KR20210139472A - 조작된 iPSC 및 면역 효과기 세포에서의 CD3 재구성 - Google Patents

조작된 iPSC 및 면역 효과기 세포에서의 CD3 재구성 Download PDF

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KR20210139472A
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톰 통 리
알렉 위티
목타르 프리바디
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페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

게놈 조작된 iPSC의 유도 분화로부터 얻은 기능적으로 향상된 분화 효과기(effector) 세포를 얻기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 본원에 제공된 iPSC 유래 세포는 개선된 또는 향상된 치료학적 효과를 전달하는 안정하고 기능적인 게놈 편집을 갖는다. 단독으로, 또는 조합 치료에서의 항체 또는 관문 억제제와 함께 기능적으로 향상된 분화 효과기 세포를 포함하는 치료학적 조성물 및 이의 용도가 또한 제공된다.

Description

조작된 iPSC 및 면역 효과기 세포에서의 CD3 재구성
관련 출원
본 출원은 2019년 4월 11일에 출원된 미국 임시출원 제62/832,622호의 우선권을 주장하고, 이는 그 전체가 본원에 인용되어 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 광범위하게 기성품 면역세포 산물의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 개시내용은 생체내 치료학적으로 관련된 특성을 전달할 수 있는 다기능성 효과기(effector) 세포를 전달하기 위한 전략에 관한 것이다. 본 개시내용 하에 개발된 세포 산물은 환자 원천 세포 치료의 중대한 제한을 해결한다.
전자로 제출된 서열 목록의 참조
본 출원은 발명이 명칭이 056932-518001WO_SEQUENCE_LISTING_ST25.TXT인 본 출원에 의해 제출된 ASCII 텍스트 형식으로 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능한 형식(CRF)을 참조로 포함하고, 2020년 4월 2일에 생성되었고, 크기가 76,442 바이트이다.
입양 세포 치료의 분야는 현재 환자 원천 세포 및 공여자 원천 세포의 사용에 초점을 두는데, 이는 암 면역요법의 일관된 제조를 달성하고 이익일 수 있는 모든 환자에 치료를 전달하는 것이 특히 어렵게 한다. 유리한 환자 결과를 촉진하기 위해 입양으로 운반된 림프구의 효능 및 지속성을 개선할 필요성이 또한 있다. T 세포 및 자연 살해(NK: natural killer) 세포와 같은 림프구는 선천성 면역 및 적응 면역에서 중요한 역할을 하는 강력한 항종양 효과기이다. 그러나, 입양 세포 치료에 대한 이 면역 세포의 사용은 도전으로 있고, 충족되지 않은 개선 필요성을 갖는다. 따라서, T 세포 및 NK 세포, 또는 입양 면역요법에서의 다른 림프구의 완전한 가능성을 이용하기 위한 상당한 기회가 남아 있다.
반응 속도, 세포 탈진, 수혈된 세포의 소실(생존기간 및/또는 지속성), 표적 소실 또는 계통 스위치를 통한 종양 회피, 종양 표적화 정확성, 오프 타깃 독성, 오프 종양 효과에서 고형 종양, 즉 종양 미세환경에 대한 효능 및 관련된 면역 억제, 동원, 수송 및 침윤에 이르는 문제를 해결하는 기능적으로 개선된 효과기 세포에 대한 필요성이 있다.
본 발명의 목적은 단일 세포 유래 iPSC(induced pluripotent stem cell: 유도 만능 줄기 세포) 클론 라인으로부터 분화된 분화 비(非)만능 세포를 생성하는 방법 및 조성물을 제공하는 것이고, iPSC 라인은 이의 게놈에서 하나 또는 여러 유전자 변형을 포함한다. 상기 하나 또는 여러 유전자 변형은 DNA 삽입, 결실 및 치환을 포함하고, 변형은 보유되고, 분화, 증식, 계대배양 및/또는 이식 후 후속하여 유래된 세포에서 기능적으로 있다.
본 출원의 iPSC 유래 비만능 세포는 비제한적인 예로서 CD34 세포, 동형유전자성 내피 세포, HSC(조혈 줄기 세포 및 전구 세포), 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구세포, NK 세포 전구세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포 및 B 세포를 포함한다. 본 출원의 iPSC 유래 비만능 세포는 동일한 유전자 변형을 포함하는 iPSC로부터의 분화를 통해 이의 게놈에서 하나 또는 여러 유전자 변형을 포함한다. 유전 조작된 iPSC 유래 세포를 얻기 위한 조작된 클론 iPSC 분화 전략은 유도 분화에서의 iPSC의 발생 가능성이 iPSC에서 조작된 양상에 의해 불리하게 영향을 받지 않고, 또한 조작된 양상이 분화 세포에서 의도된 대로 기능할 것을 요한다. 추가로, 이 전략은 말초혈, 제대혈 또는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 얻은 T 세포 또는 NK 세포와 같은 일차 림프구의 조작에서 현재의 장벽을 극복하는데, 이러한 세포가 조작하기 어렵기 때문이고, 이러한 세포의 조작은 대개 재현성 및 균일성이 결여되어 높은 세포 사멸 및 낮은 세포 증식과 함께 불량한 세포 지속성을 나타내는 세포를 생성시킨다. 더욱이, 이 전략은 이종성 효과기 세포 집단의 생성을 피하고, 달리 시작하기 위해 외생인 일차 세포 원천을 사용하여 이것을 얻는다.
본 발명의 여러 양태는 (I), (II) 또는 (III)을 포함하는 방법을 이용하여 얻은 게놈 조작된 iPSC를 제공하고, 이는 각각 재프로그래밍 과정에 후속하여, 이것과 동시에 그리고 이것 전에 게놈 조작의 전략을 반영한다:
(I): 임의의 순서로 (i) 선택된 부위(들)에서의 표적화된 통합을 허용하기 위한 하나 이상의 작제물(들)을 iPSC로 도입하는 단계; (ii) (a) 선택된 부위 인식을 할 수 있는 하나 이상의 엔도뉴클레아제를 사용하여 선택된 부위(들)에서의 하나 이상의 이중 가닥 절단(들)을 iPSC로 도입하는 단계; 및 (b) 동시에 또는 순차적으로 내인성 DNA 수선이 선택된 부위(들)에서 표적화된 삽입-결실(in/del)을 생성하게 하도록 단계 (I)(ii)(a)의 iPSC를 배양하는 단계(이로써, 부분적으로 또는 완전히 분화된 세포로 분화할 수 있는 게놈 조작된 iPSC를 얻음)인 (i) 및 (ii) 중 하나 또는 둘 다에 의해 iPSC를 유전 조작하는 것.
(II): (i) 비만능 세포의 재프로그래밍을 개시하도록 비만능 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제, MEK 억제제, GSK3 억제제 및/또는 ROCK 억제제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (ii) 임의의 순서로 (a) 선택된 부위(들)에서의 표적화된 통합을 허용하기 위한 하나 이상의 작제물(들); (b) 선택된 부위 인식을 할 수 있는 적어도 하나의 엔도뉴클레아제를 사용하여 선택된 부위에서의 하나 이상의 이중 가닥 절단(들)인 (a) 및 (b) 중 하나 또는 둘 다를 단계 (II)(i)의 재프로그래밍하는 비만능 세포로 도입하는 단계(이후, 단계 (II)(ii)(b)의 세포는 내인성 DNA 수선이 선택된 부위(들)에서 표적화된 삽입-결실을 생성하게 하도록 배양되고; 그렇게 하여 얻은 게놈 조작된 iPSC는 적어도 하나의 기능적 표적화된 게놈 편집을 포함하고, 상기 게놈 조작된 iPSC는 부분적으로 또는 완전히 분화된 세포로 분화할 수 있음)를 포함하는, 게놈 조작된 iPSC를 얻도록 재프로그래밍하는 비만능 세포를 유전 조작하는 것.
(III): (i) 임의의 순서로 (a) 선택된 부위(들)에서의 표적화된 통합을 허용하기 위한 하나 이상의 작제물(들); (b) 선택된 부위 인식을 할 수 있는 적어도 하나의 엔도뉴클레아제를 사용하여 선택된 부위에서의 하나 이상의 이중 가닥 절단(들)인 (a) 및 (b) 중 하나 또는 둘 다를 비만능 세포로 도입하는 단계(여기서, 단계 (III)(i)(b)의 세포는 내인성 DNA 수선이 선택된 부위에서 표적화된 삽입-결실을 생성하게 하도록 배양됨); 및 (ii) 선택된 부위에서 표적화된 편집을 포함하는 게놈 조작된 iPSC를 얻도록 단계 (III)(i)의 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제, MEK 억제제, GSK3 억제제 및/또는 ROCK 억제제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시키는 단계(이로써, 적어도 하나의 기능적 표적화된 게놈 편집을 포함하는 게놈 조작된 iPSC를 얻고, 상기 게놈 조작된 iPSC는 부분 분화된 세포 또는 완전 분화된 세포로 분화할 수 있음)인 (i) 및 (ii)를 포함하는 게놈 조작된 iPSC를 얻도록 재프로그래밍을 위해 비만능 세포를 유전 조작하는 것.
상기 방법의 일 실시형태에서, 하나 이상의 선택된 부위에서의 적어도 하나의 표적화된 게놈 편집은 안전성 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적 활성 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보자; 또는 게놈 조작된 iPSC 또는 이로부터의 분화 세포의 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존기간을 촉진하는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드의 삽입을 포함한다. 일부 실시형태에서, 삽입을 위한 외인성 폴리뉴클레오타이드는 (1) CMV, EF1α, PGK, CAG, UBC, 또는 다른 항시적 프로모터, 유도성 프로모터, 시간 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 세포 유형 특이적 프로모터를 포함하는 하나 이상의 외인성 프로모터; 또는 (2) AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, CD38, GAPDH, TCR 또는 RUNX1, 또는 게놈 안전 항구의 기준을 충족하는 다른 유전자좌를 포함하는 선택된 부위에서 포함된 하나 이상의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법을 이용하여 생성된 게놈 조작된 iPSC는 카스파제, 티미딘 키나제, 사이토신 탈아미노효소, 변형된 EGFR, 또는 B 세포 CD20을 포함하는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 상이한 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 게놈 조작된 iPSC가 2개 이상의 자살 유전자를 포함할 때, 자살 유전자는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, CD38, GAPDH, TCR 또는 RUNX1을 포함하는 상이한 안전 항구 유전자좌에서 통합된다. 일 실시형태에서, 외인성 폴리뉴클레오타이드는 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21의 부분 길이 또는 전체 길이 펩타이드 및/또는 이들의 각각의 수용체를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 외인성 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21의 부분 또는 전체 펩타이드 및/또는 이들의 각각의 수용체는 융합 단백질의 형태이다.
일부 다른 실시형태에서, 본원에 제공된 방법을 이용하여 생성된 게놈 조작된 iPSC는 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약물 표적 후보자, 면역 반응 조절 및 조정, 또는 iPSC 또는 이로부터의 분화 세포의 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존기간을 억제하는 단백질과 연관된 하나 이상의 내인성 유전자에서 삽입-결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 파괴(disruption)를 위한 내인성 유전자는 CD38, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, RAG1, 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 유전자 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 또 다른 실시형태에서, 본원에 제공된 방법을 이용하여 생성된 게놈 조작된 iPSC는 AAVS1 유전자좌에서 외인성 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 카스파제 및 H11 유전자좌에서 외인성 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 티미딘 키나제를 포함한다.
일부 또 다른 실시형태에서, 접근법 (I), (II) 및/또는 (III)은 게놈 조작된 iPSC의 만능성을 유지하기 위해 게놈 조작된 iPSC를 MEK 억제제, GSK3 억제제 및 ROCK 억제제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 표적화된 게놈 편집을 포함하는 얻은 게놈 조작된 iPSC는 기능적이고, 분화 강력하고, 동일한 기능적 게놈 편집을 포함하는 비만능 세포로 분화할 수 있다.
본 발명은 또한 하기를 제공한다.
본 출원의 일 양태는 세포 또는 이의 집단을 제공하고, 여기서 세포는 유도 만능 세포(iPSC), 클론 iPSC 또는 클론 iPS 세포주 세포, 또는 임의의 위의 상기 iPSC를 분화하여 얻은 분화 세포이고; 임의의 위의 상기 세포는 적어도 TCRneg 및 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. iPSC 분화로부터 얻은 분화 세포의 일부 실시형태에서, 분화 세포는 비제한적인 예로서 CD34 세포, 동형유전자성 내피 세포, HSC(조혈 줄기 세포 및 전구 세포), 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구세포, NK 세포 전구세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포 및 B 세포를 포함하는 조혈 세포이고; 분화 조혈 세포(즉, 분화 CD34 세포, 분화 동형유전자성 내피 세포, 분화 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, 분화 조혈 만능 전구 세포, 분화 T 세포 전구세포, 분화 NK 세포 전구세포, 분화 T 세포, 분화 NKT 세포, 분화 NK 세포 또는 분화 B 세포)는 말초혈, 제대혈 또는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 얻은 이의 자연적 대응 세포와 비교하여 더 긴 텔로미어를 포함한다. iPSC 분화로부터 얻은 분화 세포의 일부 실시형태에서, 분화 세포는 T 세포 전구세포 또는 T 세포이다. iPSC 분화로부터 얻은 분화 세포의 일부 실시형태에서, 분화 세포는 NK 세포 전구세포 또는 NK 세포이다.
TCRneg 및 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 상기 iPSC 및 이의 분화 세포의 일부 실시형태에서, 세포는 (i) B2M 음성 또는 저; (ii) CIITA 음성 또는 저; (iii) HLA-G 또는 비절단성 HLA-G의 발현 도입; (iv) 고친화도 비절단성 CD16(hnCD16) 또는 이의 변이체; (v) 키메라 항원 수용체(CAR); (vi) 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이 펩타이드; (vii) CD38 음성; (viii) 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나; (ix) TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, RAG1, 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 유전자 중 적어도 하나에서의 결실 또는 발현 감소; 및 (x) HLA-E, 41BBL, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, Fc 수용체, 인게이저(engager), 및 이중특이적 인게이저, 다중특이적 인게이저 또는 보편적 인게이저와 커플링하기 위한 표면 트리거링 수용체 중 적어도 하나에서의 발현 도입 또는 발현 증가의 상기의 게놈 편집 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
적어도 TCRneg 및 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기에 및 본 출원에 걸쳐 기재된 것처럼 선택적인 추가 게놈 편집을 포함하는 상기 iPSC 및 이의 분화 세포의 일부 실시형태에서, 세포는 (i) 하나의 안전 항구 유전자좌에서 통합된 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ii) 상이한 안전 항구 유전자좌에서 통합된 2개 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 안전 항구 유전자좌는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, CD38, GAPDH, TCR 또는 RUNX1 중 적어도 하나를 포함한다. 하나의 특정 실시형태에서, 안전 항구 유전자좌는 H11이다. 하나의 특정 실시형태에서, 안전 항구 유전자좌 TCR은 TCR 알파 또는 TCR 베타의 불변 영역이다. 일부 실시형태에서, 안전 항구에서의 내인성 유전자의 파괴 또는 넉아웃을 초래하는 안전 항구 유전자좌에서의 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드의 삽입, 예를 들어 B2M, CD38 또는 TCR 알파/베타 유전자의 넉아웃을 초래하는 B2M, CD38 또는 TCR 알파/베타에서의 삽입.
세포 또는 이의 집단의 일부 실시형태에서, TCRneg 및 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 추가 게놈 편집 중 하나 이상을 포함하는 세포는 상기 게놈 편집을 포함하는 iPSC로부터 얻은 일부 실시형태에서는 분화 T 세포, 및 일부 다른 실시형태에서는 분화 NK 세포이고, 분화 T 세포 또는 분화 NK 세포는 말초혈, 제대혈 또는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 얻은 이의 자연적 대응 일차 T 세포 또는 NK 세포와 비교할 때 비제한적인 예로서 (i) 지속성 및/또는 생존기간의 개선; (ii) 자연적(즉, 수혜자) 면역 세포의 내성의 증가; (iii) 세포독성의 증가; (iv) 종양 침투의 개선; (v) ADCC의 향상 또는 획득; (vi) 종양 부위에 방관자 면역 세포를 이동시키고/시키거나 활성화하거나 동원하는 데 있어서의 능력의 향상; (vii) 종양 면역억제를 감소시키는 능력의 향상; (viii) 종양 항원 회피를 구제하는 능력의 개선; 및 (ix) 동족살해(fratricide)의 감소를 포함하는 상기의 특징 중 적어도 하나를 갖는다. TCRneg 및 표면 제시된 CD3 복합체, 또는 이의 아단위 또는 하위도메인이 가능하게 하는 하나 이상의 외인성 단백질 둘 다를 포함하는 분화 T 세포 또는 분화 NK 세포는, 세포 표면 CD3 음성인 TCRneg T 세포 또는 NK 세포(일차 또는 분화)와 비교할 때, 비제한적인 예로서 세포 표면 제시된 전체 또는 부분 내인성 또는 외인성 세포 표면 CD3 복합체, 및 CD3 관련된 세포 표면 트리거링 수용체에 결합하는 분자에 반응하는 능력을 포함하는 상기의 표현형적 특징 및 기능적 특징 중 적어도 하나를 추가로 갖고, 이 분자는 CD3 결합 항체 또는 이의 기능적 변이체, scFV 및/또는 다양한 CD3 인게이저를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
세포 또는 이의 집단의 일 실시형태에서, TCRneg 및 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포는 고친화도 비절단성 CD16 또는 이의 변이체(hnCD16)를 추가로 포함한다. 고친화도 비절단성 CD16 또는 이의 변이체(hnCD16)의 일부 실시형태는 (a) CD16의 엑토도메인 도메인에서의 F176V 및 S197P; (b) CD64로부터 기원한 전체 또는 부분 엑토도메인; (c) 비자연적(또는 비-CD16) 막관통 도메인; (d) 비자연적(또는 비-CD16) 세포내 도메인; (e) 비자연적(또는 비-CD16) 신호전달 도메인; (f) 비자연적 자극 도메인; 및 (g) CD16으로부터 기원하지 않는 막관통 도메인, 신호전달 도메인 및 자극 도메인의 상기 중 적어도 어느 하나를 포함하고, 동일한 폴리펩타이드 또는 상이한 폴리펩타이드로부터 기원한다. 일부 실시형태에서, 비자연적 막관통 도메인은 CD3D, CD3E, CD3G, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D, 또는 T 세포 수용체(TCR) 폴리펩타이드로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 비자연적 자극 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래된다. 일부 다른 실시형태에서, 비자연적 신호전달 도메인은 CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137(41BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래된다. hnCD16 또는 이의 변이체의 일부 특정 실시형태에서, 비자연적 막관통 도메인은 NKG2D로부터 유래되고, 비자연적 자극 도메인은 2B4로부터 유래되고, 비자연적 신호전달 도메인은 CD3ζ 또는 DAP10으로부터 유래된다.
세포 또는 이의 집단의 일 실시형태에서, TCRneg 및 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포는 적어도 하나의 키메라 항원 수용체(CAR)를 추가로 포함하고, CAR은 (i) T 세포 특이적 또는 NK 세포 특이적이고/이거나; (ii) 이중특이적 항원 결합 CAR이고/이거나; (iii) 스위치 가능한 CAR이고/이거나; (iv) 이합체화된 CAR이고/이거나; (v) 분할 CAR이고/이거나; (vi) 다중사슬 CAR이고/이거나; (vii) 유도성 CAR이고/이거나; (viii) 다른 CAR과 동시발현되고/되거나; (ix) 선택적으로 별개의 작제물에서 또는 이중시스트론성 작제물 또는 다중시스트론성 작제물에서 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이 펩타이드와 동시발현되고/되거나; (xi) 선택적으로 별개의 작제물에서 또는 이중시스트론성 작제물 또는 다중시스트론성 작제물에서 관문 억제제와 동시발현되고/되거나; (xii) CD19 또는 BCMA에 특이적이고/이거나; (xiii) ADGRE2, 탄산무수화효소 IX(CAIX), CCRI, CCR4, 암배아 항원(CEA: carcinoembryonic antigen), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV: cytomegalovirus) 감염된 세포의 항원, 상피 당단백질2(EGP 2: epithelial glycoprotein2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 부착 분자(EpCAM: epithelial cell adhesion molecule), EGFRvIII, 수용체 티로신-단백질 키나제 erb­ B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산-결합 단백질(FBP: folate-binding protein), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR: acetylcholine receptor), 엽산 수용체-a, 강글리오사이드 G2(GD2: Ganglioside G2), 강글리오사이드 G3(GD3: Ganglioside G3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER-2: human Epidermal Growth Factor Receptor 2), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT: human telomerase reverse transcriptase), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 아단위 알파-2(IL-13Rα2: Interleukin-13 receptor subunit alpha-2), κ-경쇄, 키나제 인서트 도메인 수용체(KDR: kinase insert domain receptor), 루이스 A(CA19.9), 루이스 Y(LeY), L1 세포 부착 분자(L1-CAM: L1 cell adhesion molecule), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A1(MAGE-A1: melanoma antigen family A1), MICA/B, 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA: prostate stem cell antigen), PRAME 전립선 특이적 막 항원(PSMA: prostate-specific membrane antigen), 종양 연관된 당단백질 72(TAG-72: tumor­ associated glycoprotein 72), TIM-3, TRBC1, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­ R2: vascular endothelial growth factor R2), 윌름스 종양 단백질(WT-1: Wilms tumor protein) 및/또는 병원균 항원 중 어느 하나에 특이적이라는 것의 상기 중 임의의 하나 이상일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 CAR 중 어느 하나는 TCRα 또는 TCRβ와 같은 TCR 유전자좌의 불변 영역에서 삽입될 수 있다. 일부 실시형태에서, TRAC 유전자좌 또는 TRBC 유전자좌에서 삽입된 CAR은 TCR의 각각의 내인성 프로모터에 의해 추진될 수 있다. 일부 실시형태에서, TRAC 유전자좌 또는 TRBC 유전자좌에서의 CAR의 삽입은 TCR 음성 또는 넉아웃을 초래한다. 일부 실시형태에서, TCR 음성 세포는 또한 CD3 음성이다.
관문 억제제가 CAR과 동시발현된 실시형태의 일부에서, 관문 억제제는 PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2aR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 또는 억제성 KIR을 포함하는 하나 이상의 관문 분자에 대한 길항제이다. CAR과 동시발현된 관문 억제제는, 임의의 상기 관문 분자에 특이적인, 항체, 또는 인간화된 변이체 또는 단편 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편, 및 이들의 기능적 균등물 및 바이오시밀러일 수 있다.
세포 또는 이의 집단의 일 실시형태에서, TCRneg 및 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포는 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이 펩타이드를 추가로 포함하고, 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체는 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21, 및 이들의 각각의 수용체 중 적어도 하나를 포함할 수 있거나; (i) 자가 절단 펩타이드를 사용한 IL15 및 IL15Rα의 동시발현; (ii) IL15와 IL15Rα의 융합 단백질; (iii) 절두된(truncated) IL15Rα(IL15Δ)의 세포내 도메인과의 IL15/IL15Rα 융합 단백질; (iv) IL15와 IL15Rα의 막 결합된 스시(Sushi) 도메인의 융합 단백질; (v) IL15와 IL15Rβ의 융합 단백질; (vi) IL15와 공통 수용체 γC의 융합 단백질(여기서, 공통 수용체 γC는 자연적 또는 변형됨); 및 (vii) IL15Rβ의 동종이합체 중 적어도 하나를 포함할 수 있고, (i) 내지 (vii) 중 어느 하나는 별개의 작제물에서 또는 이중시스트론성 작제물 또는 다중시스트론성 작제물에서 CAR과 동시발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 외인성 사이토카인 또는 수용체의 부분 또는 전체 펩타이드는 본원에 제공된 세포에서 일시적으로 발현된다. 일 실시형태에서, 세포 또는 이의 집단은 서열 번호 17, 서열 번호 19 또는 서열 번호 21과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성의 아미노산 서열을 포함하는 IL15Δ를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
세포 또는 이의 집단의 일 실시형태에서, TCRneg, 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기에 개시된 것과 같은 실시형태 (i) 내지 실시형태 (vii)를 포함하는 IL15 또는 변이체를 포함하는 세포는 B2M 음성 또는 저; CIITA 음성 또는 저; HLA-G 또는 비절단성 HLA-G의 발현 도입; 고친화도 비절단성 CD16 또는 이의 변이체(hnCD16); 키메라 항원 수용체(CAR), 세포 표면 발현된 추가의 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이 펩타이드(여기서, 사이토카인은 IL15가 아님); 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나; TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, RAG1, 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 유전자 중 적어도 하나에서의 결실 또는 발현 감소; 및 HLA-E, 41BBL, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, Fc 수용체, 인게이저, 및 이중특이적 인게이저, 다중특이적 인게이저 또는 보편적 인게이저와 커플링하기 위한 표면 트리거링 수용체 중 적어도 하나에서의 발현 도입 또는 발현 증가를 추가로 포함할 수 있다. IL15Δ 및 CAR 둘 다를 포함하는 세포 또는 이의 집단의 실시형태에서, IL15Δ는 별개의 작제물에서 또는 이중시스트론성 작제물 또는 다중시스트론성 작제물에서 CAR과 동시발현될 수 있다.
세포 또는 이의 집단의 일 실시형태에서, TCRneg 및 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포는 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포이고, 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포는 하나 이상의 관문 억제제의 존재 하에 종양 면역억제를 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 관문 억제제의 존재는 상기 세포를 받기 전에, 받은 동안에 또는 받은 후에 대상체에게 억제제(들)를 투여하는 것을 통해서이다. 일부 다른 실시형태에서, 하나 이상의 관문 억제제의 존재는 선택된 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 상기 세포에 관문 억제제 발현을 도입하여 상기 세포에 의한 억제제의 발현을 통해서이다. 일부 실시형태에서, 관문 억제제는 PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2aR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 또는 억제성 KIR을 포함하는 하나 이상의 관문 분자에 대한 길항제이다. 일부 다른 실시형태에서, 관문 억제제는 (a) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 데발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 이들의 유도체 또는 기능적 균등물 중 하나 이상; 또는 (b) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 적어도 하나를 포함한다.
본 출원의 다른 양태는 본 출원에 걸쳐 상기에 기재된 것과 같은 임의의 세포 또는 이의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, iPSC 또는 iPSC 유래 세포(본원에서 "분화 세포"라고도 칭함)는 본 출원의 표 1에 열거된 유전자형 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, TCRneg iPSC 또는 이로부터의 분화 세포는 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, TCRneg iPSC 또는 이로부터의 분화 세포는 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 및 hnCD16을 포함한다. 일부 실시형태에서, TCRneg iPSC 또는 이로부터의 분화 세포는 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; hnCD16; 및 IL15 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, TCRneg iPSC 또는 이로부터의 분화 세포는 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; hnCD16; 및 CAR을 포함한다. 일부 실시형태에서, TCRneg iPSC 또는 이로부터의 분화 세포는 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; hnCD16; IL15 또는 이의 변이체; 및 CAR을 포함한다. 일부 실시형태에서, TCRneg iPSC 또는 이로부터의 분화 세포는 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; hnCD16; CD38 음성; CAR; 및 상기에 그리고 본 출원에 걸쳐 제공된 것과 같은 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이 펩타이드를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, CAR은 ADGRE2, 탄산무수화효소 IX(CAIX), CCRI, CCR4, 암배아 항원(CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원(예를 들어, 세포 표면 항원), 상피 당단백질2(EGP 2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 부착 분자(EpCAM), EGFRvIII, 수용체 티로신-단백질 키나제 erb­ B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산-결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 엽산 수용체-a, 강글리오사이드 G2(GD2), 강글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER-2), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 아단위 알파-2(IL-13Rα2), κ-경쇄, 키나제 인서트 도메인 수용체(KDR), 루이스 A(CA19.9), 루이스 Y(LeY), L1 세포 부착 분자(L1-CAM), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A 1(MAGE-A1), MICA/B, 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), PRAME 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 종양 연관된 당단백질 72(TAG-72), TIM-3, TRBCI, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­ R2), 윌름스 종양 단백질(WT-1), 및 당해 분야에 공지된 다양한 병원균 항원 중 어느 하나에 특이적이다. TCRneg를 포함하는 세포의 다른 일부 실시형태에서, 세포는 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; hnCD16; 및 CAR을 포함하고, CAR은 CD19 또는 CD269(BCMA)에 특이적이다. TCRneg를 포함하는 세포의 일부 실시형태에서, 세포는 세포에서 발현될 때 표면 CD3 복합체, 또는 이의 아단위 또는 하위도메인; hnCD16; IL15 또는 이의 변이체; 및 CAR을 포함하고, CAR은 CD19 또는 CD269(BCMA)에 특이적이다. TCRneg를 포함하는 세포의 일부 다른 실시형태에서, 세포는 세포에서 발현될 때 표면 CD3 복합체, 또는 이의 아단위 또는 하위도메인; hnCD16; IL15 또는 이의 변이체; CD38 음성; 및 CAR을 포함하고, CAR은 CD19 또는 CD269(BCMA)에 특이적이다.
따라서, 본 출원의 추가의 양태는 본원에 제공된 것과 같은 임의의 분화 세포 이외에 하나 이상의 치료제를 포함하는 치료학적 용도를 위한 조성물을 제공한다. 치료학적 용도를 위한 조성물의 일부 실시형태에서, 치료제는 펩타이드, 사이토카인, 관문 억제제, 미토겐, 성장 인자, 소형 RNA, dsRNA(이중 가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 지지 세포(feeder cell), 지지 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 하나 이상의 관심 다중핵산을 포함하는 벡터, 항체, 화학치료제 또는 방사성 모이어티, 또는 면역조절 약물(IMiD: immunomodulatory drug)을 포함한다. 치료학적 용도를 위한 조성물의 일부 실시형태에서, 제공된 세포와 사용되는 관문 억제제는 PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2aR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 또는 억제성 KIR을 포함하는 하나 이상의 길항제 관문 분자를 포함한다. 치료학적 용도를 위한 조성물의 일부 실시형태에서, 제공된 세포와 사용된 관문 억제제는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 데발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 이들의 유도체 또는 기능적 균등물 중 하나 이상을 포함한다. 치료학적 용도를 위한 조성물의 일부 다른 실시형태에서, 제공된 세포와 사용된 관문 억제제는 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 적어도 하나를 포함한다. 치료학적 용도를 위한 조성물의 일부 실시형태에서, 치료제는 베네토클락스, 아자시티딘 및 포말리도마이드 중 하나 이상을 포함한다.
치료학적 용도를 위한 조성물의 일부 실시형태에서, 제공된 세포와 사용된 항체는 항-CD20, 항-CD22, 항-HER2, 항-CD52, 항-EGFR, 항-CD123, 항-GD2, 항-PDL1 및/또는 항-CD38 항체 중 어느 하나를 포함한다. 치료학적 용도를 위한 조성물의 일부 실시형태에서, 제공된 세포와 사용되는 항체는 리툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 우블리툭시맙, 오카라투주맙, 오비누투주맙, 이브리투모맙, 오크렐리주맙, 이노투주맙, 목세투모맙, 에프라투주맙, 트라스투주맙, 페르투주맙, 알렘투주맙, 세르툭시맙, 디누툭시맙, 아벨루맙, 다라투무맙, 이사툭시맙, MOR202, 7G3, CSL362, 엘로투주맙, 및 이들의 인간화된 변이체 또는 단편 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편, 및 이들의 기능적 균등물 및 바이오시밀러 중 하나 이상을 포함한다. 치료학적 용도를 위한 조성물의 일부 또 다른 실시형태에서, 제공된 세포와 사용된 항체는 다라투무맙을 포함한다.
본 출원은 또한 입양 세포 치료에 적합한 대상체에 대해 조성물의 도입에 의한 본원에 기재된 것과 같은 세포 또는 치료학적 조성물의 치료학적 용도를 제공한다. 일부 실시형태에서, 입양 세포 치료에 적합하거나 이를 필요로 하는 대상체는 자가면역 장애; 혈액학적 악성종양; 고형 종양; 암, 또는 바이러스 감염을 갖는다.
본 출원의 추가의 양태는 본원에 기재된 것과 같은 분화 세포를 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 TCRneg iPSC를 분화시키는 단계를 포함하고, 이것은 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 및 선택적으로 (i) B2M 음성 또는 저; (ii) CIITA 음성 또는 저; (iii) HLA-G 또는 비절단성 HLA-G의 발현 도입; (iv) 고친화도 비절단성 CD16(hnCD16) 또는 이의 변이체; (v) 키메라 항원 수용체(CAR); (vi) 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이 펩타이드; (vii) CD38 음성; (viii) 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나; (ix) TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, RAG1, 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 유전자 중 적어도 하나에서의 결실 또는 발현 감소; 및 (x) HLA-E, 41BBL, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, Fc 수용체, 인게이저, 및 이중특이적 인게이저, 다중특이적 인게이저 또는 보편적 인게이저와 커플링하기 위한 표면 트리거링 수용체 중 적어도 하나에서의 발현 도입 또는 발현 증가 중 하나 이상을 포함한다.
제조 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 (1) 내인성 TCR을 넉아웃하기 위해; 그리고 (2) 세포에서 발현될 때 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 tgTRAC, tgTRBC, tgTCRα, tgTCRβ, tgpTCRα, tgCD3(ε-δ)-TRAC, tgCD3(ε-γ)-TRBC, tgCD3(ε-γ)-TRAC, tgCD3(ε-δ)-TRBC, tgCD3(ε-γ)-ζ, tgCD3(ε-δ)-ζ, tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ, tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ 및/또는 tgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζ를 포함하는 적어도 하나의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 세포로 도입하기 위해 그리고 선택적으로 B2M 및 CIITA를 넉아웃하기 위해 또는 HLA-G 또는 비절단성 HLA-G, 고친화도 비절단성 CD16 또는 이의 변이체, CAR 및/또는 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이 펩타이드의 발현을 도입하기 위해 클론 iPSC를 게놈 조작하는 단계를 추가로 포함하고; CAR 및 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 또는 전체 펩타이드는 별개의 작제물에서 또는 이중시스트론성 작제물 또는 다중시스트론성 작제물에서 동시발현된다. 제조 방법의 일부 실시형태에서, iPSC의 게놈 조작은 표적화된 편집을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적화된 편집은 결실, 삽입 또는 삽입-결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적화된 결실/넉아웃 및 표적화된 삽입은 동시에 수행되고, 삽입은 결실이 수행되는 위치에 있다. 일부 실시형태에서, 표적화된 결실/넉아웃 및 표적화된 삽입은 임의의 방식으로 연속적으로 수행되고, 삽입 및 결실은 동일한 위치에 있거나 있지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적화된 편집 도구는 CRISPR, ZFN, TALEN, 호밍 뉴클레아제, 상동성 재조합, 또는 이들 방법 및 조성물의 임의의 다른 기능적 변형을 포함한다.
본 출원은 추가로 클론 iPSC의 표적화된 편집 도구 매개된 편집을 제공하고, 이로써 내인성 TCRα 또는 TCRβ가 결여된 편집된 클론 iPSC를 생성하고, 세포에서 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 tgTRAC, tgTRBC, tgTCRα, tgTCRβ, tgpTCRα, tgCD3(ε-δ)-TRAC, tgCD3(ε-γ)-TRBC, tgCD3(ε-γ)-TRAC, tgCD3(ε-δ)-TRBC, tgCD3(ε-γ)-ζ, tgCD3(ε-δ)-ζ, tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ, tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ 및/또는 tgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζ를 포함하는 적어도 하나의 외인성 단백질을 암호화하는 도입된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 또는 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나를 포함한다. 게놈 표적화 도구 매개된 편집의 일부 실시형태에서, 얻은 TCR 넉아웃은 내인성 TCRα 불변 영역(TRAC)의 표적화된 파괴를 통해서이다. 게놈 표적화 도구 매개된 편집의 일부 실시형태에서, 얻은 TCR 넉아웃은 내인성 TCRβ 불변 영역(TRBC)의 표적화된 파괴를 통해서이다. 상기에 게놈 표적화 도구 매개된 편집의 일부 실시형태에서, 편집은 내인성 TRAC 유전자좌 또는 TRBC 유전자좌에서의 CAR의 삽입을 추가로 포함하고/하거나, CAR은 TCRα 또는 TCRβ의 내인성 프로모터에 의해 추진되고/되거나, TCR은 CAR 삽입에 의해 넉아웃된다. 상기에 게놈 표적화 도구 매개된 편집의 일부 실시형태에서, 편집은 내인성 TRAC 유전자좌에서의 삽입을 추가로 포함하고, 외인성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 세포에서 발현될 때 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 tgTRAC, tgTCRα, tgpTCRα, tgCD3(ε-δ)-TRAC, tgCD3(ε-γ)-TRAC, tgCD3(ε-γ)-ζ, tgCD3(ε-δ)-ζ, tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ, tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ 또는 tgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζ를 포함한다. 상기에 게놈 표적화 도구 매개된 편집의 일부 실시형태에서, 편집은 내인성 TRBC 유전자좌에서의 삽입을 추가로 포함하고, 외인성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 세포에서 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 tgTRBC, tgTCRβ, tgCD3(ε-γ)-TRBC, tgCD3(ε-δ)-TRBC, tgCD3(ε-γ)-ζ, tgCD3(ε-δ)-ζ, tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ, tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ 및/또는 tgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζ를 포함한다.
제공된 것과 같은 세포 또는 이의 집단의 일 실시형태에서, 세포는 유도 만능 세포(iPSC), 클론 iPSC 또는 클론 iPS 세포주 세포, 또는 상기 iPSC를 분화하여 얻은 분화 세포이고; 세포는 TCRneg이고, 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)은 비결합성 재조합 TCR(nb-rTCR); 한정된 재조합 TCR(d-rTCR); 재조합 pre-TCR(p-rTCR)과 연관되거나; 비결합성 재조합 TCR(nb-rTCR-CD3)에 고정되거나; CD3 키메라 사슬(ccCD3)이다. 일 실시형태에서, nb-rTCR은 tgTRAC 및 tgTRBC 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. 일 실시형태에서, d-rTCR은 tgTCRα, 및 선택적으로 tgTCRβ를 포함하고, tgTCRα 및 tgTCRβ의 각각은 각각의 한정된 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, p-rTCR은 tgpTCRα, 및 선택적으로 tgTRBC 또는 tgTCRβ를 포함하고, tgTCRβ는 한정된 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, nb-rTCR-CD3은 (1) tgCD3(ε-δ)-TRAC; (2) tgCD3(ε-γ)-TRBC; (3) tgCD3(ε-γ)-TRAC; 및/또는 (4) tgCD3(ε-δ)-TRBC의 융합 단백질 중 하나 이상을 포함하고, 융합 단백질은 CD3ε, CD3δ, CD3γ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, 및/또는 TRAC 또는 TRBC의 전체 길이 또는 부분 길이를 포함한다. 일 실시형태에서, ccCD3은 tgCD3(ε-γ)-ζ, tgCD3(ε-δ)-ζ, tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ, tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ 및 tgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζ의 융합 단백질 중 적어도 하나를 포함하고, CD3ε, CD3δ 및/또는 CD3γ 단백질의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 포함하는 융합 단백질은 CDζ 단백질의 전체 길이 또는 부분 길이 엔도도메인, 및 선택적으로 CD28 신호전달 도메인 및 41BB 신호전달 도메인 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 세포질 도메인을 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 융합 단백질 tgCD3(ε-δ)-TRAC를 포함하는 nb-rTCR-CD3은 tgTRBC 또는 tgTCRβ를 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 융합 단백질 tgCD3(ε-γ)-TRBC를 포함하는 nb-rTCR-CD3은 tgTRAC 또는 tgTCRα를 추가로 포함한다. 아니면 또 다른 실시형태에서, tgTCRα 및 tgTCRβ를 포함하는 d-rTCR은 비변이체 NKT 세포의 TCRα 및 TCRβ를 포함한다.
상기의 실시형태의 관점에서, 제공된 것과 같은 세포는 일부 양태에서 nb-rTCR, d-rTCR 또는 p-rTCR의 재조합 TCR 중 하나를 포함하고, 재조합 TCR은 내인성 CD3 아단위와 복합체를 형성하고, 이로써 내인성 CD3 아단위의 세포 표면 제시 및 이의 신호전달이 가능하게 한다. 일부 다른 실시형태에서, 세포는 nb-rTCR-CD3 또는 ccCD3을 포함하고, 이로써 외인성 CD3 아단위의 세포 표면 제시 및 이의 신호전달이 가능하게 한다.
본 출원의 일 양태는 본원에 기재된 것과 같은 클론 iPSC 세포주 세포를 포함하는 클론 마스터 세포 은행을 제공한다. 본 출원의 다른 양태는 iPSC 및 본원에 기재된 것과 같은 상기 iPSC로부터 분화된 분화 세포의 다양한 실시형태를 포함하는 세포 또는 이의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 분화 세포를 포함하는 조성물은 치료학적 용도에 적합하다. 치료학적 용도를 위한 조성물의 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 원하는 바대로 분화 세포 이외에 하나 이상의 치료제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 치료제는 펩타이드, 사이토카인, 관문 억제제, 미토겐, 성장 인자, 소형 RNA, dsRNA(이중 가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 지지 세포, 지지 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 하나 이상의 관심 다중핵산을 포함하는 벡터, 항체, 화학치료제 또는 방사성 모이어티, 또는 면역조절 약물(IMiD)을 포함한다.
본 출원의 추가 양태는 입양 세포 치료에 적합한 대상체에 대한 조성물의 도입에 의해 다양한 실시형태에서 상기 치료학적 조성물의 치료학적 용도를 제공하고, 대상체는 자가면역 장애; 혈액학적 악성종양; 고형 종양; 암 또는 바이러스 감염을 갖는다.
본 출원의 추가의 양태는 TCRneg iPSC를 분화하여 분화 효과기 세포를 제조하는 방법을 제공하고, iPSC는 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 선택적으로 iPSC는 (i) B2M 음성 또는 저; (ii) CIITA 음성 또는 저; (iii) HLA-G 또는 비절단성 HLA-G의 발현 도입; (iv) 고친화도 비절단성 CD16(hnCD16) 또는 이의 변이체; (v) 키메라 항원 수용체(CAR); (vi) 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이 펩타이드; (vii) 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나; (viii) CD38, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, RAG1, 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 유전자 중 적어도 하나에서의 결실 또는 발현 감소; 및 (ix) HLA-E, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR, Fc 수용체, 인게이저, 및 이중특이적 인게이저, 다중특이적 인게이저 또는 보편적 인게이저와 커플링하기 위한 표면 트리거링 수용체 중 적어도 하나에서의 발현 도입 또는 발현 증가 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 본 출원의 세포 제조 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 게놈 조작된 TCRneg iPSC를 얻도록 클론 iPSC의 TCR을 넉아웃하여, 그리고 동시에 또는 후속하여 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 넉인하여; 또는 T 세포-TCR이 아니고 iTCRαβ를 포함하는 클론 iPSC를 제공하도록 iPSC로 비변이체 NKT 세포를 재프로그래밍하여 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하는 단계; 및 B2M 및 CIITA를 넉아웃하여, 또는 HLA-G 또는 비절단성 HLA-G, 고친화도 비절단성 CD16 또는 이의 변이체, CAR 및/또는 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이 펩타이드의 발현을 도입하여 TCR 음성 세포를 게놈 조작하는 선택적인 단계를 추가로 포함하고, 상기 CAR 및 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인의 부분 또는 전체 펩타이드 또는 이의 수용체는 별개의 작제물에서 또는 이중시스트론성 작제물에서 동시발현된다.
세포 제조 방법의 일 실시형태에서, cs-CD3을 제공하기 위해 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 넉인하는 단계는 (i) 발현될 때 nb-rTCR을 제공하도록 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 tgTRAC 및 tgTRBC 중 하나 또는 둘 다; (ii) 발현될 때 d-rTCR을 제공하도록 tgTCRα, 및 선택적으로 tgTCRβ, 암호화 폴리뉴클레오타이드(여기서, tgTCRα 및 tgTCRβ의 각각은 각각의 한정된 가변 영역을 포함함); (iii) 발현될 때 p-rTCR을 제공하도록 tgpTCRα, 및 선택적으로 tgTRBC 또는 tgTCRβ, 암호화 폴리뉴클레오타이드(여기서, tgTCRβ은 한정된 가변 영역을 포함함); (iv) nb-rTCR-CD3을 제공하도록 (1) tgCD3(ε-δ)-TRAC, (2) tgCD3(ε-γ)-TRBC, (3) tgCD3(ε-γ)-TRAC 및/또는 (4) tgCD3(ε-δ)-TRBC의 융합 단백질 중 하나 이상을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드(여기서, 융합 단백질은 CD3ε, CD3δ, CD3γ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, 및/또는 TRAC 또는 TRBC의 전체 길이 또는 부분 길이를 포함함); 또는 (v) ccCD3을 제공하도록 (1) tgCD3(ε-γ)-ζ, (2) tgCD3(ε-δ)-ζ, (3) tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ, (4) tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ 및 (5) tgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζ의 융합 단백질 중 하나 이상을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드(여기서, CD3ε, CD3δ 및/또는 CD3γ 단백질의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 포함하는 융합 단백질은 CDζ 단백질의 전체 길이 또는 부분 길이 엔도도메인, 및 선택적으로 CD28 신호전달 도메인 및 41BB 신호전달 도메인 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 세포질 도메인을 추가로 포함함) 중 하나를 iPSC로 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 기재된 것과 같은 세포 제조 방법의 일부 실시형태에서, 융합 단백질 tgCD3(ε-δ)-TRAC를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 iPSC로 도입하는 단계는 nb-rTCR-CD3을 제공하도록 tgTRBC 또는 tgTCRβ를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질 tgCD3(ε-γ)-TRBC를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 iPSC로 도입하는 단계는 nb-rTCR-CD3을 제공하도록 tgTRAC 또는 tgTCRα를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질 tgCD3(ε-γ)-TRBC를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 iPSC로 도입하는 단계는 nb-rTCR-CD3을 제공하도록 tgTRAC 또는 tgTCRα를 추가로 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, d-rTCR을 제공하도록 tgTCRα를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 선택적으로 tgTCRβ를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 iPSC로 도입하는 단계에서, tgTCRα 및 tgTCRβ는 각각 비변이체 NKT 세포의 TCRα 및 TCRβ를 포함한다.
제공된 것과 같은 세포 제조 방법의 다양한 실시형태에서, 게놈 조작은 결실 및/또는 삽입을 포함하는 표적화된 편집이다. 이러한 표적화된 편집은 CRISPR, ZFN, TALEN, 호밍 뉴클레아제, 상동성 재조합, 또는 이들 도구의 임의의 다른 기능적 변형에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 일 양태는 본원에 제공된 것과 같은 다양한 실시형태의 클론 iPSC의 CRISPR 매개된 편집을 제공하고, 이로써 TCRneg이고 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 편집된 iPSC를 얻고, 편집된 클론 iPSC는 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 매개된 편집은 TRAC 유전자좌 또는 TRBC 유전자좌에서의 CAR의 삽입을 추가로 포함하고/하거나, CAR은 TCR의 내인성 프로모터에 의해 추진되고/되거나, TCR은 CAR 삽입에 의해 넉아웃된다.
본 출원의 또 다른 양태는 조합 치료의 방법을 제공하고, 상기 방법은 TCRneg, 및 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 및 선택된 다중특이적 인게이저를 포함하는 효과기 세포를 치료 중인 대상체에게 제공하는 단계를 포함하고, 효과기 세포는 제공된 것과 같은 분화 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법에서의 선택된 다중특이적 인게이저는 (i) T 세포 인게이저; (ii) NK 세포 인게이저; (iii) 이중특이적 T 세포 인게이저(BiTE); (iv) 이중특이적 살해 세포 인게이저(BiKE); (v) 삼중특이적 살해 세포 인게이저(TriKE); (vi) CD3 인게이저; 또는 (vii) CD16 인게이저 중 적어도 하나이다. 일부 실시형태에서, 선택된 다중특이적 인게이저는 CD3 인게이저이고, CD3 인게이저는 cs-CD3에 결합하는 제1 가변 분절 및 (i) ADGRE2, 탄산무수화효소 IX(CAIX), CCRI, CCR4, 암배아 항원(CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원, 상피 당단백질2(EGP 2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 부착 분자(EpCAM), EGFRvIII, 수용체 티로신-단백질 키나제 erb­ B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산-결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 엽산 수용체-a, 강글리오사이드 G2(GD2), 강글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER-2), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 아단위 알파-2(IL-13Rα2), κ-경쇄, 키나제 인서트 도메인 수용체(KDR), 루이스 A(CA19.9), 루이스 Y(LeY), L1 세포 부착 분자(L1-CAM), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A 1(MAGE-A1), MICA/B, 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), PRAME 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 종양 연관된 당단백질 72(TAG-72), TIM-3, TRBCI, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­ R2), 윌름스 종양 단백질(WT-1) 및/또는 병원균 항원; 또는 (ii) BCMA, CD19, CD20, CD33, CD38, CD52, CD123, CEA, EGFR, EpCAM, GD2, GPA33, HER2, MICA/B, PDL1 및/또는 PSMA; 또는 (iii) CD19, CD33, CD123, CEA, EpCAM, GPA33, HER2 및/또는 PSMA 중 적어도 하나를 포함하는 항원에 결합하는 제2 가변 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3 인게이저는 블리나투모맙, 카투막소맙, 에르투막소맙, RO6958688, AFM11, MT110/AMG 110, MT111/AMG211/MEDI-565, AMG330, MT112/BAY2010112, MOR209/ES414, MGD006/S80880, MGD007 및/또는 FBTA05 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3 인게이저는 효과기 세포와 동시에 또는 이에 후속하여 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 효과기 세포는 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포를 포함하는 분화 조혈 세포를 포함하고, 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포는 CD38 넉아웃, 고친화도 비절단성 CD16 또는 이의 변이체를 포함하고, 선택적으로 (i) B2M 및 CIITA 넉아웃; (ii) HLA-G 또는 비절단성 HLA-G, CAR 및/또는 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이 펩타이드의 발현 도입(여기서, CAR 및 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이 펩타이드는 별개의 작제물에서 또는 이중시스트론성 작제물에서 동시발현됨); 및/또는 (iii) 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나를 포함한다.
본 출원의 또 다른 양태는 입양 세포 치료에서 효과기 세포에 대한 수혜자 T 세포에 의한 동종거부를 감소시키거나 예방하는 방법을 제공하고, 방법은 (i) 항-CD3 작용제, 및 (ii) TCRneg, 및 CD3 인게이저가 예비로딩된 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 포함하는 효과기 세포를 치료 중인 대상체에게 제공하는 단계를 포함하고, 효과기 세포는 본원에 제공된 분화 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 항-CD3 작용제는 CD3 항체 또는 CD3-CAR이고, CD3-CAR은 NK 세포에 포함되고; 항-CD3 작용제는 수혜자 T 세포를 탈활성화하고, 이로써 동종거부를 감소시키거나 예방한다. 일부 실시형태에서, 효과기 세포의 cs-CD3에 결합하는 제1 가변 분절을 포함하는 상기 CD3 인게이저는 자가면역 장애; 혈액학적 악성종양; 고형 종양; 암 또는 바이러스 감염과 관련된 항원에 결합하는 제2 가변 분절을 포함한다. 항원에 결합하는 제2 가변 분절을 포함하는 CD3 인게이저의 일부 실시형태에서, 항원은 (i) ADGRE2, 탄산무수화효소 IX(CAIX), CCRI, CCR4, 암배아 항원(CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원, 상피 당단백질2(EGP 2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 부착 분자(EpCAM), EGFRvIII, 수용체 티로신-단백질 키나제 erb­ B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산-결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 엽산 수용체-a, 강글리오사이드 G2(GD2), 강글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER-2), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 아단위 알파-2(IL-13Rα2), κ-경쇄, 키나제 인서트 도메인 수용체(KDR), 루이스 A(CA19.9), 루이스 Y(LeY), L1 세포 부착 분자(L1-CAM), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A 1(MAGE-A1), MICA/B, 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), PRAME 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 종양 연관된 당단백질 72(TAG-72), TIM-3, TRBCI, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­ R2), 윌름스 종양 단백질(WT-1) 및/또는 병원균 항원; 또는 (ii) BCMA, CD19, CD20, CD33, CD38, CD52, CD123, CEA, EGFR, EpCAM, GD2, GPA33, HER2, MICA/B, PDL1 및/또는 PSMA; 또는 (iii) CD19, CD33, CD123, CEA, EpCAM, GPA33, HER2 및/또는 PSMA 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 또 다른 실시형태에서, CD3 인게이저는 블리나투모맙, 카투막소맙, 에르투막소맙, RO6958688, AFM11, MT110/AMG 110, MT111/AMG211/MEDI-565, AMG330, MT112/BAY2010112, MOR209/ES414, MGD006/S80880, MGD007 및/또는 FBTA05 중 적어도 하나를 포함한다.
본원에 제공된 것과 같은 조성물 및 방법의 다양한 목적 및 이점은 동반된 도면과 함께 취해져 하기 설명으로부터 명확해질 것이고, 이는 예시 및 예, 본 발명의 소정의 실시형태의 방식으로 기재된다.
도 1a 내지 도 1c는 세포에서 내인성 TCR의 파괴 시 재조합 TCR 복합체, 또는 이의 아단위와 연관된 세포 표면 제시된 CD3 복합체, 또는 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 생성하기 위한 예시적인 디자인을 보여준다: (1) nb-rTCR(비결합성 재조합 TCR); (2) d-rTCR(한정된 재조합 TCR); (3) p-rTCR(선택적인 비결합성 TCRβ를 갖는 재조합 pre-TCRα); (4) nb-rTCR-CD3(비결합성 재조합 TCR 고정된 CD3); 및 (5) ccCD3(CD3 키메라 사슬).
도 2는 iPSC 유래 세포에서 세포 표면 발현된 사이토카인을 위한 여러 작제물 디자인의 그래프 표시이다. IL15는 다른 바람직한 사이토카인으로 대체될 수 있는 예시적인 예로서 사용된다.
도 3은 단일 세포 유래된 TRAC 표적화된 CAR TiPSC 클론으로의 αβT 세포의 재프로그래밍 및 조작을 보여준다. A: 표시된 것처럼 상이한 단계에서의 배양의 위상 대비 이미지. B: 재프로그래밍 전 αβT 세포(왼쪽 패널), 분류 전 재프로그래밍되고 조작된 세포 풀 및 클론 TiPSC 클론(오른쪽 패널)의 유세포분석법 프로파일.
도 4는 hnCD16 발현, B2M 넉아웃("B2M"으로 표시됨; HLA-A2 발현 소실), HLA-G 발현 및 IL-15/IL-15ra(LNGFR) 작제물 발현의 단계별 조작을 나타내는 성숙 TCRneg iPSC 유래 NK 세포의 유세포분석법의 그래프 표시이다.
도 5는 유세포분석법에 의해 결정된 텔로미어 길이의 그래프 표시이고, iPSC로부터의 성숙 분화 NK 세포는 성체 말초혈 NK 세포와 비교하여 더 긴 텔로머를 유지한다.
도 6은 전체 길이 IL15/IL15Rα 융합 작제물(채워진 원; 양성 대조군), 또는 세포질 신호전달 도메인이 없는 절두된 IL15/IL15Rα 융합 작제물(빈 원)에 의해 형질도입된 iNK 세포가 외인성 가용성 IL2와 독립적인 동일한 배양에서 비형질도입된 세포 또는 GFP 형질도입된 세포와 비교하여 생존기간 이점을 갖는다는 것을 보여준다. A: 외인성 IL2의 존재 하; B: 외인성 IL2의 존재 없이.
