiada, puede transcribirse y traducirse para dar un polipéptido. Un “sistema de expresión” se refiere habitualmente a una célula huésped adecuada compuesta por un vector de expresión que puede funcionar para producir un producto de expresión deseado.

El término “célula huésped” tal como se usa en el presente documento designa cualquier clase de sistema celular que puede modificarse por ingeniería para generar los anticuerpos divulgados en el presente documento. En una realización se usan células HEK293 y células CHO como células huésped.

Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas usan promotores, potenciadores y señales de poliadenilación.

Un ácido nucleico está “operativamente unido” cuando se pone en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN para una presecuencia o líder secretor está unido a ADN para un polipéptido si se expresa como preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está operativamente unido a una secuencia codificante si está posicionado de modo que facilita la traducción. Generalmente, “operativamente unido” significa que las secuencias de ADN que están uniéndose son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se logra mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se usan los ligadores o adaptadores de oligonucleótidos sintéticos según la práctica convencional.

En el presente documento también se divulga ácido nucleico aislado que codifica para los anticuerpos humanos anti-ANG-2 monoespecíficos o biespecíficos, vectores y células huésped que comprenden los ácidos nucleicos, y técnicas recombinantes para la producción de los anticuerpos.

Para la producción recombinante de los anticuerpos, el ácido nucleico que codifica para los mismos puede aislarse e insertarse en un vector replicable para su clonación adicional (amplificación del ADN) o para su expresión. En algunas realizaciones, el anticuerpo puede producirse mediante recombinación homóloga, por ejemplo tal como se describe en el documento US5.204.244. a Dn que codifica para el anticuerpo se aísla y se secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Hay muchos vectores disponibles. Los componentes de vector incluyen generalmente, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes de marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción, por ejemplo, tal como se describe en el documento US5.534.615, incorporado específicamente en el presente documento como referencia en cuanto a todo lo que divulga con respecto a la expresión de proteínas.

Células huésped adecuadas para clonación y expresión del ADN en los vectores en el presente documento son las células procariotas, de levadura o eucariotas superiores descritas anteriormente. Las procariotas adecuadas para este propósito incluyen eubacterias, tales como organismos gram-negativos o gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis, Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un huésped de clonación de E. coli a modo de ejemplo es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) y E. coli W3110 (ATCC 27.325) son adecuadas. Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitativos.

Además de procariotas, microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores de codificación de anticuerpos humanos anti-ANG-2 monoespecíficos o biespecíficos. Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadero habitual, es el más habitualmente usada entre los microorganismos huésped eucariotas inferiores. Sin embargo, varios otros géneros, especies y cepas están habitualmente disponibles y son útiles en el presente documento, tales como Schizosaccharomyces pombe; huéspedes de Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. Lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATc C 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, huéspedes de Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

Células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpos humanos anti-ANG-2 monoespecíficos o biespecíficos glicosilados se derivan a partir de organismos multicelulares, incluyendo células de invertebrados tales como células vegetales y de insectos. Se han identificado numerosas cepas y variantes de baculovirus y células huésped de insectos permisivas correspondientes a partir de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Una variedad de cepas viral para transfección están públicamente disponibles, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y tales virus pueden usarse como virus en el presente documento según la presente invención, particularmente para transfección de células Spodoptera frugiperda. También pueden usarse como huéspedes cultivos de célula vegetales de algodón, maíz, patata, semilla de soja, petunia, tomate y tabaco.

Sin embargo, interés más grande se ha centrado en células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo tisular) ha pasado a ser un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas de células huésped de mamíferos útiles son línea CV1 de riñón de mono transformada mediante VS40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humana (293 o células 293 subclonadas para su crecimiento en cultivo en suspensión); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO); células de Sertoli de ratón (TM4); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma de cuello uterino humanas (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón de perro (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humanas (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humanas (Hep G2, HB 8065); tumor de mama de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI; células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humana (Hep G2).

Se transforman células huésped con los vectores de expresión anteriormente descritos para la producción de anticuerpos anti-ANG-2 monoespecíficos o biespecíficos y se cultivan en medios de nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican para las secuencias deseadas.

Las células huésped usadas para producir los anticuerpos humanos anti-ANG-2 monoespecíficos o biespecíficos pueden cultivarse en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tales como F10 de Ham (Sigma), medio esencial mínimo (MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio de Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, los documentos US4.767.704; US4.657.866; US4.927.762; US4.560.655; o US5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; o US Re. 30.985 pueden usarse como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede suplementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como GENTAMYCIN™), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos habitualmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También puede incluirse cualquier otro suplemento necesario a concentraciones apropiadas que conocerán los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las usadas anteriormente con la célula huésped seleccionada para expresión, y resultarán evidentes para el experto habitual en la técnica.

Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse de manera intracelular, en el espacio periplasmático, o secretarse directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce de manera intracelular, como primera etapa, se retira el residuo particulado, o bien células huésped o bien fragmentos sometidos a lisis, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración.

