KR20240031361A - 동종이계 입양 세포 치료를 위한 보호된 이펙터 세포 및 이의 용도 - Google Patents

동종이계 입양 세포 치료를 위한 보호된 이펙터 세포 및 이의 용도 Download PDF

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KR20240031361A
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cell
derived
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receptor
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KR1020247004057A
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바흐람 발라메르
라이언 비요르달
조드 굿리지
앨런 윌리엄스
리나 음보풍
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페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

게놈 조작된 iPSC의 지향성 분화로부터 얻은 기능적으로 향상된 유래 이펙터 세포(derivative effector cell)를 얻기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 본원에 제공된 유래 세포의 실시형태는 개선된 또는 향상된 치료 효과를 전달하는 안정적이고 기능적인 게놈 편집을 갖는다. 기능적으로 향상된 유래 이펙터 세포만을 단독으로 포함하거나, 병용 요법에서의 항체 또는 관문 억제제와 함께 포함하는 치료 조성물 및 이의 용도가 또한 제공된다.

Description

동종이계 입양 세포 치료를 위한 보호된 이펙터 세포 및 이의 용도
관련 출원
본 출원은 2021년 7월 2일자에 출원된 미국 임시 출원 제63/218,204호, 2021년 12월 9일자에 출원된 미국 임시 출원 제63/265,190호 및 2022년 5월 13일자에 출원된 미국 임시 출원 제63/341,943호의 우선권을 주장하고, 이의 각각의 개시내용은 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록의 참조에 의한 통합
2022년 7월 1일자에 생성되고 크기가 16,198바이트인 184143-635601_SequenceListing.xml이라는 명칭의 서열 목록은 이의 전체가 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 기성품(off-the-shelf) 면역세포 산물의 분야와 광범위하게 관련된다. 보다 특히, 본 개시내용은 치료적 관련 특성을 생체내로 전달할 수 있는 다기능성 이펙터 세포를 개발하기 위한 전략에 관한 것이다. 본 개시내용 하에 개발된 세포 산물은 환자-공급 세포 치료(patient-sourced cell therapy)의 중대한 제한을 해결한다.
입양 세포 치료의 분야는 현재 환자-공급 세포 및 공여자-공급 세포의 사용에 초점을 두는데, 이는 암 면역요법의 일관된 제조를 달성하고, 이로부터 이익을 얻을 수 있는 모든 환자에게 치료를 전달하는 것을 특히 어렵게 한다. 또한 유리한 환자 결과를 촉진하기 위해 입양으로 운반된 림프구의 효능 및 지속성을 개선할 필요성이 있다. T 세포 및 자연 살해(NK) 세포와 같은 림프구는 선천성 면역 및 적응 면역에서 중요한 역할을 하는 강력한 항종양 이펙터이다. 그러나, 입양 세포 치료에 대한 이들 면역 세포의 사용은 난제로 남아 있고, 개선에 대한 미충족 필요성을 갖는다. 따라서, 입양 면역요법에서 T 세포 및 NK 세포 또는 다른 림프구의 완전한 잠재력을 이용하기 위한 상당한 기회가 남아 있다.
반응 속도, 세포 탈진, 수혈된 세포의 소실(생존 및/또는 지속성), 표적 소실 또는 계통 스위치를 통한 종양 회피, 종양 표적화 정확성, 오프 타겟 독성, 오프 종양 효과에서 고형 종양, 즉 종양 미세환경에 대한 효능 및 관련된 면역 억제, 동원, 수송 및 침윤에 이르는 문제를 해결하는 기능적으로 개선된 이펙터 세포에 대한 필요성이 있다.
본 발명의 실시형태의 목적은 단일 세포 유래된 iPSC(유도 만능성 줄기 세포) 클론성주로부터 분화된 유래 비-만능성 세포(derivative non-pluripotent cell)를 생성시키기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이며, iPSC주는 게놈 내에 하나 또는 몇몇 유전자 변형을 포함한다. 상기 하나 또는 몇몇 유전자 변형은, 일부 실시형태에서, DNA 삽입, 결실 및 치환을 포함하며, 그 변형은 분화, 확장, 계대배양 및/또는 이식 후, 후속적으로 유래된 세포에서 보유되고 기능적으로 유지된다.
본 출원의 iPSC-유래된 비-만능성 세포는 CD34+ 세포, 조혈 내피 세포, HSC(조혈 줄기 및 전구 세포), 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포 및 B 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 iPSC-유래된 비-만능성 세포는 동일한 유전자 변형을 포함하는 iPSC로부터의 분화를 통해 이의 게놈에서 하나 또는 몇몇 유전자 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자 조작된 유래 세포(derivative cell)를 얻기 위한 조작된 클론성 iPSC 분화 전략은, iPSC에서 조작된 모달리티(modality)에 의해 유의한 악영향을 받지 않고, 또한 조작된 모달리티가 유래 세포에서 의도된 대로 기능하는, 지향성 분화에서의 iPSC의 발생 능력(developmental potential)으로부터 이익을 얻는다. 추가로, 이 전략은 말초혈로부터 얻은 T 세포 또는 NK 세포와 같은 1차 림프구의 조작에서 현재의 장벽을 극복하는데, 이는 상기 세포가 조작하기 어렵기 때문이고, 상기 세포의 조작은 대개 재현성 및 균일성이 결여되어 높은 세포 사멸 및 낮은 세포 확장과 함께 불량한 세포 지속성을 나타내는 세포를 생성시킨다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 세포 또는 이의 집단을 제공하며, (i) 세포는 유도 만능성 세포(iPSC: induced pluripotent cell), 클론성 iPSC, iPS 세포주 세포, 또는 iPSC의 분화로부터 얻어진 유래 세포이고; (ii) 세포는 (a) HLA-I 결핍; (b) CD38 녹아웃; 및 선택적으로, (c) CD16 또는 이의 변이체를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 세포 또는 이의 집단은 하기 중 하나 이상을 추가로 포함한다: (i) 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 펩티드 또는 전체 펩티드를 포함하는 사이토카인 신호전달 복합체를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드; (ii) 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드; (iii) HLA-II 결핍; 및 (iv) HLA-G, HLA-E, 또는 이의 변이체를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드 - 이때, 세포는 CD38 컨디셔닝에 적합하고, 세포는 CD38 컨디셔닝을 도입하는 입양 세포 치료에서 동종반응성 숙주 세포의 존재 하에서 개선된 지속성을 가짐 -. 다양한 실시형태에서, 세포는 (i) 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나를 포함하고; (ii) CD58 및 CD54 중 하나 또는 둘 모두의 녹아웃을 포함하고; (iii) B2M, CIITA, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD25, CD69, CD44, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 및 TIGIT 중 적어도 하나의 파괴를 포함하고; (iv) 4-1BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, TCR, Fc 수용체, 항체 또는 이의 기능적 변이체 또는 이의 단편, 관문 억제제, 인게이저, 및 이중특이적 또는 다중특이적 또는 범용 인게이저와 커플링하기 위한 표면 유도 수용체 중 적어도 하나의 도입을 포함하고; 그리고/또는 (v) HLA-G, HLA-E, 또는 이의 변이체를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, HLA-I 결핍은 B2M, TAP1, TAP2, 및 타파신 중 적어도 하나의 파괴를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, HLA-II 결핍은 CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 적어도 하나의 파괴를 포함한다.
세포 또는 이의 집단의 다양한 실시형태에서, 유래 세포는 말초혈, 제대혈, 또는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 얻은 이의 천연 대응 세포와 비교하여 (a) 유래 CD34+ 세포, 유래 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, 유래 조혈 다능성 전구 세포, 유래 T 세포 전구 세포, 유래 NK 세포 전구 세포, 유래 T 세포, 유래 NKT 세포, 유래 NK 세포, 또는 유래 B 세포를 포함하거나; (b) 동종이계 이펙터 세포로서 사용되고, 이펙터 세포는 하기를 포함하는 특징 중 적어도 하나를 갖는 유래 NK 세포 또는 유래 T 세포이다: (i) 개선된 지속성 및/또는 생존; (ii) 활성화된 수용자 면역 세포에 대한 증가된 내성; (iii) 증가된 세포독성; (iv) 종양 침투의 개선; (v) 향상된 또는 획득된 ADCC; (vi) 방관자 면역 세포를 종양 부위로 이동시키고/시키거나, 활성화 또는 동원하는 데 있어서의 향상된 능력; (vii) 종양 면역억제를 감소시키는 능력의 향상; (viii) 종양 항원 탈출을 구제하는 것의 개선된 능력; 및 (ix) 감소된 동족살해(fratricide) .
세포 또는 이의 집단의 다양한 실시형태에서, CD16 또는 이의 변이체는 하기 중 적어도 하나를 포함한다: (a) 고 친화도 비-절단성 CD16(hnCD16) 또는 이의 변이체; (b) CD16의 엑토도메인 도메인에서의 F176V 및 S197P; (c) CD64로부터 기원한 전체 또는 부분 엑토도메인; (d) 비-천연(또는 비-CD16) 막관통 도메인; (e) 비-천연(또는 비-CD16) 세포내 도메인; (f) 비-천연(또는 비-CD16) 신호전달 도메인; (g) 비-천연 자극 도메인; 및 (h) CD16으로부터 기원하지 않고, 동일한 폴리펩티드 또는 상이한 폴리펩티드로부터 기원한 막관통 도메인, 신호전달 도메인 및 자극 도메인. 특정한 실시형태에서, (a) 비-천연 막관통 도메인은 CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D, 또는 T 세포 수용체(TCR) 폴리펩티드로부터 유래되거나; (b) 비-천연 자극 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 또는 NKG2D 폴리펩티드로부터 유래되거나; (c) 비-천연 신호전달 도메인은 CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137(4-1BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 또는 NKG2D 폴리펩티드로부터 유래되거나; (d) 비-천연 막관통 도메인은 NKG2D로부터 유래되고, 비-천연 자극 도메인은 2B4로부터 유래되고, 비-천연 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다.
세포 또는 이의 집단의 다양한 실시형태에서, CAR은 하기와 같다: (i) T 세포 특이적 또는 NK 세포 특이적임; (ii) 이중특이적 항원 결합 CAR임; (iii) 스위칭가능한(switchable) CAR임; (iv) 이량체화된 CAR임; (v) 분할 CAR임; (vi) 다중-사슬 CAR임; (vii) 유도성 CAR임; (viii) 선택적으로 별개의 작제물에서 또는 바이-시스트로닉 작제물에서, 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 펩티드 또는 전체 펩티드를 포함하는 사이토카인 신호전달 복합체와 공동 발현됨; (ix) 선택적으로 별개의 작제물에서 또는 바이-시스트로닉 작제물에서 관문 억제제와 공동 발현됨; 그리고/또는 (x) 선택적으로 TRAC 또는 TRBC 좌위에서 삽입되고, 그리고/또는 TCR의 내인성 프로모터에 의해 유도되고, 그리고/또는 TCR은 CAR 삽입에 의해 녹아웃됨; 세이프 하버(safe harbor) 좌위에서 삽입됨; 또는 파괴를 목적으로 하는 유전자좌에서 삽입됨. 세포 또는 이의 집단의 다양한 실시형태에서, CAR은 (i) CD19, BCMA, B7H3, MICA/B, 또는 MR1에 특이적이고/이거나; (ii) ADGRE2, 탄산탈수효소 IX(CAIX), CCR1, CCR4, 암배아 항원(CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원, 상피 당단백질-2(EGP-2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 부착 분자(EpCAM), EGFRvIII, 수용체 티로신-단백질 키나아제 erb­B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산-결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 엽산 수용체-α, 갱글리오사이드 G2(GD2), 갱글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2), 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Rα2), κ-경쇄, 키나아제 삽입 도메인 수용체(KDR), 루이스 A(CA19.9), 루이스 Y(LeY), L1 세포 부착 분자(L1-CAM), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A 1(MAGE-A1), 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), PRAME 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 종양 관련 당단백질 72(TAG-72), TIM-3, TRBC1, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­R2), 윌름스 종양 단백질(WT-1), 및 병원성 항원 중 어느 하나에 특이적이다.
세포 또는 이의 집단의 다양한 실시형태에서, 사이토카인 신호전달 복합체는 (a) IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21, 또는 이의 각각의 수용체(들) 중 적어도 하나를 포함하는 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 또는 완전 펩티드; 또는 (b) 하기 중 적어도 하나를 포함하고; (i) 사이의 자가-절단 펩티드를 이용한 IL15 및 IL15Rα의 공동 발현; (ii) IL15와 IL15Rα의 융합 단백질; (iii) IL15Rα의 세포내 도메인이 절단된 IL15/IL15Rα 융합 단백질(IL15Δ); (iv) IL15와 IL15Rα의 막 결합된 스시(Sushi) 도메인의 융합 단백질; (v) IL15와 IL15Rβ의 융합 단백질; (vi) IL15와 공통 수용체 γC의 융합 단백질로서, 공통 수용체 γC는 천연 또는 변형된 융합 단백질; 및 (vii) IL15Rβ의 동종이량체; - 이때, (i) 내지 (vii) 중 어느 하나는 선택적으로 개별 작제물에서 또는 바이-시스트로닉 작제물에서 CAR과 공동 발현됨 -; 선택적으로, (c) 일시적으로 발현된다.
세포 또는 이의 집단의 다양한 실시형태에서, 세포는 유래 NK 또는 유래 T 세포이며, 유래 NK 세포는 T 세포를 종양 부위로 동원 및/또는 이동시킬 수 있고, 유래 NK 세포 또는 유래 T 세포는 하나 이상의 관문 억제제의 존재 하에서 종양 면역억제를 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 관문 억제제는 PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E, 또는 억제성 KIR을 포함하는 하나 이상의 관문 분자에 대한 길항제이다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 관문 억제제는 (a) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 이의 유도체 또는 기능적 균등물 중 하나 이상; 또는 (b) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 적어도 하나를 포함한다.
세포 또는 이의 집단의 다양한 실시형태에서, 세포는 (i) 하나의 세이프 하버 좌위 또는 파괴를 목적으로 하는 좌위에 통합된 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하거나; (ii) 상이한 세이프 하버 좌위 또는 파괴를 목적으로 하는 좌위에 통합된 2개 초과의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세이프 하버 좌위(들)는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, TCR 또는 RUNX1 중 적어도 하나를 포함하거나; 파괴를 목적으로 하는 유전자좌(들)는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD38, CD25, CD69, CD71, CD44, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, 또는 TIGIT를 포함한다.
세포 또는 이의 집단의 다양한 실시형태에서, CD38 컨디셔닝은 (i) 항-CD38 항체 또는 CD38에 특이적으로 결합하는 CAR(CD38-CAR)을 포함하는 CD38 길항제를 통해 이루어지고; (ii) 다라투무맙, 이사툭시맙, 또는 MOR202를 통해 이루어지고; (iii) 다라투무맙을 통해 이루어지고; (iv) 치료를 위해 세포 또는 이의 집단의 주입 전, 주입 중, 또는 주입 후 입양 세포 치료를 필요로 하는 대상체에게 CD38 길항제를 투여하는 것을 포함하고; (v) 사전로딩된 세포 또는 이의 집단의 주입 전 시험관내에서 세포 또는 이의 집단에 CD38 길항제를 사전로딩하는 것을 포함하고; (vi) 동종반응성 숙주 세포의 수를 제거하거나 감소시키고; (vii) 숙주 면역 재구성을 지연시키고; 그리고/또는 (viii) 입양 세포 치료를 필요로 하는 대상체의 동종반응성 숙주 세포의 존재 하에서 세포 또는 이의 집단의 생존과 지속성을 연장한다. 세포 또는 이의 집단의 다양한 실시형태에서, 동종반응성 숙주 세포는 (i) 세포 또는 이의 집단에 동종이계인 1차 T, B 및/또는 NK 세포를 포함하고; (ii) 세포 또는 이의 집단에 의해 CD38 컨디셔닝에 대해 감작되고; 그리고/또는 (iii) 용량 의존적 방식으로 CD38 길항제를 통한 CD38 컨디셔닝에 의해 제거된다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 CD38 길항제 및 세포 또는 이의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 다양한 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 치료제를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 치료제는 펩티드, 사이토카인, 관문 억제제, 미토겐, 성장 인자, 작은 RNA, dsRNA(이중가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 피더 세포, 피더 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 하나 이상의 관심 다중핵산을 포함하는 벡터, 항체, 화학치료제 또는 방사성 모이어티, 또는 면역조절 약물(IMiD)을 포함한다. 일부 실시형태에서, (i) 관문 억제제는 (a) PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxp1, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E, 또는 억제성 KIR을 포함하는 관문 분자에 대한 하나 이상의 길항제; (b) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 릴리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 이의 유도체 또는 기능적 균등물 중 하나 이상; (c) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 적어도 하나를 포함하거나; (ii) 치료제는 베네토클락스, 아자시티딘, 및 포말리도마이드 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 (a) 항-CD20 항체, 항-HER2 항체, 항-CD52 항체, 항-EGFR 항체, 항-CD123 항체, 항-GD2 항체, 항-PDL1 항체, 항-CD25 항체, 항-CD69 항체, 항-CD71 항체, 또는 항-CD44 항체; 또는 (b) 리툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 우블리툭시맙, 오카라투주맙, 오비누투주맙, 트라스투주맙, 퍼투주맙, 알렘투주맙, 세툭시맙, 디누툭시맙, 아벨루맙, 다클리주맙, 바실릭시맙, M-A251, 2A3, BC69, 24204, 22722, 24212, MAB23591, FN50, 298614, AF2359, CY1G4, DF1513, 비바투주맙, RG7356, G44-26, 7G3, CSL362, 엘로투주맙, 및 이의 인간화되거나 Fc 변형된 변이체 또는 단편 및 이의 기능적 균등물 및 바이오시밀러 중 하나 이상을 포함한다.
조성물의 다양한 실시형태에서, CD38 길항제는 (i) 항-CD38 항체 또는 CD38-CAR을 포함하거나; (ii) 다라투무맙, 이사툭시맙, 또는 MOR202를 포함하거나; (iii) 다라투무맙을 포함하거나; (iv) 세포 또는 이의 집단의 주입 전, 주입 중, 또는 주입 후 입양 세포 치료를 필요로 하는 대상체에게 제공된다. 다른 양태에서, 본 발명은 입양 세포 치료를 필요로 하는 대상체로의 조성물의 도입에 의한 본원에 기재된 조성물의 치료학적 용도를 제공하고, 대상체는 자가면역 장애, 혈액학적 악성종양, 고형 종양, 암, 또는 바이러스 감염을 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 입양 세포 치료를 필요로 하는 대상체에게 제공된 입양 세포 치료에서 동종이계 이펙터 세포에 대한 숙주 세포의 동종반응성을 감소시키거나 예방하는 방법을 제공하며, 동종이계 이펙터 세포는 본원에 기재된 세포 또는 이의 집단을 포함하고, 방법은 CD38 컨디셔닝을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 숙주 세포는 1차 T 세포, B 세포, 및/또는 NK 세포를 포함하는 동종반응성 면역 세포를 포함한다. 다양한 실시형태에서, CD38 컨디셔닝은 (i) 대상체에 동종이계 이펙터 세포의 주입 전, 주입 중, 주입 후 대상체에게 CD38 길항제를 투여하는 것을 포함하거나; (ii) 대상체에 동종이계 이펙터 세포의 주입 전 시험관내에서 동종이계 이펙터 세포에 CD38 길항제를 사전로딩하는 것을 포함하며; CD38 컨디셔닝은 (a) 동종반응성 숙주 세포의 수를 제거하거나 감소시키고; (b) 소정 용량의 CD38 길항제에 의해 제어가능한 정도로 동종이계 이펙터 세포의 생존 및 지속성을 연장시키고; 그리고/또는 (c) 숙주 면역 재구성을 지연시킨다. 일부 실시형태에서, CD38 길항제는 (i) 항-CD38 항체 또는 CD38-CAR; (ii) 다라투무맙, 이사툭시맙, 또는 MOR202; 및/또는 (iii) 다라투무맙을 포함한다. 일부 실시형태에서, 동종반응성 숙주 세포는 상향조절된 CD38 발현을 포함한다.
입양 세포 치료에서 동종이계 이펙터 세포에 대한 숙주 세포의 동종반응성의 감소 또는 예방 방법의 다양한 실시형태에서, 방법은 대상체에 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료제는 펩티드, 사이토카인, 관문 억제제, 미토겐, 성장 인자, 작은 RNA, dsRNA(이중가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 피더 세포, 피더 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 관심대상의 하나 이상의 폴리핵산을 포함하는 벡터, 항체, 화학치료제 또는 방사성 모이어티 또는 면역조절 약물(IMiD)을 포함한다. 특정 실시형태에서, (i) 관문 억제제는 (a) PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxp1, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, 레티노산 수용체 알파(Rara), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E, 또는 억제성 KIR을 포함하는 관문 분자에 대한 하나 이상의 길항제; (b) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 릴리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 이의 유도체 또는 기능적 균등물 중 하나 이상; 또는 (c) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 적어도 하나를 포함하거나; (ii) 치료제는 베네토클락스, 아자시티딘 및 포말리도마이드 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 시클로포스파미드와 플루다라빈(Cy/Flu)의 조합을 이용한 림프구 제거가 없거나 이를 최소한으로 필요로 한다. 일부 실시형태에서, 방법은 Cy/Flu을 이용한 림프구 고갈(lymphodepletion)을 포함하지 않는다.
다른 양태에서, 본 발명은 입양 세포 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법을 제공하며, 방법은 CD38 컨디셔닝을 위해 대상체에게 CD38 길항제를 투여하는 것 및 본원에 기재된 세포 또는 이의 집단을 주입하는 것을 포함한다. 다양한 실시형태에서, CD38 컨디셔닝은 (i) 동종이계 이펙터 세포에 대해 숙주 세포의 동종반응성을 감소시키거나 방지하고; (ii) 동종반응성 숙주 세포의 수를 제거하거나 감소시키고; (iii) 동종이계 이펙터 세포의 생존 및 지속성을 연장하고; (iv) 숙주 면역 재구성을 지연시키고; (v) HLA-G 또는 HLA-E의 과발현을 통해 숙주 세포의 동종반응성에 대한 동종이계 이펙터 세포의 보호의 누출(leaking)을 방지하고; 그리고/또는 (vi) 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD) 이용가능성을 증가시키고, 세포 사멸과 관련된 NAD 소비를 감소시키고, 세포 역노화(rejuvenation)를 지지한다. 일부 실시형태에서, 방법은 시클로포스파미드와 플루다라빈(Cy/Flu)의 조합을 이용한 림프구 제거가 없거나 이를 최소한으로 필요로 한다. 일부 실시형태에서, 방법은 Cy/Flu을 이용한 림프구 고갈을 포함하지 않는다.
본원에 제공된 것과 같은 조성물 및 방법의 다양한 목적 및 이점은, 본 발명의 특정한 실시형태를 예시 및 실시예의 방식으로 기재한 첨부 도면과 함께 취해져 하기 설명으로부터 명확해질 것이다.
도 1a는 B2M WT와 B2M KO 이펙터 세포주 사이의 표현형 유사성을 보여준다. 도 1b는 B2M WT와 B2M KO 이펙터 세포주 사이의 유사한 수준의 항체 의존성 세포 독성을 보여준다.
도 2a는 iNK 세포가 유세포분석법에 의해 모든 조작된 요소에 대해 성공적으로 조작되었고, 평가되었다는 것을 보여준다. 도 2b는 HLA-I 및 HLA-II 결핍(dKO)이 동종이계 T 세포 반응성에 대해 보호성이라는 것을 보여준다.
도 3은 억제성 리간드 과발현이 NK 세포의 모든 하위세트에 대해 보호하지 않고, NK 세포의 하위세트가 CD47 및 HLA-E 신호전달을 포함하는 억제성 경로에 내성이라는 것을 보여준다.
도 4는 항-CD38 항체 컨디셔닝에 의해 매개된 이펙터 세포에 대한 보호성 효과와 pbNK에 의한 B2M KO 이펙터 세포주의 인식을 보여준다.
도 5a 및 도 5b는 항-CD38 항체 컨디셔닝이 iNK 세포를 시험관내 pbNK 동종 거부로부터 보호한다는 것을 보여준다. 좌측에서 우측으로의 막대 그룹은 각각 상부에서 하부의 범례로 표시된다.
도 6a 및 도 6b는 단독 배양된, 그리고 동종이계 iNK 세포로 프라이밍된 후 배양된 공여자 PBMC의 CD38 발현 수준을 보여준다.
도 7a 및 도 7b는 동종이계 숙주 세포(PBMC)에 대한 iPSC-유래된 B2M KO 세포의 감응성에 대한 항-CD38 항체 컨디셔닝의 용량 의존성 효과를 보여준다.
도 8a 내지 도 8f는 CD38 및 B2M에서 결핍인 iNK 세포가 시험관내에서 동종이계 T 세포 및 NK 세포 공격에 내성을 갖는다는 것을 보여준다.
도 9a 내지 도 9d는 B2M KO 및 항-CD38 항체 컨디셔닝이 활성화된 PBMC 시그니처를 iNK 세포와의 공동 배양물에서 약화시킨다는 것을 보여준다.
도 10a 내지 도 10c는 B2M/CIITA dKO의 조합을 갖는 세포에 대한 예시적인 결과를 보여준다.
도 11a 및 도 11b는 iT 세포에서의 CD38 녹아웃이, 말초혈 NK 세포와 조합될 때 항-CD38 ADCC를 제거한다는 것을 보여준다.
도 12는 항-CD38 항체 컨디셔닝이, NSG-IL15 형질전환 마우스 모델에서 pbNK 세포를 효과적으로 고갈시킨다는 것을 보여준다.
도 13a 내지 도 13e는 IL15 형질전환 NSG 마우스를 사용하여 항-CD38 항체가 생체내에서 pbNK 동종 거부로부터 iNK 세포를 보호한다는 것을 보여준다. 도 13a는 항-CD38 항체와 함께 또는 항체 없이 단독으로 주입된 경우의 순환 중의 pbNK 수준을 보여주는 한편, 도 13b는 pbNK 없이 주입된 경우의 순환 중의 WT, B2M KO, 및 B2M/CIITA dKO iNK 수준을 보여준다. 도 13c는 다라투무맙의 존재 및 부재 하에 pbNK와 동시 주입된 경우의 순환 중의 WT iNK 수준을 보여준다. 도 13d는 다라투무맙의 존재 및 부재 하에 pbNK와 동시 주입된 경우의 순환 중의 B2M KO iNK 수준을 보여준다. 도 13e는 다라투무맙의 존재 및 부재 하에 pbNK와 동시 주입된 경우의 순환 중의 B2M/CIITA KO iNK 수준을 보여준다. (n = 그룹당 5마리의 마우스; P 값 * < 0.05, ** <0.001, **** < 0.0001).
도 14a 내지 도 14c는 pbNK 수가 다라투무맙의 존재 하에서 유의하게 감소되어, IL15 형질전환 NSG 마우스의 혈액, 비장 및 골수에서 B2M KO 및 B2M/CIITA KO iNK가 지속된다는 것을 보여준다. 세포 수는 다라투무맙 없음 그룹으로 정규화되었다(그룹당 n = 5마리의 마우스; P 값 * < 0.05, ** <0.001, **** < 0.0001).
도 15는 림프구 고갈 화학요법(LDC: lympho-depleting chemotherapy)에 항-CD38 항체를 부가하면 다라투무맙과 조합하여 조작된 CD38KO hnCD16 iNK 세포로 치료된 환자에서 숙주 면역 재구성이 지연되고, 입양 세포 치료에 대한 기회의 창을 연장시킨다는 것을 보여준다.
도 16은 조작된 iNK 세포를 다라투무맙과 조합하여 치료된 1명의 대상체에서 림프구 프로파일의 균일 매니폴드 근사화 및 프로젝션(UMAP: Uniform Manifold Approximation and Projection) 시각화를 보여준다.
iPSC(유도 만능성 줄기 세포)의 게놈 변형은 폴리뉴클레오티드 삽입, 결실 및 치환을 포함한다. 게놈 조작된 iPSC에서의 외인성 유전자 발현은 대개 원래의 게놈 조작된 iPSC의 연장된 클론 확장 후, 세포 분화 후 및 게놈 조작된 iPSC로부터 유래된 세포로부터 탈분화된 세포 유형에서 유전자 사일런싱 또는 유전자 발현 감소와 같은 문제점에 직면한다. 다른 한편, T 세포 또는 NK 세포와 같은 1차 면역 세포의 직접적인 조작은 도전적이고, 입양 세포 치료를 위해 조작된 면역 세포의 제조 및 전달에 대한 어려움을 나타낸다. 다양한 실시형태에서, 본 발명은 자살 유전자 및 다른 기능성 모달리티를 포함하는 하나 이상의 외인성 유전자를 안정적으로 통합시키기 위한 효율적이고, 실현가능하고, 표적화된 접근법을 제공하며, 이는 HSC(조혈 줄기 및 전구 세포), T 세포 전구 세포, NK 세포 전구 세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 iPSC 유래 세포에 생착, 수송, 호밍, 이동, 세포독성, 생존력, 유지, 확장, 수명, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존과 관련된 개선된 치료 특성을 제공한다.
정의
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 연결되어 사용된 과학 용어 및 기술 용어는 당업자가 흔히 이해하는 의미를 가지는 것으로 한다. 추가로, 맥락에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하며, 복수 용어는 단수를 포함하는 것으로 한다.
본 발명이 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등으로 제한되지 않고, 이에 변할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 용어는 오직 특정 실시형태를 기재할 목적을 위한 것이고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않고, 이는 청구항에 의해 오로지 한정된다.
본원에서 사용된 관사("a", "an" 및 "the")는 본원에서 그 관사의 문법상 목적어의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭하도록 사용된다. 예로서, "요소(an element)"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
대안(예를 들어, "또는")의 사용은 대안의 하나, 둘 모두, 또는 임의의 이들의 조합 중 어느 하나를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
"및/또는"이라는 용어는 대안의 하나 또는 둘 모두 중 어느 하나를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 사용된, 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 비교하여 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%만큼 변하는 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시형태에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2% 또는 ± 1%의 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 범위를 지칭한다.
본원에서 사용된, 용어 "실질적으로" 또는 "본질적으로"는 기준 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 비교하여 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시형태에서, 용어 "본질적으로 동일한" 또는 "실질적으로 동일한"은 기준 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 대략 동일한 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 범위를 지칭한다.
본원에서 사용된, 용어 "실질적으로 없는" 및 "본질적으로 없는"은 상호교환가능하고, 세포 집단 또는 배양 배지와 같은 조성을 기재하도록 사용될 때, 특정 물질 또는 이의 공급원이 없는, 예컨대 특정 물질 또는 이의 공급원이 95% 없거나, 96% 없거나, 97% 없거나, 98% 없거나, 99% 없거나, 종래의 수단에 의해 측정된 것처럼 검출 불가능한 조성을 지칭한다. 조성에서 특정 성분 또는 물질이 "없는" 또는 "본질적으로 없는"이라는 용어는 또한 이러한 성분 또는 물질이 (1) 임의의 농도로 조성에 포함되지 않거나, (2) 기능적으로 불활성이고 낮은 농도로 조성에 포함됨을 의미한다. 유사한 의미는 "부재"라는 용어에 적용될 수 있으며, 조성의 특정 물질 또는 이의 공급원의 부재를 지칭한다.
본 명세서에 전반에 걸쳐, 맥락이 달리 요구하지 않는 한, "포함한다", "포함한" 및 "포함하는"이라는 단어는 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소의 그룹의 배제가 아니라 기술된 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소의 그룹의 포함을 함축하는 것으로 이해될 것이다. 특정 실시형태에서, "포함한다(include)", "갖는다", "함유한다" 및 "포함한다(comprise)"라는 용어는 동의어로 사용된다.
"이루어진"이란, "이루어진"이라는 구절에 뒤따르는 어떤 것이든 이것을 포함하고, 이에 제한되는 것을 의미한다. 이와 같이, "~로 이루어진"이라는 구절은 열거된 요소가 필요하거나 의무적이고, 다른 요소가 존재하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다.
"~로 본질적으로 이루어진"이란, 그 구절 뒤에 열거된 임의의 요소를 포함하고, 열거된 요소에 대해 개시내용에 기재된 활성 또는 작용과 상호작용하지 않거나 이에 기여하지 않는 다른 요소로 제한됨을 의미한다. 이와 같이, "~로 본질적으로 이루어진"이라는 구절은 열거된 요소가 필요하거나 의무적이지만, 다른 요소가 선택적이지 않고, 열거된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치는 여부에 따라 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다.
본 명세서에 전반에 걸쳐 "하나의 실시형태", "일 실시형태", "특정 실시형태", "관련된 실시형태", "특정한 실시형태", "추가의 실시형태" 또는 "추가 실시형태" 또는 이들의 조합에 대한 언급은 그 실시형태와 연관되어 기재된 특정한 특성, 구조 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다. 이와 같이, 본 명세서에 전반에 걸쳐 다양한 위치에서의 상기의 구절의 출현은 반드시 모두가 동일한 실시형태를 지칭하는 것은 아니다. 더욱이, 하나 이상의 실시형태에서 임의의 적합한 방식으로 특정한 특성, 구조 또는 특징이 조합될 수 있다.
"생체외"라는 용어는 일반적으로 바람직하게는 자연 조건의 최소 변경으로 유기체 밖의 인공 환경에서 살아 있는 조직에서 또는 상에서 수행된 실험 또는 측정과 같은 유기체 밖에서 발생하는 활성을 지칭한다. 특정 실시형태에서, "생체외" 절차는 보통 멸균 조건 하에 통상적으로 수 시간 또는 최대 약 24시간 동안이지만 상황에 따라 48시간 또는 72시간 또는 더 긴 기간 동안 유기체로부터 취하고 실험실 장치에서 배양된 살아 있는 세포 또는 조직을 수반한다. 특정한 실시형태에서, 상기 조직 또는 세포는 생체외 처리를 위해 수집되고 동결되고 나중에 해동될 수 있다. 살아 있는 세포 또는 조직을 사용하여 수 일보다 길게 지속하는 조직 배양 실험 또는 절차는 통상적으로 "시험관내"인 것으로 여겨지지만, 특정한 실시형태에서, 이러한 용어는 생체외와 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
"생체내"라는 용어는 일반적으로 유기체 내에서 발생하는 활성을 지칭한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "재프로그래밍" 또는 "탈분화" 또는 "세포 능력의 증가" 또는 "발생 능력의 증가"는 세포의 능력을 증가시키거나 세포를 덜 분화된 상태로 탈분화시키는 방법을 지칭한다. 예를 들어, 세포 능력이 증가된 세포는 재프로그래밍되지 않은 상태의 동일한 세포와 비교하여 발생의 가소성이 더 높다(즉, 더 많은 세포 유형으로 분화할 수 있음). 달리 말하면, 재프로그래밍된 세포는 재프로그래밍되지 않은 상태의 동일한 세포보다 덜 분화된 상태로 있는 것이다.
본원에 사용된, 용어 "분화"는 비특수화된("비결정된") 세포 또는 덜 특수화된 세포가 예를 들어 혈액 세포 또는 근육 세포와 같은 특수화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 세포 또는 분화 유도된 세포는 세포의 계통 내에 보다 특수화된("결정된") 위치에서 취해진 것이다. 용어 "결정된(committed)"은 분화의 과정에 적용될 때, 정상 상황 하에서 이것이 특정 세포 유형 또는 세포 유형의 하위세트로 계속해서 분화할 것이고, 정상 상황 하에서 상이한 세포 유형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포 유형으로 되돌아갈 수 없는 지점으로 분화 경로에서 진행된 세포를 지칭한다. 본원에서 사용된, 용어 "만능(pluripotent)"은 신체 또는 체세포(즉, 고유배)의 모든 계통을 형성하는 세포의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 배아 줄기 세포는 외배엽, 중배엽 및 내배엽의 3개의 배엽의 각각으로부터 세포를 형성할 수 있는 만능성 줄기 세포의 유형이다. 만능성은 완전한 유기체를 생성할 수 없는 불완전하게 또는 부분적으로 만능인 세포(예를 들어, 외배반 줄기 세포 또는 EpiSC)로부터 완전한 유기체(예를 들어, 배아 줄기 세포)를 생성할 수 있는 보다 원시인, 보다 만능인 세포에 이르는 발생 능력의 연속체이다.
본원에서 사용된, 용어 "유도 만능성 줄기 세포" 또는 "iPSC"는 중배엽, 내배엽 및 외배엽의 모든 3개의 배엽 또는 진피 층의 조직으로 분화할 수 있는 세포로 유도되거나 변경된, 즉 재프로그래밍된, 분화된 성체, 신생아 또는 태아 세포로부터, 재프로그래밍 인자 및/또는 소분자 화학 유도 방법을 사용하여 시험관내에서 생성되는 줄기 세포를 지칭한다. 생성된 iPSC는 자연계에 존재하는 세포를 지칭하지 않는다.
본원에서 사용된, 용어 "배아 줄기 세포"는 배아 배반포의 내부 세포 덩어리의 자연 발생 만능성 줄기 세포를 지칭한다. 배아 줄기 세포는 만능성이고, 발생 동안 외배엽, 내배엽 및 중배엽이라는 3개의 주요 배엽의 모든 유래물을 생성한다. 이들은 배아외막 또는 태반에 기여하지 않는다(즉, 전능성이 아니다).
본원에서 사용된, 용어 "다능성 줄기 세포"는 하나 이상의 배엽(즉, 외배엽, 중배엽 및 내배엽)의 세포로 분화하지만, 3가지 모두로 분화하는 것은 아닌 발생 능력을 갖는 세포를 지칭한다. 이에 따라, 다능성 세포는 "부분적으로 분화된 세포"라고 지칭할 수도 있다. 다능성 세포는 당업계에 잘 알려져 있고, 다능성 세포의 예는 예를 들어 조혈 줄기 세포 및 신경 줄기 세포와 같은 성체 줄기 세포를 포함한다. "다능성"은 세포가 소정의 계통에서의 세포의 많은 유형을 형성할 수 있으나, 다른 계통의 세포는 형성할 수 없다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 다능성 조혈 세포는 많은 상이한 유형의 혈액 세포(적혈구, 백혈구, 혈소판 등)를 형성할 수 있지만, 이것은 뉴런을 형성하지 않을 수 있다. 따라서, 용어 "다능성"은 전능성 및 만능성보다 더 적은 발생 능력 정도를 갖는 세포 상태를 지칭한다.
만능성은 세포의 만능성 특징을 평가하여 부분적으로 결정될 수 있다. 만능성 특징은 (i) 만능성 줄기 세포 형태; (ii) 비제한된 자가 재생에 대한 능력; (iii) 비제한적으로 SSEA1(마우스 단독), SSEA3/4, SSEA5, TRA1-60/81, TRA1-85, TRA2-54, GCTM-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133/프로미닌, CD140a, CD56, CD73, CD90, CD105, OCT4, NANOG, SOX2, CD30 및/또는 CD50을 포함하는 만능성 줄기 세포 마커의 발현; (iv) 모든 3개의 체세포 계통(외배엽, 중배엽 및 내배엽)으로 분화시키는 능력; (v) 3개의 체세포 계통으로 이루어진 사합체 형성; 및 (vi) 3개의 체세포 계통으로부터의 세포로 이루어진 배양체의 형성을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
이전에 후기 배반포의 외배반 줄기 세포(EpiSC)와 유사한 만능성의 "프라이밍된" 또는 "준안정" 상태, 및 초기/착상전 배반포의 내부 세포 덩어리와 유사한 만능성의 "나이브" 또는 "그라운드" 상태의 2가지 유형의 만능성이 기재되어 있다. 두개의 만능 상태 모두가 상기 기재된 것과 같은 특징을 나타내지만, 나이브 또는 그라운드 상태는 (i) 암컷 세포에서의 X-염색체의 사전활성화 또는 재활성화; (ii) 단일 세포 배양 동안 개선된 클론성 및 생존; (iii) DNA 메틸화의 전반적 감소; (iv) 발생 조절 유전자 프로모터에서 H3K27me3 억제 염색질 마크 침착의 감소; 및 (v) 프라이밍된 상태의 만능성 세포에 대한 분화 마커의 발현 감소를 추가로 나타낸다. 외인성 만능성 유전자가 체세포에 도입되고, 발현된 후, 수득된 만능성 세포로부터 사일런싱되거나 제거된 세포 프로그래밍의 표준 방법은 일반적으로 만능성의 프라이밍된 상태의 특징을 갖는 것으로 보인다. 표준 만능성 세포 배양 조건 하에서, 상기 세포는, 외인성 전이유전자 발현이 유지되지 않는 한, 프라이밍된 상태로 남아있고, 그라운드 상태의 특징이 관찰된다.
본원에서 사용된, 용어 "만능성 줄기 세포 형태"는 배아 줄기 세포의 전통적인 형태학적 특징을 지칭한다. 정상 배아 줄기 세포 형태는 높은 핵-대-세포질 비로 형상이 원형이고 소형이라는 것, 핵소체가 현저하게 존재한다는 것, 및 통상적인 세포간 간격이 있다는 것을 특징으로 한다.
