KR20230040337A - 면역요법 사용을 위한 iPSC-유래 이펙터 세포 유형들의 조합 - Google Patents

면역요법 사용을 위한 iPSC-유래 이펙터 세포 유형들의 조합 Download PDF

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바흐람 발라메르
조드 굿리지
라이언 비요르달
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페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

게놈 조작된 iPSC의 유도 분화로부터 얻어진 기능적으로 향상된 유도체 효과기 세포를 수득하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 본 명세서에 제공된 유도체 세포는 개선된 또는 향상된 치료 효과를 전달하는 안정적이고 기능적인 게놈 편집을 갖는다. 또한, 기능적으로 향상된 유도체 효과기 세포를 단독으로 포함하거나, 또는 조합 요법으로 유도체 효과기 세포와 항체 또는 면역관문 저해제 또는 추가의 세포를 포함하는 치료 조성물 및 이의 용도가 제공된다.

Description

면역요법 사용을 위한 iPSC-유래 이펙터 세포 유형들의 조합
관련 출원
본 출원은 2020년 6월 19일자로 출원된 미국 가출원 제63/041,672호를 우선권으로 주장하며, 이러한 문헌의 개시는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 출원은 본 출원과 함께 제출된 ASCII 텍스트 형식의 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능한 형태(Computer Readable Form: CRF)를 참조에 의해 포함하며, 이의 파일명은 056932-527001WO_SEQ_LISTING.txt이고, 이것은 2021년 6월 18일에 생성되었고, 크기가 36,268바이트이다.
기술분야
본 개시내용은 광범위하게는 오프-더-쉘프(off-the-shelf) 면역세포 생성물 분야에 관한 것이다. 보다 특별하게는, 본 개시내용은 생체내(in vivo)에서 치료 관련 특성을 전달할 수 있는 다기능성 효과기 세포(multifunctional effector cell)를 개발하기 위한 전략에 관한 것이다. 본 개시내용에 따라서 개발된 세포 생성물은 환자-기원의 세포 요법의 중요한 한계를 해결한다.
입양 세포 요법 분야는 현재 환자-기원 세포 및 공여자-기원 세포의 사용에 초점을 맞추고 있으며, 이는 암 면역요법의 일관된 제조를 달성하고, 이로울 수 있는 모든 환자에게 요법을 전달하는 것을 특히 어렵게 한다. 유리한 환자 결과를 촉진시키기 위해서 입양에 의해서 전달되는 림프구의 효능 및 지속성을 개선할 필요가 있다. 림프구, 예컨대, T 세포 및 자연 살해(natural killer: NK) 세포는 선천 면역 및 적응 면역에서 중요한 역할을 하는 강력한 항-종양 효과기이다. 그러나, 입양 세포 요법을 위해서 이들 면역 세포를 사용하는 것은 여전히 어려운 과제이며, 개선해야 할 충족되지 않은 요구가 있다. 따라서, 입양 면역요법에서 T 세포 및 NK 세포 또는 다른 림프구의 완전한 잠재력을 이용하기 위한 상당한 기회가 남아 있다.
반응 속도, 세포 탈진, 수혈된 세포의 손실(생존 및/또는 지속성), 표적 손실 또는 계통 전환을 통한 종양 탈출, 종양 표적화 정확도, 표적-이탈(off-target) 독성, 종양-이탈(off-tumor) 효과에서부터 고형 종양에 대한 효능, 즉, 종양 미세환경 및 관련 면역 억제, 동원, 수송(trafficking) 및 침윤까지의 범위의 문제를 해결하는 기능적으로 개선된 효과기 세포가 필요하다.
본 발명의 목적은 단일 세포 유래된 iPSC(유도 만능성 줄기세포(induced pluripotent stem cell)) 클론주로부터 분화된 유도체 비-만능성 세포를 생성시키기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이며, iPSC주는 게놈 내에 하나 또는 몇몇 유전자 변형을 포함한다. 상기 하나 또는 몇몇 유전자 변형은 DNA 삽입, 결실 및 치환을 포함하고, 이러한 변형은 분화, 증폭, 계대 및/또는 이식 후에 후속으로 유래된 세포에서 유지되고, 기능을 유지한다.
본 출원의 iPSC-유래된 비-만능성 세포는 CD34 세포, 조혈 내피 세포, HSC(조혈 줄기 및 전구 세포), 조혈 다능성 전구 세포(hematopoietic multipotent progenitor cell), T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포 및 B 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 본 출원의 iPSC-유래된 비-만능성 세포는 동일한 유전자 변형을 포함하는 iPSC로부터의 분화를 통해서 게놈 내에 하나 또는 몇몇 유전자 변형을 포함한다. 유전자 조작된 유도체 세포를 수득하기 위한 조작된 클론성 iPSC 분화 전략은, 유도 분화(directed differentiation)에서의 iPSC의 발달 가능성이 iPSC에서의 조작된 양상에 의해서 악영향을 받지 않고, 또한 조작된 양상이 유도체 세포에서 의도된 바와 같이 기능할 것을 요구한다. 추가로, 이러한 전략은 1차 림프구, 예컨대, 말초 혈액으로부터 얻어진 T 세포 또는 NK 세포의 조작에서 현재 장벽을 극복하였는데, 그 이유는 이러한 세포가 조작하기 어렵고, 이러한 세포의 조작은 종종 재현성 및 균일성이 결여되어, 높은 세포사 및 낮은 세포 증폭과 함께 불량한 세포 지속성을 나타내는 세포를 생성하기 때문이다. 또한, 이러한 전략은, 달리는 이질적인 1차 세포 공급원을 사용하여 수득되었을 이질 효과기 세포 집단의 생산을 회피한다.
본 발명의 일부 태양은, 각각 재프로그래밍 과정에 이어서, 그와 동시에 또는 그 이전에 게놈 조작의 전략을 반영하는, 하기 (I), (II) 또는 (III)을 포함하는 방법을 사용하여 수득된 게놈-조작된 iPSC를 제공한다:
(I): 임의의 순서로 (i) 및 (ii) 중 하나 또는 둘 다에 의해 iPSC를 유전자 조작함: (i) 하나 이상의 작제물(들)을 iPSC에 도입하여 선택된 부위(들)에서의 표적화된 통합을 가능하게 하는 단계; (ii) (a) 선택된 부위 인식이 가능한 하나 이상의 엔도뉴클레아제를 사용하여, 선택된 부위(들)에서 하나 이상의 이중 가닥 절단부(들)를 iPSC에 도입하는 단계; 및 (b) 단계 (I)(ii)(a)의 iPSC를 배양하여 내인성 DNA 수복이 선택된 부위(들)에서 표적화된 in/del을 생성될 수 있게 함으로써, 부분 또는 완전 분화된 세포로 분화될 수 있는 게놈-조작된 iPSC를 수득하는 단계;
(II): 하기 단계들에 의해 비-만능성 세포를 유전자 조작하고 재프로그래밍하여 게놈-조작된 iPSC를 수득함: (i) 비-만능성 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로, TGFβ 수용체/ALK 저해제, MEK 저해제, GSK3 저해제 및/또는 ROCK 저해제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시켜 비-만능성 세포의 재프로그래밍을 개시하는 단계; 및 (ii) 임의의 순서로 (a) 및 (b) 중 하나 또는 둘 다를 단계 (II)(i)의 재프로그래밍 동안 재프로그래밍 비-만능성 세포에 도입하는 단계: (a) 하나 이상의 작제물(들) - 이의 도입은 선택된 부위(들)에서 표적화된 통합을 가능하게 함 -; (b) 하나 이상의 이중 가닥 절단부(들) - 이는 선택된 부위 인식이 가능한 적어도 하나의 엔도뉴클레아제를 사용하여, 선택된 부위(들)에서 도입됨 -, 이어서 단계 (II)(ii)(b)의 세포를 배양하여 내인성 DNA 수복이 선택된 부위(들)에서 표적화된 in/del을 생성할 수 있게 함; 이와 같이 수득된 게놈-조작된 iPSC는 적어도 하나의 기능성의 표적화된 게놈 편집을 포함하고, 상기 게놈-조작된 iPSC는 부분 또는 완전 분화된 세포로의 분화가 가능하다.
(III): (i) 및 (ii)에 의해, 재프로그래밍을 위하여 비-만능성 세포를 유전자 조작하여 게놈-조작된 iPSC를 수득함: (i): 임의의 순서로 (a) 및 (b) 중 하나 또는 둘 다를 비-만능성 세포에 도입하는 단계: (a) 하나 이상의 작제물 - 이의 도입은 선택된 부위(들)에서 표적화된 통합을 가능하게 함 -; (b) 하나 이상의 이중 가닥 절단부 - 이는 선택된 부위 인식이 가능한 적어도 하나의 엔도뉴클레아제를 사용하여, 선택된 부위(들)에서 도입됨 -, 여기서는 단계 (III)(i)(b)의 세포를 배양하여 내인성 DNA 수복이 선택된 부위(들)에서 표적화된 in/del을 생성할 수 있게 함; 및 (ii) 단계 (III)(i)의 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제, MEK 저해제, GSK3 저해제 및/또는 ROCK 저해제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시켜, 선택된 부위(들)에서 표적화된 편집을 포함하는 게놈-조작된 iPSC를 수득하는 단계; 이들 단계에 의해 적어도 하나의 기능성의 표적화된 게놈 편집을 포함하는 게놈-조작된 iPSC를 수득하고, 상기 게놈-조작된 iPSC는 부분 분화된 세포 또는 완전 분화된 세포로 분화될 수 있다.
상기 방법의 일 실시 형태에서, 하나 이상의 선택된 부위에서의 적어도 하나의 표적화된 게놈 편집은 안전 스위치 단백질(safety switch protein), 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보, 또는 게놈-조작된 iPSC 또는 이로부터의 유도체 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자가-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진시키는 단백질을 암호화하는 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드의 삽입을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 삽입을 위한 외인성 폴리뉴클레오타이드는 (1) CMV, EF1α, PGK, CAG, UBC, 또는 다른 구성적, 유도성, 일시적-, 조직- 또는 세포 유형-특이적 프로모터를 포함하는 하나 이상의 외인성 프로모터; 또는 (2) AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1, 또는 게놈 안전 하버(genome safe harbor)의 기준을 충족시키는 다른 유전자좌를 포함하는 선택된 부위(들)에 포함된 하나 이상의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법을 사용하여 생성된 게놈-조작된 iPSC는 카스파제, 티미딘 카이나제, 사이토신 데아미나제, 변형된 EGFR 또는 B-세포 CD20을 포함하는 단백질을 암호화하는 1종 이상의 상이한 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 게놈-조작된 iPSC가 2종 이상의 자살 유전자를 포함하는 경우, 자살 유전자는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1을 포함하는 상이한 안전 하버 유전자좌 내에 통합된다. 일부 실시 형태에서, 외인성 폴리뉴클레오타이드는 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21 및/또는 이들의 각각의 수용체의 부분 또는 전체 펩타이드를 암호화한다. 일부 실시 형태에서, 외인성 폴리뉴클레오타이드에 의해서 암호화된 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21 및/또는 이들의 각각의 수용체의 부분 또는 전체 펩타이드는 융합 단백질의 형태이다.
일부 다른 실시 형태에서, 본 명세서에 제공된 방법을 사용하여 생성된 게놈-조작된 iPSC는 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약물 표적 후보, 면역 반응 조절 및 조정, 또는 iPSC 또는 이로부터의 유도체 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자가-재생, 지속성 및/또는 생존을 억제하는 단백질과 연관된 1종 이상의 내인성 유전자에서 in/del을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 파괴를 위한 내인성 유전자는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신(Tapasin), NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자 중 적어도 하나를 포함한다.
추가의 일부 다른 실시 형태에서, 본 명세서에 제공된 방법을 사용하여 생성된 게놈-조작된 iPSC는 AAVS1 유전자좌에서 카스파제를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드, 및 H11 유전자좌에서 티미딘 카이나제 암호화 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
더 일부의 다른 실시 형태에서, 접근법 (I), (II) 및/또는 (III)은 게놈-조작된 iPSC를 MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시켜, 수득된 게놈-조작된 iPSC의 만능성을 유지시키는 단계를 추가로 포함한다. 일 실시 형태에서, 적어도 하나의 표적화된 게놈 편집을 포함하는 수득된 게놈 조작된 iPSC는 기능성이고, 분화 효력이 있고, 동일한 기능성의 게놈 편집을 포함하는 비-만능성 세포로 분화할 수 있다.
따라서, 일 태양에서, 본 발명은 또한 2개 이상의 합성 세포 집단을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은, (i) iPSC-유래된 NK 세포를 포함하는 제1 합성 세포 집단으로서, 여기서 상기 iPSC-유래된 NK 세포는, (a) 외인성 CD16 또는 이의 변이체; 및 (b) 제1 키메라 항원 수용체(CAR), 및 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 또는 전장 펩타이드 중 하나 또는 둘 다를 포함하는, 제1 합성 세포 집단; 및 (ii) iPSC-유래된 T 세포를 포함하는 제2 합성 세포 집단으로서, 여기서 상기 iPSC-유래된 T 세포는 적어도 제2 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하며, 상기 제2 CAR은 TCR 유전자좌의 내인성 프로모터의 제어 하에서 발현되는, 제2 합성 세포 집단을 포함한다. 다양한 실시 형태에서, 외인성 CD16 또는 이의 변이체는 고 친화도 비-절단성 CD16(hnCD16)이거나; 또는 외인성 CD16 또는 이의 변이체는 하기 중 적어도 하나를 포함한다: (a) CD16의 엑토도메인 도메인 내의 F176V 및 S197P; (b) CD64로부터 기원된 전체 또는 부분 엑토도메인; (c) 비-네이티브(non-native)(또는 비-CD16) 막관통 도메인; (d) 비-네이티브(또는 비-CD16) 세포내 도메인; (e) 비-네이티브(또는 비-CD16) 신호전달 도메인; (f) 비-네이티브 자극성 도메인; 또는 (g) CD16으로부터 기원되지 않고, 동일하거나 상이한 폴리펩타이드로부터 기원된 막관통 도메인, 신호전달 도메인, 및 자극성 도메인. 조성물의 특정 실시 형태에서, (a) 비-네이티브 막관통 도메인은 CD3D, CD3E, CD3G, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D, 또는 T 세포 수용체(TCR) 폴리펩타이드로부터 유래되거나; (b) 비-네이티브 자극성 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래되거나; (c) 비-네이티브 신호전달 도메인은 CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137(4-1BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래되거나; 또는 (d) 비-네이티브 막관통 도메인은 NKG2D로부터 유래되고, 비-네이티브 자극성 도메인은 2B4로부터 유래되고, 비-네이티브 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다.
조성물의 다양한 실시 형태에서, 제1 CAR과 제2 CAR은 표적화 특이성이 동일하거나 상이하고, 제1 CAR 또는 제2 CAR은, (i) T 세포 특이적 또는 NK 세포 특이적이고/이거나; (ii) 이중특이성 항원 결합 CAR이고/이거나; (iii) 전환 가능한 CAR이고/이거나; (iv) 이량체화된 CAR이고/이거나; (v) 스플리트(split) CAR이고/이거나; (vi) 다중쇄 CAR이고/이거나; (vii) 유도성 CAR이고/이거나; (viii) 또 다른 CAR과 공동발현되고/되거나; (ix) 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 또는 전장(full length) 펩타이드와, 선택적으로 별개의 작제물로 또는 바이-시스트론성(bi-cistronic) 작제물로 공동발현되고/되거나; (x) 면역관문 저해제와, 선택적으로 별개의 작제물로 또는 바이-시스트론성 작제물로 공동발현되고/되거나; (xi) CD19 또는 BCMA에 특이적이고/이거나; (xii) ADGRE2, 탄산 탈수효소 IX(CAIX), CCR1, CCR4, 암배아 항원(carcinoembryonic antigen: CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus: CMV) 감염된 세포의 항원, 상피 당단백질2(epithelial glycoprotein2: EGP 2), 상피 당단백질-40(epithelial glycoprotein-40: EGP-40), 상피 세포 접착 분자(epithelial cell adhesion molecule: EpCAM), EGFRvIII, 수용체 타이로신-단백질 카이나제 erb­B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산염-결합 단백질(folate-binding protein: FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(fetal acetylcholine receptor: AChR), 엽산염 수용체-a, 강글리오사이드 G2(Ganglioside G2: GD2), 강글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(human Epidermal Growth Factor Receptor 2: HER-2), 인간 텔로머라제 역전사효소(human telomerase reverse transcriptase: hTERT), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 하위단위 알파-2(Interleukin-13 수용체 하위단위 alpha-2: IL-13Rα2), κ-경쇄, 카이나제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor: KDR), Lewis A(CA19.9), Lewis Y(LeY), L1 세포 접착 분자(L1 cell adhesion molecule: L1-CAM), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A 1(melanoma antigen family A 1: MAGE-A1), MICA/B, 뮤신 1(Mucin 1: Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아성 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기세포 항원(prostate stem cell antigen: PSCA), PRAME 전립선-특이적 막 항원(prostate-specific membrane antigen: PSMA), 종양­연관 당단백질(tumor­associated glycoprotein) 72(TAG-72), TIM-3, TRBC1, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­R2), 빌름스 종양 단백질(Wilms tumor protein)(WT-1) 및 병원체 항원 중 임의의 하나에 특이적이다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 또는 전장 펩타이드는, (a) IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21 및 이들 각각의 수용체 중 적어도 하나를 포함하거나; 또는 (b) (i) 자가-절단 펩타이드를 사용함으로써 IL15와 IL15Rα의 공동발현; (ii) IL15와 IL15Rα의 융합 단백질; (iii) IL15Rα의 세포내 도메인이 절단된 IL15/IL15Rα 융합 단백질; (iv) IL15와, IL15Rα의 막 결합된 스시 도메인의 융합 단백질; (v) IL15와 IL15Rβ의 융합 단백질; (vi) IL15와 공통 수용체 γC의 융합 단백질 - 여기서, 상기 공통 수용체 γC는 네이티브 또는 변형됨 -; 및 (vii) IL15Rβ의 동종이량체 중 적어도 하나를 포함하고; (i) 내지 (vii) 중 임의의 하나는 별개의 작제물로 또는 바이-시스트론성 작제물로 CAR과 공동발현될 수 있고; 선택적으로, (c) 일시적으로 발현된다.
조성물의 일부 실시 형태에서, iPSC-유래된 NK 세포 또는 iPSC-유래된 T 세포는 하기 중 하나 이상을 추가로 포함한다:(i) HLA-I 결핍; (ii) HLA-II 결핍; (iii) HLA-G 또는 비-절단성 HLA-G의 도입된 발현; (iv) lig-, inR+, cs-CD3+, En+, 및 Ab+ 중 적어도 하나; 여기서, (1) lig-는 발현된 동종항원에서 음성이고; (2) inR+는 상기 음성 동종항원에 상응하는 발현된 비활성화-CAR에서 양성이고; (3) cs-CD3+는 세포 표면 발현된 CD3에서 양성이고; (4) En+는 적어도 하나의 발현된 인게이저에서 양성이며, 여기서 상기 인게이저는 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE) 또는 삼중특이성 살해 세포 인게이저(TriKE)를 포함하고; (5) Ab+는 적어도 하나의 발현된 항체 또는 면역관문 저해제에서 양성임; (v) TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, RFX5, RAG1, RFXAP, 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자 중 적어도 하나에서의 결실 또는 감소된 발현; 및 (vi) HLA-E, HLA-G, 4-1BBL, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, TCR, Fc 수용체, 및 이중특이성 또는 다중특이성 또는 보편적(universal) 인게이저와의 커플링을 위한 표면 촉발 수용체(surface triggering receptor) 중 적어도 하나에서의 도입된 또는 증가된 발현. 특정 실시 형태에서, (i) 동종항원은 CD40L, OX40, 또는 4-1BB를 포함하거나; (ii) 상기 비활성화-CAR은 CD40L-CAR, OX40-CAR, 또는 4-1BB-CAR을 포함하거나; (iii) 상기 BiTE 또는 상기 TriKE는 (a) CD3, CD28, CD5, CD16, NKG2D, CD64, CD32, CD89, NKG2C, 또는 이의 키메라 Fc 수용체를 포함하는 면역 세포 표면 분자; 및 (b) B7H3, BCMA, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD179b, CEA, CLEC12A, CS-1, DLL3, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, FLT-3, FOLR1, FOLR3, GD2, gpA33, HER2, HM1.24, LGR5, MSLN, MCSP, MICA/B, PSMA, PAMA, P-카드헤린, 또는 ROR1을 포함하는 종양 표면 분자를 인식하거나; (iv) 상기 BiTE는 CD3-CD19, CD16-CD30, CD64-CD30, CD16-BCMA, CD64-BCMA, 또는 CD3-CD33을 포함하거나; (v) 상기 TriKE는 CD16-IL15-EPCAM, CD64-IL15-EPCAM, CD16-IL15-CD33, CD64-IL15-CD33, 또는 NKG2C-IL15-CD33을 포함하거나; (vi) 상기 항체는 항-CD20, 항-HER2, 항-CD52, 항-EGFR, 항-CD123, 항-GD2, 항-PDL1, 또는 항-CD38 항체를 포함하거나; 또는 (vii) 면역관문 저해제는 (a) PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 또는 저해성 KIR을 포함하는 면역관문 분자에 대한 길항제; (b) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리릴루맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이들의 유도체 또는 기능성 등가물 중 1종; 또는 (c) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 1종을 포함한다.
조성물의 다양한 실시 형태에서, iPSC-유래된 NK 세포 또는 iPSC-유래된 T 세포는,(i) 하나의 목적하는 통합 부위에 통합된 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ii) 상이한 목적하는 통합 부위에 통합된 2종 초과의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 목적하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD40L, CD44, CD54, CD56, CD58, CD69, CD71, OX40, 4-1BB, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, 및 TIGIT 중 적어도 하나를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 목적하는 통합 부위는 TCR α 또는 β 불변 영역, CD25, CD38, CD40L, CD44, CD54, CD58, CD69, CD71, OX40 또는 4-1BB를 포함하며; 선택적으로, 상기 TCRα 또는 TCRβ, CD25, CD38, CD40L, CD44, CD54, CD58, CD69, CD71, OX40 또는 4-1BB는 상기 각각의 통합 부위에서의 상기 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드의 통합의 결과로서 녹아웃된다.
조성물의 다양한 실시 형태에서, iPSC-유래된 NK 세포 또는 iPSC-유래된 T 세포는 하기를 포함하는 특징들 중 적어도 하나를 갖는다: 말초 혈액, 제대혈 또는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 수득된 이의 네이티브 상대 세포에 비해, (i) 개선된 지속성 및/또는 생존, (ii) 네이티브 면역 세포에 대한 증가된 저항성, (iii) 증가된 세포독성, (iv) 개선된 종양 침투, (v) 향상된 또는 획득된 ADCC, (vi) 방관자 면역 세포(bystander immune cell)를 종양 부위로 이동시키고/시키거나, 활성화 또는 동원하는 데 있어서의 향상된 능력, (vii) 종양 면역억제를 감소시키는 향상된 능력, 및 (viii) 종양 항원 탈출을 구제하는 데 있어서의 개선된 능력. 조성물의 다양한 실시 형태에서, iPSC-유래된 NK 세포 또는 iPSC-유래된 T 세포는 말초 혈액, 제대혈 또는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 수득된 그들 각각의 네이티브 상대 세포에 비해 더 긴 텔로미어(telomere)를 포함한다. 조성물의 다양한 실시 형태에서, 제1 합성 세포 집단 또는 제2 합성 세포 집단은 생체외(ex vivo)에서 조절된다. 특정 실시 형태에서, iPSC-유래된 NK 세포를 포함하는 조절된 제1 합성 세포 집단은 조절되지 않은 제1 합성 세포 집단에 비해, 증가된 수 또는 비의 I형 NKT 세포 및/또는 적응 NK 세포를 포함하거나; iPSC-유래된 T 세포를 포함하는 조절된 제2 합성 세포 집단은 조절되지 않은 제2 합성 세포 집단에 비해, 증가된 수 또는 비의 미감작(
Figure pct00001
) T 세포, 줄기세포 기억 T 세포, 및/또는 중앙 기억 T 세포를 포함한다.
조성물의 다양한 실시 형태에서, (i) iPSC-유래된 NK 세포와 iPSC-유래된 T 세포는 100:1 내지 1:100 범위의 비이거나; (ii) 조성물은 하나 이상의 추가의 세포 집단을 추가로 포함하거나; (iii) 조성물은 1종 이상의 치료제를 추가로 포함한다. 특정 실시 형태에서, 추가의 세포 집단은 조절 세포를 포함한다. 추가의 세포 집단이 조절 세포를 포함하는 일부 실시 형태에서, 조절 세포는 iPSC-유래된 면역 조절 세포 또는 골수계-유래된 억제인자 세포(MDSC)이다. 조성물이 1종 이상의 치료제를 추가로 포함하는 일부 실시 형태에서, 1종 이상의 치료제는 펩타이드, 사이토카인, 면역관문 저해제, 미토겐, 성장 인자, 작은 RNA, dsRNA(이중 가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 피더 세포(feeder cell), 피더 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 하나 이상의 관심 폴리핵산을 포함하는 벡터, 항체, 화학치료제 또는 방사성 모이어티, 또는 면역조절 약물(immunomodulatory drug: IMiD)을 포함한다. 1종 이상의 치료제가 면역관문 저해제를 포함하는 일부 실시 형태에서, 면역관문 저해제는 (a) PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 또는 저해성 KIR을 포함하는 1종 이상의 길항제 면역관문 분자; (b) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리릴루맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이들의 유도체 또는 기능성 등가물 중 1종 이상; 또는 (c) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 적어도 1종을 포함한다. 1종 이상의 치료제가 항체를 포함하는 일부 실시 형태에서, 항체는, (a) 항-CD20, 항-HER2, 항-CD52, 항-EGFR, 항-CD123, 항-GD2, 항-PDL1 및/또는 항-CD38 항체; (b) 레툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 유블리툭시맙, 오카라투주맙, 오비누투주맙, 트라스투주맙, 퍼투주맙, 알렘투주맙, 서툭시맙, 디누툭시맙, 아벨루맙, 다라투무맙, 이사툭시맙, MOR202, 7G3, CSL362, 엘로투주맙 및 이들의 인간화된 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편 및 이들의 기능성 등가물 및 바이오시밀러 중 1종 이상; 또는 (c) 다라투무맙을 포함한다.
조성물의 다양한 실시 형태에서, 제1 합성 세포 집단 및 제2 합성 세포 집단은 별개의 집단이거나, 또는 혼합 집단으로 조합된다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 명세서의 조성물의 치료 용도를 제공하며, 상기 용도는 입양 세포 요법에 적합한 대상체에게 상기 조성물을 도입함으로써 사용되며, 여기서 상기 대상체는 자가면역 장애; 혈액 악성종양; 고형 종양; 암; 또는 바이러스 감염을 갖는다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 CAR-T 세포의 집단에 의한 종양 살해 및/또는 클리어런스를 개선하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 iPSC-유래된 NK 세포를 포함하는 합성 세포 집단을 상기 CAR-T 세포의 집단에 제공하여 조합된 세포 집단을 수득하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 iPSC-유래된 NK 세포는, (a) 외인성 CD16 또는 이의 변이체; 및 (b) 제1 키메라 항원 수용체(CAR), 및 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 또는 전장 펩타이드 중 하나 또는 둘 다를 포함하고; 상기 iPSC-유래된 NK 세포의 제1 CAR은 상기 CAR-T 세포와 동일하거나 상이한 CAR 표적화 특이성을 포함한다. 다양한 실시 형태에서, CAR-T 세포는 임의의 공급원으로부터의 CAR 보유 T 세포를 지칭한다. 예를 들어, T 세포는 1차 세포일 수 있거나 계통 세포(line cell)로부터의 세포일 수 있고, 자가 또는 동종이계 세포일 수 있고, iPSC로부터 분화될 수 있다.
종양 살해 및/또는 클리어런스를 개선하는 방법의 일부 실시 형태에서, 조합된 세포 집단은, iPSC-유래된 NK 세포의 조합 없이 CAR-T 세포의 집단 단독에 의한 종양 살해 및/또는 클리어런스에 비해, (i) 개선된 지속성 및/또는 생존, (ii) 네이티브 면역 세포에 대한 증가된 저항성, (iii) 증가된 세포독성, (iv) 개선된 종양 침투, (v) 향상된 또는 획득된 ADCC, (vi) 방관자 면역 세포를 종양 부위로 이동시키고/시키거나, 활성화 또는 동원하는 데 있어서의 향상된 능력, (vii) 종양 면역억제를 감소시키는 향상된 능력, 및 (viii) 종양 항원 탈출을 구제하는 데 있어서의 개선된 능력을 갖는 세포를 포함한다. 방법의 일부 실시 형태에서, 외인성 CD16 또는 이의 변이체는 고 친화도 비-절단성 외인성 CD16(hnCD16)이거나; 또는 외인성 CD16 또는 이의 변이체는 하기 중 적어도 하나를 포함한다: (a) CD16의 엑토도메인 도메인 내의 F176V 및 S197P; (b) CD64로부터 기원된 전체 또는 부분 엑토도메인; (c) 비-네이티브(또는 비-CD16) 막관통 도메인; (d) 비-네이티브(또는 비-CD16) 세포내 도메인; (e) 비-네이티브(또는 비-CD16) 신호전달 도메인; (f) 비-네이티브 자극성 도메인; 및 (g) CD16으로부터 기원되지 않고, 동일하거나 상이한 폴리펩타이드로부터 기원된 막관통 도메인, 신호전달 도메인, 및 자극성 도메인.
방법의 일부 실시 형태에서, (a) 비-네이티브 막관통 도메인은 CD3D, CD3E, CD3G, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D, 또는 T 세포 수용체(TCR) 폴리펩타이드로부터 유래되거나; (b) 비-네이티브 자극성 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래되거나; (c) 비-네이티브 신호전달 도메인은 CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137(4-1BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래되거나; 또는 (d) 비-네이티브 막관통 도메인은 NKG2D로부터 유래되고, 비-네이티브 자극성 도메인은 2B4로부터 유래되고, 비-네이티브 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다. 방법의 다른 실시 형태에서, 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 또는 전장 펩타이드는, (a) IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21 및/또는 이들 각각의 수용체 중 적어도 하나를 포함하거나; 또는 (b) (i) 자가-절단 펩타이드를 사용함으로써 IL15와 IL15Rα의 공동발현; (ii) IL15와 IL15Rα의 융합 단백질; (iii) IL15Rα의 세포내 도메인이 절단된 IL15/IL15Rα 융합 단백질; (iv) IL15와, IL15Rα의 막 결합된 스시 도메인의 융합 단백질; (v) IL15와 IL15Rβ의 융합 단백질; (vi) IL15와 공통 수용체 γC의 융합 단백질 - 여기서, 상기 공통 수용체 γC는 네이티브 또는 변형됨 -; 및 (vii) IL15Rβ의 동종이량체 중 적어도 하나를 포함하고; (i) 내지 (vii) 중 임의의 하나는 별개의 작제물로 또는 바이-시스트론성 작제물로 CAR과 공동발현될 수 있고; 선택적으로, (c) 일시적으로 발현된다. 방법의 일부 실시 형태에서, CAR-T 세포는 조작된 iPSC로부터 분화되고/되거나, CAR-T 세포는 ADGRE-2, 탄산 탈수효소 IX(CAIX), CCR1, CCR4, 암배아 항원(CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원, 상피 당단백질2(EGP 2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 접착 분자(EpCAM), EGFRvIII, 수용체 타이로신-단백질 카이나제 erb­B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산염-결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 엽산염 수용체-a, 강글리오사이드 G2(GD2), 강글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER-2), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 하위단위 알파-2(IL-13Rα2), κ-경쇄, 카이나제 삽입 도메인 수용체(KDR), Lewis A(CA19.9), Lewis Y(LeY), L1 세포 접착 분자(L1-CAM), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A 1(MAGE-A1), MICA/B, 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아성 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기세포 항원(PSCA), PRAME 전립선-특이적 막 항원(PSMA), 종양­연관 당단백질 72(TAG-72), TIM-3, TRBC1, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­R2), 빌름스 종양 단백질(WT-1) 및 병원체 항원 중 임의의 하나에 대해 표적화 특이성을 갖는 CAR을 포함한다.
종양 살해 및/또는 클리어런스를 개선하는 방법의 일부 실시 형태에서, iPSC-유래된 NK 세포 및/또는 CAR-T 세포는 하기 중 하나 이상을 추가로 포함한다: (i) HLA-I 결핍; (ii) HLA-II 결핍; (iii) HLA-G 또는 비-절단성 HLA-G의 도입된 발현; (iv) lig-, inR+, cs-CD3+, En+, 및 Ab+ 중 적어도 하나; 여기서, (1) lig-는 발현된 동종항원에서 음성이고; (2) inR+는 상기 음성 동종항원에 상응하는 발현된 비활성화-CAR에서 양성이고; (3) cs-CD3+는 세포 표면 발현된 CD3에서 양성이고; (4) En+는 적어도 하나의 발현된 인게이저에서 양성이며, 여기서 상기 인게이저는 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE) 또는 삼중특이성 살해 세포 인게이저(TriKE)를 포함하고; (5) Ab+는 적어도 하나의 발현된 항체 또는 면역관문 저해제에서 양성임; (v) B2M, CIITA, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, RFX5, RAG1, RFXAP, 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자 중 적어도 하나에서의 결실 또는 감소된 발현; 및 (vi) HLA-E, HLA-G, 4-1BBL, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, TCR, Fc 수용체, 및 이중특이성 또는 다중특이성 또는 보편적 인게이저와의 커플링을 위한 표면 촉발 수용체 중 적어도 하나에서의 도입된 또는 증가된 발현. 특정 실시 형태에서, (i) 동종항원은 CD40L, OX40, 또는 4-1BB를 포함하거나; (ii) 상기 비활성화-CAR은 CD40L-CAR, OX40-CAR, 또는 4-1BB-CAR을 포함하거나; (iii) 상기 BiTE 또는 상기 TriKE는 (a) CD3, CD28, CD5, CD16, NKG2D, CD64, CD32, CD89, NKG2C, 또는 이의 키메라 Fc 수용체를 포함하는 면역 세포 표면 분자; 및 (b) B7H3, BCMA, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD179b, CEA, CLEC12A, CS-1, DLL3, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, FLT-3, FOLR1, FOLR3, GD2, gpA33, HER2, HM1.24, LGR5, MSLN, MCSP, MICA/B, PSMA, PAMA, P-카드헤린, 또는 ROR1을 포함하는 종양 표면 분자를 인식하거나; (iv) 상기 BiTE는 CD3-CD19, CD16-CD30, CD64-CD30, CD16-BCMA, CD64-BCMA, 또는 CD3-CD33을 포함하거나; (v) 상기 TriKE는 CD16-IL15-EPCAM, CD64-IL15-EPCAM, CD16-IL15-CD33, CD64-IL15-CD33, 또는 NKG2C-IL15-CD33을 포함하거나; (vi) 상기 항체는 항-CD20, 항-HER2, 항-CD52, 항-EGFR, 항-CD123, 항-GD2, 항-PDL1, 또는 항-CD38 항체를 포함하거나; 또는 (vii) 면역관문 저해제는 (a) PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 또는 저해성 KIR을 포함하는 면역관문 분자에 대한 길항제; (b) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리릴루맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이들의 유도체 또는 기능성 등가물 중 1종; 또는 (c) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 1종을 포함한다.
종양 살해 및/또는 클리어런스를 개선하는 방법의 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 1종 이상의 치료제를 제공하는 단계를 추가로 포함하며, 1종 이상의 치료제는 펩타이드, 사이토카인, 면역관문 저해제, 항체, 미토겐, 성장 인자, 작은 RNA, dsRNA(이중 가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 피더 세포, 피더 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 하나 이상의 관심 폴리핵산을 포함하는 벡터, 화학치료제 또는 방사성 모이어티, 또는 면역조절 약물(IMiD)을 포함한다. 1종 이상의 치료제가 면역관문 저해제를 포함하는, 종양 살해 및/또는 클리어런스를 개선하는 방법의 일부 실시 형태에서, 면역관문 저해제는 (a) PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 또는 저해성 KIR을 포함하는 1종 이상의 길항제 면역관문 분자; (b) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리릴루맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이들의 유도체 또는 기능성 등가물 중 1종 이상; 또는 (c) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 적어도 1종을 포함한다. 1종 이상의 치료제가 항체를 포함하는, 종양 살해 및/또는 클리어런스를 개선하는 방법의 일부 실시 형태에서, 항체는, (a) 항-CD20, 항-HER2, 항-CD52, 항-EGFR, 항-CD123, 항-GD2, 항-PDL1 및/또는 항-CD38 항체; (b) 레툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 유블리툭시맙, 오카라투주맙, 오비누투주맙, 트라스투주맙, 퍼투주맙, 알렘투주맙, 서툭시맙, 디누툭시맙, 아벨루맙, 다라투무맙, 이사툭시맙, MOR202, 7G3, CSL362, 엘로투주맙 및 이들의 인간화된 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편 및 이들의 기능성 등가물 및 바이오시밀러 중 1종 이상; 또는 (c) 다라투무맙을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 조성물을 사용하여 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) iPSC-유래된 NK 세포를 포함하는 상기 제1 합성 세포 집단을 상기 대상체에게 투여하는 단계로서, 여기서 상기 iPSC-유래된 NK 세포는, (a) 외인성 CD16 또는 이의 변이체; 및 (b) 제1 키메라 항원 수용체(CAR), 및 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 또는 전장 펩타이드 중 하나 또는 둘 다를 포함하는, 상기 단계; 및 (ii) iPSC-유래된 T 세포를 포함하는 상기 제2 합성 세포 집단을 상기 대상체에게 투여하는 단계로서, 여기서 상기 iPSC-유래된 T 세포는 적어도 제2 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하며, 상기 제2 CAR은 TCR 유전자좌의 내인성 프로모터의 제어 하에서 발현되고, 상기 제1 CAR과 상기 제2 CAR은 표적화 특이성이 동일하거나 상이한, 상기 단계를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 대상체는 자가면역 장애; 혈액 악성종양; 고형 종양; 암; 또는 바이러스 감염을 포함하는 병태를 갖고/갖거나; 상기 방법은 제1 또는 제2 합성 세포 집단을 단독으로 사용하는 것에 비해 병태의 향상된 개선을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 제1 합성 세포 집단과 제2 합성 세포 집단은 병행적으로, 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여된다. 본 명세서에 기재된 조성물을 사용하여 대상체를 치료하는 방법의 다양한 실시 형태에서, 제1 합성 세포 집단 및 제2 합성 세포 집단은 별개의 집단이거나, 또는 대상체에게 투여 전에 혼합 집단으로 조합된다. 본 명세서에 기재된 조성물을 사용하여 대상체를 치료하는 방법의 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 1종 이상의 치료제를 투여하는 단계; 및/또는 추가의 세포 집단을 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 1종 이상의 치료제 및/또는 추가의 세포 집단은 제1 합성 세포 집단 또는 제2 합성 세포 집단 중 어느 하나와 병행적으로 또는 순차적으로 투여된다. 일부 실시 형태에서, 방법이 추가의 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는 경우, 추가의 세포 집단은 조절 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조절 세포는 iPSC-유래된 면역 조절 세포 또는 골수계-유래된 억제인자 세포(MDSC)이다. 일부 실시 형태에서, 방법은 1종 이상의 치료제를 투여하는 단계를 포함하며, 1종 이상의 치료제는 펩타이드, 사이토카인, 면역관문 저해제, 미토겐, 성장 인자, 작은 RNA, dsRNA(이중 가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 피더 세포, 피더 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 하나 이상의 관심 폴리핵산을 포함하는 벡터, 항체, 화학치료제 또는 방사성 모이어티, 또는 면역조절 약물(IMiD)을 포함한다.
본 명세서에 기재된 조성물을 사용하여 대상체를 치료하는 방법의 다양한 실시 형태에서, 상기 방법은 대상체에게 하기를 투여하는 단계를 추가로 포함한다: (i) (a) CD3, CD28, CD5, CD16, NKG2D, CD64, CD32, CD89, NKG2C, 또는 이의 키메라 Fc 수용체를 포함하는 면역 세포 표면 분자; 및 (b) B7H3, BCMA, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD179b, CEA, CLEC12A, CS-1, DLL3, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, FLT-3, FOLR1, FOLR3, GD2, gpA33, HER2, HM1.24, LGR5, MSLN, MCSP, MICA/B, PSMA, PAMA, P-카드헤린, 또는 ROR1을 포함하는 종양 표면 분자에 특이적인 BiTE 또는 TriKE; (ii) CD3-CD19, CD16-CD30, CD64-CD30, CD16-BCMA, CD64-BCMA, 또는 CD3-CD33을 포함하는 BiTE; (iii) CD16-IL15-EPCAM, CD64-IL15-EPCAM, CD16-IL15-CD33, CD64-IL15-CD33, 또는 NKG2C-IL15-CD33을 포함하는 TriKE; (iv) 항-CD20, 항-HER2, 항-CD52, 항-EGFR, 항-CD123, 항-GD2, 항-PDL1, 또는 항-CD38 항체를 포함하는 항체; 또는 (v) (a) PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 또는 저해성 KIR을 포함하는 면역관문 분자에 대한 길항제; (b) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리릴루맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이들의 유도체 또는 기능성 등가물 중 1종; 또는 (c) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 1종.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 조성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 제1 유전자 조작된 iPSC를 분화하여 iPSC-유래된 NK 세포를 포함하는 제1 합성 세포 집단을 수득하는 단계로서, 여기서 상기 제1 iPSC는 (a) 외인성 CD16 또는 이의 변이체; 및 (b) 제1 키메라 항원 수용체(CAR), 및 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 또는 전장 펩타이드 중 하나 또는 둘 다를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상기 iPSC-유래된 NK 세포는 (a) 및 (b)를 포함하는, 상기 단계; 및 (ii) 제2 유전자 조작된 iPSC를 분화하여 iPSC-유래된 T 세포를 포함하는 제2 합성 세포 집단을 수득하는 단계로서, 여기서 상기 제2 iPSC는 적어도 제2 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 제2 CAR은 TCR 유전자좌의 내인성 프로모터의 제어 하에서 발현되고, 상기 iPSC-유래된 T 세포는 상기 제2 CAR을 포함하는, 상기 단계를 포함하며, 상기 단계들에 의해 본 명세서에 기재된 조성물을 제조한다. 제조 방법의 일부 실시 형태에서, 외인성 CD16 또는 이의 변이체는 고 친화도 비-절단성 외인성 CD16(hnCD16)이거나; 또는 외인성 CD16 또는 이의 변이체는 하기 중 적어도 하나를 포함한다: (a) CD16의 엑토도메인 도메인 내의 F176V 및 S197P; (b) CD64로부터 기원된 전체 또는 부분 엑토도메인; (c) 비-네이티브(또는 비-CD16) 막관통 도메인; (d) 비-네이티브(또는 비-CD16) 세포내 도메인; (e) 비-네이티브(또는 비-CD16) 신호전달 도메인; (f) 비-네이티브 자극성 도메인; 및 (g) CD16으로부터 기원되지 않고, 동일하거나 상이한 폴리펩타이드로부터 기원된 막관통 도메인, 신호전달 도메인, 및 자극성 도메인. 제조 방법의 일부 실시 형태에서, (a) 비-네이티브 막관통 도메인은 CD3D, CD3E, CD3G, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D, 또는 T 세포 수용체(TCR) 폴리펩타이드로부터 유래되거나; (b) 비-네이티브 자극성 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래되거나; (c) 비-네이티브 신호전달 도메인은 CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137(4-1BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래되거나; 또는 (d) 비-네이티브 막관통 도메인은 NKG2D로부터 유래되고, 비-네이티브 자극성 도메인은 2B4로부터 유래되고, 비-네이티브 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다.
제조 방법의 일부 실시 형태에서, 제1 CAR과 제2 CAR은 표적화 특이성이 동일하거나 상이하고, 제1 CAR 또는 제2 CAR은, (i) T 세포 특이적 또는 NK 세포 특이적이고/이거나; (ii) 이중특이성 항원 결합 CAR이고/이거나; (iii) 전환 가능한 CAR이고/이거나; (iv) 이량체화된 CAR이고/이거나; (v) 스플리트 CAR이고/이거나; (vi) 다중쇄 CAR이고/이거나; (vii) 유도성 CAR이고/이거나; (viii) 또 다른 CAR과 공동발현되고/되거나; (ix) 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 또는 전장 펩타이드와, 선택적으로 별개의 작제물로 또는 바이-시스트론성 작제물로 공동발현되고/되거나; (x) 면역관문 저해제와, 선택적으로 별개의 작제물로 또는 바이-시스트론성 작제물로 공동발현되고/되거나; (xi) CD19 또는 BCMA에 특이적이고/이거나; (xii) ADGRE-2, 탄산 탈수효소 IX(CAIX), CCR1, CCR4, 암배아 항원(CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원, 상피 당단백질2(EGP 2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 접착 분자(EpCAM), EGFRvIII, 수용체 타이로신-단백질 카이나제 erb­B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산염-결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 엽산염 수용체-a, 강글리오사이드 G2(GD2), 강글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER-2), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 하위단위 알파-2(IL-13Rα2), κ-경쇄, 카이나제 삽입 도메인 수용체(KDR), Lewis A(CA19.9), Lewis Y(LeY), L1 세포 접착 분자(L1-CAM), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A 1(MAGE-A1), MICA/B, 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아성 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기세포 항원(PSCA), PRAME 전립선-특이적 막 항원(PSMA), 종양­연관 당단백질 72(TAG-72), TIM-3, TRBC1, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­R2), 빌름스 종양 단백질(WT-1) 및 병원체 항원 중 임의의 하나에 특이적이다. 제조 방법의 다른 실시 형태에서, 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 또는 전장 펩타이드는, (a) IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21 및/또는 이들 각각의 수용체 중 적어도 하나를 포함하거나; 또는 (b) (i) 자가-절단 펩타이드를 사용함으로써 IL15와 IL15Rα의 공동발현; (ii) IL15와 IL15Rα의 융합 단백질; (iii) IL15Rα의 세포내 도메인이 절단된 IL15/IL15Rα 융합 단백질; (iv) IL15와, IL15Rα의 막 결합된 스시 도메인의 융합 단백질; (v) IL15와 IL15Rβ의 융합 단백질; (vi) IL15와 공통 수용체 γC의 융합 단백질 - 여기서, 상기 공통 수용체 γC는 네이티브 또는 변형됨 -; 및 (vii) IL15Rβ의 동종이량체 중 적어도 하나를 포함하고; (i) 내지 (vii) 중 임의의 하나는 별개의 작제물로 또는 바이-시스트론성 작제물로 CAR과 공동발현될 수 있고; 선택적으로, (c) 일시적으로 발현된다.
제조 방법의 일부 실시 형태에서, 제1 유전자 조작된 iPSC 또는 제2 유전자 조작된 iPSC는 하기 중 하나 이상을 추가로 포함한다: (i) HLA-I 결핍; (ii) HLA-II 결핍; (iii) HLA-G 또는 비-절단성 HLA-G의 도입된 발현; (iv) lig-, inR+, cs-CD3+, En+, 및 Ab+ 중 적어도 하나; 여기서, (1) lig-는 발현된 동종항원에서 음성이고; (2) inR+는 상기 음성 동종항원에 상응하는 발현된 비활성화-CAR에서 양성이고; (3) cs-CD3+는 세포 표면 발현된 CD3에서 양성이고; (4) En+는 적어도 하나의 발현된 인게이저에서 양성이며, 여기서 상기 인게이저는 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE) 또는 삼중특이성 살해 세포 인게이저(TriKE)를 포함하고; (5) Ab+는 적어도 하나의 발현된 항체 또는 면역관문 저해제에서 양성임; (v) B2M, CIITA, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, RFX5, RAG1, RFXAP, 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자 중 적어도 하나에서의 결실 또는 감소된 발현; 및 (vi) HLA-E, HLA-G, 4-1BBL, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, TCR, Fc 수용체, 및 이중특이성 또는 다중특이성 또는 보편적 인게이저와의 커플링을 위한 표면 촉발 수용체 중 적어도 하나에서의 도입된 또는 증가된 발현. 특정 실시 형태에서, (i) 동종항원은 CD40L, OX40, 또는 4-1BB를 포함하거나; (ii) 상기 비활성화-CAR은 CD40L-CAR, OX40-CAR, 또는 4-1BB-CAR을 포함하거나; (iii) 상기 BiTE 또는 상기 TriKE는 a) CD3, CD28, CD5, CD16, NKG2D, CD64, CD32, CD89, NKG2C, 또는 이의 키메라 Fc 수용체를 포함하는 면역 세포 표면 분자; 및 (b) B7H3, BCMA, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD179b, CEA, CLEC12A, CS-1, DLL3, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, FLT-3, FOLR1, FOLR3, GD2, gpA33, HER2, HM1.24, LGR5, MSLN, MCSP, MICA/B, PSMA, PAMA, P-카드헤린, 또는 ROR1을 포함하는 종양 표면 분자에 특이적이거나; (iv) 상기 BiTE는 CD3-CD19, CD16-CD30, CD64-CD30, CD16-BCMA, CD64-BCMA, 또는 CD3-CD33을 포함하거나; (v) 상기 TriKE는 CD16-IL15-EPCAM, CD64-IL15-EPCAM, CD16-IL15-CD33, CD64-IL15-CD33, 또는 NKG2C-IL15-CD33을 포함하거나; (vi) 상기 항체는 항-CD20, 항-HER2, 항-CD52, 항-EGFR, 항-CD123, 항-GD2, 항-PDL1, 또는 항-CD38 항체를 포함하거나; 또는 (vii) 면역관문 저해제는 (a) PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 또는 저해성 KIR을 포함하는 면역관문 분자에 대한 길항제; (b) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리릴루맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이들의 유도체 또는 기능성 등가물 중 1종; 또는 (c) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 1종을 포함한다.