도 7은 TCRβ를 갖거나 갖지 않는 비변이체 NKT TCRα를 형질도입하기 위한 예시적인 작제물을 보여준다.
도 8a 내지 도 8b는 CD3이 비변이체 NKT TCR 형질도입된 iPSC 또는 iPSC 유래 iCD34 전구 세포에 의해 발현되지 않는다는 것을 보여준다.
도 9a 내지 도 9c는 비변이체 NKT TCR이 TCR 결핍 iPSC 유래 T 세포에서 CD3의 표면 발현을 지지한다는 것을 보여준다. 도 9a 내지 도 9b는 CD3 및 TCR 발현에 대한 다양한 시점에서의 유세포분석법 결과를 보여준다. 도 9c는 iCD34 분화 후 25일에 CD3의 MFI를 보여준다.
도 10은 NKT TCRβ를 갖거나 갖지 않는 NKT TCRα를 포함하는 iPSC 유래 T 세포가 사합체를 사용한 세포 표면 CD3 결합에 의한 자극 시 응집한다는 것을 보여준다.
도 11은 NKT TCRβ를 갖거나 갖지 않는 NKT TCRα를 포함하는 iPSC 유래 T 세포가 CD3 사합체 자극을 발현하는 증가된 CD25를 갖는다는 것을 보여준다.
도 12a 내지 도 12b는 NKT TCRβ를 갖거나 갖지 않는 NKT TCRα를 포함하는 iPSC 유래 T 세포가 CD3 결합 BiTE의 존재 하에 향상된 세포독성을 갖는다는 것을 보여준다. 도 12a는 10:1의 효과기 대 표적 비로 CD19xCD3 및 CD20xCD3 BiTE의 존재 하에 표적 세포의 향상된 사멸을 나타내는 대표적인 FACS 선도를 보여준다. 도 12b는 NKT TCRβ를 갖거나 갖지 않는 NKT TCRα를 포함하는 iPSC 유래 효과기 세포에 대한 특정한 세포독성의 백분율을 보여준다.
iPSC(유도 만능 줄기 세포)의 게놈 변형은 폴리뉴클레오타이드 삽입, 결실 및 치환을 포함한다. 게놈 조작된 iPSC에서의 외인성 유전자 발현은 대개 원래의 게놈 조작된 iPSC의 연장된 클론 증식 후, 세포 분화 후 및 게놈 조작된 iPSC로부터 유래된 세포로부터 탈분화된 세포 유형에서 유전자 침묵화 또는 유전자 발현 감소와 같은 문제점에 부딪친다. 다른 한편, 말초혈, 제대혈 또는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 단리된 T 세포 또는 NK 세포와 같은 일차 면역 세포의 직접적인 조작은 도전적이고, 입양 세포 치료를 위해 조작된 면역 세포의 준비 및 전달에 대한 장애물을 나타낸다. 본 발명은 비제한적인 예로서 HSC(조혈 줄기 세포 및 전구 세포), T 세포 전구 세포, NK 세포 전구 세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포를 포함하는 iPSC로부터 분화된 분화 세포로, 생착, 수송, 호밍, 이동, 세포독성, 생존능력, 유지, 증식, 수명, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존기간과 관련한 개선된 치료학적 특성 개선을 제공하는, 자살 유전자 및 다른 기능적 양상을 포함하는 하나 이상의 외인성 유전자를 안정하게 통합하기 위한 효과적이고 신뢰성 있고 표적화된 접근법을 제공한다.
정의
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 연결되어 사용된 과학 용어 및 기술 용어는 당업자가 흔히 이해하는 의미를 가져야 한다. 추가로, 맥락에 의해 달리 필요하지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함해야 하고, 복수 용어는 단수를 포함해야 한다.
본 발명이 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등으로 제한되지 않고 그러므로 변할 수 있다고 이해되어야 한다. 본원에 사용된 전문용어는 오직 특정 실시형태를 기술할 목적을 위한 것이고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않고, 이는 청구항에 의해 오로지 한정된다.
본원에 사용된 "일", "하나" 및 "이"라는 관사는 본원에서 그 관사의 문법상 목적어의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭하도록 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
대안(예를 들어, "또는")의 사용은 대안의 하나, 둘 다, 또는 임의의 이들의 조합 중 어느 하나를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
"및/또는"이라는 용어는 대안의 하나 또는 둘 다 중 어느 하나를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 "약" 또는 "대략"이라는 용어는 기준 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 비교하여 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%만큼 변하는 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시형태에서, "약" 또는 "대략"이라는 용어는 약 기준 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2% 또는 ± 1%의 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 범위를 지칭한다.
본원에 사용된 "실질적으로" 또는 "본질적으로"이라는 용어는 기준 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 비교하여 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 이보다 높은 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시형태에서, "본질적으로 동일한" 또는 "실질적으로 동일한"이라는 용어는 기준 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 대락 동일한 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 범위를 지칭한다.
본원에 사용된 "실질적으로 없는" 및 "본질적으로 없는"이라는 용어는 상호교환 가능하고, 세포 집단 또는 배양 배지와 같은 조성을 기술하도록 사용될 때 특별 물질 또는 이의 원천이 없는, 예컨대 특별 물질 또는 이의 원천이 95% 없거나, 96% 없거나, 97% 없거나, 98% 없거나, 99% 없거나, 종래의 수단에 의해 측정된 것처럼 검출 불가능한 조성을 지칭한다. 조성에서 소정의 성분 또는 물질이 "없는" 또는 "본질적으로 없는"이라는 용어는 또한 이러한 성분 또는 물질이 (1) 임의의 농도로 조성에 포함되지 않거나, (2) 기능적으로 불활성이지만 낮은 농도로 조성에 포함됨을 의미한다. 유사한 의미는 "부재"라는 용어에 적용될 수 있고, 여기서 조성의 특정 물질 또는 이의 원천의 부재를 지칭한다.
본 명세서에 걸쳐, 맥락이 달리 요하지 않는 한, "포함한다", "포함한" 및 "포함하는"이라는 단어는 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소의 그룹의 배제가 아니라 기술된 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소의 그룹의 포함을 함축하는 것으로 이해될 것이다. 특정 실시형태에서, "포함한다", "갖는다", "함유한다" 및 "수반한다"라는 용어는 동의어로 사용된다.
"이루어진"에 의해 "이루어진"이라는 구절에 뒤따르는 어떤 것이든 이것을 포함하고, 이것으로 제한됨을 의도된다. 이와 같이, "이루어진"이라는 구절은 열거된 요소가 필요하거나 의무적이고, 다른 요소가 존재하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다.
"본질적으로 이루어진"에 의해 그 구절 뒤에 열거된 임의의 요소를 포함하고, 열거된 요소에 대해 개시내용에 기재된 활성 또는 작용과 상호작용하지 않거나 이에 기여하지 않는 다른 요소로 제한됨이 의도된다. 이와 같이, "본질적으로 이루어진"이라는 구절은 열거된 요소가 필요하거나 의무적이지만, 다른 요소가 선택적이지 않고, 열거된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지 또는 아닌지에 따라 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다.
본 명세서에 걸쳐 "하나의 실시형태", "일 실시형태", "특정 실시형태", "관련된 실시형태", "소정의 실시형태", "추가의 실시형태" 또는 "추가 실시형태" 또는 이들의 조합에 대한 언급은 그 실시형태와 연관되어 기재된 특정한 특성, 구조 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다. 이와 같이, 본 명세서에 걸쳐 다양한 위치에서의 상기의 구절의 출현은 반드시 동일한 실시형태를 모두 지칭할 필요는 없다. 더욱이, 하나 이상의 실시형태에서 임의의 적합한 방식으로 특정한 특성, 구조 또는 특징이 조합될 수 있다.
"생체외"라는 용어는 일반적으로 바람직하게는 자연 조건의 최소 변경으로 유기체 밖의 인공 환경에서 살아 있는 조직에서 또는 상에서 수행된 실험 또는 측정과 같은 유기체 밖에서 발생하는 활성을 지칭한다. 특정 실시형태에서, "생체외" 절차는 보통 멸균 조건 하에 통상적으로 수시간 또는 약 24시간 이하 동안이지만 상황에 따라 48시간 또는 72시간 또는 더 긴 기간 동안 유기체로부터 취하고 실험실 장치에서 배양된 살아 있는 세포 또는 조직을 수반한다. 소정의 실시형태에서, 이러한 조직 또는 세포는 생체외 처리를 위해 수집되고 동결되고 나중에 해동된다. 살아 있는 세포 또는 조직을 사용하여 수일보다 길게 지속하는 조직 배양 실험 또는 절차는 통상적으로 "시험관내"인 것으로 여겨지지만, 소정의 실시형태에서 이 용어가 생체외와 상호교환 가능하게 사용될 수 있다.
"생체내"라는 용어는 일반적으로 유기체 내에서 발생하는 활성을 지칭한다.
본원에 사용된 "재프로그래밍" 또는 "탈분화" 또는 "세포 효능의 증가" 또는 "발생 효능의 증가"라는 용어는 세포의 효능을 증가시키는 방법 또는 덜 분화된 상태로 세포를 탈분화시키는 방법을 지칭한다. 예를 들어, 세포 효능이 증가된 세포는 비재프로그래밍된 상태의 동일한 세포와 비교하여 발달 가소성이 더 높다(즉, 더 많은 세포 유형으로 분화할 수 있음). 바꾸어 말하면, 재프로그래밍된 세포는 비재프로그래밍된 상태의 동일한 세포보다 덜 분화된 상태로 있는 것이다.
본원에 사용된 "분화"라는 용어는 비특수화된("비결정된") 세포 또는 덜 특수화된 세포가 예를 들어 혈액 세포 또는 근육 세포와 같은 특수화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 세포 또는 분화 유도된 세포는 세포의 계통 내에 보다 특수화된("결정된") 위치에서 취해진 것이다. "결정된(committed)"이라는 용어는, 분화의 과정에 적용될 때, 정상 상황 하에서 이것이 특정한 세포 유형 또는 세포 유형의 하위집단으로 계속해서 분화하고, 정상 상황 하에서 상이한 세포 유형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포 유형으로 되돌아갈 수 없는 지점으로 분화 경로에서 진행된 세포를 지칭한다. 본원에 사용된 "만능(pluripotent)"이라는 용어는 신체 또는 체세포(즉, 고유배)의 모든 계통을 형성하는 세포의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 배아 줄기 세포는 외배엽, 중배엽 및 내배엽의 3개의 배엽의 각각으로부터 세포를 형성할 수 있는 만능 줄기 세포의 유형이다. 만능성은 완전한 유기체를 생성할 수 없는 불완전하게 또는 부분적으로 만능인 세포(예를 들어, 외배반 줄기 세포 또는 EpiSC)로부터 완전한 유기체(예를 들어, 배아 줄기 세포)를 생성할 수 있는 보다 원시인, 보다 만능인 세포에 이르는 발생 가능성의 연속체이다.
본원에 사용된 "유도 만능 줄기 세포" 또는 iPSC와 같은 용어는, 중배엽, 내배엽 및 외배엽의 모든 3개의 배엽 또는 진피 층의 조직으로 분화할 수 있는 세포로 유도되거나 변경된, 즉 재프로그래밍된, 분화된 성체, 신생아 또는 태아 세포로부터, 재프로그래밍 인자 및/또는 소분자 화학 추진 방법을 이용하여 줄기 세포가 시험관내 생산된다는 것을 의미한다. 생산된 iPSC는 자연에서 발견되므로 세포라 칭하지 않는다.
본원에 사용된 "배아 줄기 세포"라는 용어는 배아 배반포의 내부 세포 덩어리의 자연 발생 만능 줄기 세포를 지칭한다. 배아 줄기 세포는 만능성이고, 외배엽, 내배엽 및 중배엽의 3개의 주요 배엽의 모든 분화체로 발생 동안 생긴다. 이들은 배아외 막 또는 태반에 기여하지 않고, 즉 전능성이 아니다.
본원에 사용된 "다능성 줄기 세포"라는 용어는 모든 3개는 아니지만 1개 이상의 배엽(외배엽, 중배엽 및 내배엽)의 세포로 분화하는 발생 가능성을 갖는 세포를 지칭한다. 이와 같이, 다능성 세포는 또한 "부분적으로 분화된 세포"라 칭할 수 있다. 다능성 세포는 당해 분야에 잘 공지되어 있고, 다능성 세포의 예는 예를 들어 조혈 줄기 세포 및 신경 줄기 세포와 같은 성체 줄기 세포를 포함한다. "다능성"은 세포가 다른 계통의 세포가 아니라 주어진 계통에서의 세포의 많은 유형을 형성할 수 있다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 다능성 조혈 세포는 많은 상이한 유형의 혈액 세포(적혈구, 백혈구, 혈소판 등)를 형성할 수 있지만, 이것은 뉴런을 형성하지는 않는다. 따라서, 용어 "다능성"은 전능성 및 만능보다 발생 가능성의 정도가 덜한 세포의 상태를 지칭한다.
만능성은 부분적으로 세포의 만능성 특징을 평가하여 결정될 수 있다. 만능성 특징은 (i) 만능 줄기 세포 형태; (ii) 비제한된 자가 재생에 대한 가능성; (iii), 비제한적인 예로서 SSEA1(마우스 단독), SSEA3/4, SSEA5, TRA1-60/81, TRA1-85, TRA2-54, GCTM-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133/프로미닌, CD140a, CD56, CD73, CD90, CD105, OCT4, NANOG, SOX2, CD30 및/또는 CD50을 포함하는 만능 줄기 세포 마커의 발현; (iv) 모든 3개의 체세포 계통(외배엽, 중배엽 및 내배엽)으로 분화시키는 능력; (v) 3개의 체세포 계통으로 이루어진 사합체 형성; 및 (vi) 이들 체세포 계통으로부터의 세포로 이루어진 배양체의 형성을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
이전에 후기 배반포의 외배반 줄기 세포(EpiSC)와 유사한 만능성의 "프라이밍된" 상태 또는 "준안정" 상태 및 초기/착상전 배반포의 내부 세포 덩어리와 유사한 만능성의 "미경험" 상태 또는 "기초" 상태의 2가지 유형의 만능성은 기재되어 있다. 만능 상태 둘 다가 상기 기술된 것과 같은 특징을 나타내지만, 미경험 상태 또는 기초 상태는 (i) 암컷 세포에서의 X-염색체의 예비활성화 또는 재활성화; (ii) 단일 세포 배양 동안 개선된 클론성 및 생존기간; (iii) DNA 메틸화의 전반적 감소; (iv) 발생 조절 유전자 프로모터에서 H3K27me3 억압적 염색질 마크 침착의 감소; 및 (v) 프라이밍된 상태의 만능 세포에 대한 분화 마커의 발현 감소를 추가로 나타낸다. 외인성 만능성 유전자가 체세포로 도입되고, 발현되고 이후 생성된 만능 세포로부터 침묵화되거나 제거되는 세포 재프로그래밍의 표준 방법론은 일반적으로 만능성의 프라이밍된 상태의 특징을 갖는 것으로 보인다. 표준 만능 세포 배양 조건 하에 외인성 전이유전자 발현이 유지되지 않으면 이러한 세포는 프라이밍된 상태로 있고, 여기서 기초 상태의 특징이 관찰된다.
본원에 사용된 "만능 줄기 세포 형태"라는 용어는 배아 줄기 세포의 전통적인 형태학적 특징을 지칭한다. 정상 배아 줄기 세포 형태는 높은 핵-대-세포질 비율로 형상이 원형이고 소형이라는 것, 주목할만한 핵소체 존재 및 통상적인 세포간 간격을 특징으로 한다.
본원에 사용된 "대상체"라는 용어는 임의의 동물, 바람직하게는 인간 환자, 가축 또는 다른 사육동물을 지칭한다.
"만능성 인자" 또는 "재프로그래밍 인자"는 단독으로 또는 다른 작용제와 조합되어 세포의 발생 효능을 증가시킬 수 있는 작용제를 지칭한다. 만능성 인자는 제한 없이 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 세포의 발생 효능을 증가시킬 수 있는 소분자를 포함한다. 예시적인 만능성 인자는 예를 들어 전사 인자 및 소분자 재프로그래밍제를 포함한다.
"배양" 또는 "세포 배양"은 시험관내 환경에서의 세포의 유지, 성장 및/또는 분화를 지칭한다. "세포 배양 배지들", "배양 배지들"(각각의 경우에 단수형 "배지"), "보충제" 및 "배지 보충제"는 세포 배양물을 배양하는 영양적 조성물을 지칭한다.
"배양한다" 또는 "유지한다"는 예를 들어 멸균 플라스틱(또는 코팅된 플라스틱) 세포 배양 접시 또는 플라스크에서 조직 또는 신체의 밖에서 세포를 지속시키고/시키거나, 전파(성장)시키고/시키거나, 분화시키는 것을 지칭한다. "배양" 또는 "유지"는 영양소, 호르몬 및/또는 세포를 전파시키고/시키거나 지속시키는 것을 돕는 다른 인자의 원천으로서 배양 배지를 사용할 수 있다.
본원에 사용된 "중배엽"이라는 용어는 초기 배아발생 동안 생기고, 순환계의 혈액 세포, 근육, 심장, 진피, 골격, 및 다른 지지 조직 및 결합 조직을 포함하는 다양한 특수화된 세포 유형을 생성시키는 3개의 배엽 중 하나를 지칭한다.
본원에 사용된 "한정적 동형유전자성 내피세포"(HE: hemogenic endothelium) 또는 "만능 줄기 세포 유래된 한정적 동형유전자성 내피세포"(iHE)라는 용어는 내피 조혈 전환(endothelial-to-hematopoietic transition)이라 칭하는 과정에서 조혈 줄기 세포 및 전구 세포를 생성시키는 내피 세포의 하위집단을 지칭한다. 배아에서의 조혈 세포의 발생은 가쪽판 중배엽으로부터 혈관아세포를 통해 한정적 동형유전자성 내피세포 및 조혈 전구세포로 순차적으로 진행한다.
"조혈 줄기 세포 및 전구 세포", "조혈 줄기 세포", "조혈 전구 세포" 또는 "조혈 전구 세포"라는 용어는 조혈 계통에 대해 결정되지만 추가의 조혈 분화를 할 수 있는 세포를 지칭하고, 다능성 조혈 줄기 세포(조혈세포), 골수성 전구세포, 거핵세포 전구세포, 적혈구 전구세포 및 림프구성 전구세포를 포함한다. 조혈 줄기 세포 및 전구 세포(HSC)는 골수성 계통(단핵구 및 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 거핵세포/혈소판, 수지상 세포), 및 림프구성 계통(T 세포, B 세포, NK 세포)을 포함하는 모든 혈액 세포 유형을 생성시키는 다능성 줄기 세포이다. 본원에 사용된 "한정적 조혈 줄기 세포"라는 용어는 T 세포, NK 세포 및 B 세포를 포함하는 성숙 골수성 세포 및 림프구성 세포 유형 둘 다를 생성할 수 있는 CD34+ 조혈 세포를 지칭한다. 조혈 세포는 또한 원시 적혈구, 거핵세포 및 대식세포를 생성하는 원시 조혈 세포의 다양한 하위집단을 포함한다.
본원에 사용된 "T 림프구" 및 "T 세포"라는 용어는 상호교환 가능하게 사용되고, 흉선에서 성숙을 완료하고 신체에서의 특정 외래 항원의 확인 및 다른 면역 세포의 활성화 및 탈활성화를 포함하는 면역계에서 다양한 역할을 갖는 백혈구의 주요 유형을 지칭한다. T 세포는 임의의 T 세포, 예컨대 배양된 T 세포, 예를 들어 일차 T 세포, 또는 배양된 T 세포주로부터의 T 세포, 예를 들어 Jurkat, SupT1 등, 또는 포유동물로부터 얻은 T 세포일 수 있다. T 세포는 CD3+ 세포일 수 있다. T 세포는 임의의 유형의 T 세포일 수 있고, 비제한적인 예로서 CD4+/CD8+ 이중 양성 T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포(예를 들어, Th1 및 Th2 세포), CD8+ T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포), 말초혈 단핵 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cell), 말초혈 백혈구(PBL: peripheral blood leukocyte), 종양 침윤 림프구(TIL: tumor infiltrating lymphocyte), 기억 T 세포, 미경험 T 세포, 조절 T 세포, 감마 델타 T 세포(γδ T 세포) 등을 포함하는 임의의 발생 단계를 가질 수 있다. 헬퍼 T 세포의 추가의 유형은 Th3(Treg), Th17, Th9 또는 Tfh 세포와 같은 세포를 포함한다. 기억 T 세포의 추가의 유형은 중앙 기억 T 세포(Tcm 세포), 효과기 기억 T 세포(Tem 세포 및 TEMRA 세포)와 같은 세포를 포함한다. T 세포는 또한 유전 조작된 T 세포, 예컨대 T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 변형된 T 세포를 지칭할 수 있다. T 세포는 줄기 세포 또는 전구 세포로부터 또한 분화될 수 있다.
"CD4+ T 세포"는 표면 상에 CD4를 발현하고 세포 매개된 면역 반응과 연관된 T 세포의 하위집단을 지칭한다. 이것은 IFN-감마, TNF-알파, IL2, IL4 및 IL10과 같은 사이토카인의 분비를 포함할 수 있는 자극 후 분비 프로파일을 특징으로 한다. "CD4"는 T 림프구 상에서 분화 항원으로 기원상 정의되지만, 단핵구/대식세포를 포함하는 다른 세포 상에서 또한 발견되는 55 kD 당단백질이다. CD4 항원은 면역글로불린 슈퍼유전자 패밀리의 구성원이고, MHC(주요 조직접합성 복합체: major histocompatibility complex) 클래스 II 제한된 면역 반응에서 관련 인식 요소로 관여하고 있다. 이것은 T 림프구에서 헬퍼/인듀서 하위집단을 한정한다.
"CD8+ T 세포"는 표면 상에 CD8을 발현하고, MHC 클래스 I-제한되고, 세포독성 T 세포로서 작용하는 T 세포의 하위집단을 지칭한다. "CD8" 분자는 흉선세포 및 세포독성 및 억제자 T 림프구 상에서 발견되는 분화 항원이다. CD8 항원은 면역글로불린 슈퍼유전자 패밀리의 구성원이고, 주요 조직접합성 복합체 클래스 I 제한된 상호작용에서 관련 인식 요소이다.
본원에 사용된 "NK 세포" 또는 "자연 살해 세포"라는 용어는 CD56 또는 CD16의 발현 및 T 세포 수용체(CD3)의 부재에 의해 정의되는 말초혈 림프구의 하위집단을 지칭한다. 본원에 사용된 "적응성 NK 세포" 및 "기억 NK 세포"라는 용어는 상호교환 가능하고, NKG2C 및 CD57 중 적어도 하나, 및 선택적으로 CD16을 발현하는 표현형적으로 CD3- 및 CD56+이지만, PLZF, SYK, FceRγ 및 EAT-2 중 하나 이상의 발현이 결여된 NK 세포의 하위집단을 지칭한다. 일부 실시형태에서, CD56+ NK 세포의 단리된 하위집단은 CD16, NKG2C, CD57, NKG2D, NCR 리간드, NKp30, NKp40, NKp46, 활성화 및 억제성 KIR, NKG2A 및/또는 DNAM-1의 발현을 포함한다. CD56+는 흐린 발현 또는 밝은 발현일 수 있다.
본원에 사용된 "NKT 세포" 또는 "자연 살해 T 세포"라는 용어는 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 CD1d 제한된 T 세포를 지칭한다. NKT 세포는, 종래의 주요 조직접합성(MHC) 분자에 의해 제시된 펩타이드 항원을 검출하는 종래의 T 세포와 달리, 비전통적 MHC 분자인 CD1d에 의해 제시된 지질 항원을 인식한다. 2가지 유형의 NKT 세포가 인식된다. 비변이체 또는 I형 NKT 세포는 매우 제한된 TCR 레퍼토리 - β 사슬(인간에서의 Vβ11)의 제한된 스펙트럼과 회합된 정규적 α-사슬(인간에서의 Vα24-Jα18)을 발현한다. 비전통적 또는 비-비변이체 II형 NKT 세포라 불리는 NKT 세포의 제2 집단은 더 이종성인 TCR αβ 용법을 디스플레이한다. I형 NKT 세포는 면역요법에 적합하다고 여겨진다. 적응성 또는 비변이체(I형) NKT 세포는 TCR Va24-Ja18, Vb11, CD1d, CD3, CD4, CD8, aGalCer, CD161 및 CD56의 마커 중 적어도 하나 이상의 발현으로 확인될 수 있다.
본원에 사용된 "단리된"이라는 용어 또는 기타는 이의 원래의 환경으로부터 분리된 세포 또는 세포의 집단을 지칭하고, 즉 단리된 세포의 환경은 "비단리된" 기준 세포가 존재하는 환경에서 발견되는 적어도 하나의 성분이 실질적으로 없다. 상기 용어는 세포가 이의 자연 환경에서 발견되면서, 예를 들어 조직 또는 생검 샘플로부터 단리되면서 일부 또는 모든 성분들로부터 제거된 세포를 포함한다. 상기 용어는 세포가 비자연 발생 환경에서 발견되면서, 예를 들어 세포 배양물 또는 세포 현탁액으로부터 단리되면서 적어도 하나의, 일부 또는 모든 성분으로부터 제거된 세포를 또한 포함한다. 따라서, 단리된 세포는 세포가 자연에서 발견되면서 또는 비자연 발생 환경에서 성장하거나 저장되거나 존속하면서 다른 물질, 세포 또는 세포 집단을 포함하는 적어도 하나의 성분으로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된다. 단리된 세포의 특정 예는 부분적으로 순수한 세포 조성, 실질적으로 순수한 세포 조성 및 비자연 발생인 배지에서 배양된 세포를 포함한다. 환경에서 다른 물질 또는 세포로부터 원하는 세포 또는 이의 집단을 분리하여, 또는 환경으로부터 하나 이상의 다른 세포 집단 또는 하위집단을 제거하여 단리된 세포를 얻을 수 있다.
본원에 사용된 "정제한다"라는 용어 또는 기타는 순도의 증가를 지칭한다. 예를 들어, 순도는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%까지 증가할 수 있다.
본원에 사용된 "암호화하는"이라는 용어는 뉴클레오타이드(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 한정된 서열 또는 아미노산의 한정된 서열 중 어느 하나를 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오타이드에서의 뉴클레오타이드의 특정 서열의 고유한 특성 및 이로부터 생긴 생물학적 특성을 지칭한다. 이와 같이, 유전자는 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 그 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 단백질을 생산하면 단백질을 암호화한다. mRNA 서열과 동일하고 보통 서열 목록에 제공된 뉴클레오타이드 서열인 암호화 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용된 비암호화 가닥 둘 다는 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 산물을 암호화한다고 칭할 수 있다.
"작제물"은 시험관내 또는 생체내 어느 하나로 숙주 세포에 전달되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 거대분자 또는 분자 복합체를 지칭한다. 본원에 사용된 "벡터"는 이것이 복제되고/되거나 발현될 수 있는 표적 세포에 대한 외래 유전 물질의 전달 또는 이동을 지시할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 지칭한다. 본원에 사용된 "벡터"라는 용어는 전달되는 작제물을 포함한다. 벡터는 선형 분자 또는 원형 분자일 수 있다. 벡터는 통합 또는 비통합일 수 있다. 벡터의 주요 유형은 플라스미드, 에포솜 벡터, 바이러스 벡터, 코스미드 및 인공 염색체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
"통합"에 의해 작제물의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 세포 게놈으로 안정하게 삽입된, 즉 세포의 염색체 DNA 내에 핵산 서열에 공유 연결됨이 의도된다. "표적화된 통합"에 의해 작제물의 뉴클레오타이드(들)가 예비선택된 부위 또는 "통합 부위"에서 세포의 염색체 또는 마토콘드리아 DNA로 삽입됨이 의도된다. 본원에 사용된 "통합"이라는 용어는 통합 부위에서의 내인성 서열 또는 뉴클레오타이드의 결실과 함께 또는 이것 없이 작제물의 하나 이상의 외인성 서열 또는 뉴클레오타이드의 삽입을 수반하는 과정을 추가로 지칭한다. 삽입 부위에서 결실이 있는 경우, "통합"은 하나 이상의 삽입된 뉴클레오타이드가 결실된 내인성 서열 또는 뉴클레오타이드의 대체를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "외인성"이라는 용어는 기준 분자 또는 기준 활성은 숙주 세포 내로 도입되거나 이것에 대해 비자연적이라는 것을 의미하도록 의도된다. 예를 들어, 숙주 유전 재료로의 암호화 핵산의 도입에 의해, 예컨대 숙주 염색체로의 통합에 의해 또는 플라스미드와 같은 비염색체 유전 재료로서 분자가 도입될 수 있다. 따라서, 암호화 핵산의 발현과 관련하여 사용되면서 상기 용어는 세포로 발현 가능한 형태의 암호화 핵산의 도입을 지칭한다. "내인성"이라는 용어는 숙주 세포에 존재하는 기준 분자 또는 활성을 지칭한다. 유사하게, 암호화 핵산의 발현과 관련하여 사용되면서 상기 용어는 외인성으로 도입되지 않고 세포 내에 함유된 암호화 핵산의 발현을 지칭한다.
본원에 사용된 "관심 유전자" 또는 "관심 폴리뉴클레오타이드 서열"은 RNA로 전사되고 일부 경우에 적절한 조절 서열의 제어 하에 위치할 때 생체내 폴리펩타이드로 번역되는 DNA 서열이다. 관심 유전자 또는 관심 폴리뉴클레오타이드는 원핵 서열, 진핵 mRNA로부터의 cDNA, 진핵(예를 들어, 포유동물) DNA로부터의 게놈 DNA 서열 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 관심 유전자는 miRNA, shRNA, 자연적 폴리펩타이드(즉, 자연에서 발견된 폴리펩타이드) 또는 이들의 단편; 변이체 폴리펩타이드(즉, 자연적 폴리펩타이드와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 자연적 폴리펩타이드의 돌연변이체) 또는 이의 단편; 조작된 폴리펩타이드 또는 펩타이드 단편, 치료학적 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 영상화 마커, 선택 가능한 마커 등을 암호화할 수 있다.
본원에 사용된 "폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중 어느 하나인 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태 또는 이들의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드의 서열은 폴리뉴클레오타이드가 RNA일 때 아데닌(A); 사이토신(C); 구아닌 (G); 티민(T); 및 티민의 경우 우라실(U)인 4개의 뉴클레오타이드 염기로 구성된다. 폴리뉴클레오타이드는 유전자 또는 유전자 단편(예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, 리보좀, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지된 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 이중 가닥 및 단일 가닥 분자 둘 다를 지칭한다.
본원에 사용된 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"이라는 용어는 상효교환 가능하게 사용되고, 펩타이드 결합에 의해 공유 연결된 아미노산 잔기를 갖는 분자를 지칭한다. 폴리펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하고, 폴리펩타이드의 아미노산의 최대 수에 대해 제한이 없다. 본원에 사용된 상기 용어는 당해 분야에서 또한 흔히 예를 들어 펩타이드, 올리고펩타이드 및 올리고머라 칭하는 짧은 사슬과 당해 분야에서 일반적으로 폴리펩타이드 또는 단백질이라 칭하는 더 긴 사슬 둘 다를 지칭한다. "폴리펩타이드"는, 다른 것들 중에서, 예를 들어 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성인 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 동종이합체, 이종이합체, 폴리펩타이드의 변이체, 변형된 폴리펩타이드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩타이드는 천연 폴리펩타이드, 재조합 폴리펩타이드, 합성 폴리펩타이드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에 사용된 "아단위"라는 용어는 단백질 복합체의 각각의 별개의 폴리펩타이드 사슬을 지칭하고, 여기서 각각의 별개의 폴리펩타이드 사슬은 스스로 안정한 폴딩된 구조를 형성할 수 있다. 많은 단백질 분자는 하나 초과의 아단위로 이루어지고, 여기서 아미노산 서열은 각각의 아단위에 대해 동일하거나 유사하거나 완전히 상이할 수 있다. 예를 들어, CD3 복합체는 CD3α, CD3ε, CD3δ, CD3γ 및 CD3ζ 아단위로 이루어지고, 이는 CD3ε/CD3γ, CD3ε/ CD3δ, 및 CD3ζ/ CD3ζ 이합체를 형성한다. 폴리펩타이드 사슬의 인접한 부분은 단일 아단위 내에서 흔히 "도메인"이라 칭하는 압축된, 국부적인, 반독립적 단위로 폴딩한다. 많은 단백질 도메인은 하위도메인이라고도 칭하는 독립적인 "구조적 아단위"를 추가로 포함할 수 있어서 도메인의 흔한 기능에 기여한다. 이와 같이, 본원에 사용된 "하위도메인"이라는 용어는 더 큰 도메인의 내부의 단백질 도메인, 예를 들어 세포 표면 수용체의 엑토도메인 내의 결합 도메인; 또는 세포 표면 수용체의 엔도도메인의 자극 도메인 또는 신호전달 도메인을 지칭한다.
"작동적으로 연결된"은 하나의 기능이 다른 기능에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상의 핵산 서열의 회합을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 암호화 서열 또는 기능적 RNA의 발현에 영향을 미칠 수 있을 때 그 암호화 서열 또는 기능적 RNA와 작동적으로 연결된다(즉, 암호화 서열 또는 기능적 RNA는 프로모터의 전사 제어 하에 있음). 암호화 서열은 센스 배향 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있다.
본원에 사용된 "유전 각인"이라는 용어는 원천 세포 또는 iPSC에서 우선적 치료학적 속성에 기여하고, 원천 세포 유래 iPSC 및/또는 iPSC 유래 조혈 계통 세포에서 보유 가능한 유전적 정보 또는 후성적 정보를 지칭한다. 본원에 사용된 "원천 세포"는 재프로그래밍을 통해 iPSC를 생성하기 위해 사용될 수 있는 비만능 세포이고, 원천 세포 유래 iPSC는 임의의 조혈 계통 세포를 포함하는 특정한 세포 유형으로 더 분화할 수 있다. 원천 세포 유래 iPSC, 및 이로부터 분화된 세포는 맥락에 따라 때때로 총체적으로 "유래" 세포 또는 "분화" 세포라 칭한다. 예를 들어, 본 출원에 걸쳐 사용된 분화 효과기 세포, 또는 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포는 말초혈, 제대혈 또는 다른 공여자 조직과 같은 자연/자연적 원천으로부터 얻은 이의 일차 대응물과 비교하여 iPSC로부터 분화된 세포이다. 본원에 사용된 것처럼, 우선적 치료학적 속성을 부여하는 유전 각인(들)은 공여자 특이적, 질환 특이적 또는 치료 반응 특이적인 선택된 원천 세포의 재프로그래밍을 통해, 또는 게놈 편집을 이용하여 iPSC로 유전 변형된 양상의 도입을 통해 iPSC로 혼입된다. 특이적으로 선택된 공여자, 질환 또는 치료 맥락으로부터 얻은 원천 세포의 양태에서, 우선적 치료학적 속성에 기인한 유전 각인은 보유 가능한 표현형, 즉 우선적 치료학적 속성을 나타내는 임의의 맥락 특이적 유전적 특이적 또는 후성적 특이적을 포함할 수 있고, 이는 확인되거나 확인되지 않은 기초하는 분자 사건과 무관하게 선택된 원천 세포의 iPSC 유래 세포로 전달된다. 공여자 특이적, 질환 특이적 또는 치료 반응 특이적 원천 세포는 iPSC 및 유래된 조혈 계통 세포에서 보유 가능한 유전 각인을 포함할 수 있고, 유전 각인은 예를 들어 바이러스 특이적 T 세포 또는 비변이체 자연 살해 T (iNKT) 세포로부터의 예비정렬된 단일특이적 TCR; 예를 들어 선택된 공여자에서 고친화도 CD16 수용체를 암호화하는 점 돌연변이에 동형접합성인 추적 가능하고 바람직한 유전 다형; 및 예비결정된 HLA 요건, 즉 증가된 집단을 갖는 일배체형을 나타내는 선택된 HLA 일치된 공여자 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 것처럼, 우선적 치료학적 속성은 유래된 세포의 개선된 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 생존 및 세포독성을 포함한다. 우선적 치료학적 속성은 또한 항원 표적화 수용체 발현; HLA 제시 또는 이의 결여; 종양 미세환경에 대한 내성; 방관자 면역 세포의 유도 및 면역 조절; 감소된 오프 종양 효과를 갖는 개선된 온 타깃 특이성; 화학요법과 같은 치료에 대한 내성과 관련될 수 있다.
본원에 사용된 "향상된 치료학적 특성"이라는 용어는 동일한 일반 세포 유형의 통상적인 면역 세포와 비교하여 향상된 세포의 치료학적 특성을 지칭한다. 예를 들어, "향상된 치료학적 특성"을 갖는 NK 세포는 통상적인, 비변형된 및/또는 자연 발생하는 NK 세포와 비교하여 향상된, 개선된 및/또는 증강된 치료학적 특성을 보유할 것이다. 면역 세포의 치료학적 특성은 세포 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 생존 및 세포독성을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 면역 세포의 치료학적 특성은 또한 항원 표적화 수용체 발현; HLA 제시 또는 이의 결여; 종양 미세환경에 대한 내성; 방관자 면역 세포의 유도 및 면역 조절; 화학요법과 같은 치료에 대한 감소된 오프 종양 효과를 갖는 개선된 온 타깃 특이성에 의해 나타난다.
본원에 사용된 "인게이저"라는 용어는 면역 세포, 예를 들어 T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 호중구와 종양 세포 사이에 연결을 형성하고; 면역 세포를 활성화할 수 있는 분자, 예를 들어 융합 폴리펩타이드를 지칭한다. 인게이저의 예는 이중특이적 T 세포 인게이저(BiTE), 이중특이적 살해 세포 인게이저(BiKE), 삼중특이적 살해 세포 인게이저, 또는 다중특이적 살해 세포 인게이저, 또는 다수의 면역 세포 유형과 적합한 보편적 인게이저를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "표면 트리거링 수용체"라는 용어는 면역 반응, 예를 들어 세포독성 반응을 촉발하거나 개시할 수 있는 수용체를 지칭한다. 표면 트리거링 수용체는 조작될 수 있고, 효과기 세포, 예를 들어 T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 호중구 상에서 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표면 트리거링 수용체는 효과기 세포의 천연 수용체 및 세포 유형과 독립적인 특정한 표적 세포, 예를 들어 종양 세포와 효과기 세포 사이의 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체 결합을 용이하게 한다. 이 접근법을 이용하여 보편적 표면 트리거링 수용체를 포함하는 iPSC를 생성하고, 이후 보편적 표면 트리거링 수용체를 발현하는 다양한 효과기 세포 유형의 집단으로 이러한 iPSC를 분화시킬 수 있다. "보편적"에 의해 표면 트리거링 수용체가 세포 유형과 무관하게 임의의 효과기 세포에서 발현되고 이를 활성화할 수 있고, 보편적 수용체를 발현하는 모든 효과기 세포가 인게이저의 종양 결합 특이성과 무관하게 표면 트리거링 수용체에 의해 인식 가능한 동일한 에피토프를 갖는 인게이저에 커플링되거나 연결될 수 있음이 의도된다. 일부 실시형태에서, 동일한 종양 표적화 특이성을 갖는 인게이저는 보편적 표면 트리거링 수용체와 커플링하도록 사용된다. 일부 실시형태에서, 상이한 종양 표적화 특이성을 갖는 인게이저는 보편적 표면 트리거링 수용체와 커플링하도록 사용된다. 이와 같이, 하나 또는 다수의 효과기 세포 유형은 일부 경우에 종양 세포의 하나의 특정한 유형을 사멸하고, 일부 다른 경우에 종양의 2종 이상의 유형을 사멸하도록 결합될 수 있다. 표면 트리거링 수용체는 일반적으로 효과기 세포 활성화를 위한 공동자극 도메인 및 인게이저의 에피토프에 특이적인 항에피토프를 포함한다. 이중특이적 인게이저는 일 말단에서 표면 트리거링 수용체의 항에피토프에 특이적이고, 다른 말단에서 종양 항원에 특이적이다.
본원에 사용된 "안전성 스위치 단백질"이라는 용어는 잠재적인 독성 또는 달리 세포 치료의 불리한 효과를 방지하도록 설계된 조작된 단백질을 지칭한다. 일부 경우에, 안전성 스위치 단백질 발현은 게놈으로 안전성 스위치 단백질을 암호화하는 유전자가 주로 혼입된 이식된 조작된 세포에 대한 안전성 우려를 해결하기 위해 조건적으로 제어된다. 이 제어 조절은 가변적일 수 있고, 소분자 매개된 번역후 활성화 및 조직 특이적 및/또는 시간적 전사 조절을 통한 제어를 포함할 것이다. 안전성 스위치는 아폽토시스의 유도, 단백질 합성의 억제, DNA 복제, 성장 정지, 전사 및 전사후 유전 조절 및/또는 항체 매개된 고갈을 매개할 수 있었다. 일부 경우에, 안전성 스위치 단백질은 외인성 분자, 예를 들어 프로드럭에 의해 활성화되고, 이것은 활성화될 때 치료학적 세포의 아폽토시스 및/또는 세포사를 촉발한다. 안전성 스위치 단백질의 예는 자살 유전자, 예컨대 카스파제 9(또는 카스파제 3 또는 7), 티미딘 키나제, 사이토신 탈아미노효소, B 세포 CD20, 변형된 EGFR, 및 임의의 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이 전략에서, 불리한 사건의 경우에 투여된 프로드럭은 자살-유전자 산물에 의해 활성화되고 형질도입된 세포를 사멸한다.
본원에 사용된 "약제학적 활성 단백질 또는 펩타이드"라는 용어는 유기체에 대한 생물학적 효과 및/또는 약제학적 효과를 달성할 수 있는 단백질 또는 펩타이드를 지칭한다. 약제학적 활성 단백질은 질환에 대해 치유하는 치유력 있는 또는 일시적인 특성을 갖고, 질환의 중증도를 완화하거나 개선하거나 경감하거나 역전시키거나 축소하도록 투여될 수 있다. 약제학적 활성 단백질은 또한 예방적 특성을 갖고, 질환의 발생을 예방하거나 이것이 나온 이러한 질환 또는 병리학적 병태의 중증도를 축소하도록 사용된다. 약제학적으로 활성인 단백질은 전체 단백질 또는 펩타이드 또는 이의 약제학적 활성 단편을 포함한다. 이것은 또한 단백질 또는 펩타이드의 약제학적 활성 유사체 또는 단백질 또는 펩타이드의 단편의 유사체를 포함한다. 약제학적 활성 단백질이라는 용어는 또한 치료학적 이익을 제공하도록 협력하여 또는 상승적으로 작용하는 복수의 단백질 또는 펩타이드를 지칭한다. 약제학적 활성 단백질 또는 펩타이드의 예는 수용체, 결합 단백질, 전사 및 번역 인자, 종양 성장 억제 단백질, 항체 또는 이의 단편, 성장 인자 및/또는 사이토카인을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "신호전달 분자"라는 용어는 세포 신호 유도를 조절하거나 이에 참여하거나 이를 억제하거나 활성화하거나 감소시키거나 증가시키는 임의의 분자를 지칭한다. 신호 유도는 세포에서 생화학적 사건을 궁극적으로 촉발하는 경로를 따른 단백질 복합체의 동원에 의한 화학 변형의 형태의 분자 신호의 전송을 지칭한다. 신호 전달 경로는 당해 분야에 잘 공지되어 있고, G 단백질 커플링된 수용체 신호전달, 티로신 키나제 수용체 신호전달, 인테그린 신호전달, 톨 게이트 신호전달, 리간드 개폐된 이온 채널 신호전달, ERK/MAPK 신호전달 경로, Wnt 신호전달 경로, cAMP 의존적 경로 및 IP3/DAG 신호전달 경로를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "표적화 양상"이라는 용어는, 비제한적인 예로서 i) 이것이 고유한 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)와 관련이 있는 항원 특이성, ii) 이것이 단일클론 항체 또는 이중특이적 인게이저와 관련이 있는 인게이저 특이성, iii) 형질전환된 세포의 표적화, iv) 암 줄기 세포의 표적화 및 v) 특이적 항원 또는 표면 분자의 부재 하의 다른 표적화 전략을 포함하는, 항원 및/또는 에피토프 특이성을 촉진하도록 세포로 유전적으로 혼입된 분자, 예를 들어 폴리펩타이드를 지칭한다.
본원에 사용된 "특이적" 또는 "특이성"이라는 용어는 비특이적 결합 또는 비선택적 결합과 비교하여 표적 분자에 선택적으로 결합하는 분자, 예를 들어 수용체 또는 인게이저의 능력을 지칭하도록 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "입양 세포 치료"라는 용어는 세포 기반 면역요법을 지칭하고, 이는 본원에 사용된 것처럼, 상기 수혈 전에 생체외 증식된, 유전 변형되거나 변형되지 않는 T 세포 또는 B 세포로서 확인된 자가유래 림프구 또는 동종이계 림프구의 수혈을 지칭한다.
본원에 사용된 "치료학적으로 충분한 양"은 이의 의미 내에서 원하는 치료학적 효과를 제공한다고 칭해지는 특정한 치료학적 조성물 및/또는 약제학적 조성물의 비독성이지만 충분하고/하거나 효과적인 양을 포함한다. 필요한 정확한 양은 환자의 일반 건강, 환자의 연령, 및 병태의 병기 및 중증도와 같은 인자에 따라 대상체마다 변할 것이다. 특정 실시형태에서, 치료학적으로 충분한 양은 치료되는 대상체의 질환 또는 병태와 연관된 적어도 하나의 증상을 완화하고/하거나, 감소하고/하거나 개선하기에 충분하고/하거나 효과적이다.
만능 줄기 세포의 분화는 배양 시스템의 변경, 예컨대 배양 배지에서의 자극 물질 또는 세포의 물리적 상태의 변경을 요한다. 대부분의 종래의 전략은 계통 특이적 분화를 개시하도록 흔하고 중요한 중간체로서 배양체(EB)의 형성을 이용한다. "배양체"는 이의 3차원 면적에서 많은 계통을 생성시키므로 배아 발생을 모방하는 것으로 나타난 3차원 클러스터이다. 분화 과정을 통해, 통상적으로 수시간 내지 수일에, 단순한 EB(예를 들어, 분화하도록 유발된 응집된 만능 줄기 세포)는 계속해서 성숙하여 낭종성 EB로 발생하고, 이때에 통상적으로 수일 내지 수주에 이들은 더 처리되어 계속해서 분화한다. 세포의 3차원 다층 클러스터에서 만능 줄기 세포가 가깝게 근접하게 하여 EB 형성이 개시되고, 통상적으로 이는 만능 세포가 액체 액적에서 침전하게 하는 것, 세포를 "U" 바닥 웰-플레이트로 침전시키는 것 또는 기계적 아지테이션을 포함하는 여러 방법 중 하나에 의해 달성된다. EB 발생을 촉진하기 위해, 만능 배양 유지 배지에서 유지된 응집체가 적절한 EB를 형성하지 않으면서, 만능 줄기 세포 응집체는 추가의 분화를 요한다. 이와 같이, 만능 줄기 세포 응집체는 선택된 계통에 대해 신호의 유발을 제공하는 분화 배지로 이동될 필요가 있다. 만능 줄기 세포의 EB 기반 배양은 통상적으로 EB 세포 클러스터 내의 적절한 증식으로 분화된 세포 집단(외배엽, 중배엽 및 내배엽의 배엽)을 생성시킨다. 그러나, EB는 세포 분화를 용이하게 하는 것으로 입증되었지만 환경으로부터의 분화 신호에 대한 3차원 구조에서의 세포의 불일치한 노출 때문에 변동적인 분화 상태의 이종성 세포를 생성시킨다. 게다가, EB는 생성하고 유지하기에 힘들다. 더욱이, EB를 통한 세포 분화는 보통의 세포 증식이 동반되고, 이는 낮은 분화 효능에 또한 기여한다.
비교하면, "EB 형성"과 구별되는 "응집체 형성"은 만능 줄기 세포 유래된 세포의 집단을 증식시키도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 응집체 기반 만능 줄기 세포 증식 동안, 배양 배지는 증식 및 만능성을 유지하도록 선택된다. 세포 증식은 일반적으로 응집체의 크기를 증가시켜 더 응집체를 형성하고, 이 응집체는 배양물 내 세포 증식을 유지하고 세포수를 증가시키도록 일상적으로 더 작은 응집체로 기계적으로 또는 효소적으로 분리된다. 유지 배양에서 응집체 내에 배양된 세포는 EB 배양과 달리 만능성의 마커를 유지한다. 만능 줄기 세포 응집체는 분화를 유도하도록 추가의 분화 신호를 요한다.
본원에 사용된 "단층 분화"는 세포의 3차원 다층 클러스터, 즉 "EB 형성"을 통한 분화와 구별되는 분화 방법을 지칭하는 용어이다. 단층 분화는 본원에 개시된 다른 이점들 중에서 분화 개시를 위한 EB 형성의 필요성을 피한다. 단층 배양이 EB 형성과 같은 배아 발생을 모방하지 않으므로, 특이적 계통에 대한 분화는 EB에서의 모든 3개의 배엽 분화와 비교하여 최소로 여겨진다.
본원에 사용된 "분리된" 세포는 다른 세포 또는 표면(예를 들어, 배양 플레이트 표면)으로부터 실질적으로 분리되거나 정제된 세포를 지칭한다. 예를 들어, 세포는 기계적 방법 또는 효소적 방법에 의해 동물 또는 조직으로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, 시험관내 응집하는 세포는 효소적으로 또는 기계적으로 클러스터, 단일 세포 또는 단일 세포와 클러스터의 혼합물의 현탁액으로 분리되어 서로 분리될 수 있다. 또 다른 대안적인 실시형태에서, 부착성 세포는 배양 플레이트 또는 다른 표면으로부터 분리된다. 이에 같이 분리는 세포외 기질(ECM: extracellular matrix)과 기질(예를 들어, 배양 표면) 사이의 세포 상호작용을 파괴하거나, 세포들 사이의 ECM을 파괴하는 것을 수반할 수 있다.
본원에 사용된 "지지 세포" 또는 "피더"는 지지 세포가 제2 세포 유형의 지지를 위해 자극, 성장 인자 및 영양소를 제공하면서 제2 유형의 세포가 성장, 증식 또는 분화할 수 있는 환경을 제공하도록 제2 유형의 세포와 동시배양되는 하나의 유형의 세포를 지칭하는 용어이다. 지지 세포는 선택적으로 이것이 지지하는 세포와 상이한 종으로부터 유래한다. 예를 들어, 줄기 세포를 포함하는 인간 세포의 소정의 유형은 마우스 배아 섬유아세포 또는 불활성화된 마우스 배아 섬유아세포의 일차 배양에 의해 지지될 수 있다. 다른 예에서, 말초혈 유래된 세포 또는 형질전환된 백혈병 세포는 자연 살해 세포의 증식 및 성숙을 지지한다. 지지 세포는 통상적으로 이것이 지지하는 세포를 과성장시키는 것을 방지하도록 조사 또는 미토마이신과 같은 항유사분열제에 의한 처리에 의해 다른 세포와 동시배양될 때 불활성화될 수 있다. 지지 세포는 내피 세포, 기질 세포(예를 들어, 상피 세포 또는 섬유아세포) 및 백혈병 세포를 포함할 수 있다. 상기에 제한됨이 없이, 하나의 특정한 지지 세포 유형은 인간 피부 섬유아세포와 같은 인간 피더일 수 있다. 다른 지지 세포 유형은 마우스 배아 섬유아세포(MEF: mouse embryonic fibroblast)일 수 있다. 일반적으로, 다양한 지지 세포는 부분적으로 만능성을 유지하고, 소정의 계통에 대한 분화를 지시하고, 증식 역량을 향상시키고, 효과기 세포와 같은 특수화된 세포 유형에 대한 성숙을 촉진하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "피더 비함유"(FF) 환경은 본질적으로 피더 또는 기질 세포가 없고/없거나, 지지 세포의 배양에 의해 예비컨디셔닝되지 않은 배양 조건, 세포 배양물 또는 배양 배지와 같은 환경을 지칭한다. "예비컨디셔닝된" 배지는 적어도 1일 동안과 같은 시간 기간 동안 배지 내에 지지 세포가 배양된 후 수확된 배지를 지칭한다. 예비컨디셔닝된 배지는 배지에서 배양된 지지 세포에 의해 분비된 성장 인자 및 사이토카인을 포함하는 많은 매개자 물질을 함유한다. 일부 실시형태에서, 피더 비함유 환경은 피더 또는 기질 세포 둘 다가 없고, 또한 지지 세포의 배양에 의해 예비컨디셔닝되지 않는다.
iPSC, 및 이로부터 분화된 유래된 비만능 세포의 게놈 편집 또는 변형, 또는 비만능 세포 및 이로부터 재프로그래밍된 유래된 iPSC의 게놈 편집 또는 변형의 맥락에서 사용되는 것과 같은 "기능적"은 (1) 유전자 수준에서는 -- 직접적인 게놈 편집 또는 변형을 통해, 또는 초기에 게놈 조작된 출발 세포로부터의 분화 또는 이의 재프로그래밍을 통한 "계대배양"을 통해 달성되는, 원하는 세포 발생 단계에서의 성공적인 넉인된, 넉아웃된, 넉다운된 유전자 발현, 형질전환 또는 제어된 유전자 발현, 예컨대 유도성 발현 또는 시간적 발현; 또는 (2) 세포 수준에서는 - (i) 직접적인 게놈 편집을 통해 상기 세포에서 얻은 유전자 발현 변형, (ii) 초기에 게놈 조작된 출발 세포로부터의 분화 또는 이의 재프로그래밍을 통한 "계대배양"을 통해 상기 세포에서 유지된 유전자 발현 변형; (iii) 상기 세포의 초기 발생 단계에 오직 생기는, 또는 분화 또는 재프로그래밍을 통해 상기 세포를 생성시키는 출발 세포에서 오직 생기는 유전자 발현 변형의 결과로서 상기 세포에서의 하향 유전자 조절; 또는 (iv) iPSC, 전구세포 또는 탈분화된 세포 기원에서 수행된 게놈 편집 또는 변형으로부터 초기에 유래된, 성숙 세포 산물 내에 나타난 향상된 또는 새로 획득된 세포 기능 또는 속성을 통한, 세포 기능/특징의 성공적인 제거, 부가 또는 변경을 지칭한다.
HLA-클래스 I 결핍, 또는 HLA-클래스 II 결핍, 또는 둘 다를 포함하는 "HLA 결핍"은, 줄어들거나 감소된 수준이 다른 세포 또는 합성 방법에 의해 자연적으로 검출 가능한 수준보다 낮도록, HLA 클래스 I 단백질 이종이합체 및/또는 HLA 클래스 II 이종이합체를 포함하는 완전한 MHC 복합체의 표면 발현이 결여되거나 더 이상 유지하지 않거나 이의 감소된 수준을 갖는 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 "변형된 HLA 결핍 iPSC"는, 비전통적 HLA 클래스 I 단백질(예를 들어, HLA-E 및 HLA-G), 키메라 항원 수용체(CAR), T 세포 수용체(TCR), CD16 Fc 수용체, BCL11b, NOTCH, RUNX1, IL15, 41BB, DAP10, DAP12, CD24, CD3z, 41BBL, CD47, CD113, 및 PDL1과 같은, 비제한적인 예로서 개선된 분화 가능성, 항원 표적화, 항원 제시, 항체 인식, 지속성, 면역 회피, 억제에 대한 내성, 증식, 공동자극, 사이토카인 자극, 사이토카인 생성물(자가분비 또는 주변분비), 화학주성 및 세포 독성과 관련되는 유전자 발현 단백질을 도입하여 추가로 변형된 HLA 결핍 iPSC를 지칭한다. "변형된 HLA 결핍"인 세포는 iPSC 이외의 세포를 또한 포함한다.