La composición de anticuerpo preparada a partir de las células puede purificarse usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. La idoneidad de proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y del isotipo de cualquier dominio de Fc de inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. Puede usarse proteína A para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas y1, y2 o y4 humanas. Se recomienda la proteína G para todos los isotipos de ratón y para y3 humana. La matriz a la que se une el ligando de afinidad es lo más habitualmente agarosa, pero hay otras matrices disponibles. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poros controlados o poli(estirendivinil)benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos de lo que puede lograrse con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ es útil para la purificación. También están disponibles otras técnicas para la purificación de proteínas tales como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre heparina, cromatografía de SEPHAROSE™ sobre una resina de intercambio aniónico catiónico (tal como una columna de poli(ácido aspártico)), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio dependiendo del anticuerpo que va a recuperarse.

Tras cualquier etapa de purificación preliminar, puede someterse la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y contaminantes a cromatografía de interacción hidrófoba a bajo pH usando un tampón de elución a un pH de entre aproximadamente 2,5-4,5, preferiblemente realizada a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, sal a desde aproximadamente 0-0,25 M).

En el presente documento también se divulgan métodos de uso de los anticuerpos humanos anti-ANG-2 monoespecíficos y biespecíficos para el tratamiento de trastornos oftalmológicos. Los ejemplos de trastornos oftalmológicos incluyen, pero no se limitan a, degeneración macular seca (no exudativa) relacionada con la edad, degeneración macular húmeda (exudativa o neovascular) relacionada con la edad, neovascularización coroidea (CNV), edema macular cistoide (CME), neovascularización coroidea asociada con miopía, estrías vasculares, edema macular diabético (DME), edema macular, edema macular debido a oclusión de la vena retiniana, y angiogénesis en la parte delantera del ojo tal como angiogénesis de la córnea, por ejemplo, después de queratitis, trasplante de córnea o queratoplastia, angiogénesis de la córnea debida a hipoxia (uso extenso de lentes de contacto), pterigón conjuntival, edema subretiniano y edema intrarretiniano.

La degeneración macular, también denominada degeneración macular relacionada con la edad, es la causa más común de pérdida de visión en los Estados Unidos en las personas de 50 años de edad o mayores, y su prevalencia aumenta con la edad. AMD se clasifica como o bien húmeda (neovascular) o bien seca (no neovascular). La forma seca de la enfermedad es la más común. Se produce cuando la retina central se ha deformado, pigmentado o, lo más habitualmente, adelgazado, un proceso asociado con atrofia del epitelio de pigmento retiniano y pérdida de fotorreceptores maculares. El resultado es atrofia geográfica central. La forma húmeda de la enfermedad es responsable de la pérdida más intensa de visión. La forma húmeda está habitualmente asociada con el envejecimiento, pero otras enfermedades que pueden provocar degeneración macular húmeda incluyen miopía intensa y algunas infecciones intraoculares tales como histoplasmosis, que pueden agravarse en individuos con SIDA. La forma húmeda está caracterizada por crecimiento anómalo de vasos sanguíneos a través del epitelio de pigmento retinianio, dando como resultado hemorragia, exudación, cicatrización o desprendimiento de retina.

En el presente documento se divulgan formulaciones de liberación sostenida de anticuerpos humanos anti-ANG-2 monoespecíficos y biespecíficos para el tratamiento de trastornos oculares. Por tanto, los anticuerpos humanos anti-ANG-2 monoespecíficos y biespecíficos pueden liberarse al interior del cuerpo vítreo a lo largo de un periodo de 3­ 6 meses a partir de un sistema de administración de fármacos de liberación sostenida para proporcionar tratamiento a largo plazo de un estado ocular crónico tal como AMD seca.

Un hidrogel es un gel coloidal formado como dispersión en agua u otro medio acuoso. Por tanto, un hidrogel se forma tras la formación de un coloide en el que se ha combinado una fase dispersada (el polímero) con una fase continua (es decir, agua) para producir un producto de tipo gelatinoso viscoso; por ejemplo, ácido silícico coagulado. Un hidrogel es una red tridimensional de cadenas de polímero hidrófilo que están reticuladas mediante unión química o física. Debido a la naturaleza hidrófila de las cadenas de polímero, los hidrogeles absorben agua y se hinchan (a menos que ya hayan absorbido su cantidad máxima de agua). El proceso de hinchamiento es el mismo que la disolución de polímeros hidrófilos no reticulados. Por definición, el agua constituye al menos el 10% del peso (o volumen) total de un hidrogel.

Los ejemplos de hidrogeles incluyen polímeros sintéticos tales como poli(metacrilato de hidroxietilo), y poli(alcohol vinílico) química o físicamente reticulado, poliacrilamida, poli(N-vinilpirrolidona), poli(óxido de etileno) y poliacrilonitrilo hidrolizado. Los ejemplos de hidrogeles que son polímeros orgánicos incluyen hidrogeles basados en polisacáridos covalentes o reticulados de manera iónica tales como las sales de metales polivalentes de alginato, pectina, carboximetilcelulosa, heparina, hialuronato e hidrogeles de quitina, quitosano, pululano, goma gellan y goma xantana. Los hidrogeles particulares usados en el presente experimento fueron un compuesto de celulosa (es decir, hidroxipropilmetilcelulosa [HPMC]) y un ácido hialurónico de alto peso molecular (HA).