제조 방법의 일부 실시 형태에서, 제1 유전자 조작된 iPSC 또는 제2 유전자 조작된 iPSC는, (i) 하나의 목적하는 통합 부위에 통합된 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ii) 상이한 목적하는 통합 부위에 통합된 2종 초과의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 목적하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD40L, CD44, CD54, CD56, CD58, CD69, CD71, OX40, 4-1BB, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, 및 TIGIT 중 적어도 하나를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 목적하는 통합 부위는 TCR α 또는 β 불변 영역, CD25, CD38, CD40L, CD44, CD54, CD58, CD69, CD71, OX40 또는 4-1BB를 포함하며; 선택적으로, 상기 TCRα 또는 TCRβ, CD25, CD38, CD40L, CD44, CD54, CD58, CD69, CD71, OX40 또는 4-1BB는 상기 각각의 통합 부위에서의 상기 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드의 통합의 결과로서 녹아웃된다.
제조 방법의 일부 실시 형태에서, iPSC-유래된 NK 세포 또는 iPSC-유래된 T 세포는 하기를 포함하는 특징들 중 적어도 하나를 갖는다: 말초 혈액, 제대혈 또는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 수득된 이의 네이티브 상대 세포에 비해, (i) 개선된 지속성 및/또는 생존, (ii) 네이티브 면역 세포에 대한 증가된 저항성, (iii) 증가된 세포독성, (iv) 개선된 종양 침투, (v) 향상된 또는 획득된 ADCC, (vi) 방관자 면역 세포를 종양 부위로 이동시키고/시키거나, 활성화 또는 동원하는 데 있어서의 향상된 능력, (vii) 종양 면역억제를 감소시키는 향상된 능력, 및 (viii) 종양 항원 탈출을 구제하는 데 있어서의 개선된 능력. 제조 방법의 다양한 실시 형태에서, 제1 합성 세포 집단 또는 제2 합성 세포 집단은 생체외에서 조절된다. 특정 실시 형태에서, iPSC-유래된 NK 세포를 포함하는 조절된 제1 합성 세포 집단은 조절되지 않은 제1 합성 세포 집단에 비해, 증가된 수 또는 비의 I형 NKT 세포 및/또는 적응 NK 세포를 포함하거나; iPSC-유래된 T 세포를 포함하는 조절된 제2 합성 세포 집단은 조절되지 않은 제2 합성 세포 집단에 비해, 증가된 수 또는 비의 미감작 T 세포, 줄기세포 기억 T 세포, 및/또는 중앙 기억 T 세포를 포함한다.
제조 방법의 일부 실시 형태에서, (i) iPSC-유래된 NK 세포와 iPSC-유래된 T 세포는 100:1 내지 1:100 범위의 비이거나; (ii) 상기 방법은 하나 이상의 추가의 세포 집단을 생성된 제1 및 제2 합성 세포 집단에 첨가하는 단계를 추가로 포함하거나; 또는 (iii) 상기 방법은 1종 이상의 치료제를 생성된 제1 및 제2 합성 세포 집단에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시 형태에서, 하나 이상의 추가의 세포 집단은 조절 세포를 포함한다. 하나 이상의 추가의 세포 집단이 조절 세포를 포함하는 일부 실시 형태에서, 조절 세포는 iPSC-유래된 면역 조절 세포 또는 골수계-유래된 억제인자 세포(MDSC)이다. 상기 방법이 1종 이상의 치료제를 생성된 제1 및 제2 합성 세포 집단에 추가로 첨가하는 단계를 포함하는 일부 실시 형태에서, 1종 이상의 치료제는 펩타이드, 사이토카인, 면역관문 저해제, 미토겐, 성장 인자, 작은 RNA, dsRNA(이중 가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 피더 세포, 피더 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 하나 이상의 관심 폴리핵산을 포함하는 벡터, 항체, 화학치료제 또는 방사성 모이어티, 또는 면역조절 약물(IMiD)을 포함한다. 1종 이상의 치료제가 면역관문 저해제를 포함하는 일부 실시 형태에서, 면역관문 저해제는 (a) PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 또는 저해성 KIR을 포함하는 1종 이상의 길항제 면역관문 분자; (b) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리릴루맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이들의 유도체 또는 기능성 등가물 중 1종 이상; 또는 (c) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 적어도 1종을 포함한다. 1종 이상의 치료제가 항체를 포함하는 일부 실시 형태에서, 항체는, (a) 항-CD20, 항-HER2, 항-CD52, 항-EGFR, 항-CD123, 항-GD2, 항-PDL1 및/또는 항-CD38 항체; (b) 레툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 유블리툭시맙, 오카라투주맙, 오비누투주맙, 트라스투주맙, 퍼투주맙, 알렘투주맙, 서툭시맙, 디누툭시맙, 아벨루맙, 다라투무맙, 이사툭시맙, MOR202, 7G3, CSL362, 엘로투주맙 및 이들의 인간화된 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편 및 이들의 기능성 등가물 및 바이오시밀러 중 1종 이상; 또는 (c) 다라투무맙을 포함한다. 제조 방법의 다양한 실시 형태에서, 상기 방법은 제1 합성 세포 집단과 제2 합성 세포 집단을 혼합 집단으로 조합하는 단계를 추가로 포함한다.
본 명세서에 제공된 바와 같은 조성물 및 방법의 다양한 목적 및 이점은 첨부된 도면과 함께 제공된 하기 설명으로부터 명백할 것이며, 여기서 예시 및 예의 방식에 의해서 본 발명의 특정 실시 형태가 언급되어 있다.
도 1은 iPSC-유래된 세포에서 세포 표면 발현된 사이토카인 또는 이의 수용체에 대한 몇몇 작제물 설계의 그래프도이다. IL15는 예시적인 예로서 사용되며, 이는 다른 바람직한 사이토카인으로 대체될 수 있다.
도 2는 유세포측정에 의해서 결정된 텔로미어 길이의 그래프도로서, iPSC로부터의 성숙 유도체 NK 세포는 성체 말초 혈액 NK 세포에 비해서 더 긴 텔로미어를 유지하는 것을 보여주고 있다.
도 3은 CAR-iNK 세포의 순차적 첨가가 CAR-iT 세포 세포독성을 개선한다는 것과, 표적 종양 세포의 살해가 ADCC에 의해 추가로 증가된다는 것을 나타낸 그래프도이다.
도 4a 및 도 4b는, RTX Raji-모(parental) 표적(CD19+; 도 4a) 및 Raji-CD19KO(CD19-; 도 4b)를 첨가함으로써 증가된 E:T 비와 조합된, CAR-iT 및 CAR-iNK 세포의 직접 세포독성 및 ADCC 상가적 효과의 평가를 나타낸 그래프도로서, 도 4a는 이중 표적화 효과를 입증하고, 도 4b는 종양 항원 탈출 환경에서 표적 세포에 대한 효과기 세포 콤보 세포독성을 추가로 제시한다.
도 5a는 표적 세포주 ARH-77(CD19+CD20+)에 대한 효과기 대 표적 비의 적정(titration)을 나타낸 그래프도로서, 이는 CAR-iT 단독, CAR-iT 및 CAR-iNK, 및 리툭시맙과 조합된 CAR-iT 및 CAR-iNK에 의한 항-종양 활성의 상가적 증가를 입증한다. 도 5b는 B 종양주들의 패널에 대한 CAR-iT 단독, CAR-iT 및 CAR-iNK, 및 리툭시맙과 조합된 CAR-iT 및 CAR-iNK의 상대 활성을 나타낸 것으로, 이는 곡선 아래 면적(AUC)으로서 계산되어 있고, 히트맵에 예시되어 있다.
도 6a 내지 도 6c는, RAJI 종양 세포가 접종되고, (도 6a) 리툭시맙 단독, (도 6b) 1차 CAR-T 세포, 및 (도 6c) CAR-iT, CAR-iNK 및 리툭시맙의 조합물로 처리된 NSG 마우스로부터의 결과를 나타낸 그래프도이다.
도 6d는 주사 후 41일의 기간에 걸친 각 마우스의 IVIS 이미지를 나타내는데, 이는 CAR-iT, CAR-iNK 및 ADCC 기능의 조합을 사용할 때의 생체내 림프종 모델에서의 Raji 종양 세포의 효과적인 제거를 입증한다.
iPSC(유도 만능성 줄기세포)의 게놈 변형은 폴리뉴클레오타이드 삽입, 결실 및 치환을 포함한다. 게놈-조작된 iPSC에서의 외인성 유전자 발현은 종종 본래 게놈-조작된 iPSC의 연장된 클론성 증폭 후, 세포 분화 후 및 게놈-조작된 iPSC로부터 유래된 세포로부터의 탈분화된 세포 유형에서 유전자 침묵 또는 유전자 발현 감소와 같은 문제를 경험한다. 다른 한편, 1차 면역 세포, 예컨대, T 또는 NK 세포의 직접 조작은 도전적이며, 입양 세포 요법을 위한 조작된 면역 세포의 제조 및 전달에 장애물을 제공한다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명은 자살 유전자 및 다른 기능성 양상을 비롯한 하나 이상의 외인성 유전자를 안정적으로 통합시키기 위한 효율적이고, 실현 가능하고, 표적화된 접근법을 제공하며, 이것은 유도 iPSC 분화로부터 얻어진 iPSC 유도체 세포에 생착, 수송, 귀소, 이동, 세포독성, 생존력, 유지, 증폭, 수명, 자가-재생, 지속성 및/또는 생존과 관련된 개선된 치료 특성을 제공하며, 유도체 세포는 HSC(조혈 줄기 및 전구 세포), 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구 세포, NK 세포 전구 세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
정의
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 관련하여 사용된 과학 용어 및 기술 용어는 당업자에게 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수형은 복수를 포함하고 복수형은 단수를 포함할 것이다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않으며, 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정 실시 형태를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명의 범주를 한정하려는 의도가 아니며, 본 발명의 범주는 청구범위에 의해서만 정의된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수의 용어는 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
대안의(예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 둘 다 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "및/또는"은 대안 중 하나, 둘 다 또는 모두를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 비해 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%만큼 많이 변하는 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시 형태에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2% 또는 ± 1%가 되는, 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 범위를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "실질적으로" 또는 "본질적으로"는 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 비해 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 더 높은 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시 형태에서, 용어 "본질적으로 동일한" 또는 "실질적으로 동일한"은 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 거의 동일한 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 범위를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "실질적으로 없는" 및 "본질적으로 없는"은 상호 교환 가능하게 사용되고, 조성물, 예컨대 세포 집단 또는 배양 배지를 기재하기 위해 사용될 때, 특정된 물질 또는 그의 공급원이 없는, 예컨대 구체화된 물질 또는 그의 공급원이 95% 없는, 96% 없는, 97% 없는, 98% 없는, 99% 없거나, 또는 통상적인 수단에 의해 측정하여 검출 불가능한 조성물을 지칭한다. 조성물 중의 특정 성분 또는 물질이 "없는" 또는 "본질적으로 없는"이라는 용어는 또한 이러한 성분 또는 물질이 (1) 임의의 농도로 조성물 중에 포함되지 않거나, 또는 (2) 기능적으로 불활성인 저농도로 조성물 중에 포함된다는 것을 의미한다. 조성물의 특정 물질 또는 그의 공급원의 부재를 지칭할 때, 용어 "의 부재"에 유사한 의미가 적용될 수 있다.
본 명세서 전체적으로, 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다", "포함한다" 및 "포함하는"은 단계들 또는 요소들의 언급된 단계 또는 요소의 포함을 나타내지만, 단계들 또는 요소들의 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 그룹의 제외를 나타내는 것으로 이해될 것이다. 특정 실시 형태에서, 용어 "포함한다(include, comprise)", "갖는다(has)" 및 "함유한다(contain)"는 동의어로 사용된다.
"~로 이루어진"이란, 어구 "~로 이루어진" 앞에 오는 것은 무엇이든지 포함하고 이로 한정됨을 의미한다. 따라서, 어구 "~로 이루어진"은 열거된 요소가 필요하거나 필수적이며 다른 요소가 존재할 수 없음을 나타낸다.
"본질적으로 이루어진"은 어구 다음에 열거된 임의의 요소를 포함하고, 열거된 요소에 대해 개시내용에서 구체화된 활성 또는 작용을 방해하지 않거나 또는 기여하지 않는 다른 요소로 제한된다는 것을 의미한다. 따라서, 어구 "본질적으로 이루어진"은 열거된 요소가 필요하거나 또는 필수적인 것이지만, 다른 요소가 선택적이지는 않고, 그들이 열거된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지의 여부에 따라 제공될 수도 있고 제공되지 않을 수도 있다는 것을 나타낸다.
본 명세서 전체적으로 "일 실시 형태", "실시 형태", "특정 실시 형태", "관련된 실시 형태", "특정 실시 형태", "추가적인 실시 형태" 또는 "추가 실시 형태" 또는 이들의 조합에 대한 언급은 실시 형태와 관련하여 기재된 특정 특성, 구조 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 실시 형태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체적으로 다양한 곳에서 앞서 언급한 어구의 출현은 반드시 동일한 실시 형태를 모두 언급할 필요는 없다. 더 나아가, 특정 특성, 구조 또는 특징은 하나 이상의 실시 형태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
용어 "생체외"는 일반적으로 유기체 외부, 예컨대 바람직하게는 자연 조건의 최소 변형을 갖는 유기체 외부의 인공 환경에서의 살아있는 조직 내 또는 살아있는 조직 상에서 행해지는 실험 또는 측정에서 일어나는 활성을 지칭한다. 특정 실시 형태에서, "생체외" 절차는 유기체로부터 취해지고, 보통 멸균 조건 하에 실험 장치에서, 그리고 전형적으로 환경에 따라서 몇 시간 동안 또는 약 24시간까지(48시간 또는 72시간 또는 그 이상을 포함) 배양되는 살아있는 세포 또는 조직을 수반한다. 특정 실시 형태에서, 이러한 조직 또는 세포는 수집되고, 냉동될 수 있고, 이후에 생체외 처리를 위해 해동될 수 있다. 살아있는 세포 또는 조직을 이용하여 며칠보다 더 길게 지속되는 조직 배양 실험 또는 절차는 전형적으로 "시험관내"가 (특정 실시 형태에서, 이 용어가 생체외 상호 교환 가능하게 사용될 수는 있지만) 되는 것으로 고려된다.
용어 "생체내"는 일반적으로 유기체 내에서 일어나는 활동을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "재프로그래밍" 또는 "탈분화" 또는 세포 효력의 증가" 또는 "발생 효력의 증가"는 세포의 효력을 증가시키거나 또는 세포를 덜 분화된 상태로 분화시키는 방법을 지칭한다. 예를 들어, 증가된 세포 효력을 갖는 세포는 비-재프로그래밍 상태에서의 동일 세포에 비해 더 발생된 가소성을 가진다(즉, 더 많은 세포 유형으로 분화할 수 있음). 다시 말해서, 재프로그래밍된 세포는 비-재프로그래밍 상태에서의 동일 세포보다 덜 분화된 상태의 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "분화"는 비분화된("비수임된(uncommitted)") 또는 덜 분화된 세포가 분화된 세포, 예를 들어, 혈액 세포 또는 근육 세포의 특징을 수득하는 과정이다. 분화된 또는 분화-유도 세포는 세포 계통 내에서 더 분화된("수임된(committed)") 위치 상에서 취해진 것이다. 용어 "수임된"은 분화 과정에 적용될 때, 정상 환경 하에서 그것이 특정 세포 유형 또는 세포 유형의 하위세트로 분화를 계속할 수 있는 지점으로 분화 경로에서 진행하고, 정상 환경 하에서 상이하나 세포 유형으로 분화하거나 또는 덜 분화된 세포 유형으로 되돌아가는 지점까지 분화 경로에서 진행되는 세포를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "만능"은 신체 또는 체세포의 모든 계통(즉, 배아 적합)을 형성하는 세포의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 배아 줄기세포는 각각 3가지의 배층(외배엽, 중배엽 및 내배엽)으로부터의 세포를 형성할 수 있는 만능성 줄기세포 유형이다. 만능성은 완전한 유기체를 더 원시적으로 발생되게 할 수 없는 불완전하게 또는 부분적으로 만능성 세포(예를 들어, 원외배엽 줄기세포 또는 EpiSC), 완전한 유기체(예를 들어, 배아 줄기세포)가 생기게 할 수 있는 더 만능의 세포의 범위에 있는 발생 효력의 연속체이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "유도 만능성 줄기세포" 또는 iPSC는 유도 또는 변화된, 즉, 모두 3가지의 배아 또는 진피층(중배엽, 내배엽 및 외배엽)으로 분화할 수 있는 세포로 재프로그래밍된 분화된 성체, 신생아 또는 태아 세포로부터 생성되는 줄기세포를 지칭한다. 생성된 iPSC는 그들이 자연에서 발견되기 때문에 세포를 지칭하지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "배아 줄기세포"는 배아 배반포의 내부 세포 덩어리의 자연 발생 만능성 줄기세포를 지칭한다. 배아 줄기세포는 만능성이며, 3가지의 1차 배엽(외배엽, 내배엽 및 중배엽)의 모든 유도체로의 발생 동안 생기게 한다. 그들은 배아외막 또는 태반에 기여하지 않는다(즉, 전능성(totipotent)이 아니다).
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "다능성 줄기세포"는 하나 이상의 배엽(즉, 외배엽, 중배엽 및 내배엽)(그러나 3가지 모두는 아님)의 세포로 분화하는 발생 가능성을 갖는 세포를 지칭한다. 따라서, 다능성 세포는 "부분 분화된 세포"로도 칭해질 수 있다. 다능성 세포는 관련 기술 분야에 잘 공지되어 있고, 다능성 세포의 예는 성체 줄기세포, 예를 들어, 조혈 줄기세포 및 신경 줄기세포를 포함한다. "다능성"은 세포가 주어진 계통에서 다수 유형의 세포(그러나 다른 계통의 세포는 아님)를 형성할 수 있다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 다능성 조혈 세포는 다수의 상이한 유형의 혈액 세포(적혈구, 백혈구, 혈소판 등)를 형성할 수 있지만, 뉴런을 형성할 수 없다. 따라서, 용어 "다능성"은 전능성 및 만능성보다 더 적은 발생 가능성 정도를 갖는 세포 상태를 지칭한다.
만능성은 세포의 만능성 특징을 평가함으로써 부분적으로 결정될 수 있다. 만능성 특징은 하기를 포함하지만 이로 한정되지 않는다: (i) 만능성 줄기세포 형태; (ii) 무제한 자가-재생에 대한 잠재성; (iii) SSEA1(마우스만), SSEA3/4, SSEA5, TRA1-60/81, TRA1-85, TRA2-54, GCTM-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133/프로미닌, CD140a, CD56, CD73, CD90, CD105, OCT4, NANOG, SOX2, CD30 및/또는 CD50을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 만능성 줄기세포 마커의 발현; (iv) 3가지 모든 체세포 계통(외배엽, 중배엽 및 내배엽)으로 분화되는 능력; (v) 3가지 체세포 계통으로 이루어진 기형종 형성; 및 (vi) 3가지 체세포 계통으로부터의 세포로 이루어진 배상체(embryoid body)의 형성.
다음 2가지 유형의 만능성이 이전에 기재되었다: 후기 배반포의 원외배엽 줄기세포(EpiSC)와 유사한 만능성의 "프라이밍된" 또는 "전이성" 상태, 및 초기/이식전 배반포의 내부 세포 덩어리와 유사한 만능성의 "미감작" 또는 "바닥" 상태. 만능성 상태는 둘 다 상기 기재한 바와 같은 특징을 나타내지만, 미감작 또는 바닥 상태는 추가로 다음을 나타낸다: (i) 암컷 세포에서 X-염색체의 사전-비활성화 또는 재활성화; (ii) 단일-세포 배양 동안 개선된 클론성 및 생존; (iii) DNA 메틸화에서의 전반적 감소; (iv) 발생 조절 유전자 프로모터에 대한 H3K27me3 억제 염색질 마크 침착의 감소; 및 (v) 만능성 세포의 프라이밍된 상태에 비해 분화 마커의 감소된 발현. 외인성 만능성 유전자가 체세포에 도입되고, 발현되며, 이어서 수득된 만능성 세포로부터 침묵화되거나 제거된 세포 프로그래밍의 표준 방법은 일반적으로 만능성의 프라이밍-상태의 특징을 갖는 것으로 보인다. 표준 만능성 세포 배양 조건 하에서, 외인성 이식유전자 발현이 유지되지 않는 한 이러한 세포는 프라이밍된 상태로 남아있되, 바닥 상태의 특징이 관찰된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "만능성 줄기세포 형태"는 배아 줄기세포의 고전적 형태 특징을 지칭한다. 정상 배아 줄기세포 형태는 높은 핵-대-세포질 비, 핵소체의 주목할 만한 존재 및 전형적인 세포내 간격과 함께 형상이 둥글고 작은 것을 특징으로 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 임의의 동물, 바람직하게는, 인간 환자, 가축 또는 다른 집에서 기르는 동물을 지칭한다.
"만능성 인자" 또는 "재프로그래밍 인자"는 단독으로 또는 다른 작용제와 조합하여, 세포의 발생 효력을 증가시킬 수 있는 작용제를 지칭한다. 만능성 인자는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 소분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 만능성 인자는, 예를 들어, 전사 인자 및 소분자 재프로그래밍제를 포함한다.
"배양물" 또는 "세포 배양물"은 시험관내(in vitro) 환경에서 세포의 유지, 성장 및/또는 분화를 지칭한다. "세포 배양 배지", "배양 배지"(각각의 경우에 단수 "배지"), "보충물" 및 "배지 보충물"은 세포 배양물을 배양하는 영양 조성물을 지칭한다.
"배양하다" 또는 "유지하다"는, 예를 들어 멸균 플라스틱(또는 코팅된 플라스틱)세포 배양물 접시 또는 플라스크에서 조직 또는 신체 밖에서 세포를 지속하고/하거나, 증식(성장)시키고/시키거나 분화시키는 것을 지칭한다. "배양" 또는 "유지하는"은 세포를 증식시키고/시키거나 지속시키는 데 도움이 되는 영양소, 호르몬 및/또는 다른 인자의 공급원으로서 배양 배지를 이용할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "중배엽"은 초기 배형성 동안 나타나고, 순환계, 근육, 심장, 진피, 골격 및 기타 지지 및 결합 조직의 혈액 세포를 포함하는 다양한 분화된 세포 유형이 생기게 하는 3가지 배엽 중 하나를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "확정적 조혈 내피"(HE) 또는 "만능성 줄기세포-유래된 확정적 조혈 내피"(iHE)는 내피세포에서 조혈세포로의 이행(endothelial-to-hematopoietic transition)으로 불리는 과정에서 조혈 줄기 및 전구 세포를 생기게 하는 내피 세포의 하위세트를 지칭한다. 배아 내 조혈 세포의 발생은 혈액모세포에서 확정적 조혈 내피 및 조혈 전구체까지 측판 중배엽으로부터 순차적으로 진행된다.
용어 "조혈 줄기 및 전구 세포", "조혈 줄기세포", "조혈 전구 세포", 또는 "조혈 전구체 세포"는 조혈 계통에 수임되지만, 추가로 조혈 분화가 가능하고, 다능성 조혈 줄기세포(혈구모세포), 골수 전구체, 거핵세포 전구체, 적혈구 전구체 및 림프구 전구체를 포함하는 세포를 지칭한다. 조혈 줄기 및 전구 세포(HSC)는 골수(단핵구 및 대식세포, 호중구, 호염구, 호산구, 적혈구, 거핵세포/혈소판, 수지상 세포), 및 림프구 계통(T 세포, B 세포, NK 세포)을 비롯한, 혈액 세포 유형 모두를 생성시키는 다능성 줄기세포다. 용어 "확정적 조혈 줄기세포"는 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 성숙 골수, 및 T 계통 세포, NK 계통 세포 및 B 계통 세포를 비롯한 림프구 세포 유형 둘 다를 생성할 수 있는 CD34+ 조혈 세포를 지칭한다. 조혈 세포는 또한 원시적 적혈구, 거핵세포 및 대식세포를 생성시키는 원시적 조혈 세포의 다양한 하위세트를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "T 림프구" 및 "T 세포"는 상호교환 가능하게 사용되고, 흉선에서 성숙을 완결하고, 신체에서의 특이적 외부 항원의 식별 및 MHC 클래스 I-제한된 방식으로의 다른 면역 세포의 활성화 및 비활성화를 비롯한, 면역계에서 다양한 역할을 갖는 백혈구의 주요 유형을 지칭한다. T 세포는 임의의 T 세포, 예컨대 배양된 T 세포, 예를 들어, 1차 T 세포, 또는 배양된 T 세포주로부터의 T 세포, 예를 들어, Jurkat, SupT1 등, 또는 포유동물로부터 얻은 T 세포일 수 있다. T 세포는 CD3+ 세포일 수 있다. T 세포는 T 세포의 임의의 유형일 수 있고, CD4+/CD8+ 이중 양성 T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포(예를 들어, Th1 및 Th2 세포), CD8+ T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포), 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell: PBMC), 말초 혈액 백혈구(peripheral blood leukocyte: PBL), 종양 침윤성 림프구(tumor infiltrating lymphocyte: TIL), 기억 T 세포, 미감작 T 세포, 조절 T 세포, 감마 델타 T 세포(γδT 세포) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 발생 단계를 가질 수 있다. 추가적인 유형의 헬퍼 T 세포는 Th3(Treg), Th17, Th9 또는 Tfh 세포와 같은 세포를 포함한다. 추가적인 유형의 기억 T 세포는 중앙 기억 T 세포(Tcm 세포), 효과기 기억 T 세포(Tem 세포 및 TEMRA 세포)와 같은 세포를 포함한다. 용어 "T 세포"는 또한 유전자 조작된 T 세포, 예컨대 T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키도록 변형된 T 세포를 지칭할 수 있다. T 세포 또는 T 세포 유사 효과기 세포는 또한 줄기세포 또는 전구 세포로부터 분화될 수 있다. 유래된 T 세포 유사 효과기 세포는 어떤 면에서 T 세포 계통을 가질 수 있지만, 동시에 1차 T 세포에 존재하지 않는 하나 이상의 기능적 특징을 갖는다. 이러한 세포는 가장 가까운 상대 1차 세포와 비교될 때 하나 이상의 비-네이티브 세포 기능을 갖기 위한 "합성 세포"로 지칭될 수 있다.
"CD4+ T 세포"는 이의 표면 상에서 CD4를 발현하고, 세포-매개된 면역 반응과 연관된 T 세포의 하위세트를 지칭한다. 이것은 사이토카인, 예컨대 IFN-감마, TNF-알파, IL2, IL4 및 IL10의 분비를 포함할 수 있는, 자극 이후의 분비 프로파일을 특징으로 한다. "CD4" 분자는 T-림프구 상의 분화 항원으로서 본래 정의되지만, 단핵구/대식세포를 비롯한 다른 세포 상에서도 발견되는 55-kD 당단백질이다. CD4 항원은 면역글로불린 초유전자 패밀리의 구성원이고, MHC(주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex)) 클래스 II-제한된 면역 반응에서 회합성 인식 요소로서 관련된다. T-림프구 상에서 이것은 헬퍼/유도자 하위세트를 정의한다.
"CD8+ T 세포"는 이의 표면 상에서 CD8을 발현하고, MHC 클래스 I-제한되고, 세포독성 T 세포로서 기능하는 T 세포의 하위세트를 지칭한다. "CD8" 분자는 흉선세포 상에서 그리고 세포독성 및 억제인자(suppressor) T-림프구 상에서 발견되는 분화 항원이다. CD8 항원은 면역글로불린 초유전자 패밀리의 구성원이고, 주요 조직적합성 복합체 클래스 I-제한된 상호작용에서 회합성 인식 요소이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "NK 세포" 또는 "자연 살해 세포"는 CD56 또는 CD16의 발현 및 T 세포 수용체(CD3)의 부재에 의해 나타나는 말초 혈액 림프구의 하위세트를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "적응 NK 세포" 및 "기억 NK 세포"는 상호 교환 가능하며, NKG2C 및 CD57, 및 선택적으로, CD16 중 적어도 하나를 발현시키지만, 다음의 PLZF, SYK, FceR 및 EAT-2 중 하나 이상의 발현이 결여된 표현형으로 CD3- 및 CD56+인 NK 세포의 하위세트를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, CD56+ NK 세포의 단리된 하위집단은 CD16, NKG2C, CD57, NKG2D, NCR 리간드, NKp30, NKp40, NKp46, 활성화 및 저해 KIR, NKG2A 및/또는 DNAM-1의 발현을 포함한다. CD56+는 약한(dim) 또는 강한(bright) 발현일 수 있다. NK 세포 또는 NK 세포 유사 효과기 세포는 줄기세포 또는 전구 세포로부터 분화될 수 있다. 유도체 NK 세포 유사 효과기 세포는 어떤 면에서 NK 세포 계통을 가질 수 있지만, 동시에 1차 NK 세포에 존재하지 않는 하나 이상의 기능적 특징을 갖는다. 이러한 세포는 가장 가까운 상대 1차 세포와 비교될 때 하나 이상의 비-네이티브 세포 기능을 갖기 위한 "합성 세포"로 지칭될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "NKT 세포" 또는 "자연 살해 T 세포"는 T 세포 수용체(TCR)를 발현시키는 CD1d-제한된 T 세포를 지칭한다. 통상적인 주요 조직적합성(MHC) 분자에 의해 제시된 펩타이드 항원을 검출하는 통상적인 T 세포와 달리, NKT 세포는 CD1d, 비-고전적 MHC 분자에 의해 제시된 지질 항원을 인식한다. 2가지 유형의 NKT 세포가 인식된다. 비변이체 또는 I형 NKT 세포는 제한된 범위의 β 쇄(인간에서의 Vβ11)와 관련된 매우 제한된 TCR 레퍼토리 - 정규 α-쇄(인간에서의 Vα24-Jα18)를 발현시킨다. 비정규 또는 비변이체가 아닌 II형 NKT 세포로 불리는 NKT 세포의 제2 집단은 더 이종성의 TCR αβ 사용을 나타낸다. I형 NKT 세포는 면역요법에 적합한 것으로 고려된다. 적응 또는 비변이체(I형) NKT 세포는 다음의 마커, TCR Va24-Ja18, Vb11, CD1d, CD3, CD4, CD8, aGalCer, CD161 및 CD56 중 하나 이상의 발현에 의해 확인될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "단리된" 등은 이의 본래 환경으로부터 분리된 세포 또는 세포의 집단을 지칭하고, 즉, 단리된 세포의 환경은 "비-단리된" 참조 세포가 존재하는 환경에서 발견되는 바와 같은 적어도 하나의 성분이 실질적으로 없다. 이 용어는 이것이 이의 자연 환경에서 발견되고, 예를 들어, 조직 또는 생검물 샘플에서 단리되는 바와 같은 일부 또는 모든 성분으로부터 제거된 세포를 포함한다. 이 용어는 또한 세포가 비-자연 발생 환경에서 발견되고, 예를 들어, 세포 배양물 또는 세포 현탁물로부터 단리되는 바와 같은 적어도 하나의, 일부의 또는 모든 성분으로부터 제거된 세포를 포함한다. 따라서, "단리된" 세포는 이것이 자연에서 발견되는 바와 같은 또는 이것이 비-자연 발생 환경에서 성장, 저장 또는 존재하는 바와 같은, 다른 물질, 세포 또는 세포 집단을 비롯한 적어도 하나의 성분으로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된다. 단리된 세포의 구체적인 예는 부분적으로 순수한 세포 조성물, 실질적으로 순수한 세포 조성물 및 비-자연 발생인 배지에서 배양된 세포를 포함한다. 단리된 세포는 목적하는 세포 또는 이의 집단을 환경에서의 다른 물질 또는 세포로부터 분리하거나, 또는 하나 이상의 다른 세포 집단 또는 하위집단을 환경으로부터 제거함으로써 수득될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "순도" 등은 순도를 증가시키는 것을 지칭한다. 예를 들어 순도는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%로 증가될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "암호화"는 뉴클레오타이드(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 정의된 서열 또는 아미노산의 정의된 서열 중 어느 하나 및 그로부터 생성된 생물학적 특성을 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 기능하는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA에서의 뉴클레오타이드의 특이적 서열의 고유 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자는, 그 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물계에서 단백질을 생산하는 경우 단백질을 암호화한다. 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는, 뉴클레오타이드 서열이 mRNA 서열과 동일하고, 통상적으로 서열 목록으로 제공되는 암호 가닥, 및 비-암호 가닥 둘 다는 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 산물을 "암호화"한다고 지칭될 수 있다.
"작제물"은 시험관내 또는 생체내에서 숙주 세포에 전달될 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 거대분자 또는 분자의 복합체를 지칭한다. "벡터"는 본 명세서에 사용되는 바와 같이 외부 유전 물질의 표적 세포로의 전달 또는 이송을 안내할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 지칭하고, 여기서 그것은 복제 및/또는 발현될 수 있다. 따라서, 용어 "벡터"는 전달될 작제물을 포함한다. 벡터는 선형 또는 원형 분자일 수 있다. 벡터는 통합 또는 비통합될 수 있다. 벡터의 주요 유형은 플라스미드, 에피솜 벡터, 바이러스 벡터, 코스미드 및 인공 염색체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
"통합"이라는 것은, 작제물의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 세포 게놈 내로 안정하게 삽입되는 것, 즉 세포의 염색체 DNA 내의 핵산 서열에 공유 연결되는 것을 의미한다. "표적화된 통합"이라는 것은, 작제물의 뉴클레오타이드(들)가 미리-선택된 부위 또는 "통합 부위"에서 세포의 염색체 또는 미토콘드리아 DNA에 삽입되는 것을 의미한다. 용어 "통합"은 본 명세서에 사용되는 바와 같이 통합 부위에서 내인성 서열 또는 뉴클레오타이드의 결실이 있거나 또는 결실이 없는, 작제물의 1종 이상의 외인성 서열 또는 뉴클레오타이드의 삽입에 관련된 과정을 추가로 지칭한다. 이 경우, 삽입 부위 내에 결실이 존재하는 경우, "통합"은 하나 이상의 삽입된 뉴클레오타이드가 결실된 내인성 서열 또는 뉴클레오타이드의 대체를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "외인성"은 언급된 분자 또는 언급된 활성이 숙주 세포에 도입되거나 숙주 세포에 대해서 비-네이티브인 것을 의미하도록 의도된다. 분자는 예를 들어, 암호화 핵산을 숙주 유전 물질에 도입함으로써, 예컨대 숙주 염색체에 또는 비-염색체 유전 물질, 예컨대 플라스미드로서 통합시킴으로써 도입될 수 있다. 따라서, 암호화 핵산의 발현과 관련하여 사용되는 바와 같이 이 용어는 발현성 형태의 암호화 핵산의 세포로의 도입을 지칭한다. 용어 "내인성"은 숙수 세포에 존재하는 언급된 분자 또는 활성을 지칭한다. 유사하게, 암호화 핵산의 발현과 관련하여 사용되는 경우 이 용어는 외인성으로 도입된 것이 아닌 세포 내에 함유된 암호화 핵산의 발현을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "관심 유전자" 또는 "관심 폴리뉴클레오타이드 서열"은 RNA로 전사되고, 일부예에서는 적절한 조절 서열의 제어 하에서 일어나는 경우 생체내에서 폴리펩타이드로 번역되는 DNA 서열이다. 관심 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드는 원핵생물 서열, 진핵생물 mRNA로부터의 cDNA, 진핵생물(예를 들어 포유동물) DNA로부터의 게놈 DNA 서열 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 관심 유전자는 miRNA, shRNA, 네이티브 폴리펩타이드(즉, 자연에서 발견되는 폴리펩타이드) 또는 이의 단편; 변이체 폴리펩타이드(즉, 네이티브 폴리펩타이드와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 네이티브 폴리펩타이드의 돌연변이) 또는 이의 단편; 조작된 폴리펩타이드 또는 펩타이드 단편, 치료 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 이미징 마커, 선택성 마커 등을 암호화할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 또는 이들의 유사체인, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드의 서열은 4개의 뉴클레오타이드 염기: 아데닌(A); 사이토신(C); 구아닌(G); 티민(T); 및 폴리뉴클레오타이드가
RNA인 경우 티민에 대해서 우라실(U)로 구성된다. 폴리뉴클레오타이드는 유전자 또는 유전자 단편(예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 트랜스퍼 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 이중-가닥 분자 및 단일-가닥 분자 둘 다를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드", 및 "단백질"은 상호교환 가능하게 사용되고, 펩타이드 결합에 의해서 공유 연결된 아미노산 잔기를 갖는 분자를 지칭한다. 폴리펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하고, 폴리펩타이드의 아미노산의 최대 수에는 제한이 없다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어는 또한 일반적으로 관련 기술 분야에서 예를 들어, 펩타이드, 올리고펩타이드 및 올리고머라 지칭되는 단쇄, 및 일반적으로 관련 기술 분야에서 폴리펩타이드 또는 단백질이라 지칭되는 장쇄 둘 다를 지칭한다. "폴리펩타이드"는 예를 들어, 특히 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성인 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩타이드의 변이체, 변형된 폴리펩타이드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩타이드는 자연 폴리펩타이드, 재조합 폴리펩타이드, 합성 폴리펩타이드 또는 이들의 조합물을 포함한다.
"작동 가능하게 연결된"은 하나의 기능이 서로에 의해서 영향을 받도록 하는 단일 핵산 단편 상에서의 핵산 서열의 회합을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 그것이 그 암호 서열 또는 기능성 RNA의 발현에 영향을 줄 수 있는 경우(즉, 암호 서열 또는 기능성 RNA가 프로모터의 전사 제어 하에 있는 경우) 암호 서열 또는 기능성 RNA와 작동 가능하게 연결된다. 암호 서열은 센스 또는 안티센스 방향으로 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "유전자 각인"은 공급원 세포 또는 iPSC에서 우선적 치료적 속성에 기여하는 유전적 또는 후성적 정보를 지칭하고, 공급원 세포-유래된 iPSC 및/또는 iPSC-유래된 조혈 계통 세포에서 유지 가능하다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은, "공급원 세포"는 재프로그래밍을 통해 iPSC를 생성하기 위해 사용될 수 있는 비만능성 세포이고, 공급원 세포-유래된 iPSC는 임의의 조혈 계통 세포를 포함하는 특정 세포 유형으로 추가로 분화될 수 있다. 공급원 세포 유래된 iPSC, 및 이로부터의 분화 세포는 때때로 맥락에 따라서 "유래된" 또는 "유도체" 세포로 총괄적으로 불린다. 예를 들어, 유도체 효과기 세포 또는 유도체 NK 계통 세포 또는 유도체 T 계통 세포는 본 출원 전체에서 사용된 바와 같이, 자연/네이티브 공급원, 예컨대, 말초 혈액, 제대혈 또는 다른 공여자 조직으로부터 얻어진 이의 1차 상대물과 비교할 때 iPSC로부터 분화된 세포이다. 우선적인 치료적 속성을 부여하는 본 명세서에 사용되는 바와 같은 유전자 각인(들)은 공여자-, 질환- 또는 치료 반응-특이적인 선택된 공급원 세포의 재프로그래밍을 통해 또는 게놈 편집을 이용하여 유전자 변형된 양상을 iPSC에 도입하는 것을 통해 iPSC 내에 도입된다. 구체적으로 선택된 공여자, 질환 또는 치료 내용으로부터 얻은 공급원 세포의 측면에서, 우선적 치료적 속성에 기여하는 유전자 각인은 식별되든 아니든 근본적인 분자 사건과 상관없이 선택된 공급원 세포의 유도 세포 상에서 통과된 유지 가능한 표현형, 즉, 우선적인 치료적 속성을 나타내는 임의의 내용 특이적인 유전적 또는 후성적 변형을 포함할 수 있다. 공여자-, 질환- 또는 치료 반응-특이적 공급원 세포는 iPSC에서 유지 가능한 유전자 각인 및 유래된 조혈 계통 세포를 포함할 수 있으며, 이 유전자 각인은, 예를 들어, 바이러스 특이적 T 세포 또는 비변이체 자연 살해 T(iNKT) 세포로부터의 사전배열된 단일특이성 TCR; 추적할 수 있는 그리고 바람직한 유전적 다형성, 예를 들어, 선택된 공여자에서 고 친화도 CD16 수용체를 암호화하는 점 돌연변이에 대한 동형접합성; 및 사전결정된 HLA 요건, 즉, 증가된 집단을 갖는 단상형을 나타내는 선택된 HLA-매칭된 공여자 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 우선적 치료적 속성은 유래된 세포의 개선된 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자가-재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 생존 및 세포독성을 포함한다. 우선적인 치료적 속성은 또한 항원 표적화 수용체 발현; HLA 제시 또는 이의 결여; 종양 미세환경에 대한 저항성; 방관자 면역 세포 및 면역 조정의 유도; 감소된 종양-이탈 효과와 함께 개선된 표적-적중(on-target) 특이성; 및 화학요법과 같은 치료에 대한 저항성에 관한 것일 수 있다. 하나 이상의 치료적 속성을 갖는 유도체 세포가 우선적 치료적 속성을 부여하는 유전자 각인(들)이 도입된 iPSC의 분화로부터 수득될 때, 그러한 유도체 세포도 "합성 세포"로 불린다. 예를 들어, 합성 효과기 세포 또는 합성 NK 세포 또는 합성 T 세포는 본 출원 전체에서 사용된 바와 같이, 자연/네이티브 공급원, 예컨대, 말초 혈액, 제대혈 또는 다른 공여자 조직으로부터 얻어진 이의 1차 상대물과 비교할 때 게놈 변형된 iPSC로부터 분화된 세포이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "향상된 치료적 특성"은 동일한 일반적 세포 유형의 전형적 면역 세포에 비해 향상된 세포의 치료적 특성을 지칭한다. 예를 들어, "향상된 치료적 특성"을 갖는 NK 세포는 전형적, 비변형 및/또는 자연 발생 NK 세포에 비해 향상된, 개선된 그리고/또는 증가된 치료적 특성을 가질 것이다. 면역 세포의 치료적 특성은 세포 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자가-재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 생존 및 세포독성을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 면역 세포의 치료적 특성은 또한 항원 표적화 수용체 발현; HLA 제시 또는 이의 결여; 종양 미세환경에 대한 저항성; 방관자 면역 세포 및 면역 조정의 유도; 감소된 종양-이탈 효과와 함께 개선된 표적-적중 특이성; 및 화학요법과 같은 치료에 대한 저항성에 의해 나타난다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "인게이저"는 면역 세포, 예를 들어, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 호중구 및 종양 세포 사이에 연결을 형성할 수 있고; 면역 세포를 활성화시킬 수 있는 분자, 예를 들어 융합 폴리펩타이드를 지칭한다. 인게이저의 예는 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE), 이중특이성 살해 세포 인게이저(BiKE), 삼중특이성 살해 세포 인게이저(TriKE) 또는 다중특이성 살해 세포 인게이저 또는 다수의 면역 세포 유형과 양립가능한 보편적 인게이저를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "표면 촉발 수용체"는 면역 반응, 예를 들어, 세포독성 반응을 촉발시키거나 또는 개시할 수 있는 수용체를 지칭한다. 표면 촉발 수용체는 조작될 수 있고, 효과기 세포, 예를 들어, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 또는 호중구 상에서 발현될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 표면 촉발 수용체는 효과기 세포의 자연 수용체 및 세포 유형과 독립적인 효과기 세포와 특정 표적 세포, 예를 들어, 종양 세포 사이의 이중특이성 또는 다중특이성 항체 인게이지먼트를 용이하게 한다. 이 접근을 사용하여, 보편적 표면 촉발 수용체를 포함하는 iPSC를 생성할 수 있고, 이어서, 이러한 iPSC를 보편적 표면 촉발 수용체를 발현시키는 다양한 효과기 세포 유형의 집단으로 분화시킬 수 있다. "보편적"은 표면 촉발 수용체가 세포 유형과 상관 없이 임의의 효과기 세포에서 발현되고, 활성화시킬 수 있으며, 보편적 수용체를 발현시키는 모든 효과기 세포는 인게이저의 종양 결합 특이성과 상관없이 표면 촉발 수용체에 의해 인식될 수 있는 동일한 에피토프를 갖는 인게이저에 결합되거나 또는 연결될 수 있다는 것을 의미한다. 일부 실시 형태에서, 동일한 종양 표적화 특이성을 갖는 인게이저는 보편적 표면 촉발 수용체와 결합하기 위해 사용된다. 일부 실시 형태에서, 상이한 종양 표적화 특이성을 갖는 인게이저는 보편적 표면 촉발 수용체와 결합하기 위해 사용된다. 이렇게 해서, 하나 또는 다수의 효과기 세포 유형이 일부 경우에 종양 세포의 한 가지 특정 유형을 살해하기 위해 그리고 다른 경우에 2가지 이상의 유형의 종양을 살해하기 위해 인게이징될 수 있다. 표면 촉발 수용체는 일반적으로 효과기 세포 활성화를 위한 공자극성 도메인 및 인게이저의 에피토프에 특이적인 항-에피토프를 포함한다. 이중 특이성 인게이저는 한 말단 상에서 표면 촉발 수용체의 항-에피토프에 특이적이고, 다른 말단 상에서 종양 항원에 특이적이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "안전 스위치 단백질"은 세포 요법의 잠재적인 독성 또는 다른 유해 효과를 방지하도록 설계된 조작 단백질을 지칭한다. 일부 상황에서, 안전 스위치 단백질 발현은 안전 스위치 단백질을 그의 게놈으로 암호화하는 유전자 내에 영구적으로 도입된 이식 조작 세포에 대한 안전 문제를 처리하기 위해 조건적으로 제어된다. 이 조건적 조절은 가변적일 수 있고, 소분자-매개 번역 후 활성화 및 조직-특이적 및/또는 일시적 전사 조절을 통한 제어를 포함할 수 있다. 안전 스위치 단백질은 세포자멸사의 저해, 단백질 합성의 저해, DNA 복제, 성장 저지, 전사 및 전사 후 유전적 조절 및/또는 항체-매개 고갈을 매개할 수 있었다. 일부 예에서, 안전 스위치 단백질은 활성화될 때 치료 세포의 세포자멸사 및/또는 세포사를 촉발시키는 외인성 분자, 예를 들어, 전구약물에 의해 활성화된다. 안전 스위치 단백질의 예는 자살 유전자, 예컨대, 카스파제 9(또는 카스파제 3 또는 7), 티미딘 카이나제, 사이토신 데아미나제, B-세포 CD20, 변형된 EGFR 및 이들의 임의의 조합물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 이 전략에서, 유해 사건이 있는 경우에 투여되는 전구약물은 자살-유전자 산물에 의해 활성화되고, 형질도입 세포를 살해한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "약제학적으로 활성인 단백질 또는 펩타이드"는 유기체에 대한 생물학적 및/또는 약제학적 효과를 달성할 수 있는 단백질 또는 펩타이드를 지칭한다. 약제학적으로 활성인 단백질은 질환에 대한 치유하는 근치적 또는 고식적 특성을 가지며, 질환의 중증도를 개선시키거나, 경감시키거나, 완화시키거나, 반전시키거나 또는 줄이기 위해 투여될 수 있다. 약제학적으로 활성인 단백질은 또한 예방적 특성을 가지며, 질환의 개시를 방지하기 위해 또는 그것이 생길 때 이러한 질환 또는 병리적 병태의 중증도를 줄이기 위해 사용된다. "약제학적으로 활성인 단백질"은 전체 단백질 또는 펩타이드 또는 이의 약제학적으로 활성인 단편을 포함한다. 이 용어는 또한 단백질 또는 펩타이드의 약제학적으로 활성인 유사체 또는 단백질 또는 펩타이드의 단편의 유사체를 포함한다. 용어 약제학적으로 활성인 단백질은 또한 치료적 이점을 제공하기 위해 협력적으로 또는 상승적으로 작용하는 복수의 단백질 또는 펩타이드를 지칭한다. 약제학적으로 활성인 단백질 또는 펩타이드의 예는 수용체, 결합 단백질, 전사 및 번역 인자, 종양 성장 억제 단백질, 항체 또는 이의 단편, 성장 인자 및/또는 사이토카인을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "신호전달 분자"는 세포 신호 형질도입을 조절하거나, 이에 참여하거나, 저해하거나, 활성화시키거나, 감소시키거나 또는 증가시키는 임의의 분자를 지칭한다. "신호 형질도입"은 세포에서 생화학적 사건을 궁극적으로 촉발시키는 경로를 따라서 단백질 복합체의 동원에 의한 화학적 변형의 형태로 분자 신호의 전달을 지칭한다. 신호 형질도입 경로는 관련 기술 분야에 잘 공지되어 있고, G 단백질 결합 수용체 신호전달, 타이로신 카이나제 수용체 신호전달, 인테그린 신호전달, 톨 게이트 신호전달, 리간드-개폐 이온 통로 신호전달, ERK/MAPK 신호전달 경로, Wnt 신호전달 경로, cAMP-의존성 경로, 및 IP3/DAG 신호전달 경로를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "표적화 양상"은 i) 고유한 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)와 관련된 항원 특이성, ii) 단클론성 항체 또는 이중특이성 인게이저와 관련된 인게이저 특이성, iii) 형질전환 세포의 표적화, iv) 암 줄기세포의 표적화, 및 v) 특정 항원 또는 표면 분자의 부재 하에서의 다른 표적화 전략을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 항원 및/또는 에피토프 특이성을 촉진시키기 위해 세포 내에 유전적으로 도입된 분자, 예를 들어, 폴리펩타이드를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "특이적" 또는 "특이성"은 비특이적 또는 비선택적 결합과 대조적으로 표적 분자에 선택적으로 결합하는 분자, 예를 들어 수용체 또는 인게이저의 능력을 지칭하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "입양 세포 요법"은 상기 형질도입 전에 생체외에서 증폭된 유전자 변형된 또는 변형되지 않은 T 또는 B 세포로서 식별된 자가 또는 동종이계 림프구의 형질도입에 관한 세포 기반 면역요법을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "치료적 충분량"은 그의 의미 내에서 비독성이지만 충분하고 그리고/또는 유효한 양의 특정 치료제 및/또는 약제학적 조성물을 포함하며, 목적으로 하는 치료 효과를 제공하는 것을 언급한다. 필요한 정확한 양은 환자의 일반적 건강상태, 환자의 연령 및 병기 및 치료되는 병태의 중증도와 같은 인자에 따라서 대상체에 따라 달라질 것이다. 특정 실시 형태에서, "치료적 충분량"은 치료 중인 대상체의 질환 또는 병태와 관련된 적어도 하나의 증상을 호전시키고/시키거나, 감소시키고/시키거나, 개선하는 데 충분하고/하거나 효과적이다.
