JP2023548829A - 異種腫瘍制御のための操作されたｉＰＳＣ及び免疫エフェクター細胞 - Google Patents

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Abstract

ゲノム操作されたｉＰＳＣの指向性分化から得られる機能的に増強された誘導エフェクター細胞を取得するための方法及び組成物が提供される。本明細書において提供されるｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、改善又は増強された治療効果をもたらす安定した機能的なゲノム編集を有する。機能的に増強された派生エフェクター細胞を単独で、又は組み合わせ療法において抗体若しくはチェックポイント阻害剤とともに含む、治療組成物及びその使用も提供される。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年１１月４日に出願された米国特許仮出願第６３／１０９，８２９号、及び２０２１年４月９日に出願された米国特許仮出願第６３／１７２，８９１号の優先権を主張し、それらの各々の開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
（発明の分野）
本開示は、既製の免疫細胞製品の分野に広く関する。より具体的には、本開示は、インビボで治療に適切な特性をもたらすことができる多機能エフェクター細胞を開発するための戦略に関する。本開示の下で開発された細胞製品は、患者由来の細胞療法の重大な限界に対処する。
（電子的に提出された配列表への言及）
本出願は、本出願とともに提出された、作成日２０２１年１１月４日、サイズ６１，６０３バイト、名称１８４１４３－６３２６０１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである、ＡＳＣＩＩテキスト形式の配列表のコンピュータ可読形式（Computer Readable Form、ＣＲＦ）を参照により組み込む。
養子細胞療法の分野は現在、患者由来及びドナー由来の細胞を使用することに焦点が当てられているため、がん免疫療法の一貫した製造を達成することと、恩恵を受ける可能性のある全ての患者に療法を提供することとが特に困難なものとなっている。養子移入されたリンパ球の有効性及び持続性を改善して、患者の良好な転帰を促進する必要もある。Ｔ細胞及びナチュラルキラー（natural killer、ＮＫ）細胞などのリンパ球は、自然免疫及び適応免疫に重要な役割を果たす強力な抗腫瘍エフェクターである。しかしながら、養子細胞療法のためにこれらの免疫細胞を使用することは、依然として困難であり、改善に対する満たされていない必要性が存在する。したがって、養子免疫療法においてＴ細胞及びＮＫ細胞、又は他の免疫エフェクター細胞の可能性を最大限に活用するための大きなチャンスがある。
応答率、細胞の消耗、輸注された細胞の損失（生存率及び／又は持続性）、標的の喪失又は系統転換による腫瘍エスケープ、腫瘍の標的化の精度、標的外毒性、腫瘍外効果、固形腫瘍に対する有効性、すなわち腫瘍微小環境及び関連する免疫抑制、動員、輸送、及び浸潤など、様々な問題に対処する機能的に改善されたエフェクター細胞が必要である。
本発明の目的は、単一細胞由来のｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞）クローン株から分化した派生非多能性細胞を生成する方法及び組成物を提供することであり、このｉＰＳＣは、そのゲノムに１つ又はいくつかの遺伝子改変を含む。前述の１つ又はいくつかの遺伝子改変には、ＤＮＡ挿入、欠失、及び置換が含まれ、これらの改変は、分化、増殖、継代及び／又は移植の後、その後の由来細胞において保持され、機能し続ける。
本出願のｉＰＳＣ由来非多能性細胞には、ＣＤ３４＋細胞、造血内皮細胞、ＨＳＣ（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ、造血幹前駆細胞）、造血多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、並びに初代ＮＫ、Ｔ、及び／又はＮＫＴ細胞には存在しない１つ以上の機能的特質を有する免疫エフェクター細胞が含まれるが、これらに限定されない。本出願のｉＰＳＣ由来の非多能性細胞は、同一の遺伝子改変を含むｉＰＳＣからの分化を通じて、それらのゲノムに１つ又はいくつかの遺伝子改変を含む。遺伝子操作された派生細胞を得るための操作されたクローンｉＰＳＣ分化戦略では、分化におけるｉＰＳＣの発生の可能性が、ｉＰＳＣの操作されたモダリティによって悪影響を受けないこと、及び操作されたモダリティが派生細胞で意図したとおりに機能することも必要である。更に、この戦略は、末梢血から取得されたＴ細胞又はＮＫ細胞などの初代リンパ球を操作する際の現在の障壁、すなわち、そのような細胞はしばしば、再現性と均一性を欠き、高い細胞死と低い細胞増殖を伴う不十分な細胞の持続性を呈する細胞をもたらし、そのような細胞を操作することが困難であることに起因する障壁を克服する。更に、この戦略は、最初は不均質である初代細胞源を使用して別の方法で得られる不均質のエフェクター細胞集団の生成を回避する。
本発明のいくつかの態様は、リプログラミングプロセスに続いて、同時に、及びその前に、それぞれ、ゲノム操作の戦略を反映する（Ｉ）、（ＩＩ）、又は（ＩＩＩ）を含む方法を使用して得られたゲノム操作されたｉＰＳＣを提供する。
（Ｉ）：以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の一方又は両方を任意の順序で実施してｉＰＳＣを遺伝子操作する。（ｉ）ｉＰＳＣに１つ以上のコンストラクトを導入して、選択された部位での標的化組み込みを可能にし、（ｉｉ）（ａ）選択された部位を認識することができる１つ以上のエンドヌクレアーゼを使用して、選択された部位における１つ以上の二本鎖切断をｉＰＳＣに導入し、（ｂ）ステップ（Ｉ）（ｉｉ）（ａ）のｉＰＳＣを培養して、内因性ＤＮＡ修復が、選択された部位に標的化インデルを同時に又は順次生成することを可能にし、それによって、部分又は完全分化細胞に分化することができるゲノム操作されたｉＰＳＣを得る。
（ＩＩ）：非多能性細胞を遺伝子操作リプログラミングしてゲノム操作されたｉＰＳＣを得る。これには、（ｉ）非多能性細胞を１つ以上のリプログラミング因子と、並びに任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、及び／又はＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、非多能性細胞のリプログラミングを開始することと、（ｉｉ）ステップ（ＩＩ）（ｉ）の以下の（ａ）及び（ｂ）の一方又は両方を任意の順序でリプログラミング非多能性細胞に導入することと、が含まれる：（ａ）選択された部位での標的化組み込みを可能にする１つ以上の構築物、（ｂ）選択された部位を認識することができる少なくとも１つのエンドヌクレアーゼを使用する、選択された部位での１つ以上の二本鎖切断、次いで、ステップ（ＩＩ）（ｉｉ）（ｂ）の細胞を培養して、内因性ＤＮＡ修復が、選択された部位に標的化イン／デルを生成することを可能にする。したがって、得られたゲノム操作されたｉＰＳＣは、少なくとも１つの機能的な標的化ゲノム編集を含み、前述のゲノム操作されたｉＰＳＣは、部分又は完全分化細胞に分化することができる。
（ＩＩＩ）：リプログラミングしてゲノム操作されたｉＰＳＣを得るために、非多能性細胞を遺伝子操作する。これには、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）が含まれる：（ｉ）以下の（ａ）及び（ｂ）の一方又は両方を任意の順序で非多能性細胞に導入すること：（ａ）選択された部位での標的化組み込みを可能にする１つ以上の構築物、（ｂ）選択された部位を認識することができる少なくとも１つのエンドヌクレアーゼを使用する、選択された部位での１つ以上の二本鎖切断、であって、ステップ（ＩＩＩ）（ｉ）（ｂ）の細胞を培養して、内因性ＤＮＡ修復が、選択された部位に標的化イン／デルを生成することを可能にする、導入することと、（ｉｉ）ステップ（ＩＩＩ）（ｉ）の細胞を、１つ以上のリプログラミング因子、並びに任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、及び／又はＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、選択された部位での標的化編集を含むゲノム操作されたｉＰＳＣを得ること。それによって、少なくとも１つの機能的な標的化ゲノム編集を含むゲノム操作されたｉＰＳＣを得、前述のゲノム操作されたｉＰＳＣは、部分分化細胞又は完全分化細胞に分化することができる。
上述の方法の一実施形態では、１つ以上の選択された部位での少なくとも１つの標的化されたゲノム編集は、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、あるいは、ゲノム操作されたｉＰＳＣ又はそれからの派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び／又は生存率を促進するタンパク質をコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドの挿入を含む。いくつかの実施形態では、挿入のための外因性ポリヌクレオチドは、（１）ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、又は他の構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、若しくは細胞型特異的プロモータを含む１つ以上の外因性プロモータ、又は（２）ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ２ミクログロブリン、ＣＤ３８、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ若しくはＲＵＮＸ１、又はゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む選択された部位に含まれる１つ以上の内因性プロモータに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、上述の方法を使用して生成されたゲノム操作されたｉＰＳＣは、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変ＥＧＦＲ、又はＢ細胞ＣＤ２０を含むタンパク質をコードする１つ以上の異なる外因性ポリヌクレオチドを含み、ゲノム操作されたｉＰＳＣが２つ以上の自殺遺伝子を含む場合、自殺遺伝子は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ２ミクログロブリン、ＣＤ３８、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、又はＲＵＮＸ１を含む異なるセーフハーバー遺伝子座に組み込まれている。一実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、及び／又はそれらのそれぞれの受容体の部分長又は全長ペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドによってコードされるＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、及び／又はそれらのそれぞれの受容体の部分的又は完全なペプチドは、融合タンパク質の形態である。
いくつかの他の実施形態では、本明細書において提供される方法を使用して生成されたゲノム操作されたｉＰＳＣは、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答調節及び修飾、あるいはｉＰＳＣ又はそれらからの派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び／又は生存率を抑制するタンパク質と関連する１つ以上の内因性遺伝子におけるイン／デルを含む。いくつかの実施形態では、破壊のための内因性遺伝子は、ＣＤ３８、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＡＧ１、及び染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子のうちの少なくとも１つを含む。
更にいくつかの他の実施形態では、本明細書で提供される方法を使用して生成されるゲノム操作されたｉＰＳＣは、ＡＡＶＳ１遺伝子座に外因性ポリヌクレオチドをコードするカスパーゼ、及びＨ１１遺伝子座に外因性ポリヌクレオチドをコードするチミジンキナーゼを含む。
更にいくつかの他の実施形態では、アプローチ（Ｉ）、（ＩＩ）及び／又は（ＩＩＩ）は、ゲノム操作されたｉＰＳＣを、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、ゲノム操作されたｉＰＳＣの多能性を維持することを更に含む。一実施形態では、少なくとも１つの標的化されたゲノム編集を含む取得されたゲノム操作されたｉＰＳＣは機能的であり、分化能があり、同一の機能のゲノム編集を含む非多能性細胞に分化することができる。
したがって、一態様では、本発明は、細胞又はその集団であって、細胞が、Ｂ７Ｈ３腫瘍抗原を標的とするＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含み、ＣＡＲが、（ｉ）配列番号３６、３７、３８、３９、４０、若しくは４１と少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、若しくは８０％同一であるアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号３６のバリアントによって表されるアミノ酸配列であって、バリアントが、配列番号３６の１、４０、４６、７９、８７、８８、８９、９７、９８、及び１１７を含む位置に１つ以上の突然変異を有する、アミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号３６のバリアントによって表されるアミノ酸配列であって、バリアントが、配列番号３６に従いＱ１Ｅ、Ｔ４０Ａ、Ｅ４６Ｖ、Ｇ７９Ｌ、Ｋ８７Ｒ、Ｐ８８Ａ、Ｄ８９Ｅ、Ｖ９７Ａ、Ｓ９８Ｒ、及びＱ１１７Ｌを含む１つ以上の置換を有する、アミノ酸配列、又は（ｉｖ）配列番号３６、３７、３８、３９、４０、及び４１のうちのいずれかによって表されるアミノ酸配列、を含む結合ドメインを含み、細胞が、真核細胞、動物細胞、ヒト細胞、免疫細胞、人工多能性細胞（induced pluripotent cell、ｉＰＳＣ）、又はそれから分化した派生細胞である、細胞又はその集団を提供する。
様々な実施形態では、細胞は、エンゲージャをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、及び任意選択でＣＦＲ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｆｕｓｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、キメラ融合受容体）を更に含み、エンゲージャは、Ｂ７Ｈ３ではない腫瘍抗原標的化特異性を有する。いくつかの実施形態では、（ｉ）エンゲージャは、ＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有する第１の結合ドメインを含み、第１の結合ドメインは、ＡＤＧＲＥ２、Ｂ７Ｈ３、炭酸脱水酵素ＩＸ（carbonic anhydrase IX、ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（carcinoembryonic antigen、ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus、ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質－２（epithelial glycoprotein-2、ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（epithelial glycoprotein-40、ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（epithelial cell adhesion molecule、ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシン－タンパク質キナーゼｅｒｂ Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（folate-binding protein、ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（acetylcholine receptor、ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－α、ガングリオシドＧ２（Ganglioside G2、ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（Ganglioside G3、ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（human Epidermal Growth Factor Receptor 2、ＨＥＲ２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（human telomerase reverse transcriptase、ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（Interleukin-13 receptor subunit alpha-2、ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kinase insert domain receptor、ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（Lewis Y、ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（L1 cell adhesion molecule、Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（melanoma antigen family A1、ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＲ１、ムチン１（Mucin 1、Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Mucin 16、Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（Mesothelin、ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（oncofetal antigen、ｈ５Ｔ４）、ＰＤＬ１、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（prostate stem cell antigen、ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（PRAME prostate-specific membrane antigen、ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（tumor-associated glycoprotein 72、ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（vascular endothelial growth factor R2、ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（Wilms tumor protein、ＷＴ－１）、及び病原体抗原のうちのいずれか１つに特異的であるか、（ｉｉ）エンゲージャは、第１の結合ドメインの特異性とは異なり、かつＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、若しくはそれらの任意の機能的バリアントの細胞外部分に対するものである特異性を有する第２の結合ドメインを含むか、又はエンゲージャの第２の結合ドメインが、ＣＦＲの外部ドメインに特異的であるか、あるいは（ｉｉｉ）エンゲージャは、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間にサイトカイン若しくはそのバリアントを含み、サイトカインは、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、及びＩＬ２１のうちの少なくとも１つを含む。
細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、（ｉ）ＣＦＲは、膜貫通ドメインに融合した外部ドメインを含み、膜貫通ドメインは、内部ドメインに作動可能に接続されており、外部ドメイン、膜貫通ドメイン及び内部ドメインは、いずれの小胞体（endoplasmic reticulum、ＥＲ）保持シグナルもエンドサイトーシスシグナルも含まないか、（ｉｉ）ＣＦＲは、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、それらの任意の機能的バリアント、及びそれらの組み合わせ又はキメラのうちの少なくとも１つを含むシグナル伝達タンパク質の細胞外部分の全長又は部分長を含む外部ドメインを含むか、（ｉｉｉ）ＣＦＲは、選択されたアゴニストに結合するとシグナル伝達を開始する外部ドメインを含むか、（ｉｖ）ＣＦＲは、ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、又はＮＫＧ２Ｄポリペプチドの少なくとも全長又は一部分を含む細胞傷害性ドメインを含む内部ドメインを含み、任意選択で、内部ドメインは、（ａ）ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ－４、若しくはＮＫＧ２Ｄポリペプチド、若しくはそれらの任意の組み合わせの全長若しくは一部分を含む共刺激ドメイン、（ｂ）ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、若しくはそれらの任意の組み合わせの全長若しくは少なくとも一部分を含む共刺激ドメイン、（ｃ）ＩＬ７Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、ＩＬ１８Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ２３Ｒ、若しくはそれらの組み合わせを含むサイトカイン受容体の内部ドメインの全長若しくは一部分を含む持続シグナル伝達ドメイン、及び／又は（ｄ）受容体チロシンキナーゼ（receptor tyrosine kinase、ＲＴＫ）、腫瘍壊死因子受容体（tumor necrosis factor receptor、ＴＮＦＲ）、ＥＧＦＲ、若しくはＦＡＳ受容体の完全な若しくは部分的な細胞内部分、のうちの１つ以上を更に含むか、あるいは（ｉｖ）ＣＦＲは、別個の構築物内で、又はバイシストロン性発現カセット内で、エンゲージャ又はＣＡＲと共発現される。
細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、細胞は、その対応する初代細胞と比較して、以下の編集：ＣＤ３８ノックアウト、ＨＬＡ－Ｉの欠損及び／又はＨＬＡ－ＩＩの欠損、ＨＬＡ－Ｇ又は非切断性ＨＬＡ－Ｇの導入、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント、細胞表面発現外因性サイトカイン及び／若しくはその受容体の部分若しくは完全ペプチドを含むシグナル伝達複合体、表１に列挙される遺伝子型のうちの少なくとも１つ、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの少なくとも１つの破壊、並びに／あるいはＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャ、及び二重若しくは多重特異性又はユニバーサルエンゲージャとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、のうちの１つ以上を更に含む。いくつかの実施形態では、細胞又はその集団は、末梢血、臍帯血、又は任意の他のドナー組織から得られたその対応する初代細胞と比較して、（ｉ）増加された細胞傷害性、（ｉｉ）改善された持続性及び／又は生存率、（ｉｉｉ）腫瘍部位にバイスタンダー免疫細胞を遊走させる、及び／又は活性化させる、若しくは動員する増強された能力、（ｉｖ）改善された腫瘍浸透、（ｖ）腫瘍免疫抑制を低下させる増強された能力、（ｖｉ）腫瘍抗原エスケープを救済する改善された能力、（ｖｉｉ）制御されたアポトーシス、（ｖｉｉｉ）増強又は獲得されたＡＤＣＣ、並びに（ｉｘ）フラトリサイドを回避する能力、うちの１つ以上を含む治療特性を有する。
当該細胞又はその集団のいくつかの他の実施形態では、細胞は、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントを更に含む。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６は、高親和性の非切断性ＣＤ１６（high affinity non-cleavable CD16、ｈｎＣＤ１６）若しくはそのバリアントである。いくつかの実施形態では、ｈｎＣＤ１６又はそのバリアントは、ＣＤ１６の外部ドメインにおけるＦ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐ、又は、ＣＤ６４に由来する完全若しくは部分外部ドメイン、非ＣＤ１６（非天然）の膜貫通ドメイン、非ＣＤ１６の細胞内ドメイン、非ＣＤ１６のシグナル伝達ドメイン、並びに／又は刺激ドメイン、又は、同じ又は異なる非ＣＤ１６のポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン、シグナル伝達ドメイン、及び刺激ドメイン、を含む。当該細胞又はその集団のいくつかの他の実施形態では、細胞は、表面発現外因性サイトカイン又はその受容体を更に含み、表面発現外因性サイトカイン又はその受容体は、（ａ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、及びそのそれぞれの受容体のうちの少なくとも１つを含むか、又は（ｂ）（ｉ）自己切断ペプチドを使用することによるＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαの共発現、（ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの融合タンパク質、（ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが短縮化若しくは排除されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、（ｉｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインの融合タンパク質、（ｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβの融合タンパク質、（ｖｉ）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、共通受容体γＣが、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及びＩＬ１５Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つを含み、（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つは、任意選択で、別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、ＣＡＲと共発現されるか、又は（ｃ）（ｉ）ＩＬ７とＩＬ７Ｒαとの融合タンパク質、（ｉｉ）ＩＬ７と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、共通受容体γＣが、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び（ｉｉｉ）ＩＬ７Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つを含み、（ｃ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のうちのいずれか１つは、任意選択で、別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性発現カセット内で、ＣＡＲと共発現され、任意選択で、（ｄ）一過的に発現される。
細胞がチェックポイント阻害剤の導入を含む、細胞又はその集団の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ＡＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐ１、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ、レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、及び抑制性ＫＩＲを含む１つ以上のチェックポイント分子に対するアンタゴニストであってもよい。
細胞又はその集団の様々な実施形態では、細胞は、（ｉ）セーフハーバー遺伝子座若しくは選択された遺伝子座に組み込まれた１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、又は（ｉｉ）異なるセーフハーバー遺伝子座若しくは２つ以上の選択された遺伝子座に組み込まれた２つを超える外因性ポリヌクレオチド、を含む。様々な実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、若しくはＲＵＮＸ１のうちの少なくとも１つを含み、選択された遺伝子座は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、若しくはＴＩＧＩＴのうちの１つであり、かつ／又は外因性ポリヌクレオチドの組み込みは、遺伝子座における遺伝子の発現をノックアウトする。特定の実施形態では、ＴＣＲ遺伝子座は、ＴＣＲアルファ及び／又はＴＣＲベータの定常領域（ＴＲＡＣ及び／又はＴＲＢＣ）である。
様々な実施形態では、ｉＰＳＣは、クローンｉＰＳＣ、単一細胞解離ｉＰＳＣ、ｉＰＳＣ細胞株細胞、若しくはｉＰＳＣマスタ細胞バンク（master cell bank、ＭＣＢ）細胞であるか、あるいは、派生細胞が、派生ＣＤ３４＋細胞、派生造血幹前駆細胞、派生造血多能性前駆細胞、派生Ｔ細胞前駆体、派生ＮＫ細胞前駆体、派生Ｔ系統細胞、派生ＮＫＴ系統細胞、派生ＮＫ系統細胞、派生Ｂ系統細胞、又は対応する初代Ｔ、ＮＫ、ＮＫＴ、及び／若しくはＢ細胞には存在しない１つ以上の機能的特質を有する派生エフェクター細胞を含む。
別の態様では、本出願は、本明細書に記載される細胞又はその集団を含む、組成物を提供する。更に別の態様では、本出願は、本明細書に記載の細胞又はその集団と、１つ以上の治療剤と、を含む、治療用途のための組成物を提供する。様々な実施形態では、１つ以上の治療剤は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、増殖因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血球、フィーダ細胞、フィーダ細胞成分若しくはその補充因子、１つ以上の目的のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤若しくは放射性部分、又は免疫調節薬（immunomodulatory drug、ＩＭｉＤ）を含む。治療剤がチェックポイント阻害剤である実施形態では、チェックポイント阻害剤は、（ａ）ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ＡＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、若しくは抑制性ＫＩＲを含むチェックポイント分子に対する１つ以上のアンタゴニスト、（ｂ）アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びそれらの誘導体若しくは機能的同等物のうちの１つ以上、（ｃ）アテゾリズマブ、ニボルマブ、及びペンブロリズマブのうちの少なくとも１つ、を含み得るか、又は（ｉｉ）治療剤は、ベネトクラクス、アザシチジン、及びポマリドマイドのうちの１つ以上を含む。治療剤が抗体である実施形態では、抗体は、（ａ）抗ＣＤ２０、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ５２、抗ＥＧＦＲ、抗ＣＤ１２３、抗ＧＤ２、抗ＰＤＬ１、及び／又は抗ＣＤ３８抗体、（ｂ）リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、ジヌツキシマブ、アベルマブ、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、７Ｇ３、ＣＳＬ３６２、エロツズマブ、及びそれらのヒト化若しくはＦｃ改変されたバリアント又は断片、並びにそれらの機能的同等物及びバイオシミラーのうちの１つ以上、あるいは（ｃ）ダラツムマブを含み得、派生造血細胞が、ＣＤ３８ノックアウト及び任意選択で外因性ＣＤ１６又はそのバリアントの発現を含む派生ＮＫ細胞又は派生Ｔ細胞を含む。したがって、本出願は、本明細書に記載の組成物を養子細胞療法に好適な対象に導入することによる当該組成物の治療的使用であって、対象が、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、がん、又はウイルス感染を有する、治療的使用を提供する。
更に別の態様では、本出願は、細胞又はその集団を含む、組成物であって、細胞が、キメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor、ＣＡＲ）、エンゲージャ、及び任意選択でＣＦＲ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｆｕｓｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、キメラ融合受容体）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含み、ＣＦＲが、任意選択で、エンゲージャカップリングのためのものであり、細胞が、真核細胞、動物細胞、ヒト細胞、免疫細胞、人工多能性細胞（(induced pluripotent cell、ｉＰＳＣ）、又はそれから分化した派生細胞である、組成物を提供する。様々な実施形態では、（ｉ）エンゲージャは、ＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有するか、又は（ｉｉ）エンゲージャが、ＣＡＲ又はＣＦＲと共発現される。組成物の様々な実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）Ｔ細胞特異的若しくはＮＫ細胞特異的なもの、（ｉｉ）二重特異性抗原結合ＣＡＲ、（ｉｉｉ）切り替え可能なＣＡＲ、（ｉｖ）二量体化されたＣＡＲ、（ｖ）スプリットＣＡＲ、（ｖｉ）多重鎖ＣＡＲ、（ｖｉｉ）誘導可能なＣＡＲ、（ｖｉｉｉ）別のＣＡＲと共発現されたもの、（ｉｘ）任意選択で別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、細胞表面発現外因性サイトカイン若しくはその受容体の部分若しくは完全ペプチドと共発現されたもの、（ｘｉ）任意選択で別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、チェックポイント阻害剤と共発現されたもの、並びに／又は（ｘｉ）ＡＤＧＲＥ２、Ｂ７Ｈ３、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシン－タンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－α、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＲ１、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＤＬ１、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、及び病原体抗原のうちのいずれか１つに特異的なものであり、（ｉ）～（ｘｉ）のうちのいずれか１つのＣＡＲは、任意選択でＴＲＡＣ又はＴＲＢＣ遺伝子座に挿入されている、かつ／あるいはＴＣＲの内因性プロモータによって駆動されている、かつ／あるいはＴＣＲは、ＣＡＲ挿入によってノックアウトされている。
組成物の様々な実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）Ｂ７Ｈ３に特異的な抗原認識領域、（ｉｉ）配列番号３６、３７、３８、３９、４０、若しくは４１と少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、若しくは８０％同一であるアミノ酸配列を含む結合ドメイン、（ｉｉｉ）配列番号３６のバリアントによって表されるアミノ酸配列を含む結合ドメインであって、バリアントが、配列番号３６の１、４０、４６、７９、８７、８８、８９、９７、９８、及び１１７を含む位置に１つ以上の突然変異を有する、結合ドメイン、（ｉｖ）配列番号３６のバリアントによって表されるアミノ酸配列を含む結合ドメインであって、バリアントが、配列番号３６に従いＱ１Ｅ、Ｔ４０Ａ、Ｅ４６Ｖ、Ｇ７９Ｌ、Ｋ８７Ｒ、Ｐ８８Ａ、Ｄ８９Ｅ、Ｖ９７Ａ、Ｓ９８Ｒ、及びＱ１１７Ｌを含む１つ以上の置換を有する、結合ドメイン、又は（ｖ）配列番号３６、３７、３８、３９、４０、及び４１のうちのいずれかによって表されるアミノ酸配列を含む結合ドメイン、を含む。
組成物の様々な実施形態では、（ｉ）エンゲージャは、ＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有する第１の結合ドメインを含み、第１の結合ドメインは、ＡＤＧＲＥ２、Ｂ７Ｈ３、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシン－タンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－α、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＲ１、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＤＬ１、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、及び病原体抗原のうちのいずれか１つに特異的であるか、又は（ｉｉ）エンゲージャは、ＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有する第１の結合ドメインを含み、ＣＡＲは、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、若しくはＲＯＲ１のうちのいずれか１つに特異的な結合ドメインを含むか、又は（ｉｉｉ）エンゲージャは、第１の結合ドメインの特異性とは異なり、かつＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、若しくはそれらの任意の機能的バリアントの細胞外部分に対するものである特異性を有する第２の結合ドメインを含むか、又は（ｉｖ）エンゲージャは、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間にサイトカイン若しくはそのバリアントを含み、サイトカインは、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、及びＩＬ２１のうちの少なくとも１つを含む。
組成物の様々な実施形態では、組成物の細胞は、その対応する初代細胞と比較して、（ｉ）ＣＤ３８ノックアウト、（ｉｉ）ＨＬＡ－Ｉの欠損及び／又はＨＬＡ－ＩＩの欠損、（ｉｉｉ）ＨＬＡ－Ｇ若しくは非切断性ＨＬＡ－Ｇの導入、又はＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方のノックアウト、（ｉｖ）外因性ＣＤ１６又はそのバリアント、（ｖ）キメラ抗原受容体（ＣＦＲ）、（ｖｉ）不活性化ＣＡＲ、（ｖｉｉ）細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はその受容体の部分又は完全ペプチドを含むシグナル伝達複合体、（ｖｉｉｉ）表１に列挙された遺伝子型のうちの少なくとも１つ、（ｉｘ）Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの少なくとも１つの破壊、あるいは（ｘ）ＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、抗体又はその機能的バリアント若しくは断片、チェックポイント阻害剤、及びアゴニストとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、のうちの１つ以上を更に含む。組成物の様々な実施形態では、細胞は、末梢血、臍帯血、又は任意の他のドナー組織から得られたその対応する初代細胞と比較して、（ｉ）増加した細胞傷害性、（ｉｉ）改善された持続性及び／又は生存率、（ｉｉｉ）腫瘍部位にバイスタンダー免疫細胞を遊走させる、及び／又は活性化させる、若しくは動員する増強された能力、（ｉｖ）改善された腫瘍浸透、（ｖ）腫瘍免疫抑制を低下させる増強された能力、（ｖｉ）腫瘍抗原エスケープを救済する改善された能力、（ｖｉｉ）制御されたアポトーシス、（ｖｉｉｉ）増強又は獲得されたＡＤＣＣ、並びに（ｉｘ）フラトリサイドを回避する能力、うちの１つ以上を含む治療特性を有する。
組成物の細胞が外因性ＣＤ１６又はそのバリアントを含む実施形態では、ＣＤ１６又はそのバリアントは、（ａ）高親和性の非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）、（ｂ）ＣＤ１６の外部ドメインにおけるＦ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐ、（ｃ）ＣＤ６４に由来する完全な又は部分的な外部ドメイン、（ｄ）非天然（又は非ＣＤ１６）の膜貫通ドメイン、（ｅ）非天然（又は非ＣＤ１６）の細胞内ドメイン、（ｆ）非天然（又は非ＣＤ１６）のシグナル伝達ドメイン、（ｇ）非天然の刺激ドメイン、並びに（ｈ）ＣＤ１６に由来せず、同じ若しくは異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン、シグナル伝達ドメイン、及び刺激ドメイン、のうちの少なくとも１つを含んでもよい。
組成物の細胞がＣＦＲを含む実施形態では、（ｉ）ＣＦＲは、膜貫通ドメインに融合した外部ドメインを含み得、膜貫通ドメインは、内部ドメインに作動可能に接続されており、外部ドメイン、膜貫通ドメイン及び内部ドメインは、いずれの小胞体（ＥＲ）保持シグナルもエンドサイトーシスシグナルも含まない。いくつかの実施形態では、（ｉ）ＣＦＲの外部ドメインは、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、それらの任意の機能的バリアント、及びそれらの組み合わせ又はキメラのうちの少なくとも１つを含むシグナル伝達タンパク質の細胞外部分の全長又は部分長を含むか、（ｉｉ）ＣＦＲの外部ドメインが、選択されたアゴニストに結合するとシグナル伝達を開始するか、（ｉｉｉ）ＣＦＲの内部ドメインは、ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、又はＮＫＧ２Ｄポリペプチドの少なくとも全長又は一部分を含む細胞傷害性ドメインを含み、任意選択で、内部ドメインは、（ａ）ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ－４、若しくはＮＫＧ２Ｄポリペプチド、若しくはそれらの任意の組み合わせの全長若しくは一部分を含む共刺激ドメイン、（ｂ）ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、若しくはそれらの組み合わせの全長若しくは一部分を含む共刺激ドメイン、（ｃ）ＩＬ７Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、ＩＬ１８Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ２３Ｒ、若しくはそれらの組み合わせを含むサイトカイン受容体の内部ドメインの全長若しくは一部分を含む持続シグナル伝達ドメイン、及び／又は（ｄ）受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＥＧＦＲ、若しくはＦＡＳ受容体の完全な若しくは部分的な細胞内部分、のうちの１つ以上を更に含むか、あるいは（ｉｖ）ＣＦＲは、別個の構築物内で、又はバイシストロン性発現カセット内で、エンゲージャと共発現され、任意選択で、エンゲージャは、ＣＦＲの外部ドメインに対する結合特異性を有する。
いくつかの実施形態では、選択されたアゴニストは、（ｉ）抗体又はその機能的バリアント若しくは断片、（ｉｉ）アゴニストリガンド、あるいは（ｉｉｉ）エンゲージャであり、選択されたアゴニストは、（ａ）組成物の細胞に含まれるポリヌクレオチドによってコードされるか、又は組成物に含まれてもよく、（ｂ）Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、又はＲＯＲ１を含む少なくとも１つの腫瘍抗原に特異的である第１の結合ドメインを少なくとも含んでもよく、任意選択で、（ｃ）（１）組成物の細胞、又は（２）バイスタンダーエフェクター細胞、の細胞表面タンパク質に特異的な第２の結合ドメインを含んでもよく、細胞表面タンパク質が、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、又はそれらの任意の機能的バリアントの細胞外部分を含む。
組成物の細胞が不活性化ＣＡＲを含む実施形態では、不活性化ＣＡＲは、（ｉ）活性化されたレシピエント免疫細胞において上方制御された表面タンパク質を標的とし得るか、又は（ｉｉ）ＣＤ３８－ＣＡＲ、ＣＤ２５－ＣＡＲ、ＣＤ６９－ＣＡＲ、ＣＤ４４－ＣＡＲ、４－１ＢＢ－ＣＡＲ、ＯＸ４０－ＣＡＲ、及びＣＤ４０Ｌ－ＣＡＲのうちの少なくとも１つを含み得る。
組成物の細胞が細胞表面発現外因性サイトカイン又はその受容体を含む実施形態では、細胞表面発現外因性サイトカイン又はその受容体は、（ａ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、及びそのそれぞれの受容体のうちの少なくとも１つを含み得るか、又は（ｂ）（ｉ）自己切断ペプチドを使用することによるＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαの共発現、（ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの融合タンパク質、（ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが短縮化若しくは排除されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、（ｉｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインの融合タンパク質、（ｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβの融合タンパク質、（ｖｉ）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、共通受容体γＣが、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び（ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つを含み得、（ｂ）（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つは、任意選択で、別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、ＣＡＲと共発現されるか、又は（ｃ）（ｉ）ＩＬ７とＩＬ７Ｒαとの融合タンパク質、（ｉｉ）ＩＬ７と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、共通受容体γＣが、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び（ｉｉｉ）ＩＬ７Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つを含み得、（ｃ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のうちのいずれか１つは、任意選択で、別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、ＣＡＲと共発現され、任意選択で、（ｄ）一過的に発現される。
組成物の細胞がチェックポイント阻害剤を含む実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ＡＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐ１、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、及び抑制性ＫＩＲを含む１つ以上のチェックポイント分子に対するアンタゴニストであってもよい。
いくつかの実施形態では、組成物の細胞は、（ｉ）セーフハーバー遺伝子座若しくは選択された遺伝子座に組み込まれた１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、又は（ｉｉ）異なるセーフハーバー遺伝子座若しくは２つ以上の選択された遺伝子座に組み込まれた２つを超える外因性ポリヌクレオチド、を含んでもよい。いくつかの実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、若しくはＲＵＮＸ１のうちの少なくとも１つを含み、選択された遺伝子座は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、若しくはＴＩＧＩＴのうちの１つであり、かつ／又は外因性ポリヌクレオチドの組み込みは、遺伝子座における遺伝子の発現をノックアウトする。特定の実施形態では、ＴＣＲ遺伝子座は、ＴＣＲアルファ及び／又はＴＣＲベータの定常領域（ＴＲＡＣ及び／又はＴＲＢＣ）であってもよい。
組成物の様々な実施形態では、派生細胞は、派生ＣＤ３４＋細胞、派生造血幹前駆細胞、派生造血多能性前駆細胞、派生Ｔ細胞前駆体、派生ＮＫ細胞前駆体、派生Ｔ系統細胞、派生ＮＫＴ系統細胞、派生ＮＫ系統細胞、派生Ｂ系統細胞、又は対応する初代Ｔ、ＮＫ、ＮＫＴ、及び／若しくはＢ細胞には存在しない１つ以上の機能的特質を有する派生エフェクター細胞を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上の治療剤を更に含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の治療剤は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、抗体又はその機能的バリアント若しくは断片、マイトジェン、増殖因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血球、フィーダ細胞、フィーダ細胞成分又はその補充因子、１つ以上の目的のポリ核酸を含むベクター、化学療法剤又は放射性部分、あるいは免疫調節薬（ＩＭｉＤ）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の治療剤は、ベネトクラクス、アザシチジン、及びポマリドマイドのうちの１つ以上を含む。治療剤がチェックポイント阻害剤を含むいくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、（ｉ）ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ＡＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、若しくは抑制性ＫＩＲを含む１つ以上のアンタゴニストチェックポイント分子、（ｉｉ）アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びそれらの誘導体若しくは機能的同等物のうちの１つ以上、又は（ｉｉｉ）アテゾリズマブ、ニボルマブ、及びペンブロリズマブのうちの少なくとも１つ、を含む。治療剤が抗体又はその機能的バリアント若しくは断片を含む実施形態では、抗体又はその機能的バリアント若しくは断片は、（ａ）抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ５２、抗ＥＧＦＲ、抗ＣＤ１２３、抗ＧＤ２、抗ＰＤＬ１、及び／又は抗ＣＤ３８抗体、（ｂ）リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、オクレリズマブ、イノツズマブ、モキセツモマブ、エプラツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、ジヌツキシマブ、アベルマブ、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、７Ｇ３、ＣＳＬ３６２、エロツズマブ、及びそれらのヒト化若しくはＦｃ改変されたバリアント又は断片、並びにそれらの機能的同等物及びバイオシミラーのうちの１つ以上、あるいは（ｃ）ダラツムマブを含み得、派生エフェクター細胞は、ＣＤ３８ノックアウトを含み、任意選択でＣＤ１６又はそのバリアントを発現する。
別の態様では、本発明は、本明細書において提供される組成物を養子細胞療法に好適な対象に導入することによる組成物の治療的使用であって、対象が、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、がん、又はウイルス感染を有する、治療的使用を提供する。
更に別の態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１のポリヌクレオチドと、エンゲージャ及びＣＦＲの一方又は両方をコードする１つ以上の追加のポリヌクレオチドと、を含む派生エフェクター細胞を製造する方法であって、エンゲージャが、ＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有し、方法が、遺伝子操作されたｉＰＳＣを分化させることを含み、ｉＰＳＣが、第１のポリヌクレオチド及び１つ以上の追加のポリヌクレオチド、並びに任意選択で、その対応する初代細胞と比較して、（ｉ）ＣＤ３８ノックアウト、（ｉｉ）ＨＬＡ－Ｉの欠損及び／又はＨＬＡ－ＩＩの欠損、（ｉｉｉ）ＨＬＡ－Ｇ若しくは非切断性ＨＬＡ－Ｇの導入、又はＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方のノックアウト、（ｉｖ）外因性ＣＤ１６又はそのバリアント、（ｖ）キメラ抗原受容体（ＣＦＲ）、（ｖｉ）不活性化ＣＡＲ、（ｖｉｉ）細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はその受容体の部分若しくは完全ペプチドを含むシグナル伝達複合体、（ｖｉｉｉ）表１に列挙された遺伝子型のうちの少なくとも１つ、（ｉｘ）Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの少なくとも１つの破壊、あるいは（ｘ）ＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、抗体又はその機能的バリアント若しくは断片、チェックポイント阻害剤、及びアゴニストとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、を含む１つ以上のゲノム編集を含む、方法を提供する。
方法のいくつかの実施形態では、（ｉ）エンゲージャは、ＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有する第１の結合ドメインを含み、結合ドメインは、ＡＤＧＲＥ２、Ｂ７Ｈ３、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシン－タンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－α、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＲ１、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＤＬ１、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、及び病原体抗原のうちのいずれか１つに特異的であるか、又は（ｉｉ）エンゲージャは、ＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有する第１の結合ドメインを含み、結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、若しくはＲＯＲ１のうちのいずれか１つに特異的であるか、又は（ｉｉｉ）エンゲージャは、第１の結合ドメインの特異性とは異なり、かつＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、若しくはそれらの任意の機能的バリアントの細胞外部分に対するものである特異性を有する第２の結合ドメインを含むか、又は（ｉｖ）エンゲージャは、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間にサイトカイン若しくはそのバリアントを含み、サイトカインは、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、及びＩＬ２１のうちの少なくとも１つを含む。方法のいくつかの実施形態では、派生エフェクター細胞は、派生ＣＤ３４＋細胞、派生造血幹前駆細胞、派生造血多能性前駆細胞、派生Ｔ細胞前駆体、派生ＮＫ細胞前駆体、派生Ｔ系統細胞、派生ＮＫＴ系統細胞、派生ＮＫ系統細胞、派生Ｂ系統細胞、又は対応する初代Ｔ、ＮＫ、ＮＫＴ、及び／若しくはＢ細胞には存在しない１つ以上の機能的特質を有する派生エフェクター細胞を含む。
方法のいくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）Ｔ細胞特異的若しくはＮＫ細胞特異的なもの、（ｉｉ）二重特異性抗原結合ＣＡＲ、（ｉｉｉ）切り替え可能なＣＡＲ、（ｉｖ）二量体化されたＣＡＲ、（ｖ）スプリットＣＡＲ、（ｖｉ）多重鎖ＣＡＲ、（ｖｉｉ）誘導可能なＣＡＲ、（ｖｉｉｉ）別のＣＡＲと共発現されたもの、（ｉｘ）任意選択で別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、細胞表面発現外因性サイトカイン及び／若しくはその受容体の部分若しくは完全ペプチドと共発現されたもの、（ｘ）任意選択で別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、チェックポイント阻害剤と共発現されたもの、並びに／又は（ｘｉ）ＡＤＧＲＥ２、Ｂ７Ｈ３、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシン－タンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－α、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＲ１、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＤＬ１、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、及び病原体抗原のうちのいずれか１つに特異的なものであり、（ｉ）～（ｘｉ）のうちのいずれか１つのＣＡＲが、任意選択でＴＣＲ遺伝子座に挿入されている、及び／又はＴＣＲの内因性プロモータによって駆動されている、かつ／あるいはＴＣＲが、ＣＡＲ挿入によってノックアウトされている。方法の様々な実施形態では、ＣＡＲは、Ｂ７Ｈ３に特異的な抗原認識領域を含む。
ｉＰＳＣが外因性ＣＤ１６又はそのバリアントに対するゲノム編集を含む、方法の実施形態では、ＣＤ１６又はそのバリアントは、（ａ）高親和性の非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）、（ｂ）ＣＤ１６の外部ドメインにおけるＦ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐ、（ｃ）ＣＤ６４に由来する完全な又は部分的な外部ドメイン、（ｄ）非天然（又は非ＣＤ１６）の膜貫通ドメイン、（ｅ）非天然（又は非ＣＤ１６）の細胞内ドメイン、（ｆ）非天然（又は非ＣＤ１６）のシグナル伝達ドメイン、（ｇ）非天然の刺激ドメイン、並びに（ｈ）ＣＤ１６に由来せず、同じ若しくは異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン、シグナル伝達ドメイン、及び刺激ドメイン、のうちの少なくとも１つを含んでもよい。
ｉＰＳＣがＣＦＲに対するゲノム編集を含む、方法の実施形態では、ＣＦＲは、膜貫通ドメインに融合した外部ドメインを含み得、膜貫通ドメインは、内部ドメインに作動可能に接続されており、外部ドメイン、膜貫通ドメイン及び内部ドメインは、いずれの小胞体（ＥＲ）保持シグナルもエンドサイトーシスシグナルも含まない。いくつかの実施形態では、（ｉ）ＣＦＲの外部ドメインは、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、それらの任意の機能的バリアント、及びそれらの組み合わせ又はキメラのうちの少なくとも１つを含むシグナル伝達タンパク質の細胞外部分の全長又は部分長を含むか、（ｉｉ）ＣＦＲの外部ドメインが、選択されたアゴニストに結合するとシグナル伝達を開始するか、あるいは（ｉｉｉ）ＣＦＲの内部ドメインは、ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、又はＮＫＧ２Ｄポリペプチドの少なくとも全長又は一部分を含む細胞傷害性ドメインを含み、任意選択で、内部ドメインは、（ａ）ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ－４、若しくはＮＫＧ２Ｄポリペプチド、若しくはそれらの任意の組み合わせの全長若しくは一部分を含む共刺激ドメイン、（ｂ）ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、若しくはそれらの組み合わせの全長若しくは一部分を含む共刺激ドメイン、（ｃ）ＩＬ７Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、ＩＬ１８Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ２３Ｒ、若しくはそれらの組み合わせを含むサイトカイン受容体の内部ドメインの全長若しくは一部分を含む持続シグナル伝達ドメイン、及び／又は（ｄ）受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＥＧＦＲ、若しくはＦＡＳ受容体の完全な若しくは部分的な細胞内部分、のうちの１つ以上を更に含む。いくつかの実施形態では、選択されたアゴニストは、（ｉ）抗体又はその機能的バリアント若しくは断片、あるいは（ｉｉ）エンゲージャであり得、（ａ）組成物の細胞に含まれるポリヌクレオチドによってコードされ得るか、若しくは組成物に含まれ、（ｂ）Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、若しくはＲＯＲ１を含む少なくとも１つの腫瘍抗原に特異的である第１の結合ドメインを少なくとも含み得、任意選択で、（ｃ）（１）組成物の細胞、又は（２）バイスタンダーエフェクター細胞、の細胞表面タンパク質に特異的な第２の結合ドメインを含み得、細胞表面タンパク質が、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、又はそれらの任意の機能的バリアントの細胞外部分を含む。