En algunas realizaciones, se divulga una formulación de hidrogel para inyección intravítrea que usa un ácido hialurónico polimérico y los anticuerpos humanos anti-ANG-2 monoespecíficos y/o biespecíficos divulgados en el presente documento. Este sistema de administración de fármacos puede proporcionar liberación sostenida de una dosis diaria baja de los anticuerpos humanos anti-ANG-2 monoespecíficos y biespecíficos a lo largo de un periodo de 3 a 6 meses y prevenir la conversión de AMD seca a húmeda. El sistema de administración de fármacos también puede comprender encapsulación de microesferas del anticuerpo humano anti-ANG-2 monoespecífico y biespecífico en el hidrogel. El sistema de administración de fármacos de liberación sostenida puede proporcionar el bloqueo anti-ANG-2 necesario en el ojo para reducir la probabilidad de progresión de AMD seca a neovascular. Además, las dosis bajas liberadas en el ojo a lo largo de un periodo de tiempo prolongado no proporcionan un nivel tóxico sistémico del agente.

El sistema de administración de fármacos de liberación sostenida también puede usarse para proporcionar bloqueo anti-ANG-2 de liberación sostenida en pacientes con oclusión central de la vena retiniana que corren el riesgo de neovascularización y en pacientes con retinopatía diabética no proliferativa intensa que corren el riesgo de progresar a enfermedad neovascular.

Alternativamente, el sistema de administración de fármacos puede ser un implante de PLGA, anticuerpos encapsulados liposómicos opcionalmente atrapados en un ácido hialurónico reticulado. Adicionalmente, microesferas, microcápsulas (que oscilan desde 0,001 hasta 100 micrómetros) y liposomas con superficies modificadas para crear una interacción con el polímero de hidrogel para modificar la liberación.

También se abarcan en el presente documento formulaciones de sistemas de administración de fármacos particulares y métodos para administrar estos sistemas de administración de fármacos para tratar un estado ocular. La administración intraocular puede ser mediante implantación o inyección en la cavidad vítrea (cámara posterior) del ojo. Los sistemas de administración de fármacos dentro del alcance de esta divulgación pueden ser implantes y/o microesferas biodegradables. Los sistemas de administración de fármacos pueden ser monolíticos, es decir, el agente activo se distribuye o dispersa de manera homogénea a través de todo el polímero biodegradable. El agente terapéutico puede liberarse a partir de sistemas de administración de fármacos realizados según la presente invención durante un periodo de tiempo de entre aproximadamente 2 horas y 12 meses o más. Una característica importante de los sistemas de administración de fármacos es que no incluyen ningún medio (tal como una tapa, protuberancia o pestaña de sutura) para fijar el sistema de administración de fármacos a la ubicación intraocular a la que se administra.

Una característica importante de un sistema de administración de fármacos dentro del alcance de la presente divulgación es que puede implantarse o inyectarse en una ubicación intraocular (tal como una ubicación subtenoniana anterior, subconjuntival, intravítrea o supracoroidea) para proporcionar liberación sostenida de un agente terapéutico sin la aparición o persistencia de inmunogenicidad significativa en y adyacente al sitio de la implantación o inyección intraocular.

Los polímeros de polilactida (PLA) existen en dos formas químicas, poli(L-lactida) y poli(D,L-lactida). La poli(L-lactida) pura es regioregular y por tanto también es altamente cristalina, por tanto se degrada in vivo a una tasa muy lenta. La poli(D,L-lactida) es regioaleatoria, lo cual conduce a una degradación más rápida in vivo. Por tanto, un polímero de PLA que es una mezcla predominantemente de polímero de poli(L-lactida), siendo el resto un polímero de poli(D lactida), se degradará in vivo a una tasa más lenta que un polímero de PLA que es predominantemente polímero de poli(D-lactida). Un PLGA es un copolímero que combina poli(D,L-lactida) con poli(glicolida) en diversas razones posible. Cuanto mayor es el contenido de glicolida en un PLGa más rápida es la degradación de polímero.

En algunas realizaciones, un sistema de administración de fármacos para administración intraocular (es decir, mediante implantación o inyección intravítrea) comprende configurado, consiste en o consiste esencialmente en al menos un 75 por ciento en peso de un PLA y no más de aproximadamente un 25 por ciento en peso de un polímero de poli(D,L-lactida-co-glicolida).

También se encuentran dentro del alcance de la divulgación suspensiones de microesferas (que incorporan un agente anti-neovascular) suspendidas en un hidrogel (tal como un ácido hialurónico polimérico) que puede administrarse a una ubicación intraocular a través de una aguja de jeringa. La administración de una suspensión de este tipo requiere que la viscosidad de la suspensión de microesferas a 25°C sea de menos de aproximadamente 300.000 cP. La viscosidad del agua a 25°C es de aproximadamente 1,0 cP (cP o cps es centipoise, una medida de viscosidad). A 25°C la viscosidad del aceite de oliva es de 84 cP, la del aceite de ricino es de 986 cP y la de glicerol es de 1490 cP.