만능성 줄기세포의 분화는 배양 시스템의 변화, 예컨대 배양 배지 또는 세포의 물리적 상태에서 자극제의 변화를 필요로 한다. 가장 통상적인 전략은 공통된 중요한 중간체로서 배상체(EB)의 형성을 이용하여 계통-특이적 분화를 개시한다. "배상체"는 그들의 3차원 면적 내에서 수많은 계통을 생기게 하기 때문에 배아 발생을 모방하는 것으로 나타난 3차원 클러스터이다. 분화 과정, 전형적으로 몇 시간 내지 며칠을 통해, 단순한 EB(예를 들어, 응집된 만능성 줄기세포는 분화하도록 유발됨)는 성숙을 계속하고, 그들이 추가로 분화를 계속하도록 진행되는 시간, 전형적으로 며칠 내지 몇주에 낭포성 EB로 발생된다. EB 형성은, 만능성 줄기세포가 세포의 3차원 다층 클러스터에서 서로 매우 근접하게 함으로써 개시된다. 전형적으로, 이는, 만능성 세포가 액적(liquid droplet) 중에 침강될 수 있게 하는 방법, 세포를 "U"자형 바닥 웰-플레이트 내로 침강시키는 방법 또는 기계적 교반에 의한 방법을 포함한 몇몇 방법들 중 하나에 의해 달성된다. EB 발생을 촉진시키기 위해, 만능성 줄기세포 응집물은 추가적인 분화 신호가 필요한데, 만능성 배양물 유지 배지 내에 유지된 응집물이 적절한 EB를 형성하지 않기 때문이다. 이렇게 해서, 만능성 줄기세포 응집물은 선택 계통에 대한 유발 신호를 제공하는 분화 배지로 전달될 필요가 있다. 만능성 줄기세포의 EB-기반 배양물은 전형적으로 EB 세포 클러스터 내에서 보통의 증식을 갖는 분화된 세포 집단(예를 들어, 외배엽, 중배엽 및 내배엽의 배엽)의 생성을 초래한다. 세포 분화를 용이하게 하는 것으로 입증되었지만, 그러나 EB는, 환경 내의 분화 신호에 대한 3차원 구조에서의 세포의 일관되지 않은 노출로 인해 가변성 분화 상태에서 불균질 세포가 생기게 한다. 추가로, EB는 생성 및 유지하는 데 힘이 든다. 게다가, EB를 통한 세포 분화는 보통 세포 증폭을 수반하는데, 이는 또한 낮은 분화 효율에 기여한다.
비교하면, "EB 형성"과 별개인 "응집물 형성"은 만능성 줄기세포-유래된 세포의 집단을 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 응집물-기반 만능성 줄기세포 증폭 동안, 배양 배지는 증식 및 만능성을 유지하도록 선택된다. 세포 증식은 일반적으로 응집물의 크기를 증가시켜 더 큰 응집물을 형성하고, 이것은 배양물 내의 세포 증식을 유지시키기 위해 그리고 세포수를 증가시키기 위해 더 작은 응집물로 일상적으로 기계적으로 또는 효소적으로 해리될 수 있다. EB 배양물과 별개로, 유지 배양 배지 중의 응집물 내에서 배양된 세포는 만능성 마커를 유지한다. 만능성 줄기세포 응집물은 분화를 유도하기 위한 추가적인 분화 신호를 필요로 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단일층 분화"는 세포의 3차원 다층 클러스터를 통한 분화, 즉, "EB 형성"과 구별되는 분화 방법을 지칭하는 용어이다. 본 명세서에 개시된 다른 이점들 중에서, 단일층 분화는 분화를 개시하는 데 있어서의 EB 형성에 대한 필요성을 피한다. 단일층 배양은, EB 형성에서와 같은 배아 발생을 모방하지 않기 때문에, 특정 계통에 대한 분화는 EB 형성에서의 모두 3가지 배엽 분화에 비해 최소인 것으로 여겨진다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "해리된" 세포는 다른 세포로부터 또는 표면(예를 들어, 배양 플레이트 표면)으로부터 실질적으로 분리되거나 또는 정제된 세포를 지칭한다. 예를 들어, 세포는 기계적 또는 효소적 방법에 의해 동물 또는 조직으로부터 해리될 수 있다. 대안적으로, 시험관내에서 응집하는 세포는 서로로부터, 예컨대 클러스터, 단일 세포 또는 단일 세포와 클러스터의 혼합물의 현탁액으로 해리에 의해 효소적으로 또는 기계적으로 해리될 수 있다. 또 다른 대안의 실시 형태에서, 부착 세포는 배양 플레이트 또는 다른 표면으로부터 해리될 수 있다. 따라서 해리는 세포외 기질(ECM) 및 기질(예를 들어, 배양 표면)과의 세포 상호작용을 파괴하는 것 또는 세포 사이의 ECM을 파괴하는 것을 수반할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "피더 세포" 또는 "피더"는 피더 세포가 제2 세포 유형의 지지체에 대한 자극, 성장 인자 및 영양소를 제공하기 때문에 제2 유형의 세포가 성장, 증폭 분화할 수 있는 환경을 제공하는 제2 유형의 세포와 함께 공동배양되는 한 가지 유형의 세포를 기재하는 용어이다. 피더 세포는 그들의 지지하는 세포와 상이한 종으로부터 선택적으로 유래된다. 예를 들어, 줄기세포를 포함하는 특정 유형의 인간 세포는 마우스 배아 섬유아세포, 또는 불멸 마우스 배아 섬유아세포의 1차 배양물에 의해 지지될 수 있다. 또 다른 예에서, 말초 혈액 유래된 세포 또는 형질전환된 백혈병 세포는 자연 살해 세포의 증폭 및 성숙을 지지한다. 피더 세포는 그들이 지지하는 세포보다 더 커지는 것을 방지하기 위해 방사선 조사 또는 항-유사분열제, 예컨대 미토마이신에 의한 처리에 의해 다른 세포와 함께 공동배양시킬 때 전형적으로 비활성화될 수 있다. 피더 세포는 내피 세포, 기질 세포(예를 들어, 상피 세포 또는 섬유아세포) 및 백혈병 세포를 포함할 수 있다. 앞서 언급한 것으로 제한하는 일 없이, 한 가지의 특정 피더 세포 유형은 인간 피더, 예컨대 인간 피부 섬유아세포일 수 있다. 다른 피더 세포 유형은 마우스 배아 섬유아세포(MEF)일 수 있다. 일반적으로, 다양한 피더 세포는 만능성을 유지시키고, 특정 계통에 대한 분화를 지시하고, 증식 능력을 향상시키고, 분화된 세포 유형, 예컨대, 효과기 세포로의 성숙을 촉진시키기 위해서 부분적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "피더-무함유"(feeder-free: FF) 환경은 피더 또는 기질 세포가 본질적으로 없고, 그리고/또는 피더 세포의 배양에 의해 사전조건화되지 않은 배양 조건, 세포 배양물 또는 배양 배지와 같은 환경을 지칭한다. "사전조건화된" 배지는 피더 세포가 배지 중에서 일정 기간 동안, 예컨대 적어도 1일 동안 배양된 후에 수집된 배지를 지칭하며, 이에 따라 배지 중에서 배양된 피더 세포에 의해 분비된 성장 인자 및 사이토카인을 포함한 많은 매개체 물질을 함유한다. 일부 실시 형태에서, 피더-무함유 환경은 피더 또는 기질 세포 둘 다가 없고, 또한 피더 세포의 배양에 의해서 사전조건화되지 않는다.
"기능성"은, iPSC 및 그로부터 분화된 유래된 비-만능성 세포의 게놈 편집 또는 변형, 또는 비-만능성 세포 및 그로부터 재프로그래밍된 유래된 iPSC의 게놈 편집 또는 변형과 관련하여 사용되는 바와 같이, (1) 유전자 수준에서는, 성공적인 녹인(knock-in), 녹아웃(knock-out), 녹다운(knock-down) 유전자 발현, 유전자도입된 또는 제어된 유전자 발현, 예컨대 목적하는 세포 발생 단계에서 유도성 또는 일시적 발현(이것은 직접적인 게놈 편집 또는 변형을 통해서 또는 초기에 게놈 조작된 출발 세포로부터의 분화 또는 출발 세포의 재프로그래밍을 통한 "패싱-온(passing-on)"을 통해서 달성됨)을 지칭하거나; 또는 (2) 세포 수준에서는, (i) 직접적인 게놈 편집을 통해서 상기 세포에서 수득된 유전자 발현 변형, (ii) 초기에 게놈 조작된 출발 세포로부터의 분화 또는 출발 세포의 재프로그래밍을 통한 "패싱-온"을 통해서 상기 세포에서 유지된 유전자 발현 변형; (iii) 상기 세포의 초기 발달 단계에서만 보이거나, 또는 분화 또는 재프로그래밍을 통해서 상기 세포를 생성시키는 출발 세포에서만 보이는 유전자 발현 변형의 결과로서의 상기 세포에서의 하류 유전자 조절; 또는 (iv) iPSC, 전구체 또는 탈분화된 세포 기원에서 수행된 게놈 편집 또는 변형으로부터 초기에 유래된, 성숙 세포 산물 내에 나타난 향상되거나 또는 새로 성취된 세포 기능 또는 속성을 통해서 세포 기능/특징을 성공적으로 제거, 부가 또는 변경한 것을 지칭한다.
HLA-클래스 I 결핍, HLA-클래스 II 결핍, 또는 둘 다를 비롯한, "HLA 결핍"은 HLA 클래스 I 단백질 이종이량체 및/또는 HLA 클래스 II 이종이량체를 포함하는 완전한 MHC 복합체의 표면 발현이 결여되거나 또는 더 이상 유지되지 않거나 또는 감소되어, 줄어들거나 또는 감소된 수준이 다른 세포에 의해서 또는 합성 방법에 의해서 자연적으로 검출 가능한 수준보다 낮은, 세포를 지칭한다.
"변형된 HLA 결핍 iPSC"는 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 개선된 분화 가능성, 항원 표적화, 항원 제시, 항체 인식, 지속성, 면역 회피, 억제에 대한 저항성, 증식, 공자극, 사이토카인 자극, 사이토카인 생산(오토크린 또는 파라크린), 주화성, 및 세포 세포독성, 예컨대 비-고전적 HLA 클래스 I 단백질(예를 들어, HLA-E 및 HLA-G), 키메라 항원 수용체(CAR), T 세포 수용체(TCR), CD16 Fc 수용체, BCL11b, NOTCH, RUNX1, IL15, 4-1BB, DAP10, DAP12, CD24, CD3ζ, 4-1BBL, CD47, CD113 및 PDL1로 제한되지 않는 관련된 단백질을 발현하는 유전자를 도입함으로써 추가로 변형된 HLA 결핍 iPSC를 지칭한다. "변형된 HLA 결핍"된 세포는 iPSC가 아닌 세포를 또한 포함한다.
FcR로 약칭되는 "Fc 수용체"는 그것이 인식한 항체의 유형을 기반으로 분류된다. 예를 들어, 항체의 가장 일반적인 클래스, IgG에 결합하는 것은 Fc-감마 수용체(FcγR)라 지칭되며, IgA에 결합하는 것은 Fc-알파 수용체(FcαR)라 지칭되고, IgE에 결합하는 것은 Fc-엡실론 수용체(FcεR)라 지칭된다. FcR의 클래스는 또한 이를 발현하는 세포(대식세포, 과립구, 자연 살해 세포, T 및 B 세포) 및 각각의 수용체의 신호전달 특성에 의해서 구별된다. Fc-감마 수용체(FcγR)는 몇몇 구성원, FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32), FcγRIIB(CD32), FcγRIIIA(CD16a), FcγRIIIB(CD16b)을 포함하는데, 이들은 이들의 상이한 분자 구조로 인해서 이들의 항체 친화도가 상이하다.
CFcR로 약칭되는 "키메라 Fc 수용체"는 변형된 네이티브 막관통 및/또는 세포내 신호전달 도메인을 갖거나, 비-네이티브 막관통 및/또는 세포내 신호전달 도메인으로 대체된 조작된 Fc 도메인을 기재하기 위해서 사용되는 용어이다. 키메라 Fc 수용체의 일부 실시 형태에서, 비-네이티브인 막관통 도메인 및 신호전달 도메인 중 하나 또는 둘 다를 갖는 것에 더하여, 세포 활성화, 수용체의 촉발 시 증폭 및 기능을 향상시키기 위해서 하나 이상의 자극성 도메인이 조작된 Fc 수용체의 세포내 부분에 도입될 수 있다. 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인을 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR)와 달리, 키메라 Fc 수용체는 Fc 단편 또는 항체의 Fc 영역 또는 인게이저 또는 결합 분자에 포함된 Fc 영역에 결합하고, 표적화된 세포를 근접하게 한 상태 또는 근접하게 하지 않은 상태에서 세포 기능을 활성화시킨다. 예를 들어, Fcγ 수용체는 세포외 도메인에서 IgG의 결합에 반응하는 세포내 영역에 선택된 막관통 도메인, 자극성 도메인 및/또는 신호전달 도메인을 포함하여 CFcR을 생성시키도록 조작될 수 있다. 일례에서, CFcR은 CD16, Fcγ 수용체를 조작함으로써, 이의 막관통 도메인 및/또는 세포내 도메인을 대체함으로써 생산된다. CD16 기반 CFcR의 결합 친화도를 추가로 개선시키기 위해서, CD64 또는 CD16의 고 친화도 변이체의 세포외 도메인(예를 들어, F176V)이 도입될 수 있다. 고 친화도 CD16 세포외 도메인이 인게이징하는 CFcR의 일부 실시 형태에서, 197번 위치에 세린을 포함하는 단백질분해 절단 부위는 제거되거나 또는 수용체의 세포외 도메인이 비-절단성이도록, 즉 쉐딩(shedding)되지 않아서 hnCD16 기반 CFcR을 얻도록 대체된다.
CD16, FcγR 수용체는 두 아이소폼, Fc 수용체 FcγRIIIa(CD16a) 및 FcγRIIIb(CD16b)를 갖는 것으로 식별되었다. CD16a는 표적 세포에 부착된 단량체 IgG에 결합하여 NK 세포를 활성화시켜 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC)을 가능하게 하는, NK 세포에 의해서 발현된 막관통 단백질이다. "고 친화도 CD16", "비-절단성 CD16", 또는 "고 친화도 비-절단성 CD16"(hnCD16으로 약기됨)은, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, CD16의 자연 또는 비자연 변이체를 지칭한다. 야생형 CD16은 낮은 친화도를 갖고, NK 세포 활성화 시 백혈구 상의 다양한 세포 표면 분자의 세포 표면 밀도를 조절하는 단백질분해 절단 과정인, 엑토도메인 쉐딩에 적용된다. F176V 및 F158V는 높은 친화도를 갖는 예시적인 CD16 다형성 변이체이다. 변경된 또는 제거된 막-근위 영역(189 내지 212번 위치)에서 절단 부위(195 내지 198번 위치)를 갖는 CD16 변이체는 쉐딩에 적용되지 않는다. 절단 부위 및 막-근위 영역은 국제 특허 출원 공개 WO2015/148926호에 상세하게 기재되어 있고, 이의 완전한 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. CD16 S197P 변이체는 조작된 CD16의 비-절단성 버전이다. F158V 및 S197P 둘 다를 포함하는 CD16 변이체는 높은 친화도를 갖고, 비-절단성이다. 또 다른 예시적인 고 친화도 및 비-절단성 CD16(hnCD16) 변이체는 CD64 엑토도메인의 3개의 엑손 중 하나 이상으로부터 유래된 엑토도메인을 포함하는 조작된 CD16이다.
I. 향상된 특성을 갖는 입양 세포 요법에 유용한 세포 및 조성물
본 명세서에는 iPSC로부터 분화된 유도체 세포의 치료 특성을 향상시키면서, iPSC 및 이의 유도체 세포의 분화 효력 및 세포 발달 생물학에 영향을 미치지 않고 클론성 iPSC의 조절 회로를 체계적으로 조작하기 위한 전략이 제공된다. iPSC-유래된 세포는 기능적으로 개선되고, 게놈 조작을 통해서 iPSC의 수준에서 세포에 도입될 선택적 양상의 조합 후 입양 세포 요법에 적합하다. 본 발명 이전에는, 하나 이상의 제공된 유전자 편집을 포함하는 변경된 iPSC가 조절된 활성을 유지하면서 세포 발달 및/또는 성숙에 들어가고/가거나 기능적으로 분화된 세포를 생성시키는 능력을 여전히 갖는지가 불명확하였다. iPSC로부터의 유도된 세포 분화 동안 예상치 못한 실패는, 발달 단계 특이적 유전자 발현 또는 이의 결핍, HLA 복합체 제시에 대한 요건, 도입된 표면 발현 양상의 단백질 쉐딩 및 세포에서 표현형 및/또는 기능성 변화를 가능하게 하는 분화 프로토콜의 재구성에 대한 필요성을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 측면에 기여되었다. 본 출원은 본 명세서에 제공된 바와 같은 하나 이상의 선택된 게놈 변형이 iPSC 분화 효력에 부정적으로 영향을 미치지 않고, 조작된 iPSC로부터 유래된 기능성 효과기 세포가 iPSC 분화 이후에 효과기 세포에서 보유된 개별 또는 조합된 게놈 변형에 기인한 향상된 및/또는 수득된 치료 특성을 가짐을 나타내었다.
1. hnCD16 녹인
상기에 논의된 바와 같이, CD16은 두 아이소폼, Fc 수용체 FcγRIIIa(CD16a; NM_000569.6) 및 FcγRIIIb(CD16b; NM_000570.4)로서 식별되어 있다. CD16a는 표적 세포에 부착된 단량체 IgG에 결합하여 NK 세포를 활성화시켜 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC)을 가능하게 하는, NK 세포에 의해서 발현된 막관통 단백질이다. CD16b는 인간 호중구에 의해서 독점적으로 발현된다. "고 친화도 CD16", "비-절단성 CD16", 또는 "고 친화도 비-절단성 CD16" 또는 "hnCD16"은 본 명세서에서 사용된 바와 같이 다양한 CD16 변이체를 지칭한다. 야생형 CD16은 낮은 친화도를 갖고, NK 세포 활성화 시 백혈구 상의 다양한 세포 표면 분자의 세포 표면 밀도를 조절하는 단백질분해 절단 과정인, 엑토도메인 쉐딩에 적용된다. F176V(일부 간행물에서 F158V로도 불림)는 높은 친화도를 갖는 예시적인 CD16 다형성 대립유전자/변이체인 반면, S197P 변이체는 CD16의 유전자 조작된 비-절단성 버전의 예이다. F176V 및 S197P 둘 다를 포함하는 조작된 CD16 변이체는 높은 친화도를 갖고, 비-절단성인데, 이것은 전체 개시내용이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 특허 출원 공개 WO2015/148926호에 더 상세하게 기재되었다. 또한, CD64 엑토도메인의 적어도 일부로 본질적으로 대체된 CD16의 엑토도메인을 갖는 키메라 CD16 수용체는 또한 ADCC를 수행할 수 있는 CD16 수용체의 목적하는 높은 친화도 및 비-절단성 특징을 달성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 키메라 CD16의 교체 엑토도메인은 CD64(UniPRotKB_P12314 또는 이의 아이소폼 또는 다형성 변이체)의 EC1, EC2 및 EC3 엑손 중 하나 이상을 포함한다.
이와 같이, 고-친화도 비-절단성 CD16 수용체(hnCD16)는 일부 실시 형태에서 F176V 및 S197P 둘 다를 포함하고; 일부 실시 형태에서, F176V를 포함하고, 절단 영역이 제거되어 있다. 일부 다른 실시 형태에서, hnCD16은 예시적인 서열, 서열 번호 1 내지 3(각각은 CD64 엑토도메인의 적어도 일부를 포함함) 중 임의의 것과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100% 또는 그 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 서열 번호 1 내지 3은 각각 서열 번호 4 내지 6을 예시함으로써 암호화된다. 본 명세서 및 본 출원 전체에서 사용되는 바와 같이, 2개의 서열들 사이의 퍼센트 동일성은 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수(즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총수 x 100)이며, 이때 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 도입되어야 할 필요가 있는 갭(gap)의 수, 및 각각의 갭의 길이를 고려한다. 두 서열 간의 서열의 비교 및 동일성 백분율의 결정은 당업계에 인식된 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
서열 번호 1:
MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLQLPTPVWFHYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSV KTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
(340 a.a. CD64 도메인-기반 작제; CD16TM; CD16ICD )
서열 번호 2
MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSV KTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
(336 a.a. CD64 엑손-기반 작제; CD16TM; CD16ICD )
서열 번호 3
MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSV KTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
(335 a.a. CD64 엑손-기반 작제; CD16TM; CD16ICD )
서열 번호 4
cttggagaca acatgtggtt cttgacaact ctgctccttt gggttccagt tgatgggcaa gtggacacca caaaggcagt gatcactttg cagcctccat gggtcagcgt gttccaagag gaaaccgtaa ccttgcattg tgaggtgctc catctgcctg ggagcagctc tacacagtgg tttctcaatg gcacagccac tcagacctcg acccccagct acagaatcac ctctgccagt gtcaatgaca gtggtgaata caggtgccag agaggtctct cagggcgaag tgaccccata cagctggaaa tccacagagg ctggctacta ctgcaggtct ccagcagagt cttcacggaa ggagaacctc tggccttgag gtgtcatgcg tggaaggata agctggtgta caatgtgctt tactatcgaa atggcaaagc ctttaagttt ttccactgga attctaacct caccattctg aaaaccaaca taagtcacaa tggcacctac cattgctcag gcatgggaaa gcatcgctac acatcagcag gaatatctgt cactgtgaaa gagctatttc cagctccagt gctgaatgca tctgtgacat ccccactcct ggaggggaat ctggtcaccc tgagctgtga aacaaagttg ctcttgcaga ggcctggttt gcagctttac ttctccttct acatgggcag caagaccctg cgaggcagga acacatcctc tgaataccaa atactaactg ctagaagaga agactctggg ttatactggt gcgaggctgc cacagaggat ggaaatgtcc ttaagcgcag ccctgagttg gagcttcaag tgcttggcct ccagttacca actcctgtct ggtttcatta ccaagtctct ttctgcttgg tgatggtact cctttttgca gtggacacag gactatattt ctctgtgaag acaaacattc gaagctcaac aagagactgg aaggaccata aatttaaatg gagaaaggac cctcaagaca aa
서열 번호 5
cttggagaca acatgtggtt cttgacaact ctgctccttt gggttccagt tgatgggcaa gtggacacca caaaggcagt gatcactttg cagcctccat gggtcagcgt gttccaagag gaaaccgtaa ccttgcattg tgaggtgctc catctgcctg ggagcagctc tacacagtgg tttctcaatg gcacagccac tcagacctcg acccccagct acagaatcac ctctgccagt gtcaatgaca gtggtgaata caggtgccag agaggtctct cagggcgaag tgaccccata cagctggaaa tccacagagg ctggctacta ctgcaggtct ccagcagagt cttcacggaa ggagaacctc tggccttgag gtgtcatgcg tggaaggata agctggtgta caatgtgctt tactatcgaa atggcaaagc ctttaagttt ttccactgga attctaacct caccattctg aaaaccaaca taagtcacaa tggcacctac cattgctcag gcatgggaaa gcatcgctac acatcagcag gaatatctgt cactgtgaaa gagctatttc cagctccagt gctgaatgca tctgtgacat ccccactcct ggaggggaat ctggtcaccc tgagctgtga aacaaagttg ctcttgcaga ggcctggttt gcagctttac ttctccttct acatgggcag caagaccctg cgaggcagga acacatcctc tgaataccaa atactaactg ctagaagaga agactctggg ttatactggt gcgaggctgc cacagaggat ggaaatgtcc ttaagcgcag ccctgagttg gagcttcaag tgcttggttt gttctttcca cctgggtacc aagtctcttt ctgcttggtg atggtactcc tttttgcagt ggacacagga ctatatttct ctgtgaagac aaacattcga agctcaacaa gagactggaa ggaccataaa tttaaatgga gaaaggaccc tcaagacaaa
서열 번호 6
atgtggttct tgacaactct gctcctttgg gttccagttg atgggcaagt ggacaccaca aaggcagtga tcactttgca gcctccatgg gtcagcgtgt tccaagagga aaccgtaacc ttgcactgtg aggtgctcca tctgcctggg agcagctcta cacagtggtt tctcaatggc acagccactc agacctcgac ccccagctac agaatcacct ctgccagtgt caatgacagt ggtgaataca ggtgccagag aggtctctca gggcgaagtg accccataca gctggaaatc cacagaggct ggctactact gcaggtctcc agcagagtct tcacggaagg agaacctctg gccttgaggt gtcatgcgtg gaaggataag ctggtgtaca atgtgcttta ctatcgaaat ggcaaagcct ttaagttttt ccactggaac tctaacctca ccattctgaa aaccaacata agtcacaatg gcacctacca ttgctcaggc atgggaaagc atcgctacac atcagcagga atatctgtca ctgtgaaaga gctatttcca gctccagtgc tgaatgcatc tgtgacatcc ccactcctgg aggggaatct ggtcaccctg agctgtgaaa caaagttgct cttgcagagg cctggtttgc agctttactt ctccttctac atgggcagca agaccctgcg aggcaggaac acatcctctg aataccaaat actaactgct agaagagaag actctgggtt atactggtgc gaggctgcca cagaggatgg aaatgtcctt aagcgcagcc ctgagttgga gcttcaagtg cttggcttct ttccacctgg gtaccaagtc tctttctgct tggtgatggt actccttttt gcagtggaca caggactata tttctctgtg aagacaaaca ttcgaagctc aacaagagac tggaaggacc ataaatttaa atggagaaag gaccctcaag acaaa
따라서, 본 명세서에는 다른 편집 중에서 본 명세서에서 고려되고 기술된 바와 같이 외인성 CD16(예를 들어, 고-친화도 비-절단성 CD16 수용체(hnCD16))을 포함하도록 유전자 조작된 클론성 iPSC가 제공되며, 여기서 유전자 조작된 iPSC는 iPSC에 도입된 외인성 CD16을 포함하는 효과기 세포로 분화될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 외인성 CD16을 포함하는 유래된 효과기 세포는 NK 세포이다. 일부 실시 형태에서, 외인성 CD16을 포함하는 유래된 효과기 세포는 T 세포이다. iPSC 또는 이로부터의 유도체 세포에서 발현되는 외인성 CD16은 ADCC 항체 또는 이의 단편, 뿐만 아니라 상기 외인성 CD16 및 이의 변이체의 CD16 또는 CD64 세포외 결합 도메인을 인식하는 이중특이성, 삼중특이성 또는 다중특이성 인게이저 또는 바인더에 대한 결합 시에 높은 친화도를 갖는다. 이중특이성, 삼중특이성 또는 다중특이성 인게이저 또는 바인더는 본 출원에서 하기에 추가로 기재되어 있다(하기 참고). 이와 같이, 본 출원은 유도체 효과기 세포 상에서 발현되는 외인성 CD16의 세포외 도메인과의 고-친화도 결합을 통해서 하나 이상의 미리 선택된 ADCC 항체가 미리 로딩된 유도체 효과기 세포 또는 이의 세포 집단을, 하기에 추가로 상세하게 기재된 바와 같이 병태, 질환 또는 감염의 치료에서 치료 용도에 충분한 양으로 제공하며, 여기서 상기 외인성 CD16은 F176V 및 S197P를 갖는 CD64 또는 CD16의 세포외 결합 도메인을 포함한다.
일부 다른 실시 형태에서, hnCD16의 네이티브 CD16 막관통- 및/또는 세포내- 도메인은, 비-네이티브 막관통 도메인, 비-네이티브 자극성 도메인 및/또는 비-네이티브 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 Fc 수용체(CFcR)가 생산되도록 추가로 변형 또는 대체된다. 본 명세서에 사용된 용어 "비-네이티브"는 막관통, 자극성 및/또는 신호전달 도메인이 세포외 도메인을 제공하는 수용체 이외의 상이한 수용체로부터 유래됨을 의미한다. 본 명세서의 예시적인 설명에서, CD16 또는 이의 변이체를 기반으로 하는 CFcR은 CD16으로부터 유래된 막관통, 자극성 또는 신호전달 도메인을 갖지 않는다. 일부 실시 형태에서, 외인성 CD16 기반 CFcR은 CD3D, CD3E, CD3G, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D, 또는 T 세포 수용체 폴리펩타이드로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 외인성 CD16 기반 CFcR은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래된 비-네이티브 자극성/저해성 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 외인성 CD16 기반 CFcR은 CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137(4-1BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래된 비-네이티브 신호전달 도메인을 포함한다. 일 실시 형태에서, 제공된 키메라 수용체는 막관통 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하는데, 둘 다는 IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 및 NKG2D 폴리펩타이드 중 하나로부터 유래된다. CD16 기반 키메라 Fc 수용체의 특정 일 실시 형태는 NKG2D의 막관통 도메인, 2B4의 자극성 도메인 및 CD3ζ의 신호전달 도메인을 포함하며; 여기서 hnCD16의 세포외 도메인은 CD64 또는 CD16의 세포외 도메인의 전장 또는 부분 서열로부터 유래되고, 여기서 CD16의 세포외 도메인은 F176V 및 S197P를 포함한다. CD16 기반 키메라 Fc 수용체의 또 다른 실시 형태는 CD3ζ의 막관통 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하며; 여기서 hnCD16의 세포외 도메인은 CD64 또는 CD16의 세포외 도메인의 전장 또는 부분 서열로부터 유래되고, 여기서 CD16의 세포외 도메인은 F176V 및 S197P를 포함한다.
상기에 기재된 바와 같은 CD16 기반 키메라 Fc 수용체의 다양한 실시 형태는 높은 친화도로 항체의 Fc 영역 또는 이의 단편; 또는 이중특이성, 삼중특이성 또는 다중특이성 인게이저 또는 바인더의 Fc 영역에 결합할 수 있다. 결합 시, 키메라 수용체의 자극성 및/또는 신호전달 도메인은 효과기 세포의 활성화 및 사이토카인 분비 및 항체 또는 종양 항원 결합 성분 및 Fc 영역을 갖는 상기 이중특이성, 삼중특이성 또는 다중특이성 인게이저 또는 바인더에 의해서 표적화된 종양 세포의 살해를 가능하게 한다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 비-네이티브 막관통, 자극성 및/또는 신호전달 도메인을 통해서, 또는 CD16 기반 키메라 Fc 수용체의 엑토도메인에 대한 인게이저 결합을 통해서, CFcR은 효과기 세포의 증식 및/또는 증폭 가능성을 증가시키면서, 효과기 세포의 살해 능력에 기여할 수 있다. 항체 및 인게이저는 항원을 발현하는 종양 세포 및 CFcR을 발현하는 효과기 세포들을 서로 근접하게 할 수 있는데, 이것은 또한 종양 세포의 향상된 살해에 기여한다. 이중특이성, 삼중특이성, 다중특이성 인게이저 또는 바인더에 대한 예시적인 종양 항원은 B7H3, BCMA, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD179b, CEA, CLEC12A, CS-1, DLL3, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, FLT-3, FOLR1, FOLR3, GD2, gpA33, HER2, HM1.24, LGR5, MSLN, MCSP, MICA/B, PSMA, PAMA, P-카드헤린 및 ROR1을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 종양 세포 공격에서 CD16 기반 CFcR을 발현하는 효과기 세포를 결속시키기에 적합한 일부 비제한적인 예시적인 이중특이성, 삼중특이성, 다중특이성 인게이저 또는 바인더는 CD16(또는 CD64)-CD30, CD16(또는 CD64)-BCMA, CD16(또는 CD64)-IL15-EPCAM 및 CD16(또는 CD64)-IL15-CD33을 포함한다.
NK 세포 활성화 후 세포 표면으로부터 절단되는 1차 NK 세포에 의해서 발현되는 내인성 CD16 수용체와 달리, 유도체 NK 세포에서 CD16의 다양한 비-절단성 버전은 CD16 쉐딩을 회피하고, 일정한 발현을 유지한다. 유도체 NK 세포에서, 비-절단성 CD16은 개선된 세포 기능성을 나타내는 TNFα 및 CD107a의 발현을 증가시킨다. 비-절단성 CD16은 또한 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC) 및 이중특이성, 삼중특이성 또는 다중특이성 인게이저의 인게이지먼트를 향상시킨다. ADCC는 항체-코팅된 표적 세포에 대한 CD16의 결합을 통한 NK 세포 매개된 용해의 기전이다. 유래된 NK 세포에서 도입된 hnCD16의 추가적인 고 친화도 특징은 또한 세포 요법을 필요로 하는 대상체에게 세포를 투여하기 전에 hnCD16을 통해서 NK 세포에 ADCC 항체를 시험관내에서 로딩하는 것을 가능하게 한다. 제공된 바와 같이, hnCD16은 일부 실시 형태에서 F176V 및 S197P를 포함할 수 있거나 또는 서열 번호 1, 2 또는 3으로 예시된 바와 같은 CD64로부터 유래된 전체 또는 부분 엑토도메인을 포함할 수 있거나 또는 비-네이티브 막관통 도메인, 자극성 도메인 및 신호전달 도메인 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다. 개시된 바와 같이, 본 출원은 또한 하나 이상의 미리 선택된 ADCC 항체가 하기에 추가로 상세하게 기재된 바와 같이 병태, 질환 또는 감염의 치료에서의 치료 용도에 충분한 양으로 로딩된 유도체 NK 세포 또는 이의 세포 집단을 제공한다.
1차 NK 세포와 달리, 1차 공급원(즉, 자연/네이티브 공급원, 예컨대, 말초 혈액, 제대혈 또는 다른 공여자 조직)으로부터의 성숙 T 세포는 CD16을 발현하지 않는다. 발현된 외인성 비-절단성 CD16을 포함하는 iPSC가 T 세포 발달 생물학을 손상시키지 않고, 외인성 CD16을 발현할 뿐만 아니라, 수득된 ADCC 기전을 통해서 기능을 수행할 수 있는 기능성 유도체 T 계통 세포로 분화할 수 있다는 것은 예상치 못한 것이었다. 유도체 T 계통 세포에서의 이러한 획득된 ADCC는 이중 표적화를 위하여 그리고/또는 CAR-T 세포 요법에서 종종 발생하는 항원 탈출을 구제하기 위한 접근법으로서 추가로 사용될 수 있고, 여기서 종양은 감소된 또는 손실된 CAR-T 표적화된 항원 발현 또는 CAR에 의한 인식을 회피하기 위한 돌연변이된 항원의 발현으로 재발한다. 상기 유도체 T 계통 세포가 외인성 CD16 - 기능성 변이체 및 CD16 기반 CFcR을 포함함 - 발현을 통해서 획득된 ADCC를 포함하는 경우, 항체가 CAR에 의해서 표적화된 것과 상이한 종양 항원을 표적화하는 경우, 항체는 CAR-T 항원 탈출을 구제하기 위해서 그리고 CAR-T 치료에서 종종 관찰되는 표적화된 종양의 재발 또는 재발생을 감소시키거나 예방하기 위해서 사용될 수 있다. 이중 표적화를 달성하면서 항원 탈출을 감소시키고/시키거나 예방하기 위한 이러한 전략은 하나 이상의 CAR을 발현하는 NK 세포에 동등하게 적용 가능하다. 이러한 항원 탈출 감소 및 예방에 사용될 수 있는 다양한 CAR이 하기에 추가로 기술된다.
이와 같이, 본 발명의 실시 형태는 외인성 CD16을 포함하는 유도체 T 계통 세포를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 유도체 T 계통 세포에 포함된 CD16은 F176V 및 S197P를 포함하는 hnCD16이다. 일부 다른 실시 형태에서, 유도체 T 계통 세포에 포함된 hnCD16은 서열 번호 1, 2 또는 3으로 예시된 바와 같은 CD64로부터 기원된 전체 또는 부분 엑토도메인을 포함하거나, 비-네이티브 막관통 도메인, 자극성 도메인 및 신호전달 도메인 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다. 설명된 바와 같이, 이러한 유도체 T 계통 세포는 항체의 치료 효과를 향상시키기 위해서 ADCC에 의해서 매개된 단클론성 항체로 종양을 표적화하기 위한 획득된 기전을 갖는다. 개시된 바와 같이, 본 출원은 또한 하나 이상의 미리 선택된 ADCC 항체가 하기에 추가로 상세하게 기재된 바와 같이 병태, 질환 또는 감염의 치료에서의 치료 용도에 충분한 양으로 로딩된 유도체 T 계통 세포 또는 이의 세포 집단을 제공한다.
외인성 CD16을 포함하지만 이로 제한되지 않는, 본 명세서에 제공된 바와 같은 적어도 하나의 표현형을 갖는, 단일 세포 분류 및 증폭된 클론성의 조작된 iPSC를 포함하는 마스터 세포 뱅크가 본 출원에 추가로 제공되며, 여기서 세포 뱅크는 추가의 iPSC 조작을 위한 플랫폼 및 오프-더-쉘프, 조작된, 균질한 세포 요법 제품 - 유도체 NK 및 T 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않음 - 의 제조를 위한 재생 가능한 공급원을 제공하는데, 이러한 제품은 조성이 명확하고 균일하고, 비용-효과적인 방식으로 상당한 규모로 대량 생산될 수 있다.
2. CAR 발현
유전자 조작된 iPSC 및 이의 유도체 효과기 세포에 적용 가능한 것은 당업계에 공지된 임의의 CAR 설계일 수 있다. CAR, 키메라 항원 수용체는 일반적으로 항원 인식 영역을 포함하는 엑토도메인, 막관통 도메인, 및 엔도도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시 형태에서, 엑토도메인은 단일 펩타이드 또는 리더 서열 및/또는 스페이서를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CAR은 유도 만능성 줄기세포(iPSCs), 및 CAR을 포함하도록 조작된 iPSC로부터 분화되는 유도체 효과기 세포에서 발현되고 기능하도록 설계된다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CAR은 iPSC 분화를 파괴하지 않도록, 그리고/또는 목적하는 효과기 세포 유형으로 유도된 iPSC의 분화를 촉진하도록 설계된다. 일부 실시 형태에서, CAR은 효과기 세포 증폭, 지속성, 생존, 세포독성, 동종거부(allorejection)에 대한 저항성, 종양 침투, 이동, 방관자 면역 세포를 활성화 및/또는 동원하는 데 있어서의 능력, 및/또는 종양 억제를 극복하는 능력을 향상시킨다. 실시 형태에서, 본 명세서에 제공된 CAR은 또한 세포주 세포, 및 1차 공급원, 즉, 자연/네이티브 공급원, 예컨대 말초 혈액, 제대혈 또는 다른 공여자 조직으로부터의 세포에서 직접 발현될 수 있다.
일부 실시 형태에서, CAR은 상기 CAR을 발현하는 T 또는 NK 계통 세포를 활성화시키기에 적합하다. 일부 실시 형태에서, CAR은 NK-특이적 신호전달 성분을 포함함으로써 NK 세포 특이적이다. 특정 실시 형태에서, 상기 T 계통 세포는 CAR 발현 iPSC로부터 유래되고, 유도체 T 계통 세포는 T 헬퍼 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포, αβ T 세포, γδ T 세포 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 NK 계통 세포는 CAR 발현 iPSC로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, NK 세포-특이적 신호전달 성분을 포함하는 CAR은 T 세포 또는 다른 세포 유형에도 적합하다. 일부 실시 형태에서, CAR은 T 세포-특이적 신호전달 성분을 포함함으로써 T 세포 특이적이다. 일부 실시 형태에서, T 세포-특이적 신호전달 성분을 포함하는 CAR은 NK 세포 또는 다른 세포 유형에도 적합하다. 일부 실시 형태에서, CAR은 NKT 세포-특이적 신호전달 성분을 포함함으로써 NKT 세포 특이적이다. 일부 실시 형태에서, NKT 세포-특이적 신호전달 성분을 포함하는 CAR은 NK 또는 T 세포, 또는 다른 세포 유형에도 적합하다.
특정 실시 형태에서, 상기 항원 인식 영역은 뮤린 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 낙타 Ig, 상어 중쇄-단독 항체(VNAR), Ig NAR, 키메라 항체, 재조합 항체 또는 이의 항체 단편을 포함한다. 항체 단편의 비제한적인 예는 Fab, Fab′, F(ab)′2, F(ab)′3, Fv, 단일쇄 항원 결합 단편(scFv), (scFv)2, 다이설파이드 안정화된 Fv(dsFv), 미니바디, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 단일-도메인 항원 결합 단편(sdAb, 나노바디), 재조합 중쇄-단독 항체(VHH) 및 전체 항체의 결합 특이성을 유지하는 다른 항체 단편을 포함한다. 유전자 조작된 iPSC 및 유도체 효과기 세포에 포함된 CAR(들)에 의해서 표적화될 수 있는 항원의 비제한적인 예는 ADGRE-2, 탄산 탈수효소 IX(CAIX), CCR1, CCR4, 암배아 항원(CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CD269(BCMA), CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원(예를 들어, 세포 표면 항원), 상피 당단백질 2(EGP 2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 접착 분자(EpCAM), EGFRvIII, 수용체 타이로신-단백질 카이나제 erb­B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산염-결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 엽산염 수용체-a, 강글리오사이드 G2 (GD2), 강글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER-2), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 하위단위 알파-2(IL-13Rα2), κ-경쇄, 카이나제 삽입 도메인 수용체(KDR), Lewis A(CA19.9), Lewis Y(LeY), L1 세포 접착 분자(L1-CAM), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A 1(MAGE-A1), MICA/B, 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아성 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기세포 항원(PSCA), PRAME 전립선-특이적 막 항원(PSMA), 종양­연관 당단백질 72(TAG-72), TIM-3, TRBC1, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­ R2), 빌름스 종양 단백질(WT-1) 및 당업계에 공지된 다양한 병원성 항원을 포함한다. 병원체의 비제한적인 예는 질환을 유발할 수 있는 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충 및 원생동물을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 유전자 조작된 iPSC 및 유도체 효과기 세포에 포함된 CAR의 막관통 도메인은 CD3D, CD3E, CD3G, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D 및 T 세포 수용체 폴리펩타이드의 네이티브 또는 변형된 막관통 영역의 전체 길이 또는 적어도 일부를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 유전자 조작된 iPSC 및 유도체 효과기 세포에 포함된 CAR의 엔도도메인(또는 세포내 도메인)의 신호전달 펩타이드는 CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137(4-1BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 또는 NKG2D의 전장 또는 적어도 일부분을 포함한다. 일 실시 형태에서, CAR의 신호전달 펩타이드는 CD3ζ의 적어도 하나의 ITAM(면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프)과 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 형태에서, 상기 엔도도메인은 적어도 하나의 공자극성 신호전달 영역을 추가로 포함한다. 상기 공자극성 신호전달 영역은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 또는 NKG2D 또는 이들의 임의의 조합의 폴리펩타이드의 전체 길이 또는 적어도 일부를 포함한다. 일 실시 형태에서, 본 출원에 제공된 세포에 적용 가능한 CAR은 CD28로부터 유래된 공자극성 도메인 및 서열 번호 7과 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 아미노산 서열로 표현되는, CD3ζ의 네이티브 또는 변형된 ITAM1을 포함하는 신호전달 도메인을 포함한다. 추가 실시 형태에서, CD28로부터 유래된 공자극성 도메인, 및 CD3ζ의 네이티브 또는 변형된 ITAM1을 포함하는 CAR은 또한 CD28로부터 유래된 힌지 도메인 및 막관통 도메인을 포함하고, 여기서 scFv는 힌지를 통해서 막관통 도메인에 연결될 수 있고, CAR은 서열 번호 8의 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
서열 번호 7
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQ
LYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGE
RRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR
(153 a.a. CD28 공자극 + CD3ζITAM)
서열 번호 8
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP FWVLVVVGGVLACYSLLVTVA
FIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAY
QQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSE
IGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR
(219 a.a. CD28 힌지 + CD28 TM + CD28 공자극 + CD3ζITAM)
또 다른 실시 형태에서, 본 출원에 제공된 세포에 적용 가능한 CAR은 NKG2D로부터 유래된 막관통 도메인, 2B4로부터 유래된 공자극성 도메인 및 서열 번호 9와 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 아미노산 서열로 표현되는, 네이티브 또는 변형된 CD3ζ를 포함하는 신호전달 도메인을 포함한다. NKG2D로부터 유래된 막관통 도메인, 2B4로부터 유래된 공자극성 도메인 및 네이티브 또는 변형된 CD3ζ를 포함하는 신호전달 도메인을 포함하는 상기 CAR은 CD8 힌지를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 이러한 구조의 아미노산 서열은 서열 번호 10과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성을 갖는다.
서열 번호 9
SNLFVASWIAVMIIFRIGMAVAIFCCFFFPSWRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKT
RRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNS
TIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRR
EEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGL
YQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
(263 a.a NKG2D TM + 2B4 + CD3ζ)
서열 번호 10
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD SNLFVASWIAVMIIF
RIGMAVAIFCCFFFPSWRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGS
TIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTIYEVIGKSQPKAQN
PARLSRKELENFDVYSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPE
MGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDAL
HMQALPPR
(308 a.a CD8 힌지 + NKG2D TM + 2B4 + CD3ζ)
비제한적인 CAR 전략은 한 쌍의 세포내 도메인의 이량체화를 통한 이종이량체성 조건부 활성화된 CAR(예를 들어, 미국 특허 제9,587,020호 참고); 스플리트 CAR을 추가로 포함하고, 여기서 CAR을 생성시키기 위한 항원 결합, 힌지 및 엔도도메인의 상동성 재조합(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2017/0183407호 참고); 각각 항원 결합 도메인 및 신호전달 도메인에 연결된 두 막관통 도메인 간의 비공유 연결을 가능하게 하는 다중쇄 CAR(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2014/0134142호 참고); 이중특이성 항원 결합 도메인을 갖는 CAR(예를 들어, 미국 특허 제9,447,194호 참고), 또는 동일하거나 또는 상이한 항원 또는 에피토프를 인식하는 한 쌍의 항원 결합 도메인을 갖는 CAR(예를 들어, 미국 특허 제8,409,577호 참고) 또는 탠덤 CAR(예를 들어, 문헌[Hegde et al., J Clin Invest. 2016;126(8):3036-3052] 참고); 유도성 CAR(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 2016/0046700호, 제2016/0058857호, 제2017/0166877호 참고); 전환 가능한 CAR(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2014/0219975호 참고); 및 당업계에 공개된 임의의 다른 설계를 추가로 포함한다.
따라서 본 명세서는 게놈 조작된 iPSC의 분화로부터 얻어진 유도체 세포를 포함하고, 여기서 iPSC 및 유도체 세포 둘 다는 외인성 CD16의 발현을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 추가적인 변형된 양상과 함께 하나 이상의 CAR을 포함한다. 특정 일 실시 형태에서, iPSC 및 이의 유도체 세포는 hnCD16, 및 선택된 종양 또는 바이러스 항원을 표적으로 하는 CAR을 포함하고, 여기서 유도체 세포는 NK 또는 T 계통 세포이고, 여기서 유도체 세포는 동일한 종양의 이중 표적화를 달성하면서, hnCD16 결합을 통해서, 종양 항원 탈출을 회피하거나 감소시키기 위해서 CAR에 의해서 표적화된 것과 상이한 종양 항원을 표적으로 하는 하나 이상의 ADCC 항체 또는 이중특이성, 삼중특이성 또는 다중특이성 인게이저와 함께 사용될 수 있다.
