JP2023545992A - 操作されたiPSC及び装備された免疫エフェクター細胞 - Google Patents
操作されたiPSC及び装備された免疫エフェクター細胞 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023545992A JP2023545992A JP2023520531A JP2023520531A JP2023545992A JP 2023545992 A JP2023545992 A JP 2023545992A JP 2023520531 A JP2023520531 A JP 2023520531A JP 2023520531 A JP2023520531 A JP 2023520531A JP 2023545992 A JP2023545992 A JP 2023545992A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cell
- domain
- receptor
- cfr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 title claims description 6
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 title claims description 6
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims abstract description 77
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 45
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 38
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 claims abstract description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 32
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims abstract description 17
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 claims abstract description 16
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 656
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 192
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 192
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 190
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims description 150
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 claims description 146
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 144
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 claims description 143
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 141
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 claims description 140
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 95
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 92
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 90
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 90
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 87
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 86
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 86
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 85
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 85
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 79
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 78
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 75
- 101000946860 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Proteins 0.000 claims description 68
- 102100035794 T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Human genes 0.000 claims description 68
- -1 CD179b Proteins 0.000 claims description 65
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 62
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 61
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims description 57
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 50
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 47
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 44
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 44
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 44
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 36
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 claims description 35
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 claims description 35
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 34
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 34
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 claims description 32
- 102100022680 NKG2-D type II integral membrane protein Human genes 0.000 claims description 32
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 claims description 32
- 101001109501 Homo sapiens NKG2-D type II integral membrane protein Proteins 0.000 claims description 31
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 30
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 30
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 29
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims description 29
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 claims description 28
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 claims description 28
- 102100022683 NKG2-C type II integral membrane protein Human genes 0.000 claims description 25
- 101001109503 Homo sapiens NKG2-C type II integral membrane protein Proteins 0.000 claims description 24
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 claims description 24
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 claims description 24
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 claims description 24
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims description 24
- 102100028967 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain G Human genes 0.000 claims description 23
- 108010024164 HLA-G Antigens Proteins 0.000 claims description 23
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 23
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 23
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 23
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 claims description 22
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 claims description 22
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 22
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 claims description 21
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 claims description 21
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 21
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 claims description 20
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims description 19
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 claims description 18
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 claims description 18
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 claims description 18
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 18
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 claims description 18
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 18
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 17
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 claims description 17
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 claims description 16
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 16
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 claims description 16
- 101100382122 Homo sapiens CIITA gene Proteins 0.000 claims description 15
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 15
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 15
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 claims description 15
- 102100026371 MHC class II transactivator Human genes 0.000 claims description 15
- 108700002010 MHC class II transactivator Proteins 0.000 claims description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 15
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 15
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 claims description 14
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 claims description 14
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 14
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 14
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 14
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 14
- 230000002688 persistence Effects 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 14
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 claims description 13
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 claims description 13
- 101150069255 KLRC1 gene Proteins 0.000 claims description 13
- 101100404845 Macaca mulatta NKG2A gene Proteins 0.000 claims description 13
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 claims description 13
- 102100022682 NKG2-A/NKG2-B type II integral membrane protein Human genes 0.000 claims description 13
- 102100029822 B- and T-lymphocyte attenuator Human genes 0.000 claims description 12
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 claims description 12
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 claims description 12
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 claims description 12
- 101000864344 Homo sapiens B- and T-lymphocyte attenuator Proteins 0.000 claims description 12
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 claims description 12
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 claims description 12
- 101001063392 Homo sapiens Lymphocyte function-associated antigen 3 Proteins 0.000 claims description 12
- 101000831007 Homo sapiens T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Proteins 0.000 claims description 12
- 102100021592 Interleukin-7 Human genes 0.000 claims description 12
- 101150030213 Lag3 gene Proteins 0.000 claims description 12
- 102100030984 Lymphocyte function-associated antigen 3 Human genes 0.000 claims description 12
- 102100030301 MHC class I polypeptide-related sequence A Human genes 0.000 claims description 12
- 102100024834 T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Human genes 0.000 claims description 12
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims description 12
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 12
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 12
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 claims description 12
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 12
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 12
- 239000010445 mica Substances 0.000 claims description 12
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 12
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims description 11
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims description 11
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 11
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims description 11
- 108010004217 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 1 Proteins 0.000 claims description 11
- 108010004222 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 3 Proteins 0.000 claims description 11
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 11
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000002121 endocytic effect Effects 0.000 claims description 11
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 11
- RJBDSRWGVYNDHL-XNJNKMBASA-N (2S,4R,5S,6S)-2-[(2S,3R,4R,5S,6R)-5-[(2S,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-2-[(2R,3S,4R,5R,6R)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(E,2R,3S)-3-hydroxy-2-(octadecanoylamino)octadec-4-enoxy]oxan-3-yl]oxy-3-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-5-amino-6-[(1S,2R)-2-[(2S,4R,5S,6S)-5-amino-2-carboxy-4-hydroxy-6-[(1R,2R)-1,2,3-trihydroxypropyl]oxan-2-yl]oxy-1,3-dihydroxypropyl]-4-hydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@H](CO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[C@@H]2O[C@H](CO)[C@H](O[C@@H]3O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]3NC(C)=O)[C@H](O[C@@]3(C[C@@H](O)[C@H](N)[C@H](O3)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]3(C[C@@H](O)[C@H](N)[C@H](O3)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)C(O)=O)[C@H]2O)[C@H](O)[C@H]1O)[C@@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC RJBDSRWGVYNDHL-XNJNKMBASA-N 0.000 claims description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 10
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 claims description 10
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 10
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 claims description 10
- 102100029360 Hematopoietic cell signal transducer Human genes 0.000 claims description 10
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 claims description 10
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 claims description 10
- 101000990188 Homo sapiens Hematopoietic cell signal transducer Proteins 0.000 claims description 10
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 claims description 10
- 101000809875 Homo sapiens TYRO protein tyrosine kinase-binding protein Proteins 0.000 claims description 10
- 102100030704 Interleukin-21 Human genes 0.000 claims description 10
- 102100032870 Natural cytotoxicity triggering receptor 1 Human genes 0.000 claims description 10
- 102100032852 Natural cytotoxicity triggering receptor 3 Human genes 0.000 claims description 10
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 claims description 10
- 102100038717 TYRO protein tyrosine kinase-binding protein Human genes 0.000 claims description 10
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 10
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 claims description 10
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 10
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 10
- 108010082808 4-1BB Ligand Proteins 0.000 claims description 9
- 102100030346 Antigen peptide transporter 1 Human genes 0.000 claims description 9
- 102100030343 Antigen peptide transporter 2 Human genes 0.000 claims description 9
- 102100020986 DNA-binding protein RFX5 Human genes 0.000 claims description 9
- 102100021044 DNA-binding protein RFXANK Human genes 0.000 claims description 9
- 102100028970 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain E Human genes 0.000 claims description 9
- 101000834898 Homo sapiens Alpha-synuclein Proteins 0.000 claims description 9
- 101001075432 Homo sapiens DNA-binding protein RFX5 Proteins 0.000 claims description 9
- 101001075464 Homo sapiens DNA-binding protein RFXANK Proteins 0.000 claims description 9
- 101000986085 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain E Proteins 0.000 claims description 9
- 101000868279 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 claims description 9
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 claims description 9
- 101000589305 Homo sapiens Natural cytotoxicity triggering receptor 2 Proteins 0.000 claims description 9
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 claims description 9
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 9
- 101000979565 Homo sapiens Protein NLRC5 Proteins 0.000 claims description 9
- 101001075466 Homo sapiens Regulatory factor X-associated protein Proteins 0.000 claims description 9
- 101000652359 Homo sapiens Spermatogenesis-associated protein 2 Proteins 0.000 claims description 9
- 102100032913 Leukocyte surface antigen CD47 Human genes 0.000 claims description 9
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 claims description 9
- 108010023335 Member 2 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 claims description 9
- 102000003735 Mesothelin Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000015 Mesothelin Proteins 0.000 claims description 9
- 102100032851 Natural cytotoxicity triggering receptor 2 Human genes 0.000 claims description 9
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 claims description 9
- 102100023432 Protein NLRC5 Human genes 0.000 claims description 9
- 102100021043 Regulatory factor X-associated protein Human genes 0.000 claims description 9
- 101800000849 Tachykinin-associated peptide 2 Proteins 0.000 claims description 9
- 102100028082 Tapasin Human genes 0.000 claims description 9
- 238000011467 adoptive cell therapy Methods 0.000 claims description 9
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 claims description 9
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 9
- 108010059434 tapasin Proteins 0.000 claims description 9
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 claims description 8
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 claims description 8
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 claims description 8
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 claims description 8
- 102100031940 Epithelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 claims description 8
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 claims description 8
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 claims description 8
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 claims description 8
- 101000878602 Homo sapiens Immunoglobulin alpha Fc receptor Proteins 0.000 claims description 8
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 claims description 8
- 101000998120 Homo sapiens Interleukin-3 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 8
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 claims description 8
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 claims description 8
- 101000687808 Homo sapiens Suppressor of cytokine signaling 2 Proteins 0.000 claims description 8
- 101000934341 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD5 Proteins 0.000 claims description 8
- 102100038005 Immunoglobulin alpha Fc receptor Human genes 0.000 claims description 8
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 claims description 8
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 8
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 8
- 102100033493 Interleukin-3 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims description 8
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 8
- 102100024784 Suppressor of cytokine signaling 2 Human genes 0.000 claims description 8
- 102100025244 T-cell surface glycoprotein CD5 Human genes 0.000 claims description 8
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 claims description 8
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 claims description 8
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 claims description 8
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 8
- BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-n-[3-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-(dimethylamino)phenyl]-1-n,1-n-dimethylbenzene-1,4-diamine Chemical compound C1=C(C(C=2C=CC(Cl)=CC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)C(N(C)C)=CC=C1NC(C=1)=CC=C(N(C)C)C=1C(C=1C=CC(Cl)=CC=1)C1=CC=C(Cl)C=C1 BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108010008014 B-Cell Maturation Antigen Proteins 0.000 claims description 7
- 102000006942 B-Cell Maturation Antigen Human genes 0.000 claims description 7
- 101001068133 Homo sapiens Hepatitis A virus cellular receptor 2 Proteins 0.000 claims description 7
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 claims description 7
- 102000026633 IL6 Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims description 7
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 claims description 7
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 7
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 claims description 7
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 claims description 7
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 7
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000013411 master cell bank Methods 0.000 claims description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 7
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 claims description 6
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 claims description 6
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 claims description 6
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 claims description 6
- 101710083479 Hepatitis A virus cellular receptor 2 homolog Proteins 0.000 claims description 6
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000874179 Homo sapiens Syndecan-1 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 claims description 6
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 claims description 6
- 108090000177 Interleukin-11 Proteins 0.000 claims description 6
- 102000003815 Interleukin-11 Human genes 0.000 claims description 6
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 claims description 6
- 102000000585 Interleukin-9 Human genes 0.000 claims description 6
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 claims description 6
- 102000003729 Neprilysin Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000028 Neprilysin Proteins 0.000 claims description 6
- 102100035721 Syndecan-1 Human genes 0.000 claims description 6
- 229940126547 T-cell immunoglobulin mucin-3 Drugs 0.000 claims description 6
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 claims description 6
- 230000000981 bystander Effects 0.000 claims description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 6
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 claims description 6
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 claims description 6
- 108010087914 epidermal growth factor receptor VIII Proteins 0.000 claims description 6
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 6
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 claims description 6
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 claims description 6
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 claims description 6
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 claims description 5
- 102100026094 C-type lectin domain family 12 member A Human genes 0.000 claims description 5
- 102100038077 CD226 antigen Human genes 0.000 claims description 5
- 108010043471 Core Binding Factor Alpha 2 Subunit Proteins 0.000 claims description 5
- 102100035139 Folate receptor alpha Human genes 0.000 claims description 5
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 claims description 5
- 101000912622 Homo sapiens C-type lectin domain family 12 member A Proteins 0.000 claims description 5
- 101000884298 Homo sapiens CD226 antigen Proteins 0.000 claims description 5
- 101001005728 Homo sapiens Melanoma-associated antigen 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 101001023712 Homo sapiens Nectin-3 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000884271 Homo sapiens Signal transducer CD24 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000655352 Homo sapiens Telomerase reverse transcriptase Proteins 0.000 claims description 5
- 108010043610 KIR Receptors Proteins 0.000 claims description 5
- 102000002698 KIR Receptors Human genes 0.000 claims description 5
- 102100025050 Melanoma-associated antigen 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100035487 Nectin-3 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100025373 Runt-related transcription factor 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100038081 Signal transducer CD24 Human genes 0.000 claims description 5
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 claims description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 claims description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 5
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000035515 penetration Effects 0.000 claims description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000001256 tonic effect Effects 0.000 claims description 5
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 4
- FSPQCTGGIANIJZ-UHFFFAOYSA-N 2-[[(3,4-dimethoxyphenyl)-oxomethyl]amino]-4,5,6,7-tetrahydro-1-benzothiophene-3-carboxamide Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C(=O)NC1=C(C(N)=O)C(CCCC2)=C2S1 FSPQCTGGIANIJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- AHLWZBVXSWOPPL-RGYGYFBISA-N 20-deoxy-20-oxophorbol 12-myristate 13-acetate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(C=O)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C AHLWZBVXSWOPPL-RGYGYFBISA-N 0.000 claims description 4
- 101000840545 Bacillus thuringiensis L-isoleucine-4-hydroxylase Proteins 0.000 claims description 4
- 102100037086 Bone marrow stromal antigen 2 Human genes 0.000 claims description 4
- 108700012439 CA9 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100024263 CD160 antigen Human genes 0.000 claims description 4
- 102100024210 CD166 antigen Human genes 0.000 claims description 4
- 102100038078 CD276 antigen Human genes 0.000 claims description 4
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 108010062802 CD66 antigens Proteins 0.000 claims description 4
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 claims description 4
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 claims description 4
- 101100463133 Caenorhabditis elegans pdl-1 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 102100024423 Carbonic anhydrase 9 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100024533 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100021396 Cell surface glycoprotein CD200 receptor 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 4
- 101710093674 Cyclic nucleotide-gated cation channel beta-1 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100039061 Cytokine receptor common subunit beta Human genes 0.000 claims description 4
- 102100036466 Delta-like protein 3 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100029722 Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100035143 Folate receptor gamma Human genes 0.000 claims description 4
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 4
- 101000740785 Homo sapiens Bone marrow stromal antigen 2 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000761938 Homo sapiens CD160 antigen Proteins 0.000 claims description 4
- 101000980840 Homo sapiens CD166 antigen Proteins 0.000 claims description 4
- 101000884279 Homo sapiens CD276 antigen Proteins 0.000 claims description 4
- 101000969553 Homo sapiens Cell surface glycoprotein CD200 receptor 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000916489 Homo sapiens Chondroitin sulfate proteoglycan 4 Proteins 0.000 claims description 4
- 101001033280 Homo sapiens Cytokine receptor common subunit beta Proteins 0.000 claims description 4
- 101000928513 Homo sapiens Delta-like protein 3 Proteins 0.000 claims description 4
- 101001012447 Homo sapiens Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101001023230 Homo sapiens Folate receptor alpha Proteins 0.000 claims description 4
- 101001023202 Homo sapiens Folate receptor gamma Proteins 0.000 claims description 4
- 101001103039 Homo sapiens Inactive tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101001037256 Homo sapiens Indoleamine 2,3-dioxygenase 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000945331 Homo sapiens Killer cell immunoglobulin-like receptor 2DL4 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000945340 Homo sapiens Killer cell immunoglobulin-like receptor 2DS1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101001063456 Homo sapiens Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000971513 Homo sapiens Natural killer cells antigen CD94 Proteins 0.000 claims description 4
- 101001103036 Homo sapiens Nuclear receptor ROR-alpha Proteins 0.000 claims description 4
- 101001109698 Homo sapiens Nuclear receptor subfamily 4 group A member 2 Proteins 0.000 claims description 4
- 101001098352 Homo sapiens OX-2 membrane glycoprotein Proteins 0.000 claims description 4
- 101000829725 Homo sapiens Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase Proteins 0.000 claims description 4
- 101000713322 Homo sapiens SAP30-binding protein Proteins 0.000 claims description 4
- 101000633778 Homo sapiens SLAM family member 5 Proteins 0.000 claims description 4
- 101001056234 Homo sapiens Sperm mitochondrial-associated cysteine-rich protein Proteins 0.000 claims description 4
- 101000596234 Homo sapiens T-cell surface protein tactile Proteins 0.000 claims description 4
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000831496 Homo sapiens Toll-like receptor 3 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000979190 Homo sapiens Transcription factor MafB Proteins 0.000 claims description 4
- 101000666896 Homo sapiens V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Proteins 0.000 claims description 4
- 102100039615 Inactive tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR1 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100040061 Indoleamine 2,3-dioxygenase 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100020793 Interleukin-13 receptor subunit alpha-2 Human genes 0.000 claims description 4
- 101710112634 Interleukin-13 receptor subunit alpha-2 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100033633 Killer cell immunoglobulin-like receptor 2DL4 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100033631 Killer cell immunoglobulin-like receptor 2DS1 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100031036 Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100028198 Macrophage colony-stimulating factor 1 receptor Human genes 0.000 claims description 4
- 101710150918 Macrophage colony-stimulating factor 1 receptor Proteins 0.000 claims description 4
- 108010061593 Member 14 Tumor Necrosis Factor Receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102100021462 Natural killer cells antigen CD94 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100022676 Nuclear receptor subfamily 4 group A member 2 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100037589 OX-2 membrane glycoprotein Human genes 0.000 claims description 4
- 102100035591 POU domain, class 2, transcription factor 2 Human genes 0.000 claims description 4
- 101710084411 POU domain, class 2, transcription factor 2 Proteins 0.000 claims description 4
- 108060006580 PRAME Proteins 0.000 claims description 4
- 102000036673 PRAME Human genes 0.000 claims description 4
- 241001602688 Pama Species 0.000 claims description 4
- 101710120463 Prostate stem cell antigen Proteins 0.000 claims description 4
- 102100036735 Prostate stem cell antigen Human genes 0.000 claims description 4
- 101150066717 Rara gene Proteins 0.000 claims description 4
- 102100020718 Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Human genes 0.000 claims description 4
- 101710151245 Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100036909 SAP30-binding protein Human genes 0.000 claims description 4
- 102100029216 SLAM family member 5 Human genes 0.000 claims description 4
- 101001037255 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Indoleamine 2,3-dioxygenase Proteins 0.000 claims description 4
- 102100026503 Sperm mitochondrial-associated cysteine-rich protein Human genes 0.000 claims description 4
- 102100035268 T-cell surface protein tactile Human genes 0.000 claims description 4
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 claims description 4
- 210000000173 T-lymphoid precursor cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 102100024324 Toll-like receptor 3 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100023234 Transcription factor MafB Human genes 0.000 claims description 4
- 102100025946 Transforming growth factor beta activator LRRC32 Human genes 0.000 claims description 4
- 101710169732 Transforming growth factor beta activator LRRC32 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100028785 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 14 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100038282 V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Human genes 0.000 claims description 4
- 102100022748 Wilms tumor protein Human genes 0.000 claims description 4
- 101710127857 Wilms tumor protein Proteins 0.000 claims description 4
- 102000034337 acetylcholine receptors Human genes 0.000 claims description 4
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 4
- 229960003852 atezolizumab Drugs 0.000 claims description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 claims description 4
- 229940127276 delta-like ligand 3 Drugs 0.000 claims description 4
- IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N fluquinconazole Chemical compound C=1C=C(Cl)C=C(Cl)C=1N1C(=O)C2=CC(F)=CC=C2N=C1N1C=NC=N1 IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000003881 globally optimized alternating phase rectangular pulse Methods 0.000 claims description 4
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 4
- 229960003301 nivolumab Drugs 0.000 claims description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N tryptophan Chemical compound C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010008629 CA-125 Antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 108010009685 Cholinergic Receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 101710178046 Chorismate synthase 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101710152695 Cysteine synthase 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 229940126611 FBTA05 Drugs 0.000 claims description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 3
- 102100022132 High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit gamma Human genes 0.000 claims description 3
- 108091010847 High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit gamma Proteins 0.000 claims description 3
- 101100232351 Homo sapiens IL12RB1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101000853012 Homo sapiens Interleukin-23 receptor Proteins 0.000 claims description 3
- 101001043809 Homo sapiens Interleukin-7 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 3
- 101000610551 Homo sapiens Prominin-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100020790 Interleukin-12 receptor subunit beta-1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100036672 Interleukin-23 receptor Human genes 0.000 claims description 3
- 102100021593 Interleukin-7 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims description 3
- 108020003285 Isocitrate lyase Proteins 0.000 claims description 3
- 102100020943 Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000007298 Mucin-1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100023123 Mucin-16 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010012255 Neural Cell Adhesion Molecule L1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100024964 Neural cell adhesion molecule L1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100040120 Prominin-1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100032831 Protein ITPRID2 Human genes 0.000 claims description 3
- 101001039269 Rattus norvegicus Glycine N-methyltransferase Proteins 0.000 claims description 3
- 102100023606 Retinoic acid receptor alpha Human genes 0.000 claims description 3
- 229950002916 avelumab Drugs 0.000 claims description 3
- 229960002204 daratumumab Drugs 0.000 claims description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims description 3
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 claims description 3
- 108010025001 leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 229960002621 pembrolizumab Drugs 0.000 claims description 3
- 108091008726 retinoic acid receptors α Proteins 0.000 claims description 3
- NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 5-azacytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 2
- 102100026402 Adhesion G protein-coupled receptor E2 Human genes 0.000 claims description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 2
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 102100031172 C-C chemokine receptor type 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 101710149814 C-C chemokine receptor type 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101710149863 C-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100024217 CAMPATH-1 antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 102100032976 CCR4-NOT transcription complex subunit 6 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 102100025221 CD70 antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 102000024905 CD99 Human genes 0.000 claims description 2
