JP2018527327A - Ａｎｇ−２に対する重鎖のみ抗体 - Google Patents

Abstract

本明細書は、ＡＮＧ−２に対する抗原結合特異性を有する単一特異性ＨＣＡｂ抗体、及びＡＮＧ−２及びＶＥＧＦまたはＰＤＧＦに対する抗原結合特異性を有する二重特異性抗体を開示する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年７月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／１９８，５１８号及び２０１５年８月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／２０５，１８５号に対する利益を主張するものであり、それら両方の全記載内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

血管新生は既存の脈管構造から新たな血管が形成されるものであり、未熟児網膜症、増殖糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、及び加齢黄斑変性のような、失明を引き起こすいくつかの網膜血管疾患における主要な要素である。眼血管新生では、眼の血管が異常または過剰に形成される。眼血管新生は、糖尿病網膜症及び加齢黄斑変性の両方に関連していることが示されている。

加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、高齢母集団の失明の主要な原因であり、萎縮型ＡＭＤ及び滲出型ＡＭＤとして認識されている。萎縮型、すなわち非滲出型では、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の萎縮性変化及び肥厚性変化の両方が伴う。萎縮型は、死亡細胞及び代謝産物を含有する、黄斑のドルーゼンという色素沈着領域を特徴とし、これが網膜を歪め、最終的に急性の視力障害を引き起こす。非滲出性ＡＭＤ（萎縮型）患者は、ウェットＡＭＤ、すなわち滲出型または新生血管を伴うＡＭＤに進行する可能性があり、その場合、網膜下に病的な脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶＭ）を発症し、体液及び血液を漏出させ、最終的に、未治療で放置した場合、中心が見えなくなる円板状の瘢痕を比較的短い期間で生じさせる。脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）では、脈絡膜毛細血管網由来の新しい血管がブルッフ膜／ＲＰＥの界面を横断して神経網膜内へ成長し、網膜剥離、網膜下及び網膜内の浮腫、ならびに瘢痕化をもたらす。

糖尿病は、多くの面で眼に影響を及ぼし得る。糖尿病網膜症（ＤＲ）は糖尿病の合併症であり、眼の最内層の光感受性組織（網膜）の血管が損傷されることにより引き起こされる。糖尿病網膜症は、最初、症状がないかまたは軽度の視力障害のみの場合がある。しかし、最終的には糖尿病網膜症は失明をもたらし得る。糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）は、黄斑内の血管から体液が漏出することによる、真性糖尿病における網膜膨潤である。

本明細書は、ＡＮＧ−２に対する特異性を有する単一特異性の重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）ならびにＡＮＧ−２とＰＤＧＦまたはＶＥＧＦとに対する特異性を有する二重特異性抗体を開示する。

したがって、いくつかの実施形態では、重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）を、ＡＮＧ−２に対する抗原結合特異性と共に開示する。ある実施形態では、ＨＣＡｂは、アミノ酸配列が配列番号２５、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２４であるＶＨを有する。

さらに別の実施形態では、ＨＣＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列番号１２、１４、及び１６を含む。他の実施形態では、ＨＣＡｂのＣＤＲは、配列番号２６、２７、及び２８を含む。他の実施形態では、ＨＣＡｂのＣＤＲは、配列番号２９、３０、及び３１を含む。他の実施形態では、ＨＣＡｂのＣＤＲは、配列番号３２、３３、及び３４を含む。他の実施形態では、ＨＣＡｂのＣＤＲは、配列番号３５、３６、及び３７を含む。

また、ＡＮＧ−２に対する抗原結合特異性のあるＨＣＡｂも本明細書に開示し、ここで、ＣＤ１はＧＦＴＦＳＳＹＷ（配列番号１２）を含み、また、１位、３位、４位、５位、６位のアミノ酸のうち１つ、２つ、３つ、４つ、またはすべてが任意のアミノ酸で置換される。他の実施形態では、１位、３位、４位、５位、６位のアミノ酸のうち１つ、２つ、３つ、４つ、またはすべてが保存的アミノ酸で置換される。さらに別の実施形態では、１位、３位、４位、５位、６位のアミノ酸のうち１つ、２つ、３つ、４つ、またはすべてが同一クラスのアミノ酸で置換される。

また、ＡＮＧ−２に対する抗原結合特異性のあるＨＣＡｂも本明細書に開示し、ここで、ＣＤ２はＩＮＳＤＧＳＳＴ（配列番号１４）を含み、また、１位、３位、６位、７位、または８位のアミノ酸のうち１つ、２つ、３つ、４つ、またはすべてが任意のアミノ酸で置換される。他の実施形態では、１位、３位、６位、７位、または８位のアミノ酸のうち１つ、２つ、３つ、４つ、またはすべてが保存的アミノ酸で置換される。さらに別の実施形態では、１位、３位、６位、７位、または８位のアミノ酸のうち１つ、２つ、３つ、４つ、またはすべてが同一クラスのアミノ酸で置換される。

また、ＡＮＧ−２に対する抗原結合特異性のあるＨＣＡｂも本明細書に開示し、ここで、ＣＤ３はＡＲＥＧＹＳＳＧＧＱＦＤＹ（配列番号１６）を含み、また、１位、１０位、または１１位のアミノ酸のうち１つ、２つ、またはすべてが任意のアミノ酸で置換される。他の実施形態では、１位、１０位、または１１位のアミノ酸のうち１つ、２つ、またはすべてが保存的アミノ酸で置換される。さらに別の実施形態では、１位、１０位、または１１位のアミノ酸のうち１つ、２つ、またはすべてが同一クラスのアミノ酸で置換される。

また、ＡＮＧ−２への結合について、ＨＣＡｂ Ａ３３Ａ８、Ａ１Ｇ２、Ａ１Ｆ８、Ａ２Ｂ６、またはＡ１Ｂ１のＶＨ領域と競合するヒト抗体またはヒト化抗体も本明細書に開示する。

ある実施形態では、ＡＮＧ−２に対する第１の抗原結合特異性と、ＶＥＧＦに対する第２の抗原結合特異性とを有する二重特異性抗体を提供する。他の実施形態では、第１の抗原結合特異性はＡ３３Ａ８、Ａ１Ｇ２、Ａ１Ｆ８、Ａ２Ｂ６、もしくはＡ１Ｂ１またはそのＶＨドメインによって表される。さらに別の実施形態では、第２の抗原結合特異性は、ベバシズマブ、またはそのＶＨもしくはＶＬ領域によって表される。ある実施形態では、第２の抗原結合特異性は、ラニビズマブ、またはそのＶＨもしくはＶＬ領域によって表される。

また、ＡＮＧ−２に対する第１の抗原結合特異性と、ＰＤＧＦに対する第２の抗原結合特異性とを有する二重特異性抗体も開示される。ある実施形態では、第１の抗原結合特異性は、Ａ３３Ａ８、Ａ１Ｇ２、Ａ１Ｆ８、Ａ２Ｂ６、もしくはＡ１Ｂ１、またはそのＶＨドメインによって表される。他の実施形態では、第２の抗原結合特異性は、ＨＣＡｂ Ｐ３６Ｆ３によって表される。

また、眼科障害の治療を必要とする対象に対し、本明細書に開示するＶＨ領域を有するＨＣＡｂ、または本明細書に開示する二重特異性抗体を投与することを含む、眼科障害の治療方法も本明細書に開示する。

また、眼科障害の治療を必要とする対象の眼科障害を治療するための医薬品の製造における、本明細書に開示するＶＨ領域を有するＨＣＡｂ、または本明細書に開示する二重特異性抗体の使用も本明細書に開示する。

いくつかの実施形態では、眼科障害は、萎縮型（非滲出型）加齢黄斑変性、滲出型（滲出性または新生血管を伴う）加齢黄斑変性、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、近視性脈絡膜新生血管、血管線条、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、黄斑の浮腫、網膜静脈閉塞、角膜血管新生異常、結膜翼状片、網膜下浮腫、または網膜内浮腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、角膜血管新生異常は、角膜炎、角膜移植、角膜形成術または低酸素症の結果として生じる。

トランスジェニックマウスＨＣＡｂ（ハーバー（Ｈａｒｂｏｕｒ）抗体）のヒト免疫グロブリン遺伝子座を示す。 ＨＣＡｂマウスにより産生されるＨＣＡｂ抗体構造を示す。 単一ドメインＶＨを示す。 二重特異性ＨＣＡｂ抗体を示す。 二重特異性ＨＣＡｂ抗体を示す。 四量体抗体／ＶＨ二重特異性抗体を示す。 二重特異性Ｆａｂ／ＶＨ抗体を含む、いくつかの二重特異性抗体の型を示す。第２の抗原結合性ドメインは楕円で示されている。第２の抗原結合性ドメインの任意選択の位置はアスタリスクで示されている。 本明細書に開示するヒト化ＨＣＡｂの遺伝子構造を示す。 抗ｈＩｇＧ Ｆｃ捕捉バイオセンサーチップ及びストレプトアビジンでコートしたバイオセンサーが装備されたｆｏｒｔｅＢｉｏ ＯＣＴＥＴ（登録商標）ＱＫ^eシステムを使用して、ヒト抗ＡＮＧ−２ ＨＣＡｂ Ａ３３Ａ８の親和性結合を示す。ＯＣＴＥＴ（登録商標）データ解析ソフトウェア６．４を使用してデータの処理と解析を行った。 ヒト抗ＡＮＧ−２ ＨＣＡｂ Ａ３３Ａ８の系列希釈とＡＮＧ−２とから生成された複合体のＴｉｅ−２への結合を検出する化学発光ＥＬＩＳＡの結果を示す。 全細胞結合アッセイを示し、ヒト抗ＡＮＧ−２ ＨＣＡｂ Ａ３３Ａ８は、ＨＥＫ２９３細胞で過剰発現していたＴｉｅ−２受容体へのＡＮＧ−２の結合を完全に遮断した。 以下のクマシーブルー染色したＰＡＧＥゲルを示す。図７は、Ａ３３Ａ８（中段のバンド）及び図２ＢのフォーマットのＡ３３Ａ８／Ｐ３６Ｆ３ ＨＣＡｂ二重特異性抗体（Ｐ３６Ｆ３は、ＰＤＧＦに対して特異的なＨＣＡｂである）である。図７Ｂは、Ａ３３Ａ８領域のみである。図７Ｃは、図２ＤのフォーマットのＡ３３Ａ８／ベバシズマブ二重特異性抗体である。図７Ｄは、図２ＥのフォーマットのＡ３３Ａ８／ラニビズマブ二重特異性抗体である。 ｆｏｒｔｅＢｉｏ ＯＣＴＥＴ（登録商標）ＱＫ^eシステムを使用して、Ａ３３Ａ８ ＶＨの結合を示す。 Ａ３３Ａ８／Ｐ３６Ｆ３ ＨＣＡｂ二重特異性抗体（図２Ｂ参照）の結合特性解析を示す。 ｆｏｒｔｅＢｉｏ ＯＣＴＥＴ（登録商標）ＱＫ^eシステムを使用して、Ａ３３Ａ８ ＶＨ／ラニビズマブ ＩｇＧ（図２Ｄ参照）の結合を示す。 二重特異性Ａ３３Ａ８／ラニビズマブＦａｂ断片の、クマシーブルー染色ＰＡＧＥゲルを示す。 各種抗ＡＮＧ−２ ＨＣＡｂの競合的ＥＬＩＳＡ分析を示す。

本明細書は、ＡＮＧ−２に対する特異性を有する単一特異性の重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）ならびにＡＮＧ−２とＰＤＧＦまたはＶＥＧＦとに対する特異性を有する二重特異性抗体を開示する。

