JP2022527405A - 操作されたiPSCおよび免疫エフェクター細胞におけるCD3の再構成 - Google Patents
操作されたiPSCおよび免疫エフェクター細胞におけるCD3の再構成 Download PDFInfo
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Abstract
ゲノム操作されたiPSCの指向された分化から得られた機能的に増強された派生エフェクター細胞を得るための方法および組成物が提供される。本明細書で提供されるiPSC由来細胞は、改善または増強された治療効果を提供する安定した機能的なゲノム編集を有する。機能的に増強された派生エフェクター細胞のみを含む、または抗体もしくはチェックポイント阻害剤との併用療法での治療用組成物およびその使用も提供される。【選択図】なし
Description
関連出願
本出願は、2019年4月11日に出願された米国仮出願第62/832,622号の優先権を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2019年4月11日に出願された米国仮出願第62/832,622号の優先権を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、既製の免疫細胞製品の分野に広く関係している。より具体的には、本開示は、インビボで治療的に関連する特性を送達することができる多機能エフェクター細胞を開発するための戦略に関係している。本開示の下で開発された細胞製品は、患者由来の細胞療法の重大な制限に対処している。
電子的に提出された配列表への参照
本出願は、参照により、本出願とともに提出されたASCIIテキスト形式の配列表のコンピューター可読形式(CRF)を組み込んでおり、056932-518001WO_SEQUENCE_LISTING_ST25.TXTという名称で、2020年4月2日に作成され、サイズは76,442バイトである。
本出願は、参照により、本出願とともに提出されたASCIIテキスト形式の配列表のコンピューター可読形式(CRF)を組み込んでおり、056932-518001WO_SEQUENCE_LISTING_ST25.TXTという名称で、2020年4月2日に作成され、サイズは76,442バイトである。
養子細胞療法の分野は現在、患者由来およびドナー由来の細胞の使用に重点が置かれているため、がん免疫療法の一貫した製造を達成し、利益を得る可能性のあるすべての患者に治療を提供することが特に困難である。患者の良好な転帰を促進するために、養子移入されたリンパ球の有効性および持続性を改善する必要もある。T細胞およびナチュラルキラー(NK)細胞などのリンパ球は、自然免疫および獲得免疫において重要な役割を果たす強力な抗腫瘍エフェクターである。しかしながら、養子細胞療法のためのこれらの免疫細胞の使用は依然として困難であり、改善に対する満たされていない要求が存在する。したがって、養子免疫療法においてT細胞およびNK細胞、または他のリンパ球の可能性を最大限に利用する重要な機会が残っている。
応答率、細胞枯渇、輸血された細胞の喪失(生存および/または持続性)、標的喪失または系譜転換による腫瘍エスケープ、腫瘍標的化の精度、標的外毒性、腫瘍外効果から、固形腫瘍に対する有効性、すなわち、腫瘍微小環境および関連する免疫抑制、動員、輸送、および浸潤に及ぶ問題に対処する機能的に改善されたエフェクター細胞が必要である。
本発明の目的は、単一細胞由来のiPSC(人工多能性幹細胞)クローン株から分化した派生非多能性細胞を生成するための方法および組成物を提供することであり、iPSC株はそのゲノムに1つまたはいくつかの遺伝子修飾を含む。該1つまたはいくつかの遺伝子修飾には、DNAの挿入、欠失、および置換が含まれ、これらの修飾は、分化、拡大、継代、および/または移植後の、その後の由来細胞において保持され、機能し続ける。
本出願のiPSC由来の非多能性細胞には、CD34細胞、造血性内皮細胞、HSC(造血幹細胞および前駆細胞)、造血多分化能前駆細胞、T細胞前駆細胞、NK細胞前駆細胞、T細胞、NKT細胞、NK細胞、およびB細胞が含まれるが、これらに限定されない。本出願のiPSC由来の非多能性細胞は、同じ遺伝子修飾を含むiPSCからの分化を通じて、それらのゲノムに1つまたはいくつかの遺伝子修飾を含む。遺伝子操作されたiPSC由来の細胞を得るための操作されたクローンiPSC分化戦略では、指向された分化におけるiPSCの発生の可能性が、iPSCの操作されたモダリティによって悪影響を受けないこと、および操作されたモダリティが派生細胞で意図されたとおりに機能することが必要である。さらに、この戦略は、細胞、末梢血、臍帯血、または任意の他のドナー組織から得られるT細胞またはNK細胞などの初代リンパ球を操作する際の現在の障壁、つまりそのような細胞を操作するのは困難であり、そのような細胞の操作は、再現性および均一性に欠くことが多く、細胞死が多く、細胞拡大が少ない、細胞持続性の低い細胞をもたらす障壁を克服する。さらに、この戦略は、最初は不均一な一次細胞源を使用して別の方法で得られる不均一なエフェクター細胞集団の生成を回避する。
本発明のいくつかの態様は、それぞれ、再プログラミングプロセスの後、それと同時、およびその前のゲノム操作の戦略を反映する、(I)、(II)、または(III)を含む方法を使用して得られたゲノム操作されたiPSCを提供する。
(I):(i)と(ii)の一方または両方によって、任意の順序でiPSCを遺伝子操作する:(i)1つ以上の構築物をiPSCに導入して、選択された部位での標的化された組み込みを可能にする、(ii)(a)選択された部位認識が可能な1つ以上のエンドヌクレアーゼを使用して、選択された部位での1つ以上の二本鎖切断をiPSCに導入し、(b)ステップ(I)(ii)(a)のiPSCを培養して、内因性DNA修復により、選択された部位に標的化されたイン/デルを同時にまたは連続して生成することができるようにし、それにより、部分的または完全に分化した細胞への分化が可能なゲノム操作されたiPSCを得る。
(II):再プログラミング非多能性細胞を遺伝子操作して、ゲノム操作されたiPSCを得る:これには、(i)非多能性細胞を1つ以上の再プログラミング因子、ならびに任意選択で、非多能性細胞の再プログラミングを開始するためのTGFβ受容体/ALK阻害剤、MEK阻害剤、GSK3阻害剤および/またはROCK阻害剤を含む小分子組成物と接触させることと、(ii)ステップ(II)(i)の再プログラミング非多能性細胞に、(a)および(b):(a)選択された部位での標的化された組み込みを可能にする1つ以上の構築物、(b)選択された部位認識が可能な少なくとも1つのエンドヌクレアーゼを使用して、選択された部位での1つ以上の二本鎖切断、の一方または両方を任意の順序で導入し、次いで、ステップ(II)(ii)(b)の細胞を培養して、内因性DNA修復により、選択された部位に標的化されたイン/デルを生成することができるようにすることと、が含まれ、したがって、得られるゲノム操作されたiPSCは少なくとも1つの機能的な標的化されたゲノム編集を含み、該ゲノム操作されたiPSCは部分的または完全に分化した細胞に分化することができる。
(III):再プログラミングするために非多能性細胞を遺伝子操作して、ゲノム操作されたiPSCを得る:これには、(i)非多能性細胞に、(a)および(b):(a)選択された部位での標的化された組み込みを可能にする1つ以上の構築物、(b)選択された部位認識が可能な少なくとも1つのエンドヌクレアーゼを使用して、選択された部位での1つ以上の二本鎖切断、の一方または両方を任意の順序で導入する(ステップ(III)(i)(b)の細胞を培養して、内因性DNA修復により、選択された部位に標的化されたイン/デルを生成することができるようにする)ことと、(ii)ステップ(III)(i)の細胞を、1つ以上の再プログラミング因子、ならびに任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤、MEK阻害剤、GSK3阻害剤、および/またはROCK阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、選択された部位に標的化された編集を含むゲノム操作されたiPSCを得ることと、の(i)および(ii)が含まれ、それにより、少なくとも1つの機能的な標的化されたゲノム編集を含むゲノム操作されたiPSCを得、該ゲノム操作されたiPSCは、部分的に分化した細胞または完全に分化した細胞に分化することができる。
上記の方法の一実施形態では、1つ以上の選択された部位での少なくとも1つの標的化されたゲノム編集は、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、またはゲノム操作されたiPSCもしくはそれからの派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能、自己再生、持続性、および/または生存を促進するタンパク質をコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチドの挿入を含む。いくつかの実施形態では、挿入のための外因性ポリヌクレオチドは、(1)CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC、または他の構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、もしくは細胞型特異的プロモーターを含む1つ以上の外因性プロモーター、あるいは(2)AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、ベータ-2ミクログロブリン、CD38、GAPDH、TCR、もしくはRUNX1を含む選択された部位、またはゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座に含まれる1つ以上の内因性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、上記の方法を使用して生成されたゲノム操作されたiPSCは、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、修飾されたEGFR、またはB細胞CD20を含むタンパク質をコードする1つ以上の異なる外因性ポリヌクレオチドを含み、ゲノム操作されたiPSCが2つ以上の自殺遺伝子を含む場合、自殺遺伝子は、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、ベータ2ミクログロブリン、CD38、GAPDH、TCR、またはRUNX1を含む異なるセーフハーバー遺伝子座に組み込まれる。一実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21、および/またはそれらのそれぞれの受容体の部分長または完全長のペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドによってコードされるIL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21、および/またはそれらのそれぞれの受容体の部分的または完全なペプチドは、融合タンパク質の形態である。
いくつかの他の実施形態では、本明細書で提供される方法を使用して生成されたゲノム操作されたiPSCは、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答制御および調節、またはiPSCもしくはそれからの派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能、自己再生、持続性、および/または生存を抑制するタンパク質に関連する1つ以上の内因性遺伝子においてイン/デルを含む。いくつかの実施形態では、妨害のための内因性遺伝子は、CD38、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、RAG1、および染色体6p21領域の任意の遺伝子の少なくとも1つを含む。
さらにいくつかの他の実施形態では、本明細書で提供される方法を使用して生成されたゲノム操作されたiPSCは、AAVS1遺伝子座に外因性ポリヌクレオチドをコードするカスパーゼ、およびH11遺伝子座に外因性ポリヌクレオチドをコードするチミジンキナーゼを含む。
またいくつかの他の実施形態では、アプローチ(I)、(II)、および/または(III)は、ゲノム操作されたiPSCを、MEK阻害剤、GSK3阻害剤、およびROCK阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、ゲノム操作されたiPSCの多能性を維持する。一実施形態では、少なくとも1つの標的化されたゲノム編集を含む、得られたゲノム操作されたiPSCは、機能的であり、分化能があり、同じ機能的なゲノム編集を含む非多能性細胞に分化することができる。
本発明はまた、以下を提供する。
本出願の一態様は、細胞またはその集団を提供し、細胞は、人工多能性細胞(iPSC)、クローンiPSC、もしくはクローンiPS細胞株細胞、または上記の該iPSCのいずれかの分化から得られる派生細胞であり、上記の該細胞のいずれかは、少なくともTCRnegと、発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドとを含む。iPSC分化から得られる派生細胞のいくつかの実施形態では、派生細胞は、CD34細胞、造血内皮細胞、HSC(造血幹細胞および前駆細胞)、造血多分化能前駆細胞、T細胞前駆細胞、NK細胞前駆細胞、T細胞、NKT細胞、NK細胞、およびB細胞を含むがこれらに限定されない造血細胞であり、派生造血細胞(すなわち、派生CD34細胞、派生造血内皮細胞、派生造血幹細胞および前駆細胞、派生造血多分化能前駆細胞、派生T細胞前駆細胞、派生NK細胞前駆細胞、派生T細胞、派生NKT細胞、派生NK細胞、または派生B細胞)は、末梢血、臍帯血、または他のドナー組織から得られたその天然の対応細胞と比較して、より長いテロメアを含む。iPSC分化から得られる派生細胞のいくつかの実施形態では、派生細胞は、T細胞前駆細胞またはT細胞である。iPSC分化から得られる派生細胞のいくつかの実施形態では、派生細胞は、NK細胞前駆細胞またはNK細胞である。
TCRnegと、発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドとを含む該iPSCおよびその派生細胞のいくつかの実施形態では、細胞は、以下のゲノム編集:(i)B2M陰性または低B2M、(ii)CIITA陰性または低CIITA、(iii)HLA-Gまたは切断不可能なHLA-Gの導入された発現、(iv)高親和性の切断不可能なCD16(hnCD16)またはそのバリアント、(v)キメラ抗原受容体(CAR)、(vi)細胞表面発現外因性サイトカインまたはその受容体の部分長または完全長ペプチド、(vii)CD38陰性、(viii)表1に列記される遺伝子型のうちの少なくとも1つ、(ix)TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、RAG1、および染色体6p21領域の任意の遺伝子のうちの少なくとも1つに欠失または発現低下、(x)HLA-E、41BBL、CD4、CD8、CD16、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、Fc受容体、エンゲージャー、および二重もしくは多重特異性またはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも1つに導入されたまたは増加した発現のうちの1つ以上をさらに含む。
少なくともTCRnegと、発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドと、上記および本出願全体を通して記載される任意選択の追加のゲノム編集とを含む該iPSCおよびその派生細胞のいくつかの実施形態では、細胞は、(i)1つのセーフハーバー遺伝子座に組み込まれた1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)異なるセーフハーバー遺伝子座に組み込まれた2つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、ベータ-2ミクログロブリン、CD38、GAPDH、TCR、またはRUNX1のうちの少なくとも1つを含む。1つの特定の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座はH11である。1つの特定の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座TCRは、TCRアルファまたはTCRベータの定常領域である。いくつかの実施形態では、セーフハーバー遺伝子座での1つ以上の外因性ポリヌクレオチドの挿入は、セーフハーバーでの内因性遺伝子の妨害またはノックアウトをもたらし、例えば、B2M、CD38、またはTCRアルファ/ベータでの挿入は、B2M、CD38、またはTCRアルファ/ベータ遺伝子のノックアウトをもたらす。
細胞またはその集団のいくつかの実施形態では、TCRnegと、発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドと、上記の追加のゲノム編集のうちの1つ以上を含む細胞は、いくつかの実施形態では、派生T細胞であり、いくつかの他の実施形態では、該ゲノム編集を含むiPSCから得られた派生NK細胞であり、派生T細胞またはNK細胞は、末梢血、臍帯血、または任意の他のドナー組織から得られるその天然の対応する初代T細胞またはNK細胞と比較して、(i)持続性および/または生存の改善、(ii)天然(すなわち、レシピエント)免疫細胞に対する耐性の増加、(iii)細胞傷害性の増加、(iv)腫瘍浸透の改善、(v)ADCCの増強もしくは獲得、(vi)バイスタンダー免疫細胞を遊走させる、および/もしくは活性化するか、または腫瘍部位に動員する能力の増強、(vii)腫瘍の免疫抑制を低下させる能力の増強、(viii)腫瘍抗原エスケープを救済する能力の改善、ならびに(ix)フラトリサイドの低減を含むがこれらに限定されない特徴のうちの少なくとも1つを有するが、これらに限定されない。細胞表面CD3陰性であるTCRnegT細胞またはNK細胞(一次または派生)と比較した場合、TCRneg、および表面がCD3複合体またはそのサブユニットもしくはサブドメインを提示するのを可能にする1つ以上の外因性タンパク質の両方を含む派生T細胞またはNK細胞は、完全または部分的な内因性または外因性の細胞表面CD3複合体を提示する細胞表面、およびCD3関連細胞表面トリガー受容体に結合する分子に応答する能力をさらに含むがこれらに限定されない表現型および機能的特徴のうちの少なくとも1つを有し、この分子には、CD3結合抗体またはその機能的バリアント、scFV、および/または様々なCD3エンゲージャーが含まれるが、これらに限定されない。
細胞またはその集団の一実施形態では、TCRnegと、発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドとを含む細胞は、高親和性の切断不可能なCD16またはそのバリアント(hnCD16)をさらに含む。高親和性の切断不可能なCD16またはそのバリアント(hnCD16)のいくつかの実施形態は、以下のうちの少なくともいずれか1つを含む:(a)CD16の外部ドメインドメインにおけるF176VおよびS197P、(b)CD64に由来する完全または部分的な外部ドメイン、(c)非天然(または非CD16)膜貫通ドメイン、(d)非天然(または非CD16)細胞内ドメイン、(e)非天然(または非CD16)シグナル伝達ドメイン、(f)非天然刺激ドメイン、ならびに(g)CD16に由来せず、同じまたは異なるポリペプチドに由来する膜貫通、シグナル伝達、および刺激ドメイン。いくつかの実施形態では、非天然膜貫通ドメインは、CD3D、CD3E、CD3G、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、またはT細胞受容体(TCR)ポリペプチドに由来する。いくつかの実施形態では、非天然刺激ドメインは、CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4、またはNKG2Dポリペプチドに由来する。いくつかの他の実施形態では、非天然シグナル伝達ドメインは、CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(41BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、またはNKG2Dポリペプチドに由来する。hnCD16またはそのバリアントのいくつかの特定の実施形態では、非天然膜貫通ドメインはNKG2Dに由来し、非天然刺激ドメインは2B4に由来し、非天然シグナル伝達ドメインはCD3ζまたはDAP10に由来する。
細胞またはその集団の一実施形態では、TCRnegと、発現されると細胞表面CD3複合体、またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドとを含む細胞は、少なくとも1つのキメラ抗原受容体(CAR)をさらに含み、CARは、以下:(i)T細胞特異的またはNK細胞特異的である、(ii)二重特異性抗原結合CARである、(iii)切り替え可能なCARである、(iv)二量体化されたCARである、(v)分割CARである、(vi)多鎖CARである、(vii)誘導性CARである、(viii)別のCARと共発現される、(ix)細胞表面発現外因性サイトカインまたはその受容体の部分長もしくは完全長ペプチドと、任意選択で別個の構築物またはバイシストロン性もしくはポリシストロン性構築物において共発現される、(xi)チェックポイント阻害剤と、任意選択で別個の構築物またはバイシストロン性もしくはポリシストロン性構築物において共発現される、(xii)CD19またはBCMAに特異的である、ならびに/あるいは(xiii)ADGRE2、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、CCRI、CCR4、がん胎児性抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、サイトメガロウイルス(CMV)感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質2(EGP2)、上皮糖タンパク質-40(EGP-40)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、EGFRvIII、受容体チロシン-タンパク質キナーゼerb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB葉酸結合タンパク質(FBP)、胎児アセチルコリン受容体(AChR)、葉酸受容体-a、ガングリオシドG2(GD2)、ガングリオシドG3(GD3)、ヒト上皮成長因子受容体2(HER-2)、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、ICAM-1、インテグリンB7、インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2(IL-13Rα2)、κ-軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体(KDR)、ルイスA(CA19.9)、ルイスY(LeY)、L1細胞接着分子(L1-CAM)、LILRB2、メラノーマ抗原ファミリーA 1(MAGE-A1)、MICA/B、ムチン1(Muc-1)、ムチン16(Muc-16)、メソセリン(MSLN)、NKCSI、NKG2Dリガンド、c-Met、がん-精巣抗原NY-ESO-1、腫瘍胎児性抗原(h5T4)、PRAME、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、PRAME前立腺特異的膜抗原(PSMA)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG-72)、TIM-3、TRBCI、TRBC2、血管内皮成長因子R2(VEGF-R2)、ウィルムス腫瘍タンパク質(WT-1)、および病原体抗原のうちのいずれか1つに特異的である、のうちのいずれか1つ以上であり得る。いくつかの実施形態では、上記のCARのうちのいずれか1つは、TCRαまたはTCRβなどのTCR遺伝子座の定常領域に挿入され得る。いくつかの実施形態では、TRACまたはTRBC遺伝子座に挿入されたCARは、TCRのそれぞれの内因性プロモーターによって駆動され得る。いくつかの実施形態では、TRACまたはTRBC遺伝子座でのCARの挿入は、TCR陰性またはノックアウトをもたらす。いくつかの実施形態では、TCR陰性細胞はまた、CD3陰性である。
チェックポイント阻害剤がCARと共発現されるいくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2aR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara(レチノイン酸受容体アルファ)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E、または阻害性KIRを含む1つ以上のチェックポイント分子に対するアンタゴニストである。CARと共発現されるチェックポイント阻害剤は、上記のチェックポイント分子のいずれかに特異的な、抗体、またはそれらのヒト化もしくはFc修飾されたバリアントもしくは断片、ならびに機能的同等物およびバイオシミラーであり得る。
細胞またはその集団の一実施形態では、TCRnegと、発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドとを含む細胞は、細胞表面発現外因性サイトカインまたはその受容体の部分長もしくは完全長ペプチドをさらに含み、外因性サイトカインまたはその受容体は、IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21、およびそれらのそれぞれの受容体のうちの少なくとも1つを含み得るか、または(i)自己切断ペプチドを使用することによるIL15およびIL15Rαの共発現、(ii)IL15とIL15Rαとの融合タンパク質、(iii)切断されたIL15Rαの細胞内ドメインを有するIL15/IL15Rα融合タンパク質(IL15Δ)、(iv)IL15とIL15Rαの膜結合Sushiドメインとの融合タンパク質、(v)IL15とIL15Rβとの融合タンパク質、(vi)IL15と共通受容体γCとの融合タンパク質(共通受容体γCは、天然または修飾されている)、ならびに(vii)IL15Rβのホモ二量体のうちの少なくとも1つを含み得、(i)~(vii)のうちのいずれか1つは、別個の構築物またはバイシストロン性もしくはポリシストロン性構築物においてCARと共発現され得る。いくつかの実施形態では、細胞表面外因性サイトカインまたは受容体の部分的または完全なペプチドは、本明細書で提供される細胞において一過性に発現される。一実施形態では、細胞またはその集団は、配列番号17、19、または21に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、または99%の同一性のアミノ酸配列を含むIL15Δをコードするポリヌクレオチドを含む。
細胞またはその集団の一実施形態では、TCRnegと、発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドと、上記に開示されるこれらの実施形態(i)~(vii)を含むIL15もしくはバリアントとを含む細胞は、B2M陰性または低B2M;CIITA陰性または低CIITA;HLA-Gまたは切断不可能なHLA-Gの導入された発現;高親和性の切断不可能なCD16またはそのバリアント(hnCD16);キメラ抗原受容体(CAR);細胞表面発現された追加の外因性サイトカインまたはその受容体の部分長または完全長ペプチド(サイトカインはIL15ではない);表1に列記される遺伝子型のうちの少なくとも1つ;TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、RAG1、および染色体6p21領域の任意の遺伝子うちの少なくとも1つに欠失または発現低下;ならびにHLA-E、41BBL、CD4、CD8、CD16、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、Fc受容体、エンゲージャー、および二重もしくは多重特異性またはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも1つに導入されたまたは増加した発現のうちの1つ以上をさらに含み得る。IL15ΔおよびCARの両方を含む細胞またはその集団の実施形態では、IL15Δは、CARと、別個の構築物またはバイシストロン性構築物もしくはポリシストロン性構築物において共発現され得る。
細胞またはその集団の一実施形態では、TCRnegと、発現されると細胞表面CD3複合体、またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドとを含む細胞は、派生NK細胞または派生T細胞であり、派生NK細胞または派生T細胞は、1つ以上のチェックポイント阻害剤の存在下で腫瘍免疫抑制を低減することが可能である。いくつかの実施形態では、1つ以上のチェックポイント阻害剤の存在は、該細胞を受ける前、受けている間、または受けた後に、阻害剤を対象に投与することによる。いくつかの他の実施形態では、1つ以上のチェックポイント阻害剤の存在は、選択された阻害剤をコードするポリヌクレオチドを使用してチェックポイント阻害剤発現を該細胞に導入することによって、該細胞により阻害剤を発現させることによる。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2aR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara(レチノイン酸受容体アルファ)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E、または阻害性KIRを含む1つ以上のチェックポイント分子に対するアンタゴニストである。いくつかの他の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、(a)アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、IPH4102、IPH43、IPH33、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、およびそれらの誘導体もしくは機能的同等物のうちの1つ以上、または(b)アテゾリズマブ、ニボルマブ、およびペムブロリズマブのうちの少なくとも1つのいずれかを含む。
本出願の別の態様は、上記および本出願全体を通して記載される細胞またはその集団のいずれかを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、iPSCまたはiPSC由来細胞(本明細書では「派生細胞」とも呼ばれる)は、本出願の表1に列記される遺伝子型のうちのいずれか1つを含み得る。いくつかの実施形態では、TCRneg iPSCまたはそれからの派生細胞は、発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、TCRneg iPSCまたはそれからの派生細胞は、発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドと、hnCD16とを含む。いくつかの実施形態では、TCRneg iPSCまたはそれからの派生細胞は、発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドと、hnCD16と、IL15またはそのバリアントとを含む。いくつかの実施形態では、TCRneg iPSCまたはそれからの派生細胞は、発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドと、hnCD16と、CARとを含む。いくつかの実施形態では、TCRneg iPSCまたはそれからの派生細胞は、発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドと、hnCD16と、IL15またはそのバリアントと、CARとを含む。いくつかの実施形態では、TCRneg iPSCまたはそれからの派生細胞は、発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドと、hnCD16と、CD38陰性と、CARと、上記および本出願全体を通して記載される表面発現外因性サイトカインまたはその受容体の部分長または完全長のペプチドとを含む。いくつかの他の実施形態では、CARは、ADGRE2、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、CCRI、CCR4、がん胎児性抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、サイトメガロウイルス(CMV)感染細胞の抗原(例えば、細胞表面抗原)、上皮糖タンパク質2(EGP2)、上皮糖タンパク質-40(EGP-40)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、EGFRvIII、受容体チロシン-タンパク質キナーゼerb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB葉酸結合タンパク質(FBP)、胎児アセチルコリン受容体(AChR)、葉酸受容体-a、ガングリオシドG2(GD2)、ガングリオシドG3(GD3)、ヒト上皮成長因子受容体2(HER-2)、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、ICAM-1、インテグリンB7、インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2(IL-13Rα2)、κ-軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体(KDR)、ルイスA(CA19.9)、ルイスY(LeY)、L1細胞接着分子(L1-CAM)、LILRB2、メラノーマ抗原ファミリーA 1(MAGE-A1)、MICA/B、ムチン1(Muc-1)、ムチン16(Muc-16)、メソセリン(MSLN)、NKCSI、NKG2Dリガンド、c-Met、がん-精巣抗原NY-ESO-1、腫瘍胎児性抗原(h5T4)、PRAME、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、PRAME前立腺特異的膜抗原(PSMA)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG-72)、TIM-3、TRBCI、TRBC2、血管内皮成長因子R2(VEGF-R2)、ウィルムス腫瘍タンパク質(WT-1)、および当該技術分野で既知の様々な病原体抗原のうちのいずれか1つに特異的である。TCRnegを含む細胞のさらにいくつかの実施形態では、細胞は、発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドと、hnCD16と、CARとを含み、CARは、CD19またはCD269(BCMA)に特異的である。TCRnegを含む細胞のいくつかの実施形態では、細胞は、細胞で発現されると表面CD3複合体またはそのサブユニットもしくはサブドメインと、hnCD16と、IL15またはそのバリアントと、CARとを含み、CARは、CD19またはCD269(BCMA)に特異的である。TCRnegを含む細胞のいくつかの他の実施形態では、細胞は、細胞で発現されると表面CD3複合体またはそのサブユニットもしくはサブドメインと、hnCD16と、IL15またはそのバリアントと、CD38陰性と、CARとを含み、CARは、CD19またはCD269(BCMA)に特異的である。
したがって、本出願のさらなる態様は、本明細書で提供される派生細胞のいずれかに加えて、1つ以上の治療薬を含む、治療用途のための組成物を提供する。治療用途のための組成物のいくつかの実施形態では、治療薬は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、成長因子、小RNA、dsRNA(二本鎖RNA)、単核血液細胞、フィーダー細胞、フィーダー細胞構成要素もしくはその置換因子、目的の1つ以上のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤もしくは放射性部分、または免疫調節薬(IMiD)を含む。治療用途のための組成物のいくつかの実施形態では、提供される細胞とともに使用されるチェックポイント阻害剤は、PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2aR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara(レチノイン酸受容体アルファ)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E、または阻害性KIRを含む1つ以上のアンタゴニストチェックポイント分子を含む。治療用途のための組成物のいくつかの実施形態では、提供される細胞とともに使用されるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、IPH4102、IPH43、IPH33、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、およびそれらの誘導体または機能的同等物のうちの1つ以上を含む。治療用途のための組成物のいくつかの他の実施形態では、提供される細胞とともに使用されるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、ニボルマブ、およびペムブロリズマブのうちの少なくとも1つを含む。治療用途のための組成物のいくつかの実施形態では、治療薬は、ベネトクラクス、アザシチジン、およびポマリドミドのうちの1つ以上を含む。
治療用途のための組成物のいくつかの実施形態では、提供される細胞とともに使用される抗体は、抗CD20、抗CD22、抗HER2、抗CD52、抗EGFR、抗CD123、抗GD2、抗PDL1、および/または抗CD38抗体のうちのいずれか1つを含む。治療用途のための組成物のいくつかの実施形態では、提供される細胞とともに使用される抗体は、リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、オクレリズマブ、イノツズマブ、モキセツモマブ、エプラツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アレムツズマブ、セルツキシマブ(certuximab)、ジヌツキシマブ、アベルマブ、ダラツムマブ、イサツキシマブ、MOR202、7G3、CSL362、エロツズマブ、およびそれらのヒト化もしくはFc修飾されたバリアントもしくは断片、ならびにそれらの機能的同等物およびバイオシミラーのうちの1つ以上を含む。治療用途のための組成物のまたいくつかの他の実施形態では、提供された細胞とともに使用される抗体は、ダラツムマブを含む。
本出願はまた、養子細胞療法に好適な対象に組成物を導入することにより、本明細書に記載される細胞または治療組成物の治療用途を提供する。いくつかの実施形態では、養子細胞療法に好適であり、それを必要としている対象は、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、がん、またはウイルス感染を有する。
本出願のさらなる態様は、本明細書に記載される派生細胞を製造する方法を提供し、方法は、発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドと、任意選択で、(i)B2M陰性または低B2M、(ii)CIITA陰性または低CIITA、(iii)HLA-Gまたは切断不可能なHLA-Gの導入された発現、(iv)高親和性の切断不可能なCD16(hnCD16)またはそのバリアント、(v)キメラ抗原受容体(CAR)、(vi)細胞表面発現外因性サイトカインまたはその受容体の部分長または完全長ペプチド、(vii)CD38陰性、(viii)表1に列記される遺伝子型のうちの少なくとも1つ、(ix)TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、RAG1、および染色体6p21領域の任意の遺伝子の少なくとも1つに欠失または発現低下、ならびに(x)HLA-E、41BBL、CD4、CD8、CD16、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、Fc受容体、エンゲージャー、および二重もしくは多重特異性またはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも1つに導入されたまたは増加した発現のうちの1つ以上とを含むTCRneg iPSCを分化させることを含む。
製造方法のいくつかの実施形態では、方法は、(1)内因性TCRをノックアウトするため、ならびに(2)細胞に、細胞で発現すると表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する、tgTRAC、tgTRBC、tgTCRα、tgTCRβ、tgpTCRα、tgCD3(ε-δ)-TRAC、tgCD3(ε-γ)-TRBC、tgCD3(ε-γ)-TRAC、tgCD3(ε-δ)-TRBC、tgCD3(ε-γ)-ζ、tgCD3(ε-δ)-ζ、tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ、tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ、および/またはtgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζを含む少なくとも1つの外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを導入するため、ならびに任意選択でB2MおよびCIITAをノックアウトするか、またはHLA-Gもしくは切断不可能なHLA-G、高親和性の切断不可能なCD16もしくはそのバリアント、CAR、および/または細胞表面発現外因性サイトカインまたはその受容体の部分長または完全長ペプチドの発現を導入するために、クローンiPSCをゲノム操作することをさらに含み、CARおよび細胞表面発現外因性サイトカインもしくはその受容体の部分的または完全なペプチドは、別個の構築物またはバイシストロン性もしくはポリシストロン性構築物において共発現される。製造方法のいくつかの実施形態では、iPSCのゲノム操作は、標的化された編集を含む。いくつかの実施形態では、標的化された編集は、欠失、挿入、またはイン/デルを含む。いくつかの実施形態では、標的化された欠失/ノックアウトおよび標的化された挿入は、同時に実施され、挿入は、欠失が行われる位置にある。いくつかの実施形態では、標的化された欠失/ノックアウトおよび標的化された挿入は、任意の順序で連続して実施され、挿入および欠失は、同じ位置にあってもなくてもよい。いくつかの実施形態では、標的化された編集ツールは、CRISPR、ZFN、TALEN、ホーミングヌクレアーゼ、相同組換え、またはこれらの方法および組成物の任意の他の機能的変化を含む。
本出願はさらに、クローンiPSCの標的化された編集ツールを介した編集を提供し、それにより、内因性TCRαまたはTCRβを欠き、細胞で発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)、あるいは表1に列記される遺伝子型のうちの少なくとも1つを提供する、tgTRAC、tgTRBC、tgTCRα、tgTCRβ、tgpTCRα、tgCD3(ε-δ)-TRAC、tgCD3(ε-γ)-TRBC、tgCD3(ε-γ)-TRAC、tgCD3(ε-δ)-TRBC、tgCD3(ε-γ)-ζ、tgCD3(ε-δ)-ζ、tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ、tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ、および/またはtgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζを含む少なくとも1つの外因性タンパク質をコードする導入された1つ以上のポリヌクレオチドを含む、編集されたクローンiPSCを産生する。ゲノム標的化ツールを介した編集のいくつかの実施形態では、得られるTCRノックアウトは、内因性TCRα定常領域(TRAC)の標的化された妨害によるものである。ゲノム標的化ツールを介した編集のいくつかの実施形態では、得られるTCRノックアウトは、内因性TCRβ定常領域(TRBC)の標的化された妨害によるものである。上記のゲノム標的化ツールを介した編集のいくつかの実施形態では、編集は、内因性TRACまたはTRBC遺伝子座でのCARの挿入をさらに含み、かつ/またはCARは、TCRαまたはTCRβの内因性プロモーターによって駆動され、かつ/またはTCRは、CAR挿入によってノックアウトされる。上記のゲノム標的化ツールを介した編集のいくつかの実施形態では、編集は、内因性TRAC遺伝子座での、細胞で発現されると表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはそのサブドメイン(cs-CD3)を提供する、tgTRAC、tgTCRα、tgpTCRα、tgCD3(ε-δ)-TRAC、tgCD3(ε-γ)-TRAC、tgCD3(ε-γ)-ζ、tgCD3(ε-δ)-ζ、tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ、tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ、またはtgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζを含む外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入をさらに含む。上記のゲノム標的化ツールを介した編集のいくつかの実施形態では、編集は、内因性TRBC遺伝子座での、細胞で発現されると表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはそのサブドメイン(cs-CD3)を提供する、tgTRBC、tgTCRβ、tgCD3(ε-γ)-TRBC、tgCD3(ε-δ)-TRBC、tgCD3(ε-γ)-ζ、tgCD3(ε-δ)-ζ、tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ、tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ、および/またはtgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζを含む外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入をさらに含む。
提供される細胞またはその集団の一実施形態では、細胞は、人工多能性細胞(iPSC)、クローンiPSC、またはクローンiPS細胞株細胞、または該iPSCを分化させることから得られる派生細胞であり、細胞はTCRnegであり、発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)は、非結合組換えTCR(nb-rTCR)、定義された組換えTCR(d-rTCR)、組換えプレTCR(p-rTCR)と会合するか、または非結合組換えTCRに固定される(nb-rTCR-CD3)か、またはCD3キメラ鎖(ccCD3)である。一実施形態では、nb-rTCRは、tgTRACおよびtgTRBCの一方または両方を含む。一実施形態では、d-rTCRは、tgTCRα、および任意選択でtgTCRβを含み、tgTCRαおよびtgTCRβのそれぞれは、それぞれの定義された可変領域を含む。一実施形態では、p-rTCRは、tgpTCRα、および任意選択でtgTRBCまたはtgTCRβを含み、tgTCRβは、定義された可変領域を含む。一実施形態では、nb-rTCR-CD3は、融合タンパク質:(1)tgCD3(ε-δ)-TRAC、(2)tgCD3(ε-γ)-TRBC、(3)tgCD3(ε-γ)-TRAC、および/または(4)tgCD3(ε-δ)-TRBCのうちの1つ以上を含み、融合タンパク質は、CD3ε、CD3δ、CD3γの完全長もしくは部分長の外部ドメイン、および/または完全長もしくは部分長のTRACもしくはTRBCを含む。一実施形態では、ccCD3は、融合タンパク質:tgCD3(ε-γ)-ζ、tgCD3(ε-δ)-ζ、tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ、tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ、およびtgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζのうちの少なくとも1つを含み、CD3ε、CD3δ、および/またはCD3γタンパク質の完全長または部分長の外部ドメインを含む融合タンパク質は、CDζタンパク質の完全長または部分長の内部ドメインを含む細胞質ドメイン、および任意選択でCD28シグナル伝達ドメインおよび41BBシグナル伝達ドメインの一方または両方をさらに含む。さらに別の実施形態では、融合タンパク質tgCD3(ε-δ)-TRACを含むnb-rTCR-CD3は、tgTRBCまたはtgTCRβをさらに含む。さらに別の実施形態では、融合タンパク質tgCD3(ε-γ)-TRBCを含むnb-rTCR-CD3は、tgTRACまたはtgTCRαをさらに含む。あるいは、さらに別の実施形態では、tgTCRαおよびtgTCRβを含むd-rTCRは、インバリアントNKT細胞のTCRαおよびTCRβを含む。
上記の実施形態を考慮して、提供される細胞は、いくつかの態様では、組換えTCR:nb-rTCR、d-rTCR、もしくはp-rTCRのうちの1つを含み、組換えTCRは、内因性CD3サブユニットと複合体を形成し、それにより内因性CD3サブユニットの細胞表面提示およびそのシグナル伝達を可能にする。いくつかの他の実施形態では、細胞は、nb-rTCR-CD3またはccCD3を含み、それにより、外因性CD3サブユニットの細胞表面提示およびそのシグナル伝達を可能にする。
本出願の一態様は、本明細書に記載されるクローンiPSC細胞株細胞を含むクローンマスター細胞バンクを提供する。本出願の別の態様は、本明細書に記載されるように、iPSCおよび該iPSCから分化した派生細胞の様々な実施形態を含む、細胞またはその集団を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、該派生細胞を含む組成物は、治療用途に好適である。治療用途のための組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、必要に応じて、派生細胞に加えて、1つ以上の治療薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、該治療薬は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、成長因子、小RNA、dsRNA(二本鎖RNA)、単核血液細胞、フィーダー細胞、フィーダー細胞構成要素もしくはその置換因子、目的の1つ以上のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤もしくは放射性部分、または免疫調節薬(IMiD)を含む。
本出願の追加の態様は、養子細胞療法に好適な対象に組成物を導入することによる、様々な実施形態における該治療組成物の治療用途を提供し、対象は、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、がん、またはウイルス感染を有する。
本出願のさらなる態様は、TCRneg iPSCを分化させることにより派生エフェクター細胞を製造する方法を提供し、iPSCは、発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含み、任意選択で、iPSCは、(i)B2M陰性または低B2M、(ii)CIITA陰性または低CIITA、(iii)HLA-Gまたは切断不可能なHLA-Gの導入された発現、(iv)高親和性の切断不可能なCD16(hnCD16)またはそのバリアント、(v)キメラ抗原受容体(CAR)、(vi)細胞表面発現外因性サイトカインまたはその受容体の部分長または完全長ペプチド、(vii)表1に列記される遺伝子型のうちの少なくとも1つ、(viii)CD38、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、RAG1、および染色体6p21領域の任意の遺伝子の少なくとも1つに欠失または発現低下、(ix)HLA-E、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD16、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、TCR、Fc受容体、エンゲージャー、および二重もしくは多重特異性またはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも1つにおける導入された、または増加した発現のうちの1つ以上をさらに含む。本出願の細胞を製造する方法のいくつかの実施形態では、方法は、クローンiPSCのTCRをノックアウトして、ゲノム操作されたTCRneg iPSCを得ることによって、および同時にまたは続いて、1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドをノックインすることによって、またはインバリアントNKT細胞をiPSCに再プログラミングして、T細胞-TCRではなくiTCRαβを含むクローンiPSCを提供することによって、細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供するステップと、B2MおよびCIITAをノックアウトするか、またはHLA-Gもしくは切断不可能なHLA-G、高親和性の切断不可能なCD16もしくはそのバリアント、CAR、および/または細胞表面発現外因性サイトカインもしくはその受容体の部分長または完全長ペプチドの発現を導入することによって、TCR陰性細胞をゲノム操作する任意選択のステップとをさらに含み、該CARおよび細胞表面発現外因性サイトカインもしくはその受容体の部分的または完全なペプチドは、別個の構築物またはバイシストロン性構築物において共発現される。
細胞を製造する方法の一実施形態では、1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドをノックインしてcs-CD3を提供するステップは、(i)発現されるとnb-rTCRを提供するポリヌクレオチドをコードするtgTRACおよびtgTRBCの一方または両方、(ii)発現されるとd-rTCRを提供するポリヌクレオチドをコードするtgTCRα、および任意選択でtgTCRβ(tgTCRαおよびtgTCRβのそれぞれは、それぞれの定義された可変領域を含む)、(iii)p-rTCRを提供するポリヌクレオチドをコードするtgpTCRα、および任意選択でtgTRBCもしくはtgTCRβ(tgTCRβは、定義された可変領域を含む)、(iv)nb-rTCR-CD3を提供する、融合タンパク質:(1)tgCD3(ε-δ)-TRAC、(2)tgCD3(ε-γ)-TRBC、(3)tgCD3(ε-γ)-TRAC、および/または(4)tgCD3(ε-δ)-TRBCのうちの1つ以上をコードする1つ以上のポリヌクレオチド(融合タンパク質は、CD3ε、CD3δ、CD3γの完全長もしくは部分長の外部ドメイン、および/または完全長または部分長のTRACまたはTRBCを含む)、あるいは(v)ccCD3を提供する、融合タンパク質:(1)tgCD3(ε-γ)-ζ、(2)tgCD3(ε-δ)-ζ、(3)tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ、(4)tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ、および(5)tgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζのうちの1つ以上をコードする1つ以上のポリヌクレオチド(融合タンパク質は、CD3ε、CD3δ、および/またはCD3γタンパク質の完全長もしくは部分長の外部ドメインを含み、CDζタンパク質の完全長または部分長の内部ドメインを含む細胞質ドメインと、任意選択でCD28シグナル伝達ドメインおよび41BBシグナル伝達ドメインの一方または両方をさらに含む)のうちの1つをiPSCに導入することをさらに含む。記載される細胞の製造方法のいくつかの実施形態では、融合タンパク質tgCD3(ε-δ)-TRACをコードする1つ以上のポリヌクレオチドをiPSCに導入するステップは、nb-rTCR-CD3を提供するtgTRBCまたはtgTCRβをコードするポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質tgCD3(ε-γ)-TRBCをコードする1つ以上のポリヌクレオチドをiPSCに導入するステップは、nb-rTCR-CD3を提供するtgTRACまたはtgTCRαをさらに含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質tgCD3(ε-γ)-TRBCをコードする1つ以上のポリヌクレオチドをiPSCに導入するステップは、nb-rTCR-CD3を提供するtgTRACまたはtgTCRαをさらに含む。いくつかの他の実施形態では、d-rTCRを提供する、tgTCRαをコードするポリヌクレオチド、および任意選択でtgTCRβをコードするポリヌクレオチドをiPSCに導入するステップでは、tgTCRαおよびtgTCRβはそれぞれ、インバリアントNKT細胞のTCRαおよびTCRβを含む。
提供される細胞の製造方法の様々な実施形態では、ゲノム操作は、欠失および/または挿入を含む標的化された編集である。そのような標的化された編集は、CRISPR、ZFN、TALEN、ホーミングヌクレアーゼ、相同性組換え、またはこれらのツールの任意の他の機能的変化によって実施され得る。本発明の一態様は、本明細書で提供される様々な実施形態のクローンiPSCのCRISPRを介した編集を提供し、それにより、TCRnegであり、発現すると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む編集されたiPSCを得、編集されたクローンiPSCは、表1に列記される遺伝子型のうちの少なくとも1つを含む。いくつかの実施形態では、CRISPRを介した編集は、TRACもしくはTRBC遺伝子座においてCARの挿入をさらに含み、かつ/またはCARは、TCRの内因性プロモーターによって駆動され、かつ/またはTCRは、CAR挿入によってノックアウトされる。
本出願のまた別の態様は、組み合わせ治療の方法を提供し、方法は、TCRnegと、発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドと、選択された多重特異性エンゲージャーとを含むエフェクター細胞を、治療中の対象に提供することを含み、エフェクター細胞は、提供される派生細胞を含む。いくつかの実施形態では、該方法における選択された多重特異性エンゲージャーは、(i)T細胞エンゲージャー、(ii)NK細胞エンゲージャー、(iii)二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)、(iv)二重特異性キラー細胞エンゲージャー(BiKE)、(v)三重特異性キラー細胞エンゲージャー(TriKE)、(vi)CD3エンゲージャー、または(vii)CD16エンゲージャーのうちの少なくとも1つである。いくつかの実施形態では、選択された多重特異性エンゲージャーは、CD3エンゲージャーであり、CD3エンゲージャーは、cs-CD3に結合する第1の可変セグメントと、(i)ADGRE2、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、CCRI、CCR4、がん胎児性抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、サイトメガロウイルス(CMV)感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質2(EGP2)、上皮糖タンパク質-40(EGP-40)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、EGFRvIII、受容体チロシン-タンパク質キナーゼerb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB葉酸結合タンパク質(FBP)、胎児アセチルコリン受容体(AChR)、葉酸受容体-a、ガングリオシドG2(GD2)、ガングリオシドG3(GD3)、ヒト上皮成長因子受容体2(HER-2)、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、ICAM-1、インテグリンB7、インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2(IL-13Rα2)、κ-軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体(KDR)、ルイスA(CA19.9)、ルイスY(LeY)、L1細胞接着分子(L1-CAM)、LILRB2、メラノーマ抗原ファミリーA 1(MAGE-A1)、MICA/B、ムチン1(Muc-1)、ムチン16(Muc-16)、メソセリン(MSLN)、NKCSI、NKG2Dリガンド、c-Met、がん-精巣抗原NY-ESO-1、腫瘍胎児性抗原(h5T4)、PRAME、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、PRAME前立腺特異的膜抗原(PSMA)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG-72)、TIM-3、TRBCI、TRBC2、血管内皮成長因子R2(VEGF-R2)、ウィルムス腫瘍タンパク質(WT-1)、および/もしくは病原体抗原、または(ii)BCMA、CD19、CD20、CD33、CD38、CD52、CD123、CEA、EGFR、EpCAM、GD2、GPA33、HER2、MICA/B、PDL1、および/もしくはPSMA、または(iii)CD19、CD33、CD123、CEA、EpCAM、GPA33、HER2、および/もしくはPSMAのうちの少なくとも1つを含む抗原に結合する第2の可変セグメントとを含む。いくつかの実施形態では、CD3エンゲージャーは、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、エルツマキソマブ、RO6958688、AFM11、MT110/AMG110、MT111/AMG211/MEDI-565、AMG330、MT112/BAY2010112、MOR209/ES414、MGD006/S80880、MGD007、および/またはFBTA05のうちの少なくとも1つを含む。いくつかの実施形態では、CD3エンゲージャーは、エフェクター細胞と同時にまたは続いて対象に投与される。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、派生NK細胞または派生T細胞を含む派生造血細胞を含み、派生NK細胞または派生T細胞は、CD38ノックアウト、高親和性の切断不可能なCD16またはそのバリアントを含み、任意選択で、(i)B2MおよびCIITAノックアウト、(ii)HLA-Gまたは切断不可能なHLA-G、CAR、および/もしくは細胞表面発現外因性サイトカインもしくはその受容体の部分長もしくは完全長のペプチドの導入された発現(CARおよび細胞表面発現外因性サイトカインまたはその受容体の部分長または完全長ペプチドは、別個の構築物またはバイシストロン性構築物において共発現される)、ならびに/あるいは(iii)表1に列記される遺伝子型のうちの少なくとも1つを含む。