- 108060001253 CD99 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 108050001931 Folate receptor alpha Proteins 0.000 claims description 2
- 102000005915 GABA Receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 108010005551 GABA Receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 102100030595 HLA class II histocompatibility antigen gamma chain Human genes 0.000 claims description 2
- 206010066476 Haematological malignancy Diseases 0.000 claims description 2
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 101000718211 Homo sapiens Adhesion G protein-coupled receptor E2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000934356 Homo sapiens CD70 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000920667 Homo sapiens Epithelial cell adhesion molecule Proteins 0.000 claims description 2
- 101001082627 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen gamma chain Proteins 0.000 claims description 2
- 101000994365 Homo sapiens Integrin alpha-6 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001078143 Homo sapiens Integrin alpha-IIb Proteins 0.000 claims description 2
- 101000984189 Homo sapiens Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000904196 Homo sapiens Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000662909 Homo sapiens T cell receptor beta constant 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000662902 Homo sapiens T cell receptor beta constant 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000914496 Homo sapiens T-cell antigen CD7 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100032816 Integrin alpha-6 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100025306 Integrin alpha-IIb Human genes 0.000 claims description 2
- 102100025583 Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 2 Human genes 0.000 claims description 2
- 101100346932 Mus musculus Muc1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102000019315 Nicotinic acetylcholine receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 108050006807 Nicotinic acetylcholine receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 2
- 102100024019 Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2 Human genes 0.000 claims description 2
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 claims description 2
- 229940100514 Syk tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 102100037272 T cell receptor beta constant 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100037298 T cell receptor beta constant 2 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100027208 T-cell antigen CD7 Human genes 0.000 claims description 2
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 claims description 2
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 claims description 2
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 claims description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims description 2
- 229960000548 alemtuzumab Drugs 0.000 claims description 2
- SRHNADOZAAWYLV-XLMUYGLTSA-N alpha-L-Fucp-(1->2)-beta-D-Galp-(1->4)-[alpha-L-Fucp-(1->3)]-beta-D-GlcpNAc Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](NC(C)=O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)O[C@H]2[C@H]([C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O2)O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O SRHNADOZAAWYLV-XLMUYGLTSA-N 0.000 claims description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 2
- 229960002756 azacitidine Drugs 0.000 claims description 2
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 claims description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 claims description 2
- 229950009791 durvalumab Drugs 0.000 claims description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 108010052621 fas Receptor Proteins 0.000 claims description 2
- 102000018823 fas Receptor Human genes 0.000 claims description 2
- 101150022222 foxp1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 claims description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 2
- 229940124622 immune-modulator drug Drugs 0.000 claims description 2
- 229960005386 ipilimumab Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 claims description 2
- 229950001907 monalizumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229960003347 obinutuzumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229950009090 ocaratuzumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229950005751 ocrelizumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229960002450 ofatumumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229960002087 pertuzumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229960000688 pomalidomide Drugs 0.000 claims description 2
- UVSMNLNDYGZFPF-UHFFFAOYSA-N pomalidomide Chemical compound O=C1C=2C(N)=CC=CC=2C(=O)N1C1CCC(=O)NC1=O UVSMNLNDYGZFPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 2
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 claims description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims description 2
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229950004593 ublituximab Drugs 0.000 claims description 2
- 229950000815 veltuzumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229960001183 venetoclax Drugs 0.000 claims description 2
- LQBVNQSMGBZMKD-UHFFFAOYSA-N venetoclax Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1C=1CC(C)(C)CCC=1CN(CC1)CCN1C(C=C1OC=2C=C3C=CNC3=NC=2)=CC=C1C(=O)NS(=O)(=O)C(C=C1[N+]([O-])=O)=CC=C1NCC1CCOCC1 LQBVNQSMGBZMKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 2
- 102100027314 Beta-2-microglobulin Human genes 0.000 claims 5
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 claims 5
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 claims 5
- 102100026882 Alpha-synuclein Human genes 0.000 claims 4
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims 4
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims 4
- 101000937544 Homo sapiens Beta-2-microglobulin Proteins 0.000 claims 4
- 102100032101 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Human genes 0.000 claims 4
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 claims 3
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 claims 1
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 claims 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 claims 1
- 101000851181 Homo sapiens Epidermal growth factor receptor Proteins 0.000 claims 1
- 101001000998 Homo sapiens Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C Proteins 0.000 claims 1
- 102100035620 Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C Human genes 0.000 claims 1
- 101001051488 Takifugu rubripes Neural cell adhesion molecule L1 Proteins 0.000 claims 1
- 229960000106 biosimilars Drugs 0.000 claims 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 claims 1
- 229960004497 dinutuximab Drugs 0.000 claims 1
- 229960004137 elotuzumab Drugs 0.000 claims 1
- 229950009760 epratuzumab Drugs 0.000 claims 1
- 229950007752 isatuximab Drugs 0.000 claims 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 claims 1
- 108090000064 retinoic acid receptors Proteins 0.000 claims 1
- 102000003702 retinoic acid receptors Human genes 0.000 claims 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 abstract description 52
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 abstract 1
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 75
- 102100030569 Nuclear receptor corepressor 2 Human genes 0.000 description 44
- 101710153660 Nuclear receptor corepressor 2 Proteins 0.000 description 44
- 238000013461 design Methods 0.000 description 44
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 42
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 36
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 32
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 28
- 108010005327 CD19-specific chimeric antigen receptor Proteins 0.000 description 21
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 19
- 108010082091 pre-T cell receptor alpha Proteins 0.000 description 18
- 230000006870 function Effects 0.000 description 17
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 16
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 16
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 15
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 15
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 15
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 13
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 10
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 10
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 10
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 9
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 9
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 8
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 8
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 8
- 101000642536 Apis mellifera Venom serine protease 34 Proteins 0.000 description 7
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 7
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 6
- 102100037935 Polyubiquitin-C Human genes 0.000 description 6
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 6
- 108010056354 Ubiquitin C Proteins 0.000 description 6
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 6
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 6
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 6
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 6
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 6
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 6
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 6
- 102000002627 4-1BB Ligand Human genes 0.000 description 5
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 5
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 5
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 5
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 5
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000009258 tissue cross reactivity Effects 0.000 description 5
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 4
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 4
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 4
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 4
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 3
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 3
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 3
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 3
- 102000012804 EPCAM Human genes 0.000 description 3
- 101150084967 EPCAM gene Proteins 0.000 description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000001267 GSK3 Human genes 0.000 description 3
- 108060006662 GSK3 Proteins 0.000 description 3
- 108091005250 Glycophorins Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 description 3
- 101710099301 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- 101150057140 TACSTD1 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 3
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 3
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 3
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002829 mitogen activated protein kinase inhibitor Substances 0.000 description 3
- NFVJNJQRWPQVOA-UHFFFAOYSA-N n-[2-chloro-5-(trifluoromethyl)phenyl]-2-[3-(4-ethyl-5-ethylsulfanyl-1,2,4-triazol-3-yl)piperidin-1-yl]acetamide Chemical compound CCN1C(SCC)=NN=C1C1CN(CC(=O)NC=2C(=CC=C(C=2)C(F)(F)F)Cl)CCC1 NFVJNJQRWPQVOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 229940122531 Anaplastic lymphoma kinase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 2
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 102000000311 Cytosine Deaminase Human genes 0.000 description 2
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 102100021260 Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Human genes 0.000 description 2
- 102000028180 Glycophorins Human genes 0.000 description 2
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 2
- 101000894906 Homo sapiens Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Proteins 0.000 description 2
- 229940124647 MEK inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 2
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000001712 STAT5 Transcription Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010029477 STAT5 Transcription Factor Proteins 0.000 description 2
- 108091005735 TGF-beta receptors Proteins 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000016715 Transforming Growth Factor beta Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical group O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009925 apoptotic mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229960003008 blinatumomab Drugs 0.000 description 2
- 229960000419 catumaxomab Drugs 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 2
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 108700010039 chimeric receptor Proteins 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000001228 classical NK T cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 2
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 2
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 2
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 2
- 229950008579 ertumaxomab Drugs 0.000 description 2
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003566 hemangioblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 2
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 2
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 2
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 2
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 2
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 2
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N (-)-Nicotine Chemical compound CN1CCC[C@H]1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 108010005465 AC133 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000005908 AC133 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100022089 Acyl-[acyl-carrier-protein] hydrolase Human genes 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011357 CAR T-cell therapy Methods 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 1
- 108090000567 Caspase 7 Proteins 0.000 description 1
- 102100029855 Caspase-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100038902 Caspase-7 Human genes 0.000 description 1
- 102100026550 Caspase-9 Human genes 0.000 description 1
- 108090000566 Caspase-9 Proteins 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025682 Dystroglycan 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 1
- 108091060211 Expressed sequence tag Proteins 0.000 description 1
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 1
- 108010021468 Fc gamma receptor IIA Proteins 0.000 description 1
- 108010021472 Fc gamma receptor IIB Proteins 0.000 description 1
- 102000010451 Folate receptor alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- 102100035716 Glycophorin-A Human genes 0.000 description 1
- 108010026389 Gramicidin Proteins 0.000 description 1
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 1
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000599862 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000945339 Homo sapiens Killer cell immunoglobulin-like receptor 2DS2 Proteins 0.000 description 1
- 101001023379 Homo sapiens Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001126417 Homo sapiens Platelet-derived growth factor receptor alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000764622 Homo sapiens Transmembrane and immunoglobulin domain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101100377226 Homo sapiens ZBTB16 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100037871 Intercellular adhesion molecule 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 102100033630 Killer cell immunoglobulin-like receptor 2DS2 Human genes 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 108090000543 Ligand-Gated Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000004086 Ligand-Gated Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 102100029205 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Human genes 0.000 description 1
- 102100035133 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 201000007114 MHC class I deficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 1
- 108010001880 NK Cell Lectin-Like Receptor Subfamily C Proteins 0.000 description 1
- 108010001657 NK Cell Lectin-Like Receptor Subfamily K Proteins 0.000 description 1
- 230000006051 NK cell activation Effects 0.000 description 1
- 102000002755 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010004220 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000002751 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000002752 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 3 Human genes 0.000 description 1
- 102000005650 Notch Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010070047 Notch Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102100030485 Platelet-derived growth factor receptor alpha Human genes 0.000 description 1
- 108700003766 Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Proteins 0.000 description 1
- 102000001183 RAG-1 Human genes 0.000 description 1
- 108060006897 RAG1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102100031778 SH2 domain-containing protein 1B Human genes 0.000 description 1
- 101710097986 SH2 domain-containing protein 1B Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004241 Th2 cell Anatomy 0.000 description 1
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100026224 Transmembrane and immunoglobulin domain-containing protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 101800000385 Transmembrane protein Proteins 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000004156 Wnt signaling pathway Effects 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 102100040314 Zinc finger and BTB domain-containing protein 16 Human genes 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 108010087408 alpha-beta T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006707 alpha-beta T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 210000000648 angioblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 229940127079 antineoplastic immunimodulatory agent Drugs 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 102220385206 c.12C>A Human genes 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000023549 cell-cell signaling Effects 0.000 description 1
- 230000023715 cellular developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 230000008143 early embryonic development Effects 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004049 epigenetic modification Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002219 extraembryonic membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000004475 gamma-delta t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 108040006861 interleukin-7 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 238000003468 luciferase reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000012913 medium supplement Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037230 mobility Effects 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 229960002715 nicotine Drugs 0.000 description 1
- SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N nicotine Natural products CN1CCCC1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000004526 pharmaceutical effect Effects 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 210000004990 primary immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000009131 signaling function Effects 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000012421 spiking Methods 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 210000000037 type II NK T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- ZWCXYZRRTRDGQE-LUPIJMBPSA-N valyl gramicidin a Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC=O)C(C)C)CC(C)C)C(=O)NCCO)=CNC2=C1 ZWCXYZRRTRDGQE-LUPIJMBPSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4633—Antibodies or T cell engagers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
- A61K39/464412—CD19 or B4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464466—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/75—Agonist effect on antigen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/04—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing an ER retention signal such as a C-terminal HDEL motif
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
Abstract
ゲノム操作されたiPSCの指示された分化から得られる機能的に増強された派生エフェクター細胞を得るための方法及び組成物が提供される。本明細書において提供されるiPSC由来細胞は、改善又は増強された治療効果をもたらす安定した機能的なゲノム編集を有する。機能的に増強された派生エフェクター細胞を単独で、又は併用療法において抗体若しくはチェックポイント阻害剤とともに含む、治療用組成物及びその使用も提供される。
Description
関連出願
本出願は、2020年10月9日に出願された米国特許仮出願第63/090,113号、及び2021年4月8日に出願された米国特許仮出願第63/172,383号の優先権を主張し、それらの各々の開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2020年10月9日に出願された米国特許仮出願第63/090,113号、及び2021年4月8日に出願された米国特許仮出願第63/172,383号の優先権を主張し、それらの各々の開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
電子的に提出された配列表への言及
本出願は、本出願とともに提出された、作成日、2021年10月7日、サイズ86,415バイト、名称184143-629601_SEQUENCE_LISTING_ST25.TXTである、ASCIIテキスト形式の配列表のコンピュータ可読形式(Computer Readable Form、CRF)を参照により組み込む。
本出願は、本出願とともに提出された、作成日、2021年10月7日、サイズ86,415バイト、名称184143-629601_SEQUENCE_LISTING_ST25.TXTである、ASCIIテキスト形式の配列表のコンピュータ可読形式(Computer Readable Form、CRF)を参照により組み込む。
本開示は、既製の免疫細胞製品の分野に広く関する。より具体的には、本開示は、インビボで治療に適切な特性を送達することができる多機能エフェクター細胞を開発するための戦略に関する。本開示による実施形態の下で開発された細胞製品は、患者由来の細胞療法の重大な限界に対処する。
養子細胞療法の分野は現在、患者由来及びドナー由来の細胞を使用することに焦点が当てられているため、がん免疫療法の一貫した製造を達成することと、恩恵を受ける可能性のある全ての患者に療法を提供することとが特に困難なものとなっている。養子移入されたリンパ球の有効性及び持続性を改善して、患者の良好な転帰を促進する必要性も存在する。T細胞及びナチュラルキラー(natural killer、NK)細胞などのリンパ球は、自然免疫及び適応免疫に重要な役割を果たす強力な抗腫瘍エフェクターである。しかしながら、養子細胞療法のためにこれらの免疫細胞を使用することは、依然として困難であり、改善に対する満たされていない要求が存在する。したがって、養子免疫療法においてT細胞及びNK細胞、又は他の免疫エフェクター細胞の可能性を最大限に活用するための大きなチャンスがある。
応答率、細胞の消耗、輸注された細胞の損失(生存率及び/又は持続性)、標的の喪失又は系統転換による腫瘍エスケープ、腫瘍の標的化の精度、標的外毒性、腫瘍外効果、固形腫瘍に対する有効性、すなわち腫瘍微小環境及び関連する免疫抑制、動員、輸送、及び浸潤など、様々な問題に対処する機能的に改善されたエフェクター細胞が必要である。
本発明の目的は、単一細胞由来のiPSC(induced pluripotent stem cell、人工多能性幹細胞)クローン株から分化した派生非多能性細胞を生成する方法及び組成物を提供することであり、このiPSCは、そのゲノムに1つ又はいくつかの遺伝子改変を含む。前述の1つ又はいくつかの遺伝子改変には、DNA挿入、欠失、及び置換が含まれ、これらの改変は、分化、増殖、継代及び/又は移植の後、その後の由来細胞において保持され、機能し続ける。
いくつかの実施形態では、本出願のiPSC由来非多能性細胞には、CD34細胞、造血内皮細胞、HSC(hematopoietic stem and progenitor cells、造血幹前駆細胞)、造血多能性前駆細胞、T細胞前駆体、NK細胞前駆体、T細胞、NKT細胞、NK細胞、B細胞、並びに初代NK、T、及び/又はNKT細胞には存在しない1つ以上の機能的特質を有する免疫エフェクター細胞が含まれるが、これらに限定されない。本出願のいくつかの実施形態によるiPSC由来の非多能性細胞は、同一の遺伝子改変を含むiPSCからの分化を通じて、それらのゲノムに1つ又はいくつかの遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された派生細胞を取得するための操作されたクローンiPSC分化戦略では、指示された分化におけるiPSCの発生の可能性が、iPSCの操作されたモダリティによって悪影響を受けないこと、及び操作されたモダリティが派生細胞で意図したとおりに機能することも必要である。更に、この戦略は、末梢血から取得されたT細胞又はNK細胞などの初代リンパ球を操作する際の現在の障壁、すなわち、そのような細胞はしばしば、再現性と均一性を欠き、高い細胞死と低い細胞増殖を伴う不十分な細胞の持続性を呈する細胞をもたらし、そのような細胞を操作することが困難であることに起因する障壁を克服する。更に、この戦略は、最初は不均質である初代細胞源を使用して別の方法で得られる不均質のエフェクター細胞集団の生成を回避する。
本発明のいくつかの態様は、リプログラミングプロセスに続いて、同時に、及びその前に、それぞれ、ゲノム操作の戦略を反映する(I)、(II)、又は(III)を含む方法を使用して得られたゲノム操作されたiPSCを提供する。
(I):以下の(i)及び(ii)の一方又は両方を任意の順序で実施してiPSCを遺伝子操作する。(i)iPSCに1つ以上の構築物を導入して、選択された部位での標的化組み込みを可能にし、(ii)(a)選択された部位を認識することができる1つ以上のエンドヌクレアーゼを使用して、選択された部位における1つ以上の二本鎖切断をiPSCに導入し、(b)ステップ(I)(ii)(a)のiPSCを培養して、内因性DNA修復が、選択された部位に標的化インデルを同時に又は順次生成することを可能にし、それによって、部分又は完全分化細胞に分化することができるゲノム操作されたiPSCを得る。
(II):非多能性細胞を遺伝子操作リプログラミングしてゲノム操作されたiPSCを得る。これには、(i)非多能性細胞を1つ以上のリプログラミング因子と、並びに必要に応じて、TGFβ受容体/ALK阻害剤、MEK阻害剤、GSK3阻害剤、及び/又はROCK阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、非多能性細胞のリプログラミングを開始することと、(ii)ステップ(II)(i)の以下の(a)及び(b)の一方又は両方を任意の順序でリプログラミング非多能性細胞に導入することと、が含まれる:(a)選択された部位での標的化組み込みを可能にする1つ以上の構築物、(b)選択された部位を認識することができる少なくとも1つのエンドヌクレアーゼを使用する、選択された部位での1つ以上の二本鎖切断、次いで、ステップ(II)(ii)(b)の細胞を培養して、内因性DNA修復が、選択された部位に標的化インデルを生成することを可能にする。したがって、得られたゲノム操作されたiPSCは、少なくとも1つの機能的な標的化ゲノム編集を含み、前述のゲノム操作されたiPSCは、部分又は完全分化細胞に分化することができる。
(III):リプログラミングしてゲノム操作されたiPSCを得るために、非多能性細胞を遺伝子操作する。これには、以下の(i)及び(ii)が含まれる:(i)以下の(a)及び(b)の一方又は両方を任意の順序で非多能性細胞に導入すること:(a)選択された部位での標的化組み込みを可能にする1つ以上の構築物、(b)選択された部位を認識することができる少なくとも1つのエンドヌクレアーゼを使用する、選択された部位での1つ以上の二本鎖切断、であって、ステップ(III)(i)(b)の細胞を培養して、内因性DNA修復が、選択された部位に標的化イン/デルを生成することを可能にする、導入することと、(ii)ステップ(III)(i)の細胞を、1つ以上のリプログラミング因子、並びに必要に応じて、TGFβ受容体/ALK阻害剤、MEK阻害剤、GSK3阻害剤、及び/又はROCK阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、選択された部位での標的化編集を含むゲノム操作されたiPSCを得ること。それによって、少なくとも1つの機能的な標的化ゲノム編集を含むゲノム操作されたiPSCを得、前述のゲノム操作されたiPSCは、部分分化細胞又は完全分化細胞に分化することができる。
上述の方法の一実施形態では、1つ以上の選択された部位での少なくとも1つの標的化されたゲノム編集は、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、あるいは、ゲノム操作されたiPSC又はそれからの派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び/又は生存率を促進するタンパク質をコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチドの挿入を含む。いくつかの実施形態では、挿入のための外因性ポリヌクレオチドは、(1)CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC、又は他の構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、若しくは細胞型特異的プロモータを含む1つ以上の外因性プロモータ、又は(2)AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、ベータ2ミクログロブリン、CD38、GAPDH、TCR若しくはRUNX1、又はゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む選択された部位に含まれる1つ以上の内因性プロモータに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、上述の方法を使用して生成されたゲノム操作されたiPSCは、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変EGFR、又はB細胞CD20を含むタンパク質をコードする1つ以上の異なる外因性ポリヌクレオチドを含み、ゲノム操作されたiPSCが2つ以上の自殺遺伝子を含む場合、自殺遺伝子は、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、ベータ2ミクログロブリン、CD38、GAPDH、TCR、又はRUNX1を含む異なるセーフハーバー遺伝子座に組み込まれている。一実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21、及び/又はそれらのそれぞれの受容体の部分長又は全長ペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドによってコードされるIL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21、及び/又はそのそれぞれの受容体の部分的又は完全なペプチドは、融合タンパク質の形態である。
いくつかの他の実施形態では、本明細書で提供される方法を使用して生成されたゲノム操作されたiPSCは、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答調節及び修飾、あるいはiPSC若しくはそれからの派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び/又は生存率を抑制するタンパク質と関連する1つ以上の内因性遺伝子におけるインデルを含む。いくつかの実施形態では、破壊のための内因性遺伝子は、CD38、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、RAG1、及び染色体6p21領域の任意の遺伝子のうちの少なくとも1つを含む。
更にいくつかの他の実施形態では、本明細書で提供される方法を使用して生成されるゲノム操作されたiPSCは、AAVS1遺伝子座に外因性ポリヌクレオチドをコードするカスパーゼ、及びH11遺伝子座に外因性ポリヌクレオチドをコードするチミジンキナーゼを含む。
更にいくつかの他の実施形態では、アプローチ(I)、(II)及び/又は(III)は、ゲノム操作されたiPSCを、MEK阻害剤、GSK3阻害剤、及びROCK阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、ゲノム操作されたiPSCの多能性を維持することを更に含む。一実施形態では、少なくとも1つの標的化されたゲノム編集を含む取得されたゲノム操作されたiPSCは機能的であり、分化能があり、同一の機能のゲノム編集を含む非多能性細胞に分化することができる。
したがって、一態様では、本発明は、キメラ融合受容体(chimeric fusion receptor、CFR)であって、CFRが、外部ドメインと、膜貫通ドメインと、内部ドメインと、を含み、当該外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び内部ドメインが、いかなる小胞体(endoplasmic reticulum、ER)保持シグナルもエンドサイトーシスシグナルも含まない、キメラ融合受容体(CFR)を提供する。いくつかの実施形態では、外部ドメイン抗体は、抗体のscFv(単鎖可変領域断片(single-chain variable fragment))ではなく、外部ドメインは、選択されたアゴニストに結合するとシグナル伝達を開始し、内部ドメインは、細胞治療特性を増強するために選択されたシグナル伝達経路を活性化させる少なくとも1つのシグナル伝達ドメインを含み、CFRは、発現されたときに細胞表面提示され、CFRは、低減された内在化及び表面下方調節を有する。いくつかの実施形態では、内部ドメイン及び外部ドメインは、モジュール式であるか、又はCFRの所与の内部ドメインについて、外部ドメインは、選択されたアゴニストの結合特異性に応じて切り替え可能であるか、又は所与の外部ドメインについて、内部ドメインは、調節のために選択されたシグナル伝達経路に応じて切り替え可能である。特定の実施形態では、外部ドメインは、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD28、CD5、CD16、CD64、CD32、CD33、CD89、NKG2C、NKG2D、それらの任意の機能的バリアント、及びそれらの組み合わせ若しくはキメラのうちの少なくとも1つを含むシグナル伝達タンパク質の細胞外部分の全長又は部分長を含む。
いくつかの実施形態では、外部ドメインは、(a)CD3ε、CD3γ、CD3δ、それらの任意の機能的バリアント、又は組み合わせ若しくはキメラ形態、(b)CD3ε及びCD3γのヘテロ二量体、又は(c)CD3ε及びCD3δのヘテロ二量体、の細胞外部分の全長又は部分長を含み、アゴニストは、CD3の外部ドメインに対する結合特異性を有するか、あるいはアゴニストは、CD3×CD19、CD3×CD20、CD3×CD33、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、エルツマキソマブ、RO6958688、AFM11、MT110/AMG110、MT111/AMG211/MEDI-565、AMG330、MT112/BAY2010112、MOR209/ES414、MGD006/S80880、MGD007、及びFBTA05のうちの少なくとも1つを含む。他の実施形態では、外部ドメインは、NKG2C若しくはその任意の機能的バリアントの細胞外部分の全長若しくは部分長を含み、アゴニストは、NKG2Cの外部ドメインに対する結合特異性を有するか、又はアゴニストは、NKG2C-IL15-CD33 TriKE、NKG2C-IL15-CD19 TriKE、及びNKG2C-IL15-CD20 TriKEのうちの少なくとも1つを含む。更に他の実施形態では、外部ドメインは、CD28若しくはその任意の機能的バリアントの細胞外部分の全長若しくは部分長を含み、アゴニストは、CD28の外部ドメインに対する結合特異性を有するか、又はアゴニストは、15E8、CD28.2、CD28.6、YTH913.12、37.51、9D7(TGN1412)、5.11A1、ANC28.1/5D10、及び37407のうちの少なくとも1つを含む。更に他の実施形態では、外部ドメインは、CD16、CD64、又はそれらの任意の機能的バリアント若しくは組み合わせ/キメラ形態の細胞外部分の全長又は部分長を含み、アゴニストは、CD16又はCD64の外部ドメインに対する結合特異性を有するか、あるいはアゴニストは、IgG抗体、CD16×CD30、CD64×CD30、CD16×BCMA、CD64×BCMA、CD16-IL-EPCAM又はCD64-IL-EPCAM、CD16-IL-CD33、及びCD64-IL-CD33のうちの少なくとも1つを含み、ILは、IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21、又はそれらの任意の機能的バリアント若しくはキメラ形態を含む少なくとも1つのサイトカインの全部又は一部分を含む。
外部ドメインが選択されたリガンドに結合するとシグナル伝達を開始するそれらの実施形態では、選択されたリガンドは、(i)抗体又はその機能的バリアント若しくは断片、あるいは(ii)エンゲージャ、であってもよく、選択されたアゴニストは、CFRの外部ドメインに含まれるエピトープに特異的な結合ドメインを少なくとも含み得る。いくつかの実施形態では、選択されたリガンドは、選択されたアゴニストである。いくつかの実施形態では、選択されたアゴニストは、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD28、CD5、CD16、CD64、CD32、CD33、CD89、NKG2C、NKG2D、若しくはそれらの任意の機能的バリアントの細胞外部分に特異的な結合ドメインを少なくとも含むか、又はエンゲージャは、B7H3、BCMA、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、PSMA、PAMA、P-カドヘリン、若しくはROR1を含む少なくとも1つの腫瘍抗原に特異的な結合ドメインを更に含む。
CFRの様々な実施形態では、CFRの膜貫通ドメインは、(i)ER保持シグナルもエンドサイトーシスシグナルも有しないか、又は操作によってER保持シグナル及びエンドサイトーシスシグナルが除去されており、(ii)(a)膜貫通タンパク質若しくは膜タンパク質、(b)CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD137、CD166、FcεRIγ、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、T細胞受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、GABA受容体、若しくはそれらの組み合わせを含むタンパク質、又は(c)CD28、CD8、CD3ε、若しくはCD4、の膜貫通ドメインの全部又は一部を含む。
CFRの様々な実施形態では、内部ドメインは、少なくとも細胞傷害性ドメインと、必要に応じて共刺激ドメイン、持続性シグナル伝達ドメイン、死誘導シグナル伝達ドメイン、腫瘍細胞制御シグナル伝達ドメイン、及びそれらの任意の組み合わせのうちの1つ以上と、を含む。いくつかの実施形態では、内部ドメインは、CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(4-1BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、若しくはNKG2Dポリペプチドの少なくとも全長若しくは一部分を含む細胞傷害性ドメインを含み、必要に応じて、内部ドメインは、(i)CD2、CD27、CD28、CD40L、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4、若しくはNKG2Dポリペプチド、又はそれらの任意の組み合わせの全長又は一部分を含む共刺激ドメイン、(ii)CD28、4-1BB、CD27、CD40L、ICOS、CD2、若しくはそれらの任意の組み合わせの全長若しくは一部分を含む共刺激ドメイン、(iii)IL2R、IL7R、IL15R、IL18R、IL12R、IL23R、若しくはそれらの任意の組み合わせを含むサイトカイン受容体の内部ドメインの全長若しくは一部分を含む持続性シグナル伝達ドメイン、及び/又は(iv)受容体チロシンキナーゼ(receptor tyrosine kinase、RTK)、腫瘍壊死因子受容体(tumor necrosis factor receptor、TNFR)、EGFR、若しくはFAS受容体の完全若しくは部分的な細胞内部分、のうちの1つ以上を更に含む。
別の態様では、本発明は、細胞又はその集団であって、細胞が、本明細書に記載のキメラ融合受容体(CFR)をコードするポリヌクレオチドを含み、細胞が、真核細胞、動物細胞、ヒト細胞、免疫細胞、フィーダ細胞、人工多能性幹細胞(iPSC)、クローンiPSC、又はそれらの派生エフェクター細胞である、細胞又はその集団を提供する。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、(i)標的化特異性を有するCAR、(ii)CD16若しくはそのバリアント、(iii)CD38ノックアウト、(iv)細胞表面発現外因性サイトカイン及び/若しくはその受容体の部分的若しくは完全なペプチド、(v)HLA-Iの欠損、及び必要に応じてHLA-IIの欠損、(vi)HLA-G若しくは非切断性HLA-Gの導入、又はCD58及びCD54の一方若しくは両方のノックアウト、(vii)表1に列挙される遺伝子型のうちの少なくとも1つ、(viii)TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD25、CD69、CD44、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、及びTIGITのうちの少なくとも1つの欠失若しくは破壊、又は(ix)HLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD16、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、抗原特異的TCR、Fc受容体、抗体若しくはその機能的バリアント若しくは断片、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、及びアゴニストとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも1つの導入、のうちの1つ以上を更に含む。
いくつかの実施形態では、細胞は、末梢血、臍帯血、又は任意の他のドナー組織から得られたその対応する初代細胞と比較して、(i)増加された細胞傷害性、(ii)改善された持続性及び/又は生存率、(iii)腫瘍部位へのバイスタンダー免疫細胞の増強された遊走、及び/又は活性化、若しくは動員、(iv)改善された腫瘍浸透、(v)腫瘍免疫抑制を低下させる増強された能力、(vi)腫瘍抗原エスケープを救済する改善された能力、(vii)制御されたアポトーシス、(viii)増強又は獲得されたADCC、並びに(ix)フラトリサイドを回避する能力、のうちの1つ以上を含む治療特性を有する。エフェクター細胞がCD16又はそのバリアントを含むそれらの実施形態では、CD16又はそのバリアントは、(a)高親和性の非切断性CD16(high affinity non-cleavable CD16、hnCD16)、(b)CD16の外部ドメインにおけるF176V及びS197P、(c)CD64に由来する完全又は部分的な外部ドメイン、(d)非天然(又は非CD16)の膜貫通ドメイン、(e)非天然(又は非CD16)の細胞内ドメイン、(f)非天然(又は非CD16)のシグナル伝達ドメイン、(g)非天然の刺激ドメイン、並びに(h)CD16に由来せず、同じ若しくは異なるポリペプチドに由来する膜貫通、シグナル伝達、及び刺激ドメイン、のうちの少なくとも1つを含み得る。エフェクター細胞が標的化特異性を有するCARを含むそれらの実施形態では、CARは、(i)T細胞特異的若しくはNK細胞特異的なもの、(ii)二重特異性抗原結合CAR、(iii)切り替え可能なCAR、(iv)二量体化されたCAR、(v)スプリットCAR、(vi)多重鎖CAR、(vii)誘導可能なCAR、(viii)必要に応じて別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、細胞表面発現外因性サイトカイン及び/若しくはその受容体の部分的若しくは完全なペプチドと共発現されたもの、(xi)必要に応じて別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、チェックポイント阻害剤と共発現されたもの、(x)CD19、BCMA、CD20、CD22、CD38、CD123、HER2、CD52、EGFR、GD2、MICA/B、MSLN、VEGF-R2、PSMA、及びPDL1のうちの少なくとも1つに特異的なもの、並びに/又は、(xi)ADGRE2、炭酸脱水酵素IX(carbonic anhydrase IX、CAIX)、CCR1、CCR4、がん胎児性抗原(carcinoembryonic antigen、CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、サイトメガロウイルス(cytomegalovirus、CMV)感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質-2(epithelial glycoprotein-2、EGP-2)、上皮糖タンパク質-40(epithelial glycoprotein-40、EGP-40)、上皮細胞接着分子(epithelial cell adhesion molecule、EpCAM)、EGFRvIII、受容体チロシンタンパク質キナーゼerb-B2、3、4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB葉酸結合タンパク質(folate-binding protein、FBP)、胎児のアセチルコリン受容体(acetylcholine receptor、AChR)、葉酸受容体-α、ガングリオシドG2(Ganglioside G2、GD2)、ガングリオシドG3(Ganglioside G3、GD3)、ヒト上皮増殖因子受容体2(human Epidermal Growth Factor Receptor2、HER2)、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(human telomerase reverse transcriptase、hTERT)、ICAM-1、インテグリンB7、インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2(Interleukin-13 receptor subunit alpha-2、IL-13Rα2)、κ-軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体(kinase insert domain receptor、KDR)、ルイスA(CA19.9)、ルイスY(Lewis Y、LeY)、L1細胞接着分子(L1 cell adhesion molecule、L1-CAM)、LILRB2、黒色腫抗原ファミリーA1(melanoma antigen family A1、MAGE-A1)、MICA/B、ムチン1(Mucin1、Muc-1)、ムチン16(Mucin16、Muc-16)、メソセリン(Mesothelin、MSLN)、NKCSI、NKG2Dリガンド、c-Met、がん-精巣抗原NY-ESO-1、腫瘍胎児性抗原(h5T4)、PRAME、前立腺幹細胞抗原(prostate stem cell antigen、PSCA)、PRAME前立腺特異的膜抗原(prostate-specific membrane antigen、PSMA)、腫瘍関連糖タンパク質72(tumor-associated glycoprotein 72、TAG-72)、TIM-3、TRBC1、TRBC2、血管内皮増殖因子R2(vascular endothelial growth factor R2、VEGF-R2)、ウィルムス腫瘍タンパク質(Wilms tumor protein、WT-1)、及び病原体抗原のうちのいずれか1つに特異的なもの、であり得、(i)~(xi)のうちのいずれか1つのCARは、TCR遺伝子座に挿入されている、及び/又はTCRの内因性プロモータによって駆動されている、かつ/あるいはTCRは、CAR挿入によってノックアウトされている。
いくつかの実施形態では、細胞は、細胞表面発現外因性サイトカイン及び/又はその受容体の部分的又は完全なペプチドを含み、外因性サイトカイン又はその受容体は、(a)IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21、及びそのそれぞれの受容体のうちの少なくとも1つを含むか、又は(b)(i)自己切断ペプチドを使用することによるIL15及びIL15Rαの共発現、(ii)IL15とIL15Rαの融合タンパク質、(iii)IL15Rαの細胞内ドメインが短縮化若しくは排除されたIL15/IL15Rα融合タンパク質、(iv)IL15とIL15Rαの膜結合Sushiドメインの融合タンパク質、(v)IL15とIL15Rβの融合タンパク質、(vi)IL15と共通受容体γCとの融合タンパク質であって、共通受容体γCが、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び(vii)IL15Rβのホモ二量体、のうちの少なくとも1つを含み、(i)~(vii)のうちのいずれか1つは、別個の構築物内で、又はバイシストロン性構築物内で、CARと共発現され得、必要に応じて、(c)一過的に発現される。
エフェクター細胞がチェックポイント阻害剤の導入を含むそれらの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2AR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxp1、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara(レチノイン酸受容体アルファ)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E、及び阻害性KIRを含む1つ以上のチェックポイント分子に対するアンタゴニストであってもよいか、又は、二重特異性T細胞エンゲージャ(bi-specific T cell engager、BiTE)又は三重特異性キラー細胞エンゲージャ(tri-specific killer cell engager、TriKE)を含み得る。
様々な実施形態では、派生エフェクター細胞は、腫瘍部位にT細胞を動員する及び/又は遊走させることができ、派生エフェクター細胞は、1つ以上のチェックポイント阻害剤の存在下で腫瘍免疫抑制を低下させることができる。様々な実施形態では、細胞は、(i)セーフハーバー遺伝子座若しくは選択された遺伝子座に組み込まれた1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、又は(ii)異なるセーフハーバー遺伝子座若しくは2つ以上の選択された遺伝子座に組み込まれた2つを超える外因性ポリヌクレオチド、を含む。特定の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、GAPDH、若しくはRUNX1のうちの少なくとも1つを含み、選択された遺伝子座は、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、若しくはTIGITのうちの1つであり、かつ/又は外因性ポリヌクレオチドの組み込みは、遺伝子座における遺伝子の発現をノックアウトする。いくつかの実施形態では、TCR遺伝子座は、TCRアルファ及び/又はTCRベータの定常領域であってもよい。様々な実施形態では、派生エフェクター細胞は、派生CD34細胞、派生造血幹前駆細胞、派生造血多能性前駆細胞、派生T細胞前駆体、派生NK細胞前駆体、派生T系統細胞、派生NKT系統細胞、派生NK系統細胞、派生B系統細胞、又は対応する初代T、NK、NKT、及び/若しくはB細胞には存在しない1つ以上の機能的特質を有する派生免疫エフェクター細胞を含む。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される細胞又はその集団を含む、組成物を提供する。また、本明細書に記載されるクローンiPSCを含む、マスター細胞バンク(master cell bank、MCB)も提供される。