Los anticuerpos presentes en los sistemas de administración de fármacos pueden dispersarse de manera homogénea en el polímero biodegradable del sistema de administración de fármacos. La selección del polímero biodegradable usado puede variar con la cinética de liberación deseada, tolerancia de paciente, la naturaleza de la enfermedad que va a tratarse y similares. Las características de polímero que se consideran incluyen, pero no se limitan a, la biocompatibilidad y biodegradabilidad en el sitio de implantación, compatibilidad con el agente activo de interés, y temperaturas de procesamiento. La matriz de polímero biodegradable comprende habitualmente al menos aproximadamente el 10, al menos aproximadamente el 20, al menos aproximadamente el 30, al menos aproximadamente el 40, al menos aproximadamente el 50, al menos aproximadamente el 60, al menos aproximadamente el 70, al menos aproximadamente el 80 o al menos aproximadamente el 90 por ciento en peso del implante. En una variación, la matriz de polímero biodegradable comprende aproximadamente del 40% al 50% en peso del sistema de administración de fármacos.

Los polímeros biodegradables que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, polímeros compuestos por monómeros tales como ésteres o éteres orgánicos, que cuando se degradan dan como resultado productos de degradación fisiológicamente aceptables. También pueden usarse anhídridos, amidas, ortoésteres o similares, en sí mismos o en combinación con otros monómeros. Los polímeros son generalmente polímeros de condensación. Los polímeros pueden estar reticulados o no reticulados.

En su mayor parte, además de carbono e hidrógeno, los polímeros incluirán oxígeno y nitrógeno, particularmente oxígeno. El oxígeno puede estar presente como oxi, por ejemplo, hidroxilo o éter, carbonilo, por ejemplo, carbonilo distinto de oxo, tal como éster de ácido carboxílico, y similares. El nitrógeno puede estar presente como amida, ciano y amino. Una lista a modo de ejemplo de polímeros biodegradables que pueden usarse se describe en Heller, Biodegradable Polymers in Controlled Drug Delivery, en: “CRC Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems”, vol. 1. CRC Press, Boca Raton, Fla. (1987).

Resultan de particular interés los polímeros de ácidos carboxílicos hidroxialifáticos, o bien homo o bien copolímeros, y polisacáridos. Entre los poliésteres de interés se incluyen homo o copolímeros de ácido D-láctico, ácido L-láctico, ácido láctico racémico, ácido glicólico, caprolactona y combinaciones de los mismos. Los copolímeros de ácido glicólico y láctico son de particular interés, cuando la tasa de biodegradación se controla mediante la razón de ácido glicólico con respecto a láctico. El porcentaje de cada monómero en copolímero de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) puede ser del 0-100%, aproximadamente el 15-85%, aproximadamente el 25-75% o aproximadamente el 35-65%. En determinadas variaciones, se usan copoplímeros de 25/75 de PLGA y/o 50/50 de PLGA. En otras variaciones, se usan copolímeros de PLGA junto con polímeros de polilactida.

Pueden emplearse otros agentes en una formulación de sistema de administración de fármacos para una variedad de propósitos. Por ejemplo, pueden emplearse agentes tamponantes y conservantes. Los conservantes que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, bisulfito de sodio, bisulfato de sodio, tiosulfato de sodio, cloruro de benzalconio, clorobutanol, timerosal, acetato fenilmercúrico, nitrato fenilmercúrico, metilparabeno, poli(alcohol vinílico) y alcohol feniletílico. Los ejemplos de agentes tamponantes que pueden emplearse incluyen, pero no se limitan a, carbonato de sodio, borato de sodio, fosfato de sodio, acetato de sodio, bicarbonato de sodio y similares, según está aprobado por la FDA para la vía de administración deseada. También pueden incluirse en la formulación los tensioactivos que pueden usarse para estabilizar partículas en un coloide y/o electrolitos tales como cloruro de sodio y cloruro de potasio. El sistema de administración de fármacos también puede incluir excipientes ácidos y básicos para controlar el pH en el microentorno así como en las interfaces (capa de difusión estancada).

Los sistemas de administración de fármacos biodegradables también pueden incluir compuestos hidrófilos o hidrófobos adicionales que aceleran o retardan la liberación del agente activo. Adicionalmente, pueden incluirse moduladores de la liberación tales como los descritos en la patente estadounidense n.° 5.869.079 en los implantes. La cantidad de modulador de la liberación empleado dependerá del perfil de liberación deseado, la actividad del modulador y del perfil de liberación del glucocorticoide en ausencia de modulador. Cuando el agente tamponante o potenciador o modulador de la liberación es hidrófilo, también puede actuar como acelerador de la liberación. Los aditivos hidrófilos actúan para aumentar las tasas de liberación mediante una disolución más rápida del material que rodea a las partículas de fármaco, lo cual aumenta el área de superficie del fármaco expuesto, aumentando así la tasa de difusión de fármaco. De manera similar, un agente tamponante o potenciador o modulador hidrófobo puede disolverse más lentamente, ralentizando la exposición de partículas de fármaco, y ralentizando de ese modo la tasa de difusión de fármaco.

