KR20230098649A - 조작된 iPSC 및 지속성 면역 효과기 세포 - Google Patents

조작된 iPSC 및 지속성 면역 효과기 세포 Download PDF

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KR20230098649A
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바흐람 발라메르
아이젠 페랄타
치아-웨이 창
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페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

게놈 조작된 iPSC의 유도 분화로부터 얻은 기능적으로 향상된 분화 효과기 세포를 얻기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 본원에 제공된 iPSC-유래 세포는 개선된 또는 향상된 치료학적 효과를 전달하는 안정하고 기능적인 게놈 편집을 갖는다. 기능적으로 향상된 분화 효과기 세포를 단독으로, 또는 조합 치료에서의 항체 또는 관문 억제제와 함께 포함하는 치료학적 조성물 및 이의 용도가 또한 제공된다.

Description

조작된 iPSC 및 지속성 면역 효과기 세포
관련 출원
본 출원은 2020년 11월 4일에 출원된 미국 임시 출원 제63/109,828호의 우선권을 주장하고, 이의 개시내용은 그 전체가 본원에 인용되어 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 기성품 면역세포 생성물의 분야와 광범위하게 관련된다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 치료학적 관련 특성을 인 비보로 전달할 수 있는 다기능성 효과기 세포를 개발하기 위한 전략에 관한 것이다. 본 개시내용 하에 개발된 세포 생성물은 환자 원천 세포 치료의 중대한 제한을 해결한다.
전자적으로 제출된 서열 목록의 참조
본 출원은 명칭이 184143-631601_SequenceListing_ST25인 본 출원에 의해 제출된 ASCII 텍스트 형식으로 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능한 형식(CRF)을 참조로 포함하고, 이는 2021년 10월 26일에 생성되었고, 크기가 36,486 바이트이다.
입양 세포 치료의 분야는 현재 환자 원천 세포 및 공여자 원천 세포의 사용에 초점을 두는데, 이는 암 면역요법의 일관된 제조를 달성하고 이익일 수 있는 모든 환자에 치료를 전달하는 것을 특히 어렵게 한다. 또한 유리한 환자 결과를 촉진하기 위해 입양으로 운반된 림프구의 효능 및 지속성을 개선할 필요성이 있다. T 세포 및 자연 살해(NK) 세포와 같은 림프구는 선천성 면역 및 적응 면역에서 중요한 역할을 하는 강력한 항종양 효과기이다. 그러나, 입양 세포 치료에 대한 이 면역 세포의 사용은 여전히 도전 요소이며, 충족되지 않은 개선 필요성을 갖는다. 따라서, T 세포 및 NK 세포, 또는 입양 면역요법에서의 다른 면역 효과기 세포의 완전한 가능성을 이용하기 위한 상당한 기회가 존재한다.
반응 속도, 세포 탈진, 수혈된 세포의 소실(생존율 및/또는 지속성), 표적 소실 또는 계통 스위치를 통한 종양 회피, 종양 표적화 정확성, 오프 타깃 독성, 오프 종양 효과에서 고형 종양, 즉 종양 미세환경에 대한 효능 및 관련된 면역 억제, 동원, 수송 및 침윤에 이르는 문제를 해결하는 기능적으로 개선된 효과기 세포에 대한 필요성이 있다.
본 발명의 목적은 단일 세포 유래 iPSC(induced pluripotent stem cell: 유도 만능 줄기 세포) 클론주(clonal line)로부터 분화된 분화 비(non)만능 세포를 생성하는 방법 및 조성물을 제공하는 것이고, iPSC는 이의 게놈에서 하나 또는 여러 유전자 변형을 포함한다. 상기 하나 또는 여러 유전자 변형은 DNA 삽입, 결실 및 치환을 포함하며, 그 변형은, 분화, 확장, 계대배양 및/또는 이식 후, 후속하여 분화된 세포에서 보유되고 기능적으로 유지된다.
본 출원의 iPSC-유래 비만능 세포는 CD34 세포, 동형유전자성 내피 세포, HSC(조혈 줄기 세포 및 전구 세포), 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구 세포, NK 세포 전구 세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 및 1차 NK 세포, T 세포 및/또는 NKT 세포에 존재하지 않는 하나 이상의 기능적 특징을 갖는 면역 효과기 세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본 출원의 iPSC-유래 비만능 세포는 동일한 유전자 변형을 포함하는 iPSC로부터의 분화를 통해 이의 게놈에서 하나 또는 여러 유전자 변형을 포함한다. 유전자 조작된 분화 세포를 얻기 위한 조작된 클론성 iPSC 분화 전략은 분화에서의 iPSC의 발생 가능성이 iPSC에서 조작된 양상에 의해 유해한 영향을 받지 않고, 또한 조작된 양상이 분화 세포에서 의도된 대로 기능할 것을 요한다. 추가로, 이 전략은 말초혈로부터 얻은 T 세포 또는 NK 세포와 같은 1차 림프구의 조작에서 현재의 장벽을 극복하는데, 이는 상기 세포가 조작하기 어렵기 때문이고, 상기 세포의 조작은 대개 재현성 및 균일성이 결여되어 높은 세포 사멸 및 낮은 세포 확장과 함께 불량한 세포 지속성을 나타내는 세포를 생성시킨다. 나아가, 이러한 전략은 시작부터 이종성인 1차 세포 원천을 사용하여 얻은 이종성 효과기 세포 집단의 생산을 방지한다.
본 발명의 여러 양태는 (I), (II) 또는 (III)을 포함하는 방법을 이용하여 얻은 게놈 조작된 iPSC를 제공하고, 이는 각각 재프로그래밍 과정에 후속하여, 이것과 동시에 그리고 이전에 게놈 조작의 전략을 반영한다:
(I): 임의의 순서로 (i) 선택된 부위(들)에서의 표적화된 통합을 허용하기 위한 하나 이상의 작제물(들)을 iPSC로 도입하는 단계; (ii) (a) 선택된 부위 인식을 할 수 있는 하나 이상의 엔도뉴클레아제를 사용하여 선택된 부위(들)에서의 하나 이상의 이중 가닥 절단(들)을 iPSC로 도입하는 단계; 및 (b) 동시에 또는 순차적으로 내인성 DNA 수선이 선택된 부위(들)에서 표적화된 삽입-결실(in/del)을 생성하게 하도록 단계 (I)(ii)(a)의 iPSC를 배양하여, 부분적으로 또는 완전히 분화된 세포로 분화할 수 있는 게놈 조작된 iPSC를 얻는 단계인 (i) 및 (ii) 중 하나 또는 둘 모두에 의해 iPSC를 유전자 조작하는 것.
(II): (i) 비만능 세포의 재프로그래밍을 개시하도록 비만능 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제, MEK 억제제, GSK3 억제제 및/또는 ROCK 억제제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (ii) 임의의 순서로 (a) 선택된 부위(들)에서의 표적화된 통합을 허용하기 위한 하나 이상의 작제물(들); (b) 선택된 부위 인식을 할 수 있는 적어도 하나의 엔도뉴클레아제를 사용하여 선택된 부위에서의 하나 이상의 이중 가닥 절단(들)인 (a) 및 (b) 중 하나 또는 둘 모두를 단계 (II)(i)의 재프로그래밍하는 비만능 세포로 도입한 후, 단계 (II)(ii)(b)의 세포는 내인성 DNA 수선이 선택된 부위(들)에서 표적화된 삽입-결실을 생성하게 하도록 배양되는 단계로서; 그렇게 하여 수득한 게놈 조작된 iPSC는 적어도 하나의 기능적 표적화된 게놈 편집을 포함하고, 상기 게놈 조작된 iPSC는 부분적으로 또는 완전히 분화된 세포로 분화할 수 있는 단계를 포함하는, 게놈 조작된 iPSC를 얻도록 재프로그래밍하는 비만능 세포를 유전자 조작하는 것.
(III): (i) 임의의 순서로 (a) 선택된 부위(들)에서의 표적화된 통합을 허용하기 위한 하나 이상의 작제물(들); (b) 선택된 부위 인식을 할 수 있는 적어도 하나의 엔도뉴클레아제를 사용하여 선택된 부위에서의 하나 이상의 이중 가닥 절단(들)인 (a) 및 (b) 중 하나 또는 둘 모두를 비만능 세포로 도입하는 단계로서, 단계 (III)(i)(b)의 세포는 내인성 DNA 수선이 선택된 부위에서 표적화된 삽입-결실을 생성하게 하도록 배양되는 단계; 및 (ii) 선택된 부위에서 표적화된 편집을 포함하는 게놈 조작된 iPSC를 얻도록 단계 (III)(i)의 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제, MEK 억제제, GSK3 억제제 및/또는 ROCK 억제제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시켜, 적어도 하나의 기능적 표적화된 게놈 편집을 포함하는 게놈 조작된 iPSC를 수득하는 단계로서, 상기 게놈 조작된 iPSC는 부분 분화된 세포 또는 완전 분화된 세포로 분화할 수 있는 단계인 (i) 및 (ii)를 포함하는, 게놈 조작된 iPSC를 얻도록 재프로그래밍을 위해 비만능 세포를 유전자 조작하는 것.
상기 방법의 일 실시형태에서, 하나 이상의 선택된 부위에서의 적어도 하나의 표적화된 게놈 편집은 안전성 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약학적 활성 단백질 및 펩티드, 약물 표적 후보자; 또는 게놈 조작된 iPSC 또는 이로부터의 분화 세포의 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존기간을 촉진하는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드의 삽입을 포함한다. 일부 실시형태에서, 삽입을 위한 외인성 폴리뉴클레오티드는 (1) CMV, EF1α, PGK, CAG, UBC, 또는 다른 항시적 프로모터, 유도성 프로모터, 시간 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 세포 유형 특이적 프로모터를 포함하는 하나 이상의 외인성 프로모터; 또는 (2) AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, CD38, GAPDH, TCR 또는 RUNX1, 또는 게놈 세이프 하버(genome safe harbor)의 기준을 충족하는 다른 좌위를 포함하는 선택된 부위에서 포함된 하나 이상의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법을 이용하여 생성된 게놈 조작된 iPSC는 카스파아제, 티미딘 키나아제, 사이토신 탈아미노효소, 변형된 EGFR, 또는 B 세포 CD20을 포함하는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 상이한 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 게놈 조작된 iPSC가 둘 이상의 자살 유전자를 포함할 때, 자살 유전자는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, CD38, GAPDH, TCR 또는 RUNX1을 포함하는 상이한 세이프 하버 좌위에서 통합된다. 일 실시형태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21의 부분 길이 또는 전체 길이 펩티드 및/또는 이들의 각각의 수용체를 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21의 부분 또는 전체 펩티드 및/또는 이들의 각각의 수용체는 융합 단백질의 형태이다.
일부 다른 실시형태에서, 본원에 제공된 방법을 이용하여 생성된 게놈 조작된 iPSC는 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약물 표적 후보자, 면역 반응 조절 및 조정, 또는 iPSC 또는 이로부터의 분화 세포의 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존기간을 억제하는 단백질과 연관된 하나 이상의 내인성 유전자에서 삽입-결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 파괴를 위한 내인성 유전자는 CD38, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, RAG1, 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 유전자 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 또 다른 실시형태에서, 본원에 제공된 방법을 이용하여 생성된 게놈 조작된 iPSC는 AAVS1 좌위에서 외인성 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는 카스파아제 및 H11 좌위에서 외인성 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는 티미딘 키나아제를 포함한다.
일부 또 다른 실시형태에서, 접근법 (I), (II) 및/또는 (III)은 게놈 조작된 iPSC의 만능성을 유지하기 위해 게놈 조작된 iPSC를 MEK 억제제, GSK3 억제제 및 ROCK 억제제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 표적화된 게놈 편집을 포함하는 얻은 게놈 조작된 iPSC는 기능적이고, 분화 강력하고, 동일한 기능적 게놈 편집을 포함하는 비만능 세포로 분화할 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 세포 또는 이의 집단을 제공하고, (a) 세포는 재조합 사이토카인 신호전달 복합체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 선택적으로 키메릭 항원 수용체(CAR)를 포함하고; (b) 세포는 진핵 세포, 동물 세포, 인간 세포, 면역 세포, 피더 세포(feeder cell), 유도 만능줄기 세포(iPSC), 또는 이로부터 분화된 분화 세포이고; (c) 사이토카인 신호전달 복합체는 (i) 전체 또는 부분 사이토카인 및 (ii) 전체 또는 부분 IL7 수용체, IL2 수용체, IL4 수용체, IL9 수용체, IL21 수용체, 또는 γC 수용체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달 복합체는 개별 작제물 또는 바이-시스트로닉 작제물에서 CAR과 공동 발현된다. 일부 실시형태에서, iPSC는 클론성 iPSC, 단일 세포 해리 iPSC, iPSC 세포주 세포, 또는 iPSC 마스터 세포 은행(MCB) 세포이다. 일부 실시형태에서, 분화 세포는 분화 CD34+ 세포, 분화 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, 분화 조혈 다능성 전구 세포, 분화 T 세포 전구 세포, 분화 NK 세포 전구 세포, 분화 T계 세포, 분화 NKT계 세포, 분화 NK계 세포 또는 분화 B계 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, 분화 세포는 대응 1차 T, NK, NKT, 및/또는 B 세포에 존재하지 않는 하나 이상의 기능적 특징을 갖는 분화 효과기 세포를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 사이토카인 신호전달 복합체는 IL7 및 IL7 수용체의 부분 또는 전체 펩티드를 포함하고, 여기서 사이토카인 신호전달 복합체는 (a) (i) 자가 절단 펩티드를 사용하여 공동 발현된 IL7 및 IL7Rα; (ii) IL7 및 IL7Rα의 융합 단백질(IL7RF); (iii) 절두 또는 제거된 IL7Rα의 세포내 도메인과의 IL7/IL7Rα 융합 단백질; (iv) IL7 및 IL7Rβ의 융합 단백질; (v) IL7 및 공통 수용체 γC의 융합 단백질, 여기서 공통 수용체 γC는 천연이거나 또는 변형되고; 및 (vi) IL7Rβ의 동종이합체 중 적어도 하나를 포함하고, 여기서 (i) 내지 (vi) 중 적어도 하나는 선택적으로 개별 작제물 또는 바이-시스트로닉 작제물에서 CAR과 공동 발현되고; 선택적으로, (b) 이는 일시적으로 발현된다. 일부 실시형태에서, 세포는 (i) CD38 녹아웃; (ii) 이의 대응 1차 세포와 비교하여 HLA-I 결핍 및/또는 HLA-II 결핍; (iii) HLA-G 또는 비절단성 HLA-G의 발현 도입, 또는 CD58 및 CD54 중 하나 또는 둘 모두의 녹아웃; (iv) 외인성 CD16 또는 이의 변이체; (v) 키메릭 융합 수용체(CFR); (vi) 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 펩티드 또는 전체 펩티드; (vii) 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나; (viii) B2M, CIITA, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD25, CD69, CD44, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 및 TIGIT의 적어도 하나에서의 결실 또는 파괴; 또는 (ix) HLA-E, 4-1BBL, CD3, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, 항원 특이적 TCR, Fc 수용체, 이의 항체 또는 기능적 변이체 또는 단편, 관문 저해제, 인게이저, 및 작용제와 커플링하기 위한 표면 유도 수용체의 적어도 하나의 도입 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 동일한 유전적 편집(들)을 갖지 않는 말초혈, 제대혈 또는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 얻은 이의 대응 1차 세포와 비교하여, (i) 세포독성의 증가; (ii) 지속성 및/또는 생존율의 개선; (iii) 종양 부위에 방관자 면역 세포를 이동시키고/시키거나 활성화하거나 동원하는 데 있어서의 능력의 향상; (iv) 종양 침투의 개선; (v) 종양 면역억제를 감소시키는 능력의 향상; (vi) 종양 항원 회피를 구제하는 능력의 개선; (vii) 제어된 아폽토시스; (viii) ADCC의 향상 또는 획득; 및 (ix) 동족살해를 피하는 능력 중 하나 이상을 포함하는 치료적 특성을 갖는다.
세포 또는 이의 집단이 외인성 CD16 또는 이의 변이체를 포함하는 상기 실시형태에서, CD16 또는 이의 변이체는 (a) 고친화도 비-절단성 CD16(hnCD16); (b) CD16의 엑토도메인 도메인에서의 F176V 및 S197P; (c) CD64로부터 기원한 전체 또는 부분 엑토도메인; (d) 비-천연적(또는 비-CD16) 막관통 도메인; (e) 비-천연적(또는 비-CD16) 세포내 도메인; (f) 비-천연적(또는 비-CD16) 신호전달 도메인; (g) 비-천연적 자극 도메인; 및 (h) CD16으로부터 기원하지 않는 막관통 도메인, 신호전달 도메인 및 자극 도메인의 상기 중 적어도 하나를 포함할 수 있고, 이는 동일한 폴리펩티드 또는 상이한 폴리펩티드로부터 기원한다.
세포 또는 이의 집단이 분화 효과기 세포인 실시형태에서, 분화 효과기 세포는 사이토카인 신호전달 복합체가 없는 이의 대응 세포와 비교하여, (a) 개선된 상대적 세포 확장; (b) 증가된 CAR 발현의 퍼센트; (c) 증가된 CD69 발현; 및 (d) PD-1 발현 감소 중 적어도 하나를 포함한다.
세포 또는 이의 집단이 CAR을 포함하는 상기 실시형태에서, CAR은 (i) T 세포 특이적 또는 NK 세포 특이적; (ii) 이중특이적 항원 결합 CAR; (iii) 스위치 가능한 CAR; (iv) 이합체화된 CAR; (v) 분할 CAR; (vi) 다중사슬 CAR; (vii) 유도성 CAR; (viii) 불활성화 CAR일 수 있고; (ix) 선택적으로 개별 작제물에서 또는 바이-시스트로닉 작제물에서, 관문 억제제와 공동발현될 수 있고; (x) CD19, BCMA, CD20, CD22, CD38, CD123, HER2, CD52, EGFR, GD2, MICA/B, MSLN, VEGF-R2, PSMA 및 PDL1 중 적어도 하나에 특이적일 수 있고; 그리고/또는 (xi) ADGRE2, 탄산탈수효소 IX(CAIX), CCR1, CCR4, 암배아 항원(CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원, 상피 당단백질-2(EGP-2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 부착 분자(EpCAM), EGFRvIII, 수용체 티로신-단백질 키나아제 erb­ B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산-결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 엽산 수용체-α, 갱글리오사이드 G2(GD2), 갱글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2), 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 아단위 알파-2(IL-13Rα2), κ-경쇄, 키나아제 삽입 도메인 수용체(KDR), 루이스 A(CA19.9), 루이스 Y(LeY), L1 세포 부착 분자(L1-CAM), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A 1(MAGE-A1), MICA/B, 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), PRAME 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 종양 연관된 당단백질 72(TAG-72), TIM-3, TRBCI, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­R2), 윌름스 종양 단백질(WT-1) 및 병원균 항원 중 어느 하나에 특이적일 수 있으며; 선택적으로, (i) 내지 (xi) 중 어느 하나의 CAR은 TCR 좌위에 삽입되고/되거나, TCR의 내인성 프로모터에 의해 유도되고/되거나, TCR은 CAR 삽입에 의해 녹아웃된다. CAR이 불활성화 CAR인 일부 실시형태에서, 불활성화 CAR은 활성화된 수용체 면역 세포에서 상향조절된 표면 단백질을 표적으로 한다. 특정 실시형태에서, 불활성화 CAR은 CD38-CAR, 4-1BB-CAR, OX40-CAR, 및 CD40L-CAR 중 적어도 하나를 포함한다.
세포 또는 이의 집단이 CFR을 포함하는 실시형태에서, CFR은 막관통 도메인에 융합된 엑토도메인을 포함하고, 이는 엔도도메인에 작동적으로 연결되어 있고, 엑토도메인, 막관통 도메인 및 엔도도메인은 임의의 소포체(ER) 체류 신호 또는 엔도사이토시스 신호를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, CFR의 엑토도메인은 CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD28, CD5, CD16, CD64, CD32, CD33, CD89, NKG2C, NKG2D, 이의 임의의 기능적 변이체, 및 조합 또는 키메라 중 적어도 하나를 포함하는 신호전달 단백질의 세포외 부분의 전체 또는 부분 길이를 포함한다. 일부 실시형태에서, CFR의 엑토도메인은 CD3, CD28, CD5, CD16, CD64, CD32, CD33, CD89, NKG2C, NKG2D, 또는 이의 임의의 기능적 변이체의 세포외 부분에 특이적인 적어도 하나의 결합 도메인을 포함하는 선택된 작용제에 결합 시 신호 유도를 개시하거나; 여기서 선택된 작용제는 B7H3, BCMA, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD179b, CEA, CLEC12A, CS-1, DLL3, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, FLT-3, FOLR1, FOLR3, GD2, gpA33, HER2, HM1.24, LGR5, MSLN, MCSP, MICA/B, PSMA, PAMA, P-카드헤린, 또는 ROR1을 포함하는 적어도 하나의 종양 항원에 특이적인 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CFR의 엔도도메인은 CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137(4-1BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, 또는 NKG2D 폴리펩티드의 적어도 하나의 전체 길이 또는 부분을 포함하는 세포독성 도메인을 포함하고; 선택적으로 엔도도메인은 하기 중 하나 이상을 추가로 포함한다: (i) CD2, CD27, CD28, CD40L, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 또는 NKG2D 폴리펩티드의 전체 길이 또는 부분, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 공동자극 도메인; (ii) CD28, 4-1BB, CD27, CD40L, ICOS, CD2의 전체 길이 또는 부분, 또는 이의 조합을 포함하는 공동자극 도메인; (iii) IL7R, IL15R, IL18R, IL12R, IL23R을 포함하는 사이토카인 수용체의 엔도도메인의 전체 길이 또는 부분, 또는 이의 조합을 포함하는 지속성 신호전달 도메인; 및/또는 (iv) 수용체 티로신 키나아제(RTK), 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), EGFR 또는 FAS 수용체의 전체 또는 부분 세포내 부분.
세포 또는 이의 집단이 관문 억제제의 도입된 발현 또는 증가된 발현을 포함하는 상기 실시형태에서, 관문 억제제는 PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 및 억제성 KIR을 포함하는 하나 이상의 관문 분자에 대한 길항제일 수 있다.
세포 또는 이의 집단의 다양한 실시형태에서, 세포는 (i) 세이프 하버 좌위 또는 선택된 유전자 좌위에서 통합된 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드; 또는 (ii) 상이한 세이프 하버 좌위 또는 2개 이상의 선택된 유전자 좌위에서 통합된 2개 초과의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세이프 하버 좌위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH 또는 RUNX1 중 적어도 하나를 포함하거나; 선택된 유전자 좌위는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD25, CD69, CD44, CD58, CD54, CD56, CD71, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT 중 하나이고/이거나; 외인성 폴리뉴클레오티드의 통합은 좌위에서 유전자의 발현을 녹아웃한다. 특정 실시형태에서, TCR 좌위는 TCR 알파 및/또는 TCR 베타의 불변 영역이다.
세포 또는 이의 집단이 분화 효과기 세포인 상기 실시형태에서, 분화 효과기 세포는 T계 세포일 수 있고, 외인성 IL15를 함유하지 않는 배양 배지에서 확장된다. 일부 실시형태에서, 배양 배지는 외인성 IL2 및 IL7 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양 배지는 IL2 또는 IL7 어느 것도 함유하지 않는다. 일부 실시형태에서, 분화 효과기 세포는 CD69+, 및/또는 PD1- 또는 PD1low이다. 일부 실시형태에서, 분화 효과기 세포는 사이토카인 서포트(cytokine support)의 부재 하에서 사이토카인 신호전달 복합체가 없는 이의 대응 세포와 비교하여, 증가된 항종양 기능 및/또는 지속성을 갖는다.
다른 양태에서, 본 발명은 T계 세포 확장 및/또는 종양 세포 제어 및 클리어런스를 개선하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 T계 세포에 IL7 사이토카인 신호전달 복합체를 도입하여, 사이토카인 신호전달 복합체가 없는 대응 세포와 비교하여, 개선된 세포 확장 및/또는 종양 세포 제어 및 클리어런스를 갖는 T계 세포를 생성하고, 상기 T계 세포는 선택적으로 키메릭 항원 수용체(CAR)를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 도입 단계는 (i) 유도 만능줄기 세포(iPSC)를 조작하여 IL7 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로, CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 편집된 iPSC를 생성하는 단계; 및 (ii) 게놈 편집된 iPSC를 IL7 신호전달 복합체를 포함하는 분화 T계 세포로 분화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 말초혈, 제대혈 또는 동일한 게놈 편집(들)이 없는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 얻은 이의 대응 1차 세포와 비교하여, 게놈 편집된 iPSC는 하기를 야기하는 하나 이상의 편집을 추가로 포함한다: (i) CD38 녹아웃; (ii) 이의 대응 1차 세포와 비교하여 HLA-I 결핍 및/또는 HLA-II 결핍; (iii) HLA-G 또는 비절단성 HLA-G의 발현 도입, 또는 CD58 및 CD54 중 하나 또는 둘 모두의 녹아웃; (iv) CD16 또는 이의 변이체; (v) 키메릭 융합 수용체(CFR); (vi) 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 펩티드 또는 전체 펩티드; (vii) 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나; (viii) B2M, CIITA, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD25, CD69, CD44, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 및 TIGIT의 적어도 하나에서의 결실 또는 파괴; 또는 (ix) HLA-E, 4-1BBL, CD3, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, 항원 특이적 TCR, Fc 수용체, 이의 항체 또는 기능적 변이체 또는 단편, 관문 저해제, 인게이저, 및 작용제와 커플링하기 위한 표면 유도 수용체의 적어도 하나의 도입.
다양한 실시형태에서, 방법은 외인성 IL15를 함유하지 않는 배양 배지에서 IL7 사이토카인 신호전달 복합체를 포함하는 T계 세포를 확장하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양 배지는 외인성 IL2 및 IL7 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양 배지는 IL2 또는 IL7 어느 것도 함유하지 않는다. 특정 실시형태에서, T계 세포는 CD69+, 및/또는 PD1- 또는 PD1low이다. 일부 실시형태에서, 개선된 세포 확장 및/또는 종양 세포 제어 및 클리어런스는 인 비트로 및/또는 인 비보이다. 실시형태에서, 본 발명은 또한 본원에 개시된 방법에 따라 CAR-T 세포 인 비보 항종양 기능을 개선하는 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 것과 같은 세포 또는 이의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 것과 같은 클론성 iPSC를 포함하는, 마스터 세포 은행(MCB)을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 것과 같은 iPSC 분화 효과기 세포, 및 하나 이상의 치료제를 포함하는 치료학적 용도를 위한 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 치료제는 펩티드, 사이토카인, 관문 억제제, 항체 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편, 미토겐, 성장 인자, 소형 RNA, dsRNA(이중 가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 피더 세포, 피더 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 하나 이상의 관심 다중핵산을 포함하는 벡터, 화학치료제 또는 방사성 모이어티, 또는 면역조절 약물(IMiD)을 포함한다. 하나 이상의 치료제가 관문 억제제인 실시형태에서, 관문 억제제는 (i) PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E, 또는 억제성 KIR을 포함하는 관문 분자에 대한 하나 이상의 길항제; (ii) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 이들의 유도체 또는 기능적 균등물 중 하나 이상; 또는 (iii) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료제는 베네토클락스, 아자시티딘 및 포말리도마이드 중 하나 이상을 포함한다. 치료제가 항체, 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편인 상기 실시형태에서, 항체, 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편은 (a) 항-CD20, 항-CD22, 항-HER2, 항-CD52, 항-EGFR, 항-CD123, 항-GD2, 항-PDL1, 및/또는 항-CD38 항체; (b) 리툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 우블리툭시맙, 오카라투주맙, 오비누투주맙, 이브리투모맙, 오크렐리주맙, 이노투주맙, 목세투모맙, 에프라투주맙, 트라스투주맙, 퍼투주맙, 알렘투주맙, 세르툭시맙, 디누툭시맙, 아벨루맙, 다라투무맙, 이사툭시맙, MOR202, 7G3, CSL362, 엘로투주맙, 및 이들의 인간화된 변이체 또는 단편 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편, 및 이들의 기능적 균등물 및 바이오시밀러 중 하나 이상; 또는 (c) 다라투무맙을 포함할 수 있고, 분화 효과기 세포는 CD38 녹아웃, 및 선택적으로 CD16 또는 이의 변이체의 발현을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 입양 세포 치료에 적합한 대상체로의 조성물의 도입에 의한 본원에 기재된 조성물의 치료학적 용도를 제공하고, 대상체는 자가면역 장애, 혈액학적 악성종양, 고형 종양, 암 또는 바이러스 감염을 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 치료 도중 사이토카인 서포트를 필요로 하지 않는다.
다른 양태에서, 본 발명은 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로, CAR을 포함하는 분화 효과기 세포의 제조 방법을 제공하고, 상기 방법은: (i) 유전자 조작된 iPSC를 분화 효과기 세포로 분화하는 단계로서, 여기서 iPSC는 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단계; 및 (ii) 외인성 IL15를 함유하지 않는 배양 배지 중 분화 효과기 세포를 확장하는 단계로서, 여기서 분화 효과기 세포는 외인성 IL15를 함유하는 배양 배지에서 배양된 세포와 비교하여, 하기 중 하나 이상을 포함하는 치료적 특성을 갖는 단계를 포함한다: (a) 세포독성의 증가; (b) 지속성 및/또는 생존율의 개선; (c) 종양 부위에 방관자 면역 세포를 이동시키고/시키거나 활성화하거나 동원하는 데 있어서의 능력의 향상; (d) 종양 침투의 개선; (e) 종양 면역억제를 감소시키는 능력의 향상; (f) 종양 항원 회피를 구제하는 능력의 개선; (g) 아폽토시스의 제어; (h) ADCC의 향상 또는 획득; 및 (i) 동족살해를 피하는 능력. 일부 실시형태에서, 배양 배지는 외인성 IL2 및 IL7 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양 배지는 IL2 또는 IL7 어느 것도 함유하지 않는다. 특정 실시형태에서, 사이토카인 신호전달 복합체는 IL7 수용체 융합물(IL7RF)을 포함한다.
다양한 실시형태에서, CAR은 (i) T 세포 특이적 또는 NK 세포 특이적; (ii) 이중특이적 항원 결합 CAR; (iii) 스위치 가능한 CAR; (iv) 이합체화된 CAR; (v) 분할 CAR; (vi) 다중사슬 CAR; (vii) 유도성 CAR; (viii) 불활성화 CAR이고; (ix) 선택적으로 개별 작제물에서 또는 바이-시스트로닉 작제물에서, 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 또는 전체 펩티드와 공동발현되고; (x) 선택적으로 개별 작제물에서 또는 바이-시스트로닉 작제물에서, 관문 억제제와 공동발현되고; (xi) CD19, BCMA, CD20, CD22, CD38, CD123, HER2, CD52, EGFR, GD2, MICA/B, MSLN, VEGF-R2, PSMA 및 PDL1 중 적어도 하나에 특이적이고/이거나; (xii) ADGRE2, 탄산탈수효소 IX(CAIX), CCR1, CCR4, 암배아 항원(CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원, 상피 당단백질-2(EGP-2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 부착 분자(EpCAM), EGFRvIII, 수용체 티로신-단백질 키나아제 erb­ B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산-결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 엽산 수용체-α, 갱글리오사이드 G2(GD2), 갱글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2), 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 아단위 알파-2(IL-13Rα2), κ-경쇄, 키나아제 삽입 도메인 수용체(KDR), 루이스 A(CA19.9), 루이스 Y(LeY), L1 세포 부착 분자(L1-CAM), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A 1(MAGE-A1), MICA/B, 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), PRAME 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 종양 연관된 당단백질 72(TAG-72), TIM-3, TRBCI, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­R2), 윌름스 종양 단백질(WT-1) 및 병원균 항원 중 어느 하나에 특이적이고; 선택적으로, (i) 내지 (xii) 중 어느 하나의 CAR은 TCR 좌위에 삽입되고/되거나, TCR의 내인성 프로모터에 의해 유도되고/되거나 TCR은 CAR 삽입에 의해 녹아웃된다. CAR이 불활성화 CAR인 상기 실시형태에서, 불활성화 CAR은 CD38-CAR, 4-1BB-CAR, OX40-CAR, 및 CD40L-CAR 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
분화 효과기 세포의 제조 방법의 일부 실시형태에서, 말초혈, 제대혈 또는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 얻은 이의 대응 1차 세포와 비교하여, iPSC는 하기를 야기하는 하나 이상의 편집을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다: (i) CD38 녹아웃; (ii) 이의 대응 1차 세포와 비교하여 HLA-I 결핍 및/또는 HLA-II 결핍; (iii) HLA-G 또는 비절단성 HLA-G의 발현 도입, 또는 CD58 및 CD54 중 하나 또는 둘 모두의 녹아웃; (iv) CD16 또는 이의 변이체; (v) 키메릭 융합 수용체(CFR); (vi) 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 펩티드 또는 전체 펩티드; (vii) 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나; (viii) B2M, CIITA, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD25, CD69, CD44, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 및 TIGIT의 적어도 하나에서의 결실 또는 파괴; 또는 (ix) HLA-E, 4-1BBL, CD3, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, 항원 특이적 TCR, Fc 수용체, 이의 항체 또는 기능적 변이체 또는 단편, 관문 저해제, 인게이저, 및 작용제와 커플링하기 위한 표면 유도 수용체의 적어도 하나의 도입. iPSC가 CD16 또는 이의 변이체를 야기하는 하나 이상의 편집을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 실시형태에서, CD16 또는 이의 변이체는 (a) 고친화도 비-절단성 CD16(hnCD16); (b) CD16의 엑토도메인 도메인에서의 F176V 및 S197P; (c) CD64로부터 기원한 전체 또는 부분 엑토도메인; (d) 비-천연적(또는 비-CD16) 막관통 도메인; (e) 비-천연적(또는 비-CD16) 세포내 도메인; (f) 비-천연적(또는 비-CD16) 신호전달 도메인; (g) 비-천연적 자극 도메인; 및 (h) CD16으로부터 기원하지 않는 막관통 도메인, 신호전달 도메인 및 자극 도메인의 상기 중 적어도 하나를 포함할 수 있고, 이는 동일한 폴리펩티드 또는 상이한 폴리펩티드로부터 기원한다.
분화 효과기 세포의 제조 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 녹인하기 위해; 및 선택적으로: (i) CD38을 녹아웃하기 위해, (ii) B2M 및/또는 CIITA를 녹아웃하기 위해, (iii) CD58 및 CD54의 하나 또는 둘 모두를 녹아웃하기 위해, 및/또는 (iv) HLA-G 또는 비절단성 HLA-G, 고친화성 비절단성 CD16 또는 이의 변이체, CFR, 및/또는 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 펩티드 및/또는 전체 펩티드의 발현을 도입하기 위해 클론성 iPSC를 게놈 조작하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 게놈 조작은 표적화된 편집을 포함한다. 특정 실시형태에서, 표적화된 편집은 결실, 삽입 또는 삽입-결실(in/del)을 포함하고, 표적화된 편집은 CRISPR, ZFN, TALEN, 호밍 뉴클레아제, 상동성 재조합, 또는 이들 방법의 임의의 다른 기능적 변형에 의해 수행된다. 일 양태에서, 본 발명은 클론성 iPSC의 CRISPR 매개 편집을 사용하여 클론성 마스터 조작된 iPSC주를 생성하는 방법을 제공하고, 상기 편집은 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로 CAR을 클론성 iPSC로 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 녹-인을 포함하고, 상기 사이토카인 신호전달 복합체는 IL7 수용체 융합물(IL7RF)을 포함하여 클론성 마스터 조작된 iPSC주를 생성한다. 클론성 마스터 조작된 iPSC주의 생성 방법의 일부 실시형태에서, (a) 클론성 iPSC의 편집은 TCR을 녹아웃하는 것을 추가로 포함하거나; (b) CAR은 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD38, CD25, CD69, CD44, CD58, CD54, CD56, CD71, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, 또는 TIGIT를 포함하는 유전자 좌위 중 하나에서 삽입되고; 삽입은 좌위에서 유전자의 발현을 녹아웃한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 것과 같은 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 질환 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 치료 도중 사이토카인 서포트를 필요로 하지 않는다. 일부 실시형태에서, 조성물의 세포는 항체 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편, 또는 인게이저를 발현한다. 일부 실시형태에서, 조성물의 세포는 하기 중 하나 이상을 추가로 포함하는 iPSC-유래 효과기 세포이다: (a) CD38 녹아웃, (ii) TCRneg; (iii) 외인성 CD16 또는 이의 변이체; (iv) HLA-I 및/또는 HLA-II 결핍; (v) HLA-G 또는 비절단성 HLA-G의 도입된 발현, 또는 CD58 및 CD54의 하나 또는 둘 모두의 녹아웃; (vi) CFR의 도입된 발현, 및/또는 (vii) 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 또는 전체 펩티드. 일부 실시형태에서, 조성물의 세포의 투여는 사이토카인 서포트의 부재 하에서 이의 대응 1차 세포와 비교하여, 하기 중 하나 이상을 야기한다: (i) 세포독성의 증가; (ii) 지속성 및/또는 생존율의 개선; (iii) 종양 부위에 방관자 면역 세포를 이동시키고/시키거나 활성화하거나 동원하는 데 있어서의 능력의 향상; (iv) 종양 침투의 개선; (v) 종양 면역억제를 감소시키는 능력의 향상; (vi) 종양 항원 회피를 구제하는 능력의 개선; (vii) 제어된 아폽토시스; (viii) ADCC의 향상 또는 획득; 및 (ix) 동족살해를 피하는 능력.
본원에 제공된 것과 같은 조성물 및 방법의 다양한 목적 및 이점은 동반된 도면과 함께 취해져 하기 설명으로부터 명확해질 것이고, 이는 예시 및 예, 본 발명의 특정한 실시형태의 방식으로 기재된다.
도 1은 iPSC-유래 세포에서 세포 표면 발현된 사이토카인을 위한 여러 작제물 설계의 그래프 표시이다. IL7은 다른 바람직한 사이토카인으로 대체될 수 있는 예시적인 예로서 사용된다.
도 2a 및 2b는 IL7RF를 발현하기 위해 조작된 CAR-iT 세포가 특정한 확장 조건에서 개선된 확장 및 생존성을 보여준다는 것을 입증하였다. 도 2a는 다양한 사이토카인 조합에 의해 지지된 배지에서 IL7RF/CAR-iT 세포 또는 대조 CAR-iT 세포(형질유도된 IL7RF 없음)의 확장 배수를 보여주고, 도 2b는 다양한 사이토카인 조합에 의해 지지된 배지에서 IL7RF/CAR-iT 세포 또는 대조 CAR-iT 세포(형질유도된 IL7RF 없음)의 확장 과정의 종료점에서 생존성을 보여준다.
도 3a 내지 3d는 일련의 자극 어세이에서 시험된 상이한 확장 조건으로부터 생성된 효과기 세포(CAR-iT 또는 IL7RF/CAR-iT)를 보여준다. 도 3a 및 3b는 IL7RF로 조작된 효과기 CAR-iT 세포가 특히 특정한 확장 조건에서 일련의 자극 어세이를 통해 세포수의 보유를 개선하였음을 보여준다. 도 3c 및 3d는 CAR 발현이 CAR-iT 세포와 비교하여 IL7RF/CAR-iT 세포에서 더 양호하게 유지되었을 보여준다.
도 4a 및 4b는 활성화 마커 CD69의 발현을 위한 염색에 의한 각각의 사이토카인 확장 조건 하에서 IL7RF/CAR-iT 세포의 CD69 발현의 보다 긴 유지를 보여준다.
도 5a 및 5b는 IL7RF/CAR-iT 세포가 소진 마커 PD-1을 위한 염색에 의한 각각의 사이토카인 확장 조건 하에서 일련의 자극에 대한 반응으로 감소된 PD-1 상향조절을 갖는다는 것을 보여준다.
도 6a 내지 6e는 확장 배지에서 임의의 사이토카인의 부재 하에서 IL7RF/CAR-iT 세포의 확장이 개선된 종양 성장 제어를 야기할 수 있음을 보여준다. 도 6a는 배지에서 3개의 사이토카인을 갖는 표준 조건에서 확장된 IL7RF/CAR-iT 세포의 종양 성장 제어를 보여준다. 도 6b는 임의의 사이토카인을 갖지 않는 배지에서 확장된 IL7RF/CAR-iT 및 CAR-iT세포의 종양 성장 제어를 보여준다. 도 6c는 표준 조건 하에서 확장된 그리고 사이토카인 없는 배지에서 확장된 IL7RF/CAR-iT 세포 및 대조 세포의 10일차까지의 곡선하 면적(ACU) 데이터의 요약을 제공한다. 도 6d 및 6e는 0 내지 250 IU/ml 범위의 다양한 농도에서 IL2가 보충된 배지에서 IL7RF/CAR-iT 및 CAR-iT 세포의 종양 성장 제어 및 세포 확장을 보여준다.
도 7a 및 7b는 10일 어세이에 걸쳐 IL2 단독 존재 하에서, IL7 단독 존재 하에서, 그리고 IL2 및 IL7 둘 모두의 존재 하에서, 표준 조건에서 확장된 IL7RF/CAR-iT 세포 및 대조 세포에 의한 종양 성장 제어를 보여준다.
도 8은 상이한 조건에서 확장된 CAR-iT 세포 또는 IL7RF/CAR-iT 세포로 처리된 상이한 그룹의 마우스(사이토카인 서포트를 갖는 Nalm6 iv/iv)의 평균 종양 총량을 보여주는 22일차 BLI 데이터를 제공한다.
도 9는 마우스에 사이토카인 서포트가 제공되지 않은 마우스 모델에서 CAR-iT 세포와 비교하여, IL7RF/CAR-iT 세포에 의한 개선된 인 비보 종양 성장 억제(TGI)를 보여주는 시간에 따른 BLI 데이터를 제공한다.
iPSC(유도 만능 줄기 세포)의 게놈 변형은 폴리뉴클레오티드 삽입, 결실 및 치환을 포함한다. 게놈 조작된 iPSC에서의 외인성 유전자 발현은 대개 원래의 게놈 조작된 iPSC의 연장된 클론 확장 후, 세포 분화 후 및 게놈 조작된 iPSC로부터 분화된 세포로부터 탈분화된 세포 유형에서 유전자 침묵화 또는 유전자 발현 감소와 같은 문제점에 부딪친다. 다른 한편, T 세포 또는 NK 세포와 같은 1차 면역 세포의 직접적인 조작은 도전적이고, 입양 세포 치료를 위해 조작된 면역 세포의 준비 및 전달에 대한 장애물을 나타낸다. 본 발명은 HSC(조혈 줄기 세포 및 전구 세포), T 세포 전구 세포, NK 세포 전구 세포, T계 세포, NKT계 세포, NK계 세포, 및 일차 NK, T, 및/또는 NKT 세포에 존재하지 않는 하나 이상의 기능적 특징을 갖는 면역 효과기 세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 iPSC 분화 세포로, 생착, 수송, 호밍, 이동, 세포독성, 생존능력, 유지, 확장, 수명, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존율과 관련한 개선된 치료적 특성을 제공하는, 자살 유전자 및 다른 기능적 양상을 포함하는 하나 이상의 외인성 유전자를 안정하게 통합하기 위한 효율적이고 신뢰성 있고 표적화된 접근법을 제공한다.
정의
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 연결되어 사용된 과학 용어 및 기술 용어는 당업자가 흔히 이해하는 의미를 가지는 것으로 한다. 추가로, 맥락에 의해 달리 필요하지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하며, 복수 용어는 단수를 포함하는 것으로 한다.
본 발명이 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등으로 제한되지 않고 그러므로 변할 수 있다고 이해되어야 한다. 본원에 사용된 전문용어는 오직 특정 실시형태를 기술할 목적을 위한 것이고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않고, 이는 청구항에 의해 오로지 한정된다.
본원에 사용된 "일(a)", "하나(an)" 및 "이(the)"라는 관사는 본원에서 그 관사의 문법상 목적어의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭하도록 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
대안(예를 들어, "또는")의 사용은 대안의 하나, 둘 모두, 또는 임의의 이들의 조합 중 어느 하나를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
"및/또는"이라는 용어는 대안의 하나 또는 둘 모두 중 어느 하나를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 "약" 또는 "대략"이라는 용어는 기준 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 비교하여 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%만큼 변하는 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시형태에서, "약" 또는 "대략"이라는 용어는 약 기준 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2% 또는 ± 1%의 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 범위를 지칭한다.
본원에 사용된 "실질적으로" 또는 "본질적으로"이라는 용어는 기준 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 비교하여 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 이보다 높은 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시형태에서, "본질적으로 동일한" 또는 "실질적으로 동일한"이라는 용어는 기준 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 대락 동일한 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 범위를 지칭한다.