FcR로 축약된 "Fc 수용체"는 이것이 인식하는 항체의 유형에 기초하여 분류된다. 예를 들어, IgG인 항체의 가장 흔한 종류에 결합하는 것은 Fc-감마 수용체(FcγR)라 칭하고, IgA에 결합하는 것은 Fc-알파 수용체(FcαR)라 칭하고, IgE에 결합하는 것은 Fc-엡실론 수용체(FcεR)라 칭한다. FcR의 종류는 이들을 발현하는 세포(대식세포, 과립구, 자연 살해 세포, T 세포 및 B 세포) 및 각각의 수용체의 신호전달 특성에 의해 또한 구별된다. Fc-감마 수용체(FcγR)는 이의 상이한 분자 구조로 인해 이의 항체 친화도가 다른 FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32), FcγRIIB(CD32), FcγRIIIA(CD16a), FcγRIIIB(CD16b)인 여러 구성원을 포함한다.
CFcR로 축약된 "키메라 Fc 수용체"는 비자연적 막관통 도메인 및/또는 세포내 신호전달 도메인으로 변형되거나 대체된 이의 자연적 막관통 도메인 및/또는 세포내 신호전달 도메인을 갖는 조작된 Fc 수용체를 기재하도록 사용된 용어이다. 키메라 Fc 수용체의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 자극 도메인은, 비자연적인 막관통 도메인 및 신호전달 도메인의 하나 또는 둘 다를 갖는 것 이외에, 수용체의 트리거링 시 세포 활성화, 증식 및 기능을 향상시키도록 조작된 Fc 수용체의 세포내 부분으로 도입될 수 있다. 키메라 Fc 수용체는, 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인을 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR)와 달리, 표적화된 세포가 근처에 가깝게 있게 하거나 하지 않으면서 항체의 Fc 단편 또는 Fc 영역, 또는 세포 기능을 활성화하고 인게이저 또는 결합 분자에 포함된 Fc 영역에 결합한다. 예를 들어, Fcγ 수용체는 세포외 도메인에서 IgG의 결합에 반응하여 CFcR을 생성하는 세포내 영역에서 선택된 막관통 도메인, 자극 도메인 및/또는 신호전달 도메인을 포함하도록 조작될 수 있다. 일 예에서, CFcR은 이의 막관통 도메인 및/또는 세포내 도메인을 대체하여 Fcγ 수용체인 CD16을 조작하여 생산된다. CD16 기반 CFcR의 결합 친화도를 추가로 개선하기 위해, CD64의 세포외 도메인 또는 CD16의 고친화도 변이체(예를 들어 F176V)가 혼입될 수 있다. 고친화도 CD16 세포외 도메인이 관여된 CFcR의 일부 실시형태에서, 197번 위치에서 세린을 포함하는 단백분해 절단 부위는 수용체의 세포외 도메인에서 비절단성이도록, 즉 쉐딩으로 비처리되도록 제거되거나 대체되고, 이로써 hnCD16 기반 CFcR을 얻는다.
FcγR 수용체인 CD16은 Fc 수용체 FcγRIIIa(CD16a) 및 FcγRIIIb(CD16b)인 2개의 이소폼을 갖는 것으로 확인되었다. CD16a는 NK 세포에 의해 발현된 막관통 단백질이고, 이는 NK 세포를 활성화하고 항체 의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)을 촉진하도록 표적 세포에 부착된 단량체성 IgG에 결합한다. 본원에 사용된 "고친화도 CD16", "비절단성 CD16" 또는 "고친화도 비절단성 CD16(hnCD16)"은 CD16의 천연 변이체 또는 비천연 변이체를 지칭한다. 야생형 CD16은 낮은 친화도를 갖고, NK 세포 활성화 시 백혈구에 대한 다양한 세포 표면 분자의 세포 표면 밀도를 조절하는 단백분해 절단 과정인 엑토도메인 쉐딩으로 처리된다. F176V 및 F158V는 고친화도를 갖는 예시적인 CD16 다형 변이체이다. 변경되거나 제거된 막 근위 영역(189번 내지 212번 위치)에서 절단 부위(195번 내지 198번 위치)를 갖는 CD16 변이체는 쉐딩으로 처리되지 않는다. 절단 부위 및 막 근위 영역은 국제공개 WO 2015148926호에 자세히 기재되어 있고, 이의 완전한 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. CD16 S197P 변이체는 CD16의 조작된 비절단성 버전이다. F158V 및 S197P 둘 다를 포함하는 CD16 변이체는 고친화도를 갖고 비절단성이다. 다른 예시적인 고친화도 및 비절단성 CD16(hnCD16) 변이체는 CD64 엑토도메인의 3개의 엑손 중 하나 이상으로부터 기원한 엑토도메인을 포함하는 조작된 CD16이다.
I. 향상된 특성을 갖는 입양 세포 치료에 유용한 세포 및 조성물
본원에는 iPSC로부터 분화된 분화 세포의 치료학적 특성을 향상시키면서 iPSC의 분화 효능 및 iPSC 및 이의 분화 세포의 세포 발생 생물학에 영향을 미치지 않으면서 클론 iPSC의 조절 회로를 체계적으로 조작하기 위한 전략이 제공된다. iPSC 유래 세포는 기능적으로 개선되고, 게놈 조작을 통해 iPSC의 수준에서 세포로 도입되는 선택적 양상의 조합 후 입양 세포 치료에 적합하다. 본 발명 이전에는 하나 이상의 제공된 유전 편집을 포함하는 변경된 iPSC가 세포 발생에 들어가는 능력 및/또는 조절된 활성을 보유하면서 기능적인 분화된 세포를 성숙시키고 생성하는 능력을 여전히 갖는지가 불확실하였다. iPSC로부터의 유도 세포 분화 동안 예상치 못한 실패는 비제한적인 예로서 발생 단계 특이적 유전자 발현 또는 이의 결여, HLA 복합체 제시에 대한 요건, 도입된 표면 발현 양상의 단백질 쉐딩, 및 세포에서 표현형적 변화 및/또는 기능적 변화가 가능하게 하는 분화 프로토콜의 재구성에 대한 필요성을 포함하는 양태 때문이었다. 본 출원은 본원에 제공된 것과 같은 하나 이상의 선택된 게놈 변형이 iPSC 분화 효능에 부정적으로 영향을 미치지 않고, 조작된 iPSC로부터 유래된 기능적인 효과기 세포가 iPSC 분화 후에 효과기 세포에 보유된 개별 게놈 변형 또는 조합된 게놈 변형에 기인한 향상된 및/또는 획득된 치료학적 특성을 갖는다는 것을 보여주었다.
1. 내인성 TCR의 부재 하의 CD3 표면 제시
알파-베타 T 세포 수용체(αβTCR)는 면역 반응에 필수적인 항원 특이적 수용체이고, αβ T 림프구의 세포 표면 상에 제시된다. 펩타이드 주요 조직접합성 복합체(pMHC)에 대한 TCRαβ의 결합은 TCR-CD3 세포내 활성화, 많은 신호전달 분자의 동원, 및 신호전달 경로의 분지 및 통합을 개시하여 유전자 발현 및 T 세포 성장 및 기능 획득에 중요한 전사 인자의 동원으로 이어진다. NKT 세포가 또한 αβ TCR을 발현하고, 종래의 αβ T 세포와 다른 T 세포의 하위집단이지만, NKT 세포의 TCR은 정규적 비변이체 TCR α 사슬(인간에서의 Vα24-Jα18)과 제한된 Vβ 분절을 사용하는 TCR β 사슬(인간에서의 Vβ11)로 이루어지는데, 이 분절은 다양성이 제한되고, CD1d에 의해 제시된 지질 항원을 제한된 수로 인식한다.
변형된 분화 T 세포를 얻기 위한 원천으로서 직접적인 T 세포 편집 또는 iPSC 편집 중 어느 하나를 통한 TCR 알파 또는 TCR 베타(TRAC 또는 TRBC)의 불변 영역의 파괴는 TCRneg T 세포를 제조하기 위한 접근법 중 하나이다. 예를 들어, TRAC 또는 TRBC에서의 예비선택된 위치에서의 TRAC 또는 TRBC의 내인성 프로모터 또는 외인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 2A 서열의 삽입은 TRAC 또는 TRBC 파괴(또는 이 예에서는 절두) 및 TCR 음성 세포(TCRneg)로 이어질 수 있다. 특정 실시형태에서, TCRneg 세포는 iPSC이다. 다른 실시형태에서, TCRneg 세포는 NK 계통 세포이다. 본원에 사용된 "TCR 음성" 또는 "TCRneg"라는 용어는 (예컨대, T 계통 세포: 일차 또는 iPSC 유래 T 계통 세포에서) TCR 유전자 발현 파괴로 인해 또는 (예를 들어, iPSC 또는 NK 계통 세포: 일차 또는 iPSC 유래 NK 계통 세포) 게놈에서의 TCR 유전자좌의 존재에도 불구하고 TCR 유전자 발현의 자연 부재로 인해 내인성 TCR 발현의 결여를 지칭한다. 조혈 세포에 대한 클론으로 선택된 조작된 iPSC의 후속하는 유도 분화는 TCR 발현 없이 iPSC 유래 면역 효과기 세포 및/또는 이의 균질한 집단을 생성하는 것이 가능하게 한다.
일부 실시형태에서, 2A와 같은 자가 절단 펩타이드를 사용한 표적화된 절두 또는 파괴는 선택적으로 절두 또는 파괴의 위치에서 하나 이상의 관심 외인성 유전자의 통합과 동시에 발생할 수 있었고, 통합된 유전자(들)의 발현은 작동 가능하게 연결된 외인성 프로모터에 의해 또는 통합 시 TCR 알파 또는 TCR 베타의 내인성 프로모터에 의해 추진될 수 있었고, 이는 TRAC 유전자좌 또는 TRBC 유전자좌에서 삽입된 하나 이상의 외인성 유전자를 발현하면서 TRAC 또는 TRBC 넉아웃, 및 이에 따라 TCR 음성으로 이어진다.
이 접근법을 이용하여 얻은 iPSC 유래 TCR 음성 T 세포(외인성 유전자 통합과 함께 또는 이것 없이)는 HLA 일치를 요하지 않고, 동종이식편반응이 감소되고, 동종이계 입양 세포 치료에 사용될 때 GvHD(이식편 대 숙주 질환)를 예방할 수 있다. 그러나, TCR 파괴는 또한 세포에서 CD3 아단위 유전자 발현에도 불구하고 T 세포 표면으로부터 CD3 신호전달 복합체를 제거한다는 것이 발견되었다. 세포 표면 CD3의 결여는 증식 및/또는 생존에 대한 세포의 능력을 변경하고 세포 표면 CD3 인식 및 결합을 요하는 기술과의 비적합성으로 인해 세포의 기능적 가능성을 감소시킬 수 있고, 이는 BiTE, BiKE 또는 TRiKE(또는 총체적으로 인게이저라 칭함) 기술; CD3/CD28 T 세포 활성화 기반 기술; 및 항-CD3 항체 또는 CD3-CAR 자극 기술을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 추가로, 유도 T 세포 분화에 TCRneg iPSC를 사용할 때, T 세포 발생 생물학 및 T 세포 기능 성숙에 대한 영향이 또한 있을 수 있다. 그러나, TCR 음성인 세포에서의 과발현 CD3은 CD3 복합체의 세포 표면 제시 및/또는 CD3 신호전달을 회복시키는 것으로 보이지 않는다. TCR 유전자, 예를 들어 NK 또는 NK 전구 세포의 존재에도 불구하고 TCR을 발현하지 않는 세포에 대해서는, TCRneg NK 세포에서 본원에 개시된 것과 같은 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)은 비제한적인 예로서 항체 또는 이의 기능적 변이체 및/또는 CD3 수용체를 인식하는 이중특이적 인게이저 또는 다중특이적 인게이저를 포함하는 분자와의 결합을 위한 획득된 CD3 관련된 세포 표면 트리거링 수용체로서 작용할 수 있다. 본원에 기재된 다른 제공된 이점들 중에서 당해 분야에서 해결되지 않은 문제를 해결하기 위해, 도 1a 내지 도 1c에 도시된 것과 같은 하기 디자인은 (예컨대, 분화 T 계통 세포에서) 유전자 파괴를 통한 내인성 TCR 유전자 발현의 소실로 인해 또는 (예컨대, 분화 NK 계통 세포에서) TCR 유전자 발현의 자연 부재로 인해 내인성 TCR 발현이 없을 때(TCRneg 세포) 표면 CD3 제시를 재구성하고/하거나 제공하는 것으로 본 출원에 상세히 기술되어 있다.
디자인 1: 비결합성 재조합 TCR(nb-rTCR)
도 1a에 제시된 것처럼, 이 디자인 1에서, 표적화된 게놈 편집 도구를 사용하여 세포에서의 내인성 TCRα가 넉아웃(TCRα-/-)되어 TCR 음성 (TCRneg)으로 이어지지만, TCRβ의 넉아웃(TCRβ-/-)은 선택적이거나; 반대로, 표적화된 게놈 편집 도구를 사용하여 세포에서의 내인성 TCRβ가 넉아웃(TCRβ-/-)되어 TCR 음성(TCRneg)으로 이어지지만, TCRα의 넉아웃(TCRα-/-)은 선택적이다. TCRα 넉아웃을 포함하는 실시형태에서, TCRα의 불변 영역의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(형질전환 TRAC 또는 tgTRAC)는 후속하여 세포로 도입되거나, 표적화된 TRAC 넉아웃 시 TRAC에서 통합되고, 폴리뉴클레오타이드의 발현은 TCRα의 내인성 프로모터에 의해 또는 대안적으로 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 외인성 프로모터에 의해 추진된다. 일부 실시형태에서, TCRα의 불변 영역의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 TCRα의 불변 영역의 전체 길이 또는 부분 길이와 커플링된 적절한 N 말단 신호 펩타이드를 추가로 포함한다. 내인성 TCRβ가 넉아웃(TCRβ-/-)된 실시형태에서, TCRβ의 불변 영역(tgTCRβ 또는 tgTRBC)의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 세포로 도입되고; tgTCRβ 또는 tgTRBC의 발현은 TCRβ의 내인성 프로모터에 의해 또는 대안적으로 외인성 프로모터에 의해 추진된다. 일부 실시형태에서, TCRβ의 불변 영역의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 TCRβ의 불변 영역의 전체 길이 또는 부분 길이와 커플링된 적절한 N 말단 신호 펩타이드를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 프로모터는 항시적 프로모터, 유도성 프로모터, 시간 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 세포 유형 특이적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 프로모터는 CMV, EF1α, PGK, CAG 및 UBC 중 하나를 포함한다. 일 실시형태에서, 외인성 프로모터는 적어도 CAG를 포함한다.
일부 실시형태에서, 전체 또는 부분 TCRα 불변 영역(tgTRAC)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 1인 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 전체 또는 부분 불변 영역(tgTRBC)을 포함하는 TCRβ를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 2 또는 서열 번호 3인 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. N 말단 신호 펩타이드 및 TCRα 또는 TCRβ 불변 영역의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 신호 펩타이드와 TCR 불변 영역과 관련된 서열 사이의 링커 펩타이드를 추가로 포함한다. N 말단 신호 펩타이드 및 TCRα 또는 TCRβ 불변 영역의 전체 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 C 말단에서의 폴리 A 꼬리를 추가로 포함한다. N 말단 신호 펩타이드 및 TCRα 또는 TCRβ 불변 영역의 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드의 통합은 내인성 불변 영역(예를 들어, 엑손) 내의 부위에 있고, 프레임 내에 있고, 즉 통합 부위의 하류에서의 TCRα 또는 TCRβ 불변 영역의 남은 내인성 서열과 프레임 내에 있어서, 전체 길이 형질전환/키메라 TRAC 또는 TRBC는 외인성/형질전환인 이의 서열의 부분과 내인성인 다른 부분으로 형성된다. 디자인 1의 일부 실시형태에서, 내인성 TCRα 및 내인성 TCRβ 중 적어도 하나는 발현될 때 세포 표면에 각각의 형질전환 불변 영역을 제시하면서 각각의 가변 영역을 본질적으로 제거하도록 조작된다. 일부 실시형태에서, 내인성 TCRα 및 내인성 TCRβ의 오직 하나는 세포 표면에 형질전환 불변 영역 및 야생형 TCR 아단위(TCRα 또는 TCRβ)를 제시하면서 관련된 가변 영역을 본질적으로 제거하도록 조작된다. 일부 실시형태에서, 내인성 TCRα 및 내인성 TCRβ 둘 다는 발현될 때 세포 표면에 형질전환 불변 영역 둘 다를 제시하면서 각각의 가변 영역을 제거하도록 제공된 것처럼 조작된다. 예시적인 N 말단 신호 펩타이드는 MALPVTALLLPLALLLHA(서열 번호 4; CD8asp) 또는 MDFQVQIFSFLLISASVIMSR(서열 번호 5; IgKsp), 또는 임의의 신호 펩타이드 서열 또는 당해 분야에 공지된 이의 기능적 변이체를 포함한다. 예시적인 링커 펩타이드는 DYKDDDDK(서열 번호 6; FLAG), 또는 임의의 링커 펩타이드 서열 또는 당해 분야에 공지된 이의 기능적 변이체를 포함한다.
서열 번호 1:
IQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
(TRAC)
서열 번호 2:
DLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRNHFRCRVSATFWQNPQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
(TRBC1)
서열 번호 3
DLKNVFPPKVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
(TRBC2)
본 출원에서, 다른 TCR 아단위(내인성/야생형 또는 형질전환; 형질전환이면, 이의 각각의 가변 영역과 함께 또는 이것 없이) 및 내인성 CD3 아단위와 회합함으로써 재조합 TCR 복합체(rTCR)를 형성할 수 있으면서 tgTRAC 또는 tgTRBC인 TCR 아단위 중 어느 하나의 형질전환 불변 영역이 항원 인식에 참여하는 TCRα 또는 TCRβ 가변 영역의 결여에 대해 펩타이드-MHC 결합이 가능하게 하지 않는다는 것이 발견되었다. 생성된 세포는 세포 표면 제시된 내인성 CD3(cs-CD3) 복합체를 통해 정규적 TCR/CD3 신호전달을 재획득하지만, 내인성 TCR 넉아웃 및 TCRα 가변 영역이 없는 rTCR로 인해 동종이식편반응을 갖지 않는다. 이와 같이, 디자인 1의 관점에서, 본원에는 세포 또는 이의 집단이 제공되고, 여기서 세포는 iPSC, 클론 iPSC, 클론 iPS 세포주 세포, 또는 상기 iPSC를 분화하여 얻은 분화 세포이고; 세포는 내인성 TCR이 넉아웃(TCRneg)되도록 내인성 TCRα 및 내인성 TCRβ 불변 영역 중 적어도 하나에서의 파괴, 및 파괴된 TCRα(tgTRAC) 및/또는 TCRβ(tgTRBC)의 불변 영역을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드의 하나 또는 둘 다를 포함하고; tgTRAC 및/또는 tgTRAB는 발현될 때 내인성 CD3(cs-CD3)의 세포 표면 제시가 가능하게 한다. tgTRAC 및 tgTRBC 중 적어도 하나를 포함하는 재조합 TCR 복합체는 TCR 아단위의 가변 영역 둘 다(Vα 및 Vβ)를 갖지 않는 것에 대해 MHC에 의해 제시된 항원 펩타이드에 결합하지 않고, 이에 따라 비결합성 재조합 TCR(nb-rTCR)이라 칭한다.
디자인 2: 한정된 재조합 TCR(d-rTCR)
도 1a에 제시된 것과 같이, 이 디자인 2에서, 게놈 편집 도구를 사용하여 내인성 TCRα 및 내인성 TCRβ 둘 다가 세포에서 넉아웃(TCRα-/- 및 TCRβ-/-; 또는 TCRneg TCRβneg)되어 TCRneg 세포로 이어진다. TCR 넉아웃과 동시에 또는 이에 후속하여, TCRα의 한정된 가변 영역 및 전체 또는 부분 불변 영역을 포함하는 TCRα(tgTCRα)를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 TCRβ의 한정된 가변 영역 및 전체 또는 부분 불변 영역을 포함하는 TCRβ(tgTCRβ)를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드는 상기 TCRneg 세포로 도입된다. 한정된 TCRα 또는 한정된 TCRβ 가변 영역은 이의 서열이 확인되거나 확인될 수 있도록 임의의 주어진 특이성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드의 하나 또는 둘 다는 각각 TCRα 및 TCRβ의 내인성 프로모터에 의해 추진된다. 일부 다른 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드의 하나 또는 둘 다는 외인성 프로모터에 의해 추진된다. 일부 실시형태에서, 제2 폴리뉴클레오타이드는 TCRβ의 내인성 프로모터에 의해 추진되는 반면, 일부 다른 실시형태에서, 제2 폴리뉴클레오타이드는 외인성 프로모터에 의해 추진된다. 일부 실시형태에서, 외인성 프로모터는 항시적 프로모터, 유도성 프로모터, 시간 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 세포 유형 특이적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 프로모터는 CMV, EF1α, PGK, CAG 및 UBC 중 하나를 포함한다. 일 실시형태에서, 외인성 프로모터는 적어도 CAG를 포함한다. 일부 실시형태에서, TCRα 불변 영역 및 소정의 한정된 가변 영역의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 1인 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%의 동일성, 또는 사이의 임의의 백분율을 갖는 서열을 적어도 포함한다. 일부 실시형태에서, TCRβ 불변 영역 및 소정의 한정된 가변 영역의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 2 또는 서열 번호 3인 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%의 동일성, 또는 사이의 임의의 백분율을 갖는 서열을 적어도 포함한다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 80%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 90%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 95%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 100%이다. TCRα 또는 TCRβ 불변 영역의 전체 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 C' 말단에서 폴리A 꼬리를 추가로 포함한다. TCRα 또는 TCRβ 불변 영역의 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드의 통합은 내인성 불변 영역 내의 부위에 있고, 통합 부위의 하류에서의 TCRα 또는 TCRβ 불변 영역의 남은 내인성 서열과 프레임 내에 있어서, 전체 길이 형질전환/키메라 TRAC 또는 TRBC는 외인성/형질전환인 이의 서열의 부분과 내인성인 다른 부분으로 형성된다. TCRα 또는 TCRβ 가변 영역에 대한 서열은 예를 들어 Universal Protein Resource(UniProt) 데이터베이스에서 발견될 수 있고, 일부 비제한적인 한정된 TCRα 또는 TCRβ 가변 영역 예는 각각 하기 표 A 및 표 B에 열거되어 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
비변이체 NKT 세포는 정규적 비변이체 TCRα 사슬(인간에서의 Vα24-Jα18; 또는 iTCRα) 및 제한된 Vβ 분절을 사용하는 TCRβ 사슬(인간에서의 Vβ11; 또는 iTCRβ)을 발현하여 고도로 보존된 TCR 및 CD1d 의존적 항원 제시를 초래하는 T 세포의 고유한 하위집단이다. 비변이체 NKT의 TCR(iTCR 또는 iTCRαβ)의 이 특성을 이용하기 위해, 디자인 2의 일부 실시형태에서, TCRα 불변 영역 및 소정의 한정된 가변 영역의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 서열 번호 44인 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 적어도 포함하고; TCRβ 불변 영역 및 소정의 한정된 가변 영역의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 서열 번호 45인 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 적어도 포함하도록, 한정된 TCR은 비변이체 NKT 세포의 TCRα 및 TCRβ(iTCRα 또는 iTCRαβ) 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함한다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 80%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 90%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 95%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 100%이다.
서열 번호 44
MKKHLTTFLVILWLYFYRGNGKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYTVSPFSNLRWYKQDTGRGPVSLTIMTFSENTKSNGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYICVVSDRGSTLGRLYFGRGTQLTVWPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
(인간 Vα24Jα18의 iNKT TCR α 사슬; 밑줄 표시된 위치는 가변 영역임)
서열 번호 45
MTIRLLCYMGFYFLGAGLMEADIYQTPRYLVIGTGKKITLECSQTMGHDKMYWYQQDPGMELHLIHYSYGVNSTEKGDLSSESTVSRIRTEHFPLTLESARPSHTSQYLCASEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
(인간 Vβ11의 iNKT TCR β 사슬; 밑줄 표시된 부분은 가변 영역임)
본 출원에서, 선택적으로 불변 영역 및 한정된 가변 영역을 갖는 형질전환 TCRβ(tgTCRβ)와 함께 불변 영역 및 한정된 가변 영역을 갖는 형질전환 TCRα(tgTCRα)가 tgTCRα 및 tgTCRβ의 가변 영역의 특이성으로 인해 한정된 펩타이드-MHC 결합을 갖거나 갖지 않으면서 CD3ζ 사슬을 포함하는 내인성 CD3 아단위와 회합함으로써 재조합 TCR 복합체(rTCR)를 형성할 수 있다는 것이 발견되었다. 비변이체 NKT 세포의 TCRα 및 TCRβ의 이점을 취하는 다른 접근법은, 한정된 재조합 TCR에 대한 형질전환 TCR 아단위의 유전 조작 이외에, iPSC로 단리된 NKT 세포를 재프로그래밍하는 것 및 T 세포로 iPSC를 분화시키는 것을 포함하고, 그 결과 유래된 T 세포는 본원에 개시된 재프로그래밍 및 분화 조성물 및 방법을 이용하여 비변이체 NKT 세포의 TCRα 및 TCRβ(iTCRα, iTCRβ; 및 iTCR, 복합체)를 포함한다. 유전 조작된 iPSC 또는 iNKT 재프로그래밍된 iPSC로부터 분화된 생성된 세포는 공지된 및 한정된 MHC 결합 특이성을 갖거나 갖지 않으면서 세포 표면 제시된 내인성 CD3(cs-CD3)을 통해 정규적 TCR/CD3 신호전달을 재획득한다. 이와 같이, 디자인 2의 관점에서, 본원에는 세포 또는 이의 집단이 제공되고, 여기서 세포는 iPSC, 클론 iPSC, 클론 iPS 세포주 세포, 또는 iPSC를 분화하여 얻은 분화 세포이고; 세포는 내인성 TCRα 및 내인성 TCRβ의 각각에서의 파괴, 전체 또는 부분 불변 영역 및 한정된 가변 영역을 갖는 tgTCRα를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드, 및 전체 또는 부분 불변 영역 및 한정된 가변 영역을 갖는 tgTCRβ를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하고; 내인성 CD3 분자는 발현될 때 세포 표면(cs-CD3)에서 제시된다.
디자인 3: 선택적인 비결합 TCRβ를 갖는 재조합 pre-TCRα(p-rTCR)
pre-TCRα는 T 세포 발생에서의 초기 단계인 미숙 흉선세포에서 발생적으로 제어된 유전자에 의해 암호화된 I형 막관통 수용체 단백질이다. pre-TCRα는 pre-TCR 복합체를 형성하도록 TCRβ 및 CD3 아단위와 공유 회합한다. pre-TCRα는 다른 구조적 차이 및 기능적 차이들 중에서도 TCRα 사슬과 비교하여 비교적 더 긴 세포질 꼬리를 갖는다. 도 1a에 제시된 것처럼, 이 디자인 3에서, 게놈 편집 도구를 사용하여 TCR 음성 세포는 적어도 내인성 TCRα 넛아웃(TCRneg)을 갖고, 내인성 TCRβ의 넉아웃은 선택적이다. TCR 넉아웃과 동시에 또는 이에 후속하여, pre-TCRα의 전체 길이 또는 부분 길이(tgpTCRα)를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오타이드는 상기 TCRneg 세포로 도입된다. 상기 TCRneg 세포가 TCRβ 넉아웃을 추가로 포함하는 일부 실시형태에서, 소정의 한정된 가변 영역(tgTCRβ 또는 tgTRBC)을 갖거나 갖지 않는 전체 또는 부분 TCRβ 불변 영역을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드는 TCRneg 세포로 도입되고, 세포는 초기 단계, 미숙 흉선세포가 아니다. TCRα 또는 TCRβ 불변 영역의 전체 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 C' 말단에서 폴리A 꼬리를 추가로 포함한다. TCRα 또는 TCRβ 불변 영역의 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드의 통합은 내인성 불변 영역 내의 부위에 있고, 통합 부위의 하류에서의 TCRα 또는 TCRβ 불변 영역의 남은 내인성 서열과 프레임 내에 있어서, 전체 길이 형질전환/키메라 TRAC 또는 TRBC는 외인성/형질전환인 이의 서열의 부분과 내인성인 다른 부분으로 형성된다.
일부 실시형태에서, pre-TCRα의 전체 길이 또는 부분 길이(tgpTCRα)를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오타이드는 통합 시 TCRα의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, pre-TCRα의 전체 길이 또는 부분 길이(tgpTCRα)를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오타이드는 외인성 프로모터에 의해 추진된다. 일부 실시형태에서, 소정의 한정된 가변 영역을 갖거나 갖지 않는 전체 또는 부분 TCRβ 불변 영역을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드는 통합 시 TCRβ의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 소정의 한정된 가변 영역을 갖거나 갖지 않는 전체 또는 부분 TCRβ 불변 영역을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드는 외인성 프로모터에 의해 추진된다. 일부 실시형태에서, 외인성 프로모터는 항시적 프로모터, 유도성 프로모터, 시간 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 세포 유형 특이적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 프로모터는 CMV, EF1α, PGK, CAG 및 UBC 중 하나를 포함한다. 일 실시형태에서, 외인성 프로모터는 적어도 CAG를 포함한다. 일부 실시형태에서, tgpTCRα 불변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 23인 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 적어도 포함한다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 80%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 90%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 95%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 100%이다. 일부 실시형태에서, tgpTCRα를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 본원에서 서열 번호 24로서 표시된 서열 번호 23의 부분 길이를 포함한다. 서열 번호 23의 전체 길이 또는 부분 길이를 포함하는 tgpTCRα를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 임의의 이의 기능적 변이체의 일부 실시형태에서, 암호화된 tgpTCRα는 당해 분야에 공지된 신호 펩타이드를 추가로 포함한다. 하나의 비제한적인 예시적인 신호 펩타이드는 서열 번호 22로 표시된 펩타이드를 포함한다.
서열 번호 22
MAGTWLLLLLALGCPALPTGVGG
서열 번호 23
TPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGNGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTCPQEPLRGGCGLLRAPERFLLAGTPGG ALWLGVLRLLLFKLLLFDLLL TCSCLCDPAGPLPSPATTTRLRALGSHRLHPATETGGREATSSPRPQPRDRRWGDTPPGRKPGSPVWGEGSYLSSYPTCPAQAWCSRSALRAPSSSLGAFFAGDLPPPLQAGAA
( TM 을 갖는 tgpTCRα)
서열 번호 24
TPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGNGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTCPQEPLRGGCGLLRAPERFLLAGTPGG ALWLGVLRLLLFKLLLFDLLL TCSCLCDPAGPLPSPATTTRLRALGSHRLHPATETGGREATSSPRPQPRDRRWGDTPPGRKPGSPV
( TM 을 갖는 절두된 tgpTCRα)
일부 실시형태에서, 전체 또는 부분 불변 영역 및 소정의 한정된 가변 영역을 포함하는 TCRβ를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 2 또는 서열 번호 3인 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 적어도 포함한다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 80%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 90%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 95%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 100%이다. 한정된 TCRβ 가변 영역은 이의 서열이 확인되거나 확인될 수 있도록 임의의 주어진 특이성을 가질 수 있다. 비제한적인 한정된 TCRβ 가변 영역은 상기 표 B에 예시되고, 서열 번호 45에 포함된다(밑줄 표시된 부분).
자연적 프로모터(즉, pre-TCRα 프로모터)와 다른 프로모터(외인성 프로모터 또는 내인성 TCRα 프로모터이든)에 의해 제어된 pre-TCRα 발현을 갖는 iPSC가 기능적인 효과기 T 세포로 분화하는 능력을 여전히 갖는지가 이전에는 공지되지 않았다. 여기서 본 발명자들은 기능적 T 세포를 생성하기 위 해 iPSC 유래 T 세포에 대한 유도 분화가 수행될 수 있는 정도로 비자연적 프로모터에 의해 제어된 형질전환 pre-TCRα(tgpTCRα)를 포함하는 iPSC의 세포 발생 생물학이 유지될 수 있다는 것을 입증하도록 시도하였다. 이는 내인성 pre-TCR의 정상 발현이 발생적으로 조절되므로 놀랍다. 추가로, tgpTCRα TCRneg iPSC로부터 유래된 T 세포는 펩타이드-MHC 결합 능력을 갖지 않으면서 CD3ζ 사슬을 포함하는 내인성 CD3 아단위와 회합함으로써 발현된 표면 재조합 pre-TCR 복합체(rpTCR)를 포함한다. 이론에 의해 제한됨이 없이, 형질전환 pre-TCR/CD3 복합체는 그렇더라도 세포 표면 제시된 내인성 CD3(cs-CD3) 복합체를 통해 정규적 CD3 신호전달을 통해 iPSC 유래 T 세포 성숙을 추진할 수 있다. 상기의 관점에서, 본 출원의 범위는 또한 내인성 pre-TCRα의 상향조절 및/또는 하향조절의 방지의 다양한 방법을 포함한다. 초기/미숙 흉선세포가 아닌 세포에서의 과발현된 pre-TCRα는 펩타이드-MHC 결합 능력을 갖지 않으면서 CD3 세포 표면 제시가 가능하게 하도록 발현된 내인성 TCRβ 및 CD3 아단위와 회합할 것이다.
이와 같이, 디자인 3의 관점에서, 본원에는 세포 또는 이의 집단이 제공되고, 여기서 세포는 iPSC, 클론 iPSC, 클론 iPS 세포주 세포, 또는 상기 iPSC를 분화하여 얻은 분화 세포이고; 세포는 내인성 TCR이 넉아웃(TCRneg)되도록 적어도 내인성 TCRα 또는 TCRβ의 파괴, 및 pre-TCRα의 전체 길이 또는 부분 길이를 포함하는 펩타이드를 암호화하는 적어도 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하고; TCRα의 부재 하의 pre-TCRα의 발현은 세포에서 내인성 또는 형질전환 TCRβ와 회합하여 세포 표면 CD3 복합체(cs-CD3)를 재구성하지만, 또한 T 세포를 포함하는 기능적 분화 효과기 세포로의 iPSC의 유도 분화에 기여한다.
디자인 4: 비결합성 재조합 TCR 부착된 CD3(nb-rTCR-CD3)
도 1b에 제시된 것처럼, 이 디자인 4에서, 게놈 편집 도구를 사용하여 내인성 TCRα 및 내인성 TCRβ의 하나 또는 둘 다는 세포에서 넛아웃(TCRneg; TCRα-/- 및 TCRβ-/-)된다. TCR 넉아웃과 동시에 또는 이에 후속하여, 하나의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 CD3ε과 CD3δ 사이의 하나의 이종이합체 및/또는 다른 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 CD3ε과 CD3γ 사이의 다른 이종이합체가 세포 표면에서 형성될 수 있도록, 외인성 폴리뉴클레오타이드는 상기 TCRneg 세포로 도입되고, 이는 TCRα 불변 영역을 포함하는 재조합 TCRα, CD3ε과 CD3δ 및 CD3γ 중 하나의 전체 길이 또는 부분 길이 엑토도메인을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오타이드; 및/또는 TCRβ 불변 영역을 포함하는 재조합 TCRβ, CD3ε과 재조합 TCRα에 포함되지 않은 CD3δ 및 CD3γ 중 하나의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 TCRα는 N 말단에서의 CD3ε 및 CD3δ 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이와 융합된 C 말단에서의 전체 또는 부분 TCRα 불변 영역을 포함한다(tgCD3(ε-δ)-TRAC). 일부 실시형태에서, 재조합 TCRα는 N 말단에서의 CD3ε 및 CD3γ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이와 융합된 C 말단에서의 전체 또는 부분 TCRα 불변 영역을 포함한다(tgCD3(ε-γ)-TRAC). 일부 실시형태에서, 재조합 TCRβ는 N 말단에서의 CD3ε 및 CD3γ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이와 융합된 C 말단에서의 전체 또는 부분 TCRβ 불변 영역을 포함한다(tgCD3(ε-γ)-TRBC). 일부 실시형태에서, 재조합 TCRβ는 N 말단에서의 CD3ε 및 CD3δ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이와 융합된 C 말단에서의 전체 또는 부분 TCRβ 불변 영역을 포함한다(tgCD3(ε-δ)-TRBC). TCRα 또는 TCRβ 불변 영역의 전체 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 C 말단에서 폴리A 꼬리를 추가로 포함한다. TCRα 또는 TCRβ 불변 영역의 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드의 통합은 각각의 내인성 불변 영역 내의 부위에 있고, 통합 부위의 하류에서의 TCRα 또는 TCRβ 불변 영역의 남은 내인성 서열과 프레임 내에 있어서, 전체 길이 형질전환/키메라 TRAC 또는 TRBC는 외인성/형질전환인 이의 서열의 부분과 내인성인 다른 부분으로 형성된다.
일부 다른 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드의 둘 다가 세포로 도입된 경우, 재조합 TCRα는 tgCD3(ε-δ)-TRAC를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되고, 재조합 TCRβ는 tgCD3(ε-γ)-TRBC를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되거나; 재조합 TCRα는 tgCD3(ε-γ)-TRAC를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되고, 재조합 TCRβ는 tgCD3(ε-δ)-TRBC를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된다. 이와 같이, 상기의 실시형태에서, 세포 표면에서 하나의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 CD3ε과 CD3δ 사이의 하나의 이종이합체 및 다른 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 CD3ε과 CD3γ 사이의 다른 이종이합체가 형성될 수 있었다.
일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드 중 오직 하나가 세포로 도입된 경우, 다른 TCR 아단위는 야생형/내인성 중 어느 하나이거나, 한정된 가변 영역으로 대체되거나 대체되지 않으면서 내인성 가변 영역이 제거된 불변 영역만을 포함하도록 조작된다: 예를 들어, 도 1a에서의 디자인 1의 tgTRAC 또는 tgTRBC(가변 영역 없음), 또는 도 1a에서의 디자인 2의 tgTCRα 또는 tgTCRβ(한정된 가변 영역을 가짐). 이와 같이, 도 1b의 디자인 4에 도시된 것과 같이, 재조합 TCRα 아단위를 제공하도록 세포로 tgCD3(ε-δ)-TRAC를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드가 도입된 일 실시형태에서, 이 실시형태에서, 세포 표면에서 내인성 CD3ε과 내인성 CD3γ 사이의 하나의 이종이합체, 및 tgCD3(ε-δ)-TRAC를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 CD3ε과 CD3δ 사이의 다른 이종이합체가 형성될 수 있도록, tgTRBC 또는 tgTCRβ를 포함하는 다른 폴리뉴클레오타이드는 재조합 TCRβ 아단위를 제공하도록 세포로 또한 도입된다. 도 1b의 디자인 4의 또 다른 실시형태에서, 재조합 TCRβ 아단위를 제공하도록 세포로 tgCD3(ε-γ)-TRBC를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드가 도입된 경우, 세포 표면에서 내인성 CD3ε과 내인성 CD3δ 사이의 이종이합체, 및 tgCD3(ε-γ)-TRBC를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 CD3ε과 CD3γ 사이의 다른 이종이합체가 형성될 수 있도록, tgTRAC 또는 tgTCRα를 포함하는 다른 폴리뉴클레오타이드는 재조합 TCRα 아단위를 제공하도록 세포로 또한 도입된다.
일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 TCRα의 내인성 프로모터에 의해 추진되는 반면, 일부 다른 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 외인성 프로모터에 의해 추진된다. 일부 실시형태에서, 제2 폴리뉴클레오타이드는 TCRβ의 내인성 프로모터에 의해 추진되는 반면, 일부 다른 실시형태에서, 제2 폴리뉴클레오타이드는 외인성 프로모터에 의해 추진된다. 일부 실시형태에서, 재조합 TCRα 또는 재조합 TCRβ 중 어느 하나에 대한 외인성 프로모터는 항시적 프로모터, 유도성 프로모터, 시간 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 세포 유형 특이적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 프로모터는 CMV, EF1α, PGK, CAG 및 UBC 중 하나를 포함한다. 일 실시형태에서, 외인성 프로모터는 적어도 CAG를 포함한다. 일부 실시형태에서, TCRα 불변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 1인 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 적어도 포함한다. 일부 실시형태에서, TCRβ 불변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 2 또는 서열 번호 3인 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 적어도 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3ε 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 25인 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 적어도 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3δ 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 26인 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 적어도 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3γ 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 27인 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 적어도 포함한다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 80%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 90%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 95%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 100%이다. CD3ε, CD3δ 또는 CD3γ 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 신호 펩타이드는 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30 중 하나, 또는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 신호 펩타이드를 포함한다. CD3ε 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 28의 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. CD3δ 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 29의 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. CD3γ 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 30의 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다.
서열 번호 25
DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMD
(엑토-CD3ε)
서열 번호 26
FKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVA
(엑토-CD3δ)
서열 번호 27
QSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATIS
(엑토-CD3γ)
서열 번호 28
MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQ
서열 번호 29
MEHSTFLSGLVLATLLSQVSP
서열 번호 30
MEQGKGLAVLILAIILLQGTLA
tgCD3(ε-δ)-TRAC 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 31인 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 여기서 서열 번호 31에 포함된 2개의 링커 서열(서열 번호 33 및 서열 번호 34)의 각각은 당해 분야에 공지된 임의의 것으로 대체될 수 있다. tgCD3(ε-γ)-TRBC 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 32인 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 여기서 서열 번호 32에 포함된 2개의 링커 서열(서열 번호 33 및 서열 번호 34)의 각각은 당해 분야에 공지된 임의의 것으로 대체될 수 있다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 80%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 90%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 95%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 100%이다. 본원에 제공된 것과 같은 재조합 TCRα 또는 TCRβ 융합 단백질의 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 당해 분야에 공지된 신호 펩타이드를 추가로 포함한다. 하나의 비제한적인 예시적인 신호 펩타이드는 서열 번호 28로 표시된 펩타이드를 포함한다.
서열 번호 31
DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVGSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGSFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRM GGGGSGGGGSGGGGS IQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
(N'-CD3ε-링커-CD3δ- G4S 링커 -TRAC-C')
서열 번호 32
DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVGSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGSQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRM GGGGSGGGGSGGGGS DLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
(N'-CD3ε-링커-CD3γ- G4S 링커 -TRBC-C')
서열 번호 33
GSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGS
서열 번호 34
GGGGSGGGGSGGGGS
본 출원에서, CD3ε과 CD3δ 및 CD3γ 중 하나의 엑토도메인과 융합된 TCRα 또는 TCRβ 불변 영역은 CD3ε/CD3δ 및 CD3ε/CD3γ 이종이합체를 형성하도록 CD3ε과 CD3δ 및 CD3γ 중 하나의 융합된 엑토도메인을 갖거나 갖지 않는 형질전환 TCRβ 또는 TCRα 불변 영역과 회합할 수 있다는 것이 발견되었다. 회합된 형질전환 TCRα 및 TCRβ 아단위는 CD3 엑토도메인(cs-CD3)의 세포 표면 발현 및 펩타이드-MHC 결합 가능성을 갖지 않으면서 내인성 CD3ζ를 통한 신호전달 유도를 지지하기 위해 내인성 CD3ζ와 추가로 회합할 수 있다. 이와 같이, 디자인 4의 관점에서, 본원에는 세포 또는 이의 집단이 제공되고, 여기서 세포는 iPSC, 클론 iPSC, 클론 iPS 세포주 세포, 또는 상기 iPSC를 분화하여 얻은 분화 세포이고; 세포는 내인성 TCRα 불변 영역 및 내인성 TCRβ 불변 영역의 각각에서의 파괴, 및 융합된 전체 또는 부분 TCRα 불변 영역, 및 CD3ε과 CD3δ 및 CD3γ 중 하나의 전체 또는 부분 엑토도메인을 포함하는 tgTCRα를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오타이드(tgCD3(ε-δ/γ)-TRAC); 및 융합된 전체 또는 부분 TCRβ 불변 영역, 및 CD3ε과 CD3δ 및 CD3γ 중 하나의 전체 또는 부분 엑토도메인을 포함하는 tgTCRβ를 암호화하는 제2 외인성 폴리뉴클레오타이드(tgCD3(ε-γ/δ)-TRBC) 중 적어도 하나를 포함하고; CD3 아단위의 엑토도메인은 발현될 때 세포 표면(cs-CD3)에 존재하고; 오직 상기 제1 외인성 폴리뉴클레오타이드가 세포에 포함될 때, 세포는 본원에 제공된 것과 같은 tgTRBC 또는 tgTCRβ를 추가로 포함하고; 오직 상기 제2 외인성 폴리뉴클레오타이드가 세포에 포함될 때, 세포는 본원에 제공된 것과 같은 tgTRAC 또는 tgTCRα를 추가로 포함한다.
디자인 5: CD3 키메라 사슬(ccCD3)
도 1b에 제시된 것처럼, 이 디자인 5에서, 세포 표면 제시된 CD3(cs-CD3)은 CD3ε 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, CD3γ 또는 CD3δ 중 어느 하나의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, 및 적어도 하나의 ITAM(면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프)을 포함하는 CD3ζ의 엔도도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 포함하도록 구성된 CD3 키메라 사슬(ccCD3)의 형태이다. 상기 CD3 키메라 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포는 내인성 TCRα 및 내인성 TCRβ 중 어느 하나 또는 둘 다에서의 파괴를 추가로 포함할 수 있다. TCR 넉아웃과 동시에 또는 이에 후속하여, TRAC 및/또는 TRBC의 표적화된 편집에 의해 TCRneg 세포를 생성하도록 게놈 편집 도구를 사용할 때, 상기 CD3 키메라 사슬을 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 세포로 도입된다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 TRAC 또는 TRBC로 도입되고, 각각 TCRα 또는 TCRβ의 내인성 프로모터에 의해 추진되는 반면, 일부 다른 실시형태에서, 도입된 폴리뉴클레오타이드는 외인성 프로모터에 의해 추진된다. 일부 실시형태에서, 외인성 프로모터는 항시적 프로모터, 유도성 프로모터, 시간 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 세포 유형 특이적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 프로모터는 CMV, EF1α, PGK, CAG 및 UBC 중 하나를 포함한다. 일 실시형태에서, 외인성 프로모터는 적어도 CAG를 포함한다.
일부 실시형태에서, CD3 키메라 사슬은 CD3ε 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, CD3γ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, 및 적어도 하나의 ITAM을 포함하는 CD3ζ의 엔도도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 포함하고(tgCD3(ε-γ)-ζ), CD3 키메라 사슬은 N 말단에서의 엑토도메인 중 어느 하나와의 융합 단백질이고, 2개의 엑토도메인은 이종이합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, CD3 키메라 사슬은 CD3ε 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, CD3δ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, 및 적어도 하나의 ITAM을 포함하는 CD3ζ의 엔도도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 포함하고(tgCD3(ε-δ)-ζ), CD3 키메라 사슬은 N 말단에서의 엑토도메인 중 어느 하나와의 융합 단백질이고, 2개의 엑토도메인은 이종이합체를 형성한다. CD3 키메라 사슬의 일부 실시형태에서, CD3ζ의 엔도도메인은 2개의 ITAM을 포함한다. CD3 키메라 사슬의 일부 실시형태에서, CD3ζ의 엔도도메인은 모든 3개의 ITAM을 포함한다.
일부 실시형태에서, CD3ε 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 25인 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 적어도 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3δ 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 26인 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 적어도 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3γ 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 27인 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 적어도 포함한다. CD3ε, CD3δ 또는 CD3γ 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 신호 펩타이드는 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 30 중 하나, 또는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 신호 펩타이드를 포함한다. CD3ε 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 28의 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. CD3δ 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 29의 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. CD3γ 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 30의 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3ζ 엔도도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 CD3ζ ITAM1, ITAM2 및 ITAM3(서열 번호 36 내지 서열 번호 38)을 포함하는 서열 번호 35인 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 적어도 포함한다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 80%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 90%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 95%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 100%이다.
서열 번호 35
MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSAD APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKR RGRDPEMGGK PRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGM KG ERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ ALPPR
(… ITAM1 … ITAM2 … ITAM3 …)
서열 번호 36
APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKR
서열 번호 37
PRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGM
서열 번호 38
ERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ
CD3 키메라 사슬의 일부 실시형태에서, 적어도 1개, 2개 또는 3개의 ITAM을 포함하는 CD3ζ의 엔도도메인은 신호 유도 및/또는 공동자극을 위해 2B4, 4-1BB, CD16, CD2, CD28, CD28H, CD3ζ, DAP10, DAP12, DNAM1, FcERIγ IL21R, IL-2Rβ(IL-15Rβ), IL-2Rγ, IL-7R, KIR2DS2, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, CD3ζ1XX, CS1 또는 CD8의 하나 이상의 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. CD3 키메라 사슬의 일 실시형태에서, 적어도 1개, 2개 또는 3개의 ITAM을 포함하는 CD3ζ의 엔도도메인은 적어도 CD28의 신호전달 도메인을 추가로 포함한다(tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ). CD28의 신호전달 도메인을 포함하는 CD3ζ 엔도도메인의 일부 실시형태에서, 28ζ 엔도도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 임의의 1개 또는 2개의 CD3ζ ITAM이 제거될 수 있는 서열 번호 39인 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. CD3 키메라 사슬의 일부 실시형태에서, 적어도 1개, 2개 또는 3개의 ITAM을 포함하는 CD3ζ의 엔도도메인은 41BB의 신호전달 도메인을 추가로 포함한다(tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ). 41BB의 신호전달 도메인을 포함하는 CD3ζ 엔도도메인의 일부 실시형태에서, BBζ 엔도도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 임의의 1개 또는 2개의 CD3ζ ITAM이 제거될 수 있는 서열 번호 40인 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. CD3 키메라 사슬의 일부 실시형태에서, 적어도 1개, 2개 또는 3개의 ITAM을 포함하는 CD3ζ의 엔도도메인은 CD28의 신호전달 도메인 및 41BB의 신호전달 도메인을 추가로 포함한다(tgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζ). 28 및 41BB 둘 다의 신호전달 도메인을 포함하는 CD3ζ 엔도도메인의 일부 실시형태에서, 28BBζ 엔도도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 임의의 1개 또는 2개의 CD3ζ ITAM이 제거될 수 있는 서열 번호 41인 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. tgCD3(ε-γ)-(28/BB)ζ를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일 실시형태에서, 암호화된 폴리펩타이드는, 임의의 1개 또는 2개의 CD3ζ ITAM이 제거될 수 있거나, 링커 서열이 당해 분야에 공지된 임의의 다른 링커 서열로 대체될 수 있거나, CD28 신호전달 도메인이 일부 또 다른 실시형태에서 41BB 신호전달 도메인으로 대체되거나 이를 첨가하여 향상될 수 있는, 서열 번호 42인 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. tgCD3(ε-δ)-(28/BB)ζ의 일 실시형태에서, 암호화된 폴리펩타이드는, 임의의 1개 또는 2개의 CD3ζ ITAM이 제거될 수 있거나, 링커 서열이 당해 분야에 공지된 임의의 다른 링커 서열로 대체될 수 있거나, CD28 신호전달 도메인이 일부 또 다른 실시형태에서 41BB 신호전달 도메인으로 대체되거나 이의 추가의 포함을 통해 향상될 수 있는, 서열 번호 43인 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 암호화된 CD3 키메라 사슬 tgCD3(ε-γ)-(28/BB)ζ 또는 tgCD3(ε-δ)-(28/BB)ζ의 일부 다른 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열 번호 28의 신호 펩타이드, 또는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 신호 펩타이드를 추가로 포함한다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 80%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 90%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 95%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 100%이다.
서열 번호 39
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSAD APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKR RGRDPEMGGK PRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGM KG ERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ ALPPR
(… ITAM1 … ITAM2 … ITAM3 …)
서열 번호 40
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSAD APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKR RGRDPEMGGK PRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGM KG ERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ ALPPR
(… ITAM1 … ITAM2 … ITAM3 …)
서열 번호 41
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSAD APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKR RGRDPEMGGK PRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGM KG ERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ ALPPR
(… ITAM1 … ITAM2 … ITAM3 …)
서열 번호 42
DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVGSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGS QSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMRAAA IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS RVKFSRSAD APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKR RGRDPEMGGK PRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGM KG ERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ ALPPR
(CD3ε-링커-CD3γ- CD28 -CD3ζ (… ITAM1 … ITAM2 … ITAM3 …))
서열 번호 43
DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVGSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGS FKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMRAAA IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS RVKFSRSAD APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKR RGRDPEMGGK PRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGM KG ERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ ALPPR
(CD3ε-링커-CD3δ- CD28 -CD3ζ (… ITAM1 … ITAM2 … ITAM3 …))
본 출원에서, 본원에 제공된 것과 같은 CD3 키메라 사슬(여기서, CD3 키메라 사슬은 CD3ε 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, CD3δ 및 CD3γ 전체 길이 또는 부분 길이 엑토도메인 중 적어도 하나, 및 적어도 하나의 ITAM을 포함하는 CD3ζ 엔도도메인 및 선택적으로 하나 이상의 신호전달 도메인을 포함하는 융합 단백질임)은 TCRneg인 세포에서 발현될 때 세포 표면에 키메라 CD3 엑토도메인을 제시할 수 있다는 것이 발견되었다. 추가로 CD3 엑토도메인의 세포 표면 발현은 펩타이드-MHC 결합 가능성을 갖지 않으면서 융합된 CD3ζ 엔도도메인을 통해 CD3 결합 촉발된 신호전달 유도가 가능하게 한다.
이와 같이, 디자인 5의 관점에서, 본원에는 세포 또는 이의 집단이 제공되고, 여기서 세포는 iPSC, 클론 iPSC, 클론 iPS 세포주 세포, 또는 iPSC를 분화하여 얻은 분화 세포이고; 세포는 내인성 TCRα 불변 영역 및 내인성 TCRβ 불변 영역 중 적어도 하나의 파괴, 및 CD3 키메라 사슬 융합 단백질(ccCD3)을 암호화하는 적어도 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 융합 단백질은 CD3ε의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, 및 CD3δ 및 CD3γ 중 어느 하나의 전체 길이 또는 부분 길이 엑토도메인, 및 적어도 하나의 ITAM을 갖는 CD3ζ의 엔도도메인의 전체 길이 또는 부분 길이 및 선택적으로 하나 이상의 신호전달 도메인을 포함하고, CD3 키메라 사슬의 엑토도메인은 발현될 때 세포 표면(cs-CD3)에 존재한다.