Un sistema de administración de fármacos dentro del alcance de la presente divulgación puede formularse con partículas de un anticuerpo de agente activo dispersadas dentro de un polímero biodegradable. Sin desear limitarse por la teoría, se cree que la liberación del agente activo puede lograrse mediante erosión de la matriz de polímero biodegradable y mediante difusión del agente particulado en un líquido ocular, por ejemplo, el cuerpo vítreo, con posterior disolución de la matriz de polímero y liberación del agente activo. Los factores que influyen en la cinética de liberación de agente activo a partir del implante pueden incluir características tales como el tamaño y la forma del implante, el tamaño de las partículas de agente activo, la solubilidad del agente activo, la razón de agente activo con respecto a polímero(s), el método de fabricación, el área de superficie expuesta, la densidad del implante y la tasa de erosión del/ de los polímero(s).

La tasa de liberación del agente activo puede depender, al menos en parte, de la tasa de degradación del componente o componentes de esqueleto de polímero que constituyen la matriz de polímero biodegradable. Por ejemplo, los polímeros de condensación pueden degradarse mediante hidrólisis (entre otros mecanismos) y por tanto cualquier cambio en la composición del implante que potencie la captación de agua por el implante aumentará probablemente la tasa de hidrólisis, aumentando así la tasa de degradación y erosión de polímero, y aumentando por tanto la tasa de liberación de agente activo. La tasa de liberación del agente activo también puede verse influida por la cristalinidad del agente activo, el pH en el implante y el pH en las interfaces.

La cinética de liberación de los sistemas de administración de fármacos de la presente invención puede depender en parte del área de superficie de los sistemas de administración de fármacos. Un área de superficie más grande expone más polímero y agente activo a líquido ocular, provocando una erosión más rápida del polímero y disolución de las partículas de agente activo en el líquido.

En el presente documento también se divulgan composiciones farmacéuticas que comprenden un HCab humano anti-ANG-2 monoespecífico y/o un anticuerpo biespecífico en el que una de las especificidades es ANG-2. También se divulga el uso de los anticuerpos descritos en el presente documento para la fabricación de una composición farmacéutica. También se divulgan métodos de uso de los anticuerpos divulgados y composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos para el tratamiento de trastornos oculares

Tal como se usa en el presente documento, “portador farmacéutico” incluye todos y cada uno de disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferiblemente, el portador es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, intraocular, intravítrea, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión).

Una composición divulgada en el presente documento puede administrarse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Tal como apreciará el experto en la técnica, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Para administrar los anticuerpos divulgados mediante determinadas vías de administración, puede ser necesario asociar los anticuerpos con, o administrar conjuntamente los anticuerpos con, un material para prevenir su inactivación. Por ejemplo, los anticuerpos pueden administrarse a un sujeto en un portador apropiado, por ejemplo, liposomas, o un diluyente. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina y disoluciones acuosas de tampón. Los portadores farmacéuticos incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersión inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la técnica.

Las frases “administración parenteral” y “administrado por vía parenteral” tal como se usan en el presente documento significan modos de administración distintos de administración enteral y tópica, habitualmente mediante inyección, e incluyen, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intraocular, intravítrea, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede garantizarse tanto mediante procedimientos de esterilización, citados anteriormente, como mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Además, puede provocarse la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable mediante la inclusión de agentes que retardan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Independientemente de la vía de administración seleccionada, los anticuerpos divulgados, que pueden usarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos, se formulan para dar formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica.

Los niveles de dosificación reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas pueden hacerse variar para obtener una cantidad del principio activo que es eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particulares, sin ser tóxica para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que está empleándose, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, estado, salud general e historia clínica previa del paciente que está tratándose, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.

Las dosis adecuadas para las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento cuando se administran por vía intravítrea están en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 50 mg por ojo. Las dosis adecuadas adicionales incluyen, pero no se limitan a, de aproximadamente 0,2 mg a aproximadamente 40 mg por ojo, de aproximadamente 0,3 mg a aproximadamente 30 mg por ojo, de aproximadamente 0,4 mg a aproximadamente 20 mg por ojo, de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 15 mg por ojo, de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 10 mg por ojo, aproximadamente 0,5 mg por ojo, aproximadamente 0,75 mg por ojo, aproximadamente 1 mg por ojo, aproximadamente 1,5 mg por ojo, aproximadamente 2 mg por ojo, aproximadamente 2,5 mg por ojo, aproximadamente 3 mg por ojo, aproximadamente 3,5 mg por ojo, aproximadamente 4 mg por ojo, aproximadamente 4,5 mg por ojo, aproximadamente 5 mg por ojo, aproximadamente 5,5 mg por ojo, aproximadamente 6 mg por ojo, aproximadamente 6,5 mg por ojo, aproximadamente 7 mg por ojo, aproximadamente 7,5 mg por ojo, aproximadamente 8 mg por ojo, aproximadamente 8,5 mg por ojo, aproximadamente 9 mg por ojo, aproximadamente 9,5 mg por ojo, aproximadamente 10 mg por ojo, aproximadamente 11 mg por ojo, aproximadamente 12 mg por ojo, aproximadamente 13 mg por ojo, aproximadamente 14 mg por ojo, aproximadamente 15 mg por ojo, aproximadamente 15 mg por ojo, aproximadamente 17 mg por ojo, aproximadamente 18 mg por ojo, aproximadamente 19 mg por ojo o aproximadamente 20 mg por ojo.