ｉＰＳＣが不活性化ＣＡＲに対するゲノム編集を含む、方法の実施形態では、不活性化ＣＡＲは、（ｉ）活性化されたレシピエント免疫細胞において上方制御された表面タンパク質を標的とし得るか、又は（ｉｉ）ＣＤ３８－ＣＡＲ、ＣＤ２５－ＣＡＲ、ＣＤ６９－ＣＡＲ、ＣＤ４４－ＣＡＲ、４－１ＢＢ－ＣＡＲ、ＯＸ４０－ＣＡＲ、及びＣＤ４０Ｌ－ＣＡＲのうちの少なくとも１つを含み得る。ｉＰＳＣがチェックポイント阻害剤の導入された又は増加された発現に対するゲノム編集を含む、方法の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ＡＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐ１、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、及び抑制性ＫＩＲを含む１つ以上のチェックポイント分子に対するアンタゴニストであってもよい。
方法のいくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、（ｉ）セーフハーバー遺伝子座若しくは選択された遺伝子座に組み込まれた１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、又は（ｉｉ）異なるセーフハーバー遺伝子座若しくは２つ以上の選択された遺伝子座に組み込まれた２つを超える外因性ポリヌクレオチド、を含んでもよい。いくつかの実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、若しくはＲＵＮＸ１のうちの少なくとも１つを含み、選択された遺伝子座は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、若しくはＴＩＧＩＴのうちの１つであり、かつ／又は外因性ポリヌクレオチドの組み込みは、遺伝子座における遺伝子の発現をノックアウトする。特定の実施形態では、ＴＣＲ遺伝子座は、ＴＣＲアルファ及び／又はＴＣＲベータの定常領域（ＴＲＡＣ及び／又はＴＲＢＣ）であってもよい。
ｉＰＳＣが、細胞表面発現外因性サイトカイン又はその受容体の部分又は完全ペプチドを含むシグナル伝達複合体に対するゲノム編集を含む、方法の実施形態では、細胞表面発現外因性サイトカイン又はその受容体は、（ａ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、及びそのそれぞれの受容体のうちの少なくとも１つを含み得るか、又は（ｂ）（ｉ）自己切断ペプチドを使用することによるＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαの共発現、（ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの融合タンパク質、（ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが短縮化若しくは排除されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、（ｉｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインの融合タンパク質、（ｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβの融合タンパク質、（ｖｉ）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、共通受容体γＣが、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び（ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つを含み得、（ｂ）（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つは、任意選択で、別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、ＣＡＲと共発現されるか、又は（ｃ）（ｉ）ＩＬ７とＩＬ７Ｒαとの融合タンパク質、（ｉｉ）ＩＬ７と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、共通受容体γＣが、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び（ｉｉｉ）ＩＬ７Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つを含み得、（ｃ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のうちのいずれか１つは、任意選択で、別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、ＣＡＲと共発現され、任意選択で、（ｄ）一過的に発現される。
方法のいくつかの実施形態では、方法は、ＣＡＲと、エンゲージャ及びＣＦＲの一方又は両方と、をコードするポリヌクレオチドをノックインするために、かつ、任意選択で、（ｉ）ＣＤ３８をノックアウトするために、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ及び／又はＣＩＩＴＡをノックアウトするために、（ｉｉｉ）ＣＤ５８及びＣＤ５４の一方又は両方をノックアウトするために、並びに／あるいは（ｉｖ）ＨＬＡ－Ｇ若しくは非切断性ＨＬＡ－Ｇ、高親和性の非切断性ＣＤ１６若しくはそのバリアント、及び／又は細胞表面発現の外因性サイトカイン及び／若しくはその受容体の部分若しくは完全ペプチドの発現を導入するために、クローンｉＰＳＣをゲノム操作することを更に含み得る。いくつかの実施形態では、ゲノム操作は、標的化された編集を含む。いくつかの実施形態では、標的化された編集は、欠失、挿入、又はインデルを含み、標的化された編集は、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ホーミングヌクレアーゼ、相同組換え、又はこれらの方法の任意の他の機能的バリエーションによって行われる。
更に別の態様では、本発明は、腫瘍細胞の制御及びクリアランスを改善する方法であって、それを必要とする対象に本明細書において提供される組成物を投与することを含み、腫瘍が固形腫瘍であるか、又は腫瘍が異種である、方法を提供する。いくつかの実施形態では、組成物の細胞は、抗体又はその機能的バリアント若しくは断片、あるいはエンゲージャを発現する。他の実施形態では、組成物は、エンゲージャを含む。いくつかの実施形態では、（ｉ）エンゲージャは、ＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有する第１の結合ドメインを含み、結合ドメインは、ＡＤＧＲＥ２、Ｂ７Ｈ３、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシン－タンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－α、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＲ１、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＤＬ１、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、及び病原体抗原のうちのいずれか１つに特異的であるか、又は（ｉｉ）エンゲージャは、ＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有する第１の結合ドメインを含み、結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、若しくはＲＯＲ１のうちのいずれか１つに特異的であるか、又は（ｉｉｉ）エンゲージャは、第１の結合ドメインの特異性とは異なり、かつＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、若しくはそれらの任意の機能的バリアントの細胞外部分に対するものである特異性を有する第２の結合ドメインを含むか、又は（ｉｖ）エンゲージャは、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間にサイトカイン若しくはそのバリアントを含み、サイトカインは、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、及びＩＬ２１のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、組成物の細胞は、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞であり、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、（ｉ）ＣＤ３８ノックアウト、（ｉｉ）外因性ＣＤ１６又はそのバリアント、（ｉｉｉ）ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩの欠損、（ｉｖ）ＨＬＡ－Ｇ若しくは非切断性ＨＬＡ－Ｇの導入、又はＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方のノックアウト、（ｖ）ＣＦＲの導入、（ｖｉ）細胞表面発現外因性サイトカイン又はその受容体の部分又は完全ペプチドを含むシグナル伝達複合体、（ｖｉｉ）不活性化ＣＡＲ、（ｖｉｉｉ）Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの少なくとも１つの破壊、並びに／あるいは（ｉｘ）ＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、抗体又はその機能的バリアント若しくは断片、チェックポイント阻害剤、及びアゴニストとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、のうちの１つ以上を更に含む。いくつかの実施形態では、組成物の細胞の投与は、それらの対応する初代細胞の投与と比較して、（ｉ）増加された細胞傷害性、（ｉｉ）改善された持続性及び／又は生存率、（ｉｉｉ）腫瘍部位にバイスタンダー免疫細胞を遊走させる、及び／又は活性化させる、若しくは動員する増強された能力、（ｉｖ）改善された腫瘍浸透、（ｖ）腫瘍免疫抑制を低下させる増強された能力、（ｖｉ）腫瘍抗原エスケープを救済する改善された能力、（ｖｉｉ）制御されたアポトーシス、（ｖｉｉｉ）増強又は獲得されたＡＤＣＣ、並びに（ｉｘ）フラトリサイドを回避する能力、のうちの１つ以上をもたらす。
本出願の別の態様は、結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、結合ドメインが、（ｉ）配列番号３６、３７、３８、３９、４０、若しくは４１と少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、若しくは８０％同一であるアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号３６のバリアントによって表されるアミノ酸配列であって、バリアントが、配列番号３６の１、４０、４６、７９、８７、８８、８９、９７、９８、及び１１７を含む位置に１つ以上の突然変異を有する、アミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号３６のバリアントによって表されるアミノ酸配列であって、バリアントが、配列番号３６に従いＱ１Ｅ、Ｔ４０Ａ、Ｅ４６Ｖ、Ｇ７９Ｌ、Ｋ８７Ｒ、Ｐ８８Ａ、Ｄ８９Ｅ、Ｖ９７Ａ、Ｓ９８Ｒ、及びＱ１１７Ｌを含む１つ以上の置換を有する、アミノ酸配列、又は（ｉｖ）配列番号３６、３７、３８、３９、４０、及び４１のうちのいずれかによって表されるアミノ酸配列を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。ＣＡＲの様々な実施形態では、ＣＡＲは、８０個以下のアミノ酸を含むか、又は８０～１８０個のアミノ酸を含む、ヒンジペプチドを更に含む。様々な実施形態では、ＣＡＲは、以下の特徴：（ｉ）Ｔ細胞特異的であること、（ｉｉ）ＮＫ細胞特異的であること、（ｉｉｉ）腫瘍細胞表面Ｂ７Ｈ３に結合すること、（ｉｖ）Ｂ７Ｈ３抗原の腫瘍細胞表面脱落を減少させること、又は（ｖ）腫瘍細胞表面Ｂ７Ｈ３密度を増加させること、のうちの少なくとも１つを有する。ＣＡＲの別の実施形態では、ＣＡＲがエフェクター細胞において発現される場合、当該エフェクター細胞は、以下の特徴：（ｉ）キメラ受容体を欠く、対応するエフェクター細胞と比較して、エフェクター細胞活性化及び殺傷機能を増強すること、並びに（ｉｉ）キメラ受容体を欠く、対応する細胞と比較して、インビボでの腫瘍進行の制御、腫瘍細胞負荷の低減、腫瘍クリアランス、及び／又は腫瘍を保有する対象の生存率の改善が可能であること、のうちの１つ以上を有する。
本出願の更に別の態様は、本明細書に記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む派生細胞を製造する方法であって、ｉＰＳＣを分化させて派生細胞を得ることを含み、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドが、分化前にｉＰＳＣに導入されるか、又はｉＰＳＣ分化後に派生細胞に導入される、方法を提供する。
本明細書で提供される組成物及び方法の様々な目的及び利点は、例示及び例として本発明の特定の実施形態が示される添付の図面と併せて以下の説明から明らかになるであろう。
Ｔ細胞エンゲージャが、様々な腫瘍モデルにおいてＣＡＲ－Ｔ細胞有効性を改善することを実証する。図１Ａは、ＳＫＯＶ３、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｊｉｍｔ１、及びＫ５６２腫瘍細胞株における抗原及びＥｐＣＡＭ発現のプロファイリングを示す。図１Ｂは、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの存在下でＳＫＯＶ３腫瘍細胞と共培養したＣＤ８＋Ｔ細胞による細胞溶解の用量依存的増加を示す。図１Ｃは、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの存在下及び不在下で抗原特異的ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞と共培養したＳＫＯＶ３（抗原高）、ＪＩＭＴ１（抗原＋）、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１（抗原低）腫瘍細胞の特異的細胞溶解結果を示す。図１Ｄは、細胞内サイトカイン染色による、ＢｉＴＥの存在下又は不在下でのＣＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮγ産生を示し、図１Ｅは、ＥＬＩＳＡを用いた、ＢｉＴＥの存在下又は不在下でのエフェクター細胞ＩＦＮγ産生の比較を示す（Ｐ＜０．００１）。 Ｔ細胞エンゲージャが、様々な腫瘍モデルにおいてＣＡＲ－Ｔ細胞有効性を改善することを実証する。図１Ａは、ＳＫＯＶ３、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｊｉｍｔ１、及びＫ５６２腫瘍細胞株における抗原及びＥｐＣＡＭ発現のプロファイリングを示す。図１Ｂは、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの存在下でＳＫＯＶ３腫瘍細胞と共培養したＣＤ８＋Ｔ細胞による細胞溶解の用量依存的増加を示す。図１Ｃは、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの存在下及び不在下で抗原特異的ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞と共培養したＳＫＯＶ３（抗原高）、ＪＩＭＴ１（抗原＋）、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１（抗原低）腫瘍細胞の特異的細胞溶解結果を示す。図１Ｄは、細胞内サイトカイン染色による、ＢｉＴＥの存在下又は不在下でのＣＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮγ産生を示し、図１Ｅは、ＥＬＩＳＡを用いた、ＢｉＴＥの存在下又は不在下でのエフェクター細胞ＩＦＮγ産生の比較を示す（Ｐ＜０．００１）。 Ｔ細胞エンゲージャが、様々な腫瘍モデルにおいてＣＡＲ－Ｔ細胞有効性を改善することを実証する。図１Ａは、ＳＫＯＶ３、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｊｉｍｔ１、及びＫ５６２腫瘍細胞株における抗原及びＥｐＣＡＭ発現のプロファイリングを示す。図１Ｂは、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの存在下でＳＫＯＶ３腫瘍細胞と共培養したＣＤ８＋Ｔ細胞による細胞溶解の用量依存的増加を示す。図１Ｃは、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの存在下及び不在下で抗原特異的ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞と共培養したＳＫＯＶ３（抗原高）、ＪＩＭＴ１（抗原＋）、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１（抗原低）腫瘍細胞の特異的細胞溶解結果を示す。図１Ｄは、細胞内サイトカイン染色による、ＢｉＴＥの存在下又は不在下でのＣＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮγ産生を示し、図１Ｅは、ＥＬＩＳＡを用いた、ＢｉＴＥの存在下又は不在下でのエフェクター細胞ＩＦＮγ産生の比較を示す（Ｐ＜０．００１）。 Ｔ細胞エンゲージャが、様々な腫瘍モデルにおいてＣＡＲ－Ｔ細胞有効性を改善することを実証する。図１Ａは、ＳＫＯＶ３、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｊｉｍｔ１、及びＫ５６２腫瘍細胞株における抗原及びＥｐＣＡＭ発現のプロファイリングを示す。図１Ｂは、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの存在下でＳＫＯＶ３腫瘍細胞と共培養したＣＤ８＋Ｔ細胞による細胞溶解の用量依存的増加を示す。図１Ｃは、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの存在下及び不在下で抗原特異的ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞と共培養したＳＫＯＶ３（抗原高）、ＪＩＭＴ１（抗原＋）、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１（抗原低）腫瘍細胞の特異的細胞溶解結果を示す。図１Ｄは、細胞内サイトカイン染色による、ＢｉＴＥの存在下又は不在下でのＣＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮγ産生を示し、図１Ｅは、ＥＬＩＳＡを用いた、ＢｉＴＥの存在下又は不在下でのエフェクター細胞ＩＦＮγ産生の比較を示す（Ｐ＜０．００１）。 Ｔ細胞エンゲージャが、様々な腫瘍モデルにおいてＣＡＲ－Ｔ細胞有効性を改善することを実証する。図１Ａは、ＳＫＯＶ３、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｊｉｍｔ１、及びＫ５６２腫瘍細胞株における抗原及びＥｐＣＡＭ発現のプロファイリングを示す。図１Ｂは、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの存在下でＳＫＯＶ３腫瘍細胞と共培養したＣＤ８＋Ｔ細胞による細胞溶解の用量依存的増加を示す。図１Ｃは、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの存在下及び不在下で抗原特異的ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞と共培養したＳＫＯＶ３（抗原高）、ＪＩＭＴ１（抗原＋）、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１（抗原低）腫瘍細胞の特異的細胞溶解結果を示す。図１Ｄは、細胞内サイトカイン染色による、ＢｉＴＥの存在下又は不在下でのＣＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮγ産生を示し、図１Ｅは、ＥＬＩＳＡを用いた、ＢｉＴＥの存在下又は不在下でのエフェクター細胞ＩＦＮγ産生の比較を示す（Ｐ＜０．００１）。 図２のＡ～Ｃは、Ｔ細胞エンゲージャが３Ｄ腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖制御を増強することを示す。Ａは、ＣＡＲ－Ｔ細胞と共培養したＳＫＯＶ３腫瘍スフェロイドを使用して、ＢｉＴＥの存在下でのＣＡＲ－Ｔ細胞の改善された腫瘍浸透を示す。 図２のＡ～Ｃは、Ｔ細胞エンゲージャが３Ｄ腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖制御を増強することを示す。Ｂは、ＢｉＴＥの存在下で示されたＥＴ比でエフェクター細胞と共培養したＳＫＯＶ３腫瘍スフェロイドを使用して腫瘍クリアランスの増加を示す（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．０１）。Ｃは、ＢｉＴＥの存在下で示されたＥＴ比でエフェクター細胞と共培養したＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍スフェロイドを使用して腫瘍クリアランスの増加を示す（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．０１）。 多抗原標的化が異種腫瘍培養物の制御を増強することを示す。図３Ａは、Ｉｎｃｕｃｙｔｅアッセイによりモニターされた、ＢｉＴＥを含む又は含まない抗原特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞による２つの腫瘍型の標準又は個々の培養物の腫瘍細胞の細胞溶解を示す。図３Ｂは、ＢｉＴＥを含む又は含まない抗原特異的ＣＡＲ－Ｔによる２つの腫瘍型の混合腫瘍細胞培養の腫瘍細胞溶解を示す。 多抗原標的化が異種腫瘍培養物の制御を増強することを示す。図３Ａは、Ｉｎｃｕｃｙｔｅアッセイによりモニターされた、ＢｉＴＥを含む又は含まない抗原特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞による２つの腫瘍型の標準又は個々の培養物の腫瘍細胞の細胞溶解を示す。図３Ｂは、ＢｉＴＥを含む又は含まない抗原特異的ＣＡＲ－Ｔによる２つの腫瘍型の混合腫瘍細胞培養の腫瘍細胞溶解を示す。 Ｂ７Ｈ３ ＴｒｉＫＥが、外因性ＩＬ－１５培養条件と比較して、ＮＫ細胞機能（図４Ａ）及び増殖（図４Ｂ）を増加させることを示す。 Ｂ７Ｈ３ ＴｒｉＫＥが、外因性ＩＬ－１５培養条件と比較して、ＮＫ細胞機能（図４Ａ）及び増殖（図４Ｂ）を増加させることを示す。 操作されたｉＮＫ細胞が、腫瘍スフェロイドを貫通し、かつＢ７Ｈ３ ＴｒｉＫＥの存在下でＢ７Ｈ３発現前立腺がん細胞をより効果的に標的化することを示す。 操作されたｉＮＫ細胞及びＢ７Ｈ３ ＴｒｉＫＥの組み合わせが相乗作用して、卵巣がん細胞を標的化し、かつ排除することを示す。 ＢｉＴＥを分泌する操作されたｉＰＳＣ由来ＣＡＲ－ｉＴ細胞が、同種異系バイスタンダーＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化させ、協調して腫瘍クリアランスを制御することを示す。図７Ａは、ＣＡＲ及びＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥを発現するｉＰＳＣ由来エフェクター細胞を示す。図７Ｂは、ＢｉＴＥの添加を伴う又は伴わない初代ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びバイスタンダーＴ細胞を伴う又は伴わないＢｉＴＥを発現するＣＡＲ－ｉＴ細胞によるＳＫＯＶ３スフェロイドのクリアランスを示す。 ＢｉＴＥを分泌する操作されたｉＰＳＣ由来ＣＡＲ－ｉＴ細胞が、同種異系バイスタンダーＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化させ、協調して腫瘍クリアランスを制御することを示す。図７Ａは、ＣＡＲ及びＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥを発現するｉＰＳＣ由来エフェクター細胞を示す。図７Ｂは、ＢｉＴＥの添加を伴う又は伴わない初代ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びバイスタンダーＴ細胞を伴う又は伴わないＢｉＴＥを発現するＣＡＲ－ｉＴ細胞によるＳＫＯＶ３スフェロイドのクリアランスを示す。 Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲ ｉＰＳＣ及びエフェクター細胞を生成するための例示的なＣＡＲ構築物を示し、エフェクター細胞における細胞表面ｃａｍＢ７Ｈ３－ＣＡＲ発現を、Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲ発現を伴わない対照細胞と比較して示す。 Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲエフェクター細胞が、対照細胞と比較して、複数の固形腫瘍株にわたって有効な機能的応答（図９Ａ）及び持続性の抗腫瘍細胞傷害性（図９Ｂ）を実証することを示す。 Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲエフェクター細胞が、対照細胞と比較して、複数の固形腫瘍株にわたって有効な機能的応答（図９Ａ）及び持続性の抗腫瘍細胞傷害性（図９Ｂ）を実証することを示す。 広範な腫瘍細胞株パネルにおける抗原特異的刺激時のＢ７Ｈ３－ＣＡＲ Ｔ細胞活性化を示す。 ＰＣ３前立腺がん細胞に対する細胞傷害性アッセイを使用して、Ｂ７Ｈ３標的化のための最適な立体配置を決定するための３つの例示的なＢ７Ｈ３－ＣＡＲモチーフの評価を示す。 ３つの例示的なＣＡＲモチーフを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞が、広範な腫瘍細胞株に対して反応性であることを示す。 ｃａｍＢ７Ｈ３－ＣＡＲを形質導入した、操作されたｉＰＳＣ細胞の表現型プロファイリングを示す。 Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲ＋ｉＮＫ細胞のフェオノタイプ（pheonotype）及び機能プロファイリングを示す。図１４Ａは、均質なｉＰＳＣ由来ｉＮＫ細胞集団及び表面ｃａｍＢ７Ｈ３－ＣＡＲ発現を示す。図１４Ｂは、インビトロでの抗原特異的刺激下でのＢ７Ｈ３－ＣＡＲ＋ｉＮＫによる抗原特異的サイトカイン放出及び脱顆粒を実証する。図１４Ｃは、Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲ＋ｉＮＫ細胞が抗原用量依存的に細胞表面Ｂ７Ｈ３に応答することを示す。 Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲ＋ｉＮＫ細胞のフェオノタイプ（pheonotype）及び機能プロファイリングを示す。図１４Ａは、均質なｉＰＳＣ由来ｉＮＫ細胞集団及び表面ｃａｍＢ７Ｈ３－ＣＡＲ発現を示す。図１４Ｂは、インビトロでの抗原特異的刺激下でのＢ７Ｈ３－ＣＡＲ＋ｉＮＫによる抗原特異的サイトカイン放出及び脱顆粒を実証する。図１４Ｃは、Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲ＋ｉＮＫ細胞が抗原用量依存的に細胞表面Ｂ７Ｈ３に応答することを示す。 Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲ＋ｉＮＫ細胞のフェオノタイプ（pheonotype）及び機能プロファイリングを示す。図１４Ａは、均質なｉＰＳＣ由来ｉＮＫ細胞集団及び表面ｃａｍＢ７Ｈ３－ＣＡＲ発現を示す。図１４Ｂは、インビトロでの抗原特異的刺激下でのＢ７Ｈ３－ＣＡＲ＋ｉＮＫによる抗原特異的サイトカイン放出及び脱顆粒を実証する。図１４Ｃは、Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲ＋ｉＮＫ細胞が抗原用量依存的に細胞表面Ｂ７Ｈ３に応答することを示す。 異なるレベルで発現されるＣＡＲ抗原を有する異種腫瘍細胞のｉＰＳＣ由来ＣＡＲ－Ｔエフェクター細胞認識及び標的化、並びにＣＡＲのものとは異なる二次腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ）のｉＰＳＣ由来エフェクター細胞による腫瘍内産生、並びにバイスタンダーＴ細胞による、又はＢｉＴＥとカップリングするためのＣＦＲ（キメラ融合受容体）などの表面トリガー受容体を含むｉＰＳＣ由来エフェクター細胞による、異種腫瘍細胞のＨＬＡ非依存性標的化につながる二次腫瘍関連抗原のＢｉＴＥ依存性認識を示す。
ｉＰＳＣ（誘導多能性幹細胞）のゲノム改変には、ポリヌクレオチドの挿入、欠失、置換が含まれる。ゲノム操作されたｉＰＳＣでの外因性遺伝子発現は、元のゲノム操作されたｉＰＳＣの長期のクローン増殖後、細胞分化後、及びゲノム操作されたｉＰＳＣに由来する細胞からの脱分化細胞型において、遺伝子サイレンシング、又は低下した遺伝子発現などの問題にしばしば遭遇する。一方、Ｔ細胞又はＮＫ細胞などの初代免疫細胞を直接操作することは困難であり、養子細胞療法のための操作された免疫細胞の調製及び送達に障害をもたらす。本発明は、自殺遺伝子及び他の機能的モダリティを含む１つ以上の外因性遺伝子を安定的に組み込むための効率的で信頼できる標的化アプローチを提供し、これは生着、輸送、ホーミング、遊走、細胞傷害性、生存能力、維持、増殖、寿命、自己複製、持続性、及び／又は生存率に関する改善された治療的特性を、ＨＳＣ（造血幹前駆細胞）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ系統細胞、ＮＫＴ系統細胞、ＮＫ系統細胞、並びに初代ＮＫ、Ｔ、及び／若しくはＮＫＴ細胞には存在しない１つ以上の機能的特質を有する免疫エフェクター細胞を含むが、これらに限定されないｉＰＳＣ派生細胞にもたらす。
定義
本明細書で特に定義されない限り、本出願に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。更に、文脈で特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬などに限定されず、したがって変化し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためのみのものであり、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図しない。
本明細書で使用されるとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、本明細書において、冠詞の文法的な対象の、１又は１を超えるもの（すなわち、少なくとも１）を指すために本明細書において使用される。例として、「要素（an element）」は、１つの要素又は１つを超える要素を意味する。
代替（例えば、「又は」）の使用は、代替の一方、両方、又はそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。
「及び／又は」という用語は、代替の一方又は両方のいずれかを意味すると理解されるべきである。
本明細書で使用されるとき、「約」又は「およそ」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さと比較して、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％もの量で変動する、量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを指す。一実施形態では、「約」又は「およそ」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さの、およそ、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、又は±１％の、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さの範囲を指す。
本明細書で使用されるとき、「実質的に」又は「本質的に」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さと比較して、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％以上である量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを指す。一実施形態では、「実質的に同じ」又は「本質的に同じ」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さとほぼ同一である、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さの範囲を指す。
本明細書で使用されるとき、「実質的に含まない」及び「本質的に含まない」という用語は互換可能に使用され、細胞集団又は培養培地などの組成物を記載するために使用されるとき、例えば、特定の物質又はその供給源の、９５％を含まない、９６％を含まない、９７％を含まない、９８％を含まない、９９％を含まないなど、又は従来の手段で測定して検出できないなどのように、特定の物質又はその供給源を含まない組成物を指す。組成物中の特定の成分又は物質を「含まない」又は「本質的に含まない」という用語はまた、そのような成分又は物質が（１）任意の濃度で組成物に含まれない、又は（２）組成物に含まれるが低密度であり機能的に不活性であることも意味する。同様の意味が、「存在しない」という用語に適用され得、組成物の特定の物質又はその供給源が存在しないことを指す。
本明細書全体を通して、文脈がそうでないことを必要としない限り、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、及び「含むこと（comprising）」は、述べられたステップ、若しくは要素、又はステップ若しくは要素の群を含むことを意味するが、任意の他のステップ、若しくは要素、又はステップ若しくは要素の群を排除することを意味しないことが理解されるであろう。特定の実施形態では、「含む（include）」、「有する」、「含む（contain）」、及び「含む（comprise）」という用語は、同義的に使用される。
「～からなる（consisting of）」とは、「～からなる」という語句に続く全てのものを含み、かつそれに限定されることを意味する。したがって、「～からなる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であり、かつ他の要素が存在し得ないことを示す。
「～から本質的になる（consisting essentially of）」とは、語句の後に列挙された任意の要素を含むことを意味し、列挙された要素の開示で指定された活性又は動作を妨害しないか、又はそれらに寄与しない他の要素に限定される。したがって、「～から本質的になる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であることを示すが、他の要素は必要に応じたものではなく、列挙された要素の活性又は動作に影響するか否かに応じて存在し得るか、又は存在し得ないことを示す。
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「特定の実施形態」、「追加の実施形態」、若しくは「更なる実施形態」又はそれらの組み合わせへの言及は、実施形態に関連して記載された特定の特質、構造、又は特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる様々な場所での前述の語句の出現は、必ずしも全てが同一の実施形態を参照しているとは限らない。更に、特定の特質、構造、又は特性は、１つ以上の実施形態において任意の好適な方法で組み合わせることができる。
「エクスビボ」という用語は、概して、好ましくは自然条件の変化を最小限に抑えて、生体外の人工環境内の生体組織内又は生体組織上で行われる実験又は測定など、生体外で行われる活動を指す。特定の実施形態では、「エクスビボ」手順は、生体から採取され、通常無菌条件下で、典型的には数時間又は約２４時間まで、しかしながら状況に応じて最大４８時間若しくは７２時間以上を含む、実験装置で培養される生細胞又は組織を含む。特定の実施形態では、そのような組織又は細胞は、収集及び凍結され得、エクスビボ処理のために後に解凍され得る。生細胞又は組織を使用して数日より長く続く組織培養実験又は手順は、典型的には「インビトロ」であると考えられるが、特定の実施形態では、この用語はエクスビボと互換可能に使用され得る。
「インビボ」という用語は、概して、生体内部で起こる活動を指す。
本明細書で使用する場合、「リプログラミング」又は「脱分化」又は「細胞能力の増加」又は「発生能力の増加」という用語は、細胞の能力を増加させるか、又は細胞をより分化していない状態に脱分化する方法を指す。例えば、細胞能力が増加した細胞は、リプログラミングされていない状態の同じ細胞と比較して、より多くの発生可塑性を有する（すなわち、より多くの細胞型に分化することができる）。言い換えると、リプログラミングされた細胞は、リプログラミングされていない状態の同じ細胞よりも分化が進んでいない状態の細胞である。
本明細書で使用されるとき、「分化」という用語は、特殊化していない（「コミットされていない」）又はあまり特殊化していない細胞が、例えば、血液細胞又は筋細胞などの特殊化細胞の特質を獲得するプロセスである。分化した又は分化誘導された細胞は、細胞の系統内でより特殊化された（「コミットされた」）位置を呈する細胞である。「コミットされた」という用語は、分化のプロセスに適用されるとき、通常の状況下で特定の細胞型又は細胞型のサブセットに分化し続ける位置まで分化経路を進み、通常の状況下では、異なる細胞型に分化し、分化度の低い細胞型に戻ることのできない細胞を指す。本明細書で使用されるとき、「多能性」という用語は、生体又は体細胞の全ての系統を形成する細胞（すなわち、胚そのもの）の能力を指す。例えば、胚性幹細胞は、３つの胚葉、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の各々から細胞を形成することができる多能性幹細胞の一種である。多能性は、完全な生物を生じさせることができない不完全な又は部分的な多能性細胞（例えば、エピブラスト幹細胞又はＥｐｉＳＣ）から、完全な生物を生じさせることができるより原始的でより多能性の細胞（例えば、胚性幹細胞）までの範囲に及ぶ一連の発生能である。
本明細書で使用されるとき、「人工多能性幹細胞」又はｉＰＳＣという用語は、幹細胞が、リプログラミング因子及び／又は小分子の化学的駆動法を使用して、誘導又は変更された、分化した成人、新生児又は胎児細胞からインビトロで産生された、すなわち、３つの全ての胚葉又は真皮層：中胚葉、内胚葉、及び外胚葉の全ての組織に分化できる細胞にリプログラミングされたことを意味する。産生されたｉＰＳＣは、天然に存在する細胞を指していない。
本明細書で使用されるとき、「胚性幹細胞」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊の天然に存在する多能性幹細胞を指す。胚性幹細胞は多能性であり、発生時に３つの一次胚葉、すなわち、外胚葉、内胚葉、及び中胚葉の全ての誘導体を発生させる。それらは、胚体外膜又は胎盤に寄与しない、すなわち、全能性ではない。
本明細書で使用されるとき、「多能性幹細胞」という用語は、１つ以上の胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）の細胞に分化するが、３つ全てには分化しない発生能を有する細胞を指す。したがって、多能性細胞はまた、「部分的に分化した細胞」と呼ぶこともできる。多能性細胞は当該技術分野で周知であり、多能性細胞の例には、例えば造血幹細胞及び神経幹細胞などの成体幹細胞が含まれる。「多能性」は、細胞が所与の系統での多くの型の細胞を形成し得るが、他の系統の細胞は形成しないことを示す。例えば、多能性造血細胞は多くの異なる型の血液細胞（赤、白、血小板など）を形成することができるが、ニューロンを形成することはできない。したがって、「多分化能」という用語は、全能性及び多能性よりも低い発生能の程度を有する細胞の状態を指す。
多能性は、細胞の多能性特徴を評価することにより、部分的に決定することができる。多能性の特徴としては、（ｉ）多能性幹細胞形態、（ｉｉ）無制限自己再生の可能性、（ｉｉｉ）ＳＳＥＡ１（マウスのみ）、ＳＳＥＡ３／４、ＳＳＥＡ５、ＴＲＡ１－６０／８１、ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ３０及び／又はＣＤ５０を含むが、これらに限定されない、多能性幹細胞マーカーの発現、（ｉｖ）３つ全ての体細胞系統（外胚葉、中胚葉及び内胚葉）に分化する能力、（ｖ）３つの体細胞系統からなる奇形腫形成、並びに（ｖｉ）３つの体細胞系統からの細胞からなる胚様体の形成が挙げられるが、これらに限定されない。
これまでに２つのタイプの多能性が説明されており、後期胚盤胞の胚盤葉上層幹細胞（ＥｐｉＳＣ）に類似した「プライミング」又は「準安定」状態の多能性と、多能性初期／着床前の胚盤胞の内部細胞塊に類似した「ナイーブ」又は「基底」状態である。両方の多能性状態が上記のような特徴を示す一方で、ナイーブ状態又は基底状態は、（ｉ）雌性細胞におけるＸ染色体の前不活性化又は再活性化、（ｉｉ）単一細胞培養中のクローン性及び生存率の改善、（ｉｉｉ）ＤＮＡメチル化の全体的な減少、（ｉｖ）発生調節遺伝子プロモータ上のＨ３Ｋ２７ｍｅ３抑制クロマチンマーク沈着の低減、並びに（ｖ）プライミング状態多能性細胞と比較しての分化マーカーの発現低下を更に示す。外因性多能性遺伝子が体細胞に導入され、発現され、その後、得られる多能性細胞からサイレンシングされるか又は除去されるかのいずれかである細胞リプログラミングの標準的な方法論は、概して、多能性の準備状態の特徴を有するようである。標準的な多能性細胞培養条件下で、そのような細胞は、外因性導入遺伝子発現が維持されない限り、準備状態に留まり、基底状態の特徴が観察される。
本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞形態」という用語は、胚性幹細胞の古典的な形態学的特質を指す。正常な胚性幹細胞の形態は、高い核対細胞質比を有し、核小体が顕著に存在し、典型的な細胞間間隔がある、形状が丸くて小さいことを特徴とする。
本明細書で使用されるとき、「対象」という用語は、任意の動物、好ましくはヒト患者、家畜、又は他の飼育動物を指す。
「多能性因子」又は「リプログラミング因子」は、単独で又は他の薬剤と組み合わせて、細胞の発生能を増加させることができる薬剤を指す。多能性因子には、細胞の発生能を増加させることができるポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び小分子が含まれるが、これらに限定されない。例示的な多能性因子には、例えば、転写因子及び小分子リプログラミング剤が含まれる。
「培養」又は「細胞培養」は、インビトロ環境における細胞の維持、増殖及び／又は分化を指す。「細胞培養培地」、「培養培地」（各場合で単数は「培地（medium）」）、「補充成分」及び「培地補充成分」は、細胞培養を培養する栄養組成物を指す。
「培養する」又は「維持する（maintain）」とは、例えば滅菌プラスチック（又はコーティングされたプラスチック）細胞培養皿又はフラスコ内で、組織又は体外の細胞を維持（sustaining）、増殖（propagating）（増殖（growing））、及び／又は分化させることを指す。「培養」又は「維持すること」は、細胞の増殖及び／又は維持に役立つ栄養素、ホルモン、及び／又は他の因子の供給源として培地を利用することができる。
本明細書で使用されるとき、「中胚葉」という用語は、初期胚発生中に出現し、循環系の血液細胞、筋肉、心臓、真皮、骨格、その他の支持組織と結合組織を含む様々な特殊化された細胞型を生じさせる、３つの胚葉のうちの１つを指す。
本明細書で使用される場合、「決定的な造血内皮」（hemogenic endothelium、ＨＥ）又は「多能性幹細胞由来の決定的な造血内皮」（pluripotent stem cell-derived definitive hemogenic endothelium、ｉＨＥ）という用語は、内皮造血転換と呼ばれるプロセスにおいて造血幹細胞及び前駆細胞を生じさせる内皮細胞のサブセットを指す。胚における造血細胞の発生は、側板中胚葉から血管芽細胞を経て決定的な造血内皮細胞及び造血前駆体へと順次進行する。
「造血幹細胞及び前駆細胞」、「造血幹細胞」、「造血前駆細胞」、又は「造血前駆体細胞」という用語は、造血系統にコミットしているが、更なる造血分化が可能であり、多能性造血幹細胞（血球）、骨髄前駆体、巨核球前駆体、赤血球前駆体、及びリンパ球前駆体を含む細胞を指す。造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＣ）は、骨髄系（単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、及びリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含む全ての血液細胞型を生じる多能性幹細胞である。本明細書で使用されるとき、「二次造血幹細胞」という用語は、Ｔ系統細胞、ＮＫ系統細胞、及びＢ系統細胞を含む成熟骨髄性とリンパ性細胞型の両方を生じさせることができるＣＤ３４＋造血細胞を指す。造血細胞はまた、原始赤血球、巨核球、及びマクロファージを生じさせる原始造血細胞の様々なサブセットを含む。
本明細書で使用されるとき、「Ｔリンパ球」及び「Ｔ細胞」という用語は互換可能に使用され、胸腺での成熟を完了し、体内の特定の外来抗原の同定、並びにＭＨＣクラスＩ拘束性での他の免疫細胞の活性化及び不活性化を含む免疫系における様々な役割を有する主要なタイプの白血球を指す。Ｔ細胞は、任意のＴ細胞、例えば、培養Ｔ細胞、例えば、初代Ｔ細胞、又は培養Ｔ細胞株、例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１などからのＴ細胞、又は哺乳動物から取得されたＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ３＋細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ）、末梢血白血球（peripheral blood leukocyte、ＰＢＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（tumor infiltrating lymphocyte、ＴＩＬ）、メモリＴ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞（gamma delta T cell、γδＴ細胞）、などを含むが、これらに限定されない、任意のタイプのＴ細胞であることができ、任意の発生段階のものであることができる。追加のタイプのヘルパーＴ細胞には、Ｔｈ３（Ｔｒｅｇ）、Ｔｈ１７、Ｔｈ９、又はＴｆｈ細胞などの細胞が含まれる。追加のタイプのメモリＴ細胞には、セントラルメモリＴ細胞（Ｔｃｍ細胞）、エフェクターメモリＴ細胞（Ｔｅｍ細胞及びＴＥＭＲＡ細胞）などの細胞が含まれる。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（T cell receptor、ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変されたＴ細胞などの遺伝子操作されたＴ細胞を指すこともできる。Ｔ細胞又はＴ細胞様エフェクター細胞はまた、幹細胞又は前駆細胞（「派生Ｔ細胞」若しくは「派生Ｔ細胞様エフェクター細胞」、又は集合的に「派生Ｔ系統細胞」）から分化され得る。Ｔ細胞様派生エフェクター細胞は、いくつかの点でＴ細胞系統を有し得るが、同時に、初代Ｔ細胞には存在しない１つ以上の機能的特質を有する。本出願において、Ｔ細胞、Ｔ細胞様エフェクター細胞、派生Ｔ細胞、派生Ｔ細胞様エフェクター細胞、又は派生Ｔ系統細胞は、集合的に「Ｔ系統細胞」と呼ばれる。
「ＣＤ４＋細胞」は、それらの表面でＣＤ４を発現し、細胞性免疫応答と関連するＴ細胞のサブセットを指す。それらは刺激後の分泌プロファイルによって特徴付けられ、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ２、ＩＬ４、及びＩＬ１０などのサイトカインの分泌が含まれ得る。「ＣＤ４」は、もともとＴリンパ球の分化抗原として定義された５５－ｋＤの糖タンパク質であるが、単球／マクロファージを含む他の細胞にも見出される。ＣＤ４抗原は免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）クラスＩＩ拘束性免疫応答の関連認識要素として関与している。Ｔリンパ球では、ヘルパー／インデューサのサブセットを定義する。
「ＣＤ８＋細胞」は、それらの表面上でＣＤ８を発現し、ＭＨＣクラスＩ拘束性であり、細胞傷害性Ｔ細胞として機能するＴ細胞のサブセットを指す。「ＣＤ８」分子は、胸腺細胞と細胞傷害性及びサプレッサＴリンパ球に見られる分化抗原である。ＣＤ８抗原は免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、主要組織適合性複合体クラスＩ拘束性相互作用の関連認識要素である。
本明細書で使用されるとき、「ＮＫ細胞」又は「ナチュラルキラー細胞」という用語は、ＣＤ５６又はＣＤ１６の発現及びＴ細胞受容体（ＣＤ３）の不在によって定義される末梢血リンパ球のサブセットを指す。本明細書で使用されるとき、「適応ＮＫ細胞」及び「メモリＮＫ細胞」という用語は互換可能であり、表現型的にＣＤ３－及びＣＤ５６＋であり、ＮＫＧ２Ｃ及びＣＤ５７のうちの少なくとも１つ、並びに任意選択でＣＤ１６を発現するが、ＰＬＺＦ、ＳＹＫ、ＦｃｅＲγ、及びＥＡＴ－２のうちの１つ以上の発現を欠く、ＮＫ細胞のサブセットを指す。いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の単離された亜集団は、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ５７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲリガンド、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４０、ＮＫｐ４６、活性化及び抑制性ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａ、並びに／又はＤＮＡＭ－１の発現を含む。ＣＤ５６＋は、弱陽性（dim）又は強陽性（bright）発現であり得る。ＮＫ細胞又はＮＫ細胞様エフェクター細胞は、幹細胞又は前駆細胞（「派生ＮＫ細胞」若しくは「派生ＮＫ細胞様エフェクター細胞」、又は集合的に「派生ＮＫ系統細胞」）から分化され得る。派生ＮＫ細胞様エフェクター細胞は、いくつかの点でＮＫ細胞系統を有し得るが、同時に、初代ＮＫ細胞には存在しない１つ以上の機能的特質を有する。本出願において、ＮＫ細胞、ＮＫ細胞様エフェクター細胞、派生ＮＫ細胞、派生ＮＫ細胞様エフェクター細胞、又は派生ＮＫ系統細胞は、集合的に「ＮＫ系統細胞」と呼ばれる。
本明細書で使用されるとき、「ＮＫＴ細胞」又は「ナチュラルキラーＴ細胞」という用語は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＣＤ１ｄ拘束性Ｔ細胞を指す。従来の主要組織適合性（major histocompatibility、ＭＨＣ）分子によって提示されるペプチド抗原を検出する従来のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞は、非古典的ＭＨＣ分子であるＣＤ１ｄによって提示される脂質抗原を認識する。２つのタイプのＮＫＴ細胞が認識される。インバリアント又はＩ型ＮＫＴ細胞は、非常に限られたＴＣＲレパートリ－限定された範囲のβ鎖（ヒトではＶβ１１）と関連する正規のα鎖（ヒトではＶα２４－Ｊα１８）を発現する。非古典的又は非インバリアントのタイプＩＩ ＮＫＴ細胞と呼ばれるＮＫＴ細胞の第２の集団は、より不均一なＴＣＲαβの使用を提示する。Ｉ型ＮＫＴ細胞は免疫療法に好適であると考えられている。適応又はインバリアント（Ｉ型）ＮＫＴ細胞は、ＴＣＲ Ｖａ２４－Ｊａ１８、Ｖｂ１１、ＣＤ１ｄ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ａＧａｌＣｅｒ、ＣＤ１６１、及びＣＤ５６のマーカーのうちの少なくとも１つ以上の発現によって識別できる。
「エフェクター細胞」という用語は、概して、刺激及び／又は活性化に応答して特定の活性を実行する免疫系における特定の細胞、又は活性化の際に特異的機能をもたらす細胞に適用される。本明細書で使用されるとき、「エフェクター細胞」という用語は、免疫細胞、「分化した免疫細胞」、並びに刺激及び／又は活性化に応答して特定の活性を実行するように編集及び／又は調節された初代細胞又は分化した細胞を含み、いくつかの文脈ではそれらと交換可能である。エフェクター細胞の非限定的な例としては、初代由来又はｉＰＳＣ由来のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、及び好中球が挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「単離された」などの用語は、元の環境から分離された細胞、又は細胞の集団を指し、すなわち、単離された細胞の環境は、「単離されていない」参照細胞が存在する環境に見出される少なくとも１つの成分を実質的に含まない。この用語は、例えば、組織又は生検試料から単離された、その天然環境で見出されるようないくつか又は全ての成分から取り出された細胞を含む。この用語はまた、細胞が非天然環境、例えば、細胞培養物又は細胞懸濁液から単離された環境で見出されるため、少なくとも１つ、いくつか、又は全ての成分から取り出された細胞を含む。したがって、単離された細胞は、天然で見出される場合、又は非天然の環境で増殖、保管、又は存続する場合、他の物質、細胞、又は細胞集団を含む少なくとも１つの成分から部分的又は完全に分離される。単離された細胞の具体例には、部分的に純粋な細胞組成物、実質的に純粋な細胞組成物、及び天然に存在しない培地で培養された細胞が含まれる。単離された細胞は、所望の細胞又はその集団を、環境中の他の物質又は細胞から分離することから、又は環境から１つ以上の他の細胞集団又は亜集団を取り除くことから取得することができる。
本明細書中で使用されるとき、「精製する」などの用語は、純度を増加することをいう。例えば、純度は少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％に増加させることができる。
本明細書で使用されるとき、「コードすること」という用語は、ヌクレオチド（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）の定義された配列又はアミノ酸の定義された配列及びそれらから生じる生物学的特性を有する生物学的プロセスにおける他のポリマー及び巨大分子の合成のためのテンプレートとして機能する、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。したがって、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が細胞又は他の生物学的システムでタンパク質を産生する場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に記載されているコード鎖と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写のテンプレートとして使用される非コード鎖の両方を、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードしていると称され得る。
「コンストラクト」は、インビトロ又はインビボのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む高分子又は分子の複合体を指す。本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、外来遺伝物質の標的細胞への送達又は移入を誘導することができ、標的細胞で複製及び／又は発現することができる任意の核酸コンストラクトを指す。本明細書で使用されるとき、「ベクター」という用語は、送達されるコンストラクトを含む。ベクターは、線状又は環状分子であり得る。ベクターは、組み込まれてもよく、又は組み込まれなくてもよい。ベクターの主なタイプには、プラスミド、エピソームベクター、ウイルスベクター、コスミド、及び人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。
「組み込み」とは、コンストラクトの１つ以上のヌクレオチドが細胞ゲノムに安定して挿入される、すなわち、細胞の染色体ＤＮＡ内の核酸配列に共有結合されることを意味する。「標的化組み込み」とは、構築物のヌクレオチドが、予め選択された部位又は「組み込み部位」で細胞の染色体又はミトコンドリアＤＮＡに挿入されることを意味する。本明細書で使用されるとき、「組み込み」という用語は、組み込み部位での内因性配列又はヌクレオチドの欠失を伴うか又は伴わない、コンストラクトの１つ以上の外因性配列又はヌクレオチドの挿入を含むプロセスを更に指す。挿入部位に欠失がある場合、「組み込み」は、内因性配列又は１つ以上の挿入されたヌクレオチドで欠失されたヌクレオチドの置換を更に含み得る。
本明細書で使用されるとき、「外因性」という用語は、参照分子又は参照活性が宿主細胞に導入されるか、又は宿主細胞に対して非天然であることを意味することを意図している。分子は、例えば、コード核酸を宿主の遺伝物質に導入することにより、例えば、宿主の染色体に組み込むことにより、又は非染色体の遺伝物質、例えば、プラスミドとして導入することができる。したがって、コード核酸の発現に関して使用される用語は、コード核酸を発現可能な形態で細胞に導入することを指す。「内因性」という用語は、宿主細胞に存在する参照分子又は活性を指す。同様に、この用語は、コード核酸の発現に関して使用されるとき、細胞内に含まれ、外因的に導入されていないコード核酸の発現を指す。
本明細書で使用されるとき、「目的の遺伝子」又は「目的のポリヌクレオチド配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれると、ＲＮＡに転写され、場合によってはインビボでポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。目的の遺伝子又はポリヌクレオチドは、原核生物配列、真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列を含み得るが、これらに限定されない。例えば、目的の遺伝子は、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、天然ポリペプチド（すなわち、天然に見出されるポリペプチド）又はその断片、バリアントポリペプチド（すなわち、天然ポリペプチドとの１００％未満の配列同一性を有する天然ポリペプチドの突然変異体）又はその断片、操作されたポリペプチド又はペプチド断片、治療用ペプチド又はポリペプチド、造影用マーカー、選択マーカーなどをコードし得る。
本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又はそれらの類似体のいずれかである、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドの配列は、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）から構成され、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、チミンはウラシル（Ｕ）である。ポリヌクレオチドには、遺伝子又は遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ、又はＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマーが含まれ得る。ポリヌクレオチドはまた、二本鎖分子及び一本鎖分子の両方を指す。
本明細書で使用されるとき、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は互換可能に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基を有する分子を指す。ポリペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならず、ポリペプチドのアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書で使用されるとき、これらの用語は、例えば、当該技術分野では概してペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも称される短い鎖と、概して当該技術分野でポリペプチド又はタンパク質と称される長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、改変ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドは、天然ポリペプチド、組換えポリペプチド、合成ポリペプチド、又はそれらの組み合わせを含む。