本出願のまた別の態様は、養子細胞治療におけるエフェクター細胞に対するレシピエントT細胞によるアロ拒絶を低減または防止する方法を提供し、方法は、治療中の対象に、(i)抗CD3剤、および(ii)TCRnegと、CD3エンゲージャーで予め充填された細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)とを含むエフェクター細胞を提供することを含み、エフェクター細胞は、本明細書に提供される派生細胞を含む。いくつかの実施形態では、該抗CD3剤は、CD3抗体またはCD3-CARであり、CD3-CARはNK細胞に含まれ、抗CD3剤はレシピエントT細胞を不活性化し、それにより、アロ拒絶を低減または防止する。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞のcs-CD3に結合する第1の可変セグメントを含む該CD3エンゲージャーは、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、がん、またはウイルス感染に関連する抗原に結合する第2の可変セグメントを含む。抗原に結合する第2の可変セグメントを含むCD3エンゲージャーのいくつかの実施形態では、抗原は、(i)ADGRE2、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、CCRI、CCR4、がん胎児性抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、サイトメガロウイルス(CMV)感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質2(EGP2)、上皮糖タンパク質-40(EGP-40)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、EGFRvIII、受容体チロシン-タンパク質キナーゼerb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB葉酸結合タンパク質(FBP)、胎児アセチルコリン受容体(AChR)、葉酸受容体-a、ガングリオシドG2(GD2)、ガングリオシドG3(GD3)、ヒト上皮成長因子受容体2(HER-2)、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、ICAM-1、インテグリンB7、インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2(IL-13Rα2)、κ-軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体(KDR)、ルイスA(CA19.9)、ルイスY(LeY)、L1細胞接着分子(L1-CAM)、LILRB2、メラノーマ抗原ファミリーA 1(MAGE-A1)、MICA/B、ムチン1(Muc-1)、ムチン16(Muc-16)、メソセリン(MSLN)、NKCSI、NKG2Dリガンド、c-Met、がん-精巣抗原NY-ESO-1、腫瘍胎児性抗原(h5T4)、PRAME、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、PRAME前立腺特異的膜抗原(PSMA)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG-72)、TIM-3、TRBCI、TRBC2、血管内皮成長因子R2(VEGF-R2)、ウィルムス腫瘍タンパク質(WT-1)、および/もしくは病原体抗原、または(ii)BCMA、CD19、CD20、CD33、CD38、CD52、CD123、CEA、EGFR、EpCAM、GD2、GPA33、HER2、MICA/B、PDL1、および/もしくはPSMA、または(iii)CD19、CD33、CD123、CEA、EpCAM、GPA33、HER2、および/もしくはPSMAのうちの少なくとも1つを含む。さらにいくつかの他の実施形態では、CD3エンゲージャーは、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、エルツマキソマブ、RO6958688、AFM11、MT110/AMG110、MT111/AMG211/MEDI-565、AMG330、MT112/BAY2010112、MOR209/ES414、MGD006/S80880、MGD007、および/またはFBTA05のうちの少なくとも1つを含む。
本明細書で提供される組成物および方法の様々な目的および利点は、例示および例として、本発明のある特定の実施形態が示される添付の図面と併せて以下の説明から明らかになるであろう。
iPSC(人工多能性幹細胞)のゲノム修飾には、ポリヌクレオチドの挿入、欠失、および置換が含まれる。ゲノム操作されたiPSCにおける外因性遺伝子発現は、元のゲノム操作されたiPSCの長期クローン拡大後、細胞分化後、およびゲノム操作されたiPSCに由来する細胞からの脱分化細胞型において、遺伝子サイレンシングまたは遺伝子発現の低下などの問題に遭遇することが多い。一方、末梢血、臍帯血、または任意の他のドナー組織から単離されたT細胞またはNK細胞などの一次免疫細胞の直接操作は困難であり、養子細胞療法のための操作された免疫細胞の調製および送達に障害を示す。本発明は、生着、輸送、ホーミング、遊走、細胞傷害性、生存能、維持、拡大、寿命、自己再生、持続性、および/または生存に関連する改善された治療特性を提供する、自殺遺伝子および他の機能的モダリティを含む1つ以上の外因性遺伝子を、HSC(造血幹細胞および前駆細胞)、T細胞前駆細胞、NK細胞前駆細胞、T細胞、NKT細胞、NK細胞を含むがこれらに限定されないiPSCから分化した派生細胞に安定して組み込むための効率的で信頼性のある、標的化されたアプローチを提供する。
定義
本明細書で別段の定義がない限り、本出願に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上別段の必要がない限り、単数形には複数形が含まれ、複数形には単数形が含まれるものとする。
本明細書で別段の定義がない限り、本出願に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上別段の必要がない限り、単数形には複数形が含まれ、複数形には単数形が含まれるものとする。
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、したがって異なり得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明することを目的としており、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
本明細書で使用される場合、冠詞「a」、「an」、および「the」は、冠詞の文法的目的語の1つまたは2つ以上(すなわち、少なくとも1つ)を指すために本明細書で使用される。例として、「要素(an element)」は、1つの要素または2つ以上の要素を意味する。
代替案(例えば、「または」)の使用は、代替案の一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。
「および/または」という用語は、代替案の一方または両方のいずれかを意味すると理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さと比較して、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、または1%まで変動する数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの、±15%、±10%、±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%、または±1%の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲を指す。
本明細書で使用される場合、「実質的に」または「本質的に」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さと比較して、約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%以上の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態では、「本質的に同じ」または「実質的に同じ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さとほぼ同じ数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲を指す。
本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」および「本質的に含まない」という用語は交換可能に使用され、細胞集団または培養培地などの組成物を説明するために使用される場合、特定の物質またはその供給源を含まない、例えば、特定の物質またはその供給源を95%含まない、96%含まない、97%含まない、98%含まない、99%含まないか、または従来の手段によって測定されるとき検出不能である組成物を指す。組成物中のある特定の成分または物質を「含まない」または「本質的に含まない」という用語はまた、そのような成分または物質が、(1)任意の濃度で組成物に含まれない、または(2)機能的に不活性だが、低濃度で組成物に含まれることを意味する。同様の意味は、「不在」という用語に適用することができ、特定の物質または組成物のその供給源が不在であることを指す。
本明細書全体を通して、文脈上別段の必要がない限り、「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、および「含む(comprising)」という用語は、記載されたステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を含むことを意味するが、任意の他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を除外することを意味しないと理解される。特定の実施形態では、「含む(include)」、「有する」、「含有する」、および「含む(comprise)」という用語は、同義語として使用される。
「からなる」とは、「からなる」という句に続くものを含み、これに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という句は、列記された要素が必要または必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。
「本質的にからなる」とは、句の後に列記された任意の要素を含むことを意味し、列記される要素の開示において特定された活性または動作に干渉または寄与しない他の要素に限定される。したがって、「本質的にからなる」という句は、列記される要素が必要または必須であることを示すが、他の要素は任意選択ではなく、列記された要素の活性または動作に影響を及ぼすか否かに応じて存在しても存在しなくてもよい。
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加の実施形態」、または「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせへの言及は、実施形態に関連して説明される特定の特色、構造、または特徴は、本発明の少なくとも1つの実施形態に含まれる。したがって、本明細書全体を通して様々な場所での前述の句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を参照しているわけではない。さらに、特定の特色、構造、または特徴は、1つ以上の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。
「エクスビボ」という用語は、一般に、好ましくは自然条件の改変を最小限に抑えて、生体外の人工環境の生体組織内または生体組織上で行われる実験または測定など、生体外で行われる活動を指す。特定の実施形態では、「エクスビボ」手順は、生物から採取され、通常は無菌条件下で、典型的には数時間または最大約24時間(しかしながら、状況に応じて最大48または72時間以上を含む)実験装置で培養された生細胞または組織を伴う。ある特定の実施形態では、そのような組織または細胞を収集して凍結し、後にエクスビボ処理のために解凍することができる。生細胞または組織を使用して数日より長く続く組織培養実験または手順は、典型的には、「インビトロ」であるとみなされるが、ある特定の実施形態では、この用語は、エクスビボと交換可能に使用され得る。
「インビボ」という用語は、一般に、生体内で行われる活動を指す。
本明細書で使用される場合、「再プログラミング」または「脱分化」または「分化能の増加」または「発生能の増加」という用語は、細胞の分化能を増加させるか、または細胞をより分化していない状態に脱分化する方法を指す。例えば、分化能が増加した細胞は、再プログラミングされていない状態の同じ細胞と比較して、より大きな発生可塑性を有する(つまり、より多くの細胞型に分化することができる)。言い換えれば、再プログラミングされた細胞は、再プログラミングされていない状態の同じ細胞よりもあまり分化しない状態にある細胞である。
本明細書で使用される場合、「分化」という用語は、特殊化していない(「コミットしていない」)またはあまり特殊化していない細胞が、例えば、血液細胞または筋細胞などの特殊化された細胞の特色を獲得するプロセスである。分化したまたは分化誘導された細胞は、細胞の系統内でより特殊化した(「コミットした」)位置をとった細胞である。「コミットした」という用語は、分化のプロセスに適用される場合、通常の状況下で、特定の細胞型または細胞型のサブセットに分化し続ける点まで分化経路を進んでおり、通常の状況下では、異なる細胞型に分化するか、またはあまり分化しない細胞型に戻ることができない細胞を指す。本明細書で使用される場合、「多能性」という用語は、体または体細胞のすべての系統(すなわち、胚そのもの)を形成する細胞の能力を指す。例えば、胚性幹細胞は、外胚葉、中胚葉、内胚葉の3つの胚葉のそれぞれから細胞を形成できる多能性幹細胞の一種である。多能性は、完全な生物を生み出すことができない不完全または部分的に多能性の細胞(例えば、エピブラスト幹細胞またはEpiSC)から、完全な生物(例えば、胚性幹細胞)を生み出すことができるより原始的でより多能性の細胞に及ぶ発生能の連続体である。
本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」またはiPSCという用語は、幹細胞が、誘導されたまたは変更された分化した成体、新生児、または胎児細胞から、再プログラミング因子および/または小分子化学駆動された方法を使用して、幹細胞がインビトロで産生される、すなわち、中胚葉、内胚葉、および外胚葉の3つすべての胚葉または皮層すべての組織に分化することができる細胞に再プログラミングされることを意味する。産生されたiPSCは、自然界に見られる細胞を指さない。
本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊の天然に存在する多能性幹細胞を指す。胚性幹細胞は多能性であり、発生中に外胚葉、内胚葉、中胚葉の3つの主要な胚葉のすべての誘導体を生じさせる。それらは胚体外膜または胎盤に寄与しない、すなわち、全能性ではない。
本明細書で使用される場合、「多分化能幹細胞」という用語は、1つ以上の胚葉(外胚葉、中胚葉、および内胚葉)の細胞に分化するが、3つすべてにではない発生の可能性を有する細胞を指す。したがって、多分化能細胞は「部分的に分化した細胞」とも呼ばれる。多分化能細胞は当技術分野で周知であり、多分化能細胞の例には、例えば、造血幹細胞および神経幹細胞などの成体幹細胞が含まれる。「多分化能」は、細胞が所与の系統で多くの細胞型を形成する可能性があるが、他の系統の細胞は形成しない可能性があることを示す。例えば、多分化能造血細胞は、多くの異なる血液細胞型(赤、白、血小板など)を形成することができるが、ニューロンを形成することはできない。したがって、「多分化能」という用語は、全能性および多能性よりも低い発生能の程度を有する細胞の状態を指す。
多能性は、部分的に、細胞の多能性の特徴を評価することによって決定することができる。多能性の特徴には、(i)多能性幹細胞の形態、(ii)無制限の自己再生の可能性、(iii)SSEA1(マウスのみ)、SSEA3/4、SSEA5、TRA1-60/81、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/プロミニン、CD140a、CD56、CD73、CD90、CD105、OCT4、NANOG、SOX2、CD30、および/またはCD50を含むがこれらに限定されない多能性幹細胞マーカーの発現、(iv)3つすべての体細胞系統(外胚葉、中胚葉、内胚葉)に分化する能力、(v)3つの体細胞系統からなる奇形腫の形成、ならびに(vi)3つの体細胞系統からの細胞からなる胚様体の形成が含まれるが、これらに限定されない。
後期胚盤胞のエピブラスト幹細胞(EpiSC)に類似した多能性の「プライミング」または「準安定」状態、および初期/着床前胚盤胞の細胞塊に類似した多能性の「ナイーブ」または「グラウンド」状態の2種類の多能性が以前に説明されている。両方の多能性状態は上述のような特徴を呈するが、ナイーブまたはグラウンド状態はさらに、(i)雌性細胞におけるX染色体の事前不活性化または再活性化、(ii)単一細胞培養中のクローン性および生存の改善、(iii)DNAメチル化の全体的な低下、(iv)発生制御遺伝子プロモーターへのH3K27me3抑制クロマチンマーク沈着の低下、および(v)プライミング状態の多能性細胞と比較して分化マーカーの発現の低下を呈する。外因性多能性遺伝子が体細胞に導入され、発現され、その後、サイレンシングされるか、または結果として得られる多能性細胞から除去される細胞再プログラミングの標準的な方法論は、一般に、多能性のプライミング状態の特徴を有するとみなされる。標準的な多能性細胞培養条件下では、そのような細胞は、グラウンド状態の特徴が観察される外因性導入遺伝子の発現が維持されない限り、プライミング状態のままであり、グラウンド状態の特徴が観察される。
本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞形態」という用語は、胚性幹細胞の古典的な形態学的特色を指す。正常な胚性幹細胞の形態は、核と細胞質の比率が高く、核小体が顕著に存在し、典型的な細胞間間隔がある、形状が丸くて小さいことを特徴とする。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、任意の動物、好ましくはヒト患者、家畜、または他の飼育動物を指す。
「多能性因子」または「再プログラミング因子」は、単独で、または他の薬剤と組み合わせてのいずれかで、細胞の発生能を増加させることができる薬剤を指す。多能性因子には、細胞の発生能を増加させることができるポリヌクレオチド、ポリペプチド、および小分子が含まれるが、これらに限定されない。例示的な多能性因子には、例えば、転写因子および小分子再プログラミング剤が含まれる。
「培養」または「細胞培養」は、インビトロ環境における細胞の維持、成長、および/または分化を指す。「細胞培養培地」、「培養培地」(それぞれの場合において単数の「培地」)、「補充成分」および「培地補充成分」は、細胞培養を培養する栄養組成物を指す。
「培養する」または「維持する」とは、例えば滅菌プラスチック(またはコーティングされたプラスチック)細胞培養皿またはフラスコ内で、組織外または体外で細胞を維持、増殖(成長)、および/または分化させることを指す。「培養」または「維持」は、細胞を増殖および/または維持するのに役立つ栄養素、ホルモン、および/または他の因子の供給源として培養培地を利用し得る。
本明細書で使用される場合、「中胚葉」という用語は、初期胚発生中に現れ、循環系の血液細胞、筋肉、心臓、真皮、骨格、ならびに他の支持組織および結合組織を含む様々な特殊化した細胞型を生じさせる3つの胚葉のうちの1つを指す。
本明細書で使用される場合、「二次造血内皮細胞」(HE)または「多能性幹細胞由来の二次造血内皮細胞」(iHE)という用語は、内皮造血転換と呼ばれるプロセスにおいて造血幹細胞および前駆細胞を生じさせる内皮細胞のサブセットを指す。胚における造血細胞の発達は、側板中胚葉から血管芽細胞を経て二次造血内皮細胞および造血前駆細胞へと順次進行する。
「造血幹細胞および前駆細胞」、「造血幹細胞」、「造血前駆細胞」、または「造血前駆細胞」という用語は、造血系統にコミットしているが、さらなる造血分化が可能であり、多分化能造血幹細胞(血球芽細胞)、骨髄系前駆細胞、巨核球前駆細胞、赤血球前駆細胞、およびリンパ系前駆細胞を含む細胞を指す。造血幹細胞および前駆細胞(HSC)は、骨髄(単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球/血小板、樹状細胞)、およびリンパ系(T細胞、B細胞、NK細胞)を含むすべての血液細胞型を生じさせる多分化能幹細胞である。本明細書で使用される「二次造血幹細胞」という用語は、T細胞、NK細胞、およびB細胞を含む成熟骨髄およびリンパ系細胞型の両方を生じさせることができるCD34+造血細胞を指す。造血細胞には、原始赤血球、巨核球、およびマクロファージを生じさせる原始造血細胞の様々なサブセットも含まれる。
本明細書で使用される場合、「Tリンパ球」および「T細胞」という用語は、交換可能に使用され、胸腺で成熟を完了し、体内の特定の外来抗原の特定ならびに他の免疫細胞の活性化および非活性化を含む、免疫系において様々な役割を有する主要な型の白血球を指す。T細胞は、培養されたT細胞、例えば、初代T細胞、もしくは培養されたT細胞株、例えば、ジャーカット、SupT1などからのT細胞、または哺乳動物から得られたT細胞などの任意のT細胞であり得る。T細胞は、CD3+細胞であり得る。T細胞は、任意の型のT細胞であり得、CD4+/CD8+二重陽性T細胞、CD4+ヘルパーT細胞(例えば、Th1およびTh2細胞)、CD8+T細胞(例えば、細胞傷害性T細胞)、末梢血単核細胞(PBMC)、末梢血白血球(PBL)、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、メモリーT細胞、ナイーブT細胞、制御性T細胞、ガンマデルタT細胞(γδT細胞)などを含むがこれらに限定されない任意の発生段階のものであり得る。追加の型のヘルパーT細胞には、Th3(Treg)、Th17、Th9、またはTfh細胞などの細胞が含まれる。追加の型のメモリーT細胞には、セントラルメモリーT細胞(Tcm細胞)、エフェクターメモリーT細胞(Tem細胞およびTEMRA細胞)などの細胞が含まれる。T細胞はまた、T細胞受容体(TCR)またはキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように修飾されたT細胞などの遺伝子操作されたT細胞を指し得る。T細胞はまた、幹細胞または前駆細胞から分化され得る。
「CD4+T細胞」は、表面にCD4を発現し、細胞媒介性免疫応答に関連するT細胞のサブセットを指す。それらは、刺激後の分泌プロファイルを特徴とし、これには、IFN-ガンマ、TNF-アルファ、IL2、IL4、およびIL10などのサイトカインの分泌が含まれ得る。「CD4」は、最初はTリンパ球上の分化抗原として定義された55kDの糖タンパク質であるが、単球/マクロファージを含む他の細胞にも見られる。CD4抗原は、免疫グロブリン超遺伝子ファミリーのメンバーであり、MHC(主要組織適合遺伝子複合体)クラスII制限免疫応答の関連認識要素として関与している。Tリンパ球では、それらはヘルパー/インデューサーサブセットを定義する。
「CD8+T細胞」とは、表面にCD8を発現し、MHCクラスI制限され、細胞傷害性T細胞として機能するT細胞のサブセットを指す。「CD8」分子は、胸腺細胞、ならびに細胞傷害性およびサプレッサーTリンパ球に見られる分化抗原である。CD8抗原は、免疫グロブリン超遺伝子ファミリーのメンバーであり、主要組織適合遺伝子複合体クラスI制限相互作用における関連認識要素である。
本明細書で使用される場合、「NK細胞」または「ナチュラルキラー細胞」という用語は、CD56またはCD16の発現およびT細胞受容体(CD3)の不在によって定義される末梢血リンパ球のサブセットを指す。本明細書で使用される場合、「適応NK細胞」および「メモリーNK細胞」という用語は、交換可能であり、表現型的にCD3-およびCD56+であり、NKG2CおよびCD57のうちの少なくとも1つ、および任意選択でCD16を発現するが、PLZF、SYK、FceRγ、およびEAT-2のうちの1つ以上の表現に欠くNK細胞のサブセットを指す。いくつかの実施形態では、CD56+NK細胞の単離された亜集団は、CD16、NKG2C、CD57、NKG2D、NCRリガンド、NKp30、NKp40、NKp46、活性化および阻害性KIR、NKG2A、ならびに/またはDNAM-1の発現を含む。CD56+は、暗いまたは明るい発現であり得る。
本明細書で使用される場合、「NKT細胞」または「ナチュラルキラーT細胞」という用語は、T細胞受容体(TCR)を発現するCD1d制限T細胞を指す。従来の主要組織適合(MHC)分子によって提示されるペプチド抗原を検出する従来のT細胞とは異なり、NKT細胞は、非古典的なMHC分子であるCD1dによって提示される脂質抗原を認識する。2つの型のNKT細胞が認識されている。インバリアントまたはI型NKT細胞は、非常に限られたTCRレパートリー、つまり、限られたスペクトルのβ鎖(ヒトではVβ11)に関連する標準的なα鎖(ヒトではVα24-Jα18)を発現する。非古典的または非インバリアントII型NKT細胞と呼ばれるNKT細胞の2番目の集団は、より不均一なTCRαβの使用を示す。I型NKT細胞は、免疫療法に好適であると考えられる。適応またはインバリアント(I型)NKT細胞は、以下のマーカー:TCR Va24-Ja18、Vb11、CD1d、CD3、CD4、CD8、aGalCer、CD161、およびCD56のうちの少なくとも1つ以上の発現により特定され得る。
本明細書で使用される場合、「単離された」などの用語は、元の環境から分離された、すなわち、単離された細胞の環境は、「単離されていない」参照細胞が存在する環境で見出される少なくとも1つの構成要素を実質的に含まない細胞または細胞の集団を指す。この用語には、自然環境で見出される一部またはすべての構成要素から取り出された、例えば、組織や生検試料から単離された細胞が含まれる。この用語はまた、細胞が天然に存在しない環境で見出される、例えば、細胞培養または細胞懸濁液から単離されるため、少なくとも1つ、いくつか、またはすべての構成要素から取り出される細胞を含む。したがって、単離された細胞は、自然界に見られる場合、または天然に存在しない環境で成長するか、保存されるか、もしくは生存する場合、他の物質、細胞、または細胞集団を含む少なくとも1つの構成要素から部分的または完全に分離される。単離された細胞の特定の例には、部分的に純粋な細胞組成物、実質的に純粋な細胞組成物、および天然に存在しない培地で培養された細胞が含まれる。単離された細胞は、所望の細胞またはその集団を環境中の他の物質または細胞から分離することから、または環境から1つ以上の他の細胞集団もしくは亜集団を取り除くことから得ることができる。
本明細書で使用される場合、「精製する」などの用語は、純度を高めることを指す。例えば、純度を少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、または100%に増加させることができる。
本明細書で使用される場合、「コード化」という用語は、ヌクレオチドの定義された配列(すなわち、rRNA、tRNA、およびmRNA)またはアミノ酸の定義された配列およびそれらから生じる生物学的特性のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび巨大分子の合成のためのテンプレートとして役立つ、遺伝子、cDNA、またはmRNAなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳が細胞または他の生物学的系においてタンパク質を産生する場合、タンパク質をコードする。mRNA配列と同一であり、通常配列表に提供されるヌクレオチド配列であるコード鎖と、遺伝子またはcDNAの転写のテンプレートとして使用される非コード鎖との両方を、その遺伝子またはcDNAのタンパク質または他の産物をコードすると称することができる。
「構築物」は、インビトロまたはインビボのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む巨大分子または分子の複合体を指す。本明細書で使用される場合、「ベクター」は、外来遺伝子材料の標的細胞への送達または移動を指向することができる任意の核酸構築物を指し、標的細胞で複製および/または発現することができる。本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、送達される構築物を含む。ベクターは、線状または環状分子であり得る。ベクターは、組み込みまたは非組み込みであり得る。ベクターの主な種類には、プラスミド、エピソームベクター、ウイルスベクター、コスミド、および人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。
「組み込み」とは、構築物の1つ以上のヌクレオチドが細胞ゲノムに安定して挿入される、すなわち、細胞の染色体DNA内の核酸配列に共有結合されることを意味する。「標的化された組み込み」とは、構築物のヌクレオチドが、予め選択された部位または「組み込み部位」で細胞の染色体またはミトコンドリアDNAに挿入されることを意味する。本明細書で使用される場合、「組み込み」という用語はさらに、組み込み部位での内因性配列またはヌクレオチドの欠失の有無にかかわらず、構築物の1つ以上の外因性配列またはヌクレオチドの挿入を伴うプロセスを指す。挿入部位に欠失がある場合、「組み込み」は、欠失される内因性配列またはヌクレオチドを1つ以上の挿入されたヌクレオチドに置き換えることをさらに含み得る。
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、参照される分子または参照される活性が宿主細胞に導入されるか、または宿主細胞に非天然であることを意味することを意図する。分子は、例えば、コード化核酸を宿主の遺伝子材料に導入することにより、例えば、宿主の染色体に組み込むことにより、またはプラスミドなどの非染色体遺伝子材料として導入され得る。したがって、コード化核酸の発現に関して使用される場合の用語は、コード化核酸を発現可能な形態で細胞に導入することを指す。「内因性」という用語は、宿主細胞に存在する参照される分子または活性を指す。同様に、コード化核酸の発現に関して使用される場合の用語は、細胞内に含まれ、外因的に導入されていないコード化核酸の発現を指す。
本明細書で使用される場合、「目的の遺伝子」または「目的のポリヌクレオチド配列」は、適切な制御配列の制御下に置かれると、RNAに転写され、場合によってはインビボでポリペプチドに翻訳されるDNA配列である。目的の遺伝子またはポリヌクレオチドには、原核生物の配列、真核生物のmRNAからのcDNA、真核生物(例えば、哺乳類)からのDNAからのゲノムDNA配列、および合成DNA配列が含まれ得るが、これらに限定されない。例えば、目的の遺伝子は、miRNA、shRNA、天然ポリペプチド(すなわち、自然界に見られるポリペプチド)またはそれらの断片;バリアントポリペプチド(すなわち、天然ポリペプチドと100%未満の配列同一性を有する天然ポリペプチドの変異体)またはその断片;操作されたポリペプチドまたはペプチド断片、治療用ペプチドまたはポリペプチド、撮像マーカー、選択可能なマーカーなどをコードし得る。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体のいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドの配列は、4つのヌクレオチド塩基:アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、チミン(T)、およびポリヌクレオチドがRNAの場合、チミンに対してウラシル(U)で構成される。ポリヌクレオチドは、遺伝子または遺伝子断片(例えば、プローブ、プライマー、EST、またはSAGEタグ)、エキソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ、およびプライマーを含み得る。ポリヌクレオチドはまた、二本鎖分子および一本鎖分子の両方を指す。
本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、交換可能に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基を有する分子を指す。ポリペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含まなければならず、ポリペプチドのアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書で使用される場合、これらの用語は、例えば、当技術分野で一般にペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーとも呼ばれる短い鎖と、当技術分野で一般にポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれるより長い鎖との両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ポリペプチド、組換えポリペプチド、合成ポリペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。
本明細書で使用される場合、「サブユニット」という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質複合体の各別個のポリペプチド鎖を指し、各別個のポリペプチド鎖は、それ自体で安定な折り畳み構造を形成することができる。多くのタンパク質分子は2つ以上のサブユニットで構成され、アミノ酸配列は各サブユニットで同一であるか、類似しているか、または完全に異なるかのいずれかであり得る。例えば、CD3複合体は、CD3α、CD3ε、CD3δ、CD3γ、およびCD3ζサブユニットで構成され、これは、CD3ε/CD3γ、CD3ε/CD3δ、およびCD3ζ/CD3ζ二量体を形成する。単一のサブユニット内で、ポリペプチド鎖の隣接する部分は、「ドメイン」と呼ばれるコンパクトで局所的な半独立した単位に頻繁に折り畳まれる。多くのタンパク質ドメインは、サブドメインとも呼ばれる独立した「構造サブユニット」をさらに含み、ドメインの共通の機能に寄与し得る。したがって、本明細書で使用される場合、「サブドメイン」という用語は、より大きなドメイン内のタンパク質ドメイン、例えば、細胞表面受容体の外部ドメイン内の結合ドメイン、または細胞表面受容体の内部ドメインの刺激ドメインもしくはシグナル伝達ドメインを指す。
「作動可能に連結された」とは、一方の機能が他方によって影響を受けるように、単一の核酸断片上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列または機能的RNAの発現に影響を及ぼすことができる場合(すなわち、コード配列または機能的RNAがプロモーターの転写制御下にある)、コード配列または機能的RNAと作動可能に連結されている。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で制御配列に作動可能に連結され得る。
本明細書で使用される場合、「遺伝子インプリント」という用語は、供給源細胞またはiPSCにおける優先的な治療属性に寄与し、供給源細胞由来のiPSCおよび/またはiPSC由来の造血系細胞において保持可能な遺伝的または後成的情報を指す。本明細書で使用される場合、「供給源細胞」は、再プログラミングを通じてiPSCを生成するために使用され得る非多能性細胞であり、供給源細胞由来のiPSCは、任意の造血系統細胞を含む特定の細胞型にさらに分化され得る。供給源細胞由来のiPSC、およびそれから分化した細胞は、時折、状況に応じて、まとめて「由来」または「派生」細胞と呼ばれる。例えば、本明細書全体を通して使用される派生エフェクター細胞、または派生NK細胞もしくは派生T細胞は、末梢血、臍帯血、または他のドナー組織などの天然/天然源から得られた一次対応物と比較して、iPSCから分化した細胞である。本明細書で使用される場合、優先的な治療属性を付与する遺伝子インプリントは、ドナー特異的、疾患特異的、または治療応答特異的な選択された供給源細胞を再プログラミングすることによって、またはゲノム編集を使用して、遺伝子修飾されたモダリティをiPSCに導入することによってのいずれかでiPSCに組み込まれる。具体的に選択されたドナー、疾患、または治療状況から得られた供給源細胞の態様では、優先的な治療属性に寄与する遺伝子インプリントは、基礎となる分子事象が特定されているかどうかに関係なく、選択された供給源細胞のiPSC由来細胞に伝えられる保持可能な表現型、すなわち、優先的な治療属性を示す任意の状況特異的な遺伝的または後成的修飾を含み得る。ドナー特異的、疾患特異的、または治療応答特異的供給源細胞は、iPSCおよび由来造血系統細胞において保持可能な遺伝子インプリントを含み得、これらの遺伝子インプリントには、例えば、ウイルス特異的T細胞またはインバリアントナチュラルキラーT(iNKT)細胞からの予め配置された単一特異性TCR;追跡可能で望ましい遺伝子多型、例えば、選択されたドナーの高親和性CD16受容体をコードする点突然変異のためのホモ接合性;所定のHLA要件、すなわち、集団が増加したハプロタイプを呈する選択されたHLA適合ドナー細胞が含まれるが、これに限定されない。本明細書で使用される場合、優先的な治療属性には、由来細胞の改善された生着、輸送、ホーミング、生存能、自己再生、持続性、免疫応答の制御および調節、生存、ならびに細胞傷害性が含まれる。優先的な治療属性は、抗原標的化受容体の発現、HLAの提示またはその欠如、腫瘍微小環境に対する耐性、バイスタンダー免疫細胞の誘導および免疫調節、腫瘍外効果の低減による改善された標的特異性、化学療法などの治療に対する耐性にも関係している可能性がある。
本明細書で使用される場合、「増強された治療特性」という用語は、同じ一般的な細胞型の典型的な免疫細胞と比較して増強された細胞の治療特性を指す。例えば、「増強された治療特性」を有するNK細胞は、典型的な、未修飾の、および/または天然に存在するNK細胞と比較して、増強、改善、および/または増大された治療特性を有する。免疫細胞の治療特性には、細胞生着、輸送、ホーミング、生存能、自己再生、持続性、免疫応答の制御および調節、生存、ならびに細胞傷害性が含まれ得るが、これらに限定されない。免疫細胞の治療特性は、抗原標的化受容体の発現、HLAの提示またはその欠如、腫瘍微小環境に対する耐性、バイスタンダー免疫細胞の誘導および免疫調節、腫瘍外効果の低減による改善された標的特異性、化学療法などの治療に対する耐性よっても示される。
本明細書で使用される場合、「エンゲージャー」という用語は、免疫細胞、例えば、T細胞、NK細胞、NKT細胞、B細胞、マクロファージ、好中球、および腫瘍細胞間の連結を形成し、免疫細胞を活性化することができる分子、例えば、融合ポリペプチドを指す。エンゲージャーの例には、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)、二重特異性キラー細胞エンゲージャー(BiKE)、三重特異性キラー細胞エンゲージャー、もしくは多重特異性キラー細胞エンゲージャー、または複数の免疫細胞型と適合性のあるユニバーサルエンゲージャーが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「表面トリガー受容体」という用語は、免疫応答、例えば、細胞傷害性応答を誘発または開始することができる受容体を指す。表面トリガー受容体は操作することができ、エフェクター細胞、例えば、T細胞、NK細胞、NKT細胞、B細胞、マクロファージ、好中球で発現させることができる。いくつかの実施形態では、表面トリガー受容体は、エフェクター細胞の天然の受容体および細胞型とは関係なく、エフェクター細胞と特定の標的細胞、例えば、腫瘍細胞との間の二重または多重特異性抗体の結合を容易にする。このアプローチを使用して、ユニバーサル表面トリガー受容体を含むiPSCを生成し、次いでそのようなiPSCをユニバーサル表面トリガー受容体を発現する様々なエフェクター細胞型の集団に分化させることができる。「ユニバーサル」とは、表面トリガー受容体が、細胞型に関係なく任意のエフェクター細胞で発現および活性化され得、ユニバーサル受容体を発現するすべてのエフェクター細胞が、エンゲージャーの腫瘍結合特異性に関係なく、表面トリガー受容体によって認識可能な同じエピトープを有するエンゲージャーに結合または連結され得ることを意味する。いくつかの実施形態では、同じ腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャーは、ユニバーサル表面トリガー受容体と結合するために使用される。いくつかの実施形態では、異なる腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャーは、ユニバーサル表面トリガー受容体と結合するために使用される。したがって、1つまたは複数のエフェクター細胞型を使用して、特定の型の腫瘍細胞を殺滅する場合もあれば、2つ以上の型の腫瘍を殺滅する場合もある。表面トリガー受容体は、一般に、エフェクター細胞活性化のための共刺激ドメインと、エンゲージャーのエピトープに特異的な抗エピトープとを含む。二重特異性エンゲージャーは、一方の端で表面トリガー受容体の抗エピトープに特異的であり、もう一方の端で腫瘍抗原に特異的である。
本明細書で使用される場合、「安全スイッチタンパク質」という用語は、細胞療法の潜在的な毒性またはさもなければ有害作用を防止するように設計された操作されたタンパク質を指す。場合によっては、安全スイッチタンパク質の発現は、安全スイッチタンパク質をコードする遺伝子をそのゲノムに恒久的に組み込んだ、移植された操作された細胞の安全性の懸念に対処するために条件付きで制御される。この条件付き制御は可変であってよく、小分子を介した翻訳後活性化ならびに組織特異的および/または一時的な転写制御による制御が含まれ得る。安全スイッチは、アポトーシスの誘導、タンパク質合成の阻害、DNA複製、成長停止、転写および転写後の遺伝子制御、ならびに/または抗体を介した枯渇を媒介し得る。場合によっては、安全スイッチタンパク質は、外因性分子、例えば、プロドラッグによって活性化され、活性化されると、治療用細胞のアポトーシスおよび/または細胞死を誘発する。安全スイッチタンパク質の例には、カスパーゼ9(またはカスパーゼ3または7)、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、B細胞CD20、修飾されたEGFR、およびそれらの任意の組み合わせなどの自殺遺伝子が含まれるが、これに限定されない。この戦略では、有害事象が発生した場合に投与されるプロドラッグは、自殺遺伝子産物によって活性化され、形質導入された細胞を殺滅する。
本明細書で使用される場合、「薬学的に活性なタンパク質またはペプチド」という用語は、生物に対して生物学的および/または薬学的効果を達成することができるタンパク質またはペプチドを指す。薬学的に活性なタンパク質は、疾患に対して治癒的、根治的、または姑息的特性を有し、疾患の重症度を回復させる、緩和する、軽減する、逆転させる、または和らげるために投与することができる。薬学的に活性なタンパク質はまた、予防的特性を有し、疾患の発症を予防するため、またはそれが出現したときにそのような疾患もしくは病的状態の重症度を和らげるために使用される。薬学的に活性なタンパク質には、全タンパク質もしくはペプチド、またはそれらの薬学的に活性な断片が含まれる。それはまた、タンパク質もしくはペプチドの薬学的に活性な類似体、またはタンパク質もしくはペプチドの断片の類似体を含む。薬学的に活性なタンパク質という用語はまた、協調的または相乗的に作用して治療上の利益を提供する複数のタンパク質またはペプチドを指す。薬学的に活性なタンパク質またはペプチドの例には、受容体、結合タンパク質、転写および翻訳因子、腫瘍成長抑制タンパク質、抗体もしくはその断片、成長因子、および/またはサイトカインが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「シグナル伝達分子」という用語は、細胞シグナル伝達を調節する、それに関与する、阻害する、活性化する、低減する、または増加させる任意の分子を指す。シグナル伝達とは、最終的に細胞内の生化学的事象を引き起こす経路に沿ったタンパク質複合体の動員による化学修飾の形態での分子シグナルの伝達を指す。シグナル伝達経路は当技術分野で周知であり、Gタンパク質結合受容体シグナル伝達、チロシンキナーゼ受容体シグナル伝達、インテグリンシグナル伝達、トールゲートシグナル伝達、リガンド依存性イオンチャネルシグナル伝達、ERK/MAPKシグナル伝達経路、Wntシグナル伝達経路、cAMP依存性経路、およびIP3/DAGシグナル伝達経路を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「標的化モダリティ」という用語は、細胞に遺伝的に組み込まれて、i)独特のキメラ抗原受容体(CAR)またはT細胞受容体(TCR)に関連する場合、抗原特異性、ii)モノクローナル抗体または二重特異性エンゲージャーに関連する場合、エンゲージャー特異性、iii)形質転換された細胞の標的化、iv)がん幹細胞の標的化、およびv)特定の抗原または表面分子の不在下での他の標的化戦略が含まれるがこれらに限定されない抗原および/またはエピトープ特異性を促進する分子、例えば、ポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「特異的」または「特異性」という用語は、非特異的または非選択的結合とは対照的に、分子、例えば、受容体またはエンゲージャーが標的分子に選択的に結合する能力を指すために使用され得る。
本明細書で使用される場合、「養子細胞療法」という用語は、本明細書で使用される場合、遺伝子修飾されているか否かにかかわらず、注入前にインビボで拡大されたT細胞またはB細胞として特定される、自家または同種異系リンパ球の該注入に関連する細胞ベースの免疫療法を指す。
本明細書で使用される場合、「治療的に十分な量」は、その意味の範囲内で、非毒性であるが、それが言及する特定の治療および/または薬学的組成物の十分なおよび/または有効な量を含み、所望の治療効果を提供する。必要な正確な量は、患者の一般的な健康状態、患者の年齢、ならびに状態の段階および重症度などの要因に応じて、対象ごとに異なる。特定の実施形態では、治療的に十分な量は、治療される対象の疾患または状態に関連する少なくとも1つの症状を回復させる、低減する、および/または改善するのに十分である、および/または効果的である。
多能性幹細胞の分化には、培養培地中の刺激剤または細胞の物理的状態の変化など、培養系の変化が必要である。最も一般的な戦略は、系統特異的分化を開始するための一般的かつ重要な中間体として胚様体(EB)の形成を利用する。「胚様体」は、三次元領域内に多数の系統を生じさせるため、胚発生を模倣することが示されている三次元クラスターである。典型的には数時間から数日である分化プロセスを通じて、単純なEB(例えば、分化を誘発する凝集した多能性幹細胞)は成熟を続け、嚢胞性EBに発達し、その時点で(典型的には数日から数週間)、さらに処理されて分化を続ける。EB形成は、多能性幹細胞を三次元の多層細胞クラスター内で互いに近接させることによって開始され、典型的には、これは多能性細胞を液滴に沈降させ、細胞を「U」底ウェルプレートに沈降させるか、または機械的攪拌などによるものを含む、いくつかの方法のうちの1つによって達成される。多能性培養維持培地中で維持された凝集体は適切なEBを形成しないため、EBの発生を促進するために、多能性幹細胞凝集体はさらなる分化の手掛かりが必要である。したがって、多能性幹細胞の凝集体は、選択した系統に向けて誘発の手掛かりを提供する分化培地に移す必要がある。多能性幹細胞のEBベースの培養は、典型的には、EB細胞クラスター内で中程度の増殖を伴う分化した細胞集団(外胚葉、中胚葉、および内胚葉胚葉)の生成をもたらす。細胞分化を促進することが証明されているが、EBは、三次元構造の細胞が環境からの分化の手掛かりに一貫して曝されていないため、異なる分化状態の異種細胞を生じさせる。加えて、EBは作製および維持が困難である。さらに、EBを介した細胞分化は、適度な細胞拡大を伴い、これも分化効率の低下に寄与する。
対照的に、「EB形成」とは異なる「凝集体形成」は、多能性幹細胞由来細胞の集団を拡大するために使用することができる。例えば、凝集体ベースの多能性幹細胞の拡大中に、増殖および多能性を維持するための培養培地が選択される。細胞増殖は一般に、より大きな凝集体を形成する凝集体のサイズを増加させ、これらの凝集体は、培養内の細胞増殖を維持し、細胞数を増加させるために、日常的に機械的または酵素的に小さな凝集体に解離され得る。EB培養とは異なり、維持培養下の凝集体内で培養された細胞は、多能性のマーカーを維持する。多能性幹細胞凝集体は、分化を誘導するためにさらなる分化の手掛かりを必要とする。
本明細書で使用される場合、「単層分化」は、細胞の三次元多層クラスターによる分化とは異なる分化方法、すなわち「EB形成」を指す用語である。本明細書に開示される他の利点の中でも、単層分化は、分化開始のためのEB形成の必要性を回避する。単層培養はEB形成などの胚発生を模倣しないため、特定の系統への分化は、EBの3つすべての胚葉分化と比較して最小限であるとみなされる。
本明細書で使用される場合、「解離した」細胞は、他の細胞から、または表面(例えば、培養プレート表面)から実質的に分離または精製された細胞を指す。例えば、細胞は、機械的または酵素的方法によって動物または組織から解離され得る。あるいは、インビトロで凝集する細胞は、クラスターの懸濁液、単一細胞、または単一細胞とクラスターとの混合物への解離などによって、酵素的または機械的に互いに解離することができる。さらに別の代替の実施形態では、付着細胞は、培養プレートまたは他の表面から解離される。したがって、解離は、細胞外マトリックス(ECM)および基質(例えば、培養表面)との細胞相互作用の破壊、または細胞間のECMの破壊を伴い得る。
本明細書で使用される場合、「フィーダー細胞」または「フィーダー」は、フィーダー細胞が、第2の細胞型を支持するための刺激、成長因子、および栄養素を提供するため、第2の型の細胞が成長、拡大、または分化することができる環境を提供するために第2の型の細胞と共培養される1つの型の細胞を説明する用語である。フィーダー細胞は、任意選択で、それらが支持する細胞とは異なる種からである。例えば、幹細胞を含むある特定の型のヒト細胞は、マウス胚性線維芽細胞または不死化マウス胚性線維芽細胞の初代培養によって支持することができる。別の例では、末梢血由来細胞または形質転換された白血病細胞がナチュラルキラー細胞の拡大および成熟を支持する。フィーダー細胞は、典型的には、他の細胞と共培養するときに、それらが支持している細胞よりも成長するのを防ぐために、照射またはマイトマイシンなどの有糸分裂阻害剤で処理することによって不活化され得る。フィーダー細胞は、内皮細胞、間質細胞(例えば、上皮細胞または線維芽細胞)、および白血病細胞を含み得る。前述のことを制限することなく、1つの特定のフィーダー細胞型は、ヒト皮膚線維芽細胞などのヒトフィーダーであり得る。別のフィーダー細胞型は、マウス胚性線維芽細胞(MEF)であり得る。一般に、様々なフィーダー細胞を部分的に使用して、多能性を維持し、ある特定の系統への分化を指向し、増殖能力を高め、エフェクター細胞などの特殊化された細胞型への成熟を促進することができる。
本明細書で使用される場合、「フィーダーフリー」(FF)環境は、フィーダー細胞または間質細胞を本質的に含まない、および/またはフィーダー細胞の培養によって予め条件付けされていない培養条件、細胞培養物、または培養培地などの環境を指す。「予め条件付けされた」培地とは、フィーダー細胞が培地内で少なくとも1日などの期間培養された後に採取された培地を指す。予め条件付けされた培地には、培地で培養されたフィーダー細胞によって分泌される成長因子およびサイトカインを含む、多くのメディエーター物質を含む。いくつかの実施形態では、フィーダーフリー環境は、フィーダー細胞または間質細胞の両方を含まず、またフィーダー細胞の培養によって予め条件付けされていない。
iPSCおよびそれから分化した由来非多能性細胞のゲノム編集もしくは修飾、または非多能性細胞およびそれから再プログラミングされた由来iPSCのゲノム編集または修飾の文脈で使用される場合、「機能的」は、(1)直接的なゲノム編集もしくは修飾により、または最初にゲノム操作される開始細胞からの分化もしくはその再プログラミングを介した「伝達」により達成される、遺伝子レベルでの良好なノックイン、ノックアウト、ノックダウン遺伝子発現、トランスジェニックもしくは制御された遺伝子発現、例えば、所望の細胞の発達段階での誘導性もしくは一時的な発現、あるいは(2)(i)直接的なゲノム編集により該細胞において得られた遺伝子発現の修飾、(ii)最初にゲノム操作される開始細胞からの分化もしくはその再プログラミングを介した「伝達」により該細胞で維持される遺伝子発現の修飾、(iii)該細胞の初期の発生段階でのみ現れる、または分化または再プログラミングを介して該細胞を生じさせる開始細胞でのみ現れる遺伝子発現の修飾の結果としての該細胞における下流の遺伝子制御、または(iv)最初に、iPSC、前駆細胞、もしくは脱分化した細胞起源で行われたゲノム編集もしくは修飾に由来する、成熟細胞産物内に提示される、増強されたもしくは新たに獲得された細胞機能もしくは属性による、細胞レベルでの良好な細胞機能/特性の除去、追加、または改変を指す。
HLAクラスI欠損、HLAクラスII欠損、またはその両方を含む「HLA欠損」とは、HLAクラスIタンパク質ヘテロ二量体および/またはHLAクラスIIのヘテロ二量体を含む完全なMHC複合体の表面発現が欠如しているか、またはもはや維持されていないか、またはレベルの減少もしくは低下が他の細胞または合成方法によって自然に検出可能なレベルよりも低いようなレベルの低下を有するいずれかの細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「修飾されたHLA欠損iPSC」は、改善された分化の可能性、抗原標的化、抗原提示、抗体認識、持続性、免疫回避、抑制に対する耐性、増殖、共刺激、サイトカイン刺激、サイトカイン産生(オートクリンまたはパラクリン)、走化性、ならびに細胞傷害性に関連するがこれらに限定されないタンパク質、例えば、非古典的HLAクラスIタンパク質(例えば、HLA-EおよびHLA-G)、キメラ抗原受容体(CAR)、T細胞受容体(TCR)、CD16 Fc受容体、BCL11b、NOTCH、RUNX1、IL15、41BB、DAP10、DAP12、CD24、CD3z、41BBL、CD47、CD113、およびPDL1を発現する遺伝子を導入することによってさらに修飾されるHLA欠損iPSCを指す。「修飾されたHLA欠損」の細胞には、iPSC以外の細胞も含まれる。
FcRと略される「Fc受容体」は、それらが認識する抗体の種類に基づいて分類される。例えば、最も一般的なクラスの抗体であるIgGに結合するものは、Fc-ガンマ受容体(FcγR)と呼ばれ、IgAに結合するものはFc-アルファ受容体(FcαR)と呼ばれ、IgEに結合するものはFc-イプシロン受容体(FcεR)と呼ばれる。FcRのクラスは、それらを発現する細胞(マクロファージ、顆粒球、ナチュラルキラー細胞、T細胞およびB細胞)および各受容体のシグナル伝達特性によっても区別される。Fc-ガンマ受容体(FcγR)には、FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b)のいくつかのメンバーが含まれ、これらは、分子構造が異なるため抗体親和性が異なる。
CFcRと略される「キメラFc受容体」は、それらの天然の膜貫通ドメインおよび/または細胞内シグナル伝達ドメインが修飾されたか、または非天然の膜貫通とメインおよび/または細胞内シグナル伝達ドメインで置き換えられた操作されたFc受容体を説明するために使用される用語である。キメラFc受容体のいくつかの実施形態では、膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインの一方または両方が非天然であることに加えて、1つ以上の刺激ドメインを操作されたFc受容体の細胞内部分に導入して、受容体の誘発により細胞活性化、拡大、および機能を増強することができる。標的抗原への抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)とは異なり、キメラFc受容体は、Fc断片、または抗体のFc領域、またはエンゲージャーもしくは結合分子に含まれるFc領域に結合し、標的化された細胞を近接させるかどうかに関係なく細胞を活性化する。例えば、Fcγ受容体は、細胞外ドメインでのIgGの結合に応答し、それによりCFcRを生成する、細胞内領域内の選択された膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、および/またはシグナル伝達ドメインを含むように操作され得る。一例では、CFcRは、その膜貫通ドメインおよび/または細胞内ドメインを置き換えることにより、Fcγ受容体であるCD16を操作することによって生成される。CD16ベースのCFcRの結合親和性をさらに改善するために、CD64の細胞外ドメインまたはCD16の高親和性バリアント(例えば、F176V)を組み込むことができる。高親和性CD16細胞外ドメインを伴うCFcRのいくつかの実施形態では、197位にセリンを含むタンパク質分解切断部位が排除されるか、または受容体の細胞外ドメインが切断不可能であるように置き換えられる、すなわち、シェディングの影響を受けず、それにより、hnCD16ベースのCFcRが得られる。
FcγR受容体であるCD16は、Fc受容体FcγRIIIa(CD16a)およびFcγRIIIb(CD16b)の2つのアイソフォームを有することが特定されている。CD16aは、NK細胞によって発現される膜貫通タンパク質であり、標的細胞に付着した単量体IgGに結合して、NK細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害(ADCC)を容易にする。本明細書で使用される場合、「高親和性CD16」、「切断不可能なCD16」、または「高親和性の切断不可能なCD16(hnCD16)」は、CD16の天然または非天然バリアントを指す。野生型CD16は親和性が低く、NK細胞の活性化により白血球上の様々な細胞表面分子の細胞表面密度を制御するタンパク質分解切断プロセスである外部ドメインシェディングを受ける。F176VおよびF158Vは、高い親和性を有する例示的なCD16多型バリアントである。膜近位領域(189~212位)における切断部位(195~198位)が改変または排除されているCD16バリアントは、シェディングを受けない。切断部位および膜近位領域は、WO2015/148926に詳細に記載されており、その完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれる。CD16 S197Pバリアントは、CD16の設計された切断不可能なバージョンである。F158VおよびS197Pの両方を含むCD16バリアントは、親和性が高く、切断不可能である。別の例示的な高親和性で切断不可能なCD16(hnCD16)バリアントは、CD64外部ドメインの3つのエキソンのうちの1つ以上に由来する外部ドメインを含む操作されたCD16である。
I.増強された特性を有する養子細胞療法に有用な細胞および組成物
iPSCの分化能ならびにiPSCおよびその派生細胞の細胞発生生物学に影響を与えることなく、クローンiPSCの制御回路を系統的に操作する一方で、iPSCから分化した派生細胞の治療特性を増強する戦略が本明細書で提供される。iPSC由来細胞は、機能的に改善されており、選択的モダリティの組み合わせがゲノム操作を通じてiPSCレベルで細胞に導入された後の養子細胞療法に好適である。本発明以前は、1つ以上の提供された遺伝子編集を含む改変されたiPSCが、細胞発生に入る能力、および/または調節された活性を保持しながら機能的分化細胞を成熟および生成する能力を依然として有するかどうかは不明であった。iPSCからの指向された細胞分化中の予期せぬ失敗は、発生段階特異的遺伝子発現またはその欠如、HLA複合体提示の要件、導入された表面発現モダリティのタンパク質シェディング、ならびに細胞の表現型および/または機能の変化を可能にする分化プロトコルの再構成の必要性を含むがこれらに限定されない態様に起因している。本出願は、本明細書で提供される1つ以上の選択されたゲノム修飾がiPSC分化能に悪影響を及ぼさず、操作されたiPSCに由来する機能的エフェクター細胞がiPSC分化後のエフェクター細胞において保持された個々のまたは組み合わされたゲノム修飾に起因する治療特性を増強および/または獲得したことを示した。