La composición debe ser estéril y fluida hasta el grado de que la composición pueda administrarse mediante jeringa. Además de agua, el portador es preferiblemente una solución salina tamponada isotónica.

Puede mantenerse la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de recubrimiento tal como lecitina, mediante mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol o sorbitol, y cloruro de sodio en la composición.

Las composiciones farmacéuticas y sistemas de administración de fármacos que incluyen los anticuerpos humanos anti-ANG-2 monoespecíficos y/o biespecíficos pueden inyectarse en una ubicación intraocular mediante jeringa o pueden insertarse (implantarse) en el ojo mediante una variedad de métodos, incluyendo colocación mediante pinzas, mediante trocar, o mediante otros tipos de aplicadores, después de realizar una incisión en la esclerótica. En algunos casos, puede usarse un trocar o aplicador sin crear una incisión. En una variación preferida, se usa un aplicador manual para insertar uno o más implantes biodegradables en el ojo. El aplicador manual comprende normalmente una aguja de acero inoxidable de 18-30 GA, una palanca, un actuador y un émbolo. Los dispositivos adecuados para insertar un implante o implantes en una región o sitio ocular posterior incluyen los divulgados en el documento US7.090.681.

El método de administración implica generalmente en primer lugar acceder a la zona objetivo dentro de la región ocular con la aguja, trocar o dispositivo de implantación. Una vez dentro de la zona objetivo, por ejemplo, la cavidad vítrea, puede pulsarse una palanca en un dispositivo manual para hacer que un actuador impulse un émbolo hacia delante. A medida que el émbolo se mueve hacia delante, puede empujar el implante o los implantes al interior de la zona objetivo (es decir, el cuerpo vítreo).

Pueden emplearse diversas técnicas para elaborar implantes dentro del alcance de la presente divulgación. Las técnicas útiles incluyen métodos de separación de fases, métodos interfaciales, métodos de extrusión, métodos de compresión, métodos de moldeo, métodos de moldeo por inyección, métodos de prensado térmico y similares.

El término “ inyección intraocular” se refiere a una inyección que se administra entrando en el globo ocular del paciente. El término “inyección periocular” se refiere a una inyección que se administra detrás del ojo pero fuera del globo ocular. El término “transzonular” se refiere a una inyección administrada a través de la zónula ciliar que es una serie de fibras que conectan el cuerpo ciliar y el cristalino del ojo. El término “intravítreo” se refiere a una inyección administrada a través de un ojo del paciente, directamente al interior de la cavidad interna del ojo.

Las formulaciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden administrarse mediante inyección intravítrea intraocular que puede ser transzonular, o, si se desea no transzonular. La inyección intravítrea intraocular de esta formulación, tanto si se realiza mediante inyección transzonular como directa en la parte plana (transescleral), administra potentes antibióticos de amplio espectro directamente al interior del tejido supurante sin requerir la combinación urgente de múltiples medicamentos individuales o múltiples inyecciones individuales en el ojo.

Normalmente, una composición farmacéutica descrita anteriormente se administrará por vía intraocular a un sujeto mamífero (por ejemplo, humanos, gatos, perros, otras mascotas, animales domésticos, salvajes o de granja) que necesita tratamiento. La composición debe inyectarse por vía intravítrea y transzonular usando métodos y técnicas conocidos por los expertos habituales en la técnica de oftalmología.

Normalmente, puede emplearse la administración a través de una cánula de calibre 27 típica usando una jeringa TB de 1 ml, con atención a resuspender la formulación usando golpes y agitaciones momentáneos justo antes de la inyección. El volumen medicinal (es decir, dosificación) requerido de esta formulación varía basándose en el tipo de trastorno ocular y consideraciones anatómicas referentes al volumen disponible para la inyección que está añadiéndose a un espacio intraocular cerrado.

Adicionalmente, las inyecciones intracamerales (es decir, cámara anterior) se encuentran dentro del alcance de la presente divulgación.

En realizaciones alternativas, si se desea o es necesario, las formulaciones también pueden administrarse en forma de colirios o pulverizaciones para los ojos, así como mediante inyección subconjuntival, inyección intracameral intraocular, inyección subtenoniana, inyección intraarticular o inyección intralesional, particularmente, pero sin limitarse a, en algunos casos cuando se necesita administrar medicamento adicional cuando lo justifican las necesidades del paciente.

Los siguientes ejemplos, lista de secuencias y figuras se proporcionan para ayudar a entender la presente invención, cuyo verdadero alcance se expone en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Ejemplo 1. HCAb anti-ANG-2 con regiones constantes murinas

Todos los procedimientos con animales se realizaron según las directrices establecidas por el Comité institucional de uso y cuidado de animales. Se usaron ratones HCAb de Harbour Antibodies (Cambridge, MA) para generar los anticuerpos anti-ANG-2.