更に別の態様では、本発明は、本明細書に記載の細胞又はその集団と、1つ以上の治療剤と、を含む、治療用途のための組成物を提供する。いくつかの実施形態では、治療剤は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、抗体又はその機能的バリアント若しくは断片、エンゲージャ、マイトジェン、増殖因子、低分子RNA、dsRNA(二本鎖RNA)、単核血球、フィーダ細胞、フィーダ細胞成分又はその補充因子、1つ以上の目的のポリ核酸を含むベクター、化学療法剤又は放射性部分、及び/あるいは免疫修飾薬(immunomodulatory drug、IMiD)を含む。治療剤がチェックポイント阻害剤を含む組成物のそれらの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、(i)PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2AR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara(レチノイン酸受容体アルファ)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E、若しくは阻害性KIRを含む1つ以上のアンタゴニストチェックポイント分子、(ii)アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、IPH4102、IPH43、IPH33、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びそれらの派生体若しくは機能的同等物のうちの1つ以上、又は(iii)アテゾリズマブ、ニボルマブ、及びペンブロリズマブのうちの少なくとも1つ、を含み得る。いくつかの実施形態では、エンゲージャは、二重特異性T細胞エンゲージャ(BiTE)又は三重特異性キラー細胞エンゲージャ(TriKE)を含む。特定の実施形態では、治療剤は、ベネトクラクス、アザシチジン、及びポマリドマイドのうちの1つ以上を含む。
治療剤が抗体又はその機能的バリアント若しくは断片を含む組成物のそれらの実施形態では、抗体又はその機能的バリアント若しくは断片は、(a)抗CD20、抗CD22、抗HER2、抗CD52、抗EGFR、抗CD123、抗GD2、抗PDL1、及び/若しくは抗CD38抗体、(b)リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、オクレリズマブ、イノツズマブ、モキセツモマブ、エプラツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、ジヌツキシマブ、アベルマブ、ダラツムマブ、イサツキシマブ、MOR202、7G3、CSL362、エロツズマブ、及びそれらのヒト化若しくはFc改変されたバリアント又は断片、並びにそれらの機能的同等物及びバイオシミラーのうちの1つ以上、又は(c)ダラツムマブを含み得、派生エフェクター細胞は、CD38ノックアウト、及び必要に応じてCD16又はそのバリアントの発現を含み得る。
更に別の態様では、本発明は、本明細書に記載の組成物を養子細胞療法に好適な対象に導入することによる組成物の治療的使用であって、対象が、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、がん、又はウイルス感染を有する、治療的使用を提供する。
更に別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるCFRを含む派生エフェクター細胞を製造する方法であって、当該方法が、遺伝子操作されたiPSCを分化させることを含み、iPSCが、CFRをコードするポリヌクレオチドと、必要に応じて、(i)CD38ノックアウト、(ii)HLA-Iの欠損、及び必要に応じてHLA-IIの欠損、(iii)HLA-G若しくは切断不可能なHLA-Gの導入、又はCD58及びCD54の一方若しくは両方のノックアウト、(iv)CD16若しくはそのバリアント、(v)標的化特異性を有するCAR、(vi)細胞表面発現外因性サイトカイン及び/若しくはその受容体の部分的若しくは完全なペプチド、(vii)表1に列挙される遺伝子型のうちの少なくとも1つ、(viii)TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD25、CD69、CD44、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、及びTIGITのうちの少なくとも1つの欠失若しくは破壊、又は(ix)HLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD16、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、抗原特異的TCR、Fc受容体、抗体若しくはその機能的バリアント若しくは断片、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、及びアゴニストとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも1つの導入、をもたらす1つ以上の編集と、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、CFRをコードするポリヌクレオチドをノックインするために、かつ、必要に応じて、(i)CD38をノックアウトするために、(ii)B2M及びCIITAをノックアウトするために、(iii)一方若しくは両方のCD58及びCD54をノックアウトするために、並びに/あるいは、(iv)HLA-G若しくは非切断性HLA-G、高親和性の非切断性CD16若しくはそのバリアント、CAR、及び/又は細胞表面発現外因性サイトカイン及び/若しくはその受容体の部分的若しくは完全なペプチドを導入するために、クローンiPSCをゲノム操作することを更に含む。様々な実施形態では、ゲノム操作は、標的化編集を含む。いくつかの実施形態では、標的化編集は、欠失、挿入、又はインデルを含み、標的化編集は、CRISPR、ZFN、TALEN、ホーミングヌクレアーゼ、相同組換え、又はこれらの方法の任意の他の機能的バリエーションによって行われる。
更に別の態様では、本発明は、クローンiPSCのCRISPR媒介性編集であって、当該編集が、本明細書に記載のCFRをコードするポリヌクレオチドのノックインを含む、CRISPR媒介性編集を提供する。いくつかの実施形態では、クローンiPSCの編集は、TCRをノックアウトすることを更に含むか、又はCFRは、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、若しくはTIGITを含む遺伝子座のうちの1つに挿入され、挿入は、遺伝子座における遺伝子の発現をノックアウトする。
更に別の態様では、本発明は、疾患又は状態を治療する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載のCFRと、CFRに特異的なアゴニストと、を含む細胞を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、抗体又はその機能的バリアント若しくは断片、あるいはCFRに特異的なエンゲージャを発現し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、iPSC由来エフェクター細胞であり、iPSC由来エフェクター細胞は、(i)CD38ノックアウト、(ii)TCRneg、(iii)外因性CD16若しくはそのバリアント、(iv)HLA-I及び/若しくはHLA-IIの欠損、(v)HLA-G若しくは非切断性HLA-Gの導入、又はCD58及びCD54の一方若しくは両方のノックアウト、(vi)CARの導入、及び/又は(vii)細胞表面発現外因性サイトカイン及び/若しくはその受容体の部分的若しくは完全なペプチド、のうちの1つ以上を更に含む。いくつかの実施形態では、細胞の投与は、末梢血、臍帯血、又は任意の他のドナー組織から得られたその対応する初代細胞と比較して、(i)増加された細胞傷害性、(ii)改善された持続性及び/又は生存率、(iii)腫瘍部位にバイスタンダー免疫細胞を遊走させる、及び/又は活性化させる、若しくは動員する増強された能力、(iv)改善された腫瘍浸透、(v)腫瘍免疫抑制を低下させる増強された能力、(vi)腫瘍抗原エスケープを救済する改善された能力、(vii)制御されたアポトーシス、(viii)増強又は獲得されたADCC、並びに(ix)フラトリサイドを回避する能力、のうちの1つ以上をもたらす。
本明細書で提供される組成物及び方法の様々な目的及び利点は、例示及び例として本発明の特定の実施形態が示される添付の図面と併せて以下の説明から明らかになるであろう。
iPSC(誘導多能性幹細胞)のゲノム改変には、ポリヌクレオチドの挿入、欠失、置換が含まれる。ゲノム操作されたiPSCでの外因性遺伝子発現は、元のゲノム操作されたiPSCの長期のクローン増殖後、細胞分化後、及びゲノム操作されたiPSCに由来する細胞からの脱分化細胞型において、遺伝子サイレンシング、又は低下した遺伝子発現などの問題にしばしば遭遇する。一方、T細胞又はNK細胞などの初代免疫細胞を直接操作することは困難であり、養子細胞療法のための操作された免疫細胞の調製及び送達に障害をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明は、自殺遺伝子及び他の機能的モダリティを含む1つ以上の外因性遺伝子を安定的に組み込むための効率的で信頼できる標的化アプローチを提供し、これは生着、輸送、ホーミング、遊走、細胞傷害性、生存能力、維持、増殖、寿命、自己複製、持続性、及び/又は生存率に関する改善された治療的特性を、HSC(造血幹前駆細胞)、T細胞前駆細胞、NK細胞前駆細胞、T系統細胞、NKT系統細胞、NK系統細胞、並びに初代NK、T、及び/若しくはNKT細胞には存在しない1つ以上の機能的特質を有する免疫エフェクター細胞を含むが、これらに限定されないiPSC派生細胞にもたらす。
定義
本明細書で特に定義されない限り、本出願に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。更に、文脈で特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬などに限定されず、したがって変化し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためのみのものであり、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図しない。
本明細書で使用されるとき、冠詞「a」、「an」、及び「the」は、本明細書において、冠詞の文法的な対象の、1又は1を超えるもの(すなわち、少なくとも1)を指すために本明細書において使用される。例として、「要素(an element)」は、1つの要素又は1つを超える要素を意味する。
代替(例えば、「又は」)の使用は、代替の一方、両方、又はそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。
「及び/又は」という用語は、代替の一方又は両方のいずれかを意味すると理解されるべきである。
本明細書で使用されるとき、「約」又は「およそ」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さと比較して、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、又は1%もの量で変動する、量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを指す。一実施形態では、「約」又は「およそ」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さの、およそ、±15%、±10%、±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%、又は±1%の、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さの範囲を指す。
本明細書で使用されるとき、「実質的に」又は「本質的に」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さと比較して、約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%以上である量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを指す。一実施形態では、「実質的に同じ」又は「本質的に同じ」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さとほぼ同一である、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さの範囲を指す。
本明細書で使用されるとき、「実質的に含まない」及び「本質的に含まない」という用語は互換可能に使用され、細胞集団又は培養培地などの組成物を記載するために使用されるとき、例えば、特定の物質又はその供給源の、95%を含まない、96%を含まない、97%を含まない、98%を含まない、99%を含まないなど、又は従来の手段で測定して検出できないなどのように、特定の物質又はその供給源を含まない組成物を指す。組成物中の特定の成分又は物質を「含まない」又は「本質的に含まない」という用語はまた、そのような成分又は物質が(1)任意の濃度で組成物に含まれない、又は(2)組成物に含まれるが低密度であり機能的に不活性であることも意味する。同様の意味が、「存在しない」という用語に適用され得、組成物の特定の物質又はその供給源が存在しないことを指す。
本明細書全体を通して、文脈がそうでないことを必要としない限り、「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、及び「含むこと(comprising)」は、述べられたステップ、若しくは要素、又はステップ若しくは要素の群を含むことを意味するが、任意の他のステップ、若しくは要素、又はステップ若しくは要素の群を排除することを意味しないことが理解されるであろう。特定の実施形態では、「含む(include)」、「有する」、「含む(contain)」、及び「含む(comprise)」という用語は、同義的に使用される。
「~からなる(consisting of)」とは、「~からなる」という語句に続く全てのものを含み、かつそれに限定されることを意味する。したがって、「~からなる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であり、かつ他の要素が存在し得ないことを示す。
「~から本質的になる(consisting essentially of)」とは、語句の後に列挙された任意の要素を含むことを意味し、列挙された要素の開示で指定された活性又は動作を妨害しないか、又はそれらに寄与しない他の要素に限定される。したがって、「~から本質的になる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であることを示すが、他の要素は必要に応じたものではなく、列挙された要素の活性又は動作に影響するか否かに応じて存在し得るか、又は存在し得ないことを示す。
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「特定の実施形態」、「追加の実施形態」、若しくは「更なる実施形態」又はそれらの組み合わせへの言及は、実施形態に関連して記載された特定の特徴、構造、又は特性が、本発明の少なくとも1つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる様々な場所での前述の語句の出現は、必ずしも全てが同一の実施形態を参照しているとは限らない。更に、特定の特徴、構造、又は特性は、1つ以上の実施形態において任意の好適な様式で組み合わせることができる。
「エキスビボ」という用語は、一般に、好ましくは自然条件の変化を最小限に抑えて、生体外の人工環境内の生体組織内又は生体組織上で行われる実験又は測定など、生体外で行われる活動を指す。特定の実施形態では、「エキスビボ」手順は、生体から採取され、通常無菌条件下で、典型的には数時間又は約24時間まで、しかしながら状況に応じて最大48時間若しくは72時間又はそれ以上を含む、実験装置で培養される生細胞又は組織を含む。特定の実施形態では、そのような組織又は細胞は、収集及び凍結され得、エキスビボ処理のために後に解凍され得る。生細胞又は組織を使用して数日より長く続く組織培養実験又は手順は、典型的には「インビトロ」であると考えられるが、特定の実施形態では、この用語はエキスビボと互換可能に使用され得る。
「インビボ」という用語は、一般に、生体内部で起こる活動を指す。
本明細書で使用する場合、「リプログラミング」又は「脱分化」又は「細胞能力の増加」又は「発生能力の増加」という用語は、細胞の能力を増加させるか、又は細胞をより分化していない状態に脱分化する方法を指す。例えば、細胞能力が増加した細胞は、リプログラミングされていない状態の同じ細胞と比較して、より多くの発生可塑性を有する(すなわち、より多くの細胞型に分化することができる)。言い換えると、リプログラミングされた細胞は、リプログラミングされていない状態の同じ細胞よりも分化が進んでいない状態の細胞である。
本明細書で使用されるとき、「分化」という用語は、特殊化していない(「コミットされていない」)又はあまり特殊化していない細胞が、例えば、血液細胞又は筋細胞などの特殊化細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した又は分化誘導された細胞は、細胞の系統内でより特殊化された(「コミットされた」)位置を呈する細胞である。「コミットされた」という用語は、分化のプロセスに適用されるとき、通常の状況下で特定の細胞型又は細胞型のサブセットに分化し続ける位置まで分化経路を進み、通常の状況下では、異なる細胞型に分化し、又は分化度の低い細胞型に戻ることのできない細胞を指す。本明細書で使用されるとき、「多能性」という用語は、生体又は体細胞の全ての系統を形成する細胞(すなわち、胚そのもの)の能力を指す。例えば、胚性幹細胞は、3つの胚葉、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の各々から細胞を形成することができる多能性幹細胞の一種である。多能性は、完全な生物を生じさせることができない不完全な又は部分的な多能性細胞(例えば、エピブラスト幹細胞又はEpiSC)から、完全な生物を生じさせることができるより原始的でより多能性の細胞(例えば、胚性幹細胞)までの範囲に及ぶ一連の発生能である。
本明細書で使用されるとき、「人工多能性幹細胞」又はiPSCという用語は、幹細胞が、リプログラミング因子及び/又は小分子の化学的駆動法を使用して、誘導又は変更された、分化した成人、新生児又は胎児細胞からインビトロで産生された、すなわち、3つの全ての胚葉又は真皮層:中胚葉、内胚葉、及び外胚葉の全ての組織に分化できる細胞にリプログラミングされたことを意味する。産生されたiPSCは、天然に存在する細胞を指していない。
本明細書で使用されるとき、「胚性幹細胞」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊の天然に存在する多能性幹細胞を指す。胚性幹細胞は多能性であり、発生時に3つの一次胚葉、すなわち、外胚葉、内胚葉、及び中胚葉の全ての派生体を発生させる。それらは、胚体外膜又は胎盤に寄与しない、すなわち、全能性ではない。
本明細書で使用されるとき、「多能性幹細胞」という用語は、1つ以上の胚葉(外胚葉、中胚葉、及び内胚葉)の細胞に分化するが、3つ全てには分化しない発生能を有する細胞を指す。したがって、多能性細胞はまた、「部分的に分化した細胞」と呼ぶこともできる。多能性細胞は当該技術分野で周知であり、多能性細胞の例には、例えば造血幹細胞及び神経幹細胞などの成体幹細胞が含まれる。「多能性」は、細胞が所与の系統での多くの型の細胞を形成し得るが、他の系統の細胞は形成しないことを示す。例えば、多能性造血細胞は多くの異なる型の血液細胞(赤、白、血小板など)を形成することができるが、ニューロンを形成することはできない。したがって、「多分化能」という用語は、全能性及び多能性よりも低い発生能の程度を有する細胞の状態を指す。
多能性は、細胞の多能性特徴を評価することにより、部分的に決定することができる。多能性の特徴としては、(i)多能性幹細胞形態、(ii)無制限自己再生の潜在能力、(iii)SSEA1(マウスのみ)、SSEA3/4、SSEA5、TRA1-60/81、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/プロミニン、CD140a、CD56、CD73、CD90、CD105、OCT4、NANOG、SOX2、CD30及び/又はCD50を含むが、これらに限定されない、多能性幹細胞マーカーの発現、(iv)3つ全ての体細胞系統(外胚葉、中胚葉及び内胚葉)に分化する能力、(v)3つの体細胞系統からなる奇形腫形成、並びに(vi)3つの体細胞系統からの細胞からなる胚様体の形成が挙げられるが、これらに限定されない。
これまでに2つのタイプの多能性が説明されており、後期胚盤胞の胚盤葉上層幹細胞(epiblast stem cell、EpiSC)に類似した「プライミング」又は「準安定」状態の多能性と、多能性初期/着床前の胚盤胞の内部細胞塊に類似した「ナイーブ」又は「基底」状態である。両方の多能性状態が上記のような特徴を示す一方で、ナイーブ状態又は基底状態は、(i)雌性細胞におけるX染色体の前不活性化又は再活性化、(ii)単一細胞培養中のクローン性及び生存率の改善、(iii)DNAメチル化の全体的な減少、(iv)発生調節遺伝子プロモータ上のH3K27me3抑制クロマチンマーク沈着の低減、並びに(v)プライミング状態多能性細胞と比較しての分化マーカーの発現低下を更に示す。外因性多能性遺伝子が体細胞に導入され、発現され、その後、得られる多能性細胞からサイレンシングされるか又は除去されるかのいずれかである細胞リプログラミングの標準的な方法論は、一般に、多能性の準備状態の特徴を有するようである。標準的な多能性細胞培養条件下で、そのような細胞は、外因性導入遺伝子発現が維持されない限り、準備状態に留まり、基底状態の特徴が観察される。
本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞形態」という用語は、胚性幹細胞の古典的な形態学的特徴を指す。正常な胚性幹細胞の形態は、高い核対細胞質比を有し、核小体が顕著に存在し、典型的な細胞間間隔がある、形状が丸くて小さいことを特徴とする。
本明細書で使用されるとき、「対象」という用語は、任意の動物、好ましくはヒト患者、家畜、又は他の飼育動物を指す。
「多能性因子」又は「リプログラミング因子」は、単独で又は他の薬剤と組み合わせて、細胞の発生能を増加させることができる薬剤を指す。多能性因子には、細胞の発生能を増加させることができるポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び小分子が含まれるが、これらに限定されない。例示的な多能性因子には、例えば、転写因子及び小分子リプログラミング剤が含まれる。
「培養」又は「細胞培養」は、インビトロ環境における細胞の維持、増殖及び/又は分化を指す。「細胞培養培地」、「培養培地」(各場合で単数は「培地(medium)」)、「補充成分」及び「培地補充成分」は、細胞培養を培養する栄養組成物を指す。
「培養する」又は「維持する(maintain)」とは、例えば滅菌プラスチック(又はコーティングされたプラスチック)細胞培養皿又はフラスコ内で、組織又は体外の細胞を維持(sustaining)、増殖(propagating)(増殖(growing))、及び/又は分化させることを指す。「培養すること」又は「維持すること」は、細胞の増殖及び/又は維持に役立つ栄養素、ホルモン、及び/又は他の因子の供給源として培地を利用することができる。
本明細書で使用されるとき、「中胚葉」という用語は、初期胚発生中に出現し、循環系の血液細胞、筋肉、心臓、真皮、骨格、その他の支持組織と結合組織を含む様々な特殊化された細胞型を生じさせる、3つの胚葉のうちの1つを指す。
本明細書で使用される場合、「決定的な造血内皮」(definitive hemogenic endothelium、HE)又は「多能性幹細胞由来の決定的な造血内皮」(pluripotent stem cell-derived definitive hemogenic endothelium、iHE)という用語は、内皮造血転換と呼ばれるプロセスにおいて造血幹前駆細胞を生じさせる内皮細胞のサブセットを指す。胚における造血細胞の発生は、側板中胚葉から血管芽細胞を経て決定的な造血内皮細胞及び造血前駆体へと順次進行する。
「造血幹前駆細胞」、「造血幹細胞」、「造血前駆細胞」、又は「造血前駆体細胞」という用語は、造血系統にコミットしているが、更なる造血分化が可能であり、多能性造血幹細胞(血球)、骨髄前駆体、巨核球前駆体、赤血球前駆体、及びリンパ球前駆体を含む細胞を指す。造血幹前駆細胞(HSC)は、骨髄系(単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球/血小板、樹状細胞)、及びリンパ系(T細胞、B細胞、NK細胞)を含む全ての血液細胞型を生じる多能性幹細胞である。本明細書で使用されるとき、「二次造血幹細胞」という用語は、T系統細胞、NK系統細胞、及びB系統細胞を含む成熟骨髄性とリンパ性細胞型の両方を生じさせることができるCD34+造血細胞を指す。造血細胞はまた、原始赤血球、巨核球、及びマクロファージを生じさせる原始造血細胞の様々なサブセットを含む。
本明細書で使用されるとき、「Tリンパ球」及び「T細胞」という用語は互換可能に使用され、胸腺での成熟を完了し、体内の特定の外来抗原の同定、並びにMHCクラスI拘束性での他の免疫細胞の活性化及び不活性化を含む免疫系における様々な役割を有する主要なタイプの白血球を指す。T細胞は、任意のT細胞、例えば、培養T細胞、例えば、初代T細胞、又は培養T細胞株、例えば、Jurkat、SupT1などからのT細胞、又は哺乳動物から取得されたT細胞であり得る。T細胞は、CD3+細胞であり得る。T細胞は、CD4+/CD8+二重陽性T細胞、CD4+ヘルパーT細胞(例えば、Th1及びTh2細胞)、CD8+T細胞(例えば、細胞傷害性T細胞)、末梢血単核細胞(peripheral blood mononuclear cell、PBMC)、末梢血白血球(peripheral blood leukocyte、PBL)、腫瘍浸潤リンパ球(tumor infiltrating lymphocyte、TIL)、メモリT細胞、ナイーブT細胞、制御性T細胞、ガンマデルタT細胞(gamma delta T cell、γδT細胞)、などを含むが、これらに限定されない、任意のタイプのT細胞であることができ、任意の発生段階のものであることができる。追加のタイプのヘルパーT細胞には、Th3(Treg)、Th17、Th9、又はTfh細胞などの細胞が含まれる。追加のタイプのメモリT細胞には、セントラルメモリT細胞(central memory T cell、Tcm細胞)、エフェクターメモリT細胞(Tem細胞及びTEMRA細胞)などの細胞が含まれる。T細胞は、T細胞受容体(T cell receptor、TCR)又はキメラ抗原受容体(chimeric antigen receptor、CAR)を発現するように改変されたT細胞などの遺伝子操作されたT細胞を指すこともできる。T細胞又はT細胞様エフェクター細胞は、幹細胞又は前駆細胞から分化させることもできる。T細胞様派生エフェクター細胞は、いくつかの点でT細胞系統を有し得るが、同時に、初代T細胞には存在しない1つ以上の機能的特質を有する。
「CD4+細胞」は、それらの表面でCD4を発現し、細胞性免疫応答と関連するT細胞のサブセットを指す。それらは刺激後の分泌プロファイルによって特徴付けられ、IFN-ガンマ、TNF-アルファ、IL2、IL4、及びIL10などのサイトカインの分泌が含まれ得る。「CD4」は、もともとTリンパ球の分化抗原として定義された55-kDの糖タンパク質であるが、単球/マクロファージを含む他の細胞にも見出される。CD4抗原は免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、MHC(major histocompatibility complex、主要組織適合性複合体)クラスII拘束性免疫応答の関連認識要素として関与している。Tリンパ球では、ヘルパー/インデューサのサブセットを定義する。
「CD8+細胞」は、それらの表面上でCD8を発現し、MHCクラスI拘束性であり、細胞傷害性T細胞として機能するT細胞のサブセットを指す。「CD8」分子は、胸腺細胞と細胞傷害性及びサプレッサTリンパ球に見られる分化抗原である。CD8抗原は免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、主要組織適合性複合体クラスI拘束性相互作用の関連認識要素である。
本明細書で使用されるとき、「NK細胞」又は「ナチュラルキラー細胞」という用語は、CD56又はCD16の発現及びT細胞受容体(CD3)の不在によって定義される末梢血リンパ球のサブセットを指す。本明細書で使用されるとき、「適応NK細胞」及び「メモリNK細胞」という用語は互換可能であり、表現型的にCD3-及びCD56+であり、NKG2C及びCD57のうちの少なくとも1つ、並びに必要に応じてCD16を発現するが、PLZF、SYK、FceRγ、及びEAT-2のうちの1つ以上の発現を欠く、NK細胞のサブセットを指す。いくつかの実施形態では、CD56+NK細胞の単離された亜集団は、CD16、NKG2C、CD57、NKG2D、NCRリガンド、NKp30、NKp40、NKp46、活性化及び阻害性KIR、NKG2A、並びに/又はDNAM-1の発現を含む。CD56+は、弱陽性(dim)又は強陽性(bright)発現であり得る。NK細胞、又はNK細胞様エフェクター細胞は、幹細胞又は前駆細胞から分化され得る。派生NK細胞様エフェクター細胞は、いくつかの点でNK細胞系統を有し得るが、同時に、初代NK細胞には存在しない1つ以上の機能的特質を有する。
本明細書で使用されるとき、「NKT細胞」又は「ナチュラルキラーT細胞」という用語は、T細胞受容体(TCR)を発現するCD1d拘束性T細胞を指す。従来の主要組織適合性(MHC)分子によって提示されるペプチド抗原を検出する従来のT細胞とは異なり、NKT細胞は、非古典的MHC分子であるCD1dによって提示される脂質抗原を認識する。2つの型のNKT細胞が認識される。インバリアント又はI型NKT細胞は、非常に限られたTCRレパートリ-限定された範囲のβ鎖(ヒトではVβ11)と関連する正規のα鎖(ヒトではVα24-Jα18)を発現する。非古典的又は非インバリアントのII型NKT細胞と呼ばれるNKT細胞の第2の集団は、より不均一なTCRαβの使用を提示する。I型NKT細胞は免疫療法に好適であると考えられている。適応又はインバリアント(I型)NKT細胞は、TCR Va24-Ja18、Vb11、CD1d、CD3、CD4、CD8、aGalCer、CD161、及びCD56のマーカーのうちの少なくとも1つ以上の発現によって識別され得る。
本明細書で使用されるとき、「単離された」などの用語は、元の環境から分離されている細胞、又は細胞の集団を指し、すなわち、単離された細胞の環境は、「単離されていない」参照細胞が存在する環境に見出される少なくとも1つの成分を実質的に含まない。この用語は、例えば、組織又は生検試料から単離された、その天然環境で見出されるようないくつか又は全ての成分から取り出される細胞を含む。この用語はまた、細胞が非天然環境、例えば、細胞培養物又は細胞懸濁液から単離された環境で見出されるため、少なくとも1つ、いくつか、又は全ての成分から取り出される細胞を含む。したがって、単離された細胞は、天然で見出される場合、又は非天然の環境で増殖、保管、又は存続する場合、他の物質、細胞、又は細胞集団を含む少なくとも1つの成分から部分的又は完全に分離される。単離された細胞の具体例には、部分的に純粋な細胞組成物、実質的に純粋な細胞組成物、及び天然に存在しない培地で培養された細胞が含まれる。単離された細胞は、所望の細胞若しくはその集団を、環境中の他の物質若しくは細胞から分離することによって、又は環境から1つ以上の他の細胞集団若しくは亜集団を取り除くことによって得ることができる。
本明細書中で使用されるとき、「精製する」などの用語は、純度を増加することを指す。例えば、純度は少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、又は100%に増加させることができる。
本明細書で使用されるとき、「コードすること」という用語は、ヌクレオチド(すなわち、rRNA、tRNA、及びmRNA)の定義された配列又はアミノ酸の定義された配列及びそれらから生じる生物学的特性を有する生物学的プロセスにおける他のポリマー及び巨大分子の合成のためのテンプレートとして機能する、遺伝子、cDNA、又はmRNAなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。したがって、その遺伝子に対応するmRNAの転写及び翻訳が細胞又は他の生物学的システムでタンパク質を産生する場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がmRNA配列と同一であり、通常は配列表に記載されているコード鎖と、遺伝子又はcDNAの転写のテンプレートとして使用される非コード鎖の両方を、その遺伝子又はcDNAのタンパク質又は他の産物をコードしているということができる。
「構築物」は、インビトロ又はインビボのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む高分子又は分子の複合体を指す。本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、外来遺伝物質の標的細胞への送達又は移入を誘導することができ、標的細胞で複製及び/又は発現することができる任意の核酸構築物を指す。本明細書で使用されるとき、「ベクター」という用語は、送達される構築物を含む。ベクターは、線状又は環状分子であり得る。ベクターは、組み込まれてもよく、又は組み込まれなくてもよい。ベクターの主なタイプには、プラスミド、エピソームベクター、ウイルスベクター、コスミド、及び人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。
「組み込み」とは、構築物の1つ以上のヌクレオチドが細胞ゲノムに安定して挿入される、すなわち、細胞の染色体DNA内の核酸配列に共有結合されることを意味する。「標的化組み込み」とは、構築物のヌクレオチドが、予め選択された部位又は「配列番号部位」で細胞の染色体又はミトコンドリアDNAに挿入されることを意味する。本明細書で使用されるとき、「組み込み」という用語は、組み込み部位での内因性配列又はヌクレオチドの欠失を伴うか又は伴わない、構築物の1つ以上の外因性配列又はヌクレオチドの挿入を含むプロセスを更に指す。挿入部位に欠失がある場合、「組み込み」は、内因性配列又は1つ以上の挿入されたヌクレオチドで欠失されたヌクレオチドの置換を更に含み得る。
本明細書で使用されるとき、「外因性」という用語は、参照分子又は参照活性が宿主細胞に導入されるか、又は宿主細胞に対して非天然であることを意味することを意図している。分子は、例えば、コード核酸を宿主の遺伝物質に導入することにより、例えば、宿主の染色体に組み込むことにより、又は非染色体の遺伝物質、例えば、プラスミドとして導入することができる。したがって、コード核酸の発現に関して使用される用語は、コード核酸を発現可能な形態で細胞に導入することを指す。「内因性」という用語は、宿主細胞に存在する参照分子又は活性を指す。同様に、この用語は、コード核酸の発現に関して使用されるとき、細胞内に含まれ、外因的に導入されていないコード核酸の発現を指す。
本明細書で使用されるとき、「目的の遺伝子」又は「目的のポリヌクレオチド配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれると、RNAに転写され、場合によってはインビボでポリペプチドに翻訳されるDNA配列である。目的の遺伝子又はポリヌクレオチドは、原核生物配列、真核生物のmRNAからのcDNA、真核生物(例えば、哺乳動物)のDNAからのゲノムDNA配列、及び合成DNA配列を含み得るが、これらに限定されない。例えば、目的の遺伝子は、miRNA、shRNA、天然ポリペプチド(すなわち、天然に見出されるポリペプチド)又はその断片、バリアントポリペプチド(すなわち、天然ポリペプチドとの100%未満の配列同一性を有する天然ポリペプチドの突然変異体)又はその断片、操作されたポリペプチド又はペプチド断片、治療用ペプチド又はポリペプチド、造影用マーカー、選択マーカーなどをコードし得る。
本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又はそれらの類似体のいずれかである、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドの配列は、4つのヌクレオチド塩基:アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、チミン(T)から構成され、ポリヌクレオチドがRNAである場合、チミンはウラシル(U)である。ポリヌクレオチドには、遺伝子又は遺伝子断片(例えば、プローブ、プライマー、EST、又はSAGEタグ)、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA(messenger RNA、mRNA)、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ及びプライマーが含まれ得る。ポリヌクレオチドはまた、二本鎖分子と一本鎖分子の両方を指す。
本明細書で使用されるとき、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は互換可能に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基を有する分子を指す。ポリペプチドは少なくとも2つのアミノ酸を含まなければならず、ポリペプチドのアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書で使用されるとき、これらの用語は、例えば、当該技術分野では一般にペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも称される短い鎖と、一般に当該技術分野でポリペプチド又はタンパク質と称される長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、改変ポリペプチド、派生体、類似体、及び融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドは、天然ポリペプチド、組換えポリペプチド、合成ポリペプチド、又はそれらの組み合わせを含む。
本明細書で使用されるとき、「サブユニット」という用語は、タンパク質複合体の各別個のポリペプチド鎖を指し、各別個のポリペプチド鎖は、それ自体で安定な折り畳み構造を形成することができる。多くのタンパク質分子は、2つ以上のサブユニットから構成され、ここで、アミノ酸配列は、各サブユニットについて同一であるか、又は類似しているか、又は完全に異なるかのいずれかであり得る。例えば、CD3複合体は、CD3α、CD3ε、CD3δ、CD3γ、及びCD3ζサブユニットから構成され、これらはCD3ε/CD3γ、CD3ε/CD3δ、及びCD3ζ/CD3ζ二量体を形成する。単一のサブユニット内で、ポリペプチド鎖の連続した部分は、「ドメイン」と呼ばれるコンパクトで局所的な半独立単位に折り畳まれることが多い。多くのタンパク質ドメインは、ドメインの共通機能に寄与する、サブドメインとも呼ばれる独立した「構造サブユニット」を更に含み得る。したがって、本明細書で使用されるとき、「サブドメイン」という用語は、より大きなドメインの内側のタンパク質ドメイン、例えば、細胞表面受容体の外部ドメイン内の結合ドメイン、又は細胞表面受容体の内部ドメインの刺激ドメイン若しくはシグナル伝達ドメインを指す。
「作動可能に連結された(operably-linked)」又は「作動可能に連結された(operatively linked)」は、「作動可能に接続された(operably connected)」又は「作動可能に接続された(operatively connected)」と交換可能であり、一方の機能が他方によって影響を受けるような、単一の核酸断片上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモータは、そのコード配列又は機能的RNAの発現に影響を与えることができる場合、コード配列又は機能的RNAと作動可能に連結している(すなわち、コード配列又は機能的RNAがプロモータの転写制御下にある)。コード配列は、センス又はアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結することができる。
「融合タンパク質」又は「キメラタンパク質」は、本明細書で使用されるとき、別々のタンパク質をコードする配列をコードする2つ以上の部分的又は完全なポリヌクレオチドを接合するための遺伝子操作を介して作製されるタンパク質であり、これらの接合されたポリヌクレオチドの発現は、元のタンパク質又はその断片の各々に由来する機能的特性を有する単一のペプチド又は複数のポリペプチドを生じる。融合タンパク質における異なる供給源の2つの隣接するポリペプチド間に、リンカー(又はスペーサ)ペプチドを付加することができる。本明細書に記載のキメラ融合受容体(CFR)は、融合タンパク質又はキメラタンパク質である。
本明細書で使用されるとき、「遺伝的インプリント」という用語は、ソース細胞又はiPSCの優先的な治療属性に寄与し、ソース細胞由来iPSC及び/又はiPSC由来造血系統細胞で保持可能な遺伝的又はエピジェネティックな情報を指す。本明細書で使用されるとき、「ソース細胞」は、リプログラミングを通じてiPSCを生成するために使用され得る非多能性細胞であり、ソース細胞由来iPSCは、任意の造血系統細胞を含む特定の細胞型に更に分化し得る。ソース細胞由来iPSC、及びそれから分化した細胞は、文脈に応じて、「由来(derived)」細胞又は「派生(derivative)」細胞と総称し得る。例えば、本出願全体で使用されるとき、派生エフェクター細胞、又は派生NK系統細胞若しくは派生T系統細胞は、末梢血、臍帯血、又は他のドナー組織などの天然(natural)/天然(native)供給源から取得されたそれらの対応する初代細胞と比較して、iPSCから分化した細胞である。本明細書で使用されるとき、優先的な治療属性を付与する遺伝的インプリントは、ドナー、疾患、若しくは治療応答に特異的である選択されたソース細胞をリプログラミングすることにより、又はゲノム編集を使用してiPSCに遺伝子組換えモダリティを導入することにより、iPSCに組み込まれる。特異的に選択されたドナー、疾患、又は治療状況から取得されたソース細胞の態様では、優先的な治療属性に寄与する遺伝的インプリントには、根本的な分子事象が同定されているかどうかに関係なく、選択されたソース細胞のiPSC由来細胞に渡される、保持可能な表現型、すなわち優先的な治療属性を表す、状況特異的な遺伝的又はエピジェネティックな改変を含み得る。ドナー、疾患、若しくは治療応答に特異的であるソース細胞は、iPSC及び由来造血系統細胞において保持可能な遺伝的インプリントを含んでいてもよく、この遺伝的インプリントには、例えば、ウイルス特異的T細胞又はインバリアントナチュラルキラーT(invariant natural killer T、iNKT)細胞からの、予め配置された単一特異的TCR、追跡可能で望ましい遺伝子多型、例えば、選択されたドナーにおける高親和性CD16受容体をコードする点突然変異のホモ接合、及び所定のHLA要件、すなわち、増加した集団でハプロタイプを示す選択されたHLA適合ドナー細胞が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用されるとき、優先的な治療属性には、由来細胞の、改善された生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、免疫応答の調節と修飾、生存率、及び細胞傷害性が含まれる。優先的な治療属性はまた、抗原標的化受容体発現、HLA提示又はその欠如、腫瘍微小環境に対する耐性、バイスタンダー免疫細胞及び免疫修飾の誘導、腫瘍外効果の減少を伴う改善されたオンターゲット特異性、並びに/又は化学療法などの治療に対する耐性によっても明らかにされる。
本明細書で使用されるとき、「増強された治療特性」という用語は、同じ一般的な細胞型の典型的な免疫細胞と比較して増強された細胞の治療特性を指す。例えば、「増強された治療特性」を有するNK細胞は、典型的な未改変及び/又は天然に存在するNK細胞と比較して、増強され、改善され、及び/又は増加された治療特性を有する。免疫細胞の治療特性には、細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、免疫応答の調節と修飾、生存率、及び細胞傷害性が含まれ得るが、これらに限定されない。免疫細胞の治療特性はまた、抗原標的化受容体発現、HLA提示又はその欠如、腫瘍微小環境に対する耐性、バイスタンダー免疫細胞及び免疫修飾の誘導、腫瘍外効果の減少を伴う改善されたオンターゲット特異性、並びに/又は化学療法などの治療に対する耐性によっても明らかにされる。
本明細書で使用されるとき、「エンゲージャ」という用語は、免疫細胞(例えば、T細胞、NK細胞、NKT細胞、B細胞、マクロファージ、又は好中球)と、腫瘍細胞との間の連結を形成することができ、免疫細胞を活性化させることができる分子、例えば、融合ポリペプチドを指す。エンゲージャの例には、二重特異性T細胞エンゲージャ(BiTE)、二重特異性キラー細胞エンゲージャ(BiKE)、三重特異性キラー細胞エンゲージャ(TriKE)、若しくは多重特異性キラー細胞エンゲージャ、及び複数の免疫細胞型と適合し得るユニバーサルエンゲージャが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「表面トリガー受容体」という用語は、免疫応答、例えば、細胞傷害性応答を誘発又は開始することができる受容体を指す。表面トリガー受容体を操作することができ、エフェクター細胞、例えば、T細胞、NK細胞、NKT細胞、B細胞、マクロファージ、好中球で発現させることができる。いくつかの実施形態では、表面トリガー受容体は、エフェクター細胞の天然受容体及び細胞型とは無関係に、エフェクター細胞と特異的な標的細胞(例えば、腫瘍細胞)との間の二重特異性抗体又は多重特異性抗体の結合を促進する。このアプローチを使用すると、ユニバーサル表面トリガー受容体を含むiPSCを生成し、そのようなiPSCをユニバーサル表面トリガー受容体を発現する様々なエフェクター細胞型の集団に分化させることができる。「ユニバーサル」とは、表面トリガー受容体が細胞型に関係なく任意のエフェクター細胞で発現及び活性化することができることを意味し、ユニバーサル受容体を発現する全てのエフェクター細胞は、エンゲージャの腫瘍結合特異性に関係なく、表面トリガー受容体によって認識され得るエンゲージャに結合又は連結され得る。いくつかの実施形態では、同じ腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャを使用して、ユニバーサル表面トリガー受容体と結合する。いくつかの実施形態では、異なる腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャを使用して、ユニバーサル表面トリガー受容体と結合する。したがって、1つ以上のエフェクター細胞型を使用して、ある特異的な型の腫瘍細胞を殺傷する場合もあれば、2つ以上の型の腫瘍を殺傷する場合もある。表面トリガー受容体は一般に、エフェクター細胞の活性化のための共刺激ドメインと、エンゲージャのエピトープ結合領域に特異的なエピトープと、を含む。二重特異性エンゲージャは、一方の端の表面トリガー受容体のエピトープに特異的であり、もう一方の端の腫瘍抗原に特異的である。
本明細書で使用されるとき、「安全スイッチタンパク質」という用語は、細胞療法の潜在的な毒性又はその他の有害作用を防止するように設計された操作されたタンパク質を指す。いくつかの例では、安全スイッチタンパク質の発現は条件付きで制御され、安全スイッチタンパク質をコードする遺伝子をゲノムに永久的に組み込んだ移植された操作された細胞の安全性の懸念に対処する。この条件付き調節は変動する可能性があり、小分子を介した翻訳後活性化及び組織特異的及び/又は一過性の転写調節による制御が含まれる可能性がある。安全スイッチは、アポトーシスの誘導、タンパク質合成の阻害、DNA複製、増殖停止、転写及び転写後の遺伝子調節及び/又は抗体媒介性枯渇を媒介する可能性がある。いくつかの例において、安全スイッチタンパク質は、外因性分子、例えば、プロドラッグによって活性化され、活性化されると、治療用細胞のアポトーシス及び/又は細胞死を誘発する。安全スイッチタンパク質の例には、カスパーゼ9(又はカスパーゼ3若しくは7)、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、B細胞CD20、改変EGFR、及びそれらの任意の組み合わせなどの自殺遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。この戦略では、有害事象の発生時に投与されるプロドラッグが自殺遺伝子産物によって活性化され、形質導入された細胞を殺傷する。
本明細書で使用されるとき、「薬学的に活性なタンパク質又はペプチド」という用語は、生物に対して生物学的及び/又は薬学的効果を達成することができるタンパク質又はペプチドを指す。薬学的に活性なタンパク質は、疾患に対する治癒的(healing)、治癒的(curative)又は緩和的特性を有し、疾患の重症度を改善、軽減(relieve)、緩和、逆転又は軽減(lessen)するために投与することができる。薬学的に活性なタンパク質はまた、予防特性を有し、疾患の発症を予防するために、又はそれが出現した場合にそのような疾患又は病的状態の重症度を軽減するために使用される。薬学的に活性なタンパク質には、タンパク質又はペプチド全体又はその薬学的に活性な断片が含まれる。それはまた、タンパク質若しくはペプチドの薬学的に活性な類似体又はタンパク質若しくはペプチドの断片の類似体を含む。薬学的に活性なタンパク質という用語はまた、協調的又は相乗的に作用して治療効果をもたらす複数のタンパク質又はペプチドを指す。薬学的に活性なタンパク質又はペプチドの例には、受容体、結合タンパク質、転写及び翻訳因子、腫瘍増殖抑制タンパク質、抗体又はその断片、増殖因子、及び/又はサイトカインが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「シグナル伝達分子」という用語は、細胞シグナル伝達を調節、関与、阻害、活性化、低減、又は増大させる任意の分子を指す。「シグナル伝達」とは、細胞内で最終的に生化学的事象を引き起こす経路に沿ったタンパク質複合体の動員による化学改変の形での分子シグナルの伝達を指す。シグナル伝達経路は当該技術分野で周知であり、Gタンパク質共役受容体シグナル伝達、チロシンキナーゼ受容体シグナル伝達、インテグリンシグナル伝達、トールゲートシグナル伝達、リガンド依存性イオンチャネルシグナル伝達、ERK/MAPKシグナル伝達経路、Wntシグナル伝達経路、cAMP依存経路、及びIP3/DAGシグナル伝達経路が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「標的化モダリティ」という用語は、細胞に遺伝的に組み込まれて、i)固有のキメラ抗原受容体(CAR)又はT細胞受容体(TCR)に関連するときの抗原特異性、ii)モノクローナル抗体又は二重特異性エンゲージャに関連するときのエンゲージャ特異性、iii)形質転換細胞の標的化、iv)がん幹細胞の標的化、及びv)特異的な抗原又は表面分子の不在下でのその他の標的化戦略を含むがこれらに限定されない、抗原及び/又はエピトープの特異性を促進する分子、例えば、ポリペプチドを指す。
本明細書で使用されるとき、「特異的」又は「特異性」という用語は、非特異的又は非選択的な結合とは対照的に、標的分子に選択的に結合する分子、例えば受容体又はエンゲージャの能力を指すために使用され得る。
本明細書で使用されるとき、「養子細胞療法」という用語は、輸注の前にエキスビボで増殖している、遺伝子改変された、又は改変されていない、T又はB細胞として同定される、自家性又は同種異系のリンパ球の輸注に関連する、本明細書で使用される、細胞ベースの免疫療法を指す。
本明細書で使用されるとき、「治療上十分な量」は、その意味の範囲内で、それが参照する特定の治療及び/又は医薬組成物の非毒性であるが十分かつ/又は有効な量を含み、所望の治療効果を提供する。必要とされる正確な量は、患者の全体的な健康状態、患者の年齢、並びに状態のステージ及び重症度などの要因に応じて、対象ごとに異なる。特定の実施形態では、治療的に十分な量は、治療されている対象の疾患又は状態と関連する少なくとも1つの症状を改善、軽減、及び/又は改善するのに十分及び/又は有効である。
多能性幹細胞の分化には、培養液中の刺激剤及び細胞の物理的状態の変化など、培養系の変化が必要とされる。最も一般的な戦略は、系統特異的な分化を開始するための共通かつ重要な中間体として胚様体(embryoid body、EB)の形成を利用する。「胚様体」とは、胚の発生を模倣することが示されている三次元のクラスタであり、三次元領域内で多数の系統を発生させる。典型的には数時間から数日である分化プロセスを通じて、単純なEB(例えば、分化を誘発された凝集多能性幹細胞)は成熟を続け、嚢胞性EBにまで成長し、典型的には数日から数週間であるこのとき、それらは、更に分化を続けるように処理される。EB形成は、多能性幹細胞を細胞の三次元多層クラスタ内で互いに近接させることによって開始され、これは典型的には、多能性細胞を液滴として沈降させ、細胞を「U」底ウェルプレートに沈降させること、又は機械的撹拌によるものを含むいくつかの方法の1つによって実現される。多能性培養維持培地で維持された凝集体は適切なEBを形成しないため、EBの成長を促進するために、多能性幹細胞の凝集体には更に分化の手掛かりが必要である。そのため、多能性幹細胞の凝集体は、選択した系統へのキュー誘発を提供する分化培地に移す必要がある。多能性幹細胞のEBベースの培養は、典型的には、EB細胞クラスタ内の中程度の増殖(proliferation)の分化した細胞集団(外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の胚葉)を生成する。EBは、細胞分化を促進することが証明されているが、環境からの分化のキューに対する三次元構造の細胞の露出に一貫性がないため、様々な分化状態の異種細胞を生じさせる。加えて、EBは作成と維持が面倒である。更に、EB形成による細胞分化には適度な細胞増殖が伴い、分化効率の低下にもつながる。
対照的に、「凝集体形成」は、「EB形成」とは異なり、多能性幹細胞由来細胞の集団を増殖させるために使用することができる。例えば、凝集体に基づく多能性幹細胞の増殖の間、培養培地は、増殖及び多能性を維持するように選択される。細胞増殖は一般に、より大きな凝集体を形成する凝集体のサイズを増加させ、これらの凝集体は、日常的に機械的又は酵素的に小さな凝集体に解離して、培養内の細胞増殖を維持し、細胞数を増やすことができる。EB培養とは異なり、維持培養で凝集体内で培養された細胞は、多能性のマーカーを維持する。多能性幹細胞凝集体は、分化を誘導するために更なる分化のキューを必要とする。
本明細書で使用されるとき、「単層分化」は、細胞の三次元多層クラスタにわたる分化、すなわち「EB形成」とは異なる分化方法を指す用語である。単層分化は、本明細書に開示される他の利点の中でも特に、EB形成が分化を開始する必要性を回避する。単層培養はEB形成などの胚発生を模倣しないため、特定の系統への分化は、EBの3つ全ての胚葉分化と比較して最小限とみなされる。
本明細書で使用されるとき、「解離した」細胞は、他の細胞から又は表面(例えば、培養プレート表面)から実質的に分離又は精製されている細胞をいう。例えば、細胞は、機械的又は酵素的方法によって動物又は組織から解離され得る。代替的に、インビトロで凝集する細胞は、例えば、クラスタの懸濁液、単一の細胞又は単一の細胞とクラスタの混合物への酵素的又は機械的な解離によって、互いに解離され得る。更に別の代替的な実施形態では、付着細胞は培養プレート又は他の表面から解離される。したがって、解離には、細胞外マトリックス(extracellular matrix、ECM)及び基質(培養面など)との細胞相互作用を破壊すること、又は細胞間のECMを破壊することが含まれる。
本明細書で使用されるとき、「フィーダ細胞」又は「フィーダ」は、第2の型の細胞と共培養されて、第2の型の細胞が増殖、増殖、又は分化できる環境を提供する、1つの型の細胞を表す用語であり、フィーダ細胞は刺激、増殖因子、栄養素を提供し、第2の細胞型を支持する。フィーダ細胞は、それらが支持している細胞とは異なる種に由来してもよい。例えば、幹細胞を含む特定の型のヒト細胞は、マウス胚性線維芽細胞又は不死化マウス胚性線維芽細胞の初代培養によって支持することができる。別の例では、末梢血由来細胞又は形質転換白血病細胞は、ナチュラルキラー細胞の増殖及び成熟を支持する。フィーダ細胞は、他の細胞と共培養されるときに、それらが支持している細胞よりも増殖するのを防ぐために、照射又はマイトマイシンなどの拮抗有糸分裂剤での処理によって、典型的には不活性化され得る。フィーダ細胞は、内皮細胞、間質細胞(例えば、上皮細胞又は線維芽細胞)、及び白血病細胞を含み得る。前述を限定することなく、1つの特定のフィーダ細胞型は、ヒト皮膚線維芽細胞などのヒトフィーダであり得る。別のフィーダ細胞型は、マウス胚性線維芽細胞(mouse embryonic fibroblast、MEF)であり得る。一般に、様々なフィーダ細胞を一部使用して、多能性を維持し、特定の系統に分化を指示し、増殖能力を高め、エフェクター細胞などの特殊化した細胞型への成熟を促進することができる。
本明細書で使用されるとき、「フィーダフリー」(feeder-free、FF)環境とは、フィーダ又は間質細胞を本質的に含まない、及び/又はフィーダ細胞の培養によって前処理されていない、培養条件、細胞培養又は培養培地などの環境を指す。「前処理された」培地とは、フィーダ細胞が培地内で少なくとも1日などの期間培養された後に採取された培地を指す。前処理された培地には、培地で培養されたフィーダ細胞から分泌された増殖因子及びサイトカインを含む、多くのメディエータ物質が含まれる。いくつかの実施形態では、フィーダフリー環境は、フィーダ細胞又は間質細胞の両方を含まず、フィーダ細胞の培養によって前処理もされていない。
iPSC及びそれから分化した由来非多能性細胞のゲノム編集若しくは改変、又は非多能性細胞及びそれからリプログラミングされた由来iPSCのゲノム編集若しくは改変との関連で使用される「機能的」とは、(1)遺伝子レベルでは、ノックイン、ノックアウト、ノックダウン遺伝子発現、直接ゲノム編集若しくは改変によって、又は最初にゲノム操作された出発細胞からの分化若しくはリプログラミングを介した「継代」によって達成される、所望の細胞発生段階での誘導性若しくは一時的発現などのトランスジェニック若しくは制御された遺伝子発現の成功、あるいは(2)細胞レベルでは、(i)直接ゲノム編集を通して当該細胞において得られる遺伝子発現改変、(ii)最初にゲノム操作された出発細胞からの分化若しくはそのリプログラミングを介した「継代」を通して当該細胞において維持される遺伝子発現改変、(iii)当該細胞のより初期の発生段階においてのみ出現するか、又は分化若しくはリプログラミングを介して当該細胞を生じる出発細胞においてのみ出現する遺伝子発現改変の結果としての、当該細胞における下流遺伝子調節、又は(iv)iPSC、前駆体若しくは脱分化した細胞起源で行われたゲノム編集若しくは改変に最初に由来する成熟細胞産物内に示される、増強された若しくは新たに達成された細胞機能若しくは属性による、細胞機能/特質の除去、付加又は改変の成功を指す。
HLAクラスI欠損、若しくはHLAクラスII欠損、又はその両方を含む「又はHLA欠損」とは、HLAクラスIタンパク質ヘテロ二量体及び/又はHLAクラスIIヘテロ二量体を含む完全なMHC複合体の表面発現のレベルが不足している、又はもはや維持されていない、又は低減している細胞を指し、減少又は低減したレベルが、他の細胞又は合成方法によって自然に検出可能なレベルよりも低くなっている。
本明細書で使用されるとき、「改変されたHLA欠損iPSC」は、改善された分化能、抗原標的化、抗原提示、抗体認識、持続性、免疫回避、抑制に対する耐性、増殖、共刺激、サイトカイン刺激、サイトカイン産生(オートクリン又はパラクリン)、走化性、及び細胞傷害性、例えば、非古典的HLAクラスIタンパク質(例えば、HLA-E及びHLA-G)、キメラ抗原受容体(CAR)、T細胞受容体(TCR)、CD16 Fc受容体、BCL11b、NOTCH、RUNX1、IL15、4-1BB、DAP10、DAP12、CD24、CD3ζ、4-1BBL、CD47、CD113、及びPDL1に関連するがこれらに限定されないタンパク質を発現する遺伝子を導入することによって更に改変されるHLA欠損iPSCを指す。「改変されたHLA欠損」の細胞には、iPSC以外の細胞も含まれる。
「リガンド」という用語は、標的分子と複合体を形成して、標的上の部位に結合することによってシグナルを生成する物質を指す。リガンドは、標的(taget)に特異的に結合することができる天然又は人工物質であってもよい。リガンドは、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体複合体、コンジュゲート、核酸、脂質、多糖、単糖、小分子、ナノ粒子、イオン、神経伝達物質、又は標的に特異的に結合することができる任意の他の分子実体の形態であってもよい。リガンドが結合する標的は、タンパク質、核酸、抗原、受容体、タンパク質複合体、又は細胞であり得る。標的に結合してその機能を変化させ、応答を誘発するリガンドは、「アゴニスト(agonistic)」又は「アゴニスト(agonist)」と呼ばれる。標的に結合するが、応答を生じないリガンドは、「拮抗性」又は「アンタゴニスト」である。
「抗体」という用語は、本明細書において最も広い意味で使用され、一般に、目的とする特定の標的に特異的に結合する少なくとも1つの結合部位を含有する分子を指し、標的は、抗原、又はある特定の抗体と相互作用することができる受容体であり得る。例えば、NK細胞は、抗体又は抗体のFc領域のそのFc-ガンマ受容体(Fc-gamma receptor、FcγR)への結合によって活性化され、それによって、ADCC(antibody-dependent cellular cytotoxicity、抗体依存性細胞傷害)媒介性エフェクター細胞活性化を誘発することができる。抗体が結合する抗原若しくは受容体の特定の断片若しくは部分、又は一般に標的は、エピトープ又は抗原決定基として知られている。「抗体」という用語は、天然抗体及びそのバリアント、天然抗体及びそのバリアントの断片、ペプチボディ及びそのバリアント、並びに単鎖抗体及びその断片を含む、抗体又はその特定の断片若しくは部分の構造及び/又は機能を模倣する抗体模倣体を含むが、これらに限定されない。抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダIgG、単一可変新規抗原受容体(variable new antigen receptor、VNAR)、サメ重鎖抗体(Ig-NAR)、キメラ抗体、組換え抗体、単一ドメイン抗体(single-domain antibody、dAb)、抗イディオタイプ抗体、二重特異性、多重特異性、若しくは多量体抗体、又はその断片であってもよい。抗イディオタイプ抗体は、別の抗体のイディオトープへの結合に特異的であり、イディオトープは、抗体の抗原決定基である。二重特異性抗体は、BiTE(二重特異性T細胞エンゲージャ)又はBiKE(二重特異性キラー細胞エンゲージャ)であってもよく、多重特異性抗体は、TriKE(三重特異性キラー細胞エンゲージャ)であってもよい。抗体断片の非限定的な例には、Fab、Fab’、F(ab’)2、F(ab’)3、Fv、Fabc、pFc、Fd、単鎖可変領域断片(scFv)、タンデムscFv(scFv)2、単鎖Fab(single chain Fab、scFab)、ジスルフィド安定化Fv(disulfide stabilized Fv、dsFv)、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片(single-domain antigen binding fragment、sdAb)、ラクダ重鎖IgG及びNanobody(登録商標)断片、組換え重鎖のみ抗体(heavy-chain-only antibody、VHH)、及び抗体全体の結合特異性を維持する他の抗体断片が含まれる。
「Fc受容体」は「FcR」と略され、認識される抗体の種類に基づいて分類される。例えば、最も一般的なクラスの抗体IgGに結合するものはFc-ガンマ受容体(FcγR)と呼ばれ、IgAに結合するものはFc-アルファ受容体(Fc-alpha receptor、FcαR)と呼ばれ、IgEに結合するものはFc-イプシロン受容体(Fc-epsilon receptor、FcεR)と呼ばれる。FcRのクラスは、それらを発現する細胞(マクロファージ、顆粒球、ナチュラルキラー細胞、T及びB細胞)と各受容体のシグナル伝達特性によっても区別される。Fc-ガンマ受容体(FcγR)には、FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、及びFcγRIIIB(CD16b)など、分子構造が異なるために抗体親和性が異なるいくつかのメンバーが含まれる。
FcγR受容体であるCD16には、Fc受容体FcγRIIIa(CD16a)とFcγRIIIb(CD16b)の2つのアイソフォームがあることが確認されている。CD16aは単量体IgGに結合してNK細胞を活性化させ、抗体依存性細胞傷害(ADCC)を促進する、NK細胞によって発現される膜貫通タンパク質である。本明細書で使用されるとき、「高親和性CD16」、「非切断性CD16」、又は「高親和性非切断性CD16(hnCD16)」は、CD16の天然又は非天然バリアントを指す。野生型CD16は親和性が低く、NK細胞が活性化されると、白血球上の様々な細胞表面分子の細胞表面密度を調節するタンパク質分解切断プロセスである外部ドメインシェディングに供される。F176V及びF158Vは、高い親和性を有する例示的なCD16多型バリアントである。膜近位領域(189位~212位)における切断部位(195位~198位)が変更又は排除されたCD16バリアントは、シェディングしない。切断部位及び膜近位領域については、国際公開第2015/148926号(その完全な開示が参照により本明細書に組み込まれる)に詳細に記載されている。CD16のS197Pバリアントは、CD16の非切断性バージョンである。F158VとS197Pの両方を含むCD16バリアントは親和性が高く、非切断性である。別の例示的な高親和性非切断性CD16(hnCD16)バリアントは、CD64外部ドメインの3つのエクソンの1つ以上に由来する外部ドメインを含む操作されたCD16である。
「キメラFc受容体」は「CFcR」と略され、天然の膜貫通及び/若しくは細胞内シグナル伝達ドメインが改変されたか、又は非天然の膜貫通及び/若しくは細胞内シグナル伝達ドメインで置き換えられた操作されたFc受容体を指す。キメラFc受容体のいくつかの実施形態では、膜貫通及びシグナル伝達ドメインの一方又は両方が非天然であることに加えて、1つ以上の刺激ドメインを操作されたFc受容体の細胞内部分に導入して、受容体の誘発による細胞活性化、増殖、及び機能を増強することができる。抗原を標的とする抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)とは異なり、キメラFc受容体は、Fc断片、又は抗体のFc領域、又はエンゲージャ、若しくはリガンド、若しくは結合分子に含まれるFc領域に結合し、標的細胞を近傍に近づけるか、又は近づけなくとも、分子に結合して細胞機能を活性化させる。例えば、Fcγ受容体(Fcγreceptor、FcγR)は、細胞外ドメインでのIgGの結合に応答し、それによりCFcRを生成する細胞内領域において選択された膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、及び/又はシグナル伝達ドメインを含むように操作され得る。一例では、CFcRは、その膜貫通ドメイン及び/又は細胞内ドメインを置き換えることにより、Fcγ受容体であるCD16を操作することによって産生される。CD16ベースのCFcRの結合親和性を更に改善させるために、CD64の細胞外ドメイン又はCD16の高親和性バリアント(例えば、F176V)を組み込むことができる。高親和性CD16細胞外ドメインが含まれるCFcRのいくつかの実施形態では、197位にセリンを含むタンパク質分解性切断部位が除去されているか、又は受容体の細胞外ドメインが切断不可能であるように置き換えられて、すなわち、シェディングされないようになり、これにより、hnCD16ベースのCFcRが取得される。
I.増強された特性を有する養子細胞療法に有用な細胞及び組成物
本明細書において提供されるのは、iPSCから分化した派生細胞の治療特性を増強しながら、iPSCの分化能並びにiPSC及びその派生細胞の細胞発生生物学に影響を与えることなくクローンiPSCの調節回路を体系的に操作する戦略である。いくつかの実施形態では、iPSC由来細胞は機能的に改善されており、選択的モダリティの組み合わせがゲノム操作を通じてiPSCレベルで細胞に導入された後の養子細胞療法に好適である。以前には、提供された1つ以上の遺伝子編集を含む改変されたiPSCが調節された活性を保持しながら依然として細胞発生に入る能力又は成熟して機能的分化細胞を生成する能力を有するかどうかは不明であった。iPSCから指示された細胞分化中の予期しない失敗は、発生段階の特定の遺伝子発現又はその欠如、HLA複合体提示の要件、導入された表面発現モダリティのタンパク質シェディング、及び細胞の表現型及び/又は機能の変化を可能にする分化プロトコルの再構成の必要性を含むがこれらに限定されない側面に起因する。実証されるように、本明細書において提供される選択されたゲノム改変がiPSC分化能に悪影響を及ぼさないこと、並びに操作されたiPSCに由来する機能エフェクター細胞が、iPSC分化後にエフェクター細胞に保持される、個々の又は組み合わせたゲノム改変に起因する増強及び/又は獲得した治療特性を有することを示す。
本明細書において提供されるのは、iPSCから分化した派生細胞の治療特性を増強しながら、iPSCの分化能並びにiPSC及びその派生細胞の細胞発生生物学に影響を与えることなくクローンiPSCの調節回路を体系的に操作する戦略である。いくつかの実施形態では、iPSC由来細胞は機能的に改善されており、選択的モダリティの組み合わせがゲノム操作を通じてiPSCレベルで細胞に導入された後の養子細胞療法に好適である。以前には、提供された1つ以上の遺伝子編集を含む改変されたiPSCが調節された活性を保持しながら依然として細胞発生に入る能力又は成熟して機能的分化細胞を生成する能力を有するかどうかは不明であった。iPSCから指示された細胞分化中の予期しない失敗は、発生段階の特定の遺伝子発現又はその欠如、HLA複合体提示の要件、導入された表面発現モダリティのタンパク質シェディング、及び細胞の表現型及び/又は機能の変化を可能にする分化プロトコルの再構成の必要性を含むがこれらに限定されない側面に起因する。実証されるように、本明細書において提供される選択されたゲノム改変がiPSC分化能に悪影響を及ぼさないこと、並びに操作されたiPSCに由来する機能エフェクター細胞が、iPSC分化後にエフェクター細胞に保持される、個々の又は組み合わせたゲノム改変に起因する増強及び/又は獲得した治療特性を有することを示す。
1.細胞表面CFR(キメラ融合受容体)
本明細書において提供されるCFRの設計は、エフェクター細胞が、CFRを発現するエフェクター細胞の増強された治療特性のために選択されたアゴニストとのCFR結合を介して適切なシグナル伝達カスケードを開始することを可能にする。このような増強されたエフェクター細胞治療特性としては、増加された活性化及び細胞傷害性、獲得された二重標的化能力、延長された持続性、改善された輸送及び腫瘍浸透、腫瘍部位にバイスタンダー免疫細胞をプライミングする、活性化させる又は動員する増強された能力、免疫抑制に抵抗する増強された能力、腫瘍抗原エスケープを救済する改善された能力、並びに/又は制御された細胞シグナル伝達フィードバック、代謝及びアポトーシスが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において提供されるCFRの設計は、エフェクター細胞が、CFRを発現するエフェクター細胞の増強された治療特性のために選択されたアゴニストとのCFR結合を介して適切なシグナル伝達カスケードを開始することを可能にする。このような増強されたエフェクター細胞治療特性としては、増加された活性化及び細胞傷害性、獲得された二重標的化能力、延長された持続性、改善された輸送及び腫瘍浸透、腫瘍部位にバイスタンダー免疫細胞をプライミングする、活性化させる又は動員する増強された能力、免疫抑制に抵抗する増強された能力、腫瘍抗原エスケープを救済する改善された能力、並びに/又は制御された細胞シグナル伝達フィードバック、代謝及びアポトーシスが挙げられるが、これらに限定されない。
したがって、様々な態様では、本発明は、外部ドメインと、膜貫通ドメインと、内部ドメインと、を含む、CFRであって、当該外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び内部ドメインが、いかなる小胞体(ER)保持シグナルもエンドサイトーシスシグナルも含まない、CFRを提供する。CFRの外部ドメインは、エンゲージャに結合するとシグナル伝達を開始するためのものであり、膜貫通ドメインは、CFRの膜固定のためのものであり、内部ドメインは、腫瘍殺傷、持続性、移動性、分化、TMEの打ち消し、及び/又は制御されたアポトーシスを含むがこれらに限定されない細胞治療特性を増強するために選択されるシグナル伝達経路を調節する(すなわち、活性化又は不活性化させる)少なくとも1つのシグナル伝達ドメインを含む。CFRからのER保持シグナルの排除は、発現された場合に、それ自体によるCFR細胞表面提示を可能にし、CFRからのエンドサイトーシスシグナルの排除は、CFR内在化及び表面下方制御を減少させる。ER保持もエンドサイトーシスシグナルも有しないドメイン成分を選択するか、又は分子工学ツールを用いてCFRの選択された成分からER保持若しくはエンドサイトーシスシグナルを除去することが重要である。加えて、本明細書におけるいくつかの実施形態によって提供されるCFRのドメインはモジュール式であり、これは、CFRの所与の内部ドメインについては、CFRの外部ドメインが、当該CFRとともに使用される選択されたアゴニスト、例えば抗体、BiTE、TRiKE、又は任意の他のタイプのエンゲージャの結合特異性に応じて切り替え可能であり、所与の外部ドメイン及び特異性マッチングアゴニストについては、内部ドメインが、活性化される所望のシグナル伝達経路に応じて切り替え可能であることを意味する。加えて、いくつかの実施形態による膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインが小胞体(ER)保持シグナルもエンドサイトーシスシグナルも含まない限り、所与の外部ドメイン及び/又は所与の内部ドメインについて切り替え可能である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるCFRの外部ドメインは、細胞-細胞シグナル伝達又は相互作用に関与するタンパク質の細胞外部分の全長又は部分長を含む。いくつかの実施形態では、CFRの外部ドメインは、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD28、CD5、CD16、CD64、CD32、CD33、CD89、NKG2C、NKG2D、又はそれらの任意の機能的バリアント、若しくは組み合わせ及びキメラの細胞外部分の全長又は部分長を含む。いくつかの実施形態では、CFRの外部ドメインは、少なくともアゴニスト、例えば、当該CFRの外部ドメインに含まれるエピトープに特異的な結合ドメインを含む抗体又はエンゲージャ(例えば、BiTE、BiKE又はTriKE)によって認識される。いくつかの実施形態では、CFR発現細胞とともに使用される抗体又はエンゲージャは、当該CFRの少なくとも1つの細胞外エピトープに結合し、CFRは、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD28、CD5、CD16、CD64、CD32、CD33、CD89、NKG2C、NKG2D、又はそれらの任意の機能的バリアント若しくは組み合わせた/キメラ形態の細胞外部分の全長又は部分長を含む。いくつかの実施形態では、エンゲージャは、B7H3、BCMA、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、PSMA、PAMA、P-カドヘリン、若しくはROR1を含む少なくとも1つの腫瘍抗原を認識する。CFR外部ドメインの特定の実施形態では、ER保持シグナル及びエンドサイトーシスシグナルの両方が存在しないか、又は遺伝子操作法を使用してCFR外部ドメインから除去若しくは排除される。
いくつかの実施形態では、CFRの外部ドメインは、CD3ベースのアゴニストを利用するために、CD3ε、CD3γ、CD3δ又はそれらの任意の機能的バリアント若しくは組み合わせ/キメラ形態の細胞外部分の全長又は部分長を含む。抗体又はエンゲージャを含むがこれらに限定されない非限定的な例示的CD3ベースのアゴニストは、CD3×CD19、CD3×CD20、CD3×CD33、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、エルツマキソマブ、RO6958688、AFM11、MT110/AMG110、MT111/AMG211/MEDI-565、AMG330、MT112/BAY2010112、MOR209/ES414、MGD006/S80880、MGD007、及び/又はFBTA05を含む。いくつかの実施形態では、CFRの外部ドメインは、NKG2Cベースのアゴニストを利用するために、NKG2C若しくはその任意の機能的バリアントの細胞外部分の全長又は部分長を含む。抗体又はエンゲージャを含むがこれらに限定されない非限定的な例示的なNKG2Cベースのアゴニストは、NKG2C-IL15-CD33、NKG2C-IL15-CD19、及び/又はNKG2C-IL15-CD20三重特異性エンゲージャを含む。いくつかの他の実施形態では、CFRの外部ドメインは、CD28ベースのアゴニストを利用するために、CD28若しくはその任意の機能的バリアントの細胞外部分の全長又は部分長を含む。抗体又はエンゲージャを含むがこれらに限定されない非限定的な例示的なCD28ベースのアゴニストは、15E8、CD28.2、CD28.6、YTH913.12、37.51、9D7(TGN1412)、5.11A1、ANC28.1/5D10、及び/又は37407のうちの少なくとも1つを含む。