ヒトのアンジオポエチン−１及びアンジオポエチン−２（ＡＮＧ−１及びＡＮＧ−２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｏ１５１２３（ＡＮＧＰ２＿ヒト］；配列番号１；別名ＡＮＧＰＴ２またはＡＮＧ２と省略））は、血管内皮細胞内に選択的に発現するチロシンキナーゼファミリーであるＴｉｅに対するリガンドとして発見された。アンジオポエチンファミリーのメンバーとして４種類が決定されている。アンジオポエチン−３及びアンジオポエチン−４（ＡＮＧ−３及びＡＮＧ−４）は、それぞれマウス及びヒトの同じ遺伝子座にある、大きく異なるアンジオポエチンを表し得る。ＡＮＧ−１とＡＮＧ−２は最初はそれぞれ、アゴニストとアンタゴニストとして組織培養実験で同定された。既知のアンジオポエチンはいずれも主としてＴｉｅ−２に結合する。ＡＮＧ−１は、内皮細胞（ＥＣ）の生存を支持して内皮の完全性を促進するが、ＡＮＧ−２は逆の作用を有し、生存因子ＶＥＧＦまたは塩基性線維芽細胞増殖因子の非存在下では血管の不安定化と退縮を促進した。しかし、ＡＮＧ−２の機能に関する多くの研究では、より複雑な状況が示唆されている。ＡＮＧ−２は、血管発芽と血管退縮の両方の役割を果たす、血管リモデリングの複雑な調節物質であり得ると考えられる。ＡＮＧ−２のそのような役割を支持するように、発現解析では、成人の血管新生発芽においてはＡＮＧ−２はＶＥＧＦと共に急速に誘導されるが、血管退縮においてはＡＮＧ−２はＶＥＧＦ非存在下で誘導されることが明らかになる。状況に応じた役割と一致して、ＡＮＧ−２は、ＡＮＧ−１によって活性化される同じ内皮特異性受容体Ｔｉｅ−２に特異的に結合するが、Ｔｉｅ−２の活性化に対して状況に応じた作用がある。

ＡＮＧ−１とＡＮＧ−２は角膜血管新生アッセイでは同様の作用があり、ＶＥＧＦと相乗的に作用して新しい血管の成長を促進する。高濃度では、ＡＮＧ−２は、血清欠乏によるアポトーシスの間、ＰＩ−３キナーゼ及びＡｋｔ経路を介してＴｉｅ−２を活性化させることによって内皮細胞のアポトーシスの生存因子として作用する。

ＡＮＧ−１の役割は成人において保存されていると考えられており、広く、かつ恒常的に発現する。対照的に、ＡＮＧ−２の発現は血管リモデリング部位に主に限定されており、そこでは、ＡＮＧ−１の構成的な安定化または成熟化機能を遮断して、発芽シグナルに対しより敏感に応答し得る形成状態に血管を戻し、かかる状態に維持させると考えられている。

ＡＮＧ−２は血管リモデリングが生じている部位で発達中に発現する。成体個体では、ＡＮＧ−２の発現は血管リモデリング部位ならびに血管新生が盛んな腫瘍に制限されている。ＡＮＧ−２は生後の血管新生に必要である。発達段階に応じてプログラムされている、眼の硝子体血管の退縮は、ＡＮＧ−２ノックアウトマウスでは起こらず、これらのマウスの網膜血管は網膜中心動脈から発芽できない。ＡＮＧ−２の欠損は、リンパ管のパターン形成と機能に重大な欠陥をもたらす。ＡＮＧ−１を用いた遺伝子レスキューではリンパ管の欠陥は補正されるが、血管新生の欠陥は補正されない。

したがって、本明細書は、ＡＮＧ−２に対する単一特異性ＨＣＡｂ抗体及び二重特異性ＨＣＡｂ抗体ならびに開示の抗体を使用する眼科障害の治療方法を開示する。

疾患治療用抗体は当技術分野において周知である。本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、抗原結合部位を含む１つ以上のポリペプチド鎖を含む単量体または多量体のタンパク質を指す。抗体は、ある抗原に特異的に結合し、その抗原の生物学的活性を調節することができる。本明細書で使用する場合、用語「抗体」には、「完全長抗体」及び「抗体断片」が含まれ得る。本明細書で使用する「結合部位」または「抗原結合部位」という用語は、リガンドが実際に結合する、抗体分子の領域（複数可）を意味する。用語「抗原結合部位」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。

抗体の特異性とは、ある抗原の特定のエピトープについて抗体が選択的に認識することを指す。例えば、天然の抗体は単一特異性である。本明細書で使用する「単一特異性」抗体という用語は、１つ以上の結合部位を有し、その各々が同一抗原の同一エピトープに結合する抗体を意味する。本明細書に開示される１価抗体、単一特異性抗体はＡＮＧ−２に対して特異的である。

「二重特異性抗体」とは、２つの異なる抗原結合特異性を有する抗体を指す。本明細書に開示する二重特異性抗体は、ＡＮＧ−２及びＶＥＧＦまたはＰＤＧＦに対して特異的である。

本明細書で使用する「価」という用語は、抗体分子において特定常の結合部位が存在することを意味する。したがって、「二価」、「四価」、及び「六価」という用語はそれぞれ、２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位が抗体分子に存在することを意味する。本明細書に開示の二重特異性抗体は「二価」である。ただし、２つの抗原結合部位が同一抗原と結合する単一特異性二価抗体は、本開示の範囲内である。単一特異性二価抗体の抗原結合部位は、その抗原にある同一エピトープも別々のエピトープでも結合できる。

本明細書の「完全長抗体」とは、可変領域及び定常領域を含む、抗体の生物学的な天然の形態を構成する構造を意味する。例えば、ヒト及びマウスを含め大半の哺乳類ではＩｇＧクラスの完全長抗体は四量体であり、２本の免疫グロブリン鎖を対とする同一な２対から構成され、各対に１本の軽鎖と１本の重鎖があり、各軽鎖は、免疫グロブリンドメインであるＶＬ及びＣＬを含み、各重鎖は免疫グロブリンドメインであるＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。一部の哺乳類、例えばラクダ及びラマでは、ＩｇＧ抗体は２本の重鎖（ＨＣＡｂ）のみからなり、各重鎖は、Ｆｃ領域（ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン）に結合した可変ドメインを含む。

自然抗体の構造ユニットは典型的に四量体を含む。各四量体は典型的に同一な２対のポリペプチド鎖で構成され、各対に、１本の「軽鎖」（典型的に、分子量は約２５ｋＤａ）及び１本の「重鎖」（典型的に、分子量は約５０〜７０ｋＤａ）を有する。軽鎖及び重鎖の各々は、可変領域及び定常領域と呼ばれる２つの別個の領域で構成される。免疫グロブリンのＩｇＧクラスの場合、重鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ向けてＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の順で連結された４つの免疫グロブリンドメインで構成され、それぞれ、重鎖可変ドメイン、重鎖定常ドメイン１、重鎖定常ドメイン２、及び重鎖定常ドメイン３と呼ばれる（ＶＨ−Ｃγ１−Ｃγ２−Ｃγ３とも呼ばれ、それぞれ、重鎖可変ドメイン、定常ガンマ１ドメイン、定常ガンマ２ドメイン、及び定常ガンマ３ドメインと呼ばれる）。ＩｇＧの軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ向けてＶＬ−ＣＬの順で連結された２つの免疫グロブリンドメインで構成され、それぞれ、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインと呼ばれる。定常領域は配列多様性が低く、重要な生化学的イベントを誘導する多数の天然タンパク質の結合に関与している。

抗体の可変領域には分子の抗原結合決定基が含有されており、これによりその標的抗原に対する抗体の特異性が決定される。可変領域は、同一クラスの他の抗体とは配列が最も大きく異なることからこの名称が付いている。可変領域では、重鎖及び軽鎖のＶドメインの各々に３本のループが集まり、抗原結合部位を形成している。ループの各々は相補性決定領域（以下、「ＣＤＲ」とする）と呼ばれ、ここでは、アミノ酸配列の変化が最も大きい。ＣＤＲは、重鎖と軽鎖に３本ずつ、合計６本あり、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３と表される。ＣＤＲ外側の可変領域はフレームワーク（ＦＲ）領域と呼ばれる。ＣＤＲほど多様性はないが、抗体ごとにＦＲ領域の配列に多様性がある。全体として、抗体のこの特徴的な構造により安定な足場（ＦＲ領域）が提供され、この足場の上でかなりの抗原結合多様性（ＣＤＲ）が免疫系により探索されて、多岐にわたる抗原に対し特異性を得ることができる。

免疫グロブリン遺伝子座をコードする遺伝子は、多数のＶ領域配列と共に「Ｄ」及び「Ｊ」という短いヌクレオチド配列を含み、Ｖ、Ｄ、及びＪの各ヌクレオチド配列の組み合わせによりＶＨに多様性を与えている。

抗体は、遺伝学的に定常領域によって決定される複数のクラスに分類され、アイソタイプとも呼ばれる。ヒトの定常軽鎖は、カッパ（Ｃκ）とラムダ（Ｃλ）という軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、またはイプシロン（ε）に分類され、各抗体のアイソタイプはそれぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとされる。ＩｇＧクラスは治療用に最もよく使用される。ヒトではこのクラスはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４というサブクラスを含む。マウスではこのクラスはＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３というサブクラスを含む。ＩｇＭには、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２などのサブクラスがあるが、これに限定されるものではない。ＩｇＡには、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２などいくつかのサブクラスがあるが、これに限定されるものではない。したがって、本明細書で使用する「アイソタイプ」は、定常領域の化学的及び抗原性の特徴により定義される免疫グロブリンのクラスまたはサブクラスのうち任意のものを意味する。ヒト免疫グロブリンの既知のアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＤ、及びＩｇＥである。開示のＨＣＡｂ抗体及び二重特異性抗体は、上記アイソタイプの全部または一部を含む定常領域を有し得る。

また、（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、及びＣＨ１ドメインを含むＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含むＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインを含むＦｖ断片、（ｉｖ）単一可変領域を含むｄＡｂ断片、（ｖ）単離されたＣＤＲ領域、（ｖｉ）結合した２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）₂断片、及び（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）などが含まれるが、これらに限定されない抗体断片であり、ここで、ＶＨドメイン及びＶＬドメインはペプチドリンカーで連結され、これにより両ドメインが会合して抗原結合部位を形成できる抗体断片も本開示の範囲内である。ある実施形態では、組換えＤＮＡ技術により抗体を作製する。さらなる実施形態では、天然に生じる抗体を酵素を用いて切断するか化学的に切断することにより抗体を作製する。

本明細書で使用する「ヒト化」抗体とは、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）及び非ヒト（通常マウスまたはラット）抗体由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体を意味する。ＣＤＲを提供する非ヒト抗体は「ドナー」と呼ばれ、またフレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。ある実施形態では、ヒト化は主に、ドナーＣＤＲをアクセプター（ヒト）のＶＬ及びＶＨの各フレームワークに移植することにより行われる。この方法は「ＣＤＲグラフティング」と呼ばれる。最初に移植を行った構成体では喪失されている親和性を回収させるために、選択したアクセプターフレームワーク残基を、対応するドナーの残基に「復帰変異」させることがしばしば必要とされる。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域も含むことになるため、典型的にヒトＦｃ領域を含むことになる。ヒト化方法または非ヒト抗体可変領域の免疫原性を低下させる他の方法にはリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）法が含まれ得る。一実施形態では、選択に基づく方法を採用して抗体可変領域のヒト化及び／または親和性成熟を行う、すなわち、その標的抗原に対する可変領域の親和性を高めてよい。他のヒト化方法ではＣＤＲ部分のみのグラフトが行われ得るが、これにはＵＳ６，７９７，４９２に記載の方法が含まれるが、これに限定されるものではなく、ＣＤＲグラフティングに関する開示内容すべてが参照により本明細書に組み込まれるものとする。ヒト化及び親和性成熟には構造に基づく方法、例えばＵＳ７，１１７，０９６に記載の方法を採用してよく、ヒト化及び親和性成熟に関する開示内容すべてが参照により本明細書に組み込まれるものとする。

本明細書のさまざまな実施形態では、抗体は重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）である。ラクダ科動物（ラクダ、ヒトコブラクダ、及びラマ）は、通常の重鎖と軽鎖の抗体（１抗体中に軽鎖２本と重鎖２本）に加え、一本鎖抗体（重鎖のみを含んでいる）（図１Ｂ参照）を持っている。これらは、ＶＨＨ遺伝子と呼ばれる固有のＶＨセグメントセットでコードされる。ＶＨ及びＶＨＨはゲノムにおいて散在している（すなわち、これらは互いに間に混合すると考えられる）。ＶＨ及びＶＨＨ ｃＤＮＡにおける同一Ｄセグメントの同定により、ＤセグメントがＶＨ及びＶＨＨに共通して使用されていることが示唆される。ＶＨＨを含有する天然抗体には、重鎖の定常領域のＣＨ１ドメインがない。ゲノムにはＣＨ１ドメインをコードするエキソンは存在するが、ＣＨ１エキソンの５’側に機能的スプライス受容部位配列が欠如しているためにスプライシングで取り除かれる。結果として、ＶＤＪ領域でスプライシングされ、ＣＨ２エキソンがつながる。そのような定常領域（ＣＨ２、ＣＨ３）にＶＨＨが再結合すると、一本鎖抗体として作用する抗体（すなわち、軽鎖相互作用のない重鎖２本の抗体）が作製される。抗原結合は従来の抗体で見られるものとは異なるが、高親和性は同様の方法、すなわち、可変領域の超変異、及びそのような高親和性抗体を発現している細胞の選択によって達成される。