본원에서 사용된, 용어 "대상체"는 임의의 동물, 바람직하게는 인간 환자, 가축 또는 다른 사육동물을 지칭한다.
"만능성 인자" 또는 "재프로그래밍 인자"는 단독으로 또는 다른 약제와 조합되어 세포의 발생 능력을 증가시킬 수 있는 약제를 지칭한다. 만능성 인자는 비제한적으로 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 세포의 발생 능력을 증가시킬 수 있는 소분자를 포함한다. 예시적인 만능성 인자는 예를 들어 전사 인자 및 소분자 재프로그래밍제를 포함한다.
"배양" 또는 "세포 배양"은 시험관내 환경에서의 세포의 유지, 성장 및/또는 분화를 지칭한다. "세포 배양 배지", "배양 배지"(각각의 경우, 단수형 "배지"), "보충제" 및 "배지 보충제"는 세포 배양물을 배양하는 영양적 조성물을 지칭한다.
"배양한다" 또는 "유지한다"는 예를 들어 멸균 플라스틱(또는 코팅된 플라스틱) 세포 배양 디쉬 또는 플라스크에서 조직 또는 신체의 밖에서 세포를 지속, 전파(성장), 및/또는 분화시키는 것을 지칭한다. "배양" 또는 "유지"는 영양소, 호르몬 및/또는 세포를 전파시키고/시키거나 지속시키는 것을 돕는 다른 인자의 공급원으로서 배양 배지를 사용할 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "중배엽"은 초기 배아발생 동안 생기고, 순환계의 혈액 세포, 근육, 심장, 진피, 골격, 및 다른 지지 조직 및 결합 조직을 포함하는 다양한 특수화된 세포 유형을 생성시키는 3개의 배엽 중 하나를 지칭한다.
본원에서 사용된, 용어 "한정적 동형유전자성 내피세포"(HE) 또는 "만능성 줄기 세포-유래된 한정적 동형유전자성 내피세포"(iHE)는 내피-조혈 전환(endothelial-to-hematopoietic transition)으로 지칭된 과정에서 조혈 줄기 세포 및 전구 세포를 생성시키는 내피 세포의 하위세트를 지칭한다. 배아에서의 조혈 세포의 발생은 측판 중배엽으로부터 혈관아세포를 통해 한정적 동형유전자성 내피세포 및 조혈 전구 세포로 순차적으로 진행한다.
용어 "조혈 줄기 세포 및 전구 세포", "조혈 줄기 세포", "조혈 전구 세포" 또는 "조혈 전구체 세포"는 조혈 계통에 대해 결정되지만 추가의 조혈 분화를 할 수 있는 세포를 지칭하고, 다능성 조혈 줄기 세포(조혈세포), 골수성 전구 세포, 거핵세포 전구 세포, 적혈구 전구 세포 및 림프구성 전구 세포를 포함한다. 조혈 줄기 세포 및 전구 세포(HSC)는 골수성 계통(단핵구 및 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 거핵세포/혈소판, 수지상 세포), 및 림프구성 계통(T 세포, B 세포, NK 세포)을 포함하는 모든 혈액 세포 유형을 생성시키는 다능성 줄기 세포이다. 본원에서 사용된, 용어 "한정적 조혈 줄기 세포"는 T계 세포, NK계 세포 및 B계 세포를 포함하는 성숙 골수성 세포 및 림프구성 세포 유형 둘 모두를 생성할 수 있는 CD34+ 조혈 세포를 지칭한다. 조혈 세포는 또한 원시 적혈구, 거핵세포 및 대식세포를 생성하는 원시 조혈 세포의 다양한 하위세트를 포함한다.
본원에서 사용된, 용어 "T 림프구"와 "T 세포"는 상호교환가능하게 사용되고, 흉선에서 성숙을 완료하고 MHC 클래스 I-제한 방식으로 신체에서의 특정 외래 항원의 확인 및 다른 면역 세포의 활성화 및 탈활성화를 포함하는 면역계에서 다양한 역할을 갖는 백혈구의 주요 유형을 지칭한다. T 세포는 임의의 T 세포, 예컨대 배양된 T 세포, 예를 들어 1차 T 세포, 또는 배양된 T 세포주로부터의 T 세포, 예를 들어 Jurkat, SupT1 등, 또는 포유동물로부터 얻은 T 세포일 수 있다. T 세포는 CD3+ 세포일 수 있다. T 세포는 임의의 유형의 T 세포일 수 있고, CD4+/CD8+ 이중 양성 T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포(예를 들어, Th1 및 Th2 세포), CD8+ T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포), 말초혈 단핵 세포(PBMC), 말초혈 백혈구(PBL), 종양 침윤 림프구(TIL), 기억 T 세포, 나이브 T 세포, 조절 T 세포, 감마 델타 T 세포(γδ T 세포) 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 임의의 발생 단계를 가질 수 있다. 헬퍼 T 세포의 추가의 유형은 Th3(Treg), Th17, Th9 또는 Tfh 세포와 같은 세포를 포함한다. 기억 T 세포의 추가의 유형은 중앙 기억 T 세포(Tcm 세포), 이펙터 기억 T 세포(Tem 세포 및 TEMRA 세포)와 같은 세포를 포함한다. 용어 "T 세포"는 또한 유전자 조작된 T 세포, 예컨대 T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키도록 변형된 T 세포를 지칭할 수 있다. T 세포 또는 T 세포 유사 이펙터 세포는 또한 줄기 세포 또는 전구 세포("유래된 T 세포" 또는 "유래된 T 세포 유사 이펙터 세포", 또는 집합적으로 "유래 T계 세포")로부터 분화될 수 있다. 유래된 T 세포 유사 이펙터 세포는 어떤 면에서 T 세포 계통을 가질 수 있지만, 동시에 1차 T 세포에 존재하지 않는 하나 이상의 기능적 특징을 갖는다. 본 명세서에서, T 세포, T 세포 유사 이펙터 세포, 유래된 T 세포, 유래된 T 세포 유사 이펙터 세포, 또는 유래 T계 세포는 집합적으로 "T계 세포"로 지칭된다.
"CD4+ T 세포"는 이의 표면 상에 CD4를 발현하고, 세포-매개된 면역 반응과 관련되어 있는 T 세포의 하위세트를 지칭한다. 이는 사이토카인, 예컨대 IFN-감마, TNF-알파, IL2, IL4 및 IL10의 분비를 포함할 수 있는, 자극 이후의 분비 프로파일을 특징으로 한다. "CD4" 분자는 원래 T 림프구 상에서 분화 항원으로 정의되지만, 단핵구/대식세포를 포함하는 다른 세포 상에서 또한 발견되는 55 kD 당단백질이다. CD4 항원은 면역글로불린 슈퍼유전자 패밀리의 구성원이고, MHC(주요 조직적합성 복합체) 클래스 II-제한된 면역 반응에서 관련 인식 요소로 관여하고 있다. 이는 T 림프구에서 헬퍼/유도제 하위세트를 정의한다.
"CD8+ T 세포"는 이의 표면 상에 CD8을 발현하고, MHC 클래스 I-제한되고, 세포독성 T 세포로서 작용하는 T 세포의 하위세트를 지칭한다. "CD8" 분자는 흉선세포 및 세포독성 및 억제자 T-림프구 상에서 발견된 분화 항원이다. CD8 항원은 면역글로불린 슈퍼유전자 패밀리의 구성원이고, 주요 조직적합성 복합체 클래스 I-제한된 상호작용에서 관련 인식 요소이다.
본원에서 사용된, 용어 "NK 세포" 또는 "자연 살해 세포"는 CD56 또는 CD16의 발현 및 T 세포 수용체(CD3)의 부재에 의해 정의된 말초혈 림프구의 하위세트를 지칭한다. NK 세포는 임의의 NK 세포, 예컨대 배양된 NK 세포, 예를 들어 1차 NK 세포, 또는 배양되거나 확장된 NK 세포 유래의 NK 세포 또는 세포주 NK 세포, 예를 들어 NK-92, 또는 건강하거나 질환 병태를 갖는 포유동물로부터 획득된 NK 세포일 수 있다. 본원에서 사용된, 용어 "적응성 NK 세포" 및 "기억 NK 세포"는 상호교환가능하고, NKG2C 및 CD57 중 적어도 하나, 및 선택적으로 CD16을 발현하는 표현형적으로 CD3- 및 CD56+이지만, PLZF, SYK, FceRγ 및 EAT-2 중 하나 이상의 발현이 결여된 NK 세포의 하위세트를 지칭한다. 일부 실시형태에서, CD56+ NK 세포의 단리된 하위집단은 CD16, NKG2C, CD57, NKG2D, NCR 리간드, NKp30, NKp40, NKp46, 활성화 및 억제성 KIR, NKG2A 및/또는 DNAM-1의 발현을 포함한다. CD56+는 흐린(dim) 발현 또는 밝은(bright) 발현일 수 있다. NK 세포, 또는 NK 세포 유사 이펙터 세포는 줄기 세포 또는 전구 세포("유래된 NK 세포" 또는 "유래된 NK 세포 유사 이펙터 세포", 또는 집합적으로 "유래 NK계 세포")로부터 분화될 수 있다. 유래 NK 세포 유사 이펙터 세포는 어떤 면에서 NK 세포 계통을 가질 수 있지만, 동시에 1차 NK 세포에 존재하지 않는 하나 이상의 기능적 특징을 갖는다. 본 출원에서, NK 세포, NK 세포 유사 이펙터 세포, 유래된 NK 세포, 유래된 NK 세포 유사 이펙터 세포, 또는 유래 NK계 세포는 집합적으로 "NK계 세포"로 지칭된다.
본원에서 사용된, 용어 "NKT 세포" 또는 "자연 살해 T 세포"는 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 CD1d-제한된 T 세포를 지칭한다. NKT 세포는 종래의 주요 조직적합성(MHC) 분자에 의해 제시된 펩티드 항원을 검출하는 종래의 T 세포와 달리, 비-전통적 MHC 분자인 CD1d에 의해 제시된 지질 항원을 인식한다. 2가지 유형의 NKT 세포가 알려져 있다. 비변이체 또는 I형 NKT 세포는 매우 제한된 TCR 레퍼토리, 즉 β 사슬(인간에서의 Vβ11)의 제한된 스펙트럼과 회합된 정규적 α-사슬(인간에서의 Vα24-Jα18)을 발현한다. 비-전통적 또는 비-비변이체 II형 NKT 세포라 불리는 NKT 세포의 제2 집단은 더 이종성인 TCR αβ 용법을 나타낸다. I형 NKT 세포는 면역요법에 적합하다고 간주된다. 적응 또는 비변이체(I형) NKT 세포는 하기 마커, TCR Va24-Ja18, Vb11, CD1d, CD3, CD4, CD8, aGalCer, CD161 및 CD56 중 하나 이상의 발현에 의해 확인될 수 있다.
용어 "이펙터 세포"는 일반적으로 자극 및/또는 활성화, 또는 활성화 시 특정 기능에 영향을 주는 세포에 대한 반응으로 특정 활동을 수행하는 면역계의 특정한 세포에 적용된다. 본원에서 사용된, 용어 "이펙터 세포"는 일부 맥락에서 상호교환가능한, 자극 및/또는 활성화에 대한 반응으로 특정 활성을 수행하기 위해 편집 및/또는 조절되는, 면역 세포, "분화된 면역 세포" 및 1차 또는 분화된 세포를 포함한다. 이펙터 세포의 비제한적인 예는 1차-공급 또는 iPSC-유래된 T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 및 호중구를 포함한다.
본원에서 사용된, 용어 "단리된" 등은 이의 원래의 환경으로부터 분리된 세포 또는 세포의 집단을 지칭하고, 즉 단리된 세포의 환경은 "비단리된" 기준 세포가 존재하는 환경에서 발견되는 적어도 하나의 성분이 실질적으로 없다. 용어는 세포가 이의 자연 환경에서 발견되면서, 예를 들어 조직 또는 생검 샘플로부터 단리되면서 일부 또는 모든 성분으로부터 제거되는 세포를 포함한다. 용어는 세포가 비자연 발생 환경에서 발견되면서, 예를 들어 세포 배양물 또는 세포 현탁액으로부터 단리되면서 적어도 하나의, 일부 또는 모든 성분으로부터 제거되는 세포를 또한 포함한다. 따라서, "단리된 세포"는 세포가 자연계에 존재하면서 또는 비자연 발생 환경에서 성장하거나 저장되거나 존속하면서 다른 물질, 세포 또는 세포 집단을 포함하는 적어도 하나의 성분으로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된다. 단리된 세포의 특정 예는 부분적으로 순수한 세포 조성, 실질적으로 순수한 세포 조성 및 비자연 발생인 배지에서 배양된 세포를 포함한다. 환경에서 다른 물질 또는 세포로부터 목적하는 세포, 또는 이의 집단을 분리하여, 또는 환경으로부터 하나 이상의 다른 세포 집단 또는 하위집단을 제거하여 단리된 세포를 얻을 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "정제한다" 등은 순도의 증가를 지칭한다. 예를 들어, 순도는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%까지 증가할 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "인코딩하는"은 뉴클레오티드(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 정의된 서열 또는 아미노산의 정의된 서열 중 어느 하나를 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드에서의 뉴클레오티드의 특정 서열의 고유한 특성 및 이로부터 생긴 생물학적 특성을 지칭한다. 이에 따라, 유전자는 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 상기 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 단백질을 생산하는 경우 단백질을 인코딩한다. 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용된, 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고, 통상적으로 서열 목록으로 제공되는 코딩 가닥, 및 비-코딩 가닥 둘 모두는 상기 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 산물을 "인코딩"한다고 지칭될 수 있다.
"작제물"은 시험관내 또는 생체내 중 어느 하나로 숙주 세포에 전달되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 거대분자 또는 분자 복합체를 지칭한다. 본원에서 사용된, "벡터"는 이것이 복제되고/되거나 발현될 수 있는 표적 세포에 대한 외래 유전 물질의 전달 또는 이동을 지시할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 지칭한다. 따라서, 용어 "벡터"는 전달될 작제물을 포함한다. 벡터는 선형 분자 또는 원형 분자일 수 있다. 벡터는 통합 또는 비통합일 수 있다. 벡터의 주요 유형은 플라스미드, 에피솜 벡터, 바이러스 벡터, 코스미드 및 인공 염색체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"통합"이란 작제물의 하나 이상의 뉴클레오티드가 세포 게놈으로 안정하게 삽입되는, 즉 세포의 염색체 DNA 내에 핵산 서열에 공유 연결된다는 것을 의미한다. "표적화된 통합"이란 작제물의 뉴클레오티드(들)가 미리-선택된 부위 또는 "통합 부위"에서 세포의 염색체 또는 미토콘드리아 DNA에 삽입되는 것을 의미한다. 본원에서 사용된, 용어 "통합"은 통합 부위에서의 내인성 서열 또는 뉴클레오티드의 결실과 함께 또는 이것 없이, 작제물의 하나 이상의 외인성 서열 또는 뉴클레오티드의 삽입을 수반하는 과정을 추가로 지칭한다. 삽입 부위에서 결실이 있는 경우, "통합"은 하나 이상의 삽입된 뉴클레오티드가 결실되어 있는 내인성 서열 또는 뉴클레오티드의 대체를 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "외인성"은 기준 분자 또는 기준 활성이 숙주 세포에 도입되거나, 이에 대해 비-천연이라는 것을 의미하도록 의도된다. 예를 들어, 숙주 유전 물질로의 인코딩 핵산의 도입에 의해, 예컨대 숙주 염색체로의 통합에 의해 또는 플라스미드와 같은 비염색체 유전 물질로서 분자가 도입될 수 있다. 따라서, 인코딩 핵산의 발현과 관련하여 사용되는 이 용어는 발현가능한 형태의 인코딩 핵산의 세포로의 도입을 지칭한다. 용어 "내인성"은 숙주 세포에 존재하는 기준 분자 또는 활성을 지칭한다. 유사하게, 인코딩 핵산의 발현과 관련하여 사용된 경우 용어는 외인성으로 도입되지 않고 세포 내에 함유된 인코딩 핵산의 발현을 지칭한다.
본원에서 사용된, "관심 유전자" 또는 "관심 폴리뉴클레오티드 서열"은 RNA로 전사되고 일부 경우에 적절한 조절 서열의 제어 하에 위치할 때 생체내 폴리펩티드로 번역되는 DNA 서열이다. 관심 유전자 또는 관심 폴리뉴클레오티드는 원핵 서열, 진핵 mRNA로부터의 cDNA, 진핵(예를 들어, 포유류) DNA로부터의 게놈 DNA 서열, 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 관심 유전자는 miRNA, shRNA, 천연 폴리펩티드(즉, 자연계에 존재하는 폴리펩티드) 또는 이의 단편; 변이체 폴리펩티드(즉, 천연 폴리펩티드와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 천연 폴리펩티드의 돌연변이체) 또는 이의 단편; 조작된 폴리펩티드 또는 펩티드 단편, 치료적 펩티드 또는 폴리펩티드, 영상화 마커, 선별가능한 마커 등을 인코딩할 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중 어느 하나인 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체성 형태 또는 이의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드의 서열은 아데닌(A); 시토신(C); 구아닌(G); 티민(T); 및 폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우는 티민이 우라실(U)인 4개의 뉴클레오티드 염기로 구성된다. 폴리뉴클레오티드는 유전자 또는 유전자 단편(예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 이중가닥 분자와 단일가닥 분자 둘 모두를 지칭한다.
본원에서 사용된, 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환가능하게 사용되고, 펩티드 결합에 의해 공유 연결된 아미노산 잔기를 갖는 분자를 지칭한다. 폴리펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하고, 폴리펩티드의 아미노산의 최대 수에 대해 제한이 없다. 본원에서 사용된, 용어는 당업계에서 또한 흔히 예를 들어 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머라고 지칭하는 짧은 사슬과 당업계에서 일반적으로 폴리펩티드 또는 단백질이라고 지칭하는 더 긴 사슬 둘 모두를 지칭한다. "폴리펩티드"는 특히 예를 들어 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에서 사용된, 용어 "서브유닛"은 단백질 복합체의 각각의 별개의 폴리펩티드 사슬을 지칭하며, 각각의 별개의 폴리펩티드 사슬은 그 자체로 안정한 폴딩된 구조를 형성할 수 있다. 다수의 단백질 분자는 하나 초과의 서브유닛으로 구성되며, 아미노산 서열은 각각의 서브유닛에 대해 동일하거나 유사하거나 완전히 상이할 수 있다. 예를 들어, CD3 복합체는 CD3α, CD3ε, CD3δ, CD3γ, 및 CD3ζ 서브유닛으로 구성되고, 이는 CD3ε/CD3γ, CD3ε/CD3δ, 및 CD3ζ/CD3ζ 이량체를 형성한다. 폴리펩티드 사슬의 연속적 부분은 단일 서브유닛 내에서 흔히 "도메인"이라고 지칭하는 압축된, 국부적인, 반독립적 단위로 폴딩된다. 다수의 단백질 도메인은 하위도메인이라고도 지칭하는 독립적인 "구조적 서브유닛"을 추가로 포함할 수 있어서 도메인의 공통적 기능에 기여한다. 이와 같이, 본원에서 사용된 용어 "하위도메인"은 더 큰 도메인의 내부의 단백질 도메인, 예를 들어 세포 표면 수용체의 엑토도메인 내의 결합 도메인; 또는 세포 표면 수용체의 엔도도메인의 자극 도메인 또는 신호전달 도메인을 지칭한다.
"작동적으로 결합된" 또는 "작동가능하게 결합된"과 상호교환가능한 "작동적으로 연결된" 또는 "작동가능하게 연결된"은 하나의 기능이 다른 기능에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편(또는 다중 도메인을 갖는 폴리펩티드의 아미노산) 상의 핵산 서열의 회합을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현에 영향을 미칠 수 있을 때 코딩 서열 또는 기능적 RNA와 작동적으로 연결된다(즉, 코딩 서열 또는 기능적 RNA는 프로모터의 전사 제어 하에 있음). 코딩 서열은 센스 배향 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 추가의 예로서, 수용체-결합 도메인은 세포내 신호전달 도메인에 작동가능하게 결합되어, 리간드에 대한 수용체의 결합이 상기 결합에 대한 반응으로 신호를 변환할 수 있다.
본원에서 사용된, "융합 단백질" 또는 "키메라 단백질"은 개별 단백질을 인코딩하는 둘 이상의 부분 또는 전체 폴리뉴클레오티드 코딩 서열을 연결하기 위한 유전자 조작을 통해 생성된 단백질이고, 이들 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현은 각각의 원래 단백질 또는 이의 단편에서 유래된 기능적 특성을 갖는 단일 펩티드 또는 다중 폴리펩티드를 야기한다. 융합 단백질의 상이한 공급원의 두 인접 폴리펩티드 사이에, 링커(또는 스페이서) 펩티드가 부가될 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "유전 각인(genetic imprint)"은 공급원 세포 또는 iPSC에서 우선적 치료적 속성에 기여하고, 공급원 세포 유래된 iPSC 및/또는 iPSC-유래된 조혈 계통 세포에서 보유가능한 유전적 정보 또는 후성적 정보를 지칭한다. 본원에서 사용된, "공급원 세포"는 재프로그래밍을 통해 iPSC를 생성하기 위해 사용될 수 있는 비-만능성 세포이고, 공급원 세포 유래된 iPSC는 임의의 조혈 계통 세포를 포함하는 특정 세포 유형으로 추가로 분화할 수 있다. 공급원 세포 유래된 iPSC, 및 이로부터 분화된 세포는 맥락에 따라 때때로 총체적으로 "유래된" 세포 또는 "유래" 세포라고 지칭된다. 예를 들어, 유래 이펙터 세포, 또는 유래 NK 세포 또는 유래 T 세포는 본 출원 전체에서 사용된 바와 같이, 자연/천연 공급원, 예컨대 말초혈, 제대혈, 또는 다른 공여자 조직으로부터 얻어진 이의 1차 대응물과 비교할 때 iPSC로부터 분화된 세포이다. 본원에서 사용된, 우선적인 치료적 속성을 부여하는 유전 각인(들)은 공여자-, 질환- 또는 치료 반응-특이적인 선택된 공급원 세포의 재프로그래밍을 통해, 또는 게놈 편집을 사용하여 유전자 변형된 모달리티를 iPSC에 도입하는 것을 통해 iPSC 내에 혼입된다. 특이적으로 선택된 공여자, 질환 또는 치료 맥락으로부터 얻은 공급원 세포의 양태에서, 우선적 치료적 속성에 기인한 유전 각인은 보유가능한 표현형, 즉 우선적 치료적 속성을 나타내는 임의의 맥락-특이적 유전적 또는 후성적 변형을 포함할 수 있고, 이는 확인되거나 확인되지 않은 기저의 분자 사건과 무관하게 선택된 공급원 세포의 유래 세포로 전달된다. 공여자 특이적, 질환 특이적, 또는 치료 반응 특이적 공급원 세포는 iPSC 및 유래된 조혈 계통 세포에서 보유가능한 유전 각인을 포함할 수 있고, 유전 각인은 예를 들어 바이러스 특이적 T 세포 또는 비변이체 자연 살해 T(iNKT) 세포로부터의 예비정렬된 단일특이적 TCR; 예를 들어 선택된 공여자에서 고친화성 CD16 수용체를 인코딩하는 점 돌연변이에 동형적합성인 추적가능하고 바람직한 유전적 다형체; 및 예비결정된 HLA 요건, 즉 증가된 집단을 갖는 일배체형을 나타내는 선택된 HLA 일치된 공여자 세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 사용된, 우선적 치료학적 속성은 유래된 세포의 개선된 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 생존 및 세포독성을 포함한다. 우선적 치료적 속성은 또한 항원 표적화 수용체 발현; HLA 제시 또는 이의 결여; 종양 미세환경에 대한 내성; 방관자 면역 세포의 유도 및 면역 조절; 감소된 오프 종양 효과를 갖는 개선된 온 타겟 특이성; 및 화학요법과 같은 치료에 대한 내성과 관련될 수 있다. 하나 이상의 치료 속성을 갖는 유래 세포가 혼입된 바람직한 치료 속성을 부여하는 유전 각인(들)을 갖는 iPSC의 분화로부터 수득되는 경우, 상기 유래 세포는 또한 "합성 세포"로 지칭된다. 예를 들어, 합성 이펙터 세포, 또는 합성 NK 세포 또는 합성 T 세포는 본 출원 전체에 걸쳐 사용된 바와 같이, 자연/천연 공급원, 예컨대 말초혈, 제대혈 또는 다른 공여자 조직으로부터 얻어진 이의 1차 대응물과 비교할 때 게놈 변형된 iPSC로부터 분화된 세포이다. 일부 실시형태에서, 합성 세포는 가장 가까운 대응물 1차 세포와 비교될 때 하나 이상의 비-천연 세포 기능을 갖는다.
본원에서 사용된, 용어 "향상된 치료 특성"은 동일한 일반 세포 유형의 통상적인 면역 세포와 비교하여 향상되어 있는 세포의 치료 특성을 지칭한다. 예를 들어, "향상된 치료 특성"을 갖는 NK 세포는 통상적인, 비변형된, 및/또는 자연 발생 NK 세포와 비교하여 향상된, 개선된 및/또는 증강된 치료 특성을 가질 것이다. 면역 세포의 치료 특성은 세포 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 생존 및 세포독성을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 면역 세포의 치료 특성은 또한 항원 표적화 수용체 발현; HLA 제시 또는 이의 결여; 종양 미세환경에 대한 내성; 방관자 면역 세포의 유도 및 면역 조절; 감소된 오프 종양 효과를 갖는 개선된 온 타겟 특이성; 및 화학요법과 같은 치료에 대한 내성에 의해 나타난다.
본원에서 사용된, 용어 "인게이저"는 면역 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 호중구)와 종양 세포 사이에 연결을 형성할 수 있고; 면역 세포를 활성화할 수 있는 분자, 예를 들어 융합 폴리펩티드를 지칭한다. 인게이저의 예는 이중특이적 T 세포 인게이저(BiTE), 이중특이적 살해 세포 인게이저(BiKE), 삼중특이적 살해 세포 인게이저(TriKE), 또는 다중특이적 살해 세포 인게이저, 또는 다수의 면역 세포 유형과 상용성인 범용 인게이저를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용된, 용어 "표면 유도 수용체"는 면역 반응, 예를 들어 세포독성 반응을 유발하거나 개시할 수 있는 수용체를 지칭한다. 표면 유도 수용체는 조작될 수 있고, 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 또는 호중구 상에서 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표면 유도 수용체는 이펙터 세포의 자연 수용체 및 세포 유형과 독립적인 특정 표적 세포(예를 들어, 종양 세포)와 이펙터 세포 사이의 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체 결합을 용이하게 한다. 이러한 접근법을 이용하여, 범용 표면 유도 수용체를 포함하는 iPSC를 생성한 후, 범용 표면 유도 수용체를 발현하는 다양한 이펙터 세포 유형의 집단으로 상기 iPSC를 분화시킬 수 있다. "범용"이란 표면 유도 수용체가 세포 유형과 상관없이 임의의 이펙터 세포에서 발현되고, 활성화시킬 수 있으며, 범용 수용체를 발현시키는 모든 이펙터 세포는 인게이저의 종양 결합 특이성과 상관없이 표면 유도 수용체에 의해 인식될 수 있는 동일한 에피토프를 갖는 인게이저에 결합될 수 있거나 연결될 수 있다는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 동일한 종양 표적화 특이성을 갖는 인게이저는 범용 표면 유도 수용체와 커플링하도록 사용된다. 일부 실시형태에서, 상이한 종양 표적화 특이성을 갖는 인게이저는 범용 표면 유도 수용체와 커플링하도록 사용된다. 이와 같이, 하나 또는 다수의 이펙터 세포 유형은 일부 경우에 종양 세포의 하나의 특정한 유형을 사멸하고, 다른 경우에 종양의 둘 이상의 유형을 사멸하도록 결합될 수 있다. 표면 유도 수용체는 일반적으로 이펙터 세포 활성화를 위한 공동 자극 도메인 및 인게이저의 에피토프에 특이적인 항-에피토프를 포함한다. 이중특이적 인게이저는 한 말단 상에서 표면 유도 수용체의 항-에피토프에 특이적이고, 다른 말단 상에서 종양 항원에 특이적이다.
본원에서 사용된, 용어 "안전성 스위치 단백질"은 잠재적인 독성 또는 아니면 세포 치료의 유해 효과를 방지하도록 설계된 조작된 단백질을 지칭한다. 일부 경우에, 안전성 스위치 단백질 발현은 게놈으로 안전성 스위치 단백질을 인코딩하는 유전자가 주로 혼입된 이식된 조작된 세포에 대한 안전성 우려를 해결하기 위해 조건적으로 제어된다. 이러한 조건적 조절은 가변적일 수 있고, 소분자 매개된 번역후 활성화 및 조직 특이적 및/또는 시간적 전사 조절을 통한 제어를 포함할 것이다. 안전성 스위치 단백질은 아폽토시스의 유도, 단백질 합성의 억제, DNA 복제, 성장 저지, 전사 및 전사후 유전적 조절 및/또는 항체-매개 고갈을 매개할 수 있었다. 일부 경우에, 안전성 스위치 단백질은 외인성 분자, 예를 들어 프로드러그에 의해 활성화되고, 활성화 시, 치료적 세포의 아폽토시스 및/또는 세포 사멸을 유발한다. 안전성 스위치 단백질의 예는 자살 유전자, 예컨대 카스파아제 9(또는 카스파아제 3 또는 7), 티미딘 키나아제, 시토신 탈아미노효소, B 세포 CD20, 변형된 EGFR, 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이러한 전략에서, 이상 사건의 경우에 투여되는 프로드러그는 자살-유전자 산물에 의해 활성화되고, 형질도입된 세포를 사멸한다.
본원에서 사용된, 용어 "약학적 활성 단백질 또는 펩티드"는 유기체에 대한 생물학적 효과 및/또는 약학적 효과를 달성할 수 있는 단백질 또는 펩티드를 지칭한다. 약학적 활성 단백질은 질환에 대해 치유하는 치유 특성 또는 완화 특성을 갖고, 질환의 중증도를 완화하거나 개선하거나 경감하거나 역전시키거나 축소하도록 투여될 수 있다. 약학적 활성 단백질은 또한 예방적 특성을 갖고, 질환의 발생을 예방하거나 이러한 질환 또는 병리학적 병태의 중증도를 축소하도록 사용된다. "약학적 활성 단백질"은 전체 단백질 또는 펩티드 또는 이의 약학적 활성 단편을 포함한다. 용어는 또한 단백질 또는 펩티드의 약학적 활성 유사체 또는 단백질 또는 펩티드의 단편의 유사체를 포함한다. 용어 약학적 활성 단백질은 또한 치료적 이익을 제공하도록 협동적 또는 상승적으로 작용하는 복수의 단백질 또는 펩티드를 지칭한다. 약학적 활성 단백질 또는 펩티드의 예는 수용체, 결합 단백질, 전사 및 번역 인자, 종양 성장 억제 단백질, 항체 또는 이의 단편, 성장 인자 및/또는 사이토카인을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용된, 용어 "신호전달 분자"는 세포 신호 변환을 조절, 이에 참여, 이를 억제, 활성화, 감소, 또는 증가시키는 임의의 분자를 지칭한다. "신호 변환"은 세포에서 생화학적 사건을 궁극적으로 유발하는 경로에 따른 단백질 복합체의 동원에 의한 화학 변형의 형태의 분자 신호의 전송을 지칭한다. 신호 변환 경로는 당업계에 잘 알려져 있고, G 단백질 커플링된 수용체 신호전달, 티로신 키나아제 수용체 신호전달, 인테그린 신호전달, 톨 게이트 신호전달, 리간드 개폐된 이온 채널 신호전달, ERK/MAPK 신호전달 경로, Wnt 신호전달 경로, cAMP 의존적 경로, 및 IP3/DAG 신호전달 경로를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용된, 용어 "표적화 모달리티"는 비제한적으로 i) 이것이 고유한 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)와 관련이 있는 항원 특이성, ii) 이것이 단일클론 항체 또는 이중특이적 인게이저와 관련이 있는 인게이저 특이성, iii) 변형된 세포의 표적화, iv) 암 줄기 세포의 표적화, 및 v) 특정 항원 또는 표면 분자의 부재 하의 다른 표적화 전략을 포함하는, 항원 및/또는 에피토프 특이성을 촉진하도록 세포로 유전적으로 혼입되는 분자(예를 들어, 폴리펩티드)를 지칭한다.
본원에서 사용된, 용어 "특이적" 또는 "특이성"은 비특이적 결합 또는 비선택적 결합과 대조적으로, 표적 분자에 선택적으로 결합하는 분자, 예를 들어 수용체 또는 인게이저의 능력을 지칭하도록 사용될 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "입양 세포 치료"는 수혈 전에 생체외로 확장된, 유전자 변형되거나 변형되지 않은, 자가유래 림프구 또는 동종이계 림프구(예를 들어, T 세포, B 세포, 및/또는 NK 세포)의 수혈과 관련되는 세포-기반 면역요법을 지칭한다.
본원에서 사용된, "림프구 고갈" 및 "림포-컨디셔닝"은 통상적으로 면역요법 이전에 림프구와 T 세포의 파괴를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 입양 세포 치료의 시행 전 림포-컨디셔닝의 목적은 이펙터 세포의 항상성 증식을 촉진할 뿐만 아니라 조절 면역 세포와 항상성 사이토카인과 경쟁하는 면역계의 다른 경쟁 요소를 제거하는 것이다. 따라서, 림포-컨디셔닝은 통상적으로 입양 세포 치료의 첫번째 투여 전에 대상체에게 하나 이상의 화학치료제를 투여하는 것에 의해 달성된다. 다양한 실시형태에서, 림포-컨디셔닝은 입양 세포 치료의 첫번째 투여보다 수 시간에서 수 일 정도 선행된다. 림포-컨디셔닝에 유용한 예시적인 화학치료제는 시클로포스파미드(CY), 플루다라빈(FLU), 및 하기 기재된 것을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 그러나, 항-CD38 mAb를 통한 충분한 림프구 고갈은 본원에 추가로 기재된 바와 같이 CY/FLU-기반 림포-컨디셔닝 절차를 필요로 하지 않거나 최소한으로 필요로 하면서, 본 iNK 세포 치료에 대한 대체 컨디셔닝 과정을 제공할 수 있다.
본원에서 사용된, "호밍" 또는 "트래피킹(trafficking)"은 표적 부위(예를 들어, 세포, 조직(예를 들어, 종양), 또는 장기)에 대한 세포의 능동적 탐색(이동)을 지칭한다. "호밍 분자"는 세포를 표적 부위에 유도하는 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 호밍 분자는 표적 부위에 대한 세포의 상호작용을 인식 및/또는 개시하는 기능을 한다.
본원에서 사용된, "치료학적으로 충분한 양"은 이의 의미 내에서 목적하는 치료학적 효과를 제공한다고 언급되는 특정한 치료 조성물 및/또는 약학적 조성물의 비독성이지만 충분하고/하거나 효과적인 양을 포함한다. 요구된 정확한 양은 환자의 일반적 건강상태, 환자의 연령 및 병기 및 치료되는 병태의 중증도와 같은 인자에 따라서 대상체에 따라 달라질 것이다. 특정 실시형태에서, "치료적으로 충분한 양"은 치료되는 대상체의 질환 또는 병태와 관련된 적어도 하나의 증상을 완화, 감소, 및/또는 개선하기에 충분하고/하거나 효과적이다.
만능성 줄기 세포의 분화는 배양 시스템의 변경, 예컨대 배양 배지에서의 자극제 또는 세포의 물리적 상태의 변경을 필요로 한다. 가장 통상적인 전략은 공통의 중요한 중간체로서 배양체(EB)의 형성을 이용하여 계통-특이적 분화를 개시한다. "배양체"는 이의 3차원 면적에서 많은 계통을 생성시키므로 배아 발생을 모방하는 것으로 나타난 3차원 클러스터이다. 분화 과정을 통해, 통상적으로 수 시간 내지 수 일에, 단순한 EB(예를 들어, 분화하도록 유도된 응집된 만능성 줄기 세포)는 계속해서 성숙하여 낭종성 EB로 발생하고, 이때 통상적으로 수 일 내지 수 주에 이들은 더욱 진행되어 계속해서 분화한다. 세포의 3차원 다층 클러스터에서 만능성 줄기 세포를 서로 가까이 근접하게 하여 EB 형성을 개시한다. 통상적으로, 이는 만능성 세포가 액체 액적에서 침강하게 하는 것, 세포를 "U" 바닥 웰-플레이트로 침강시키는 것 또는 기계적 진탕을 포함하는 몇몇 방법 중 하나에 의해 달성된다. EB 발생을 촉진하기 위해, 만능 배양 유지 배지에서 유지된 응집체가 적절한 EB를 형성하지 않기 때문에, 만능성 줄기 세포 응집체는 추가의 분화 신호를 필요로 한다. 이와 같이, 만능성 줄기 세포 응집체는 선택된 계통에 대해 신호의 유도를 제공하는 분화 배지로 이동될 필요가 있다. 만능성 줄기 세포의 EB 기반 배양은 통상적으로 EB 세포 클러스터 내의 보통 정도의 증식으로 분화된 세포 집단(즉, 외배엽, 중배엽 및 내배엽의 배엽)을 생성시킨다. 세포 분화를 용이하게 하는 것으로 입증되었지만, EB는 환경 내의 분화 신호에 대한 3차원 구조에서의 세포의 일관되지 않은 노출로 인해 가변성 분화 상태에서 불균질한 세포를 생성한다. 또한, EB는 생성하고 유지하기 어렵다. 나아가, EB를 통한 세포 분화는 보통 세포 확장과 동반되는데, 이는 또한 낮은 분화 효율에 기여한다.
비교하면, "EB 형성"과 구별되는 "응집체 형성"은 만능성 줄기 세포 유래된 세포의 집단을 확장시키도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 응집체-기반 만능성 줄기 세포 확장 동안, 배양 배지는 증식 및 만능성을 유지하도록 선택된다. 세포 증식은 일반적으로 응집체의 크기를 증가시켜 더 큰 응집체를 형성하고, 이것은 배양물 내의 세포 증식을 유지시키기 위해 그리고 세포 수를 증가시키기 위해 더 작은 응집체로 기계적으로 또는 효소적으로 해리될 수 있다. EB 배양물과 별개로, 유지 배양 배지 중의 응집체 내에서 배양된 세포는 만능성 마커를 유지한다. 만능성 줄기 세포 응집체는 분화를 유도하도록 추가의 분화 신호를 필요로 한다.
본원에서 사용된, "단층 분화"는 세포의 3차원 다층 클러스터, 즉 "EB 형성"을 통한 분화와 구별되는 분화 방법을 지칭하는 용어이다. 단층 분화는 본원에 개시된 다른 이점 중에서 분화를 개시하기 위한 EB 형성의 필요성을 피한다. 단층 배양은 EB 형성의 경우와 같은 배아 발생을 모방하지 않기 때문에, 특정 계통에 대한 분화는 EB 형성에서의 모든 3가지 배엽 분화에 비해 최소인 것으로 여겨진다.
본원에서 사용된, "해리 세포" 또는 "단일 해리 세포"는 다른 세포 또는 표면(예를 들어, 배양 플레이트 표면)으로부터 실질적으로 분리되거나 정제된 세포를 지칭한다. 예를 들어, 세포는 기계적 방법 또는 효소적 방법에 의해 동물 또는 조직으로부터 해리될 수 있다. 대안적으로, 시험관내 응집하는 세포는 효소적으로 또는 기계적으로 클러스터, 단일 세포 또는 단일 세포와 클러스터의 혼합물의 현탁액으로 해리되는 것과 같이 서로 해리될 수 있다. 또 다른 대안적인 실시형태에서, 부착성 세포는 배양 플레이트 또는 다른 표면으로부터 해리될 수 있다. 이에 따라 해리는 세포외 매트릭스(ECM)와 기질(예를 들어, 배양 표면) 사이의 세포 상호작용을 파괴하거나, 세포 사이의 ECM을 파괴하는 것을 수반할 수 있다.
본원에서 사용된, "마스터 세포 은행" 또는 "MCB"는 클론성 마스터 조작된 iPSC주를 지칭하고, 이는 하나 이상의 치료 특성을 포함하도록 조작되고, 특징화, 시험, 적격화, 그리고 확장되었고, 제조 환경에서 지향성 분화를 통해 세포 기반 치료제 생산을 위한 시작 세포 물질로서 안정적으로 작용하는 것으로 나타난 iPSC의 클론성 집단이다. 다양한 실시형태에서, MCB는 다중 용기에서 유지, 보관 및/또는 동결보존되어, iPS 세포주가 제조 과정 도중 계대배양, 해동 또는 조작되는 총 횟수를 감소 및/또는 제거시킴으로써 유전적 변경 및/또는 잠재적인 오염을 방지하도록 한다.