본원에 사용된 "실질적으로 없는" 및 "본질적으로 없는"이라는 용어는 상호교환 가능하게 사용되고, 세포 집단 또는 배양 배지와 같은 조성을 기술하도록 사용될 때 특별 물질 또는 이의 원천이 없는, 예컨대 특별 물질 또는 이의 원천이 95% 없거나, 96% 없거나, 97% 없거나, 98% 없거나, 99% 없거나, 종래의 수단에 의해 측정된 것처럼 검출 불가능한 조성을 지칭한다. 조성에서 소정의 성분 또는 물질이 "없는" 또는 "본질적으로 없는"이라는 용어는 또한 이러한 성분 또는 물질이 (1) 임의의 농도로 조성에 포함되지 않거나, (2) 기능적으로 불활성이지만 낮은 농도로 조성에 포함됨을 의미한다. 유사한 의미는 "부재"라는 용어에 적용될 수 있고, 여기서 조성의 특정 물질 또는 이의 원천의 부재를 지칭한다.
본 명세서에 전반에 걸쳐, 맥락이 달리 요구하지 않는 한, "포함한다", "포함한" 및 "포함하는"이라는 단어는 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소의 그룹의 배제가 아니라 기술된 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소의 그룹의 포함을 함축하는 것으로 이해될 것이다. 특정 실시형태에서, "포함한다", "갖는다", "함유한다" 및 "수반한다"라는 용어는 동의어로 사용된다.
"이루어진"에 의해 "이루어진"이라는 구절에 뒤따르는 어떤 것이든 이것을 포함하고, 이것으로 제한됨을 의도된다. 이와 같이, "이루어진"이라는 구절은 열거된 요소가 필요하거나 의무적이고, 다른 요소가 존재하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다.
"본질적으로 이루어진"에 의해 그 구절 뒤에 열거된 임의의 요소를 포함하고, 열거된 요소에 대해 개시내용에 기재된 활성 또는 작용과 상호작용하지 않거나 이에 기여하지 않는 다른 요소로 제한됨이 의도된다. 이와 같이, "본질적으로 이루어진"이라는 구절은 열거된 요소가 필요하거나 의무적이지만, 다른 요소가 선택적이지 않고, 열거된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치는 여부에 따라 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다.
본 명세서에 전반에 걸쳐 "하나의 실시형태", "일 실시형태", "특정 실시형태", "관련된 실시형태", "특정한 실시형태", "추가의 실시형태" 또는 "추가 실시형태" 또는 이들의 조합에 대한 언급은 그 실시형태와 연관되어 기재된 특정한 특성, 구조 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다. 이와 같이, 본 명세서에 전반에 걸쳐 다양한 위치에서의 상기의 구절의 출현은 반드시 동일한 실시형태를 모두 지칭할 필요는 없다. 더욱이, 하나 이상의 실시형태에서 임의의 적합한 방식으로 특정한 특성, 구조 또는 특징이 조합될 수 있다.
"엑스 비보"라는 용어는 일반적으로 바람직하게는 자연 조건의 최소 변경으로 유기체 밖의 인공 환경에서 살아 있는 조직에서 또는 상에서 수행된 실험 또는 측정과 같은 유기체 밖에서 발생하는 활성을 지칭한다. 특정 실시형태에서, "엑스 비보" 절차는 보통 멸균 조건 하에 통상적으로 수시간 또는 약 24시간 이하 동안이지만 상황에 따라 48시간 또는 72시간 또는 더 긴 기간 동안 유기체로부터 취하고 실험실 장치에서 배양된 살아 있는 세포 또는 조직을 수반한다. 특정한 실시형태에서, 상기 조직 또는 세포는 엑스 비보 처리를 위해 수집되고 동결되고 나중에 해동될 수 있다. 살아 있는 세포 또는 조직을 사용하여 수 일보다 길게 지속하는 조직 배양 실험 또는 절차는 통상적으로 "인 비트로"인 것으로 여겨지지만, 특정한 실시형태에서 이 용어가 엑스 비보와 상호교환 가능하게 사용될 수 있다.
"인 비보"라는 용어는 일반적으로 유기체 내에서 발생하는 활성을 지칭한다.
본원에 사용된 "재프로그래밍" 또는 "탈분화" 또는 "세포 효능의 증가" 또는 "발생 효능의 증가"라는 용어는 세포의 효능을 증가시키는 방법 또는 덜 분화된 상태로 세포를 탈분화시키는 방법을 지칭한다. 예를 들어, 세포 효능이 증가된 세포는 재프로그래밍되지 않은 상태의 동일한 세포와 비교하여 발달 가소성이 더 높다(즉, 더 많은 세포 유형으로 분화할 수 있음). 달리 말하면, 재프로그래밍된 세포는 재프로그래밍되지 않은 상태의 동일한 세포보다 덜 분화된 상태로 있는 것이다.
본원에 사용된 "분화"라는 용어는 비특수화된("비결정된") 세포 또는 덜 특수화된 세포가 예를 들어 혈액 세포 또는 근육 세포와 같은 특수화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 세포 또는 분화 유도된 세포는 세포의 계통 내에 보다 특수화된("결정된") 위치에서 취해진 것이다. "결정된(committed)"이라는 용어는, 분화의 과정에 적용될 때, 정상 상황 하에서 이것이 특정한 세포 유형 또는 세포 유형의 하위집단으로 계속해서 분화하고, 정상 상황 하에서 상이한 세포 유형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포 유형으로 되돌아갈 수 없는 지점으로 분화 경로에서 진행된 세포를 지칭한다. 본원에 사용된 "만능(pluripotent)"이라는 용어는 신체 또는 체세포(즉, 고유배)의 모든 계통을 형성하는 세포의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 배아 줄기 세포는 외배엽, 중배엽 및 내배엽의 3개의 배엽의 각각으로부터 세포를 형성할 수 있는 만능 줄기 세포의 유형이다. 만능성은 완전한 유기체를 생성할 수 없는 불완전하게 또는 부분적으로 만능인 세포(예를 들어, 외배반 줄기 세포 또는 EpiSC)로부터 완전한 유기체(예를 들어, 배아 줄기 세포)를 생성할 수 있는 보다 원시인, 보다 만능인 세포에 이르는 발생 가능성의 연속체이다.
본원에 사용된 "유도 만능 줄기 세포" 또는 iPSC와 같은 용어는, 중배엽, 내배엽 및 외배엽의 모든 3개의 배엽 또는 진피 층의 조직으로 분화할 수 있는 세포로 유도되거나 변경된, 즉 재프로그래밍된, 분화된 성체, 신생아 또는 태아 세포로부터, 재프로그래밍 인자 및/또는 소분자 화학 유도 방법을 이용하여 줄기 세포가 인 비트로로 생산된다는 것을 의미한다. 생산된 iPSC는 자연에서 발견되므로 세포라 칭하지 않는다.
본원에 사용된 "배아 줄기 세포"라는 용어는 배아 배반포의 내부 세포 덩어리의 자연 발생 만능 줄기 세포를 지칭한다. 배아 줄기 세포는 만능성이고, 외배엽, 내배엽 및 중배엽의 3개의 1차 배엽의 모든 분화체로 발생 동안 생긴다. 이들은 배아외 막 또는 태반에 기여하지 않고, 즉 전능성이 아니다.
본원에 사용된 "다능성 줄기 세포"라는 용어는 모든 3개는 아니지만 1개 이상의 배엽(외배엽, 중배엽 및 내배엽)의 세포로 분화하는 발생 가능성을 갖는 세포를 지칭한다. 이와 같이, 다능성 세포는 또한 "부분적으로 분화된 세포"라 칭할 수 있다. 다능성 세포는 당업계에 잘 공지되어 있고, 다능성 세포의 예는 예를 들어 조혈 줄기 세포 및 신경 줄기 세포와 같은 성체 줄기 세포를 포함한다. "다능성"은 세포가 다른 계통의 세포가 아니라 소정의 계통에서의 세포의 많은 유형을 형성할 수 있다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 다능성 조혈 세포는 많은 상이한 유형의 혈액 세포(적혈구, 백혈구, 혈소판 등)를 형성할 수 있지만, 이것은 뉴런을 형성하지 않을 수 있다. 따라서, 용어 "다능성"은 전능성 및 만능보다 발생 가능성의 정도가 덜한 세포의 상태를 지칭한다.
만능성은 부분적으로 세포의 만능성 특징을 평가하여 결정될 수 있다. 만능성 특징은 (i) 만능 줄기 세포 형태; (ii) 비제한된 자가 재생에 대한 가능성; (iii), 비제한적인 예로서 SSEA1(마우스 단독), SSEA3/4, SSEA5, TRA1-60/81, TRA1-85, TRA2-54, GCTM-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133/프로미닌, CD140a, CD56, CD73, CD90, CD105, OCT4, NANOG, SOX2, CD30 및/또는 CD50을 포함하는 만능 줄기 세포 마커의 발현; (iv) 모든 3개의 체세포 계통(외배엽, 중배엽 및 내배엽)으로 분화시키는 능력; (v) 3개의 체세포 계통으로 이루어진 기형종 형성; 및 (vi) 이들 체세포 계통으로부터의 세포로 이루어진 배양체의 형성을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
후기 배반포의 외배반 줄기 세포(EpiSC)와 유사한 만능성의 "프라이밍된" 상태 또는 "준안정" 상태 및 초기/착상전 배반포의 내부 세포 덩어리와 유사한 만능성의 "미경험" 상태 또는 "기초" 상태의 2가지 유형의 만능성이 이전에 기재되어 있다. 만능 상태 둘 모두가 상기 기술된 것과 같은 특징을 나타내지만, 미경험 상태 또는 기초 상태는 (i) 암컷 세포에서의 X-염색체의 사전활성화 또는 재활성화; (ii) 단일 세포 배양 동안 개선된 클론성 및 생존율; (iii) DNA 메틸화의 전반적 감소; (iv) 발생 조절 유전자 프로모터에서 H3K27me3 억제 염색질 마크 침착의 감소; 및 (v) 프라이밍된 상태의 만능 세포에 대한 분화 마커의 발현 감소를 추가로 나타낸다. 외인성 만능성 유전자가 체세포로 도입되고, 발현되고 이후 생성된 만능 세포로부터 침묵화되거나 제거되는 세포 재프로그래밍의 표준 방법론은 일반적으로 만능성의 프라이밍된 상태의 특징을 갖는 것으로 보인다. 표준 만능 세포 배양 조건 하에 외인성 전이유전자 발현이 유지되지 않으면 이러한 세포는 프라이밍된 상태로 있고, 여기서 기초 상태의 특징이 관찰된다.
본원에 사용된 "만능 줄기 세포 형태"라는 용어는 배아 줄기 세포의 전통적인 형태학적 특징을 지칭한다. 정상 배아 줄기 세포 형태는, 높은 핵-대-세포질 비율로 형상이 원형이고 소형이라는 것, 핵소체가 현저하게 존재한다는 것, 및 통상적인 세포간 간격이 있다는 것을 특징으로 한다.
본원에 사용된 "대상체"라는 용어는 임의의 동물, 바람직하게는 인간 환자, 가축 또는 다른 사육동물을 지칭한다.
"만능성 인자" 또는 "재프로그래밍 인자"는 단독으로 또는 다른 약제와 조합되어 세포의 발생 효능을 증가시킬 수 있는 약제를 지칭한다. 만능성 인자는 제한 없이 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 세포의 발생 효능을 증가시킬 수 있는 소분자를 포함한다. 예시적인 만능성 인자는 예를 들어 전사 인자 및 소분자 재프로그래밍제를 포함한다.
"배양" 또는 "세포 배양"은 인 비트로 환경에서의 세포의 유지, 성장 및/또는 분화를 지칭한다. "세포 배양 배지들", "배양 배지들"(각각의 경우에 단수형 "배지"), "보충제" 및 "배지 보충제"는 세포 배양물을 배양하는 영양적 조성물을 지칭한다.
"배양한다" 또는 "유지한다"는 예를 들어 멸균 플라스틱(또는 코팅된 플라스틱) 세포 배양 접시 또는 플라스크에서 조직 또는 신체의 밖에서 세포를 지속, 전파(성장), 및/또는 분화시키는 것을 지칭한다. "배양" 또는 "유지"는 영양소, 호르몬 및/또는 세포를 전파시키고/시키거나 지속시키는 것을 돕는 다른 인자의 원천으로서 배양 배지를 사용할 수 있다.
본원에 사용된 "중배엽"이라는 용어는 초기 배아발생 동안 생기고, 순환계의 혈액 세포, 근육, 심장, 진피, 골격, 및 다른 지지 조직 및 결합 조직을 포함하는 다양한 특수화된 세포 유형을 생성시키는 3개의 배엽 중 하나를 지칭한다.
본원에 사용된 "한정적 동형유전자성 내피세포"(HE) 또는 "만능 줄기 세포 분화된 한정적 동형유전자성 내피세포"(iHE)라는 용어는 내피 조혈 전환(endothelial-to-hematopoietic transition)이라 칭하는 과정에서 조혈 줄기 세포 및 전구 세포를 생성시키는 내피 세포의 하위집단을 지칭한다. 배아에서의 조혈 세포의 발생은 측판 중배엽으로부터 혈관아세포를 통해 한정적 동형유전자성 내피세포 및 조혈 전구 세포로 순차적으로 진행한다.
"조혈 줄기 세포 및 전구 세포", "조혈 줄기 세포", "조혈 전구 세포" 또는 "조혈 전구 세포"라는 용어는 조혈 계통에 대해 결정되지만 추가의 조혈 분화를 할 수 있는 세포를 지칭하고, 다능성 조혈 줄기 세포(조혈세포), 골수성 전구 세포, 거핵세포 전구 세포, 적혈구 전구 세포 및 림프구성 전구 세포를 포함한다. 조혈 줄기 세포 및 전구 세포(HSC)는 골수성 계통(단핵구 및 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 거핵세포/혈소판, 수지상 세포), 및 림프구성 계통(T 세포, B 세포, NK 세포)을 포함하는 모든 혈액 세포 유형을 생성시키는 다능성 줄기 세포이다. 본원에 사용된 "한정적 조혈 줄기 세포"라는 용어는 T계 세포, NK계 세포 및 B계 세포를 포함하는 성숙 골수성 세포 및 림프구성 세포 유형 둘 모두를 생성할 수 있는 CD34+ 조혈 세포를 지칭한다. 조혈 세포는 또한 원시 적혈구, 거핵세포 및 대식세포를 생성하는 원시 조혈 세포의 다양한 하위집단을 포함한다.
본원에 사용된 "T 림프구" 및 "T 세포"라는 용어는 상호교환 가능하게 사용되고, 흉선에서 성숙을 완료하고 MHC 클래스 I-제한 방식으로 신체에서의 특정 외래 항원의 확인 및 다른 면역 세포의 활성화 및 탈활성화를 포함하는 면역계에서 다양한 역할을 갖는 백혈구의 주요 유형을 지칭한다. T 세포는 임의의 T 세포, 예컨대 배양된 T 세포, 예를 들어 1차 T 세포, 또는 배양된 T 세포주로부터의 T 세포, 예를 들어 Jurkat, SupT1 등, 또는 포유동물로부터 얻은 T 세포일 수 있다. T 세포는 CD3+ 세포일 수 있다. T 세포는 임의의 유형의 T 세포일 수 있고, CD4+/CD8+ 이중 양성 T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포(예를 들어, Th1 및 Th2 세포), CD8+ T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포), 말초혈 단핵 세포(PBMC), 말초혈 백혈구(PBL), 종양 침윤 림프구(TIL), 기억 T 세포, 미경험 T 세포, 조절 T 세포, 감마 델타 T 세포(γδ T 세포) 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 임의의 발생 단계를 가질 수 있다. 헬퍼 T 세포의 추가의 유형은 Th3(Treg), Th17, Th9 또는 Tfh 세포와 같은 세포를 포함한다. 기억 T 세포의 추가의 유형은 중앙 기억 T 세포(Tcm 세포), 효과기 기억 T 세포(Tem 세포 및 TEMRA 세포)와 같은 세포를 포함한다. T 세포는 또한 유전자 조작된 T 세포, 예컨대 T 세포 수용체(TCR) 또는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 변형된 T 세포를 지칭할 수 있다. T 세포, 또는 T 세포 유사 효과기 세포는 또한 줄기 세포 또는 전구 세포("유도 T 세포" 또는 "유도 T 세포 유사 효과기 세포", 또는 집합적으로 "유도성 T계 세포")로부터 분화될 수 있다. T 세포 유사 분화 효과기 세포는 어느 점에서는 T 세포 계통을 가질 수 있지만, 동시에 1차 T 세포에서 존재하지 않는 하나 이상의 기능적 특징을 갖는다. 본 명세서에서, T 세포, T 세포 유사 효과기 세포, 유도 T 세포, 유도 T 세포 유사 효과기 세포, 또는 유도성 T계 세포는 집합적으로 "T계 세포"로 지칭된다.
"CD4+ T 세포"는 표면 상에 CD4를 발현하고 세포 매개된 면역 반응과 연관된 T 세포의 하위집단을 지칭한다. 이는 IFN-감마, TNF-알파, IL2, IL4 및 IL10과 같은 사이토카인의 분비를 포함할 수 있는 자극 후 분비 프로파일을 특징으로 한다. "CD4"는 T 림프구 상에서 분화 항원으로 기원상 정의되지만, 단핵구/대식세포를 포함하는 다른 세포 상에서 또한 발견되는 55 kD 당단백질이다. CD4 항원은 면역글로불린 슈퍼유전자 패밀리의 구성원이고, MHC(주요 조직접합성 복합체) 클래스 II 제한된 면역 반응에서 관련 인식 요소로 관여하고 있다. 이는 T 림프구에서 헬퍼/인듀서 하위집단을 한정한다.
"CD8+ T 세포"는 표면 상에 CD8을 발현하고, MHC 클래스 I-제한되고, 세포독성 T 세포로서 작용하는 T 세포의 하위집단을 지칭한다. "CD8" 분자는 흉선세포 및 세포독성 및 억제자 T 림프구 상에서 발견되는 분화 항원이다. CD8 항원은 면역글로불린 슈퍼유전자 패밀리의 구성원이고, 주요 조직접합성 복합체 클래스 I 제한된 상호작용에서 관련 인식 요소이다.
본원에 사용된 "NK 세포" 또는 "자연 살해 세포"라는 용어는 CD56 또는 CD16의 발현 및 T 세포 수용체(CD3)의 부재에 의해 정의되는 말초혈 림프구의 하위집단을 지칭한다. 본원에 사용된 "적응성 NK 세포" 및 "기억 NK 세포"라는 용어는 상호교환 가능하고, NKG2C 및 CD57 중 적어도 하나, 및 선택적으로 CD16을 발현하는 유전자형적으로 CD3- 및 CD56+이지만, PLZF, SYK, FceRγ 및 EAT-2 중 하나 이상의 발현이 결여된 NK 세포의 하위집단을 지칭한다. 일부 실시형태에서, CD56+ NK 세포의 단리된 하위집단은 CD16, NKG2C, CD57, NKG2D, NCR 리간드, NKp30, NKp40, NKp46, 활성화 및 억제성 KIR, NKG2A 및/또는 DNAM-1의 발현을 포함한다. CD56+는 흐린(dim) 발현 또는 밝은(bright) 발현일 수 있다. NK 세포, 또는 NK 세포 유사 효과기 세포는 줄기 세포 또는 전구 세포("분화 NK 세포" 또는 "분화 NK 세포 유사 효과기 세포", 또는 집합적으로 "분화성 NK계 세포")로부터 분화될 수 있다. NK 세포 유사 분화 효과기 세포는 어느 점에서는 NK 세포 계통을 가질 수 있지만, 동시에 1차 NK 세포에 존재하지 않는 하나 이상의 기능적 특징을 갖는다. 본 출원에서, NK 세포, NK 세포 유사 효과기 세포, 분화 NK 세포, 분화 NK 세포 유사 효과기 세포, 또는 분화성 NK계 세포는 집합적으로 "NK계 세포"로 지칭된다.
본원에 사용된 "NKT 세포" 또는 "자연 살해 T 세포"라는 용어는 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 CD1d 제한된 T 세포를 지칭한다. NKT 세포는 종래의 주요 조직접합성(MHC) 분자에 의해 제시된 펩티드 항원을 검출하는 종래의 T 세포와 달리, 비전통적 MHC 분자인 CD1d에 의해 제시된 지질 항원을 인식한다. 2가지 유형의 NKT 세포가 인식된다. 비변이체 또는 I형 NKT 세포는 매우 제한된 TCR 레퍼토리 - β 사슬(인간에서의 Vβ11)의 제한된 스펙트럼과 회합된 정규적 α-사슬(인간에서의 Vα24-Jα18)을 발현한다. 비전통적 또는 비-비변이체 II형 NKT 세포라 불리는 NKT 세포의 제2 집단은 더 이종성인 TCR αβ 용법을 디스플레이한다. I형 NKT 세포는 면역요법에 적합하다고 여겨진다. 적응성 또는 비변이체(I형) NKT 세포는 TCR Va24-Ja18, Vb11, CD1d, CD3, CD4, CD8, aGalCer, CD161 및 CD56의 마커 중 적어도 하나 이상의 발현으로 확인될 수 있다.
용어 "효과기 세포"는 일반적으로 자극 및/또는 활성화, 또는 활성화 시 특정 기능에 영향을 주는 세포에 대한 반응으로 특정 활동을 수행하는 면역계 내 특정한 세포에 적용된다. 본원에 사용된 용어 "효과기 세포"는, 일부 맥락에서 상호교환가능한, 자극 및/또는 활성화에 대한 반응으로 특정 활동을 수행하기 위해 편집 및/또는 조절되는 면역 세포, 분화 면역 세포 및 1차 또는 분화 세포를 포함한다. 효과기 세포의 비제한적 예는 1차-원천 또는 iPSC-분화 T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 및 호중구를 포함한다.
본원에 사용된 "단리된"이라는 용어 또는 기타는 이의 원래의 환경으로부터 분리된 세포 또는 세포의 집단을 지칭하고, 즉 단리된 세포의 환경은 "비단리된" 기준 세포가 존재하는 환경에서 발견되는 적어도 하나의 성분이 실질적으로 없다. 용어는 세포가 이의 자연 환경에서 발견되면서, 예를 들어 조직 또는 생검 샘플로부터 단리되면서 일부 또는 모든 성분들로부터 제거된 세포를 포함한다. 용어는 세포가 비자연 발생 환경에서 발견되면서, 예를 들어 세포 배양물 또는 세포 현탁액으로부터 단리되면서 적어도 하나의, 일부 또는 모든 성분으로부터 제거된 세포를 또한 포함한다. 따라서, 단리된 세포는 세포가 자연에서 발견되면서 또는 비자연 발생 환경에서 성장하거나 저장되거나 존속하면서 다른 물질, 세포 또는 세포 집단을 포함하는 적어도 하나의 성분으로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된다. 단리된 세포의 특정 예는 부분적으로 순수한 세포 조성, 실질적으로 순수한 세포 조성 및 비자연 발생인 배지에서 배양된 세포를 포함한다. 환경에서 다른 물질 또는 세포로부터 원하는 세포 또는 이의 집단을 분리하여, 또는 환경으로부터 하나 이상의 다른 세포 집단 또는 하위집단을 제거하여 단리된 세포를 얻을 수 있다.
본원에 사용된 "정제한다"라는 용어 또는 기타는 순도의 증가를 지칭한다. 예를 들어, 순도는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%까지 증가할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "인코딩하는"은 뉴클레오티드(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 한정된 서열 또는 아미노산의 한정된 서열 중 어느 하나를 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드에서의 뉴클레오티드의 특정 서열의 고유한 특성 및 이로부터 생긴 생물학적 특성을 지칭한다. 이와 같이, 유전자는 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 그 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 단백질을 생산하면 단백질을 인코딩한다. mRNA 서열과 동일하고 보통 서열 목록에 제공된 뉴클레오티드 서열인 코딩 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용된 비-코딩 가닥 둘 모두는 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 산물을 인코딩한다고 칭할 수 있다.
"작제물"은 인 비트로 또는 인 비보 어느 하나로 숙주 세포에 전달되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 거대분자 또는 분자 복합체를 지칭한다. 본원에 사용된 "벡터"는 이것이 복제되고/되거나 발현될 수 있는 표적 세포에 대한 외래 유전 물질의 전달 또는 이동을 지시할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 지칭한다. 본원에 사용된 "벡터"라는 용어는 전달되는 작제물을 포함한다. 벡터는 선형 분자 또는 원형 분자일 수 있다. 벡터는 통합 또는 비통합일 수 있다. 벡터의 주요 유형은 플라스미드, 에포솜 벡터, 바이러스 벡터, 코스미드, 및 인공 염색체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
"통합"에 의해 작제물의 하나 이상의 뉴클레오티드가 세포 게놈으로 안정하게 삽입된, 즉 세포의 염색체 DNA 내에 핵산 서열에 공유 연결됨이 의도된다. "표적화된 통합"에 의해 작제물의 뉴클레오티드(들)가 사전-선택된 부위 또는 "통합 부위"에서 세포의 염색체 또는 미토콘드리아 DNA로 삽입됨이 의도된다. 본원에 사용된 "통합"이라는 용어는 통합 부위에서의 내인성 서열 또는 뉴클레오티드의 결실과 함께 또는 이것 없이 작제물의 하나 이상의 외인성 서열 또는 뉴클레오티드의 삽입을 수반하는 과정을 추가로 지칭한다. 삽입 부위에서 결실이 있는 경우, "통합"은 하나 이상의 삽입된 뉴클레오티드가 결실된 내인성 서열 또는 뉴클레오티드의 대체를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "외인성"이라는 용어는 기준 분자 또는 기준 활성은 숙주 세포 내로 도입되거나 이것에 대해 비천연적이라는 것을 의미하도록 의도된다. 예를 들어, 숙주 유전 재료로의 인코딩 핵산의 도입에 의해, 예컨대 숙주 염색체로의 통합에 의해 또는 플라스미드와 같은 비염색체 유전 재료로서 분자가 도입될 수 있다. 따라서, 인코딩 핵산의 발현과 관련하여 사용되면서 용어는 세포로 발현 가능한 형태의 인코딩 핵산의 도입을 지칭한다. "내인성"이라는 용어는 숙주 세포에 존재하는 기준 분자 또는 활성을 지칭한다. 유사하게, 인코딩 핵산의 발현과 관련하여 사용되면서 용어는 외인성으로 도입되지 않고 세포 내에 함유된 인코딩 핵산의 발현을 지칭한다.
본원에 사용된 "관심 유전자" 또는 "관심 폴리뉴클레오티드 서열"은 RNA로 전사되고 일부 경우에 적절한 조절 서열의 제어 하에 위치할 때 인 비보로 폴리펩티드로 번역되는 DNA 서열이다. 관심 유전자 또는 관심 폴리뉴클레오티드는 원핵 서열, 진핵 mRNA로부터의 cDNA, 진핵(예를 들어, 포유류) DNA로부터의 게놈 DNA 서열 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 관심 유전자는 miRNA, shRNA, 천연적 폴리펩티드(즉, 자연에서 발견된 폴리펩티드) 또는 이의 단편; 변이체 폴리펩티드(즉, 천연적 폴리펩티드와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 천연적 폴리펩티드의 돌연변이체) 또는 이의 단편; 조작된 폴리펩티드 또는 펩티드 단편, 치료학적 펩티드 또는 폴리펩티드, 영상화 마커, 선택 가능한 마커 등을 인코딩할 수 있다.
본원에 사용된 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중 어느 하나인 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태 또는 이의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드의 서열은 폴리뉴클레오티드가 RNA일 때 아데닌(A); 사이토신(C); 구아닌 (G); 티민(T); 및 티민의 경우 우라실(U)인 4개의 뉴클레오티드 염기로 구성된다. 폴리뉴클레오티드는 유전자 또는 유전자 단편(예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 이중 가닥 및 단일 가닥 분자 둘 모두를 지칭한다.
본원에 사용된 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 상호교환 가능하게 사용되고, 펩티드 결합에 의해 공유 연결된 아미노산 잔기를 갖는 분자를 지칭한다. 폴리펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하고, 폴리펩티드의 아미노산의 최대 수에 대해 제한이 없다. 본원에 사용된 상기 용어는 당업계에서 또한 흔히 예를 들어 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머라 칭하는 짧은 사슬과 당업계에서 일반적으로 폴리펩티드 또는 단백질이라 칭하는 더 긴 사슬 둘 모두를 지칭한다. "폴리펩티드"는, 다른 것들 중에서, 예를 들어 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성인 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이합체, 이종이합체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드, 또는 이의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 "아단위"라는 용어는 단백질 복합체의 각각의 별개의 폴리펩티드 사슬을 지칭하고, 여기서 각각의 별개의 폴리펩티드 사슬은 스스로 안정한 폴딩된 구조를 형성할 수 있다. 많은 단백질 분자는 하나 초과의 아단위로 구성되고, 여기서 아미노산 서열은 각각의 아단위에 대해 동일하거나 유사하거나 완전히 상이할 수 있다. 예를 들어, CD3 복합체는 CD3α, CD3ε, CD3δ, CD3γ 및 CD3ζ 아단위로 이루어지고, 이는 CD3ε/CD3γ, CD3ε/ CD3δ, 및 CD3ζ/ CD3ζ 이합체를 형성한다. 폴리펩티드 사슬의 인접한 부분은 단일 아단위 내에서 흔히 "도메인"이라 칭하는 압축된, 국부적인, 반독립적 단위로 폴딩한다. 많은 단백질 도메인은 하위도메인이라고도 칭하는 독립적인 "구조적 아단위"를 추가로 포함할 수 있어서 도메인의 흔한 기능에 기여한다. 이와 같이, 본원에 사용된 "하위도메인"이라는 용어는 더 큰 도메인의 내부의 단백질 도메인, 예를 들어 세포 표면 수용체의 엑토도메인 내의 결합 도메인; 또는 세포 표면 수용체의 엔도도메인의 자극 도메인 또는 신호전달 도메인을 지칭한다.
"작동적으로 연결된" 또는 "작동가능하게 연결된"과 상호적용가능한 "작동적으로 결합된" 또는 "작동가능하게 결합된"은 하나의 기능이 다른 기능에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편(또는 다중 도메인을 갖는 폴리펩티드의 아미노산) 상의 핵산 서열의 회합을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현에 영향을 미칠 수 있을 때 그 코딩 서열 또는 기능적 RNA와 작동적으로 연결된다(즉, 코딩 서열 또는 기능적 RNA는 프로모터의 전사 제어 하에 있음). 코딩 서열은 센스 배향 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 추가의 예로서, 수용체-결합 도메인은 세포내 신호전달 도메인에 작동가능하게 연결되어, 리간드에 대한 수용체의 결합이 상기 결합에 대한 반응인 신호를 형질유도할 수 있다.
본원에 사용된 "융합 단백질" 또는 "키메릭 단백질"은 개별 단백질을 인코딩하는 둘 이상의 부분 또는 전체 폴리뉴클레오티드 코딩 서열을 연결하기 위한 유전자 조작을 통해 생성된 단백질이고, 이들 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현은 각각의 원래 단백질 또는 이의 단편에서 유래된 기능적 특성을 갖는 단일 펩티드 또는 다중 폴리펩티드를 야기한다. 융합 단백질의 상이한 원천의 두 인접 폴리펩티드 사이에, 링커(또는 스페이서) 펩티드가 첨가될 수 있다. 본원에 기재된 키메릭 융합 수용체(CFR)는 융합물, 또는 키메릭, 단백질이다.
본원에 사용된 "유전 각인"이라는 용어는, 원천 세포 또는 iPSC에서 우선적 치료학적 속성에 기여하고, 원천 세포 유래 iPSC 및/또는 iPSC-유래 조혈 계통 세포에서 보유 가능한 유전적 정보 또는 후성적 정보를 지칭한다. 본원에 사용된 "원천 세포"는 재프로그래밍을 통해 iPSC를 생성하기 위해 사용될 수 있는 비만능 세포이고, 원천 세포 유래 iPSC는 임의의 조혈 계통 세포를 포함하는 특정한 세포 유형으로 더 분화할 수 있다. 원천 세포 유래 iPSC, 및 이로부터 분화된 세포는 맥락에 따라 때때로 총체적으로 "유래" 세포 또는 "분화" 세포라 칭한다. 예를 들어, 본 출원에 걸쳐 사용된 것과 같은 분화 효과기 세포, 또는 분화 NK 계 세포 또는 분화 T 계 세포는 말초혈, 제대혈 또는 다른 공여자 조직과 같은 자연적/천연적 원천으로부터 얻은 이의 대응 1차 세포와 비교하여 iPSC로부터 분화된 세포이다. 본원에 사용된 것처럼, 우선적 치료학적 속성을 부여하는 유전 각인(들)은 공여자 특이적, 질환 특이적 또는 치료 반응 특이적인 선택된 원천 세포의 재프로그래밍을 통해, 또는 게놈 편집을 이용하여 iPSC로 유전 변형된 양상의 도입을 통해 iPSC로 혼입된다. 특이적으로 선택된 공여자, 질환 또는 치료 맥락으로부터 얻은 원천 세포의 양태에서, 우선적 치료학적 속성에 기인한 유전 각인은 보유 가능한 표현형, 즉 우선적 치료학적 속성을 나타내는 임의의 맥락 특이적 유전적 변형 또는 후성적 변형을 포함할 수 있고, 이는 확인되거나 확인되지 않은 기초하는 분자 사건과 무관하게 선택된 원천 세포의 iPSC-유래 세포로 전달된다. 공여자 특이적, 질환 특이적 또는 치료 반응 특이적 원천 세포는 iPSC 및 분화된 조혈 계통 세포에서 보유 가능한 유전 각인을 포함할 수 있고, 유전 각인은 예를 들어 바이러스 특이적 T 세포 또는 비변이체 자연 살해 T(iNKT) 세포로부터의 예비정렬된 단일특이적 TCR; 예를 들어 선택된 공여자에서 고친화성 CD16 수용체를 인코딩하는 점 돌연변이에 동형접합성인 추적 가능하고 바람직한 유전 다형; 및 예비결정된 HLA 요건, 즉 증가된 집단을 갖는 일배체형을 나타내는 선택된 HLA 일치된 공여자 세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 바와 같이, 우선적 치료학적 속성은 분화된 세포의 개선된 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 생존 및 세포독성을 포함한다. 우선적 치료학적 속성은 또한 항원 표적화 수용체 발현; HLA 제시 또는 이의 결여; 종양 미세환경에 대한 내성; 방관자 면역 세포의 유도 및 면역 조절; 감소된 오프 종양 효과를 갖는 개선된 온 타깃 특이성; 화학요법과 같은 치료에 대한 내성과 관련될 수 있다. 하나 이상의 치료 속성을 갖는 유도 세포가 혼입된 바람직한 치료 속성을 부여하는 유전적 임프린트(들)를 갖는 iPSC의 분화로부터 수득되는 경우, 상기 분화 세포는 또한 "합성 세포"로 지칭된다. 일반적으로, 합성 세포는, 이의 가장 가까운 대응 1차 세포와 비교하는 경우, 말초혈, 제대혈, 또는 다른 공여자 조직과 같은 천연/자연 원천으로부터의 1차 세포를 조작하여 수득되거나 조작된 만능 세포로부터 분화되는지와 관계 없이, 합성 세포는 하나 이상의 비-천연 세포 기능을 갖는다.
본원에 사용된 "향상된 치료적 특성"이라는 용어는 동일한 일반 세포 유형의 통상적인 면역 세포와 비교하여 향상된 세포의 치료적 특성을 지칭한다. 예를 들어, "향상된 치료적 특성"을 갖는 NK 세포는 통상적인, 비변형된 및/또는 자연 발생 NK 세포와 비교하여 향상된, 개선된 및/또는 증강된 치료적 특성을 보유할 것이다. 면역 세포의 치료적 특성은 세포 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 생존 및 세포독성을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 면역 세포의 치료적 특성은 또한 항원 표적화 수용체 발현; HLA 제시 또는 이의 결여; 종양 미세환경에 대한 내성; 방관자 면역 세포의 유도 및 면역 조절; 감소된 오프 종양 효과를 갖는 개선된 온 타겟 특이성; 화학요법과 같은 치료에 대한 내성에 의해 나타난다.
본원에 사용된 "인게이저"라는 용어는 면역 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 또는 호중구)와 종양 세포 사이에 연결을 형성하고; 면역 세포를 활성화할 수 있는 분자, 예를 들어 융합 폴리펩티드를 지칭한다. 인게이저의 예는 이중특이적 T 세포 인게이저(BiTE), 이중특이적 살해 세포 인게이저(BiKE), 삼중특이적 살해 세포 인게이저, 또는 다중특이적 살해 세포 인게이저, 또는 다수의 면역 세포 유형과 적합한 보편적 인게이저를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "표면 유도 수용체"라는 용어는 면역 반응, 예를 들어 세포독성 반응을 촉발하거나 개시할 수 있는 수용체를 지칭한다. 표면 유도 수용체는 조작될 수 있고, 효과기 세포, 예를 들어 T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 호중구 상에서 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표면 유도 수용체는 효과기 세포의 천연 수용체 및 세포 유형과 독립적인 특정한 표적 세포, 예를 들어 종양 세포와 효과기 세포 사이의 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체 결합을 용이하게 한다. 이 접근법을 이용하여 보편적 표면 유도 수용체를 포함하는 iPSC를 생성하고, 이후 보편적 표면 유도 수용체를 발현하는 다양한 효과기 세포 유형의 집단으로 이러한 iPSC를 분화시킬 수 있다. "보편적"에 의해 표면 유도 수용체가 세포 유형과 무관하게 임의의 효과기 세포에서 발현되고 이를 활성화할 수 있고, 보편적 수용체를 발현하는 모든 효과기 세포가 인게이저의 종양 결합 특이성과 무관하게 표면 유도 수용체에 의해 인식 가능한 인게이저에 커플링되거나 연결될 수 있음이 의도된다. 일부 실시형태에서, 동일한 종양 표적화 특이성을 갖는 인게이저는 보편적 표면 유도 수용체와 커플링하도록 사용된다. 일부 실시형태에서, 상이한 종양 표적화 특이성을 갖는 인게이저는 보편적 표면 유도 수용체와 커플링하도록 사용된다. 이와 같이, 하나 또는 다수의 효과기 세포 유형은 일부 경우에 종양 세포의 하나의 특정한 유형을 사멸하고, 일부 다른 경우에 종양의 2종 이상의 유형을 사멸하도록 결합될 수 있다. 표면 유도 수용체는 일반적으로 효과기 세포 활성화를 위한 공자극 도메인 및 인게이저의 에피토프 결합 영역에 특이적인 에피토프를 포함한다. 이중특이적 인게이저는 일 말단에서 표면 유도 수용체의 에피토프에 특이적이고, 다른 말단에서 종양 항원에 특이적이다.
본원에 사용된 "안전성 스위치 단백질"이라는 용어는 잠재적인 독성 또는 달리 세포 치료의 유해 효과를 방지하도록 설계된 조작된 단백질을 지칭한다. 일부 경우에, 안전성 스위치 단백질 발현은 게놈으로 안전성 스위치 단백질을 인코딩하는 유전자가 주로 혼입된 이식된 조작된 세포에 대한 안전성 우려를 해결하기 위해 조건적으로 제어된다. 이 조건적 조절은 가변적일 수 있고, 소분자 매개된 번역후 활성화 및 조직 특이적 및/또는 시간적 전사 조절을 통한 제어를 포함할 것이다. 안전성 스위치는 아폽토시스의 유도, 단백질 합성의 억제, DNA 복제, 성장 정지, 전사 및 전사후 유전 조절 및/또는 항체 매개된 고갈을 매개할 수 있었다. 일부 경우에, 안전성 스위치 단백질은 외인성 분자, 예를 들어 프로드러그에 의해 활성화되고, 이것은 활성화될 때 치료학적 세포의 아폽토시스 및/또는 세포사를 촉발한다. 안전성 스위치 단백질의 예는 자살 유전자, 예컨대 카스파아제 9(또는 카스파아제 3 또는 7), 티미딘 키나아제, 사이토신 탈아미노효소, B 세포 CD20, 변형된 EGFR, 및 임의의 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 이 전략에서, 유해 사건의 경우에 투여된 프로드러그는 자살-유전자 산물에 의해 활성화되고 형질도입된 세포를 사멸한다.
본원에 사용된 "약학적 활성 단백질 또는 펩티드"라는 용어는 유기체에 대한 생물학적 효과 및/또는 약학적 효과를 달성할 수 있는 단백질 또는 펩티드를 지칭한다. 약학적 활성 단백질은 질환에 대해 치유하는 치유력 있는 또는 일시적인 특성을 갖고, 질환의 중증도를 완화하거나 개선하거나 경감하거나 역전시키거나 축소하도록 투여될 수 있다. 약학적 활성 단백질은 또한 예방적 특성을 갖고, 질환의 발생을 예방하거나 이것이 나온 이러한 질환 또는 병리학적 병태의 중증도를 축소하도록 사용된다. 약학적으로 활성인 단백질은 전체 단백질 또는 펩티드 또는 이의 약학적 활성 단편을 포함한다. 이는 또한 단백질 또는 펩티드의 약학적 활성 유사체 또는 단백질 또는 펩티드의 단편의 유사체를 포함한다. 약학적 활성 단백질이라는 용어는 또한 치료학적 이익을 제공하도록 협력하여 또는 상승적으로 작용하는 복수의 단백질 또는 펩티드를 지칭한다. 약학적 활성 단백질 또는 펩티드의 예는 수용체, 결합 단백질, 전사 및 번역 인자, 종양 성장 억제 단백질, 항체 또는 이의 단편, 성장 인자 및/또는 사이토카인을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "신호전달 분자"라는 용어는 세포 신호 유도를 조절하거나 이에 참여하거나 이를 억제하거나 활성화하거나 감소시키거나 증가시키는 임의의 분자를 지칭한다. 신호 유도는 세포에서 생화학적 사건을 궁극적으로 촉발하는 경로를 따른 단백질 복합체의 동원에 의한 화학 변형의 형태의 분자 신호의 전송을 지칭한다. 신호 유도 경로는 당업계에 잘 공지되어 있고, G 단백질 커플링된 수용체 신호전달, 티로신 키나아제 수용체 신호전달, 인테그린 신호전달, 톨 게이트 신호전달, 리간드 게이팅된 이온 채널 신호전달, ERK/MAPK 신호전달 경로, Wnt 신호전달 경로, cAMP 의존적 경로 및 IP3/DAG 신호전달 경로를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "표적화 양상"이라는 용어는, 비제한적인 예로서 i) 이것이 고유한 키메릭 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)와 관련이 있는 항원 특이성, ii) 이것이 단일클론 항체 또는 이중특이적 인게이저와 관련이 있는 인게이저 특이성, iii) 형질전환된 세포의 표적화, iv) 암 줄기 세포의 표적화 및 v) 특이적 항원 또는 표면 분자의 부재 하의 다른 표적화 전략을 포함하는, 항원 및/또는 에피토프 특이성을 촉진하도록 세포로 유전적으로 혼입된 분자, 예를 들어 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 "특이적" 또는 "특이성"이라는 용어는 비특이적 결합 또는 비선택적 결합과 비교하여 표적 분자에 선택적으로 결합하는 분자, 예를 들어 수용체 또는 인게이저의 능력을 지칭하도록 사용될 수 있다.
"입양 세포 치료"라는 용어는 세포 기반 면역요법을 지칭하고, 이는 본원에 사용된 것처럼, 상기 수혈 전에 엑스 비보로 확장된, 유전 변형되거나 변형되지 않는 T 세포 또는 B 세포로서 확인된 자가유래 림프구 또는 동종이계 림프구의 수혈을 지칭한다.
본원에 사용된 "치료학적으로 충분한 양"은 이의 의미 내에서 원하는 치료학적 효과를 제공한다고 칭해지는 특정한 치료학적 조성물 및/또는 약학적 조성물의 비독성이지만 충분하고/하거나 효과적인 양을 포함한다. 필요한 정확한 양은 환자의 일반 건강, 환자의 연령, 및 병태의 병기 및 중증도와 같은 인자에 따라 대상체마다 변할 것이다. 특정 실시형태에서, 치료학적으로 충분한 양은 치료되는 대상체의 질환 또는 병태와 연관된 적어도 하나의 증상을 완화, 감소, 및/또는 개선하기에 충분하고/하거나 효과적이다.