iPSCの分化能ならびにiPSCおよびその派生細胞の細胞発生生物学に影響を与えることなく、クローンiPSCの制御回路を系統的に操作する一方で、iPSCから分化した派生細胞の治療特性を増強する戦略が本明細書で提供される。iPSC由来細胞は、機能的に改善されており、選択的モダリティの組み合わせがゲノム操作を通じてiPSCレベルで細胞に導入された後の養子細胞療法に好適である。本発明以前は、1つ以上の提供された遺伝子編集を含む改変されたiPSCが、細胞発生に入る能力、および/または調節された活性を保持しながら機能的分化細胞を成熟および生成する能力を依然として有するかどうかは不明であった。iPSCからの指向された細胞分化中の予期せぬ失敗は、発生段階特異的遺伝子発現またはその欠如、HLA複合体提示の要件、導入された表面発現モダリティのタンパク質シェディング、ならびに細胞の表現型および/または機能の変化を可能にする分化プロトコルの再構成の必要性を含むがこれらに限定されない態様に起因している。本出願は、本明細書で提供される1つ以上の選択されたゲノム修飾がiPSC分化能に悪影響を及ぼさず、操作されたiPSCに由来する機能的エフェクター細胞がiPSC分化後のエフェクター細胞において保持された個々のまたは組み合わされたゲノム修飾に起因する治療特性を増強および/または獲得したことを示した。
1.内因性TCRの不在下でのCD3表面提示
アルファ-ベータT細胞受容体(αβTCR)は、免疫応答に不可欠な抗原特異的受容体であり、αβTリンパ球の細胞表面に存在する。TCRαβのペプチド主要組織適合遺伝子複合体(pMHC)への結合は、TCR-CD3細胞内活性化、多数のシグナル伝達分子の動員、ならびにシグナル伝達経路の分岐および統合を開始し、遺伝子発現ならびにT細胞の成長および機能獲得に重要な転写因子の動員をもたらす。NKT細胞は、αβTCRも発現するT細胞のサブセットであり、従来のαβT細胞とは異なるが、NKT細胞のTCRは、標準的なインバリアントTCRα鎖(ヒトではVα24-Jα18)、および多様性が制限され、CD1dによって提示される限られた数の脂質抗原を認識する、限定されたVβセグメントを使用するTCRβ鎖(ヒトではVβ11)で構成されている。
アルファ-ベータT細胞受容体(αβTCR)は、免疫応答に不可欠な抗原特異的受容体であり、αβTリンパ球の細胞表面に存在する。TCRαβのペプチド主要組織適合遺伝子複合体(pMHC)への結合は、TCR-CD3細胞内活性化、多数のシグナル伝達分子の動員、ならびにシグナル伝達経路の分岐および統合を開始し、遺伝子発現ならびにT細胞の成長および機能獲得に重要な転写因子の動員をもたらす。NKT細胞は、αβTCRも発現するT細胞のサブセットであり、従来のαβT細胞とは異なるが、NKT細胞のTCRは、標準的なインバリアントTCRα鎖(ヒトではVα24-Jα18)、および多様性が制限され、CD1dによって提示される限られた数の脂質抗原を認識する、限定されたVβセグメントを使用するTCRβ鎖(ヒトではVβ11)で構成されている。
T細胞の直接編集または修飾された派生T細胞を得るための供給源としてのiPSC編集のいずれかにより、TCRアルファまたはTCRベータ(TRACまたはTRBC)の定常領域を妨害することは、TCRnegT細胞を産生するためのアプローチのうちの1つである。例えば、TRACまたはTRBCの予め選択された位置に、TRACもしくはTRBCの内因性プロモーターまたは外因性プロモーターのいずれかに作動可能に連結された2A配列を挿入することにより、TRACまたはTRBCの妨害(またはこの例では切断)およびTCR陰性細胞(TCRneg)をもたらすことができる。特定の実施形態では、TCRneg細胞はiPSCである。別の実施形態では、TCRneg細胞はNK系統細胞である。本明細書で使用する場合、「TCR陰性」または「TCRneg」という用語は、TCR遺伝子発現の妨害(例えば、T系統細胞、初代またはiPSC由来のT系統細胞など)、またはゲノム内にTCR遺伝子座が存在するにもかかわらずTCR遺伝子発現の自然な欠如(例えば、iPSC、またはNK系統細胞、初代またはiPSC由来のNK系統細胞)のいずれかによる、内因性TCRの発現の欠如を指す。クローン的に選択された操作されたiPSCの造血細胞へのその後の指向された分化により、TCR発現なしでiPSC由来の免疫エフェクター細胞および/またはその均質な集団を生成することが可能となる。
いくつかの実施形態では、2Aなどの自己切断ペプチドを使用する標的化された切断または妨害は、任意選択で、切断または妨害位置での1つ以上の目的の外因性遺伝子の組み込みと同時に起こり得、組み込まれた遺伝子の発現は、作動可能に連結された外因性プロモーターにより、または組み込み時にTCRアルファもしくはTCRベータの内因性プロモーターにより駆動され得、これは、TRACまたはTRBCノックアウト、よってTCR陰性をもたらす一方で、TRACまたはTRBC遺伝子座に挿入された1つ以上の外因性遺伝子を発現する。
このアプローチを使用して得られたiPSC由来TCR陰性T細胞(外因性遺伝子組み込みの有無にかかわらず)は、同種異系の養子細胞療法で使用した場合、HLA一致を必要とせず、アロ反応性が低下し、GvHD(移植片対宿主病)を防ぐことができる。しかしながら、TCRの妨害により、細胞内でCD3サブユニット遺伝子が発現しているにもかかわらず、T細胞表面からCD3シグナル伝達複合体が排除されることもわかっている。細胞表面CD3の欠如は、BiTE、BiKE、またはTRiKE(または総称してエンゲージャーと呼ばれる)技術、CD3/CD28 T細胞活性化ビーズ技術、および抗CD3抗体またはCD3-CAR刺激技術が含まれるが、これらに限定されない細胞表面CD3の認識および結合を必要とする技術との不適合により、細胞の拡大および/または生存能力を改変し、細胞の機能的可能性を低下させる可能性がある。さらに、TCRneg iPSCが指向されたT細胞分化に使用される場合、T細胞発生生物学およびT細胞機能成熟にも影響を与える可能性がある。しかしながら、TCR陰性である細胞でCD3が過剰発現すると、CD3複合体および/またはCD3シグナル伝達の細胞表面提示が回復しないように思われる。TCR遺伝子の存在にもかかわらずTCRを発現しない細胞、例えば、TCRnegにおいて本明細書に開示されるNK細胞またはNK前駆細胞、細胞表面CD3複合体、またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)に関しては、NK細胞は、抗体もしくはその機能的バリアント、および/またはCD3受容体を認識する二重もしくは多重特異性エンゲージャーを含むがこれらに限定されない分子と結合するための獲得CD3関連細胞表面トリガー受容体として機能することができる。当技術分野における未解決の問題に対処するために、本明細書に記載される他の提供される利点の中でも、遺伝子妨害による内因性TCR遺伝子発現の喪失(派生T系統細胞などにおいて)またはTCR遺伝子発現の自然な欠如(派生NK系統細胞などにおいて)によるものであるかどうかにかかわらず、内因性TCR発現がない(TCRneg細胞)場合、表面CD3提示を再構成および/または提供する、図1A~Cに示される以下の設計が本出願において詳述される。
設計1:非結合組換えTCR(nb-rTCR)
図1(a)に示されるように、この設計1において、標的化されたゲノム編集ツールを使用して、細胞内の内因性TCRαをノックアウトして(TCRα-/-)、TCR陰性(TCRのneg)をもたらすが、TCRβのノックアウト(TCRβ-/-)は任意選択であるか、またはその逆も同様であり、標的化されたゲノム編集ツールを使用して、細胞内の内因性TCRβをノックアウトして(TCRβ-/-)、TCR陰性(TCRneg)をもたらすが、TCRαのノックアウト(TCRα-/-)は任意選択である。TCRαノックアウトを含む実施形態では、TCRαの完全長または部分長の定常領域をコードするポリヌクレオチド(トランスジェニックTRAC、またはtgTRAC)がその後細胞に導入されるか、または標的化されたTRACノックアウト時にTRACに組み込まれ、ポリヌクレオチドの発現が、TCRαの内因性プロモーターによって、または代替的にポリヌクレオチドに作動可能に連結される外因性プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、TCRαの完全長または部分長の定常領域をコードするポリヌクレオチドは、TCRαの完全長または部分長の定常領域と結合した適切なN末端シグナルペプチドをさらに含む。内因性TCRβ(TCRβ-/-)がノックアウトされる実施形態では、TCRβの完全長または部分長の定常領域をコードするポリヌクレオチド(tgTCRβまたはtgTRBC)が細胞に導入され、tgTCRβまたはtgTRBCの発現が、TCRβの内因性プロモーターによって、または代替的に外因性プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、TCRβの完全長または部分長の定常領域をコードするポリヌクレオチドは、TCRβの完全長または部分長の定常領域と結合した適切なN末端シグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、外因性プロモーターは、構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、または細胞型特異的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、外因性プロモーターは、CMV、EF1α、PGK、CAG、およびUBCのうちの1つを含む。一実施形態では、外因性プロモーターは、少なくともCAGを含む。
図1(a)に示されるように、この設計1において、標的化されたゲノム編集ツールを使用して、細胞内の内因性TCRαをノックアウトして(TCRα-/-)、TCR陰性(TCRのneg)をもたらすが、TCRβのノックアウト(TCRβ-/-)は任意選択であるか、またはその逆も同様であり、標的化されたゲノム編集ツールを使用して、細胞内の内因性TCRβをノックアウトして(TCRβ-/-)、TCR陰性(TCRneg)をもたらすが、TCRαのノックアウト(TCRα-/-)は任意選択である。TCRαノックアウトを含む実施形態では、TCRαの完全長または部分長の定常領域をコードするポリヌクレオチド(トランスジェニックTRAC、またはtgTRAC)がその後細胞に導入されるか、または標的化されたTRACノックアウト時にTRACに組み込まれ、ポリヌクレオチドの発現が、TCRαの内因性プロモーターによって、または代替的にポリヌクレオチドに作動可能に連結される外因性プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、TCRαの完全長または部分長の定常領域をコードするポリヌクレオチドは、TCRαの完全長または部分長の定常領域と結合した適切なN末端シグナルペプチドをさらに含む。内因性TCRβ(TCRβ-/-)がノックアウトされる実施形態では、TCRβの完全長または部分長の定常領域をコードするポリヌクレオチド(tgTCRβまたはtgTRBC)が細胞に導入され、tgTCRβまたはtgTRBCの発現が、TCRβの内因性プロモーターによって、または代替的に外因性プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、TCRβの完全長または部分長の定常領域をコードするポリヌクレオチドは、TCRβの完全長または部分長の定常領域と結合した適切なN末端シグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、外因性プロモーターは、構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、または細胞型特異的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、外因性プロモーターは、CMV、EF1α、PGK、CAG、およびUBCのうちの1つを含む。一実施形態では、外因性プロモーターは、少なくともCAGを含む。
いくつかの実施形態では、完全または部分的なTCRα定常領域をコードするポリヌクレオチド(tgTRAC)は、例示的な配列の配列番号1と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも完全または部分的な定常領域を含むTCRβをコードするポリヌクレオチド(tgTRBC)は、例示的な配列の配列番号2または配列番号3と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。N末端シグナルペプチドおよび完全長または部分長のTCRαまたはTCRβ定常領域をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドとTCR定常領域に関連する配列との間にリンカーペプチドをさらに含む。N末端シグナルペプチドおよび完全長のTCRαまたはTCRβ定常領域をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、C末端にポリAテールをさらに含む。N末端シグナルペプチドおよび部分長のTCRαまたはTCRβ定常領域をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの組み込みは、内因性定常領域(例えば、エキソン)内の部位にあり、インフレーム、すなわち、完全長のトランスジェニック/キメラTRACまたはTRBCが、外因性/トランスジェニックであるその配列の一部、および内因性である別の部分で形成されるように、組み込み部位の下流のTCRαまたはTCRβ定常領域の残りの内因性配列とインフレームである。設計1のいくつかの実施形態では、内因性TCRαおよびTCRβのうちの少なくとも1つは、それぞれの可変領域を本質的に除去する一方で、発現されるとそれぞれのトランスジェニック定常領域を細胞表面に提示するように操作される。いくつかの実施形態では、内因性TCRαおよびTCRβのうちの1つのみが、関連する可変領域を本質的に除去する一方で、トランスジェニック定常領域および野生型TCRサブユニット(TCRαまたはTCRβ)を細胞表面に提示するように操作される。いくつかの実施形態では、内因性TCRαおよびTCRβの両方は、提供されるように、それぞれの可変領域を除去する一方で、発現されると両方のトランスジェニック定常領域を細胞表面に提示するように操作される。例示的なN末端シグナルペプチドには、MALPVTALLLPLALLLHA(配列番号4;CD8asp)もしくはMDFQVQIFSFLLISASVIMSR(配列番号5;IgKsp)、または当技術分野で既知の任意のシグナルペプチド配列もしくはその機能的バリアントが含まれる。例示的なリンカーペプチドには、DYKDDDDK(配列番号6;FLAG)、または当技術分野で既知の任意のリンカーペプチド配列もしくはその機能的バリアントが含まれる。
配列番号1:
[配列表1]
[配列表2]
配列番号3
[配列表3]
配列番号1:
[配列表1]
[配列表2]
配列番号3
[配列表3]
本出願において、TCRサブユニットのtgTRACまたはtgTRBCのいずれかのトランスジェニック定常領域(他のTCRサブユニット(内因性/野生型またはトランスジェニック;トランスジェニックの場合、そのそれぞれの可変領域の有無にかかわらず)と会合することによって組換えTCR複合体(rTCR)を形成することができる)、および内因性CD3サブユニットが、抗原認識に関与するTCRαまたはTCRβ可変領域の欠如のためペプチド-MHC結合を可能にしないことを発見した。結果として得られる細胞は、細胞表面提示内因性CD3(cs-CD3)複合体を通じて標準的なTCR/CD3シグナル伝達を取り戻すが、内因性TCRノックアウトおよびTCRα可変領域のないrTCRによりアロ反応性はない。したがって、設計1を考慮して、細胞またはその集団が本明細書で提供され、細胞は、iPSC、クローンiPSC、クローンiPS細胞株細胞、または該iPSCの分化から得られる派生細胞であり、細胞は、内因性TCRがノックアウトされる(TCRneg)ような、内因性TCRαおよびTCRβ定常領域のうちの少なくとも1つでの妨害、ならびに妨害されるTCRα(tgTRAC)および/またはTCRβ(tgTRBC)の定常領域をコードする一方または両方の外因性ポリヌクレオチドを含み、tgTRACおよび/またはtgTRABは、発現されると内因性CD3(cs-CD3)の細胞表面提示を可能にする。tgTRACおよびtgTRBCのうちの少なくとも1つを含む組換えTCR複合体は、TCRサブユニットの両方の可変領域(VαおよびVβ)を有しないためにMHCによって提示される抗原ペプチドに結合せず、したがって非結合組換えTCR(nb-rTCR)と呼ばれる。
設計2:定義された組換えTCR(d-rTCR)
図1Aに示されるように、この設計2において、ゲノム編集ツールを使用して、内因性TCRαおよびTCRβ内因性の両方が細胞においてノックアウトされており(TCRα-/-およびTCRβ-/-またはTCRneg TCRβneg)、TCRneg細胞をもたらす。TCRノックアウトと同時に、またはそれに続いて、TCRαの定義された可変領域および完全なまたは部分的な定常領域を含むTCRα(tgTCRα)をコードする第1のポリヌクレオチドならびにTCRβの定義された可変領域および完全なまたは部分的な定常領域を含むTCRβ(tgTCRβ)をコードする第2のポリヌクレオチドが該TCRneg細胞に導入される。定義されたTCRαまたはTCRβ可変領域は、その配列が特定されているか、または特定され得るように、任意の所与の特異性のものであり得る。いくつかの実施形態では、第1および第2のポリヌクレオチドの一方または両方は、それぞれ、TCRαおよびTCRβの内因性プロモーターによって駆動される。いくつかの他の実施形態では、第1および第2のポリヌクレオチドの一方または両方は、外因性プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、第2のポリヌクレオチドは、TCRβの内因性プロモーターによって駆動されるが、いくつかの他の実施形態では、第2のポリヌクレオチドは、外因性プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、外因性プロモーターは、構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、または細胞型特異的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、外因性プロモーターは、CMV、EF1α、PGK、CAG、およびUBCのうちの1つを含む。一実施形態では、外因性プロモーターは、少なくともCAGを含む。いくつかの実施形態では、完全長または部分長のTCRα定常領域および所与の定義された可変領域をコードするポリヌクレオチドは、少なくとも、例示的な配列の配列番号1と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長または部分長のTCRβ定常領域および所与の定義された可変領域をコードするポリヌクレオチドは、少なくとも、例示的な配列の配列番号2または配列番号3と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。実施形態では、配列同一性は少なくとも80%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも90%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも95%である。実施形態では、配列同一性は100%である。完全長のTCRαまたはTCRβ定常領域をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、C’末端にポリAテールをさらに含む。部分長のTCRαまたはTCRβ定常領域をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの組み込みは、内因性定常領域内の部位にあり、完全長のトランスジェニック/キメラTRACまたはTRBCが、外因性/トランスジェニックであるその配列の一部、および内因性である別の部分で形成されるように、組み込み部位の下流のTCRαまたはTCRβ定常領域の残りの内因性配列とインフレームである。TCRαまたはTCRβ可変領域の配列は、例えば、Universal Protein Resource(UniProt)データベースに見出され、いくつかの非限定的な定義されたTCRαまたはTCRβ可変領域の例をそれぞれ以下の表AおよびBに列記する。
図1Aに示されるように、この設計2において、ゲノム編集ツールを使用して、内因性TCRαおよびTCRβ内因性の両方が細胞においてノックアウトされており(TCRα-/-およびTCRβ-/-またはTCRneg TCRβneg)、TCRneg細胞をもたらす。TCRノックアウトと同時に、またはそれに続いて、TCRαの定義された可変領域および完全なまたは部分的な定常領域を含むTCRα(tgTCRα)をコードする第1のポリヌクレオチドならびにTCRβの定義された可変領域および完全なまたは部分的な定常領域を含むTCRβ(tgTCRβ)をコードする第2のポリヌクレオチドが該TCRneg細胞に導入される。定義されたTCRαまたはTCRβ可変領域は、その配列が特定されているか、または特定され得るように、任意の所与の特異性のものであり得る。いくつかの実施形態では、第1および第2のポリヌクレオチドの一方または両方は、それぞれ、TCRαおよびTCRβの内因性プロモーターによって駆動される。いくつかの他の実施形態では、第1および第2のポリヌクレオチドの一方または両方は、外因性プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、第2のポリヌクレオチドは、TCRβの内因性プロモーターによって駆動されるが、いくつかの他の実施形態では、第2のポリヌクレオチドは、外因性プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、外因性プロモーターは、構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、または細胞型特異的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、外因性プロモーターは、CMV、EF1α、PGK、CAG、およびUBCのうちの1つを含む。一実施形態では、外因性プロモーターは、少なくともCAGを含む。いくつかの実施形態では、完全長または部分長のTCRα定常領域および所与の定義された可変領域をコードするポリヌクレオチドは、少なくとも、例示的な配列の配列番号1と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長または部分長のTCRβ定常領域および所与の定義された可変領域をコードするポリヌクレオチドは、少なくとも、例示的な配列の配列番号2または配列番号3と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。実施形態では、配列同一性は少なくとも80%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも90%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも95%である。実施形態では、配列同一性は100%である。完全長のTCRαまたはTCRβ定常領域をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、C’末端にポリAテールをさらに含む。部分長のTCRαまたはTCRβ定常領域をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの組み込みは、内因性定常領域内の部位にあり、完全長のトランスジェニック/キメラTRACまたはTRBCが、外因性/トランスジェニックであるその配列の一部、および内因性である別の部分で形成されるように、組み込み部位の下流のTCRαまたはTCRβ定常領域の残りの内因性配列とインフレームである。TCRαまたはTCRβ可変領域の配列は、例えば、Universal Protein Resource(UniProt)データベースに見出され、いくつかの非限定的な定義されたTCRαまたはTCRβ可変領域の例をそれぞれ以下の表AおよびBに列記する。
インバリアントNKT細胞は、標準的なインバリアントTCRα鎖(ヒトではVα24-Jα18、またはiTCRα)および限定されたVβセグメント(ヒトではVβ11、またはiTCRβ)を使用するTCRβ鎖を発現するT細胞の独特なサブセットであり、高度に保存されたTCRおよびCD1d依存性抗原提示をもたらす。インバリアントNKTのTCR(iTCRまたはiTCRαβ)のこの特性を利用するために、設計2のいくつかの実施形態では、定義されたTCRは、完全長または部分長のTCRα定常領域および所与の定義された可変領域をコードするポリヌクレオチドが、少なくとも、例示的な配列の配列番号44と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を少なくとも含み、完全長または部分長のTCRβ定常領域および所与の定義された可変領域をコードするポリヌクレオチドが、少なくとも、例示的な配列の配列番号45と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を少なくとも含むように、インバリアントNKT細胞のTCRαおよびTCRβ(iTCRαまたはiTCRαβ)のいずれかまたは両方を含む。実施形態では、配列同一性は少なくとも80%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも90%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも95%である。実施形態では、配列同一性は100%である。
配列番号44
[配列表4]
配列番号45
[配列表5]
配列番号44
[配列表4]
配列番号45
[配列表5]
本出願において、定常領域および定義された可変領域を有するトランスジェニックTCRα(tgTCRα)、任意選択で、定常領域および定義された可変領域を有するトランスジェニックTCRβ(tgTCRβ)が、tgTCRαおよびtgTCRβの可変領域の特異性により、定義されたペプチド-MHC結合を有するか、またはペプチド-MHC結合を有さないが、CD3ζ鎖を含む内因性CD3サブユニットと会合することによって、組換えTCR複合体(rTCR)を形成することができることが発見された。定義された組換えTCRのためのトランスジェニックTCRサブユニットの遺伝子操作に加えて、インバリアントNKT細胞のTCRαおよびTCRβを利用する他のアプローチは、単離されたNKT細胞をiPSCに再プログラミングすること、およびiPSCをT細胞に分化させることを含み、結果として、由来T細胞は、本明細書に開示される再プログラミングおよび分化組成物および方法を使用して、インバリアントNKT細胞のTCRαおよびTCRβ(iTCRα、iTCRβ、およびiTCR、複合体)を含む。遺伝子操作されたiPSCまたはiNKTで再プログラミングされたiPSCから分化した結果として得られる細胞は、MHC結合特異性がないか、または既知で定義されたMHC結合特異性を有するが、細胞表面提示内因性CD3(cs-CD3)を通じて、標準的なTCR/CD3シグナル伝達を取り戻す。したがって、設計2を考慮して、細胞またはその集団が本明細書で提供され、細胞は、iPSC、クローンiPSC、クローンiPS細胞株細胞、またはiPSCの分化から得られる派生細胞であり、細胞は、内因性TCRαおよび内因性TCRβのそれぞれでの妨害、完全なまたは部分的な定常領域および定義された可変領域を有するtgTCRαをコードする外因性ポリヌクレオチド、ならびに完全なまたは部分的な定常領域および定義された可変領域を有するtgTCRβをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、内因性CD3分子は、発現されると細胞表面(cs-CD3)に存在する。
設計3:任意選択の非結合TCRβを有する組換えプレTCRα(p-rTCR)
プレTCRαは、T細胞発生の初期段階である未成熟胸腺細胞の発生制御遺伝子によってコードされるI型膜貫通受容体タンパク質である。プレTCRαは、TCRβおよびCD3サブユニットと共有結合して、プレTCR複合体を形成する。プレTCRαは、他の構造的および機能的な違いの中でも、TCRα鎖と比較して比較的長い細胞質テールを有する。図1Aに示されるように、この設計3において、TCR陰性細胞は、ゲノム編集ツールを使用することにより、少なくとも内因性TCRαノックアウト(TCRneg)を有し、内因性TCRβのノックアウトは任意選択である。TCRノックアウトと同時に、またはそれに続いて、完全長または部分長のプレTCRα(tgpTCRα)をコードする第1のポリヌクレオチドが、該TCRneg細胞に導入される。該TCRneg細胞がTCRβノックアウトをさらに含むいくつかの実施形態では、所与の定義された可変領域(tgTCRβまたはtgTRBC)の有無にかかわらず、完全または部分的なTCRβ定常領域をコードする第2のポリヌクレオチドは、TCRneg細胞に導入され、細胞は初期段階の未成熟胸腺細胞ではない。完全長のTCRαまたはTCRβ定常領域をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、C’末端にポリAテールをさらに含む。部分長のTCRαまたはTCRβ定常領域をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの組み込みは、内因性定常領域内の部位にあり、完全長のトランスジェニック/キメラTRACまたはTRBCが、外因性/トランスジェニックであるその配列の一部、および内因性である別の部分で形成されるように、組み込み部位の下流のTCRαまたはTCRβ定常領域の残りの内因性配列とインフレームである。
プレTCRαは、T細胞発生の初期段階である未成熟胸腺細胞の発生制御遺伝子によってコードされるI型膜貫通受容体タンパク質である。プレTCRαは、TCRβおよびCD3サブユニットと共有結合して、プレTCR複合体を形成する。プレTCRαは、他の構造的および機能的な違いの中でも、TCRα鎖と比較して比較的長い細胞質テールを有する。図1Aに示されるように、この設計3において、TCR陰性細胞は、ゲノム編集ツールを使用することにより、少なくとも内因性TCRαノックアウト(TCRneg)を有し、内因性TCRβのノックアウトは任意選択である。TCRノックアウトと同時に、またはそれに続いて、完全長または部分長のプレTCRα(tgpTCRα)をコードする第1のポリヌクレオチドが、該TCRneg細胞に導入される。該TCRneg細胞がTCRβノックアウトをさらに含むいくつかの実施形態では、所与の定義された可変領域(tgTCRβまたはtgTRBC)の有無にかかわらず、完全または部分的なTCRβ定常領域をコードする第2のポリヌクレオチドは、TCRneg細胞に導入され、細胞は初期段階の未成熟胸腺細胞ではない。完全長のTCRαまたはTCRβ定常領域をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、C’末端にポリAテールをさらに含む。部分長のTCRαまたはTCRβ定常領域をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの組み込みは、内因性定常領域内の部位にあり、完全長のトランスジェニック/キメラTRACまたはTRBCが、外因性/トランスジェニックであるその配列の一部、および内因性である別の部分で形成されるように、組み込み部位の下流のTCRαまたはTCRβ定常領域の残りの内因性配列とインフレームである。
いくつかの実施形態では、完全長または部分長のプレTCRα(tgpTCRα)をコードする第1のポリヌクレオチドは、組み込み時に、TCRαの内因性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、完全長または部分長のプレTCRα(tgpTCRα)をコードする第1のポリヌクレオチドは、外因性プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、所与の定義された可変領域の有無にかかわらず、完全または部分的なTCRβ定常領域をコードする第2のポリヌクレオチドは、組み込み時に、TCRβの内因性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、所与の定義された可変領域の有無にかかわらず、完全または部分的なTCRβ定常領域をコードする第2のポリヌクレオチドは、外因性プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、外因性プロモーターは、構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、または細胞型特異的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、外因性プロモーターは、CMV、EF1α、PGK、CAG、およびUBCのうちの1つを含む。一実施形態では、外因性プロモーターは、少なくともCAGを含む。いくつかの実施形態では、tgpTCRαをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも、例示的な配列の配列番号23と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。実施形態では、配列同一性は少なくとも80%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも90%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも95%である。実施形態では、配列同一性は100%である。いくつかの実施形態では、tgpTCRαをコードするポリヌクレオチドは、部分長の配列番号23を含み、これは、本明細書において、配列番号24として表される。完全長もしくは部分長の配列番号23を含むtgpTCRαまたはその任意の機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、コードされるtgpTCRαは、当技術分野で既知のシグナルペプチドをさらに含む。1つの非限定的な例示的なシグナルペプチドは、配列番号22によって表されるペプチドを含む。
配列番号22
[配列表6]
配列番号23
[配列表7]
配列番号24
[配列表8]
配列番号22
[配列表6]
配列番号23
[配列表7]
配列番号24
[配列表8]
いくつかの実施形態では、完全または部分的な定常領域および所与の定義された可変領域を含むTCRβをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも、例示的な配列の配列番号2または配列番号3と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。実施形態では、配列同一性は少なくとも80%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも90%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも95%である。実施形態では、配列同一性は100%である。定義されたTCRβ可変領域は、その配列が特定されているか、または特定され得るように、任意の所与の特異性のものであり得る。非限定的な定義されたTCRβ可変領域は、上記の表Bに例示されており、それは、配列番号45(下線部分)に含まれている。
天然のプロモーター(すなわち、プレTCRαプロモーター)とは異なるプロモーター(外因性プロモーターまたは内因性TCRαプロモーター)によって制御されるプレTCRα発現を有するiPSCが依然として機能的エフェクターT細胞に分化する能力を有するかどうかは、以前は不明であった。ここでは、非天然プロモーターによって制御されるトランスジェニックプレTCRα(tgpTCRα)を含むiPSCの細胞発生生物学が、iPSC由来T細胞への指向された分化が機能的T細胞を生成するように実施され得る程度まで維持され得ることを示そうとした。通常、内因性のプレTCRの発現は発生的に制御されているため、これは驚くべきことである。さらに、tgpTCRα TCRnegiPSCに由来するT細胞には、ペプチドMHC結合能力を有さないが、CD3ζ鎖を含む内因性のCD3サブユニットと会合することによって発現された表面組換えプレTCR複合体(rpTCR)を含む。理論に制限されることなく、トランスジェニックプレTCR/CD3複合体は、それにもかかわらず、細胞表面提示内因性CD3(cs-CD3)複合体を介した標準的なCD3シグナル伝達を通じてiPSC由来T細胞の成熟を駆動した可能性がある。上記を考慮して、本出願の範囲はまた、内因性プレTCRαを上方制御する、および/またはその下方制御を防止する様々な方法を含む。初期/未成熟胸腺細胞ではない細胞での過剰発現されたプレTCRαは、発現された内因性TCRβおよびCD3サブユニットと会合して、ペプチド-MHC結合能力を有さないが、CD3細胞表面提示を可能にする。
したがって、設計3を考慮して、細胞またはその集団が本明細書で提供され、細胞は、iPSC、クローンiPSC、クローンiPS細胞株細胞、または該iPSCの分化から得られる派生細胞であり、細胞は、内因性TCRがノックアウトされる(TCRneg)ような少なくとも内因性TCRαもしくはTCRβの妨害、および少なくとも完全長もしくは部分長のプレTCRαを含むペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、TCRαの不在下でのプレTCRαの発現は、細胞内の内因性またはトランスジェニックTCRβと会合して細胞表面CD3複合体(cs-CD3)の再構成をもたらすが、iPSCの、T細胞を含む機能的派生エフェクター細胞への指向された分化にも寄与する。
設計4:非結合組換えTCR固定CD3(nb-rTCR-CD3)
図1Bに示されるように、この設計4では、内因性TCRαおよび内因性TCRβの一方または両方が、ゲノム編集ツールを使用して細胞においてノックアウトされる(TCRneg;TCRα-/-およびTCRβ-/-)。TCRノックアウトと同時に、またはそれに続いて、外因性ポリヌクレオチドが該TCRneg細胞に導入され、これは、1つのポリヌクレオチドによってコードされるCD3εとCD3δとの間の1つのヘテロ二量体、および/または別のポリヌクレオチドによってコードされるCD3εとCD3γとの間の別のヘテロ二量体が細胞表面に形成され得るように、TCRα定常領域と、CD3εの完全長または部分長の外部ドメインと、CD3δおよびCD3γのうちの1つとを含む組換えTCRαをコードする第1のポリヌクレオチド、および/またはTCRβ定常領域と、CD3εの完全長または部分長の外部ドメインと、組換えTCRαに含まれないCD3δおよびCD3γのうちの1つとを含む組換えTCRβをコードする第2のポリヌクレオチドを含む。
図1Bに示されるように、この設計4では、内因性TCRαおよび内因性TCRβの一方または両方が、ゲノム編集ツールを使用して細胞においてノックアウトされる(TCRneg;TCRα-/-およびTCRβ-/-)。TCRノックアウトと同時に、またはそれに続いて、外因性ポリヌクレオチドが該TCRneg細胞に導入され、これは、1つのポリヌクレオチドによってコードされるCD3εとCD3δとの間の1つのヘテロ二量体、および/または別のポリヌクレオチドによってコードされるCD3εとCD3γとの間の別のヘテロ二量体が細胞表面に形成され得るように、TCRα定常領域と、CD3εの完全長または部分長の外部ドメインと、CD3δおよびCD3γのうちの1つとを含む組換えTCRαをコードする第1のポリヌクレオチド、および/またはTCRβ定常領域と、CD3εの完全長または部分長の外部ドメインと、組換えTCRαに含まれないCD3δおよびCD3γのうちの1つとを含む組換えTCRβをコードする第2のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、組換えTCRαは、N末端で完全長または部分長のCD3εおよびCD3δ外部ドメインと融合しているC末端に完全または部分的なTCRα定常領域を含む(tgCD3(ε-δ)-TRAC)。いくつかの実施形態では、組換えTCRαは、N末端でCD3εおよびCD3γの完全長または部分長の外部ドメインと融合しているC末端に完全または部分的なTCRα定常領域を含む(tgCD3(ε-γ)-TRAC)。いくつかの実施形態では、組換えTCRβは、N末端でCD3εおよびCD3γの完全長または部分長の外部ドメインと融合しているC末端に完全または部分的なTCRβ定常領域(tgCD3(ε-γ)-TRBC)を含む。いくつかの実施形態では、組換えTCRβは、N末端でCD3εおよびCD3δの完全長または部分長の外部ドメインと融合しているC末端に完全または部分的なTCRβ定常領域を含む(tgCD3(ε-δ)-TRBC)。完全長のTCRαまたはTCRβ定常領域をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、C末端にポリAテールをさらに含む。部分長のTCRαまたはTCRβ定常領域をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの組み込みは、それぞれの内因性定常領域内の部位にあり、完全長のトランスジェニック/キメラTRACまたはTRBCが、外因性/トランスジェニックであるその配列の一部、および内因性である別の部分で形成されるように、組み込み部位の下流のTCRαまたはTCRβ定常領域の残りの内因性配列とインフレームである。
第1および第2のポリヌクレオチドの両方が細胞に導入されるいくつかの他の実施形態では、組換えTCRαは、tgCD3(ε-δ)-TRACを含む第1のポリヌクレオチドによってコードされ、組換えTCRβは、tgCD3(ε-γ)-TRBCを含む第2のポリヌクレオチドによってコードされるか、または組換えTCRαは、tgCD3(ε-γ)-TRACを含む第1のポリヌクレオチドによってコードされ、組換えTCRβは、tgCD3(ε-δ)-TRBCを含む第2のポリヌクレオチドによってコードされる。したがって、該実施形態では、1つのポリヌクレオチドによってコードされるCD3εとCD3δとの間の1つのヘテロ二量体、および別のポリヌクレオチドによってコードされるCD3εとCD3γとの間の別のヘテロ二量体が細胞表面に形成され得る。
第1および第2のポリヌクレオチドのうちの1つのみが細胞に導入されるいくつかの実施形態では、他のTCRサブユニットは、野生型/内因性であるか、または定義された可変領域に置き換えられている、または置き換えられていない、その内因性可変領域が除去された定常領域のみを含むように操作されるかのいずれかである:例えば、図1Aの設計1のtgTRACもしくはtgTRBC(可変領域なし)、または図1Aの設計2のtgTCRαもしくはtgTCRβ(定義された可変領域を有する)。したがって、図1Bの設計4に示されるように、tgCD3(ε-δ)-TRACを含む第1のポリヌクレオチドを細胞に導入して、組換えTCRαサブユニットを提供する一実施形態では、tgTRBCまたはtgTCRβを含む別のポリヌクレオチドもまた細胞に導入されて、組換えTCRβサブユニットを提供する。そのため、この実施形態では、内因性CD3εと内因性CD3γとの間の1つのヘテロ二量体、およびtgCD3(ε-δ)-TRACを含むポリヌクレオチドによってコードされるCD3εとCD3δとの間の別のヘテロ二量体が細胞表面に形成され得る。図1Bの設計4のさらに別の実施形態では、tgCD3(ε-γ)-TRBCを含む第2のポリヌクレオチドが細胞に導入されて、組換えTCRβサブユニットを提供し、tgTRACまたはtgTCRαを含む別のポリヌクレオチドもまた細胞に導入されて、組換えTCRαサブユニットを提供し、そのため、内因性CD3εと内因性CD3δとの間の1つのヘテロ二量体、およびtgCD3(ε-γ)-TRBCを含むポリヌクレオチドによってコードされるCD3εとCD3γとの間の別のヘテロ二量体が細胞表面に形成され得る。
いくつかの実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、TCRαの内因性プロモーターによって駆動されるが、いくつかの他の実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、外因性プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、第2のポリヌクレオチドは、TCRβの内因性プロモーターによって駆動されるが、いくつかの他の実施形態では、第2のポリヌクレオチドは、外因性プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、組換えTCRαまたは組換えTCRβのいずれかの外因性プロモーターは、構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、または細胞型特異的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、外因性プロモーターは、CMV、EF1α、PGK、CAG、およびUBCのうちの1つを含む。一実施形態では、外因性プロモーターは、少なくともCAGを含む。いくつかの実施形態では、TCRα定常領域をコードするポリヌクレオチドは、少なくとも、例示的な配列の配列番号1と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、TCRβ定常領域をコードするポリヌクレオチドは、少なくとも、例示的な配列の配列番号2または配列番号3と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長または部分長のCD3ε外部ドメインをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも、例示的な配列の配列番号25と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長または部分長のCD3δ外部ドメインをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも、例示的な配列の配列番号26と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長または部分長のCD3γ外部ドメインをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも、例示的な配列の配列番号27と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。実施形態では、配列同一性は少なくとも80%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも90%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも95%である。実施形態では、配列同一性は100%である。完全長または部分長のCD3ε、CD3δ、またはCD3γ外部ドメインをコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号28、配列番号29、配列番号30、または当技術分野で既知の任意の他のシグナルペプチドのうちの1つを含む。完全長または部分長のCD3ε外部ドメインをコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号28のシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む。完全長または部分長のCD3δ外部ドメインをコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号29のシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む。完全長または部分長のCD3γ外部ドメインをコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号30のシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む。
配列番号25
[配列表9]
配列番号26
[配列表10]
配列番号27
[配列表11]
配列番号28
[配列表12]
配列番号29
[配列表13]
配列番号30
[配列表14]
配列番号25
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配列番号26
[配列表10]
配列番号27
[配列表11]
配列番号28
[配列表12]
配列番号29
[配列表13]
配列番号30
[配列表14]
tgCD3(ε-δ)-TRAC融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、例示的な配列の配列番号31と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含み、配列番号31に含まれる2つのリンカー配列(配列番号33および配列番号34)のそれぞれは、当技術分野で既知のいずれかに置き換えられ得る。tgCD3(ε-γ)-TRBC融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、例示的な配列の配列番号32と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含み、配列番号32に含まれる2つのリンカー配列(配列番号33および配列番号34)のそれぞれは、当技術分野で既知のいずれかに置き換えられ得る。実施形態では、配列同一性は少なくとも80%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも90%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも95%である。実施形態では、配列同一性は100%である。本明細書で提供される、組換えTCRαまたはTCRβ融合タンパク質のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、当技術分野で既知のシグナルペプチドをさらに含む。1つの非限定的な例示的なシグナルペプチドは、配列番号28によって表されるペプチドを含む。
配列番号31
[配列表15]
配列番号32
[配列表16]
[配列表17]
配列番号34
[配列表18]
配列番号31
[配列表15]
配列番号32
[配列表16]
[配列表17]
配列番号34
[配列表18]
本出願では、CD3εならびにCD3δおよびCD3γのうちの1つの外部ドメインと融合したTCRαまたはTCRβ定常領域が、CD3εならびにCD3δおよびCD3γのうちの1つの融合外部ドメインの有無にかかわらず、トランスジェニックTCRβまたはTCRα定常領域と会合して、CD3ε/CD3δおよびCD3ε/CD3γヘテロ二量体を形成することが可能であることを発見した。会合したトランスジェニックTCRαおよびTCRβサブユニットは、内因性CD3ζとさらに会合して、ペプチド-MHC結合可能性は有さないが、CD3外部ドメイン(cs-CD3)の細胞表面発現および内因性CD3ζを通したシグナル伝達を支持することが可能である。したがって、設計4を考慮して、細胞またはその集団が本明細書で提供され、細胞は、iPSC、クローンiPSC、クローンiPS細胞株細胞、または該iPSCの分化から得られる派生細胞であり、細胞は、内因性TCRα定常領域および内因性TCRβ定常領域のそれぞれでの妨害、ならびに融合した完全または部分的なTCRα定常領域を含むtgTCRαと、CD3εならびにCD3δおよびCD3γのうちの1つの完全または部分的な外部ドメインとをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド(tgCD3(ε-δ/γ)-TRAC)、ならびに融合した完全または部分的なTCRβ定常領域を含むtgTCRβと、CD3εならびにCD3δおよびCD3γのうちの1つの完全または部分的な外部ドメインとをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド(tgCD3(ε-γ/δ)-TRBC)のうちの少なくとも1つを含み、CD3サブユニットの外部ドメインは、発現されると細胞表面(cs-CD3)に存在し、該第1の外因性ポリヌクレオチドのみが細胞に含まれる場合、細胞は、本明細書で提供されるtgTRBCまたはtgTCRβをさらに含み、該第2の外因性ポリヌクレオチドのみが細胞に含まれる場合、細胞は、本明細書で提供されるtgTRACまたはtgTCRαをさらに含む。
設計5:CD3キメラ鎖(ccCD3)
図1Bに示されるように、この設計5において、細胞表面提示CD3(cs-CD3)は、CD3キメラ鎖(ccCD3)の形態であり、これは、完全長または部分長のCD3ε外部ドメインと、CD3γまたはCD3δのいずれかの完全長または部分長の外部ドメインと、少なくとも1つのITAM(免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ)を含むCD3ζの完全長または部分長の内部ドメインとを含むように構築される。該CD3キメラ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む細胞は、内因性TCRαおよびTCRβのいずれかまたは両方での妨害をさらに含み得る。ゲノム編集ツールを使用して、TRACおよび/またはTRBCの標的化された編集により、TCRneg細胞を生成する場合、TCRノックアウトと同時に、またはそれに続いて、該CD3キメラ鎖をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドが細胞に導入される。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、TRACまたはTRBCに導入され、それぞれ、TCRαまたはTCRβの内因性プロモーターによって駆動されるが、いくつかの他の実施形態では、導入されたポリヌクレオチドは、外因性プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、外因性プロモーターは、構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、または細胞型特異的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、外因性プロモーターは、CMV、EF1α、PGK、CAG、およびUBCのうちの1つを含む。一実施形態では、外因性プロモーターは、少なくともCAGを含む。
図1Bに示されるように、この設計5において、細胞表面提示CD3(cs-CD3)は、CD3キメラ鎖(ccCD3)の形態であり、これは、完全長または部分長のCD3ε外部ドメインと、CD3γまたはCD3δのいずれかの完全長または部分長の外部ドメインと、少なくとも1つのITAM(免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ)を含むCD3ζの完全長または部分長の内部ドメインとを含むように構築される。該CD3キメラ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む細胞は、内因性TCRαおよびTCRβのいずれかまたは両方での妨害をさらに含み得る。ゲノム編集ツールを使用して、TRACおよび/またはTRBCの標的化された編集により、TCRneg細胞を生成する場合、TCRノックアウトと同時に、またはそれに続いて、該CD3キメラ鎖をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドが細胞に導入される。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、TRACまたはTRBCに導入され、それぞれ、TCRαまたはTCRβの内因性プロモーターによって駆動されるが、いくつかの他の実施形態では、導入されたポリヌクレオチドは、外因性プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、外因性プロモーターは、構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、または細胞型特異的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、外因性プロモーターは、CMV、EF1α、PGK、CAG、およびUBCのうちの1つを含む。一実施形態では、外因性プロモーターは、少なくともCAGを含む。
いくつかの実施形態では、CD3キメラ鎖は、完全長または部分長のCD3ε外部ドメインと、CD3γの完全長または部分長の外部ドメインと、少なくとも1つのITAMを含むCD3ζの完全長または部分長の内部ドメインとを含み(tgCD3(ε-γ)-ζ)、CD3キメラ鎖は、N末端にいずれかの外部ドメインを有する融合タンパク質であり、2つの外部ドメインはヘテロ二量体を形成する。いくつかの実施形態では、CD3キメラ鎖は、完全長または部分長のCD3ε外部ドメインと、CD3δの完全長または部分長の外部ドメインと、少なくとも1つのITAMを含むCD3ζの完全長または部分長の内部ドメインとを含み(ITAM(tgCD3(ε-δ)-ζ))、CD3キメラ鎖は、N末端にいずれかの外部ドメインを有する融合タンパク質であり、2つの外部ドメインはヘテロ二量体を形成する。CD3キメラ鎖のいくつかの実施形態では、CD3ζの内部ドメインは2つのITAMを含み、CD3キメラ鎖のいくつかの実施形態では、CD3ζの内部ドメインは3つすべてのITAMを含む。
いくつかの実施形態では、完全長または部分長のCD3ε外部ドメインをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも、例示的な配列の配列番号25と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長または部分長のCD3δ外部ドメインをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも、例示的な配列の配列番号26と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長または部分長のCD3γ外部ドメインをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも、例示的な配列の配列番号27と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。完全長または部分長のCD3ε、CD3δ、またはCD3γ外部ドメインをコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号27、配列番号29、配列番号30、または当技術分野で既知の任意の他のシグナルペプチドのうちの1つを含む。完全長または部分長のCD3ε外部ドメインをコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号28のシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む。完全長または部分長のCD3δ外部ドメインをコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号29のシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む。完全長または部分長のCD3γ外部ドメインをコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号30のシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、完全長または部分長のCD3ζ内部ドメインをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも、例示的な配列の配列番号35と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含み、これには、CD3ζ ITAM1、ITAM2、およびITAM3(配列番号36~38)が含まれる。実施形態では、配列同一性は少なくとも80%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも90%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも95%である。実施形態では、配列同一性は100%である。
配列番号35
[配列表19]
配列番号36
[配列表20]
配列番号37
[配列表21]
配列番号38
[配列表22]
配列番号35
[配列表19]
配列番号36
[配列表20]
配列番号37
[配列表21]
配列番号38
[配列表22]