도 1a 내지 도 1c의 다양한 디자인에서 본원에 개시된 것과 같은 TCRneg 세포(TCRneg cs-CD3)에서의 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)은 비제한적인 예로서 하기에 추가로 기재된 CD3 특이적 항체 또는 이의 기능적 변이체, CAR 및/또는 인게이저를 포함하는 분자와의 결합을 위해 CD3 관련된 세포 표면 트리거링 수용체로서 작용할 수 있다. 추가로 제공된 것처럼, 상기 TCRneg cs-CD3 세포 또는 이의 집단은 hnCD16 넉인; CAR; 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이 펩타이드; B2M 넉아웃 또는 넉다운; CIITA 넉아웃 또는 넉다운; HLA-G 또는 비절단성 HLA-G의 발현 도입; CD38 넉아웃, 및 본원에 기재된 추가의 조작된 양상 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 본 출원에는 비제한적인 예로서 TCRneg cs-CD3, CD16, CAR, CD38 음성, IL15(수용체 또는 절두된 변이체와의 융합 단백질), B2M-/- CIITA-/- 및 B2M-/- CIITA-/- HLA-G를 포함하는 본원에 제공된 것과 같은 적어도 하나의 표현형을 갖는 단일 세포 분류되고 증식된 클론 조작된 iPSC를 포함하는 마스터 세포 은행이 추가로 제공되고, 여기서 세포 은행은 추가의 iPSC 조작을 위한 플랫폼, 및 조성이 잘 한정되고 균일하며 비용 효과적인 방식으로 상당한 규모로 대량 생산될 수 있는 기성품, 조작된, 균일한 세포 치료 산물을 제조하기 위한 재생 가능한 원천을 제공한다.
2. hnCD16 넉인
CD16은 Fc 수용체 FcγRIIIa(CD16a; NM_000569.6) 및 FcγRIIIb(CD16b; NM_000570.4)인 2개의 이소폼을 갖는 것으로 확인되었다. CD16a는 NK 세포에 의해 발현된 막관통 단백질이고, 이는 NK 세포를 활성화하고 항체 의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)을 촉진하도록 표적 세포에 부착된 단량체성 IgG에 결합한다. CD16b는 인간 호중구에 의해 배타적으로 발현된다. 본원에 사용된 "고친화도 CD16", "비절단성 CD16" 또는 "고친화도 비절단성 CD16"은 다양한 CD16 변이체를 지칭한다. 야생형 CD16은 낮은 친화도를 갖고, NK 세포 활성화 시 백혈구에 대한 다양한 세포 표면 분자의 세포 표면 밀도를 조절하는 단백분해 절단 과정인 엑토도메인 쉐딩을 포함하는 하향조절로 처리된다. F176V(일부 간행물에서는 F158V라고도 칭함)는 고친화도를 갖는 예시적인 CD16 다형 대립유전자/변이체인 반면; S197P 변이체는 CD16의 유전 조작된 비절단성 버전의 예이다. F176V 및 S197P 둘 다를 포함하는 조작된 CD16 변이체는 고친화도를 갖고 비절단성이고, 이는 국제공개 WO 2015/148926호에 더 자세히 기재되어 있고, 이의 완전한 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 게다가, CD64 엑토도메인의 적어도 일부로 본질적으로 대체된 CD16의 엑토도메인을 갖는 키메라 CD16 수용체는 ADCC를 수행할 수 있는 CD16 수용체의 원하는 고친화도 및 비절단성 특징을 또한 달성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키메라 CD16의 대체 엑토도메인은 CD64의 EC1, EC2 및 EC3 엑손 중 하나 이상(UniPRotKB_P12314, 또는 이의 이소폼 또는 다형 변이체)을 포함한다.
이와 같이, 고친화도 비절단성 CD16 수용체(hnCD16)는 일부 실시형태에서 F176V 및 S197P 둘 다를 포함하고; 일부 실시형태에서 절단 영역이 제거된 F176V를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, hnCD16은 CD64 엑토도메인의 적어도 일부를 각각 포함하는 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9인 임의의 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 80%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 90%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 95%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 100%이다. 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9는 서열 번호 10 내지 서열 번호 12를 예시함으로써 각각 암호화된다. 본원에 그리고 본 명세서에 걸쳐 사용된 것처럼, 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여 서열이 공유한 동일한 위치의 수의 함수(즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100)이다. 당해 분야에서 인정된 수학적 알고리즘을 이용하여 서열의 비교 및 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성의 결정이 달성될 수 있다.
서열 번호 7:
MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLQLPTPVWFHYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSV KTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
(340 a.a. CD64 도메인 기반 구성; CD16TM; CD16ICD )
서열 번호 8
MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSV KTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
(336 a.a. CD64 엑손 기반 구성; CD16TM; CD16ICD )
서열 번호 9
MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNG
TATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPL
ALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAG
ISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSFYMGSKTLRGRN
TSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGFFPPGYQVSFCLVMVLLF
AVDTGLYFSV KTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
(335 a.a. CD64 엑손 기반 구성; CD16TM; CD16ICD )
서열 번호 10
cttggagaca acatgtggtt cttgacaact ctgctccttt gggttccagt tgatgggcaa
gtggacacca caaaggcagt gatcactttg cagcctccat gggtcagcgt gttccaagag gaaaccgtaa ccttgcattg tgaggtgctc catctgcctg ggagcagctc tacacagtgg tttctcaatg gcacagccac tcagacctcg acccccagct acagaatcac ctctgccagt gtcaatgaca gtggtgaata caggtgccag agaggtctct cagggcgaag tgaccccata cagctggaaa tccacagagg ctggctacta ctgcaggtct ccagcagagt cttcacggaa ggagaacctc tggccttgag gtgtcatgcg tggaaggata agctggtgta caatgtgctt tactatcgaa atggcaaagc ctttaagttt ttccactgga attctaacct caccattctg aaaaccaaca taagtcacaa tggcacctac cattgctcag gcatgggaaa gcatcgctac acatcagcag gaatatctgt cactgtgaaa gagctatttc cagctccagt gctgaatgca tctgtgacat ccccactcct ggaggggaat ctggtcaccc tgagctgtga aacaaagttg ctcttgcaga ggcctggttt gcagctttac ttctccttct acatgggcag caagaccctg cgaggcagga acacatcctc tgaataccaa atactaactg ctagaagaga agactctggg ttatactggt gcgaggctgc cacagaggat ggaaatgtcc ttaagcgcag ccctgagttg gagcttcaag tgcttggcct ccagttacca actcctgtct ggtttcatta ccaagtctct ttctgcttgg tgatggtact cctttttgca gtggacacag gactatattt ctctgtgaag acaaacattc gaagctcaac aagagactgg aaggaccata aatttaaatg gagaaaggac cctcaagaca aa
서열 번호 11
cttggagaca acatgtggtt cttgacaact ctgctccttt gggttccagt tgatgggcaa
gtggacacca caaaggcagt gatcactttg cagcctccat gggtcagcgt gttccaagag
gaaaccgtaa ccttgcattg tgaggtgctc catctgcctg ggagcagctc tacacagtgg
tttctcaatg gcacagccac tcagacctcg acccccagct acagaatcac ctctgccagt
gtcaatgaca gtggtgaata caggtgccag agaggtctct cagggcgaag tgaccccata
cagctggaaa tccacagagg ctggctacta ctgcaggtct ccagcagagt cttcacggaa
ggagaacctc tggccttgag gtgtcatgcg tggaaggata agctggtgta caatgtgctt
tactatcgaa atggcaaagc ctttaagttt ttccactgga attctaacct caccattctg
aaaaccaaca taagtcacaa tggcacctac cattgctcag gcatgggaaa gcatcgctac
acatcagcag gaatatctgt cactgtgaaa gagctatttc cagctccagt gctgaatgca
tctgtgacat ccccactcct ggaggggaat ctggtcaccc tgagctgtga aacaaagttg
ctcttgcaga ggcctggttt gcagctttac ttctccttct acatgggcag caagaccctg
cgaggcagga acacatcctc tgaataccaa atactaactg ctagaagaga agactctggg
ttatactggt gcgaggctgc cacagaggat ggaaatgtcc ttaagcgcag ccctgagttg
gagcttcaag tgcttggttt gttctttcca cctgggtacc aagtctcttt ctgcttggtg
atggtactcc tttttgcagt ggacacagga ctatatttct ctgtgaagac aaacattcga
agctcaacaa gagactggaa ggaccataaa tttaaatgga gaaaggaccc tcaagacaaa
서열 번호 12
atgtggttct tgacaactct gctcctttgg gttccagttg atgggcaagt ggacaccaca
aaggcagtga tcactttgca gcctccatgg gtcagcgtgt tccaagagga aaccgtaacc
ttgcactgtg aggtgctcca tctgcctggg agcagctcta cacagtggtt tctcaatggc
acagccactc agacctcgac ccccagctac agaatcacct ctgccagtgt caatgacagt
ggtgaataca ggtgccagag aggtctctca gggcgaagtg accccataca gctggaaatc
cacagaggct ggctactact gcaggtctcc agcagagtct tcacggaagg agaacctctg
gccttgaggt gtcatgcgtg gaaggataag ctggtgtaca atgtgcttta ctatcgaaat
ggcaaagcct ttaagttttt ccactggaac tctaacctca ccattctgaa aaccaacata
agtcacaatg gcacctacca ttgctcaggc atgggaaagc atcgctacac atcagcagga
atatctgtca ctgtgaaaga gctatttcca gctccagtgc tgaatgcatc tgtgacatcc
ccactcctgg aggggaatct ggtcaccctg agctgtgaaa caaagttgct cttgcagagg
cctggtttgc agctttactt ctccttctac atgggcagca agaccctgcg aggcaggaac
acatcctctg aataccaaat actaactgct agaagagaag actctgggtt atactggtgc
gaggctgcca cagaggatgg aaatgtcctt aagcgcagcc ctgagttgga gcttcaagtg
cttggcttct ttccacctgg gtaccaagtc tctttctgct tggtgatggt actccttttt
gcagtggaca caggactata tttctctgtg aagacaaaca ttcgaagctc aacaagagac
tggaaggacc ataaatttaa atggagaaag gaccctcaag acaaa
따라서, 본원에는 본원에서 고려되고 기재된 것과 같은 다른 편집들 중에서 포함되도록 유전 조작된 클론 iPSC 및 고친화도 비절단성 CD16 수용체(hnCD16)가 제공되고, 여기서 유전 조작된 iPSC는 iPSC로 도입된 hnCD16을 포함하는 효과기 세포로 분화할 수 있다. 일부 실시형태에서, hnCD16을 포함하는 유래된 효과기 세포는 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, hnCD16을 포함하는 유래된 효과기 세포는 T 세포이다. iPSC 또는 이로부터의 분화 세포에서 발현된 외인성 hnCD16은 ADCC 항체 또는 이의 단편뿐만 아니라 CD16 또는 상기 hnCD16 및 이의 변이체의 CD64 세포외 결합 도메인을 인식하는 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 인게이저 또는 결합제에 대한 결합에서 고친화도를 갖는다. 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 인게이저 또는 결합제는 본 출원에서 하기에 추가로 기재되어 있다(I.7 부문 참조). 이와 같이, 본 출원의 양태 중 적어도 하나는 하기에 V. 부문에 더 자세히 기술된 것처럼 병태, 질환 또는 감염의 치료에서의 치료학적 용도를 위한 충분한 양으로 분화 효과기 세포 상에 발현된 hnCD16의 세포외 도메인과의 고친화도 결합을 통해 하나 이상의 예비선택된 ADCC 항체가 예비로딩된 분화 효과기 세포 또는 이의 세포 집단을 제공하고, 여기서 상기 hnCD16은 CD64, 또는 F176V 및 S197P를 갖는 CD16의 세포외 결합 도메인을 포함한다.
일부 다른 실시형태에서, 비자연적 막관통 도메인, 비자연적 자극 도메인 및/또는 비자연적 신호전달 도메인을 포함하도록 키메라 Fc 수용체(CFcR)가 제조되도록, hnCD16의 자연적 CD16 막관통 도메인 및/또는 세포내 도메인이 추가로 변형되거나 대체된다. 본원에 사용된 "비자연적"이라는 용어는 세포외 도메인을 제공하는 수용체 이외의 상이한 수용체로부터 막관통 도메인, 자극 도메인 또는 신호전달 도메인이 유래된다는 것을 의미한다. 여기서 예시에서, CD16 또는 이의 변이체에 기초한 CFcR은 CD16으로부터 유래된 막관통 도메인, 자극 도메인 또는 신호전달 도메인을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 외인성 hnCD16 기반 CFcR은 CD3D, CD3E, CD3G, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D, T 세포 수용체 폴리펩타이드로부터 유래된 비자연적 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 hnCD16 기반 CFcR은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래된 비자연적 자극/억제 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 hnCD16 기반 CFcR은 CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137(41BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래된 비자연적 신호전달 도메인을 포함한다. hnCD16의 일 실시형태에서, 제공된 키메라 수용체는 IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 및 NKG2D 폴리펩타이드 중 하나로부터 둘 다 유래된 막관통 도메인 및 신호전달 도메인을 포함한다. hnCD16 기반 키메라 Fc 수용체의 하나의 특정 실시형태는 NKG2D의 막관통 도메인, 2B4의 자극 도메인 및 CD3ζ의 신호전달 도메인을 포함하고; 여기서 hnCD16의 세포외 도메인은 CD64 또는 CD16의 세포외 도메인의 전체 길이 또는 부분 서열로부터 유래되고, CD16의 세포외 도메인은 F176V 및 S197P를 포함한다. hnCD16 기반 키메라 Fc 수용체의 다른 실시형태는 CD3ζ의 막관통 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하고; hnCD16의 세포외 도메인은 CD64 또는 CD16의 세포외 도메인의 전체 길이 또는 부분 서열로부터 유래되고, CD16의 세포외 도메인은 F176V 및 S197P를 포함한다.
상기에 기재된 것과 같은 hnCD16 기반 키메라 Fc 수용체의 다양한 실시형태는 항체 또는 이의 단편의 Fc 영역; 또는 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 인게이저 또는 결합제의 Fc 영역에 고친화도로 결합할 수 있다. 결합 시, 키메라 수용체의 자극 도메인 및/또는 신호전달 도메인은 효과기 세포의 활성화 및 사이토카인 분비, 및 항체, 또는 종양 항원 결합 성분뿐만 아니라 Fc 영역을 갖는 상기 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 인게이저 또는 결합제에 의해 표적화된 종양 세포의 사멸이 가능하게 한다. 이론에 의해 구속됨이 없이, hnCD16 기반 키메라 Fc 수용체의 비자연적 막관통, 자극 및/또는 신호전달 도메인을 통해, 또는 상기 수용체의 엑토도메인에 대한 인게이저 결합을 통해, CFcR은 효과기 세포의 증식 및/또는 증식 가능성을 증가시키면서 효과기 세포의 사멸 능력에 기여할 수 있었다. 항체 및 인게이저는 항원을 발현하는 종양 세포 및 CFcR을 발현하는 효과기 세포가 가깝게 근접하게 할 수 있고, 이는 또한 종양 세포의 향상된 사멸에 기여한다. 이중특이적, 삼중특이적, 다중특이적 인게이저 또는 결합제에 대한 예시적인 종양 항원은 B7H3, BCMA, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD179b, CEA, CLEC12A, CS-1, DLL3, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, FLT-3, FOLR1, FOLR3, GD2, gpA33, HER2, HM1.24, LGR5, MSLN, MCSP, MICA/B, PSMA, PAMA, P-카드헤린 및 ROR1을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 종양 세포를 공격하는 데 있어서 hnCD16 기반 CFcR을 발현하는 효과기 세포를 결합하기에 적합한 일부 비제한적인 예시적인 이중특이적, 삼중특이적, 다중특이적 인게이저 또는 결합제는 CD16(또는 CD64)-CD30, CD16(또는 CD64)-BCMA, CD16(또는 CD64)-IL15-EPCAM 및 CD16(또는 CD64)-IL15-CD33을 포함한다.
NK 세포 활성화 후 세포 표면으로부터 절단된 일차 NK 세포에 의해 발현된 내인성 CD16 수용체와 달리, 분화 NK에서의 CD16의 다양한 비절단성 버전은 CD16 쉐딩을 피하고 일정한 발현을 유지한다. 분화 NK 세포에서, 비절단성 CD16은 TNFα 및 CD107a의 발현을 증가시켜 개선된 세포 기능성을 나타낸다. 비절단성 CD16은 또한 항체 의존적 세포 매개된 세포독성(ADCC), 및 이중특이적 인게이저, 삼중특이적 인게이저 또는 다중특이적 인게이저의 결합을 향상시킨다. ADCC는 항체 코팅된 표적 세포에 대한 CD16의 결합을 통한 NK 세포 매개된 용해의 기전이다. 유래된 NK 세포에서의 도입된 hnCD16의 추가의 고친화도 특징은 또한 세포 치료를 필요로 하는 대상체에게 세포를 투여하기 전에 hnCD16를 통한 NK 세포로의 ADCC 항체의 시험관내 로딩이 가능하게 한다. 제공된 것처럼, hnCD16은 일부 실시형태에서 F176V 및 S197P를 포함할 수 있거나, 서열 번호 7, 서열 번호 8 또는 서열 번호 9에 의해 예시된 것처럼 CD64로부터 기원한 전체 또는 부분 엑토도메인을 포함할 수 있거나, 비자연적 막관통 도메인, 자극 도메인 및 신호전달 도메인 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다. 개시된 것처럼, 본 출원은 또한 하기에 V. 부문에 더 기술된 것처럼 병태, 질환 또는 감염의 치료에서 치료학적 용도를 위한 충분한 양으로 하나 이상의 예비선택된 ADCC 항체가 예비로딩된 분화 NK 세포 또는 이의 세포 집단을 제공한다.
일차 NK 세포와 달리 일차 원천(즉, 말초혈, 제대혈 또는 다른 공여자 조직과 같은 자연/자연적 원천)으로부터의 성숙 T 세포는 CD16을 발현하지 않는다. 발현된 외인성 비절단성 CD16을 포함하는 iPSC가 T 세포 발생 생물학을 손상시키지 않았고, 외인성 CD16을 발현할 뿐만 아니라 획득된 ADCC 기전을 통해 기능을 수행할 수 있는 기능적인 분화 T 세포로 분화할 수 있었다는 것은 예상치 못했다. 분화 T 세포에서의 이 획득된 ADCC는 이중 표적화에 대한 접근법으로서 및/또는 CAR-T 세포 치료에 의해 대개 발생한 항원 회피를 구제하도록 추가로 사용될 수 있고, 여기서 CAR(키메라 항원 수용체)에 의한 인식을 피하기 위한 CAR-T 표적화된 항원 발현 또는 돌연변이된 항원의 발현이 감소되거나 소실되면서 종양이 재발한다. 상기 분화 T 세포가 외인성 CD16 발현을 통해 획득된 ADCC를 포함할 때, 그리고 항체가 CAR에 의해 표적화된 종양 항원과 다른 종양 항원을 표적화할 때, CAR-T 항원 회피를 구제하고, CAR-T 치료에서 대개 보이는 표적화된 종양의 재발 또는 재발생을 감소시키거나 방지하기 위해 항체가 사용될 수 있다. 이중 표적화를 달성하면서 항원 회피를 감소시키고/시키거나 방지하기 위한 이러한 전략은 하나 이상의 CAR을 발현하는 NK 세포에 동등하게 적용 가능하다. 이 항원 회피 감소 및 방지 전략에 사용될 수 있는 다양한 CAR은 하기에 추가로 기술된다.
이와 같이, 본 발명은 외인성 CD16을 포함하는 분화 T 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, 분화 T 세포에 포함된 hnCD16은 F176V 및 S197P를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 분화 T 세포에 포함된 hnCD16은 서열 번호 7, 서열 번호 8 또는 서열 번호 9에 의해 예시된 것처럼 CD64로부터 기원한 전체 또는 부분 엑토도메인을 포함하거나, 비자연적 막관통 도메인, 자극 도메인 및 신호전달 도메인 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다. 설명된 것처럼, 이러한 분화 T 세포는 항체의 치료학적 효과를 향상시키기 위해 ADCC에 의해 매개된 단일클론 항체에 의한 종양을 표적화하기 위한 획득된 기전을 갖는다. 개시된 것처럼, 본 출원은 또한 하기에 V. 부문에 더 기술된 것처럼 병태, 질환 또는 감염의 치료에서 치료학적 용도를 위한 충분한 양으로 하나 이상의 예비선택된 ADCC 항체가 예비로딩된 분화 T 세포 또는 이의 세포 집단을 제공한다.
본 출원에는 비제한적인 예로서 CD16을 포함하는 본원에 제공된 것과 같은 적어도 하나의 표현형을 갖는 단일 세포 분류되고 증식된 클론 조작된 iPSC를 포함하는 마스터 세포 은행이 추가로 제공되고, 여기서 세포 은행은 추가의 iPSC 조작을 위한 플랫폼, 및 조성이 잘 한정되고 균일하며 비용 효과적인 방식으로 상당한 규모로 대량 생산될 수 있는, 비제한적인 예로서 분화 NK 세포 및 분화 T 세포를 포함하는, 기성품, 조작된, 균일한 세포 치료 산물을 제조하기 위한 재생 가능한 원천을 제공한다.
3. CAR 발현
당해 분야에 공지된 임의의 CAR 디자인은 유전 조작된 iPSC 및 이의 분화 효과기 세포에 적용 가능할 수 있다. 키메라 항원 수용체인 CAR은 항원 인식 영역, 막관통 도메인 및 엔도도메인을 포함하는 엑토도메인을 일반적으로 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 엑토도메인은 신호 펩타이드 또는 리더 서열 및/또는 스페이서를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 엔도도메인은 CAR을 발현하는 효과기 세포를 활성화하는 신호전달 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 인식 도메인은 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 인식 도메인은 질환 또는 병원균과 연관된 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 질환 연관된 항원은 종양 항원이고, 종양은 액체 종양 또는 고형 종양일 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR은 상기 CAR을 발현하는 T 세포 또는 NK 세포 중 어느 하나를 활성화하는 데 적합하다. 일부 실시형태에서, CAR은 NK 특이적 신호전달 성분의 포함에 특이적인 NK 세포이다. 소정의 실시형태에서, 상기 T 세포는 CAR을 발현하는 iPSC로부터 유래되고, 분화 T 세포는 T 헬퍼 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포, αβ T 세포, γδ T 세포, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 상기 NK 세포는 CAR을 발현하는 iPSC로부터 유래된다.
소정의 실시형태에서, 상기 항원 인식 영역은 쥣과 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 낙타 Ig, 상어 중쇄 전용 항체(VNAR), Ig NAR, 키메라 항체, 재조합 항체, 또는 이들의 항체 단편을 포함한다. 항체 단편의 비제한적인 예는 Fab, Fab′, F(ab)′2, F(ab)′3, Fv, 단일 사슬 항원 결합 단편(scFv), (scFv)2, 다이설파이드 안정화된 Fv(dsFv), 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 단일 도메인 항원 결합 단편(sdAb, Nanobody), 재조합 중쇄 전용 항체(VHH), 및 전체 항체의 결합 특이성을 유지하는 다른 항체 단편을 포함한다. CAR에 의해 표적화될 수 있는 항원의 비제한적인 예는 ADGRE2, 탄산무수화효소 IX (CAIX), CCRI, CCR4, 암배아 항원(CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CD269(BCMA), CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원(예를 들어, 세포 표면 항원), 상피 당단백질2(EGP 2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 부착 분자(EpCAM), EGFRvIII, 수용체 티로신-단백질 키나제 erb­ B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산-결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 엽산 수용체-a, 강글리오사이드 G2(GD2), 강글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER-2), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 아단위 알파-2(IL-13Rα2), κ-경쇄, 키나제 인서트 도메인 수용체(KDR), 루이스 A(CA19.9), 루이스 Y(LeY), L1 세포 부착 분자(L1-CAM), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A 1(MAGE-A1), MICA/B, 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), PRAME 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 종양 연관된 당단백질 72(TAG-72), TIM-3, TRBCI, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­ R2), 윌름스 종양 단백질(WT-1), 및 당해 분야에 공지된 다양한 병원균 항원을 포함한다. 병원균의 비제한적인 예는 질환을 야기할 수 있는 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충 및 원생동물을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR의 막관통 도메인은 CD3D, CD3E, CD3G, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D, T 세포 수용체 폴리펩타이드의 자연적 막관통 영역 또는 변형된 막관통 영역의 전체 길이 또는 적어도 일부를 포함한다.
일부 실시형태에서, 엔도도메인(또는 세포내 도메인)의 신호전달 펩타이드는 CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137(41BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 또는 NKG2D의 폴리펩타이드의 전체 길이 또는 적어도 일부를 포함한다. 일 실시형태에서, CAR의 신호전달 펩타이드는 CD3ζ의 적어도 하나의 ITAM(면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프)과 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 동일성인 아미노산 서열을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 상기 엔도도메인은 적어도 하나의 공동자극 신호전달 영역을 추가로 포함한다. 상기 공동자극 신호전달 영역은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 또는 NKG2D의 폴리펩타이드의 전체 길이 또는 적어도 일부, 또는 임의의 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 출원에 제공된 세포에 적용 가능한 CAR은 CD28로부터 유래된 공동자극 도메인 및 서열 번호 13과 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 동일성의 아미노산 서열로 표시된 CD3ζ의 자연적 ITAM1 또는 변형된 ITAM1을 포함하는 신호전달 도메인을 포함한다. 추가의 실시형태에서, CD28로부터 유래된 공동자극 도메인, 및 CD3ζ의 자연적 ITAM1 또는 변형된 ITAM1을 포함하는 CAR은 CD28로부터 유래된 막관통 도메인 및 힌지 도메인을 또한 포함하고, scFv는 힌지를 통해 막관통 도메인에 연결될 수 있고, CAR은 서열 번호 14와 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 동일성의 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 80%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 90%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 95%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 100%이다.
서열 번호 13
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQ
LYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGE
RRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR
(153 a.a. CD28 공동자극 + CD3ζITAM)
서열 번호 14
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP FWVLVVVGGVLACYSLLVTVA
FIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAY
QQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSE
IGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR
(219 a.a. CD28 힌지 + CD28 TM + CD28 공동자극 + CD3ζITAM)
다른 실시형태에서, 본 출원에서 제공된 세포에 적용 가능한 CAR은 NKG2D로부터 유래된 막관통 도메인, 2B4로부터 유래된 공동자극 도메인, 및 서열 번호 15와 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 동일성의 아미노산 서열로 표시된 자연적 CD3ζ 또는 변형된 CD3ζ를 신호전달 도메인을 포함한다. NKG2D로부터 유래된 막관통 도메인, 2B4로부터 유래된 공동자극 도메인 및 자연적 CD3ζ 또는 변형된 CD3ζ를 포함하는 신호전달 도메인을 포함하는 상기 CAR은 CD8 힌지를 추가로 포함할 수 있고, 이러한 구조의 아미노산 서열은 서열 번호 16과 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 80%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 90%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 95%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 100%이다.
서열 번호 15
SNLFVASWIAVMIIFRIGMAVAIFCCFFFPSWRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKT
RRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNS
TIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRR
EEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGL
YQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
(263 a.a NKG2D TM + 2B4 + CD3ζ)
서열 번호 16
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD SNLFVASWIAVMIIF
RIGMAVAIFCCFFFPSWRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGS
TIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTIYEVIGKSQPKAQN
PARLSRKELENFDVYSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPE
MGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDAL
HMQALPPR
(308 a.a CD8 힌지 + NKG2D TM + 2B4 + CD3ζ)
비제한적인 CAR 전략은 한 쌍의 세포내 도메인의 이합체화를 통한 이종이합체성인 조건적으로 활성화된 CAR(예를 들어, 미국 특허 제9587020호 참조); 분할 CAR(여기서, CAR을 생성하기 위한 항원 결합, 힌지 및 엔도도메인의 상동성 재조합)(예를 들어, 미국 특허출원공개 US 제20170183407호 참조); 각각 항원 결합 도메인 및 신호전달 도메인에 연결된 2개의 막관통 도메인 사이의 비공유 연결을 허용하는 다중사슬 CAR(예를 들어, 미국 특허출원공개 US 제20140134142호 참조); 이중특이적 항원 결합 도메인을 갖는 CAR(예를 들어, 미국 특허 제9447194호 참조), 또는 동일한 또는 상이한 항원 또는 에피토프를 인식하는 한 쌍의 항원 결합 도메인을 갖는 것(예를 들어, 미국 특허 제8409577호 참조), 또는 탠덤 CAR(예를 들어, 문헌[Hegde et al., J Clin Invest. 2016;126(8):3036-3052] 참조); 유도성 CAR(예를 들어, 미국 특허출원공개 US 제20160046700호, 미국 특허출원공개 US 제20160058857호, 미국 특허출원공개 US 제20170166877호 참조); 스위치 가능한 CAR(예를 들어, 미국 특허출원공개 US 제20140219975호 참조); 및 당해 분야에 공지된 임의의 다른 디자인을 추가로 포함한다.
본원에는 따라서 게놈 조작된 iPSC를 분화하여 얻은 분화 세포가 제공되고, 여기서 iPSC 및 분화 세포 둘 다는 비제한적인 예로서 TCRneg cs-CD3 및/또는 hnCD16을 포함하는 추가의 변형된 양상과 함께 하나 이상의 CAR을 포함한다. 본 출원에는 비제한적인 예로서 CAR과 TCRneg cs-CD3 및 hnCD16 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 본원에 제공된 것과 같은 적어도 하나의 표현형을 갖는 단일 세포 분류되고 증식된 클론 조작된 iPSC를 포함하는 마스터 세포 은행이 추가로 제공되고, 여기서 세포 은행은 추가의 iPSC 조작을 위한 플랫폼, 및 조성이 잘 한정되고 균일하며 비용 효과적인 방식으로 상당한 규모로 대량 생산될 수 있는 기성품, 조작된, 균일한 세포 치료 산물을 제조하기 위한 재생 가능한 원천을 제공한다. 하나의 특정 실시형태에서, iPSC 및 이의 분화 세포는 TCRneg cs-CD3, hnCD16, 및 선택된 종양 또는 바이러스 항원을 표적화하는 CAR을 포함하고, 분화 세포는 NK 세포 또는 T 세포이고, 분화 세포는 동일한 종양의 이중 표적화를 달성하면서 종양 항원 회피를 피하거나 감소시키기 위해 hnCD16 결합을 통해 CAR에 의해 표적화된 종양 항원과 다른 종양 항원을 표적화하는 하나 이상의 ADCC 항체 또는 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 인게이저와 사용될 수 있다.
추가의 실시형태에서, CAR을 포함하는 iPSC 및 이의 분화 T 세포는 TCR 불변 영역에서 삽입된 CAR을 가져서, TCR 넉아웃으로 이어지고, CAR 발현이 내인성 TCR 프로모터의 제어 하에 있게 한다. 추가의 삽입 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 조작된 iPSC로부터 유래된 분화 TCR 음성 CAR-T 세포는 CD16에 자연적(F176V 및/또는 S197P)이거나 CD64로부터 유래된 엑토도메인, 및 자연적 또는 비자연적인 막관통 도메인, 자극 도메인 및 신호전달 도메인을 갖는 hnCD16을 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, CAR을 포함하는 iPSC 및 이의 분화 NK 세포는 NKG2A 유전자좌 또는 NKG2D 유전자좌에서 삽입된 CAR을 가져서, NKG2A 또는 NKG2D 넉아웃으로 이어지고, CAR 발현이 내인성 NKG2A 또는 NKG2D 프로모터의 제어 하에 있게 한다. 비제한적인 예로서 CAR을 포함하는 본원에 제공된 것과 같은 적어도 하나의 표현형을 갖는 단일 세포 분류되고 증식된 클론 조작된 iPSC를 포함하는 마스터 세포 은행이 추가로 제공되고, 여기서 세포 은행은 추가의 iPSC 조작을 위한 플랫폼, 및 조성이 잘 한정되고 균일하며 비용 효과적인 방식으로 상당한 규모로 대량 생산될 수 있는 기성품, 조작된, 균일한 세포 치료 산물을 제조하기 위한 재생 가능한 원천을 제공한다.
4. 외인성으로 도입된 사이토카인 및/또는 사이토카인 신호전달
임상적으로 관련된 사이토카인의 전신 고용량 투여를 피함으로써, 사이토카인 매개된 세포 자율성이 확립되면서 이러한 실행으로 인한 용량 제한 독성의 위험은 감소한다. 가용성 사이토카인을 추가로 투여할 필요성 없이 림프구 자율성을 달성하기 위해, IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21 및/또는 이의 각각의 수용체 중 하나 이상의 부분 길이 또는 전체 길이 펩타이드는 사이토카인 자체의 발현과 함께 또는 이것 없이 사이토카인 신호전달이 가능하게 하도록 세포로 도입되어서, 사이토카인 독성의 위험이 감소하면서 세포 성장, 급증, 증식 및/또는 효과기 기능을 유지하거나 개선한다. 일부 실시형태에서, 세포 표면에서 사이토카인 신호전달을 위한 도입된 사이토카인 및/또는 이의 각각의 자연적 수용체 또는 변형된 수용체가 발현된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달은 항시적으로 활성화된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달의 활성화는 유도성이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달의 활성화는 일시적이고/이거나 시간적이다.
도 2는 예시적인 예로서 IL15를 사용한 몇몇 작제물 디자인을 제시한다. 도 2에서의 임의의 디자인의 막관통(TM) 도메인은 IL15 수용체에 자연적일 수 있거나, 임의의 다른 막 결합된 단백질의 막관통 도메인으로 변형되거나 대체될 수 있다.
도 2 디자인 1: IL15의 같은 쪽 제시(cis-presentation)를 제거할 필요 없이 IL15의 다른 쪽 제시(trans-presentation)를 모방하는 자가 절단 펩타이드를 사용하여 IL15 및 IL15Rα는 동시발현된다.
도 2 디자인 2: IL15Rα는 링커를 통해 C 말단에서 IL15에 융합되어서, IL15의 같은 쪽 제시의 제거 없이 다른 쪽 제시를 모방할 뿐만 아니라 IL15 막-결합성을 보장한다.
도 2 디자인 3: 절두된 세포내 도메인을 갖는 IL15Rα가 링커를 통해 C 말단에서 IL15에 융합되어서, IL15의 다른 쪽 제시를 모방하고, IL15 막-결합성을 유지하고, 이의 세포내 도메인을 통해 일반 IL15R에 의해 매개된 같은 쪽 제시 및/또는 임의의 다른 가능한 신호 전달 경로를 추가로 제거한다. IL15Rα의 세포내 도메인은 수용체가 IL15 반응 세포를 발현하는 데 중요하고, 반응 세포가 증식하고 작용하는 데 중요한 것으로 간주된다. 이러한 절두된 작제물은 서열 번호 18로 표시된 예시적인 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있는 서열 번호 17과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성의 아미노산 서열을 포함한다. 절두된 IL15/IL15Rα의 일 실시형태에서, 작제물은 서열 번호17의 마지막 4개의 아미노산 "KSRQ"를 포함하지 않고, 서열 번호 21과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성의 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 80%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 90%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 95%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 100%이다.
서열 번호 17
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LLCGLSAVSLLACYLKSRQ
(379 a.a.; 신호 및 링커 펩타이드는 밑줄 표시됨)
서열 번호 18
ATGGACTGGACCTGGATTCTGTTCCTGGTCGCGGCTGCAACGCGAGTCCATAGCGGTATC
CATGTTTTTATTCTTGGGTGTTTTTCTGCTGGGCTGCCTAAGACCGAGGCCAACTGGGTA
AATGTCATCAGTGACCTCAAGAAAATAGAAGACCTTATACAAAGCATGCACATTGATGCT
ACTCTCTACACTGAGTCAGATGTACATCCCTCATGCAAAGTGACGGCCATGAAATGTTTC
CTCCTCGAACTTCAAGTCATATCTCTGGAAAGTGGCGACGCGTCCATCCACGACACGGTC
GAAAACCTGATAATACTCGCTAATAATAGTCTCTCTTCAAATGGTAACGTAACCGAGTCA
GGTTGCAAAGAGTGCGAAGAGTTGGAAGAAAAAAACATAAAGGAGTTCCTGCAAAGTTTC
GTGCACATTGTGCAGATGTTCATTAATACCTCTAGCGGCGGAGGATCAGGTGGCGGTGGA
AGCGGAGGTGGAGGCTCCGGTGGAGGAGGTAGTGGCGGAGGTTCTCTTCAAATAACTTGT
CCTCCACCGATGTCCGTAGAACATGCGGATATTTGGGTAAAATCCTATAGCTTGTACAGC
CGAGAGCGGTATATCTGCAACAGCGGCTTCAAGCGGAAGGCCGGCACAAGCAGCCTGACC
GAGTGCGTGCTGAACAAGGCCACCAACGTGGCCCACTGGACCACCCCTAGCCTGAAGTGC
ATCAGAGATCCCGCCCTGGTGCATCAGCGGCCTGCCCCTCCAAGCACAGTGACAACAGCT
GGCGTGACCCCCCAGCCTGAGAGCCTGAGCCCTTCTGGAAAAGAGCCTGCCGCCAGCAGC
CCCAGCAGCAACAATACTGCCGCCACCACAGCCGCCATCGTGCCTGGATCTCAGCTGATG
CCCAGCAAGAGCCCTAGCACCGGCACCACCGAGATCAGCAGCCACGAGTCTAGCCACGGC
ACCCCATCTCAGACCACCGCCAAGAACTGGGAGCTGACAGCCAGCGCCTCTCACCAGCCT
CCAGGCGTGTACCCTCAGGGCCACAGCGATACCACAGTGGCCATCAGCACCTCCACCGTG
CTGCTGTGTGGACTGAGCGCCGTGTCACTGCTGGCCTGCTACCTGAAGTCCAGACAGTGA
(1140 n.a.)
서열 번호 21
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LLCGLSAVSLLACYL
(375 a.a.; 신호 및 링커 펩타이드는 밑줄 표시됨)
당업자는 상기의 신호 펩타이드 및 링커 서열이 예시적이고, 신호 펩타이드 또는 링커로서 사용하기에 적합한 이들의 변형을 어떤 방식으로든 제한하지 않음을 이해할 것이다. 당업자에게 공지되고 이용 가능한 많은 적합한 신호 펩타이드 또는 링커 서열이 있다. 당업자는 신호 펩타이드 및/또는 링커 서열이 신호 펩타이드에 의해 이어지거나 링커에 의해 연결된 기능적 펩타이드의 활성을 변경하지 않으면서 다른 서열에 대해 치환될 수 있다는 것을 이해한다.
도 2 디자인 4: 디자인 3 작제물이 효과기 세포 생존 및 증식을 촉진하는 데 기능적인 것으로 밝혀져 이러한 디자인에서 IL15가 갖춰진 효과기 세포의 자율적인 특징에 부정적으로 영향을 미치지 않으면서 IL15Rα의 세포질 도메인이 생략될 수 있음을 입증하므로, 디자인 4는 디자인 3의 다른 작용 대안을 제공하는 작제물이고, 이로부터 선택적으로 스시 도메인과 막관통 도메인 사이의 링커와 함께 일 말단에서 IL15과 융합되고 다른 말단에서 막관통 도메인(mb-스시)과 융합된 스시 도메인을 제외하고는 전체 IL15Rα가 본질적으로 제거된다. 세포 표면에서 임의의 막 결합된 단백질의 막관통 도메인을 통해 융합된 IL15/mb-스시가 발현된다. 디자인 4와 같은 작제물에 의해, IL15의 바람직한 다른 쪽 제시가 오직 보유될 때 같은 쪽 제시를 포함하는 IL15Rα를 통한 불필요한 신호전달이 제거된다. 일부 실시형태에서, 스시 도메인과 융합된 IL15를 포함하는 성분은 서열 번호 20으로 표시된 예시적인 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있는 서열 번호 19와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성의 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 80%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 90%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 적어도 95%이다. 실시형태에서, 서열 동일성은 100%이다.
서열 번호 19
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TLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTES
GCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITC
PPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKC
IR
(242 a.a.; 신호 및 링커 펩타이드는 밑줄 표시됨)
서열 번호 20
ATGGACTGGACCTGGATTCTGTTCCTGGTCGCGGCTGCAACGCGAGTCCATAGCGGTATC
CATGTTTTTATTCTTGGGTGTTTTTCTGCTGGGCTGCCTAAGACCGAGGCCAACTGGGTA
AATGTCATCAGTGACCTCAAGAAAATAGAAGACCTTATACAAAGCATGCACATTGATGCT
ACTCTCTACACTGAGTCAGATGTACATCCCTCATGCAAAGTGACGGCCATGAAATGTTTC
CTCCTCGAACTTCAAGTCATATCTCTGGAAAGTGGCGACGCGTCCATCCACGACACGGTC
GAAAACCTGATAATACTCGCTAATAATAGTCTCTCTTCAAATGGTAACGTAACCGAGTCA
GGTTGCAAAGAGTGCGAAGAGTTGGAAGAAAAAAACATAAAGGAGTTCCTGCAAAGTTTC
GTGCACATTGTGCAGATGTTCATTAATACCTCTAGCGGCGGAGGATCAGGTGGCGGTGGA
AGCGGAGGTGGAGGCTCCGGTGGAGGAGGTAGTGGCGGAGGTTCTCTTCAAATAACTTGT
CCTCCACCGATGTCCGTAGAACATGCGGATATTTGGGTAAAATCCTATAGCTTGTACAGC
CGAGAGCGGTATATCTGCAACAGCGGCTTCAAGCGGAAGGCCGGCACAAGCAGCCTGACC
GAGTGCGTGCTGAACAAGGCCACCAACGTGGCCCACTGGACCACCCCTAGCCTGAAGTGC
ATCAGA
(726 n.a.)
당업자는 상기의 신호 펩타이드 및 링커 서열이 예시적이고, 신호 펩타이드 또는 링커로서 사용하기에 적합한 이들의 변형을 어떤 방식으로든 제한하지 않음을 이해할 것이다. 당업자에게 공지되고 이용 가능한 많은 적합한 신호 펩타이드 또는 링커 서열이 있다. 당업자는 신호 펩타이드 및/또는 링커 서열이 신호 펩타이드에 의해 이어지거나 링커에 의해 연결된 기능적 펩타이드의 활성을 변경하지 않으면서 다른 서열에 대해 치환될 수 있다는 것을 이해한다.
도 2 디자인 5: 자연적 또는 변형된 IL15Rβ는 링커를 통해 C 말단에서 IL15에 융합되어서, 항시적 신호전달이 가능하게 하고, IL15 막 결합성 및 다른 쪽 제시를 유지한다.
도 2 디자인 6: 자연적 또는 변형된 공통 수용체 γC는 사이토카인의 항시적 신호전달 및 막 결합된 다른 쪽 제시를 위한 링커를 통해 C 말단에서 IL15에 융합된다. 공통 수용체 γC는, IL2 수용체 아단위 감마 또는 IL2RG로도 공지된, 공통 감마 사슬 또는 CD132라 또한 칭한다. γC는 비제한적인 예로서 IL2, IL4, IL7, IL9, IL15 및 IL21 수용체를 포함하는 많은 인터류킨 수용체에 대해 수용체 복합체에 공통인 사이토카인 수용체 아단위이다.
도 2 디자인 7: IL15의 부재 하에 동종이합체를 형성하는 조작된 IL15Rβ는 사이토카인의 항시적 신호전달을 생성하는 데 유용하다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18 및 IL21 중 하나 이상 및/또는 이의 수용체는 도 2에서의 디자인 중 하나 이상을 사용하여 iPSC로 도입되고, iPSC 분화 시 이의 분화 세포로 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, IL2 또는 IL15 세포 표면 발현 및 신호전달은 디자인 1 내지 디자인 7 중 어느 하나에 예시된 작제물을 통해서이다. 일부 실시형태에서, IL4, IL7, IL9 또는 IL21 세포 표면 발현 및 신호전달은 공통 수용체 또는 사이토카인 특이적 수용체 중 어느 하나를 사용하여 디자인 5, 디자인 6 또는 디자인 7에 예시된 작제물을 통해서이다. 일부 실시형태에서, IL7 표면 발현 및 신호전달은 공통 수용체 또는 사이토카인 특이적 수용체, 예컨대 IL4 수용체 중 어느 하나를 사용하여 디자인 5, 디자인 6 또는 디자인 7에 예시된 작제물을 통해서이다. 도 2에서의 임의의 디자인의 막관통(TM) 도메인은 각각의 사이토카인 수용체에 자연적일 수 있거나, 임의의 다른 막 결합된 단백질의 막관통 도메인으로 변형되거나 대체될 수 있다.
유도 만능 세포(iPSC) 이외에, 또한 제공된 본원에 개시된 것과 같은 적어도 하나의 조작된 양상을 포함하는, 클론 iPSC, 클론 iPS 세포주 세포 또는 iPSC 유래 세포는 이 부문에 기재된 것과 같은 적어도 외인성으로 도입된 사이토카인 및/또는 사이토카인 수용체 신호전달을 갖는 단일 세포 분류되고 증식된 클론 조작된 iPSC를 포함하는 마스터 세포 뱅크이고, 여기서 세포 은행은 추가의 iPSC 조작을 위한 플랫폼, 및 조성이 잘 한정되고 균일하며 비용 효과적인 방식으로 상당한 규모로 대량 생산될 수 있는 기성품, 조작된, 균일한 세포 치료 산물을 제조하기 위한 재생 가능한 원천을 제공한다. CAR 및 외인성 사이토카인 및/또는 사이토카인 수용체 신호전달 둘 다를 포함하는 iPSC 및 이로부터의 분화 세포에서, CAR 및 IL은 별개의 작제물에서 발현될 수 있거나, CAR 및 IL 둘 다를 포함하는 이중시스트론성 작제물에서 동시발현될 수 있다. 일부 추가의 실시형태에서, 도 2에서의 임의의 작제물 디자인에 의해 표시된 형태의 IL15는 예를 들어 CAR-2A-IL15 또는 IL15-2A-CAR로 에시된 자가 절단 2A 암호화 서열을 통해 CAR 발현 작제물의 5' 말단 또는 3' 말단 중 어느 하나에 연결될 수 있다. IL15 및 CAR은 그렇게 단일 오픈 리딩 프레임(ORF: open reading frame)에 있다. 일 실시형태에서, CAR-2A-IL15 또는 IL15-2A-CAR 작제물은 도 2의 디자인 3에서 IL15를 포함한다. 다른 실시형태에서, CAR-2A-IL15 또는 IL15-2A-CAR 작제물은 도 2의 디자인 3에서 IL15를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CAR-2A-IL15 또는 IL15-2A-CAR 작제물은 도 2의 디자인 7에서 IL15를 포함한다. CAR-2A-IL15 또는 IL15-2A-CAR이 발현될 때, 자가 절단 2A 펩타이드는 발현된 CAR 및 IL15가 분리되게 하고, 이후 세포 표면에서 분리된 IL15가 제시될 수 있다. CAR-2A-IL15 또는 IL15-2A-CAR 이중시스트론성 디자인은 시기 및 분량 둘 다에서 단일 ORF의 발현을 위한 예를 들어 유도성 프로모터를 혼입하기 위해 선택될 수 있는 동일한 제어 기전 하에 조직화된 CAR 및 IL15 발현을 허용한다. 아프토바이러스(aphthovirus), 예컨대 수족구병 바이러스(FMDV: foot-and-mouth disease virus), 말 비염 A 바이러스(ERAV: equine rhinitis A virus), 토세아 아시그나 바이러스(TaV: Thosea asigna virus) 및 돼지 테스코 바이러스- 1(PTV-I: porcine tescho virus-1)(문헌[Donnelly, ML, et al, J. Gen. Virol, 82, 1027-101 (2001)]; 문헌[Ryan, MD, et al., J. Gen. Virol., 72, 2727-2732 (2001)]) 및 카디오바이러스(cardiovirus), 예컨대 테일로바이러스(Theilovirus)(예를 들어, 테일러 쥣과 뇌척수염) 및 뇌심근염 바이러스를 포함하는 피코르나비리다에(Picornaviridae) 바이러스 패밀리의 구성원에서 자가 절단 펩타이드가 발견되었다. FMDV, ERAV, PTV-I, 및 TaV로부터 유래된 2 A 펩타이드는 때때로 각각 "F2A", "E2A", "P2A", 및 "T2A"라고도 칭한다.
본원에 개시된 것과 같은 IL15에 대한 이중시스트론성 CAR-2A-IL15 또는 IL15-2A-CAR 실시형태는 본원에 제공된 임의의 다른 사이토카인, 예를 들어 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL18 및 IL21의 발현에 또한 고려된다. 일부 실시형태에서, IL2 세포 표면 발현 및 신호전달은 디자인 1 내지 디자인 7 중 어느 것에 예시된 작제물을 통해서이다. 일부 다른 실시형태에서, IL4, IL7, IL9 또는 IL21 세포 표면 발현 및 신호전달은 공통 수용체 및/또는 사이토카인 특이적 수용체 중 어느 하나를 사용하여 디자인 5, 디자인 6 또는 디자인 7에 예시된 작제물을 통해서이다.
비제한적인 예로서 IL15를 포함하는 CAR 및 외인성 사이토카인 및/또는 사이토카인 수용체 신호전달 둘 다를 포함하는 iPSC 및 이로부터의 분화 세포에서, iPSC 및 분화 세포는 TCRneg cs-CD3 및/또는 CD16을 추가로 포함할 수 있다.
5. HLA-I- 및 HLA-II- 결핍
다수의 HLA 클래스 I 및 클래스 II 단백질은 동종이계 거부 문제를 피하도록 동종이계 수혜자에서 조직접합성에 대해 일치되어야 한다. 본원에는 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 단백질 둘 다의 발현이 제거되거나 실질적으로 감소된 iPSC 세포주 및 이로부터 분화된 이의 분화 세포가 제공된다. HLA 클래스 I 결핍은 HLA 클래스 I 유전자좌(염색체 6p21)의 임의의 영역의 기능적 결실, 또는 비제한적인 예로서 베타-2 마이크로글로불린(B2M) 유전자, TAP 1 유전자, TAP 2 유전자 및 타파신을 포함하는 HLA 클래스-I 연관된 유전자의 결실 또는 이의 발현 수준의 감소에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, B2M 유전자는 모든 HLA 클래스 I 이종이합체의 세포 표면 발현에 필수적인 공통 아단위를 암호화한다. B2M 음성 세포는 HLA-I 결핍이다. HLA 클래스 II 결핍은 비제한적인 예로서 RFXANK, CIITA, RFX5 및 RFXAP를 포함하는 HLA-II 연관된 유전자의 기능적 결실 또는 감소에 의해 달성될 수 있다. CIITA는 클래스 II 단백질 발현에 필요한 RFX5인 전사 인자의 활성화를 통해 작용하는 전사적 공동활성자이다. CIITA 음성 세포는 HLA-II 결핍이다. 본원에는 예를 들어 B2M 및 CIITA 발현 둘 다의 결여를 위한 HLA-I 및 HLA-II 결핍 둘 다를 갖는 iPSC 라인 및 이의 분화 세포가 제공되고, 여기서 얻은 분화 효과기 세포는 MHC(주요 조직접합성 복합체) 일치에 대한 필요성을 제거하여 동종이계 세포 치료가 가능하게 하고, 숙주 (동종이계) T 세포에 의한 인식 및 사멸을 피한다.
일부 세포 유형에 대해, 클래스 I 발현의 결여는 NK 세포에 의해 용해로 이어진다. 이 "소실된 자가" 반응을 극복하기 위해, NK 세포 인식 및 조작된 iPSC로부터 유래된 HLA-I 결핍 효과기 세포의 사멸을 피하도록 HLA-G는 선택적으로 넉인될 수 있다. 일 실시형태에서, HLA-I 결핍 iPSC 및 이의 분화 세포는 HLA-G 넉인을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제공된 HLA-I 결핍 iPSC 및 이의 분화 세포는 CD58 넉아웃 및 CD54 넉아웃의 하나 또는 둘 다를 추가로 포함한다. CD58(또는 LFA-3) 및 CD54(또는 ICAM-1)는 신호 의존적 세포 상호작용을 개시하고, 면역 세포를 포함하는 세포 이동을 용이하게 하는 부착 단백질이다. CD58 넉아웃이 CD54 넉아웃보다 동종이계 NK 세포 활성화를 감소시키는 데 있어서 더 높은 효능을 갖지만; CD58 및 CD54 둘 다의 이중 넉아웃이 NK 세포 활성화의 가장 향상된 감소를 갖는 것으로 밝혀졌다. 일부 관찰에서, CD58 및 CD54 이중 넉아웃은 "소실된 자가" 효과를 극복하는 데 있어서 HLA-I 결핍 세포에 대해 HLA-G 과발현보다 훨씬 더 효과적이다. 본원에 제공된 것처럼 iPSC의 분화 가능성 및 분화 T 세포 및 분화 NK 세포를 포함하는 유래된 효과기 세포의 기능에 부정적으로 영향을 미치지 않으면서 TCRneg cs-CD3, HLA-I 및 HLA-II 결핍을 갖는 단일 세포 분류되고 증식된 클론 조작된 iPSC, 및 hnCD16, CAR 및 IL 중 하나 이상을 포함하는 마스터 세포 은행이 있다. 상기 제공된 것처럼, 일부 실시형태에서, HLA-I 및 HLA-II 결핍 iPSC 및 이의 분화 세포는 HLA-G를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 실시형태에서, HLA-I 및 HLA-II 결핍 iPSC 및 이의 분화 세포는 CD58 null이다. 일부 다른 실시형태에서, HLA-I 및 HLA-II 결핍 iPSC 및 이의 분화 세포는 CD54 null이다. 또한 일부 다른 실시형태, HLA-I 및 HLA-II 결핍 iPSC 및 이의 분화 세포는 CD58 null 및 CD54 null이다. 상기 세포 은행은 추가의 iPSC 조작을 위한 플랫폼, 및 조성이 잘 한정되고 균일하며 비용 효과적인 방식으로 상당한 규모로 대량 생산될 수 있는 기성품, 조작된, 균일한 세포 치료 산물을 제조하기 위한 재생 가능한 원천을 제공한다.
6. CD38 넉아웃
세포 표면 분자 CD38은 다발성 골수종 및 CD20 음성 B 세포 악성종양을 포함하는 림프구성 계통 및 골수성 계통 둘 다로부터 유래된 다수의 혈액학적 악성종양에서 고도로 상향조절되고, 이는 암 세포를 고갈시키는 것을 항체 치료제에 대한 매력적인 표적으로 만든다. 항체 매개된 암 세포 고갈은 보통 직접적인 세포 아폽토시스 유도와 ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: 항체 의존적 세포 매개된 세포독성)와 같은 면역 효과기 기전의 활성화의 조합에 기인한다. ADCC 이외에, 치료학적 항체와 조화된 면역 효과기 기전은 식세포작용(ADCP) 및/또는 보체 의존적 세포독성(CDC: complement-dependent cytotoxicity)을 또한 포함할 수 있다.
CD38은 악성 세포에서 고도로 발현되기 보다는 혈장 세포뿐만 아니라 NK 세포 및 활성화된 T 세포 및 B 세포에서 또한 발현된다. CD38은 조혈작용 동안 CD34+ 줄기 세포 및 림프구성, 적혈구성 및 골수성의 계통 결정 전구세포 상에서 혈장 세포 단계에 걸쳐 계속되는 성숙의 최종 단계 동안 발현된다. CD38은 II형 막관통 당단백질로서 뉴클레오타이드-대사물질의 생성에 관여된 다기능성 효소 및 수용체 둘 다로서 세포 기능을 수행한다. CD38은 효소로서 NAD+로부터 ADP-리보스로의 반응의 가수분해 및 합성을 촉매화하여서, CADPR 및 NAADP인 2차 메신저를 생성하고, 이것은 과정이 칼슘 의존적인 세포 부착의 과정에 중요한 소포체 및 리소좀으로부터 칼슘의 방출을 자극한다. CD38은 수용체로서 CD31을 인식하고, 활성화된 NK 세포에서 세포독성 및 사이토카인 방출을 조절한다. CD38은 세포질 Ca2+ 플럭스를 조절하고, 림프구성 및 골수성 세포에서 신호 전달을 매개하기 위해 지질 뗏목에서 세포 표면 단백질과 회합하는 것으로 또한 보고된다.