만능 줄기 세포의 분화는 배양 시스템의 변경, 예컨대 배양 배지에서의 자극 물질 또는 세포의 물리적 상태의 변경을 요한다. 대부분의 종래의 전략은 계통 특이적 분화를 개시하도록 흔하고 중요한 중간체로서 배양체(EB)의 형성을 이용한다. "배양체"는 이의 3차원 면적에서 많은 계통을 생성시키므로 배아 발생을 모방하는 것으로 나타난 3차원 클러스터이다. 분화 과정을 통해, 통상적으로 수 시간 내지 수 일에, 단순한 EB(예를 들어, 분화하도록 유발된 응집된 만능 줄기 세포)는 계속해서 성숙하여 낭종성 EB로 발생하고, 이때 통상적으로 수 일 내지 수 주에 이들은 더 처리되어 계속해서 분화한다. 세포의 3차원 다층 클러스터에서 만능 줄기 세포가 서로 가깝게 근접하게 하여 EB 형성이 개시되고, 통상적으로 이는 만능 세포가 액체 액적에서 침전하게 하는 것, 세포를 "U" 바닥 웰-플레이트로 침전시키는 것 또는 기계적 교반을 포함하는 여러 방법 중 하나에 의해 달성된다. EB 발생을 촉진하기 위해, 만능 배양 유지 배지에서 유지된 응집체가 적절한 EB를 형성하지 않으면서, 만능 줄기 세포 응집체는 추가의 분화 신호를 요한다. 이와 같이, 만능 줄기 세포 응집체는 선택된 계통에 대해 신호의 유발을 제공하는 분화 배지로 이동될 필요가 있다. 만능 줄기 세포의 EB 기반 배양은 통상적으로 EB 세포 클러스터 내의 적절한 증식으로 분화된 세포 집단(외배엽, 중배엽 및 내배엽의 배엽)을 생성시킨다. 그러나, EB는 세포 분화를 용이하게 하는 것으로 입증되었지만 환경으로부터의 분화 신호에 대한 3차원 구조에서의 세포의 불일치한 노출 때문에 변동적인 분화 상태의 이종성 세포를 생성시킨다. 또한, EB는 생성하고 유지하기에 힘들다. 더욱이, EB 형성을 통한 세포 분화는 보통의 세포 확장이 동반되고, 이는 낮은 분화 효능에 또한 기여한다.
비교하면, "EB 형성"과 구별되는 "응집체 형성"은 만능 줄기 세포 유래 세포의 집단을 확장시키도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 응집체 기반 만능 줄기 세포 확장 동안, 배양 배지는 증식 및 만능성을 유지하도록 선택된다. 세포 증식은 일반적으로 응집체의 크기를 증가시켜 더 응집체를 형성하고, 이 응집체는 배양물 내 세포 증식을 유지하고 세포수를 증가시키도록 통상적으로 더 작은 응집체로 기계적으로 또는 효소적으로 분리된다. 유지 배양에서 응집체 내에 배양된 세포는 EB 배양과 달리 만능성의 마커를 유지한다. 만능 줄기 세포 응집체는 분화를 유도하도록 추가의 분화 신호를 요한다.
본원에 사용된 "단층 분화"는 세포의 3차원 다층 클러스터, 즉 "EB 형성"을 통한 분화와 구별되는 분화 방법을 지칭하는 용어이다. 단층 분화는 본원에 개시된 다른 이점 중에서 분화 개시를 위한 EB 형성의 필요성을 피한다. 단층 배양이 EB 형성과 같은 배아 발생을 모방하지 않으므로, 특이적 계통에 대한 분화는 EB에서의 모든 3개의 배엽 분화와 비교하여 최소로 여겨진다.
본원에 사용된 "해리 세포" 또는 "단일 해리 세포"는 다른 세포 또는 표면(예를 들어, 배양 플레이트 표면)으로부터 실질적으로 분리되거나 정제된 세포를 지칭한다. 예를 들어, 세포는 기계적 방법 또는 효소적 방법에 의해 동물 또는 조직으로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, 인 비트로 응집하는 세포는 효소적으로 또는 기계적으로 클러스터, 단일 세포 또는 단일 세포와 클러스터의 혼합물의 현탁액으로 분리되어 서로 분리될 수 있다. 또 다른 대안적인 실시형태에서, 부착성 세포는 배양 플레이트 또는 다른 표면으로부터 분리될 수 있다. 이에 같이 분리는 세포외 기질(ECM)과 기질(예를 들어, 배양 표면) 사이의 세포 상호작용을 파괴하거나, 세포 사이의 ECM을 파괴하는 것을 수반할 수 있다.
본원에 사용된 "마스터 세포 은행" 또는 "MCB"는 클론성 마스터 조작된 iPSC주를 지칭하고, 이는 하나 이상의 치료적 특성을 포함하도록 조작되고, 특징화, 시험, 적격화, 그리고 확장되었고, 제조 환경에서 유도 분화를 통해 세포 기반 치료제 생산을 위한 시작 세포 물질로서 안정적으로 작용하는 것으로 나타난 iPSC의 클론 집단이다. 다양한 실시형태에서, MCB는 다중 용기에서 보유, 보관 및/또는 동결보존되어, iPS 세포주가 제조 과정 도중 계대배양, 해동 또는 처리되는 총 횟수를 감소시키고/시키거나 제거함으로써 유전적 변경 및/또는 잠재적인 오염을 방지하도록 한다.
본원에 사용된 "피더 세포" 또는 "피더"는 피더 세포가 제2 세포 유형의 지지를 위해 자극, 성장 인자 및 영양소를 제공하면서 제2 유형의 세포가 성장, 확장 또는 분화할 수 있는 환경을 제공하도록 제2 유형의 세포와 공배양되는 하나의 유형의 세포를 지칭하는 용어이다. 피더 세포는 선택적으로 이것이 지지하는 세포와 상이한 종으로부터 유래한다. 예를 들어, 줄기 세포를 포함하는 인간 세포의 특정한 유형은 마우스 배아 섬유아세포 또는 불멸화된 마우스 배아 섬유아세포의 1차 배양에 의해 지지될 수 있다. 다른 예에서, 말초혈 분화 세포 또는 형질전환된 백혈병 세포는 자연 살해 세포의 확장 및 성숙을 지지한다. 피더 세포는 통상적으로 이것이 지지하는 세포를 과성장시키는 것을 방지하도록 조사 또는 미토마이신과 같은 길항 유사분열제에 의한 처리에 의해 다른 세포와 공배양될 때 불활성화될 수 있다. 피더 세포는 내피 세포, 기질 세포(예를 들어, 상피 세포 또는 섬유아세포) 및 백혈병 세포를 포함할 수 있다. 상기에 제한됨이 없이, 하나의 특정 피더 세포 유형은 인간 피부 섬유아세포와 같은 인간 피더일 수 있다. 다른 피더 세포 유형은 마우스 배아 섬유아세포(MEF)일 수 있다. 일반적으로, 다양한 피더 세포는 부분적으로 만능성을 유지하고, 특정한 계통에 대한 분화를 지시하고, 증식 역량을 향상시키고, 효과기 세포와 같은 특수화된 세포 유형에 대한 성숙을 촉진하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "피더 비함유"(FF) 환경은, 본질적으로 피더 또는 기질 세포가 없고/없거나, 피더 세포의 배양에 의해 사전 컨디셔닝되지 않은 배양 조건, 세포 배양물 또는 배양 배지와 같은 환경을 지칭한다. "사전 컨디셔닝된" 배지는 적어도 1일 동안과 같은 시간 기간 동안 배지 내에 피더 세포가 배양된 후 수확된 배지를 지칭한다. 사전 컨디셔닝된 배지는 배지에서 배양된 피더 세포에 의해 분비된 성장 인자 및 사이토카인을 포함하는 많은 매개자 물질을 함유한다. 일부 실시형태에서, 피더 비함유 환경은 피더 또는 기질 세포 둘 모두가 없고, 또한 피더 세포의 배양에 의해 사전 컨디셔닝되지 않는다.
iPSC, 및 이로부터 분화된 분화 비만능 세포의 게놈 편집 또는 변형, 또는 비만능 세포 및 이로부터 재프로그래밍된 유래된 iPSC의 게놈 편집 또는 변형의 맥락에서 사용되는 것과 같은 "기능적"은 (1) 유전자 수준에서는 -- 직접적인 게놈 편집 또는 변형을 통해, 또는 초기에 게놈 조작된 출발 세포로부터의 분화 또는 이의 재프로그래밍을 통한 "계대배양"을 통해 달성되는, 원하는 세포 발생 단계에서의 성공적인 녹인된, 녹아웃된, 녹다운된 유전자 발현, 형질전환 또는 제어된 유전자 발현, 예컨대 유도성 발현 또는 시간적 발현; 또는 (2) 세포 수준에서는-(i) 직접적인 게놈 편집을 통해 상기 세포에서 얻은 유전자 발현 변형, (ii) 초기에 게놈 조작된 출발 세포로부터의 분화 또는 이의 재프로그래밍을 통한 "계대배양"을 통해 상기 세포에서 유지된 유전자 발현 변형; (iii) 상기 세포의 초기 발생 단계에 오직 생기는, 또는 분화 또는 재프로그래밍을 통해 상기 세포를 생성시키는 출발 세포에서 오직 생기는 유전자 발현 변형의 결과로서 상기 세포에서의 하향 유전자 조절; 또는 (iv) iPSC, 전구 세포 또는 탈분화된 세포 기원에서 수행된 게놈 편집 또는 변형으로부터 초기에 유래된, 성숙 세포 산물 내에 나타난 향상된 또는 새로 획득된 세포 기능 또는 속성을 통한, 세포 기능/특징(들)의 성공적인 제거, 부가 또는 변경을 지칭한다.
HLA 클래스 I 결핍, HLA 클래스 II 결핍, 또는 둘 모두를 포함하는 "HLA 결핍"은, 줄어들거나 감소된 수준이 다른 세포 또는 합성 방법에 의해 자연적으로 검출 가능한 수준보다 낮도록, HLA 클래스 I 단백질 이종이합체 및/또는 HLA 클래스 II 이종이합체를 포함하는 완전한 MHC 복합체의 표면 발현이 결여되거나 더 이상 유지하지 않거나 이의 감소된 수준을 갖는 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 "변형된 HLA 결핍 iPSC"는, 비전통적 HLA 클래스 I 단백질(예를 들어, HLA-E 및 HLA-G), 키메릭 항원 수용체(CAR), T 세포 수용체(TCR), CD16 Fc 수용체, BCL11b, NOTCH, RUNX1, IL15, 4-1BB, DAP10, DAP12, CD24, CD3ζ, 4-1BBL, CD47, CD113, 및 PDL1과 같은, 비제한적인 예로서 개선된 분화 가능성, 항원 표적화, 항원 제시, 항체 인식, 지속성, 면역 회피, 억제에 대한 내성, 증식, 공자극, 사이토카인 자극, 사이토카인 생성물(자가분비 또는 주변분비), 화학주성 및 세포독성과 관련되는 유전자 발현 단백질을 도입하여 추가로 변형된 HLA 결핍 iPSC를 지칭한다. "변형된 HLA 결핍"인 세포는 iPSC 이외의 세포를 또한 포함한다.
"리간드"라는 용어는 표적 분자와 복합체를 형성하여 표적 상의 부위에 결합하여 신호를 생성하는 물질을 지칭한다. 리간드는 표적에 특이적 결합이 가능한 천연 또는 인공 물질일 수 있다. 리간드는 단백질, 펩티드, 항체, 항체 복합체, 콘쥬게이트, 핵산, 지질, 다당류, 단당류, 소분자, 나노입자, 이온, 신경전달물질, 또는 표적에 특이적 결합이 가능한 임의의 다른 분자 엔티티 형태일 수 있다. 리간드가 결합하는 표적은 단백질, 핵산, 항원, 수용체, 단백질 복합체, 또는 세포일 수 있다. 표적에 결합하고 표적의 기능을 변경하고, 신호전달 반응을 유발하는 리간드는 "작용적" 또는 "작용제"로 불린다. 표적에 결합하고, 신호전달 반응을 차단하거나 감소시키는 리간드는 "길항적" 또는 "길항제"로 불린다.
"항체"란 용어는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 일반적으로 표적에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 결합 부위를 함유하는 면역-반응 발생 분자를 지칭하고, 여기서 표적은 항원 또는 특정 항체와 상호작용할 수 있는 수용체일 수 있다. 예를 들어, NK 세포는 Fc-감마 수용체(FcγR)에 항체 또는 항체의 Fc 영역의 결합에 의해 활성화되어, ADCC(항체-의존성 세포독성) 매개된 효과기 세포 활성화를 유발할 수 있다. 항체가 결합하는 항원 또는 수용체, 또는 일반적으로 표적의 특정 조각 또는 부분은 에피토프 또는 항원 결정기로 알려져 있다. 용어 "항체"는 천연 항체 및 이의 변이체, 천연 항체 및 이의 변이체의 단편, 펩티바디 및 이의 변이체, 및 단일 사슬 항체 및 이의 단편을 포함하는 항체 또는 이의 특정 단편 또는 부분의 구조 및/또는 기능을 모방하는 항체 모방체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 항체는 쥐과 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 낙타 IgG, 단일 가변 신항원 수용체(VNAR), 상어 중쇄 항체(Ig-NAR), 키메릭 항체, 재조합 항체, 단일-도메인 항체(dAb), 항-개별특이형 항체, 이중특이적, 다중특이적 또는 다량체 항체, 또는 이의 항체 단편일 수 있다. 항-개별특이형 항체는 다른 항체의 개별특이형에 대한 결합에 특이적이고, 개별특이형은 항체의 항원 결정기이다. 이중특이적 항체는 BiTE(이중특이적 T 세포 인게이저) 또는 BiKE(이중특이적 사멸 세포 인게이저)일 수 있고, 다중 특이적 항체는 TriKE(삼중특이적 사멸 세포 인게이저)일 수 있다. 항체 단편의 비제한적인 예는 Fab, Fab', F(ab')2, F(ab')3, Fv, Fabc, pFc, Fd, 단일 사슬 단편 가변(scFv), 탠덤 scFv (scFv)2, 단일 사슬 Fab(scFab), 디설파이드 안정화된 Fv(dsFv), 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 단일 도메인 항원 결합 단편(sdAb), 낙타과 중쇄 IgG 및 Nanobody® 단편, 재조합 중쇄-전용 항체(VHH), 및 항체의 결합 특이성을 유지하는 다른 항체 단편을 포함한다.
FcR로 축약된 "Fc 수용체"는 이것이 인식하는 항체의 유형에 기초하여 분류된다. 예를 들어, IgG인 항체의 가장 흔한 종류에 결합하는 것은 Fc-감마 수용체(FcγR)라 칭하고, IgA에 결합하는 것은 Fc-알파 수용체(FcαR)라 칭하고, IgE에 결합하는 것은 Fc-엡실론 수용체(FcεR)라 칭한다. FcR의 종류는 이들을 발현하는 세포(대식세포, 과립구, 자연 살해 세포, T 세포 및 B 세포) 및 각각의 수용체의 신호전달 특성에 의해 또한 구별된다. Fc-감마 수용체(FcγR)는 이의 상이한 분자 구조로 인해 이의 항체 친화성이 다른 FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32), FcγRIIB(CD32), FcγRIIIA(CD16a), 및 FcγRIIIB(CD16b)인 여러 구성원을 포함한다.
"키메릭 수용체"는 적어도 2개의 상이한 단백질 유래의 둘 이상의 부분의 아미노산 서열을 포함하도록 만들어지는 조작된, 인공, 또는 하이브리드 수용체 단백질 분자를 설명하기 위해 사용된 일반적 용어이다. 키메릭 수용체 단백질은 신호 유도를 개시하는 능력을 세포에 제공하도록 조작되었고, 수용체에 작용제 리간드의 결합 시 다운스트림 기능을 수행한다. 예시적 "키메릭 수용체"는 키메릭 항원 수용체(CAR), 키메릭 융합 수용체(CFR), 키메릭 Fc 수용체(CFcR)뿐만 아니라 둘 이상의 수용체의 융합물을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
CFcR로 축약된 "키메릭 Fc 수용체"는 비자연적 막관통 도메인 및/또는 세포내 신호전달 도메인으로 변형되거나 대체된 이의 자연적 막관통 도메인 및/또는 세포내 신호전달 도메인을 갖는 조작된 Fc 수용체를 기재하도록 사용된 용어이다. 키메릭 Fc 수용체의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 자극 도메인은 비자연적인 막관통 도메인 및 신호전달 도메인의 하나 또는 둘 모두를 갖는 것 이외에, 수용체의 유발 시 세포 활성화, 확장 및 기능을 향상시키도록 조작된 Fc 수용체의 세포내 부분으로 도입될 수 있다. 키메릭 Fc 수용체는 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인을 함유하는 키메릭 항원 수용체(CAR)와 달리, 표적화된 세포가 근처에 가깝게 있게 하거나 하지 않으면서 항체의 Fc 단편 또는 Fc 영역, 또는 세포 기능을 활성화하고 인게이저 또는 결합 분자에 포함된 Fc 영역에 결합한다. 예를 들어, Fcγ 수용체는 세포외 도메인에서 IgG의 결합에 반응하고, 이로 인해 CFcR을 생성하는 세포내 영역에서 선택된 막관통 도메인, 자극 도메인 및/또는 신호전달 도메인을 포함하도록 조작될 수 있다. 일 예에서, CFcR은 이의 막관통 도메인 및/또는 세포내 도메인을 대체하여 Fcγ 수용체인 CD16을 조작하여 생산된다. CD16 기반 CFcR의 결합 친화성을 추가로 개선하기 위해, CD64의 세포외 도메인 또는 CD16의 고친화성 변이체(예를 들어 F176V)가 혼입될 수 있다. 고친화성 CD16 세포외 도메인이 관여된 CFcR의 일부 실시형태에서, 197번 위치에서 세린을 포함하는 단백분해 절단 부위는 수용체의 세포외 도메인에서 비절단성이도록, 즉 분비로 처리되지 않도록 제거되거나 대체되고, 이로써 hnCD16 기반 CFcR을 얻는다.
FcγR 수용체인 CD16은 Fc 수용체 FcγRIIIa(CD16a) 및 FcγRIIIb(CD16b)인 2개의 이소폼을 갖는 것으로 확인되었다. CD16a는 NK 세포에 의해 발현된 막관통 단백질이고, 이는 NK 세포를 활성화하고 항체 의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)을 촉진하도록 표적 세포에 부착된 단량체성 IgG에 결합한다. 본원에 사용된 "고친화성 CD16", "비절단성 CD16" 또는 "고친화성 비절단성 CD16(hnCD16으로 약칭됨)"은 CD16의 천연 변이체 또는 비천연 변이체를 지칭한다. 야생형 CD16은 낮은 친화성을 갖고, NK 세포 활성화 시 백혈구에 대한 다양한 세포 표면 분자의 세포 표면 밀도를 조절하는 단백분해 절단 과정인 엑토도메인 쉐딩으로 처리된다. F176V 및 F158V는 고친화도를 갖는 예시적인 CD16 다형 변이체이다. 변경되거나 제거된 막 근위 영역(189번 내지 212번 위치)에서 절단 부위(195번 내지 198번 위치)를 갖는 CD16 변이체는 쉐딩으로 처리되지 않는다. 절단 부위 및 막 근위 영역은 국제공개 WO 2015148926호에 자세히 기재되어 있고, 이의 완전한 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. CD16 S197P 변이체는 CD16의 조작된 비절단성 버전이다. F158V 및 S197P 둘 모두를 포함하는 CD16 변이체는 높은 친화성을 갖고 비절단성이다. 다른 예시적인 고친화성 및 비절단성 CD16(hnCD16) 변이체는 CD64 엑토도메인의 3개의 엑손 중 하나 이상으로부터 기원한 엑토도메인을 포함하는 조작된 CD16이다.
I. 향상된 특성을 갖는 입양 세포 요법에 유용한 세포 및 조성물
본원에는 iPSC로부터 분화된 분화 세포의 치료학적 특성을 향상시키면서 iPSC의 분화 효능 및 iPSC 및 이의 분화 세포의 세포 발생 생물학에 영향을 미치지 않으면서 클론성 iPSC의 조절 회로를 체계적으로 조작하기 위한 전략이 제공된다. iPSC-유래 세포는 기능적으로 개선되고, 게놈 조작을 통해 iPSC의 수준에서 세포로 도입되는 선택적 양상의 조합 후 입양 세포 치료에 적합하다. 이전에는 하나 이상의 제공된 유전 편집을 포함하는 변경된 iPSC가 세포 발생에 들어가는 능력 및/또는 조절된 활성 및/또는 특성을 보유하면서 기능적 분화된 세포를 성숙시키고 생성하는 능력을 여전히 갖는지가 불확실하였다. iPSC로부터의 유도 세포 분화 동안 예상치 못한 실패는 비제한적인 예로서 발생 단계 특이적 유전자 발현 또는 이의 결여, HLA 복합체 제시에 대한 요건, 도입된 표면 발현 양상의 단백질 분비, 및 세포에서 유전자형적 변화 및/또는 기능적 변화가 가능하게 하는 분화 프로토콜의 재구성에 대한 필요성을 포함하는 양태 때문이었다. 본 출원은 본원에 제공된 것과 같은 하나 이상의 선택된 게놈 변형이 iPSC 분화 효능에 부정적으로 영향을 미치지 않고, 조작된 iPSC로부터 분화된 기능적 효과기 세포가 iPSC 분화 후에 효과기 세포에 보유된 개별 게놈 변형 또는 조합된 게놈 변형에 기인한 향상된 및/또는 획득된 치료적 특성을 갖는다는 것을 보인다. 추가로, iPSC 및 iPSC-분화 효과기 세포의 맥락에서 기재될 수 있는 것과 같은 모든 게놈 변형 및 이의 조합이, 배양되거나 확장되는지와 무관하게, T, NK, 또는 면역조절 세포와 같은 1차 면역 세포를 포함하는 1차 원천 세포에 적용가능하고, 이의 변형은 입양 세포 요법에 유용한 조작된 면역 세포를 야기한다.
1. 외인성으로 도입된 사이토카인 및/또는 사이토카인 신호전달
임상적으로 관련된 사이토카인의 전신 고용량 투여를 회피함으로써, 사이토카인 매개된 세포 자율성이 확립되면서 이러한 실행으로 인한 용량 제한 독성의 위험은 감소한다는 것이 본 명세서에 제공된다. IL7R(인터류킨7 수용체 아단위 알파)은 인터류킨-7에 대한 수용체이고, IL7 매개된 신호전달 경로, 세포 형태발생, 세포 수 항상성, 세포 증식, 면역 반응 및 면역글로불린 생성에 관여된다. 본원에 제공된 바와 같이, IL7 수용체의 부분 또는 전체 길이 펩티드는 수용성 사이토카인을 투여하지 않고 림프구 자율성을 달성하기 위해 사이토카인 그 자체의 발현이 있거나 발현 없이 사이토카인 신호전달을 가능하게 하도록 세포로 도입될 수 있어 세포 성장, 증식, 확장, 지속성 및/또는 효과기 기능을 유지 또는 개선하고, 사이토카인 독성의 위험을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 상에서 사이토카인 신호전달을 위한 도입된 사이토카인 및/또는 이의 각각의 천연적 수용체 또는 변형된 수용체(사이토카인 신호전달 복합체)가 발현된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달은 항시적으로 활성화된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달의 활성화는 유도성이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달의 활성화는 일시적이고/이거나 시간적이다.
도 1은 세포로 비제한적인 예로서 IL2, IL4, IL7, IL9, 및 IL21을 포함하는 사이토카인의 신호전달을 위한 단백질 복합체(사이토카인 신호전달 복합체)를 도입하기 위한 다양한 예시 작제물 설계를 제시한다. 다양한 실시형태에서, 사이토카인 신호전달 복합체는 IL7의 전체 또는 부분 길이 및 IL7 수용체의 전체 또는 부분 길이를 포함하는 IL7 수용체 융합물(IL7RF)을 포함한다. 예시 목적을 위해 IL7 신호전달을 사용하여, 도 1에서의 임의의 설계의 막관통(TM) 도메인은 IL7 수용체에 천연적일 수 있거나, 임의의 다른 막 결합된 단백질의 막관통 도메인으로 변형되거나 대체될 수 있다.
도 1의 설계 1에 나타난 바와 같이, 천연(또는 야생형) 또는 변형된 IL7R은 링커를 통해 C 말단에서 IL7에 융합되어, 항시적 신호전달이 가능하게 하고, IL7 막 결합성을 유지한다. 이와 같은 작제물은 서열 번호 1과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성의 아미노산 서열을 포함하고, 이때 막관통 도메인, 신호 펩티드 및 링커는 가요성이고 길이 및/또는 서열이 가변적이다. 일부 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 80%이다. 일부 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 90%이다. 일부 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 95%이다. 일부 실시형태에서, 서열 동일성은 100%이다.
서열 번호 1
Figure pct00001
(신호 펩티드-IL7-링커-IL7R; 막관통 도메인(TM), 신호 펩티드 및 링커는 길이 및 서열이 가변적일 수 있음)
당업자는 상기의 신호 펩티드 및 링커 서열이 예시적이고, 신호 펩티드 또는 링커로서 사용하기에 적합한 이들의 변형을 어떤 방식으로든 제한하지 않음을 이해할 것이다. 당업자에게 알려지고 이용가능한 많은 적합한 신호 펩티드 또는 링커 서열이 있다. 당업자는 신호 펩티드 및/또는 링커 서열이 신호 펩티드에 의해 이어지거나 링커에 의해 연결된 기능적 펩티드의 활성을 변경하지 않으면서 다른 서열에 대해 치환될 수 있다는 것을 이해한다.
도 1의 설계 2에 나타난 바와 같이, 항시적 및 막-결합 사이토카인 신호전달 복합체에 대한 링커를 통해 C-말단에서 천연 또는 변형된 공통 수용체 γC는 IL7에 융합된다. 공통 수용체 γC는 IL2 수용체 아단위 감마 또는 IL2RG로도 알려진, 공통 감마 사슬 또는 CD132라 또한 지칭한다. γC는 비제한적인 예로서 IL2, IL4, IL7, IL9, 및 IL21 수용체를 포함하는 많은 인터류킨 수용체에 대해 수용체 복합체에 공통인 사이토카인 수용체 아단위이다.
도 1의 설계 3에 나타난 바와 같이, IL7의 부재 하에 동종이합체를 형성하는 조작된 IL7R은 사이토카인의 항시적 신호전달을 생성하는 데 또한 유용하다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 IL7 및/또는 이의 수용체는 도 1에서 도시된 설계 중 하나 이상을 사용하여 iPSC로 도입되고, iPSC 분화 시 이의 분화 세포로 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, IL7 세포 표면 발현 및 신호전달은 도 1의 설계 1 또는 설계 2 중 어느 하나에 예시된 작제물을 통해서이다. 일부 실시형태에서, IL7 세포 표면 발현 및 신호전달은 공통 수용체 또는 사이토카인 특이적 수용체(즉, IL7R) 중 어느 하나를 사용하여, 도 1의 설계 1 내지 3에 예시된 작제물을 통해서이다. 도 1에서의 임의의 설계의 막관통(TM) 도메인은 사이토카인 수용체에 천연적일 수 있거나, 임의의 다른 막 결합된 단백질의 막관통 도메인으로 변형되거나 대체될 수 있다.
유도 만능 세포(iPSC) 이외에, 본원에 개시된 것과 같은 적어도 하나의 조작된 도입된 양상을 포함하는 클론성 iPSC, 클론성 iPS 세포주, 또는 iPSC-유래 세포가 제공된다. 또한 이 부문에 기재된 것과 같은 적어도 외인성으로 도입된 사이토카인 및/또는 사이토카인 수용체 신호전달을 갖는 단일 세포 분류되고 확장된 클론 조작된 iPSC를 포함하는 마스터 세포 은행이고, 여기서 세포 은행은 추가의 iPSC 조작을 위한 플랫폼, 및 조성이 잘 한정되고 균일하며 비용 효과적인 방식으로 상당한 규모로 대량 생산될 수 있는 기성품, 조작된, 균일한 세포 치료 산물을 제조하기 위한 재생 가능한 원천을 제공한다.
2. 키메릭 항원 수용체(CAR) 발현
당업계에 알려진 임의의 CAR 디자인은 유전자 조작된 iPSC 및 이의 분화 효과기 세포에 적용가능할 수 있다. CAR은 항원 인식 영역, 막관통 도메인 및 엔도도메인을 포함하는 엑토도메인을 일반적으로 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 엑토도메인은 신호 펩티드 또는 리더 서열 및/또는 스페이서를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 엔도도메인은 CAR을 발현하는 효과기 세포를 활성화하는 신호전달 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 인식 도메인은 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 인식 도메인은 질환 또는 병원균과 연관된 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 질환 연관된 항원은 종양 항원이고, 종양은 액체 종양 또는 고형 종양일 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR은 상기 CAR을 발현하는 T계 세포 또는 NK계 세포 중 어느 하나를 활성화하는 데 적합하다. 일부 실시형태에서, CAR은 NK 특이적 신호전달 성분의 포함에 특이적인 NK 세포이다. 특정한 실시형태에서, 상기 T 세포는 CAR을 발현하는 iPSC로부터 유래되고, 분화 T계 세포는 T 헬퍼 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포, αβ T 세포, γδ T 세포, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 상기 NK 세포는 CAR을 발현하는 iPSC로부터 분화된다.
특정한 실시형태에서, 상기 항원 인식 영역은 쥐과 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 낙타 Ig, 단일 가변 신항원 수용체(VNAR), 상어 중쇄 전용 항체(Ig NAR), 키메릭 항체, 재조합 항체, 또는 이의 항체 단편을 포함한다. 항체 단편의 비제한적인 예는 Fab, Fab′, F(ab)′2, F(ab)′3, Fv, 단일 사슬 항원 결합 단편(scFv), (scFv)2, 디설파이드 안정화된 Fv(dsFv), 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 단일 도메인 항원 결합 단편(sdAb, 나노바디), 재조합 중쇄 전용 항체(VHH), 및 전체 항체의 결합 특이성을 유지하는 다른 항체 단편을 포함한다. CAR에 의해 표적화될 수 있는 항원의 비제한적인 예는 ADGRE2, 탄산탈수효소 IX (CAIX), CCR1, CCR4, 암배아 항원(CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CD269(BCMA), CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원(예를 들어, 세포 표면 항원), 상피 당단백질-2(EGP-2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 부착 분자(EpCAM), EGFRvIII, 수용체 티로신-단백질 키나아제 erb­ B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산-결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 엽산 수용체-α, 갱글리오사이드 G2(GD2), 갱글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2), 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 아단위 알파-2(IL-13Rα2), κ-경쇄, 키나아제 삽입 도메인 수용체(KDR), 루이스 A(CA19.9), 루이스 Y(LeY), L1 세포 부착 분자(L1-CAM), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A1(MAGE-A1), MICA/B, 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), PRAME 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 종양 연관된 당단백질 72(TAG-72), TIM-3, TRBCI, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­R2), 윌름스 종양 단백질(WT-1), 및 당업계에 알려진 다양한 병원균 항원을 포함한다. 병원균의 비제한적인 예는 질환을 야기할 수 있는 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충 및 원생동물을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR의 막관통 도메인은 CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D, 또는 T 세포 수용체 폴리펩티드의 천연적 막관통 영역 또는 변형된 막관통 영역의 전체 길이 또는 적어도 일부를 포함한다.
일부 실시형태에서, 엔도도메인(또는 세포내 도메인)의 신호전달 펩티드는 CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137(4-1BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 또는 NKG2D의 폴리펩티드의 전체 길이 또는 적어도 일부를 포함한다. 일 실시형태에서, CAR의 신호전달 펩티드는 CD3ζ의 적어도 하나의 ITAM(면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프)과 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 실시형태에서, 상기 엔도도메인은 적어도 하나의 공동자극 신호전달 영역을 추가로 포함한다. 상기 공동자극 신호전달 영역은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 또는 NKG2D의 폴리펩티드의 전체 길이 또는 적어도 일부, 또는 임의의 이의 조합을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본원에 제공된 세포에 적용가능한 CAR은 CD28로부터 유래된 공동자극 도메인 및 서열 번호 2와 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표시된 CD3ζ의 천연적 ITAM1 또는 변형된 ITAM1을 포함하는 신호전달 도메인을 포함한다. 추가의 실시형태에서, CD28로부터 유래된 공동자극 도메인, 및 CD3ζ의 천연적 ITAM1 또는 변형된 ITAM1을 포함하는 CAR은 CD28로부터 유래된 막관통 도메인 및 힌지 도메인을 또한 포함하고, scFv는 힌지를 통해 막관통 도메인에 연결될 수 있고, CAR은 서열 번호 3과 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 동일성의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 80%이다. 일부 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 90%이다. 일부 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 95%이다. 일부 실시형태에서, 서열 동일성은 100%이다.
서열 번호 2
Figure pct00002
(153 아미노산 CD28 공동자극 + CD3ζITAM)
서열 번호 3
Figure pct00003
(219 아미노산 CD28 힌지 + CD28 TM + CD28 공동자극 + CD3ζITAM)
다른 실시형태에서, 본원에 제공된 세포에 적용가능한 CAR은 NKG2D로부터 유래된 막관통 도메인, 2B4로부터 유래된 공동자극 도메인, 및 서열 번호 4와 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 동일성의 아미노산 서열로 표시된 천연적 CD3ζ 또는 변형된 CD3ζ를 포함하는 신호전달 도메인을 포함한다. NKG2D로부터 유래된 막관통 도메인, 2B4로부터 유래된 공동자극 도메인 및 천연적 CD3ζ 또는 변형된 CD3ζ를 포함하는 신호전달 도메인을 포함하는 상기 CAR은 CD8 힌지를 추가로 포함할 수 있고, 이러한 구조의 아미노산 서열은 서열 번호 5와 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 80%이다. 일부 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 90%이다. 일부 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 95%이다. 일부 실시형태에서, 서열 동일성은 100%이다.
서열 번호 4
Figure pct00004
(263 아미노산 NKG2D TM + 2B4 + CD3ζ)
서열 번호 5
Figure pct00005
(308 아미노산 CD8 힌지 + NKG2D TM + 2B4 + CD3ζ)
비제한적인 CAR 전략은 한 쌍의 세포내 도메인의 이합체화를 통한 이종이합체성인 조건적으로 활성화된 CAR(예를 들어, 미국 특허 제9,587,020호 참조); 분할 CAR(여기서, CAR을 생성하기 위한 항원 결합, 힌지 및 엔도도메인의 상동성 재조합)(예를 들어, 미국 특허출원공개 US 2017/0183407호 참조); 각각 항원 결합 도메인 및 신호전달 도메인에 연결된 2개의 막관통 도메인 사이의 비공유 연결을 허용하는 다중사슬 CAR(예를 들어, 미국 특허출원공개 US 2014/0134142호 참조); 이중특이적 항원 결합 도메인을 갖는 CAR(예를 들어, 미국 특허 제9,447,194호 참조), 또는 동일한 또는 상이한 항원 또는 에피토프를 인식하는 한 쌍의 항원 결합 도메인을 갖는 것(예를 들어, 미국 특허 제8,409,577호 참조), 또는 탠덤 CAR(예를 들어, 문헌[Hegde et al., J Clin Invest. 2016;126(8):3036-3052] 참조); 유도성 CAR(예를 들어, 미국 특허출원공개 US 2016/0046700호, 미국 특허출원공개 US 2016/0058857호, 및 미국 특허출원공개 US 2017/0166877호 참조); 스위치 가능한 CAR(예를 들어, 미국 특허출원공개 US 2014/0219975호 참조); 및 당업계에 알려진 임의의 다른 디자인을 추가로 포함한다.
이와 같이, 본 발명의 양태는 게놈 조작된 iPSC를 분화하여 얻은 분화 세포를 제공하고, 여기서 iPSC 및 분화 세포 둘 모두는 추가의 변형된 양상과 함께 사이토카인 신호전달 복합체 및 하나 이상의 CAR을 포함한다. 본 출원에는 적어도 하나의 신호전달 복합체, 선택적으로 CAR과 TCRneg, 및 외인성 CD16 중 하나 또는 둘 모두를 갖는 단일 세포 분류되고 확장된 클론 조작된 iPSC를 포함하는 마스터 세포 은행이 추가로 제공되고, 여기서 세포 은행은 추가의 iPSC 조작을 위한 플랫폼, 및 기성품, 조작된, 균일한 세포 치료 산물을 제조하기 위한 재생 가능한 원천을 제공한다.
알파-베타 T 세포 수용체(αβTCR)는 면역 반응에 필수적인 항원 특이적 수용체이고, αβ T 림프구의 세포 표면 상에 제시된다. 펩티드 주요 조직접합성 복합체(pMHC)에 대한 TCRαβ의 결합은 TCR-CD3 세포내 활성화, 많은 신호전달 분자의 동원, 및 신호전달 경로의 분지 및 통합을 개시하여 유전자 발현 및 T 세포 성장 및 기능 획득에 중요한 전사 인자의 동원으로 이어진다. 변형된 분화 T계 세포를 얻기 위한 원천으로서 직접적인 T 세포 편집 또는 게놈 iPSC 편집 및 분화 중 어느 하나를 통한 TCR 알파 또는 TCR 베타(TRAC 또는 TRBC)의 불변 영역의 파괴는 TCRneg T 세포를 제조하기 위한 접근법 중 하나이다. TCRneg T 세포는 HLA 일치를 요하지 않고, 동종이식편반응이 감소되고, 동종이계 입양 세포 치료에 사용될 때 GvHD(이식편 대 숙주 질환)를 예방할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 사이토카인 신호전달 복합체 및 CAR을 포함하는 iPSC 및 이의 분화 효과기 세포는 TCR 불변 영역(TRAC 또는 TRBC)에서 삽입된 CAR을 가져서, TCR 녹아웃으로 이어지고, CAR 발현이 내인성 TCR 프로모터의 제어 하에 있게 한다. 추가의 삽입 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD44, CD54, CD56, CD58, CD69, CD71, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 및 TIGIT를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 조작된 iPSC로부터 유래된 IL/TCRneg/CAR/ T 세포는 CD16에 천연적(F176V 및/또는 S197P)이거나 CD64로부터 유래된 엑토도메인, 및 천연적 또는 비천연적인 막관통 도메인, 자극 도메인 및 신호전달 도메인을 갖는 외인성 CD16을 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, iPSC 및 이의 분화 NK 세포는 사이토카인 신호전달 복합체 및 CAR을 포함하고, 여기서 CAR은 NKG2A 좌위 또는 NKG2D 좌위에서 삽입되어, NKG2A 또는 NKG2D 녹아웃으로 이어져, CAR 발현이 내인성 NKG2A 또는 NKG2D 프로모터의 제어 하에 있게 한다.
CAR 및 외인성 사이토카인 및/또는 사이토카인 수용체 신호전달(신호전달 복합체, 또는 "IL") 둘 모두를 포함하는 iPSC 및 이로부터의 분화 세포에서, CAR 및 IL은 별개의 작제물에서 발현될 수 있거나, CAR 및 IL 둘 모두를 포함하는 바이-시스트로닉 작제물에서 공동발현될 수 있다. 일부 추가의 실시형태에서, 도 1에서의 임의의 작제물 설계에 의해 표시된 형태의 IL7 사이토카인 신호전달 복합체는 자가 절단 2A 코딩 서열을 통해 CAR 발현 작제물의 5' 말단 또는 3' 말단 중 어느 하나에 연결될 수 있다. 이와 같이, IL7 사이토카인 신호전달 복합체 및 CAR은 단일 오픈 리딩 프레임(ORF)일 수 있다. 일 실시형태에서, IL7 사이토카인 신호전달 복합체는 도 1의 설계 1을 포함하고, 이는 CAR-2A-IL 또는 IL-2A-CAR 작제물에 추가로 포함된다. 다른 실시형태에서, CAR-2A-IL 또는 IL-2A-CAR 작제물은 도 1의 설계 2에 도시된 것과 같은 IL7 사이토카인 신호전달 복합체를 포함된다. 또 다른 실시형태에서, CAR-2A-IL 또는 IL-2A-CAR 작제물은 도 1의 설계 3에 도시된 것과 같은 IL7 사이토카인 신호전달 복합체를 포함된다. CAR-2A-IL7 또는 IL7-2A-CAR이 발현될 때, 자가 절단 2A 펩티드는 발현된 CAR 및 IL7이 분리되게 하고, 이후 세포 표면에서 분리된 IL7이 제시될 수 있게 하고, 이때 세포막에 막관통 도메인이 고정된다. CAR-2A-IL7 또는 IL7-2A-CAR 바이-시스트로닉 설계는 시기 및 분량 둘 모두에서 단일 ORF의 발현을 위한 예를 들어 유도성 프로모터 또는 시간적 또는 공간적 특이성을 갖는 프로모터를 혼입하기 위해 선택될 수 있는 동일한 제어 기전 하에 조직화된 CAR 및 IL7 사이토카인 신호전달 복합체 발현을 허용한다. 아프토바이러스(aphthovirus), 예컨대 수족구병 바이러스(FMDV), 말 비염 A 바이러스(ERAV), 토세아 아시그나 바이러스(TaV) 및 돼지 테스코 바이러스- 1(PTV-I)(문헌[Donnelly, ML, et al, J. Gen. Virol, 82, 1027-101 (2001)]; 문헌[Ryan, MD, et al., J. Gen. Virol., 72, 2727-2732 (2001)]) 및 카디오바이러스, 예컨대 테일로바이러스(예를 들어, 테일러 쥐과 뇌척수염) 및 뇌심근염 바이러스를 포함하는 피코르나비리다에 바이러스 패밀리의 구성원에서 자가 절단 펩티드가 발견된다. FMDV, ERAV, PTV-I, 및 TaV로부터 유래된 2A 펩티드는 때때로 각각 "F2A", "E2A", "P2A", 및 "T2A"라고도 지칭한다.
본원에 개시된 것과 같은 IL7에 대한 바이-시스트로닉 CAR-2A-IL 또는 IL-2A-CAR 실시형태는 본원에 제공된 임의의 다른 사이토카인 또는 사이토카인 신호전달 복합체, 예를 들어 IL2, IL4, IL6, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18 및 IL21의 발현에 또한 고려된다. 일부 실시형태에서, 바이-시스트로닉 CAR-2A-IL 또는 IL-2A-CAR은 IL2, IL4, IL7, IL9, 및 IL21 중 하나 이상의 발현을 위한 것이다. 일부 실시형태에서, IL7 세포 표면 발현 및 신호전달은 도 1의 설계 1 내지 3 중 어느 것에 예시된 작제물을 통해서이다. 다른 일부 실시형태에서, IL7 세포 표면 발현 및 신호전달은 공통 수용체 및/또는 사이토카인 특이적 수용체 중 어느 하나를 사용하여 도 1의 설계 1, 2, 또는 3에 예시된 작제물을 통해서일 수 있다.
비제한적인 예로서 IL7을 포함하는 CAR 및 외인성 사이토카인 및/또는 사이토카인 수용체 신호전달 둘 모두를 포함하는 iPSC 및 이로부터의 분화 세포에서, iPSC 및 분화 세포는 CFR, TCRneg, 및/또는 외인성 CD16 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
3. 세포 표면 CFR(키메릭 융합 수용체)
본원에 제공된 CFR의 설계는 CFR을 발현하는 효과기 세포의 향상된 치료적 특성을 위한 선택된 작용제와의 CFR 결합을 통한 적절한 신호 유도 캐스케이드를 효과기 세포가 개시하도록 한다. 상기 향상된 효과기 세포 치료적 특성은 증가된 활성화 및 세포독성, 획득된 이중 표적화 능력, 연장된 지속성, 개선된 수송 및 종양 침투, 프라이밍 능력 향상, 종양 부위에 대한 방관자 면역 세포 활성화 또는 모집, 면역억제에 저항하는 향상된 능력, 종양 항원 회피를 구제하는 능력의 개선, 및/또는 제어된 세포 신호전달 피드백, 대사 및 아폽토시스를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
따라서, 다양한 양태에서, iPSC 및 분화 세포는 막관통 도메인에 융합된 엑토도메인을 일반적으로 포함하는 CFR을 추가로 포함할 수 있고, 이는 엔도도메인에 작동적으로 연결되어 있고, CFR은 엑토도메인, 막관통 도메인 및 엔도도메인의 어느 것에서 ER(소포체) 체류 신호 또는 엔도사이토시스 신호를 갖지 않는다. CFR의 엑토도메인은 인게이저에 결합 시 신호 유도를 개시하기 위한 것이고, 막관통 도메인은 CFR의 막 고정을 위한 것이고; 엔도도메인은 종양 사멸, 지속성, 이동성, 분화, TME 대응, 및/또는 제어된 아폽토시스를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 세포 치료적 특성을 향상시키기 위해 선택한 신호전달 경로를 조절하는(즉, 활성화 또는 불활성화시키는) 적어도 하나의 신호전달 도메인을 포함한다. CFR로부터의 ER 체류 신호를 제거하는 것은 발현될 때 CFR 세포 표면 자체에 의해 CFR 세포 표면 제시를 허용하고, CFR로부터의 엔도사이토시스 신호의 제거는 CFR 내재화 및 표면 하향 조절을 감소시킨다. ER 체류 및 엔도사이토시스 신호 둘 모두를 갖지 않는 도메인 성분을 선택하거나, 분자 조작 툴을 사용하여 CFR의 선택된 성분으로부터의 엔도사이토시스 신호 또는 ER 체류를 제거하는 것이 중요하다. 또한, 본원에 제공된 CFR의 도메인은 모듈식(modular)이며, 이는 CFR의 소정의 엔도도메인의 경우, CFR의 엑토도메인이 항체, BiTE, TriKE와 같은 선택된 작용제, 또는 상기 CFR과 함께 사용되는 임의의 다른 유형의 인게이저의 결합 특이성에 따라 전환가능함을 의미하고; 소정의 엑토도메인 및 특이성 매칭 작용제의 경우, 엔도도메인은 활성화되고자 하는 목적하는 신호전달 경로에 따라 전환가능함을 의미한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 CFR의 엑토도메인은 세포-세포 신호전달 또는 상호작용에 수반되는 단백질의 세포외 부분의 전체 또는 부분 길이를 포함한다. 일부 실시형태에서, CFR의 엑토도메인은 CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD28, CD5, CD16, CD64, CD32, CD33, CD89, NKG2C, NKG2D, 또는 이의 임의의 기능적 변이체, 또는 조합 또는 키메릭의 세포외 부분의 전체 또는 부분 길이를 포함한다. 일부 실시형태에서, CFR의 엑토도메인은 적어도 하나의 작용제, 예를 들어 CFR의 엑토도메인에 포함된 에피토프에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 인게이저(예를 들어, BiTE, BiKE 또는 TriKE)에 의해 인식된다. 일부 실시형태에서, CFR 발현 세포와 사용되는 항체 또는 인게이저는 적어도 하나의 CFR의 세포외 에피토프에 결합하고, 여기서 CFR은 CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD28, CD5, CD16, CD64, CD32, CD33, CD89, NKG2C, NKG2D, 또는 이의 임의의 기능적 변이체 또는 조합된/키메릭 형태의 세포외 부분의 전체 또는 부분 길이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인게이저는 B7H3, BCMA, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD179b, CEA, CLEC12A, CS-1, DLL3, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, FLT-3, FOLR1, FOLR3, GD2, gpA33, HER2, HM1.24, LGR5, MSLN, MCSP, MICA/B, PSMA, PAMA, P-카드헤린 또는 ROR1을 포함하는 적어도 하나의 종양 항원을 인식한다. 특정 실시형태에서, ER 체류 및 엔도사이토시스 신호 둘 모두는 부재하거나, 유전자 조작 방법을 사용하여 CFR 엑토도메인으로부터 제거되거나 없어진다.
