CN116457367A - 工程改造的iPSC和武装的免疫效应细胞 - Google Patents

工程改造的iPSC和武装的免疫效应细胞 Download PDF

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CN116457367A CN202180074848.7A CN202180074848A CN116457367A CN 116457367 A CN116457367 A CN 116457367A CN 202180074848 A CN202180074848 A CN 202180074848A CN 116457367 A CN116457367 A CN 116457367A
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E·佩拉塔
B·瓦拉马尔
吕丹
李彤
A·威蒂
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Abstract

本发明提供了用于获得通过对基因组工程改造的iPSC进行定向分化获得的功能上增强的衍生效应细胞的方法和组合物。本文提供的该iPSC衍生细胞具有递送改善的或增强的治疗效果的稳定且功能性基因组编辑。还提供了治疗性组合物和其用途，所述治疗性组合物包括单独的所述功能上增强的衍生效应细胞或在组合疗法中所述功能上增强的衍生效应细胞与抗体或检查点抑制剂。

Description

工程改造的iPSC和武装的免疫效应细胞
相关申请
本申请要求2020年10月9日提交的美国临时申请序列号63/090,113和2021年4月8日提交的美国临时申请序列号63/172,383的优先权，这些临时申请中的每篇临时申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中。
电子提交的序列表的引用
本申请以引用的方式并入标题为184143-629601_SEQUENCE_LISTING_ST25.TXT的以ASCII文本形式与本申请一起提交的序列表的计算机可读格式(CRF)，其创建于2021年10月7日，并且大小为86,415字节。
技术领域
本公开与现成的免疫细胞产物领域广泛地相关。更具体地说，本公开与研发能够体内递送治疗相关特性的多功能效应细胞的策略相关。根据本公开的实施方案研发的细胞产物解决了患者来源的细胞疗法的关键限制。
背景技术
过继性细胞疗法领域目前的重点是使用患者来源的细胞和供体来源的细胞，这使得实现癌症免疫疗法的持续制造以及向所有可能受益的患者递送疗法尤其困难。还需要改善过继转移的淋巴细胞的功效和存留，以促进良好的患者结果。淋巴细胞(诸如T细胞和自然杀伤(NK)细胞)是有效的抗肿瘤效应子，其在先天性和适应性免疫中起重要作用。然而，将这些免疫细胞用于过继性细胞疗法仍然有挑战性，并且尚未满足改善的需求。因此，在过继性免疫疗法中，仍有大量机会来利用T细胞和NK细胞或其它免疫效应细胞的全部潜能。
发明内容
需要功能上改善的效应细胞，以在以下范围内解决问题：从反应速率、细胞耗竭、输血细胞损失(存活和/或存留)、肿瘤经由靶标损失或谱系转换逃逸、肿瘤靶向精确度、脱靶毒性、肿瘤外效应到针对实体肿瘤的功效，即肿瘤微环境和相关免疫抑制、募集、运输和浸润。
本发明的一个目的是提供产生由单细胞衍生的iPSC(诱导性多能干细胞)克隆系分化的衍生非多能细胞的方法和组合物，该iPSC包含在其基因组中的一种或几种基因修饰。所述一种或几种基因修饰包括DNA插入、缺失和取代，并且该修饰在分化、扩增、传代和/或移植后在随后衍生细胞中保留并且保持功能性。
在一些实施方案中，本申请的iPSC衍生的非多能细胞包括但不限于CD34细胞、生血内皮细胞、HSC(造血干细胞和祖细胞)、造血多能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞和具有一种或多种功能特征的免疫效应细胞，这些功能特征不存在于原代NK细胞、T细胞和/或NKT细胞中。根据本申请的一些实施方案的iPSC衍生的非多能细胞通过由包含相同基因修饰的iPSC分化而在它们的基因组中包含一种或多种基因修饰。在一些实施方案中，用于获得基因工程改造的衍生细胞的工程改造的克隆iPSC分化策略要求iPSC在分化中的发育潜能不会受到iPSC中的工程改造模式的不利影响，并且还要求工程改造模式如预期一般在衍生细胞中发挥作用。此外，这一策略克服了工程改造的原代淋巴细胞的现有障碍，原代淋巴细胞诸如从外周血获得的T细胞或NK细胞，因为这类细胞难以工程改造，并且工程改造这类细胞通常缺乏再现性和均匀性，使得细胞展现伴随高细胞死亡和低细胞扩增的不良细胞存留。此外，这一策略避免产生使用起始时是异源的原代细胞源以其它方式获得的异源效应细胞群。
本发明的一些方面提供使用包含(I)、(II)或(III)的方法获得的基因组工程改造的iPSC，分别反映了在重编程过程之后、同时和之前的基因组工程改造的策略：
(I)：按任何次序利用(i)和(ii)中的一者或两者对iPSC进行基因工程改造：(i)将一个或多个构建体引入iPSC中以允许在所选位点进行靶向整合；(ii)(a)使用一种或多种能够进行所选位点识别的核酸内切酶在所选位点将一个或多个双链断裂引入iPSC中；以及(b)培养步骤(I)(ii)(a)中的iPSC以允许进行内源DNA修复，从而同时或依序地在所选位点生成靶向插入/缺失；从而获得能够分化成部分或完全分化细胞的基因组工程改造的iPSC。
(II)：通过以下方式对重编程非多能细胞进行基因工程改造，以获得基因组工程改造的iPSC，包括：(i)使非多能细胞与一种或多种重编程因子和任选小分子组合物接触，以启动非多能细胞重编程，该小分子组合物包含TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂；以及(ii)按任何次序将(a)和(b)中的一者或两者引入步骤(II)(i)中的重编程非多能细胞中：(a)允许在所选位点进行靶向整合的一个或多个构建体；(b)使用至少一种能够进行所选位点识别的核酸内切酶在所选位点的一个或多个双链断裂，然后培养步骤(II)(ii)(b)中的细胞以允许进行内源DNA修复，从而在所选位点生成靶向插入/缺失；因此所获基因组工程改造的iPSC包含至少一种功能性靶向基因组编辑，并且所述基因组工程改造的iPSC能够分化成部分或完全分化细胞。
(III)：对重编程的非多能细胞进行基因工程改造以获得基因组工程改造的iPSC的方式包括(i)和(ii)：(i)按任何次序将(a)和(b)中的一者或两者引入非多能细胞中：(a)允许在所选位点进行靶向整合的一个或多个构建体；(b)使用至少一种能够进行所选位点识别的核酸内切酶在所选位点的一个或多个双链断裂，其中培养步骤(III)(i)(b)中的细胞以允许进行内源DNA修复，从而在所选位点生成靶向插入/缺失；以及(ii)使步骤(III)(i)中的细胞与一种或多种重编程因子和任选小分子组合物接触，以获得在所选位点处包含靶向编辑的基因组工程改造的iPSC，该小分子组合物包含TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂；由此获得基因组工程改造的iPSC，其包含至少一种功能性靶向基因组编辑，并且所述基因组工程改造的iPSC能够分化成部分分化细胞或完全分化细胞。
在上述方法的一个实施方案中，在一个或多个所选位点处的至少一种靶向基因组编辑包含一个或多个外源多核苷酸的插入，该外源多核苷酸编码安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物靶标候选物或促进基因组工程改造的iPSC或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些实施方案中，用于插入的外源多核苷酸可操作地连接到(1)一种或多种外源启动子，其包含CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC或其它组成性、诱导性、时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性启动子；或者(2)一种或多种内源启动子包含在所选位点中，所选位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、CD38、GAPDH、TCR或RUNX1或满足基因组安全港准则的其它基因座。在一些实施方案中，使用上述方法产生的基因组工程改造的iPSC包含一个或多个不同的外源多核苷酸，这些外源多核苷酸编码包含胱天蛋白酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、经修饰的EGFR或B细胞CD20的蛋白质，其中当基因组工程改造的iPSC包含两种或更多种自杀基因时，这些自杀基因被整合在不同的安全港基因座中，这些安全港基因座包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、CD38、GAPDH、TCR或RUNX1。在一个实施方案中，外源多核苷酸编码IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21和/或它们的相应受体的部分或全长肽。在一些实施方案中，由外源多核苷酸编码的IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21和/或它们的相应受体的部分或完整肽呈融合蛋白形式。
在一些其它实施方案中，使用本文所提供的方法产生的基因组工程改造的iPSC包含位于与以下相关的一个或多个内源基因处的插入/缺失：靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药物靶标候选物、免疫反应调控和调节或抑制iPSC或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些实施方案中，用于破坏的内源基因包括以下中的至少一者：CD38、B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白(Tapasin)、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、RAG1以及染色体6p21区域中的任何基因。
在又一些其它实施方案中，使用本文所提供的方法产生的基因组工程改造的iPSC包含位于AAVS1基因座的编码胱天蛋白酶的外源多核苷酸和位于H11基因座的编码胸苷激酶的外源多核苷酸。
在另外一些其它实施方案中，方法(I)、(II)和/或(III)还包含：使基因组工程改造的iPSC与包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的小分子组合物接触，以维持基因组工程改造的iPSC的多能性。在一个实施方案中，包含至少一种靶向基因组编辑的所获得的基因组工程改造的iPSC具有功能性、能有效分化并且能够分化成包含相同功能性基因组编辑的非多能细胞。
因此，在一个方面，本发明提供了一种嵌合融合受体(CFR)，其中该CFR包含胞外域、跨膜域和胞内域，并且其中该胞外域、该跨膜域和该胞内域不包含任何内质网(ER)滞留信号或胞吞信号。在一些实施方案中，该胞外域不是抗体的scFv(单链可变片段)；该胞外域在与所选激动剂结合后启动信号转导；该胞内域包含至少一个信号传导域，该至少一个信号传导域激活所选信号传导路径以增强细胞治疗特性；该CFR在表达时是细胞表面呈递的；并且该CFR减少了内化和表面下调。在一些实施方案中，该胞内域和该胞外域是模块化的；或者其中对于该CFR的给定胞内域，该胞外域是可切换的，这取决于所选激动剂的结合特异性；或者其中对于给定的胞外域，该胞内域是可切换的，这取决于用于调控的所选信号传导路径。在特定实施方案中，该胞外域包含信号传导蛋白的全部或部分长度的胞外部分，该信号传导蛋白包括以下中的至少一者：CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD28、CD5、CD16、CD64、CD32、CD33、CD89、NKG2C、NKG2D、它们的任何功能性变体以及它们的组合或嵌合体。
在一些实施方案中，该胞外域包含以下项的全部或部分长度的胞外部分：(a)CD3ε、CD3γ、CD3δ、它们的任何功能性变体或者组合或嵌合形式；(b)CD3ε和CD3γ的异源二聚体；或(c)CD3ε和CD3δ的异源二聚体；并且该激动剂对CD3的胞外域具有结合特异性；或者其中该激动剂包括以下中的至少一者：CD3×CD19、CD3×CD20、CD3×CD33、博纳吐单抗(blinatumomab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、厄妥索单抗(ertumaxomab)、RO6958688、AFM11、MT110/AMG 110、MT111/AMG211/MEDI-565、AMG330、MT112/BAY2010112、MOR209/ES414、MGD006/S80880、MGD007和FBTA05。在其它实施方案中，该胞外域包含NKG2C或其任何功能性变体的全部或部分长度的胞外部分；并且该激动剂对NKG2C的胞外域具有结合特异性；或者其中该激动剂包括以下中的至少一者：NKG2C-IL15-CD33 TriKE、NKG2C-IL15-CD19TriKE和NKG2C-IL15-CD20 TriKE。在另外的其它实施方案中，该胞外域包含CD28或其任何功能性变体的全部或部分长度的胞外部分；并且该激动剂对CD28的胞外域具有结合特异性；或者该激动剂包括以下中的至少一者：15E8、CD28.2、CD28.6、YTH913.12、37.51、9D7(TGN1412)、5.11A1、ANC28.1/5D10和37407。在另外的其它实施方案中，该胞外域包含CD16、CD64或它们的任何功能性变体或组合/嵌合形式的全部或部分长度的胞外部分；该激动剂对CD16或CD64的胞外域具有结合特异性；或者该激动剂包括以下中的至少一者：IgG抗体、CD16×CD30、CD64×CD30、CD16×BCMA、CD64×BCMA、CD16-IL-EPCAM或CD64-IL-EPCAM、CD16-IL-CD33和CD64-IL-CD33；并且IL包含至少一种细胞因子的全部或一部分，该至少一种细胞因子包括IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21或它们的任何功能性变体或嵌合形式。
在其中该胞外域在与所选配体结合后启动信号转导的那些实施方案中，所选配体可以是(i)抗体或其功能性变体或片段；或(ii)衔接子；并且所选激动剂可包含至少一个结合域，该至少一个结合域对包含在CFR的胞外域中的表位具有特异性。在一些实施方案中，所选配体是所选激动剂。在一些实施方案中，所选激动剂包含对CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD28、CD5、CD16、CD64、CD32、CD33、CD89、NKG2C、NKG2D或它们的任何功能性变体的胞外部分具有特异性的至少一个结合域；或者其中该衔接子还包含对至少一种肿瘤抗原具有特异性的结合域，该至少一种肿瘤抗原包括B7H3、BCMA、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、PSMA、PAMA、P-钙粘素或ROR1。
在CFR的各种实施方案中，CFR的跨膜域：(i)没有ER滞留或胞吞信号，或者通过工程改造去除ER滞留和胞吞信号；并且(ii)包含以下项的跨膜域的全部或一部分：(a)跨膜蛋白或膜蛋白；(b)包含以下项的蛋白质：CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD137、CD166、FcεRIγ、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、T细胞受体、烟碱型乙酰胆碱受体、GABA受体或它们的组合；或(c)CD28、CD8、CD3ε或CD4。