CD3キメラ鎖のいくつかの実施形態では、少なくとも1つ、2つ、または3つのITAMを含むCD3ζの内部ドメインは、シグナル伝達および/または共刺激のための、2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγ IL21R、IL-2Rβ(IL-15Rβ)、IL-2Rγ、IL-7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD3ζ1XX、CS1、またはCD8のうちの1つ以上のシグナル伝達ドメインをさらに含む。CD3キメラ鎖の一実施形態では、少なくとも1つ、2つ、または3つのITAMを含むCD3ζの内部ドメインは、少なくとも、CD28のシグナル伝達ドメインをさらに含む(tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ)。CD28のシグナル伝達ドメインを含むCD3ζ内部ドメインのいくつかの実施形態では、完全長または部分長の28ζ内部ドメインをコードするポリヌクレオチドは、任意の1つまたは2つのCD3ζITAMが除去され得る、例示的な配列の配列番号39と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはそれらの間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。CD3キメラ鎖のいくつかの実施形態では、少なくとも1つ、2つ、または3つのITAMを含むCD3ζの内部ドメインは、41BBのシグナル伝達ドメインをさらに含む(tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ)。41BBのシグナル伝達ドメインを含むCD3ζ内部ドメインのいくつかの実施形態では、完全長または部分長のBBζ内部ドメインをコードするポリヌクレオチドは、任意の1つまたは2つのCD3ζ ITAMが除去されてもよい例示的な配列の配列番号40と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはそれらの間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。CD3キメラ鎖のいくつかの実施形態では、少なくとも1つ、2つ、または3つのITAMを含むCD3ζの内部ドメインは、CD28のシグナル伝達ドメインと、41BBのシグナル伝達ドメインとをさらに含む(tgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζ)。28および41BBの両方のシグナル伝達ドメインを含むCD3ζ内部ドメインのいくつかの実施形態では、完全長または部分長の28BBζ内部ドメインをコードするポリヌクレオチドは、任意の1つまたは2つのCD3ζITAMが除去され得る例示的な配列の配列番号41と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはそれらの間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。tgCD3(ε-γ)-(28/BB)ζをコードするポリヌクレオチドの一実施形態では、コードされたポリペプチドは、さらにいくつかの他の実施形態では、任意の1つもしくは2つのCD3ζITAMが除去され得るか、リンカー配列が当技術分野で既知の任意の他のリンカー配列に置き換えられ得るか、またはCD28シグナル伝達ドメインが41BBシグナル伝達ドメインに置き換えられるかもしくはそれを追加することによって増強され得る例示的な配列の配列番号42と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。tgCD3(ε-δ)-(28/BB)ζの一実施形態では、コードされたポリペプチドは、さらにいくつかの他の実施形態では、任意の1つもしくは2つのCD3ζITAMが除去され得るか、リンカー配列が当技術分野で既知の任意の他のリンカー配列に置き換えられ得るか、またはCD28シグナル伝達ドメインが41BBシグナル伝達ドメインで置き換えられるかもしくはそれをさらに含むことによって増強され得る例示的な配列の配列番号43と比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。コードされたCD3キメラ鎖tgCD3(ε-γ)-(28/BB)ζまたはtgCD3(ε-δ)-(28/BB)ζのいくつかの他の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号28のシグナルペプチドまたは当技術分野で知られている任意の他のシグナルペプチドをさらに含む。実施形態では、配列同一性は少なくとも80%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも90%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも95%である。実施形態では、配列同一性は100%である。
配列番号39
[配列表23]
配列番号40
[配列表24]
配列番号41
[配列表25]
配列番号42
[配列表26]
配列番号43
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配列番号39
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配列番号40
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配列番号41
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配列番号42
[配列表26]
配列番号43
[配列表27]
本出願において、本明細書に提供されるCD3キメラ鎖が発見され、このCD3キメラ鎖は、完全長または部分長のCD3ε外部ドメインと、CD3δおよびCD3γのうちの少なくとも1つの完全長または部分長の外部ドメインと、少なくとも1つのITAMを含むCD3ζ内部ドメインと、任意選択で1つ以上のシグナル伝達ドメインとを含む融合タンパク質であり、TCRnegである細胞で発現される場合、キメラCD3外部ドメインを細胞表面に提示することができる。さらに、CD3外部ドメインの細胞表面発現は、ペプチド-MHC結合可能性は有しないが、融合したCD3ζ内部ドメインを通じてCD3結合トリガーシグナル伝達を可能にする。
したがって、設計5を考慮して、細胞またはその集団が本明細書で提供され、細胞は、iPSC、クローンiPSC、クローンiPS細胞株細胞、またはiPSCの分化から得られる派生細胞であり、細胞は、内因性TCRα定常領域および内因性TCRβ定常領域のうちの少なくとも1つの妨害、およびCD3キメラ鎖融合タンパク質(ccCD3)をコードする少なくとも外因性ポリヌクレオチドを含み、融合タンパク質は、CD3εの完全長または部分長の外部ドメインと、CD3δおよびCD3γのうちのいずれか1つの完全長または部分長の外部ドメインと、少なくとも1つのITAMを有するCD3ζの完全長または部分長の内部ドメインと、任意選択で1つ以上のシグナル伝達ドメインを含み、CD3キメラ鎖の外部ドメインは、発現されると細胞表面(cs-CD3)に存在する。
図1A~Cの様々な設計において本明細書に開示されるTCRneg細胞における細胞表面CD3複合体、またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)(TCRneg cs-CD3)は、以下でさらに説明される、CD3特異的抗体またはその機能的バリアント、CAR、および/またはエンゲージャーを含むがこれらに限定されない分子と結合するためのCD3関連細胞表面トリガー受容体として機能することができる。さらに提供されるように、該TCRneg cs-CD3細胞またはその集団は、hnCD16ノックイン、CAR、細胞表面発現外因性サイトカインまたはその受容体の部分長または完全長のペプチド、B2Mノックアウトまたはノックダウン、CIITAノックアウトまたはノックダウン、HLA-Gまたは切断不可能なHLA-Gの導入された発現、CD38ノックアウト、および本書に記載される追加の操作されたモダリティのうちの1つ以上をさらに含み得る。さらに、本出願において、TCRneg cs-CD3、CD16、CAR、CD38陰性、IL15(受容体または切断型バリアントを有する融合タンパク質)、B2M-/-CIITA-/-、およびB2M-/-CIITA-/-HLA-Gを含むがこれらに限定されない、本明細書に提供される少なくとも1つの表現型を有する、単一細胞選別され、拡大されたクローン操作されたIPSCを含むマスター細胞バンクが提供され、細胞バンクは、追加のiPSC操作のためのプラットフォーム、および十分に定義され、組成が均一で、費用効果の高い方法で大規模に大量生産することができる、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供する。
2.hnCD16ノックイン
CD16は、Fc受容体FcγRIIIa(CD16a;NM_000569.6)およびFcγRIIIb(CD16b;NM_000570.4)の2つのアイソフォームとして特定されている。CD16aは、NK細胞によって発現される膜貫通タンパク質であり、標的細胞に付着した単量体IgGに結合して、NK細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害(ADCC)を容易にする。CD16bはヒト好中球によって排他的に発現される。本明細書で使用される場合、「高親和性CD16」、「切断不可能なCD16」、または「高親和性の切断不可能なCD16」は、様々なCD16バリアントを指す。野生型CD16は親和性が低く、NK細胞の活性化により白血球上の様々な細胞表面分子の細胞表面密度を制御するタンパク質分解切断プロセスである外部ドメインシェディングを含む下方制御を受ける。F176V(一部の刊行物ではF158Vとも呼ばれる)は、高親和性を有する例示的なCD16多型対立遺伝子/バリアントであるが、S197Pバリアントは、CD16の遺伝子操作された切断不可能なバージョンの例である。F176VおよびS197Pの両方を含む操作されたCD16バリアントは、親和性が高く、切断不可能であり、これは、WO2015/148926により詳細に記載されており、その完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれる。加えて、CD16の外部ドメインが本質的にCD64外部ドメインの少なくとも一部に置き換えられたキメラCD16受容体はまた、ADCCを実施することが可能なCD16受容体の所望の高親和性および切断不可能な特色を達成することができる。いくつかの実施形態では、キメラCD16の置換外部ドメインは、CD64(UniPRotKB_P12314またはそのアイソフォームもしくは多型バリアント)のEC1、EC2、およびEC3エキソンのうちの1つ以上を含む。
CD16は、Fc受容体FcγRIIIa(CD16a;NM_000569.6)およびFcγRIIIb(CD16b;NM_000570.4)の2つのアイソフォームとして特定されている。CD16aは、NK細胞によって発現される膜貫通タンパク質であり、標的細胞に付着した単量体IgGに結合して、NK細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害(ADCC)を容易にする。CD16bはヒト好中球によって排他的に発現される。本明細書で使用される場合、「高親和性CD16」、「切断不可能なCD16」、または「高親和性の切断不可能なCD16」は、様々なCD16バリアントを指す。野生型CD16は親和性が低く、NK細胞の活性化により白血球上の様々な細胞表面分子の細胞表面密度を制御するタンパク質分解切断プロセスである外部ドメインシェディングを含む下方制御を受ける。F176V(一部の刊行物ではF158Vとも呼ばれる)は、高親和性を有する例示的なCD16多型対立遺伝子/バリアントであるが、S197Pバリアントは、CD16の遺伝子操作された切断不可能なバージョンの例である。F176VおよびS197Pの両方を含む操作されたCD16バリアントは、親和性が高く、切断不可能であり、これは、WO2015/148926により詳細に記載されており、その完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれる。加えて、CD16の外部ドメインが本質的にCD64外部ドメインの少なくとも一部に置き換えられたキメラCD16受容体はまた、ADCCを実施することが可能なCD16受容体の所望の高親和性および切断不可能な特色を達成することができる。いくつかの実施形態では、キメラCD16の置換外部ドメインは、CD64(UniPRotKB_P12314またはそのアイソフォームもしくは多型バリアント)のEC1、EC2、およびEC3エキソンのうちの1つ以上を含む。
したがって、いくつかの実施形態では、高親和性の切断不可能なCD16受容体(hnCD16)は、F176VおよびS197Pの両方を含み、いくつかの実施形態では、F176Vを含み、切断領域が排除されている。いくつかの他の実施形態では、hnCD16は、それぞれ、CD64外部ドメインの少なくとも一部を含む、例示的な配列の配列番号7、8、および9のいずれかと比較した場合、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。実施形態では、配列同一性は少なくとも80%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも90%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも95%である。実施形態では、配列同一性は100%である。配列番号7、8、および9は、配列番号10~12を例示することによってそれぞれコードされる。本明細書および本出願全体を通して使用される場合、2つの配列間の同一性パーセントは、2つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一位置の数の関数(すなわち、同一性%=同一位置の数/位置の総数×100)である。配列の比較および2つの配列間の同一性パーセントの決定は、当技術分野で認識されている数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。
配列番号7:
[配列表28]
配列番号8
[配列表29]
配列番号9
[配列表30]
配列番号10
[配列表31]
配列番号11
[配列表32]
配列番号12
[配列表33]
配列番号7:
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配列番号8
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配列番号9
[配列表30]
配列番号10
[配列表31]
配列番号11
[配列表32]
配列番号12
[配列表33]
したがって、本明細書で企図および記載される他の編集の中でも、高親和性の切断不可能なCD16受容体(hnCD16)を含むように遺伝子操作されたクローンiPSCが本明細書で提供され、遺伝子操作されたiPSCは、iPSCに導入されたhnCD16を含むエフェクター細胞に分化することができる。いくつかの実施形態では、hnCD16を含む由来エフェクター細胞は、NK細胞である。いくつかの実施形態では、hnCD16を含む由来エフェクター細胞は、T細胞である。iPSCまたはそれからの派生細胞において発現される外因性hnCD16は、ADCC抗体またはその断片だけでなく、該hnCD16およびそのバリアントのCD16またはCD64の細胞外結合ドメインを認識する二重特異性、三重特異性、または多重特異性エンゲージャーまたはバインダーへの結合にも高親和性を示す。二重特異性、三重特異性、または多重特異性のエンゲージャーまたはバインダーについては、本出願で以下にさらに記載される(セクションI.7を参照されたい)。したがって、本出願の態様のうちの少なくとも1つは、以下のセクションVでさらに詳述される状態、疾患、または感染の治療における治療用途に十分な量で、派生エフェクター細胞上に発現されるhnCD16の細胞外ドメインとの高親和性結合を介して1つ以上の予め選択されたADCC抗体で予め充填された派生エフェクター細胞またはその細胞集団を提供し、該hnCD16は、CD64、またはF176VおよびS197Pを有するCD16の細胞外結合ドメインを含む。
いくつかの他の実施形態では、hnCD16の天然のCD16膜貫通ドメインおよび/または細胞内ドメインは、キメラFc受容体(CFcR)が非天然膜貫通ドメイン、非天然刺激ドメイン、および/または非天然シグナル伝達ドメインを含むように産生されるように、さらに修飾または置き換えられる。本明細書で使用される場合、「非天然」という用語は、膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、またはシグナル伝達ドメインが、細胞外ドメインを提供する受容体以外の異なる受容体に由来することを意味する。ここの図では、CD16またはそのバリアントに基づくCFcRは、CD16に由来する膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、またはシグナル伝達ドメインを有さない。いくつかの実施形態では、外因性hnCD16ベースのCFcRは、CD3D、CD3E、CD3G、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、T細胞受容体ポリペプチドに由来する非天然膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、外因性hnCD16ベースのCFcRは、CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4、またはNKG2Dポリペプチドに由来する非天然刺激/阻害ドメインを含む。いくつかの実施形態では、外因性hnCD16ベースのCFcRは、CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(41BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、またはNKG2Dポリペプチドに由来する非天然シグナル伝達ドメインを含む。hnCD16の一実施形態では、提供されるキメラ受容体は、膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含み、両方ともIL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、およびNKG2Dポリペプチドのうちの1つに由来する。hnCD16ベースのキメラFc受容体の1つの特定の実施形態は、NKG2Dの膜貫通ドメイン、2B4の刺激ドメイン、およびCD3ζのシグナル伝達ドメインを含み、hnCD16の細胞外ドメインは、CD64またはCD16の完全長または部分配列の細胞外ドメインに由来し、CD16の細胞外ドメインは、F176VおよびS197Pを含む。hnCD16ベースのキメラFc受容体の別の実施形態は、CD3ζの膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含み、hnCD16の細胞外ドメインは、CD64またはCD16の完全長または部分配列の細胞外ドメインに由来し、CD16の細胞外ドメインは、F176VおよびS197Pを含む。
上述のhnCD16ベースのキメラFc受容体の様々な実施形態は、高親和性で抗体もしくはその断片のFc領域に、または二重特異性、三重特異性、もしくは多重特異性エンゲージャーもしくはバインダーのFc領域に結合することができる。結合すると、キメラ受容体の刺激ドメインおよび/またはシグナル伝達ドメインは、エフェクター細胞の活性化およびサイトカイン分泌、ならびに抗体、または腫瘍抗原結合構成要素ならびにFc領域を有する該二重特異性、三重特異性、もしくは多重特異性エンゲージャーもしくはバインダーによって標的とされる腫瘍細胞の殺滅を可能にする。理論に制限されることなく、hnCD16ベースのキメラFc受容体の非天然膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、および/またはシグナル伝達ドメインを通じて、または外部ドメインに結合するエンゲージャーを通じて、CFcRは、エフェクター細胞の殺滅能力に寄与する一方で、エフェクター細胞の増殖および/または拡大の可能性を増加させることができる。抗体およびエンゲージャーは、抗原を発現する腫瘍細胞とCFcRを発現するエフェクター細胞を近接させることができ、これも腫瘍細胞の殺滅の増強に寄与する。二重特異性、三重特異性、多重特異性エンゲージャーまたはバインダーの例示的な腫瘍抗原には、B7H3、BCMA、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、PSMA、PAMA、P-カドヘリン、およびROR1が含まれるが、これらに限定されない。腫瘍細胞を攻撃する際にhnCD16ベースのCFcRを発現するエフェクター細胞を結合させるのに好適ないくつかの非限定的な例示的な二重特異性、三重特異性、多重特異性エンゲージャーまたはバインダーには、CD16(またはCD64)-CD30、CD16(またはCD64)-BCMA、CD16(またはCD64)-IL15-EPCAM、およびCD16(またはCD64)-IL15-CD33が含まれる。
NK細胞の活性化後に細胞表面から切断される初代NK細胞によって発現される内因性CD16受容体とは異なり、派生NKにおけるCD16の様々な切断不可能なバージョンは、CD16のシェディングを回避し、一定の発現を維持する。派生NK細胞では、切断不可能なCD16は、細胞機能の改善を示すTNFαおよびCD107aの発現を増加させる。切断不可能なCD16は、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)、および二重特異性、三重特異性、または多重特異性エンゲージャーの結合も増強する。ADCCは、抗体でコーティングされた標的細胞へのCD16の結合を介したNK細胞媒介溶解機構である。由来NK細胞における導入されたhnCD16の追加の高親和性の特徴により、細胞療法を必要とする対象に細胞を投与する前に、hnCD16を介したNK細胞へのADCC抗体のインビトロ充填も可能となる。提供されるように、hnCD16は、いくつかの実施形態では、F176VおよびS197Pを含み得るか、または配列番号7、8、もしくは9によって例示されるようにCD64に由来する完全または部分的な外部ドメインを含み得るか、または非天然膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも1つをさらに含み得る。開示されるように、本出願はまた、以下のセクションVでさらに詳述されるように、状態、疾患、または感染の治療における治療用途に十分な量で、1つ以上の予め選択されたADCC抗体で予め充填された派生NK細胞またはその細胞集団を提供する。
初代NK細胞とは異なり、初代供給源(すなわち、末梢血、臍帯血、または他のドナー組織などの天然/天然源)からの成熟T細胞は、CD16を発現しない。発現された外因性の切断不可能なCD16を含むiPSCがT細胞の発生生物学を損なわず、外因性のCD16を発現するだけでなく、獲得ADCC機構を介して機能を実行することができる機能的派生T細胞に分化することができることは予想外であった。派生T細胞におけるこの獲得ADCCは、二重標的化のためのアプローチとして、および/またはCAR-T標的化された抗原の発現低下もしくは喪失、またはCAR(キメラ抗原受容体)による認識を回避する変異抗原を伴って腫瘍が再発する、CAR-T細胞療法でしばしば発生する抗原エスケープを救済するためのアプローチとしてさらに使用できる。該派生T細胞が外因性CD16発現を介した獲得ADCCを含む場合、および抗体がCARによって標的とされるものとは異なる腫瘍抗原を標的とする場合、抗体を使用して、CAR-T抗原エスケープを救済し、CAR-T治療でよく見られる標的化された腫瘍の再発生または再発を低減または防止することができる。二重標的化を達成しながら抗原エスケープを低減および/または防止するそのような戦略は、1つ以上のCARを発現するNK細胞にも同様に適用される。この抗原エスケープの低減および防止戦略で使用することができる様々なCARは、以下でさらに詳しく説明される。
したがって、本発明は、外因性CD16を含む派生T細胞を提供する。いくつかの実施形態では、派生T細胞に含まれるhnCD16は、F176VおよびS197Pを含む。いくつかの他の実施形態では、派生T細胞に含まれるhnCD16は、配列番号7、8、または9によって例示されるようにCD64に由来する完全または部分的な外部ドメインを含むか、または非天然膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも1つをさらに含み得る。説明されるように、そのような派生T細胞は、抗体の治療効果を増強するためにADCCによって瞑想されたモノクローナル抗体で腫瘍を標的とする獲得機構を有する。開示されるように、本出願はまた、以下のセクションVでさらに詳述されるように、状態、疾患、または感染の治療における治療用途に十分な量で、1つ以上の予め選択されたADCC抗体で予め充填された派生T細胞またはその細胞集団を提供する。
本出願において、CD16を含むがこれに限定されない、本明細書で提供される少なくとも1つの表現型を有する単一細胞選別され、拡大されたクローン操作されたiPSCを含むマスター細胞バンクがさらに提供され、細胞バンクは、追加のiPSC操作のためのプラットフォーム、および十分に定義され、組成が均一で、費用効果の高い方法で大規模に大量生産することができる、派生NK細胞およびT細胞を含むがこれらに限定されない、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供する。
3.CARの発現
遺伝子操作されたiPSCおよびその派生エフェクター細胞に適用されるのは、当技術分野で既知の任意のCAR設計であり得る。キメラ抗原受容体であるCARは、抗原認識領域、膜貫通ドメイン、および内部ドメインを含む一般に外部ドメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、外部ドメインは、シグナルペプチドもしくはリーダー配列、および/またはスペーサーをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、内部ドメインは、CARを発現するエフェクター細胞を活性化するシグナル伝達ペプチドをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、抗原認識ドメインは、抗原に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、抗原認識ドメインは、疾患または病原体に関連する抗原に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、疾患関連抗原は腫瘍抗原であり、腫瘍は液性または固形腫瘍であり得る。いくつかの実施形態では、CARは、該CARを発現するT細胞またはNK細胞のいずれかを活性化するのに好適である。いくつかの実施形態では、NK特異的シグナル伝達構成要素を含むCARは、NK細胞特異的である。ある特定の実施形態では、該T細胞は、CAR発現iPSCに由来し、派生T細胞は、Tヘルパー細胞、細胞傷害性T細胞、メモリーT細胞、制御性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、αβT細胞、γδT細胞、またはそれらの組み合わせを含み得る。ある特定の実施形態では、該NK細胞は、CAR発現iPSCに由来する。
遺伝子操作されたiPSCおよびその派生エフェクター細胞に適用されるのは、当技術分野で既知の任意のCAR設計であり得る。キメラ抗原受容体であるCARは、抗原認識領域、膜貫通ドメイン、および内部ドメインを含む一般に外部ドメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、外部ドメインは、シグナルペプチドもしくはリーダー配列、および/またはスペーサーをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、内部ドメインは、CARを発現するエフェクター細胞を活性化するシグナル伝達ペプチドをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、抗原認識ドメインは、抗原に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、抗原認識ドメインは、疾患または病原体に関連する抗原に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、疾患関連抗原は腫瘍抗原であり、腫瘍は液性または固形腫瘍であり得る。いくつかの実施形態では、CARは、該CARを発現するT細胞またはNK細胞のいずれかを活性化するのに好適である。いくつかの実施形態では、NK特異的シグナル伝達構成要素を含むCARは、NK細胞特異的である。ある特定の実施形態では、該T細胞は、CAR発現iPSCに由来し、派生T細胞は、Tヘルパー細胞、細胞傷害性T細胞、メモリーT細胞、制御性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、αβT細胞、γδT細胞、またはそれらの組み合わせを含み得る。ある特定の実施形態では、該NK細胞は、CAR発現iPSCに由来する。
ある特定の実施形態では、該抗原認識領域は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダIg、サメ重鎖のみの抗体(VNAR)、Ig NAR、キメラ抗体、組換え抗体、またはその抗体断片を含む。抗体断片の非限定的な例としては、Fab、Fab’、F(ab)’2、F(ab)’3、Fv、単鎖抗原結合断片(scFv)、(scFv)2、ジスルフィド安定化Fv(dsFv)、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片(sdAb、ナノボディ)、組換え重鎖のみの抗体(VHH)、および全抗体の結合特異性を維持する他の抗体断片が挙げられる。CARによって標的とされ得る抗原の非限定的な例としては、ADGRE2、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、CCRI、CCR4、がん胎児性抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CD269(BCMA)、CDS、CLEC12A、サイトメガロウイルス(CMV)感染細胞の抗原(例えば、細胞表面抗原)、上皮糖タンパク質2(EGP2)、上皮糖タンパク質-40(EGP-40)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、EGFRvIII、受容体チロシン-タンパク質キナーゼerb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB葉酸結合タンパク質(FBP)、胎児アセチルコリン受容体(AChR)、葉酸受容体-a、ガングリオシドG2(GD2)、ガングリオシドG3(GD3)、ヒト上皮成長因子受容体2(HER-2)、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、ICAM-1、インテグリンB7、インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2(IL-13Rα2)、κ-軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体(KDR)、ルイスA(CA19.9)、ルイスY(LeY)、L1細胞接着分子(L1-CAM)、LILRB2、メラノーマ抗原ファミリーA 1(MAGE-A1)、MICA/B、ムチン1(Muc-1)、ムチン16(Muc-16)、メソセリン(MSLN)、NKCSI、NKG2Dリガンド、c-Met、がん-精巣抗原NY-ESO-1、腫瘍胎児性抗原(h5T4)、PRAME、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、PRAME前立腺特異的膜抗原(PSMA)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG-72)、TIM-3、TRBCI、TRBC2、血管内皮成長因子R2(VEGF-R2)、ウィルムス腫瘍タンパク質(WT-1)、および当該技術分野で既知の様々な病原体抗原が挙げられる。病原体の非限定的な例としては、病気を引き起こすことが可能なウイルス、細菌、真菌、寄生虫、および原生動物が挙げられる。
いくつかの実施形態では、CARの膜貫通ドメインは、CD3D、CD3E、CD3G、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、T細胞受容体ポリペプチドの天然または修飾された膜貫通領域の完全長または少なくとも一部を含む。
いくつかの実施形態では、内部ドメイン(または細胞内ドメイン)のシグナル伝達ペプチドは、CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(41BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、またはNKG2Dのポリペプチドの完全長または少なくとも一部を含む。一実施形態では、CARのシグナル伝達ペプチドは、CD3ζの少なくとも1つのITAM(免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ)に対して少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%の同一性であるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、該内部ドメインは、少なくとも1つの共刺激シグナル伝達領域をさらに含む。該共刺激シグナル伝達領域は、CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4、もしくはNKG2D、またはそれらの任意の組み合わせのポリペプチドの完全長または少なくとも一部を含み得る。
一実施形態では、本出願で提供される細胞に適用されるCARは、CD28に由来する共刺激ドメインと、CD3ζの天然または修飾されたITAM1を含むシグナル伝達ドメインとを含み、配列番号13に対して少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%の同一性のアミノ酸配列によって表される。さらなる実施形態では、CD28に由来する共刺激ドメインと、CD3ζの天然または修飾されたITAM1とを含むCARはまた、CD28に由来するヒンジドメインと、膜貫通ドメインとを含み、scFvは、ヒンジを介して膜貫通ドメインに接続され得、CARは、配列番号14に対して少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%の同一性のアミノ酸配列を含む。実施形態では、配列同一性は少なくとも80%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも90%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも95%である。実施形態では、配列同一性は100%である。
配列番号13
[配列表34]
配列番号14
[配列表35]
配列番号13
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配列番号14
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別の実施形態では、本出願で提供される細胞に適用されるCARは、NKG2Dに由来する膜貫通ドメインと、2B4に由来する共刺激ドメインと、天然または修飾されたCD3ζを含むシグナル伝達ドメインとを含み、配列番号15に対して少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%の同一性のアミノ酸配列によって表される。NKG2Dに由来する膜貫通ドメインと、2B4に由来する共刺激ドメインと、天然または修飾されたCD3ζを含むシグナル伝達ドメインとを含む該CARは、CD8ヒンジをさらに含み得、そのような構造のアミノ酸配列は、配列番号16に対して少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%の同一性のものである。実施形態では、配列同一性は少なくとも80%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも90%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも95%である。実施形態では、配列同一性は100%である。
配列番号15
[配列表36]
配列番号16
[配列表37]
配列番号15
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配列番号16
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非限定的なCAR戦略には、一対の細胞内ドメインの二量体化を介したヘテロ二量体の条件付き活性化CAR(例えば、米国特許第9587020号を参照されたい);CARを生成するための抗原結合、ヒンジ、および内部ドメインの相同組換えであるスプリットCAR(例えば、米国公開第2017/0183407号を参照されたい);抗原結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインにそれぞれ接続された2つの膜貫通ドメイン間の非共有結合を可能にする多鎖CAR(例えば、米国公開第2014/0134142を参照されたい);二重特異性抗原結合ドメインを有する(例えば、米国特許第9447194号を参照されたい)か、または同じもしくは異なる抗原もしくはエピトープを認識する一対の抗原結合ドメインを有する(例えば、米国特許第8409577号を参照されたい)CAR、あるいはタンデムCAR(例えば、Hegde et al.,J Clin Invest.2016;126(8):3036-3052を参照されたい);誘導性CAR(例えば、米国公開第2016/0046700号、同第2016/0058857号、同第2017/0166877号を参照されたい);切り替え可能なCAR(例えば、米国公開第2014/0219975号を参照されたい);および当技術分野で既知の任意の他の設計が含まれる。
したがって、本明細書で提供されるのは、ゲノム操作されたiPSCの分化から得られた派生細胞を含み、iPSCおよび派生細胞の両方は、TCRneg cs-CD3および/またはhnCD16を含むがこれらに限定されない、追加の修飾されたモダリティとともに、1つ以上のCARを含む。本出願において、CARならびにTCRneg cs-CD3およびhnCD16のうちの1つもしくは両方を含むがこれに限定されない、本明細書で提供される少なくとも1つの表現型を有する単一細胞選別され、拡大されたクローン操作されたiPSCを含むマスター細胞バンクがさらに提供され、細胞バンクは、追加のiPSC操作のためのプラットフォーム、および十分に定義され、組成が均一で、費用効果の高い方法で大規模に大量生産することができる、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供する。1つの特定の実施形態では、iPSCおよびその派生細胞は、TCRneg cs-CD3、hnCD16、および選択された腫瘍またはウイルス抗原を標的とするCARを含み、派生細胞は、NK細胞またはT細胞であり、派生細胞は、hnCD16結合を介して、同じ腫瘍の二重標的化を達成しながら腫瘍抗原エスケープを回避または低減するために、CARによって標的とされたものとは異なる腫瘍抗原を標的とする1つ以上のADCC抗体、または二重特異性、三重特異性、もしくは多重特異性エンゲージャーとともに使用され得る。
さらなる実施形態では、CARを含むiPSCおよびその派生T細胞は、TCR定常領域に挿入されたCARを有し、TCRノックアウトをもたらし、CAR発現を内因性TCRプロモーターの制御下に置く。追加の挿入部位には、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、またはTIGITが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、操作されたiPSCに由来する派生TCR陰性CAR-T細胞は、CD16(F176Vおよび/またはS197P)に天然な、またはCD64に由来する外部ドメイン、ならびに天然または非天然の膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを有するhnCD16をさらに含む。別の実施形態では、CARを含むiPSCおよびその派生NK細胞は、NKG2A遺伝子座またはNKG2D遺伝子座に挿入されたCARを有し、NKG2AまたはNKG2Dノックアウトをもたらし、CAR発現を内因性NKG2AまたはNKG2Dプロモーターの制御下に置く。CARを含むがこれに限定されない、本明細書で提供される少なくとも1つの表現型を有する単一細胞選別され、拡大されたクローン操作されたiPSCを含むマスター細胞バンクがさらに提供され、細胞バンクは、追加のiPSC操作のためのプラットフォーム、および十分に定義され、組成が均一で、費用効果の高い方法で大規模に大量生産することができる、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供する。
4.外因的に導入されたサイトカインおよび/またはサイトカインシグナル伝達
臨床的に関連するサイトカインの全身的な高用量投与を回避することにより、そのような実践による用量制限毒性のリスクが低減される一方で、サイトカインを介した細胞自律性が確立される。可溶性サイトカインを追加投与する必要なしにリンパ球の自律性を達成するために、IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21、および/またはそれらのそれぞれの受容体のうちの1つ以上の部分長または完全長のペプチドが、細胞に導入されて、サイトカイン自体の発現の有無にかかわらず、サイトカインのシグナル伝達を可能にし、それにより、サイトカイン毒性のリスクを低減しながら、細胞の成長、増殖、拡大、および/またはエフェクター機能を維持または改善する。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達のための導入されたサイトカインおよび/またはそのそれぞれの天然または修飾された受容体が、細胞表面で発現される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達は、構成的に活性化される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、誘導性である。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、一過性および/または一時的である。
臨床的に関連するサイトカインの全身的な高用量投与を回避することにより、そのような実践による用量制限毒性のリスクが低減される一方で、サイトカインを介した細胞自律性が確立される。可溶性サイトカインを追加投与する必要なしにリンパ球の自律性を達成するために、IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21、および/またはそれらのそれぞれの受容体のうちの1つ以上の部分長または完全長のペプチドが、細胞に導入されて、サイトカイン自体の発現の有無にかかわらず、サイトカインのシグナル伝達を可能にし、それにより、サイトカイン毒性のリスクを低減しながら、細胞の成長、増殖、拡大、および/またはエフェクター機能を維持または改善する。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達のための導入されたサイトカインおよび/またはそのそれぞれの天然または修飾された受容体が、細胞表面で発現される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達は、構成的に活性化される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、誘導性である。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、一過性および/または一時的である。
図2は、例示的な例としてIL15を使用するいくつかの構築物設計を提示する。図2の設計のいずれかの膜貫通(TM)ドメインは、IL15受容体に天然であり得るか、または任意の他の膜結合タンパク質の膜貫通ドメインで修飾されるか、またはそれに置き換えられてもよい。
図2の設計1:IL15およびIL15Rαは、自己切断ペプチドを使用することによって共発現され、IL15のシス提示を排除することなくIL15のトランス提示を模倣する。
図2の設計2:IL15Rαは、リンカーを介してC末端でIL15に融合し、IL15のシス提示を排除することなくトランス提示を模倣し、IL15の膜結合を確実にする。
図2の設計3:切断型細胞内ドメインを有するIL15Rαは、リンカーを介してC末端でIL15に融合され、IL15のトランス提示を模倣し、IL15膜結合を維持し、さらにシス提示および/またはその細胞内ドメインを介して正常なIL15Rによって媒介される任意の他の潜在的なシグナル伝達経路を排除する。IL15Rαの細胞内ドメインは、受容体がIL15応答細胞で発現し、応答細胞が拡大し、機能するために重要であると考えられている。そのような切断型構築物は、配列番号17に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、または99%の同一性のアミノ酸配列を含み、これは、配列番号18によって表される例示的な核酸配列によってコードされ得る。切断型IL15/IL15Rαの一実施形態では、構築物は、配列番号17の最後4つのアミノ酸「KSRQ」を含まず、配列番号21に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、または99%の同一性のアミノ酸配列を含む。実施形態では、配列同一性は少なくとも80%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも90%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも95%である。実施形態では、配列同一性は100%である。
配列番号17
[配列表38]
配列番号18
[配列表39]
配列番号21
[配列表40]
配列番号17
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配列番号18
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配列番号21
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当業者は、上記のシグナルペプチドおよびリンカー配列が例示的であり、シグナルペプチドまたはリンカーとしての使用に好適なそれらのバリエーションを決して制限しないことを理解するであろう。当業者に既知であり、利用可能な多くの好適なシグナルペプチドまたはリンカー配列が存在する。当業者は、シグナルペプチドおよび/またはリンカー配列が、シグナルペプチドによってもたらされるか、またはリンカーによって連結される機能性ペプチドの活性を改変することなく、別の配列で置換してもよいことを理解する。
図2の設計4:設計3の構築物は、エフェクター細胞の生存および拡大の促進に機能することが示され、IL15Rαの細胞質ドメインは、そのような設計でIL15を備えたエフェクター細胞の自律的特色に悪影響を与えることなく省略できることを示したため、設計4は、設計3の別の実用的な代替案を提供する構築物であり、Sushiドメインが、一方の端でIL15と、もう一方の端で膜貫通ドメインと融合しており(mb-Sushi)、任意選択で、Sushiドメインと膜貫通ドメインとの間にリンカーを有することを除いて、本質的にIL15Rα全体が除去される。融合したIL15/mb-Sushiは、任意の膜結合タンパク質の膜貫通ドメインを介して細胞表面に発現する。設計4などの構築物では、IL15の望ましいトランス提示のみが保持されている場合、シス提示を含むIL15Rαを介した不要なシグナル伝達は排除される。いくつかの実施形態では、Sushiドメインと融合したIL15を含む構成要素は、配列番号19に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、または99%の同一性のアミノ酸配列を含み、これは、配列番号20によって表される例示的な核酸配列によってコードされ得る。実施形態では、配列同一性は少なくとも80%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも90%である。実施形態では、配列同一性は少なくとも95%である。実施形態では、配列同一性は100%である。
配列番号19
[配列表41]
配列番号20
[配列表42]
配列番号19
[配列表41]
配列番号20
[配列表42]
当業者は、上記のシグナルペプチドおよびリンカー配列が例示的であり、シグナルペプチドまたはリンカーとしての使用に好適なそれらのバリエーションを決して制限しないことを理解するであろう。当業者に既知であり、利用可能な多くの好適なシグナルペプチドまたはリンカー配列が存在する。当業者は、シグナルペプチドおよび/またはリンカー配列が、シグナルペプチドによってもたらされるか、またはリンカーによって連結される機能性ペプチドの活性を改変することなく、別の配列で置換してもよいことを理解する。
図2の設計5:天然または修飾されたIL15Rβは、リンカーを介してC末端でIL15に融合され、構成的シグナル伝達を可能にし、IL15の膜結合およびトランス表現を維持する。
図2の設計6:天然または修飾された共通受容体γCは、サイトカインの構成的シグナル伝達および膜結合トランス提示のためのリンカーを介して、C末端でIL15に融合される。共通受容体γCは、共通ガンマ鎖またはCD132とも呼ばれ、IL2受容体サブユニットガンマまたはIL2RGとしても知られる。γCは、IL2、IL4、IL7、IL9、IL15、およびIL21受容体を含むがこれらに限定されない、多くのインターロイキン受容体の受容体複合体に共通するサイトカイン受容体サブユニットである。
図2の設計7:IL15の不在下でホモ二量体を形成する操作されたIL15Rβは、サイトカインの構成的シグナル伝達を産生するのに有用である。
いくつかの実施形態では、サイトカインIL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、およびIL21、ならびに/またはそれらの受容体のうちの1つ以上は、図2の設計のうちの1つ以上を使用してiPSCに、およびiPSC分化時のその派生細胞に導入され得る。いくつかの実施形態では、IL2またはIL15細胞表面の発現およびシグナル伝達は、設計1~7のいずれか1つに図示される構築物を介する。いくつかの実施形態では、IL4、IL7、IL9、またはIL21細胞表面の発現およびシグナル伝達は、共通の受容体またはサイトカイン特異的受容体のいずれかを使用することにより、設計5、6、または7に図示される構築物を介する。いくつかの実施形態では、IL7表面発現およびシグナル伝達は、共通の受容体またはサイトカイン特異的受容体(IL4受容体など)のいずれかを使用することにより、設計5、6、または7に図示される構築物を介する。図2の設計のいずれかの膜貫通(TM)ドメインは、それぞれのサイトカイン受容体に天然であり得るか、または任意の他の膜結合タンパク質の膜貫通ドメインで修飾されるか、またはそれに置き換えられてもよい。
本明細書に開示される少なくとも1つの操作されたモダリティを含む、人工多能性細胞(iPSC)、クローンiPSC、クローンiPS細胞株細胞、またはiPSC由来細胞に加えて、このセクションで説明される、少なくとも外因的に導入されたサイトカインおよび/またはサイトカイン受容体シグナル伝達を有する、単一細胞選別され、拡大されたクローン操作されたiPSCを含むマスター細胞バンクが提供され、細胞バンクは、追加のiPSC操作のためのプラットフォーム、および十分に定義され、組成が均一で、費用効果の高い方法で大規模に大量生産することができる、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供する。CARおよび外因性サイトカインおよび/またはサイトカイン受容体シグナル伝達の両方を含むiPSCおよびそれからの派生細胞において、CARおよびILは、別個の構築物で発現され得るか、またはCARおよびILの両方を含むバイシストロン性構築物において共発現され得る。いくつかのさらなる実施形態では、図2の構築物設計のいずれかによって表される形態のIL15は、例えば、CAR-2A-IL15またはIL15-2A-CARとして図示される自己切断2Aコード配列を介して、CAR発現構築物の5’または3’末端のいずれかに連結され得る。したがって、IL15およびCARは、単一のオープンリーディングフレーム(ORF)にある。一実施形態では、CAR-2A-IL15またはIL15-2A-CAR構築物は、図2の設計3のIL15を含む。別の実施形態では、CAR-2A-IL15またはIL15-2A-CAR構築物は、図2の設計3のIL15を含む。さらに別の実施形態では、CAR-2A-IL15またはIL15-2A-CAR構築物は、図2の設計7のIL15を含む。CAR-2A-IL15またはIL15-2A-CARが発現すると、自己切断2Aペプチドにより、発現されたCARおよびIL15が解離し、解離したIL15が細胞表面に提示される。CAR-2A-IL15またはIL15-2A-CARバイシストロン設計により、タイミングおよび量の両方で、および例えば、単一ORFの表現のための誘導性プロモーターを組み込むために選択され得る同じ制御機構の下で、協調されたCARおよびIL15の発現が可能になる。自己切断ペプチドは、口蹄疫ウイルス(FMDV)、ウマ鼻炎Aウイルス(ERAV)、Thosea asignaウイルス(TaV)、およびブタテシオウイルス-1(PTV-I)(Donnelly,ML,et al,J.Gen.Virol,82,1027-101(2001)、Ryan,MD,et al.,J.Gen.Virol.,72,2727-2732(2001))などの口蹄疫ウイルス、ならびにタイロウイルス(例えば、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス)および脳心筋炎ウイルスなどのカルジオウイルスのメンバーにおいて見出される。FMDV、ERAV、PTV-I、およびTaVに由来する2 Aペプチドは、それぞれ、「F2A」、「E2A」、「P2A」、および「T2A」とも呼ばれる。
IL15について本明細書に開示されるバイシストロン性CAR-2A-IL15またはIL15-2A-CARの実施形態はまた、本明細書で提供される任意の他のサイトカイン、例えば、IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL18、およびIL21の発現も企図する。いくつかの実施形態では、IL2細胞表面発現およびシグナル伝達は、設計1~7のいずれかに図示される構築物を介する。いくつかの実施形態では、IL4、IL7、IL9、またはIL21細胞表面の発現およびシグナル伝達は、共通の受容体および/またはサイトカイン特異的受容体のいずれかを使用して、設計5、6、または7に図示される構築物を介する。
CARならびに外因性サイトカインおよび/またはIL15を含むがこれに限定されないサイトカイン受容体シグナル伝達の両方を含むiPSCおよびそれからの派生細胞において、iPSCおよび派生細胞は、TCRneg cs-CD3および/またはCD16をさらに含み得る。
5.HLA-I-およびHLA-II-欠損
同種異系拒絶反応の問題を回避するために、同種異系レシピエントの組織適合性について、複数のHLAクラスIおよびクラスIIタンパク質を一致させる必要がある。HLAクラスIおよびHLAクラスIIタンパク質の両方の発現が排除または実質的に低下したiPSC細胞株およびそれから分化したその派生細胞が本明細書で提供される。HLAクラスI欠損は、HLAクラスI遺伝子座の任意の領域(染色体6p21)の機能的欠失、またはベータ-2ミクログロブリン(B2M)遺伝子、TAP1遺伝子、TAP2遺伝子、およびタパシンを含むが、これらに限定されない、HLAクラスI関連遺伝子の欠失または発現レベルの低下によって達成され得る。例えば、B2M遺伝子は、すべてのHLAクラスIヘテロ二量体の細胞表面発現に不可欠な共通のサブユニットをコードする。B2M陰性細胞は、HLA-I欠損である。HLAクラスII欠損は、RFXANK、CIITA、RFX5、およびRFXAPを含むがこれらに限定されない、HLA-II関連遺伝子の機能的欠失または低下によって達成され得る。CIITAは転写コアクチベーターであり、クラスIIタンパク質の発現に必要な転写因子RFX5の活性化を介して機能する。CIITA陰性細胞は、HLA-II欠損である。例えば、B2MおよびCIITA発現の両方を欠くためのHLA-IおよびHLA-II欠損の両方を有するiPSC株およびその派生細胞が本明細書で提供され、得られた派生エフェクター細胞は、MHC(主要組織適合遺伝子複合体)一致の必要性を排除することによって同種異系細胞療法を可能にし、宿主(同種異系)T細胞による認識および殺滅を回避する。
同種異系拒絶反応の問題を回避するために、同種異系レシピエントの組織適合性について、複数のHLAクラスIおよびクラスIIタンパク質を一致させる必要がある。HLAクラスIおよびHLAクラスIIタンパク質の両方の発現が排除または実質的に低下したiPSC細胞株およびそれから分化したその派生細胞が本明細書で提供される。HLAクラスI欠損は、HLAクラスI遺伝子座の任意の領域(染色体6p21)の機能的欠失、またはベータ-2ミクログロブリン(B2M)遺伝子、TAP1遺伝子、TAP2遺伝子、およびタパシンを含むが、これらに限定されない、HLAクラスI関連遺伝子の欠失または発現レベルの低下によって達成され得る。例えば、B2M遺伝子は、すべてのHLAクラスIヘテロ二量体の細胞表面発現に不可欠な共通のサブユニットをコードする。B2M陰性細胞は、HLA-I欠損である。HLAクラスII欠損は、RFXANK、CIITA、RFX5、およびRFXAPを含むがこれらに限定されない、HLA-II関連遺伝子の機能的欠失または低下によって達成され得る。CIITAは転写コアクチベーターであり、クラスIIタンパク質の発現に必要な転写因子RFX5の活性化を介して機能する。CIITA陰性細胞は、HLA-II欠損である。例えば、B2MおよびCIITA発現の両方を欠くためのHLA-IおよびHLA-II欠損の両方を有するiPSC株およびその派生細胞が本明細書で提供され、得られた派生エフェクター細胞は、MHC(主要組織適合遺伝子複合体)一致の必要性を排除することによって同種異系細胞療法を可能にし、宿主(同種異系)T細胞による認識および殺滅を回避する。
一部の細胞型では、クラスIの発現の欠如は、NK細胞による溶解をもたらす。この「自己喪失」応答を克服するために、HLA-Gを任意選択でノックインして、操作されたiPSCに由来するHLA-I欠損エフェクター細胞のNK細胞の認識および殺滅を回避することができる。一実施形態では、HLA-I欠損iPSCおよびその派生細胞は、HLA-Gノックインをさらに含む。いくつかの実施形態では、提供されるHLA-I欠損iPSCおよびその派生細胞は、CD58ノックアウトおよびCD54ノックアウトの一方または両方をさらに含む。CD58(またはLFA-3)およびCD54(またはICAM-1)は、シグナル依存性細胞相互作用を開始し、免疫細胞を含む細胞の遊走を容易にする接着タンパク質である。CD58ノックアウトはCD54ノックアウトよりも同種異系NK細胞の活性化を低減する効率が高い一方で、CD58およびCD54の両方をダブルノックアウトすると、NK細胞の活性化の低減がもっとも増強されることが示された。いくつかの観察では、CD58およびCD54ダブルノックアウトは、「自己喪失」効果を克服する上で、HLA-I欠損細胞に対するHLA-G過剰発現よりもさらに効果的である。PSCの分化の可能性および派生T細胞およびNK細胞を含む由来エフェクター細胞の機能に悪影響を与えることなく、TCRnegcs-CD3、HLA-IおよびHLA-II欠損、ならびにhnCD16、CAR、およびILのうちの1つ以上を有する単一細胞選別され、拡大されたクローン操作されたiPSCを含むマスター細胞バンクが本明細書で提供される。上記に提供されるように、いくつかの実施形態では、HLA-IおよびHLA-II欠損iPSCならびにその派生細胞は、HLA-Gをコードする外因性ポリヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、HLA-IおよびHLA-II欠損iPSCならびにその派生細胞は、CD58ヌルである。いくつかの他の実施形態では、HLA-IおよびHLA-II欠損iPSCならびにその派生細胞は、CD54ヌルである。さらにいくつかの他の実施形態では、HLA-IおよびHLA-II欠損iPSCならびにその派生細胞は、CD58ヌルおよびCD54ヌルである。該細胞バンクは、追加のiPSC操作のためのプラットフォーム、および十分に定義され、組成が均一で、費用効果の高い方法で大規模に大量生産することができる、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供する。
6.CD38ノックアウト
細胞表面分子CD38は、多発性骨髄腫およびCD20陰性B細胞悪性腫瘍を含む、リンパ系統および骨髄系統の両方に由来する複数の血液悪性腫瘍において高度に上方制御されており、がん細胞を枯渇させる抗体療法の魅力的な標的となっている。抗体を介したがん細胞の枯渇は、通常、直接的な細胞アポトーシスの誘導と、ADCC(抗体依存性細胞傷害性)などの免疫エフェクター機構の活性化との組み合わせに起因する。ADCCに加えて、治療用抗体と協調する免疫エフェクター機構には、食作用(ADCP)および/または補体依存性細胞傷害性(CDC)も含まれる場合がある。
細胞表面分子CD38は、多発性骨髄腫およびCD20陰性B細胞悪性腫瘍を含む、リンパ系統および骨髄系統の両方に由来する複数の血液悪性腫瘍において高度に上方制御されており、がん細胞を枯渇させる抗体療法の魅力的な標的となっている。抗体を介したがん細胞の枯渇は、通常、直接的な細胞アポトーシスの誘導と、ADCC(抗体依存性細胞傷害性)などの免疫エフェクター機構の活性化との組み合わせに起因する。ADCCに加えて、治療用抗体と協調する免疫エフェクター機構には、食作用(ADCP)および/または補体依存性細胞傷害性(CDC)も含まれる場合がある。
悪性細胞上で高度に発現する以外に、CD38は、形質細胞およびNK細胞、ならびに活性化T細胞およびB細胞でも発現される。造血中、CD38は、CD34+幹細胞、ならびにリンパ系、赤血球、および骨髄の系統にコミットした前駆細胞で、形質細胞段階まで続く成熟の最終段階中に発現される。CD38は、II型膜貫通糖タンパク質として、ヌクレオチド代謝物の産生に関与する受容体および多機能酵素の両方として細胞機能を実行する。酵素として、CD38は、NAD+からADP-リボースへの反応の合成および加水分解を触媒し、それにより細胞接着のプロセス(このプロセスはカルシウム依存である)に重要な小胞体およびリソソームからのカルシウムの放出を刺激する二次メッセンジャーCADPRおよびNAADPを産生する。受容体として、CD38は、CD31を認識し、活性化されたNK細胞におけるサイトカイン放出および細胞傷害性を制御する。CD38は、脂質ラフトの細胞表面タンパク質と会合し、細胞質のCa2+フラックスを制御し、リンパ系および骨髄系細胞におけるシグナル伝達を媒介することも報告されている。