例示的な一実施形態では、内因性マウス抗体の発現を消失させ、ヒト導入遺伝子を導入してあるトランスジェニックマウスを免疫化することにより開示のＨＣＡｂを作製する（図１Ａ参照）。ＨＣＡｂマウスはＵＳ８，８８３，１５０、ＵＳ８，９２１，５２４、ＵＳ８，９２１，５２２、ＵＳ８，５０７，７４８、ＵＳ８，５０２，０１４、ＵＳ２０１４／０３５６９０８、ＵＳ２０１４／００３３３３５、ＵＳ２０１４／００３７６１６、ＵＳ２０１４／０３５６９０８、ＵＳ２０１３／０３４４０５７、ＵＳ２０１３／０３２３２３５、ＵＳ２０１１／０１１８４４４、及びＵＳ２００９／０３０７７８７に開示されており、トランスジェニックマウスにおける重鎖のみ抗体及びその作製に関するそれらの開示内容のすべてが参照により本明細書に組み込まれる。ＨＣＡｂマウスを免疫化し、得られる感作脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを形成させる。その後、得られるＨＣＡｂは、マウスのＣＨ２領域及びＣＨ３領域をヒト配列と置き換えることによって完全ヒトに作製可能である。

また、２つの抗原結合ドメインが接続されて単一二重特異性分子になった二官能性抗体も本明細書に開示する。二官能性抗体は多くの形態を取り得、これには（ｉ）二重特異性Ｆｖ断片（図２Ａ）、（ｉｉ）第２の特異性を有する第２のＶＨドメインが会合している第１の特異性のＨＣＡｂ（図２Ｂ及び２Ｃ）、（ｉｉｉ）第２の特異性を有する第２のＶＨドメインが会合している第１の特異性を有する四量体モノクローナル抗体、ただし、第２のＶＨドメインは第１のＶＨドメインと会合している（図２Ｄ）、（ｉｖ）第２の特異性を有する第２のＶＨドメインが会合している第１の特異性のＦａｂ断片（ＶＨ−ＣＨ１／ＶＬ／ＣＬ）（図２Ｅ−２Ｆ）が含まれる。例示的なＦａｂ断片が図２Ｅに示されており、図中、第２の特異性を有する第２のＶＨ配列は、第１のＶＨドメインのＣ末端もしくはＮ末端、または第１のＣＨ１ドメインもしくは第１のＣＬドメインのＣ末端もしくはＮ末端と会合している。図２Ｅにも示されているさらなる実施形態では、第２及び／または第３の特異性を有するＶＨ配列は、第１のＶＨドメインのＣ末端もしくはＮ末端、または第１のＣＨ１ドメインもしくは第１のＣＬドメインのＣ末端もしくはＮ末端と会合することができる。

二重特異性抗体には、Ａ３３Ａ８などのＡＮＧ−２特異的抗体の配列と、第２の特異性を有するＶＨ領域とを連結するリンカー配列が含まれてよく、これにより、配列が適切に折り畳まれて、所望の三次元コンホメーションと抗原結合特性の生成が可能になる。好適なリンカーには、ＥＰＫＳＣＤ（配列番号２）、ＡＳＴＫＧＰ（配列番号３）、及び（ＧＧＧＧＳ）_n（配列番号４）（ここで、ｎは０〜８の整数）が挙げられるが、これに限定されるものではない。一実施形態では、ｎは１である。

本明細書に開示される二重特異性抗体は、ＡＮＧ−２に対する第１の特異性、ならびに血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を含むがこれに限定されない因子に対する第２の特異性を含む二価抗体である。第１の特異性と第２の特異性は、互いに独立してＡＮＧ−２、ＶＥＧＦ、またはＰＤＧＦであるが第１の特異性と第２の特異性は同一であり得ない二重特異性抗体は、本開示の範囲内である。

哺乳類のＶＥＧＦファミリーは、ＶＥＦＧ−Ａ、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、及びＶＥＧＦ−Ｄという５つのメンバーで構成される。ＶＥＧＦファミリーのすべてのメンバーは、部位、時間、及び程度は異なるものの、細胞表面のチロシンキナーゼ受容体（ＶＥＧＦＲ）に結合し、トランスリン酸化により二量体化及び活性化を引き起こすことによって細胞応答を刺激する。ＶＥＧＦ受容体は、７つの免疫グロブリン様ドメインからなる細胞外部分、単一膜貫通領域、及び分かれたチロシンキナーゼドメインを含有する細胞内部分を有する。ＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）及びＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結合する。ＶＥＧＦＲ−２は、ＶＥＧＦに対する既知の細胞応答のほとんどすべてを仲介すると考えられている。ＶＥＧＦＲ−１の機能はあまり明らかになっていないが、ＶＥＧＦＲ−２のシグナル伝達を調節すると考えられている。ＶＥＧＦＲ−１の別の機能は、ＶＥＧＦＲ−２の結合からＶＥＧＦを隔離するダミー／おとりの受容体として作用することであり得る（これは、胚における脈管形成の際に特に重要であると考えられる）。ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄは第３の受容体（ＶＥＧＦＲ−３／Ｆｌｔ４）に対するリガンドであり（ＶＥＧＦ−Ａはそうではない）、リンパ管新生を誘導する。かかる受容体（ＶＥＧＦＲ−３）は、主要リガンド（ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄ）が結合する部位であり、標的細胞でリガンドの永続的な作用及び機能を仲介する。ＶＥＧＦ−Ｃはリンパ管新生（ＶＥＧＦＲ−３を介して）とＶＥＧＦＲ−２を介した血管新生とを刺激する。ＶＥＧＦ−Ａは、２３２アミノ酸の配列である（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ１５６９２）。

ＰＤＧＦは、既存の血管組織に由来する血管の成長である血管形成（血管新生）において重要な役割を担う。ＰＤＧＦは、線維芽細胞、平滑筋細胞及びグリア細胞などの間葉起源細胞の強力な分裂促進因子である。ＰＤＧＦは、２つのＡ（−ＡＡ）サブユニットまたは２つのＢ（−ＢＢ）サブユニット、または両者の組み合わせ（−ＡＢ）で構成される二量体糖タンパク質である。Ａサブユニットは２１１アミノ酸の配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０４０８５）、またＢサブユニットは２４１アミノ酸の配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０１１２７）である。したがって、さまざまな実施形態では、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、及び／もしくはＰＤＧＦ−ＡＢ、またはその断片に対する特異性を有する抗体が開示されている。マウス及びヒトのいずれにおいても、ＰＤＧＦシグナル伝達ネットワークは、ＰＤＧＦＡからＰＤＧＦ−Ｄまでの４つのリガンド、ならびにＰＤＧＦＲアルファ及びＰＤＧＦＲベータ（受容体チロシンキナーゼ）という２つの受容体からなっている。すべてのＰＤＧＦは、分泌される、ジスルフィド結合したホモ二量体として機能するが、ＰＤＧＦのＡとＢのみが機能的ヘテロ二量体を形成することができる。

したがって、本明細書は、ＡＮＧ−２に対して特異的なＨＣＡｂ、及びＡＮＧ−２とＰＤＧＦの両方に対して特異的であるか、またはＡＮＧ−２とＶＥＧＦの両方に対して特異的な二重特異性抗体を開示する。他の実施形態では、ＡＮＧ−２／ＶＥＧＦ二重特異性抗体は、本明細書に開示するヒト抗ＡＮＧ−２ ＨＣＡｂ抗体Ａ３３Ａ８ならびに任意のＶＥＧＦ特異的ヒト抗体もしくはＶＥＧＦ特異的ヒト化抗体のＶＨ領域及び／またはＶＬ領域から形成される二重特異性抗体である。ＶＥＧＦ特異的抗体には、ＵＳ７，２９７，３３４、ＵＳ６，８８４，８７９、ＵＳ８，９４５，５５２、ＷＯ１９９８０４５３３１、ＵＳ２０１５０１７５６８９、及びＵＳ２００９０１４２３４３に開示される抗体を挙げることができるが、これに限定されるものではない。例示的な抗ＶＥＧＦヒト化抗体はベバシズマブ及びラニビズマブである。

ある実施形態では、ＡＮＧ−２／ＶＥＧＦ二重特異性抗体は、本明細書に開示するヒト抗ＡＮＧ−２ ＨＣＡｂ抗体Ａ３３Ａ８ならびにベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）のＶＨ領域及び／またはＶＬ領域から形成される二重特異性抗体である。ベバシズマブのアミノ酸配列はＵＳ７，２９７，３３４に開示されており、抗ＶＥＧＦ抗体のアミノ酸配列に関してそれが開示するすべての記載内容は参照により本明細書に組み込まれるものとする。ある実施形態では、ベバシズマブのＶＨ配列はＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲＲＦＴＦＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５）であり、ベバシズマブのＶＬ配列はＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＦＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳ ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＴＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号６）である。

ある実施形態では、ＡＮＧ−２／ＶＥＧＦ二重特異性抗体は、本明細書に開示するヒト抗ＡＮＧ−２ ＨＣＡｂ抗体Ａ３３Ａ８ならびにラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）のＶＨ領域及び／またはＶＬ領域から形成される二重特異性抗体である。ラニビズマブのアミノ酸配列はＵＳ６，８８４，８７９に開示されており、抗ＶＥＧＦ抗体のアミノ酸配列に関してそれが開示するすべての記載内容は参照により本明細書に組み込まれるものとする。ある実施形態では、ラニビズマブのＶＨ配列はＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＤＦＴ ＨＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲＲＦＴＦＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７）であり、ラニビズマブのＶＬ配列はＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＦＴＳＳＬ ＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＴＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号８）である。

他の実施形態では、ＡＮＧ−２／ＰＤＧＦ二重特異性抗体は、本明細書に開示するヒト抗ＡＮＧ−２ ＨＣＡｂ抗体Ａ３３Ａ８ならびに任意のＰＤＧＦ特異的ヒト抗体もしくはＰＤＧＦ特異的ヒト化抗体のＶＨ領域及び／またはＶＬ領域から形成される二重特異性抗体である。例示的な抗ＶＥＧＦヒト化抗体はＷＯ２０１４／０７２８７６、ＷＯ２００５０８７８１２、及びＷＯ２０１４１０９９９９に開示されており、あらゆるＰＤＧＦ抗体に関しそれらが開示するすべての記載内容は参照により本明細書に組み込まれるものとする。例示的なＰＤＧＦ抗体も、同時係属中の米国特許出願第６２／２０５，１９１号（２０１５年８月１４日出願）、及び第６２／３３３，７７２号（２０１６年５月９日出願）（代理人整理番号１９８６４（ＮＴＢ））に開示されおり、あらゆるＰＤＧＦ抗体に関しそれらが開示するすべての記載内容は参照により本明細書に組み込まれるものとする。

また、抗体ＤＮＡへの適切なヌクレオチド変化の導入によって作製されるか、またはペプチド合成によって作製される抗ＡＮＧ−２ヒトの単一特異性もしくは二重特異性抗体のアミノ酸配列変異も本開示の範囲内である。そのような変異には、例えば、本明細書の例示的抗体のアミノ酸配列内での残基の欠失、及び／または挿入及び／または置換が含まれる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行って最終構成体を作製するが、最終構成体は所望の特徴を有するものとする。アミノ酸変化は、ヒト化抗体または変異型抗体の翻訳後プロセシングも改変し得、例えば、グリコシル化部位の数または位置を変化させ得る。