본원에서 사용된, "피더 세포" 또는 "피더"는 피더 세포가 제2 세포 유형의 지지를 위해 자극, 성장 인자 및 영양소를 제공하면서 제2 유형의 세포가 성장, 확장 또는 분화할 수 있는 환경을 제공하도록 제2 유형의 세포와 공동-배양되는 하나의 유형의 세포를 설명하는 용어이다. 피더 세포는 선택적으로 이것이 지지하는 세포와 상이한 종으로부터 유래한다. 예를 들어, 줄기 세포를 포함하는 인간 세포의 특정한 유형은 마우스 배아 섬유아세포 또는 불활성화된 마우스 배아 섬유아세포의 1차 배양에 의해 지지될 수 있다. 다른 예에서, 말초혈 유래된 세포 또는 형질전환된 백혈병 세포는 자연 살해 세포의 확장 및 성숙을 지지한다. 피더 세포는 이들이 지지하는 세포보다 더 커지는 것을 방지하기 위해 조사 또는 항-유사분열제, 예컨대 미토마이신으로의 처리에 의해 다른 세포와 공동배양될 때 통상적으로 불활성화될 수 있다. 피더 세포는 내피 세포, 기질 세포(예를 들어, 상피 세포 또는 섬유아세포) 및 백혈병 세포를 포함할 수 있다. 상기에 제한됨이 없이, 하나의 특정 피더 세포 유형은 인간 피부 섬유아세포와 같은 인간 피더일 수 있다. 다른 피더 세포 유형은 마우스 배아 섬유아세포(MEF)일 수 있다. 일반적으로, 다양한 피더 세포는 부분적으로 만능성을 유지하고, 특정한 계통에 대한 분화를 지시하고, 증식 역량을 향상시키고, 이펙터 세포와 같은 특수화된 세포 유형에 대한 성숙을 촉진하기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 사용된, "피더 비함유"(FF) 환경은 본질적으로 피더 또는 기질 세포가 없고/없거나, 피더 세포의 배양에 의해 사전 컨디셔닝되지 않은 배양 조건, 세포 배양물 또는 배양 배지와 같은 환경을 지칭한다. "사전 컨디셔닝된" 배지는 적어도 1일 동안과 같은 시간 기간 동안 배지 내에 피더 세포가 배양된 후 수확되어, 배지에서 배양된 피더 세포에 의해 분비된 사이토카인 및 성장 인자를 포함한 다수의 매개 물질을 함유하는 배지를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 피더 비함유 환경은 피더 또는 기질 세포 둘 모두가 없고, 또한 피더 세포의 배양에 의해 사전 컨디셔닝되지 않는다.
iPSC, 및 이로부터 유래된, 유래된 비-만능성 세포의 게놈 편집 또는 변형, 또는 비-만능성 세포 및 이로부터 재프로그래밍된 유래된 iPSC의 게놈 편집 또는 변형의 맥락에서 사용된, "기능적"은 (1) 유전자 수준에서는 - 직접적인 게놈 편집 또는 변형을 통해, 또는 초기에 게놈 조작된 출발 세포로부터의 분화 또는 이의 재프로그래밍을 통한 "계대배양"을 통해 달성되는, 원하는 세포 발생 단계에서의 성공적인 녹인된, 녹아웃된, 녹다운된 유전자 발현, 형질전환 또는 제어된 유전자 발현, 예컨대 유도성 발현 또는 시간적 발현; 또는 (2) 세포 수준에서는 - (i) 직접적인 게놈 편집을 통해 상기 세포에서 얻은 유전자 발현 변형, (ii) 초기에 게놈 조작된 출발 세포로부터의 분화 또는 이의 재프로그래밍을 통한 "계대배양"을 통해 상기 세포에서 유지된 유전자 발현 변형; (iii) 상기 세포의 초기 발생 단계에 단지 발생하는, 또는 분화 또는 재프로그래밍을 통해 상기 세포를 생성시키는 출발 세포에서 단지 발생하는 유전자 발현 변형의 결과로서 상기 세포에서의 다운스트림 유전자 조절; 또는 (iv) iPSC, 전구체 또는 탈분화된 세포 기원에서 수행된 게놈 편집 또는 변형으로부터 초기에 유래된, 성숙 세포 산물 내에 나타난 향상되거나 새로 획득된 세포 기능 또는 속성을 통한, 세포 기능/특징의 성공적인 제거, 부가 또는 변경을 지칭한다.
HLA 클래스 I 결핍, HLA 클래스 II 결핍, 또는 둘 모두를 포함하는 "HLA 결핍"은 줄어들거나 감소된 수준이 다른 세포 또는 합성 방법에 의해 자연적으로 검출가능한 수준보다 낮도록, HLA 클래스 I 단백질 이종이량체 및/또는 HLA 클래스 II 이종이량체를 포함하는 완전한 MHC 복합체의 표면 발현이 결여되거나 더 이상 유지하지 않거나 이의 감소된 수준을 갖는 세포를 지칭한다.
본원에서 사용된, "변형된 HLA 결핍 iPSC"는 개선된 분화능, 항원 표적화, 항원 제시, 항체 인식, 지속성, 면역 회피, 억제에 대한 내성, 증식, 공동자극, 사이토카인 자극, 사이토카인 생산(자가분비 또는 주변분비), 주화성, 및 세포 독성, 예컨대 비-전통적 HLA 클래스 I 단백질(예를 들어, HLA-E 및 HLA-G), 키메라 항원 수용체(CAR), T 세포 수용체(TCR), CD16 Fc 수용체, BCL11b, NOTCH, RUNX1, IL15, 4-1BB, DAP10, DAP12, CD24, CD3ζ, 4-1BBL, CD47, CD113 및 PDL1과 관련되지만 이에 제한되지 않는 단백질을 발현하는 유전자를 도입함으로써 추가로 변형되는 HLA 결핍 iPSC를 지칭한다. "변형된 HLA 결핍"인 세포는 iPSC 이외의 세포를 또한 포함한다.
"리간드"라는 용어는 표적 분자와 복합체를 형성하여 표적 상의 부위에 결합하여 신호를 생성하는 물질을 지칭한다. 리간드는 표적에 특이적 결합이 가능한 자연 또는 인공 물질일 수 있다. 리간드는 단백질, 펩티드, 항체, 항체 복합체, 콘쥬게이트, 핵산, 지질, 다당류, 단당류, 소분자, 나노입자, 이온, 신경전달물질, 또는 표적에 특이적 결합이 가능한 임의의 다른 분자 엔티티 형태일 수 있다. 리간드가 결합하는 표적은 단백질, 핵산, 항원, 수용체, 단백질 복합체, 또는 세포일 수 있다. 표적에 결합하고 표적의 기능을 변경하고, 반응을 유발하는 리간드는 "작용적" 또는 "작용제"로 불린다. 표적에 결합하고, 신호전달 반응을 차단하거나 감소시키는 리간드는 "길항적" 또는 "길항제"이다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 일반적으로 표적에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 결합 부위를 함유하는 면역-반응 발생 분자를 지칭하며, 표적은 특정한 항체와 상호작용할 수 있는 수용체 또는 항원일 수 있다. 예를 들어, NK 세포는 Fc-감마 수용체(FcγR)에 항체 또는 항체의 Fc 영역의 결합에 의해 활성화되어, ADCC(항체-의존성 세포 독성) 매개된 이펙터 세포 활성화를 유발할 수 있다. 항체가 결합하는 항원 또는 수용체, 또는 일반적으로 표적의 특정 조각 또는 부분은 에피토프 또는 항원 결정기로 알려져 있다. 용어 "항체"는 천연 항체 및 이의 변이체, 천연 항체 및 이의 변이체의 단편, 펩티바디 및 이의 변이체, 및 단일 사슬 항체 및 이의 단편을 포함하는 항체 또는 이의 특정 단편 또는 부분의 구조 및/또는 기능을 모방하는 항체 모방체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 항체는 쥐과 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 낙타 IgG, 단일 가변 신항원 수용체(VNAR), 상어 중쇄 항체(Ig-NAR), 키메라 항체, 재조합 항체, 단일-도메인 항체(dAb), 항-개별특이형 항체, 이중특이적, 다중특이적 또는 다량체 항체, 또는 이의 항체 단편일 수 있다. 항-개별특이형 항체는 다른 항체의 개별특이형에 대한 결합에 특이적이고, 개별특이형은 항체의 항원 결정기이다. 이중특이적 항체는 BiTE(이중특이적 T 세포 인게이저) 또는 BiKE(이중특이적 사멸 세포 인게이저), 및 다중특이적 항체는 TriKE(삼중특이적 사멸 세포 인게이저)일 수 있다. 항체 단편의 비제한적인 예는 Fab, Fab', F(ab')2, F(ab')3, Fv, Fabc, pFc, Fd, 단일 사슬 단편 가변(scFv), 탠덤 scFv(scFv)2, 단일 사슬 Fab(scFab), 디설파이드 안정화된 Fv(dsFv), 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 단일 도메인 항원 결합 단편(sdAb), 낙타과 중쇄 IgG 및 Nanobody® 단편, 재조합 중쇄-전용 항체(VHH), 및 항체의 결합 특이성을 유지하는 다른 항체 단편을 포함한다.
FcR로 축약된 "Fc 수용체"는 이것이 인식하는 항체의 유형에 기초하여 분류된다. 예를 들어, IgG인 항체의 가장 흔한 종류에 결합하는 것은 Fc-감마 수용체(FcγR)라고 지칭하고, IgA에 결합하는 것은 Fc-알파 수용체(FcαR)라고 지칭하고, IgE에 결합하는 것은 Fc-엡실론 수용체(FcεR)라고 지칭한다. FcR의 클래스는 또한 이를 발현하는 세포(대식세포, 과립구, 자연 살해 세포, T 및 B 세포) 및 각각의 수용체의 신호전달 특성에 의해 구별된다. Fc-감마 수용체(FcγR)는 몇몇 구성원, FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32), FcγRIIB(CD32), FcγRIIIA(CD16a), FcγRIIIB(CD16b)를 포함하고, 이들은 이들의 상이한 분자 구조로 인해서 이들의 항체 친화도가 상이하다.
"키메라 수용체"는 적어도 2개의 상이한 단백질 유래의 2개 이상의 부분의 아미노산 서열을 포함하도록 만들어지는 조작된, 인공, 또는 하이브리드 수용체 단백질 분자를 설명하기 위해 사용된 일반적 용어이다. 키메라 수용체 단백질은 신호 변환을 개시하는 능력을 세포에 제공하도록 조작되었고, 수용체에 작용제 리간드의 결합 시 다운스트림 기능을 수행한다. 예시적 "키메라 수용체"는 키메라 항원 수용체(CAR), 키메라 융합 수용체(CFR), 키메라 Fc 수용체(CFcR)뿐만 아니라 둘 이상의 수용체의 융합물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
CFcR로 축약된 "키메라 Fc 수용체"는 비천연 막관통 도메인 및/또는 세포내 신호전달 도메인으로 변형되거나 대체된 이의 천연 막관통 도메인 및/또는 세포내 신호전달 도메인을 갖는 조작된 Fc 수용체를 설명하기 위해 사용된 용어이다. 키메라 Fc 수용체의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 자극 도메인은 비-천연인 막관통 도메인 및 신호전달 도메인의 하나 또는 둘 모두를 갖는 것 이외에, 수용체 유도 시 세포 활성화, 확장 및 기능을 향상시키도록 조작된 Fc 수용체의 세포내 부분으로 도입될 수 있다. 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인을 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR)와 달리, 키메라 Fc 수용체는 표적화된 세포가 근처에 가깝게 있게 하거나 하지 않으면서 항체의 Fc 단편, 또는 Fc 영역, 또는 세포 기능을 활성화하고 인게이저 또는 결합 분자에 포함된 Fc 영역에 결합한다. 예를 들어, Fcγ 수용체는 세포외 도메인에서 IgG의 결합에 반응하며, 이로써 CFcR을 생성하는 세포내 영역에서 선택된 막관통 도메인, 자극 도메인 및/또는 신호전달 도메인을 포함하도록 조작될 수 있다. 일 예에서, CFcR은 이의 막관통 도메인 및/또는 세포내 도메인을 대체하여 Fcγ 수용체인 CD16을 조작하여 생산된다. CD16 기반 CFcR의 결합 친화성을 추가로 개선하기 위해, CD64의 세포외 도메인 또는 CD16의 고친화성 변이체(예를 들어, F176V)가 혼입될 수 있다. 고친화성 CD16 세포외 도메인이 수반되는 CFcR의 일부 실시형태에서, 197번 위치에 세린을 포함하는 단백질분해 절단 부위는 제거되거나 수용체의 세포외 도메인이 비-절단성이도록, 즉 섀딩되지 않아서 hnCD16 기반 CFcR을 얻도록 대체된다.
FcγR 수용체인 CD16은 Fc 수용체 FcγRIIIa(CD16a) 및 FcγRIIIb(CD16b)인 2개의 이소폼을 갖는 것으로 확인되었다. CD16a는 NK 세포에 의해 발현된 막관통 단백질이고, 이는 NK 세포를 활성화하고 항체 의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)을 촉진하도록 표적 세포에 부착된 단량체성 IgG에 결합한다. 본원에서 사용된, "고친화성 CD16", "비절단성 CD16" 또는 "고친화성 비절단성 CD16(hnCD16으로 약칭됨)"은 CD16의 천연 변이체 또는 비천연 변이체를 지칭한다. 야생형 CD16은 낮은 친화성을 갖고, NK 세포 활성화 시 백혈구에 대한 다양한 세포 표면 분자의 세포 표면 밀도를 조절하는 단백분해 절단 과정인 엑토도메인 섀딩에 적용된다. F176V 및 F158V는 고친화도를 갖는 예시적인 CD16 다형 변이체이다. 변경되거나 제거된 막-근위 영역(위치 189 내지 212)에서 절단 부위(위치 195 내지 198)를 갖는 CD16 변이체는 섀딩에 적용되지 않는다. 절단 부위 및 막-근위 영역은 국제공개 WO 2015/148926호에 자세히 기재되어 있고, 이의 완전한 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. CD16 S197P 변이체는 CD16의 조작된 비절단성 버전이다. F158V 및 S197P 둘 모두를 포함하는 CD16 변이체는 높은 친화성을 갖고 비절단성이다. 다른 예시적인 고친화성 및 비절단성 CD16(hnCD16) 변이체는 CD64 엑토도메인의 3개의 엑손 중 하나 이상으로부터 유래된 엑토도메인을 포함하는 조작된 CD16이다.
"TCR"로 약칭된 "T 세포 수용체"는 일반적으로 T 세포 표면 상에서 발견된 단백질 복합체를 지칭하고, 이는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 항원 펩티드의 단편을 인식하는 데 관여한다. 항원 펩티드에 대한 TCR의 결합은 TCR-CD3 세포내 활성화, 많은 신호전달 분자의 동원, 및 신호전달 경로의 분지 및 통합을 개시하여 유전자 발현 및 일반적인 T 세포 성장 및 기능 획득에 중요한 전사 인자의 동원으로 이어진다. 일반적인 TCR은 2개의 고도의 가변적 단백질 사슬(α 및 β)을 포함하고, 이들 각각의 사슬은 펩티드/MHC에 결합하는 가변 영역(즉, 결합 도메인) 및 세포 막에 근접한 불변 영역을 포함한다.
I. 향상된 특성을 갖는 입양 세포 치료에 유용한 세포 및 조성물
본원에는 iPSC로부터 분화된 유래 세포의 치료 특성을 향상시키면서, iPSC 및 이의 유래 세포의 분화 효능 및 세포 발생 생물학에 영향을 미치지 않고 클론성 iPSC의 조절 회로를 체계적으로 조작하기 위한 전략이 제공된다. iPSC-유래된 세포는 기능적으로 개선되고, 게놈 조작을 통해 iPSC의 수준에서 세포로 도입되는 선택적 모달리티의 조합 후 입양 세포 치료에 적합하다. 이전에는 하나 이상의 제공된 유전자 편집을 포함하는 변경된 iPSC가 세포 발생에 도입되는 능력 및/또는 변형된 활성 및/또는 특성을 보유하면서 기능적 분화된 세포를 성숙시키고 생성하는 능력을 여전히 갖는지가 불확실하였다. iPSC로부터의 지향성 세포 분화 동안 예상치 못한 실패는 발생 단계 특이적 유전자 발현 또는 이의 결핍, HLA 복합체 제시에 대한 요건, 도입된 표면 발현 모달리티의 단백질 섀딩 및 세포에서 표현형 및/또는 기능성 변화를 가능하게 하는 분화 프로토콜의 재구성에 대한 필요성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 양태에 기여하였다. 본 출원은 본원에서 제공된 바와 같은 하나 이상의 선택된 게놈 변형이 iPSC 분화능에 부정적으로 영향을 미치지 않고, 조작된 iPSC로부터 유래된 기능성 이펙터 세포가 iPSC 분화 이후에 이펙터 세포에서 보유된 개별 또는 조합된 게놈 변형에 기인한 향상된 및/또는 수득된 치료 특성을 가짐을 보였다. 추가로, iPSC 및 iPSC-유래된 이펙터 세포의 맥락에서 기재될 수 있는 것과 같은 모든 게놈 변형 및 이들의 조합이 배양되거나 확장되는지와 무관하게, T, NK, 또는 면역조절 세포와 같은 1차 면역 세포를 포함하는 1차 공급 세포에 적용가능하고, 이의 변형은 입양 세포 치료에 유용한 조작된 면역 세포를 야기한다.
또한 본원에는 조작된 iPSC로부터 유래된 이펙터 세포를 사용하여 기성품 동종이계 입양 세포 치료 환경에서 동종이계 거부 제어를 위한 솔루션이 제공된다. 다수의 HLA 클래스 I 및 클래스 II 단백질은 동종이계 거부 문제를 회피하기 위해서 동종이계 수용자에서 조직적합성을 위해서 일치되어야 하는 것으로 여겨진다. MHC 매칭 없이, 동종이계 입양 세포 치료에서 연구된 한 가지 접근법은 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 단백질 둘 다의 발현을 제거하거나 실질적으로 감소시키는 것이다. HLA 클래스 I 결핍은 HLA 클래스 I 좌위(염색체 6p21)의 임의의 영역의 기능적 결실 또는 파괴, 또는 베타-2 마이크로글로불린(B2M) 유전자, TAP1 유전자, TAP2 유전자 및 타파신을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 HLA 클래스 I-관련 유전자의 결실 또는 파괴 또는 이의 발현 수준의 감소에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, B2M 유전자는 모든 HLA 클래스 I 이종이량체의 세포 표면 발현에 필수적인 공통 서브유닛을 인코딩한다. B2M 음성 세포는 HLA-I 결핍이다. HLA 클래스 II 결핍은 비제한적으로 RFXANK, CIITA, RFX5 및 RFXAP를 포함하는 HLA II-관련 유전자의 기능적 결실, 파괴 또는 감소에 의해 달성될 수 있다. CIITA는 클래스 II 단백질 발현에 필요한 RFX5인 전사 인자의 활성화를 통해 작용하는 전사적 공동활성자이다. CIITA 음성 세포는 HLA-II 결핍이다.
그러나, HLA 클래스 I 발현의 결여는 NK 세포에 의한 용해에 대한 감응성을 증가시킨다. 또한, HLA-I 및 HLA-II 둘 다의 결핍은 여전히 동종이계 입양 세포의 MHC 이외의 동종항원에 의해 매개된 동종 거부를 방지하지 못한다. 나아가, HLA-I-의존성 NK 세포 배양 과정, 예컨대 라이센싱, 아밍(arming) 또는 디스아밍(disarming)은 동종이계 공여자 세포에 대한 수용자 NK 세포의 반응성, 또는 부분 반응성을 야기할 수 있는 동종이계 세포에 대한 선천성 면역 반응성에 영향을 미치는 것으로 여겨지며, 이는, 심지어 상기 공여자 세포가 HLA-I 충분성일 때에도 그러한 것으로 여겨진다.
본 출원은 동종이계 이펙터 세포에서 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 단백질 중 하나 또는 둘 모두의 발현을 제거하거나 실질적으로 감소시키고, CD38 컨디셔닝을 위해 이들 세포를 변경함으로써 동종이계 거부 제어를 위한 전략을 제공한다. 나아가, 본 출원은 HLA-I 결핍 동종이계 입양 이펙터 세포의 수용자 1차 NK 세포 용해를 회피할 목적으로 HLA-E, HLA-G, 또는 다른 비-전통적인 HLA-I 단백질의 외인성 또는 증가된 발현에서 제시된 기술적 문제를 다룬다. HLA-E 및 HLA-G를 인식하는 억제 수용체가 1차 NK 세포에서 확률적으로 발현되기 때문에(즉, 모든 1차 NK 세포에서 발현되지는 않음) HLA-E/G는 1차 NK 세포 기반 인식으로부터 HLA-I 결핍 동종이계 세포를 완전하게 보호하지 못해, NK 세포 용해에 대한 HLA-E/G 전달성 보호에서 누출이 존재하게 된다. 또한, HLA-I 결핍 및 HLA-E/G 발현 입양 세포의 거부를 촉진할 수 있는 HLA-E(및 HLA-G일 가능성이 있음)를 인식하는 1차 NK 세포에 상응하는 활성화 수용체가 존재한다. 본 출원에 제시된 바와 같이, CD38 컨디셔닝에 적용가능/적합한 변형된 HLA-I 결핍 이펙터 세포(예를 들어, 항-CD38 항체 또는 CD38-CAR과 같은 CD38 길항제를 사용함으로써)는 동종 거부에 대해 더 잘 보호되기 때문에 입양 세포 치료의 치료적 가치가 더 높다. 본원에서 제공된 동종이계 거부 제어 전략은 입양 세포 치료에서 동종이계 거부에 대한 개선된 및/또는 보다 완전한 보호를 위해 HLA-I 결핍 동종이계 이펙터 세포에서 HLA-E/G의 증가된 또는 외인성 발현에 대한 필요성을 회피한다. 또한, 본 출원은 본원에 상세히 설명된 바와 같이 이펙터 세포의 향상된 기능성을 달성하기 위한 추가적인 게놈 조작 양태를 제공한다.
1. HLA-I- 및 HLA-II- 결핍
상기 논의된 바와 같이, 다수의 HLA 클래스 I 및 클래스 II 단백질은 동종이계 거부 문제를 회피하기 위해서 동종이계 수용자에서 조직적합성을 위해서 일치되어야 한다. 본원에는 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 단백질 중 하나 또는 둘 모두의 발현이 제거되거나 실질적으로 감소된 iPSC 세포주가 제공된다. HLA 클래스 I 결핍은 HLA 클래스 I 좌위(염색체 6p21)의 임의의 영역의 기능적 결실, 또는 베타-2 마이크로글로불린(B2M) 유전자, TAP1 유전자, TAP2 유전자 및 타파신을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 HLA 클래스-I 관련 유전자의 결실, 파괴, 또는 이의 발현 수준의 감소에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, B2M 유전자는 모든 HLA 클래스 I 이종이량체의 세포 표면 발현에 필수적인 공통 서브유닛을 인코딩한다. B2M 음성 세포는 HLA-I 결핍이다. HLA 클래스 II 결핍은 RFXANK, CIITA, RFX5 및 RFXAP를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 HLA-II 관련 유전자의 기능성 결실, 파괴 또는 감소에 의해 달성될 수 있다. CIITA는 클래스 II 단백질 발현에 필요한 RFX5인 전사 인자의 활성화를 통해 작용하는 전사적 공동활성자이다. CIITA 음성 세포는 HLA-II 결핍이다. 본원에는 예를 들어 B2M 녹-아웃 및 선택적으로 CIITA 녹-아웃을 통해, HLA-I, 및 선택적으로 HLA-II에서의 결핍을 갖는 iPSC주 및 이의 유래 세포가 제공되며, 얻어진 유래 이펙터 세포는 MHC(주요 조직적합성 복합체) 매칭에 대한 필요성을 제거하여 동종이계 세포 치료가 가능하게 하고, 숙주(동종이계) T 세포에 의한 인식 및 사멸을 회피한다.
일부 세포 유형에 대해, HLA 클래스 I 발현의 결여는 NK 세포에 의해 용해로 이어진다. 이러한 "소실된 자가" 반응을 극복하기 위해, NK 세포 인식 및 조작된 iPSC로부터 유래된 HLA-I 결핍 이펙터 세포의 사멸을 피하도록 HLA-G 또는 HLA-E는 선택적으로 녹인될 수 있다. 대안적으로, 신호-의존성 세포 상호작용을 개시하고 면역 세포를 포함한 세포 이동을 촉진하는 접착 단백질인 CD58(또는 LFA-3) 및 CD54(또는 ICAM-1) 중 하나 또는 둘 모두의 녹아웃은 동종이계 NK 세포 활성화를 감소시키는 것으로 나타났다. 따라서, 일 실시형태에서, 제공된 HLA-I 결핍 iPSC 및 이의 유래 세포는 HLA-G 녹인을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 제공된 HLA-I 결핍 iPSC 및 이의 유래 세포는 HLA-E 녹인을 추가로 포함한다. 그러나, 본원에서 제시된 바와 같이, HLA-E 및 HLA-G를 인식하는 억제성 수용체는 확률적으로 발현되며, 즉 이들은 모든 세포에서 발현되지는 않으며, 이에 따라 HLA-E/G의 녹인은 1차 NK 세포-기반 인식으로부터 완전한 보호를 제공하지 않는다. 부가적으로, HLA-I 결핍 이펙터 세포의 거부를 촉진할 수 있는 HLA-E(및 가능하게는 HLA-G)를 인식할 수 있는 상응하는 활성화 수용체가 존재한다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 유래 T 및 NK 세포를 포함하는 유래된 이펙터 세포의 기능과 iPSC의 분화능 및 기능에 부정적인 영향을 주지 않으면서 HLA-I 및/또는 HLA-II 결핍을 생성함으로써 동종 거부를 감소시키거나 방지시킴으로써 이펙터 세포 지속성 및/또는 생존을 향상시키기 위한 전략을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이펙터 세포는 본원에 기재된 다양한 치료제의 존재 하에서 및/또는 이에 대한 노출 후에 생체내에서 증가된 지속성 및/또는 생존을 갖는다. 제공된 바와 같이, 전략은 B2M 녹-아웃을 포함하는 iPSC주를 생성하고, 조작된 iPSC주의 지향성 분화를 통해 B2M 음성(B2M-/-)을 포함하는 유래 이펙터 세포를 획득하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 이펙터 세포는 치료제의 존재 하에서 및/또는 이에 대한 노출 후에 생체내에서 증가된 지속성 및/또는 생존을 갖는다. 따라서, 일부 실시형태에서, iPSC 및 이의 유래 세포는 HLA-I 결핍(예를 들어, B2M 음성(B2M-/-))이다. 일부 실시형태에서, iPSC 및 이의 유래 세포는 HLA-I 결핍 및 HLA-II 결핍(예를 들어, B2M-/- 및 CIITA 음성(CIITA-/-))이다. 일부 실시형태에서, B2M-/-을 포함하는 이펙터 세포는 iPSC로부터 유래된 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, B2M-/-CIITA-/-를 포함하는 이펙터 세포는 iPSC로부터 유래된 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, B2M-/-를 포함하는 이펙터 세포는 iPSC로부터 유래된 T 세포이다. 일부 실시형태에서, B2M-/-CIITA-/-를 포함하는 이펙터 세포는 iPSC로부터 유래된 T 세포이다. 일부 실시형태에서, iPSC 및 이의 유래 세포는 iPSC의 분화능 및 유래 T 세포와 NK 세포를 포함하는 유래된 이펙터 세포의 기능에 부정적인 영향을 주지 않으면서, 추가 모달리티뿐만 아니라 CD38 음성, 외인성 CD16 또는 이의 변이체, CAR 발현, 사이토카인/사이토카인 수용체 발현을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 본원에 기재된 하나 이상의 추가적인 게놈 편집을 포함한다.
2. CD38 녹-아웃
세포 표면 분자 CD38은 다발성 골수종 및 CD20 음성 B 세포 악성종양을 포함하는 림프구성 계통 및 골수성 계통 둘 모두로부터 유래된 다수의 혈액학적 악성종양에서 고도로 상향조절되고, 이는 암 세포를 고갈시키는 항체 치료제를 매력적인 표적으로 만든다. 항체 매개된 암 세포 고갈은 보통 직접적인 세포 아폽토시스 유도와 ADCC(항체 의존적 세포 매개된 세포독성)와 같은 면역 이펙터 기전의 활성화의 조합에 기인한다. ADCC 이외에, 치료적 항체와 조화된 면역 이펙터 기전은 항체-의존성 세포-매개 식세포작용(ADCP) 및/또는 보체 의존적 세포독성(CDC)을 또한 포함할 수 있다.
CD38은 악성 세포에서 고도로 발현되기 보다는 혈장 세포뿐만 아니라 NK 세포 및 활성화된 T 세포 및 B 세포에서 또한 발현된다. CD38은 조혈작용 동안 CD34+ 줄기 세포 및 림프구성, 적혈구성 및 골수성의 계통 결정 전구체 상에서 혈장 세포 단계에 걸쳐 계속되는 성숙의 최종 단계 동안 발현된다. CD38은 II형 막관통 당단백질로서 뉴클레오티드-대사물질의 생성에 관여된 다기능성 효소 및 수용체 둘 모두로서 세포 기능을 수행한다. 효소로서, CD38은 NAD+에서 ADP-리보오스로의 반응의 합성 및 가수분해를 촉매함으로써, 칼슘 의존적인 세포 부착 과정에 중요한 세포내 소포체 및 리소좀으로부터의 칼슘의 방출을 자극하는 2차 메신저 CADPR 및 NAADP를 생성한다. CD38은 수용체로서 CD31을 인식하고, 활성화된 NK 세포에서 세포독성 및 사이토카인 방출을 조절한다. CD38은 세포질 Ca2+ 플럭스를 조절하고, 림프구성 및 골수성 세포에서 신호 변환을 매개하기 위해 지질 뗏목(lipid raft)에서 세포 표면 단백질과 회합하는 것으로 또한 보고된다.
악성종양 치료에서, CD38 항원 결합 수용체 형질도입된 T 세포의 전신 사용은 CD34+ 조혈 전구 세포, 단핵구, NK 세포, T 세포 및 B 세포의 CD38+ 분획을 용해시키는 것으로 밝혀졌고, 이는 손상된 수용자 면역 이펙터 세포 기능 때문에 불완전한 치료 반응과 감소되거나 제거된 효능을 야기한다. 또한, CD38 특이적 항체인 다라투무맙으로 치료된 다발성 골수종 환자에서, T 세포 및 B 세포와 같은 다른 면역 세포 유형이 이의 CD38 발현에도 불구하고 영향을 받지 않지만 골수 및 말초혈 둘 모두에서의 NK 세포 감소가 관찰되었다(문헌[Casneuf et al., Blood Advances. 2017; 1(23):2105-2114]). 이론에 의해 제한되지 않으면서, 본 출원은 HLA 결핍 및 CD38 컨디셔닝을 통해 동종이계 이펙터 세포에 대한 동종 거부를 감소시킴으로써, 이펙터 세포 생존 및 지속성을 증가시키는 CD38 표적화된 암 치료의 가능성을 최대한 활용하는 전략을 제공한다. 이와 같이, 본 출원은 또한 수용자 T 및 B 세포의 활성화에 대해 항-CD38 항체 또는 CD38-CAR(키메라 항원 수용체)과 같은 CD38 길항제를 사용함으로써 동종 거부를 감소시키거나 방지함으로써 이펙터 세포 지속성 및/또는 생존을 향상시키는 전략을 제공하며, 이는 일부 실시형태에서 입양 세포 전달 전 Cy/Flu(시클로포스파미드/플루다라빈)와 같은 화학요법을 사용하는 림프구 고갈의 대체재로서 사용될 수 있다. 본 출원에 또한 개시된 것은, 일부 실시형태에서, 항-CD38 항체 또는 CD38 억제제의 존재 하에서 hnCD16a+/CD38- 이펙터 세포를 사용하여 CD38+ T 및 pbNK 세포를 표적화하는 경우, CD38+ 동종반응성 세포의 고갈은 NAD(니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, CD38의 기질) 이용가능성을 증가시키고, NAD 소모 관련 세포 사멸을 감소시키고, 이는 다른 이점 중에서, 면역억제성 종양 미세환경에서 이펙터 세포 반응을 촉진하고, 노화, 퇴행성 또는 염증성 질환에서 세포 역노화를 지지한다는 것이다.
따라서, 본원에 제공된 전략은 또한 B2M-/-, CD38 녹-아웃, 및 선택적으로 CIITA-/-를 포함하는 iPSC주를 생성하는 것, 단일 세포 분류 및 확장된 클론성 iPSC를 포함하는 마스터 세포 은행을 생성하는 것과 조작된 iPSC주의 지향성 분화를 통해 B2M-/-CIITA-/-CD38-/-를 포함하는 유래 이펙터 세포 또는 B2M-/- CD38 음성(CD38-/-)을 포함하는 유래 이펙터 세포를 획득하는 것을 포함하며, 이때 유래 이펙터 세포는 대사 적합성 향상, 산화 스트레스에 대한 내성 증가 및 세포 활성화 및 이펙터 기능을 향상시키는 이펙터 세포의 단백질 발현 프로그램 유도 등의 다른 이점 중에서 CD38 표적화된 치료 모이어티가 이펙터 세포와 이용되는 경우, 동족살해 및 동종 거부에 대하여 보호된다. 또한, 항-CD38 단일클론 항체 치료는 환자의 조혈 줄기 세포 구획에 유해한 영향을 미치지 않으면서 환자의 활성화된 면역계를 상당히 고갈시킨다. CD38 음성 유래 세포는 CD38 항체 매개된 고갈에 저항하는 능력을 갖지만, 독성 컨디셔닝제의 사용 없이 항-CD38 항체 또는 CD38-CAR과 조합되어 효과적으로 투여될 수 있기 때문에, 화학요법-기반 림프구 제거를 감소 및/또는 대체할 수 있다. 일 실시형태에서, iPSC주에서의 CD38 녹아웃은 이중대립유전자 녹아웃이다.
본원에서 개시된 바와 같이, 제공된 B2M-/-CD38-/-, 및 선택적으로 CIITA-/-를 포함하는 iPSC주는 한정적 조혈 내피(HE) 능력을 갖는 중배엽 세포, 한정적 HE, CD34+ 조혈 세포, 조혈 줄기 및 전구체, 조혈 다능성 전구체(MPP), T 세포 전구체, NK 세포 전구체, 골수 세포, 호중구 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 호중구, 수지상 세포 및 대식세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 기능성 유래 조혈 세포를 생성하기 위한 지향성 분화가 가능하다. 일부 실시형태에서, 항-CD38 항체를 사용하여 ADCC를 유도하거나 CD38-CAR을 표적화된 세포 사멸을 위해 사용하는 경우, B2M-/-CD38-/-를 포함하는 iPSC 및 B2M-/-CIITA-/-CD38-/-를 포함하는 iPSC 및/또는 이의 유래 이펙터 세포는 항-CD38 항체 또는 CD38-CAR에 의해 제거되지 않고, 이에 의해 상기 치료 모이어티의 존재 하에서 및/또는 이에 대한 노출 후에 iPSC 및 이의 이펙터 세포 지속성 및/또는 생존을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 이펙터 세포는 상기 치료적 모이어티의 존재 하에 및/또는 이에 대한 노출 후에 증가된 생체내 지속성 및/또는 생존을 갖는다. 일부 실시형태에서, 유래된 이펙터 세포는 iPSC로부터 유래된 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, B2M-/-CD38-/-를 포함하는 이펙터 세포는 iPSC로부터 유래된 T 세포이다. 일부 실시형태에서, B2M-/-CIITA-/-CD38-/-를 포함하는 이펙터 세포는 iPSC로부터 유래된 T 세포이다. 일부 실시형태에서, B2M-/-CD38-/-를 포함하는 iPSC 및/또는 B2M-/-CIITA-/-CD38-/-를 포함하는 iPSC 및/또는 이의 유래 세포는 추가의 모달리티뿐만 아니라 외인성 CD16 발현, CAR 발현, 사이토카인/사이토카인 수용체 발현을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가적인 게놈 편집을 포함한다.
3. CD16 녹-인
CD16은 Fc 수용체 FcγRIIIa(CD16a; NM_000569.6) 및 FcγRIIIb(CD16b; NM_000570.4)인 2개의 이소폼을 갖는 것으로 확인되었다. CD16a는 NK 세포에 의해 발현된 막관통 단백질이고, 이는 NK 세포를 활성화하고 항체 의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)을 촉진하도록 표적 세포에 부착된 단량체성 IgG에 결합한다. CD16b는 인간 호중구에 의해 배타적으로 발현된다. 본원에 사용된 "고친화성 CD16", "비절단성 CD16" 또는 "고친화성 비절단성 CD16"은 다양한 CD16 변이체를 지칭한다. 야생형 CD16은 낮은 친화성을 갖고, NK 세포 활성화 시 백혈구에 대한 다양한 세포 표면 분자의 세포 표면 밀도를 조절하는 단백분해 절단 과정인 엑토도메인 섀딩에 적용된다. F176V(일부 간행물에서는 F158V라고도 지칭됨)는 고친화도를 갖는 예시적인 CD16 다형 변이체인 반면; S197P 변이체는 CD16의 유전자 조작된 비절단성 버전의 예이다. F176V 및 S197P 둘 모두를 포함하는 조작된 CD16 변이체는 고친화도를 갖고 비절단성이고, 이는 국제공개 WO 2015/148926호에 더 자세히 기재되어 있고, 이의 완전한 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 또한, CD64 엑토도메인의 적어도 일부로 본질적으로 대체된 CD16의 엑토도메인을 갖는 키메라 CD16 수용체는 ADCC를 수행할 수 있는 CD16 수용체의 원하는 고친화성 및 비절단성 특징을 또한 달성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키메라 CD16의 대체 엑토도메인은 CD64의 EC1, EC2 및 EC3 엑손 중 하나 이상(UniPRotKB_P12314, 또는 이의 이소폼 또는 다형 변이체)을 포함한다.
이와 같이, 세포로 도입된 외인성 CD16의 다양한 실시형태는 기능성 CD16 변이체 및 이의 키메라 수용체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 기능적 CD16 변이체는 고친화성 비절단성 CD16 수용체(hnCD16)이다. hnCD16은 일부 실시형태에서 F176V 및 S197P 둘 모두를 포함하고; 일부 실시형태에서 절단 영역이 제거되고, F176V를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, hnCD16은 CD64 엑토도메인의 적어도 일부를 각각 포함하는 서열 번호 1, 2 및 3인 임의의 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100% 또는 그 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 본원 및 본 출원 전체에서 사용된 바와 같이, 두 서열 사이의 퍼센트 동일성은 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수(즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총수 x 100)이며, 이때 두 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭(gap)의 수, 및 각각의 갭의 길이를 고려한다. 당업계에 알려진 수학적 알고리즘을 사용하여 서열의 비교 및 두 서열 사이의 퍼센트 동일성의 결정이 달성될 수 있다.
서열 번호 1
MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLQLPTPVWFHYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSV KTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
(340 아미노산 CD64 도메인-기반 구성; CD16TM; CD16ICD )
서열 번호 2
MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSV KTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
(336 아미노산 CD64 엑손 기반 구성; CD16TM; CD16ICD )
서열 번호 3
MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNG
TATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPL
ALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAG
ISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSFYMGSKTLRGRN
TSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGFFPPGYQVSFCLVMVLLF
AVDTGLYFSV KTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
(335 아미노산 CD64 엑손 기반 구성; CD16TM; CD16ICD )
따라서, 본원에는 본원에 고려되고 기재된 다른 편집들 중에서, 고친화성 비절단성 CD16 수용체(hnCD16)인 외인성 Cd16을 포함하도록 유전자 조작된 클론성 iPSC가 제공되며, 유전자 조작된 iPSC는 iPSC로 도입된 hnCD16을 포함하는 이펙터 세포로 분화할 수 있다. 일부 실시형태에서, B2M-/- CD38-/- 및 외인성 CD16을 포함하는 유래된 이펙터 세포는 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, B2M-/- CIITA-/-CD38-/- 및 외인성 CD16을 포함하는 유래된 이펙터 세포는 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, B2M-/-CD38-/- 및 외인성 CD16을 포함하는 유래된 이펙터 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, B2M-/-CIITA-/-CD38-/- 및 외인성 CD16을 포함하는 유래된 이펙터 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 유래된 NK 세포는 항체로 사전로딩된다. 일부 실시형태에서, 유래된 NK 세포는 항체와의 병용 요법에서 사용된다. 일부 실시형태에서, 병용 요법에서의 항체 또는 유래된 NK 세포로 사전로딩된 항체는 CD38을 특이적으로 표적화한다. 일부 실시형태에서, 병용 요법에서의 항체 또는 유래된 NK 세포로 사전로딩된 항체는 CD38과 상이한 항원을 특이적으로 표적화한다. 일부 실시형태에서, 항-CD38 항체는 다라투무맙이다.
iPSC 또는 이의 유래 세포에서 발현된 외인성 hnCD16은 ADCC 항체 또는 이의 단편뿐만 아니라 상기 hnCD16의 CD16 또는 CD64 세포외 결합 도메인을 인식하는 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 인게이저 또는 결합제에 대한 결합에서 높은 친화성을 갖는다. 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 인게이저 또는 결합제는 본 출원에서 하기에 추가로 기재되어 있다. 이와 같이, 본 출원은 유래 이펙터 세포 상에서 발현된 hnCD16의 세포외 도메인과의 고친화성 결합을 통해서 하나 이상의 미리 선택된 ADCC 항체가 사전로딩된 유래 이펙터 세포 또는 이의 세포 집단을 하기에 추가로 상세하게 기재된 병태, 질환 또는 감염의 치료에서 치료 용도에 충분한 양으로 제공하며, 상기 hnCD16은 F176V 및 S197P를 갖는 CD64 또는 CD16의 세포외 결합 도메인을 포함한다.