일부 실시형태에서, CFR의 엑토도메인은 CD3ε, CD3γ, CD3δ, 또는 이의 임의의 기능적 변이체, 또는 조합된/키메릭 형태의 세포외 부분의 전체 또는 부분 길이를 포함하여 CD3-기반 작용제를 이용한다. 항체 또는 인게이저를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 비제한적인 예시적 CD3-기반 작용제는 CD3×CD19, CD3×CD20, CD3×CD33, 블리나투모맙, 카투막소맙, 에르투막소맙, RO6958688, AFM11, MT110/AMG 110, MT111/AMG211/MEDI-565, AMG330, MT112/BAY2010112, MOR209/ES414, MGD006/S80880, MGD007 및/또는 FBTA05를 포함한다. 일부 실시형태에서, CFR의 엑토도메인은 NKG2C, 또는 이의 임의의 기능적 변이체의 세포외 부분의 전체 또는 부분 길이를 포함하여 NKG2C-기반 작용제를 이용한다. 항체 또는 인게이저를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 비제한적인 예시적 NKG2C-기반 작용제는 NKG2C-IL15-CD33, NKG2C-IL15-CD19, 및/또는 NKG2C-IL15-CD20을 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, CFR의 엑토도메인은 CD28 또는 이의 임의의 기능적 변이체의 세포외 부분의 전체 또는 부분 길이를 포함하여 CD28-기반 작용제를 이용한다. 항체 또는 인게이저를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 비제한적인 예시적 CD28-기반 작용제는15E8, CD28.2, CD28.6, YTH913.12, 37.51, 9D7 (TGN1412), 5.11A1, ANC28.1/5D10, 및/또는 37407 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시형태에서, CFR의 엑토도메인은 CD16, CD64, 또는 이의 임의의 기능적 변이체, 및 조합된/키메릭 형태의 세포외 부분의 전체 또는 부분 길이를 포함하여 CD16-기반 또는 CD64-기반 작용제를 이용한다. 항체 또는 인게이저를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 비제한적인 예시적 CD16-기반 또는 CD64-기반 작용제는 IgG 항체, 또는 CD16-기반 또는 CD64-기반 인게이저를 포함한다. IgG 항체의 Fc 부분이 CD16 또는 CD64 기반 CFR에 결합하는 경우, 이는 CFR의 엔도도메인에 포함된 신호전달 도메인에 의해 부여되는 다른 향상된 치료적 특성과 함께 CFR 발현 세포에서 항체 의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)을 활성화시킨다. 항체 또는 인게이저를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 비제한적인 예시적 CD16-기반 또는 CD64-기반 작용제는 CD16×CD30, CD64×CD30, CD16×BCMA, CD64×BCMA, CD16-IL-EPCAM 또는 CD64-IL-EPCAM, CD16-IL-CD33 또는 CD64-IL-CD33 중 적어도 하나를 포함하고, 여기서 TriKE에 포함된 "IL"은 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21, 또는 이의 임의의 기능적 변이체 또는 조합된/키메릭 형태를 포함하는 적어도 하나의 사이토카인의 전부 또는 일부를 포함한다.
일반적으로, 막관통 도메인은 생물학적 막(예를 들어, 세포 또는 세포 소포의 막)의 인지질 이중층과 같은 막에서 열역학적으로 안정한 3차원 단백질 구조이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 CFR의 막관통 도메인은 단일 알파 이중나선, 여러 막관통 알파 이중나선의 안정한 복합체, 막관통 베타 바렐, 그라미시딘 A의 베타-이중나선, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 다양한 실시형태에서, CFR의 막관통 도메인은 막 내에 있는 "막관통 단백질" 또는 "막 단백질"의 전부 또는 일부를 포함한다. 본원에 사용된 "막관통 단백질" 또는 "막 단백질"은 막에 위치한 및/또는 막 내에 위치한 단백질이다. 본 발명의 CFR에 포함된 막관통 도메인을 제공하기에 적합한 막관통 단백질의 예는 수용체, 리간드, 면역글로불린, 글리코포린, 또는 이의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, CFR에 포함된 막관통 도메인은 CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD137, CD166, FcεRIγ, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D, T 세포 수용체(예컨대 TCRα 및/또는 TCRβ), 니코틴성 아세틸콜린 수용체, GABA 수용체, 또는 이의 조합의 막관통 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, 또는 이의 조합의 막관통 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 글리코포린 A, 글리코포린 D 또는 이의 조합의 막관통 단백질의 전부 또는 일부를 포함한다. CFR 막관통 도메인의 특정 실시형태에서, ER 체류 및 엔도사이토시스 신호 둘 모두는 부재하거나, 유전자 조작을 사용하여 제거된다. 다양한 실시형태에서, ER 체류 및 엔도사이토시스 신호 둘 모두는 부재하거나, 유전자 조작 방법을 사용하여 CFR 막관통 도메인으로부터 제거되거나 없어진다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD28, CD8, 또는 CD4의 막관통 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 CFR의 엔도도메인은 선택된 세포내 신호전달 경로를 활성화하는 적어도 하나의 신호전달 도메인을 포함한다. CFR 엔도도메인의 다양한 실시형태에서, ER 체류 및 엔도사이토시스 신호 둘 모두는 부재하거나, 유전자 조작 방법을 사용하여 이로부터 제거되거나 없어진다. 일부 실시형태에서, 엔도도메인은 적어도 하나의 세포독성 도메인을 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 엔도도메인은 세포독성 도메인 이외에 선택적으로 하나 이상의 공동자극 도메인, 지속성 신호전달 도메인, 사멸-유도 신호전달 도메인, 종양 세포 제어 신호전달 도메인, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, CFR의 세포독성 도메인은 CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137(4-1BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 또는 NKG2D의 폴리펩티드의 적어도 하나의 전체 길이 또는 일부를 포함한다. 일 실시형태에서, CFR의 세포독성 도메인은 CD3ζ의 적어도 하나의 ITAM(면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프)과 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, CFR의 세포독성 도메인은 변형된 CD3ζ(예를 들어, 국제공개 WO 2019/133969호 참조)를 포함한다.
일부 실시형태에서, CFR은 세포독성 신호전달 도메인 이외에 공동자극 도메인을 추가로 포함하는 엔도도메인을 포함한다. CFR에서 사용하기에 적합한 공동자극 도메인은 CD2, CD27, CD28, CD40L, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4, 또는 NKG2D의 폴리펩티드의 전체 길이 또는 적어도 일부, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, CFR의 공동자극 도메인은 CD28, 4-1BB, CD27, CD40L, ICOS, CD2, 또는 이의 조합의 폴리펩티드의 전체 길이 또는 적어도 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, CFR은 CD3ζ의 세포독성 도메인 및 CD28의 공동자극 도메인을 포함하는 엔도도메인("28ζ"로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, CFR의 엔도도메인의 -CD28-CD3ζ 부분은 서열 번호 2와 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 나타내어진다.
일부 실시형태에서, CFR은 세포독성 신호전달 도메인 및/또는 공동자극 도메인 이외에 지속성 신호전달 도메인을 추가로 포함하는 엔도도메인을 포함한다. CFR에서 사용하기에 적합한 지속성 신호전달 도메인은 IL7R, IL15R, IL18R, IL12R, IL23R, 또는 이의 조합과 같은 사이토카인 수용체의 엔도도메인의 전부 또는 일부를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 또한, EGFR과 같은 수용체 티로신 키나아제(RTK)의 엔도도메인은 종양 세포 제어를 제공하거나, FAS와 같은 종양 괴사 인자 수용체(TNFR)는 제어된 세포 사멸을 제공한다.
다양한 실시형태에서, 예시적인 CFR은 CD3 아단위- CD3ε, CD3δ, 또는 CD3γ, 또는 CD28의 적어도 하나의 세포외 부분; 서열 번호 6, 서열 번호 7 및 서열 번호 8과 적어도 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성의 아미노산 서열로 각각 나타내어지는 CD28, CD8, 또는 CD4의 막관통 도메인; 및 제거된 엑토도메인, 막관통 도메인, 및/또는 엔도도메인의 ER 체류 모티프 및/또는 엔도사이토시스 모티프를 갖는 CD3ε, CD3γ, CD3δ, 또는 CD28의 엔도도메인을 포함한다. 예를 들어, CD3ε 야생형 엔도도메인 서열(서열 번호 9)에 대한 R183S 돌연변이의 도입은 ER 체류 모티프를 제거하여, 서열 번호 10과 적어도 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성의 아미노산 서열로 나타내어지는 CD3ε 엔도도메인 변이체를 야기한다. CD3δ 야생형 엔도도메인 서열(서열 번호 11)에 대한 L142A 및 R169A 돌연변이의 도입은 WT 서열로부터의 엔도사이토시스 모티프 및 ER 체류 모티프를 제거하여, 서열 번호 12와 적어도 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 약 99%의 동일성의 아미노산 서열로 나타내어지는 CD3δ 엔도도메인 변이체를 야기한다. 추가로, CD3γ 야생형 엔도도메인 서열(서열 번호 13)에 대한 L131A 및 R158A 돌연변이의 도입은 WT 서열로부터의 ER 체류 모티프를 제거하여, 서열 번호 14와 적어도 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성의 아미노산 서열로 나타내어지는 CD3γ 엔도도메인 변이체를 야기한다. CD28 야생형 엔도도메인은 ER 체류 또는 엔도사이토시스 모티프 어느 것도 갖지 않고, 서열 번호 15와 적어도 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 동일성의 아미노산 서열로 나타내어진다. 다양한 실시형태에서, 본원에 제공된 것과 같은 CFR은 CFR 엑토도메인의 N-말단에서 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 비제한적인 예시적 신호 펩티드는 서열 번호 16과 적어도 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 동일성의 아미노산 서열로 나타내어진 것을 포함한다.
서열 번호 6
Figure pct00006
서열 번호 7
Figure pct00007
서열 번호 8
Figure pct00008
서열 번호 9
Figure pct00009
(엔도-CD3ε WT)
서열 번호 10
Figure pct00010
(엔도-CD3εmut)
서열 번호 11
Figure pct00011
(엔도-CD3δ WT)
서열 번호 12
Figure pct00012
(엔도-CD3δmut)
서열 번호 13
Figure pct00013
(엔도-CD3γ WT)
서열 번호 14
Figure pct00014
(엔도-CD3γmut)
서열 번호 15
Figure pct00015
(엔도-CD28)
서열 번호 16
Figure pct00016
일부 예시적인 실시형태에서, CFR은 하나의 CD3 아단위의 엑토도메인을 포함하고, 일부 다른 실시형태에서, CFR은 CD3δ 또는 CD3γ(각각 서열 번호 17 또는 서열 번호 18)의 엑토도메인과 연결된 CD3ε의 엑토도메인을 포함하는 단일 사슬 이종이합체성 엑토도메인을 포함한다. 단일 사슬 이종이합체성 엑토도메인의 링커 유형과 길이는 가변적일 수 있다.
서열 번호 17
Figure pct00017
(3ε- 링커 -3δ; 링커 서열 및 길이는 가변적일 수 있음)
서열 번호 18
Figure pct00018
(3ε- 링커 -3γ; 링커 서열 및 길이는 가변적일 수 있음)
본원에 기재된 다양한 구조에서 세포 표면 발현된 CFR(cs-CD3로도 지칭되는 CD3-기반 CFR 포함)은 선택된 결합 특이성을 갖는, 항체, 인게이저, 및/또는 CAR을 포함하는 분자와 결합하기 위한 세포 표면 유도 수용체로서 기능할 수 있다. 신호전달 복합체, 및 선택적으로 본 발명의 CAR 및/또는 하나 이상의 CFR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포는 임의의 유형의 세포일 수 있으며, 이는 인간 세포 및 비인간 세포, 만능 세포 또는 비만능 세포, 면역 세포, 면역 조절 세포, APC(항원 제시 세포) 또는 피더 세포, 1차 원천(예를 들어, PMBC), 또는 배양 또는 조작된 세포(예를 들어, iPSC로부터 분화된 세포주, 세포, 및/또는 분화 세포)로부터의 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 신호전달 복합체, 및 선택적으로 CAR 및/또는 하나 이상의 CFR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포는 1차 또는 분화 CD34 세포, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구 세포, NK 세포 전구 세포, T계 세포, NKT계 세포, NK계 세포, 또는 B계 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달 복합체, 및 선택적으로 CAR 및/또는 하나 이상의 CFR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분화 세포는 사이토카인 신호전달 복합체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 선택적으로 CAR 및/또는 하나 이상의 CFR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 iPSC를 분화하여 수득된 효과기 세포이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달 복합체, 및 선택적으로 CAR 및/또는 하나 이상의 CFR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분화 효과기 세포는 신호전달 복합체, 및 선택적으로 CAR 및/또는 하나 이상의 CFR을 분화 효과기 세포를 iPSC로부터 생성한 후에 혼입하기 위해 분화 효과기 세포를 조작하여 수득된다.
추가로 제공된 것과 같이, 신호전달 복합체, 및 선택적으로 CAR 및/또는 하나 이상의 CFR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 세포, 또는 이의 집단은 하기 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다: TCR 녹아웃, CD16 녹-인; B2M 녹아웃 또는 녹다운; CIITA 녹아웃 또는 녹다운; HLA-G 또는 비절단성 HLA-G의 도입된 발현; CD38 녹아웃, 및 본원에 기재된 추가의 조작된 양상. 본 출원에서 IL7RF, CAR, CFR, TCRneg, CD16, CD38 음성, 추가의 외인성 사이토카인 또는 이의 융합 변이체, B2M-/-, CIITA-/-, HLA-G, 및 이의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 본원에 제공된 것과 같은 적어도 하나의 표현형을 갖는 단일 세포 분류 및 확장된 클론 조작된 iPSC를 포함하는 마스터 세포 은행이 추가로 제공되고, 여기서 세포 은행은 추가의 iPSC 조작을 위한 플랫폼, 및 조성이 잘 정의되고 균일하며, 비용 효과적인 방식으로 상당한 규모로 대량 생산될 수 있는, 기성품, 조작된, 균일한 효과기 세포의 제조를 위한 재생 가능한 원천을 제공한다.
4. CD16 녹인
CD16은 Fc 수용체 FcγRIIIa(CD16a; NM_000569.6) 및 FcγRIIIb(CD16b; NM_000570.4)인 2개의 이소폼으로서 확인되었다. CD16a는 NK 세포에 의해 발현된 막관통 단백질이고, 이는 NK 세포를 활성화하고 항체 의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)을 촉진하도록 표적 세포에 부착된 단량체성 IgG에 결합한다. CD16b는 인간 호중구에 의해 배타적으로 발현된다. 본원에 사용된 "고친화도 CD16", "비절단성 CD16" 또는 "고친화도 비절단성 CD16"은 다양한 CD16 변이체를 지칭한다. 야생형 CD16은 낮은 친화도를 갖고, NK 세포 활성화 시 백혈구에 대한 다양한 세포 표면 분자의 세포 표면 밀도를 조절하는 단백분해 절단 과정인 엑토도메인 쉐딩을 포함하는 하향조절로 처리된다. F176V(일부 간행물에서는 F158V라고도 칭함)는 고친화도를 갖는 예시적인 CD16 다형 대립유전자/변이체인 반면; S197P 변이체는 CD16의 유전자 조작된 비절단성 버전의 예이다. F176V 및 S197P 둘 모두를 포함하는 조작된 CD16 변이체는 고친화도를 갖고 비절단성이고, 이는 국제공개 WO 2015/148926호에 더 자세히 기재되어 있고, 이의 완전한 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 게다가, CD64 엑토도메인의 적어도 일부로 본질적으로 대체된 CD16의 엑토도메인을 갖는 키메릭 CD16 수용체는 ADCC를 수행할 수 있는 CD16 수용체의 원하는 고친화성 및 비절단성 특징을 또한 달성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키메릭 CD16의 대체 엑토도메인은 CD64의 EC1, EC2 및 EC3 엑손 중 하나 이상(UniPRotKB_P12314, 또는 이의 이소폼 또는 다형 변이체)을 포함한다.
그러므로, 세포로 도입된 외인성 CD16의 다양한 실시형태는 기능성 CD16 변이체 및 이의 키메릭 수용체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 기능적 CD16 변이체는 고친화성 비절단성 CD16 수용체(hnCD16)이다. hnCD16은 일부 실시형태에서 F176V 및 S197P 둘 모두를 포함하고; 일부 실시형태에서 절단 영역이 제거된 F176V를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, hnCD16은 CD64 엑토도메인의 적어도 일부를 각각 포함하는 서열 번호 19, 20 및 21인 임의의 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100% 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 80%이다. 일부 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 90%이다. 일부 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 95%이다. 일부 실시형태에서, 서열 동일성은 100%이다. 서열 번호 19, 20 및 21은 예를 들어 서열 번호 22 내지 24에 의해 각각 인코딩된다. 본원에 그리고 본 명세서에 걸쳐 사용된 것처럼, 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여 서열이 공유한 동일한 위치의 수의 함수(즉, %의 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100)이다. 당업계에서 인정된 수학적 알고리즘을 이용하여 서열의 비교 및 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성의 결정이 달성될 수 있다.
서열 번호 19
Figure pct00019
(340 아미노산 CD64 도메인 기반 구성; CD16TM; CD16ICD )
서열 번호 20
Figure pct00020
(336 아미노산 CD64 엑손 기반 구성; CD16TM; CD16ICD )
서열 번호 21
Figure pct00021
(335 아미노산 CD64 엑손 기반 구성; CD16TM; CD16ICD )
서열 번호 22
Figure pct00022
서열 번호 23
Figure pct00023
서열 번호 24
Figure pct00024
따라서, 본원에는 본원에서 고려되고 기재된 것과 같은 다른 편집들 중에서 포함되도록 유전자 조작된 클론성 iPSC 및 고친화성 비절단성 CD16 수용체(hnCD16)인 외인성 CD16이 제공되고, 여기서 유전자 조작된 iPSC는 iPSC로 도입된 hnCD16을 포함하는 효과기 세포로 분화할 수 있다. 일부 실시형태에서, hnCD16을 포함하는 분화된 효과기 세포는 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, hnCD16을 포함하는 분화된 효과기 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, hnCD16은 CD64의 전체 또는 부분 길이 세포외 도메인을 포함한다. iPSC 또는 분화 세포에 포함된 외인성 hnCD16 또는 이의 기능적 변이체는 ADCC 항체 또는 이의 단편뿐만 아니라 CD16 또는 상기 hnCD16의 CD64 세포외 결합 도메인을 인식하는 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 인게이저 또는 결합제에 대한 결합에서 높은 친화성을 갖는다. 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 인게이저 또는 결합제는 본 출원에서 하기에 추가로 기재되어 있다. 이와 같이, 본 출원의 적어도 하나의 양태는 본 출원에서 더 자세히 기술된 것처럼 병태, 질환 또는 감염의 치료에서의 치료학적 용도를 위한 충분한 양으로 분화 효과기 세포 상에 발현된 외인성 CD16을 통해 하나 이상의 사전-선택된 ADCC 항체가 사전 로딩된 분화 효과기 세포 또는 이의 세포 집단을 제공하고, 여기서 상기 외인성 CD16은 CD64, 또는 F176V 및 S197P를 갖는 CD16의 세포외 결합 도메인을 포함한다.
다른 일부 실시형태에서, 외인성 CD16은 CFcR에 기초하여 CD16-, 또는 이의 변이체를 포함한다. 키메릭 Fc 수용체(CFcR)는 천연 CD16 막관통 도메인 및/또는 세포내 도메인을 변형시키거나 대체함으로써 비천연적 막관통 도메인, 비천연적 자극 도메인 및/또는 비천연 신호전달 도메인을 포함하도록 제조된다. 본원에 사용된 "비천연"이라는 용어는 세포외 도메인을 제공하는 수용체 이외의 상이한 수용체로부터 막관통 도메인, 자극 도메인 또는 신호전달 도메인이 유래된다는 것을 의미한다. 여기서 예시에서, CD16 또는 이의 변이체에 기초한 CFcR은 CD16으로부터 유래된 막관통 도메인, 자극 도메인 또는 신호전달 도메인을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 외인성 CD16-기반 CFcR은 CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D, 또는 T 세포 수용체 폴리펩티드로부터 유래된 비천연적 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 CD16-기반 CFcR은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 또는 NKG2D 폴리펩티드로부터 유래된 비천연적 자극/억제 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 CD16-기반 CFcR은 CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137(4-1BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 또는 NKG2D 폴리펩티드로부터 유래된 비천연적 신호전달 도메인을 포함한다. CD16-기반 CFcR의 일 실시형태에서, 제공된 키메릭 수용체는 IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 또는 NKG2D 폴리펩티드 중 하나로부터 둘 모두 유래된 막관통 도메인 및 신호전달 도메인을 포함한다. CD16-기반 키메릭 Fc 수용체의 하나의 특정 예시적 실시형태는 NKG2D의 막관통 도메인, 2B4의 자극 도메인 및 CD3ζ의 신호전달 도메인을 포함하고; 여기서 CFcR의 세포외 도메인은 CD64 또는 CD16의 세포외 도메인의 전체 길이 또는 부분 서열로부터 유래되고, CD16의 세포외 도메인은 F176V 및 S197P를 포함한다. CD16-기반 키메릭 Fc 수용체의 다른 예시적 실시형태는 CD3ζ의 막관통 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하고; CFcR의 세포외 도메인은 CD64 또는 CD16의 세포외 도메인의 전체 길이 또는 부분 서열로부터 유래되고, CD16의 세포외 도메인은 F176V 및 S197P를 포함한다.
상기에 기재된 것과 같은 CD16-기반 키메릭 Fc 수용체의 다양한 실시형태는 항체 또는 이의 단편의 Fc 영역; 또는 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 인게이저 또는 결합제의 Fc 영역에 높은 친화성으로 결합할 수 있다. 결합 시, 키메릭 수용체의 자극 도메인 및/또는 신호전달 도메인은 효과기 세포의 활성화 및 사이토카인 분비, 및 항체, 또는 종양 항원 결합 성분뿐만 아니라 Fc 영역을 갖는 상기 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 인게이저 또는 결합제에 의해 표적화된 종양 세포의 사멸이 가능하게 한다. 이론에 의해 구속됨이 없이, CD16-기반 키메릭 Fc 수용체의 비-천연적 막관통, 자극 및/또는 신호전달 도메인을 통해, 또는 상기 수용체의 엑토도메인에 대한 인게이저 결합을 통해, CFcR은 효과기 세포의 증식 및/또는 확장 가능성을 증가시키면서 효과기 세포의 사멸 능력에 기여할 수 있었다. 항체 및 인게이저는 항원을 발현하는 종양 세포 및 CFcR을 발현하는 효과기 세포가 가깝게 근접하게 할 수 있고, 이는 또한 종양 세포의 향상된 사멸에 기여한다. 이중특이적, 삼중특이적, 다중특이적 인게이저 또는 결합제에 대한 예시적인 종양 항원은 B7H3, BCMA, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD179b, CEA, CLEC12A, CS-1, DLL3, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, FLT-3, FOLR1, FOLR3, GD2, gpA33, HER2, HM1.24, LGR5, MSLN, MCSP, MICA/B, PSMA, PAMA, P-카드헤린 및 ROR1을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 종양 세포를 공격하는 데 있어서 CD16 기반 CFcR을 발현하는 효과기 세포를 결합하기에 적합한 일부 비제한적인 예시적인 이중특이적, 삼중특이적, 다중특이적 인게이저 또는 결합제는 CD16(또는 CD64)-CD30, CD16(또는 CD64)-BCMA, CD16(또는 CD64)-IL15-EPCAM 및 CD16(또는 CD64)-IL15-CD33을 포함한다.
NK 세포 활성화 후 세포 표면으로부터 절단된 1차 NK 세포에 의해 발현된 내인성 CD16과 달리, 분화 NK 세포에서의 CD16의 다양한 비절단성 버전은 CD16 분비를 피하고 일정한 발현을 유지한다. 분화 NK 세포에서, 비절단성 CD16은 TNFα 및 CD107a의 발현을 증가시켜 개선된 세포 기능성을 나타낸다. 비절단성 CD16은 또한 항체 의존적 세포 매개된 세포독성(ADCC), 및 이중특이적 인게이저, 삼중특이적 인게이저 또는 다중특이적 인게이저의 결합을 향상시킨다. ADCC는 항체 코팅된 표적 세포에 대한 CD16의 결합을 통한 NK 세포 매개된 용해의 기전이다. 유래된 NK 세포에서의 도입된 hnCD16의 추가의 고친화성 특징은 또한 세포 치료를 필요로 하는 대상체에게 세포를 투여하기 전에 hnCD16을 통한 NK 세포로의 ADCC 항체의 인 비트로로 로딩이 가능하게 한다. 본원에 제공된 바와 같이, hnCD16은 일부 실시형태에서 F176V 및 S197P를 포함할 수 있거나, 서열 번호 19, 20 또는 21에 의해 예시된 것처럼 CD64로부터 기원한 전체 또는 부분 길이 엑토도메인을 포함할 수 있거나, 비천연 막관통 도메인, 자극 도메인 및 신호전달 도메인 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다. 개시된 것처럼, 본 출원은 또한 본 출원에서 더 자세히 설명된 것처럼 병태, 질환 또는 감염의 치료에서 치료학적 용도를 위한 충분한 양으로 하나 이상의 사전-선택된 ADCC 항체가 사전 로딩된 분화 NK 세포 또는 이의 세포 집단을 제공한다.
1차 NK 세포와 달리 1차 원천(즉, 말초혈, 제대혈 또는 다른 공여자 조직과 같은 자연/천연적 원천)으로부터의 성숙 T 세포는 CD16을 발현하지 않는다. 발현된 외인성 비절단성 CD16을 포함하는 iPSC가 T 세포 발생 생물학을 손상시키지 않았고, 외인성 CD16을 발현할 뿐만 아니라 획득된 ADCC 기전을 통해 기능을 수행할 수 있는 기능적 분화 T계 세포로 분화할 수 있었다는 것은 예상치 못했다. 분화 T계 세포에서의 이 획득된 ADCC는 이중 표적화에 대한 접근법으로서 및/또는 CAR-T 세포 치료에 의해 대개 발생한 항원 회피를 구제하도록 추가로 사용될 수 있고, 여기서 CAR에 의한 인식을 피하기 위한 CAR-T 표적화된 항원 발현 또는 돌연변이된 항원의 발현이 감소되거나 소실되면서 종양이 재발한다. 상기 분화 T계 세포가 기능적 변이체 및 CD16-기반 CFcR, 발현을 포함하는 외인성 CD16을 통해 획득된 ADCC를 포함할 때, 그리고 항체가 CAR에 의해 표적화된 종양 항원과 다른 종양 항원을 표적화할 때, CAR-T 항원 회피를 구제하고, CAR-T 치료에서 대개 보이는 표적화된 종양의 재발 또는 재발생을 감소시키거나 방지하기 위해 항체가 사용될 수 있다. 이중 표적화를 달성하면서 항원 회피를 감소시키고/시키거나 방지하기 위한 이러한 전략은 하나 이상의 CAR을 발현하는 NK 세포에 동등하게 적용가능하다. 이 항원 회피 감소 및 방지 전략에 사용될 수 있는 다양한 CAR은 하기에 추가로 기술된다.
이와 같이, 본 발명의 실시형태는 본원에 제공된 것과 같은 사이토카인 신호전달 복합체 및 CAR 이외에 외인성 CD16을 포함하는 분화 T 계통 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, 분화 T계 세포에 포함된 CD16은 F176V 및 S197P를 포함하는 CD16 엑토도메인을 포함하는 hnCD16이다. 일부 다른 실시형태에서, 분화 T계 세포에 포함된 hnCD16은 서열 번호 19, 20 또는 21에 의해 예시된 것처럼 CD64로부터 기원한 전체 또는 부분 길이 엑토도메인을 포함하거나, 비-천연적 막관통 도메인, 자극 도메인 및 신호전달 도메인 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 설명된 바와 같이, 상기 분화 T계 세포는 항체의 치료 효과를 향상시키기 위해 ADCC에 의해 매개된 단일클론 항체에 의한 종양을 표적화하기 위한 획득된 기전을 갖는다. 개시된 바와 같이, 본 출원은 또한 하기에 자세히 설명된 것처럼 병태, 질환 또는 감염의 치료에서 치료학적 용도를 위한 충분한 양으로 하나 이상의 사전-선택된 ADCC 항체가 사전 로딩된 분화 T계 세포 또는 이의 세포 집단을 제공한다.
본 출원에는 비제한적인 예로서 외인성 CD16을 포함하는 본원에 제공된 것과 같은 적어도 하나의 표현형을 갖는 단일 세포 분류되고 확장된 클론 조작된 iPSC를 포함하는 마스터 세포 은행이 추가로 제공되고, 여기서 세포 은행은 추가의 iPSC 조작을 위한 플랫폼, 및 조성이 잘 한정되고 균일하며 비용 효과적인 방식으로 상당한 규모로 대량 생산될 수 있는, 비제한적인 예로서 분화 NK 세포 및 분화 T 세포를 포함하는, 기성품, 조작된, 균일한 세포 치료 산물을 제조하기 위한 재생 가능한 원천을 제공한다.
5. CD38 녹아웃
세포 표면 분자 CD38은 다발성 골수종 및 CD20 음성 B 세포 악성종양을 포함하는 림프구성 계통 및 골수성 계통 둘 모두로부터 유래된 다수의 혈액학적 악성종양에서 고도로 상향조절되고, 이는 암 세포를 고갈시키는 것을 항체 치료제에 대한 매력적인 표적으로 만든다. 항체 매개된 암 세포 고갈은 보통 직접적인 세포 아폽토시스 유도와 ADCC(항체 의존적 세포 매개된 세포독성)와 같은 면역 효과기 기전의 활성화의 조합에 기인한다. ADCC 이외에, 치료학적 항체와 조화된 면역 효과기 기전은 식세포작용(ADCP) 및/또는 보체 의존적 세포독성(CDC)을 또한 포함할 수 있다.
CD38은 악성 세포에서 고도로 발현되기 보다는 혈장 세포뿐만 아니라 NK 세포 및 활성화된 T 세포 및 B 세포에서 또한 발현된다. CD38은 조혈작용 동안 CD34+ 줄기 세포 및 림프구성, 적혈구성 및 골수성의 계통 결정 전구세포 상에서 혈장 세포 단계에 걸쳐 계속되는 성숙의 최종 단계 동안 발현된다. CD38은 II형 막관통 당단백질로서 뉴클레오티드-대사물질의 생성에 관여된 다기능성 효소 및 수용체 둘 모두로서 세포 기능을 수행한다. CD38은 효소로서 NAD+로부터 ADP-리보오스로의 반응의 가수분해 및 합성을 촉매화하고, 이로 인해 CADPR 및 NAADP인 2차 메신저를 생성하고, 이것은 과정이 칼슘 의존적인 세포 부착의 과정에 중요한 소포체 및 리소좀으로부터 칼슘의 방출을 자극한다. CD38은 수용체로서 CD31을 인식하고, 활성화된 NK 세포에서 세포독성 및 사이토카인 방출을 조절한다. CD38은 세포질 Ca2+ 플럭스를 조절하고, 림프구성 및 골수성 세포에서 신호 유도를 매개하기 위해 지질 뗏목에서 세포 표면 단백질과 회합하는 것으로 또한 보고된다.
악성종양 치료에서, CD38 항원 결합 수용체 형질도입된 T 세포의 전신 사용은 CD34+ 조혈 전구 세포, 단핵구, NK 세포, T 세포 및 B 세포의 CD38+ 분획을 용해시키는 것으로 밝혀졌고, 이는 손상된 수혜자 면역 효과기 세포 기능 때문에 불완전한 치료 반응 및 감소된 또는 제거된 효능을 야기한다. 게다가, CD38 특이적 항체인 다라투무맙으로 치료된 다발성 골수종 환자에서, T 세포 및 B 세포와 같은 다른 면역 세포 유형이 이의 CD38 발현에도 불구하고 영향을 받지 않지만 골수 및 말초혈 둘 모두에서의 NK 세포 감소가 관찰되었다(문헌[Casneuf et al., Blood Advances. 2017; 1(23):2105-2114]). 이론에 의해 구속되지 않으면서, 본 출원은 CD38 특이적 항체 및/또는 CD38 항원 결합 도메인 유도된 효과기 세포 고갈 또는 동족살해를 통한 감소를 극복함으로써 CD38 표적화된 암 치료의 완전한 가능성을 이용하는 전략을 제공한다. 또한, 동종이계 효과기 세포의 수혜자에서 다라투무맙과 같은 CD38 특이적 항체를 사용하여 이 수혜자 림프구의 활성화를 억제하여 CD38이 T 세포 또는 B 세포와 같은 활성화된 림프구에서 상향조절되므로, 이 효과기 세포에 대한 동종거부성은 감소되고/되거나 예방될 것이고, 이로써 효과기 세포 생존성 및 지속성을 증가시킨다.
이와 같이, 본 출원은 또한 수혜자 T 세포 및 B 세포의 활성화, 즉 대개 입양 세포 이동 전에 활성화된 T 세포 및 B 세포의 림프고갈에 대한 분비된 CD38 특이적 인게이저 또는 CD38 CAR(키메릭 항원 수용체)인 CD38 특이적 항체를 사용하여 동종거부성의 감소 또는 예방을 통해 효과기 세포 지속성 및/또는 생존기간을 향상시키는 전략을 제공한다. 구체적으로는, 제공된 것과 같은 전략은 단일 세포 분류되고 확장된 클론성 CD38 음성 iPSC를 포함하는 마스터 세포 은행인 CD38 녹아웃 iPSC 라인을 생성하는 것, 및 조작된 iPSC 라인의 유도 분화를 통해 CD38 음성(CD38neg) 분화 효과기 세포를 수득하는 것을 포함하고, 여기서 CD38 표적화된 치료학적 모이어티가 효과기 세포와 사용될 때 다른 이점들 중에서 동족살해 및 동종거부성에 대해 분화 효과기 세포가 보호된다. 또한, 항-CD38 단일클론 항체 치료는 환자의 조혈 줄기 세포 구획에 유해한 영향을 미치지 않으면서 환자의 활성화된 면역계를 상당히 고갈시킨다. CD38 음성 분화 세포는 CD38 항체 매개된 고갈에 저항하는 능력을 갖지만, 독성 컨디셔닝제의 사용 없이 항-CD38 또는 CD38-CAR과 조합되어 효과적으로 투여될 수 있고, 이와 같이 화학요법 기반 림프고갈을 감소 및/또는 대체한다.
본원에 제공된 것과 같은 일 실시형태에서, iPSC 주에서의 CD38 녹아웃은 이중대립유전자 녹아웃이다. 본원에 개시된 바와 같이, 제공된 CD38 음성 iPSC주는 적어도 하나의 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로 하나 이상의 CAR, TCRneg, CFR, CD16, 이의 외인성 사이토카인 또는 융합 변이체, 및 HLA I 및 II 결핍을 추가로 포함하고; 상기 iPSC는 한정적 동형유전자성 내피세포(HE) 가능성을 갖는 중배엽 세포, 한정적 HE, CD34 조혈 세포, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구세포(MPP), T 세포 전구세포, NK 세포 전구세포, 공통 골수성 전구 세포, 공통 림프성 전구 세포, 적혈구, 골수성 세포, 중성구 전구세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 중성구, 수지상 세포, 대식세포, 및 1차 NK 세포, T 세포 및/또는 NKT 세포에 존재하지 않는 하나 이상의 기능적 특징을 갖는 분화 면역 효과기 세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 기능적 분화 효과기 세포를 생성하도록 유도적으로 분화할 수 있다. 일부 실시형태에서, ADCC를 유도하도록 항-CD38 항체를 사용하거나 표적화된 세포 사멸에 항-CD38 CAR을 사용할 때, CD38neg iPSC 및/또는 이의 분화 효과기 세포는 항-CD38 항체, 항-CD38 CAR, 또는 수혜자 활성화된 T 세포 또는 B 세포에 의해 제거되지 않고, 이로써 이러한 치료학적 모이어티의 존재 하에 및/또는 이에 대한 노출 후 iPSC 및 이의 효과기 세포 지속성 및/또는 생존기간을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 효과기 세포는 이러한 치료학적 모이어티의 존재 하에 및/또는 이에 대한 노출 후 인 비보 지속성 및/또는 생존기간이 증가한다.
6. HLA-I- 및 HLA-II- 결핍
다수의 HLA 클래스 I 및 클래스 II 단백질은 동종이계 거부 문제를 피하도록 동종이계 수혜자에서 조직접합성에 대해 일치되어야 한다. 본원에는 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 단백질 둘 모두의 발현이 제거되거나 실질적으로 감소된 iPSC 세포주 및 이로부터 분화된 이의 분화 세포가 제공된다. HLA 클래스 I 결핍은 HLA 클래스 I 좌위(염색체 6p21)의 임의의 영역의 기능적 결실, 또는 베타-2 마이크로글로불린(B2M) 유전자, TAP1 유전자, TAP2 유전자 및 타파신을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 HLA 클래스-I 연관된 유전자의 결실 또는 파괴에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, B2M 유전자는 모든 HLA 클래스 I 이종이합체의 세포 표면 발현에 필수적인 공통 아단위를 인코딩한다. B2M 음성 세포는 HLA-I 결핍이다. HLA 클래스 II 결핍은 비제한적인 예로서 RFXANK, CIITA, RFX5 및 RFXAP를 포함하는 HLA-II 연관된 유전자의 기능적 결실 또는 파괴에 의해 달성될 수 있다. CIITA는 클래스 II 단백질 발현에 필요한 RFX5인 전사 인자의 활성화를 통해 작용하는 전사적 공동활성자이다. CIITA 음성 세포는 HLA-II 결핍이다. 본원에는 예를 들어 B2M 및 CIITA 발현 둘 모두의 결여를 위한 HLA-I 및 HLA-II 결핍 둘 모두를 갖는 iPSC 계통 및 이의 분화 세포가 제공되고, 여기서 얻은 분화 효과기 세포는 MHC(주요 조직접합성 복합체) 일치에 대한 필요성을 제거하여 동종이계 세포 치료가 가능하게 하고, 숙주(동종이계) T 세포에 의한 인식 및 사멸을 피한다.
일부 세포 유형에 대해, 클래스 I 발현의 결여는 NK 세포에 의해 용해로 이어진다. 이 "소실된 자가" 반응을 극복하기 위해, NK 세포 인식 및 조작된 iPSC로부터 분화된 HLA-I 결핍 효과기 세포의 사멸을 피하도록 HLA-G는 선택적으로 녹인될 수 있다. 일 실시형태에서, HLA-I 결핍 iPSC 및 이의 분화 세포는 HLA-G 녹인을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제공된 HLA-I 결핍 iPSC 및 이의 분화 세포는 CD58 녹아웃 및 CD54 녹아웃의 하나 또는 둘 모두를 추가로 포함한다. CD58(또는 LFA-3) 및 CD54(또는 ICAM-1)는 신호 의존적 세포 상호작용을 개시하고, 면역 세포를 포함하는 세포 이동을 용이하게 하는 부착 단백질이다. CD58 녹아웃이 CD54 녹아웃보다 동종이계 NK 세포 활성화를 감소시키는 데 있어서 더 높은 효능을 갖지만; CD58 및 CD54 둘 모두의 이중 녹아웃이 NK 세포 활성화의 가장 향상된 감소를 갖는 것으로 밝혀졌다. 일부 관찰에서, CD58 및 CD54 이중 녹아웃은 "소실된 자가" 효과를 극복하는 데 있어서 HLA-I 결핍 세포에 대해 HLA-G 과발현보다 훨씬 더 효과적이다.
상기 제공된 바와 같이, 일부 실시형태에서, HLA-I 및 HLA-II 결핍 iPSC 및 이의 분화 세포는 HLA-G를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시형태에서, HLA-I 및 HLA-II 결핍 iPSC 및 이의 분화 세포는 CD58 null이다. 다른 일부 실시형태에서, HLA-I 및 HLA-II 결핍 iPSC 및 이의 분화 세포는 CD54 null이다. 또 다른 일부 실시형태에서, HLA-I 및 HLA-II 결핍 iPSC 및 이의 분화 세포는 CD58 null 및 CD54 null이다.
일부 실시형태에서, HLA-I 및/또는 HLA-II 결핍에 대한 조작은 우회되거나, 동종거부를 피하도록 활성화된 수혜자 면역 세포에서 상향조절된 표면 단백질을 표적화하는 불활성화 CAR을 발현시킴으로써 온전히 유지될 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화된 수혜자 면역 세포에서 상기 상향조절된 표면 단백질은 CD38, CD25, CD69, CD44, 4-1BB, OX40, 또는 CD40L을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 세포가 이러한 불활성화 CAR을 발현할 때, 세포가 CAR에 의해 표적화된 동일한 표면 단백질을 발현하지 않거나 이의 녹아웃을 갖는 것이 바람직하다. 일부 실시형태에서, 불활성화 CAR은 CD38-CAR, 4-1BB-CAR, OX40-CAR, 및 CD40L-CAR 중 적어도 하나를 포함한다.
7. 추가의 변형
일부 실시형태에서, 표 1에서의 유전자형 중 어느 하나를 포함하는 iPSC 및 이의 분화 효과기 세포는 TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, RFX5, RFXAP, RAG1, 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 유전자 중 적어도 하나에서의 결실, 파괴 또는 발현 감소; 또는 HLA-E, 4-1BBL, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, TCR, Fc 수용체, 항체, 인게이저, 및 이중특이적 인게이저, 다중특이적 인게이저 또는 보편적 인게이저와 커플링하기 위한 표면 유도 수용체 중 적어도 하나의 도입을 추가로 포함할 수 있다.
이중특이적 인게이저 또는 다중특이적 인게이저는 상이한 항체의 2개 이상의 단일-사슬 가변 단편(scFv) 또는 다른 기능적 변이체로 이루어진 융합 단백질이고, 적어도 하나의 scFv와 함께 종양 특이적 표면 분자를 통해 효과기 세포 표면 분자 또는 표면 유도 수용체, 및 적어도 다른 것을 종양 세포에 연결한다. 일부 실시형태에서, 표면 유도 수용체는 효과기 세포의 자연 수용체 및 세포 유형과 독립적인 특정 표적 세포(예를 들어 종양 세포)와 효과기 세포 사이의 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체 결합을 용이하게 한다. 일부 다른 실시형태에서, 하나 이상의 외인성 표면 유도 수용체는 본원에 제공된 방법 및 조성물을 사용하여, 즉 iPSC의 조작을 통해 효과기 세포로 도입될 수 있어서, 선택적으로 단일 세포 분류되고 확장된 클론 조작된 iPSC를 포함하는 마스터 세포 은행을 생성시키고, 이후 T, NK 또는 원천 iPSC와 동일한 유전자형을 포함하는 임의의 다른 효과기 세포로의 iPSC의 분화를 지시한다.