在CFR的各种实施方案中，该胞内域包含至少一个细胞毒性结构域和任选的以下中的一者或多者：共刺激域、持久性信号传导域、诱导死亡的信号传导域、肿瘤细胞控制信号传导域、以及它们的任何组合。在一些实施方案中，该胞内域包含细胞毒性结构域，该细胞毒性结构域至少包含CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(4-1BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C或NKG2D多肽的全长或一部分；并且任选地，其中该胞内域还包含以下中的一者或多者：(i)共刺激域，其包含CD2、CD27、CD28、CD40L、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4或NKG2D多肽或它们的任何组合的全长或一部分；(ii)共刺激域，其包含CD28、4-1BB、CD27、CD40L、ICOS、CD2或它们的任何组合的全长或一部分；(iii)持久性信号传导域，其包含细胞因子受体的胞内域的全长或一部分，该细胞因子受体包含IL2R、IL7R、IL15R、IL18R、IL12R、IL23R或它们的任何组合；和/或(iv)受体酪氨酸激酶(RTK)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、EGFR或FAS受体的全部或部分胞内部分。
在另一个方面，本发明提供了一种细胞或其群体，其中该细胞包含编码本文所述的嵌合融合受体(CFR)的多核苷酸，其中该细胞是真核细胞、动物细胞、人细胞、免疫细胞、饲养细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、克隆iPSC或它们的衍生效应细胞。在一些实施方案中，效应细胞还包含以下中的一者或多者：(i)具有靶向特异性的CAR；(ii)CD16或其变体；(iii)CD38敲除；(iv)细胞表面表达的外源细胞因子和/或其受体的部分或完整肽；(v)HLA-I缺乏和任选的HLA-II缺乏；(vi)HLA-G或不可裂解的HLA-G的引入，或CD58和CD54中的一者或两者的敲除；(vii)表1中所列的基因型中的至少一者；(viii)TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD25、CD69、CD44、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT中的至少一者的缺失或破坏；或者(ix)HLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD16、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、抗原特异性TCR、Fc受体、抗体或其功能性变体或片段、检查点抑制剂、衔接子和用于与激动剂偶联的表面触发受体中的至少一者的引入。
在一些实施方案中，与从外周血、脐带血或任何其它供体组织获得的其对应原代细胞相比，该细胞具有包括以下中的一者或多者的治疗特性：(i)增加的细胞毒性；(ii)改善的存留和/或存活；(iii)增强将旁邻免疫细胞迁移到肿瘤部位以及/或者激活或募集这些旁邻免疫细胞；(iv)改善的肿瘤渗透；(v)增强的降低肿瘤免疫抑制的能力；(vi)提高的挽救肿瘤抗原逃逸的能力；(vii)控制的凋亡；(viii)增强或获得的ADCC；以及(ix)避免自相残杀的能力。在其中效应细胞包含CD16或其变体的那些实施方案中，CD16或其变体可包含以下中的至少一者：(a)不可裂解的高亲和力CD16(hnCD16)；(b)CD16的胞外域中的F176V和S197P；(c)源自CD64的全部或部分胞外域；(d)非原生(或非CD16)跨膜域；(e)非原生(或非CD16)胞内域；(f)非原生(或非CD16)信号传导域；(g)非原生刺激域；以及(h)并非源自CD16并且源自相同或不同多肽的跨膜域、信号传导域和刺激域。在其中效应细胞包含具有靶特异性的CAR的那些实施方案中，该CAR可以是：(i)T细胞特异性或NK细胞特异性；(ii)双特异性抗原结合CAR；(iii)可切换的CAR；(iv)二聚化CAR；(v)分离CAR；(vi)多链CAR；(vii)诱导性CAR；(viii)任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中，与细胞表面表达的外源细胞因子和/或其受体的部分或完整肽共表达；(xi)任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中，与检查点抑制剂共表达；(x)对CD19、BCMA、CD20、CD22、CD38、CD123、HER2、CD52、EGFR、GD2、MICA/B、MSLN、VEGF-R2、PSMA和PDL1中的至少一者具有特异性；以及/或者(xi)对以下中的任一者具有特异性：ADGRE2、碳酸酐酶IX(CAIX)、CCR1、CCR4、癌胚抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、巨细胞病毒(CMV)感染的细胞的抗原、上皮糖蛋白2(EGP-2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、EGFRvIII、受体酪氨酸-蛋白激酶erb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB叶酸结合蛋白(FBP)、胎儿型乙酰胆碱受体(AChR)、叶酸受体α、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、人类表皮生长因子受体2(HER2)、人类端粒酶逆转录酶(hTERT)、ICAM-1、整合素B7、白细胞介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)、κ-轻链、激酶插入域受体(KDR)、路易斯A(CA19.9)、路易斯Y(LeY)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、LILRB2、黑色素瘤抗原家族A1(MAGE-A1)、MICA/B、粘蛋白1(Muc-1)、粘蛋白16(Muc-16)、间皮素(MSLN)、NKCSI、NKG2D配体、c-Met、癌症-睾丸抗原NY-ESO-1、癌胚抗原(h5T4)、PRAME、前列腺干细胞抗原(PSCA)、PRAME前列腺特异性膜抗原(PSMA)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、TIM-3、TRBC1、TRBC2、血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)、威尔姆斯肿瘤蛋白质(WT-1)和病原体抗原；并且任选地，其中(i)至(xi)中任一项所述的CAR插入在TCR基因座处以及/或者由TCR的内源启动子驱动，以及/或者该TCR通过CAR插入而被敲除。
在一些实施方案中，细胞包含细胞表面表达的外源细胞因子和/或其受体的部分或完整肽，并且其中该外源细胞因子或其受体：(a)包含IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21以及它们的相应受体中的至少一者；或者(b)包含以下中的至少一者：(i)通过使用自裂解肽进行IL15和IL15Rα的共表达；(ii)IL15和IL15Rα的融合蛋白；(iii)IL15Rα的胞内域截短或消除的IL15/IL15Rα融合蛋白；(iv)IL15和IL15Rα的结合膜的寿司域的融合蛋白；(v)IL15和IL15Rβ的融合蛋白；(vi)IL15和共同受体γC的融合蛋白，其中该共同受体γC是原生的或经修饰的；和(vii)IL15Rβ的同源二聚体；其中(i)至(vii)中的任一者都可在单独构建体中或在双顺反子构建体中与CAR共表达；以及任选地，(c)瞬时表达。
在其中效应细胞包括引入检查点抑制剂的那些实施方案中，该检查点抑制剂可以是一个或多个检查点分子的拮抗剂，该一个或多个检查点分子的拮抗剂包括：PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2AR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara(视黄酸受体α)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E和抑制性KIR；或者衔接子可包括双特异性T细胞衔接子(BiTE)或三特异性杀伤细胞衔接子(TriKE)。
在各种实施方案中，衍生效应细胞能够将T细胞募集和/或迁移到肿瘤部位，并且其中该衍生效应细胞能够在一种或多种检查点抑制剂存在下降低肿瘤免疫抑制。在各种实施方案中，该细胞包含：(i)整合在安全港基因座或所选基因座中的一个或多个外源多核苷酸；或(ii)整合在不同安全港基因座或两个或更多个所选基因座中的超过两个外源多核苷酸。在特定实施方案中，安全港基因座包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH或RUNX1中的至少一者；并且其中所选基因座是B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT中的一者；并且/或者其中外源多核苷酸的整合敲除了基因座中的该基因的表达。在一些实施方案中，TCR基因座可以是TCRα和/或TCRβ的恒定区。在各种实施方案中，衍生细胞包括衍生CD34细胞、衍生造血干细胞和祖细胞、衍生造血多能祖细胞、衍生T细胞祖细胞、衍生NK细胞祖细胞、衍生T谱系细胞、衍生NKT谱系细胞、衍生NK谱系细胞、衍生B谱系细胞或具有一种或多种功能特征的衍生免疫效应细胞，这些功能特征不存在对应的原代T细胞、NK细胞、NKT细胞和/或B细胞中。
在另一个方面，本申请提供了一种组合物，该组合物包含如本文所述的细胞或其群体。还提供了一种主细胞库(MCB)，其包含如本文所述的克隆iPSC。
在又一个方面，本发明提供了一种用于治疗用途的组合物，该组合物包含如本文所述的细胞或其群体以及一种或多种治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂包括肽、细胞因子、检查点抑制剂、抗体或其功能性变体或片段、衔接子、丝裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或其置换因子、包含一种或多种所关注多核酸的载体、化学治疗剂或放射性部分和/或免疫调节药物(IMiD)。在其中治疗剂包含检查点抑制剂的组合物的那些实施方案中，该检查点抑制剂可包含：(i)一种或多种拮抗剂检查点分子，其包括PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2AR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara(视黄酸受体α)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E或抑制性KIR；(ii)阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、伊匹单抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗以及它们的衍生物或功能等效物中的一者或多者；或(iii)阿特珠单抗、纳武单抗和帕博利珠单抗中的至少一者。在一些实施方案中，衔接子包括双特异性T细胞衔接子(BiTE)或三特异性杀伤细胞衔接子(TriKE)。在特定实施方案中，治疗剂包含维奈妥拉(venetoclax)、阿扎胞苷(azacitidine)和泊马度胺(pomalidomide)中的一者或多者。
在其中治疗剂包含抗体或其功能性变体或片段的组合物的那些实施方案中，该抗体或其功能性变体或片段可包括：(a)抗CD20、抗CD22、抗HER2、抗CD52、抗EGFR、抗CD123、抗GD2、抗PDL1和/或抗CD38抗体；(b)利妥昔单抗(rituximab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、乌妥昔单抗(ublituximab)、奥卡妥珠单抗(ocaratuzumab)、奥妥珠单抗(obinutuzumab)、异贝莫单抗(ibritumomab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥英妥珠单抗(inotuzumab)、莫塞妥单抗(moxetumomab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、阿伦单抗(alemtuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、迪妥昔单抗(dinutuximab)、阿维鲁单抗(avelumab)、达雷木单抗(daratumumab)、伊沙妥昔单抗(isatuximab)、MOR202、7G3、CSL362、依托珠单抗(elotuzumab)和它们的人源化或经Fc修饰的变体或片段以及它们的功能等效物和生物类似物中的一者或多者；或(c)达雷木单抗，并且其中衍生效应细胞包含CD38敲除，以及任选地CD16或其变体的表达。
在又一个方面，本发明提供了本文所述的组合物的治疗用途，该治疗用途通过将该组合物引入适于过继性细胞疗法的受试者体内，其中该受试者患有：自身免疫性障碍；血液系统恶性肿瘤；实体瘤；癌症或病毒感染。
在又一个方面，本发明提供了一种制备包含如本文所述的CFR的衍生效应细胞的方法，其中该方法包括分化基因工程改造的iPSC，其中该iPSC包含编码CFR的多核苷酸，以及任选的一个或多个编辑，该一个或多个编辑产生：(i)CD38敲除；(ii)HLA-I缺乏和任选的HLA-II缺乏；(iii)引入HLA-G或不可裂解的HLA-G，或敲除CD58和CD54中的一者或两者；(iv)CD16或其变体；(v)具有靶向特异性的CAR；(vi)细胞表面表达的外源细胞因子和/或其受体的部分或完整肽；(vii)表1中所列的基因型中的至少一者；(viii)TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD25、CD69、CD44、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT中的至少一者的缺失或破坏；或者(ix)HLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD16、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、抗原特异性TCR、Fc受体、抗体或其功能性变体或片段、检查点抑制剂、衔接子和用于与激动剂偶联的表面触发受体中的至少一者的引入。在一些实施方案中，该方法还包括对克隆iPSC进行基因组工程改造以敲入编码CFR的多核苷酸；以及任选地：(i)敲除CD38，(ii)敲除B2M和CIITA，(iii)敲除CD58和CD54中的一者或两者，以及/或者(iv)引入HLA-G或不可裂解的HLA-G、不可裂解的高亲和力CD16或其变体、CAR和/或细胞表面表达的外源细胞因子和/或其受体的部分或完整肽。在各种实施方案中，该基因组工程改造包括靶向编辑。在一些实施方案中，该靶向编辑包括缺失、插入或插入/缺失，并且其中该靶向编辑通过CRISPR、ZFN、TALEN、归巢核酸酶、同源重组或这些方法的任何其它功能性变型进行。
在又一个方面，本发明提供了CRISPR介导的克隆iPSC的编辑，其中该编辑包括敲入编码如本文所述的CFR的多核苷酸。在一些实施方案中，克隆iPSC的编辑还包括敲除TCR，或将CFR插入到包含以下项的基因座中的一者中：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT；并且其中该插入敲除了基因座中的该基因的表达。