いくつかの実施形態では、CFRの外部ドメインは、CD16又はCD64ベースのアゴニストを利用するために、CD16、CD64、又はそれらの任意の機能的バリアント若しくは組み合わせ/キメラ形態の細胞外部分の全長又は部分長を含む。抗体又はエンゲージャを含むがこれらに限定されない非限定的な例示的なCD16又はCD64ベースのアゴニストは、IgG抗体、又はCD16若しくはCD64ベースのエンゲージャを含む。IgG抗体のFc部分がCD16又はCD64ベースのCFRに結合すると、それは、CFRの内部ドメインに含まれるシグナル伝達ドメインによって付与される他の増強された治療特性とともに、CFR発現細胞における抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を活性化させる。非限定的な例示的なCD16又はCD64ベースのアゴニスト(抗体又はエンゲージャが挙げられるが、これらに限定されない)は、CD16×CD30、CD64×CD30、CD16×BCMA、CD64×BCMA、CD16-IL-EPCAM若しくはCD64-IL-EPCAM、CD16-IL-CD33、又はCD64-IL-CD33のうちの少なくとも1つを含み、TriKEに含まれる「IL」は、IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21、又はそれらの任意の機能的バリアント若しくは組み合わせ/キメラ形態を含む少なくとも1つのサイトカインの全部又は一部分を含む。
一般に、膜貫通ドメインは、生体膜(例えば、細胞又は細胞小胞の膜)のリン脂質二重層などの膜において熱力学的に安定である三次元タンパク質構造である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のCFRの膜貫通ドメインは、単一のアルファヘリックス、いくつかの膜貫通アルファヘリックスの安定な複合体、膜貫通ベータバレル、グラミシジンAのベータヘリックス、又はそれらの任意の組み合わせを含む。様々な実施形態では、CFRの膜貫通ドメインは、膜内にある「膜貫通タンパク質」又は「膜タンパク質」の全部又は一部分を含む。本明細書で使用されるとき、「膜貫通タンパク質」又は「膜タンパク質」は、膜に及び/又は膜内に位置するタンパク質である。本発明のCFRに含まれる膜貫通ドメインを提供するのに好適な膜貫通タンパク質の例としては、受容体、リガンド、免疫グロブリン、グリコホリン、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、CFRに含まれる膜貫通ドメインは、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD137、CD166、FcεRIγ、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、T細胞受容体(例えば、TCRα及び/又はTCRβ)、ニコチン性アセチルコリン受容体、GABA受容体、又はそれらの組み合わせの膜貫通ドメインの全部又は一部分を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、IgG、IgA、IgM、IgE、IgD、又はそれらの組み合わせの膜貫通ドメインの全部又は一部分を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、グリコホリンA、グリコホリンD、又はそれらの組み合わせの膜貫通ドメインの全部又は一部分を含む。CFR膜貫通ドメインの特定の実施形態では、ER保持シグナル及びエンドサイトーシスシグナルの両方が存在しないか、又は遺伝子操作を使用して除去される。様々な実施形態では、ER保持シグナル及びエンドサイトーシスシグナルの両方が存在しないか、又は遺伝子操作法を使用してCFR膜貫通ドメインから除去若しくは排除される。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、CD3ε、CD28、CD27、CD8、ICOS、又はCD4の膜貫通ドメインの全部又は一部分を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のCFRの内部ドメインは、選択された細胞内シグナル伝達経路を活性化する少なくとも1つのシグナル伝達ドメインを含む。CFR内部ドメインの様々な実施形態では、ER保持シグナル及びエンドサイトーシスシグナルの両方が存在しないか、又は遺伝子操作法を使用してそれから除去若しくは排除される。いくつかの実施形態では、内部ドメインは、少なくとも細胞傷害性ドメインを含む。いくつかの他の実施形態では、内部ドメインは、必要に応じて、細胞傷害性ドメインに加えて、共刺激ドメイン、持続性シグナル伝達ドメイン、死誘導シグナル伝達ドメイン、腫瘍細胞制御シグナル伝達ドメイン、又はそれらの任意の組み合わせのうちの1つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、CFRの細胞傷害性ドメインは、CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(4-1BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、又はNKG2Dのポリペプチドの少なくとも全長又は一部分を含む。一実施形態では、CFRの細胞傷害性ドメインは、CD3ζの少なくとも1つのITAM(immunoreceptor tyrosine-based activation motif、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ)に対して、少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、又は約99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、CFRの細胞傷害性ドメインは、配列番号35に対して、少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、又は約99%の同一性を有するアミノ酸配列によって表される改変CD3ζを含む。
いくつかの実施形態では、CFRは、細胞傷害性シグナル伝達ドメインに加えて共刺激ドメインを更に含む内部ドメインを含む。CFRでの使用に好適な共刺激ドメインは、CD2、CD27、CD28、CD40L、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4、若しくはNKG2D、又はそれらの任意の組み合わせのポリペプチドの全長又は少なくとも一部分を含むが、これらに限定されない。CFRのいくつかの実施形態では、その共刺激ドメインは、CD28、4-1BB、CD27、CD40L、ICOS、CD2、若しくはそれらの組み合わせのポリペプチドの全長又は少なくとも一部分を含む。いくつかの実施形態では、CFRは、CD28の共刺激ドメインと、CD3ζ(「28ζ」とも称される)の細胞傷害性ドメインと、を含む内部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、CFRの内部ドメインの-CD28-CD3ζ部分は、配列番号13に対して、少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、又は約99%の同一性を有するアミノ酸配列によって表される。
いくつかの実施形態において、CFRは、細胞傷害性シグナル伝達ドメイン及び/又は共刺激ドメインに加えて、持続性シグナル伝達ドメインを更に含む内部ドメインを含む。CFRでの使用に好適な持続性シグナル伝達ドメインとしては、IL2R、IL7R、IL15R、IL18R、IL12R、IL23R、又はそれらの組み合わせなどのサイトカイン受容体の内部ドメインの全部又は一部が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、EGFRなどの受容体チロシンキナーゼ(RTK)の内部ドメインは、腫瘍細胞制御を提供するか、又はFASなどの腫瘍壊死因子受容体(tumor necrosis factor receptor、TNFR)は、制御された細胞死を提供する。
図1は、説明のために、いくつかの例示的なCFRを含む。例示的なCFRの各々は、例えば、配列番号25、配列番号26、配列番号27、及び配列番号46と少なくとも約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、又は約99%同一のアミノ酸配列によってそれぞれ表される、CD3サブユニット-CD3ε、CD3δ、又はCD3γ、又はCD28の少なくとも1つの細胞外部分と、配列番号47、配列番号48、及び配列番号49と少なくとも約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、又は約99%同一のアミノ酸配列によってそれぞれ表される、CD28、CD8、又はCD4の膜貫通ドメインと、外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び/又は内部ドメイン中のER保持モチーフ及び/又はエンドサイトーシスモチーフが排除された、CD3ε、CD3γ、CD3δ、又はCD28の内部ドメインと、をそれぞれ含む。例えば、CD3ε野生型内部ドメイン配列(配列番号50)へのR183S変異の導入は、ER保持モチーフを排除し、配列番号51と少なくとも約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、又は約99%同一のアミノ酸配列によって表されるCD3ε内部ドメインバリアントをもたらす。CD3δ野生型内部ドメイン配列(配列番号52)へのL142A及びR169A変異の導入は、WT配列からエンドサイトーシスモチーフ及びER保持モチーフを排除し、配列番号53と少なくとも約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、又は約99%同一のアミノ酸配列によって表されるCD3δ内部ドメインバリアントをもたらす。更に、CD3γ野生型内部ドメイン配列(配列番号54)へのL131A及びR158A突然変異の導入は、WT配列からER保持モチーフを排除し、配列番号55と少なくとも約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、又は約99%同一のアミノ酸配列によって表されるCD3γ内部ドメインバリアントをもたらす。いくつかの実施形態では、CD28野生型内部ドメインは、ER保持モチーフもエンドサイトーシスモチーフも有さず、配列番号56と少なくとも約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、又は約99%同一のアミノ酸配列によって表される。本明細書において提供されるCFRの様々な実施形態は、CFR外部ドメインのN末端にシグナルペプチドを更に含む。非限定的な例示的シグナルペプチドとしては、配列番号28、配列番号29、配列番号30、又は配列番号57と少なくとも約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、又は約99%同一のアミノ酸配列によって表されるものが挙げられる。
いくつかの例示的な設計では、CFRは、1つのCD3サブユニットの外部ドメインを含み、いくつかの他の設計では、CFRは、CD3δ又はCD3γ(それぞれ、配列番号58又は配列番号59)の外部ドメインと連結されたCD3εの外部ドメインを含む単鎖ヘテロ二量体外部ドメインを含む。単鎖ヘテロ二量体外部ドメインにおけるリンカーのタイプ及び長さは、様々であり得る。
本明細書に記載される様々な構築物中の細胞表面発現CFR(以下に更に記載されるように、cs-CD3とも呼ばれる、CD3ベースのCFRを含む)は、選択された結合特異性を有する分子と結合するための細胞表面トリガー受容体として機能することができ、この分子には、抗体、エンゲージャ、及び/又はCAR(キメラ抗原受容体)が含まれる。本発明の1つ以上のCFRをコードするポリヌクレオチドを含む細胞は、ヒト細胞及び非ヒト細胞、多能性細胞若しくは非多能性細胞、免疫細胞若しくは免疫調節細胞、APC(antigen presenting cell、抗原提示細胞)若しくはフィーダ細胞、初代供給源(例えば、PMBC)由来の細胞、又は培養若しくは操作された細胞(例えば、細胞株、細胞、及び/又はiPSCから分化した派生細胞)由来の細胞を含む、任意のタイプの細胞であり得る。いくつかの実施形態では、1つ以上のCFRをコードするポリヌクレオチドを含む細胞は、初代若しくは派生CD34細胞、造血幹前駆細胞、造血多能性前駆細胞、T細胞前駆体、NK細胞前駆体、T系統細胞、NKT系統細胞、NK系統細胞、又はB系統細胞を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上のCFRをコードするポリヌクレオチドを含む派生細胞は、1つ以上のCFRをコードするポリヌクレオチドを含むiPSCを分化させることによって得られるエフェクター細胞である。いくつかの実施形態では、1つ以上のCFRをコードするポリヌクレオチドを含む派生エフェクター細胞は、iPSCから派生エフェクター細胞を生成した後に1つ以上のCFRを組み込むように派生エフェクター細胞を操作することによって得られる。
更に提供されるように、1つ以上のCFRをコードするポリヌクレオチドを含む細胞又はその集団は、TCRノックアウト、CD16ノックイン、CAR、細胞表面発現外因性サイトカイン及び/又はその受容体の部分的又は完全なペプチド、B2Mノックアウト又はノックダウン(例えば、HLA-I欠損をもたらすため)、CIITAノックアウト又はノックダウン(例えば、HLA-II欠損をもたらすため)、HLA-G又は非切断性HLA-Gの導入、CD38ノックアウト、及び追加の操作されたモダリティ、のうちの1つ以上を更に含み得る。本出願において更に提供されるのは、CFR、TCRneg、CD16、CAR、CD38陰性、外因性サイトカイン又はその融合バリアント、B2M-/-、CIITA-/-、HLA-G、及びそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、本明細書において提供されるような少なくとも1つの表現型を有するソーティングされた単一細胞及び増殖されたクローン操作iPSCを含むマスター細胞バンクであり、この細胞バンクは、更なるiPSC操作のためのプラットフォームと、組成が明確かつ均一であり、費用効果の高い様式で大規模に大量生産することができる、既製の操作された均質なエフェクター細胞を製造するための再生可能な供給源と、を提供する。
2.CD3再構成/表面提示を達成するための設計
アルファ-ベータT細胞受容体(TCRαβ)は、免疫応答に必須の抗原特異的受容体であり、αβTリンパ球の細胞表面に存在する。ペプチド-主要組織適合性複合体(peptide-major histocompatibility complex、pMHC)へのTCRαβの結合は、TCR-CD3細胞内活性化、多数のシグナル伝達分子の動員、並びにシグナル伝達経路の分岐及び統合を開始し、遺伝子発現並びにT細胞増殖及び機能獲得に重要な転写因子の動員をもたらす。T細胞の直接編集によって、又は改変された派生T系統細胞を得るための供給源としてのゲノムiPSC編集及び分化によってのいずれかで、TCRアルファ又はTCRベータの定常領域(TRAC又はTRBC)を破壊することは、TCRnegT細胞を産生するためのアプローチのうちの1つである。TCRnegT細胞は、同種異系養子細胞療法において使用される場合、アロ反応性が減少し、GvHD(移植片対宿主病(Graft versus Host Disease))を予防することができる。
アルファ-ベータT細胞受容体(TCRαβ)は、免疫応答に必須の抗原特異的受容体であり、αβTリンパ球の細胞表面に存在する。ペプチド-主要組織適合性複合体(peptide-major histocompatibility complex、pMHC)へのTCRαβの結合は、TCR-CD3細胞内活性化、多数のシグナル伝達分子の動員、並びにシグナル伝達経路の分岐及び統合を開始し、遺伝子発現並びにT細胞増殖及び機能獲得に重要な転写因子の動員をもたらす。T細胞の直接編集によって、又は改変された派生T系統細胞を得るための供給源としてのゲノムiPSC編集及び分化によってのいずれかで、TCRアルファ又はTCRベータの定常領域(TRAC又はTRBC)を破壊することは、TCRnegT細胞を産生するためのアプローチのうちの1つである。TCRnegT細胞は、同種異系養子細胞療法において使用される場合、アロ反応性が減少し、GvHD(移植片対宿主病(Graft versus Host Disease))を予防することができる。
しかしながら、TCR破壊はまた、細胞内での内因性CD3サブユニット遺伝子発現にもかかわらず、T細胞表面からのCD3シグナル伝達複合体の排除をもたらすことが見出されている。細胞表面CD3の欠如は、細胞表面CD3認識及び結合を必要とする技術(CD3ベースの抗体及びエンゲージャ技術、CD3/CD28 T細胞活性化ビーズ技術、並びにCD3-CAR刺激技術を含むが、これらに限定されない)との不適合性に起因して、細胞の増殖及び/又は生存の能力を変化させ、細胞の機能的潜在能力を低下させ得る。更に、TCRnegiPSCが指向性T細胞分化のために使用される場合、T細胞発生生物学及びT細胞機能成熟に対する望ましくない影響も存在し得る。しかしながら、TCR陰性である細胞におけるCD3の過剰発現は、CD3複合体の細胞表面提示及び/又はCD3シグナル伝達を回復しないようである。TCR遺伝子の存在にもかかわらずCD3及び/又はTCRを発現しない細胞、例えば、NK又はNK前駆細胞に関して、獲得された表面CD3発現は、これらの細胞と自然に適合しなかったであろうCD3ベースの抗体、エンゲージャ及びCAR技術により、NK系統細胞における特異的シグナル伝達及び細胞機能を可能にする。
上記で提供されるCD3ベースのCFR設計は、TCR及び表面発現CD3の不在下でのCD3再構成/表面提示に対処するために使用することができるアプローチのうちの1つであり、したがって、本出願全体を通して使用される「細胞表面提示CD3(cs-CD3)」又は「細胞表面CD3複合体、又はその1つ以上のサブユニット若しくはサブドメイン」という用語は、本明細書において提供されるCD3ベースのCFR設計を含む。加えて、図2A~図2Cに示すような以下の設計も、細胞表面提示CD3(cs-CD3)を得るための代替的な実施形態として提供される。
設計1:非結合組換えTCR(non-binding Recombinant TCR、nb-rTCR)
図2Aに示すように、設計1では、標的化ゲノム編集ツールを使用して、細胞内の内因性TCRαがノックアウトされ(TCRα-/-)、TCR陰性(TCRneg)をもたらすが、TCRβのノックアウト(TCRβ-/-)は必要に応じてであり、逆もまた同様である。一方、標的化ゲノム編集ツールを使用して、細胞内の内因性TCRβがノックアウトされ(TCRβ-/-)、TCR陰性(TCRneg)をもたらすが、TCRαのノックアウト(TCRα-/-)は必要に応じてである。TCRαノックアウトを含む実施形態では、TCRαの定常領域(トランスジェニックTRAC、又はtgTRAC)の全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドが、続いて細胞に導入されるか、又は標的化されたTRACノックアウトの際にTRACに組み込まれ、ポリヌクレオチドの発現が、TCRαの内因性プロモータによって、又は代替的に、ポリヌクレオチドに作動可能に連結された外因性プロモータによって駆動される。いくつかの実施形態において、TCRαの定常領域の全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドは、TCRαの定常領域の全長又は部分長とカップリングされた適切なN末端シグナルペプチドを更に含む。内因性TCRβ(TCRβ-/-)がノックアウトされている実施形態では、TCRβ、(tgTCRβ、又はtgTRBC)の定常領域の全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドが細胞に導入され、tgTCRβ又はtgTRBCの発現が、TCRβの内因性プロモータによって、又は代替的に、外因性プロモータによって駆動される。いくつかの実施形態において、TCRβの定常領域の全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドは、TCRβの定常領域の全長又は部分長とカップリングされた適切なN末端シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、外因性プロモータは、構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、又は細胞型特異的プロモータを含む。いくつかの実施形態では、外因性プロモータは、CMV、EF1α、PGK、CAG、及びUBCのうちの1つを含む。一実施形態では、外因性プロモータは、少なくともCAGを含む。
いくつかの実施形態では、完全又は部分的なTCRα定常領域(tgTRAC)をコードするポリヌクレオチドは、例示的な配列である配列番号1と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも完全又は部分的な定常領域(tgTRBC)を含むTCRβをコードするポリヌクレオチドは、例示的な配列である配列番号2又は配列番号3と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。N末端シグナルペプチド及びTCRα又はTCRβ定常領域の全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドとTCR定常領域に関連する配列との間にリンカーペプチドを更に含む。N末端シグナルペプチド及びTCRα又はTCRβ定常領域の全長をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、C末端にポリAテールを更に含む。N末端シグナルペプチド及びTCRα又はTCRβ定常領域の部分長をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの組み込みは、内因性定常領域(例えば、エクソン)内の部位においてであり、インフレームである、すなわち、組み込み部位の下流のTCRα又はTCRβ定常領域の残りの内因性配列とインフレームであり、その結果、全長トランスジェニック/キメラTRAC又はTRBCは、その配列の一部が外因性/トランスジェニックであり、別の部分が内因性であるように形成される。設計1のいくつかの実施形態では、内因性TCRα及びTCRβのうちの少なくとも1つは、発現されたときにそれぞれのトランスジェニック定常領域を細胞表面に提示しながら、それぞれの可変領域を本質的に除去するように操作される。いくつかの実施形態では、内因性TCRα及びTCRβの一方のみが、細胞表面にトランスジェニック定常領域及び野生型TCRサブユニット(TCRα又はTCRβ)を提示しながら、関連する可変領域を本質的に除去するように操作される。いくつかの実施形態において、内因性TCRα及びTCRβの両方は、発現されたときに両方のトランスジェニック定常領域を細胞表面に提示しながら、それぞれの可変領域を除去するように、提供されるように操作される。例示的なN末端シグナルペプチドとしては、MALPVTALLLPLALLLHA(配列番号4、CD8a sp)又はMDFQVQIFSFLLISASVIMSR(配列番号5、IgK sp)、又は当該技術分野で既知の任意のシグナルペプチド配列若しくはその機能的バリアントを含む。例示的なリンカーペプチドとしては、DYKDDDDK(配列番号6、FLAG)、又は当該技術分野で既知の任意のリンカーペプチド配列若しくはその機能的バリアントを含む。
本明細書で実証されるように、tgTRAC又はtgTRBCのいずれかのTCRサブユニットのトランスジェニック定常領域は、他方のTCRサブユニット(内因性/野生型又はトランスジェニック、トランスジェニックの場合、そのそれぞれの可変領域の有無にかかわらず)及び内因性CD3サブユニットと会合することによって組換えTCR(rTCR)を形成することができるが、抗原認識に関与するTCRα又はTCRβ可変領域が欠如しているためにペプチド-MHC結合を可能にしないことが発見された。得られた細胞は、細胞表面提示されたCD3(cs-CD3)複合体を介して正規のTCR/CD3シグナル伝達を回復するが、内因性TCRノックアウト及びTCRα可変領域を有しないrTCRによるアロ反応性を有しない。したがって、設計1を考慮して、本明細書において提供されるのは、細胞又はその集団であって、当該細胞が、iPSC、クローンiPSC、クローンiPS細胞株細胞、又は当該iPSCを分化させることから得られる派生細胞であり、当該細胞が、内因性TCRがノックアウトされる(TCRneg)ような内因性TCRα定常領域及びTCRβ定常領域のうちの少なくとも1つにおける破壊と、破壊されたTCRα(tgTRAC)及び/又はTCRβ(tgTRBC)の定常領域をコードする一方又は両方の外因性ポリヌクレオチドと、を含み、tgTRAC及び/又はtgTRBCが、発現されたときに内因性CD3(cs-CD3)の細胞表面提示を可能にする、細胞又はその集団である。tgTRAC及びtgTRBCのうちの少なくとも1つを含む組換えTCR複合体は、TCRサブユニットの両方の可変領域(Vα及びVβ)を有しないため、MHCによって提示される抗原ペプチドに結合せず、したがって、非結合組換えTCR(nb-rTCR)と呼ばれる。
設計2:定義された組換えTCR(defined recombinant TCR、d-rTCR)
図2Aに示されるように、設計2では、ゲノム編集ツールを使用して、細胞内で内因性TCRα及び内因性TCRβの両方をノックアウト(TCRα-/-及びTCRβ-/-、又はTCRαneg TCRβneg)して、TCRneg細胞をもたらす。TCRノックアウトと同時に、又はそれに続いて、TCRαの定義された可変領域及び完全又は部分的な定常領域(tgTCRα)を含むTCRαをコードする第1のポリヌクレオチドと、TCRβの定義された可変領域及び完全又は部分的な定常領域(tgTCRβ)を含むTCRβをコードする第2のポリヌクレオチドとが、TCRnegに導入される。定義されたTCRα又はTCRβ可変領域は、その配列が同定されているか、又は同定され得るような任意の所与の特異性のものであり得る。いくつかの実施形態では、第1及び第2のポリヌクレオチドの一方又は両方は、それぞれTCRα及びTCRβの内因性プロモータによって駆動される。いくつかの他の実施形態では、第1及び第2のポリヌクレオチドの一方又は両方は、外因性プロモータによって駆動される。いくつかの実施形態では、第2のポリヌクレオチドは、TCRβの内因性プロモータによって駆動されるが、いくつかの他の実施形態では、第2のポリヌクレオチドは、外因性プロモータによって駆動される。いくつかの実施形態では、外因性プロモータは、構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、又は細胞型特異的プロモータを含む。いくつかの実施形態では、外因性プロモータは、CMV、EF1α、PGK、CAG、又はUBCのうちの1つを含む。一実施形態では、外因性プロモータは、少なくともCAGを含む。いくつかの実施形態では、TCRα定常領域の全長又は部分長及び所与の定義された可変領域をコードするポリヌクレオチドは、例示的な配列である配列番号1と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、TCRβ定常領域の全長又は部分長及び所与の定義された可変領域をコードするポリヌクレオチドは、例示的な配列である配列番号2又は配列番号3と比較した場合に、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも80%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも90%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも95%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、100%である。TCRα又はTCRβ定常領域の全長をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、C末端にポリAテールを更に含む。TCRα又はTCRβ定常領域の部分長をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの組み込みは、内因性定常領域内の部位においてであり、インフレームである、すなわち、組み込み部位の下流のTCRα又はTCRβ定常領域の残りの内因性配列とインフレームであり、その結果、全長トランスジェニック/キメラTRAC又はTRBCは、その配列の一部が外因性/トランスジェニックであり、別の部分が内因性であるように形成される。TCRα又はTCRβ可変領域の配列は、例えば、Universal Protein Resource(UniProt)データベースに見出すことができ、いくつかの非限定的な例示的な定義されたTCRα又はTCRβ可変領域を、それぞれ以下の表A及びBに列挙する。
NKT細胞は、αβTCRも発現するT細胞のサブセットであるが、NKT細胞のTCRが正規のインバリアントTCRα鎖(ヒトにおけるVα24-Jα18)及び限定されたVβセグメント(ヒトにおけるVβ11)を使用するTCRβ鎖から構成されるという点で従来のαβT細胞とは異なり、多様性が限定されており、CD1dによって提示される限られた数の脂質抗原を認識する。正規のインバリアントTCRα鎖(ヒトにおけるVα24-Jα18、又はiTCRα)及び限られたVβセグメント(ヒトにおけるVβ11、又はiTCRβ)を使用するTCRβ鎖の発現は、高度に保存されたTCR及びCD1d依存性抗原提示をもたらす。インバリアントNKTのTCR(iTCR又はiTCRαβ)のこの特性を利用するために、設計2のいくつかの実施形態では、定義されたTCRは、インバリアントNKT細胞のTCRα及びTCRβ(iTCRα又はiTCRαβ)のいずれか又は両方を含み、その結果、TCRα定常領域及び所与の定義された可変領域の全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドは、例示的配列である配列番号44と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を少なくとも含み、TCRβ定常領域及び所与の定義された可変領域の全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドは、例示的配列である配列番号45と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも80%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも90%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも95%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、100%である。
本明細書中で更に実証されるように、定常領域及び定義された可変領域を有するトランスジェニックTCRα(tgTCRα)は、必要に応じて定常領域及び定義された可変領域を有するトランスジェニックTCRβ(tgTCRβ)とともに、tgTCRα及びtgTCRβの可変領域の特異性に起因して定義されたペプチド-MHC結合を有するか又は有しない一方で、CD3ζ鎖を含む内因性CD3サブユニットと会合することによって、組換えTCR複合体(rTCR)を形成し得ることが発見される。定義された組換えTCRのためのトランスジェニックTCRサブユニットの遺伝子操作に加えて、インバリアントNKT細胞のTCRα及びTCRβを利用するための他のアプローチは、本明細書に開示されるリプログラミング及び分化組成物並びに方法を使用して、単離されたNKT細胞をiPSCにリプログラミングすること、及びiPSCを由来T細胞に分化させることを含み、この由来T細胞は、結果として、インバリアントNKT細胞のTCRα及びTCRβ(iTCRα、iTCRβ;及びiTCR、複合体)を含む。遺伝子操作されたiPSC又はiNKTリプログラミングiPSCから分化した、得られた細胞は、細胞表面提示CD3(cs-CD3)を介して正規のTCR/CD3シグナル伝達を回復するが、MHC結合特異性を有しないか、又は既知の定義されたMHC結合特異性を有する。したがって、設計2を考慮して、本明細書において提供されるのは、細胞又はその集団であって、当該細胞が、iPSC、クローンiPSC、クローンiPS細胞株、又はiPSCを分化させることから得られた派生細胞であり、当該細胞が、内因性TCRα及び内因性TCRβの各々における破壊、完全又は部分的な定常領域及び定義された可変領域を有するtgTCRαをコードする外因性ポリヌクレオチド、並びに完全又は部分的な定常領域及び定義された可変領域を有するtgTCRβをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、内因性CD3分子が、発現されると細胞表面に存在する(cs-CD3)、細胞又はその集団である。
設計3:必要に応じた非結合TCRβを有する組換えプレTCRα(p-rTCR)
プレ-TCRαは、T細胞発生の初期段階である未成熟胸腺細胞において発生的に制御される遺伝子によってコードされるI型膜貫通受容体タンパク質である。プレTCRαは、TCRβ及びCD3サブユニットと共有結合して、プレTCR複合体を形成する。プレ-TCRαは、他の構造的及び機能的差異の中でも、TCRα鎖と比較して比較的長い細胞質尾部を有する。図2Aに提示されるように、この設計3では、TCR陰性細胞は、ゲノム編集ツールを使用して少なくとも内因性TCRαがノックアウトされており(TCRneg)、内因性TCRβのノックアウトは必要に応じてである。TCRノックアウトと同時に又はその後に、プレTCRα(tgpTCRα)の全長又は部分長をコードする第1のポリヌクレオチドをTCRneg細胞に導入する。TCRnegがTCRβノックアウトを更に含むいくつかの実施形態では、所与の定義された可変領域(tgTCRβ又はtgTRBC)を有するか又は有しない完全又は部分的なTCRβ定常領域をコードする第2のポリヌクレオチドが、TCRneg細胞に導入され、当該細胞は、初期段階の未熟胸腺細胞ではない。いくつかの実施形態では、TCRα又はTCRβ定常領域の全長をコードするポリヌクレオチドは、C末端にポリAテールを更に含む。TCRα又はTCRβ定常領域の部分長をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの組み込みは、内因性定常領域内の部位においてであり、インフレームである、すなわち、組み込み部位の下流のTCRα又はTCRβ定常領域の残りの内因性配列とインフレームであり、その結果、全長トランスジェニック/キメラTRAC又はTRBCは、その配列の一部が外因性/トランスジェニックであり、別の部分が内因性であるように形成される。
いくつかの実施形態では、プレTCRα(tgpTCRα)の全長又は部分長をコードする第1のポリヌクレオチドは、組み込み時にTCRαの内因性プロモータに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、プレTCRα(tgpTCRα)の全長又は部分長をコードする第1のポリヌクレオチドは、外因性プロモータによって駆動される。いくつかの実施形態では、所与の定義された可変領域を有するか又は有しない完全又は部分的なTCRβ定常領域をコードする第2のポリヌクレオチドは、組み込み時にTCRβの内因性プロモータに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、所与の定義された可変領域を有するか又は有しない完全又は部分的なTCRβ定常領域をコードする第2のポリヌクレオチドは、外因性プロモータによって駆動される。いくつかの実施形態では、外因性プロモータは、構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、又は細胞型特異的プロモータを含む。いくつかの実施形態では、外因性プロモータは、CMV、EF1α、PGK、CAG、又はUBCのうちの1つを含む。一実施形態では、外因性プロモータは、少なくともCAGを含む。いくつかの実施形態では、tgpTCRαをコードするポリヌクレオチドは、例示的な配列である配列番号23と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも80%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも90%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも95%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、100%である。いくつかの実施形態では、tgpTCRαをコードするポリヌクレオチドは、本明細書において配列番号24として表される、配列番号23の部分長を含む。配列番号23の全長若しくは部分長、又はその任意の機能的バリアントを含むtgpTCRαをコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、コードされるtgpTCRαは、当該技術分野で既知のシグナルペプチドを更に含む。1つの非限定的な例示的シグナルペプチドは、配列番号22によって表されるペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、完全又は部分的な定常領域及び所与の定義された可変領域を含むTCRβをコードするポリヌクレオチドは、例示的な配列である配列番号2又は配列番号3と比較した場合に、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも80%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも90%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも95%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、100%である。定義されたTCRβ可変領域は、その配列が同定されているか、又は同定され得るような任意の所与の特異性のものであり得る。非限定的な定義されたTCRβ可変領域は、上記の表Bに例示されており、配列番号45(下線部分)に含まれる。
その天然プロモータ(すなわち、プレTCRαプロモータ)とは異なるプロモータ(外因性プロモータであれ内因性TCRαプロモータであれ)によって制御されるプレTCRα発現を有するiPSCが、機能的エフェクターT細胞に分化する能力を依然として有するかどうかは、以前には知られていなかった。本明細書において実証されるように、非天然プロモータによって制御されるトランスジェニックプレTCRα(tgpTCRα)を含むiPSCの細胞増殖生物学は、機能的T細胞を生成するためにiPSC由来T細胞への指向性分化を実施することができる程度まで維持することができる。通常、内因性プレTCRの発現は発生的に調節されるので、これは驚くべきことである。また、tgpTCRαTCRneg iPSC由来のT細胞は、CD3ζ鎖を含む内因性CD3サブユニットと会合して発現された表面組換えプレTCR複合体(rpTCR)を含むが、ペプチド-MHC結合能力を有しない。理論によって限定されるものではないが、それにもかかわらず、トランスジェニックプレTCR/CD3複合体は、細胞表面提示CD3(cs-CD3)複合体を介した正規のCD3シグナル伝達を通じてiPSC由来T細胞成熟を駆動した可能性がある。上記を考慮して、本発明の実施形態はまた、内因性プレTCRαを上方調節する及び/又はその下方調節を防止する様々な方法を含む。初期/未成熟胸腺細胞ではない細胞において過剰発現されたプレTCRαは、発現された内因性TCRβ及びCD3サブユニットと会合して、CD3細胞表面提示を可能にするが、ペプチド-MHC結合能力を有しない。
したがって、設計3を考慮して、明細書において提供されるのは、細胞又はその集団であって、当該細胞が、iPSC、クローンiPSC、クローンiPS細胞株、又は当該iPSCを分化させることから得られる派生細胞であり、当該細胞が、内因性TCRがノックアウトされる(TCRneg)ような内因性TCRα又はTCRβのうちの少なくとも破壊と、少なくとも、プレTCRの全長又は部分長を含むペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドと、を含み、TCRαの不在下でのプレTCRαの発現が、細胞における内因性又はトランスジェニックTCRβと会合した細胞表面CD3(cs-CD3)複合体の再構成をもたらすだけでなく、T細胞を含む機能的派生エフェクター細胞へのiPSCの指向性分化にも寄与する、細胞又はその集団である。
設計4:非結合組換えTCRアンカー型CD3(non-binding recombinant TCR anchored CD3、nb-rTCR-CD3)
図2Bに示されるように、この設計4では、ゲノム編集ツールを使用して、細胞内で内因性TCRαと内因性TCRβの一方又は両方をノックアウト(TCRneg;TCRα-/-及び/又はTCRβ-/-)する。TCRノックアウトと同時に、又はその後に、外因性ポリヌクレオチドが当該TCRneg細胞に導入され、この外因性ポリヌクレオチドは、TCRα定常領域、CD3εの全長若しくは部分長の外部ドメイン、並びにCD3δ及びCD3γのうちの1つを含む組換えTCRαをコードする第1のポリヌクレオチド、並びに/又はTCRβ定常領域、CD3εの全長若しくは部分長の外部ドメイン、及び組換えTCRαに含まれないCD3δ及びCD3γのうちの1つを含む組換えTCRβをコードする第2のポリヌクレオチドを含み、その結果、1つのポリヌクレオチドによってコードされるCD3εとCD3δとの間の1つのヘテロ二量体、及び/又は別のポリヌクレオチドによってコードされるCD3εとCD3γとの間の別のヘテロ二量体が細胞表面で形成され得る。
いくつかの実施形態では、組換えTCRαは、N末端で全長又は部分長のCD3ε及びCD3δ外部ドメインと融合した、C末端での完全又は部分的なTCRα定常領域を含む(tgCD3(ε-δ)-TRAC)。いくつかの実施形態では、組換えTCRαは、N末端でCD3ε及びCD3γの全長又は部分長の外部ドメインと融合した、C末端での完全又は部分的なTCRα定常領域を含む(tgCD3(ε-γ)-TRAC)。いくつかの実施形態では、組換えTCRβは、N末端でCD3ε及びCD3γの全長又は部分長の外部ドメインと融合した、C末端での全長又は部分長のTCRβ定常領域を含む(tgCD3(ε-γ)-TRBC)。いくつかの実施形態では、組換えTCRβは、N末端でCD3ε及びCD3δの全長又は部分長の外部ドメインと融合した、C末端での全長又は部分長のTCRβ定常領域を含む(tgCD3(ε-δ)-TRBC)。TCRα又はTCRβ定常領域の全長をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、C末端にポリAテールを更に含む。TCRα又はTCRβ定常領域の部分長をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの組み込みは、それぞれの内因性定常領域内の部位においてであり、インフレームである、すなわち、組み込み部位の下流のTCRα又はTCRβ定常領域の残りの内因性配列とインフレームであり、その結果、全長トランスジェニック/キメラTRAC又はTRBCは、その配列の一部が外因性/トランスジェニックであり、別の部分が内因性であるように形成される。
いくつかの他の実施形態では、第1及び第2のポリヌクレオチドの両方が細胞に導入される場合、組換えTCRαは、tgCD3(ε-δ)-TRACを含む第1のポリヌクレオチドによってコードされ、組換えTCRβは、tgCD3(ε-γ)-TRBCを含む第2のポリヌクレオチドによってコードされるか、又は組換えTCRαは、tgCD3(ε-γ)-TRACを含む第1のポリヌクレオチドによってコードされ、組換えTCRβは、tgCD3(ε-δ)-TRBCを含む第2のポリヌクレオチドによってコードされる。したがって、当該実施形態では、1つのポリヌクレオチドによってコードされるCD3εとCD3δとの間の1つのヘテロ二量体、及び別のポリヌクレオチドによってコードされるCD3εとCD3γとの間の別のヘテロ二量体が細胞表面で形成され得る。
いくつかの実施形態では、第1及び第2のポリヌクレオチドの一方のみが細胞に導入される場合、他方のTCRサブユニットは、野生型/内在性であるか、又は定義された可変領域で置換されているかどうかにかかわらず、その内在性可変領域が除去された定常領域のみを含むように操作されているかのいずれかである:例えば、図2Aの設計1のtgTRAC若しくはtgTRBC(可変領域なし)、又は図2Aの設計2のtgTCRα若しくはtgTCRβ(定義された可変領域あり)。したがって、図2Bの設計4に示されるように、tgCD3(ε-δ)-TRACを含む第1のポリヌクレオチドが組換えTCRαサブユニットを提供するために細胞に導入される例示的な一実施形態では、tgTRBC又はtgTCRβを含む別のポリヌクレオチドも組換えTCRβサブユニットを提供するために細胞に導入され、その結果、この実施形態では、tgCD3(ε-δ)-TRACを含むポリヌクレオチドによってコードされる、内因性CD3εと内因性CD3γとの間の1つのヘテロ二量体、及びCD3εとCD3δとの間の別のヘテロ二量体が、細胞表面で形成され得る。図2Bの設計4の更に別の例示的な実施形態では、tgCD3(ε-γ)-TRBCを含む第2のポリヌクレオチドが組換えTCRβサブユニットを提供するために細胞に導入され、tgTRAC又はtgTCRαを含む別のポリヌクレオチドも組換えTCRαサブユニットを提供するために細胞に導入され、その結果、tgCD3(ε-γ)-TRBCを含むポリヌクレオチドによってコードされる内因性CD3εと内因性CD3δとの間の1つのヘテロ二量体、及びCD3εとCD3γとの間の別のヘテロ二量体が、細胞表面で形成され得る。
いくつかの実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、TCRαの内因性プロモータによって駆動されるが、いくつかの他の実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、外因性プロモータによって駆動される。いくつかの実施形態では、第2のポリヌクレオチドは、TCRβの内因性プロモータによって駆動されるが、いくつかの他の実施形態では、第2のポリヌクレオチドは、外因性プロモータによって駆動される。いくつかの実施形態では、組換えTCRα又は組換えTCRβのいずれかのための外因性プロモータは、構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、又は細胞型特異的プロモータを含む。いくつかの実施形態では、外因性プロモータは、CMV、EF1α、PGK、CAG、又はUBCのうちの1つを含む。一実施形態では、外因性プロモータは、少なくともCAGを含む。いくつかの実施形態では、TCRα定常領域をコードするポリヌクレオチドは、例示的な配列である配列番号1と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、TCRβ定常領域をコードするポリヌクレオチドは、例示的な配列である配列番号2又は配列番号3と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、CD3ε外部ドメインの全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドは、例示的な配列である配列番号25と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、CD3δ外部ドメインの全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドは、例示的配列である配列番号26と比較した場合に、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を少なくとも含む。いくつかの実施形態は、CD3γ外部ドメインの全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドは、例示的な配列である配列番号27と比較した場合に、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも80%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも90%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも95%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、100%である。CD3ε、CD3δ、又はCD3γ外部ドメインの全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドをコードする核酸を更に含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号28、配列番号29、配列番号30、又は当該技術分野で既知の任意の他のシグナルペプチドのうちの1つを含む。CD3ε外部ドメインの全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号28のシグナルペプチドをコードする核酸を更に含む。CD3δ外部ドメインの全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号29のシグナルペプチドをコードする核酸を更に含む。CD3γ外部ドメインの全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号30のシグナルペプチドをコードする核酸を更に含む。
tgCD3(ε-δ)-TRAC融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、例示的な配列である配列番号31と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含み、配列番号31に含まれる2つのリンカー配列(配列番号33及び配列番号34)のそれぞれは、当該技術分野で既知の任意のもので置き換えられていてもよい。tgCD3(ε-γ)-TRBC融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、例示的な配列である配列番号32と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含み、配列番号32に含まれる2つのリンカー配列(配列番号33及び配列番号34)のそれぞれは、当該技術分野で既知の任意のもので置き換えられていてもよい。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも80%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも90%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも95%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、100%である。本明細書で提供される組換えTCRα又はTCRβ融合タンパク質のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、当該技術分野で既知のシグナルペプチドを更に含む。1つの非限定的な例示的シグナルペプチドは、配列番号28によって表されるペプチドを含む。
本明細書で実証されるように、CD3εの外部ドメイン、並びにCD3δ及びCD3γのうちの1つと融合したTCRα又はTCRβ定常領域は、CD3εの外部ドメイン、並びにCD3δ及びCD3γのうちの1つと融合したか又は融合していないトランスジェニックTCRβ又はTCRα定常領域と会合して、CD3ε/CD3δ及びCD3ε/CD3γヘテロ二量体を形成することができることが発見される。会合したトランスジェニックTCRα及びTCRβサブユニットは、内因性CD3ζと更に会合して、CD3外部ドメイン(cs-CD3)の細胞表面発現及び内因性CD3ζを介したシグナル伝達を支持することができるが、ペプチド-MHC結合能力を有しない。したがって、設計4を考慮して、本明細書において提供されるのは、細胞又はその集団であって、当該細胞が、iPSC、クローンiPSC、クローンiPS細胞株、又は当該iPSCを分化させることから得られる派生細胞であり、当該細胞が、内因性TCRα定常領域及び内因性TCRβ定常領域の各々における破壊、並びに融合された全長又は部分長のTCRα定常領域と、CD3ε並びにCD3δ及びCD3γのうちの1つの全長又は部分長の外部ドメインとを含むtgTCRα(tgCD3(ε-δ/γ)-TRAC)をコードする第1の外因性ポリヌクレオチドのうちの少なくとも1つ、及び融合された全長又は部分長のTCRβ定常領域と、CD3ε並びにCD3δ及びCD3γのうちの1つの全長又は部分長の外部ドメインとを含むtgTCRβ(tgCD3(ε-γ/δ)-TRBC)をコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、のうちの少なくとも1つを含み、CD3サブユニットの外部ドメインが、発現されると細胞表面に存在する(cs-CD3)、細胞又はその集団である。様々な実施形態では、当該第1の外因性ポリヌクレオチドのみが細胞に含まれる場合、当該細胞は、本明細書で提供されるtgTRBC又はtgTCRβを更に含み、当該第2の外因性ポリヌクレオチドのみが細胞に含まれる場合、当該細胞は、本明細書で提供されるtgTRAC又はtgTCRαを更に含む。
設計5:CD3キメラ鎖(ccCD3)
図2Bに示されるように、この設計5では、細胞表面提示CD3(cs-CD3)は、CD3キメラ鎖(ccCD3)の形態であり、これは、CD3ε外部ドメインの全長又は部分長、CD3γ又はCD3δのいずれかの外部ドメインの全長又は部分長、及び少なくとも1つのITAM(免疫受容体チロシン活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif))を含むCD3ζの内部ドメインの全長又は部分長を含むように構築される。当該CD3キメラ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む細胞は、内因性TCRα及びTCRβのいずれか又は両方における破壊を更に含み得る。ゲノム編集ツールを使用して、TRAC及び/又はTRBCの標的化編集によってTCRneg細胞を生成する場合、TCRノックアウトと同時に又はその後に、当該CD3キメラ鎖をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドが細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、TRAC又はTRBCに導入され、それぞれ、TCRα又はTCRβの内因性プロモータによって駆動される。一方、いくつかの他の実施形態では、導入されたポリヌクレオチドは、外因性プロモータによって駆動される。いくつかの実施形態では、外因性プロモータは、構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、又は細胞型特異的プロモータを含む。いくつかの実施形態では、外因性プロモータは、CMV、EF1α、PGK、CAG、又はUBCのうちの1つを含む。一実施形態では、外因性プロモータは、少なくともCAGを含む。
いくつかの実施形態では、CD3キメラ鎖は、CD3ε外部ドメインの全長又は部分長、CD3γ外部ドメインの全長又は部分長、及び少なくとも1つのITAM(tgCD3(ε-γ)-ζ)を含むCD3ζの内部ドメインの全長又は部分長を含み、CD3キメラ鎖は、N末端にいずれかの外部ドメインを有する融合タンパク質であり、2つの外部ドメインはヘテロ二量体を形成する。いくつかの実施形態では、CD3キメラ鎖は、CD3ε外部ドメインの全長又は部分長、CD3δ外部ドメインの全長又は部分長、及び少なくとも1つのITAM(tgCD3(ε-δ)-ζ)を含むCD3ζの内部ドメインの全長又は部分長を含み、CD3キメラ鎖は、N末端にいずれかの外部ドメインを有する融合タンパク質であり、2つの外部ドメインはヘテロ二量体を形成する。CD3キメラ鎖のいくつかの実施形態では、CD3ζの内部ドメインは、2つのITAMを含む。CD3キメラ鎖のいくつかの実施形態では、CD3ζの内部ドメインは、3つ全てのITAMを含む。
いくつかの実施形態では、CD3ε外部ドメインの全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドは、例示的な配列である配列番号25と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、CD3δ外部ドメインの全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドは、例示的配列である配列番号26と比較した場合に、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、CD3γ外部ドメインの全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドは、例示的な配列である配列番号27と比較した場合に、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を少なくとも含む。CD3ε、CD3δ、又はCD3γ外部ドメインの全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドをコードする核酸を更に含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号27、配列番号29、配列番号30、又は当該技術分野で既知の任意の他のシグナルペプチドのうちの1つを含む。CD3ε外部ドメインの全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号28のシグナルペプチドをコードする核酸を更に含む。CD3δ外部ドメインの全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号29のシグナルペプチドをコードする核酸を更に含む。CD3γ外部ドメインの全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号30のシグナルペプチドをコードする核酸を更に含む。いくつかの実施形態では、CD3ζ内部ドメインの全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドは、CD3ζのITAM1、ITAM2、及びITAM3(それぞれ配列番号36~38)を含む例示的な配列番号35と比較した場合に、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも80%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも90%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも95%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、100%である。
CD3キメラ鎖のいくつかの実施形態では、少なくとも1つ、2つ、又は3つのITAMを含むCD3ζの内部ドメインは、シグナル伝達及び/又は共刺激のために、2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγIL21R、IL-2Rβ(IL-15Rβ)、IL-2Rγ、IL-7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD3ζ1XX、CS1、又はCD8の1つ以上のシグナル伝達ドメインを更に含む。CD3キメラ鎖の一実施形態では、少なくとも1つ、2つ、又は3つのITAMを含むCD3ζの内部ドメインは、少なくともCD28のシグナル伝達ドメインを更に含む(tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ)。CD28のシグナル伝達ドメインを含むCD3ζ内部ドメインのいくつかの実施形態において、28ζ内部ドメインの全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドは、任意の1つ又は2つのCD3ζITAMが除去され得る例示的な配列番号39と比較した場合に、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。CD3キメラ鎖のいくつかの実施形態では、少なくとも1つ、2つ、又は3つのITAMを含むCD3ζの内部ドメインは、4-1BBのシグナル伝達ドメインを更に含む(tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ)。4-1BBのシグナル伝達ドメインを含むCD3ζ内部ドメインのいくつかの実施形態において、BBζ内部ドメインの全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドは、任意の1つ又は2つのCD3ζITAMが除去され得る例示的な配列番号40と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。CD3キメラ鎖のいくつかの実施形態では、少なくとも1つ、2つ、又は3つのITAMを含むCD3ζの内部ドメインは、CD28のシグナル伝達ドメイン及び4-1BBのシグナル伝達ドメインを更に含む(tgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζ)。CD28及び4-1BBの両方のシグナル伝達ドメインを含むCD3ζ内部ドメインのいくつかの実施形態において、28BBζ内部ドメインの全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドは、任意の1つ又は2つのCD3ζITAMが除去され得る例示的な配列番号41と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。tgCD3(ε-γ)-(28/BB)ζをコードするポリヌクレオチドの一実施形態では、コードされるポリペプチドは、例示的配列である配列番号42と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含み、更にいくつかの他の実施形態では、それから任意の1つ又は2つのCD3ζITAMが除去されていてもよく、それからリンカー配列が当該技術分野で既知の任意の他のリンカー配列で置き換えられてもよく、又はそれからCD28シグナル伝達ドメインが4-1BBシグナル伝達ドメインで置き換えられるか、若しくは4-1BBシグナル伝達ドメインを付加することによって増強されてもよい。tgCD3(ε-δ)-(28/BB)ζの一実施形態では、コードされるポリペプチドは、例示的配列である配列番号43と比較した場合に、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含み、更にいくつかの他の実施形態では、それから任意の1つ又は2つのCD3ζITAMが除去されていてもよく、それからリンカー配列が当該技術分野において既知の任意の他のリンカー配列で置き換えられてもよく、又はそれからCD28シグナル伝達ドメインが4-1BBシグナル伝達ドメインによって置き換えられるか、若しくは4-1BBシグナル伝達ドメインを更に含むことによって増強されてもよい。コードされたCD3キメラ鎖tgCD3(ε-γ)-(28/BB)ζ又はtgCD3(ε-δ)-(28/BB)ζのいくつかの他の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号28のシグナルペプチド、又は当該技術分野で既知の任意の他のシグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも80%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも90%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも95%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、100%である。
本明細書で実証されるように、CD3ε外部ドメインの全長又は部分長と、CD3δ及びCD3γの全長又は部分長の外部ドメインのうちの少なくとも1つと、少なくとも1つのITAM及び必要に応じて1つ以上のシグナル伝達ドメインを含むCD3ζ内部ドメインと、を含む融合タンパク質である、本明細書において提供されるCD3キメラ鎖は、TCRnegである細胞において発現される場合、細胞表面にキメラCD3外部ドメインを提示することができることが発見される。更に、CD3外部ドメインの細胞表面発現は、融合CD3ζ内部ドメインを介したCD3結合誘発シグナル伝達を可能にするが、ペプチド-MHC結合能力を有しない。
したがって、設計5を考慮して、本明細書で提供されるのは、細胞又はその集団であって、当該細胞が、iPSC、クローンiPSC、クローンiPS細胞株、又はiPSCを分化させることから得られた派生細胞であり、当該細胞が、内因性TCRα定常領域及び内因性TCRβ定常領域のうちの少なくとも1つの破壊と、CD3キメラ鎖融合タンパク質(ccCD3)をコードする少なくとも1つの外因性ポリヌクレオチドと、を含み、融合タンパク質が、CD3εの全長又は部分長の外部ドメインと、CD3δ及びCD3γのいずれか1つの全長又は部分長の外部ドメインと、少なくとも1つのITAM及び必要に応じて1つ以上のシグナル伝達ドメインを有するCD3ζの全長又は部分長の内部ドメインと、を含み、CD3キメラ鎖の外部ドメインが、発現時に細胞表面に存在する(cs-CD3)、細胞又はその集団である。
本明細書で提供されるのは、発現されたときに細胞表面CD3複合体、又はその1つ以上のサブユニット若しくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含むiPSC又はiPSC由来細胞であって、当該細胞が、必要に応じてTCR陰性である、iPSC又はiPSC由来細胞である。cs-CD3が発現されると、それはCD3関連細胞表面トリガー受容体として機能する。CD3関連表面トリガー受容体がTCRneg細胞に提供されるいくつかの実施形態では、受容体は、発現されるとエフェクター細胞表面提示される完全又は部分的な内因性CD3分子に含まれ、内因性CD3分子の提示は、そうでなければ、発現されてもTCRneg細胞において起こらず、本明細書で提供される外因性TCRα、外因性TCRβ、及びそれらの任意のバリアントの全長又は部分長のうちの1つ以上を含む組換えTCRとのその会合によって可能になる。いくつかの実施形態では、TCRneg細胞における完全又は部分的な内因性CD3分子の細胞表面提示は、当該細胞において、少なくとも、非結合性組換えTCR(nb-rTCR)、定義された組換えTCR(d-rTCR)及び/又は組換えプレTCRを含む組換えTCRを更に発現させることによって可能になる。
いくつかの実施形態において、CD3関連表面トリガー受容体を含むTCRneg細胞は、非結合組換えTCR(nb-rTCR)を含み、nb-rTCRは、tgTRAC(transgenic TCRαconstant region、トランスジェニックTCRα定常領域)及びtgTRBC(transgenic TCRβconstant region、トランスジェニックTCRβ定常領域)の一方又は両方を含む。したがって、TCRneg iPSC又はiPSC由来細胞は、tgTRAC及び/又はtgTRBCをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。tgTRACをコードするポリヌクレオチドを含むTCRnegのいくつかの実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、TRAC遺伝子座に挿入され、挿入されたポリヌクレオチドは、内因性TRACの発現を破壊し、それによって内因性TCRノックアウトをもたらし、必要に応じて、挿入されたポリヌクレオチドは、TRACの内因性プロモータ又は異種プロモータによって駆動される。tgTRBCをコードするポリヌクレオチドを含むTCRnegのいくつかの実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、TRBC遺伝子座に挿入され、挿入されたポリヌクレオチドは、内因性TRBCの発現を破壊し、それによって内因性TCRノックアウトをもたらし、必要に応じて、挿入されたポリヌクレオチドは、TRBCの内因性プロモータ又は異種プロモータによって駆動される。
いくつかの実施形態では、CD3関連表面トリガー受容体を含むTCRneg細胞は、定義された組換えTCR(d-rTCR)を含み、d-rTCRは、tgTCRα(トランスジェニックTCRα)及びtgTCRβ(トランスジェニックTCRβ)を含み、tgTCRα及びtgTCRβの各々は、それぞれの定常領域(すなわち、TRAC及びTRBC)に加えて、それぞれの定義された可変領域を含み、したがって、TCRnegiPSC又はiPSC由来細胞は、tgTCRα及び/又はtgTCRβをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、定義された可変領域は、既知のTCR特異性を有するT細胞のTCRα及びTCRβに由来する。いくつかの実施形態では、定義された可変領域は、インバリアントNKT細胞のTCRα及びTCRβに由来する。tgTCRαをコードするポリヌクレオチドを含むTCRnegのいくつかの実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、TRAC遺伝子座に挿入され、挿入されたポリヌクレオチドは、内因性TRACの発現を破壊し、それによって内因性TCRノックアウトをもたらし、必要に応じて、挿入されたポリヌクレオチドは、TRACの内因性プロモータ又は異種プロモータによって駆動される。tgTCRβをコードするポリヌクレオチドを含むTCRneg細胞のいくつかの実施形態では、当該ポリヌクレオチドはTRBC遺伝子座に挿入され、挿入されたポリヌクレオチドは内因性TRBCの発現を破壊し、それによって内因性TCRノックアウトをもたらし、必要に応じて、挿入されたポリヌクレオチドはTRBCの内因性プロモータ又は異種プロモータによって駆動される。
いくつかの実施形態では、CD3関連表面トリガー受容体を含むTCRneg細胞は、組換えプレTCR(p-rTCR)を含み、p-rTCRは、tgpTCRα(トランスジェニックプレTCRα)、及び必要に応じてtgTRBC又はtgTCRβを含み、tgTCRβは、定義された可変領域を含み、したがって、TCRnegiPSC又はiPSC由来細胞は、少なくとも、tgpTCRαをコードするポリヌクレオチドを含む。tgpTCRαをコードするポリヌクレオチドを含むTCRneg細胞のいくつかの実施形態では、当該ポリヌクレオチドはTRAC遺伝子座に挿入され、挿入されたポリヌクレオチドは内因性TRACの発現を破壊し、それによって内因性TCRノックアウトをもたらし、必要に応じて、挿入されたポリヌクレオチドはTRACの内因性プロモータ又は異種プロモータによって駆動される。tgpTCRαに加えてtgTRBC又はtgTCRβをコードするポリヌクレオチドを含むTCRneg細胞のいくつかの実施形態では、当該tgTRBC又はtgTCRβをコードするポリヌクレオチドは、TRBC遺伝子座に挿入され、挿入されたポリヌクレオチドは、内因性TRBCの発現を破壊し、それによって内因性TCRノックアウトをもたらし、必要に応じて、挿入されたtgTRBC又はtgTCRβをコードするポリヌクレオチドは、TRBCの内因性プロモータ又は異種プロモータによって駆動される。
TCRneg細胞におけるCD3関連表面トリガー受容体のいくつかの実施形態では、受容体は、CD3ε、CD3δ、及びCD3γのうちの1つ以上に由来する少なくとも1つの外因性サブユニット又はサブドメインを含む完全又は部分的なCD3分子に含まれる。一実施形態では、TCRneg細胞におけるエンゲージャ認識のためのCD3関連表面トリガー受容体は、CD3εの全長又は部分長の外部ドメインを少なくとも含む部分的なCD3分子に含まれる。一実施形態では、TCRneg細胞におけるエンゲージャ認識のためのCD3関連表面トリガー受容体は、少なくともCD3εの全長又は部分長の外部ドメイン、更にCD3γ又はCD3δの全長又は部分長の外部ドメインを含む部分的なCD3分子に含まれる。一実施形態では、当該CD3分子は、CD3ε、CD3γ及び/又はCD3δの外部ドメインの少なくとも全長又は部分長を含み、外部ドメインの全長又は部分長は、TCRα又はTCRβの定常領域と融合しており、TRAC又はTRBCをそれぞれ含む部分融合タンパク質は、内因性CD3ζとヘテロ二量体を形成することができる。したがって、CD3関連表面トリガー受容体を有するTCRnegiPSC又はiPSC由来細胞の一実施形態では、細胞は、(i)CD3ε及びCD3δの外部ドメインの全長部分長と、TCRα定常領域と、を含むトランスジェニック融合タンパク質(tgCD3(ε-δ)-TRAC)、(ii)CD3ε及びCD3γの外部ドメインの全長又は部分長と、TCRβ定常領域と、を含むトランスジェニック融合タンパク質(tgCD3(ε-γ)-TRBC)、(iii)CD3ε及びCD3γの外部ドメインの全長又は部分長と、TCRα定常領域と、を含むトランスジェニック融合タンパク質(tgCD3(ε-γ)-TRAC)、及び/又は(iv)CD3ε及びCD3δの外部ドメインの全長又は部分長と、TCRβ定常領域と、を含むトランスジェニック融合タンパク質(tgCD3(ε-δ)-TRBC)、のうちの少なくとも1つを含む。CD3関連表面トリガー受容体を有するTCRneg細胞のいくつかの実施形態では、細胞は、少なくともCD3εの全長又は部分長の外部ドメインと融合したTCRα定常領域を含むトランスジェニック融合タンパク質と、少なくともCD3εの全長又は部分長の外部ドメインと融合したTCRβ定常領域を含むトランスジェニック融合タンパク質と、を含むヘテロ二量体を含む。
TCRneg細胞における細胞表面CD3複合体、又はその1つ以上のサブユニット若しくはサブドメイン(cs-CD3)を対象とする図2A~図2Cの様々な設計に加えて、本明細書に記載されるCD3ベースのCFRはまた、以下に更に記載されるCD3特異的抗体、CD3-CAR、及び/又はCD3標的化エンゲージャを含むがこれらに限定されない分子に結合するためのCD3関連細胞表面トリガー受容体として機能することもできる。更に提供されるように、CFR及びTCRnegをコードするポリヌクレオチドを含む細胞又はその集団は、cs-CD3、CD16又はバリアントノックイン、CAR、外因性サイトカイン又はその融合バリアント、B2Mノックアウト又はノックダウン(例えば、HLA欠損をもたらすため)、CIITAノックアウト又はノックダウン(例えば、HLA-II欠損をもたらすため)、HLA-G又は非切断性HLA-Gの導入、CD38ノックアウト、及び本明細書に記載される追加の操作されたモダリティ、のうちの1つ以上を更に含み得る。CFR、TCRneg、CD16、CAR、CD38陰性、外因性サイトカイン又はその融合バリアント、B2M-/-、CIITA-/-、HLA-G、及びそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、本明細書で提供される少なくとも1つの表現型を有する、ソーティングされた単一細胞及び増殖されたクローン操作iPSCを含むマスター細胞バンクが、本明細書で更に提供される。
3.CD16ノックイン
CD16は、2つのアイソフォーム、Fc受容体FcγRIIIa(CD16a;NM_000569.6)及びFcγRIIIb(CD16b;NM_000570.4)として同定されている。CD16aは、標的細胞に付着した単量体IgGに結合してNK細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害(ADCC)を促進する、NK細胞によって発現される膜貫通タンパク質である。CD16bはヒト好中球によって排他的に発現する。本明細書で使用されるとき、「高親和性CD16」、「非切断性CD16」、又は「高親和性非切断性CD16」は、様々なCD16バリアントを指す。野生型CD16は親和性が低く、NK細胞が活性化されると、白血球上の様々な細胞表面分子の細胞表面密度を調節するタンパク質分解切断プロセスである外部ドメインシェディングを含む下方制御に供される。F176V(いくつかの刊行物ではF158Vとも呼ばれる)は、高親和性を有する例示的なCD16多型アレル/バリアントであり、一方、S197Pバリアントは、CD16の遺伝子操作された非切断性バージョンの一例である。F176VとS197Pの両方を含む操作されたCD16バリアントは、高い親和性を有し、非切断性であり、これは、国際公開第2015/148926号により詳細に記載されており、その完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれる。加えて、CD16の外部ドメインがCD64の外部ドメインの少なくとも一部で本質的に置き換えられたキメラCD16受容体は、ADCCを実行することができるCD16受容体の望ましい高親和性と切断不可能な特質も実現され得る。いくつかの実施形態では、キメラCD16の置換外部ドメインは、CD64(UniPRotKB_P12314又はそのアイソフォーム又は多型バリアント)のEC1、EC2、及びEC3エクソンのうちの1つ以上を含む。