추가 실시 형태에서, CAR을 포함하는 iPSC 및 이의 유도체 T 계통 세포는 TCR α 또는 β 불변 영역(TRAC 또는 TRBC)에 삽입된 CAR을 갖고, TCR 녹아웃으로 이어지고, 선택적으로 CAR 발현을 내인성 TCR 프로모터의 제어 하에 둔다. 추가의 CAR 삽입 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD44, CD54, CD56, CD58, CD69, CD71, OX40, 4-1BB, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, 및 TIGIT를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 조작된 iPSC로부터 유래된 유도체 TCR 음성 CAR-T 세포는 CD16에 네이티브인 엑토도메인(F176V 및/또는 S197P)을 갖거나 또는 CD64로부터 유래된 외인성 CD16, 및 네이티브 또는 비-네이티브 막관통, 자극성 및 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 제공된 바와 같은 엔도도메인들 중 하나를 포함하는 CAR 및 TCR 널(null)을 포함하는 iPSC 유도체 세포의 특정 일 실시 형태에서, 상기 유도체 세포는 T 계통 세포이다. 또 다른 실시 형태에서, CAR을 포함하는 iPSC 및 이의 유도체 NK 계통 세포는 NKG2A 유전자좌 또는 NKG2D 유전자좌에 삽입된 CAR을 갖고, NKG2A 또는 NKG2D 녹아웃으로 이어지고, 선택적으로 CAR 발현을 내인성 NKG2A 또는 NKG2D 프로모터의 제어 하에 둔다. NKG2A 또는 NKG2D 널 및 CAR을 포함하는 iPSC 유도체 세포의 특정 일 실시 형태에서, 상기 유도체 세포는 NK 계통 세포이다.
3. 외인적으로 도입된 사이토카인 및/또는 사이토카인 신호전달
임상적으로 관련된 사이토카인의 체계적인 고용량 투여를 회피함으로써, 사이토카인 매개된 세포 자율성이 확립되면서, 이러한 실시로 인한 용량-제한적인 독성의 위험이 감소된다. 가용성 사이토카인을 추가로 투여할 필요성 없이, 림프구 자율성을 달성하기 위해서, IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21 및/또는 이들 각각의 수용체 중 하나 이상의 부분 또는 전장 펩타이드를 포함하는 신호전달 복합체가 사이토카인 자체의 발현과 함께 또는 발현 없이 사이토카인 신호전달을 가능하게 하기 위해서 세포에 도입되고, 이에 의해서 사이토카인 독성의 위험 감소와 함께 세포 성장, 증식, 증폭 및/또는 효과기 기능을 유지시키거나 개선시킨다. 일부 실시 형태에서, 사이토카인 신호전달을 위한 도입된 사이토카인 및/또는 이의 각각의 네이티브 또는 변형된 수용체(신호전달 복합체)가 세포 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, 사이토카인 신호전달은 구성적으로 활성화된다. 일부 실시 형태에서, 사이토카인 신호전달의 활성화는 유도성이다. 일부 실시 형태에서, 사이토카인 신호전달의 활성화는 일시적이고/이거나 순간적이다.
IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18 및 IL21을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 사이토카인의 신호전달을 위한 단백질 복합체를 세포에 도입하기 위한 다양한 작제물 설계가 본 명세서에 제공된다.
도 1은 예시적인 예로서 IL15를 사용하는 몇몇 작제물 설계를 제공한다. 도 1에서의 설계들 중 임의의 것의 막관통(TM) 도메인은 IL15 수용체에 대해서 네이티브일 수 있거나, 또는 임의의 다른 막 결합된 단백질의 막관통 도메인으로 변형 또는 대체될 수 있다.
설계 1: IL15 및 IL15Rα는 IL15의 시스-제시를 제거하지 않으면서, 자가-절단 펩타이드를 사용하고, IL15의 트랜스-제시를 모방함으로써 공동발현된다.
설계 2: IL15Rα는 IL15 막-결합되는 것을 보장할 뿐만 아니라 IL15의 시스-제시를 제거하지 않으면서, 링커를 통해서 C-말단에서 IL15에 융합되고, 트랜스-제시를 모방한다. 재조합 단백질은 서열 번호 11과 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 재조합 단백질은 신호 펩타이드의 하류에서 IL15 프로-펩타이드를 포함한다. 서열 번호 12는 서열 번호 11의 아미노산 서열을 암호화된 예시적인 DNA 서열을 기재한다.
서열 번호 11
MDWTWILFLVAAATRVHSGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDA
TLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTES
GCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITC
PPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKC
IRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLM
PSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTV
LLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL
(414 a.a.)
서열 번호 12
ATGGACTGGACCTGGATTCTGTTCCTGGTCGCGGCTGCAACGCGAGTCCATAGCGGTATC
CATGTTTTTATTCTTGGGTGTTTTTCTGCTGGGCTGCCTAAGACCGAGGCCAACTGGGTA
AATGTCATCAGTGACCTCAAGAAAATAGAAGACCTTATACAAAGCATGCACATTGATGCT
ACTCTCTACACTGAGTCAGATGTACATCCCTCATGCAAAGTGACGGCCATGAAATGTTTC
CTCCTCGAACTTCAAGTCATATCTCTGGAAAGTGGCGACGCGTCCATCCACGACACGGTC
GAAAACCTGATAATACTCGCTAATAATAGTCTCTCTTCAAATGGTAACGTAACCGAGTCA
GGTTGCAAAGAGTGCGAAGAGTTGGAAGAAAAAAACATAAAGGAGTTCCTGCAAAGTTTC
GTGCACATTGTGCAGATGTTCATTAATACCTCTAGCGGCGGAGGATCAGGTGGCGGTGGA
AGCGGAGGTGGAGGCTCCGGTGGAGGAGGTAGTGGCGGAGGTTCTCTTCAAATAACTTGT
CCTCCACCGATGTCCGTAGAACATGCGGATATTTGGGTAAAATCCTATAGCTTGTACAGC
CGAGAGCGGTATATCTGCAACAGCGGCTTCAAGCGGAAGGCCGGCACAAGCAGCCTGACC
GAGTGCGTGCTGAACAAGGCCACCAACGTGGCCCACTGGACCACCCCTAGCCTGAAGTGC
ATCAGAGATCCCGCCCTGGTGCATCAGCGGCCTGCCCCTCCAAGCACAGTGACAACAGCT
GGCGTGACCCCCCAGCCTGAGAGCCTGAGCCCTTCTGGAAAAGAGCCTGCCGCCAGCAGC
CCCAGCAGCAACAATACTGCCGCCACCACAGCCGCCATCGTGCCTGGATCTCAGCTGATG
CCCAGCAAGAGCCCTAGCACCGGCACCACCGAGATCAGCAGCCACGAGTCTAGCCACGGC
ACCCCATCTCAGACCACCGCCAAGAACTGGGAGCTGACAGCCAGCGCCTCTCACCAGCCT
CCAGGCGTGTACCCTCAGGGCCACAGCGATACCACAGTGGCCATCAGCACCTCCACCGTG
CTGCTGTGTGGACTGAGCGCCGTGTCACTGCTGGCCTGCTACCTGAAGTCCAGACAGACC
CCTCCACTGGCCAGCGTGGAAATGGAAGCCATGGAAGCACTGCCCGTGACCTGGGGCACC
AGCTCCAGAGATGAGGATCTGGAAAACTGCTCCCACCACCTG
(1242 n.a.)
설계 3: 절단된 세포내 도메인을 갖는 IL15Rα는 링커를 통해서 C-말단에서 IL15에 융합되고, IL15의 트랜스-제시를 모방하고, IL15 막-결합되는 것을 유지하고, 추가로 시스-제시 및/또는 세포내 도메인을 통한 정상 IL15R에 의해서 매개되는 임의의 다른 잠재적인 신호전달 경로를 추가로 제거한다. IL15Rα의 세포내 도메인은 수용체가 IL15 반응 세포에서 발현하고, 반응 세포가 증폭 및 기능하는 데 결정적이라고 여겨져 왔다. 이러한 절단된 작제물은 서열 번호 13에 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성의 아미노산 서열을 포함하고, 이것은 서열 번호 14로 표현되는 예시적인 핵산 서열에 의해서 암호화될 수 있다. 절단된 IL15/IL15Rα의 일 실시 형태에서, 작제물은 서열 번호 13의 마지막 4개의 아미노산 잔기(KSRQ)를 포함하지 않는다.
서열 번호 13
MDWTWILFLVAAATRVHSGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQ
(379 a.a.; (신호 및 링커 펩타이드는 밑줄 쳐짐)
서열 번호 14
ATGGACTGGACCTGGATTCTGTTCCTGGTCGCGGCTGCAACGCGAGTCCATAGCGGTATCCATGTTTTTATTCTTGGGTGTTTTTCTGCTGGGCTGCCTAAGACCGAGGCCAACTGGGTAAATGTCATCAGTGACCTCAAGAAAATAGAAGACCTTATACAAAGCATGCACATTGATGCTACTCTCTACACTGAGTCAGATGTACATCCCTCATGCAAAGTGACGGCCATGAAATGTTTCCTCCTCGAACTTCAAGTCATATCTCTGGAAAGTGGCGACGCGTCCATCCACGACACGGTCGAAAACCTGATAATACTCGCTAATAATAGTCTCTCTTCAAATGGTAACGTAACCGAGTCAGGTTGCAAAGAGTGCGAAGAGTTGGAAGAAAAAAACATAAAGGAGTTCCTGCAAAGTTTCGTGCACATTGTGCAGATGTTCATTAATACCTCTAGCGGCGGAGGATCAGGTGGCGGTGGAAGCGGAGGTGGAGGCTCCGGTGGAGGAGGTAGTGGCGGAGGTTCTCTTCAAATAACTTGTCCTCCACCGATGTCCGTAGAACATGCGGATATTTGGGTAAAATCCTATAGCTTGTACAGCCGAGAGCGGTATATCTGCAACAGCGGCTTCAAGCGGAAGGCCGGCACAAGCAGCCTGACCGAGTGCGTGCTGAACAAGGCCACCAACGTGGCCCACTGGACCACCCCTAGCCTGAAGTGCATCAGAGATCCCGCCCTGGTGCATCAGCGGCCTGCCCCTCCAAGCACAGTGACAACAGCTGGCGTGACCCCCCAGCCTGAGAGCCTGAGCCCTTCTGGAAAAGAGCCTGCCGCCAGCAGCCCCAGCAGCAACAATACTGCCGCCACCACAGCCGCCATCGTGCCTGGATCTCAGCTGATGCCCAGCAAGAGCCCTAGCACCGGCACCACCGAGATCAGCAGCCACGAGTCTAGCCACGGCACCCCATCTCAGACCACCGCCAAGAACTGGGAGCTGACAGCCAGCGCCTCTCACCAGCCTCCAGGCGTGTACCCTCAGGGCCACAGCGATACCACAGTGGCCATCAGCACCTCCACCGTGCTGCTGTGTGGACTGAGCGCCGTGTCACTGCTGGCCTGCTACCTGAAGTCCAGACAGTGA
(1140 n.a.)
당업자는 상기 신호 펩타이드 및 링커 서열이 예시적이고, 어떠한 방식으로도 신호 펩타이드 또는 링커로서 사용하기에 적합한 그들의 변이를 제한하지 않음을 이해할 것이다. 당업자에게 공지되고 이용가능한 많은 적합한 신호 펩타이드 또는 링커 서열이 존재하며, 당업자는 신호 펩타이드 및/또는 링커 서열이 신호 펩타이드에 의해서 유도되거나 링커에 의해서 연결된 기능성 펩타이드의 활성을 변경시키지 않으면서 또 다른 서열 대신 치환될 수 있다는 것을 이해한다.
설계 4: 설계 3 작제물이 효과기 세포 생존 및 증폭의 촉진에서 기능성인 것으로 나타났는데, 이는 IL15Rα의 세포질 도메인이 이러한 설계에서 IL15가 구비된 효과기 세포의 자율 특징부에 부정적으로 영향을 미치지 않으면서 누락될 수 있다는 것을 입증하기 때문에, 설계 4는 설계 3의 또 다른 작업 대안을 제공하는 작제물인데, 이로부터 본질적으로 전체 IL15Rα는 스시 도메인을 제외하고는 제거되고, 선택적으로 스시 도메인과 막관통 도메인 사이에 링커를 사용하여 한 단부에서 IL15와 그리고 다른 단부(mb-스시)에서 막관통 도메인과 융합된다. 융합된 IL5/mb-스시는 임의의 막 결합된 단백질의 막관통 도메인을 통해서 세포 표면에서 발현된다. 작제물, 예컨대, 설계 4를 사용하여, 시스-제시를 비롯한 IL15Rα를 통한 불필요한 신호전달은 단지 IL15의 목적하는 트랜스-제시가 유지될 때만 제거된다. 일부 실시 형태에서, 스시 도메인과 융합된 IL15를 포함하는 성분은 서열 번호 15와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는데, 이것은 서열 번호 16으로 표현되는 예시적인 핵산 서열에 의해서 암호화될 수 있다.
서열 번호 15
MDWTWILFLVAAATRVHSGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
(242 a.a.; (신호 및 링커 펩타이드는 밑줄 쳐짐)
서열 번호 16
ATGGACTGGACCTGGATTCTGTTCCTGGTCGCGGCTGCAACGCGAGTCCATAGCGGTATCCATGTTTTTATTCTTGGGTGTTTTTCTGCTGGGCTGCCTAAGACCGAGGCCAACTGGGTAAATGTCATCAGTGACCTCAAGAAAATAGAAGACCTTATACAAAGCATGCACATTGATGCTACTCTCTACACTGAGTCAGATGTACATCCCTCATGCAAAGTGACGGCCATGAAATGTTTCCTCCTCGAACTTCAAGTCATATCTCTGGAAAGTGGCGACGCGTCCATCCACGACACGGTCGAAAACCTGATAATACTCGCTAATAATAGTCTCTCTTCAAATGGTAACGTAACCGAGTCAGGTTGCAAAGAGTGCGAAGAGTTGGAAGAAAAAAACATAAAGGAGTTCCTGCAAAGTTTCGTGCACATTGTGCAGATGTTCATTAATACCTCTAGCGGCGGAGGATCAGGTGGCGGTGGAAGCGGAGGTGGAGGCTCCGGTGGAGGAGGTAGTGGCGGAGGTTCTCTTCAAATAACTTGTCCTCCACCGATGTCCGTAGAACATGCGGATATTTGGGTAAAATCCTATAGCTTGTACAGCCGAGAGCGGTATATCTGCAACAGCGGCTTCAAGCGGAAGGCCGGCACAAGCAGCCTGACCGAGTGCGTGCTGAACAAGGCCACCAACGTGGCCCACTGGACCACCCCTAGCCTGAAGTGCATCAGA
(726 n.a.)
당업자는 상기 신호 펩타이드 및 링커 서열이 예시적이고, 어떠한 방식으로도 신호 펩타이드 또는 링커로서 사용하기에 적합한 그들의 변이를 제한하지 않음을 이해할 것이다. 당업자에게 공지되고 이용가능한 많은 적합한 신호 펩타이드 또는 링커 서열이 존재하며, 당업자는 신호 펩타이드 및/또는 링커 서열이 신호 펩타이드에 의해서 유도되거나 링커에 의해서 연결된 기능성 펩타이드의 활성을 변경시키지 않으면서 또 다른 서열 대신 치환될 수 있다는 것을 이해한다.
설계 5: 네이티브 또는 변형된 IL15Rβ가 링커를 통해서 C-말단에서 IL15에 융합되어, 구성적 신호전달이 가능해지고, IL15 막 결합 및 트랜스-제시를 유지한다.
설계 6: 네이티브 또는 변형된 공통 수용체 γC가 사이토카인의 구성적 신호전달 및 막 결합된 트랜스-제시를 위해서 링커를 통해서 C-말단에서 IL15에 융합된다. 공통 수용체 γC는 공통 감마 사슬 또는 CD132로도 불리며, 이는 IL2 수용체 하위단위 감마 또는 IL2RG로도 알려져 있다. γC는 IL2, IL4, IL7, IL9, IL15 및 IL21 수용체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 많은 인터류킨 수용체에 대한 수용체 복합체에 공통된 사이토카인 수용체 하위단위이다.
설계 7: IL15의 부재 하에서 동종이량체를 형성하는 조작된 IL15Rβ는 사이토카인의 구성적 신호전달을 생성시키기에 유용하다.
일부 실시 형태에서, 사이토카인 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18 및 IL21 및/또는 이의 수용체 중 하나 이상은 도 1에 제시된 설계들 중 하나 이상을 사용하여 iPSC에 도입될 수 있고, iPSC 분화 시에 이의 유도체 세포에 도입될 수 있다. 일부 실시 형태에서, IL2 또는 IL15 세포 표면 발현 및 신호전달은 설계 1 내지 설계 7 중 임의의 하나에 예시된 작제물을 통한 것이다. 일부 실시 형태에서, IL4, IL7, IL9 또는 IL21 세포 표면 발현 및 신호전달은 공통 수용체 또는 사이토카인 특이적 수용체를 사용함으로써 설계 5, 설계 6 또는 설계 7에 도시된 작제물을 통한 것이다. 일부 실시 형태에서, IL7 표면 발현 및 신호전달은 공통 수용체 또는 사이토카인 특이적 수용체, 예컨대, IL4 수용체를 사용함으로써 설계 5, 설계 6 또는 설계 7에 도시된 작제물을 통한 것이다. 도 1에서의 설계들 중 임의의 것의 막관통(TM) 도메인은 각각의 사이토카인 수용체에 대해서 네이티브일 수 있거나, 또는 임의의 다른 막 결합된 단백질의 막관통 도메인으로 변형 또는 대체될 수 있다.
CAR 및 외인성 사이토카인 및/또는 사이토카인 수용체(신호전달 복합체, 또는 "IL") 신호전달 둘 다를 포함하는 iPSC 및 이로부터의 유도체 세포에서, CAR 및 IL은 별개의 작제물에서 발현될 수 있거나, CAR 및 IL 둘 다를 포함하는 바이-시스트론성 작제물로 공동발현될 수 있다. 일부 추가 실시 형태에서, 신호전달 복합체는 도 1의 작제물 설계들 중 임의의 것으로 표현된 형태이고, 예를 들어, CAR-2A-IL15 또는 IL15-2A-CAR로서 예시된 자가-절단 2A 암호 서열을 통해서 CAR 발현 작제물의 5' 또는 3' 단부에 연결될 수 있다. 이와 같이, IL15 및 CAR은 단일 오픈 리딩 프레임(single open reading frame: ORF)에 존재한다. 일 실시 형태에서, CAR-2A-IL15 또는 IL15-2A-CAR 작제물은 도 1의 설계 3에 도시된 바와 같은 IL15를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, CAR-2A-IL15 또는 IL15-2A-CAR 작제물은 도 1의 설계 4에 도시된 바와 같은 IL15를 포함한다. 또 다른 추가 실시 형태에서, CAR-2A-IL15 또는 IL15-2A-CAR 작제물은 도 1의 설계 7에 도시된 바와 같은 IL15를 포함한다. CAR-2A-IL15 또는 IL15-2A-CAR이 발현되는 경우, 자가-절단 2A 펩타이드는 발현된 CAR 및 IL15가 해리되게 하고, 이어서 해리된 IL15는 세포 표면에 제시될 수 있다. CAR-2A-IL15 또는 IL15-2A-CAR 바이-시스트론성 설계는 시기 및 양 둘 다에서 그리고 예를 들어, 단일 ORF의 발현을 위한 유도성 프로모터를 도입하도록 선택될 수 있는 동일한 제어 기전 하에서 협조적인(coordinated) CAR 및 IL15 발현을 허용한다. 자가-절단 펩타이드는 아프토바이러스, 예컨대, 구제역 바이러스(FMDV), 말 비염 A 바이러스(ERAV), 토세아 아시그나 바이러스(Thosea asigna virus: TaV) 및 돼지 테스코 바이러스-1(porcine tescho virus-1: PTV-I)(문헌[Donnelly, ML, et al, J. Gen. Virol, 82, 1027-101(2001)]; 문헌[Ryan, MD, et al., J. Gen. Virol., 72, 2727-2732(2001)]) 및 카디오바이러스, 예컨대, 테일로바이러스(Theilovirus)(예를 들어, 테일러의 뮤린 뇌척수염(Theiler's murine encephalomyelitis)) 및 뇌심근염 바이러스를 비롯한, 피코나비리대 바이러스 패밀리의 구성원에서 발견된다. FMDV, ERAV, PTV-I 및 TaV로부터 유래된 2A 펩타이드는 때로는 각각 "F2A", "E2A", "P2A", 및 "T2A"로도 지칭된다.
IL15에 대해서 본 명세서에 개시된 바와 같은 바이-시스트론성 CAR-2A-IL15 또는 IL15-2A-CAR 실시 형태는 또한 본 명세서에 제공된 임의의 다른 사이토카인, 예를 들어, IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL18 및 IL21의 발현을 위해서 고려된다. 일부 실시 형태에서, IL2 세포 표면 발현 및 신호전달은 설계 1 내지 설계 7 중 임의의 것에 예시된 작제물을 통해서이다. 일부 다른 실시 형태에서, IL4, IL7, IL9 또는 IL21 세포 표면 발현 및 신호전달은 공통 수용체 및/또는 사이토카인 특이적 수용체를 사용함으로써 설계 5, 설계 6 또는 설계 7에 예시된 작제물을 통한 것이다.
일부 실시 형태에서, CAR+, IL+ 및 CD16+를 포함한 하나 이상의 속성을 포함하는 유전자형을 포함하는 iPSC, 및 이의 유도체 효과기 세포는 표 1에서의 추가의 속성들 중 임의의 하나를 추가로 포함할 수 있는데, 이들 속성에는 lig-(리간드 음성), inR+ (비활성화 CAR 양성), cs-CD3+(세포 표면 CD3 양성), En+(인게이저 양성), 및 Ab+(항체 또는 면역관문 저해제 양성) 중 하나 이상이 포함된다.
4. 비활성화 CAR 및 동종항원
본 명세서에서 앞서 기재된 바와 같은 CAR, 키메라 항원 수용체는 일반적으로 항원 인식 영역을 포함하는 엑토도메인, 막관통 도메인, 및 엔도도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시 형태에서, 엑토도메인은 단일 펩타이드 또는 리더 서열 및/또는 스페이서를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 엔도도메인은 CAR을 발현하는 효과기 세포를 활성화시키는 신호전달 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에서, "비활성화 CAR"(표 1에서 inR+로 약기됨)은 활성화된, 또는 동종재활성화된 T, B 또는 NK 세포 상에 발현됨으로써 그러한 세포를 제거하거나 감소시키는, 상향조절된 표면 단백질(본 명세서에서 동종항원 또는 리간드로도 지칭되며, 표 1에서 lig-로 약기됨)에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 길항적 CAR이다. 조작된 iPSC로부터 유래된 합성 효과기 세포 내에서 그러한 비활성화 CAR을 발현시키는 것이 상기 유도체 효과기 세포를 사용하는 오프-더-쉘프 동종이계 입양 세포 요법 환경에서의 동종이계 거부 제어에 대한 해결책이다.
다수의 HLA 클래스 I 및 클래스 II 단백질은 동종이계 거부 문제를 회피하기 위해서 동종이계 수용자에서 조직적합성을 위해서 일치되어야 하는 것으로 여겨진다. MHC 매칭 없이, 동종이계 입양 세포 요법에서 연구된 한 가지 접근법은 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 단백질 둘 다의 발현을 제거하거나 실질적으로 감소시키는 것이다. HLA 클래스 I 결핍은 HLA 클래스 I 유전자좌(염색체 6p21)의 임의의 영역의 기능성 결실에 의해 달성되거나, 베타-2 마이크로글로불린(B2M) 유전자, TAP1 유전자, TAP2 유전자 및 타파신을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 HLA 클래스-I 연관된 유전자의 발현 수준을 결실 또는 감소시킴으로써 달성된다. 예를 들어, B2M 유전자는 모든 HLA 클래스 I 이종이량체의 세포 표면 발현에 필수적인 공통 하위단위를 암호화한다. B2M 널 세포는 HLA-I 결핍성이다. HLA 클래스 II 결핍은 RFXANK, CIITA, RFX5 및 RFXAP를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 HLA-II 연관된 유전자의 기능성 결실 또는 감소에 의해서 달성될 수 있다. CIITA는 클래스 II 단백질 발현에 필요한 전사 인자 RFX5의 활성화를 통해서 기능하는 전사 공활성자이다. CIITA 널 세포는 HLA-II 결핍성이다. 그러나, HLA 클래스 I 발현의 결여는 NK 세포에 의한 용해에 대한 감수성을 증가시킨다. 또한, HLA-I 및 HLA-II 둘 다의 결핍은 여전히 동종이계 입양 세포의 MHC 이외의 동종항원에 의해 매개된 동종거부를 방지하지 못한다. 더욱이, HLA-I-의존성 NK 세포 배양 과정, 예컨대 라이센싱(licensing), 아밍(arming) 또는 디스아밍(disarming)은 동종이계 공여자 세포에 대한 수용자 NK 세포의 반응성, 또는 부분 반응성을 야기할 수 있는 동종이계 세포에 대한 선천성 면역 반응성에 영향을 미치는 것으로 여겨지며, 이는, 심지어 그러한 공여자 세포가 HLA-I 충분성일 때에도 그러한 것으로 여겨진다.
동종재활성화된 세포의 상향조절된 표면 단백질/리간드는 CD40L, OX40 및 4-1BB를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 이와 같이, 상응하는 비활성화-CAR은 CD40L-CAR, OX40-CAR, 또는 4-1BB-CAR을 포함한다. 따라서, 조작된 iPSC로부터 유래된 하나 이상의 합성 효과기 세포의 수용자에서 활성화된 T, B 세포 및 NK 세포를 제거 또는 감소시킴으로써 동종거부를 피하면서, 동종이계 효과기 세포에서 HLA-I, 또는 HLA-II, 또는 둘 다를 온전하게 유지하기 위하여(즉, HLA-I 야생형, 또는 HLA-II 야생형, 또는 둘 다를 포함함), 본 명세서에 제공된 바와 같은 iPSC 및 그로부터 유래된 효과기 세포는 적어도 하나의 비활성화-CAR을 포함할 수 있다. 또한, 비활성화-CAR 발현 효과기 세포 집단 중에서 동족살해(fratricide)를 피하기 위하여, 일부 실시 형태에서, iPSC 및 그로부터 유래된 효과기 세포는 또한 상기 비활성화-CAR에 의해 특이적으로 표적화된 표면 단백질에서 음성이며, 이로써 CD40L-CAR/CD40L-, OX40-CAR/OX40-, 또는 4-1BB-CAR/4-1BB-와 같은 유전자형을 갖는다. 일부 다른 실시 형태에서, iPSC 및 그로부터 유래된 효과기 세포는 상응하는 비활성화-CAR이 없는 상태에서 표면 단백질에서만 단지 음성이며, 그러한 세포는 효과기 세포를 제거하지 않고서 반응성 세포의 상기 표면 단백질에 대한 항체와 조합하여 사용될 수 있다.
5. TCR 음성 세포에서 CD3의 세포 표면 제시
변형된 유도체 T 계통 세포를 수득하기 위한 공급원으로서 T 세포의 직접 편집을 통해 또는 iPSC 편집을 통해 TCR 알파 또는 TCR 베타(TRAC 또는 TRBC)의 불변 영역을 파괴하는 것은 TCRneg T 세포를 생성하는 접근법 중 하나이다. 예를 들어, TRAC 또는 TRBC의 내인성 프로모터에 또는 외인성 프로모터에 작동가능하게 연결된, TRAC 또는 TRBC 내의 사전선택된 위치에서의 2A 서열의 삽입이 TRAC 또는 TRBC 파괴(또는 이 예예서는 절단)로, 그리고 TCR 음성 세포(TCRneg)로 이어질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 자가-절단 펩타이드, 예컨대 2A를 사용한 표적화된 절단 또는 파괴는 절단 또는 파괴의 위치에서의 하나 이상의 관심 외인성 유전자의 통합에 수반하여 선택적으로 일어날 수 있으며, 통합된 유전자(들)의 발현은 통합 시에 TCR 알파 또는 TCR 베타의 내인성 프로모터에 의해, 또는 작동가능하게 연결된 외인성 프로모터에 의해 유도될 수 있으며, 이는 TRAC 또는 TRBC 녹아웃으로, 그리고 이로써 TCRneg로 이어지며, 이와 동시에 TRAC 또는 TRBC 유전자좌에 삽입된 하나 이상의 외인성 유전자를 발현한다.
특정 실시 형태에서, TCRneg 세포는 iPSC이다. 또 다른 실시 형태에서, TCRneg 세포는 NK 계통 세포이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "TCR 음성" 또는 "TCRneg"는 TCR 유전자 발현의 파괴로 인해(예컨대, T 계통 세포에서: 1차 또는 iPSC-유래된 T 계통 세포) 또는 게놈에서의 TCR 유전자좌의 존재에도 불구하고 TCR 유전자 발현의 자연 부재로 인해(예를 들어, iPSC, 또는 NK 계통 세포에서: 1차 또는 iPSC-유래된 NK 계통 세포) 내인성 TCR 발현의 결여를 지칭한다. 클론적으로 선택된 조작된 iPSC의 조혈 세포로의 후속 유도 분화는 TCR 발현 없이 iPSC-유래된 면역 효과기 세포 및/또는 이의 균질한 집단의 생성을 가능하게 한다.
이 접근법을 사용하여 수득된 (외인성 유전자 통합을 갖거나 갖지 않는) iPSC-유래된 TCR 음성 T 계통 세포는 동종이계 입양 세포 요법에 사용될 때 HLA 매칭을 필요로 하지 않으며, 감소된 동종반응성을 가지며, GvHD(이식편 대 숙주 질환)를 예방할 수 있다. 그러나, TCR 파괴는 또한 세포에서의 CD3 하위단위 유전자 발현에도 불구하고 T 세포 표면으로부터의 CD3 신호전달 복합체의 제거를 가져오는 것으로 확인되었다. 세포 표면 CD3의 결여는 증폭 및/또는 생존에 대한 세포의 능력을 변경시키고, 세포 표면 CD3 인식 및 결합을 필요로 하는 기술과의 양립 불가능성으로 인해 세포의 기능적 잠재성을 감소시킬 수 있으며, 이러한 기술에는 BiTE, BiKE 또는 TRiKE(또는 인게이저로 총칭됨) 기술; CD3/CD28 T 세포 활성화 비드 기술; 및 항-CD3 항체 또는 CD3-CAR 자극 기술을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. TCR 유전자, 예를 들어, NK 또는 NK 전구 세포, 세포 표면 CD3 복합체, 또는 이들의 하나 이상의 하위단위 또는 하위도메인(cs-CD3)의 존재에도 불구하고 TCR을 발현하지 않는 세포의 경우, 이들의 항체 또는 기능성 변이체, 및/또는 세포 표면 CD3을 인식하는 이중특이성 또는 다중특이성 인게이저를 포함하지만 이로 한정되지 않는 분자와의 결합을 위한 세포 표면 촉발 수용체로서 기능할 수 있다. cs-CD3+ iPSC 및 iPSC-유래된 효과기 세포를 수득하기 위한 적용 가능한 작제물 및 게놈 편집 방법 및 조성물은 국제 특허 출원 공개 WO2020/210398호에 더 상세히 기재되어 있으며, 이의 전체 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
6. 인게이저
인게이저는 상이한 항체들 또는 이들의 단편의 2개 이상의 단일쇄 가변 단편(scFv) 또는 다른 기능성 변이체로 이루어진 융합 단백질로서, 여기서 적어도 하나의 scFv는 효과기 세포 표면 분자 또는 표면 촉발 수용체에 결합하고, 적어도 또 다른 하나는 표적 세포 특이적 표면 분자를 통해서 표적 세포에 결합한다. 인게이저의 예는 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE), 이중특이성 살해 세포 인게이저(BiKE), 삼중특이성 살해 세포 인게이저(TriKE), 다중특이성 살해 세포 인게이저 또는 다수의 면역 세포 유형과 양립가능한 보편적 인게이저를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 인게이저는 이중특이성 또는 다중특이성일 수 있다. 그러한 이중특이성 또는 다중특이성 인게이저는 종양 세포에 대해 효과기 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 및/또는 호중구)를 유도하고 면역 효과기 세포를 활성화할 수 있으며, CAR-T 세포 요법의 이익을 최대화하는 데 큰 잠재성을 보여주었다.
일부 실시 형태에서, 인게이저는 병행적 또는 연속적 투여에 의해 합성 효과기 세포의 집단과 조합하여 사용되며, 여기서 합성 효과기 세포는 인게이저에 의해 인식되는 표면 분자, 또는 표면 촉발 수용체를 포함한다. 일부 다른 실시 형태에서, 인게이저는 iPSC의 유전자 조작 및 조작된 iPSC의 유도 분화를 통해 합성 효과기 세포에 의해 발현되는 이중특이성 항체이다. 이중특이성 또는 다중특이성 인게이저 인식 또는 이의 커플링을 위해서 사용될 수 있는 예시적인 효과기 세포 표면 분자 또는 표면 촉발 수용체는 본 명세서에 개시된 바와 같은 CD3, CD28, CD5, CD16, NKG2D, CD64, CD32, CD89, NKG2C 및 키메라 Fc 수용체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 인게이저 인식을 위해서 합성 효과기 세포의 표면 상에서 발현되는 외인성 CD16은 본 명세서에 기재된 바와 같은 CD16(F176V 및 선택적으로 S197P 함유) 또는 CD64 세포외 도메인 및 네이티브 또는 비-네이티브 막관통, 자극성 및/또는 신호전달 도메인을 포함하는 hnCD16이다. 일부 실시 형태에서, 인게이저 인식을 위해서 효과기 세포의 표면 상에서 발현되는 CD16은 CD16 기반 키메라 Fc 수용체(CFcR)이다. 일부 실시 형태에서, CD16 기반 CFcR은 NKG2D의 막관통 도메인, 2B4의 자극성 도메인 및 CD3ζ의 신호전달 도메인을 포함하며; 여기서 CD16의 세포외 도메인은 CD64 또는 CD16의 세포외 도메인의 전장 또는 부분 서열로부터 유래되고; 여기서 CD16의 세포외 도메인은 F176V 및 선택적으로 S197P를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 인게이저에 대한 표적 세포는 종양 세포이다. 이중특이성 또는 다중특이성 인게이저 인식을 위한 예시적인 종양 세포 표면 분자는 B7H3, BCMA, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD179b, CEA, CLEC12A, CS-1, DLL3, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, FLT-3, FOLR1, FOLR3, GD2, gpA33, HER2, HM1.24, LGR5, MSLN, MCSP, MICA/B, PSMA, PAMA, P-카드헤린, ROR1을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일 실시 형태에서, 이중특이성 인게이저는 CD3 및 CD19에 특이적인 이중특이성 항체(CD3-CD19)이다. 또 다른 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 CD16-CD30 또는 CD64-CD30이다. 또 다른 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 CD16-BCMA 또는 CD64-BCMA이다. 또 다른 추가 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 CD3-CD33이다.
또 다른 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 효과기 세포 결합 도메인과 종양 세포 항원 결합 도메인 사이에 링커를 추가로 포함한다. 예를 들어, 변형된 IL15가, 세포 증폭을 촉진하기 위하여, 효과기 NK 세포를 위한 링커로서 사용된다(일부 간행물에서 TriKE, 또는 삼중특이성 살해 인게이저로 불림). 일 실시 형태에서, TriKE는 CD16-IL15-EPCAM 또는 CD64-IL15-EPCAM이다. 또 다른 실시 형태에서, TriKE는 CD16-IL15-CD33 또는 CD64-IL15-CD33이다. 또 다른 추가 실시 형태에서, TriKE는 NKG2C-IL15-CD33이다. TriKE 내의 IL15는 또한 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL18, 및 IL21을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다른 사이토카인으로부터 기원될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 또는 다중특이성 인게이저를 위한 표면 촉발 수용체는 때때로 세포 유형에 따라서 효과기 세포에 내인성일 수 있다. 일부 다른 실시 형태에서, 하나 이상의 외인성 표면 촉발 수용체는 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물을 사용하여, 예를 들어, 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 iPSC의 추가적인 조작, 그 다음 iPSC가 공급원 iPSC와 동일한 유전자형 및 표면 촉발 수용체를 포함하는 T, NK 또는 임의의 다른 효과기 세포로 분화하는 것을 지시함으로써 효과기 세포에 도입될 수 있다.
7. 면역요법을 위한 항체
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 게놈 조작된 효과기 세포에 더하여, 병태, 질환 또는 적응증과 연관된 항원을 표적으로 하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 추가 치료제가 조합 요법에서 이들 효과기 세포와 함께 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항체는 대상체에 대한 병행적 또는 연속적 투여에 의해 합성 효과기 세포들의 집단과 조합하여 사용된다. 일부 다른 실시 형태에서, 그러한 항체 또는 이의 단편은 상기 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열을 사용한 iPSC의 유전자 조작, 및 조작된 iPSC의 유도 분화에 의해 효과기 세포에 의해 발현될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 효과기 세포는 CD16 변이체를 발현하며, 여기서 효과기 세포의 세포독성은 ADCC를 통해 항체에 의해 향상된다. 일부 실시 형태에서, 항체는 단클론성 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 인간화된 항체, 인간화된 단클론성 항체 또는 키메라 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체 또는 항체 단편은 바이러스 항원에 특이적으로 결합한다. 다른 실시 형태에서, 항체 또는 항체 단편은 종양 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 종양 또는 바이러스 특이적 항원은 투여된 iPSC-유래된 효과기 세포를 활성화시켜 살해 능력을 향상시킨다. 일부 실시 형태에서, 투여된 iPSC-유래된 효과기 세포에 추가의 치료제로서 조합 치료에 적합한 항체는 항-CD20(리툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 유블리툭시맙, 오카라투주맙, 오비누투주맙), 항-HER2(트라스투주맙, 퍼투주맙), 항-CD52(알렘투주맙), 항-EGFR(서툭시맙), 항-GD2(디누툭시맙), 항-PDL1(아벨루맙), 항-CD38(다라투무맙, 이사툭시맙, MOR202), 항-CD123(7G3, CSL362), 항-SLAMF7(엘로투주맙) 및 이들의 인간화된 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편 또는 이들의 기능성 등가물 및 바이오시밀러를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
8. 면역관문 저해제
면역관문은 저해되지 않을 때 면역 반응을 억제 또는 하향조절할 수 있는 세포 분자, 종종 세포 표면 분자이다. 현재 종양은 특히 종양 항원에 특이적인 T 세포에 대한 면역 저항성의 주요 기전으로서 면역관문 경로를 선택한다는 것이 명백하다. 면역관문 저해제(CI)는 면역관문 유전자 발현 또는 유전자 생성물을 감소시키거나 면역관문 분자의 활성을 낮춤으로써, 저해성 면역관문을 차단하고, 면역계 기능을 회복시킬 수 있는 길항제이다. PD1/PDL1 또는 CTLA4를 표적으로 하는 면역관문 저해제의 개발은 종양학 환경을 변화시켰으며, 이들 작용제는 다수의 적응증에서 장기간 완화를 제공한다. 그러나, 다수의 종양 아형은 면역관문 차단 요법에 저항성이 있고, 재발은 중요한 관심사이다. 본 출원의 일 태양은, CI와의 조합 요법에서 제공된 바와 같은 게놈 조작된 기능성 유도체 세포를 포함시킴으로써 CI 저항성을 극복하기 위한 치료적 접근법을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 면역관문 저해제는 대상체에 대한 병행적 또는 연속적 투여에 의해 합성 효과기 세포들의 집단과 조합하여 사용된다. 일부 다른 실시 형태에서, 면역관문 저해제는 상기 면역관문 저해제, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열을 사용한 iPSC의 유전자 조작, 및 조작된 iPSC의 유도 분화에 의해 효과기 세포에 의해 발현된다.
일부 실시 형태에서, 면역관문 저해제 또는 이의 단편을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열은 별개의 작제물로 또는 바이-시스트론성 작제물로 CAR과 공동발현된다. 일부 추가 실시 형태에서, 면역관문 저해제 또는 이의 단편을 암호화하는 서열은, 예를 들어, CAR-2A-CI 또는 CI-2A-CAR로서 예시된 자가-절단 2A 암호 서열을 통해서 CAR 발현 작제물의 5' 또는 3' 단부에 연결될 수 있다. 이와 같이, 면역관문 저해제 및 CAR의 암호 서열은 단일 오픈 리딩 프레임(ORF)에 존재한다. 면역관문 저해제가 종양 미세환경(tumor microenvironment: TME)을 침윤할 수 있는 유도체 효과기 세포에 의해서 페이로드로서 전달, 발현 및 분비되는 경우, 그것은 TME와의 결속 시에 저해성 면역관문 분자에 대응하여, 양상, 예컨대, CAR을 활성화시키거나 수용체를 활성화시킴으로써 효과기 세포의 활성화를 가능하게 한다. 조합 요법의 일 실시 형태에서, 유도체 세포는 NK 계통 세포이다. 조합 요법의 또 다른 실시 형태에서, 유도체 세포는 T 계통 세포이다.
본 명세서에 제공된 바와 같은 유도체 NK 계통 세포 또는 T 계통 세포와의 조합 요법에 적합한 면역관문 저해제는 PD-1(Pdcdl, CD279), PDL-1(CD274), TIM-3(Havcr2), TIGIT(WUCAM 및 Vst㎥), LAG-3(Lag3, CD223), CTLA-4(Ctla4, CD152), 2B4(CD244), 4-1BB(CD137), 4-1BBL(CD137L), A2AR, BATE, BTLA, CD39(Entpdl), CD47, CD73(NT5E), CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2(Pou2f2), 레티노산 수용체 알파(Rara), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 및 저해성 KIR(예를 들어, 2DL1, 2DL2, 2DL3, 3DL1 및 3DL2)의 길항제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시 형태에서, 상기 면역관문 분자 중 임의의 것을 저해하는 길항제는 항체이다. 일부 실시 형태에서, 면역관문 저해성 항체는 뮤린 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 낙타 Ig, 상어 중쇄-단독 항체(VNAR), Ig NAR, 키메라 항체, 재조합 항체 또는 이의 항체 단편일 수 있다. 항체 단편의 비제한적인 예는 Fab, Fab′, F(ab)′2, F(ab)′3, Fv, 단일쇄 항원 결합 단편(scFv), (scFv)2, 다이설파이드 안정화된 Fv(dsFv), 미니바디, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 단일-도메인 항원 결합 단편(sdAb, 나노바디), 재조합 중쇄-단독 항체(VHH) 및 전체 항체의 결합 특이성을 보유하는 다른 항체 단편(이것은 제조하기에 더 비용 효과적일 수 있거나, 보다 용이하게 사용될 수 있거나, 전체 항체보다 더 민감할 수 있음)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 면역관문 저해제는 아테졸리주맙(항-PDL1 mAb), 아벨루맙(항-PDL1 mAb), 더발루맙(항-PDL1 mAb),트레멜리무맙(항-CTLA4 mAb), 이필리무맙(항-CTLA4 mAb), IPH4102(항-KIR), IPH43(항-MICA), IPH33(항-TLR3), 리릴루맙(항-KIR), 모날리주맙(항-NKG2A), 니볼루맙(항-PD1 mAb), 펨브롤리주맙(항-PD1 mAb) 및 이들의 임의의 유도체, 기능성 등가물 또는 바이오시밀러 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 면역관문 분자 중 임의의 것을 저해하는 길항제는, 다수의 miRNA가 면역관문의 발현을 제어하는 조절제로서 발견되는 바와 같은 마이크로RNA-기반이다(문헌[Dragomir et al., Cancer Biol Med. 2018, 15(2):103-115]). 일부 실시 형태에서, 면역관문 길항성 miRNA는 miR-28, miR-15/16, miR-138, miR-342, miR-20b, miR-21, miR-130b, miR-34a, miR-197, miR-200c, miR-200, miR-17-5p, miR-570, miR-424, miR-155, miR-574-3p, miR-513 및 miR-29c를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시 형태에서, CAR과 공동발현되는 면역관문 저해제는 면역관문 분자: PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39(Entpdl), CD47, CD73(NT5E), CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2(Pou2f2), 레티노산 수용체 알파(Rara), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 및 저해성 KIR 중 적어도 1종을 저해한다. 일부 실시 형태에서, 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 유도체 세포에서 CAR과 함께 공동발현되는 면역관문 저해제는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 트레멜리무맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리릴루맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 이들의 인간화된 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 및 이들의 기능성 등가물 또는 바이오시밀러를 포함하는 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, CAR과 함께 공동발현되는 면역관문 저해제는 아테졸리주맙 또는 이의 인간화된 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 또는 이의 기능성 등가물 또는 바이오시밀러이다. 일부 다른 실시 형태에서, CAR과 함께 공동발현되는 면역관문 저해제는 니볼루맙 또는 이의 인간화된 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 또는 이의 기능성 등가물 또는 바이오시밀러이다. 일부 다른 실시 형태에서, CAR과 함께 공동발현되는 면역관문 저해제는 펨브롤리주맙 또는 이의 인간화된 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 또는 이의 기능성 등가물 또는 바이오시밀러이다.
본 명세서에 제공된 유도체 세포 및 면역관문 분자를 저해하는 적어도 1종의 항체를 포함하는 조합 요법의 일부 다른 실시 형태에서, 상기 항체는 유도체 세포에 의해서 또는 유도체 세포에서 생산되지 않고, 본 명세서에 제공된 바와 같은 유도체 세포의 투여 이전에, 투여와 함께 또는 투여 후에 추가로 투여된다. 일부 실시 형태에서, 제공된 유도체 NK 계통 세포 또는 T 계통 세포와의 조합 요법에서 1종, 2종 또는 3종 또는 그 초과의 면역관문 저해제의 투여는 동시 또는 순차적이다. 유래된 NK 계통 세포 또는 T 계통 세포를 포함하는 조합 치료의 일 실시 형태에서, 치료에 포함되는 면역관문 저해제는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 트레멜리무맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리릴루맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이들의 인간화된 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 및 이들의 기능성 등가물 또는 바이오시밀러 중 1종 이상이다. 유래된 NK 세포 또는 T 세포를 포함하는 조합 치료의 일부 실시 형태에서, 치료에 포함되는 면역관문 저해제는 아테졸리주맙 또는 이의 인간화된 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 및 이의 기능성 등가물 또는 바이오시밀러이다. 유래된 NK 계통 세포 또는 T 계통 세포를 포함하는 조합 치료의 일부 실시 형태에서, 치료에 포함되는 면역관문 저해제는 니볼루맙 또는 이의 인간화된 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 또는 이의 기능성 등가물 또는 바이오시밀러이다. 유래된 NK 계통 세포 또는 T 계통 세포를 포함하는 조합 치료의 일부 실시 형태에서, 치료에 포함되는 면역관문 저해제는 펨브롤리주맙 또는 이의 인간화된 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 또는 이의 기능성 등가물 또는 바이오시밀러이다.
9. 본 명세서에 제공된 유전자 조작된 iPSC 주 및 유도체 세포
상기 내용에 비추어, 본 출원은, 적어도 CAR을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드, 및 선택적으로, 외인성 CD16 및 사이토카인 및/또는 이의 수용체(IL) 변이체 중 하나 또는 둘 다를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 iPSC, iPS 세포주 세포, 또는 이로부터의 유도체 세포(표 1에서 CAR(CD16/IL))를 제공하며, 여기서 유도체 세포는 CAR을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드, 및 외인성 CD16 및 IL 중 하나 또는 둘 다를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조작된 iPSC의 분화로부터 수득되는 기능성 효과기 세포이다. 일부 실시 형태에서, 유도체 세포는 조혈 계통 세포이고, 이것은 확정적 조혈 내피(HE) 가능성을 갖는 중배엽 세포, 확정적 HE, CD34 조혈 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구 세포(MPP), T 세포 전구 세포, NK 세포 전구 세포, 골수 세포, 호중구 전구 세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 호중구, 수지상 세포 및 대식세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 기능성 유도체 조혈 세포는 효과기 세포, 예컨대, T, NK 및 조절 세포를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 유도체 세포는 NK 또는 T 계통 세포를 포함한다. 외인성 CD16 및 CAR 둘 다를 포함하는 iPSC-유래된 NK 또는 T 계통 세포는 항체와 CAR 표적화된 치료를 조합함으로써 CAR-T 단독 요법에서 관찰되는 종양 항원 탈출과 연관된 종양 재발을 극복하거나 감소시키기에 유용하되, 단, 항체 및 CAR은 종양의 상이한 항원에 대해서 특이성을 갖는다. hnCD16을 발현하는 유도체 CAR-T 세포는 획득된 ADCC를 가져서, CAR 표적화에 더하여 종양 살해를 위한 추가 기전을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 유도체 세포는 NK 계통 세포를 포함한다. hnCD16 및 CAR을 포함하는 iPSC-유래된 NK 세포는 향상된 세포독성을 갖고, 종양 세포를 침윤 및 살해하기 위해서 T 세포를 비롯한 방관자 세포를 동원하는 데 효과적이다.
추가로 iPSC, iPS 세포주 세포, 또는 이로부터의 유도체 세포가 제공되는데, 이것은 외인성 CD16을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 세포 생존, 지속성 및/또는 증폭에 기여하는 사이토카인 신호전달을 가능하게 하기 위해서 적어도 하나의 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체(IL)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 여기서 iPSC 주(line)는 개선된 생존, 지속성, 증폭 및 효과기 세포 기능을 갖는 기능성 유도체 조혈 계통 세포를 생성하도록 분화를 지시할 수 있다. 외인성으로 도입된 사이토카인 신호전달(들)은 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18 및 IL21 중 임의의 하나, 2개 또는 그 초과의 신호전달을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 사이토카인 신호전달을 위하여 도입된 부분 또는 전체 사이토카인 및/또는 이의 각각의 수용체는 세포 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, 사이토카인 신호전달은 구성적으로 활성화된다. 일부 실시 형태에서, 사이토카인 신호전달의 활성화는 유도성이다. 일부 실시 형태에서, 사이토카인 신호전달의 활성화는 일시적이고/이거나 순간적이다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면 사이토카인/사이토카인 수용체의 일시적/순간적 발현은 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 에피솜, 미니-서클 또는 mRNA를 비롯한 RNA를 통해서이다.