在又一个方面，本发明提供了一种治疗疾病或病况的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用包含如本文所述的CFR的细胞和对CFR具有特异性的激动剂。在一些实施方案中，这些细胞可表达抗体或其功能性变体或片段，或对CFR具有特异性的衔接子。在一些实施方案中，这些细胞是iPSC衍生的效应细胞，这些细胞还包含以下中的一者或多者：(i)CD38敲除；(ii)TCRneg；(iii)外源CD16或其变体；(iv)HLA-I和/或HLA-II缺乏；(v)HLA-G或不可裂解的HLA-G的引入，或CD58和CD54中的一者或两者的敲除；(vi)CAR的引入；和/或(vii)细胞表面表达的外源细胞因子和/或其受体的部分或完整肽。在一些实施方案中，与从外周血、脐带血或任何其它供体组织获得的其对应原代细胞相比，细胞的施用导致以下中的一者或多者：(i)增加的细胞毒性；(ii)改善的存留和/或存活；(iii)增强的将旁邻免疫细胞迁移到肿瘤部位以及/或者激活或募集旁邻免疫细胞的能力；(iv)改善的肿瘤渗透；(v)增强的降低肿瘤免疫抑制的能力；(vi)提高的挽救肿瘤抗原逃逸的能力；(vii)控制的凋亡；(viii)增强或获得的ADCC；以及(ix)避免自相残杀的能力。
通过结合附图进行的以下描述，如本文所提供的组合物和方法的各个目的和优势将变得显而易见，在所述附图中借助于说明和实施例阐述本发明的某些实施方案。
附图说明
图1示出了示例性的基于CD3和CD28的CFR设计，其包含胞外域、跨膜域和具有至少一个激活/细胞毒性信号的胞内域，并且CFR不具有ER滞留和胞吞基序。
图2A至图2C示出了用于在破坏细胞中的内源TCR后，产生与重组TCR复合体或其亚基缔合的细胞表面呈递的CD3复合体或其亚基或亚结构域(cs-CD3)的示例性说明性设计：(1)nb-rTCR(非结合性重组TCR)；(2)d-rTCR(定义的重组TCR)；(3)p-rTCR(重组前TCRα，具有任选的非结合性TCRβ)；(4)nb-rTCR-CD3(非结合性重组TCR锚定的CD3)；和(5)ccCD3(CD3嵌合链)。
图3是iPSC衍生的细胞中细胞表面表达的细胞因子的几种示例性构建体设计的图示。IL15用作说明性示例，其可用其它期望的细胞因子置换。
图4A至图4G示出了具有可切换跨膜域的CFR设计(图4A)；CAR-(图4B)和CAR+(图4D)Jurkat-NFAT-TRAC KO细胞上的CFR表面表达；在BiTE细胞和靶细胞的存在下，表达CFR的CAR19-(图4C)和CAR19+(图4E)Jurkat-NFAT-TRAC KO细胞中的NFAT报告基因活性；CAR在表达具有不同跨膜域的CFR的Jurkat-NFAT-TRAC KO CAR19+细胞上的表面表达(图4F)；以及在抗原+靶标的存在下，表达CFR的TRAC KO-CAR19+或TRAC KO-CAR19-Jurkat细胞中的NFAT报告基因活性的差异(图4G)。
图5A至图5F示出了CFR在使用抗CD3抗体SP34和OKT3或者抗CD28抗体CD28.2转导的Jurkat-TRAC KO细胞上的表面表达，其中(图5A)3ε-28-3ε*+3γ-28-3γ*、(图5B)3ε-28-3ε*+3δ-28-3δ*、(图5C)3ε-28-[-]、(图5D)3ε-28-3ε*、(图5E)3ε-28-28或(图5F)28-28-3ε*。
图6A至图6D示出了经由抗CD3抗体刺激启动的CFR信号转导：(图6A)对NFAT-荧光素酶报告基因测定的说明；(图6B)Jurkat-NFAT WT细胞(左)和TRAC KO细胞(右)中的细胞表面CD3和TCRαβ表达；(图6C)用抗CD3抗体刺激24小时的Jurkat WT细胞和TRAC KO细胞中的NFAT荧光素酶活性；(图6D)用SP34或OKT3抗体刺激24小时的经各种CFR工程改造的Jurkat-TRAC KO细胞中的NFAT荧光素酶活性。
图7A至图7B示出了由BiTE交联启动的CFR信号转导：(图7A)对BiTE在靶细胞上的结合以及将具有NFAT报告基因转基因的效应细胞的CFR用于NFAT-荧光素酶测定的说明；(图7B)表达CFR(3ε-28-3ε*单独或者与3γ-28-3γ*或3δ-28-3δ*组合)的Jurkat WT细胞和TRAC KO细胞中的NFAT荧光素酶活性。
图8A至图8C示出了CFR结构域的模块化性质：(图8A)具有可切换的胞外域和胞内域的CFR设计；(图8B和图8C)Jurkat TRAC KO细胞中的NFAT报告基因活性，这些JurkatTRAC KO细胞表达共享相同胞内域但具有不同胞外域的CFR，或者表达共享相同胞外域但具有不同胞内域的CFR。
图9A至图9B表明，在与Nalm6靶细胞以指定的E:T比例共培养过夜后，使用基于流动的测定，表达CFR的CAR-iT效应物改善了激动性抗体的细胞毒性：(图9A)在抗CD3的存在下，用3ε-28-3ε*与3δ-28-3δ*或3γ-28-3γ*的CFR转导的CAR-iT细胞中的细胞毒性测量；(图9B)在抗CD28的存在下，单独用28-28-28z的CFR转导的CAR-iT细胞中的细胞毒性测量。未转导的CAR-iT细胞被包括在内，以示出每个实验中的基线细胞毒性。
图10A至图10C表明，在pro-CAR-iT阶段表达CFR未损害CAR-iT分化和功能。图10A示出了具有选择性T细胞表面标记物的CFR+(3ε-28-3ε*)和CFR-(未转导的；UNTR)iT表型。xCELLligence测定结果表明，在E:T比例为3:1(图10B)或1:1(图10C)时，CFR+(3ε-28-3ε*)与CFR-(UNTR)iT针对抗原+靶细胞的CAR依赖性细胞溶解相当。
图11A至图11E示出了在从293个培养物收集的BiTE上清液的存在下，表达CFR的CAR-iT针对抗原-靶标具有改善的细胞毒性。图11A示出了将从293个培养物收集的BiTE上清液掺入到CAR-iT细胞中的示意图；
图11B和图11C示出了在E:T比例为3:1(图11B)或1:1(图11C)时，在具有或不具有BiTE上清液的情况下，CAR-iT针对抗原-靶标的CFR依赖性细胞溶解；在E:T比例为1:1时，在具有BiTE上清液的情况下，CFR+CAR-iT显示针对抗原+/抗原-混合靶标具有增强的细胞溶解(图11D)；并且图11E示出了混合的抗原+/抗原-靶细胞的测定结束表型。
图12A至图12B说明(图12A)：表达CFR的效应细胞和BiTE作为双重靶向和/或对抗肿瘤逃避的策略；并且(图12B)表达CFR的效应细胞或饲养细胞具有诱导性凋亡机制。
图13A至图13C表明，表达BiTE的CFR武装的T细胞表现出靶依赖性信号传导和激活。图13A示出了将表达BiTE和基于CD3的CFR的Jurkat TRAC KO细胞在有或和没有靶细胞的情况下培养24小时，并通过流式细胞术测试NFAT报告基因活性(图13B)和活化标记物表达(图13C)的示意图。
图14A至图14D表明，表达CFR/产生BiTE的CAR+iT细胞显示针对抗原-靶标具有改善的细胞毒性。图14A说明了通过将编码BiTE的多核苷酸引入CAR-iT细胞中的示例性BiTE自分泌模型；图14B示出了iT细胞中的CFR(对CD3e和mCherry染色)、BiTE(对Thy1.1染色)和CAR的表达；图14C示出了在E:T比例为3:1时，针对抗原-靶标的CFR依赖性BiTE诱导性细胞溶解；图14D表明，在E:T比例为1:1时且在具有自分泌的BiTE的情况下，CFR+/CAR+iT细胞针对抗原+/抗原-混合靶标具有增强的细胞溶解。
图15是由流式细胞术测定的端粒长度的图示，并且表明来自iPSC的成熟衍生NK细胞与成体外周血NK细胞相比维持更长的端粒。
图16A至图16C表明，具有细胞因子受体胞内域的CFR可在激动性抗体结合后传播信号传导。图16A示出了激动性抗CD28抗体与IL-2受体β胞内域结合并激活CFR，从而允许STAT5的信号转导和磷酸化的图示。图16B示出了流式细胞术数据，该流式细胞术数据显示基于CD28的CFR在TRAC KO Jurkat中的表达。图16C示出了在存在或不存在激动性抗体的情况下，未转导的或CFR转导的细胞中磷酸化的STAT5的基于流动的检测。
具体实施方式
iPSC(诱导性多能干细胞)的基因组修饰包括多核苷酸插入、缺失和取代。基因组工程改造的iPSC中的外源基因表达通常遇到问题，例如在初始基因组工程改造的iPSC长期克隆扩增之后、在细胞分化之后并且在来自衍生自基因组工程改造的iPSC的细胞的去分化细胞类型中基因沉默或基因表达减少。另一方面，直接工程改造例如T细胞或NK细胞的原代免疫细胞具有挑战性，并且对制备和递送用于过继性细胞疗法的工程改造的免疫细胞存在障碍。在一些实施方案中，本发明提供了用于将一种或多种外源基因(包括自杀基因和其它功能模式)稳定地整合到iPSC衍生细胞中的有效的、可靠的和针对性的方法，该一种或多种外源基因提供了与移植、运输、归巢、迁移、细胞毒性、活力、维持、扩增、寿命、自我更新、存留和/或存活有关的有所改善的治疗特性，这些iPSC衍生细胞包括但不限于HSC(造血干细胞和祖细胞)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T谱系细胞、NKT谱系细胞、NK谱系细胞和具有一种或多种功能特征的免疫效应细胞，这些功能特征不存在于原代NK细胞、T细胞和/或NKT细胞中。
定义
除非本文中另外定义，否则结合本申请使用的科学与技术术语将具有所属领域的技术人员通常了解的含义。另外，除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。
应理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可变化。本文所用的术语仅仅是出于描述特定实施方案的目的，并且并不意欲限制本发明的范围，本发明的范围只由权利要求书来界定。
如本文所用，冠词“一个”、“一种”和“该”在本文中是指一个或超过一个(即，至少一个)的该冠词的语法对象。例如，“一个要素”意指一个要素或多于一个要素。
替代方案(例如“或”)的使用应理解为意指替代方案中的任一个、两个或其任何组合。
术语“和/或”应理解为意指替代方案中的一者或两者。
如本文所用，术语“约”或“大约”是指与参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度相比，数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度变化多达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。在一个实施方案中，术语“约”或“大约”是指关于参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度，数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的范围。
如本文所使用，术语“实质上”或“基本上”是指数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度为参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度的约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高。在一个实施方案中，术语“基本上相同”或“实质上相同”是指与参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度大约相同的数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度的范围。
如本文所用，术语“实质上不含”与“基本上不含”可互换地使用，并且当用于描述组合物(例如细胞群或培养基)时，是指不含所指定物质或其来源的组合物，例如95％不含、96％不含、97％不含、98％不含、99％不含所指定物质或其来源，或检测不到，如通过常规方式所测量。术语组合物中“不含”或“基本上不含”某种成分或物质也意指(1)所述组合物中不包括任何浓度的这类成分或物质，或(2)所述组合物中包括功能上呈惰性、但呈低浓度的这类成分或物质。类似含义可以应用于术语“缺乏”，其是指组合物中物缺乏特定质或其来源。
在整个本说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包含(comprise/comprises/comprising)”应理解成暗指包括所陈述步骤或要素或一组步骤或要素，但不排除任何其它步骤或要素或一组步骤或要素。在特定实施方案中，术语“包括”、“具有”、“含有”和“包含”同义地使用。
“由……组成”意在包括并且限于短语“由……组成”之后的任何事物。因此，短语“由……组成”指示所列要素是需要或必需的，并且不能存在其它要素。
“基本上由……组成”打算包括短语后所列的任何要素，并且限于不干扰或影响本公开中指定的所列要素的活性或作用的其它要素。因此，短语“主要由……组成”指示所列要素是需要或必需的，但其它要素是任选的并且可视其是否影响所列要素的活性或作用而存在或不存在。
在整个本说明书中提及“一个实施方案”、“一实施方案”、“特定实施方案”、“相关实施方案”、“某个实施方案”、“附加实施方案”或“另外实施方案”或它们的组合意指结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括于本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个本说明书中的各处出现的前述短语不一定全部指代同一实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，特定特征、结构或特性可以任何合适方式组合。
术语“离体”一般是指在生物体外部发生的活动，例如在生物体外部的人工环境中，在活组织中或活组织上进行的实验或测量，优选地其中自然条件的变化最小。在特定实施方案中，“离体”程序涉及从生物体中获取活细胞或组织并且通常在无菌条件下在实验室设备中培养，并且通常培养几小时或长达约24小时，但包括长达48小时或72小时或更长，这视情况而定。在某些实施方案中，可以收集和冷冻这类组织或细胞，并且稍后解冻以便进行离体处理。使用活细胞或组织持续时间长于几天的组织培养实验或程序通常被视为“体外”，但在某些实施方案中，这个术语可以与离体互换使用。
术语“体内”一般是指在生物体内部进行的活动。
如本文所用，术语“重编程”或“去分化”或“提高细胞效能”或“提高发育效能”是指一种提高细胞效能或使细胞去分化成较低分化状态的方法。例如，具有提高的细胞效能的细胞具有与非重编程状态下相同细胞相比更大的发育可塑性(即，可分化成更多细胞类型)。换句话说，重编程细胞是与非重编程状态下相同细胞相比分化状态较低的细胞。
如本文所用，术语“分化”是未特化(“未专门化”)或弱特化细胞借以获得特化细胞(例如血细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化细胞或分化诱导性细胞是已处在细胞谱系内的更特化(“专门化”)位置的细胞。术语“专门化”在应用于分化过程时是指一种细胞，其在分化路径中已经行进到在正常情况下其将继续分化成特定细胞类型或细胞类型的亚群并且在正常情况下其不能分化成不同细胞类型或恢复为更弱分化细胞类型的时刻。如本文所用，术语“多能”是指细胞形成身体或胞体(即，胚胎本身)的所有谱系的能力。例如，胚胎干细胞是一种类型多能干细胞，其能够形成三种胚层：外胚层、中胚层和内胚层中的每一者的细胞。多能性是一种连续的发育效能，范围为不能产生完整生物体的不完全或部分多能细胞(例如外胚层干细胞或EpiSC)到能够产生完整生物体的更原始、更多能细胞(例如胚胎干细胞)。
如本文所用，术语“诱导性多能干细胞”或“iPSC”意指在体外使用重编程因子和/或小分子化学驱动方法由分化的成体、新生儿或胎儿细胞产生的干细胞，这些干细胞已被诱导或改变，即重编程为能够分化成所有三种胚层或真皮层：中胚层、内胚层和外胚层的组织的细胞。所产生的iPSC并非指如其在自然界中被发现的细胞。