Inicialmente se inmunizaron por vía intraperitoneal cinco ratones HCAb hembra con 10 |ig de ANG-2 humana purificada (R&D Systems, Minneapolis, MN) y adyuvante completo de Freund (CFA, Sigma, St. Louis, MO) en el día 0. Se sometieron los ratones a inmunización de refuerzo por vía intraperitoneal con 10 |ig de ANG-2 humana purificada y adyuvante incompleto de Freund (IFA, Sigma, St. Louis, MO) en los días 15, 30 y 45. Se determinaron los títulos de anticuerpos en suero contra ANG-2 en el día 60 del calendario de inmunización. Tres días antes de extirpar los bazos, se sometieron los ratones a inmunización de refuerzo por vía intravenosa con la ANG-2 humana (10 |ig/ratón). Se realizaron fusiones según métodos de tecnología de hibridoma convencionales con la pareja de fusión SP20. Se examinaron los sobrenadantes de hibridoma mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) para detectar anticuerpo anti-ANG-2 humana. Se expandieron los cultivos positivos y se subclonaron dos veces mediante dilución limitante. Se usaron preparaciones de anticuerpos purificadas mediante proteína A en todos los estudios.

Ejemplo 2. HCAb anti-ANG-2 con regiones constantes humanas

Se aisló ARN total a partir de hibridomas deseados y se amplificó mediante PCR usando cebadores específicos. Se fusionaron las regiones VH aisladas a partir de cada hybridoma (figura 3) con una región bisagra de IgG1 y regiones CH2/CH3 para formar una secuencia de HCAb en el plásmido de expresión GS SYSTEM™ (Lonza, Basilea, Suiza). Se transfectó el plásmido de expresión al interior de una línea celular CHO para producir HCAb recombinante totalmente humano.

Un anticuerpo humano anti-ANG-2 a modo de ejemplo producido mediante los métodos divulgados se designa A33A8 y tiene la secuencia de aminoácidos en la tabla 2. Las regiones de entramado (FR), bisagra y constante (CH) pueden usarse con cualquier CDR de HCAb.

Tabla 2

Región

Secuencia

SEQ ID NO:

HCAb anti-ANG-2 adicionales, designados A1G2, A2F8, A2B6 y A1B1, tienen las siguientes secuencias de aminoácidos de región VH:

Tabla 3

Ejemplo 3. Caracterización de HCAb anti-ANG-2

Se realizaron mediciones de afinidad usando un sistema fortéBIO OCTET® QK^e equipado con puntas de biosensor de captura anti-Fc de hlgG (AHC) y biosensores recubiertos con estreptavidina (fortéBIO, Menlo Park, CA). Para la medición de afinidad de AHC, se sometió a prueba HCAb anti-ANG-2 A33A8 purificado para determinar su capacidad de unión con puntas de sensor de AHC. Se cargaron las puntas usando 20 |ig/ml de HCAb anti-ANG-2 A33A8. La carga avanzó durante 300 s dando como resultado niveles de captura de entre 1,8 y 2 nm. Se preparó antígeno de ANG-2 (R & D Systems) para el análisis de unión mediante dilución hasta concentraciones de 20 a 500 nM en 1xPBS. Se inició la asociación y se monitorizó durante 200 s, tras lo cual se transfirieron las puntas a tampón 1xPBS sin proteína de factor (Gibco, PBS pH 7,2), con el fin de monitorizar la disociación. Después se monitorizó la actividad de unión de HCAb anti-ANG-2 A33A8 en tiempo real usando análisis de interferometría de bio-capa. Se calcularon afinidades de unión a antígeno para la ANG-2 sometida a prueba basándose las constantes asociación (“K^asoc”) y disociación (“K^disoc”) medidas. Se procesaron los datos y se analizaron usando el software de análisis de datos de OCTET® 6.4 (fortéBIO) (figura 4). A33A8 se une a An G-2 con una Kd de menos de 1 picomolar. No reacciona de manera cruzada con ANG-2 de rata pero sí reacciona de manera cruzada con ANG-2 de conejo. Además, A33A8 no reacciona de manera cruzada con ANG-1.

Se recubrieron dos microgramos por mililitro por pocillo de Tie-2-hFc (R & D Systems) en placas de microtitulación de 96 pocillos durante la noche a 4°C. En una placa independiente, se incubaron diluciones en serie de anticuerpos anti-HCAb A33A8 con ANG-2 biotinilada humana 2 nM (R&D Systems) durante 1 h. Se aplicaron cien microlitros de la mezcla de A33A8-ANG-2 a la placa de microtitulación recubierta con Tie-2-hFc durante 1 h. Después se añadió el anticuerpo de detección (HRP anti-biotina) durante 1 h y se desarrolló el ELISA con un sustrato de HRP quimioluminiscente y se leyó mediante un lector de placas de ELISA (figura 5). A33A8 bloquea completamente la unión de ANG-2 a su receptor Tie-2.