이 접근법을 이용하여 보편적 표면 유도 수용체를 포함하는 iPSC를 또한 생성할 수 있고, 이후 보편적 표면 유도 수용체를 발현하는 다양한 효과기 세포 유형의 집단으로 이러한 iPSC를 분화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 동일한 종양 표적화 특이성을 갖는 인게이저는 상이한 보편적 표면 유도 수용체와 커플링하도록 사용된다. 일부 실시형태에서, 상이한 종양 표적화 특이성을 갖는 인게이저는 동일한 보편적 표면 유도 수용체와 커플링하도록 사용된다. 이와 같이, 하나 또는 다수의 효과기 세포 유형은 일부 경우에 종양 세포의 하나의 특정한 유형을 사멸하고, 일부 다른 경우에 종양의 2종 이상의 유형을 사멸하도록 결합될 수 있다. 표면 유도 수용체는 일반적으로 효과기 세포 활성화를 위한 공동자극 도메인 및 인게이저의 에피토프에 특이적인 항에피토프를 포함하거나, 반대로, 표면 유도 수용체는 인식 가능하거나 인게이저의 항에피토프에 특이적인 에피토프를 포함한다. 예를 들어, 이중특이적 인게이저는 일 말단에서 표면 유도 수용체의 에피토프에 특이적이고, 다른 말단에서 종양 항원에 특이적이다.
이중특이적 인게이저 또는 다중특이적 인게이저 인식, 또는 커플링, 또는 결합에 사용될 수 있는 예시적인 효과기 세포 표면 분자, 또는 표면 유도 수용체는 본원에 개시된 것과 같은 CD3, CD28, CD5, CD16, CD64, CD32, CD33, CD89, NKG2C, NKG2D 또는 본원에 개시된 이의 임의의 기능적 변이체 또는 키메릭 수용체 형태를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 인게이저 인식을 위한 효과기 세포의 표면 상에서 발현된 CD16은 본원에 기재된 것과 같이 CD16(F176V 및 선택적으로 S197P를 함유) 또는 CD64 세포외 도메인, 및 천연적 또는 비-천연적 막관통 도메인, 자극 도메인 및/또는 신호전달 도메인을 포함하는 hnCD16이다. 일부 실시형태에서, 인게이저 인식을 위한 효과기 세포의 표면 상에서 발현된 CD16은 CD16-기반 키메릭 Fc 수용체(CFcR)이다. 일부 실시형태에서, CD16-기반 CFcR은 NKG2D의 막관통 도메인, 2B4의 자극 도메인 및 CD3ζ의 신호전달 도메인을 포함하고; CD16의 세포외 도메인은 CD64 또는 CD16의 세포외 도메인의 전체 길이 또는 부분 서열로부터 유래되고; 선택적으로 CD16의 세포외 도메인은 F176V 및 선택적으로 S197P를 포함한다.
이중특이적 인게이저 또는 다중특이적 인게이저 인식을 위한 예시적인 종양 세포 표면 분자는 B7H3, BCMA, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD179b, CEA, CLEC12A, CS-1, DLL3, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, FLT-3, FOLR1, FOLR3, GD2, gpA33, HER2, HM1.24, LGR5, MSLN, MCSP, MICA/B, PSMA, PAMA, P-카드헤린, 및 ROR1을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3-CD19이고; 다른 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3-CD33이다. 효과기 세포 상의 CD16의 결합을 위해 이중특이적 항체는 CD16-CD30 또는 CD64-CD30이다. 다른 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD16-BCMA 또는 CD64-BCMA이다. 또 다른 실시형태에서, 이중특이적 항체는 효과기 세포와 종양 세포 항원 결합 도메인 사이의 링커를 추가로 포함하고, 예를 들어 변형된 IL15는 효과기 NK 세포가 효과기 세포 확장을 용이하게 하기 위한 링커(일부 간행물에서 TriKE 또는 삼중특이적 살해 인게이저라 칭함)로서 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, TriKE는 CD16-IL15-EPCAM 또는 CD64-IL15-EPCAM이다. 다른 실시형태에서, TriKE는 CD16-IL15-CD33 또는 CD64-IL15-CD33이다. 또 다른 실시형태에서, TriKE는 NKG2C-IL15-CD33이다. TriKE의 IL15는 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL18 및 IL21을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 다른 사이토카인으로부터 또한 기원할 수 있다.
일부 실시형태에서, 이중특이적 인게이저 또는 다중특이적 인게이저를 위한 표면 유도 수용체는 때때로 세포 유형에 따라 효과기 세포에 내인성일 수 있었다. 다른 일부 실시형태에서, 하나 이상의 외인성 표면 유도 수용체는 본원에 제공된 방법 및 조성물을 사용하여, 즉 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 iPSC의 추가 조작을 통해 효과기 세포로 도입될 수 있어서, 원천 iPSC와 동일한 유전자형 및 표면 유도 수용체를 포함하는 효과기 세포로의 iPSC의 분화를 유도한다.
8. 본원에 제공된 유전자 조작된 iPSC주 및 iPSC-유래 세포
상기의 견지에서, 본 출원은 상기 iPSC의 분화로부터 수득된 세포, 또는 이의 집단, 및 분화 효과기 세포를 제공하고, 여기서 각각의 세포는 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로, CAR을 인코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 세포는 진핵생물 세포, 동물 세포, 인간 세포, 유도 만능 세포(iPSC), iPSC-유래 효과기 세포, 면역 세포, 또는 피더 세포이다. 본원에 기재된 것과 같은 표현형을 갖는 단일 세포 분류되고 확장된 클론 조작된 iPSC를 포함하는 마스터 세포 은행이 또한 제공되고, 여기서 세포 은행은 조성이 잘 한정되고 균일하며 비용 효과적인 방식으로 상당한 규모로 대량 생산될 수 있는 기성품, 조작된, 균일한 세포 치료 산물을 제조하기 위한 재생 가능한 원천을 제공한다. 일부 실시형태에서, iPSC-유래 세포는 비제한적인 예로서 한정적 동형유전자성 내피세포(HE) 가능성을 갖는 중배엽 세포, 한정적 HE, CD34 조혈 세포, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구세포(MPP), T 세포 전구세포, NK 세포 전구세포, 골수성 세포, 호중구 전구세포이고/이거나, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 호중구, 수지상 세포 및 대식세포와 특징을 공유하는 것을 포함하는 조혈 세포이다. 일부 실시형태에서, iPSC-유래 조혈 세포는 적어도 하나의 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로, CAR을 발현하는 면역 효과기 세포를 포함한다. 추가로 본원에서 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로, CAR, 및 하나 이상의 TCRneg을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 외인성 CD16; CFR; 사이토카인 및/또는 이의 수용체 또는 이의 변이체를 포함하는 추가의 사이토카인 신호전달 복합체; 및 CD38 녹아웃을 포함하는 세포를 제공하고, 여기서 iPSC는 기능적 분화 조혈 세포를 생성하도록 유도적으로 분화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 기능적 분화 조혈 세포는 면역 효과기 세포이다. 일부 실시형태에서, 기능적 분화 면역 효과기 세포는 NK 및/또는 T 세포와 특징을 공유한다. 일부 실시형태에서, NK 및/또는 T 세포와 특징을 공유하는 기능적 분화 면역 효과기 세포는 NK 세포 또는 T 세포가 아니다.
사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로, CAR을 인코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포의 일부 실시형태에서, 세포는 TCRneg이다. 본원에 사용된 TCRneg는 TCR 음성, TCR-/-, "TCR null" 또는 TCR 녹아웃이라고도 칭하고, 이는 자연에 의해(예를 들어, NK 세포 또는 iPSC-유래 NK 세포), 유전자 발현 조절에 의해, 또는 내인성 TCR 또는 하나 이상의 이의 아단위를 녹아웃하기 위한 iPSC 세포(예를 들어, iPSC, T 세포로부터 재프로그래밍된 iPSC(TiPSC)) 또는 T 세포의 게놈 편집에 의해, 또는 TCR이 녹아웃된 iPSC로부터 분화된 TCR 음성 분화 세포의 수득에 의해 내인성 TCR 발현이 없는 세포를 포함한다. 이와 같이, 개시된 것과 같은 세포에서 녹아웃된 TCR은 내인성 TCR 복합체이다. 세포에서의 TCR의 TCRα 또는 TCRβ 중 어느 하나의 불변 영역의 발현의 파괴는 세포의 내인성 TCR 복합체를 녹아웃하는 많은 방법들 중 하나이다. TCRneg 세포는 TCRneg 세포에서의 모든 CD3 아단위의 발현에도 불구하고 세포 표면에 CD3 복합체를 제시할 수 없는 것으로 발견되었고, 이는 세포 표면 CD3 인식, 결합 및/또는 신호전달을 요하는 세포 기능에 유해한 영향을 미친다. 신호전달 복합체, CAR, 및 CFR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 TCRneg 세포의 일부 실시형태에서, CFR은 CD3 기반이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로, CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 TCRneg 세포는 또한 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 아단위 또는 이의 하위도메인(cs-CD3)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로, CAR을 포함하는 세포는 TCRneg이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로, CAR을 포함하는 세포는 TCR의 불변 영역에 삽입된 CAR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로, CAR을 포함하는 세포는 TCRneg이고, TCR의 불변 영역에 삽입된 CAR을 포함하고, CAR의 발현은 외인성 TCR 프로모터에 의해 유도된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로, CAR을 포함하는 세포는 IL2, IL4, IL7, IL9, IL21, 또는 이의 임의의 조합의 외인성 사이토카인 신호전달을 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 사이토카인 신호전달은 세포 막 결합된다. 일부 실시형태에서, 외인성 사이토카인 신호전달은 사이토카인 및/또는 이의 각각의 수용체 또는 이의 돌연변이되거나 절두된 변이체의 도입된 일부 또는 전체 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달은 항시적으로 활성화된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달의 활성화는 유도성이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달의 활성화는 일시적이고/이거나 시간적이다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 사이토카인 신호전달의 일시적/시간적 발현은 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 에피솜, 미니서클, 또는 mRNA를 포함하는 RNA를 통해서이다. 일부 실시형태에서, 외인성 세포 표면 사이토카인 신호전달은 IL2 신호전달을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 외인성 세포 표면 사이토카인 신호전달은 IL4 신호전달을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 외인성 세포 표면 사이토카인 신호전달은 IL7 신호전달을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 외인성 세포 표면 사이토카인 신호전달은 IL9 신호전달을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 외인성 세포 표면 사이토카인 신호전달은 IL21 신호전달을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로, CAR을 포함하는 세포는 외인성 CD16 또는 이의 기능적 변이체 또는 키메릭 수용체를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 CD16은 F176V 및 S197P를 포함하는 엑토도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 CD16은 CD64의 엑토도메인의 전체 또는 일부 길이를 포함한다. 다른 일부 실시형태에서, 외인성 CD16은 키메릭 Fc 수용체를 포함한다. 외인성 CD16은 ADCC를 통한 세포 사멸을 가능하게 하여, 예를 들어 CAR을 발현하는 효과기 세포에 대한 이중 표적 메커니즘을 제공한다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로, CAR을 포함하는 세포는 CD38 녹아웃을 추가로 포함한다. 세포 표면 분자 CD38은 다발성 골수종 및 CD20 음성 B 세포 악성종양을 포함하는 림프구성 계통 및 골수성 계통 둘 모두로부터 유래된 다수의 혈액학적 악성종양에서 고도로 상향조절되고, 이는 암 세포를 고갈시키는 것을 항체 치료제에 대한 매력적인 표적으로 만든다. CD38은 악성 세포에서 고도로 발현되기 보다는 혈장 세포뿐만 아니라 NK 세포 및 활성화된 T 세포 및 B 세포에서 또한 발현된다. 일부 실시형태에서, CD38-/-인 효과기 세포는 CD38 유도 동족살해를 피할 수 있다. 일부 실시형태에서, ADCC 및/또는 종양 세포 표적화를 유도하기 위해 항-CD38 항체, CD38 결합 CAR, 또는 항-CD38 scFV를 포함하는 CD3 인게이저를 사용할 때, CD38-/- iPSC 및/또는 이의 분화 효과기 세포는 효과기 세포 제거를 야기함이 없이, 즉 CD38 발현 효과기 세포의 감소 또는 고갈 없이 CD38 발현 (종양) 세포를 표적화할 수 있고, 이로써 iPSC 및 이의 효과기 세포 지속성 및/또는 생존기간을 증가시킨다.
사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로, CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포의 일부 실시형태에서, 세포는 B2M 녹아웃 및/또는 CIITA 녹아웃, 및 선택적으로, HLA-G 또는 HLA-E를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
상기의 관점에서, 본원에 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 추가로 선택적으로 하기 중 하나, 둘, 셋 이상, 또는 모두를 포함하는 iPSC가 제공되고: TCRneg, CD16, CFR, 외인성 IL, CD38 녹아웃, 및 B2M/CIITA 녹아웃; B2M이 녹아웃되는 경우, HLA-G를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 대안적으로, CD58 및 CD54 녹아웃 중 하나 또는 둘 모두가 선택적으로 도입되고, 여기서 iPSC는 기능적 분화 조혈 세포를 생성하기 위해 유도적으로 분화할 수 있다.
이와 같이, 본 출원은 iPSC 및 이의 기능적 분화 조혈 세포를 제공하고, 이는 표 1에서 하기 유전자형 중 어느 하나를 포함한다. 또한 본원에 iPSC의 분화 가능성 및 분화된 효과기 세포의 기능에 유해한 영향을 미치지 않으면서, 표 1의 하기 유전자형 중 어느 하나를 포함하는 단일 세포 분류되고 확장된 클론 조작된 iPSC를 포함하는 마스터 세포 은행, 즉 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로, CAR, 및 TCRneg, CD16, CFR, 외인성 IL, CD38 녹아웃, 및 HLA-I 및/또는 HLA-II 결핍 중 하나 이상을 갖는 마스터 세포 은행이 제공된다. 상기 세포 은행은 추가의 iPSC 조작을 위한 플랫폼, 및 기성품, 조작된, 균일한 세포 치료 산물을 제조하기 위한 재생 가능한 원천을 제공한다.
표 1에 제공된 것과 같은 "IL"은, 어떤 특이적 사이토카인/수용체 또는 조합 발현이 선택되는지에 따라, IL2, IL4, IL7, IL9, 및 IL21 중 하나를 나타내고; IL7이 선택되는 경우, IL은 IL7Rα 및 IL7Rβ를 포함하는 IL7을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체는 자가 절단 펩티드를 사용하여 IL7 및 IL7Rα의 공동발현; IL7와 IL7Rα의 융합 단백질; 절두 또는 제거된 IL7Rα의 세포내 도메인과의 IL7/IL7Rα 융합 단백질; IL7 및 IL7Rβ의 융합 단백질; IL7 및 공통 수용체 γC의 융합 단백질 중 적어도 하나를 포함하고, 여기서 공통 수용체 γC는 천연 또는 변형되고, IL7Rβ의 동종이합체이다. 일부 실시형태에서, IL7/IL7Rα 융합 단백질은 서열 번호 1과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL7/IL7Rα 융합 단백질은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 추가로, iPSC 및 이의 기능적 분화 조혈 세포가 CAR 및 IL 둘 모두를 포함하는 유전자형을 가질 때, CAR 및 IL은 선택적으로 2A 서열을 포함하는 바이-시스트로닉 발현 카세트에 포함될 수 있다. 비교로서, 다른 일부 실시형태에서, CAR 및 IL은 iPSC 및 이의 기능적인 분화 조혈 세포에 포함된 별개의 발현 카세트에 있다.
[표 1]
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
10. 면역요법을 위한 항체
일부 실시형태에서, 병태, 질환 또는 적응증과 연관된 항원을 표적화하는 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 추가의 치료제는, 본원에 제공된 것과 같은 게놈 조작된 효과기 세포 이외에도, 조합 치료에서 이들 효과기 세포와 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간화된 항체, 인간화된 단일클론 항체 또는 키메릭 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편은 바이러스 항원에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편은 종양 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 종양 또는 바이러스 특이적 항원은 이의 사멸 능력을 향상시키기 위해 투여된 iPSC-유래 효과기 세포를 활성화한다. 일부 실시형태에서, 투여된 iPSC-유래 효과기 세포에 대한 추가의 치료제로서 조합 치료에 적합한 항체는 항-CD20(리툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 우블리툭시맙, 오카라투주맙, 오비누투주맙, 이브리투모맙, 오크렐리주맙), 항-CD22(이노투주맙, 목세투모맙, 에프라투주맙), 항-HER2(트라스투주맙, 퍼투주맙), 항-CD52(알렘투주맙), 항-EGFR (세르툭시맙), 항-GD2(디누툭시맙), 항-PDL1(아벨루맙), 항-CD38 (다라투무맙, 이사툭시맙, MOR202), 항-CD123(7G3, CSL362), 항-SLAMF7(엘로투주맙), 및 이들의 인간화된 변이체 또는 단편 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편, 또는 이들의 기능적 균등물 및 바이오시밀러를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 투여된 iPSC-유래 효과기 세포에 대한 추가의 치료제로서 조합 치료에 적합한 항체는 표적 세포 상의 하나 초과의 항원 또는 에피토프를 표적화하거나 표적 세포를 표적화하면서 표적 세포를 향해 효과기 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포 또는 대식세포)를 동원하는 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체를 추가로 포함한다. 이러한 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체는 종양 세포에 효과기 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포 및/또는 호중구)를 지시하고 면역 효과기 세포를 활성화할 수 있는 인게이저로서 작용하고, 항체 치료의 이익을 최대화할 높은 가능성을 나타냈다. 인게이저는 적어도 하나의 종양 항원에 특이적이고, 면역 효과기 세포의 적어도 하나의 표면 유도 수용체에 특이적이다. 인게이저의 예는 이중특이적 T 세포 인게이저(BiTE), 이중특이적 살해 세포 인게이저(BiKE), 삼중특이적 살해 세포 인게이저(TriKE), 또는 다중특이적 살해 세포 인게이저, 또는 다수의 면역 세포 유형과 적합한 보편적 인게이저를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시형태에서, iPSC-유래 효과기 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 조혈 계통 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC-유래 효과기 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 NK 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC-유래 효과기 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 T 세포를 포함한다.
액체 종양 또는 고형 종양을 치료하는 데 유용한 조합의 일부 실시형태에서, 조합은 본원에 제공된 적어도 하나의 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로 CAR을 포함하는 iPSC-유래 효과기 세포를 포함한다. 액체 종양 또는 고형 종양을 치료하는 데 유용한 조합의 일부 다른 실시형태에서, 조합은 적어도 하나의 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로 CAR 및 외인성 CD16 중 하나 이상을 포함하는 예비 선택된 단일클론 항체 및 iPSC-유래 효과기 세포를 포함한다. 액체 종양 또는 고형 종양을 치료하는 데 유용한 조합의 일부 실시형태에서, 조합은 적어도 하나의 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로 CAR, 및 선택적으로 TCRneg; 외인성 CD16; CFR; 사이토카인 및/또는 이의 수용체 또는 이의 변이체를 포함하는 추가의 사이토카인 신호전달 복합체; 및 CD38 녹아웃 중 하나 이상을 포함하는 단일클론 항체 및 iPSC-유래 효과기 세포를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 외인성 CD16은 hnCD16이다. 이론에 의해 제한되지 않으면서, hnCD16은 단일클론 항체의 향상된 ADCC를 제공하는 한편, CAR은 특이적 종양 항원을 표적화할 뿐만 아니라 상이한 종양 항원을 표적화하는 단일클론 항체와 함께 이중 표적화 전략을 사용하여 종양 항원 회피를 방지한다.
일부 추가의 실시형태에서, 다라투무맙과 조합되어 포함된 iPSC-유래 NK 세포는 IL7R 및 선택적으로 CAR, 및 선택적으로 외인성 CD16, IL7, 및 CAR 표적화 MICA/B 중 하나 이상 또는 CD19, BCMA, CD20, CD22, CD123, HER2, CD52, EGFR, GD2, MSLN, VEGF-R2, PSMA 및 PDL1 중 하나를 포함하고; 여기서 IL7은 CAR과 공동발현 또는 개별적으로 발현하고; IL7은 도 1의 작제물 1 내지 3에 제시된 형태 중 어느 하나로 존재한다.
11. 관문 억제제
관문은 억제되지 않을 때 면역 반응을 억제하거나 하향조절할 수 있는 세포 분자, 대개 세포 표면 분자이다. 종양이 특히 종양 항원에 특이적인 T 세포에 대해 면역 내성의 주요 기전으로서 소정의 면역-관문 경로를 선택한다는 것이 이제 명확하다. 관문 억제제(CI)는 관문 유전자 발현 또는 유전자 산물을 감소시키거나, 관문 분자의 활성을 감소시킬 수 있고, 이로 인해 억제성 관문을 차단하여 면역계 기능을 회복할 수 있는 길항제이다. PD1/PDL1 또는 CTLA4를 표적화하는 관문 억제제의 발생은 종양학적 지형을 변화시켰고, 이들 약제는 다수의 적응증에서 장기간 관해를 제공한다. 그러나, 많은 종양 하위유형은 관문 봉쇄 치료에 내성이고, 재발은 상당한 우려로 남아 있다. 따라서, 본 출원의 일 양태는 CI와의 조합 치료에서 본원에 제공된 것과 같은 게놈 조작된 기능적 iPSC-유래 세포를 포함함으로써 CI 내성을 극복하기 위한 치료학적 접근법을 제공한다. 조합 치료의 일 실시형태에서, iPSC-유래 세포는 NK 세포이다. 조합 치료의 다른 실시형태에서, iPSC-유래 세포는 T 세포이다. 본원에 제공된 분화 NK 세포는 직접적인 항종양 능력을 나타내는 것 이외에도 PDL1-PD1 매개된 억제에 내성이고, T 세포 이동을 향상시키고, 종양 미세환경에 T 세포를 동원하고, 종양 부위에서 T 세포 활성화를 증대시키는 능력을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, 기능적으로 강력한 게놈 조작된 분화 NK 세포에 의해 용이해진 T 세포의 종양 침윤은 상기 NK 세포가 국소 면역억제를 완화하고 종양 부담을 감소시키도록 관문 억제제를 포함하는 T 세포 표적화된 면역요법과 상승작용할 수 있다는 것을 나타낸다.
일 실시형태에서, 관문 억제제 조합 치료를 위한 분화 TCRneg NK 세포는 신호전달 복합체, 및 선택적으로 CAR 발현, 외인성 CD16 발현, CFR 발현, B2M/CIITA 녹아웃, CD38 녹아웃, 및 외인성 세포 표면 사이토카인 및/또는 수용체 발현의 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 모든 여섯개를 포함하고; 여기서 B2M이 녹아웃될 때 HLA-G를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 CD58 및 CD54 중 하나 또는 둘 모두의 녹아웃이 선택적으로 포함된다. 일부 실시형태에서, 분화 NK 세포는 표 1에 열거된 유전자형 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 분화 NK 세포는 TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, RFX5, RFXAP, RAG1, 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 유전자 중 적어도 하나에서의 결실, 파괴 또는 발현 감소; 또는 HLA-E, 4-1BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, Fc 수용체, 인게이저, 및 이중특이적 인게이저, 다중특이적 인게이저 또는 보편적 인게이저와 커플링하기 위한 표면 유도 수용체 중 적어도 하나의 도입을 추가로 포함한다.
다른 실시형태에서, 관문 억제제 조합 치료를 위한 유래된 TCRneg T 세포는 신호전달 복합체, 및 선택적으로 CAR 발현, 외인성 CD16 발현, CFR 발현, B2M/CIITA 녹아웃, CD38 녹아웃, 및 외인성 세포 표면 사이토카인 및/또는 수용체 발현의 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 모든 여섯개를 포함하고; 여기서 B2M이 녹아웃될 때 HLA-G를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 CD58 및 CD54 중 하나 또는 둘 모두의 녹아웃이 선택적으로 포함된다. 일부 실시형태에서, 분화 효과기 세포는 표 1에 열거된 유전자형 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 분화 효과기 세포는 TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, RFX5, RFXAP, RAG1, 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 유전자 중 적어도 하나에서의 결실, 파괴 또는 발현 감소; 또는 HLA-E, 4-1BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, Fc 수용체, 인게이저, 및 이중특이적 인게이저, 다중특이적 인게이저 또는 보편적 인게이저와 커플링하기 위한 표면 유도 수용체 중 적어도 하나의 도입을 추가로 포함한다.
다양한 실시형태에서, 분화 효과기 세포는 신호전달 복합체, 및 선택적으로 CAR 발현, 외인성 CD16 발현, B2M/CIITA 녹아웃, CD38 녹아웃, 및 외인성 세포 표면 사이토카인 발현의 하나, 둘, 셋, 넷, 또는 모든 다섯 개의 세포를 포함하는 TCRneg iPSC 클론주를 분화하여 수득되고; 여기서 B2M이 녹아웃될 때 HLA-G를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 CD58 및 CD54 중 하나 또는 둘 모두의 녹아웃이 선택적으로 도입된다. 일부 실시형태에서, 상기 기재된 iPSC 클론주는 TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, RFX5, RFXAP, RAG1, 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 유전자 중 적어도 하나에서의 결실, 파괴 또는 발현 감소; 또는 HLA-E, 4-1BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, Fc 수용체, 인게이저, 및 이중특이적 인게이저, 다중특이적 인게이저 또는 보편적 인게이저와 커플링하기 위한 표면 유도 수용체 중 적어도 하나의 도입을 추가로 포함한다.
본원에 제공된 것과 같은 분화 효과기 세포에 의한 조합 치료에 적합한 관문 억제제는 PD-1(Pdcdl, CD279), PDL-1(CD274), TIM-3(Havcr2), TIGIT(WUCAM 및 Vstm3), LAG-3(Lag3, CD223), CTLA-4(Ctla4, CD152), 2B4(CD244), 4-1BB(CD137), 4-1BBL(CD137L), A2AR, BATE, BTLA, CD39(Entpdl), CD47, CD73(NT5E), CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2(Pou2f2), 레티노산 수용체 알파(Rara), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 및 억제성 KIR(예를 들어, 2DL1, 2DL2, 2DL3, 3DL1 및 3DL2)의 길항제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시형태에서, 임의의 상기 관문 분자를 억제하는 길항제는 항체이다. 일부 실시형태에서, 관문 억제성 항체는 쥐과 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 낙타 Ig, 단일 가변 신항원 수용체(VNAR), 상어 중쇄 전용 항체(Ig NAR), 키메릭 항체, 재조합 항체, 또는 이의 항체 단편일 수 있다. 항체 단편의 비제한적인 예는 Fab, Fab′, F(ab)′2, F(ab)′3, Fv, 단일 사슬 항원 결합 단편(scFv), (scFv)2, 디설파이드 안정화된 Fv(dsFv), 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 단일-도메인 항원 결합 단편(sdAb, 나노바디), 재조합 중쇄 전용 항체(VHH), 및 전체 항체의 결합 특이성을 유지하는 다른 항체 단편을 포함하고, 이는 전체 항체보다 제조하기에 보다 비용 효과적이거나, 보다 용이하게 사용되거나, 보다 민감할 수 있다. 일부 실시형태에서, 1개 또는 2개, 또는 3개, 또는 이것 초과의 관문 억제제는 아테졸리주맙(항-PDL1 mAb), 아벨루맙(항-PDL1 mAb), 더발루맙(항-PDL1 mAb), 트레멜리무맙(항-CTLA4 mAb), 이필리무맙(항-CTLA4 mAb), IPH4102(항-KIR), IPH43(항-MICA), IPH33(항-TLR3), 리리무맙(항-KIR), 모날리주맙(항-NKG2A), 니볼루맙(항-PD1 mAb), 펨브롤리주맙(항-PD1 mAb), 및 임의의 이의 유도체, 기능적 균등물 또는 바이오시밀러 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시형태에서, 많은 miRNA가 면역 관문의 발현을 제어하는 조절자로서 발견되면서 임의의 상기 관문 분자를 억제하는 길항제는 마이크로RNA-기반이다(문헌[Dragomir et al., Cancer Biol Med. 2018, 15(2):103-115]). 일부 실시형태에서, 관문 길항제성 miRNA는 miR-28, miR-15/16, miR-138, miR-342, miR-20b, miR-21, miR-130b, miR-34a, miR-197, miR-200c, miR-200, miR-17-5p, miR-570, miR-424, miR-155, miR-574-3p, miR-513 및 miR-29c를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
제공된 iPSC-유래 효과기 세포와의 조합 치료의 일부 실시형태는 적어도 하나의 관문 분자를 표적화하기 위한 적어도 하나의 관문 억제제를 포함하고; 여기서 iPSC-유래 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 갖는다. 제공된 분화 효과기 세포와의 조합 치료의 일부 다른 실시형태는 2개, 3개 이상의 관문 분자가 표적화되도록 2개, 3개 이상의 관문 억제제를 포함한다. 적어도 하나의 관문 억제제 및 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 iPSC-유래 세포를 포함하는 조합 치료의 일부 실시형태에서, 상기 관문 억제제는 항체, 또는 이의 인간화된 변이체 또는 단편 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편, 또는 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이고, 상기 관문 억제제는 상기 항체, 또는 이의 단편 또는 변이체를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 발현함으로써 iPSC-유래 세포에 의해 제조된다. 일부 실시형태에서, 관문을 억제하는 항체, 또는 이의 단편 또는 변이체를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 개별 작제물에서 또는 CAR 및 항체 또는 이의 단편을 인코딩하는 서열 둘 모두를 포함하는 바이-시스트로닉 작제물에서 CAR과 공동발현된다. 일부 추가의 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편을 인코딩하는 서열은 예를 들어 CAR-2A-CI 또는 CI-2A-CAR로 예시된 자가 절단 2A 코딩 서열을 통해 CAR 발현 작제물의 5' 말단 또는 3' 말단 중 어느 하나에 연결될 수 있다. 이와 같이, 관문 억제제의 코딩 서열 및 CAR은 단일 오픈 리딩 프레임(ORF)일 수 있다. 종양 미세환경(TME)을 침윤시킬 수 있는 분화 효과기 세포에 의해 페이로드로서 관문 억제제가 전달되고 발현되고 분비될 때, 이것은 TME 결합 시 억제성 관문 분자에 대응하여서, CAR 또는 활성화 수용체와 같은 활성화 양상에 의한 효과기 세포의 활성화가 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, CAR과 공동발현된 관문 억제제는 PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39(Entpdl), CD47, CD73(NT5E), CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2(Pou2f2), 레티노산 수용체 알파(Rara), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 및 억제성 KIR의 관문 분자 중 적어도 하나를 억제한다. 일부 실시형태에서, 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 분화 세포에서 CAR과 공동발현된 관문 억제제는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 트레멜리무맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이들의 인간화된 변이체, 단편 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 및 이들의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러를 포함하는 군에서 선택된다. 일부 실시형태에서, CAR과 공동발현된 관문 억제제는 아테졸리주맙, 또는 이의 인간화된 변이체, 단편 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 또는 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이다. 일부 다른 실시형태에서, CAR과 공동발현된 관문 억제제는 니볼루맙, 또는 이의 인간화된 변이체, 단편, 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 또는 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이다. 일부 다른 실시형태에서, CAR과 공동발현된 관문 억제제는 펨브롤리주맙, 또는 이의 인간화된 변이체, 단편 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 또는 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이다.
본원에 제공된 iPSC-유래 세포 및 관문 분자를 억제하는 적어도 하나의 항체를 포함하는 조합 치료의 일부 다른 실시형태에서, 상기 항체는 iPSC-유래 세포에 의해 또는 이것에서 제조되지 않고, 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 iPSC-유래 세포의 투여 전에, 이와 같이 또는 이것 후에 추가적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 제공된 분화 효과기 세포와의 조합 치료에서 하나, 둘, 셋 이상의 관문 억제제의 투여는 동시적이거나 순차적이다. 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 유래된 NK 세포 또는 T 세포를 포함하는 조합 치료의 일 실시형태에서, 치료에 포함된 관문 억제제는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 트레멜리무맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이들의 인간화된 변이체, 단편 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 및 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러 중 하나 이상이다. 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 유래된 NK 세포 또는 T 세포를 포함하는 조합 치료의 일부 실시형태에서, 치료에 포함된 관문 억제제는 아테졸리주맙, 또는 이의 인간화된 변이체, 단편 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 및 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이다. 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 유래된 NK 세포 또는 T 세포를 포함하는 조합 치료의 일부 실시형태에서, 치료에 포함된 관문 억제제는 니볼루맙, 또는 이의 인간화된 변이체, 단편 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 또는 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이다. 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 유래된 NK 세포 또는 T 세포를 포함하는 조합 치료의 일부 실시형태에서, 치료에 포함된 관문 억제제는 펨브롤리주맙, 또는 이의 인간화된 변이체, 단편 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 또는 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이다.
II. iPSC에서 선택된 좌위에서 표적화된 게놈 편집을 위한 방법
본원에 상호교환 가능하게 사용된 게놈 편집 또는 게놈성 편집 또는 유전 편집은 DNA가 표적화된 세포의 게놈에서 삽입, 결실, 및/또는 대체되는 유전자 조작의 유형이다. 표적화된 게놈 편집("표적화된 게놈 편집" 또는 "표적화된 유전성 편집"과 상호교환 가능함)은 게놈에서 사전-선택된 부위에서 삽입, 결실 및/또는 치환이 가능하게 한다. 표적화된 편집 동안 삽입 부위에서 내인성 서열이 결실될 때, 영향을 받은 서열을 포함하는 내인성 유전자는 서열 결실로 인해 녹아웃되거나 녹다운될 수 있다. 따라서, 표적화된 편집은 정확하게 내인성 유전자 발현을 파괴하도록 또한 사용될 수 있다. 삽입 부위에서의 내인성 서열의 결실과 함께 또는 이것 없이 하나 이상의 외인성 서열의 삽입을 수반하는 과정을 지칭하는 "표적화된 통합"이라는 용어는 본원에서 유사하게 사용된다. 비교하면, 무작위로 통합된 유전자는 위치 효과 및 침묵화로 처리되어 이의 발현이 신뢰성이 없고 예측 불가능하게 만든다. 예를 들어, 센트로머 및 하위텔로머 영역은 전이유전자 침묵화가 되기 특히 쉽다. 호혜적으로, 새로 통합된 유전자는 둘러싼 내인성 유전자 및 염색질에 영향을 미칠 수 있어서, 잠재적으로 세포 거동을 변경하거나 세포 형질전환을 선호한다. 따라서, 세이프 하버 유전자 좌위, 또는 게놈 세이프 하버(GSH)와 같은 예비선택된 유전자 좌위에서의 외인성 DNA의 삽입은 안전성, 효능, 카피수 제어 및 신뢰성 있는 유전자 반응 제어에 중요하다.
뉴클레아제 독립적 접근법을 통해 또는 뉴클레아제 의존적 접근법을 통해 표적화된 편집이 달성될 수 있다. 뉴클레아제 독립적 표적화된 편집 접근법에서, 상동성 재조합은 숙주 세포의 효소 기전을 통해 삽입되는 외인성 폴리뉴클레오티드를 플랭킹하는 상동성 서열에 의해 가이드된다.
대안적으로, 특이적 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의해 이중 가닥 절단(DSB)의 특이적 도입을 통해 표적화된 편집이 더 높은 빈도로 달성될 수 있었다. 상기 뉴클레아제 의존적 표적화된 편집은 DSB에 반응하여 생기는 비상동성 말단 봉합(NHEJ)을 포함하는 DNA 수선 기전을 이용한다. NHEJ는 외인성 유전 재료를 함유하는 공여자 벡터 없이는 대개 적은 수의 내인성 뉴클레오티드의 무작위 삽입 또는 결실(in/del)로 이어진다. 비교하면, 한 쌍의 상동성 아암에 의해 플랭킹된 외인성 유전 재료를 함유하는 공여자 벡터가 존재할 때, 외인성 유전 재료는 상동성 재조합에 의해 상동성 유도 수선(HDR) 동안 게놈으로 도입되어서, "표적화된 통합"을 생성시킨다. 일부 상황에서, 표적화된 통합 부위는 선택된 유전자의 코딩 영역 내에 있도록 의도되고, 이에 따라 표적화된 통합은 유전자 발현을 파괴시켜서, 하나의 단일 편집 단계에서 동시의 녹인 및 녹아웃(KI/KO)을 생성시킬 수 있었다.
동시에 유전자를 녹아웃하기 위한 관심 유전자 좌위(GOI)에서 선택된 위치에서의 하나 이상의 전이유전자의 삽입을 달성할 수 있다. 동시의 녹인 및 녹아웃(KI/KO)에 적합한 유전자 좌위는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD44, CD58, CD54, CD56, CD69, CD71, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 및 TIGIT를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 위치 선택적 삽입을 위한 각각의 부위 특정한 표적화 상동성 아암에 의해, 이것은 그 부위에서의 내인성 프로모터 하에서 또는 작제물에 포함된 외인성 프로모터 하에서 전이유전자(들)가 발현되게 한다. 둘 이상의 전이유전자가 선택된 위치에서(예를 들어, CD38 유전자 좌위에서) 삽입될 때, 링커 서열, 예를 들어 2A 링커 또는 IRES는 임의의 2개의 전이유전자들 사이에 위치한다. 2A 링커는 FMDV, ERAV, PTV-I 또는 TaV(각각 "F2A", "E2A", "P2A" 및 "T2A"라고 칭함)로부터 분화된 자가 절단 펩티드를 인코딩하여, 개별 단백질이 단일 번역으로부터 제조되게 한다. 일부 실시형태에서, 전이유전자 및/또는 외인성 프로모터 침묵화의 위험을 감소시키도록 절연인자는 작제물에 포함된다. 외인성 프로모터는 CAG, 또는 비제한적인 예로서 CMV, EF1α, PGK, 및 UBC를 포함하는 다른 항시적 프로모터, 유도성 프로모터, 시간 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 세포 유형 특이적 프로모터일 수 있다.
특이적인 및 표적화된 DSB를 도입할 수 있는 이용 가능한 엔도뉴클레아제는 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성자 유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), RNA 가이드된 CRISPR(클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부) 시스템을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 추가적으로, phiC31 및 Bxb1 인터그라아제를 이용한 DICE(이중 인터그라아제 카세트 교환) 시스템은 또한 표적화된 통합에 대한 유망한 도구이다.
ZFN은 징크 핑거 DNA 결합 도메인에 융합된 뉴클레아제를 포함하는 표적화된 뉴클레아제이다. "징크 핑거 DNA 결합 도메인" 또는 "ZFBD"에 의해 하나 이상의 징크 핑거를 통해 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합하는 폴리펩티드 도메인이 의도된다. 징크 핑거는 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화되는 징크 핑거 결합 도메인 내의 약 30개의 아미노산의 도메인이다. 징크 핑거의 예는 C2H2 징크 핑거, C3H 징크 핑거 및 C4 징크 핑거를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. "설계된" 징크 핑거 도메인은 설계/조성이 주로 합리적 기준, 예를 들어 치환 규칙의 적용 및 기존의 ZFP 설계 및 결합 데이터의 정보를 저장하는 데이터베이스에서 가공 정보에 대한 컴퓨터화 알고리즘으로부터 생기는 성질에서 발생하지 않는 도메인이다. 예를 들어, 미국 특허 제6,140,081호; 제6,453,242호; 및 제6,534,261호를 참조하고; 또한 국제공개 WO 98/53058호; WO 98/53059호; WO 98/53060호; WO 02/016536호 및 WO 03/016496를 참조한다. "선택된" 징크 핑거 도메인은 주로 경험적 과정, 예컨대 파지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 하이브리드 선택으로부터 제조되는 자연에서 발견되지 않는 도메인이다. ZFN은 미국 특허 제7,888,121호 및 미국 특허 제7,972,854호에 더 자세히 기재되어 있고, 이의 완전한 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 당업계에서 ZFN의 가장 인식되는 예는 징크 핑거 DNA 결합 도메인과의 FokI 뉴클레아제의 융합이다.
TALEN은 TAL 효과기 DNA 결합 도메인에 융합된 뉴클레아제를 포함하는 표적화된 뉴클레아제이다. "전사 활성자 유사 효과기 DNA 결합 도메인", "TAL 효과기 DNA 결합 도메인" 또는 "TALE DNA 결합 도메인"에 의해 DNA에 대한 TAL 효과기 단백질의 결합을 담당하는 TAL 효과기 단백질의 폴리펩티드 도메인이 의도된다. TAL 효과기 단백질은 감염 동안 잔토모나스(Xanthomonas) 속의 식물 병원균에 의해 분비된다. 이러한 단백질은 식물 세포의 핵에 들어가고, 이의 DNA 결합 도메인을 통해 효과기 특이적 DNA 서열에 결합하고, 이의 전사촉진 도메인을 통해 이 서열에서 유전자 전사를 활성화한다. TAL 효과기 DNA 결합 도메인 특이성은 효과기-가변 수의 불완전 34개 아미노산 반복부에 따라 달라지고, 이는 반복 가변-이중잔기(RVD)라 칭하는 선택 반복부 위치에서 다형성을 포함한다. TALEN은 본원에 인용되어 포함된 미국 특허출원공개 US 2011/0145940호에 더 자세히 기재되어 있다. 당업계에서 TALEN의 가장 인식되는 예는 TAL 효과기 DNA 결합 도메인에 대한 FokI 뉴클레아제의 융합 폴리펩티드이다.
해당 방법에서 사용하는 표적화된 뉴클레아제의 다른 예는 표적화된 Spo11 뉴클레아제, DNA 결합 도메인, 예를 들어 징크 핑거 DNA 결합 도메인에 융합된 뉴클레아제 활성을 갖는 Spo11 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드, 관심 DNA 서열에 대한 특이성을 갖는 TAL 효과기 DNA 결합 도메인 등이다.
본 발명에 적합한 표적화된 뉴클레아제의 추가의 예는 개별적으로 사용되든지 조합으로 사용되든지 Bxb1, phiC31, R4, PhiBT1 및 Wβ/SPBc/TP901-1을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
표적화된 뉴클레아제의 다른 비제한적인 예는 자연 발생 및 재조합 뉴클레아제; cas, cpf, cse, csy, csn, csd, cst, csh, csa, csm 및 cmr을 포함하는 패밀리로부터의 CRISPR 관련된 뉴클레아제; 제한 엔도뉴클레아제; 메가뉴클레아제; 호밍 엔도뉴클레아제 등을 포함한다.
한 예로서 Cas9를 사용하여, CRISPR/Cas9는 (1) Cas9 엔도뉴클레아제 및 (2) crRNA-tracrRNA 복합체의 2개의 주요 성분을 필요로 한다. 2개의 성분은 공동발현될 때 PAM 및 PAM 근처의 시딩 영역을 포함하는 표적 DNA 서열에 동원된 복합체를 형성한다. 선택된 서열을 표적화하기 위해 Cas9를 가이드하도록 키메릭 가이드 RNA(gRNA)를 형성하기 위해 crRNA 및 tracrRNA를 조합할 수 있다. 이후, 이들 2개의 성분은 형질주입 또는 형질도입을 통해 포유류 세포로 전달될 수 있다. CRISPR/Cpf 시스템을 사용할 때, 이것은 Cpf 엔도뉴클레아제(Cpf1, MAD7 및 당업계에 더 공지된 많은 것) 및 (2) gNA(이는 선택된 서열을 표적화하기 위해 Cpf 엔도뉴클레아제를 가이드하도록 tracrRNA를 대개 필요로 하지 않음)를 필요로 한다.
DICE 매개된 삽입은 각각의 효소의 자체의 작은 attB 및 attP 인식 부위로 치밀히 제한된 외인성 DNA의 일방향성 통합을 제공하기 위해 한 쌍의 재조합효소, 예를 들어 phiC31 및 Bxb1을 사용한다. 이 표적 att 부위는 포유류 게놈에서 천연적으로 존재하지 않으므로, 이는 처음에 원하는 통합 부위에서 게놈으로 도입되어야 한다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 US 2015/0140665호를 참조하고, 이의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
본 발명의 일 양태는 표적화된 게놈 통합에 대한 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물을 제공한다. 일 실시형태에서, 작제물은 원하는 통합 부위에 특이적인 한 쌍의 상동성 아암을 추가로 포함하고, 표적화된 통합 방법은 세포 숙주 효소 기전에 의해 부위 특이적 상동성 재조합이 가능하게 하도록 세포에 작제물을 도입하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계 및 ZFN 매개된 삽입이 가능하게 하도록 세포로 원하는 통합 부위에 특이적인 DNA 결합 도메인을 포함하는 ZFN 발현 카세트를 도입하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계 및 TALEN 매개된 삽입이 가능하게 하도록 세포로 원하는 통합 부위에 특이적인 DNA 결합 도메인을 포함하는 TALEN 발현 카세트를 도입하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계, Cas9 매개된 삽입이 가능하게 하도록 세포로 Cas9 발현 카세트, 및 원하는 통합 부위에 특이적인 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 도입하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포에서 표적화된 통합 방법은 세포에서 원하는 통합 부위로 한 쌍의 DICE 재조합효소의 하나 이상의 att 부위를 포함하는 작제물을 도입하는 단계, 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계, 및 DICE 매개된 표적화된 통합이 가능하게 하도록 DICE 재조합효소에 대한 발현 카세트를 도입하는 단계를 포함한다.