本明細書で使用されるとき、「サブユニット」という用語は、本明細書で使用されるとき、タンパク質複合体の各別個のポリペプチド鎖を指し、各別個のポリペプチド鎖は、それ自体で安定な折り畳み構造を形成することができる。多くのタンパク質分子は、２つ以上のサブユニットから構成され、ここで、アミノ酸配列は、各サブユニットについて同一であるか、又は類似しているか、又は完全に異なるかのいずれかであり得る。例えば、ＣＤ３複合体は、ＣＤ３α、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、及びＣＤ３ζサブユニットから構成され、これらはＣＤ３ε／ＣＤ３γ、ＣＤ３ε／ＣＤ３δ、及びＣＤ３ζ／ＣＤ３ζ二量体を形成する。単一のサブユニット内で、ポリペプチド鎖の連続した部分は、「ドメイン」と呼ばれるコンパクトで局所的な半独立単位に折り畳まれることが多い。多くのタンパク質ドメインは、ドメインの共通機能に寄与する、サブドメインとも呼ばれる独立した「構造サブユニット」を更に含み得る。したがって、本明細書で使用されるとき、「サブドメイン」という用語は、より大きなドメインの内側のタンパク質ドメイン、例えば、細胞表面受容体の外部ドメイン内の結合ドメイン、又は細胞表面受容体の内部ドメインの刺激ドメイン若しくはシグナル伝達ドメインを指す。
「作動可能に連結された（operably-linked）」又は「作動可能に連結された（operatively linked）」は、「作動可能に接続された（operably connected）」又は「作動可能に接続された（operatively connected）」と交換可能であり、一方の機能が他方によって影響を受けるような、単一の核酸断片上の核酸配列（又は複数のドメインを有するポリペプチド中のアミノ酸）の会合を指す。例えば、プロモータは、そのコード配列又は機能的ＲＮＡの発現に影響を与えることができる場合、コード配列又は機能的ＲＮＡと作動可能に連結している（すなわち、コード配列又は機能的ＲＮＡがプロモータの転写制御下にある）。コード配列は、センス又はアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結することができる。更なる例として、受容体結合ドメインは、リガンドへの受容体の結合が当該結合に応答するシグナルを変換するように、細胞内シグナル伝達ドメインに作動可能に接続され得る。
「融合タンパク質」又は「キメラタンパク質」は、本明細書で使用されるとき、別々のタンパク質をコードする配列をコードする２つ以上の部分的又は完全なポリヌクレオチドを接合するための遺伝子操作を介して作製されるタンパク質であり、これらの接合されたポリヌクレオチドの発現は、元のタンパク質又はその断片の各々に由来する機能的特性を有する単一のペプチド又は複数のポリペプチドを生じる。融合タンパク質における異なる供給源の２つの隣接するポリペプチド間に、リンカー（又はスペーサ）ペプチドを付加することができる。本明細書に記載のキメラ融合受容体（ＣＦＲ）は、融合タンパク質又はキメラタンパク質である。
本明細書で使用されるとき、「遺伝的インプリント」という用語は、ソース細胞又はｉＰＳＣの優先的な治療属性に寄与し、ソース細胞由来ｉＰＳＣ及び／又はｉＰＳＣ由来造血系統細胞で保持可能な遺伝的又はエピジェネティックな情報を指す。本明細書で使用されるとき、「ソース細胞」は、リプログラミングを通じてｉＰＳＣを生成するために使用され得る非多能性細胞であり、ソース細胞由来ｉＰＳＣは、任意の造血系統細胞を含む特定の細胞型に更に分化し得る。ソース細胞由来ｉＰＳＣ、及びそれから分化した細胞は、文脈に応じて、「由来（derived）」細胞又は「派生（derivative）」細胞と総称され得る。例えば、本出願全体で使用されるとき、派生エフェクター細胞、又は派生ＮＫ系統細胞若しくは派生Ｔ系統細胞は、末梢血、臍帯血、又は他のドナー組織などの天然（natural）／天然（native）供給源から取得されたそれらの対応する初代細胞と比較して、ｉＰＳＣから分化した細胞である。本明細書で使用されるとき、優先的な治療属性を付与する遺伝的インプリントは、ドナー、疾患、又は治療応答に特異的である選択されたソース細胞をリプログラミングすることにより、又はゲノム編集を使用してｉＰＳＣに遺伝子組換えモダリティを導入することにより、ｉＰＳＣに組み込まれる。特異的に選択されたドナー、疾患、又は治療状況から取得されたソース細胞の態様では、優先的な治療属性に寄与する遺伝的インプリントには、根本的な分子事象が同定されているかどうかに関係なく、選択されたソース細胞のｉＰＳＣ由来細胞に渡される、保持可能な表現型、すなわち優先的な治療属性を表す、状況特異的な遺伝的又はエピジェネティックな改変を含み得る。ドナー、疾患、若しくは治療応答に特異的であるソース細胞は、ｉＰＳＣ及び由来造血系統細胞において保持可能な遺伝的インプリントを含んでいてもよく、この遺伝的インプリントには、例えば、ウイルス特異的Ｔ細胞又はインバリアントナチュラルキラーＴ（invariant natural killer T、ｉＮＫＴ）細胞からの、予め配置された単一特異的ＴＣＲ、追跡可能で望ましい遺伝子多型、例えば、選択されたドナーにおける高親和性ＣＤ１６受容体をコードする点突然変異のホモ接合、及び所定のＨＬＡ要件、すなわち、増加した集団でハプロタイプを示す選択されたＨＬＡ適合ドナー細胞が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用されるとき、優先的な治療属性には、由来細胞の、改善された生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、免疫応答の調節と修飾、生存率、及び細胞傷害性が含まれる。優先的な治療属性はまた、抗原標的化受容体発現、ＨＬＡ提示又はその欠如、腫瘍微小環境に対する耐性、バイスタンダー免疫細胞及び免疫修飾の誘導、低減された腫瘍外効果を伴う改善されたオンターゲット特異性、化学療法などの治療に対する耐性にも関連する。優先的な治療属性を付与する遺伝的インプリントが組み込まれているｉＰＳＣを分化させることから、１つ以上の治療属性を有する誘導細胞が得られる場合、そのような誘導細胞はまた「合成細胞」とも呼ばれる。概して、合成細胞は、その最も近い対応する初代細胞と比較した場合、合成細胞が、操作された多能性細胞から分化されるか、又は末梢血、臍帯血、若しくは他のドナー組織などの天然／天然供給源由来の初代細胞を操作することによって取得されるかにかかわらず、１つ以上の非天然細胞機能を有する。
本明細書で使用されるとき、「増強された治療特性」という用語は、同じ一般的な細胞型の典型的な免疫細胞と比較して増強された細胞の治療特性を指す。例えば、「増強された治療特性」を有するＮＫ細胞は、典型的な未改変及び／又は天然に存在するＮＫ細胞と比較して、増強され、改善され、及び／又は増加された治療特性を有する。免疫細胞の治療特性には、細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、免疫応答の調節と修飾、生存率、及び細胞傷害性が含まれ得るが、これらに限定されない。免疫細胞の治療特性はまた、抗原標的化受容体発現、ＨＬＡ提示又はその欠如、腫瘍微小環境に対する耐性、バイスタンダー免疫細胞及び免疫修飾の誘導、低減された腫瘍外効果を伴う改善されたオンターゲット特異性、化学療法などの治療に対する耐性によって表される。
本明細書で使用されるとき、「エンゲージャ」という用語は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、又は好中球）と、腫瘍細胞との間の連結を形成することができ、免疫細胞を活性化することができる分子、例えば、融合ポリペプチドを指す。エンゲージャの例には、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（bi-specific T cell engager、ＢｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲージャ（bi-specific killer cell engager、ＢｉＫＥ）、三重特異性キラー細胞エンゲージャ、又は多重特異性キラー細胞エンゲージャ、及び複数の免疫細胞型と適合し得るユニバーサルエンゲージャが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「表面トリガー受容体」という用語は、免疫応答、例えば、細胞傷害性応答を誘発又は開始することができる受容体を指す。表面トリガー受容体を操作することができ、エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球で発現させることができる。いくつかの実施形態では、表面トリガー受容体は、エフェクター細胞の天然受容体及び細胞型とは無関係に、エフェクター細胞と特異的な標的細胞（例えば、腫瘍細胞）との間の二重特異性抗体又は多重特異性抗体の結合を促進する。このアプローチを使用すると、ユニバーサル表面トリガー受容体を含むｉＰＳＣを生成し、そのようなｉＰＳＣをユニバーサル表面トリガー受容体を発現する様々なエフェクター細胞型の集団に分化させることができる。「ユニバーサル」とは、表面トリガー受容体が細胞型に関係なく任意のエフェクター細胞で発現及び活性化することができることを意味し、ユニバーサル受容体を発現する全てのエフェクター細胞は、エンゲージャの腫瘍結合特異性に関係なく、表面トリガー受容体によって認識できるエンゲージャに結合又は連結され得る。いくつかの実施形態では、同じ腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャを使用して、ユニバーサル表面トリガー受容体と結合する。いくつかの実施形態では、異なる腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャを使用して、ユニバーサル表面トリガー受容体と結合する。したがって、１つ以上のエフェクター細胞型を使用して、ある特異的な型の腫瘍細胞を殺傷する場合もあれば、２つ以上の型の腫瘍を殺傷する場合もある。表面トリガー受容体は概して、エフェクター細胞の活性化のための共刺激ドメインと、エンゲージャのエピトープ結合領域に特異的なエピトープと、を含む。二重特異性エンゲージャは、一方の端の表面トリガー受容体のエピトープに特異的であり、もう一方の端の腫瘍抗原に特異的である。
本明細書で使用されるとき、「安全スイッチタンパク質」という用語は、細胞療法の可能性のある毒性又はその他の有害作用を防止するように設計された操作されたタンパク質を指す。いくつかの例では、安全スイッチタンパク質の発現は条件付きで制御され、安全スイッチタンパク質をコードする遺伝子をゲノムに永久的に組み込んだ移植された操作された細胞の安全性の懸念に対処する。この条件付き調節は変動する可能性があり、小分子を介した翻訳後活性化及び組織特異的及び／又は一過性の転写調節による制御が含まれる可能性がある。安全スイッチは、アポトーシスの誘導、タンパク質合成の阻害、ＤＮＡ複製、増殖停止、転写及び転写後の遺伝子調節及び／又は抗体媒介性枯渇を媒介する可能性がある。いくつかの例において、安全スイッチタンパク質は、外因性分子、例えば、プロドラッグによって活性化され、活性化されると、治療用細胞のアポトーシス及び／又は細胞死を誘発する。安全スイッチタンパク質の例には、カスパーゼ９（又はカスパーゼ３若しくは７）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、Ｂ細胞ＣＤ２０、改変ＥＧＦＲ、及びそれらの任意の組み合わせなどの自殺遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。この戦略では、有害事象の発生時に投与されるプロドラッグが自殺遺伝子産物によって活性化され、形質導入された細胞を殺傷する。
本明細書で使用されるとき、「薬学的に活性なタンパク質又はペプチド」という用語は、生物に対して生物学的及び／又は薬学的効果を達成することができるタンパク質又はペプチドを指す。薬学的に活性なタンパク質は、疾患に対する治癒的又は緩和的特性を有し、疾患の重症度を改善、軽減（relieve）、緩和、逆転又は軽減（lessen）するために投与することができる。薬学的に活性なタンパク質はまた、予防特性を有し、疾患の発症を予防するために、又はそれが出現した場合にそのような疾患又は病的状態の重症度を軽減するために使用される。薬学的に活性なタンパク質には、タンパク質又はペプチド全体又はその薬学的に活性な断片が含まれる。それはまた、タンパク質若しくはペプチドの薬学的に活性な類似体又はタンパク質若しくはペプチドの断片の類似体を含む。薬学的に活性なタンパク質という用語はまた、協調的又は相乗的に作用して治療効果をもたらす複数のタンパク質又はペプチドを指す。薬学的に活性なタンパク質又はペプチドの例には、受容体、結合タンパク質、転写及び翻訳因子、腫瘍増殖抑制タンパク質、抗体又はその断片、増殖因子、及び／又はサイトカインが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「シグナル伝達分子」という用語は、細胞シグナル伝達を調整、関与、阻害、活性化、低減、又は増大させる任意の分子を指す。シグナル伝達とは、細胞内で最終的に生化学的事象を引き起こす経路に沿ったタンパク質複合体の動員による化学改変の形態での分子シグナルの伝達を指す。シグナル伝達経路は当該技術分野で周知であり、Ｇタンパク質共役受容体シグナル伝達、チロシンキナーゼ受容体シグナル伝達、インテグリンシグナル伝達、トールゲートシグナル伝達、リガンド依存性イオンチャネルシグナル伝達、ＥＲＫ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路、Ｗｎｔシグナル伝達経路、ｃＡＭＰ依存経路、及びＩＰ３／ＤＡＧシグナル伝達経路が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「標的化モダリティ」という用語は、細胞に遺伝的に組み込まれて、ｉ）固有のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関連するときの抗原特異性、ｉｉ）モノクローナル抗体又は二重特異性エンゲージャに関連するときのエンゲージャ特異性、ｉｉｉ）形質転換細胞の標的化、ｉｖ）がん幹細胞の標的化、及びｖ）特異的な抗原又は表面分子の不在下でのその他の標的化戦略を含むがこれらに限定されない、抗原及び／又はエピトープの特異性を促進する分子、例えば、ポリペプチドを指す。
本明細書で使用されるとき、「特異的」又は「特異性」という用語は、非特異的又は非選択的な結合とは対照的に、標的分子に選択的に結合する分子、例えば受容体又はエンゲージャの能力を指すために使用され得る。
本明細書で使用されるとき、「養子細胞療法」という用語は、輸注の前にエクスビボで増殖している、遺伝子改変された、又は改変されていない、Ｔ又はＢ細胞として同定される、自家性又は同種異系のリンパ球の輸注に関連する、本明細書で使用される、細胞ベースの免疫療法を指す。
本明細書で使用されるとき、「治療上十分な量」は、その意味の範囲内で、それが参照する特定の治療及び／又は医薬組成物の非毒性であるが十分かつ／又は有効な量を含み、所望の治療効果を提供する。必要とされる正確な量は、患者の全体的な健康状態、患者の年齢、並びに状態のステージ及び重症度などの要因に応じて、対象ごとに異なる。特定の実施形態では、治療的に十分な量は、治療されている対象の疾患又は状態と関連する少なくとも１つの症状を改善、軽減、及び／又は改善するのに十分及び／又は有効である。
多能性幹細胞の分化には、培養液中の刺激剤及び細胞の物理的状態の変化など、培養系の変化が必要とされる。最も一般的な戦略は、系統特異的な分化を開始するための共通かつ重要な中間体として胚様体（embryoid body、ＥＢ）の形成を利用する。「胚様体」とは、胚の発生を模倣することが示されている三次元のクラスタであり、三次元領域内で多数の系統を発生させる。典型的には数時間から数日である分化プロセスを通じて、単純なＥＢ（例えば、分化を誘発された凝集多能性幹細胞）は成熟を続け、嚢胞性ＥＢにまで成長し、典型的には数日から数週間であるこのとき、それらは、更に分化を続けるように処理される。ＥＢ形成は、多能性幹細胞を細胞の三次元多層クラスタ内で互いに近接させることによって開始さ、これは典型的には、多能性細胞を液滴として沈降させ、細胞を「Ｕ」底ウェルプレートに沈降させること、又は機械的撹拌によるものを含むいくつかの方法の１つによって実現される。多能性培養維持培地で維持された凝集体は適切なＥＢを形成しないため、ＥＢの成長を促進するために、多能性幹細胞の凝集体には更に分化の手掛かりが必要である。そのため、多能性幹細胞の凝集体は、選択した系統へのキュー誘発を提供する分化培地に移す必要がある。多能性幹細胞のＥＢベースの培養は、典型的には、ＥＢ細胞クラスタ内の中程度の増殖（proliferation）の分化した細胞集団（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の胚葉）を生成する。ＥＢは、細胞分化を促進することが証明されているが、環境からの分化のキューに対する三次元構造の細胞の露出に一貫性がないため、様々な分化状態の異種細胞を生じさせる。加えて、ＥＢは作成及び維持することが面倒である。更に、ＥＢ形成による細胞分化には適度な細胞増殖が伴い、分化効率の低下にもつながる。
対照的に、「凝集体形成」は、「ＥＢ形成」とは異なり、多能性幹細胞由来細胞の集団を増殖させるために使用することができる。例えば、凝集体に基づく多能性幹細胞の増殖中、培養培地は、増殖及び多能性を維持するように選択される。細胞増殖は概して、より大きな凝集体を形成する凝集体のサイズを増加させ、これらの凝集体は、日常的に機械的又は酵素的に小さな凝集体に解離して、培養内の細胞増殖を維持し、細胞数を増やすことができる。ＥＢ培養とは異なり、維持培養で凝集体内で培養された細胞は、多能性のマーカーを維持する。多能性幹細胞凝集体は、分化を誘導するために更なる分化のキューを必要とする。
本明細書で使用されるとき、「単層分化」は、細胞の三次元多層クラスタにわたる分化、すなわち「ＥＢ形成」とは異なる分化方法を指す用語である。単層分化は、本明細書に開示される他の利点の中でも特に、ＥＢ形成が分化を開始する必要性を回避する。単層培養はＥＢ形成などの胚発生を模倣しないため、特定の系統への分化は、ＥＢの３つ全ての胚葉分化と比較して最小限とみなされる。
本明細書で使用されるとき、「解離した細胞」又は「単一の解離した細胞」は、他の細胞から又は表面（例えば、培養プレート表面）から実質的に分離又は精製された細胞をいう。例えば、細胞は、機械的又は酵素的方法によって動物又は組織から解離され得る。代替的に、インビトロで凝集する細胞は、例えば、クラスタの懸濁液、単一の細胞又は単一の細胞とクラスタの混合物への酵素的又は機械的な解離によって、互いに解離され得る。更に別の代替的な実施形態では、付着細胞は培養プレート又は他の表面から解離される。したがって、解離には、細胞外マトリックス（extracellular matrix、ＥＣＭ）及び基質（培養面など）との細胞相互作用を破壊すること、又は細胞間のＥＣＭを破壊することが含まれる。
本明細書で使用されるとき、「マスタ細胞バンク」又は「ＭＣＢ」は、１つ以上の治療属性を含むように操作されており、特徴付けられ、試験され、適格化され、拡大されており、かつ製造環境における指向性分化による細胞ベースの治療剤の産生のための出発細胞材料として確実に役立つことが示されているｉＰＳＣのクローン集団であるクローンマスタ操作ｉＰＳＣ株を指す。様々な実施形態では、ＭＣＢは、製造プロセス中にｉＰＳ細胞株が継代され、解凍され、又は取り扱われる合計回数を低減及び／又は排除することによって、遺伝的変異及び／又は汚染可能性を防止するために、複数の容器中で維持、貯蔵、及び／又は凍結保存される。
本明細書で使用されるとき、「フィーダ細胞」又は「フィーダ」は、第２の型の細胞と共培養されて、第２の型の細胞が増殖、増殖、又は分化することができる環境を提供する、１つの型の細胞を表す用語であり、フィーダ細胞は刺激、増殖因子、栄養素を提供し、第２の細胞型を支持する。フィーダ細胞は、それらが支持している細胞とは異なる種に由来してもよい。例えば、幹細胞を含む特定の型のヒト細胞は、マウス胚性線維芽細胞又は不死化マウス胚性線維芽細胞の初代培養によって支持することができる。別の例では、末梢血由来細胞又は形質転換白血病細胞は、ナチュラルキラー細胞の増殖及び成熟を支持する。フィーダ細胞は、他の細胞と共培養されるときに、それらが支持している細胞よりも増殖するのを防ぐために、照射又はマイトマイシンなどの拮抗有糸分裂剤での処理によって、典型的には不活性化され得る。フィーダ細胞は、内皮細胞、間質細胞（例えば、上皮細胞又は線維芽細胞）、及び白血病細胞を含み得る。前述を限定することなく、１つの特定のフィーダ細胞型は、ヒト皮膚線維芽細胞などのヒトフィーダであり得る。別のフィーダ細胞型は、マウス胚性線維芽細胞（mouse embryonic fibroblast、ＭＥＦ）であり得る。概して、様々なフィーダ細胞を一部使用して、多能性を維持し、特定の系統に分化を指示し、増殖能力を高め、エフェクター細胞などの特殊化した細胞型への成熟を促進することができる。
本明細書で使用されるとき、「フィーダフリー」（feeder-free、ＦＦ）環境とは、フィーダ又は間質細胞を本質的に含まない、及び／又はフィーダ細胞の培養によって前処理されていない、培養条件、細胞培養又は培養培地などの環境を指す。「前処理された」培地とは、フィーダ細胞が培地内で少なくとも１日などの期間培養された後に採取された培地を指す。前処理された培地には、培地で培養されたフィーダ細胞から分泌された増殖因子及びサイトカインを含む、多くのメディエータ物質が含まれる。いくつかの実施形態では、フィーダフリー環境は、フィーダ細胞又は間質細胞の両方を含まず、フィーダ細胞の培養によって前処理もされていない。
ｉＰＳＣ及びそれから分化した派生非多能性細胞のゲノム編集若しくは改変、又は非多能性細胞及びそれからリプログラミングされた由来ｉＰＳＣのゲノム編集若しくは改変との関連で使用される「機能的」とは、（１）遺伝子レベルでは、ノックイン、ノックアウト、ノックダウン遺伝子発現、直接ゲノム編集若しくは改変によって、又は最初にゲノム操作された出発細胞からの分化若しくはリプログラミングを介した「継代」によって達成される、所望の細胞発生段階での誘導性若しくは一時的発現などのトランスジェニック若しくは制御された遺伝子発現の成功、あるいは（２）細胞レベルでは、（ｉ）直接ゲノム編集を通して当該細胞において得られる遺伝子発現改変、（ｉｉ）最初にゲノム操作された出発細胞からの分化若しくはそのリプログラミングを介した「継代」を通して当該細胞において維持される遺伝子発現改変、（ｉｉｉ）当該細胞のより初期の発生段階においてのみ出現するか、又は分化若しくはリプログラミングを介して当該細胞を生じる出発細胞においてのみ出現する遺伝子発現改変の結果としての、当該細胞における下流遺伝子調節、又は（ｉｖ）ｉＰＳＣ、前駆体若しくは脱分化した細胞起源で行われたゲノム編集若しくは改変に最初に由来する成熟細胞産物内に示される、増強された若しくは新たに達成された細胞機能若しくは属性による、細胞機能／特徴の除去、付加又は改変の成功を指す。
ＨＬＡクラスＩ欠損若しくはＨＬＡクラスＩＩ欠損、又はその両方を含む「ＨＬＡ欠損」とは、ＨＬＡクラスＩタンパク質ヘテロ二量体及び／又はＨＬＡクラスＩＩヘテロ二量体を含む完全なＭＨＣ複合体の表面発現のレベルが不足している、又はもはや維持されていない、又は低減している細胞を指し、減少又は低減したレベルが、他の細胞又は合成方法によって自然に検出可能なレベルよりも低くなっている。
本明細書で使用されるとき、「改変されたＨＬＡ欠損ｉＰＳＣ」は、改善された分化能、抗原標的化、抗原提示、抗体認識、持続性、免疫回避、抑制に対する耐性、増殖、共刺激、サイトカイン刺激、サイトカイン産生（オートクリン又はパラクリン）、走化性、及び細胞傷害性、例えば、非古典的ＨＬＡクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ｅ及びＨＬＡ－Ｇ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＢＣＬ１１ｂ、ＮＯＴＣＨ、ＲＵＮＸ１、ＩＬ１５、４－１ＢＢ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２４、ＣＤ３ζ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、及びＰＤＬ１に関連するがこれらに限定されないタンパク質を発現する遺伝子を導入することによって更に改変されるＨＬＡ欠損ｉＰＳＣを指す。「改変されたＨＬＡ欠損」の細胞には、ｉＰＳＣ以外の細胞も含まれる。
「リガンド」という用語は、標的分子と複合体を形成して、標的上の部位に結合することによってシグナルを生成する物質を指す。リガンドは、標的に特異的に結合することができる天然又は人工物質であってもよい。リガンドは、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体複合体、コンジュゲート、核酸、脂質、多糖、単糖、小分子、ナノ粒子、イオン、神経伝達物質、又は標的に特異的に結合することができる任意の他の分子実体の形態であってもよい。リガンドが結合する標的は、タンパク質、核酸、抗原、受容体、タンパク質複合体、又は細胞であり得る。標的に結合してその機能を変化させ、シグナル伝達応答を誘発するリガンドは、「アゴニスト（agonistic）」又は「アゴニスト（agonist）」と呼ばれる。標的に結合し、シグナル伝達応答を遮断又は低減するリガンドは、「拮抗」又は「アンタゴニスト」である。
「抗体」という用語は、本明細書において最も広い意味で使用され、概して、標的に特異的に結合する少なくとも１つの結合部位を含有する免疫応答生成分子を指し、標的は、抗原、又はある特定の抗体と相互作用することができる受容体であり得る。例えば、ＮＫ細胞は、抗体又は抗体のＦｃ領域のそのＦｃ－ガンマ受容体（Fc-gamma receptor、ＦｃγＲ）への結合によって活性化され、それによって、ＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、抗体依存性細胞傷害）媒介性エフェクター細胞活性化を誘発することができる。抗体が結合する抗原若しくは受容体の特定の断片若しくは部分、又は概して標的は、エピトープ又は抗原決定基として知られている。「抗体」という用語は、天然抗体及びそのバリアント、天然抗体及びそのバリアントの断片、ペプチボディ及びそのバリアント、並びに一本鎖抗体及びその断片を含む、抗体又はその特定の断片若しくは部分の構造及び／又は機能を模倣する抗体模倣体を含むが、これらに限定されない。抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇＧ、単一可変新規抗原受容体（single variable new antigen receptor、ＶＮＡＲ）、サメ重鎖抗体（Ｉｇ－ＮＡＲ）、キメラ抗体、組換え抗体、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、抗イディオタイプ抗体、二重特異性、多重特異性、若しくは多量体抗体、又はその断片であってもよい。抗イディオタイプ抗体は、別の抗体のイディオトープへの結合に特異的であり、イディオトープは、抗体の抗原決定基である。二重特異性抗体は、ＢｉＴＥ（ｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ）又はＢｉＫＥ（ｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ、二重特異性キラー細胞エンゲージャ）であってもよく、多重特異性抗体は、ＴｒｉＫＥ（ｔｒｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ、三重特異性キラー細胞エンゲージャ）であってもよい。抗体断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、Ｆｖ、Ｆａｂｃ、ｐＦｃ、Ｆｄ、一本鎖抗原結合断片（single chain fragment variable、ｓｃＦｖ）、タンデムｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、一本鎖Ｆａｂ（single chain Fab、ｓｃＦａｂ）、ジスルフィド安定化Ｆｖ（disulfide stabilized Fv、ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（single-domain antigen binding fragment、ｓｄＡｂ）、ラクダ重鎖ＩｇＧ及びＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）断片、組換え重鎖のみ抗体（heavy-chain-only antibody、ＶＨＨ）、及び抗体全体の結合特異性を維持する他の抗体断片が含まれる。
「Ｆｃ受容体」はＦｃＲと略され、認識される抗体の種類に基づいて分類される。例えば、最も一般的なクラスの抗体ＩｇＧに結合するものはＦｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）と呼ばれ、ＩｇＡに結合するものはＦｃ－アルファ受容体（Fc-alpha receptor、ＦｃαＲ）と呼ばれ、ＩｇＥに結合するものはＦｃ－イプシロン受容体（Fc-epsilon receptor、ＦｃεＲ）と呼ばれる。ＦｃＲのクラスは、それらを発現する細胞（マクロファージ、顆粒球、ナチュラルキラー細胞、Ｔ及びＢ細胞）と各受容体のシグナル伝達特性によっても区別される。Ｆｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）には、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、及びＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）など、分子構造が異なるために抗体親和性が異なるいくつかのメンバーが含まれる。
「キメラ受容体」は、少なくとも２つの異なるタンパク質に由来するアミノ酸配列の２つ以上の部分を含むように作製される、操作された人工又はハイブリッド受容体タンパク質分子を記載するために使用される一般用語である。キメラ受容体タンパク質は、シグナル伝達を開始し、受容体へのアゴニストリガンドの結合時に下流機能を実施する能力を細胞に与えるように操作されている。例示的な「キメラ受容体」としては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラ融合受容体（ＣＦＲ）、キメラＦｃ受容体（ＣＦｃＲ）、並びに２つ以上の受容体の融合体が挙げられるが、これらに限定されない。
「ＣＦｃＲ」と略される「キメラＦｃ受容体」は、天然の膜貫通及び／若しくは細胞内シグナル伝達ドメインが改変されたか、又は非天然の膜貫通及び／若しくは細胞内シグナル伝達ドメインで置き換えられた操作されたＦｃ受容体を記載するために使用される用語である。キメラＦｃ受容体のいくつかの実施形態では、膜貫通及びシグナル伝達ドメインの一方又は両方が非天然であることに加えて、１つ以上の刺激ドメインを操作されたＦｃ受容体の細胞内部分に導入して、受容体の誘発による細胞活性化、増殖、及び機能を増強することができる。標的抗原への抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とは異なり、キメラＦｃ受容体は、Ｆｃ断片、又は抗体のＦｃ領域、又はエンゲージャ若しくは結合分子に含まれるＦｃ領域に結合し、標的細胞を近傍に近づけるか、又は近づけなくとも、分子に結合して細胞機能を活性化する。例えば、Ｆｃγ受容体は、細胞外ドメインでのＩｇＧの結合に応答し、それによりＣＦｃＲを生成する細胞内領域において選択された膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、及び／又はシグナル伝達ドメインを含むように操作され得る。一例では、ＣＦｃＲは、その膜貫通ドメイン及び／又は細胞内ドメインを置き換えることにより、Ｆｃγ受容体であるＣＤ１６を操作することによって産生される。ＣＤ１６ベースのＣＦｃＲの結合親和性を更に改善させるために、ＣＤ６４の細胞外ドメイン又はＣＤ１６の高親和性バリアント（例えば、Ｆ１７６Ｖ）を組み込むことができる。高親和性ＣＤ１６細胞外ドメインが含まれるＣＦｃＲのいくつかの実施形態では、１９７位にセリンを含むタンパク質分解性切断部位が除去されているか、又は受容体の細胞外ドメインが切断不可能であるように置き換えられて、すなわち、脱落されないようになり、これにより、ｈｎＣＤ１６ベースのＣＦｃＲが取得される。
ＦｃγＲ受容体であるＣＤ１６には、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）とＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）の２つのアイソフォームがあることが確認されている。ＣＤ１６ａは、標的細胞に付着した単量体ＩｇＧに結合してＮＫ細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity、ＡＤＣＣ）を促進する、ＮＫ細胞によって発現される膜貫通タンパク質である。本明細書で使用されるとき、「高親和性ＣＤ１６」、「非切断性ＣＤ１６」、又は「高親和性の非切断性ＣＤ１６」（ｈｎＣＤ１６と略される）は、ＣＤ１６の天然又は非天然バリアントを指す。野生型ＣＤ１６は親和性が低く、ＮＫ細胞が活性化されると、白血球上の様々な細胞表面分子の細胞の表面密度を調節するタンパク質分解切断プロセスである外部ドメイン脱落に供される。Ｆ１７６Ｖ及びＦ１５８Ｖは、高い親和性を有する例示的なＣＤ１６多型バリアントである。膜近位領域（１８９位～２１２位）における切断部位（１９５位～１９８位）が変更又は排除されたＣＤ１６バリアントは、脱落しない。切断部位及び膜近位領域は、国際公開第２０１５／１４８９２６号に詳細に記載されており、その完全な開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＣＤ１６のＳ１９７Ｐバリアントは、ＣＤ１６の非切断性バージョンである。Ｆ１５８Ｖ及びＳ１９７Ｐの両方を含むＣＤ１６バリアントは親和性が高く、非切断性である。別の例示的な高親和性非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）バリアントは、ＣＤ６４外部ドメインの３つのエクソンの１つ以上に由来する外部ドメインを含む操作されたＣＤ１６である。
Ｉ．増強された特性を持つ養子細胞療法に有用な細胞及び組成物
本明細書において提供されるのは、ｉＰＳＣから分化した派生細胞の治療特性を増強しながら、ｉＰＳＣの分化能並びにｉＰＳＣ及びその派生細胞の細胞発生生物学に影響を与えることなくクローンｉＰＳＣの調節回路を体系的に操作する戦略である。ｉＰＳＣ由来細胞は機能的に改善されており、選択的モダリティの組み合わせがゲノム操作を通じてｉＰＳＣレベルで細胞に導入された後の養子細胞療法に好適である。以前には、提供された１つ以上の遺伝子編集を含む改変されたｉＰＳＣが調節された活性及び／若しくは特性を保持しながら依然として細胞発生に入る能力、並びに／又は成熟して機能的分化細胞を生成する能力を有するかどうかは不明であった。ｉＰＳＣからの指向性細胞分化中の予期しない失敗は、発生段階の特定の遺伝子発現又はその欠如、ＨＬＡ複合体提示の要件、導入された表面発現モダリティのタンパク質脱落、及び細胞の表現型及び／又は機能の変化を可能にする分化プロトコルの再構成の必要性を含むがこれらに限定されない側面に起因する。本出願は、本明細書において提供される１つ以上の選択されたゲノム改変がｉＰＳＣ分化能に悪影響を及ぼさないこと、並びに操作されたｉＰＳＣに由来する機能エフェクター細胞が、ｉＰＳＣ分化後にエフェクター細胞に保持される、個々の又は組み合わせたゲノム改変に起因する増強及び／又は獲得した治療特性を有することを示す。更に、ｉＰＳＣ及びｉＰＳＣ由来エフェクター細胞の文脈において記載され得る全てのゲノム改変及びそれらの組み合わせは、培養されているか増殖されているかにかかわらず、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又は免疫調節細胞などの初代免疫細胞を含む初代由来細胞に適用可能であり、その改変は、養子細胞療法に有用な操作された免疫細胞をもたらす。
更に、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、いくつかの血液悪性腫瘍を処置する際に有効かつ強力であることが示されているが、操作されたＴ細胞療法は、固形腫瘍に対処する際に限られた成功しか収めていない。均一に発現された抗原が接近可能であり、効果的に標的化され得る液体腫瘍とは異なり、腫瘍接近及び抗原不均一性は、固形腫瘍におけるＣＡＲ－Ｔ細胞の発達の成功に対する有意な障壁である。本明細書において実証されるように、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ）と、ｉＰＳＣ由来ＣＡＲ－エフェクター細胞を含むＣＡＲ－Ｔ細胞との組み合わせは、異種固形腫瘍に対する抗腫瘍活性を増強する。
１．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現
遺伝子操作されたｉＰＳＣ及びその誘導エフェクター細胞に適用可能なものは、当該技術分野で知られている任意のＣＡＲの設計であり得る。ＣＡＲは、概して、標的結合領域（例えば、抗原認識ドメイン）、膜貫通ドメイン、及び内部ドメインを含む外部ドメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、外部ドメインは、シグナルペプチド若しくはリーダー配列及び／又はスペーサを更に含むことができる。いくつかの実施形態では、内部ドメインは、ＣＡＲを発現するエフェクター細胞を活性化するシグナル伝達ペプチドを更に含むことができる。いくつかの実施形態では、抗原認識ドメインは、抗原に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、抗原認識ドメインは、疾患又は病原体と関連する抗原に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、疾患関連抗原は腫瘍抗原であり、腫瘍は液体腫瘍又は固形腫瘍であってよい。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲを発現するＴ系統細胞又はＮＫ系統細胞のいずれかを活性化するのに好適である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＮＫ特異的シグナル伝達成分を含むＮＫ細胞特異的である。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＡＲ発現ｉＰＳＣに由来し、派生Ｔ系統細胞は、Ｔヘルパー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、αβＴ細胞、γδＴ細胞、又はそれらの組み合わせを含み得る。特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＡＲ発現ｉＰＳＣから派生する。
特定の実施形態では、抗原認識ドメインは、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇＧ、単一可変新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）、サメ重鎖抗体（Ｉｇ－ＮＡＲ）、キメラ抗体、組換え抗体、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、抗イディオタイプ抗体、二重特異性、多重特異性、若しくは多量体抗体、又はその断片であってもよい。抗イディオタイプ抗体は、別の抗体のイディオトープへの結合に特異的であり、イディオトープは、抗体の抗原決定基である。二重特異性抗体は、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ）又はＢｉＫＥ（二重特異性キラー細胞エンゲージャ）であってもよく、多重特異性抗体は、ＴｒｉＫＥ（三重特異性キラー細胞エンゲージャ）であってもよい。抗体断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、Ｆｖ、Ｆａｂｃ、ｐＦｃ、Ｆｄ、一本鎖抗原結合断片（ｓｃＦｖ）、タンデムｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ）、ラクダ重鎖ＩｇＧ及びＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）断片、組換え重鎖のみ抗体（ＶＨＨ）、及び抗体全体の結合特異性を維持する他の抗体断片が含まれる。ＣＡＲによって標的化され得る抗原の非限定的な例には、ＡＤＧＲＥ２、Ｂ７Ｈ３、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡｌＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原（例えば、細胞表面抗原）、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＲ１、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、がん－精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＤＬ１、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、及び当該技術分野で既知の様々な病原体抗原が含まれる。病原体の非限定的な例には、疾患を引き起こす可能性のある、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、及び原生動物が含まれる。
Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）は、免疫チェックポイント阻害剤のＢ７ファミリーに属し、免疫細胞（例えば、抗原提示細胞又はマクロファージ）及び腫瘍細胞上で発現され、Ｔ細胞上で阻害的役割を有し、腫瘍細胞免疫回避に寄与する。最近の研究は、Ｂ７Ｈ３が免疫調節の役割を超えた腫瘍増殖及び転移における重要なプレーヤであることを示している。更に、Ｂ７Ｈ３発現は、卵巣、ＲＣＣ、ＮＳＣＬＣ、膵臓がん、前立腺がん及び結腸がんにおける予後不良と相関している。したがって、本明細書は、遺伝子操作されたｉＰＳＣ及びその派生細胞であって、Ｂ７Ｈ３腫瘍抗原を標的とするＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む、細胞を提供する。
Ｂ７Ｈ３腫瘍抗原を標的とするＣＡＲの様々な実施形態では、ＣＡＲは、Ｂ７Ｈ３に特異的に結合する組換え重鎖のみ抗体（ＶＨＨ）を含む。一実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３６と少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む結合ドメインを含む。別の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３７と少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む結合ドメインを含む。別の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３８と少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む結合ドメインを含む。別の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３９と少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む結合ドメインを含む。別の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号４０と少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む結合ドメインを含む。別の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号４１と少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む結合ドメインを含む。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３６のバリアントを含む結合ドメインを含み、バリアントは、配列番号３６の１、４０、４６、７９、８７、８８、８９、９７、９８、及び１１７を含む位置に１つ以上の突然変異を有する。他の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３６のバリアントによって表されるアミノ酸配列を含み、バリアントは、配列番号３６に従いＱ１Ｅ、Ｔ４０Ａ、Ｅ４６Ｖ、Ｇ７９Ｌ、Ｋ８７Ｒ、Ｐ８８Ａ、Ｄ８９Ｅ、Ｖ９７Ａ、Ｓ９８Ｒ、及びＱ１１７Ｌを含む１つ以上の置換を有する。他の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、及び４１のうちのいずれかによって表されるアミノ酸配列を含む。
配列番号３６
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＷＭＹＷＶＲＱＴＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＮＲＤＧＳＡＴＷＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＧＹＬＱＭＮＳＬＫＰＤＤＴＡＶＹＹＣＶＳＤＰＤＮＹＳＳＤＥＭＶＰＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
（１２２アミノ酸のＶＨＨラクダＢ７Ｈ３）
配列番号３７
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＷＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＶＷＶＳＴＩＮＲＤＧＳＡＴＷＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＤＮＹＳＳＤＥＭＶＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
（１２２アミノ酸のＶＨＨ１）
配列番号３８
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＷＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＶＷＶＳＴＩＮＲＤＧＳＡＴＷＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＳＤＰＤＮＹＳＳＤＥＭＶＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
（１２２アミノ酸のＶＨＨ２）
配列番号３９
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＷＭＹＷＶＲＱＴＰＧＫＧＬＶＷＶＳＴＩＮＲＤＧＳＡＴＷＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＳＤＰＤＮＹＳＳＤＥＭＶＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
（１２２アミノ酸のＶＨＨ３）
配列番号４０
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＷＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＮＲＤＧＳＡＴＷＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＳＤＰＤＮＹＳＳＤＥＭＶＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
（１２２アミノ酸のＶＨＨ４）
配列番号４１
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＷＭＹＷＶＲＱＴＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＮＲＤＧＳＡＴＷＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＧＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＳＤＰＤＮＹＳＳＤＥＭＶＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
（１２２ＡＡ．ＶＨＨ５）
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識領域と膜貫通ドメインとの間にスペーサ／ヒンジが存在するが、いくつかの他の実施形態では、そのようなスペーサ／ヒンジは必要とされない。ＣＡＲに含まれ得る例示的なスペーサは、当該技術分野において一般的に既知であり、ＩｇＧ４スペーサ、ＣＤ２８スペーサ、ＣＤ８スペーサ、又は２つ以上のスペーサの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。スペーサの長さもまた、約１５アミノ酸から約３００アミノ酸以上まで変化し得る。本出願では、説明を容易にするために、約８０アミノ酸未満、例えば１０～８０アミノ酸のスペーサは短いと考えられる。約８０～１８０アミノ酸のスペーサは中程度と考えられ、１８０アミノ酸を超えるスペーサは長いと考えられる。非限定的な例示的スペーサペプチドとしては、配列番号３１～３５のいずれかと少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列によって表されるものが挙げられる。
配列番号３１
ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ
（３９アミノ酸）
配列番号３２
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬ
（８８アミノ酸）
配列番号３３
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＥＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴ
（８９アミノ酸）
配列番号３４
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
（１２９アミノ酸）
配列番号３５
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＥＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
（２２９アミノ酸）
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＢＴＬＡ、ＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、ＣＳ１、ＣＴＬＡ－４、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＥＲＩγ、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＬＡＧ３、ＰＤ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、又はＴ細胞受容体ポリペプチドの天然又は改変膜貫通領域の全長又は少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態では、内部ドメイン（又は細胞内ドメイン）のシグナル伝達ペプチドは、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＳ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２Ｒβ（ＩＬ１５Ｒβ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、又はＮＫＧ２Ｄのポリペプチドの全長又は少なくとも一部分を含む。一実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ペプチドは、ＣＤ３ζの少なくとも１つのＩＴＡＭ（免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ）に対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、内部ドメインは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域を更に含む。共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ－４、若しくはＮＫＧ２Ｄ、又はそれらの任意の組み合わせのポリペプチドの全長又は少なくとも一部を含むことができる。
一実施形態では、本明細書において提供される細胞に適用可能なＣＡＲは、ＣＤ２８から派生する共刺激ドメイン、及び配列番号１と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列によって表されるＣＤ３ζの天然又は改変ＩＴＡＭ１を含むシグナル伝達ドメインを含む。更なる実施形態では、ＣＤ２８から派生する共刺激ドメイン及びＣＤ３ζの天然又は改変ＩＴＡＭ１を含むＣＡＲはまた、ＣＤ２８から派生するヒンジドメイン及び膜貫通ドメインを含み、ｓｃＦｖはヒンジを介して膜貫通ドメインに接続され得、ＣＡＲは、配列番号２と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも８０％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、１００％である。
別の実施形態では、本明細書において提供される細胞に適用可能なＣＡＲは、ＮＫＧ２Ｄに由来する膜貫通ドメイン、２Ｂ４に由来する共刺激ドメイン、及び配列番号３と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列によって表される天然又は改変ＣＤ３ζを含むシグナル伝達ドメインを含む。ＮＫＧ２Ｄから派生する膜貫通ドメイン、２Ｂ４から派生する共刺激ドメイン、及び天然又は改変されたＣＤ３ζを含むシグナル伝達ドメインを含む当該ＣＡＲは、ＣＤ８ヒンジを更に含み得、そのような構造のアミノ酸配列は、配列番号４と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも８０％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、１００％である。
非限定的なＣＡＲ戦略としては、一対の細胞内ドメインの二量体化によるヘテロ二量体条件的活性化ＣＡＲ（例えば、米国特許第９，５８７，０２０号を参照されたい）；スプリットＣＡＲ（ＣＡＲを生成するための抗原結合、ヒンジ、及び内部ドメインの相同組換え（例えば、米国特許出願公開第２０１７／０１８３４０７号を参照されたい））；それぞれ抗原結合ドメイン及びシグナル伝達ドメインに接続された２つの膜貫通ドメイン間の非共有結合を可能にする多重鎖ＣＡＲ（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１３４１４２号を参照されたい）；二重特異性抗原結合ドメインを有するＣＡＲ（例えば、米国特許第９，４４７，１９４号を参照されたい）、又は同じ若しくは異なる抗原若しくはエピトープを認識する一対の抗原結合ドメインを有するＣＡＲ（例えば、米国特許第８，４０９，５７７号を参照されたい）、又はタンデムＣＡＲ（例えば、Ｈｅｇｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１６；１２６（８）：３０３６－３０５２）；誘導性ＣＡＲ（例えば、米国特許出願公開第２０１６／００４６７００号、同第２０１６／００５８８５７号、及び同第２０１７／０１６６８７７号を参照されたい）；スイッチ可能なＣＡＲ（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２１９９７５号を参照されたい）；並びに当該技術分野で既知の任意の他の設計が更に含まれる。
更なる実施形態では、ＣＡＲを含むｉＰＳＣ及びその派生エフェクター細胞は、ＴＣＲ定常領域（ＴＲＡＣ又はＴＲＢＣ）に挿入されたＣＡＲを有し、ＴＣＲノックアウトをもたらし、任意選択でＣＡＲ発現を内因性ＴＣＲプロモータの制御下に置く。ＴＣＲアルファ又はＴＣＲベータの定常領域（ＴＲＡＣ又はＴＲＢＣ）の破壊は、ＴＣＲ陰細胞を産生する。加えて、ＴＣＲの発現は、ｉＰＳＣから分化したＮＫ系統エフェクター細胞においても陰性である。ＴＣＲ陰は、同種異系養子細胞療法において使用される場合、アロ反応性が減少し、ＧｖＨＤ（Ｇｒａｆｔ ｖｅｒｓｕｓ Ｈｏｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ、移植片対宿主病）を予防することができる。ＣＡＲの追加の挿入部位には、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴが含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、ｉＰＳＣ及びその派生ＮＫ細胞はＣＡＲを含み、ＣＡＲをＮＫＧ２Ａ遺伝子座又はＮＫＧ２Ｄ遺伝子座に挿入する場合、ＮＫＧ２Ａ又はＮＫＧ２Ｄノックアウトをもたらし、それにより、ＣＡＲ発現を内因性ＮＫＧ２Ａ又はＮＫＧ２Ｄプロモータの制御下に置く。アルファ－ベータＴ細胞受容体（ＴＣＲαβ）は、免疫応答に必須の抗原特異的受容体であり、αβＴリンパ球の細胞表面に存在する。ペプチド－主要組織適合性複合体（peptide-major histocompatibility complex、ｐＭＨＣ）へのＴＣＲαβの結合は、ＴＣＲ－ＣＤ３細胞内活性化、多数のシグナル伝達分子の動員、並びにシグナル伝達経路の分岐及び統合を開始し、遺伝子発現並びにＴ細胞増殖及び機能獲得に重要な転写因子の動員をもたらす。
したがって、本明細書において提供される機能的モダリティを含む遺伝子操作された免疫細胞に加えて、本発明の態様は、ゲノム操作されたｉＰＳＣを分化させることから得られる派生細胞であって、ｉＰＳＣ及び派生細胞の両方が、１つ以上のＣＡＲ、及び任意選択で、ＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャをコードするポリヌクレオチドを、追加の改変されたモダリティとともに含む、派生細胞を提供する。本明細書に示されるように、Ｂ７Ｈ３腫瘍抗原を標的とするＣＡＲを含むエフェクター細胞は、Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲを発現する免疫細胞（初代Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ｉＰＳＣ由来Ｔ系統細胞、及びｉＰＳＣ由来ＮＫ系統細胞を含むが、これらに限定されない）を活性化して標的腫瘍細胞殺傷を行う一方で、Ｂ７Ｈ３発現がん細胞の標的化及び破壊の増強、腫瘍部位への免疫細胞の浸潤の促進、及び抗がん応答の増強／延長を提供する。本出願において更に提供されるのは、Ｂ７Ｈ３腫瘍抗原を標的とする少なくとも１つのＣＡＲ及び任意選択で表１に列挙される遺伝子型のうちのいずれか１つを有する単一細胞選別及び増殖されたクローン操作ｉＰＳＣを含むマスタ細胞バンクであり、細胞バンクは、更なるｉＰＳＣ操作のためのプラットフォーム及び既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供する。
２．エンゲージャ
いくつかの実施形態では、ＣＡＲを含むｉＰＳＣ及びその派生エフェクター細胞は、ＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャの導入された発現を更に含み得る。エンゲージャは、少なくとも１つの腫瘍抗原に特異的であり、任意選択で、免疫エフェクター細胞の少なくとも１つの表面トリガー受容体にも特異的である。エンゲージャの例には、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲージャ（ＢｉＫＥ）、三重特異性キラー細胞エンゲージャ（ＴｒｉＫＥ）、多重特異性キラー細胞エンゲージャ、又は複数の免疫細胞型と適合し得るユニバーサルエンゲージャが含まれるが、これらに限定されない。二重特異的エンゲージャは、２つ以上のリガンド結合ドメインからなる融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、リガンド結合ドメインは、異なる抗体若しくはその断片の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）又は他の機能的バリアントを含み、ｓｃＦｖは、エフェクター細胞表面分子若しくは表面トリガー受容体、又は腫瘍特異的表面分子を介して腫瘍細胞に結合する。このような二重特異性又は多重特異性エンゲージャは、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、及び／又は好中球）を腫瘍細胞に誘導し、免疫エフェクター細胞を活性化することができ、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の利益を最大化する大きな可能性を示している。
いくつかの実施形態では、エンゲージャの添加は、それを必要とする対象への細胞の輸注の前、間又は後に、エフェクター細胞を含む組成物に行われる。いくつかの実施形態では、エンゲージャは、エフェクター細胞が培養エナゲージャ（enagager）を発現及び／又は分泌するように、エフェクター細胞に含まれるように操作される。いくつかの実施形態では、操作されたｉＰＳＣ派生エフェクター細胞によって発現されるエンゲージャは、エンゲージャによって認識及び結合される表面分子を含むバイスタンダー免疫細胞を係合させる。いくつかの実施形態では、操作されたｉＰＳＣ派生ＣＡＲエフェクター細胞によって発現されるエンゲージャは、派生エフェクター細胞に結合し、ＣＡＲ抗原とは異なる腫瘍抗原に結合すると、派生エフェクター細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、操作されたｉＰＳＣ派生ＣＡＲエフェクター細胞によって発現されるエンゲージャは、エフェクター細胞の内因性表面分子を介して派生エフェクター細胞に結合する。いくつかの実施形態では、操作されたｉＰＳＣ派生ＣＡＲエフェクター細胞によって発現されるエンゲージャは、エフェクター細胞の外因性表面トリガー受容体を介して派生エフェクター細胞に結合する。いくつかの実施形態では、エンゲージャを発現するエフェクター細胞の外因性表面トリガー受容体は、本明細書において更に提供されるようなＣＦＲ（キメラ融合受容体）を含む。
いくつかの実施形態では、表面トリガー受容体は、エフェクター細胞の天然受容体及び細胞型とは無関係に、エフェクター細胞と特異的な標的細胞、例えば腫瘍細胞との間の二重特異性抗体又は多重特異性抗体の結合を促進する。いくつかの他の実施形態では、本明細書において提供される方法及び組成物を使用して、すなわち、ｉＰＳＣを更に操作し、任意選択で、単一細胞選別及び増殖されたクローン操作ｉＰＳＣを含むマスタ細胞バンクを生成し、その後、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はソースｉＰＳＣと同一の遺伝子型を含む任意の他のエフェクター細胞へのｉＰＳＣの分化を指示することによって、１つ以上の外因性表面トリガー受容体をエフェクター細胞に導入することができる。