악성종양 치료에서, CD38 항원 결합 수용체 형질도입된 T 세포의 전신 사용은 CD34+ 조혈 전구 세포, 단핵구, NK 세포, T 세포 및 B 세포의 CD38+ 분획을 용해시키는 것으로 밝혀졌고, 이는 손상된 수혜자 면역 효과기 세포 기능 때문에 불완전한 치료 반응 및 감소된 또는 제거된 효능을 야기한다. 게다가, CD38 특이적 항체인 다라투무맙으로 치료된 다발성 골수종 환자에서, T 세포 및 B 세포와 같은 다른 면역 세포 유형이 이의 CD38 발현에도 불구하고 영향을 받지 않지만 골수 및 말초혈 둘 다에서의 NK 세포 감소가 관찰되었다(문헌[Casneuf et al., Blood Advances. 2017; 1(23):2105-2114]). 이론에 의해 구속되지는 않지만, 본 출원은 CD38 특이적 항체 및/또는 CD38 항원 결합 도메인 유도된 효과기 세포 고갈 또는 동족살해를 통한 감소를 극복함으로써 CD38 표적화된 암 치료의 완전한 가능성을 이용하는 전략을 제공한다. 게다가, 동종이계 효과기 세포의 수혜자에서 다라투무맙과 같은 CD38 특이적 항체를 사용하여 이 수혜자 림프구의 활성화를 억제하여 CD38이 T 세포 또는 B 세포와 같은 활성화된 림프구에서 상향조절되므로, 이 효과기 세포에 대한 동종거부성은 감소되고/되거나 예방될 것이고, 이로써 효과기 세포 생존성 및 지속성을 증가시킨다. 이와 같이, 본 출원은 또한 수혜자 T 세포 및 B 세포의 활성화, 즉 대개 입양 세포 이동 전에 활성화된 T 세포 및 B 세포의 림프고갈에 대한 분비된 CD38 특이적 인게이저 또는 CD38 CAR(키메라 항원 수용체)인 CD38 특이적 항체를 사용하여 동종거부성의 감소 또는 예방을 통해 효과기 세포 지속성 및/또는 생존기간을 향상시키는 전략을 제공한다. 구체적으로는, 제공된 것과 같은 전략은 단일 세포 분류되고 증식된 클론성 CD38 음성 iPSC를 포함하는 마스터 세포 은행인 CD38 넉아웃 iPSC 라인을 생성하는 것, 및 조작된 iPSC 라인의 유도 분화를 통해 CD38 음성 (CD38neg) 분화 효과기 세포를 수득하는 것을 포함하고, 여기서 CD38 표적화된 치료학적 모이어티가 효과기 세포와 사용될 때 다른 이점들 중에서 동족살해 및 동종거부성에 대해 분화 효과기 세포가 보호된다. 게다가, 항-CD38 단일클론 항체 치료는 환자의 조혈 줄기 세포 구획에 부정적으로 영향을 미치지 않으면서 환자의 활성화된 면역계를 상당히 고갈시킨다. CD38 음성 분화 세포는 CD38 항체 매개된 고갈에 저항하는 능력을 갖지만, 독성 컨디셔닝제의 사용 없이 항-CD38 또는 CD38-CAR고 조합되어 효과적으로 투여될 수 있고, 이와 같이 화학요법 기반 림프고갈을 감소 및/또는 대체한다. 단일 세포 분류되고 증식된 클론성 CD38neg iPSC를 포함하는 마스터 세포 은행은 비제한적인 예로서 TCRneg cs-CD3, hnCD16, CAR, IL 및 HLA I 및 II 결핍 중 하나 이상을 포함하는 추가의 iPSC 조작을 위한 플랫폼, 및 조성이 잘 한정되고 균일하며 비용 효과적인 방식으로 상당한 규모로 대량 생산될 수 있는 기성품, 조작된, 균일한 세포 치료 산물을 제조하기 위한 재생 가능한 원천을 제공한다.
본원에 제공된 것과 같은 일 실시형태에서, iPSC 라인에서의 CD38 넉아웃은 이중대립유전자 넉아웃이다. 본원에 개시된 것처럼, 제공된 CD38 음성 iPSC 라인은 적어도 TCRneg 및 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하고; 상기 iPSC는 비제한적인 예로서 한정적 동형유전자성 내피세포(HE) 가능성을 갖는 중배엽 세포, 한정적 HE, CD34 조혈 세포, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구세포(MPP), T 세포 전구세포, NK 세포 전구세포, 골수성 세포, 호중구 전구세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 호중구, 수지상 세포 및 대식세포를 포함하는 기능적인 분화 조혈 세포를 생산하도록 유도 분화할 수 있다. 일부 실시형태에서, ADCC를 유도하도록 항-CD38 항체를 사용하거나 표적화된 세포 사멸에 항-CD38 CAR을 사용할 때, CD38neg iPSC 및/또는 이의 분화 효과기 세포는 항-CD38 항체, 항-CD38 CAR, 또는 수혜자 활성화된 T 세포 또는 B 세포에 의해 제거되지 않고, 이로써 이러한 치료학적 모이어티의 존재 하에 및/또는 이에 대한 노출 후 iPSC 및 이의 효과기 세포 지속성 및/또는 생존기간을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 효과기 세포는 이러한 치료학적 모이어티의 존재 하에 및/또는 이에 대한 노출 후 생체내 지속성 및/또는 생존기간이 증가한다.
7. 추가의 변형
일부 실시형태에서, TCRneg cs-CD3 및 CD16, CAR, IL, HLA I 및 II 결핍 및 CD38-/- 중 하나 이상을 포함하는 iPSC 및 이의 분화 효과기 세포는 TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, RFX5, RFXAP, RAG1, 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 유전자 중 적어도 하나에서의 결실 또는 발현 감소; 또는 HLA-E, 41BBL, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, TCR, Fc 수용체, 인게이저, 및 이중특이적 인게이저, 다중특이적 인게이저 또는 보편적 인게이저와 커플링하기 위한 표면 트리거링 수용체 중 적어도 하나에서의 발현 도입 또는 발현 증가를 추가로 포함할 수 있다.
이중특이적 인게이저 또는 다중특이적 인게이저는 상이한 항체의 2개 이상의 단일-사슬 가변 단편(scFv) 또는 다른 기능적 변이체로 이루어진 융합 단백질이고, 적어도 하나의 scFv와 함께 종양 특이적 표면 분자를 통해 효과기 세포 표면 분자 또는 "표면 트리거링 수용체", 및 적어도 다른 것을 종양 세포에 연결한다. 본원에 사용된 "표면 트리거링 수용체"라는 용어는 효과기 세포의 면역 반응, 예를 들어 세포독성 반응을 촉발거하거나 개시할 수 있는 수용체를 지칭한다. 표면 트리거링 수용체는 조작될 수 있고, 효과기 세포, 예를 들어 T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 호중구 상에서 발현된 내인성 표면 단백질일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표면 트리거링 수용체는 효과기 세포의 천연 수용체 및 세포 유형과 독립적인 특정한 표적 세포, 예를 들어 종양 세포와 효과기 세포 사이의 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체 결합을 용이하게 한다. 일부 다른 실시형태에서, 하나 이상의 외인성 표면 트리거링 수용체는 본원에 제공된 방법 및 조성물을 사용하여, 즉 iPSC의 조작을 통해 효과기 세포로 도입될 수 있어서, 선택적으로 단일 세포 분류되고 증식된 클론 조작된 iPSC를 포함하는 마스터 세포 은행을 생성시키고, 이후 T, NK 또는 원천 iPSC와 동일한 유전자형을 포함하는 임의의 다른 효과기 세포로의 iPSC의 분화를 지시한다.
이 접근법을 이용하여 보편적 표면 트리거링 수용체를 포함하는 iPSC를 또한 생성할 수 있고, 이후 보편적 표면 트리거링 수용체를 발현하는 다양한 효과기 세포 유형의 집단으로 이러한 iPSC를 분화시킬 수 있다. "보편적"에 의해 표면 트리거링 수용체가 세포 유형과 무관하게 임의의 효과기 세포에서 발현되고 이를 활성화할 수 있고, 보편적 수용체를 발현하는 모든 효과기 세포가 인게이저의 종양 결합 특이성과 무관하게 표면 트리거링 수용체에 의해 인식 가능한 동일한 에피토프를 갖는 인게이저에 커플링되거나 연결될 수 있음이 의도된다. 일부 실시형태에서, 동일한 종양 표적화 특이성을 갖는 인게이저는 상이한 보편적 표면 트리거링 수용체와 커플링하도록 사용된다. 일부 실시형태에서, 상이한 종양 표적화 특이성을 갖는 인게이저는 동일한 보편적 표면 트리거링 수용체와 커플링하도록 사용된다. 이와 같이, 하나 또는 다수의 효과기 세포 유형은 일부 경우에 종양 세포의 하나의 특정한 유형을 사멸하고, 일부 다른 경우에 종양의 2종 이상의 유형을 사멸하도록 결합될 수 있다. 표면 트리거링 수용체는 일반적으로 효과기 세포 활성화를 위한 공동자극 도메인 및 인게이저의 에피토프에 특이적인 항에피토프를 포함하거나, 반대로, 표면 트리거링 수용체는 인식 가능하거나 인게이저의 항에피토프에 특이적인 에피토프를 포함한다. 예를 들어, 이중특이적 인게이저는 일 말단에서 표면 트리거링 수용체의 항에피토프/에피토프에 특이적이고, 다른 말단에서 종양 항원에 특이적이다.
본원에 제공된 것처럼, 개시된 것과 같은 세포 표면 제시된 CD3 분자의 다양한 형태는 다른 기능들 중에서, 발현된 CD3 분자가 이의 발현에도 불구하고 세포 표면 상에서 제시되지 않도록, TCR 음성인 세포에서 특히 유용한 인게이저 인식을 위한 CD3 관련된 세포 표면 트리거링 수용체로서 적용 가능하다. 일부 실시형태에서, 인게이저 인식을 위한 CD3 관련된 표면 트리거링 수용체는 발현될 때 효과기 세포의 세포 표면에서 제시된 전체 또는 부분 CD3 분자(즉, CD3 복합체의 아단위 또는 하위도메인)에 포함된다. 일부 실시형태에서, 효과기 세포 표면에서 제시된 전체 또는 부분 CD3 분자는 (1) CD3ε, CD3δ 및/또는 CD3ε을 포함하는 하나 이상의 CD3 아단위로부터의 적어도 하나의 엑토도메인의 적어도 전체 길이 또는 부분 길이; 및 선택적으로 (2) CD3ζ의 엔도도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3 관련된 표면 트리거링 수용체를 포함하는 전체 또는 부분 CD3 분자의 모든 아단위 또는 하위도메인은 내인성이다. 일부 실시형태에서, CD3 관련된 표면 트리거링 수용체를 포함하는 전체 또는 부분 CD3 분자의 적어도 하나의 아단위 또는 하위도메인은 외인성이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 것과 같은 CD3 관련된 세포 표면 트리거링 수용체를 결합하는 이중특이적 항체는 CD3-CD19이다. 또 다른 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3-CD33이다. 또 다른 실시형태에서, 이중특이적 항체는, 효과기 NK 세포가 효과기 세포 증식을 용이하게 하기 위한 링커(일부 간행물에서 TriKE 또는 삼중특이적 살해 인게이저라 칭함)로서, 효과기 세포와 종양 세포 항원 결합 도메인, 예를 들어 변형된 IL15 사이의 링커를 추가로 포함한다.
이중특이적 인게이저 또는 다중특이적 인게이저 인식, 또는 커플링에 사용될 수 있는 추가의 효과기 세포 표면 분자, 또는 표면 트리거링 수용체는 CD3 이외에 본원에 개시된 것과 같은 CD28, CD5, CD16, NKG2D, CD64, CD32, CD89, NKG2C 및 키메라 Fc 수용체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 인게이저 인식을 위한 효과기 세포의 표면 상에서 발현된 CD16은 I.2 부문에 기재된 것과 같이 CD16(F176V 및 선택적으로 S197P를 함유) 또는 CD64 세포외 도메인, 및 자연적 또는 비자연적 막관통 도메인, 자극 도메인 및/또는 신호전달 도메인을 포함하는 hnCD16이다. 일부 실시형태에서, 인게이저 인식을 위한 효과기 세포의 표면 상에서 발현된 CD16은 hnCD16 기반 키메라 Fc 수용체(CFcR)이다. 일부 실시형태에서, hnCD16 기반 CFcR은 NKG2D의 막관통 도메인, 2B4의 자극 도메인 및 CD3ζ의 신호전달 도메인을 포함하고; hnCD16의 세포외 도메인은 CD64 또는 CD16의 세포외 도메인의 전체 길이 또는 부분 서열로부터 유래되고; CD16의 세포외 도메인은 F176V 및 선택적으로 S197P를 포함한다.
이중특이적 인게이저 또는 다중특이적 인게이저 인식을 위한 예시적인 종양 세포 표면 분자는 B7H3, BCMA, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD179b, CEA, CLEC12A, CS-1, DLL3, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, FLT-3, FOLR1, FOLR3, GD2, gpA33, HER2, HM1.24, LGR5, MSLN, MCSP, MICA/B, PSMA, PAMA, P-카드헤린, ROR1을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
상기의 관점에서, 효과기 세포 상의 CD3의 결합을 위해, 일 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3-CD19이고; 다른 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3-CD33이다. 효과기 세포 상의 CD16의 결합을 위해 이중특이적 항체는 CD16-CD30 또는 CD64-CD30이다. 다른 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD16-BCMA 또는 CD64-BCMA이다. 또 다른 실시형태에서, 이중특이적 항체는, 효과기 NK 세포가 효과기 세포 증식을 용이하게 하기 위한 링커(일부 간행물에서 TriKE 또는 삼중특이적 살해 인게이저라 칭함)로서, 효과기 세포와 종양 세포 항원 결합 도메인, 예를 들어 변형된 IL15 사이의 링커를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, TriKE는 CD16-IL15-EPCAM 또는 CD64-IL15-EPCAM이다. 다른 실시형태에서, TriKE는 CD16-IL15-CD33 또는 CD64-IL15-CD33이다. 또 다른 실시형태에서, TriKE는 NKG2C-IL15-CD33이다. 링커는 비제한적인 예로서 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL18 및 IL21을 포함하는 다른 사이토카인으로부터 또한 기원할 수 있다.
8. 본원에 제공된 유전 조작된 iPSC 라인 및 iPSC 유래 세포
상기의 관점에서, 본 출원은 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 포함하는 TCRneg 세포 또는 이의 집단(TCRneg cs-CD3)을 제공하고, 여기서 세포는 유도 만능 세포(iPSC), 클론 iPSC, 클론 iPS 세포주 세포, 또는 TCRneg cs-CD3 iPSC의 유도 분화로부터 얻은 iPSC 유래 세포이다. 본원에 기재된 것과 같은 표현형을 갖는 단일 세포 분류되고 증식된 클론 조작된 iPSC를 포함하는 마스터 세포 은행이 또한 제공되고, 여기서 세포 은행은 조성이 잘 한정되고 균일하며 비용 효과적인 방식으로 상당한 규모로 대량 생산될 수 있는 기성품, 조작된, 균일한 세포 치료 산물을 제조하기 위한 재생 가능한 원천을 제공한다.
일부 실시형태에서, iPSC 유래 세포는 비제한적인 예로서 한정적 동형유전자성 내피세포(HE) 가능성을 갖는 중배엽 세포, 한정적 HE, CD34 조혈 세포, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구세포(MPP), T 세포 전구세포, NK 세포 전구세포, 골수성 세포, 호중구 전구세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 호중구, 수지상 세포 및 대식세포를 포함하는 조혈 세포이다. 일부 실시형태에서, iPSC 유래 조혈 세포는 TCRneg이고 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 포함하는 T, NK 및 조절 세포와 같은 효과기 세포를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 출원은 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 포함하는 iPSC 유래 TCRneg T 세포(TCRneg cs-CD3) 또는 이의 집단을 제공하고, 여기서 TCRneg cs-CD3 iPSC의 유도 분화로부터 T 세포를 얻는다.
본원에 사용된 TCRneg는 TCR 음성, TCR-/-, "TCR null" 또는 TCR 넉아웃이라고도 칭하고, 이는 자연에 의해(예를 들어, NK 세포 또는 iPSC 유래 NK 세포), 유전자 발현 조절에 의해, 또는 내인성 TCR 또는 하나 이상의 이의 아단위를 넉아웃하기 위한 iPSC 세포(예를 들어, iPSC, T 세포로부터 재프로그래밍된 iPSC(TiPSC)) 또는 T 세포의 게놈 편집에 의해, 또는 TCR이 넉아웃된 iPSC로부터 분화된 TCR 음성 분화 세포의 수득에 의해 내인성 TCR 발현이 없는 세포를 포함한다. 이와 같이, 개시된 것과 같은 세포에서 넉아웃된 TCR은 내인성 TCR 복합체이다. 세포에서의 TCR의 TCRα 또는 TCRβ 중 어느 하나의 불변 영역의 발현의 파괴는 세포의 내인성 TCR 복합체를 넉아웃하는 많은 방법들 중 하나이다. TCRneg 세포는 TCRneg 세포에서의 모든 CD3 아단위의 발현에도 불구하고 세포 표면에 CD3 복합체를 제시할 수 없는 것으로 발견되었고, 이는 세포 표면 CD3 인식, 결합 및/또는 신호전달을 요하는 세포 기능에 부정적으로 영향을 미친다. TCRneg 세포에서의 본원에 개시된 것과 같은 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)은 비제한적인 예로서 본원에 기재된 것과 같은 항체 또는 이의 기능적 변이체 및/또는 인게이저를 포함하는 분자와의 결합을 위해 CD3 관련된 세포 표면 트리거링 수용체로서 작용할 수 있다.
본원에는 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 iPSC 또는 iPSC 유래 세포가 또한 제공되고, 여기서 세포는 선택적으로 TCR 음성이다. 이것은 cs-CD3이 발현될 때 CD3 관련된 세포 표면 트리거링 수용체로서 작용한다. TCRneg 세포에 제공된 것과 같은 CD3 관련된 표면 트리거링 수용체의 일부 실시형태에서, 그 수용체는 발현될 때 효과기 세포 표면에서 제시된 전체 또는 부분 내인성 CD3 분자에 포함되고, 여기서 내인성 CD3 분자 제시는 발현될 때에도 달리 TCRneg 세포에서 발생하지 않고, 본 출원에 제공된 것과 같은 외인성 TCRα, 외인성 TCRβ, 및 임의의 이의 변이체의 전체 길이 또는 부분 길이 중 하나 이상을 포함하는 재조합 TCR과의 이의 회합에 의해 가능해진다. 일부 실시형태에서, TCRneg 세포에서의 전체 또는 부분 내인성 CD3 분자의 세포 표면 제시는 상기 세포에서 비결합성 재조합 TCR(nb-rTCR), 한정된 재조합 TCR(d-rTCR) 및/또는 재조합 pre-TCR을 포함하는 적어도 재조합 TCR을 추가로 발현시켜 가능해진다.
일부 실시형태에서, CD3 관련된 표면 트리거링 수용체를 포함하는 TCRneg 세포는 비결합성 재조합 TCR(nb-rTCR)을 포함하고, 여기서 nb-rTCR은 tgTRAC(형질전환 TCRα 불변 영역) 및 tgTRBC(형질전환 TCRβ 불변 영역)의 하나 또는 둘 다를 포함하고; 그러므로 TCRneg iPSC 또는 iPSC 유래 세포는 tgTRAC 및/또는 tgTRBC를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. tgTRAC를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 TCRneg 세포의 일부 실시형태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 TRAC 유전자좌에서 삽입되고, 삽입된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 TRAC의 발현을 파괴하고, 이로써 내인성 TCR 넉아웃을 초래하고, 선택적으로 삽입된 폴리뉴클레오타이드는 TRAC의 내인성 프로모터 또는 이종성(heterologous) 프로모터에 의해 추진된다. tgTRBC를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 TCRneg 세포의 일부 실시형태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 TRBC 유전자좌에서 삽입되고, 삽입된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 TRBC의 발현을 파괴하고, 이로써 내인성 TCR 넉아웃을 초래하고, 선택적으로 삽입된 폴리뉴클레오타이드는 TRBC의 내인성 프로모터 또는 이종성 프로모터에 의해 추진된다.
일부 실시형태에서, CD3 관련된 표면 트리거링 수용체를 포함하는 TCRneg 세포는 한정된 재조합 TCR(d-rTCR)을 포함하고, 여기서 d-rTCR은 tgTCRα(형질전환 TCRα) 및 tgTCRβ(형질전환 TCRβ)를 포함하고, tgTCRα 및 tgTCRβ의 각각은 각각의 불변 영역(즉, TRAC 및 TRBC) 이외에 각각의 한정된 가변 영역을 포함하고; 그러므로 TCRneg iPSC 또는 iPSC 유래 세포는 tgTCRα 및/또는 tgTCRβ를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 한정된 가변 영역은 공지된 TCR 특이성을 갖는 T 세포의 TCR 알파 및 TCR 베타로부터 기원한다. 일부 실시형태에서, 한정된 가변 영역은 비변이체 NKT 세포의 TCR 알파 및 TCR 베타로부터 기원한다. tgTCRα를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 TCRneg 세포의 일부 실시형태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 TRAC 유전자좌에서 삽입되고, 삽입된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 TRAC의 발현을 파괴하고, 이로써 내인성 TCR 넉아웃을 초래하고, 선택적으로 삽입된 폴리뉴클레오타이드는 TRAC의 내인성 프로모터 또는 이종성 프로모터에 의해 추진된다. tgTCRβ를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 TCRneg 세포의 일부 실시형태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 TRBC 유전자좌에서 삽입되고, 삽입된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 TRBC의 발현을 파괴하고, 이로써 내인성 TCR 넉아웃을 초래하고, 선택적으로 삽입된 폴리뉴클레오타이드는 TRBC의 내인성 프로모터 또는 이종성 프로모터에 의해 추진된다.
일부 실시형태에서, CD3 관련된 표면 트리거링 수용체를 포함하는 TCRneg 세포는 재조합 pre-TCR(p-rTCR)을 포함하고, 여기서 p-rTCR은 tgpTCRα(형질전환 pre-TCRα), 및 선택적으로 tgTRBC 또는 tgTCRβ를 포함하고, tgTCRβ는 한정된 가변 영역을 포함하고; 그러므로 TCRneg iPSC 또는 iPSC 유래 세포는 적어도 tgpTCRα를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. tgpTCRα를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 TCRneg 세포의 일부 실시형태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 TRAC 유전자좌에서 삽입되고, 삽입된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 TRAC의 발현을 파괴하고, 이로써 내인성 TCR 넉아웃을 초래하고, 선택적으로 삽입된 폴리뉴클레오타이드는 TRAC의 내인성 프로모터 또는 이종성 프로모터에 의해 추진된다. tgpTCRα 이외에 tgTRBC 또는 tgTCRβ를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 TCRneg 세포의 일부 실시형태에서, 상기 tgTRBC 또는 tgTCRβ 암호화 폴리뉴클레오타이드는 TRBC 유전자좌에서 삽입되고, 삽입된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 TRBC의 발현을 파괴하고, 이로써 내인성 TCR 넉아웃을 초래하고, 선택적으로 삽입된 tgTRBC 또는 tgTCRβ 암호화 폴리뉴클레오타이드는 TRBC의 내인성 프로모터 또는 이종성 프로모터에 의해 추진된다.
TCRneg 세포에서의 CD3 관련된 표면 트리거링 수용체의 일부 실시형태에서, 수용체는 CD3ε, CD3δ 및 CD3γ 중 하나 이상으로부터의 적어도 하나의 외인성 아단위 또는 하위도메인을 포함하는 전체 또는 부분 CD3 분자에 포함된다. 일 실시형태에서, TCRneg 세포에서 인게이저 인식을 위한 CD3 관련된 표면 트리거링 수용체는 적어도 CD3ε의 전체 길이 또는 부분 길이 엑토도메인을 포함하는 부분 CD3 분자에 포함된다. 일 실시형태에서, TCRneg 세포에서 인게이저 인식을 위한 CD3 관련된 표면 트리거링 수용체는 적어도 CD3ε의 전체 길이 또는 부분 길이 엑토도메인, 및 추가로 CD3γ 또는 CD3δ의 전체 길이 또는 부분 길이 엑토도메인을 포함하는 부분 CD3 분자에 포함된다. 일 실시형태에서, 상기 CD3 분자는 적어도 CD3ε, CD3γ 및/또는 CD3δ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 포함하고, 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이(들)는 TCRα 또는 TCRβ의 불변 영역과 융합되고, TRAC 또는 TRBC를 각각 포함하는 부분 융합 단백질은 내인성 CD3ζ와 이종이합체를 형성할 수 있다. 이와 같이, CD3 관련된 표면 트리거링 수용체를 갖는 TCRneg iPSC 또는 iPSC 유래 세포의 일 실시형태에서, 세포는 (i) CD3ε 및 CD3δ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, 및 TCRα 불변 영역을 포함하는 형질전환 융합 단백질(tgCD3(ε-δ)-TRAC); (ii) CD3ε 및 CD3γ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, 및 TCRβ 불변 영역을 포함하는 형질전환 융합 단백질(tgCD3(ε-γ)-TRBC); (iii) CD3ε 및 CD3γ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, 및 TCRα 불변 영역을 포함하는 형질전환 융합 단백질(tgCD3(ε-γ)-TRAC); 및/또는 (iv) CD3ε 및 CD3δ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, 및 TCRβ 불변 영역을 포함하는 형질전환 융합 단백질(tgCD3(ε-δ)-TRBC) 중 적어도 하나를 포함한다. CD3 관련된 표면 트리거링 수용체를 갖는 TCRneg 세포의 일부 실시형태에서, 세포는 적어도 CD3ε의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이와 융합된 TCRα 불변 영역을 포함하는 형질전환 융합 단백질과 적어도 CD3ε의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이와 융합된 TCRβ 불변 영역을 포함하는 형질전환 융합 단백질을 포함하는 이종이합체를 포함한다.
TCRneg 세포에서의 CD3 관련된 표면 트리거링 수용체의 일부 실시형태에서, 수용체는 신호 유도 및/또는 공동자극을 위해 CD3ε, CD3δ, CD3γ 및/또는 CD3ζ 중 하나 이상, 및 선택적으로 2B4, 4-1BB, CD16, CD2, CD28, CD28H, CD3ζ, DAP10, DAP12, DNAM1, FcERIγ IL21R, IL-2Rβ(IL-15Rβ), IL-2Rγ, IL-7R, KIR2DS2, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, CD3ζ1XX, CS1 또는 CD8의 하나 이상의 신호전달 도메인으로부터의 적어도 하나의 외인성 아단위 또는 하위도메인을 포함하는 전체 또는 부분 CD3 분자에 포함되고, 신호전달 도메인을 포함하는 모든 아단위 또는 하위도메인은 키메라 사슬을 형성하도록 키메라 사슬에 융합된다. 일 실시형태에서, TCRneg 세포에서 인게이저 인식을 위한 CD3 관련된 표면 트리거링 수용체는 적어도 CD3ε의 전체 길이 또는 부분 길이 엑토도메인; CD3δ 및 CD3γ의 하나 또는 둘 다의 전체 길이 또는 부분 길이 엑토도메인; 및 CDζ의 엔도도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 포함하는 CD3 키메라 사슬에 포함된다. 일 실시형태에서, TCRneg 세포에서 인게이저 인식을 위한 CD3 관련된 표면 트리거링 수용체는 CD3ε의 전체 길이 또는 부분 길이 엑토도메인; CD3δ 및 CD3γ의 하나 또는 둘 다의 전체 길이 또는 부분 길이 엑토도메인; CDζ의 엔도도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 포함하는 CD3 키메라 사슬에 포함되고, CD28 및 41BBL의 하나 또는 둘 다의 세포질 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 이와 같이, CD3 관련된 표면 트리거링 수용체를 갖는 TCRneg iPSC 또는 iPSC 유래 세포의 일 실시형태에서, 세포는 (i) CD3ε 및 CD3γ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, 및 CD3ζ의 엔도도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 포함하는 형질전환 융합 단백질[tgCD3(ε-γ)-ζ]; (ii) CD3ε 및 CD3δ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, 및 CD3ζ의 엔도도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 포함하는 형질전환 융합 단백질[tgCD3(ε-δ)-ζ]; (iii) CD3ε의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 포함하는 형질전환 융합 단백질(형질전환 융합 단백질은 CD3γ 또는 CD3δ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, CD3ζ의 엔도도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함함)[tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ]; (iv) CD3ε의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 포함하는 형질전환 융합 단백질(형질전환 융합 단백질은 CD3γ 또는 CD3δ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, CD3ζ의 엔도도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, 및 41BB의 신호전달 도메인을 포함함)[tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ]; 및/또는 (v) CD3γ 또는 CD3δ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, CD3ζ의 엔도도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, CD28의 신호전달 도메인 및 41BB의 신호전달 도메인을 포함하는 형질전환 융합 단백질[tgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζ] 중 적어도 하나를 포함한다.
본원에는 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 및 고친화도 비절단성 CD16(hnCD16)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 iPSC가 추가로 제공되고, 여기서 iPSC는 기능적인 분화 조혈 세포를 제공하도록 유도 분화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 효과기 세포는 T 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 효과기 세포는 NK 세포를 포함한다.
발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 및 표적 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 iPSC가 본원에 제공되고, 여기서 iPSC는 기능적 분화 효과기 세포를 제조하도록 유도 분화할 수 있다.
발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 및 사이토카인 신호전달이 세포 생존기간, 지속성 및/또는 증식에 기여하게 하도록 적어도 하나의 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체(IL)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 iPSC가 추가로 제공되고, 여기서 iPSC 라인은 생존기간, 지속성, 증식 및 효과기 세포 기능이 개선된 기능적인 분화 조혈 세포를 제조하도록 유도 분화할 수 있다. 일부 실시형태에서, cs-CD3을 포함하는 iPSC는 TCR 음성(TCRneg cs-CD3)이다. 외인성으로 도입된 사이토카인 신호전달(들)은 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18 및 IL21 중 임의의 1개 또는 2개, 또는 이것 초과의 신호전달을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달에 대한 사이토카인 및/또는 이의 각각의 수용체의 도입된 부분 또는 전체 펩타이드는 세포 표면 상에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달은 항시적으로 활성화된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달의 활성화는 유도성이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달의 활성화는 일시적이고/이거나 시간적이다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 사이토카인/사이토카인 수용체의 일시적/시간적 발현은 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 에피솜, 미니서클, 또는 mRNA를 포함하는 RNA를 통해서이다. 일부 실시형태에서, TCRneg cs-CD3 iPSC 또는 이로부터의 분화 세포에 포함된 외인성 세포 표면 사이토카인 및/또는 수용체는 IL7 신호전달이 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, TCRneg cs-CD3 iPSC 또는 이로부터의 분화 세포에 포함된 외인성 세포 표면 사이토카인 및/또는 수용체는 IL10 신호전달이 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, TCRneg cs-CD3 iPSC 또는 이로부터의 분화 세포에 포함된 외인성 세포 표면 사이토카인 및/또는 수용체는 IL15 신호전달이 가능하게 한다. 상기 TCRneg cs-CD3 IL iPSC의 일부 실시형태에서, IL15 발현은 도 2의 작제물 3을 통해서이다. 상기 TCRneg cs-CD3 IL iPSC의 일부 실시형태에서, IL15 발현은 도 2의 작제물 4를 통해서이다. 상기의 실시형태의 상기 TCRneg cs-CD3 IL iPSC 및 이의 분화 세포는 자율적으로 시험관내 또는 생체내 추가로 공급된 가용성 사이토카인과 접촉 없이 세포 성장, 급증, 증식 및/또는 효과기 기능을 유지하거나 개선할 수 있다. 일부 실시형태에서, TCRneg cs-CD3 IL iPSC 및 이의 분화 효과기 세포는 효과기 세포 제거를 야기함이 없이 ADCC를 유도하도록 항-CD38 항체와 사용될 수 있고, 이로써 iPSC 및 이의 효과기 세포 지속성 및/또는 생존기간을 상승적으로 증가시킨다.
발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 및 CD38 넉아웃을 포함하는 iPSC가 추가로 제공되고, 여기서 iPSC는 생존기간, 지속성, 증식 및 효과기 세포 기능이 개선된 기능적인 분화 조혈 세포를 제조하도록 유도 분화할 수 있다. 일부 실시형태에서, cs-CD3을 포함하는 iPSC는 TCR 음성(TCRneg cs-CD3)이다. 세포 표면 분자 CD38은 다발성 골수종 및 CD20 음성 B 세포 악성종양을 포함하는 림프구성 계통 및 골수성 계통 둘 다로부터 유래된 다수의 혈액학적 악성종양에서 고도로 상향조절되고, 이는 암 세포를 고갈시키는 것을 항체 치료제에 대한 매력적인 표적으로 만든다. CD38은 악성 세포에서 고도로 발현되기 보다는 혈장 세포뿐만 아니라 NK 세포 및 활성화된 T 세포 및 B 세포에서 또한 발현된다. 일부 실시형태에서, ADCC 및/또는 종양 세포 표적화를 유도하기 위해 항-CD38 항체, CD38 결합 CAR, 또는 항-CD38 scFV를 포함하는 CD3 인게이저를 사용할 때, TCRneg cs-CD3 CD38-/- iPSC 및/또는 이의 분화 효과기 세포는 효과기 세포 제거를 야기함이 없이, 즉 CD38 발현 효과기 세포의 감소 또는 고갈 없이 CD38 발현 (종양) 세포를 표적화할 수 있고, 이로써 iPSC 및 이의 효과기 세포 지속성 및/또는 생존기간을 증가시킨다.
발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, B2M 넉아웃 및 CIITA 넉아웃, 및 선택적으로 HLA-G를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 iPSC가 또한 제공되고, 여기서 iPSC는 기능적인 분화 조혈 세포를 제조하도록 유도 분화할 수 있다. 일부 실시형태에서, cs-CD3을 포함하는 iPSC는 TCR 음성(TCRneg cs-CD3)이다. 일부 실시형태에서, 상기 TCRneg cs-CD3 B2M-/- CIITA-/- iPSC 및 이의 분화 효과기 세포는 HLA-I 및 HLA-II 결핍 둘 다이다.
상기의 관점에서, 본원에는 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 및 선택적으로 hnCD16, CAR, 외인성 사이토카인/수용체, 및 B2M/CIITA 넉아웃의 1개, 2개, 3개 또는 모든 4개를 포함하는 iPSC가 제공되고; 여기서 B2M이 넉아웃될 때, HLA-G를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 대안적으로, CD58 넉아웃 및 CD54 넉아웃 중 하나 또는 둘 다가 선택적으로 도입되고, iPSC는 기능적인 분화 조혈 세포를 제공하도록 유도 분화할 수 있다. 일부 실시형태에서, cs-CD3을 포함하는 iPSC는 TCR 음성(TCRneg cs-CD3)이다. 본 출원에는 또한 TCRneg, cs-CD3, 및 선택적으로 hnCD16, B2M/CIITA 넉아웃, CAR, 및 외인성 사이토카인/수용체의 1개, 2개, 3개 또는 모든 4개를 포함하는 기능적 iPSC 분화 조혈 세포가 포함되고; 여기서 B2M이 넉아웃될 때, HLA-G를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 대안적으로, CD58 넉아웃 및 CD54 넉아웃 중 하나 또는 둘 다는 선택적으로 도입되고, 분화 조혈 세포는 한정적 동형유전자성 내피세포(HE) 가능성을 갖는 중배엽 세포, 한정적 HE, CD34 조혈 세포, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구세포(MPP), T 세포 전구세포, NK 세포 전구세포, 골수성 세포, 호중구 전구세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 호중구, 수지상 세포 및 대식세포를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본원에 제공된 다른 양태는 TCRneg, cs-CD3, 및 IL15 및 IL15Rα의 절두된 융합 단백질을 포함하는 iPSC 또는 iPSC 유래 세포를 포함하고, 여기서 융합 단백질은 세포내 도메인을 포함하지 않는다. 도 2에서 "IL15Rα(ΔICD) 융합" 및 "IL5/mb-스시"로 제공된 것처럼, 이들 실시형태는 본 출원에 걸쳐 총체적으로 IL15Δ로 추가로 축약된다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인이 결여된 절두된 IL15/IL15Rα 융합 단백질은 서열 번호 17, 서열 번호 19 또는 서열 번호 21과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인이 결여된 절두된 IL15/IL15Rα 융합 단백질은 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인이 결여된 절두된 IL15/IL15Rα 융합 단백질은 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인이 결여된 절두된 IL15/IL15Rα 융합 단백질은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함한다. 또한 일부 다른 실시형태에서, TCRneg, cs-CD3, 세포내 도메인이 결여된 절두된 IL15/IL15Rα 융합 단백질(IL15Δ)을 포함하는 iPSC 또는 iPSC 유래 세포는 CD38 넉아웃, hnCD16, CAR, 외인성 사이토카인/수용체 및 B2M/CIITA 넉아웃 중 하나 이상을 추가로 포함하고; 여기서 B2M이 넉아웃될 때, HLA-G를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 선택적으로 도입되고, iPSC는 기능적인 분화 조혈 세포를 제조하도록 유도 분화할 수 있고, 분화 조혈 세포는 한정적 동형유전자성 내피세포(HE) 가능성을 갖는 중배엽 세포, 한정적 HE, CD34 조혈 세포, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구세포(MPP), T 세포 전구세포, NK 세포 전구세포, 골수성 세포, 호중구 전구세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 호중구, 수지상 세포 및 대식세포를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
이와 같이, 본 출원은 iPSC 및 이의 기능적인 분화 조혈 세포를 제공하고, 이는 표 1에서 하기 유전자형 중 어느 하나를 포함한다. 표 1에 제공된 것과 같은 "IL"은 어떤 특이적 사이토카인/수용체 발현이 선택되는지에 따라 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18 및 IL21 중 하나를 나타내고; IL이 IL15를 나타낼 때, 이것은 세포내 도메인이 없음을 제외하고 IL15 및 IL15Rα의 절두된 융합 단백질로서 상기에 기재된 IL15Δ를 또한 포함한다. 추가로, iPSC 및 이의 기능적인 분화 조혈 세포가 CAR 및 IL 둘 다를 포함하는 유전자형을 가질 때, CAR 및 IL은 선택적으로 2A 서열을 포함하는 이중시스트론성 발현 카세트에 포함된다. 비교로서, 일부 다른 실시형태에서, CAR 및 IL은 iPSC 및 이의 기능적인 분화 조혈 세포에 포함된 별개의 발현 카세트에 있다. 하나의 특정 실시형태에서, CAR 및 IL 둘 다를 발현하는 iPSC 및 이의 기능적 분화 효과기 세포에 포함된, IL은 도 2의 작제물 3 또는 작제물 4에서 IL15이고, IL15 작제물은 CAR과 함께 또는 이와 별개로 발현 카세트에 포함된다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
9. 면역요법을 위한 항체
일부 실시형태에서, 병태, 질환 또는 적응증과 연관된 항원을 표적화하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 추가의 치료제는, 본원에 제공된 것과 같은 게놈 조작된 효과기 세포 이외에, 조합 치료에서 이들 효과기 세포와 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간화된 항체, 인간화된 단일클론 항체 또는 키메라 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편은 바이러스 항원에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편은 종양 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 종양 또는 바이러스 특이적 항원은 이의 사멸 능력을 향상시키기 위해 투여된 iPSC 유래 효과기 세포를 활성화한다. 일부 실시형태에서, 투여된 iPSC 유래 효과기 세포에 대한 추가의 치료제로서 조합 치료에 적합한 항체는 항-CD20(리툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 우블리툭시맙, 오카라투주맙, 오비누투주맙, 이브리투모맙, 오크렐리주맙), 항-CD22(이노투주맙, 목세투모맙, 에프라투주맙), 항-HER2(트라스투주맙, 페르투주맙), 항-CD52(알렘투주맙), 항-EGFR (세르툭시맙), 항-GD2(디누툭시맙), 항-PDL1(아벨루맙), 항-CD38 (다라투무맙, 이사툭시맙, MOR202), 항-CD123(7G3, CSL362), 항-SLAMF7(엘로투주맙), 및 이들의 인간화된 변이체 또는 단편 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편, 및 이들의 기능적 균등물 및 바이오시밀러를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 투여된 iPSC 유래 효과기 세포에 대한 추가의 치료제로서 조합 치료에 적합한 항체는 표적 세포 상의 하나 초과의 항원 또는 에피토프를 표적화하거나 표적 세포를 표적화하면서 표적 세포를 향해 효과기 세포(T 세포, NK 세포 또는 대식 세포)를 동원하는 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체를 추가로 포함한다. 이러한 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체는 종양 세포에 효과기 세포, 예를 들어 T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포 및/또는 호중구를 지시하고 면역 효과기 세포를 활성화할 수 있는 인게이저로서 작용하고, 항체 치료의 이익을 최대화할 높은 가능성을 나타냈다. 인게이저는 적어도 하나의 종양 항원에 특이적이고, 면역 효과기 세포의 적어도 하나의 표면 트리거링 수용체에 특이적이다. 인게이저의 예는 이중특이적 T 세포 인게이저(BiTE), 이중특이적 살해 세포 인게이저(BiKE), 삼중특이적 살해 세포 인게이저(TriKE), 또는 다중특이적 살해 세포 인게이저, 또는 다수의 면역 세포 유형과 적합한 보편적 인게이저를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 실시형태에서, iPSC 유래 효과기 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 조혈 계통 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC 유래 효과기 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 NK 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC 유래 효과기 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 T 세포를 포함한다. 액체 종양 또는 고형 종양을 치료하는 데 유용한 조합의 일부 실시형태에서, 조합은 적어도 TCRneg cs-CD3, 및 세포 표면 CD3을 갖는 세포를 결합하는 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체를 포함하는 iPSC 유래 NK 세포 또는 T 세포를 포함한다. CD3 인게이저는 cs-CD3에 결합하는 적어도 제1 가변 분절 및 ADGRE2, 탄산무수화효소 IX(CAIX), CCRI, CCR4, 암배아 항원(CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원, 상피 당단백질2(EGP 2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 부착 분자(EpCAM), EGFRvIII, 수용체 티로신-단백질 키나제 erb­ B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산-결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 엽산 수용체-a, 강글리오사이드 G2(GD2), 강글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER-2), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 아단위 알파-2(IL-13Rα2), κ-경쇄, 키나제 인서트 도메인 수용체(KDR), 루이스 A(CA19.9), 루이스 Y(LeY), L1 세포 부착 분자(L1-CAM), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A 1(MAGE-A1), MICA/B, 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), PRAME 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 종양 연관된 당단백질 72(TAG-72), TIM-3, TRBCI, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­ R2), 윌름스 종양 단백질(WT-1) 및/또는 병원균 항원 중 적어도 하나를 포함하는 항원에 결합하는 제2 가변 분절을 포함한다.
CD3 인게이저의 일부 실시형태에서, 인게이저는 적어도 cs-CD3에 결합하는 제1 가변 분절 및 BCMA, CD19, CD20, CD33, CD38, CD52, CD123, CEA, EGFR, EpCAM, GD2, GPA33, HER2, MICA/B, PDL1 및/또는 PSMA 중 적어도 하나를 포함하는 항원에 결합하는 제2 가변 분절을 포함한다. CD3 인게이저의 일부 또 다른 실시형태에서, 인게이저는 CD19, CD33, CD123, CEA, EpCAM, GPA33, HER2 및/또는 PSMA 중 적어도 하나를 포함하는 항원에 결합하는 제2 가변 분절을 포함한다. CD3 인게이저의 일부 또 다른 실시형태에서, 인게이저는 블리나투모맙, 카투막소맙, 에르투막소맙, RO6958688, AFM11, MT110/AMG 110, MT111/AMG211/MEDI-565, AMG330, MT112/BAY2010112, MOR209/ES414, MGD006/S80880, MGD007 및/또는 FBTA05 중 적어도 하나이다. 일 실시형태에서, 조합은 CD3 인게이저 및 TCRneg cs-CD3 및 hnCD16을 포함하는 iPSC 유래 NK 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 조합은 CD3 인게이저 및 TCRneg cs-CD3 및 hnCD16을 포함하는 iPSC 유래 NK 세포를 포함한다. 일부 추가의 실시형태에서, CD3 인게이저와 조합되어 포함된 iPSC 유래 NK 세포는 CD19, BCMA, CD20, CD22, CD38, CD123, HER2, CD52, EGFR, GD2, 및 PDL1 중 하나를 표적화하는 TCRneg cs-CD3, hnCD16, IL15 및 CAR을 포함하고; IL15는 CAR과 동시발현되거나 별개로 발현되고; IL15는 도 2의 작제물 1 내지 작제물 7에 제시된 형태 중 어느 하나로 있다. 일부 특정 실시형태에서, IL15는 CAR과 동시발현되거나 별개로 발현될 때 작제물 3, 작제물 4 또는 작제물 7의 형태로 있다.
10. 관문 억제제
관문은 억제되지 않을 때 면역 반응을 억제하거나 하향조절할 수 있는 세포 분자, 대개 세포 표면 분자이다. 종양이 특히 종양 항원에 특이적인 T 세포에 대해 면역 내성의 주요 기전으로서 소정의 면역-관문 경로를 끌어들인다는 것이 이제 명확하다. 관문 억제제(CI)는 관문 유전자 발현 또는 유전자 산물을 감소시키거나, 관문 분자의 활성을 감소시킬 수 있고, 이로써 억제성 관문을 차단하여 면역계 기능을 회복할 수 있는 길항제이다. PD1/PDL1 또는 CTLA4를 표적화하는 관문 억제제의 발생은 종양학 풍경을 변화시켰고, 이들 작용제는 다수의 적응증에서 장기간 관해를 제공한다. 그러나, 많은 종양 하위유형은 관문 봉쇄 치료에 내성이고, 재발은 상당한 우려로 남아 있다. 본 출원의 일 양태는 CI와의 조합 치료에서 제공된 것과 같은 게놈 조작된 기능적 iPSC 유래 세포를 포함함으로써 CI 내성을 극복하기 위한 치료학적 접근법을 제공한다. 조합 치료의 일 실시형태에서, iPSC 유래 세포는 NK 세포이다. 조합 치료의 다른 실시형태에서, iPSC 유래 세포는 T 세포이다. 본원에 제공된 분화 NK 세포는 직접적인 항종양 능력을 나타내는 것 이외에 PDL1-PD1 매개된 억제에 내성이고, T 세포 이동을 향상시키고, 종양 미세환경에 T 세포를 동원하고, 종양 부위에서 T 세포 활성화를 증대시키는 능력을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, 기능적으로 강력한 게놈 조작된 분화 NK 세포에 의해 용이해진 T 세포의 종양 침윤은 상기 NK 세포가 국소 면역억제를 완화하고 종양 부담을 감소시키도록 관문 억제제를 포함하는 T 세포 표적화된 면역요법과 상승작용할 수 있다는 것을 나타낸다.
일 실시형태에서, 관문 억제제 조합 치료를 위한 유래된 TCRneg NK 세포는 cs-CD3, 및 선택적으로 hnCD16 발현, B2M/CIITA 넉아웃, CAR 발현, CD38 넉아웃, 및 외인성 세포 표면 사이토카인 및/또는 수용체 발현의 1개, 2개, 3개 또는 모든 4개를 포함하고; 여기서 B2M이 넉아웃될 때 HLA-G를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 CD58 및 CD54 중 하나 또는 둘 다의 넉아웃이 선택적으로 포함된다. 일부 실시형태에서, 분화 NK 세포는 표 1에 열거된 유전자형 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 분화 NK 세포는 TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, RFX5, RFXAP, RAG1, 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 유전자 중 적어도 하나에서의 결실 또는 발현 감소; 또는 HLA-E, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, Fc 수용체, 인게이저, 및 이중특이적 인게이저, 다중특이적 인게이저 또는 보편적 인게이저와 커플링하기 위한 표면 트리거링 수용체 중 적어도 하나에서의 발현 도입 또는 발현 증가를 추가로 포함한다.
다른 실시형태에서, 관문 억제제 조합 치료를 위한 유래된 TCRneg T 세포는 cs-CD3, 및 선택적으로 hnCD16 발현, B2M/CIITA 넉아웃, CAR 발현, CD38 넉아웃, 및 외인성 세포 표면 사이토카인 및/또는 수용체 발현의 1개, 2개, 3개 또는 모든 4개를 포함하고; 여기서 B2M이 넉아웃될 때 HLA-G를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 CD58 및 CD54 중 하나 또는 둘 다의 넉아웃이 선택적으로 포함된다. 일부 실시형태에서, 분화 T 세포는 표 1에 열거된 유전자형 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 분화 T 세포는 TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, RFX5, RFXAP, RAG1, 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 유전자 중 적어도 하나에서의 결실 또는 발현 감소; 또는 HLA-E, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, Fc 수용체, 인게이저, 및 이중특이적 인게이저, 다중특이적 인게이저 또는 보편적 인게이저와 커플링하기 위한 표면 트리거링 수용체 중 적어도 하나에서의 발현 도입 또는 발현 증가를 추가로 포함한다.
상기의 상기 분화 NK 세포 또는 T 세포는 TCRneg cs-CD3, 및 선택적으로 hnCD16 발현, B2M/CIITA 넉아웃, CAR 발현, CD38 넉아웃, 및 외인성 세포 표면 사이토카인 및/또는 수용체 발현의 1개, 2개, 3개 또는 모든 4개를 포함하는 iPSC 클론 라인을 분화하여 얻고; 여기서 B2M이 넉아웃될 때 HLA-G를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 CD58 및 CD54 중 하나 또는 둘 다의 넉아웃이 선택적으로 도입된다. 일부 실시형태에서, 상기의 상기 iPSC 클론 라인은 TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, RFX5, RFXAP, RAG1, 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 유전자 중 적어도 하나에서의 결실 또는 발현 감소; 또는 HLA-E, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, Fc 수용체, 인게이저, 및 이중특이적 인게이저, 다중특이적 인게이저 또는 보편적 인게이저와 커플링하기 위한 표면 트리거링 수용체 중 적어도 하나에서의 발현 도입 또는 발현 증가를 추가로 포함한다.
본원에 제공된 것과 같은 분화 NK 세포 또는 T 세포에 의한 조합 치료에 적합한 관문 억제제는 PD-1(Pdcdl, CD279), PDL-1(CD274), TIM-3(Havcr2), TIGIT(WUCAM 및 Vstm3), LAG-3(Lag3, CD223), CTLA-4(Ctla4, CD152), 2B4(CD244), 4-1BB(CD137), 4-1BBL(CD137L), A2aR, BATE, BTLA, CD39(Entpdl), CD47, CD73(NT5E), CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2(Pou2f2), 레티노산 수용체 알파(Rara), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 및 억제성 KIR(예를 들어, 2DL1, 2DL2, 2DL3, 3DL1 및 3DL2)의 길항제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 실시형태에서, 임의의 상기 관문 분자를 억제하는 길항제는 항체이다. 일부 실시형태에서, 관문 억제성 항체는 쥣과 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 낙타 Ig, 상어 중쇄 전용 항체(VNAR), Ig NAR, 키메라 항체, 재조합 항체, 또는 이들의 항체 단편일 수 있다. 항체 단편의 비제한적인 예는 Fab, Fab′, F(ab)′2, F(ab)′3, Fv, 단일 사슬 항원 결합 단편(scFv), (scFv)2, 다이설파이드 안정화된 Fv(dsFv), 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 단일-도메인 항원 결합 단편(sdAb, Nanobody), 재조합 중쇄 전용 항체(VHH), 및 전체 항체의 결합 특이성을 유지하는 다른 항체 단편을 포함하고, 이는 전체 항체보다 제조하기에 보다 비용 효과적이거나, 보다 용이하게 사용되거나, 보다 민감할 수 있다. 일부 실시형태에서, 1개 또는 2개, 또는 3개, 또는 이것 초과의 관문 억제제는 아테졸리주맙(항-PDL1 mAb), 아벨루맙(항-PDL1 mAb), 데발루맙(항-PDL1 mAb), 트레멜리무맙(항-CTLA4 mAb), 이필리무맙(항-CTLA4 mAb), IPH4102(항-KIR), IPH43(항-MICA), IPH33(항-TLR3), 리리무맙(항-KIR), 모날리주맙(항-NKG2A), 니볼루맙(항-PD1 mAb), 펨브롤리주맙(항-PD1 mAb), 및 임의의 이들의 유도체, 기능적 균등물 또는 바이오시밀러 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시형태에서, 많은 miRNA가 면역 관문의 발현을 제어하는 조절자로서 발견되면서 임의의 상기 관문 분자를 억제하는 길항제는 마이크로RNA-기반이다(문헌[Dragomir et al., Cancer Biol Med. 2018, 15(2):103-115]). 일부 실시형태에서, 관문 길항제성 miRNA는 miR-28, miR-15/16, miR-138, miR-342, miR-20b, miR-21, miR-130b, miR-34a, miR-197, miR-200c, miR-200, miR-17-5p, miR-570, miR-424, miR-155, miR-574-3p, miR-513 및 miR-29c를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
제공된 iPSC 유래 NK 세포 또는 T 세포와의 조합 치료의 일부 실시형태는 적어도 하나의 관문 분자를 표적화하기 위한 적어도 하나의 관문 억제제를 포함하고; 여기서 iPSC 유래 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 갖는다. 제공된 분화 NK 세포 또는 T 세포와의 조합 치료의 일부 다른 실시형태는 2개, 3개 또는 이것 초과의 관문 분자가 표적화되도록 2개, 3개 또는 이것 초과의 관문 억제제를 포함한다. 적어도 하나의 관문 억제제 및 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 iPSC 유래 세포를 포함하는 조합 치료의 일부 실시형태에서, 상기 관문 억제제는 항체, 또는 이의 인간화된 변이체 또는 단편 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편, 또는 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이고, 상기 관문 억제제는 상기 항체, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 iPSC 유래 세포에 의해 제조된다. 일부 실시형태에서, 관문을 억제하는 항체, 또는 단편 또는 이의 변이체를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열은 별개의 작제물에서 또는 CAR 및 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 서열 둘 다를 포함하는 이중시스트론성 작제물에서 CAR과 동시발현된다. 일부 추가의 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 서열은 예를 들어 CAR-2A-CI 또는 CI-2A-CAR로 예시된 자가 절단 2A 암호화 서열을 통해 CAR 발현 작제물의 5' 말단 또는 3' 말단 중 어느 하나에 연결될 수 있다. 이와 같이, 관문 억제제의 암호화 서열 및 CAR은 단일 오픈 리딩 프레임(ORF)에 있다. 종양 미세환경(TME)을 침윤시킬 수 있는 분화 효과기 세포에 의해 페이로드로서 관문 억제제가 전달되고 발현되고 분비될 때, 이것은 TME 결합 시 억제성 관문 분자에 대응하여서, CAR 또는 활성화 수용체와 같은 활성화 양상에 의한 효과기 세포의 활성화를 허용한다. 일부 실시형태에서, CAR과 동시발현된 관문 억제제는 PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2aR, BATE, BTLA, CD39(Entpdl), CD47, CD73(NT5E), CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2(Pou2f2), 레티노산 수용체 알파(Rara), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 및 억제성 KIR의 관문 분자 중 적어도 하나를 억제한다. 일부 실시형태에서, 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 분화 세포에서 CAR과 동시발현된 관문 억제제는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 데발루맙, 트레멜리무맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이들의 인간화된 변이체, 단편 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 및 이들의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러를 포함하는 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, CAR과 동시발현된 관문 억제제는 아테졸리주맙, 또는 이의 인간화된 변이체, 단편 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 또는 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이다. 일부 다른 실시형태에서, CAR과 동시발현된 관문 억제제는 니볼루맙, 또는 이의 인간화된 변이체, 단편, 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 또는 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이다. 일부 다른 실시형태에서, CAR과 동시발현된 관문 억제제는 펨브롤리주맙, 또는 이의 인간화된 변이체, 단편 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 또는 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이다.