Ejemplo 4. Análisis por ELISA de competencia de HCAb anti-ANG2

Se recubrieron dos microgramos por mililitro por pocillo de Tie-2-hFc (R&D Systems) en placas de microtitulación de 96 pocillos durante la noche a 4°C. En una placa independiente, se incubaron diluciones en serie de anticuerpos anti-HCAb con ANG-2 biotinilada humana 2 nM (R&D Systems) durante 1 h. Se aplicaron cien microlitros de la mezcla de HCAb anti-ANG-2-ANG-2 a la placa de microtitulación recubierta con Tie-2-hFc durante 1 h. Después se añadió el anticuerpo de detección (HRP anti-biotina) durante 1 h y se desarrolló el ELISA con un sustrato de HRP quimioluminiscente y se leyó mediante un lector de placas de ELISA. Se analizaron los datos usando GraphPad Prism 6 (figura 12).

Ejemplo 5. Análisis por barrido con alanina para detectar molécula de HCAb anti-ANG-2, A33A8

Se usó barrido con alanina para identificar posiciones de aminoácido en las secuencias de CDR que, cuando se modifican, alteran la afinidad de unión de HCAb anti-ANG-2 A33A8.

En la tabla 4 se presentan CDR específicas para su uso en el HCAb anti-ANG-2 A33A8 divulgado, los aminoácidos subrayados son aquellos en los que la sustitución por alanina disminuyó sustancialmente la unión.

Tabla 4

Por tanto, los anticuerpos anti-HCAb que tienen sustituciones en determinados residuos de las CDR de A33A8 se encuentran dentro del alcance de la presente divulgación. En una realización, CDR1 de A33A8 comprende GFTFSSYW (SEQ ID NO: 12), en la que uno, dos, tres, cuatro o la totalidad de los aminoácidos en las posiciones 1, 3, 4, 5, 6 están sustituidos por cualquier aminoácido. En otras realizaciones, CDR1 de A33A8 comprende GFTFSSYW, en la que uno, dos, tres, cuatro o la totalidad de los aminoácidos en las posiciones 1, 3, 4, 5, 6 están sustituidos por un aminoácido conservativo tal como se divulga en el presente documento. En otra realización, CDR1 de A33A8 comprende GFTFSSYW, en la que uno, dos, tres, cuatro o la totalidad de los aminoácidos en las posiciones 1, 3, 4, 5, 6 están sustituidos por un aminoácido de la misma clase tal como se define en el presente documento.

En una realización, CDR2 de A33A8 comprende INSDGSST (SEQ ID NO: 14), en la que uno, dos, tres, cuatro o la totalidad de los aminoácidos en las posiciones 1, 3, 6, 7 u 8 están sustituidos por cualquier aminoácido. En otras realizaciones, CDR2 de A33A8 comprende INSDGSST, en la que uno, dos, tres, cuatro o la totalidad de los aminoácidos en las posiciones 1, 3, 6, 7 u 8 están sustituidos por un aminoácido conservativo tal como se divulga en el presente documento. En otras realizaciones, CDR2 de A33A8 comprende INSDGSST, en la que uno, dos, tres,

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   i. Anticuerpo sólo de cadena pesada (HCAb) con una especificidad de unión a antígeno por ANG-2, en el que este HCAb se selecciona del siguiente grupo:

   a) en el que el HCAb tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9,

   b) un HCAb con una especificidad de unión a antígeno por ANG-2, en el que la región variable (VH) de HCAb tiene la secuencia de SEQ ID NO: 25.
2. 2. HCAb con una especificidad de unión a antígeno por ANG-2 según la reivindicación 1, en el que e1HCAb tiene la secuencia de aminoácidos de VH de SEQ ID NO: 25.
3. 3. Anticuerpo biespecífico que tiene una primera especificidad de unión a antígeno para ANG-2, en el que dicha especificidad de unión a antígeno se define según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, y una segunda especificidad de unión a antígeno para VEGF.
4. 4. Anticuerpo biespecífico según la reivindicación 3, en el que la primera especificidad de unión a antígeno está representada por HCAb A33A8, es decir SEQ ID NO: 25, y/o

   en el que la segunda especificidad de unión a antígeno está representada por bevacizumab, o

   en el que la segunda especificidad de unión a antígeno está representada por ranibizumab.
5. 5. Anticuerpo biespecífico que tiene una primera especificidad de unión a antígeno para ANG-2, en el que dicha especificidad de unión a antígeno se define según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, y una segunda especificidad de unión a antígeno para PDGF.
6. 6. Anticuerpo biespecífico según la reivindicación 5, en el que la primera especificidad de unión a antígeno está representada por HCAb A33A8, es decir SEQ ID NO: 25.
7. 7. HCAb que tiene una región VH según una de las reivindicaciones 1 ó 2, o anticuerpo biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones 3 - 6 , para su uso en un método de tratamiento de un trastorno oftalmológico.
8. 8. HCAb para su uso según la reivindicación 7, en el que el trastorno oftalmológico se selecciona del grupo que consiste en degeneración macular seca relacionada con la edad, degeneración macular húmeda relacionada con la edad, neovascularización coroidea (CNV), edema macular cistoide (CME), neovascularización coroidea asociada con miopía, estrías vasculares, edema macular diabético (DME), edema macular, oclusión de la vena retiniana, angiogénesis de la córnea anómala, pterigón conjuntival, edema subretiniano y edema intrarretiniano, y preferiblemente,

   en el que la angiogénesis de la córnea anómala es un resultado de queratitis, trasplante de córnea, queratoplastia o hipoxia.