このアプローチを使用すると、ユニバーサル表面トリガー受容体を含むｉＰＳＣを生成し、そのようなｉＰＳＣをユニバーサル表面トリガー受容体を発現する様々なエフェクター細胞型の集団に分化させることもできる。いくつかの実施形態では、同じ腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャを使用して、異なるユニバーサル表面トリガー受容体とカップリングする。いくつかの実施形態では、異なる腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャを使用して、同じユニバーサル表面トリガー受容体とカップリングする。したがって、１つ以上のエフェクター細胞型を使用して、ある特異的な型の腫瘍細胞を殺傷する場合もあれば、２つ以上の型の腫瘍細胞を殺傷する場合もある。表面トリガー受容体は、概して、エフェクター細胞活性化のための共刺激ドメインと、エンゲージャのエピトープに特異的な抗エピトープと、を含むか、又はその逆であり、表面トリガー受容体は、エンゲージャの抗エピトープに認識可能又は特異的なエピトープを含む。例えば、二重特異性エンゲージャは、一方の端の表面トリガー受容体の抗エピトープに特異的であり、もう一方の端の腫瘍抗原に特異的である。
二重若しくは多重特異性エンゲージャ認識、又はカップリング、又は結合のために使用することができる例示的なエフェクター細胞表面分子、又は表面トリガー受容体としては、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、又は本明細書に開示されるそれらの任意の機能的バリアント若しくはキメラ受容体形態（本出願において更に詳述されるＣＦＲが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、エンゲージャ認識のためにエフェクター細胞の表面に発現するＣＤ１６は、本明細書に記載されるような、ＣＤ１６（Ｆ１７６Ｖ及び任意選択でＳ１９７Ｐを含む）又はＣＤ６４細胞外ドメイン、並びに天然又は非天然の膜貫通、刺激及び／又はシグナル伝達ドメインを含むｈｎＣＤ１６である。いくつかの実施形態では、エンゲージャ認識のためにエフェクター細胞の表面に発現するＣＤ１６は、ＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体（ＣＦｃＲ）である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＮＫＧ２Ｄの膜貫通ドメイン、２Ｂ４の刺激ドメイン、及びＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含み、ＣＤ１６の細胞外ドメインは、ＣＤ６４又はＣＤ１６の細胞外ドメインの全長又は部分配列に由来し、任意選択で、ＣＤ１６の細胞外ドメインは、Ｆ１７６Ｖ及び任意選択でＳ１９７Ｐを含む。
二重特異性又は多重特異性エンゲージャ認識のための例示的な腫瘍細胞表面分子には、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、及びＲＯＲ１が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、二重特異性エンゲージャは、ＣＤ３及びＣＤ１９に特異的な二重特異性抗体（ＣＤ３×ＣＤ１９又はＣＤ３－ＣＤ１９）であり、別の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ３－ＣＤ３３である。別の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ３－ＥｐＣＡＭである。エフェクター細胞上のＣＤ１６に係合するために、二重特異性抗体は、ＣＤ１６－ＣＤ３０又はＣＤ６４－ＣＤ３０を含む。別の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ１６－ＢＣＭＡ又はＣＤ６４－ＢＣＭＡである。更に別の実施形態では、二重特異性抗体は、エフェクター細胞と腫瘍細胞抗原結合ドメインの間にリンカーを更に含み、例えば、改変ＩＬ１５を、エフェクター細胞増殖／自立性を促進するエフェクターＮＫ細胞のリンカーとして（いくつかの刊行物では、ＴｒｉＫＥ、又は三重特異性キラーエンゲージャと呼ばれる）使用してもよい。一実施形態では、ＴｒｉＫＥは、ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＥｐＣＡＭ又はＣＤ６４－ＩＬ１５－ＥｐＣＡＭである。一実施形態では、ＴｒｉＫＥは、ＣＤ１６－ＩＬ１５－Ｂ７Ｈ３又はＣＤ６４－ＩＬ１５－Ｂ７Ｈ３である。別の実施形態では、ＴｒｉＫＥはＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＤ３３又はＣＤ６４－ＩＬ１５－ＣＤ３３である。更に別の実施形態では、ＴｒｉＫＥはＮＫＧ２Ｃ－ＩＬ１５－ＣＤ３３である。ＴｒｉＫＥにおけるＩＬ１５はまた、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１８、及びＩＬ２１を含むが、これらに限定されない、他のサイトカインに由来し得る。
いくつかの実施形態では、エンゲージャは、ＡＤＧＲＥ２、Ｂ７Ｈ３、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡｌＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原（例えば、細胞表面抗原）、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＲ１、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、がん－精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＤＬ１、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、及び様々な病原体抗原のうちのいずれか１つに特異的な第１の結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、エンゲージャは、第１の結合ドメインの特異性とは異なる特異性を有する第２の結合ドメインを含む。様々な実施形態では、第２の結合ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、又はそれらの任意の機能的バリアントの細胞外部分を含む。いくつかの実施形態では、エンゲージャは、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間にサイトカイン若しくはそのバリアントを含み、サイトカインは、以下で更に検討するように、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、及びＩＬ２１のうちの少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態では、二重特異性又は多重特異性のエンゲージャのための表面トリガー受容体は、ときには細胞型に応じて、エフェクター細胞に対して内因性であり得る。いくつかの他の実施形態では、本明細書において提供される方法及び組成物を使用して、すなわち、表１に列挙された遺伝子型を含むｉＰＳＣを更に操作し、ソースｉＰＳＣと同一の遺伝子型と表面トリガー受容体を含むエフェクター細胞へのｉＰＳＣの分化を指示することによって、１つ以上の外因性表面トリガー受容体をエフェクター細胞に導入することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるようなエンゲージャを発現するゲノム操作されたエフェクター細胞の代替として、エンゲージャは、状態、疾患、又は適応症（上記のような）と関連する１つ以上の抗原を標的とする併用療法組成物においてエフェクター細胞とともに治療剤として使用され得る。いくつかの実施形態では、エンゲージャは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ）である。いくつかの実施形態では、エンゲージャは、二重特異性キラー細胞エンゲージャ（ＢｉＫＥ）である。いくつかの実施形態では、エンゲージャは、三重特異性キラー細胞エンゲージャ（ＴｒｉＫＥ）である。いくつかの実施形態では、エンゲージャは、多重特異性キラー細胞エンゲージャである。いくつかの実施形態では、エンゲージャは、複数の免疫細胞型と適合性のユニバーサルエンゲージャである。いくつかの実施形態では、併用療法組成物中のエンゲージャは、組成物のレシピエントにおける腫瘍殺傷のためにバイスタンダー免疫細胞を活性化させる。いくつかの実施形態では、併用療法組成物中のエンゲージャは、併用療法組成物に含まれるエフェクター細胞を活性化させる。液体腫瘍又は固形腫瘍の治療に有用な併用療法組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、本明細書において提供されるような、少なくともＣＡＲを含むｉＰＳＣ由来エフェクター細胞を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、表１に列挙された遺伝子型を含む造血系統細胞を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、表１に列挙された遺伝子型を含むＮＫ系統細胞を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、表１に列挙された遺伝子型を含むＴ系統細胞を含む。
３．細胞表面ＣＦＲ（キメラ融合受容体）
ＣＦＲの実施は、エフェクター細胞が、ＣＦＲを発現するエフェクター細胞の増強された治療特性のために選択されたアゴニストとのＣＦＲ結合を介して適切なシグナル伝達カスケードを開始することを可能にする。このような増強されたエフェクター細胞治療特性としては、増加された活性化及び細胞傷害性、獲得された二重標的化能力、延長された持続性、改善された輸送及び腫瘍浸透、腫瘍部位にバイスタンダー免疫細胞をプライミングする、活性化させる又は動員する増強された能力、免疫抑制に抵抗する増強された能力、腫瘍抗原エスケープをレスキューする改善された能力、並びに／又は制御された細胞シグナル伝達フィードバック、代謝及びアポトーシスが挙げられるが、これらに限定されない。
したがって、様々な態様では、ＣＡＲ及び任意選択でエンゲージャを含むｉＰＳＣ及び派生細胞は、内部ドメインに作動可能に接続された膜貫通ドメインに融合した外部ドメインを概して含むＣＦＲを更に含み得、ＣＦＲは、外部ドメイン、膜貫通、又は内部ドメインのいずれにおいても、ＥＲ（小胞体）保持シグナルもエンドサイトーシスシグナルも有しない。ＣＦＲの外部ドメインは、エンゲージャに結合するとシグナル伝達を開始するためのものであり、膜貫通ドメインは、ＣＦＲの膜固定のためのものであり、内部ドメインは、腫瘍殺傷、持続性、移動性、分化、ＴＭＥの打ち消し、及び／又は制御されたアポトーシスを含むがこれらに限定されない細胞治療特性を増強するために選択されるシグナル伝達経路を調節する（すなわち、活性化又は不活性化させる）少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む。ＣＦＲからのＥＲ保持シグナルの排除は、発現された場合に、それ自体によるＣＦＲ細胞表面提示を可能にし、ＣＦＲからのエンドサイトーシスシグナルの排除は、ＣＦＲ内在化及び表面下方制御を減少させる。ＥＲ保持もエンドサイトーシスシグナルも有しないドメイン成分を選択するか、又は分子工学ツールを用いてＣＦＲの選択された成分からＥＲ保持若しくはエンドサイトーシスシグナルを除去することが重要である。加えて、本明細書において提供されるＣＦＲのドメインはモジュール式であり、これは、ＣＦＲの所与の内部ドメインについては、ＣＦＲの外部ドメインが、当該ＣＦＲとともに使用される選択されたアゴニスト、例えば抗体、ＢｉＴＥ、ＴＲｉＫＥ、又は任意の他のタイプのエンゲージャの結合特異性に応じて切り替え可能であり、所与の外部ドメイン及び特異性マッチングアゴニストについては、内部ドメインが、活性化される所望のシグナル伝達経路に応じて切り替え可能であることを意味する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＦＲの外部ドメインは、細胞－細胞シグナル伝達又は相互作用に関与するタンパク質の細胞外部分の全長又は部分長を含む。いくつかの実施形態では、ＣＦＲの外部ドメインは、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、又はそれらの任意の機能的バリアント、若しくは組み合わせ及びキメラの細胞外部分の全長又は部分長を含む。いくつかの実施形態では、ＣＦＲの外部ドメインは、少なくともアゴニスト、例えば、ＣＦＲの外部ドメインに含まれるエピトープに特異的な結合ドメインを含む抗体又はエンゲージャ（例えば、ＢｉＴＥ、ＢｉＫＥ又はＴｒｉＫＥ）によって認識される。いくつかの実施形態では、ＣＦＲ発現細胞とともにアゴニストとして使用される抗体又はエンゲージャは、ＣＦＲの少なくとも１つの細胞外エピトープに結合し、ＣＦＲは、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、又はそれらの任意の機能的バリアント若しくは組み合わせた／キメラ形態の細胞外部分の全長又は部分長を含む。いくつかの実施形態では、エンゲージャは、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、若しくはＲＯＲ１を含む少なくとも１つの腫瘍抗原を認識する。特定の実施形態では、ＥＲ保持シグナル及びエンドサイトーシスシグナルの両方が存在しないか、又は遺伝子操作法を使用してＣＦＲ外部ドメインから除去若しくは排除される。
いくつかの実施形態では、ＣＦＲの外部ドメインは、ＣＤ３ベースのアゴニストを利用するために、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ又はそれらの任意の機能的バリアント若しくは組み合わせ／キメラ形態の細胞外部分の全長又は部分長を含む。抗体又はエンゲージャを含むがこれらに限定されない非限定的な例示的ＣＤ３ベースのアゴニストは、ＣＤ３×ＣＤ１９、ＣＤ３×ＣＤ２０、ＣＤ３×ＣＤ３３、ＣＤ３×ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３×Ｂ７Ｈ３、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、エルツマキソマブ、ＲＯ６９５８６８８、ＡＦＭ１１、ＭＴ１１０／ＡＭＧ１１０、ＭＴ１１１／ＡＭＧ２１１／ＭＥＤＩ－５６５、ＡＭＧ３３０、ＭＴ１１２／ＢＡＹ２０１０１１２、ＭＯＲ２０９／ＥＳ４１４、ＭＧＤ００６／Ｓ８０８８０、ＭＧＤ００７、及び／又はＦＢＴＡ０５を含む。いくつかの実施形態では、ＣＦＲの外部ドメインは、ＮＫＧ２Ｃベースのアゴニストを利用するために、ＮＫＧ２Ｃ若しくはその任意の機能的バリアントの細胞外部分の全長又は部分長を含む。抗体又はエンゲージャを含むがこれらに限定されない非限定的な例示的なＮＫＧ２Ｃベースのアゴニストは、ＮＫＧ２Ｃ－ＩＬ１５－ＣＤ３３、ＮＫＧ２Ｃ－ＩＬ１５－ＣＤ１９、及び／又はＮＫＧ２Ｃ－ＩＬ１５－ＣＤ２０を含む。いくつかの他の実施形態では、ＣＦＲの外部ドメインは、ＣＤ２８ベースのアゴニストを利用するために、ＣＤ２８若しくはその任意の機能的バリアントの細胞外部分の全長又は部分長を含む。抗体又はエンゲージャを含むがこれらに限定されない非限定的な例示的なＣＤ２８ベースのアゴニストは、１５Ｅ８、ＣＤ２８．２、ＣＤ２８．６、ＹＴＨ９１３．１２、３７．５１、９Ｄ７（ＴＧＮ１４１２）、５．１１Ａ１、ＡＮＣ２８．１／５Ｄ１０、及び／又は３７４０７のうちの少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＦＲの外部ドメインは、ＣＤ１６又はＣＤ６４ベースのアゴニストを利用するために、ＣＤ１６、ＣＤ６４、又はそれらの任意の機能的バリアント若しくは組み合わせ／キメラ形態の細胞外部分の全長又は部分長を含む。抗体又はエンゲージャを含むがこれらに限定されない非限定的な例示的なＣＤ１６又はＣＤ６４ベースのアゴニストは、ＩｇＧ抗体、又はＣＤ１６若しくはＣＤ６４ベースのエンゲージャを含む。ＩｇＧ抗体のＦｃ部分がＣＤ１６又はＣＤ６４ベースのＣＦＲに結合すると、それは、ＣＦＲの内部ドメインに含まれるシグナル伝達ドメインによって付与される他の増強された治療特性とともに、ＣＦＲ発現細胞における抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を活性化させる。非限定的な例示的なＣＤ１６又はＣＤ６４ベースのアゴニスト（抗体又はエンゲージャが挙げられるが、これらに限定されない）は、ＣＤ１６×ＣＤ３０、ＣＤ６４×ＣＤ３０、ＣＤ１６×ＢＣＭＡ、ＣＤ６４×ＢＣＭＡ、ＣＤ１６－ＩＬ－Ｂ７Ｈ３、ＣＤ６４－ＩＬ－Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１６－ＩＬ－ＥｐＣＡＭ若しくはＣＤ６４－ＩＬ－ＥｐＣＡＭ、ＣＤ１６－ＩＬ－ＣＤ３３、又はＣＤ６４－ＩＬ－ＣＤ３３のうちの少なくとも１つを含み、ＴｒｉＫＥに含まれる「ＩＬ」は、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、又はそれらの任意の機能的バリアント若しくは組み合わせ／キメラ形態を含む少なくとも１つのサイトカインの全て又は一部分を含む。
概して、膜貫通ドメインは、生体膜（例えば、細胞又は細胞小胞の膜）のリン脂質二重層などの膜において熱力学的に安定である三次元タンパク質構造である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のＣＦＲの膜貫通ドメインは、単一のアルファヘリックス、いくつかの膜貫通アルファヘリックスの安定な複合体、膜貫通ベータバレル、グラミシジンＡのベータヘリックス、又はそれらの任意の組み合わせを含む。様々な実施形態では、ＣＦＲの膜貫通ドメインは、膜内にある「膜貫通タンパク質」又は「膜タンパク質」の全て又は一部分を含む。本明細書で使用されるとき、「膜貫通タンパク質」又は「膜タンパク質」は、膜に及び／又は膜内に位置するタンパク質である。本発明のＣＦＲに含まれる膜貫通ドメインを提供するのに好適な膜貫通タンパク質の例としては、受容体、リガンド、免疫グロブリン、グリコホリン、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＣＦＲに含まれる膜貫通ドメインは、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＢＴＬＡ、ＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、ＣＳ１、ＣＴＬＡ－４、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＥＲＩγ、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＬＡＧ３、ＰＤ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、Ｔ細胞受容体ポリペプチド（例えば、ＴＣＲα及び／又はＴＣＲβ）、ニコチン性アセチルコリン受容体、ＧＡＢＡ受容体、又はそれらの任意の組み合わせの膜貫通ドメインの全部又は一部分を含む。
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はそれらの任意の組み合わせの膜貫通ドメインの全部又は一部分を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、グリコホリンＡ、グリコホリンＤ、又はそれらの任意の組み合わせの膜貫通ドメインの全部又は一部分を含む。ＣＦＲ膜貫通ドメインの特定の実施形態では、ＥＲ保持及びエンドサイトーシスシグナルの両方が存在しないか、又は遺伝子操作を使用して除去される。様々な実施形態では、ＥＲ保持シグナル及びエンドサイトーシスシグナルの両方が存在しないか、又は遺伝子操作法を使用してＣＦＲ膜貫通ドメインから除去若しくは排除される。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ８、又はＣＤ４の膜貫通ドメインの全部又は一部分を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＦＲの内部ドメインは、選択された細胞内シグナル伝達経路を活性化する少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む。ＣＦＲ内部ドメインの様々な実施形態では、ＥＲ保持及びエンドサイトーシスシグナルの両方が存在しないか、又は遺伝子操作法を使用してそれから除去若しくは排除される。いくつかの実施形態では、内部ドメインは、少なくとも細胞傷害性ドメインを含む。いくつかの他の実施形態任意選択ででは、内部ドメインは、細胞傷害性ドメインに加えて、共刺激ドメイン、持続性シグナル伝達ドメイン、死誘導シグナル伝達ドメイン、腫瘍細胞制御シグナル伝達ドメイン、又はそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、内部ドメイン（又は細胞内ドメイン）のシグナル伝達ペプチドは、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＳ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２Ｒβ（ＩＬ１５Ｒβ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、又はＮＫＧ２Ｄのポリペプチドの全長又は少なくとも一部分を含む。いくつかの実施形態では、ＣＦＲの細胞傷害性ドメインは、ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、又はＮＫＧ２Ｄのポリペプチドの全長又は一部分を含む。一実施形態では、ＣＦＲの細胞傷害性ドメインは、ＣＤ３ζの少なくとも１つのＩＴＡＭ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ）に対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＣＦＲの細胞傷害性ドメインは、改変ＣＤ３ζを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＦＲは、細胞傷害性シグナル伝達ドメインに加えて共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。ＣＦＲでの使用に好適な共刺激ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ－４、若しくはＮＫＧ２Ｄ、又はそれらの任意の組み合わせのポリペプチドの全長又は少なくとも一部分を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＣＦＲの共刺激ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、若しくはそれらの組み合わせのポリペプチドの全長又は少なくとも一部分を含む。いくつかの実施形態では、ＣＦＲは、ＣＤ２８の共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ（「２８ζ」とも称される）の細胞傷害性ドメインと、を含む内部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＦＲの内部ドメインの－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ部分は、配列番号１と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列によって表される。
いくつかの実施形態では、ＣＦＲは、細胞傷害性シグナル伝達ドメイン及び／又は共刺激ドメインに加えて持続性シグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。ＣＦＲでの使用に好適な持続性シグナル伝達ドメインとしては、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、ＩＬ１８Ｒ、ＩＬ２３Ｒ、又はそれらの組み合わせなどのサイトカイン受容体の内部ドメインの全部又は一部が挙げられるが、これらに限定されない。追加の実施形態では、ＣＦＲの内部ドメインは、腫瘍細胞制御を提供するためのＥＧＦＲなどの受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、若しくは制御された細胞死能力を提供するためのＦＡＳなどの腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の完全な又は部分的な細胞内部分を含み得る。
様々な実施形態では、例示的なＣＦＲは、例えば、配列番号５と少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸によって表される、ＣＤ３サブユニット－ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、又はＣＤ３γ、又はＣＤ２８の少なくとも１つの細胞外部分、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８と少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列によってそれぞれ表される、ＣＤ２８、ＣＤ８、又はＣＤ４の膜貫通ドメイン、並びに外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び／又は内部ドメイン中のＥＲ保持モチーフ及び／又はエンドサイトーシスモチーフが排除された、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、又はＣＤ２８の内部ドメインを含む。例えば、ＣＤ３ε野生型内部ドメイン配列（配列番号９）へのＲ１８３Ｓ変異の導入は、ＥＲ保持モチーフを排除し、配列番号１０と少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列によって表されるＣＤ３ε内部ドメインバリアントをもたらす。ＣＤ３δ野生型内部ドメイン配列（配列番号１１）へのＬ１４２Ａ及びＲ１６９Ａ変異の導入は、ＷＴ配列からエンドサイトーシスモチーフ及びＥＲ保持モチーフを排除し、配列番号１２と少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列によって表されるＣＤ３δ内部ドメインバリアントをもたらす。更に、ＣＤ３γ野生型内部ドメイン配列（配列番号１３）へのＬ１３１Ａ及びＲ１５８Ａ突然変異の導入は、ＷＴ配列からＥＲ保持モチーフを排除し、配列番号１４と少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列によって表されるＣＤ３γ内部ドメインバリアントをもたらす。ＣＤ２８野生型内部ドメインは、ＥＲ保持モチーフもエンドサイトーシスモチーフも有さず、配列番号１５と少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列によって表される。様々な実施形態では、本明細書において提供されるＣＦＲは、ＣＦＲ外部ドメインのＮ末端にシグナルペプチドを更に含む。非限定的な例示的シグナルペプチドとしては、配列番号１６と少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列によって表されるものが挙げられる。
いくつかの例示的な実施形態では、ＣＦＲは、１つのＣＤ３サブユニットの外部ドメインを含み、いくつかの他の実施形態では、ＣＦＲは、ＣＤ３δ又はＣＤ３γ（それぞれ、配列番号１７又は配列番号１８）の外部ドメインと連結されたＣＤ３εの外部ドメインを含む単鎖ヘテロ二量体外部ドメインを含む。単鎖ヘテロ二量体外部ドメインにおけるリンカーのタイプ、長さ、及び配列は、変動し得る。
本明細書に記載される様々な構築物中の細胞表面発現ＣＦＲ（ＣＤ３ベースのＣＦＲを含み、いくつかの文脈ではｃｓ－ＣＤ３とも呼ばれる）は、選択された結合特異性を有する分子と結合するための細胞表面トリガー受容体として機能することができ、この分子には、抗体、エンゲージャ、及び／又はＣＡＲが含まれる。エフェクター細胞の細胞表面発現ＣＦＲは、当該エフェクター細胞によって発現されるエンゲージャとともに機能してもよい。本発明のＣＡＲ、任意選択でエンゲージャ、及び／又は１つ以上のＣＦＲをコードするポリヌクレオチドを含む細胞は、ヒト細胞及び非ヒト細胞、多能性細胞若しくは非多能性細胞、免疫細胞若しくは免疫調節細胞、ＡＰＣ（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ、抗原提示細胞）若しくはフィーダ細胞、初代供給源（例えば、ＰＭＢＣ）由来の細胞、又は培養若しくは操作された細胞（例えば、細胞株、細胞、及び／又はｉＰＳＣから分化した派生細胞）由来の細胞を含む、任意のタイプの細胞であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ、任意選択でエンゲージャ、及び／又は１つ以上のＣＦＲをコードするポリヌクレオチドを含む細胞は、初代若しくは派生ＣＤ３４＋細胞、造血幹前駆細胞、造血多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ系統細胞、ＮＫＴ系統細胞、ＮＫ系統細胞、又はＢ系統細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ、任意選択でエンゲージャ、及び／又は１つ以上のＣＦＲをコードするポリヌクレオチドを含む派生細胞は、ＣＡＲ、任意選択でエンゲージャ、及び／又は１つ以上のＣＦＲをコードするポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣを分化させることから得られるエフェクター細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ、任意選択でエンゲージャ、及び／又は１つ以上のＣＦＲをコードするポリヌクレオチドを含む派生エフェクター細胞は、ｉＰＳＣから派生エフェクター細胞を生成した後に、ＣＡＲ、任意選択でエンゲージャ、及び／又は１つ以上のＣＦＲを組み込むように派生エフェクター細胞を操作することから得られる。ＣＡＲ、任意選択でエンゲージャ、ＴＣＲ陰、及び／又は１つ以上のＣＦＲを含むｉＰＳＣ及びそれから派生した細胞において、１つ以上のＣＦＲは、別個の構築物においてＣＡＲ及び任意選択でエンゲージャとともに発現されてもよく、又は１つ以上のＣＦＲ、ＣＡＲ及び任意選択でエンゲージャを含むバイシストロン性構築物において共発現されてもよい。
更に提供されるように、ＣＡＲ、任意選択でエンゲージャ、ＴＣＲ陰、及び／又は１つ以上のＣＦＲをコードするポリヌクレオチドを含む細胞又はその集団は、本明細書に記載される、及び／又は表１に示される１つ以上の追加の操作されたモダリティを更に含み得る。本出願において更に提供されるのは、本明細書において提供されるような少なくとも１つの表現型を有する、単一細胞選別及び増殖されたクローン操作ｉＰＳＣを含むマスタ細胞バンクであり、この細胞バンクは、更なるｉＰＳＣ操作のためのプラットフォームと、組成が明確かつ均一であり、費用効果の高い様式でかなりの規模で大量生産することができる、既製の操作された均質なエフェクター細胞を製造するための再生可能な供給源を提供する。
４．ＣＤ１６ノックイン
ＣＤ１６は、２つのアイソフォーム、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ；ＮＭ＿０００５６９．６）及びＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ；ＮＭ＿０００５７０．４）として同定されている。ＣＤ１６ａは、標的細胞に付着した単量体ＩｇＧに結合してＮＫ細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を促進する、ＮＫ細胞によって発現される膜貫通タンパク質である。ＣＤ１６ｂはヒト好中球によって排他的に発現する。本明細書で使用されるとき、「高親和性ＣＤ１６」、「非切断性ＣＤ１６」、又は「高親和性の非切断性ＣＤ１６」（ｈｎＣＤ１６と略される）は、様々なＣＤ１６バリアントを指す。野生型ＣＤ１６は親和性が低く、ＮＫ細胞が活性化されると、白血球上の様々な細胞表面分子の細胞表面密度を調節するタンパク質分解切断プロセスである外部ドメイン脱落を含む下方制御に供される。Ｆ１７６Ｖ（いくつかの刊行物ではＦ１５８Ｖとも呼ばれる）は、高親和性を有する例示的なＣＤ１６多型アレル／バリアントであり、一方、Ｓ１９７Ｐバリアントは、ＣＤ１６の遺伝子操作された非切断性バージョンの一例である。Ｆ１７６ＶとＳ１９７Ｐの両方を含む操作されたＣＤ１６バリアントは、高い親和性を有し、非切断性であり、これは、国際公開第２０１５／１４８９２６号により詳細に記載されており、その完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれる。加えて、ＣＤ１６の外部ドメインがＣＤ６４の外部ドメインの少なくとも一部分で本質的に置き換えられたキメラＣＤ１６受容体は、ＡＤＣＣを実行することができるＣＤ１６受容体の望ましい高親和性及び切断不可能という特質も実現することができる。いくつかの実施形態では、キメラＣＤ１６の置換外部ドメインは、ＣＤ６４（ＵｎｉＰＲｏｔＫＢ＿Ｐ１２３１４又はそのアイソフォーム又は多型バリアント）のＥＣ１、ＥＣ２、及びＥＣ３エクソンのうちの１つ以上を含む。
したがって、細胞に導入された外因性ＣＤ１６の様々な実施形態は、機能的ＣＤ１６バリアント及びそのキメラ受容体を含む。いくつかの実施形態では、機能的ＣＤ１６バリアントは、高親和性の非切断性ＣＤ１６受容体（ｈｎＣＤ１６）である。いくつかの実施形態では、ｈｎＣＤ１６は、Ｆ１７６ＶとＳ１９７Ｐの両方を含み、いくつかの実施形態では、Ｆ１７６Ｖを含み、切断領域が排除されている。いくつかの他の実施形態では、ｈｎＣＤ１６は、例示的な配列である、各々がＣＤ６４外部ドメインの少なくとも一部分を含む配列番号１９、２０、及び２１のうちのいずれかと比較されるとき、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも８０％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、１００％である。配列番号１９、２０、及び２１は、それぞれ、配列番号２２～２４によってコードされる。本明細書及び本出願全体で使用されるように、２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要のあるギャップの数と各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）である。配列の比較と２つの配列間の同一性パーセントの決定は、当該技術分野で認識されている数学的アルゴリズムを使用して実行され得る。
したがって、本明細書において企図され、記載される他の編集の中でも、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントを含むように遺伝子操作されたエフェクター細胞又はｉＰＳＣが本明細書において提供され、エフェクター細胞は、初代供給源由来の細胞であるか、若しくはｉＰＳＣ分化に由来する細胞であるか、又は遺伝子操作されたｉＰＳＣは、ｉＰＳＣに導入された外因性ＣＤ１６又はそのバリアントを含む派生エフェクター細胞に分化することができる。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６は、高親和性の非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）である。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６は、ＣＤ６４外部ドメインの少なくとも一部分を含む。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６は、ＣＤ１６に由来しない膜貫通ドメイン、刺激性ドメイン及び／又はシグナル伝達ドメインを含むＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体（ＣＦｃＲ）の形態である。
いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントを含む初代由来（sourced）又は由来（derived）エフェクター細胞は、ＮＫ系統細胞である。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントを含む初代由来又は由来エフェクター細胞は、Ｔ系統細胞である。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６は、ｈｎＣＤ１６を含む。いくつかの実施形態では、ｈｎＣＤ１６は、ＣＤ６４の全長又は部分長細胞外ドメインを含む。ｉＰＳＣ又はエフェクター細胞に含まれる外因性ＣＤ１６又はその機能的バリアントは、結合時に下流シグナル伝達を誘発するリガンドへの結合において高い親和性を有する。外因性ＣＤ１６又は機能的バリアントに結合するリガンドは、ＡＤＣＣ抗体又はその断片だけでなく、当該外因性ＣＤ１６のＣＤ１６又はＣＤ６４の細胞外結合ドメインを認識する二重特異性、三重特異性、又は多重特異性のエンゲージャ又はバインダを含む。このように、本出願の態様のうちの少なくとも１つは、本出願で更に詳述する状態、疾患、又は感染症の治療における治療的使用に十分な量で、エフェクター細胞上で発現する外因性ＣＤ１６を介して１つ以上の予め選択されたＡＤＣＣ抗体が予めロードされた、派生エフェクター細胞又はその細胞集団を提供し、上記外因性ＣＤ１６は、ＣＤ６４の、又はＦ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐを有するＣＤ１６の細胞外結合ドメインを含む。
いくつかの他の実施形態では、外因性ＣＤ１６は、ＣＤ１６又はそのバリアントをベースとするＣＦｃＲを含む。キメラＦｃ受容体（ＣＦｃＲ）は、天然ＣＤ１６膜貫通及び／又は細胞内ドメインを改変又は置換することによって、非天然膜貫通ドメイン、非天然刺激ドメイン及び／又は非天然シグナル伝達ドメインを含むように産生される。本明細書で使用される「非天然」という用語は、膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、又はシグナル伝達ドメインが、細胞外ドメインを提供する受容体以外の異なる受容体から派生することを意味する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６又はそのバリアントに基づくＣＦｃＲは、ＣＤ１６から派生する膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、又はシグナル伝達ドメインを有しない。いくつかの実施形態では、外因性のＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、又はＴ細胞受容体ポリペプチドに由来する非天然の膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、外因性のＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ－４、又はＮＫＧ２Ｄポリペプチドに由来する非天然の刺激／阻害ドメインを含む。いくつかの実施形態では、外因性のＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、又はＮＫＧ２Ｄポリペプチドに由来する非天然のシグナル伝達ドメインを含む。ＣＤ１６ベースのＣＦｃＲの一実施形態では、提供されるキメラＦｃ受容体は、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、又はＮＫＧ２Ｄポリペプチドのうちの１つから両方が派生する膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含む。ＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の特定の例示的な一実施形態は、ＮＫＧ２Ｄの膜貫通ドメイン、２Ｂ４の刺激ドメイン、及びＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含み、ＣＦｃＲの細胞外ドメインは、ＣＤ６４又はＣＤ１６の細胞外ドメインの全長又は部分配列に由来し、ＣＤ１６の細胞外ドメインは、Ｆ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐを含む。ＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の別の例示的な実施形態は、ＣＤ３ζの膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含み、ＣＦｃＲの細胞外ドメインは、ＣＤ６４又はＣＤ１６の細胞外ドメインの全長又は部分配列に由来し、ＣＤ１６の細胞外ドメインは、Ｆ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐを含む。
上述のようなＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の様々な実施形態は、抗体又はその断片のＦｃ領域に、又は、二重特異性、三重特異性、若しくは多重特異性のエンゲージャ若しくはバインダに、高い親和性で結合することができる。結合すると、キメラ受容体の刺激ドメイン及び／又はシグナル伝達ドメインは、エフェクター細胞の活性化及びサイトカイン分泌、並びに抗体が、又は腫瘍抗原結合成分及びＦｃ領域を有する上記の二重特異性、三重特異性、若しくは多重特異性のエンゲージャ若しくはバインダが標的とする腫瘍細胞の殺傷を可能にする。理論に制限されることなく、ＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の、非天然の膜貫通、刺激及び／若しくはシグナル伝達ドメインを通じて、又は外部ドメインへのエンゲージャの結合を通じて、ＣＦｃＲはエフェクター細胞の殺傷能力に寄与し得、エフェクター細胞の増殖及び／又は増殖の可能性を増加させる。抗体及びエンゲージャは、抗原を発現している腫瘍細胞とＣＦｃＲを発現しているエフェクター細胞を近接させることができ、これも増強された腫瘍細胞の殺傷に寄与する。二重特異性、三重特異性、多重特異性エンゲージャ又はバインダのための例示的な腫瘍抗原には、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、及びＲＯＲ１が含まれるが、これらに限定されない。腫瘍細胞を攻撃する際にＣＤ１６ベースのＣＦｃＲを発現するエフェクター細胞を結合させるのに好適ないくつかの非限定的な例示的な二重特異性、三重特異性、多重特異性のエンゲージャ又はバインダには、ＣＤ１６（又はＣＤ６４）－ＣＤ３０、ＣＤ１６（又はＣＤ６４）－ＢＣＭＡ、ＣＤ１６（又はＣＤ６４）－ＩＬ１５－ＥｐＣＡＭ、及びＣＤ１６（又はＣＤ６４）－ＩＬ１５－ＣＤ３３が含まれる。
ＮＫ細胞活性化に続いて細胞表面から切断される初代ＮＫ細胞によって発現される内因性ＣＤ１６とは異なり、派生ＮＫ細胞の様々な非切断性バージョンのＣＤ１６は、ＣＤ１６の脱落を回避し、一定の発現を維持する。誘導ＮＫ細胞では、非切断性ＣＤ１６は、改善した細胞機能の指標であるＴＮＦα及びＣＤ１０７ａの発現を増加させる。非切断性ＣＤ１６はまた、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び二重、三重、又は多重特異的エンゲージャの結合も増強する。ＡＤＣＣは、抗体でコーティングされた標的細胞へのＣＤ１６の結合を介したＮＫ細胞媒介性溶解のメカニズムである。由来ＮＫ細胞に導入されたｈｎＣＤ１６の追加の高親和性特性により、細胞療法を必要とする対象に細胞を投与する前に、ｈｎＣＤ１６を介したＡＤＣＣ抗体のＮＫ細胞へのインビトロ負荷も可能になる。本明細書において提示されるように、ｈｎＣＤ１６は、いくつかの実施形態では、Ｆ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐを含み得、又は配列番号１９、２０、若しくは２１によって例示されるようにＣＤ６４に由来する全長又は部分長の外部ドメインを含み得、又は非天然の膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、及びシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも１つを更に含み得る。開示されるように、本出願はまた、本出願で更に詳しく説明するように、状態、疾患、又は感染症の治療における治療的使用に十分な量の１つ以上の予め選択されたＡＤＣＣ抗体が予めロードされた、派生ＮＫ細胞又はその細胞集団を提供する。
初代ＮＫ細胞とは異なり、初代供給源（すなわち、末梢血、臍帯血、又は他のドナー組織などの天然／天然源）由来の成熟Ｔ細胞はＣＤ１６を発現しない。発現した外因性の非切断性ＣＤ１６を含むｉＰＳＣが、Ｔ系統細胞の発生生物学を損なうことなく、外因性ＣＤ１６を発現するだけでなく、獲得したＡＤＣＣメカニズムを通じて機能を実行することができる機能的な派生Ｔ細胞に分化することができることは予想外であった。派生Ｔ系統細胞で獲得したこのＡＤＣＣは、二重標的化、及び／又はＣＡＲ－Ｔ細胞療法でよく発生する、低下若しくは消失したＣＡＲ－Ｔ標的抗原の発現、若しくはＣＡＲによる認識を回避する変異抗原の発現を伴って腫瘍が再発する、抗原エスケープを救済するためのアプローチとして更に使用され得る。上記派生Ｔ系統細胞が、外因性ＣＤ１６（機能的バリアント及びＣＤ１６ベースのＣＦｃＲを含む）発現を介して獲得したＡＤＣＣを含み、抗体又はエンゲージャが、ＣＡＲが標的とする腫瘍抗原とは異なる腫瘍抗原を標的とする場合、抗体又はエンゲージャを使用してＣＡＲ－Ｔ抗原エスケープを救済し、ＣＡＲ－Ｔ治療でよく見られる標的腫瘍の再発又は再発を軽減又は防止することができる。二重標的化を達成しながら抗原エスケープを低減及び／又は防止するこのような戦略は、１つ以上のＣＡＲを発現するＮＫ細胞にも同様に適用可能である。
したがって、本発明の実施形態は、本明細書において提供されるＣＡＲ及び任意選択でエンゲージャに加えて、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントを含む派生Ｔ系統細胞を提供する。いくつかの実施形態では、派生Ｔ系統細胞に含まれるＣＤ１６は、Ｆ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐを含むＣＤ１６外部ドメインを含むｈｎＣＤ１６である。いくつかの他の実施形態では、派生Ｔ系統細胞に含まれるｈｎＣＤ１６は、配列番号１９、２０又は２１によって例示されるような、ＣＤ６４に由来する全長又は部分長の外部ドメインを含むか、又は非天然の膜貫通ドメイン、刺激ドメイン及びシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも１つを更に含み得る。本明細書で説明されているように、そのような派生Ｔ系統細胞は、抗体の治療効果を高めるためにＡＤＣＣによって媒介されたモノクローナル抗体で腫瘍を標的とする獲得されたメカニズムを有する。開示されるように、本出願はまた、以下で更に詳しく説明するように、状態、疾患、又は感染症の治療における治療的使用に十分な量の１つ以上の予め選択されたＡＤＣＣ抗体が予めロードされた、派生Ｔ系統細胞又はその集団を提供する。
更に提供されるように、ＣＡＲ、任意選択でエンゲージャ、ＴＣＲ陰、並びに／又は１つ以上のＣＦＲ、及び外因性ＣＤ１６又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む細胞又はその集団は、本明細書に記載される、及び／又は表１に示される１つ以上の追加の操作されたモダリティを更に含み得る。本出願において更に提供されるのは、本明細書において提供されるような少なくとも１つの表現型を有する、単一細胞選別及び増殖されたクローン操作ｉＰＳＣを含むマスタ細胞バンクであり、この細胞バンクは、更なるｉＰＳＣ操作のためのプラットフォームと、組成が明確かつ均一であり、費用効果の高い様式でかなりの規模で大量生産することができる、派生ＮＫ及びＴ細胞を含むがこれに限定されない、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供する。
５．ＣＤ３８ノックアウト
細胞表面分子ＣＤ３８は、多発性骨髄腫及びＣＤ２０陰性Ｂ細胞性悪性腫瘍を含む、リンパ系と骨髄系の両方に由来する多発性血液系悪性腫瘍で高度に上方制御されており、これによりがん細胞を枯渇させる抗体治療の魅力的なターゲットとなっている。抗体を介したがん細胞の枯渇は、通常、直接的な細胞アポトーシスの誘導とＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）などの免疫エフェクターメカニズムの活性化との組み合わせに起因する。ＡＤＣＣに加えて、治療用抗体と連携した免疫エフェクター機構には、抗体依存性細胞媒介性食作用（antibody-dependent cell-mediated phagocytosis、ＡＤＣＰ）及び／又は補体依存性細胞傷害性（complement-dependent cytotoxicity、ＣＤＣ）も含まれ得る。
ＣＤ３８はまた、悪性細胞で高度に発現する以外に、形質細胞並びにＮＫ細胞、活性化Ｔ細胞及びＢ細胞にも発現する。造血中、ＣＤ３８は、ＣＤ３４＋幹細胞と、リンパ系、赤血球系、及び骨髄系の系統にコミットした前駆細胞、並びに形質細胞期まで続く成熟の最終段階で発現する。タイプＩＩ膜貫通型糖タンパク質であるＣＤ３８は、受容体及びヌクレオチド代謝産物の生産に関与する多機能酵素の両方として細胞機能を果たす。酵素として、ＣＤ３８は合成とＮＡＤ＋からＡＤＰ－リボースへの反応の加水分解を触媒し、これによって、カルシウム依存性である、細胞接着のプロセスに重要である、小胞体とリソソームからのカルシウムの放出を刺激する二次メッセンジャＣＡＤＰＲとＮＡＡＤＰを生成する。ＣＤ３８は受容体としてＣＤ３１を認識し、活性化されたＮＫ細胞のサイトカイン放出と細胞傷害性を調節する。ＣＤ３８は、脂質ラフトの細胞表面タンパク質と会合し、細胞質のＣａ２＋フラックスを調節し、リンパ系及び骨髄系細胞のシグナル伝達を媒介することも報告されている。
悪性腫瘍の治療では、ＣＤ３８抗原結合受容体で形質導入されたＴ細胞を全身的に使用すると、ＣＤ３４＋造血前駆細胞、単球、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、及びＢ細胞のＣＤ３８＋画分が溶解し、レシピエントの免疫エフェクター細胞機能が損なわれるため、治療応答が不完全になり、効力が低下又は排除される。加えて、ＣＤ３８特異的抗体であるダラツムマブで治療された多発性骨髄腫患者では、骨髄と末梢血の両方でＮＫ細胞の減少が観察されたが、Ｔ細胞やＢ細胞などの他の免疫細胞タイプは、ＣＤ３８の発現にもかかわらず影響を受けなかった（Ｃａｓｎｅｕｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ａｄｖａｎｃｅｓ．２０１７；１（２３）：２１０５－２１１４）。理論に拘束されることなく、本出願は、ＣＤ３８特異的抗体及び／又はＣＤ３８抗原結合ドメインが誘導するフラトリサイドを通じたエフェクター細胞の枯渇又は減少を克服することにより、ＣＤ３８標的化がん治療の潜在能力を最大限に活用する戦略を提供する。加えて、ＣＤ３８はＴ細胞やＢ細胞などの活性化リンパ球で上方制御されるため、同種異系エフェクター細胞のレシピエントでダラツムマブなどのＣＤ３８特異的抗体を使用してこれらのレシピエントリンパ球の活性化を抑制することにより、これらのエフェクター細胞に対する同種拒絶反応が減少及び／又は防ぎ、それによってエフェクター細胞の生存率と持続性を増加させる。
このように、本出願はまた、多くの場合、養子細胞移入の前に、レシピエントＴ細胞及びＢ細胞の活性化、すなわち、活性化されたＴ細胞及びＢ細胞のリンパ球枯渇に対するＣＤ３８特異的抗体、分泌型ＣＤ３８特異的エンゲージャ又はＣＤ３８ ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）を使用することによる同種拒絶反応の低減又は防止を通じてエフェクター細胞の持続性及び／又は生存率を増強する戦略を提供する。具体的には、提供される戦略は、ＣＤ３８ノックアウトを含むｉＰＳＣ株、単一細胞選別及び増殖されたクローンＣＤ３８陰性ｉＰＳＣを含むマスタ細胞バンクを作製すること、並びに操作されたｉＰＳＣ株の指向性分化を通じてＣＤ３８陰性（ＣＤ３８陰）派生エフェクター細胞を得ることを含み、派生エフェクター細胞は、ＣＤ３８標的化治療部分がエフェクター細胞とともに使用される場合、他の利点の中でもとりわけ、フラトリサイド及び同種拒絶反応から保護される。加えて、抗ＣＤ３８モノクローナル抗体療法は、患者の造血幹細胞区画に悪影響を及ぼすことなく、患者の活性化免疫系を有意に枯渇させる。ＣＤ３８陰性派生細胞は、ＣＤ３８抗体媒介性枯渇に抵抗する能力を有し、毒性コンディショニング剤を使用せずに抗ＣＤ３８抗体又はＣＤ３８－ＣＡＲと組み合わせて有効に投与することができ、したがって化学療法に基づくリンパ球枯渇を低減及び／又は置換することができる。
本明細書で提供される一実施形態では、ｉＰＳＣ株におけるＣＤ３８ノックアウトは、二対立遺伝子ノックアウトである。本明細書に開示されるように、提供されるＣＤ３８陰性ｉＰＳＣ株は、少なくともＣＡＲ、任意選択でエンゲージャ、及び／又はＴＣＲ陰、ＣＦＲ、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアントのうちの１つ以上を更に含み、本明細書に記載され、かつ表１に示されるような１つ以上の追加の操作されたモダリティを更に含んでもよく、当該ｉＰＳＣは、限定されないが、決定的な造血内皮（hemogenic endothelium、ＨＥ）能を有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４＋造血細胞、造血幹前駆細胞、造血多能性前駆体（multipotent progenitor、ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、共通骨髄前駆細胞、共通リンパ前駆細胞、赤血球、骨髄細胞、好中球前駆体、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、マクロファージ、並びに初代ＮＫ、Ｔ及び／若しくはＮＫＴ細胞には存在しない１つ以上の機能的特質を有する派生免疫エフェクター細胞を含む、機能的派生エフェクター細胞を産生するように分化誘導することができる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体を使用してＡＤＣＣを誘導するか、又は抗ＣＤ３８ ＣＡＲを標的化細胞殺傷に使用する場合、ＣＤ３８陰 ｉＰＳＣ及び／又はその派生エフェクター細胞は抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ、又はレシピエント活性化Ｔ細胞若しくはＢ細胞によって排除されず、これにより、そのような治療部分の存在下及び／又は曝露後のｉＰＳＣ及びそのエフェクター細胞の持続性及び／又は生存率を増加させる。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、そのような治療部分の存在下で、及び／又は曝露後の、インビボでの持続性及び／又は生存率が増加している。
６．ＨＬＡ－Ｉ－及びＨＬＡ－ＩＩ－の欠損
同種拒絶の問題を回避するために、複数のＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩタンパク質は、同種異系レシピエントの組織適合性のために一致している必要がある。本明細書において提供されるのは、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩタンパク質の一方又は両方の発現が排除されたか、又は実質的に減少したｉＰＳＣ細胞株及びそれから分化したその派生細胞である。ＨＬＡクラスＩ欠損は、ＨＬＡクラスＩ遺伝子座（染色体６ｐ２１）の任意の領域の機能的欠失、又はベータ２ミクログロブリン（beta-2 microglobulin、Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子、及びタパシンを含むが、これらに限定されない、ＨＬＡクラスＩ関連遺伝子の欠失若しくは破壊によって達成され得る。例えば、Ｂ２Ｍ遺伝子は、全てのＨＬＡクラスＩヘテロ二量体の細胞表面発現に不可欠な共通のサブユニットをコードする。Ｂ２Ｍ陰性細胞はＨＬＡ－Ｉ欠損である。ＨＬＡクラスＩＩ欠損は、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、及びＲＦＸＡＰを含むがこれらに限定されないＨＬＡクラスＩＩ関連遺伝子の機能的欠失又は破壊によって達成され得る。ＣＩＩＴＡは転写コアクチベータであり、クラスＩＩタンパク質の発現に必要な転写因子ＲＦＸ５の活性化を通じて機能する。ＣＩＩＴＡ陰性細胞はＨＬＡ－ＩＩ欠損である。ここで提供されるのは、例えばＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ発現の両方を欠いたＨＬＡ－Ｉ欠損及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損を有するｉＰＳＣ系統とその派生細胞であり、取得された派生エフェクター細胞は、ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）マッチングの必要性を排除して宿主の（同種異系）Ｔ細胞による認識と殺傷を回避することによって、同種異系細胞治療を可能にする。
一部の細胞型では、ＨＬＡクラスＩ発現の欠如がＮＫ細胞による溶解を引き起こす。この「自己喪失」応答を克服するために、ＨＬＡ－Ｇを任意選択でノックインして、操作されたｉＰＳＣに由来するＨＬＡ－Ｉ欠損エフェクター細胞のＮＫ細胞の認識と殺傷を回避することができる。一実施形態では、ＨＬＡ－Ｉ欠損ｉＰＳＣ及びその派生細胞は、ＨＬＡ－Ｇノックインを更に含む。いくつかの実施形態では、提供されるＨＬＡ－Ｉ欠損ｉＰＳＣ及びその派生細胞は、ＣＤ５８ノックアウト及びＣＤ５４ノックアウトの一方又は両方を更に含む。ＣＤ５８（又はＬＦＡ－３）及びＣＤ５４（又はＩＣＡＭ－１）は、シグナル依存性細胞相互作用を開始し、免疫細胞を含む、細胞の遊走を促進する接着タンパク質である。ＣＤ５８ノックアウトは、ＣＤ５４ノックアウトよりも同種異系ＮＫ細胞活性化の低減において高い効率を有するが、一方、ＣＤ５８及びＣＤ５４の両方の二重ノックアウトは、ＮＫ細胞活性化の最も増強された低減を有することが示された。いくつかの観察において、ＣＤ５８及びＣＤ５４二重ノックアウトは、「自己喪失」効果を克服することにおいて、ＨＬＡ－Ｉ欠損細胞に対するＨＬＡ－Ｇ過剰発現よりも更に効果的である。
本明細書において提供されるように、いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ欠損ｉＰＳＣ並びにその派生細胞は、ＨＬＡ－Ｇをコードする外因性ポリヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ欠損ｉＰＳＣ並びにその派生細胞は、ＣＤ５８陰性である。いくつかの他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ欠損ｉＰＳＣ並びにその派生細胞は、ＣＤ５４陰性である。更にいくつかの他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ欠損ｉＰＳＣ並びにその派生細胞は、ＣＤ５８陰性及びＣＤ５４陰性である。
いくつかの実施形態では、活性化されたレシピエント免疫細胞において上方制御された表面タンパク質を標的とする不活性化ＣＡＲを発現させることによって、ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩの欠損のための操作をバイパスするか又はインタクトなままにして、同種拒絶反応を回避することができる。いくつかの実施形態では、活性化されたレシピエント免疫細胞において上方制御される表面タンパク質には、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、又はＣＤ４０Ｌが含まれるが、これらに限定されない。細胞がそのような不活性化ＣＡＲを発現する場合、細胞は、ＣＡＲによって標的化される同じ表面タンパク質を発現しないか、又はそのノックアウトを有することが好ましい。いくつかの実施形態では、不活性化ＣＡＲは、ＣＤ３８－ＣＡＲ、ＣＤ２５－ＣＡＲ、ＣＤ６９－ＣＡＲ、ＣＤ４４－ＣＡＲ、４－１ＢＢ－ＣＡＲ、ＯＸ４０－ＣＡＲ、及びＣＤ４０Ｌ－ＣＡＲのうちの少なくとも１つを含む。
更に、ＣＡＲ、任意選択でエンゲージャ、及び／又は１つ以上のＣＦＲ、ＴＣＲ陰、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、並びにＣＤ３８ノックアウトを含むｉＰＳＣ及びその派生細胞のいくつかの実施形態では、当該細胞は、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩの欠損であり、ＨＬＡ－Ｇをコードする外因性ポリヌクレオチドを有する。ＣＡＲ、任意選択でエンゲージャ、及び／又は１つ以上のＣＦＲ、ＴＣＲ陰、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、並びにＣＤ３８ノックアウトを含むｉＰＳＣ及びその派生細胞のいくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩの欠損であり、ＣＤ５８陰性である。ＣＡＲ、任意選択でエンゲージャ、及び／又は１つ以上のＣＦＲ、ＴＣＲ陰、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、並びにＣＤ３８ノックアウトを含むｉＰＳＣ及びその派生細胞のいくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩの欠損であり、かつＣＤ５４陰性である。ＣＣＡＲ、任意選択でエンゲージャ、及び／又は１つ以上のＣＦＲ、ＴＣＲ陰、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、並びにＣＤ３８ノックアウトを含むｉＰＳＣ及びその派生細胞の更にいくつかの他の実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩの欠損であり、ＣＤ５８陰性及びＣＤ５４陰性の両方である。
本出願において更に提供されるのは、ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩの欠損を含むがこれらに限定されない、本明細書において提供されるような少なくとも１つの表現型を有する、ソーティングされた単一細胞及び増殖されたクローン操作ｉＰＳＣを含むマスタ細胞バンクであり、この細胞バンクは、更なるｉＰＳＣ操作のためのプラットフォームと、組成が明確かつ均一であり、費用効果の高い様式でかなりの規模で大量生産することができる、派生ＮＫ及びＴ細胞を含むがこれに限定されない、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供する。
６．外因的に導入されたサイトカイン及び／又はサイトカインシグナル伝達