如本文所用，术语“胚胎干细胞”是指胚胎囊胚的内部细胞团块中的天然存在的多能干细胞。胚胎干细胞是多能的并且在发育期间产生三种原代胚层：外胚层、内胚层和中胚层的所有衍生细胞。其对胚胎外膜或胎盘没有贡献，即，并非分化全能的。
如本文所用，术语“多潜能干细胞”是指具有分化成一种或多种胚层(外胚层、中胚层和内胚层)但非全部三种胚层的细胞的发育潜能的细胞。因此，多潜能细胞也可以称为“部分分化细胞”。多潜能细胞在所属领域中是众所周知的，并且多潜能细胞的示例包括成体干细胞，例如造血干细胞和神经干细胞。“多潜能”表示细胞可以形成指定谱系内的许多类型的细胞，而非其它谱系的细胞。例如，多潜能造血细胞能够形成许多不同类型的血细胞(红细胞、白细胞、血小板等)，但其不能形成神经元。因此，术语“多潜能性”是指一种细胞状态，其中发育潜能的程度低于分化全能和多能。
多能性可部分地通过评定细胞的多能性特性确定。多能性特性包括但不限于：(i)多能干细胞形态；(ii)无限自我更新的潜能；(iii)多能干细胞标记物的表达，该标记物包括但不限于SSEA1(仅小鼠)、SSEA3/4、SSEA5、TRA1-60/81、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/prominin、CD140a、CD56、CD73、CD90、CD105、OCT4、NANOG、SOX2、CD30和/或CD50；(iv)分化成所有三种体细胞谱系(外胚层、中胚层和内胚层)的能力；(v)由三种体细胞谱系组成的畸胎瘤形成；以及(vi)由来自三种体细胞谱系的细胞组成的类胚胎体的形成。
先前已描述两种类型的多能性：“激发”或“亚稳定”的多能性状态等效于后期囊胚的外胚层干细胞(EpiSC)，并且“初始”或“基础”的多能性状态等效于早期/植入前囊胚的内部细胞团块。尽管两种多能状态都展现如上所述的特性，但初始或基础状态进一步表现出：(i)雌性细胞中的X染色体的预先失活或再激活；(ii)在单细胞培养期间，克隆性和存活率改善；(iii)DNA甲基化总体减少；(iv)发育调控基因启动子上的H3K27me3抑制性染色质标记沉积减少；以及(v)相对于激发状态的多能细胞，分化标记物的表达减少。通常发现细胞重编程标准方法(其中将外源多能性基因引入体细胞中，表达，然后沉默或从所得多能细胞中去除)具有多能性激发状态的特性。在标准多能细胞培养条件下，除非维持外源转基因表达(其中观察到基础状态的特性)，否则此类细胞保持激发状态。
如本文所用，术语“多能干细胞形态”是指胚胎干细胞的经典形态特点。正常胚胎干细胞形态的特征是小圆形形状，细胞核与细胞质比例高，明显存在核仁，和典型的细胞间间距。
如本文所用，术语“受试者”是指任何动物，优选地是人类患者、牲畜或其它驯养动物。
“多能性因子”或“重编程因子”是指一种试剂，其能够单独或与其它试剂组合来增强细胞的发育效能。多能性因子包括但不限于能够提高细胞发育效能的多核苷酸、多肽和小分子。示例性多能性因子包括例如转录因子和小分子重编程剂。
“培养”或“细胞培养”是指细胞在体外环境中维持、生长和/或分化。“细胞培养基”、“培养基”(在各种情况下，为单数形式“培养基(medium)”)、“补充剂”和“培养基补充剂”是指培育细胞培养物的营养组合物。
“培育”或“维持”是指细胞在组织或身体外部(例如在无菌塑料(或经涂布的塑料)细胞培养皿或烧瓶中)维持、繁殖(生长)和/或分化。“培育”或“维持”可使用培养基作为有助于繁殖和/或维持细胞的营养、激素和/或其它因子来源。
如本文所用，术语“中胚层”是指三种胚层之一，其出现于早期胚胎发生期间并且产生各种特化细胞类型，包括循环系统、肌肉、心脏、真皮、骨骼和其它支持和结缔组织的血细胞。
如本文所用，术语“永久性生血内皮细胞”(HE)或“多能干细胞衍生永久性生血内皮细胞”(iHE)是指在称为内皮细胞向造血细胞转变的过程中产生造血干细胞和祖细胞的内皮细胞亚群。胚胎中的造血细胞发育依序进行：从侧板中胚层到成血管细胞到永久性生血内皮细胞和造血祖细胞。
术语“造血干细胞和祖细胞”、“造血干细胞”、“造血祖细胞”或“造血前驱细胞”是指向造血谱系专门化、但能够进一步向造血分化的细胞，并且包括多潜能造血干细胞(血胚细胞)、骨髓祖细胞、巨核细胞祖细胞、红细胞祖细胞和淋巴祖细胞。造血干细胞和祖细胞(HSC)是多潜能干细胞，其产生所有血细胞类型，包括骨髓(单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞)和淋巴谱系(T细胞、B细胞、NK细胞)。如本文所用，术语“永久性造血干细胞”是指CD34+造血细胞，其能够产生成熟骨髓细胞类型和淋巴细胞类型，包括T谱系细胞、NK谱系细胞和B谱系细胞。造血细胞还包括原始造血细胞的多种亚群，其产生原始红细胞、巨核细胞和巨噬细胞。
如本文所用，术语“T淋巴细胞”和“T细胞”可互换地使用并且是指白血细胞的主要类型，其在胸腺中完成成熟并且在免疫系统中具有多种作用，包括鉴别体内的特异性外来抗原以及以MHC I类受限方式使其它免疫细胞激活和去激活。T细胞可以是任何T细胞，诸如培养的T细胞，例如原代T细胞，或来自培养的T细胞系的T细胞，例如Jurkat、SupT1等，或从哺乳动物获得的T细胞。T细胞可以是CD3+细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞并且可处于任何发育阶段，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞(例如Th1和Th2细胞)、CD8+T细胞(例如细胞毒性T细胞)、外周血单核细胞(PBMC)、外周血白细胞(PBL)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、记忆T细胞、初始T细胞、调控T细胞、gamma delta T细胞(γδT细胞)等等。其它类型的辅助T细胞包括诸如Th3(Treg)、Th17、Th9或Tfh细胞的细胞。其它类型的记忆T细胞包括诸如中枢记忆T细胞(Tcm细胞)、效应记忆T细胞(Tem细胞和TEMRA细胞)的细胞。T细胞还可以指经基因工程改造的T细胞，诸如经修饰可表达T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。T细胞或T细胞样效应细胞还可由干细胞或祖细胞分化。T细胞样衍生效应细胞在一些方面可具有T细胞谱系，但同时具有一种或多种不存在于原代T细胞中的功能特征。
“CD4+T细胞”是指T细胞的亚群，其在其表面上表达CD4并且与细胞介导的免疫反应相关。其特征在于刺激后的分泌概况，其可能包括分泌细胞因子，例如IFN-γ、TNF-α、IL2、IL4和IL10。“CD4”是最初被定义为T淋巴细胞上的分化抗原，但也发现于包括单核细胞/巨噬细胞的其它细胞上的55-kD的糖蛋白。CD4抗原是免疫球蛋白超基因家族成员并且表明为主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex；MHC)II类限制的免疫反应中的相关识别元件。在T淋巴细胞上，其界定了辅助/诱导因子亚群。
“CD8+T细胞”是指T细胞的亚群，其在其表面上表达CD8，受限于MHC I类，并且充当细胞毒性T细胞。“CD8”分子是发现于胸腺细胞上和细胞毒性和抑制性T淋巴细胞上的分化抗原。CD8抗原是免疫球蛋白超基因家族成员并且主要组织相容性复合体I类限制的相互作用中的相关识别元件。
如本文所用，术语“NK细胞”或“自然杀伤细胞”是指外周血淋巴细胞的亚群，其根据CD56或CD16的表达和T细胞受体(CD3)的缺乏来定义。如本文所用，术语“适应性NK细胞”与“记忆NK细胞”可互换并且是指NK细胞的亚群，其表型为CD3-和CD56+，表达NKG2C和CD57和任选的CD16中的至少一者，但缺乏以下一者或多者的表达：PLZF、SYK、FceRγ和EAT-2。在一些实施方案中，分离的CD56+NK细胞亚群包含CD16、NKG2C、CD57、NKG2D、NCR配体、NKp30、NKp40、NKp46、激活的和抑制性KIR、NKG2A和/或DNAM-1的表达。CD56+可以是较弱或较强的表达。NK细胞或NK细胞样效应细胞可以由干细胞或祖细胞分化。NK细胞样衍生效应细胞在一些方面可具有NK细胞谱系，但同时具有一种或多种不存在于原代NK细胞中的功能特征。
如本文所用，术语“NKT细胞”或“自然杀伤T细胞”是指受限于CD1d的T细胞，其表达T细胞受体(TCR)。不同于常规T细胞检测由常规主要组织相容性(MHC)分子呈递的肽抗原，NKT细胞识别由CD1d(一种非经典MHC分子)呈递的脂质抗原。识别两种类型的NKT细胞。恒定型或I型NKT细胞表达非常有限的TCR谱系：典型α链(人类中为Vα24-Jα18)与有限光谱的β链(人类中为Vβ11)的结合。第二个NKT细胞群，称为非经典或非恒定II型NKT细胞，显示更不均匀的TCRαβ利用率。I型NKT细胞被认为适于免疫疗法。适应性或恒定(I型)NKT细胞可以根据以下标记物中的至少一种或多种的表达来鉴别：TCR Va24-Ja18、Vb11、CD1d、CD3、CD4、CD8、αGalCer、CD161和CD56。
如本文所用，术语“分离”等是指一种细胞或细胞群，其已与其初始环境中分离，即，分离细胞的环境实质上不含如存在“未分离”参考细胞的环境中所发现的至少一种组分。该术语包括从一些或所有组分去除的细胞，因为该细胞存在于其自然环境中，例如分离自组织或活检样品。该术语还包括从至少一种、一些或所有组分中去除的细胞，因为该细胞存在于非天然存在的环境中，例如分离自细胞培养物或细胞悬浮液。因此，所分离的细胞部分地或完全地与至少一种组分(包括其它物质、细胞或细胞群)分离，因为该细胞存在于自然界中或者因为该细胞是在非天然存在的环境中生长、储存或生存的。分离细胞的特定示例包括部分纯细胞组合物、实质上纯细胞组合物和非天然存在的培养基中培养的细胞。分离细胞可以通过将所期望的细胞或其群与环境中的其它物质或细胞分离或通过从环境中去除一个或多个其它细胞群或亚群来获得。
如本文所用，术语“纯化”等是指提高的纯度。例如，纯度可以提高到至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。
如本文所用，术语“编码”是指多核苷酸中的核苷酸的特异性序列(例如基因、cDNA或mRNA)的固有特性，以充当生物过程中合成其它聚合物和大分子的模板，所述其它聚合物和大分子具有定义的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或定义的氨基酸序列和由其获得的生物特性。因此，如果与一种基因对应的mRNA的转录和转译在细胞或其它生物系统中产生一种蛋白质，那么该基因编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列一致并且通常提供于序列表中)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)两者都可以称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其它产物。
“构建体”是指包含待体外或体内传递给宿主细胞中的多核苷酸的大分子或分子复合体。如本文所用，“载体”是指能够引导外来遗传物质递送或转移到靶细胞的任何核酸构建体，在靶细胞中，所述核酸构建体能够复制和/或表达。如本文所用，术语“载体”包括待递送的构建体。载体可以是线性或环形分子。载体可以是整合或非整合载体。载体的主要类型包括但不限于质粒、游离型载体、病毒载体、粘粒和人工染色体。病毒载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体(Sendai virusvector)等。
所谓“整合”意指构建体的一个或多个核苷酸稳定插入细胞基因组中，即，共价连接至细胞染色体DNA内的核酸序列。“靶向整合”意指构建体的核苷酸在预选位点或“整合位点”插入细胞染色体或线粒体DNA中。如本文所用，术语“整合”进一步是指一种过程，其涉及在内源序列或核苷酸缺失或不缺失的情况下在整合位点插入构建体的一个或多个外源序列或核苷酸。在插入位点存在缺失的情况下，“整合”还可包含用一个或多个所插入核苷酸置换缺失的内源序列或核苷酸。
如本文所用，术语“外源”旨在意指参考分子或参考活性引入宿主细胞中，或对于宿主细胞是非原生的。所述分子可以通过例如将编码核酸引入宿主遗传物质中来引入，例如整合于宿主染色体中，或作为非染色体遗传物质，例如质粒。因此，该术语当关于编码核酸的表达使用时是指编码核酸以可表达形式引入细胞中。术语“内源”是指存在于宿主细胞中的参考分子或活性。类似地，该术语当关于编码核酸的表达使用时，是指细胞内所含而非外源引入的编码核酸的表达。
如本文所用，“所关注基因”或“所关注多核苷酸序列”是当放置在适当调控序列的控制下时体内转录成RNA并且在一些情况下转译成多肽的DNA序列。所关注基因或多核苷酸可以包括但不限于原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列和合成DNA序列。例如，所关注基因可以编码miRNA、shRNA、原生多肽(即，自然界中发现的多肽)或它们的片段；变体多肽(即，与原生多肽具有小于100％的序列同一性的原生多肽的突变体)或其片段；工程改造的多肽或肽片段、治疗肽或多肽、成像标记物、可选标记物等。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指具有任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的聚合物形式或其类似物。多核苷酸序列由四个核苷酸碱基构成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；以及尿嘧啶(U)(当多核苷酸是RNA时，尿嘧啶代替胸腺嘧啶)。多核苷酸可以包括基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸还指双链和单链分子。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换地使用并且是指氨基酸残基通过肽键共价连接的分子。多肽必须含有至少两个氨基酸，并且多肽的氨基酸最大数目不受限制。如本文所用，该术语是指短链(在所属领域中通常也称为例如肽、寡肽和寡聚物)和较长链(在所属领域中通常称为多肽或蛋白质)。“多肽”包括例如生物活性片段、实质上同源多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽变体、经过修饰的多肽、衍生物、类似物和融合蛋白等等。这些多肽包括自然多肽、重组多肽、合成多肽或它们的组合。
如本文所用，术语“亚基”是指蛋白质复合体的每条单独的多肽链，其中每条单独的多肽链可由自身形成稳定的折叠结构。许多蛋白质分子由多于一个亚基构成，其中氨基酸序列对于每个亚基可以是一致的，或相似的，或完全不同的。例如，CD3复合体由CD3α、CD3ε、CD3δ、CD3γ和CD3ζ亚基构成，其形成CD3ε/CD3γ、CD3ε/CD3δ和CD3ζ/CD3ζ二聚体。在单个亚基内，多肽链的连续部分经常折叠成紧凑的、局部的、半独立的单元，称为“结构域”。许多蛋白质结构域还可包含独立的“结构亚基”，也称为亚结构域，该亚结构域有助于结构域的共同功能。因此，如本文所用，术语“亚结构域”是指较大结构域内的蛋白质结构域，例如，细胞表面受体的胞外域内的结合域；或者细胞表面受体的胞内域的刺激域或信号传导域。
“可操作地连接(Operably linked/operatively linked与operably connected/operatively connected可互换使用)”与是指单一核酸片段上的核酸序列的缔合，以使得一者的功能或操作受另一者影响。例如，当启动子能够影响编码序列或功能性RNA表达(即，该编码序列或功能性RNA处于启动子的转录控制下)时，该启动子与该编码序列或功能性RNA进行可操作地连接。编码序列可按照有义或反义定向可操作地连接到调控序列。