일부 다른 실시형태에서, iPSC 또는 이의 유래 세포에서 발현된 외인성 CD16은 CD16-기반 CFcR, 또는 이의 변이체를 포함한다. 키메라 Fc 수용체(CFcR)는 천연 CD16 막관통 도메인 및/또는 세포내 도메인을 변형시키거나 대체함으로써 비천연 막관통 도메인, 비천연 자극 도메인 및/또는 비천연 신호전달 도메인을 포함하도록 제조된다. 본원에서 사용된 용어 "비천연"은 세포외 도메인을 제공하는 수용체 이외의 상이한 수용체로부터 막관통 도메인, 자극 도메인 또는 신호전달 도메인이 유래된다는 것을 의미한다. 본원의 예시에서, CD16을 기반으로 하는 CFcR 또는 이의 변이체는 CD16으로부터 유래되는 막관통 도메인, 자극 도메인 또는 신호전달 도메인을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 외인성 CD16-기반 CFcR은 CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D, 또는 T 세포 수용체 폴리펩티드로부터 유래된 비-천연 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 CD16-기반 CFcR은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 또는 NKG2D 폴리펩티드로부터 유래된 비-천연 자극/억제 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 CD16-기반 CFcR은 CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137(4-1BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 또는 NKG2D 폴리펩티드로부터 유래된 비-천연 신호전달 도메인을 포함한다. CD16-기반 CFcR의 일부 실시형태에서, 제공된 키메라 Fc 수용체는 IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 또는 NKG2D 폴리펩티드 중 하나로부터 둘 모두 유래된 막관통 도메인 및 신호전달 도메인을 포함한다. CD16-기반 키메라 Fc 수용체의 하나의 특정 예시적 실시형태는 NKG2D의 막관통 도메인, 2B4의 자극 도메인 및 CD3ζ의 신호전달 도메인을 포함하며; CFcR의 세포외 도메인은 CD64 또는 CD16의 세포외 도메인의 전체 길이 또는 부분 서열로부터 유래되고, CD16의 세포외 도메인은 F176V 및 S197P를 포함한다. CD16-기반 키메라 Fc 수용체의 다른 예시적 실시형태는 CD3ζ의 막관통 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하고; CFcR의 세포외 도메인은 CD64 또는 CD16의 세포외 도메인의 전체 길이 또는 부분 서열로부터 유래되고, CD16의 세포외 도메인은 F176V 및 S197P를 포함한다.
상기 기재된 것과 같은 CD16-기반 키메라 Fc 수용체의 다양한 실시형태는 항체 또는 이의 단편의 Fc 영역; 또는 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 인게이저 또는 결합제에 고친화성으로 결합할 수 있다. 결합 시, 키메라 수용체의 자극 도메인 및/또는 신호전달 도메인은 이펙터 세포의 활성화 및 사이토카인 분비, 및 항체, 또는 종양 항원 결합 성분뿐만 아니라 Fc 영역을 갖는 상기 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 인게이저 또는 결합제에 의해 표적화된 종양 세포의 사멸을 가능하게 한다. 이론에 의해 제한되지 않으면서, CD16-기반 키메라 Fc 수용체의 비-천연 막관통, 자극 및/또는 신호전달 도메인을 통해, 또는 이의 엑토도메인에 대한 인게이저 결합을 통해, CFcR은 이펙터 세포의 증식 및/또는 확장 능력을 증가시키면서 이펙터 세포의 사멸 능력에 기여할 수 있었다. 항체 및 인게이저는 항원을 발현하는 종양 세포 및 CFcR을 발현하는 이펙터 세포가 가까이 근접하게 할 수 있고, 이는 또한 종양 세포의 향상된 사멸에 기여한다. 이중특이적, 삼중특이적, 다중특이적 인게이저 또는 결합제에 대한 예시적인 종양 항원은 B7H3, BCMA, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD179b, CEA, CLEC12A, CS-1, DLL3, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, FLT-3, FOLR1, FOLR3, GD2, gpA33, HER2, HM1.24, LGR5, MSLN, MCSP, MICA/B, PSMA, PAMA, P-카드헤린 및 ROR1을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 종양 세포를 공격하는 데 있어서 CD16-기반 CFcR을 발현하는 이펙터 세포를 결합하기에 적합한 일부 비제한적인 예시적인 이중특이적, 삼중특이적, 다중특이적 인게이저 또는 결합제는 CD16(또는 CD64)-CD30, CD16(또는 CD64)-BCMA, CD16(또는 CD64)-IL15-EPCAM 및 CD16(또는 CD64)-IL15-CD33을 포함한다.
NK 세포 활성화 후 세포 표면으로부터 절단된 1차 NK 세포에 의해 발현된 내인성 CD16과 달리, 유래 NK 세포에서의 CD16의 다양한 비절단성 버전은 CD16 섀딩을 피하고 일정한 발현을 유지한다. 유래 NK 세포에서, 비절단성 CD16은 TNFα 및 CD107a의 발현을 증가시켜 개선된 세포 기능성을 나타낸다. 비절단성 CD16은 또한 항체 의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC), 및 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 인게이저의 결합을 향상시킨다. ADCC는 항체 코팅된 표적 세포에 대한 CD16의 결합을 통한 NK 세포 매개된 용해의 메커니즘이다. 유래된 NK 세포에서의 도입된 hnCD16의 추가의 고친화성 특징은 또한 세포 치료를 필요로 하는 대상체에게 세포를 투여하기 전에 hnCD16을 통한 NK 세포로의 ADCC 항체의 시험관내 로딩을 가능하게 한다. 본원에 제공된 바와 같이, 일부 실시형태에서, hnCD16은 F176V 및 S197P를 포함할 수 있거나, CD64로부터 유래된 전체 길이 또는 부분 길이 엑토도메인을 포함할 수 있거나, 비-천연 막관통 도메인, 자극 도메인 및 신호전달 도메인 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다. 개시된 바와 같이, 본 출원은 또한 본 출원에서 추가로 상세하게 기재된 병태, 질환 또는 감염의 치료에서 치료 용도에 충분한 양으로 하나 이상의 사전-선택된 ADCC 항체가 사전로딩된, 유래 NK 세포 또는 이의 세포 집단을 제공한다. 일부 실시형태에서, 사전로딩된 항체는 항-CD38 항체이다. 일 특정 실시형태에서, 항-CD38 항체는 다라투무맙이다.
1차 NK 세포와 달리, 1차 공급원(즉, 말초혈, 제대혈 또는 다른 공여자 조직과 같은 자연/천연 공급원)으로부터의 성숙 T 세포는 CD16을 발현하지 않는다. 발현된 외인성 비절단성 CD16을 포함하는 iPSC가 T 세포 발생 생물학을 손상시키지 않았고, 외인성 CD16을 발현할 뿐만 아니라 획득된 ADCC 기전을 통해 기능을 수행할 수 있는 기능적 유래 T계 세포로 분화할 수 있었다는 것은 예상치 못했다. 유래 T계 세포에서의 이러한 획득된 ADCC는 이중 표적화에 대한 접근법으로서 및/또는 CAR-T 세포 치료에 의해 대개 발생한 항원 회피를 구제하도록 추가로 사용될 수 있으며, CAR(키메라 항원 수용체)에 의한 인식을 피하기 위한 CAR-T 표적화된 항원 발현 또는 돌연변이된 항원의 발현이 감소되거나 소실되면서 종양이 재발한다. 상기 유래 T계 세포가 기능적 변이체 및 CD16-기반 CFcR, 발현을 포함하는 외인성 CD16을 통해 획득된 ADCC를 포함할 때, 그리고 항체가 CAR에 의해 표적화된 종양 항원과 다른 종양 항원을 표적화할 때, CAR-T 항원 회피를 구제하고, CAR-T 치료에서 대개 보이는 표적화된 종양의 재발 또는 재발생을 감소시키거나 방지하기 위해 항체가 사용될 수 있다. 이중 표적화를 달성하면서 항원 회피를 감소시키고/시키거나 방지하기 위한 이러한 전략은 하나 이상의 CAR을 발현하는 NK 세포에 동등하게 적용가능하다. 이러한 항원 회피 감소 및 방지 전략에 사용될 수 있는 다양한 CAR은 하기에 추가로 기술된다.
4. 키메라 항원 수용체(CAR) 발현
당업계에 알려진 임의의 CAR 설계는 유전자 조작된 iPSC 및 이의 유래 이펙터 세포에 적용가능할 수 있다. CAR은 항원 인식 도메인을 포함하는 엑토도메인, 막관통 도메인, 및 엔도도메인을 일반적으로 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 엑토도메인은 신호 펩티드 또는 리더 서열 및/또는 스페이서를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 엔도도메인은 CAR을 발현하는 이펙터 세포를 활성화하는 신호전달 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 엔도도메인은 신호전달 도메인을 추가로 포함할 수 있으며, 신호전달 도메인은 T 및/또는 NK 세포 활성화 또는 기능화에 특이적인 신호 변환 단백질의 세포질 도메인에서 기원한다. 일부 실시형태에서, 항원 인식 도메인은 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 인식 도메인은 질환 또는 병원균과 관련된 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 질환 관련 항원은 종양 항원이고, 종양은 액체 종양 또는 고형 종양일 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR은 상기 CAR을 발현하는 T계 세포 또는 NK계 세포 중 어느 하나를 활성화하는 데 적합하다. 일부 실시형태에서, CAR은 NK-특이적 신호전달 성분을 포함하기 위해 NK 세포-특이적이다. 특정한 실시형태에서, 상기 T 세포는 CAR을 발현하는 iPSC로부터 유래되고, 유래 T계 세포는 T 헬퍼 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포, αβ T 세포, γδ T 세포, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 상기 NK 세포는 CAR-발현 iPSC로부터 유래된다.
특정한 실시형태에서, 상기 항원 인식 영역/도메인은 쥐과 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 낙타 Ig, 단일 가변 신항원 수용체(VNAR), 상어 중쇄 항체(Ig NAR), 키메라 항체, 재조합 항체, 또는 이의 항체 단편을 포함한다. 항체 단편의 비제한적인 예는 Fab, Fab', F(ab)'2, F(ab)'3, Fv, 단일 사슬 항원 결합 단편(scFv), (scFv)2, 디설파이드 안정화된 Fv(dsFv), 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 단일 도메인 항원 결합 단편(sdAb, 나노바디), 재조합 중쇄 전용 항체(VHH), 및 전장 항체의 결합 특이성을 유지하는 다른 항체 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR의 항원 인식 영역은 종양 관련 항원(TAA)을 표적화하는 T 세포 수용체(TCR)의 결합 도메인에서 기원한다.
CAR에 의해 표적화될 수 있는 항원의 비제한적인 예는 ADGRE2, B7H3, 탄산탈수효소 IX(CAIX), CCR1, CCR4, 암배아 항원(CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원, 상피 당단백질-2(EGP-2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 부착 분자(EpCAM), EGFRvIII, 수용체 티로신-단백질 키나아제 erb­B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산-결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 엽산 수용체-α, 갱글리오사이드 G2(GD2), 갱글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2), 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Rα2), κ-경쇄, 키나아제 삽입 도메인 수용체(KDR), 루이스 A(CA19.9), 루이스 Y(LeY), L1 세포 부착 분자(L1-CAM), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A 1(MAGE-A1), MICA/B, MR1, 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, NY-ESO-1, 종양태아 항원(h5T4), PDL1, PRAME, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), PRAME 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 종양 관련 당단백질 72(TAG-72), TIM-3, TRBC1, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­R2), 윌름스 종양 단백질(WT-1), 및 당업계에 알려진 다양한 병원성 항원을 포함한다. 병원균의 비제한적인 예는 질환을 야기할 수 있는 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충 및 원생동물을 포함한다.
따라서, 일부 실시형태에서, 유전자 조작된 iPSC 및 이의 유래 세포는 CAR을 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하며, CAR은 CD19-CAR, BCMA-CAR, B7H3-CAR, MICA/B-CAR, HER2-CAR, 또는 MR1-CAR을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR의 막관통 도메인은 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD16, CD27, CD28, CD28H, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA4, PD1, LAG3, 2B4, BTLA, DNAM1, DAP10, DAP12, FcERIγ, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D, CS1, 또는 T 세포 수용체 폴리펩티드의 천연 막관통 영역 또는 변형된 막관통 영역의 전체 길이 또는 적어도 일부를 포함한다.
일부 실시형태에서, 엔도도메인(또는 세포내 도메인)의 신호 변환 펩티드는 2B4(자연 살해 세포 수용체 2B4), 4-1BB(종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 9), CD16(IgG Fc 영역 수용체 III-A), CD2(T-세포 표면 항원 CD2), CD28(T-세포-특이적 표면 당단백질 CD28), CD28H(막관통 및 면역글로불린 도메인-함유 단백질 2), CD3ζ(T-세포 표면 당단백질 CD3 제타 사슬), CD3ζ1XX(CD3ζ 변이체), DAP10(조혈 세포 신호 변환제), DAP12(TYRO 단백질 티로신 키나아제-결합 단백질), DNAM1(CD226 항원), FcERIγ(고친화도 면역글로불린 엡실론 수용체 서브유닛 감마), IL21R(인터류킨-21 수용체), IL-2Rβ/IL-15RB(인터류킨-2 수용체 서브유닛 베타), IL-2Rγ(사이토카인 수용체 공통 서브유닛 감마), IL-7R(인터류킨-7 수용체 서브유닛 알파), KIR2DS2(살해 세포 면역글로불린-유사 수용체 2DS2), NKG2D(NKG2-D형 II 통합 막 단백질), NKp30(자연 세포독성 유발 수용체 3), NKp44(자연 세포독성 유발 수용체 2), NKp46(자연 세포독성 유발 수용체 1), CS1(SLAM 패밀리 구성원 7), 및 CD8(T-세포 표면 당단백질 CD8 알파 사슬)의 폴리펩티드의 전체 길이 또는 적어도 일부를 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR의 엔도도메인은 제2 신호전달 도메인, 및 선택적으로 제3 신호전달 도메인을 추가로 포함하고, 제1 신호전달 도메인, 제2 신호전달 도메인 및 제3 신호전달 도메인 각각은 상이하다. 특정 실시형태에서, 제2 신호전달 도메인 및/또는 제3 신호전달 도메인은 2B4, 4-1BB, CD16, CD2, CD28, CD28H, CD3ζ, DAP10, DAP12, DNAM1, FcERIγ IL21R, IL-2Rβ(IL-15Rβ), IL-2Rγ, IL-7R, KIR2DS2, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, CD3ζ1XX, CS1, 또는 CD8의 세포질 도메인 또는 이의 부분을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 엔도도메인은 적어도 하나의 공동자극 신호전달 영역을 추가로 포함한다. 상기 공동자극 신호전달 영역은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 또는 NKG2D의 폴리펩티드의 전체 길이 또는 적어도 일부, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 세포에 적용가능한 CAR은 CD28로부터 유래된 공동자극 도메인 및 서열 번호 4와 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표시된 CD3ζ의 천연 ITAM1 또는 변형된 ITAM1을 포함하는 신호전달 도메인을 포함한다. 추가의 실시형태에서, CD28로부터 유래된 공동자극 도메인, 및 CD3ζ의 천연 ITAM1 또는 변형된 ITAM1을 포함하는 CAR은 CD28로부터 유래된 막관통 도메인 및 힌지 도메인을 또한 포함하며, scFv는 힌지를 통해 막관통 도메인에 연결될 수 있고, CAR은 서열 번호 5와 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
서열 번호 4
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQ
LYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGE
RRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR
(153 아미노산 CD28 공동자극 + CD3ζITAM)
서열 번호 5
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP FWVLVVVGGVLACYSLLVTVA
FIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAY
QQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSE
IGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR
(219 아미노산 CD28 힌지 + CD28 TM + CD28 공동자극 + CD3ζITAM)
다양한 실시형태에서, 본원에 제공된 세포에 적용가능한 CAR은 NKG2D로부터 유래된 막관통 도메인, 2B4로부터 유래된 공동자극 도메인, 및 서열 번호 6과 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표시된 천연 CD3ζ 또는 변형된 CD3ζ를 포함하는 신호전달 도메인을 포함한다. NKG2D로부터 유래된 막관통 도메인, 2B4로부터 유래된 공동자극 도메인, 및 천연 CD3ζ 또는 변형된 CD3ζ를 포함하는 신호전달 도메인을 포함하는 상기 CAR은 CD8 힌지를 추가로 포함할 수 있고, 이와 같은 구조의 아미노산 서열은 서열 번호 7과 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 동일성을 갖는다.
서열 번호 6
SNLFVASWIAVMIIFRIGMAVAIFCCFFFPSWRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKT
RRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNS
TIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRR
EEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGL
YQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
(263 아미노산 NKG2D TM + 2B4 + CD3ζ)
서열 번호 7
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD SNLFVASWIAVMIIF
RIGMAVAIFCCFFFPSWRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGS
TIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTIYEVIGKSQPKAQN
PARLSRKELENFDVYSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPE
MGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDAL
HMQALPPR
(308 아미노산 CD8 힌지 + NKG2D TM + 2B4 + CD3ζ)
비제한적인 CAR 전략은 한 쌍의 세포내 도메인의 이량체화를 통한 이종이량체성인 조건적으로 활성화된 CAR(예를 들어, 미국 특허 제9,587,020호 참조); CAR을 생성하기 위한 항원 결합, 힌지 및 엔도도메인의 상동성 재조합이 있는 분할 CAR(예를 들어, 미국 특허출원공개 US 2017/0183407호 참조); 각각 항원 결합 도메인 및 신호전달 도메인에 연결된 2개의 막관통 도메인 사이의 비공유 연결을 허용하는 다중쇄 CAR(예를 들어, 미국 특허출원공개 US 2014/0134142호 참조); 이중특이적 항원 결합 도메인을 갖는 CAR(예를 들어, 미국 특허 제9,447,194호 참조), 또는 동일한 또는 상이한 항원 또는 에피토프를 인식하는 한 쌍의 항원 결합 도메인을 갖는 것(예를 들어, 미국 특허 제8,409,577호 참조), 또는 탠덤 CAR(예를 들어, 문헌[Hegde et al., J Clin Invest. 2016;126(8):3036-3052] 참조); 유도성 CAR(예를 들어, 미국 특허출원공개 US 2016/0046700호, 미국 특허출원공개 US 2016/0058857호, 및 미국 특허출원공개 US 2017/0166877호 참조); 스위칭가능한 CAR(예를 들어, 미국 특허출원공개 US 2014/0219975호 참조); 및 당업계에 알려진 임의의 다른 설계를 추가로 포함한다.
이와 같이, 본 발명의 양태는 게놈 조작된 iPSC를 분화하여 얻은 유래 세포를 제공하며, iPSC 및 유래 세포 둘 모두는 표 1에 제공된 바와 같은 추가의 변형된 모달리티와 함께 하나 이상의 CAR을 포함한다. 일부 실시형태에서, B2M-/-CD38-/- CAR을 포함하는 이펙터 세포는 iPSC로부터 유래된 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, B2M-/-CIITA-/-CD38-/- CAR을 포함하는 이펙터 세포는 iPSC로부터 유래된 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, B2M-/-CD38-/- CAR을 포함하는 이펙터 세포는 iPSC로부터 유래된 T 세포이다. 일부 실시형태에서, B2M-/-CIITA-/-CD38-/- CAR을 포함하는 이펙터 세포는 iPSC로부터 유래된 T 세포이다. 일부 실시형태에서, iPSC 및 이의 유래 세포는 iPSC의 분화능 및 유래 T 세포와 NK 세포를 포함하는 유래된 이펙터 세포의 기능에 부정적인 영향을 주지 않으면서, 추가 모달리티뿐만 아니라 외인성 CD16 발현 및/또는 사이토카인/사이토카인 수용체 발현을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 본원에 기재된 하나 이상의 추가적인 게놈 편집을 포함한다.
5. 외인성으로 도입된 사이토카인 신호전달 복합체
임상적으로 관련된 사이토카인의 전신 고용량 투여를 회피함으로써, 사이토카인 매개된 세포 자율성이 확립되면서 이러한 실행으로 인한 용량 제한 독성의 위험은 감소한다. 가용성 사이토카인을 추가로 투여할 필요성 없이, 림프구 자율성을 달성하기 위해서, IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21 및/또는 이들 각각의 수용체 중 하나 이상의 부분 또는 전장 펩티드를 포함하는 사이토카인 신호전달 복합체가 사이토카인 자체의 발현과 함께 또는 발현 없이 사이토카인 신호전달을 가능하게 하기 위해서 세포로 도입되고, 이에 의해서 사이토카인 독성의 위험 감소와 함께 세포 성장, 증식, 확장 및/또는 이펙터 기능을 유지하거나 개선시킨다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달을 위한 도입된 사이토카인 및/또는 이의 각각의 천연 또는 변형된 수용체(신호전달 복합체)가 세포 표면 상에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달은 항시적으로 활성화된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달의 활성화는 유도성이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달의 활성화는 일시적(transient)이고/이거나 시간적(temporal)이다.
IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18 및 IL21을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 사이토카인 신호전달을 위한 사이토카인 신호전달 복합체의 세포로의 도입을 위한 다양한 작제물 설계가 본원에 제공된다. 사이토카인 신호전달 복합체가 IL15에 대한 것인 실시형태에서, 막관통(TM) 도메인은 IL15 수용체에 천연일 수 있거나, 임의의 다른 막 결합된 단백질의 막관통 도메인으로 변형되거나 대체될 수 있다. 일부 실시형태에서, IL15 및 IL15Rα는 IL15의 시스 제시(cis-presentation)를 배제함 없이 IL15의 트랜스 제시(trans-presentation)를 모방하는 자가 절단 펩티드를 사용하여 공동 발현한다. 다른 실시형태에서, IL15Rα는 링커를 통해 C-말단에서 IL15에 융합되어, IL15의 시스 제시의 제거 없이 트랜스 제시를 모방할 뿐만 아니라 IL15 막-결합성을 보장한다. 다른 실시형태에서, 절단된 세포내 도메인을 갖는 IL15Rα가 링커를 통해 C-말단에서 IL15에 융합되어서, IL15의 트랜스 제시를 모방하고, IL15 막-결합성을 유지하고, 이의 세포내 도메인을 통해 일반 IL15R에 의해 매개된 시스 제시 및/또는 임의의 다른 가능한 신호 변환 경로를 추가로 제거한다.
이와 같이 절단된 작제물은 서열 번호 8과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 절단된 IL15/IL15Rα의 일 실시형태에서, 작제물은 서열 번호 8의 마지막 4개 아미노산 잔기(KSRQ)를 포함하지 않고, 서열 번호 9와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
서열 번호 8
MDWTWILFLVAAATRVHSGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDA
TLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTES
GCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITC
PPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKC
IRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLM
PSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTV
LLCGLSAVSLLACYLKSRQ
(379 아미노산; 신호 및 링커 펩티드는 밑줄 표시됨)
서열 번호 9
MDWTWILFLVAAATRVHSGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDA
TLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTES
GCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITC
PPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKC
IRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLM
PSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTV
LLCGLSAVSLLACYL
(375 아미노산; 신호 및 링커 펩티드는 밑줄 표시됨)
또 다른 실시형태에서, IL15Rα의 세포질 도메인은 IL15가 갖춰진 이펙터 세포의 자율적인 특징에 부정적 영향을 미치지 않으면서 생략될 수 있다. 다른 실시형태에서, 선택적으로 스시 도메인과 막관통 도메인 사이의 링커와 함께 일 말단에서 IL15와 융합되고 다른 말단에서 막관통 도메인(mb-스시)과 융합된 스시 도메인을 제외하고는 전체 IL15Rα는 본질적으로 제거된다. 세포 표면에서 임의의 막 결합된 단백질의 막관통 도메인을 통해 융합된 IL15/mb-스시가 발현된다. 따라서, IL15의 바람직한 트랜스 제시가 유지될 때에만, 시스 제시를 포함하는 IL15Rα를 통한 불필요한 신호전달이 제거된다. 일부 실시형태에서, 스시 도메인과 융합된 IL15를 포함하는 성분은 서열 번호 10과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
서열 번호 10
MDWTWILFLVAAATRVHSGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDA
TLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTES
GCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITC
PPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKC
IR
(242 아미노산; 신호 및 링커 펩티드는 밑줄 표시됨)
사이토카인 신호전달 복합체의 다른 실시형태에서, 천연 또는 변형된 IL15Rβ는 링커를 통해 C 말단에서 IL15에 융합되어, 항시적 신호전달이 가능하게 하고, IL15 막 결합성 및 트랜스 제시를 유지한다. 다른 실시형태에서, 천연 또는 변형된 공통 수용체 γC는 사이토카인의 막 결합성 및 트랜스 제시 및 항시적 신호전달을 위해 링커를 통해 C 말단에서 IL15에 융합된다. 공통 수용체 γC는 IL2 수용체 서브유닛 감마 또는 IL2RG로도 알려진, 공통 감마 사슬 또는 CD132라 또한 지칭한다. γC는 비제한적으로 IL2, IL4, IL7, IL9, IL15 및 IL21 수용체를 포함하는 많은 인터류킨 수용체에 대해 수용체 복합체에 공통인 사이토카인 수용체 서브유닛이다. 다른 실시형태에서, IL15의 부재 하에 동종이량체를 형성하는 조작된 IL15Rβ는 사이토카인의 항시적 신호전달을 생성하는 데 유용하다.
당업자는 상기의 신호 펩티드 및 링커 서열이 예시적이고, 신호 펩티드 또는 링커로서 사용하기에 적합한 이들의 변형을 어떤 방식으로든 제한하지 않음을 이해할 것이다. 당업자에게 알려지고 이용가능한 많은 적합한 신호 펩티드 또는 링커 서열이 존재하며, 당업자는 신호 펩티드 및/또는 링커 서열이 신호 펩티드에 의해서 유도되거나 링커에 의해서 연결된 기능성 펩티드의 활성을 변경하지 않으면서 또 다른 서열 대신 치환될 수 있다는 것을 이해한다.
CAR 및 사이토카인 및/또는 사이토카인 수용체 신호전달("IL")을 포함하는 외인성 신호전달 복합체를 포함하는 iPSC 및 이로부터의 유래 세포에서, CAR 및 IL은 별개의 작제물에서 발현될 수 있거나, CAR 및 IL 둘 모두를 포함하는 바이-시스트로닉 작제물에서 공동 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, iPSC 및 이의 유래 이펙터 세포는 B2M-/-, CIITA-/-, CD38-/-, CD16+, CAR+, 및 IL+를 포함하는 하나 이상의 속성을 포함하는 유전자형을 포함하며, 이는 표 1의 추가 속성 중 어느 하나를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, B2M-/-CD38-/-IL+를 포함하는 이펙터 세포는 iPSC로부터 유래된 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, B2M-/-CIITA-/-CD38-/-IL+를 포함하는 이펙터 세포는 iPSC로부터 유래된 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, B2M-/-CD38-/-IL+를 포함하는 이펙터 세포는 iPSC로부터 유래된 T 세포이다. 일부 실시형태에서, B2M-/-CIITA-/-CD38-/-IL+를 포함하는 이펙터 세포는 iPSC로부터 유래된 T 세포이다. 일부 실시형태에서, iPSC 및 이의 유래 세포는 iPSC의 분화능 및 유래 T 세포와 NK 세포를 포함하는 유래된 이펙터 세포의 기능에 부정적인 영향을 주지 않으면서, 본원에 기재된 하나 이상의 추가적인 게놈 편집을 포함한다.
이와 같이, 다양한 실시형태에서, 사이토카인 IL15 및/또는 이의 수용체는 상기 기재된 작제물 설계 중 하나 이상을 사용하여 iPSC, 및 iPSC 분화 시 이의 유래 세포로 도입될 수 있다. 유도 만능성 세포(iPSC) 이외에, 본원에 개시된 것과 같은 적어도 하나의 조작된 모달리티를 포함하는 클론성 iPSC, 클론성 iPS 세포주, 또는 iPSC 유래된 세포가 제공된다. 또한 이 부문에 기재된 것과 같은 사이토카인 및/또는 사이토카인 수용체 신호전달을 포함하는 적어도 하나의 외인성으로 도입된 신호전달 복합체를 갖는 단일 세포 분류되고 확장된 클론 조작된 iPSC를 포함하는 마스터 세포 은행을 제공하며, 세포 은행은 추가의 iPSC 조작을 위한 플랫폼, 및 조성이 잘 정의되고 균일하며 비용 효과적인 방식으로 상당한 규모로 대량 생산될 수 있는 기성품의, 조작되고 균일한 세포 치료 산물을 제조하기 위한 재생가능한 공급원을 제공한다.
6. 인게이저
인게이저는 상이한 항체 또는 이의 단편의 둘 이상의 단쇄 가변 단편(scFv) 또는 다른 기능성 변이체로 이루어진 융합 단백질로서, 적어도 하나의 scFv는 이펙터 세포 표면 분자 또는 표면 유도 수용체에 결합하고, 적어도 또 다른 하나는 표적 세포 특이적 표면 분자를 통해서 표적 세포에 결합한다. 인게이저의 예는 이중특이적 T 세포 인게이저(BiTE), 이중특이적 살해 세포 인게이저(BiKE), 삼중특이적 살해 세포 인게이저(TriKE), 다중특이적 살해 세포 인게이저, 또는 다수의 면역 세포 유형과 상용성인 범용 인게이저를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 인게이저는 이중특이적 또는 다중특이적일 수 있다. 상기 이중특이적 또는 다중특이적 인게이저는 종양 세포에 대해 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 및/또는 호중구)를 유도하고 면역 이펙터 세포를 활성화할 수 있으며, CAR-T 세포 치료의 이익을 최대화하는 데 큰 잠재성을 보여주었다.
일부 실시형태에서, 인게이저는 병행적 또는 연속적 투여에 의해 본원에 기재된 이펙터 세포의 집단과 병용하여 사용되며, 이펙터 세포는 인게이저에 의해 인식되는 표면 분자, 또는 표면 유도 수용체를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 인게이저는 본원에 기재된 iPSC의 유전자 조작 및 조작된 iPSC의 지향성 분화를 통해 유래 이펙터 세포에 의해 발현되는 이중특이적 항체이다. 이중특이적 또는 다중특이적 인게이저 인식 또는 이의 커플링을 위해서 사용될 수 있는 예시적인 이펙터 세포 표면 분자 또는 표면 유도 수용체는 본원에 개시된 바와 같은 CD3, CD28, CD5, CD16, NKG2D, CD64, CD32, CD89, NKG2C 및 키메라 Fc 수용체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 인게이저 인식을 위해서 유래 이펙터 세포의 표면 상에서 발현되는 외인성 CD16은 본원에 기재된 바와 같은 CD16(F176V 및 선택적으로 S197P 함유) 또는 CD64 세포외 도메인 및 천연 또는 비-천연 막관통, 자극 및/또는 신호전달 도메인을 포함하는 hnCD16이다. 일부 실시형태에서, 인게이저 인식을 위한 이펙터 세포의 표면 상에서 발현된 CD16은 CD16-기반 키메라 Fc 수용체(CFcR)이다. 일부 실시형태에서, CD16-기반 CFcR은 NKG2D의 막관통 도메인, 2B4의 자극 도메인 및 CD3ζ의 신호전달 도메인을 포함하고; CD16의 세포외 도메인은 CD64 또는 CD16의 세포외 도메인의 전체 길이 또는 부분 서열로부터 유래되고; CD16의 세포외 도메인은 F176V 및 선택적으로 S197P를 포함한다.
일부 실시형태에서, 인게이저에 대한 표적 세포는 종양 세포이다. 이중특이적 또는 다중특이적 인게이저 인식을 위한 예시적인 종양 세포 표면 분자는 B7H3, BCMA, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD179b, CEA, CLEC12A, CS-1, DLL3, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, FLT-3, FOLR1, FOLR3, GD2, gpA33, HER2, HM1.24, LGR5, MSLN, MCSP, MICA/B, PSMA, PAMA, P-카드헤린, ROR1을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일 실시형태에서, 이중특이적 인게이저는 CD3 및 CD19에 특이적인 이중특이적 항체(CD3-CD19)이다. 다른 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD16-CD30 또는 CD64-CD30이다. 다른 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD16-BCMA 또는 CD64-BCMA이다. 또 다른 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3-CD33이다.
또 다른 실시형태에서, 이중특이적 항체는 이펙터 세포와 종양 세포 항원 결합 도메인 사이에 링커를 추가로 포함한다. 예를 들어, 변형된 IL15가 세포 확장을 촉진하기 위해 이펙터 NK 세포를 위한 링커로서 사용될 수 있다(일부 간행물에서, TriKE, 또는 삼중특이적 살해 인게이저로 지칭됨). 일 실시형태에서, TriKE는 CD16-IL15-EPCAM 또는 CD64-IL15-EPCAM이다. 다른 실시형태에서, TriKE는 CD16-IL15-CD33 또는 CD64-IL15-CD33이다. 또 다른 실시형태에서, TriKE는 NKG2C-IL15-CD33이다. TriKE에서 IL15는 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL18 및 IL21을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 다른 사이토카인으로부터 또한 기원할 수 있다.
일부 실시형태에서, 이중특이적 인게이저 또는 다중특이적 인게이저를 위한 표면 유도 수용체는 때때로 세포 유형에 따라 이펙터 세포에 내인성일 수 있다. 일부 다른 실시형태에서, 하나 이상의 외인성 표면 유도 수용체는 본원에 제공된 방법 및 조성물을 사용하여, 예를 들어 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 iPSC의 추가적인 조작, 이후 iPSC가 공급원 iPSC와 동일한 유전자형 및 표면 유도 수용체를 포함하는 T, NK 또는 임의의 다른 이펙터 세포로 분화하는 것을 유도함으로써 이펙터 세포에 도입될 수 있다.
7. 면역요법을 위한 항체
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 바와 같은 게놈 조작된 이펙터 세포 이외에, 병태, 질환 또는 적응증과 관련된 항원을 표적으로 하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 추가 치료제가 병용 요법에서 이들 이펙터 세포와 함께 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 대상체에 대한 병행적 또는 연속적 투여에 의해 본원에 기재된 이펙터 세포의 집단과 조합하여 사용된다. 다른 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 상기 항체 또는 이의 단편을 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 사용한 iPSC의 유전자 조작, 및 조작된 iPSC의 유도 분화에 의해 이펙터 세포에 의해 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이펙터 세포는 외인성 CD16 변이체를 발현하며, 이펙터 세포의 세포독성은 ADCC를 통해 항체에 의해 향상된다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간화된 항체, 인간화된 단일클론 항체 또는 키메라 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편은 바이러스 항원에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편은 종양 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 종양 또는 바이러스 특이적 항원은 이의 사멸 능력을 향상시키기 위해 투여된 iPSC-유래된 이펙터 세포를 활성화한다. 일부 실시형태에서, 투여된 iPSC-유래된 이펙터 세포에 대한 추가의 치료제로서 병용 치료에 적합한 항체는 항-CD20(리툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 유블리툭시맙, 오카라투주맙, 오비누투주맙), 항-HER2(트라스투주맙, 퍼투주맙), 항-CD52(알렘투주맙), 항-EGFR(세툭시맙), 항-GD2(디누툭시맙), 항-PDL1(아벨루맙), 항-CD38(다라투무맙, 이사툭시맙, MOR202), 항-CD123(7G3, CSL362), 항-SLAMF7(엘로투주맙) 및 이의 인간화된 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편 또는 이의 기능적 균등물 및 바이오시밀러를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, iPSC-유래된 이펙터 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 조혈 계통 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC-유래된 이펙터 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 NK 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC-유래된 이펙터 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 T 세포를 포함한다. 액체 종양 또는 고형 종양의 치료에 유용한 병용물의 일부 실시형태에서, 병용물은 적어도 CD38 음성 및 B2M 음성을 포함하는 iPSC-유래된 NK 또는 T 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 병용물은 CD38 음성, B2M 음성 및 외인성 CD16을 포함하는 iPSC-유래된 NK 세포; 및 항-CD38 항체, 다라투무맙, 이사툭시맙 및 MOR202 중 하나를 포함한다. 일 실시형태에서, 병용물은 B2M 음성, CD38 음성, 외인성 CD16을 포함하는 iPSC-유래된 NK 세포, 및 다라투무맙을 포함한다. 일부 추가의 실시형태에서, 다라투무맙과 병용하여 포함된 iPSC-유래된 NK 세포는 B2M 음성, CD38 음성, 외인성 CD16, IL15, 및 선택적으로, 하나 이상의 CIITA 음성, 및 CAR을 포함하고; IL15는 CAR과 공동 발현되거나 별개로 발현되고; IL15는 본원에 기재된 형태 중 어느 하나로 있다. 일부 특정 실시형태에서, IL15는 CAR과 공동으로 또는 별도로 발현된다.
8. 관문 억제제
관문은 억제되지 않을 때 면역 반응을 억제하거나 하향조절할 수 있는 세포 분자, 대개 세포 표면 분자이다. 종양이, 특히 종양 항원에 특이적인 T 세포에 대한 면역 내성의 주요 기전으로서 특정 면역-관문 경로를 이용한다는 것이 이제 분명하다. 관문 억제제(CI)는 관문 유전자 발현 또는 유전자 산물을 감소시키거나 관문 분자의 활성을 낮춤으로써, 저해성 관문을 차단하고, 면역계 기능을 회복시킬 수 있는 길항제이다. PD1/PDL1 또는 CTLA4를 표적화하는 관문 억제제의 발생은 종양학적 지형을 변화시켰고, 이들 약제는 다수의 적응증에서 장기간 관해를 제공한다. 그러나, 다수의 종양 하위유형은 관문 차단 치료에 내성이고, 재발은 상당한 우려사항으로 남는다. 본 출원의 일 양태는 본원에 제공된 바와 같은 게놈 조작된 기능성 유래 세포를 CI와의 병용 요법에 포함시킴으로써 CI 내성을 극복하기 위한 치료적 접근법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 관문 억제제는 대상체에 대한 병행적 또는 연속적 투여에 의해 본원에서 기재된 이펙터 세포의 집단과 병용하여 사용된다. 일부 다른 실시형태에서, 관문 억제제는 상기 관문 억제제, 또는 이의 단편 또는 변이체를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 사용한 iPSC의 유전자 조작, 및 조작된 iPSC의 유도 분화에 의해 이펙터 세포에 의해 발현된다. 본원에 기재된 이펙터 세포와의 병용 요법의 일부 실시형태는 적어도 하나의 관문 분자를 표적화하기 위한 적어도 하나의 관문 억제제를 포함하며; 유래 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 갖는다.
일부 실시형태에서, 관문 억제제 또는 이의 단편을 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 별개의 작제물에서 또는 바이-시스트로닉 작제물에서 CAR과 공동 발현된다. 일부 추가의 실시형태에서, 관문 억제제 또는 이의 단편을 인코딩하는 서열은 자가 절단 2A 코딩 서열을 통해 CAR 발현 작제물(예를 들어 CAR-2A-CI 또는 CI-2A-CAR로 예시됨)의 5' 말단 또는 3' 말단 중 어느 하나에 연결될 수 있다. 이와 같이, 관문 억제제 및 CAR의 코딩 서열은 단일 오픈 리딩 프레임(ORF)에 존재한다. 종양 미세환경(TME)을 침윤시킬 수 있는 유래 이펙터 세포에 의해 페이로드로서 관문 억제제가 전달되고 발현되고 분비될 때, 이는 TME 결합 시 억제성 관문 분자에 대응하여서, CAR 또는 활성화 수용체와 같은 활성화 모달리티에 의한 이펙터 세포의 활성화를 허용한다. 병용 요법의 일 실시형태에서, 유래 이펙터 세포는 NK 계통 세포이다. 병용 요법의 다른 실시형태에서, 유래 이펙터 세포는 T 계통 세포이다.