臨床的に適切なサイトカインの全身的高用量投与を回避することにより、そのような行為による用量制限毒性のリスクが減少し、サイトカイン媒介性細胞自律性が確立される。可溶性サイトカインを追加投与する必要なしにリンパ球自律性を達成するために、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、及び／又はそれらのそれぞれの受容体のうちの１つ以上の部分長又は全長ペプチドを含むシグナル伝達複合体が細胞に導入されて、サイトカイン自体の発現を伴って又は伴わずに、サイトカインのシグナル伝達を可能にし、それによってサイトカインの毒性のリスクを低減して、細胞の増殖（growth）、増殖（proliferation）、増殖（expansion）、持続性、及び／又はエフェクター機能を維持又は改善し得る。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達のための導入されたサイトカイン及び／又はそのそれぞれの天然又は改変された受容体（シグナル伝達複合体）は、細胞表面上で発現する。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達は構成的に活性化される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は誘導可能である。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、一過性及び／又は一時的である。
ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８及びＩＬ２１を含むが、これらに限定されない、サイトカインのシグナル伝達のためのタンパク質複合体を細胞に導入するための様々なコンストラクト設計が、本明細書において提供される。シグナル伝達複合体がＩＬ１５に対するものである実施形態では、膜貫通（transmembrane、ＴＭ）ドメインは、ＩＬ１５受容体に対して陰性であり得るか、又は任意の他の膜結合タンパク質の膜貫通ドメインで改変若しくは置換されてもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαは、ＩＬ１５のトランス提示を模倣する自己切断ペプチドを使用して、ＩＬ１５のシス提示を排除することなく共発現される。他の実施形態では、ＩＬ１５Ｒαはリンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合されており、ＩＬ１５のシス提示を排除することなくトランス提示を模倣し、ＩＬ１５が膜結合されることを確保する。他の実施形態では、短縮された細胞内ドメインを持つＩＬ１５Ｒαは、リンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合され、ＩＬ１５のトランス提示を模倣し、ＩＬ１５の膜結合を維持し、シス提示及び／又はその細胞内ドメインを介した正常ＩＬ１５Ｒによって媒介される他の可能性のあるシグナル伝達経路を排除する。
そのような短縮化構築物は、配列番号２５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含み、これは、配列番号２６によって表される例示的な核酸配列によってコードされ得る。短縮化ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒαの一実施形態では、構築物は、配列番号２５の最後の４アミノ酸残基「ＫＳＲＱ」を含まず、配列番号２７と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも８０％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、１００％である。
更に他の実施形態では、ＩＬ１５Ｒαの細胞質ドメインは、ＩＬ１５を備えたエフェクター細胞の自律的特質に悪影響を与えることなく省略することができる。他の実施形態では、ＩＬ１５Ｒα全体が除去されるが、一端でＩＬ１５と融合し、他で膜貫通ドメインと融合し（ｍｂ－Ｓｕｓｈｉ）、任意選択で、Ｓｕｓｈｉドメインと膜貫通ドメインとの間にリンカーがあるＳｕｓｈｉドメインは例外である。融合したＩＬ１５／ｍｂ－Ｓｕｓｈｉは、膜結合タンパク質の膜貫通ドメインを介して細胞表面に発現する。ＩＬ１５の望ましいトランス提示のみが保持されている場合、シス提示を含む、ＩＬ１５Ｒαを介した不要なシグナル伝達が排除される。いくつかの実施形態では、Ｓｕｓｈｉドメインと融合したＩＬ１５を含む成分は、配列番号２８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含み、これは、配列番号２９によって表される例示的な核酸配列によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも８０％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、１００％である。
当業者は、上述のシグナルペプチド及びリンカー配列が例示であり、シグナルペプチド又はリンカーとしての使用に好適なそれらのバリエーションを決して限定しないことを理解するであろう。当業者には既知であり利用可能な多くの好適なシグナルペプチド又はリンカー配列が存在する。当業者は、シグナルペプチド及び／又はリンカー配列が、シグナルペプチドによって導かれるか、又はリンカーによって連結される機能性ペプチドの活性を変えることなく、別の配列で置換され得ることを理解する。
他の実施形態では、天然又は改変されたＩＬ１５Ｒβは、リンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合され、構成的シグナル伝達を可能にし、ＩＬ１５膜結合及びトランス提示を維持する。他の実施形態では、天然又は改変された共通受容体γＣは、サイトカインの構成的シグナル伝達及び膜結合トランス提示のために、リンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合される。共通受容体γＣは、共通ガンマ鎖又はＣＤ１３２とも呼ばれ、ＩＬ２受容体サブユニットガンマ又はＩＬ２ＲＧとしても知られている。γＣは、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５及びＩＬ２１受容体を含むが、これらに限定されない、多くのインターロイキン受容体の受容体複合体に共通するサイトカイン受容体サブユニットである。他の実施形態では、ＩＬ１５の不在下でホモ二量体を形成する操作されたＩＬ１５Ｒβは、サイトカインの構成的シグナル伝達を生成するのに有用である。
シグナル伝達複合体がＩＬ７に対するものである実施形態では、種々の設計のうちのいずれかの膜貫通（ＴＭ）ドメインは、サイトカイン受容体に対して天然であり得るか、又は任意の他の膜結合タンパク質の膜貫通ドメインで改変若しくは置換されてもよい。いくつかの実施形態では、天然（又は野生型）又は改変ＩＬ７Ｒは、リンカーを介してＣ末端でＩＬ７に融合されてもよく、構成的シグナル伝達を可能にし、膜結合ＩＬ７を維持する。いくつかの実施形態では、そのような構築物は、配列番号３０と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一のアミノ酸配列を含み、膜貫通ドメイン、シグナルペプチド及びリンカーは柔軟であり、長さ及び／又は配列は様々である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも８０％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、１００％である。
当業者は、上述のシグナルペプチド及びリンカー配列が例示であり、シグナルペプチド又はリンカーとしての使用に好適なそれらのバリエーションを決して限定しないことを理解するであろう。当業者には既知であり利用可能な多くの好適なシグナルペプチド又はリンカー配列が存在する。当業者は、シグナルペプチド及び／又はリンカー配列が、シグナルペプチドによって導かれるか、又はリンカーによって連結される機能性ペプチドの活性を変えることなく、別の配列で置換され得ることを理解する。
一実施形態では、天然又は改変された共通受容体γＣは、構成的及び膜結合サイトカインシグナル伝達複合体のために、リンカーを介してＣ末端でＩＬ７に融合される。共通受容体γＣは、共通ガンマ鎖又はＣＤ１３２とも呼ばれ、ＩＬ２受容体サブユニットガンマ又はＩＬ２ＲＧとしても知られている。γＣは、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、及びＩＬ２１受容体を含むが、これらに限定されない、多くのインターロイキン受容体の受容体複合体に共通するサイトカイン受容体サブユニットである。別の実施形態では、ＩＬ７の不在下でホモ二量体を形成する操作されたＩＬ７Ｒは、サイトカインの構成的シグナル伝達を生成するのにも有用である。
したがって、様々な実施形態では、サイトカインＩＬ１５若しくはＩＬ７及び／又はそれらの受容体は、上記の構築物設計のうちの１つ以上を使用してｉＰＳＣに導入されてもよく、ｉＰＳＣ分化時にその派生細胞に導入されてもよい。人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）に加えて、本明細書に開示される少なくとも１つの操作されたモダリティを含むクローンｉＰＳＣ、クローンｉＰＳ細胞株、又はｉＰＳＣ由来細胞が提供される。また、提供されるのは、本セクションに記載されるような細胞表面発現外因性サイトカイン及び／若しくはその受容体の部分若しくは完全ペプチドを含むシグナル伝達複合体を少なくとも有する、単一細胞選別及び増殖されたクローン操作ｉＰＳＣを含むマスタ細胞バンクであり、細胞バンクは、更なるｉＰＳＣ操作のためのプラットフォームと、組成が明確かつ均一であり、費用効果の高い様式でかなりの規模で大量生産することができる、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供する。
ＣＡＲと外因性サイトカイン及び／又はサイトカイン受容体シグナル伝達（シグナル伝達複合体、又は「ＩＬ」）の両方を含むｉＰＳＣ及びそれからの派生細胞では、ＣＡＲとＩＬは別々の構築物で発現され得るか、ＣＡＲとＩＬの両方を含むバイシストロン性構築物で共発現され得る。いくつかの更なる実施形態において、シグナル伝達複合体は、自己切断２Ａコード配列を介してＣＡＲ発現構築物の５’末端又は３’末端のいずれかに連結され得る。したがって、ＩＬシグナル伝達複合体（例えば、ＩＬ７シグナル伝達複合体）及びＣＡＲは、単一のオープンリーディングフレーム（open reading frame、ＯＲＦ）内にあってもよい。一実施形態では、シグナル伝達複合体は、ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ又はＩＬ－２Ａ－ＣＡＲ構築物に含まれる。ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ又はＩＬ－２Ａ－ＣＡＲが発現される場合、自己切断性２Ａペプチドは、発現されたＣＡＲ及びＩＬが解離することを可能にし、次いで、解離したＩＬは、膜貫通ドメインが細胞膜に固定された状態で細胞表面に提示され得る。ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ又はＩＬ－２Ａ－ＣＡＲのバイシストロン性設計により、タイミングと数量の両方で、例えば、単一のＯＲＦの発現のための誘導可能なプロモータ又は時間的若しくは空間的特異性を持つプロモータなどの、組み込むために選択され得る同一の制御メカニズムの下で、ＣＡＲとＩＬのシグナル伝達複合体の協調された発現を可能にする。自己切断ペプチドは、口蹄疫ウイルス（foot-and-mouth disease virus、ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（equine rhinitis A virus、ＥＲＡＶ）、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス（Thosea asigna virus、ＴａＶ）、及びブタテシオウイルス１（ｐｏｒｃｉｎｅ ｔｅｓｃｈｏ ｖｉｒｕｓ－１、ＰＴＶ－Ｉ）（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ＭＬ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，８２，１０２７－１０１（２００１）；Ｒｙａｎ，ＭＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，２７２７－２７３２（２００１））などのアフトウイルス属、並びにタイロウイルス（例えば、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス）及び脳心筋炎ウイルスなどのカルジオウイルス属を含む、ピコルナウイルス科（Picornaviridae virus family）のメンバーにおいて見出される。ＦＭＤＶ、ＥＲＡＶ、ＰＴＶ－１、及びＴａＶから派生する２Ａペプチドは、それぞれ「Ｆ２Ａ」、「Ｅ２Ａ」、「Ｐ２Ａ」、及び「Ｔ２Ａ」と称されることもある。
本明細書に開示されるバイシストロン性ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ又はＩＬ－２Ａ－ＣＡＲは、本明細書において提供される任意の他のサイトカイン、例えばＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１８、及びＩＬ２１の発現も企図される。いくつかの実施形態では、バイシストロン性ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ又はＩＬ－２Ａ－ＣＡＲは、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５及びＩＬ２１のうちの１つ以上の発現のためのものである。
ＣＡＲ、任意選択でエンゲージャ、並びに細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はそのサイトカイン受容体の部分ペプチド又は完全ペプチドを含むシグナル伝達複合体の両方を含むｉＰＳＣ及びそれからの派生細胞において、ｉＰＳＣ及び派生細胞は、ＣＦＲ、ＴＣＲ陰、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント、ＣＤ３８陰性のＨＬＡ－Ｉ及び／若しくはＨＬＡ－ＩＩの欠損、並びに／又はＨＬＡ－Ｇのうちの１つ以上を更に含み得る。
いくつかの実施形態では、表１の遺伝子型のうちのいずれか１つを含むｉＰＳＣ及びその派生エフェクター細胞は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＡＧ１、及び染色体６ｐ２１領域内の任意の遺伝子のうちの少なくとも１つの破壊、又はＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、抗体、及び二重特異性、多重特異性、若しくはユニバーサルエンゲージャとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、を更に含み得る。
７．本明細書において提供される遺伝子操作されたｉＰＳＣ株とｉＰＳＣ由来細胞
上記を考慮して、本出願は、ｉＰＳＣ、ｉＰＳ細胞株細胞、又はそれらの集団、及びｉＰＳＣを分化させることから得られる派生エフェクター細胞を提供し、各細胞は、少なくとも、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、及び任意選択でＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャをコードするポリヌクレオチドを含み、細胞は、真核細胞、動物細胞、ヒト細胞、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞、免疫細胞、又はフィーダ細胞である。また、本明細書に記載される表現型を有する単一細胞選別及び増殖されたクローン操作ｉＰＳＣを含むマスタ細胞バンクも提供され、細胞バンクは、組成が明確かつ均一であり、費用効率の高い様式でかなりの規模で大量生産することができる、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来細胞は造血細胞であり、決定的な造血内皮（ＨＥ）能を有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４＋造血細胞、造血幹前駆細胞、造血多能性前駆体（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、骨髄細胞、好中球前駆体を含むがこれらに限定されず、かつ／又はＴ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、及びマクロファージと特質を共有する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来造血細胞は、少なくともＣＡＲ及び任意選択でＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャを発現する免疫エフェクター細胞を含む。本明細書では、ｉＰＳＣ、ｉＰＳ細胞株細胞、又はそのクローン集団、及びｉＰＳＣを分化させることから得られる派生機能性細胞が更に提供され、各細胞は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、任意選択で、ＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャをコードするポリヌクレオチドと、ＣＤ３８ノックアウト、ＨＬＡ－Ｉの欠損及び／又はＨＬＡ－ＩＩの欠損、ＨＬＡ－Ｇ若しくは非切断性ＨＬＡ－Ｇの導入、又はＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方のノックアウト、外因性ＣＤ１６又はそのバリアント、ＣＦＲ、サイトカイン及び／又はその受容体、又はそれらのバリアントを含むシグナル伝達複合体、のうちの１つ以上と、を含み、ｉＰＳＣは、指向性分化して機能的派生造血細胞を産生することができる。いくつかの実施形態では、機能的派生造血細胞は、免疫エフェクター細胞である。いくつかの実施形態では、機能的派生免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞と特質を共有する。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞と特質を共有する機能的派生免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞又はＴ細胞ではない。
ｉＰＳＣ、ｉＰＳ細胞株細胞、又はそのクローン集団、及びｉＰＳＣを分化させることから得られる派生機能性細胞のいくつかの実施形態では、各細胞は、少なくとも、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、任意選択で、ＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャをコードするポリヌクレオチドと、を含み、細胞はＴＣＲ陰である。本明細書で使用されるとき、ＴＣＲ陰は、ＴＣＲ陰性、ＴＣＲ－／－、「ＴＣＲヌル」、又はＴＣＲノックアウトとも称され、天然に（例えば、ＮＫ細胞又はｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞）、遺伝子発現調節によって、又はｉＰＳＣ細胞（例えば、ｉＰＳＣ、Ｔ細胞からリプログラミングされたｉＰＳＣ（ＴｉＰＳＣ））若しくは内因性ＴＣＲ又はその１つ以上のサブユニットをノックアウトするためのＴ細胞のゲノム編集によって、あるいはＴＣＲがノックアウトされたｉＰＳＣから分化したＴＣＲ陰性派生細胞を得ることによって、内因性ＴＣＲを発現しない細胞を含む。したがって、開示される細胞においてノックアウトされるＴＣＲは、内因性ＴＣＲ複合体である。細胞中のＴＣＲα又はＴＣＲβのいずれかの定常領域の発現を破壊することは、細胞の内因性ＴＣＲ複合体をノックアウトする多くの方法のうちの１つである。ＴＣＲ陰細胞は、ＴＣＲ陰細胞において全てのＣＤ３サブユニットを発現しているにもかかわらず、細胞表面にＣＤ３複合体を提示することができず、これは、細胞表面ＣＤ３認識、結合及び／又はシグナル伝達を必要とする細胞機能に悪影響を及ぼす。したがって、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、任意選択で、ＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャをコードするポリヌクレオチド、及びＣＦＲを含むＴＣＲ陰細胞のいくつかの実施形態では、ＣＦＲはＣＤ３ベースである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、及び任意選択で、ＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャをコードするポリヌクレオチドを含むＴＣＲ陰細胞は、発現された場合、細胞表面ＣＤ３複合体、又はその１つ以上のサブユニット若しくはサブドメイン（ｃｓ－ＣＤ３）も含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ及び任意選択でエンゲージャを含む細胞は、ＴＣＲの定常領域に挿入されたＣＡＲも含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ及び任意選択でエンゲージャを含む細胞は、ＴＣＲ陰であり、ＴＣＲの定常領域に挿入されたＣＡＲを含み、ＣＡＲの発現は、内因性ＴＣＲプロモータによって駆動される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ及び任意選択でエンゲージャを含む細胞は、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５、ＩＬ２１、又はそれらの任意の組み合わせの外因性サイトカインシグナル伝達も含む。いくつかの実施形態では、外因性サイトカインシグナル伝達は、細胞膜に結合している。いくつかの実施形態では、外因性サイトカインシグナル伝達は、サイトカイン及び／又はそのそれぞれの受容体の導入された部分若しくは完全ペプチド、又はその突然変異若しくは短縮化バリアントを含む。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達は構成的に活性化される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は誘導可能である。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、一過性及び／又は一時的である。いくつかの実施形態では、細胞表面サイトカインシグナル伝達の一過性／一時的発現は、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、又はｍＲＮＡを含むＲＮＡを介する。いくつかの実施形態では、外因性細胞表面サイトカインシグナル伝達は、ＩＬ２シグナル伝達を可能にする。いくつかの実施形態では、外因性細胞表面サイトカインシグナル伝達は、ＩＬ４シグナル伝達を可能にする。いくつかの実施形態では、外因性細胞表面サイトカインシグナル伝達は、ＩＬ７シグナル伝達を可能にする。いくつかの実施形態では、外因性細胞表面サイトカインシグナル伝達は、ＩＬ９シグナル伝達を可能にする。いくつかの実施形態では、外因性細胞表面サイトカインシグナル伝達は、ＩＬ１５シグナル伝達を可能にする。いくつかの実施形態では、外因性細胞表面サイトカインシグナル伝達は、ＩＬ２１シグナル伝達を可能にする。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ及び任意選択でエンゲージャを含む細胞は、外因性ＣＤ１６又はその機能的バリアント若しくはキメラ受容体を更に含む。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６は、Ｆ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐを含む外部ドメインを含む。いくつかの実施形態、外因性ＣＤ１６は、ＣＤ６４の外部ドメインの全長又は部分長を含む。いくつかの他の実施形態では、外因性ＣＤ１６は、キメラＦｃ受容体を含む。外因性ＣＤ１６は、ＡＤＣＣによる細胞殺傷を可能にし、それによって、例えば、ＣＡＲを発現するエフェクター細胞に二重標的化メカニズムを提供する。
いくつかの実施形態は、ＣＡＲ及び任意選択でエンゲージャを含む細胞は、ＣＤ３８ノックアウトを更に含む。細胞表面分子ＣＤ３８は、多発性骨髄腫及びＣＤ２０陰性Ｂ細胞性悪性腫瘍を含む、リンパ系と骨髄系の両方に由来する多発性血液系悪性腫瘍で高度に上方制御されており、これによりがん細胞を枯渇させる抗体治療の魅力的なターゲットとなっている。ＣＤ３８はまた、悪性細胞で高度に発現する以外に、形質細胞並びにＮＫ細胞、活性化Ｔ細胞及びＢ細胞にも発現する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８－／－であるエフェクター細胞は、ＣＤ３８誘導性フラクトリサイド（ｆｒａｃｔｒｉｃｉｄｅ）を回避することができる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体、ＣＤ３８結合ＣＡＲ、又は抗ＣＤ３８ ｓｃＦＶを含むＣＤ３エンゲージャを使用してＡＤＣＣ及び／又は腫瘍細胞標的化を誘導する場合、ＣＤ３８－／－ ｉＰＳＣ及び／又はその派生エフェクター細胞は、エフェクター細胞の排除、すなわち、ＣＤ３８発現エフェクター細胞の減少又は枯渇を引き起こすことなく、ＣＤ３８発現（腫瘍）細胞を標的化し、それによってｉＰＳＣとそのエフェクター細胞の持続性及び／又は生存率を増加させることができる。
ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、任意選択で、エンゲージャをコードするポリヌクレオチドとを含む細胞のいくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩの欠損（例えば、Ｂ２Ｍノックアウト及び／又はＣＩＩＴＡノックアウト）と、任意選択で、ＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドと、を更に含む。ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、任意選択でエンゲージャをコードするポリヌクレオチドと、を含む細胞のいくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩの欠損（例えば、Ｂ２Ｍノックアウト及び／又はＣＩＩＴＡノックアウト）、並びに任意選択で、ＣＤ５８及びＣＤ５４ノックアウトの一方又は両方を更に含む。
上記を考慮して、本明細書では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、任意選択で、エンゲージャをコードするポリヌクレオチドと、更に任意選択で、ＴＣＲ陰、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント、ＣＦＲ、細胞表面発現外因性ＩＬを含むシグナル伝達複合体、ＣＤ３８ノックアウト、及びＢ２Ｍ／ＣＩＩＴＡノックアウトのうちの１つ、２つ、３つ、若しくはそれ超、又は全てと、を含むｉＰＳＣが提供される。Ｂ２Ｍがノックアウトされる場合、ＨＬＡ－Ｇ、又は代替的に、ＣＤ５８及びＣＤ５４ノックアウトの一方若しくは両方をコードするポリヌクレオチドが任意選択で導入され、ｉＰＳＣが指向性分化して機能的派生造血細胞を産生することが可能である。
したがって、本出願は、表１の以下の遺伝子型のうちのいずれか１つを含むｉＰＳＣ及びその機能的派生造血細胞を提供する。また、本明細書では、ｉＰＳＣの分化能及び派生エフェクター細胞の機能に悪影響を及ぼすことなく、表１の以下の遺伝子型のうちのいずれか１つを含む、すなわち、ＣＡＲと、エンゲージャ（表１の「Ｅｇ」）及びＣＦＲの一方又は両方と、任意選択で、外因性ＣＤ１６又はそのバリアント、ＴＣＲ陰、細胞表面発現外因性ＩＬを含むシグナル伝達複合体、ＣＤ３８ノックアウト、並びにＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損のうちの１つ以上と、を有する、単一細胞選別及び増殖されたクローン改変ｉＰＳＣを含むマスタ細胞バンクも提供される。当該細胞バンクは、更なるｉＰＳＣ操作のためのプラットフォーム、及び既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供する。外因性ポリヌクレオチドのいずれか１つの挿入部位に応じて、操作されたエフェクター細胞は、内因性ＴＣＲ発現が陰性であり得る。更に、操作されたエフェクター細胞がＮＫ細胞系統のものである場合、細胞もＴＣＲ陰性である。
表１に提供される「ＩＬ」は、どの特定のサイトカイン／受容体又は組み合わせ発現が選択されるかに応じて、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、及びＩＬ２１のうちの１つを表し、ＩＬ７が選択される場合、ＩＬは、ＩＬ７Ｒα及びＩＬ７Ｒβを含むＩＬ７を表す。同様に、ＩＬ１５が選択される場合、ＩＬは、ＩＬ１５Ｒα及びＩＬ１５Ｒβを含むＩＬ１５を表す。いくつかの実施形態は、細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はその受容体は、自己切断ペプチドを使用することによるＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの共発現、ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが短縮化又は排除されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβとの融合タンパク質、ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質（共通受容体γＣは天然であるか若しくは改変されている）、及びＩＬ１５Ｒβのホモ二量体のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質は、配列番号２５、２７又は２８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインを欠く短縮化ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインを欠く短縮化ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインを欠く短縮化ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態は、細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はその受容体は、自己切断ペプチドを使用することによるＩＬ７とＩＬ７Ｒαとの共発現、ＩＬ７とＩＬ７Ｒαとの融合タンパク質、ＩＬ７Ｒαの細胞内ドメインが短縮化又は排除されたＩＬ７／ＩＬ７Ｒα融合タンパク質、ＩＬ７とＩＬ７Ｒβとの融合タンパク質、ＩＬ７と共通受容体γＣとの融合タンパク質（共通受容体γＣは天然であるか若しくは改変されている）、及びＩＬ７Ｒβのホモ二量体のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ７／ＩＬ７Ｒα融合タンパク質は、配列番号３０と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ７／ＩＬ７Ｒα融合タンパク質は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
更に、ｉＰＳＣとその機能的派生造血細胞がＣＡＲとＩＬの両方を含む遺伝子型を有する場合、ＣＡＲとＩＬは、任意選択で、２Ａ配列を含むバイシストロン性発現カセットに含まれ得る。対照的に、いくつかの他の実施形態では、ＣＡＲ及びＩＬは、ｉＰＳＣ及びその機能的派生造血細胞に含まれる別々の発現カセット中にある。
８．免疫療法のための抗体
いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるゲノム操作されたエフェクター細胞に加えて、ゲノム操作されたエフェクター細胞によって発現されるのと比較して、状態、疾患、又は適応症と関連する抗原を標的とする抗体又はその抗体断片を含む追加の治療剤を、これらのエフェクター細胞とともに併用療法にて使用することができる。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、又はキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、ウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体又は抗体断片は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍又はウイルス特異的抗原は、投与されたｉＰＳＣ由来エフェクター細胞を活性化して、それらの殺傷能力を増強する。いくつかの実施形態では、投与されたｉＰＳＣ由来エフェクター細胞に対する追加の治療剤として、組み合わせ治療に好適な抗体は、抗ＣＤ２０（リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、オクレリズマブ）、抗ＣＤ２２（イノツズマブ、モキセツモマブ、エプラツズマブ）、抗ＨＥＲ２（トラスツズマブ、パーツズマブ）、抗ＣＤ５２（アレムツズマブ）、抗ＥＧＦＲ（セツキシマブ）、抗ＧＤ２（ジヌツキシマブ）、抗ＰＤＬ１（アベルマブ）、抗ＣＤ３８（ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２）、抗ＣＤ１２３（７Ｇ３、ＣＳＬ３６２）、抗ＳＬＡＭＦ７（エロツズマブ）、並びにそれらのヒト化又はＦｃ改変されたバリアント若しくは断片、又はそれらの機能的同等物及びバイオシミラーを含むがそれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、投与されたｉＰＳＣ由来エフェクター細胞に対する追加の治療剤としての併用治療に好適な抗体は、標的細胞上の２つ以上の抗原若しくはエピトープを標的とするか、又は標的細胞を標的としながらエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、若しくはマクロファージ細胞）を標的細胞に向けて動員する、二重特異性抗体又は多重特異性抗体を更に含む。そのような二重特異性又は多重特異性抗体は、バイスタンダー免疫細胞（例えば、治療のレシピエントにおけるＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、及び／又は好中球）であろうと治療用組成物中の操作されたエフェクター細胞であろうと、エフェクター細胞を腫瘍細胞に指向させ、腫瘍抗原の結合時に免疫エフェクター細胞を活性化させることができるエンゲージャとして機能し、抗体治療の利益を最大化する大きな可能性を示している。エンゲージャは、少なくとも１つの腫瘍抗原に特異的であり、免疫エフェクター細胞の少なくとも１つの表面トリガー受容体に特異的であり、これは、腫瘍抗原回避及び腫瘍不均一性に対処するための、本明細書に開示される操作された細胞のためのマルチターゲティングアプローチを提供し得る。エンゲージャの例には、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲージャ（ＢｉＫＥ）、三重特異性キラー細胞エンゲージャ（ＴｒｉＫＥ）、若しくは多重特異性キラー細胞エンゲージャ、又は複数の免疫細胞型と適合し得るユニバーサルエンゲージャが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、表１に列挙された遺伝子型を含む造血系統細胞を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、表１に列挙された遺伝子型を含む。液体腫瘍又は固形腫瘍の治療に有用な組み合わせのいくつかの実施形態では、組み合わせは、本明細書において提供されるような、少なくともＣＡＲ及び任意選択でＣＦＲを含むｉＰＳＣ由来エフェクター細胞を含み、任意選択で、ＣＦＲは、エンゲージャカップリングのためのものである。液体腫瘍又は固形腫瘍の治療に有用な組み合わせのいくつかの他の実施形態では、組み合わせは、予め選択されたモノクローナル抗体と、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞と、を含み、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、少なくともＣＡＲと、任意選択でＣＦＲ及び外因性ＣＤ１６又はそのバリアントのうちの１つ以上と、を含む。液体腫瘍又は固形腫瘍の治療に有用な組み合わせのいくつかの実施形態では、組み合わせは、モノクローナル抗体と、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞と、を含み、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、少なくともＣＡＲと、任意選択で、ＴＣＲ陰、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント、ＣＦＲ、サイトカイン及び／又はその受容体若しくはそのバリアントを含む追加のサイトカインシグナル伝達複合体、並びにＣＤ３８ノックアウト、のうちの１つ以上と、を含む。様々な実施形態では、外因性ＣＤ１６は、ｈｎＣＤ１６である。理論によって制限されることなく、ｈｎＣＤ１６は、モノクローナル抗体の増強されたＡＤＣＣを提供するが、ＣＡＲは、特異的腫瘍抗原を標的とするだけでなく、異なる腫瘍抗原を標的とするモノクローナル抗体と組み合わせて二重標的化戦略を使用して腫瘍抗原エスケープも防止する。
いくつかの更なる実施形態では、ダラツムマブとの組み合わせに含まれるｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞は、ＣＡＲと、任意選択で、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント、ＩＬ７又はＩＬ１５のうちの１つ以上と、を含み、ＣＡＲは、Ｂ７Ｈ３、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ及びＰＤＬ１のうちの少なくとも１つを標的とし、ＩＬ７又はＩＬ１５シグナル伝達複合体は、ＣＡＲと共発現されるか、又は別々に発現される。
９．チェックポイント阻害剤
チェックポイントは、阻害されていない場合に免疫応答を抑制又は下方制御することができる細胞分子、しばしば細胞表面分子である。腫瘍が特定の免疫チェックポイント経路を、特に腫瘍抗原に特異的なＴ細胞に対する免疫抵抗性の主要なメカニズムとして選択していることが明らかになっている。チェックポイント阻害剤（checkpoint inhibitor、ＣＩ）は、チェックポイント遺伝子の発現又は遺伝子産物を減少させるか、又はチェックポイント分子の活性を低下させ、それにより、阻害性チェックポイントを遮断し、免疫系機能を回復させることができるアンタゴニストである。ＰＤ１／ＰＤＬ１又はＣＴＬＡ４を標的化するチェックポイント阻害剤の開発により、腫瘍学の展望が変わり、これらの薬剤は複数の適応症で長期の寛解をもたらした。しかしながら、多くの腫瘍サブタイプはチェックポイント遮断療法に耐性があり、再発は依然として重大な懸念事項である。したがって、本出願の一態様は、ＣＩとの併用療法に、本明細書で提供されるようなゲノム操作された機能性ｉＰＳＣ由来細胞を含めることにより、ＣＩ耐性を克服するための治療アプローチを提供する。併用療法の一実施形態では、ｉＰＳＣ由来細胞は、ＮＫ細胞である。併用療法の別の実施形態では、ｉＰＳＣ由来細胞は、Ｔ細胞である。直接的な抗腫瘍能力を示すことに加えて、本明細書において提供される派生ＮＫ細胞は、ＰＤＬ１－ＰＤ１媒介阻害に抵抗し、Ｔ細胞遊走を増強し、Ｔ細胞を腫瘍微小環境に動員し、腫瘍部位でのＴ細胞活性化を増強する能力を有することが示されている。したがって、機能的に強力なゲノム操作された派生ＮＫ細胞によって促進されるＴ細胞の腫瘍浸潤は、当該ＮＫ細胞がチェックポイント阻害剤を含むＴ細胞標的免疫療法と相乗作用して、局所免疫抑制を緩和し、腫瘍量を低減することができることを示している。
一実施形態では、チェックポイント阻害剤併用療法のためのｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、ＣＡＲと、エンゲージャ発現、外因性ＣＤ１６発現、ＣＦＲ発現、ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損、ＣＤ３８ノックアウト、並びに外因性細胞表面サイトカイン及び／又は受容体発現のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上と、を任意選択で含み、Ｂ２Ｍがノックアウトされている場合、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチド、又はＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方のノックアウトが任意選択で含まれる。いくつかの実施形態では、派生ＮＫ細胞は、表１に列挙された遺伝子型のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、上記の派生エフェクター細胞は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＡＧ１、及び染色体６ｐ２１領域内の任意の遺伝子のうちの少なくとも１つの欠失、破壊、又は発現低下、又はＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＡＲ、Ｆｃ受容体、及び二重特異性、多重特異性、若しくはユニバーサルエンゲージャとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、を更に含む。
様々な実施形態では、派生エフェクター細胞は、ＣＡＲ発現、エンゲージャ発現、外因性ＣＤ１６発現、ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損、ＣＤ３８ノックアウト、並びに外因性細胞表面サイトカイン発現のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上を含むｉＰＳＣクローン株を分化させることから得られ、Ｂ２Ｍがノックアウトされている場合、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチド、又はＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方のノックアウトが任意選択で導入される。いくつかの実施形態では、上記のｉＰＳＣクローン株は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＡＧ１、及び染色体６ｐ２１領域内の任意の遺伝子のうちの少なくとも１つの欠失、破壊、又は発現低下、又はＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＡＲ、Ｆｃ受容体、及び二重特異性、多重特異性、若しくはユニバーサルエンゲージャとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、を更に含む。
本明細書において提供されるような派生エフェクター細胞との併用療法に好適なチェックポイント阻害剤には、ＰＤ－１（Ｐｄｃｄｌ、ＣＤ２７９）、ＰＤＬ－１（ＣＤ２７４）、ＴＩＭ－３（Ｈａｖｃｒ２）、ＴＩＧＩＴ（ＷＵＣＡＭ及びＶｓｔｍ３）、ＬＡＧ－３（Ｌａｇ３、ＣＤ２２３）、ＣＴＬＡ－４（Ｃｔｌａ４、ＣＤ１５２）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、Ａ２ＡＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄｌ）、ＣＤ４７、ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２（Ｐｏｕ２ｆ２）、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、及び抑制性ＫＩＲ（例えば、２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３、３ＤＬ１、及び３ＤＬ２）のアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、上述のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストは抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇ、単一可変新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）、サメ重鎖抗体（Ｉｇ－ＮＡＲ）、キメラ抗体、組換え抗体、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、抗イディオタイプ抗体、二重特異性、多重特異性、若しくは多量体抗体、又はその断片であってもよい。抗体断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、Ｆｖ、Ｆａｂｃ、ｐＦｃ、Ｆｄ、一本鎖抗原結合断片（ｓｃＦｖ）、タンデムｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ）、ラクダ重鎖ＩｇＧ及びＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）断片、組換え重鎖のみ抗体（ＶＨＨ）、及び抗体全体の結合特異性を維持するその他の抗体断片が含まれ、それらは、抗体全体よりも、製造するのに費用対効果が高く、より簡単に使用することができ、又は感度が高くあり得る。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ又は３つ又はそれ以上のチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ（抗ＰＤＬ１ ｍＡｂ）、アベルマブ（抗ＰＤＬ１ ｍＡｂ）、デュルバルマブ（抗ＰＤＬ１ ｍＡｂ）、トレメリムマブ（抗ＣＴＬＡ４ ｍＡｂ）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ４ ｍＡｂ）、ＩＰＨ４１０２（抗ＫＩＲ）、ＩＰＨ４３（抗ＭＩＣＡ）、ＩＰＨ３３（抗ＴＬＲ３）、リリムマブ（抗ＫＩＲ）、モナリズマブ（抗ＮＫＧ２Ａ）、ニボルマブ（抗－ＰＤ１ ｍＡｂ）、ペンブロリズマブ（抗ＰＤ１ ｍＡｂ）、及びそれらの派生体、機能的同等物、又はそれらのバイオシミラーの少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態では、多くのｍｉＲＮＡが免疫チェックポイントの発現を制御する調節因子として見出されるため、上述のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストはマイクロＲＮＡベースである（Ｄｒａｇｏｍｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．２０１８，１５（２）：１０３－１１５）。いくつかの実施形態では、チェックポイント拮抗ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－２８、ｍｉＲ－１５／１６、ｍｉＲ－１３８、ｍｉＲ－３４２、ｍｉＲ－２０ｂ、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－１３０ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１９７、ｍｉＲ－２００ｃ、ｍｉＲ－２００、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－５７０、ｍｉＲ－４２４、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｍｉＲ－５１３、及びｍｉＲ－２９ｃを含むがこれらに限定されない。
提供されるｉＰＳＣ由来エフェクター細胞を含む併用療法のいくつかの実施形態は、少なくとも１つのチェックポイント分子を標的化する少なくとも１つのチェックポイント阻害剤を含み、ｉＰＳＣ由来細胞は、表１に列挙された遺伝子型を有する。提供される派生エフェクター細胞との組み合わせ療法のいくつかの他の実施形態は、２つ、３つ以上のチェックポイント分子が標的とされるように、２つ、３つ以上のチェックポイント阻害剤を含む。少なくとも１つのチェックポイント阻害剤及び表１に列挙された遺伝子型を有するｉＰＳＣ由来細胞を含む組み合わせ療法のいくつかの実施形態では、当該チェックポイント阻害剤は、抗体、又はヒト化若しくはＦｃ改変バリアント若しくは断片、又はそれらの機能的同等物若しくはバイオシミラーであり、当該チェックポイント阻害剤は、上記抗体、又はその断片若しくはバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド配列を発現することにより、ｉＰＳＣ由来細胞により産生される。いくつかの実施形態では、抗体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列、又はチェックポイントを阻害するその断片若しくはバリアントは、別個の構築物内、又はＣＡＲと抗体若しくはその断片をコードする配列の両方を含むバイシストロン性構築物内のいずれかで、ＣＡＲと共発現される。いくつかの更なる実施形態では、抗体又はその断片をコードする配列は、例えば、ＣＡＲ－２Ａ－ＣＩ又はＣＩ－２Ａ－ＣＡＲのように例示される自己切断２Ａコード配列を介してＣＡＲ発現コンストラクトの５’又は３’末端のいずれかに連結され得る。したがって、チェックポイント阻害剤とＣＡＲのコード配列は、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にあり得る。チェックポイント阻害剤が送達され、腫瘍微小環境（tumor microenvironment、ＴＭＥ）に浸潤することができる誘導エフェクター細胞によってペイロードとして発現及び分泌されると、それは、ＴＭＥに結合すると阻害性チェックポイント分子を打ち消し、ＣＡＲなどのモダリティを活性化するか、又は受容体を活性化することによって、エフェクター細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲと共発現するチェックポイント阻害剤は、チェックポイント分子、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ＡＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄｌ）、ＣＤ４７、ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐ１、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２（Ｐｏｕ２ｆ２）、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、又は抑制性ＫＩＲのうちの少なくとも１つを阻害する。いくつかの実施形態では、表１に列挙される遺伝子型を有する誘導細胞においてＣＡＲと共発現するチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、トレメリムマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びそれらのヒト化、又はＦｃ改変バリアント、断片、及びそれらの機能的同等物又はバイオシミラーを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲと共発現するチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、又はそのヒト化、又はＦｃ改変バリアント、断片又はそれらの機能的同等物又はバイオシミラーである。いくつかの他の実施形態では、ＣＡＲと共発現するチェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、又はそのヒト化、又はＦｃ改変バリアント、断片又はそれらの機能的同等物又はバイオシミラーである。いくつかの他の実施形態では、ＣＡＲと共発現するチェックポイント阻害剤は、ペンブロリズマブ、又はそのヒト化、又はＦｃ改変バリアント、断片又はそれらの機能的同等物又はバイオシミラーである。
本明細書において提供されるｉＰＳＣ由来細胞及びチェックポイント分子を阻害する少なくとも１つの抗体を含む併用療法のいくつかの他の実施形態では、当該抗体は、ｉＰＳＣ由来細胞によって、又はｉＰＳＣ由来細胞内で産生されず、表１に列挙されている遺伝子型を持つｉＰＳＣ由来細胞の投与の前、それと同時、又はその後に更に投与される。いくつかの実施形態では、提供される派生エフェクター細胞との組み合わせ療法における１つ、２つ、３つ以上のチェックポイント阻害剤の投与は、同時又は逐次的である。表１に列挙された遺伝子型を有する誘導ＮＫ細胞又は誘導Ｔ細胞を含む組み合わせ治療の一実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、トレメリムマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びそれらのヒト化、又はＦｃ改変バリアント、断片、及びそれらの機能的同等物又はバイオシミラーのうちの１つ以上である。表１に列挙された遺伝子型を有する派生ＮＫ細胞又は派生Ｔ細胞を含む組み合わせ治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、又はそのヒト化若しくはＦｃ改変バリアント、断片及びその機能的同等物若しくはバイオシミラーである。表１に列挙された遺伝子型を有する派生ＮＫ細胞又は派生Ｔ細胞を含む組み合わせ治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、又はそのヒト化若しくはＦｃ改変バリアント、断片及びその機能的同等物若しくはバイオシミラーである。表１に列挙された遺伝子型を有する派生ＮＫ細胞又は派生Ｔ細胞を含む組み合わせ治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、ペンブロリズマブ、又はそのヒト化若しくはＦｃ改変バリアント、断片及びその機能的同等物若しくはバイオシミラーである。
ＩＩ．ｉＰＳＣの選択された遺伝子座における標的化ゲノム編集のための方法
本明細書で互換可能に使用されるゲノム編集、又はゲノム編集、又は遺伝子編集は、標的細胞のゲノムにＤＮＡが挿入、欠失、及び／又は置換される一種の遺伝子工学である。標的化ゲノム編集（「標的化ゲノム編集」又は「標的化遺伝子編集」と互換可能である）は、ゲノム内の事前に選択された部位での挿入、欠失、置換を可能にする。標的化編集中に挿入部位で内因性配列が欠失すると、影響を受けた配列を含む内因性遺伝子は、配列欠失によりノックアウト又はノックダウンされる可能性がある。したがって、標的化編集を使用して、内因性遺伝子発現を正確に破壊することもできる。本明細書で同様に使用される用語「標的化組み込み」は、挿入部位での内因性配列の欠失を伴うか又は伴わない、１つ以上の外因性配列の挿入を含むプロセスを指す。対照的に、ランダムに組み込まれた遺伝子は位置効果とサイレンシングの影響を受けやすく、その発現は信頼できず、予測できない。例えば、セントロメア及びサブテロメア領域は、特に導入遺伝子サイレンシングを起こしやすい。相互に新しく組み込まれた遺伝子は、周囲の内因性遺伝子とクロマチンに影響を与え、細胞の挙動を変え、又は細胞の形質転換を促進する可能性がある。したがって、セーフハーバー遺伝子座やゲノムセーフハーバー（genomic safe harbor、ＧＳＨ）などの事前に選択された遺伝子座に外来性ＤＮＡを挿入することは、安全性、効率、コピー数制御、及び信頼性の高い遺伝子応答制御にとって重要である。
標的化編集は、ヌクレアーゼに依存しないアプローチ、又はヌクレアーゼに依存するアプローチのいずれかによって実現され得る。ヌクレアーゼに依存しない標的化編集アプローチでは、相同組換えは、宿主細胞の酵素機構を介して、挿入される外因性ポリヌクレオチドに隣接する相同配列によって導かれる。
代替的に、特異的なレアカットエンドヌクレアーゼによる二本鎖切断（double strand break、ＤＳＢ）の特異的な導入により、より高い頻度で標的化編集を実現することができる。このようなヌクレアーゼ依存の標的化編集は、ＤＳＢに応答して発生する非相同末端結合（non-homologous end joining、ＮＨＥＪ）を含むＤＮＡ修復メカニズムを利用する。外因性の遺伝物質を含むドナーベクターがない場合、ＮＨＥＪは少数の内因性ヌクレオチドのランダムな挿入又は欠失（インデル）をしばしば引き起こす。対照的に、一対のホモロジアームと隣接する外因性遺伝物質を含むドナーベクターが存在する場合、相同組換えによる相同指向性修復（homology directed repair、ＨＤＲ）中に外因性遺伝物質がゲノムに導入され得、「標的化組み込み」がもたらされる。いくつかの状況において、標的化組み込み部位は、選択された遺伝子のコード領域内にあることが意図され、したがって、標的化組み込みは、遺伝子発現を破壊し、１つの単一編集ステップにおいて同時ノックイン及びノックアウト（knock-in and knockout、ＫＩ／ＫＯ）をもたらし得る。
目的の遺伝子座（gene locus of interest、ＧＯＩ）における選択位置に１つ以上の導入遺伝子を挿入して、同時に遺伝子をノックアウトすることを達成することができる。同時ノックイン及びノックアウト（ＫＩ／ＫＯ）に好適な遺伝子座には、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα又はβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴが含まれるが、これらに限定されない。位置選択的挿入のためのそれぞれの部位特異的標的化ホモロジアームにより、導入遺伝子が、部位の内因性プロモータ下又はコンストラクトに含まれる外因性プロモータ下のいずれかで発現されることが可能になる。２つ以上の導入遺伝子が、選択された位置（例えば、ＣＤ３８遺伝子座）に挿入される場合、リンカー配列、例えば２Ａリンカー又はＩＲＥＳは、任意の２つの導入遺伝子の間に配置される。２Ａリンカーは、ＦＭＤＶ、ＥＲＡＶ、ＰＴＶ－１、又はＴａＶに由来する自己切断ペプチド（それぞれ「Ｆ２Ａ」、「Ｅ２Ａ」、「Ｐ２Ａ」、及び「Ｔ２Ａ」と称される）をコードし、単一の翻訳から別々のタンパク質を産生することを可能にする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子及び／又は外因性プロモータサイレンシングのリスクを低減するために、コンストラクトにインスレータが含まれる。外因性プロモータは、ＣＡＧ、又はＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、及びＵＢＣを含むがこれらに限定されない他の構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、若しくは細胞型特異的プロモータであり得る。
特異的な標的化ＤＳＢを導入することができる利用可能なエンドヌクレアーゼには、ジンクフィンガヌクレアーゼ（zinc-finger nucleases、ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（transcription activator-like effector nucleases、ＴＡＬＥＮ）、ＲＮＡ誘導ＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats、クラスタ化等間隔短鎖回分リピート）システムが含まれるが、これらに限定されない。加えて、ｐｈｉＣ３１及びＢｘｂ１インテグラーゼを利用するＤＩＣＥ（ｄｕａｌ ｉｎｔｅｇｒａｓｅ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ、デュアルインテグラーゼカセット交換）システムも、標的化組み込みのための有望なツールである。
ＺＦＮは、ジンクフィンガＤＮＡ結合ドメインに融合したヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。「ジンクフィンガＤＮＡ結合ドメイン」又は「ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ、ＺＦＢＤ」とは、１つ以上のジンクフィンガを介して配列特異的な様式でＤＮＡに結合するポリペプチドドメインを意味する。ジンクフィンガは、亜鉛イオンの配位により構造が安定化されるジンクフィンガ結合ドメイン内の約３０アミノ酸のドメインである。ジンクフィンガの例には、Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガ、Ｃ３Ｈジンクフィンガ、及びＣ４ジンクフィンガが含まれるが、これらに限定されない。「設計された」ジンクフィンガドメインは、天然に存在しないドメインであり、その設計／構成は主に合理的な基準、例えば、既存のＺＦＰ設計と結合データの情報を格納するデータベースの情報を処理するための置換ルールとコンピュータ化アルゴリズムの適用に起因する。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号及び同第６，５３４，２６１号を参照されたい、また、国際公開第９８／５３０５８号、同第９８／５３０５９号、同第９８／５３０６０号、同第０２／０１６５３６号及び同第０３／０１６４９６号も参照されたい。「選択された」ジンクフィンガドメインは、その生産が主にファージディスプレイ、相互作用トラップ、又はハイブリッド選択などの経験的プロセスから生じる天然では見られないドメインである。ＺＦＮは、米国特許第７，８８８，１２１号及び同第７，９７２，８５４号で詳細に説明されており、それらの完全な開示は参照により本明細書に組み込まれる。当該技術分野で最も認識されているＺＦＮの例は、ＦｏｋＩヌクレアーゼとジンクフィンガＤＮＡ結合ドメインとの融合である。
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインに融合したヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。「転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、「ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、又は「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」とは、ＴＡＬエフェクタータンパク質のＤＮＡへの結合に関与するＴＡＬエフェクタータンパク質のポリペプチドドメインを意味する。ＴＡＬエフェクタータンパク質は、感染中にＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原体によって分泌される。これらのタンパク質は植物細胞の核に入り、それらのＤＮＡ結合ドメインを介してエフェクター特異的なＤＮＡ配列に結合し、トランス活性化ドメインを介してこれらの配列で遺伝子転写を活性化する。ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインの特異性は、反復可変残基（repeat variable-diresidue、ＲＶＤ）と呼ばれる選択された反復位置に多型を含む不完全な３４アミノ酸リピートのエフェクター可変数に依存する。ＴＡＬＥＮについては、米国特許出願公開第２０１１／０１４５９４０号により詳細に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。当該技術分野で最も認識されているＴＡＬＥＮの例は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインへのＦｏｋＩヌクレアーゼの融合ポリペプチドである。