본원에 제공된 iPSC 유래 세포 및 관문 분자를 억제하는 적어도 하나의 항체를 포함하는 조합 치료의 일부 다른 실시형태에서, 상기 항체는 iPSC 유래 세포에 의해 또는 이것에서 제조되지 않고, 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 iPSC 유래 세포의 투여 전에, 이와 같이 또는 이것 후에 추가적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 제공된 분화 NK 세포 또는 T 세포와의 조합 치료에서 1종, 2종, 3종 또는 이것 초과의 관문 억제제의 투여는 동시적이거나 순차적이다. 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 유래된 NK 세포 또는 T 세포를 포함하는 조합 치료의 일 실시형태에서, 치료에 포함된 관문 억제제는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 데발루맙, 트레멜리무맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이들의 인간화된 변이체, 단편 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 및 이들의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러 중 하나 이상이다. 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 유래된 NK 세포 또는 T 세포를 포함하는 조합 치료의 일부 실시형태에서, 치료에 포함된 관문 억제제는 아테졸리주맙, 또는 이의 인간화된 변이체, 단편 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 및 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이다. 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 유래된 NK 세포 또는 T 세포를 포함하는 조합 치료의 일부 실시형태에서, 치료에 포함된 관문 억제제는 니볼루맙, 또는 이의 인간화된 변이체, 단편 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 또는 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이다. 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 유래된 NK 세포 또는 T 세포를 포함하는 조합 치료의 일부 실시형태에서, 치료에 포함된 관문 억제제는 펨브롤리주맙, 또는 이의 인간화된 변이체, 단편 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 또는 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이다.
II. iPSC에서 선택된 유전자좌에서 표적화된 게놈 편집을 위한 방법
본원에 상호교환 가능하게 사용된 게놈 편집 또는 게놈성 편집 또는 유전 편집은 DNA가 표적화된 세포의 게놈에서 삽입되고/되거나, 결실되고/되거나, 대체되는 유전 조작의 유형이다. 표적화된 게놈 편집("표적화된 게놈 편집" 또는 "표적화된 유전성 편집"과 상호교환 가능함)은 게놈에서 예비선택된 부위에서 삽입, 결실 및/또는 치환이 가능하게 한다. 표적화된 편집 동안 삽입 부위에서 내인성 서열이 결실될 때, 영향을 받은 서열을 포함하는 내인성 유전자는 서열 결실로 인해 넉아웃되거나 넉다운될 수 있다. 따라서, 표적화된 편집은 정확하게 내인성 유전자 발현을 파괴하도록 또한 사용될 수 있다. 삽입 부위에서의 내인성 서열의 결실과 함께 또는 이것 없이 하나 이상의 외인성 서열의 삽입을 수반하는 과정을 지칭하는 "표적화된 통합"이라는 용어는 본원에서 유사하게 사용된다. 비교하면, 무작위로 통합된 유전자는 위치 효과 및 침묵화로 처리되어 이의 발현이 신뢰성이 없고 예측 불가능하게 만든다. 예를 들어, 센트로머 및 하위텔로머 영역은 전이유전자 침묵화가 되기 특히 쉽다. 호혜적으로, 새로 통합된 유전자는 둘러싼 내인성 유전자 및 염색질에 영향을 미칠 수 있어서, 잠재적으로 세포 거동을 변경하거나 세포 형질전환을 선호한다. 따라서, 안전 항구 유전자좌, 또는 게놈 안전 항구(GSH: genomic safe harbor)와 같은 예비선택된 유전자좌에서의 외인성 DNA의 삽입은 안전성, 효능, 카피수 제어 및 신뢰성 있는 유전자 반응 제어에 중요하다.
뉴클레아제 독립적 접근법을 통해 또는 뉴클레아제 의존적 접근법을 통해 표적화된 편집이 달성될 수 있다. 뉴클레아제 독립적 표적화된 편집 접근법에서, 상동성 재조합은 숙주 세포의 효소 기계를 통해 삽입되는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 측접시키는 상동성 서열에 의해 가이드된다.
대안적으로, 특이적 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의해 이중 가닥 절단(DSB: double strand break)의 특이적 도입을 통해 표적화된 편집이 더 높은 빈도로 달성될 수 있었다. 이러한 뉴클레아제 의존적 표적화된 편집은 DSB에 반응하여 생기는 비상동성 말단 봉합(NHEJ: non-homologous end joining)을 포함하는 DNA 수선 기전을 이용한다. NHEJ는 외인성 유전 재료를 함유하는 공여자 벡터 없이는 대개 적은 수의 내인성 뉴클레오타이드의 무작위 삽입 또는 결실(삽입-결실)로 이어진다. 비교하면, 한 쌍의 상동성 아암에 의해 측접된 외인성 유전 재료를 함유하는 공여자 벡터가 존재할 때, 외인성 유전 재료는 상동성 재조합에 의해 상동성 유도 수선(HDR: homology directed repair) 동안 게놈으로 도입되어서, "표적화된 통합"을 생성시킨다. 일부 상황에서, 표적화된 통합 부위는 선택된 유전자의 암호화 영역 내에 있도록 의도되고, 이에 따라 표적화된 통합은 유전자 발현을 파괴시켜서, 하나의 단일 편집 단계에서 동시의 넉인 및 넉아웃(KI/KO)을 생성시킬 수 있었다.
동시에 유전자를 넉아웃하기 위한 관심 유전자좌(GOI)에서 선택된 위치에서의 하나 이상의 전이유전자의 삽입을 달성할 수 있다. 동시의 넉인 및 넉아웃(KI/KO)에 적합한 유전자좌는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 및 TIGIT를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 위치 선택적 삽입을 위한 각각의 부위 특정한 표적화 상동성 아암에 의해, 이것은 그 부위에서의 내인성 프로모터 하에서 또는 작제물에 포함된 외인성 프로모터 하에서 전이유전자(들)가 발현되게 한다. 2개 이상의 전이유전자가 선택된 위치에서(예를 들어, CD38 유전자좌에서) 삽입될 때, 링커 서열, 예를 들어 2A 링커 또는 IRES는 임의의 2개의 전이유전자들 사이에 위치한다. 2A 링커는 FMDV, ERAV, PTV-I 또는 TaV(각각 "F2A", "E2A", "P2A" 및 "T2A"라고 칭함)로부터 유래된 자가 절단 펩타이드를 암호화하여, 별개의 단백질이 단일 번역으로부터 제조되게 한다. 일부 실시형태에서, 전이유전자 및/또는 외인성 프로모터 침묵화의 위험을 감소시키도록 절연인자는 작제물에 포함된다. 외인성 프로모터는 CAG, 또는 비제한적인 예로서 CMV, EF1α, PGK, 및 UBC를 포함하는 다른 항시적 프로모터, 유도성 프로모터, 시간 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 세포 유형 특이적 프로모터일 수 있다.
특이적인 및 표적화된 DSB를 도입할 수 있는 이용 가능한 엔도뉴클레아제는 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN: zinc-finger nuclease), 전사 활성자 유사 효과기 뉴클레아제(TALEN: transcription activator-like effector nuclease), RNA 가이드된 CRISPR(클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부: Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeat) 시스템을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 추가적으로, phiC31 및 Bxb1 인터그라제를 이용한 DICE(이중 인터그라제 카세트 교환) 시스템은 또한 표적화된 통합에 대한 유망한 도구이다.
ZFN은 징크 핑거 DNA 결합 도메인에 융합된 뉴클레아제를 포함하는 표적화된 뉴클레아제이다. "징크 핑거 DNA 결합 도메인" 또는 "ZFBD"에 의해 하나 이상의 징크 핑거를 통해 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합하는 폴리펩타이드 도메인이 의도된다. 징크 핑거는 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화되는 징크 핑거 결합 도메인 내의 약 30개의 아미노산의 도메인이다. 징크 핑거의 예는 비제한적인 예로서 C2H2 징크 핑거, C3H 징크 핑거 및 C4 징크 핑거를 포함한다. "설계된" 징크 핑거 도메인은 디자인/조성이 주로 합리적 기준, 예를 들어 치환 규칙의 적용 및 기존의 ZFP 디자인 및 결합 데이터의 정보를 저장하는 데이터베이스에서 가공 정보에 대한 컴퓨터화 알고리즘으로부터 생기는 성질에서 발생하지 않는 도메인이다. 예를 들어, 미국 특허 제6,140,081호; 제6,453,242호; 및 제6,534,261호를 참조하고; 또한 국제공개 WO 98/53058호; 국제공개 WO 98/53059호; 국제공개 WO 98/53060호; 국제공개 WO 02/016536호 및 국제공개 WO 03/016496호를 참조한다. "선택된" 징크 핑거 도메인은 주로 경험적 과정, 예컨대 파지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 하이브리드 선택으로부터 제조되는 자연에서 발견되지 않는 도메인이다. ZFN은 미국 특허 제7,888,121호 및 미국 특허 제7,972,854호에 더 자세히 기재되어 있고, 이의 완전한 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 당해 분야에서 ZFN의 가장 인식되는 예는 징크 핑거 DNA 결합 도메인과의 FokI 뉴클레아제의 융합이다.
TALEN은 TAL 효과기 DNA 결합 도메인에 융합된 뉴클레아제를 포함하는 표적화된 뉴클레아제이다. "전사 활성자 유사 효과기 DNA 결합 도메인", "TAL 효과기 DNA 결합 도메인" 또는 "TALE DNA 결합 도메인"에 의해 DNA에 대한 TAL 효과기 단백질의 결합을 담당하는 TAL 효과기 단백질의 폴리펩타이드 도메인이 의도된다. TAL 효과기 단백질은 감염 동안 잔토모나스(Xanthomonas) 속의 식물 병원균에 의해 분비된다. 이 단백질은 식물 세포의 핵에 들어가고, 이의 DNA 결합 도메인을 통해 효과기 특이적 DNA 서열에 결합하고, 이의 전사촉진 도메인을 통해 이 서열에서 유전자 전사를 활성화한다. TAL 효과기 DNA 결합 도메인 특이성은 효과기-가변 수의 불완전 34개 아미노산 반복부에 따라 달라지고, 이는 반복 가변-이중잔기(RVD: repeat variable-diresidue)라 칭하는 선택 반복부 위치에서 다형성을 포함한다. TALEN은 본원에 인용되어 포함된 미국 특허출원공개 US 2011/0145940호에 더 자세히 기재되어 있다. 당해 분야에서 TALEN의 가장 인식되는 예는 TAL 효과기 DNA 결합 도메인에 대한 FokI 뉴클레아제의 융합 폴리펩타이드이다.
해당 방법에서 사용하는 표적화된 뉴클레아제의 다른 예는 표적화된 Spo11 뉴클레아제, DNA 결합 도메인, 예를 들어 징크 핑거 DNA 결합 도메인에 융합된 뉴클레아제 활성을 갖는 Spo11 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드, 관심 DNA 서열에 대한 특이성을 갖는 TAL 효과기 DNA 결합 도메인 등이다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 US 61/555,857호를 참조하고, 이의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
본 발명에 적합한 표적화된 뉴클레아제의 추가의 예는 개별적으로 사용되든 또는 조합으로 사용되든 비제한적인 예로서 Bxb1, phiC31, R4, PhiBT1 및 Wβ/SPBc/TP901-1을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
표적화된 뉴클레아제의 다른 비제한적인 예는 자연 발생 및 재조합 뉴클레아제; cas, cpf, cse, csy, csn, csd, cst, csh, csa, csm 및 cmr을 포함하는 패밀리로부터의 CRISPR 관련된 뉴클레아제; 제한 엔도뉴클레아제; 메가뉴클레아제; 호밍 엔도뉴클레아제 등을 포함한다.
예시적인 예로서, CRISPR/Cas9는 (1) Cas9 엔도뉴클레아제 및 (2) crRNA-tracrRNA 복합체의 2개의 주요 성분을 요한다. 2개의 성분은 동시발현될 때 PAM 및 PAM 근처의 시딩 영역을 포함하는 표적 DNA 서열에 동원된 복합체를 형성한다. 선택된 서열을 표적화하기 위해 Cas9를 가이드하도록 키메라 가이드 RNA(gRNA)를 형성하기 위해 crRNA 및 tracrRNA를 조합할 수 있다. 이후, 이들 2개의 성분은 형질주입 또는 형질도입을 통해 포유동물 세포로 전달될 수 있다. CRISPR/Cpf 시스템을 사용할 때, 이것은 Cpf 엔도뉴클레아제(Cpf1, MAD7 및 당해 분야에 더 공지된 많은 것) 및 (2) gNA(이는 선택된 서열을 표적화하기 위해 Cpf 엔도뉴클레아제를 가이드하도록 tracrRNA를 대개 필요로 하지 않음)를 필요로 한다.
DICE 매개된 삽입은 각각의 효소의 자체의 작은 attB 및 attP 인식 부위로 치밀히 제한된 외인성 DNA의 단향성 통합을 제공하기 위해 한 쌍의 재조합효소, 예를 들어 phiC31 및 Bxb1을 사용한다. 이 표적 att 부위는 포유동물 게놈에서 자연적으로 존재하지 않으므로, 이것은 처음에 원하는 통합 부위에서 게놈으로 도입되어야 한다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 US 2015/0140665호를 참조하고, 이의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
본 발명의 일 양태는 표적화된 게놈 통합에 대한 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 제공한다. 일 실시형태에서, 작제물은 원하는 통합 부위에 특이적인 한 쌍의 상동성 아암을 추가로 포함하고, 표적화된 통합 방법은 세포 숙주 효소 기계에 의해 부위 특이적 상동성 재조합이 가능하게 하도록 세포에 작제물을 도입하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계 및 ZFN 매개된 삽입이 가능하게 하도록 세포로 원하는 통합 부위에 특이적인 DNA 결합 도메인을 포함하는 ZFN 발현 카세트를 도입하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계 및 TALEN 매개된 삽입이 가능하게 하도록 세포로 원하는 통합 부위에 특이적인 DNA 결합 도메인을 포함하는 TALEN 발현 카세트를 도입하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계, Cas9 매개된 삽입이 가능하게 하도록 세포로 Cas9 발현 카세트, 및 원하는 통합 부위에 특이적인 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 도입하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포에서 표적화된 통합 방법은 세포에서 원하는 통합 부위로 한 쌍의 DICE 재조합효소의 하나 이상의 att 부위를 포함하는 작제물을 도입하는 단계, 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계, 및 DICE 매개된 표적화된 통합이 가능하게 하도록 DICE 재조합효소에 대한 발현 카세트를 도입하는 단계를 포함한다.
표적화된 통합에 유망한 부위는 이론적으로 숙주 세포 또는 유기체에 대한 불리한 효과를 갖지 않으면서 새로 통합된 DNA의 예측 가능한 발현을 수용할 수 있는 인간 게놈의 유전자내 영역 또는 유전자외 영역인 안전 항구 유전자좌 또는 게놈 안전 항구(GSH)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 유용한 안전 항구는 벡터 암호화된 단백질 또는 비암호화 RNA의 원하는 수준을 생성하기에 충분한 전이유전자 발현을 허용해야 한다. 안전 항구는 또한 세포를 악성 형질전환에 취약하게 하지도 세포 기능을 변경하지도 않아야 한다. 가능한 안전 항구 유전자좌인 통합 부위에 대해, 비제한적인 예로서 서열 주석에 의해 판단되는 것처럼 조절 요소 또는 유전자의 파괴의 부재의 조건; 유전자 치밀 부위에서의 유전자간 영역, 또는 반대의 방향에서 전사된 2개의 유전자들 사이의 수렴에서의 위치에 있는 조건; 벡터 암호화된 전사 활성자와 인접한 유전자, 특히 암 관련된 유전자 및 마이크로RNA 유전자의 프로모터 사이의 긴 범위 상호작용의 가능성을 최소화하기 위한 거리의 유지의 조건; 및 유비쿼터스 전사 활성을 나타내는 넓은 공간적 및 시간적 발현된 서열 태그(EST: expressed sequence tag) 발현 패턴에 의해 반영된 것처럼 명백히 유비쿼터스 전사 활성을 가짐의 조건을 포함하는 조건을 충족하는 것이 이상적으로 필요하다. 이 후자의 특징은 줄기 세포에서 특히 중요하고, 여기서 분화 동안, 염색질 개형은 통상적으로 일부 유전자좌의 침묵화 및 다른 것의 잠재적 활성화로 이어진다. 외인성 삽입에 적합한 영역 내에서 삽입에 선택된 정확한 유전자좌는 반복적 요소 및 보존된 서열이 없어야 하고, 상동성 아암의 증폭을 위한 프라이머가 쉽게 설계될 수 있었다.
인간 게놈 편집, 또는 구체적으로 표적화된 통합에 적합한 부위는 아데노 연관된 바이러스 부위 1(AAVS1), 케모카인(CC 모티프) 수용체 5(CCR5) 유전자좌 및 마우스 ROSA26 유전자좌의 인간 오솔로그를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 추가적으로, 마우스 H11 유전자좌의 인간 오솔로그는 또한 본원에 개시된 표적화된 통합의 조성물 및 방법을 이용하여 삽입에 적합한 부위일 수 있다. 추가로, 콜라겐 및 HTRP 유전자좌는 표적화된 통합에 대한 안전 항구로서 또한 사용될 수 있다. 그러나, 각각의 선택된 부위의 검증은 특히 특이적 통합 사건에 대해 줄기 세포에서 필요한 것으로 나타났고, 프로모터 선출, 외인성 유전자 서열 및 정렬, 및 작제물 디자인을 포함하는 삽입 전략의 최적화가 대개 필요하다.
표적화된 삽입-결실을 위해, 편집 부위는 대개 발현 및/또는 기능이 파괴되도록 의도된 내인성 유전자에 포함된다. 일 실시형태에서, 표적화된 삽입-결실을 포함하는 내인성 유전자는 면역 반응 조절 및 조정과 연관된다. 일부 다른 실시형태에서, 표적화된 삽입-결실을 포함하는 내인성 유전자는 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약물 표적 후보자, 면역 반응 조절 및 조정, 또는 줄기 세포 및/또는 전구 세포, 및 이로부터 유래된 세포의 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존기간을 억제하는 단백질과 연관된다.
이와 같이, 본 발명의 일 양태는 본원에 제공된 것과 같은 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, TRAC 또는 CD38 유전자좌와 같은 연속적 또는 시간적 유전자 발현에 대해 안전하고 잘 조절되는 것으로 공지되거나 입증된 게놈 안전 항구 또는 예비선택된 유전자좌를 포함하는 선택된 유전자좌에서 표적화된 통합 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 표적화된 통합 방법을 위한 게놈 안전 항구는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, CD38, GAPDH, TCR 또는 RUNX1, 또는 게놈 안전 항구의 기준을 충족하는 다른 유전자좌를 포함하는 하나 이상의 원하는 통합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적화된 통합은 통합의 결과로서 유전자의 넉다운 또는 넉아웃이 원해지는 하나 이상의 유전자좌에 있고, 여기서 이러한 유전자좌는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 및 TIGIT를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계 및 세포 숙주 효소 기전에 의해 부위 특이적 상동성 재조합이 가능하게 하도록 하나 이상의 외인성 서열 및 원하는 통합 부위에 특이적인 한 쌍의 상동성 아암을 포함하는 작제물을 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 원하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT를 포함한다.
다른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계 및 ZFN 매개된 삽입이 가능하게 하도록 세포로 원하는 통합 부위에 특이적인 DNA 결합 도메인을 포함하는 ZFN 발현 카세트를 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 원하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계 및 TALEN 매개된 삽입이 가능하게 하도록 세포로 원하는 통합 부위에 특이적인 DNA 결합 도메인을 포함하는 TALEN 발현 카세트를 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 원하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT를 포함한다. 다른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계, Cas9 매개된 삽입이 가능하게 하도록 세포로 Cas9 발현 카세트, 및 원하는 통합 부위에 특이적인 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 원하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포에서 표적화된 통합의 방법은 세포에서 원하는 통합 부위로 한 쌍의 DICE 재조합효소의 하나 이상의 att 부위를 포함하는 작제물을 도입하는 단계, 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계, 및 DICE 매개된 표적화된 통합이 가능하게 하도록 DICE 재조합효소에 대한 발현 카세트를 도입하는 단계를 포함하고, 여기서, 원하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, 또는 TIGIT를 포함한다.
추가로, 본원에 제공된 것처럼, 안전 항구에서 표적화된 통합을 위한 상기 방법은 임의의 관심 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 안전성 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적 활성 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보자, 및 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존기간을 촉진하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 삽입하도록 사용된다. 일부 다른 실시형태에서, 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물은 하나 이상의 마커 유전자를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 작제물에서 외인성 폴리뉴클레오타이드는 안전 스위치 단백질을 암호화하는 자살 유전자이다. 유도된 세포사에 적합한 자살 유전자 시스템은 비제한적인 예로서 카스파제 9(또는 카스파제 3 또는 7) 및 AP1903; 티미딘 키나제(TK) 및 간시클로버(GCV); 사이토신 탈아미노효소(CD) 및 5-플루오로사이토신 (5-FC)을 포함한다. 추가적으로, 일부 자살 유전자 시스템은 세포 유형 특이적이고, 예를 들어 B 세포 분자 CD20에 의한 T 림프구의 유전자 변형은 mAb 리툭시맙의 투여 시 이의 제거를 허용한다. 추가로, 세툭시맙에 의해 인식된 에피토프를 함유하는 변형된 EGFR은 세포가 세툭시맙에 노출될 때 유전 조작된 세포를 고갈시키도록 사용될 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 일 양태는 카스파제 9(카스파제 3 또는 7), 티미딘 키나제, 사이토신 탈아미노효소, 변형된 EGFR 및 B 세포 CD20으로부터 선택된 안전성 스위치 단백질을 암호화하는 하나 이상의 자살 유전자의 표적화된 통합 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본원에서의 방법에 의해 통합된 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 표적화된 통합을 위해 작제물에 포함된 작동 가능하게 연결된 외인성 프로모터에 의해 추진된다. 프로모터는 유도성 또는 항시적일 수 있고, 시간 특이적, 조직 특이적 또는 세포 유형 특이적일 수 있다. 본 발명의 방법에 적합한 항시적 프로모터는 비제한적인 예로서 사이토메갈로바이러스(CMV), 연장 인자 1α(EF1α), 포스포글리세레이트 키나제(PGK), 하이브리드 CMV 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 및 유비퀴틴C(UBC) 프로모터를 포함한다. 일 실시형태에서, 외인성 프로모터는 CAG이다.
본원에서의 방법에 의해 통합된 외인성 폴리뉴클레오타이드는 통합 부위에서 숙주 게놈에서의 내인성 프로모터에 의해 추진될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포의 게놈에서 AAVS1 유전자좌에서의 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드의 표적화된 통합에 사용된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 AAVS1 프로모터에 의해 추진된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포의 게놈에서 ROSA26 유전자좌에서의 표적화된 통합에 사용된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 ROSA26 프로모터에 의해 추진된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포의 게놈에서 H11 유전자좌에서의 표적화된 통합에 사용된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 H11 프로모터에 의해 추진된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포의 게놈에서 콜라겐 유전자좌에서의 표적화된 통합에 사용된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 콜라겐 프로모터에 의해 추진된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포의 게놈에서 HTRP 유전자좌에서의 표적화된 통합에 사용된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 HTRP 프로모터에 의해 추진된다. 이론적으로, 원하는 위치에서의 오직 정확한 삽입이 내인성 프로모터에 의해 추진된 외인성 유전자의 유전자 발현을 허용할 것이다.
일부 실시형태에서, 표적화된 통합의 방법을 위해 작제물에 포함된 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 하나의 프로모터에 의해 추진된다. 일부 실시형태에서, 작제물은 모이어티 사이의 더 큰 물리적 분리를 제공하고 효소 기계에 대한 접근 가능성을 최대화하도록 동일한 프로모터에 의해 추진된 2개의 인접한 폴리뉴클레오타이드 사이에 하나 이상의 링커 서열을 포함한다. 링커 서열의 링커 펩타이드는 모이어티(외인성 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이로부터 암호화된 단백질 또는 펩타이드) 사이의 물리적 분리가 관련된 기능에 따라 보다 가요성이거나 보다 경질이 되게 하도록 선택된 아미노산으로 이루어질 수 있다. 링커 서열은 별개의 모이어티를 생성하도록 프로테아제에 의해 절단 가능하거나 화학적으로 절단 가능할 수 있다. 링커에서의 효소 절단 부위의 예는 엔테로키나제, Xa 인자, 트립신, 콜라게나제 및 트롬빈과 같은 단백분해 효소에 의한 절단을 위한 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로테아제는 숙주에 의해 자연적으로 제조된 것이거나, 이것은 외인성으로 도입된다. 대안적으로, 링커에서의 절단 부위는 선택된 화학물질, 예를 들어 시아노겐 브로마이드, 하이드록실아민, 또는 낮은 pH에 대한 노출 시 절단될 수 있는 부위일 수 있다. 선택적인 링커 서열은 절단 부위의 제공 이외의 목적을 제공할 수 있다. 링커 서열은 모이어티가 적절히 작용하도록 다른 인접한 모이어티와 관련하여 모이어티의 효과적인 배치를 허용해야 한다. 링커는 또한 모이어티 사이의 임의의 입체 장애를 막기에 충분한 길이의 단순한 아미노산 서열일 수 있다. 게다가, 링커 서열은 비제한적인 예로서 예를 들어 인산화 부위, 비오티닐화 부위, 황화 부위, γ-카복실화 부위 등을 포함하는 번역후 변형을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 단일의 원치 않는 입체형태의 생물학적 활성 펩타이드를 보유하지 않도록 가요성이다. 링커는 가요성을 제공하도록 글리신, 알라닌 및 세린과 같은 작은 측쇄를 갖는 아미노산으로 주로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 약 80 또는 90% 이상의 링커 서열은 글리신, 알라닌 또는 세린 잔기, 특히 글리신 및 세린 잔기를 포함한다. 여러 실시형태에서, G4S 링커 펩타이드는 융합 단백질의 말단 가공 도메인 및 엔도뉴클레아제 도메인을 분리시킨다. 다른 실시형태에서, 2A 링커 서열은 2개의 별개의 단백질이 단일 번역으로부터 제조되게 한다. 적합한 링커 서열은 용이하게 경험적으로 확인될 수 있다. 추가적으로, 링커 서열의 적합한 크기 및 서열은 종래의 컴퓨터 모델링 기법에 의해 또한 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 링커 서열은 자가 절단 펩타이드를 암호화한다. 일 실시형태에서, 자가 절단 펩타이드는 2A이다. 일부 다른 실시형태에서, 링커 서열은 내부 리보솜 진입 서열(IRES: Internal Ribosome Entry Sequence)을 제공한다. 일부 실시형태에서, 임의의 2개의 연속적 링커 서열은 상이하다.
특히 공지된 세포로의 유전자 이동의 방법을 이용하여 표적화된 통합을 위한 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 세포로 도입하는 방법이 달성될 수 있다. 일 실시형태에서, 작제물은 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관된 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터의 골격을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라스미드 벡터는 표적 세포(예를 들어, pAl- 11, pXTl, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo) 등에 외인성 폴리뉴클레오타이드를 전달하고/하거나 발현하도록 사용된다. 일부 다른 실시형태에서, 에피솜 벡터는 표적 세포에 외인성 폴리뉴클레오타이드를 전달하도록 사용된다. 일부 실시형태에서, 재조합 아데노 연관된 바이러스(rAAV)는 상동성 재조합을 통해 삽입, 결실 또는 치환을 도입하도록 유전 조작을 위해 사용될 수 있다. rAAV는 렌티바이러스와 달리 숙주 게놈으로 통합되지 않는다. 게다가, 에피솜 rAAV 벡터는 종래의 표적화 플라스미드의 형질주입과 비교하여 훨씬 더 높은 속도로 상동성 유도 유전자 표적화를 매개한다. 일부 실시형태에서, AAV6 또는 AAV2 벡터는 iPSC의 게놈에서의 표적 부위에서 삽입, 결실 또는 치환을 도입하도록 사용된다. 일부 실시형태에서, 본원에서의 방법 및 조성물을 사용하여 얻은 게놈 변형된 iPSC 및 이의 분화 세포는 표 1에 열거된 적어도 하나의 유전자형을 포함한다.
III. 게놈 조작된 iPSC를 수득하고 유지하는 방법
본 발명은 하나 이상의 원하는 부위에서 하나 이상의 표적화된 편집을 포함하는 게놈 조작된 iPSC를 수득하고 유지시키는 방법을 제공하고, 여기서 표적화된 편집은 각각의 선택된 편집 부위에서 증식된 게놈 조작된 iPSC 또는 iPSC 유래 비만능 세포에서 온전하고 기능적으로 있는다. 표적화된 편집은 게놈 iPSC 및 이로부터의 분화 세포로 삽입, 결실 및/또는 치환, 즉 선택된 부위에서의 표적화된 통합 및/또는 삽입-결실을 도입한다. 환자 원천의, 말초혈 유래된 일차 효과기 세포의 직접적인 조작과 비교하여, 본원에 제공된 것과 같은 iPSC의 편집 및 분화를 통한 유래된 게놈 조작된 iPSC를 수득하는 것의 많은 이익은 조작된 효과기 세포에 대한 비제한된 원천; 특히 다수의 조작된 양상이 관여될 때 효과기 세포의 반복 조작의 필요성이 없음; 얻은 효과기 세포가 연장된 텔로미어를 갖기 위해 재생되고 탈진을 덜 경험함; 효과기 세포 집단은 주로 본원에 제공된 것과 같은 조작된 iPSC에서의 가능해진 클론 선택으로 인해 편집 부위, 카피수, 및 대립유전자 변이의 부재, 랜덤 돌연변이 및 발현 다양성의 면에서 동종성임을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 선택된 부위에서 하나 이상의 표적화된 편집을 포함하는 게놈 조작된 iPSC는 운명 유지 배지(FMM: Fate Maintenance Medium)로서 표 2에 기재된 세포 배양 배지에서 연장된 기간 동안 단일 세포로서 유지되고 계대배양되고 증식되고, 여기서 iPSC는 선택된 부위(들)에서 표적화된 편집 및 기능적 변형을 보유한다. 배지의 성분은 표 2에 도시된 최적 범위 내의 양으로 배지에 존재할 수 있다. FMM에서 배양된 iPSC는 이의 비분화된, 및 준거 또는 미경험 프로파일; 배양 세정 또는 선택의 필요 없는 게놈 안정성을 계속해서 유지시키는 것으로 나타났고; 모든 3개의 체세포 계통, 배양체 또는 단층을 통한 시험관내 분화(배양체의 형성 없음); 및 기형종 형성에 의한 생체내 분화를 용이하게 발생시킨다. 예를 들어, 미국 특허 제61/947,979호를 참조하고, 이의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
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일부 실시형태에서, 하나 이상의 표적화된 통합 및/또는 삽입-결실을 포함하는 게놈 조작된 iPSC는 MEK 억제제, GSK3 억제제 및 ROCK 억제제를 포함하고, TGFβ 수용체/ALK5 억제제가 없거나 본질적으로 없는 배지에서 유지되고 계대배양되고 증식되고, iPSC는 선택된 부위에서 온전하고 기능적인 표적화된 편집을 보유한다.
본 발명의 다른 양태는 iPSC의 표적화된 편집을 통해; 또는 표적화된 편집에 의해 게놈 조작된 비만능 세포를 처음에 생성하고 이후에 비만능 세포와 동일한 표적화된 편집을 포함하는 iPSC를 얻기 위해 선택된/단리된 게놈 조작된 비만능 세포의 재프로그래밍을 통해 게놈 조작된 iPSC를 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명의 추가의 양태는 세포로 표적화된 통합 및/또는 표적화된 삽입-결실을 도입함으로써 현재 재프로그래밍을 겪는 비만능 세포의 게놈 조작을 제공하고, 여기서 접촉된 비만능 세포는 재프로그래밍에 충분한 조건 하에 있고, 재프로그래밍에 대한 조건은 비만능 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자 및 소분자와 접촉시키는 것을 포함한다. 동시의 게놈 조작 및 재프로그래밍에 대한 방법의 다양한 실시형태에서, 표적화된 통합 및/또는 표적화된 삽입-결실은 비만능 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자 및 선택적으로 소분자와 접촉시켜 재프로그래밍을 개시하기 전에, 또는 본질적으로 이와 동시에 비만능 세포로 도입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 비만능 세포를 동시에 게놈 조작하고 재프로그래밍하기 위해, 표적화된 통합 및/또는 삽입-결실은 비만능 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자 및 소분자와 접촉시켜 개시된 재프로그래밍의 수일 과정 후 비만능 세포로 또한 도입될 수 있고, 재프로그래밍 세포가 비제한적인 예로서 SSEA4, Tra181 및 CD30을 포함하는 하나 이상의 내인성 만능 유전자의 안정한 발현을 제시하기 전에 작제물을 보유하는 벡터가 도입된다.
일부 실시형태에서, 비만능 세포를 적어도 하나의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제, MEK 억제제, GSK3 억제제 및 ROCK 억제제의 조합과 접촉시켜 재프로그래밍이 개시된다(FRM; 표 2). 일부 실시형태에서, 임의의 상기 방법을 통해 게놈 조작된 iPSC는 MEK 억제제, GSK3 억제제 및 ROCK 억제제의 조합을 포함하는 혼합물을 사용하여 추가로 유지되고 증식된다(FMM; 표 2).
게놈 조작된 iPSC의 생성 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 적어도 하나의 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 게놈 조작된 iPSC를 얻도록 하나 이상의 표적화된 통합 및/또는 삽입-결실을 iPSC로 도입하여 iPSC를 게놈 조작하는 것을 포함한다. 대안적으로, 게놈 조작된 iPSC를 생성하는 방법은 (a) 선택된 부위에서 표적화된 통합 및/또는 삽입-결실을 포함하는 게놈-조작된 비만능 세포를 얻도록 하나 이상의 표적화된 편집을 비만능 세포로 도입하는 단계, 및 (b) 선택된 부위에서 표적화된 통합 및/또는 삽입-결실을 포함하는 게놈 조작된 iPSC를 얻도록 게놈 조작된 비만능 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제, MEK 억제제, GSK3 억제제 및/또는 ROCK 억제제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 대안적으로, 게놈 조작된 iPSC를 생성하는 방법은 (a) 비만능 세포의 재프로그래밍을 개시하도록 비만능 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제, MEK 억제제, GSK3 억제제 및/또는 ROCK 억제제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시키는 단계; (b) 게놈 조작을 위해 재프로그래밍 비만능 세포로 하나 이상의 표적화된 통합 및/또는 삽입-결실을 도입하는 단계; 및 (c) 선택된 부위에서 표적화된 통합 및/또는 삽입-결실을 포함하는 게놈 조작된 iPSC를 수득하는 단계를 포함한다. 임의의 상기 방법은 클론 iPSC를 수득하기 위해 단일 세포 분류 게놈 조작된 iPSC를 추가로 포함할 수 있다. 이 게놈 조작된 iPSC의 클론 증식을 통해, 본원에 표 1에 제공된 것처럼 적어도 하나의 표현형을 갖는 단일 세포 분류되고 증식된 클론 조작된 iPSC를 포함하도록 마스터 세포 은행이 생성된다. 마스터 세포 은행은 후속하여 저온보존되어서, 추가의 iPSC 조작을 위한 플랫폼, 및 조성이 잘 한정되고 균일하며 비용 효과적인 방식으로 상당한 규모로 대량 생산될 수 있는 기성품, 조작된, 균일한 세포 치료 산물을 제조하기 위한 재생 가능한 원천을 제공한다.
재프로그래밍 인자는 국제출원 PCT/US2015/018801호 및 국제출원 PCT/US16/57136호에 개시된 것처럼 OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3, L1TD1, 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 하나 이상의 재프로그래밍 인자는 폴리펩타이드의 형태일 수 있다. 재프로그래밍 인자는 또한 폴리뉴클레오타이드의 형태일 수 있고, 이에 따라 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 에피솜, 플라스미드 및 미니서클과 같은 벡터에 의해 비만능 세포로 도입된다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 재프로그래밍 인자를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 렌티바이러스 벡터에 의해 도입된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 에피솜 벡터에 의해 도입된다. 다양한 다른 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 센다이 바이러스 벡터에 의해 도입된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 플라스미드의 조합에 의해 도입된다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 US 62/571,105호를 참조하고, 이의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
일부 실시형태에서, 비만능 세포는 동일한 선택 부위 또는 상이한 선택 부위에서 표적화된 통합을 위해 다수의 벡터에 의해 상이한 외인성 폴리뉴클레오타이드 및/또는 상이한 프로모터를 포함하는 다수의 작제물에 의해 옮겨진다. 이 외인성 폴리뉴클레오타이드는 자살 유전자, 또는 표적화 양상을 암호화하는 유전자, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적 활성 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보자, 또는 iPSC 또는 이로부터의 분화 세포의 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존기간을 촉진하는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 외인성 폴리뉴클레오타이드는 비제한적인 예로서 siRNA, shRNA, miRNA 및 안티센스 핵산을 포함하는 RNA를 암호화한다. 이 외인성 폴리뉴클레오타이드는 항시적 프로모터, 유도성 프로모터, 시간 특이적 프로모터, 및 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로모터에 의해 추진될 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 유도제의 존재 하에 또는 특정 분화된 세포 유형에서 프로모터를 활성화하는 조건 하일 때 발현 가능하다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 iPSC에서 및/또는 iPSC로부터 분화된 세포에서 발현된다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 자살 유전자는 항시적 프로모터에 의해 추진되고, 예를 들어 Capase-9는 CAG에 의해 추진된다. 상이한 외인성 폴리뉴클레오타이드 및/또는 상이한 프로모터를 함유하는 이 작제물은 동시에 또는 연속적으로 비만능 세포로 이송될 수 있다. 다수의 작제물의 표적화된 통합으로 처리되는 비만능 세포는 게놈 조작과 동시에 재프로그래밍을 개시하도록 하나 이상의 재프로그래밍 인자와 동시에 접촉하여서, 동일한 세포 풀에서 다수의 표적화된 통합을 포함하는 게놈 조작된 iPSC를 얻을 수 있다. 이와 같이, 이 강건한 방법은 하나 이상의 선택된 표적 부위로 통합된 다수의 양상을 갖는 클론 게놈 조작된 hiPSC를 유래하기 위한 동시의 재프로그래밍 및 조작 전략이 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 본원에서의 방법 및 조성물을 사용하여 얻은 게놈 변형된 iPSC 및 이의 분화 세포는 표 1에 열거된 적어도 하나의 유전자형을 포함한다.
IV. 게놈 조작된 iPSC를 분화하여 유전 조작된 효과기 세포를 얻는 방법
본 발명의 추가의 양태는 기형종 형성에 의한 게놈 조작된 iPSC의 생체내 분화의 방법을 제공하고, 여기서 게놈 조작된 iPSC로부터 생체내 유래된 분화된 세포는 원하는 부위(들)에서의 표적화된 통합 및/또는 삽입-결실을 포함하여 온전하고 기능적인 표적화된 편집을 보유한다. 일부 실시형태에서, 기형종을 통해 게놈 조작된 iPSC로부터 생체내 유래된 분화된 세포는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP H11, 베타-2 마이크로글로불린, CD38, GAPDH, TCR 또는 RUNX1, 또는 게놈 안전 항구의 기준을 충족하는 다른 유전자좌를 포함하는 하나 이상의 원하는 통합 부위에서 통합된 하나 이상의 유도성 자살 유전자를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 기형종을 통해 게놈 조작된 iPSC로부터 생체내 유래된 분화된 세포는 표적화 양상을 암호화하는, 또는 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존기간을 촉진하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 유도성 자살 유전자를 포함하는 기형종을 통해 게놈 조작된 iPSC로부터 생체내 유래된 분화된 세포는 면역 반응 조절 및 매개와 연관된 내인성 유전자에서 하나 이상의 삽입-결실을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 삽입-결실은 하나 이상의 내인성 관문 유전자에 포함된다. 일부 실시형태에서, 삽입-결실은 하나 이상의 내인성 T 세포 수용체 유전자에 포함된다. 일부 실시형태에서, 삽입-결실은 하나 이상의 내인성 MHC 클래스 I 억제자 유전자에 포함된다. 일부 실시형태에서, 삽입-결실은 주요 조직접합성 복합체와 연관된 하나 이상의 내인성 유전자에 포함된다. 일부 실시형태에서, 삽입-결실은 비제한적인 예로서 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT를 포함하는 하나 이상의 내인성 유전자에 포함된다. 일 실시형태에서, 선택된 부위(들)에서 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 게놈 조작된 iPSC는 B2M(베타-2-마이크로글로불린) 암호화 유전자에서 표적화된 편집을 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 것과 같은 하나 이상의 유전자 변형을 포함하는 게놈 조작된 iPSC는 조혈 세포 계통 또는 시험관내 임의의 다른 특정한 세포 유형을 유래하도록 사용되고, 여기서 유래된 비만능 세포는 선택된 부위(들)에서의 표적화된 편집을 포함하는 기능적 유전자 변형을 보유한다. 일부 실시형태에서, 조혈 세포 계통 또는 시험관내 임의의 다른 특정한 세포 유형을 유래하도록 사용된 게놈 조작된 iPSC는 저온보존되고 이의 사용 직전에 해동되는 마스터 세포 은행 세포이다. 일 실시형태에서, 게놈 조작된 iPSC 유래 세포는 한정적 동형유전자성 내피세포(HE) 가능성을 갖는 중배엽 세포, 한정적 HE, CD34 조혈 세포, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구세포(MPP), T 세포 전구세포, NK 세포 전구세포, 골수성 세포, 호중구 전구세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 호중구, 수지상 세포 및 대식세포를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않고, 여기서 게놈 조작된 iPSC로부터 유래된 이들 세포는 원하는 부위(들)에서 표적화된 편집을 포함하는 기능적 유전자 변형을 보유한다.
iPSC 유래 조혈 세포 계통을 수득하기 위한 적용 가능한 분화 방법 및 조성물은 예를 들어 국제 출원 PCT/US2016/044122호에 기재된 것을 포함하고, 이의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 제공된 것처럼, 조혈 세포 계통을 생성하기 위한 방법 및 조성물은 EB 형성의 필요성 없이 확장 가능한 단층 배양 플랫폼에서 혈청 비함유, 피더 비함유 및/또는 기질 비함유 조건 하에서 hiPSC를 포함하는 만능 줄기 세포로부터 유래된 한정적 동형유전자성 내피세포(HE)를 통해서이다. 제공된 방법에 따라 분화될 수 있는 세포는 만능 줄기 세포로부터 특정한 말단 분화된 세포 및 전환분화된 세포로 결정된 전구 세포로, 그리고 만능 중간체를 거치지 않고 조혈 운명으로 직접 이행된 다양한 계통의 세포에 이른다. 유사하게, 줄기 세포를 분화하여 제조될 수 있는 세포는 다능성 줄기 세포 또는 전구 세포로부터 말단 분화된 세포로, 그리고 모든 개재하는 조혈 세포 계통에 이른다.
단층 배양에서 만능 줄기 세포로부터 조혈 계통의 세포를 분화하고 증식시키는 방법은 만능 줄기 세포를 BMP 경로 활성자 및 선택적으로, bFGF와 접촉시키는 것을 포함한다. 제공된 것처럼, 만능 줄기 세포 유래된 중배엽 세포가 얻어지고, 만능 줄기 세포로부터 배양체를 형성함이 없이 증식된다. 이후, 중배엽 세포는 만능 줄기 세포로부터 배양체를 형성함이 없이 한정적 동형유전자성 내피세포(HE) 가능성을 갖는 증식된 중배엽 세포를 얻기 위해 BMP 경로 활성자, bFGF 및 WNT 경로 활성자와의 접촉으로 처리된다. bFGF, 및 선택적으로 ROCK 억제제 및/또는 WNT 경로 활성자와의 후속하는 접촉에 의해, 한정적 HE 가능성을 갖는 중배엽 세포는 분화 동안 또한 증식된 한정적 HE 세포로 분화한다.
조혈 계통의 세포를 얻기 위한 본원에 제공된 방법은 EB 매개된 만능 줄기 세포 분화보다 우수한데, EB 형성이 보통의 세포 증식 내지는 최소 세포 증식을 야기하고, 집단에서의 세포의 동종성 증식 및 동종성 분화를 요하는 많은 분야에 중요한 단층 배양을 허용하지 않고, 힘들며 효능이 낮기 때문이다.
제공된 단층 분화 플랫폼은 한정적 동형유전자성 내피세포를 향한 분화가 용이하게 하여 조혈 줄기 세포 및 T 세포, B 세포, NKT 세포 및 NK 세포와 같은 분화된 자손이 유래되게 한다. 단층 분화 전략은 향상된 분화 효능을 대규모 증식과 조합하여서 다양한 치료학적 분야에 대해 치료학적으로 관련된 수의 만능 줄기 세포 유래된 조혈 세포의 전달이 가능하게 한다. 추가로, 본원에 제공된 방법을 이용한 단층 배양은 시험관내 분화, 생체외 조절, 및 생체내 장기간 조혈 자가 재생, 재구성 및 생착의 완전 범위가 가능하게 하는 기능적 조혈 계통 세포를 생성시킨다. 제공된 것처럼, iPSC 유래된 조혈 계통 세포는 비제한적인 예로서 한정적 동형유전자성 내피세포, 조혈 다능성 전구 세포, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, T 세포 전구세포, NK 세포 전구세포, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포 및 호중구를 포함한다.
한정적 조혈 계통의 세포로 만능 줄기 세포의 분화를 지시하기 위한 방법, 여기서 상기 방법은 (i) 만능 줄기 세포로부터 중배엽 세포의 분화 및 증식을 개시하도록 만능 줄기 세포를 BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; (ii) 중배엽 세포로부터 한정적 HE 가능성을 갖는 중배엽 세포의 분화 및 증식을 개시하도록 중배엽 세포를 BMP 활성자, bFGF, 및 GSK3 억제제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계(여기서, 상기 조성물은 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제가 없음); (iii) 한정적 동형유전자성 내피세포 가능성을 갖는 만능 줄기 세포 유래된 중배엽 세포로부터 한정적 동형유전자성 내피세포의 분화 및 증식을 개시하도록 한정적 HE 가능성을 갖는 중배엽 세포를 ROCK 억제제; bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로, Wnt 경로 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계(여기서, 상기 조성물은 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제가 없음)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 만능 줄기 세포를 시딩하고 증식하기 위해 만능 줄기 세포를 MEK 억제제, GSK3 억제제 및 ROCK 억제제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 추가로 포함하고, 상기 조성물은 TGFβ 수용체/ALK 억제제가 없다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 iPSC, 또는 미경험 iPSC, 또는 하나 이상의 유전 각인을 포함하는 iPSC이고, iPSC에 포함된 하나 이상의 유전 각인은 이로부터 분화된 조혈 세포에 보유된다. 조혈 계통의 세포로의 만능 줄기 세포의 분화를 지시하는 방법의 일부 실시형태에서, 조혈 계통의 세포로의 만능 줄기 세포의 분화는 배양체의 생성이 없고, 단층 배양 형태로 있다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 얻은 만능 줄기 세포 유래된 한정적 동형유전자성 내피 세포는 CD34+이다. 일부 실시형태에서, 얻은 한정적 동형유전자성 내피 세포는 CD34+CD43-이다. 일부 실시형태에서, 한정적 동형유전자성 내피 세포는 CD34+CD43-CXCR4-CD73-이다. 일부 실시형태에서, 한정적 동형유전자성 내피 세포는 CD34+ CXCR4-CD73-이다. 일부 실시형태에서, 한정적 동형유전자성 내피 세포는 CD34+CD43-CD93-이다. 일부 실시형태에서, 한정적 동형유전자성 내피 세포는 CD34+ CD93-이다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 (i) pre-T 세포 전구세포로의 한정적 동형유전자성 내피세포의 분화를 개시시키도록 만능 줄기 세포 유래된 한정적 동형유전자성 내피세포를 ROCK 억제제; VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 선택적으로, (ii) T 세포 전구세포 또는 T 세포로의 pre-T 세포 전구세포의 분화를 개시시키도록 pre-T 세포 전구세포를 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하지만, VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 억제제 중 하나 이상이 없는 조성물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포 유래된 T 세포 전구세포는 CD34+CD45+CD7+이다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포 유래된 T 세포 전구세포는 CD45+CD7+이다.
조혈 계통의 세포로 만능 줄기 세포의 분화를 지시하기 위한 상기 방법의 다른 일부 실시형태에서, 상기 방법은 (i) pre-NK 세포 전구세포로의 한정적 동형유전자성 내피세포의 분화를 개시시키도록 만능 줄기 세포 유래된 한정적 동형유전자성 내피세포를 ROCK 억제제; VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로, BMP 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 선택적으로 (ii) NK 세포 전구세포 또는 NK 세포로의 pre-NK 세포 전구세포의 분화를 개시시키도록 만능 줄기 세포 유래된 pre-NK 세포 전구세포를 SCF, Flt3L, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 배지는 VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 억제제 중 하나 이상이 없다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포 유래된 NK 전구세포는 CD3-CD45+CD56+CD7+이다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포 유래된 NK 세포는 CD3-CD45+CD56+이고, NKp46+, CD57+ 및 CD16+에 의해 선택적으로 추가로 한정된다.
따라서, 상기 분화 방법을 이용하여, (i) iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하여 CD34+ HE 세포(iCD34); (ii) iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하여 한정적 동형유전자성 내피세포(iHE); (iii) iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하여 한정적 HSC; (iv) iMPP-A를 사용하여 다능성 전구 세포(iMPP); (v) iTC-A2 및 iTC-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하여 T 세포 전구세포(ipro-T); (vi) iTC-B2를 사용하여 T 세포(iTC); (vii) iNK-A2 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하여 NK 세포 전구세포(ipro-NK); 및/또는 (viii) NK 세포(iNK) 및 iNK-B2인 iPSC 유래 조혈 세포의 하나 이상의 집단을 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 배지:
a. iCD34-C는 ROCK 억제제, bFGF, VEGF, SCF, IL6, IL11, IGF 및 EPO로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인, 및 선택적으로 Wnt 경로 활성자를 포함하고; TGFβ 수용체/ALK 억제제가 없고;
b. iMPP-A는 BMP 활성자, ROCK 억제제, 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하고;
c. iTC-A2는 ROCK 억제제; SCF, Flt3L, TPO 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자를 포함하고;
d. iTC-B2는 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하고;
e. iNK-A2는 ROCK 억제제, 및 SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7, 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자를 포함하고,
f. iNK-B2는 SCF, Flt3L, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법으로부터 얻은 게놈 조작된 iPSC 유래 세포는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, TCR α 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT, 또는 게놈 안전 항구의 기준을 충족하는 다른 유전자좌를 포함하는 하나 이상의 원하는 통합 부위에서 통합된 하나 이상의 유도성 자살 유전자를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 게놈 조작된 iPSC 유래 세포는 안전성 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적 활성 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보자, 또는 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존기간을 촉진하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 자살 유전자를 포함하는 게놈 조작된 iPSC 유래 세포는 비제한적인 예로서 관문 유전자, 내인성 T 세포 수용체 유전자 및 MHC 클래스 I 억제자 유전자를 포함하는 면역 반응 조절 및 매개와 연관된 하나 이상의 내인성 유전자에 포함된 하나 이상의 삽입-결실을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 자살 유전자를 포함하는 게놈 조작된 iPSC 유래 세포는 B2M 유전자에서 삽입-결실을 추가로 포함하고, B2M은 넉아웃된다.
추가적으로, 제2 운명의 게놈 조작된 조혈 세포로 제1 운명의 게놈 조작된 조혈 세포를 얻기 위한 적용 가능한 탈분화 방법 및 조성물은 예를 들어 국제공개 WO 2011/159726호에 기재된 것을 포함하고, 이의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 여기서 제공된 방법 및 조성물은 재프로그래밍 동안 내인성 Nanog 유전자의 발현을 제한함으로써; 및 원하는 세포 유형으로 중간 세포를 분화하기 위한 조건으로 비만능 중간 세포를 처리함으로써 비만능 중간 세포로 출발 비만능 세포를 부분적으로 재프로그래밍하는 것을 허용한다. 일부 실시형태에서, 본원에서의 방법 및 조성물을 사용하여 얻은 게놈 변형된 iPSC 및 이의 분화 세포는 표 1에 열거된 적어도 하나의 유전자형을 포함한다.
V. 유전 조작된 iPSC로부터 분화된 기능적 양상을 갖는 분화 면역 세포의 치료학적 용도
일부 실시형태에서, 본 발명은 개시된 것과 같은 방법 및 조성물을 사용하여 게놈 조작된 iPSC로부터 분화된 단리된 집단 또는 하위집단 기능적으로 향상된 분화 면역 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, iPSC는 iPSC 유래 면역 세포에서 보유 가능한 하나 이상의 표적화된 유전 편집을 포함하고, 여기서 유전 조작된 iPSC 및 이로부터의 분화 세포는 세포 기반 입양 치료에 적합하다. 일 실시형태에서, 유전 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC 유래 CD34 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC 유래 HSC 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC 유래 proT 세포 또는 T 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC 유래 proNK 세포 또는 NK 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC 유래 면역 조절 세포 또는 골수성 유래 억제자 세포(MDSC)를 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC 유래된 유전 조작된 면역 세포는 개선된 치료학적 가능성을 위해 생체외 추가로 변경된다. 일 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 유전 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 미경험 T 세포, 줄기 세포 기억 T 세포 및/또는 중앙 기억 T 세포의 증가된 수 또는 비율을 포함한다. 일 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 유전 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 I형 NKT 세포의 증가된 수 또는 비율을 포함한다. 다른 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 유전 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 입양 NK 세포의 증가된 수 또는 비율을 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 유전 조작된 CD34 세포, HSC 세포, T 세포, NK 세포 또는 골수성 유래 억제자 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 동종이계이다. 일부 다른 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 유전 조작된 CD34 세포, HSC 세포, T 세포, NK 세포 또는 MDSC의 단리된 집단 또는 하위집단은 자연발생적이다.
일부 실시형태에서, 분화를 위한 iPSC는 효과기 세포에서 바람직한 치료학적 속성을 전달하도록 선택된 유전 각인을 포함하고, 단 분화 동안 세포 발생 생물학은 파괴되지 않고, 단 유전 각인은 상기 iPSC로부터 유래된 분화된 조혈 세포에서 보유되고 기능적이다.
일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포의 유전 각인은 (i) iPSC로의 비만능 세포의 재프로그래밍 동안 또는 후에 만능 세포의 게놈에서 게놈 삽입, 결실 또는 치환을 통해 얻은 하나 이상의 유전 변형된 양상; 또는 (ii) 공여자 특이적, 질환 특이적 또는 치료 반응 특이적인 원천 특이적 면역 세포의 하나 이상의 보유 가능한 치료학적 속성을 포함하고, 만능 세포는 원천 특이적 면역 세포로부터 재프로그래밍되고, iPSC는 iPSC 유래된 조혈 계통 세포에 또한 포함된 원천 치료학적 속성을 보유한다.