悪性腫瘍治療では、CD38抗原結合受容体を形質導入したT細胞を全身使用すると、CD34+造血前駆細胞、単球、NK細胞、T細胞、およびB細胞のCD38+画分が溶解し、レシピエント免疫エフェクター細胞機能障害のため、治療応答が不完全になり、有効性が低下または排除されることが示されている。加えて、CD38特異的抗体であるダラツムマブで治療された多発性骨髄腫患者では、骨髄および末梢血の両方でNK細胞の低減が観察されたが、T細胞およびB細胞などの他の免疫細胞型は、CD38の発現にもかかわらず影響を受けなかった(Casneuf et al.,Blood Advances.2017;1(23):2105-2114)。理論に制限されることなく、本出願は、フラトリサイドによるCD38特異的抗体および/またはCD38抗原結合ドメイン誘導エフェクター細胞の枯渇もしくは低減を克服することにより、CD38標的化されたがん治療の可能性を最大限に活用する戦略を提供する。加えて、CD38は、同種異系エフェクター細胞のレシピエントにおいてダラツムマブなどのCD38特異的抗体を使用してこれらのレシピエントリンパ球の活性化を抑制することにより、T細胞またはB細胞などの活性化リンパ球で上方制御されるため、これらのエフェクター細胞に対する同種異系拒絶反応が低減および/または防止され、それによりエフェクター細胞の生存および持続性が増加する。したがって、本出願はまた、レシピエントT細胞およびB細胞の活性化に対してCD38特異的抗体、分泌されたCD38特異的エンゲージャー、またはCD38CAR(キメラ抗原受容体)を使用すること、すなわち、しばしば養子細胞移植の前の、活性化されたT細胞およびB細胞のリンパ球枯渇による同種異系拒絶反応の低下または防止を介してエフェクター細胞の持続性および/または生存を増強する戦略も提供する。具体的には、提供される戦略は、CD38ノックアウトiPSC株、単一選別され、拡大されたクローンCD38陰性iPSCを含むマスター細胞バンクを生成することと、操作されたiPSC株の指向された分化を介してCD38陰性(CD38neg)派生エフェクター細胞を得ることとを含み、CD38標的化された治療部分がエフェクター細胞とともに用いられる場合、派生エフェクター細胞は、他の利点の中でもフラトリサイドおよび同種異系拒絶反応から保護される。加えて、抗CD38モノクローナル抗体療法は、患者の造血幹細胞コンパートメントに悪影響を及ぼすことなく、患者の活性化免疫系を大幅に枯渇させる。CD38陰性派生細胞は、CD38抗体を介した枯渇に抵抗する能力があり、有毒なコンディショニング剤を使用せずに抗CD38またはCD38-CARと組み合わせて効果的に投与することができるため、化学療法に基づくリンパ球枯を低減および/または置き換えることができる。単一細胞選別され、拡大されたクローンCD38negiPSCを含むマスター細胞バンクは、TCRneg cs-CD3、hnCD16、CAR、IL、ならびにHLA IおよびII欠損のうちの1つ以上を含むがこれらに限定されない追加のiPSC操作のためのプラットフォーム、および十分に定義され、組成が均一で、費用効果の高い方法で大規模に大量生産することができる、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供する。
本明細書で提供される一実施形態では、iPSC株におけるCD38ノックアウトは、二対立遺伝子ノックアウトである。本明細書に開示されるように、提供されるCD38陰性iPSC株は、発現されると細胞表面CD3複合体、またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(CS-CD3)を提供する、少なくともTCRneg、および1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドをさらに含み、該iPSCは、二次造血内皮(HE)の可能性を有する中胚葉細胞、二次HE、CD34造血細胞、造血幹細胞および前駆細胞、造血多分化能前駆細胞(MPP)、T細胞前駆細胞、NK細胞前駆細胞、骨髄細胞、好中球前駆細胞、T細胞、NKT細胞、NK細胞、B細胞、好中球、樹状細胞、およびマクロファージを含むがこれらに限定されない、機能的派生造血細胞を産生すための指向された分化が可能である。いくつかの実施形態では、抗CD38抗体がADCCを誘導するために使用されるか、または抗CD38 CARが標的化された細胞殺滅に使用される場合、CD38neg iPSCおよび/またはその派生エフェクター細胞は、抗CD38抗体、抗CD38CAR、またはレシピエント活性化T細胞またはB細胞によって排除されず、それにより、そのような治療部分の存在下で、および/またはそれへの曝露後にiPSCおよびそのエフェクター細胞の持続性および/または生存を増加させる。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、そのような治療部分の存在下で、および/または曝露後に、インビボで持続性および/または生存を増加させた。
7.追加の修飾
いくつかの実施形態では、TCRneg cs-CD3、ならびにCD16、CAR、IL、HLA IおよびII欠損、ならびにCD38-/-のうちの1つ以上を含むiPSCおよびその派生エフェクター細胞は、追加で、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP、RAG1のうちの少なくとも1つ、および染色体6p21領域の任意の遺伝子のうちの少なくとも1つに欠失もしくは発現低下、または、HLA-E、41BBL、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、TCR、Fc受容体、エンゲージャー、および二重特異的、多重特異的、もしくはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも1つに導入されたまたは増加した発現を含む。
いくつかの実施形態では、TCRneg cs-CD3、ならびにCD16、CAR、IL、HLA IおよびII欠損、ならびにCD38-/-のうちの1つ以上を含むiPSCおよびその派生エフェクター細胞は、追加で、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP、RAG1のうちの少なくとも1つ、および染色体6p21領域の任意の遺伝子のうちの少なくとも1つに欠失もしくは発現低下、または、HLA-E、41BBL、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、TCR、Fc受容体、エンゲージャー、および二重特異的、多重特異的、もしくはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも1つに導入されたまたは増加した発現を含む。
二重特異性または多重特異性エンゲージャーは、異なる抗体の2つ以上の単鎖可変断片(scFv)または他の機能的バリアントからなる融合タンパク質であり、少なくとも1つのscFvがエフェクター細胞表面分子または「表面トリガー受容体」に結合し、少なくとも別のscFvが腫瘍特異的表面分子を介して腫瘍細胞に結合する。本明細書で使用される場合、「表面トリガー受容体」という用語は、エフェクター細胞の免疫応答、例えば、細胞傷害性応答を引き起こすまたは開始することができる受容体を指す。表面トリガー受容体は操作することができ、エフェクター細胞、例えば、T細胞、NK細胞、NKT細胞、B細胞、マクロファージ、好中球で発現される内因性表面タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、表面トリガー受容体は、エフェクター細胞の天然の受容体および細胞型とは関係なく、エフェクター細胞と特定の標的細胞、例えば、腫瘍細胞との間の二重または多重特異性抗体の結合を容易にする。いくつかの他の実施形態では、1つ以上の外因性表面トリガー受容体は、本明細書に提供される方法および組成物を使用して、すなわち、iPSCの操作を介してエフェクター細胞に導入され得、任意選択で、単一細胞選別され、拡大されたクローン操作されたiPSCを含むマスター細胞バンクを生成し、次いで、iPSCの、T細胞、NK細胞、または供給源iPSCと同じ遺伝子型を含む任意の他のエフェクター細胞への分化を指向する。
このアプローチを使用して、ユニバーサル表面トリガー受容体を含むiPSCも生成し、次いでそのようなiPSCをユニバーサル表面トリガー受容体を発現する様々なエフェクター細胞型の集団に分化させることができる。「ユニバーサル」とは、表面トリガー受容体が、細胞型に関係なく任意のエフェクター細胞で発現および活性化され得、ユニバーサル受容体を発現するすべてのエフェクター細胞が、エンゲージャーの腫瘍結合特異性に関係なく、表面トリガー受容体によって認識可能な同じエピトープを有するエンゲージャーに結合または連結され得ることを意味する。いくつかの実施形態では、同じ腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャーは、異なるユニバーサル表面トリガー受容体と結合するために使用される。いくつかの実施形態では、異なる腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャーは、同じユニバーサル表面トリガー受容体と結合するために使用される。したがって、1つまたは複数のエフェクター細胞型を使用して、特定の型の腫瘍細胞を殺滅する場合もあれば、2つ以上の型の腫瘍を殺滅する場合もある。表面トリガー受容体は、一般に、エフェクター細胞活性化のための共刺激ドメインと、エンゲージャーのエピトープに特異的な抗エピトープとを含むか、またはその逆も同様であり、表面トリガー受容体は、エンゲージャーの抗エピトープを認識可能であるか、またはそれに特異的であるエピトープを含む。例えば、二重特異性エンゲージャーは、一方の端で表面トリガー受容体の抗エピトープ/エピトープに特異的であり、もう一方の端で腫瘍抗原に特異的である。
本明細書で提供されるように、開示される様々な形態の細胞表面提示CD3分子は、他の機能の中でも特に、エンゲージャー認識のためのCD3関連細胞表面トリガー受容体として適用され、これは、発現されたCD3分子がその発現にもかかわらず、細胞表面には存在しないようなTCR陰性である細胞において特に有用である。いくつかの実施形態では、エンゲージャー認識のためのCD3関連表面トリガー受容体は、発現されるとエフェクター細胞の細胞表面に提示される完全または部分的なCD3分子(すなわち、CD3複合体のサブユニットまたはサブドメイン)に含まれる。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞表面に提示される完全または部分的なCD3分子は、(1)少なくともCD3ε、CD3δ、および/またはCD3εを含む1つ以上のCD3サブユニットからの完全長または部分長の少なくとも1つの外部ドメイン、ならびに任意選択で(2)CD3ζの完全長または部分長の内部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、CD3関連表面トリガー受容体を含む完全または部分的なCD3分子のすべてのサブユニットまたはサブドメインは内因性である。いくつかの実施形態では、CD3関連表面トリガー受容体を含む完全または部分的なCD3分子の少なくとも1つのサブユニットまたはサブドメインは外因性である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるCD3関連細胞表面トリガー受容体を結合する二重特異性抗体は、CD3-CD19である。また別の実施形態では、二重特異性抗体はCD3-CD33である。さらに別の実施形態では、二重特異性抗体は、エフェクター細胞と腫瘍細胞抗原結合ドメインとの間にリンカー、例えば、エフェクター細胞拡大を容易にするためのエフェクターNK細胞のリンカーとして修飾されたIL15(一部の刊行物では、TriKEまたは三重特異性キラーエンゲージャーと呼ばれる)をさらに含む。
CD3以外に、二重特異性または多重特異性エンゲージャー認識または結合に使用され得る追加のエフェクター細胞表面分子、または表面トリガー受容体には、本明細書に開示されるCD28、CD5、CD16、NKG2D、CD64、CD32、CD89、NKG2C、およびキメラFc受容体が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、エンゲージャー認識のためにエフェクター細胞の表面で発現されるCD16は、セクションI.2に記載される、CD16(F176Vおよび任意選択でS197Pを含む)またはCD64細胞外ドメイン、ならびに天然または非天然の膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、および/またはシグナル伝達ドメインを含むhnCD16である。いくつかの実施形態では、エンゲージャー認識のためにエフェクター細胞の表面で発現されるCD16は、hnCD16ベースのキメラFc受容体(CFcR)である。いくつかの実施形態では、hnCD16ベースのCFcRは、NKG2Dの膜貫通ドメイン、2B4の刺激ドメイン、およびCD3ζのシグナル伝達ドメインを含み、hnCD16の細胞外ドメインは、CD64またはCD16の完全長または部分配列の細胞外ドメインに由来し、CD16の細胞外ドメインは、F176Vおよび任意選択でS197Pを含む。
二重特異性または多重特異性エンゲージャー認識の例示的な腫瘍細胞表面分子には、B7H3、BCMA、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、PSMA、PAMA、P-カドヘリン、ROR1が含まれるが、これらに限定されない。
上記を考慮して、エフェクター細胞上でCD3を結合させるために、一実施形態では、二重特異性抗体はCD3-CD19である。別の実施形態では、二重特異性抗体はCD3-CD33である。エフェクター細胞上でCD16を結合させるために、二重特異性抗体は、CD16-CD30またはCD64-CD30である。別の実施形態では、二重特異性抗体は、CD16-BCMAまたはCD64-BCMAである。さらに別の実施形態では、二重特異性抗体は、エフェクター細胞と腫瘍細胞抗原結合ドメインとの間にリンカー、例えば、エフェクター細胞拡大を容易にするためのエフェクターNK細胞のリンカーとして修飾されたIL15(一部の刊行物では、TriKEまたは三重特異性キラーエンゲージャーと呼ばれる)をさらに含む。一実施形態では、TriKEは、CD16-IL15-EPCAMまたはCD64-IL15-EPCAMである。別の実施形態では、TriKEは、CD16-IL15-CD33またはCD64-IL15-CD33である。さらに別の実施形態では、TriKEはNKG2C-IL15-CD33である。リンカーはまた、IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL18、およびIL21を含むがこれらに限定されない、他のサイトカインに由来し得る。
8.本明細書で提供される遺伝子操作されたiPSC株およびiPSC由来細胞
上記に照らして、本出願は、発現されると、細胞表面CD3複合体、またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を含むTCRneg細胞(TCRneg cs-CD3)またはその集団を提供し、細胞は、人工多能性細胞(iPSC)、クローンiPSC、クローンiPS細胞株細胞、またはTCRneg cs-CD3 iPSCの指向された分化から得られたiPSC由来細胞である。本明細書に記載される表現型を有する、単一細胞選別され、拡大されたクローン操作されたiPSCを含むマスター細胞バンクも提供され、細胞バンクは、十分に定義され、組成が均一で、費用効果の高い方法で大規模に大量生産することができる、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供する。
上記に照らして、本出願は、発現されると、細胞表面CD3複合体、またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を含むTCRneg細胞(TCRneg cs-CD3)またはその集団を提供し、細胞は、人工多能性細胞(iPSC)、クローンiPSC、クローンiPS細胞株細胞、またはTCRneg cs-CD3 iPSCの指向された分化から得られたiPSC由来細胞である。本明細書に記載される表現型を有する、単一細胞選別され、拡大されたクローン操作されたiPSCを含むマスター細胞バンクも提供され、細胞バンクは、十分に定義され、組成が均一で、費用効果の高い方法で大規模に大量生産することができる、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供する。
いくつかの実施形態では、iPSC由来細胞は、二次造血内皮(HE)の可能性を有する中胚葉細胞、二次HE、CD34造血細胞、造血幹細胞および前駆細胞、造血多分化能前駆細胞(MPP)、T細胞前駆細胞、NK細胞前駆細胞、骨髄細胞、好中球前駆細胞、T細胞、NKT細胞、NK細胞、B細胞、好中球、樹状細胞、およびマクロファージを含むがこれらに限定されない造血細胞である。いくつかの実施形態では、iPSC由来造血細胞は、T細胞、NK細胞、制御性細胞などのエフェクター細胞を含み、これは、TCRnegであり、発現されると細胞表面CD3複合体、またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を含む。さらなる実施形態では、本出願は、細胞表面CD3複合体、またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を含むiPSC由来のTCRnegT細胞(TCRneg cs-CD3)またはその集団を提供し、T細胞は、TCRneg cs-CD3 iPSCの指向された分化から得られる。
本明細書で使用される場合、TCRnegはまた、TCR陰性、TCR-/-、「TCRヌル」、またはTCRノックアウトと呼ばれ、これは、もともと(例えば、NK細胞またはiPSC由来Nk細胞)、または遺伝子発現制御による、またはiPSC細胞(例えば、iPSC、T細胞から再プログラミングされたiPSC(TiPSC))もしくはT細胞をゲノム編集して、内因性TCRもしくはその1つ以上のサブユニットをノックアウトすることによる、またはTCRノックアウトを有するiPSCから分化したTCR陰性派生細胞を得ることによるいずれかで、内因性TCR発現がない細胞を含む。したがって、開示されるように、細胞においてノックアウトされるTCRは、内因性TCR複合体である。細胞におけるTCRのTCRαまたはTCRβのいずれかの定常領域の発現を妨害することは、細胞の内因性TCR複合体をノックアウトする多くの方法のうちの1つである。TCRneg細胞は、細胞表面のCD3認識、結合、および/またはシグナル伝達を必要とする細胞機能に悪影響を及ぼす、TCRneg細胞におけるすべてのCD3サブユニットの発現にもかかわらず、CD3複合体を細胞表面に提示することができないことが発見された。TCRneg細胞において本明細書に開示される細胞表面CD3複合体、またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)は、本明細書に記載される、抗体もしくはその機能的バリアントおよび/またはエンゲージャーを含むがこれらに限定されない分子と結合するためのCD3関連細胞表面トリガー受容体として機能し得る。
発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含むiPSCまたはiPSC由来細胞も本明細書で提供され、細胞は任意選択でTCR陰性である。cs-CD3が発現されると、CD3関連細胞表面トリガー受容体として機能する。TCRneg細胞で提供されるCD3関連表面トリガー受容体のいくつかの実施形態では、受容体は、発現されるとエフェクター細胞表面に提示される完全または部分的な内因性CD3分子に含まれ、発現される場合でも、さもなければTCRneg細胞において起こらない内因性CD3分子の提示は、本出願で提供される完全長または部分長の外因性TCRα、外因性TCRβ、およびそれらの任意のバリアントのうちの1つ以上を含む組換えTCRとの会合によって可能となる。いくつかの実施形態では、TCRneg細胞における完全または部分的な内因性CD3分子の細胞表面提示は、非結合組換えTCR(nb-rTCR)、定義された組換えTCR(d-rTCR)、および/または組換えプレTCRを含む少なくとも組み合えTCRを該細胞において追加で発現することによって可能となる。
いくつかの実施形態では、CD3関連表面トリガー受容体を含むTCRneg細胞は、非結合組換えTCR(nb-rTCR)を含み、nb-rTCRは、tgTRAC(トランスジェニックTCRα定常領域)およびtgTRBC(トランスジェニックTCRβ定常領域)の一方または両方を含み、したがって、TCRneg iPSCまたはiPSC由来細胞は、tgTRACおよび/またはtgTRBCをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。tgTRACをコードするポリヌクレオチドを含むTCRneg細胞のいくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、TRAC遺伝子座に挿入され、挿入されたポリヌクレオチドは、内因性TRACの発現を妨害し、それにより内因性TCRノックアウトをもたらし、任意選択で、挿入されたポリヌクレオチドは、TRACの内因性プロモーターまたは異種プロモーターによって駆動される。tgTRBCをコードするポリヌクレオチドを含むTCRneg細胞のいくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、TRBC遺伝子座に挿入され、挿入されたポリヌクレオチドは、内因性TRBCの発現を妨害し、それにより内因性TCRノックアウトをもたらし、任意選択で、挿入されたポリヌクレオチドは、TRBCの内因性プロモーターまたは異種プロモーターによって駆動される。
いくつかの実施形態では、CD3関連表面トリガー受容体を含むTCRneg細胞は、定義された組換えTCR(d-rTCR)を含み、d-rTCRは、tgTCRα(トランスジェニックTCRα)およびtgTCRβ(トランスジェニックTCRβ)を含み、tgTCRαおよびtgTCRβのそれぞれは、それぞれの定常領域(すなわち、TRACおよびTRBC)に加えて、それぞれの定義された可変領域を含み、したがって、TCRneg iPSCまたはiPSC由来細胞は、tgTCRαおよび/またはtgTCRβをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、定義された可変領域は、既知のTCR特異性を有するT細胞のTCRアルファおよびベータに由来する。いくつかの実施形態では、定義された可変領域は、インバリアントNKT細胞のTCRアルファおよびベータに由来する。tgTCRαをコードするポリヌクレオチドを含むTCRneg細胞のいくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、TRAC遺伝子座に挿入され、挿入されたポリヌクレオチドは、内因性TRACの発現を妨害し、それにより内因性TCRノックアウトをもたらし、任意選択で、挿入されたポリヌクレオチドは、TRACの内因性プロモーターまたは異種プロモーターによって駆動される。tgTCRβをコードするポリヌクレオチドを含むTCRneg細胞のいくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、TRBC遺伝子座に挿入され、挿入されたポリヌクレオチドは、内因性TRBCの発現を妨害し、それにより内因性TCRノックアウトをもたらし、任意選択で、挿入されたポリヌクレオチドは、TRBCの内因性プロモーターまたは異種プロモーターによって駆動される。
いくつかの実施形態では、CD3関連表面トリガー受容体を含むTCRneg細胞は、組換えプレTCR(p-rTCR)を含み、p-rTCRは、tgpTCRα(トランスジェニックプレTCRα)、および任意選択で、tgTRBCまたはtgTCRβを含み、tgTCRβは、定義された可変領域を含み、したがって、TCRneg iPSCまたはiPSC由来細胞は、少なくともtgpTCRαをコードするポリヌクレオチドを含む。tgpTCRαをコードするポリヌクレオチドを含むTCRneg細胞のいくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、TRAC遺伝子座に挿入され、挿入されたポリヌクレオチドは、内因性TRACの発現を妨害し、それにより内因性TCRノックアウトをもたらし、任意選択で、挿入されたポリヌクレオチドは、TRACの内因性プロモーターまたは異種プロモーターによって駆動される。tgpTCRαに加えて、tgTRBCまたはtgTCRβをコードするポリヌクレオチドを含むTCRneg細胞のいくつかの実施形態では、該tgTRBCまたはtgTCRβコードポリヌクレオチドは、TRBC遺伝子座に挿入され、挿入されたポリヌクレオチドは、内因性TRBCの発現を妨害し、それにより内因性TCRノックアウトをもたらし、任意選択で、挿入されたtgTRBCまたはtgTCRβコードポリヌクレオチドは、TRBCの内因性プロモーターまたは異種プロモーターによって駆動される。それぞれの定義された可変領域。
TCRneg細胞におけるCD3関連表面トリガー受容体のいくつかの実施形態では、受容体は、CD3ε、CD3δ、およびCD3γのうちの1つ以上からの少なくとも1つの外因性サブユニットまたはサブドメインを含む完全または部分的なCD3分子に含まれる。一実施形態では、TCRneg細胞におけるエンゲージャー認識のためのCD3関連表面トリガー受容体は、CD3εの少なくとも完全長または部分長の外部ドメインを含む部分的なCD3分子に含まれる。一実施形態では、TCRneg細胞におけるエンゲージャー認識のためのCD3関連表面トリガー受容体は、CD3εの少なくとも完全長または部分長の外部ドメイン、および追加で、CD3γまたはCD3δの完全長または部分長の外部ドメインを含む部分的なCD3分子に含まれる。一実施形態では、該CD3分子は、CD3ε、CD3γ、および/またはCD3δの少なくとも完全長または部分長の外部ドメインを含み、完全長または部分長の外部ドメインは、TCRαまたはTCRβの定常領域と融合し、それぞれTRACまたはTRBCを含む部分的な融合タンパク質は、内因性CD3ζとヘテロ二量体を形成することができる。したがって、CD3関連表面トリガー受容体を有するTCRneg iPSCまたはiPSC由来細胞の一実施形態では、細胞は、(i)CD3εおよびCD3δの完全長または部分長の外部ドメインと、TCRα定常領域とを含むトランスジェニック融合タンパク質(tgCD3(ε-δ)-TRAC)、(ii)CD3εおよびCD3γの完全長または部分長の外部ドメインと、TCRβ定常領域とを含むトランスジェニック融合タンパク質(tgCD3(ε-γ)-TRBC)、(iii)CD3εおよびCD3γの完全長または部分長の外部ドメインと、TCRα定常領域とを含むトランスジェニック融合タンパク質(tgCD3(ε-γ)-TRAC)、ならびに/または(iv)CD3εおよびCD3δの完全長または部分長の外部ドメインと、TCRβ定常領域とを含むトランスジェニック融合タンパク質(tgCD3(ε-δ)-TRBC)のうちの少なくとも1つを含む。CD3関連表面トリガー受容体を有するTCRneg細胞のいくつかの実施形態では、細胞は、少なくともCD3εの完全長または部分長の外部ドメインと融合したTCRα定常領域を含むトランスジェニック融合タンパク質と、少なくともCD3εの完全長または部分長の外部ドメインと融合したTCRβ定常領域を含むトランスジェニック融合タンパク質とを含む、ヘテロ二量体を含む。
TCRneg細胞におけるCD3関連表面トリガー受容体のいくつかの実施形態では、受容体は、CD3ε、CD3δ、CD3γ、および/またはCD3ζのうちの1つ以上からの少なくとも1つの外因性サブユニットもしくはサブドメイン、ならびに任意選択でシグナル伝達および/または共刺激のための2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγ IL21R、IL-2Rβ(IL-15Rβ)、IL-2Rγ、IL-7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD3ζ1XX、CS1、またはCD8うちの1つ以上のシグナル伝達ドメインを含む完全または部分的なCD3分子に含まれ、シグナル伝達ドメインを含むすべてのサブユニットまたはサブドメインは融合してキメラ鎖を形成する。一実施形態では、TCRneg細胞におけるエンゲージャー認識のためのCD3関連表面トリガー受容体は、CD3εの少なくとも完全長または部分長の外部ドメインと、CD3δおよびCD3γの一方または両方の完全長または部分長の外部ドメインと、CDζの完全長または部分長の内部ドメインとを含むCD3キメラ鎖に含まれる。一実施形態では、TCRneg細胞におけるエンゲージャー認識のためのCD3関連表面トリガー受容体は、CD3εの完全長または部分長の外部ドメインと、CD3δおよびCD3γの一方または両方の完全長または部分長の外部ドメインと、CDζの完全長または部分長の内部ドメインとを含むCD3キメラ鎖に含まれ、CD28および41BBLの一方または両方の細胞質シグナル伝達ドメインをさらに含む。したがって、CD3関連表面トリガー受容体を有するTCRneg iPSCまたはiPSC由来細胞の一実施形態では、細胞は、(i)CD3εおよびCD3γの完全長もしくは部分長の外部ドメインと、CD3ζの完全長もしくは部分長の内部ドメインとを含むトランスジェニック融合タンパク質[tgCD3(ε-γ)-ζ]、(ii)CD3εおよびCD3δの完全長もしくは部分長の外部ドメインと、CD3ζの完全長もしくは部分長の内部ドメインとを含むトランスジェニック融合タンパク質[tgCD3(ε-δ)-ζ]、(iii)CD3εの完全長もしくは部分長の外部ドメインを含むトランスジェニック融合タンパク質、CD3γもしくはCD3δの完全長もしくは部分長の外部ドメインと、CD3ζの完全長もしくは部分長の内部ドメインと、CD28のシグナル伝達ドメインとを含むトランスジェニック融合タンパク質[tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ]、(iv)CD3εの完全長もしくは部分長の外部ドメインを含むトランスジェニック融合タンパク質、CD3γもしくはCD3δの完全長もしくは部分長の外部ドメインと、CD3ζの完全長もしくは部分長の内部ドメインと、41BBのシグナル伝達ドメインとを含むトランスジェニック融合タンパク質[tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ]、および/または(v)CD3γもしくはCD3δの完全長もしくは部分長の外部ドメインと、CD3ζの完全長もしくは部分長の内部ドメインと、CD28のシグナル伝達ドメインと、41BBのシグナル伝達ドメインとを含むトランスジェニック融合タンパク質[tgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζ]のうちの少なくとも1つを含む。
発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドと、高親和性の切断不可能なCD16(hnCD16)をコードするポリヌクレオチドとを含むiPSCが本明細書でさらに提供され、iPSCは、機能的な派生造血細胞を産生するように指向された分化が可能である。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、T細胞を含む。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、NK細胞を含む。
発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドと、標的特異的キメラ抗原受容体(CAR)をコードするポリヌクレオチドとを含むiPSCが本明細書で提供され、iPSCは、機能的な派生エフェクター細胞を産生するように指向された分化が可能である。
発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドと、細胞の生存、持続性、および/または拡大に寄与するサイトカインシグナル伝達を可能にする少なくとも1つの外因性サイトカインおよび/またはその受容体(IL)をコードするポリヌクレオチドとを含むiPSCがさらに提供され、iPSC株は、改善された生存、持続性、拡大、およびエフェクター細胞機能を有する機能的な派生造血細胞を産生するように指向された分化が可能である。いくつかの実施形態では、cs-CD3を含むiPSCは、TCR陰性(TCRneg cs-CD3)である。外因的に導入されたサイトカインシグナル伝達は、IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、およびIL21のうちのいずれか1つまたは2つ以上のシグナル伝達を含む。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達のための、サイトカインの導入された部分的または完全なペプチドおよび/またはそのそれぞれの受容体は、細胞表面で発現される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達は、構成的に活性化される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、誘導性である。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、一過性および/または一時的である。いくつかの実施形態では、細胞表面サイトカイン/サイトカイン受容体の一過性/一時的発現は、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、またはmRNAを含むRNAを介する。いくつかの実施形態では、TCRneg cs-CD3 iPSCまたはそれからの派生細胞に含まれる外因性細胞表面サイトカインおよび/または受容体は、IL7シグナル伝達を可能にする。いくつかの実施形態では、TCRneg cs-CD3 iPSCまたはそれからの派生細胞に含まれる外因性細胞表面サイトカインおよび/または受容体は、IL10シグナル伝達を可能にする。いくつかの実施形態では、TCRneg cs-CD3 iPSCまたはそれからの派生細胞に含まれる外因性細胞表面サイトカインおよび/または受容体は、IL15シグナル伝達を可能にする。該TCRneg cs-CD3 IL iPSCのいくつかの実施形態では、IL15発現は、図2の構築物3を介する。該TCRneg cs-CD3 IL iPSCのいくつかの実施形態では、IL15発現は、図2の構築物4を介する。上記の実施形態の該TCRneg cs-CD3 IL iPSCおよびその派生細胞は、インビトロまたはインビボで追加で供給される可溶性サイトカインを接触させることなく、細胞成長、増殖、拡大、および/またはエフェクター機能を自律的に維持または改善することができる。いくつかの実施形態では、TCRneg cs-CD3 IL iPSCおよびその派生エフェクター細胞は、エフェクター細胞を排除することなくADCCを誘導するために抗CD38抗体とともに使用され得、それにより、iPSCならびにそのエフェクター細胞の持続性および/または生存を相乗的に増加させる。
発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドと、CD38ノックアウトとを含むiPSCがさらに提供され、iPSCは、改善された生存、持続性、拡大、およびエフェクター細胞機能を有する機能的な派生造血細胞を産生するように指向された分化が可能である。いくつかの実施形態では、cs-CD3を含むiPSCは、TCR陰性(TCRneg cs-CD3)である。細胞表面分子CD38は、多発性骨髄腫およびCD20陰性B細胞悪性腫瘍を含む、リンパ系統および骨髄系統の両方に由来する複数の血液悪性腫瘍において高度に上方制御されており、がん細胞を枯渇させる抗体療法の魅力的な標的となっている。悪性細胞上で高度に発現する以外に、CD38は、形質細胞およびNK細胞、ならびに活性化T細胞およびB細胞でも発現される。いくつかの実施形態では、抗CD38抗体、CD38結合CAR、または抗CD38 scFvを含むCD3エンゲージャーがADCCおよび/または腫瘍細胞標的化を誘導するために使用される場合、TCRneg cs-CD3 CD38-/-iPSCおよび/またはその派生エフェクター細胞は、エフェクター細胞を排除することなく、すなわち、CD38発現エフェクター細胞の低減または枯渇を引き起こさずに、CD38発現(腫瘍)細胞を標的とし、それにより、iPSCおよびそのエフェクター細胞の持続性および/または生存を増加させることができる。
発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドと、B2Mノックアウトと、CIITAノックアウトと、任意選択でHLA-Gをコードするポリヌクレオチドとを含むiPSCも提供され、iPSCは、機能的な派生造血細胞を産生するように指向された分化が可能である。いくつかの実施形態では、cs-CD3を含むiPSCは、TCR陰性(TCRneg cs-CD3)である。いくつかの実施形態では、該TCRneg cs-CD3 B2M-/-CIITA-/-iPSCおよびその派生エフェクター細胞は、HLA-IおよびHLA-IIの両方が欠損している。
上記を考慮して、本明細書で提供されるのは、発現されると細胞表面CD3複合体またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドと、任意選択で、hnCD16、CAR、外因性サイトカイン/受容体、およびB2M/CIITAノックアウトのうちの1つ、2つ、3つ、または4つすべてを含むiPSCを含み、B2Mがノックアウトされる場合、HLA-Gをコードするポリヌクレオチド、または代替的に、CD58およびCD54ノックアウトの一方または両方が任意選択で導入され、iPSCは、機能的な派生造血細胞を産生するように指向された分化が可能である。いくつかの実施形態では、cs-CD3を含むiPSCは、TCR陰性(TCRneg cs-CD3)である。本出願において、TCRneg、cs-CD3、および任意選択でhnCD16、B2M/CIITAノックアウト、CAR、および外因性サイトカイン/受容体のうちの1つ、2つ、3つ、または4つすべてを含む機能的なiPSC派生造血細胞も含まれ、B2Mがノックアウトされる場合、HLA-Gをコードするポリヌクレオチド、または代替的に、CD58およびCD54ノックアウトの一方または両方が任意選択で導入され、派生造血細胞には、二次造血内皮(HE)の可能性を有する中胚葉細胞、二次HE、CD34造血細胞、造血幹細胞および前駆細胞、造血多分化能前駆細胞(MPP)、T細胞前駆細胞、NK細胞前駆細胞、骨髄細胞、好中球前駆細胞、T細胞、NKT細胞、NK細胞、B細胞、好中球、樹状細胞、およびマクロファージが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で提供される別の態様は、TCRneg、cs-CD3、ならびにIL15およびIL15Rαの切断型融合タンパク質を含むiPSCまたはiPSC由来細胞を含み、融合タンパク質は細胞内ドメインを含まない。図2に「IL15Rα(ΔICD)融合」および「IL5/mb-Sushi」として示されるこれらの実施形態は、本出願全体を通してさらに集合的にIL15Δと略される。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインを欠く切断型IL15/IL15Rα融合タンパク質は、配列番号17、19、または21に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、または99%の同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインを欠く切断型IL15/IL15Rα融合タンパク質は、配列番号17のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインを欠く切断型IL15/IL15Rα融合タンパク質は、配列番号19のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインを欠く切断型IL15/IL15Rα融合タンパク質は、配列番号21のアミノ酸配列を含む。さらにいくつかの他の実施形態では、TCRneg、cs-CD3、細胞内ドメインを欠く切断型IL15/IL15Rα融合タンパク質(IL15Δ)を含むiPSCまたはiPSC由来細胞は、CD38ノックアウト、hnCD16、CAR、外因性サイトカイン/受容体、およびB2M/CIITAノックアウトのうちの1つ以上をさらに含み、B2Mがノックアウトされる場合、HLA-Gをコードするポリヌクレオチドが任意選択で導入され、iPSCは、機能的な派生造血細胞を産生するように指向された分化が可能であり、派生造血細胞には、最二次造血内皮(HE)の可能性、二次HE、CD34造血細胞、造血幹細胞および前駆細胞、造血多分化能前駆細胞(MPP)、T細胞前駆細胞、NK細胞前駆細胞、骨髄細胞、好中球前駆細胞、T細胞、NKT細胞、NK細胞、B細胞、好中球、樹状細胞、およびマクロファージが含まれるが、これらに限定されない。
したがって、本出願は、表1の以下の遺伝子型のいずれか1つを含む、iPSCおよびその機能的な派生造血細胞を提供する。表1に提供される「IL」は、選択される特定のサイトカイン/受容体発現に応じて、IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、およびIL21のうちの1つを表し、ILがIL15を表す場合には、IL15およびIL15Rαの切断型融合タンパク質として上記で詳述されるIL15Δも含むが、細胞内ドメインは含まれない。さらに、iPSCおよびその機能的な派生造血細胞が、CARおよびILの両方を含む遺伝子型を有する場合、CARおよびILは、任意選択で、2A配列を含むバイシストロン性発現カセットに含まれる。比較として、いくつかの他の実施形態では、CARおよびILは、iPSCおよびその機能的な派生造血細胞に含まれる別個の発現カセットにある。1つの特定の実施形態では、CARおよびILの両方を発現するiPSCおよびその機能的な派生エフェクター細胞に含まれ、ILは、図2の構築物3または4のIL15であり、IL15構築物は、CARとともにまたはそれから分離されて発現カセットに含まれる。
9.免疫療法のための抗体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるゲノム操作されたエフェクター細胞に加えて、状態、疾患、または適応症に関連する抗原を標的とする抗体または抗体断片を含む追加の治療薬を、組み合わせ療法でこれらのエフェクター細胞とともに使用することができる。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、またはキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体または抗体断片は、ウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体または抗体断片は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍またはウイルス特異的抗原は、投与されたiPSC由来エフェクター細胞を活性化して、それらの殺滅能力を増強する。いくつかの実施形態では、投与されたiPSC由来エフェクター細胞に対する追加の治療薬としての組み合わせ治療に好適な抗体には、抗CD20(リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、オクレリズマブ)、抗CD22(イノツズマブ、モキセツモマブ、エプラツズマブ)、抗HER2(トラスツズマブ、ペルツズマブ)、抗CD52(アレムツズマブ)、抗EGFR(セルツキシマブ)、抗GD2(ジヌツキシマブ)、抗PDL1(アベルマブ)、抗-CD38(ダラツムマブ、イサツキシマブ、MOR202)、抗CD123(7G3、CSL362)、抗SLAMF7(エロツズマブ)、およびそれらのヒト化もしくはFc修飾されたバリアントもしくは断片、またはそれらの機能的同等物およびバイオシミラーが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、投与されたiPSC由来エフェクター細胞に対する追加の治療薬としての組み合わせ治療に好適な抗体は、標的細胞を標的としながら、標的細胞上の2つ以上の抗原またはエピトープを標的とするか、またはエフェクター細胞(T細胞、NK細胞、またはマクロファージ細胞)を標的細胞に動員する二重特異性または多重特異性抗体をさらに含む。そのような二重特異性または多重特異性抗体は、エフェクター細胞、例えば、T細胞、NK細胞、NKT細胞、B細胞、マクロファージ、および/または好中球を腫瘍細胞に指向し、免疫エフェクター細胞を活性化することができるエンゲージャーとして機能し、抗体療法の利益を最大化する大きな可能性を示す。エンゲージャーは、少なくとも1つの腫瘍抗原に特異的であり、免疫エフェクター細胞の少なくとも1つの表面トリガー受容体に特異的である。エンゲージャーの例には、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)、二重特異性キラー細胞エンゲージャー(BiKE)、三重特異性キラー細胞エンゲージャー(TriKE)、もしくは多重特異性キラー細胞エンゲージャー、または複数の免疫細胞型と適合性のあるユニバーサルエンゲージャーが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるゲノム操作されたエフェクター細胞に加えて、状態、疾患、または適応症に関連する抗原を標的とする抗体または抗体断片を含む追加の治療薬を、組み合わせ療法でこれらのエフェクター細胞とともに使用することができる。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、またはキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体または抗体断片は、ウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体または抗体断片は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍またはウイルス特異的抗原は、投与されたiPSC由来エフェクター細胞を活性化して、それらの殺滅能力を増強する。いくつかの実施形態では、投与されたiPSC由来エフェクター細胞に対する追加の治療薬としての組み合わせ治療に好適な抗体には、抗CD20(リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、オクレリズマブ)、抗CD22(イノツズマブ、モキセツモマブ、エプラツズマブ)、抗HER2(トラスツズマブ、ペルツズマブ)、抗CD52(アレムツズマブ)、抗EGFR(セルツキシマブ)、抗GD2(ジヌツキシマブ)、抗PDL1(アベルマブ)、抗-CD38(ダラツムマブ、イサツキシマブ、MOR202)、抗CD123(7G3、CSL362)、抗SLAMF7(エロツズマブ)、およびそれらのヒト化もしくはFc修飾されたバリアントもしくは断片、またはそれらの機能的同等物およびバイオシミラーが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、投与されたiPSC由来エフェクター細胞に対する追加の治療薬としての組み合わせ治療に好適な抗体は、標的細胞を標的としながら、標的細胞上の2つ以上の抗原またはエピトープを標的とするか、またはエフェクター細胞(T細胞、NK細胞、またはマクロファージ細胞)を標的細胞に動員する二重特異性または多重特異性抗体をさらに含む。そのような二重特異性または多重特異性抗体は、エフェクター細胞、例えば、T細胞、NK細胞、NKT細胞、B細胞、マクロファージ、および/または好中球を腫瘍細胞に指向し、免疫エフェクター細胞を活性化することができるエンゲージャーとして機能し、抗体療法の利益を最大化する大きな可能性を示す。エンゲージャーは、少なくとも1つの腫瘍抗原に特異的であり、免疫エフェクター細胞の少なくとも1つの表面トリガー受容体に特異的である。エンゲージャーの例には、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)、二重特異性キラー細胞エンゲージャー(BiKE)、三重特異性キラー細胞エンゲージャー(TriKE)、もしくは多重特異性キラー細胞エンゲージャー、または複数の免疫細胞型と適合性のあるユニバーサルエンゲージャーが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、iPSC由来エフェクター細胞は、表1に列記される遺伝子型を含む造血系統細胞を含む。いくつかの実施形態では、iPSC由来エフェクター細胞は、表1に列記される遺伝子型を含むNK細胞を含む。いくつかの実施形態では、iPSC由来エフェクター細胞は、表1に列記される遺伝子型を含むT細胞を含む。液性または固形腫瘍を治療するのに有用な組み合わせのいくつかの実施形態では、組み合わせは、少なくともTCRneg cs-CD3を含むiPSC由来NK細胞またはT細胞、および細胞表面CD3を有する細胞を結合する二重特異性または多重特異性抗体を含む。CD3エンゲージャーは、cs-CD3に結合する少なくとも第1の可変セグメントと、ADGRE2、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、CCRI、CCR4、がん胎児性抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、サイトメガロウイルス(CMV)感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質2(EGP2)、上皮糖タンパク質-40(EGP-40)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、EGFRvIII、受容体チロシン-タンパク質キナーゼerb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB葉酸結合タンパク質(FBP)、胎児アセチルコリン受容体(AChR)、葉酸受容体-a、ガングリオシドG2(GD2)、ガングリオシドG3(GD3)、ヒト上皮成長因子受容体2(HER-2)、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、ICAM-1、インテグリンB7、インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2(IL-13Rα2)、κ-軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体(KDR)、ルイスA(CA19.9)、ルイスY(LeY)、L1細胞接着分子(L1-CAM)、LILRB2、メラノーマ抗原ファミリーA 1(MAGE-A1)、MICA/B、ムチン1(Muc-1)、ムチン16(Muc-16)、メソセリン(MSLN)、NKCSI、NKG2Dリガンド、c-Met、がん-精巣抗原NY-ESO-1、腫瘍胎児性抗原(h5T4)、PRAME、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、PRAME前立腺特異的膜抗原(PSMA)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG-72)、TIM-3、TRBCI、TRBC2、血管内皮成長因子R2(VEGF-R2)、ウィルムス腫瘍タンパク質(WT-1)、および/または病原体抗原のうちの少なくとも1つを含む抗原に結合する第2の可変セグメントとを含む。
CD3エンゲージャーのいくつかの実施形態では、エンゲージャーは、cs-CD3に結合する少なくとも第1の可変セグメントと、BCMA、CD19、CD20、CD33、CD38、CD52、CD123、CEA、EGFR、EpCAM、GD2、GPA33、HER2、MICA/B、PDL1、および/またはPSMAのうちの少なくとも1つを含む抗原に結合する第2の可変セグメントとを含む。Cd3エンゲージャーのさらにいくつかの他の実施形態では、エンゲージャーは、CD19、CD33、CD123、CEA、EpCAM、GPA33、HER2、および/またはPSMAのうちの少なくとも1つを含む抗原に結合する第2の可変セグメントを含む。CD3エンゲージャーのまたいくつかの他の実施形態では、エンゲージャーは、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、エルツマキソマブ、RO6958688、AFM11、MT110/AMG110、MT111/AMG211/MEDI-565、AMG330、MT112/BAY2010112、MOR209/ES414、MGD006/S80880、MGD007、および/またはFBTA05のうちの少なくとも1つである。一実施形態では、組み合わせは、CD3エンゲージャーと、TCRneg cs-CD3およびhnCD16を含むiPSC由来NK細胞とを含む。一実施形態では、組み合わせは、CD3エンゲージャーと、TCRneg cs-CD3およびhnCD16を含むiPSC由来NK細胞とを含む。いくつかのさらなる実施形態では、CD3エンゲージャーとの組み合わせに含まれるiPSC由来NK細胞は、TCRneg cs-CD3、hnCD16、IL15、ならびにCD19、BCMA、CD20、CD22、CD38、CD123、HER2、CD52、EGFR、GD2、およびPDL1のうちの1つを標的とするCARを含み、IL15は、CARと同時または別個に発現され、IL15は、図2の構築物1~7に提示される形態のうちのいずれか1つである。いくつかの特定の実施形態では、IL15は、CARと同時または別個に発現される場合、構築物3、4、または7の形態である。
10.チェックポイント阻害剤
チェックポイントは、阻害されていない場合、免疫応答を抑制または下方制御することができる細胞分子、多くの場合細胞表面分子である。腫瘍がある特定の免疫チェックポイント経路を、特に腫瘍抗原に特異的なT細胞に対する免疫抵抗性の主要機構として利用していることが今では明らかになっている。チェックポイント阻害剤(CI)は、チェックポイント遺伝子発現または遺伝子産物を低減するか、またはチェックポイント分子の活性を減少させ、それによって阻害チェックポイントを遮断し、免疫系機能を回復させることができるアンタゴニストである。PD1/PDL1またはCTLA4を標的とするチェックポイント阻害剤の開発により、腫瘍学の展望が変わり、これらの薬剤は複数の適応症で長期寛解をもたらした。しかしながら、多くの腫瘍サブタイプはチェックポイント遮断療法に耐性があり、再発生は依然として重大な懸念事項である。本出願の一態様は、CIとの併用療法で提供される、ゲノム操作された機能的なiPSC由来細胞を含めることによって、CI耐性を克服するための治療アプローチを提供する。併用療法の一実施形態では、iPSC由来細胞はNK細胞である。併用療法の別の実施形態では、iPSC由来細胞はT細胞である。直接的な抗腫瘍能力を呈することに加えて、本明細書で提供される派生NK細胞は、PDL1-PD1媒介阻害に抵抗し、T細胞遊走を増強し、T細胞を腫瘍微小環境に動員し、腫瘍部位でT細胞の活性化を増強する能力を有することが示されている。したがって、機能的に強力なゲノム操作された派生NK細胞によって容易になるT細胞の腫瘍浸潤は、該NK細胞がチェックポイント阻害剤を含むT細胞標的化された免疫療法と相乗作用して局所免疫抑制を軽減し、腫瘍負荷を低減することが可能であることを示している。
チェックポイントは、阻害されていない場合、免疫応答を抑制または下方制御することができる細胞分子、多くの場合細胞表面分子である。腫瘍がある特定の免疫チェックポイント経路を、特に腫瘍抗原に特異的なT細胞に対する免疫抵抗性の主要機構として利用していることが今では明らかになっている。チェックポイント阻害剤(CI)は、チェックポイント遺伝子発現または遺伝子産物を低減するか、またはチェックポイント分子の活性を減少させ、それによって阻害チェックポイントを遮断し、免疫系機能を回復させることができるアンタゴニストである。PD1/PDL1またはCTLA4を標的とするチェックポイント阻害剤の開発により、腫瘍学の展望が変わり、これらの薬剤は複数の適応症で長期寛解をもたらした。しかしながら、多くの腫瘍サブタイプはチェックポイント遮断療法に耐性があり、再発生は依然として重大な懸念事項である。本出願の一態様は、CIとの併用療法で提供される、ゲノム操作された機能的なiPSC由来細胞を含めることによって、CI耐性を克服するための治療アプローチを提供する。併用療法の一実施形態では、iPSC由来細胞はNK細胞である。併用療法の別の実施形態では、iPSC由来細胞はT細胞である。直接的な抗腫瘍能力を呈することに加えて、本明細書で提供される派生NK細胞は、PDL1-PD1媒介阻害に抵抗し、T細胞遊走を増強し、T細胞を腫瘍微小環境に動員し、腫瘍部位でT細胞の活性化を増強する能力を有することが示されている。したがって、機能的に強力なゲノム操作された派生NK細胞によって容易になるT細胞の腫瘍浸潤は、該NK細胞がチェックポイント阻害剤を含むT細胞標的化された免疫療法と相乗作用して局所免疫抑制を軽減し、腫瘍負荷を低減することが可能であることを示している。
一実施形態では、チェックポイント阻害剤併用療法のための由来TCRneg NK細胞は、cs-CD3、ならびに任意選択で、hnCD16発現、B2M/CIITAノックアウト、CAR発現、CD38ノックアウト、および外因性細胞表面サイトカインおよび/または受容体の発現のうちの1つ、2つ、3つ、または4つすべてを含み、B2Mがノックアウトされる場合、HLA-GをコードするポリヌクレオチドまたはCD58およびCD54の一方または両方のノックアウトが任意選択で含まれる。いくつかの実施形態では、派生NK細胞は、表1に列記される遺伝子型のうちのいずれか1つを含む。いくつかの実施形態では、上記の派生NK細胞は、追加で、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP、RAG1、および染色体6p21領域の任意の遺伝子のうちの少なくとも1つに欠失もしくは発現低下、または、HLA-E、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、Fc受容体、エンゲージャー、および二重特異的、多重特異的、もしくはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも1つに導入されたまたは増加した発現を含む。
別の実施形態では、チェックポイント阻害剤併用療法のための由来TCRneg T細胞は、cs-CD3、ならびに任意選択で、hnCD16発現、B2M/CIITAノックアウト、CAR発現、CD38ノックアウト、および外因性細胞表面サイトカインおよび/または受容体の発現のうちの1つ、2つ、3つ、または4つすべてを含み、B2Mがノックアウトされる場合、HLA-GをコードするポリヌクレオチドまたはCD58およびCD54の一方または両方のノックアウトが任意選択で含まれる。いくつかの実施形態では、派生T細胞は、表1に列記される遺伝子型のうちのいずれか1つを含む。いくつかの実施形態では、上記の派生T細胞は、追加で、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP、RAG1、および染色体6p21領域の任意の遺伝子のうちの少なくとも1つに欠失もしくは発現低下、または、HLA-E、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、Fc受容体、エンゲージャー、および二重特異的、多重特異的、もしくはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも1つに導入されたまたは増加した発現を含む。
上記の該派生NK細胞またはT細胞は、TCRneg cs-CD3、ならびに任意選択で、hnCD16発現、B2M/CIITAノックアウト、CAR発現、CD38ノックアウト、および外因性細胞表面サイトカイン発現のうちの1つ、2つ、3つ、または4つすべてを含むiPSCクローン株の分化から得られ、B2Mがノックアウトされる場合、HLA-GをコードするポリヌクレオチドまたはCD58およびCD54の一方または両方のノックアウトが任意選択で導入される。いくつかの実施形態では、上記の該iPSCクローン株は、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP、RAG1、および染色体6p21領域の任意の遺伝子のうちの少なくとも1つに欠失もしくは発現低下、または、HLA-E、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、Fc受容体、エンゲージャー、および二重特異的、多重特異的、もしくはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも1つに導入されたまたは増加した発現をさらに含む。
本明細書で提供される派生NK細胞またはT細胞との併用療法に好適なチェックポイント阻害剤には、PD-1(Pdcdl、CD279)、PDL-1(CD274)、TIM-3(Havcr2)、TIGIT(WUCAMおよびVstm3)、LAG-3(Lag3、CD223)、CTLA-4(Ctla4、CD152)、2B4(CD244)、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、A2aR、BATE、BTLA、CD39(Entpdl)、CD47、CD73(NT5E)、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、レチノイン酸受容体アルファ(Rara)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E、および阻害性KIR(例えば、2DL1、2DL2、2DL3、3DL1、および3DL2)のアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、上記のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストは抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダIg、サメ重鎖のみの抗体(VNAR)、Ig NAR、キメラ抗体、組換え抗体、またはそれらの抗体断片であり得る。抗体断片の非限定的な例としては、Fab、Fab’、F(ab)’2、F(ab)’3、Fv、単鎖抗原結合断片(scFv)、(scFv)2、ジスルフィド安定化Fv(dsFv)、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片(sdAb、ナノボディ)、組換え重鎖のみの抗体(VHH)、および全抗体の結合特異性を維持する他の抗体断片が挙げられ、これらは、産生するのに費用対効果が高いか、使用がより容易であるか、または全抗体よりも感度が高い可能性がある。いくつかの実施形態では、1つ、2つ、または3つ以上のチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ(抗PDL1 mAb)、アベルマブ(抗PDL1 mAb)、デュルバルマブ(抗PDL1 mAb)、トレメリムマブ(抗CTLA4 mAb)、イピリムマブ(抗CTLA4 mAb)、IPH4102(抗KIR)、IPH43(抗MICA)、IPH33(抗TLR3)、リリムマブ(抗KIR)、モナリズマブ(抗NKG2A)、ニボルマブ(抗-PD1 mAb)、ペンブロリズマブ(抗PD1 mAb)、およびそれらの誘導体、機能的同等物、またはバイオシミラーのうちの少なくとも1つを含む。