일부 실시 형태에서, hnCD16/CAR iPSC 또는 이로부터의 유도체 세포에 포함된 외인성 세포 표면 사이토카인 및/또는 수용체는 IL7 신호전달을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, hnCD16/CAR iPSC 또는 이로부터의 유도체 세포에 포함된 외인성 세포 표면 사이토카인 및/또는 수용체는 IL10 신호전달을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, hnCD16/CAR iPSC 또는 이로부터의 유도체 세포에 포함된 외인성 세포 표면 사이토카인 및/또는 수용체는 IL15 신호전달을 가능하게 한다. 상기 hnCD16/CAR/IL iPSC의 일부 실시 형태에서, IL15 발현은 도 1의 설계 3을 통한 것이다. 상기 hnCD16/CAR/IL iPSC의 일부 실시 형태에서, IL15 발현은 도 1의 설계 4를 통한 것이다. 따라서, 상기 실시 형태의 상기 hnCD16/CAR/IL iPSC 및 이의 유도체 세포는 시험관내 또는 생체내에서 추가로 공급된 가용성 사이토카인을 접촉하지 않으면서 세포 성장, 증식, 증폭, 및/또는 효과기 기능을 유지 또는 개선시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, hnCD16/CAR/IL iPSC 및 이의 유도체 효과기 세포는 종양 항원 탈출 및 후속 종양 재발을 감소 또는 제거시킴으로써 CAR 표적화된 종양 살해와 상승작용하도록 ADCC를 유도하기 위해서 항체와 함께 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, iPSC-유래된 효과기 세포는, 적어도 CAR을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드, 및 선택적으로, hnCD16 및 사이토카인 및/또는 이의 수용체(IL) 변이체 중 하나 또는 둘 다를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조혈 계통 세포(표 1에서 CAR(CD16/IL))를 포함하고, lig-, inR+, cs-CD3+, En+ 및 Ab+(각각 동종항원 녹아웃, 비활성화 CAR 발현, 세포-표면 CD3 발현, 인게이저 발현 및 항체 발현)를 포함하는 속성들 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, iPSC-유래된 효과기 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 추가로 포함하는 CAR(CD16/IL) iNK 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, iPSC-유래된 효과기 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 추가로 포함하는 CAR(CD16/IL) iT 세포를 포함한다.
일부 다른 실시 형태에서, 적어도 CAR을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드, 및 선택적으로, hnCD16 및 사이토카인 및/또는 이의 수용체(IL) 중 하나 또는 둘 다를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드, 및 lig-, inR+, cs-CD3+, En+ 및 Ab+를 포함하는 속성들 중 하나 이상을 포함하는 iPSC-유래된 효과기 세포(표 1 참고)는 HLA-I 및/또는 HLA-II 결핍을 추가로 포함할 수 있다.
다수의 HLA 클래스 I 및 클래스 II 단백질은 동종이계 거부 문제를 회피하기 위해서 동종이계 수용자에서 조직적합성을 위해서 일치되어야 한다. 본 명세서에는 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 단백질 둘 다의 발현이 제거되거나 실질적으로 감소된 iPSC 세포주 및 그로부터 분화된 이의 유도체 세포가 제공된다. HLA 클래스 I 결핍은 HLA 클래스 I 유전자좌(염색체 6p21)의 임의의 영역의 기능성 결실, 또는 베타-2 마이크로글로불린(B2M) 유전자, TAP 1 유전자, TAP 2 유전자 및 타파신을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 HLA 클래스-I 연관된 유전자의 발현 수준을 결실 또는 감소시킴으로써 달성된다. 예를 들어, B2M 유전자는 모든 HLA 클래스 I 이종이량체의 세포 표면 발현에 필수적인 공통 하위단위를 암호화한다. B2M 음성 세포는 HLA-I 결핍성이다. HLA 클래스 II 결핍은 RFXANK, CIITA, RFX5 및 RFXAP를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 HLA-II 연관된 유전자의 기능성 결실 또는 감소에 의해서 달성될 수 있다. CIITA는 클래스 II 단백질 발현에 필요한 전사 인자 RFX5의 활성화를 통해서 기능하는 전사 공활성자이다. CIITA 음성 세포는 HLA-II 결핍성이다.
일부 세포 유형의 경우, HLA 클래스 I 발현의 결여는 NK 세포에 의한 용해로 이어진다. 이러한 "자가 미싱(missing self)" 반응을 극복하기 위해서, HLA-G는 NK 세포 인식 및 조작된 iPSC로부터 유래된 HLA-I 결핍 효과기 세포의 살해를 회피하기 위해서 선택적으로 녹인될 수 있다. 일 실시 형태에서, HLA-I 결핍 iPSC 및 이의 유도체 세포는 HLA-G 녹인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제공된 HLA-I 결핍 iPSC 및 이의 유도체 세포는 CD58 녹아웃 및 CD54 녹아웃 중 하나 또는 둘 다를 추가로 포함한다. CD58(또는 LFA-3) 및 CD54(또는 ICAM-1)는, 신호-의존성 세포 상호작용을 개시하고 세포(면역 세포를 포함함) 이동을 촉진하는 접착 단백질이다. CD58 녹아웃은 동종이계 NK 세포 활성화를 감소시키는 데 있어서 CD54 녹아웃보다 더 높은 효율을 갖는 것으로 밝혀졌으며; 한편, CD58 및 CD54 둘 다의 이중 녹아웃이 NK 세포 활성화의 가장 향상된 감소를 갖는 것으로 밝혀졌다. 일부 관찰에서, CD58 및 CD54 이중 녹아웃은 "자가 미싱" 효과를 극복하는 데 있어서 HLA-I 결핍 세포에 대한 HLA-G 과발현보다 훨씬 더 효과적이다. 본 명세서에 제공된 바와 같이, 일부 실시 형태에서, HLA-I 및 HLA-II 결핍 iPSC 및 이의 유도체 세포는 HLA-G를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 실시 형태에서, HLA-I 및 HLA-II 결핍 iPSC 및 이의 유도체 세포는 CD58 널이다. 일부 다른 실시 형태에서, HLA-I 및 HLA-II 결핍 iPSC 및 이의 유도체 세포는 CD54 널이다. 추가의 일부 다른 실시 형태에서, HLA-I 및 HLA-II 결핍 iPSC 및 이의 유도체 세포는 CD58 널 및 CD54 널이다. 세포 뱅크는 추가의 iPSC 조작을 위한 플랫폼, 및 오프-더-쉘프, 조작된, 균질한 세포 요법 제품의 제조를 위한 재생 가능한 공급원을 제공하는데, 이러한 제품은 조성이 명확하고 균일하고, 비용-효과적인 방식으로 상당한 규모로 대량 생산될 수 있다.
상기 내용에 비추어, 추가의 일부 다른 실시 형태에서, 적어도 CAR을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드, 및 선택적으로, hnCD16 및 사이토카인 및/또는 이의 수용체(IL) 변이체 중 하나 또는 둘 다를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드, 및 lig-, inR+, cs-CD3+, En+ 및 Ab+를 포함하는 속성들 중 하나 이상을 포함하는 iPSC-유래된 효과기 세포(표 1 참고)는 B2M, CIITA, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, RFX5, RAG1, RFXAP, 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자 중 적어도 하나의 결실 또는 감소된 발현; 또는 HLA-E, HLA-G, 4-1BBL, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, TCR, Fc 수용체, 및 이중특이성 또는 다중특이성 또는 보편적 인게이저와의 커플링을 위한 표면 촉발 수용체 중 적어도 하나의 도입된 또는 증가된 발현을 추가로 포함할 수 있다.
[표 1]
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이와 같이, 본 출원의 일 태양은 게놈 조작된 iPSC로부터 분화된 2가지 이상의 합성 효과기 세포 유형을 포함하는 조성물을 제공한다. 따라서, 다양한 실시 형태에서, 조성물은 게놈 조작된 iPSC로부터 분화된 합성 효과기 세포의 제1 집단 및 게놈 조작된 iPSC로부터 분화된 합성 효과기 세포의 제2 집단을 포함한다. 조성물의 일 실시 형태에서, 제1 유형의 합성 효과기 세포 또는 이의 집단(즉, 제1 집단)은 기능적으로 향상된 iPSC-유래된 T 세포이고, 제2 유형의 합성 효과기 세포 또는 이의 집단(즉, 제2 집단)은 기능적으로 향상된 iPSC-유래된 NK 세포이다. 일부 실시 형태에서, 기능적으로 향상된 iPSC-유래된 T 세포는 적어도 (제1) CAR을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 기능적으로 향상된 iPSC-유래된 NK 세포는 적어도 (제2) CAR과, CD16 변이체 및 부분 또는 전장의 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. 다양한 실시 형태에서, CD16 변이체는 고 친화도 비-절단성 CD16(hnCD16)이다.
제공된 바와 같이, 상기 고 친화도 비-절단성 CD16(hnCD16) 또는 이의 변이체의 실시 형태는 하기 중 적어도 하나를 포함하다: (a) CD16의 엑토도메인 도메인 내의 F176V 및 S197P; (b) CD64로부터 기원된 전체 또는 부분 엑토도메인; (c) 비-네이티브(또는 비-CD16) 막관통 도메인; (d) 비-네이티브(또는 비-CD16) 세포내 도메인; (e) 비-네이티브(또는 비-CD16) 신호전달 도메인; (f) 비-네이티브 자극성 도메인; 및 (g) CD16으로부터 기원되지 않고, 동일하거나 상이한 폴리펩타이드로부터 기원된 막관통 도메인, 신호전달 도메인, 및 자극성 도메인. 일부 실시 형태에서, 비-네이티브 막관통 도메인은 CD3D, CD3E, CD3G, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D, 또는 T 세포 수용체(TCR) 폴리펩타이드로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 비-네이티브 자극성 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래된다. 일부 다른 실시 형태에서, 비-네이티브 신호전달 도메인은 CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137(4-1BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래된다. 추가의 일부 다른 실시 형태에서, 비-네이티브 막관통 도메인은 NKG2D로부터 유래되고, 비-네이티브 자극성 도메인은 2B4로부터 유래되고, 비-네이티브 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다.
제공된 바와 같이, 제1 집단에서의 합성 세포의 제1 CAR 및 제2 집단에서의 합성 세포의 제2 CAR은 합성 세포에 표적화 특이성을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 제1 CAR과 제2 CAR은 동일한 표적화 특이성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 CAR과 제2 CAR은 표적화 특이성이 상이하다. 일부 실시 형태에서, 제1 CAR과 제2 CAR은 표적화 특이성이 동일하거나 상이하고, 제1 및/또는 제2 CAR은 하기 특징들 중 임의의 하나를 가질 수 있으며, 이로써 제1 CAR 및/또는 제2 CAR은, (i) T 세포 특이적이거나; (ii) NK 세포 특이적이거나; (iii) 이중특이성 항원 결합 CAR이거나; (iv) 전환 가능한 CAR이거나; (v) 이량체화된 CAR이거나; (vi) 스플리트 CAR이거나; (vii) 다중쇄 CAR이거나; 또는 (viii) 유도성 CAR이다. 일부 다른 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 CAR은 제1 또는 제2 CAR 중 어느 것과도 동일하거나 상이한 표적화 특이성을 가질 수 있는 또 다른 CAR과 공동발현된다.
일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 CAR은 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 또는 전장 펩타이드와, 선택적으로 별개의 작제물로 또는 바이-시스트론성 작제물로 공동발현된다. 추가의 일부 다른 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 CAR은 면역관문 저해제와, 선택적으로 별개의 작제물로 또는 바이-시스트론성 작제물로 공동발현된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 CAR은 CD19 또는 BCMA에 특이적이다. 다른 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 CAR은 ADGRE-2, 탄산 탈수효소 IX(CAIX), CCR1, CCR4, 암배아 항원(CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원, 상피 당단백질2(EGP 2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 접착 분자(EpCAM), EGFRvIII, 수용체 타이로신-단백질 카이나제 erb­B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산염-결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 엽산염 수용체-a, 강글리오사이드 G2(GD2), 강글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER-2), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 하위단위 알파-2(IL-13Rα2), κ-경쇄, 카이나제 삽입 도메인 수용체(KDR), Lewis A(CA19.9), Lewis Y(LeY), L1 세포 접착 분자(L1-CAM), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A 1(MAGE-A1), MICA/B, 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아성 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기세포 항원(PSCA), PRAME 전립선-특이적 막 항원(PSMA), 종양­연관 당단백질 72(TAG-72), TIM-3, TRBC1, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­R2), 빌름스 종양 단백질(WT-1) 및 병원체 항원 중 적어도 하나에 특이적이다.
제1 또는 제2 집단의 CAR-발현 세포의 일부 실시 형태에서, 세포는 또한 외인성 세포 표면 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 또는 전장 펩타이드를 발현한다. 일부 실시 형태에서, 외인성 세포 표면 사이토카인 및/또는 이의 수용체 변이체는 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21, 및/또는 이들 각각의 수용체 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 다른 실시 형태에서, 사이토카인 및/또는 이의 수용체 변이체는, (i) 자가-절단 펩타이드를 사용함으로써 IL15와 IL15Rα의 공동발현; (ii) IL15와 IL15Rα의 융합 단백질; (iii) IL15Rα의 세포내 도메인이 절단된 IL15/IL15Rα 융합 단백질; (iv) IL15와, IL15Rα의 막 결합된 스시 도메인의 융합 단백질; (v) IL15와 IL15Rβ의 융합 단백질; (vi) IL15와 공통 수용체 γC의 융합 단백질 - 여기서, 공통 수용체 γC는 네이티브 또는 변형됨 -; 및 (vii) IL15Rβ의 동종이량체 중 적어도 하나를 포함하고, (i) 내지 (vii) 중 임의의 하나는 별개의 작제물로 또는 바이-시스트론성 작제물로 CAR과 공동발현될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 또는 전장 펩타이드는 세포에서 일시적으로 발현된다.
일부 실시 형태에서, 유전자 변형된 iPSC 및 이로부터의 기능적으로 향상된 유도체 효과기 세포 - 이에는 iPSC-유래된 T 및 NK 세포가 포함되지만 이들로 제한되지 않음 - 는 하기를 포함한다: (i) HLA-I 결핍, 또는 B2M 널 또는 저; (ii) HLA-II 결핍, 또는 CIITA 널 또는 저; (iii) HLA-G 또는 비-절단성 HLA-G의 도입된 발현; (iv) lig-, inR+, cs-CD3+, En+, 및 Ab+ 중 적어도 하나; 여기서, "lig-"는 발현된 동종항원에서 음성이고; inR+는 상기 음성 동종항원에 상응하는 발현된 비활성화-CAR에서 양성이고; "cs-CD3+"는 세포 표면 발현된 CD3에서 양성이고; "En+"는 적어도 하나의 발현된 인게이저에서 양성이며, 여기서 상기 인게이저는 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE) 또는 삼중특이성 살해 세포 인게이저(TriKE)를 포함하고; "Ab+"는 적어도 하나의 발현된 항체 또는 면역관문 저해제에서 양성임; (v) TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, RFX5, RFXAP, RAG1, 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자 중 하나 이상의 결실 또는 감소된 발현; 및 (vi) HLA-E, HLA-G, 4-1BBL, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, TCR, Fc 수용체, 및 이중특이성, 다중특이성 또는 보편적 인게이저와의 커플링을 위한 표면 촉발 수용체 중 적어도 하나의 도입된 또는 증가된 발현.
일부 실시 형태에서, iPSC-유래된 효과기 세포 - 유도체 NK 또는 T 세포를 포함함 - 에서 녹아웃 또는 녹다운될 상기 동종항원은 CD40L, OX40, 또는 4-1BB를 포함하는데, 이들은 활성화된 수용자 T, NK 또는 B 세포에서 상향조절된다. 일부 실시 형태에서, iPSC-유래된 효과기 세포 내의 상기 비활성화-CAR은 CD40L-CAR, OX40-CAR 또는 4-1BB-CAR을 포함하는데, 이들은 iPSC-유래된 효과기 세포 내의 녹아웃된 동종항원 분자에 상응한다.
일부 실시 형태에서, iPSC-유래된 효과기 세포에서 발현되는 BiTE 또는 TriKE는 CD3, CD28, CD5, CD16, NKG2D, CD64, CD32, CD89, NKG2C, 또는 이의 키메라 Fc 수용체를 포함하는 적어도 하나의 면역 세포 표면 분자, 및 B7H3, BCMA, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD179b, CEA, CLEC12A, CS-1, DLL3, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, FLT-3, FOLR1, FOLR3, GD2, gpA33, HER2, HM1.24, LGR5, MSLN, MCSP, MICA/B, PSMA, PAMA, P-카드헤린, 또는 ROR1을 포함하는 적어도 하나의 종양 표면 분자를 인식한다. 일부 실시 형태에서, iPSC-유래된 효과기 세포에서 발현되는 BiTE는 CD3-CD19, CD16-CD30, CD64-CD30, CD16-BCMA, CD64-BCMA, 또는 CD3-CD33을 포함한다. 일부 실시 형태에서, iPSC-유래된 효과기 세포에서 발현되는 TriKE는 CD16-IL15-EPCAM, CD64-IL15-EPCAM, CD16-IL15-CD33, CD64-IL15-CD33, 또는 NKG2C-IL15-CD33을 포함한다.
iPSC-유래된 효과기 세포의 일부 실시 형태에서, 세포는 항체를 발현하며, 여기서 항체는 항-CD20, 항-HER2, 항-CD52, 항-EGFR, 항-CD123, 항-GD2, 항-PDL1, 항체, 또는 항-CD38 항체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. iPSC-유래된 효과기 세포의 일부 실시 형태에서, 세포는 면역관문 저해제를 발현하며, 면역관문 저해제는 PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 또는 저해성 KIR을 포함하는 면역관문 분자에 대한 길항제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시 형태에서, iPSC-유래된 효과기 세포에서 발현된 면역관문 저해제는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리릴루맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 또는 이들의 유도체 또는 기능성 등가물 중 1종이다. 또 다른 실시 형태에서, iPSC-유래된 효과기 세포에서 발현된 면역관문 저해제는 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 1종이다.
본 명세서에 제공된 바와 같이, 조성물의 제1 및 제2 세포 집단 각각의 iPSC-유래된 T 세포 또는 iPSC-유래된 NK 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 합성 세포는 합성 세포의 고유한 특징에 기여하는 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, iPSC-유래된 T 세포 및/또는 iPSC-유래된 NK 세포는 하나의 목적하는 통합 부위에 통합된 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 다른 실시 형태에서, iPSC-유래된 T 세포 및/또는 iPSC-유래된 NK 세포는 상이한 목적하는 통합 부위에 통합된 2종 초과의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 목적하는 통합 부위(들)는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역(TRAC 또는 TRBC), NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD40L, CD44, CD54, CD56, CD58, CD69, CD71, OX40, 4-1BB, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, 및 TIGIT 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 다른 실시 형태에서, 목적하는 통합 부위(들)는 TCR α 또는 β 불변 영역(TRAC 또는 TRBC), CD25, CD38, CD40L, CD44, CD54, CD58, CD69, CD71, OX40 또는 4-1BB를 포함한다. 추가의 일부 다른 실시 형태에서, TCRα 또는 TCRβ, CD25, CD38, CD40L, CD44, CD54, CD58, CD69, CD71, OX40 또는 4-1BB는 각각의 통합 부위(들)에서 상기 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 통합한 결과로서 녹아웃된다.
2개 이상의 합성 세포 집단을 포함하는 조성물의 실시 형태에서, 각 집단의 합성 세포는 게놈 조작된 iPSC로부터 유래된다. 다양한 실시 형태에서, 제1 집단은 iPSC-유래된 T 세포의 집단이고, 제2 집단은 iPSC-유래된 NK 세포의 집단이거나, 또는 그 반대이다(즉, 제1 집단은 iPSC-유래된 NK 세포의 집단이고, 제2 집단은 iPSC-유래된 T 세포의 집단이다). 일부 실시 형태에서, iPSC-유래된 T 세포의 제1 집단 및 iPSC-유래된 NK 세포의 제2 집단 각각은 하기 특징들 중 적어도 하나를 갖는다: 말초 혈액, 제대혈 또는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 수득된 이들의 네이티브 상대 세포에 비해, (i) 개선된 지속성 및/또는 생존, (ii) 네이티브 면역 세포에 대한 증가된 저항성, (iii) 증가된 세포독성, (iv) 개선된 종양 침투, (v) 향상된 또는 획득된 ADCC, (vi) 방관자 면역 세포를 종양 부위로 이동시키고/시키거나, 활성화 또는 동원하는 데 있어서의 향상된 능력, (vii) 종양 면역억제를 감소시키는 향상된 능력, 및 (viii) 종양 항원 탈출을 구제하는 데 있어서의 개선된 능력. 또한, iPSC-유래된 T 세포 및/또는 iPSC-유래된 NK 세포는 말초 혈액, 제대혈 또는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 수득된 그들 각각의 네이티브 상대 세포에 비해 더 긴 텔로미어를 포함한다.
2개 이상의 합성 세포 집단을 포함하는 조성물의 일부 실시 형태에서, 게놈 조작된 iPSC로부터 유래되는 제1 및/또는 제2 집단의 합성 세포는 조절된다. 일부 실시 형태에서, 제1 집단의 조절된 합성 세포는 iPSC-유래된 T 세포이고, 제1 집단은 조절을 갖지 않은 제1 세포 집단에 비해, 증가된 수 또는 비의 미감작 T 세포, 줄기세포 기억 T 세포, 및/또는 중앙 기억 T 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제2 집단의 조절된 합성 세포는 iPSC-유래된 NK 세포이고, 제2 집단은 조절을 갖지 않은 세포 집단에 비해, 증가된 수 또는 비의 I형 NKT 세포 및/또는 적응 NK 세포를 포함한다.
조작된 iPSC와 상이한 유도체 T 세포를 포함하는 제1 합성 세포 집단, 및 조작된 iPSC와 상이한 유도체 NK 세포를 포함하는 제2 합성 세포 집단을 포함하는 조성물의 일부 실시 형태에서, 유도체 T 세포와 유도체 NK 세포는 100:1 내지 1:100 범위의 비로 존재한다. 일부 실시 형태에서, 유도체 T 세포와 유도체 NK 세포는 50:1 내지 1:50 범위의 비로 존재한다. 일부 실시 형태에서, 유도체 T 세포와 유도체 NK 세포는 20:1 내지 1:20 범위의 비로 존재한다. 일부 다른 실시 형태에서, 유도체 T 세포와 유도체 NK 세포는 10:1 내지 1:10 범위의 비로 존재한다. 일부 다른 실시 형태에서, 유도체 T 세포와 유도체 NK 세포는 1:1의 비로 존재한다.
조작된 iPSC와 상이한 유도체 T 세포를 포함하는 제1 합성 세포 집단, 및 조작된 iPSC와 상이한 유도체 NK 세포를 포함하는 제2 합성 세포 집단을 포함하는 조성물의 일부 실시 형태에서, 조성물은 하나 이상의 추가의 세포 집단을 추가로 포함한다. 일 실시 형태에서, 추가의 세포 집단은 조절 세포를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 추가의 세포 집단은 골수계-유래된 억제인자 세포(MDSC)를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 추가의 세포 집단의 MDSC는 iPSC로부터 유래된다.
본 출원의 또 다른 태양은, iPSC-유래된 T 세포 및 iPSC-유래된 NK 세포를 각각 포함하는 적어도 2개의 합성 세포 집단에 더하여, 1종 이상의 치료제를 추가로 포함하는 상기 기재된 바와 같은 조성물을 제공한다. 합성 세포와 함께 사용될 수 있는 적합한 치료제 - 항체 및 면역관문 저해제를 포함하지만 이들로 제한되지 않음 - 는 하기에 추가로 상세히 설명된다.
II. iPSC 내의 선택된 유전자좌에서 표적화된 게놈 편집을 위한 방법
게놈 편집 또는 유전자 편집은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 DNA가 표적화된 세포의 게놈에서 삽입, 결실 및/또는 대체되는 유전자 조작의 유형이다. 표적화된 게놈 편집("표적화된 게놈 편집" 또는 "표적화된 유전자 편집"과 상호 교환 가능함)은 게놈 내의 미리-선택된 부위에서 삽입, 결실 및/또는 치환을 가능하게 한다. 내인성 서열이 표적화된 편집 동안 삽입 부위 내에서 결실되는 경우, 영향을 받은 서열을 포함하는 내인성 유전자는 서열 결실로 인해서 녹아웃 또는 녹다운될 수 있다. 따라서, 표적화된 편집은 또한 내인성 유전자 발현을 정확하게 파괴하기 위해서 사용될 수 있다. 삽입 부위에서 내인성 서열의 결실이 있거나 없는 1종 이상의 외인성 서열의 삽입을 포함하는 과정을 지칭하는 "표적화된 통합"이 유사하게 본 명세서에서 사용된다. 비교하면, 무작위로 통합된 유전자는 위치 효과 및 침묵화되어, 이의 발현이 신뢰할 수 없거나 예측할 수 없게 만드는 경향이 있다. 예를 들어, 동원체 및 하위-말단소체 영역은 특히 이식유전자 침묵화되는 경향이 있다. 상반되게, 새로 통합된 유전자는 주변 내인성 유전자 및 염색질에 영향을 주어, 가능하게는 세포 거동을 변경하거나 또는 세포 형질전환을 선호하는 경향이 있다. 따라서, 외인성 DNA를 미리-선택된 유전자좌, 예컨대 안전 하버 유전자좌 또는 게놈 안전 하버(GSH)에 삽입하는 것은 안전성, 효율성, 카피수 대조군 및 신뢰할 수 있는 유전자 반응 대조군을 위해서 중요하다.
표적화된 편집은 뉴클레아제-비의존성 접근법을 통해서 또는 뉴클레아제-의존성 접근법을 통해서 달성될 수 있다. 뉴클레아제-비의존성 표적화된 편집 접근법에서, 상동 재조합은 숙주 세포의 효소적 기구를 통해서, 삽입될 외인성 폴리뉴클레오타이드에 측접하는 상동성 서열에 의해서 안내된다.
대안적으로, 표적화된 편집은 특이적인 희귀한-절단 엔도뉴클레아제에 의해서 이중 가닥 브레이크(DSB)의 특이적 도입을 통해서 더 높은 빈도로 달성될 수 있다. 이러한 뉴클레아제-의존성 표적화된 편집은 비-상동 단부 결합(non-homologous end joining: NHEJ)을 비롯한 DNA 수복 기전을 사용하는데, 이것은 DSB에 반응하여 일어난다. 외인성 유전 물질을 함유하는 공여자 벡터가 없는 경우, NHEJ는 종종 적은 수의 내인성 뉴클레오타이드의 무작위 삽입 또는 결실(in/del)로 이어진다. 비교하면, 한 쌍의 상동성 아암 측접된 외인성 유전 물질을 함유하는 공여자 벡터가 존재하는 경우, 외인성 유전 물질은 상동 재조합에 의해서 상동 재조합 수복(homology directed repair: HDR) 동안 게놈 내에 도입되어, "표적화된 통합"을 유발할 수 있다. 일부 상황에서, 표적화된 통합은 선택된 유전자의 암호 영역 내에 존재하도록 의도되고, 따라서, 표적화된 통합은 유전자 발현을 파괴하여, 하나의 단일 편집 단계로 동시에 녹인과 녹아웃(KI/KO)을 가져올 수 있다.
선택된 위치에서의 하나 이상의 도입유전자를 관심 유전자좌(gene locus of interest: GOI) 내에 삽입시켜 동시에 유전자를 녹아웃시키는 것이 달성될 수 있다. 동시 녹인 및 녹아웃(KI/KO)에 적합한 유전자좌는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역(TRAC 또는 TRBC), NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD44, CD54, CD56, CD58, CD69, CD71, OX40, 4-1BB, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, 및 TIGIT를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 위치-선택적 삽입을 위한 각각의 부위-특이적 표적화 상동성 아암의 사용으로, 도입유전자(들)는 그 부위에서의 내인성 프로모터 하에서 또는 작제물에 포함된 외인성 프로모터 하에서 발현될 수 있다. 2개 이상의 도입유전자를 (예를 들어, CD38 유전자좌 내의) 선택된 위치에 삽입하려는 경우, 링커 서열, 예를 들어, 2A 링커 또는 IRES를 임의의 2개의 도입유전자 사이에 배치한다. 2A 링커는 FMDV, ERAV, PTV-I 또는 TaV로부터 유래된 자가 절단 펩타이드(각각 "F2A", "E2A", "P2A" 및 "T2A"로서 지칭됨)를 암호화하여, 개별 단백질이 단일 번역으로부터 생산되도록 한다. 일부 실시 형태에서, 도입유전자 및/또는 외인성 프로모터 침묵의 위험을 감소시키기 위해서 인설레이터를 작제물에 포함시킨다. 다양한 실시 형태에서, 외인성 프로모터는 CAG, 또는 CMV, EF1α, PGK 및 UBC를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다른 구성적, 유도성, 일시적-, 조직- 또는 세포 유형-특이적 프로모터일 수 있다.
특이적이고, 표적화된 DSB를 도입할 수 있는 사용 가능한 엔도뉴클레아제는 아연-핑거 뉴클레아제(zinc-finger nuclease: ZFN), 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease: TALEN), RNA-안내 CRISPR(Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 추가로, phiC31 및 Bxb1 인테그라제를 사용하는 DICE(이중 인테그라제 카세트 교환(dual integrase cassette exchange)) 시스템이 또한 표적화된 통합을 위한 유망한 툴이다.
ZFN은 아연 핑거 DNA 결합 도메인에 융합된 뉴클레아제를 포함하는 표적화된 뉴클레아제이다. "아연 핑거 DNA 결합 도메인" 또는 "ZFBD"라는 것은, 하나 이상의 아연 핑거를 통해서 서열-특이적인 방식으로 DNA에 결합하는 폴리펩타이드 도메인을 의미한다. 아연 핑거는 구조가 아연 이온의 배위를 통해서 안정화된 아연 핑거 결합 도메인 내의 약 30개 아미노산의 도메인이다. 아연 핑거의 예는 C2H2 아연 핑거, C3H 아연 핑거 및 C4 아연 핑거를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. "설계된" 아연 핑거 도메인은 그의 설계/조성이 합리적 기준, 예를 들어, 기존의 ZFP 설계 및 결합 데이터의 정보를 분류하는 데이터베이스에서의 치환 규칙 및 처리 정보를 위한 컴퓨터 계산된 알고리즘의 응용으로부터 원칙적으로 유래되는 자연에서 발생하지 않는 도메인이다. 예를 들어, 미국 특허 제6,140,081호; 제6,453,242호; 및 제6,534,261호를 참고하며; 또한 국제 특허 출원 공개 WO98/53058호; WO98/53059호; WO98/53060호; WO02/016536호 및 WO03/016496호를 참고하며, 이들의 완전한 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. "선택된" 아연 핑거 도메인은 그의 생산이 경험적 공정, 예컨대 파지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 혼성 선택으로부터 주로 유발되는 자연에서 발견되지 않는 도메인이다. ZFN은 전체 개시내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제7,888,121호 및 미국 특허 제7,972,854호에 보다 상세하게 기술된다. 관련 기술 분야에서 ZFN의 가장 인식되는 예는 FokI 뉴클레아제와 아연 핑거 DNA 결합 도메인의 융합이다.
TALEN은 TAL 효과기 DNA 결합 도메인에 융합된 뉴클레아제를 포함하는 표적화된 뉴클레아제이다. "전사 활성자-유사 효과기 DNA 결합 도메인", "TAL 효과기 DNA 결합 도메인", 또는 "TALE DNA 결합 도메인"이라는 것은 DNA에 대한 TAL 효과기 단백질의 결합에 대한 책임이 있는 TAL 효과기 단백질의 폴리펩타이드 도메인을 의미한다. TAL 효과기 단백질은 감염 동안 산토모나스(Xanthomonas) 속의 식물 병원체에 의해서 분해된다. 이들 단백질은 식물 세포의 핵에 들어가서, 이의 DNA 결합 도메인을 통해서 효과기-특이적 DNA 서열에 결합하여, 이의 전사활성화 도메인을 통해서 이러한 서열에서 유전자 전사를 활성화시킨다. TAL 효과기 DNA 결합 도메인 특이성은 반복 가변-이중잔기(repeat variable-diresidues: RVD)라 지칭되는 선택된 반복 위치에서 다형성을 포함하는 불완전한 34개의 아미노산 반복부의 효과기-가변 수에 좌우된다. TALEN은 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 출원 공개 제2011/0145940호에 보다 상세하게 기술되어 있다. 관련 기술 분야에서 TALEN의 가장 인식되는 예는 TAL 효과기 DNA 결합 도메인에 대한 FokI 뉴클레아제의 융합 폴리펩타이드이다.
본 방법에서의 용도를 발견한 표적화된 뉴클레아제의 또 다른 예는 DNA 결합 도메인, 예를 들어 관심 DNA 서열에 대해서 특이성을 갖는 아연 핑거 DNA 결합 도메인, TAL 효과기 DNA 결합 도메인 등에 융합된 뉴클레아제 활성을 갖는 Spo11 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드인, 표적화된 Spo11 뉴클레아제이다.
본 발명에 적합한 표적화된 뉴클레아제의 추가 예는 개별적으로 사용되든지 조합으로 사용되든지에 관계 없이 Bxb1, phiC31, R4, PhiBT1, 및 Wβ/SPBc/TP901-1을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
표적화된 뉴클레아제의 다른 비제한적인 예는 자연 발생 및 재조합 뉴클레아제; cas, cpf, cse, csy, csn, csd, cst, csh, csa, csm, 및 cmr을 비롯한 패밀리로부터의 CRISPR 관련 뉴클레아제; 제한 엔도뉴클레아제; 메가뉴클레아제; 귀소 엔도뉴클레아제 등을 포함한다.
예로서 Cas9를 사용하는 경우, CRISPR/Cas9는 다음 2개의 주요 성분이 필요하다: (1) Cas9 엔도뉴클레아제 및 (2) crRNA-tracrRNA 복합체. 공동발현되는 경우, 두 성분은 PAM 및 PAM 근처의 시딩 영역을 포함하는 표적 DNA 서열에 동원된 복합체를 형성한다. crRNA 및 tracrRNA는 Cas9가 선택된 서열을 표적화하는 것을 안내하기 위해서 키메라 가이드 RNA(gRNA)를 형성하도록 조합될 수 있다. 이어서 이러한 두 성분은 형질주입 또는 형질도입을 통해서 포유동물 세포에 전달될 수 있다. CRISPR/Cpf 시스템의 사용은, Cpf 엔도뉴클레아제가, 선택된 서열을 표적화하는 것을 안내하기 위해, 전형적으로 (1) Cpf 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cpf1, MAD7 및 당업계에 더 많이 알려진 다수의 것) 및 (2) gNA - 이는 종종 tracrRNA를 필요로 하지 않음 - 를 필요로 한다.
DICE 매개된 삽입은 재조합효소, phiC31 및 Bxb1의 쌍을 사용하여, 각각의 효소 자신의 작은 attB 및 attP 인식 부위에 엄격하게 제한된 외인성 DNA의 단방향성 통합을 제공한다. 이들 표적 att 부위는 포유류 게놈에 자연적으로 존재하지 않기 때문에, 이들은 먼저 목적하는 통합 부위에서 게놈에 도입되어야 한다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2015/0140665호를 참고하며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
본 발명의 일 태양은 표적화된 게놈 통합을 위해서 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 제공한다. 따라서, 본 발명의 조성물의 제1 및 제2 집단의 합성 세포는 표적화된 게놈 통합을 위한 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 작제물을 사용하여 생성될 수 있다. 일 실시 형태에서, 작제물은 목적하는 통합 부위에 특이적인 상동 아암의 쌍을 추가로 포함하고, 표적화된 통합의 방법은 세포 숙주 효소 기구에 의한 부위 특이적 상동 재조합이 가능하도록 작제물을 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 세포에 도입하는 단계, 및 ZFN-매개된 삽입이 가능하도록 목적하는 통합 부위에 특이적인 DNA-결합 도메인을 포함하는 ZFN 발현 카세트를 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 추가로 또 다른 실시 형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 세포에 도입하는 단계, 및 TALEN-매개된 삽입이 가능하도록 목적하는 통합 부위에 특이적인 DNA-결합 도메인을 포함하는 TALEN 발현 카세트를 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물 세포에 도입하는 단계, Cas9-매개된 삽입이 가능하도록 Cas9 발현 카세트, 및 목적하는 통합 부위에 특이적인 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 추가의 또 다른 실시 형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 DICE 재조합효소의 쌍의 하나 이상의 att 부위를 포함하는 작제물을 세포 내의 목적하는 통합 부위에 도입하는 단계, 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 세포에 도입하는 단계, 및 DICE-매개된 표적화된 통합이 가능하도록, DICE 재조합효소를 위한 발현 카세트를 도입하는 단계를 포함한다.
표적화된 통합을 위한 유망한 부위는 안전 하버 유전자좌, 또는 게놈 안전 하버(GSH)를 포함하지만 이들로 제한되지 않으며, 이것은 숙주 세포 또는 유기체에 악영향을 미치지 않으면서 새로 통합된 DNA의 예측 가능한 발현을 이론적으로 수용할 수 있는 인간 게놈의 유전자내 또는 유전자외 영역이다. 유용한 안전 하버는 벡터-암호화된 단백질 또는 비-암호 RNA의 목적하는 수준을 산출하기에 충분한 이식유전자 발현을 허용해야 한다. 안전 하버는 또한 세포를 악성 형질전환하게 만들지도 않고 세포 기능을 변경시키지도 않아야 한다. 잠재적인 안전 하버 유전자좌일 통합 부위의 경우, 서열 주석에 의해서 판단되는 바와 같은, 조절 요소 또는 유전자의 파괴의 부재를 포함하지만 이에 제한되지 않는 기준을 충족하는 것이 이상적으로 필요하며; 이것은 반대 방향으로 전사되는 2개의 유전자 사이의 수렴부(convergence)에서의 유전자 밀집 면적 또는 위치 내의 유전자간 영역이고; 벡터-암호화된 전사 활성자와 인접한 유전자, 특히 암-관련된 유전자 및 마이크로RNA 유전자의 프로모터 간의 긴-범위 상호작용의 가능성을 최소화하는 거리를 유지하고; 넓은 공간 및 일시적 발현 서열 태그(EST) 발현 패턴에 의해서 반영되는 바와 같은, 편재적인 전사 활성을 나타내는, 외견상 편재적인 전사 활성을 갖는다. 후자 특징은, 분화 동안 염색질 리모델링이 전형적으로 일부 유전자좌의 침묵 및 다른 것의 잠재적인 활성화로 이어지는 경우, 줄기세포에서 특히 중요하다. 외인성 삽입에 적합한 영역 내에서, 삽입을 위해서 선택된 정확한 유전자좌는 반복적인 요소 및 보존 서열이 없고, 상동성 아암의 증폭을 위한 프라이머가 쉽게 설계될 수 있다.
인간 게놈 편집 또는 구체적으로 표적화된 통합에 적합한 부위는 아데노-연관된 바이러스 부위 1(AAVS1), 케모카인(CC 모티프) 수용체 5(CCR5) 유전자좌 및 마우스 ROSA26 유전자좌의 인간 오르토로그(orthologue)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 추가로, 마우스 H11 유전자좌의 인간 오르토로그는 또한 본 명세서에 개시된 표적화된 통합의 조성물 및 방법을 사용한 삽입에 적합한 부위일 수 있다. 추가로, 콜라겐 및 HTRP 유전자좌는 또한 표적화된 통합을 위한 안전 하버로서 사용될 수 있다. 그러나, 각각의 선택된 부위의 검증은 특이적 통합 사건 및 프로모터 선출, 외인성 유전자 서열 및 배열을 비롯한 삽입 전략의 최적화를 위해서 특히 줄기세포에서 필수적인 것으로 밝혀져 있고, 작제물 설계가 종종 필요하다.
표적화된 in/del을 위해서, 편집 부위는 종종 발현 및/또는 기능이 방해되도록 의도되는 내인성 유전자 내에 포함된다. 일부 실시 형태에서, 표적화된 in/del을 포함하는 내인성 유전자는 면역 반응 조절 및 조정과 연관된다. 일부 다른 실시 형태에서, 표적화된 in/del을 포함하는 내인성 유전자는 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약물 표적 후보, 면역 반응 조절 및 조정, 또는 줄기세포 및/또는 전구 세포 및 그로부터 유래된 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자가-재생, 지속성 및/또는 생존을 억제하는 단백질과 연관된다.
이와 같이, 본 발명의 또 다른 태양은 계속적 또는 일시적 유전자 발현에 대해서 안전하고, 널리 조절되는 것으로 공지되거나 증명된 게놈 안전 하버 또는 미리 선택된 유전자좌를 비롯한 선택된 유전자좌, 예컨대 본 명세서에 제공된 바와 같은 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, TRAC, 또는 CD38 유전자좌에서의 표적화된 통합 방법을 제공하고; 본 발명의 조성물의 제1 및 제2 집단의 합성 세포가 그러한 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 일 실시 형태에서, 표적화된 통합 방법을 위한 게놈 안전 하버는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, CD38, GAPDH, TCR 또는 RUNX1 또는 게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 다른 유전자좌를 포함하는 하나 이상의 목적하는 통합 부위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적화된 통합은 통합의 결과로서 유전자의 녹다운 또는 녹아웃이 요구되는 하나 이상의 유전자좌에 존재하고, 여기서 이러한 유전자좌는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역(TRAC 또는 TRBC), NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD44, CD54, CD56, CD58, CD69, CD71, OX40, 4-1BB, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, 및 TIGIT를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
다른 실시 형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 세포에 도입하는 단계, 및 ZFN-매개된 삽입이 가능하도록 목적하는 통합 부위에 특이적인 DNA-결합 도메인을 포함하는 ZFN 발현 카세트를 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 목적하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD44, CD54, CD56, CD58, CD69, CD71, OX40, 4-1BB, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, 또는 TIGIT를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 세포에 도입하는 단계, 및 TALEN-매개된 삽입이 가능하도록 목적하는 통합 부위에 특이적인 DNA-결합 도메인을 포함하는 TALEN 발현 카세트를 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 목적하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD44, CD54, CD56, CD58, CD69, CD71, OX40, 4-1BB, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, 또는 TIGIT를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 세포에 도입하는 단계, Cas9 발현 카세트, 및 Cas9-매개된 삽입이 가능하도록 목적하는 통합 부위에 특이적인 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 목적하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD44, CD54, CD56, CD58, CD69, CD71, OX40, 4-1BB, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, 또는 TIGIT를 포함한다. 추가의 또 다른 실시 형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 DICE 재조합효소의 쌍의 하나 이상의 att 부위를 포함하는 작제물을 세포 내의 목적하는 통합부위에 도입하는 단계, 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 세포에 도입하는 단계, 및 DICE-매개된 표적화된 통합이 가능하도록 DICE 재조합효소를 위한 발현 카세트를 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 목적하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD44, CD54, CD56, CD58, CD69, CD71, OX40, 4-1BB, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT를 포함한다.
추가로, 본 명세서에 제공된 바와 같이, 상기 안전 하버에서의 표적화된 통합 방법을 사용하여 임의의 관심 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 안전 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보, 및 줄기세포 및/또는 전구 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자가-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 삽입한다. 일부 다른 실시 형태에서, 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물은 하나 이상의 마커 유전자를 추가로 포함한다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 작제물에서 외인성 폴리뉴클레오타이드는 안전 스위치 단백질을 암호화하는 자살 유전자이다. 유도된 세포사에 적합한 자살 유전자 시스템은 카스파제 9(또는 카스파제 3 또는 7) 및 AP1903; 티미딘 카이나제(TK) 및 간시클로버(GCV); 사이토신 데아미나제(CD) 및 5-플루오로사이토신(5-FC)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 추가로, 일부 자살 유전자 시스템은 세포 유형 특이적이고, 예를 들어, T 림프구의 B-세포 분자 CD20에 의한 유전자 변형은 mAb 리툭시맙의 투여 시에 이의 제거를 허용한다. 추가로, 세툭시맙에 의해서 인식되는 에피토프를 함유하는 변형된 EGFR을 사용하여 세포가 세툭시맙에 노출되는 경우 유전자 조작된 세포를 고갈시킬 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 일 태양은 카스파제 9(카스파제 3 또는 7), 티미딘 카이나제, 사이토신 데아미나제, 변형된 EGFR 및 B-세포 CD20으로부터 선택된 안전 스위치 단백질을 암호화하는 하나 이상의 자살 유전자의 표적화된 통합 방법을 제공한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해서 통합된 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 표적화된 통합을 위해서 작제물 내에 포함된 작동 가능하게 연결된 외인성 프로모터에 의해서 유도된다. 프로모터는 유도성 또는 작제성일 수 있고, 일시적-, 조직- 또는 세포 유형-특이적일 수 있다. 본 발명의 방법에 적합한 작제성 프로모터는, 거대세포바이러스(CMV), 연장 인자 1α(EF1α), 포스포글리세레이트 카이나제(PGK), 혼성 CMV 증강자/닭 β-액틴(CAG) 및 유비퀴틴 C(UBC) 프로모터를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일 실시 형태에서, 외인성 프로모터는 CAG이다.
본 명세서에 기재된 방법에 의해서 통합된 외인성 폴리뉴클레오타이드는 통합 부위에서, 숙주 게놈 내의 내인성 프로모터에 의해서 유도될 수 있다. 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 세포의 게놈 내의 AAVS1 유전자좌에서 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드의 표적화된 통합을 위해서 사용된다. 일 실시 형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 AAVS1 프로모터에 의해서 유도된다. 다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 세포의 게놈 내의 ROSA26 유전자좌에서 표적화된 통합을 위해서 사용된다. 일 실시 형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 ROSA26 프로모터에 의해서 유도된다. 추가의 또 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 세포의 게놈 내의 H11 유전자좌에서 표적화된 통합을 위해서 사용된다. 일 실시 형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 H11 프로모터에 의해서 유도된다. 다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 세포의 게놈 내의 콜라겐 유전자좌에서 표적화된 통합을 위해서 사용된다. 일 실시 형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 콜라겐 프로모터에 의해서 유도된다. 추가의 또 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 세포의 게놈 내의 HTRP 유전자좌에서 표적화된 통합을 위해서 사용된다. 일 실시 형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 HTRP 프로모터에 의해서 유도된다. 이론적으로, 목적하는 장소에서의 올바른 삽입만이 내인성 프로모터에 의해서 유도된 외인성 유전자의 유전자 발현을 가능하게 할 것이다.
일부 실시 형태에서, 표적화된 통합 방법을 위한 작제물 내에 포함된 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 하나의 프로모터에 의해서 유도된다. 일부 실시 형태에서, 작제물은 동일한 프로모터에 의해서 유도된 2개의 인접한 폴리뉴클레오타이드 사이에 하나 이상의 링커 서열을 포함하여 모이어티들 사이에서 더 큰 물리적 분리를 제공하고, 효소 기구에 대한 접근성을 최대화한다. 링커 서열의 링커 펩타이드는 모이어티들(외인성 폴리뉴클레오타이드 및/또는 그로부터 암호화된 단백질 또는 펩타이드) 간의 물리적 분리를 관련 기능에 따라서 더 가요성이거나 더 강하게 만들도록 선택된 아미노산으로 이루어질 수 있다. 링커 서열은 프로테아제에 의해서 절단 가능하거나 또는 화학적으로 절단 가능하여 별개의 모이어티를 산출할 수 있다. 링커 내의 효소 절단 부위의 예는 단백질분해 효소, 예컨대 엔테로카이나제, 인자 Xa, 트립신, 콜라게나제 및 트롬빈에 의한 전달을 위한 부위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로테아제는 숙주에 의해서 자연적으로 생성된 것이거나 또는 그것은 외인성으로 도입된다. 대안적으로, 링커 내의 절단 부위는 선택된 화학물질, 예를 들어, 시아노겐 브로마이드, 하이드록실아민, 또는 저 pH에 노출될 때 절단될 수 있는 부위일 수 있다. 선택적인 링커 서열은 절단 부위의 제공이 아닌 목적을 제공할 수 있다. 링커 서열은 모이어티를 위해서 또 다른 인접한 모이어티에 대한 모이어티의 효과적인 위치결정이 적절하게 기능하는 것을 허용해야 한다. 링커는 또한 모이어티들 간의 임의의 입체 장애를 예방하기에 충분한 길이의 단순한 아미노산 서열일 수 있다. 또한, 링커 서열은 예를 들어, 인산화 부위, 바이오티닐화 부위, 황산화 부위, γ-카복실화 부위 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 번역-후 변형을 제공할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 링커 서열은 생물학적 활성 펩타이드를 단일의 바람직하지 않은 컨포메이션으로 유지하지 않도록 가요성이다. 링커는 가요성을 제공하기 위해서, 작은 측쇄를 갖는 아미노산, 예컨대 글리신, 알라닌, 및 세린으로 주로 구성될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 링커 서열의 약 80 내지 90% 또는 그 초과는 글리신, 알라닌, 또는 세린 잔기, 특히 글리신 및 세린 잔기를 포함한다. 몇몇 실시 형태에서, G4S 링커 펩타이드는 융합 단백질의 단부-가공 도메인과 엔도뉴클레아제 도메인을 분리한다. 다른 실시 형태에서, 2A 링커 서열은 2개의 별개의 단백질이 단일 번역으로부터 생성되는 것을 허용한다. 적합한 링커 서열은 경험적으로 쉽게 식별될 수 있다. 추가로, 링커 서열의 적합한 크기 및 서열은 또한 종래의 컴퓨터 모델링 기술에 의해서 결정될 수 있다. 일 실시 형태에서, 링커 서열은 자가-절단 펩타이드를 암호화한다. 일 실시 형태에서, 자가-절단 펩타이드는 2A이다. 일부 다른 실시 형태에서, 링커 서열은 내부 리보솜 도입 서열(Internal Ribosome Entry Sequence: IRES)을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 연속적인 링커 서열은 상이하다.