본원에 제공된 것과 같은 유래 이펙터 세포와의 병용 요법에 적합한 관문 억제제는 PD-1(Pdcdl, CD279), PDL-1(CD274), TIM-3(Havcr2), TIGIT(WUCAM 및 Vstm3), LAG-3(Lag3, CD223), CTLA-4(Ctla4, CD152), 2B4(CD244), 4-1BB(CD137), 4-1BBL(CD137L), A2AR, BATE, BTLA, CD39(Entpdl), CD47, CD73(NT5E), CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2(Pou2f2), 레티노산 수용체 알파(Rara), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 및 억제성 KIR(예를 들어, 2DL1, 2DL2, 2DL3, 3DL1 및 3DL2)의 길항제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시형태에서, 임의의 상기 관문 분자를 억제하는 길항제는 항체이다. 일부 실시형태에서, 관문 억제성 항체는 쥐과 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 낙타 Ig, 단일 가변 신항원 수용체(VNAR), 상어 중쇄 항체(Ig NAR), 키메라 항체, 재조합 항체, 또는 이의 항체 단편일 수 있다. 항체 단편의 비제한적인 예는 Fab, Fab', F(ab)'2, F(ab)'3, Fv, 단일 사슬 항원 결합 단편(scFv), (scFv)2, 디설파이드 안정화된 Fv(dsFv), 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 단일-도메인 항원 결합 단편(sdAb, 나노바디), 재조합 중쇄 전용 항체(VHH), 및 전장 항체의 결합 특이성을 유지하는 다른 항체 단편을 포함하고, 이는 전장 항체보다 제조하기에 보다 비용 효과적이거나, 보다 용이하게 사용되거나, 보다 민감할 수 있다. 일부 실시형태에서, 관문 억제제는 아테졸리주맙(항-PDL1 mAb), 아벨루맙(항-PDL1 mAb), 더발루맙(항-PDL1 mAb), 트레멜리무맙(항-CTLA4 mAb), 이필리무맙(항-CTLA4 mAb), IPH4102(항-KIR), IPH43(항-MICA), IPH33(항-TLR3), 리리무맙(항-KIR), 모날리주맙(항-NKG2A), 니볼루맙(항-PD1 mAb), 펨브롤리주맙(항-PD1 mAb) 및 이의 임의의 유도체, 기능적 균등물 또는 바이오시밀러 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시형태에서, 많은 miRNA가 면역 관문의 발현을 제어하는 조절자로서 발견되면서 임의의 상기 관문 분자를 억제하는 길항제는 마이크로RNA-기반이다(문헌[Dragomir et al., Cancer Biol Med. 2018, 15(2):103-115]). 일부 실시형태에서, 관문 길항적 miRNA는 miR-28, miR-15/16, miR-138, miR-342, miR-20b, miR-21, miR-130b, miR-34a, miR-197, miR-200c, miR-200, miR-17-5p, miR-570, miR-424, miR-155, miR-574-3p, miR-513 및 miR-29c를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시형태에서, 관문 억제제는 CAR과 공동 발현되고, 적어도 하나의 하기 관문 분자를 억제한다: PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39(Entpdl), CD47, CD73(NT5E), CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2(Pou2f2), 레티노산 수용체 알파(Rara), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 및 억제성 KIR. 일부 실시형태에서, 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 유래 세포에서 CAR과 공동 발현된 관문 억제제는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 트레멜리무맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이의 인간화된 변이체, 단편 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 및 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러를 포함하는 군에서 선택된다. 일부 실시형태에서, CAR과 공동 발현된 관문 억제제는 아테졸리주맙, 또는 이의 인간화 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 또는 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이다. 일부 다른 실시형태에서, CAR과 공동 발현된 관문 억제제는 니볼루맙, 또는 이의 인간화된 변이체, 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 또는 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이다. 일부 다른 실시형태에서, CAR과 공동 발현된 관문 억제제는 펨브롤리주맙, 또는 이의 인간화 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 또는 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이다.
본원에서 제공된 유래 이펙터 세포 및 관문 분자를 저해하는 적어도 하나의 항체를 포함하는 병용 요법의 일부 다른 실시형태에서, 상기 항체는 유래 세포에 의해서 또는 유래 세포에서 생산되지 않고, 본원에서 제공된 바와 같은 유래 세포의 투여 이전에, 투여와 함께 또는 투여 후에 추가로 투여된다. 일부 실시형태에서, 제공된 유래 NK 계통 세포 또는 T 계통 세포와의 병용 요법에서 1개, 2개, 또는 3개 이상의 관문 억제제의 투여는 동시 또는 순차적이다. 병용 치료의 일 실시형태에서, 치료에 포함된 관문 억제제는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 트레멜리무맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리릴루맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이의 인간화된 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 및 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러 중 하나 이상이다. 병용 치료의 일부 실시형태에서, 치료에 포함된 관문 억제제는 아테졸리주맙 또는 이의 인간화된 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 및 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이다. 병용 치료의 일부 실시형태에서, 치료에 포함된 관문 억제제는 니볼루맙 또는 이의 인간화된 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 또는 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이다. 병용 치료의 일부 실시형태에서, 치료에 포함된 관문 억제제는 펨브롤리주맙 또는 이의 인간화된 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 또는 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이다.
9. 본원에 제공된 유전자 조작된 iPSC주 및 유래 세포
상기 내용에 비추어, 본 출원은 표 1에 나타난 바와 같은 B2M-/-CD38-/- 및 선택적으로 CIITA-/-, 외인성 CD16을 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드, 사이토카인 신호전달 복합체(IL)를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드, CAR을 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드, 항체를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드, 및 추가 모달리티 중 하나 이상을 포함하는 iPSC, iPS 세포주 세포, 또는 이로부터의 유래 세포를 제공하며, 유래 세포는 표 1에 나타난 바와 같은 B2M-/-, CD38-/-, (선택적으로 CIITA-/-), 외인성 CD16, IL, CAR, 항체, 및 임의의 다른 모달리티 중 하나 이상을 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된 iPSC의 분화로부터 획득된 기능성 이펙터 세포이다. 일부 실시형태에서, 유래 세포는 조혈 계통 세포이고, 이것은 한정적 조혈 내피(HE) 능력을 갖는 중배엽 세포, 한정적 HE, CD34+ 조혈 세포, 조혈 줄기 및 전구체, 조혈 다능성 전구체(MPP), T 세포 전구체, NK 세포 전구체, 골수 세포, 호중구 전구체, T계 세포, NKT계 세포, NK계 세포, B계 세포, 호중구, 수지상 세포 및 대식세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 기능성 유래 조혈 세포는 대응 1차 T, NK, NKT, 및/또는 B 세포에 존재하지 않는 하나 이상의 기능적 특징을 갖는 이펙터 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 유래 세포는 NK 또는 T계 세포를 포함한다. B2M-/-, CD38-/-, 및 선택적으로 CIITA-/- 및 사이토카인 신호전달 복합체(IL), 외인성 CD16, 및 CAR 중 하나 이상을 포함하는 iPSC-유래된 NK 또는 T계 세포는 항체와 CAR 표적화된 치료를 조합함으로써 CAR-T 단독 치료에서 관찰되는 종양 항원 탈출과 관련된 종양 재발을 극복하거나 감소시키기에 유용하되, 단 항체 및 CAR은 종양의 상이한 항원에 대해서 특이성을 갖는다. hnCD16을 발현하는 유래 CAR-T 세포는 획득된 ADCC를 가져서, CAR 표적화에 더하여 종양 살해를 위한 추가 기전을 제공한다. 일부 실시형태에서, 유래 세포는 NK계 세포를 포함한다. B2M-/-, CD38-/-, 및 선택적으로 CIITA-/- 사이토카인 신호전달 복합체(IL), 외인성 CD16 및 CAR 중 하나 이상을 포함하는 iPSC-유래된 NK 세포는 향상된 세포독성을 가지며, 종양 세포에 침윤하여 사멸시키기 위해 T 세포를 포함한 방관자 세포를 동원하는 데 효과적이다.
일부 실시형태에서, 항-CD38 항체를 사용하여 CD16-매개된 향상된 ADCC를 유도하는 경우, iPSC 및/또는 이의 유래 이펙터 세포는 이펙터 세포 제거를 야기하지 않으면서, 즉 CD38 발현 이펙터 세포의 감소 또는 고갈을 야기하지 않으면서 CD38 발현 (종양) 세포를 표적으로 함으로써, iPSC 및 이의 이펙터 세포의 지속성 및/또는 생존을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 이펙터 세포는 항-CD38 항체일 수 있는 항-CD38 치료제의 존재 하에서 증가된 생체내 지속성 및/또는 생존을 가졌다. 일부 실시형태에서, 항-CD38 항체는 다라투무맙, 이사툭시맙, 또는 MOR202이다. 또한, CD38이 T 또는 B 세포와 같은 활성화된 림프구에서 상향조절되기 때문에, CD38-특이적 항체가 림프구 고갈에 사용되어 상기 활성화된 림프구를 제거할 수 있고, 동종 거부를 극복할 수 있고, 동종이계 이펙터 세포 치료의 수용자에서 동족살해 없이 CD38 음성 이펙터 세포의 생존 및 지속성을 증가시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 이펙터 세포는 T계 세포를 포함한다. B2M 음성 및 CD38 음성을 포함하는 iPSC-유래된 T계 세포는 항-CD38 항체의 존재 하에서 감소된 세포 고갈을 경험하고; 획득된 ADCC를 가져 T 세포에 의해 매개된 종양 살해에 대한 추가 기전을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이펙터 세포는 NK계 세포를 포함한다. B2M 음성 및 CD38 음성을 포함하는 iPSC-유래된 NK계 세포는 향상된 세포독성을 갖고, 항-CD38 항체의 존재 하에서 감소된 NK 세포 동족살해를 갖는다.
B2M 녹아웃, CD38 녹아웃, 및 선택적으로 CIITA 녹-아웃을 포함하는 iPSC가 본원에 제공되며, iPSC는 기능성 유래 이펙터 세포를 생산하기 위한 지향성 분화가 가능하다. 조작된 iPSC로부터 유래된 B2M 음성/CD38 음성을 포함하는 이펙터 세포의 일부 실시형태에서, 세포는 HLA-II에서 무손상이고(intact), 활성화된 수용자 T, B 및 NK 세포에 의한 동종 거부를 여전히 견딘다. 일부 실시형태에서, B2M 녹아웃 및 CD38 녹아웃을 포함하는 iPSC 및 이의 유래 이펙터 세포는 CIITA 녹아웃을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, B2M 녹아웃(및 선택적으로 CIITA 녹아웃) 및 CD38 녹아웃을 포함하는 iPSC 및 이의 유래 이펙터 세포는 CAR을 포함하며, CAR은 CD38을 표적화할 수 있거나 표적화하지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, B2M 음성, CD38 음성, 및 선택적으로 CIITA 음성을 포함하는 CAR 발현-유래 이펙터 세포는 외인성 CD16을 추가로 포함하고, 항-CD38 항체와 사용되어 이펙터 세포 제거를 유발하지 않으면서 ADCC를 유도하여, iPSC 및 이의 이펙터 세포의 지속성 및/또는 생존을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 이펙터 세포는 병용 치료에서 생체내 지속성 및/또는 생존이 증가한다.
추가로 B2M 녹아웃, CD38 녹아웃, 및 선택적으로 하나 이상의 CIITA 녹아웃, CAR, 및 사이토카인 신호전달을 가능하게 하기 위한 적어도 하나의 외인성 사이토카인 신호전달 복합체(IL)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 iPSC가 제공되며, iPSC주는 개선된 생존, 지속성, 확장 및 이펙터 기능을 갖는 기능성 유래 이펙터 세포를 생성하도록 조혈 분화할 수 있다. 외인성으로 도입된 사이토카인 신호전달 복합체는 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18 및 IL21 중 임의의 하나, 둘, 또는 그 초과의 신호전달을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달을 위한 사이토카인 및/또는 이의 각각의 수용체의 도입된 부분 또는 전체 펩티드는 세포 표면 상에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달은 항시적으로 활성화된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달의 활성화는 유도성이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달의 활성화는 일시적이고/이거나 시간적이다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 사이토카인/사이토카인 수용체의 일시적/시간적 발현은 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 에피솜, 미니-서클 또는 mRNA를 포함한 RNA를 통해 이루어진다. 일부 실시형태에서, B2M-/-CD38-/- (및 선택적으로 CIITA-/-) IL을 포함하는 iPSC 또는 이의 유래 세포에 포함된 외인성 세포 표면 사이토카인 및/또는 수용체는 IL7 신호전달을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, B2M-/-CD38-/- (및 선택적으로 CIITA-/-) IL을 포함하는 iPSC 또는 이의 유래 세포에 포함된 외인성 세포 표면 사이토카인 및/또는 수용체는 IL10 신호전달을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, B2M-/-CD38-/- (및 선택적으로 CIITA-/-) IL을 포함하는 iPSC 또는 이의 유래 세포에 포함된 외인성 세포 표면 사이토카인 및/또는 수용체는 IL15 신호전달을 가능하게 한다. B2M-/-CD38-/- (및 선택적으로 CIITA-/-) IL을 포함하는 상기 iPSC의 일부 실시형태에서, IL15 발현은 본원에 기재된 작제물을 통해 이루어진다. 상기 실시형태의 B2M-/-CD38-/- (및 선택적으로 CIITA-/-) IL 및 이의 유래 세포를 포함하는 상기 iPSC는 시험관내 또는 생체내에서 추가로 공급된 가용성 사이토카인을 접촉하지 않으면서 자율적으로 세포 성장, 증식, 확장, 및/또는 이펙터 기능을 유지 또는 개선시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, B2M-/-CD38-/- IL을 포함하는 iPSC 및 이의 유래 이펙터 세포는 HLA-II에서 무손상이며, 활성화된 수용자 T, B, 및 NK 세포의 존재 하에서, 상승적으로 증가된 지속성 및/또는 생존을 갖는다. 항-CD38 항체가 병용 요법에서 상기 유래 이펙터 세포와 함께 사용되는 경우, 상기 세포는 상승적으로 증가된 지속성, 생존 및 이펙터 기능을 갖는다.
또한, B2M 녹아웃, CD38 녹아웃, 및 선택적으로 CIITA 녹아웃, IL, CAR, 및 hnCD16 중 하나 이상을 포함하는 iPSC가 제공되며, iPSC는 동종반응성 NK 세포를 극복하기 위한 HLA-G 및/또는 HLA-E 발현에 대한 필요 없이 기능적 유래 조혈 세포를 생성하기 위한 지향성 분화가 가능하다. 일부 실시형태에서, 유래 조혈 세포는 한정적 조혈 내피(HE) 능력을 갖는 중배엽 세포, 한정적 HE, CD34+ 조혈 세포, 조혈 줄기 및 전구체, 조혈 다능성 전구체(MPP), T 세포 전구체, NK 세포 전구체, 골수 세포, 호중구 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 호중구, 수지상 세포 및 대식세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. iPSC 및 이의 유래 이펙터 세포는 이펙터 세포 제거, 또는 활성화된 수용자 T, B 및 NK 세포에 의한 동종 거부를 유발하지 않으면서 ADCC를 유도하기 위해 항-CD38 항체와 함께 사용되어, iPSC 및 이의 이펙터 세포의 지속성 및/또는 생존을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 이펙터 세포는 생체내에서 증가된 지속성 및/또는 생존을 갖는다.
또한 본원에서 상기 논의된 바와 같은 iPSC 또는 iPSC-유래된 세포가 제공되며, iPSC 또는 iPSC-유래된 세포는 IL15 및 IL15Rα의 절단된 융합 단백질을 추가로 포함하고, 융합 단백질은 세포내 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인이 결여된 절단된 IL15/IL15Rα 융합 단백질은 서열 번호 8, 9 또는 10과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인이 결여된 절단된 IL15/IL15Rα 융합 단백질은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인이 결여된 절단된 IL15/IL15Rα 융합 단백질은 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인이 결여된 절단된 IL15/IL15Rα 융합 단백질은 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 일부 다른 실시형태에서, 세포내 도메인이 결여된 절단된 IL15/IL15Rα 융합 단백질(IL15Δ)을 포함하는 iPSC 또는 iPSC 유래된 세포는 B2M 녹아웃, CIITA 녹아웃, CD38 녹아웃, hnCD16, CAR, 및 외인성 사이토카인 신호전달 복합체 중 하나 이상을 추가로 포함하며, iPSC는 기능성 유래 조혈 세포를 생산하기 위한 지향성 분화가 가능하고, 유래 조혈 세포는 한정적 조혈 내피(HE) 능력을 갖는 중배엽 세포, 한정적 HE, CD34+ 조혈 세포, 조혈 줄기 및 전구체, 조혈 다능성 전구체(MPP), T 세포 전구체, NK 세포 전구체, 골수 세포, 호중구 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 호중구, 수지상 세포, 대식세포, 또는 대응 1차 T, NK, NKT, 및/또는 B 세포에 존재하지 않는 하나 이상의 기능성 특징을 갖는 유래 이펙터 세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
이와 같이, 본 출원은 iPSC 및 이의 기능성 유래 조혈 세포를 제공하며, 이는 하기 표 1의 유전자형 중 어느 하나를 포함한다. IL15Δ로서 명시되어 있지 않는 한, 표 1에 제공된 것과 같은 "IL"은 어떤 특정 사이토카인 신호전달 복합체 발현이 선택되는지에 따라 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18 및 IL21 중 어느 하나를 나타낸다. 추가로, iPSC 및 이의 기능적 유래 조혈 세포가 CAR과 IL 둘 모두를 포함하는 유전자형을 가질 때, CAR 및 IL은 2A 서열을 포함하는 바이-시스트로닉 발현 카세트에 포함될 수 있다. 비교로서, 일부 다른 실시형태에서, CAR 및 IL은 iPSC 및 이의 기능성 유래 조혈 세포에 포함된 별개의 발현 카세트에 존재한다. 하나의 특정 실시형태에서, CAR과 IL 둘 다를 발현하는 iPSC 및 이의 기능성 유래 이펙터 세포에는 IL15가 포함되며, IL15 작제물은 CAR와 함께, 또는 이와 별개로 발현 카세트에 포함된다.
[표 1]
7. 추가의 변형
일부 실시형태에서, 유전자 변형된 모달리티는 안전성 스위치 단백질, 표적화 모달리티, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약학적 활성 단백질 및 펩티드, 약물 표적 후보자; 또는 iPSC 또는 이의 유래 세포의 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정 및/또는 생존을 촉진하는 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형된 iPSC 및 이의 유래 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표 1에서의 유전자형 중 어느 하나를 포함하는 iPSC, 및 이의 유래 이펙터 세포는 B2M, CIITA, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD25, CD69, CD44, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, 및 TIGIT 중 적어도 하나의 결실 또는 파괴; 또는 HLA-E, HLA-G, 4-1BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, TCR, Fc 수용체, 항체 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편, 관문 억제제, 및 이중특이적, 다중특이적 인게이저 또는 범용 인게이저와 커플링하기 위한 표면 유도 수용체 중 적어도 하나의 도입을 추가로 포함할 수 있다.
II. iPSC의 선택된 좌위에서의 표적화된 게놈 편집을 위한 방법
본원에 상호교환가능하게 사용된 게놈 편집 또는 게놈성 편집 또는 유전자 편집은 DNA가 표적화된 세포의 게놈에서 삽입되고, 결실되고, 그리고/또는 대체되는 유전자 조작의 유형이다. 표적화된 게놈 편집("표적화된 게놈성 편집" 또는 "표적화된 유전자 편집"과 상호교환가능함)은 게놈에서 사전-선택된 부위에서 삽입, 결실 및/또는 치환을 가능하게 한다. 표적화된 편집 동안 삽입 부위에서 내인성 서열이 결실될 때, 영향을 받은 서열을 포함하는 내인성 유전자는 서열 결실로 인해 녹아웃되거나 녹다운될 수 있다. 따라서, 표적화된 편집은 정확하게 내인성 유전자 발현을 파괴하도록 또한 사용될 수 있다. 삽입 부위에서의 내인성 서열의 결실과 함께 또는 결실 없이 하나 이상의 외인성 서열의 삽입을 수반하는 과정을 지칭하는 용어 "표적화된 통합"이 본원에서 유사하게 사용된다. 비교하면, 무작위로 통합된 유전자는 위치 효과 및 사일런싱의 영향을 받기 쉬워서 이의 발현의 신뢰성이 없고 예측 불가능하게 된다. 예를 들어, 센트로미어 및 하위텔로미어 영역은 전이유전자 사일런싱이 되기 특히 쉽다. 한편, 새로 통합된 유전자는 주변의 내인성 유전자 및 염색질에 영향을 미칠 수 있어서, 잠재적으로 세포 거동을 변경하거나 세포 변형을 선호한다. 따라서, 세이프 하버 좌위, 또는 게놈 세이프 하버(GSH)와 같은 예비 선택된 좌위에서 외인성 DNA의 삽입은 안전성, 효율, 카피수 제어 및 신뢰성 있는 유전자 반응 제어에 중요하다.
뉴클레아제 독립적 접근법 또는 뉴클레아제 의존적 접근법 중 어느 하나를 통해, 표적화된 편집이 달성될 수 있다. 뉴클레아제 독립적 표적화된 편집 접근법에서, 상동성 재조합은 숙주 세포의 효소 기전을 통해 삽입되는 외인성 폴리뉴클레오티드를 플랭킹하는 상동성 서열에 의해 가이드된다.
대안적으로, 특이적 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의해 이중가닥 절단(DSB)의 특이적 도입을 통해 표적화된 편집이 더 높은 빈도로 달성될 수 있었다. 상기 뉴클레아제 의존적 표적화된 편집은 DSB에 반응하여 생기는 비상동성 말단 연결(NHEJ)을 포함하는 DNA 수선 기전을 이용한다. 외인성 유전적 물질을 함유하는 공여자 벡터 없이, NHEJ는 대개 적은 수의 내인성 뉴클레오티드의 무작위 삽입 또는 결실(in/del)로 이어진다. 비교하면, 한 쌍의 상동성 아암에 의해 플랭킹된 외인성 유전적 물질을 함유하는 공여자 벡터가 존재할 때, 외인성 유전적 물질은 상동성 재조합에 의해 상동성 지향성 수선(HDR: homology directed repair) 동안 게놈으로 도입되어, "표적화된 통합"을 유도한다. 일부 상황에서, 표적화된 통합 부위는 선택된 유전자의 코딩 영역 내에 있도록 의도되고, 이에 따라 표적화된 통합은 유전자 발현을 파괴시켜서, 하나의 단일 편집 단계에서 동시의 녹인 및 녹아웃(KI/KO)을 생성할 수 있다.
동시에 유전자를 녹아웃하기 위한 관심 유전자좌(GOI)의 선택된 위치에서 하나 이상의 전이유전자의 삽입을 달성할 수 있다. 동시의 녹인 및 녹아웃(KI/KO)에 적합한 유전자좌는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD38, CD25, CD69, CD71, CD44, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 및 TIGIT를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 위치 선택적 삽입을 위한 각각의 부위 특이적 표적화 상동성 아암에 의해, 이것은 그 부위에서의 내인성 프로모터 하에서 또는 작제물에 포함된 외인성 프로모터 하에서 전이유전자(들)가 발현되게 한다. 둘 이상의 전이유전자를 CD38 좌위의 선택된 위치에 삽입하려는 경우, 링커 서열, 예를 들어 2A 링커 또는 IRES를 임의의 2개의 전이유전자 사이에 배치한다. 2A 링커는 예를 들어 FMDV, ERAV, PTV-I 또는 TaV로부터 유래된 자가 절단 펩티드(각각 "F2A", "E2A", "P2A" 및 "T2A"라고 지칭됨)를 인코딩하여, 개별 단백질이 단일 번역으로부터 제조되게 한다. 일부 실시형태에서, 전이유전자 및/또는 외인성 프로모터 사일런싱의 위험을 감소시키도록 절연인자가 작제물에 포함된다. 다양한 실시형태에서, 외인성 프로모터는 CAG, 또는 CMV, EF1α, PGK 및 UBC를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 다른 구성적, 유도성, 시간적-, 조직- 또는 세포 유형-특이적 프로모터일 수 있다.
특이적인 및 표적화된 DSB를 도입할 수 있는 이용가능한 엔도뉴클레아제는 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), RNA 가이드된 CRISPR(클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부) 시스템을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 추가로, phiC31 및 Bxb1 인테그라아제를 사용하는 DICE(이중 인테그라아제 카세트 교환(dual integrase cassette exchange)) 시스템이 또한 표적화된 통합을 위한 유망한 툴이다.
ZFN은 징크 핑거 DNA 결합 도메인에 융합된 뉴클레아제를 포함하는 표적화된 뉴클레아제이다. "징크 핑거 DNA 결합 도메인" 또는 "ZFBD"란, 하나 이상의 징크 핑거를 통해 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합하는 폴리펩티드 도메인을 의미한다. 징크 핑거는 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화되는 징크 핑거 결합 도메인 내의 약 30개의 아미노산의 도메인이다. 징크 핑거의 예는 C2H2 징크 핑거, C3H 징크 핑거 및 C4 징크 핑거를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. "설계된" 징크 핑거 도메인은 자연계에 존재하지 않는 도메인이며, 그 설계/조성은 주로 합리적 기준, 예를 들어 기존의 ZFP 설계의 정보 및 결합 데이터를 저장하는 데이터베이스 내의 정보를 처리하기 위한 치환 규칙 및 컴퓨터화 알고리즘의 적용에 기인한다. 예를 들어, 미국 특허 제6,140,081호; 제6,453,242호; 및 제6,534,261호를 참조하고; 또한 국제공개 WO 98/53058호; WO 98/53059호; WO 98/53060호; WO 02/016536호 및 WO 03/016496호를 참조하며, 이의 전체 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. "선택된" 징크 핑거 도메인은 주로 경험적 과정, 예컨대 파지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 하이브리드 선택으로부터 제조되는, 자연계에 존재하지 않는 도메인이다. ZFN은 미국 특허 제7,888,121호 및 미국 특허 제7,972,854호에 더 자세히 기재되어 있고, 이의 전체 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 당업계에 가장 잘 알려진 ZFN의 예는 징크 핑거 DNA 결합 도메인과의 FokI 뉴클레아제의 융합이다.
TALEN은 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인에 융합된 뉴클레아제를 포함하는 표적화된 뉴클레아제이다. "전사 활성자-유사 이펙터 DNA 결합 도메인", "TAL 이펙터 DNA 결합 도메인", 또는 "TALE DNA 결합 도메인"이라는 것은 DNA에 대한 TAL 이펙터 단백질의 결합에 관여하는 TAL 이펙터 단백질의 폴리펩티드 도메인을 의미한다. TAL 이펙터 단백질은 감염 동안 잔토모나스(Xanthomonas) 속의 식물 병원균에 의해 분비된다. 이러한 단백질은 식물 세포의 핵에 들어가고, 이의 DNA 결합 도메인을 통해 이펙터 특이적 DNA 서열에 결합하고, 이의 전사활성화 도메인을 통해 이러한 서열에서 유전자 전사를 활성화한다. TAL 이펙터 DNA 결합 도메인 특이성은 이펙터-가변 수의 불완전 34개 아미노산 반복부에 따라 달라지고, 이는 반복 가변-이중잔기(RVD)라고 지칭하는 선택 반복부 위치에서 다형성을 포함한다. TALEN은 본원에 참조로 포함되어 있는 미국 특허출원공개 US 제2011/0145940호에 보다 상세하게 기재되어 있다. 당업계에 가장 잘 알려진 TALEN의 예는 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인에 대한 FokI 뉴클레아제의 융합 폴리펩티드이다.
해당 방법에서 사용하는 표적화된 뉴클레아제의 다른 예는 표적화된 Spo11 뉴클레아제, DNA 결합 도메인, 예를 들어 징크 핑거 DNA 결합 도메인에 융합된 뉴클레아제 활성을 갖는 Spo11 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드, 관심 DNA 서열에 대한 특이성을 갖는 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인 등이다.
본 발명의 실시형태에 적합한 표적화된 뉴클레아제의 추가 예는 개별적으로 사용되든지 조합으로 사용되든지, Bxb1, phiC31, R4, PhiBT1, 및 Wβ/SPBc/TP901-1을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
표적화된 뉴클레아제의 다른 비제한적인 예는 자연 발생 및 재조합 뉴클레아제; cas, cpf, cse, csy, csn, csd, cst, csh, csa, csm 및 cmr을 포함하는 패밀리로부터의 CRISPR 관련된 뉴클레아제; 제한 엔도뉴클레아제; 메가뉴클레아제; 호밍 엔도뉴클레아제 등을 포함한다.
Cas9을 일 예로 들면, CRISPR/Cas9은 (1) Cas9 엔도뉴클레아제 및 (2) crRNA-tracrRNA 복합체의 2개의 주요 성분을 필요로 한다. 공동 발현될 때, 두 성분은 PAM 및 PAM 근처의 시딩 영역을 포함하는 표적 DNA 서열에 동원된 복합체를 형성한다. 선택된 서열을 표적화하기 위해 Cas9을 가이드하도록 키메라 가이드 RNA(gRNA)를 형성하기 위해 crRNA와 tracrRNA를 조합할 수 있다. 이후, 이들 두 성분은 형질주입 또는 형질도입을 통해 포유류 세포로 전달될 수 있다.
DICE 매개된 삽입은 각각의 효소의 자체의 작은 attB 및 attP 인식 부위로 치밀히 제한되어 있는 외인성 DNA의 단방향성 통합을 제공하기 위해 한 쌍의 재조합효소, 예를 들어 phiC31 및 Bxb1을 사용한다. 이러한 표적 att 부위가 포유류 게놈에 자연적으로 존재하지 않기 때문에, 이들은 먼저 목적하는 통합 부위에서 게놈에 도입되어야 한다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 US 2015/0140665호를 참조하고, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 일 양태는 표적화된 게놈 통합에 대한 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물을 제공한다. 일 실시형태에서, 작제물은 원하는 통합 부위에 특이적인 한 쌍의 상동성 아암을 추가로 포함하고, 표적화된 통합 방법은 세포 숙주 효소 기전에 의해 부위 특이적 상동성 재조합이 가능하도록 세포에 작제물을 도입하는 것을 포함한다. 다른 실시형태에서, 세포에서 표적화된 통합 방법은 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물을 세포로 도입하는 것 및 ZFN 매개된 삽입이 가능하도록 원하는 통합 부위에 특이적인 DNA 결합 도메인을 포함하는 ZFN 발현 카세트를 세포로 도입하는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포에서 표적화된 통합 방법은 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물을 세포로 도입하는 것 및 TALEN 매개된 삽입이 가능하도록 원하는 통합 부위에 특이적인 DNA 결합 도메인을 포함하는 TALEN 발현 카세트를 세포로 도입하는 것을 포함한다. 다른 실시형태에서, 세포에서 표적화된 통합 방법은 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물을 세포로 도입하는 것, Cas9 매개된 삽입이 가능하도록 Cas9 발현 카세트, 및 원하는 통합 부위에 특이적인 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 세포로 도입하는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포에서 표적화된 통합 방법은 한 쌍의 DICE 재조합효소의 하나 이상의 att 부위를 포함하는 작제물을 세포의 원하는 통합 부위로 도입하는 것, 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물을 세포로 도입하는 것, 및 DICE 매개된 표적화된 통합이 가능하도록 DICE 재조합효소에 대한 발현 카세트를 도입하는 것을 포함한다.
표적화된 통합에 유망한 부위는 이론적으로 숙주 세포 또는 유기체에 대한 유해 효과를 갖지 않으면서 새로 통합된 DNA의 예측가능한 발현을 수용할 수 있는 인간 게놈의 유전자내 영역 또는 유전자외 영역인 세이프 하버 좌위 또는 게놈 세이프 하버(GSH)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 유용한 세이프 하버는 벡터 인코딩된 단백질 또는 비-코딩 RNA의 목적하는 수준을 생성하기에 충분한 전이유전자 발현을 허용해야 한다. 세이프 하버는 또한 세포를 악성 형질전환에 취약하게 하지도 세포 기능을 변경하지도 않아야 한다. 가능한 세이프 하버 좌위인 통합 부위에 대해, 비제한적인 예로서 서열 주석에 의해 판단되는 것처럼 조절 요소 또는 유전자의 파괴의 부재의 조건; 유전자 치밀 부위에서의 유전자간 영역, 또는 반대의 방향에서 전사된 2개의 유전자 사이의 수렴에서의 위치에 있는 조건; 벡터 인코딩된 전사 활성자와 인접한 유전자, 특히 암 관련된 유전자 및 마이크로RNA 유전자의 프로모터 사이의 긴 범위 상호작용의 가능성을 최소화하기 위한 거리의 유지의 조건; 및 유비쿼터스 전사 활성을 나타내는 넓은 공간적 및 시간적 발현된 서열 태그(EST) 발현 패턴에 의해 반영된 것처럼 명백히 유비쿼터스 전사 활성을 가짐의 조건을 포함하는 조건을 충족하는 것이 이상적으로 필요하다. 이러한 후자의 특징은 줄기 세포에서 특히 중요하며, 분화 동안 염색질 리모델링은 통상적으로 일부 좌위의 사일런싱 및 다른 것의 잠재적 활성화로 이어진다. 외인성 삽입에 적합한 영역 내에서, 삽입에 선택된 정확한 좌위는 반복적 요소 및 보존된 서열이 없고, 상동성 아암의 증폭을 위한 프라이머가 쉽게 설계될 필요가 있다.
인간 게놈 편집, 또는 구체적으로 표적화된 통합에 적합한 부위는 아데노-관련 바이러스 부위 1(AAVS1), 케모카인(CC 모티프) 수용체 5(CCR5) 유전자좌 및 마우스 ROSA26 좌위의 인간 오솔로그를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 추가적으로, 마우스 H11 좌위의 인간 오솔로그는 또한 본원에 개시된 표적화된 통합의 조성물 및 방법을 이용하여 삽입에 적합한 부위일 수 있다. 추가로, 콜라겐 및 HTRP 유전자좌는 표적화된 통합에 대한 세이프 하버로서 또한 사용될 수 있다. 그러나, 각각의 선택된 부위의 검증은 특히 특정 통합 사건에 대해 줄기 세포에서 필요한 것으로 나타났고, 프로모터 선출, 외인성 유전자 서열 및 배렬, 및 작제물 설계를 포함하는 삽입 전략의 최적화가 흔히 요구된다.
표적화된 삽입/결실을 위해, 편집 부위는 대개 발현 및/또는 기능이 파괴되도록 의도된 내인성 유전자에 포함된다. 일부 실시형태에서, 표적화된 삽입/결실을 포함하는 내인성 유전자는 면역 반응 조절 및 조정과 관련된다. 일부 다른 실시형태에서, 표적화된 삽입/결실을 포함하는 내인성 유전자는 표적화 모달리티, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약물 표적 후보자, 면역 반응 조절 및 조정, 또는 줄기 세포 및/또는 전구 세포, 및 이로부터 유래된 세포의 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존을 억제하는 단백질과 관련된다.
이와 같이, 본 발명의 일 양태는 계속적 또는 시간적 유전자 발현에 대해 안전하고, 잘 조절되는 것으로 알려지거나 증명된 게놈 세이프 하버 또는 미리 선택된 좌위를 포함한 선택된 좌위, 예컨대 본원에서 제공된 바와 같은 TRAC 및 TRBC 좌위에서의 표적화된 통합 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 표적화된 통합 방법을 위한 게놈 세이프 하버는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, TCR(TRAC 또는 TRBC) 또는 RUNX1, 또는 게놈 세이프 하버의 기준을 충족하는 다른 좌위를 포함하는 하나 이상의 목적하는 통합 부위를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포에서 표적화된 통합 방법은 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물을 세포로 도입하는 것과, 세포 숙주 효소 기전에 의한 부위 특이적 상동 재조합이 가능하도록, 목적하는 통합 부위 및 하나 이상의 외인성 서열에 특이적인 상동성 아암의 쌍을 포함하는 작제물을 도입하는 것을 포함하며, 목적하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, TCR 또는 RUNX1 또는 게놈 세이프 하버의 기준을 충족시키는 다른 좌위를 포함한다. 추가적인 통합 부위는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD38, CD25, CD69, CD71, CD44, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT를 포함하는 파괴, 예컨대 감소 또는 녹아웃에 의도된 내인성 유전자좌를 포함한다.
다른 실시형태에서, 세포에서 표적화된 통합 방법은 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물을 세포로 도입하는 것과 ZFN 매개된 삽입이 가능하도록 원하는 통합 부위에 특이적인 DNA 결합 도메인을 포함하는 ZFN 발현 카세트를 세포로 도입하는 것을 포함하며, 원하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD44, CD54, CD56, CD58, CD69, CD71, OX40, 4-1BB, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, 또는 TIGIT를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포에서 표적화된 통합 방법은 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물을 세포로 도입하는 것과 TALEN 매개된 삽입이 가능하도록 원하는 통합 부위에 특이적인 DNA 결합 도메인을 포함하는 TALEN 발현 카세트를 세포로 도입하는 것을 포함하며, 원하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD44, CD54, CD56, CD58, CD69, CD71, OX40, 4-1BB, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, 또는 TIGIT를 포함한다. 다른 실시형태에서, 세포에서 표적화된 통합 방법은 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물을 세포로 도입하는 것, Cas9 매개된 삽입이 가능하도록 Cas9 발현 카세트, 및 원하는 통합 부위에 특이적인 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 세포로 도입하는 것을 포함하며, 원하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD44, CD54, CD56, CD58, CD69, CD71, OX40, 4-1BB, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, 또는 TIGIT를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포에서 표적화된 통합 방법은 세포의 원하는 통합 부위로 한 쌍의 DICE 재조합효소의 하나 이상의 att 부위를 포함하는 작제물을 도입하는 것, 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물을 세포로 도입하는 것, 및 DICE 매개된 표적화된 통합이 가능하도록 DICE 재조합효소에 대한 발현 카세트를 도입하는 것을 포함하며, 목적하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD44, CD54, CD56, CD58, CD69, CD71, OX40, 4-1BB, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT를 포함한다.
추가로, 본원에 제공된 바와 같이, 세이프 하버에서 표적화된 통합을 위한 상기 방법은 임의의 관심 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 안전성 스위치 단백질, 표적화 모달리티, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약학적 활성 단백질 및 펩티드, 약물 표적 후보자, 및 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하도록 사용된다. 일부 다른 실시형태에서, 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물은 하나 이상의 마커 유전자를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 작제물에서 외인성 폴리뉴클레오티드는 안전성 스위치 단백질을 인코딩하는 자살 유전자이다. 유도된 세포 사멸에 적합한 자살 유전자 시스템은 카스파아제 9(또는 카스파아제 3 또는 7) 및 AP1903; 티미딘 키나아제(TK) 및 간시클로버(GCV); 시토신 탈아미노효소(CD) 및 5-플루오로시토신(5-FC)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 추가적으로, 일부 자살 유전자 시스템은 세포 유형 특이적이고, 예를 들어 B 세포 분자 CD20에 의한 T 림프구의 유전자 변형은 mAb 리툭시맙의 투여 시 이의 제거를 허용한다. 추가로, 세툭시맙에 의해 인식된 에피토프를 함유하는 변형된 EGFR은 세포가 세툭시맙에 노출될 때 유전자 조작된 세포를 고갈시키도록 사용될 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 일 양태는 카스파아제 9(카스파아제 3 또는 7), 티미딘 키나아제, 시토신 탈아미노효소, 변형된 EGFR, 및 B 세포 CD20으로부터 선택된 안전성 스위치 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 자살 유전자의 표적화된 통합 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 통합된 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드는 표적화된 통합을 위해 작제물에 포함된 작동가능하게 연결된 외인성 프로모터에 의해 유도된다. 프로모터는 유도성 또는 작제성일 수 있고, 시간적-, 조직- 또는 세포 유형-특이적일 수 있다. 본 발명의 방법에 적합한 작제성 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV), 연장 인자 1α(EF1α), 포스포글리세레이트 키나아제(PGK), 혼성 CMV 인핸서/치킨 β-액틴(CAG) 및 유비퀴틴 C(UBC) 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일 실시형태에서, 외인성 프로모터는 CAG이다.
본원에 기재된 방법에 의해 통합된 외인성 폴리뉴클레오티드는 통합 부위에서, 숙주 게놈 내의 내인성 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 일 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 세포의 게놈의 AAVS1 좌위에서 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드의 표적화된 통합에 사용된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오티드는 내인성 AAVS1 프로모터에 의해 유도된다. 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 세포의 게놈의 ROSA26 좌위에서 표적화된 통합에 사용된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오티드는 내인성 ROSA26 프로모터에 의해 유도된다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 세포의 게놈의 H11 좌위에서 표적화된 통합에 사용된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오티드는 내인성 H11 프로모터에 의해 유도된다. 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 세포의 게놈의 콜라겐 좌위에서 표적화된 통합에 사용된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오티드는 내인성 콜라겐 프로모터에 의해 유도된다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 세포의 게놈의 HTRP 좌위에서 표적화된 통합에 사용된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오티드는 내인성 HTRP 프로모터에 의해 유도된다. 이론적으로, 원하는 위치에서의 정확한 삽입만이 내인성 프로모터에 의해 유도된 외인성 유전자의 유전자 발현을 허용할 것이다.