如本文所用，“融合蛋白”或“嵌合蛋白”是通过基因工程改造产生的蛋白，用于连接编码单独蛋白的两个或更多个部分或全部多核苷酸编码序列，并且这些连接的多核苷酸的表达产生具有衍生自原始蛋白或其片段中的每一者的功能特性的单个肽或多个多肽。在融合蛋白中不同来源的两个相邻多肽之间，可添加接头(或间隔区)肽。本文所述的嵌合融合受体(CFR)是融合蛋白或嵌合蛋白。
如本文所用，术语“遗传印记”是指对源细胞或iPSC的优选治疗属性有贡献的遗传或表观遗传信息，并且能保留于源细胞衍生iPSC和/或iPSC衍生造血谱系细胞中。如本文所用，“源细胞”是一种可以用于通过重编程来产生iPSC的非多能细胞，并且源细胞衍生iPSC可以进一步分化成特定细胞类型，包括任何造血谱系细胞。根据上下文，源细胞衍生的iPSC和由其分化的细胞有时统称为“衍生(derived或derivative)细胞”。例如，如在整个本申请中所使用，衍生效应细胞或衍生NK谱系细胞或衍生T谱系细胞与从自然/原生来源(诸如外周血、脐带血或其它供体组织)获得的其对应原代细胞相比是由iPSC分化的细胞。如本文所用，赋予优选治疗属性的遗传印记是通过使对供体、疾病或治疗反应具有特异性的所选源细胞进行重编程或通过使用基因组编辑将经基因修饰的模式引入iPSC而被并入iPSC中。在从特别选择的供体、疾病或治疗背景获得的源细胞的方面，对优选治疗属性有贡献的遗传印记可包括任何背景特异性基因或表观基因修饰，这些表观基因修饰表现出可保留的表型，即优选的治疗属性，该表型被传递给所选源细胞的iPSC衍生的细胞，无论潜在分子事件是否得到鉴别。对供体、疾病或治疗反应具有特异性的源细胞可包含可保留在iPSC和衍生造血谱系细胞中的遗传印记，这些遗传印记包括但不限于预排列的单特异性TCR，例如来自病毒特异性T细胞或恒定型自然杀伤T(iNKT)细胞；可跟踪和期望的遗传多态性，例如对编码所选供体中的高亲和力CD16受体的点突变来说为同型；和预定的HLA需求，即，所选的HLA匹配供体细胞随着群增大而表现出单倍型。如本文所用，优选治疗属性包括衍生细胞的移植、运输、归巢、活力、自更新、存留、免疫反应调控和调节、存活和细胞毒性改善。优先治疗属性还可涉及抗原靶向受体表达；HLA呈递或其缺乏；对肿瘤微环境的抗性；旁邻免疫细胞的诱导和免疫调节；随着肿瘤外效应降低，靶上特异性改善；以及/或者对诸如化学疗法等治疗的抗性。
如本文所用，术语“增强的治疗特性”是指细胞的治疗特性与相同一般细胞类型的典型免疫细胞相比增强。例如，与典型的、未修饰的和/或天然存在的NK细胞相比，具有“增强的治疗特性”的NK细胞将具有增强、改善和/或强化的治疗特性。免疫细胞的治疗特性可以包括但不限于细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留、免疫反应调控和调节、存活和细胞毒性。免疫细胞的治疗特性也通过以下来体现：抗原靶向受体表达；HLA呈递或其缺乏；对肿瘤微环境的抗性；旁邻免疫细胞的诱导和免疫调节；随着肿瘤外效应降低，靶上特异性改善；以及/或者对诸如化学疗法等治疗的抗性。
如本文所用，术语“衔接子”是指分子，例如融合多肽，其能够使免疫细胞(例如T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞)与肿瘤细胞之间形成连接；并且激活免疫细胞。衔接子的示例包括但不限于双特异性T细胞衔接子(BiTE)、双特异性杀伤细胞衔接子(BiKE)、三特异性杀伤细胞衔接子(TriKE)或多特异性杀伤细胞衔接子，以及与多种免疫细胞类型相容的通用衔接子。
如本文所用，术语“表面触发受体”是指一种能够触发或启动免疫反应(例如，细胞毒性反应)的受体。表面触发受体可加以工程改造，并且可在效应细胞(例如T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞)上表达。在一些实施方案中，在不依赖于效应细胞的自然受体和细胞类型的情况下，表面触发受体促进效应细胞与特定靶细胞(例如肿瘤细胞)之间发生双特异性或多特异性抗体接合。使用这种方法，可以产生包含通用表面触发受体的iPSC，并且然后使这类iPSC分化成表达通用表面触发受体的各种效应细胞类型的群。“通用”意指表面触发受体可表达于任何效应细胞中并且激活任何效应细胞(无论细胞类型如何)，并且表达通用受体的所有效应细胞都可与表面触发受体可识别的衔接子偶联或连接(不考虑衔接子的肿瘤结合特异性)。在一些实施方案中，具有相同肿瘤靶向特异性的衔接子用于与通用表面触发受体偶联。在一些实施方案中，具有不同肿瘤靶向特异性的衔接子用于与通用表面触发受体偶联。因此，可使一种或多种效应细胞类型接合，从而在一些情况下杀死一种特定类型的肿瘤细胞，并且在一些其它情况下杀死两种或更多种类型的肿瘤。表面触发受体通常包含用于效应细胞活化的共刺激域和对衔接子的表位结合区域具有特异性的表位。双特异性衔接子对位于一端的表面触发受体的表位具有特异性，并且对位于另一端的肿瘤抗原具有特异性。
如本文所用，术语“安全开关蛋白质”是指一种工程改造的蛋白质，其经设计以防止细胞疗法的潜在毒性或以其它方式防止副作用。在一些情况下，安全开关蛋白质表达受到有条件的控制，以解决所移植的工程改造的细胞的安全问题，该细胞已经将编码安全开关蛋白质的基因永久性地并入其基因组中。这种条件性调控可以是可变的并且可能包括通过小分子介导的转译后激活和组织特异性和/或时间转录调控来进行控制。安全开关可介导对凋亡的诱导、对蛋白合成或DNA复制的抑制、生长阻滞、转录和转录后遗传调节和/或抗体介导的耗竭。在一些情况下，安全开关蛋白由外源分子例如前药活化，该外源分子在被活化时触发了治疗细胞的凋亡和/或细胞死亡。安全开关蛋白的示例包括但不限于自杀基因，诸如胱天蛋白酶9(或胱天蛋白酶3或7)、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、B细胞CD20、经修饰的EGFR以及它们的任何组合。在这种策略中，在发生不良事件时施用的前药由自杀基因产物激活并且杀死转导的细胞。
如本文所用，术语“医药学活性蛋白质或肽”是指能够对生物体实现生物学和/或医药作用的蛋白质或肽。医药学活性蛋白质具有针对疾病的治愈性或姑息性特性，并且可被施用以改善、缓解、减缓、逆转或减轻疾病严重程度。医药学活性蛋白质还具有预防特性并且用于防止疾病发作或减轻这类疾病或病理病况在其显现时的严重强度。医药学活性蛋白质包括完整蛋白质或肽或其医药学活性片段。其还包括所述蛋白质或肽的医药学活性类似物或所述蛋白质或肽的片段的类似物。术语医药学活性蛋白质还指以协作或协同方式发挥作用以提供治疗效益的多种蛋白质或肽。医药学活性蛋白质或肽的示例包括但不限于受体、结合性蛋白、转录和转译因子、肿瘤生长抑制蛋白质、抗体或其片段、生长因子和/或细胞因子。
如本文所用，术语“信号传导分子”是指调节、参与、抑制、激活、减少或增加细胞信号转导的任何分子。“信号转导”是指分子信号以化学修饰形式传递，其通过沿着最终触发细胞中的生物化学事件的路径募集蛋白质复合体来实现。信号转导路径在所属领域中是众所周知的，并且包括但不限于G蛋白偶联受体信号传导、酪氨酸激酶受体信号传导、整合素信号传导、TG点信号传导、配体门控离子通道信号传导、ERK/MAPK信号传导路径、Wnt信号传导路径、cAMP依赖性路径和IP3/DAG信号传导路径。
如本文所用，术语“靶向模式”是指分子(例如，多肽)以遗传方式并入细胞中以促进抗原和/或表位特异性，其包括但不限于i)抗原特异性(当其涉及独特嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)时)；ii)衔接子特异性(当其涉及单克隆抗体或双特异性衔接子时)；iii)靶向转化细胞；iv)靶向癌症干细胞，和v)在不存在特异性抗原或表面分子的情况下的其它靶向策略。
如本文所用，与非特异性或非选择性结合相比，术语“特异性(specific/specificity)”可以用于指分子(例如，受体或衔接子)能够选择性地结合到靶分子。
如本文所用，术语“过继性细胞疗法”是指一种基于细胞的免疫疗法，如本文所用，其是指自体或同种异体淋巴细胞的输注，这些淋巴细胞经鉴别为经遗传修饰或未经遗传修饰的T细胞或B细胞，其在所述输注之前已离体扩增。
如本文所用，“治疗上足够的量”在其含义内包含无毒但足够和/或有效量的其所指代的用于提供期望的治疗效果的特定治疗和/或药物组合物。所需精确量将随各受试者而变化，这取决于例如患者总体健康状况、患者年龄和病况分期和严重强度等因素。在特定实施方案中，治疗上足够的量足以和/或有效地使与所治疗的受试者的疾病或病况相关的至少一种症状改善、减少和/或好转。
多能干细胞的分化需要改变培养系统，例如改变培养基中的刺激剂或细胞的物理状态。大部分常规策略是使用类胚胎体(EB)的形成作为启动谱系特异性分化的共同和关键中间步骤。“类胚胎体”是三维团簇，其已表明可模拟胚胎发育，因为其在其三维区域内产生多种谱系。通过分化过程，通常为几小时到几天，简单的EB(例如，经过诱发可分化的聚集多能干细胞)继续成熟并且发育成囊性EB，此时，通常进一步将其处理数日到几周以继续分化。EB形成是通过使多能干细胞彼此紧密接近地形成三维多层细胞团簇来启动，这通常是通过若干种方法之一来实现，所述方法包括允许多能细胞在液滴中沉降、使细胞在“U”形底孔板中沉降或通过机械搅拌。为了促进EB发育，多能干细胞聚集体需要进一步分化提示，原因是多能培养维持性培养基中所维持的聚集体不形成适当EB。因此，多能干细胞聚集体需要转移到分化培养基中，该分化培养基向所选谱系提供诱发提示。通过在EB细胞团簇内适度增殖，多能干细胞的基于EB的培养通常引起分化细胞群(外胚层、中胚层和内胚层胚层)产生。虽然经证实可促进细胞分化，然而，EB产生了分化状态可变的异质细胞，原因是三维结构中的细胞不一致地暴露于来自环境的分化提示。另外，EB的形成和维持是费力的。此外，通过EB形成进行的细胞分化伴随适度细胞扩增，这还导致分化效率降低。
相比之下，与“EB形成”不同的“聚集体形成”可以用于扩增多能干细胞衍生细胞群。例如，在基于聚集体的多能干细胞扩增期间，选择可维持增殖和多能性的培养基。细胞增殖通常增加聚集体的尺寸，从而形成更大聚集体，并且这些聚集体可用常规的机械或酶方式解离成更小聚集体，从而维持培养物内的细胞增殖以及增加细胞数目。与EB培养不同，在维持培养物的聚集体内培养的细胞维持多能性标记物。多能干细胞聚集体需要进一步分化提示来诱导分化。
如本文所用，“单层分化”是关于分化方法的术语，其不同于通过三维多层细胞团簇进行的分化，即，“EB形成”。除了本文公开的其它优点之外，单层分化避免了分化启动时需要的EB形成。由于单层培养不模拟胚胎发育，诸如EB形成，因此相较于EB中的所有三种胚层分化，向特定谱系的分化被认为是最少的。
如本文所用，“解离”细胞是指已实质上与其它细胞或表面(例如，培养板表面)分离或纯化的细胞。例如，细胞可通过机械或酶方法从动物或组织中解离。可替代地，在体外聚集的细胞可彼此解离，诸如酶促地或机械地解离成簇、单细胞或单细胞和簇的混合物的悬浮液。在又一个替代实施方案中，粘着细胞从培养板或其它表面解离。因此，解离可能涉及破坏与胞外基质(ECM)和衬底(例如培养表面)的细胞相互作用，或破坏细胞之间的ECM。
如本文所用，“饲养细胞”或“饲养层”是描述与第二类型的细胞共培养以提供第二类型的细胞可在其中生长、扩增或分化的环境的一种类型的细胞的术语，因为饲养细胞为支持第二细胞类型提供刺激、生长因子和营养。饲养细胞任选地来自与其支持的细胞不同的物种。例如，某些类型的人类细胞，包括干细胞，可以由小鼠胚胎成纤维细胞或永生化小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养物支持。在另一个示例中，外周血衍生细胞或转化的白血病细胞支持自然杀伤细胞的扩增和成熟。饲养细胞在与其它细胞共培养时，可通常通过照射或用拮抗性有丝分裂剂(诸如丝裂霉素)处理使其失活，以防止其生长超出其支持的细胞。饲养细胞可以包括内皮细胞、基质细胞(例如上皮细胞或成纤维细胞)和白血病细胞。不限于前述，一种特定的饲养细胞类型可以是人类饲养层，例如人类皮肤成纤维细胞。另一饲养细胞类型可以是小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。一般来说，多种饲养细胞可部分地用于维持多能性、朝向某一谱系的定向分化，增强增殖能力并且促进向特化细胞类型(例如效应细胞)的成熟。
如本文所用，“无饲养层”(FF)环境是指一种环境，例如培养条件、细胞培养物或培养基，其基本上不含饲养层或基质细胞，和/或尚未通过培育饲养细胞加以预调节。“预调节”培养基是指饲养细胞在培养基内已培育一定时段(例如至少一天)之后所收集的培养基。预调节培养基含有多种介体物质，包括在培养基中培育的饲养细胞所分泌的生长因子和细胞因子。在一些实施方案中，无饲料环境不含饲养层或基质细胞，并且也不通过培育饲养细胞进行预调节。
如在iPSC和由其分化的衍生非多能细胞的基因组编辑或修饰或非多能细胞和由其重编程的衍生iPSC的基因组编辑或修饰的上下文中所用的“功能”是指(1)在基因层面—成功的敲入、敲除、降低基因表达、转基因或受控基因表达，诸如期望的细胞发育阶段处的诱导性或暂时表达，这通过直接的基因组编辑或修饰或通过“传递”，经由最初进行基因组工程改造的起始细胞的分化或重编程来实现；或者(2)在细胞层面—成功的去除、添加或改变细胞功能/特性，这经由以下实现：(i)在所述细胞中通过直接基因组编辑而获得的基因表达修饰，(ii)在所述细胞中通过“传递”，经由从最初进行基因组工程改造的起始细胞的分化或重编程而维持的基因表达修饰；(iii)在所述细胞中作为基因表达修饰的结果的下游基因调控，该基因表达修饰仅出现于所述细胞的较早发育阶段或仅出现于经由分化或重编程而产生所述细胞的起始细胞中；或者(iv)成熟细胞产物内所呈现的增强的或新获得的细胞功能或属性，该成熟细胞产物最初来源于在iPSC、祖细胞或去分化细胞来源处进行的基因组编辑或修饰。
“HLA缺乏”，包括HLA-I类缺乏，HLA-II类缺乏，或两者，是指缺乏或不再维持包含HLA I类蛋白质异源二聚体和/或HLA II类异源二聚体的完整MHC复合体的表面表达或该表面表达的水平降低，使得减弱或降低的水平低于被其它细胞天然可检测到的或被合成方法可检测到的水平。
如本文所用，“经修饰的HLA缺乏的iPSC”是指HLA缺乏的iPSC，其另外通过引入基因表达蛋白质而被修饰，该蛋白质与以下有关但不限于：改善的分化潜能、抗原靶向、抗原呈递、抗体识别、存留、免疫逃避、抑制抗性、增殖、共刺激、细胞因子刺激、细胞因子产生(自分泌或旁分泌)、趋化性和细胞毒性，诸如非经典HLA I类蛋白质(例如HLA-E和HLA-G)、嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、CD16 Fc受体、BCL11b、NOTCH、RUNX1、IL15、4-1BB、DAP10、DAP12、CD24、CD3ζ、4-1BBL、CD47、CD113和PDL1。“经修饰的HLA缺乏的”细胞还包括除iPSC之外的细胞。
术语“配体”是指与靶分子形成复合体以通过与该靶上的位点结合产生信号的物质。配体可以是能够与靶特异性结合的天然或人工物质。配体可以是蛋白质、肽、抗体、抗体复合体、缀合物、核酸、脂质、多糖、单糖、小分子、纳米颗粒、离子、神经递质或任何能够与靶特异性结合的其它分子实体的形式。与配体结合的靶可以是蛋白质、核酸、抗原、受体、蛋白质复合体或细胞。与靶结合并改变靶的功能从而触发应答的配体被称为“激动性”或“激动剂”。与靶结合但无法产生应答的配体被称为“拮抗性”或“拮抗剂”。