표적화된 통합에 유망한 부위는 이론적으로 숙주 세포 또는 유기체에 대한 유해 효과를 갖지 않으면서 새로 통합된 DNA의 예측 가능한 발현을 수용할 수 있는 인간 게놈의 유전자내 영역 또는 유전자외 영역인 세이프 하버 좌위 또는 게놈 세이프 하버(GSH)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 유용한 세이프 하버는 벡터 인코딩된 단백질 또는 비코딩 RNA의 원하는 수준을 생성하기에 충분한 전이유전자 발현을 허용해야 한다. 세이프 하버는 또한 세포를 악성 형질전환에 취약하게 하지도 세포 기능을 변경하지도 않아야 한다. 가능한 세이프 하버 좌위인 통합 부위에 대해, 비제한적인 예로서 서열 주석에 의해 판단되는 것처럼 조절 요소 또는 유전자의 파괴의 부재의 조건; 유전자 치밀 부위에서의 유전자간 영역, 또는 반대의 방향에서 전사된 2개의 유전자들 사이의 수렴에서의 위치에 있는 조건; 벡터 인코딩된 전사 활성자와 인접한 유전자, 특히 암 관련된 유전자 및 마이크로RNA 유전자의 프로모터 사이의 긴 범위 상호작용의 가능성을 최소화하기 위한 거리의 유지의 조건; 및 유비쿼터스 전사 활성을 나타내는 넓은 공간적 및 시간적 발현된 서열 태그(EST) 발현 패턴에 의해 반영된 것처럼 명백히 유비쿼터스 전사 활성을 가짐의 조건을 포함하는 조건을 충족하는 것이 이상적으로 필요하다. 이 후자의 특징은 줄기 세포에서 특히 중요하고, 여기서 분화 동안, 염색질 개형은 통상적으로 일부 좌위의 침묵화 및 다른 것의 잠재적 활성화로 이어진다. 외인성 삽입에 적합한 영역 내에서 삽입에 선택된 정확한 좌위는 반복적 요소 및 보존된 서열이 없어야 하고, 상동성 아암의 증폭을 위한 프라이머가 쉽게 설계될 수 있었다.
인간 게놈 편집, 또는 구체적으로 표적화된 통합에 적합한 부위는 아데노 연관된 바이러스 부위 1(AAVS1), 케모카인(CC 모티프) 수용체 5(CCR5) 유전자 좌위 및 마우스 ROSA26 좌위의 인간 오솔로그(orthologue)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 추가적으로, 마우스 H11 좌위의 인간 오솔로그는 또한 본원에 개시된 표적화된 통합의 조성물 및 방법을 이용하여 삽입에 적합한 부위일 수 있다. 추가로, 콜라겐 및 HTRP 유전자 좌위는 표적화된 통합에 대한 세이프 하버로서 또한 사용될 수 있다. 그러나, 각각의 선택된 부위의 검증은 특히 특이적 통합 사건에 대해 줄기 세포에서 필요한 것으로 나타났고, 프로모터 선출, 외인성 유전자 서열 및 정렬, 및 작제물 디자인을 포함하는 삽입 전략의 최적화가 대개 필요하다.
표적화된 삽입/결실을 위해, 편집 부위는 대개 발현 및/또는 기능이 파괴되도록 의도된 내인성 유전자에 포함된다. 일 실시형태에서, 표적화된 삽입/결실을 포함하는 내인성 유전자는 면역 반응 조절 및 조정과 연관된다. 일부 다른 실시형태에서, 표적화된 삽입/결실을 포함하는 내인성 유전자는 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약물 표적 후보자, 면역 반응 조절 및 조정, 또는 줄기 세포 및/또는 전구 세포, 및 이로부터 분화된 세포의 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존을 억제하는 단백질과 연관된다.
이와 같이, 본 발명의 다른 양태는 본원에 제공된 것과 같은 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, TRAC 또는 CD38 좌위와 같은 연속적 또는 시간적 유전자 발현에 대해 안전하고 잘 조절되는 것으로 공지되거나 입증된 게놈 세이프 하버 또는 예비선택된 좌위를 포함하는 선택된 좌위에서 표적화된 통합 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 표적화된 통합 방법을 위한 게놈 세이프 하버는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, CD38, GAPDH, TCR 또는 RUNX1, 또는 게놈 세이프 하버의 기준을 충족하는 다른 좌위를 포함하는 하나 이상의 원하는 통합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적화된 통합은 통합의 결과로서 유전자의 녹다운 또는 녹아웃이 요구되는 하나 이상의 유전자 좌위에 있고, 상기 이러한 유전자 좌위는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD44, CD58, CD54, CD56, CD69, CD71, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 및 TIGIT를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계 및 세포 숙주 효소 기전에 의해 부위 특이적 상동성 재조합이 가능하게 하도록 하나 이상의 외인성 서열 및 원하는 통합 부위에 특이적인 한 쌍의 상동성 아암을 포함하는 작제물을 도입하는 단계를 포함하고, 원하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD44, CD58, CD54, CD56, CD69, CD71, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT를 포함한다.
다른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계 및 ZFN 매개된 삽입이 가능하게 하도록 세포로 원하는 통합 부위에 특이적인 DNA 결합 도메인을 포함하는 ZFN 발현 카세트를 도입하는 단계를 포함하고, 원하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD44, CD58, CD54, CD56, CD69, CD71, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, 또는 TIGIT를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계 및 TALEN 매개된 삽입이 가능하게 하도록 세포로 원하는 통합 부위에 특이적인 DNA 결합 도메인을 포함하는 TALEN 발현 카세트를 도입하는 단계를 포함하고, 원하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD44, CD58, CD54, CD56, CD69, CD71, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT를 포함한다. 다른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계, Cas9 매개된 삽입이 가능하게 하도록 세포로 Cas9 발현 카세트, 및 원하는 통합 부위에 특이적인 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 도입하는 단계를 포함하고, 원하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD44, CD58, CD54, CD56, CD69, CD71, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포에서 표적화된 통합의 방법은 세포에서 원하는 통합 부위로 한 쌍의 DICE 재조합효소의 하나 이상의 att 부위를 포함하는 작제물을 도입하는 단계, 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계, 및 DICE 매개된 표적화된 통합이 가능하게 하도록 DICE 재조합효소에 대한 발현 카세트를 도입하는 단계를 포함하고, 여기서, 원하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD44, CD58, CD54, CD56, CD69, CD71, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT를 포함한다.
추가로, 본원에 제공된 바와 같이, 세이프 하버에서 표적화된 통합을 위한 상기 방법은 임의의 관심 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 안전성 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약학적 활성 단백질 및 펩티드, 약물 표적 후보자, 및 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하도록 사용된다. 일부 다른 실시형태에서, 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물은 하나 이상의 마커 유전자를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 작제물에서 외인성 폴리뉴클레오티드는 안전 스위치 단백질을 인코딩하는 자살 유전자이다. 유도된 세포사에 적합한 자살 유전자 시스템은 비제한적인 예로서 카스파아제 9(또는 카스파아제 3 또는 7) 및 AP1903; 티미딘 키나아제(TK) 및 간시클로버(GCV); 사이토신 탈아미노효소(CD) 및 5-플루오로사이토신(5-FC)을 포함한다. 추가적으로, 일부 자살 유전자 시스템은 세포 유형 특이적이고, 예를 들어 B 세포 분자 CD20에 의한 T 림프구의 유전자 변형은 mAb 리툭시맙의 투여 시 이의 제거를 허용한다. 추가로, 세툭시맙에 의해 인식된 에피토프를 함유하는 변형된 EGFR은 세포가 세툭시맙에 노출될 때 유전자 조작된 세포를 고갈시키도록 사용될 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 일 양태는 카스파아제 9(카스파아제 3 또는 7), 티미딘 키나아제, 사이토신 탈아미노효소, 변형된 EGFR 및 B 세포 CD20으로부터 선택된 안전성 스위치 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 자살 유전자의 표적화된 통합 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본원에서의 방법에 의해 통합된 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드는 표적화된 통합을 위해 작제물에 포함된 작동 가능하게 연결된 외인성 프로모터에 의해 유도된다. 프로모터는 유도성 또는 구성적일 수 있고, 시간 특이적, 조직 특이적 또는 세포 유형 특이적일 수 있다. 본 발명의 방법에 적합한 구성적 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV), 연장 인자 1α(EF1α), 포스포글리세레이트 키나아제(PGK), 하이브리드 CMV 인핸서/치킨 β-액틴(CAG) 및 유비퀴틴C(UBC) 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일 실시형태에서, 외인성 프로모터는 CAG이다.
본원에 제공된 방법에 의해 통합된 외인성 폴리뉴클레오티드는 통합 부위에서 숙주 게놈에서의 내인성 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포의 게놈에서 AAVS1 좌위에서의 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드의 표적화된 통합에 사용된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오티드는 내인성 AAVS1 프로모터에 의해 유도된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포의 게놈에서 ROSA26 좌위에서의 표적화된 통합에 사용된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오티드는 내인성 ROSA26 프로모터에 의해 유도된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포의 게놈에서 H11 좌위에서의 표적화된 통합에 사용된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오티드는 내인성 H11 프로모터에 의해 유도된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포의 게놈에서 콜라겐 좌위에서의 표적화된 통합에 사용된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오티드는 내인성 콜라겐 프로모터에 의해 유도된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포의 게놈에서 HTRP 좌위에서의 표적화된 통합에 사용된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오티드는 내인성 HTRP 프로모터에 의해 유도된다. 이론적으로, 원하는 위치에서의 오직 정확한 삽입이 내인성 프로모터에 의해 유도된 외인성 유전자의 유전자 발현을 허용할 것이다.
일부 실시형태에서, 표적화된 통합의 방법을 위해 작제물에 포함된 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드는 하나의 프로모터에 의해 유도된다. 일부 실시형태에서, 작제물은 모이어티 사이의 더 큰 물리적 분리를 제공하고 효소 기전에 대한 접근 가능성을 최대화하도록 동일한 프로모터에 의해 유도된 2개의 인접한 폴리뉴클레오티드 사이에 하나 이상의 링커 서열을 포함한다. 링커 서열의 링커 펩티드는 모이어티(외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 이로부터 인코딩된 단백질 또는 펩티드) 사이의 물리적 분리가 관련된 기능에 따라 보다 가요성이거나 보다 경질이 되게 하도록 선택된 아미노산으로 이루어질 수 있다. 링커 서열은 별개의 모이어티를 생성하도록 프로테아제에 의해 절단 가능하거나 화학적으로 절단 가능할 수 있다. 링커에서의 효소 절단 부위의 예는 엔테로키나아제, Xa 인자, 트립신, 콜라게나아제 및 트롬빈과 같은 단백분해 효소에 의한 절단을 위한 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로테아제는 숙주에 의해 자연적으로 제조된 것이거나, 이는 외인성으로 도입된다. 대안적으로, 링커에서의 절단 부위는 선택된 화학물질 또는 조건, 예를 들어 시아노겐 브로마이드, 히드록실아민, 또는 낮은 pH에 대한 노출 시 절단될 수 있는 부위일 수 있다. 선택적인 링커 서열은 절단 부위의 제공 이외의 목적을 제공할 수 있다. 링커 서열은 모이어티가 적절히 작용하도록 다른 인접한 모이어티와 관련하여 모이어티의 효과적인 배치를 허용해야 한다. 링커는 또한 모이어티 사이의 임의의 입체 장애를 막기에 충분한 길이의 단순한 아미노산 서열일 수 있다. 게다가, 링커 서열은 예를 들어 인산화 부위, 비오티닐화 부위, 황화 부위, γ-카르복실화 부위 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 번역후 변형을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 단일의 원치 않는 입체형태의 생물학적 활성 펩티드를 보유하지 않도록 가요성이다. 링커는 가요성을 제공하도록 글리신, 알라닌 및 세린과 같은 작은 측쇄를 갖는 아미노산으로 주로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 약 80 또는 90% 이상의 링커 서열은 글리신, 알라닌 또는 세린 잔기, 특히 글리신 및 세린 잔기를 포함한다. 여러 실시형태에서, G4S 링커 펩티드는 융합 단백질의 말단 가공 도메인 및 엔도뉴클레아제 도메인을 분리시킨다. 다른 실시형태에서, 2A 링커 서열은 2개의 개별 단백질이 단일 번역으로부터 제조되게 한다. 적합한 링커 서열은 용이하게 경험적으로 확인될 수 있다. 추가적으로, 링커 서열의 적합한 크기 및 서열은 종래의 컴퓨터 모델링 기법에 의해 또한 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 링커 서열은 자가 절단 펩티드를 인코딩한다. 일 실시형태에서, 자가 절단 펩티드는 2A이다. 일부 다른 실시형태에서, 링커 서열은 내부 리보솜 진입 서열(IRES)을 제공한다. 일부 실시형태에서, 임의의 2개의 연속적 링커 서열은 상이하다.
표적화된 통합을 위한 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물을 세포로 도입하는 방법은, 그 자체가 알려진 세포로의 유전자 도입의 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 일 실시형태에서, 작제물은 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관된 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 또는 센다이 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터의 골격을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라스미드 벡터는 표적 세포(예를 들어, pAl- 11, pXTl, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo) 등에 외인성 폴리뉴클레오티드를 전달하고/하거나 발현하도록 사용된다. 일부 다른 실시형태에서, 에피솜 벡터는 표적 세포에 외인성 폴리뉴클레오티드를 전달하도록 사용된다. 일부 실시형태에서, 재조합 아데노 연관된 바이러스(rAAV)는 상동성 재조합을 통해 삽입, 결실 또는 치환을 도입하도록 유전적 조작을 위해 사용될 수 있다. rAAV는 렌티바이러스와 달리 숙주 게놈으로 통합되지 않는다. 또한, 에피솜 rAAV 벡터는 종래의 표적화 플라스미드의 형질주입과 비교하여 훨씬 더 높은 속도로 상동성 유도 유전자 표적화를 매개한다. 일부 실시형태에서, AAV6 또는 AAV2 벡터는 iPSC의 게놈에서의 표적 부위에서 삽입, 결실 또는 치환을 도입하도록 사용된다. 일부 실시형태에서, 본원에서의 방법 및 조성물을 사용하여 얻은 게놈 변형된 iPSC 및 이의 분화 세포는 표 1에 열거된 적어도 하나의 유전자형을 포함한다.
III. 게놈 조작된 iPSC를 수득하고 유지하는 방법
본 발명은 하나 이상의 원하는 부위에서 하나 이상의 표적화된 편집을 포함하는 게놈 조작된 iPSC를 수득하고 유지시키는 방법을 제공하고, 여기서 표적화된 편집은 각각의 선택된 편집 부위에서 확장된 게놈 조작된 iPSC 또는 iPSC 유래 비만능 세포에서 온전하고 기능적으로 유지된다. 표적화된 편집은 게놈 iPSC 및 이로부터의 분화 세포로 삽입, 결실 및/또는 치환, 즉 선택된 부위에서의 표적화된 통합 및/또는 삽입/결실을 도입한다. 환자 원천의, 말초혈 유래된 1차 효과기 세포의 직접적인 조작과 비교하여, 본원에 제공된 것과 같은 iPSC의 편집 및 분화를 통한 게놈 조작된 iPSC-유래 효과기 세포를 수득하는 것의 많은 이익은 조작된 효과기 세포에 대한 비제한된 원천; 특히 다수의 조작된 양상이 관여될 때 효과기 세포의 반복 조작의 필요성이 없음; 얻은 효과기 세포가 연장된 텔로미어를 갖기 위해 재생되고 탈진을 덜 경험함; 효과기 세포 집단은 주로 본원에 제공된 것과 같은 조작된 iPSC에서의 가능해진 클론 선택으로 인해 편집 부위, 카피 수, 및 대립유전자 변이의 부재, 랜덤 돌연변이 및 발현 다양성의 측면에서 균일함을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 선택된 부위에서 하나 이상의 표적화된 편집을 포함하는 게놈 조작된 iPSC는 운명 유지 배지(FMM)로서 표 2에 기재된 세포 배양 배지에서 연장된 기간 동안 단일 세포로서 유지되고 계대배양되고 확장되고, 여기서 iPSC는 선택된 부위(들)에서 표적화된 편집 및 기능적 변형을 보유한다. 배지의 성분은 표 2에 도시된 최적 범위 내의 양으로 배지에 존재할 수 있다. FMM에서 배양된 iPSC는 배양 세정 또는 선택의 필요 없이 이의 비분화된, 및 기본 또는 미경험 프로파일; 게놈 안정성을 계속해서 유지시키는 것으로 나타났고; 모든 3개의 체세포 계통, 배양체 또는 단층을 통한 인 비트로 분화(배양체 형성 없음); 및 기형종 형성에 의한 인 비보 분화를 용이하게 발생시킨다. 예를 들어, 국제공개 WO 2015/134652호를 참조하고, 이의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
[표 2]
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일부 실시형태에서, 하나 이상의 표적화된 통합 및/또는 삽입-결실을 포함하는 게놈 조작된 iPSC는 MEK 억제제, GSK3 억제제 및 ROCK 억제제를 포함하고, TGFβ 수용체/ALK5 억제제가 없거나 본질적으로 없는 배지에서 유지되고 계대배양되고 확장되고, iPSC는 선택된 부위에서 온전하고 기능적인 표적화된 편집을 보유한다.
본원에 제시된 바와 같이, 사이토카인 수용체 융합(RF) 전이유전자를 함유하는 CAR-iT 세포는, RF 전이유전자가 부족한 CAR-iT 세포와 비교하여, 외인성 사이토카인 서포트에 의존하지 않으면서 분화되고 확장된 경우, 향상된 지속성을 부여한다는 것을 확인하였다. 따라서, 일부 실시형태에서, 하나 이상의 표적화된 통합 및/또는 삽입-결실을 포함하는 게놈 조작된 iPSC는 외인성 IL15를 함유하지 않는 배지에서 유지되고, 계대배양되고, 확장된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 표적화된 통합 및/또는 삽입-결실을 포함하는 게놈 조작된 iPSC는 외인성 IL2 및 IL7 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 배지에서 유지되고, 계대배양되고, 확장된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 표적화된 통합 및/또는 삽입-결실을 포함하는 게놈 조작된 iPSC는 외인성 사이토카인을 함유하지 않는 배지에서 유지되고, 계대배양되고, 확장된다.
본 발명의 다른 양태는 iPSC의 표적화된 편집을 통해; 또는 표적화된 편집에 의해 게놈 조작된 비만능 세포를 처음에 생성하고 이후에 비만능 세포와 동일한 표적화된 편집을 포함하는 iPSC를 얻기 위해 선택된/단리된 게놈 조작된 비만능 세포의 재프로그래밍을 통해 게놈 조작된 iPSC를 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명의 추가의 양태는 세포로 표적화된 통합 및/또는 표적화된 삽입-결실을 도입함으로써 현재 재프로그래밍을 겪는 비만능 세포의 게놈 조작을 제공하고, 여기서 접촉된 비만능 세포는 재프로그래밍에 충분한 조건 하에 있고, 재프로그래밍에 대한 조건은 비만능 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자 및 소분자와 접촉시키는 것을 포함한다. 동시의 게놈 조작 및 재프로그래밍에 대한 방법의 다양한 실시형태에서, 표적화된 통합 및/또는 표적화된 삽입-결실은 비만능 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자 및 선택적으로 소분자와 접촉시켜 재프로그래밍을 개시하기 전에, 또는 본질적으로 이와 동시에 비만능 세포로 도입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 비만능 세포를 동시에 게놈 조작하고 재프로그래밍하기 위해, 표적화된 통합 및/또는 삽입/결실은 비만능 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자 및 소분자와 접촉시켜 개시된 재프로그래밍의 수 일 과정 후 비만능 세포로 또한 도입될 수 있고, 재프로그래밍 세포가 비제한적인 예로서 SSEA4, Tra181 및 CD30을 포함하는 하나 이상의 내인성 만능 유전자의 안정한 발현을 제시하기 전에 작제물을 보유하는 벡터가 도입된다.
일부 실시형태에서, 비만능 세포를 적어도 하나의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제, MEK 억제제, GSK3 억제제 및 ROCK 억제제의 조합과 접촉시켜 재프로그래밍이 개시된다(FRM; 표 2). 일부 실시형태에서, 임의의 상기 방법을 통해 게놈 조작된 iPSC는 MEK 억제제, GSK3 억제제 및 ROCK 억제제의 조합을 포함하는 혼합물을 사용하여 추가로 유지되고 확장된다(FMM; 표 2). 일부 실시형태에서, 게놈 조작된 iPSC는 외인성 IL15를 함유하지 않는 배지에서 유지되고, 계대배양되고, 확장된다. 일부 실시형태에서, 게놈 조작된 iPSC는 외인성 IL2 및 IL7 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 배지에서 유지되고, 계대배양되고, 확장된다. 일부 실시형태에서, 게놈 조작된 iPSC는 외인성 사이토카인을 함유하지 않는 배지에서 유지되고, 계대배양되고, 확장된다.
게놈 조작된 iPSC의 생성 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 적어도 하나의 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 게놈 조작된 iPSC를 얻도록 하나 이상의 표적화된 통합 및/또는 삽입/결실을 iPSC로 도입하여 iPSC를 게놈 조작하는 것을 포함한다. 대안적으로, 게놈 조작된 iPSC를 생성하는 방법은 (a) 선택된 부위에서 표적화된 통합 및/또는 삽입-결실을 포함하는 게놈-조작된 비만능 세포를 얻도록 하나 이상의 표적화된 편집을 비만능 세포로 도입하는 단계, 및 (b) 선택된 부위에서 표적화된 통합 및/또는 삽입-결실을 포함하는 게놈 조작된 iPSC를 얻도록 게놈 조작된 비만능 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제, MEK 억제제, GSK3 억제제 및/또는 ROCK 억제제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 대안적으로, 게놈 조작된 iPSC를 생성하는 방법은 (a) 비만능 세포의 재프로그래밍을 개시하도록 비만능 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제, MEK 억제제, GSK3 억제제 및/또는 ROCK 억제제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시키는 단계; (b) 게놈 조작을 위해 재프로그래밍 비만능 세포로 하나 이상의 표적화된 통합 및/또는 삽입-결실을 도입하는 단계; 및 (c) 선택된 부위에서 표적화된 통합 및/또는 삽입-결실을 포함하는 게놈 조작된 iPSC를 수득하는 단계를 포함한다. 임의의 상기 방법은 클론성 iPSC를 수득하기 위해 단일 세포 분류 게놈 조작된 iPSC를 추가로 포함할 수 있다. 외인성 IL15를 함유하지 않는 배지, 또는 외인성 IL2 및 IL7 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 배지, 또는 외인성 사이토카인을 함유하지 않는 배지에서 이러한 게놈-조작된 iPSC의 클론 확장을 통해, 본원에 표 1에 제공된 것처럼 적어도 하나의 표현형을 갖는 단일 세포 분류되고 확장된 클론 조작된 iPSC를 포함하도록 마스터 세포 은행이 생성된다. 마스터 세포 은행은 후속하여 저온보존되어서, 추가의 iPSC 조작을 위한 플랫폼, 및 조성이 잘 한정되고 균일하며 비용 효과적인 방식으로 상당한 규모로 대량 생산될 수 있는 기성품, 조작된, 균일한 세포 치료 산물을 제조하기 위한 재생 가능한 원천을 제공한다.
재프로그래밍 인자는 국제공개 WO 2015/134652호 및 WO 2017/066634호에 개시된 것처럼 OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3, L1TD1, 및 임의의 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되고, 이의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 하나 이상의 재프로그래밍 인자는 폴리펩티드의 형태일 수 있다. 재프로그래밍 인자는 또한 폴리뉴클레오티드의 형태일 수 있고, 이에 따라 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 에피솜, 플라스미드 및 미니서클과 같은 벡터에 의해 비만능 세포로 도입된다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 재프로그래밍 인자를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 벡터에 의해 도입된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 에피솜 벡터에 의해 도입된다. 다양한 다른 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 센다이 바이러스 벡터에 의해 도입된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 플라스미드의 조합에 의해 도입된다. 예를 들어, 국제공개 WO 2019/075057호를 참조하고, 이의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
일부 실시형태에서, 비만능 세포는 동일한 선택 부위 또는 상이한 선택 부위에서 표적화된 통합을 위해 다수의 벡터에 의해 상이한 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 상이한 프로모터를 포함하는 다수의 작제물에 의해 옮겨진다. 이 외인성 폴리뉴클레오티드는 자살 유전자, 또는 표적화 양상을 인코딩하는 유전자, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약학적 활성 단백질 및 펩티드, 약물 표적 후보자, 또는 iPSC 또는 이로부터의 분화 세포의 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 비제한적인 예로서 siRNA, shRNA, miRNA 및 안티센스 핵산을 포함하는 RNA를 인코딩한다. 이러한 외인성 폴리뉴클레오티드는 항시적 프로모터, 유도성 프로모터, 시간 특이적 프로모터, 및 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 유도제의 존재 하에 또는 특정 분화된 세포 유형에서 프로모터를 활성화하는 조건 하일 때 발현 가능하다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 iPSC에서 및/또는 iPSC로부터 분화된 세포에서 발현된다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 자살 유전자는 항시적 프로모터에 의해 유도되고, 예를 들어 Capase-9는 CAG에 의해 유도된다. 상이한 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 상이한 프로모터를 함유하는 이 작제물은 동시에 또는 연속적으로 비만능 세포로 이송될 수 있다. 다수의 작제물의 표적화된 통합으로 처리되는 비만능 세포는 게놈 조작과 동시에 재프로그래밍을 개시하도록 하나 이상의 재프로그래밍 인자와 동시에 접촉하고, 이로 인해 동일한 세포 풀에서 다수의 표적화된 통합을 포함하는 게놈 조작된 iPSC를 얻을 수 있다. 이와 같이, 이 강건한 방법은 하나 이상의 선택된 표적 부위로 통합된 다수의 양상을 갖는 클론 게놈 조작된 hiPSC를 유래하기 위한 동시의 재프로그래밍 및 조작 전략이 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 본원에서의 방법 및 조성물을 사용하여 얻은 게놈 변형된 iPSC 및 이의 분화 세포는 표 1에 열거된 적어도 하나의 유전자형을 포함한다.
IV. 게놈 조작된 iPSC를 분화하여 유전자 조작된 효과기 세포를 얻는 방법
본 발명의 추가의 양태는 기형종 형성에 의한 게놈 조작된 iPSC의 인 비보 분화의 방법을 제공하고, 여기서 게놈 조작된 iPSC로부터 인 비보 분화된 분화 세포는 원하는 부위(들)에서의 표적화된 통합 및/또는 삽입-결실을 포함하여 온전하고 기능적인 표적화된 편집을 보유한다. 일부 실시형태에서, 기형종을 통해 게놈 조작된 iPSC로부터 인 비보 분화된 분화 세포는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP H11, 베타-2 마이크로글로불린, CD38, GAPDH, TCR 또는 RUNX1, 또는 게놈 세이프 하버의 기준을 충족하는 다른 좌위를 포함하는 하나 이상의 원하는 통합 부위에서 통합된 하나 이상의 유도성 자살 유전자를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 기형종을 통해 게놈 조작된 iPSC로부터 인 비보 분화된 분화 세포는 표적화 양상을 인코딩하는, 또는 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 유도성 자살 유전자를 포함하는 기형종을 통해 게놈 조작된 iPSC로부터 인 비보 분화된 분화 세포는 면역 반응 조절 및 매개와 연관된 내인성 유전자에서 하나 이상의 삽입-결실을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 삽입-결실은 하나 이상의 내인성 관문 유전자에 포함된다. 일부 실시형태에서, 삽입-결실은 하나 이상의 내인성 T 세포 수용체 유전자에 포함된다. 일부 실시형태에서, 삽입-결실은 하나 이상의 내인성 MHC 클래스 I 억제자 유전자에 포함된다. 일부 실시형태에서, 삽입/결실은 주요 조직접합성 복합체와 연관된 하나 이상의 내인성 유전자에 포함된다. 일부 실시형태에서, 삽입-결실은 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD44, CD58, CD54, CD56, CD69, CD71, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 내인성 유전자에 포함된다. 일 실시형태에서, 선택된 부위(들)에서 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 조작된 iPSC는 B2M(베타-2-마이크로글로불린) 인코딩 유전자에서 표적화된 편집을 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 것과 같은 하나 이상의 유전자 변형을 포함하는 게놈 조작된 iPSC는 조혈 세포 계통 또는 인 비트로로 임의의 다른 특정한 세포 유형을 유래하도록 사용되고, 여기서 분화된 비만능 세포는 선택된 부위(들)에서의 표적화된 편집을 포함하는 기능적 유전자 변형을 보유한다. 일부 실시형태에서, 조혈 세포 계통 또는 인 비트로로 임의의 다른 특정한 세포 유형을 유래하도록 사용된 게놈 조작된 iPSC는 저온보존되고 이의 사용 직전에 해동되는 마스터 세포 은행 세포이다. 일 실시형태에서, 게놈 조작된 iPSC-유래 세포는 한정적 동형유전자성 내피세포(HE) 가능성을 갖는 중배엽 세포, 한정적 HE, CD34 조혈 세포, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구세포(MPP), T 세포 전구세포, NK 세포 전구세포, 골수성 세포, 호중구 전구세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 호중구, 수지상 세포 및 대식세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않고, 여기서 게놈 조작된 iPSC로부터 분화된 이들 세포는 원하는 부위(들)에서 표적화된 편집을 포함하는 기능적 유전자 변형을 보유한다.
iPSC-유래 조혈 세포 계통을 수득하기 위한 적용가능한 분화 방법 및 조성물은 예를 들어 국제공개 WO 2017/078807호에 기재된 것을 포함하고, 이의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 제공된 것처럼, 조혈 세포 계통을 생성하기 위한 방법 및 조성물은 EB 형성의 필요성 없이 증식 가능한 단층 배양 플랫폼에서 혈청 비함유, 피더 비함유 및/또는 기질 비함유 조건 하에서 hiPSC를 포함하는 만능 줄기 세포로부터 분화된 한정적 동형유전자성 내피세포(HE)를 통해서이다. 제공된 방법에 따라 분화될 수 있는 세포는 만능 줄기 세포로부터 특정한 말단 분화된 세포 및 전환분화된 세포로 결정된 전구 세포로, 그리고 만능 중간체를 거치지 않고 조혈 운명으로 직접 이행된 다양한 계통의 세포에 이른다. 유사하게, 줄기 세포를 분화하여 제조될 수 있는 세포는 다능성 줄기 세포 또는 전구 세포로부터 말단 분화된 세포로, 그리고 모든 개재하는 조혈 세포 계통에 이른다.
단층 배양에서 만능 줄기 세포로부터 조혈 계통의 세포를 분화하고 확장시키는 방법은 만능 줄기 세포를 BMP 경로 활성자 및 선택적으로, bFGF와 접촉시키는 것을 포함한다. 제공된 것처럼, 만능 줄기 세포 유래된 중배엽 세포가 얻어지고, 만능 줄기 세포로부터 배양체를 형성함이 없이 확장된다. 이후, 중배엽 세포는 만능 줄기 세포로부터 배양체를 형성함이 없이 한정적 동형유전자성 내피세포(HE) 가능성을 갖는 확장된 중배엽 세포를 얻기 위해 BMP 경로 활성자, bFGF 및 WNT 경로 활성자와의 접촉에 적용된다. bFGF, 및 선택적으로 ROCK 억제제 및/또는 WNT 경로 활성자와의 후속하는 접촉에 의해, 한정적 HE 가능성을 갖는 중배엽 세포는 분화 동안 또한 확장된 한정적 HE 세포로 분화한다.
조혈 계통의 세포를 얻기 위한 본원에 제공된 방법은 EB 매개된 만능 줄기 세포 분화보다 우수한데, 이는 EB 형성이 보통의 세포 확장 내지는 최소 세포 확장을 야기하고, 집단에서의 세포의 동종성 확장 및 동종성 분화를 요하는 많은 분야에 중요한 단층 배양을 허용하지 않고, 힘들며 효능이 낮기 때문이다.
제공된 단층 분화 플랫폼은 한정적 동형유전자성 내피세포를 향한 분화가 용이하게 하여 조혈 줄기 세포 및 T 세포, B 세포, NKT 세포 및 NK 세포와 같은 분화된 자손이 유래되게 한다. 단층 분화 전략은 향상된 분화 효능을 대규모 확장과 조합하여서 다양한 치료학적 분야에 대해 치료학적으로 관련된 수의 만능 줄기 세포 분화된 조혈 세포의 전달이 가능하게 한다. 추가로, 본원에 제공된 방법을 이용한 단층 배양은 인 비트로 분화, 엑스 비보 조절, 및 인 비보 장기간 조혈 자가 재생, 재구성 및 생착의 완전 범위가 가능하게 하는 기능적 조혈 계통 세포를 생성시킨다. 제공된 것처럼, iPSC-유래 조혈 계통 세포는 한정적 동형유전자성 내피세포, 조혈 다능성 전구 세포, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, T 세포 전구세포, NK 세포 전구세포, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포 및 호중구를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
한정적 조혈 계통의 세포로 만능 줄기 세포의 분화를 지시하기 위한 방법, 여기서 상기 방법은 (i) 만능 줄기 세포로부터 중배엽 세포의 분화 및 확장을 개시하도록 만능 줄기 세포를 BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; (ii) 중배엽 세포로부터 한정적 HE 가능성을 갖는 중배엽 세포의 분화 및 확장을 개시하도록 중배엽 세포를 BMP 활성자, bFGF, 및 GSK3 억제제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계 - 상기 조성물은 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제가 없음 -; (iii) 한정적 동형유전자성 내피세포 가능성을 갖는 만능 줄기 세포 분화된 중배엽 세포로부터 한정적 동형유전자성 내피세포의 분화 및 확장을 개시하도록 한정적 HE 가능성을 갖는 중배엽 세포를 ROCK 억제제; bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로, Wnt 경로 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계 - 상기 조성물은 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제가 없음 -를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 만능 줄기 세포를 시딩하고 확장하기 위해 만능 줄기 세포를 MEK 억제제, GSK3 억제제 및 ROCK 억제제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 추가로 포함하고, 상기 조성물은 TGFβ 수용체/ALK 억제제가 없다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 iPSC, 또는 미경험 iPSC, 또는 하나 이상의 유전 각인을 포함하는 iPSC이고, iPSC에 포함된 하나 이상의 유전 각인은 이로부터 분화된 조혈 세포에 보유된다. 조혈 계통의 세포로의 만능 줄기 세포의 분화를 지시하는 방법의 일부 실시형태에서, 조혈 계통의 세포로의 만능 줄기 세포의 분화는 배양체의 생성이 없고, 단층 배양 형태로 있다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 얻은 만능 줄기 세포 분화된 한정적 동형유전자성 내피 세포는 CD34+이다. 일부 실시형태에서, 얻은 한정적 동형유전자성 내피 세포는 CD34+CD43-이다. 일부 실시형태에서, 한정적 동형유전자성 내피 세포는 CD34+CD43-CXCR4-CD73-이다. 일부 실시형태에서, 한정적 동형유전자성 내피 세포는 CD34+CXCR4-CD73-이다. 일부 실시형태에서, 한정적 동형유전자성 내피 세포는 CD34+CD43-CD93-이다. 일부 실시형태에서, 한정적 동형유전자성 내피 세포는 CD34+CD93-이다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 (i) pre-T 세포 전구세포로의 한정적 동형유전자성 내피세포의 분화를 개시시키도록 만능 줄기 세포 분화된 한정적 동형유전자성 내피세포를 ROCK 억제제; VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 선택적으로, (ii) T 세포 전구세포 또는 T 세포로의 pre-T 세포 전구세포의 분화를 개시시키도록 pre-T 세포 전구세포를 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하지만, VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 억제제 중 하나 이상이 없는 조성물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 단계 (ii)는 외인성 IL15를 함유하지 않는 조성물, 또는 외인성 IL2 및 IL7 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 조성물, 또는 외인성 사이토카인을 함유하지 않는 조성물과 pre-T 세포 전구세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 방법의 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포 분화된 T 세포 전구세포는 CD34+CD45+CD7+이다. 방법의 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포 분화된 T 세포 전구세포는 CD45+CD7+이다.
조혈 계통의 세포로 만능 줄기 세포의 분화를 지시하기 위한 상기 방법의 또 다른 일부 실시형태에서, 상기 방법은 (i) pre-NK 세포 전구세포로의 한정적 동형유전자성 내피세포의 분화를 개시시키도록 만능 줄기 세포 분화된 한정적 동형유전자성 내피세포를 ROCK 억제제; VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로, BMP 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 선택적으로 (ii) NK 세포 전구세포 또는 NK 세포로의 pre-NK 세포 전구세포의 분화를 개시시키도록 만능 줄기 세포 유래된 pre-NK 세포 전구세포를 SCF, Flt3L, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 배지는 VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 억제제 중 하나 이상이 없다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 단계 (ii)는 외인성 IL15를 함유하지 않는 조성물, 또는 외인성 IL2 및 IL7 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 조성물, 또는 외인성 사이토카인을 함유하지 않는 조성물과 만능 줄기 세포 분화된 pre-NK 세포 전구세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포 분화된 NK 전구세포는 CD3-CD45+CD56+CD7+이다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포 분화된 NK 세포는 CD3-CD45+CD56+이고, NKp46+, CD57+ 및 CD16+에 의해 선택적으로 추가로 한정된다.
따라서, 상기 분화 방법을 이용하여, (i) iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하여 CD34+ HE 세포(iCD34); (ii) iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하여 한정적 동형유전자성 내피세포(iHE); (iii) iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하여 한정적 HSC; (iv) iMPP-A를 사용하여 다능성 전구 세포(iMPP); (v) iTC-A2 및 iTC-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하여 T 세포 전구세포(ipro-T); (vi) iTC-B2를 사용하여 T 세포(iTC); (vii) iNK-A2 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하여 NK 세포 전구세포(ipro-NK); 및/또는 (viii) NK 세포(iNK) 및 iNK-B2인 iPSC-유래 조혈 세포의 하나 이상의 집단을 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 배지는:
a. iCD34-C는 ROCK 억제제, bFGF, VEGF, SCF, IL6, IL11, IGF 및 EPO로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인, 및 선택적으로 Wnt 경로 활성자를 포함하고; TGFβ 수용체/ALK 억제제가 없고;
b. iMPP-A는 BMP 활성자, ROCK 억제제, 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하고;
c. iTC-A2는 ROCK 억제제; SCF, Flt3L, TPO 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자를 포함하고;
d. iTC-B2는 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하고;
e. iNK-A2는 ROCK 억제제, 및 SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7, 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자를 포함하고,
f. iNK-B2는 SCF, Flt3L, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 열거된 조성물 중 하나 이상은 조작된 효과기 세포의 도입된 특성에 따라 일부 또는 전부의 열거된 외인성 사이토카인을 함유하지 않는다. 일부 실시형태에서, 조작된 효과기 세포는 하기 중 하나 이상을 포함하는 치료적 특성을 갖는다: 세포독성의 증가; 지속성 및/또는 생존율의 개선; 향상된 이동 능력, 및/또는 종양 부위에 방관자 면역 세포를 이동시키고/시키거나 활성화하거나 동원하는 데 있어서의 능력의 향상; 종양 침투의 개선; 종양 면역억제를 감소시키는 능력의 향상; 종양 항원 회피를 구제하는 능력의 개선; 제어된 아폽토시스; ADCC의 향상 또는 획득; 및 열거된 외인성 사이토카인 중 하나 이상, 또는 전부를 갖지 않으면서 확장, 활성화하는 능력.
일부 실시형태에서, 상기 방법으로부터 얻은 게놈 조작된 iPSC-유래 세포는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD44, CD58, CD54, CD56, CD69, CD71, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT, 또는 게놈 세이프 하버의 기준을 충족하는 다른 좌위를 포함하는 하나 이상의 원하는 통합 부위에서 통합된 하나 이상의 유도성 자살 유전자를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 게놈 조작된 iPSC-유래 세포는 안전성 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약학적 활성 단백질 및 펩티드, 약물 표적 후보자, 또는 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 자살 유전자를 포함하는 게놈 조작된 iPSC-유래 세포는 관문 유전자, 내인성 T 세포 수용체 유전자 및 MHC 클래스 I 억제자 유전자를 포함하지만 이를 제한하지는 않는 면역 반응 조절 및 매개와 연관된 하나 이상의 내인성 유전자에 포함된 하나 이상의 삽입-결실을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 자살 유전자를 포함하는 게놈 조작된 iPSC-유래 세포는 B2M 유전자에서 삽입/결실을 추가로 포함하고, B2M은 녹아웃된다.
추가적으로, 제2 운명의 게놈 조작된 조혈 세포로 제1 운명의 게놈 조작된 조혈 세포를 얻기 위한 적용가능한 탈분화 방법 및 조성물은 예를 들어 국제공개 WO 2011/159726호에 기재된 것을 포함하고, 이의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 여기서 제공된 방법 및 조성물은 재프로그래밍 동안 내인성 Nanog 유전자의 발현을 제한함으로써; 및 원하는 세포 유형으로 중간 세포를 분화하기 위한 조건으로 비만능 중간 세포를 처리함으로써 비만능 중간 세포로 출발 비만능 세포를 부분적으로 재프로그래밍하는 것이 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 본원에서의 방법 및 조성물을 사용하여 얻은 게놈 변형된 iPSC 및 이의 분화 세포는 표 1에 열거된 적어도 하나의 유전자형을 포함한다.
V. 유전자 조작된 iPSC로부터 분화된 기능적 양상을 갖는 분화 면역 세포의 치료학적 용도
일부 실시형태에서, 본 발명은 개시된 것과 같은 방법 및 조성물을 사용하여 게놈 조작된 iPSC로부터 분화된 기능적으로 향상된 분화 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, iPSC는 iPSC-유래 면역 세포에서 보유 가능한 하나 이상의 표적화된 유전 편집을 포함하고, 여기서 유전자 조작된 iPSC 및 이로부터의 분화 세포는 세포 기반 입양 치료에 적합하다. 일 실시형태에서, 유전자 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC-유래 CD34 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC-유래 HSC 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC-유래 proT 세포 또는 T계 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC-유래 proNK 세포 또는 NK계 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC-유래 면역 조절 세포 또는 골수성 유래 억제자 세포(MDSC)를 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC-유래 유전자 조작된 면역 세포는 개선된 치료학적 가능성을 위해 엑스 비보로 추가로 변경된다. 일 실시형태에서, iPSC로부터 분화된 유전자 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 미경험 T 세포, 줄기 세포 기억 T 세포 및/또는 중앙 기억 T 세포의 증가된 수 또는 비를 포함한다. 일 실시형태에서, iPSC로부터 분화된 유전자 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 I형 NKT 세포의 증가된 수 또는 비를 포함한다. 다른 실시형태에서, iPSC로부터 분화된 유전자 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 적응성 NK 세포의 증가된 수 또는 비를 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC로부터 분화된 유전자 조작된 CD34 세포, HSC 세포, T계 세포, NK계 세포 또는 골수성 유래 억제자 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 동종이계이다. 일부 다른 실시형태에서, iPSC로부터 분화된 유전자 조작된 CD34 세포, HSC 세포, T계 세포, NK계 세포 또는 MDSC의 단리된 집단 또는 하위집단은 자연발생적이다.
일부 실시형태에서, 분화를 위한 iPSC는 효과기 세포에서 바람직한 치료학적 속성을 전달하도록 선택된 유전 각인을 포함하고, 단, 분화 동안 세포 발생 생물학은 파괴되지 않고, 단, 유전 각인은 상기 iPSC로부터 분화된 분화 조혈 세포에서 보유되고 기능적이다.
일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포의 유전 각인은 (i) iPSC로의 비만능 세포의 재프로그래밍 동안 또는 후에 만능 세포의 게놈에서 게놈 삽입, 결실 또는 치환을 통해 얻은 하나 이상의 유전자 변형된 양상; 또는 (ii) 공여자 특이적, 질환 특이적 또는 치료 반응 특이적인 원천 특이적 면역 세포의 하나 이상의 보유 가능한 치료학적 속성을 포함하고, 만능 세포는 원천 특이적 면역 세포로부터 재프로그래밍되고, iPSC는 iPSC-유래 조혈 계통 세포에 또한 포함된 원천 치료학적 속성을 보유한다.