일부 실시형태에서, 표적화된 통합 방법을 위해 작제물에 포함된 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드는 하나의 프로모터에 의해 유도된다. 일부 실시형태에서, 작제물은 모이어티 사이의 더 큰 물리적 분리를 제공하고 효소 기전에 대한 접근가능성을 최대화하도록 동일한 프로모터에 의해 유도된 2개의 인접한 폴리뉴클레오티드 사이에 하나 이상의 링커 서열을 포함한다. 링커 서열의 링커 펩티드는 모이어티(외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 이로부터 인코딩된 단백질 또는 펩티드) 사이의 물리적 분리가 관련된 기능에 따라 보다 가요성이거나 보다 경질이 되게 하도록 선택된 아미노산으로 이루어질 수 있다. 링커 서열은 별개의 모이어티를 생성하도록 프로테아제에 의해 절단가능하거나 화학적으로 절단가능할 수 있다. 링커에서의 효소 절단 부위의 예는 엔테로키나아제, Xa 인자, 트립신, 콜라게나아제 및 트롬빈과 같은 단백분해 효소에 의한 절단을 위한 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로테아제는 숙주에 의해 자연적으로 제조된 것이거나, 이는 외인성으로 도입된다. 대안적으로, 링커의 절단 부위는 선택된 화학물질, 예를 들어 시아노겐 브로마이드, 히드록실아민, 또는 저 pH에 노출될 때 절단될 수 있는 부위일 수 있다. 선택적 링커 서열은 절단 부위의 제공 이외의 목적을 제공할 수 있다. 링커 서열은 모이어티가 적절히 작용하도록 다른 인접한 모이어티와 관련하여 모이어티의 효과적인 배치를 허용해야 한다. 링커는 또한 모이어티 사이의 임의의 입체 장애를 막기에 충분한 길이의 단순한 아미노산 서열일 수 있다. 또한, 링커 서열은 예를 들어 인산화 부위, 비오티닐화 부위, 황화 부위, γ-카르복실화 부위 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 번역후 변형을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 단일의 목적하지 않는 형태의 생물학적 활성 펩티드를 보유하지 않도록 가요성이다. 링커는 가요성을 제공하도록 글리신, 알라닌 및 세린과 같은 작은 측쇄를 갖는 아미노산으로 주로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커 서열의 약 80 내지 90% 이상은 글리신, 알라닌, 또는 세린 잔기, 특히 글리신 및 세린 잔기를 포함한다. 여러 실시형태에서, G4S 링커 펩티드는 융합 단백질의 말단 가공 도메인 및 엔도뉴클레아제 도메인을 분리시킨다. 다른 실시형태에서, 2A 링커 서열은 2개의 별개의 단백질이 단일 번역으로부터 제조되게 한다. 적합한 링커 서열은 용이하게 경험적으로 확인될 수 있다. 추가적으로, 링커 서열의 적합한 크기 및 서열은 종래의 컴퓨터 모델링 기법에 의해 또한 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 링커 서열은 자가 절단 펩티드를 인코딩한다. 일 실시형태에서, 자가 절단 펩티드는 2A이다. 일부 다른 실시형태에서, 링커 서열은 내부 리보솜 진입 서열(IRES)을 제공한다. 일부 실시형태에서, 임의의 2개의 연속적 링커 서열은 상이하다.
표적화된 통합을 위한 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물을 세포로 도입하는 방법은 그 자체가 알려진 세포로의 유전자 도입의 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 일 실시형태에서, 작제물은 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터의 골격을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라스미드 벡터는 표적 세포(예를 들어, pAl- 11, pXTl, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo) 등에 외인성 폴리뉴클레오티드를 전달하고/하거나 발현하도록 사용된다. 일부 다른 실시형태에서, 에피솜 벡터는 표적 세포에 외인성 폴리뉴클레오티드를 전달하도록 사용된다. 일부 실시형태에서, 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV)는 상동성 재조합을 통해 삽입, 결실 또는 치환을 도입하도록 유전자 조작을 위해 사용될 수 있다. rAAV는 렌티바이러스와 달리 숙주 게놈으로 통합되지 않는다. 또한, 에피솜 rAAV 벡터는 종래의 표적화 플라스미드의 형질주입과 비교하여 훨씬 더 높은 속도로 상동성 지향성 유전자 표적화를 매개한다. 일부 실시형태에서, AAV6 또는 AAV2 벡터는 iPSC의 게놈의 표적 부위에서 삽입, 결실 또는 치환을 도입하도록 사용된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 수득된 게놈 변형된 iPSC 및 이의 유래 세포는 표 1에 열거된 적어도 하나의 유전자형을 포함한다.
III. 게놈 조작된 iPSC를 수득하고 유지하는 방법
다양한 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 목적하는 부위에서 하나 이상의 표적화된 편집을 포함하는 게놈-조작된 iPSC를 수득 및 유지하는 방법을 제공하며, 하나 이상의 표적화된 편집은 각각의 선택된 편집 부위에서 확장된 게놈-조작된 iPSC 또는 iPSC-유래된 비-만능성 세포에서 무손상이고 기능성을 유지한다. 표적화된 편집은 게놈 iPSC 및 이로부터의 유래 세포 내에 삽입, 결실, 및/또는 치환(즉, 선택된 부위에서 표적화된 통합 및/또는 삽입/결실)을 도입한다. 환자-공급의, 말초혈 유래된 1차 이펙터 세포의 직접적인 조작과 비교하여, 본원에 제공된 iPSC의 편집 및 분화를 통한 게놈 조작된 유래 세포를 수득하는 것의 많은 이점은 다음을 비제한적으로 포함한다: 조작된 이펙터 세포에 대한 비제한된 공급원; 특히 다수의 조작된 모달리티가 관여될 때 이펙터 세포의 반복 조작의 필요성이 없음; 얻은 이펙터 세포가 연장된 텔로미어를 갖기 위해 재생되고 탈진을 덜 경험함; 이펙터 세포 집단이 주로 본원에 제공된 것과 같은 조작된 iPSC에서의 가능해진 클론 선택으로 인해 편집 부위, 카피수, 및 대립유전자 변이의 부재, 랜덤 돌연변이 및 발현 다양성의 측면에서 균일함.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 선택된 부위에서 하나 이상의 표적화된 편집을 포함하는 게놈-조작된 iPSC는 Fate 유지 배지(FMM)로서 표 2에 나타낸 세포 배양 배지 중에서 연장된 기간 동안 단일 세포로서 유지, 계대배양 및 확장되며, iPSC는 선택된 부위(들)에서 표적화된 편집 및 기능성 변형을 보유한다. 배지의 성분은 표 2에 나타난 최적 범위 내의 양으로 배지에 존재할 수 있다. FMM에서 배양된 iPSC는 배양 세정 또는 선택의 필요 없이 이의 비분화된, 그리고 그라운드 또는 나이브 프로파일; 제공된 게놈 안정성을 계속해서 유지시키는 것으로 나타났고; 모든 3개의 체세포 계통, 배양체 또는 단층(배양체 형성 없음)을 통한 시험관내 분화; 및 기형종 형성에 의한 생체내 분화를 용이하게 발생시킨다. 예를 들어, 국제공개 WO 2015/134652호를 참조하고, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
[표 2]
일부 실시형태에서, 하나 이상의 표적화된 통합 및/또는 삽입-결실을 포함하는 게놈 조작된 iPSC는 MEK 억제제, GSK3 억제제 및 ROCK 억제제를 포함하고, TGFβ 수용체/ALK5 억제제가 없거나 본질적으로 없는 배지에서 유지되고 계대배양되고 확장되고, iPSC는 선택된 부위에서 무손상이고 기능성인 표적화된 편집을 보유한다.
본 발명의 다른 양태는 iPSC의 표적화된 편집을 통해; 또는 표적화된 편집에 의해 게놈 조작된 비-만능성 세포를 처음에 생성한 후, 비-만능성 세포와 동일한 표적화된 편집을 포함하는 iPSC를 얻기 위해 선택된/단리된 게놈 조작된 비-만능성 세포의 재프로그래밍을 통해, 게놈 조작된 iPSC를 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명의 추가의 양태는 표적화된 통합 및/또는 표적화된 삽입-결실을 세포로 도입함으로써 동시에 재프로그래밍을 겪는 비-만능성 세포의 게놈 조작을 제공하며, 접촉된 비-만능성 세포는 재프로그래밍에 충분한 조건 하에 있고, 재프로그래밍에 대한 조건은 비-만능성 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자 및 소분자와 접촉시키는 것을 포함한다. 동시 게놈-조작 및 재프로그래밍을 위한 방법의 다양한 실시형태에서, 표적화된 통합 및/또는 표적화된 삽입/결실은 비-만능성 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자 및 선택적으로 하나 이상의 소분자와 접촉시킴으로써 재프로그래밍 개시 이전에, 또는 이에 본질적으로 부수적으로 비-만능성 세포에 도입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 비-만능성 세포를 동시에 게놈 조작하고 재프로그래밍하기 위해, 표적화된 통합 및/또는 삽입/결실은 비-만능성 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자 및 소분자와 접촉시킴으로써 개시되는 재프로그래밍의 수 일의 과정 후 비-만능성 세포로 또한 도입될 수 있으며, 재프로그래밍 세포는 비제한적으로 SSEA4, Tra181 및 CD30을 포함하는 하나 이상의 내인성 만능 유전자의 안정한 발현을 제시하기 전에 작제물을 갖는 벡터가 도입된다.
일부 실시형태에서, 비-만능성 세포를 적어도 하나의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제, MEK 억제제, GSK3 억제제 및 ROCK 억제제의 조합(FRM; 표 2)과 접촉시킴으로써 재프로그래밍이 개시된다. 일부 실시형태에서, 상기 임의의 방법을 통해 생성된 게놈-조작된 iPSC는 MEK 억제제, GSK3 억제제 및 ROCK 억제제의 조합(FMM; 표 2)을 포함하는 혼합물을 사용하여 추가로 유지 및 확장된다.
게놈 조작된 iPSC의 생성 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 적어도 하나의 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 게놈 조작된 iPSC를 얻도록 하나 이상의 표적화된 통합 및/또는 삽입/결실을 iPSC로 도입하여 iPSC를 게놈 조작하는 것을 포함한다. 대안적으로, 게놈 조작된 iPSC의 생성 방법은 (a) 선택된 부위에서 표적화된 통합 및/또는 삽입-결실을 포함하는 게놈-조작된 비-만능성 세포를 얻도록 하나 이상의 표적화된 편집을 비-만능성 세포로 도입하는 단계, 및 (b) 선택된 부위에서 표적화된 통합 및/또는 삽입-결실을 포함하는 게놈 조작된 iPSC를 얻도록 게놈 조작된 비-만능성 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제, MEK 억제제, GSK3 억제제 및/또는 ROCK 억제제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 대안적으로, 게놈 조작된 iPSC의 생성 방법은 (a) 비-만능성 세포의 재프로그래밍을 개시하도록 비-만능성 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제, MEK 억제제, GSK3 억제제 및/또는 ROCK 억제제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시키는 단계; (b) 게놈 조작을 위해 재프로그래밍 비-만능성 세포로 하나 이상의 표적화된 통합 및/또는 삽입-결실을 도입하는 단계; 및 (c) 선택된 부위에서 표적화된 통합 및/또는 삽입-결실을 포함하는 클론성 게놈-조작된 iPSC를 수득하는 단계를 포함한다. 임의의 상기 방법은 클론성 iPSC를 수득하기 위해 게놈-조작된 iPSC의 단일 세포 분류, 및/또는 게놈-조작된 iPSC에서 표적외 편집 및 비정상 핵형에 대한 스크리닝을 추가로 포함할 수 있다. 게놈-조작된 iPSC의 클론성 확장을 통해, 본원에 제공된 적어도 하나의 표현형을 갖는, 단일 세포 분류 및 확장된 클론성의 조작된 iPSC를 포함하도록 마스터 세포 은행이 생성된다. 마스터 세포 은행은 후속적으로 동결보존되어, 추가의 iPSC 조작을 위한 플랫폼, 및 조성이 잘 정의되고 균일하며 비용 효과적인 방식으로 상당한 규모로 대량 생산될 수 있는 기성품의, 조작되고 균일한 세포 치료 산물을 제조하기 위한 재생가능한 공급원을 제공한다.
재프로그래밍 인자는 국제공개 WO 2015/134652호 및 WO 2017/066634호에 개시된 것처럼 OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3, L1TD1, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되고, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 하나 이상의 재프로그래밍 인자는 폴리펩티드의 형태일 수 있다. 재프로그래밍 인자는 또한 재프로그래밍 인자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 형태일 수 있고, 이에 따라 벡터, 예컨대 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 에피솜, 플라스미드 및 미니-서클에 의해 비-만능성 세포로 도입될 수 있다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 재프로그래밍 인자를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 벡터에 의해 도입된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 에피솜 벡터에 의해 도입된다. 다양한 다른 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 센다이 바이러스 벡터에 의해 도입된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 플라스미드의 조합에 의해 도입된다. 예를 들어, 국제공개 WO 2019/075057 A1호를 참조하고, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 비-만능성 세포는 동일한 선택 부위 또는 상이한 선택 부위에서 표적화된 통합을 위해 다수의 벡터에 의해 상이한 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 상이한 프로모터를 포함하는 다수의 작제물에 의해 형질주입된다. 이러한 외인성 폴리뉴클레오티드는 자살 유전자, 또는 표적화 모달리티를 인코딩하는 유전자, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약학적 활성 단백질 및 펩티드, 약물 표적 후보자, 또는 iPSC 또는 이의 유래 세포의 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 비제한적으로 siRNA, shRNA, miRNA 및 안티센스 핵산을 포함하는 RNA를 인코딩한다. 이러한 외인성 폴리뉴클레오티드는 항시적 프로모터, 유도성 프로모터, 시간 특이적 프로모터, 및 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 유도제의 존재 하에 또는 특정 분화된 세포 유형에서 프로모터를 활성화하는 조건 하일 때 발현가능하다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 iPSC에서 및/또는 iPSC로부터 분화된 세포에서 발현된다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 자살 유전자는 항시적 프로모터에 의해 유도되고, 예를 들어 카스파아제-9는 CAG에 의해 유도된다. 상이한 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 상이한 프로모터를 포함하는 이러한 작제물은 동시에 또는 연속적으로 비-만능성 세포로 형질감염될 수 있다. 다수의 작제물의 표적화된 통합에 적용되는 비-만능성 세포는 게놈 조작과 동시에 재프로그래밍을 개시하도록 하나 이상의 재프로그래밍 인자와 동시에 접촉하여, 동일한 세포 풀에서 다수의 표적화된 통합을 포함하는 게놈 조작된 iPSC를 얻을 수 있다. 이와 같이, 이러한 견고한 방법은 하나 이상의 선택된 표적 부위로 통합된 다수의 모달리티를 갖는 클론 게놈-조작된 hiPSC를 분화하기 위한 동시의 재프로그래밍 및 조작 전략을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 본원의 방법 및 조성물을 사용하여 얻은 게놈 변형된 iPSC 및 이의 유래 세포는 표 1에 열거된 적어도 하나의 유전자형을 포함한다.
IV. 게놈-조작된 iPSC를 분화하여 유전자-조작된 이펙터 세포를 얻는 방법
본 발명의 추가 양태는 테라토마 형성에 의한 게놈-조작된 iPSC의 생체내 분화 방법을 제공하며, 게놈-조작된 iPSC로부터 생체내에서 유래된 분화된 세포는 목적하는 부위(들)에서 표적화된 통합(들) 및/또는 삽입/결실을 포함하는 무손상 및 기능성 표적화된 편집을 보유한다. 일부 실시형태에서, 테라토마 형성을 통해 게놈-조작된 iPSC로부터 생체내에서 유래된 분화된 세포는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, CD38, GAPDH, TCR 또는 RUNX1, 또는 게놈 세이프 하버의 기준을 충족시키는 다른 좌위를 포함하는 하나 이상의 목적하는 부위에서 통합된 하나 이상의 유도성 자살 유전자를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 테라토마 형성을 통해 게놈-조작된 iPSC로부터 생체내에서 유래된 분화된 세포는 표적화 모달리티를 인코딩하거나, 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 유도성 자살 유전자를 포함하는 테라토마 형성을 통해 게놈-조작된 iPSC로부터 생체내에서 유래된 분화된 세포는 면역 반응 조절 및 매개와 관련된 내인성 유전자에 하나 이상의 삽입/결실을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 삽입/결실은 하나 이상의 내인성 관문 유전자에 포함된다. 일부 실시형태에서, 삽입/결실은 하나 이상의 내인성 T 세포 수용체 유전자에 포함된다. 일부 실시형태에서, 삽입/결실은 하나 이상의 내인성 MHC 클래스 I 억제자 유전자에 포함된다. 일부 실시형태에서, 삽입/결실은 주요 조직적합성 복합체와 관련된 하나 이상의 내인성 유전자에 포함된다. 일부 실시형태에서, 삽입/결실은 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD44, CD54, CD56, CD58, CD69, CD71, OX40, 4-1BB, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, 및 TIGIT를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 내인성 유전자에 포함된다. 일 실시형태에서, 선택된 부위(들)에서 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈-조작된 iPSC는 B2M(베타-2-마이크로글로불린) 인코딩 유전자에서 표적화된 편집을 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 하나 이상의 유전자 변형을 포함하는 게놈-조작된 iPSC는 조혈 세포 계통 또는 임의의 다른 특정 세포 유형을 시험관내에서 유도하도록 사용되며, 유래된 비-만능성 세포는 선택된 부위(들)에서의 표적화된 편집을 포함하는 기능적 유전자 변형을 보유한다. 일 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC-유래된 세포는 한정적 동형유전자성 내피세포(HE) 능력을 갖는 중배엽 세포, 한정적 HE, CD34+ 조혈 세포, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구체(MPP), T 세포 전구체, NK 세포 전구체, 골수성 세포, 호중구 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 호중구, 수지상 세포 및 대식세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않으며, 게놈-조작된 iPSC로부터 유래된 세포는 목적하는 부위(들)에서 표적화된 편집을 포함하는 기능적 유전자 변형을 보유한다.
iPSC-유래된 조혈 세포 계통을 수득하기 위한 적용가능한 분화 방법 및 조성물은 예를 들어 국제공개 WO 2017/078807호에 기재된 것을 포함하고, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 제공된 바와 같이, 조혈 세포 계통의 생성 방법 및 조성물은 EB 형성이 필요 없는 무-혈청, 피더-무함유 및/또는 기질-무함유 조건 하에서 그리고 플랫폼을 배양하는 증폭가능한 단층에서의 iPSC를 포함하는, 만능성 줄기 세포로부터 유래된 한정적 조혈 내피세포(HE)를 통한 것이다. 제공된 방법에 따라 분화될 수 있는 세포는 만능성 줄기 세포로부터 특정 말단 분화된 세포 및 전환분화된(transdifferentiated) 세포로 결정된 전구 세포로, 그리고 만능 중간체를 거치지 않고 조혈 페이트(hematopoietic fate)로 직접 이행된 다양한 계통의 세포에 이른다. 유사하게, 줄기 세포를 분화하여 제조될 수 있는 세포는 다능성 줄기 세포 또는 전구 세포로부터 말단 분화된 세포로, 그리고 모든 개재하는 조혈 세포 계통에 이른다.
단층 배양에서 만능성 줄기 세포로부터 조혈 계통의 세포를 분화하고 확장시키는 방법은 만능성 줄기 세포를 BMP 경로 활성자 및 선택적으로 bFGF와 접촉시키는 것을 포함한다. 제공된 것처럼, 만능성 줄기 세포-유래된 중배엽 세포가 얻어지고, 만능성 줄기 세포로부터 배양체를 형성함이 없이 확장된다. 이후, 중배엽 세포는 만능성 줄기 세포로부터 배양체를 형성함이 없이 한정적 동형유전자성 내피세포(HE) 능력을 갖는 확장된 중배엽 세포를 얻기 위해 BMP 경로 활성자, bFGF 및 WNT 경로 활성자와의 접촉에 적용된다. bFGF, 및 선택적으로 ROCK 억제제 및/또는 WNT 경로 활성자와의 후속하는 접촉에 의해, 한정적 HE 능력을 갖는 중배엽 세포는 분화 동안 또한 확장되는 한정적 HE 세포로 분화한다.
조혈 계통의 세포를 얻기 위한 본원에 제공된 방법은 EB 매개된 만능성 줄기 세포 분화보다 우수한데, 이는 EB 형성이 보통 정도의 세포 확장 내지는 최소 세포 확장을 야기하고, 집단에서의 세포의 동종성 확장 및 동종성 분화를 필요로 하는 많은 분야에 중요한 단층 배양을 허용하지 않고, 힘들며 효율이 낮기 때문이다.
제공된 단층 분화 플랫폼은 한정적 동형유전자성 내피세포를 향한 분화가 용이하게 하여 조혈 줄기 세포 및 T 세포, B 세포, NKT 세포 및 NK 세포와 같은 분화된 자손이 생성되게 한다. 단층 분화 전략은 향상된 분화 효율과 대규모 확장을 조합하며, 다양한 치료적 응용을 위한 치료적으로 관련된 수의 만능성 줄기 세포-유래된 조혈 세포의 전달을 가능하게 한다. 추가로, 본원에 제공된 방법을 사용하는 단층 배양은 전체 범위의 시험관내 분화, 생체외 조절, 및 생체내 장기간 조혈 자가 재생, 재구성 및 생착을 가능하게 하는 기능성 조혈 계통 세포로 이어진다. 제공된 것처럼, iPSC-유래된 조혈 계통 세포는 한정적 동형유전자성 내피세포, 조혈 다능성 전구 세포, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포 및 호중구를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
따라서, 다양한 실시형태에서, 한정적 조혈 계통의 세포로 만능성 줄기 세포의 분화를 유도하기 위한 방법은 (i) 만능성 줄기 세포로부터 중배엽 세포의 분화 및 확장을 개시하도록 만능성 줄기 세포를 BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; (ii) 중배엽 세포로부터 한정적 HE 능력을 갖는 중배엽 세포의 분화 및 확장을 개시하도록 중배엽 세포를 BMP 활성자, bFGF, 및 GSK3 억제제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계 - 이때, 조성물은 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제가 없음 -; (iii) 한정적 동형유전자성 내피세포 능력을 갖는 만능성 줄기 세포-유래된 중배엽 세포로부터 한정적 동형유전자성 내피세포의 분화 및 확장을 개시하도록 한정적 HE 능력을 갖는 중배엽 세포를 ROCK 억제제; bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로, Wnt 경로 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계 - 이때, 조성물은 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제가 없음 - 를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 만능성 줄기 세포를 시딩하고 확장하기 위해 만능성 줄기 세포를 MEK 억제제, GSK3 억제제 및 ROCK 억제제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 추가로 포함하며, 조성물은 TGFβ 수용체/ALK 억제제가 없다. 일부 실시형태에서, 만능성 줄기 세포는 iPSC, 또는 나이브 iPSC, 또는 하나 이상의 유전 각인을 포함하는 iPSC이고, iPSC에 포함된 하나 이상의 유전 각인은 이로부터 분화된 조혈 세포에 보유된다. 조혈 계통의 세포로의 만능성 줄기 세포의 분화를 지시하는 방법의 일부 실시형태에서, 조혈 계통의 세포로의 만능성 줄기 세포의 분화는 배양체의 생성이 없고, 단층 배양 형태로 있다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 획득한 만능성 줄기 세포-유래된 한정적 동형유전자성 내피 세포는 CD34+이다. 일부 실시형태에서, 획득한 한정적 동형유전자성 내피 세포는 CD34+CD43-이다. 일부 실시형태에서, 한정적 동형유전자성 내피 세포는 CD34+CD43-CXCR4-CD73-이다. 일부 실시형태에서, 한정적 동형유전자성 내피 세포는 CD34+ CXCR4-CD73-이다. 일부 실시형태에서, 한정적 동형유전자성 내피 세포는 CD34+CD43-CD93-이다. 일부 실시형태에서, 한정적 동형유전자성 내피 세포는 CD34+CD93-이다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 (i) pre-T 세포 전구체로의 한정적 동형유전자성 내피세포의 분화를 개시하도록 만능성 줄기 세포-유래된 한정적 동형유전자성 내피세포를 ROCK 억제제; VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 선택적으로, (ii) T 세포로의 T 세포 전구체 또는 pre-T 세포 전구체의 분화를 개시하도록 pre-T 세포 전구체를 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하지만, VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 억제제 중 하나 이상이 없는 조성물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 방법의 일부 실시형태에서, 만능성 줄기 세포-유래된 T 세포 전구체는 CD34+CD45+CD7+이다. 방법의 일부 실시형태에서, 만능성 줄기 세포-유래된 T 세포 전구체는 CD45+CD7+이다.
조혈 계통의 세포로 만능성 줄기 세포의 분화를 유도하기 위한 상기 방법의 일부 추가의 실시형태에서, 방법은 (i) pre-NK 세포 전구체로의 한정적 동형유전자성 내피세포의 분화를 개시하도록 만능성 줄기 세포-유래된 한정적 동형유전자성 내피세포를 ROCK 억제제; VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로, BMP 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 선택적으로 (ii) NK 세포 전구체 또는 NK 세포로의 pre-NK 세포 전구체의 분화를 개시하도록 만능성 줄기 세포-유래된 pre-NK 세포 전구체를 SCF, Flt3L, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며, 배지는 VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 억제제 중 하나 이상이 없다. 일부 실시형태에서, 만능성 줄기 세포-유래된 NK 전구체는 CD3-CD45+CD56+CD7+이다. 일부 실시형태에서, 만능성 줄기 세포-유래된 NK 세포는 CD3-CD45+CD56+이고, 선택적으로 NKp46+, CD57+ 및 CD16+인 것으로 추가로 정의된다.
따라서, 상기 분화 방법을 사용하여, (i) iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하여 CD34+ HE 세포(iCD34); (ii) iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하여 한정적 동형유전자성 내피세포(iHE); (iii) iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하여 한정적 HSC; (iv) iMPP-A를 사용하여 다능성 전구 세포(iMPP); (v) iTC-A2 및 iTC-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하여 T 세포 전구체(ipro-T); (vi) iTC-B2를 사용하여 T 세포(iTC); (vii) iNK-A2 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하여 NK 세포 전구체(ipro-NK); 및/또는 (viii) NK 세포(iNK) 및 iNK-B2인 iPSC-유래된 조혈 세포의 하나 이상의 집단을 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 배지는:
a. iCD34-C는 ROCK 억제제, bFGF, VEGF, SCF, IL6, IL11, IGF 및 EPO로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인, 및 선택적으로 Wnt 경로 활성자를 포함하고; TGFβ 수용체/ALK 억제제가 없고;
b. iMPP-A는 BMP 활성자, ROCK 억제제, 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하고;
c. iTC-A2는 ROCK 억제제; SCF, Flt3L, TPO 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자를 포함하고;
d. iTC-B2는 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하고;
e. iNK-A2는 ROCK 억제제, 및 SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7, 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자를 포함하고,
f. iNK-B2는 SCF, Flt3L, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법으로부터 수득된 게놈-조작된 iPSC-유래된 세포는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD44, CD54, CD56, CD58, CD69, CD71, OX40, 4-1BB, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, 및 TIGIT, 또는 게놈 세이프 하버의 기준을 충족시키는 다른 좌위를 포함하는 하나 이상의 목적하는 통합 부위에 통합된 하나 이상의 유도성 자살 유전자를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC-유래된 세포는 안전성 스위치 단백질, 표적화 모달리티, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약학적 활성 단백질 및 펩티드, 약물 표적 후보자, 또는 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 자살 유전자를 포함하는 게놈-조작된 iPSC-유래된 세포는 관문 유전자, 내인성 T 세포 수용체 유전자 및 MHC 클래스 I 억제자 유전자를 포함하지만 이를 제한하지는 않는 면역 반응 조절 및 매개와 관련된 하나 이상의 내인성 유전자에 포함된 하나 이상의 삽입/결실을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 자살 유전자를 포함하는 게놈-조작된 iPSC-유래된 세포는 B2M 유전자 내에 삽입/결실을 추가로 포함하며, B2M이 녹아웃된다.
추가적으로, 제2 fate의 게놈-조작된 조혈 세포로 제1 fate의 게놈-조작된 조혈 세포를 얻기 위한 적용가능한 탈분화 방법 및 조성물은 예를 들어 국제공개 WO 2011/159726호에 기재된 것을 포함하고, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 본원에 제공된 방법 및 조성물은 재프로그래밍 동안 내인성 Nanog 유전자의 발현을 제한함으로써; 및 목적하는 세포 유형으로 중간 세포를 분화하기 위한 조건으로 비-만능성 중간 세포를 처리함으로써 비-만능성 중간 세포로 개시 비-만능성 세포를 부분적으로 재프로그래밍하는 것을 허용한다. 일부 실시형태에서, 본원의 방법 및 조성물을 사용하여 얻은 게놈 변형된 iPSC 및 이의 유래 세포는 표 1에 열거된 적어도 하나의 유전자형을 포함한다.
V. 유전자 조작된 iPSC로부터 분화된 기능적 모달리티를 갖는 유래 면역 세포의 치료적 용도
일부 실시형태에서, 본 발명은 개시된 것과 같은 방법 및 조성물을 사용하여 게놈 조작된 iPSC로부터 분화된 기능적으로 향상된 유래 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, iPSC는 iPSC-유래된 이펙터 세포에서 유지될 수 있는 하나 이상의 표적화된 유전자 편집을 포함하며, 유전자 조작된 iPSC 및 이의 유래 세포는 세포 기반 입양 치료에 적합하다. 일 실시형태에서, 유전자 조작된 이펙터 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC-유래된 CD34+ 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자 조작된 이펙터 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC-유래된 HSC 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자 조작된 이펙터 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC-유래된 proT 또는 T 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자 조작된 이펙터 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC-유래된 proNK 또는 NK 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자 조작된 이펙터 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC-유래된 면역 조절 세포 또는 골수 유래된 억제자 세포(MDSC)를 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC-유래된 유전자 조작된 이펙터 세포는 개선된 치료학적 가능성을 위해 생체외에서 추가로 조절된다. 일 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 유전자 조작된 이펙터 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 나이브 T 세포, 줄기 세포 기억 T 세포 및/또는 중앙 기억 T 세포의 증가된 수 또는 비를 포함한다. 일 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 유전자 조작된 이펙터 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 I형 NKT 세포의 증가된 수 또는 비를 포함한다. 다른 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 유전자 조작된 이펙터 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 적응성 NK 세포의 증가된 수 또는 비를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자 조작된 CD34+ 세포, HSC 세포, T 세포, NK 세포, 또는 iPSC로부터 유래된 골수 유래된 억제자 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 동종이계이다. 일부 다른 실시형태에서, 유전자 조작된 CD34+ 세포, HSC 세포, T 세포, NK 세포, 또는 iPSC로부터 유래된 MDSC의 단리된 집단 또는 하위집단은 자가유래이다.
일부 실시형태에서, 분화를 위한 iPSC는 유래된 이펙터 세포에서 바람직한 치료학적 속성을 전달하도록 선택된 유전 각인을 포함하되, 단 분화 동안 세포 발생 생물학은 파괴되지 않고, 유전 각인은 상기 iPSC로부터 유래된 분화 조혈 세포에서 보유되고 기능성이다.
일부 실시형태에서, 만능성 줄기 세포의 유전 각인은 (i) iPSC로의 비-만능성 세포의 재프로그래밍 동안 또는 후에 만능성 세포의 게놈에서 게놈 삽입, 결실 또는 치환을 통해 얻은 하나 이상의 유전자 변형된 모달리티; 또는 (ii) 공여자 특이적, 질환 특이적 또는 치료 반응 특이적인 공급원 특이적 면역 세포의 하나 이상의 보유가능한 치료학적 속성을 포함하고, 만능성 세포는 공급원 특이적 면역 세포로부터 재프로그래밍되고, iPSC는 iPSC-유래된 조혈 계통 세포에 또한 포함된 공급원 치료학적 속성을 보유한다.
일부 실시형태에서, 유전자 변형된 모달리티는 안전성 스위치 단백질, 표적화 모달리티, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약학적 활성 단백질 및 펩티드, 약물 표적 후보자; 또는 iPSC 또는 이의 유래 세포의 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정 및/또는 생존을 촉진하는 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형된 iPSC 및 이의 유래 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 유전자 변형된 iPSC 및 이의 유래 세포는 (1) NLRC5, PD1, LAG3, 및 TIM3 중 하나 이상의 결실 또는 파괴; 및 (2) HLA-E, HLA-G, 4-1BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR, Fc 수용체, 또는 이중특이적 인게이저 또는 다중특이적 인게이저 또는 범용 인게이저와 커플링하기 위한 표면 유도 수용체의 도입을 포함하는 추가의 유전자 변형된 모달리티를 추가로 포함한다.
일부 또 다른 실시형태에서, iPSC-유래된 조혈 계통 세포는 (i) 하나 이상의 항원 표적화 수용체의 발현; (ii) 변형된 HLA; (iii) 종양 미세환경에 대한 내성; (iv) 방관자 면역 세포의 동원 및 면역 조절; (iv) 감소된 오프 종양 효과를 갖는 개선된 온 타겟 특이성; 및 (v) 개선된 호밍, 지속성, 세포독성, 또는 항원 회피 구제 중 적어도 2개의 조합과 관련된 공급원 특이적 면역 세포의 치료학적 속성을 포함한다.
일부 실시형태에서, 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 iPSC-유래된 조혈 세포, 및 상기 세포는 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18 또는 IL21 또는 이의 임의의 변형된 단백질을 포함하는 적어도 하나의 사이토카인 및/또는 이의 수용체를 발현하고, 적어도 하나의 CAR을 발현한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인(들) 및 CAR(들)의 조작된 발현은 NK 세포 특이적이다. 일부 다른 실시형태에서, 사이토카인(들) 및 CAR(들)의 조작된 발현은 T 세포 특이적이다. 일부 실시형태에서, iPSC-유래된 조혈 이펙터 세포는 항원 특이적이다. 일부 실시형태에서, 항원 특이적 유래 이펙터 세포는 액체 종양을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 항원 특이적 유래 이펙터 세포는 고형 종양을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 항원 특이적 iPSC-유래된 조혈 이펙터 세포는 종양 항원 회피를 구제할 수 있다.
구체적으로, 본 출원은 입양 세포 치료에서 수용자 활성화된 면역 세포에 의한 동종이계 이펙터 세포의 동종 거부를 감소 또는 예방하는 방법을 제공하며, 방법은 병용 요법을 투여하는 것을 포함하고, 병용 요법은 본원에 기재된 유래 이펙터 세포와 항-CD38 치료제를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 유래 이펙터 세포는 B2M-/-CD38-/-(및 선택적으로 CIITA-/-)이고, 표 1에 나타난 외인성 CD16, IL, CAR, 항체, 및 임의의 다른 모달리티 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 다양한 실시형태에서, 병용 요법의 항-CD38 치료제는 항-CD38 항체 또는 이의 단편이다. 일부 실시형태에서, 항-CD38 항체는 다라투무맙, 이사툭시맙, 또는 MOR202이다. 일부 실시형태에서, 항-CD38 치료제는 유래 이펙터 세포의 투여와 함께, 이전에 또는 이후에 투여된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 항체는 대상체에 대한 동시 또는 연속적 투여에 의해 본원에 기재된 이펙터 세포의 집단과 조합하여 사용된다. 다른 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 본원에 기재된 것과 같이 상기 항체 또는 이의 단편을 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 사용하여 iPSC를 유전자 조작하고, 조작된 iPSC의 분화 유도를 분화함으로써 이펙터 세포에 의해 발현될 수 있다. 방법의 일부 실시형태에서, 동종이계 이펙터 세포는 iPSC 유래된 조혈 세포이다. 방법의 일부 실시형태에서, 동종이계 이펙터 세포는 iPSC 유래된 T, NK, 또는 NKT 세포이다.
입양 세포 치료에서 수용자 활성화된 면역 세포에 의한 동종이계 이펙터 세포의 동종 거부를 감소 또는 예방하는 방법의 추가의 실시형태에서, 방법은 CAR에 의해 표적화된 동일 또는 상이한 상향조절된 표면 단백질에 특이적인 항체 및/또는 하나 이상의 추가 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 방법의 일부 실시형태에서, 항체는 적어도 하나의 항-CD20, 항-HER2, 항-CD52, 항-EGFR, 항-CD123, 항-GD2, 항-PDL1, 항-CD38 항체, 항-CD25 항체, 항-CD69 항체, 항-CD71 항체, 항-CD44 항체, 또는 이의 임의의 인간화 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편, 기능적 균등물 및 바이오시밀러를 포함한다. 방법에서 사용된 치료제의 일부 실시형태에서, 치료제는 펩티드, 사이토카인, 관문 억제제, 미토겐, 성장 인자, 작은 RNA, dsRNA(이중가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 피더 세포, 피더 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 관심대상의 하나 이상의 폴리핵산을 포함하는 벡터, 항체, 화학치료제 또는 방사성 모이어티 또는 면역조절 약물(IMiD)을 포함한다.
입양 세포 치료에 적합한 대상체에 본 발명의 유래 이펙터 세포를 도입함으로써 다양한 질환이 완화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 iPSC-유래된 조혈 세포는 동종이계 입양 세포 치료를 위한 것이다. 추가적으로, 본 발명은 일부 실시형태에서 입양 세포 치료에 적합한 대상체에 조성물을 도입함으로써 상기 치료 조성물 및/또는 병용 요법의 치료학적 용도를 제공하며, 대상체는 자가면역 장애; 혈액학적 악성종양; 고형 종양; 또는 HIV, RSV, EBV, CMV, 아데노바이러스 또는 BK 폴리오마바이러스와 관련된 감염을 갖는다.
혈액학적 악성종양의 예는 급성 백혈병 및 만성 백혈병(급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 만성 골수성 백혈병(CML), 림프종, 비호지킨 림프종(NHL), 호지킨병, 다발성 골수종 및 골수이형성 증후군을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 고형 암의 예는 뇌, 전립선, 유방, 폐, 대장, 자궁, 피부, 간, 골, 췌장, 난소, 고환, 방광, 신장, 두부, 경부, 위, 자궁경부, 직장, 후두 및 식도의 암을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 다양한 자가면역 장애의 예는 원형 탈모증, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 피부근육염, (1형) 당뇨병, 소아 특발성 관절염의 일부 형태, 사구체신염, 그레이브병, 길랑 바레 증후군, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 심근염의 일부 형태, 다발성 경화증, 천포창/유사천포창, 악성빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발근염, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 류마티스성 관절염, 피부경화증/전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 전신 루푸스, 홍반성, 갑상선염의 일부 형태, 포도막염의 일부 형태, 백반증, 다발혈관염 동반 육아종증(베게너)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 바이러스 감염의 예는 HIV(인간 면역결핍 바이러스), HSV(단순 포진 바이러스), KSHV(카포시 육종 관련 헤르페스바이러스), RSV(호흡기 융합 바이러스), EBV(엡스타인 바 바이러스), CMV(사이토메갈로바이러스), VZV(바리셀라 조스터 바이러스), 아데노바이러스, 렌티바이러스, BK 폴리오마바이러스 관련된 장애를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
증상 제시에 대해 또는 재발 예방을 위해 본원에 개시된 실시형태의 유래된 조혈 계통 세포를 사용하는 치료가 수행될 수 있다. 용어 "치료하는", "치료" 등은 일반적으로 목적하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미하도록 본원에서 사용된다. 효과는 질환을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 면에서 예방적일 수 있고/있거나, 질환에 기인한 질환 및/또는 유해 효과에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 면에서 치료학적일 수 있다. 본원에서 사용된 "치료"는 대상체에서의 임의의 질환 중재를 포괄하고, 질환의 소인이 있을 수 있지만 이것을 갖는 것으로 아직 진단되지 않은 대상체에서 질환이 발생하는 것을 방지하는 것; 및 질환의 억제, 즉 이의 발생의 중지; 또는 질환의 경감, 즉 질환 퇴행의 야기를 포함한다. 치료제 또는 조성물은 질환 또는 손상의 발생 이전에, 동안에 및/또는 이후에 투여될 수 있다. 치료가 환자의 바람직하지 않은 임상 증상을 안정화시키거나 감소시키는 경우 진행 중인 질환의 치료가 또한 특정 관심대상이 된다. 특정 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 세포 치료에 의해 적어도 하나의 관련 증상에서 함유되고, 완화되고/되거나 개선될 수 있는 질환, 병태 및/또는 손상을 갖는다. 특정한 실시형태는 세포 치료를 필요로 하는 대상체가 골수 또는 줄기 세포 이식의 후보자, 화학요법 또는 조사 치료를 받는 대상체, 과증식성 장애 또는 암, 예를 들어 과증식성 장애 또는 조혈계의 암을 갖거나 가질 위험에 있는 대상체, 종양, 예를 들어 고형 종양을 갖거나 발생시킬 위험에 있는 대상체, 바이러스 감염 또는 바이러스 감염과 관련된 질환을 갖거나 가질 위험에 있는 대상체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다는 것을 고려한다.