いくつかの実施形態では、多くのmiRNAが免疫チェックポイントの発現を制御する制御因子として見出されるため、上記のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストはマイクロRNAベースである(Dragomir et al.,Cancer Biol Med.2018,15(2):103-115)。いくつかの実施形態では、チェックポイントアンタゴニストmiRNAには、miR-28、miR-15/16、miR-138、miR-342、miR-20b、miR-21、miR-130b、miR-34a、miR-197、miR-200c、miR-200、miR-17-5p、miR-570、miR-424、miR-155、miR-574-3p、miR-513、およびmiR-29cが含まれるが、これらに限定されない。
提供されたiPSC由来NK細胞またはT細胞との併用療法のいくつかの実施形態は、少なくとも1つのチェックポイント分子を標的とする少なくとも1つのチェックポイント阻害剤を含み、iPSC由来細胞は、表1に列記載される遺伝子型を有する。提供される派生NK細胞またはT細胞との併用療法のいくつかの他の実施形態は、2つ、3つ以上のチェックポイント分子が標的とされるように、2つ、3つ以上のチェックポイント阻害剤を含む。少なくとも1つのチェックポイント阻害剤および表1に列記される遺伝子型を有するiPSC由来細胞を含む併用療法のいくつかの実施形態では、該チェックポイント阻害剤は、抗体、またはヒト化もしくはFc修飾されたバリアントもしくは断片、またはその機能的同等物またはバイオシミラーであり、該チェックポイント阻害剤は、該抗体、またはその断片もしくはバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド配列を発現することにより、iPSC由来細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、チェックポイントを阻害する抗体またはその断片もしくはバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド配列は、別個の構築物、またはCARおよび抗体もしくはその断片をコードする配列の両方を含むバイシストロン性構築物のいずれかにおいて、CARと共発現される。いくつかのさらなる実施形態では、抗体またはその断片をコードする配列は、例えば、CAR-2A-CIまたはCI-2A-CARとして図示される自己切断2Aコード配列を介して、CAR発現構築物の5’または3’末端のいずれかに連結され得る。そのため、チェックポイント阻害剤およびCARのコード配列は、単一のオープンリーディングフレーム(ORF)にある。チェックポイント阻害剤が、腫瘍微小環境(TME)に浸潤することが可能な派生エフェクター細胞によってペイロードとして送達、発現、分泌される場合、TMEに結合すると阻害性チェックポイント分子を相殺し、CARまたは活性化受容体などのモダリティを活性化することによってエフェクター細胞の活性化を可能にする。いくつかの実施形態では、CARと共発現されるチェックポイント阻害剤は、チェックポイント分子:PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2aR、BATE、BTLA、CD39(Entpdl)、CD47、CD73(NT5E)、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、レチノイン酸受容体アルファ(Rara)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E、および阻害性KIRのうちの少なくとも1つを阻害する。いくつかの実施形態では、表1に列記される遺伝子型を有する派生細胞においてCARと共発現されるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、トレメリムマブ、イピリムマブ、IPH4102、IPH43、IPH33、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ならびにそれらのヒト化またはFc修飾されたバリアント、断片、およびそれらの機能的同等物またはバイオシミラーを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、CARと共発現されるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、またはそのヒト化もしくはFc修飾されたバリアント、断片、またはそれらの機能的同等物もしくはバイオシミラーである。いくつかの実施形態では、CARと共発現されるチェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、またはそのヒト化もしくはFc修飾されたバリアント、断片、またはそれらの機能的同等物もしくはバイオシミラーである。いくつかの実施形態では、CARと共発現されるチェックポイント阻害剤は、ペムブロリズマブ、またはそのヒト化もしくはFc修飾されたバリアント、断片、またはそれらの機能的同等物もしくはバイオシミラーである。
本明細書で提供されるiPSC由来細胞およびチェックポイント分子を阻害する少なくとも1つの抗体を含む併用療法のいくつかの他の実施形態では、該抗体は、iPSC由来細胞によって、またはiPSC由来細胞において産生されず、表1に列記される遺伝子型を有するiPSC由来細胞の投与前、それとともに、またはその後に追加で投与される。いくつかの実施形態では、提供される派生NK細胞またはT細胞との併用療法における1つ、2つ、3つ以上のチェックポイント阻害剤の投与は、同時または連続的である。表1に列記される遺伝子型を有する派生NK細胞またはT細胞を含む併用治療の一実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、トレメリムマブ、イピリムマブ、IPH4102、IPH43、IPH33、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ならびにそれらのヒト化またはFc修飾されたバリアント、断片、およびそれらの機能的同等物またはバイオシミラーのうちの1つ以上である。表1に列記される遺伝子型を有する由来NK細胞またはT細胞を含む併用治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、またはそのヒト化もしくはFc修飾されたバリアント、断片、およびその機能的同等物もしくはバイオシミラーである。表1に列記される遺伝子型を有する由来NK細胞またはT細胞を含む併用治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、あるいはそのヒト化もしくはFc修飾されたバリアント、断片、またはその機能的同等物もしくはバイオシミラーである。表1に列記される遺伝子型を有する由来NK細胞またはT細胞を含む併用治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、ペムブロリズマブ、あるいはそのヒト化もしくはFc修飾されたバリアント、断片、またはその機能的同等物もしくはバイオシミラーである。
II.iPSCの選択された遺伝子座での標的化されたゲノム編集の方法
本明細書で交換可能に使用されるゲノム編集(genome editing)、またはゲノム編集(genomic editing)、または遺伝子編集は、標的化された細胞のゲノムにおいてDNAが挿入される、欠失される、および/または置き換えられる遺伝子操作の一種である。標的化されたゲノム編集(targeted genome editing)(「標的化されたゲノム編集(targeted genomic editing)」または「標的化された遺伝子編集」と交換可能)により、ゲノム内の予め選択された部位での挿入、欠失、および/または置換が可能となる。標的化された編集中に挿入部位で内因性配列が欠失されると、影響を受ける配列を含む内因性遺伝子が、配列の欠失によりノックアウトまたはノックダウンされる可能性がある。したがって、標的化された編集を使用して、内因性遺伝子の発現を正確に妨害することもできる。「標的化された組み込み」という用語は、本明細書で同様に使用され、挿入部位での内因性配列の欠失の有無にかかわらず、1つ以上の外因性配列の挿入を伴うプロセスを指す。比較すると、ランダムに組み込まれた遺伝子は、位置効果およびサイレンシングを受け、それらの発現は信頼性がなく、予測できない。例えば、セントロメアおよびサブテロメア領域は、特に導入遺伝子サイレンシングを起こしやすい。相互に、新たに組み込まれた遺伝子は、周囲の内因性遺伝子およびクロマチンに影響を及ぼし、細胞の挙動を改変するか、または細胞の形質転換を支持する可能性がある。したがって、セーフハーバー遺伝子座またはゲノムセーフハーバー(GSH)などの予め選択された遺伝子座に外因性DNAを挿入することは、安全性、効率、コピー数制御、および信頼性の高い遺伝子応答制御にとって重要である。
本明細書で交換可能に使用されるゲノム編集(genome editing)、またはゲノム編集(genomic editing)、または遺伝子編集は、標的化された細胞のゲノムにおいてDNAが挿入される、欠失される、および/または置き換えられる遺伝子操作の一種である。標的化されたゲノム編集(targeted genome editing)(「標的化されたゲノム編集(targeted genomic editing)」または「標的化された遺伝子編集」と交換可能)により、ゲノム内の予め選択された部位での挿入、欠失、および/または置換が可能となる。標的化された編集中に挿入部位で内因性配列が欠失されると、影響を受ける配列を含む内因性遺伝子が、配列の欠失によりノックアウトまたはノックダウンされる可能性がある。したがって、標的化された編集を使用して、内因性遺伝子の発現を正確に妨害することもできる。「標的化された組み込み」という用語は、本明細書で同様に使用され、挿入部位での内因性配列の欠失の有無にかかわらず、1つ以上の外因性配列の挿入を伴うプロセスを指す。比較すると、ランダムに組み込まれた遺伝子は、位置効果およびサイレンシングを受け、それらの発現は信頼性がなく、予測できない。例えば、セントロメアおよびサブテロメア領域は、特に導入遺伝子サイレンシングを起こしやすい。相互に、新たに組み込まれた遺伝子は、周囲の内因性遺伝子およびクロマチンに影響を及ぼし、細胞の挙動を改変するか、または細胞の形質転換を支持する可能性がある。したがって、セーフハーバー遺伝子座またはゲノムセーフハーバー(GSH)などの予め選択された遺伝子座に外因性DNAを挿入することは、安全性、効率、コピー数制御、および信頼性の高い遺伝子応答制御にとって重要である。
標的化された編集は、ヌクレアーゼに依存しないアプローチ、またはヌクレアーゼに依存するアプローチのいずれかによって達成され得る。ヌクレアーゼに依存しない標的化された編集アプローチでは、相同組換えは、宿主細胞の酵素機構を介して、挿入される外因性ポリヌクレオチドに隣接する相同配列によって誘導される。
代替的に、特定のレアカッティング(rare-cutting)エンドヌクレアーゼによる二本鎖切断(DSB)の特異的導入を介して、より高い頻度で標的化された編集を達成することができる。そのようなヌクレアーゼに依存する標的化された編集は、DSBに応答して起こる非相同末端結合(NHEJ)を含むDNA修復機構を利用する。外因性遺伝子材料を含むドナーベクターがないと、NHEJは、多くの場合、少数の内因性ヌクレオチドのランダムな挿入または欠失(イン/デル)をもたらす。比較すると、一対の相同性アームに隣接する外因性遺伝子材料を含むドナーベクターが存在する場合、外因性遺伝子材料は、相同組換えによる相同性指向修復(HDR)中にゲノムに導入され、「標的化された組み込み」をもたらし得る。場合によっては、標的化された組み込み部位が選択された遺伝子のコード領域内にあることが意図されているため、標的化された組み込みが遺伝子発現を妨害し、1回の編集ステップでノックインおよびノックアウト(KI/KO)を同時にもたらすことができる。
目的の遺伝子座(GOI)の選択された位置に1つ以上の導入遺伝子を挿入して、同時に遺伝子をノックアウトすることが達成され得る。同時ノックインおよびノックアウト(KI/KO)に好適な遺伝子座には、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRαまたはβ定常領域、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、およびTIGITが含まれるが、これらに限定されない。位置選択的挿入のためのそれぞれの部位特異的標的化相同性アームにより、導入遺伝子が、その部位の内因性プロモーターの下、または構築物に含まれる外因性プロモーターの下のいずれかで発現することを可能にする。2つ以上の導入遺伝子を選択した位置に(例えば、CD38遺伝子座に)挿入する場合、リンカー配列、例えば、2AリンカーまたはIRESを任意の2つの導入遺伝子の間に配置する。2Aリンカーは、FMDV、ERAV、PTV-I、またはTaV(それぞれ「F2A」、「E2A」、「P2A」、および「T2A」と呼ばれる)に由来する自己切断ペプチドをコードし、別個のタンパク質が単一の翻訳から産生されることを可能にする。いくつかの実施形態では、インスレーターは、導入遺伝子および/または外因性プロモーターサイレンシングのリスクを低減するために構築物に含まれる。外因性プロモーターは、CAG、またはCMV、EF1α、PGK、およびUBCを含むがこれらに限定されない他の構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、または細胞型特異的プロモーターであり得る。
特定のおよび標的化されたDSBを導入することができる利用可能なエンドヌクレアーゼには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、RNAガイドCRISPR(クラスター化された規則的な配置の回文配列リピート)系が含まれるが、これらに限定されない。加えて、phiC31およびBxb1インテグラーゼを利用するDICE(デュアルインテグラーゼカセット交換)系も、標的化された組み込みのための有望なツールである。
ZFNは、ジンクフィンガーDNA結合ドメインに融合したヌクレアーゼを含む標的化されたヌクレアーゼである。「ジンクフィンガーDNA結合ドメイン」または「ZFBD」とは、1つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的様式でDNAに結合するポリペプチドドメインを意味する。ジンクフィンガーは、ジンクフィンガー結合ドメイン内の約30アミノ酸のドメインであり、その構造は亜鉛イオンの配位により安定化される。ジンクフィンガーの例には、C2H2ジンクフィンガー、C3Hジンクフィンガー、およびC4ジンクフィンガーが含まれるが、これらに限定されない。「設計された」ジンクフィンガードメインは、その設計/組成が主に合理的な基準、例えば、既存のZFP設計の情報と結合データを格納するデータベースの情報を処理するための置換規則およびコンピューター化されたアルゴリズムの適用から生じる、自然界では存在しないドメインである。例えば、米国特許第6,140,081号、同第6,453,242号、および同第6,534,261号を参照されたく、また、WO98/53058、WO98/53059、WO98/53060、WO02/016536、およびWO03/016496も参照されたい。「選択された」ジンクフィンガードメインは、自然界では見られないドメインであり、その産生は、主にファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択などの経験的プロセスから生じる。ZFNは、米国特許第7,888,121号および米国特許第7,972,854号により詳細に記載されており、その完全な開示は参照により本明細書に組み込まれる。当技術分野で最も認識されているZFNの例は、FokIヌクレアーゼとジンクフィンガーDNA結合ドメインとの融合である。
TALENは、TALエフェクターDNA結合ドメインに融合したヌクレアーゼを含む標的化されたヌクレアーゼである。「転写活性化因子様エフェクターDNA結合ドメイン」、「TALエフェクターDNA結合ドメイン」、または「TALE DNA結合ドメイン」とは、TALエフェクタータンパク質のDNAへの結合に関与するTALエフェクタータンパク質のポリペプチドドメインを意味する。TALエフェクタータンパク質は、感染中にXanthomonas属の植物病原体から分泌される。これらのタンパク質は植物細胞の核に入り、DNA結合ドメインを介してエフェクター特異的DNA配列に結合し、それらのトランス活性化ドメインを介してこれらの配列で遺伝子転写を活性化する。TALエフェクターDNA結合ドメインの特異性は、リピート可変二残基(RVD)と呼ばれる選択リピート位置で多型を含む不完全な34アミノ酸リピートのエフェクター可変数に依存する。TALENは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第2011/0145940号により詳細に記載されている。当技術分野で最も認識されているTALENの例は、FokIヌクレアーゼのTALエフェクターDNA結合ドメインへの融合ポリペプチドである。
主題の方法で使用が見出される標的化されたヌクレアーゼの別の例は、標的化されたSpo11ヌクレアーゼであり、目的のDNA配列に特異性を有するDNA結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガーDNA結合ドメイン、TALエフェクターDNA結合ドメインなどに融合したヌクレアーゼ活性を有するSpo11ポリペプチドを含むポリペプチドである。例えば、米国特許出願第61/555,857号を参照されたく、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明に好適な標的化されたヌクレアーゼの追加の例には、個々にまたは組み合わせて使用されるかにかかわらず、Bxb1、phiC31、R4、PhiBT1、およびWβ/SPBc/TP901-1が含まれるが、これらに限定されない。
標的化されたヌクレアーゼの他の非限定的な例には、天然に存在するヌクレアーゼおよび組換えヌクレアーゼ;cas、cpf、cse、csy、csn、csd、cst、csh、csa、csm、およびcmrを含むファミリーからのCRISPR関連ヌクレアーゼ;制限エンドヌクレアーゼ;メガヌクレアーゼ;ホーミングエンドヌクレアーゼなどが含まれる。
例示的な例として、CRISPR/Cas9は、2つの主要な構成要素:(1)Cas9エンドヌクレアーゼおよび(2)crRNA-tracrRNA複合体を必要とする。共発現されると、2つの構成要素は複合体を形成し、PAMおよびPAM近くのシーディング領域を含む標的DNA配列に動員される。crRNAおよびtracrRNAを組み合わせてキメラガイドRNA(gRNA)を形成し、Cas9を誘導して選択された配列を標的とすることができる。これらの2つの構成要素は、トランスフェクションまたは形質導入を介して哺乳類細胞に送達され得る。CRISPR/Cpf系を使用する場合、Cpfエンドヌクレアーゼ(Cpf1、MAD7、および当技術分野で多くのより知られるもの)および(2)Cpfエンドヌクレアーゼを誘導して、選択された配列を標的とするための、しばしばtracrRNAを必要としないgNAが必要である。
DICEを介した挿入では、一対のリコンビナーゼ、例えば、phiC31およびBxb1を使用して、各酵素自体の小さなattBおよびattP認識部位に厳密に制限されている外因性DNAの一方向の組み込みを提供する。これらの標的att部位は哺乳類のゲノムには天然に存在しないため、最初に所望の組み込み部位でゲノムに導入する必要がある。例えば、米国出願公開第2015/0140665号を参照されたく、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の一態様は、標的化されたゲノム組み込みのための1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を提供する。一実施形態では、構築物は、所望の組み込み部位に特異的な一対の相同アームをさらに含み、標的化された組み込み方法は、細胞に構築物を導入して、細胞宿主酵素機構による部位特異的相同組換えを可能にすることを含む。別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なDNA結合ドメインを含むZFN発現カセットを細胞に導入して、ZFNを介した挿入を可能にすることとを含む。さらに別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なDNA結合ドメインを含むTALEN発現カセットを細胞に導入して、TALENを介した挿入を可能にすることとを含む。別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、Cas9発現カセットを導入することと、所望の組み込み部位に特異的なガイド配列を含むgRNAを細胞に導入して、Cas9を介した挿入を可能にすることとを含む。また別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、一対のDICEリコンビナーゼの1つ以上のatt部位を含む構築物を細胞の所望の組み込み部位に導入することと、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、DICEリコンビナーゼの発現カセットを導入して、DICEを介した標的化された組み込みを可能にすることとを含む。
標的化された組み込みのための有望な部位には、ヒトのゲノムの遺伝子内または遺伝子外領域であり、理論的には、宿主細胞または生物に悪影響を与えることなく、新たに組み込まれたDNAの予測可能な発現に対応できる、セーフハーバー遺伝子座またはゲノムセーフハーバー(GSH)が含まれるか、これらに限定されない。有用なセーフハーバーは、ベクターにコードされたタンパク質または非コードRNAの所望のレベルを得るのに十分な導入遺伝子の発現を可能にする必要がある。セーフハーバーはまた、細胞を悪性形質転換させやすくしてはならず、また細胞機能を改変してはならない。組み込み部位が可能性のあるセーフハーバー遺伝子座となるために、理想的には、以下を含むがこれらに限定されない基準を満たす必要がある:配列アノテーションによって判断される制御要素もしくは遺伝子の破壊がない;遺伝子の密集した領域内の遺伝子間領域であるか、または反対方向に転写された2つの遺伝子間の収束位置である;ベクターにコードされた転写活性化因子と隣接する遺伝子、特にがん関連遺伝子およびマイクロRNA遺伝子のプロモーターとの間の長距離にわたる相互作用の可能性を最小限に抑えるために距離を保つ;かつユビキタスな転写活性を示す広範な空間的および時間的発現配列タグ(EST)発現パターンに反映されるように、明らかにユビキタスな転写活性を有する。この後者の特徴は、分化中にクロマチンリモデリングが、典型的にはいくつかの遺伝子座のサイレンシングおよび他の遺伝子座の潜在的な活性化をもたらす幹細胞において特に重要である。外因性挿入に好適な領域内で、挿入のために選択された正確な遺伝子座は、反復要素および保存された配列を欠き、相同アーム増幅のためのプライマーを容易に設計することができるはずである。
ヒトゲノム編集、または具体的には標的化された組み込みに好適な部位には、アデノ随伴ウイルス部位1(AAVS1)、ケモカイン(CCモチーフ)受容体5(CCR5)遺伝子座、およびマウスROSA26遺伝子座のヒトオルソログが含まれるが、これらに限定されない。加えて、マウスH11遺伝子座のヒトオルソログもまた、本明細書に開示される組成物および標的化された組み込み方法を使用する挿入に好適な部位であり得る。さらに、コラーゲンおよびHTRP遺伝子座は、標的化された組み込みのためのセーフハーバーとしても使用され得る。しかしながら、選択された各部位の検証は、特に特定の組み込み事象のための幹細胞で必要であることが示されており、プロモーターの選択、外因性遺伝子の配列および配置、ならびに構築物の設計を含む挿入戦略の最適化がしばしば必要である。
標的化されたイン/デルの場合、編集部位は、その発現および/または機能が妨害されることを意図している内因性遺伝子に含まれることが多い。一実施形態では、標的化されたイン/デルを含む内因性遺伝子は、免疫応答の制御および調節に関連している。いくつかの他の実施形態では、標的化されたイン/デルを含む内因性遺伝子は、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答制御および調節、または幹細胞および/もしくは前駆細胞、ならびにその由来細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能、自己再生、持続性、および/または生存を抑制するタンパク質に関連する。
したがって、本発明の一態様は、ゲノムセーフハーバーを含む選択された遺伝子座、または本明細書に提供されるB2M、TAP1、TAP2、タパシン、TRAC、またはCD38遺伝子座などの連続的または一時的な遺伝子発現に安全であり、十分に制御されていることが既知のまたは証明されている予め選択された遺伝子座における標的化された組み込み方法を提供する。一実施形態では、標的化された組み込み方法のためのゲノムセーフハーバーは、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、ベータ-2ミクログロブリン、CD38、GAPDH、TCRもしくはRUNX1、またはゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む1つ以上の所望の組み込み部位を含む。いくつかの実施形態では、標的化された組み込みは、組み込みの結果としての遺伝子のノックダウンまたはノックアウトが所望される1つ以上の遺伝子座にあり、そのような遺伝子座には、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRαまたはβ定常領域、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、およびTIGITが含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的な一対の相同アームおよび1つ以上の外因性配列を含む構築物を導入して、細胞宿主酵素機構による部位特異的相同組換えを可能にすることとを含み、所望の組み込み部位は、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRαもしくはβ定常領域、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、またはTIGITを含む。
別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なDNA結合ドメインを含むZFN発現カセットを細胞に導入して、ZFNを介した挿入を可能にすることとを含み、所望の組み込み部位は、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRαもしくはβ定常領域、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、またはTIGITを含む。さらに別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なDNA結合ドメインを含むTALEN発現カセットを細胞に導入して、TALENを介した挿入を可能にすることとを含み、所望の組み込み部位は、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRαもしくはβ定常領域、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、またはTIGITを含む。別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、Cas9発現カセットおよび所望の組み込み部位に特異的なガイド配列を含むgRNAを細胞に導入して、Cas9を介した挿入を可能にすることとを含み、所望の組み込み部位は、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRαもしくはβ定常領域、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、またはTIGITを含む。また別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、一対のDICEリコンビナーゼの1つ以上のatt部位を含む構築物を、細胞の所望の組み込み部位に導入することと、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、DICEリコンビナーゼの発現カセットを導入して、DICEを介した標的化された組み込みを可能にすることとを含み、所望の組み込み部位は、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRαもしくはβ定常領域、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、またはTIGITを含む。
さらに、本明細書で提供されるように、セーフハーバーにおける標的化された組み込みのための上記の方法は、目的の任意のポリヌクレオチド、例えば、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、ならびに幹細胞および/または前駆細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能、自己複製、持続性、および/または生存を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入するために使用される。いくつかの他の実施形態では、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物は、1つ以上のマーカー遺伝子をさらに含む。一実施形態では、本発明の構築物における外因性ポリヌクレオチドは、安全スイッチタンパク質をコードする自殺遺伝子である。誘導された細胞死に好適な自殺遺伝子系には、カスパーゼ9(またはカスパーゼ3もしくは7)およびAP1903;チミジンキナーゼ(TK)およびガンシクロビル(GCV);シトシンデアミナーゼ(CD)および5-フルオロシトシン(5-FC)が含まれるが、これらに限定されない。加えて、一部の自殺遺伝子系は細胞型特異的であり、例えば、B細胞分子CD20でのTリンパ球の遺伝子修飾により、mAbリツキシマブの投与によりそれらを排除することができる。さらに、セツキシマブによって認識される修飾されたEGFR含有エピトープは、細胞がセツキシマブに曝露されたときに遺伝子操作された細胞を枯渇させるために使用することができる。したがって、本発明の一態様は、カスパーゼ9(カスパーゼ3または7)、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、修飾されたEGFR、およびB細胞CD20から選択される安全スイッチタンパク質をコードする1つ以上の自殺遺伝子の標的化された組み込み方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書の方法によって組み込まれる1つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、標的化された組み込みのための構築物に含まれる作動可能に連結された外因性プロモーターによって駆動される。プロモーターは、誘導性または構成的であってもよく、時間特異的、組織特異的、または細胞型特異的であってもよい。本発明の方法に好適な構築的プロモーターには、サイトメガロウイルス(CMV)、伸長因子1α(EF1α)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、ハイブリッドCMVエンハンサー/ニワトリβ-アクチン(CAG)、およびユビキチンC(UBC)プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、外因性プロモーターはCAGである。
本明細書の方法によって組み込まれる外因性ポリヌクレオチドは、組み込み部位で、宿主ゲノムの内因性プロモーターによって駆動され得る。一実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムのAAVS1遺伝子座での1つ以上の外因性ポリヌクレオチドの標的化された組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも1つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性AAVS1プロモーターによって駆動される。別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムのROSA26遺伝子座での標的化された組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも1つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性ROSA26プロモーターによって駆動される。また別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムのH11遺伝子座での標的化された組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも1つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性H11プロモーターによって駆動される。別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムのコラーゲン遺伝子座での標的化された組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも1つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性コラーゲンプロモーターによって駆動される。また別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムのHTRP遺伝子座での標的化された組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも1つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性HTRPプロモーターによって駆動される。理論的には、所望の位置への正しい挿入のみが、内因性プロモーターによって駆動される外因性遺伝子の遺伝子発現を可能にするであろう。
いくつかの実施形態では、標的化された組み込み方法のための構築物に含まれる1つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、1つのプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、構築物は、部分間の物理的分離を広げ、酵素機構へのアクセスを最大にするために、同じプロモーターによって駆動される2つの隣接するポリヌクレオチド間に1つ以上のリンカー配列を含む。リンカー配列のリンカーペプチドは、部分(外因性ポリヌクレオチド、および/またはそれからコードされるタンパク質またはペプチド)間の物理的分離を、関連する機能に応じてより柔軟にまたはより堅固にするように選択されたアミノ酸からなり得る。リンカー配列は、別個の部分を生じさせるために、プロテアーゼによって切断可能であるか、または化学的に切断可能であり得る。リンカーにおける酵素的切断部位の例には、エンテロキナーゼ、第Xa因子、トリプシン、コラゲナーゼ、およびトロンビンなどのタンパク質分解酵素による切断のための部位が含まれる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、宿主によって自然に産生されるか、または外因的に導入されるものである。代替的に、リンカーにおける切断部位は、選択された化学物質、例えば、臭化シアン、ヒドロキシルアミン、または低pHへの曝露時に切断が可能な部位であり得る。任意選択のリンカー配列は、切断部位を提供する以外の目的を果たし得る。リンカー配列は、部分が適切に機能するために、別の隣接する部分に対する部分の効果的な配置を可能にするべきである。リンカーはまた、部分間の立体障害を防ぐのに十分な長さの単純なアミノ酸配列であり得る。加えて、リンカー配列は、例えば、リン酸化部位、ビオチン化部位、硫酸化部位、γ-カルボキシル化部位などを含むがこれらに限定されない、翻訳後修飾を提供し得る。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、生物学的に活性なペプチドを単一の望ましくない立体構造に保持しないように柔軟である。リンカーは、柔軟性を提供するために、グリシン、アラニン、およびセリンなどの小さな側鎖を有するアミノ酸から主に構成され得る。いくつかの実施形態では、リンカー配列の約80または90パーセント以上は、グリシン、アラニン、またはセリン残基、特にグリシンおよびセリン残基を含む。いくつかの実施形態では、G4Sリンカーペプチドは、融合タンパク質の末端プロセシングドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインを分離する。他の実施形態では、2Aリンカー配列は、2つの別個のタンパク質が単一の翻訳から産生されることを可能にする。適切なリンカー配列は、経験的に容易に特定することができる。加えて、リンカー配列の好適なサイズおよび配列もまた、従来のコンピューターモデリング技法によって決定することができる。一実施形態では、リンカー配列は、自己切断ペプチドをコードする。一実施形態では、自己切断ペプチドは2Aである。いくつかの他の実施形態では、リンカー配列は、内部リボソーム侵入配列(IRES)を提供する。いくつかの実施形態では、任意の2つの連続するリンカー配列は異なる。
標的化された組み込みのための外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入する方法は、それ自体が知られている細胞への遺伝子移入の方法を使用して達成することができる。一実施形態では、構築物は、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどのウイルスベクターの骨格を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベクターは、外因性ポリヌクレオチドを標的細胞(例えば、pAl-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)などに送達および/または発現するために使用される。いくつかの他の実施形態では、エピソームベクターは、外因性ポリヌクレオチドを標的細胞に送達するために使用される。いくつかの実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)を遺伝子操作のために使用して、相同組換えを介して挿入、欠失、または置換を導入することができる。レンチウイルスとは異なり、rAAVは宿主ゲノムに組み込まれない。加えて、エピソームrAAVベクターは、従来の標的化プラスミドのトランスフェクションと比較して、はるかに高い割合で相同性指向遺伝子標的化を媒介する。いくつかの実施形態では、AAV6またはAAV2ベクターは、iPSCのゲノムの標的部位に挿入、欠失または置換を導入するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書の方法および組成物を使用して得られたゲノム修飾されたiPSCおよびその派生細胞は、表1に列記される少なくとも1つの遺伝子型を含む。
III.ゲノム操作されたiPSCを取得および維持する方法
本発明は、1つ以上の所望の部位で1つ以上の標的化された編集を含むゲノム操作されたiPSCを取得および維持する方法を提供し、標的化された編集は、拡大されたゲノム操作されたiPSCまたはiPSC由来非多能性細胞において、それぞれの選択した編集部位で無傷および機能的であり続ける。標的化された編集は、iPSCおよびそれからの派生細胞のゲノムに、挿入、欠失、および/または置換、すなわち、選択した部位での標標的化された組み込みおよび/またはイン/デルを導入する。患者由来の末梢血由来一次エフェクター細胞を直接操作する場合と比較して、本明細書で提供されるようにiPSCの編集および分化を介してゲノム操作されたiPSC由来を得ることの多くの利点には、以下が含まれるが、これらに限定されない:操作されたエフェクター細胞の無制限の供給源;特に複数の操作されたモダリティが含まれる場合、エフェクター細胞を繰り返し操作する必要がない;得られたエフェクター細胞は、伸長したテロメアを有し、消耗が少ないために回復している;主に本明細書で提供される操作されたiPSCでのクローン選択が可能であるため、エフェクター細胞集団は、編集部位、コピー数、および対立遺伝子変異、無作為変異、および発現多様性がないという点で均質である。
本発明は、1つ以上の所望の部位で1つ以上の標的化された編集を含むゲノム操作されたiPSCを取得および維持する方法を提供し、標的化された編集は、拡大されたゲノム操作されたiPSCまたはiPSC由来非多能性細胞において、それぞれの選択した編集部位で無傷および機能的であり続ける。標的化された編集は、iPSCおよびそれからの派生細胞のゲノムに、挿入、欠失、および/または置換、すなわち、選択した部位での標標的化された組み込みおよび/またはイン/デルを導入する。患者由来の末梢血由来一次エフェクター細胞を直接操作する場合と比較して、本明細書で提供されるようにiPSCの編集および分化を介してゲノム操作されたiPSC由来を得ることの多くの利点には、以下が含まれるが、これらに限定されない:操作されたエフェクター細胞の無制限の供給源;特に複数の操作されたモダリティが含まれる場合、エフェクター細胞を繰り返し操作する必要がない;得られたエフェクター細胞は、伸長したテロメアを有し、消耗が少ないために回復している;主に本明細書で提供される操作されたiPSCでのクローン選択が可能であるため、エフェクター細胞集団は、編集部位、コピー数、および対立遺伝子変異、無作為変異、および発現多様性がないという点で均質である。
特定の実施形態では、1つ以上の選択された部位での1つ以上の標的化された編集を含むゲノム操作されたiPSCは、運命維持培地(FMM)として表2に示される細胞培養培地において、単一細胞として長期間維持、継代、および拡大され、iPSCは、選択された部位で標的化された編集および機能修飾を保持する。培地の組成は、表2に示される最適範囲内の量で培地中に存在し得る。FMMで培養されたiPSCは、未分化で、基底またはナイーブなプロファイル、培養物を洗浄または選択する必要なくゲノム安定性を維持し続けることが示されており、3つすべての体細胞系統、胚様体または単層(胚様体の形成なし)を介したインビトロ分化、および奇形腫形成によるインビボ分化を容易に生じさせる。例えば、米国特許出願第61/947,979号を参照されたく、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、1つ以上の標的化された組み込みおよび/またはイン/デルを含むゲノム操作されたiPSCは、MEK阻害剤、GSK3阻害剤、およびROCK阻害剤を含み、TGFβ受容体/ALK5阻害剤を含まないか、または本質的に含まない培地中で維持、継代、拡大され、iPSCは、選択された部位において無傷で機能的な標的化された編集を保持する。
本発明の別の態様は、iPSCの標的化された編集を通じて、または最初に標的化された編集によりゲノム操作された非多能性細胞を生成し、次に選択/単離されたゲノム操作された非多能性細胞を再プログラミングして、非多能性細胞と同じ標的化された編集を含むiPSCを得ることを通じて、ゲノム操作されたiPSCを生成する方法を提供する。本発明のさらなる態様は、標的化された組み込みおよび/または標的化されたイン/デルを細胞に導入することによって同時に再プログラミングを受けているゲノム操作された非多能性細胞を提供し、接触した非多能性細胞は再プログラミングに十分な条件下にあり、再プログラミングの条件は、非多能性細胞を1つ以上の再プログラミング因子および小分子と接触させることを含む。同時のゲノム操作および再プログラミングのための方法の様々な実施形態では、非多能性細胞を1つ以上の再プログラミング因子および任意選択で小分子と接触させることにより再プログラミングを開始する前に、または本質的に同時に、標的化された組み込みおよび/または標的化されたイン/デルを非多能性細胞に導入することができる。
いくつかの実施形態では、非多能性細胞を同時にゲノム操作および再プログラミングするために、標的化された組み込みおよび/またはイン/デルはまた、非多能性細胞を1つ以上の再プログラミング因子および小分子と接触させることによって再プログラミングの複数日のプロセスが開始された後に非多能性細胞に導入されてもよく、再プログラミング細胞がSSEA4、Tra181、およびCD30を含むがこれらに限定されない1つ以上の内因性多能性遺伝子の安定した発現を示す前に、構築物を担持するベクターが導入される。
いくつかの実施形態では、再プログラミングは、非多能性細胞を少なくとも1つの再プログラミング因子、ならびに任意選択でTGFβ受容体/ALK阻害剤、MEK阻害剤、GSK3阻害剤、およびROCK阻害剤の組み合わせ(FRM;表2)と接触させることによって開始される。いくつかの実施形態では、上述の任意の方法によるゲノム操作されたiPSCは、MEK阻害剤、GSK3阻害剤、およびROCK阻害剤の組み合わせを含む混合物(FMM;表2)を使用してさらに維持および拡大される。
ゲノム操作されたiPSCを生成する方法のいくつかの実施形態では、方法は、iPSCに1つ以上の標的化された組み込みおよび/またはイン/デルを導入することによりiPSCをゲノム操作し、表1に列記される少なくとも1つの遺伝子型を有するゲノム操作されたiPSCを得ることを含む。代替的に、ゲノム操作されたiPSCを生成する方法は、(a)1つ以上の標的化された編集を非多能性細胞に導入して、選択した部位で標的化された組み込みおよび/またはイン/デルを含むゲノム操作された非多能性細胞を得ることと、(b)ゲノム操作された非多能性細胞を、1つ以上の再プログラミング因子、ならびに任意選択でTGFβ受容体/ALK阻害剤、MEK阻害剤、GSK3阻害剤、および/またはROCK阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、選択された部位で標的化された組み込みおよび/またはイン/デルを含むゲノム操作されたiPSCを得ることと、を含む。代替的に、ゲノム操作されたiPSCを生成する方法は、(a)非多能性細胞を、1つ以上の再プログラミング因子、ならびに任意選択でTGFβ受容体/ALK阻害剤、MEK阻害剤、GSK3阻害剤、および/またはROCK阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、非多能性細胞の再プログラミングを開始することと、(b)1つ以上の標的化された組み込みおよび/またはイン/デルを、ゲノム操作のための再プログラミング非多能性細胞に導入することと、(c)選択された部位で標的化された組み込みおよび/またはイン/デルを含む、ゲノム操作されたiPSCを得ることと、を含む。上記の方法のいずれも、クローンiPSCを得るためにゲノム操作されたiPSCを選別する単一細胞をさらに含み得る。このゲノム操作されたiPSCのクローン拡大により、本明細書の表1に提供される、少なくとも1つの表現型を有する単一細胞で選別され、拡大されたクローン操作されたiPSCを含むマスター細胞バンクが生成される。マスター細胞バンクは、その後凍結保存され、追加のiPSC操作のためのプラットフォーム、および十分に定義され、組成が均一で、費用効果の高い方法で大規模に大量生産することができる、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供する。
再プログラミング因子は、PCT/US2015/018801およびPCT/US16/57136に開示される(これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる)、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C-MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、SV40LT、HESRG、CDH1、TDGF1、DPPA4、DNMT3B、ZIC3、L1TD1、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。1つ以上の再プログラミング因子は、ポリペプチドの形態であり得る。再プログラミング因子はまた、ポリヌクレオチドの形態であり得るため、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、プラスミド、およびミニサークルなどのベクターによって非多能性細胞に導入される。特定の実施形態では、少なくとも1つの再プログラミング因子をコードする1つ以上のポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクターによって導入される。いくつかの実施形態では、1つ以上のポリヌクレオチドは、エピソームベクターによって導入される。様々な他の実施形態では、1つ以上のポリヌクレオチドは、センダイウイルスベクターによって導入される。いくつかの実施形態では、1つ以上のポリヌクレオチドは、プラスミドの組み合わせによって導入される。例えば、米国特許出願第62/571,105号を参照されたく、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、非多能性細胞は、同じまたは異なる選択された部位での標的化された組み込みのための複数のベクターによって、異なる外因性ポリヌクレオチドおよび/または異なるプロモーターを含む複数の構築物で移入される。これらの外因性ポリヌクレオチドは、自殺遺伝子、または標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補をコードする遺伝子、またはiPSCもしくはそれからの派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能、自己複製、持続性、および/または生存を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、siRNA、shRNA、miRNA、およびアンチセンス核酸を含むがこれらに限定されないRNAをコードする。これらの外因性ポリヌクレオチドは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、および組織または細胞型特異的プロモーターからなる群から選択される1つ以上のプロモーターによって駆動され得る。したがって、ポリヌクレオチドは、プロモーターを活性化する条件下で、例えば、誘導剤の存在下で、または特定の分化した細胞型において発現可能である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、iPSCおよび/またはiPSCから分化した細胞において発現される。一実施形態では、1つ以上の自殺遺伝子は、構成的プロモーター、例えば、CAGによって駆動されるカパーゼ-9によって駆動される。異なる外因性ポリヌクレオチドおよび/または異なるプロモーターを含むこれらの構築物は、同時にまたは連続してのいずれかで非多能性細胞に移入することができる。複数の構築物の標的化された組み込みに供される非多能性細胞は、1つ以上の再プログラミング因子に同時に接触させて、ゲノム操作と同時に再プログラミングを開始でき、それにより、同じ細胞のプールにおいて複数の標的化された組み込みを含むゲノム操作されたiPSCを得ることができる。このように、この堅牢な方法により、同時再プログラミングおよび操作戦略が、1つ以上の選択された標的部位に組み込まれた複数のモダリティを有するクローンゲノム操作されたhiPSCを導くことを可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書の方法および組成物を使用して得られたゲノム修飾されたiPSCおよびその派生細胞は、表1に列記される少なくとも1つの遺伝子型を含む。
IV.ゲノム操作されたiPSCを分化させることにより遺伝子操作されたエフェクター細胞を得る方法
本発明のさらなる態様は、奇形腫形成によるゲノム操作されたiPSCのインビボでの分化の方法を提供し、ゲノム操作されたiPSCに由来するインビボ分化細胞は、所望の部位で標的化された組み込みおよび/またはイン/デルを含む無傷で機能的な標的化された編集を保持する。いくつかの実施形態では、奇形腫を介してゲノム操作されたiPSCに由来するインビボ分化細胞は、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP H11、ベータ-2ミクログロブリン、CD38、GAPDH、TCR、もしくはRUNX1、またはゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、1つ以上の所望の部位に組み込まれた1つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む。いくつかの他の実施形態では、奇形腫を介してゲノム操作されたiPSCに由来するインビボ分化細胞は、標的化モダリティをコードするポリヌクレオチド、または幹細胞および/または前駆細胞の輸送、ホーミング、生存能、自己複製、持続性、および/または生存を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む奇形腫を介してゲノム操作されたiPSCに由来するインビボ分化細胞は、免疫応答の制御および媒介に関連する内因性遺伝子の1つ以上のイン/デルをさらに含む。いくつかの実施形態では、イン/デルは、1つ以上の内因性チェックポイント遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、イン/デルは、1つ以上の内因性T細胞受容体遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、イン/デルは、1つ以上の内因性MHCクラスIサプレッサー遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、イン/デルは、主要組織適合遺伝子複合体に関連する1つ以上の内因性遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、イン/デルは、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRαまたはβ定常領域、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、またはTIGITを含むがこれらに限定されない1つ以上の内因性遺伝子に含まれる。一実施形態では、選択された部位に1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むゲノム操作されたiPSCは、B2M(ベータ-2-ミクログロブリン)をコードする遺伝子における標的化された編集をさらに含む。
本発明のさらなる態様は、奇形腫形成によるゲノム操作されたiPSCのインビボでの分化の方法を提供し、ゲノム操作されたiPSCに由来するインビボ分化細胞は、所望の部位で標的化された組み込みおよび/またはイン/デルを含む無傷で機能的な標的化された編集を保持する。いくつかの実施形態では、奇形腫を介してゲノム操作されたiPSCに由来するインビボ分化細胞は、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP H11、ベータ-2ミクログロブリン、CD38、GAPDH、TCR、もしくはRUNX1、またはゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、1つ以上の所望の部位に組み込まれた1つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む。いくつかの他の実施形態では、奇形腫を介してゲノム操作されたiPSCに由来するインビボ分化細胞は、標的化モダリティをコードするポリヌクレオチド、または幹細胞および/または前駆細胞の輸送、ホーミング、生存能、自己複製、持続性、および/または生存を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む奇形腫を介してゲノム操作されたiPSCに由来するインビボ分化細胞は、免疫応答の制御および媒介に関連する内因性遺伝子の1つ以上のイン/デルをさらに含む。いくつかの実施形態では、イン/デルは、1つ以上の内因性チェックポイント遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、イン/デルは、1つ以上の内因性T細胞受容体遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、イン/デルは、1つ以上の内因性MHCクラスIサプレッサー遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、イン/デルは、主要組織適合遺伝子複合体に関連する1つ以上の内因性遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、イン/デルは、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRαまたはβ定常領域、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、またはTIGITを含むがこれらに限定されない1つ以上の内因性遺伝子に含まれる。一実施形態では、選択された部位に1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むゲノム操作されたiPSCは、B2M(ベータ-2-ミクログロブリン)をコードする遺伝子における標的化された編集をさらに含む。
特定の実施形態では、本明細書で提供される1つ以上の遺伝子修飾を含むゲノム操作されたiPSCを使用して、インビトロで造血細胞系統または任意の他の特定の細胞型を導き、由来非多能性細胞は、選択された部位で標的化された編集を含む機能的遺伝子修飾を保持する。いくつかの実施形態では、インビトロで造血細胞系統または任意の他の特定の細胞型を導くために使用されるゲノム操作されたiPSCは、凍結保存され、それらの使用の直前に解凍されるマスター細胞バンク細胞である。一実施形態では、ゲノム操作されたiPSC由来細胞には、二次造血内皮(HE)の可能性を有する中胚葉細胞、二次HE、CD34造血細胞、造血幹細胞および前駆細胞、造血多分化能前駆細胞(MPP)、T細胞前駆細胞、NK細胞前駆細胞、骨髄細胞、好中球前駆細胞、T細胞、NKT細胞、NK細胞、B細胞、好中球、樹状細胞、およびマクロファージが含まれるが、これらに限定されず、ゲノム操作されたiPSCに由来するこれらの細胞は、所望の部位で標的化された編集を含む機能的な遺伝子修飾を保持する。
iPSC由来の造血細胞系統を得るための適用される分化方法および組成物には、例えば、国際出願第PCT/US2016/044122号に示されているものが含まれ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。提供されるように、造血細胞系統を生成するための方法および組成物は、無血清、フィーダーフリー、および/または間質を含まない条件下で、またスケーラブルで単層のEB形成を必要としない培養プラットフォームにおいて、hiPSCを含む、多能性幹細胞に由来する二次造血内皮(HE)を介する。提供された方法に従って分化され得る細胞は、多能性幹細胞から、特定の最終分化細胞および分化転換細胞にコミットされた前駆細胞、ならびに多能性中間体を経由せずに造血運命に直接移行した様々な系統の細胞にまで及ぶ。同様に、幹細胞を分化させることによって産生される細胞は、多分化能幹細胞または前駆細胞から、最終分化細胞、および介在するすべての造血細胞系統にまで及ぶ。
単層培養において造血系統の細胞を多能性幹細胞から分化および拡大する方法は、多能性幹細胞をBMP経路活性化因子、および任意選択でbFGFと接触させることを含む。提供されるように、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞は、多能性幹細胞から胚様体を形成することなく得られ、拡大される。次いで、中胚葉細胞をBMP経路活性化因子、bFGF、およびWNT経路活性化因子と接触させて、多能性幹細胞から胚様体を形成することなく、二次造血性内皮(HE)の可能性を有する拡大された中胚葉細胞を得る。その後のbFGF、ならびに任意選択でROCK阻害剤および/またはWNT経路活性化因子との接触により、二次HEの可能性を有する中胚葉細胞は、二次HE細胞に分化し、これも分化中に拡大される。
造血系統の細胞を得るために本明細書で提供される方法は、EB形成が中程度から最小の細胞拡大をもたらし、均質な拡大を必要とする多くの用途に重要である単層培養、および集団内の細胞の均質な分化を可能にせず、困難で、効率が低いため、EBを介した多能性幹細胞分化よりも優れている。
提供される単層分化プラットフォームは、造血幹細胞およびT細胞、B細胞、NKT細胞、NK細胞などの分化した子孫の派生をもたらす、二次造血内皮への分化を容易にする。単層分化戦略は、増強された分化効率と大規模な拡大を組み合わせて、様々な治療用途のための多能性幹細胞由来造血細胞の治療上適切な数の送達を可能にする。さらに、本明細書で提供される方法を使用する単層培養は、インビトロ分化、エクスビボ調節、ならびにインビボ長期造血自己再生、再構成、および生着の全範囲を可能にする機能的な造血系統細胞をもたらす。提供されるように、iPSC由来造血系統細胞には、二次造血内皮、造血多分化能前駆細胞、造血幹細胞および前駆細胞、T細胞前駆細胞、NK細胞前駆細胞、T細胞、NK細胞、NKT細胞、B細胞、マクロファージ、ならびに好中球が含まれるが、これらに限定されない。