変異誘発に好ましい位置である、抗体の特定の残基または領域を同定する有用な方法は、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。標的残基からなる残基または基を同定し（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕなどの荷電残基）、中性または陰性荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）による置換を行い、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を与える。その後、置換部位で、または置換部位についての、さらなる変異もしくは他の変異を導入することによって、置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置をさらに見直す。したがって、アミノ酸配列変異の導入部位はあらかじめ決定されているが、変異自体の性質を事前に決定する必要はない。例えば、所与の部位での変異の性能を分析するためには、標的とするコドンもしくは領域でアラニンスキャニングまたはランダム変異誘発を行い、発現した抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。

アミノ酸配列の挿入には、長さの範囲が１残基から、１００残基以上を含有するポリペプチドまでの、アミノ末端及び／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内（ｉｎｔｒａｓｅｑｕｅｎｃｅ）挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端にメチオニル残基を有する抗ＡＮＧ−２抗体またはエピトープタグに融合させた該抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異には、抗体の血清中半減期を延長させる酵素もしくはポリペプチドの抗体のＮ末端またはＣ末端への融合が含まれる。

変異の別の型はアミノ酸置換変異である。これらの変異では、抗体分子の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その場所に別の残基が挿入されている。置換による変異誘発で最も関心のある部位としては超可変領域が挙げられるが、ＦＲの改変もまた意図される。保存的置換は、表１の「好ましい置換」という項目名で示されている（この列に示すアミノ酸は、「元の残基」列に示すアミノ酸を置換する場合、「保存的アミノ酸」と呼ばれる）。そのような置換によって生物学的活性に変化がもたらされる場合は、表１の「例示的置換」、またはアミノ酸クラスに関し以下に詳述されるような、より大幅な変化を導入し、その作製物のスクリーニングを行ってよい。

抗体の生物学的特性の大幅な変更は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えば、シートコンホメーションまたは螺旋コンホメーション、（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の大きさ、の維持に与える影響の点で大きく相違する置換を選択することによって達成される。天然に生じる残基は、共通の側鎖特性に基づいて以下のような群に分けられる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

非保存的置換では、これらのクラスの１つが別のクラスと交換されることになる。

単一特異性または二重特異性の抗ＡＮＧ−２抗体の適切なコンホメーション維持に関与しない任意のシステイン残基も、一般にセリンと置換して、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防いでよい。逆に、抗体にシステイン結合（複数可）を付加してその安定性を改善してよい（特に、抗体がＦｖ断片のような抗体断片である場合）。

置換変異の別の型では、親抗体の１つ以上の超可変領域残基の置換が行われる（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）。一般に、さらなる開発用に選択される、得られる変異（複数可）は、それらの作製の元となる親抗体に比べ、改善された生物学的特性を有することになるであろう。そのような置換変異を作製す好都合な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性成熟である。簡単に言えば、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を変異させて、部位ごとに考えられるアミノ置換をすべて作製する。このようにして作製した抗体変異体を、各粒子内にパッケージングされているＭ１３の遺伝子ＩＩＩＩ産物との融合体として１価で繊維状ファージ粒子に提示させる。その後、ファージが提示された変異体を、本明細書に開示のように、その生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。修飾候補となる超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング変異誘発を実施して抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定することができる。別法として、または追加として、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析し、抗体とヒトＡＮＧ−２間の接触点を同定することが有益であり得る。そのような接触残基及び隣接残基は、本明細書に詳述の技術にしたがった置換の候補となる。そのような変異体が一旦作製されたのち、その変異体パネルを本明細書に記載のスクリーニングに供し、１つ以上の関連アッセイで特性が優れている抗体をさらなる開発用に選択してよい。

抗体の別の型のアミノ酸変異では抗体の本来のグリコシル化パターンを改変させる。改変とは、抗体に見られる１つ以上の炭水化物部分を欠失させ、かつ／または抗体に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。

抗体のグリコシル化は典型的にＮ−結合型またはＯ−結合型である。Ｎ−結合型とは、アスパラギン残基の側鎖に炭水化物部分が結合することを指す。アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸）というトリペプチド配列は、炭水化物部分とアスパラギン側鎖との酵素的結合の認識配列である。したがって、これらのトリペプチド配列をポリペプチド中に存在させると潜在的なグリコシル化部位が作製される。Ｏ−結合型グリコシル化とは、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうち１つと、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニン（５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンを使用してもよい）とが結合することを指す。

抗体へのグリコシル化部位の付加は、上記のトリペプチド配列の１つ以上が含有されるようにアミノ酸配列を改変することによって好都合に達成される（Ｎ−結合型グリコシル化部位の場合）。元抗体の配列に１つ以上のセリンまたはスレオニン残基で付加または置換を行って、改変を行ってもよい（Ｏ−結合型グリコシル化部位の場合）。

当技術分野で公知の多様な方法によって、単一特異性または二重特異性の抗ＡＮＧ−２抗体のアミノ酸配列変異をコードする核酸分子を調製する。これらの方法には、天然供給源からの単離（天然に生じるアミノ酸配列の変異の場合）、または先に調製された抗ＡＮＧ−２抗体変異体または非変異体の、オリゴヌクレオチド媒介（または部位指向）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、及びカセット変異誘発による調製が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

単一特異性または二重特異性の抗ＡＮＧ−２抗体の他の修飾も意図される。例えば、疾患治療時に抗体の有効性を高めるために、例えば、エフェクター機能について抗体を修飾することが望ましい場合がある。例えば、システイン残基（複数可）をＦｃ領域に導入し、これにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させてよい。このようにして作製したホモ二量体抗体は、改善された内在化能及び／または高い補体介在性細胞殺傷及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）有し得る。抗腫瘍活性が増強されたホモ二量体抗体をヘテロ二官能性クロスリンカーを使用して調製してもよい。別法として、Ｆｃ領域を二重に有する抗体を人工合成することができ、これにより、抗体は増強された補体溶解性及びＡＤＣＣ能を有し得る。

また、化学療法薬などの細胞傷害性薬剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素活性毒素、またはその断片）、または放射性同位体（すなわち、放射性複合体）と複合体を形成する本明細書に記載の抗体を含む免疫複合体も本明細書に開示する。

そのような免疫複合体の作製に有用な化学療法薬についてはこれまでに記載がある。使用され得る酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、ボツリヌス毒素、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害因子、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害因子、ゲロニン、マイトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンが挙げられる。放射性複合体化した単一特異性または二重特異性抗ＡＮＧ−２抗体の作製にはさまざまな放射性核種が利用可能である。例として、²¹²Ｂｉ、¹³¹Ｉ、¹³¹Ｉｎ、⁹⁰Ｙ、及び¹⁸⁶Ｒｅが挙げられる。

抗体と細胞傷害性薬剤との複合体は、多種多様な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジピミド酸ジメチルＨＣＬなど）、活性エステル（ジスクシニミジルスベラートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（などビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル（ｄｉａｚｏｎｉｕｍｂｅｎｚｏｙｌ））エチレンジアミン）、ジイソシアナート（トリエン（ｔｏｌｙｅｎｅ）２，６−ジイソシアナートなど）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）を使用して作製する。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は抗体に放射性核種を結合させる例示的キレート剤である。

別の実施形態では、プレターゲティング（ｐｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）で利用するための「受容体」（ストレプトアビジンなど）に抗体を結合させてよく、その場合、抗体−受容体複合体を患者に投与した後、消失剤（ｃｌｅａｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を使用して未結合の複合体を循環から除去し、次いで、細胞傷害性薬剤（例えば、放射性核種）に結合させた「リガンド」（例えば、アビジン）を投与する。

本明細書に開示する単一特異性または二重特異性抗ＡＮＧ−２抗体をリポソームに製剤してもよい。抗体を含有しているリポソームは、ＵＳ４，４８５，０４５、ＵＳ４，５４４，５４５、及びＵＳ５，０１３，５５６に記載のような当技術分野で公知の方法によって調製される。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法によって作製可能である。孔径の定められたフィルターにリポソームを通して押し出し、所望の直径のリポソームを得る。抗体のＦａｂ’断片は、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに結合させることができる。

単一特異性または二重特異性の抗ＡＮＧ−２抗体の共有結合的修飾もまた、本開示の範囲内に含まれる。かかる修飾は、可能であれば、抗体の化学合成によって、または抗体の酵素的もしくは化学的切断によって行われ得る。抗体の他の共有結合的修飾は、標的とする抗体アミノ酸残基と、選択側鎖またはＮ末端残基もしくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤とを反応させることによって分子内に導入される。共有結合によるポリペプチド修飾例はＵＳ５，５３４，６１５に記載されており、共有結合によるポリペプチド修飾に関してそれが開示するすべての記載内容は参照により本明細書に明確に組み込まれるものとする。共有結合による抗体修飾の例示的種類は、多種多様な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンの１つと抗体とを、ＵＳ４，６４０，８３５、ＵＳ４，４９６，６８９、ＵＳ４，３０１，１４４、ＵＳ４，６７０，４１７、ＵＳ４，７９１，１９２、またはＵＳ４，１７９，３３７に記載の方法で連結することを含む。

本明細書に開示の単一特異性抗体及び二重特異性抗体は、組換え手段によって作製してよい。したがって、本明細書は、抗体をコードする核酸と、抗体をコードする核酸を含有する発現ベクターと、抗体をコードする核酸を含む細胞とを開示する。組換え体作製方法は当業者に広く知られており、原核細胞及び真核細胞におけるタンパク質の発現、その後の抗体単離、ならびに、通常、薬理学的に許容される純度への精製を含む。宿主細胞に前述のように抗体を発現させる場合、抗体をコードする核酸配列を発現ベクターに標準的な方法で挿入する。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母、またはＥ．ｃｏｌｉ細胞のような適切な原核生物または真核生物の宿主細胞内で実施し、その抗体を細胞から回収する（上清または溶解後細胞）。

したがって、本明細書に開示する特定の実施形態には、単一特異性または二重特異性抗体を調製する方法が含まれ、かかる方法は、ａ）抗体をコードする核酸分子を含む少なくとも１つの発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、ｂ）かかる宿主細胞を、抗体分子が合成されるような条件下で培養し、かつｃ）該抗体分子を培養物から回収するという工程を含む。

抗体は、例えば、タンパク質Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製手順によって培地から好適に分離される。

本明細書で使用する場合、「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養」という表現は同じ意味で使用され、そのような表現はいずれも後代を含む。したがって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という語には、移した数とは関係なく、その初代対象細胞及びそれに由来する培養物が含まれる。故意または不注意による変異のため、ＤＮＡ含量において全後代が正確に同一であるわけではないことが理解される。機能または生物学的活性が、最初に形質転換された細胞でのスクリーニング時と同一な変異型後代が含まれる。異なる名称が意図される場合は、文脈より明らかとなるであろう。

本明細書で使用する「形質転換」という用語は、ベクター／核酸を宿主細胞内に移すプロセスを指す。手強い細胞壁バリアのない細胞を宿主細胞として使用する場合、トランスフェクションは、例えば、リン酸カルシウム沈殿法により行うことができる。しかし、ＤＮＡを細胞に導入する他の方法、例えば、核注入による方法、またはプロトプラスト融合による方法を使用してもよい。原核細胞または実質的な細胞壁構成を含有する細胞を使用する場合、例えば、トランスフェクションの一方法は塩化カルシウムを使用するカルシウム処理である。

本明細書で使用する場合、「発現」とは、ｍＲＮＡに核酸が転写されるプロセス、及び／または転写されたｍＲＮＡ（転写産物とも呼ばれる）がその後ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写産物及びコードされたポリペプチドをまとめて遺伝子産物と呼ぶ。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、真核細胞での発現にはｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。

「ベクター」とは、核酸分子、特に自己複製する核酸分子であり、挿入された核酸分子を宿主細胞内及び／または宿主細胞間に移す。かかる用語には、ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞内に挿入する（例えば、染色体の組込み）ために主に機能するベクター、ＤＮＡまたはＲＮＡを複製するために主に機能するベクターの複製、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡの転写及び／または翻訳のために機能する発現ベクターが含まれる。記載の機能の１つ以上を提供するベクターもまた含まれる。

「発現ベクター」は、適切な宿主細胞内に導入された場合に、ポリペプチドに転写及び翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現系」は、通常、所望の発現産物が得られるように機能する発現ベクターで構成される好適な宿主細胞を指す。

本明細書で使用する用語「宿主細胞」は、人工的に操作して本明細書に開示する抗体を作製することができる任意の種類の細胞系を意味する。一実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞を宿主細胞として使用する。