CD16は、2つのアイソフォーム、Fc受容体FcγRIIIa(CD16a;NM_000569.6)及びFcγRIIIb(CD16b;NM_000570.4)として同定されている。CD16aは、標的細胞に付着した単量体IgGに結合してNK細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害(ADCC)を促進する、NK細胞によって発現される膜貫通タンパク質である。CD16bはヒト好中球によって排他的に発現する。本明細書で使用されるとき、「高親和性CD16」、「非切断性CD16」、又は「高親和性非切断性CD16」は、様々なCD16バリアントを指す。野生型CD16は親和性が低く、NK細胞が活性化されると、白血球上の様々な細胞表面分子の細胞表面密度を調節するタンパク質分解切断プロセスである外部ドメインシェディングを含む下方制御に供される。F176V(いくつかの刊行物ではF158Vとも呼ばれる)は、高親和性を有する例示的なCD16多型アレル/バリアントであり、一方、S197Pバリアントは、CD16の遺伝子操作された非切断性バージョンの一例である。F176VとS197Pの両方を含む操作されたCD16バリアントは、高い親和性を有し、非切断性であり、これは、国際公開第2015/148926号により詳細に記載されており、その完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれる。加えて、CD16の外部ドメインがCD64の外部ドメインの少なくとも一部で本質的に置き換えられたキメラCD16受容体は、ADCCを実行することができるCD16受容体の望ましい高親和性と切断不可能な特質も実現され得る。いくつかの実施形態では、キメラCD16の置換外部ドメインは、CD64(UniPRotKB_P12314又はそのアイソフォーム又は多型バリアント)のEC1、EC2、及びEC3エクソンのうちの1つ以上を含む。
したがって、細胞に導入された外因性CD16の様々な実施形態は、機能的CD16バリアント及びそのキメラ受容体を含む。いくつかの実施形態では、機能的CD16バリアントは、高親和性の非切断性CD16受容体(hnCD16)である。いくつかの実施形態では、hnCD16は、F176VとS197Pの両方を含み、いくつかの実施形態では、F176Vを含み、切断領域が排除されている。いくつかの他の実施形態では、hnCD16は、例示的な配列である、それぞれがCD64外部ドメインの少なくとも一部分を含む配列番号7、8、及び9のうちのいずれかと比較される場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも80%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも90%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも95%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、100%である。配列番号7、8、及び9は、それぞれ、配列番号10~12によってコードされる。本明細書及び本出願全体で使用されるように、2つの配列間の同一性パーセントは、2つの配列の最適なアライメントのために導入する必要のあるギャップの数と各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一位置の数の関数(すなわち、同一性%=同一位置の数/位置の総数×100)である。配列の比較と2つの配列間の同一性パーセントの決定は、当該技術分野で認識されている数学的アルゴリズムを使用して実行され得る。
したがって、本明細書において企図され、記載される他の編集の中でも、外因性CD16又はそのバリアントを含むように遺伝子操作されたエフェクター細胞又はiPSCが本明細書において提供され、エフェクター細胞は、初代供給源由来の細胞であるか、若しくはiPSC分化に由来する細胞であるか、又は遺伝子操作されたiPSCは、iPSCに導入された外因性CD16を含む由来エフェクター細胞に分化することができる。いくつかの実施形態では、外因性CD16は、高親和性の非切断性CD16(hnCD16)である。いくつかの実施形態では、外因性CD16は、CD64外部ドメインの少なくとも一部分を含む。いくつかの実施形態では、外因性CD16は、CD16に由来しない膜貫通ドメイン、刺激性ドメイン及び/又はシグナル伝達ドメインを含むCD16ベースのキメラFc受容体(chimeric Fc receptor、CFcR)の形態である。
いくつかの実施形態では、外因性CD16又はそのバリアントを含む初代由来(sourced)又は由来(derived)エフェクター細胞は、NK系統細胞である。いくつかの実施形態では、外因性CD16又はそのバリアントを含む初代由来又は由来エフェクター細胞は、T系統細胞である。いくつかの実施形態では、外因性CD16は、hnCD16を含む。いくつかの実施形態では、hnCD16は、CD64の全長又は部分長細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、iPSC又はエフェクター細胞に含まれる外因性CD16又はその機能的バリアントは、結合時に下流シグナル伝達を誘発するリガンドへのこのような結合において高い親和性を有する。外因性CD16又はその機能的バリアントに結合するリガンドの非限定例は、ADCC抗体又はその断片だけでなく、当該外因性CD16のCD16又はCD64の細胞外結合ドメインを認識する二重特異性、三重特異性、又は多重特異性のエンゲージャ又はバインダを含む。二重特異性、三重特異性、又は多重特異性のエンゲージャ又はバインダの例については、本出願で以下で更に説明する。このように、本出願の態様のうちの少なくとも1つは、本出願で更に詳述する状態、疾患、又は感染症の治療における治療的使用に十分な量で、エフェクター細胞上で発現する外因性CD16を介して1つ以上の予め選択されたADCC抗体が予めロードされた、派生エフェクター細胞又はその細胞集団を提供し、上記外因性CD16は、CD64の、又はF176V及びS197Pを有するCD16の細胞外結合ドメインを含む。
いくつかの他の実施形態では、外因性CD16は、CD16又はそのバリアントをベースとするCFcRを含む。キメラFc受容体(CFcR)は、天然CD16膜貫通及び/又は細胞内ドメインを改変又は置換することによって、非天然膜貫通ドメイン、非天然刺激ドメイン及び/又は非天然シグナル伝達ドメインを含むように産生される。本明細書で使用される「非天然」という用語は、膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、又はシグナル伝達ドメインが、細胞外ドメインを提供する受容体以外の異なる受容体に由来することを意味する。本明細書での例示では、CD16又はそのバリアントをベースとするCFcRは、CD16に由来する膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、又はシグナル伝達ドメインを有しない。いくつかの実施形態では、外因性のCD16ベースのCFcRは、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、又はT細胞受容体ポリペプチドに由来する非天然の膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、外因性のCD16ベースのCFcRは、CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4、又はNKG2Dポリペプチドに由来する非天然の刺激/阻害ドメインを含む。いくつかの実施形態では、外因性のCD16ベースのCFcRは、CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(4-1BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、又はNKG2Dポリペプチドに由来する非天然のシグナル伝達ドメインを含む。CD16ベースのCFcRの一実施形態では、提供されるキメラFc受容体は、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、又はNKG2Dポリペプチドのうちの1つに両方が由来する膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含む。CD16ベースのキメラFc受容体の特定の例示的な一実施形態は、NKG2Dの膜貫通ドメイン、2B4の刺激ドメイン、及びCD3ζのシグナル伝達ドメインを含み、CFcRの細胞外ドメインは、CD64又はCD16の細胞外ドメインの全長又は部分配列に由来し、CD16の細胞外ドメインは、F176V及びS197Pを含む。CD16ベースのキメラFc受容体の別の例示的な実施形態は、CD3ζの膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含み、CFcRの細胞外ドメインは、CD64又はCD16の細胞外ドメインの全長又は部分配列に由来し、CD16の細胞外ドメインは、F176V及びS197Pを含む。
上述のようなCD16ベースのキメラFc受容体の様々な実施形態は、抗体又はその断片のFc領域に、高い親和性で結合することができるか、又は、二重特異性、三重特異性、若しくは多重特異性のエンゲージャ若しくはバインダに、高い親和性で結合することができる。結合すると、キメラ受容体の刺激ドメイン及び/又はシグナル伝達ドメインは、エフェクター細胞の活性化及びサイトカイン分泌、並びに抗体が、又は腫瘍抗原結合成分及びFc領域を有する上記の二重特異性、三重特異性、若しくは多重特異性のエンゲージャ若しくはバインダが標的とする腫瘍細胞の殺傷を可能にする。理論に制限されることなく、CD16ベースのキメラFc受容体の、非天然の膜貫通、刺激及び/若しくはシグナル伝達ドメインを通じて、又は外部ドメインへのエンゲージャの結合を通じて、CFcRはエフェクター細胞の殺傷能力に寄与し得、エフェクター細胞の増殖及び/又は増殖の可能性を増加させる。抗体とエンゲージャは、抗原を発現している腫瘍細胞とCFcRを発現しているエフェクター細胞を近接させることができ、これも増強された腫瘍細胞の殺傷に寄与する。二重特異性、三重特異性、多重特異性エンゲージャ又はバインダのための例示的な腫瘍抗原には、B7H3、BCMA、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、PSMA、PAMA、P-カドヘリン、及びROR1が含まれるが、これらに限定されない。腫瘍細胞を攻撃する際にCD16ベースのCFcRを発現するエフェクター細胞を結合させるのに好適ないくつかの非限定的な例示的な二重特異性、三重特異性、多重特異性のエンゲージャ又はバインダには、CD16(又はCD64)-CD30、CD16(又はCD64)-BCMA、CD16(又はCD64)-IL15-EPCAM、及びCD16(又はCD64)-IL15-CD33が含まれる。
NK細胞活性化に続いて細胞表面から切断される初代NK細胞によって発現される内因性CD16とは異なり、派生NK細胞の様々な非切断性バージョンのCD16は、CD16のシェディングを回避し、一定の発現を維持する。誘導NK細胞では、非切断性CD16は、改善した細胞機能の指標であるTNFα及びCD107aの発現を増加させる。非切断性CD16はまた、抗体依存性細胞傷害(ADCC)、及び二重、三重、又は多重特異的エンゲージャの結合も増強する。ADCCは、抗体でコーティングされた標的細胞へのCD16の結合を介したNK細胞媒介性溶解のメカニズムである。由来NK細胞に導入されたhnCD16の追加の高親和性特性により、細胞療法を必要とする対象に細胞を投与する前に、hnCD16を介したADCC抗体のNK細胞へのインビトロローディングも可能になる。本明細書において提示されるように、hnCD16は、いくつかの実施形態においてF176V及びS197Pを含み得、又は配列番号7、8、若しくは9によって例示されるようにCD64に由来する全長又は部分長の外部ドメインを含み得、又は非天然の膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、及びシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも1つを更に含み得る。開示されるように、本出願はまた、本出願で更に詳しく説明するように、状態、疾患、又は感染症の治療における治療的使用に十分な量の1つ以上の予め選択されたADCC抗体が予めロードされた、派生NK細胞又はその細胞集団を提供する。
初代NK細胞とは異なり、初代供給源(すなわち、末梢血、臍帯血、又は他のドナー組織などの天然/天然源)由来の成熟T細胞はCD16を発現しない。発現した外因性の非切断性CD16を含むiPSCが、T細胞の発生生物学を損なうことなく、外因性CD16を発現するだけでなく、獲得したADCCメカニズムを通じて機能を実行することができる機能的な派生T系統細胞に分化することができることは予想外であった。派生T系統細胞で獲得したこのADCCは、二重標的化、及び/又はCAR-T細胞療法でよく発生する、低減若しくは消失したCAR-T標的抗原の発現、若しくはCAR(キメラ抗原受容体)による認識を回避する変異抗原を伴って腫瘍が再燃する、抗原エスケープを救済するためのアプローチとして更に使用され得る。上記誘導T系統細胞が、外因性CD16(機能的バリアント及びCD16ベースのCFcRを含む)発現を介して獲得したADCCを含み、抗体が、CARが標的とする腫瘍抗原とは異なる腫瘍抗原を標的とする場合、抗体を使用してCAR-T抗原エスケープを救済し、CAR-T治療でよく見られる標的腫瘍の再発又は再発を軽減又は防止することができる。二重標的化を達成しながら抗原エスケープを低減及び/又は防止するこのような戦略は、1つ以上のCARを発現するNK細胞にも同様に適用され得る。この抗原エスケープの低減及び防止戦略で使用され得る様々なCARについて、以下で更に説明する。
このように、本発明は、外因性CD16を含む派生T系統細胞を提供する。いくつかの実施形態では、派生T系統細胞に含まれるCD16は、F176V及びS197Pを含むCD16外部ドメインを含むhnCD16である。いくつかの他の実施形態では、派生T系統細胞に含まれるhnCD16は、配列番号7、8又は9によって例示されるような、CD64に由来する全長又は部分長の外部ドメインを含むか、又は非天然の膜貫通ドメイン、刺激ドメイン及びシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも1つを更に含み得る。本明細書で説明されているように、そのような派生T系統細胞は、抗体の治療効果を高めるためにADCCによって媒介されたモノクローナル抗体で腫瘍を標的とする獲得されたメカニズムを有する。開示されるように、本出願はまた、以下で更に詳しく説明するように、状態、疾患、又は感染症の治療における治療的使用に十分な量の1つ以上の予め選択されたADCC抗体が予めロードされた、派生T系統細胞又はその細胞集団を提供する。
本出願において更に提供されるのは、外因性CD16を含むがこれに限定されない、本明細書において提供されるような少なくとも1つの表現型を有する、ソーティングされた単一細胞及び増殖されたクローンの操作されたiPSCを含むマスター細胞バンクであり、この細胞バンクは、更なるiPSC操作のためのプラットフォームと、組成が明確かつ均一であり、費用効果の高い様式で大規模に大量生産することができる、誘導NK及びT細胞を含むがこれに限定されない、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供する。
4.キメラ抗原受容体(CAR)発現
遺伝子操作されたiPSC及びその派生エフェクター細胞に適用可能なものは、当該技術分野で知られている任意のCARの設計であり得る。CARは、抗原認識領域、膜貫通ドメイン、及び内部ドメインを含む外部ドメインを一般に含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、外部ドメインは、シグナルペプチド若しくはリーダー配列及び/又はスペーサを更に含むことができる。いくつかの実施形態では、内部ドメインは、CARを発現するエフェクター細胞を活性化するシグナル伝達ペプチドを更に含むことができる。いくつかの実施形態では、抗原認識ドメインは、抗原に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、抗原認識ドメインは、疾患又は病原体と関連する抗原に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、疾患関連抗原は腫瘍抗原であり、腫瘍は液体腫瘍又は固形腫瘍であってよい。いくつかの実施形態では、CARは、当該CARを発現するT系統細胞又はNK系統細胞のいずれかを活性化するのに好適である。いくつかの実施形態では、CARは、NK特異的シグナル伝達成分を含むためにNK細胞特異的である。特定の実施形態では、当該T細胞は、CAR発現iPSCに由来し、派生T系統細胞は、Tヘルパー細胞、細胞傷害性T細胞、メモリT細胞、制御性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、αβT細胞、γδT細胞、又はそれらの組み合わせを含み得る。特定の実施形態では、当該NK細胞は、CAR発現iPSCに由来する。
遺伝子操作されたiPSC及びその派生エフェクター細胞に適用可能なものは、当該技術分野で知られている任意のCARの設計であり得る。CARは、抗原認識領域、膜貫通ドメイン、及び内部ドメインを含む外部ドメインを一般に含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、外部ドメインは、シグナルペプチド若しくはリーダー配列及び/又はスペーサを更に含むことができる。いくつかの実施形態では、内部ドメインは、CARを発現するエフェクター細胞を活性化するシグナル伝達ペプチドを更に含むことができる。いくつかの実施形態では、抗原認識ドメインは、抗原に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、抗原認識ドメインは、疾患又は病原体と関連する抗原に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、疾患関連抗原は腫瘍抗原であり、腫瘍は液体腫瘍又は固形腫瘍であってよい。いくつかの実施形態では、CARは、当該CARを発現するT系統細胞又はNK系統細胞のいずれかを活性化するのに好適である。いくつかの実施形態では、CARは、NK特異的シグナル伝達成分を含むためにNK細胞特異的である。特定の実施形態では、当該T細胞は、CAR発現iPSCに由来し、派生T系統細胞は、Tヘルパー細胞、細胞傷害性T細胞、メモリT細胞、制御性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、αβT細胞、γδT細胞、又はそれらの組み合わせを含み得る。特定の実施形態では、当該NK細胞は、CAR発現iPSCに由来する。
特定の実施形態では、上記抗原認識領域は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダIg、サメ重鎖のみ抗体(VNAR)、Ig NAR、キメラ抗体、組換え抗体、又はその抗体断片を含む。抗体断片の非限定的な例には、Fab、Fab’、F(ab’)2、F(ab’)3、Fv、一本鎖抗原結合断片(scFv)、(scFv)2、ジスルフィド安定化Fv(dsFv)、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片(sdAb、ナノボディ)、組換え重鎖のみ抗体(VHH)、及び抗体全体の結合特異性を維持するその他の抗体断片が含まれる。CARによって標的化され得る抗原の非限定的な例には、ADGRE2、炭酸脱水酵素IX(CAlX)、CCR1、CCR4、がん胎児性抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CD269(BCMA)、CDS、CLEC12A、サイトメガロウイルス(CMV)感染細胞の抗原(例えば、細胞表面抗原)、上皮糖タンパク質-2(EGP-2)、上皮糖タンパク質-40(EGP-40)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、EGFRvIII、受容体チロシンタンパク質キナーゼerb-B2、3、4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB葉酸結合タンパク質(FBP)、胎児のアセチルコリン受容体(AChR)、葉酸受容体-a、ガングリオシドG2(GD2)、ガングリオシドG3(GD3)、ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2)、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、ICAM-1、インテグリンB7、インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2(IL-13Rα2)、κ-軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体(KDR)、ルイスA(CA19.9)、ルイスY(LeY)、L1細胞接着分子(L1-CAM)、LILRB2、黒色腫抗原ファミリーA1(MAGE-A1)、MICA/B、ムチン1(Muc-1)、ムチン16(Muc-16)、メソセリン(MSLN)、NKCSI、NKG2Dリガンド、c-Met、がん-精巣抗原NY-ESO-1、腫瘍胎児性抗原(h5T4)、PRAME、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、PRAME前立腺特異的膜抗原(PSMA)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG-72)、TIM-3、TRBC1、TRBC2、血管内皮増殖因子R2(VEGF-R2)、ウィルムス腫瘍タンパク質(WT-1)、及び当該技術分野で既知の様々な病原体抗原が含まれる。病原体の非限定的な例には、疾患を引き起こす可能性のある、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、及び原生動物が含まれる。
いくつかの実施形態では、CARの膜貫通ドメインは、CD3D、CD3E、CD3G、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、又はT細胞受容体ポリペプチドの天然又は改変された膜貫通領域の全長又は少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態では、内部ドメイン(又は細胞内ドメイン)のシグナル伝達ペプチドは、CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(4-1BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、又はNKG2Dのポリペプチドの全長又は少なくとも一部分を含む。一実施形態では、CARのシグナル伝達ペプチドは、CD3ζの少なくとも1つのITAM(免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ)に対して、少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、又は約99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、当該内部ドメインは、少なくとも1つの共刺激シグナル伝達領域を更に含む。当該共刺激シグナル伝達領域は、CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4、若しくはNKG2D、又はそれらの任意の組み合わせのポリペプチドの全長又は少なくとも一部分を含むことができる。
一実施形態では、本明細書において提供される細胞に適用可能なCARは、CD28に由来する共刺激ドメイン、及び配列番号13と少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、又は約99%同一のアミノ酸配列によって表されるCD3ζの天然又は改変ITAM1を含むシグナル伝達ドメインを含む。更なる実施形態では、CD28に由来する共刺激ドメイン及びCD3ζの天然又は改変ITAM1を含むCARはまた、CD28に由来するヒンジドメイン及び膜貫通ドメインを含み、scFvはヒンジを介して膜貫通ドメインに接続され得、CARは、配列番号14と少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、又は約99%の同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも80%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも90%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも95%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、100%である。
別の実施形態では、本明細書において提供される細胞に適用可能なCARは、NKG2Dに由来する膜貫通ドメイン、2B4に由来する共刺激ドメイン、及び配列番号15と少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、又は約99%同一のアミノ酸配列によって表される天然又は改変CD3ζを含むシグナル伝達ドメインを含む。NKG2Dに由来する膜貫通ドメイン、2B4に由来する共刺激ドメイン、及び天然又は改変されたCD3ζを含むシグナル伝達ドメインを含む上記CARは、CD8ヒンジを更に含み得、そのような構造のアミノ酸配列は、配列番号16と少なくとも約85%約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、又は約99%同一のものである。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも80%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも90%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも95%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、100%である。
非限定的なCAR戦略としては、一対の細胞内ドメインの二量体化によるヘテロ二量体条件的活性化CAR(例えば、米国特許第9,587,020号を参照されたい);スプリットCAR(CARを生成するための抗原結合、ヒンジ、及び内部ドメインの相同組換え(例えば、米国特許出願公開第2017/0183407号を参照されたい));それぞれ抗原結合ドメイン及びシグナル伝達ドメインに接続された2つの膜貫通ドメイン間の非共有結合を可能にする多重鎖CAR(例えば、米国特許出願公開第2014/0134142号を参照されたい);二重特異性抗原結合ドメインを有するCAR(例えば、米国特許第9,447,194号を参照されたい)、又は同じ若しくは異なる抗原若しくはエピトープを認識する一対の抗原結合ドメインを有するCAR(例えば、米国特許第8,409,577号を参照されたい)、又はタンデムCAR(例えば、Hegde et al.,J Clin Invest.2016;126(8):3036-3052);誘導性CAR(例えば、米国特許出願公開第2016/0046700号、同第2016/0058857号、及び同第2017/0166877号を参照されたい);切り替え可能なCAR(例えば、米国特許出願公開第2014/0219975号を参照されたい);並びに当該技術分野で既知の任意の他の設計が更に含まれる。
したがって、本発明の態様は、ゲノム操作されたiPSCを分化させることから得られる派生細胞であって、iPSC及び派生細胞の両方が、1つ以上のCARを、追加の改変されたモダリティとともに含む、派生細胞を提供する。本出願において更に提供されるのは、CFR、CAR及びTCRnegと外因性CD16の一方又は両方を少なくとも有する、ソーティングされた単一細胞及び増殖されたクローン操作iPSCを含むマスター細胞バンクであり、この細胞バンクは、更なるiPSC操作のためのプラットフォームと、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源と、を提供する。
更なる実施形態では、CFR及びCARを含むiPSC及びその派生エフェクター細胞は、TCR定常領域に挿入されたCARを有し、TCRノックアウトをもたらし、CAR発現を内因性TCRプロモータの制御下に置く。追加の挿入部位には、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、及びTIGITが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、操作されたiPSCに由来するTCRneg/CAR/CFR T細胞は、CD16(F176V及び/又はS197P)に天然な、又はCD64に由来する外部ドメイン、並びに天然又は非天然の膜貫通、刺激、及びシグナル伝達ドメインを有する外因性CD16を更に含む。別の実施形態では、iPSC及びその派生NK細胞はCFR及びCARを含み、CARをNKG2A遺伝子座又はNKG2D遺伝子座に挿入する場合、NKG2A又はNKG2Dノックアウトをもたらし、それにより、CAR発現を内因性NKG2A又はNKG2Dプロモータの制御下に置く。
5.外因的に導入されたサイトカイン及び/又はサイトカインシグナル伝達
臨床的に適切なサイトカインの全身的高用量投与を回避することにより、そのような行為による用量制限毒性のリスクが減少し、サイトカイン媒介性細胞自律性が確立される。可溶性サイトカインを追加投与する必要なしにリンパ球自律性を達成するために、IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21、及び/又はそれらの対応する受容体のうちの1つ以上の部分長又は全長ペプチドが細胞に導入されて、サイトカイン自体の発現を伴って又は伴わずに、サイトカインのシグナル伝達を可能にし得、それによってサイトカインの毒性のリスクを低減して、細胞の増殖(growth)、増殖(proliferation)、増殖(expansion)、及び/又はエフェクター機能を維持又は改善する。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達のための導入されたサイトカイン及び/又はそのそれぞれの天然又は改変された受容体は、細胞表面上で発現する。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達は構成的に活性化される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は誘導可能である。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、一過性及び/又は一時的である。
臨床的に適切なサイトカインの全身的高用量投与を回避することにより、そのような行為による用量制限毒性のリスクが減少し、サイトカイン媒介性細胞自律性が確立される。可溶性サイトカインを追加投与する必要なしにリンパ球自律性を達成するために、IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21、及び/又はそれらの対応する受容体のうちの1つ以上の部分長又は全長ペプチドが細胞に導入されて、サイトカイン自体の発現を伴って又は伴わずに、サイトカインのシグナル伝達を可能にし得、それによってサイトカインの毒性のリスクを低減して、細胞の増殖(growth)、増殖(proliferation)、増殖(expansion)、及び/又はエフェクター機能を維持又は改善する。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達のための導入されたサイトカイン及び/又はそのそれぞれの天然又は改変された受容体は、細胞表面上で発現する。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達は構成的に活性化される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は誘導可能である。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、一過性及び/又は一時的である。
図3は、例示的な例としてIL15を使用した、IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、又はIL21についてのいくつかの構築物設計を提示する。図3の設計のいずれかの膜貫通(transmembrane、TM)ドメインは、IL15受容体に対して天然であり得るか、又は任意の他の膜結合タンパク質の膜貫通ドメインで改変若しくは置換されてもよい。
図3に示されるように、設計1は、IL15及びIL15Rαが、IL15のトランス提示を模倣する自己切断ペプチドを使用して、IL15のシス提示を排除することなく共発現されることを提供する。
図3の設計2に示されるように、IL15Rαはリンカーを介してC末端でIL15に融合されており、IL15のシス提示を排除することなくトランス提示を模倣し、IL15の膜結合を確保する。
図3の設計3に示されるように、短縮化された細胞内ドメインを有するIL15Rαは、リンカーを介してC末端でIL15に融合され、IL15のトランス提示を模倣し、IL15の膜結合を維持し、シス提示及び/又はその細胞内ドメインを介した正常IL15Rによって媒介される他の潜在的なシグナル伝達経路を更に排除する。IL15Rαの細胞内ドメインは、受容体がIL15応答細胞で発現し、応答細胞が増殖して機能するために重要であると考えられている。そのような短縮化構築物は、配列番号17と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、又は99%同一のアミノ酸配列を含み、これは、配列番号18によって表される例示的な核酸配列によってコードされ得る。短縮化IL15/IL15Rαの一実施形態では、構築物は、配列番号17の最後の4アミノ酸残基「KSRQ」を含まず、配列番号21と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、又は99%同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも80%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも90%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも95%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、100%である。
当業者は、上述のシグナルペプチド及びリンカー配列が例示であり、シグナルペプチド又はリンカーとしての使用に好適なそれらのバリエーションを決して限定しないことを理解するであろう。当業者には既知であり利用可能な多くの好適なシグナルペプチド又はリンカー配列が存在する。シグナルペプチド及び/又はリンカー配列が、シグナルペプチドによって導かれるか、又はリンカーによって連結される機能性ペプチドの活性を変えることなく、別の配列で置換され得ることが理解されるであろう。
設計3の構築物は、エフェクター細胞の生存及び増殖の促進において機能的であることが示されたので、図3の設計4は、そのような設計においてIL15を備えたエフェクター細胞の自律的特徴に負の影響を与えることなく、IL15Rαの細胞質ドメインを省くことができることを実証する。したがって、設計4は、設計3の別の実用的な代替案を提供する構成物であり、それから本質的にIL15Rα全体が除去されるが、一端でIL15と融合し、他で膜貫通ドメインと融合し(mb-Sushi)、必要に応じて、Sushiドメインと膜貫通ドメインとの間にリンカーがあるSushiドメインは例外である。融合したIL15/mb-Sushiは、膜結合タンパク質の膜貫通ドメインを介して細胞表面に発現する。設計4などの構築物では、IL15の望ましいトランス提示のみが保持されている場合、シス提示を含む、IL15Rαを介した不要なシグナル伝達が排除される。いくつかの実施形態では、Sushiドメインと融合したIL15を含む成分は、配列番号19に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、又は99%の同一性のアミノ酸配列を含み、これは、配列番号20によって表される例示的な核酸配列によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも80%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも90%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも95%である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、100%である。
当業者は、上述のシグナルペプチド及びリンカー配列が例示であり、シグナルペプチド又はリンカーとしての使用に好適なそれらのバリエーションを決して限定しないことを理解するであろう。当業者には既知であり利用可能な多くの好適なシグナルペプチド又はリンカー配列が存在する。シグナルペプチド及び/又はリンカー配列が、シグナルペプチドによって導かれるか、又はリンカーによって連結される機能性ペプチドの活性を変えることなく、別の配列で置換され得ることが理解されるであろう。
図3の設計5に示されるように、天然又は改変されたIL15Rβは、リンカーを介してC末端でIL15に融合され、構成的シグナル伝達を可能にし、IL15膜結合及びトランス提示を維持する。
図3の設計6に示されるように、天然又は改変された共通受容体γCは、サイトカインの構成的シグナル伝達及び膜結合トランス提示のために、リンカーを介してC末端でIL15に融合される。共通受容体γCは、共通ガンマ鎖又はCD132とも呼ばれ、IL2受容体サブユニットガンマ又はIL2RGとしても知られている。γCは、IL2、IL4、IL7、IL9、IL15及びIL21受容体を含むが、これらに限定されない、多くのインターロイキン受容体の受容体複合体に共通するサイトカイン受容体サブユニットである。
図3の設計7に示されるように、IL15の不在下でホモ二量体を形成する操作されたIL15Rβは、サイトカインの構成的シグナル伝達を生成するのに有用である。
いくつかの実施形態では、サイトカインIL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18及びIL21、並びに/又はそれらの受容体、の3つ以上は、図1に示される設計の1つ以上を使用してiPSCに、及びiPSC分化時にその派生細胞に導入され得る。いくつかの実施形態では、IL2又はIL15の細胞表面発現及びシグナル伝達は、図3の設計1~7のいずれか1つに示される構築物を介する。いくつかの実施形態では、IL4、IL7、IL9、又はIL21の細胞表面発現及びシグナル伝達は、共通受容体又はサイトカイン特異的受容体のいずれかを使用することにより、図3の設計5、6、又は7に示される構築物を介する。いくつかの実施形態では、IL7の細胞表面発現及びシグナル伝達は、共通受容体又はIL4受容体などのサイトカイン特異的受容体のいずれかを使用することにより、図3の設計5、6、又は7に示される構築物を介する。図3の設計のいずれかの膜貫通(TM)ドメインは、それぞれのサイトカイン受容体に対して天然であり得るか、又は任意の他の膜結合タンパク質の膜貫通ドメインで改変若しくは置換されてよい。
人工多能性幹細胞(iPSC)に加えて、本明細書に開示される少なくとも1つの操作されたモダリティを含むクローンiPSC、クローンiPS細胞株、又はiPSC由来細胞が提供される。また、提供されるのは、本セクションに記載されるような外因的に導入されたサイトカイン及び/若しくはサイトカイン受容体シグナル伝達を少なくとも有する、ソーティングされた単一細胞及び増殖されたクローン操作iPSCを含むマスター細胞バンクであり、この細胞バンクは、更なるiPSC操作のためのプラットフォームと、組成が明確かつ均一であり、費用効果の高い様式で大規模に大量生産することができる、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源とを提供する。CARと外因性サイトカイン及び/又はサイトカイン受容体シグナル伝達の両方を含むiPSC及びそれからの派生細胞では、CARとILは別々の構築物で発現されるか、CARとILの両方を含むバイシストロン性構築物において共発現される。いくつかの更なる実施形態では、図3の構築物設計のいずれかによって表される形態のIL15は、例えば、CAR-2A-IL15又はIL15-2A-CARのように例示される自己切断2Aコード配列を介してCAR発現構築物の5’又は3’末端のいずれかに連結され得る。そのため、IL15とCARは単一のオープンリーディングフレーム(open reading frame、ORF)にあり得る。一実施形態では、CAR-2A-IL15又はIL15-2A-CAR構築物は、図3の設計3に示されるようなIL15を含む。別の実施形態では、CAR-2A-IL15又はIL15-2A-CAR構築物は、図3の設計4に示されるようなIL15を含む。更に別の実施形態では、CAR-2A-IL15又はIL15-2A-CAR構築物は、図3の設計7に示されるようなIL15を含む。CAR-2A-IL15又はIL15-2A-CARが発現すると、自己切断2Aペプチドにより、発現されたCARとIL15が解離し、解離したIL15を細胞表面に提示することができるようになる。CAR-2A-IL15又はIL15-2A-CARのバイシストロン性設計により、タイミングと数量の両方で、例えば、単一のORFの発現のための誘導可能なプロモータなどの、組み込むために選択され得る同一の制御メカニズムの下で、CARとIL15の協調された発現を可能にする。自己切断ペプチドは、口蹄疫ウイルス(foot-and-mouth disease virus、FMDV)、ウマ鼻炎Aウイルス(equine rhinitis A virus、ERAV)、Thosea asignaウイルス(Thosea asigna virus、TaV)、及びブタテシオウイルス1(porcine tescho virus-1、PTV-I)(Donnelly,ML,et al,J.Gen.Virol,82,1027-101(2001);Ryan,MD,et al.,J.Gen.Virol.,72,2727-2732(2001))などのアフトウイルス属、並びにタイロウイルス(例えば、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス)及び脳心筋炎ウイルスなどのカルジオウイルス属を含む、ピコルナウイルス科(Picornaviridae virus family)のメンバーにおいて見出される。FMDV、ERAV、PTV-1、及びTaVに由来する2Aペプチドは、それぞれ「F2A」、「E2A」、「P2A」、及び「T2A」と称されることもある。
IL15について本明細書に開示されるバイシストロン性CAR-2A-IL15又はIL15-2A-CARの実施形態は、本明細書で提供される他の任意のサイトカイン、例えばIL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL18、及びIL21の発現も企図される。いくつかの実施形態では、IL2の細胞表面発現及びシグナル伝達は、図3の設計1~7のいずれかに示される構築物を介する。いくつかの他の実施形態では、IL4、IL7、IL9、又はIL21の細胞表面発現及びシグナル伝達は、共通受容体及び/又はサイトカイン特異的受容体のいずれかを使用する、図3の設計5、6、又は7に示される構築物を介する。
CARと、IL15を含むがこれに限定されない外因性サイトカイン及び/又はサイトカイン受容体シグナル伝達との両方を含むiPSC及びそれからの派生細胞において、iPSC及び派生細胞は、CFR、TCRneg、及び/又は外因性CD16を更に含み得る。
6.HLA-I-及びHLA-II-の欠損
同種拒絶の問題を回避するために、複数のHLAクラスI及びクラスIIタンパク質は、同種異系レシピエントの組織適合性のために一致している必要がある。本明細書で提供されるのは、HLAクラスI及びHLAクラスIIタンパク質の両方の発現が排除又は実質的に減少したiPSC細胞株及びそれから分化したその派生細胞である。HLAクラスI欠損は、HLAクラスI遺伝子座(染色体6p21)の任意の領域の機能的欠失、又はベータ2ミクログロブリン(beta-2 microglobulin、B2M)遺伝子、TAP1遺伝子、TAP2遺伝子、及びタパシンを含むが、これらに限定されない、HLAクラスI関連遺伝子の欠失若しくは発現レベルの低下によって達成できる。例えば、B2M遺伝子は、全てのHLAクラスIヘテロ二量体の細胞表面発現に不可欠な共通のサブユニットをコードする。B2M陰性細胞はHLA-I欠損である。HLAクラスII欠損は、RFXANK、CIITA、RFX5、及びRFXAPを含むがこれらに限定されないHLA-II関連遺伝子の機能的欠失又は減少によって達成され得る。CIITAは転写コアクチベータであり、クラスIIタンパク質の発現に必要な転写因子RFX5の活性化を通じて機能する。CIITA陰性細胞はHLA-II欠損である。本明細書で提供されるのは、例えばB2M及びCIITA発現の両方を欠いたHLA-I及びHLA-II欠損の両方を有するiPSC系統とその派生細胞であり、取得された派生エフェクター細胞は、MHC(主要組織適合性複合体)マッチングの必要性を排除して宿主の(同種異系)T細胞による認識と殺傷を回避することによって、同種異系細胞治療を可能にする。
同種拒絶の問題を回避するために、複数のHLAクラスI及びクラスIIタンパク質は、同種異系レシピエントの組織適合性のために一致している必要がある。本明細書で提供されるのは、HLAクラスI及びHLAクラスIIタンパク質の両方の発現が排除又は実質的に減少したiPSC細胞株及びそれから分化したその派生細胞である。HLAクラスI欠損は、HLAクラスI遺伝子座(染色体6p21)の任意の領域の機能的欠失、又はベータ2ミクログロブリン(beta-2 microglobulin、B2M)遺伝子、TAP1遺伝子、TAP2遺伝子、及びタパシンを含むが、これらに限定されない、HLAクラスI関連遺伝子の欠失若しくは発現レベルの低下によって達成できる。例えば、B2M遺伝子は、全てのHLAクラスIヘテロ二量体の細胞表面発現に不可欠な共通のサブユニットをコードする。B2M陰性細胞はHLA-I欠損である。HLAクラスII欠損は、RFXANK、CIITA、RFX5、及びRFXAPを含むがこれらに限定されないHLA-II関連遺伝子の機能的欠失又は減少によって達成され得る。CIITAは転写コアクチベータであり、クラスIIタンパク質の発現に必要な転写因子RFX5の活性化を通じて機能する。CIITA陰性細胞はHLA-II欠損である。本明細書で提供されるのは、例えばB2M及びCIITA発現の両方を欠いたHLA-I及びHLA-II欠損の両方を有するiPSC系統とその派生細胞であり、取得された派生エフェクター細胞は、MHC(主要組織適合性複合体)マッチングの必要性を排除して宿主の(同種異系)T細胞による認識と殺傷を回避することによって、同種異系細胞治療を可能にする。
一部の細胞型では、HLAクラスI発現の欠如がNK細胞による溶解を引き起こす。この「自己喪失」応答を克服するために、HLA-Gを必要に応じてノックインして、操作されたiPSCに由来するHLA-I欠損エフェクター細胞のNK細胞の認識と殺傷を回避することができる。一実施形態では、HLA-I欠損iPSC及びその派生細胞は、HLA-Gノックインを更に含む。いくつかの実施形態では、提供されるHLA-I欠損iPSC及びその派生細胞は、CD58ノックアウト及びCD54ノックアウトの一方又は両方を更に含む。CD58(又はLFA-3)及びCD54(又はICAM-1)は、シグナル依存性細胞相互作用を開始し、免疫細胞を含む、細胞の遊走を促進する接着タンパク質である。CD58ノックアウトは、CD54ノックアウトよりも同種異系NK細胞活性化の低減において高い効率を有するが、一方、CD58及びCD54の両方の二重ノックアウトは、NK細胞活性化の最も増強された低減を有することが示された。いくつかの観察において、CD58及びCD54二重ノックアウトは、「自己喪失」効果を克服することにおいて、HLA-I欠損細胞に対するHLA-G過剰発現よりも更に効果的である。
本明細書で提供されるように、いくつかの実施形態では、HLA-I及びHLA-II欠損iPSC並びにその派生細胞は、HLA-Gをコードする外因性ポリヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、HLA-I及びHLA-II欠損iPSC並びにその派生細胞は、CD58 nullである。いくつかの他の実施形態では、HLA-I及びHLA-II欠損iPSC並びにその派生細胞は、CD54 nullである。更にいくつかの他の実施形態では、HLA-I及びHLA-II欠損iPSC並びにその派生細胞は、CD58 null及びCD54 nullである。
7.CD38ノックアウト
細胞表面分子CD38は、多発性骨髄腫及びCD20陰性B細胞性悪性腫瘍を含む、リンパ系と骨髄系の両方に由来する多発性血液系悪性腫瘍で高度に上方制御されており、これによりがん細胞を枯渇させる抗体治療の魅力的なターゲットとなっている。抗体を介したがん細胞の枯渇は、通常、直接的な細胞アポトーシスの誘導とADCC(抗体依存性細胞傷害)などの免疫エフェクターメカニズムの活性化との組み合わせに起因する。ADCCに加えて、治療用抗体と連携した免疫エフェクターメカニズムには、抗体依存性細胞媒介性食作用(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis、ADCP)及び/又は補体依存性細胞傷害性(complement-dependent cytotoxicity、CDC)も含まれ得る。
細胞表面分子CD38は、多発性骨髄腫及びCD20陰性B細胞性悪性腫瘍を含む、リンパ系と骨髄系の両方に由来する多発性血液系悪性腫瘍で高度に上方制御されており、これによりがん細胞を枯渇させる抗体治療の魅力的なターゲットとなっている。抗体を介したがん細胞の枯渇は、通常、直接的な細胞アポトーシスの誘導とADCC(抗体依存性細胞傷害)などの免疫エフェクターメカニズムの活性化との組み合わせに起因する。ADCCに加えて、治療用抗体と連携した免疫エフェクターメカニズムには、抗体依存性細胞媒介性食作用(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis、ADCP)及び/又は補体依存性細胞傷害性(complement-dependent cytotoxicity、CDC)も含まれ得る。
CD38はまた、悪性細胞で高度に発現する以外に、形質細胞並びにNK細胞、活性化T細胞及びB細胞にも発現する。造血中、CD38は、CD34+幹細胞と、リンパ系、赤血球系、及び骨髄系の系統にコミットした前駆細胞、並びに形質細胞段階まで続く成熟の最終段階中で発現する。II型膜貫通型糖タンパク質であるCD38は、受容体及びヌクレオチド代謝産物の生産に関与する多機能酵素の両方として細胞機能を果たす。酵素として、CD38は合成とNAD+からADP-リボースへの反応の加水分解を触媒し、これによって、カルシウム依存性である、細胞接着のプロセスに重要である、小胞体とリソソームからのカルシウムの放出を刺激する二次メッセンジャーCADPRとNAADPを生成する。CD38は受容体としてCD31を認識し、活性化されたNK細胞のサイトカイン放出と細胞傷害性を調節する。CD38は、脂質ラフトの細胞表面タンパク質と会合し、細胞質のCa2+フラックスを調節し、リンパ系及び骨髄系細胞のシグナル伝達を媒介することも報告されている。
悪性腫瘍の治療では、CD38抗原結合受容体で形質導入されたT細胞を全身的に使用すると、CD34+造血前駆細胞、単球、NK細胞、T細胞、及びB細胞のCD38+画分が溶解し、レシピエントの免疫エフェクター細胞機能が損なわれるため、治療応答が不完全になり、効力が低下又は排除されることが示されている。加えて、CD38特異的抗体であるダラツムマブで治療された多発性骨髄腫患者では、骨髄と末梢血の両方でNK細胞の減少が観察されたが、T細胞やB細胞などの他の免疫細胞型は、CD38の発現にもかかわらず影響を受けなかった(Casneuf et al.,Blood Advances.2017;1(23):2105-2114)。理論に拘束されることなく、本出願は、CD38特異的抗体及び/又はCD38抗原結合ドメインが誘導するフラトリサイドを通じたエフェクター細胞の枯渇又は減少を克服することにより、CD38標的化がん治療の潜在能力を最大限に活用する戦略を提供する。加えて、CD38はT細胞やB細胞などの活性化リンパ球で上方制御されるため、同種異系エフェクター細胞のレシピエントでダラツムマブなどのCD38特異的抗体を使用してこれらのレシピエントリンパ球の活性化を抑制することにより、これらのエフェクター細胞に対する同種拒絶反応が減少し、及び/又は防止され、それによってエフェクター細胞の生存率と持続性を増加させる。このように、本出願はまた、多くの場合、養子細胞移入の前に、レシピエントT細胞及びB細胞の活性化、すなわち、活性化されたT細胞及びB細胞のリンパ球枯渇に対するCD38特異的抗体、分泌型CD38特異的エンゲージャ又はCD38 CAR(キメラ抗原受容体)を使用することによる同種拒絶反応の低減又は防止を通じてエフェクター細胞の持続性及び/又は生存率を増強する戦略を提供する。具体的には、提供される戦略は、CD38ノックアウトiPSC株、ソーティングされた単一細胞及び増殖されたクローンCD38陰性iPSCを含むマスター細胞バンクを生成すること、並びに操作されたiPSC株の指向性分化を通じてCD38陰性(CD38neg)派生エフェクター細胞を得ることを含み、派生エフェクター細胞は、CD38標的化治療部分がエフェクター細胞とともに使用される場合、他の利点の中でもとりわけ、フラトリサイド及び同種拒絶反応から保護される。加えて、抗CD38モノクローナル抗体療法は、患者の造血幹細胞区画に悪影響を及ぼすことなく、患者の活性化免疫系を有意に枯渇させる。CD38陰性派生細胞は、CD38抗体媒介性枯渇に抵抗する能力を有し、毒性コンディショニング剤を使用せずに抗CD38又はCD38-CARと組み合わせて有効に投与することができ、したがって化学療法に基づくリンパ球枯渇を低減及び/又は置換することができる。
本明細書で提供される一実施形態では、iPSC株におけるCD38ノックアウトは、二対立遺伝子ノックアウトである。本明細書に開示されるように、提供されるCD38陰性iPSC株は、少なくともCFRと、必要に応じて、TCRneg、hnCD16、CAR、外因性サイトカイン又はその融合バリアント、並びにHLA-I及び/又はHLA-II欠損のうちの1つ以上と、を更に含み、当該iPSCは、免疫エフェクター細胞を含むが、これに限定されない機能的派生造血細胞を産生するように分化誘導することができる。いくつかの実施形態では、抗CD38抗体を使用してADCCを誘導するか、又は抗CD38 CARを標的化細胞殺傷に使用する場合、CD38neg iPSC及び/又はその派生エフェクター細胞は抗CD38抗体、抗CD38 CAR、又はレシピエント活性化T細胞若しくはB細胞によって排除されず、これにより、そのような治療部分の存在下及び/又は曝露後のiPSC及びそのエフェクター細胞の持続性及び/又は生存率を増加させる。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、そのような治療部分の存在下で、及び/又は曝露後の、インビボでの持続性及び/又は生存率が増加している。
8.追加の改変
いくつかの実施形態では、CFRと、TCRneg、CD16、CAR、IL、HLA-I及び/又はHLA-II欠損、並びにCD38-/-のうちの1つ以上と、を含むiPSC及びその派生エフェクター細胞は、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP、RAG1、及び染色体6p21領域中の任意の遺伝子のうちの少なくとも1つの破壊、又はHLA-E、4-1BBL、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、TCR、Fc受容体、抗体、エンゲージャ、及び二重特異性、多重特異性、若しくはユニバーサルエンゲージャとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも1つの導入、を更に含み得る。
いくつかの実施形態では、CFRと、TCRneg、CD16、CAR、IL、HLA-I及び/又はHLA-II欠損、並びにCD38-/-のうちの1つ以上と、を含むiPSC及びその派生エフェクター細胞は、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP、RAG1、及び染色体6p21領域中の任意の遺伝子のうちの少なくとも1つの破壊、又はHLA-E、4-1BBL、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、TCR、Fc受容体、抗体、エンゲージャ、及び二重特異性、多重特異性、若しくはユニバーサルエンゲージャとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも1つの導入、を更に含み得る。
二重特異性又は多重特異性エンゲージャは、異なる抗体の2つ以上の単鎖可変断片(single-chain variable fragment、scFv)、又は他の機能的バリアントからなる融合タンパク質であり、少なくとも1つのscFvがエフェクター細胞表面分子又は表面トリガー受容体に結合し、少なくとも別の1つが腫瘍特異的表面分子を介して腫瘍細胞に結合する。いくつかの実施形態では、表面トリガー受容体は、エフェクター細胞の天然受容体及び細胞型とは無関係に、エフェクター細胞と特異的な標的細胞、例えば腫瘍細胞との間の二重特異性抗体又は多重特異性抗体の結合を促進する。いくつかの他の実施形態では、本明細書において提供される方法及び組成物を使用して、すなわち、iPSCを更に操作し、必要に応じて、単一細胞選別及び増殖されたクローン操作iPSCを含むマスター細胞バンクを生成し、その後、T細胞、NK細胞、又はソースiPSCと同一の遺伝子型を含む任意の他のエフェクター細胞へのiPSCの分化を指示することによって、1つ以上の外因性表面トリガー受容体をエフェクター細胞に導入することができる。
このアプローチを使用すると、ユニバーサル表面トリガー受容体を含むiPSCを生成し、そのようなiPSCをユニバーサル表面トリガー受容体を発現する様々なエフェクター細胞型の集団に分化させることもできる。いくつかの実施形態では、同じ腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャを使用して、異なるユニバーサル表面トリガー受容体とカップリングする。いくつかの実施形態では、異なる腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャを使用して、同じユニバーサル表面トリガー受容体とカップリングする。したがって、1つ以上のエフェクター細胞型を使用して、ある特異的な型の腫瘍細胞を殺傷する場合もあれば、2つ以上の型の腫瘍を殺傷する場合もある。表面トリガー受容体は、一般に、エフェクター細胞活性化のための共刺激ドメインと、エンゲージャのエピトープに特異的な抗エピトープと、を含むか、又はその逆であり、表面トリガー受容体は、エンゲージャの抗エピトープに認識可能又は特異的なエピトープを含む。例えば、二重特異性エンゲージャは、一方の端の表面トリガー受容体の抗エピトープに特異的であり、もう一方の端の腫瘍抗原に特異的である。エンゲージャの例には、二重特異性T細胞エンゲージャ(BiTE)、二重特異性キラー細胞エンゲージャ(BiKE)、三重特異性キラー細胞エンゲージャ(TriKE)、多重特異性キラー細胞エンゲージャ、及び複数の免疫細胞型と適合し得るユニバーサルエンゲージャが含まれるが、これらに限定されない。TriKEの非限定的な例は、米国特許出願公開第2018/0282386号を参照されたい。
本明細書で提供されるように、開示されるCFRの様々な形態は、他の機能の中でも、エンゲージャ認識のための細胞表面トリガー受容体として適用可能である。加えて、本明細書で提供されるように、開示されるCD3ベースのCFRを含む細胞表面提示CD3分子の様々な形態は、他の機能の中でも、エンゲージャ認識のためのCD3関連細胞表面トリガー受容体として適用可能であり、これは、発現されたCD3分子が発現にもかかわらず細胞表面上に存在しないようなTCR陰性である細胞において特に有用である。
CFR又はcs-CD3以外に、二重若しくは多重特異性エンゲージャ認識、又はカップリング、又は結合のために使用することができる更なるエフェクター細胞表面分子、又は表面トリガー受容体としては、CD28、CD5、CD16、CD64、CD32、CD33、CD89、NKG2C、NKG2D、又は本明細書に開示されるそれらの任意の機能的バリアント若しくはキメラ受容体形態が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、エンゲージャ認識のためにエフェクター細胞の表面に発現するCD16は、本明細書に記載されるような、CD16(F176V及び必要に応じてS197Pを含む)又はCD64細胞外ドメイン、並びに天然又は非天然の膜貫通、刺激及び/又はシグナル伝達ドメインを含むhnCD16である。いくつかの実施形態では、エンゲージャ認識のためにエフェクター細胞の表面に発現するCD16は、CD16ベースのキメラFc受容体(CFcR)である。いくつかの実施形態では、CD16ベースのCFcRは、NKG2Dの膜貫通ドメイン、2B4の刺激ドメイン、及びCD3ζのシグナル伝達ドメインを含み、CD16の細胞外ドメインは、CD64又はCD16の細胞外ドメインの全長又は部分配列に由来し、必要に応じて、CD16の細胞外ドメインは、F176V及び必要に応じてS197Pを含む。
二重特異性又は多重特異性エンゲージャ認識のための例示的な腫瘍細胞表面分子には、B7H3、BCMA、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、PSMA、PAMA、P-カドヘリン、及びROR1が含まれるが、これらに限定されない。
上記を考慮して、エフェクター細胞上のCD3と係合するために、一実施形態では、二重特異性抗体はCD3-CD19であり、別の実施形態では、二重特異性抗体はCD3-CD33である。エフェクター細胞上のCD16に係合するために、二重特異性抗体は、CD16-CD30又はCD64-CD30である。別の実施形態では、二重特異性抗体は、CD16-BCMA又はCD64-BCMAである。更に別の実施形態では、二重特異性抗体は、エフェクター細胞と腫瘍細胞抗原結合ドメインの間にリンカーを更に含み、例えば、改変IL15を、エフェクター細胞増殖を促進するエフェクターNK細胞のリンカーとして(いくつかの刊行物では、TriKE、又は三重特異性キラーエンゲージャと呼ばれる)使用してもよい。一実施形態では、TriKEはCD16-IL15-EPCAM又はCD64-IL15-EPCAMである。別の実施形態では、TriKEはCD16-IL15-CD33又はCD64-IL15-CD33である。更に別の実施形態では、TriKEはNKG2C-IL15-CD33である。TriKEにおけるIL15はまた、IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL18、及びIL21を含むが、これらに限定されない、他のサイトカインに由来し得る。
9.本明細書において提供される遺伝子操作されたiPSC株とiPSC由来細胞
上記に照らして、本出願は、CFRをコードするポリヌクレオチドを少なくとも含む、細胞又はその集団であって、当該細胞が、真核細胞、動物細胞、ヒト細胞、人工多能性幹細胞(iPSC)、iPSC由来エフェクター細胞、免疫細胞、又はフィーダ細胞である、細胞又はその集団を提供する。また、本明細書に記載される表現型を有する単一細胞選別及び増殖されたクローン操作iPSCを含むマスター細胞バンクも提供され、細胞バンクは、組成が明確かつ均一であり、費用効率の高い様式で大規模に大量生産することができる、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供する。いくつかの実施形態では、iPSC由来細胞は造血細胞であり、決定的な造血内皮(HE)の可能性を有する中胚葉細胞、決定的なHE、CD34造血細胞、造血幹前駆細胞、造血多能性前駆体(multipotent progenitor、MPP)、T細胞前駆体、NK細胞前駆体、骨髄細胞、好中球前駆体を含むがこれらに限定されず、かつ/又はT細胞、NKT細胞、NK細胞、B細胞、好中球、樹状細胞、及びマクロファージと特質を共有する。いくつかの実施形態では、iPSC由来造血細胞は、少なくともCFRを発現する免疫エフェクター細胞を含む。本明細書では、CFRをコードするポリヌクレオチドと、TCRneg、外因性CD16、標的特異的CAR、HLA-Iの欠損及び/若しくはHLA-IIの欠損、サイトカイン及び/若しくはその受容体又はそれらのバリアントを含むサイトカインシグナル伝達複合体、並びにCD38ノックアウト、のうちの1つ以上と、を含む細胞が更に提供され、iPSCは、分化誘導されて、機能的派生造血細胞を産生することができる。いくつかの実施形態では、機能的派生造血細胞は、免疫エフェクター細胞である。いくつかの実施形態では、機能的派生免疫エフェクター細胞は、NK細胞及び/又はT細胞と特質を共有する。いくつかの実施形態では、NK細胞及び/又はT細胞と特質を共有する機能的派生免疫エフェクター細胞は、NK細胞又はT細胞ではない。
上記に照らして、本出願は、CFRをコードするポリヌクレオチドを少なくとも含む、細胞又はその集団であって、当該細胞が、真核細胞、動物細胞、ヒト細胞、人工多能性幹細胞(iPSC)、iPSC由来エフェクター細胞、免疫細胞、又はフィーダ細胞である、細胞又はその集団を提供する。また、本明細書に記載される表現型を有する単一細胞選別及び増殖されたクローン操作iPSCを含むマスター細胞バンクも提供され、細胞バンクは、組成が明確かつ均一であり、費用効率の高い様式で大規模に大量生産することができる、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供する。いくつかの実施形態では、iPSC由来細胞は造血細胞であり、決定的な造血内皮(HE)の可能性を有する中胚葉細胞、決定的なHE、CD34造血細胞、造血幹前駆細胞、造血多能性前駆体(multipotent progenitor、MPP)、T細胞前駆体、NK細胞前駆体、骨髄細胞、好中球前駆体を含むがこれらに限定されず、かつ/又はT細胞、NKT細胞、NK細胞、B細胞、好中球、樹状細胞、及びマクロファージと特質を共有する。いくつかの実施形態では、iPSC由来造血細胞は、少なくともCFRを発現する免疫エフェクター細胞を含む。本明細書では、CFRをコードするポリヌクレオチドと、TCRneg、外因性CD16、標的特異的CAR、HLA-Iの欠損及び/若しくはHLA-IIの欠損、サイトカイン及び/若しくはその受容体又はそれらのバリアントを含むサイトカインシグナル伝達複合体、並びにCD38ノックアウト、のうちの1つ以上と、を含む細胞が更に提供され、iPSCは、分化誘導されて、機能的派生造血細胞を産生することができる。いくつかの実施形態では、機能的派生造血細胞は、免疫エフェクター細胞である。いくつかの実施形態では、機能的派生免疫エフェクター細胞は、NK細胞及び/又はT細胞と特質を共有する。いくつかの実施形態では、NK細胞及び/又はT細胞と特質を共有する機能的派生免疫エフェクター細胞は、NK細胞又はT細胞ではない。
CFRをコードするポリヌクレオチドを少なくとも含む細胞のいくつかの実施形態では、細胞は、TCRnegである。本明細書で使用されるとき、TCRnegは、TCR陰性、TCR-/-、「TCR null」、又はTCRノックアウトとも称され、天然に(例えば、NK細胞又はiPSC由来NK細胞)、遺伝子発現調節によって、又はiPSC細胞(例えば、iPSC、T細胞からリプログラミングされたiPSC(TiPSC))若しくは内因性TCR又はその1つ以上のサブユニットをノックアウトするためのT細胞のゲノム編集によって、あるいはTCRがノックアウトされたiPSCから分化したTCR陰性派生細胞を得ることによって、内因性TCRを発現しない細胞を含む。したがって、開示される細胞においてノックアウトされるTCRは、内因性TCR複合体である。細胞中のTCRのTCRα又はTCRβのいずれかの定常領域の発現を破壊することは、細胞の内因性TCR複合体をノックアウトする多くの方法のうちの1つである。TCRneg細胞は、TCRneg細胞において全てのCD3サブユニットを発現しているにもかかわらず、細胞表面にCD3複合体を提示することができないことが発見され、これは、細胞表面CD3認識、結合及び/又はシグナル伝達を必要とする細胞機能に悪影響を及ぼす。CFRをコードするポリヌクレオチドを含むTCRneg細胞のいくつかの実施形態では、CFRは、CD3ベースである。いくつかの実施形態では、CFRをコードするポリヌクレオチドを含むTCRneg細胞は、発現された場合、細胞表面CD3複合体、又はその1つ以上のサブユニット若しくはサブドメイン(cs-CD3)も含む。CFR TCRneg cs-CD3遺伝子型を有する細胞のいくつかの実施形態では、CFRは、CD3ベースではない。CFR TCRneg cs-CD3遺伝子型を有する細胞のいくつかの他の実施形態では、CFRは、CD3ベースである。CD3ベースのCFRに加えて、TCRneg細胞における、本明細書に開示される細胞表面CD3複合体、又はその1つ以上のサブユニット若しくはサブドメイン(cs-CD3)は、抗体若しくはその機能的バリアント、及び/又は本明細書に記載されるエンゲージャを含むがこれらに限定されない分子と結合するためのCD3関連細胞表面トリガー受容体として機能することができる。
本明細書で提供されるのは、発現されたときに細胞表面CD3複合体、又はその1つ以上のサブユニット若しくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含むiPSC又はiPSC由来細胞であって、当該細胞が、必要に応じてTCR陰性である、iPSC又はiPSC由来細胞である。cs-CD3が発現されると、それはCD3関連細胞表面トリガー受容体として機能する。TCRneg細胞において提供されるCD3関連表面トリガー受容体のいくつかの実施形態では、受容体は、発現されるとエフェクター細胞表面提示される完全又は部分的な内因性CD3分子に含まれ、内因性CD3分子の提示は、そうでなければ、発現されてもTCRneg細胞において起こらず、本出願において提供される外因性TCRα、外因性TCRβ、及びそれらの任意のバリアントの全長又は部分長のうちの1つ以上を含む組換えTCRとのその会合によって可能になる。いくつかの実施形態では、TCRneg細胞における完全又は部分的な内因性CD3分子の細胞表面提示は、当該細胞において、少なくとも、非結合性組換えTCR(nb-rTCR)、定義された組換えTCR(d-rTCR)及び/又は組換えプレTCRを含む組換えTCRを更に発現させることによって可能になる。
いくつかの実施形態において、CD3関連表面トリガー受容体を含むTCRneg細胞は、非結合組換えTCR(nb-rTCR)を含み、nb-rTCRは、tgTRAC(トランスジェニックTCRα定常領域)及びtgTRBC(トランスジェニックTCRβ定常領域)の一方又は両方を含む。したがって、TCRneg iPSC又はiPSC由来細胞は、tgTRAC及び/又はtgTRBCをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。tgTRACをコードするポリヌクレオチドを含むTCRnegのいくつかの実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、TRAC遺伝子座に挿入され、挿入されたポリヌクレオチドは、内因性TRACの発現を破壊し、それによって内因性TCRノックアウトをもたらし、必要に応じて、挿入されたポリヌクレオチドは、TRACの内因性プロモータ又は異種プロモータによって駆動される。tgTRBCをコードするポリヌクレオチドを含むTCRnegのいくつかの実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、TRBC遺伝子座に挿入され、挿入されたポリヌクレオチドは、内因性TRBCの発現を破壊し、それによって内因性TCRノックアウトをもたらし、必要に応じて、挿入されたポリヌクレオチドは、TRBCの内因性プロモータ又は異種プロモータによって駆動される。
いくつかの実施形態では、CD3関連表面トリガー受容体を含むTCRneg細胞は、定義された組換えTCR(d-rTCR)を含み、d-rTCRは、tgTCRα(トランスジェニックTCRα)及びtgTCRβ(トランスジェニックTCRβ)を含み、tgTCRα及びtgTCRβの各々は、それぞれの定常領域(すなわち、TRAC及びTRBC)に加えて、それぞれの定義された可変領域を含み、したがって、TCRnegiPSC又はiPSC由来細胞は、tgTCRα及び/又はtgTCRβをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、定義された可変領域は、既知のTCR特異性を有するT細胞のTCRα及びTCRβに由来する。いくつかの実施形態では、定義された可変領域は、インバリアントNKT細胞のTCRα及びTCRβに由来する。tgTCRαをコードするポリヌクレオチドを含むTCRnegのいくつかの実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、TRAC遺伝子座に挿入され、挿入されたポリヌクレオチドは、内因性TRACの発現を破壊し、それによって内因性TCRノックアウトをもたらし、必要に応じて、挿入されたポリヌクレオチドは、TRACの内因性プロモータ又は異種プロモータによって駆動される。tgTCRβをコードするポリヌクレオチドを含むTCRneg細胞のいくつかの実施形態では、当該ポリヌクレオチドはTRBC遺伝子座に挿入され、挿入されたポリヌクレオチドは内因性TRBCの発現を破壊し、それによって内因性TCRノックアウトをもたらし、必要に応じて、挿入されたポリヌクレオチドはTRBCの内因性プロモータ又は異種プロモータによって駆動される。
いくつかの実施形態では、CD3関連表面トリガー受容体を含むTCRneg細胞は、組換えプレTCR(p-rTCR)を含み、p-rTCRは、tgpTCRα(トランスジェニックプレTCR)、及び必要に応じてtgTRBC又はtgTCRβを含み、tgTCRβは、定義された可変領域を含み、したがって、TCRnegiPSC又はiPSC由来細胞は、少なくとも、tgpTCRαをコードするポリヌクレオチドを含む。tgpTCRαをコードするポリヌクレオチドを含むTCRnegのいくつかの実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、TRAC遺伝子座に挿入され、挿入されたポリヌクレオチドは、内因性TRACの発現を破壊し、それによって内因性TCRノックアウトをもたらし、必要に応じて、挿入されたポリヌクレオチドは、TRACの内因性プロモータ又は異種プロモータによって駆動される。tgpTCRαに加えてtgTRBC又はtgTCRβをコードするポリヌクレオチドを含むTCRneg細胞のいくつかの実施形態では、当該tgTRBC又はtgTCRβをコードするポリヌクレオチドは、TRBC遺伝子座に挿入され、挿入されたポリヌクレオチドは、内因性TRBCの発現を破壊し、それによって内因性TCRノックアウトをもたらし、必要に応じて、挿入されたtgTRBC又はtgTCRβをコードするポリヌクレオチドは、TRBCの内因性プロモータ又は異種プロモータによって駆動される。
TCRneg細胞におけるCD3関連表面トリガー受容体のいくつかの実施形態では、受容体は、CD3ε、CD3δ、及びCD3γのうちの1つ以上に由来する少なくとも1つの外因性サブユニット又はサブドメインを含む完全又は部分的なCD3分子に含まれる。一実施形態では、TCRneg細胞におけるエンゲージャ認識のためのCD3関連表面トリガー受容体は、CD3εの全長又は部分長の外部ドメインを少なくとも含む部分的なCD3分子に含まれる。一実施形態では、TCRneg細胞におけるエンゲージャ認識のためのCD3関連表面トリガー受容体は、少なくともCD3εの全長又は部分長の外部ドメイン、更にCD3γ又はCD3δの全長又は部分長の外部ドメインを含む部分的なCD3分子に含まれる。一実施形態では、当該CD3分子は、CD3ε、CD3γ及び/又はCD3δの外部ドメインの少なくとも全長又は部分長を含み、外部ドメインの全長又は部分長は、TCRα又はTCRβの定常領域と融合しており、各々TRAC又はTRBCを含む部分融合タンパク質は、内因性CD3ζとヘテロ二量体を形成することができる。したがって、CD3関連表面トリガー受容体を有するTCRnegiPSC又はiPSC由来細胞の一実施形態では、細胞は、(i)CD3ε及びCD3δの外部ドメインの全長部分長と、TCRα定常領域と、を含むトランスジェニック融合タンパク質(tgCD3(ε-δ)-TRAC)、(ii)CD3ε及びCD3γの外部ドメインの全長又は部分長と、TCRβ定常領域と、を含むトランスジェニック融合タンパク質(tgCD3(ε-γ)-TRBC)、(iii)CD3ε及びCD3γの外部ドメインの全長又は部分長と、TCRα定常領域と、を含むトランスジェニック融合タンパク質(tgCD3(ε-γ)-TRAC)、及び/又は(iv)CD3ε及びCD3δの外部ドメインの全長又は部分長と、TCRβ定常領域と、を含むトランスジェニック融合タンパク質(tgCD3(ε-δ)-TRBC)、のうちの少なくとも1つを含む。CD3関連表面トリガー受容体を有するTCRneg細胞のいくつかの実施形態では、細胞は、少なくともCD3εの全長又は部分長の外部ドメインと融合したTCRα定常領域を含むトランスジェニック融合タンパク質と、少なくともCD3εの全長又は部分長の外部ドメインと融合したTCRβ定常領域を含むトランスジェニック融合タンパク質と、を含むヘテロ二量体を含む。