术语“抗体”在本文中以最广义使用，并且通常是指含有与特定的所关注靶特异性结合的至少一个结合位点的分子，其中该靶可以是抗原或能够与某些抗体相互作用的受体。例如，NK细胞可通过抗体或抗体的Fc区与其Fc-γ受体(FcγR)的结合而被活化，从而触发ADCC(抗体依赖性细胞毒性)介导的效应细胞活化。与抗体结合的抗原或受体或靶的特定片段或部分通常被称为表位或抗原决定簇。术语“抗体”包括但不限于原生抗体及其变体、原生抗体及其变体的片段、肽体及其变体，以及模拟抗体或其特定片段或部分(包括单链抗体及其片段)的结构和/或功能的抗体模拟物。抗体可以是鼠抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼IgG、单可变新抗原受体(VNAR)、鲨鱼重链抗体(Ig-NAR)、嵌合抗体、重组抗体、单域抗体(dAb)、抗独特型抗体、双特异性抗体、多特异性抗体或多聚体抗体，或它们的抗体片段。抗独特型抗体对与另一种抗体的独特型结合具有特异性，其中该独特型是抗体的抗原决定簇。双特异性抗体可以是BiTE(双特异性T细胞衔接子)或BiKE(双特异性杀伤细胞衔接子)，多特异性抗体可以是TriKE(三特异性杀伤细胞衔接子)。抗体片段的非限制性示例包括Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab')3、Fv、Fabc、pFc、Fd、单链可变区片段(scFv)、串联scFv(scFv)2、单链Fab(scFab)、二硫键稳定的Fv(dsFv)、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、单域抗原结合性片段(sdAb)、骆驼重链IgG和片段、只有重链的重组抗体(VHH)和维持抗体的结合特异性的其它抗体片段。
“Fc受体”(缩写为“FcR”)是基于其识别的抗体类型而分类的。例如，结合最常见类别的抗体(IgG)的受体称为Fc-γ受体(FcγR)，结合IgA的受体称为Fc-α受体(FcαR)，并且结合IgE的受体称为Fc-ε受体(FcεR)。FcR的类别还通过表达其(巨噬细胞、粒细胞、自然杀伤细胞、T细胞和B细胞)的细胞和每种受体的信号传导特性来区分。Fc-γ受体(FcγR)包括若干成员：FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)，这些成员因其分子结构不同而对其抗体具有不同亲和力。
FcγR受体CD16已鉴别为具有两种异构体：Fc受体FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb(CD16b)。CD16a是由NK细胞表达的跨膜蛋白，其结合单体IgG以活化NK细胞并促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。如本文所用，“高亲和力CD16”、“不可裂解的CD16”或“不可裂解的高亲和力CD16(hnCD16)”是指天然或非天然的CD16变体。野生型CD16具有低亲和力并且经历胞外域脱落，这是一种蛋白水解裂解过程，该过程在NK细胞活化后调控白细胞上的多种细胞表面分子的细胞表面密度。F176V和F158V是具有高亲和力的示例性CD16多态变体。在接近膜的区域(位置189-212)中改变或消除裂解位点(位置195-198)的CD16变体不经历脱落。裂解位点和接近膜的区域被详细地描述于国际公布号WO 2015/148926中，该文献的完整公开内容以引用方式并入本文中。CD16S197P变体是工程改造的CD16的不可裂解型式。包含F158V和S197P的CD16变体具有高亲和力，并且不可裂解。另一示例性高亲和力和不可裂解的CD16(hnCD16)变体是包含源自CD64胞外域的3个外显子中的一个或多个的胞外域的工程改造的CD16。
“嵌合Fc受体”(缩写为“CFcR”)是指其原生跨膜域和/或胞内信号传导域被非原生跨膜域和/或胞内信号传导域修饰或置换的工程改造的Fc受体。在嵌合Fc受体的一些实施方案中，除了使跨膜域和信号传导域中的一者或两者变为非原生之外，还可将一种或多种刺激域引入工程改造的Fc受体的胞内部分中，以在触发受体后增强细胞激活、扩增和功能。不同于含有抗原结合域以靶向抗原的嵌合抗原受体(CAR)，嵌合Fc受体与Fc片段、或抗体的Fc区、或包含在衔接子或配体或结合分子中的Fc区结合，并在有或没有使所靶向的细胞靠近附近的情况下激活细胞功能。例如，Fcγ受体(FcγR)可经工程改造以将所选跨膜域、刺激域和/或信号传导域包含在对在胞外域处结合IgG有反应的胞内区域中，从而产生CFcR。在一个示例中，CFcR由工程改造的CD16、Fcγ受体通过置换其跨膜域和/或胞内域来产生。为了进一步提高基于CD16的CFcR的结合性亲和力，可合并CD64或CD16的高亲和力变体(例如F176V)的胞外域。在其中涉及高亲和力CD16胞外域的CFcR的一些实施方案中，位置197处包含丝氨酸的蛋白水解裂解位点被消除或置换，使得受体的胞外域不可裂解，即不经历脱落，从而获得基于hnCD16的CFcR。
I.适用于具有增强特性的过继性细胞疗法的细胞和组合物
本文提供一种策略，该策略系统地工程改造克隆iPSC的调控回路，并且不影响iPSC的分化效能以及iPSC及其衍生细胞的细胞发育生物学，同时增强从iPSC分化的衍生细胞的治疗特性。在一些实施方案中，在iPSC水平上通过基因组工程改造将选择性模式组合引入iPSC衍生细胞之后，这些细胞在功能上得到改善，并且适于过继性细胞疗法。尚不清楚的是，包含一种或多种所提供的基因编辑的改变的iPSC是否仍具有介入细胞发育的能力和/或在保留调节活性的同时使功能分化细胞成熟和产生的能力。从iPSC定向细胞分化期间的意外失败归因于包括但不限于以下方面：发育阶段特定的基因表达或缺乏基因表达、HLA复合体呈递的需求、所引入表面表达模式的蛋白质脱落，以及实现细胞中表型和/或功能变化的分化方案重配置的需要。如所证明的，如本文所提供的所选基因组修饰不会对iPSC分化效能产生负面影响，并且衍生自工程改造的iPSC的功能性效应细胞具有增强的和/或获得的治疗特性，这归因于在iPSC分化之后保留在效应细胞中的单独的或组合的基因组修饰。
1.细胞表面CFR(嵌合融合受体)
本文提供的CFR的设计使得效应细胞能够通过CFR与所选激动剂的结合而启动适当的信号转导级联，以增强表达CFR的效应细胞的治疗特性。此类增强的效应细胞治疗特性包括但不限于：增强的激活和细胞毒性，获得的双重靶向能力，延长的持久性，改善的运输和肿瘤渗透，增强的将旁邻免疫细胞引发、激活或募集到肿瘤部位的能力，增强的抗免疫抑制能力，提高的挽救肿瘤抗原逃逸能力，以及/或者控制的细胞信号传导反馈、代谢和凋亡。
因此，在多个方面，本发明提供了一种包含胞外域、跨膜域和胞内域的CFR，其中该胞外域、该跨膜域和该胞内域不包含任何内质网(ER)滞留信号或胞吞信号。CFR的胞外域用于在与衔接子结合后启动信号转导；跨膜域用于CFR的膜锚定；并且胞内域包含至少一个信号传导域，该至少一个信号传导域调节(即，激活或失活)选择用于增强细胞治疗特性的信号传导路径，这些细胞治疗特性包括但不限于肿瘤杀伤、存留、迁移、分化、TME抵消和/或控制凋亡。当表达时，从CFR消除ER滞留信号允许CFR通过自身进行细胞表面呈递，并且从CFR消除胞吞信号减少了CFR内化和表面下调。重要的是，选择既不具有ER滞留信号也不具有胞吞信号的结构域组分，或者使用分子工程改造工具从CFR的所选组分中去除ER滞留信号或胞吞信号。此外，如本文一些实施方案提供的CFR的结构域是模块化的，这意味着对于CFR的给定胞内域，CFR的胞外域是可切换的，这取决于待与所述CFR一起使用的所选激动剂(诸如抗体、BiTE、TriKE或任何其它类型的衔接子)的结合特异性；并且对于给定的胞外域和特异性匹配的激动剂，胞内域是可切换的，这取决于待激活的期望信号传导路径。另外，根据一些实施方案的跨膜域对于给定的胞外域和/或给定的胞内域是可切换的，只要该跨膜域不包含任何内质网(ER)滞留信号或胞吞信号。
在一些实施方案中，本文所述的CFR的胞外域包含参与细胞-细胞信号传导或相互作用的蛋白质的全部或部分长度的胞外部分。在一些实施方案中，CFR的胞外域包含CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD28、CD5、CD16、CD64、CD32、CD33、CD89、NKG2C、NKG2D或它们的任何功能性变体或组合和嵌合的全部或部分长度的胞外部分。在一些实施方案中，CFR的胞外域被至少一种激动剂例如抗体或衔接子(例如BiTE、BiKE或TriKE)识别，该至少一种激动剂包含结合域，该结合域对包含在所述CFR的胞外域中的表位具有特异性。在一些实施方案中，待与表达CFR的细胞一起使用的抗体或衔接子结合到所述CFR的至少一个胞外表位，其中CFR包含CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD28、CD5、CD16、CD64、CD32、CD33、CD89、NKG2C、NKG2D或它们的任何功能性变体或组合/嵌合形式的全部或部分长度的胞外部分。在一些实施方案中，衔接子识别包括以下的至少一种肿瘤抗原：B7H3、BCMA、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、PSMA、PAMA、P-钙粘素和ROR1。在CFR胞外域的特定实施方案中，不存在ER滞留信号和胞吞信号两者，或使用基因工程改造方法从CFR胞外域去除或消除这些ER滞留信号和胞吞信号。
在一些实施方案中，CFR的胞外域包含CD3ε、CD3γ、CD3δ或它们的任何功能性变体或组合/嵌合形式的全部或部分长度的胞外部分，以利用基于CD3的激动剂。非限制性的基于CD3的示例性激动剂包括但不限于抗体或衔接子，这些抗体或衔接子包括CD3×CD19、CD3×CD20、CD3×CD33、博纳吐单抗、卡妥索单抗、厄妥索单抗、RO6958688、AFM11、MT110/AMG110、MT111/AMG211/MEDI-565、AMG330、MT112/BAY2010112、MOR209/ES414、MGD006/S80880、MGD007和/或FBTA05。在一些实施方案中，CFR的胞外域包含NKG2C或其任何功能性变体的全部或部分长度的胞外部分，以利用基于NKG2C的激动剂。非限制性的基于NKG2C的示例性激动剂包括但不限于抗体或衔接子，这些抗体或衔接子包括NKG2C-IL15-CD33、NKG2C-IL15-CD19和/或NKG2C-IL15-CD20三特异性衔接子。在一些其它实施方案中，CFR的胞外域包含CD28或其任何功能性变体的全部或部分长度的胞外部分，以利用基于CD28的激动剂。非限制性的基于CD28的示例性激动剂包括但不限于抗体或衔接子，这些抗体或衔接子包括15E8、CD28.2、CD28.6、YTH913.12、37.51、9D7(TGN1412)、5.11A1、ANC28.1/5D10和/或37407中的至少一者。
在一些实施方案中，CFR的胞外域包含CD16、CD64或它们的任何功能性变体或组合/嵌合形式的全部或部分长度的胞外部分，以利用基于CD16或CD64的激动剂。非限制性的基于CD16或CD64的示例性激动剂包括但不限于抗体或衔接子，这些抗体或衔接子包括IgG抗体，或基于CD16或CD64的衔接子。当IgG抗体的Fc部分结合基于CD16或CD64的CFR时，其在表达CFR的细胞中激活抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)以及由包含在CFR的胞内域中的信号传导域赋予的其它增强的治疗特性。非限制性的基于CD16或CD64的示例性激动剂包括但不限于抗体或衔接子，这些抗体或衔接子包括CD16×CD30、CD64×CD30、CD16×BCMA、CD64×BCMA、CD16-IL-EPCAM或CD64-IL-EPCAM、CD16-IL-CD33或CD64-IL-CD33中的至少一者，其中包含在TriKE中的“IL”包括至少一种细胞因子的全部或一部分，该至少一种细胞因子包括IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21或它们的任何功能性变体或组合/嵌合形式。
通常，跨膜域是三维蛋白结构，该三维蛋白结构在膜(诸如生物膜(例如，细胞或细胞囊泡的膜)的磷脂双层)中是热力学稳定的。因此，在一些实施方案中，本发明的CFR的跨膜域包含单个α螺旋、若干个跨膜α螺旋的稳定复合体、跨膜β桶、短杆菌肽A的β螺旋或它们的任何组合。在各种实施方案中，CFR的跨膜域包含膜内的“跨膜蛋白”或“膜蛋白”的全部或一部分。如本文所用，“跨膜蛋白”或“膜蛋白”是位于膜上和/或膜内的蛋白质。适于提供包含在本发明的CFR中的跨膜域的跨膜蛋白的示例包括但不限于受体、配体、免疫球蛋白、血型糖蛋白或它们的组合。在一些实施方案中，包含在CFR中的跨膜域包含以下项的跨膜域的全部或一部分：CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD137、CD166、FcεRIγ、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、T细胞受体(诸如TCRα和/或TCRβ)、烟碱型乙酰胆碱受体、GABA受体或它们的组合。在一些实施方案中，跨膜域包含以下项的跨膜域的全部或一部分：IgG、IgA、IgM、IgE、IgD或它们的组合。在一些实施方案中，跨膜域包含以下项的跨膜域的全部或一部分：血型糖蛋白A、血型糖蛋白D或它们的组合。在CFR跨膜域的特定实施方案中，不存在ER滞留信号和胞吞信号两者，或使用基因工程改造去除这些ER滞留信号和胞吞信号。在各种实施方案中，不存在ER滞留信号和胞吞信号两者，或使用基因工程改造方法从CFR跨膜域去除或消除这些ER滞留信号和胞吞信号。在一些实施方案中，跨膜域包含以下项的跨膜域的全部或一部分：CD3ε、CD28、CD27、CD8、ICOS或CD4。
在一些实施方案中，本文所述的CFR的胞内域包含至少一个信号传导域，该至少一个信号传导域激活所选择的胞内信号传导路径。在CFR胞内域的各种实施方案中，不存在ER滞留信号和胞吞信号两者，或使用基因工程改造方法从其中去除或消除这些ER滞留信号和胞吞信号。在一些实施方案中，该胞内域包含至少一个细胞毒性结构域。在一些其它实施方案中，该胞内域除了包含细胞毒性结构域之外，还可任选地包含共刺激域、持久性信号传导域、诱导死亡的信号传导域、肿瘤细胞控制信号传导域中的一者或多者，或它们的任何组合。在一些实施方案中，CFR的细胞毒性结构域至少包含CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(4-1BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C或NKG2D的多肽的全长或一部分。在一个实施方案中，CFR的细胞毒性结构域包含与CD3ζ的至少一种ITAM(基于免疫受体酪氨酸的激活基序)具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，CFR的细胞毒性结构域包含经修饰的CD3ζ，该经修饰的CD3ζ由与SEQ ID NO:35具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列表示。
在一些实施方案中，CFR包含胞内域，该胞内域除了包含细胞毒性信号传导域之外还包含共刺激域。适于在CFR中使用的共刺激域包含但不限于以下项的多肽的全长或至少一部分：CD2、CD27、CD28、CD40L、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4或NKG2D或它们的任何组合。在CFR的一些实施方案中，其共刺激域包含以下项的多肽的全长或至少一部分：CD28、4-1BB、CD27、CD40L、ICOS、CD2或它们的组合。在一些实施方案中，CFR包含胞内域，该胞内域包含CD28的共刺激域和CD3ζ的细胞毒性结构域(也称为“28ζ”)。在一些实施方案中，CFR的胞内域的-CD28-CD3ζ部分由与SEQ ID NO:13具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列表示。
在一些实施方案中，CFR包含胞内域，该胞内域除了包含细胞毒性信号传导域和/或共刺激域之外还包含持久性信号传导域。适于在CFR中使用的持久性信号传导域包括但不限于细胞因子受体的胞内域的全部或一部分，该细胞因子受体诸如IL2R、IL7R、IL15R、IL18R、IL12R、IL23R或它们的组合。另外，受体酪氨酸激酶(RTK)诸如EGFR的胞内域提供了肿瘤细胞控制，或者肿瘤坏死因子受体(TNFR)诸如FAS提供了受控的细胞死亡。