本発明の方法で使用される標的化ヌクレアーゼの別の例は、標的化Ｓｐｏ１１ヌクレアーゼ、目的のＤＮＡ配列に特異性を有するＤＮＡ結合ドメイン、例えばジンクフィンガＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインなどに融合したヌクレアーゼ活性を有するＳｐｏ１１ポリペプチドを含むポリペプチドである。
本発明に好適な標的化ヌクレアーゼの更なる例には、個別に又は組み合わせて使用されるかどうかにかかわらず、Ｂｘｂ１、ｐｈｉＣ３１、Ｒ４、ＰｈｉＢＴ１、及びＷβ／ＳＰＢｃ／ＴＰ９０１－１が含まれるが、これらに限定されない。
標的化ヌクレアーゼの他の非限定的な例には、天然に存在するヌクレアーゼ及び組換えヌクレアーゼ、ｃａｓ、ｃｐｆ、ｃｓｅ、ｃｓｙ、ｃｓｎ、ｃｓｄ、ｃｓｔ、ｃｓｈ、ｃｓａ、ｃｓｍ、及びｃｍｒを含むファミリーからのＣＲＩＳＰＲ関連のヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼなどが挙げられる。
一例としてＣａｓ９を使用すると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、２つの主要な成分：（１）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと（２）ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体とを必要とする。共発現すると、２つの成分が複合体を形成し、ＰＡＭ及びＰＡＭ近位のシーディング領域（seeding region）を含む標的ＤＮＡ配列に動員される。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを組み合わせてキメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を形成し、Ｃａｓ９を選択した配列を標的に導くことができる。次いで、これら２つの成分は、トランスフェクション又は形質導入を介して哺乳動物細胞に送達できる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ系を使用すると、選択された配列を標的化するようにＣｐｆエンドヌクレアーゼをガイドするために、Ｃｐｆエンドヌクレアーゼ（Ｃｐｆ１、ＭＡＤ７、及び当該技術分野において既知の更に多くのもの）及び（２）ｇＮＡ（これは、多くの場合、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない）が必要とされる。
ＤＩＣＥを介した挿入は、例えば、ｐｈｉＣ３１とＢｘｂ１などのリコンビナーゼの対を使用して、各酵素自体の小さなａｔｔＢ及びａｔｔＰ認識部位に厳しく制限されている外因性ＤＮＡの一方向の組み込みを提供する。これらの標的化ａｔｔ部位は哺乳類のゲノムには天然に存在しないため、最初に所望の組み込み部位のゲノムに導入する必要がある。例えば、米国特許出願公開第２０１５／０１４０６６５号（その開示が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
本発明の一態様は、標的化されたゲノム組み込みのための１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを提供する。一実施形態では、コンストラクトは、所望の組み込み部位に特異的な一対の相同アームを更に含み、標的化組み込みの方法は、コンストラクトを細胞に導入して、細胞宿主酵素機構による部位特異的相同組換えを可能にすることを含む。別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＺＦＮ発現カセットを細胞に導入してＺＦＮを介した挿入を可能にすることと、を含む。更に別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬＥＮ発現カセットを細胞に導入してＴＡＬＥＮを介した挿入を可能にすることと、を含む。別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入することと、Ｃａｓ９発現カセット及び所望の組み込み部位に特異的なガイド配列を含むｇＲＮＡを細胞に導入してＣａｓ９を介した挿入を可能にすることと、を含む。更に別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、一対のＤＩＣＥリコンビナーゼの１つ以上のａｔｔ部位を含むコンストラクトを細胞内の所望の組み込み部位に導入することと、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入することと、ＤＩＣＥリコンビナーゼ用の発現カセットを導入し、ＤＩＣＥを介した標的化組み込みを可能にすることと、を含む。
標的化組み込みのための有望な部位には、ヒトのゲノムの遺伝子内又は遺伝子外領域であり、理論的には、宿主細胞又は生物に悪影響を与えることなく、新たに組み込まれたＤＮＡの予測可能な発現に対応できる、セーフハーバー遺伝子座、又はゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）が含まれるが、これらに限定されない。有用なセーフハーバーは、ベクターにコードされたタンパク質又は非コードＲＮＡの望ましいレベルを生成するために十分な導入遺伝子発現を可能にする必要がある。セーフハーバーはまた、細胞を悪性形質転換しやすくしたり、細胞機能を変化させたりするものであってはならない。組み込み部位が、可能性のあるセーフハーバー遺伝子座であるためには、理想的には、以下を含むがこれらに限定されない基準を満たす必要がある：配列アノテーションによって判断されるような、調節エレメント又は遺伝子の破壊が存在しないこと、遺伝子密集領域内の遺伝子間領域、又は反対方向に転写された２つの遺伝子の間の収束位置であること、ベクターにコードされた転写活性化因子と、隣接する遺伝子、特にがん関連遺伝子及びマイクロＲＮＡ遺伝子のプロモータとの間の長距離相互作用の可能性を最小限にする距離を保つこと、並びに遍在的な転写活性を示す、広範な空間的及び時間的発現配列タグ（expressed sequence tag、ＥＳＴ）発現パターンによって反映されるような、明らかに遍在的な転写活性を有すること。この後者の特質は幹細胞で特に重要であり、幹細胞では、分化中にクロマチンのリモデリングが通常、いくつかの遺伝子座のサイレンシングと他の遺伝子座の活性化の可能性をもたらす。外因性挿入に好適な領域内では、挿入のために選択された正確な遺伝子座は、反復要素と保存された配列を欠き、ホモロジアームの増幅用のプライマーを簡単に設計することができるはずである。
ヒトゲノム編集、又は具体的には標的化組み込みに好適な部位には、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、ケモカイン（ＣＣモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子座、及びマウスＲＯＳＡ２６遺伝子座のヒトのオルソログが含まれるが、これらに限定されない。加えて、マウスＨ１１遺伝子座のヒトオルソログはまた、本明細書に開示される標的化組み込みの組成物及び方法を使用して挿入するための好適な部位であり得る。更に、コラーゲンとＨＴＲＰ遺伝子座は、標的化組み込みのためのセーフハーバーとしても使用され得る。しかしながら、選択した各部位の検証は、特定の組み込み事象のために特に幹細胞で必要であることが示されており、プロモータの選択、外因性遺伝子の配列と配置、コンストラクトの設計などの挿入戦略の最適化がしばしば必要である。
標的化されたインデルのために、編集部位はしばしばその発現及び／又は機能が破壊されることが意図されている内因性遺伝子に含まれている。一実施形態では、標的化されたインデルを含む内因性遺伝子は、免疫応答の調節及び調整と関連する。いくつかの他の実施形態では、標的化インデルを含む内因性遺伝子は、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答調節及び修飾、あるいは幹細胞及び／又は前駆細胞、並びにそれらに由来する細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び／又は生存率を抑制するタンパク質と関連する。
したがって、本発明の別の態様は、ゲノムセーフハーバーを含む選択された遺伝子座、又は本明細書において提供されるような、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＴＲＡＣ、若しくはＣＤ３８遺伝子座などの継続的又は一時的な遺伝子発現について安全かつ十分に調節されていることが既知の若しくは証明された事前に選択された遺伝子座における標的化組み込みの方法を提供する。一実施形態では、標的化組み込みの方法のためのゲノムセーフハーバーは、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ－２ミクログロブリン、ＣＤ３８、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、若しくはＲＵＮＸ１、又はゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、１つ以上の望ましい組み込み部位を含む。いくつかの実施形態では、標的化組み込みは、組み込みの結果としての遺伝子のノックダウン又はノックアウトが望まれる、１つ以上の遺伝子座にあり、そのような遺伝子座には、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα又はβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴが含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なホモロジアームの対及び１つ以上の外因性配列を含む構築物を導入して、細胞宿主酵素機構による部位特異的相同組換えを可能にすることと、を含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、又はＴＩＧＩＴを含む。
別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＺＦＮ発現カセットを細胞に導入して、ＺＦＮ媒介挿入を可能にすることと、を含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、又はＴＩＧＩＴを含む。更に別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬＥＮ発現カセットを細胞に導入して、ＴＡＬＥＮ媒介挿入を可能にすることと、を含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、又はＴＩＧＩＴを含む。別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＣａｓ９発現カセット、及びガイド配列を含むｇＲＮＡを細胞に導入して、Ｃａｓ９媒介挿入を可能にすることと、を含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、又はＴＩＧＩＴを含む。更に別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、ＤＩＣＥレコンビナーゼの対の１つ以上のａｔｔ部位を含む構築物を細胞における所望の組み込み部位に導入することと、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、ＤＩＣＥレコンビナーゼの発現カセットを導入して、ＤＩＣＥ媒介標的化組み込みを可能にすることと、を含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、又はＴＩＧＩＴを含む。
更に、本明細書で提供されるように、セーフハーバーでの標的化組み込みのための上述の方法は、目的のポリヌクレオチド、例えば、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、及び幹細胞及び／又は前駆細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び／又は生存率を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入するために使用される。いくつかの他の実施形態では、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトは、１つ以上のマーカー遺伝子を更に含む。一実施形態では、本発明の構築物中の外因性ポリヌクレオチドは、安全スイッチタンパク質をコードする自殺遺伝子である。誘導された細胞死のための好適な自殺遺伝子系としては、カスパーゼ９（又はカスパーゼ３若しくは７）及びＡＰ１９０３、チミジンキナーゼ（thymidine kinase、ＴＫ）及びガンシクロビル（ganciclovir、ＧＣＶ）、シトシンデアミナーゼ（cytosine deaminase、ＣＤ）及び５－フルオロシトシン（5-fluorocytosine、５－ＦＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、一部の自殺遺伝子系は細胞型に特異的であり、例えば、Ｂ細胞分子ＣＤ２０によるＴリンパ球の遺伝子改変は、ｍＡｂリツキシマブの投与時にそれらを排除することができる。更に、セツキシマブによって認識されるエピトープを含む改変されたＥＧＦＲは、細胞がセツキシマブに曝露されたときに遺伝子操作された細胞を枯渇させるために使用することができる。したがって、本発明の一態様は、カスパーゼ９（カスパーゼ３又は７）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変ＥＧＦＲ、及びＢ細胞ＣＤ２０から選択される安全スイッチタンパク質をコードする１つ以上の自殺遺伝子の標的化組み込みの方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書の方法によって組み込まれた１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、標的化組み込みのためのコンストラクトに含まれる作動可能に連結された外因性プロモータによって駆動される。プロモータは誘導性又は構成的であり得、時間特異的、組織特異的又は細胞型特異的であり得る。本発明の方法に好適な構成的プロモータには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、伸長因子１α（elongation factor 1α、ＥＦ１α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（phosphoglycerate kinase、ＰＧＫ）、ハイブリッドＣＭＶエンハンサ／ニワトリβ－アクチン（enhancer/chicken β-actin、ＣＡＧ）、及びユビキチンＣ（ubiquitin C、ＵＢＣ）プロモータが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、外因性プロモータはＣＡＧである。
本明細書において提供される方法によって組み込まれた外因性ポリヌクレオチドは、組み込み部位において、宿主ゲノム中の内因性プロモータによって駆動され得る。一実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムにおけるＡＡＶＳ１遺伝子座における１つ以上の外因性ポリヌクレオチドの標的化組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性ＡＡＶＳ１プロモータによって駆動される。別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムにおけるＲＯＳＡ２６遺伝子座での標的化組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性ＲＯＳＡ２６プロモータによって駆動される。更に別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムにおけるＨ１１遺伝子座での標的化組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性Ｈ１１プロモータによって駆動される。別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムにおけるコラーゲン遺伝子座での標的化組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性コラーゲンプロモータによって駆動される。更に別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムにおけるＨＴＲＰ遺伝子座での標的化組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性ＨＴＲＰプロモータによって駆動される。理論的には、所望の位置での正しい挿入のみが、内因性プロモータによって駆動される外因性遺伝子の遺伝子発現を可能にするであろう。
いくつかの実施形態では、標的化組み込みの方法のためのコンストラクトに含まれる１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、１つのプロモータによって駆動される。いくつかの実施形態では、コンストラクトは、同じプロモータによって駆動される２つの隣接するポリヌクレオチド間に１つ以上のリンカー配列を含み、部分間の物理的分離を高め、酵素機構へのアクセスを最大にする。リンカー配列のリンカーペプチドは、関連する機能に応じて、部分（外因性ポリヌクレオチド、及び／又はそこからコードされるタンパク質又はペプチド）間の物理的分離をより柔軟又はより堅くするように選択されたアミノ酸からなり得る。リンカー配列は、プロテアーゼにより切断可能であり得るか、又は化学的に切断可能であり、別個の部分を生じ得る。リンカーにおける酵素的切断部位の例には、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、トリプシン、コラゲナーゼ、及びトロンビンなどのタンパク質分解酵素による切断のための部位が含まれる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、宿主によって天然に産生されるものであるか、又は外因的に導入される。代替的に、リンカー中の切断部位は、選択された化学物質又は条件、例えば臭化シアン、ヒドロキシルアミン、又は低ｐＨへの曝露時に切断され得る部位であり得る。必要に応じたリンカー配列は、切断部位の提供以外の目的を果たし得る。リンカー配列は、部分が適切に機能するために、別の隣接部分に対する部分の効果的な配置を可能にするべきである。リンカーはまた、部分間のいずれかの立体障害を防ぐのに十分な長さの単純なアミノ酸配列であってもよい。加えて、リンカー配列は、例えば、リン酸化部位、ビオチン化部位、硫酸化部位、γ－カルボキシル化部位などを含むがこれらに限定されない翻訳後改変を提供することができる。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、生物学的に活性なペプチドを単一の望ましくない立体配座に保持しないように柔軟である。リンカーは、柔軟性を提供するために、グリシン、アラニン、及びセリンなどの小さな側鎖を有するアミノ酸から主になっていてもよい。いくつかの実施形態では、リンカー配列の約８０又は９０パーセント以上が、グリシン、アラニン、又はセリン残基、特にグリシン及びセリン残基を含む。いくつかの実施形態では、Ｇ４Ｓリンカーペプチドは、融合タンパク質の末端プロセシング及びエンドヌクレアーゼドメインを分離する。他の実施形態では、２Ａリンカー配列は、２つの別個のタンパク質が単一の翻訳から産生されることを可能にする。好適なリンカー配列は、経験的に容易に同定することができる。加えて、リンカー配列の好適なサイズ及び配列はまた、従来のコンピュータモデリング技術によって決定され得る。一実施形態では、リンカー配列は、自己切断ペプチドをコードする。一実施形態では、自己切断ペプチドは２Ａである。いくつかの他の実施形態では、リンカー配列は、配列内リボソーム進入部位（Internal Ribosome Entry Sequence、ＩＲＥＳ）を提供する。いくつかの実施形態では、任意の２つの連続するリンカー配列は異なる。
標的化組み込みのための外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入する方法は、それ自体既知の細胞への遺伝子移入の方法を使用して達成することができる。一実施形態では、構築物は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどのウイルスベクターの骨格を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベクターは、外因性ポリヌクレオチドを標的細胞（例えば、ｐＡ１－１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）などに送達及び／又は発現するために使用される。いくつかの他の実施形態では、エピソームベクターは、外因性ポリヌクレオチドを標的細胞に送達するために使用される。いくつかの実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス（recombinant adeno-associated virus、ｒＡＡＶ）を遺伝子操作に使用して、相同組換えを介して挿入、欠失、又は置換を導入することができる。レンチウイルスとは異なり、ｒＡＡＶは宿主ゲノムに組み込まれない。加えて、エピソームｒＡＡＶベクターは、従来の標的化プラスミドのトランスフェクションと比較して、相同指向性遺伝子標的化をはるかに高い割合で仲介する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ６又はＡＡＶ２ベクターを使用して、ｉＰＳＣのゲノム中の標的部位に挿入、欠失、又は置換を導入する。いくつかの実施形態では、本明細書の方法及び組成物を使用して取得されたゲノム改変されたｉＰＳＣ及びその派生細胞は、表１に列挙された少なくとも１つの遺伝子型を含む。
ＩＩＩ．ゲノム操作されたｉＰＳＣを取得及び維持する方法
本発明は、１つ以上の所望の部位での１つ以上の標的化編集を含むゲノム操作されたｉＰＳＣを取得及び維持する方法であって、標的化編集が、増殖されたゲノム操作されたｉＰＳＣ又はｉＰＳＣ派生非多能性細胞において、それぞれの選択された編集部位で無傷で機能的であり続ける、方法を提供する。標的化編集は、ｉＰＳＣとそれからの派生細胞のゲノムに、挿入、欠失、及び／又は置換を導入、すなわち、選択した部位での標的化組み込み及び／又はインデルを導入する。患者由来の末梢血由来一次エフェクター細胞の直接操作と比較して、本明細書において提供されるｉＰＳＣの編集及び分化を通じてゲノム操作されたｉＰＳＣ由来エフェクター細胞を得ることの多くの利点としては、操作されたエフェクター細胞の供給源が無制限であること、特に複数の操作された様式が関与する場合、エフェクター細胞の反復操作の必要がないこと、得られたエフェクター細胞が、伸長したテロメアを有し、消耗が少ないために若返っていること、エフェクター細胞集団は、編集部位、コピー数、並びに対立遺伝子変異、ランダム突然変異及び発現多様性（variegation）の欠如に関して均質であり、これは主に、本明細書において提供される操作されたｉＰＳＣにおけるクローン選択が可能であることに起因する。
特定の実施形態では、１つ以上の選択された部位に１つ以上の標的化編集を含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、運命維持培地（Fate Maintenance Medium、ＦＭＭ）として表２に示される細胞培養培地で長期間単一細胞として維持、継代、及び増殖され、ｉＰＳＣは、選択された部位で標的化編集と機能改変を保持する。培地の成分は、表２に示される最適範囲内の量で培地中に存在し得る。ＦＭＭ中で培養されたｉＰＳＣは、それらの未分化プロファイル及び基底プロファイル又はナイーブプロファイル；培養洗浄又は選択を必要としないゲノム安定性を維持し続けることが示されており、３つの体細胞系統全て、すなわち、胚様体又は単層を介するインビトロ分化（胚様体の形成を伴わない）、及びテラトーマ形成によるインビボ分化を容易に生じる。例えば、国際公開第２０１５／１３４６５２号（その開示が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、１つ以上の標的化組み込み及び／又はインデルを含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中で維持され、継代され、増殖され、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤を含まないか、又は本質的に含まず、ｉＰＳＣは、選択された部位において無傷で機能的な標的化編集を保持する。
本発明の別の態様は、ｉＰＳＣの標的化編集を通じて、あるいは最初に標的化編集によりゲノム操作非多能性細胞を生成し、次に選択／分離されたゲノム操作非多能性細胞をリプログラミングして非多能性細胞と同じ標的化編集を含むｉＰＳＣを取得することを通じて、ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法を提供する。本発明の更なる態様は、標的化組み込み及び／又は標的化インデルを細胞に導入することによって同時にリプログラミングを受けているゲノム操作非多能性細胞を提供し、接触した非多能性細胞はリプログラミングに十分な条件下にあり、リプログラミングの条件は、非多能性細胞を１つ以上のリプログラミング因子及び小分子と接触させることを含む。同時のゲノム操作及びリプログラミングのための方法の様々な実施形態では、非多能性細胞を１つ以上のリプログラミング因子及び任意選択で小分子と接触させることにより、リプログラミングを開始する前に、又は本質的に同時に、非標的多能性細胞に標的化組み込み及び／又は標的化インデルを導入することができる。
いくつかの実施形態では、非多能性細胞を同時にゲノム操作及びリプログラミングするために、標的化組み込み及び／又はインデルはまた、非多能性細胞を１つ以上のリプログラミング因子及び小分子と接触させることによりリプログラミングの複数日のプロセスが開始された後に非多能性細胞に導入され得、リプログラミング細胞がＳＳＥＡ４、Ｔｒａ１８１及びＣＤ３０を含むがこれらに限定されない１つ以上の内因性多能性遺伝子の安定した発現を示す前に、コンストラクトを担持するベクターが導入される。
いくつかの実施形態では、リプログラミングは、非多能性細胞を少なくとも１つのリプログラミング因子、及び任意選択でＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせ（ＦＲＭ；表２）と接触させることにより開始される。いくつかの実施形態では、上述の任意の方法によるゲノム操作されたｉＰＳＣは、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせを含む混合物（ＦＭＭ；表２）を使用して更に維持及び増殖される。
ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法のいくつかの実施形態では、方法は、ｉＰＳＣに１つ以上の標的化組み込み及び／又はインデルを導入してｉＰＳＣをゲノム操作し、表１に列挙された少なくとも１つの遺伝子型を有するゲノム操作されたｉＰＳＣを取得することを含む。代替的に、ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法は、（ａ）１つ以上の標的化編集を非多能性細胞に導入して、選択した部位で標的化組み込み及び／又はインデルを含むゲノム操作非多能性細胞を取得することと、（ｂ）ゲノム操作された非多能性細胞を１つ以上のリプログラミング因子、及び任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及び／又はＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、選択された部位で標的化組み込み及び／又はインデルを含むゲノム操作されたｉＰＳＣを取得することと、を含む。代替的に、ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法は、（ａ）非多能性細胞を、１つ以上のリプログラミング因子、並びに任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及び／又はＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、非多能性細胞のリプログラミングを開始することと、（ｂ）ゲノム操作のためにリプログラミング非多能性細胞に１つ以上の標的組込み及び／又は挿入／欠失を導入することと、（ｃ）選択された部位に標的組込み及び／又は挿入／欠失を含むゲノム操作されたｉＰＳＣを得ることと、を含む。上記の方法のいずれかは、クローンｉＰＳＣを得るために、ゲノム操作されたｉＰＳＣの単一細胞ソーティングを更に含み得る。このゲノム操作されたｉＰＳＣのクローン増殖を通じて、本明細書において提供されるような少なくとも１つの表現型を有する単一細胞ソーティング及び増殖されたクローン操作ｉＰＳＣを含むようにマスタ細胞バンクが生成される。マスタ細胞バンクは、続いて凍結保存され、更なるｉＰＳＣ操作のためのプラットフォーム、及び既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供し、これらの製品は、組成が明確かつ均一であり、費用効果の高い様式でかなりの規模で大量生産することができる。
リプログラミング因子は、国際公開第２０１５／１３４６５２号及び同第２０１７／０６６６３４号に開示されているような、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３、Ｌ１ＴＤ１、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。１つ以上のリプログラミング因子は、ポリペプチドの形態であり得る。リプログラミング因子はまた、ポリヌクレオチドの形態であり得、したがって、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、プラスミド、及びミニサークルなどのベクターによって非多能性細胞に導入される。特定の実施形態では、少なくとも１つのリプログラミング因子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクターによって導入される。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドはエピソームベクターによって導入される。様々な他の実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、センダイウイルスベクターによって導入される。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、プラスミドの組み合わせによって導入される。例えば、国際公開第２０１９／０７５０５７号（その開示が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、非多能性細胞は、同一の又は異なる選択された部位での標的化組み込みのための複数のベクターによって、異なる外因性ポリヌクレオチド及び／又は異なるプロモータを含む複数の構築物で移入される。これらの外因性ポリヌクレオチドは、自殺遺伝子、又は標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、又はｉＰＳＣ若しくはそれからの誘導細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び／又は生存率を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びアンチセンス核酸を含むがこれらに限定されないＲＮＡをコードする。これらの外因性ポリヌクレオチドは、構成的プロモータ、誘導性プロモータ、時間特異的プロモータ、及び組織特異的又は細胞型特異的プロモータからなる群から選択される１つ以上のプロモータによって駆動され得る。したがって、ポリヌクレオチドは、プロモータを活性化する条件下で、例えば、誘導剤の存在下で、又は特定の分化した細胞型で発現可能である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｉＰＳＣ及び／又はｉＰＳＣから分化した細胞で発現される。一実施形態では、１つ以上の自殺遺伝子は、構成的プロモータにより駆動され、例えば、ＣＡＧにより駆動されるキャパーゼ－９である。異なる外因性ポリヌクレオチド及び／又は異なるプロモータを含むこれらのコンストラクトは、同時又は連続的に非多能性細胞に移入することができる。複数のコンストラクトの標的化組み込みに供される非多能性細胞は、１つ以上のリプログラミング因子に同時に接触させて、ゲノム操作と同時にリプログラミングを開始することができ、これにより、同じ細胞のプールに複数の標的化組み込みを含むゲノム操作されたｉＰＳＣを取得する。このように、この堅牢な方法により、同時のリプログラミングと操作戦略により、選択された１つ以上の標的部位に組み込まれた複数のモダリティを持つクローンゲノム操作ｈｉＰＳＣを派生させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書の方法及び組成物を使用して取得されたゲノム改変されたｉＰＳＣ及びそれらの誘導細胞は、表１に列挙された少なくとも１つの遺伝子型を含む。
ＩＶ．ゲノム操作されたｉＰＳＣを分化させることにより遺伝子操作されたエフェクター細胞を取得する方法
本発明の更なる態様は、奇形腫形成によるゲノム操作されたｉＰＳＣのインビボ分化の方法を提供し、ゲノム操作されたｉＰＳＣからインビボで誘導された分化細胞は、所望の部位で標的化組み込み及び／又はインデルを含む無傷で機能的な標的化編集を保持する。いくつかの実施形態では、奇形腫を介してゲノム操作されたｉＰＳＣからインビボで誘導された分化細胞は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ２ミクログロブリン、ＣＤ３８、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、若しくはＲＵＮＸ１、又はゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、１つ以上の望ましい部位に組み込まれた１つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む。いくつかの他の実施形態では、奇形腫を介してゲノム操作されたｉＰＳＣからインビボで誘導された分化細胞は、標的化モダリティをコードするポリヌクレオチド、又は幹細胞及び／若しくは前駆細胞の輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び／若しくは生存率を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む奇形腫を介してゲノム操作されたｉＰＳＣからインビボで派生した分化細胞は、免疫応答の調節及び媒介と関連する内因性遺伝子の１つ以上のインデルを更に含む。いくつかの実施形態では、インデルは、１つ以上の内因性チェックポイント遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、１つ以上の内因性Ｔ細胞受容体遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、１つ以上の内因性ＭＨＣクラスＩサプレッサ遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、主要組織適合性複合体と関連する１つ以上の内因性遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、イン／デルは、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα又はβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、又はＴＩＧＩＴを含むが、これらに限定されない、１つ以上の内因性遺伝子に含まれる。一実施形態では、選択された部位に１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、Ｂ２Ｍ（ｂｅｔａ－２－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、ベータ－２－ミクログロブリン）をコードする遺伝子における標的化編集を更に含む。
特定の実施形態では、本明細書で提供される１つ以上の遺伝子改変を含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、造血細胞系統又は他の特定の細胞型をインビトロで誘導するために使用され、誘導された非多能性細胞は、選択された部位で標的化編集を含む機能的遺伝子改変を保持する。いくつかの実施形態では、造血細胞系統又は他の特定の細胞型をインビトロで誘導するために使用されるゲノム操作されたｉＰＳＣは、凍結保存され、それらの使用直前に解凍される、マスタ細胞バンク細胞である。一実施形態では、ゲノム操作されたｉＰＳＣ派生細胞は、決定的な造血内皮（ＨＥ）能を有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４＋造血細胞、造血幹前駆細胞、造血多能性前駆体（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、骨髄細胞、好中球前駆体、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、及びマクロファージを含むがこれらに限定されず、ゲノム操作されたｉＰＳＣから派生するこれらの細胞は、所望の部位で標的化編集を含む機能的な遺伝子改変を保持する。
ｉＰＳＣ由来造血細胞系統を得るための適用可能な分化方法及び組成物には、例えば、国際公開第２０１７／０７８８０７号に示されるものが含まれ、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。提供されているように、造血細胞系統を生成するための方法と組成物は、無血清、フィーダを含まない、及び／又は間質を含まない条件下で、スケーラブルで単層のＥＢ形成を必要としない培養プラットフォームにおいて、ｉＰＳＣを含む、多能性幹細胞に由来する決定的な造血内皮（ＨＥ）を介する。提供された方法に従って分化され得る細胞は、多能性幹細胞から、特定の最終分化細胞及び分化転換細胞にコミットした前駆細胞、及び多能性中間体を経由せずに造血運命に直接移行した様々な系統の細胞にまで及ぶ。同様に、幹細胞を分化させることによって産生される細胞は、多能性幹細胞又は前駆細胞から、最終分化細胞まで、及び全ての介在する造血細胞系統にまで及ぶ。
単層培養において造血系統の細胞を多能性幹細胞から分化及び増殖させる方法は、多能性幹細胞をＢＭＰ経路活性化因子、及び任意選択でｂＦＧＦと接触させることを含む。提供されるように、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が得られ、多能性幹細胞から胚様体を形成することなく増殖される。次いで、中胚葉細胞をＢＭＰ経路活性化因子、ｂＦＧＦ、及びＷＮＴ経路活性化因子との接触に供して、多能性幹細胞から胚様体を形成することなく、決定的な造血内皮（ＨＥ）能を有する増殖中胚葉細胞を取得する。その後のｂＦＧＦとの接触、及び任意選択でＲＯＣＫ阻害剤、及び／又はＷＮＴ経路活性化因子との接触により、決定的なＨＥ能を有する中胚葉細胞は、同様に分化中に増殖される、決定的なＨＥ細胞に分化する。
本明細書において提供される造血系統の細胞を取得するための方法はＥＢ媒介の多能性幹細胞分化より優れているが、これは、ＥＢ形成が適度な増殖から最小限の細胞増殖をもたらし、均一な増殖を必要とする多くの用途で重要な単層培養、及び集団内の細胞の均一な分化を可能にせず、骨が折れ、効率が低くなるためである。
提供されている単層分化プラットフォームは、造血幹細胞及びＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＮＫ細胞などの分化した子孫の誘導をもたらす決定的な造血内皮への分化を促進する。単層分化戦略は、増強された分化効率と大規模な増殖を組み合わせて、様々な治療用途のための多能性幹細胞由来造血細胞の治療上適切な数の送達を可能にする。更に、本明細書において提供される方法を使用した単層培養は、インビトロ分化、エクスビボ修飾、及びインビボ長期造血自己複製、再構成及び生着の全範囲を可能にする機能的造血系統細胞をもたらす。提供されているように、ｉＰＳＣ由来造血系統細胞には、決定的な造血内皮、造血多能性前駆細胞、造血幹細胞及び前駆細胞、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、並びに好中球が含まれるがこれらに限定されない。
決定的な造血系統の細胞への多能性幹細胞の分化を指示するための方法であって、当該方法は、（ｉ）多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子、及び任意選択でｂＦＧＦを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞からの中胚葉細胞の分化及び増殖を開始させることと、（ｉｉ）中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子、ｂＦＧＦ、及びＧＳＫ３阻害剤を含む組成物と接触させて、中胚葉細胞からの決定的なＨＥの可能性を有する中胚葉細胞の分化及び増殖を開始させることであって、組成物は、任意選択でＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない、ことと、（ｉｉｉ）決定的なＨＥ能を有する中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＧＦ、ＥＰＯ、ＩＬ６、及びＩＬ１１からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカイン、並びに任意選択でＷｎｔ経路活性化因子を含む組成物と接触させて、決定的な造血内皮能を有する多能性幹細胞由来中胚葉細胞からの決定的な造血内皮の分化及び増殖を開始させることであって、組成物は、任意選択でＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない、ことと、を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、多能性幹細胞を、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させ、多能性幹細胞を播種及び増殖させることを更に含む。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣ、又はナイーブｉＰＳＣ、又は１つ以上の遺伝的インプリントを含むｉＰＳＣであり、ｉＰＳＣに含まれる１つ以上の遺伝的インプリントは、そこから分化した造血細胞に保持される。多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化を指示するための方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化は、胚様体の生成がなく、単層培養形態である。
上述の方法のいくつかの実施形態では、取得された多能性幹細胞由来の決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋である。いくつかの実施形態では、取得された決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－である。いくつかの実施形態では、決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＣＸＣＲ４－ＣＤ７３－である。いくつかの実施形態では、決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＸＣＲ４－ＣＤ７３－である。いくつかの実施形態では、決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＣＤ９３－である。いくつかの実施形態では、決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ９３－である。
上述の方法のいくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）多能性幹細胞由来の決定的な造血内皮を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、及びＩＬ７からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカインと、任意選択でＢＭＰ活性化因子とを含む組成物と接触させて、プレＴ細胞前駆体への決定的な造血内皮の分化を開始させることと、任意選択で、（ｉｉ）プレＴ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、及びＩＬ７からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカインを含むが、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ活性化因子及びＲＯＣＫ阻害剤のうちの１つ以上を含まない組成物と接触させて、Ｔ細胞前駆体又はＴ細胞へのプレＴ細胞前駆体の分化を開始させることと、を更に含む。この方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来Ｔ細胞前駆体は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ７＋である。この方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来Ｔ細胞前駆体は、ＣＤ４５＋ＣＤ７＋である。
多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化を指示するための上記方法の更にいくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）多能性幹細胞由来の決定的な造血内皮を、ＲＯＣＫ阻害剤；ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＩＬ７、及びＩＬ１５からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカイン、並びにＢＭＰ活性化因子を含む組成物と接触させ、決定的な造血内皮のプレＮＫ細胞前駆体への分化を開始することと、任意選択で（ｉｉ）多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、及びＩＬ１５からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカインを含む任意選択で組成物と接触させ、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ活性化因子、及びＲＯＣＫ阻害剤の１つ以上を含まない培地は、プレＮＫ細胞前駆体からＮＫ細胞前駆体又はＮＫ細胞への分化を開始することと、を更に含む。上記方法のいくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、多能性幹細胞由来プレＮＫ細胞前駆体を接触させることを含む。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来ＮＫ前駆体は、ＣＤ３－ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋ＣＤ７＋である。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来ＮＫ細胞は、ＣＤ３－ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋であり、任意選択で、ＮＫｐ４６＋、ＣＤ５７＋及びＣＤ１６＋であることによって更に規定される。
したがって、上記の分化方法を使用すると、以下のｉＰＳＣ由来造血細胞の１つ以上の集団を取得し得る：（ｉ）ｉＭＰＰ－Ａ、ｉＴＣ－Ａ２、ｉＴＣ－Ｂ２、ｉＮＫ－Ａ２、及びｉＮＫ－Ｂ２から選択される１つ以上の培養培地を使用する、ＣＤ３４＋ ＨＥ細胞（ｉＣＤ３４）、（ｉｉ）ｉＭＰＰ－Ａ、ｉＴＣ－Ａ２、ｉＴＣ－Ｂ２、ｉＮＫ－Ａ２、及びｉＮＫ－Ｂ２から選択される１つ以上の培養培地を使用する、決定的な造血内皮（ｉＨＥ）、（ｉｉｉ）ｉＭＰＰ－Ａ、ｉＴＣ－Ａ２、ｉＴＣ－Ｂ２、ｉＮＫ－Ａ２、及びｉＮＫ－Ｂ２から選択される１つ以上の培養培地を使用する、決定的なＨＳＣ、（ｉｖ）ｉＭＰＰ－Ａを使用する、多能性前駆細胞（ｉＭＰＰ）、（ｖ）ｉＴＣ－Ａ２、及びｉＴＣ－Ｂ２から選択される１つ以上の培養培地を使用する、Ｔ細胞前駆体（ｉｐｒｏ－Ｔ）、（ｖｉ）ｉＴＣ－Ｂ２を使用する、Ｔ細胞（ｉＴＣ）、（ｖｉｉ）ｉＮＫ－Ａ２、及びｉＮＫ－Ｂ２から選択される１つ以上の培養培地を使用する、ＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏ－ＮＫ）、並びに／又は（ｖｉｉｉ）ＮＫ細胞（ｉＮＫ）、及びｉＮＫ－Ｂ２。いくつかの実施形態では、培地は以下である：
ａ．ｉＣＤ３４－Ｃは、ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＧＦ、及びＥＰＯからなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカインと、任意選択で、Ｗｎｔ経路活性化因子とを含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない。
ｂ．ｉＭＰＰ－Ａは、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、Ｆｌｔ３Ｌ、及びＩＬ１１からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカインとを含む。
ｃ．ｉＴＣ－Ａ２は、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、及びＩＬ７からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカインと、任意選択でＢＭＰ活性化因子と、を含む。
ｄ．ｉＴＣ－Ｂ２は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、及びＩＬ７からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカインを含む。
ｅ．ｉＮＫ－Ａ２は、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＩＬ７、及びＩＬ１５からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカインと、任意選択で、ＢＭＰ活性化因子とを含む。
ｆ．ｉＮＫ－Ｂ２は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、及びＩＬ１５からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカインを含む。
いくつかの実施形態では、上記の方法から得られるゲノム操作ｉＰＳＣ由来細胞は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、又はＴＩＧＩＴ、又はゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、１つ以上の所望の組み込み部位で組み込まれる１つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む。いくつかの他の実施形態では、ゲノム操作されたｉＰＳＣ由来細胞は、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、又は幹細胞及び／若しくは前駆細胞の輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び／若しくは生存率を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の自殺遺伝子を含むゲノム操作されたｉＰＳＣ派生細胞は、チェックポイント遺伝子、内因性Ｔ細胞受容体遺伝子、及びＭＨＣクラスＩサプレッサ遺伝子を含むがこれに限定されない、免疫応答調節及び媒介と関連する１つ以上の内在性遺伝子に含まれる１つ以上のイン／デルを更に含む。一実施形態では、１つ以上の自殺遺伝子を含むゲノム操作されたｉＰＳＣ派生細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子にインデルを含み、Ｂ２Ｍがノックアウトされている。
加えて、第１の運命のゲノム操作造血細胞から第２の運命のゲノム操作造血細胞を取得するための適用可能な脱分化方法及び組成物は、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれている国際公開第２０１１／１５９７２６号に示されているものを含む。その中で提供される方法及び組成物は、リプログラミング中に内因性Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現を制限することによって、開始非多能性細胞を非多能性中間細胞に部分的にリプログラミングすることを可能にし、非多能性中間細胞を、中間細胞を所望の細胞型に分化させるための条件に供する。いくつかの実施形態では、本明細書の方法及び組成物を使用して取得されたゲノム改変されたｉＰＳＣ及びその派生細胞は、表１に列挙された少なくとも１つの遺伝子型を含む。
Ｖ．遺伝子操作されたｉＰＳＣから分化した機能的モダリティを有する派生免疫細胞の治療的使用
本発明は、いくつかの実施形態では、開示される方法及び組成物を使用してゲノム操作されたｉＰＳＣから分化された機能的に増強された派生免疫細胞の単離された集団又は亜集団を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物のｉＰＳＣは、ｉＰＳＣ派生免疫細胞に保持可能な、開示されるような１つ以上の標的化遺伝子編集を含み、遺伝子操作されたｉＰＳＣ及びそれからの派生細胞は、細胞ベースの養子療法に好適である。一実施形態では、組成物の遺伝子操作エフェクター細胞の単離された集団又は亜集団は、ｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞を含む。一実施形態では、組成物の遺伝子操作エフェクター細胞の単離された集団又は亜集団は、ｉＰＳＣ由来ＨＳＣ細胞を含む。一実施形態では、組成物の遺伝子操作エフェクター細胞の単離された集団又は亜集団は、ｉＰＳＣ由来プロＴ細胞又はＴ細胞を含む。一実施形態では、組成物の遺伝子操作エフェクター細胞の単離された集団又は亜集団は、ｉＰＳＣ由来プロＮＫ細胞又はＮＫ細胞を含む。一実施形態では、組成物の遺伝子操作エフェクター細胞の単離された集団又は亜集団は、ｉＰＳＣ由来免疫調節細胞又は骨髄由来のサプレッサ細胞（myeloid derived suppressor cell、ＭＤＳＣ）を含む。いくつかの実施形態では、組成物のｉＰＳＣ由来遺伝子操作エフェクター細胞は、改善された治療の可能性のために、エクスビボで更に調整される。一実施形態では、ｉＰＳＣに由来している遺伝子操作エフェクター細胞の単離された集団又は亜集団は、ナイーブＴ細胞、幹細胞メモリＴ細胞、及び／又はセントラルメモリＴ細胞の数又は比率の増加を含む。一実施形態では、ｉＰＳＣに由来している遺伝子操作エフェクター細胞の単離された集団又は亜集団は、Ｉ型ＮＫＴ細胞の数又は比率の増加を含む。別の実施形態では、ｉＰＳＣに由来している遺伝子操作エフェクター細胞の単離された集団又は亜集団は、適応ＮＫ細胞の数又は比率の増加を含む。組成物のいくつかの実施形態では、遺伝子操作ＣＤ３４＋細胞、ＨＳＣ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又は骨髄由来サプレッサ細胞の単離された集団又は亜集団は、同種異系である。組成物のいくつかの他の実施形態では、遺伝子操作ＣＤ３４＋細胞、ＨＳＣ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はＭＤＳＣの単離された集団又は亜集団は自家性である。
組成物のいくつかの実施形態では、分化のためのｉＰＳＣは、エフェクター細胞において望ましい治療属性を伝えるために選択された遺伝子インプリントを含み、分化中の細胞発生生物学が破壊されず、当該ｉＰＳＣ由来分化造血細胞において遺伝子インプリントが保持され、機能的であることを条件とする。
組成物のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞の遺伝的インプリントは、（ｉ）非多能性細胞をｉＰＳＣにリプログラミングする間若しくはその後に、多能性細胞のゲノムにおけるゲノム挿入、欠失若しくは置換を通じて得られる１つ以上の遺伝子組換えモダリティ、又は（ｉｉ）ドナー、疾患、若しくは治療応答に特異的である、供給源特異的免疫細胞の１つ以上の保持可能な治療属性を含み、多能性細胞は、供給源特異的免疫細胞からリプログラミングされ、ｉＰＳＣは、供給源治療属性を保持し、供給源治療属性はまた、ｉＰＳＣ由来造血系統細胞にも含まれている。
組成物のいくつかの実施形態では、遺伝子組換えモダリティは、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、又はｉＰＳＣ若しくはそれからの誘導細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、免疫応答調節及び修飾、並びに／若しくは生存率を促進するタンパク質、のうちの１つ以上を含む。組成物のいくつかの実施形態では、遺伝子改変されたｉＰＳＣ及びそれからの派生細胞は、表１に列挙された遺伝子型を含む。組成物のいくつかの他の実施形態では、表１に列挙された遺伝子型を含む遺伝子改変ｉＰＳＣ及びそれからの派生細胞は、（１）ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、又はＲＦＸＡＰ、ＲＡＧ１、及び染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子の１つ以上の欠失、破壊又は発現低下、並びに（２）ＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＡＲ、Ｆｃ受容体、又は二重特異性若しくは多重特異性若しくはユニバーサルエンゲージャとのカップリングのための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、を含む追加の遺伝子改変モダリティを更に含む。
組成物の更にいくつかの他の実施形態では、造血系統細胞は、以下のうちの少なくとも２つの組み合わせに関する供給源特異的免疫細胞の治療属性を含む：（ｉ）１つ以上の抗原標的化受容体発現、（ｉｉ）改変されたＨＬＡ、（ｉｉｉ）腫瘍微小環境に対する耐性、（ｉｖ）バイスタンダー免疫細胞及び免疫修飾の動員、（ｉｖ）低減された腫瘍外効果を伴う改善されたオンターゲット特異性、並びに（ｖ）改善されたホーミング、持続性、細胞傷害性、又は抗原エスケープ救済。
組成物のいくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来造血細胞は、表１に列挙される遺伝子型を含み、当該細胞は、少なくともＣＡＲと、エンゲージャ及びＣＦＲの一方又は両方を発現し、任意選択で、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、若しくはＩＬ２１を含む少なくとも１つのサイトカイン及び／若しくはその受容体、又はそれらの任意の改変タンパク質を発現する。組成物のいくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５、及びＩＬ２１を含む少なくとも１つのサイトカイン及び／又はその受容体を発現する。組成物のいくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ７又はＩＬ１５を含む少なくとも１つのサイトカイン及び／又はその受容体を発現する。組成物のいくつかの実施形態では、サイトカイン及びＣＡＲの操作された発現は、ＮＫ系統細胞特異的である。組成物のいくつかの他の実施形態では、サイトカイン及びＣＡＲの操作された発現は、Ｔ系統細胞特異的である。組成物のいくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来造血エフェクター細胞は、抗原特異的である。組成物のいくつかの実施形態では、抗原特異的派生エフェクター細胞は、液体腫瘍を標的とする。組成物のいくつかの実施形態では、抗原特異的派生エフェクター細胞は、固形腫瘍を標的とする。組成物のいくつかの実施形態では、抗原特異的ｉＰＳＣ由来造血エフェクター細胞は、腫瘍抗原エスケープを救済することができる。