例えば、原核生物に好適な制御配列には、プロモーターが含まれ、任意選択でオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。

ある核酸が別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、その核酸は「機能的に連結されている」。例えば、プレ配列または分泌リーダーに対するＤＮＡが、ポリペプチドの分泌に関与する前駆タンパク質として発現する場合、それはポリペプチドに対するＤＮＡに機能的に連結されており、プロモーターまたはエンハンサーが配列の転写に影響を与える場合、それはコード配列に機能的に連結されており、または、リボソーム結合部位が、翻訳を促進するような位置にある場合、それはコード配列に機能的に連結されている。一般に、「機能的に連結されている」とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接していることを意味し、分泌リーダーの場合は、配列が隣接しリーディングフレーム内にあることを意味する。ただし、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位がない場合は、従来の実施方法に従って合成オリゴヌクレオチドのアダプターまたはリンカーを使用する。

また、単一特異性または二重特異性抗ＡＮＧ−２ヒト抗体をコードする単離された核酸、ベクター及び核酸を含む宿主細胞、ならびに抗体を作製するための組換え技術も本明細書に開示する。

抗体の組換え体作製の場合、それをコードする核酸は、単離されて、さらなるクローニング（ＤＮＡ増幅）用または発現用に複製可能なベクター内に挿入され得る。いくつかの実施形態では、抗体は、相同組換えによって、例えば、ＵＳ５，２０４，２４４に記載のように作製してよく、抗体作製に関してそれが開示するすべての記載内容は参照により本明細書に明確に組み込まれるものとする。抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）容易に単離され配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクターの構成要素には一般に、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列、例えば、ＵＳ５，５３４，６１５に記載のもの（タンパク質発現に関してそれが開示するすべての記載内容は参照により本明細書に明確に組み込まれるものとする）のうち１つ以上が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本明細書のベクターでのＤＮＡのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、上述のような原核生物、酵母、または高等真核生物の細胞である。この目的に好適な原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、及びＳｈｉｇｅｌｌａといったＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、ならびにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのようなＢａｃｉｌｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのようなＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓといった、真正細菌が挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉクローニング宿主の一例はＥ．ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、他にはＥ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）、及びＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５）のような株が好適である。これらの例は、例示的であって限定的なものではない。

原核生物のほかに、糸状菌または酵母などの真核微生物は、単一特異性または二重特異性の抗ＡＮＧ−２ヒト抗体をコードするベクターに好適なクローニング宿主または発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、すなわち一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物のうち最もよく使用されるものである。しかし、他の多数の属、種、及び株も一般的に利用可能で、本明細書において有用であり、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ；例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、及びＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓなどのＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主；ｙａｒｒｏｗｉａ （ＥＰ ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ （ＥＰ １８３，０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ （ＥＰ ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなどのＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ；ならびに、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、及びＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓとＡ．ｎｉｇｅｒのようなＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主などの糸状菌などがある。

グリコシル化された単一特異性または二重特異性抗ＡＮＧ−２ヒト抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞性生物由来であり、これには植物細胞及び昆虫細胞のような無脊椎動物の細胞が含まれる。バキュロウイルスの多数の株及び変異体ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ヨウトガ）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、及びＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉなどの宿主に由来する、対応する許容される昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクション用のさまざまなウイルス株、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶのＬ−１変異体及びＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶのＢｍ−５株が公的に入手可能であり、そのようなウイルスは、本明細書のウイルスとして、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクション用に本発明にしたがって使用され得る。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコの植物細胞培養物も宿主として利用することができる。

しかし、脊椎動物細胞に対する関心は最も高く、脊椎動物の細胞を培養（組織培養）で増殖させることは常套的手順になっている。有用な哺乳類宿主の細胞株例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１ライン；ヒト胎児腎臓株（２９３または浮遊培養での増殖用にサブクローニングされた２９３細胞）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ）；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４）；サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。

単一特異性または二重特異性抗ＡＮＧ−２抗体作製用に上記の発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望配列をコードする遺伝子の増幅に適するよう改変した従来の栄養培地で培養する。

単一特異性または二重特異性抗ＡＮＧ−２ヒト抗体の作製に使用する宿主細胞は、さまざまな培地で培養され得る。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販培地は、宿主細胞培養に好適である。さらに、ＵＳ４，７６７，７０４；ＵＳ４，６５７，８６６；ＵＳ４，９２７，７６２；ＵＳ４，５６０，６５５；もしくはＵＳ５，１２２，４６９；ＷＯ ９０／０３４３０；ＷＯ ８７／００１９５；またはＵＳ Ｒｅ．３０，９８５を宿主細胞の培養培地として使用してよい。これらの培地はいずれも、必要に応じ、ホルモン及び／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、バッファー（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）など）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、及びグルコースまたは等価なエネルギー源を添加してよい。他に必要な任意の補充物質もまた、当業者に公知であろう適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨ等のような培養条件は、先に発現用に選択された宿主細胞の場合に用いた条件であり、当業者には明らかであろう。

組換え技術を使用する場合、抗体は、細胞内、細胞膜周辺腔で作製することも、または培地中に直接分泌させることもできる。抗体を細胞内に作製した場合、第１の工程として、粒子状の細片は、宿主細胞でも溶解した断片でも、例えば遠心分離または限外濾過によって除去する。

細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製できるが、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製法である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている。アフィニティーリガンドが結合するマトリックスはアガロースであることが最も多いが、他のマトリックスも使用可能である。孔制御ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成できるものより高流量及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、精製にはＢａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂が有用である。タンパク質精製用の他の技術、例えば、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム）上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収すべき抗体に応じて利用可能である。

任意の予備的精製工程（複数可）に続いて、対象抗体及び混入物を含む混合物を、ｐＨ約２．５〜４．５、好ましくは低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍ塩）の溶出緩衝液を使用して低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供してよい。

また、単一特異性及び二重特異性抗ＡＮＧ−２ヒト抗体を眼科障害の治療に使用する方法も本明細書に開示する。眼科障害の例としては、萎縮型（非滲出型）加齢黄斑変性、滲出型（滲出性または新生血管を伴う）加齢黄斑変性、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、近視性脈絡膜新生血管、血管線条、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、黄斑の浮腫、網膜静脈閉塞による黄斑の浮腫、及び例えば、角膜炎、角膜移植または角膜形成術に続発する角膜血管新生のような眼前面の血管新生、低酸素症（コンタクトレンズの長時間装着）による角膜血管新生、結膜翼状片、網膜下浮腫及び網膜内浮腫が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

加齢黄斑変性とも呼ばれる黄斑変性は、米国では５０歳以上の視力障害の最も多い原因であり、その有病率は年齢と共に増加する。ＡＭＤは滲出型（新生血管を伴う）または萎縮型（新生血管を伴わない）に分類される。疾患は萎縮型が最もよく見られる。網膜中央部に変形、色素沈着、または最もよく見られるように菲薄化が起こった場合に生じ、網膜色素上皮の萎縮及び黄斑部の視細胞の消失を伴う過程をたどる。その結果、中心部の地図状萎縮となる。疾患の滲出型は最も重度の視力障害の原因である。滲出型は通常、加齢に関連しているが、滲出型黄斑変性を引き起こし得る他の疾患として、重度の近視、及びヒストプラスマ症のような眼球内感染が含まれ、これはＡＩＤＳ患者では悪化し得る。滲出型は、網膜色素上皮を介した異常な血管増殖を特徴とし、出血、滲出、瘢痕化、または網膜剥離をもたらす。

本明細書は、眼障害を治療するための、単一特異性及び二重特異性抗ＡＮＧ−２ヒト抗体の徐放性製剤を開示する。したがって、単一特異性及び二重特異性抗ＡＮＧ−２ヒト抗体を、徐放性薬物送達システムから硝子体内に３〜６月間にわたって放出させ、萎縮型ＡＭＤなどの慢性の眼病態の長期治療を提供することができる。

ヒドロゲルは、水または他の水性培地に分散した物質として形成されるコロイド状のゲルである。したがって、ヒドロゲルはコロイドが形成されて形成され、その場合、分散相（ポリマー）が連続相（すなわち、水）と混ざり合って粘性のゼリー状生成物が生成され、例えば、凝固させたケイ酸がある。ヒドロゲルは、化学的または物理的結合によって架橋している親水性ポリマー鎖の三次元ネットワークである。ポリマー鎖は親水性であるため、ヒドロゲルは水を吸収して膨潤する（すでに最大水分量を吸収している場合を除く）。膨潤過程は、非架橋の親水性ポリマーの溶解の場合と同じである。定義としては、ヒドロゲルの総重量（または総容量）の少なくとも１０％が水で構成される。

ヒドロゲルの例には、ポリメタクリル酸ヒドロキシエチルのような合成ポリマー、ならびに化学的にまたは物理的に架橋させたポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチレンオキシド、及び加水分解したポリアクリロニトリルが挙げられる。有機ポリマーであるヒドロゲルの例としては、共有結合またはイオン結合で架橋した、アルギン酸、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、ヘパリン、ヒアルロン酸の多価金属塩のような多糖類系ヒドロゲル、ならびに、キチン、キトサン、プルラン、ゲラン及びキサンタンのヒドロゲルが挙げられる。本実験で使用した特定のヒドロゲルは、セルロース化合物（すなわち、ヒドロキシプロピルメチルセルロース［ＨＰＭＣ］）及び高分子ヒアルロン酸（ＨＡ）であった。

いくつかの実施形態では、高分子ヒアルロン酸ならびに本明細書に開示する単一特異性及び／または二重特異性抗ＡＮＧ−２ヒト抗体を使用して、硝子体内注射用のヒドロゲル製剤が開示されている。この薬物送達システムにより、単一特異性及び二重特異性抗ＡＮＧ−２ヒト抗体を１日あたり低用量で３〜６月間にわたり持続放出させること、及び萎縮型ＡＭＤから滲出型ＡＭＤへの移行を予防することができる。また、薬物送達システムは、単一特異性及び二重特異性抗ＡＮＧ−２ヒト抗体を入れたヒドロゲルのマイクロスフェア封入を含むこともできる。徐放性薬物送達システムは、萎縮型から新生血管ＡＭＤに進行する可能性を低減するよう、眼で必要とされる抗ＡＮＧ−２遮断を提供することができる。さらに、長期間にわたり眼内で放出される用量が低く、薬剤濃度は全身毒性とはならない。

また、徐放性薬物送達システムを使用して、血管新生のリスクがある網膜中心静脈閉塞症の患者、及び新生血管を伴う疾患に進行するリスクのある重度の非増殖糖尿病網膜症の患者に、徐放性抗ＡＮＧ−２遮断を提供することができる。

あるいは、薬物送達システムは、ＰＬＧＡインプラント、任意選択で架橋ヒアルロン酸に閉じ込められたリポソームに封入した抗体であり得る。さらに、マイクロスフェア、マイクロカプセル（０．００１〜１００ミクロンの範囲）、及びヒドロゲルポリマーと相互作用させて放出が調整されるよう表面が修飾されたリポソームがある。

眼病態を治療するための、特定の薬物送達システム製剤及びこれらの薬物送達システムの投与方法もまた本明細書に包含される。眼球内投与は、移植または眼の硝子体腔（後眼房）への注射によって可能である。本開示の範囲内である薬物送達システムは、生物分解性のインプラント及び／またはマイクロスフェアであり得る。薬物送達システムは、モノリシック型、すなわち、活性薬剤が生物分解性ポリマー全体に均一に分布または分散しているものであり得る。治療剤は、本発明にしたがって作製された薬物送達システムから約２時間〜１２か月またはそれ以上の期間放出され得る。薬物送達システムの重要な特徴は、薬物送達システムを、それが投与される眼球内の位置に固定するためのいかなる手段（キャップ、突出部または縫合タブなど）も含まないことである。

本開示の範囲内である薬物送達システムの重要な特性は、かかる薬物送達システムを眼球内の位置（テノン嚢下、結膜下、硝子体内または上脈絡膜の前部位置など）に移植または注射して、眼球内の移植または注射の部位及び隣接部位で有意な免疫原性を発現または持続させることなく治療剤を持続放出させ得ることである。