일부 실시형태에서, 일반적으로 변형된 양상은 안전성 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약학적 활성 단백질 및 펩티드, 약물 표적 후보자; 또는 iPSC 또는 이로부터의 분화 세포의 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정 및/또는 생존을 촉진하는 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 변형된 iPSC 및 이로부터의 분화 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 유전 변형된 iPSC 및 이로부터의 분화 세포는 (1) 하나 이상의 TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, 또는 RFXAP, RAG1, 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 유전자의 결실, 파괴, 또는 발현 감소; 및 (2) HLA-E, 4-1BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, Fc 수용체, 또는 이중특이적 인게이저 또는 다중특이적 인게이저 또는 보편적 인게이저와 커플링하기 위한 표면 유도 수용체 중 적어도 하나의 도입을 포함하는 추가의 유전 변형된 양상을 추가로 포함한다.
일부 또 다른 실시형태에서, 조혈 계통 세포는 (i) 하나 이상의 항원 표적화 수용체 발현; (ii) 변형된 HLA; (iii) 종양 미세환경에 대한 내성; (iv) 방관자 면역 세포의 동원 및 면역 조절; (iv) 감소된 오프 종양 효과를 갖는 개선된 온 타깃 특이성; 및 (v) 개선된 호밍, 지속성, 세포독성, 또는 항원 회피 구제 중 적어도 2개의 조합과 관련된 원천 특이적 면역 세포의 치료학적 속성을 포함한다.
일부 실시형태에서, iPSC-유래 조혈 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 포함하고, 상기 세포는 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18 또는 IL21을 포함하는 적어도 하나의 사이토카인 및/또는 이의 수용체, 또는 임의의 이의 변형된 단백질을 발현하고, 적어도 CAR을 발현한다. 일부 실시형태에서, 세포는 IL2, IL4, IL7, IL9, 및 IL21을 포함하는 적어도 하나의 사이토카인 및/또는 이의 수용체를 발현한다. 일부 실시형태에서, 세포는 IL7을 포함하는 적어도 하나의 사이토카인 및/또는 이의 수용체를 발현한다. 일부 실시형태에서, 세포는 IL7RF를 발현한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인(들) 및 CAR(들)의 조작된 발현은 NK 세포 특이적이다. 일부 다른 실시형태에서, 사이토카인(들) 및 CAR(들)의 조작된 발현은 T계 세포 특이적이다. 일 실시형태에서, CAR은 CD38 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC-유래 조혈 효과기 세포는 항원 특이적이다. 일부 실시형태에서, 항원 특이적 분화 효과기 세포는 액체 종양을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 항원 특이적 분화 효과기 세포는 고형 종양을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 항원 특이적 iPSC-유래 조혈 효과기 세포는 종양 항원 회피를 구제할 수 있다.
입양 세포 치료에 적합한 대상체에 대한 본 발명의 면역 세포를 유도함으로써 다양한 질환이 개선될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 것과 같은 iPSC-유래 조혈 세포는 동종이계 입양 세포 치료를 위한 것이다. 추가적으로, 본 발명은 일부 실시형태에서 입양 세포 치료에 적합한 대상체에게 조성물을 도입함으로써 상기 치료학적 조성물의 치료학적 용도를 제공하고, 여기서 대상체는 자가면역 장애; 혈액학적 악성종양; 고형 종양; 또는 HIV, RSV, EBV, CMV, 아데노바이러스 또는 BK 폴리오마바이러스와 연관된 감염을 갖는다. 혈액학적 악성종양의 예는 급성 백혈병 및 만성 백혈병(급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 만성 골수성 백혈병(CML), 림프종, 비호지킨 림프종(NHL), 호지킨병, 다발성 골수종 및 골수이형성 증후군을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 고형 암의 예는 뇌, 전립선, 유방, 폐, 대장, 자궁, 피부, 간, 골, 췌장, 난소, 고환, 방광, 신장, 두부, 경부, 위, 자궁경부, 직장, 후두 및 식도의 암을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 다양한 자가면역 장애의 예는 원형 탈모증, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 피부근육염, (1형) 당뇨병, 소아 특발성 관절염의 일부 형태, 사구체신염, 그레이브병, 길랭 바레 증후군, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 중증 근무력증, 심근염의 일부 형태, 다발성 경화증, 천포창/유사천포창, 악성빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발근염, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 류마티스성 관절염, 피부경화증/전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 전신 루푸스, 홍반성, 갑상선염의 일부 형태, 포도막염의 일부 형태, 백반증, 다발혈관염 동반 육아종증(베게너)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 바이러스 감염의 예는 HIV-(인간 면역결핍 바이러스), HSV-(단순 포진 바이러스), KSHV-(카포시 육종 연관된 헤르페스바이러스), RSV-(호흡기 융합 바이러스), EBV-(엡스타인 바 바이러스), CMV-(사이토메갈로바이러스), VZV-(바리셀라 조스터 바이러스), 아데노바이러스-, 렌티바이러스-, BK 폴리오마바이러스- 연관된 장애를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
증상에 대해 또는 재발 예방을 위해 본원에 개시된 실시형태의 유래된 조혈 계통 세포를 사용하는 치료가 실행될 수 있었다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하는", "치료" 등은 일반적으로 원하는 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 효과는 질환을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 면에서 예방적일 수 있고/있거나, 질환에 기인한 질환 및/또는 유해 효과에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 면에서 치료학적일 수 있다. 본원에 사용된 "치료"는 대상체에서의 임의의 질환 중재를 포괄하고, 질환의 소인이 있을 수 있지만 이것을 갖는 것으로 아직 진단되지 않은 대상체에서 질환이 발생하는 것을 방지하는 것; 질환의 억제, 즉 이의 발생의 정지; 또는 질환의 경감, 즉 질환 퇴행의 야기를 포함한다. 치료제 또는 조성물은 질환 또는 손상의 발생 전에, 동안에 또는 후에 투여될 수 있다. 치료가 환자의 바람직하지 않은 임상 증상을 안정화하거나 감소시키는 진행 중인 질환의 치료는 또한 특히 관심이 높다. 특정 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 세포 치료에 의해 적어도 하나의 연관된 증상에서 함유되고/되거나, 완화되고/되거나, 개선될 수 있는 질환, 병태 및/또는 손상을 갖는다. 특정한 실시형태는 세포 치료를 필요로 하는 대상체가 골수 또는 줄기 세포 이식을 위한 후보, 화학요법 또는 조사 치료를 받는 대상체, 과증식성 장애 또는 암, 예를 들어 조혈계의 과증식성 장애 또는 암을 갖거나 가질 위험에 있는 대상체, 종양, 예를 들어 고형 종양을 갖거나 발생시킬 위험에 있는 대상체, 바이러스 감염 또는 바이러스 감염과 연관된 질환을 갖거나 가질 위험에 있는 대상체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다는 것을 고려한다.
본원에 개시된 실시형태의 유래된 조혈 계통 세포를 포함하는 치료에 대한 반응을 평가할 때, 임상 이익률, 사망까지의 생존, 병리학적 완전 반응, 병리학적 반응의 반정량적 측정치, 임상 완전 관해, 임상 부분 관해, 임상 안정 병변, 무재발 생존, 무전이 생존, 무질환 생존, 순환 종양 세포 감소, 순환 마커 반응 및 RECIST(Response Evaluation Criteria In Solid Tumor: 고형 종양에서의 반응 평가 기준) 기준 중 적어도 하나를 포함하는 기준에 의해 반응이 평가될 수 있다.
개시된 것과 같은 유래된 조혈 계통 세포를 포함하는 치료학적 조성물은 다른 치료 전에, 동안에 및/또는 후에 대상체에 투여될 수 있다. 이와 같이 추가의 치료제의 사용 전에, 동안에 및/또는 후에 조합 치료의 방법은 iPSC-유래 면역 세포의 투여 또는 준비를 수반할 수 있다. 상기 제공된 것처럼, 하나 이상의 추가의 치료제는 펩티드, 사이토카인, 관문 억제제, 미토겐, 성장 인자, 소형 RNA, dsRNA(이중 가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 피더 세포, 피더 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 하나 이상의 관심 다중핵산을 포함하는 벡터, 항체, 화학치료제 또는 방사성 모이어티, 또는 면역조절 약물(IMiD)을 포함한다. iPSC-유래 면역 세포의 투여는 시간, 일 또는 심지어 주에 추가의 치료제의 투여와 시간상 분리될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 투여는 다른 생물학적 활성제 또는 양상, 예컨대 비제한적인 예로서 항신생물제, 비약물 치료, 예컨대 수술과 조합될 수 있다.
조합 세포 치료의 일부 실시형태에서, 치료학적 조합은 본원에 제공된 iPSC-유래 조혈 계통 세포 및 항체 또는 항체 단편인 추가의 치료제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간화된 항체, 인간화된 단일클론 항체 또는 키메릭 항체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편은 바이러스 항원에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편은 종양 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 종양 또는 바이러스 특이적 항원은 이의 사멸 능력을 향상시키기 위해 투여된 iPSC-유래 조혈 계통 세포를 활성화한다. 일부 실시형태에서, 투여된 iPSC-유래 조혈 계통 세포에 대한 추가의 치료제로서의 조합 치료에 적합한 항체는 항-CD20(예를 들어, 리툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 우블리툭시맙, 오카라투주맙, 오비누투주맙, 이브리투모맙, 오크렐리주맙), 항-CD22(이노투주맙, 목세투모맙, 에프라투주맙), 항-HER2(예를 들어, 트라스투주맙, 퍼투주맙), 항-CD52(예를 들어, 알렘투주맙), 항-EGFR(예를 들어, 세르툭시맙), 항-GD2(예를 들어, 디누툭시맙), 항-PDL1(예를 들어, 아벨루맙), 항-CD38(예를 들어, 다라투무맙, 이사툭시맙, MOR202), 항-CD123(예를 들어, 7G3, CSL362), 항-SLAMF7(엘로투주맙), 및 이들의 인간화된 변이체 또는 단편 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편, 또는 이들의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시형태에서, 추가의 치료제는 하나 이상의 관문 억제제를 포함한다. 관문은 세포 분자, 대개 억제될 때 면역 반응을 억제하거나 하향조절할 수 있는 세포 표면 분자라 칭한다. 관문 억제제는 관문 유전자 발현 또는 유전자 산물을 감소시키거나, 관문 분자의 활성을 감소시킬 수 있는 길항제이다. 본원에 제공된 것과 같은, NK계 세포 또는 T계 세포를 포함하는 분화 효과기 세포에 의한 조합 치료에 적합한 관문 억제제는 PD-1(Pdcdl, CD279), PDL-1(CD274), TIM-3(Havcr2), TIGIT(WUCAM 및 Vst㎥), LAG-3(Lag3, CD223), CTLA-4(Ctla4, CD152), 2B4(CD244), 4-1BB(CD137), 4-1BBL(CD137L), A2AR, BATE, BTLA, CD39(Entpdl), CD47, CD73(NT5E), CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2(Pou2f2), 레티노산 수용체 알파(Rara), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 및 억제성 KIR(예를 들어, 2DL1, 2DL2, 2DL3, 3DL1 및 3DL2)의 길항제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
제공된 분화 효과기 세포를 포함하는 조합 치료의 일부 실시형태는 관문 분자를 표적화하는 적어도 하나의 억제제를 추가로 포함한다. 제공된 분화 효과기 세포와의 조합 치료의 일부 다른 실시형태는 둘, 셋 이상의 관문 분자가 표적화되도록 둘, 셋 이상의 억제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 것과 같은 조합 치료를 위한 효과기 세포는 제공된 것과 같은 분화 NK계 세포이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 것과 같은 조합 치료를 위한 효과기 세포는 분화 T계 세포이다. 일부 실시형태에서, 조합 치료를 위한 분화 NK 세포 또는 T계 세포는 본원에 제공된 것처럼 기능적으로 향상된다. 일부 실시형태에서, 둘, 셋 이상의 관문 억제제는 분화 효과기 세포의 투여와 조합 치료와 함께, 이것 전에 또는 이것 후에 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 둘 이상의 관문 억제제는 동시에, 또는 한 번에 1회(순차적) 투여된다.
일부 실시형태에서, 임의의 상기 관문 분자를 억제하는 길항제는 항체이다. 일부 실시형태에서, 관문 억제성 항체는 쥐과 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 낙타 Ig, 단일 가변 신항원 수용체(VNAR), 상어 중쇄 전용 항체(Ig NAR), 키메릭 항체, 재조합 항체, 또는 이의 항체 단편일 수 있다. 항체 단편의 비제한적인 예는 Fab, Fab′, F(ab)′2, F(ab)′3, Fv, 단일 사슬 항원 결합 단편(scFv), (scFv)2, 디설파이드 안정화된 Fv(dsFv), 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 단일-도메인 항원 결합 단편(sdAb, 나노바디), 재조합 중쇄 전용 항체(VHH), 및 전체 항체의 결합 특이성을 유지하는 다른 항체 단편을 포함하고, 이는 전체 항체보다 제조하기에 보다 비용 효과적이거나, 보다 용이하게 사용되거나, 보다 민감할 수 있다. 일부 실시형태에서, 1개, 또는 2개 또는 3개 이상의 관문 억제제는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 이의 유도체 또는 기능적 균등물 중 적어도 하나를 포함한다.
분화 효과기 세포 및 하나 이상의 관문 억제제를 포함하는 조합 치료는 피부 T 세포 림프종, 비호지킨 림프종(NHL), 균상 식육종, 파제트병모양 망상증, 세자리 증후군, 육아종성 이완 피부, 림프종양 구진증, 만성 태선모양 잔비늘증, 급성 두창태선모양 잔비늘증, CD30+ 피부 T 세포 림프종, 속발성 피부 CD30+ 대세포 림프종, 비균상 식육종 CD30 피부 T 대세포 림프종, 다형성 T 세포 림프종, 레네트(Lennert) 림프종, 피하 T 세포 림프종, 혈관중심성 림프종, 아구성 NK 세포 림프종, B 세포 림프종, 호지킨 림프종(HL), 두경부 종양; 편평 세포 암종, 횡문근육종, 루이스 폐 암종(LLC), 비소세포 폐암, 식도 편평 세포 암종, 식도 선암, 신장 세포 암종(RCC), 대장직장암(CRC), 급성 골수성 백혈병(AML), 유방암, 위암, 전립선 소세포 신경내분비 암종(SCNC), 간암, 교모세포종, 간암, 구강 편평 세포 암종, 췌장암, 갑상선 유두암, 간내 담관세포 암종, 간세포 암종, 골암, 전이 및 비인두 암종을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 액체 암 및 고형 암의 치료에 적용가능하다.
일부 실시형태에서, 치료학적 용도를 위한 조합은, 본원에 제공된 것과 같은 분화 효과기 세포 이외에, 화학치료제 또는 방사성 모이어티를 포함하는 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다. 화학치료제는 신생물 세포를 우선적으로 사멸하거나 신속히 증식하는 세포의 세포 주기를 파괴하거나, 줄기 암 세포를 근절하는 것으로 발견되고, 신생물 세포의 성장을 예방하거나 감소시키도록 치료학적으로 사용된 세포독성 항신생물제, 즉 화학제를 지칭한다. 화학치료제는 또한 때때로 항신생물 또는 세포독성의 약물 또는 약제라 칭하고, 당업계에 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 화학치료제는 안트라사이클린, 알킬화제, 알킬 설포네이트, 아지리딘, 에틸렌이민, 메틸멜라민, 질소 머스타드, 니트로소우레아, 항생제, 항대사물질, 엽산 유사체, 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 효소, 포도필로톡신, 백금 함유 약제, 인터페론 및 인터류킨을 포함한다. 예시적인 화학치료제는 알킬화제(시클로포스파미드, 메클로르에타민, 메팔린, 클로르암부실, 헤아메틸멜라민(heamethylmelamine), 티오테파, 부술판, 카르무스틴, 로무스틴, 세무스틴), 항대사물질(메토트렉세이트, 플루오로우라실, 플록수리딘, 시타라빈, 6-메르캅토퓨린, 티오구아닌, 펜토스타틴), 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신), 에피포도필로톡신(에토포사이드, 에토포사이드 오르토퀴논 및 테니포사이드), 항생제(다우노루비신, 독소루비신, 미톡산트론, 비산트렌(bisanthrene), 악티노마이신 D, 플리카마이신, 퓨로마이신 및 그라미시딘 D), 파클리탁셀, 콜히신, 시토칼라신 B, 에메틴, 메이탄신 및 암사크린을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 추가의 약제는 아민글루테티미드, 시스플라틴, 카보플라틴, 미토마이신, 알트레타민, 시클로포스파미드, 로무스틴(CCNU), 카르무스틴(BCNU), 이리노테칸(CPT-11), 알렘투주맙, 알트레타민, 아나스트로졸, L-아스파라기나아제, 아자시티딘, 베바시주맙, 벡사로텐, 블레오마이신, 보르테조밉, 부술판, 칼루스테론, 카페시타빈, 셀레콕시브, 세툭시맙, 클라드리빈, 클로푸라빈, 시타라빈, 다카르바진, 데니류킨 디프티톡스, 디에틀스틸베스트롤, 도세탁셀, 드로모스타놀론, 에피루비신, 에를로티닙, 에스트라무스틴, 에토포사이드, 에티닐 에스트라디올, 엑세메스탄, 플록수리딘, 5-플루오로우라실, 플루다라빈, 플루타미드, 풀베스트란트, 게피티닙, 겜시타빈, 고세렐린, 히드록시우레아, 이브리투모맙, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티닙, 인터페론 알파(2a, 2b), 이리노테칸, 레트로졸, 류코보린, 류프롤라이드, 레바미솔, 메클로르에타민, 메게스트롤, 멜팔린, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 메톡살렌, 미토마이신 C, 미토탄, 미톡산트론, 난드롤론, 노페투모맙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파미드로네이트, 페메트렉세드, 페가데마아제, 페가스파라가아제, 펜토스타틴, 피포브로만, 플리카마이신, 포리페프로산, 포르피머, 프로카바진, 퀴나크린, 리툭시맙, 사르그라모스팀, 스트렙토조신, 타목시펜, 테모졸로마이드, 테니포사이드, 테스토락톤, 티오구아닌, 티오테파, 토페테칸, 토레미펜, 토시투모맙, 트라스투주맙, 트레티노인, 우라실 머스타드, 발루비신, 비노렐빈 및 졸레드로네이트를 포함한다. 다른 적합한 약제는 화학치료제 또는 방사선치료제로서 허가되고, 당업계에 알려진 것을 포함하여 인간 사용을 위해 허가된 것이다. 상기 약제는 임의의 수의 표준 의사 및 종양학자의 참조문헌(예를 들어, 문헌[Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, McGraw-Hill, N.Y., 1995])을 통해 또는 국제 암 협회 웹사이트(fda.gov/cder/cancer/druglistfrarne.htm)를 통해 참조될 수 있고, 이 둘 모두는 시간마다 업데이트된다.
탈리도마이드, 레날리도마이드 및 포말리도마이드와 같은 면역조절 약물(IMiD)은 NK 세포 및 T 세포 둘 모두를 자극한다. 본원에 제공된 것처럼, IMiD는 암 치료에 대한 iPSC-유래 치료학적 면역 세포와 사용될 수 있다.
환자에 대한 투여에 적합한 조성물은 치료학적 조성물에 포함된 iPSC-유래 조혈 계통 세포의 단리된 집단 이외에, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체(첨가제) 및/또는 희석제(예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 배지, 예를 들어 세포 배양 배지), 또는 다른 약학적으로 허용가능한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제는 부분적으로 투여되는 특정 조성물뿐만 아니라 치료학적 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 본 발명의 치료학적 조성물의 매우 다양한 적합한 제제가 있다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985](이의 개시내용은 본원에 의해 이의 전체가 인용되어 포함됨) 참조).
일 실시형태에서, 치료학적 조성물은 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래 T 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 치료학적 조성물은 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래 NK 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 치료학적 조성물은 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래 CD34+ HE 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 치료학적 조성물은 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래 HSC를 포함한다. 일 실시형태에서, 치료학적 조성물은 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래 MDSC를 포함한다. 본원에 개시된 것과 같은 iPSC-유래 조혈 계통 세포의 집단을 포함하는 치료학적 조성물은 정맥내 투여, 복강내 투여, 경장 투여 또는 기관 투여 방법에 의해 별개로 또는 원하는 치료 목표에 영향을 미치도록 다른 적합한 화합물과 조합되어 투여될 수 있다.
이러한 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제는 약 3 내지 약 10의 치료학적 조성물의 pH를 유지시키기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 이와 같이, 완충제는 총 조성물을 기준으로 중량 대 중량 기준으로 약 5%만큼 많을 수 있다. 전해질, 예컨대 염화나트륨 및 염화칼륨은 치료학적 조성물에 또한 포함될 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 일 양태에서, 치료학적 조성물의 pH는 약 4 내지 약 10의 범위이다. 대안적으로, 치료학적 조성물의 pH는 약 5 내지 약 9, 약 6 내지 약 9, 또는 약 6.5 내지 약 8의 범위이다. 다른 실시형태에서, 치료학적 조성물은 상기 pH 범위의 하나에서 pH를 갖는 완충제를 포함한다. 다른 실시형태에서, 치료학적 조성물은 pH가 약 7이다. 대안적으로, 치료학적 조성물은 pH가 약 6.8 내지 약 7.4의 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 치료학적 조성물은 pH가 약 7.4이다.
본 발명은 또한 부분적으로 본 발명의 특정 조성물 및/또는 배양물에서 약학적으로 허용가능한 세포 배양 배지의 용도를 제공한다. 상기 조성물은 인간 대상체에 대한 투여에 적합하다. 일반적으로 말해서, 본 발명의 실시형태에 따라 iPSC-유래 면역 세포의 유지, 성장 및/또는 건강을 지지하는 임의의 배지는 약학적 세포 배양 배지로서 사용하기에 적합하다. 특정 실시형태에서, 약학적으로 허용가능한 세포 배양 배지는 혈청 비함유 및/또는 피더 비함유 배지이다. 다양한 실시형태에서, 혈청 비함유 배지는 동물 비함유이고, 선택적으로 단백질 비함유일 수 있다. 선택적으로, 배지는 생물약학적으로 허용가능한 재조합 단백질을 함유할 수 있다. 동물 비함유 배지는 비동물 원천으로부터 성분이 유래된 배지를 지칭한다. 재조합 단백질은 동물 비함유 배지에서 자연적 동물 단백질을 대체하고, 합성 원천, 식물 원천 또는 미생물 원천으로부터 영양소를 얻는다. 대조적으로, 단백질 비함유 배지는 단백질이 실질적으로 없는 것으로 정의된다. 당업자는 배지의 상기 예가 예시적이고, 본 발명에서 사용하기에 적합한 배지의 제제를 어떤 방식으로든 제한하지 않고, 당업자에게 알려져 있고 이용 가능한 많은 적합한 배지가 있다는 것을 이해할 것이다.
단리된 만능 줄기 세포 유래 조혈 계통 세포는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 T 세포, NK 세포, NKT 세포, proT 세포, proNK 세포, CD34+ HE 세포, HSC, B 세포, 골수성 유래 억제자 세포 (MDSC), 조절 대식세포, 조절 수지상 세포 또는 간엽성 기질 세포를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 단리된 만능 줄기 세포 유래 조혈 계통 세포는 약 95% 내지 약 100%의 T 세포, NK 세포, proT 세포, proNK 세포, CD34+ HE 세포 또는 골수성 유래 억제자 세포(MDSC)를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 세포 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위해 정제된 T 세포 또는 NK 세포를 갖는 치료학적 조성물, 예컨대 약 95%의 T 세포, NK 세포, proT 세포, proNK 세포, CD34+ HE 세포 또는 골수성 유래 억제자 세포(MDSC)의 단리된 집단을 갖는 조성물을 제공한다.
일 실시형태에서, 조합 세포 치료는 치료학적 단백질 또는 펩티드 및 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 게놈 조작된 iPSC로부터 분화된 효과기 세포의 집단을 포함하고, 분화된 효과기 세포는 본원에 기재된 것과 같은 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로 CAR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조합 세포 치료는 블리나투모맙, 카투막소맙, 에르투막소맙, RO6958688, AFM11, MT110/AMG 110, MT111/AMG211/MEDI-565, AMG330, MT112/BAY2010112, MOR209/ES414, MGD006/S80880, MGD007 및/또는 FBTA05 중 하나, 및 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 게놈 조작된 iPSC로부터 분화된 효과기 세포의 집단을 포함하고, 여기서 분화된 효과기 세포는 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로 CAR, 및 선택적으로, CD16을 포함한다. 또 일부 다른 실시형태에서, 조합 세포 치료는 블리나투모맙, 카투막소맙, 및 에르투막소맙 중 하나, 및 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 게놈 조작된 iPSC로부터 분화된 효과기 세포의 집단을 포함하고, 여기서 분화된 효과기 세포는 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로 CAR, CD16, 및 CFR을 포함한다. 또한 추가의 일부 실시형태에서, 조합 세포 치료는 블리나투모맙, 카투막소맙, 및 에르투막소맙 중 하나, 및 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 게놈 조작된 iPSC로부터 분화된 효과기 세포의 집단을 포함하고, 여기서 분화된 효과기 세포는 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로 CAR, TCRneg, CD16, CFR 및 하나 이상의 외인성 사이토카인을 포함한다.
당업자가 이해하는 것처럼, 본원에서의 방법 및 조성물에 기초하여 iPSC로부터 분화된 자가유래 조혈 계통 세포 및 동종이계 조혈 계통 세포 둘 모두는 상기에 기재된 것과 같은 세포 치료에 사용될 수 있다. 자가유래 이식을 위해, 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단은 환자와 전체 또는 부분 HLA 일치에 있다. 다른 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포는 대상체에 일치된 HLA가 아니고, 여기서 유래된 조혈 계통 세포는 HLA I 및 HLA II null을 갖는 NK 세포 또는 T 세포이다.
일부 실시형태에서, 치료학적 조성물에서의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 용량당 적어도 0.1 x 105개의 세포, 적어도 1 x 105개의 세포, 적어도 5 x 105개의 세포, 적어도 1 x 106개의 세포, 적어도 5 x 106개의 세포, 적어도 1 x 107개의 세포, 적어도 5 x 107개의 세포, 적어도 1 x 108개의 세포, 적어도 5 x 108개의 세포, 적어도 1 x 109개의 세포, 또는 적어도 5 x 109개의 세포이다. 일부 실시형태에서, 치료학적 조성물에서의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 용량당 약 0.1 x 105개의 세포 내지 약 1 x 106개의 세포; 용량당 약 0.5 x 106개의 세포 내지 약 1x 107개의 세포; 용량당 약 0.5 x 107개의 세포 내지 약 1 x 108개의 세포; 용량당 약 0.5 x 108개의 세포 내지 약 1 x 109개의 세포; 용량당 약 1 x 109개의 세포 내지 약 5 x 109개의 세포; 용량당 약 0.5 x 109개의 세포 내지 약 8 x 109개의 세포; 용량당 약 3 x 109개의 세포 내지 약 3 x 1010개의 세포, 또는 사이의 임의의 범위이다. 일반적으로, 60 ㎏ 환자의 경우 1 x 108 세포/용량은 1.67 x 106 세포/㎏로 번역된다.
일 실시형태에서, 치료학적 조성물에서의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 부분 또는 단일 제대혈에서의 면역 세포의 수이거나, 적어도 0.1 x 105 세포/㎏ 체중, 적어도 0.5 x 105 세포/㎏ 체중, 적어도 1 x 105 세포/㎏ 체중, 적어도 5 x 105 세포/㎏ 체중, 적어도 10 x 105 세포/㎏ 체중, 적어도 0.75 x 106 세포/㎏ 체중, 적어도 1.25 x 106 세포/㎏ 체중, 적어도 1.5 x 106 세포/㎏ 체중, 적어도 1.75 x 106 세포/㎏ 체중, 적어도 2 x 106 세포/㎏ 체중, 적어도 2.5 x 106 세포/㎏ 체중, 적어도 3 x 106 세포/㎏ 체중, 적어도 4 x 106 세포/㎏ 체중, 적어도 5 x 106 세포/㎏ 체중, 적어도 10 x 106 세포/㎏ 체중, 적어도 15 x 106 세포/㎏ 체중, 적어도 20 x 106 세포/㎏ 체중, 적어도 25 x 106 세포/㎏ 체중, 적어도 30 x 106 세포/㎏ 체중, 1 x 108 세포/㎏ 체중, 5 x 108 세포/㎏ 체중 또는 1 x 109 세포/㎏ 체중이다.
일 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포의 용량은 대상체에게 전달된다. 일 예시적인 실시형태에서, 대상체에게 제공되는 세포의 유효량은 적어도 2 x 106개의 세포/㎏, 적어도 3 x 106개의 세포/㎏, 적어도 4 x 106개의 세포/㎏, 적어도 5 x 106개의 세포/㎏, 적어도 6 x 106개의 세포/㎏, 적어도 7 x 106개의 세포/㎏, 적어도 8 x 106개의 세포/㎏, 적어도 9 x 106개의 세포/㎏, 또는 적어도 10 x 106개의 세포/㎏, 또는 그 이상의 세포/㎏, 및 모든 개재하는 세포 용량이다.
다른 예시적인 실시형태에서, 대상체에게 제공되는 세포의 유효량은 약 2 x 106개의 세포/㎏, 약 3 x 106개의 세포/㎏, 약 4 x 106개의 세포/㎏, 약 5 x 106개의 세포/㎏, 약 6 x 106개의 세포/㎏, 약 7 x 106개의 세포/㎏, 약 8 x 106개의 세포/㎏, 약 9 x 106개의 세포/㎏, 또는 약 10 x 106개의 세포/㎏, 또는 이것 초과의 세포/㎏ 및 모든 개재하는 세포 용량이다.
다른 예시적인 실시형태에서, 대상체에게 제공되는 세포의 유효량은 약 2 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 10 x 106개의 세포/㎏, 약 3 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 10 x 106개의 세포/㎏, 약 4 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 10 x 106개의 세포/㎏, 약 5 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 10 x 106개의 세포/㎏, 2 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 6 x 106개의 세포/㎏, 2 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 7 x 106개의 세포/㎏, 2 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 8 x 106개의 세포/㎏, 3 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 6 x 106개의 세포/㎏, 3 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 7 x 106개의 세포/㎏, 3 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 8 x 106개의 세포/㎏, 4 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 6 x 106개의 세포/㎏, 4 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 7 x 106개의 세포/㎏, 4 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 8 x 106개의 세포/㎏, 5 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 6 x 106개의 세포/㎏, 5 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 7 x 106개의 세포/㎏, 5 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 8 x 106개의 세포/㎏, 또는 6 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 8 x 106개의 세포/㎏, 및 모든 개재하는 세포 용량이다.
일부 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포의 치료학적 용도는 단일 용량 치료이다. 일부 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포의 치료학적 용도는 다중 용량 치료이다. 일부 실시형태에서, 다중 용량 치료는 매일마다, 3일마다, 7일마다, 10일마다, 15일마다, 20일마다, 25일마다, 30일마다, 35일마다, 40일마다, 45일마다 또는 50일마다, 또는 사이의 임의의 숫자의 일에 하나의 용량이다. 일부 실시형태에서, 다중 용량 치료는 3, 또는 4, 또는 5, 매주 1회 용량을 포함한다. 3, 또는 4, 또는 5를 포함하는 다중 용량 치료의 일부 실시형태에서, 매주 1회 용량은 추가의 단일 용량 또는 다중 용량이 필요한지를 결정하기 위한 관찰 기간을 추가로 포함한다.
본 발명의 유래된 조혈 계통 세포의 집단을 포함하는 조성물은 멸균일 수 있고, 인간 환자에 대한 투여에 적합하고 준비될 수 있다(즉, 임의의 추가의 가공 없이 투여될 수 있음). 투여에 준비된 세포 기반 조성물은 상기 조성물이 대상체에 대한 이식 또는 투여 전에 임의의 추가의 가공 또는 조작을 필요로 하지 않는다는 것을 의미한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 약제에 의한 투여 전에 확장되고/되거나 조절된 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단을 제공한다. 사이토카인 신호전달 복합체 및/또는 CAR을 발현하도록 유전자 조작된 유래된 조혈 계통 세포에 대해, 예를 들어 미국특허 제6,352,694호에 기재된 것과 같은 방법을 이용하여 세포를 활성화하고 확장시킬 수 있다.
특정한 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포에 대한 1차 자극 신호 및 공동자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 각각의 신호를 제공하는 약제는 용액에 있거나 표면에 커플링될 수 있다. 약제는 표면에 커플링될 때 동일한 표면에(즉, "시스" 형성으로) 또는 개별 표면에(즉, "트랜스" 형성으로) 커플링될 수 있다. 대안적으로, 하나의 약제는 용액 중의 표면 및 다른 약제에 커플링될 수 있다. 일 실시형태에서, 공동자극 신호를 제공하는 약제는 세포 표면에 결합될 수 있고, 1차 활성화 신호를 제공하는 약제는 용액 중에 있거나 표면에 커플링된다. 특정한 실시형태에서, 약제 둘 모두는 용액에 있을 수 있다. 다른 실시형태에서, 약제는 가용성 형태로 있을 수 있고, 이후 Fc 수용체를 발현하는 세포 또는 항체 또는 다른 결합제와 같은 표면에 가교결합할 수 있고, 이는 본 발명의 실시형태에서 T 림프구를 활성화하고 확장하는 데 사용하기 위해 고려되는 인공 항원 제시 세포(aAPC)에 대해 예컨대 미국 특허출원공개 US 2004/0101519호 및 미국 특허출원공개 US 2006/0034810호에 개시된 약제에 결합할 것이다.
치료될 대상체의 컨디션에 따라 투여량, 빈도 및 프로토콜의 약간의 변동이 필연적으로 발생할 것이다. 투여를 책임지는 사람은 임의의 사건에서 개별 대상체에 대한 적절한 용량, 빈도 및 프로토콜을 결정할 것이다.
실시예
하기 실시예는 제한의 방식이 아니라 예시의 방식으로 제공된다.
실시예 1 - 재료 및 방법
상이한 세이프 하버 좌위 통합 전략과 조합되어 다양한 프로모터의 제어 하에 자살 시스템을 효과적으로 선택하고 시험하기 위해, 단일 또는 다수의 유전 조절에 의해 클론 hiPSC의 분화를 허용하도록 단일 세포 계대배양 및 고속, 96웰 플레이트 기반 유세포분석법 분류가 가능하게 하는 출원인의 독점적 hiPSC 플랫폼이 사용되었다.
소분자 배양에서의 hiPSC 유지 : 배양의 포화상태가 75% 내지 90%에 도달하면 hiPSC를 단일 세포로서 통상적으로 계대배양하였다. 단일 세포 분리를 위해, hiPSC를 PBS(Mediatech)로 1회 세척하고, 단일 세포 분리를 보장하도록 37℃에서 3분 내지 5분 동안 Accutase(Millipore)로 처리한 후 피펫팅하였다. 이후, 단일 세포 현탁액을 종래의 배지와 동일한 부피에서 혼합하고, 225 × g에서 4분 동안 원심분리하고, FMM에 재현탁하고, Matrigel 코팅된 표면에 플레이팅하였다. 계대배양은 통상적으로 1:6 내지 1:8이고, 37℃에서 2시간 내지 4시간 동안 Matrigel로 미리 코팅된 조직 배양 플레이트로 옮기고, 2일 내지 3일마다 FMM을 공급하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 설정된 습윤 인큐베이터에서 세포 배양을 유지시켰다.
관심 양상의 표적화된 편집을 위한 ZFN, CRISPR에 의한 인간 iPSC 조작 : 예로서 ROSA26 표적화된 삽입을 사용하여, ZFN 매개된 게놈 편집을 위해, 200만개의 iPSC를 AAVS1 표적화된 삽입을 위해 2.5 ㎍의 ZFN-L(FTV893), 2.5 ㎍의 ZFN-R(FTV894)과 5 ㎍의 공여자 작제물의 혼합물에 의해 형질주입하였다. CRISPR 매개된 게놈 편집을 위해, 200만개의 iPSC를 ROSA26 표적화된 삽입을 위해 5 ㎍의 ROSA26-gRNA/Cas9(FTV922)와 5 ㎍의 공여자 작제물의 혼합물로 형질주입하였다. 매개변수 1500 V, 10 ms, 3 펄스를 사용하여 Neon 형질주입 시스템(Life Technologies)을 사용하여 형질주입을 수행하였다. 형질주입 후 2일 또는 3일차에, 플라스미드가 인공 프로모터-드라이버 GFP 및/또는 RFP 발현 카세트를 함유하면 유세포분석법을 이용하여 형질주입 효능을 측정하였다. 형질주입 후 4일차에, 표적화된 세포를 선택하도록 처음 7일 동안 0.1 ㎍/ml 및 7일 후 0.2 ㎍/ml의 농도로 퓨로마이신을 배지에 첨가하였다. 퓨로마이신 선택 동안, 10일차에 세포를 새로운 Matrigel 코팅된 웰에 계대배양하였다. 퓨로마이신 선택의 16일차 또는 그 후에, GFP+ iPS 세포 백분율에 대해 유세포분석법에 의해 생존 세포를 분석하였다.
게놈 편집된 iPSC의 벌크 분류 및 클론 분류 : ZFN 또는 CRISPR-Cas9를 사용하여 게놈 표적화된 편집을 갖는 iPSC는 퓨로마이신 선택의 20일 후 GFP+SSEA4+TRA181+ iPSC에 대해 벌크 분류되고 클론 분류되었다. 단일 세포 분리된 표적화된 iPSC 풀을 Hank 균형 염 용액(MediaTech), 4% 태아 소 혈청(Invitrogen), 1x 페니실린/스트렙토마이신(Mediatech) 및 10 mM Hepes(Mediatech)를 함유하는 차가운 염색 완충제에 재현탁하고; 최적 수행을 위해 새롭게 만들었다. SSEA4-PE, TRA181-Alexa Fluor-647(BD Biosciences)을 포함하는 접합된 1차 항체를 세포 용액에 첨가하고, 15분 동안 얼음에서 인큐베이팅하였다. 모든 항체는 100만개의 세포당 100 μL의 염색 완충제 중의 7 μL로 사용되었다. 용액을 염색 완충제에서 1회 세척하고, 225 g에서 4분 동안 스피닝하고, 10 μM 티아조비빈을 함유하는 염색 완충제에 재현탁하고, 유세포분석법 분류를 위해 얼음에서 유지시켰다. FACS Aria II(BD Biosciences)에서 유세포분석법 분류를 수행하였다. 벌크 분류를 위해, GFP+SSEA4+TRA181+ 세포를 게이팅하고, 7 ml의 FMM이 충전된 15 ml 정규 관에 분류하였다. 분류된 세포를 클론 분류를 위해 웰당 3 사건의 농도로 100 μM 노즐을 사용하여 96웰 플레이트에 직접 분사하였다. 각각의 웰을 5 ㎍/mL의 피브로넥틴 및 1x 페니실린/스트렙토마이신(Mediatech)으로 보충되고 5x Matrigel로 미리 밤새 코팅된 200 μL의 FMM으로 사전충전하였다. 5x Matrigel 사전코팅은 1 분취액의 Matrigel을 5 mL의 DMEM/F12에 첨가하고, 이후 4℃에서 밤새 인큐베이팅하여 적절한 재현탁이 되게 하고, 마지막으로 웰당 50 μL로 96웰 플레이트에 첨가한 후 37℃에서 밤새 인큐베이팅하는 것을 포함하였다. 배지를 각각의 웰에 첨가하기 직전에 5x Matrigel을 흡인한다. 분류 완료 시, 96웰 플레이트를 인큐베이션 전에 225 g에서 1분 내지 2분 동안 원심분리하였다. 플레이트를 7일 동안 방해되지 않게 두었다. 7일차에, 각각의 웰로부터 150 μL의 배지를 제거하고, 100 μL의 FMM으로 대체하였다. 분류 후 10일차에 추가의 100 μL의 FMM을 웰에 재공급하였다. 2일만큼 일찍 콜로니 형성이 검출되었고, 분류 후 7일 내지 10일차에 대부분의 콜로니가 확장하였다. 제1 계대배양에서, 웰을 PBS로 세척하고, 37℃에서 대략 10분 동안 30 μL의 Accutase로 분리하였다. 연장된 Accutase 처리의 필요성은 연장된 기간 동안 배양에서 정지된 콜로니의 조밀함을 반영한다. 세포가 분리하는 것으로 보인 후, 200 μL의 FMM을 각각의 웰에 첨가하고, 수회 피펫팅하여 콜로니를 파괴한다. 분리된 콜로니를 5x Matrigel로 미리 코팅된 96웰 플레이트의 다른 웰로 옮기고, 이후 인큐베이션 전에 225 g에서 2분 동안 원심분리하였다. 확장 전에 초기 콜로니를 분산시키도록 이 1:1 계대배양을 수행한다. 3분 내지 5분 동안 Accutase 처리 및 75% 내지 90% 포화상태 시 FMM 중의 1x Matrigel로 미리 코팅된 더 큰 웰로의 1:4 내지 1:8의 확장에 의해 후속하는 계대배양을 통상적으로 수행하였다. GFP 형광 수준 및 TRA1-81 발현 수준에 대해 각각의 클론성 세포주를 분석하였다. 거의 100% GFP+ 및 TRA1-81+를 갖는 클론주는 추가의 PCR 스크리닝 및 분석을 위해 선택되었고, 마스터 세포 은행으로서 저온보존되었다. Guava EasyCyte 8 HT(Millipore)에서 유세포분석법 분석을 수행하고, Flowjo(FlowJo, LLC)를 사용하여 분석하였다.
CAR19-2A 사이토카인RF iT 세포의 생성
출원인의 독점적 세포 재프로그래밍 및 조작 플랫폼 및 단계 특이적 T 세포 분화 프로토콜을 사용하여, iPSC가 단일 세포 수준에서 조작되어 완전히 특징화된 클론성 iPSC주를 생성할 수 있고, 이후 확장성이 뛰어난 제조 공정(100,000배 초과 확장)에서 CAR 발현 T계 세포(CAR-iT)를 산출하기 위해 액세스할 수 있음이 입증되었다. 조작된 iPSC의 분화 및 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 영역으로의 CAR의 이중대립유전자 표적화를 통해, CD19에 특이적인 iT 세포 발현 키메릭 항원 수용체는 균일한 CAR 발현(99.0 ± 0.5% CAR+) 및 T 세포 수용체(TCR) 발현의 완전한 제거와 함께 생성되어, 동종이계 환경에서 이식편대숙주병(GvHD)의 위험을 완화하였다. 본 출원에 제공된 것과 같은 CD3ζ1XX를 포함하는 엔도도메인을 갖는 1XX-CAR 구성이 예시 목적으로 선택되었다. iT 세포로 도입된 경우, CD19-CAR은 향상된 항원 특이성을 보였다. 외인성 사이토카인 서포트에 의존하지 않으면서 지속성을 시험하기 위해, IL7 수용체 융합물(IL7RF)을 포함하는 하나 이상의 신호전달-융합 복합체를 iPSC로 조작하고, CAR-iT 세포 표현형, 지속성, 및 효능에 대한 도입된 사이토카인 신호전달 복합체의 영향을 연구하였다.
실시예 2 - 사이토카인 수용체 융합 전이유전자는 CAR-iT 세포의 지속성을 향상시킴
iPSC에서 T계 세포로의 세포 분화는 일반적으로 상이한 단계의 다양한 성장 인자 및/또는 사이토카인으로의 분화에서 세포의 노출을 수반한다. 본원에 제시된 바와 같이, 사이토카인 수용체 융합(RF) 전이유전자를 함유하는 CAR-iT 세포는, RF 전이유전자가 부족한 CAR-iT 세포와 비교하여, 외인성 사이토카인 서포트에 의존하지 않으면서 분화되고 확장된 경우, 향상된 지속성을 부여한다는 것을 확인하였다.
사이토카인 조합의 매트릭스는 IL-7 수용체 융합물(IL7RF)을 포함하는 조작된 신호전달-융합 복합체와 함께 또는 복합체가 없는 iCD34+ 세포로부터의 iT 세포의 확장 및 성숙에 대해 시험되었고, iT 세포의 상대적인 확장을 비교하였다. 도 3a 내지 3d에 도시된 바와 같이, IL7RF 전이유전자를 함유하는 모든 3개의 사이토카인의 존재 하에서 더 양호한 확장 및 생존능력이 확인된 iT 세포(IL7RF KI 풀)는, 대조 iT 세포와 대조적으로, 사이토카인의 부재에도 불구하고(즉 IL7RF 전이유전자 부재), 개선된 세포 확장을 보였다(도 3a 내지 3b). 추가로, IL7RF 전이유전자를 함유하는 iT 세포는 또한 동일한 조건 하에서 대조 iT 세포와 비교하여, 단지 IL2의 조건 하에서 향상된 확장을 보이고, 이는 임의의 사이토카인 첨가와 독립적으로 또는 IL2 첨가와 상승적으로, IL7RF의 능력이 세포 확장을 향상시킴을 의미한다.