표적화된 통합을 위해서 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 세포에 도입하는 방법은 그 자체로 공지된 세포에 대한 유전자 도입 방법을 사용함으로써 달성될 수 있다. 일 실시 형태에서, 작제물은 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관된 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터의 골격을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 외인성 폴리뉴클레오타이드의 표적 세포(예를 들어, pAl- 11, pXTl, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo)로의 전달 및/또는 발현 등을 위해서 플라스미드 벡터가 사용된다. 일부 다른 실시 형태에서, 외인성 폴리뉴클레오타이드를 표적 세포로 전달하기 위해서 에피솜 벡터가 사용된다. 상동 재조합을 통해서 삽입, 결실 또는 치환을 도입하도록 유전자 조작하기 위해서 재조합 아데노-연관된 바이러스(rAAV)가 사용될 수 있다. 렌티바이러스와 달리, rAAV는 숙주 게놈에 통합되지 않는다. 또한, 에피솜 rAAV 벡터는 종래의 표적화 플라스미드의 형질주입과 비교할 때 훨씬 더 높은 비율로 상동성-유도 유전자 표적화를 매개한다. 일부 실시 형태에서, iPSC의 게놈 내의 표적 부위에서 삽입, 결실 또는 치환을 도입하기 위해서 AAV6 또는 AAV2 벡터가 사용된다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 수득된 게놈 변형된 iPSC 및 이의 유도체 세포는 표 1에 열거된 적어도 하나의 유전자형을 포함한다.
III. 게놈-조작된 iPSC의 수득 및 유지 방법
다양한 실시 형태에서, 본 발명은 하나 이상의 목적하는 부위에서 하나 이상의 표적화된 편집을 포함하는 게놈-조작된 iPSC를 수득 및 유지하는 방법을 제공하고, 여기서 하나 이상의 표적화된 편집은 각각의 선택된 편집 부위에서 증폭된 게놈-조작된 iPSC 또는 iPSC-유래된 비-만능성 세포에서 무손상이고 기능성을 유지한다. 표적화된 편집은 게놈 iPSC 및 그로부터의 유도체 세포 내에 삽입, 결실, 및/또는 치환(즉, 선택된 부위에서 표적화된 통합 및/또는 in/del)을 도입한다. 환자-기원의 말초 혈액 기원의 1차 효과기 세포의 직접 조작과 비교하면, 본 명세서에 제공된 바와 같은 iPSC의 편집 및 분화를 통해서 게놈-조작된 유도체 세포를 수득하는 것의 다수의 이점은 하기를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다: 조작된 효과기 세포에 대한 무제한 공급원; 특히 다수의 조작된 양상이 관여할 때, 효과기 세포의 반복되는 조작에 대한 불필요; 수득된 효과기 세포가, 연장된 텔로미어를 갖고 탈진을 덜 겪어서 활기를 회복함; 효과기 세포 집단은 대부분 본 명세서에 제공된 바와 같은 조작된 iPSC의 가능한 클론성 선택으로 인해서 편집 부위, 카피수, 및 대립유전자 변이, 무작위 돌연변이 및 발현 변이의 결핍과 관련하여 균질함.
특정 실시 형태에서, 하나 이상의 선택된 부위에서 하나 이상의 표적화된 편집을 포함하는 게놈-조작된 iPSC은 페이트 유지 배지(Fate Maintenance Medium: FMM)로서 표 2에 나타낸 세포 배양 배지 중에서 연장된 기간 동안 단일 세포로서 유지, 계대배양 및 증폭되고, 여기서 iPSC는 선택된 부위(들)에서 표적화된 편집 및 기능성 변형을 보유한다. 배지의 성분은 표 2에 나타낸 최적의 범위 내의 양으로 배지 중에 존재할 수 있다. FMM 중에서 배양된 iPSC는 이의 미분화되고 바닥 또는 미감작인 프로파일; 배양물 세정 또는 선택이 필요 없는 게놈 안정성을 계속 유지시키는 것으로 나타났고; 배상체 또는 단일층(배상체의 형성 없음)을 통한 3개의 모든 체세포 계통, 시험관내 분화; 및 테라토마 형성에 의한 생체내 분화를 쉽게 일으킨다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2015/134652호를 참고하며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
[표 2]
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일부 실시 형태에서, 하나 이상의 표적화된 통합 및/또는 in/del을 포함하는 게놈-조작된 iPSC는 MEK 저해제, GSK 저해제 및 ROCK 저해제를 포함하고, TGFβ 수용체/ALK5 저해제가 없거나 본질적으로 없는 배지 중에서 유지, 계대배양 및 증폭되고, 여기서 iPSC는 선택된 부위에서 무손상이고 기능성 표적화된 편집을 보유한다.
본 발명의 또 다른 태양은 iPSC의 표적화 편집을 통해서; 또는 먼저 표적화 편집에 의해서 게놈-조작된 비-만능성 세포를 생성하고, 이어서 선택된/단리된 게놈-조작된 비-만능성 세포를 재프로그래밍하여 비-만능성 세포와 동일한 표적화 편집을 포함하는 iPSC를 수득함으로써 게놈-조작된 iPSC를 생성시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 추가 태양은 표적화된 통합 및/또는 표적화된 in/del을 세포에 도입함으로써 재프로그래밍을 병행하여 겪는 게놈-조작된 비-만능성 세포를 제공하며, 여기서 접촉된 비-만능성 세포는 재프로그래밍을 위해서 충분한 조건 하에 있고, 여기서 재프로그래밍을 위한 조건은 비-만능성 세포를 1종 이상의 재프로그래밍 인자 및 소분자와 접촉시키는 것을 포함한다. 동시 게놈-조작 및 재프로그래밍을 위한 방법의 다양한 실시 형태에서, 표적화된 통합 및/또는 표적화된 in/del은 비-만능성 세포를 1종 이상의 재프로그래밍 인자 및 선택적으로 하나 이상의 소분자와 접촉시킴으로써 재프로그래밍 개시 이전에, 또는 이것에 본질적으로 부수적으로 비-만능성 세포에 도입될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 병행하여 게놈-조작하고, 비-만능성 세포를 재프로그래밍하기 위해서, 표적화된 통합 및/또는 in/del은 또한 비-만능성 세포를 1종 이상의 재프로그래밍 인자 및 소분자와 접촉시킴으로써 재프로그래밍의 수 일 공정이 개시된 후에 비-만능성 세포에 도입될 수 있고, 여기서 작제물 보유 벡터는 재프로그래밍 세포가 SSEA4, Tra181 및 CD30을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 1종 이상의 내인성 만능성 유전자의 안정한 발현을 제시하기 전에 도입된다.
일부 실시 형태에서, 재프로그래밍은 비-만능성 세포를 적어도 하나의 재프로그래밍 인자 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제, MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제의 조합물(FRM; 표 2)과 접촉시킴으로써 개시된다. 일부 실시 형태에서, 상기 임의의 방법을 통해 생성된 게놈-조작된 iPSC는 MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제의 조합물(FMM; 표 2)을 포함하는 혼합물을 사용하여 추가로 유지 및 증폭된다.
게놈-조작된 iPSC를 생성시키는 상기 방법의 일부 실시 형태에서, 방법은 하나 이상의 표적화된 통합 및/또는 in/del을 PSC에 도입하여 표 1에 열거된 적어도 하나의 유전자형을 갖는 게놈-조작된 iPSC를 수득함으로써 iPSC를 게놈 조작하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 게놈-조작된 iPSC를 생성시키는 방법은 (a) 하나 이상의 표적화된 편집을 비-만능성 세포에 도입하여 선택된 부위에서 표적화된 통합 및/또는 in/del을 포함하는 게놈-조작된 비-만능성 세포를 수득하는 단계, 및 (b) 게놈-조작된 비-만능성 세포를 1종 이상의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제, MEK 저해제, GSK3 저해제 및/또는 ROCK 저해제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시켜 선택된 부위에서 표적화된 통합 및/또는 in/del을 포함하는 게놈-조작된 iPSC를 수득하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 게놈-조작된 iPSC를 생성시키는 방법은 (a) 비-만능성 세포를 1종 이상의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제, MEK 저해제, GSK3 저해제 및/또는 ROCK 저해제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시켜 비-만능성 세포의 재프로그래밍을 개시하는 단계; (b) 하나 이상의 표적화된 통합 및/또는 in/del을 게놈-조작을 위해서 재프로그래밍 비-만능성 세포에 도입하는 단계; 및 (c) 선택된 부위에서 표적화된 통합 및/또는 in/del을 포함하는 게놈-조작된 iPSC를 수득하는 단계를 포함한다. 상기 방법들 중 임의의 것은 게놈-조작된 iPSC의 단일 세포 분류를 추가로 포함하여 클론성 iPSC를 수득할 수 있다. 게놈-조작된 iPSC의 클론성 증폭을 통해, 본 명세서에 제공된 바와 같은 적어도 하나의 표현형을 갖는, 단일 세포 분류 및 증폭된 클론성의 조작된 iPSC를 포함하는 마스터 세포 뱅크가 생성된다. 마스터 세포 뱅크는 후속으로 동결보존되어, 추가의 iPSC 조작을 위한 플랫폼, 및 오프-더-쉘프, 조작된, 균질한 세포 요법 제품의 제조를 위한 재생 가능한 공급원을 제공하는데, 이러한 제품은 조성이 명확하고 균일하고, 비용-효과적인 방식으로 상당한 규모로 대량 생산될 수 있다.
재프로그래밍 인자는, 개시내용이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 특허 출원 공개 WO2015/134652호 및 WO2017/066634호에 개시된 바와 같이, OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3, L1TD1 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 1종 이상의 재프로그래밍 인자는 폴리펩타이드의 형태일 수 있다. 재프로그래밍 인자는 또한 재프로그래밍 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 형태일 수 있고, 따라서 벡터, 예컨대 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 에피솜, 플라스미드 및 미니-서클에 의해서 비-만능성 세포에 도입될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 적어도 하나의 재프로그래밍 인자를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 렌티바이러스 벡터에 의해서 도입된다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 에피솜 벡터에 의해서 도입된다. 다양한 다른 실시 형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 센다이 바이러스 벡터에 의해서 도입된다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 플라스미드의 조합물에 의해서 도입된다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2019/075057A1호를 참고하며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
일부 실시 형태에서, 비-만능성 세포는 동일하거나 또는 상이한 선택된 부위에서 표적화된 통합을 위해서 다수의 벡터에 의해서 상이한 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 다수의 작제물 및/또는 상이한 프로모터가 형질주입된다. 이러한 외인성 폴리뉴클레오타이드는 자살 유전자, 또는 표적화 양상을 암호화하는 유전자, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보, 또는 iPSC 또는 이로부터의 유도체 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자가-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 외인성 폴리뉴클레오타이드는 siRNA, shRNA, miRNA 및 안티센스 핵산을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 RNA를 암호화한다. 이들 외인성 폴리뉴클레오타이드는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 일시적-특이적 프로모터, 및 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로모터에 의해서 유도될 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드는 프로모터를 활성화시키는 조건 하에 있는 경우, 예를 들어 유도제의 존재 하에서 또는 특정 분화된 세포 유형 내에서 발현성이다. 일부 실시 형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 iPSC에서 그리고/또는 iPSC로부터 분화된 세포에서 발현된다. 일 실시 형태에서, 하나 이상의 자살 유전자는 구성적 프로모터, 예를 들어 CAG에 의해서 유도된 카스파제-9에 의해서 유도된다. 이들 상이한 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물 및/또는 상이한 프로모터는 비-만능성 세포로 동시에 또는 연속적으로 형질주입될 수 있다. 다수의 작제물의 표적화된 통합을 거친 비-만능성 세포는 1종 이상의 재프로그래밍 인자를 동시에 접촉하여 게놈 조작과 병행하여 재프로그래밍을 개시하여, 세포의 동일한 풀 중에서 다수의 표적화된 통합을 포함할 수 있는 게놈-조작된 iPSC를 수득할 수 있다. 이와 같이, 이러한 견고한 방법은 동시 재프로그래밍 및 조작 전략을 가능하게 하여 하나 이상의 선택된 표적 부위 내에 통합된 다수의 양상을 갖는 클론성 게놈 조작된 iPSC를 유도한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물을 사용하여 수득된 게놈 변형된 iPSC 및 이의 유도체 세포는 표 1에 열거된 적어도 하나의 유전자형을 포함한다.
IV. 게놈-조작된 iPSC를 분화시킴으로써 합성 효과기 세포를 수득하는 방법
본 발명의 추가 태양은 테라토마 형성에 의한 게놈-조작된 iPSC의 생체내 분화 방법을 제공하며, 여기서 게놈-조작된 iPSC로부터 생체내에서 유래된 분화된 세포는 목적하는 부위(들)에서 표적화된 통합(들) 및/또는 in/del을 비롯한 무손상 및 기능성 표적화된 편집을 보유한다. 일부 실시 형태에서, 테라토마 형성을 통해서 게놈-조작된 iPSC로부터 생체내에서 유래된 분화된 세포는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, CD38, GAPDH, TCR 또는 RUNX1, 또는 게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 다른 유전자좌를 포함하는 하나 이상의 목적하는 부위에서 통합된 하나 이상의 유도성 자살 유전자를 포함한다. 일부 다른 실시 형태에서, 테라토마 형성을 통해서 게놈-조작된 iPSC로부터 생체내에서 유래된 분화된 세포는 표적화 양상을 암호화하거나, 또는 줄기세포 및/또는 전구 세포의 수송, 귀소, 생존도, 자가-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 유도성 자살 유전자를 포함하는 테라토마 형성을 통해서 게놈-조작된 iPSC로부터 생체내에서 유래된 분화된 세포는 면역 반응 조절 및 매개와 연관된 내인성 유전자 내에 하나 이상의 in/del을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, in/del은 1종 이상의 내인성 면역관문 유전자 내에 포함된다. 일부 실시 형태에서, in/del은 1종 이상의 내인성 T 세포 수용체 유전자 내에 포함된다. 일부 실시 형태에서, in/del은 1종 이상의 내인성 MHC 클래스 I 억제인자 유전자 내에 포함된다. 일부 실시 형태에서, in/del은 주요 조직적합성 복합체와 연관된 1종 이상의 내인성 유전자 내에 포함된다. 일부 실시 형태에서, in/del은, AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD44, CD54, CD56, CD58, CD69, CD71, OX40, 4-1BB, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, 및 TIGIT를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 내인성 유전자 내에 포함된다. 일 실시 형태에서, 선택된 부위(들)에서 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 게놈-조작된 iPSC는 B2M(베타-2-마이크로글로불린) 암호화 유전자에서 표적화된 편집을 추가로 포함한다.
특정 실시 형태에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 하나 이상의 유전자 변형을 포함하는 게놈-조작된 iPSC는 시험관내에서 조혈 세포 계통 또는 임의의 다른 특이적 세포 유형을 유래시키는 데 사용되며, 여기서, 유래된 비-만능성 세포는 선택된 부위(들)에서 표적화된 편집을 포함하는 기능성 유전자 변형을 보유한다. 일부 실시 형태에서, 조혈 세포 계통 또는 임의의 다른 특정 세포 유형을 시험관내에서 유도하는 데 사용되는 게놈-조작된 iPSC는, 동결보존되고 사용 직전에 해동된 마스터 세포 뱅크 세포이다. 일 실시 형태에서, 게놈-조작된 iPSC-유래된 세포는 확정적 조혈 내피세포(HE) 가능성을 갖는 중배엽 세포, 확정적 HE, CD34 조혈 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구체(MPP), T 세포 전구체, NK 세포 전구체, 골수성 세포, 호중구 전구세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 호중구, 수지상 세포 및 대식세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않으며, 여기서 게놈-조작된 iPSC로부터 유래된 이들 세포는 목적하는 부위(들)에서 표적화된 편집을 포함하는 기능성 유전자 변형을 보유한다.
iPSC-유래된 조혈 세포 계통을 수득하기 위한 적용 가능한 분화 방법 및 조성물은, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 WO2017/078807호에 기재된 것들을 포함하며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. 제공된 바와 같이, 조혈 세포 계통을 생성시키는 방법 및 조성물은 EB 형성이 필요 없는 무-혈청, 피더-무함유 및/또는 기질-무함유 조건 하에서 그리고 플랫폼을 배양하는 증폭 가능한 단일층에서의 iPSC를 비롯한, 만능성 줄기세포로부터 유래된 확정적 조혈 내피세포(HE)를 통한 것이다. 제공된 방법에 따라서 분화될 수 있는 세포는 만능성 줄기세포로부터 특히 말단 분화된 세포 및 교차분화된 세포, 만능성 중간체를 통하지 않는 조혈 운명으로 직접 전이되는 다양한 계통의 세포에 수임된 전구 세포까지의 범위이다. 유사하게, 줄기세포의 분화에 의해서 생산된 세포는 다능성 줄기 또는 전구 세포로부터 말단 분화된 세포, 및 모든 그 사이의 조혈 세포 계통까지의 범위이다.
단일층 배양물 중의 만능성 줄기세포로부터 조혈 계통의 세포를 분화 및 증폭시키는 방법은 만능성 줄기세포를 BMP 경로 활성자, 및 선택적으로, bFGF와 접촉시키는 단계를 포함한다. 제공된 바와 같이, 만능성 줄기세포-유래된 중배엽 세포는 만능성 줄기세포로부터 배상체를 형성하지 않고 수득 및 증폭된다. 이어서 중배엽 세포를 BMP 경로 활성자, bFGF 및 WNT 경로 활성자와의 접촉에 적용하여 만능성 줄기세포로부터 배상체를 형성하지 않고 확정적 조혈 내피세포(HE) 가능성을 갖는 증폭된 중배엽 세포를 수득한다. bFGF, 및 선택적으로, ROCK 저해제 및/또는 WNT 경로 활성자와의 후속 접촉에 의해서, 확정적 HE 가능성을 갖는 중배엽 세포는 확정적 HE 세포로 분화되고, 이것은 분화 동안 증폭된다.
조혈 계통의 세포를 수득하기 위한 본 명세서에 제공된 방법은 EB-매개된 만능성 줄기세포 분화보다 우수한데, 그 이유는 EB 형성은 보통 최소 세포 증폭으로 이어지고, 집단에서 세포의 균질한 증폭 및 균질한 분화가 요구되는 다수의 응용에 중요한 단일층 배양물을 허용하지 않고, 힘들고, 낮은 효율이기 때문이다.
제공된 단일층 분화 플랫폼은 조혈 줄기세포 및 분화된 자손, 예컨대 T, B, NKT 및 NK 세포를 유도하는 확정적 조혈 내피세포로의 분화를 가능하게 한다. 단일층 분화 전략은 향상된 분화 효율과 대규모 증폭을 조합하며, 다양한 치료적 응용을 위한 만능성 줄기세포-유래된 조혈 세포의 치료적으로 관련된 수의 전달을 가능하게 한다. 추가로, 본 명세서에 제공된 방법을 사용하는 단일층 배양은 전체 범위의 시험관내 분화, 생체외 조절, 및 생체내 장기간 조혈 자가-재생, 재구성 및 생착을 가능하게 하는 기능성 조혈 계통 세포로 이어진다. 제공된 바와 같이, iPSC-유래된 조혈 계통 세포는 확정적 조혈 내피세포, 조혈 다능성 전구 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포 및 호중구를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
따라서, 다양한 실시 형태에서, 만능성 줄기세포의 확정적 조혈 계통의 세포로의 분화를 유도하는 방법은 하기를 포함한다: (i) 만능성 줄기세포를 BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 조성물과 접촉시켜, 만능성 줄기세포로부터 중배엽 세포의 분화 및 증폭을 개시하는 단계; (ii) 중배엽 세포를 BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시켜(여기서 조성물에는 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없음), 중배엽 세포로부터 확정적 HE 가능성을 갖는 중배엽 세포의 분화 증폭을 개시하는 단계; (iii) 확정적 HE 가능성을 갖는 중배엽 세포를 ROCK 저해제; bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6, 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로, Wnt 경로 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시켜(여기서 조성물에는 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없음), 확정적 조혈 내피세포 가능성을 갖는 만능성 줄기세포-유래된 중배엽 세포로부터의 확정적 조혈 내피세포의 분화 및 증폭을 개시하는 단계.
일부 실시 형태에서, 방법은 만능성 줄기세포를 MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시켜(여기서 조성물은 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없음), 만능성 줄기세포를 시딩 및 증폭시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 만능성 줄기세포는 iPSC, 또는 미감작 iPSC, 또는 하나 이상의 유전자 각인을 포함하는 iPSC; 및 iPSC 내에 포함된 하나 이상의 유전자 각인은 그로부터 분화된 조혈 세포에서 보유된다. 만능성 줄기세포의 조혈 계통의 세포로의 유도를 위한 상기 방법의 일부 실시 형태에서, 만능성 줄기세포의 조혈 계통의 세포로의 분화는 배상체의 생성이 없고, 단일층 배양 형태이다.
상기 방법의 일부 실시 형태에서, 수득된 만능성 줄기세포-유래된 확정적 조혈 내피 세포는 CD34+이다. 일부 실시 형태에서, 수득된 확정적 조혈 내피 세포는 CD34+CD43-이다. 일부 실시 형태에서, 확정적 조혈 내피 세포는 CD34+CD43-CXCR4-CD73-이다. 일부 실시 형태에서, 확정적 조혈 내피 세포는 CD34+ CXCR4-CD73-이다. 일부 실시 형태에서, 확정적 조혈 내피 세포는 CD34+CD43-CD93-이다. 일부 실시 형태에서, 확정적 조혈 내피 세포는 CD34+CD93-이다.
상기 방법의 일부 실시 형태에서, 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다: (i) 만능성 줄기세포-유래된 확정적 조혈 내피세포를 ROCK 저해제; VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시켜, 확정적 조혈 내피세포의 프리-T 세포 전구체(pre-T cell progenitor)로의 분화를 개시하는 단계; 및 선택적으로, (ii) 프리-T 세포 전구체를 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하지만, VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없는 조성물과 접촉시켜, 프리-T 세포 전구체의 T 세포 전구체 또는 T 세포로의 분화를 개시하는 단계.
상기 방법의 일부 실시 형태에서, 만능성 줄기세포-유래된 T 세포 전구체는 CD34+CD45+CD7+이다. 상기 방법의 일부 실시 형태에서, 만능성 줄기세포-유래된 T 세포 전구체는 CD45+CD7+이다.
만능성 줄기세포의 조혈 계통의 세포로의 분화를 유도를 위한 상기 방법의 추가의 일부 실시 형태에서, 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다: (i) 만능성 줄기세포-유래된 확정적 조혈 내피세포를 ROCK 저해제; VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7, 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로, BMP 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시켜, 확정적 조혈 내피세포의 프리-NK 세포 전구체로의 분화를 개시하는 단계; 및 선택적으로, (ii) 만능성 줄기세포-유래된 프리-NK 세포 전구체를 SCF, Flt3L, IL3, IL7, 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하는 조성물과 접촉시켜(여기서 배지에는 VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없음), 프리-NK 세포 전구체의 NK 세포 전구체 또는 NK 세포로의 분화를 개시하는 단계. 일부 실시 형태에서, 만능성 줄기세포-유래된 NK 전구체는 CD3-CD45+CD56+CD7+이다. 일부 실시 형태에서, 만능성 줄기세포-유래된 NK 세포는 CD3-CD45+CD56+이고, 선택적으로 NKp46+, CD57+ 및 CD16+인 것으로 추가로 정의된다.
따라서, 상기 분화 방법을 사용하면, 다음과 같은 iPSC-유래된 조혈 세포의 하나 이상의 집단을 수득할 수 있다: (i) iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2, 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하는 경우, CD34+ HE 세포(iCD34); (ii) iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2, 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하는 경우, 확정적 조혈 내피세포(iHE); iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2, 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하는 경우, 확정적 HSC; (iv) iMPP-A를 사용하는 경우, 다능성 전구 세포(iMPP); (v) iTC-A2 및 iTC-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하는 경우, T 세포 전구체(i프로-T); (vi) iTC-B2를 사용하는 경우, T 세포(iTC); (vii) iNK-A2 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하는 경우, NK 세포 전구체(i프로-NK); 및/또는 (viii) NK 세포(iNK), 및 iNK-B2. 일부 실시 형태에서, 배지는 다음과 같다:
a. iCD34-C는 ROCK 저해제, bFGF, VEGF, SCF, IL6, IL11, IGF, 및 EPO로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장 인자 및 사이토카인, 및 선택적으로, Wnt 경로 활성자를 포함하고; TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없고;
b. iMPP-A는 BMP 활성자, ROCK 저해제, 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하고;
c. iTC-A2는ROCK 저해제; SCF, Flt3L, TPO, 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로, BMP 활성자를 포함하고;
d. iTC-B2는 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하고;
e. iNK-A2는 ROCK 저해제, 및 SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로, BMP 활성자를 포함하고;
f. iNK-B2는 SCF, Flt3L, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 방법으로부터 수득된 게놈-조작된 iPSC-유래된 세포는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD44, CD54, CD56, CD58, CD69, CD71, OX40, 4-1BB, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, 및 TIGIT, 또는 게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 다른 유전자좌를 포함하는 하나 이상의 목적하는 통합 부위에 통합된 1종 이상의 유도성 자살 유전자를 포함한다. 일부 다른 실시 형태에서, 게놈-조작된 iPSC-유래된 세포는 안전 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보, 또는 줄기세포 및/또는 전구 세포의 수송, 귀소, 생존도, 자가-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 자살 유전자를 포함하는 게놈-조작된 iPSC-유래된 세포는 면역관문 유전자, 내인성 T 세포 수용체 유전자, 및 MHC 클래스 I 억제인자 유전자를 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 면역 반응 조절 및 매개와 연관된 1종 이상의 내인성 유전자 내에 포함된 하나 이상의 in/del을 추가로 포함한다. 일 실시 형태에서, 하나 이상의 자살 유전자를 포함하는 게놈-조작된 iPSC-유래된 세포는 B2M 유전자 내에 in/del을 추가로 포함하고, 여기서 B2M이 녹아웃된다.
추가로, 제1 운명의 게놈-조작된 조혈 세포를 제2 운명의 게놈-조작된 조혈 세포로 얻기 위한 적용 가능한 탈분화 방법 및 조성물은 예를 들어, 개시내용이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 특허 출원 공개 WO2011/159726호에 설명된 것을 포함한다. 그것에 제공된 방법 및 조성물은 재프로그래밍 동안 내인성 Nanog 유전자의 발현을 제한하고; 비-만능성 중간 세포를 중간 세포의 목적하는 세포 유형으로의 분화를 위한 조건에 적용함으로써 출발 비-만능성 세포를 비-만능성 중간 세포로 부분적으로 재프로그래밍하는 것을 허용한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 수득된 게놈 변형된 iPSC 및 이의 유도체 세포는 표 1에 열거된 적어도 하나의 유전자형을 포함한다.
V. 유전자 조작된 iPSC로부터 분화된, 조합된 합성 효과기 세포 유형들의 치료적 용도
일부 실시 형태에서, 본 발명은 2가지 이상의 합성 효과기 세포 유형 또는 상이한 합성 효과기 세포 유형들의 2개 이상의 집단을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 합성 효과기 세포 각각은 개시된 바와 같은 방법 및 조성물을 사용하여 게놈 조작된 iPSC로부터 분화되었다. 일부 실시 형태에서, 조작된 iPSC는, iPSC-유래된 효과기 세포에 보유 가능하여, 그 결과 향상된 기능성 양상을 갖는 합성 효과기 세포를 생성하는, 하나 이상의 표적화된 유전자 편집을 포함하며, 여기서 유전자 조작된 iPSC 및 유도체 합성 효과기 세포는 세포 기반 입양 요법에 적합하다. 일 실시 형태에서, 향상된 합성 효과기 세포는 iPSC-유래된 CD34 세포를 포함한다. 일 실시 형태에서, 향상된 합성 효과기 세포는 iPSC-유래된 HSC 세포를 포함한다. 일 실시 형태에서, 향상된 합성 효과기 세포는 iPSC-유래된 프로T 또는 T 세포를 포함한다. 일 실시 형태에서, 향상된 합성 효과기 세포는 iPSC-유래된 프로NK 또는 NK 세포를 포함한다. 일 실시 형태에서, 향상된 합성 효과기 세포는 iPSC-유래된 면역 조절 세포 또는 골수계-유래된 억제인자 세포(MDSC)를 포함한다.
일부 실시 형태에서, iPSC-유래된 향상된 합성 효과기 세포는 개선된 치료 가능성을 위해서 생체외에서 추가로 조절된다. 일 실시 형태에서, iPSC로부터 유래된 향상된 합성 효과기의 단리된 집단들 또는 하위집단들 중 하나는 미감작 T 세포, 줄기세포 기억 T 세포 및/또는 중앙 기억 T 세포의 증가된 수 또는 비를 포함한다. 일 실시 형태에서, iPSC로부터 유래된 향상된 합성 효과기의 단리된 집단들 또는 하위집단들 중 하나는 I형 NKT 세포의 증가된 수 또는 비를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, iPSC로부터 유래된 향상된 합성 효과기의 단리된 집단들 또는 하위집단들 중 하나는 적응 NK 세포의 증가된 수 또는 비를 포함한다. 일부 실시 형태에서, iPSC로부터 유래된 향상된 합성 CD34 세포, HSC 세포, T 세포, NK 세포 또는 골수계 유래된 억제인자 세포의 단리된 집단들 또는 하위집단들 중 적어도 하나는 동종이계이다. 일부 다른 실시 형태에서, iPSC로부터 유래된 향상된 합성 CD34 세포, HSC 세포, T 세포, NK 세포 또는 MDSC의 단리된 집단들 또는 하위집단들 중 적어도 하나는 동종이계이다.
2가지 이상의 합성 효과기 세포 유형 또는 상이한 합성 효과기 세포 유형들의 2개 이상의 집단을 포함하고, 여기서 합성 효과기 세포 각각은 게놈 조작된 iPSC로부터 분화된, 조성물의 일부 실시 형태에서, 제1 유형의 합성 효과기 세포는 기능적으로 향상된 iPSC-유래된 T 세포이고, 제2 유형의 합성 효과기 세포는 기능적으로 향상된 iPSC-유래된 NK 세포이다. 일부 실시 형태에서, 기능적으로 향상된 iPSC-유래된 T 세포는 적어도 제1 CAR을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 기능적으로 향상된 iPSC-유래된 NK 세포는 적어도 제2 CAR과, CD16 변이체 및 부분 또는 전장의 외인성 세포 표면 발현된 사이토카인 및/또는 이의 수용체 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 2가지 상이한 유형의 합성 효과기 세포는 2개의 별개의 집단으로 존재한다. 일부 실시 형태에서, 합성 효과기 세포의 2개의 별개의 집단은 혼합 집단으로 조합된다(즉, 2개의 집단은 혼합된다).
일부 실시 형태에서, 분화를 위한 iPSC는 유래된 효과기 세포에서 목적하는 치료적 속성을 전달하도록 선택된 추가의 유전자 각인을 포함하되, 분화 동안 세포 발달 생물학이 파괴되지 않고, 유전자 각인이 상기 iPSC로부터 유래된 분화된 조혈 세포에서 보유되고 기능성이어야 한다.
일부 실시 형태에서, 만능성 줄기세포의 유전자 각인은 (i) 비-만능성 세포를 iPSC로 재프로그래밍하는 동안 또는 그 후에 만능성 세포의 게놈에서 게놈 삽입, 결실 또는 치환을 통해 획득된 하나 이상의 유전자 변형된 양상; 또는 (ii) 공여자-, 질환- 또는 치료 반응-특이적인, 공급원 특이적 면역 세포의 하나 이상의 보유 가능한 치료적 속성을 포함하며, 여기서 만능성 세포는 공급원 특이적 면역 세포로부터 재프로그래밍되고, iPSC는 공급원 치료적 속성을 보유하며, 이는 또한 iPSC-유래된 조혈 계통 세포 내에 포함된다.
일부 실시 형태에서, 유전자 변형된 양상은 하기 중 하나 이상을 포함한다: 안전 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보, 또는 iPSC 또는 이로부터의 유도체 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자가-재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 및/또는 생존을 촉진하는 단백질.
추가의 일부 다른 실시 형태에서, iPSC-유래된 조혈 계통 세포는 하기 중 적어도 2개의 조합과 관련된 공급원 특이적 면역 세포의 치료적 속성을 포함한다: (i) 하나 이상의 항원 표적화 수용체의 발현; (ii) 변형된 HLA; (iii) 종양 미세환경에 대한 저항성; (iv) 방관자 면역 세포의 동원 및 면역 조정; (iv) 감소된 종양-이탈 효과와 함께 개선된 표적-적중 특이성; 및 (v) 개선된 귀소, 지속성, 세포독성, 또는 항원 탈출 구제.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 합성 효과기 세포 및/또는 합성 효과기 세포의 제1 및 제2 집단을 포함하는 조성물은 다양한 질환을 치료하고/하거나 호전시키는 데 유용하다. 본 명세서에 제공된 바와 같은 조성물을 사용하여 대상체를 치료하는 방법의 일 실시 형태에서, 상기 방법은 iPSC-유래된 NK 세포를 포함하는 제1 합성 세포 집단을 투여하는 단계로서, 여기서 iPSC-유래된 NK 세포는, (a) 고 친화도 비-절단성 CD16(hnCD16) 또는 이의 변이체; 및 (b) 제1 키메라 항원 수용체(CAR), 및 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 또는 전장 펩타이드 중 하나 또는 둘 다를 포함하는, 상기 단계; 및 iPSC-유래된 T 세포를 포함하는 제2 합성 세포 집단을 대상체에게 투여하는 단계로서, 여기서 iPSC-유래된 T 세포는 적어도 제2 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하며, 제2 CAR은 상기 TCR 유전자좌의 내인성 프로모터의 제어 하에서 발현되고, 제1 CAR과 제2 CAR은 동일하거나 상이한 표적화 특이성을 갖는, 상기 단계를 포함한다. 개시된 바와 같이, 이 방법은 많은 다른 이점들 중에서, 세포독성에서의 지속적인 반응, 다중-항원 표적화를 제공하며, 종양 항원 탈출을 극복하는 데 효과적이고, 다수의 적응증에서의 다양한 적용을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 iPSC-유래된 조혈 세포 및 상기 세포는 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18 또는 IL21 또는 이들의 임의의 변형된 단백질을 포함하는 적어도 하나의 사이토카인 및/또는 이의 수용체를 발현하고, 적어도 CAR을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 사이토카인(들) 및 CAR(들)의 조작된 발현은 NK 세포 특이적이다. 일부 다른 실시 형태에서, 사이토카인(들) 및 CAR(들)의 조작된 발현은 T 세포 특이적이다. 일 실시 형태에서, 유도체 조혈 세포의 CAR은 CD19, BCMA, CD20, CD22, CD38, CD123, HER2, CD52, EGFR, GD2 및 PDL1 항원 중 임의의 하나를 인식하는 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항원 특이적 iPSC-유래된 효과기 세포는 액체 종양을 표적으로 한다. 일부 실시 형태에서, 항원 특이적 iPSC-유래된 효과기 세포는 고형 종양/암을 표적으로 한다. 일부 실시 형태에서, 항원 특이적 iPSC-유래된 효과기 세포는 종양 항원 탈출을 구제할 수 있다.
입양 세포 요법에 적합한 대상체에게 본 발명의 2가지 이상의 유형의 합성 효과기 세포를 도입함으로써 다양한 질환이 치료 및/또는 호전될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 2가지 이상의 유형의 iPSC-유래된 조혈 세포가 동종이계 입양 세포 요법에 제공된다. 추가로, 일부 실시 형태에서, 본 발명은 입양 세포 요법에 적합한 대상체에게 2가지 이상의 유형의 iPSC-유래된 효과기 세포를 포함하는 조성물을 도입함으로써 상기 치료 조성물의 치료적 용도를 제공하며, 여기서 대상체는 자가면역 장애; 혈액 악성종양; 고형 종양; 또는 HIV, RSV, EBV, CMV, 아데노바이러스, 또는 BK 폴리오마바이러스와 연관된 감염을 갖는다.
혈액 악성종양의 예는 급성 및 만성 백혈병(급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 만성 골수성 백혈병(CML), 림프종, 비호지킨 림프종(NHL), 호지킨병, 다발성 골수종 및 골수이형성 증후군을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 고형 암의 예는 뇌, 전립선, 유방, 폐, 결장, 자궁, 피부, 간, 뼈, 췌장, 난소, 고환, 방광, 신장, 머리, 목, 위, 자궁경부, 직장, 후두 및 식도의 암을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 다양한 자가면역 장애의 예는 질환의 예는 원형 탈모증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 피부근육염, 당뇨병(1형), 일부 형태의 소아 특발성 관절염, 사구체신염, 그레이브스병(Graves' disease), 길랑-바레 증후군(Guillain-
Figure pct00004
syndrome), 특발성 혈소판 감소성 자반증, 중증 근무력증, 일부 형태의 심근염, 다발성 경화증, 천포창/유사천포창, 악성빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발근육염, 원발성 담즙성 간병변, 건선, 류마티스 관절염, 피부경화증/전신 경화증, 쇼그렌 증후군(
Figure pct00005
syndrome), 전신성 홍반성 낭창, 일부 형태의 갑상선염, 일부 형태의 포도막염, 백반증, 다발혈관염 육아종증(베게너 육아종증)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않다. 바이러스 감염의 예는 HIV(인간 면역결핍 바이러스), HSV(단순 포진 바이러스), KSHV(카포시 육종-연관 허피스바이러스), RSV(호흡기 세포융합 바이러스), EBV(엡스타인-바르 바이러스), CMV(사이토메갈로바이러스), VZV(수두 대상 포진 바이러스), 아데노바이러스-, 렌티바이러스-, BK 폴리오마바이러스-연관 장애를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 2가지 이상의 유형의 iPSC-유래된 조혈 계통 세포를 포함하는 조성물을 사용한 치료는 증상 제시 시에, 또는 재발 방지 또는 치료를 위해 수행될 수 있다. 용어 "치료하는", "치료" 등은 일반적으로 목적으로 하는 약리학적 및/또는 생리적 효과를 얻는 것을 의미하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 효과는 질환을 완전히 또는 부분적으로 방지한다는 면에서 예방적일 수 있고/있거나 질환 및/또는 질환에 기여하는 유해 효과에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 면에서 치료적일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "치료"는 대상체에서 질환의 임의의 개입을 포괄하며, 질환의 성향이 있을 수 있지만, 아직 그것이 있는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환이 생기는 것을 방지하는 것; 질환을 저해하는 것, 즉, 그의 발생을 저지하는 것; 또는 질환을 없애는 것, 즉, 질환의 퇴행을 야기하는 것을 포함한다. 2가지 이상의 유형의 iPSC-유래된 조혈 계통 세포를 포함하는 조성물은 질환 또는 손상의 발병 전에, 동안에 또는 후에 투여될 수 있다. 치료가 환자의 바람직하지 않은 임상 증상을 안정화시키거나 또는 감소시키는 경우 진행 중인 질환의 치료가 또한 특정 관심 대상이 된다. 특정 실시 형태에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 세포 요법에 의해서 적어도 하나의 연관된 증상이 포함, 개선 및/또는 향상될 수 있는 질환, 병태 및/또는 손상을 갖는다. 특정 실시 형태는 세포 요법이 필요한 대상체가 골수 또는 줄기세포 이식을 위한 후보, 화학요법 또는 방사선 조사 요법을 받은 대상체, 과증식성 장애 또는 암, 예를 들어, 조혈계의 과증식성 장애 또는 암을 갖거나 또는 가질 위험에 있는 대상체, 종양, 예를 들어, 고형 종양이 있거나 또는 발생할 위험에 있는 대상체, 바이러스 감염 또는 바이러스 감염과 관련된 질환을 갖거나 또는 가질 위험에 있는 대상체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다는 것을 고려한다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 2가지 이상의 유형의 iPSC-유래된 조혈 계통 세포를 포함하는 조성물에 의한 치료에 대한 반응을 평가하는 경우, 반응은 하기 중 적어도 하나를 포함하는 기준에 의해서 측정될 수 있다: 임상 유익비, 사망까지의 생존, 병리학적 완전 반응, 병리학적 반응의 반-정량적 측정, 임상적 완전 관해, 임상적 부분적 관해, 임상적으로 안정적인 질환, 재발이 없는 생존, 무전이 생존, 무질환 생존, 순환 종양 세포 감소, 순환 마커 반응 및 RECIST(Response Evaluation Criteria In Solid Tumors) 기준.
본 명세서에 개시된 바와 같은 2가지 이상의 유형의 iPSC-유래된 조혈 계통 세포를 포함하는 치료 조성물은 다른 치료 전, 동안, 및/또는 후에 대상체에게 투여될 수 있다. 이와 같이, 조합 요법의 방법이 제공되며, 상기 방법은 추가의 치료제의 사용 전, 동안, 및/또는 후에 2가지 이상의 iPSC-유래된 효과기 세포 유형의 투여 또는 제조를 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 조성물은 게놈 조작된 iPSC로부터 유래된 2가지 이상의 합성 효과기 세포 유형을 포함하며, 여기서 조성물은 iPSC-유래된 NK 세포, iPSC-유래된 T 세포, iPSC-유래된 CD34+ HE 세포, iPSC-유래된 HSC, iPSC-유래된 NKT 세포, iPSC-유래된 B 세포, iPSC-유래된 T 전구체, iPSC-유래된 NK 전구체, 및 iPSC-유래된 MDSC 중 적어도 하나 또는 둘 이상을 포함하며, 이들 세포는 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 2가지 이상의 유형의 iPSC-유래된 조혈 계통 세포를 포함하는 조성물은 정맥내, 복막내, 장내 또는 기관 투여 방법에 의해 병행적으로 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 2가지 유형의 유도체 효과기 세포가 병행적으로 투여될 때, 각 세포 유형은 그 각각의 별개의 집단으로 존재하거나, 또는 2가지 유형의 유도체 효과기 세포는 하나의 혼합 집단으로 투여된다. 일부 실시 형태에서, 조성물의 각 집단은 목적하는 치료 목적을 달성하기 위해 1종 이상의 적합한 치료제와 병행적으로 또는 연속적으로 투여된다.
상기에 제공된 바와 같이, 하나 이상의 추가의 치료제는 펩타이드, 사이토카인, 면역관문 저해제, 미토겐, 성장 인자, 작은 RNA, dsRNA(이중 가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 피더 세포, 피더 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 고려되는 하나 이상의 폴리핵산을 포함하는 벡터, 항체, 화학치료제, 또는 방사성 모이어티, 또는 면역조절 약물(IMiD)을 포함한다. 면역조절 약물(IMiD), 예를 들어, 탈리도마이드, 레날리도마이드 및 포말리도마이드는 NK 세포와 T 세포를 둘 다 자극한다. 본 명세서에 제공된 바와 같이, IMiD는 암 치료를 위해서 iPSC-유래된 치료 효과기 세포와 함께 사용될 수 있다.
2가지 이상의 유형의 iPSC-유래된 효과기 세포의 투여는 추가의 치료제의 투여로부터 수 시간, 수 일 또는 심지어 수 주만큼 시간적으로 분리될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 투여는 다른 생물학적 활성제 또는 양상, 예를 들어 비제한적으로, 항신생물제, 또는 비-약물 요법, 예컨대 수술과 조합될 수 있다.
조합 세포 요법의 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 제공된 2가지 이상의 유형의 iPSC-유래된 조혈 계통 세포를 포함하는 치료 조성물은 항체 또는 항체 단편인 추가의 치료제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 단클론성 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 인간화된 항체, 인간화된 단클론성 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항체 또는 항체 단편은 바이러스 항원에 특이적으로 결합한다. 다른 실시 형태에서, 항체 또는 항체 단편은 종양 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 종양 또는 바이러스 특이적 항원은 이의 살해 능력을 향상시키기 위해 투여된 iPSC-유래된 조혈 계통 세포를 활성화시킨다. 일부 실시 형태에서, 투여된 iPSC-유래된 조혈 계통 세포에 추가의 치료제로서 조합 치료에 적합한 항체는 항-CD20(예를 들어, 리툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 유블리툭시맙, 오카라투주맙, 오비누투주맙, 이브리투모맙, 오크렐리주맙), 항-CD22(이노투주맙, 목세투모맙, 에프라투주맙), 항-HER2(예를 들어, 트라스투주맙, 퍼투주맙), 항-CD52(예를 들어, 알렘투주맙), 항-EGFR(예를 들어, 서툭시맙), 항-GD2(예를 들어, 디누툭시맙), 항-PDL1(예를 들어, 아벨루맙), 항-CD38(예를 들어, 다라투무맙, 이사툭시맙, MOR202), 항-CD123(예를 들어, 7G3, CSL362), 항-SLAMF7(엘로투주맙) 및 이들의 인간화된 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편 또는 이들의 기능성 등가물 또는 바이오시밀러를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시 형태에서, 추가 치료제는 1종 이상의 면역관문 저해제를 포함한다. 면역관문은 저해되지 않을 때 면역 반응을 억제 또는 하향조절할 수 있는 세포 분자, 종종 세포 표면 분자이다. 면역관문 저해제는 면역관문 유전자 발현 또는 유전자 생성물을 감소시킬 수 있거나 면역관문 분자의 활성을 감소시킬 수 있는 길항제이다. 본 명세서에 제공된 유도체 효과기 세포와의 조합 요법에 적합한 면역관문 저해제는 PD-1(Pdcdl, CD279), PDL-1(CD274), TIM-3(Havcr2), TIGIT(WUCAM 및 Vst㎥), LAG-3(Lag3, CD223), CTLA-4(Ctla4, CD152), 2B4(CD244), 4-1BB(CD137), 4-1BBL(CD137L), A2AR, BATE, BTLA, CD39(Entpdl), CD47, CD73(NT5E), CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2(Pou2f2), 레티노산 수용체 알파(Rara), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 및 저해성 KIR(예를 들어, 2DL1, 2DL2, 2DL3, 3DL1 및 3DL2)의 길항제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
제공된 2가지 이상의 유형의 유도체 효과기 세포를 포함하는 조합 요법의 일부 실시 형태는 면역관문 분자를 표적으로 하는 적어도 1종의 저해제를 추가로 포함한다. 제공된 2가지 이상의 유형의 유도체 효과기 세포와의 조합 요법의 일부 다른 실시 형태는 2종, 3종 또는 그 초과의 면역관문 분자가 표적화되도록 2종, 3종 또는 그 초과의 저해제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조합 요법을 위한 2가지 유형의 효과기 세포는 제공된 바와 같은 유도체 T 세포의 집단 및 유도체 NK 세포의 집단을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 유도체 T 또는 NK 세포는 본 명세서에 제공된 바와 같이 기능적으로 향상된다. 일부 실시 형태에서, 2종, 3종 또는 그 초과의 면역관문 저해제는 2가지 유형의 유도체 효과기 세포와 함께, 이것의 투여 이전에 또는 투여 후에 조합 요법으로 투여될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 2종 이상의 면역관문 저해제가 동시에 또는 한번에 하나씩(순차적으로) 투여된다.
일부 실시 형태에서, 상기 면역관문 분자 중 임의의 것을 저해하는 길항제는 항체이다. 일부 실시 형태에서, 면역관문 저해성 항체는 뮤린 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 낙타 Ig, 상어 중쇄-단독 항체(VNAR), Ig NAR, 키메라 항체, 재조합 항체 또는 이의 항체 단편일 수 있다. 항체 단편의 비제한적인 예는 Fab, Fab′, F(ab)′2, F(ab)′3, Fv, 단일쇄 항원 결합 단편(scFv), (scFv)2, 다이설파이드 안정화된 Fv(dsFv), 미니바디, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 단일-도메인 항원 결합 단편(sdAb, 나노바디), 재조합 중쇄-단독 항체(VHH) 및 전체 항체의 결합 특이성을 보유하는 다른 항체 단편(이것은 제조하기에 더 비용 효과적일 수 있거나, 보다 용이하게 사용될 수 있거나, 전체 항체보다 더 민감할 수 있음)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 1종 또는 2종 또는 3종 또는 그 초과의 면역관문 저해제는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리릴루맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이들의 유도체 또는 기능성 등가물 중 적어도 1종을 포함한다.