ポリラクチド（ＰＬＡ）ポリマーには、ポリ（Ｌ−ラクチド）及びポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）の２種類の化学的形態が存在する。純粋なポリ（Ｌ−ラクチド）は立体規則性であるため、結晶性も高く、したがって、生体内で非常に緩徐に分解される。ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）は立体規則性がないため、生体内ではより急速に分解される。したがって、ポリ（Ｌ−ラクチド）ポリマーを主とし、残部がポリ（Ｄ−ラクチド）ポリマーからなる混合物のＰＬＡポリマーは、ポリ（Ｄ−ラクチド）ポリマーを主成分とするＰＬＡポリマーよりも緩徐に生体内で分解される。ＰＬＧＡは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）とポリ（グリコリド）がさまざまな比で混合している共重合体である。ＰＬＧＡ中のグリコリド含有量が多いほど、ポリマーの分解は速い。

いくつかの実施形態では、眼球内投与（すなわち、硝子体内への移植または注射）のための薬物送達システムは、ＰＬＡの少なくとも７５重量パーセント及びポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）ポリマーの約２５重量パーセント以下の構成を含むか、またはその構成からなるか、または本質的にその構成からなる。

眼球内の位置に注射針で投与可能な、ヒドロゲル（高分子ヒアルロン酸など）に懸濁させたマイクロスフェア（抗血管新生薬を組み込んでいる）懸濁液もまた範囲内である。そのような懸濁液の投与には、マイクロスフェア懸濁液の粘度が２５℃で約３００，０００ｃＰ未満であることが必要とされる。２５℃での水の粘度は約１．０ ｃＰである（ｃＰまたはｃｐｓはセンチポアズであり、粘度尺度である）。２５℃におけるオリーブ油の粘度は８４ ｃＰ、ヒマシ油の粘度は９８６ ｃＰ、またグリセロールの粘度は１４９０ ｃＰである。

薬物送達システム中に存在する抗体は、薬物送達システムの生物分解性ポリマーに均一に分散され得る。どの生物分解性ポリマーを使用するかは、所望の放出動態、患者の忍容性、治療すべき疾患の性質等により異なり得る。考慮されるポリマーの特徴には、移植部位での生体適合性と生物分解性、対象活性薬剤との適合性、及びプロセシング温度が挙げられるが、これらに限定されるものではない。生物分解性ポリマーマトリックスは通常、インプラントの少なくとも約１０重量パーセント、少なくとも約２０重量パーセント、少なくとも約３０重量パーセント、少なくとも約４０重量パーセント、少なくとも約５０重量パーセント、少なくとも約６０重量パーセント、少なくとも約７０重量パーセント、少なくとも約８０重量パーセント、または少なくとも約９０重量パーセント含まれる。一変法では、生物分解性ポリマーマトリックスは、薬物送達システムの約４０重量％〜５０重量％含まれる。

使用可能な生物分解性ポリマーには、分解されたときに生理学的に許容される分解産物となる、有機エステルまたはエーテルなどのモノマーでできたポリマーが挙げられるが、これに限定されるものではない。無水物、アミド、オルトエステル等を単独または他のモノマーとの組合せで使用してもよい。ポリマーは一般に縮合ポリマーである。ポリマーは架橋されていても、または架橋されていなくてもよい。

大部分では、ポリマーには、炭素と水素の他、酸素及び窒素、特に酸素が含まれるであろう。酸素は、オキシ、例えば、ヒドロキシまたはエーテル、カルボニル、例えば、ノナーオキソ−カルボニル、例えばカルボン酸エステル等として存在してよい。窒素は、アミド、シアノ、及びアミノとして存在してよい。使用可能な生物分解性ポリマーの例示的な一覧は、Ｈｅｌｌｅｒ，Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎ：”ＣＲＣ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｖｏｌ．１．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９８７）に記載がある。

特に対象となるのは、ヒドロキシ脂肪族（ｈｙｄｒｏｘｙａｌｉｐｈａｔｉｃ）カルボン酸のポリマー（単独重合体または共重合体）及び多糖類である。対象ポリエステルに含まれるものには、Ｄ−乳酸、Ｌ−乳酸、ラセミ乳酸、グリコール酸、カプロラクトン、及びその組み合わせの単独重合体または共重合体である。グリコール酸と乳酸の共重合体は特に対象となるポリマーであり、その場合、グリコール酸と乳酸の比によって生体内分解速度を制御する。乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）コポリマーにおける各モノマーの割合は、０〜１００％、約１５〜８５％、約２５〜７５％、または約３５〜６５％であってよい。特定の変法では、２５／７５ ＰＬＧＡ及び／または５０／５０ ＰＬＧＡ共重合体を使用する。他の変法では、ＰＬＧＡ共重合体をポリラクチドポリマーと併用する。

多種多様な目的のために薬物送達システム製剤に他の薬剤を採り入れてよい。例えば、緩衝剤及び防腐剤を使用してよい。使用可能な防腐剤には、亜硫酸水素ナトリウム、重硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、メチルパラベン、ポリビニルアルコール及びフェニルエチルアルコールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。使用され得る緩衝剤の例には、所望の投与経路についてＦＤＡの承認を受けた、炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。塩化ナトリウム及び塩化カリウムのような、コロイド及び／または電解質で粒子を安定させるために使用できる界面活性剤を製剤中に含めることもできる。薬物送達システムには、微小環境中ならびに界面（拡散静止（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎａｌ ｓｔａｇｎａｎｔ）層）のｐＨを調節する酸性及び塩基性の添加物も含まれ得る。

生物分解性薬物送達システムには、活性薬剤の放出を速めるかまたは遅らせる、さらなる親水性または疎水性化合物も含まれ得る。さらに、米国特許第５，８６９，０７９号に記載されるような放出調節物質をインプラントに含めることができる。使用する放出調節物質の量は、所望の放出プロファイル、調節物質の活性、及び調節物質がない場合のグルココルチコイド放出プロファイルに依存することになる。緩衝剤または放出増強物質もしくは調節物質が親水性の場合、放出促進物質としても作用し得る。親水性添加剤は、薬物粒子を取り囲む物質を迅速に溶解させて放出速度を高めるよう作用し、薬物の曝露表面積を増やして、薬物拡散速度を高める。同様に、疎水性の緩衝剤または増強物質もしくは調節物質は、より緩徐に溶解され得るため、薬物粒子の曝露を緩徐にして、薬物拡散速度を低下させる。

本開示の範囲内である薬物送達システムは、生物分解性ポリマー内に分散させた活性薬剤抗体粒子を用いて製剤化することができる。理論に拘束されることなく、生物分解性ポリマーマトリックスの浸食によって、また、眼液内、例えば、硝子体内への微粒子薬剤の拡散、それに続くポリマーマトリックスの溶解と活性薬剤の放出によって達成され得ると考えられる。インプラントからの活性薬剤の放出動態に影響を与える因子には、インプラントの大きさと形状、活性薬剤粒子の大きさ、活性薬剤の溶解度、活性薬剤とポリマー（複数可）との比、製造方法、曝露表面積、インプラント密度及びポリマー（複数可）の浸食速度のような特徴が含まれ得る。

活性薬剤の放出速度は、少なくとも部分的に、ポリマー骨格成分または生物分解性ポリマーマトリックスの構成成分の分解速度に依存し得る。例えば、縮合ポリマーは（他の機序の中でも）加水分解によって分解され得るため、インプラントによる水分の取り込みを増強させるようなインプラント組成物のいかなる変化によっても加水分解速度が高まり、それによりポリマーの分解速度と浸食速度が高まるために、活性薬剤の放出速度が高まることになる可能性がある。活性薬剤の放出速度はまた、活性薬剤の結晶性、インプラントのｐＨ及び界面ｐＨによっても影響され得る。

本発明の薬物送達システムの放出動態は、一部には、薬物送達システムの表面積に依存し得る。表面積が大きいと、より多くのポリマー及び活性薬剤が眼液に曝露され、眼液中でのポリマーの浸食及び活性薬剤粒子の溶解を早める。

また、単一特異性抗ＡＮＧ−２ヒトＨＣＡｂ及び／または一方の特異性がＡＮＧ−２である二重特異性抗体を含む医薬組成物も本明細書に開示する。また、医薬組成物を製造するための本明細書に記載する抗体の使用も開示される。また、眼障害の治療用抗体を含む、開示の抗体と医薬組成物を使用する方法も開示される。

本明細書で使用する場合、「医薬担体」には、生理学的に適合性のある、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌薬及び抗真菌薬、等張性吸収遅延剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ ａｎｄ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｄｅｌａｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）等が含まれる。好ましくは、担体は、静脈内投与、筋肉内投与、眼球内投与、硝子体内投与、皮下投与、腸管外投与、脊髄投与または表皮投与（例えば、注射または注入による）に好適である。

本明細書に開示する組成物は、当技術分野で公知の多様な方法で投与可能である。当業者には理解されるように、投与の経路及び／または方法は、所望される結果により異なってくる。開示される抗体を特定の投与経路で投与するためには、抗体の不活性化を防ぐ物質と抗体を結合させるか、またはかかる物質と抗体を同時投与することが必要であり得る。例えば、抗体を適切な担体、例えば、リポソーム、または希釈剤に入れて対象に投与してよい。薬理学的に許容される希釈剤には、生理食塩水及び水性緩衝溶液が挙げられる。医薬担体には、滅菌水溶液もしくは分散液、及び滅菌注射液もしくは分散液の用時調製用滅菌粉末が挙げられる。薬理学的活性物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は当技術分野で公知である。

本明細書で使用する語句「非経口投与」及び「非経口投与される」とは、経腸投与及び局所投与以外の、通常、注射による投与方法を意味し、これには、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心内、眼球内、硝子体内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、及び胸骨内への注射及び注入が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などのアジュバントも含有し得る。微生物の存在は、前掲の滅菌手順を行うこと、ならびに各種の抗菌薬及び抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等を含有させることの双方によって確実に予防され得る。糖、塩化ナトリウム等のような等張化剤を組成物に含めることも望ましい場合がある。さらに、注射用製剤の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなど、吸収を遅延させる薬剤を含めることによりもたらされ得る。

どの投与経路を選択するかにかかわらず、好適な水和物形態で使用され得る開示の抗体、及び／またはかかる抗体を含有する医薬組成物は、当業者に公知の従来方法によって薬理学的に許容される剤形で製剤化される。

医薬組成物中の有効成分の実際の用量レベルは、特定の患者、組成物、及び投与方法について、患者に毒性を示すことなく所望の治療応答を達成するのに有効な有効成分量が得られるよう異なってよい。選択用量レベルは、さまざまな薬物動態因子に応じて異なることになり、それらとしては、使用する本発明の特定組成物の活性、投与経路、投与時間、使用する特定の化合物の排泄速度、治療期間、使用する特定の組成物と併用する他の薬物、化合物及び／または物質、治療を受ける患者の年齢、性別、体重、状態、全体的健康状態及び病歴、ならびに医療分野で周知の同様の因子が挙げられる。

本明細書に開示する医薬組成物を硝子体内送達する場合の好適用量は、１眼あたり約０．１ｍｇ〜約５０ｍｇの範囲である。別の好適な用量としては、１眼あたり約０．２ｍｇ〜約４０ｍｇ、１眼あたり約０．３ｍｇ〜約３０ｍｇ、１眼あたり約０．４ｍｇ〜約２０ｍｇ、１眼あたり約０．５ｍｇ〜約１５ｍｇ、１眼あたり約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、１眼あたり約０．５ｍｇ、１眼あたり約０．７５ｍｇ、１眼あたり約１ｍｇ、１眼あたり約１．５ｍｇ、１眼あたり約２ｍｇ、１眼あたり約２．５ｍｇ、１眼あたり約３ｍｇ、１眼あたり約３．５ｍｇ、１眼あたり約４ｍｇ、１眼あたり約４．５ｍｇ、１眼あたり約５ｍｇ、１眼あたり約５．５ｍｇ、１眼あたり約６ｍｇ、１眼あたり約６．５ｍｇ、１眼あたり約７ｍｇ、１眼あたり約７．５ｍｇ、１眼あたり約８ｍｇ、１眼あたり約８．５ｍｇ、１眼あたり約９ｍｇ、１眼あたり約９．５ｍｇ、１眼あたり約１０ｍｇ、１眼あたり約１１ｍｇ、１眼あたり約１２ｍｇ、１眼あたり約１３ｍｇ、１眼あたり約１４ｍｇ、１眼あたり約１５ｍｇ、１眼あたり約１５ｍｇ、１眼あたり約１７ｍｇ、１眼あたり約１８ｍｇ、１眼あたり約１９ｍｇ、または１眼あたり約２０ｍｇが含まれるが、これに限定されるものではない。