本発明のエフェクター細胞及び／又は組成物を養子細胞療法に好適な対象に導入することにより、種々の疾患を改善することができる。いくつかの実施形態では、提供されるｉＰＳＣ由来造血細胞又は組成物は、同種異系養子細胞療法のためのものである。加えて、本発明は、いくつかの実施形態において、養子細胞療法に好適な対象に細胞又は組成物を導入することによる、上記免疫細胞及び／又は治療用組成物及び／又は併用療法の治療的使用であって、対象が自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、又はＨＩＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、若しくはＢＫポリオーマウイルスと関連する感染を有する、治療的使用を提供する。血液悪性腫瘍の例には、急性及び慢性白血病（急性骨髄性白血病（acute myelogenous leukemia、ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（acute lymphoblastic leukemia、ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（chronic myelogenous leukemia、ＣＭＬ）、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（non-Hodgkin lymphoma、ＮＨＬ）、ホジキン病、多発性骨髄腫、及び骨髄異形成症候群が含まれるが、これらに限定されない。固形がんの例には、脳、前立腺、乳房、肺、結腸、子宮、皮膚、肝臓、骨、膵臓、卵巣、精巣、膀胱、腎臓、頭、首、胃、子宮頸、直腸、喉頭、及び食道のがんが含まれるが、これらに限定されない。様々な自己免疫疾患の例には、円形脱毛症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、糖尿病（１型）、若年性特発性関節炎のいくつかの形態、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、いくつかの形態の心筋炎、多発性硬化症、類天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、リウマチ様関節炎、強皮症／全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎のいくつかの形態、ブドウ膜炎のいくつかの形態、白斑、多発血管炎を伴う肉芽腫症（ウェゲナー病）が含まれるが、これらに限定されない。ウイルス感染症の例には、ＨＩＶ－（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＳＶ－（単純ヘルペスウイルス）、ＫＳＨＶ－（カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）、ＲＳＶ－（呼吸器合胞体ウイルス）、ＥＢＶ－（エプスタイン－バーウイルス）、ＣＭＶ－（サイトメガロウイルス）、ＶＺＶ（水痘帯状疱疹ウイルス）、アデノウイルス－、レンチウイルス－、ＢＫポリオーマウイルス－関連疾患が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に開示されている実施形態の派生造血系統細胞、又は本明細書に開示される組成物を使用する治療は、症状に基づいて、又は再燃防止のために行うことができる。「治療すること」、「治療」などの用語は、本明細書では、概して、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を取得することを意味するために使用される。効果は、疾患を完全に若しくは部分的に予防することに関して予防的であり得、かつ／又は疾患及び／若しくは疾患に起因する有害作用の部分的若しくは完全な治癒に関して治療的であり得る。本明細書で使用されるとき、「治療」は、対象における疾患のあらゆる介入を網羅し、以下を含む：疾患にかかりやすいが、まだそれを有していると診断されていない対象において疾患が生じることを予防すること、疾患を阻害すること、すなわちその発症を阻止すること、又は疾患を緩和する、すなわち疾患を後退させること。治療剤及び／又は組成物は、疾患又は傷害の発症前、発症中又は発症後に投与され得る。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化又は軽減させる進行中の疾患の治療もまた、特に重要である。特定の実施形態では、治療を必要とする対象は、細胞療法により少なくとも１つの関連する症状を抑制、改善、及び／又は改善することができる疾患、状態、及び／又は傷害を有する。特定の実施形態は、細胞療法を必要とする対象が、骨髄又は幹細胞移植の候補、化学療法又は放射線療法を受けた対象、過剰増殖性障害又はがん、例えば、造血系の過剰増殖性障害又はがんを有するか又は有するリスクがある対象、腫瘍、例えば、固形腫瘍を有するか又は発症するリスクがある対象、ウイルス感染又はウイルス感染と関連する疾患を有するか又は有するリスクがある対象を含むが、これらに限定されないことを企図する。
本明細書に開示された実施形態の派生造血系統細胞を含む治療に対する応答性を評価するとき、応答は、臨床的利益率、死亡までの生存率、病理学的完全奏功、病理学的応答の版定量的測定、臨床的完全寛解、臨床的部分寛解、臨床的安定疾患、無再発生存、無転移生存、無病生存、循環腫瘍細胞減少、循環マーカー応答、及びＲＥＣＩＳＴ（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ Ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ、固形腫瘍における応答評価基準）基準、のうちの少なくとも１つによって測定され得る。
開示されるようなｉＰＳＣ由来造血系統細胞を含む治療用組成物は、他の治療の前、間、及び／又は後に対象に投与することができる。したがって、併用療法の方法は、１つ以上の追加の治療剤の使用前、使用中、及び／又は使用後のｉＰＳＣ由来免疫細胞の投与又は調製を含み得る。上述のように、１つ以上の追加の治療剤は、ペプチド、サイトカイン、エンゲージャ、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、マイトジェン、増殖因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血球、フィーダ細胞、フィーダ細胞成分若しくはその補充因子、１つ以上の目的のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤若しくは放射性部分、又は免疫調節薬（ＩＭｉＤ）を含む。ｉＰＳＣ由来免疫細胞の投与は、追加の治療剤の投与から、時間、日、又は週単位によって時間的に分離することができる。追加的又は代替的に、投与は、抗腫瘍剤、手術などの非薬物療法などであるがこれらに限定されない他の生物活性剤又はモダリティと組み合わせることができる。
組み合わせ細胞療法のいくつかの実施形態では、治療用組み合わせは、本明細書において提供されるｉＰＳＣ由来造血系統細胞と、エンゲージャである追加の治療剤とを含み、エンゲージャは、（上記のような）状態、疾患、又は適応症と関連する抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、エンゲージャは、操作されたｉＰＳＣ由来造血系統細胞のＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有する。いくつかの実施形態では、エンゲージャは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ）である。いくつかの実施形態では、エンゲージャは、二重特異性キラー細胞エンゲージャ（ＢｉＫＥ）である。いくつかの実施形態では、エンゲージャは、三重特異性キラー細胞エンゲージャ（ＴｒｉＫＥ）である。いくつかの実施形態では、エンゲージャは、多重特異性キラー細胞エンゲージャである。いくつかの実施形態では、エンゲージャは、複数の免疫細胞型と適合性のユニバーサルエンゲージャである。
組み合わせ細胞療法のいくつかの実施形態では、治療的組み合わせは、本明細書において提供されるｉＰＳＣ由来造血系統細胞及び抗体又はその断片である追加の治療剤を含む。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、又はキメラ抗体であってもよい。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、ウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体又は抗体断片は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍又はウイルス特異的抗原は、投与されたｉＰＳＣ由来造血系統細胞を活性化して、それらの殺傷能力を増強する。いくつかの実施形態では、投与されたｉＰＳＣ由来造血系統細胞に対する追加の治療剤として組み合わせ治療に好適な抗体は、抗ＣＤ２０（例えば、リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、オクレリズマブ）、抗ＣＤ２２（イノツズマブ、モキセツモマブ、エプラツズマブ）、抗ＨＥＲ２（例えば、トラスツズマブ、パーツズマブ）、抗ＣＤ５２（例えば、アレムツズマブ）、抗ＥＧＦＲ（例えば、セツキシマブ）、抗ＧＤ２（例えば、ジヌツキシマブ）、抗ＰＤＬ１（例えば、アベルマブ）、抗ＣＤ３８（例えば、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２）、抗ＣＤ１２３（例えば、７Ｇ３、ＣＳＬ３６２）、抗ＳＬＡＭＦ７（エロツズマブ）、及びそれらのヒト化又はＦｃ改変バリアント若しくは断片、又はそれらの機能的同等物若しくはバイオシミラーを含むがそれらに限定されない。本発明は、表１に列挙され、本明細書において提供される遺伝子型を有するｉＰＳＣ由来造血系統細胞と、上記の抗体又は抗体断片である追加の治療剤と、を含む治療用組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、１つ以上のチェックポイント阻害剤を含む。チェックポイントは、阻害されていない場合に免疫応答を抑制又は下方制御することができる細胞分子、しばしば細胞表面分子を指す。チェックポイント阻害剤は、チェックポイントの遺伝子発現又は遺伝子産物を減少させるか、又はチェックポイント分子の活性を低下させることができるアンタゴニストである。派生エフェクター細胞との併用療法に好適なチェックポイント阻害剤は、上に提供されている。
提供される派生エフェクター細胞を含む併用療法のいくつかの実施形態は、チェックポイント分子を標的化する少なくとも１つの阻害剤を更に含む。提供される派生エフェクター細胞との併用療法のいくつかの他の実施形態は、２つ、３つ、又はそれ以上のチェックポイント分子が標的とされるように、２つ、３つ、又はそれ以上の阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の併用療法のためのエフェクター細胞は、提供されるような派生ＮＫ系統細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の併用療法のためのエフェクター細胞は、派生Ｔ系統細胞である。いくつかの実施形態では、併用療法のための派生ＮＫ系統細胞又はＴ系統細胞は、本明細書において提供されるように機能的に増強されている。いくつかの実施形態では、２つ、３つ、又はそれ以上のチェックポイント阻害剤は、派生エフェクター細胞の投与と同時、前、又は後に併用療法で投与することができる。いくつかの実施形態では、２つ以上のチェックポイント阻害剤は、同時に、又は一度に１つ（逐次的に）投与される。本発明は、表１に列挙される遺伝子型を有するｉＰＳＣ由来エフェクター細胞を含むエフェクター細胞と、上記のような１つ以上のチェックポイント阻害剤と、を含む治療用組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、上述のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストは抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇ、単一可変新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）、サメ重鎖抗体（Ｉｇ－ＮＡＲ）、キメラ抗体、組換え抗体、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、抗イディオタイプ抗体、二重特異性、多重特異性、若しくは多量体抗体、又はその断片であってもよい。抗体断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、Ｆｖ、Ｆａｂｃ、ｐＦｃ、Ｆｄ、一本鎖抗原結合断片（ｓｃＦｖ）、タンデムｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ）、ラクダ重鎖ＩｇＧ及びＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）断片、組換え重鎖のみ抗体（ＶＨＨ）、及び抗体全体の結合特異性を維持するその他の抗体断片が含まれ、それらは、抗体全体よりも、製造するのに費用対効果が高く、より簡単に使用することができ、又は感度が高くあり得る。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ又は３つ又はそれ以上のチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びそれらの誘導体又は機能的同等物のうちの少なくとも１つを含む。
派生エフェクター細胞及び１つ以上のチェック阻害剤を含む併用療法は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、菌状息肉症、パジェット様細網症、セザリー症候群、肉芽腫様弛緩皮膚、リンパ腫様丘疹症、慢性苔癬状粃糠疹、急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、ＣＤ３０＋皮膚Ｔ細胞リンパ腫、二次皮膚ＣＤ３０＋大細胞リンパ腫、非菌状息肉症ＣＤ３０皮膚大Ｔ細胞リンパ腫、多形性Ｔ細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、皮下Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、芽球性ＮＫ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、頭頸部腫瘍：扁平上皮がん、横紋筋肉腫、ルイス肺がん（ＬＬＣ）、非小細胞肺がん、食道扁平上皮がん、食道腺がん、腎細胞がん（ＲＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、乳がん、胃がん、前立腺小細胞神経内分泌がん（ＳＣＮＣ）、肝臓がん、膠芽腫、肝臓がん、口腔扁平上皮がん、膵臓がん、甲状腺乳頭がん、肝内胆管細胞がん、肝細胞がん、骨がん、転移、及び鼻咽頭がんを含むがこれらに限定されない、液性及び固形がんの治療に適用できる。
本明細書において提供されるような派生エフェクター細胞以外のいくつかの実施形態では、治療的使用のための組み合わせは、化学療法剤又は放射性部分を含む１つ以上の追加の治療剤を含む。化学療法剤とは、細胞傷害性抗腫瘍剤、すなわち、腫瘍細胞を優先的に殺傷するか、又は急速に増殖する細胞の細胞周期を破壊するか、又は幹がん細胞を根絶することが見出され、腫瘍性細胞の増殖を防止又は低減するために治療的に使用される化学剤を指す。化学療法剤はまた、抗腫瘍性又は細胞傷害性の薬物又は薬剤と称されることもあり、当該技術分野で周知である。
いくつかの実施形態では、化学療法剤は、アントラサイクリン、アルキル化剤、スルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミン、メチルメラミン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、抗生物質、代謝拮抗剤、葉酸類似体、プリン類似体、ピリミジン類似体、酵素、ポドフィロトキシン、白金含有薬剤、インターフェロン、及びインターロイキンを含む。例示的な化学療法剤には、アルキル化剤（シクロホスファミド、メクロレタミン、メファリン、クロラムブシル、ヘアメチルメラミン、チオテパ、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン）、代謝拮抗剤（メトトレキサート、フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６－メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン）、エピポドフィロトキシン（エトポシド、エトポシドオルトキノン、及びテニポシド）、抗生物質（ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ビスアントレン、アクチノマイシンＤ、プリカマイシン、ピューロマイシン、及びグラミシジンＤ）、パクリタキセル、コルヒチン、サイトカラシンＢ、エメチン、メイタンシン、並びにアムサクリンが含まれるが、これらに限定されない。追加の薬剤には、アミングルテチミド、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、アルトレタミン、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、アレムツザマブ、アルトレタミン、アナストロゾール、Ｌ－アスパラギナーゼ、アザシチジン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルステロン、カペシタビン、セレコキシブ、セツキシマブ、クラドリビン、クロフラビン、シタラビン、ダカルバジン、デニロイキンジフチトクス、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドロモスタノロン、エピルビシン、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エチニルエストラジオール、エキセメスタン、フロクスウリジン、５－フルオロウラシル、フルダラビン、フルタミド、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、インターフェロンアルファ（２ａ、２ｂ）、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、メクロレタミン、メゲストロール、メルファリン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトキサレン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロン、ノフェツモマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペメトレキセド、ペガデマーゼ、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ポリフェプロサン、ポルフィマー、プロカルバジン、キナクリン、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、トペテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビノレルビン、及びゾレドロネートが含まれる。他の好適な薬剤は、化学療法剤又は放射線療法剤として承認され、当該技術分野で知られているものを含む、ヒトへの使用が承認されているものである。そのような薬剤は、多くの標準的な医師や腫瘍学者の参考文献（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｎｉｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｙ．，１９９５）又はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅウェブサイト（ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｅｒ／ｃａｎｃｅｒ／ｄｒｕｇｌｉｓｔｆｒａｒｎｅ．ｈｔｍ）のいずれかを参照でき、どちらも随時更新される。
サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイドなどの免疫調節薬（ＩＭｉＤ）は、ＮＫ細胞とＴ細胞の両方を刺激する。本明細書において提供されるように、ＩＭｉＤは、がん治療のためにｉＰＳＣ派生治療用免疫細胞とともに使用され得る。
治療組成物に含まれるｉＰＳＣ由来造血系統細胞及び／又はエンゲージャの単離された集団以外に、対象／患者への投与に好適な組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加物）及び／又は希釈剤（例えば、薬学的に許容される媒体、例えば、細胞培養培地）、又は他の薬学的に許容される成分を更に含むことができる。薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤は、部分的には、投与される特定の組成物によって、並びに治療用組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、本発明の治療用組成物の多種多様な好適な製剤が存在する（例えば、その開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．１９８５を参照されたい）。
一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製されたいｉＰＳＣ由来Ｔ細胞を含む。一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製された多能性細胞由来ＮＫ細胞を含む。一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製されたｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋ＨＥ細胞を含む。一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製された多能性細胞由来ＨＳＣを含む。一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製された多能性細胞由来ＭＤＳＣを含む。本明細書に開示される、ｉＰＳＣ由来造血系統細胞の集団を、任意選択でｉＰＳＣ由来造血系統細胞のＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャと組み合わせて含む治療用組成物は、静脈内、腹腔内、経腸、若しくは気管投与方法によって別々に、又は所望の治療目標に影響を及ぼす他の好適な化合物と組み合わせて投与することができる。
これらの薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤は、治療用組成物のｐＨを約３～約１０に維持するのに十分な量で存在することができる。このように、緩衝液は、全組成物の重量対重量ベースで約５％もの多さであり得る。限定されないが、塩化ナトリウム及び塩化カリウムなどの電解質もまた、治療用組成物に含まれ得る。一態様では、治療用組成物のｐＨは、約４～約１０の範囲である。代替的に、治療用組成物のｐＨは、約５～約９、約６～約９、又は約６．５～約８の範囲である。別の実施形態では、治療用組成物は、当該ｐＨ範囲のうちの１つのｐＨを有する緩衝液を含む。別の実施形態では、治療用組成物は、約７のｐＨを有する。代替的に、治療用組成物は、約６．８～約７．４の範囲のｐＨを有する。更に別の実施形態では、治療用組成物は、約７．４のｐＨを有する。
本発明はまた、部分的に、本発明の特定の組成物及び／又は培養物における薬学的に許容される細胞培養培地の使用を提供する。そのような組成物は、ヒト対象への投与に好適である。一般的に言えば、本発明の実施形態によるｉＰＳＣ由来免疫細胞の維持、増殖、及び／又は健康を支持する任意の培地は、医薬細胞培養培地としての使用に好適である。特定の実施形態では、薬学的に許容される細胞培養培地は、無血清及び／又はフィーダを含まない培地である。様々な実施形態では、無血清培地は動物成分を含まず、任意選択で無タンパク質であり得る。任意選択で、培地は、生物薬学的に許容される組換えタンパク質を含み得る。動物成分を含まない培地は、成分が非動物源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物を含まない培地で天然の動物タンパク質に取って代わり、栄養素は、合成、植物、又は微生物の供給源から取得される。対照的に、無タンパク質培地は、実質的にタンパク質を含まないと定義される。当業者は、上述の培地の例は例示であり、本発明での使用に好適な培地の配合を決して限定するものではなく、当業者に既知であり利用可能な多くの好適な培地があることを理解するであろう。
ｉＰＳＣ由来造血系統細胞は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％のＴ系統細胞、ＮＫ系統細胞、ＮＫＴ系統細胞、プロＴ細胞、プロＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ ＨＥ細胞、ＨＳＣ、Ｂ系統細胞、骨髄由来サプレッサ細胞（ＭＤＳＣ）、調節性マクロファージ、調節性樹状細胞、又は間葉系間質細胞を有することができる。いくつかの実施形態では、単離された多能性幹細胞由来造血系統細胞は、約９５％～約１００％のＴ系統細胞、ＮＫ系統細胞、プロＴ細胞、プロＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞、又は骨髄由来サプレッサ細胞（ＭＤＳＣ）を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞治療を必要とする対象を治療するための、約９５％のＴ系統細胞、ＮＫ系統細胞、プロＴ細胞、プロＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ ＨＥ細胞、又は骨髄由来サプレッサ細胞（ＭＤＳＣ）の単離された集団を有する組成物などの、精製ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞を有する治療用組成物を提供する。
一実施形態では、組み合わせ細胞療法又はそのために使用される組成物は、治療用タンパク質又はペプチドと、表１に列挙される遺伝子型を含むゲノム操作ｉＰＳＣに由来するエフェクター細胞の集団とを含み、由来するエフェクター細胞は、本明細書に記載されるように、ＣＡＲと、エンゲージャ及びＣＦＲの一方又は両方と、を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせ細胞療法、又はそのために使用される組成物は、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、エルツマキソマブ、ＲＯ６９５８６８８、ＡＦＭ１１、ＭＴ１１０／ＡＭＧ１１０、ＭＴ１１１／ＡＭＧ２１１／ＭＥＤＩ－５６５、ＡＭＧ３３０、ＭＴ１１２／ＢＡＹ２０１０１１２、ＭＯＲ２０９／ＥＳ４１４、ＭＧＤ００６／Ｓ８０８８０、ＭＧＤ００７、及び／又はＦＢＴＡ０５のうちの１つと、表１に列挙される遺伝子型を含むゲノム操作ｉＰＳＣに由来するエフェクター細胞の集団とを含み、誘導されたエフェクター細胞は、ＣＡＲと、エンゲージャ及びＣＦＲの一方又は両方と、任意選択で、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント、又は他の編集と、を含む。更にいくつかの他の実施形態では、組み合わせ細胞療法又はそのために使用される組成物は、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、及びエルツマキソマブのうちの１つと、表１に列挙される遺伝子型を含むゲノム操作ｉＰＳＣに由来するエフェクター細胞の集団と、を含み、由来するエフェクター細胞は、ＣＡＲと、エンゲージャ及びＣＦＲのうちの一方又は両方と、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントと、ＩＬと、を含む。更にいくつかの追加の実施形態では、組み合わせ細胞療法、又はそのために使用される組成物は、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、及びエルツマキソマブのうちの１つと、表１に列挙された遺伝子型を含むゲノム操作ｉＰＳＣに由来するエフェクター細胞の集団と、を含み、由来するエフェクター細胞は、ＣＡＲと、エンゲージャ及びＣＦＲの一方又は両方と、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントと、ＣＤ３８ノックアウトと、１つ以上の外因性サイトカインと、を含む。
当業者が理解するように、本明細書において提供される方法及び組成物に基づくｉＰＳＣから派生する自己と同種異系の造血系統細胞の両方は、上述のような細胞療法で使用することができる。自家移植の場合、派生造血系統細胞の単離された集団は、患者と完全又は部分的にＨＬＡ一致する。別の実施形態では、派生造血系統細胞は、対象とＨＬＡが一致せず、派生造血系統細胞は、ＨＬＡ Ｉ及び／又はＨＬＡ ＩＩ欠損を有するＮＫ細胞又はＴ細胞である。
いくつかの実施形態では、治療組成物中の派生造血系統細胞の数は、用量当たり、少なくとも０．１×１０５細胞、少なくとも１×１０５細胞、少なくとも５×１０５細胞、少なくとも１×１０６細胞、少なくとも５×１０６細胞、少なくとも１×１０７細胞、少なくとも５×１０７細胞、少なくとも１×１０８細胞、少なくとも５×１０８細胞、少なくとも１×１０９細胞、又は少なくとも５×１０９細胞である。いくつかの実施形態では、治療用組成物中の派生造血系統細胞の数は、１用量当たり、約０．１×１０５細胞～約１×１０６細胞、１用量当たり、約０．５×１０６細胞～約１×１０７細胞、１用量当たり、約０．５×１０７細胞～約１×１０８細胞、１用量当たり、約０．５×１０８細胞～約１×１０９細胞、１用量当たり、約１×１０９細胞～約５×１０９細胞、１用量当たり、約０．５×１０９細胞～約８×１０９細胞、１用量当たり、約３×１０９細胞～約３×１０１０細胞、又はその間の任意の範囲である。概して、６０ｋｇの患者の場合、１×１０８細胞／用量は１．６７×１０６細胞／ｋｇに変換される。
一実施形態では、治療組成物中の派生造血系統細胞の数は、血液の部分的又は単一の臍帯中の免疫細胞の数であるか、又は少なくとも０．１×１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも１０×１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．７５×１０６細胞／体ｋｇ体重、少なくとも１．２５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１．５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１．７５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２．５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも３×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも４×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１０×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２０×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも３０×１０６細胞／ｋｇ体重、１×１０８細胞／ｋｇ体重、５×１０８細胞／ｋｇ体重、又は１×１０９細胞／ｋｇ体重である。
一実施形態では、ある用量の派生造血系統細胞が対象に送達される。例示的な一実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、少なくとも２×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも３×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも４×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも５×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも６×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも７×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも８×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも９×１０６細胞／ｋｇ、又は少なくとも１０×１０６細胞／ｋｇ、又はそれ以上の細胞／ｋｇであり、介在する全ての細胞用量を含む。
別の例示的な実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、約２×１０６細胞／ｋｇ、約３×１０６細胞／ｋｇ、約４×１０６細胞／ｋｇ、約５×１０６細胞／ｋｇ、約６×１０６細胞／ｋｇ、約７×１０６細胞／ｋｇ、約８×１０６細胞／ｋｇ、約９×１０６細胞／ｋｇ、又は約１０×１０６細胞／ｋｇ、又はそれ以上の細胞／ｋｇであり、介在する全ての細胞用量を含む。
別の例示的な実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、約２×１０６細胞／ｋｇ～約１０×１０６細胞／ｋｇ、約３×１０６細胞／ｋｇ～約１０×１０６細胞／ｋｇ、約４×１０６細胞／ｋｇ～約１０×１０６細胞／ｋｇ、約５×１０６細胞／ｋｇ～約１０×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ～約６×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ～約７×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ～約８×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ～約６×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ～約７×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ～約８×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ～約６×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ～約７×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ～約８×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ～約６×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ～約７×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ～約８×１０６細胞／ｋｇ、又は６×１０６細胞／ｋｇ～約８×１０６細胞／ｋｇであり、介在する全ての細胞用量を含む。
いくつかの実施形態では、派生造血系統細胞の治療的使用は、単回投与治療である。いくつかの実施形態では、派生造血系統細胞の治療的使用は、複数回投与治療である。いくつかの実施形態では、複数回投与治療は、毎日、３日ごと、７日ごと、１０日ごと、１５日ごと、２０日ごと、２５日ごと、３０日ごと、３５日ごと、４０日ごと、４５日ごと、５０日ごとの１回の投与、又はその間の任意の日数の任意の回数の投与である。いくつかの実施形態では、複数回投与治療は、３回、又は４回、又は５回の週１回用量を含む。３回又は４回又は５回を含む複数回投与治療のいくつかの実施形態では、週１回用量は、追加の単回用量又は複数回用量が必要かどうかを決定するための観察期間を更に含む。
本発明の派生造血系統細胞及び任意選択でエンゲージャの集団を含む組成物は、無菌であり得、ヒト患者への投与に好適であり、すぐに投与され得る（すなわち、更なる処理なしに投与され得る）。すぐに投与される細胞ベースの組成物は、組成物が、対象への移植又は投与の前に、いずれかの更なる処理又は操作を必要としないことを意味する。他の実施形態では、本発明は、１つ以上の薬剤の投与前に増殖及び／又は調整される、派生造血系統細胞の単離された集団を提供する。シグナル伝達複合体及び／又はＣＡＲを発現するように遺伝子操作された由来造血系統細胞については、細胞は、例えば、米国特許第６、３５２，６９４号（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法を使用して活性化及び増殖させることができる。
特定の実施形態では、由来造血系統細胞に対する一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供することができる。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、又は表面に結合することができる。表面に結合される場合、薬剤は、同じ表面に（すなわち、「シス」形成で）又は別個の表面に（すなわち、「トランス」形成で）結合され得る。代替的に、一方の薬剤を表面に結合させ、他方の薬剤を溶液中に存在させることができる。一実施形態では、共刺激シグナルを提供する薬剤は、細胞表面に結合することができ、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、又は表面に結合される。特定の実施形態では、両方の薬剤が溶液中にあり得る。別の実施形態では、薬剤は、可溶性形態であり得、次いで、本発明の実施形態におけるＴリンパ球の活性化及び増殖における使用が企図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）について、米国特許出願公開第２００４／０１０１５１９号及び同第２００６／００３４８１０号に開示されるもののような、Ｆｃ受容体を発現する細胞又は抗体若しくは薬剤に結合する他の結合剤などの表面に架橋されてもよい。
投与量、頻度、及びプロトコルのいくらかの変動は、治療される対象の状態に応じて必然的に発生する。投与の責任者は、いずれにしても、個々の対象に対しての適切な用量、頻度及びプロトコルを決定する。
次の例は、例示のために提供されるものであり、限定のためのものではない。
実施例１－材料及び方法
様々なプロモータの制御下で自殺系を効果的に選択し、異なるセーフハーバー遺伝子座組み込み戦略と組み合わせて試験するために、単一細胞の継代と高スループットの９６ウェルプレートベースのフローサイトメトリソーティングを可能にする、出願人独自のｈｉＰＳＣプラットフォームを使用し、単一又は複数の遺伝子調整によるクローンｈｉＰＳＣの導出を可能にした。
小分子培養におけるｈｉＰＳＣの維持：ｈｉＰＳＣは、培養のコンフルエンシが７５％～９０％に達すると、単一細胞として日常的に継代された。単細胞解離の場合、ｈｉＰＳＣをＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）で１回洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で３７℃において３～５分間処理した後、ピペッティングして単細胞解離を確実にした。次いで、単細胞懸濁液を従来の培地と等量で混合し、２２５×ｇで４分間遠心分離し、ＦＭＭに再懸濁し、マトリゲルでコーティングした表面に播種した。継代は通常１：６～１：８で、３７℃で２～４時間マトリゲルで前もってコーティングされた組織培養プレートに移し、２～３日ごとにＦＭＭを供給した。細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ２に設定された加湿インキュベーターで維持された。
ＺＦＮによるヒトのｉＰＳＣ操作、目的のモダリティの標的化編集のためのＣＲＩＳＰＲ：ＲＯＳＡ２６標的化挿入を例として使用して、ＺＦＮを介したゲノム編集では、２００万個のｉＰＳＣが２．５μｇのＺＦＮ－Ｌ（ＦＴＶ８９３）、２．５μｇのＺＦＮ－Ｒ（ＦＴＶ８９４）の混合物及びＡＡＶＳ１標的化挿入用の５μｇのドナー構築物でトランスフェクトされた。ＣＲＩＳＰＲを介したゲノム編集では、２００万個のｉＰＳＣが、５μｇのＲＯＳＡ２６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９（ＦＴＶ９２２）とＲＯＳＡ２６標的化挿入用の５μｇドナー構築物の混合物でトランスフェクトされた。トランスフェクションは、パラメータ１５００Ｖ、１０ｍｓ、３パルスを使用するＮｅｏｎトランスフェクションシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行われた。トランスフェクション後の２日目又は３日目に、プラスミドに人工プロモータ－ドライバーＧＦＰ及び／又はＲＦＰ発現カセットが含まれている場合、フローサイトメトリを使用してトランスフェクション効率を測定した。トランスフェクション後４日目に、ピューロマイシンを最初の７日間０．１μｇ／ｍＬの濃度で、７日後に０．２μｇ／ｍＬの濃度で培地に添加して、標的細胞を選択した。ピューロマイシンの選択中、細胞は１０日目に新鮮なマトリゲルコーティングされたウェルに継代された。ピューロマイシン選択の１６日目以降に、生存細胞をＧＦＰ＋ｉＰＳ細胞のパーセンテージについてフローサイトメトリで分析した。
ゲノム編集されたｉＰＳＣの一括ソーティング及びクローンソーティング：ＺＦＮ又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用したゲノム標的化編集を含むｉＰＳＣは、ピューロマイシン選択の２０日後にＧＦＰ＋ＳＳＥＡ４＋ＴＲＡ１８１＋ｉＰＳＣについて一括ソーティング及びクローンソーティングされた。単一細胞解離標的化ｉＰＳＣプールを、最適な性能のために新規に作製した、ハンクス平衡塩溶液（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ）、４％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を含む冷却染色緩衝液に再懸濁した。ＳＳＥＡ４－ＰＥ、ＴＲＡ１８１－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などのコンジュゲート一次抗体を細胞溶液に加え、氷上で１５分間インキュベートした。全ての抗体は、１００万細胞当たり１００μＬの染色緩衝液中に７μＬで使用した。溶液を染色緩衝液で１回洗浄し、２２５ｇで４分間スピンダウンし、１０μＭチアゾビブを含む染色緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリでのソーティングのために氷上で維持した。フローサイトメトリによるソーティングは、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行った。一括ソーティングでは、ＧＦＰ＋ＳＳＥＡ４＋ＴＲＡ１８１＋細胞にゲートをかけ、７ｍｌのＦＭＭで満たされた１５ｍｌの標準チューブにソーティングした。クローンソーティングでは、１００μＭノズルを使用して、１ウェル当たり３イベントの濃度で、ソーティングされた細胞を９６ウェルプレートに直接排出した。各ウェルには、５μｇ／ｍＬフィブロネクチンと１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）が補充された２００μＬのＦＭＭが予め充填されており、予め５×マトリゲルで一晩コーティングされていた。５×マトリゲルプレコーティングには、１アリコートのマトリゲルを５ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２に追加し、４℃で一晩インキュベートして適切に再懸濁させ、最後にウェル当たり５０μＬで９６ウェルプレートに加え、３７℃で一晩インキュベートする。５×マトリゲルは、各ウェルに培地を加える直前に吸引される。ソーティングが完了したら、９６ウェルプレートを２２５ｇで１～２分間遠心分離してからインキュベーションした。プレートを７日間静置した。７日目に、１５０μＬの培地を各ウェルから除去し、１００μＬのＦＭＭと交換した。ウェルは、ソーティング後１０日目に追加の１００μＬのＦＭＭを再供給した。コロニー形成は早くも２日目に検出され、ほとんどのコロニーはソーティング後７～１０日の間に増殖した。最初の継代では、ウェルをＰＢＳで洗浄し、３０μＬのアキュターゼで３７℃において約１０分間解離させた。長期間のアキュターゼ処理の必要性は、長期間培養で遊ばなかったコロニーのコンパクトさを反映している。細胞が解離しているのが認められた後、２００μＬのＦＭＭを各ウェルに加え、数回ピペッティングしてコロニーを破壊する。解離したコロニーを、予め５×マトリゲルでコーティングした９６ウェルプレートの別のウェルに移し、インキュベーション前に２２５ｇで２分間遠心分離する。この１対１の継代は、増殖前の初期のコロニーを広げるために行われる。その後の継代は、３～５分間のアキュターゼ処理と、予めＦＭＭの１×マトリゲルでコーティングされた大きなウェルへの７５～９０％のコンフルエンシでの１：４～１：８の増殖で日常的に行われた。各クローン細胞株をＧＦＰ蛍光レベル及びＴＲＡ１－８１発現レベルについて分析した。１００％に近いＧＦＰ＋及びＴＲＡ１－８１＋のクローン株を、更なるＰＣＲスクリーニング及び分析のために選択し、マスタ細胞バンクとして凍結保存した。フローサイトメトリ分析はＧｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ ８ ＨＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で実行され、Ｆｌｏｗｊｏ（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）を使用して分析された。
実施例２－Ｔ細胞エンゲージャは、腫瘍モデルにおけるＣＡＲ－Ｔ有効性を改善する
ＣＡＲ－Ｔ細胞は、いくつかの血液悪性腫瘍を処置する際に有効かつ強力であることが示されているが、操作されたＴ細胞療法は、固形腫瘍に対処する際に限られた成功しか収めていない。均一に発現された抗原が接近可能であり、効果的に標的化され得る液体腫瘍とは異なり、腫瘍接近及び抗原不均一性は、固形腫瘍におけるＣＡＲ－Ｔ細胞の発達の成功に対する有意な障壁である。
概念実証の目的で、ＥｐＣＡＭを標的とする二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ）と、異なる抗原を標的とする抗原特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞との組み合わせを、異種固形腫瘍に対するそれらの併用抗腫瘍活性について調査した。特定の腫瘍抗原及びＥｐＣＡＭ抗原の発現レベルを、いくつかの腫瘍細胞においてフローサイトメトリによって評価した。図１Ａに示すように、ＳＫＯＶ３は抗原高腫瘍細胞株であり、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１は抗原低腫瘍細胞株であり、一方、ＪＩＭＴ１は抗原発現が中程度である（抗原中）。次いで、ＳＫＯＶ３細胞を、エフェクター：標的比１０：１でＣＡＲ－Ｔ細胞と共発現させ、Ｔ細胞溶解評価のために０～１０ｎｇ／ｍｌの範囲の示された濃度でＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥと共発現させた。ＣＡＲ－Ｔ細胞溶解活性のエンゲージャ用量特異的増強が、抗原特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞とともにＥｐＣＡＭ特異的ＢｉＴＥ滴定を使用して示された（図１Ｂ）。更に、ＳＫＯＶ３、ＪＩＭＴ１、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞を、Ｅ：Ｔ比１：２で、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの存在下及び不在下でＣＡＲ－Ｔ細胞と共培養した。異なる条件下でのＣＡＲ－Ｔ細胞の特異的細胞溶解を、ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ（商標）ＲＴＣＡアッセイ（図１Ｃ）を介して測定し、ＩＦＮγ産生を、細胞内サイトカイン染色（図１Ｄ）及びＩＦＮγ特異的ＥＬＩＳＡ（図１Ｅ）を介して決定したが、これらの全ては、Ｔ細胞エンゲージャが、２Ｄ腫瘍モデルにおいて、低いＥ：Ｔ比でもＣＡＲ－Ｔ有効性を改善することを示した。
３Ｄスフェロイドを、ＳＫＯＶ３又はＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞から確立し、示されたＥ：Ｔ比で、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの有無にかかわらずＣＡＲ－Ｔ細胞と共培養した。図２Ａは、ＣＡＲ－Ｔ細胞（２：１）と共培養したＳＫＯＶ３腫瘍スフェロイドからの、示された時点でのＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの存在下及び不在下での代表的な画像を示し、ＣＡＲ－Ｔ及びＢｉＴＥの組み合わせの存在下での改善された腫瘍浸透を示す。図２Ｂに示されるように、Ｉｎｃｕｃｙｔｅアッセイを介して決定され、腫瘍単独に対して正規化されたＳＫＯＶ３スフェロイドクリアランスは、より高いＥ：Ｔ比で増加した。同様に、図２Ｃに示すように、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１スフェロイドクリアランスは、（より少ない程度ではあるが）より高いＥ：Ｔ比で増加した。
実施例３－多抗原標的化は、異種混合腫瘍を制御する
異種混合腫瘍環境における腫瘍増殖制御を実証するために、ＳＫＯＶ３－Ｎｕｃ明赤色（ＮＬＲ；抗原高）又はＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｎｕｃ淡緑色（ＮＬＧ；抗原低）をプレーティングした。別に、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＮＬＧ：ＳＫＯＶ３－ＮＬＲの３：１（Ｅ：Ｔ）混合培養物をプレーティングした。播種の２４時間後、抗原特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＢｉＴＥの存在下及び不在下で、３：１（Ｅ：Ｔ比）で更に９６時間共培養した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（商標）アッセイを介してモニターした場合の標準又は個々の培養物の腫瘍細胞の細胞溶解を図３Ａに示し、混合腫瘍細胞培養物の細胞溶解を図３Ｂに示す。ＣＡＲ－Ｔ細胞単独では、抗原低腫瘍を含有することができなかったが（図３Ａ、右パネル）、腫瘍増殖は、ＥｐＣＡＭ特異的ＢｉＴＥ及びＣＡＲ－Ｔ細胞の両方の存在によって効果的に制御された。図３Ｂに示すように、ＣＡＲ－Ｔ細胞を単独で使用した場合の混合異種培養系における抗原低腫瘍細胞の回避は、ＣＡＲ－Ｔ細胞とＥｐＣＡＭ特異的ＢｉＴＥとの組み合わせによって回避された。
まとめると、これらのデータは、ＢｉＴＥ及びＣＡＲによって媒介される多抗原標的化が、異種固形腫瘍の前臨床モデルにおいて全体的な抗腫瘍有効性を拡大することを実証する。
実施例４－広範な固形腫瘍に対する増強された機能及び特異性のためのＢ７Ｈ３ ＴｒｉＫＥ及び操作されたｉＰＳＣ由来エフェクター細胞
エンゲージャの併用を更に試験するために、Ｂ７Ｈ３ ＴＲｉＫＥ（三重特異性キラー細胞エンゲージャ）を複数の細胞組成物設計に適用した。Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）は、免疫チェックポイント阻害剤のＢ７ファミリーに属し、固形悪性腫瘍及び血液悪性腫瘍の両方に対して広範囲の発現を有する。Ｂ７Ｈ３は、腫瘍血管形成及び転移の重要なメディエータであり、腫瘍におけるより高いＢ７Ｈ３発現は、概して予後不良と相関する。ここで使用されるＢ７Ｈ３ ＴｒｉＫＥ（Ｂ７Ｈ３－ＩＬ１５－ＣＤ１６）は、ＩＬ１５成分を含み、その存在は、外因性ＩＬ１５培養条件と比較して、ＮＫ細胞活性化（図４Ａ）及びＩＬ１５補充非依存性増殖（図４Ｂ）を増加させた。Ｂ７Ｈ３発現前立腺がん細胞ＰＣ－３の３Ｄスフェロイド腫瘍モデルを使用して、操作されたｉＰＳＣ由来ＣＡＲ－ＮＫ系統細胞が、Ｂ７Ｈ３ ＴｒｉＫＥと組み合わせて前立腺がん細胞をより効果的に標的化することが図５に示された。更に、図６に示されるように、操作されたｉＰＳＣ由来ＣＡＲ－ＮＫ系統細胞とＢ７Ｈ３ ＴｒｉＫＥとの組み合わせは、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ細胞傷害性アッセイにおいてＳＫＯＶ－３卵巣がん細胞を効率的に標的化した。ＳＫＯＶ－３－ＮＬＲ細胞をエフェクターの添加の１日前にプレーティングし、抗Ｂ７Ｈ３ ＴｒｉＫＥ又は等モル濃度のＩＬ－１５の存在下で２：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で添加した。
実施例５－ｉＰＳＣの段階的操作と改変派生エフェクター細胞の検証
次に、合理的な細胞設計によるＢｉＴＥ又はＴＲｉＫＥを含むエンゲージャの自律的細胞分泌によるＣＡＲ－ｉＴ細胞への多抗原標的化及び動員能の組み込みの実現可能性を調査するために、概念実証のためにＣＤ１９に特異的なｉＰＳＣ細胞にＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥを保有するレンチウイルスを形質導入して、エフェクター細胞分化及び機能プロファイルを決定した（図７Ａ）。当該操作されたｉＰＳＣに由来するレポーター陽性ＣＡＲ－ｉＴ細胞を、初代非活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞とともに、ＣＤ１９＋ＳＫＯＶ３腫瘍スフェロイドと共培養した。別の対照ウェルにおいて、初代ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＢｉＴＥをＣＤ１９＋ＳＫＯＶ３腫瘍スフェロイドと共培養し、スフェロイドクリアランスをＩｎｃｕｃｙｔｅアッセイによって測定した。図７Ｂに示されるように、ＢｉＴＥを産生するように操作されたｉＰＳＣ由来ＣＡＲ－Ｔ細胞は、同種異系ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化させ、標的腫瘍細胞に係合し、バイスタンダー免疫細胞の動員、浸潤及び活性化の能力を示す。
実施例６－がん細胞に対するＢ７Ｈ３－ＣＡＲ構成及びＢ７Ｈ３－ＣＡＲエフェクター細胞機能
その結合領域（ｃａｍＢ７Ｈ３）に対して単一ドメイン抗Ｂ７Ｈ３抗体のＶＨＨドメイン（例えば、配列番号３６～４１及びそれらのバリアント）を使用するＢ７Ｈ３－ＣＡＲを設計した。ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（１ＸＸ）、ＮＫＧ２Ｄ－２Ｂ４－ＣＤ３ζ、又は４－１ＢＢ－ＣＤ３ζを、Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲ構成のための例示的な共刺激及びシグナル伝達ドメインとして使用し、Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲ形質導入を伴わない対照細胞と比較して、形質導入細胞における細胞表面ｃａｍＢ７Ｈ３－ＣＡＲ発現を示す（図８）。Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞は、細胞活性化を示すＩＦＮγ発現の増強（図９Ａ）、並びに卵巣がん（ＳＫＯＶ３）、トリプルネガティブ乳がん（ＭＤＡ－ＭＢ２３１）、前立腺がん（ＰＣ－３、ＤＵ１４５）、子宮頸がん（Ｃａｓｋｉ）、及び腎細胞がん（７８６－Ｏ）を含む複数の固形腫瘍株にわたって耐久性を有する有効な腫瘍細胞認識及び排除（図９Ｂ）を示した。別のアッセイでは、Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲ Ｔ細胞及びＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞を、３７℃でＥ：Ｔ比２：１で腫瘍株のより広範なコレクションとともにインキュベートし、約４時間後、ＣＤ４５、ＣＤ７及びＴｈｙ１．１細胞表面染色を使用して、形質導入されたＣＡＲ－Ｔ細胞を残存腫瘤細胞から区別した。Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲ発現Ｔ細胞によるこれらの腫瘍株の陽性及び陰性Ｂ７Ｈ３抗原認識が、％ＴＮＦα陽性（ＴＮＦα＋）ＣＡＲ－Ｔ細胞を通して示されている（図１０）。
異なるスペーサ（外部結合ドメインと膜貫通ドメインとの間のヒンジ）設計（すなわち、それぞれ、短－ ＜８０アミノ酸、中間－ ８０～１８０アミノ酸、及び長－ ＞１８０アミノ酸；ＣＡＲ１～ＣＡＲ３）もまたスクリーニングして、ｃａｍＢ７Ｈ３－ＣＡＲ標的化のための最適な立体配置を決定した。それぞれ異なるスペーサを有する３つ全ての候補ＣＡＲ設計を使用してＣＡＲ－Ｔ細胞を生成し、これらをＰＣ３前立腺がん細胞に対する細胞傷害性について試験した。非形質導入Ｔ細胞を陰性対照として含めた。図１１に示すように、全てのＣＡＲ設計が細胞傷害性を実証したが、Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲ１及びＢ７Ｈ３－ＣＡＲ２は、Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲ３設計と比較して細胞傷害性の増加を示した。更に、３つの候補Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲ設計を発現する初代ＣＡＲ－Ｔ細胞を、示された腫瘍細胞株とのインキュベーション後のＴＮＦαの細胞内産生について評価した。Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲ１及びＢ７Ｈ３－ＣＡＲ２は、Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲ３設計よりも性能が優れ続けており、Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲ１は、Ｔエフェクター細胞において最も高いＴＮＦα産生を示した（図１２）。
更に、ｃａｍＢ７Ｈ３－ＣＡＲをｉＰＳＣ由来エフェクター細胞に導入した。概念実証のために、Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲ＋ｉＮＫ細胞を、まず、ＩＬ１５サイトカインシグナル伝達複合体であるｈｎＣＤ１６を発現し、事前の標的化操作によってＣＤ３８がノックアウトされたｉＰＳＣ細胞株細胞に、ｃａｍＢ７Ｈ３－ＣＡＲ構築物を形質導入することによって生成した。抗Ｔｈｙ１．１ ｍＡｂ及びビオチン化組換えＢ７Ｈ３タンパク質をストレプトアビジン－フィコエリトリン（ＳＡ－ＰＥ）と組み合わせて利用して、形質導入効率を確認し、非形質導入対照（図１３、右パネル）と比較して、ｉＰＳ細胞における表面ｃａｍＢ７Ｈ３－ＣＡＲ発現を検出した（図１３、左パネル）。次いで、Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲを含む選択された形質導入クローンｉＰＳＣ細胞を分化させて、ｉＮＫ細胞を生成し（図１４Ａ、左パネル；ＣＤ５６及びＣＤ４５でゲート）、表面ｃａｍＢ７Ｈ３－ＣＡＲ発現は、非形質導入ｉＮＫ細胞対照及び未染色ｉＮＫ細胞対照と比較して実証した（図１４Ａ、右パネル）。
エフェクター細胞としてのＢ７Ｈ３－ＣＡＲ＋ｉＮＫの機能性を特徴付けるために、細胞を、様々なＥ：Ｔ比で、対照としてのＣＡＲ陰性ｉＮＫ細胞と、細胞傷害性アッセイについて陰性、低又は高Ｂ７Ｈ３発現体のいずれかであったＮａｌｍ６細胞とともにインキュベートした。３７℃で４時間共培養した後、フローサイトメトリを使用してｉＮＫ細胞の特異的腫瘍細胞傷害性を計算して、ＣＡＲ ｉＮＫ細胞殺傷の結果としてのカスパーゼ３／７陽性腫瘍細胞のパーセンテージを決定した。Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲ＋ｉＮＫ細胞は、腫瘍細胞表面Ｂ７Ｈ３のレベルの増加とともに細胞傷害性の増加を示し（図１４Ｃ）、抗原特異的抗腫瘍細胞傷害性を抗原用量応答的に実証した。
Ｂ７Ｈ３依存性サイトカイン放出及び脱顆粒（ＣＲ／Ｄ）応答（これは、標的化殺傷の能力を有する活性化エフェクター細胞の指標である）を評価するために、高純度かつ均質なＢ７Ｈ３－ＣＡＲ＋ｉＮＫ細胞（図１４Ａ）を、単独（未刺激）で、又は表面Ｂ７Ｈ３タンパク質を異なるレベルで過剰発現するＮＡＬＭ６腫瘍細胞（ＮＡＬＭ６ ＷＴ－Ｂ７Ｈ３陰性、ＮＡＬＭ６－Ｂ７Ｈ３培地、及びＮＡＬＭ６－Ｂ７Ｈ３高）とともに抗ＣＤ１０７ａｂ抗体の存在下で２：１のＥ：Ｔ比で培養した。Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲ形質導入を伴わないＢ７Ｈ３－ＣＡＲｉＮＫ細胞を対照として使用した。プレートを約３７℃で４時間インキュベートした後、抗ＣＤ５６及び抗ｈｎＣＤ１６で表面染色して、ｉＮＫ細胞を残存腫瘤細胞から区別した。ＩＦＮγ、ＴＮＦα及び脱顆粒（ＣＤ１０７ａｂ＋）細胞のパーセンテージを、細胞内サイトカイン染色を使用して定量化し、Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲ＋ｉＮＫ細胞における抗原特異的及び抗原用量反応性エフェクター細胞活性化を示した（図１４Ｃ）。
理論によって限定されるものではないが、図１５は、ＣＡＲによって標的化される原発腫瘍抗原の発現レベルが不均一な腫瘍細胞を認識及び標的化する能力が増強されたエフェクター細胞を提供するための、ｉＰＳＣ由来ＣＡＲ－Ｔ細胞又はＮＫ細胞を含むエフェクター細胞の合理的設計を要約しており、原発腫瘍抗原はＢ７Ｈ３を含む。本明細書に提供されるデータによって実証されるように、図示されるようなＣＡＲのものとは異なる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的なエンゲージャ（ＢｉＴＥ又はＴＲｉＫＥ）の腫瘍内産生は、二次腫瘍関連抗原のエンゲージャ依存的認識を可能にし、これは、レシピエント免疫系におけるバイスタンダーＴ細胞による、またエンゲージャに対する表面トリガー受容体を介したエフェクター細胞による、異種腫瘍細胞のＨＬＡ非依存的標的化をもたらし得る。このような表面トリガー受容体としては、本出願に記載されるＣＦＲ（キメラ融合受容体）が挙げられるが、これに限定されない。ＢｉＴＥ又はＴＲｉＫＥなどのエンゲージャとのカップリング時のＣＦＲのシグナル伝達は、異種腫瘍細胞に対する、本明細書に示されるＢ７Ｈ３－ＣＡＲエフェクター細胞を含むがこれに限定されないＣＡＲ発現エフェクター細胞の更なる殺傷能力を誘発し、それによって、腫瘍ＣＡＲ抗原回避を克服するための新規アプローチを提供する。
当業者は、本明細書に記載の方法、組成物、及び製品が例示的な実施形態の代表であり、本発明の範囲に対する限定として意図されていないことを容易に理解するであろう。本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、本明細書に開示された本開示に対して様々な置換及び修正を行うことができることは、当業者には容易に明らかであろう。
本明細書で言及される全ての特許及び刊行物は、本開示が関係する当業者の技術水準を示している。全ての特許及び刊行物は、個々の刊行物が参照により組み込まれるものとして具体的かつ個別に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に例示的に記載された本開示は、本明細書に具体的に開示されていない任意の１つ又は複数の要素、限定又は複数の限定がなくても実施することができる。したがって、例えば、本明細書の各例において、「含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」という用語はいずれも、他の２つの用語のいずれかに置き換えることができる。使用されている用語及び表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、そのような用語及び表現の使用において、示され説明された特徴又はその一部のいずれかの同等物を除外する意図はなく、そうではなくて特許請求される本開示の範囲内で様々な修正が可能であると認識される。したがって、本開示は、好ましい実施形態及び任意選択の特質によって具体的に開示されているが、本明細書で開示される概念の修正及び変形は、当業者によって想到されてもよく、そのような修正及び変形は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内である。

Claims (71)

  1. 細胞又はその集団であって、前記細胞が、Ｂ７Ｈ３腫瘍抗原を標的とするＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ＣＡＲが、
    （ｉ）配列番号３６、３７、３８、３９、４０、若しくは４１と少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、若しくは８０％同一であるアミノ酸配列、