图1包括一些用于说明目的的示例性CFR。示例性CFR中的每一者分别包含：分别由与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:46具有至少约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列表示的CD3亚基-CD3ε、CD3δ或CD3γ或CD28的至少一个胞外部分；分别由与SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49具有至少约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列表示的CD28、CD8或CD4的跨膜域；以及其中胞外域、跨膜域和/或胞内域中的ER滞留基序和/或胞吞基序被消除的CD3ε、CD3γ、CD3δ或CD28的胞内域。例如，将R183S突变引入CD3ε野生型胞内域序列(SEQ ID NO:50)消除了ER滞留基序，从而产生由与SEQ ID NO:51具有至少约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列表示的CD3ε胞内域变体。将L142A和R169A突变引入CD3δ野生型胞内域序列(SEQ ID NO:52)消除了来自WT序列的胞吞基序和ER滞留基序，从而产生由与SEQ ID NO:53具有至少约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列表示的CD3δ胞内域变体。此外，将L131A和R158A突变引入CD3γ野生型胞内域序列(SEQ ID NO:54)消除了来自WT序列的ER滞留基序，从而产生由与SEQ ID NO:55具有至少约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列表示的CD3γ胞内域变体。在一些实施方案中，CD28野生型胞内域不具有ER滞留基序或胞吞基序，并且该野生型胞内域由与SEQ ID NO:56具有至少约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列表示。如本文所提供的CFR的各种实施方案还包括在CFR胞外域的N末端处的信号肽。非限制性的示例性信号肽包括由与SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:57具有至少约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列表示的那些信号肽。
SEQ ID NO:46
NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP
(CD28胞外域)
SEQ ID NO:47
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
(CD28跨膜域)
SEQ ID NO:48
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT
(CD8跨膜域)
SEQ ID NO:49
MALIVLGGVAGLLLFIGLGIFF
(CD4跨膜域)
SEQ ID NO:50
KNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRD LYSGLNQRRI
(CD3ε野生型胞内域)
SEQ ID NO:51
KNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRD LYSGLNQSRI
(CD3εmut胞内域)
SEQ ID NO:52
GHETGRLSGAADTQALLRNDQVYQPLRDRDDAQYSHLGGNWARN K
(CD3δ野生型胞内域)
SEQ ID NO:53
GHETGRLSGAADTQAALRNDQVYQPLRDRDDAQYSHLGGNWAAN K
(CD3δmut胞内域)
SEQ ID NO:54
GQDGVRQSRASDKQTLLPNDQLYQPLKDREDDQYSHLQGNQLRRN
(CD3γ野生型胞内域)
SEQ ID NO:55
GQDGVRQSRASDKQTALPNDQLYQPLKDREDDQYSHLQGNQLARN
(CD3γmut胞内域)
SEQ ID NO:56
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
(CD28胞内域)
SEQ ID NO:57
MLRLLLALNLFPSIQVT
在一些示例性设计中，CFR包含一个CD3亚基的胞外域；在一些其它设计中，CFR包含单链异源二聚体胞外域，该单链异源二聚体胞外域包含与CD3δ或CD3γ(分别为SEQ IDNO:58或SEQ ID NO:59)的胞外域连接的CD3ε的胞外域。单链异源二聚体胞外域的接头类型和长度可发生变化。
SEQ ID NO:58
DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDGSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGSFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVA
(3ε-接头-3δ；接头序列和长度可发生变化)
SEQ ID NO:59
DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDGSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGSQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATIS
(3ε-接头-3γ；接头序列和长度可发生变化)
如本文所述的各种构造中的细胞表面表达的CFR(包括基于CD3的CFR，也称为cs-CD3，如下文进一步描述的)可充当细胞表面触发受体，用于与具有所选结合特异性的分子结合，这些分子包括抗体、衔接子和/或CAR(嵌合抗原受体)。包含编码本发明的一种或多种CFR的多核苷酸的细胞可以是任何类型的细胞，包括人细胞和非人细胞、多能细胞或非多能细胞、免疫细胞或免疫调控细胞、APC(抗原呈递细胞)或饲养细胞、来自原代来源的细胞(例如，PMBC)、或来自培养的或工程改造的细胞(例如，由iPSC分化的细胞系、细胞和/或衍生细胞)。在一些实施方案中，包含编码一种或多种CFR的多核苷酸的细胞包括原代或衍生的CD34细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T谱系细胞、NKT谱系细胞、NK谱系细胞或B谱系细胞。在一些实施方案中，包含编码一种或多种CFR的多核苷酸的衍生细胞是通过对包含编码一种或多种CFR的多核苷酸的iPSC进行分化而获得的效应细胞。在一些实施方案中，包含编码一种或多种CFR的多核苷酸的衍生效应细胞是通过在由iPSC产生衍生效应细胞之后对衍生效应细胞进行工程改造以引入一种或多种CFR而获得的。
如进一步提供的，包含编码一种或多种CFR的多核苷酸的细胞或其群体还可包含以下中的一者或多者：TCR敲除；CD16敲入；CAR；细胞表面表达的外源细胞因子或其受体的部分或全长肽；B2M敲除或敲落(例如，得到HLA-I缺乏)；CIITA敲除或敲落(例如，得到HLA-II缺乏)；引入HLA-G或不可裂解的HLA-G；CD38敲除，以及本文所述的附加工程改造模式。本申请中还提供了主细胞库，其包含经单细胞分选和扩增的克隆工程改造的iPSC，该iPSC具有如本文所提供的至少一种表型，该至少一种表型包括但不限于CFR、TCRneg、CD16、CAR、CD38阴性、外源细胞因子或其融合变体、B2M-/-、CIITA-/-、HLA-G以及它们的任何组合，其中该细胞库提供了用于附加iPSC工程改造的平台和用于制造现成的、工程改造的、同质的效应细胞的可再生来源，这些效应细胞在组成上是明确定义的且均一的，并且可以成本有效的方式大规模生产。
2.实现CD3重建/表面呈递的设计
α-βT细胞受体(TCRαβ)是免疫应答所必需的抗原特异性受体，并且该细胞受体在αβT淋巴细胞的细胞表面上呈递。TCRαβ与肽-主要组织相容性复合体(pMHC)的结合启动了TCR-CD3胞内激活、大量信号传导分子的募集以及信号传导路径的分支和整合，从而导致对基因表达以及T细胞生长和功能获取至关重要的转录因子的动员。通过直接编辑T细胞或通过基因组iPSC编辑和分化，破坏TCRα或TCRβ的恒定区(TRAC或TRBC)，作为获得经修饰的衍生T谱系细胞的来源是产生TCRneg T细胞的方法之一。TCRneg T细胞不需要HLA匹配，具有降低的同种异体反应性，并且当用于同种异体过继性细胞疗法时能够预防GvHD(移植物抗宿主病)。
然而，TCR破坏还导致从T细胞表面消除CD3信号传导复合体，尽管内源CD3亚基基因在细胞中表达。由于与需要细胞表面CD3识别和结合的技术不相容，因此细胞表面CD3的缺乏可能会改变细胞扩增和/或存活的能力并降低细胞的功能性潜能，这些技术包括但不限于：基于CD3的抗体和衔接子技术；CD3/CD28 T细胞激活珠技术；和CD3-CAR刺激技术。此外，当TCRnegiPSC用于定向T细胞分化时，也可能会对T细胞发育生物学和T细胞功能成熟产生不期望的影响。然而，在TCR阴性的细胞中过表达CD3似乎不能恢复CD3复合体和/或CD3信号传导的细胞表面呈递。对于尽管存在TCR基因但不表达CD3和/或TCR的细胞，例如NK或NK祖细胞，所获得的表面CD3表达经由基于CD3的抗体、衔接子和CAR技术能够在NK谱系细胞中实现特异性信号转导和细胞功能，这些技术将与这些细胞天然不相容。
以上提供的基于CD3的CFR设计是可用于在不存在TCR和表面表达的CD3的情况下解决CD3重建/表面呈递的方法之一，因此，如整个本申请中使用的术语“细胞表面呈递的CD3(cs-CD3)”或“细胞表面CD3复合体，或其一个或多个亚基或亚结构域”将包括本文提供的基于CD3的CFR设计。另外，如图2A至图2C所示，还提供了以下设计作为获得细胞表面呈递的CD3(cs-CD3)的替代实施方案。
设计1：非结合性重组TCR(nb-rTCR)
如图2A中所示，在设计1中，当使用靶向基因组编辑工具敲除细胞中的内源TCRα(TCRα-/-)产生TCR阴性(TCRneg)时，TCRβ的敲除(TCRβ-/-)是任选的；或者反之亦然，当使用靶向基因组编辑工具敲除细胞中的内源TCRβ(TCRβ-/-)产生TCR阴性(TCRneg)时，TCRα的敲除(TCRα-/-)是任选的。在包括TCRα敲除的实施方案中，随后将编码TCRα的全部或部分长度的恒定区(转基因TRAC或tgTRAC)的多核苷酸引入细胞中，或在靶向TRAC敲除后整合于TRAC处，并且多核苷酸的表达由TCRα的内源启动子驱动，或者可替代地，由与多核苷酸可操作地连接的外源启动子驱动。在一些实施方案中，编码TCRα的全部或部分长度的恒定区的多核苷酸还包含与TCRα的全部或部分长度的恒定区偶联的适当N末端信号肽。在敲除内源TCRβ(TCRβ-/-)的实施方案中，将编码TCRβ(tgTCRβ或tgTRBC)的全部或部分长度的恒定区的多核苷酸引入细胞中；并且tgTCRβ或tgTRBC的表达由TCRβ的内源启动子驱动，或者可替代地由外源启动子驱动。在一些实施方案中，编码TCRβ的全部或部分长度的恒定区的多核苷酸还包含与TCRβ的全部或部分长度的恒定区偶联的适当N末端信号肽。在一些实施方案中，外源启动子包括组成性、诱导性、时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性启动子。在一些实施方案中，外源启动子包括CMV、EF1α、PGK、CAG和UBC中的一者。在一个实施方案中，外源启动子至少包括CAG。
在一些实施方案中，编码全部或部分TCRα恒定区(tgTRAC)的多核苷酸包含与示例性序列SEQ ID NO:1相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间任何百分比的同一性的序列。在一些实施方案中，编码TCRβ的多核苷酸包含与示例性序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间任何百分比的同一性的序列，该TCRβ包含至少全部或部分恒定区(tgTRBC)。在编码N末端信号肽以及全部或部分长度的TCRα或TCRβ恒定区的多核苷酸的一些实施方案中，该多核苷酸还包含在信号肽和与TCR恒定区相关的序列之间的接头肽。在编码N末端信号肽以及全长的TCRα或TCRβ恒定区的多核苷酸的一些实施方案中，该多核苷酸还包含在C末端处的聚A尾部。在编码N末端信号肽以及部分长度的TCRα或TCRβ恒定区的多核苷酸的一些实施方案中，该多核苷酸的整合位于内源恒定区(例如，外显子)内的位点处并且是符合读框的，即与整合位点下游的TCRα或TCRβ恒定区的剩余内源序列符合读框，使得形成全长转基因/嵌合TRAC或TRBC，该全长转基因/嵌合TRAC或TRBC序列的一部分是外源/转基因的并且另一部分是内源的。在设计1的一些实施方案中，内源TCRα和TCRβ中的至少一者经工程改造以基本上去除相应可变区，同时在表达时向细胞表面呈递相应转基因恒定区。在一些实施方案中，内源TCRα和TCRβ中的仅一者经工程改造以基本上去除相关可变区，同时向细胞表面呈递转基因恒定区和野生型TCR亚基(TCRα或TCRβ)。在一些实施方案中，内源TCRα和TCRβ两者都被设置成经工程改造以去除相应可变区，同时在表达时向细胞表面呈递两个转基因恒定区。示例性N末端信号肽包括MALPVTALLLPLALLLHA(SEQ ID NO:4；CD8a sp)或MDFQVQIFSFLLISASVIMSR(SEQ ID NO:5；IgK sp)，或所属领域中已知的任何信号肽序列或其功能性变体。示例性接头肽包括DYKDDDDK(SEQ ID NO:6；FLAG)，或所属领域中已知的任何接头肽序列或其功能性变体。
SEQ ID NO:1：
IQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
(TRAC)
SEQ ID NO:2：
DLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRNHFRCRVSATFWQNPQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
(TRBC1)
SEQ ID NO:3
DLKNVFPPKVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
(TRBC2)
如本文所证明的，研究发现，TCR亚基的转基因恒定区tgTRAC或tgTRBC虽然能够通过与其它TCR亚基(内源/野生型或转基因；如果是转基因的，具有或不具有其相应可变区域)和内源CD3亚基缔合形成重组TCR复合体(rTCR)，但由于缺乏参与抗原识别的TCRα或TCRβ可变区域而不能实现肽-MHC结合。所得的细胞通过细胞表面呈递的CD3(cs-CD3)复合体重新获得典型TCR/CD3信号传导，但由于敲除内源TCR以及rTCR没有TCRα可变区而不具有同种异体反应性。因此，考虑到设计1，本文提供了细胞或其群体，其中该细胞是iPSC、克隆iPSC、克隆iPS细胞系细胞或由所述iPSC分化获得的衍生细胞；并且该细胞包含：内源TCRα和TCRβ恒定区中的至少一者处的破坏，使得内源TCR被敲除(TCRneg)，以及编码被破坏的TCRα的恒定区(tgTRAC)和/或TCRβ的恒定区(tgTRBC)的一个或两个外源多核苷酸；其中tgTRAC和/或tgTRBC在表达时能够实现内源CD3(cs-CD3)的细胞表面呈递。包含tgTRAC和tgTRBC中的至少一者的重组TCR复合体由于不具有TCR亚基的两个可变区(Vα和Vβ)而不结合由MHC呈递的抗原肽，因此被称为非结合性重组TCR(nb-rTCR)。