組成物は、滅菌され、かつ組成物を注射器で送達できる程度に液体である必要がある。水の他に、好ましい担体には等張性の緩衝生理食塩水がある。

適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用すること、分散させる場合は要求される粒径を維持すること、及び界面活性剤を使用することによって維持が可能である。多くの場合、等張化剤、例えば、糖、マンニトールまたはソルビトールなどのポリアルコール、及び塩化ナトリウムを組成物に含ませることが好ましい。

単一特異性及び／または二重特異性抗ＡＮＧ−２ヒト抗体を含む医薬組成物及び薬物送達システムは、眼球内の位置に注射器で注射することも、または強膜切開後、鑷子、トロカール、もしくは他のタイプのアプリケーターによる設置を含め、さまざまな方法で眼に挿入（移植）することもできる。ある場合には、切開を行わずにトロカールまたはアプリケーターを使用してよい。好ましい変法では、携帯型アプリケーターを使用して、１つ以上の生物分解性インプラントを眼内に挿入する。携帯型アプリケーターは典型的に、１８〜３０ＧＡステンレス鋼製針、レバー、アクチュエーター、及びプランジャーを含む。後部眼領域もしくは部位へのインプラント（複数可）挿入用の好適なデバイスには、ＵＳ７，０９０，６８１に開示されるものが挙げられる。

投与方法は一般に、まず、針、トロカールまたは移植デバイスを用いて眼領域内の標的領域へのアクセスを行う。一旦、標的領域、例えば、硝子体腔にアクセスした後、携帯型デバイスのレバーを押し下げ、アクチュエーターを駆動させてプランジャーを前進させることができる。プランジャーが前進すると、インプラント（複数可）が標的領域（すなわち、硝子体）に押し込まれ得る。

多種多様な技術を採り入れて本開示の範囲のインプラントを作製してよい。有用な技術としては、相分離方法、界面法、押出成形法、圧縮法、成形法、射出成形法、熱プレス法等が挙げられる。

用語「眼内注射」とは、患者の眼球に進入して投与する注射を指す。用語「眼球周囲注射」とは、眼後方、眼球壁外側に投与する注射を指す。用語「経小帯（ｔｒａｎｓｚｏｎｕｌａｒ）」とは、眼の毛様体と水晶体を結合する一連の繊維である毛様体小帯から投与する注射を指す。用語「硝子体内」とは、患者の眼から眼の内腔へ直接投与する注射を指す。

本明細書に記載の医薬製剤は、眼球内硝子体内注射によって送達可能であり、経小帯（ｔｒａｎｓｚｏｎｕｌａｒ）であっても、また所望の場合はそうでなくても可能である。この製剤の眼球内硝子体内注射では、経小帯（ｔｒａｎｓｚｏｎｕｌａｒ）注射であるか毛様体扁平部（経強膜的）直接注射であるかを問わず、強力な広域抗生物質が化膿性組織に直接送達され、別々になった複数の薬剤を至急調合したり、複数の注射を別々に眼内に行ったりする必要がない。

典型的に、上記の医薬組成物は、治療を必要とする哺乳類対象（例えば、ヒト、ネコ、イヌ、他のペット、飼育動物、野生動物または家畜）に眼内投与されることになる。組成物は、眼科学の当業者に公知の方法及び技術を使用して、硝子体内注射及び経小帯（ｔｒａｎｓｚｏｎｕｌａｒｌｙ）注射される。

典型的に、一般的な２７ゲージカニューレを介した送達が１ｍＬ ＴＢ注射器を用いて行われ得るが、注射に先立ち、瞬間的に軽く叩いたり振ったりして製剤を再調製することに注意する。この製剤に要する医薬品の容量（すなわち、用量）は、眼障害の種類、及び狭い眼球内空間に投与される注射で利用可能な容量に関する解剖学的考慮因子によって異なる。

さらに、腔内（すなわち、前房）注射は、本開示の範囲内である。

代替的実施形態では、所望される場合または必要に応じ、製剤を、点眼剤または眼スプレーの形態、ならびに結膜下注射、眼球内腔内注射、テノン嚢下注射、関節内注射または病変内注射によって送達してよく、これは特に、限定するわけではないが、患者のニーズで必要とされる場合でさらなる薬物の送達を要する場合に当てはまる。

以下の例、配列表及び図は、本発明の理解を助けるために提供されるものであり、本発明の真の範囲は添付の請求の範囲に記載される。本発明の趣旨から逸脱することなく記載手順の変更が可能であることは理解されるべきである。

実施例１．マウス定常領域を有する抗ＡＮＧ−２ ＨＣＡｂ
動物を用いたすべての手順は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって作成されたガイドラインに従って実施した。Ｈａｒｂｏｕｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）由来ＨＣＡｂマウスを使用して抗ＡＮＧ−２抗体を作製した。

０日目、最初に雌ＨＣＡｂマウス５匹を、１０μｇの精製ヒトＡＮＧ−２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）及びＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＣＦＡ、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を腹腔内投与して免疫化した。１５日目、３０日目及び４５日目に、１０μｇの精製ヒトＡＮＧ−２及びＩｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＩＦＡ、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）でマウスを腹腔内にブーストした。免疫化スケジュール６０日目にＡＮＧ−２に対する血清抗体価を測定した。脾臓採取３日前、ヒトＡＮＧ−２をマウスに静脈内ブーストした（１０μｇ／マウス）。ＳＰ２０融合パートナーを用いる標準的なハイブリドーマ技術の方法にしたがって融合を実施した。抗ヒトＡＮＧ−２を検出するため、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によりハイブリドーマの上清のスクリーニングを行った。培養陽性を増殖させ、限界希釈法により２回サブクローニングを行った。プロテインＡ精製抗体調製物をすべての試験で使用した。

実施例２．ヒト定常領域を有する抗ＡＮＧ−２ ＨＣＡｂ
トータルＲＮＡを所望のハイブリドーマから単離し、特定のプライマーを使用してＰＣＲ増幅を行った。各ハイブリドーマから単離されたＶＨ領域（図３）をＩｇＧ１ヒンジ領域及びＣＨ２／ＣＨ３領域と融合させ、ＧＳ ＳＹＳＴＥＭ（商標）（Ｌｏｎｚａ、スイス、バーゼル）発現プラスミドにＨＣＡｂ配列を生成させた。発現プラスミドをＣＨＯ細胞株にトランスフェクションし、完全ヒト組換えＨＣＡｂを作製した。

開示の方法で作成された例示的な抗ＡＮＧ−２ヒト抗体をＡ３３Ａ８とし、これは、表２のアミノ酸配列を有する。どのＨＣＡｂのＣＤＲを用いても、フレームワーク（ＦＲ）領域、ヒンジ領域、及び定常（ＣＨ）領域を使用できる。

さらなる抗ＡＮＧ−２−ＨＣＡｂをＡ１Ｇ２、Ａ２Ｆ８、Ａ２Ｂ６、及びＡ１Ｂ１とし、これらは以下のアミノ酸配列のＶＨ領域を有する。

実施例３．抗ＡＮＧ−２ ＨＣＡｂの特性解析
抗ｈＩｇＧ Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサーチップ及びストレプトアビジンでコートしたバイオセンサー（ｆｏｒｔｅＢＩＯ、カリフォルニア州メンローパーク）が装備されたｆｏｒｔｅＢＩＯ ＯＣＴＥＴ（登録商標）ＱＫ^eシステムを使用して親和性測定を実施した。ＡＨＣ親和性測定では、精製抗ＡＮＧ−２ ＨＣＡｂ Ａ３３Ａ８を、そのＡＨＣセンサーチップとの結合能について試験した。チップに２０μｇ／ｍｌの抗ＡＮＧ−２ Ａ３３Ａ８ ＨＣＡｂを用いて担持させた。担持を３００秒進行させたところ、捕捉レベルは１．８〜２ｎｍであった。ＡＮＧ−２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）抗原を濃度２０〜５００ｎＭまで１ｘＰＢＳで希釈して結合分析用に調製した。会合が開始し、２００秒間監視を行い、その後、Ｆａｃｔｏｒタンパク質（Ｇｉｂｃｏ、ＰＢＳ ｐＨ７．２）を含まない１ｘＰＢＳ緩衝液にチップを移し、解離を監視した。その後、バイオレイヤー干渉分析を使用して、抗ＡＮＧ−２ Ａ３３Ａ８ ＨＣＡｂの結合活性をリアルタイムで監視した。測定した会合定数（「Ｋ_assoc」）と解離（「Ｋ_dissoc」）定数に基づいて、被験ＡＮＧ−２の抗原結合親和性を計算した。ＯＣＴＥＴ（登録商標）データ解析ソフトウェア６．４を使用してデータの処理と解析を行った（ｆｏｒｔｅＢＩＯ）（図４）。Ａ３３Ａ８はＡＮＧ−２に１ピコモル未満のＫｄで結合する。ラットＡＮＧ−２と交差反応しないが、ウサギＡＮＧ−２とは交差反応する。さらに、Ａ３３Ａ８はＡＮＧ−１と交差反応する。

１ウェルにつき１ミリリットルあたり２マイクログラムのＴｉｅ−２−ｈＦｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で９６ウェルマイクロタイタープレートを４℃で一晩コートした。別のプレートに、Ａ３３Ａ８抗ＨＣＡｂの系列希釈を、２ｎＭのビオチン化ヒトＡＮＧ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に１時間インキュベートした。１００マイクロリットルのＡ３３Ａ８−ＡＮＧ−２混合物をＴｉｅ−２−ｈＦｃでコートしたマイクロタイタープレートに１時間塗布した。その後、検出抗体（抗ビオチンＨＲＰ）を１時間加え、化学発光ＨＲＰ基質でＥＬＩＳＡを作成し、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーで読み取った（図５）。Ａ３３Ａ８は、ＡＮＧ−２がその受容体Ｔｉｅ−２に結合するのを完全に遮断する。

実施例４．抗ＡＮＧ２ ＨＣＡｂの競合的ＥＬＩＳＡ分析
１ウェルにつき１ミリリットルあたり２マイクログラムのＴｉｅ−２−ｈＦｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で９６ウェルマイクロタイタープレートを４℃で一晩コートした。別のプレートに、抗ＨＣＡｂの系列希釈を、２ｎＭのビオチン化ヒトＡＮＧ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に１時間インキュベートした。１００マイクロリットルの抗ＡＮＧ−２ ＨＣＡｂ−ＡＮＧ−２混合物をＴｉｅ−２−ｈＦｃでコートしたマイクロタイタープレートに１時間塗布した。その後、検出抗体（抗ビオチンＨＲＰ）を１時間加え、化学発光ＨＲＰ基質でＥＬＩＳＡを作成し、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーで読み取った。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して分析した（図１２）。

実施例５．抗ＡＮＧ−２ ＨＣＡｂ分子Ａ３３Ａ８のアラニンスキャニング分析
アラニンスキャニングを使用して、修飾を受けると、抗ＡＮＧ−２ ＨＣＡｂ Ａ３３Ａ８の結合親和性が改変される、ＣＤＲ配列内のアミノ酸位置を同定した。

開示された抗ＡＮＧ−２ ＨＣＡｂ Ａ３３Ａ８で使用するための特定のＣＤＲは表４に記載されており、下線のアミノ酸は、アラニンへの置換によって結合が実質的に減少したアミノ酸である。

したがって、Ａ３３Ａ８ ＣＤＲの特定の残基において置換を有する抗ＨＣＡｂ抗体は、本開示の範囲内である。一実施形態では、Ａ３３Ａ８ ＣＤＲ１はＧＦＴＦＳＳＹＷ（配列番号１２）を含み、ここで、１位、３位、４位、５位、６位のアミノ酸のうち１つ、２つ、３つ、４つ、またはすべてが任意のアミノ酸で置換される。他の実施形態では、Ａ３３Ａ８ ＣＤＲ１はＧＦＴＦＳＳＹＷを含み、ここで、１位、３位、４位、５位、６位のアミノ酸のうち１つ、２つ、３つ、４つ、またはすべてが本明細書に開示する保存的アミノ酸で置換される。別の実施形態では、Ａ３３Ａ８ ＣＤＲ１はＧＦＴＦＳＳＹＷを含み、ここで、１位、３位、４位、５位、６位のアミノ酸のうち１つ、２つ、３つ、４つ、またはすべてが本明細書で定義する同一クラスのアミノ酸で置換される。