2가지 유형의 유도체 효과기 세포 및 1종 이상의 면역관문 저해제를 포함하는 조합 요법은 액체 암 및 고형 암의 치료에 적용 가능하며, 이러한 암에는 피부 T-세포 림프종, 비호지킨 림프종(NHL), 균상 식육종, 파제트병모양 망상증, 세자리 증후군, 육아종 이완 피부, 림프종양 구진증, 만성 태선양 비강진, 급성 두창양 태선양 비강진, CD30+ 피부 T-세포 림프종, 속발성 피부 CD30+ 거대 세포 림프종, 비균상 식육종 CD30 피부 거대 T-세포 림프종, 다형성 T-세포 림프종, 레너트(Lennert) 림프종, 피하 T 세포 림프종, 혈관중심성 림프종, 아구성 NK-세포 림프종, B 세포 림프종, 호지킨 림프종(HL), 두경부 종양; 편평 세포 암종, 횡문근종, 루이스 폐 암종(LLC), 비소세포 폐암, 식도 편평 세포 암종, 식도 선암종, 신세포 암종(RCC), 결직장암(CRC), 급성 골수성 백혈병(AML), 유방암, 위암, 전립선 소세포 신경내분비 암종(SCNC), 간암, 교아세포종, 간암, 구강 편평 세포 암종, 췌장암, 갑상선 유두암, 간내 담관세포 암종, 간세포 암종, 골암, 전이, 및 비인두 암종이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 2가지 유형의 유도체 효과기 세포 이외에, 치료적 용도를 위한 조합물은 화학치료제 또는 방사성 모이어티를 포함하는 1종 이상의 추가 치료제를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 화학치료제는 세포독성 항신생물제, 즉, 우선적으로 신생 세포를 살해하거나 빠르게 증식하는 세포의 세포 주기를 파괴하거나 줄기 암 세포를 퇴치하고, 신생 세포의 성장을 예방하거나 감소시키기 위해 치료학적으로 사용되는 화학 작용제를 지칭한다. 화학치료제는 또한, 때때로 항신생 또는 세포독성 약물 또는 작용제로서 지칭되고, 당업계에 널리 공지되어 있다.
일부 실시 형태에서, 화학치료제는 안트라사이클린, 알킬화제, 알킬 설포네이트, 아지리딘, 에틸렌이민, 메틸렌아민, 질소 머스터드, 나이트로소유레아, 항생제, 항대사물질, 엽산 유사체, 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 효소, 포도필로톡신, 백금-함유제, 인터페론 및 인터류킨을 포함한다. 예시적인 화학치료제는 알킬화제(사이클로포스포아마이드, 메클로르에타민, 메팔린, 클로람부실, 헤아메틸멜라민, 티오테파, 부설판, 카무스틴, 로무스틴, 세무스틴), 항대사물질(메토트렉세이트, 플루오로유라실, 플록수리딘, 사이타라빈, 6-머캅토퓨린, 티오구아닌, 펜토스타틴), 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신), 에피도필로톡신(에토포사이드, 에토포사이드 오르토퀴논, 및 테니포사이드), 항생제(다우노루비신, 독소루비신, 미톡산트론, 비산트렌, 악티노마이신 D, 플리카마이신, 퓨로마이신 및 그라미시딘 D), 파클리탁셀, 콜히친, 사이토칼라신 B, 에메틴, 메이탄신 및 암사크린을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 추가적인 작용제는 아민글루테티미드, 시스플라틴, 카보플라틴, 미토마이신, 알트레타민, 사이클로포스포아마이드, 로무스틴(CCNU), 카무스틴(BCNU), 이리노테칸(CPT-11), 알렘투자맙, 알트레타민, 아나스트로졸, L-아스파라기나제, 아자시티딘, 베바시주맙, 벡사로텐, 블레오마이신, 보르테조밉, 부설판, 칼루스테론, 카페시타빈, 셀레콕시브, 세툭시맙, 클라드리빈, 클로푸라빈, 사이타라빈, 다카르바진, 데니류킨 디프티톡스, 다이에틀스틸베스트롤, 도세탁셀, 드로모스타놀론, 에피루비신, 에를로티닙, 에스트라무스틴, 에토포사이드, 에티닐 에스트라다이올, 엑셈스탄, 플록수리딘, 5-플루오로유라실, 플루다라빈, 플루타마이드, 풀베스트란트, 게피티닙, 겜시타빈, 고세렐린, 하이드록시유레아, 이브리투모맙, 이다루비신, 이포스파마이드, 이마티닙, 인터페론 알파(2a, 2b), 이리노테칸, 레트로졸, 류코보린, 류플로라이드, 레바미졸, 메클로르에타민, 메게스트롤, 멜팔린, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 메톡스살렌, 미토마이신 C, 미토탄, 미톡산트론, 난드롤론, 노페투모맙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파미드로네이트, 페메트렉세드, 페가데마제, 페가스파라가제, 펜토스타틴, 피포브로만, 플리카마이신, 폴리페프로산, 포르피머, 프로카바진, 퀴나크린, 리툭시맙, 사르그라모스팀, 스트렙토조신, 타목시펜, 테모졸로마이드, 테니포사이드, 테스톨락톤, 티오구아닌, 티오테파, 토페테칸, 토레미펜, 토시투모맙, 트라스투주맙, 트레티노인, 유라실 머스터드, 발루비신, 비노렐빈, 및 졸레드로네이트를 포함한다. 다른 적합한 작용제는 화학치료제 또는 방사선치료제로서 인간 용도로 승인된 것(승인될 것을 포함) 및 당업계에 공지된 것이다. 이러한 작용제는 다수의 표준 의사 및 종양학자 문헌을 통해(예를 들어 문헌[Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, McGraw-Hill, N.Y., 1995]) 또는 국립 암 연구소 웹사이트(fda.gov/cder/cancer/druglistfrarne.htm)를 통해(둘 다 시간에 따라 업데이트됨) 언급될 수 있다.
일 실시 형태에서, 조합 세포 요법은 CD3 인게이저인 치료 단백질 또는 펩타이드, 및 게놈 조작된 iPSC로부터 유래된 합성 효과기 세포의 2개의 집단을 포함하며, 여기서 유래된 합성 NK 또는 T 세포는 세포 표면 CD3(cs-CD3)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD3 인게이저는 블리나투모맙, 카투마톡소맙, 에르투막소맙, RO6958688, AFM11, MT110/AMG 110, MT111/AMG211/MEDI-565, AMG330, MT112/BAY2010112, MOR209/ES414, MGD006/S80880, MGD007, 및/또는 FBTA05 중 하나를 포함한다. 추가의 일부 다른 실시 형태에서, CD3 인게이저는 블리나투모맙, 카투마톡소맙, 및 에르투막소맙 중 하나를 포함하고, 유래된 NK 또는 T 세포는 CD19, BCMA, CD38, CD20, CD22, 또는 CD123, hnCD16, 및 cs-CD3을 표적화하는 CAR을 포함한다. 또 다른 일부 추가의 실시 형태에서, CD3 인게이저는 블리나투모맙, 카투마톡소맙, 및 에르투막소맙 중 하나를 포함하고, 게놈 조작된 iPSC로부터 유래된 합성 NK 또는 T 세포는 cs-CD3, hnCD16, CAR 및 하나 이상의 외인성 사이토카인을 포함한다.
치료 조성물에 포함된 2가지 이상의 유형의 iPSC-유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단 이외에, 대상체에게 투여하기에 적합한 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체(첨가제) 및/또는 희석제(예를 들어, 약제학적으로 허용 가능한 배지, 예를 들어, 세포 배양 배지) 또는 다른 약제학적으로 허용 가능한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제는 투여될 특정 조성물뿐만 아니라 치료 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 의해서 부분적으로 결정된다. 따라서, 본 발명의 치료 조성물의 광범위한 적합한 제형이 존재한다(개시내용이 참조에 의해서 본 명세서에 포함된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985] 참고).
이들 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제는 약 3 내지 약 10의 치료 조성물의 pH를 유지시키기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 이와 같이, 완충제는 총 조성물의 중량 대 중량 기준으로 약 5% 정도일 수 있다. 전해질, 예를 들어 비제한적으로, 염화나트륨 및 염화칼륨이 또한 치료 조성물 중에 포함될 수 있다. 일 태양에서, 치료 조성물의 pH는 약 4 내지 약 10의 범위이다. 대안적으로, 치료 조성물의 pH는 약 5 내지 약 9, 약 6 내지 약 9 또는 약 6.5 내지 약 8의 범위이다. 또 다른 실시 형태에서, 치료 조성물은 상기 pH 범위 중 하나의 pH를 갖는 완충제를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 치료 조성물은 약 7의 pH를 갖는다. 대안적으로, 치료 조성물은 약 6.8 내지 약 7.4 범위의 pH를 갖는다. 또 다른 추가 실시 형태에서, 치료 조성물은 약 7.4의 pH를 갖는다.
본 발명은 또한, 부분적으로, 본 발명의 특정 조성물 및/또는 배양물에서의 약제학적으로 허용되는 세포 배양 배지의 용도를 제공한다. 이러한 조성물은 인간 대상체에 투여하기에 적합하다. 일반적으로 말하면, 본 발명의 실시 형태에 따른 iPSC-유래된 효과기 세포의 유지, 성장, 및/또는 건강을 지지하는 임의의 배지는 약제학적 세포 배양 배지로서 사용하기에 적합하다. 특정 실시 형태에서, 약제학적으로 허용되는 세포 배양 배지는 혈청-무함유 및/또는 피더-무함유 배지이다. 다양한 실시 형태에서, 혈청-무함유 배지는 무동물성이고(animal-free), 선택적으로, 단백질-무함유일 수 있다. 선택적으로, 배지는 생약제학적으로 허용되는 재조합 단백질을 함유할 수 있다. 무동물성 배지는 성분이 비-동물 공급원로부터 유래된 배지를 지칭한다. 재조합 단백질은 무동물성 배지에서 천연 동물 단백질을 대체하며, 영양소는 합성, 식물 또는 미생물 공급원으로부터 얻어진다. 대조적으로, 단백질 무함유 배지는 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 것으로서 규정된다. 당업자는, 상기 배지의 예가 예시적이고 어떠한 방식으로도 본 발명에서 사용하기에 적합한 배지의 제형을 제한하지 않는다는 것을 인식할 것이다.
iPSC-유래된 조혈 계통 세포는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 프로(pro)T 세포, 프로NK 세포, CD34+ HE 세포, HSC, B 세포, 골수계-유래된 억제인자 세포(MDSC), 조절 대식세포, 조절 수지상 세포 또는 간엽 기질 세포를 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, iPSC-유래된 조혈 계통 세포는 약 95% 내지 약 100%의 T 세포, NK 세포, 프로T 세포, 프로NK 세포, CD34+ HE 세포 또는 골수계-유래된 억제인자 세포(MDSC)를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 본 발명은 세포 요법을 필요로 하는 대상체를 치료하기 위한 정제된 T 세포 또는 NK 세포를 갖는 치료 조성물, 예컨대, 약 95%의 T 세포, NK 세포, 프로T 세포, 프로NK 세포, CD34+ HE 세포 또는 골수계-유래된 억제인자 세포(MDSC)의 단리된 집단을 갖는 조성물을 제공한다. 조작된 iPSC로부터 유래된 2가지 이상의 유형의 합성 효과기 세포를 포함하는 본 명세서에 제공된 바와 같은 조성물에서, 세포 카운트에서의 2가지 유형의 세포의 비는 100:1 내지 1:100, 또는 50:1 내지 1:50, 또는 20:1 내지 1:20, 또는 10:1 내지 1:10, 또는 2:1 내지 1:2, 또는 이들 사이의 임의의 범위이다.
당업자는, 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물을 기초로 하여 iPSC로부터 유래된 자가 및 동종이계 조혈 계통 세포 둘 다가, 전술한 바와 같은 조합된 세포 유형을 이용하는 요법에서 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 자가 이식의 경우, 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단은 대상체와 완전 또는 부분 HLA-매칭된다. 또 다른 실시 형태에서, 유래된 조혈 계통 세포는 대상체에 HLA-매칭되지 않는데, 여기서 유래된 조혈 계통 세포는 HLA I 및 HLA II 널을 갖는 NK 세포 또는 T 세포이다.
일부 실시 형태에서, 조성물 내의 각 유형의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 용량당 적어도 0.1 x 105개의 세포, 적어도 1 x 105개의 세포, 적어도 5 x 105개의 세포, 적어도 1 x 106개의 세포, 적어도 5 x 106개의 세포, 적어도 1 x 107개의 세포, 적어도 5 x 107개의 세포, 적어도 1 x 108개의 세포, 적어도 5 x 108개의 세포, 적어도 1 x 109개의 세포, 또는 적어도 5 x 109개의 세포이며, 이때 2가지 유형의 세포의 세포 카운트 비는 100:1 내지 1:100, 50:1 내지 1:50, 20:1 내지 1:20, 10:1 내지 1:10, 2:1 내지 1:2, 1:1, 또는 이들 사이의 임의의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 조성물 내의 각 유형의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 용량당 약 0.1 x 105개의 세포 내지 약 1 x 106개의 세포; 용량당 약 0.5 x 106개의 세포 내지 약 1 x 107개의 세포; 용량당 약 0.5 x 107개의 세포 내지 약 1 x 108개의 세포; 용량당 약 0.5 x 108개의 세포 내지 약 1 x 109개의 세포; 용량당 약 1 x 109개의 세포 내지 약 5 x 109개의 세포; 용량당 약 0.5 x 109개의 세포 내지 약 8 x 109개의 세포; 용량당 약 3 x 109개의 세포 내지 약 3 x 1010개의 세포이며, 이때 2가지 유형의 세포의 세포 카운트 비는 100:1 내지 1:100, 50:1 내지 1:50, 20:1 내지 1:20, 10:1 내지 1:10, 2:1 내지 1:2, 1:1, 또는 이들 사이의 임의의 범위이다. 일반적으로, 1 x 108개의 세포/용량은 60 ㎏ 환자/대상체의 경우 1.67 x 106개의 세포/㎏으로 환산된다.
일 실시 형태에서, 조성물 중의 유래된 조혈 계통 세포의 각 유형의 수는 부분 또는 단일 제대혈 중의 면역 세포의 수이거나 또는 적어도 0.1 x 105개의 세포/㎏ 체중, 적어도 0.5 x 105개의 세포/㎏ 체중, 적어도 1 x 105개의 세포/㎏ 체중, 적어도 5 x 105개의 세포/㎏ 체중, 적어도 10 x 105개의 세포/㎏ 체중, 적어도 0.75 x 106개의 세포/㎏ 체중, 적어도 1.25 x 106개의 세포/㎏ 체중, 적어도 1.5 x 106개의 세포/㎏ 체중, 적어도 1.75 x 106개의 세포/㎏ 체중, 적어도 2 x 106개의 세포/㎏ 체중, 적어도 2.5 x 106개의 세포/㎏ 체중, 적어도 3 x 106개의 세포/㎏ 체중, 적어도 4 x 106개의 세포/㎏ 체중, 적어도 5 x 106개의 세포/㎏ 체중, 적어도 10 x 106개의 세포/㎏ 체중, 적어도 15 x 106개의 세포/㎏ 체중, 적어도 20 x 106개의 세포/㎏ 체중, 적어도 25 x 106개의 세포/㎏ 체중, 적어도 30 x 106개의 세포/㎏ 체중, 1 x 108개의 세포/㎏ 체중, 5 x 108개의 세포/㎏ 체중 또는 1 x 109개의 세포/㎏ 체중이며, 이때 2가지 유형의 세포의 세포 카운트 비는 100:1 내지 1:100, 50:1 내지 1:50, 20:1 내지 1:20, 10:1 내지 1:10, 2:1 내지 1:2, 1:1, 또는 이들 사이의 임의의 범위이다.
일 실시 형태에서, 2가지 유형의 유래된 조혈 계통 세포의 용량이 대상체에게 전달된다. 예시적인 일 실시 형태에서, 대상체에게 제공되는 세포의 유효량은 적어도 2 x 106개의 세포/㎏, 적어도 3 x 106개의 세포/㎏, 적어도 4 x 106개의 세포/㎏, 적어도 5 x 106개의 세포/㎏, 적어도 6 x 106개의 세포/㎏, 적어도 7 x 106개의 세포/㎏, 적어도 8 x 106개의 세포/㎏, 적어도 9 x 106개의 세포/㎏, 또는 적어도 10 x 106개의 세포/㎏, 또는 그 이상의 개수의 세포/㎏이며, 모든 사이의 세포 용량을 포함하며, 이때 2가지 유형의 세포의 세포 카운트 비는 100:1 내지 1:100, 50:1 내지 1:50, 20:1 내지 1:20, 10:1 내지 1:10, 2:1 내지 1:2, 1:1 또는 이들 사이의 임의의 범위이다.
또 다른 예시적인 실시 형태에서, 대상체에게 제공되는 세포의 유효량은, 2가지 유형의 세포의 세포 카운트 비가 100:1 내지 1:100, 50:1 내지 1:50, 20:1 내지 1:20, 10:1 내지 1:10, 2:1 내지 1:2, 1:1 또는 이들 사이의 임의의 범위일 때, 약 2 x 106개의 세포/㎏, 약 3 x 106개의 세포/㎏, 약 4 x 106 세포s/㎏, 약 5 x 106개의 세포/㎏, 약 6 x 106개의 세포/㎏, 약 7 x 106개의 세포/㎏, 약 8 x 106개의 세포/㎏, 약 9 x 106개의 세포/㎏, 또는 약 10 x 106개의 세포/㎏, 또는 그 이상의 개수의 세포/㎏이고, 모든 사이의 세포 용량을 포함한다.
또 다른 예시적인 실시 형태에서, 대상체에게 제공되는 세포의 유효량은, 2가지 유형의 세포의 세포 카운트 비가 100:1 내지 1:100, 50:1 내지 1:50, 20:1 내지 1:20, 10:1 내지 1:10, 2:1 내지 1:2, 1:1, 또는 이들 사이의 임의의 범위일 때, 약 2 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 10 x 106개의 세포/㎏, 약 3 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 10 x 106개의 세포/㎏, 약 4 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 10 x 106개의 세포/㎏, 약 5 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 10 x 106개의 세포/㎏, 2 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 6 x 106개의 세포/㎏, 2 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 7 x 106개의 세포/㎏, 2 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 8 x 106개의 세포/㎏, 3 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 6 x 106개의 세포/㎏, 3 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 7 x 106개의 세포/㎏, 3 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 8 x 106개의 세포/㎏, 4 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 6 x 106개의 세포/㎏, 4 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 7 x 106개의 세포/㎏, 4 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 8 x 106개의 세포/㎏, 5 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 6 x 106개의 세포/㎏, 5 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 7 x 106개의 세포/㎏, 5 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 8 x 106개의 세포/㎏ 또는 6 x 106세포/㎏ 내지 약 8 x 106개의 세포/㎏이고, 모든 사이의 세포 용량을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 2가지 이상의 유형의 유래된 조혈 계통 세포를 포함하는 조성물의 치료적 용도는 단회 용량 치료이며, 여기서는 2가지 이상의 유형의 세포가 병행적으로 또는 연속적으로 투여된다. 일부 실시 형태에서, 2가지 이상의 유형의 유래된 조혈 계통 세포를 포함하는 조성물의 치료적 용도는 다회 용량 치료이다. 일부 실시 형태에서, 다회 용량 치료는 매일, 3일마다, 7일마다, 10일마다, 15일마다, 20일마다, 25일마다, 30일마다, 35일마다, 40일마다, 45일마다, 또는 50일마다, 또는 이들 사이의 임의의 일수마다 1회 용량이며, 이때 2가지 유형의 세포의 각 용량은 병행적으로 또는 연속적으로 투여된다.
일부 실시 형태에서, 조작된 iPSC로부터 유래된 2가지 이상의 유형의 합성 효과기 세포를 포함하는 조성물은 해동 후 멸균성일 수 있으며, 인간 환자/대상체에게 투여하기에 적합하고 즉시 투여 가능할 수 있다(즉, 어떠한 추가의 처리 없이 투여될 수 있다). 투여를 위해 준비된 세포 기반 조성물은, 조성물이 대상체에 이식 또는 투여 전에 임의의 추가 가공 또는 조작을 필요로 하지 않음을 의미한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명은 화학 소분자를 포함한 1종 이상의 작용제를 사용하여 투여 전에 증폭 및/또는 조절되는 유래된 조혈 계통 세포의 2가지 이상의 유형의 단리된 집단을 제공한다. 조절은 유래된 조혈 계통 세포를 화학 소분자, 단백질, 핵산, 또는 선택된 세포 또는 이의 세포 성분과 접촉시키는 것을 통해 이루어질 수 있다. iPSC-유래된 효과기 세포를 포함한 면역 세포를 조절하기 위한 조성물 및 방법은, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 WO2017/127755호에 더 상세히 기재되어 있으며, 이의 관련 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. 재조합 TCR 또는 CAR을 발현시키기 위해 유전적으로 조작된 유래된 조혈 계통 세포에 대하여, 세포는 예를 들어, 미국 특허 제6,352,694호에 기술된 바와 같은 방법을 이용하여 활성화되고 증폭될 수 있다.
특정 실시 형태에서, 유래된 유전자 조작된 조혈 계통 세포에 대한 1차 자극 신호 및 공자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 각각의 신호를 제공하는 작용제는 용액 중에 있을 수 있거나 또는 표면에 커플링될 수 있다. 표면에 커플링될 때, 작용제는 동일한 표면(즉, "시스" 형성)에 또는 별개의 표면(즉, "트랜스" 형성)에 커플링될 수 있다. 대안적으로, 하나의 작용제는 표면에 결합될 수 있고, 다른 작용제는 용액 중에 존재할 수 있다. 일 실시 형태에서, 공자극 신호를 제공하는 작용제는 세포 표면에 결합될 수 있고, 1차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 용액 중에 있거나 또는 표면에 결합된다. 특정 실시 형태에서, 작용제는 둘 다 용액 중에 있을 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 작용제는 가용성 형태이고, 이어서, 표면, 예컨대 세포 발현 Fc 수용체, 또는 본 발명의 실시 형태에서 T 림프구를 활성화 및 증폭시키는 데 사용하기 위한 것으로 고려되는 인공 항원 제시 세포(aAPC)에 대해 미국 특허 출원 공개 제2004/0101519호 및 제2006/0034810호에 개시된 것과 같은 작용제에 결합하게 될 항체 또는 다른 결합제에 가교결합된다.
치료될 대상체의 상태에 따라서 투여량, 빈도 및 프로토콜에서의 약간의 변경이 필연적으로 일어날 것이다. 임의의 사례에서 투여 책임자는 개별 대상체에 대한 적절한 용량, 빈도 및 프로토콜을 결정할 것이다.
실시예
다음의 실시예는 예시의 방법에 의해, 그리고 제한의 방법에 의하지 않고 제공한다.
실시예 1 - 물질 및 방법
상이한 안전 하버 유전자좌 통합 전략과 조합하여 다양한 프로모터의 제어 하에서 자살 시스템을 효과적으로 선택 및 시험하기 위해서, 본 출원인의 소유의 iPSC 플랫폼을 사용하였는데, 이는 단일 세포 계대배양 및 고-처리량, 96-웰 플레이트-기반 유세포측정 분류를 가능하게 하여, 단일 또는 다수의 유전자 조절을 갖는 클론성 iPSC의 유도를 허용한다.
소분자 배양물 중에서의 iPSC 유지 : 배양물의 컨플루언시가 75% 내지 90%에 도달된 후 iPSC를 단일 세포로서 일상적으로 계대배양하였다. 단일-세포 해리를 위해서, iPSC를 PBS(미디어테크(Mediatech))로 1회 세척하고, 애큐타제(Accutase)(밀리포어(Millipore))로 3 내지 5분 동안 37℃에서 처리한 후, 피펫팅하여 단일-세포 해리를 보장하였다. 이어서, 단일-세포 현탁물을 종래의 배지와 동일 부피로 혼합하고, 225 x g에서 4분 동안 원심분리하고, FMM 중에 재현탁하고, 마트리겔-코팅된 표면 상에 플레이팅하였다. 계대배양은 전형적으로 1:6 내지 1:8이었고, 마트리겔로 2 내지 4시간 동안 37℃에서 미리 코팅된 조직 배양 플레이트로 옮기고, FMM을 2 내지 3일마다 공급하였다. 세포 배양물을 37℃ 및 5% CO2로 설정된 가습 인큐베이터에서 유지시켰다.
관심 양상의 표적화 편집을 위해서 ZFN, CRISPR을 사용한 인간 iPSC 조작: 한 예로서 ROSA26 표적화된 삽입을 사용하여, ZFN 매개된 게놈 편집을 위해서, 2백만 개의 iPSC에 AAVS1 표적화된 삽입을 위해서 2.5 ㎍ ZFN-L(FTV893), 2.5 ㎍ ZFN-R(FTV894) 및 5 ug 공여자 작제물의 혼합물을 형질주입하였다. CRISPR 매개된 게놈 편집을 위해서, 2백만개의 iPSC에 ROSA26 표적화된 삽입을 위해서 5 ug ROSA26-gRNA/Cas9(FTV922) 및 5 ug 공여자 작제물의 혼합물을 형질주입하였다. 형질주입은 파라미터 1500 V, 10 ms, 3 펄스를 사용하여 네온 형질주입 시스템(Neon transfection system)(라이프 테크놀로지스)을 사용하여 수행하였다. 형질주입 후 일수 2 또는 일수 3에서, 플라스미드가 인공 프로모터-드라이버 GFP 및/또는 RFP 발현 카세트를 함유하는 경우 유세포측정을 사용하여 형질주입 효율을 측정하였다. 형질주입 후 일수 4에서, 퓨로마이신을 0.1 ug/㎖의 농도로 처음 7일 동안 그리고 7일 후에는 0.2 ug/㎖의 농도로 배지에 첨가하여 표적화된 세포를 선택하였다. 퓨로마이신 선택 동안, 세포를 일수 10에서 새로운 마트리겔-코팅된 웰 상에서 계대배양하였다. 일수 16에서 또는 퓨로마이신 선택 이후에, 살아남은 세포를 GFP+ iPS 세포 백분율에 대해서 유세포측정에 의해서 분석하였다.
게놈-편집된 iPSC의 벌크 분류 및 클론 분류 : ZFN 또는 CRISPR-Cas9를 사용한 게놈 표적화된 편집을 사용하여 iPSC를 벌크 분류하고, 퓨로마이신 선택 20일 후에 GFP+SSEA4+TRA181+ iPSC를 클론 분류하였다. 단일 세포 해리된 표적화된 iPSC 풀을 행크스 평형 염 용액(Hanks' Balanced Salt Solution)(미디어테크(MediaTech)), 4% 우태아 혈청(인비트로젠사), 1x 페니실린/스트렙토마이신(미디어테크) 및 10 mM 헤페스(Hepes)(미디어테크)를 함유하고; 최적 성능을 위해서 새로 제조된 급냉 염색 완충제 중에 재현탁시켰다. SSEA4-PE, TRA181-알렉사 플루오르-647(비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))을 포함하는 접합된 1차 항체를 세포 용액에 첨가하고, 얼음 상에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 모든 항체를 백만개의 세포당 100 ㎕의 염색 완충제 중에서 7 ㎕로 사용하였다. 용액을 염색 완충제 중에서 1회 세척하고, 225 g에서 4분 동안 스핀 다운하고, 10 μM 티아조비빈을 함유하는 염색 완충제 중에 재현탁하고, 유세포측정 분류를 위해서 얼음 상에서 유지시켰다. 유세포측정 분류를 FACS 아리아(Aria) II(비디 바이오사이언시스) 상에서 수행하였다. 벌크 분류를 위해서, GFP+SSEA4+TRA181+ 세포를 7 ㎖ FMM으로 충전된 15 ㎖ 캐노니컬 튜브(canonical tube) 내에서 게이팅 및 분류하였다. 클론 분류를 위해서, 분류된 세포를 100 μM 노즐을 사용하여, 웰당 3개 사건의 농도로 직접 96-웰 플레이트에 배출하였다. 각각의 웰은 5 ㎍/㎖ 피브로넥틴 및 1x 페니실린/스트렙토마이신(미디어테크)이 보충된 200 ㎕ FMM을 미리 충전되어 있었고, 이미 5x 마트리겔로 하룻밤 코팅되어 있었다. 5x 마트리겔 예비코팅은 DMEM/F12 5 ㎖에 마트리겔의 하나의 분취물을 첨가하고, 이어서 적절한 재현탁을 허용하도록 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하고, 마지막으로 96-웰 플레이트에 웰당 50 ㎕로 첨가한 후 하룻밤 37℃에서 인큐베이션하는 것을 포함한다. 각각의 웰에 배지를 첨가하기 직전에 5x 마트리겔을 흡인시켰다. 분류가 완결된 후, 96-웰 플레이트를 인큐베이션 전에 225 g에서 1 내지 2분 동안 원심분리하였다. 플레이트를 7일 동안 방해하지 않고 정치시켰다. 7일째에, 150 ㎕의 배지를 각각의 웰로부터 제거하고, 100 ㎕의 FMM으로 대체하였다. 분류 후 일수 10에서 추가 100 ㎕의 FMM을 웰에 재공급하였다. 집락 형성을 일수 2에서 초기 검출하고, 대부분의 집락을 분류 후 일수 7 내지 일수 10에서 증폭시켰다. 제1 계대배양에서, 웰을 PBS로 세척하고, 37℃에서 대략 10분 동안 30 ㎕의 애큐타제로 해리시켰다. 증폭된 애큐타제 처리에 대한 요구는 연장된 기간 동안 배양물에서 유휴 상태에 있는 집락의 압축성을 반영한다. 세포가 해리된 것으로 보인 후, 200 ㎕의 FMM을 각각의 웰에 첨가하고, 수회 피펫팅하여 집락을 파괴하였다. 해리된 집락을 5x 마트리겔에 의해 미리 코팅된 96-웰 플레이트의 또 다른 웰로 옮기고, 이어서 인큐베이션 전에 225 g에서 2분 동안 원심분리하였다. 증폭 전에 초기 집락을 분산시키도록 이러한 1:1 계대배양을 수행하였다. 후속 계대배양을 3분 내지 5분 동안 애큐타제 처리 및 75 내지 90%의 컨플루언시 시 FMM에서 1x 마트리겔로 미리 코팅된 더 큰 웰로 1:4 내지 1:8의 증폭에 의해 일상적으로 수행하였다. 각각의 클론성 세포주를 GFP 형광 수준 및 TRA1-81 발현 수준에 대해서 분석하였다. 대략 100%의 GFP+ 및 TRA1-81+를 갖는 클론주를 추가 PCR 스크리닝 및 분석을 위해서 선택하였다. 유세포측정 분석을 구아바 이지사이트(Guava EasyCyte) 8 HT(밀리포어) 상에서 수행하고, 플로우조(Flowjo)(플로우조, 엘엘씨(Flowjo, LLC))를 사용하여 분석하였다.
실시예 2 - 향상된 유도체 NK 및 T 효과기 세포
CAR-발현 iPSC로부터의 유도체 NK 세포를 본 명세서에 기재된 지시 분화 플랫폼에 따라서 수득하였다. NK 살해 능력과 관련된 그랜자임 B의 생산 증가 및 KIR2DL3 및 KIR2DL1의 증가된 발현에 의해 입증된 바와 같이, 합성 hnCD16-CAR-IL-15/IL-15Ra iNK 세포에서 NK 세포 성숙이 향상되었으며, 이는 NK 세포가 효과기 기능을 획득한 라이센싱된 상태를 부여한다. Nalm6 및 ARH-77 표적 세포주에 대한 hnCD16-CAR-IL15/IL15Ra iNK 세포의 시험관내 세포독성을 연구하였으며, 이는 시험관내에서 B 세포 악성종양에 대한 CAR 유도된 CD19 특이적 살해 및 리툭시맙-유도 ADCC를 보여주었다.
내인성 조절 요소의 전사 제어 하에서 CD19 CAR의 T 세포 수용체 α(TRAC) 유전좌 내의 표적화된 삽입을 갖는 말초 혈액 유래된 T 세포를 단일 세포-유래된 클론성 TRAC-표적화된 CAR 함유 마스터 iPSC 주(TRAC-CAR TiPSC)를 생성시키도록 재프로그래밍하였다. T 세포 분화 이후 대략 일수 28에서, 유래된 세포는 TCR 발현의 부재 하에서 부유 상태에서 더 성장하고 증폭할 수 있었다. 이러한 합성 T 세포(TRAC-CAR iT)는, 시험관내에서 효과기 사이토카인(IFNγ, TNFα, IL2)의 생산, 탈과립화(CD107a/b, 퍼포린, 그랜자임 B), 증식(>85% 세포 주기 진입) 및 활성화 마커 CD69 및 CD25의 상향조절과 함께 CD 19 항원에 대한 효율적인 세포독성 T 림프구 반응을 도출하는 기능성 능력을 입증하였다. 성숙 TRAC-CAR iT 세포에 의한 IFNγ 및 TNFα의 생산은 CAR 을 발현하는 1차 T 세포보다 현저히 더 높다. TRAC-CAR iT는 또한 항원 특이적 방식으로, 그리고 CAR을 발현하는 1차 T 세포에서 보이는 항원 특이적 세포독성의 변동 없이 종양을 표적으로 한다.
여기서, iPSC의 유도 분화를 통해서 수득된 성숙 iNK 세포는 성인 말초 혈액 NK 세포에 비해서 더 긴 텔로미어를 함유하는 것을 추가로 나타낸다. 텔로미어 길이는 G0/1 세포의 DNA 지수에 대한 보정과 함께 대조군(100%)으로서 iPSC, 성체 말초 혈액 NK 세포 및 iPSC-유래된 NK 세포의 경우에는 1301 T 세포 백혈병 주를 사용하여 유세포측정에 의해서 결정하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, iPSC-유래된 NK 세포는 성인 말초 혈액 NK 세포와 비교할 때 상당히 더 긴 텔로미어 길이를 유지하는데(p=.105, ANOVA), 이는 iPSC-유래된 NK 세포에서의 더 큰 증식, 생존 및 지속 가능성을 나타낸다. 더 긴 텔로미어 연장의 유사한 관찰이 또한 iPSC-유래된 T 세포에서도 이루어진다. 이는 텔로미어 단축이 세포 노화에 따라서 발생하며, 줄기세포 기능장애 및 세포 노화와 관련된다는 사실과 일치한다.
실시예 3 - 효과기 세포 유형들의 조합은 다회 라운드에 걸쳐 세포독성의 지속적인 반응 및 다중-항원 표적화를 가져온다
Raji 종양 세포를 사전-플레이팅한 후, CAR-iT(0.3:1 E:T, 하룻밤)를 첨가하고, 96시간의 총 지속시간 동안 0.1 ㎍/ml RTX(리툭시맙), 또는 CAR-iNK 및 0.1 ug/ml RTX(0.3:1 E:T 비) 중 어느 하나의 후속 첨가를 수행하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, CAR-iNK의 첨가는 CAR-iT의 세포독성을 개선하며, 이는 ADCC에 의해 추가로 증가된다.
또 다른 검정에서는, Raji-모 표적(도 4a) 및 Raji-CD19KO 표적(도 4b)을 96-웰 플레이트의 표면 상에 고정화하였다. 표적들을 각각의 단일 유형으로서 사전배양하거나 또는 이중 표적화 혼합물(duo targeting mix)과 유사하도록 50/50 조합 공동배양물 형태로 사전배양하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 조합된 CAR-iT, CAR-iNK를 증가된 E:T 비로 첨가하였으며, 세포 생성물들의 조합물은 CD19 항원 탈출 환경에서 세포독성/표적화를 가능하게 하는 것으로 나타났으며(도 4b), RTX의 추가의 첨가는 ADCC를 통한 직접 세포독성의 효과를 가능하게 하였으며(도 4a 및 도 4b), 그 결과 향상된 표적 제거를 가져왔다.
실시예 4 - 효과기 세포 유형들과 mAb의 조합은 다양한 B 세포 악성종양에서 효능을 증가시킨다
CAR-iT, CAR-iNK 및 리툭시맙의 조합물을 B 세포 악성종양을 나타내는 각종 종양 세포주들의 패널뿐만 아니라, 엡스타인 바르 바이러스(EBV)를 사용하여 형질전환된 1차 B 세포주, 예컨대 ARH-77 세포주에 대해서도 시험하였다. 도 5a는 표적 세포주 ARH-77(CD19+CD20+)에 대한 효과기 대 표적 비의 적정 하에서의 CAR-iT 단독, CAR-iT 및 CAR-iNK, 및 리툭시맙과 조합된 CAR-iT 및 CAR-iNK(0.1 ㎍/mL)에 의한 항-종양 활성의 증가를 나타낸다. 보여지는 바와 같이, RTX에 추가하여 CAR-iT 및 CAR-iNK 둘 다의 조합물이 최고의 세포독성을 갖는다.
다양한 B 종양주들의 패널에 대한 CAR-iT, CAR-iNK 및 리툭시맙의 상대 활성이 곡선 아래 면적(AUC)으로서 계산되어 있으며, 도 5b에 나타낸 히트맵에 그려져 있다. Nalm-6(CD19+, CD20-)을 CD19 특이성을 확인하기 위한 대조군으로서 사용하였다. 도 5b에 나타낸 바와 같이, 다양한 B 세포 악성종양에 걸친 반응성 및 반응성의 폭은 CAR-iT 단독, CAR-iT 및 CAR-iNK, 및 리툭시맙과 조합된 CAR-iT 및 CAR-iNK(0.1 ㎍/mL)의 연속적인 첨가와 함께 증가된다.
RAJI 종양 세포가 접종된 NSG 마우스를 사용한 생체내 림프종 모델은 리툭시맙 단독(7일에 걸쳐 3회 용량의 3 ㎍/마우스)에 의한 마우스의 처리가 부분적으로 효과적이었음을 나타낸다(도 6a 및 도 6d). 1차 CAR-T 세포에 의한 마우스의 처리는 리툭시맙 단독보다 더 효과적이었다(도 6b 및 도 6d). CAR-iT, CAR-iNK 및 리툭시맙의 조합물이 41일의 기간에 걸쳐 Raji 종양 세포를 제거하는 데 가장 효과적인 것으로 입증되었다(도 6c 및 도 6d).
실시예 5 - 효과기 세포 유형들과 면역관문 저해제 길항제의 조합물
면역관문은 저해되지 않을 때 면역 반응을 억제 또는 하향조절할 수 있는 세포 분자, 종종 세포 표면 분자이다. 면역관문 저해제는 면역관문 유전자 발현 또는 유전자 생성물을 감소시킬 수 있거나 면역관문 분자의 활성을 감소시킬 수 있는 길항제이다. PD1/PDL1 또는 CTLA4를 표적으로 하는 면역관문 저해제(CI)의 개발은 종양학 환경을 변화시켰으며, 이들 작용제는 다수의 적응증에서 장기간 완화를 제공한다. 그러나, 다수의 종양 아형은 면역관문 차단 요법에 저항성이 있고, 재발은 중요한 관심사이다. 따라서, CI 저항성을 극복할 수 있는 능력을 갖는 새로운 치료법이 필요하다.
유도체 NK 세포가 유도체 T 세포를 종양 미세환경(TME)에 동원하고 종양 부위에서 유도체 T 세포 활성화를 증가시키는 능력을 둘 다 갖는지의 여부를 나타내도록 검정을 설계한다. 활성화된 유도체 NK 세포에 의한 CCL3, CCL4, CXCL10 및 다른 가용성 인자의 분비 시에, 활성화된 유도체 T 세포의 이동이 입증된다. 본 검정에서, hnCD16 iNK 세포를, ADCC-유도 항-PDL1 항체의 존재 하에서 높은 수준의 PDL1을 발현하는 SKOV-3 또는 SKOV-3-PDL1과 조합한다. 하룻밤 인큐베이션시킨 후, 상층액을 수집하고, 표준 트랜스웰 주화성 챔버의 하부 챔버에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 상부 챔버에서 유도체 T 세포를 인큐베이션한다. 인큐베이션 후에, 하부 챔버로의 유도체 T 세포 이동을 유세포측정에 의해 정량화하여, 활성화된 iNK 컬럼 세포가 유도체 T 세포 이동을 향상시키는지의 여부를 결정한다.
활성화 시, 유도체 NK 세포는 인터페론 감마(IFNγ), CCL3, CCL4, CXCL10 및 CCL22를 포함하여, 풍부한 염증성 사이토카인 및 케모카인의 세포 생산에 의해 입증되는 직접적인 항종양 능력을 나타낸다는 것을 앞서 보여주었다. IFNγ는 항-종양 T 세포 활성을 조절하는 데 결정적인 역할을 한다. 생체내 검정에서는, NSG 마우스에 1E7 iNK 세포 I.P.(복막내), 또는 5E6 활성화된 유도체 T 세포 R.O.(후안와동), 또는 둘 다를 주사한다. 4일 후, 말초 혈액 및 복강을 유세포측정에 의해 유도체 T 세포의 존재에 대해 평가한다. 유도체 T 세포를 제공받지만 유도체 NK 세포를 제공받지 않은 마우스와 비교하여, iPSC-유래된 NK 세포 I.P.를 제공받은 마우스는, 활성화된 유도체 T 세포를 순환 밖으로 나와서 복막 내로 동원함으로써 유도체 T 세포 이동을 향상시키는 유도체 NK 세포의 능력으로 인해, 말초 혈액 중에서는 감소된 유도체 T 세포 빈도를 갖고 복막강 중에서는 증가된 유도체 T 세포를 가질 것으로 예상되었다.
시험관내 3차원 종양 스페로이드 모델을 이용할 때, 유도체 NK 세포의 존재 하에서의 유도체 T 세포의 종양 스페로이드 내로의 향상된 침투가 관찰된다. 녹색 형광 표지된 30,000개의 유도체 T 세포를 SKOV-3 미소구체(적색 핵)와 함께 단독으로 인큐베이션하거나 15,000개의 iNK 세포와 조합하여 인큐베이션하고, 15시간 초과 동안 이미징한다. 유도체 T 세포만으로는 스페로이드의 중심을 침투하지 못하지만, iNK 세포의 첨가는 종양 스페로이드로의 유도체 T 세포 침윤 및 종양 스페로이드 파괴를 촉진시킬 것으로 예상된다.
유래된 NK 세포와 공동배양될 때 종양 스페로이드의 향상된 유도체 T 세포 침윤 및 향상된 세포독성을, 가장 큰 적색 물체 마스크 내에서 총 적분된 녹색 형광 강도를 측정함으로써 또한 정량적으로 도시한다. 유래된 NK 세포는 종양 스페로이드의 유도체 T 세포 침윤을 향상시킨다는 것을 보여주기 위해, SKOV-3 스페로이드 내로의 유도체 T 세포의 침윤을 유래된 NK 세포(1:1 비), CD3+ T 세포(2:1 비) 또는 iNK(1:1 비) + iT 세포(2:1 비)와의 24시간 공동배양에 대해 측정한다.
3D 종양 스페로이드 모델에서의 유도체 T 세포와 유도체 NK 세포의 공동배양은 종양 세포 살해 및 IFNγ 및 TNFα의 향상된 생성으로 이어진다. 유래된 NK 세포를 SKOV-3 스페로이드와 1:1 ET 비로, 또는 CD3+ T 세포(2:1 비), 또는 iNK(1:1 비) + iT 세포(2:1 비)와 7일간 인큐베이션한 후에, 상층액을 수집하고 TNFα 및 IFNγ 생성에 대해 평가한다. iPSC-유래된 NK 세포는 iT 세포와 iPSC-NK의 공동배양 시에 스페로이드 모델에서 고형 종양 살해를 위해 IFNγ 및 TNFα의 생성을 향상시키는 데 있어서 유도체 T 세포와 상승작용하고, CD4+ 및 CD8+ iT 세포 둘 다에 대해 증가된 사이토카인 생성으로 이어졌다.
이와 같이, 종양 부위에 대한 유도체 T 세포의 동원을 촉진시킴으로써 그리고 유도체 T 세포 활성화 및 침윤을 향상시킴으로써, 이러한 기능적으로 강력한 유도체 NK 세포는 면역관문 저해제를 비롯한 유도체 T 세포 표적화된 면역요법과 함께 상승작용하여, 고형 종양 환경에서 국소 면역억제를 완화시키고 종양 부하를 감소시킬 수 있다고 입증된다. 종합하면, 이들 데이터는 유도체 NK 세포 및 유도체 T 세포를 포함하고, 선택적으로 추가로 면역관문 저해제 또는 다른 T 세포 표적화된 치료제와 조합된 동종이계 조합 요법을 뒷받침하는 증거를 제공한다.
유도체 NK 및 유도체 T 세포 콤보와의 조합 요법에 적합한 면역관문 저해제가 본 명세서에 개시된다.
유도체 NK 및 유도체 T 세포 및 선택적으로 1종 이상의 면역관문 저해제를 포함하는 조합 요법은 액체 암 및 고형 종양의 치료에 적용 가능하다. 제공된 유도체 NK 세포 및 유도체 T 세포 조합 및 항-면역 면역관문 저해제(들)를 포함하는 조합 요법에 대한 반응을 평가하는 경우, 반응은 하기 중 적어도 하나를 포함하는 기준에 의해서 측정될 수 있다: 임상 유익비, 사망까지의 생존, 병리학적 완전 반응, 병리학적 반응의 반-정량적 측정, 임상적 완전 관해, 임상적 부분적 관해, 임상적으로 안정적인 질환, 재발이 없는 생존, 무전이 생존, 무질환 생존, 순환 종양 세포 감소, 순환 마커 반응 및 RECIST(Response Evaluation Criteria In Solid Tumors) 기준.