일부 실시형태에서, 일반적으로 변형된 양상은 안전성 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적 활성 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보자; 또는 iPSC 또는 이로부터의 분화 세포의 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정 및/또는 생존기간을 촉진하는 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 변형된 iPSC 및 이로부터의 분화 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 유전 변형된 iPSC 및 이로부터의 분화 세포는 (1) TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, 또는 RFXAP, RAG1, 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 유전자 중 하나 이상의 결실 또는 발현 감소; 및 (2) HLA-E, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, Fc 수용체, 또는 이중특이적 인게이저 또는 다중특이적 인게이저 또는 보편적 인게이저와 커플링하기 위한 표면 트리거링 수용체의 발현 도입 또는 발현 증가를 포함하는 추가의 유전 변형된 양상을 추가로 포함한다.
일부 또 다른 실시형태에서, 조혈 계통 세포는 (i) 하나 이상의 항원 표적화 수용체 발현; (ii) 변형된 HLA; (iii) 종양 미세환경에 대한 내성; (iv) 방관자 면역 세포의 동원 및 면역 조절; (iv) 감소된 오프 종양 효과를 갖는 개선된 온 타깃 특이성; 및 (v) 개선된 호밍, 지속성, 세포독성, 또는 항원 회피 구제 중 적어도 2개의 조합과 관련된 원천 특이적 면역 세포의 치료학적 속성을 포함한다.
일부 실시형태에서, iPSC 분화 조혈 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 포함하고, 상기 세포는 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18 또는 IL21을 포함하는 적어도 하나의 사이토카인 및/또는 이의 수용체, 또는 임의의 이들의 변형된 단백질을 발현하고, 적어도 CAR을 발현한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인(들) 및 CAR(들)의 조작된 발현은 NK 세포 특이적이다. 일부 다른 실시형태에서, 사이토카인(들) 및 CAR(들)의 조작된 발현은 T 세포 특이적이다. 일 실시형태에서, CAR은 CD38 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC 분화 조혈 효과기 세포는 항원 특이적이다. 일부 실시형태에서, 항원 특이적 분화 효과기 세포는 액체 종양을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 항원 특이적 분화 효과기 세포는 고형 종양을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 항원 특이적 iPSC 분화 조혈 효과기 세포는 종양 항원 회피를 구제할 수 있다.
입양 세포 치료에 적합한 대상체에 대한 본 발명의 면역 세포를 유도함으로써 다양한 질환이 개선될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 것과 같은 iPSC 분화 조혈 세포는 동종이계 입양 세포 치료를 위한 것이다. 추가적으로, 본 발명은 일부 실시형태에서 입양 세포 치료에 적합한 대상체에게 상기 조성물을 도입함으로써 상기 치료학적 조성물의 치료학적 용도를 제공하고, 여기서 대상체는 자가면역 장애; 혈액학적 악성종양; 고형 종양; 또는 HIV, RSV, EBV, CMV, 아데노바이러스 또는 BK 폴리오마바이러스와 연관된 감염을 갖는다. 혈액학적 악성종양의 예는 급성 백혈병 및 만성 백혈병(급성 골수성 백혈병(AML: acute myelogenous leukemia), 급성 림프아구성 백혈병(ALL: acute lymphoblastic leukemia), 만성 골수성 백혈병(CML: chronic myelogenous leukemia), 림프종, 비호지킨 림프종(NHL: non-Hodgkin lymphoma), 호지킨병, 다발성 골수종 및 골수이형성 증후군을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 고형 암의 예는 뇌, 전립선, 유방, 폐, 대장, 자궁, 피부, 간, 골, 췌장, 난소, 고환, 방광, 신장, 두부, 경부, 위, 자궁경부, 직장, 후두 및 식도의 암을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 다양한 자가면역 장애의 예는 원형 탈모증, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 피부근육염, (1형) 당뇨병, 소아 특발성 관절염의 일부 형태, 사구체신염, 그레이브병, 갈랑 바레 증후군, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 심근염의 일부 형태, 다발성 경화증, 천포창/유사천포창, 악성빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발근염, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 류마티스성 관절염, 피부경화증/전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 전신 루푸스, 홍반성, 갑상선염의 일부 형태, 포도막염의 일부 형태, 백반증, 다발혈관염 동반 육아종증(베게너)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 바이러스 감염의 예는 HIV(인간 면역결핍 바이러스), HSV(단순 포진 바이러스), KSHV(카포시 육종 연관된 헤르페스바이러스), RSV(호흡기 융합 바이러스), EBV(엡스타인 바 바이러스), CMV(사이토메갈로바이러스), VZV(바리셀라 조스터 바이러스), 아데노바이러스, 렌티바이러스, BK 폴리오마바이러스 연관된 장애를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
증상에 대해 또는 재발 예방을 위해 본원에 개시된 실시형태의 유래된 조혈 계통 세포의 치료가 실행될 수 있었다. 본원에 사용된 "치료하는", "치료" 및 기타의 용어는 일반적으로 원하는 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 그 효과는 질환을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 면에서 예방적일 수 있고/있거나, 질환에 기인한 질환 및/또는 불리한 효과에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 면에서 치료학적일 수 있다. 본원에 사용된 "치료"는 대상체에서의 임의의 질환 중재를 포괄하고, 질환의 소인이 있을 수 있지만 이것을 갖는 것으로 아직 진단되지 않은 대상체에서 질환이 발생하는 것을 방지하는 것; 질환의 억제, 즉 이의 발생의 정지; 또는 질환의 경감, 즉 질환 퇴행의 야기를 포함한다. 치료제 또는 조성물은 질환 또는 손상의 발생 전에, 동안에 및/또는 후에 투여될 수 있다. 치료가 환자의 바람직하지 않은 임상 증상을 안정화하거나 감소시키는 진행 중인 질환의 치료는 또한 특히 관심 있다. 특정 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 세포 치료에 의해 적어도 하나의 연관된 증상에서 함유되고/되거나, 완화되고/되거나, 개선될 수 있는 질환, 병태 및/또는 손상을 갖는다. 소정의 실시형태는 세포 치료를 필요로 하는 대상체가 골수 또는 줄기 세포 이식의 후보자, 화학요법 또는 조사 치료를 받는 대상체, 과증식성 장애 또는 암, 예를 들어 과증식성 장애 또는 조혈계의 암을 갖거나 가질 위험에 있는 대상체, 종양, 예를 들어 고형 종양을 갖거나 발생시킬 위험에 있는 대상체, 바이러스 감염 또는 바이러스 감염과 연관된 질환을 갖거나 가질 위험에 있는 대상체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다는 것을 고려한다.
본원에 개시된 실시형태의 유래된 조혈 계통 세포를 포함하는 치료에 대한 반응을 평가할 때, 임상 이익률, 사망까지의 생존기간, 병리학적 완전 반응, 병리학적 반응의 반정량적 측정치, 임상 완전 관해, 임상 부분 관해, 임상 안정 질환, 무재발 생존기간, 무전이 생존기간, 무질환 생존기간, 순환 종양 세포 감소, 순환 마커 반응 및 RECIST(Response Evaluation Criteria In Solid Tumor: 고형 종양에서의 반응 평가 기준) 기준 중 적어도 하나를 포함하는 기준에 의해 반응이 평가될 수 있다.
개시된 것과 같은 유래된 조혈 계통 세포를 포함하는 치료학적 조성물은 다른 치료 전에, 동안에 및/또는 후에 투여될 수 있다. 그러므로 추가의 치료제의 사용 전에, 동안에 및/또는 후에 조합 치료의 방법은 iPSC 유래 면역 세포의 투여 또는 준비를 수반할 수 있다. 상기 제공된 것처럼, 하나 이상의 추가의 치료제는 펩타이드, 사이토카인, 관문 억제제, 미토겐, 성장 인자, 소형 RNA, dsRNA(이중 가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 지지 세포, 지지 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 하나 이상의 관심 다중핵산을 포함하는 벡터, 항체, 화학치료제 또는 방사성 모이어티, 또는 면역조절 약물(IMiD)을 포함한다. iPSC 유래 면역 세포의 투여는 시간, 일 또는 심지어 주에 추가의 치료제의 투여와 시간상 분리될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 다른 생물학적 활성제 또는 양상, 예컨대 비제한적인 예로서 항종양제, 비약물 치료, 예컨대 수술과 조합될 수 있다.
조합 세포 치료의 일부 실시형태에서, 치료학적 조합은 본원에 제공된 iPSC 유래 조혈 계통 세포 및 항체 또는 항체 단편인 추가의 치료제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간화된 항체, 인간화된 단일클론 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편은 바이러스 항원에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편은 종양 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 종양 또는 바이러스 특이적 항원은 이의 사멸 능력을 향상시키기 위해 투여된 iPSC 유래 조혈 계통 세포를 활성화한다. 일부 실시형태에서, 투여된 iPSC 유래된 조혈 계통 세포에 대한 추가의 치료제로서의 조합 치료에 적합한 항체는 항-CD20(예를 들어, 리툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 우블리툭시맙, 오카라투주맙, 오비누투주맙, 이브리투모맙, 오크렐리주맙), 항-CD22(이노투주맙, 목세투모맙, 에프라투주맙), 항-HER2(예를 들어, 트라스투주맙, 페르투주맙), 항-CD52(예를 들어, 알렘투주맙), 항-EGFR(예를 들어, 세르툭시맙), 항-GD2(예를 들어, 디누툭시맙), 항-PDL1(예를 들어, 아벨루맙), 항-CD38(예를 들어, 다라투무맙, 이사툭시맙, MOR202), 항-CD123(예를 들어, 7G3, CSL362), 항-SLAMF7(엘로투주맙), 및 이들의 인간화된 변이체 또는 단편 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편, 및 이들의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 실시형태에서, 추가의 치료제는 하나 이상의 관문 억제제를 포함한다. 관문은 세포 분자, 대개 억제될 때 면역 반응을 억제하거나 하향조절할 수 있는 세포 표면 분자라 칭한다. 관문 억제제는 관문 유전자 발현 또는 유전자 산물을 감소시키거나, 관문 분자의 활성을 감소시킬 수 있는 길항제이다. 본원에 제공된 것과 같은 NK 세포 또는 T 세포를 포함하는 분화 효과기 세포에 의한 조합 치료에 적합한 관문 억제제는 PD-1(Pdcdl, CD279), PDL-1(CD274), TIM-3(Havcr2), TIGIT(WUCAM 및 Vstm3), LAG-3(Lag3, CD223), CTLA-4(Ctla4, CD152), 2B4(CD244), 4-1BB(CD137), 4-1BBL(CD137L), A2aR, BATE, BTLA, CD39(Entpdl), CD47, CD73(NT5E), CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2(Pou2f2), 레티노산 수용체 알파(Rara), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 및 억제성 KIR(예를 들어, 2DL1, 2DL2, 2DL3, 3DL1 및 3DL2)의 길항제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
제공된 분화 효과기 세포를 포함하는 조합 치료의 일부 실시형태는 관문 분자를 표적화하는 적어도 하나의 억제제를 추가로 포함한다. 제공된 분화 효과기 세포와의 조합 치료의 일부 다른 실시형태는 2개, 3개 또는 이것 초과의 관문 분자가 표적화되도록 2개, 3개 또는 이것 초과의 억제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 것과 같은 조합 치료를 위한 효과기 세포는 제공된 것과 같은 분화 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 것과 같은 조합 치료를 위한 효과기 세포는 분화 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 조합 치료를 위한 분화 NK 세포 또는 T 세포는 본원에 제공된 것처럼 기능적으로 향상된다. 일부 실시형태에서, 2종, 3종 또는 이것 초과의 관문 억제제는 분화 효과기 세포의 투여와 조합 치료와 함께, 이것 전에 또는 이것 후에 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 관문 억제제는 동시에, 또는 한번에 1회(순차적) 투여된다.
일부 실시형태에서, 임의의 상기 관문 분자를 억제하는 길항제는 항체이다. 일부 실시형태에서, 관문 억제성 항체는 쥣과 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 낙타 Ig, 상어 중쇄 전용 항체(VNAR), Ig NAR, 키메라 항체, 재조합 항체, 또는 이들의 항체 단편일 수 있다. 항체 단편의 비제한적인 예는 Fab, Fab′, F(ab)′2, F(ab)′3, Fv, 단일 사슬 항원 결합 단편(scFv), (scFv)2, 다이설파이드 안정화된 Fv(dsFv), 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 단일-도메인 항원 결합 단편(sdAb, Nanobody), 재조합 중쇄 전용 항체(VHH), 및 전체 항체의 결합 특이성을 유지하는 다른 항체 단편을 포함하고, 이는 전체 항체보다 제조하기에 보다 비용 효과적이거나, 보다 용이하게 사용되거나, 보다 민감할 수 있다. 일부 실시형태에서, 1개, 또는 2개 또는 3개, 또는 이것 초과의 관문 억제제는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 데발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 이들의 유도체 또는 기능적 균등물 중 적어도 하나를 포함한다.
분화 효과기 세포 및 하나 이상의 관문 억제제를 포함하는 조합 치료는 비제한적인 예로서 피부 T 세포 림프종, 비호지킨 림프종(NHL), 균상 식육종, 파제트병모양 망상증, 세자리 증후군, 육아종성 이완 피부, 림프종양 구진증, 만성 태선모양 잔비늘증, 급성 두창태선모양 잔비늘증, CD30+ 피부 T 세포 림프종, 속발성 피부 CD30+ 대세포 림프종, 비균상 식육종 CD30 피부 T 대세포 림프종, 다형성 T 세포 림프종, 레네트(Lennert) 림프종, 피하 T 세포 림프종, 혈관중심성 림프종, 아구성 NK 세포 림프종, B 세포 림프종, 호지킨 림프종(HL), 두경부 종양; 편평 세포 암종, 횡문근육종, 루이스 폐 암종(LLC), 비소세포 폐암, 식도 편평 세포 암종, 식도 선암, 신장 세포 암종(RCC), 대장직장암(CRC), 급성 골수성 백혈병(AML), 유방암, 위암, 전립선 소세포 신경내분비 암종(SCNC), 간암, 교모세포종, 간암, 구강 편평 세포 암종, 췌장암, 유두 갑상선암, 간내 담관세포 암종, 간세포 암종, 골암, 전이 및 비인두 암종을 포함하는 액체 암 및 고형 암의 치료에 적용 가능하다.
일부 실시형태에서, 치료학적 용도를 위한 조합은, 본원에 제공된 것과 같은 분화 효과기 세포 이외에, 화학치료제 또는 방사성 모이어티를 포함하는 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다. 화학치료제는 신생물 세포를 우선적으로 사멸하거나 신속히 증식하는 세포의 세포 주기를 파괴하거나, 줄기 암 세포를 근절하는 것으로 발견되고, 신생물 세포의 성장을 예방하거나 감소시키도록 치료학적으로 사용된 세포독성 항종양성 작용제, 즉 화학 작용제를 지칭한다. 화학치료제는 또한 때때로 항종양성 또는 세포독성 약물 또는 작용제라 칭하고, 당해 분야에 잘 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 화학치료제는 안트라사이클린, 알킬화제, 알킬 설포네이트, 아지리딘, 에틸렌이민, 메틸멜라민, 질소 머스타드, 니트로소우레아, 항생제, 항대사물질, 엽산 유사체, 푸린 유사체, 피리미딘 유사체, 효소, 포도필로톡신, 백금 함유 작용제, 인터페론 및 인터류킨을 포함한다. 예시적인 화학치료제는 알킬화제(사이클로포스파미드, 메클로르에타민, 메팔린, 클로르암부실, 헤아메틸멜라민, 티오테파, 부술판, 카르무스틴, 로무스틴, 세무스틴), 항대사물질(메토트렉세이트, 플루오로우라실, 플록수리딘, 사이타라빈, 6-머캅토푸린, 티오구아닌, 펜토스타틴), 빈카 알카로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신), 에피포도필로톡신(에토포사이드, 에토포사이드 오르토퀴논 및 테니포사이드), 항생제(다우노루비신, 독소루비신, 미톡산트론, 비산트렌, 악티노마이신 D, 플리카마이신, 푸로마이신 및 그라미시딘 D), 파클리탁셀, 콜히신, 시토칼라신 B, 에메틴, 메이탄신 및 암사크린을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 추가의 작용제는 아민글루테티미드, 시스플라틴, 카보플라틴, 미토마이신, 알트레타민, 사이클로포스파미드, 로무스틴(CCNU), 카르무스틴(BCNU), 이리노테칸(CPT-11), 알렘투주맙, 알트레타민, 아나스트로졸, L-아스파라기나제, 아자시티딘, 베바시주맙, 벡사로텐, 블레오마이신, 보르테조밉, 부술판, 칼루스테론, 카페시타빈, 셀레콕시브, 세툭시맙, 클라드리빈, 클로푸라빈, 사이타라빈, 다카르바진, 데니류킨 디프티톡스, 디에틀스틸베스트롤, 도세탁셀, 드로모스타놀론, 에피루비신, 에를로티닙, 에스트라무스틴, 에토포사이드, 에티닐 에스트라디올, 엑세메스탄, 플록수리딘, 5-플루오로우라실, 플루다라빈, 플루타미드, 풀베스트란트, 게피티닙, 겜시타빈, 고세렐린, 하이드록시우레아, 이브리투모맙, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티닙, 인터페론 알파(2a, 2b), 이리노테칸, 레트로졸, 류코보린, 류프롤라이드, 레바미솔, 메클로르에타민, 메게스트롤, 멜팔린, 머캅토푸린, 메토트렉세이트, 메톡살렌, 미토마이신 C, 미토탄, 미톡산트론, 난드롤론, 노페투모맙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파미드로네이트, 페메트렉세드, 페가데마제, 페가스파라가제, 펜토스타틴, 피포브로만, 플리카마이신, 포리페프로산, 포르피머, 프로카바진, 퀴나크린, 리툭시맙, 사르그라모스팀, 스트렙토조신, 타목시펜, 테모졸로마이드, 테니포사이드, 테스토락톤, 티오구아닌, 티오테파, 토포테칸, 토레미펜, 토시투모맙, 트라스투주맙, 트레티노인, 우라실 머스타드, 발루비신, 비노렐빈 및 졸레드로네이트를 포함한다. 다른 적합한 작용제는 화학치료제 또는 방사선치료제로서 허가되고, 당해 분야에 공지된 것을 포함하여 인간 사용을 위해 허가된 것이다. 이러한 작용제는 임의의 수의 표준 의사 및 종양학자의 참조문헌(예를 들어, 문헌[Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, McGraw-Hill, N.Y., 1995])을 통해 또는 국제 암 협회 웹사이트(fda.gov/cder/cancer/druglistfrarne.htm)를 통해 참조될 수 있고, 이들 둘 다는 시간마다 업데이트된다.
탈리도마이드, 레날리도마이드 및 포말리도마이드와 같은 면역조절 약물(IMiD)은 NK 세포 및 T 세포 둘 다를 자극한다. 본원에 제공된 것처럼, IMiD는 암 치료에 대한 iPSC 유래 치료학적 면역 세포와 사용될 수 있다.
환자에 대한 투여에 적합한 조성물은, 치료학적 조성물에 포함된 iPSC 유래 조혈 계통 세포의 단리된 집단 이외에, 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체(첨가제) 및/또는 희석제(예를 들어, 약제학적으로 허용 가능한 배지, 예를 들어 세포 배양 배지), 또는 다른 약제학적으로 허용 가능한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 부분적으로 투여되는 특정 조성물에 의해, 또한 치료학적 조성물을 투여하기 위해 사용된 특정 방법에 의해 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제가 결정된다. 따라서, 본 발명의 치료학적 조성물의 매우 다양한 적합한 제제가 있다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985](이의 개시내용은 본원에 의해 그 전체가 인용되어 포함됨) 참조).
일 실시형태에서, 치료학적 조성물은 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래 T 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 치료학적 조성물은 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래 NK 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 치료학적 조성물은 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래 CD34+ HE 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 치료학적 조성물은 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래 HSC를 포함한다. 일 실시형태에서, 치료학적 조성물은 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래 MDSC를 포함한다. 본원에 개시된 것과 같은 iPSC 유래된 조혈 계통 세포의 집단을 포함하는 치료학적 조성물은 정맥내 투여, 복강내 투여, 경장 투여 또는 기관 투여 방법에 의해 별개로 또는 원하는 치료 목표에 영향을 미치도록 다른 적합한 화합물과 조합되어 투여될 수 있다.
이 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제는 약 3 내지 약 10의 치료학적 조성물의 pH를 유지시키기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 이와 같이, 완충제는 총 조성물을 기준으로 중량 대 중량 기준으로 약 5%만큼 많을 수 있다. 전해질, 예컨대 비제한적인 예로서 염화나트륨 및 염화칼륨은 치료학적 조성물에 또한 포함될 수 있다. 일 양태에서, 치료학적 조성물의 pH는 약 4 내지 약 10의 범위이다. 대안적으로, 치료학적 조성물의 pH는 약 5 내지 약 9, 약 6 내지 약 9, 또는 약 6.5 내지 약 8의 범위이다. 다른 실시형태에서, 치료학적 조성물은 상기 pH 범위의 하나에서 pH를 갖는 완충액을 포함한다. 다른 실시형태에서, 치료학적 조성물은 pH가 약 7이다. 대안적으로, 치료학적 조성물은 pH가 약 6.8 내지 약 7.4의 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 치료학적 조성물은 pH가 약 7.4이다.
본 발명은 또한 부분적으로 본 발명의 특정 조성물 및/또는 배양물에서 약제학적으로 허용 가능한 세포 배양 배지의 용도를 제공한다. 이러한 조성물은 인간 대상체에 대한 투여에 적합하다. 일반적으로 말해서, 본 발명의 실시형태에 따라 iPSC 유래 면역 세포의 유지, 성장 및/또는 건강을 지지하는 임의의 배지는 약제학적 세포 배양 배지로서 사용하기에 적합하다. 특정 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 세포 배양 배지는 혈청 비함유 및/또는 피더 비함유 배지이다. 다양한 실시형태에서, 혈청 비함유 배지는 동물 비함유이고, 선택적으로 단백질 비함유일 수 있다. 선택적으로, 배지는 생물약제학적으로 허용 가능한 재조합 단백질을 함유할 수 있다. 동물 비함유 배지는 비동물 원천으로부터 성분이 유래된 배지를 지칭한다. 재조합 단백질은 동물 비함유 배지에서 자연적 동물 단백질을 대체하고, 합성 원천, 식물 원천 또는 미생물 원천으로부터 영양소를 얻는다. 단백질 비함유 배지는 반대로 단백질이 실질적으로 없는 것으로 정의된다. 당업자는 배지의 상기 예가 예시적이고, 본 발명에서 사용하기에 적합한 배지의 제제를 어떤 방식으로든 제한하지 않고, 당업자에게 공지되고 이용 가능한 많은 적합한 배지가 있다는 것을 이해할 것이다.
단리된 만능 줄기 세포 유래 조혈 계통 세포는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 T 세포, NK 세포, NKT 세포, proT 세포, proNK 세포, CD34+ HE 세포, HSC, B 세포, 골수성 유래 억제자 세포 (MDSC), 조절 대식세포, 조절 수지상 세포 또는 간엽성 기질 세포를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 단리된 만능 줄기 세포 유래된 조혈 계통 세포는 약 95% 내지 약 100%의 T 세포, NK 세포, proT 세포, proNK 세포, CD34+ HE 세포 또는 골수성 유래 억제자 세포(MDSC)를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 세포 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위해 정제된 T 세포 또는 NK 세포를 갖는 치료학적 조성물, 예컨대 약 95%의 T 세포, NK 세포, proT 세포, proNK 세포, CD34+ HE 세포 또는 골수성 유래 억제자 세포(MDSC)의 단리된 집단을 갖는 조성물을 제공한다.
일 실시형태에서, 조합 세포 치료는 CD3 인게이저인 치료학적 단백질 또는 펩타이드 및 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 게놈 조작된 iPSC로부터 유래된 NK 세포의 집단을 포함하고, 여기서 유래된 NK 세포는 TCRneg cs-CD3을 포함한다. 다른 실시형태에서, 조합 세포 치료는 CD3 인게이저인 치료학적 단백질 또는 펩타이드 및 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 게놈 조작된 iPSC로부터 유래된 T 세포의 집단을 포함하고, 여기서 유래된 T 세포는 TCRneg cs-CD3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조합 세포 치료는 블리나투모맙, 카투막소맙, 에르투막소맙, RO6958688, AFM11, MT110/AMG 110, MT111/AMG211/MEDI-565, AMG330, MT112/BAY2010112, MOR209/ES414, MGD006/S80880, MGD007 및/또는 FBTA05 중 하나, 및 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 게놈 조작된 iPSC로부터 유래된 NK 세포 또는 T 세포의 집단을 포함하고, 여기서 유래된 NK 세포 또는 T 세포는 TCRneg cs-CD3, 및 선택적으로 hnCD16을 포함한다. 일부 또 다른 실시형태에서, 조합 세포 치료는 블리나투모맙, 카투막소맙 및 에르투막소맙 중 하나, 및 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 게놈 조작된 iPSC로부터 유래된 NK 세포 또는 T 세포의 집단을 포함하고, 여기서 유래된 NK 세포 또는 T 세포는 TCRneg cs-CD3, hnCD16, 및 CAR 표적화 CD19, BCMA, CD38, CD20, CD22 또는 CD123을 포함한다. 일부 더 추가의 실시형태에서, 조합 세포 치료는 블리나투모맙, 카투막소맙 및 에르투막소맙 중 하나, 및 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 게놈 조작된 iPSC로부터 유래된 NK 세포 또는 T 세포의 집단을 포함하고, 여기서 유래된 NK 세포 또는 T 세포는 TCRneg cs-CD3, hnCD16, CAR 및 하나 이상의 외인성 사이토카인을 포함한다.
당업자가 이해하는 것처럼, 본원에서의 방법 및 조성물에 기초하여 iPSC로부터 유래된 자가유래 조혈 계통 세포 및 동종이계 조혈 계통 세포 둘 다는 상기에 기재된 것과 같은 세포 치료에 사용될 수 있다. 자가유래 이식을 위해, 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단은 환자와 전체 또는 부분 HLA 일치에 있다. 다른 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포는 대상체에 일치된 HLA가 아니고, 여기서 유래된 조혈 계통 세포는 HLA I 및 HLA II null을 갖는 NK 세포 또는 T 세포이다.
일부 실시형태에서, 치료학적 조성물에서의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 용량당 적어도 0.1 x 105개의 세포, 적어도 1 x 105개의 세포, 적어도 5 x 105개의 세포, 적어도 1 x 106개의 세포, 적어도 5 x 106개의 세포, 적어도 1 x 107개의 세포, 적어도 5 x 107개의 세포, 적어도 1 x 108개의 세포, 적어도 5 x 108개의 세포, 적어도 1 x 109개의 세포, 또는 적어도 5 x 109개의 세포이다. 일부 실시형태에서, 치료학적 조성물에서의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 용량당 약 0.1 x 105개의 세포 내지 약 1 x 106개의 세포; 용량당 약 0.5 x 106개의 세포 내지 약 1x 107개의 세포; 용량당 약 0.5 x 107개의 세포 내지 약 1 x 108개의 세포; 용량당 약 0.5 x 108개의 세포 내지 약 1 x 109개의 세포; 용량당 약 1 x 109개의 세포 내지 약 5 x 109개의 세포; 용량당 약 0.5 x 109개의 세포 내지 약 8 x 109개의 세포; 용량당 약 3 x 109개의 세포 내지 약 3 x 1010 개의 세포, 또는 사이의 임의의 범위이다. 일반적으로, 60 kg 환자의 경우 1 x 108 세포/용량은 1.67 x 106 세포/kg로 번역된다.
일 실시형태에서, 치료학적 조성물에서의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 부분 또는 단일 제대혈에서의 면역 세포의 수이거나, 적어도 0.1 x 105 세포/kg 체중, 적어도 0.5 x 105 세포/kg 체중, 적어도 1 x 105 세포/kg 체중, 적어도 5 x 105 세포/kg 체중, 적어도 10 x 105 세포/kg 체중, 적어도 0.75 x 106 세포/kg 체중, 적어도 1.25 x 106 세포/kg 체중, 적어도 1.5 x 106 세포/kg 체중, 적어도 1.75 x 106 세포/kg 체중, 적어도 2 x 106 세포/kg 체중, 적어도 2.5 x 106 세포/kg 체중, 적어도 3 x 106 세포/kg 체중, 적어도 4 x 106 세포/kg 체중, 적어도 5 x 106 세포/kg 체중, 적어도 10 x 106 세포/kg 체중, 적어도 15 x 106 세포/kg 체중, 적어도 20 x 106 세포/kg 체중, 적어도 25 x 106 세포/kg 체중, 적어도 30 x 106 세포/kg 체중, 1 x 108 세포/kg 체중, 5 x 108 세포/kg 체중 또는 1 x 109 세포/kg 체중이다.
일 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포의 용량은 대상체에게 전달된다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 대상체에게 제공되는 세포의 유효량은 적어도 2 x 106개의 세포/kg, 적어도 3 x 106개의 세포/kg, 적어도 4 x 106개의 세포/kg, 적어도 5 x 106개의 세포/kg, 적어도 6 x 106개의 세포/kg, 적어도 7 x 106개의 세포/kg, 적어도 8 x 106개의 세포/kg, 적어도 9 x 106개의 세포/kg, 또는 적어도 10 x 106개의 세포/kg, 또는 이것 초과의 세포/kg, 및 모든 개재하는 세포 용량이다.
다른 예시적인 실시형태에서, 대상체에게 제공되는 세포의 유효량은 약 2 x 106개의 세포/kg, 약 3 x 106개의 세포/kg, 약 4 x 106개의 세포/kg, 약 5 x 106개의 세포/kg, 약 6 x 106개의 세포/kg, 약 7 x 106개의 세포/kg, 약 8 x 106개의 세포/kg, 약 9 x 106개의 세포/kg, 또는 약 10 x 106개의 세포/kg, 또는 이것 초과의 세포/kg 및 모든 개재하는 세포 용량이다.
다른 예시적인 실시형태에서, 대상체에게 제공되는 세포의 유효량은 약 2 x 106개의 세포/kg 내지 약 10 x 106개의 세포/kg, 약 3 x 106개의 세포/kg 내지 약 10 x 106개의 세포/kg, 약 4 x 106개의 세포/kg 내지 약 10 x 106개의 세포/kg, 약 5 x 106개의 세포/kg 내지 약 10 x 106개의 세포/kg, 2 x 106개의 세포/kg 내지 약 6 x 106개의 세포/kg, 2 x 106개의 세포/kg 내지 약 7 x 106개의 세포/kg, 2 x 106개의 세포/kg 내지 약 8 x 106개의 세포/kg, 3 x 106개의 세포/kg 내지 약 6 x 106개의 세포/kg, 3 x 106개의 세포/kg 내지 약 7 x 106개의 세포/kg, 3 x 106개의 세포/kg 내지 약 8 x 106개의 세포/kg, 4 x 106 개의 세포/kg 내지 약 6 x 106개의 세포/kg, 4 x 106개의 세포/kg 내지 약 7 x 106개의 세포/kg, 4 x 106개의 세포/kg 내지 약 8 x 106개의 세포/kg, 5 x 106개의 세포/kg 내지 약 6 x 106개의 세포/kg, 5 x 106개의 세포/kg 내지 약 7 x 106개의 세포/kg, 5 x 106개의 세포/kg 내지 약 8 x 106개의 세포/kg, 또는 6 x 106개의 세포/kg 내지 약 8 x 106개의 세포/kg, 및 모든 개재하는 세포 용량이다.
일부 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포의 치료학적 용도는 단일 용량 치료이다. 일부 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포의 치료학적 용도는 다중 용량 치료이다. 일부 실시형태에서, 다중 용량 치료는 매일마다, 3일마다, 7일마다, 10일마다, 15일마다, 20일마다, 25일마다, 30일마다, 35일마다, 40일마다, 45일마다 또는 50일마다, 또는 사이의 임의의 숫자의 일에 하나의 용량이다. 일부 실시형태에서, 다중 용량 치료는 3, 또는 4, 또는 5의 주마다 1회 용량을 포함한다. 3, 또는 4, 또는 5를 포함하는 다중 용량 치료의 일부 실시형태에서, 1주 1회 용량은 추가의 단일 용량 또는 다중 용량이 필요한지를 결정하기 위한 관찰 기간을 추가로 포함한다.
본 발명의 유래된 조혈 계통 세포의 집단을 포함하는 조성물은 멸균일 수 있고, 인간 환자에 대한 투여에 적합하고 준비될 수 있다(즉, 임의의 추가의 가공 없이 투여될 수 있음). 투여에 준비된 세포 기반 조성물은 상기 조성물이 대상체에 대한 이식 또는 투여 전에 임의의 추가의 가공 또는 조작을 필요로 하지 않는다는 것을 의미한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 작용제에 의한 투여 전에 증식되고/되거나 조절된 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단을 제공한다. 재조합 TCR 또는 CAR을 발현하도록 유전 조작된 유래된 조혈 계통 세포에 대해, 예를 들어 미국 특허 제6,352,694호에 기재된 것과 같은 방법을 이용하여 세포를 활성화하고 증식시킬 수 있다.
소정의 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포에 대한 일차 자극 신호 및 공동자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 이러한 신호를 제공하는 작용제는 용액에 있거나 표면에 커플링될 수 있다. 작용제는 표면에 커플링될 때 동일한 표면에(즉, "시스(cis)" 형성으로) 또는 별개의 표면에(즉, "트랜스(trans)" 형성으로) 커플링될 수 있다. 대안적으로, 하나의 작용제는 용액 중의 표면 및 다른 작용제에 커플링될 수 있다. 일 실시형태에서, 공동자극 신호를 제공하는 작용제는 세포 표면에 결합될 수 있고, 일차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 용액 중에 있거나 표면에 커플링된다. 소정의 실시형태에서, 작용제 둘 다는 용액에 있을 수 있다. 다른 실시형태에서, 작용제는 가용성 형태로 있을 수 있고, 이후 Fc 수용체를 발현하는 세포 또는 항체 또는 다른 결합제와 같은 표면에 가교결합할 수 있고, 이것은 본 발명의 실시형태에서 T 림프구를 활성화하고 증식하는 데 사용하기 위해 고려되는 인공 항원 제시 세포(aAPC)에 대해 예컨대 미국 특허출원공개 US 20040101519호 및 미국 특허출원공개 US 20060034810호에 개시된 작용제에 결합할 것이다.
치료되는 대상체의 컨디션에 따라 투여량, 빈도 및 프로토콜의 약간의 변동이 반드시 발생할 것이다. 투여를 책임지는 사람은 임의의 사건에서 개별 대상체에 대한 적절한 용량, 빈도 및 프로토콜을 결정할 것이다.
실시예
하기 실시예는 제한의 방식이 아니라 예시의 방식으로 제공된다.
실시예 1 - 재료 및 방법
상이한 안전 항구 유전자좌 통합 전략과 조합되어 다양한 프로모터의 제어 하에 자살 시스템을 효과적으로 선택하고 시험하기 위해, 단일 또는 다수의 유전 조절에 의해 클론 hiPSC의 분화를 허용하도록 단일 세포 계대배양 및 고속, 96웰 플레이트 기반 유세포분석법 분류가 가능하게 하는 출원인의 독점적 hiPSC 플랫폼이 사용되었다.
소분자 배양에서의 hiPSC 유지 : 배양의 포화상태가 75% 내지 90%에 도달하면 hiPSC를 단일 세포로서 일상적으로 계대배양하였다. 단일 세포 분리를 위해, hiPSC를 PBS(Mediatech)로 1회 세척하고, 단일 세포 분리를 보장하도록 37℃에서 3분 내지 5분 동안 Accutase(Millipore)로 처리한 후 피펫팅하였다. 이후, 단일 세포 현탁액을 종래의 배지와 동일한 부피에서 혼합하고, 225 × g에서 4분 동안 원심분리하고, FMM에 재현탁하고, 마트리겔 코팅된 표면에 플레이팅하였다. 계대배양은 통상적으로 1:6 내지 1:8이고, 37℃에서 2시간 내지 4시간 동안 마트리겔로 이전에 코팅된 조직 배양 플레이트로 옮기고, 2일 내지 3일마다 FMM을 공급하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 설정된 습윤 항온처리기에서 세포 배양을 유지시켰다.
관심 양상의 표적화된 편집을 위한 ZFN, CRISPR에 의한 인간 iPSC 조작 : 예로서 ROSA26 표적화된 삽입을 사용하여, ZFN 매개된 게놈 편집을 위해, 200만개의 iPSC를 AAVS1 표적화된 삽입을 위해 2.5 ug의 ZFN-L(FTV893), 2.5 ug의 ZFN-R(FTV894)과 5 ug의 공여자 작제물의 혼합물에 의해 형질주입하였다. CRISPR 매개된 게놈 편집을 위해, 200만개의 iPSC를 ROSA26 표적화된 삽입을 위해 5 ug의 ROSA26-gRNA/Cas9(FTV922)와 5 ug의 공여자 작제물의 혼합물로 형질주입하였다. 매개변수 1500V, 10ms, 3 펄스를 사용하여 Neon 형질주입 시스템(Life Technologies)을 사용하여 형질주입을 수행하였다. 형질주입 후 2일 또는 3일에, 플라스미드가 인공 프로모터-드라이버 GFP 및/또는 RFP 발현 카세트를 함유하면 유세포분석법을 이용하여 형질주입 효능을 측정하였다. 형질주입 후 4일에, 표적화된 세포를 선택하도록 처음 7일 동안 0.1 ug/ml 및 7일 후 0.2 ug/ml의 농도로 푸로마이신을 배지에 첨가하였다. 푸로마이신 선택 동안, 10일에 세포를 새로운 마트리겔 코팅된 겔에 계대배양하였다. 푸로마이신 선택의 16일 또는 그 후에, GFP+ iPS 세포 백분율에 대해 살아 있는 유세포분석법에 의해 세포를 분석하였다.
게놈 편집된 iPSC의 벌크 분류 및 클론 분류 : ZFN 또는 CRISPR-Cas9를 사용하여 게놈 표적화된 편집을 갖는 iPSC는 푸로마이신 선택의 20일 후 GFP+SSEA4+TRA181+ iPSC의 벌크 분류되고 클론 분류되었다. 단일 세포 분리된 표적화된 iPSC 풀을 Hank 균형 염 용액(MediaTech), 4% 태아 소 혈청(Invitrogen), 1x 페니실린/스트렙토마이신(Mediatech) 및 10 mM Hepes(Mediatech)를 함유하는 차가운 염색 완충액에 재현탁하고; 최적 수행에 새롭게 만들었다. SSEA4-PE, TRA181-Alexa Fluor-647(BD Biosciences)을 포함하는 접합된 일차 항체를 세포 용액에 첨가하고, 15분 동안 얼음에서 항온처리하였다. 모든 항체는 100만개의 세포당 100 μL의 염색 완충액 중의 7 μL로 사용되었다. 그 용액을 염색 완충액에서 1회 세척하고, 225 g에서 4분 동안 스피닝하고, 10 μM 티아조비빈을 함유하는 염색 완충액에 재현탁하고, 유세포분석법 분류를 위해 얼음에서 유지시켰다. FACS Aria II(BD Biosciences)에서 유세포분석법 분류를 수행하였다. 벌크 분류를 위해, GFP+SSEA4+TRA181+ 세포를 게이팅하고, 7 mL의 FMM이 충전된 15 ml 정규 관에 분류하였다. 분류된 세포를 클론 분류를 위해 웰당 3 사건의 농도로 100 μM 노즐을 사용하여 96웰 플레이트에 직접 분사하였다. 각각의 웰을 5 μg/mL의 피브로넥틴 및 1x 페니실린/스트렙토마이신(Mediatech)으로 보충되고 5x 마트리겔로 이전에 밤새 코팅된 200 μL의 FMM으로 예비충전하였다. 5x 마트리겔 프리코팅은 1 분취액의 마트리겔을 5 mL의 DMEM/F12에 첨가하는 것을 포함하고, 이후 4℃에서 밤새 항온처리하여 적절한 재현탁이 되게 하고, 마지막으로 웰당 50 μL로 96웰 플레이트에 첨가한 후 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 배지를 각각의 웰에 첨가하기 직전에 5x 마트리겔을 흡인한다. 분류의 완료 시, 96웰 플레이트를 항온처리 전에 225 g에서 1분 내지 2분 동안 원심분리하였다. 플레이트를 7일 동안 방해되지 않게 두었다. 7번째일에, 각각의 웰로부터 150 μL의 배지를 제거하고, 100 μL의 FMM으로 대체하였다. 분류 후 10일에 추가의 100 μL의 FMM을 웰에 재공급하였다. 2일만큼 일찍 콜로니 형성이 검출되었고, 분류 후 7일 내지 10일에 대부분의 콜로니가 증식하였다. 제1 계대배양에서, 웰을 PBS로 세척하고, 37℃에서 대략 10분 동안 30 μL의 Accutase로 분리하였다. 연장된 Accutase 처리의 필요성은 연장된 기간 동안 배양에서 한가로이 있는 콜로니의 빽빽함을 반영한다. 세포가 분리하는 것으로 보인 후, 200 μL의 FMM을 각각의 웰에 첨가하고, 수회 피펫팅하여 콜로니를 파괴한다. 분리된 콜로니를 5x 마트리겔로 이전에 코팅된 96웰 플레이트의 다른 웰로 옮기고, 이후 항온처리 전에 225 g에서 2분 동안 원심분리하였다. 증식 전에 초기 콜로니를 분산시키도록 이 1:1 계대배양을 수행한다. 3분 내지 5분 동안 Accutase 처리 및 75% 내지 90% 포화상태 시 FMM 중의 1x 마트리겔로 이전에 코팅된 더 큰 웰로의 1:4-1:8의 증식에 의해 후속하는 계대배양을 일상적으로 수행하였다. GFP 형광 수준 및 TRA1-81 발현 수준에 대해 각각의 클론성 세포주를 분석하였다. 거의 100% GFP+ 및 TRA1-81+를 갖는 클론 라인은 추가의 PCR 스크리닝 및 분석을 위해 선택되었고, 마스터 세포 은행으로서 저온보존되었다. Guava EasyCyte 8 HT(Millipore)에서 유세포분석법 분석을 수행하고, Flowjo (FlowJo, LLC)를 사용하여 분석하였다.
실시예 2 - 향상된 기능을 위한 다수의 양상으로 조작된 마스터 클론 iPSC 라인의 생성을 위한 iPSC 플랫폼의 적용
본 출원에 제공된 방법을 이용하여 재프로그래밍 후 2주 내지 3주에 αβT 세포의 유전 조작을 개시하였다. 이후, 이것에 이어서 96웰 플레이트로 단일 세포 분류하고 특이적 조작을 위해 클론을 스크리닝하였다. 이 특정 실시예에서, 조작은 예시된 CD3ζ1XX CD19 CAR을 사용하여 TRAC 유전자좌 표적화된 전이유전자 통합에 대한 것이었다. 상동성 재조합은 TRAC 유전자좌로의 CD3ζ 1XX CD19 CAR의 특이적 통합을 야기한다. 도 3의 A 파트는 상이한 단계에서 배양의 상 대비 이미지를 나타낸다. 도 3의 B 파트는 재프로그래밍 전 αβT 세포(왼쪽 패널), 분류 전 재프로그래밍되고 조작된 세포 풀 및 클론 TiPSC 클론(오른쪽 패널)의 유세포분석법 프로파일을 보여준다.
PCR 검정, SNP 페이징 검정을 포함하는 방법에 의해, 그리고 통합된 전이유전자의 카피수를 분석하기 위해 추가로 디지털 드롭플렛 PCR에 의해 TRAC 유전자좌로의 CAR과 같은 전이유전자의 특이적 이중대립유전자 통합이 추가로 확인되었다. 이중대립유전자 TRAC 표적화된 전이유전자 통합을 갖는 선택된 클론 TiPSC가 임의의 오프 타깃 편집을 갖지 않고 게놈 통합성을 유지시킨다는 것을 보장하기 위해 SITE-Seq를 이용하여 TRAC 표적화된 CAR TiPSC 클론에서의 오프 타깃 편집을 또한 분석하였다. 확인 및 검증 후, 적은 선택된 클론 TiPSC 라인을 각각 증식시키고, 개별 마스터 세포 은행으로서 저온보존하였다.
다음에, 도 1a 내지 도 1c에서 cs-CD3 디자인이 가능하게 하기 위한 작제물이 제조되고 유사한 방법 및 절차를 사용하여 T 세포로 도입되었다.
실시예 3 -- iPSC 및 iPSC 유래 효과기 세포의 단계별 게놈 조작
고친화도 비절단성 CD16 발현, B2M 유전자의 넉아웃에 의한 HLA-I의 소실, CIITA의 넉아웃에 의한 HLA-II의 소실, 비전통적 HLA 분자 HLA-G의 과발현, 및 연결된 IL15/IL15 수용체 알파 작제물의 발현을 얻기 위해 TCR 음성 이외에 유도 만능 줄기 세포를 또한 연속 조작하였다. 각각의 조작 단계 후, 다음의 조작 단계 전에 원하는 표현형에 대해 iPSC를 분류하였다. 이후, 조작된 iPSC를 시험관내 또는 분화 세포 생성을 위해 투여할 수 있다. 도 4는 iPSC 유래 NK 세포에서 hnCD16 발현, B2M 넉아웃, HLA-G 발현 및 IL15/IL15Rα 발현을 보여주었다. 이 데이터는 원하는 세포 운명으로 세포의 시험관내 유도된 발생을 동요시키지 않으면서 이 유전 조작된 양상이 조혈 분화 동안 유지된다는 것을 입증한다.
CD19-CAR이 TRAC 유전자좌로 표적화되어 TCR 넉아웃(TCRα KO)을 생성시키는 T 세포 유래 iPSC는, 도 7에 도시된 것처럼, 비변이체 NKT(iTCRα) 또는 비변이체 NKT TCRα 및 비변이체 NKT TCRβ(iTCRβ) 둘 다를 항시적으로 발현하도록 렌티바이러스로 형질도입되어서, 한정된 TCR을 갖는 재조합 TCR 복합체를 생성시킨다(I. 1 부문에서 디자인 2와 관련하여 텍스트를 동반하여 도 1a 및 도 1c 참조, 및 추가의 참조를 위해 서열 번호 44 및 45 참조). 형질도입된 작제물은 형질도입 효능 및 세포 분류를 통한 농후화를 평가할 목적을 위해 예시적인 리포터로서 Thy1.1을 포함하였다. 이후, 생성된 iPSC 라인은 야생형(WT) 및 TRAC 표적화된 CD19-CAR 제어 라인과 함께 iPSC 유래 CD34+ 조혈 전구 세포(iCD34)로 분화하고, 후속하여 분화 T 세포 (iT)로 분화하였다.
이후, 대조군 및 형질도입된 라인으로부터의 iPSC를 (i) 만능성 마커 SSEA4 및 TRA181, (ii) pan-TCRαβ 프로브를 사용하여 발현된 TCRα 및/또는 TCRβ를 갖는 세포 표면에 수송된 T 세포 동시수용체 CD3(내인성 TCR 및 외인성 TCR을 검출), 및 (iii) 작제물 리포터 Thy1.1에 대해 세포외 유세포분석법에 의해 평가하였다. 도 8a에 도시된 것처럼, iTCRα 또는 iTCRαβ에 의한 형질도입은 만능성 마커에 의해 보이는 것처럼 iPSC 동일성에 영향을 미치지 않았다. 형질도입된 iPSC 라인 둘 다에서 Thy1.1 발현이 WT iPSC에서의 관찰과 동일하게 관찰되지만, CD3은 형질도입된 iPSC의 세포 표면에서 관찰되지 않았고, 이는 TCR이 iPSC 단계에서 발현하지 않는다는 사실과 일치한다.
이후, 대조군 및 형질도입된 iPSC는 본원에 기재된 조성물 및 방법을 이용하여 iCD34 조혈 전구 세포로 분화하고, 각각 pan-TCRαβ 프로브를 사용하여 CD3, Thy1.1 및 TCRαβ에 대해 유세포분석법에 의해 평가되었다. 도 8b에 도시된 것처럼, iTCRα 또는 iTCRαβ에 의해 형질도입된 라인은 아직 검출 가능한 세포 표면 CD3 없이 Thy1.1 발현을 유지시켰다. CD3 및 TCRab는 WT iPSC 유래 iCD34에서 관찰되지 않아서, iTCRα 또는 iTCRαβ 형질도입이 iCD34 세포 단계에서 세포 표면 상에 CD3 발현을 발현하지 않거나 이것으로 이어지지 않는다는 것을 제시한다.
iCD34는 본원에 기재된 조성물 및 방법을 이용하여 분화 T 세포(iT)로 더 분화하고, CD3 및 TCRαβ 발현(대조군 세포에 대해 내인성 TCR, 형질도입된 세포에 대해 외인성 TCR)을 위한 분화 과정 동안 다양한 시점(세포 발생 단계)에서 유세포분석법에 의해 평가되었다. 도 9a 내지 도 9b에 도시된 것처럼, WT, iTCRα 및 iTCRαβ 라인에서 iT 세포 분화의 과정에 걸쳐 CD3 및 TCRαβ 발현이 상향조절되었다. CD3 및 TCRαβ 발현은 예상된 것처럼 TCR KO 라인에서 부재하였다. 추가적으로, CD3은 형광성 강도(MFI)가 WT 및 iTCRα 및 iTCRαβ 형질도입된 라인 사이에 유사하다는 것을 의미한다. 이 데이터는 단독으로 또는 iTCRβ 발현과 함께 iTCRα가 iT 세포 분화의 과정 동안, 및 iCD34 세포 단계를 넘어 세포 표면 상에 CD3 발현을 유도하거나 수송하기에 충분하다는 것을 제시한다. 도 9c는 iCD34 단계 후 25일에 표시된 세포주에서의 CD3 및 TCRαβ 발현을 추가로 입증하였다.
텔로미어 단축은 세포 노화에 따라 생기고, 줄기 세포 기능이상 및 세포 노쇠와 연관된다. 성숙 iNK 세포가 성체 말초혈 NK 세포와 비교하여 더 긴 텔로미어를 유지한다고 여기서 밝혀졌다. G0/1 세포의 DNA 지수에 대한 보정 없이 대조군(100%)으로서 1301 T 세포 백혈병 라인을 사용하여 iPSC, 성체 말초혈 NK 세포 및 iPSC 유래 NK 세포에 대해 유세포분석법에 의해 텔로미어 길이를 결정하였다. 도 5에 도시된 것처럼, iPSC 유래 NK 세포는 성체 말초혈 NK 세포와 비교할 때 상당히 더 긴 텔로미어 길이를 유지하여서(p=.105, ANOVA), iPSC 유래 NK 세포에서 더 높은 증식, 생존기간 및 지속성 가능성을 나타낸다. 말초혈로부터 얻은 일차 T 세포와 비교하여 iPSC 유래 T 세포에서 유사한 관찰이 이루어졌다.
실시예 4 - 분화 T 세포의 CD3 자극 및 세포 반응
iT를 발현하는 iTCR 유도된 CD3 세포 표면이 CD3/CD2/CD28-사합체 자극에 반응하는지를 평가하기 위해, 상기에 기재된 것과 같은 각각의 iPSC 세포주로부터 유래된 iT 세포를 저온보존하고, 해동하고, 이후 사이토카인의 존재 하에 CD3/CD2/CD28 사합체와 함께 또는 이것 없이 배양하고, 활성화의 마커에 대해 평가하였다. 사합체 자극 후 72시간에, WT, iTCRα 및 iTCRαβ 형질도입된 iPSC 라인으로부터 분화된 분화 T 세포에서 광시야 현미경관찰에 의해 iT 세포 응집이 용이하게 명확하지만, TCR KO iT 세포에서는 대부분 부재한다(도 10). T 세포 응집은 활성화의 특징이고, 데이터는 단독으로 또는 iTCRβ와 함께 iTCRα로 형질도입된 iPSC로부터 분화된 분화 T 세포가 iTCR 유도된 세포 표면 CD3 발현을 통한 자극 및 활성화를 할 수 있다는 것을 제시한다.
T 세포 활성화 마커 CD25에 대해 72시간 후 유세포분석법에 의해 사합체 자극된 iT 세포를 평가하였다. WT, iTCRα 및 iTCRαβ 형질도입된 라인은 비처리된 대조군 배양물과 비교하여 사합체 상향조절된 CD25 발현으로 자극되었다. 이 반응은 TCR KO iT 세포에서 부재한다. CD25 유세포분석법 데이터는 iTCR 형질도입된 라인이 iTCR 유도된 세포 표면 CD3 발현을 통한 자극 및 활성화를 할 수 있다는 것을 입증한다.
활성화 시, T 세포가 발현하는 CD45RA로부터 CD45RO로 스위치할 것이라는 것이 알려졌다. 추가의 기능 검증을 위해, 이 특징 표현형 변화를 위해 72시간 후 유세포분석법에 의해 사합체 자극된 iT 세포를 평가하였다. 도 11에 도시된 것처럼, 사합체에 의한 자극 후, WT, iTCRα 및 iTCRαβ 형질도입된 iPSC 라인으로부터 유래된 iT 세포는 각각의 비치료된 iT 세포 대조군 배양과 비교하여 CD45RO의 상향조절된 발현 및 CD45RA의 하향조절된 발현을 나타냈다. 이 반응은 TCR KO iPSC로부터 유래된 iT에서 부재한다. 이 데이터는 단독 또는 iTCRβ와 함께 iTCRα로 형질도입된 iPSC로부터 유래된 iT 세포가 비변이체 NKT 세포로부터 기원한 한정된 형질전환 TCRβ(tgTCRα)를 갖거나 갖지 않으면서, 한정된 형질전환 TCRα(tgTCRα)를 포함하는, 본원에 예시된 것처럼, 하나에 의해 예시된 한정된 재조합 TCR(d-rTCR)에 의해 세포 표면으로 수송된 발현된 CD3을 통한 자극 및 활성화를 할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 5 - 재구성된 세포 표면 CD3을 통한 BiTE 매개된 세포 독성
iTCRα 및 iTCRαβ 형질도입된 iPSC 라인으로부터 유래된 iT 효과기 세포를 세포 증식 염료 eFluorTM 450으로 라벨링된 Nalm6 CD19WT 세포 및 세포 증식 염료 eFluorTM 670으로 라벨링된 Nalm6-CD19KO 세포로 이루어진 50:50의 표적 세포 혼합물과 동시배양하여 효과기 세포 독성을 평가하였다. 혼합된 표적 세포를 96웰 U 바닥 플레이트에서 플레이팅하고, 다양한 농도의 효과기 세포를 약 4시간 동안 CD19xCD3 BiTE(Invivogen, 캘리포니아주 샌 디에고) 또는 CD20xCD3 BiTE(G&P Biosciences, 캘리포니아주 산타 클라라)와 함께 또는 이것 없이 0:1, 1:1, 3.16:1 및 10:1의 원하는 효과기 대 표적(E:T) 범위에 대해 각각의 웰에 첨가하고, 후속하여 유세포분석법에 의해 분석하였다. eFluorTM 450+ Nalm6 CD19WT 세포들 중에서 카스파제 3/7+ 세포의 백분율, 또는 eFluorTM 670+ Nalm6-CD19KO 세포들 중에서 카스파제 3/7+ 세포의 백분율에 기초하여 아폽토시스 표적 세포의 백분율을 결정하였다.