TCRneg細胞におけるCD3関連表面トリガー受容体のいくつかの実施形態では、受容体は、シグナル伝達及び/又は共刺激のための、CD3ε、CD3δ、CD3γ、及び/又はCD3ζの1つ以上からの少なくとも1つの外因性サブユニット又はサブドメインと、必要に応じて2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγIL21R、IL-2Rβ(IL-15Rβ)、IL-2Rγ、IL-7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD3ζ1XX、CS1、又はCD8の1つ以上のシグナル伝達ドメインと、を含む完全又は部分的なCD3分子に含まれ、シグナル伝達ドメインを含む全てのサブユニット又はサブドメインは、融合してキメラ鎖を形成する。一実施形態では、TCRneg細胞におけるエンゲージャ認識のためのCD3関連表面トリガー受容体は、CD3εの全長又は部分長の外部ドメインと、CD3δ及びCD3γの一方又は両方の全長又は部分長の外部ドメインと、CD3ζの全長又は部分長の内部ドメインと、を少なくとも含むCD3キメラ鎖に含まれる。一実施形態では、TCRneg細胞におけるエンゲージャ認識のためのCD3関連表面トリガー受容体は、CD3εの全長又は部分長の外部ドメインと、CD3δ及びCD3γの一方又は両方の全長又は部分長の外部ドメインと、CD3ζの全長又は部分長の内部ドメインと、を含むCD3キメラ鎖に含まれ、CD28及び4-1BBLの一方又は両方の細胞質シグナル伝達ドメインを更に含む。したがって、CD3関連表面トリガー受容体を有するTCRnegiPSC又はiPSC由来細胞の一実施形態では、細胞は、(i)CD3ε及びCD3γの外部ドメインの全長若しくは部分長と、CD3ζの内部ドメインの全長若しくは部分長と、を含むトランスジェニック融合タンパク質[tgCD3(ε-γ)-ζ]、(ii)CD3ε及びCD3δの外部ドメインの全長若しくは部分長と、CD3ζの内部ドメインの全長若しくは部分長と、を含むトランスジェニック融合タンパク質[tgCD3(ε-δ)-ζ]、(iii)CD3εの全長若しくは部分長の外部ドメインを含むトランスジェニック融合タンパク質、CD3γ若しくはCD3δの全長若しくは部分長の外部ドメインと、CD3ζの全長若しくは部分長の内部ドメインと、CD28のシグナル伝達ドメインと、を含むトランスジェニック融合タンパク質[tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ]、(iv)CD3εの全長若しくは部分長の外部ドメインを含むトランスジェニック融合タンパク質、CD3γ若しくはCD3δの全長若しくは部分長の外部ドメインと、CD3ζの全長若しくは部分長の内部ドメインと、4-1BBのシグナル伝達ドメインと、を含むトランスジェニック融合タンパク質[tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ]、及び/又は(v)CD3γ又はCD3δの全長若しくは部分長の外部ドメインと、CD3ζの全長若しくは部分長の内部ドメインと、CD28のシグナル伝達ドメインと、4-1BBのシグナル伝達ドメインと、を含むトランスジェニック融合タンパク質[tgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζ]、のうちの少なくとも1つを含む。
本明細書では、CFRをコードするポリヌクレオチドと、TCRneg、外因性CD16、標的特異的CAR、HLA-Iの欠損及び/若しくはHLA-IIの欠損、サイトカイン及び/若しくはその受容体又はそれらのバリアントを含むサイトカインシグナル伝達複合体、並びにCD38ノックアウト、のうちの1つ以上と、を含むiPSCが更に提供され、iPSCは、分化誘導されて、機能的派生造血細胞を産生することができる。
いくつかの実施形態では、CFRを含む細胞は、TCRnegである。いくつかの実施形態では、CFRを含む細胞は、TCRの定常領域に挿入されたCARを含む。いくつかの実施形態では、CFRを含む細胞は、TCRnegであり、TCRの定常領域に挿入されたCARを含み、CARの発現は、内因性TCRプロモータによって駆動される。いくつかの実施形態では、CFRを含む細胞は、IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21、又はそれらの任意の組み合わせの外因性サイトカインシグナル伝達を含む。いくつかの実施形態では、外因性サイトカインシグナル伝達は、細胞膜に結合している。いくつかの実施形態では、外因性サイトカインシグナル伝達は、サイトカイン及び/又はそのそれぞれの受容体の導入された一部分若しくは完全ペプチド、又はその突然変異若しくは短縮化バリアントを含む。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達は構成的に活性化される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は誘導可能である。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、一過性及び/又は一時的である。いくつかの実施形態では、細胞表面サイトカインシグナル伝達の一過性/一時的発現は、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、又はmRNAを含むRNAを介する。いくつかの実施形態では、外因性細胞表面サイトカインシグナル伝達は、IL7シグナル伝達を可能にする。いくつかの実施形態では、外因性細胞表面サイトカインシグナル伝達は、IL10シグナル伝達を可能にする。いくつかの実施形態では、外因性細胞表面サイトカインシグナル伝達は、IL15シグナル伝達を可能にする。いくつかの実施形態では、CFRを含む細胞は、外因性CD16又はその機能的バリアント若しくはキメラ受容体を更に含む。いくつかの実施形態では、外因性CD16は、F176V及びS197Pを含む外部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、外因性CD16は、CD64の外部ドメインの全長又は部分長を含む。いくつかの他の実施形態では、外因性CD16は、キメラFc受容体を含む。外因性CD16は、ADCCによる細胞殺傷を可能にし、それによって、例えば、CARを発現するエフェクター細胞に二重標的化メカニズムを提供する。
いくつかの実施形態では、CFRを含む細胞は、CD38ノックアウトを更に含む。細胞表面分子CD38は、多発性骨髄腫及びCD20陰性B細胞性悪性腫瘍を含む、リンパ系と骨髄系の両方に由来する多発性血液系悪性腫瘍で高度に上方制御されており、これによりがん細胞を枯渇させる抗体治療の魅力的なターゲットとなっている。CD38はまた、悪性細胞で高度に発現する以外に、形質細胞並びにNK細胞、活性化T細胞及びB細胞にも発現する。いくつかの実施形態では、CD38-/-であるエフェクター細胞は、CD38誘導性フラクトリサイド(fractricide)を回避することができる。いくつかの実施形態では、抗CD38抗体、CD38結合CAR、又は抗CD38 scFVを含むCD3エンゲージャを使用してADCC及び/又は腫瘍細胞標的化を誘導する場合、CD38-/-iPSC及び/又はその派生エフェクター細胞は、エフェクター細胞の排除、すなわち、CD38発現エフェクター細胞の減少又は枯渇を引き起こすことなく、CD38発現(腫瘍)細胞を標的化し、それによってiPSCとそのエフェクター細胞の持続性及び/又は生存率を増加させることができる。
CFRをコードするポリヌクレオチドを含む細胞のいくつかの実施形態では、細胞は、HLA-I欠損(例えば、B2Mノックアウト)及び/又はHLA-II欠損(例えば、CIITAノックアウト)、並びに必要に応じて、HLA-G又はHLA-Eをコードするポリヌクレオチドを更に含む。
上記を考慮して、本明細書では、CFRをコードするポリヌクレオチドと、必要に応じて、TCRneg、外因性CD16又はバリアント、CAR、外因性IL、CD38ノックアウト、及びB2M/CIITAノックアウトのうちの1つ、2つ、3つ以上、又は全てと、を含むiPSCが提供される。B2Mがノックアウトされる場合、HLA-G、又は代替的に、CD58及びCD54ノックアウトの一方若しくは両方をコードするポリヌクレオチドが必要に応じて導入され、iPSCが分化誘導されて機能的派生造血細胞を産生することが可能である。
したがって、本出願は、表1の以下の遺伝子型のうちのいずれか1つを含むiPSC及びその機能的派生造血細胞を提供する。iPSCの分化能及び由来エフェクター細胞の機能に悪影響を及ぼすことなく、表1の以下の遺伝子型のうちのいずれか1つを含む、すなわち、CFRと、TCRneg、外因性CD16又はバリアント、CAR、外因性IL、CD38ノックアウト、並びにHLA-I及び/又はHLA-II欠損のうちの1つ以上とを有する、ソーティングされた単一細胞及び増殖されたクローン操作iPSCを含む、マスター細胞バンクも本明細書において提供される。当該細胞バンクは、更なるiPSC操作のためのプラットフォーム、及び既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供する。
表1に提供されるように、「IL」は、どの特定のサイトカイン/受容体又は組み合わせ発現が選択されるかに応じて、IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、及びIL21のうちの1つを表す。例えば、IL15が選択される場合、「IL」は、IL15Δを含むIL15関連シグナル伝達複合体を表す。図3では「IL15Rα(ΔICD)融合」及び「IL5/mb-Sushi」として示されているが、これらの実施形態は、本出願全体で更にまとめてIL15Δと略される。いくつかの実施形態では、IL15Δは、細胞内ドメインを欠き、かつ配列番号17、19又は21と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、又は99%同一のアミノ酸配列を含む短縮化IL15/IL15Rα融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインを欠く短縮化IL15/IL15Rα融合タンパク質は、配列番号17のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインを欠く短縮化IL15/IL15Rα融合タンパク質は、配列番号19のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインを欠く短縮化IL15/IL15Rα融合タンパク質は、配列番号21のアミノ酸配列を含む。更に、iPSCとその機能的派生造血細胞がCARとILの両方を含む遺伝子型を有する場合、CARとILは、必要に応じて、2A配列を含むバイシストロン性発現カセットに含まれ得る。対照的に、いくつかの他の実施形態では、CAR及びILは、iPSC及びその機能的派生造血細胞に含まれる別々の発現カセット中にある。
10.免疫療法のための抗体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるゲノム操作されたエフェクター細胞に加えて、状態、疾患、又は指標と関連する抗原を標的とする抗体又は抗体断片を含む追加の治療剤をこれらのエフェクター細胞とともに併用療法にて使用することができる。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、又はキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、ウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体又は抗体断片は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍又はウイルス特異的抗原は、投与されたiPSC由来エフェクター細胞を活性化して、それらの殺傷能力を増強する。いくつかの実施形態では、投与されたiPSC由来エフェクター細胞に対する追加の治療剤として、組み合わせ治療に好適な抗体は、抗CD20(リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、オクレリズマブ)、抗CD22(イノツズマブ、モキセツモマブ、エプラツズマブ)、抗HER2(トラスツズマブ、パーツズマブ)、抗CD52(アレムツズマブ)、抗EGFR(セツキシマブ)、抗GD2(ジヌツキシマブ)、抗PDL1(アベルマブ)、抗CD38(ダラツムマブ、イサツキシマブ、MOR202)、抗CD123(7G3、CSL362)、抗SLAMF7(エロツズマブ)、並びにそれらのヒト化又はFc改変されたバリアント若しくは断片、又はそれらの機能的同等物及びバイオシミラーを含むがそれらに限定されない。いくつかの実施形態では、投与されたiPSC由来エフェクター細胞に対する追加の治療剤としての併用治療に好適な抗体は、標的細胞上の2つ以上の抗原若しくはエピトープを標的とするか、又は標的細胞を標的としながらエフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞、若しくはマクロファージ細胞)を標的細胞に向けて動員する、二重特異性抗体又は多重特異性抗体を更に含む。このような二重特異性又は多重特異性抗体は、エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞、NKT細胞、B細胞、マクロファージ、及び/又は好中球)を腫瘍細胞に誘導し、免疫エフェクター細胞を活性化することができるエンゲージャとして機能し、抗体療法の利益を最大化する大きな可能性を示している。エンゲージャは、少なくとも1つの腫瘍抗原に特異的であり、免疫エフェクター細胞の少なくとも1つの表面トリガー受容体に特異的である。エンゲージャの例には、二重特異性T細胞エンゲージャ(BiTE)、二重特異性キラー細胞エンゲージャ(BiKE)、三重特異性キラー細胞エンゲージャ(TriKE)、若しくは多重特異性キラー細胞エンゲージャ、又は複数の免疫細胞型と適合し得るユニバーサルエンゲージャが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるゲノム操作されたエフェクター細胞に加えて、状態、疾患、又は指標と関連する抗原を標的とする抗体又は抗体断片を含む追加の治療剤をこれらのエフェクター細胞とともに併用療法にて使用することができる。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、又はキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、ウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体又は抗体断片は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍又はウイルス特異的抗原は、投与されたiPSC由来エフェクター細胞を活性化して、それらの殺傷能力を増強する。いくつかの実施形態では、投与されたiPSC由来エフェクター細胞に対する追加の治療剤として、組み合わせ治療に好適な抗体は、抗CD20(リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、オクレリズマブ)、抗CD22(イノツズマブ、モキセツモマブ、エプラツズマブ)、抗HER2(トラスツズマブ、パーツズマブ)、抗CD52(アレムツズマブ)、抗EGFR(セツキシマブ)、抗GD2(ジヌツキシマブ)、抗PDL1(アベルマブ)、抗CD38(ダラツムマブ、イサツキシマブ、MOR202)、抗CD123(7G3、CSL362)、抗SLAMF7(エロツズマブ)、並びにそれらのヒト化又はFc改変されたバリアント若しくは断片、又はそれらの機能的同等物及びバイオシミラーを含むがそれらに限定されない。いくつかの実施形態では、投与されたiPSC由来エフェクター細胞に対する追加の治療剤としての併用治療に好適な抗体は、標的細胞上の2つ以上の抗原若しくはエピトープを標的とするか、又は標的細胞を標的としながらエフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞、若しくはマクロファージ細胞)を標的細胞に向けて動員する、二重特異性抗体又は多重特異性抗体を更に含む。このような二重特異性又は多重特異性抗体は、エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞、NKT細胞、B細胞、マクロファージ、及び/又は好中球)を腫瘍細胞に誘導し、免疫エフェクター細胞を活性化することができるエンゲージャとして機能し、抗体療法の利益を最大化する大きな可能性を示している。エンゲージャは、少なくとも1つの腫瘍抗原に特異的であり、免疫エフェクター細胞の少なくとも1つの表面トリガー受容体に特異的である。エンゲージャの例には、二重特異性T細胞エンゲージャ(BiTE)、二重特異性キラー細胞エンゲージャ(BiKE)、三重特異性キラー細胞エンゲージャ(TriKE)、若しくは多重特異性キラー細胞エンゲージャ、又は複数の免疫細胞型と適合し得るユニバーサルエンゲージャが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、iPSC由来エフェクター細胞は、表1に列挙された遺伝子型を含む造血系統細胞を含む。いくつかの実施形態では、iPSC由来エフェクター細胞は、表1に列挙された遺伝子型を含むNK細胞を含む。いくつかの実施形態では、iPSC由来エフェクター細胞は、表1に列挙された遺伝子型を含むT細胞を含む。液性腫瘍又は固形腫瘍の治療に有用な組み合わせのいくつかの実施形態では、組み合わせは、少なくともTCRnegcs-CD3を含むiPSC由来NK又はT細胞と、細胞表面CD3を有する細胞に係合する二重特異性抗体又は多重特異性抗体と、を含む。いくつかの実施形態では、CD3エンゲージャは、cs-CD3に結合する少なくとも第1の可変セグメントと、ADGRE2、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、CCR1、CCR4、がん胎児性抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、サイトメガロウイルス(CMV)感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質-2(EGP-2)、上皮糖タンパク質-40(EGP-40)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、EGFRvIII、受容体チロシン-タンパク質キナーゼerb-B2、3、4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB葉酸結合タンパク質(FBP)、胎児のアセチルコリン受容体(AChR)、葉酸受容体-α、ガングリオシドG2(GD2)、ガングリオシドG3(GD3)、ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2)、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、ICAM-1、インテグリンB7、インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2(IL-13Rα2)、κ-軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体(KDR)、ルイスA(CA19.9)、ルイスY(LeY)、L1細胞接着分子(L1-CAM)、LILRB2、黒色腫抗原ファミリーA1(MAGE-A1)、MICA/B、ムチン1(Muc-1)、ムチン16(Muc-16)、メソセリン(MSLN)、NKCSI、NKG2Dリガンド、c-Met、がん精巣抗原、NY-ESO-1、腫瘍胎児性抗原(h5T4)、PRAME、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、PRAME前立腺特異的膜抗原(PSMA)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG-72)、TIM-3、TRBC1、TRBC2、血管内皮増殖因子R2(VEGF-R2)、ウィルムス腫瘍タンパク質(WT-1)、及び/又は病原体抗原のうちの少なくとも1つを含む抗原に結合する第2の可変セグメントと、を少なくとも含む。本明細書において提供されるiPSC由来細胞と、細胞表面CD3を有する細胞と係合する(すなわち、エンゲージャである)少なくとも1つの二重特異性又は多重特異性抗体と、を含む併用療法のいくつかの他の実施形態では、当該抗体は、iPSC由来細胞によって、又はiPSC由来細胞内で産生されず、表1に列挙されている遺伝子型を有するiPSC由来細胞の投与の前、それと同時、又はその後に更に投与される。
CD3エンゲージャのいくつかの実施形態では、エンゲージャは、少なくとも、cs-CD3に結合する第1の可変セグメントと、BCMA、CD19、CD20、CD33、CD38、CD52、CD123、CEA、EGFR、EpCAM、GD2、GPA33、HER2、MICA/B、PDL1及び/又はPSMAの少なくとも1つを含む抗原に結合する第2の可変セグメントと、を含む。CD3エンゲージャの更にいくつかの他の実施形態では、エンゲージャは、CD19、CD33、CD123、CEA、EpCAM、GPA33、HER2及び/又はPSMAのうちの少なくとも1つを含む抗原に結合する第2の可変セグメントを含む。CD3エンゲージャの更にいくつかの他の実施形態では、エンゲージャは、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、エルツマキソマブ、RO6958688、AFM11、MT110/AMG110、MT111/AMG211/MEDI-565、AMG330、MT112/BAY2010112、MOR209/ES414、MGD006/S80880、MGD007、及び/又はFBTA05のうちの少なくとも1つである。一実施形態では、組み合わせは、CD3エンゲージャと、TCRnegcs-CD3及びhnCD16を含むiPSC由来NK細胞と、を含む。一実施形態では、組み合わせは、CD3エンゲージャと、TCRnegcs-CD3及びhnCD16を含むiPSC由来NK細胞と、を含む。いくつかの更なる実施形態では、CD3エンゲージャとの組み合わせに含まれるiPSC由来NK細胞は、TCRnegcs-CD3、hnCD16、IL15、並びにCD19、BCMA、CD20、CD22、CD38、CD123、HER2、CD52、EGFR、GD2、及びPDL1のうちの1つを標的とするCARを含み、IL15は、CARと共発現されるか、又は別々に発現され、IL15は、図3の構築物設計1~7に示される形態のうちのいずれか1つである。いくつかの特定の実施形態では、IL15は、それがCARとともに又は別々に発現される場合、図3の構築物設計3、4、又は7の形態である。
11.チェックポイント阻害剤
チェックポイントは、阻害されていない場合に免疫応答を抑制又は下方制御することができる細胞分子、しばしば細胞表面分子である。腫瘍が特定の免疫チェックポイント経路を、特に腫瘍抗原に特異的なT細胞に対する免疫抵抗性の主要なメカニズムとして選択していることが明らかになっている。チェックポイント阻害剤(Checkpoint inhibitor、CI)は、チェックポイント遺伝子の発現若しくは遺伝子産物を減少させ、又はチェックポイント分子の活性を低下させ、阻害性チェックポイントをブロックし、免疫系機能を回復させることができるアンタゴニストである。PD1/PDL1又はCTLA4を標的化するチェックポイント阻害剤の開発により、腫瘍学の展望が変わり、これらの薬剤は複数の適応症で長期の寛解をもたらした。しかしながら、多くの腫瘍サブタイプはチェックポイント遮断療法に耐性があり、再発は依然として重大な懸念事項である。したがって、本出願の一態様は、CIとの併用療法に、本明細書で提供されるようなゲノム操作された機能性iPSC由来細胞を含めることにより、CI耐性を克服するための治療アプローチを提供する。併用療法の一実施形態では、iPSC由来細胞は、NK細胞である。併用療法の別の実施形態では、iPSC由来細胞は、T細胞である。直接的な抗腫瘍能力を示すことに加えて、本明細書において提供される派生NK細胞は、PDL1-PD1媒介阻害に抵抗し、T細胞遊走を増強し、T細胞を腫瘍微小環境に動員し、腫瘍部位でのT細胞活性化を増強する能力を有することが示されている。したがって、機能的に強力なゲノム操作された派生NK細胞によって促進されるT細胞の腫瘍浸潤は、当該NK細胞がチェックポイント阻害剤を含むT細胞標的免疫療法と相乗作用して、局所免疫抑制を緩和し、腫瘍量を低減することができることを示している。
チェックポイントは、阻害されていない場合に免疫応答を抑制又は下方制御することができる細胞分子、しばしば細胞表面分子である。腫瘍が特定の免疫チェックポイント経路を、特に腫瘍抗原に特異的なT細胞に対する免疫抵抗性の主要なメカニズムとして選択していることが明らかになっている。チェックポイント阻害剤(Checkpoint inhibitor、CI)は、チェックポイント遺伝子の発現若しくは遺伝子産物を減少させ、又はチェックポイント分子の活性を低下させ、阻害性チェックポイントをブロックし、免疫系機能を回復させることができるアンタゴニストである。PD1/PDL1又はCTLA4を標的化するチェックポイント阻害剤の開発により、腫瘍学の展望が変わり、これらの薬剤は複数の適応症で長期の寛解をもたらした。しかしながら、多くの腫瘍サブタイプはチェックポイント遮断療法に耐性があり、再発は依然として重大な懸念事項である。したがって、本出願の一態様は、CIとの併用療法に、本明細書で提供されるようなゲノム操作された機能性iPSC由来細胞を含めることにより、CI耐性を克服するための治療アプローチを提供する。併用療法の一実施形態では、iPSC由来細胞は、NK細胞である。併用療法の別の実施形態では、iPSC由来細胞は、T細胞である。直接的な抗腫瘍能力を示すことに加えて、本明細書において提供される派生NK細胞は、PDL1-PD1媒介阻害に抵抗し、T細胞遊走を増強し、T細胞を腫瘍微小環境に動員し、腫瘍部位でのT細胞活性化を増強する能力を有することが示されている。したがって、機能的に強力なゲノム操作された派生NK細胞によって促進されるT細胞の腫瘍浸潤は、当該NK細胞がチェックポイント阻害剤を含むT細胞標的免疫療法と相乗作用して、局所免疫抑制を緩和し、腫瘍量を低減することができることを示している。
一実施形態では、チェックポイント阻害剤併用療法のための由来TCRnegNK細胞は、cs-CD3と、必要に応じて外因性CD16、B2M/CIITAノックアウト、CAR発現、CD38ノックアウト、並びに外因性細胞表面サイトカイン及び/又は受容体発現のうちの1つ、2つ、3つ、4つ以上と、を含み、B2Mがノックアウトされている場合、HLA-Gをコードするポリヌクレオチド、又はCD58及びCD54の一方若しくは両方のノックアウトが必要に応じて含まれる。いくつかの実施形態では、派生NK細胞は、表1に列挙された遺伝子型のいずれか1つを含む。いくつかの実施形態では、上記の派生NK細胞は、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP、RAG1、及び染色体6p21領域内の任意の遺伝子のうちの少なくとも1つの破壊、又はHLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、Fc受容体、エンゲージャ、及び二重特異性、多重特異性、若しくはユニバーサルエンゲージャとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも1つの導入、を更に含む。
別の実施形態では、チェックポイント阻害剤併用療法のための由来TCRnegT細胞は、cs-CD3と、必要に応じて外因性CD16、B2M/CIITAノックアウト、CAR発現、CD38ノックアウト、並びに外因性細胞表面サイトカイン及び/又は受容体発現のうちの1つ、2つ、3つ、4つ以上と、を含み、B2Mがノックアウトされている場合、HLA-Gをコードするポリヌクレオチド、又はCD58及びCD54の一方若しくは両方のノックアウトが必要に応じて含まれる。いくつかの実施形態では、派生エフェクター細胞は、表1に列挙された遺伝子型のうちのいずれか1つを含む。いくつかの実施形態では、上記の派生エフェクター細胞は、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP、RAG1、及び染色体6p21領域内の任意の遺伝子のうちの少なくとも1つの破壊、又はHLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、Fc受容体、エンゲージャ、及び二重特異性、多重特異性、若しくはユニバーサルエンゲージャとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも1つの導入、を更に含む。
様々な実施形態では、派生エフェクター細胞は、TCRnegcs-CD3と、必要に応じて外因性CD16、B2M/CIITAノックアウト、CAR発現、CD38ノックアウト、及び外因性細胞表面サイトカイン発現のうちの1つ、2つ、3つ、4つ以上と、を含むiPSCクローン株を分化させることから得られ、B2Mがノックアウトされている場合、HLA-Gをコードするポリヌクレオチド、又はCD58及びCD54の一方若しくは両方のノックアウトが必要に応じて導入される。いくつかの実施形態では、上記のiPSCクローン株は、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP、RAG1、及び染色体6p21領域内の任意の遺伝子のうちの少なくとも1つの破壊、又はHLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、Fc受容体、エンゲージャ、及び二重特異性、多重特異性、若しくはユニバーサルエンゲージャとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも1つの導入、を更に含む。
本明細書で提供される派生NK又はT細胞との併用療法に好適なチェックポイント阻害剤には、PD-1(Pdcdl、CD279)、PDL-1(CD274)、TIM-3(Havcr2)、TIGIT(WUCAM及びVstm3)、LAG-3(Lag3、CD223)、CTLA-4(Ctla4、CD152)、2B4(CD244)、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、A2AR、BATE、BTLA、CD39(Entpdl)、CD47、CD73(NT5E)、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、レチノイン酸受容体アルファ(retinoic acid receptor alpha、Rara)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E、及び阻害性KIR(例えば、2DL1、2DL2、2DL3、3DL1、及び3DL2)のアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、上述のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストは抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダIg、サメ重鎖のみ抗体(VNAR)、Ig NAR、キメラ抗体、組換え抗体、又はそれらの抗体断片であり得る。抗体断片の非限定的な例には、Fab、Fab’、F(ab’)2、F(ab’)3、Fv、一本鎖抗原結合断片(scFv)、(scFv)2、ジスルフィド安定化Fv(dsFv)、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片(sdAb、ナノボディ)、組換え重鎖のみ抗体(VHH)、及び抗体全体の結合特異性を維持するその他の抗体断片が含まれ、それらは、抗体全体よりも、製造するのに費用対効果が高く、より簡単に使用することができ、又は感度が高くあり得る。いくつかの実施形態では、1つ又は2つ又は3つ又はそれ以上のチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ(抗PDL1 mAb)、アベルマブ(抗PDL1 mAb)、デュルバルマブ(抗PDL1 mAb)、トレメリムマブ(抗CTLA4 mAb)、イピリムマブ(抗CTLA4 mAb)、IPH4102(抗KIR)、IPH43(抗MICA)、IPH33(抗TLR3)、リリムマブ(抗KIR)、モナリズマブ(抗NKG2A)、ニボルマブ(抗-PD1 mAb)、ペンブロリズマブ(抗PD1 mAb)、及びそれらの派生体、機能的同等物、又はそれらのバイオシミラーの少なくとも1つを含む。
いくつかの実施形態では、多くのmiRNAが免疫チェックポイントの発現を制御する調節因子として見出されるため、上述のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストはマイクロRNAベースである(Dragomir et al.,Cancer Biol Med.2018,15(2):103-115)。いくつかの実施形態では、チェックポイント拮抗miRNAは、miR-28、miR-15/16、miR-138、miR-342、miR-20b、miR-21、miR-130b、miR-34a、miR-197、miR-200c、miR-200、miR-17-5p、miR-570、miR-424、miR-155、miR-574-3p、miR-513、及びmiR-29cを含むがこれらに限定されない。
提供されるiPSC由来NK又はT細胞を含む併用療法のいくつかの実施形態は、少なくとも1つのチェックポイント分子を標的化する少なくとも1つのチェックポイント阻害剤を含み、iPSC由来細胞は、表1に列挙された遺伝子型を有する。提供される派生NK細胞又は派生T細胞との併用療法のいくつかの他の実施形態は、2つ、3つ以上のチェックポイント分子が標的とされるように、2つ、3つ以上のチェックポイント阻害剤を含む。少なくとも1つのチェックポイント阻害剤及び表1に列挙された遺伝子型を有するiPSC由来細胞を含む併用療法のいくつかの実施形態では、当該チェックポイント阻害剤は、抗体、又はヒト化若しくはFc改変バリアント若しくは断片、又はそれらの機能的同等物若しくはバイオシミラーであり、当該チェックポイント阻害剤は、上記抗体、又はその断片若しくはバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド配列を発現することにより、iPSC由来細胞により産生される。いくつかの実施形態では、抗体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列、又はチェックポイントを阻害するその断片若しくはバリアントは、別個の構築物内、又はCARと抗体若しくはその断片をコードする配列の両方を含むバイシストロン性構築物内のいずれかで、CARと共発現される。いくつかの更なる実施形態では、抗体又はその断片をコードする配列は、例えば、CAR-2A-CI又はCI-2A-CARのように例示される自己切断2Aコード配列を介してCAR発現構築物の5’又は3’末端のいずれかに連結され得る。したがって、チェックポイント阻害剤とCARのコード配列は、単一のオープンリーディングフレーム(ORF)にあり得る。チェックポイント阻害剤が送達され、腫瘍微小環境(tumor microenvironment、TME)に浸潤することができる派生エフェクター細胞によってペイロードとして発現及び分泌されると、それは、TMEに結合すると阻害性チェックポイント分子を打ち消し、CARなどのモダリティを活性化するか、又は受容体を活性化することによって、エフェクター細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、CARと共発現するチェックポイント阻害剤は、チェックポイント分子、PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2AR、BATE、BTLA、CD39(Entpdl)、CD47、CD73(NT5E)、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxp1、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、レチノイン酸受容体アルファ(Rara)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E、又は阻害性KIRのうちの少なくとも1つを阻害する。いくつかの実施形態では、表1に列挙される遺伝子型を有する派生細胞においてCARと共発現するチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、トレメリムマブ、イピリムマブ、IPH4102、IPH43、IPH33、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びそれらのヒト化、又はFc改変バリアント、断片、及びそれらの機能的同等物又はバイオシミラーを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、CARと共発現するチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、又はそのヒト化、又はFc改変バリアント、断片又はそれらの機能的同等物又はバイオシミラーである。いくつかの他の実施形態では、CARと共発現するチェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、又はそのヒト化、又はFc改変バリアント、断片又はそれらの機能的同等物又はバイオシミラーである。いくつかの他の実施形態では、CARと共発現するチェックポイント阻害剤は、ペンブロリズマブ、又はそのヒト化、又はFc改変バリアント、断片又はそれらの機能的同等物又はバイオシミラーである。
本明細書において提供されるiPSC由来細胞及びチェックポイント分子を阻害する少なくとも1つの抗体を含む併用療法のいくつかの他の実施形態では、当該抗体は、iPSC由来細胞によって、又はiPSC由来細胞内で産生されず、表1に列挙されている遺伝子型を有するiPSC由来細胞の投与の前、それと同時、又はその後に更に投与される。いくつかの実施形態では、提供される派生NK細胞又は派生T細胞との併用療法における1つ、2つ、3つ以上のチェックポイント阻害剤の投与は、同時又は逐次的である。表1に列挙された遺伝子型を有する由来NK細胞又は由来T細胞を含む組み合わせ治療の一実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、トレメリムマブ、イピリムマブ、IPH4102、IPH43、IPH33、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びそれらのヒト化、又はFc改変バリアント、断片、及びそれらの機能的同等物又はバイオシミラーのうちの1つ以上である。表1に列挙された遺伝子型を有する由来NK細胞又は由来T細胞を含む組み合わせ治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、又はそのヒト化若しくはFc改変バリアント、断片及びその機能的同等物若しくはバイオシミラーである。表1に列挙された遺伝子型を有する由来NK細胞又は由来T細胞を含む組み合わせ治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、又はそのヒト化若しくはFc改変バリアント、断片及びその機能的同等物若しくはバイオシミラーである。表1に列挙された遺伝子型を有する由来NK細胞又は由来T細胞を含む組み合わせ治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、ペンブロリズマブ、又はそのヒト化若しくはFc改変バリアント、断片及びその機能的同等物若しくはバイオシミラーである。
II.iPSCの選択された遺伝子座における標的化ゲノム編集の方法
本明細書で互換可能に使用されるゲノム編集、又はゲノム編集、又は遺伝子編集は、標的細胞のゲノムにDNAが挿入、欠失、及び/又は置換される一種の遺伝子工学である。標的化ゲノム編集(「標的化ゲノム編集」又は「標的化遺伝子編集」と互換可能である)は、ゲノム内の事前に選択された部位での挿入、欠失、置換を可能にする。標的化編集中に挿入部位で内因性配列が欠失すると、影響を受けた配列を含む内因性遺伝子は、配列欠失によりノックアウト又はノックダウンされる可能性がある。したがって、標的化編集を使用して、内因性遺伝子発現を正確に破壊することもできる。本明細書で同様に使用される用語「標的化組み込み」は、挿入部位での内因性配列の欠失を伴うか又は伴わない、1つ以上の外因性配列の挿入を含むプロセスを指す。対照的に、ランダムに組み込まれた遺伝子は位置効果とサイレンシングの影響を受けやすく、その発現は信頼できず、予測できない。例えば、セントロメア及びサブテロメア領域は、特に導入遺伝子サイレンシングを起こしやすい。相互に新しく組み込まれた遺伝子は、周囲の内因性遺伝子とクロマチンに影響を与え、細胞の挙動を変えたり、細胞の形質転換を促進したりする可能性がある。したがって、セーフハーバー遺伝子座やゲノムセーフハーバー(genomic safe harbor、GSH)などの事前に選択された遺伝子座に外来性DNAを挿入することは、安全性、効率、コピー数制御、及び信頼性の高い遺伝子応答制御にとって重要である。
本明細書で互換可能に使用されるゲノム編集、又はゲノム編集、又は遺伝子編集は、標的細胞のゲノムにDNAが挿入、欠失、及び/又は置換される一種の遺伝子工学である。標的化ゲノム編集(「標的化ゲノム編集」又は「標的化遺伝子編集」と互換可能である)は、ゲノム内の事前に選択された部位での挿入、欠失、置換を可能にする。標的化編集中に挿入部位で内因性配列が欠失すると、影響を受けた配列を含む内因性遺伝子は、配列欠失によりノックアウト又はノックダウンされる可能性がある。したがって、標的化編集を使用して、内因性遺伝子発現を正確に破壊することもできる。本明細書で同様に使用される用語「標的化組み込み」は、挿入部位での内因性配列の欠失を伴うか又は伴わない、1つ以上の外因性配列の挿入を含むプロセスを指す。対照的に、ランダムに組み込まれた遺伝子は位置効果とサイレンシングの影響を受けやすく、その発現は信頼できず、予測できない。例えば、セントロメア及びサブテロメア領域は、特に導入遺伝子サイレンシングを起こしやすい。相互に新しく組み込まれた遺伝子は、周囲の内因性遺伝子とクロマチンに影響を与え、細胞の挙動を変えたり、細胞の形質転換を促進したりする可能性がある。したがって、セーフハーバー遺伝子座やゲノムセーフハーバー(genomic safe harbor、GSH)などの事前に選択された遺伝子座に外来性DNAを挿入することは、安全性、効率、コピー数制御、及び信頼性の高い遺伝子応答制御にとって重要である。
標的化編集は、ヌクレアーゼに依存しないアプローチ、又はヌクレアーゼに依存するアプローチのいずれかによって実現され得る。ヌクレアーゼに依存しない標的化編集アプローチでは、相同組換えは、宿主細胞の酵素機構を介して、挿入される外因性ポリヌクレオチドに隣接する相同配列によって導かれる。
代替的に、特異的なレアカットエンドヌクレアーゼによる二本鎖切断(double strand break、DSB)の特異的な導入により、より高い頻度で標的化編集を実現され得る。このようなヌクレアーゼ依存の標的化編集は、DSBに応答して発生する非相同末端結合(non-homologous end joining、NHEJ)を含むDNA修復メカニズムを利用する。外因性の遺伝物質を含むドナーベクターがない場合、NHEJは少数の内因性ヌクレオチドのランダムな挿入又は欠失(インデル)をしばしば引き起こす。対照的に、一対のホモロジアームと隣接する外因性遺伝物質を含むドナーベクターが存在する場合、相同組換えによる相同指向性修復(homology directed repair、HDR)中に外因性遺伝物質がゲノムに導入され得、「標的化組み込み」がもたらされる。いくつかの状況において、標的化組み込み部位は、選択された遺伝子のコード領域内にあることが意図され、したがって、標的化組み込みは、遺伝子発現を破壊し、1つの単一編集ステップにおいて同時ノックイン及びノックアウト(knock-in and knockout、KI/KO)をもたらし得る。
目的の遺伝子座(gene locus of interest、GOI)における選択位置に1つ以上の導入遺伝子を挿入して、同時に遺伝子をノックアウトすることを達成することができる。同時ノックイン及びノックアウト(KI/KO)に好適な遺伝子座には、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα又はβ定常領域(TRAC又はTRBC)、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、及びTIGITが含まれるが、これらに限定されない。位置選択的挿入のためのそれぞれの部位特異的標的化ホモロジアームにより、導入遺伝子が、部位の内因性プロモータ下又は構築物に含まれる外因性プロモータ下のいずれかで発現されることが可能になる。2つ以上の導入遺伝子が、選択された位置(例えば、CD38遺伝子座)に挿入される場合、リンカー配列、例えば2Aリンカー又はIRESは、任意の2つの導入遺伝子の間に配置される。2Aリンカーは、FMDV、ERAV、PTV-1、又はTaVに由来する自己切断ペプチド(それぞれ「F2A」、「E2A」、「P2A」、及び「T2A」と称される)をコードし、単一の翻訳から別々のタンパク質を産生することを可能にする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子及び/又は外因性プロモータサイレンシングのリスクを低減するために、構築物にインスレータが含まれる。外因性プロモータは、CAG、又はCMV、EF1α、PGK、及びUBCを含むがこれらに限定されない他の構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、若しくは細胞型特異的プロモータであり得る。
特異的な標的化DSBを導入することができる利用可能なエンドヌクレアーゼには、ジンクフィンガヌクレアーゼ(zinc-finger nuclease、ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(transcription activator-like effector nuclease、TALEN)、RNA誘導CRISPR(Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats、クラスタ化等間隔短鎖回分リピート)システムが含まれるが、これらに限定されない。加えて、phiC31及びBxb1インテグラーゼを利用するDICE(dual integrase cassette exchange、デュアルインテグラーゼカセット交換)システムも、標的化組み込みのための有望なツールである。
ZFNは、ジンクフィンガDNA結合ドメインに融合したヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。「ジンクフィンガDNA結合ドメイン」又は「ZFBD」とは、1つ以上のジンクフィンガを介して配列特異的な様式でDNAに結合するポリペプチドドメインを意味する。ジンクフィンガは、亜鉛イオンの配位により構造が安定化されるジンクフィンガ結合ドメイン内の約30アミノ酸のドメインである。ジンクフィンガの例には、C2H2ジンクフィンガ、C3Hジンクフィンガ、及びC4ジンクフィンガが含まれるが、これらに限定されない。「設計された」ジンクフィンガドメインは、天然に存在しないドメインであり、その設計/構成は主に合理的な基準、例えば、既存のZFP設計と結合データの情報を格納するデータベースの情報を処理するための置換ルールとコンピュータ化アルゴリズムの適用に起因する。例えば、米国特許第6,140,081号、同第6,453,242号及び同第6,534,261号を参照されたい。また、国際公開第98/53058号、同第98/53059号、同第98/53060号、同第02/016536号、及び同第03/016496号(その完全な開示が参照により本明細書に組み込まれる)も参照されたい。「選択された」ジンクフィンガドメインは、その生産が主にファージディスプレイ、相互作用トラップ、又はハイブリッド選択などの経験的プロセスから生じる天然では見られないドメインである。ZFNは、米国特許第7,888,121号及び同第7,972,854号で詳細に説明されており、それらの完全な開示は参照により本明細書に組み込まれる。当該技術分野で最も認識されているZFNの例は、FokIヌクレアーゼとジンクフィンガDNA結合ドメインとの融合である。
TALENは、TALエフェクターDNA結合ドメインに融合したヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。「転写活性化因子様エフェクターDNA結合ドメイン」、「TALエフェクターDNA結合ドメイン」、又は「TALE DNA結合ドメイン」とは、TALエフェクタータンパク質のDNAへの結合に関与するTALエフェクタータンパク質のポリペプチドドメインを意味する。TALエフェクタータンパク質は、感染時にXanthomonas属の植物病原体によって分泌される。これらのタンパク質は植物細胞の核に入り、それらのDNA結合ドメインを介してエフェクター特異的なDNA配列に結合し、トランス活性化ドメインを介してこれらの配列で遺伝子転写を活性化する。TALエフェクターDNA結合ドメインの特異性は、反復可変残基(repeat variable-diresidue、RVD)と呼ばれる選択された反復位置に多型を含む不完全な34アミノ酸リピートのエフェクター可変数に依存する。TALENについては、米国特許出願公開第2011/0145940号により詳細に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。当該技術分野で最も認識されているTALENの例は、TALエフェクターDNA結合ドメインへのFokIヌクレアーゼの融合ポリペプチドである。
本発明の方法で使用される標的化ヌクレアーゼの別の例は、標的化Spo11ヌクレアーゼ、目的のDNA配列に特異性を有するDNA結合ドメイン、例えばジンクフィンガDNA結合ドメイン、TALエフェクターDNA結合ドメインなどに融合したヌクレアーゼ活性を有するSpo11ポリペプチドを含むポリペプチドである。
本発明に好適な標的化ヌクレアーゼの更なる例には、個別に又は組み合わせて使用されるかどうかにかかわらず、Bxb1、phiC31、R4、PhiBT1、及びWβ/SPBc/TP901-1が含まれるが、これらに限定されない。
標的化ヌクレアーゼの他の非限定的な例には、天然に存在するヌクレアーゼ及び組換えヌクレアーゼ、cas、cpf、cse、csy、csn、csd、cst、csh、csa、csm、及びcmrを含むファミリーからのCRISPR関連のヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼなどが挙げられる。
例示的な例として、CRISPR/Cas9は2つの主要な成分:(1)Cas9エンドヌクレアーゼと(2)crRNA-tracrRNA複合体を必要とする。共発現すると、2つの成分が複合体を形成し、PAM及びPAM近位のシーディング領域(seeding region)を含む標的DNA配列に動員される。crRNAとtracrRNAを組み合わせてキメラガイドRNA(gRNA)を形成し、Cas9を選択した配列を標的に導くことができる。次いで、これら2つの成分は、トランスフェクション又は形質導入を介して哺乳動物細胞に送達できる。CRISPR/Cpf系を使用すると、選択された配列を標的化するようにCpfエンドヌクレアーゼをガイドするために、Cpfエンドヌクレアーゼ(Cpf1、MAD7、及び当該技術分野において既知の更に多くのもの)及び(2)gNA(これは、多くの場合、tracrRNAを必要としない)が必要とされる。
DICEを介した挿入は、例えば、phiC31とBxb1などのリコンビナーゼの対を使用して、各酵素自体の小さなattB及びattP認識部位に厳しく制限されている外因性DNAの一方向の組み込みを提供する。これらの標的化att部位は哺乳類のゲノムには天然に存在しないため、最初に所望の組み込み部位のゲノムに導入する必要がある。例えば、米国特許出願公開第2015/0140665号(その開示が参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
本発明の一態様は、標的化されたゲノム組み込みのための1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を提供する。一実施形態では、構築物は、所望の組み込み部位に特異的な一対の相同アームを更に含み、標的化組み込みの方法は、構築物を細胞に導入して、細胞宿主酵素機構による部位特異的相同組換えを可能にすることを含む。別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なDNA結合ドメインを含むZFN発現カセットを細胞に導入してZFNを介した挿入を可能にすることと、を含む。更に別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なDNA結合ドメインを含むTALEN発現カセットを細胞に導入してTALENを介した挿入を可能にすることと、を含む。別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、Cas9発現カセット及び所望の組み込み部位に特異的なガイド配列を含むgRNAを細胞に導入してCas9を介した挿入を可能にすることと、を含む。更に別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、一対のDICEリコンビナーゼの1つ以上のatt部位を含む構築物を細胞内の所望の組み込み部位に導入することと、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、DICEリコンビナーゼ用の発現カセットを導入し、DICEを介した標的化組み込みを可能にすることと、を含む。
標的化組み込みのための有望な部位には、ヒトのゲノムの遺伝子内又は遺伝子外領域であり、理論的には、宿主細胞又は生物に悪影響を与えることなく、新たに組み込まれたDNAの予測可能な発現に対応できる、セーフハーバー遺伝子座、又はゲノムセーフハーバー(GSH)が含まれるが、これらに限定されない。有用なセーフハーバーは、ベクターにコードされたタンパク質又は非コードRNAの望ましいレベルを生成するために十分な導入遺伝子発現を可能にする必要がある。セーフハーバーはまた、細胞を悪性形質転換しやすくしたり、細胞機能を変化させたりするものであってはならない。組み込み部位が、潜在的なセーフハーバー遺伝子座であるためには、理想的には、以下を含むがこれらに限定されない基準を満たす必要がある:配列アノテーションによって判断されるような、調節エレメント又は遺伝子の破壊が存在しないこと、遺伝子密集領域内の遺伝子間領域、又は反対方向に転写された2つの遺伝子の間の収束位置であること、ベクターにコードされた転写活性化因子と、隣接する遺伝子、特にがん関連遺伝子及びマイクロRNA遺伝子のプロモータとの間の長距離相互作用の可能性を最小限にする距離を保つこと、並びに遍在的な転写活性を示す、広範な空間的及び時間的発現配列タグ(expressed sequence tag、EST)発現パターンによって反映されるような、明らかに遍在的な転写活性を有すること。この後者の特徴は幹細胞で特に重要であり、幹細胞では、分化中にクロマチンのリモデリングが通常、いくつかの遺伝子座のサイレンシングと他の遺伝子座の潜在的な活性化をもたらす。外因性挿入に好適な領域内では、挿入のために選択された正確な遺伝子座は、反復要素と保存された配列を欠き、ホモロジアームの増幅用のプライマーを簡単に設計することができるはずである。
ヒトゲノム編集、又は具体的には標的化組み込みに好適な部位には、アデノ随伴ウイルス部位1(adeno-associated virus site1、AAVS1)、ケモカイン(CCモチーフ)受容体5(CCR5)遺伝子座、及びマウスROSA26遺伝子座のヒトのオルソログが含まれるが、これらに限定されない。加えて、マウスH11遺伝子座のヒトオルソログはまた、本明細書に開示される標的化組み込みの組成物及び方法を使用して挿入するための好適切な部位であり得る。更に、コラーゲンとHTRP遺伝子座は、標的化組み込みのためのセーフハーバーとしても使用され得る。しかしながら、選択した各部位の検証は、特定の組み込み事象のために特に幹細胞で必要であることが示されており、プロモータの選択、外因性遺伝子の配列と配置、構築物の設計などの挿入戦略の最適化がしばしば必要である。
標的化されたインデルのために、編集部位はしばしばその発現及び/又は機能が破壊されることが意図されている内因性遺伝子に含まれている。一実施形態では、標的化されたインデルを含む内因性遺伝子は、免疫応答の調節及び修飾と関連する。いくつかの他の実施形態では、標的化インデルを含む内因性遺伝子は、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答調節及び修飾、あるいは幹細胞及び/又は前駆細胞、並びにそれらに由来する細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び/又は生存率を抑制するタンパク質と関連する。
したがって、本発明の別の態様は、ゲノムセーフハーバーを含む選択された遺伝子座、又は本明細書において提供されるような、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、TRAC、若しくはCD38遺伝子座などの継続的又は一時的な遺伝子発現について安全かつ十分に調節されていることがわかっている若しくは証明された事前に選択された遺伝子座における標的化組み込みの方法を提供する。一実施形態では、標的化組み込みの方法のためのゲノムセーフハーバーは、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、ベータ-2ミクログロブリン、CD38、GAPDH、TCR、若しくはRUNX1、又はゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、1つ以上の望ましい組み込み部位を含む。いくつかの実施形態では、標的化組み込みは、組み込みの結果としての遺伝子のノックダウン又はノックアウトが望まれる、1つ以上の遺伝子座にあり、そのような遺伝子座には、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα又はβ定常領域(TRAC又はTRBC)、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、及びTIGITが含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なホモロジアームの対及び1つ以上の外因性配列を含む構築物を導入して、細胞宿主酵素機構による部位特異的相同組換えを可能にすることと、を含み、所望の組み込み部位は、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα若しくはβ定常領域(TRAC若しくはTRBC)、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、又はTIGITを含む。
別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なDNA結合ドメインを含むZFN発現カセットを細胞に導入して、ZFN媒介挿入を可能にすることと、を含み、所望の組み込み部位は、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα若しくはβ定常領域(TRAC若しくはTRBC)、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、又はTIGITを含む。更に別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なDNA結合ドメインを含むTALEN発現カセットを細胞に導入して、TALEN媒介挿入を可能にすることと、を含み、所望の組み込み部位は、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα若しくはβ定常領域(TRAC若しくはTRBC)、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、又はTIGITを含む。別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なCas9発現カセット、及びガイド配列を含むgRNAを細胞に導入して、Cas9媒介挿入を可能にすることと、を含み、所望の組み込み部位は、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα若しくはβ定常領域(TRAC若しくはTRBC)、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、又はTIGITを含む。更に別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、DICEレコンビナーゼの対の1つ以上のatt部位を含む構築物を細胞における所望の組み込み部位に導入することと、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、DICEレコンビナーゼの発現カセットを導入して、DICE媒介標的化挿入を可能にすることと、を含み、所望の組み込み部位は、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα若しくはβ定常領域(TRAC若しくはTRBC)、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、又はTIGITを含む。
更に、本明細書で提供されるように、セーフハーバーでの標的化組み込みのための上述の方法は、目的のポリヌクレオチド、例えば、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、及び幹細胞及び/又は前駆細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び/又は生存率を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入するために使用される。いくつかの他の実施形態では、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物は、1つ以上のマーカー遺伝子を更に含む。一実施形態では、本発明の構築物中の外因性ポリヌクレオチドは、安全スイッチタンパク質をコードする自殺遺伝子である。誘導された細胞死のための好適な自殺遺伝子系としては、カスパーゼ9(又はカスパーゼ3若しくは7)及びAP1903、チミジンキナーゼ(thymidine kinase、TK)及びガンシクロビル(ganciclovir、GCV)、シトシンデアミナーゼ(cytosine deaminase、CD)及び5-フルオロシトシン(5-fluorocytosine、5-FC)が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、一部の自殺遺伝子系は細胞型に特異的であり、例えば、B細胞分子CD20によるTリンパ球の遺伝子改変は、mAbリツキシマブの投与時にそれらを排除することができる。更に、セツキシマブによって認識されるエピトープを含む改変されたEGFRは、細胞がセツキシマブに曝露されたときに遺伝子操作された細胞を枯渇させるために使用することができる。したがって、本発明の一態様は、カスパーゼ9(カスパーゼ3又は7)、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変EGFR、及びB細胞CD20から選択される安全スイッチタンパク質をコードする1つ以上の自殺遺伝子の標的化組み込みの方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書の方法によって組み込まれた1つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、標的化組み込みのための構築物に含まれる作動可能に連結された外因性プロモータによって駆動される。プロモータは、誘導性又は構成的であり得、時間特異的、組織特異的又は細胞型特異的であり得る。本発明の方法に好適な構成的プロモータには、サイトメガロウイルス(CMV)、伸長因子1α(elongation factor1α、EF1α)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(phosphoglycerate kinase、PGK)、ハイブリッドCMVエンハンサ/ニワトリβ-アクチン(CAG)、及びユビキチンC(ubiquitin C、UBC)プロモータが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、外因性プロモータはCAGである。
本明細書において提供される方法によって組み込まれた外因性ポリヌクレオチドは、組み込み部位において、宿主ゲノム中の内因性プロモータによって駆動され得る。一実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムにおけるAAVS1遺伝子座における1つ以上の外因性ポリヌクレオチドの標的化組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも1つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性AAVS1プロモータによって駆動される。別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムにおけるROSA26遺伝子座での標的化組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも1つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性ROSA26プロモータによって駆動される。更に別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムにおけるH11遺伝子座での標的化組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも1つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性H11プロモータによって駆動される。別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムにおけるコラーゲン遺伝子座での標的化組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも1つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性コラーゲンプロモータによって駆動される。更に別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムにおけるHTRP遺伝子座での標的化組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも1つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性HTRPプロモータによって駆動される。理論的には、所望の位置での正しい挿入のみが、内因性プロモータによって駆動される外因性遺伝子の遺伝子発現を可能にするであろう。
いくつかの実施形態では、標的化組み込みの方法のための構築物に含まれる1つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、1つのプロモータによって駆動される。いくつかの実施形態では、構築物は、同じプロモータによって駆動される2つの隣接するポリヌクレオチド間に1つ以上のリンカー配列を含み、部分間の物理的分離を高め、酵素機構へのアクセスを最大にする。リンカー配列のリンカーペプチドは、関連する機能に応じて、部分(外因性ポリヌクレオチド、及び/又はそこからコードされるタンパク質又はペプチド)間の物理的分離をより柔軟又はより堅くするように選択されたアミノ酸からなり得る。リンカー配列は、プロテアーゼにより切断可能であり得るか、又は化学的に切断可能であり、別個の部分を生じ得る。リンカーにおける酵素的切断部位の例には、エンテロキナーゼ、第Xa因子、トリプシン、コラゲナーゼ、及びトロンビンなどのタンパク質分解酵素による切断のための部位が含まれる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、宿主によって天然に産生されるものであるか、又は外因的に導入される。代替的に、リンカー中の切断部位は、選択された化学物質又は条件、例えば臭化シアン、ヒドロキシルアミン、又は低pHへの曝露時に切断され得る部位であり得る。必要に応じたリンカー配列は、切断部位の提供以外の目的を果たし得る。リンカー配列は、部分が適切に機能するために、別の隣接部分に対する部分の効果的な配置を可能にするべきである。リンカーはまた、部分間のいずれかの立体障害を防ぐのに十分な長さの単純なアミノ酸配列であってもよい。加えて、リンカー配列は、例えば、リン酸化部位、ビオチン化部位、硫酸化部位、γ-カルボキシル化部位などを含むがこれらに限定されない翻訳後改変を提供することができる。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、生物学的に活性なペプチドを単一の望ましくない立体配座に保持しないように柔軟である。リンカーは、柔軟性を提供するために、グリシン、アラニン、及びセリンなどの小さな側鎖を有するアミノ酸から主になっていてもよい。いくつかの実施形態では、リンカー配列の約80又は90パーセント以上が、グリシン、アラニン、又はセリン残基、特にグリシン及びセリン残基を含む。いくつかの実施形態では、G4Sリンカーペプチドは、融合タンパク質の末端プロセシング及びエンドヌクレアーゼドメインを分離する。他の実施形態では、2Aリンカー配列は、2つの別個のタンパク質が単一の翻訳から産生されることを可能にする。好適なリンカー配列は、経験的に容易に同定することができる。加えて、リンカー配列の好適なサイズ及び配列はまた、従来のコンピュータモデリング技術によって決定され得る。一実施形態では、リンカー配列は、自己切断ペプチドをコードする。一実施形態では、自己切断ペプチドは2Aである。いくつかの他の実施形態では、リンカー配列は、配列内リボソーム進入部位(Internal Ribosome Entry Sequence、IRES)を提供する。いくつかの実施形態では、任意の2つの連続するリンカー配列は異なる。
標的化組み込みのための外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入する方法は、それ自体既知の細胞への遺伝子移入の方法を使用して達成することができる。一実施形態では、構築物は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどのウイルスベクターの骨格を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベクターは、外因性ポリヌクレオチドを標的細胞(例えば、pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)などに送達及び/又は発現するために使用される。いくつかの他の実施形態では、エピソームベクターは、外因性ポリヌクレオチドを標的細胞に送達するために使用される。いくつかの実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス(recombinant adeno-associated virus、rAAV)を遺伝子操作に使用して、相同組換えを介して挿入、欠失、又は置換を導入することができる。レンチウイルスとは異なり、rAAVは宿主ゲノムに組み込まれない。加えて、エピソームrAAVベクターは、従来の標的化プラスミドのトランスフェクションと比較して、相同指向性遺伝子標的化をはるかに高い割合で仲介する。いくつかの実施形態では、AAV6又はAAV2ベクターを使用して、iPSCのゲノム中の標的部位に挿入、欠失、又は置換を導入する。いくつかの実施形態では、本明細書の方法及び組成物を使用して取得されたゲノム改変されたiPSC及びその派生細胞は、表1に列挙された少なくとも1つの遺伝子型を含む。
III.ゲノム操作されたiPSCを取得及び維持する方法
本発明は、1つ以上の所望の部位での1つ以上の標的化編集を含むゲノム操作されたiPSCを取得及び維持する方法であって、標的化編集が、増殖されたゲノム操作されたiPSC又はiPSC派生非多能性細胞において、それぞれの選択された編集部位で無傷で機能的であり続ける、方法を提供する。標的化編集は、iPSCとそれからの派生細胞のゲノムに、挿入、欠失、及び/又は置換を導入、すなわち、選択した部位での標的化組み込み及び/又はインデルを導入する。患者由来の末梢血由来一次エフェクター細胞の直接操作と比較して、本明細書において提供されるiPSCの編集及び分化を通じて由来するゲノム操作されたiPSCを得ることの多くの利点としては、操作されたエフェクター細胞の供給源が無制限であること、特に複数の操作された様式が関与する場合、エフェクター細胞の反復操作の必要がないこと、得られたエフェクター細胞が、伸長したテロメアを有し、消耗が少ないために若返っていること、エフェクター細胞集団は、編集部位、コピー数、並びに対立遺伝子変異、ランダム突然変異及び発現多様性(variegation)の欠如に関して均質であり、これは主に、本明細書において提供される操作されたiPSCにおけるクローン選択が可能であることに起因する。
本発明は、1つ以上の所望の部位での1つ以上の標的化編集を含むゲノム操作されたiPSCを取得及び維持する方法であって、標的化編集が、増殖されたゲノム操作されたiPSC又はiPSC派生非多能性細胞において、それぞれの選択された編集部位で無傷で機能的であり続ける、方法を提供する。標的化編集は、iPSCとそれからの派生細胞のゲノムに、挿入、欠失、及び/又は置換を導入、すなわち、選択した部位での標的化組み込み及び/又はインデルを導入する。患者由来の末梢血由来一次エフェクター細胞の直接操作と比較して、本明細書において提供されるiPSCの編集及び分化を通じて由来するゲノム操作されたiPSCを得ることの多くの利点としては、操作されたエフェクター細胞の供給源が無制限であること、特に複数の操作された様式が関与する場合、エフェクター細胞の反復操作の必要がないこと、得られたエフェクター細胞が、伸長したテロメアを有し、消耗が少ないために若返っていること、エフェクター細胞集団は、編集部位、コピー数、並びに対立遺伝子変異、ランダム突然変異及び発現多様性(variegation)の欠如に関して均質であり、これは主に、本明細書において提供される操作されたiPSCにおけるクローン選択が可能であることに起因する。
特定の実施形態では、1つ以上の選択された部位に1つ以上の標的化編集を含むゲノム操作されたiPSCは、運命維持培地(Fate Maintenance Medium、FMM)として表2に示される細胞培養培地で長期間単一細胞として維持、継代、及び増殖され、ここで、iPSCは、選択された部位で標的化編集と機能改変を保持する。培地の成分は、表2に示される最適範囲内の量で培地中に存在し得る。FMM中で培養されたiPSCは、それらの未分化プロファイル及び基底プロファイル又はナイーブプロファイルを維持し続けること、培養洗浄又は選択を必要としないゲノム安定性及び胚様体又は単層を介するインビトロ分化である(胚様体の形成を伴わない)3つの体細胞系統全てを容易に生じること、及びテラトーマ形成によるインビボ分化、が示されている。例えば、国際公開第2015/134652号(その開示が参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
いくつかの実施形態では、1つ以上の標的化組み込み及び/又はインデルを含むゲノム操作されたiPSCは、MEK阻害剤、GSK3阻害剤、及びROCK阻害剤を含む培地中で維持され、継代され、増殖され、TGFβ受容体/ALK5阻害剤を含まないか、又は本質的に含まず、ここで、iPSCは、選択された部位において無傷で機能的な標的化編集を保持する。
本発明の別の態様は、iPSCの標的化編集を通じて、あるいは最初に標的化編集によりゲノム操作された非多能性細胞を生成し、次に選択/分離されたゲノム操作された非多能性細胞をリプログラミングして非多能性細胞と同じ標的化編集を含むiPSCを取得することを通じて、ゲノム操作されたiPSCを生成する方法を提供する。本発明の更なる態様は、標的化組み込み及び/又は標的化インデルを細胞に導入することによって同時にリプログラミングを受けているゲノム操作非多能性細胞を提供し、接触した非多能性細胞はリプログラミングに十分な条件下にあり、リプログラミングの条件は、非多能性細胞を1つ以上のリプログラミング因子及び小分子と接触させることを含む。同時のゲノム操作及びリプログラミングのための方法の様々な実施形態では、非多能性細胞を1つ以上のリプログラミング因子及び必要に応じて小分子と接触させることにより、リプログラミングを開始する前に、又は本質的に同時に、非標的多能性細胞に標的化組み込み及び/又は標的化インデルを導入することができる。
いくつかの実施形態では、非多能性細胞を同時にゲノム操作及びリプログラミングするために、標的化組み込み及び/又はインデルはまた、非多能性細胞を1つ以上のリプログラミング因子及び小分子と接触させることによりリプログラミングの複数日のプロセスが開始された後に非多能性細胞に導入され得、リプログラミング細胞がSSEA4、Tra181及びCD30を含むがこれらに限定されない1つ以上の内因性多能性遺伝子の安定した発現を示す前に、構築物を担持するベクターが導入される。
いくつかの実施形態では、リプログラミングは、非多能性細胞を少なくとも1つのリプログラミング因子、及び必要に応じてTGFβ受容体/ALK阻害剤、MEK阻害剤、GSK3阻害剤、及びROCK阻害剤の組み合わせ(FRM;表2)と接触させることにより開始される。いくつかの実施形態では、上述の任意の方法によるゲノム操作されたiPSCは、MEK阻害剤、GSK3阻害剤、及びROCK阻害剤の組み合わせを含む混合物(FMM;表2)を使用して更に維持及び増殖される。