당업자는 본 명세서에 기술된 방법, 조성물 및 생성물이 예시적인 실시 형태를 대표하고, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것을 쉽게 인식할 것이다. 다양한 치환 및 변형은 본 발명의 범주 및 사상으로부터 벗어나지 않으면서 본 명세서에 개시된 본 개시내용에 행해질 수 있음은 당업자에게 쉽게 자명할 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 당업자의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 간행물은 각각의 개별 간행물이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조에 의해 포함된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
본 명세서에 예시적으로 기술된 본 개시내용은 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에서 적합하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 각각의 예에서 본 명세서에서 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진" 중 임의의 것은 다른 2개의 용어 중 어느 하나에 의해 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아니라 설명의 관점에서 사용되고, 도시되고 기술된 특징의 임의의 등가물 또는 이의 부분을 배제하는 이러한 용어 및 표현의 사용에서 의도가 없지만, 다양한 변형이 청구된 개시내용의 범주 내에서 가능하다는 것이 인식된다. 따라서, 본 개시내용이 바람직한 실시 형태 및 선택적인 특징에 의해 구체적으로 개시되어 있지만, 본 명세서에 개시된 개념의 변형 및 변경은 관련 기술 분야의 통사의 기술자에 의해서 분류될 수 있고, 이러한 변형 및 변경은 첨부된 청구범위에 의해서 정의되는 바와 같은 본 발명의 범주에 포함되는 것으로 간주되는 것으로 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Fate Therapeutics, Inc. <120> COMBINING iPSC-DERIVED EFFECTOR CELL TYPES FOR IMMUNOTHERAPY USE <130> 056932-527001WO <150> US 63/041,672 <151> 2020-06-19 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD64 domain-based construction <400> 1 Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln 1 5 10 15 Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser 20 25 30 Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu 35 40 45 Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln 50 55 60 Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser 65 70 75 80 Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile 85 90 95 Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg 100 105 110 Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys 115 120 125 Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe 130 135 140 Lys Phe Phe 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attctaacct caccattctg 480 aaaaccaaca taagtcacaa tggcacctac cattgctcag gcatgggaaa gcatcgctac 540 acatcagcag gaatatctgt cactgtgaaa gagctatttc cagctccagt gctgaatgca 600 tctgtgacat ccccactcct ggaggggaat ctggtcaccc tgagctgtga aacaaagttg 660 ctcttgcaga ggcctggttt gcagctttac ttctccttct acatgggcag caagaccctg 720 cgaggcagga acacatcctc tgaataccaa atactaactg ctagaagaga agactctggg 780 ttatactggt gcgaggctgc cacagaggat ggaaatgtcc ttaagcgcag ccctgagttg 840 gagcttcaag tgcttggcct ccagttacca actcctgtct ggtttcatta ccaagtctct 900 ttctgcttgg tgatggtact cctttttgca gtggacacag gactatattt ctctgtgaag 960 acaaacattc gaagctcaac aagagactgg aaggaccata aatttaaatg gagaaaggac 1020 cctcaagaca aa 1032 <210> 5 <211> 1020 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD64 exon-based construction (encoding SEQ ID NO. 2) <400> 5 cttggagaca acatgtggtt cttgacaact ctgctccttt gggttccagt tgatgggcaa 60 gtggacacca caaaggcagt gatcactttg cagcctccat gggtcagcgt gttccaagag 120 gaaaccgtaa ccttgcattg tgaggtgctc catctgcctg ggagcagctc tacacagtgg 180 tttctcaatg gcacagccac tcagacctcg acccccagct acagaatcac ctctgccagt 240 gtcaatgaca gtggtgaata caggtgccag agaggtctct cagggcgaag tgaccccata 300 cagctggaaa tccacagagg ctggctacta ctgcaggtct ccagcagagt cttcacggaa 360 ggagaacctc tggccttgag gtgtcatgcg tggaaggata agctggtgta caatgtgctt 420 tactatcgaa atggcaaagc ctttaagttt ttccactgga attctaacct caccattctg 480 aaaaccaaca taagtcacaa tggcacctac cattgctcag gcatgggaaa gcatcgctac 540 acatcagcag gaatatctgt cactgtgaaa gagctatttc cagctccagt gctgaatgca 600 tctgtgacat ccccactcct ggaggggaat ctggtcaccc tgagctgtga aacaaagttg 660 ctcttgcaga ggcctggttt gcagctttac ttctccttct acatgggcag caagaccctg 720 cgaggcagga acacatcctc tgaataccaa atactaactg ctagaagaga agactctggg 780 ttatactggt gcgaggctgc cacagaggat ggaaatgtcc ttaagcgcag ccctgagttg 840 gagcttcaag tgcttggttt gttctttcca cctgggtacc aagtctcttt ctgcttggtg 900 atggtactcc tttttgcagt ggacacagga ctatatttct ctgtgaagac aaacattcga 960 agctcaacaa gagactggaa ggaccataaa tttaaatgga gaaaggaccc tcaagacaaa 1020 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agaagagaag actctgggtt atactggtgc 780 gaggctgcca cagaggatgg aaatgtcctt aagcgcagcc ctgagttgga gcttcaagtg 840 cttggcttct ttccacctgg gtaccaagtc tctttctgct tggtgatggt actccttttt 900 gcagtggaca caggactata tttctctgtg aagacaaaca ttcgaagctc aacaagagac 960 tggaaggacc ataaatttaa atggagaaag gaccctcaag acaaa 1005 <210> 7 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 co-stim + CD3-zeta-ITAM construct <400> 7 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser 35 40 45 Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu 50 55 60 Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg 65 70 75 80 Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln 85 90 95 Glu Gly Leu Phe Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Phe 100 105 110 Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp 115 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cattaatacc tctagcggcg gaggatcagg tggcggtgga 480 agcggaggtg gaggctccgg tggaggaggt agtggcggag gttctcttca aataacttgt 540 cctccaccga tgtccgtaga acatgcggat atttgggtaa aatcctatag cttgtacagc 600 cgagagcggt atatctgcaa cagcggcttc aagcggaagg ccggcacaag cagcctgacc 660 gagtgcgtgc tgaacaaggc caccaacgtg gcccactgga ccacccctag cctgaagtgc 720 atcagagatc ccgccctggt gcatcagcgg cctgcccctc caagcacagt gacaacagct 780 ggcgtgaccc cccagcctga gagcctgagc ccttctggaa aagagcctgc cgccagcagc 840 cccagcagca acaatactgc cgccaccaca gccgccatcg tgcctggatc tcagctgatg 900 cccagcaaga gccctagcac cggcaccacc gagatcagca gccacgagtc tagccacggc 960 accccatctc agaccaccgc caagaactgg gagctgacag ccagcgcctc tcaccagcct 1020 ccaggcgtgt accctcaggg ccacagcgat accacagtgg ccatcagcac ctccaccgtg 1080 ctgctgtgtg gactgagcgc cgtgtcactg ctggcctgct acctgaagtc cagacagacc 1140 cctccactgg ccagcgtgga aatggaagcc atggaagcac tgcccgtgac ctggggcacc 1200 agctccagag atgaggatct ggaaaactgc tcccaccacc tg 1242 <210> 13 <211> 379 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a construct mimicking trans-presentation of IL15 (Design 3) <400> 13 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu 20 25 30 Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys 35 40 45 Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr 50 55 60 Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe 65 70 75 80 Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile 85 90 95 His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser 100 105 110 Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu 115 120 125 Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val 130 135 140 Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu 165 170 175 Gln Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp 180 185 190 Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser 195 200 205 Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu 210 215 220 Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys 225 230 235 240 Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr 245 250 255 Val Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser 260 265 270 Gly Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala 275 280 285 Thr Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser 290 295 300 Pro Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly 305 310 315 320 Thr Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala 325 330 335 Ser His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr 340 345 350 Val Ala Ile Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val 355 360 365 Ser Leu Leu Ala Cys Tyr Leu Lys Ser Arg Gln 370 375 <210> 14 <211> 1140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 <400> 14 atggactgga cctggattct gttcctggtc gcggctgcaa cgcgagtcca tagcggtatc 60 catgttttta ttcttgggtg tttttctgct gggctgccta agaccgaggc caactgggta 120 aatgtcatca gtgacctcaa gaaaatagaa gaccttatac aaagcatgca cattgatgct 180 actctctaca ctgagtcaga tgtacatccc tcatgcaaag tgacggccat gaaatgtttc 240 ctcctcgaac ttcaagtcat atctctggaa agtggcgacg cgtccatcca cgacacggtc 300 gaaaacctga taatactcgc taataatagt ctctcttcaa atggtaacgt aaccgagtca 360 ggttgcaaag agtgcgaaga gttggaagaa aaaaacataa aggagttcct gcaaagtttc 420 gtgcacattg tgcagatgtt cattaatacc tctagcggcg gaggatcagg tggcggtgga 480 agcggaggtg gaggctccgg tggaggaggt agtggcggag gttctcttca aataacttgt 540 cctccaccga tgtccgtaga acatgcggat atttgggtaa aatcctatag cttgtacagc 600 cgagagcggt atatctgcaa cagcggcttc aagcggaagg ccggcacaag cagcctgacc 660 gagtgcgtgc tgaacaaggc caccaacgtg gcccactgga ccacccctag cctgaagtgc 720 atcagagatc ccgccctggt gcatcagcgg cctgcccctc caagcacagt gacaacagct 780 ggcgtgaccc cccagcctga gagcctgagc ccttctggaa aagagcctgc cgccagcagc 840 cccagcagca acaatactgc cgccaccaca gccgccatcg tgcctggatc tcagctgatg 900 cccagcaaga gccctagcac cggcaccacc gagatcagca gccacgagtc tagccacggc 960 accccatctc agaccaccgc caagaactgg gagctgacag ccagcgcctc tcaccagcct 1020 ccaggcgtgt accctcaggg ccacagcgat accacagtgg ccatcagcac ctccaccgtg 1080 ctgctgtgtg gactgagcgc cgtgtcactg ctggcctgct acctgaagtc cagacagtga 1140 <210> 15 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a construct mimicking trans-presentation of IL15 (Design 4) <400> 15 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu 20 25 30 Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys 35 40 45 Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr 50 55 60 Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe 65 70 75 80 Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile 85 90 95 His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser 100 105 110 Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu 115 120 125 Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val 130 135 140 Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu 165 170 175 Gln Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp 180 185 190 Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser 195 200 205 Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu 210 215 220 Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys 225 230 235 240 Ile Arg <210> 16 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 <400> 16 atggactgga cctggattct gttcctggtc gcggctgcaa cgcgagtcca tagcggtatc 60 catgttttta ttcttgggtg tttttctgct gggctgccta agaccgaggc caactgggta 120 aatgtcatca gtgacctcaa gaaaatagaa gaccttatac aaagcatgca cattgatgct 180 actctctaca ctgagtcaga tgtacatccc tcatgcaaag tgacggccat gaaatgtttc 240 ctcctcgaac ttcaagtcat atctctggaa agtggcgacg cgtccatcca cgacacggtc 300 gaaaacctga taatactcgc taataatagt ctctcttcaa atggtaacgt aaccgagtca 360 ggttgcaaag agtgcgaaga gttggaagaa aaaaacataa aggagttcct gcaaagtttc 420 gtgcacattg tgcagatgtt cattaatacc tctagcggcg gaggatcagg tggcggtgga 480 agcggaggtg gaggctccgg tggaggaggt agtggcggag gttctcttca aataacttgt 540 cctccaccga tgtccgtaga acatgcggat atttgggtaa aatcctatag cttgtacagc 600 cgagagcggt atatctgcaa cagcggcttc aagcggaagg ccggcacaag cagcctgacc 660 gagtgcgtgc tgaacaaggc caccaacgtg gcccactgga ccacccctag cctgaagtgc 720 atcaga 726

Claims (62)

  1. 2개 이상의 합성 세포 집단을 포함하는 조성물로서,
    (i) iPSC-유래된 NK 세포를 포함하는 제1 합성 세포 집단으로서, 여기서 상기 iPSC-유래된 NK 세포는,
    (a) 외인성 CD16 또는 이의 변이체; 및
    (b) (i) 제1 키메라 항원 수용체(CAR), 및 (ii) 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 또는 전장(full length) 펩타이드 중 하나 또는 둘 다를 포함하는, 제1 합성 세포 집단; 및
    (ii) iPSC-유래된 T 세포를 포함하는 제2 합성 세포 집단으로서, 여기서 상기 iPSC-유래된 T 세포는 적어도 제2 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하며, 상기 제2 CAR은 TCR 유전자좌의 내인성 프로모터의 제어 하에서 발현되는, 제2 합성 세포 집단을 포함하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 외인성 CD16 또는 이의 변이체는 고 친화도 비-절단성 외인성 CD16(hnCD16)이거나; 또는 상기 외인성 CD16 또는 이의 변이체는 하기 중 적어도 하나를 포함하는, 조성물:
    (a) CD16의 엑토도메인 도메인 내의 F176V 및 S197P;
    (b) CD64로부터 기원된 전체 또는 부분 엑토도메인;
    (c) 비-네이티브(non-native)(또는 비-CD16) 막관통 도메인;
    (d) 비-네이티브(또는 비-CD16) 세포내 도메인;
    (e) 비-네이티브(또는 비-CD16) 신호전달 도메인;
    (f) 비-네이티브 자극성 도메인; 및
    (g) CD16으로부터 기원되지 않고, 동일하거나 상이한 폴리펩타이드로부터 기원된 막관통 도메인, 신호전달 도메인, 및 자극성 도메인.
  3. 제2항에 있어서,
    (a) 상기 비-네이티브 막관통 도메인은 CD3D, CD3E, CD3G, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D, 또는 T 세포 수용체(TCR) 폴리펩타이드로부터 유래되거나;
    (b) 상기 비-네이티브 자극성 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래되거나;
    (c) 상기 비-네이티브 신호전달 도메인은 CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137(4-1BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래되거나; 또는
    (d) 상기 비-네이티브 막관통 도메인은 NKG2D로부터 유래되고, 상기 비-네이티브 자극성 도메인은 2B4로부터 유래되고, 상기 비-네이티브 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래되는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1 CAR과 상기 제2 CAR은 표적화 특이성이 동일하거나 상이하고, 상기 제1 CAR 또는 상기 제2 CAR은,
    (i) T 세포 특이적 또는 NK 세포 특이적이고/이거나;
    (ii) 이중특이성 항원 결합 CAR이고/이거나;
    (iii) 전환 가능한 CAR이고/이거나;
    (iv) 이량체화된 CAR이고/이거나;
    (v) 스플리트(split) CAR이고/이거나;
    (vi) 다중쇄 CAR이고/이거나;
    (vii) 유도성 CAR이고/이거나;
    (viii) 또 다른 CAR과 공동발현되고/되거나;
    (ix) 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 또는 전장 펩타이드와, 선택적으로 별개의 작제물로 또는 바이-시스트론성(bi-cistronic) 작제물로 공동발현되고/되거나;
    (x) 면역관문 저해제와, 선택적으로 별개의 작제물로 또는 바이-시스트론성 작제물로 공동발현되고/되거나;
    (xi) CD19 또는 BCMA에 특이적이고/이거나;
    (xii) ADGRE2, 탄산 탈수효소 IX(CAIX), CCR1, CCR4, 암배아 항원(carcinoembryonic antigen: CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus: CMV) 감염된 세포의 항원, 상피 당단백질2(epithelial glycoprotein2: EGP-2), 상피 당단백질-40(epithelial glycoprotein-40: EGP-40), 상피 세포 접착 분자(epithelial cell adhesion molecule: EpCAM), EGFRvIII, 수용체 타이로신-단백질 카이나제 erb­B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산염-결합 단백질(folate-binding protein: FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(fetal acetylcholine receptor: AChR), 엽산염 수용체-a, 강글리오사이드 G2(Ganglioside G2: GD2), 강글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(human Epidermal Growth Factor Receptor 2: HER-2), 인간 텔로머라제 역전사효소(human telomerase reverse transcriptase: hTERT), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 하위단위 알파-2(Interleukin-13 receptor subunit alpha-2: IL-13Rα2), κ-경쇄, 카이나제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor: KDR), Lewis A(CA19.9), Lewis Y(LeY), L1 세포 접착 분자(L1 cell adhesion molecule: L1-CAM), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A 1(melanoma antigen family A 1: MAGE-A1), MICA/B, 뮤신 1(Mucin 1: Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아성 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기세포 항원(prostate stem cell antigen: PSCA), PRAME 전립선-특이적 막 항원(prostate-specific membrane antigen: PSMA), 종양­연관 당단백질(tumor­associated glycoprotein) 72(TAG-72), TIM-3, TRBC1, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­R2), 빌름스 종양 단백질(Wilms tumor protein)(WT-1) 및 병원체 항원 중 임의의 하나에 특이적인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 또는 전장 펩타이드는,
    (a) IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21 및/또는 이들 각각의 수용체 중 적어도 하나를 포함하거나; 또는
    (b)
    (i) 자가-절단 펩타이드를 사용함으로써 IL15와 IL15Rα의 공동발현;
    (ii) IL15와 IL15Rα의 융합 단백질;
    (iii) IL15Rα의 세포내 도메인이 절단된 IL15/IL15Rα 융합 단백질;
    (iv) IL15와, IL15Rα의 막 결합된 스시(Sushi) 도메인의 융합 단백질;
    (v) IL15와 IL15Rβ의 융합 단백질;
    (vi) IL15와 공통 수용체 γC의 융합 단백질 - 여기서, 상기 공통 수용체 γC는 네이티브 또는 변형됨 -; 및
    (vii) IL15Rβ의 동종이량체 중 적어도 하나를 포함하고; 여기서, (i) 내지 (vii) 중 임의의 하나는 별개의 작제물로 또는 바이-시스트론성 작제물로 CAR과 공동발현될 수 있고;
    선택적으로,
    (c) 일시적으로 발현되는, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 iPSC-유래된 NK 세포 및/또는 상기 iPSC-유래된 T 세포는 하기 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 조성물:
    (i) HLA-I 결핍;
    (ii) HLA-II 결핍;
    (iii) HLA-G 또는 비-절단성 HLA-G의 도입된 발현;
    (iv) lig-, inR+, cs-CD3+, En+, 및 Ab+ 중 적어도 하나; 여기서,
    (1) lig-는 발현된 동종항원에서 음성이고;
    (2) inR+는 상기 음성 동종항원에 상응하는 발현된 비활성화-CAR에서 양성이고;
    (3) cs-CD3+는 세포 표면 발현된 CD3에서 양성이고;
    (4) En+는 적어도 하나의 발현된 인게이저(engager)에서 양성이며, 여기서 상기 인게이저는 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE) 또는 삼중특이성 살해 세포 인게이저(TriKE)를 포함하고;
    (5) Ab+는 적어도 하나의 발현된 항체 또는 면역관문 저해제에서 양성임;
    (v) B2M, CIITA, TAP1, TAP2, 타파신(Tapasin), NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, RFX5, RAG1, RFXAP, 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자 중 적어도 하나에서의 결실 또는 감소된 발현;
    (vi) HLA-E, HLA-G, 4-1BBL, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, TCR, Fc 수용체, 및 이중특이성 또는 다중특이성 또는 보편적(universal) 인게이저와의 커플링을 위한 표면 촉발 수용체(surface triggering receptor) 중 적어도 하나에서의 도입된 또는 증가된 발현.
  7. 제6항에 있어서,
    (i) 상기 동종항원은 CD40L, OX40, 또는 4-1BB를 포함하거나;
    (ii) 상기 비활성화-CAR은 CD40L-CAR, OX40-CAR, 또는 4-1BB-CAR을 포함하거나;
    (iii) 상기 BiTE 또는 상기 TriKE는 (a) CD3, CD28, CD5, CD16, NKG2D, CD64, CD32, CD89, NKG2C, 또는 이의 키메라 Fc 수용체를 포함하는 면역 세포 표면 분자; 및 (b) B7H3, BCMA, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD179b, CEA, CLEC12A, CS-1, DLL3, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, FLT-3, FOLR1, FOLR3, GD2, gpA33, HER2, HM1.24, LGR5, MSLN, MCSP, MICA/B, PSMA, PAMA, P-카드헤린, 또는 ROR1을 포함하는 종양 표면 분자를 인식하거나;
    (iv) 상기 BiTE는 CD3-CD19, CD16-CD30, CD64-CD30, CD16-BCMA, CD64-BCMA, 또는 CD3-CD33을 포함하거나;
    (v) 상기 TriKE는 CD16-IL15-EPCAM, CD64-IL15-EPCAM, CD16-IL15-CD33, CD64-IL15-CD33, 또는 NKG2C-IL15-CD33을 포함하거나;
    (vi) 상기 항체는 항-CD20, 항-HER2, 항-CD52, 항-EGFR, 항-CD123, 항-GD2, 항-PDL1, 또는 항-CD38 항체를 포함하거나; 또는
    (vii) 상기 면역관문 저해제는 (a) PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 또는 저해성 KIR을 포함하는 면역관문 분자에 대한 길항제; (b) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리릴루맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이들의 유도체 또는 기능성 등가물 중 1종; 또는 (c) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 1종을 포함하는, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 iPSC-유래된 NK 세포 또는 상기 iPSC-유래된 T 세포는
    (i) 하나의 목적하는 통합 부위에 통합된 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 또는
    (ii) 상이한 목적하는 통합 부위에 통합된 2종 초과의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 목적하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD40L, CD44, CD54, CD56, CD58, CD69, CD71, OX40, 4-1BB, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, 및 TIGIT 중 적어도 하나를 포함하는, 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 목적하는 통합 부위는 TCR α 또는 β 불변 영역, CD25, CD38, CD40L, CD44, CD54, CD58, CD69, CD71, OX40 또는 4-1BB를 포함하며; 선택적으로, 상기 TCRα 또는 TCRβ, CD25, CD38, CD40L, CD44, CD54, CD58, CD69, CD71, OX40 또는 4-1BB는 상기 각각의 통합 부위에서의 상기 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드의 통합의 결과로서 녹아웃(knock out)되는, 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 iPSC-유래된 NK 세포 또는 상기 iPSC-유래된 T 세포는 하기를 포함하는 특징들 중 적어도 하나를 갖는, 조성물:
    말초 혈액, 제대혈 또는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 수득된 이의 네이티브 상대 세포(counterpart cell)에 비해,
    (i) 개선된 지속성 및/또는 생존,
    (ii) 네이티브 면역 세포에 대한 증가된 저항성,
    (iii) 증가된 세포독성,
    (iv) 개선된 종양 침투,
    (v) 향상된 또는 획득된 ADCC,
    (vi) 방관자 면역 세포(bystander immune cell)를 종양 부위로 이동시키고/시키거나, 활성화 또는 동원하는 데 있어서의 향상된 능력,
    (vii) 종양 면역억제를 감소시키는 향상된 능력, 및
    (viii) 종양 항원 탈출을 구제하는 데 있어서의 개선된 능력.
  12. 제1항에 있어서, 상기 iPSC-유래된 NK 세포 또는 상기 iPSC-유래된 T 세포는 말초 혈액, 제대혈 또는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 수득된 그들 각각의 네이티브 상대 세포에 비해 더 긴 텔로미어(telomere)를 포함하는, 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 제1 합성 세포 집단 또는 상기 제2 합성 세포 집단은 생체외(ex vivo)에서 조절되는, 조성물.
  14. 제13항에 있어서, iPSC-유래된 NK 세포를 포함하는 상기 조절된 제1 합성 세포 집단은 조절되지 않은 상기 제1 합성 세포 집단에 비해, 증가된 수 또는 비의 I형 NKT 세포 및/또는 적응 NK 세포를 포함하거나; iPSC-유래된 T 세포를 포함하는 상기 조절된 제2 합성 세포 집단은 조절되지 않은 상기 제2 합성 세포 집단에 비해, 증가된 수 또는 비의 미감작(na
    Figure pct00006
    ve) T 세포, 줄기세포 기억 T 세포, 및/또는 중앙 기억 T 세포를 포함하는, 조성물.
  15. 제1항에 있어서,
    (i) 상기 iPSC-유래된 NK 세포와 상기 iPSC-유래된 T 세포는 100:1 내지 1:100 범위의 비이거나;
    (ii) 상기 조성물은 하나 이상의 추가의 세포 집단을 추가로 포함하거나; 또는
    (iii) 상기 조성물은 1종 이상의 치료제를 추가로 포함하는, 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 추가의 세포 집단은 조절 세포를 포함하는, 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 조절 세포는 iPSC-유래된 면역 조절 세포 또는 골수계-유래된 억제인자 세포(myeloid derived suppressor cell: MDSC)인, 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 상기 1종 이상의 치료제는 펩타이드, 사이토카인, 면역관문 저해제, 미토겐, 성장 인자, 작은 RNA, dsRNA(이중 가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 피더 세포(feeder cell), 피더 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 하나 이상의 관심 폴리핵산을 포함하는 벡터, 항체, 화학치료제 또는 방사성 모이어티, 또는 면역조절 약물(immunomodulatory drug: IMiD)을 포함하는, 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 면역관문 저해제는,
    (a) PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 또는 저해성 KIR을 포함하는 1종 이상의 길항제 면역관문 분자;
    (b) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리릴루맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이들의 유도체 또는 기능성 등가물 중 1종 이상; 또는
    (c) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 적어도 1종을 포함하는, 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 상기 항체는,
    (a) 항-CD20, 항-HER2, 항-CD52, 항-EGFR, 항-CD123, 항-GD2, 항-PDL1 및/또는 항-CD38 항체;
    (b) 레툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 유블리툭시맙, 오카라투주맙, 오비누투주맙, 트라스투주맙, 퍼투주맙, 알렘투주맙, 서툭시맙, 디누툭시맙, 아벨루맙, 다라투무맙, 이사툭시맙, MOR202, 7G3, CSL362, 엘로투주맙 및 이들의 인간화된 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편 및 이들의 기능성 등가물 및 바이오시밀러 중 1종 이상; 또는
    (c) 다라투무맙을 포함하는, 조성물.
  21. 제1항에 있어서, 상기 제1 합성 세포 집단 및 상기 제2 합성 세포 집단은 별개의 집단이거나, 또는 혼합 집단으로 조합되는, 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조성물의 치료 용도로서,
    입양 세포 요법에 적합한 대상체에게 상기 조성물을 도입함으로써 사용되며, 여기서 상기 대상체는 자가면역 장애; 혈액 악성종양; 고형 종양; 암; 또는 바이러스 감염을 갖는, 치료 용도.
  23. CAR-T 세포의 집단에 의한 종양 살해 및/또는 클리어런스를 개선하는 방법으로서,
    iPSC-유래된 NK 세포를 포함하는 합성 세포 집단을 상기 CAR-T 세포의 집단에 제공하여 조합된 세포 집단을 수득하는 단계를 포함하고,
    여기서 상기 iPSC-유래된 NK 세포는,
    (a) 외인성 CD16 또는 이의 변이체; 및
    (b) (i) 제1 키메라 항원 수용체(CAR), 및 (ii) 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 또는 전장 펩타이드 중 하나 또는 둘 다를 포함하고; 상기 iPSC-유래된 NK 세포의 제1 CAR은 상기 CAR-T 세포와 동일하거나 상이한 CAR 표적화 특이성을 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 조합된 세포 집단은 하기를 포함하는 특징들 중 적어도 하나를 갖는 세포를 포함하는, 방법:
    상기 iPSC-유래된 NK 세포의 조합 없이 상기 CAR-T 세포의 집단 단독에 의한 종양 살해 및/또는 클리어런스에 비해,
    (i) 개선된 지속성 및/또는 생존,
    (ii) 네이티브 면역 세포에 대한 증가된 저항성,
    (iii) 증가된 세포독성,
    (iv) 개선된 종양 침투,
    (v) 향상된 또는 획득된 ADCC,
    (vi) 방관자 면역 세포를 종양 부위로 이동시키고/시키거나, 활성화 또는 동원하는 데 있어서의 향상된 능력,
    (vii) 종양 면역억제를 감소시키는 향상된 능력, 및
    (viii) 종양 항원 탈출을 구제하는 데 있어서의 개선된 능력.
  25. 제23항에 있어서, 상기 외인성 CD16 또는 이의 변이체는 고 친화도 비-절단성 외인성 CD16(hnCD16)이거나; 또는 상기 외인성 CD16 또는 이의 변이체는 하기 중 적어도 하나를 포함하는, 방법:
    (a) CD16의 엑토도메인 도메인 내의 F176V 및 S197P;
    (b) CD64로부터 기원된 전체 또는 부분 엑토도메인;
    (c) 비-네이티브(또는 비-CD16) 막관통 도메인;
    (d) 비-네이티브(또는 비-CD16) 세포내 도메인;
    (e) 비-네이티브(또는 비-CD16) 신호전달 도메인;
    (f) 비-네이티브 자극성 도메인; 및
    (g) CD16으로부터 기원되지 않고, 동일하거나 상이한 폴리펩타이드로부터 기원된 막관통 도메인, 신호전달 도메인, 및 자극성 도메인.
  26. 제25항에 있어서,
    (a) 상기 비-네이티브 막관통 도메인은 CD3D, CD3E, CD3G, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D, 또는 T 세포 수용체(TCR) 폴리펩타이드로부터 유래되거나;
    (b) 상기 비-네이티브 자극성 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래되거나;
    (c) 상기 비-네이티브 신호전달 도메인은 CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137(4-1BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래되거나; 또는
    (d) 상기 비-네이티브 막관통 도메인은 NKG2D로부터 유래되고, 상기 비-네이티브 자극성 도메인은 2B4로부터 유래되고, 상기 비-네이티브 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래되는, 방법.
  27. 제23항에 있어서, 상기 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 또는 전장 펩타이드는,
    (a) IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21 및/또는 이들 각각의 수용체 중 적어도 하나를 포함하거나; 또는
    (b)
    (i) 자가-절단 펩타이드를 사용함으로써 IL15와 IL15Rα의 공동발현;
    (ii) IL15와 IL15Rα의 융합 단백질;
    (iii) IL15Rα의 세포내 도메인이 절단된 IL15/IL15Rα 융합 단백질;
    (iv) IL15와, IL15Rα의 막 결합된 스시 도메인의 융합 단백질;
    (v) IL15와 IL15Rβ의 융합 단백질;
    (vi) IL15와 공통 수용체 γC의 융합 단백질 - 여기서, 상기 공통 수용체 γC는 네이티브 또는 변형됨 -; 및
    (vii) IL15Rβ의 동종이량체 중 적어도 하나를 포함하고; 여기서, (i) 내지 (vii) 중 임의의 하나는 별개의 작제물로 또는 바이-시스트론성 작제물로 CAR과 공동발현될 수 있고;
    선택적으로,
    (c) 일시적으로 발현되는, 방법.
  28. 제23항에 있어서, 상기 CAR-T 세포는 조작된 iPSC로부터 분화되고/되거나, 상기 CAR-T 세포는 ADGRE-2, 탄산 탈수효소 IX(CAIX), CCR1, CCR4, 암배아 항원(CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원, 상피 당단백질2(EGP 2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 접착 분자(EpCAM), EGFRvIII, 수용체 타이로신-단백질 카이나제 erb­B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산염-결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 엽산염 수용체-a, 강글리오사이드 G2(GD2), 강글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER-2), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 하위단위 알파-2(IL-13Rα2), κ-경쇄, 카이나제 삽입 도메인 수용체(KDR), Lewis A(CA19.9), Lewis Y(LeY), L1 세포 접착 분자(L1-CAM), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A 1(MAGE-A1), MICA/B, 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아성 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기세포 항원(PSCA), PRAME 전립선-특이적 막 항원(PSMA), 종양­연관 당단백질 72(TAG-72), TIM-3, TRBC1, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­R2), 빌름스 종양 단백질(WT-1) 및 병원체 항원 중 임의의 하나에 대해 표적화 특이성을 갖는 CAR을 포함하는, 방법.
  29. 제23항에 있어서, 상기 iPSC-유래된 NK 세포 및/또는 상기 CAR-T 세포는 하기 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 방법:
    (i) HLA-I 결핍;
    (ii) HLA-II 결핍;
    (iii) HLA-G 또는 비-절단성 HLA-G의 도입된 발현;
    (iv) lig-, inR+, cs-CD3+, En+, 및 Ab+ 중 적어도 하나; 여기서,
    (1) lig-는 발현된 동종항원에서 음성이고;
    (2) inR+는 상기 음성 동종항원에 상응하는 발현된 비활성화-CAR에서 양성이고;
    (3) cs-CD3+는 세포 표면 발현된 CD3에서 양성이고;
    (4) En+는 적어도 하나의 발현된 인게이저에서 양성이며, 여기서 상기 인게이저는 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE) 또는 삼중특이성 살해 세포 인게이저(TriKE)를 포함하고;
    (5) Ab+는 적어도 하나의 발현된 항체 또는 면역관문 저해제에서 양성임;
    (v) B2M, CIITA, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, RFX5, RAG1, RFXAP, 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자 중 적어도 하나에서의 결실 또는 감소된 발현; 및
    (vi) HLA-E, HLA-G, 4-1BBL, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, TCR, Fc 수용체, 및 이중특이성 또는 다중특이성 또는 보편적 인게이저와의 커플링을 위한 표면 촉발 수용체 중 적어도 하나에서의 도입된 또는 증가된 발현.
  30. 제29항에 있어서,
    (i) 상기 동종항원은 CD40L, OX40, 또는 4-1BB를 포함하거나;
    (ii) 상기 비활성화-CAR은 CD40L-CAR, OX40-CAR, 또는 4-1BB-CAR을 포함하거나;
    (iii) 상기 BiTE 또는 상기 TriKE는 (a) CD3, CD28, CD5, CD16, NKG2D, CD64, CD32, CD89, NKG2C, 또는 이의 키메라 Fc 수용체를 포함하는 면역 세포 표면 분자; 및 (b) B7H3, BCMA, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD179b, CEA, CLEC12A, CS-1, DLL3, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, FLT-3, FOLR1, FOLR3, GD2, gpA33, HER2, HM1.24, LGR5, MSLN, MCSP, MICA/B, PSMA, PAMA, P-카드헤린, 또는 ROR1을 포함하는 종양 표면 분자를 인식하거나;
    (iv) 상기 BiTE는 CD3-CD19, CD16-CD30, CD64-CD30, CD16-BCMA, CD64-BCMA, 또는 CD3-CD33을 포함하거나;
    (v) 상기 TriKE는 CD16-IL15-EPCAM, CD64-IL15-EPCAM, CD16-IL15-CD33, CD64-IL15-CD33, 또는 NKG2C-IL15-CD33을 포함하거나;
    (vi) 상기 항체는 항-CD20, 항-HER2, 항-CD52, 항-EGFR, 항-CD123, 항-GD2, 항-PDL1, 또는 항-CD38 항체를 포함하거나; 또는
    (vii) 상기 면역관문 저해제는 (a) PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 또는 저해성 KIR을 포함하는 면역관문 분자에 대한 길항제; (b) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리릴루맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이들의 유도체 또는 기능성 등가물 중 1종; 또는 (c) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 1종을 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 1종 이상의 치료제를 제공하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 1종 이상의 치료제는 펩타이드, 사이토카인, 면역관문 저해제, 항체, 미토겐, 성장 인자, 작은 RNA, dsRNA(이중 가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 피더 세포, 피더 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 하나 이상의 관심 폴리핵산을 포함하는 벡터, 화학치료제 또는 방사성 모이어티, 또는 면역조절 약물(IMiD)을 포함하는, 방법,
  32. 제31항에 있어서, 상기 면역관문 저해제는,
    (a) PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 또는 저해성 KIR을 포함하는 1종 이상의 길항제 면역관문 분자;
    (b) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리릴루맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이들의 유도체 또는 기능성 등가물 중 1종 이상; 또는
    (c) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 적어도 1종을 포함하는, 방법.
  33. 제31항에 있어서, 상기 항체는,
    (a) 항-CD20, 항-HER2, 항-CD52, 항-EGFR, 항-CD123, 항-GD2, 항-PDL1 및/또는 항-CD38 항체;
    (b) 레툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 유블리툭시맙, 오카라투주맙, 오비누투주맙, 트라스투주맙, 퍼투주맙, 알렘투주맙, 서툭시맙, 디누툭시맙, 아벨루맙, 다라투무맙, 이사툭시맙, MOR202, 7G3, CSL362, 엘로투주맙 및 이들의 인간화된 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편 및 이들의 기능성 등가물 및 바이오시밀러 중 1종 이상; 또는
    (c) 다라투무맙을 포함하는, 방법.
  34. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조성물을 사용하여 대상체를 치료하는 방법으로서,
    (I) iPSC-유래된 NK 세포를 포함하는 상기 제1 합성 세포 집단을 상기 대상체에게 투여하는 단계로서, 여기서 상기 iPSC-유래된 NK 세포는,
    (a) 외인성 CD16 또는 이의 변이체; 및
    (b) (i) 제1 키메라 항원 수용체(CAR), 및 (ii) 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 또는 전장 펩타이드 중 하나 또는 둘 다를 포함하는, 상기 단계; 및
    (II) iPSC-유래된 T 세포를 포함하는 상기 제2 합성 세포 집단을 상기 대상체에게 투여하는 단계로서, 여기서 상기 iPSC-유래된 T 세포는 적어도 제2 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하며, 상기 제2 CAR은 TCR 유전자좌의 내인성 프로모터의 제어 하에서 발현되고, 상기 제1 CAR과 상기 제2 CAR은 표적화 특이성이 동일하거나 상이한, 상기 단계를 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 대상체는 자가면역 장애; 혈액 악성종양; 고형 종양; 암; 또는 바이러스 감염을 포함하는 병태를 갖고/갖거나; 상기 방법은 상기 제1 또는 상기 제2 합성 세포 집단을 단독으로 사용하는 것에 비해 상기 병태의 향상된 개선을 제공하는, 방법.
  36. 제34항에 있어서, 상기 제1 합성 세포 집단과 상기 제2 합성 세포 집단은 병행적으로, 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여되는, 방법.
  37. 제34항에 있어서,
    1종 이상의 치료제를 투여하는 단계; 및/또는 추가의 세포 집단을 투여하는 단계를 추가로 포함하며,
    상기 1종 이상의 치료제 및/또는 상기 추가의 세포 집단은 상기 제1 합성 세포 집단 또는 상기 제2 합성 세포 집단 중 어느 하나와 병행적으로 또는 순차적으로 투여되는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 추가의 세포 집단은 조절 세포를 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 조절 세포는 iPSC-유래된 면역 조절 세포 또는 골수계-유래된 억제인자 세포(MDSC)인, 방법.
  40. 제34항에 있어서, 상기 제1 합성 세포 집단 및 상기 제2 합성 세포 집단은 별개의 집단이거나, 또는 상기 대상체에게 투여 전에 혼합 집단으로 조합되는, 방법.
  41. 제37항에 있어서, 상기 1종 이상의 치료제는 펩타이드, 사이토카인, 면역관문 저해제, 미토겐, 성장 인자, 작은 RNA, dsRNA(이중 가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 피더 세포, 피더 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 하나 이상의 관심 폴리핵산을 포함하는 벡터, 항체, 화학치료제 또는 방사성 모이어티, 또는 면역조절 약물을 포함하는, 방법.
  42. 제34항에 있어서, 상기 대상체에게 하기를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법:
    (i) (a) CD3, CD28, CD5, CD16, NKG2D, CD64, CD32, CD89, NKG2C, 또는 이의 키메라 Fc 수용체를 포함하는 면역 세포 표면 분자; 및 (b) B7H3, BCMA, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD179b, CEA, CLEC12A, CS-1, DLL3, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, FLT-3, FOLR1, FOLR3, GD2, gpA33, HER2, HM1.24, LGR5, MSLN, MCSP, MICA/B, PSMA, PAMA, P-카드헤린, 또는 ROR1을 포함하는 종양 표면 분자에 특이적인 BiTE 또는 TriKE;
    (ii) CD3-CD19, CD16-CD30, CD64-CD30, CD16-BCMA, CD64-BCMA, 또는 CD3-CD33을 포함하는 BiTE;
    (iii) CD16-IL15-EPCAM, CD64-IL15-EPCAM, CD16-IL15-CD33, CD64-IL15-CD33, 또는 NKG2C-IL15-CD33을 포함하는 TriKE;
    (iv) 항-CD20, 항-HER2, 항-CD52, 항-EGFR, 항-CD123, 항-GD2, 항-PDL1, 또는 항-CD38 항체를 포함하는 항체; 또는
    (v) (a) PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 또는 저해성 KIR을 포함하는 면역관문 분자에 대한 길항제; (b) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리릴루맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이들의 유도체 또는 기능성 등가물 중 1종; 또는 (c) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 1종을 포함하는 면역관문 저해제.
  43. 제1항의 조성물의 제조 방법으로서,
    (I) 제1 유전자 조작된 iPSC를 분화하여 iPSC-유래된 NK 세포를 포함하는 제1 합성 세포 집단을 수득하는 단계로서, 여기서 상기 제1 iPSC는 (a) 외인성 CD16 또는 이의 변이체; 및 (b) (i) 제1 키메라 항원 수용체(CAR), 및 (ii) 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 또는 전장 펩타이드 중 하나 또는 둘 다를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상기 iPSC-유래된 NK 세포는 (a) 및 (b)를 포함하는, 상기 단계; 및
    (II) 제2 유전자 조작된 iPSC를 분화하여 iPSC-유래된 T 세포를 포함하는 제2 합성 세포 집단을 수득하는 단계로서, 여기서 상기 제2 iPSC는 적어도 제2 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 제2 CAR은 TCR 유전자좌의 내인성 프로모터의 제어 하에서 발현되고, 상기 iPSC-유래된 T 세포는 상기 제2 CAR을 포함하는, 상기 단계를 포함하며,
    상기 단계들에 의해 제1항의 조성물을 제조하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 외인성 CD16 또는 이의 변이체는 고 친화도 비-절단성 외인성 CD16(hnCD16)이거나; 또는 상기 외인성 CD16 또는 이의 변이체는 하기 중 적어도 하나를 포함하는, 방법:
    (a) CD16의 엑토도메인 도메인 내의 F176V 및 S197P;
    (b) CD64로부터 기원된 전체 또는 부분 엑토도메인;
    (c) 비-네이티브(또는 비-CD16) 막관통 도메인;
    (d) 비-네이티브(또는 비-CD16) 세포내 도메인;
    (e) 비-네이티브(또는 비-CD16) 신호전달 도메인;
    (f) 비-네이티브 자극성 도메인; 및
    (g) CD16으로부터 기원되지 않고, 동일하거나 상이한 폴리펩타이드로부터 기원된 막관통 도메인, 신호전달 도메인, 및 자극성 도메인.
  45. 제44항에 있어서,
    (a) 상기 비-네이티브 막관통 도메인은 CD3D, CD3E, CD3G, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D, 또는 T 세포 수용체(TCR) 폴리펩타이드로부터 유래되거나;
    (b) 상기 비-네이티브 자극성 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래되거나;
    (c) 상기 비-네이티브 신호전달 도메인은 CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137(4-1BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래되거나; 또는
    (d) 상기 비-네이티브 막관통 도메인은 NKG2D로부터 유래되고, 상기 비-네이티브 자극성 도메인은 2B4로부터 유래되고, 상기 비-네이티브 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래되는, 방법.
  46. 제43항에 있어서, 상기 제1 CAR과 상기 제2 CAR은 표적화 특이성이 동일하거나 상이하고, 상기 제1 CAR 또는 상기 제2 CAR은,
    (i) T 세포 특이적 또는 NK 세포 특이적이고/이거나;
    (ii) 이중특이성 항원 결합 CAR이고/이거나;
    (iii) 전환 가능한 CAR이고/이거나;
    (iv) 이량체화된 CAR이고/이거나;
    (v) 스플리트 CAR이고/이거나;
    (vi) 다중쇄 CAR이고/이거나;
    (vii) 유도성 CAR이고/이거나;
    (viii) 또 다른 CAR과 공동발현되고/되거나;
    (ix) 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 또는 전장 펩타이드와, 선택적으로 별개의 작제물로 또는 바이-시스트론성 작제물로 공동발현되고/되거나;
    (x) 면역관문 저해제와, 선택적으로 별개의 작제물로 또는 바이-시스트론성 작제물로 공동발현되고/되거나;
    (xi) CD19 또는 BCMA에 특이적이고/이거나;
    (xii) ADGRE-2, 탄산 탈수효소 IX(CAIX), CCR1, CCR4, 암배아 항원(CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원, 상피 당단백질2(EGP 2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 접착 분자(EpCAM), EGFRvIII, 수용체 타이로신-단백질 카이나제 erb­B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산염-결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 엽산염 수용체-a, 강글리오사이드 G2(GD2), 강글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER-2), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 하위단위 알파-2(IL-13Rα2), κ-경쇄, 카이나제 삽입 도메인 수용체(KDR), Lewis A(CA19.9), Lewis Y(LeY), L1 세포 접착 분자(L1-CAM), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A 1(MAGE-A1), MICA/B, 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아성 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기세포 항원(PSCA), PRAME 전립선-특이적 막 항원(PSMA), 종양­연관 당단백질 72(TAG-72), TIM-3, TRBC1, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­R2), 빌름스 종양 단백질(WT-1) 및 병원체 항원 중 임의의 하나에 특이적인, 방법.
  47. 제43항에 있어서, 상기 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체의 부분 또는 전장 펩타이드는,
    (a) IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21 및/또는 이들 각각의 수용체 중 적어도 하나를 포함하거나; 또는
    (b)
    (i) 자가-절단 펩타이드를 사용함으로써 IL15와 IL15Rα의 공동발현;
    (ii) IL15와 IL15Rα의 융합 단백질;
    (iii) IL15Rα의 세포내 도메인이 절단된 IL15/IL15Rα 융합 단백질;
    (iv) IL15와, IL15Rα의 막 결합된 스시 도메인의 융합 단백질;
    (v) IL15와 IL15Rβ의 융합 단백질;
    (vi) IL15와 공통 수용체 γC의 융합 단백질 - 여기서, 상기 공통 수용체 γC는 네이티브 또는 변형됨 -; 및
    (vii) IL15Rβ의 동종이량체 중 적어도 하나를 포함하고; 여기서, (i) 내지 (vii) 중 임의의 하나는 별개의 작제물로 또는 바이-시스트론성 작제물로 CAR과 공동발현될 수 있고;
    선택적으로,
    (c) 일시적으로 발현되는, 방법.
  48. 제43항에 있어서, 상기 제1 유전자 조작된 iPSC 또는 상기 제2 유전자 조작된 iPSC는 하기 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 방법:
    (i) HLA-I 결핍;
    (ii) HLA-II 결핍;
    (iii) HLA-G 또는 비-절단성 HLA-G의 도입된 발현;
    (iv) lig-, inR+, cs-CD3+, En+, 및 Ab+ 중 적어도 하나; 여기서,
    (1) lig-는 발현된 동종항원에서 음성이고;
    (2) inR+는 상기 음성 동종항원에 상응하는 발현된 비활성화-CAR에서 양성이고;
    (3) cs-CD3+는 세포 표면 발현된 CD3에서 양성이고;
    (4) En+는 적어도 하나의 발현된 인게이저에서 양성이며, 여기서 상기 인게이저는 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE) 또는 삼중특이성 살해 세포 인게이저(TriKE)를 포함하고; 및
    (5) Ab+는 적어도 하나의 발현된 항체 또는 면역관문 저해제에서 양성임;
    (v) B2M, CIITA, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, RFX5, RAG1, RFXAP, 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자 중 적어도 하나에서의 결실 또는 감소된 발현; 및
    (vi) HLA-E, HLA-G, 4-1BBL, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, TCR, Fc 수용체, 및 이중특이성 또는 다중특이성 또는 보편적 인게이저와의 커플링을 위한 표면 촉발 수용체 중 적어도 하나에서의 도입된 또는 증가된 발현.
  49. 제48항에 있어서,
    (i) 상기 동종항원은 CD40L, OX40, 또는 4-1BB를 포함하거나;
    (ii) 상기 비활성화-CAR은 CD40L-CAR, OX40-CAR, 또는 4-1BB-CAR을 포함하거나;
    (iii) 상기 BiTE 또는 상기 TriKE는 a) CD3, CD28, CD5, CD16, NKG2D, CD64, CD32, CD89, NKG2C, 또는 이의 키메라 Fc 수용체를 포함하는 면역 세포 표면 분자; 및 (b) B7H3, BCMA, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD179b, CEA, CLEC12A, CS-1, DLL3, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, FLT-3, FOLR1, FOLR3, GD2, gpA33, HER2, HM1.24, LGR5, MSLN, MCSP, MICA/B, PSMA, PAMA, P-카드헤린, 또는 ROR1을 포함하는 종양 표면 분자에 특이적이거나;
    (iv) 상기 BiTE는 CD3-CD19, CD16-CD30, CD64-CD30, CD16-BCMA, CD64-BCMA, 또는 CD3-CD33을 포함하거나;
    (v) 상기 TriKE는 CD16-IL15-EPCAM, CD64-IL15-EPCAM, CD16-IL15-CD33, CD64-IL15-CD33, 또는 NKG2C-IL15-CD33을 포함하거나;
    (vi) 상기 항체는 항-CD20, 항-HER2, 항-CD52, 항-EGFR, 항-CD123, 항-GD2, 항-PDL1, 또는 항-CD38 항체를 포함하거나; 또는
    (vii) 상기 면역관문 저해제는 (a) PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 또는 저해성 KIR을 포함하는 면역관문 분자에 대한 길항제; (b) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리릴루맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이들의 유도체 또는 기능성 등가물 중 1종; 또는 (c) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 1종을 포함하는, 방법.
  50. 제43항에 있어서, 상기 제1 유전자 조작된 iPSC 또는 상기 제2 유전자 조작된 iPSC는,
    (i) 하나의 목적하는 통합 부위에 통합된 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 또는
    (ii) 상이한 목적하는 통합 부위에 통합된 2종 초과의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 목적하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD25, CD38, CD40L, CD44, CD54, CD56, CD58, CD69, CD71, OX40, 4-1BB, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, 및 TIGIT 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  52. 제50항에 있어서, 상기 목적하는 통합 부위는 TCR α 또는 β 불변 영역, CD25, CD38, CD40L, CD44, CD54, CD58, CD69, CD71, OX40 또는 4-1BB를 포함하며; 선택적으로, 상기 TCRα 또는 TCRβ, CD25, CD38, CD40L, CD44, CD54, CD58, CD69, CD71, OX40 또는 4-1BB는 상기 각각의 통합 부위에서의 상기 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드의 통합의 결과로서 녹아웃되는, 방법.
  53. 제43항에 있어서, 상기 iPSC-유래된 NK 세포 또는 상기 iPSC-유래된 T 세포는 하기를 포함하는 특징들 중 적어도 하나를 갖는, 방법:
    말초 혈액, 제대혈 또는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 수득된 이의 네이티브 상대 세포에 비해,
    (i) 개선된 지속성 및/또는 생존,
    (ii) 네이티브 면역 세포에 대한 증가된 저항성,
    (iii) 증가된 세포독성,
    (iv) 개선된 종양 침투,
    (v) 향상된 또는 획득된 ADCC,
    (vi) 방관자 면역 세포를 종양 부위로 이동시키고/시키거나, 활성화 또는 동원하는 데 있어서의 향상된 능력,
    (vii) 종양 면역억제를 감소시키는 향상된 능력, 및
    (viii) 종양 항원 탈출을 구제하는 데 있어서의 개선된 능력.
  54. 제43항에 있어서, 상기 제1 합성 세포 집단 또는 상기 제2 합성 세포 집단은 생체외에서 조절되는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, iPSC-유래된 NK 세포를 포함하는 상기 조절된 제1 합성 세포 집단은 조절되지 않은 상기 제1 합성 세포 집단에 비해, 증가된 수 또는 비의 I형 NKT 세포 및/또는 적응 NK 세포를 포함하거나; iPSC-유래된 T 세포를 포함하는 상기 조절된 제2 합성 세포 집단은 조절되지 않은 상기 제2 합성 세포 집단에 비해, 증가된 수 또는 비의 미감작 T 세포, 줄기세포 기억 T 세포, 및/또는 중앙 기억 T 세포를 포함하는, 방법.
  56. 제43항에 있어서,
    (i) 상기 iPSC-유래된 NK 세포와 상기 iPSC-유래된 T 세포는 100:1 내지 1:100 범위의 비이거나;
    (ii) 상기 방법은 하나 이상의 추가의 세포 집단을 상기 생성된 제1 및 제2 합성 세포 집단에 첨가하는 단계를 추가로 포함하거나;
    (iii) 상기 방법은 1종 이상의 치료제를 상기 생성된 제1 및 제2 합성 세포 집단에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가의 세포 집단은 조절 세포를 포함하는, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 조절 세포는 iPSC-유래된 면역 조절 세포 또는 골수계-유래된 억제인자 세포(MDSC)인, 방법.
  59. 제56항에 있어서, 상기 1종 이상의 치료제는 펩타이드, 사이토카인, 면역관문 저해제, 미토겐, 성장 인자, 작은 RNA, dsRNA(이중 가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 피더 세포, 피더 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 하나 이상의 관심 폴리핵산을 포함하는 벡터, 항체, 화학치료제 또는 방사성 모이어티, 또는 면역조절 약물을 포함하는, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 면역관문 저해제는,
    (a) PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2AR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 또는 저해성 KIR을 포함하는 1종 이상의 길항제 면역관문 분자;
    (b) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리릴루맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이들의 유도체 또는 기능성 등가물 중 1종 이상; 또는
    (c) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 적어도 1종을 포함하는, 방법.
  61. 제59항에 있어서, 상기 항체는,
    (a) 항-CD20, 항-HER2, 항-CD52, 항-EGFR, 항-CD123, 항-GD2, 항-PDL1 및/또는 항-CD38 항체;
    (b) 레툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 유블리툭시맙, 오카라투주맙, 오비누투주맙, 트라스투주맙, 퍼투주맙, 알렘투주맙, 서툭시맙, 디누툭시맙, 아벨루맙, 다라투무맙, 이사툭시맙, MOR202, 7G3, CSL362, 엘로투주맙 및 이들의 인간화된 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편 및 이들의 기능성 등가물 및 바이오시밀러 중 1종 이상; 또는
    (c) 다라투무맙을 포함하는, 방법.
  62. 제43항에 있어서, 상기 제1 합성 세포 집단과 상기 제2 합성 세포 집단을 혼합 집단으로 조합하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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