본원에 개시된 실시형태의 유래된 조혈 계통 세포를 포함하는 치료에 대한 반응을 평가할 때, 임상 이익률, 사망까지의 생존기간, 병리학적 완전 반응, 병리학적 반응의 반정량적 측정치, 임상 완전 관해, 임상 부분 관해, 임상 안정 병변, 무재발 생존기간, 무전이 생존기간, 무질환 생존기간, 순환 종양 세포 감소, 순환 마커 반응 및 RECIST(Response Evaluation Criteria In Solid Tumor: 고형 종양에서의 반응 평가 기준) 기준 중 적어도 하나를 포함하는 기준에 의해 반응이 평가될 수 있다.
본원에 개시된 것과 같은 iPSC-유래된 조혈 계통 세포를 포함하는 치료 조성물은 다른 치료 이전에, 동안에 및/또는 이후에 대상체에 투여될 수 있다. 이와 같이, 병용 요법의 방법은 추가의 치료제의 사용 이전에, 동안에 및/또는 이후에 iPSC-유래된 이펙터 세포의 투여 또는 제조를 수반할 수 있다. 상기 제공된 것처럼, 하나 이상의 추가의 치료제는 펩티드, 사이토카인, 관문 억제제, 미토겐, 성장 인자, 작은 RNA, dsRNA(이중가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 피더 세포, 피더 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 하나 이상의 관심 다중핵산을 포함하는 벡터, 항체, 화학치료제 또는 방사성 모이어티, 또는 면역조절 약물(IMiD)을 포함한다. iPSC 유래된 면역 세포의 투여는 추가적인 치료제 투여로부터 수 시간, 수 일 또는 심지어 수 주의 시간의 간격으로 수행될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 다른 생물학적 활성제 또는 모달리티, 예컨대 비제한적인 예로서 항신생물제, 비약물 치료, 예컨대 수술과 조합될 수 있다.
조합 세포 치료의 일부 실시형태에서, 치료학적 조합은 본원에 제공된 iPSC-유래된 조혈 계통 세포 및 항체 또는 항체 단편인 추가의 치료제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간화된 항체, 인간화된 단일클론 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편은 바이러스 항원에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편은 종양 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 종양 또는 바이러스 특이적 항원은 이의 사멸 능력을 향상시키기 위해 투여된 iPSC 유래된 조혈 계통 세포를 활성화시킨다. 일부 실시형태에서, 투여된 iPSC 유래된 조혈 계통 세포에 대한 추가의 치료제로서 병용 치료에 적합한 항체는 항-CD20(예를 들어, 리툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 유블리툭시맙, 오카라투주맙, 오비누투주맙), 항-HER2(예를 들어, 트라스투주맙, 퍼투주맙), 항-CD52(예를 들어, 알렘투주맙), 항-EGFR(예를 들어, 세툭시맙), 항-GD2(예를 들어, 디누툭시맙), 항-PDL1(예를 들어, 아벨루맙), 항-CD38(예를 들어, 다라투무맙, 이사툭시맙, MOR202), 항-CD123(예를 들어, 7G3, CSL362), 항-SLAMF7(엘로투주맙), 항-CD25(예를 들어, 다클리주맙, 바실릭시맙, M-A251, 2A3, BC69, 24204, 22722 또는 24212), 항-CD69(예를 들어, MAB23591, FN50, 298614, 또는 AF2359), 항-CD71(예를 들어, CY1G4 또는 DF1513), 항-CD44(예를 들어, 비바투주맙, RG7356, 또는 G44-26) 및 이의 인간화된 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편 또는 이의 기능성 균등물 또는 바이오시밀러를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시형태에서, 추가의 치료제는 하나 이상의 관문 억제제를 포함한다. 관문이란, 억제되지 않을 때 면역 반응을 억제하거나 하향조절할 수 있는 세포 분자, 종종 세포 표면 분자를 지칭한다. 관문 억제제는 관문 유전자 발현 또는 유전자 산물을 감소시킬 수 있거나, 관문 분자의 활성을 감소시킬 수 있는 길항제이다. NK 또는 T 세포를 포함하는 유래 이펙터 세포와의 병용 요법에 적합한 관문 억제제가 상기 제공된다.
제공된 유래 이펙터 세포를 포함하는 병용 요법의 일부 실시형태는 관문 분자를 표적화하는 적어도 하나의 억제제를 추가로 포함한다. 제공된 유래 이펙터 세포와의 병용 요법의 일부 다른 실시형태는 2개, 3개, 또는 그 초과의 관문 분자가 표적화되도록 2개, 3개, 또는 그 초과의 억제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 병용 요법을 위한 이펙터 세포는 제공된 바와 같은 유래 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 병용 요법을 위한 이펙터 세포는 유래 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 병용 요법을 위한 유래 NK 또는 T 세포는 본원에 제공된 바와 같이 기능적으로 향상된다. 일부 실시형태에서, 2개, 3개, 또는 그 초과의 관문 억제제는 유래 이펙터 세포의 투여와 함께, 이전에 또는 이후에 병용 요법으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 둘 이상의 관문 억제제는 동시에, 또는 한 번에 하나(순차적) 투여된다.
일부 실시형태에서, 임의의 상기 관문 분자를 억제하는 길항제는 항체이다. 일부 실시형태에서, 관문 억제성 항체는 쥐과 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 낙타 Ig, 단일 가변 신항원 수용체(VNAR), 상어 중쇄 항체(Ig NAR), 키메라 항체, 재조합 항체, 또는 이의 항체 단편일 수 있다. 항체 단편의 비제한적인 예는 Fab, Fab', F(ab)'2, F(ab)'3, Fv, 단일 사슬 항원 결합 단편(scFv), (scFv)2, 디설파이드 안정화된 Fv(dsFv), 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 단일-도메인 항원 결합 단편(sdAb, 나노바디), 재조합 중쇄 전용 항체(VHH), 및 전장 항체의 결합 특이성을 유지하는 다른 항체 단편을 포함하고, 이는 전장 항체보다 제조하기에 보다 비용 효과적이거나, 보다 용이하게 사용되거나, 보다 민감할 수 있다. 일부 실시형태에서, 1, 또는 2 또는 3개 이상의 관문 억제제는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 이의 유도체 또는 기능적 균등물 중 적어도 하나를 포함한다.
유래 이펙터 세포 및 하나 이상의 관문 억제제를 포함하는 병용 요법은 액체 암 및 고형 암의 치료에 적용가능하며, 이러한 암은 피부 T-세포 림프종, 비호지킨 림프종(NHL), 균상 식육종, 파제트병모양 망상증, 세자리 증후군, 육아종 이완 피부, 림프종양 구진증, 만성 태선양 비강진, 급성 두창양 태선양 비강진, CD30+ 피부 T-세포 림프종, 속발성 피부 CD30+ 거대 세포 림프종, 비균상 식육종 CD30 피부 거대 T-세포 림프종, 다형성 T-세포 림프종, 레너트(Lennert) 림프종, 피하 T 세포 림프종, 혈관중심성 림프종, 아구성 NK-세포 림프종, B 세포 림프종, 호지킨 림프종(HL), 두경부 종양; 편평 세포 암종, 횡문근종, 루이스 폐 암종(LLC), 비소세포 폐암, 식도 편평 세포 암종, 식도 선암종, 신세포 암종(RCC), 결직장암(CRC), 급성 골수성 백혈병(AML), 유방암, 위암, 전립선 소세포 신경내분비 암종(SCNC), 간암, 교아세포종, 간암, 구강 편평 세포 암종, 췌장암, 갑상선 유두암, 간내 담관세포 암종, 간세포 암종, 골암, 전이, 및 비인두 암종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 치료적 용도를 위한 병용은 본원에 제공된 유래 이펙터 세포 이외에, 화학치료제 또는 방사성 모이어티를 포함하는 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다. 화학치료제는 세포독성 항신생물제, 즉 신생물 세포를 우선적으로 사멸하거나 신속히 증식하는 세포의 세포 주기를 파괴하는 화학제, 또는 줄기 암 세포를 근절하는 것으로 발견되고, 신생물 세포의 성장을 예방하거나 감소시키도록 치료학적으로 사용되는 화학제를 지칭한다. 화학치료제는 또한 때때로 항신생물 또는 세포독성의 약물 또는 약제라 지칭하고, 이는 당업계에 잘 알려져 있다.
일부 실시형태에서, 화학치료제는 안트라사이클린, 알킬화제, 알킬 설포네이트, 아지리딘, 에틸렌이민, 메틸멜라민, 질소 머스타드, 니트로소우레아, 항생제, 항대사물질, 엽산 유사체, 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 효소, 포도필로톡신, 백금 함유 약제, 인터페론 및 인터류킨을 포함한다. 예시적인 화학치료제는 알킬화제(시클로포스파미드, 메클로르에타민, 메팔린, 클로르암부실, 헤아메틸멜라민(heamethylmelamine), 티오테파, 부술판, 카르무스틴, 로무스틴, 세무스틴), 항대사물질(메토트렉세이트, 플루오로우라실, 플록수리딘, 시타라빈, 6-메르캅토퓨린, 티오구아닌, 펜토스타틴), 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신), 에피포도필로톡신(에토포사이드, 에토포사이드 오르토퀴논 및 테니포사이드), 항생제(다우노루비신, 독소루비신, 미톡산트론, 비산트렌, 악티노마이신 D, 플리카마이신, 퓨로마이신 및 그라미시딘 D), 파클리탁셀, 콜히신, 시토칼라신 B, 에메틴, 메이탄신 및 암사크린을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 추가의 약제는 아민글루테티미드, 시스플라틴, 카르보플라틴, 미토마이신, 알트레타민, 시클로포스파미드, 로무스틴(CCNU), 카르무스틴(BCNU), 이리노테칸(CPT-11), 알렘투주맙, 알트레타민, 아나스트로졸, L-아스파라기나아제, 아자시티딘, 베바시주맙, 벡사로텐, 블레오마이신, 보르테조밉, 부술판, 칼루스테론, 카페시타빈, 셀레콕시브, 세툭시맙, 클라드리빈, 클로푸라빈, 시타라빈, 다카르바진, 데니류킨 디프티톡스, 디에틀스틸베스트롤, 도세탁셀, 드로모스타놀론, 에피루비신, 에를로티닙, 에스트라무스틴, 에토포사이드, 에티닐 에스트라디올, 엑세메스탄, 플록수리딘, 5-플루오로우라실, 플루다라빈, 플루타미드, 풀베스트란트, 게피티닙, 겜시타빈, 고세렐린, 히드록시우레아, 이브리투모맙, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티닙, 인터페론 알파(2a, 2b), 이리노테칸, 레트로졸, 류코보린, 류프롤라이드, 레바미솔, 메클로르에타민, 메게스트롤, 멜팔린, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 메톡살렌, 미토마이신 C, 미토탄, 미톡산트론, 난드롤론, 노페투모맙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파미드로네이트, 페메트렉세드, 페가데마아제, 페가스파라가아제, 펜토스타틴, 피포브로만, 플리카마이신, 포리페프로산, 포르피머, 프로카바진, 퀴나크린, 리툭시맙, 사르그라모스팀, 스트렙토조신, 타목시펜, 테모졸로마이드, 테니포사이드, 테스토락톤, 티오구아닌, 티오테파, 토페테칸, 토레미펜, 토시투모맙, 트라스투주맙, 트레티노인, 우라실 머스타드, 발루비신, 비노렐빈 및 졸레드로네이트를 포함한다. 다른 적합한 약제는 화학치료제 또는 방사선치료제로서 허가될 것을 포함하여, 인간 사용을 위해 허가된 것이며, 당업계에 알려진 것이다. 상기 약제는 임의의 수의 표준 의사 및 종양학자의 참조문헌(예를 들어, 문헌[Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, McGraw-Hill, N.Y., 1995])을 통해 또는 국제 암 협회 웹사이트(fda.gov/cder/cancer/druglistfrarne.htm)를 통해 참조될 수 있고, 이 둘 모두는 시간마다 업데이트된다.
탈리도마이드, 레날리도마이드 및 포말리도마이드와 같은 면역조절 약물(IMiD)은 NK 세포 및 T 세포 둘 모두를 자극한다. 본원에 제공된 바와 같이, IMiD는 암 치료를 위해서 iPSC 유래된 치료 면역 세포와 함께 사용될 수 있다.
환자에 대한 투여에 적합한 조성물은 치료 조성물에 포함된 iPSC 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단 이외에, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체(첨가제) 및/또는 희석제(예를 들어, 약학적으로 허용가능한 배지, 예를 들어 세포 배양 배지), 또는 다른 약학적으로 허용가능한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 부분적으로 투여되는 특정 조성물에 의해, 또한 치료 조성물을 투여하기 위해 사용된 특정 방법에 의해 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제가 결정된다. 따라서, 본 발명의 실시형태의 치료용 조성물의 매우 다양한 적합한 제형이 존재한다(예를 들어, 이의 개시내용은 이의 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985] 참조).
일 실시형태에서, 치료 조성물은 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능성 세포 유래된 T 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 치료 조성물은 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능성 세포 유래된 NK 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 치료 조성물은 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능성 세포 유래된 CD34+ HE 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 치료 조성물은 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능성 세포 유래된 HSC를 포함한다. 일 실시형태에서, 치료 조성물은 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능성 세포 유래된 MDSC를 포함한다. 본원에 개시된 바와 같은 iPSC 유래된 조혈 계통 세포의 집단을 포함하는 치료 조성물은 정맥내, 복강내 또는 장내 또는 기관 투여 방법에 의해 별개로 투여될 수 있거나, 목적하는 치료 목적에 영향을 주도록 다른 적합한 화합물과 조합하여 투여될 수 있다.
이러한 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제는 치료 조성물의 pH를 약 3 내지 약 10으로 유지시키기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 이와 같이, 완충제는 총 조성물의 중량 대 중량 기준으로 약 5%가 될 수도 있다. 전해질, 예컨대 비제한적으로 염화나트륨 및 염화칼륨은 치료 조성물에 또한 포함될 수 있다. 일 양태에서, 치료 조성물의 pH는 약 4 내지 약 10의 범위이다. 대안적으로, 치료 조성물의 pH는 약 5 내지 약 9, 약 6 내지 약 9, 또는 약 6.5 내지 약 8의 범위이다. 다른 실시형태에서, 치료 조성물은 상기 pH 범위의 하나에서 pH를 갖는 완충제를 포함한다. 다른 실시형태에서, 치료 조성물은 pH가 약 7이다. 대안적으로, 치료 조성물은 pH가 약 6.8 내지 약 7.4의 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 치료 조성물은 pH가 약 7.4이다.
본 발명은 또한 부분적으로 본 발명의 실시형태의 특정 조성물 및/또는 배양물에서 약학적으로 허용가능한 세포 배양 배지의 용도를 제공한다. 상기 조성물은 인간 대상체에 대한 투여에 적합하다. 일반적으로 말하면, 본 발명의 실시형태에 따른 iPSC-유래된 이펙터 세포의 유지, 성장, 및/또는 건강을 지지하는 임의의 배지는 약학적 세포 배양 배지로서 사용하기에 적합하다. 특정 실시형태에서, 약학적으로 허용가능한 세포 배양 배지는 혈청 비함유 및/또는 피더 비함유 배지이다. 다양한 실시형태에서, 혈청 비함유 배지는 동물 비함유이고, 선택적으로 단백질 비함유일 수 있다. 선택적으로, 배지는 생약학적으로 허용가능한 재조합 단백질을 함유할 수 있다. 동물 비함유 배지는 비동물 공급원으로부터 성분이 유래되는 배지를 지칭한다. 재조합 단백질은 동물 비함유 배지에서 천연 동물 단백질을 대체하고, 합성, 식물 또는 미생물 공급원으로부터 영양소를 얻는다. 단백질 비함유 배지는 반대로 단백질이 실질적으로 없는 것으로 정의된다. 당업자는 배지의 상기 예가 예시적이고, 본 발명에서 사용하기에 적합한 배지의 제제를 어떤 방식으로든 제한하지 않고, 당업자에게 알려져 있고 이용가능한 많은 적합한 배지가 있다는 것을 이해할 것이다.
iPSC-유래된 조혈 계통 세포는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 T 세포, NK 세포, NKT 세포, proT 세포, proNK 세포, CD34+ HE 세포, HSC, B 세포, 골수-유래된 억제자 세포(MDSC), 조절 대식세포, 조절 수지상 세포 또는 간엽성 기질 세포를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, iPSC-유래된 조혈 계통 세포는 약 95% 내지 약 100%의 T 세포, NK 세포, proT 세포, proNK 세포, CD34+ HE 세포 또는 골수-유래된 억제자 세포(MDSC)를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 세포 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위해 정제된 T 세포 또는 NK 세포를 갖는 치료 조성물, 예컨대 약 95%의 T 세포, NK 세포, proT 세포, proNK 세포, CD34+ HE 세포 또는 골수-유래된 억제자 세포(MDSC)의 단리된 집단을 갖는 조성물을 제공한다.
일 실시형태에서, 병용 세포 요법은 항-CD38 치료 단백질 또는 펩티드 및 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 게놈 조작된 iPSC로부터 유래된 NK 세포의 집단을 포함하며, 유래된 NK 세포는 B2M 음성 및 CD38 음성을 포함한다. 다른 실시형태에서, 병용 세포 요법은 항-CD38 항체 치료 단백질 또는 펩티드 및 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 게놈 조작된 iPSC로부터 유래된 T 세포의 집단을 포함하며, 유래된 T 세포는 B2M 음성 및 CD38 음성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 병용 세포 요법은 다라투무맙, 이사툭시맙 또는 MOR202, 및 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 게놈 조작된 iPSC로부터 유래된 NK 또는 T 세포의 집단을 포함하며, 유래된 NK 또는 T 세포는 B2M 음성, CD38 음성 및 CIITA 음성을 포함한다. 또한 일부 다른 실시형태에서, 병용 세포 요법은 다라투무맙, 및 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 게놈 조작된 iPSC로부터 유래된 NK 또는 T 세포의 집단을 포함하며, 유래된 NK 또는 T 세포는 B2M 음성, CIITA 음성, CD38 음성, 및 하나 이상의 외인성 CD16 및 CAR을 포함한다. 추가의 일부 추가적인 실시형태에서, 병용 세포 요법은 다라투무맙, 이사툭시맙 또는 MOR202 및 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 게놈 조작된 iPSC로부터 유래된 NK 또는 T 세포의 집단을 포함하며, 유래된 NK 또는 T 세포는 B2M 음성, CD38 음성, 및 CIITA 음성 및 하나 이상의 CD16, CAR 및 하나 이상의 외인성 사이토카인 신호전달 복합체를 포함한다.
당업자가 이해하는 것처럼, 본원의 방법 및 조성물에 기초하여 iPSC로부터 유래된 자가유래 및 동종이계 조혈 계통 세포 둘 모두는 상기 기재된 것과 같은 세포 치료에 사용될 수 있다. 자가유래 이식을 위해, 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단은 환자와 전체 또는 부분적으로 HLA 일치이다. 다른 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포는 대상체에 일치된 HLA가 아니며, 유래된 조혈 계통 세포는 HLA-I 결핍, 및 선택적으로 HLA-II 결핍을 갖는 NK 세포 또는 T 세포이다.
일부 실시형태에서, 치료 조성물에서의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 용량당 적어도 0.1 x 105개의 세포, 적어도 1 x 105개의 세포, 적어도 5 x 105개의 세포, 적어도 1 x 106개의 세포, 적어도 5 x 106개의 세포, 적어도 1 x 107개의 세포, 적어도 5 x 107개의 세포, 적어도 1 x 108개의 세포, 적어도 5 x 108개의 세포, 적어도 1 x 109개의 세포, 또는 적어도 5 x 109개의 세포이다. 일부 실시형태에서, 치료 조성물에서의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 용량당 약 0.1 x 105개의 세포 내지 약 1 x 106개의 세포; 용량당 약 0.5 x 106개의 세포 내지 약 1x 107개의 세포; 용량당 약 0.5 x 107개의 세포 내지 약 1 x 108개의 세포; 용량당 약 0.5 x 108개의 세포 내지 약 1 x 109개의 세포; 용량당 약 1 x 109개의 세포 내지 약 5 x 109개의 세포; 용량당 약 0.5 x 109개의 세포 내지 약 8 x 109개의 세포; 용량당 약 3 x 109개의 세포 내지 약 3 x 1010개의 세포, 또는 그 사이의 임의의 범위이다. 일반적으로, 1 x 108개의 세포/용량은 60 kg 환자/대상체의 경우 1.67 x 106개의 세포/kg으로 환산된다.
일 실시형태에서, 치료 조성물에서의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 부분 또는 단일 제대혈에서의 면역 세포의 수이거나, 적어도 0.1 x 105 세포/kg 체중, 적어도 0.5 x 105 세포/kg 체중, 적어도 1 x 105 세포/kg 체중, 적어도 5 x 105 세포/kg 체중, 적어도 10 x 105 세포/kg 체중, 적어도 0.75 x 106 세포/kg 체중, 적어도 1.25 x 106 세포/kg 체중, 적어도 1.5 x 106 세포/kg 체중, 적어도 1.75 x 106 세포/kg 체중, 적어도 2 x 106 세포/kg 체중, 적어도 2.5 x 106 세포/kg 체중, 적어도 3 x 106 세포/kg 체중, 적어도 4 x 106 세포/kg 체중, 적어도 5 x 106 세포/kg 체중, 적어도 10 x 106 세포/kg 체중, 적어도 15 x 106 세포/kg 체중, 적어도 20 x 106 세포/kg 체중, 적어도 25 x 106 세포/kg 체중, 적어도 30 x 106 세포/kg 체중, 1 x 108 세포/kg 체중, 5 x 108 세포/kg 체중 또는 1 x 109 세포/kg 체중이다.
일 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포의 용량이 대상체에게 전달된다. 일 예시적인 실시형태에서, 대상체에게 제공된 세포의 유효량은 적어도 2 x 106개의 세포/kg, 적어도 3 x 106개의 세포/kg, 적어도 4 x 106개의 세포/kg, 적어도 5 x 106개의 세포/kg, 적어도 6 x 106개의 세포/kg, 적어도 7 x 106개의 세포/kg, 적어도 8 x 106개의 세포/kg, 적어도 9 x 106개의 세포/kg, 또는 적어도 10 x 106개의 세포/kg 이상의 세포/kg, 및 모든 개재하는 세포 용량이다.
다른 예시적인 실시형태에서, 대상체에게 제공된 세포의 유효량은 약 2 x 106개의 세포/kg, 약 3 x 106개의 세포/kg, 약 4 x 106개의 세포/kg, 약 5 x 106개의 세포/kg, 약 6 x 106개의 세포/kg, 약 7 x 106개의 세포/kg, 약 8 x 106개의 세포/kg, 약 9 x 106개의 세포/kg, 또는 약 10 x 106개의 세포/kg 이상의 세포/kg 및 모든 개재하는 세포 용량이다.
다른 예시적인 실시형태에서, 대상체에게 제공된 세포의 유효량은 약 2 x 106개의 세포/kg 내지 약 10 x 106개의 세포/kg, 약 3 x 106개의 세포/kg 내지 약 10 x 106개의 세포/kg, 약 4 x 106개의 세포/kg 내지 약 10 x 106개의 세포/kg, 약 5 x 106개의 세포/kg 내지 약 10 x 106개의 세포/kg, 2 x 106개의 세포/kg 내지 약 6 x 106개의 세포/kg, 2 x 106개의 세포/kg 내지 약 7 x 106개의 세포/kg, 2 x 106개의 세포/kg 내지 약 8 x 106개의 세포/kg, 3 x 106개의 세포/kg 내지 약 6 x 106개의 세포/kg, 3 x 106개의 세포/kg 내지 약 7 x 106개의 세포/kg, 3 x 106개의 세포/kg 내지 약 8 x 106개의 세포/kg, 4 x 106개의 세포/kg 내지 약 6 x 106개의 세포/kg, 4 x 106개의 세포/kg 내지 약 7 x 106개의 세포/kg, 4 x 106개의 세포/kg 내지 약 8 x 106개의 세포/kg, 5 x 106개의 세포/kg 내지 약 6 x 106개의 세포/kg, 5 x 106개의 세포/kg 내지 약 7 x 106개의 세포/kg, 5 x 106개의 세포/kg 내지 약 8 x 106개의 세포/kg, 또는 6 x 106개의 세포/kg 내지 약 8 x 106개의 세포/kg, 및 모든 개재하는 세포 용량이다.
일부 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포의 치료학적 용도는 단일 용량 치료이다. 일부 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포의 치료학적 용도는 다중 용량 치료이다. 일부 실시형태에서, 다중 용량 치료는 매일, 3일마다, 7일마다, 10일마다, 15일마다, 20일마다, 25일마다, 30일마다, 35일마다, 40일마다, 45일마다 또는 50일마다, 또는 그 사이의 임의의 숫자의 일에 하나의 용량이다.
본 발명의 유래된 조혈 계통 세포의 집단을 포함하는 조성물은 멸균일 수 있고, 인간 환자/대상체에 대한 투여에 적합하고 즉시(ready for) 투여될 수 있다(즉, 임의의 추가의 가공 없이 투여될 수 있음). 즉시 투여될 수 있는 세포 기반 조성물이란, 조성물이 대상체에 대한 이식 또는 투여 전에 임의의 추가의 가공 또는 조작을 필요로 하지 않는다는 것을 의미한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 화학 소분자를 포함하는 하나 이상의 약제에 의한 투여 전에 확장되고/되거나 조절되는 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단을 제공한다. iPSC-유래된 이펙터 세포를 포함한 면역 세포를 조절하기 위한 조성물 및 방법은 예를 들어 국제공개 WO 2017/127755호에 더 상세히 기재되어 있고, 이의 관련 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 재조합 TCR 또는 CAR을 발현시키기 위해 유전자 조작된 유래된 조혈 계통 세포에 대해, 세포는 예를 들어 미국 특허 제6,352,694호에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 활성화되고 확장될 수 있다.
특정한 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포에 대한 1차 자극 신호 및 공동자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 각각의 신호를 제공하는 약제는 용액에 있거나 표면에 커플링될 수 있다. 약제는 표면에 커플링될 때 동일한 표면에(즉, "시스" 형성으로) 또는 개별 표면에(즉, "트랜스" 형성으로) 커플링될 수 있다. 대안적으로, 하나의 약제는 표면에 커플링되고 다른 약제는 용액 중에 있을 수 있다. 일 실시형태에서, 공동자극 신호를 제공하는 약제는 세포 표면에 결합될 수 있고, 1차 활성화 신호를 제공하는 약제는 용액 중에 있거나 표면에 커플링된다. 특정한 실시형태에서, 약제 둘 모두는 용액에 있을 수 있다. 다른 실시형태에서, 약제는 가용성 형태로 있을 수 있고, 이후 Fc 수용체를 발현하는 세포 또는 항체 또는 다른 결합제와 같은 표면에 가교결합될 수 있고, 이는 본 발명의 실시형태에서 T 림프구를 활성화하고 확장하는 데 사용하기 위해 고려되는 인공 항원 제시 세포(aAPC)의 경우, 예컨대 개시내용이 참조로 포함되어 있는 미국 특허출원공개 US 2004/0101519호 및 미국 특허출원공개 US 2006/0034810호에 개시된 약제에 결합할 것이다.
치료되는 대상체의 병태에 따라 투여량, 빈도 및 프로토콜의 약간의 변동이 반드시 발생할 것이다. 투여를 책임지는 사람은 임의의 사건에서 개별 대상체에 대한 적절한 용량, 빈도 및 프로토콜을 결정할 것이다.
실시예
하기 실시예는 제한의 방식이 아니라 예시의 방식으로 제공된다.
실시예 1 - 물질 및 방법
상이한 세이프 하버 좌위 통합 전략과 조합되어 다양한 프로모터의 제어 하에 자살 시스템을 효과적으로 선택하고 시험하기 위해, 단일 또는 다수의 유전적 조절에 의해 클론성 hiPSC의 분화를 허용하도록 단일 세포 계대배양 및 고속의, 96-웰 플레이트 기반 유세포분석법 분류를 가능하게 하는 출원인의 독점적 hiPSC 플랫폼이 사용되었다.
소분자 배양에서의 hiPSC 유지 : 배양의 포화상태가 75% 내지 90%에 도달하면 hiPSC를 단일 세포로서 통상적으로 계대배양하였다. 단일 세포 해리를 위해, hiPSC를 PBS(Mediatech)로 1회 세척하고, 단일 세포 해리를 보장하도록 37℃에서 3분 내지 5분 동안 Accutase(Millipore)로 처리한 후 피펫팅하였다. 이후, 단일 세포 현탁액을 종래의 배지와 동일한 부피에서 혼합하고, 225 × g에서 4분 동안 원심분리하고, FMM에 재현탁하고, Matrigel 코팅된 표면에 플레이팅하였다. 계대배양은 통상적으로 1:6 내지 1:8이고, 37℃에서 2시간 내지 4시간 동안 Matrigel로 미리 코팅된 조직 배양 플레이트로 옮기고, 2일 내지 3일마다 FMM을 공급하였다. 37℃ 및 5% CO2로 설정된 습윤 인큐베이터에서 세포 배양을 유지시켰다.
관심 모달리티의 표적화된 편집을 위한 ZFN, CRISPR에 의한 인간 iPSC 조작 : 예로서 ROSA26 표적화된 삽입을 사용하여, ZFN 매개된 게놈 편집을 위해, 200만 개의 iPSC를 AAVS1 표적화된 삽입을 위해 2.5 μg의 ZFN-L(FTV893), 2.5 μg의 ZFN-R(FTV894)과 5 μg의 공여자 작제물의 혼합물로 형질주입하였다. CRISPR 매개된 게놈 편집을 위해, 200만개의 iPSC를 ROSA26 표적화된 삽입을 위해 5 μg의 ROSA26-gRNA/Cas9(FTV922)과 5 μg의 공여자 작제물의 혼합물로 형질주입하였다. 매개변수 1500 V, 10 ms, 3 펄스를 사용하여 Neon 형질주입 시스템(Life Technologies)을 사용하여 형질주입을 수행하였다. 형질주입 후 2일차 또는 3일차에, 플라스미드가 인공 프로모터-드라이버 GFP 및/또는 RFP 발현 카세트를 함유하는 경우, 유세포분석법을 사용하여 형질주입 효율을 측정하였다. 형질주입 후 4일차에, 퓨로마이신을 처음 7일 동안 0.1 μg/ml 및 7일 후 0.2 μg/ml의 농도로 배지에 첨가하여 표적화된 세포를 선택하였다. 퓨로마이신 선택 동안, 10일차에 세포를 신선한 Matrigel 코팅된 웰에 계대배양하였다. 퓨로마이신 선택의 16일차 또는 그 후에, GFP+ iPS 세포 백분율에 대해 유세포분석법에 의해 생존 세포를 분석하였다.
게놈-편집된 iPSC의 벌크 분류 및 클론 분류 : 게놈 표적화된 편집을 갖는 iPSC를, ZFN 또는 CRISPR-Cas9을 사용하여, 퓨로마이신 선택 20일 후 GFP+SSEA4+TRA181+ iPSC에 대해 벌크 분류하고 클론 분류하였다. 단일 세포 해리된 표적화된 iPSC 풀을 Hank 균형 염 용액(MediaTech), 4% 태아 소 혈청(Invitrogen), 1x 페니실린/스트렙토마이신(Mediatech) 및 10 mM Hepes(Mediatech)를 함유하는 차가운 염색 완충제에 재현탁하고; 최적 수행을 위해 새롭게 만들었다. SSEA4-PE, TRA181-Alexa Fluor-647(BD Biosciences)을 포함하는 콘쥬게이트된 1차 항체를 세포 용액에 첨가하고, 15분 동안 얼음에서 인큐베이션하였다. 모든 항체는 100만 개의 세포당 100 μL의 염색 완충제 중의 7 μL로 사용되었다. 용액을 염색 완충제에서 1회 세척하고, 225 g에서 4분 동안 스피닝하고, 10 μM 티아조비빈을 함유하는 염색 완충제에 재현탁하고, 유세포분석법 분류를 위해 얼음에서 유지시켰다. FACS Aria II(BD Biosciences)에서 유세포분석법 분류를 수행하였다. 벌크 분류를 위해, GFP+SSEA4+TRA181+ 세포를 게이팅하고, 7 ml의 FMM이 충전된 15 ml 표준 튜브에 분류하였다. 분류된 세포를 클론 분류를 위해 웰당 3 사건의 농도로 100 μM 노즐을 사용하여 96웰 플레이트에 직접 분사하였다. 각각의 웰을, 5 μg/mL의 피브로넥틴 및 1x 페니실린/스트렙토마이신(Mediatech)으로 보충되고 5x Matrigel로 미리 밤새 코팅된 200 μL의 FMM으로 사전충전하였다. 5x Matrigel 예비코팅은 DMEM/F12 5 mL에 Matrigel의 하나의 분취물을 첨가한 후, 적절한 재현탁을 허용하도록 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 마지막으로 96-웰 플레이트에 웰당 50 μL로 첨가한 다음, 밤새 37℃에서 인큐베이션하는 것을 포함한다. 배지를 각각의 웰에 첨가하기 직전에, 5x Matrigel을 흡인시킨다. 분류 완료 시, 96-웰 플레이트를 인큐베이션 전에 225 g에서 1 내지 2분 동안 원심분리하였다. 플레이트를 7일 동안 방해되지 않게 두었다. 7일차에, 각각의 웰로부터 150 μL의 배지를 제거하고, 100 μL의 FMM으로 대체하였다. 분류 후 10일차에 추가의 100 μL의 FMM을 웰에 재공급하였다. 콜로니 형성이 2일차에 일찍이 검출되었고, 분류 후 7일차 내지 10일차에 대부분의 콜로니가 확장하였다. 제1 계대배양에서, 웰을 PBS로 세척하고, 37℃에서 대략 10분 동안 30 μL의 Accutase로 해리하였다. 연장된 Accutase 처리의 필요성은 장기간 배양에서 정지된 콜로니의 조밀성을 반영한다. 세포가 해리하는 것으로 확인된 후, 200 μL의 FMM을 각각의 웰에 첨가하고, 수 회 피펫팅하여 콜로니를 파괴한다. 해리된 콜로니를 5x Matrigel로 미리 코팅된 96-웰 플레이트의 다른 웰로 옮기고, 이후 인큐베이션 전에 225 g에서 2분 동안 원심분리하였다. 이 1:1 계대배양을 수행하여, 확장 전에 초기 콜로니를 확산시킨다. 3분 내지 5분 동안 Accutase 처리 및 75% 내지 90% 포화상태 시 FMM 중의 1x Matrigel로 미리 코팅된 더 큰 웰로의 1:4 내지 1:8의 확장에 의해 후속 계대배양을 통상적으로 수행하였다. GFP 형광 수준 및 TRA1-81 발현 수준에 대해 각각의 클론성 세포주를 분석하였다. 클론성 집단을 동결보존하고, 마스터 세포 은행으로서 작용시키기 전에, 조작된 iPSC의 핵형 및/또는 표적외 편집을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 분석과 추가 스크리닝을 위해 약 100% GFP+ 및 TRA1-81+를 갖는 클론성주를 선택하였다. Guava EasyCyte 8 HT(Millipore)에서 유세포분석법 분석을 수행하고, Flowjo(FlowJo, LLC)를 사용하여 분석하였다.
실시예 2 - iPSC-유래된 이펙터 세포에서의 HLA-I 결핍 및 CD16 상용성
예를 들어, B2M 녹아웃을 통해 HLA 복합체 변형을 달성하기 위해, iPSC주를 CRISPR 매개 편집을 위해 B2M-표적화 gRNA 쌍으로 형질주입하였다. 후속적으로, B2M 편집된 iPSC를 유전자 조작하여 CD38을 녹아웃시키고 hnCD16과 같은 외인성 CD16을 삽입하여, B2M-/-, CD38-/- 및 CD16을 포함하는 변형된 iPSC를 생성하였다. iPSC 클론성 선택, 전이유전자 카피수 확인 및 핵형 검증 후, CD38-/- CD16을 포함하는 게놈 편집된 HLA-I 결핍 클론성 iPSC를 본원에 제공된 방법에 따라 분화시켜 CD38-/- CD16을 갖는 HLA-I 결핍 이펙터 세포(HLA-Inull CD38-/-CD16)를 생성하였다. 또한, B2M 야생형 및 CD38-/- CD16을 갖는 iPSC 유래된 이펙터 세포를 HLA-IWTCD38-/-CD16을 갖는 iPSC를 통해 유사하게 얻었고, 이를 HLA-I 결핍 이펙터 세포의 표현형 및 기능 분석을 위한 대조군으로 사용하였다.
B2M 야생형 또는 B2M 녹아웃 iPSC 백그라운드 중 어느 하나에 대해 유래된 iNK를 분화시키고 확장하였다. NK 세포 마커에 대한 유세포분석법 분석을 사용하는 표현형 분석은 양측의 백그라운드로부터의 세포가 일반적인 NK 세포 마커에 대해 매우 유사한 표면 프로파일을 공유한다는 것을 보였다(도 1a).
B2M 야생형 또는 B2M 녹아웃 iPSC 백그라운드 중 어느 하나에 대해 유래된 iNK는 CD38 녹아웃 이외에 hnCD16을 추가로 포함한다. 항체 의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)은 항체 코팅된 표적 세포에 대한 CD16의 결합을 통한 NK 세포 매개된 용해의 기전이다. ADCC 기능을 평가하기 위해, hnCD16-발현 B2M-/- iNK 세포를 항-CD38 항체, 예를 들어 다라투무맙의 존재 및 부재 하에서 Nalm-6 백혈병 세포주와 공동배양하였다. 48시간의 공동배양에서 세포의 유세포분석법 분석은 B2M-/- iNK주가 B2M WT iNK주와 비교하여 매우 유사한 수준의 ADCC 활성을 보여준다는 것을 보여준다(도 1b). 이와 같이, HLA-I 결핍은 B2M-/- CD16 이펙터 세포에서 외인성 CD16을 통해 ADCC 기전에 부정적인 영향을 미치지 않는다.
실시예 3 - 이펙터 세포에 대한 HLA 결핍, CD38 컨디셔닝, 및 동종 거부 보호
이 검정에서, 사용된 iNK 세포는 B2M-/- CIITA-/-CD38-/- hnCD16을 포함하고, 이에 따라 HLA-I 및 HLA-II 둘 모두에서 무손상인 동일한 특정 공여자 백그라운드의 WT iNK에 비해, HLA-I 및 HLA-II 둘 모두에서 결핍이다(이중 녹아웃, 도 2a의 "dKO" 또는 "B2M/CIITA KO"). 표시된 모든 세포 집단은 CD38 발현이 부족하였다. 프라이밍되고 확장된 동종이계 공여자 T 세포(E)는 1:1의 E:T 비(allo-T 세포 : iNK)의 각각의 dKO iNK 및 WT iNK 세포와 공동 배양되었다. 도 2b에 도시된 바와 같이, 동종이계 T 세포는 B2M WT iNK 세포에 대해 이러한 HLA-I 결핍 iNK를 공격하는 능력이 감소된 것을 보였다. 이와 같이, HLA-I 결핍은 동종이계 T 세포 반응성에 대해 보호성이고, 동종이계 세포 치료 환경에서 이펙터 세포 지속성을 더 촉진할 수 있다.
이전에, HLA-I 결핍 이펙터 세포에서 HLA-E 또는 HLA-G와 같은 면역억제 단백질의 발현이 동종이계 말초혈 NK(pbNK) 세포의 증식을 방지하며, 이에 따라 이펙터 세포에 대해 pbNK 세포 인식 및 세포독성을 감소시킬 수 있음이 판명되었다. 추가적으로, 절단을 피하기 위한 HLA-E 또는 HLA-G의 변형된 버전은 HLA-I 결핍 이펙터 세포의 지속성을 추가로 향상시킬 수 있다. 다양한 리간드의 억제 효과를 시험하기 위해, 18명의 공여자로부터의 pbNK 세포를 제시된 억제성 리간드를 발현하는 K562 표적 세포와 공동 배양했으며, 특정 HLA 수용체를 발현하는 NK 세포 하위세트의 세포독성에 따른 배수 변화가 도 3에 제시되어 있다. 도시된 바와 같이, HLA-E 표면 발현 이펙터 세포는 억제성 수용체 NKG2A를 발현하는 NK 세포를 비활성화할 수 있지만, 또한 HLA-E 표면 발현이 pbNK 세포의 NKG2C를 활성화하여 pbNK 세포 인식 및 결과적인 HLA-E 발현 세포의 사멸을 포함하는 부작용을 유도한다는 것이 관찰되었다. 데이터는 NK 세포의 하위세트가 CD47 및 HLA-E 신호전달을 포함한 억제 경로에 내성이 있음을 나타낸다. 따라서, HLA-E 및 HLA-G를 인식하는 억제 수용체가 확률적으로 발현되기 때문에, 즉 이들이 모든 세포에서 발현되는 것은 아니기 때문에, HLA-E/G는 1차 NK 세포-기반 인식으로부터의 완전한 보호를 제공하지는 않는 것으로 보이며, 또한 거부를 촉진할 수 있는 HLA-E(및 가능하게는 HLA-G)를 인식하는 상응하는 활성화 수용체가 존재하는 것으로 보인다.