ゲノム操作されたiPSCを生成する方法のいくつかの実施形態では、方法は、iPSCに1つ以上の標的化組み込み及び/又はインデルを導入してiPSCをゲノム操作し、表1に列挙された少なくとも1つの遺伝子型を有するゲノム操作されたiPSCを取得することを含む。代替的に、ゲノム操作されたiPSCを生成する方法は、(a)1つ以上の標的化編集を非多能性細胞に導入して、選択した部位で標的化組み込み及び/又はインデルを含むゲノム操作された非多能性細胞を取得することと、(b)ゲノム操作された非多能性細胞を1つ以上のリプログラミング因子、並びに必要に応じてTGFβ受容体/ALK阻害剤、MEK阻害剤、GSK3阻害剤及び/又はROCK阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、選択された部位で標的化組み込み及び/又はインデルを含むゲノム操作されたiPSCを取得することと、を含む。代替的に、ゲノム操作されたiPSCを生成する方法は、(a)非多能性細胞を、1つ以上のリプログラミング因子、並びに必要に応じて、TGFβ受容体/ALK阻害剤、MEK阻害剤、GSK3阻害剤及び/又はROCK阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、非多能性細胞のリプログラミングを開始することと、(b)ゲノム操作のためにリプログラミング非多能性細胞に1つ以上の標的組込み及び/又は挿入/欠失を導入することと、(c)選択された部位に標的組込み及び/又は挿入/欠失を含むゲノム操作されたiPSCを得ることと、を含む。上記の方法のいずれかは、クローンiPSCを得るために、ゲノム操作されたiPSCの単一細胞ソーティングを更に含み得る。このゲノム操作されたiPSCのクローン増殖を通じて、本明細書において提供されるような少なくとも1つの表現型を有する単一細胞ソーティング及び増殖されたクローン操作iPSCを含むようにマスター細胞バンクが生成される。マスター細胞バンクは、続いて凍結保存され、更なるiPSC操作のためのプラットフォーム、及び既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供し、これらの製品は、組成が明確かつ均一であり、費用効果の高い様式で大規模に大量生産することができる。
リプログラミング因子は、国際公開第2015/134652号及び同第2017/066634号に開示されているような、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C-MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、SV40LT、HESRG、CDH1、TDGF1、DPPA4、DNMT3B、ZIC3、L1TD1、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。1つ以上のリプログラミング因子は、ポリペプチドの形態であり得る。リプログラミング因子はまた、ポリヌクレオチドの形態であり得、したがって、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、プラスミド、及びミニサークルなどのベクターによって非多能性細胞に導入される。特定の実施形態では、少なくとも1つのリプログラミング因子をコードする1つ以上のポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクターによって導入される。いくつかの実施形態では、1つ以上のポリヌクレオチドは、エピソームベクターによって導入される。様々な他の実施形態では、1つ以上のポリヌクレオチドは、センダイウイルスベクターによって導入される。いくつかの実施形態では、1つ以上のポリヌクレオチドは、プラスミドの組み合わせによって導入される。例えば、国際公開第2019/075057号(その開示が参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
いくつかの実施形態では、非多能性細胞は、同一の又は異なる選択された部位での標的化組み込みのための複数のベクターによって、異なる外因性ポリヌクレオチド及び/又は異なるプロモータを含む複数の構築物で移入される。これらの外因性ポリヌクレオチドは、自殺遺伝子、又は標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、又はiPSC若しくはそれからの派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力マーカー、自己複製、持続性、及び/又は生存率を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、siRNA、shRNA、miRNA、及びアンチセンス核酸を含むがこれらに限定されないRNAをコードする。これらの外因性ポリヌクレオチドは、構成的プロモータ、誘導性プロモータ、時間特異的プロモータ、及び組織特異的又は細胞型特異的プロモータからなる群から選択される1つ以上のプロモータによって駆動され得る。したがって、ポリヌクレオチドは、プロモータを活性化する条件下で、例えば、誘導剤の存在下で、又は特定の分化した細胞型で発現可能である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、iPSC及び/又はiPSCから分化した細胞で発現される。一実施形態では、1つ以上の自殺遺伝子は、構成的プロモータにより駆動され、例えば、CAGにより駆動されるキャパーゼ-9である。異なる外因性ポリヌクレオチド及び/又は異なるプロモータを含むこれらの構築物は、同時又は連続的に非多能性細胞に移入することができる。複数の構築物の標的化組み込みに供される非多能性細胞は、1つ以上のリプログラミング因子に同時に接触させて、ゲノム操作と同時にリプログラミングプロセスを開始することができ、これにより、同じ細胞のプールに複数の標的化組み込みを含むゲノム操作されたiPSCを取得することができる。このように、この堅牢な方法により、同時のリプログラミングと操作戦略により、選択された1つ以上の標的部位に組み込まれた複数のモダリティを有するクローンゲノム操作hiPSCを派生させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書の方法及び組成物を使用して取得されたゲノム改変されたiPSC及びそれらの派生細胞は、表1に列挙された少なくとも1つの遺伝子型を含む。
IV.ゲノム操作されたiPSCを分化させることにより遺伝子操作されたエフェクター細胞を取得する方法
本発明の更なる態様は、奇形腫形成によるゲノム操作されたiPSCのインビボ分化の方法を提供し、ゲノム操作されたiPSCからインビボで誘導された分化細胞は、所望の部位で標的化組み込み及び/又はインデルを含む無傷で機能的な標的化編集を保持する。いくつかの実施形態では、奇形腫を介してゲノム操作されたiPSCからインビボで誘導された分化細胞は、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、ベータ2ミクログロブリン、CD38、GAPDH、TCR、若しくはRUNX1、又はゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、1つ以上の望ましい部位に組み込まれた1つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む。いくつかの他の実施形態では、奇形腫を介してゲノム操作されたiPSCからインビボで誘導された分化細胞は、標的化モダリティをコードするポリヌクレオチド、又は幹細胞及び/若しくは前駆細胞の輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び/若しくは生存率を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む奇形腫を介してゲノム操作されたiPSCからインビボで誘導された分化細胞は、免疫応答の調節及び媒介と関連する内因性遺伝子の1つ以上のインデルを更に含む。いくつかの実施形態では、インデルは、1つ以上の内因性チェックポイント遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、1つ以上の内因性T細胞受容体遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、1つ以上の内因性MHCクラスIサプレッサ遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、主要組織適合性複合体と関連する1つ以上の内因性遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、イン/デルは、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα又はβ定常領域(TRAC又はTRBC)、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、又はTIGITを含むが、これらに限定されない、1つ以上の内因性遺伝子に含まれる。一実施形態では、選択された部位に1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むゲノム操作されたiPSCは、B2M(ベータ-2-ミクログロブリン)をコードする遺伝子における標的化編集を更に含む。
本発明の更なる態様は、奇形腫形成によるゲノム操作されたiPSCのインビボ分化の方法を提供し、ゲノム操作されたiPSCからインビボで誘導された分化細胞は、所望の部位で標的化組み込み及び/又はインデルを含む無傷で機能的な標的化編集を保持する。いくつかの実施形態では、奇形腫を介してゲノム操作されたiPSCからインビボで誘導された分化細胞は、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、ベータ2ミクログロブリン、CD38、GAPDH、TCR、若しくはRUNX1、又はゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、1つ以上の望ましい部位に組み込まれた1つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む。いくつかの他の実施形態では、奇形腫を介してゲノム操作されたiPSCからインビボで誘導された分化細胞は、標的化モダリティをコードするポリヌクレオチド、又は幹細胞及び/若しくは前駆細胞の輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び/若しくは生存率を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む奇形腫を介してゲノム操作されたiPSCからインビボで誘導された分化細胞は、免疫応答の調節及び媒介と関連する内因性遺伝子の1つ以上のインデルを更に含む。いくつかの実施形態では、インデルは、1つ以上の内因性チェックポイント遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、1つ以上の内因性T細胞受容体遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、1つ以上の内因性MHCクラスIサプレッサ遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、主要組織適合性複合体と関連する1つ以上の内因性遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、イン/デルは、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα又はβ定常領域(TRAC又はTRBC)、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、又はTIGITを含むが、これらに限定されない、1つ以上の内因性遺伝子に含まれる。一実施形態では、選択された部位に1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むゲノム操作されたiPSCは、B2M(ベータ-2-ミクログロブリン)をコードする遺伝子における標的化編集を更に含む。
特定の実施形態では、本明細書で提供される1つ以上の遺伝子改変を含むゲノム操作されたiPSCは、造血細胞系統又は他の特定の細胞型をインビトロで誘導するために使用され、誘導された非多能性細胞は、選択された部位で標的化編集を含む機能的遺伝子改変を保持する。いくつかの実施形態では、造血細胞系統又は他の特定の細胞型をインビトロで誘導するために使用されるゲノム操作されたiPSCは、凍結保存され、それらの使用直前に解凍される、マスター細胞バンク細胞である。一実施形態では、ゲノム操作されたiPSC由来細胞は、決定的な造血内皮(HE)の可能性を有する中胚葉細胞、決定的なHE、CD34造血細胞、造血幹前駆細胞、造血多能性前駆細体(MPP)、T細胞前駆細体、NK細胞前駆細体、骨髄細胞、好中球前駆細体、T細胞、NKT細胞、NK細胞、B細胞、好中球、樹状細胞、及びマクロファージを含むがこれらに限定されず、ゲノム操作されたiPSCに由来するこれらの細胞は、所望の部位で標的化編集を含む機能的な遺伝子改変を保持する。
iPSC由来造血細胞系統を得るための適用可能な分化方法及び組成物には、例えば、国際公開第2017/078807号に示されるものが含まれ、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。提供されているように、造血細胞系統を生成するための方法と組成物は、無血清、フィーダを含まない、及び/又は間質を含まない条件下で、スケーラブルで単層のEB形成を必要としない培養プラットフォームにおいて、hiPSCを含む、多能性幹細胞に由来する決定的な造血内皮(HE)を介する。提供された方法に従って分化され得る細胞は、多能性幹細胞から、特定の最終分化細胞及び分化転換細胞にコミットした前駆細胞、及び多能性中間体を経由せずに造血運命に直接移行した様々な系統の細胞にまで及ぶ。同様に、幹細胞を分化させることによって産生される細胞は、多能性幹細胞又は前駆細胞から、最終分化細胞まで、及び全ての介在する造血細胞系統にまで及ぶ。
いくつかの実施形態では、単層培養において造血系統の細胞を多能性幹細胞から分化及び増殖させる方法は、多能性幹細胞をBMP経路活性化因子、及び必要に応じてbFGFと接触させることを含む。提供されるように、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が得られ、多能性幹細胞から胚様体を形成することなく増殖される。次いで、中胚葉細胞をBMP経路活性化因子、bFGF、及びWNT経路活性化因子との接触に供して、多能性幹細胞から胚様体を形成することなく、決定的な造血内皮(HE)の可能性を有する増殖中胚葉細胞を取得する。その後のbFGFとの接触、及び必要に応じてROCK阻害剤、及び/又はWNT経路活性化因子との接触により、決定的なHEの可能性を有する中胚葉細胞は、同様に分化中に増殖される、決定的なHE細胞に分化する。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される造血系統の細胞を取得するための方法はEB媒介の多能性幹細胞分化より優れているが、これは、EB形成が適度な増殖から最小限の細胞増殖をもたらし、均一な増殖を必要とする多くの用途で重要な単層培養、及び集団内の細胞の均一な分化を可能にせず、骨が折れ、効率が低くなるためである。
いくつかの実施形態では、提供されている単層分化プラットフォームは、造血幹細胞及びT細胞、B細胞、NKT細胞、及びNK細胞などの分化した子孫の誘導をもたらす決定的な造血内皮への分化を促進する。単層分化戦略は、増強された分化効率と大規模な増殖を組み合わせて、様々な治療用途のための多能性幹細胞由来造血細胞の治療上適切な数の送達を可能にする。更に、本明細書において提供される方法を使用した単層培養は、インビトロ分化、エキスビボ修飾、及びインビボ長期造血自己複製、再構成及び生着の全範囲を可能にする機能的造血系統細胞をもたらす。提供されているように、iPSC由来造血系統細胞には、決定的な造血内皮、造血多能性前駆細胞、造血幹前駆細胞、T細胞前駆体、NK細胞前駆体、T細胞、NK細胞、NKT細胞、B細胞、マクロファージ、並びに好中球が含まれるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、決定的な造血系統の細胞への多能性幹細胞の分化を指示するための方法は、(i)多能性幹細胞を、BMP活性化因子、及び必要に応じてbFGFを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞からの中胚葉細胞の分化及び増殖を開始させることと、(ii)中胚葉細胞を、BMP活性化因子、bFGF、及びGSK3阻害剤を含む組成物と接触させて、中胚葉細胞からの決定的なHEの可能性を有する中胚葉細胞の分化及び増殖を開始させることであって、組成物は、必要に応じてTGFβ受容体/ALK阻害剤を含まない、ことと、(iii)決定的なHEの可能性を有する中胚葉細胞を、ROCK阻害剤、bFGF、VEGF、SCF、IGF、EPO、IL6、及びIL11からなる群から選択される1つ以上の増殖因子及びサイトカイン、並びに必要に応じてWnt経路活性化因子を含む組成物と接触させて、決定的な造血内皮の可能性を有する多能性幹細胞由来中胚葉細胞からの決定的な造血内皮の分化及び増殖を開始させることであって、組成物は、必要に応じてTGFβ受容体/ALK阻害剤を含まない、ことと、を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、多能性幹細胞を、MEK阻害剤、GSK3阻害剤、及びROCK阻害剤を含み、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まない組成物と接触させ、多能性幹細胞を播種及び増殖させることを更に含む。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、iPSC、又はナイーブiPSC、又は1つ以上の遺伝的インプリントを含むiPSCであり、iPSCに含まれる1つ以上の遺伝的インプリントは、そこから分化した造血細胞に保持される。多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化を指示するための方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化は、胚様体の生成がなく、単層培養形態である。
上述の方法のいくつかの実施形態では、取得された多能性幹細胞由来の決定的な造血内皮細胞は、CD34+である。いくつかの実施形態では、取得された決定的な造血内皮細胞は、CD34+CD43-である。いくつかの実施形態では、決定的な造血内皮細胞は、CD34+CD43-CXCR4-CD73-である。いくつかの実施形態では、決定的な造血内皮細胞は、CD34+CXCR4-CD73-である。いくつかの実施形態では、決定的な造血内皮細胞は、CD34+CD43-CD93-である。いくつかの実施形態では、決定的な造血内皮細胞は、CD34+CD93-である。
上述の方法のいくつかの実施形態では、方法は、(i)多能性幹細胞由来の決定的な造血内皮を、ROCK阻害剤と、VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、TPO、及びIL7からなる群から選択される1つ以上の増殖因子及びサイトカインと、必要に応じてBMP活性化因子とを含む組成物と接触させて、プレT細胞前駆体への決定的な造血内皮の分化を開始させることと、必要に応じて、(ii)プレT細胞前駆体を、SCF、Flt3L、及びIL7からなる群から選択される1つ以上の増殖因子及びサイトカインを含むが、VEGF、bFGF、TPO、BMP活性化因子及びROCK阻害剤のうちの1つ以上を含まない組成物と接触させて、T細胞前駆体又はT細胞へのプレT細胞前駆体の分化を開始させることと、を更に含む。この方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来T細胞前駆体は、CD34+CD45+CD7+である。この方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来T細胞前駆体は、CD45+CD7+である。
多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化を指示するための上記方法の更にいくつかの実施形態では、方法は、(i)多能性幹細胞由来の決定的な造血内皮を、ROCK阻害剤;VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、TPO、IL3、IL7、及びIL15からなる群から選択される1つ以上の増殖因子及びサイトカイン、並びに必要に応じてBMP活性化因子を含む組成物と接触させ、決定的な造血内皮のプレNK細胞前駆体への分化を開始することと、必要に応じて(ii)多能性幹細胞由来のプレNK細胞前駆体を、SCF、Flt3L、IL3、IL7、及びIL15からなる群から選択される1つ以上の増殖因子及びサイトカインを含む組成物と接触させ、VEGF、bFGF、TPO、BMP活性化因子、及びROCK阻害剤の1つ以上を含まない培地は、プレNK細胞前駆体からNK細胞前駆体又はNK細胞への分化を開始することと、を更に含む。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来NK前駆体は、CD3-CD45+CD56+CD7+である。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来NK細胞は、CD3-CD45+CD56+であり、必要に応じて、NKp46+、CD57+及びCD16+であることによって更に規定される。
したがって、上記の分化方法を使用すると、以下のiPSC由来造血細胞の1つ以上の集団を取得し得る:(i)iMPP-A、iTC-A2、iTC-B2、iNK-A2、及びiNK-B2から選択される1つ以上の培養培地を使用する、CD34+HE細胞(iCD34)、(ii)iMPP-A、iTC-A2、iTC-B2、iNK-A2、及びiNK-B2から選択される1つ以上の培養培地を使用する、決定的な造血内皮(iHE)、(ii)iMPP-A、iTC-A2、iTC-B2、iNK-A2、及びiNK-B2から選択される1つ以上の培養培地を使用する、決定的なHSC、(iv)iMPP-Aを使用する、多能性前駆細胞(iMPP)、(v)iTC-A2、及びiTC-B2から選択される1つ以上の培養培地を使用する、T細胞前駆体(ipro-T)、(vi)iTC-B2を使用する、T細胞(iTC)、(vii)iNK-A2、及びiNK-B2から選択される1つ以上の培養培地を使用する、NK細胞前駆体(ipro-NK)、並びに/又は(viii)NK細胞(iNK)、及びiNK-B2。いくつかの実施形態では、培地は以下である:
a.iCD34-Cは、ROCK阻害剤と、bFGF、VEGF、SCF、IL6、IL11、IGF、及びEPOからなる群から選択される1つ以上の増殖因子及びサイトカインと、必要に応じて、Wnt経路活性化因子とを含み、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まない。
b.iMPP-Aは、BMP活性化因子と、ROCK阻害剤と、TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6、Flt3L、及びIL11からなる群から選択される1つ以上の増殖因子及びサイトカインとを含む。
c.iTC-A2は、ROCK阻害剤と、SCF、Flt3L、TPO、及びIL7からなる群から選択される1つ以上の増殖因子及びサイトカインと、必要に応じてBMP活性化因子と、を含む。
d.iTC-B2は、SCF、Flt3L、及びIL7からなる群から選択される1つ以上の増殖因子及びサイトカインを含む。
e.iNK-A2は、ROCK阻害剤と、SCF、Flt3L、TPO、IL3、IL7、及びIL15からなる群から選択される1つ以上の増殖因子及びサイトカインと、必要に応じて、BMP活性化因子とを含む。
f.iNK-B2は、SCF、Flt3L、IL7、及びIL15からなる群から選択される1つ以上の増殖因子及びサイトカインを含む。
a.iCD34-Cは、ROCK阻害剤と、bFGF、VEGF、SCF、IL6、IL11、IGF、及びEPOからなる群から選択される1つ以上の増殖因子及びサイトカインと、必要に応じて、Wnt経路活性化因子とを含み、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まない。
b.iMPP-Aは、BMP活性化因子と、ROCK阻害剤と、TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6、Flt3L、及びIL11からなる群から選択される1つ以上の増殖因子及びサイトカインとを含む。
c.iTC-A2は、ROCK阻害剤と、SCF、Flt3L、TPO、及びIL7からなる群から選択される1つ以上の増殖因子及びサイトカインと、必要に応じてBMP活性化因子と、を含む。
d.iTC-B2は、SCF、Flt3L、及びIL7からなる群から選択される1つ以上の増殖因子及びサイトカインを含む。
e.iNK-A2は、ROCK阻害剤と、SCF、Flt3L、TPO、IL3、IL7、及びIL15からなる群から選択される1つ以上の増殖因子及びサイトカインと、必要に応じて、BMP活性化因子とを含む。
f.iNK-B2は、SCF、Flt3L、IL7、及びIL15からなる群から選択される1つ以上の増殖因子及びサイトカインを含む。
いくつかの実施形態では、上記の方法から得られるゲノム操作されたiPSC由来細胞は、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα若しくはβ定常領域(TRAC若しくはTRBC)、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、又はTIGIT、又はゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、1つ以上の所望の組み込み部位で組み込まれる1つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む。いくつかの他の実施形態では、ゲノム操作されたiPSC由来細胞は、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、又は幹細胞及び/若しくは前駆細胞の輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び/若しくは生存率を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の自殺遺伝子を含むゲノム操作されたiPSC由来細胞は、チェックポイント遺伝子、内因性T細胞受容体遺伝子、及びMHCクラスIサプレッサ遺伝子を含むがこれに限定されない、免疫応答調節及び媒介と関連する1つ以上の内因性遺伝子に含まれる1つ以上のインデルを更に含む。一実施形態では、1つ以上の自殺遺伝子を含むゲノム操作されたiPSC派生細胞は、B2M遺伝子にインデルを含み、B2Mがノックアウトされている。
加えて、第1の運命のゲノム操作造血細胞から第2の運命のゲノム操作造血細胞を取得するための適用可能な脱分化方法及び組成物は、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれている国際公開第2011/159726号に示されているものを含む。その中で提供される方法及び組成物は、リプログラミング中に内因性Nanog遺伝子の発現を制限することによって、開始非多能性細胞を非多能性中間細胞に部分的にリプログラミングすることを可能にし、非多能性中間細胞を、中間細胞を所望の細胞型に分化させるための条件に供する。いくつかの実施形態では、本明細書の方法及び組成物を使用して取得されたゲノム改変されたiPSC及びそれらの派生細胞は、表1に列挙された少なくとも1つの遺伝子型を含む。
V.遺伝子操作されたiPSCから分化した機能的モダリティを有する派生免疫細胞の治療的使用
本発明は、いくつかの実施形態では、開示される方法及び組成物を使用してゲノム操作されたiPSCから分化された機能的に増強された派生免疫細胞の単離された集団又は亜集団を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物のiPSCは、iPSC由来免疫細胞に保持可能な、表1に列挙されるものなどの1つ以上の標的化遺伝子編集を含み、遺伝子操作されたiPSC及びそれからの派生細胞は、細胞ベースの養子療法に好適である。一実施形態では、組成物の遺伝子操作免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、iPSC由来CD34細胞を含む。一実施形態では、組成物の遺伝子操作免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、iPSC由来HSC細胞を含む。一実施形態では、組成物の遺伝子操作免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、iPSC由来プロT細胞又はT細胞を含む。一実施形態では、組成物の遺伝子操作免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、iPSC由来プロNK細胞又はNK細胞を含む。一実施形態では、組成物の遺伝子操作免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、iPSC由来免疫調節細胞又は骨髄由来のサプレッサ細胞(myeloid derived suppressor cell、MDSC)を含む。組成物のいくつかの実施形態では、iPSC由来遺伝子操作免疫細胞は、改善された治療の可能性のために、エキスビボで更に調節される。一実施形態では、iPSCに由来している遺伝子操作免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、ナイーブT細胞、幹細胞メモリT細胞、及び/又はセントラルメモリT細胞の数又は比率の増加を含む。一実施形態では、iPSCに由来している遺伝子操作エフェクター細胞の単離された集団又は亜集団は、I型NKT細胞の数又は比率の増加を含む。別の実施形態では、iPSCに由来している遺伝子操作エフェクター細胞の単離された集団又は亜集団は、適応NK細胞の数又は比率の増加を含む。組成物のいくつかの実施形態では、遺伝子操作CD34細胞、HSC細胞、T細胞、NK細胞、又はiPSCに由来する骨髄由来サプレッサ細胞の単離された集団又は亜集団は、同種異系である。組成物のいくつかの他の実施形態では、遺伝子操作CD34細胞、HSC細胞、T細胞、NK細胞、又はiPSCに由来するMDSCの単離された集団又は亜集団は、自家性である。
本発明は、いくつかの実施形態では、開示される方法及び組成物を使用してゲノム操作されたiPSCから分化された機能的に増強された派生免疫細胞の単離された集団又は亜集団を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物のiPSCは、iPSC由来免疫細胞に保持可能な、表1に列挙されるものなどの1つ以上の標的化遺伝子編集を含み、遺伝子操作されたiPSC及びそれからの派生細胞は、細胞ベースの養子療法に好適である。一実施形態では、組成物の遺伝子操作免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、iPSC由来CD34細胞を含む。一実施形態では、組成物の遺伝子操作免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、iPSC由来HSC細胞を含む。一実施形態では、組成物の遺伝子操作免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、iPSC由来プロT細胞又はT細胞を含む。一実施形態では、組成物の遺伝子操作免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、iPSC由来プロNK細胞又はNK細胞を含む。一実施形態では、組成物の遺伝子操作免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、iPSC由来免疫調節細胞又は骨髄由来のサプレッサ細胞(myeloid derived suppressor cell、MDSC)を含む。組成物のいくつかの実施形態では、iPSC由来遺伝子操作免疫細胞は、改善された治療の可能性のために、エキスビボで更に調節される。一実施形態では、iPSCに由来している遺伝子操作免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、ナイーブT細胞、幹細胞メモリT細胞、及び/又はセントラルメモリT細胞の数又は比率の増加を含む。一実施形態では、iPSCに由来している遺伝子操作エフェクター細胞の単離された集団又は亜集団は、I型NKT細胞の数又は比率の増加を含む。別の実施形態では、iPSCに由来している遺伝子操作エフェクター細胞の単離された集団又は亜集団は、適応NK細胞の数又は比率の増加を含む。組成物のいくつかの実施形態では、遺伝子操作CD34細胞、HSC細胞、T細胞、NK細胞、又はiPSCに由来する骨髄由来サプレッサ細胞の単離された集団又は亜集団は、同種異系である。組成物のいくつかの他の実施形態では、遺伝子操作CD34細胞、HSC細胞、T細胞、NK細胞、又はiPSCに由来するMDSCの単離された集団又は亜集団は、自家性である。
組成物のいくつかの実施形態では、分化のためのiPSCは、エフェクター細胞において望ましい治療属性を伝えるために選択された遺伝子インプリントを含み、分化中の細胞発生生物学が破壊されず、当該iPSC由来分化造血細胞において遺伝子インプリントが保持され、機能的であることを条件とする。
組成物のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞の遺伝的インプリントは、(i)非多能性細胞をiPSCにリプログラミングする間若しくはその後に、多能性細胞のゲノムにおけるゲノム挿入、欠失若しくは置換を通じて得られる1つ以上の遺伝子組換えモダリティ、又は(ii)ドナー、疾患、若しくは治療応答に特異的である、供給源特異的免疫細胞の1つ以上の保持可能な治療属性を含み、多能性細胞は、供給源特異的免疫細胞からリプログラミングされ、iPSCは、供給源治療属性を保持し、供給源治療属性はまた、iPSC由来造血系統細胞にも含まれている。
組成物のいくつかの実施形態では、遺伝子組換えモダリティは、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、又はiPSC若しくはそれからの派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、免疫応答調節及び修飾、並びに/若しくは生存率を促進するタンパク質、のうちの1つ以上を含む。組成物のいくつかの実施形態では、遺伝子改変されたiPSC及びそれからの派生細胞は、表1に列挙された遺伝子型を含む。組成物のいくつかの他の実施形態では、表1に列挙された遺伝子型を含む遺伝子改変iPSC及びそれからの派生細胞は、(1)TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、又はRFXAP、RAG1、及び染色体6p21領域の任意の遺伝子の1つ以上の破壊、並びに(2)HLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、Fc受容体、又は二重特異性若しくは多重特異性若しくはユニバーサルエンゲージャとのカップリングのための表面トリガー受容体の導入、を含む追加の遺伝子改変モダリティを更に含む。
組成物の更にいくつかの他の実施形態では、造血系統細胞は、以下のうちの少なくとも2つの組み合わせに関する供給源特異的免疫細胞の治療属性を含む:(i)1つ以上の抗原標的化受容体発現、(ii)改変されたHLA、(iii)腫瘍微小環境に対する耐性、(iv)バイスタンダー免疫細胞及び免疫修飾の動員、(v)低減された腫瘍外効果を伴う改善されたオンターゲット特異性、並びに(vi)改善されたホーミング、持続性、細胞傷害性、又は抗原エスケープ救済。
組成物のいくつかの実施形態では、iPSC由来造血細胞は、表1に列挙される遺伝子型を含み、IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、若しくはIL21を含む少なくとも1つのサイトカイン及び/若しくはその受容体、又はそれらの任意の改変タンパク質を発現し、少なくともCARを発現する。いくつかの実施形態では、サイトカイン及びCARの操作された発現は、NK細胞特異的である。組成物のいくつかの他の実施形態では、サイトカイン及びCARの操作された発現は、T細胞特異的である。一実施形態では、CARは、CD38結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、iPSC派生造血エフェクター細胞は抗原特異的である。いくつかの実施形態では、抗原特異的派生エフェクター細胞は、液体腫瘍を標的とする。いくつかの実施形態では、抗原特異的派生エフェクター細胞は、固形腫瘍を標的とする。いくつかの実施形態では、抗原特異的iPSC派生造血エフェクター細胞は、腫瘍抗原エスケープを救済することができる。
本発明のいくつかの実施形態による免疫細胞又は組成物を養子細胞療法に好適な対象に導入することにより、種々の疾患を改善することができる。いくつかの実施形態では、提供されるiPSC派生造血細胞又は組成物は、同種異系養子細胞療法のためのものである。加えて、本発明は、いくつかの実施形態において、養子細胞療法に好適な対象に細胞又は組成物を導入することによる、上記免疫細胞又は治療用組成物の治療的使用であって、対象が、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、又はHIV、RSV、EBV、CMV、アデノウイルス、若しくはBKポリオーマウイルスと関連する感染を有する、治療的使用を提供する。血液悪性腫瘍の例には、急性及び慢性白血病(急性骨髄性白血病(acute myelogenous leukemia、AML)、急性リンパ性白血病(acute lymphoblastic leukemia、ALL)、慢性骨髄性白血病(chronic myelogenous leukemia、CML)、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(non-Hodgkin lymphoma、NHL)、ホジキン病、多発性骨髄腫、及び骨髄異形成症候群が含まれるが、これらに限定されない。固形がんの例には、脳、前立腺、乳房、肺、結腸、子宮、皮膚、肝臓、骨、膵臓、卵巣、精巣、膀胱、腎臓、頭、首、胃、子宮頸、直腸、喉頭、及び食道のがんが含まれるが、これらに限定されない。様々な自己免疫疾患の例には、円形脱毛症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、糖尿病(1型)、若年性特発性関節炎のいくつかの形態、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、いくつかの形態の心筋炎、多発性硬化症、類天疱瘡/類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、リウマチ様関節炎、強皮症/全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎のいくつかの形態、ブドウ膜炎のいくつかの形態、白斑、多発血管炎を伴う肉芽腫症(ウェゲナー病)が含まれるが、これらに限定されない。ウイルス感染症の例には、HIV-(human immunodeficiency virus、ヒト免疫不全ウイルス)、HSV-(herpes simplex virus、単純ヘルペスウイルス)、KSHV-(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス)、RSV-(Respiratory Syncytial Virus、呼吸器合胞体ウイルス)、EBV-(Epstein-Barr virus、エプスタイン-バーウイルス)、CMV-(cytomegalovirus、サイトメガロウイルス)、VZV(Varicella zoster virus、水痘帯状疱疹ウイルス)、アデノウイルス-、レンチウイルス-、BKポリオーマウイルス-関連疾患が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に開示されている実施形態の派生造血系統細胞、又は本明細書に開示される組成物を使用する治療は、症状に基づいて、又は再燃防止のために行うことができる。「治療すること」、「治療」などの用語は、本明細書では、概して、所望の薬理学的及び/又は生理学的効果を取得することを意味するために使用される。効果は、疾患を完全に若しくは部分的に予防することに関して予防的であり得、かつ/又は疾患及び/若しくは疾患に起因する有害作用の部分的若しくは完全な治癒に関して治療的であり得る。本明細書で使用されるとき、「治療」は、対象における疾患のあらゆる介入を網羅し、以下を含む:疾患にかかりやすいが、まだそれを有していると診断されていない対象において疾患が生じることを予防すること、疾患を阻害すること、すなわちその発症を阻止すること、又は疾患を緩和する、すなわち疾患を後退させること。治療剤又は組成物は、疾患又は傷害の発症前、発症中又は発症後に投与することができる。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化又は軽減させる進行中の疾患の治療もまた、特に重要である。特定の実施形態では、治療を必要とする対象は、細胞療法により少なくとも1つの関連する症状を抑制、改善、及び/又は改善することができる疾患、状態、及び/又は傷害を有する。特定の実施形態は、細胞療法を必要とする対象が、骨髄又は幹細胞移植の候補、化学療法又は放射線療法を受けた対象、過剰増殖性障害又はがん、例えば、造血系の過剰増殖性障害又はがんを有するか又は有するリスクがある対象、腫瘍、例えば、固形腫瘍を有するか又は発症するリスクがある対象、ウイルス感染又はウイルス感染と関連する疾患を有するか又は有するリスクがある対象を含むが、これらに限定されないことを企図する。
本明細書に開示された実施形態の派生造血系統細胞を含む治療に対する応答性を評価するとき、応答は、臨床的利益率、死亡までの生存率、病理学的完全奏功、病理学的応答の版定量的測定、臨床的完全寛解、臨床的部分寛解、臨床的安定疾患、無再発生存、無転移生存、無病生存、循環腫瘍細胞減少、循環マーカー応答、及びRECIST(Respose Evaluation Criteria In Solid Tumors、固形腫瘍における応答評価基準)基準、のうちの少なくとも1つによって測定され得る。
本明細書に開示されるような派生造血系統細胞を含む治療用組成物は、他の治療の前、間、及び/又は後に対象に投与することができる。したがって、併用療法の方法は、追加の治療剤の使用前、使用中、及び/又は使用後のiPSC由来免疫細胞の投与又は調製を含み得る。上述のように、1つ以上の追加の治療剤は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、マイトジェン、増殖因子、低分子RNA、dsRNA(二本鎖RNA)、単核血球、フィーダ細胞、フィーダ細胞成分又はその補充因子、1つ以上の目的のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤又は放射性部分、又は免疫修飾薬(IMiD)を含む。iPSC由来免疫細胞の投与は、追加の治療剤の投与から、時間、日、又は週単位によって時間的に分離することができる。追加的又は代替的に、投与は、抗腫瘍剤、手術などの非薬物療法などであるがこれらに限定されない他の生物活性剤又はモダリティと組み合わせることができる。
組み合わせ細胞療法のいくつかの実施形態では、治療的組み合わせは、本明細書で提供されるiPSC由来造血系統細胞及び抗体又は抗体断片である追加の治療剤を含む。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、又はキメラ抗体であってもよい。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、ウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体又は抗体断片は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍又はウイルス特異的抗原は、投与されたiPSC由来造血系統細胞を活性化して、それらの殺傷能力を増強する。いくつかの実施形態では、投与されたiPSC由来造血系統細胞に対する追加の治療剤として組み合わせ治療に好適な抗体は、抗CD20(例えば、リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、オクレリズマブ)、抗CD22(イノツズマブ、モキセツモマブ、エプラツズマブ)、抗HER2(例えば、トラスツズマブ、パーツズマブ)、抗CD52(例えば、アレムツズマブ)、抗EGFR(例えば、セツキシマブ)、抗GD2(例えば、ジヌツキシマブ)、抗PDL1(例えば、アベルマブ)、抗CD38(例えば、ダラツムマブ、イサツキシマブ、MOR202)、抗CD123(例えば、7G3、CSL362)、抗SLAMF7(エロツズマブ)、及びそれらのヒト化又はFc改変バリアント若しくは断片、又はそれらの機能的同等物若しくはバイオシミラーを含むがそれらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明は、表1に列挙され、本明細書において提供される遺伝子型を有するiPSC由来造血系統細胞と、上記の抗体又は抗体断片である追加の治療剤と、を含む治療用組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、1つ以上のチェックポイント阻害剤を含む。チェックポイントは、阻害されていない場合に免疫応答を抑制又は下方制御することができる細胞分子、しばしば細胞表面分子を指す。チェックポイント阻害剤は、チェックポイントの遺伝子発現又は遺伝子産物を減少させるか、又はチェックポイント分子の活性を低下させることができるアンタゴニストである。本明細書で提供されるNK又はT細胞を含む派生エフェクター待望との併用療法に好適なチェックポイント阻害剤には、PD-1(Pdcdl、CD279)、PDL-1(CD274)、TIM-3(Havcr2)、TIGIT(WUCAM及びVstm3)、LAG-3(Lag3、CD223)、CTLA-4(Ctla4、CD152)、2B4(CD244)、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、A2AR、BATE、BTLA、CD39(Entpdl)、CD47、CD73(NT5E)、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、レチノイン酸受容体アルファ(Rara)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E、及び阻害性KIR(例えば、2DL1、2DL2、2DL3、3DL1、及び3DL2)のアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。
提供される派生エフェクター細胞を含む併用療法のいくつかの実施形態は、チェックポイント分子を標的化する少なくとも1つの阻害剤を更に含む。提供される派生エフェクター細胞との併用療法のいくつかの他の実施形態は、2つ、3つ、又はそれ以上のチェックポイント分子が標的とされるように、2つ、3つ以上の阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の併用療法のためのエフェクター細胞は、提供されるような派生NK系統細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の併用療法のためのエフェクター細胞は、派生T系統細胞である。いくつかの実施形態では、併用療法のための派生NK系統細胞又はT系統細胞は、本明細書において提供されるように機能的に増強されている。いくつかの実施形態では、2つ、3つ以上のチェックポイント阻害剤は、派生エフェクター細胞の投与と同時、前、又は後に併用療法で投与することができる。いくつかの実施形態では、2つ以上のチェックポイント阻害剤は、同時に、又は一度に1つ(逐次的に)投与される。いくつかの実施形態では、本発明は、表1に列挙され、本明細書で提供される遺伝子型を有するiPSC由来エフェクター細胞と、上記のような1つ以上のチェックポイント阻害剤とを含む治療用組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、上述のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストは抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダIg、サメ重鎖のみ抗体(VNAR)、Ig NAR、キメラ抗体、組換え抗体、又はそれらの抗体断片であり得る。抗体断片の非限定的な例には、Fab、Fab’、F(ab’)2、F(ab’)3、Fv、一本鎖抗原結合断片(scFv)、(scFv)2、ジスルフィド安定化Fv(dsFv)、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片(sdAb、ナノボディ)、組換え重鎖のみ抗体(VHH)、及び抗体全体の結合特異性を維持するその他の抗体断片が含まれ、それらは、抗体全体よりも、製造するのに費用対効果が高く、より簡単に使用することができ、又は感度が高くあり得る。いくつかの実施形態では、1つ又は2つ又は3つ以上のチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、IPH4102、IPH43、IPH33、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びそれらの派生体又は機能的同等物のうちの少なくとも1つを含む。
派生エフェクター細胞及び1つ以上のチェック阻害剤を含む併用療法は、皮膚T細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(NHL)、菌状息肉症、パジェット様細網症、セザリー症候群、肉芽腫様弛緩皮膚、リンパ腫様丘疹症、慢性苔癬状粃糠疹、急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、CD30+皮膚T細胞リンパ腫、二次皮膚CD30+大細胞リンパ腫、非菌状息肉症CD30皮膚大T細胞リンパ腫、多形性T細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、皮下T細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、芽球性NK細胞リンパ腫、B細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫(hodgkins lymphoma、HL)、頭頸部腫瘍;扁平上皮がん、横紋筋肉腫、ルイス肺がん(Lewis lung carcinoma、LLC)、非小細胞肺がん、食道扁平上皮がん、食道腺がん、腎細胞がん(renal cell carcinoma、RCC)、結腸直腸がん(colorectal cancer、CRC)、急性骨髄性白血病(AML)、乳がん、胃がん、前立腺小細胞神経内分泌がん(SCNC)、肝臓がん、膠芽腫、肝臓がん、口腔扁平上皮がん、膵臓がん、甲状腺乳頭がん、肝内胆管細胞がん、肝細胞がん、骨がん、転移、及び鼻咽頭がんを含むがこれらに限定されない、液性及び固形がんの治療に適用され得る。
本明細書において提供されるような派生エフェクター細胞以外のいくつかの実施形態では、治療的使用のための組み合わせは、化学療法剤又は放射性部分を含む1つ以上の追加の治療剤を含む。化学療法剤とは、細胞傷害性抗腫瘍剤、すなわち、腫瘍細胞を優先的に殺傷するか、又は急速に増殖する細胞の細胞周期を破壊するか、又は幹がん細胞を根絶することが見出され、腫瘍性細胞の増殖を防止又は低減するために治療的に使用される化学剤を指す。化学療法剤はまた、抗腫瘍性又は細胞傷害性の薬物又は薬剤と称されることもあり、当該技術分野で周知である。
いくつかの実施形態では、化学療法剤は、アントラサイクリン、アルキル化剤、スルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミン、メチルメラミン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、抗生物質、代謝拮抗剤、葉酸類似体、プリン類似体、ピリミジン類似体、酵素、ポドフィロトキシン、白金含有薬剤、インターフェロン、及びインターロイキンを含む。例示的な化学療法剤には、アルキル化剤(シクロホスファミド、メクロレタミン、メファリン、クロラムブシル、ヘアメチルメラミン、チオテパ、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン)、代謝拮抗剤(メトトレキサート、フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、6-メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン)、ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン)、エピポドフィロトキシン(エトポシド、エトポシドオルトキノン、及びテニポシド)、抗生物質(ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ビスアントレン、アクチノマイシンD、プリカマイシン、ピューロマイシン、及びグラミシジンD)、パクリタキセル、コルヒチン、サイトカラシンB、エメチン、メイタンシン、並びにアムサクリンが含まれるが、これらに限定されない。追加の薬剤には、アミングルテチミド、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、アルトレタミン、シクロホスファミド、ロムスチン(CCNU)、カルムスチン(BCNU)、イリノテカン(CPT-11)、アレムツザマブ、アルトレタミン、アナストロゾール、L-アスパラギナーゼ、アザシチジン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルステロン、カペシタビン、セレコキシブ、セツキシマブ、クラドリビン、クロフラビン、シタラビン、ダカルバジン、デニロイキンジフチトクス、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドロモスタノロン、エピルビシン、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エチニルエストラジオール、エキセメスタン、フロクスウリジン、5-フルオロウラシル、フルダラビン、フルタミド、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、インターフェロンアルファ(2a、2b)、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、メクロレタミン、メゲストロール、メルファリン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトキサレン、マイトマイシンC、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロン、ノフェツモマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペメトレキセド、ペガデマーゼ、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ポリフェプロサン、ポルフィマー、プロカルバジン、キナクリン、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、トペテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビノレルビン、及びゾレドロネートが含まれる。他の好適な薬剤は、化学療法剤又は放射線療法剤として承認され、当該技術分野で知られているものを含む、ヒトへの使用が承認されているものである。そのような薬剤は、多くの標準的な医師や腫瘍学者の参考文献(例えば、Goodman&Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,Ninth Edition,McGraw-Hill,N.Y.,1995)又はNational Cancer Instituteウェブサイト(fda.gov/cder/cancer/druglistfrarne.htm)のいずれかを参照することができ、どちらも随時更新される。
サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイドなどの免疫修飾薬(IMiD)は、NK細胞とT細胞の両方を刺激する。本明細書において提供されるように、IMiDは、がん治療のためにiPSC由来治療用免疫細胞とともに使用され得る。
治療用組成物に含まれるiPSC由来造血系統細胞の単離された集団以外に、患者への投与に好適な組成物は、1つ以上の薬学的に許容される担体(添加物)及び/又は希釈剤(例えば、薬学的に許容される媒体、例えば、細胞培養培地)、又は他の薬学的に許容される成分を更に含むことができる。薬学的に許容される担体及び/又は希釈剤は、部分的には、投与される特定の組成物によって、並びに治療用組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、本発明の治療用組成物の多種多様な好適な製剤が存在する(例えば、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Remington’s Pharmaceutical Sciences,17thed.1985を参照されたい)。
一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製されたiPSC由来T細胞を含む。一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製されたiPSC由来NK細胞を含む。一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製されたiPSC由来CD34+HE細胞を含む。一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製されたiPSC由来HSCを含む。一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製されたiPSC由来MDSCを含む。本明細書に開示されるiPSC由来造血系統細胞の集団を含む治療用組成物は、静脈内、腹腔内、経腸、又は気管投与方法によって個別に、又は他の好適な化合物と組み合わせて投与して、所望の治療目標に影響を与えることができる。
これらの薬学的に許容される担体及び/又は希釈剤は、治療用組成物のpHを約3~約10に維持するのに十分な量で存在することができる。このように、緩衝液は、全組成物の重量対重量ベースで約5%もの多さであり得る。限定されないが、塩化ナトリウム及び塩化カリウムなどの電解質もまた、治療用組成物に含まれ得る。一態様では、治療用組成物のpHは、約4~約10の範囲である。代替的に、治療用組成物のpHは、約5~約9、約6~約9、又は約6.5~約8の範囲である。別の実施形態では、治療用組成物は、当該pH範囲のうちの1つのpHを有する緩衝液を含む。別の実施形態では、治療用組成物は、約7のpHを有する。代替的に、治療用組成物は、約6.8~約7.4の範囲のpHを有する。更に別の実施形態では、治療用組成物は、約7.4のpHを有する。
本発明はまた、部分的に、本発明の特定の組成物及び/又は培養物における薬学的に許容される細胞培養培地の使用を提供する。そのような組成物は、ヒト対象への投与に好適である。一般的に言えば、本発明の実施形態によるiPSC由来免疫細胞の維持、増殖、及び/又は健康を支持する任意の培地は、医薬細胞培養培地としての使用に好適である。特定の実施形態では、薬学的に許容される細胞培養培地は、無血清及び/又はフィーダを含まない培地である。様々な実施形態では、無血清培地は動物成分を含まず、必要に応じて無タンパク質であり得る。必要に応じて、培地は、生物薬学的に許容される組換えタンパク質を含み得る。動物成分を含まない培地は、成分が非動物源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物を含まない培地で天然の動物タンパク質に取って代わり、栄養素は、合成、植物、又は微生物の供給源から取得される。対照的に、無タンパク質培地は、実質的にタンパク質を含まないと定義される。当業者は、上述の培地の例は例示であり、本発明での使用に好適な培地の配合を決して限定するものではなく、当業者に既知であり利用可能な多くの好適な培地があることを理解するであろう。
iPSC由来造血系統細胞は、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、又は99%のT細胞、NK細胞、NKT細胞、プロT細胞、プロNK細胞、CD34+HE細胞、HSC、B細胞、骨髄由来サプレッサ細胞(MDSC)、調節性マクロファージ、調節性樹状細胞、又は間葉系間質細胞を有することができる。いくつかの実施形態では、単離された多能性幹細胞由来造血系統細胞は、約95%~約100%のT細胞、NK細胞、プロT細胞、プロNK細胞、CD34+HE細胞、又は骨髄由来サプレッサ細胞(MDSC)を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞治療を必要とする対象を治療するための、約95%のT細胞、NK細胞、プロT細胞、プロNK細胞、CD34+HE細胞、又は骨髄由来サプレッサ細胞(MDSC)の単離された集団を有する組成物などの、精製T細胞又はNK細胞を有する治療用組成物を提供する。
一実施形態では、組み合わせ細胞療法又はそのために使用される組成物は、CD3エンゲージャである治療用タンパク質又はペプチド、及び表1に列挙される遺伝子型を含むゲノム操作されたiPSCに由来するNK細胞の集団を含み、由来NK細胞は、TCRnegcs-CD3を含む。別の実施形態では、組み合わせ細胞療法又はそのために使用される組成物は、CD3エンゲージャである治療用タンパク質又はペプチド、及び表1に列挙される遺伝子型を含むゲノム操作されたiPSCに由来するT細胞の集団を含み、由来T細胞は、TCRnegcs-CD3を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせ細胞療法又はそのために使用される組成物は、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、エルツマキソマブ、RO6958688、AFM11、MT110/AMG110、MT111/AMG211/MEDI-565、AMG330、MT112/BAY2010112、MOR209/ES414、MGD006/S80880、MGD007、及び/又はFBTA05のうちの1つと、表1に列挙される遺伝子型を含むゲノム操作されたiPSCに由来するNK又はT細胞の集団と、を含み、由来するNK又はT細胞は、TCRnegcs-CD3と、必要に応じてhnCD16と、を含む。更にいくつかの他の実施形態では、組み合わせ細胞療法又はそのために使用される組成物は、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、及びエルツマキソマブのうちの1つと、表1に列挙された遺伝子型を含むゲノム操作されたiPSCに由来するNK又はT細胞の集団を含み、由来するNK又はT細胞は、TCRnegcs-CD3、外因性CD16若しくはそのバリアント、及びCD19、BCMA、CD38、CD20、CD22、若しくはCD123を標的とするCARを含む。更にいくつかの追加の実施形態では、組み合わせ細胞療法、又はそのために使用される組成物は、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、及びエルツマキソマブのうちの1つと、表1に列挙された遺伝子型を含むゲノム操作されたiPSCに由来するNK又はT細胞の集団と、を含み、由来するNK又はT細胞は、TCRnegcs-CD3、外因性CD16若しくはそのバリアント、CAR、及び1つ以上の外因性サイトカインを含む。
当業者が理解するように、本明細書において提供される方法及び組成物に基づくiPSCから由来する自己と同種異系の造血系統細胞の両方は、上述のような細胞療法で使用することができる。自家移植の場合、由来造血系統細胞の単離された集団は、患者と完全又は部分的にのいずれかでHLA一致する。別の実施形態では、由来造血系統細胞は、対象とHLAが一致せず、由来造血系統細胞は、HLA I null及び/又はHLA II nullを有するNK細胞又はT細胞である。
いくつかの実施形態では、治療用組成物中の由来造血系統細胞の数は、用量当たり、少なくとも0.1×105細胞、少なくとも1×105細胞、少なくとも5×105細胞、少なくとも1×106細胞、少なくとも5×106細胞、少なくとも1×107細胞、少なくとも5×107細胞、少なくとも1×108細胞、少なくとも5×108細胞、少なくとも1×109細胞、又は少なくとも5×109細胞である。いくつかの実施形態では、治療用組成物中の由来造血系統細胞の数は、1用量当たり、約0.1×105細胞~約1×106細胞、1用量当たり、約0.5×106細胞~約1×107細胞、1用量当たり、約0.5×107細胞~約1×108細胞、1用量当たり、約0.5×108細胞~約1×109細胞、1用量当たり、約1×109細胞~約5×109細胞、1用量当たり、約0.5×109細胞~約8×109細胞、1用量当たり、約3×109細胞~約3×1010細胞、又はその間の任意の範囲である。一般に、60kgの患者の場合、1×108細胞/用量は1.67×106細胞/kgに変換される。
一実施形態では、治療用組成物中の由来造血系統細胞の数は、血液の部分的又は単一の臍帯中の免疫細胞の数であるか、又は少なくとも0.1×105細胞/kg体重、少なくとも0.5×105細胞/kg体重、少なくとも1×105細胞/kg体重、少なくとも5×105細胞/kg体重、少なくとも10×105細胞/kg体重、少なくとも0.75×106細胞/kg体重、少なくとも1.25×106細胞/kg体重、少なくとも1.5×106細胞/kg体重、少なくとも1.75×106細胞/kg体重、少なくとも2×106細胞/kg体重、少なくとも2.5×106細胞/kg体重、少なくとも3×106細胞/kg体重、少なくとも4×106細胞/kg体重、少なくとも5×106細胞/kg体重、少なくとも10×106細胞/kg体重、少なくとも15×106細胞/kg体重、少なくとも20×106細胞/kg体重、少なくとも25×106細胞/kg体重、少なくとも30×106細胞/kg体重、1×108細胞/kg体重、5×108細胞/kg体重、又は1×109細胞/kg体重である。
一実施形態では、ある用量の由来造血系統細胞が対象に送達される。例示的な一実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、少なくとも2×106細胞/kg、少なくとも3×106細胞/kg、少なくとも4×106細胞/kg、少なくとも5×106細胞/kg、少なくとも6×106細胞/kg、少なくとも7×106細胞/kg、少なくとも8×106細胞/kg、少なくとも9×106細胞/kg、又は少なくとも10×106細胞/kg以上の細胞/kgであり、介在する全ての細胞用量を含む。
別の例示的な実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、約2×106細胞/kg、約3×106細胞/kg、約4×106細胞/kg、約5×106細胞/kg、約6×106細胞/kg、約7×106細胞/kg、約8×106細胞/kg、約9×106細胞/kg、又は約10×106細胞/kg以上の細胞/kgであり、介在する全ての細胞用量を含む。
別の例示的な実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、約2×106細胞/kg~約10×106細胞/kg、約3×106細胞/kg~約10×106細胞/kg、約4×106細胞/kg~約10×106細胞/kg、約5×106細胞/kg~約10×106細胞/kg、2×106細胞/kg~約6×106細胞/kg、2×106細胞/kg~約7×106細胞/kg、2×106細胞/kg~約8×106細胞/kg、3×106細胞/kg~約6×106細胞/kg、3×106細胞/kg~約7×106細胞/kg、3×106細胞/kg~約8×106細胞/kg、4×106細胞/kg~約6×106細胞/kg、4×106細胞/kg~約7×106細胞/kg、4×106細胞/kg~約8×106細胞/kg、5×106細胞/kg~約6×106細胞/kg、5×106細胞/kg~約7×106細胞/kg、5×106細胞/kg~約8×106細胞/kg、又は6×106細胞/kg~約8×106細胞/kgであり、介在する全ての細胞用量を含む。
いくつかの実施形態では、由来造血系統細胞の治療的使用は、単回投与治療である。いくつかの実施形態では、由来造血系統細胞の治療的使用は、複数回投与治療である。いくつかの実施形態では、複数回投与治療は、毎日、3日ごと、7日ごと、10日ごと、15日ごと、20日ごと、25日ごと、30日ごと、35日ごと、40日ごと、45日ごと、50日ごとの1回の投与、又はその間の任意の日数の任意の回数の投与である。いくつかの実施形態では、複数回投与治療は、3回、4回、又は5回の週1回用量を含む。3回、4回、又は5回を含む複数回投与治療のいくつかの実施形態では、週1回用量は、追加の単回用量又は複数回用量が必要かどうかを決定するための観察期間を更に含む。
本発明の由来造血系統細胞の集団を含む組成物は、無菌であり得、ヒト患者への投与に好適であり、すぐに投与され得る(すなわち、更なる処置を伴わずに投与され得る)。すぐに投与される細胞ベースの組成物は、組成物が、対象への移植又は投与の前に、いずれかの更なる処理又は操作を必要としないことを意味する。他の実施形態では、本発明は、1つ以上の薬剤の投与前に増殖及び/又は調節される、由来造血系統細胞の単離された集団を提供する。組換えTCR又はCARを発現するように遺伝子操作された由来造血系統細胞については、細胞は、例えば、米国特許第6,352,694号に記載されている方法を使用して活性化及び増殖させることができる。
特定の実施形態では、由来造血系統細胞に対する一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供することができる。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、又は表面に結合することができる。表面に結合される場合、薬剤は、同じ表面に(すなわち、「シス」形成で)又は別個の表面に(すなわち、「トランス」形成で)結合され得る。代替的に、一方の薬剤を表面に結合させ、他方の薬剤を溶液中に存在させることができる。一実施形態では、共刺激シグナルを提供する薬剤は、細胞表面に結合することができ、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、又は表面に結合される。特定の実施形態では、両方の薬剤が溶液中にあり得る。別の実施形態では、薬剤は、可溶性形態であり得、次いで、本発明の実施形態におけるTリンパ球の活性化及び増殖における使用が企図される人工抗原提示細胞(artificial antigen presenting cell、aAPC)について、米国特許出願公開第2004/0101519号及び同第2006/0034810号に開示されるもののような、Fc受容体を発現する細胞又は抗体若しくは薬剤に結合する他の結合剤などの表面に架橋されてもよい。
投与量、頻度、及びプロトコルのいくらかの変動は、治療される対象の状態に応じて必然的に発生する。投与の責任者は、いずれにしても、個々の対象に対しての適切な用量、頻度及びプロトコルを決定する。
次の例は、例示のために提供されるものであり、限定のためのものではない。
実施例1-材料及び方法
様々なプロモータの制御下で自殺系を効果的に選択し、異なるセーフハーバー遺伝子座組み込み戦略と組み合わせて試験するために、単一細胞の継代と高スループットの96ウェルプレートベースのフローサイトメトリソーティングを可能にする、出願人独自のhiPSCプラットフォームを使用し、単一又は複数の遺伝子調節によるクローンhiPSCの導出を可能にした。
様々なプロモータの制御下で自殺系を効果的に選択し、異なるセーフハーバー遺伝子座組み込み戦略と組み合わせて試験するために、単一細胞の継代と高スループットの96ウェルプレートベースのフローサイトメトリソーティングを可能にする、出願人独自のhiPSCプラットフォームを使用し、単一又は複数の遺伝子調節によるクローンhiPSCの導出を可能にした。
小分子培養におけるhiPSCの維持:hiPSCは、培養のコンフルエンシが75%~90%に達すると、単一細胞として継代された。単細胞解離の場合、hiPSCをPBS(Mediatech)で1回洗浄し、Accutase(Millipore)で37℃において3~5分間処理した後、ピペッティングして単細胞解離を確実にした。次いで、単細胞懸濁液を従来の培地と等量で混合し、225×gで4分間遠心分離し、FMMに再懸濁し、マトリゲルでコーティングした表面に播種した。継代は通常1:6~1:8で、37℃で2~4時間マトリゲルで前もってコーティングされた組織培養プレートに移し、2~3日ごとにFMMを供給した。細胞培養は、37℃、5%CO2に設定された加湿インキュベータで維持された。
ZFNによるヒトのiPSC操作、目的のモダリティの標的化編集のためのCRISPR:ROSA26標的化挿入を例として使用して、ZFNを介したゲノム編集では、200万個のiPSCが、2.5μgのZFN-L、2.5μgのZFN-Rの混合物及びAAVS1標的化挿入用の5μgのドナー構築物でトランスフェクトされた。CRISPRを介したゲノム編集では、200万個のiPSCが、5μgのROSA26-gRNA/Cas9とROSA26標的化挿入用の5μgドナー構築物の混合物でトランスフェクトされた。トランスフェクションは、パラメータ1500V、10ms、3パルスを使用するNeonトランスフェクションシステム(Life Technologies)を使用して行われた。トランスフェクション後の2日目又は3日目に、プラスミドに人工プロモータ-ドライバーGFP及び/又はRFP発現カセットが含まれている場合、フローサイトメトリを使用してトランスフェクション効率を測定した。トランスフェクション後4日目に、ピューロマイシンを最初の7日間0.1μg/mlの濃度で、7日後に0.2μg/mlの濃度で培地に添加して、標的細胞を選択した。ピューロマイシンの選択中、細胞は10日目に新鮮なマトリゲルコーティングされたウェルに継代された。ピューロマイシン選択の16日目以降に、生存細胞をGFP+iPS細胞のパーセンテージについてフローサイトメトリで分析した。
ゲノム編集されたiPSCの一括ソーティング及びクローンソーティング:ZFN又はCRISPR-Cas9を使用したゲノム標的化編集を含むiPSCを、ピューロマイシン選択の20日後にGFP+SSEA4+TRA181+iPSCについて一括ソーティング及びクローンソーティングした。単一細胞解離標的化iPSCプールを、最適な性能のために新規に作製した、ハンクス平衡塩溶液(MediaTech)、4%ウシ胎児血清(Invitrogen)、1×ペニシリン/ストレプトマイシン(Mediatech)、及び10mMのHepes(Mediatech)を含む冷却染色緩衝液に再懸濁した。SSEA4-PE、TRA181-Alexa Fluor-647(BD Biosciences)などのコンジュゲート一次抗体を細胞溶液に加え、氷上で15分間インキュベートした。全ての抗体は、100万細胞当たり100μLの染色緩衝液中に7μLで使用した。溶液を染色緩衝液で1回洗浄し、225gで4分間スピンダウンし、10μMチアゾビブを含む染色緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリでのソーティングのために氷上で維持した。フローサイトメトリによるソーティングは、FACS Aria II(BD Biosciences)で行った。一括ソーティングでは、GFP+SSEA4+TRA181+細胞にゲートをかけ、7mlのFMMで満たされた15mlの標準チューブにソーティングした。クローンソーティングでは、100μMノズルを使用して、1ウェル当たり3イベントの濃度で、ソーティングされた細胞を96ウェルプレートに直接排出した。各ウェルには、5μg/mLフィブロネクチンと1×ペニシリン/ストレプトマイシン(Mediatech)が補充された200μLのFMMが予め充填されており、予め5×マトリゲルで一晩コーティングされていた。5×マトリゲルプレコーティングには、1アリコートのマトリゲルを5mLのDMEM/F12に追加し、4℃で一晩インキュベートして適切に再懸濁させ、最後にウェル当たり50μLで96ウェルプレートに加え、37℃で一晩インキュベートする。5×マトリゲルは、各ウェルに培地を加える直前に吸引される。ソーティングが完了したら、96ウェルプレートを225gで1~2分間遠心分離してからインキュベーションした。プレートを7日間静置した。7日目に、150μLの培地を各ウェルから除去し、100μLのFMMと交換した。ウェルは、ソーティング後10日目に追加の100μLのFMMを再供給した。コロニー形成は早くも2日目に検出され、ほとんどのコロニーはソーティング後7~10日の間に増殖した。最初の継代では、ウェルをPBSで洗浄し、30μLのアキュターゼで37℃において約10分間解離させた。長期間のアキュターゼ処理の必要性は、長期間培養で遊ばなかったコロニーのコンパクトさを反映している。細胞が解離しているのが認められた後、200μLのFMMを各ウェルに加え、数回ピペッティングしてコロニーを破壊する。解離したコロニーを、予め5×マトリゲルでコーティングした96ウェルプレートの別のウェルに移し、インキュベーション前に225gで2分間遠心分離する。この1対1の継代は、増殖前の初期のコロニーを広げるために行われる。その後の継代は、3~5分間のアキュターゼ処理と、予めFMMの1×マトリゲルでコーティングされた大きなウェルへの75~90%のコンフルエンシでの1:4~1:8の増殖で日常的に行われた。各クローン細胞株をGFP蛍光レベル及びTRA1-81発現レベルについて分析した。100%に近いGFP+及びTRA1-81+のクローン株を、更なるPCRスクリーニング及び分析のために選択し、マスター細胞バンクとして凍結保存した。フローサイトメトリ分析はGuava EasyCyte 8 HT(Millipore)で実行され、Flowjo(FlowJo,LLC)を使用して分析された。
実施例2-発現されるCFRの設計