一実施形態では、Ａ３３Ａ８ ＣＤＲ２はＩＮＳＤＧＳＳＴ（配列番号１４）を含み、ここで、１位、３位、６位、７位、または８位のアミノ酸のうち１つ、２つ、３つ、４つ、またはすべてが任意のアミノ酸で置換される。他の実施形態では、Ａ３３Ａ８ ＣＤＲ２はＩＮＳＤＧＳＳＴを含み、ここで、１位、３位、６位、７位、または８位のアミノ酸のうち１つ、２つ、３つ、４つ、またはすべてが本明細書に開示する保存的アミノ酸で置換される。他の実施形態では、Ａ３３Ａ８ ＣＤＲ２はＩＮＳＤＧＳＳＴを含み、ここで、１位、３位、６位、７位、または８位のアミノ酸のうち１つ、２つ、３つ、４つ、またはすべてが本明細書で定義する同一クラスのアミノ酸で置換される

別の実施形態では、Ａ３３Ａ８ ＣＤＲ３はＡＲＥＧＹＳＳＧＧＱＦＤＹ（配列番号１６）を含み、ここで、１位、１０位、または１１位のアミノ酸のうち１つ、２つ、またはすべてが任意のアミノ酸で置換される。他の実施形態では、Ａ３３Ａ８ ＣＤＲ３はＡＲＥＧＹＳＳＧＧＱＦＤＹを含み、ここで、１位、１０位、または１１位のアミノ酸のうち１つ、２つ、またはすべてが本明細書に開示する保存的アミノ酸で置換される。他の実施形態では、Ａ３３Ａ８ ＣＤＲ３はＡＲＥＧＹＳＳＧＧＱＦＤＹを含み、ここで、１位、１０位、または１１位のアミノ酸のうち１つ、２つ、またはすべてが本明細書で定義する同一クラスのアミノ酸で置換される。

特に明記しない限り、明細書及び請求項で使用される、成分、分子量のような特性、反応条件等の量を表すすべての数字は、すべての場合において変更されることを「約」という用語をもって理解されるべきである。本明細書で使用する「約（ａｂｏｕｔ）」及び「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、１０〜１５％以内、好ましくは５〜１０％以内であることを意味する。したがって、特に明記されていない限り、明細書及び添付の請求項に記載の数値パラメータは、本発明によって得るべく探索される所望の特性に応じて異なり得る近似値である。少なくとも、及び特許請求の範囲に対する均等論の適用を制限する意図はないが、各数値パラメータは、少なくとも記載される有意な桁数に鑑み、通常四捨五入法を適用して解釈されるべきである。本発明の広い範囲を記載する数字範囲及びパラメータが近似値であっても、特定の例に記載の数値は、可能な限り正確に報告されている。しかしながら、いかなる数値であっても、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差によってどうしても生じるある程度の誤差が本質的に含まれている。

本発明の説明において（特に以下の請求項において）使用される用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び同様の指示語は、本明細書中で特に明記したり、明らかに文脈と矛盾したりしない限り、単数及び複数の両方をカバーすると解釈することができる。本明細書で数値範囲を詳述する場合、その範囲内に該当する別々の値のそれぞれを個々に言及する簡略した方法として使用することを意図するにすぎない。本明細書中で特に明記しない限り、個々のそれぞれの値は、それが個々に本明細書で引用されているかの如く本明細書に組み込まれるものとする。本明細書に記載する方法はすべて、本明細書で特に明記したり、ほかに文脈と明らかに矛盾したりしない限り、どのような好適順序でも実施可能である。本明細書に記載されるすべての例、または例示的な言い回し（例えば、「ｓｕｃｈ ａｓ」）を使用することで、本願をより明確にすることを意図するにすぎず、ほかに請求項に記載する出願範囲に制限を設けるものではない。明細書内のいかなる言い回しも、特許請求されていない任意の要素について、本出願の実施に不可欠な要素であることを示していると解釈されるべきではない。

本明細書に開示する発明の、代替的な要素または実施形態の分類を限定的なものと解釈されるべきではない。各群のメンバーは、個々別々に、または本明細書に記載の群の他のメンバーもしくは他の要素と共に組み合わせて言及され、請求されてよい。便宜上及び／または特許性の理由により、群の１つ以上のメンバーを群に含めても、または取り除いてもよい。そのような包含または除去が生じる場合、明細書は、その群を変更として含有し、添付の請求の範囲で使用されるすべてのマーカッシュ群の記載を満たすとみなされる。

本発明の特定の実施形態を本明細書に記載し、発明者らの知る本発明を実施するための最良の実施の方法が含まれている。当然のことながら、これらの記載実施形態の変法は、上述の説明を読むと当業者に明らかとなろう。発明者は、そのような変形を適宜採用することを当業者に期待し、発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載した以外の方法でも実施されることを意図している。したがって、本発明には、適用法令によって許可されているように、本明細書に添付の請求項で引用される主題のあらゆる変更及び等価物が含まれる。さらに、本明細書で特に明記したり、明らかに文脈と矛盾したりしない限り、上記要素について、その考えられるすべての変形のいかなる組み合わせも本発明に包含される。

本明細書に開示の具体的な実施形態は、「からなる」または「本質的に〜からなる」という言い回しを使用する請求の範囲でさらに限定され得る。請求項で使用する場合、補正ごとの出願か追加かを問わず、移行句「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ（からなる）」は請求項で明記されていない要素、ステップ、または成分はすべて除外される。移行句「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（本質的に〜からなる）」は、請求の範囲を、明記される材料または工程、ならびに基本的及び新規な特徴（複数可）に実質的に影響を与えないものに限定する。そのように請求された本発明の実施形態は、本質的または明白に本明細書に記載され実施可能である。

さらに、本明細書全体を通して特許及び印刷刊行物が多数参照されている。上記で引用した参考文献及び印刷刊行物の各々は、参照により個々別々にその全体が本明細書に組み込まれる。

最後に、本明細書に開示する発明の実施形態は本発明の原則を例示するものであることを理解されるべきである。使用され得る他の変更も本発明の範囲内である。したがって、例として、限定することなく、本発明の代替的構成を本明細書の教示に従って利用してよい。したがって、本発明は正確に示され、記載されているものに限定されるものではない。

Claims (31)

1. ＡＮＧ−２に対する抗原結合特異性を有する重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）であって、配列番号９のアミノ酸配列を有する、前記重鎖のみ抗体。
2. ＡＮＧ−２に対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、可変領域（ＶＨ）が配列番号２５の配列を有する、前記ＨＣＡｂ。
3. ＡＮＧ−２に対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列番号１２、１４、及び１６を含む、前記ＨＣＡｂ。
4. ＡＮＧ−２に対する抗原結合特異性のあるＨＣＡｂであって、ＣＤ１はＧＦＴＦＳＳＹＷ（配列番号１２）を含み、１位、３位、４位、５位、６位のアミノ酸のうち１つ以上が任意のアミノ酸で置換される、前記ＨＣＡｂ。
5. １位、３位、４位、５位、６位のアミノ酸のうち１つ以上が保存的アミノ酸で置換される、請求項４に記載のＨＣＡｂ。
6. 前記ＣＤ１はＧＦＴＦＳＳＹＷを含み、１位、３位、４位、５位、６位のアミノ酸のうち１つ以上が同一クラスのアミノ酸で置換される、請求項４に記載のＨＣＡｂ。
7. ＡＮＧ−２に対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、ＣＤ２はＩＮＳＤＧＳＳＴ（配列番号１４）を含み、１位、３位、６位、７位、または８位のアミノ酸のうち１つ以上が任意のアミノ酸で置換される、前記ＨＣＡｂ。
8. １位、３位、６位、７位、または８位のアミノ酸のうち１つ以上が保存的アミノ酸で置換される、請求項７に記載のＨＣＡｂ。
9. １位、３位、６位、７位、または８位のアミノ酸のうち１つ以上が同一クラスのアミノ酸で置換される、請求項７に記載のＨＣＡｂ。
10. ＡＮＧ−２に対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、ＣＤ３はＡＲＥＧＹＳＳＧＧＱＦＤＹ（配列番号１６）を含み、１位、１０位、または１１位のアミノ酸のうち１つ以上が任意のアミノ酸で置換される、前記ＨＣＡｂ。
11. １位、１０位、または１１位のアミノ酸のうち１つ以上が保存的アミノ酸で置換される、請求項１０に記載のＨＣＡｂ。
12. １位、１０位、または１１位のアミノ酸のうち１つ以上が同一クラスのアミノ酸で置換される、請求項１０に記載のＨＣＡｂ。
13. ＡＮＧ−２に対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、ＶＨアミノ酸配列が配列番号２１〜２５のうちの１つである、前記ＨＣＡｂ。
14. ＡＮＧ−２への結合について、Ａ３３Ａ８（配列番号２５）、Ａ１Ｇ２（配列番号２１）、Ａ１Ｆ８（配列番号２２）、Ａ２Ｂ６（配列番号２３）、またはＡ１Ｂ１（配列番号２４）のＶＨ領域配列を有するＨＣＡｂと競合する、ヒトまたはヒト化抗体。
15. ＡＮＧ−２に対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列番号２６、２７、及び２８を含む、前記ＨＣＡｂ。
16. ＡＮＧ−２に対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列番号２９、３０、及び３１を含む、前記ＨＣＡｂ。
17. ＡＮＧ−２に対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列番号３２、３３、及び３４を含む、前記ＨＣＡｂ。
18. ＡＮＧ−２に対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列番号３５、３６、及び３７を含む、前記ＨＣＡｂ。
19. ＡＮＧ−２に対する第１の抗原結合特異性、及びＶＥＧＦに対する第２の抗原結合特異性を有する、二重特異性抗体。
20. 前記第１の抗原結合特異性は、ＨＣＡｂ Ａ３３Ａ８、Ａ１Ｇ２、Ａ１Ｆ８、Ａ２Ｂ６、またはＡ１Ｂ１によって表される、請求項１９に記載の二重特異性抗体。
21. 前記第２の抗原結合特異性は、ベバシズマブ、またはそのＶＨもしくはＶＬ領域によって表される、請求項１９に記載の二重特異性抗体。
22. 前記第２の抗原結合特異性は、ラニビズマブ、またはそのＶＨもしくはＶＬ領域によって表される、請求項１９に記載の二重特異性抗体。
23. ＡＮＧ−２に対する第１の抗原結合特異性及びＰＤＧＦに対する第２の抗原結合特異性を有する、二重特異性抗体。
24. 前記第１の抗原結合特異性は、ＨＣＡｂ Ａ３３Ａ８、Ａ１Ｇ２、Ａ１Ｆ８、Ａ２Ｂ６、またはＡ１Ｂ１によって表される、請求項２３に記載の二重特異性抗体。
25. 前記第２の抗原結合特異性は、ＨＣＡｂ Ｐ３６Ｆ３によって表される、請求項２３に記載の二重特異性抗体。
26. 眼科障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のＶＨ領域を有するＨＣＡｂ、または請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を投与することを含む、前記方法。
27. 前記眼科障害は、萎縮型加齢黄斑変性、滲出型加齢黄斑変性、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、近視性脈絡膜新生血管、血管線条、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、黄斑の浮腫、網膜静脈閉塞、角膜血管新生異常、結膜翼状片、網膜下浮腫、及び網膜内浮腫からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
28. 前記角膜血管新生異常は、角膜炎、角膜移植、角膜形成術または低酸素症の結果として生じる、請求項２６に記載の方法。
29. それを必要とする対象の眼科障害を治療するための医薬品の製造における、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のＶＨ領域を有するＨＣＡｂ、または請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の使用。
30. 前記眼科障害は、萎縮型加齢黄斑変性、滲出型加齢黄斑変性、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、近視性脈絡膜新生血管、血管線条、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、黄斑の浮腫、網膜静脈閉塞、角膜血管新生異常、結膜翼状片、網膜下浮腫、または網膜内浮腫からなる群から選択される、請求項２９に記載の使用。
31. 前記角膜血管新生異常は、角膜炎、角膜移植、角膜形成術または低酸素症の結果として生じる、請求項１６に記載の使用。