    （ｉｉ）配列番号３６のバリアントによって表されるアミノ酸配列であって、前記バリアントが、配列番号３６の１、４０、４６、７９、８７、８８、８９、９７、９８、及び１１７を含む位置に１つ以上の突然変異を有する、アミノ酸配列、
    （ｉｉｉ）配列番号３６のバリアントによって表されるアミノ酸配列であって、前記バリアントが、配列番号３６に従いＱ１Ｅ、Ｔ４０Ａ、Ｅ４６Ｖ、Ｇ７９Ｌ、Ｋ８７Ｒ、Ｐ８８Ａ、Ｄ８９Ｅ、Ｖ９７Ａ、Ｓ９８Ｒ、及びＱ１１７Ｌを含む１つ以上の置換を有する、アミノ酸配列、又は
    （ｉｖ）配列番号３６、３７、３８、３９、４０、及び４１のうちのいずれかによって表されるアミノ酸配列、を含む結合ドメインを含み、
    前記細胞が、真核細胞、動物細胞、ヒト細胞、免疫細胞、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、又はそれから分化した派生細胞である、細胞又はその集団。
  2. 前記細胞が、エンゲージャをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、及び任意選択でＣＦＲ（キメラ融合受容体）を更に含み、前記エンゲージャが、Ｂ７Ｈ３ではない腫瘍抗原標的化特異性を有する、請求項１に記載の細胞又はその集団。
  3. （ｉ）前記エンゲージャが、ＡＤＧＲＥ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシン－タンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－α、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＲ１、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＤＬ１、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、及び病原体抗原のうちのいずれか１つに対する腫瘍標的化特異性を有する第１の結合ドメインを含むか、
    （ｉｉ）前記エンゲージャが、前記第１の結合ドメインの前記特異性とは異なり、かつＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、若しくはそれらの任意の機能的バリアントの細胞外部分に対するものである特異性を有する第２の結合ドメインを含むか、又は前記エンゲージャの前記第２の結合ドメインが、前記ＣＦＲの外部ドメインに特異的であるか、あるいは
    （ｉｉｉ）前記エンゲージャが、前記第１の結合ドメインと前記第２の結合ドメインとの間にサイトカイン若しくはそのバリアントを含み、前記サイトカインが、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、及びＩＬ２１のうちの少なくとも１つを含む、請求項２に記載の細胞又はその集団。
  4. （ｉ）前記ＣＦＲが、膜貫通ドメインに融合した外部ドメインを含み、前記膜貫通ドメインが、内部ドメインに作動可能に接続されており、前記外部ドメイン、膜貫通ドメイン及び前記内部ドメインが、いずれの小胞体（ＥＲ）保持シグナルもエンドサイトーシスシグナルも含まないか、
    （ｉｉ）前記ＣＦＲが、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、それらの任意の機能的バリアント、及びそれらの組み合わせ又はキメラのうちの少なくとも１つを含むシグナル伝達タンパク質の細胞外部分の全長又は部分長を含む外部ドメインを含むか、
    （ｉｉｉ）前記ＣＦＲが、選択されたアゴニストに結合するとシグナル伝達を開始する外部ドメインを含むか、
    （ｉｖ）前記ＣＦＲが、ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、又はＮＫＧ２Ｄポリペプチドの少なくとも全長又は一部分を含む細胞傷害性ドメインを含む内部ドメインを含み、任意選択で、前記内部ドメインが、
    （ａ）ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ－４、若しくはＮＫＧ２Ｄポリペプチド、若しくはそれらの任意の組み合わせの全長若しくは一部分を含む共刺激ドメイン、
    （ｂ）ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、若しくはそれらの任意の組み合わせの全長若しくは一部分を含む共刺激ドメイン、
    （ｃ）ＩＬ７Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、ＩＬ１８Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ２３Ｒ、若しくはそれらの組み合わせを含むサイトカイン受容体の内部ドメインの全長若しくは一部分を含む持続シグナル伝達ドメイン、及び／又は
    （ｄ）受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＥＧＦＲ、若しくはＦＡＳ受容体の完全な若しくは部分的な細胞内部分、のうちの１つ以上を更に含むか、あるいは
    （ｉｖ）前記ＣＦＲが、別個の構築物内で、又はバイシストロン性発現カセット内で、前記エンゲージャ又は前記ＣＡＲと共発現される、請求項２に記載の細胞又はその集団。
  5. 前記細胞が、その対応する初代細胞と比較して、
    （ｉ）ＣＤ３８ノックアウト、
    （ｉｉ）ＨＬＡ－Ｉの欠損及び／又はＨＬＡ－ＩＩの欠損、
    （ｉｉｉ）ＨＬＡ－Ｇ若しくは非切断性ＨＬＡ－Ｇの導入、又はＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方のノックアウト、
    （ｉｖ）外因性ＣＤ１６又はそのバリアント、
    （ｖ）細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はその受容体の部分又は完全ペプチドを含むシグナル伝達複合体、
    （ｖｉ）表１に列挙された遺伝子型のうちの少なくとも１つ、
    （ｖｉｉ）Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの少なくとも１つの破壊、あるいは
    （ｖｉｉｉ）ＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、抗体又はその機能的バリアント若しくは断片、チェックポイント阻害剤、及びアゴニストとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、のうちの１つ以上を更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞又はその集団。
  6. 前記細胞が、末梢血、臍帯血、又は任意の他のドナー組織から得られたその対応する初代細胞と比較して、
    （ｉ）増加された細胞傷害性、
    （ｉｉ）改善された持続性及び／又は生存率、
    （ｉｉｉ）腫瘍部位にバイスタンダー免疫細胞を遊走させる、及び／又は活性化させる、若しくは動員する増強された能力、
    （ｉｖ）改善された腫瘍浸透、
    （ｖ）腫瘍免疫抑制を低下させる増強された能力、
    （ｖｉ）腫瘍抗原エスケープを救済する改善された能力、
    （ｖｉｉ）制御されたアポトーシス、
    （ｖｉｉｉ）増強又は獲得されたＡＤＣＣ、並びに
    （ｉｘ）フラトリサイドを回避する能力、
    うちの少なくとも１つを含む治療特性を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞又はその集団。
  7. 前記外因性ＣＤ１６又はそのバリアントが、
    （ａ）高親和性の非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）、
    （ｂ）ＣＤ１６の外部ドメインにおけるＦ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐ、
    （ｃ）ＣＤ６４に由来する完全な又は部分的な外部ドメイン、
    （ｄ）非天然（又は非ＣＤ１６）の膜貫通ドメイン、
    （ｅ）非天然（又は非ＣＤ１６）の細胞内ドメイン、
    （ｆ）非天然（又は非ＣＤ１６）のシグナル伝達ドメイン、
    （ｇ）非天然の刺激ドメイン、並びに
    （ｈ）ＣＤ１６に由来せず、かつ同じ又は異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン、シグナル伝達ドメイン、及び刺激ドメイン、のうちの少なくとも１つを含む、請求項６に記載の細胞又はその集団。
  8. 前記細胞表面発現外因性サイトカイン又はその受容体が、
    （ａ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、及びそのそれぞれの受容体のうちの少なくとも１つを含むか、又は
    （ｂ）
    （ｉ）自己切断ペプチドを使用することによるＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの共発現、
    （ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、
    （ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが短縮化若しくは排除されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、
    （ｉｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインとの融合タンパク質、
    （ｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβとの融合タンパク質、
    （ｖｉ）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、前記共通受容体γＣが、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び
    （ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つを含み、
    （ｂ）（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つが、任意選択で、別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、ＣＡＲと共発現されるか、又は
    （ｃ）
    （ｉ）ＩＬ７とＩＬ７Ｒαとの融合タンパク質、
    （ｉｉ）ＩＬ７と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、前記共通受容体γＣが、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び
    （ｉｉｉ）ＩＬ７Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つを含み、（ｃ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のうちのいずれか１つが、任意選択で、別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性発現カセット内で、ＣＡＲと共発現され、
    任意選択で、
    （ｄ）一過的に発現される、請求項７に記載の細胞又はその集団。
  9. 前記チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ＡＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐ１、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、及び抑制性ＫＩＲを含む１つ以上のチェックポイント分子に対するアンタゴニストである、請求項７に記載の細胞又はその集団。
  10. 前記細胞が、
    （ｉ）セーフハーバー遺伝子座若しくは選択された遺伝子座に組み込まれた１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、又は
    （ｉｉ）異なるセーフハーバー遺伝子座若しくは２つ以上の選択された遺伝子座に組み込まれた２つを超える外因性ポリヌクレオチド、を含む、請求項１に記載の細胞又はその集団。
  11. 前記セーフハーバー遺伝子座が、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、若しくはＲＵＮＸ１のうちの少なくとも１つを含み、前記選択された遺伝子座が、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、若しくはＴＩＧＩＴのうちの１つであり、かつ／又は前記外因性ポリヌクレオチドの前記組み込みが、前記遺伝子座における前記遺伝子の発現をノックアウトする、請求項１０に記載の細胞又はその集団。
  12. 前記ＴＣＲ遺伝子座が、ＴＣＲアルファ及び／又はＴＣＲベータの定常領域（ＴＲＡＣ及び／又はＴＲＢＣ）である、請求項１１に記載の細胞又はその集団。
  13. 前記ｉＰＳＣが、クローンｉＰＳＣ、単一細胞解離ｉＰＳＣ、ｉＰＳＣ細胞株細胞、若しくはｉＰＳＣマスタ細胞バンク（ＭＣＢ）細胞であるか、あるいは、前記派生細胞が、派生ＣＤ３４＋細胞、派生造血幹前駆細胞、派生造血多能性前駆細胞、派生Ｔ細胞前駆体、派生ＮＫ細胞前駆体、派生Ｔ系統細胞、派生ＮＫＴ系統細胞、派生ＮＫ系統細胞、派生Ｂ系統細胞、又は対応する初代Ｔ、ＮＫ、ＮＫＴ、及び／若しくはＢ細胞には存在しない１つ以上の機能的特色を有する派生エフェクター細胞を含む、請求項１に記載の細胞又はその集団。
  14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の細胞又はその集団を含む、組成物。
  15. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の派生細胞と、１つ以上の治療剤と、を含む、治療的使用のための組成物。
  16. 前記１つ以上の治療剤が、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、増殖因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血球、フィーダ細胞、フィーダ細胞成分若しくはその補充因子、１つ以上の目的のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤若しくは放射性部分、又は免疫調節薬（ＩＭｉＤ）を含む、請求項１５に記載の組成物。
  17. （ｉ）前記チェックポイント阻害剤が、
    （ａ）ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ＡＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、若しくは抑制性ＫＩＲを含むチェックポイント分子に対する１つ以上のアンタゴニスト、
    （ｂ）アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びそれらの誘導体若しくは機能的同等物のうちの１つ以上、
    （ｃ）アテゾリズマブ、ニボルマブ、及びペンブロリズマブのうちの少なくとも１つ、を含むか、又は
    （ｉｉ）前記治療剤が、ベネトクラクス、アザシチジン、及びポマリドマイドのうちの１つ以上を含む、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記抗体が、
    （ａ）抗ＣＤ２０、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ５２、抗ＥＧＦＲ、抗ＣＤ１２３、抗ＧＤ２、抗ＰＤＬ１、及び／又は抗ＣＤ３８抗体、
    （ｂ）リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、ジヌツキシマブ、アベルマブ、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、７Ｇ３、ＣＳＬ３６２、エロツズマブ、及びそれらのヒト化若しくはＦｃ改変されたバリアント又は断片、並びにそれらの機能的同等物及びバイオシミラーのうちの１つ以上、あるいは
    （ｃ）ダラツムマブを含み、前記派生造血細胞が、ＣＤ３８ノックアウト及び任意選択で外因性ＣＤ１６又はそのバリアントの発現を含む派生ＮＫ細胞又は派生Ｔ細胞を含む、請求項１６に記載の組成物。
  19. 請求項１４～１８のいずれか一項に記載の組成物を養子細胞療法に好適な対象に導入することによる前記組成物の治療的使用であって、前記対象が、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、がん、又はウイルス感染を有する、治療的使用。
  20. 細胞又はその集団を含む、組成物であって、前記細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、エンゲージャ、及び任意選択でＣＦＲ（キメラ融合受容体）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含み、前記ＣＦＲが、任意選択で、エンゲージャカップリングのためのものであり、前記細胞が、真核細胞、動物細胞、ヒト細胞、免疫細胞、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、又はそれから分化した派生細胞である、組成物。
  21. （ｉ）前記エンゲージャが、前記ＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有するか、又は（ｉｉ）前記エンゲージャが、前記ＣＡＲ又は前記ＣＦＲと共発現される、請求項２０に記載の組成物。
  22. 前記ＣＡＲが、
    （ｉ）Ｔ細胞特異的若しくはＮＫ細胞特異的なもの、
    （ｉｉ）二重特異性抗原結合ＣＡＲ、
    （ｉｉｉ）切り替え可能なＣＡＲ、
    （ｉｖ）二量体化されたＣＡＲ、
    （ｖ）スプリットＣＡＲ、
    （ｖｉ）多重鎖ＣＡＲ、
    （ｖｉｉ）誘導可能なＣＡＲ、
    （ｖｉｉｉ）別のＣＡＲと共発現されたもの、
    （ｉｘ）任意選択で別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、細胞表面発現外因性サイトカイン若しくはその受容体の部分若しくは完全ペプチドと共発現されたもの、
    （ｘ）任意選択で別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、チェックポイント阻害剤と共発現されたもの、並びに／又は
    （ｘｉ）ＡＤＧＲＥ２、Ｂ７Ｈ３、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシン－タンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－α、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＲ１、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＤＬ１、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、及び病原体抗原のうちのいずれか１つに特異的なものであり、
    前記（ｉ）～（ｘｉ）のうちのいずれか１つのＣＡＲが、任意選択でＴＲＡＣ又はＴＲＢＣ遺伝子座に挿入されている、かつ／あるいはＴＣＲの内因性プロモータによって駆動されている、かつ／あるいは前記ＴＣＲが、前記ＣＡＲ挿入によってノックアウトされている、請求項２０に記載の組成物。
  23. 前記ＣＡＲが、
    （ｉ）Ｂ７Ｈ３に特異的な抗原認識領域、
    （ｉｉ）配列番号３６、３７、３８、３９、４０、若しくは４１と少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、若しくは８０％同一であるアミノ酸配列を含む結合ドメイン、
    （ｉｉｉ）配列番号３６のバリアントによって表されるアミノ酸配列を含む結合ドメインであって、前記バリアントが、配列番号３６の１、４０、４６、７９、８７、８８、８９、９７、９８、及び１１７を含む位置に１つ以上の突然変異を有する、結合ドメイン、
    （ｉｖ）配列番号３６のバリアントによって表されるアミノ酸配列を含む結合ドメインであって、前記バリアントが、配列番号３６に従いＱ１Ｅ、Ｔ４０Ａ、Ｅ４６Ｖ、Ｇ７９Ｌ、Ｋ８７Ｒ、Ｐ８８Ａ、Ｄ８９Ｅ、Ｖ９７Ａ、Ｓ９８Ｒ、及びＱ１１７Ｌを含む１つ以上の置換を有する、結合ドメイン、又は
    （ｖ）配列番号３６、３７、３８、３９、４０、及び４１のうちのいずれかによって表されるアミノ酸配列を含む結合ドメイン、を含む、請求項２０に記載の組成物。
  24. （ｉ）前記エンゲージャが、前記ＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有する第１の結合ドメインを含み、前記第１の結合ドメインが、ＡＤＧＲＥ２、Ｂ７Ｈ３、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシン－タンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－α、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＲ１、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＤＬ１、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、及び病原体抗原のうちのいずれか１つに特異的であるか、又は
    （ｉｉ）前記エンゲージャが、前記ＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有する第１の結合ドメインを含み、前記ＣＡＲが、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、若しくはＲＯＲ１のうちのいずれか１つに特異的な結合ドメインを含むか、又は
    （ｉｉｉ）前記エンゲージャが、前記第１の結合ドメインの前記特異性とは異なり、かつＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、若しくはそれらの任意の機能的バリアントの細胞外部分に対するものである特異性を有する第２の結合ドメインを含むか、又は
    （ｉｖ）前記エンゲージャが、前記第１の結合ドメインと前記第２の結合ドメインとの間にサイトカイン若しくはそのバリアントを含み、前記サイトカインが、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、及びＩＬ２１のうちの少なくとも１つを含む、請求項２０又は２１に記載の組成物。
  25. 前記細胞が、その対応する初代細胞と比較して、
    （ｉ）ＣＤ３８ノックアウト、
    （ｉｉ）ＨＬＡ－Ｉの欠損及び／又はＨＬＡ－ＩＩの欠損、
    （ｉｉｉ）ＨＬＡ－Ｇ若しくは非切断性ＨＬＡ－Ｇの導入、又はＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方のノックアウト、
    （ｉｖ）外因性ＣＤ１６又はそのバリアント、
    （ｖ）キメラ抗原受容体（ＣＦＲ）、
    （ｖｉ）不活性化ＣＡＲ、
    （ｖｉｉ）細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はその受容体の部分又は完全ペプチドを含むシグナル伝達複合体、
    （ｖｉｉｉ）表１に列挙された遺伝子型のうちの少なくとも１つ、
    （ｉｘ）Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの少なくとも１つの破壊、あるいは
    （ｘ）ＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、抗体又はその機能的バリアント若しくは断片、チェックポイント阻害剤、及びアゴニストとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、のうちの１つ以上を更に含む、請求項２０に記載の組成物。
  26. 前記細胞が、末梢血、臍帯血、又は任意の他のドナー組織から得られたその対応する初代細胞と比較して、
    （ｉ）増加された細胞傷害性、
    （ｉｉ）改善された持続性及び／又は生存率、
    （ｉｉｉ）腫瘍部位にバイスタンダー免疫細胞を遊走させる、及び／又は活性化させる、若しくは動員する増強された能力、
    （ｉｖ）改善された腫瘍浸透、
    （ｖ）腫瘍免疫抑制を低下させる増強された能力、
    （ｖｉ）腫瘍抗原エスケープを救済する改善された能力、
    （ｖｉｉ）制御されたアポトーシス、
    （ｖｉｉｉ）増強又は獲得されたＡＤＣＣ、並びに
    （ｉｘ）フラトリサイドを回避する能力、
    うちの１つ以上を含む治療特性を有する、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の組成物。
  27. 前記外因性ＣＤ１６又はそのバリアントが、
    （ａ）高親和性の非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）、
    （ｂ）ＣＤ１６の外部ドメインにおけるＦ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐ、
    （ｃ）ＣＤ６４に由来する完全な又は部分的な外部ドメイン、
    （ｄ）非天然（又は非ＣＤ１６）の膜貫通ドメイン、
    （ｅ）非天然（又は非ＣＤ１６）の細胞内ドメイン、
    （ｆ）非天然（又は非ＣＤ１６）のシグナル伝達ドメイン、
    （ｇ）非天然の刺激ドメイン、並びに
    （ｈ）ＣＤ１６に由来せず、かつ同じ又は異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン、シグナル伝達ドメイン、及び刺激ドメイン、のうちの少なくとも１つを含む、請求項２５に記載の組成物。
  28. 前記ＣＦＲが、膜貫通ドメインに融合した外部ドメインを含み、前記膜貫通ドメインが、内部ドメインに作動可能に接続されており、前記外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び前記内部ドメインが、いずれの小胞体（ＥＲ）保持シグナルもエンドサイトーシスシグナルも含まない、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の組成物。
  29. （ｉ）前記ＣＦＲの前記外部ドメインが、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、それらの任意の機能的バリアント、及びそれらの組み合わせ又はキメラのうちの少なくとも１つを含むシグナル伝達タンパク質の細胞外部分の全長又は部分長を含むか、
    （ｉｉ）前記ＣＦＲの前記外部ドメインが、選択されたアゴニストに結合するとシグナル伝達を開始するか、
    （ｉｉｉ）前記ＣＦＲの前記内部ドメインが、ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、又はＮＫＧ２Ｄポリペプチドの少なくとも全長又は一部分を含む細胞傷害性ドメインを含み、任意選択で、前記内部ドメインが、
    （ａ）ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ－４、若しくはＮＫＧ２Ｄポリペプチド、若しくはそれらの任意の組み合わせの全長若しくは一部分を含む共刺激ドメイン、
    （ｂ）ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、若しくはそれらの組み合わせの全長若しくは一部分を含む共刺激ドメイン、
    （ｃ）ＩＬ７Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、ＩＬ１８Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ２３Ｒ、若しくはそれらの組み合わせを含むサイトカイン受容体の内部ドメインの全長若しくは一部分を含む持続シグナル伝達ドメイン、及び／又は
    （ｄ）受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＥＧＦＲ、若しくはＦＡＳ受容体の完全な若しくは部分的な細胞内部分、のうちの１つ以上を更に含むか、あるいは
    （ｉｖ）前記ＣＦＲが、別個の構築物内で、又はバイシストロン性発現カセット内で、前記エンゲージャと共発現され、任意選択で、前記エンゲージャが、前記ＣＦＲの前記外部ドメインに対する結合特異性を有する、請求項２８に記載の組成物。
  30. 前記選択されたアゴニストが、（ｉ）抗体又はその機能的バリアント若しくは断片、（ｉｉ）アゴニストリガンド、あるいは（ｉｉｉ）エンゲージャであり、
    前記選択されたアゴニストが、
    （ａ）前記組成物の前記細胞に含まれる前記ポリヌクレオチドによってコードされるか、又は前記組成物に含まれ、
    （ｂ）Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、又はＲＯＲ１を含む少なくとも１つの腫瘍抗原に特異的である第１の結合ドメインを少なくとも含み、任意選択で、
    （ｃ）
    （１）前記組成物の前記細胞、又は
    （２）バイスタンダーエフェクター細胞、の細胞表面タンパク質に特異的な第２の結合ドメインを含み、
    前記細胞表面タンパク質が、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、又はそれらの任意の機能的バリアントの細胞外部分を含む、請求項２９に記載の組成物。
  31. 前記不活性化ＣＡＲが、
    （ｉ）活性化されたレシピエント免疫細胞において上方制御された表面タンパク質を標的とするか、又は
    （ｉｉ）ＣＤ３８－ＣＡＲ、ＣＤ２５－ＣＡＲ、ＣＤ６９－ＣＡＲ、ＣＤ４４－ＣＡＲ、４－１ＢＢ－ＣＡＲ、ＯＸ４０－ＣＡＲ、及びＣＤ４０Ｌ－ＣＡＲのうちの少なくとも１つを含む、請求項２５に記載の組成物。
  32. 前記細胞表面発現外因性サイトカイン又はその受容体が、
    （ａ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、及びそのそれぞれの受容体のうちの少なくとも１つを含むか、又は
    （ｂ）
    （ｉ）自己切断ペプチドを使用することによるＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの共発現、
    （ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、
    （ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが短縮化若しくは排除されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、
    （ｉｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインとの融合タンパク質、
    （ｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβとの融合タンパク質、
    （ｖｉ）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、前記共通受容体γＣが、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び
    （ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つを含み、
    （ｂ）（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つが、任意選択で、別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、ＣＡＲと共発現されるか、又は
    （ｃ）
    （ｉ）ＩＬ７とＩＬ７Ｒαとの融合タンパク質、
    （ｉｉ）ＩＬ７と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、前記共通受容体γＣが、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び
    （ｉｉｉ）ＩＬ７Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つを含み、（ｃ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のうちのいずれか１つが、任意選択で、別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性発現カセット内で、ＣＡＲと共発現され、
    任意選択で、
    （ｄ）一過的に発現される、請求項２５に記載の組成物。
  33. 前記チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ＡＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐ１、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、及び抑制性ＫＩＲを含む１つ以上のチェックポイント分子に対するアンタゴニストである、請求項２５に記載の組成物。
  34. 前記細胞が、
    （ｉ）セーフハーバー遺伝子座若しくは選択された遺伝子座に組み込まれた１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、又は
    （ｉｉ）異なるセーフハーバー遺伝子座若しくは２つ以上の選択された遺伝子座に組み込まれた２つを超える外因性ポリヌクレオチド、を含む、請求項２０に記載の組成物。
  35. 前記セーフハーバー遺伝子座が、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、若しくはＲＵＮＸ１のうちの少なくとも１つを含み、前記選択された遺伝子座が、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、若しくはＴＩＧＩＴのうちの１つであり、かつ／又は前記外因性ポリヌクレオチドの前記組み込みが、前記遺伝子座における前記遺伝子の発現をノックアウトする、請求項３４に記載の組成物。
  36. 前記ＴＣＲ遺伝子座が、ＴＣＲアルファ及び／又はＴＣＲベータの定常領域（ＴＲＡＣ及び／又はＴＲＢＣ）である、請求項３５に記載の組成物。
  37. 前記派生細胞が、派生ＣＤ３４＋細胞、派生造血幹前駆細胞、派生造血多能性前駆細胞、派生Ｔ細胞前駆体、派生ＮＫ細胞前駆体、派生Ｔ系統細胞、派生ＮＫＴ系統細胞、派生ＮＫ系統細胞、派生Ｂ系統細胞、又は対応する初代Ｔ、ＮＫ、ＮＫＴ、及び／若しくはＢ細胞には存在しない１つ以上の機能的特色を有する派生エフェクター細胞を含む、請求項２０に記載の組成物。
  38. １つ以上の治療剤を更に含む、請求項２０に記載の組成物。
  39. 前記１つ以上の治療剤が、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、抗体又はその機能的バリアント若しくは断片、マイトジェン、増殖因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血球、フィーダ細胞、フィーダ細胞成分又はその補充因子、１つ以上の目的のポリ核酸を含むベクター、化学療法剤又は放射性部分、あるいは免疫調節薬（ＩＭｉＤ）を含む、請求項３８に記載の組成物。
  40. （ａ）前記チェックポイント阻害剤が、
    （ｉ）ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ＡＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、若しくは抑制性ＫＩＲを含む１つ以上のアンタゴニストチェックポイント分子、
    （ｉｉ）アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びそれらの誘導体若しくは機能的同等物のうちの１つ以上、又は
    （ｉｉｉ）アテゾリズマブ、ニボルマブ、及びペンブロリズマブのうちの少なくとも１つ、を含むか、あるいは
    （ｂ）前記１つ以上の治療剤が、ベネトクラクス、アザシチジン、及びポマリドマイドのうちの１つ以上を含む、請求項３９に記載の組成物。
  41. 前記抗体又はその機能的バリアント若しくは断片が、
    （ａ）抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ５２、抗ＥＧＦＲ、抗ＣＤ１２３、抗ＧＤ２、抗ＰＤＬ１、及び／又は抗ＣＤ３８抗体、
    （ｂ）リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、オクレリズマブ、イノツズマブ、モキセツモマブ、エプラツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、ジヌツキシマブ、アベルマブ、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、７Ｇ３、ＣＳＬ３６２、エロツズマブ、及びそれらのヒト化若しくはＦｃ改変されたバリアント又は断片、並びにそれらの機能的同等物及びバイオシミラーのうちの１つ以上、あるいは
    （ｃ）ダラツムマブを含み、前記派生エフェクター細胞が、ＣＤ３８ノックアウトを含み、任意選択でＣＤ１６又はそのバリアントを発現する、請求項３９に記載の組成物。
  42. 請求項２０～４１のいずれか一項に記載の組成物を養子細胞療法に好適な対象に導入することによる前記組成物の治療的使用であって、前記対象が、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、がん、又はウイルス感染を有する、治療的使用。
  43. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１のポリヌクレオチドと、エンゲージャ及びＣＦＲの一方又は両方をコードする１つ以上の追加のポリヌクレオチドと、を含む派生エフェクター細胞を製造する方法であって、前記エンゲージャが、前記ＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有し、前記方法が、
    遺伝子操作されたｉＰＳＣを分化させることを含み、前記ｉＰＳＣが、前記第１のポリヌクレオチド及び前記１つ以上の追加のポリヌクレオチド、並びに任意選択で、その対応する初代細胞と比較して、
    （ｉ）ＣＤ３８ノックアウト、
    （ｉｉ）ＨＬＡ－Ｉの欠損及び／又はＨＬＡ－ＩＩの欠損、
    （ｉｉｉ）ＨＬＡ－Ｇ若しくは非切断性ＨＬＡ－Ｇの導入、又はＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方のノックアウト、
    （ｉｖ）外因性ＣＤ１６又はそのバリアント、
    （ｖ）キメラ抗原受容体（ＣＦＲ）、
    （ｖｉ）不活性化ＣＡＲ、
    （ｖｉｉ）細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はその受容体の部分又は完全ペプチド、
    （ｖｉｉｉ）表１に列挙された遺伝子型のうちの少なくとも１つ、
    （ｉｘ）Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの少なくとも１つの破壊、あるいは
    （ｘ）ＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、抗体又はその機能的バリアント若しくは断片、チェックポイント阻害剤、及びアゴニストとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、を含む１つ以上のゲノム編集を含む、方法。
  44. （ｉ）前記エンゲージャが、前記ＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有する第１の結合ドメインを含み、前記結合ドメインが、ＡＤＧＲＥ２、Ｂ７Ｈ３、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシン－タンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－α、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＲ１、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＤＬ１、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、及び病原体抗原のうちのいずれか１つに特異的であるか、又は
    （ｉｉ）前記エンゲージャが、前記ＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有する第１の結合ドメインを含み、前記結合ドメインが、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、若しくはＲＯＲ１のうちのいずれか１つに特異的であるか、又は
    （ｉｉｉ）前記エンゲージャが、前記第１の結合ドメインの前記特異性とは異なり、かつＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、若しくはそれらの任意の機能的バリアントの細胞外部分に対するものである特異性を有する第２の結合ドメインを含むか、又は
    （ｉｖ）前記エンゲージャが、前記第１の結合ドメインと前記第２の結合ドメインとの間にサイトカイン若しくはそのバリアントを含み、前記サイトカインが、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、及びＩＬ２１のうちの少なくとも１つを含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記ＣＡＲが、
    （ｉ）Ｔ細胞特異的若しくはＮＫ細胞特異的なもの、
    （ｉｉ）二重特異性抗原結合ＣＡＲ、
    （ｉｉｉ）切り替え可能なＣＡＲ、
    （ｉｖ）二量体化されたＣＡＲ、
    （ｖ）スプリットＣＡＲ、
    （ｖｉ）多重鎖ＣＡＲ、
    （ｖｉｉ）誘導可能なＣＡＲ、
    （ｖｉｉｉ）別のＣＡＲと共発現されたもの、
    （ｉｘ）任意選択で別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、細胞表面発現外因性サイトカイン及び／若しくはその受容体の部分若しくは完全ペプチドと共発現されたもの、
    （ｘ）任意選択で別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、チェックポイント阻害剤と共発現されたもの、並びに／又は
    （ｘｉ）ＡＤＧＲＥ２、Ｂ７Ｈ３、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシン－タンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－α、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＲ１、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＤＬ１、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、及び病原体抗原のうちのいずれか１つに特異的なものであり、任意選択で、
    前記（ｉ）～（ｘｉ）のうちのいずれか１つのＣＡＲが、任意選択でＴＣＲ遺伝子座に挿入されている、かつ／あるいはＴＣＲの内因性プロモータによって駆動されている、かつ／あるいは前記ＴＣＲが、前記ＣＡＲ挿入によってノックアウトされている、請求項４３に記載の方法。
  46. 前記ＣＡＲが、Ｂ７Ｈ３に特異的な抗原認識領域を含む、請求項４３に記載の方法。
  47. 前記外因性ＣＤ１６又はそのバリアントが、
    （ａ）高親和性の非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）、
    （ｂ）ＣＤ１６の外部ドメインにおけるＦ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐ、
    （ｃ）ＣＤ６４に由来する完全な又は部分的な外部ドメイン、
    （ｄ）非天然（又は非ＣＤ１６）の膜貫通ドメイン、
    （ｅ）非天然（又は非ＣＤ１６）の細胞内ドメイン、
    （ｆ）非天然（又は非ＣＤ１６）のシグナル伝達ドメイン、
    （ｇ）非天然の刺激ドメイン、並びに
    （ｈ）ＣＤ１６に由来せず、かつ同じ又は異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン、シグナル伝達ドメイン、及び刺激ドメイン、のうちの少なくとも１つを含む、請求項４３に記載の方法。
  48. 前記ＣＦＲが、膜貫通ドメインに融合した外部ドメインを含み、前記膜貫通ドメインが、内部ドメインに作動可能に接続されており、前記外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び前記内部ドメインが、いずれの小胞体（ＥＲ）保持シグナルもエンドサイトーシスシグナルも含まない、請求項４３に記載の方法。
  49. （ｉ）前記ＣＦＲの前記外部ドメインが、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、それらの任意の機能的バリアント、及びそれらの組み合わせ又はキメラのうちの少なくとも１つを含むシグナル伝達タンパク質の細胞外部分の全長又は部分長を含むか、
    （ｉｉ）前記ＣＦＲの前記外部ドメインが、選択されたアゴニストに結合するとシグナル伝達を開始するか、あるいは
    （ｉｉｉ）前記ＣＦＲの前記内部ドメインが、ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、又はＮＫＧ２Ｄポリペプチドの少なくとも全長又は一部分を含む細胞傷害性ドメインを含み、任意選択で、前記内部ドメインが、
    （ａ）ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ－４、若しくはＮＫＧ２Ｄポリペプチド、若しくはそれらの任意の組み合わせの全長若しくは一部分を含む共刺激ドメイン、
    （ｂ）ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、若しくはそれらの組み合わせの全長若しくは一部分を含む共刺激ドメイン、
    （ｃ）ＩＬ７Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、ＩＬ１８Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ２３Ｒ、若しくはそれらの組み合わせを含むサイトカイン受容体の内部ドメインの全長若しくは一部分を含む持続シグナル伝達ドメイン、及び／又は
    （ｄ）受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＥＧＦＲ、若しくはＦＡＳ受容体の完全な若しくは部分的な細胞内部分、のうちの１つ以上を更に含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記選択されたアゴニストが、（ｉ）抗体又はその機能的バリアント若しくは断片、（ｉｉ）アゴニストリガンド、あるいは（ｉｉｉ）エンゲージャであり、
    前記選択されたアゴニストが、
    （ａ）前記組成物の前記細胞に含まれる前記ポリヌクレオチドによってコードされるか、又は前記組成物に含まれ、
    （ｂ）Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、又はＲＯＲ１を含む少なくとも１つの腫瘍抗原に特異的である第１の結合ドメインを少なくとも含み、任意選択で、
    （ｃ）
    （１）前記組成物の前記細胞、又は
    （２）バイスタンダーエフェクター細胞、の細胞表面タンパク質に特異的な第２の結合ドメインを含み、
    前記細胞表面タンパク質が、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、又はそれらの任意の機能的バリアントの細胞外部分を含む、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記不活性化ＣＡＲが、
    （ｉ）活性化されたレシピエント免疫細胞において上方制御された表面タンパク質を標的とするか、又は
    （ｉｉ）ＣＤ３８－ＣＡＲ、ＣＤ２５－ＣＡＲ、ＣＤ６９－ＣＡＲ、ＣＤ４４－ＣＡＲ、４－１ＢＢ－ＣＡＲ、ＯＸ４０－ＣＡＲ、及びＣＤ４０Ｌ－ＣＡＲのうちの少なくとも１つを含む、請求項４３に記載の方法。
  52. 前記チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ＡＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐ１、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、及び抑制性ＫＩＲを含む１つ以上のチェックポイント分子に対するアンタゴニストである、請求項４３に記載の方法。
  53. 前記ｉＰＳＣが、
    （ｉ）セーフハーバー遺伝子座若しくは選択された遺伝子座に組み込まれた１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、又は
    （ｉｉ）異なるセーフハーバー遺伝子座若しくは２つ以上の選択された遺伝子座に組み込まれた２つを超える外因性ポリヌクレオチド、を含む、請求項４３に記載の方法。
  54. 前記セーフハーバー遺伝子座が、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、若しくはＲＵＮＸ１のうちの少なくとも１つを含み、前記選択された遺伝子座が、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、若しくはＴＩＧＩＴのうちの１つであり、かつ／又は前記外因性ポリヌクレオチドの前記組み込みが、前記遺伝子座における前記遺伝子の発現をノックアウトする、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記ＴＣＲ遺伝子座が、ＴＣＲアルファ及び／又はＴＣＲベータの定常領域（ＴＲＡＣ及び／又はＴＲＢＣ）である、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記派生エフェクター細胞が、派生ＣＤ３４＋細胞、派生造血幹前駆細胞、派生造血多能性前駆細胞、派生Ｔ細胞前駆体、派生ＮＫ細胞前駆体、派生Ｔ系統細胞、派生ＮＫＴ系統細胞、派生ＮＫ系統細胞、派生Ｂ系統細胞、又は対応する初代Ｔ、ＮＫ、ＮＫＴ、及び／若しくはＢ細胞には存在しない１つ以上の機能的特質を有する派生エフェクター細胞を含む、請求項４３に記載の方法。
  57. 前記細胞表面発現外因性サイトカイン又はその受容体が、
    （ａ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、及びそのそれぞれの受容体のうちの少なくとも１つを含むか、又は
    （ｂ）
    （ｉ）自己切断ペプチドを使用することによるＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの共発現、
    （ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、
    （ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが短縮化若しくは排除されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、
    （ｉｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインとの融合タンパク質、
    （ｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβとの融合タンパク質、
    （ｖｉ）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、前記共通受容体γＣが、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び
    （ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つを含み、
    （ｂ）（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つが、任意選択で、別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、ＣＡＲと共発現されるか、又は
    （ｃ）
    （ｉ）ＩＬ７とＩＬ７Ｒαとの融合タンパク質、
    （ｉｉ）ＩＬ７と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、前記共通受容体γＣが、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び
    （ｉｉｉ）ＩＬ７Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つを含み、（ｃ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のうちのいずれか１つが、任意選択で、別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、前記ＣＡＲと共発現され、
    任意選択で、
    （ｄ）一過的に発現される、請求項４３に記載の方法。
  58. 前記ＣＡＲと、前記エンゲージャ及び前記ＣＦＲの一方又は両方と、をコードするポリヌクレオチドをノックインするために、かつ、任意選択で、
    （ｉ）ＣＤ３８をノックアウトするために、
    （ｉｉ）Ｂ２Ｍ及び／又はＣＩＩＴＡをノックアウトするために、
    （ｉｉｉ）ＣＤ５８及びＣＤ５４の一方又は両方をノックアウトするために、並びに／あるいは、
    （ｉｖ）ＨＬＡ－Ｇ若しくは非切断性ＨＬＡ－Ｇ、高親和性の非切断性ＣＤ１６若しくはそのバリアント、及び／又は細胞表面発現の外因性サイトカイン及び／若しくはその受容体の部分的な若しくは完全なペプチドの発現を導入するために、クローンｉＰＳＣをゲノム操作することを更に含む、請求項４３～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記ゲノム操作することが、標的化された編集を含む、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記標的化された編集が、欠失、挿入、又はイン／デルを含み、前記標的化された編集が、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ホーミングヌクレアーゼ、相同組換え、又はこれらの方法の任意の他の機能的バリエーションによって行われる、請求項５９に記載の方法。
  61. 腫瘍細胞の制御及びクリアランスを改善する方法であって、それを必要とする対象に請求項２０～４１のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含み、任意選択で、前記腫瘍が固形腫瘍であるか、又は前記腫瘍が異種である、方法。
  62. 前記組成物の前記細胞が、抗体又はその機能的バリアント若しくは断片、あるいはエンゲージャを発現する、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記組成物が、エンゲージャを含む、請求項６１に記載の方法。
  64. （ｉ）前記エンゲージャが、前記ＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有する第１の結合ドメインを含み、前記結合ドメインが、ＡＤＧＲＥ２、Ｂ７Ｈ３、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシン－タンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－α、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＲ１、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＤＬ１、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、及び病原体抗原のうちのいずれか１つに特異的であるか、又は
    （ｉｉ）前記エンゲージャが、前記ＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有する第１の結合ドメインを含み、前記結合ドメインが、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、若しくはＲＯＲ１のうちのいずれか１つに特異的であるか、又は
    （ｉｉｉ）前記エンゲージャが、前記第１の結合ドメインの前記特異性とは異なり、かつＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、若しくはそれらの任意の機能的バリアントの細胞外部分に対するものである特異性を有する第２の結合ドメインを含むか、又は
    （ｉｖ）前記エンゲージャが、前記第１の結合ドメインと前記第２の結合ドメインとの間にサイトカイン若しくはそのバリアントを含み、前記サイトカインが、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、及びＩＬ２１のうちの少なくとも１つを含む、請求項６１～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記組成物の前記細胞が、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞であり、前記ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞が、
    （ｉ）ＣＤ３８ノックアウト、
    （ｉｉ）外因性ＣＤ１６又はそのバリアント、
    （ｉｉｉ）ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩの欠損、
    （ｉｖ）ＨＬＡ－Ｇ若しくは非切断性ＨＬＡ－Ｇの導入、又はＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方のノックアウト、
    （ｖ）ＣＦＲ、
    （ｖｉ）細胞表面発現外因性サイトカイン又はその受容体の部分又は完全ペプチドを含むシグナル伝達複合体、
    （ｖｉｉ）不活性化ＣＡＲ、
    （ｖｉｉｉ）Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの少なくとも１つの破壊、並びに／あるいは
    （ｉｘ）ＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、抗体又はその機能的バリアント若しくは断片、チェックポイント阻害剤、及びアゴニストとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、のうちの１つ以上を更に含む、請求項６１に記載の方法。
  66. 前記組成物の前記細胞の投与が、それらの対応する初代細胞の投与と比較して、
    （ｉ）増加された細胞傷害性、
    （ｉｉ）改善された持続性及び／又は生存率、
    （ｉｉｉ）腫瘍部位にバイスタンダー免疫細胞を遊走させる、及び／又は活性化させる、若しくは動員する増強された能力、
    （ｉｖ）改善された腫瘍浸透、
    （ｖ）腫瘍免疫抑制を低下させる増強された能力、
    （ｖｉ）腫瘍抗原エスケープを救済する改善された能力、
    （ｖｉｉ）制御されたアポトーシス、
    （ｖｉｉｉ）増強又は獲得されたＡＤＣＣ、並びに
    （ｉｘ）フラトリサイドを回避する能力、
    のうちの１つ以上をもたらす、請求項６１に記載の方法。
  67. 結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記結合ドメインが、
    （ｉ）配列番号３６、３７、３８、３９、４０、若しくは４１と少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、若しくは８０％同一であるアミノ酸配列、
    （ｉｉ）配列番号３６のバリアントによって表されるアミノ酸配列であって、前記バリアントが、配列番号３６の１、４０、４６、７９、８７、８８、８９、９７、９８、及び１１７を含む位置に１つ以上の突然変異を有する、アミノ酸配列、
    （ｉｉｉ）配列番号３６のバリアントによって表されるアミノ酸配列であって、前記バリアントが、配列番号３６に従いＱ１Ｅ、Ｔ４０Ａ、Ｅ４６Ｖ、Ｇ７９Ｌ、Ｋ８７Ｒ、Ｐ８８Ａ、Ｄ８９Ｅ、Ｖ９７Ａ、Ｓ９８Ｒ、及びＱ１１７Ｌを含む１つ以上の置換を有する、アミノ酸配列、又は
    （ｉｖ）配列番号３６、３７、３８、３９、４０、及び４１のうちのいずれかによって表されるアミノ酸配列を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
  68. ８０個以下のアミノ酸を含むか、又は８０～１８０個のアミノ酸を含むか、又は２２９個以下のアミノ酸を含む、ヒンジペプチドを更に含む、請求項６７に記載のＣＡＲ。
  69. 前記ＣＡＲが、以下の特徴：
    （ｉ）Ｔ細胞特異的であること、
    （ｉｉ）ＮＫ細胞特異的であること、
    （ｉｉｉ）腫瘍細胞表面Ｂ７Ｈ３に結合すること、
    （ｉｖ）Ｂ７Ｈ３抗原の腫瘍細胞表面脱落を減少させること、又は
    （ｖ）腫瘍細胞表面Ｂ７Ｈ３密度を増加させること、のうちの少なくとも１つを有する、請求項６７に記載のＣＡＲ。
  70. 前記ＣＡＲがエフェクター細胞において発現される場合、前記エフェクター細胞が、以下の特徴：
    （ｉ）前記キメラ受容体を欠く、対応するエフェクター細胞と比較して、エフェクター細胞活性化及び殺傷機能を増強すること、並びに
    （ｉｉ）前記キメラ受容体を欠く、対応する細胞と比較して、インビボでの腫瘍進行の制御、腫瘍細胞負荷の低減、腫瘍クリアランス、及び／又は前記腫瘍を保有する対象の生存率の改善が可能であること、のうちの１つ以上を有する、請求項６７に記載のＣＡＲ。
  71. 請求項６７～６９のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む派生細胞を製造する方法であって、ｉＰＳＣを分化させて前記派生細胞を得ることを含み、前記ＣＡＲをコードする前記ポリヌクレオチドが、分化前に前記ｉＰＳＣに導入されるか、又はｉＰＳＣ分化後に前記派生細胞に導入される、方法。
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