多能性幹細胞の二次造血系統の細胞への分化を指向する方法であって、方法は、(i)多能性幹細胞をBMP活性化因子および任意選択でbFGFを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞から中胚葉細胞の分化および拡大を開始することと、(ii)中胚葉細胞をBMP活性化因子、bFGF、およびGSK3阻害剤を含む組成物(組成物は、任意選択でTGFβ受容体/ALK阻害剤を含まない)と接触させて、中胚葉細胞から二次HEの可能性を有する中胚葉細胞の分化および拡大を開始することと、(iii)二次HEの可能性を有する中胚葉細胞を、ROCK阻害剤;bFGF、VEGF、SCF、IGF、EPO、IL6、およびIL11からなる群から選択される1つ以上の成長因子およびサイトカイン、ならびに任意選択でWnt経路活性化因子を含む組成物(組成物は、任意選択でTGFβ受容体/ALK阻害剤を含まない)と接触させて、二次造血内皮の可能性を有する多能性幹細胞由来中胚葉細胞から二次造血内皮の分化および拡大を開始することと、を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、多能性幹細胞を、MEK阻害剤、GSK3阻害剤、およびROCK阻害剤を含む組成物(組成物はTGFβ受容体/ALK阻害剤を含まない)と接触させて、多能性幹細胞を播種および拡大することをさらに含む。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、iPSC、またはナイーブiPSC、または1つ以上の遺伝子インプリントを含むiPSCであり、iPSCに含まれる1つ以上の遺伝子インプリントは、それから分化した造血細胞に保持される。多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化を指向する方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化は、胚様体の生成を欠き、単層培養形態である。
上記の方法のいくつかの実施形態では、得られた多能性幹細胞由来の二次造血内皮細胞は、CD34+である。いくつかの実施形態では、得られた二次造血内皮細胞は、CD34+CD43-である。いくつかの実施形態では、二次造血内皮細胞は、CD34+CD43-CXCR4-CD73-である。いくつかの実施形態では、二次造血内皮細胞は、CD34+CXCR4-CD73-である。いくつかの実施形態では、二次造血内皮細胞は、CD34+CD43-CD93-である。いくつかの実施形態では、二次造血内皮細胞は、CD34+CD93-である。
上記の方法のいくつかの実施形態では、方法は、(i)多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、ROCK阻害剤;VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、TPO、およびIL7からなる群から選択される1つ以上の成長因子およびサイトカイン;ならびに任意選択でBMP活性化因子を含む組成物と接触させて、二次造血内皮のプレT細胞前駆細胞への分化を開始することと、任意選択で、(ii)プレT細胞前駆細胞を、SCF、Flt3L、およびIL7からなる群から選択される1つ以上の成長因子およびサイトカインを含むが、VEGF、bFGF、TPO、BMP活性化因子、およびROCK阻害剤のうちの1つ以上を含まない組成物と接触させて、プレT細胞前駆細胞のT細胞前駆細胞またはT細胞への分化を開始することとをさらに含む。この方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のT細胞前駆細胞は、CD34+CD45+CD7+である。この方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のT細胞前駆細胞は、CD45+CD7+である。
多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化を指向するための上記の方法のさらにいくつかの実施形態では、方法は、(i)多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、ROCK阻害剤;VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、TPO、IL3、IL7、およびIL15からなる群から選択される1つ以上の成長因子およびサイトカイン;ならびに任意選択でBMP活性化因子を含む組成物と接触させて、二次造血内皮のプレNK細胞前駆細胞への分化を開始することと、任意選択で、(ii)多能性幹細胞由来のプレNK細胞前駆細胞を、SCF、Flt3L、IL3、IL7、およびIL15からなる群から選択される1つ以上の成長因子およびサイトカインを含む組成物(培地は、VEGF、bFGF、TPO、BMP活性化因子、およびROCK阻害剤のうちの1つ以上を含まない)と接触させて、プレNK細胞前駆細胞のNK細胞前駆細胞またはNK細胞への分化を開始することとをさらに含む。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のNK細胞前駆細胞は、CD3-CD45+CD56+CD7+である。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のNK細胞は、CD3-CD45+CD56+であり、任意選択で、NKp46+、CD57+、およびCD16+によってさらに定義される。
したがって、上記の分化方法を使用して、以下のiPSC由来の造血細胞のうちの1つ以上の集団を得ることができる:(i)iMPP-A、iTC-A2、iTC-B2、iNK-A2、およびiNK-B2から選択される1つ以上の培養培地を使用したCD34+HE細胞(iCD34)、(ii)iMPP-A、iTC-A2、iTC-B2、iNK-A2、およびiNK-B2から選択される1つ以上の培養培地を使用した二次造血内皮(iHE)、(iii)iMPP-A、iTC-A2、iTC-B2、iNK-A2、およびiNK-B2から選択される1つ以上の培養培地を使用した二次HSC、(iv)iMPP-Aを使用した多分化能前駆細胞(iMPP)、(v)iTC-A2およびiTC-B2から選択される1つ以上の培養培地を使用したT細胞前駆細胞(ipro-T)、(vi)iTC-B2を使用したT細胞(iTC)、(vii)iNK-A2およびiNK-B2から選択される1つ以上の培養培地を使用したNK細胞前駆細胞(ipro-NK)、ならびに/または(viii)NK細胞(iNK)、およびiNK-B2。いくつかの実施形態では、培地は以下である:
a.iCD34-Cは、ROCK阻害剤、bFGF、VEGF、SCF、IL6、IL11、IGF、およびEPOからなる群から選択される1つ以上の成長因子およびサイトカイン、ならびに任意選択でWnt経路活性化因子を含み、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まない;
b.iMPP-Aは、BMP活性化因子、ROCK阻害剤、ならびにTPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6、Flt3L、およびIL11からなる群から選択される1つ以上の成長因子およびサイトカインを含む;
c.iTC-A2は、ROCK阻害剤;SCF、Flt3L、TPO、およびIL7からなる群から選択される1つ以上の成長因子およびサイトカイン、ならびに任意選択で、BMP活性化因子を含む;
d.iTC-B2は、SCF、Flt3L、およびIL7からなる群から選択される1つ以上の成長因子およびサイトカインを含む;
e.iNK-A2は、ROCK阻害剤、ならびにSCF、Flt3L、TPO、IL3、IL7、およびIL15からなる群から選択される1つ以上の成長因子およびサイトカイン、ならびに任意選択で、BMP活性化因子を含む;そして
f.iNK-B2は、SCF、Flt3L、IL7、およびIL15からなる群から選択される1つ以上の成長因子およびサイトカインを含む。
a.iCD34-Cは、ROCK阻害剤、bFGF、VEGF、SCF、IL6、IL11、IGF、およびEPOからなる群から選択される1つ以上の成長因子およびサイトカイン、ならびに任意選択でWnt経路活性化因子を含み、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まない;
b.iMPP-Aは、BMP活性化因子、ROCK阻害剤、ならびにTPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6、Flt3L、およびIL11からなる群から選択される1つ以上の成長因子およびサイトカインを含む;
c.iTC-A2は、ROCK阻害剤;SCF、Flt3L、TPO、およびIL7からなる群から選択される1つ以上の成長因子およびサイトカイン、ならびに任意選択で、BMP活性化因子を含む;
d.iTC-B2は、SCF、Flt3L、およびIL7からなる群から選択される1つ以上の成長因子およびサイトカインを含む;
e.iNK-A2は、ROCK阻害剤、ならびにSCF、Flt3L、TPO、IL3、IL7、およびIL15からなる群から選択される1つ以上の成長因子およびサイトカイン、ならびに任意選択で、BMP活性化因子を含む;そして
f.iNK-B2は、SCF、Flt3L、IL7、およびIL15からなる群から選択される1つ以上の成長因子およびサイトカインを含む。
いくつかの実施形態では、上記の方法から得られたゲノム操作されたiPSC由来細胞は、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRαもしくはβ定常領域、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、またはTIGIT、あるいはゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む1つ以上の所望の組み込み部位に組み込まれた1つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む。いくつかの他の実施形態では、ゲノム操作されたiPSC由来細胞は、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、または幹細胞および/もしくは前駆細胞の輸送、ホーミング、生存能、自己再生、持続性、および/または生存を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の自殺遺伝子を含むゲノム操作されたiPSC由来細胞は、チェックポイント遺伝子、内因性T細胞受容体遺伝子、およびMHCクラスI抑制遺伝子を含むがこれに限定されない、免疫応答の制御および媒介に関連する1つ以上の内因性遺伝子に含まれる1つ以上のイン/デルをさらに含む。一実施形態では、1つ以上の自殺遺伝子を含むゲノム操作されたiPSC由来細胞は、B2M遺伝子にイン/デルをさらに含み、B2Mはノックアウトされている。
加えて、第1の運命のゲノム操作された造血細胞から第2の運命のゲノム操作された造血細胞を得るための適用される脱分化方法および組成物は、例えば、国際公開第WO2011/159726号に示されるものを含み、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。その中で提供される方法および組成物は、再プログラミング中に内因性Nanog遺伝子の発現を制限することによって、開始非多能性細胞を非多能性中間細胞に部分的に再プログラミングし、非多能性中間細胞を、中間細胞を所望の細胞型に分化させるための条件に供することを可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書の方法および組成物を使用して得られたゲノム修飾されたiPSCおよびその派生細胞は、表1に列記される少なくとも1つの遺伝子型を含む。
V.遺伝子操作されたiPSCから分化された機能的モダリティを有する派生免疫細胞の治療用途
本発明は、いくつかの実施形態では、開示される方法および組成物を使用してゲノム操作されたiPSCから分化された機能的に増強された派生免疫細胞の単離された集団または亜集団を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、iPSCは、iPSC由来免疫細胞において保持可能な1つ以上の標的化された遺伝子編集を含み、遺伝子操作されたiPSCおよびそれからの派生細胞は、細胞ベースの養子療法に好適である。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、iPSC由来CD34細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、iPSC由来HSC細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、iPSC由来proTまたはT細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、iPSC由来proNKまたはNK細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、iPSC由来免疫制御細胞または骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)を含む。いくつかの実施形態では、iPSC由来の遺伝子操作された免疫細胞は、改善された治療可能性のためにエクスビボでさらに調節される。一実施形態では、iPSCに由来する遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ナイーブT細胞、幹細胞メモリーT細胞、および/またはセントラルメモリーT細胞の数または比率の増加を含む。一実施形態では、iPSCに由来する遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、I型NKT細胞の数または比率の増加を含む。別の実施形態では、iPSCに由来する遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、適応NK細胞の数または比率の増加を含む。いくつかの実施形態では、iPSCに由来する遺伝子操作されたCD34細胞、HSC細胞、T細胞、NK細胞、または骨髄由来サプレッサー細胞の単離された集団または亜集団は、同種異系である。いくつかの他の実施形態では、iPSCに由来する遺伝子操作されたCD34細胞、HSC細胞、T細胞、NK細胞、またはMDSCの単離された集団または亜集団は、自家性である。
本発明は、いくつかの実施形態では、開示される方法および組成物を使用してゲノム操作されたiPSCから分化された機能的に増強された派生免疫細胞の単離された集団または亜集団を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、iPSCは、iPSC由来免疫細胞において保持可能な1つ以上の標的化された遺伝子編集を含み、遺伝子操作されたiPSCおよびそれからの派生細胞は、細胞ベースの養子療法に好適である。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、iPSC由来CD34細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、iPSC由来HSC細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、iPSC由来proTまたはT細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、iPSC由来proNKまたはNK細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、iPSC由来免疫制御細胞または骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)を含む。いくつかの実施形態では、iPSC由来の遺伝子操作された免疫細胞は、改善された治療可能性のためにエクスビボでさらに調節される。一実施形態では、iPSCに由来する遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ナイーブT細胞、幹細胞メモリーT細胞、および/またはセントラルメモリーT細胞の数または比率の増加を含む。一実施形態では、iPSCに由来する遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、I型NKT細胞の数または比率の増加を含む。別の実施形態では、iPSCに由来する遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、適応NK細胞の数または比率の増加を含む。いくつかの実施形態では、iPSCに由来する遺伝子操作されたCD34細胞、HSC細胞、T細胞、NK細胞、または骨髄由来サプレッサー細胞の単離された集団または亜集団は、同種異系である。いくつかの他の実施形態では、iPSCに由来する遺伝子操作されたCD34細胞、HSC細胞、T細胞、NK細胞、またはMDSCの単離された集団または亜集団は、自家性である。
いくつかの実施形態では、分化のためのiPSCは、エフェクター細胞において望ましい治療属性を伝えるために選択された遺伝子インプリントを含むが、但し、分化中の細胞発生生物学が破壊されず、該iPSCに由来する分化した造血細胞において遺伝子インプリントが保持され、機能的であることを条件とする。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞の遺伝子インプリントは、(i)非多能性細胞をiPSCに再プログラミングする間もしくはその後に多能性細胞のゲノムにおけるゲノム挿入、欠失、もしくは置換により得られる1つ以上の遺伝子修飾されたモダリティ、または(ii)ドナー特異的、疾患特異的、もしくは治療応答特異的である供給源特異的免疫細胞の1つ以上の保持可能な治療属性を含み、多能性細胞が供給源特異的免疫細胞から再プログラミングされ、iPSCは、iPSC由来造血系統細胞にも含まれる供給源の治療属性を保持する。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾されたモダリティは、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、またはiPSCもしくはそれからの派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能、自己再生、持続性、免疫応答の制御および調節、ならびに/または生存を促進するタンパク質のうちの1つ以上を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾されたiPSCおよびそれからの派生細胞は、表1に列記される遺伝子型を含む。いくつかの他の実施形態では、表1に列記される遺伝子型を含む遺伝子修飾されたiPSCおよびそれからの派生細胞は、(1)TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、またはRFXAP、RAG1、および染色体6p21領域の任意の遺伝子の1つ以上の欠失または発現低下、ならびに(2)HLA-E、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、Fc受容体、または二重特異性もしくは多重特異性もしくはユニバーサルエンゲージャーとの結合のための表面トリガー受容体の導入されたまたは増加した発現を含む追加の遺伝子修飾されたモダリティをさらに含む。
またいくつかの他の実施形態では、造血系統細胞は、以下のうちの少なくとも2つの組み合わせに関する供給源特異的免疫細胞の治療属性を含む:(i)1つ以上の抗原標的化受容体の発現、(ii)修飾されたHLA、(iii)腫瘍微小環境に対する耐性、(iv)バイスタンダー免疫細胞の動員および免疫調節、(iv)腫瘍外効果の低減による改善された標的特異性、および(v)改善されたホーミング、持続性、細胞傷害性、または抗原エスケープ救済。
いくつかの実施形態では、表1に列記された遺伝子型を含むiPSC派生造血細胞、および該細胞は、IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、またはIL21を含む少なくとも1つのサイトカインおよび/もしくはその受容体、またはその任意の修飾されたタンパク質を発現し、少なくともCARを発現する。いくつかの実施形態では、サイトカインおよびCARの操作された発現は、NK細胞特異的である。いくつかの他の実施形態では、サイトカインおよびCARの操作された発現は、T細胞特異的である。一実施形態では、CARは、CD38結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、iPSC派生造血エフェクター細胞は、抗原特異的である。いくつかの実施形態では、抗原特異的派生エフェクター細胞は、液性腫瘍を標的とする。いくつかの実施形態では、抗原特異的派生エフェクター細胞は、固形腫瘍を標的とする。いくつかの実施形態では、抗原特異的iPSC派生造血エフェクター細胞は、腫瘍抗原エスケープを救済することができる。
養子細胞療法に好適な対象に本発明の免疫細胞を導入することにより、様々な疾患を回復させることができる。いくつかの実施形態では、提供されるiPSC派生造血細胞は、同種異系養子細胞療法のためのものである。加えて、本発明は、いくつかの実施形態では、養子細胞療法に好適な対象に組成物を導入することによって、上記の治療組成物の治療用途を提供し、対象は、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、または、HIV、RSV、EBV、CMV、アデノウイルス、もしくはBKポリオーマウイルスに関連する感染を有する。血液悪性腫瘍の例には、急性および慢性白血病(急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(NHL)、ホジキン病、多発性骨髄腫、および骨髄異形成症候群が含まれるが、これらに限定されない。固形がんの例には、脳、前立腺、乳房、肺、結腸、子宮、皮膚、肝臓、骨、膵臓、卵巣、精巣、膀胱、腎臓、頭、首、胃、子宮頸部、直腸、喉頭、および食道のがんが含まれるが、これらに限定されない。様々な自己免疫障害の例には、円形脱毛症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、糖尿病(1型)、若年性特発性関節炎のいくつかの形態、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、心筋炎のいくつかの形態、多発性硬化症、類天疱瘡/類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、リウマチ様関節炎、強皮症/全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎のいくつかの形態、ブドウ膜炎のいくつかの形態、白斑、多発血管炎を伴う肉芽腫症(ウェゲナー病)が含まれるが、これらに限定されない。ウイルス感染の例には、HIV-(ヒト免疫不全ウイルス)、HSV-(単純ヘルペスウイルス)、KSHV-(カポシ肉腫関連ヘルペスウイルス)、RSV-(呼吸器合胞体ウイルス)、EBV-(エプスタイン-バーウイルス)、CMV-(サイトメガロウイルス)、VZV(水痘帯状疱疹ウイルス)、アデノウイルス-、レンチウイルス-、BKポリオーマウイルス関連障害)が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に開示される実施形態の由来造血系統細胞を使用する治療は、症状に応じて、または再発生防止のために実施され得る。「治療すること」、「治療」などの用語は、本明細書では、一般に、所望の薬理学的および/または生理学的効果を得ることを意味するために使用される。効果は、疾患を完全にまたは部分的に予防するという点で予防的であり得、かつ/または疾患および/もしくは疾患に起因する有害作用の部分的または完全な治癒に関して治療的であり得る。本明細書で使用される場合「治療」は、対象における疾患のあらゆる介入を網羅し、以下を含む:疾患にかかりやすいが、まだそれを有していると診断されていない対象において疾患が生じることを予防すること、疾患を阻害すること、すなわちその発症を阻止すること、または疾患を緩和する、すなわち疾患を後退させること。治療薬または組成物は、疾患または傷害の発症前、発症中、または発症後に投与することができる。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化または低減する進行中の疾患の治療もまた、特に関心がある。特定の実施形態では、治療を必要とする対象は、細胞療法によって少なくとも1つの関連する症状を抑制し、回復させ、かつ/または改善することができる疾患、状態、および/または傷害を有する。ある特定の実施形態は、細胞療法を必要とする対象が、骨髄または幹細胞移植の候補、化学療法または放射線療法を受けた対象、過剰増殖性障害またはがん、例えば、造血系の過剰増殖性障害もしくはがんを有するかまたはそのリスクがある対象、腫瘍、例えば固形腫瘍を有するかまたはそれを発達させるリスクがある対象、ウイルス感染またはウイルス感染に関連する疾患を有するかまたはそのリスクがある対象を含むが、これらに限定されないことを企図する。
本明細書に開示される実施形態の由来造血系統細胞を含む治療に対する応答性を評価する場合、応答は、臨床的有益率、死亡までの生存、病理学的完全応答、病理学的応答の半定量的測定、臨床的完全寛解、臨床的部分寛解、臨床的安定疾患、無再発生存、無転移生存、無病生存、循環腫瘍細胞減少、循環マーカー応答、およびRECIST(固形腫瘍における応答評価基準)基準のうちの少なくとも1つを含む基準によって測定され得る。
開示される由来造血系統細胞を含む治療組成物は、他の治療の前、治療中、および/または治療後に対象に投与され得る。したがって、組み合わせ療法の方法は、追加の治療薬の使用前、使用中、および/または使用後に、iPSC由来免疫細胞の投与または調製を伴い得る。上記に提供されるように、1つ以上の追加の治療薬は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、成長因子、小RNA、dsRNA(二本鎖RNA)、単核血液細胞、フィーダー細胞、フィーダー細胞構成要素もしくはその置換因子、目的の1つ以上のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤もしくは放射性部分、または免疫調節薬(IMiD)を含む。iPSC由来免疫細胞の投与は、追加の治療薬の投与から、時間、日、さらには週単位の時間で分離することができる。加えて、または代替的に、投与は、限定されないが、抗腫瘍剤、外科手術などの非薬物療法などの他の生物学的に活性な薬剤またはモダリティと組み合わせることができる。
組み合わせ細胞療法のいくつかの実施形態では、治療的組み合わせは、本明細書で提供されるiPSC由来造血系統細胞と、抗体または抗体断片である追加の治療薬とを含む。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、またはキメラ抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗体または抗体断片は、ウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体または抗体断片は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍またはウイルス特異的抗原は、投与されたiPSC由来造血系統細胞を活性化して、それらの殺滅能力を増強する。いくつかの実施形態では、投与されたiPSC由来造血系統細胞に対する追加の治療薬としての組み合わせ治療に好適な抗体には、抗CD20(例えば、リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、オクレリズマブ)、抗CD22(イノツズマブ、モキセツモマブ、エプラツズマブ)、抗HER2(例えば、トラスツズマブ、ペルツズマブ)、抗CD52(例えば、アレムツズマブ)、抗EGFR(例えば、セルツキシマブ)、抗GD2(例えば、ジヌツキシマブ)、抗PDL1(例えば、アベルマブ)、抗-CD38(例えば、ダラツムマブ、イサツキシマブ、MOR202)、抗CD123(例えば、7G3、CSL362)、抗SLAMF7(エロツズマブ)、およびそれらのヒト化もしくはFc修飾されたバリアントもしくは断片、またはそれらの機能的同等物およびバイオシミラーが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、1つ以上のチェックポイント阻害剤を含む。チェックポイントは、阻害されていない場合、免疫応答を抑制または下方制御することができる細胞分子、多くの場合細胞表面分子である。チェックポイント阻害剤は、チェックポイント遺伝子発現または遺伝子産物を低減するか、またはチェックポイント分子の活性を減少させることができるアンタゴニストである。本明細書で提供される、NK細胞またはT細胞を含む派生エフェクター細胞との併用療法に好適なチェックポイント阻害剤には、PD-1(Pdcdl、CD279)、PDL-1(CD274)、TIM-3(Havcr2)、TIGIT(WUCAMおよびVstm3)、LAG-3(Lag3、CD223)、CTLA-4(Ctla4、CD152)、2B4(CD244)、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、A2aR、BATE、BTLA、CD39(Entpdl)、CD47、CD73(NT5E)、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、レチノイン酸受容体アルファ(Rara)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E、および阻害性KIR(例えば、2DL1、2DL2、2DL3、3DL1、および3DL2)のアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。
提供される派生エフェクター細胞を含む併用療法のいくつかの実施形態は、チェックポイント分子を標的とする少なくとも1つの阻害剤をさらに含む。提供される派生エフェクター細胞との併用療法のいくつかの他の実施形態は、2つ、3つ以上のチェックポイント分子が標的とされるように、2つ、3つ以上の阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される併用療法のためのエフェクター細胞は、提供される派生NK細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される併用療法のためのエフェクター細胞は、派生T細胞である。いくつかの実施形態では、併用療法のための派生NK細胞またはT細胞は、本明細書に提供されるように機能的に増強される。いくつかの実施形態では、2つ、3つ以上のチェックポイント阻害剤は、派生エフェクター細胞の投与とともに、投与前、または投与後に併用療法で投与され得る。いくつかの実施形態では、2つ以上のチェックポイント阻害剤は、同時に、または一度に1つ(連続的に)投与される。
いくつかの実施形態では、上記のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストは抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダIg、サメ重鎖のみの抗体(VNAR)、Ig NAR、キメラ抗体、組換え抗体、またはそれらの抗体断片であり得る。抗体断片の非限定的な例としては、Fab、Fab’、F(ab)’2、F(ab)’3、Fv、単鎖抗原結合断片(scFv)、(scFv)2、ジスルフィド安定化Fv(dsFv)、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片(sdAb、ナノボディ)、組換え重鎖のみの抗体(VHH)、および全抗体の結合特異性を維持する他の抗体断片が挙げられ、これらは、産生するのに費用対効果が高いか、使用がより容易であるか、または全抗体よりも感度が高い可能性がある。いくつかの実施形態では、1つ、または2つ、または3つ以上のチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、IPH4102、IPH43、IPH33、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびそれらの誘導体または機能的同等物のうちの少なくとも1つを含む。
派生エフェクター細胞と、1つ以上のチェック阻害剤とを含む併用療法は、皮膚T細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(NHL)、菌状息肉腫、パジェット細網症、セザリー症候群、肉芽腫性弛緩性皮膚、リンパ腫様丘疹症、慢性苔癬状粃糠疹、急性痘瘡状苔癬状ひこう疹、CD30+皮膚T細胞リンパ腫、続発性皮膚CD30+大細胞リンパ腫、非菌状息肉腫CD30皮膚大T細胞リンパ腫、多形性T細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、皮下T細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、芽球性NK細胞リンパ腫、B細胞リンパ腫、ホジキンスリンパ腫(HL)、頭頸部腫瘍、扁平上皮がん、横紋筋肉腫、ルイス肺がん(LLC)、非小細胞肺がん、食道扁平上皮がん、食道腺がん、腎細胞がん(RCC)、結腸直腸がん(CRC)、急性骨髄性白血病(AML)、乳がん、胃がん、前立腺小細胞神経内分泌がん(SCNC)、肝臓がん、神経膠芽腫、肝臓がん、口腔扁平上皮がん、膵臓がん、甲状腺乳頭がん、肝内胆管細胞がん、肝細胞がん、骨がん、転移、および鼻咽頭がんを含むがこれらに限定されない液性および固形がんの治療に適用される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される派生エフェクター細胞以外に、治療用途の組み合わせは、化学療法剤または放射性部分を含む1つ以上の追加の治療薬を含む。化学療法剤とは、細胞傷害性抗腫瘍剤、すなわち、腫瘍細胞を優先的に殺滅するか、急速に増殖する細胞の細胞周期を破壊するか、または幹がん細胞を根絶することが見出され、腫瘍性細胞の成長を防止または低減するために治療的に使用される化学剤を指す。化学療法剤はまた、抗腫瘍性または細胞傷害性の薬物または薬剤と呼ばれることもあり、当技術分野で周知である。
いくつかの実施形態では、化学療法剤は、アントラサイクリン、アルキル化剤、スルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミン、メチルメラミン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、抗生物質、代謝拮抗剤、葉酸類似体、プリン類似体、ピリミジン類似体、酵素、ポドフィロトキシン、白金含有薬剤、インターフェロン、およびインターロイキンを含む。例示的な化学療法剤には、アルキル化剤(シクロホスファミド、メクロレタミン、メファリン、クロランブシル、ヘアメチルメラミン、チオテパ、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン)、アニメタボライト(メトトレキサート、フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、6-メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン)、ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン)、エピポドフィロトキシン(エトポシド、エトポシドオルトキノン、およびテニポシド)、抗生物質(ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ビサントレン、アクチノマイシンD、プリカマイシン、ピューロマイシン、およびグラミシジンD)、パクリタキセル、コルヒチン、サイトカラシンB、エメチン、メイタンシン、およびアムサクリンが含まれるが、これらに限定されない。追加の薬剤には、アミングルテチミド、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、アルトレタミン、シクロホスファミド、ロムスチン(CCNU)、カルムスチン(BCNU)、イリノテカン(CPT-11)、アレムツザマブ、アルトレタミン、アナストロゾール、L-アスパラギナーゼ、アザシチジン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルステロン、カペシタビン、セレコキシブ、セツキシマブ、クラドリビン、クロフラビン、シタラビン、ダカルバジン、デニロイキンジフチトクス、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドロモスタノロン、エピルビシン、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エチニルエストラジオール、エキセメスタン、フロクスウリジン、5-フルオロウラシル、フルダラビン、フルタミド、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゴセレリン、ヒドロキシ尿素、イブリツモマブ、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、インターフェロンアルファ(2a、2b)、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミソール、メクロレタミン、メゲストロール、メルファリン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトキサレン、ミトマイシンC、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロン、ノフェツモマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペメトレキセド、ペガデマーゼ、ペグアスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ポリフェプロサン、ポルフィマー、プロカルバジン、キナクリン、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、トペテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビノレルビン、およびゾレドロネートが含まれる。他の適切な薬剤は、化学療法剤または放射線療法剤として承認され、当技術分野で知られているものを含む、ヒトでの使用が承認されている薬剤である。そのような薬剤は、いくつかの標準的な医師および腫瘍学者の参考文献のいずれか(例えば、Goodman&Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,Ninth Edition,McGraw-Hill,N.Y.,1995)またはNational Cancer Instituteのウェブサイト(fda.gov/cder/cancer/druglistfrarne.htm)を通じて参照でき、両方とも随時更新される。
サリドマイド、レナリドマイド、およびポマリドマイドなどの免疫調節薬(IMiD)は、NK細胞およびT細胞の両方を刺激する。本明細書で提供されるように、IMiDは、がん治療のためのiPSC由来の治療用免疫細胞とともに使用され得る。
治療組成物に含まれるiPSC由来造血系統細胞の単離された集団以外に、患者への投与に好適な組成物は、1つ以上の薬学的に許容される担体(添加剤)および/もしくは希釈剤(例えば、薬学的に許容される培地、例えば、細胞培養培地)、または他の薬学的に許容される構成要素をさらに含み得る。薬学的に許容される担体および/または希釈剤は、部分的には、投与される特定の組成物によって、ならびに治療組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、本発明の治療組成物の多種多様な好適な製剤が存在する(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,17thed.1985を参照されたく、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
一実施形態では、治療組成物は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来のT細胞を含む。一実施形態では、治療組成物は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来のNK細胞を含む。一実施形態では、治療組成物は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来のCD34+HE細胞を含む。一実施形態では、治療組成物は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来のHSCを含む。一実施形態では、治療組成物は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来のMDSCを含む。本明細書に開示されるiPSC由来造血系統細胞の集団を含む治療組成物は、静脈内、腹腔内、経腸、または気管投与法によって別個に、または他の適切な化合物と組み合わせて投与して、所望の治療目標に影響を及ぼすことができる。
これらの薬学的に許容される担体および/または希釈剤は、治療組成物のpHを約3~約10の間に維持するのに十分な量で存在することができる。したがって、緩衝剤は、全組成物の重量対重量ベースで約5%ほどであり得る。限定されないが、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどでの電解質もまた、治療組成物に含まれ得る。一態様では、治療組成物のpHは、約4~約10の範囲である。代替的に、治療組成物のpHは、約5~約9、約6~約9、または約6.5~約8の範囲である。別の実施形態では、治療組成物は、該pH範囲のうちの1つのpHを有する緩衝液を含む。別の実施形態では、治療組成物は、約7のpHを有する。代替的に、治療組成物は、約6.8~約7.4の範囲のpHを有する。さらに別の実施形態では、治療組成物は、約7.4のpHを有する。
本発明はまた、部分的に、本発明の特定の組成物および/または培養物における薬学的に許容される細胞培養培地の使用を提供する。そのような組成物は、ヒト対象への投与に好適である。一般的に言えば、本発明の実施形態によるiPSC由来免疫細胞の維持、成長、および/または健康を支持する任意の培地は、医薬細胞培養培地としての使用に好適である。特定の実施形態では、薬学的に許容される細胞培養培地は、無血清および/またはフィーダーフリー培地である。様々な実施形態では、無血清培地は動物質を含まず、任意選択でタンパク質を含まなくてもよい。任意選択で、培地は、生物学的製剤に許容される組換えタンパク質を含み得る。動物質を含まない培地とは、構成要素が動物以外の供給源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物質を含まない培地で天然の動物性タンパク質に取って代わり、栄養素は、合成、植物、または微生物源から得られる。対照的に、タンパク質を含まない培地は、実質的にタンパク質を含まないと定義される。当業者は、上記の培地の例が例示的であり、本発明での使用に好適な培地の配合を決して制限するものではなく、当業者に既知の利用可能な多くの好適な培地があることを理解するであろう。
単離された多能性幹細胞由来造血系統細胞は、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、または99%のT細胞、NK細胞、NKT細胞、proT細胞、proNK細胞、CD34+HE細胞、HSC、B細胞、骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)、制御性マクロファージ、制御性樹状細胞、または間葉系間質細胞を有し得る。いくつかの実施形態では、単離された多能性幹細胞由来造血系統細胞は、約95%~約100%のT細胞、NK細胞、proT細胞、proNK細胞、CD34+HE細胞、または骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞療法を必要とする対象を治療するための、約95%のT細胞、NK細胞、proT細胞、proNK細胞、CD34+HE細胞、または骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)の単離された集団を有する組成物などの、精製されたT細胞またはNK細胞を有する治療組成物を提供する。
一実施形態では、組み合わせ細胞療法は、CD3エンゲージャーである治療用タンパク質またはペプチド、および表1に列記される遺伝子型を含むゲノム操作されたiPSCに由来するNK細胞の集団を含み、由来NK細胞は、TCRneg cs-CD3を含む。別の実施形態では、組み合わせ細胞療法は、CD3エンゲージャーである治療用タンパク質またはペプチド、および表1に列記される遺伝子型を含むゲノム操作されたiPSCに由来するT細胞の集団を含み、由来T細胞は、TCRneg cs-CD3を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせ細胞療法は、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、エルツマキソマブ、RO6958688、AFM11、MT110/AMG 110、MT111/AMG211/MEDI-565、AMG330、MT112/BAY2010112、MOR209/ES414、MGD006/S80880、MGD007、および/またはFBTA05のうちの1つ、ならびに表1に列記される遺伝子型を含むゲノム操作されたiPSCに由来するNK細胞またはT細胞の集団を含み、由来NK細胞またはT細胞は、TCRneg cs-CD3、および任意選択でhnCD16を含む。さらにいくつかの他の実施形態では、組み合わせ細胞療法は、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、およびエルツマキソマブのうちの1つ、および表1に列記される遺伝子型を含むゲノム操作されたiPSCに由来するNK細胞またはT細胞の集団を含み、由来NK細胞またはT細胞は、TCRneg cs-CD3、hnCD16、およびCD19、BCMA、CD38、CD20、CD22、またはCD123を標的とするCARを含む。またいくつかの追加の実施形態では、組み合わせ細胞療法は、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、およびエルツマキソマブのうちの1つ、および表1に列記される遺伝子型を含むゲノム操作されたiPSCに由来するNK細胞またはT細胞の集団を含み、由来NK細胞またはT細胞は、TCRneg CS-CD3、hnCD16、CAR、および1つ以上の外因性サイトカインを含む。
当業者が理解するように、本明細書の方法および組成に基づいてiPSCに由来する自家および同種異系の造血系統細胞の両方を、上述の細胞治療に使用することができる。自家移植の場合、由来造血系統細胞の単離された集団は、患者と完全または部分的にHLA一致する。別の実施形態では、由来造血系統細胞は、対象とHLAが一致せず、由来造血系統細胞は、HLA IおよびHLA IIヌルを有するNK細胞またはT細胞である。
いくつかの実施形態では、治療組成物中の由来造血系統細胞の数は、用量当たり少なくとも0.1×105細胞、少なくとも1×105細胞、少なくとも5×105細胞、少なくとも1×106細胞、少なくとも5x106細胞、少なくとも1x107細胞、少なくとも5x107細胞、少なくとも1x108細胞、少なくとも5x108細胞、少なくとも1x109細胞、または少なくとも5x109細胞である。いくつかの実施形態では、治療組成物中の由来造血系統細胞の数は、用量当たり約0.1x105細胞~約1x106細胞、用量当たり約0.5x106細胞~約1x107細胞、用量当たり約0.5x107細胞~約1x108細胞、用量当たり約0.5x108細胞~約1x109細胞、用量当たり約1x109細胞~約5x109細胞、用量当たり約0.5x109細胞~約8x109細胞、用量当たり約3x109細胞~約3x1010細胞、またはその間の任意の範囲である。一般に、60kgの患者の場合、1×108細胞/用量は、1.67×106細胞/kgに変換される。
一実施形態では、治療組成物中の由来造血系統細胞の数は、血液の部分的または単一の臍帯中の免疫細胞の数であるか、または少なくとも0.1×105細胞/kg体重、少なくとも0.5×105細胞/kg体重、少なくとも1×105細胞/kg体重、少なくとも5×105細胞/kg体重、少なくとも10×105細胞/kg体重、少なくとも0.75×106細胞/kg体重、少なくとも1.25×106細胞/kg体重、少なくとも1.5×106細胞/kg体重、少なくとも1.75×106細胞/kg体重、少なくとも2×106細胞/kg体重、少なくとも2.5×106細胞/kg体重、少なくとも3×106細胞/kg体重、少なくとも4×106細胞/kg体重、少なくとも5×106細胞/kg体重、少なくとも10×106細胞/kg体重、少なくとも15×106細胞/kg体重、少なくとも20×106細胞/kg体重、少なくとも25×106細胞/kg体重、少なくとも30×106細胞/kg体重、1×108細胞/kg体重、5×108細胞/kg体重、または1×109細胞/kg体重である。
一実施形態では、ある用量の由来造血系統細胞が対象に送達される。例示的な一実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、少なくとも2×106細胞/kg、少なくとも3×106細胞/kg、少なくとも4×106細胞/kg、少なくとも5×106細胞/kg、少なくとも6x106細胞/kg、少なくとも7x106細胞/kg、少なくとも8x106細胞/kg、少なくとも9x106細胞/kg、もしくは少なくとも10x106細胞/kg、またはそれ以上の細胞/kg(介在するすべての細胞用量を含む)である。
別の例示的な実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、約2×106細胞/kg、約3×106細胞/kg、約4×106細胞/kg、約5×106細胞/kg、約6x106細胞/kg、約7x106細胞/kg、約8x106細胞/kg、約9x106細胞/kg、もしくは約10x106細胞/kg、またはそれ以上の細胞/kg(介在するすべての細胞用量を含む)である。
別の例示的な実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、約2×106細胞/kg~約10×106細胞/kg、約3×106細胞/kg~約10×106細胞/kg、約4x106細胞/kg~約10x106細胞/kg、約5x106細胞/kg~約10x106細胞/kg、2x106細胞/kg~約6x106細胞/kg、2x106細胞/kg~約7x106細胞/kg、2x106細胞/kg~約8x106細胞/kg、3x106細胞/kg~約6x106細胞/kg、3x106細胞/kg~約7x106細胞/kg、3x106細胞/kg~約8x106細胞/kg,4x106細胞/kg~約6x106細胞/kg、4x106細胞/kg~約7x106細胞/kg、4x106細胞/kg~約8x106細胞/kg、5x106細胞/kg~約6x106細胞/kg、5x106細胞/kg~約7x106細胞/kg、5x106細胞/kg~約8x106細胞/kg、または6x106細胞/kg~約8x106細胞/kg(介在するすべての細胞用量を含む)である。
いくつかの実施形態では、由来造血系統細胞の治療用途は、単回投与治療である。いくつかの実施形態では、由来造血系統細胞の治療用途は、複数回投与治療である。いくつかの実施形態では、複数回投与治療は、毎日、3日ごと、7日ごと、10日ごと、15日ごと、20日ごと、25日ごと、30日ごと、35日ごと、40日ごと、45日ごと、もしくは50日ごと、またはその間の任意の日数に1回の投与である。いくつかの実施形態では、複数回投与治療は、3回、または4回、または5回、週1回の投与を含む。3回、4回、または5回を含む複数回投与治療のいくつかの実施形態では、週1回の投与は、追加の単回投与または複数回投与が必要かどうかを決定するための観察期間をさらに含む。
本発明の由来造血系統細胞の集団を含む組成物は、無菌であり得、ヒト患者への投与に好適であり、投与の準備ができている(すなわち、さらに処理することなく投与することができる)。投与の準備ができている細胞ベースの組成物は、組成物が、対象への移植または投与の前に、任意のさらなる処理または操作を必要としないことを意味する。他の実施形態では、本発明は、1つ以上の薬剤を投与する前に拡大および/または調節される、由来造血系統細胞の単離された集団を提供する。組換えTCRまたはCARを発現するように遺伝子操作された由来造血系統細胞の場合、例えば、米国特許第6,352,694号に記載される方法を使用して、細胞を活性化および拡大することができる。
ある特定の実施形態では、由来造血系統細胞の一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供され得る。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、または表面に結合され得る。表面に結合される場合、薬剤は同じ表面(つまり、「シス」形成で)、または別個の表面に(つまり、「トランス」形成で)結合され得る。代替的に、一方の薬剤を表面に結合させ、もう一方の薬剤を溶液中に存在させることもできる。一実施形態では、共刺激シグナルを提供する薬剤は、細胞表面に結合され得、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、または表面に結合される。ある特定の実施形態では、両方の薬剤は、溶液中にあり得る。別の実施形態では、薬剤は、可溶性形態であり、次いで、Fc受容体を発現する細胞、または本発明の実施形態においてTリンパ球を活性化および拡大する際に使用することが企図されている人工抗原提示細胞(aAPC)について米国特許出願公開第2004/0101519号および同第2006/0034810号などに開示される薬剤に結合する抗体もしくは他の結合剤などの表面に架橋され得る。
投与量、頻度、およびプロトコルのある程度の変動は、治療される対象の状態に応じて必然的に発生する。投与の責任者は、いずれにしても、個々の対象に適切な用量、頻度、およびプロトコルを決定する。
以下の実施例は、例示ために提供され、限定のためではない。
実施例1-材料および方法
様々なプロモーターの制御下で、異なるセーフハーバー遺伝子座組み込み戦略と組み合わせて自殺系を効果的に選択し、試験するために、単一細胞の継代および高スループットの96ウェルプレートベースのフローサイトメトリー選別を可能にする、出願人独自のhiPSCプラットフォームを使用し、単一または複数の遺伝子調節によるクローンhiPSCの誘導を可能にする。
様々なプロモーターの制御下で、異なるセーフハーバー遺伝子座組み込み戦略と組み合わせて自殺系を効果的に選択し、試験するために、単一細胞の継代および高スループットの96ウェルプレートベースのフローサイトメトリー選別を可能にする、出願人独自のhiPSCプラットフォームを使用し、単一または複数の遺伝子調節によるクローンhiPSCの誘導を可能にする。
小分子培養におけるhiPSCの維持:培養のコンフルエンシーが75%~90%に達すると、hiPSCが単一細胞として日常的に継代された。単一細胞の解離では、hiPSCをPBS(Mediatech)で1回洗浄し、アキュターゼ(Millipore)で37°Cで3~5分間処理した後、ピペッティングして単一細胞の解離を確実にした。次いで、単一細胞懸濁液を従来の培地と等量で混合し、225×gで4分間遠心分離し、FMMに再懸濁し、マトリゲルでコーティングした表面にプレーティングした。継代は、典型的には、1:6~1:8で、37°Cで2~4時間、マトリゲルで前もってコーティングした組織培養プレートに移し、2~3日ごとにFMMを供給した。細胞培養は、37℃および5%CO2に設定された加湿インキュベーターで維持された。
ZFNによるヒトのiPSC操作、目的のモダリティの標的化された編集のためのCRISPR:例としてROSA26標的化された挿入を使用して、ZFNを介したゲノム編集では、AAVS1標的化された挿入のために、2.5ugのZFN-L(FTV893)、2.5ugのZFN-R(FTV894)、および5ugのドナー構築物の混合物を200万個のiPSCにトランスフェクトした。CRISPRを介したゲノム編集では、ROSA26標的化された挿入のために、5ugのROSA26-gRNA/Cas9(FTV922)および5ugのドナー構築物の混合物を200万個のiPSCにトランスフェクトした。トランスフェクションは、パラメーター1500V、10ms、3パルスを使用して、Neonトランスフェクションシステム(Life Technologies)を使用して行われた。トランスフェクション後の2日目または3日目に、プラスミドに人工プロモータードライバーGFPおよび/またはRFP発現カセットが含まれている場合、フローサイトメトリーを使用してトランスフェクション効率を測定した。トランスフェクション後の4日目に、ピューロマイシンを最初の7日間は0.1ug/mlの濃度で、7日後は0.2ug/mlの濃度で培地に添加して、標的化された細胞を選択した。ピューロマイシンの選択中、細胞は10日目にマトリゲルでコーティングされた新しいウェルに継代された。ピューロマイシン選択の16日目以降に、生存細胞をGFP+iPS細胞の割合についてフローサイトメトリーで分析した。
ゲノム編集されたiPSCのバルク選別およびクローン選別:ZFNまたはCRISPR-Cas9を使用したゲノム標的化された編集を伴うiPSCは、ピューロマイシン選択の20日後に、GFP+SSEA4+TRA181+iPSCのバルク選別およびクローン選別された。単一細胞で解離した標的化されたiPSCプールを、最適な性能のために新しく作製された、ハンクス平衡塩溶液(MediaTech)、4%ウシ胎仔児血清(Invitrogen)、1xペニシリン/ストレプトマイシン(Mediatech)、および10mMのHepes(Mediatech)を含む冷却染色緩衝液に再懸濁した。SSEA4-PE、TRA181-Alexa Fluor-647(BD Biosciences)を含む、コンジュゲートされた一次抗体を細胞溶液に添加し、氷上で15分間インキュベートした。すべての抗体は、100万個の細胞当たり100μLの染色緩衝液に7μLで使用された。溶液を染色緩衝液で1回洗浄し、225gで4分間スピンダウンし、10μMのチアゾビブンを含む染色緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリー選別のために氷上で維持した。フローサイトメトリー選別は、FACS Aria II(BD Biosciences)で行った。バルク選別では、GFP+SSEA4+TRA181+細胞をゲーティングし、7mlのFMMで満たされた15mlの標準チューブに選別した。クローン選別では、選別された細胞を、ウェル当たり3イベントの濃度で、100μMのノズルを使用して96ウェルプレートに直接排出した。各ウェルには、5μg/mLのフィブロネクチンおよび1xペニシリン/ストレプトマイシン(Mediatech)を補充した200μLのFMMを予め充填し、5xマトリゲルで前もって一晩コーティングした。5xマトリゲルプレコーティングには、1アリコートのマトリゲルを5mLのDMEM/F12に添加し、次いで、適切な再懸濁を可能にするために4°Cで一晩インキュベートし、最後にウェル当たり50μLで96ウェルプレートに添加した後、37°Cで一晩インキュベートすることが含まれる。5xマトリゲルは、各ウェルに培地を添加する直前に吸引される。選別が完了したら、インキュベーションの前に、96ウェルプレートを225gで1~2分間遠心分離した。プレートを7日間静置した。7日目に、150μLの培地を各ウェルから除去し、100μLのFMMと交換した。選別後10日目に、ウェルに追加の100μLのFMMを再供給した。コロニー形成は早くも2日目に検出され、ほとんどのコロニーは選別後7~10日で拡大した。最初の継代では、ウェルをPBSで洗浄し、30μLのアキュターゼで、37℃で約10分間解離させた。アキュターゼ処理の延長の必要性は、長期間培養でアイドリング状態にあったコロニーのコンパクトさを反映している。細胞が解離していることが認められた後、200μLのFMMを各ウェルに添加し、数回ピペッティングしてコロニーを破壊する。解離したコロニーを、5xマトリゲルで前もってコーティングした96ウェルプレートの別のウェルに移し、次いでインキュベーション前に225gで2分間遠心分離する。この1:1の継代は、拡大する前に初期のコロニーを広げるために行われる。その後の継代は、3~5分間のアキュターゼ処理、およびFMM中の1xマトリゲルで前もってコーティングされたより大きなウェルへの75~90%のコンフルエンシーでの1:4~1:8の拡大で日常的に行われた。各クローン細胞株は、GFP蛍光レベルおよびTRA1-81発現レベルについて分析された。ほぼ100%のGFP+およびTRA1-81+のクローン株を、さらなるPCRスクリーニングおよび分析のために選択し、マスター細胞バンクとして凍結保存した。フローサイトメトリー分析は、Guava EasyCyte 8 HT(Millipore)で行われ、Flowjo(FlowJo、LLC)を使用して分析された。
実施例2-機能増強のために複数のモダリティで操作されたマスタークローンiPSC株の生成のためのiPSCプラットフォームの適用
αβT細胞の遺伝子操作は、この出願で提供される方法を使用して再プログラミングの2~3週間後に開始された。その後、96ウェルプレートに単一細胞選別し、特定の操作のためにクローンをスクリーニングした。この特定の例では、操作は、CD3ζ1XX CD19 CARを例示として使用した、TRAC遺伝子座を標的とした導入遺伝子組み込みのためのものであった。CD3ζ 1XX CD19 CARのTRAC遺伝子座への特異的組み込みをもたらす相同組換え。図3のパートAは、異なる段階での培養物の位相差画像を示す。図3のパートBは、再プログラミング前のαβT細胞のフローサイトメトリープロファイル(左のパネル)、選別前の再プログラミングおよび操作された細胞プール、ならびにクローンTiPSCクローン(右のパネル)を示す。
αβT細胞の遺伝子操作は、この出願で提供される方法を使用して再プログラミングの2~3週間後に開始された。その後、96ウェルプレートに単一細胞選別し、特定の操作のためにクローンをスクリーニングした。この特定の例では、操作は、CD3ζ1XX CD19 CARを例示として使用した、TRAC遺伝子座を標的とした導入遺伝子組み込みのためのものであった。CD3ζ 1XX CD19 CARのTRAC遺伝子座への特異的組み込みをもたらす相同組換え。図3のパートAは、異なる段階での培養物の位相差画像を示す。図3のパートBは、再プログラミング前のαβT細胞のフローサイトメトリープロファイル(左のパネル)、選別前の再プログラミングおよび操作された細胞プール、ならびにクローンTiPSCクローン(右のパネル)を示す。