HLA-I 결핍 세포에서의 HLA-E/G에 의한 동종이계 1차 NK에 대한 보호의 누출을 회피하기 위해, 본 출원은 pbNK에 의한 HLA-I 결핍(예를 들어, B2M KO) 또는 HLA-I 및 HLA-II 결핍(예를 들어, B2M/CIITA dKO) 이펙터 세포에 대한 인식 및 세포독성을 감소시키는 보다 완전한 보호를 제공하는 대체 또는 추가적인 접근법을 제공한다. HLA-E/G 변형을 필요로 하지 않는 상기 접근법은 CD38 발현 부족으로 인해 이펙터 세포에 부작용을 주지 않으면서 이펙터 세포에 의해 활성화된 pbNK 세포를 제거하기 위해 항-CD38 항체를 사용하는 CD38 컨디셔닝을 통해 이루어진다.
도 4에 도시된 바와 같이, B2MWTCD38-/- 또는 B2M-/-CD38-/- iNK 세포를 건강한 공여자로부터 단리된 동종이계 pbNK 세포와 공동 배양하고, 1:5 또는 1:1(pbNK:iNK)의 E:T 비로 IL15와 밤새 프라이밍하였다. 다라투무맙 0 μg/ml에서, B2MWTCD38-/- iNK 세포에 비해 B2M-/-CD38-/- iNK 세포에 대한 pbNK 세포독성의 수준이 보다 높고, 이는 NK 세포 용해에 대한 HLA-I 결핍 세포 감응성과 일치한다. 그러나, 다라투무맙의 존재 하에서 공동 배양은 CD38 특이적 항체에 의한 CD38 컨디셔닝에 적합한 B2M-/-CD38-/- iNK 세포에 대한 pbNK 세포독성을 감소시켰다. 따라서, CD38 컨디셔닝은 숙주 1차 NK 세포 인식 및 세포독성에 적용되는 HLA-I 결핍 세포에 대해 보호 효과를 제공한다.
개별 실험에서, 건강한 공여자로부터의 동종이계 pbNK 세포를 도 5a 및 도 5b에 도시된 바와 같이, 다양한 농도에서 48시간 동안 다라투무맙으로 이중으로 전처리하였다. 48시간 후, B2MWTCD38-/-, B2M-/-CD38-/-, 또는 B2M-/-CIITA-/-CD38-/- iNK 세포를 1:1(pbNK:iNK)의 비로 적절한 웰에 첨가하고, 세포를 추가 48시간 동안 배양하였다. 도 5b에 도시된 바와 같이, 다라투무맙으로의 전처리는 공동 배양에서 pbNK 수를 크게 감소시켰고(이는 다라투무맙이 없는 웰로 정규화됨), B2M KO 및 B2M/CIITA dKO 수가 증가하여 동종 거부로부터의 보호를 나타낸다는 것을 보여준다(도 5a).
후속 검정에서, 상이한 건강한 공여자로부터의 동종이계 PBMC(T, NK 및 다른 면역 세포를 포함한 말초혈 단핵 세포)는 각각 CD38-/- iNK 세포와 공동 배양하거나 단독으로 배양되었다. 단독 배양 시 CD38을 발현하는 PBMC 하위집단의 크기에 비해(도 6a, 9일차 배양), 동종이계 CD38-/- iNK 세포로 프라이밍되어 공동 배양에서 iNK 세포의 동종이계 인식을 수행하는 PBMC는 CD38 발현을 높여 CD38-발현 동종반응성 PBMC 하위집단의 크기를 증가시켰다(도 6b, 9일차 공동 배양). 이러한 관찰은 동종이계 이펙터 세포의 주입 중 또는 주입 후 CD38 컨디셔닝 단계(예를 들어, 항-CD38 항체 주입)가 입양 세포 치료에서 더 큰 이펙터 세포 지속성을 촉진하는 데 효과적일 수 있되, 단 이펙터 세포는 CD38 컨디셔닝 단계에서 사용된 CD38 길항제에 의해 공격받지 않음을 시사하였다.
추가 분석은 혼합 림프구 반응(MLR)을 포함하며, 동종이계 PBMC는 다라투무맙의 존재 하에서 또는 다라투무맙의 부재 하에서(즉, 10 μg, 5 μg, 1 μg, 0.1 μg, 0.01 μg, 및 다라투무맙 없음; 도 7a 및 도 7b), 5:1 비의 B2M-/-, CD38-/-, IL15RF 및 hnCD16을 갖는 iPSC-유래된 iNK 세포와 공동 배양하였다. PBMC 수와 iNK 세포 수를 각각의 다라투무맙 용량 조건 하에서 공동 배양 11일차에 수집하였다. 도 7a에 도시된 바와 같이, PBMC 세포 수는 다라투무맙의 존재 하에서 용량 의존 방식으로 감소한다. HLA-I 결핍 이펙터 세포가 T 세포 매개된 동종반응성에 대해 보호되지만(상기 및 도 2 참조), PBMC의 pbNK 세포는 HLA-I 결핍으로 인해 이러한 세포에 대한 동종반응성을 나타내고, HLA-I 결핍 이펙터 세포 용해를 유도한다(도 7a 및 도 7b의 "다라투무맙 없음" 컬럼 참조). 그 결과, HLA-결핍만으로는 동종이계 이펙터 세포 생존을 연장시키는 데 충분하지 않을 수 있다. 이 검정에서, 동종이계 PBMC 반응성에 대한 iPSC-유래된 HLA-I 결핍 세포의 감응성이 다라투무맙의 존재 하에서, 보다 분명하게는, 약 0.01 μg 초과의 용량 수준에서 구제된다는 것이 관찰된다. 따라서, 동종반응성 숙주 세포의 제거 및 공여자 iNK 세포의 개선된 생존에 대한 다라투무맙의 용량 의존 효과가 관찰되었다.
다라투무맙의 존재 하에서 또는 다라투무맙의 부재 하에서(즉, 10 μg, 5 μg, 1 μg, 0.1 μg, 0.01 μg, 및 다라투무맙 없음) HLA-I 결핍 iNK 세포(B2M-/-, CD38-/-, IL15RF 및 hnCD16)와 건강한 공여자 PBMC의 공동 배양으로부터 유도된 MLR 검정을 또한 CD38-/-, IL15RF 및 hnCD16을 갖는 iNK 세포(즉, B2M WT iNK)와 공여자 PBMC를 공동 배양한 것과 비교하였다. 각각의 용량 수준에서 공동 배양 과정에 걸쳐(> 15일), 동종반응성 숙주 세포(PBMC) 제거 및 HLA-I 결핍 및 CD38 녹아웃을 모두 갖는 공여자 iNK 세포의 생존 개선에 대한 다라투무맙의 효과가 장기간에 걸쳐 개선되고(도 8a 및 도 8b), 이때 iNK 세포 수는 다라투무맙의 용량 의존 방식으로 증가한다. WT iNK 공동 배양에서 PBMC의 절대 T 세포 수(도 8c)는 다라투무맙이 T 세포 확장을 방지하였고, iNK에서 B2M KO(도 8d)가 T 세포 확장을 방지하기에 충분하였다는 것을 나타낸다. WT iNK 공동 배양(도 8e) 및 B2M KO iNK 공동 배양(도 8f) 둘 모두에서 PBMC의 절대 pbNK 세포 수는 다라투무맙이 pbNK 세포 확장도 방지했다는 것을 나타낸다. 이론에 의해 제한되지 않으면서, 동종반응성 숙주 세포에 대한 이펙터 iNK 세포의 보호에 대한 상승 효과는 하기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 여러 이유에 기인할 수 있다: (1) 이펙터 iNK 세포의 HLA-I 결핍은 숙주 동종반응성 T 세포로 인해 이들의 제거를 감소시킴; (2) 동종이계 이펙터 세포 프라이밍은 PBMC에서 동종반응성 세포의 CD38 발현을 상향조절하여, 항-CD38 항체에 대한 동종반응성 숙주 세포의 감응성을 증가시킴; (3) 외인성 CD16을 통한 향상된 ADCC는 항-CD38 항체 표적화를 가능하게 함; 및 (4) 이펙터 세포의 CD38-/- 표현형은 항-CD38 항체 표적화를 회피하는 반면, 항체는 CD38-발현 동종반응성 숙주 세포를 특이적으로 제거함.
도 8a 내지 도 8f에 관해 상기 기재된 동일한 공동 배양의 샘플을 도 9a 내지 도 9c에 제시한 대로 HLA-A2+ PBMC(iNK는 HLA-A2 음성임) 중에서 CD25, 4-1BB, 및 CD38의 발현에 대해 유세포분석법에 의해 분석하였다. 데이터는 iNK에서 B2M KO가 PBMC에서 CD38+CD25+, CD38+41BB+ 및 CD25+41BB+ 활성화를 감소시키기에 충분하였음을 보여준다(각각 도 9a, 도 9b 및 도 9c). 또한, 다라투무맙 치료는 WT iNK를 이용한 배양에서 활성화된 CD25+41BB+ PBMC를 감소시켰다(도 9d). 누적 데이터는 B2M KO와 다라투무맙의 조합이 동종이계 T 세포 및 NK 세포 반응을 강력하게 억제할 수 있음을 추가로 시사한다. 나아가, 데이터는 4-1BB 동종반응성 세포가 동종-방어 수용체(ADR)를 표적으로 하는 4-1BB의 활성화에 의해 선택적으로 고갈될 수 있는 추가 또는 대체 전략의 가능성을 시사한다. 일부 예시적인 ADR은 예를 들어 국제공개 WO 2019/210081호에 기재되어 있고, 이는 본원에 참조로 포함된다.
개별 MLR 검정에서, 동종이계 PBMC를 다라투무맙의 존재 하에서 또는 다라투무맙의 부재 하에서(10 μg, 1 μg, 0.1 μg, 또는 다라투무맙 없음), B2M-/-, CIITA-/-, CD38-/-, IL15RF 및 hnCD16(B2M/CIITA dKO)을 갖는 iPSC-유래된 iNK 세포와 공동 배양하였다. 도 10a에 도시된 바와 같이, 다라투무맙과의 공동 배양은 용량 의존 방식으로 HLA-미스매치된 PBMC와 공동 배양된 iNK 세포를 보호한다. 절대 동종반응성 NK 세포 수(도 10b)는 B2M/CIITA dKO iNK 세포가 HLA-미스매치된 PBMC와 공동 배양되는 경우 다라투무맙이 또한 용량 의존 방식으로 동종반응성 NK 세포 확장을 방지하였다는 것을 나타낸다. 무손상 HLA-I 및 HLA-II(즉, CD38-/-, IL15RF 및 hnCD16을 갖는 iNK 세포; "WT iNK"로 표시됨)를 갖는 B2M/CIITAWT iNK 세포와 비교하여, B2M/CIITA dKO iNK 세포의 유세포분석법 분석은 B2M/CIITA dKO iNK 세포가 HLA-미스매치된 PBMC와 공동 배양된 경우 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 확장을 자극하지 않는다는 것을 입증한다(도 10c). 종합적으로, 데이터는 B2M/CIITA dKO와 다라투무맙의 조합이 동종이계 T 세포 및 NK 세포 반응을 강력하게 억제할 수 있음을 지지한다.
실시예 4 - 항-CD38 항체는 1차/숙주 세포에 대해 이펙터 세포의 생존 및 지속성을 연장함
이펙터 세포에 대한 항-CD38 항체와 pbNK 세포를 이용한 항체 의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)을 통해 매개된 동족살해의 정도를 평가하기 위해, 흐름-기반 카스파아제 3/7 사멸 검정을 수행하였다. 이 검정에서, TRAC 좌위에 도입된 예시적인 CD19-CAR을 포함하는 iPSC-유래된 CAR-T(CAR-iT) 세포 및 CD38KO("CD38 KO iT") 또는 CD38 야생형("WT iT")을 항-CD38 단일클론 항체, 다라투무맙, 또는 항-CD20 단일클론 항체, 음성 대조군으로서 리툭시맙의 존재 하에서 약 3시간 동안 pbNK 세포와 공동 배양하였다. 두 항체를 모두 약 30 μg/ml에서 0으로 1:3으로 연속 희석하였다. CAR-iT 세포를 약 1e5개 세포/웰로 시딩하고, pbNK 세포를 3:1 비로 첨가하였다. iT 세포와 pbNK 세포는 차등적 형광 표지로 구별되었고, 각각의 세포 유형의 특정 세포독성(세포 사멸)을 유세포분석법에 의해 카스파아제 3/7 활성의 리포터를 사용하여 독립적으로 평가하였다.
pbNK 세포는, 내인성 CD16 및 CD38을 발현하고, 그 결과 도 11a에 도시된 바와 같이, pbNK 세포는 CD16 매개 ADCC의 존재 하에서 항-CD38 mAb 용량 의존 방식으로 항-CD38 지향성 동족살해를 수행하는 한편, 항-CD20 mAb(음성 대조군)는 이러한 세포에 영향을 미치지 않는다. 도 11b에 도시된 iT 세포에 특이적인 세포독성은 pbNK가 항-CD38 mAb와 조합될 때, WT iT 세포가 ADCC에 민감성이지만 C38 KO iT 세포에는 그렇지 않다는 것을 입증하였다. CD16 발현 pbNK 세포는 항-CD38 mAb로 코팅되어 있는 WT iT 세포를 인식하고 사멸하는 반면, CD38 KO iT 세포는 항-CD38과 조합된 pbNK 세포에 의해 ADCC에 내성인데, 그 이유는 CD38 특이적 mAb가 CD38 KO iT 세포에 결합할 수 없고, CD16 가교결합을 통한 pbNK 활성화를 유도할 수 없기 때문이다.
다라투무맙이 생체내에서 pbNK 세포를 고갈시킬 수 있는지를 시험하기 위해, MLR 검정에서 pbNK 세포를 NSG 마우스 또는 IL15 형질전환 NSG 마우스(NSG-ILtg)에 주입하고, 주입된 pbNK 세포의 지속성을 말초혈에서 시간에 따라 모니터링하였다. 간략히, pbNK 및 iNK 세포를 단독으로 주입하거나, 1회 용량의 다라투무맙과 주입하였다. 세포 수를 다라투무맙이 없는 군으로 정규화하였다. 도 12에 도시된 바와 같이, pbNK 세포는 NSG-ILtg 모델에서 지속성인 반면(> 22일차), 다라투무맙의 부가는 세포의 생존을 역전시켰으며, 이는 시험관내 관찰과 일치한다.
이러한 분석에서 다른 관찰은 항-CD38 항체의 투여가 제어될 수 있기 때문에, 이펙터 세포가 동종 거부를 통해 제거되도록 동종이계 이펙터 세포로부터의 부작용의 사건에서 제어가능한 방식으로 테이퍼링 또는 배제될 수 있다는 것이다. 또한, 항-CD38 항체는 또한 동종이계 이펙터 세포의 주입 전, 동종반응성 세포의 제거를 위한 사전-컨디셔닝 전략으로서 사용될 수 있고, 이에 따라 시간적으로 이로부터 분리될 수 있다. 이는 말초 T, NK 및 다른 동종반응성 세포에 의한 동종 거부를 극복하기 위해 HLA-E/G를 HLA-I 결핍 세포에 혼입함으로써 제공되지 않는 이점 중 하나이고, 이는 치료 과정의 유연성과 치료 중 환자 반응에 대한 반응으로 이펙터 세포 수의 제어 방식을 제공한다.
1차 NK 세포의 존재 하에서 B2M KO iNK 및 B2M/CIITA dKO iNK 세포의 생존과 지속성에 대한 CD38 컨디셔닝의 영향을 또한 생체내에서 추가로 평가하였다. 후속적으로, WT iNK 세포, B2M KO iNK 세포, 및 B2M/CIITA dKO iNK 세포를 다라투무맙의 존재 하에서 및 다라투무맙의 부재 하에서 NSG-ILtg 마우스에 공동 주입하고, iNK 세포의 지속성을 평가하고, 대략 14일차에 말초혈, 비장 및 골수에서 비교하였다. pbNK 세포를 단독으로 주입한 경우, pbNK는 순환계에서 검출되었지만, 이는 다라투무맙의 존재 하에서 상당히 감소하였다(도 13a). 도시된 바와 같이, WT iNK 세포, B2M KO iNK 세포, 및 B2M/CIITA dKO iNK 세포가 pbNK 세포 없이 각각 단독 주입된 경우, 각각의 공여자 iNK 세포는 유사한 수준으로 순환계에서 지속되었다(도 13b). pbNK와 공동 주입된 WT iNK 세포는 다라투무맙의 존재 하에서 그리고 다라투무맙의 부재 하에서 지속되었다(도 13c). 그러나, pbNK와 공동 주입된 B2M KO iNK 세포와 B2M/CIITA dKO iNK 세포는 다라투무맙의 부재 하에서 pbNK에 의해 거부된 반면, 다라투무맙의 존재 하에서 pbNK 동종 거부로부터 보호되었다(도 13d 및 도 13e). 추가로, 혈액, 비장 및 골수에서, pbNK는 다라투무맙의 존재 하에서 상당히 감소되어, B2M KO 및 B2M/CIITA KO iNK의 지속성을 유도하였다(도 14a). 또한, 다라투무맙은 PBNK 동종 거부로부터 iNK를 보호하는 데 기여한 CD38+ pbNK의 수를 상당히 감소시켰다(도 14b 및 도 14c). 따라서, 항-CD38 항체 컨디셔닝 처리와의 공동 주입은 HLA-I 결핍 세포에 대한 pbNK 세포독성에 의한 B2M KO 및 B2M/CIITA dKO 세포의 선택적 고갈을 역전시켜 이의 개선된 생존을 유도하였다.
항-CD38 항체의 존재 하에서 B2M KO CD38KO hnCD16 IL15RF iNK 세포("B2M KO" 및 "B2M/CIITA dKO") 대 B2M WT CD38KO hnCD16 IL15RF iNK 세포("WT"로 도시됨)의 증가된 지속성, 및 각각의 조직 샘플 유래의 CD38+ 하위집단(말초 NK 세포, 활성화된 B 세포 및 T 세포)의 관련 클리어런스는, 이들의 상향조절된 CD38을 표적으로 함으로써 활성화된 수용자 면역 세포를 억제하여, 본원에 제공된 B2M KO 또는 B2M/CIITA dKO 이펙터 세포의 수용자에서, 항-CD38 항체 표적이 아닌, 동종이계 이펙터 세포에 대한 동종 거부를 감소시키는 항-CD38 항체의 능력을 나타낸다.
숙주 면역 재구성에 대한 CD38 컨디셔닝의 효과는 입양 세포 치료를 받는 인간 대상체에서 추가로 평가되었다. 도 15에 도시된 바와 같이, 다라투무맙(x축에 따라 화살표로 표시됨)과 병용하여 CD38KO hnCD16 iNK 이펙터 세포로 처리된 4명의 다발성 골수종 환자(대상체 A 내지 D)로부터의 절대 림프구 프로파일은, 다라투무맙의 사용이 림프구 회복이 D4에 시작되어 치료 주기가 종료될 때까지 지속되는 다라투무맙을 받지 않은 환자(대표적 대상체 E)에 비해 림프구 고갈 화학요법(LDC; 대상체 A 내지 D) 후 림프구 회복을 약화시킨다는 것을 보여준다. LDC 전 및 LDC 후 매주 다라투무맙을 받은 대상체 A로부터의 림프구 데이터를 UMAP 시각화에 추가 적용하였다. 도 16에 도시된 바와 같이, 각 시점으로부터의 중첩된 림프구 데이터 파일은 상이한 세포 유형의 클러스터링을 색상별로 보여준다. 시점별 개별 UMAP 시각화는 스크리닝에서 내인성 CD4+ T 세포, B 세포, 및 NK 세포에 대한 CD38 발현을 입증한다. 도시된 바와 같이, 다라투무맙은 LDC 이전에 C1D-5에 의해 CD38 발현 림프구를 대부분 제거하였고, 치료 주기 중 CD38 발현 세포의 억제를 유지한다. 이와 같이, 항-CD38 항체의 존재 하에서, CD38+ 하위집단(말초 NK 세포, 활성화된 B 세포 및 T 세포)의 관찰된 클리어런스는 이들의 상향조절된 CD38을 표적으로 함으로써 활성화된 수용자 면역 세포를 억제하여 본원에 제공된 이펙터 세포의 수용자에서 동종이계 이펙터 세포에 대한 동종 거부를 감소시키고, 입양 세포 치료에 대한 기회의 창을 연장시키는 항-CD38 항체의 능력을 추가로 지지한다.
당업자는 본원에 기재된 방법, 조성물 및 생성물이 예시적인 실시형태를 나타내고, 본 발명의 범위에 제한으로 의도되지 않음을 용이하게 이해할 것이다. 본 발명의 범위 및 정신으로부터 벗어나지 않으면서 본원에 개시된 본 개시내용에 변하는 치환 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 용이하게 명확할 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 공보는 본 개시내용이 속하는 분야의 당업자의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 공보는 각각의 개별 공보가 참조로 포함된 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소(들), 제한(들)의 부재 하에 본원에 예시적으로 기재된 본 개시내용이 적합하게 실행될 수 있다. 이와 같이, 예를 들어 각각의 경우에 본원에서 임의의 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진"은 다른 2가지 용어 중 어느 하나로 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아니라 설명의 면으로 사용되고, 도시되고 기재된 특징의 임의의 균등물 또는 이의 부분을 배제하는 이러한 용어 및 표현의 사용에서 의도되지 않지만, 청구된 본 개시내용의 범위 내에 다양한 변형이 가능하다고 인식된다. 이와 같이, 본 개시내용이 바람직한 실시형태에 의해 구체적으로 개시되어 있고, 본원에 개시된 선택적인 특징, 변형 및 관념의 변경이 당업자에 의해 유보될 수 있지만, 이러한 변형 및 변경이 청구항에 의해 한정된 것처럼 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다고 이해되어야 한다.

Claims (35)

  1. 세포 또는 이의 집단으로서:
    (i) 상기 세포는 유도 만능성 세포(iPSC: induced pluripotent cell), 클론성 iPSC, iPS 세포주 세포, 또는 iPSC의 분화로부터 얻어진 유래 세포(derivative cell)이고;
    (ii) 상기 세포는 (a) HLA-I 결핍; (b) CD38 녹아웃; 및 선택적으로, (c) CD16 또는 이의 변이체를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포는
    (i) 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 펩티드 또는 전체 펩티드를 포함하는 사이토카인 신호전달 복합체를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드;
    (ii) 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드;
    (iii) HLA-II 결핍; 및
    (iv) HLA-G, HLA-E, 또는 이의 변이체를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상을 추가로 포함하며;
    CD38 컨디셔닝을 도입하는 입양 세포 치료에서 동종반응성 숙주 세포의 존재 하에서 개선된 지속성을 갖는, 세포 또는 이의 집단.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포는
    (i) 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나를 포함하고;
    (ii) CD58 및 CD54 중 하나 또는 둘 모두의 녹아웃을 포함하고;
    (iii) B2M, CIITA, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD25, CD69, CD44, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 및 TIGIT 중 적어도 하나의 파괴를 포함하고;
    (iv) 4-1BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, TCR, Fc 수용체, 항체 또는 이의 기능적 변이체 또는 이의 단편, 관문 억제제, 인게이저, 및 이중특이적 또는 다중특이적 또는 범용 인게이저와 커플링하기 위한 표면 유도 수용체 중 적어도 하나의 도입을 포함하고; 그리고/또는
    (v) HLA-G, HLA-E, 또는 이의 변이체를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않으며;
    상기 HLA-I 결핍은 B2M, TAP1, TAP2, 및 타파신 중 적어도 하나의 파괴를 포함하고/하거나;
    상기 HLA-II 결핍은 CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 적어도 하나의 파괴를 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  4. 제1항에 있어서, 상기 유래 세포는 말초혈, 제대혈, 또는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 얻은 이의 천연 대응 세포와 비교하여
    (a) 유래 CD34+ 세포, 유래 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, 유래 조혈 다능성 전구 세포, 유래 T 세포 전구 세포, 유래 NK 세포 전구 세포, 유래 T 세포, 유래 NKT 세포, 유래 NK 세포, 또는 유래 B 세포를 포함하거나;
    (b) 동종이계 이펙터 세포로서 사용되며, 이때 상기 이펙터 세포는 하기를 포함하는 특징 중 적어도 하나를 갖는 유래 NK 세포 또는 유래 T 세포인, 세포 또는 이의 집단:
    (i) 개선된 지속성 및/또는 생존;
    (ii) 활성화된 수용자 면역 세포에 대한 증가된 내성;
    (iii) 증가된 세포독성;
    (iv) 종양 침투의 개선;
    (v) 향상된 또는 획득된 ADCC;
    (vi) 방관자 면역 세포를 종양 부위로 이동시키고/시키거나, 활성화
    또는 동원하는 데 있어서의 향상된 능력;
    (vii) 종양 면역억제를 감소시키는 능력의 향상;
    (viii) 종양 항원 탈출을 구제하는 것의 개선된 능력; 및
    (ix) 감소된 동족살해(fratricide)
  5. 제1항에 있어서, CD16 또는 이의 변이체는
    (a) 고 친화도 비-절단성 CD16(hnCD16) 또는 이의 변이체;
    (b) CD16의 엑토도메인 도메인에서의 F176V 및 S197P;
    (c) CD64로부터 기원한 전체 또는 부분 엑토도메인;
    (d) 비-천연(또는 비-CD16) 막관통 도메인;
    (e) 비-천연(또는 비-CD16) 세포내 도메인;
    (f) 비-천연(또는 비-CD16) 신호전달 도메인;
    (g) 비-천연 자극 도메인; 및
    (h) CD16으로부터 기원하지 않고, 동일한 폴리펩티드 또는 상이한 폴리펩티드로부터 기원한 막관통 도메인, 신호전달 도메인 및 자극 도메인 중 적어도 하나를 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  6. 제5항에 있어서,
    (a) 상기 비-천연 막관통 도메인은 CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D, 또는 T 세포 수용체(TCR) 폴리펩티드로부터 유래되거나;
    (b) 상기 비-천연 자극 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 또는 NKG2D 폴리펩티드로부터 유래되거나;
    (c) 상기 비-천연 신호전달 도메인은 CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137(4-1BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 또는 NKG2D 폴리펩티드로부터 유래되거나;
    (d) 상기 비-천연 막관통 도메인은 NKG2D로부터 유래되고, 상기 비-천연 자극 도메인은 2B4로부터 유래되고, 상기 비-천연 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래되는, 세포 또는 이의 집단.
  7. 제2항에 있어서, 상기 CAR은 하기와 같은, 세포 또는 이의 집단:
    (i) T 세포 특이적 또는 NK 세포 특이적임;
    (ii) 이중특이적 항원 결합 CAR임;
    (iii) 스위칭가능한(switchable) CAR임;
    (iv) 이량체화된 CAR임;
    (v) 분할 CAR임;
    (vi) 다중-사슬 CAR임;
    (vii) 유도성 CAR임;
    (viii) 선택적으로 별개의 작제물에서 또는 바이-시스트로닉 작제물에서, 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 펩티드 또는 전체 펩티드를 포함하는 사이토카인 신호전달 복합체와 공동 발현됨;
    (ix) 선택적으로 별개의 작제물에서 또는 바이-시스트로닉 작제물에서 관문 억제제와 공동 발현됨; 그리고/또는
    (x) 선택적으로
    (1) TRAC 또는 TRBC 좌위에서 삽입되고, 그리고/또는 TCR의 내인성
    프로모터에 의해 유도되고, 그리고/또는 TCR은 CAR 삽입에 의해 녹아웃됨;
    (2) 세이프 하버(safe harbor) 좌위에서 삽입됨; 또는
    (3) 파괴를 목적으로 하는 유전자좌에서 삽입됨.
  8. 제2항에 있어서, 상기 CAR은
    (i) CD19, BCMA, B7H3, MICA/B, 또는 MR1에 특이적이고/이거나;
    (ii) ADGRE2, 탄산탈수효소 IX(CAIX), CCR1, CCR4, 암배아 항원(CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원, 상피 당단백질-2(EGP-2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 부착 분자(EpCAM), EGFRvIII, 수용체 티로신-단백질 키나아제 erb­B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산-결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 엽산 수용체-α, 갱글리오사이드 G2(GD2), 갱글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2), 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Rα2), κ-경쇄, 키나아제 삽입 도메인 수용체(KDR), 루이스 A(CA19.9), 루이스 Y(LeY), L1 세포 부착 분자(L1-CAM), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A 1(MAGE-A1), 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), PRAME 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 종양 관련 당단백질 72(TAG-72), TIM-3, TRBC1, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­R2), 윌름스 종양 단백질(WT-1), 및 병원성 항원 중 어느 하나에 특이적인, 세포 또는 이의 집단.
  9. 제2항에 있어서, 상기 사이토카인 신호전달 복합체는
    (a) IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21, 또는 이의 각각의 수용체(들) 중 적어도 하나를 포함하는 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 또는 완전 펩티드; 또는
    (b) 하기 중 적어도 하나를 포함하고;
    (i) 사이의 자가-절단 펩티드를 이용한 IL15 및 IL15Rα의 공동 발
    현;
    (ii) IL15와 IL15Rα의 융합 단백질;
    (iii) IL15Rα의 세포내 도메인이 절단된 IL15/IL15Rα 융합 단백
    질(IL15Δ);
    (iv) IL15와 IL15Rα의 막 결합된 스시(Sushi) 도메인의 융합 단백
    질;
    (v) IL15와 IL15Rβ의 융합 단백질;
    (vi) IL15와 공통 수용체 γC의 융합 단백질로서, 상기 공통 수용체
    γC는 천연 또는 변형된, 상기 융합 단백질; 및
    (vii) IL15Rβ의 동종이량체;
    - 이때, (i) 내지 (vii) 중 어느 하나는 선택적으로 개별 작제물에서
    또는 바이-시스트로닉 작제물에서 CAR과 공동 발현됨 -;
    선택적으로,
    (c) 일시적으로 발현되는, 세포 또는 이의 집단.
  10. 제1항에 있어서, 상기 세포는 유래 NK 또는 유래 T 세포이고, 상기 유래 NK 세포는 T 세포를 종양 부위로 동원 및/또는 이동시킬 수 있고, 상기 유래 NK 세포 또는 상기 유래 T 세포는 하나 이상의 관문 억제제의 존재 하에서 종양 면역억제를 감소시킬 수 있는, 세포 또는 이의 집단.
  11. 제10항에 있어서, 상기 하나 이상의 관문 억제제는 PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E, 또는 억제성 KIR을 포함하는 하나 이상의 관문 분자에 대한 길항제인, 세포 또는 이의 집단.
  12. 제10항에 있어서, 상기 하나 이상의 관문 억제제는
    (a) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 이의 유도체 또는 기능적 균등물 중 하나 이상; 또는
    (b) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 적어도 하나를 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  13. 제1항에 있어서, 상기 세포는
    (i) 하나의 세이프 하버 좌위 또는 파괴를 목적으로 하는 좌위에 통합된 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하거나;
    (ii) 상이한 세이프 하버 좌위 또는 파괴를 목적으로 하는 좌위에 통합된 2개 초과의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  14. 제13항에 있어서, 상기 세이프 하버 좌위(들)는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, TCR 또는 RUNX1 중 적어도 하나를 포함하거나; 파괴를 목적으로 하는 유전자좌(들)는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD38, CD25, CD69, CD71, CD44, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, 또는 TIGIT를 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  15. 제2항에 있어서, 상기 CD38 컨디셔닝은
    (i) 항-CD38 항체 또는 CD38에 특이적으로 결합하는 CAR(CD38-CAR)을 포함하는 CD38 길항제를 통해 이루어지고;
    (ii) 다라투무맙, 이사툭시맙, 또는 MOR202를 통해 이루어지고;
    (iii) 다라투무맙을 통해 이루어지고;
    (iv) 치료를 위해 세포 또는 이의 집단의 주입 전, 주입 중, 또는 주입 후 상기 입양 세포 치료를 필요로 하는 대상체에게 CD38 길항제를 투여하는 것을 포함하고;
    (v) 사전로딩된 세포 또는 이의 집단의 주입 전 시험관내에서 세포 또는 이의 집단에 CD38 길항제를 사전로딩하는 것을 포함하고;
    (vi) 동종반응성 숙주 세포의 수를 제거하거나 감소시키고;
    (vii) 숙주 면역 재구성을 지연시키고; 그리고/또는
    (viii) 입양 세포 치료를 필요로 하는 대상체의 동종반응성 숙주 세포의 존재 하에서 세포 또는 이의 집단의 생존과 지속성을 연장하는, 세포 또는 이의 집단.
  16. 제2항에 있어서, 상기 동종반응성 숙주 세포는
    (i) 세포 또는 이의 집단에 동종이계인 1차 T, B 및/또는 NK 세포를 포함하고;
    (ii) 세포 또는 이의 집단에 의해 CD38 컨디셔닝에 대해 감작되고; 그리고/또는
    (iii) 용량 의존적 방식으로 CD38 길항제를 통한 CD38 컨디셔닝에 의해 제거되는, 세포 또는 이의 집단.
  17. CD38 길항제 및 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 세포 또는 이의 집단을 포함하는 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 하나 이상의 치료제를 추가로 포함하는, 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 하나 이상의 치료제는 펩티드, 사이토카인, 관문 억제제, 미토겐, 성장 인자, 작은 RNA, dsRNA(이중가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 피더 세포, 피더 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 하나 이상의 관심 다중핵산을 포함하는 벡터, 항체, 화학치료제 또는 방사성 모이어티, 또는 면역조절 약물(IMiD: immunomodulatory drug)을 포함하는, 조성물.
  20. 제19항에 있어서,
    (i) 상기 관문 억제제는
    (a) PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-
    1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200,
    CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxp1, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-
    1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, 레티노산 수용체 알파(Rara), TLR3, VISTA,
    NKG2A/HLA-E, 또는 억제성 KIR을 포함하는 관문 분자에 대한 하나 이상의 길
    항제;
    (b) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102,
    IPH43, IPH33, 릴리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 이의 유
    도체 또는 기능적 균등물 중 하나 이상;
    (c) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 적어도 하나를 포
    함하거나;
    (ii) 상기 치료제는 베네토클락스, 아자시티딘 및 포말리도마이드 중 하나 이상을 포함하는, 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 상기 항체는
    (a) 항-CD20 항체, 항-HER2 항체, 항-CD52 항체, 항-EGFR 항체, 항-CD123 항체, 항-GD2 항체, 항-PDL1 항체, 항-CD25 항체, 항-CD69 항체, 항-CD71 항체, 또는 항-CD44 항체; 또는
    (b) 리툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 우블리툭시맙, 오카라투주맙, 오비누투주맙, 트라스투주맙, 퍼투주맙, 알렘투주맙, 세툭시맙, 디누툭시맙, 아벨루맙, 다클리주맙, 바실릭시맙, M-A251, 2A3, BC69, 24204, 22722, 24212, MAB23591, FN50, 298614, AF2359, CY1G4, DF1513, 비바투주맙, RG7356, G44-26, 7G3, CSL362, 엘로투주맙, 및 이의 인간화되거나 Fc 변형된 변이체 또는 단편 및 이의 기능적 균등물 및 바이오시밀러 중 하나 이상을 포함하는, 조성물.
  22. 제17항에 있어서, 상기 CD38 길항제는
    (i) 항-CD38 항체 또는 CD38-CAR을 포함하거나;
    (ii) 다라투무맙, 이사툭시맙, 또는 MOR202를 포함하거나;
    (iii) 다라투무맙을 포함하거나;
    (iv) 세포 또는 이의 집단의 주입 전, 주입 중, 또는 주입 후 입양 세포 치료를 필요로 하는 대상체에게 제공되는, 조성물.
  23. 입양 세포 치료를 필요로 하는 대상체에 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 도입에 의한 상기 조성물의 치료적 용도로서, 상기 대상체는 자가면역 장애, 혈액학적 악성종양, 고형 종양, 암, 또는 바이러스 감염을 갖는, 치료적 용도.
  24. 입양 세포 치료를 필요로 하는 대상체에게 제공된 입양 세포 치료에서 동종이계 이펙터 세포에 대한 숙주 세포의 동종반응성을 감소시키거나 예방하는 방법으로서, 상기 동종이계 이펙터 세포는 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 세포 또는 이의 집단을 포함하고, 상기 방법은 CD38 컨디셔닝을 포함하는, 감소 또는 예방 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 숙주 세포는 1차 T 세포, B 세포, 및/또는 NK 세포를 포함하는 동종반응성 면역 세포를 포함하는, 감소 또는 예방 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 CD38 컨디셔닝은
    (i) 상기 대상체에 상기 동종이계 이펙터 세포의 주입 전, 주입 중, 또는 주입 후 상기 대상체에게 CD38 길항제를 투여하는 것을 포함하거나;
    (ii) 상기 대상체에 상기 동종이계 이펙터 세포의 주입 전 시험관내에서 상기 동종이계 이펙터 세포에 CD38 길항제를 사전로딩하는 것을 포함하며;
    이때 상기 CD38 컨디셔닝은 (a) 동종반응성 숙주 세포의 수를 제거하거나 감소시키고; (b) 소정 용량의 상기 CD38 길항제에 의해 제어가능한 정도로 상기 동종이계 이펙터 세포의 생존 및 지속성을 연장시키고; 그리고/또는 (c) 숙주 면역 재구성을 지연시키는, 감소 또는 예방 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 CD38 길항제는
    (i) 항-CD38 항체 또는 CD38-CAR;
    (ii) 다라투무맙, 이사툭시맙, 또는 MOR202; 및/또는
    (iii) 다라투무맙을 포함하는, 감소 또는 예방 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 동종반응성 숙주 세포는 상향조절된 CD38 발현을 포함하는, 감소 또는 예방 방법.
  29. 제24항에 있어서, 상기 대상체에게 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 감소 또는 예방 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 치료제는 펩티드, 사이토카인, 관문 억제제, 미토겐, 성장 인자, 작은 RNA, dsRNA(이중가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 피더 세포, 피더 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 하나 이상의 관심 폴리핵산을 포함하는 벡터, 항체, 화학치료제 또는 방사성 모이어티, 또는 면역조절 약물(IMiD)을 포함하는, 감소 또는 예방 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    (i) 상기 관문 억제제는
    (a) PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-
    1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200,
    CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxp1, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-
    1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA,
    NKG2A/HLA-E, 또는 억제성 KIR을 포함하는 관문 분자에 대한 하나 이상의 길
    항제;
    (b) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102,
    IPH43, IPH33, 릴리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 이의 유
    도체 또는 기능적 균등물 중 하나 이상; 또는
    (c) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 적어도 하나를 포
    함하거나;
    (ii) 상기 치료제는 베네토클락스, 아자시티딘 및 포말리도마이드 중 하나 이상을 포함하는, 감소 또는 예방 방법.
  32. 제24항에 있어서, 시클로포스파미드와 플루다라빈(Cy/Flu)의 조합을 이용한 림프구 제거가 없거나 이를 최소한으로 필요로 하는, 감소 또는 예방 방법.
  33. 입양 세포 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법으로서, CD38 컨디셔닝을 위해 상기 대상체에게 CD38 길항제를 투여하는 것 및 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 세포 또는 이의 집단을 주입하는 것을 포함하는, 치료 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 CD38 컨디셔닝은
    (i) 상기 동종이계 이펙터 세포에 대해 숙주 세포의 동종반응성을 감소시키거나 방지하고;
    (ii) 동종반응성 숙주 세포의 수를 제거하거나 감소시키고;
    (iii) 상기 동종이계 이펙터 세포의 생존 및 지속성을 연장하고;
    (iv) 숙주 면역 재구성을 지연시키고;
    (v) HLA-G 또는 HLA-E의 과발현을 통해 숙주 세포의 동종반응성에 대한 상기 동종이계 이펙터 세포의 보호의 누출(leaking)을 방지하고; 그리고/또는
    (vi) 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD) 이용가능성을 증가시키고, 세포 사멸과 관련된 NAD 소비를 감소시키고, 세포 역노화(rejuvenation)를 지지하는, 치료 방법.
  35. 제33항에 있어서, 시클로포스파미드와 플루다라빈(Cy/Flu)의 조합을 이용한 림프구 제거가 없거나 이를 최소한으로 필요로 하는, 치료 방법.
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