T細胞におけるTCR発現の除去のためのTRAC又はTRBCの二対立遺伝子破壊は、GvHDのリスクを軽減するためのアプローチである。しかしながら、TCR発現の欠如は、結果的に、TCR陰性細胞における表面CD3発現の喪失をもたらす。表面CD3発現の欠如(CD3を発現しないNK細胞を含む)は、既存のエンゲージャ戦略を使用する製造段階においてフィーダフリー条件下でエフェクター細胞(初代又はiPSC由来)を分化、成熟、及び/又は増殖させる能力、並びに適切な細胞発生段階又は腫瘍微小環境において治療用抗体、BiTE、又はTriKEを含むがこれらに限定されない誘導性又はアゴニスト性リガンドを用いてエフェクター細胞を活性化させる能力を制限する。
T細胞におけるTCR発現の除去のためのTRAC又はTRBCの二対立遺伝子破壊は、GvHDのリスクを軽減するためのアプローチである。しかしながら、TCR発現の欠如は、結果的に、TCR陰性細胞における表面CD3発現の喪失をもたらす。表面CD3発現の欠如(CD3を発現しないNK細胞を含む)は、既存のエンゲージャ戦略を使用する製造段階においてフィーダフリー条件下でエフェクター細胞(初代又はiPSC由来)を分化、成熟、及び/又は増殖させる能力、並びに適切な細胞発生段階又は腫瘍微小環境において治療用抗体、BiTE、又はTriKEを含むがこれらに限定されない誘導性又はアゴニスト性リガンドを用いてエフェクター細胞を活性化させる能力を制限する。
ここでは、少なくとも1つのCFRでエフェクター細胞を装備させて適切なシグナル伝達カスケードを開始させ、エフェクター細胞治療属性を増強するためのキメラ融合受容体(CFR)戦略が開示され、エフェクター細胞治療属性としては、限定されないが、増加された活性化及び細胞傷害性、獲得された二重標的化能力、延長された持続性、改善されたトラフィッキング及び腫瘍浸透、バイスタンダー免疫細胞を腫瘍部位に活性化又は動員する増強された能力、腫瘍免疫抑制を低減する増強された能力、腫瘍抗原エスケープを救済する改善された能力、並びに/又は制御された細胞代謝及びアポトーシスが挙げられる。
提供されるCFRは、内部ドメインに接続された膜貫通ドメインに融合した外部ドメインを含み、CFRは、ER(小胞体)保持シグナルもエンドサイトーシスシグナルも有しない。CFRの外部ドメインは、シグナル伝達を開始するためのものであり、膜貫通ドメインは、膜固定のためのものであり、内部ドメインは、少なくとも細胞傷害性ドメインを提供し、持続性、移動性、分化、代謝及び/又はアポトーシスを含むがこれらに限定されない細胞属性を増強する選択された1つ以上のシグナル伝達経路を活性化させ、CFR装備エフェクター細胞による長期腫瘍増殖制御をもたらす。CFRの内部ドメインは、細胞傷害性ドメインに加えて、必要に応じて、選択された共刺激ドメイン、持続性シグナル伝達ドメイン、死誘導シグナル伝達ドメイン、又はシグナル伝達経路ドメインのうちの1つ以上を含み得る。
CFRに好適な共刺激ドメインとしては、CD28、4-1BB、CD27、CD40L、ICOS、CD2、又はそれらの組み合わせの内部ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。CFRに好適な持続性シグナル伝達ドメインとしては、IL2R、IL7R、IL15R、IL18R、IL12R、IL23R、又はそれらの組み合わせなどのサイトカイン受容体の内部ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。EGFRなどの受容体チロシンキナーゼ(RTK)、又はFASなどの腫瘍壊死因子受容体(TNFR)のエンドメインは、エフェクター細胞が組み込まれたCFRを介して活性化される場合、更なるシグナル伝達経路制御を提供する。更に、ER保持シグナルの除去は、CFRに組み込まれて、発現されたときにそれ自体でその表面提示を可能にし(perimit)、CFRにおけるエンドサイトーシスシグナルの除去は、その内部移行及び表面下方調節を低減するためのものである。ER保持もエンドサイトーシスシグナルも有しないドメイン成分を選択するか、又は分子工学ツールを使用してCFRのために選択された成分からER保持若しくはエンドサイトーシスシグナルを除去することが重要である。加えて、提供されるCFRのドメインはモジュール式であり、これは、所与の内部ドメインについて、CFRの外部ドメインが、当該CFRとともに使用されるアゴニスト抗体、BiTE、又はTriKEの結合特異性に応じて切り替え可能であり、逆もまた同様であることを意味し、所与の外部ドメイン及びマッチングアゴニストについては、内部ドメインが、活性化される所望のシグナル伝達経路に応じて切り替え可能である。
概念実証のために、本実施例における外部ドメインの選択は、CD3若しくはCD28抗体又はBiTEなどの既存のアゴニストリガンドによって認識可能な表面分子を考慮に入れる。図1及び図4Aに示されるように、例示的なCFRのそれぞれは、CD28又はCD3サブユニット(CD3ε、CD3γ又はCD3δ)の少なくとも1つの細胞外部分と、CD28、CD8、CD4、CD27、ICOS、又はCD3εの膜貫通ドメインと、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD28、ICSO、CD27、又はそれらの組み合わせの内部ドメインと、をそれぞれ含み、外部、TM、及び/又は内部ドメイン中のER保持モチーフ及び/又はエンドサイトーシスモチーフは除去されている。例えば、CD3ε*は、そのWT配列の内部ドメインからER保持モチーフを排除するためのR183S突然変異を含み、CD3δ*は、そのWT配列の内部ドメインからエンドサイトーシスモチーフ及びER保持モチーフを除去するためにL142A及びR169A突然変異を含み、CD3γ*は、そのWT配列の内部ドメインからER保持モチーフを除去するためにL131A及びR158A突然変異を含む。いくつかの例示的な設計において、CFRは、1つのCD3サブユニットの外部ドメインを含み、いくつかの他の設計では、CFRは、リンカー(スペーサとも呼ばれる)を介してCD3δ又はCD3γの外部ドメインと連結されたCD3εの外部ドメインを含む単鎖外部ドメインを含む。単鎖外部ドメインにおけるリンカーのタイプ、長さ、及び配列は、変動し得る。
構築物の配列は、gBlocks(IDT,Coralville,IA)として順序付けられ、本実施例ではそれぞれ5’及び3’末端にNheI及びEcoRI部位を含有したが、制限酵素部位は様々なCFR設計で異なっていてもよい。gBlock配列は、2Aエレメントによって分離された2つの成分を含有した。構築物及びタグは、所望であれば、mCherry、Thy1.1、又はThy1.2を含む形質導入効率を決定するために必要に応じて使用される。NheI及びEcoRIを使用して、gBlock配列並びにEF1αプロモータ及びアンピシリン耐性遺伝子を含むレンチベクター骨格を切断した。消化したDNAを合わせ、Quick Ligationキット(NEB,Ipswich,MA)を使用してライゲートした。その後、ライゲートしたDNAをDH5α細胞に形質転換し、カルベニシリンを含有するLB寒天プレート上にプレーティングした。Q5(登録商標)部位特異的突然変異誘発キット(NEBIpswichMA)を使用して異なる構築物設計の更なるクローニングを容易にするために、膜貫通ドメインの直後にAvrII部位を導入した。レンチウイルス産生のために、10cmのポリ-D-リジンコーティングディッシュに播種した293T細胞を24時間培養してから、トランスフェクションを行った。レンチベクター及びパッケージングプラスミドを、製造業者のガイドラインに従ってLipofectamine3000(ThermoFisher,Waltham,MA)でトランスフェクトした。ウイルスを48及び72時間後に回収し、超遠心分離によって濃縮した。
実施例3-TRAC null細胞における表面CFR発現
NFAT-ルシフェラーゼJurkatレポータ細胞(Invivogen,San Diego,CA)を解凍し、洗浄し、5%CO2を用いて37℃で培養し、毎週継代した。操作されたCFR構築物のレンチウイルス形質導入のために、細胞を遠心分離し、4μg/mLのポリブレン(MilliporeSigma,St.Louis,MO)を含有する培地中に1×106細胞/mLで再懸濁した。1mLの細胞懸濁液を12ウェルプレートに入れ、濃縮ウイルスを添加した。次いで、細胞を1時間遠心分離し、新鮮な培地に再懸濁した。
NFAT-ルシフェラーゼJurkatレポータ細胞(Invivogen,San Diego,CA)を解凍し、洗浄し、5%CO2を用いて37℃で培養し、毎週継代した。操作されたCFR構築物のレンチウイルス形質導入のために、細胞を遠心分離し、4μg/mLのポリブレン(MilliporeSigma,St.Louis,MO)を含有する培地中に1×106細胞/mLで再懸濁した。1mLの細胞懸濁液を12ウェルプレートに入れ、濃縮ウイルスを添加した。次いで、細胞を1時間遠心分離し、新鮮な培地に再懸濁した。
表現型プロファイリングのために、形質導入された細胞を採取し、固定可能な生存能力マーカー及びフルオロフォアコンジュゲート抗体:CD3(SP34及びOKT3)、CD5、CD7、CD8、CD45RA、CD62L、CCR7、CD27、CD28、PD1、及びTIM3(BD Biosciences,San Jose,CA;及びBioLegend,San Diego,CA)で染色した。蛍光絶対計数ビーズ(Spherotech,Lake Forest,IL)をデータ取得の直前に添加した。BD Fortessa(商標)X-20(BD Biosciences)でデータ取得を実行し、FlowJoソフトウェア(FlowJo、Ashland、OR)及びSpotfire(Tibco、Boston、MA)を使用してデータを分析した。
この概念を試験するために、図5に示される1つの実験において、Jurkat-TRAC KO細胞を、1つ又は2つのCFR:(A)3ε-28-3ε*+3γ-28-3γ*、(B)3ε-28-3ε*+3δ-28-3δ*、(C)3ε-28-[-]、(D)3ε-28-3ε*、(E)3ε-28-28、又は(F)28-28-3ε*で形質導入した。48時間後、構築物(A)~(E)が形質導入された細胞については抗CD3抗体クローンSP34及びOKT3で、又は構築物(F)が形質導入された細胞については抗CD28抗体クローンCD28.2で細胞を染色した後、フローサイトメトリによって確認した。CD3抗体SP34は、CD3ε又はその機能的バリアントに特異的であるが、OKT3結合は、CD3εとCD3δ又はCD3γとのヘテロ二量体形成を必要とする。観察されるように、TCRノックアウト細胞におけるCD3発現は、(図6Bと比較して)CD3サブユニット内部ドメインにおけるER保持及びエンドサイトーシスモチーフ突然変異を介して救済される。
実施例4-アゴニスト抗体刺激により開始されるCFRシグナル伝達
CFRのシグナル伝達能力を実証するために、アゴニスト抗体又は二重特異性抗体を様々な濃度で使用して、ルシフェラーゼ活性の産生及びその後の検出をもたらすNFATを活性化させる細胞内シグナル伝達経路を開始させた。抗体刺激又はBiTE架橋を使用するNFAT-ルシフェラーゼレポータアッセイの原理を示すスキームを、それぞれ図6A及び図7Aに示す。
CFRのシグナル伝達能力を実証するために、アゴニスト抗体又は二重特異性抗体を様々な濃度で使用して、ルシフェラーゼ活性の産生及びその後の検出をもたらすNFATを活性化させる細胞内シグナル伝達経路を開始させた。抗体刺激又はBiTE架橋を使用するNFAT-ルシフェラーゼレポータアッセイの原理を示すスキームを、それぞれ図6A及び図7Aに示す。
図6Aに示すアッセイのために、NFAT応答エレメント(RE)によって駆動されるルシフェラーゼレポータを発現するJurkat T細胞株を使用した。CFRシグナル伝達を検出するために、形質導入された細胞を、アゴニストCD3抗体SP34若しくはOKT3、又はアゴニストCD28抗体CD28.2とともに、可溶性フォーマット又はプレート結合フォーマットのいずれかで96ウェル平底プレートに播種した。図6Bに示されるように、Jurkat-NFAT WTにおける細胞表面CD3及びTCRαβ発現が存在し(左プロット)、これは、TRAC KO細胞(右プロット)では大部分が欠けている。抗CD3刺激と24時間係合すると、内因性CD3受容体媒介シグナル伝達は、核へのNFAT移行及びNFAT REとの相互作用を誘導し、Jurkat WT細胞におけるルシフェラーゼ発現をもたらすが、TRAC KO細胞ではもたらさない(図6Cを参照されたい)。クローンSP34又はクローンOKT3抗体のいずれかで24時間刺激された様々なCFR操作Jurkat-TRAC KO細胞におけるNFATルシフェラーゼ活性を図6Dに示す。示されるように、改変されたCD3ε内部ドメインを有するCFRは、NFATレポータ活性を誘導することができる。加えて、構築物3ε-28-3ε*+3γ-28-3γ*、3ε-28-3ε*+3δ-28-3δ*、及び3ε-28-3ε*は、抗CD3抗体刺激を介したCFRシグナル伝達について最も高い性能を有するものの中にあり、同時形質導入されたCFRを有する細胞における相乗的な細胞活性化を示す。
BiTE実験のために、抗CD3×CD19 BiTE(Invivogen,San Diego,CA)を、標的細胞上のCD19及びエフェクター細胞上のCD3とNFATレポータ導入遺伝子との結合に関する概念の証明のために選択した。NFAT-ルシフェラーゼJurkat(WT又はCFR形質導入)を、抗CD3×CD19BiTEの存在下又は不在下で、エフェクター対標的(E:T)比3:1でRaji細胞と共培養した。細胞を37℃、約5%CO2で一晩インキュベートした。その後、プレートを穏やかに混合し、細胞混合物の一部を採取し、QUANTI-Luc(Invivogen,San Diego,CA)と組み合わせてルシフェラーゼ活性を検出した。プレートを再び穏やかに混合し、直ちにSpectraMaxマイクロプレートリーダー(Molecular Devices,San Jose,CA)で読み取った。図7Aに示されるアッセイにおいて、TRAC-KOレポータ細胞は、3ε-28-3ε*のCFR単独(濃い灰色の点線)で、又は3γ-28-3γ*(黒色の線)若しくは3δ-28-3δ*(濃い灰色の線)と組み合わせて形質導入された。標的細胞及び抗CD3×CD19 BiTEとの24時間の共培養後、NFAT活性を測定した。図7Bに示すように、WT(薄い灰色の線)及びTRAC KO(薄い灰色の点線)NFATレポータ細胞を陽性又は陰性対照として播種し、CFR 3ε-28-3ε*+3γ-28-3γ*又は3ε-28-3ε*+3δ-28-3δ*が形質導入された細胞は、より良好なBiTE架橋開始シグナル伝達を有する。
実施例5-CFRドメインはモジュール式である
提供されるCFR設計は、モジュール式の外部及び内部ドメインを含む。所与の内部ドメインについて、CFRの外部ドメインは、当該CFRとともに使用されるアゴニスト抗体、BiTE、又はTriKEsの結合特異性に応じて切り替え可能であり、所与の外部ドメイン及びマッチングアゴニストについて、内部ドメインは、活性化される所望のシグナル伝達経路に応じて切り替え可能である。例示するために、NFATレポータ活性を、アゴニストSP34又はCD28.2抗体の存在下で24時間培養した後に、CFR装備Jurkat TRAC KO細胞及び非形質導入対照において測定した。図8A~図8Cに示すように、同じCD28ζ内部ドメインと対になったCD3ε外部ドメイン又はCD28外部ドメインのいずれかは、十分なシグナル伝達をもたらし、適切なレポータ活性を誘発することができる。更なる例示のために、CD3ε*内部ドメインは、CD3ε外部ドメイン又はCD28外部ドメインのいずれかと対合して、シグナルを変換し、活性を誘発することが示される(図8C)。他方で、同じ例示的なCD3ε外部ドメインについて、CD3ベースのアゴニストを適用してCFRのCD3ε外部ドメインに結合させると、CD28ζ内部ドメイン及びCD3ε*内部ドメインを含むがこれらに限定されない任意の選択された内部ドメインを誘導し、かつ活性化させることができる。別の例では、CD3ベースのアゴニストを使用してCFRのCD3ε外部ドメインに結合させると、同じCD28外部ドメイン、CD28ζ内部ドメイン及びCD3ε*内部ドメインを含むがこれらに限定されない任意の選択された内部ドメインを誘導し、かつ活性化させることができる。
提供されるCFR設計は、モジュール式の外部及び内部ドメインを含む。所与の内部ドメインについて、CFRの外部ドメインは、当該CFRとともに使用されるアゴニスト抗体、BiTE、又はTriKEsの結合特異性に応じて切り替え可能であり、所与の外部ドメイン及びマッチングアゴニストについて、内部ドメインは、活性化される所望のシグナル伝達経路に応じて切り替え可能である。例示するために、NFATレポータ活性を、アゴニストSP34又はCD28.2抗体の存在下で24時間培養した後に、CFR装備Jurkat TRAC KO細胞及び非形質導入対照において測定した。図8A~図8Cに示すように、同じCD28ζ内部ドメインと対になったCD3ε外部ドメイン又はCD28外部ドメインのいずれかは、十分なシグナル伝達をもたらし、適切なレポータ活性を誘発することができる。更なる例示のために、CD3ε*内部ドメインは、CD3ε外部ドメイン又はCD28外部ドメインのいずれかと対合して、シグナルを変換し、活性を誘発することが示される(図8C)。他方で、同じ例示的なCD3ε外部ドメインについて、CD3ベースのアゴニストを適用してCFRのCD3ε外部ドメインに結合させると、CD28ζ内部ドメイン及びCD3ε*内部ドメインを含むがこれらに限定されない任意の選択された内部ドメインを誘導し、かつ活性化させることができる。別の例では、CD3ベースのアゴニストを使用してCFRのCD3ε外部ドメインに結合させると、同じCD28外部ドメイン、CD28ζ内部ドメイン及びCD3ε*内部ドメインを含むがこれらに限定されない任意の選択された内部ドメインを誘導し、かつ活性化させることができる。
本明細書で提供されるCFR設計は、モジュール式膜貫通ドメインも含み得る。図4Aに示されるように、CD3ε外部ドメインを、CD28、CD3、CD4、ICOS、又はCD27の膜貫通ドメインに融合させ、(a)~(c)において同じCD28ζ内部ドメインに、又はICOS-CD28ζ内部ドメイン(d)に、又はCD27-CD28ζ内部ドメイン(e)に接続した。CAR19-又はCAR19+Jurkat-NFAT-TRAC KO細胞上の図4AのCFR(a)~(e)の各々の表面発現を、それぞれ図4B及び図4Dに示す。EpCAM+標的及びCD3ε×EpCAM BiTEの存在下でのCAR19-又はCAR19+Jurkat-TRAC KO細胞におけるCFRシグナル伝達を反映するNFATレポータ活性を、それぞれ図4C及び図4Eに示す。異なるTMドメインを有するCFRを発現するJurkat-NFAT-TRAC KO-CAR19+細胞上のCARの表面発現が、図4Fに実証されている。CD19+標的係合の存在下でのCFR発現TRAC KO-CAR19+又はTRAC KO-CAR19-Jurkat細胞におけるNFATレポータ活性の差は、CAR依存性CFRシグナル伝達の反映としてのCAR依存性レポータ活性を表した。
実施例6-CFR発現エフェクター細胞は、アゴニストの存在下で改善されたインビトロ及びインビボ機能性を示す
T又はNK細胞を含むエフェクター細胞の重要な機能は、同族抗原を発現する標的細胞を特異的に溶解する能力である。細胞傷害性アッセイを使用して、CFRがエフェクター細胞に標的細胞溶解についての増大した能力を提供するかどうかを決定した。所与のCFRを発現する誘導T細胞(iT)を、本実施例ではCD3又はCD28ベースの外部ドメインなどのCFRの外部ドメインを認識するアゴニスト抗体の存在下で、様々なエフェクター対標的(E:T)比においてNalm6-GFP細胞と共培養した。細胞を一晩インキュベートし、細胞混合物の一部をフローサイトメトリ分析のために回収した。蛍光絶対計数ビーズ(Spherotech,Lake Forest,IL)を取得直前に添加し、一晩の共培養後に細胞混合物中に存在するNalm6及びiT細胞の数を決定するために利用した。
T又はNK細胞を含むエフェクター細胞の重要な機能は、同族抗原を発現する標的細胞を特異的に溶解する能力である。細胞傷害性アッセイを使用して、CFRがエフェクター細胞に標的細胞溶解についての増大した能力を提供するかどうかを決定した。所与のCFRを発現する誘導T細胞(iT)を、本実施例ではCD3又はCD28ベースの外部ドメインなどのCFRの外部ドメインを認識するアゴニスト抗体の存在下で、様々なエフェクター対標的(E:T)比においてNalm6-GFP細胞と共培養した。細胞を一晩インキュベートし、細胞混合物の一部をフローサイトメトリ分析のために回収した。蛍光絶対計数ビーズ(Spherotech,Lake Forest,IL)を取得直前に添加し、一晩の共培養後に細胞混合物中に存在するNalm6及びiT細胞の数を決定するために利用した。
図9Aに示されるように、フローベースアッセイは、アゴニスト抗CD3抗体の存在下で、示されたE:T比においてNalm6標的細胞と一晩共培養した後、3δ-28-3δ*(黒色、実線)又は3γ-28-3γ*(黒色、点線)とともに3ε-28-3ε*のCFRが形質導入されたCAR-iT細胞における細胞傷害性を測定した。図9Bでは、抗CD28抗体の存在下で、示されたE:T比においてNalm6標的細胞と一晩共培養した後、28-28-28ζ単独のCFRが形質導入されたCAR-iT細胞(黒線)において、細胞傷害性を測定した。形質導入されていないCAR-iT細胞(図9A及び図9Bにおける灰色の線)は、各実験におけるベースライン細胞傷害性を示すために含まれており、結果は、両方のCFR発現CAR-iTエフェクターがアゴニスト抗体による細胞傷害性の改善を有することを実証した。特に低いE:T比では、CFR発現CAR-iTエフェクターは、より高い殺傷効率を有する。
別の実験において、本明細書で提供される様々なCFR設計に、プロCAR-iT段階(およそ分化D10とD20との間)でレンチウイルスを形質導入して、CFR発現が、例として3ε-28-3ε*を使用して、CAR-iT分化及び機能を損なうかどうかを決定した。分化中の異なる時点でのCAR及びCD3ε発現とともにT細胞表面マーカー発現を使用したCFR+(CFR形質導入)及びCFR(UNTR;非形質導入)のCAR-iT細胞表現型が、図10Aに提示されており、これは、CFR形質導入CAR-iT細胞及び非形質導入CAR-iT細胞におけるT細胞表現型が、分化の間、概して一致しており、特に分化プロセスの終わり(T4)まで一致していることを示している。更に、xCELLigenceアッセイの結果は、抗原+標的細胞に対する、E:T比3:1(図10B)又は1:1(図10C)におけるCAR依存性細胞溶解がCFR形質導入CAR-iT細胞と非形質導入CAR-iT細胞との間で同等であることを示した。まとめると、データは、CFR設計及び発現が、エフェクター細胞分化、表現型、又はiT細胞のCAR機能性を損なわなかったことを示す。
実施例7-CFRは、腫瘍抗原エスケープ及び制御された細胞アポトーシスを克服する戦略を提供する
CFR発現CAR-iTエフェクター細胞をエンゲージャ(例えば、BiTE)と混合して、細胞傷害性が抗原-標的に対して改善されるかどうかを示した。図11Aは、組換えタンパク質発現のための真核細胞をBiTE産生のために操作することができる例示的なBiTEスパイクインモデルを示す。本実施例では、HEK293細胞を実証のためのBiTE産生に使用する。HEK293細胞の上清を回収し、CFR発現CAR-iTエフェクター細胞と混合した。図11B及び図9Cに示されるように、灰色で示される全ての対照(すなわち、BiTEの不在下で形質導入されたCFR、及びBiTEの存在下又は不在下で形質導入されていないCFR)と比較して、3:1(図11B)又は1:1(図11C)のE:T比での抗原-標的に対するCAR-iT細胞のCFR依存性細胞溶解は、細胞溶解を改善し、形質導入されたCFR(3ε-28-3ε*を例示的実証(domonstration)として使用した)において、及びBiTEの存在下でほぼ一定のままである。CFR発現CAR-iTエフェクター細胞はまた、E:T比1:1でBiTE上清の存在下で混合腫瘍細胞集団(抗原+:抗原-1:1)において抗原+及び抗原-腫瘍標的に対して増強された細胞溶解を有することが示され(図11D)、それにより、CFR発現によるBiTEの組み込みが、CAR標的化メカニズム下で腫瘍抗原エスケープを効果的に低減することが確認された。BiTEの存在下でCFR形質導入細胞又は非形質導入CAR-iT細胞で処理した後の混合抗原+/抗原標的細胞のアッセイ終了時表現型決定においても同様の観察がなされた。図11E、左パネル(対照)に示されるように、抗原-標的細胞の有意により大きな部分が、BiTEを有するCFR非形質導入(UNTR)CAR-iT細胞で処置された後に混合腫瘍細胞集団中に残った。比較すると、抗原+/抗原-混合腫瘍細胞集団を、BiTEの存在下でCFR発現CAR-iTエフェクター細胞と共培養した後、各部分においてより少数の細胞を有する抗原+及び抗原-腫瘍細胞のほぼ等しい部分が混合腫瘍細胞集団中に残っており、これは、CARを指向する抗原特異的腫瘍標的化を逃れた抗原-腫瘍細胞の有効な排除を反映している(図11E、右パネル)。
CFR発現CAR-iTエフェクター細胞をエンゲージャ(例えば、BiTE)と混合して、細胞傷害性が抗原-標的に対して改善されるかどうかを示した。図11Aは、組換えタンパク質発現のための真核細胞をBiTE産生のために操作することができる例示的なBiTEスパイクインモデルを示す。本実施例では、HEK293細胞を実証のためのBiTE産生に使用する。HEK293細胞の上清を回収し、CFR発現CAR-iTエフェクター細胞と混合した。図11B及び図9Cに示されるように、灰色で示される全ての対照(すなわち、BiTEの不在下で形質導入されたCFR、及びBiTEの存在下又は不在下で形質導入されていないCFR)と比較して、3:1(図11B)又は1:1(図11C)のE:T比での抗原-標的に対するCAR-iT細胞のCFR依存性細胞溶解は、細胞溶解を改善し、形質導入されたCFR(3ε-28-3ε*を例示的実証(domonstration)として使用した)において、及びBiTEの存在下でほぼ一定のままである。CFR発現CAR-iTエフェクター細胞はまた、E:T比1:1でBiTE上清の存在下で混合腫瘍細胞集団(抗原+:抗原-1:1)において抗原+及び抗原-腫瘍標的に対して増強された細胞溶解を有することが示され(図11D)、それにより、CFR発現によるBiTEの組み込みが、CAR標的化メカニズム下で腫瘍抗原エスケープを効果的に低減することが確認された。BiTEの存在下でCFR形質導入細胞又は非形質導入CAR-iT細胞で処理した後の混合抗原+/抗原標的細胞のアッセイ終了時表現型決定においても同様の観察がなされた。図11E、左パネル(対照)に示されるように、抗原-標的細胞の有意により大きな部分が、BiTEを有するCFR非形質導入(UNTR)CAR-iT細胞で処置された後に混合腫瘍細胞集団中に残った。比較すると、抗原+/抗原-混合腫瘍細胞集団を、BiTEの存在下でCFR発現CAR-iTエフェクター細胞と共培養した後、各部分においてより少数の細胞を有する抗原+及び抗原-腫瘍細胞のほぼ等しい部分が混合腫瘍細胞集団中に残っており、これは、CARを指向する抗原特異的腫瘍標的化を逃れた抗原-腫瘍細胞の有効な排除を反映している(図11E、右パネル)。
別の実験において、CFR発現エフェクター細胞の細胞傷害性を、CFR形質導入iPSC株由来のiTエフェクター細胞を、細胞増殖色素eFluor(商標)450で標識したNalm6 CD19WT細胞及び細胞増殖色素eFluor(商標)670で標識したNalm6-CD19KO細胞からなる50:50標的細胞混合物と共培養することによって評価する。混合した標的細胞を96ウェルU底プレートに播種し、所望のエフェクター対標的比(E:T)が約0:1、1:1、3.16:1、及び10:1となるように、抗CD19×CD3 BiTE(Invivogen,San Diego,CA)又は抗CD20×CD3 BiTE(G&P Biosciences,Santa Clara,CA)の存在下又は不在下で、約4時間、様々な濃度のエフェクター細胞を各ウェルに添加し、続いてフローサイトメトリによって分析した。アポトーシス標的細胞のパーセンテージは、eFluor(商標)450+Nalm6 CD19WT細胞中のカスパーゼ3/7+細胞のパーセンテージ、又はeFluor(商標)670+Nalm6-CD19KO細胞中のカスパーゼ3/7+細胞のパーセンテージに基づいて決定される。
BiTE自体(抗CD19×CD3又は抗CD20×CD3のいずれか)は、標的細胞アポトーシスの増強を誘発しなかったが、CD3ベースのCFRを発現するエフェクターiT細胞の添加は、腫瘍細胞アポトーシスを増加させることが観察された。したがって、CFR発現iT細胞は、BiTEの存在下で特異的細胞傷害性の増強を示す。改善されたエフェクター細胞機能は、両方の株におけるエフェクターiT細胞単独のEC50と比較した、BiTEの存在下でのエフェクターiT細胞のEC50の減少によって更に実証される。
更に、CFRを装備したCAR発現細胞は、CARを介して腫瘍細胞の一次抗原を標的とすることができ、CFRと結合する適切なBiTE又はTriKEの存在下で二次抗原を標的とすることができる。この二重標的化戦略はまた、腫瘍細胞がCARによって標的化される一次抗原の発現を失うか又は減少させる場合に、腫瘍抗原エスケープを克服するために使用され得る。図12A及び図12Bは、表面一次抗原の喪失によりCAR-T細胞死滅を回避する標的細胞の二次腫瘍抗原に結合するアゴニストBiTE(例えば、CD3ベースのCFRにマッチし、腫瘍抗原CD20を標的とする抗CD20×CD3 BiTE)によるCFR発現CD19-CAR-iT細胞活性化の例示的な説明を提供する。
実施例8-CFR及びBiTE発現エフェクター細胞は、標的依存性シグナル伝達及び活性化を示す
BiTEの全身投与と関連する毒性を回避するために、CFRsが同じ細胞による局在化BiTE分泌に応答して活性化され得るかどうかを試験することに決めた。BiTEを介したCFRシグナル伝達の開始を実証するために、CFR(CD3ε-CD28-CD3ε、3ε-28-3ε*とも呼ばれる)装備NFAT-ルシフェラーゼ発現Jurkatに、CD3×EpCAM BiTEをコードするレンチウイルス粒子を形質導入して、CFR+BiTE+ルシフェラーゼレポータJurkatを生成した。次いで、細胞を、EpCAM+標的細胞の存在下又は不在下、37℃、5%CO2で一晩培養し、その後、CFRの機能を決定した(図13A)。
BiTEの全身投与と関連する毒性を回避するために、CFRsが同じ細胞による局在化BiTE分泌に応答して活性化され得るかどうかを試験することに決めた。BiTEを介したCFRシグナル伝達の開始を実証するために、CFR(CD3ε-CD28-CD3ε、3ε-28-3ε*とも呼ばれる)装備NFAT-ルシフェラーゼ発現Jurkatに、CD3×EpCAM BiTEをコードするレンチウイルス粒子を形質導入して、CFR+BiTE+ルシフェラーゼレポータJurkatを生成した。次いで、細胞を、EpCAM+標的細胞の存在下又は不在下、37℃、5%CO2で一晩培養し、その後、CFRの機能を決定した(図13A)。
その後、20μLの各試料を、96ウェル透明底黒色又は白色プレート中で50μLのQUANTI(登録商標)-Luc(Invivogen,San Diego,CA)アッセイ溶液と混合し、ルシフェラーゼ活性(図13B)をSpectraMax(登録商標)マイクロプレートリーダー(Molecular Devices,San Jose,CA)で読み取ったところ、標的細胞の存在下でCFR陽性細胞におけるNFAT活性の誘導が実証された。フローサイトメトリによる活性化マーカーの分析は、標的細胞と共培養されたCFR+BiTE+細胞におけるCD69及びHLA-DR陽性細胞の割合の増加を示した(図13C)。これらのデータは、CFR及びマッチングBiTE(例えば、CD3ベースのCFR及びCD3を認識するBiTE、又はCD28ベースのCFR及びCD28を認識するBiTEなど)の両方を発現する細胞が、エフェクター細胞活性化をもたらす標的依存性シグナル伝達を示し得ることを実証する。
同じ細胞による局在化したBiTE分泌を更に調査するために、また、増強された腫瘍殺傷効果のためにCFR発現CAR-iT細胞の環境にBiTEを導入するためのBiTEスパイクインアプローチの代替法として、CFR発現CAR-iT細胞を、分泌されたBiTEを自己発現するように操作した(例えば、図14AのBiTE自己分泌モデルを参照)。BiTE自己産生がその後のエフェクター細胞機能に影響を及ぼすかどうかを決定するためにCAR-iT細胞へのBiTEのレンチウイルス形質導入、TRACノックアウトiT細胞におけるCFR(本実施例ではCD3ε及びmCherryについての染色)、BiTE(本実施例ではThy1.1についての染色)及びCARの発現を図14Bに示し、表面CD3εの発現はCFRの発現と相関するか、又はそれに依存する。図14Cは、E:T比3:1における抗原-標的に対するCFR依存性BiTE誘導性細胞溶解を示す。図14Dに示されるように、CFR+/CAR+iT細胞は、自己分泌性BiTEの存在下で、E:T比1:1において抗原+/抗原-混合標的に対する細胞溶解の増強を示す。
実施例9-iPSC及びiPSC由来エフェクター細胞の段階的ゲノム操作
TCR陰性及びCFR形質導入以外に、人工多能性幹細胞はまた、高親和性非切断性CD16発現、例えばB2M遺伝子のノックアウトによるHLA-Iの喪失、例えばCIITAのノックアウトによるHLA-IIの喪失、非古典的HLA分子HLA-Gの過剰発現、及び例えば融合タンパク質構築物による組換えサイトカインシグナル伝達複合体を含むがこれらに限定されない、外因性CD16又はそのバリアントを含むように連続的に操作された。各操作ステップの後、次の操作ステップの前に、iPSCを所望の表現型についてソーティングした。操作されたiPSCは、インビトロ又は派生細胞生成のために維持され得る。これらの遺伝的に操作されたモダリティが、造血分化中、での細胞の所望の細胞運命への指示された発達を混乱させることなく維持されることが実証されている。
TCR陰性及びCFR形質導入以外に、人工多能性幹細胞はまた、高親和性非切断性CD16発現、例えばB2M遺伝子のノックアウトによるHLA-Iの喪失、例えばCIITAのノックアウトによるHLA-IIの喪失、非古典的HLA分子HLA-Gの過剰発現、及び例えば融合タンパク質構築物による組換えサイトカインシグナル伝達複合体を含むがこれらに限定されない、外因性CD16又はそのバリアントを含むように連続的に操作された。各操作ステップの後、次の操作ステップの前に、iPSCを所望の表現型についてソーティングした。操作されたiPSCは、インビトロ又は派生細胞生成のために維持され得る。これらの遺伝的に操作されたモダリティが、造血分化中、での細胞の所望の細胞運命への指示された発達を混乱させることなく維持されることが実証されている。
CAR構築物がTRAC遺伝子座に標的化され、TCRノックアウト(TCRαKO又はTCRαneg)をもたらしたT細胞由来iPSCに、レンチウイルスを形質導入して、1つ以上のCD3ベースのCFRを構成的に発現させる。形質導入された構築物は、必要に応じて、細胞ソーティングによる形質導入効率及び濃縮についてアッセイする目的のための例示的なレポータとしてThy1.1を含む。次いで、得られたiPSC株を、野生型(wild-type、WT)及びTRAC標的化CAR対照株とともに、iPSC由来CD34+造血前駆細胞(iCD34)に分化させ、その後、派生T系列細胞(iT)に分化させる。
次いで、対照株及び形質導入株由来のiPSCを、(i)多能性マーカーSSEA4及びTRA181、並びに(ii)構築物レポータThy1.1について、細胞外フローサイトメトリによってアッセイする。CFRによる形質導入は、多能性マーカーによって示されるように、iPSC同一性に影響を及ぼさない。次いで、対照及び形質導入iPSCを、本明細書に記載の組成物及び方法を使用してiCD34造血前駆細胞に分化させ、CFR及びThy1.1についてフローサイトメトリによってアッセイする。CFRが形質導入された株は、ER保持モチーフ及びエンドサイトーシスモチーフの除去により、検出可能な細胞表面CD3とともに、Thy1.1発現を維持する。CD3及びTCRαβは、WT iPSC由来iCD34において観察されず、このことは、iTCRα又はiTCRαβ形質導入が、iCD34細胞段階において細胞表面上でCD3を発現しないか、又はCD3発現をもたらさないことを示唆している。
iCD34細胞を、本明細書に記載される組成物及び方法を使用して派生T系統細胞(iT)に更に分化させ、CFR発現について分化プロセス中の様々な時点(細胞発生段階)でフローサイトメトリによってアッセイする。CD3及びTCRαβ発現は、予想通り、TCR KO株には存在しない。加えて、CD3平均蛍光強度(mean fluorescence intensity、MFI)は、WTとCD3ベースのCFR形質導入系統との間で類似している。
テロメアの短縮は、細胞の老化とともに起こり、幹細胞の機能不全と細胞の老化と関連する。図15に示されるように、成熟iNK細胞は、成人末梢ボールドNK細胞と比較して長いテロメアを維持している。テロメア長は、iPSC、成体末梢血NK細胞、及びiPSC由来NK細胞のフローサイトメトリによって、G0/1細胞のDNAインデックスを補正した対照(100%)として1301T細胞白血病株を使用して決定された。図15に更に示すように、iPSC由来NK細胞は、成体末梢血NK細胞(p=.105、ANOVA)と比較して、有意に長いテロメア長を維持し、iPSC由来NK細胞の増殖、生存率、持続性の可能性が高いことを示す。同様の観察が、末梢血から得られた初代T細胞と比較して、iPSC由来T細胞においてなされた。
実施例10-CFR内部ドメインからのサイトカイン受容体シグナル伝達
サイトカイン受容体シグナル伝達は、適切なエフェクター細胞活性化の重要な部分であり得、CFRは、これらのシグナルを適時に提供するために使用され得る。サイトカイン内部ドメインを有するCFRが機能的であるか否かを試験するために、上記のように、TRACノックアウトJurkat細胞をレンチウイルス形質導入して、IL-2受容体ベータ(IL-2 receptor beta、IL2Rb)内部ドメインに融合したCD28外部ドメイン及び膜貫通ドメインを含むキメラ融合受容体を発現させた(図16A;28-28-IL2Rb)。このキメラ融合レセプタ構築物は、アゴニストリガンド(例えば、抗CD28抗体又はBiTE)の使用を可能にして、CD28外部ドメインへの結合の際にシグナル伝達を開始し、Jak1の活性化及びSTAT5のリン酸化を生じる。
サイトカイン受容体シグナル伝達は、適切なエフェクター細胞活性化の重要な部分であり得、CFRは、これらのシグナルを適時に提供するために使用され得る。サイトカイン内部ドメインを有するCFRが機能的であるか否かを試験するために、上記のように、TRACノックアウトJurkat細胞をレンチウイルス形質導入して、IL-2受容体ベータ(IL-2 receptor beta、IL2Rb)内部ドメインに融合したCD28外部ドメイン及び膜貫通ドメインを含むキメラ融合受容体を発現させた(図16A;28-28-IL2Rb)。このキメラ融合レセプタ構築物は、アゴニストリガンド(例えば、抗CD28抗体又はBiTE)の使用を可能にして、CD28外部ドメインへの結合の際にシグナル伝達を開始し、Jak1の活性化及びSTAT5のリン酸化を生じる。
CFRの発現は、CD28に対する抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリによって細胞を分析することによって測定した。CD28について15.5%陽性であった非形質導入TRAC KO Jurkatと比較して、CFR形質導入TRAC KO Jurkatは、CD28の表面発現について97.5%陽性であり(図16B)、このことは、CD28外部ドメインCFR導入遺伝子の発現の成功を示している。IL-2受容体β内部ドメインからのシグナル伝達について試験するために、非形質導入及びCFR形質導入(28-28-IL2Rb)Jurkatをアゴニスト抗CD28抗体の存在下又は不在下で2時間培養した。
リン酸化STAT5 Y694(pSTAT5)についての細胞内染色を実行し、細胞を分析した(図16C)。簡潔に述べると、対照及びCFR装備細胞におけるリン酸化STAT5を、アゴニストの存在下又は不在下で細胞内フローサイトメトリによって分析した。細胞をBD Phosflow(登録商標)Fix Buffer(BD Biosciences,San Jose,CA)で固定した後、BD Phosflow(登録商標)Perm Buffer(BD Biosciences,San Jose,CA)で透過処理した。Alexa Fluor(登録商標)647コンジュゲート抗STAT5(pY694)(BD Biosciences,San Jose,CA)を細胞内リン酸化STAT5染色に使用した。
表現型プロファイリングのために、細胞を採取し、固定可能な生存能力マーカー(BD Biosciences)で染色した後、氷上で30分間、APC-抗CD69及びBV711-抗HLA-DR(BD Biosciences,San Jose)抗体で表面染色した。BD Fortessa(登録商標)X-20(BD Biosciences)でデータ取得を実行し、FlowJoソフトウェア(FlowJo、Ashland、OR)及びSpotfire(登録商標)(Tibco、Boston、MA)を使用してデータを分析した。
アゴニスト抗体の不在下では、CFR形質導入細胞は、非形質導入対照と比較して、pSTAT5陽性細胞の割合がわずかに高く、それぞれ8%及び3%であった。アゴニスト抗CD28の添加により、CFR形質導入細胞はpSTAT5陽性細胞の割合の顕著な増加を示したが、非形質導入細胞では変化はなかった。この結果は、IL-2受容体ベータなどのサイトカイン受容体内部ドメインをキメラ融合受容体との関連で使用することができ、シグナル伝達がアゴニスト抗体又はBiTEなどのアゴニスト及びその機能的等価物を介して誘導されることを実証する。
当業者は、本明細書に記載の方法、組成物、及び製品が例示的な実施形態の代表であり、本発明の範囲に対する限定として意図されていないことを容易に理解するであろう。本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、本明細書に開示された本開示に対して様々な置換及び修正を行うことができることは、当業者には容易に明らかであろう。
本明細書で言及される全ての特許及び刊行物は、本開示が関係する当業者の技術水準を示している。全ての特許及び刊行物は、個々の刊行物が参照により組み込まれるものとして具体的かつ個別に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に例示的に記載された本開示は、本明細書に具体的に開示されていない任意の1つ又は複数の要素、限定又は複数の限定がなくても実施することができる。したがって、例えば、本明細書の各例において、「含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」という用語はいずれも、他の2つの用語のいずれかに置き換えることができる。使用されている用語及び表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、そのような用語及び表現の使用において、示され説明された特徴又はその一部のいずれかの同等物を除外する意図はないが、特許請求される本開示の範囲内で様々な修正が可能であると認識される。したがって、本開示は、好ましい実施形態及び必要に応じた特徴によって具体的に開示されているが、本明細書で開示される概念の修正及び変形は、当業者によってしばしば想到され得、そのような修正及び変形は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内であるとみなされることが理解されるべきである。
Claims (42)
- キメラ融合受容体(CFR)であって、前記CFRが、外部ドメインと、膜貫通ドメインと、内部ドメインと、を含み、前記外部ドメイン、前記膜貫通ドメイン、及び前記内部ドメインが、いかなる小胞体(ER)保持シグナルもエンドサイトーシスシグナルも含まない、キメラ融合受容体(CFR)。
- 前記外部ドメインが、抗体のscFv(単鎖可変領域断片)ではなく、前記外部ドメインが、選択されたアゴニストに結合すると、シグナル伝達を開始し、前記内部ドメインが、細胞治療特性を増強するために選択されたシグナル伝達経路を活性化させる少なくとも1つのシグナル伝達ドメインを含み、前記CFRが、発現されたときに細胞表面提示され、前記CFRが、低減された内在化及び表面下方調節を有する、請求項1に記載のキメラ融合受容体。
- 前記内部ドメイン及び前記外部ドメインが、モジュール式であるか、又は前記CFRの所与の内部ドメインについて、前記外部ドメインが、選択されたアゴニストの結合特異性に応じて切り替え可能であるか、又は所与の外部ドメインについて、前記内部ドメインが、調節のために選択されたシグナル伝達経路に応じて切り替え可能である、請求項1に記載のキメラ融合受容体。
- 前記外部ドメインが、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD28、CD5、CD16、CD64、CD32、CD33、CD89、NKG2C、NKG2D、それらの任意の機能的バリアント及び組み合わせ又はキメラのうちの少なくとも1つを含むシグナル伝達タンパク質の細胞外部分の全長又は部分長を含む、請求項1又は2に記載のキメラ融合受容体。
- 前記選択されたアゴニストが、(i)抗体、又はその機能的バリアント若しくは断片、あるいは(ii)エンゲージャ、を含むアゴニストリガンドであり、前記選択されたアゴニストが、前記CFRの前記外部ドメインの一部分に特異的な結合ドメインを少なくとも含む、請求項2に記載のキメラ融合受容体。
- 前記選択されたアゴニストが、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD28、CD5、CD16、CD64、CD32、CD33、CD89、NKG2C、NKG2D、若しくはそれらの任意の機能的バリアントの細胞外部分に特異的な結合ドメインを少なくとも含むか、又は前記選択されたアゴニストが、B7H3、BCMA、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、PSMA、PAMA、P-カドヘリン、若しくはROR1を含む少なくとも1つの腫瘍抗原に特異的な結合ドメインを更に含むエンゲージャである、請求項5に記載のキメラ融合受容体。
- (i)前記外部ドメインが、(a)CD3ε、CD3γ、CD3δ、それらの任意の機能的バリアント、又は組み合わせ若しくはキメラ形態、(b)CD3ε及びCD3γのヘテロ二量体、又は(c)CD3ε及びCD3δのヘテロ二量体、の細胞外部分の全長又は部分長を含み、
(ii)前記選択されたアゴニストが、CD3の外部ドメインに対する結合特異性を有するか、あるいは前記選択されたアゴニストが、CD3×CD19、CD3×CD20、CD3×CD33、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、エルツマキソマブ、RO6958688、AFM11、MT110/AMG110、MT111/AMG211/MEDI-565、AMG330、MT112/BAY2010112、MOR209/ES414、MGD006/S80880、MGD007、及びFBTA05のうちの少なくとも1つを含む、請求項5に記載のキメラ融合受容体。 - (i)前記外部ドメインが、NKG2C若しくはその任意の機能的バリアントの細胞外部分の全長若しくは部分長を含み、
(ii)前記選択されたアゴニストが、NKG2Cの外部ドメインに対する結合特異性を有するか、又は前記選択されたアゴニストが、NKG2C-IL15-CD33 TriKE、NKG2C-IL15-CD19 TriKE、及びNKG2C-IL15-CD20 TriKEのうちの少なくとも1つを含む、請求項5に記載のキメラ融合受容体。 - (i)前記外部ドメインが、CD28若しくはその任意の機能的バリアントの細胞外部分の全長若しくは部分長を含み、
(ii)前記選択されたアゴニストが、CD28の外部ドメインに対する結合特異性を有するか、又は前記選択されたアゴニストが、15E8、CD28.2、CD28.6、YTH913.12、37.51、9D7(TGN1412)、5.11A1、ANC28.1/5D10、及び37407のうちの少なくとも1つを含む、請求項5に記載のキメラ融合受容体。 - (i)前記外部ドメインが、CD16、CD64、又はそれらの任意の機能的バリアント若しくは組み合わせ/キメラ形態の細胞外部分の全長又は部分長を含み、
(ii)前記選択されたアゴニストが、CD16又はCD64の外部ドメインに対する結合特異性を有するか、あるいは、前記選択されたアゴニストが、IgG抗体、CD16×CD30、CD64×CD30、CD16×BCMA、CD64×BCMA、CD16-IL-EpCAM又はCD64-IL-EpCAM、CD16-IL-CD33、及びCD64-IL-CD33のうちの少なくとも1つを含み、前記ILが、IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21、又はそれらの任意の機能的バリアント若しくはキメラ形態を含む少なくとも1つのサイトカインの全部又は一部分を含む、請求項5に記載のキメラ融合受容体。 - 前記CFRの前記膜貫通ドメインが、
(i)ER保持シグナルもエンドサイトーシスシグナルも有しないか、又は操作によってER保持シグナル及びエンドサイトーシスシグナルが除去されており、
(ii)
(a)膜貫通タンパク質若しくは膜タンパク質、
(b)CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD137、CD166、FcεRIγ、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、T細胞受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、GABA受容体、若しくはそれらの組み合わせを含むタンパク質、又は
(c)CD28、CD8、CD3ε、若しくはCD4、の膜貫通ドメインの全部又は一部を含む、請求項1~10のいずれか一項に記載のキメラ融合受容体。 - 前記内部ドメインが、少なくとも細胞傷害性ドメインと、必要に応じて共刺激ドメイン、持続性シグナル伝達ドメイン、死誘導シグナル伝達ドメイン、腫瘍細胞制御シグナル伝達ドメイン、及びそれらの任意の組み合わせのうちの1つ以上と、を含む、請求項1に記載のキメラ融合受容体。
- 前記内部ドメインが、CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(4-1BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、若しくはNKG2Dポリペプチドの全長若しくは一部分を少なくとも含む細胞傷害性ドメインを含み、必要に応じて、前記内部ドメインが、
(i)CD2、CD27、CD28、CD40L、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4、若しくはNKG2Dポリペプチド、若しくはそれらの任意の組み合わせの全長若しくは一部分を含む共刺激ドメイン、
(ii)CD28、4-1BB、CD27、CD40L、ICOS、CD2、若しくはそれらの任意の組み合わせの全長若しくは一部分を含む共刺激ドメイン、
(iii)IL2R、IL7R、IL15R、IL18R、IL12R、IL23R、若しくはそれらの任意の組み合わせを含むサイトカイン受容体の内部ドメインの全長若しくは一部分を含む持続性シグナル伝達ドメイン、及び/又は、
(iv)受容体チロシンキナーゼ(RTK)、腫瘍壊死因子受容体(TNFR)、EGFR、若しくはFAS受容体の完全若しくは部分的な細胞内部分、のうちの1つ以上を更に含む、請求項12に記載のキメラ融合受容体。 - 細胞又はその集団であって、前記細胞が、請求項1~13のいずれか一項に記載のキメラ融合受容体(CFR)をコードするポリヌクレオチドを含み、前記細胞が、真核細胞、動物細胞、ヒト細胞、免疫細胞、フィーダ細胞、人工多能性幹細胞(iPSC)、クローンiPSC、又はそれらの派生エフェクター細胞である、細胞又はその集団。
- 前記エフェクター細胞が、
(i)標的化特異性を有するCAR、
(ii)CD16若しくはそのバリアント、
(iii)CD38ノックアウト、
(iv)細胞表面発現外因性サイトカイン及び/若しくはその受容体の部分的若しくは完全なペプチド、
(v)HLA-Iの欠損、及び必要に応じてHLA-IIの欠損、
(vi)HLA-G若しくは非切断性HLA-Gの導入、又はCD58及びCD54の一方若しくは両方のノックアウト、
(vii)表1に列挙される遺伝子型のうちの少なくとも1つ、
(viii)B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD25、CD69、CD44、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、及びTIGITのうちの少なくとも1つの欠失若しくは破壊、又は
(ix)HLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD16、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、抗原特異的TCR、Fc受容体、抗体若しくはその機能的バリアント若しくは断片、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、及びアゴニストとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも1つの導入、のうちの1つ以上を更に含む、請求項14に記載の細胞又はその集団。 - 前記細胞が、末梢血、臍帯血、又は任意の他のドナー組織から得られたその対応する初代細胞と比較して、
(i)増加された細胞傷害性、
(ii)改善された持続性及び/又は生存率、
(iii)腫瘍部位にバイスタンダー免疫細胞を遊走させる、及び/又は活性化させる、若しくは動員する増強された能力、
(iv)改善された腫瘍浸透、
(v)腫瘍免疫抑制を低下させる増強された能力、
(vi)腫瘍抗原エスケープを救済する改善された能力、
(vii)制御されたアポトーシス、
(viii)増強又は獲得されたADCC、並びに
(ix)フラトリサイドを回避する能力、
のうちの1つ以上を含む治療特性を有する、請求項15に記載の細胞又はその集団。 - 前記CD16又はそのバリアントが、
(a)高親和性の非切断性CD16(hnCD16)、
(b)CD16の外部ドメインにおけるF176V及びS197P、
(c)CD64に由来する完全又は部分的な外部ドメイン、
(d)非天然(又は非CD16)の膜貫通ドメイン、
(e)非天然(又は非CD16)の細胞内ドメイン、
(f)非天然(又は非CD16)のシグナル伝達ドメイン、
(g)非天然の刺激ドメイン、並びに
(h)CD16に由来せず、かつ同じ又は異なるポリペプチドに由来する膜貫通、シグナル伝達、及び刺激ドメイン、のうちの少なくとも1つを含む、請求項15に記載の細胞又はその集団。 - 前記CARが、
(i)T細胞特異的若しくはNK細胞特異的なもの、
(ii)二重特異性抗原結合CAR、
(iii)切り替え可能なCAR、
(iv)二量体化されたCAR、
(v)スプリットCAR、
(vi)多重鎖CAR、
(vii)誘導可能なCAR、
(viii)必要に応じて別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、細胞表面発現外因性サイトカイン及び/若しくはその受容体の部分的若しくは完全なペプチドと共発現されたもの、
(ix)必要に応じて別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、チェックポイント阻害剤と共発現されたもの、
(x)CD19、BCMA、CD20、CD22、CD38、CD123、HER2、CD52、EGFR、GD2、MICA/B、MSLN、VEGF-R2、PSMA、及びPDL1のうちの少なくとも1つに特異的なもの、並びに/又は
(xi)ADGRE2、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、CCR1、CCR4、がん胎児性抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、サイトメガロウイルス(CMV)感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質-2(EGP-2)、上皮糖タンパク質-40(EGP-40)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、EGFRvIII、受容体チロシンタンパク質キナーゼerb-B2、3、4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB葉酸結合タンパク質(FBP)、胎児のアセチルコリン受容体(AChR)、葉酸受容体-α、ガングリオシドG2(GD2)、ガングリオシドG3(GD3)、ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2)、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、ICAM-1、インテグリンB7、インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2(IL-13Rα2)、κ-軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体(KDR)、ルイスA(CA19.9)、ルイスY(LeY)、L1細胞接着分子(L1-CAM)、LILRB2、黒色腫抗原ファミリーA1(MAGE-A1)、MICA/B、ムチン1(Muc-1)、ムチン16(Muc-16)、メソセリン(MSLN)、NKCSI、NKG2Dリガンド、c-Met、がん-精巣抗原NY-ESO-1、腫瘍胎児性抗原(h5T4)、PRAME、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、PRAME前立腺特異的膜抗原(PSMA)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG-72)、TIM-3、TRBC1、TRBC2、血管内皮増殖因子R2(VEGF-R2)、ウィルムス腫瘍タンパク質(WT-1)、及び病原体抗原のうちのいずれか1つに特異的なもの、であり、
必要に応じて、前記(i)~(xi)のうちのいずれか1つのCARが、TCR遺伝子座に挿入されている、及び/又はTCRの内因性プロモータによって駆動されている、かつ/あるいは前記TCRが、前記CAR挿入によってノックアウトされている、請求項15に記載の細胞又はその集団。 - 前記細胞が、細胞表面発現外因性サイトカイン及び/又はその受容体の部分的又は完全なペプチドを含み、前記外因性サイトカイン又はその受容体が、
(a)IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21、及びそのそれぞれの受容体のうちの少なくとも1つを含むか、又は
(b)
(i)自己切断ペプチドを使用することによるIL15とIL15Rαとの共発現、
(ii)IL15とIL15Rαとの融合タンパク質、
(iii)IL15Rαの細胞内ドメインが短縮化若しくは排除されたIL15/IL15Rα融合タンパク質、
(iv)IL15とIL15Rαの膜結合Sushiドメインとの融合タンパク質、
(v)IL15とIL15Rβとの融合タンパク質、
(vi)IL15と共通受容体γCとの融合タンパク質であって、前記共通受容体γCが、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び
(vii)IL15Rβのホモ二量体、のうちの少なくとも1つを含み、
(i)~(vii)のうちのいずれか1つは、別個の構築物内で、又はバイシストロン性構築物内で、CARと共発現され得、
必要に応じて、
(c)一過的に発現される、請求項15に記載の細胞又はその集団。 - 前記チェックポイント阻害剤が、PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2AR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxp1、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara(レチノイン酸受容体アルファ)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E、及び阻害性KIRを含む1つ以上のチェックポイント分子に対するアンタゴニストであるか、又は
前記エンゲージャが、二重特異性T細胞エンゲージャ(BiTE)又は三重特異性キラー細胞エンゲージャ(TriKE)を含む、請求項15に記載の細胞又はその集団。 - 前記派生エフェクター細胞が、腫瘍部位にT細胞を動員する及び/又は遊走させることができ、前記派生エフェクター細胞が、1つ以上のチェックポイント阻害剤の存在下で腫瘍免疫抑制を低下させることができる、請求項15に記載の細胞又はその集団。
- 前記細胞が、
(i)セーフハーバー遺伝子座若しくは選択された遺伝子座に組み込まれた1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、又は
(ii)異なるセーフハーバー遺伝子座若しくは2つ以上の選択された遺伝子座に組み込まれた2つを超える外因性ポリヌクレオチド、を含む、請求項14に記載の細胞又はその集団。 - 前記セーフハーバー遺伝子座が、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、GAPDH、若しくはRUNX1のうちの少なくとも1つを含み、前記選択された遺伝子座が、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、若しくはTIGITのうちの1つであり、かつ/又は前記外因性ポリヌクレオチドの前記組み込みが、前記遺伝子座における遺伝子の発現をノックアウトする、請求項22に記載の細胞又はその集団。
- 前記TCR遺伝子座が、TCRアルファ及び/又はTCRベータの定常領域である、請求項23に記載の細胞又はその集団。
- 前記派生エフェクター細胞が、派生CD34細胞、派生造血幹前駆細胞、派生造血多能性前駆細胞、派生T細胞前駆体、派生NK細胞前駆体、派生T系統細胞、派生NKT系統細胞、派生NK系統細胞、派生B系統細胞、又は対応する初代T、NK、NKT、及び/若しくはB細胞には存在しない1つ以上の機能的特質を有する派生免疫エフェクター細胞を含む、請求項14に記載の細胞又はその集団。
- 請求項14~25のいずれか一項に記載の細胞又はその集団を含む、組成物。
- 請求項14~25のいずれか一項に記載のクローンiPSCを含む、マスター細胞バンク(MCB)。
- 請求項14~25のいずれか一項に記載の細胞又はその集団と、1つ以上の治療剤と、を含む、治療的使用のための組成物。
- 前記治療剤が、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、抗体又はその機能的バリアント若しくは断片、エンゲージャ、マイトジェン、増殖因子、低分子RNA、dsRNA(二本鎖RNA)、単核血球、フィーダ細胞、フィーダ細胞成分又はその補充因子、1つ以上の目的のポリ核酸を含むベクター、化学療法剤又は放射性部分、あるいは免疫修飾薬(IMiD)を含む、請求項28に記載の組成物。
- (a)前記チェックポイント阻害剤が、
(i)PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2AR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara(レチノイン酸受容体アルファ)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E、若しくは阻害性KIRを含む1つ以上のアンタゴニストチェックポイント分子、
(ii)アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、IPH4102、IPH43、IPH33、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びそれらの派生体若しくは機能的同等物のうちの1つ以上、又は
(iii)アテゾリズマブ、ニボルマブ、及びペンブロリズマブのうちの少なくとも1つ、を含むか、あるいは
(b)前記治療剤が、ベネトクラクス、アザシチジン、及びポマリドマイドのうちの1つ以上を含むか、あるいは
(c)前記エンゲージャが、二重特異性T細胞エンゲージャ(BiTE)又は三重特異性キラー細胞エンゲージャ(TriKE)を含む、請求項29に記載の組成物。 - 前記抗体、又はその機能的バリアント若しくは断片が、
(a)抗CD20、抗CD22、抗HER2、抗CD52、抗EGFR、抗CD123、抗GD2、抗PDL1、及び/若しくは抗CD38抗体、
(b)リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、オクレリズマブ、イノツズマブ、モキセツモマブ、エプラツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、ジヌツキシマブ、アベルマブ、ダラツムマブ、イサツキシマブ、MOR202、7G3、CSL362、エロツズマブ、及びそれらのヒト化若しくはFc改変されたバリアント又は断片、並びにそれらの機能的同等物及びバイオシミラーのうちの1つ以上、又は
(c)ダラツムマブを含み、前記派生エフェクター細胞が、CD38ノックアウト、及び必要に応じてCD16又はそのバリアントの発現を含む、請求項29に記載の組成物。 - 請求項28~31のいずれか一項に記載の組成物を養子細胞療法に好適な対象に導入することによる前記組成物の治療的使用であって、前記対象が、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、がん、又はウイルス感染を有する、治療的使用。
- 請求項1~13のいずれか一項に記載のCFRを含む派生エフェクター細胞を製造する方法であって、前記方法が、遺伝子操作されたiPSCを分化させることを含み、前記iPSCが、前記CFRをコードするポリヌクレオチドと、必要に応じて、
(i)CD38ノックアウト、
(ii)HLA-Iの欠損、及び必要に応じてHLA-IIの欠損、
(iii)HLA-G若しくは非切断性HLA-Gの導入、又はCD58及びCD54の一方若しくは両方のノックアウト、
(iv)CD16若しくはそのバリアント、
(v)標的化特異性を有するCAR、
(vi)細胞表面発現外因性サイトカイン及び/若しくはその受容体の部分的若しくは完全なペプチド、
(vii)表1に列挙される遺伝子型のうちの少なくとも1つ、
(viii)B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD25、CD69、CD44、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、及びTIGITのうちの少なくとも1つの欠失若しくは破壊、又は
(ix)HLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD16、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、抗原特異的TCR、Fc受容体、抗体若しくはその機能的バリアント若しくは断片、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、及びアゴニストとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも1つの導入、をもたらす1つ以上の編集と、を含む、方法。 - 前記CFRをコードするポリヌクレオチドをノックインするために、かつ、必要に応じて、
(i)CD38をノックアウトするために、
(ii)B2M及び/若しくはCIITAをノックアウトするために、
(iii)一方若しくは両方のCD58及びCD54をノックアウトするために、並びに/あるいは、
(iv)HLA-G若しくは非切断性HLA-G、高親和性の非切断性CD16若しくはそのバリアント、CAR、及び/又は細胞表面発現外因性サイトカイン及び/若しくはその受容体の部分的若しくは完全なペプチドを導入するために、クローンiPSCをゲノム操作することを更に含む、請求項33に記載の方法。 - 前記ゲノム操作することが、標的化編集を含む、請求項34に記載の方法。
- 前記標的化編集が、欠失、挿入、又はインデルを含み、前記標的化編集が、CRISPR、ZFN、TALEN、ホーミングヌクレアーゼ、相同組換え、又はこれらの方法の任意の他の機能的バリエーションによって行われる、請求項35に記載の方法。
- クローンiPSCのCRISPR媒介性編集であって、前記編集が、請求項1~13のいずれか一項に記載のCFRをコードするポリヌクレオチドのノックインを含む、CRISPR媒介性編集。
- (a)前記クローンiPSCの編集が、TCRをノックアウトすることを更に含むか、又は
(b)前記CFRが、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、若しくはTIGITを含む遺伝子座のうちの1つに挿入され、前記挿入が、前記遺伝子座における遺伝子の発現をノックアウトする、請求項37に記載のCRISPR媒介性編集。 - 疾患又は状態を治療する方法であって、それを必要とする対象に、請求項1~13のいずれか一項に記載のCFRと、前記CFRに特異的なアゴニストと、を含む細胞を投与することを含む、方法。
- 前記CFRを含む前記細胞が、抗体又はその機能的バリアント若しくは断片、あるいは前記CFRに特異的なエンゲージャを発現する、請求項39に記載の方法。
- 前記CFRを含む前記細胞が、iPSC由来エフェクター細胞であり、前記iPSC由来エフェクター細胞が、
(i)CD38ノックアウト、
(ii)TCRneg、
(iii)外因性CD16若しくはそのバリアント、
(iv)HLA-I及び/若しくはHLA-IIの欠損、
(v)HLA-G若しくは非切断性HLA-Gの導入、又はCD58及びCD54の一方若しくは両方のノックアウト、
(vi)CARの導入、及び/又は
(vii)細胞表面発現外因性サイトカイン及び/若しくはその受容体の部分的若しくは完全なペプチド、のうちの1つ以上を更に含む、請求項39に記載の方法。 - 前記細胞の投与が、末梢血、臍帯血、又は任意の他のドナー組織から得られたその対応する初代細胞と比較して、
(i)増加された細胞傷害性、
(ii)改善された持続性及び/又は生存率、
(iii)腫瘍部位にバイスタンダー免疫細胞を遊走させる、及び/又は活性化させる、若しくは動員する増強された能力、
(iv)改善された腫瘍浸透、
(v)腫瘍免疫抑制を低下させる増強された能力、
(vi)腫瘍抗原エスケープを救済する改善された能力、
(vii)制御されたアポトーシス、
(viii)増強又は獲得されたADCC、並びに
(ix)フラトリサイドを回避する能力、
のうちの1つ以上をもたらす、請求項39に記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US202063090113P | 2020-10-09 | 2020-10-09 | |
US63/090,113 | 2020-10-09 | ||
US202163172383P | 2021-04-08 | 2021-04-08 | |
US63/172,383 | 2021-04-08 | ||
PCT/US2021/054302 WO2022076910A1 (en) | 2020-10-09 | 2021-10-08 | Engineered ipsc and armed immune effector cells |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2023545992A true JP2023545992A (ja) | 2023-11-01 |
Family
ID=81125515
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023520531A Pending JP2023545992A (ja) | 2020-10-09 | 2021-10-08 | 操作されたiPSC及び装備された免疫エフェクター細胞 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20240033355A1 (ja) |
EP (1) | EP4225785A1 (ja) |
JP (1) | JP2023545992A (ja) |
KR (1) | KR20230084533A (ja) |
AU (1) | AU2021358110A1 (ja) |
CA (1) | CA3194850A1 (ja) |
IL (1) | IL301983A (ja) |
MX (1) | MX2023004130A (ja) |
WO (1) | WO2022076910A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11661459B2 (en) | 2020-12-03 | 2023-05-30 | Century Therapeutics, Inc. | Artificial cell death polypeptide for chimeric antigen receptor and uses thereof |
CN116635064A (zh) | 2020-12-18 | 2023-08-22 | 世纪治疗股份有限公司 | 具有适应性受体特异性的嵌合抗原受体系统 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BR112019000693A2 (pt) * | 2016-07-15 | 2019-04-24 | Poseida Therapeutics, Inc. | composições de muc1- car e métodos para uso |
IL270415B1 (en) * | 2017-05-12 | 2024-04-01 | Crispr Therapeutics Ag | Materials and methods for cell engineering and their uses in immuno-oncology |
-
2021
- 2021-10-08 US US18/028,457 patent/US20240033355A1/en active Pending
- 2021-10-08 KR KR1020237015184A patent/KR20230084533A/ko unknown
- 2021-10-08 EP EP21878675.4A patent/EP4225785A1/en active Pending
- 2021-10-08 AU AU2021358110A patent/AU2021358110A1/en active Pending
- 2021-10-08 JP JP2023520531A patent/JP2023545992A/ja active Pending
- 2021-10-08 WO PCT/US2021/054302 patent/WO2022076910A1/en active Application Filing
- 2021-10-08 IL IL301983A patent/IL301983A/en unknown
- 2021-10-08 CA CA3194850A patent/CA3194850A1/en active Pending
- 2021-10-08 MX MX2023004130A patent/MX2023004130A/es unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2021358110A1 (en) | 2023-05-25 |
EP4225785A1 (en) | 2023-08-16 |
CA3194850A1 (en) | 2022-04-14 |
WO2022076910A1 (en) | 2022-04-14 |
KR20230084533A (ko) | 2023-06-13 |
IL301983A (en) | 2023-06-01 |
MX2023004130A (es) | 2023-06-13 |
US20240033355A1 (en) | 2024-02-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7467339B2 (ja) | 強化された免疫エフェクター細胞およびその使用 | |
JP2024020364A (ja) | 増強されたiPSC由来のエフェクター細胞を用いた免疫療法 | |
JP2021519061A (ja) | 操作された免疫エフェクター細胞およびその使用 | |
JP2022541441A (ja) | 免疫エフェクター細胞操作およびその使用 | |
US20220184142A1 (en) | CD3 RECONSTITUTION IN ENGINEERED iPSC AND IMMUNE EFFECTOR CELLS | |
JP2022548943A (ja) | 複数標的化エフェクター細胞およびその使用 | |
JP2022510207A (ja) | 増強されたiPSC派生エフェクター細胞を使用した免疫療法 | |
JP2022552314A (ja) | 免疫のための増強されたキメラ抗原受容体エフェクター細胞操作およびその使用 | |
US20230381235A1 (en) | Multiplexed engineered ipscs and immune effector cells targeting solid tumors | |
JP2023530704A (ja) | 免疫療法で使用するためのiPSC由来エフェクター細胞型の組み合わせ | |
JP2022550899A (ja) | 免疫のための増強されたキメラ抗原受容体エフェクター細胞操作およびその使用 | |
US20230390337A1 (en) | Engineered ipsc and persistent immune effector cells | |
US20240033355A1 (en) | ENGINEERED iPSC AND ARMED IMMUNE EFFECTOR CELLS | |
US20230405121A1 (en) | Engineered ipsc and immune effector cells for heterogenous tumor control | |
CN116457367A (zh) | 工程改造的iPSC和武装的免疫效应细胞 | |
KR20240031361A (ko) | 동종이계 입양 세포 치료를 위한 보호된 이펙터 세포 및 이의 용도 | |
CN116615530A (zh) | 靶向实体瘤的多重工程改造的iPSC和免疫效应细胞 |