CARなどの導入遺伝子のTRAC遺伝子座への特定の二対立遺伝子組み込みは、PCRアッセイ、SNPフェージングアッセイを含む方法によって、さらに組み込まれた導入遺伝子のコピー数を分析するためのデジタル液滴PCRによってさらに確認された。TRACを標的としたCAR TiPSCクローンの標的外編集も、SITE-Seqを使用して分析し、二立遺伝子TRACを標的とした導入遺伝子の組み込みを有する選択されたクローンTiPSCに標的外編集がなく、ゲノムの完全性を維持していることを確認した。確認および検証の後、いくつかの選択されたクローンTiPSC株をそれぞれ拡大し、個々のマスター細胞バンクとして凍結保存した。
次に、図1A~Cのcs-CD3設計を可能にするための構築物を作製し、同様の方法および手順を使用してT細胞に導入した。
実施例3-iPSCおよびiPSC由来エフェクター細胞の段階的ゲノム操作
TCR陰性以外に、誘導された多能性幹細胞も連続的に操作し、高親和性の切断不可能なCD16発現、B2M遺伝子のノックアウトによるHLA-Iの喪失、CIITAのノックアウトによるHLA-IIの喪失、非古典的HLA分子HLA-Gの過剰発現、および連結されたIL15/IL15受容体アルファ構築物の発現を得た。各操作ステップの後、次の操作ステップの前に、iPSCを所望の表現型について選別した。次いで、操作されたiPSCは、インビトロで、または派生細胞生成のために維持され得る。図4は、iPSC由来NK細胞におけるhnCD16発現、B2Mノックアウト、HLA-G発現、およびIL15/IL15Rα発現を示した。これらのデータは、これらの遺伝子操作されたモダリティが、造血分化中、細胞の所望の細胞運命へのインビトロでの指向された発達を乱すことなく維持されることを示す。
TCR陰性以外に、誘導された多能性幹細胞も連続的に操作し、高親和性の切断不可能なCD16発現、B2M遺伝子のノックアウトによるHLA-Iの喪失、CIITAのノックアウトによるHLA-IIの喪失、非古典的HLA分子HLA-Gの過剰発現、および連結されたIL15/IL15受容体アルファ構築物の発現を得た。各操作ステップの後、次の操作ステップの前に、iPSCを所望の表現型について選別した。次いで、操作されたiPSCは、インビトロで、または派生細胞生成のために維持され得る。図4は、iPSC由来NK細胞におけるhnCD16発現、B2Mノックアウト、HLA-G発現、およびIL15/IL15Rα発現を示した。これらのデータは、これらの遺伝子操作されたモダリティが、造血分化中、細胞の所望の細胞運命へのインビトロでの指向された発達を乱すことなく維持されることを示す。
図7に示されるように、CD19-CARがTRAC遺伝子座を標的とし、TCRノックアウト(TCRα KO)をもたらすT細胞由来iPSCにレンチウイルスを形質導入して、インバリアントNKT(iTCRα)またはインバリアントNKT TCRαおよびインバリアントNKT TCRβ(iTCRβ)の両方を構成的に発現させ、定義されたTCRを有する組換えTCR複合体を得た(図1Aおよび1C、セクションI.1の設計2に関する付属のテキスト、およびさらなる参照のための配列番号44および45を参照されたい)。形質導入された構築物は、細胞選別による形質導入効率および濃縮についてアッセイする目的で、例示的なレポーターとしてThy1.1を含んだ。次いで、結果として得られたiPSC株を、野生型(WT)およびTRAC標的化されたCD19-CAR対照株とともに、iPSC由来CD34+造血前駆細胞(iCD34)に、続いて派生T細胞(iT)に分化させた。
次いで、対照および形質導入された株からのiPSCを、細胞外フローサイトメトリーにより、(i)多能性マーカーSSEA4およびTRA181、(ii)汎TCRαβプローブ(内因性および外因性TCRを検出する)を使用して発現されたTCRαおよび/またはTCRβとともに細胞表面に輸送されるT細胞共受容体CD3、および(iii)構築物レポーターThy1.1についてアッセイした。図8Aに見られるように、iTCRαまたはiTCRαβによる形質導入は、多能性マーカーによって示されるように、iPSCの同一性に影響を及ぼさなかった。WT iPSCでの観察と同様に、両方の形質導入されたiPSC株でThy1.1の発現が観察されたが、CD3は形質導入されたiPSCの細胞表面で検出されまず、これはTCRがiPSC段階で発現しないという事実と一致する。
次いで、本明細書に記載の組成物および方法を使用して、対照および形質導入されたiPSCをiCD34造血前駆細胞に分化させ、フローサイトメトリーにより、汎TCRαβプローブを使用して、それぞれ、CD3、Thy1.1、およびTCRαβについてアッセイした。図8Bに見られるように、iTCRαまたはiTCRαβで形質導入された株は、Thy1.1発現を維持したが、検出可能な細胞表面CD3はなかった。CD3およびTCRabは、WT iPSC由来iCD34でも観察されず、iTCRαまたはiTCRαβの形質導入が、iCD34細胞段階で発現しないか、または細胞表面にCD3発現をもたらさないことを示唆する。
iCD34は、本明細書に記載の組成物および方法を使用して派生T細胞(iT)にさらに分化され、フローサイトメトリーにより、CD3およびTCRαβ発現(対照細胞に内因性TCR、形質導入された細胞に外因性)のための分化プロセス中の様々な時点(細胞発生段階)でアッセイされた。図9A~Bに示されるように、CD3およびTCRαβの発現は、WT、iTCRα、およびiTCRαβ株におけるiT細胞分化の過程にわたって上方制御された。予想通り、CD3およびTCRαβの発現はTCR KO株では不在であった。加えて、CD3平均蛍光強度(MFI)は、WTとiTCRαおよびiTCRαβ形質導入株との間で類似した。このデータは、iTCRα単独またはiTCRβ発現と一緒に、iT細胞分化の過程で、およびiCD34細胞段階を超えて細胞表面でCD3発現を誘導または輸送するのに十分であることを示唆する。図9Cは、iCD34段階後の25日目に、示された細胞株におけるCD3およびTCRαβの発現をさらに示した。
テロメアの短縮は細胞の老化とともに起こり、幹細胞の機能不全および細胞老化に関連している。ここでは、成熟iNK細胞が、成体の末梢の大胆なNK細胞と比較してより長いテロメアを維持することが示される。テロメアの長さは、1301T細胞白血病株を対照(100%)として使用し、G0/1細胞のDNAインデックスを補正して、フローサイトメトリーにより、iPSC、成体末梢血NK細胞、およびiPSC由来NK細胞ついて決定された。図5に示すように、iPSC由来NK細胞は、成体末梢血NK細胞と比較して有意に長いテロメア長を維持し(p=.105、ANOVA)、iPSC由来NK細胞における増殖、生存、および持続の可能性が高いことを示す。末梢血から得られた初代T細胞と比較して、iPSC由来T細胞でも同様の観察が行われた。
実施例4-派生T細胞のCD3刺激および細胞応答
iTCR誘導CD3細胞表面発現iTがCD3/CD2/CD28四量体刺激に応答するかどうかを評価するために、上述の各iPSC細胞株に由来するiT細胞を、凍結保存し、解凍し、サイトカインの存在下でCD3/CD2/CD28四量体の有無にかかわらず培養し、活性化のマーカーについてアッセイした。四量体刺激の72時間後、iT細胞の凝集は、WT、iTCRα、およびiTCRαβで形質導入されたiPSC株から分化した派生T細胞の明視野顕微鏡で容易に明らかであるが、TCR KO iT細胞ではほとんど見られない(図10)。T細胞凝集は活性化の特徴であり、データは、iTCRα単独またはiTCRβと一緒に形質導入されたiPSCから分化した派生T細胞が、iTCR誘導細胞表面CD3発現を介して刺激および活性化することができることを示唆する。
iTCR誘導CD3細胞表面発現iTがCD3/CD2/CD28四量体刺激に応答するかどうかを評価するために、上述の各iPSC細胞株に由来するiT細胞を、凍結保存し、解凍し、サイトカインの存在下でCD3/CD2/CD28四量体の有無にかかわらず培養し、活性化のマーカーについてアッセイした。四量体刺激の72時間後、iT細胞の凝集は、WT、iTCRα、およびiTCRαβで形質導入されたiPSC株から分化した派生T細胞の明視野顕微鏡で容易に明らかであるが、TCR KO iT細胞ではほとんど見られない(図10)。T細胞凝集は活性化の特徴であり、データは、iTCRα単独またはiTCRβと一緒に形質導入されたiPSCから分化した派生T細胞が、iTCR誘導細胞表面CD3発現を介して刺激および活性化することができることを示唆する。
四量体で刺激されたiT細胞は、T細胞活性化マーカーCD25について72時間後にフローサイトメトリーによりアッセイされた。WT、iTCRα、およびiTCRαβで形質導入された株は、未処理の対照培養と比較して、四量体で上方制御されたCD25発現で刺激された。この応答は、TCR KO iTセルでは不在である。CD25フローサイトメトリーのデータは、iTCR形質導入株がiTCR誘導細胞表面CD3発現を介して刺激および活性化することができることを示す。
活性化されると、T細胞はCD45RAの発現からCD45ROに切り替わることが知られていた。さらなる機能検証のために、四量体で刺激されたiT細胞を、この特徴的な表現型の変化について72時間後にフローサイトメトリーによりアッセイした。図11に示すように、四量体で刺激された後、WT、iTCRα、およびiTCRαβで形質導入されたiPSC株に由来するiT細胞は、それぞれの未処理のiT細胞対照培養物と比較して、CD45ROの上方制御された発現およびCD45RAの下方制御された発現を示した。この応答は、TCR KO iPSCに由来するiTでは不在である。このデータは、iTCRα単独またはiTCRβと一緒に形質導入されたiPSCに由来するiT細胞が、本明細書に例示されるものによって例示される定義された組換えTCR(d-rTCR)によって細胞表面に輸送される発現CD3を介して刺激および活性化できることを示す。インバリアントNKT細胞に由来する定義されたトランスジェニックTCRβ(tgTCRα)の有無にかかわらず、定義されたトランスジェニックTCRα(tgTCRα)を含む。
実施例5-再構成された細胞表面CD3を介したBiTE媒介性細胞傷害
エフェクター細胞の細胞傷害性は、iTCRαおよびiTCRαβ形質導入iPSC株に由来するiTエフェクター細胞を、細胞増殖色素eFluor(商標)450で標識されたNalm6CD19WT細胞および細胞増殖色素eFluor(商標)670で標識されたNalm6-CD19KO細胞からなる50:50の標的細胞混合物と共培養することによって評価された。混合した標的細胞を96ウェルU底プレートにプレーティングし、様々な濃度のエフェクター細胞を、CD19xCD3 BiTE(Invivogen、San Diego,CA)またはCD20xCD3 BiTE(G&P Biosciences、Santa Clara,CA)の有無にかかわらず、約4時間、0:1、1:1、3.16:1、および10:1の範囲の所望のエフェクター対標的(E:T)で各ウェルに添加し、その後フローサイトメトリーで分析した。アポトーシス標的細胞の割合は、eFluor(商標)450+Nalm6 CD19WT細胞中のカスパーゼ3/7+細胞の割合、またはeFluor(商標)670+Nalm6-CD19KO細胞中のカスパーゼ3/7+細胞の割合に基づいて決定された。
エフェクター細胞の細胞傷害性は、iTCRαおよびiTCRαβ形質導入iPSC株に由来するiTエフェクター細胞を、細胞増殖色素eFluor(商標)450で標識されたNalm6CD19WT細胞および細胞増殖色素eFluor(商標)670で標識されたNalm6-CD19KO細胞からなる50:50の標的細胞混合物と共培養することによって評価された。混合した標的細胞を96ウェルU底プレートにプレーティングし、様々な濃度のエフェクター細胞を、CD19xCD3 BiTE(Invivogen、San Diego,CA)またはCD20xCD3 BiTE(G&P Biosciences、Santa Clara,CA)の有無にかかわらず、約4時間、0:1、1:1、3.16:1、および10:1の範囲の所望のエフェクター対標的(E:T)で各ウェルに添加し、その後フローサイトメトリーで分析した。アポトーシス標的細胞の割合は、eFluor(商標)450+Nalm6 CD19WT細胞中のカスパーゼ3/7+細胞の割合、またはeFluor(商標)670+Nalm6-CD19KO細胞中のカスパーゼ3/7+細胞の割合に基づいて決定された。
図12Aに示されるように、iTCRαおよびiTCRαβを発現するiT細胞は、BiTEの存在下で増強された特異的細胞傷害性を呈した。BiTE自体(CD19xCD3またはCD20xCD3のいずれか)は細胞アポトーシスの増強を引き起こさなかったが、細胞表面CD3を発現するエフェクターiT細胞の添加は腫瘍細胞アポトーシスを増加させたことが観察された。したがって、iPSC由来エフェクター細胞の細胞傷害性は、再構成されたCD3へのBiTE結合によってさらに増強される。改善されたエフェクター細胞の機能性は、両方の株において、エフェクターiT細胞単独のEC50と比較して、BiTEの存在下でエフェクターiT細胞のEC50が減少することによってさらに示された(図12B)。
実施例6-持続性が改善された派生NK細胞の機能プロファイリング
加えて、IL15Rαの細胞内ドメインを欠く外因性の切断型IL15/IL15Rα融合タンパク質の発現は、可溶性の外因性IL2の添加とは無関係に、インビトロでiPSC由来NK細胞の生存を支持することが示された。細胞内ドメインを有さないIL15Rαを、リンカーを介してC末端でIL15に融合させて、シグナル伝達ドメインを有さない切断型IL15/IL15Ra融合構築物(またはこの出願では「IL15Δ」と呼ばれる)を生成した。本明細書で提供される例示的なIL15Δは、図2の設計3または4などの構造を有するものを含む。図5に示すように、iNK細胞に、GFP(四角;陰性対照)、完全長IL15/IL15Ra融合構築物(黒丸;陽性対照;図2の設計2)、または切断型IL15/IL15Ra融合構築物(白丸;図2の設計3)のいずれかを発現する過剰発現ベクターを形質導入した。IL15構築物もGFPも外因性IL2の存在下で濃縮を示さず(図6、左)、形質導入された細胞が非形質導入細胞と同等の割合で生存したことを示した。外因性IL2の不在下で、IL15/IL15Ra融合構築物のいずれかで形質導入された細胞は経時的に濃縮されたが、GFP形質導入細胞は濃縮されず、IL2がない場合、IL15/IL15Ra構築物のいずれかで形質導入された細胞が同じ培養下の非形質導入細胞と比較して生存上の利点があることを示す(図6、右)。さらに、IL15Rαの細胞内ドメインは、受容体がIL15応答細胞で発現し、細胞が拡大し、それに応じて機能するのに重要であると考えられているため、細胞内ドメイン切断型IL15/IL15Ra融合構築物が形質導入されたiNK細胞で安定して発現されるだけでなく、図6の右のプロットに示されるように、完全長IL15/IL15Ra融合構築物よりも高い拡大率でiNK細胞を支持することは驚くべきことである。したがって、本明細書で提供されるIL15Δは、IL15を膜結合形態で発現および維持することができ、完全長IL15/IL15Ra融合タンパク質を置き換えて、細胞においてIL15のトランス提示を提供することができる。根底にある機構を完全に理解せずに、IL15Rの細胞内ドメインを除去すると、おそらくその細胞内ドメインを介して正常なIL15Rによって媒介されるシス提示および/または任意の他の潜在的なシグナル伝達経路を完全に排除することにより、応答細胞に生存、拡大、および持続性においてさらなる活力、適合性、またはある特定の利点が与えられたように思われる。
加えて、IL15Rαの細胞内ドメインを欠く外因性の切断型IL15/IL15Rα融合タンパク質の発現は、可溶性の外因性IL2の添加とは無関係に、インビトロでiPSC由来NK細胞の生存を支持することが示された。細胞内ドメインを有さないIL15Rαを、リンカーを介してC末端でIL15に融合させて、シグナル伝達ドメインを有さない切断型IL15/IL15Ra融合構築物(またはこの出願では「IL15Δ」と呼ばれる)を生成した。本明細書で提供される例示的なIL15Δは、図2の設計3または4などの構造を有するものを含む。図5に示すように、iNK細胞に、GFP(四角;陰性対照)、完全長IL15/IL15Ra融合構築物(黒丸;陽性対照;図2の設計2)、または切断型IL15/IL15Ra融合構築物(白丸;図2の設計3)のいずれかを発現する過剰発現ベクターを形質導入した。IL15構築物もGFPも外因性IL2の存在下で濃縮を示さず(図6、左)、形質導入された細胞が非形質導入細胞と同等の割合で生存したことを示した。外因性IL2の不在下で、IL15/IL15Ra融合構築物のいずれかで形質導入された細胞は経時的に濃縮されたが、GFP形質導入細胞は濃縮されず、IL2がない場合、IL15/IL15Ra構築物のいずれかで形質導入された細胞が同じ培養下の非形質導入細胞と比較して生存上の利点があることを示す(図6、右)。さらに、IL15Rαの細胞内ドメインは、受容体がIL15応答細胞で発現し、細胞が拡大し、それに応じて機能するのに重要であると考えられているため、細胞内ドメイン切断型IL15/IL15Ra融合構築物が形質導入されたiNK細胞で安定して発現されるだけでなく、図6の右のプロットに示されるように、完全長IL15/IL15Ra融合構築物よりも高い拡大率でiNK細胞を支持することは驚くべきことである。したがって、本明細書で提供されるIL15Δは、IL15を膜結合形態で発現および維持することができ、完全長IL15/IL15Ra融合タンパク質を置き換えて、細胞においてIL15のトランス提示を提供することができる。根底にある機構を完全に理解せずに、IL15Rの細胞内ドメインを除去すると、おそらくその細胞内ドメインを介して正常なIL15Rによって媒介されるシス提示および/または任意の他の潜在的なシグナル伝達経路を完全に排除することにより、応答細胞に生存、拡大、および持続性においてさらなる活力、適合性、またはある特定の利点が与えられたように思われる。
当業者は、本明細書に記載の方法、組成物、および産生物が例示的な実施形態の代表であり、本発明の範囲に対する限定として意図されていないことを容易に理解するであろう。本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、本明細書に開示される本開示に対して様々な置換および修正を行うことができることは当業者には容易に明らかであろう。
本明細書で言及されるすべての特許および刊行物は、本開示が属する当業者のレベルを示している。すべての特許および刊行物は、個々の刊行物が参照により組み込まれるものとして具体的かつ個別に示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に例示的に記載されている本開示は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素、制限がなくても実施することができる。したがって、例えば、本明細書の各場合において、「含む」、「本質的にからなる」、および「からなる」という用語のいずれかを、他の2つの用語のいずれかで置き換えることができる。使用されている用語および表現は、説明の用語として使用され、限定ではなく、そのような用語および表現の使用において、示され説明された特色またはその一部の同等物を除外する意図はないが、特許請求される本開示の範囲内で様々な修正が可能であると認識される。したがって、本開示は、好ましい実施形態および任意選択の特色によって具体的に開示されているが、本明細書に開示される概念の修正および変形は、当業者によって想到され得、そのような修正および変形は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内であると考えられると理解されるべきである。
Claims (50)
- 細胞またはその集団であって、
(i)前記細胞が、人工多能性細胞(iPSC)、クローンiPSC、またはクローンiPS細胞株細胞、または前記iPSCの分化から得られた派生細胞であり、
(ii)前記細胞が、TCRnegであり、発現されると、細胞表面CD3複合体、またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む、細胞またはその集団。 - 前記細胞表面CD3複合体、またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)が、
(i)非結合組換えTCR(nb-rTCR)と会合するか、
(ii)定義された組換えTCR(d-rTCR)と会合するか、
(iii)組換えプレTCR(p-rTCR)と会合するか、
(iv)非結合組換えTCRに固定されるか(nb-rTCR-CD3)、または
(v)CD3キメラ鎖(ccCD3)である、請求項1に記載の細胞またはその集団。 - 前記1つ以上のポリヌクレオチドが、
(i)トランスジェニックTCRα定常領域(tgTRAC)、
(ii)トランスジェニックTCRβ定常領域(tgTRBC)、
(iii)トランスジェニックTCRα(tgTCRα)、
(iv)トランスジェニックTCRβ(tgTCRβ)、
(v)トランスジェニックプレTCRα(tgpTCRα)、
(vi)CD3εおよびCD3δの完全長もしくは部分長の外部ドメインと、完全もしくは部分的なTCRα定常領域と、を含む、トランスジェニック融合タンパク質(tgCD3(ε-δ)-TRAC)、
(vii)CD3εおよびCD3γの完全長もしくは部分長の外部ドメインと、完全もしくは部分的なTCRβ定常領域と、を含む、トランスジェニック融合タンパク質(tgCD3(ε-γ)-TRBC)、
(viii)CD3εおよびCD3γの完全長もしくは部分長の外部ドメインと、完全もしくは部分的なTCRα定常領域と、を含むトランスジェニック融合タンパク質(tgCD3(ε-γ)-TRAC)、
(ix)CD3εおよびCD3δの完全長もしくは部分長の外部ドメインと、完全もしくは部分的なTCRβ定常領域と、を含む、トランスジェニック融合タンパク質(tgCD3(ε-δ)-TRBC)、
(x)CD3εおよびCD3γの完全長もしくは部分長の外部ドメインと、CD3ζの完全長もしくは部分長の内部ドメインと、を含む、トランスジェニック融合タンパク質(tgCD3(ε-γ)-ζ)、
(xi)CD3εおよびCD3δの完全長もしくは部分長の外部ドメインと、CD3ζの完全長もしくは部分長の内部ドメインと、を含む、トランスジェニック融合タンパク質(tgCD3(ε-δ)-ζ)、
(xii)CD3εの完全長もしくは部分長の外部ドメインを含むトランスジェニック融合タンパク質と、CD3γもしくはCD3δの完全長もしくは部分長の外部ドメインと、CD3ζの完全長もしくは部分長の内部ドメインと、CD28のシグナル伝達ドメインと、を含むトランスジェニック融合タンパク質(tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ)、
(xiii)CD3εの完全長もしくは部分長の外部ドメインを含むトランスジェニック融合タンパク質と、CD3γもしくはCD3δの完全長もしくは部分長の外部ドメインと、CD3ζの完全長もしくは部分長の内部ドメインと、41BBのシグナル伝達ドメインと、を含むトランスジェニック融合タンパク質(tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ)、ならびに/または
(xiv)CD3γもしくはCD3δの完全長もしくは部分長の外部ドメインと、CD3ζの完全長もしくは部分長の内部ドメインと、CD28のシグナル伝達ドメインと、41BBのシグナル伝達ドメインと、を含むトランスジェニック融合タンパク質(tgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζ)、のうちの1つ以上を含む外因性タンパク質をコードする、請求項1に記載の細胞またはその集団。 - tgTRAC、tgTCRα、tgpTCRα、tgCD3(ε-δ)-TRAC、tgCD3(ε-γ)-TRAC、tgCD3(ε-γ)-ζ、tgCD3(ε-δ)-ζ、tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ、tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ、もしくはtgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζをコードする前記1つ以上のポリヌクレオチドが、TRAC遺伝子座に挿入され、任意選択で、挿入時に、TRACの内因性プロモーターに作動可能に連結されるか、または
tgTRBC、tgTCRβ、tgCD3(ε-γ)-TRBC、tgCD3(ε-δ)-TRBC、tgCD3(ε-γ)-ζ、tgCD3(ε-δ)-ζ、tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ、tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ、および/もしくはtgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζをコードする前記1つ以上のポリヌクレオチドが、TRBC遺伝子座に挿入され、任意選択で、挿入時に、TRBCの内因性プロモーターに作動可能に連結される、請求項3に記載の細胞またはその集団。 - 前記tgTRACをコードするポリヌクレオチドが、TCRαの完全長もしくは部分長の前記定常領域をコードする配列、および任意選択で、N末端シグナルペプチドを含むか、または
前記tgTRACをコードするポリヌクレオチドが、TCRαの完全長の前記定常領域をコードする配列、およびC末端にポリAテール、ならびに任意選択でN末端シグナルペプチドを含むか、または
前記tgTRACをコードするポリヌクレオチドが、TCRαの部分長の前記定常領域をコードする配列、および任意選択で、N末端シグナルペプチドを含み、前記ポリヌクレオチドの前記挿入が、前記定常領域のエキソンにおいてであり、かつインフレームであるか、または
前記tgTRBCをコードするポリヌクレオチドが、TCRβの完全長もしくは部分長の前記定常領域をコードする配列、および任意選択でN末端シグナルペプチドを含むか、または
前記tgTRBCをコードするポリヌクレオチドが、TCRβの完全長の前記定常領域をコードする配列、およびC末端にポリAテール、ならびに任意選択でN末端シグナルペプチドを含むか、または
前記tgTRBCをコードするポリヌクレオチドが、TCRβの部分長の前記定常領域をコードする配列、および任意選択で、N末端シグナルペプチドを含み、前記ポリヌクレオチドの前記挿入が、前記定常領域のエキソンにおいてであり、かつインフレームである、請求項4に記載の細胞またはその集団。 - TRACおよび/またはTRBC遺伝子座に挿入された前記1つ以上のポリヌクレオチドが、それぞれTRACおよびTRBCの発現を妨害し、TCRneg細胞をもたらす、請求項4に記載の細胞またはその集団。
- TRACおよび/またはTRBC遺伝子座に挿入された前記1つ以上のポリヌクレオチドが、(i)それぞれTRACおよびTRBCの内因性プロモーター、または(ii)異種プロモーターによって駆動される、請求項6に記載の細胞またはその集団。
- 前記異種プロモーターが、(i)構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、もしくは細胞型特異的プロモーターのうちの少なくとも1つ、または(ii)CMV、EF1α、PGK、CAG、およびUBCのうちの1つ、または(iii)CAGを含む、請求項7に記載の細胞またはその集団。
- (i)前記nb-rTCRが、tgTRACおよびtgTRBCの一方または両方を含むか、
(ii)前記d-rTCRが、tgTCRα、および任意選択でtgTCRβを含み、前記tgTCRαおよび前記tgTCRβのそれぞれが、それぞれの定義された可変領域を含むか、
(iii)前記p-rTCRが、tgpTCRα、および任意選択でtgTRBCまたはtgTCRβを含み、前記tgTCRβが、定義された可変領域を含むか、
(iv)前記nb-rTCR-CD3が、融合タンパク質:(1)tgCD3(ε-δ)-TRAC、(2)tgCD3(ε-γ)-TRBC、(3)tgCD3(ε-γ)-TRAC、および/または(4)tgCD3(ε-δ)-TRBCのうちの1つ以上を含み、前記融合タンパク質が、CD3ε、CD3δ、CD3γの完全長もしくは部分長の外部ドメイン、および/または完全長もしくは部分長のTRACもしくはTRBCを含むか、あるいは
(v)前記ccCD3が、融合タンパク質:tgCD3(ε-γ)-ζ、tgCD3(ε-δ)-ζ、tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ、tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ、およびtgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζのうちの少なくとも1つを含み、CD3ε、CD3δ、および/またはCD3γタンパク質の完全長または部分長の外部ドメインを含む前記融合タンパク質が、CDζタンパク質の完全長または部分長の内部ドメインを含む細胞質ドメイン、および任意選択でCD28シグナル伝達ドメインおよび41BBシグナル伝達ドメインのうちの1つまたは両方をさらに含む、請求項2に記載の細胞またはその集団。 - 融合タンパク質tgCD3(ε-δ)-TRACを含む前記nb-rTCR-CD3が、tgTRBCもしくはtgTCRβをさらに含むか、または融合タンパク質tgCD3(ε-γ)-TRBCを含む前記nb-rTCR-CD3が、tgTRACもしくはtgTCRαをさらに含むか、またはtgTCRαおよびtgTCRβを含む前記d-rTCRが、インバリアントNKT細胞のTCRαおよびTCRβを含む、請求項9に記載の細胞またはその集団。
- (i)前記細胞が、前記組換えTCR:nb-rTCR、d-rTCR、もしくはp-rTCRのうちの1つを含み、前記組換えTCRが、内因性CD3サブユニットと複合体を形成し、それにより内因性CD3サブユニットの細胞表面提示およびそのシグナル伝達を可能にするか、または
(ii)前記細胞が、nb-rTCR-CD3もしくはccCD3を含み、それにより外因性CD3サブユニットの細胞表面提示およびそのシグナル伝達を可能にする、請求項9に記載の細胞またはその集団。 - 前記派生細胞が、造血細胞であり、末梢血、臍帯血、または任意の他のドナー組織から得られるその天然の対応細胞と比較してより長いテロメアを含む、請求項1に記載の細胞またはその集団。
- 前記細胞が、
(i)B2M陰性または低B2M、
(ii)CIITA陰性または低CIITA、
(iii)HLA-Gまたは切断不可能なHLA-Gの導入された発現、
(iv)高親和性の切断不可能なCD16(hnCD16)またはそのバリアント、
(v)キメラ抗原受容体(CAR)、
(vi)細胞表面発現外因性サイトカインまたはその受容体の部分長または完全長ペプチド、
(vii)表1に列記される遺伝子型のうちの少なくとも1つ、
(viii)CD38、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、RAG1、および染色体6p21領域の任意の遺伝子のうちの少なくとも1つに欠失または発現低下、ならびに
(ix)HLA-E、41BBL、CD4、CD8、CD16、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、Fc受容体、エンゲージャー、および二重もしくは多重特異性またはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも1つに導入されたまたは増加した発現のうちの1つ以上をさらに含む、請求項1に記載の細胞またはその集団。 - 前記細胞が、派生NKまたは派生T細胞であり、末梢血、臍帯血、または任意の他のドナー組織から得られたその天然の対応細胞と比較して、
(i)持続性および/もしくは生存の改善、
(ii)天然免疫細胞に対する耐性の増加、
(iii)細胞傷害性の増加、
(iv)腫瘍浸潤の改善、
(v)ADCCの増強もしくは獲得、
(vi)バイスタンダー免疫細胞を遊走させる、および/もしくは活性化するか、または腫瘍部位に動員する能力の増強、
(vii)腫瘍の免疫抑制を低下させる能力の増強、
(viii)腫瘍抗原エスケープを救済する能力の改善、ならびに
(ix)フラトリサイドの低減、
を含む特徴のうちの少なくとも1つを有する、請求項1または13に記載の細胞またはその集団。 - 前記細胞が、高親和性の切断不可能なCD16(hnCD16)またはそのバリアントをさらに含む、請求項13に記載の細胞またはその集団。
- 前記高親和性の切断不可能なCD16(hnCD16)またはそのバリアントが、
(a)CD16の外部ドメインドメインのF176VおよびS197P、
(b)CD64に由来する完全または部分外部ドメイン、
(c)非天然(または非CD16)膜貫通ドメイン、
(d)非天然(または非CD16)細胞内ドメイン、
(e)非天然(または非CD16)シグナル伝達ドメイン、
(f)非天然刺激ドメイン、ならびに
(g)CD16に由来せず、同じまたは異なるポリペプチドに由来する膜貫通、シグナル伝達、および刺激ドメインのうちの少なくとも1つを含む、請求項15に記載の細胞またはその集団。 - (a)前記非天然膜貫通ドメインが、CD3D、CD3E、CD3G、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、もしくはT細胞受容体(TCR)ポリペプチドに由来するか、
(b)前記非天然刺激ドメインが、CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4、もしくはNKG2Dポリペプチドに由来するか、
(c)前記非天然シグナル伝達ドメインが、CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(41BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、もしくはNKG2Dポリペプチドに由来するか、または
(d)前記非天然膜貫通ドメインがNKG2Dに由来し、前記非天然刺激ドメインが2B4に由来し、前記非天然シグナル伝達ドメインがCD3ζに由来する、請求項16に記載の細胞またはその集団。 - 前記細胞がキメラ抗原受容体(CAR)をさらに含み、前記CARが、
(i)T細胞特異的またはNK細胞特異的である、
(ii)二重特異性抗原結合CARである、
(iii)切り替え可能なCARである、
(iv)二量体化されたCARである、
(v)分割CARである、
(vi)多鎖CARである、
(vii)誘導性CARである、
(viii)別のCARと共発現される、
(ix)細胞表面発現外因性サイトカインまたはその受容体の部分長もしくは完全長ペプチドと、任意選択で別個の構築物またはバイシストロン性構築物において共発現される、
(xi)チェックポイント阻害剤と、任意選択で別個の構築物またはバイシストロン性構築物において共発現される、
(xii)CD19またはBCMAに特異的である、ならびに/あるいは
(xiii)ADGRE2、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、CCRI、CCR4、がん胎児性抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、サイトメガロウイルス(CMV)感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質2(EGP2)、上皮糖タンパク質-40(EGP-40)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、EGFRvIII、受容体チロシン-タンパク質キナーゼerb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB葉酸結合タンパク質(FBP)、胎児アセチルコリン受容体(AChR)、葉酸受容体-a、ガングリオシドG2(GD2)、ガングリオシドG3(GD3)、ヒト上皮成長因子受容体2(HER-2)、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、ICAM-1、インテグリンB7、インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2(IL-13Rα2)、κ-軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体(KDR)、ルイスA(CA19.9)、ルイスY(LeY)、L1細胞接着分子(L1-CAM)、LILRB2、メラノーマ抗原ファミリーA 1(MAGE-A1)、MICA/B、ムチン1(Muc-1)、ムチン16(Muc-16)、メソセリン(MSLN)、NKCSI、NKG2Dリガンド、c-Met、がん-精巣抗原NY-ESO-1、腫瘍胎児性抗原(h5T4)、PRAME、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、PRAME前立腺特異的膜抗原(PSMA)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG-72)、TIM-3、TRBC1、TRBC2、血管内皮成長因子R2(VEGF-R2)、ウィルムス腫瘍タンパク質(WT-1)、および病原体抗原のうちのいずれか1つに特異的であり、
(i)~(xiii)のうちのいずれか1つの前記CARが、任意選択でTRAC遺伝子座に挿入され、かつ/またはTCRの内因性プロモーターによって駆動され、かつ/または前記TCRが、CAR挿入によってノックアウトされる、請求項13に記載の細胞またはその集団。 - 細胞表面発現外因性サイトカインまたはその受容体、前記外因性サイトカインまたはその受容体の部分長または完全長ペプチドを含む前記細胞が、
(a)IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21、およびそのそれぞれの受容体のうちの少なくとも1つを含むか、または
(b)
(i)自己切断ペプチドを使用することによるIL15およびIL15Rαの共発現、
(ii)IL15とIL15Rαとの融合タンパク質、
(iii)切断されたIL15Rαの細胞内ドメインを有するIL15/IL15Rα融合タンパク質、
(iv)IL15とIL15Rαの膜結合Sushiドメインとの融合タンパク質、
(v)IL15とIL15Rβとの融合タンパク質、
(vi)IL15と共通受容体γCとの融合タンパク質であって、前記共通受容体γCが、天然であるか、もしくは修飾されている、融合タンパク質、ならびに
(vii)IL15Rβのホモ二量体のうちの少なくとも1つを含み、
((i)~(vii)のいずれか1つが、別個の構築物またはバイシストロン性構築物においてCARと共発現され得る)、
任意選択で、
(c)一過性発現される、請求項13に記載の細胞またはその集団。 - 前記細胞が、派生NKまたは派生T細胞であり、前記派生NK細胞が、T細胞を腫瘍部位に動員および/または遊走させることができ、前記派生NKまたは前記派生T細胞が、1つ以上のチェックポイント阻害剤の存在下で腫瘍の免疫抑制を低下させることができる、請求項13に記載の細胞またはその集団。
- 前記チェックポイント阻害剤が、PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2aR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara(レチノイン酸受容体アルファ)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E、または阻害性KIRを含む1つ以上のチェックポイント分子に対するアンタゴニストである、請求項18または20に記載の細胞またはその集団。
- 前記チェックポイント阻害剤が、
(a)アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、IPH4102、IPH43、IPH33、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、およびそれらの誘導体もしくは機能的同等物のうちの1つ以上、または
(b)アテゾリズマブ、ニボルマブ、およびペムブロリズマブのうちの少なくとも1つを含む、請求項21に記載の細胞またはその集団。 - 前記派生細胞が、派生CD34細胞、派生造血幹細胞および前駆細胞、派生造血多分化能前駆細胞、派生T細胞前駆細胞、派生NK細胞前駆細胞、派生T細胞、派生NKT細胞、派生NK細胞、または派生B細胞を含む、請求項1に記載の細胞またはその集団。
- 前記細胞が、
(i)1つのセーフハーバー遺伝子座に組み込まれた1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または
(ii)異なるセーフハーバー遺伝子座に組み込まれた3つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または
(iii)配列番号17、19、もしくは21に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、もしくは99%の同一性のアミノ酸配列を含むIL15Δをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項1に記載の細胞またはその集団。 - 前記セーフハーバー遺伝子座が、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、ベータ-2ミクログロブリン、CD38、GAPDH、TCR、CD38、RUNX1、またはTCRのうちの少なくとも1つを含む、請求項24に記載の細胞またはその集団。
- 前記セーフハーバー遺伝子座TCRが、TCRアルファまたはTCRベータの定常領域である、請求項25に記載の細胞またはその集団。
- 請求項1~26のいずれか一項に記載のクローンiPSC細胞株の細胞を含む、クローンマスター細胞バンク。
- 請求項1~26のいずれか一項に記載の細胞またはその集団を含む、組成物。
- 請求項1~26のいずれか一項に記載の派生細胞と、1つ以上の治療薬を含む、治療用途のための組成物。
- 前記治療薬が、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、成長因子、小RNA、dsRNA(二本鎖RNA)、単核血液細胞、フィーダー細胞、フィーダー細胞構成要素もしくはその置換因子、目的の1つ以上のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤もしくは放射性部分、または免疫調節薬(IMiD)を含む、請求項29に記載の組成物。
- (a)前記チェックポイント阻害剤が、
(i)PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2aR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara(レチノイン酸受容体アルファ)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E、もしくは阻害性KIRを含む1つ以上のアンタゴニストチェックポイント分子、
(ii)アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、IPH4102、IPH43、IPH33、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、およびそれらの誘導体もしくは機能的同等物のうちの1つ以上、
(iii)アテゾリズマブ、ニボルマブ、およびペムブロリズマブのうちの少なくとも1つを含むか、または
(b)前記治療薬が、ベネトクラクス、アザシチジン、およびポマリドミドのうちの1つ以上を含む、請求項30に記載の組成物。 - 前記抗体が、
(a)抗CD20、抗CD22、抗HER2、抗CD52、抗EGFR、抗CD123、抗GD2、抗PDL1、および/または抗CD38抗体、
(b)リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、オクレリズマブ、イノツズマブ、モキセツモマブ、エプラツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アレムツズマブ、セルツキシマブ(certuximab)、ジヌツキシマブ、アベルマブ、ダラツムマブ、イサツキシマブ、MOR202、7G3、CSL362、エロツズマブ、およびそれらのヒト化もしくはFc修飾されたバリアントまたは断片、ならびにそれらの機能的同等物およびバイオシミラーのうちの1つ以上、あるいは
(c)ダラツムマブを含み、前記派生造血細胞が、CD38ノックアウトを含む派生NK細胞または派生T細胞、および任意選択でhnCD16またはそのバリアントの発現を含む、請求項30に記載の組成物。 - 養子細胞療法に好適な対象に前記組成物を導入することによる、請求項28~31のいずれか一項に記載の組成物の治療用途であって、前記対象が、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、がん、またはウイルス感染を有する、治療用途。
- TCRnegiPSCを分化させることを含む、請求項1~26のいずれか一項に記載の細胞を製造する方法であって、前記iPSCが、発現されると、細胞表面CD3複合体、またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供するように1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含み、任意選択で、前記iPSCが、
(i)B2M陰性または低B2M、
(ii)CIITA陰性または低CIITA、
(iii)HLA-Gまたは切断不可能なHLA-Gの導入された発現、
(iv)高親和性の切断不可能なCD16(hnCD16)またはそのバリアント、
(v)キメラ抗原受容体(CAR)、
(vi)細胞表面発現外因性サイトカインまたはその受容体の部分長または完全長ペプチド、
(vii)表1に列記される遺伝子型のうちの少なくとも1つ、
(viii)CD38、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、RAG1、および染色体6p21領域の任意の遺伝子のうちの少なくとも1つに欠失または発現低下、ならびに
(ix)HLA-E、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD16、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、TCR、Fc受容体、エンゲージャー、および二重もしくは多重特異性またはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも1つに導入されたまたは増加した発現のうちの1つ以上をさらに含む、方法。 - (a)クローンiPSCのTCRをノックアウトして、ゲノム操作されたTCRnegiPSCを得、同時にもしくは続いて、1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドをノックインすること、または
(b)インバリアントNKT細胞をiPSCに再プログラミングして、T細胞-TCRではなくiTCRαβを含むクローンiPSCを提供し、
発現されると、細胞表面CD3複合体、もしくはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供すること、ならびに
(c)任意選択で、
(i)B2MおよびCIITAをノックアウトすること、または
(ii)HLA-Gもしくは切断不可能なHLA-G、高親和性の切断不可能なCD16もしくはそのバリアント、CAR、および/もしくは細胞表面発現外因性サイトカインもしくはその受容体の部分長もしくは完全長ペプチドの発現を導入することにより、(a)もしくは(b)のiPSCをゲノム工学的に操作することをさらに含み、
前記CARおよび細胞表面発現外因性サイトカインまたはその受容体の部分的または完全なペプチドが、別個の構築物またはバイシストロン性構築物において共発現される、請求項34に記載の細胞を製造する方法。 - 1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドをノックインしてcs-CD3を提供する前記ステップ(a)が、以下:
(i)発現されるとnb-rTCRを提供するポリヌクレオチドをコードするtgTRACおよびtgTRBCの一方もしくは両方、
(ii)発現されるとd-rTCRを提供するポリヌクレオチドをコードするtgTCRα、および任意選択でtgTCRβ(前記tgTCRαおよび前記tgTCRβのそれぞれは、それぞれの定義された可変領域を含む)、
(iii)p-rTCRを提供するポリヌクレオチドをコードするtgpTCRα、および任意選択でtgTRBCもしくはtgTCRβ(前記tgTCRβは、定義された可変領域を含む)、
(iv)nb-rTCR-CD3を提供する融合タンパク質:(1)tgCD3(ε-δ)-TRAC、(2)tgCD3(ε-γ)-TRBC、(3)tgCD3(ε-γ)-TRAC、および/もしくは(4)tgCD3(ε-δ)-TRBCのうちの1つ以上をコードする1つ以上のポリヌクレオチド(前記融合タンパク質は、CD3ε、CD3δ、CD3γの完全長もしくは部分長の外部ドメイン、および/または完全長もしくは部分長のTRACもしくはTRBCを含む)、あるいは
(v)ccCD3を提供する融合タンパク質:(1)tgCD3(ε-γ)-ζ、(2)tgCD3(ε-δ)-ζ、(3)tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ、(4)tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ、および(5)tgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζのうちの1つ以上をコードする1つ以上のポリヌクレオチド(CD3ε、CD3δ、および/またはCD3γタンパク質の完全長もしくは部分長の外部ドメインを含む前記融合タンパク質は、CDζタンパク質の完全長または部分長の内部ドメインを含む細胞質ドメイン、ならびに任意選択でCD28シグナル伝達ドメインおよび41BBシグナル伝達の一方または両方をさらに含む)のうちの1つを前記iPSCに導入することをさらに含む、請求項35に記載の細胞を製造する方法。 - (iv)の融合タンパク質tgCD3(ε-δ)-TRACをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを前記iPSCに導入するステップが、nb-rTCR-CD3を提供するために、tgTRBCもしくはtgTCRβをコードするポリヌクレオチドを導入することをさらに含むか、または
(iv)の融合タンパク質tgCD3(ε-γ)-TRBCをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを前記iPSCに導入するステップが、nb-rTCR-CD3を提供するために、tgTRACもしくはtgTCRαをさらに含むか、または
d-rTCRを提供する、前記tgTCRαをコードするポリヌクレオチド、および任意選択で前記tgTCRβをコードするポリヌクレオチドを前記iPSCに導入するステップにおいて、前記tgTCRαおよび前記tgTCRβがそれぞれ、インバリアントNKT細胞のTCRαおよびTCRβを含む、請求項36に記載の細胞を製造する方法。 - 前記ノックアウト、前記ノックイン、または前記ゲノム工学的に操作することが、標的化された編集を含む、請求項35に記載の細胞を製造する方法。
- 前記標的化された編集が、欠失、挿入、またはイン/デルを含み、前記標的化された編集が、CRISPR、ZFN、TALEN、ホーミングヌクレアーゼ、相同組換え、またはこれらの方法の任意の他の機能的変形によって実施される、請求項38に記載の細胞を製造する方法。
- 前記編集されたiPSCが、TCRnegであり、発現した場合、細胞表面CD3複合体、またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供する1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含み、前記編集されたクローンiPSCが、表1に列記される遺伝子型のうちの少なくとも1つを含む、請求項1~26のいずれか一項に記載のクローンiPSCのCRISPR媒介編集。
- 前記編集が、TRACまたはTRBC遺伝子座においてCARの挿入をさらに含み、かつ/または前記CARが、TCRの内因性プロモーターによって駆動され、かつ/または前記TCRが、前記CAR挿入によってノックアウトされる、請求項40に記載のCRISPR媒介編集。
- 組み合わせ治療の方法であって、TCRnegと、発現されると細胞表面CD3複合体、またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を提供するように1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドと、選択された多重特異性エンゲージャーと、を含むエフェクター細胞を、治療中の対象に提供することを含み、前記エフェクター細胞が、請求項1~26のいずれか一項に記載の派生細胞を含む、方法。
- 前記選択された多重特異性エンゲージャーが、(i)T細胞エンゲージャー、(ii)NK細胞エンゲージャー、(iii)二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)、(iv)二重特異性キラー細胞エンゲージャー(BiKE)、(v)三重特異性キラー細胞エンゲージャー(TriKE)、(vi)CD3エンゲージャー、または(vii)CD16エンゲージャーのうちの少なくとも1つである、請求項42に記載の方法。
- 前記選択された多重特異性エンゲージャーが、CD3エンゲージャーであり、前記CD3エンゲージャーが、cs-CD3に結合する第1の可変セグメントと、
(i)ADGRE2、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、CCRI、CCR4、がん胎児性抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、サイトメガロウイルス(CMV)感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質2(EGP2)、上皮糖タンパク質-40(EGP-40)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、EGFRvIII、受容体チロシン-タンパク質キナーゼerb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB葉酸結合タンパク質(FBP)、胎児アセチルコリン受容体(AChR)、葉酸受容体-a、ガングリオシドG2(GD2)、ガングリオシドG3(GD3)、ヒト上皮成長因子受容体2(HER-2)、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、ICAM-1、インテグリンB7、インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2(IL-13Rα2)、κ-軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体(KDR)、ルイスA(CA19.9)、ルイスY(LeY)、L1細胞接着分子(L1-CAM)、LILRB2、メラノーマ抗原ファミリーA 1(MAGE-A1)、MICA/B、ムチン1(Muc-1)、ムチン16(Muc-16)、メソセリン(MSLN)、NKCSI、NKG2Dリガンド、c-Met、がん-精巣抗原NY-ESO-1、腫瘍胎児性抗原(h5T4)、PRAME、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、PRAME前立腺特異的膜抗原(PSMA)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG-72)、TIM-3、TRBCI、TRBC2、血管内皮成長因子R2(VEGF-R2)、ウィルムス腫瘍タンパク質(WT-1)、および/もしくは病原体抗原、または
(ii)BCMA、CD19、CD20、CD33、CD38、CD52、CD123、CEA、EGFR、EpCAM、GD2、GPA33、HER2、MICA/B、PDL1、および/もしくはPSMA、または
(iii)CD19、CD33、CD123、CEA、EpCAM、GPA33、HER2、および/もしくはPSMAのうちの少なくとも1つを含む抗原に結合する第2の可変セグメントと、を含むか、
または前記CD3エンゲージャーが、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、エルツマキソマブ、RO6958688、AFM11、MT110/AMG110、MT111/AMG211/MEDI-565、AMG330、MT112/BAY2010112、MOR209/ES414、MGD006/S80880、MGD007、および/もしくはFBTA05のうちの少なくとも1つを含む、請求項42に記載の方法。 - 前記CD3エンゲージャーが、前記エフェクター細胞と同時にまたは続いて前記対象に投与される、請求項44に記載の方法。
- 前記エフェクター細胞が、派生NK細胞または派生T細胞を含む派生造血細胞を含み、前記派生NK細胞または派生T細胞が、CD38ノックアウト、高親和性の切断不可能なCD16またはそのバリアントを含み、任意選択で、
(i)B2MおよびCIITAノックアウト、
(ii)HLA-Gまたは切断不可能なHLA-G、CAR、および/または細胞表面発現外因性サイトカインもしくはその受容体の部分長もしくは完全長ペプチドの導入された発現(前記CARおよび細胞表面発現外因性サイトカインまたはその受容体の部分長または完全長ペプチドは、別個の構築物またはバイシストロン性構築物において共発現される)、ならびに/あるいは
(iii)表1に列記される遺伝子型のうちの少なくとも1つを含む、請求項42に記載の方法。 - 養子細胞治療におけるエフェクター細胞に対するレシピエントT細胞によるアロ拒絶を低減または防止する方法であって、前記方法が、治療中の対象に、(i)抗CD3剤、および(ii)TCRneg、CD3エンゲージャーで予め充填された細胞表面CD3複合体、またはその1つ以上のサブユニットもしくはサブドメイン(cs-CD3)を含むエフェクター細胞を提供することを含み、前記エフェクター細胞が、請求項1~26のいずれか一項に記載の派生細胞を含む、方法。
- 前記抗CD3剤が、CD3抗体またはCD3-CARであり、前記CD3-CARが、NK細胞に含まれ、前記抗CD3剤が、レシピエントT細胞を不活性化し、それによって、アロ拒絶を減少または防止する、請求項47に記載の方法。
- 前記エフェクター細胞のcs-CD3に結合する第1の可変セグメントを含む前記CD3エンゲージャーが、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、がん、またはウイルス感染に関連する抗原に結合する第2の可変セグメントを含む、47に記載の方法。
- 抗原に結合する第2の可変セグメントを含む前記CD3エンゲージャーが、
(i)ADGRE2、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、CCRI、CCR4、がん胎児性抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、サイトメガロウイルス(CMV)感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質2(EGP2)、上皮糖タンパク質-40(EGP-40)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、EGFRvIII、受容体チロシン-タンパク質キナーゼerb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB葉酸結合タンパク質(FBP)、胎児アセチルコリン受容体(AChR)、葉酸受容体-a、ガングリオシドG2(GD2)、ガングリオシドG3(GD3)、ヒト上皮成長因子受容体2(HER-2)、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、ICAM-1、インテグリンB7、インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2(IL-13Rα2)、κ-軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体(KDR)、ルイスA(CA19.9)、ルイスY(LeY)、L1細胞接着分子(L1-CAM)、LILRB2、メラノーマ抗原ファミリーA 1(MAGE-A1)、MICA/B、ムチン1(Muc-1)、ムチン16(Muc-16)、メソセリン(MSLN)、NKCSI、NKG2Dリガンド、c-Met、がん-精巣抗原NY-ESO-1、腫瘍胎児性抗原(h5T4)、PRAME、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、PRAME前立腺特異的膜抗原(PSMA)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG-72)、TIM-3、TRBCI、TRBC2、血管内皮成長因子R2(VEGF-R2)、ウィルムス腫瘍タンパク質(WT-1)、および/もしくは病原体抗原、または
(ii)BCMA、CD19、CD20、CD33、CD38、CD52、CD123、CEA、EGFR、EpCAM、GD2、GPA33、HER2、MICA/B、PDL1、および/もしくはPSMA、または
(iii)CD19、CD33、CD123、CEA、EpCAM、GPA33、HER2、および/もしくはPSMAのうちの少なくとも1つを含む抗原に結合する第2の可変セグメントを含むか、
または前記CD3エンゲージャーが、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、エルツマキソマブ、RO6958688、AFM11、MT110/AMG110、MT111/AMG211/MEDI-565、AMG330、MT112/BAY2010112、MOR209/ES414、MGD006/S80880、MGD007、および/もしくはFBTA05のうちの少なくとも1つを含む、請求項49に記載の方法。
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