도 12a에 도시된 것처럼, iTCRα 및 iTCRαβ 발현 iT 세포는 BiTE의 존재 하에 향상된 특정한 세포독성을 나타냈다. BiTE 자체(CD19xCD3 또는 CD20xCD3 중 어느 하나)가 향상된 세포 아폽토시스를 촉발하지 않는 반면, 세포 표면 CD3을 발현하는 효과기 iT 세포의 첨가는 종양 세포 아폽토시스를 증가시키는 것으로 관찰되었다. 이와 같이, iPSC 유래 효과기 세포의 세포독성은 재구성된 CD3에 대한 BiTE 결합에 의해 추가로 향상된다. 개선된 효과기 세포 기능성은 라인 둘 다에서 단독의 효과기 iT 세포의 것과 비교하여 BiTE의 존재 하에 효과기 iT 세포의 감소된 EC50을 통해 추가로 입증되었다(도 12b).
실시예 6 - 개선된 지속성을 갖는 분화 NK 세포의 기능 프로파일링
게다가, IL15Rα의 세포내 도메인이 결여된 외인성 절두된 IL15/IL15Rα 융합 단백질의 발현이 가용성, 외인성 IL2의 첨가에 독립적으로 시험관내 iPSC 유래 NK 세포의 생존성을 지지하는 것으로 나타났다. 세포내 도메인이 없는 IL15Rα는 신호전달 도메인을 갖지 않는 절두된 IL15/IL15Ra 융합 작제물(또는 본 출원에서 "IL15Δ"라고 칭함)을 생성하기 위해 링커를 통해 C 말단에서 IL15에 융합되었다. 본원에 제공된 것과 같은 예시적인 IL15Δ는 도 2의 디자인 3 또는 디자인 4와 같은 구조를 갖는 것을 포함한다. 도 5에 도시된 것처럼, iNK 세포는 GFP(정사각형; 음성 대조군), 완전 길이 IL15/IL15Ra 융합 작제물(채워진 원; 양성 대조군; 도 2의 디자인 2), 또는 절두된 IL15/IL15Ra 융합 작제물(빈 원; 도 2의 디자인 3) 중 어느 하나를 발현하는 렌티바이러스 과발현 벡터로 형질도입되었다. IL15 작제물도 GFP도 외인성 IL2의 존재 하에 농후화를 보여주지 않아서(도 6, 왼쪽), 형질도입된 세포가 비형질도입된 세포와 필적한 속도로 생존한다는 것을 나타낸다. 외인성 IL2의 부재 하에, IL15/IL15Ra 융합 작제물 중 어느 하나에 의해 형질도입된 세포는 시간에 걸쳐 농후화되지만, GFP 형질도입된 세포는 그렇지 않아서, IL2 없이는 IL15/IL15Ra 작제물 중 어느 하나로 형질도입된 세포가 동일한 배양물 중의 비형질도입된 세포와 비교하여 생존기간 이점을 갖는다는 것을 나타낸다(도 6, 오른쪽). 더욱이, IL15Rα의 세포내 도메인은 수용체가 IL15 반응 세포에서 발현하기에 그리고 세포가 반응하여 증식하고 작용하기에 중요한 것으로 간주되므로, 세포내 도메인 절두된 IL15/IL15Ra 융합 작제물이 형질도입된 iNK 세포에서 안정하게 발현될 뿐만 아니라, 도 6의 오른쪽 선도에 도시된 것과 같이 완전 길이 IL15/IL15Ra 융합 작제물보다 더 높은 증식 속도로 iNK 세포를 지지한다는 것은 놀랍다. 이와 같이, 본원에 제공된 것과 같은 IL15Δ는 막 결합된 형태로 IL15를 발현하고 유지할 수 있고, 세포에서 IL15의 다른 쪽 제시를 제공하도록 전체 길이 IL15/IL15Ra 융합 단백질을 대체할 수 있다. 기초하는 기전이 완전히 이해되지 않으면서, IL15R의 세포내 도메인의 제거는 가능하게는 이의 세포내 도메인을 통해 정상 IL15R에 의해 매개된 같은 쪽 제시 및/또는 임의의 다른 가능한 신호 전달 경로를 전부 제거함으로써 반응 세포에 추가의 활력, 적합함, 또는 이의 생존기간, 증식 및 지속성에서의 소정의 이점이 주어지는 것으로 보인다.
당업자는 본원에 기재된 방법, 조성물 및 생성물이 예시적인 실시형태를 나타내고, 본 발명의 범위에 제한으로 의도되지 않음을 용이하게 이해할 것이다. 본 발명의 범위 및 정신으로부터 벗어나지 않으면서 본원에 개시된 본 개시내용에 변하는 치환 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 용이하게 명확할 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 공보는 본 개시내용이 속하는 분야의 당업자의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 공보는 각각의 개별 공보가 인용되어 포함된 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 인용되어 포함된다.
본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에 본원에 예시적으로 기재된 본 개시내용이 적합하게 실행될 수 있다. 이와 같이, 예를 들어 각각의 경우에 본원에서 임의의 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진"은 다른 2가지 용어 중 어느 하나로 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아니라 설명의 면으로 사용되고, 도시되고 기재된 특징의 임의의 균등물 또는 이의 부분을 배제하는 이러한 용어 및 표현의 사용에서 의도되지 않지만, 청구된 본 개시내용의 범위 내에 다양한 변형이 가능하다고 인식된다. 이와 같이, 본 개시내용이 바람직한 실시형태에 의해 구체적으로 개시되어 있고, 본원에 개시된 선택적인 특징, 변형 및 관념의 변경이 당업자에 의해 유보될 수 있지만, 이러한 변형 및 변경이 청구항에 의해 한정된 것처럼 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다고 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Fate Therapeutics, Inc. <120> CD3 RECONSTITUTION IN ENGINEERED iPSC AND IMMUNE EFFECTOR CELLS <130> 056932-518001WO <150> US 62/832,622 <151> 2019-04-11 <160> 45 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a construct expressing constant region of TCR-beta (TRBC) <400> 1 Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser 1 5 10 15 Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn 20 25 30 Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val 35 40 45 Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp 50 55 60 Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile 65 70 75 80 Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val 85 90 95 Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln 100 105 110 Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly 115 120 125 Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 130 135 140 <210> 2 <211> 176 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a construct expressing constant region of TCR-beta(TRBC1) <400> 2 Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser 1 5 10 15 Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala 20 25 30 Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly 35 40 45 Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu 50 55 60 Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg 65 70 75 80 Asn His Phe Arg Cys Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Gln 85 90 95 Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg 100 105 110 Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala 115 120 125 Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala 130 135 140 Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val 145 150 155 160 Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe 165 170 175 <210> 3 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TRBC2 <400> 3 Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Lys Val Ala Val Phe Glu Pro Ser 1 5 10 15 Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala 20 25 30 Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly 35 40 45 Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu 50 55 60 Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg 65 70 75 80 Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln 85 90 95 Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg 100 105 110 Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala 115 120 125 Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala 130 135 140 Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val 145 150 155 160 Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser 165 170 175 Arg Gly <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary signal peptide for the construct encoding TCR-beta constant region (tgTRBC) - CD8asp <400> 4 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala <210> 5 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary signal peptide for the construct encoding TCR-beta constant region (tgTRBC) - IgKsp <400> 5 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg 20 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary linker peptide for the construct encoding TCR-beta constant region (tgTRBC) - FLAG <400> 6 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 7 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 340 a.a. 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85 90 95 Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His Glu Gln Glu 100 105 110 Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met Ile Gln Ser 115 120 125 Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr Leu Tyr Ser 130 135 140 Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg Asn His Ser 145 150 155 160 Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys Ser Gln Pro 165 170 175 Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu Glu Asn Phe 180 185 190 Asp Val Tyr Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala 195 200 205 Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 210 215 220 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu 225 230 235 240 Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn 245 250 255 Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met 260 265 270 Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly 275 280 285 Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 290 295 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Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp 180 185 190 Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser 195 200 205 Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu 210 215 220 Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys 225 230 235 240 Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr 245 250 255 Val Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser 260 265 270 Gly Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala 275 280 285 Thr Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser 290 295 300 Pro Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly 305 310 315 320 Thr Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala 325 330 335 Ser His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr 340 345 350 Val Ala Ile Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val 355 360 365 Ser Leu Leu Ala Cys Tyr Leu Lys Ser Arg Gln 370 375 <210> 18 <211> 1140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an exemplary nucleic acid sequence encoding construct mimicking trans-presentation of IL15 (design 3) <400> 18 atggactgga cctggattct gttcctggtc gcggctgcaa cgcgagtcca tagcggtatc 60 catgttttta ttcttgggtg tttttctgct gggctgccta agaccgaggc caactgggta 120 aatgtcatca gtgacctcaa gaaaatagaa gaccttatac aaagcatgca cattgatgct 180 actctctaca ctgagtcaga tgtacatccc tcatgcaaag tgacggccat gaaatgtttc 240 ctcctcgaac ttcaagtcat atctctggaa agtggcgacg cgtccatcca cgacacggtc 300 gaaaacctga taatactcgc taataatagt ctctcttcaa atggtaacgt aaccgagtca 360 ggttgcaaag agtgcgaaga gttggaagaa aaaaacataa aggagttcct gcaaagtttc 420 gtgcacattg tgcagatgtt cattaatacc tctagcggcg gaggatcagg tggcggtgga 480 agcggaggtg gaggctccgg tggaggaggt agtggcggag gttctcttca aataacttgt 540 cctccaccga tgtccgtaga acatgcggat atttgggtaa aatcctatag cttgtacagc 600 cgagagcggt atatctgcaa cagcggcttc aagcggaagg ccggcacaag cagcctgacc 660 gagtgcgtgc tgaacaaggc caccaacgtg gcccactgga ccacccctag cctgaagtgc 720 atcagagatc ccgccctggt gcatcagcgg cctgcccctc caagcacagt gacaacagct 780 ggcgtgaccc cccagcctga gagcctgagc ccttctggaa aagagcctgc cgccagcagc 840 cccagcagca acaatactgc cgccaccaca gccgccatcg tgcctggatc tcagctgatg 900 cccagcaaga gccctagcac cggcaccacc gagatcagca gccacgagtc tagccacggc 960 accccatctc agaccaccgc caagaactgg gagctgacag ccagcgcctc tcaccagcct 1020 ccaggcgtgt accctcaggg ccacagcgat accacagtgg ccatcagcac ctccaccgtg 1080 ctgctgtgtg gactgagcgc cgtgtcactg ctggcctgct acctgaagtc cagacagtga 1140 <210> 19 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fused IL15/mb-Sushi construct (design 4) <400> 19 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu 20 25 30 Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys 35 40 45 Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr 50 55 60 Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe 65 70 75 80 Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile 85 90 95 His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser 100 105 110 Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu 115 120 125 Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val 130 135 140 Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu 165 170 175 Gln Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp 180 185 190 Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser 195 200 205 Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu 210 215 220 Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys 225 230 235 240 Ile Arg <210> 20 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an exemplary nucleic acid sequence encoding fused IL15/mb-Sushi construct (design 4) <400> 20 atggactgga cctggattct gttcctggtc gcggctgcaa cgcgagtcca tagcggtatc 60 catgttttta ttcttgggtg tttttctgct gggctgccta agaccgaggc caactgggta 120 aatgtcatca gtgacctcaa gaaaatagaa gaccttatac aaagcatgca cattgatgct 180 actctctaca ctgagtcaga tgtacatccc tcatgcaaag tgacggccat gaaatgtttc 240 ctcctcgaac ttcaagtcat atctctggaa agtggcgacg cgtccatcca cgacacggtc 300 gaaaacctga taatactcgc taataatagt ctctcttcaa atggtaacgt aaccgagtca 360 ggttgcaaag agtgcgaaga gttggaagaa aaaaacataa aggagttcct gcaaagtttc 420 gtgcacattg tgcagatgtt cattaatacc tctagcggcg gaggatcagg tggcggtgga 480 agcggaggtg gaggctccgg tggaggaggt agtggcggag gttctcttca aataacttgt 540 cctccaccga tgtccgtaga acatgcggat atttgggtaa aatcctatag cttgtacagc 600 cgagagcggt atatctgcaa cagcggcttc aagcggaagg ccggcacaag cagcctgacc 660 gagtgcgtgc tgaacaaggc caccaacgtg gcccactgga ccacccctag cctgaagtgc 720 atcaga 726 <210> 21 <211> 375 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protein construct further modified from SEQ ID NO. 17 <400> 21 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu 20 25 30 Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys 35 40 45 Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr 50 55 60 Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe 65 70 75 80 Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile 85 90 95 His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser 100 105 110 Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu 115 120 125 Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val 130 135 140 Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu 165 170 175 Gln Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp 180 185 190 Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser 195 200 205 Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu 210 215 220 Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys 225 230 235 240 Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr 245 250 255 Val Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser 260 265 270 Gly Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala 275 280 285 Thr Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser 290 295 300 Pro Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly 305 310 315 320 Thr Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala 325 330 335 Ser His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr 340 345 350 Val Ala Ile Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val 355 360 365 Ser Leu Leu Ala Cys Tyr Leu 370 375 <210> 22 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> non-limiting exemplary signal peptide for the construct encoding tgpTCR-alpha <400> 22 Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala 1 5 10 15 Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly 20 <210> 23 <211> 273 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary sequence of a construct encoding tgpTCR-alpha (tgpTCR-alpha with TM) <400> 23 Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro Ile Met Leu Leu Val Asp Gly 1 5 10 15 Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu Val Leu Asp Val Ala Pro Pro 20 25 30 Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu 35 40 45 Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr 50 55 60 Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu 65 70 75 80 Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly Ala Glu Gly His Ser Arg Ser 85 90 95 Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys 100 105 110 Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Gly Cys Gly Leu Leu Arg Ala Pro Glu 115 120 125 Arg Phe Leu Leu Ala Gly Thr Pro Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val 130 135 140 Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr 145 150 155 160 Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr 165 170 175 Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr 180 185 190 Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg 195 200 205 Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro Pro Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro 210 215 220 Val Trp Gly Glu Gly Ser Tyr Leu Ser Ser Tyr Pro Thr Cys Pro Ala 225 230 235 240 Gln Ala Trp Cys Ser Arg Ser Ala Leu Arg Ala Pro Ser Ser Ser Leu 245 250 255 Gly Ala Phe Phe Ala Gly Asp Leu Pro Pro Pro Leu Gln Ala Gly Ala 260 265 270 Ala <210> 24 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial length of a construct encoding tgpTCR-alpha (Truncated tgpTCR-alpha with TM) <400> 24 Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro Ile Met Leu Leu Val Asp Gly 1 5 10 15 Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu Val Leu Asp Val Ala Pro Pro 20 25 30 Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu 35 40 45 Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr 50 55 60 Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu 65 70 75 80 Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly Ala Glu Gly His Ser Arg Ser 85 90 95 Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys 100 105 110 Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Gly Cys Gly Leu Leu Arg Ala Pro Glu 115 120 125 Arg Phe Leu Leu Ala Gly Thr Pro Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val 130 135 140 Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr 145 150 155 160 Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr 165 170 175 Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr 180 185 190 Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg 195 200 205 Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro Pro Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro 210 215 220 Val 225 <210> 25 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary sequence of a construct encoding a full or partial length of CD3-epsilon ectodomain <400> 25 Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val 1 5 10 15 Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly 20 25 30 Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu 35 40 45 Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu 50 55 60 Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly 65 70 75 80 Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val 85 90 95 Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp 100 <210> 26 <211> 84 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary sequence of a construct encoding a full or partial length of CD3-delta ectodomain <400> 26 Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val Asn Cys 1 5 10 15 Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu Ser 20 25 30 Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro Arg Gly 35 40 45 Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu Ser Thr 50 55 60 Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys Val Glu Leu Asp Pro 65 70 75 80 Ala Thr Val Ala <210> 27 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary sequence of a construct encoding a full or partial length of CD3-gamma ectodomain <400> 27 Gln Ser Ile Lys Gly Asn His 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signal peptide for a construct encoding a full or partial length of CD3-gamma ectodomain <400> 30 Met Glu Gln Gly Lys Gly Leu Ala Val Leu Ile Leu Ala Ile Ile Leu 1 5 10 15 Leu Gln Gly Thr Leu Ala 20 <210> 31 <211> 348 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary sequence polynucleotide encoding tgCD3(epsilon-delta)-TRAC fusion protein <400> 31 Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val 1 5 10 15 Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly 20 25 30 Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu 35 40 45 Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu 50 55 60 Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly 65 70 75 80 Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val 85 90 95 Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala 100 105 110 Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Gly Ser Phe Lys Ile Pro Ile Glu 115 120 125 Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp 130 135 140 Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp 145 150 155 160 Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly 165 170 175 Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg 180 185 190 Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 195 200 205 Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser 210 215 220 Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn 225 230 235 240 Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val 245 250 255 Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp 260 265 270 Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile 275 280 285 Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val 290 295 300 Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln 305 310 315 320 Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly 325 330 335 Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 340 345 <210> 32 <211> 394 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary sequence polynucleotide encoding tgCD3(epsilon-delta)-TRAC fusion protein <400> 32 Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val 1 5 10 15 Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly 20 25 30 Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu 35 40 45 Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu 50 55 60 Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly 65 70 75 80 Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val 85 90 95 Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala 100 105 110 Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Gly Ser Gln Ser Ile Lys Gly Asn 115 120 125 His Leu Val Lys Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu 130 135 140 Thr Cys Asp Ala Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys 145 150 155 160 Met Ile Gly Phe Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn 180 185 190 Lys Ser Lys Pro Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Gly Gly Gly Gly Ser 195 200 205 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Leu Asn Lys Val Phe 210 215 220 Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His 225 230 235 240 Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp 245 250 255 His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly 260 265 270 Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp 275 280 285 Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp 290 295 300 Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu 305 310 315 320 Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln 325 330 335 Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser 340 345 350 Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile 355 360 365 Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val 370 375 380 Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe 385 390 <210> 33 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence to the polynucleotide encoding tgCD3(epsilon-delta)-TRAC fusion protein (G4S linker) <400> 33 Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala 1 5 10 15 Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Gly Ser 20 25 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence to the polynucleotide encoding tgCD3(epsilon-delta)-TRAC fusion protein (G4S linker) <400> 34 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 35 <211> 163 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary sequence encoding a full or partial length of CD3-zeta endodomain <400> 35 Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu 1 5 10 15 Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys 20 25 30 Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala 35 40 45 Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr 50 55 60 Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg 65 70 75 80 Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met 85 90 95 Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 100 105 110 Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 115 120 125 Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 130 135 140 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 145 150 155 160 Pro Pro Arg <210> 36 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITAM1 sequence <400> 36 Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn 1 5 10 15 Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 20 25 <210> 37 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITAM2 sequence <400> 37 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 1 5 10 15 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met 20 25 <210> 38 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITAM3 sequence <400> 38 Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser 1 5 10 15 Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln 20 25 <210> 39 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary sequence from which any one or two CD3-zeta ITAMs may be removed <400> 39 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser 35 40 45 Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu 50 55 60 Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg 65 70 75 80 Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln 85 90 95 Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr 100 105 110 Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp 115 120 125 Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala 130 135 140 Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 145 150 <210> 40 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary sequence CD3 chimeric chain with 41BB signaling domain from which any one or two CD3-zeta ITAMs may be removed <400> 40 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg 35 40 45 Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 50 55 60 Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 65 70 75 80 Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 85 90 95 Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 100 105 110 Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 115 120 125 Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 130 135 140 Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 145 150 <210> 41 <211> 195 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary sequence of polynucleotide encoding a full or partial length of 28BB-zeta endodomain <400> 41 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu 35 40 45 Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln 50 55 60 Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly 65 70 75 80 Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr 85 90 95 Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg 100 105 110 Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met 115 120 125 Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 130 135 140 Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 145 150 155 160 Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 165 170 175 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 180 185 190 Pro Pro Arg 195 <210> 42 <211> 426 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary sequence of polynucleotide encoding a full or partial length of 28BB-zeta endodomain <400> 42 Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val 1 5 10 15 Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly 20 25 30 Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu 35 40 45 Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu 50 55 60 Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly 65 70 75 80 Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val 85 90 95 Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala 100 105 110 Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Gly Ser Gln Ser Ile Lys Gly Asn 115 120 125 His Leu Val Lys Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu 130 135 140 Thr Cys Asp Ala Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys 145 150 155 160 Met Ile Gly Phe Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn 180 185 190 Lys Ser Lys Pro Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Arg Ala Ala Ala Ile 195 200 205 Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly 210 215 220 Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe 225 230 235 240 Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val 245 250 255 Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp 260 265 270 Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met 275 280 285 Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala 290 295 300 Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg 305 310 315 320 Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 325 330 335 Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 340 345 350 Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 355 360 365 Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 370 375 380 Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 385 390 395 400 Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 405 410 415 Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 420 425 <210> 43 <211> 416 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide encoding construct tgCD3(epsilon-delta)-(28/BB)-zeta <400> 43 Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val 1 5 10 15 Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly 20 25 30 Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu 35 40 45 Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu 50 55 60 Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly 65 70 75 80 Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val 85 90 95 Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala 100 105 110 Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Gly Ser Phe Lys Ile Pro Ile Glu 115 120 125 Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp 130 135 140 Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp 145 150 155 160 Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly 165 170 175 Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg 180 185 190 Met Arg Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp 195 200 205 Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu 210 215 220 Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu 225 230 235 240 Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val 245 250 255 Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His 260 265 270 Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys 275 280 285 His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 290 295 300 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 305 310 315 320 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 325 330 335 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 340 345 350 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 355 360 365 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 370 375 380 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 385 390 395 400 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 405 410 415 <210> 44 <211> 276 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Met Lys Lys His Leu Thr Thr Phe Leu Val Ile Leu Trp Leu Tyr Phe 1 5 10 15 Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Gln Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser Leu 20 25 30 Ile Ile Leu Glu Gly Lys Asn Cys Thr Leu Gln Cys Asn Tyr Thr Val 35 40 45 Ser Pro Phe Ser Asn Leu Arg Trp Tyr Lys Gln Asp Thr Gly Arg Gly 50 55 60 Pro Val Ser Leu Thr Ile Met Thr Phe Ser Glu Asn Thr Lys Ser Asn 65 70 75 80 Gly Arg Tyr Thr Ala Thr Leu Asp Ala Asp Thr Lys Gln Ser Ser Leu 85 90 95 His Ile Thr Ala Ser Gln Leu Ser Asp Ser Ala Ser Tyr Ile Cys Val 100 105 110 Val Ser Asp Arg Gly Ser Thr Leu Gly Arg Leu Tyr Phe Gly Arg Gly 115 120 125 Thr Gln Leu Thr Val Trp Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val 130 135 140 Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe 145 150 155 160 Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp 165 170 175 Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe 180 185 190 Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys 195 200 205 Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro 210 215 220 Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu 225 230 235 240 Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg 245 250 255 Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg 260 265 270 Leu Trp Ser Ser 275 <210> 45 <211> 289 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Met Thr Ile Arg Leu Leu Cys Tyr Met Gly Phe Tyr Phe Leu Gly Ala 1 5 10 15 Gly Leu Met Glu Ala Asp Ile Tyr Gln Thr Pro Arg Tyr Leu Val Ile 20 25 30 Gly Thr Gly Lys Lys Ile Thr Leu Glu Cys Ser Gln Thr Met Gly His 35 40 45 Asp Lys Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Asp Pro Gly Met Glu Leu His Leu 50 55 60 Ile His Tyr Ser Tyr Gly Val Asn Ser Thr Glu Lys Gly Asp Leu Ser 65 70 75 80 Ser Glu Ser Thr Val Ser Arg Ile Arg Thr Glu His Phe Pro Leu Thr 85 90 95 Leu Glu Ser Ala Arg Pro Ser His Thr Ser Gln Tyr Leu Cys Ala Ser 100 105 110 Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro 115 120 125 Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 130 135 140 Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn 145 150 155 160 Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys 165 170 175 Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu 180 185 190 Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys 195 200 205 Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp 210 215 220 Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg 225 230 235 240 Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser 245 250 255 Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala 260 265 270 Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp 275 280 285 Phe

Claims (50)

  1. 세포 또는 이의 집단으로서,
    (i) 세포는 유도 만능 세포(iPSC: induced pluripotent cell), 클론 iPSC 또는 클론 iPS 세포주 세포, 또는 상기 iPSC를 분화하여 얻은 분화 세포이고;
    (ii) 세포는 TCRneg이고, 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  2. 제1항에 있어서, 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)은
    (i) 비결합성 재조합 TCR(nb-rTCR)과 연관되거나;
    (ii) 한정된 재조합 TCR(d-rTCR)과 연관되거나;
    (iii) 재조합 pre-TCR(p-rTCR)과 연관되거나;
    (iv) 비결합성 재조합 TCR(nb-rTCR-CD3)에 고정되거나;
    (v) CD3 키메라 사슬(ccCD3)인, 세포 또는 이의 집단.
  3. 제1항에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는
    (i) 형질전환 TCRα 불변 영역(tgTRAC);
    (ii) 형질전환 TCRβ 불변 영역(tgTRBC);
    (iii) 형질전환 TCRα(tgTCRα);
    (iv) 형질전환 TCRβ(tgTCRβ);
    (v) 형질전환 pre-TCRα(tgpTCRα);
    (vi) CD3ε 및 CD3δ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, 및 전체 또는 부분 TCRα 불변 영역을 포함하는 형질전환 융합 단백질(tgCD3(ε-δ)-TRAC);
    (vii) CD3ε 및 CD3γ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, 및 전체 또는 부분 TCRβ 불변 영역을 포함하는 형질전환 융합 단백질(tgCD3(ε-γ)-TRBC);
    (viii) CD3ε 및 CD3γ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, 및 전체 또는 부분 TCRα 불변 영역을 포함하는 형질전환 융합 단백질(tgCD3(ε-γ)-TRAC);
    (ix) CD3ε 및 CD3δ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, 및 전체 또는 부분 TCRβ 불변 영역을 포함하는 형질전환 융합 단백질(tgCD3(ε-δ)-TRBC);
    (x) CD3ε 및 CD3γ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, 및 CD3ζ의 엔도도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 포함하는 형질전환 융합 단백질(tgCD3(ε-γ)-ζ);
    (xi) CD3ε 및 CD3δ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, 및 CD3ζ의 엔도도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 포함하는 형질전환 융합 단백질(tgCD3(ε-δ)-ζ);
    (xii) CD3ε의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 포함하는 형질전환 융합 단백질, CD3γ 또는 CD3δ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, CD3ζ의 엔도도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함하는 형질전환 융합 단백질(tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ);
    (xiii) CD3ε의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 포함하는 형질전환 융합 단백질, CD3γ 또는 CD3δ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, CD3ζ의 엔도도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, 및 41BB의 신호전달 도메인을 포함하는 형질전환 융합 단백질(tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ); 및/또는
    (xiv) CD3γ 또는 CD3δ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, CD3ζ의 엔도도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, CD28의 신호전달 도메인, 및 41BB의 신호전달 도메인을 포함하는 형질전환 융합 단백질(tgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζ) 중 하나 이상을 포함하는 외인성 단백질을 암호화하는, 세포 또는 이의 집단.
  4. 제3항에 있어서,
    tgTRAC, tgTCRα, tgpTCRα, tgCD3(ε-δ)-TRAC, tgCD3(ε-γ)-TRAC, tgCD3(ε-γ)-ζ, tgCD3(ε-δ)-ζ, tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ, tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ 또는 tgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζ를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 TRAC 유전자좌에서 삽입되고, 선택적으로 삽입 시 TRAC의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결되거나;
    tgTRBC, tgTCRβ, tgCD3(ε-γ)-TRBC, tgCD3(ε-δ)-TRBC, tgCD3(ε-γ)-ζ, tgCD3(ε-δ)-ζ, tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ, tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ 및/또는 tgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζ를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 TRBC 유전자좌에서 삽입되고, 선택적으로 삽입 시 TRBC의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 세포 또는 이의 집단.
  5. 제4항에 있어서,
    tgTRAC를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 TCRα의 불변 영역의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 서열, 및 선택적으로 N 말단 신호 펩타이드를 포함하거나;
    tgTRAC를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 TCRα의 불변 영역의 전체 길이를 암호화하는 서열 및 C 말단에서의 폴리 A 꼬리, 및 선택적으로 N 말단 신호 펩타이드를 포함하거나;
    tgTRAC를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 TCRα의 불변 영역의 부분 길이를 암호화하는 서열, 및 선택적으로 N 말단 신호 펩타이드를 포함하고; 폴리뉴클레오타이드의 삽입은 불변 영역의 엑손에 있고 프레임 내에 있거나;
    tgTRBC를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 TCRβ의 불변 영역의 전체 길이 또는 부분 길이를 암호화하는 서열, 및 선택적으로 N 말단 신호 펩타이드를 포함하거나;
    tgTRBC를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 TCRβ의 불변 영역의 전체 길이를 암호화하는 서열 및 C 말단에서의 폴리 A 꼬리, 및 선택적으로 N 말단 신호 펩타이드를 포함하거나;
    tgTRBC를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 TCRβ의 불변 영역의 부분 길이를 암호화하는 서열, 및 선택적으로 N 말단 신호 펩타이드를 포함하고; 폴리뉴클레오타이드의 삽입은 불변 영역의 엑손에 있고 프레임 내에 있는, 세포 또는 이의 집단.
  6. 제4항에 있어서, TRAC 유전자좌 및/또는 TRBC 유전자좌에서 삽입된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 각각 TRAC 및 TRBC의 발현을 파괴하여(disrupt) TCRneg 세포를 생성시키는, 세포 또는 이의 집단.
  7. 제6항에 있어서, TRAC 유전자좌 및/또는 TRBC 유전자좌에서 삽입된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 (i) 각각 TRAC 및 TRBC의 내인성 프로모터, 또는 (ii) 이종성(heterologous) 프로모터에 의해 추진되는, 세포 또는 이의 집단.
  8. 제7항에 있어서, 이종성 프로모터는 (i) 항시적 프로모터, 유도성 프로모터, 시간 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 세포 유형 특이적 프로모터 중 적어도 하나; 또는 (ii) CMV, EF1α, PGK, CAG 및 UBC 중 하나; 또는 (iii) CAG를 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  9. 제2항에 있어서,
    (i) nb-rTCR은 tgTRAC 및 tgTRBC 중 하나 또는 둘 다를 포함하거나;
    (ii) d-rTCR은 tgTCRα, 및 선택적으로 tgTCRβ를 포함하고, 여기서 tgTCRα 및 tgTCRβ의 각각은 각각의 한정된 가변 영역을 포함하거나;
    (iii) p-rTCR은 tgpTCRα, 및 선택적으로 tgTRBC 또는 tgTCRβ를 포함하고, 여기서 tgTCRβ는 한정된 가변 영역을 포함하거나;
    (iv) nb-rTCR-CD3은 (1) tgCD3(ε-δ)-TRAC; (2) tgCD3(ε-γ)-TRBC; (3) tgCD3(ε-γ)-TRAC; 및/또는 (4) tgCD3(ε-δ)-TRBC의 융합 단백질 중 하나 이상을 포함하고, 여기서 융합 단백질은 CD3ε, CD3δ, CD3γ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, 및/또는 TRAC 또는 TRBC의 전체 길이 또는 부분 길이를 포함하거나;
    (v) ccCD3은 tgCD3(ε-γ)-ζ, tgCD3(ε-δ)-ζ, tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ, tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ 및 tgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζ의 융합 단백질 중 적어도 하나를 포함하고, 여기서 CD3ε, CD3δ 및/또는 CD3γ 단백질의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 포함하는 융합 단백질은 CDζ 단백질의 전체 길이 또는 부분 길이 엔도도메인, 및 선택적으로 CD28 신호전달 도메인 및 41BB 신호전달 도메인 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 세포질 도메인을 추가로 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  10. 제9항에 있어서, 융합 단백질 tgCD3(ε-δ)-TRAC를 포함하는 nb-rTCR-CD3은 tgTRBC 또는 tgTCRβ를 추가로 포함하거나; 융합 단백질 tgCD3(ε-γ)-TRBC를 포함하는 nb-rTCR-CD3은 tgTRAC 또는 tgTCRα를 추가로 포함하거나; tgTCRα 및 tgTCRβ를 포함하는 d-rTCR은 비변이체 NKT 세포의 TCRα 및 TCRβ를 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  11. 제9항에 있어서,
    (i) 세포는 nb-rTCR, d-rTCR 또는 p-rTCR의 재조합 TCR 중 하나를 포함하고, 여기서 재조합 TCR은 내인성 CD3 아단위와 복합체를 형성하고, 이로써 내인성 CD3 아단위의 세포 표면 제시 및 이의 신호전달이 가능하게 하거나;
    (ii) 세포는 nb-rTCR-CD3 또는 ccCD3을 포함하고, 이로써 외인성 CD3 아단위의 세포 표면 제시 및 이의 신호전달을 가능하게 하는, 세포 또는 이의 집단.
  12. 제1항에 있어서, 분화 세포는 조혈 세포이고, 말초혈, 제대혈 또는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 얻은 이의 자연적 대응 세포와 비교하여 더 긴 텔로미어를 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  13. 제1항에 있어서, 세포는
    (i) B2M 음성 또는 저;
    (ii) CIITA 음성 또는 저;
    (iii) HLA-G 또는 비절단성 HLA-G의 발현 도입;
    (iv) 고친화도 비절단성 CD16(hnCD16) 또는 이의 변이체;
    (v) 키메라 항원 수용체(CAR: chimeric antigen receptor),
    (vi) 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이 펩타이드;
    (vii) 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나;
    (viii) CD38, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, RAG1, 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 유전자 중 적어도 하나에서의 결실 또는 발현 감소; 및
    (ix) HLA-E, 41BBL, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, Fc 수용체, 인게이저, 및 이중특이적 인게이저 또는 다중특이적 인게이저 또는 보편적 인게이저(engager)와 커플링하기 위한 표면 트리거링 수용체 중 적어도 하나에서의 발현 도입 또는 발현 증가 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  14. 제1항 또는 제13항에 있어서, 세포는 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포이고, 말초혈, 제대혈 또는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 얻은 이의 자연적 대응 세포와 비교하여, 하기를 포함하는 특징 중 적어도 하나를 갖는, 세포 또는 이의 집단:
    (i) 지속성 및/또는 생존기간의 개선;
    (ii) 자연 면역 세포에 내성의 증가;
    (iii) 세포독성의 증가;
    (iv) 종양 침투의 개선;
    (v) ADCC의 향상 또는 획득;
    (vi) 종양 부위에 방관자 면역 세포를 이동시키고/시키거나 활성화하거나 동원하는 데 있어서의 능력의 향상;
    (vii) 종양 면역억제를 감소시키는 능력의 향상;
    (viii) 종양 항원 회피를 구제하는 능력의 개선; 및
    (ix) 동족살해(fratricide)의 감소.
  15. 제13항에 있어서, 세포는 고친화도 비절단성 CD16(hnCD16) 또는 이의 변이체를 추가로 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  16. 제15항에 있어서, 고친화도 비절단성 CD16(hnCD16) 또는 이의 변이체는
    (a) CD16의 엑토도메인 도메인에서의 F176V 및 S197P;
    (b) CD64로부터 기원한 전체 또는 부분 엑토도메인;
    (c) 비자연적(또는 비-CD16) 막관통 도메인;
    (d) 비자연적(또는 비-CD16) 세포내 도메인;
    (e) 비자연적(또는 비-CD16) 신호전달 도메인;
    (f) 비자연적 자극 도메인; 및
    (g) CD16로부터 기원하지 않고, 동일한 폴리펩타이드 또는 상이한 폴리펩타이드로부터 기원한 막관통 도메인, 신호전달 도메인 및 자극 도메인
    중 적어도 하나를 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  17. 제16항에 있어서,
    (a) 비자연적 막관통 도메인은 CD3D, CD3E, CD3G, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D 또는 T 세포 수용체(TCR: T cell receptor) 폴리펩타이드로부터 유래되거나;
    (b) 비자연적 자극 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래되거나;
    (c) 비자연적 신호전달 도메인은 CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137(41BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래되거나;
    (d) 비자연적 막관통 도메인은 NKG2D로부터 유래되고, 비자연적 자극 도메인은 2B4로부터 유래되고, 비자연적 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래되는, 세포 또는 이의 집단.
  18. 제13항에 있어서, 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 추가로 포함하고, CAR은
    (i) T 세포 특이적 또는 NK 세포 특이적이고/이거나;
    (ii) 이중특이적 항원 결합 CAR이고/이거나;
    (iii) 스위치 가능한 CAR이고/이거나;
    (iv) 이합체화된 CAR이고/이거나;
    (v) 분할 CAR이고/이거나;
    (vi) 다중사슬 CAR이고/이거나;
    (vii) 유도성 CAR이고/이거나;
    (viii) 다른 CAR과 동시발현되고/되거나;
    (ix) 선택적으로 별개의 작제물에서 또는 이중시스트론성 작제물에서 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이 펩타이드와 동시발현되고/되거나;
    (xi) 선택적으로 별개의 작제물에서 또는 이중시스트론성 작제물에서 관문 억제제와 동시발현되고/되거나;
    (xii) CD19 또는 BCMA에 특이적이고/이거나;
    (xiii) ADGRE2, 탄산무수화효소 IX(CAIX: carbonic anhydrase IX), CCRI, CCR4, 암배아 항원(CEA: carcinoembryonic antigen), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV: cytomegalovirus) 감염된 세포의 항원, 상피 당단백질2(EGP 2: epithelial glycoprotein2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 부착 분자(EpCAM: epithelial cell adhesion molecule), EGFRvIII, 수용체 티로신-단백질 키나제 erb­ B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산-결합 단백질(FBP: folate-binding protein), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR: acetylcholine receptor), 엽산 수용체-a, 강글리오사이드 G2(GD2: Ganglioside G2), 강글리오사이드 G3(GD3: Ganglioside G3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER-2: human Epidermal Growth Factor Receptor 2), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT: human telomerase reverse transcriptase), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 아단위 알파-2(IL-13Rα2: Interleukin-13 receptor subunit alpha-2), κ-경쇄, 키나제 인서트 도메인 수용체(KDR: kinase insert domain receptor), 루이스 A(CA19.9), 루이스 Y(LeY), L1 세포 부착 분자(L1-CAM: L1 cell adhesion molecule), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A1(MAGE-A1: melanoma antigen family A1), MICA/B, 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA: prostate stem cell antigen), PRAME 전립선 특이적 막 항원(PSMA: prostate-specific membrane antigen), 종양 연관된 당단백질 72(TAG-72: tumor­ associated glycoprotein 72), TIM-3, TRBC1, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­ R2: vascular endothelial growth factor R2), 윌름스 종양 단백질(WT-1: Wilms tumor protein) 및 병원균 항원 중 어느 하나에 특이적이고;
    (i) 내지 (xiii) 중 어느 하나의 CAR은 선택적으로 TRAC 유전자좌에서 삽입되고/되거나, TCR의 내인성 프로모터에 의해 추진되고/되거나, TCR은 CAR 삽입에 의해 넉아웃된, 세포 또는 이의 집단.
  19. 제13항에 있어서, 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이 펩타이드, 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체를 포함하는 세포는
    (a) IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21 중 적어도 하나, 및 이의 각각의 수용체를 포함하거나;
    (b) 하기 중 적어도 하나를 포함하고
    (i) 자가 절단 펩타이드를 사용한 IL15 및 IL15Rα의 동시발현;
    (ii) IL15와 IL15Rα의 융합 단백질;
    (iii) 절두된(truncated) IL15Rα의 세포내 도메인과의 IL15/IL15Rα 융합 단백질;
    (iv) IL15와 IL15Rα의 막 결합된 스시(Sushi) 도메인의 융합 단백질;
    (v) IL15와 IL15Rβ의 융합 단백질;
    (vi) IL15와 자연적 또는 변형된 공통 수용체 γC의 융합 단백질; 및
    (vii) IL15Rβ의 동종이합체;
    여기서, (i) 내지 (vii) 중 어느 하나는 별개의 작제물에서 또는 이중시스트론성 작제물에서 CAR과 동시발현될 수 있음;
    선택적으로,
    (c) 일시적으로 발현되는, 세포 또는 이의 집단.
  20. 제13항에 있어서, 세포는 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포이고, 분화 NK 세포는 종양 부위에 T 세포를 동원하고/하거나 이동시킬 수 있고, 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포는 하나 이상의 관문 억제제의 존재 하에 종양 면역억제를 감소시킬 수 있는, 세포 또는 이의 집단.
  21. 제18항 또는 제20항에 있어서, 관문 억제제는 PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2aR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 또는 억제성 KIR을 포함하는 하나 이상의 관문 분자에 대한 길항제인, 세포 또는 이의 집단.
  22. 제21항에 있어서, 관문 억제제는
    (a) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 데발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 이들의 유도체 또는 기능적 균등물 중 하나 이상; 또는
    (b) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 적어도 하나인, 세포 또는 이의 집단.
  23. 제1항에 있어서, 분화 세포는 분화 CD34 세포, 분화 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, 분화 조혈 다능성 전구 세포, 분화 T 세포 전구세포, 분화 NK 세포 전구세포, 분화 T 세포, 분화 NKT 세포, 분화 NK 세포 또는 분화 B 세포를 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  24. 제1항에 있어서, 세포는
    (i) 하나의 안전 항구 유전자좌(safe harbor locus)에서 통합된 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 또는
    (ii) 상이한 안전 항구 유전자좌에서 통합된 2개 초과의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 또는
    (iii) 서열 번호 17, 서열 번호 19 또는 서열 번호 21과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성의 아미노산 서열을 포함하는 IL15Δ를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  25. 제24항에 있어서, 안전 항구 유전자좌는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, CD38, GAPDH, TCR, CD38, RUNX1 또는 TCR 중 적어도 하나를 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  26. 제25항에 있어서, 안전 항구 유전자좌 TCR은 TCR 알파 또는 TCR 베타의 불변 영역인, 세포 또는 이의 집단.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 클론 iPSC 세포주 세포를 포함하는, 클론 마스터 세포 은행.
  28. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 세포 또는 이의 집단을 포함하는, 조성물.
  29. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 분화 세포 및 하나 이상의 치료제를 포함하는, 치료학적 용도를 위한 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 치료제는 펩타이드, 사이토카인, 관문 억제제, 미토겐, 성장 인자, 소형 RNA, dsRNA(이중 가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 지지 세포(feeder cell), 지지 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 하나 이상의 관심 다중핵산을 포함하는 벡터, 항체, 화학치료제 또는 방사성 모이어티, 또는 면역조절 약물(IMiD: immunomodulatory drug)을 포함하는, 조성물.
  31. 제30항에 있어서,
    (a) 관문 억제제는
    (i) PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2aR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 또는 억제성 KIR을 포함하는 하나 이상의 길항제 관문 분자;
    (ii) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 데발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 이들의 유도체 또는 기능적 균등물 중 하나 이상;
    (iii) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 적어도 하나
    를 포함하거나;
    (b) 치료제는 베네토클락스, 아자시티딘 및 포말리도마이드 중 하나 이상을 포함하는, 조성물.
  32. 제30항에 있어서, 항체는
    (a) 항-CD20, 항-CD22, 항-HER2, 항-CD52, 항-EGFR, 항-CD123, 항-GD2, 항-PDL1 및/또는 항-CD38 항체;
    (b) 리툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 우블리툭시맙, 오카라투주맙, 오비누투주맙, 이브리투모맙, 오크렐리주맙, 이노투주맙, 목세투모맙, 에프라투주맙, 트라스투주맙, 페르투주맙, 알렘투주맙, 세르툭시맙, 디누툭시맙, 아벨루맙, 다라투무맙, 이사툭시맙, MOR202, 7G3, CSL362, 엘로투주맙, 및 이들의 인간화된 변이체 또는 단편 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편, 및 이들의 기능적 균등물 및 바이오시밀러 중 하나 이상; 또는
    (c) 다라투무맙을 포함하고, 분화 조혈 세포는 CD38 넉아웃을 포함하는 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포, 및 선택적으로 hnCD16 또는 이의 변이체의 발현을 포함하는, 조성물.
  33. 입양 세포 치료에 적합한 대상체에 대한 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항의 조성물의 도입에 의한 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항의 조성물의 치료학적 용도로서, 대상체는 자가면역 장애; 혈액학적 악성종양; 고형 종양; 암 또는 바이러스 감염을 갖는, 치료학적 용도.
  34. TCRneg iPSC를 분화시키는 단계를 포함하는 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 세포를 제조하는 방법으로서, iPSC는 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 선택적으로 iPSC는
    (i) B2M 음성 또는 저;
    (ii) CIITA 음성 또는 저;
    (iii) HLA-G 또는 비절단성 HLA-G의 발현 도입;
    (iv) 고친화도 비절단성 CD16(hnCD16) 또는 이의 변이체;
    (v) 키메라 항원 수용체(CAR);
    (vi) 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이 펩타이드;
    (vii) 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나;
    (viii) CD38, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, RAG1, 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 유전자 중 적어도 하나에서의 결실 또는 발현 감소; 및
    (ix) HLA-E, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR, Fc 수용체, 인게이저, 및 이중특이적 인게이저 또는 다중특이적 인게이저 또는 보편적 인게이저와 커플링하기 위한 표면 트리거링 수용체 중 적어도 하나에서의 발현 도입 또는 발현 증가
    중 하나 이상을 추가로 포함하는, 세포를 제조하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, (a) 게놈 조작된 TCRneg iPSC를 얻도록 클론 iPSC의 TCR을 넉아웃하고, 동시에 또는 후속하여 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 넉인하는 단계; 또는
    (b) 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 T 세포-TCR이 아니라 iTCRαβ를 포함하는 클론 iPSC를 제공하기 위해 iPSC로 비변이체 NKT 세포를 재프로그래밍하는 단계; 및
    (c) 선택적으로
    (i) B2M 및 CIITA의 넉아웃, 또는
    (ii) HLA-G 또는 비절단성 HLA-G, 고친화도 비절단성 CD16 또는 이의 변이체, CAR 및/또는 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이 펩타이드의 발현의 도입에 의해 (a) 또는 (b)의 iPSC를 게놈 조작하는 단계를 추가로 포함하고,
    CAR 및 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 또는 전체 펩타이드는 별개의 작제물에서 또는 이중시스트론성 작제물에서 동시발현된, 세포를 제조하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, cs-CD3을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 넉인하는 단계 (a)는
    (i) 발현될 때 nb-rTCR을 제공하도록 tgTRAC 및 tgTRBC 암호화 폴리뉴클레오타이드 중 하나 또는 둘 다;
    (ii) 발현될 때 d-rTCR을 제공하도록 tgTCRα, 및 선택적으로 tgTCRβ, 암호화 폴리뉴클레오타이드로서, 여기서 tgTCRα 및 tgTCRβ의 각각은 각각의 한정된 가변 영역을 포함하는 것;
    (iii) p-rTCR을 제공하도록 tgpTCRα, 및 선택적으로 tgTRBC 또는 tgTCRβ, 암호화 폴리뉴클레오타이드로서, 여기서 tgTCRβ는 한정된 가변 영역을 포함하는 것;
    (iv) nb-rTCR-CD3을 제공하도록 (1) tgCD3(ε-δ)-TRAC, (2) tgCD3(ε-γ)-TRBC, (3) tgCD3(ε-γ)-TRAC 및/또는 (4) tgCD3(ε-δ)-TRBC의 융합 단백질 중 하나 이상을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드로서, 여기서 융합 단백질은 CD3ε, CD3δ, CD3γ의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이, 및/또는 TRAC 또는 TRBC의 전체 길이 또는 부분 길이를 포함하는 것; 또는
    (v) ccCD3을 제공하도록 (1) tgCD3(ε-γ)-ζ, (2) tgCD3(ε-δ)-ζ, (3) tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ, (4) tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ 및 (5) tgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζ의 융합 단백질 중 하나 이상을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드로서, 여기서 CD3ε, CD3δ 및/또는 CD3γ 단백질의 엑토도메인의 전체 길이 또는 부분 길이를 포함하는 융합 단백질은 CDζ 단백질의 전체 길이 또는 부분 길이 엔도도메인, 및 선택적으로 CD28 신호전달 도메인 및 41BB 신호전달 도메인 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 세포질 도메인을 추가로 포함하는 것;
    중 하나를 iPSC로 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 세포를 제조하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, (iv)의 융합 단백질 tgCD3(ε-δ)-TRAC를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 iPSC로 도입하는 단계는 nb-rTCR-CD3을 제공하도록 tgTRBC 또는 tgTCRβ를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 추가로 포함하거나;
    (iv)의 융합 단백질 tgCD3(ε-γ)-TRBC를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 iPSC로 도입하는 단계는 nb-rTCR-CD3을 제공하도록 tgTRAC 또는 tgTCRα를 추가로 포함하거나;
    d-rTCR을 제공하도록 tgTCRα를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 선택적으로 tgTCRβ를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 iPSC로 도입하는 단계에서, tgTCRα 및 tgTCRβ는 각각 비변이체 NKT 세포의 TCRα 및 TCRβ를 포함하는, 세포를 제조하는 방법.
  38. 제35항에 있어서, 넉아웃, 넉인 또는 게놈 조작은 표적화된 편집을 포함하는, 세포를 제조하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 표적화된 편집은 결실, 삽입 또는 삽입-결실(in/del)을 포함하고, 표적화된 편집은 CRISPR, ZFN, TALEN, 호밍 뉴클레아제, 상동성 재조합, 또는 이들 방법의 임의의 다른 기능적 변형에 의해 수행되는, 세포를 제조하는 방법.
  40. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 클론 iPSC의 CRISPR 매개된 편집으로서, 편집된 iPSC는 TCRneg이고, 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 편집된 클론 iPSC는 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나를 포함하는, CRISPR 매개된 편집.
  41. 제40항에 있어서, 편집은 TRAC 유전자좌 또는 TRBC 유전자좌에서의 CAR의 삽입을 추가로 포함하고/하거나, CAR은 TCR의 내인성 프로모터에 의해 추진되고/되거나, TCR은 CAR 삽입에 의해 넉아웃되는, CRISPR 매개된 편집.
  42. TCRneg, 및 발현될 때 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 제공하도록 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 및 선택된 다중특이적 인게이저를 포함하는 효과기(effector) 세포를 치료 중인 대상체에게 제공하는 단계를 포함하는 조합 치료의 방법으로서, 효과기 세포는 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 분화 세포를 포함하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 선택된 다중특이적 인게이저는 (i) T 세포 인게이저; (ii) NK 세포 인게이저; (iii) 이중특이적 T 세포 인게이저(BiTE); (iv) 이중특이적 살해 세포 인게이저(BiKE); (v) 삼중특이적 살해 세포 인게이저(TriKE); (vi) CD3 인게이저; 또는 (vii) CD16 인게이저 중 적어도 하나인, 방법.
  44. 제42항에 있어서, 선택된 다중특이적 인게이저는 CD3 인게이저이고, CD3 인게이저는 cs-CD3에 결합하는 제1 가변 분절 및 하기 중 적어도 하나를 포함하는 항원에 결합하는 제2 가변 분절을 포함하거나,
    (i) ADGRE2, 탄산무수화효소 IX(CAIX), CCRI, CCR4, 암배아 항원(CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원, 상피 당단백질2(EGP 2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 부착 분자(EpCAM), EGFRvIII, 수용체 티로신-단백질 키나제 erb­ B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산-결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 엽산 수용체-a, 강글리오사이드 G2(GD2), 강글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER-2), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 아단위 알파-2(IL-13Rα2), κ-경쇄, 키나제 인서트 도메인 수용체(KDR), 루이스 A(CA19.9), 루이스 Y(LeY), L1 세포 부착 분자(L1-CAM), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A 1(MAGE-A1), MICA/B, 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), PRAME 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 종양 연관된 당단백질 72(TAG-72), TIM-3, TRBCI, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­ R2), 윌름스 종양 단백질(WT-1) 및/또는 병원균 항원; 또는
    (ii) BCMA, CD19, CD20, CD33, CD38, CD52, CD123, CEA, EGFR, EpCAM, GD2, GPA33, HER2, MICA/B, PDL1 및/또는 PSMA; 또는
    (iii) CD19, CD33, CD123, CEA, EpCAM, GPA33, HER2 및/또는 PSMA;
    CD3 인게이저는 블리나투모맙, 카투막소맙, 에르투막소맙, RO6958688, AFM11, MT110/AMG 110, MT111/AMG211/MEDI-565, AMG330, MT112/BAY2010112, MOR209/ES414, MGD006/S80880, MGD007 및/또는 FBTA05 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, CD3 인게이저는 효과기 세포와 동시에 또는 이에 후속하여 대상체에게 투여되는, 방법.
  46. 제42항에 있어서, 효과기 세포는 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포를 포함하는 분화 조혈 세포를 포함하고, 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포는 CD38 넉아웃, 고친화도 비절단성 CD16 또는 이의 변이체를 포함하고, 선택적으로 하기를 포함하는, 방법:
    (i) B2M 및 CIITA 넉아웃;
    (ii) HLA-G 또는 비절단성 HLA-G, CAR 및/또는 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이 펩타이드의 발현 도입으로서, CAR 및 세포 표면 발현된 외인성 사이토카인 또는 이의 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이 펩타이드는 별개의 작제물에서 또는 이중시스트론성 작제물에서 동시발현된 것; 및/또는
    (iii) 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나.
  47. 입양 세포 치료에서 효과기 세포에 대한 수혜자 T 세포에 의한 동종거부를 감소시키거나 예방하는 방법으로서, 방법은 (i) 항-CD3 작용제, 및 (ii) TCRneg, 및 CD3 인게이저가 예비로딩된 세포 표면 CD3 복합체, 또는 하나 이상의 이의 아단위 또는 하위도메인(cs-CD3)을 포함하는 효과기 세포를 치료 중인 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 효과기 세포는 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 분화 세포를 포함하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 항-CD3 작용제는 CD3 항체 또는 CD3-CAR이고, CD3-CAR은 NK 세포에 포함되고; 항-CD3 작용제는 수혜자 T 세포를 탈활성화하고, 이로써 동종거부를 감소시키거나 예방하는, 방법.
  49. 제47항에 있어서, 효과기 세포의 cs-CD3에 결합하는 제1 가변 분절을 포함하는 CD3 인게이저는 자가면역 장애; 혈액학적 악성종양; 고형 종양; 암 또는 바이러스 감염과 관련된 항원에 결합하는 제2 가변 분절을 포함하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 항원에 결합하는 제2 가변 분절을 포함하는 CD3 인게이저는
    (i) ADGRE2, 탄산무수화효소 IX(CAIX), CCRI, CCR4, 암배아 항원(CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원, 상피 당단백질2(EGP 2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 부착 분자(EpCAM), EGFRvIII, 수용체 티로신-단백질 키나제 erb­ B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산-결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 엽산 수용체-a, 강글리오사이드 G2(GD2), 강글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER-2), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 아단위 알파-2(IL-13Rα2), κ-경쇄, 키나제 인서트 도메인 수용체(KDR), 루이스 A(CA19.9), 루이스 Y(LeY), L1 세포 부착 분자(L1-CAM), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A 1(MAGE-A1), MICA/B, 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), PRAME 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 종양 연관된 당단백질 72(TAG-72), TIM-3, TRBCI, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­ R2), 윌름스 종양 단백질(WT-1) 및/또는 병원균 항원; 또는
    (ii) BCMA, CD19, CD20, CD33, CD38, CD52, CD123, CEA, EGFR, EpCAM, GD2, GPA33, HER2, MICA/B, PDL1 및/또는 PSMA; 또는
    (iii) CD19, CD33, CD123, CEA, EpCAM, GPA33, HER2 및/또는 PSMA
    중 적어도 하나를 포함하거나;
    CD3 인게이저는 블리나투모맙, 카투막소맙, 에르투막소맙, RO6958688, AFM11, MT110/AMG 110, MT111/AMG211/MEDI-565, AMG330, MT112/BAY2010112, MOR209/ES414, MGD006/S80880, MGD007 및/또는 FBTA05 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
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