연속적 자극 어세이에서 시간에 따른 집단 중 상대적인 CAR-iT 세포 확장, CAR 발현 iT 세포, CD69-(T 세포 조기 활성화 마커) 발현 iT 세포, 또는 PD-1 발현 iT 세포의 백분율을 또한 실시하여 다양한 사이토카인 조건 하에서 IL7RF의 영향을 평가하였다.5 x 105개의 효과기 세포 및 5 x 105개의 표적 세포를 용기에서 1:1 효과기:표적(E:T) 비로 혼합하였고, 이때 5 x 105개의 신선한 표적 세포를 연속적 자극 어세이에 매일 첨가하고, 종양 성장의 매일의 효과기 및 판독을 유세포분석에 의해 수득하였다. 도 3a 내지 3b에 도시된 바와 같이, IL7RF 발현 CAR-iT 세포의 세포 확장은, 외인성 사이토카인 노출이 없는 경우, 연속적 자극과 함께 장기간에 걸쳐 지속된 반면, IL7RF가 없는 CAR-iT 세포의 장기간 지속성은 사이토카인의 존재 또는 조합과 관계없이 연속적 자극 하에서 거의 존재하지 않았으며, 이는 반복적으로 자극된 경우 탈진을 극복하면서 지속성을 유지하는 IL7RF의 고유의 역할을 나타냈다.
도 3a 내지 3b의 관찰이 유사하게 반영되며, 이는 도 3c 내지 3d에 도시된 바와 같이 연속 자극 과정에 걸쳐 IL7RF/CAR-iT 세포 백분율의 사이토카인-의존성 증가를 입증한 것과 일치한다. 각각의 사이토카인 확장 조건의 경우 CD69+ IL7RF/CAR-iT 세포와 비교하여 CD69 발현(CD69+) CAR-iT 세포의 백분율이 도 4a 내지 4b에 도시되어 있고, 이는 활성화된 CAR-iT 세포의 상대적으로 높은 확장 및 지속성이, CAR-iT 세포가 또한 IL7RF를 발현하는 경우, 임의의 특정 사이토카인(IL2, IL7, IL15) 또는 이의 임의의 조합에 의존적이지 않음을 시사한다. CAR-iT 및 IL7RF/CAR-iT 세포에서의 활성화 마커 CD69의 발현을 위한 염색은 IL7RF/CAR-iT 세포에서의 보다 긴 CD69 발현의 유지를 보였다.
PD1은 면역억제 수용체이고, T 세포 상의 PD-1 과발현은 암에서 면역 회피에 수반된다. 각각의 사이토카인 확장 조건 하에서 PD1+ IL7RF/CAR-iT 세포와 비교하여 PD1+ CAR-iT 세포 백분율이 도 5a 내지 5b에 도시되어 있다. PD1 발현의 억제는 임의의 제시된 사이토카인 조건 하에서(다양한 조합의 부재 또는 존재 하에서) IL7RF 전이유전자를 갖지 않는 것과 비교하여 IL7RF 발현 CAR-iT 세포에서 상당하다. 사이토카인-비의존성에 더불어, 또한 제시된 것은 CAR+, CD69+, 및/또는 PD1- 또는 PD1low인 IL7RF-iT 세포의 확장 및 지속성이 임의의 사이토카인 단독 존재 하에서 또는 임의의 조합의 존재 하에서 IL7RF 전이유전자가 없는 CAR-iT 세포보다 우수하다는 것이다. 예를 들어, 외인성 사이토카인 IL2 또는 IL7 단독 존재 하에서의 확장은, 대조 세포와 비교하여 IL7RF 전이유전자를 함유하는 CAR-iT 세포의 경우 또한 개선되었다. 또한, CAR-iT 세포로의 RF 전이유전자의 통합은 외인성 IL-15 서포트가 결여된 배양 배지(즉, 외인성 사이토카인을 함유하지 않는 배양 배지, 외인성 IL2만을 함유하는 배양 배지, 외인성 IL7만을 함유하는 배양 배지, 또는 외인성 IL2 및 IL7만을 함유하는 배양 배지)에서 확장되는 경우, RF 전이유전자가 결여된 CAR-iT 세포보다 향상된 지속성을 갖는 세포를 부여한다.
실시예 3 - 사이토카인 수용체 융합 전이유전자는 CAR-iT 세포의 기능을 인 비트로로서 향상시킴
IL7RF 전이유전자를 함유하는 CAR-iT 세포의 기능을 평가하기 위해 연속적 자극/사멸 어세이를 수행하였다. 이 어세이에서, 신선한 종양 세포를 배양물 중 CAR-iT 세포에 매일 첨가하고, AUC(곡선하 면적) 데이터를 초기(0 내지 1일차), 중기(0 내지 4일차) 및 후기(0 내지 10일차)에 평가하여, 효과기 세포에 의한 종양 성장 제어를 보였다.
도 6a에 도시된 바와 같이, 표준 조건(즉, IL2, IL7 및 IL15의 외인성 사이토카인 조합을 갖는 배지)에서 확장된 TRAC 좌위에서 IL7RF 전이유전자를 함유하는 CAR-iT 세포의 종양 성장 제어는 대조 CAR-iT 세포와 근접하였다. 그러나, 도 6b에 도시된 바와 같이, 배지에서 사이토카인의 부재 하에서 확장된 경우, IL7RF 전이유전자를 함유하는 CAR-iT 세포는 전체 어세이 전반에 걸쳐 IL7RF가 결여된 CAR-iT와 비교하여, 임의의 시점에서 유의하게 개선된 종양 성장 제어를 보였다. 도 6c는 IL7RF CAR-iT 세포 및 배지에서 IL2, IL7 및 IL15를 갖거나 갖지 않는 대조 세포의 10일차까지의 곡선하 면적(AUC) 데이터를 요약하고, 이는 표준 조건(즉, 사이토카인 조합을 갖는)에서의 확장이 CAR-iT 대조 세포의 종양 제어 능력을 증가시킨 반면, IL7RF/CAR-iT는 보충의 사이토카인 조합을 갖지 않고 확장될 때 훨씬 더 양호한 종양 제어를 가짐을 보였다. 10일차 AUC가 하기 설명된 것과 같은 인 비보 데이터와 상관관계가 있는 것을 추가로 도시하였다.
별도의 실험에서, 표준 조건(즉, IL2, IL7 및 IL15의 외인성 사이토카인 조합을 갖는 배지)에서 확장된 TRAC 좌위에서 IL7RF 전이유전자를 함유하는 CAR-iT 세포는 세포 성장에 대한 외인성 IL2 종양의 효과를 평가하기 위한 연속적 종양 재자극 어세이에 적용되었다. 이 어세이에서, IL7RF/CAR-iT 및 CAR-iT 대조 세포를 약 10 IU/ml 내지 약 250 IU/ml의 외인성 IL2를 함유하는 배지에서 2일마다 종양 표적 세포로 재자극하고, 배지에 외인성 사이토카인을 첨가하지 않은("사이토카인 없음") 동일한 세포의 종양 성장 제어와 비교하였다. 도 6d 및 6e에 도시된 바와 같이, 사이토카인이 없는 대조군에서, IL7RF/CAR-iT 세포는 종양 성장을 더 양호하게 제어했고, CAR-iT 대조 세포보다 더 높은 CAR+ iT 카운트를 가졌다. 추가로, 보다 높은 IL2 농도(50 및 250 IU/ml)에서, IL7RF/CAR-iT 및 CAR-iT 대조 세포는 유사하게 거동했고, 어세이 종료 시점에서 거의 완전히 표적 종양 세포를 제거하였다. 그러나, 보다 낮은 IL2 농도(10 IU/ml)에서, IL7RF/CAR-iT 세포는 CAR-iT 대조 세포보다 훨씬 더 양호한 종양 성장 억제 및 보다 높은 CAR+ iT 카운트를 유지하고, 이는 IL2 보충에 대한 낮은 의존성을 입증한다.
도 7a 내지 7b에 도시된 바와 같이, 사이토카인이 없는 확장 이외에, 배양 배지 내에서 IL2 단독, IL7 단독, 및 IL2 및 IL7 둘 모두의 존재 하에서 확장된 IL7RF 전이유전자를 함유하는 CAR-iT 세포는 또한 대조 세포와 비교하여 10일 어세이에 걸쳐 유의한 종양 성장 제어를 야기하였다. 과학적 이론에 구속되지 않으면서, IL7RF는 CAR-iT 세포를 분화 사이토카인 처리에 대해 민감화시켜, 확장 조건이 사이토카인이 없고, IL7 단독이고, IL2 단독이거나 IL7에 더불어 IL2인 경우 향상된 종양 세포 사멸 및/또는 제어를 야기함을 보인다. 이와 같이, 확장/성숙 배지에서 사용된 사이토카인을 변경하는 것은 IL7RF/CAR-iT 세포의 기능적 성능을 변경할 수 있지만, 분화 사이토카인 처리는 IL7RF 전이유전자 없이는 CAR-iT 세포에 명백한 영향을 갖지 않는다.
실시예 4 - 사이토카인 수용체 융합 전이유전자는 CAR-iT 세포의 기능을 인 비보로서 향상시킴
0일차 전에 3일 동안 Nalm6-루시퍼라아제 세포로 정맥 주사한 NSG 암컷 마우스에 종양 주입 후 3일, 6일, 및 9일차에 3 용량의 2 x 106 IL7RF/CAR-iT 세포, 또는 대조로서 1 용량의 2 x 106 CAR iT 세포를 주사하였다. 적용가능한 경우, 사이토카인 서포트를 마우스에 제공하였다. 생물발광 영상화(BLI)에 의해 종양 주사 후 7일, 14일, 22일 및 28일차에 종양 진행을 모니터링하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 종양 이식 후 22일차에, 사이토카인 부재 하에서; 또는 IL2 단독, IL7 단독, 또는 IL2 및 IL7 둘 모두의 존재 하에서 확장된 IL7RF/CAR-iT는 인 비보 항종양 기능을 보였고, 이는 또한 3일차에 개시하여 주당 2회로 3주 동안 IL2 및 IL15를 복강내 주사한 마우스에서 대조 CAR iT 세포에 비해 우수했다. 사이토카인 부재 하에서; 또는 IL7 단독의 존재 하에서 확장된 IL7RF/CAR-iT는 인 비보 항종양 기능을 보였고, 이는 또한 사이토카인 서포트를 제공하지 않은 마우스에서 대조 CAR iT 세포에 비해 우수했다. 도시된 바와 같이, 도 9에서 시간에 따른 인 비보 BLI 데이터는 도 6b에 도시된 10일차의 인 비트로 AUC 데이터와 상관관계가 있었고, CAR-iT 대조 세포가 종양 단독 군과 비교하여 종양 총량을 낮춘 반면, IL7RF/CAR-iT 세포는 사이토카인 서포트가 제공되지 않은 마우스 모델에서 CAR-iT 대조 세포와 비교하여 개선된 인 비보 기능을 입증했다는 것을 보였다.
실시예 5 - 변형된 분화 효과기 세포 검증 및 iPSC의 단계별 조작
다음으로, 사이토카인 수용체 융합 전이유전자를 포함하는 CAR iT 세포로 다중-항원 표적 포텐셜을 혼입하기 위해, iPSC 조작 및 분화를 통해 IL7RF/CAR-iT 세포에 고친화도 비-분열성 CD16(hnCD16) Fc 수용체를 도입하였다. hnCD16과 종양 항원 특이적 CAR의 조합은 단일클론 항체와의 조합적 사용을 통해 세포에 다중 항원 특이성을 부여하여 CAR-T 세포에서 대개 확인되는 항원 회피를 처리하였다. 표적으로서 CD19 음성 백혈병 세포를 이용하여 우수한 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)이 hnCD16 CAR iT 및 리툭시맙의 조합으로 증명되었다(E:T=1:1에서 % 특이적 세포독성, hnCD16 군 + 리툭시맙: 75.64 ± 2.12; 대조군 + 리툭시맙: 16.98 ± 3.87, P<0.001).
T 세포 적합성을 다루기 위해, T 세포에서 CD38 녹아웃(KO)의 역할도 조사했는데, 이는 이전에 산화 스트레스 유도된 아폽토시스에 대한 NK 세포 저항성을 중재하는 것으로 나타났다. CD38 유전자는 CD38 발현이 결여된 CAR-iT 세포를 생성하기 위한 iPSC 단계에서 파괴되고(% CD38+ 집단, CD38WT 군: 69.67 ± 24.34; CD38KO 군: 0.12 ± 0.11), 항원 매개된 자극 시, CD38KO CAR iT 세포는 보다 높은 백분율의 탈과립화(CD107a/b에서 2.3배 증가), 및 IFNγ(4.1배 증가) 및 TNFα(2.5배 증가) 생성을 보였다. 항원 특이적 인 비트로 종양 사멸은 또한 CD38KO CAR iT 세포(EC50, 3.2배 감소)에서 향상되었다. 마지막으로, 잠재적 숙주-매개 거부를 회피하기 위해, 유의하게 숙주-매개 거부를 감소시키는 것으로 나타난 불활성화 CAR(일부 맥락에서 동종이계 디펜스 수용체(ADR)로도 지칭됨)의 포함을 시험하였다. ADR 또는 inAct-CAR은 동종재활성화된(alloreactivate) 세포의 4-1BB, OX40, 및 CD40L과 같은 상향조절된 표면 단백질에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 키메릭 수용체이고, 상기 키메릭 수용체에 의한 이에 대한 결합은 동종재활성화된 세포를 탈활성화시키거나, 이의 활성화를 감소시킨다.
당업자는 본원에 기재된 방법, 조성물 및 생성물이 예시적인 실시형태를 나타내고, 본 발명의 범위에 제한으로 의도되지 않음을 용이하게 이해할 것이다. 본 발명의 범위 및 정신으로부터 벗어나지 않으면서 본원에 개시된 본 개시내용에 변하는 치환 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 용이하게 명확할 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 공보는 본 개시내용이 속하는 분야의 당업자의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 공보는 각각의 개별 공보가 인용되어 포함된 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 인용되어 포함된다.
본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에 본원에 예시적으로 기재된 본 개시내용이 적합하게 실행될 수 있다. 이와 같이, 예를 들어 각각의 경우에 본원에서 임의의 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진"은 다른 2가지 용어 중 어느 하나로 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아니라 설명의 면으로 사용되고, 도시되고 기재된 특징의 임의의 균등물 또는 이의 부분을 배제하는 이러한 용어 및 표현의 사용에서 의도되지 않지만, 청구된 본 개시내용의 범위 내에 다양한 변형이 가능하다고 인식된다. 따라서, 본 개시내용이 바람직한 실시형태에 의해 구체적으로 개시되어 있고, 본원에 개시된 선택적인 특징, 변형 및 관념의 변경이 당업자에 의해 분류될 수 있지만, 이러한 변형 및 변경이 청구항에 의해 정의된 바와 같이, 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다고 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Fate Therapeutics, Inc. Valamehr, Bahram Peralta, Eigen Chang, Chia-Wei <120> Engineered iPSC and Persistent Immune Effector Cells <130> 184143-631601 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 635 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 1 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser 20 25 30 Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile 35 40 45 Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile 50 55 60 Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys 65 70 75 80 Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His 85 90 95 Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly 100 105 110 Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr 115 120 125 Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn 130 135 140 Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp 145 150 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Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly 245 250 255 Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg 260 265 270 Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Phe Phe Pro Pro Gly Tyr 275 280 285 Gln Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr 290 295 300 Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp 305 310 315 320 Trp Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys 325 330 335 <210> 22 <211> 1032 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 22 cttggagaca acatgtggtt cttgacaact ctgctccttt gggttccagt tgatgggcaa 60 gtggacacca caaaggcagt gatcactttg cagcctccat gggtcagcgt gttccaagag 120 gaaaccgtaa ccttgcattg tgaggtgctc catctgcctg ggagcagctc tacacagtgg 180 tttctcaatg gcacagccac tcagacctcg acccccagct acagaatcac ctctgccagt 240 gtcaatgaca gtggtgaata caggtgccag agaggtctct cagggcgaag tgaccccata 300 cagctggaaa tccacagagg ctggctacta ctgcaggtct ccagcagagt cttcacggaa 360 ggagaacctc tggccttgag gtgtcatgcg tggaaggata agctggtgta caatgtgctt 420 tactatcgaa atggcaaagc ctttaagttt ttccactgga attctaacct caccattctg 480 aaaaccaaca taagtcacaa tggcacctac cattgctcag gcatgggaaa gcatcgctac 540 acatcagcag gaatatctgt cactgtgaaa gagctatttc cagctccagt gctgaatgca 600 tctgtgacat ccccactcct ggaggggaat ctggtcaccc tgagctgtga aacaaagttg 660 ctcttgcaga ggcctggttt gcagctttac ttctccttct acatgggcag caagaccctg 720 cgaggcagga acacatcctc tgaataccaa atactaactg ctagaagaga agactctggg 780 ttatactggt gcgaggctgc cacagaggat ggaaatgtcc ttaagcgcag ccctgagttg 840 gagcttcaag tgcttggcct ccagttacca actcctgtct ggtttcatta ccaagtctct 900 ttctgcttgg tgatggtact cctttttgca gtggacacag gactatattt ctctgtgaag 960 acaaacattc gaagctcaac aagagactgg aaggaccata aatttaaatg gagaaaggac 1020 cctcaagaca aa 1032 <210> 23 <211> 1020 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 23 cttggagaca acatgtggtt cttgacaact ctgctccttt gggttccagt tgatgggcaa 60 gtggacacca caaaggcagt gatcactttg cagcctccat gggtcagcgt 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Claims (60)

  1. 세포 또는 이의 집단으로서, (a) 세포는 재조합 사이토카인 신호전달 복합체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 선택적으로 키메릭 항원 수용체(CAR)를 포함하고; (b) 세포는 진핵 세포, 동물 세포, 인간 세포, 면역 세포, 피더 세포(feeder cell), 유도 만능줄기 세포(iPSC), 또는 이로부터 분화된 분화 세포이고; (c) 사이토카인 신호전달 복합체는 (i) 전체 또는 부분 사이토카인 및 (ii) 전체 또는 부분 IL7 수용체, IL2 수용체, IL4 수용체, IL9 수용체, IL21 수용체, 또는 γC 수용체를 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  2. 제1항에 있어서, 사이토카인 신호전달 복합체는 개별 작제물 또는 바이-시스트로닉 작제물에서 CAR과 공동 발현되는, 세포 또는 이의 집단.
  3. 제1항에 있어서, iPSC는 클론성 iPSC, 단일 세포 해리 iPSC, iPSC 세포주 세포, 또는 iPSC 마스터 세포 은행(MCB) 세포이거나; 상기 분화 세포는 (i) 분화 CD34+ 세포, 분화 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, 분화 조혈 다능성 전구 세포, 분화 T 세포 전구 세포, 분화 NK 세포 전구 세포, 분화 T계 세포, 분화 NKT계 세포, 분화 NK계 세포, 또는 분화 B계 세포; 또는 (ii) 대응 1차 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 및/또는 B 세포에 존재하지 않는 하나 이상의 기능적 특징을 갖는 분화 효과기 세포를 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인 신호전달 복합체는 IL7 및 IL7 수용체의 부분 또는 전체 펩티드를 포함하고, 상기 사이토카인 신호전달 복합체는:
    (a) 하기 중 적어도 하나를 포함하고;
    (i) 자가 절단 펩티드를 사용하여 공동 발현된 IL7 및 IL7Rα;
    (ii) IL7 및 IL7Rα의 융합 단백질(IL7RF);
    (iii) 절두된 또는 제거된 IL7Rα의 세포내 도메인과의 IL7/IL7Rα 융합 단백질;
    (iv) IL7과 IL7Rβ의 융합 단백질;
    (v) IL7과 공통 수용체 γC의 융합 단백질, 상기 공통 수용체 γC는 천연 또는 변형된 것임; 및
    (vi) IL7Rβ의 동종이합체,
    여기서, (i) 내지 (vi) 중 어느 하나는 선택적으로 개별 작제물 또는 바이-시스트로닉 작제물에서 CAR과 공동 발현됨;
    선택적으로,
    (b) 일시적으로 발현되는, 세포 또는 이의 집단.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 하기 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 세포 또는 이의 집단:
    (i) CD38 녹아웃;
    (ii) HLA-I 결핍 및/또는 HLA-II 결핍;
    (iii) HLA-G 또는 비절단성 HLA-G의 발현 도입, 또는 CD58 및 CD54의 하나 또는 둘 모두의 녹아웃;
    (iv) 외인성 CD16 또는 이의 변이체;
    (v) 키메릭 융합 수용체(CFR);
    (vi) 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 펩티드 또는 전체 펩티드;
    (vii) 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나;
    (viii) B2M, CIITA, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD25, CD69, CD44, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 및 TIGIT의 적어도 하나의 결실 또는 파괴; 또는
    (ix) HLA-E, 4-1BBL, CD3, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, 항원-특이적 TCR, Fc 수용체, 항체 또는 이의 기능적 변이체 또는 이의 단편, 관문 억제제, 인게이저, 및 작용제와 커플링하기 위한 표면 유도 수용체 중 적어도 하나의 도입.
  6. 제4항에 있어서, 세포는 말초혈, 제대혈 또는 동일한 유전자 편집(들)이 없는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 얻은 이의 대응 일차 세포와 비교하여, 하기 중 하나 이상을 포함하는 치료적 특성을 갖는, 세포 또는 이의 집단:
    (i) 세포독성의 증가;
    (ii) 지속성 및/또는 생존율의 개선;
    (iii) 종양 부위에 방관자 면역 세포를 이동시키고/시키거나 활성화하거나 동원하는 데 있어서의 능력의 향상;
    (iv) 종양 침투의 개선;
    (v) 종양 면역억제를 감소시키는 능력의 향상;
    (vi) 종양 항원 회피를 구제하는 능력의 개선;
    (vii) 아폽토시스의 제어;
    (viii) ADCC의 향상 또는 획득; 및
    (ix) 동족살해(fratricide)를 피하는 능력.
  7. 제5항에 있어서, 외인성 CD16 또는 이의 변이체는 하기 중 적어도 하나를 포함하는, 세포 또는 이의 집단:
    (a) 고친화도 비절단성 CD16(hnCD16);
    (b) CD16의 엑토도메인 도메인에서의 F176V 및 S197P;
    (c) CD64로부터 기원한 전체 또는 부분 엑토도메인;
    (d) 비-천연적(또는 비-CD16) 막관통 도메인;
    (e) 비-천연적(또는 비-CD16) 세포내 도메인;
    (f) 비-천연적(또는 비-CD16) 신호전달 도메인;
    (g) 비-천연적 자극 도메인; 및
    (h) CD16으로부터 기원하지 않고, 동일한 폴리펩티드 또는 상이한 폴리펩티드로부터 기원한 막관통 도메인, 신호전달 도메인 및 자극 도메인.
  8. 제4항에 있어서, 분화 효과기 세포는 사이토카인 신호전달 복합체가 없는 이의 대응 세포와 비교하여, 하기 중 적어도 하나를 포함하는, 세포 또는 이의 집단:
    (a) 개선된 상대적 세포 확장;
    (b) 증가된 CAR 발현 백분율;
    (c) 증가된 CD69 발현; 및
    (d) 감소된 PD-1 발현.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은:
    (i) T 세포 특이적 또는 NK 세포 특이적이고;
    (ii) 이중특이적 항원 결합 CAR이고;
    (iii) 스위치 가능한 CAR이고;
    (iv) 이합체화된 CAR이고;
    (v) 분할 CAR이고;
    (vi) 다중-사슬 CAR이고;
    (vii) 유도성 CAR이고;
    (viii) 불활성화 CAR이고;
    (ix) 선택적으로 개별 작제물에서 또는 바이-시스트로닉 작제물에서 관문 억제제와 공동발현되고;
    (x) CD19, BCMA, CD20, CD22, CD38, CD123, HER2, CD52, EGFR, GD2, MICA/B, MSLN, VEGF-R2, PSMA 및 PDL1 중 적어도 하나에 특이적이고; 그리고/또는
    (xi) ADGRE2, 탄산탈수효소 IX(CAIX), CCR1, CCR4, 암배아 항원(CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원, 상피 당단백질-2(EGP-2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 부착 분자(EpCAM), EGFRvIII, 수용체 티로신-단백질 키나아제 erb­B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산-결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 엽산 수용체-α, 갱글리오사이드 G2(GD2), 갱글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2), 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 아단위 알파-2(IL-13Rα2), κ-경쇄, 키나아제 삽입 도메인 수용체(KDR), 루이스 A(CA19.9), 루이스 Y(LeY), L1 세포 부착 분자(L1-CAM), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A 1(MAGE-A1), MICA/B, 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), PRAME 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 종양 연관된 당단백질 72(TAG-72), TIM-3, TRBCI, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­R2), 윌름스 종양 단백질(WT-1), 및 병원성 항원 중 어느 하나에 특이적이고; 선택적으로,
    (i) 내지 (xi) 중 어느 하나의 CAR은 TCR 좌위에서 삽입되고/되거나, TCR의 내인성 프로모터에 의해 유도되고/되거나, TCR은 CAR 삽입에 의해 녹아웃되는, 세포 또는 이의 집단.
  10. 제9항에 있어서, 불활성화 CAR은 활성화된 수용체 면역 세포에서 상향조절된 표면 단백질을 표적으로 하는, 세포 또는 이의 집단.
  11. 제10항에 있어서, 불활성화 CAR은 CD38-CAR, 4-1BB-CAR, OX40-CAR, 및 CD40L-CAR 중 적어도 하나를 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  12. 제5항에 있어서, CFR은 막관통 도메인에 융합된 엑토도메인을 포함하고, 이는 엔도도메인에 작동적으로 연결되어 있고, 엑토도메인, 막관통 도메인 및 엔도도메인은 임의의 소포체(ER) 체류 신호 또는 엔도사이토시스 신호를 포함하지 않는, 세포 또는 이의 집단.
  13. 제12항에 있어서, CFR의 엑토도메인은 CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD28, CD5, CD16, CD64, CD32, CD33, CD89, NKG2C, NKG2D, 이의 임의의 기능적 변이체, 및 조합 또는 키메라 중 적어도 하나를 포함하는 신호전달 단백질의 세포외 부분의 전체 또는 부분 길이를 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  14. 제12항에 있어서, CFR의 엑토도메인은 CD3, CD28, CD5, CD16, CD64, CD32, CD33, CD89, NKG2C, NKG2D, 또는 이의 임의의 기능적 변이체의 세포외 부분에 특이적인 적어도 하나의 결합 도메인을 포함하는 선택된 작용제에 결합 시 신호 유도를 개시하거나; 상기 선택된 작용제는 B7H3, BCMA, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD179b, CEA, CLEC12A, CS-1, DLL3, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, FLT-3, FOLR1, FOLR3, GD2, gpA33, HER2, HM1.24, LGR5, MSLN, MCSP, MICA/B, PSMA, PAMA, P-카드헤린, 또는 ROR1을 포함하는 적어도 하나의 종양 항원에 특이적인 결합 도메인을 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, CFR의 엔도도메인은 CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137(4-1BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, 또는 NKG2D 폴리펩티드의 적어도 하나의 전체 길이 또는 부분을 포함하는 세포독성 도메인을 포함하고; 선택적으로 엔도도메인은 하기 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 세포 또는 이의 집단:
    (i) CD2, CD27, CD28, CD40L, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 또는 NKG2D 폴리펩티드의 전체 길이 또는 부분, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 공동자극 도메인;
    (ii) CD28, 4-1BB, CD27, CD40L, ICOS, CD2의 전체 길이 또는 부분, 또는 이의 조합을 포함하는 공동자극 도메인;
    (iii) IL7R, IL15R, IL18R, IL12R, IL23R, 또는 이의 조합을 포함하는 사이토카인 수용체의 엔도도메인의 전체 길이 또는 부분을 포함하는 지속성 신호전달 도메인; 및/또는
    (iv) 수용체 티로신 키나아제(RTK), 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), EGFR 또는 FAS 수용체의 전체 또는 부분 세포내 부분.
  16. 제5항에 있어서, 관문 억제제는 PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 및 억제성 KIR을 포함하는 하나 이상의 관문 분자에 대한 길항제인, 세포 또는 이의 집단.
  17. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 하기를 포함하는, 세포 또는 이의 집단:
    (i) 세이프 하버 좌위 또는 선택된 유전자 좌위에서 통합된 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드; 또는
    (ii) 상이한 세이프 하버(safe harbor) 좌위 또는 2개 이상의 선택된 유전자 좌위에서 통합된 2개 초과의 외인성 폴리뉴클레오티드.
  18. 제17항에 있어서, 세이프 하버 좌위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH 또는 RUNX1 중 적어도 하나를 포함하거나; 상기 선택된 유전자 좌위는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD38, CD25, CD44, CD58, CD54, CD56, CD69, CD71, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT 중 하나이고/이거나; 외인성 폴리뉴클레오티드의 통합은 상기 좌위에서 유전자의 발현을 녹아웃하는, 세포 또는 이의 집단.
  19. 제18항에 있어서, TCR 좌위는 TCR 알파 및/또는 TCR 베타의 불변 영역인, 세포 또는 이의 집단.
  20. 제3항 또는 제4항에 있어서, 분화 효과기 세포는 T계 세포이고, 외인성 IL15를 함유하지 않는 배양 배지에서 확장되는, 세포 또는 이의 집단.
  21. 제20항에 있어서, 배양 배지는 외인성 IL2 및 IL7 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  22. 제20항에 있어서, 배양 배지는 IL2 또는 IL7 어느 것도 함유하지 않는, 세포 또는 이의 집단.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 분화 효과기 세포는 CD69+, 및/또는 PD1- 또는 PD1low인, 세포 또는 이의 집단.
  24. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 분화 효과기 세포는 사이토카인 서포트(cytokine support)의 부재 하에서 사이토카인 신호전달 복합체가 없는 이의 대응 세포와 비교하여, 항종양 기능 및/또는 지속성이 증가된, 세포 또는 이의 집단.
  25. T계 세포 확장 및/또는 종양 세포 제어 및 클리어런스의 개선 방법으로서, 상기 방법은 T계 세포에 IL7 사이토카인 신호전달 복합체를 도입하여, 사이토카인 신호전달 복합체가 없는 대응 세포와 비교하여, 개선된 세포 확장 및/또는 종양 세포 제어 및 클리어런스를 갖는 T계 세포를 생성하고, 상기 T계 세포는 선택적으로 키메릭 항원 수용체(CAR)를 추가로 포함하는, 개선 방법.
  26. 제25항에 있어서, 도입 단계는 (i) 유도 만능줄기 세포(iPSC)를 조작하여 IL7 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로, CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 편집된 iPSC를 생성하는 단계; 및 (ii) 게놈 편집된 iPSC를 IL7 신호전달 복합체를 포함하는 분화 T계 세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 개선 방법.
  27. 제26항에 있어서, 말초혈, 제대혈, 또는 동일한 게놈 편집(들)이 없는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 얻은 이의 대응 1차 세포와 비교하여, 게놈 편집된 iPSC는 하기를 야기하는 하나 이상의 편집을 추가로 포함하는, 개선 방법:
    (i) CD38 녹아웃;
    (ii) HLA-I 결핍 및/또는 HLA-II 결핍;
    (iii) HLA-G 또는 비절단성 HLA-G의 발현 도입, 또는 CD58 및 CD54의 하나 또는 둘 모두의 녹아웃;
    (iv) 외인성 CD16 또는 이의 변이체;
    (v) 키메릭 융합 수용체(CFR);
    (vi) 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 펩티드 또는 전체 펩티드;
    (vii) 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나;
    (viii) B2M, CIITA, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD25, CD69, CD44, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 및 TIGIT의 적어도 하나의 결실 또는 파괴; 또는
    (ix) HLA-E, 4-1BBL, CD3, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, 항원-특이적 TCR, Fc 수용체, 항체 또는 이의 기능적 변이체 또는 이의 단편, 관문 억제제, 인게이저, 및 작용제와 커플링하기 위한 표면 유도 수용체 중 적어도 하나의 도입.
  28. 제26항에 있어서, 외인성 IL15를 함유하지 않는 배양 배지에서 IL7 사이토카인 신호전달 복합체를 포함하는 T계 세포를 확장하는 단계를 추가로 포함하는, 개선 방법.
  29. 제28항에 있어서, 배양 배지는 외인성 IL2 및 IL7 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는, 개선 방법.
  30. 제28항에 있어서, 배양 배지는 IL2 또는 IL7 어느 것도 함유하지 않는, 개선 방법.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, T계 세포는 CD69+, 및/또는 PD1- 또는 PD1low인, 개선 방법.
  32. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 개선된 세포 확장 및/또는 종양 세포 제어 및 클리어런스는 인 비트로 및/또는 인 비보인, 개선 방법.
  33. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항의 방법에 따른 CAR-T 세포 인 비보 항종양 기능의 개선 방법.
  34. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 세포 또는 이의 집단을 포함하는, 조성물.
  35. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 클론성 iPSC를 포함하는, 마스터 세포 은행(MCB).
  36. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 iPSC 유래 효과기 세포, 및 하나 이상의 치료제를 포함하는, 치료적 용도를 위한 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 하나 이상의 치료제는 펩티드, 사이토카인, 관문 억제제, 항체 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편, 미토겐, 성장 인자, 소형 RNA, dsRNA(이중 가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 피더 세포, 피더 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 하나 이상의 관심 다중핵산을 포함하는 벡터, 화학치료제 또는 방사성 모이어티, 또는 면역조절 약물(IMiD: immunomodulatory drug)을 포함하는, 조성물.
  38. 제37항에 있어서,
    (a) 관문 억제제는:
    (i) PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 또는 억제성 KIR을 포함하는 하나 이상의 길항제 관문 분자;
    (ii) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 이들의 유도체 또는 기능적 균등물 중 하나 이상; 또는
    (iii) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 적어도 하나를 포함하거나;
    (b) 치료제는 베네토클락스, 아자시티딘 및 포말리도마이드 중 하나 이상을 포함하는, 조성물.
  39. 제37항에 있어서, 항체, 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편은:
    (a) 항-CD20, 항-CD22, 항-HER2, 항-CD52, 항-EGFR, 항-CD123, 항-GD2, 항-PDL1 및/또는 항-CD38 항체;
    (b) 리툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 우블리툭시맙, 오카라투주맙, 오비누투주맙, 이브리투모맙, 오크렐리주맙, 이노투주맙, 목세투모맙, 에프라투주맙, 트라스투주맙, 퍼투주맙, 알렘투주맙, 세르툭시맙, 디누툭시맙, 아벨루맙, 다라투무맙, 이사툭시맙, MOR202, 7G3, CSL362, 엘로투주맙, 및 이들의 인간화된 변이체 또는 단편 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편, 및 이들의 기능적 균등물 및 바이오시밀러 중 하나 이상; 또는
    (c) 다라투무맙을 포함하고, 분화 효과기 세포는 CD38 녹아웃, 및 선택적으로 CD16 또는 이의 변이체의 발현을 포함하는, 조성물.
  40. 제37항에 있어서, 사이토카인은 IL2인, 조성물.
  41. 입양 세포 치료에 적합한 대상체로의 제34항 또는 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항의 조성물의 도입에 의한 조성물의 치료적 용도로서, 대상체는 자가면역 장애, 혈액학적 악성종양, 고형 종양, 암 또는 바이러스 감염을 갖는, 치료적 용도.
  42. 제41항에 있어서, 대상체는 치료 도중 사이토카인 서포트를 필요로 하지 않는, 치료적 용도.
  43. 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로, CAR을 포함하는 분화 효과기 세포의 제조 방법으로서, 상기 방법은: (i) 유전자 조작된 iPSC를 분화 효과기 세포로 분화하는 단계로서, 상기 iPSC는 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단계; 및 (ii) 외인성 IL15를 함유하지 않는 배양 배지 중 분화 효과기 세포를 확장하는 단계로서, 상기 분화 효과기 세포는 외인성 IL15를 함유하는 배양 배지에서 배양된 세포와 비교하여, 하기 중 하나 이상을 포함하는 치료적 특성을 갖는 단계를 포함하는, 제조 방법:
    (a) 세포독성의 증가;
    (b) 지속성 및/또는 생존율의 개선;
    (c) 종양 부위에 방관자 면역 세포를 이동시키고/시키거나 활성화하거나 동원하는 데 있어서의 능력의 향상;
    (d) 종양 침투의 개선;
    (e) 종양 면역억제를 감소시키는 능력의 향상;
    (f) 종양 항원 회피를 구제하는 능력의 개선;
    (g) 아폽토시스의 제어;
    (h) ADCC의 향상 또는 획득; 및
    (i) 동족살해를 피하는 능력.
  44. 제43항에 있어서, 배양 배지는 외인성 IL2 및 IL7 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는, 제조 방법.
  45. 제43항에 있어서, 배양 배지는 IL2 또는 IL7 어느 것도 함유하지 않는, 제조 방법.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인 신호전달 복합체는 IL7 수용체 융합물(IL7RF)을 포함하는, 제조 방법.
  47. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 말초혈, 제대혈, 또는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 얻은 이의 대응 1차 세포와 비교하여, iPSC는 하기를 야기하는 하나 이상의 편집을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 제조 방법:
    (i) CD38 녹아웃;
    (ii) HLA-I 결핍 및/또는 HLA-II 결핍;
    (iii) HLA-G 또는 비절단성 HLA-G의 발현 도입, 또는 CD58 및 CD54의 하나 또는 둘 모두의 녹아웃;
    (iv) 외인성 CD16 또는 이의 변이체;
    (v) 키메릭 융합 수용체(CFR);
    (vi) 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 펩티드 또는 전체 펩티드;
    (vii) 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나;
    (viii) B2M, CIITA, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD25, CD69, CD44, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 및 TIGIT의 적어도 하나의 결실 또는 파괴; 또는
    (ix) HLA-E, 4-1BBL, CD3, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, 항원-특이적 TCR, Fc 수용체, 항체 또는 이의 기능적 변이체 또는 이의 단편, 관문 억제제, 인게이저, 및 작용제와 커플링하기 위한 표면 유도 수용체 중 적어도 하나의 도입.
  48. 제47항에 있어서, 외인성 CD16 또는 이의 변이체는 하기 중 적어도 하나를 포함하는, 제조 방법:
    (a) 고친화도 비절단성 CD16(hnCD16);
    (b) CD16의 엑토도메인 도메인에서의 F176V 및 S197P;
    (c) CD64로부터 기원한 전체 또는 부분 엑토도메인;
    (d) 비-천연적(또는 비-CD16) 막관통 도메인;
    (e) 비-천연적(또는 비-CD16) 세포내 도메인;
    (f) 비-천연적(또는 비-CD16) 신호전달 도메인;
    (g) 비-천연적 자극 도메인; 및
    (h) CD16으로부터 기원하지 않고, 동일한 폴리펩티드 또는 상이한 폴리펩티드로부터 기원한 막관통 도메인, 신호전달 도메인 및 자극 도메인.
  49. 제43항에 있어서, CAR은:
    (i) T 세포 특이적 또는 NK 세포 특이적이고;
    (ii) 이중특이적 항원 결합 CAR이고;
    (iii) 스위치 가능한 CAR이고;
    (iv) 이합체화된 CAR이고;
    (v) 분할 CAR이고;
    (vi) 다중-사슬 CAR이고;
    (vii) 유도성 CAR이고;
    (viii) 불활성화 CAR이고;
    (ix) 선택적으로 개별 작제물에서 또는 바이-시스트로닉 작제물에서 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 펩티드 또는 전체 펩티드와 공동발현되고;
    (x) 선택적으로 개별 작제물에서 또는 바이-시스트로닉 작제물에서 관문 억제제와 공동발현되고;
    (xi) CD19, BCMA, CD20, CD22, CD38, CD123, HER2, CD52, EGFR, GD2, MICA/B, MSLN, VEGF-R2, PSMA 및 PDL1 중 적어도 하나에 특이적이고; 그리고/또는
    (xii) ADGRE2, 탄산탈수효소 IX(CAIX), CCR1, CCR4, 암배아 항원(CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원, 상피 당단백질-2(EGP-2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 부착 분자(EpCAM), EGFRvIII, 수용체 티로신-단백질 키나아제 erb­B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산-결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 엽산 수용체-α, 갱글리오사이드 G2(GD2), 갱글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2), 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 아단위 알파-2(IL-13Rα2), κ-경쇄, 키나아제 삽입 도메인 수용체(KDR), 루이스 A(CA19.9), 루이스 Y(LeY), L1 세포 부착 분자(L1-CAM), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A 1(MAGE-A1), MICA/B, 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), PRAME 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 종양 연관된 당단백질 72(TAG-72), TIM-3, TRBCI, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­R2), 윌름스 종양 단백질(WT-1), 및 병원성 항원 중 어느 하나에 특이적이고; 선택적으로,
    (i) 내지 (xii) 중 어느 하나의 CAR은 TCR 좌위에서 삽입되고/되거나, TCR의 내인성 프로모터에 의해 유도되고/되거나, TCR은 CAR 삽입에 의해 녹아웃되는, 제조 방법.
  50. 제49항에 있어서, 불활성화 CAR은 CD38-CAR, 4-1BB-CAR, OX40-CAR, 및 CD40L-CAR 중 적어도 하나를 포함하는, 제조 방법.
  51. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 녹아웃하기 위해; 그리고 선택적으로 하기를 위해, 클론성 iPSC를 게놈 조작하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법:
    (i) CD38 녹아웃,
    (ii) B2M 및/또는 CIITA 녹아웃,
    (iii) CD58 및 CD54의 하나 또는 둘 모두의 녹아웃, 및/또는
    (iv) HLA-G 또는 비절단성 HLA-G, 고친화성 비절단성 CD16 또는 이의 변이체, CFR, 및/또는 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 펩티드 또는 전체 펩티드의 발현 도입.
  52. 제51항에 있어서, 게놈 조작은 표적화된 편집을 포함하는, 제조 방법.
  53. 제52항에 있어서, 표적화된 편집은 결실, 삽입 또는 삽입/결실(in/del)을 포함하고, 표적화된 편집은 CRISPR, ZFN, TALEN, 호밍 뉴클레아제, 상동성 재조합, 또는 이들 방법의 임의의 다른 기능적 변형에 의해 수행되는, 제조 방법.
  54. 클론성 iPSC의 CRISPR 매개 편집을 사용하는 클론성 마스터 조작된 iPSC주의 생성 방법으로서, 상기 편집은 사이토카인 신호전달 복합체 및 선택적으로 CAR을 클론성 iPSC로 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 녹-인을 포함하고, 상기 사이토카인 신호전달 복합체는 IL7 수용체 융합물(IL7RF)을 포함하여 클론성 마스터 조작된 iPSC주를 생성하는, 제조 방법.
  55. 제54항에 있어서,
    (a) 클론성 iPSC의 편집은 TCR의 녹아웃을 추가로 포함하거나,
    (b) CAR은 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD38, CD25, CD69, CD44, CD58, CD54, CD56, CD69, CD71, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT를 포함하는 유전자 좌위 중 하나에서 삽입되고; 삽입은 상기 좌위에서 유전자의 발현을 녹아웃하는, 제조 방법.
  56. 질환 또는 병태의 치료 방법으로서, 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
  57. 제56항에 있어서, 대상체는 치료 도중 사이토카인 서포트를 필요로 하지 않는, 치료 방법.
  58. 제56항에 있어서, 조성물의 세포는 항체 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편, 또는 인게이저를 발현하는, 치료 방법.
  59. 제56항에 있어서, 조성물의 세포는 하기 중 하나 이상을 추가로 포함하는 iPSC-유래 효과기 세포인, 치료 방법:
    (i) CD38 녹아웃;
    (ii) TCRneg;
    (iii) 외인성 CD16 또는 이의 변이체;
    (iv) HLA-I 및/또는 HLA-II 결핍;
    (v) HLA-G 또는 비절단성 HLA-G의 발현 도입, 또는 CD58 및 CD54의 하나 또는 둘 모두의 녹아웃;
    (vi) CFR의 도입된 발현; 및/또는
    (vii) 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 펩티드 또는 전체 펩티드.
  60. 제56항에 있어서, 조성물의 세포의 투여는 사이토카인 서포트의 부재 하에서 이의 대응 1차 세포와 비교하여, 하기 중 하나 이상을 야기하는, 치료 방법:
    (i) 세포독성의 증가;
    (ii) 지속성 및/또는 생존율의 개선;
    (iii) 종양 부위에 방관자 면역 세포를 이동시키고/시키거나 활성화하거나 동원하는 데 있어서의 능력의 향상;
    (iv) 종양 침투의 개선;
    (v) 종양 면역억제를 감소시키는 능력의 향상;
    (vi) 종양 항원 회피를 구제하는 능력의 개선;
    (vii) 아폽토시스의 제어;
    (viii) ADCC의 향상 또는 획득; 및
    (ix) 동족살해를 피하는 능력.
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