设计2：定义的重组TCR(d-rTCR)
如图2A中所示，在设计2中，使用基因组编辑工具敲除细胞中的内源TCRα和内源TCRβ两者(TCRα-/-和TCRβ-/-；或TCRαneg TCRβneg)，产生TCRneg细胞。在TCR敲除的同时或之后，将编码TCRα的第一多核苷酸和编码TCRβ的第二多核苷酸引入TCRneg细胞中，该TCRα包含TCRα的定义可变区以及全部或部分恒定区(tgTCRα)，该TCRβ包含TCRβ的定义可变区以及全部或部分恒定区(tgTCRβ)。定义的TCRα或TCRβ可变区可具有任何给定的特异性，使得其序列已经被鉴别或可以被鉴别。在一些实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸中的一者或两者分别由TCRα和TCRβ的内源启动子驱动。在一些其它实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸中的一者或两者由外源启动子驱动。在一些实施方案中，第二多核苷酸由TCRβ的内源启动子驱动，而在一些其它实施方案中，第二多核苷酸由外源启动子驱动。在一些实施方案中，外源启动子包括组成性、诱导性、时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性启动子。在一些实施方案中，外源启动子包括CMV、EF1α、PGK、CAG或UBC中的一者。在一个实施方案中，外源启动子至少包括CAG。在一些实施方案中，编码全部或部分长度的TCRα恒定区以及给定的定义可变区的多核苷酸包含与示例性序列SEQ ID NO:1相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间任何百分比的同一性的至少一个序列。在一些实施方案中，编码全部或部分长度的TCRβ恒定区以及给定的定义可变区的多核苷酸包含与示例性序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间任何百分比的同一性的至少一个序列。在一些实施方案中，该序列同一性为至少80％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少90％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少95％。在一些实施方案中，该序列同一性为100％。在编码全长的TCRα或TCRβ恒定区的多核苷酸的一些实施方案中，该多核苷酸还包含在C'末端处的聚A尾部。在编码部分长度的TCRα或TCRβ恒定区的多核苷酸的一些实施方案中，该多核苷酸的整合位于内源恒定区内的位点处并且与整合位点下游的TCRα或TCRβ恒定区的剩余内源序列符合读框，使得形成全长转基因/嵌合TRAC或TRBC，该全长转基因/嵌合TRAC或TRBC序列的一部分是外源/转基因的并且另一部分是内源的。TCRα或TCRβ可变区的序列可在例如通用蛋白质资源(UniProt)数据库中找到，并且一些非限制性的示例性定义的TCRα或TCRβ可变区分别列于下表A和表B中。
表A：
/>
表B：
尽管NKT细胞是还表达αβTCR的T细胞的亚群，但NKT细胞与常规αβT细胞的不同之处在于，NKT细胞的TCR由典型不变TCRα链(人类中的Vα24-Jα18)和使用有限Vβ区段(人类中的Vβ11)的TCRβ链组成，这些有限Vβ区段的多样性是有限的并且识别由CD1d呈递的有限数目的脂质抗原。对典型不变TCRα链(人类中的Vα24-Jα18；或iTCRα)和使用有限Vβ区段(人类中的Vβ11；或iTCRβ)的TCRβ链的表达导致了高度保守的TCR和CD1d依赖性抗原呈递。为了利用不变NKT的TCR(iTRC或iTRCαβ)的这种特性，在设计2的一些实施方案中，定义的TCR包括不变NKT细胞的TCRα和TCRβ(iTRCα或iTRCαβ)中的任一者或两者，使得编码全部或部分长度的TCRα恒定区以及给定的定义可变区的多核苷酸包含与示例性序列SEQ ID NO:44相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间任何百分比的同一性的至少一个序列；并且编码全部或部分长度的TCRβ恒定区以及给定的定义可变区的多核苷酸包含与示例性序列SEQ ID NO:45相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间任何百分比的同一性的至少一个序列。在一些实施方案中，该序列同一性为至少80％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少90％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少95％。在一些实施方案中，该序列同一性为100％。
SEQ ID NO:44
MKKHLTTFLVILWLYFYRGNGKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYTVSPFSNLRWYKQDTGRGPVSLT IMTFSENTKSNGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYICVVSDRGSTLGRLYFGRGTQLTVWPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
(人Vα24Jα18的iNKT TCRα链；带下划线的部分为可变区)
SEQ ID NO:45
MTIRLLCYMGFYFLGAGLMEADIYQTPRYLVIGTGKKITLECSQTMGHDKMYWYQQDPGMELHLIHYSY GVNSTEKGDLSSESTVSRIRTEHFPLTLESARPSHTSQYLCASEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
(人Vβ11的iNKT TCRβ链；带下划线的部分为可变区)
如本文进一步证明的，研究发现具有恒定区和定义可变区的转基因TCRα(tgTCRα)任选地与具有恒定区和定义可变区的转基因TCRβ(tgTCRβ)能够通过与包含CD3ζ链的内源CD3亚基缔合而形成重组TCR复合体(rTCR)，同时由于tgTCRα和tgTCRβ的可变区的特异性而具有定义的肽-MHC结合或者没有肽-MHC结合。除了将转基因TCR亚基的基因工程改造用于定义的重组TCR之外，还利用了不变NKT细胞的TCRα和TCRβ的其它方法，这些方法包括使用本文公开的重编程和分化组合物和方法将分离的NKT细胞重编程为iPSC，并使iPSC分化成衍生的T细胞，因此该衍生的T细胞包含不变NKT细胞的TCRα和TCRβ(iTCRα、iTCRβ；和iTCR，复合体)。由基因工程改造的iPSC或iNKT重编程的iPSC分化的所得细胞通过细胞表面呈递的CD3(cs-CD3)重新获得典型TCR/CD3信号传导，同时不具有或具有已知且定义的MHC结合特异性。因此，考虑到设计2，本文提供了细胞或其群体，其中该细胞是iPSC、克隆iPSC、克隆iPS细胞系或由iPSC分化获得的衍生细胞；并且该细胞包含：内源TCRα和内源TCRβ中的每一者处的破坏，编码具有全部或部分恒定区和定义可变区的tgTCRα的外源多核苷酸，以及编码具有全部或部分恒定区和定义可变区的tgTCRβ的外源多核苷酸；其中当表达时，内源CD3分子在细胞表面(cs-CD3)呈递。
设计3：具有任选的非结合性TCRβ(p-rTCR)的重组前TCRα
前TCRα是由未成熟胸腺细胞(T细胞发育的早期阶段)中的发育控制基因编码的I型跨膜受体蛋白。前TCRα与TCRβ和CD3亚基共价缔合以形成前TCR复合体。在其它结构和功能性差异中，前TCRα与TCRα链相比具有相对较长的细胞质尾部。如图2A中所示，在该设计3中，TCR阴性细胞使用基因组编辑工具至少敲除了内源TCRα(TCRneg)，其中内源TCRβ的敲除是任选的。在TCR敲除的同时或之后，将编码全部或部分长度的前TCRα(tgpTCRα)的第一多核苷酸引入TCRneg细胞中。在其中TCRneg细胞还包括TCRβ敲除的一些实施方案中，将编码全部或部分TCRβ恒定区(其具有或不具有给定的定义可变区(tgTCRβ或tgTRBC))的第二多核苷酸引入TCRneg细胞中，其中该细胞不是早期阶段未成熟的胸腺细胞。在一些实施方案中，该多核苷酸编码全长的TCRα或TCRβ恒定区，该多核苷酸还包含在C'末端处的聚A尾部。在编码部分长度的TCRα或TCRβ恒定区的多核苷酸的一些实施方案中，该多核苷酸的整合位于内源恒定区内的位点处并且与整合位点下游的TCRα或TCRβ恒定区的剩余内源序列符合读框，使得形成全长转基因/嵌合TRAC或TRBC，该全长转基因/嵌合TRAC或TRBC序列的一部分是外源/转基因的并且另一部分是内源的。
在一些实施方案中，编码全部或部分长度的前TCRα(tgpTCRα)的第一多核苷酸在整合后可操作地连接到TCRα的内源启动子。在一些实施方案中，编码全部或部分长度的前TCRα(tgpTCRα)的第一多核苷酸由外源启动子驱动。在一些实施方案中，编码全部或部分TCRβ恒定区(其具有或不具有给定的定义可变区)的第二多核苷酸在整合后可操作地连接到TCRβ的内源启动子。在一些实施方案中，编码全部或部分TCRβ恒定区(其具有或不具有给定的定义可变区)的第二多核苷酸由外源启动子驱动。在一些实施方案中，外源启动子包括组成性、诱导性、时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性启动子。在一些实施方案中，外源启动子包括CMV、EF1α、PGK、CAG或UBC中的一者。在一个实施方案中，外源启动子至少包括CAG。在一些实施方案中，编码tgpTCRα的多核苷酸包含与示例性序列SEQ ID NO:23相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间任何百分比的同一性的至少一个序列。在一些实施方案中，该序列同一性为至少80％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少90％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少95％。在一些实施方案中，该序列同一性为100％。在一些实施方案中，编码tgpTCRα的多核苷酸包含SEQ ID NO:23的部分长度，该部分长度在本文中表示为SEQ ID NO:24。在编码tgpTCRα(其包含全部或部分长度的SEQ ID NO:23或其任何功能性变体)的多核苷酸的一些实施方案中，所编码的tgpTCRα还包含所属领域中已知的信号肽。一个非限制性的示例性信号肽包含由SEQ ID NO:22表示的肽。
SEQ ID NO:22
MAGTWLLLLLALGCPALPTGVGG
SEQ ID NO:23
TPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGNGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTCPQEPLRGGCGLLRAPERFLLAGTPGGALWLGVLR LLLFKLLLFDLLLTCSCLCDPAGPLPSPATTTRLRALGSHRLHPATETGGREATSSPRPQPRDRRWGDTPPGRKPGSPVWGEGSYLSSYPTCPAQAWCSRSALRAPSSSLGAFFAGDLPPPLQAGAA
(具有TM的tgpTCRα)
SEQ ID NO:24
TPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGNGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTCPQEPLRGGCGLLRAPERFLLAGTPGGALWLGVLR LLLFKLLLFDLLLTCSCLCDPAGPLPSPATTTRLRALGSHRLHPATETGGREATSSPRPQPRDRRWGDTPPGRKPGSPV
(具有TM的截短tgpTCRα)
在一些实施方案中，编码TCRβ(其包含全部或部分恒定区和给定的定义可变区)的多核苷酸包含与示例性序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间任何百分比的同一性的至少一个序列。在一些实施方案中，该序列同一性为至少80％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少90％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少95％。在一些实施方案中，该序列同一性为100％。定义的TCRβ可变区可具有任何给定的特异性，使得其序列已经被鉴别或可以被鉴别。非限制性的定义TCRβ可变区在上表B中举例说明，并且该可变区被包含在SEQ IDNO:45(下划线部分)中。
先前未知的是，具有由与其原生启动子(即，前TCRα启动子)不同的启动子(无论是外源启动子还是内源TCRα启动子)控制的前TCRα表达的iPSC是否仍具有分化成功能性效应T细胞的能力。如本文所证明的，包含由非原生启动子控制的转基因前TCRα(tgpTCRα)的iPSC的细胞发育生物学可维持到一定程度，使得可进行向iPSC衍生的T细胞的定向分化以产生功能性T细胞。这是令人惊奇的，因为通常内源前TCR的表达是受发育调控的。此外，衍生自tgpTCRαTCRneg iPSC的T细胞通过与包含CD3ζ链的内源CD3亚基缔合而包含了表面表达的重组前TCR复合体(rpTCR)，同时不具有肽-MHC结合能力。不受理论的限制，转基因的前TCR/CD3复合体可能仍然通过经由细胞表面呈递的CD3(cs-CD3)复合体的典型CD3信号传导来驱动iPSC衍生的T细胞成熟。考虑到上述情况，本发明的实施方案还包括上调和/或防止下调内源前TCRα的各种方法。在非早期/未成熟胸腺细胞的细胞中过表达的前TCRα将与所表达的内源TCRβ和CD3亚基缔合以实现CD3细胞表面呈递，同时不具有肽-MHC结合能力。
因此，考虑到设计3，本文提供了细胞或其群体，其中该细胞是iPSC、克隆iPSC、克隆iPS细胞系或由iPSC分化获得的衍生细胞；并且该细胞包含：至少内源TCRα或TCRβ处的破坏，使得内源TCR被敲除(TCRneg)，以及编码包含全部或部分长度的前TCRα的肽的至少一个外源多核苷酸；其中在不存在TCRα的情况下，前TCRα的表达不仅导致与细胞中内源或转基因TCRβ相关的细胞表面CD3(cs-CD3)复合体的重建，而且还有助于将iPSC定向分化成功能性衍生效应细胞，包括T细胞。
设计4：非结合性重组TCR锚定的CD3(nb-rTCR-CD3)
如图2B中所示，在该设计4中，细胞中使用基因组编辑工具敲除了内源TCRα和内源TCRβ中的一者或两者(TCRneg；TCRα-/-和/或TCRβ-/-)。在TCR敲除的同时或之后，将外源多核苷酸引入所述TCRneg细胞中，这些外源多核苷酸包含：编码重组TCRα的第一多核苷酸，该重组TCRα包含TCRα恒定区、CD3ε的全部或部分长度的胞外域以及CD3δ和CD3γ中的一者；和/或编码重组TCRβ的第二多核苷酸，该重组TCRβ包含TCRβ恒定区、CD3ε的全部或部分长度的胞外域以及重组TCRα中未包含的CD3δ和CD3γ中的一者；使得可在细胞表面形成由一个多核苷酸编码的CD3ε和CD3δ之间的一个异源二聚体，以及/或者由另一个多核苷酸编码的CD3ε和CD3γ之间的另一个异源二聚体。
在一些实施方案中，重组TCRα在C末端处包含与N末端处的全部或部分长度的CD3ε和CD3δ胞外域融合的全部或部分TCRα恒定区(tgCD3(ε-δ)-TRAC)。在一些实施方案中，重组TCRα在C末端处包含与N末端处的CD3ε和CD3γ的全部或部分长度的胞外域融合的全部或部分TCRα恒定区(tgCD3(ε-γ)-TRAC)。在一些实施方案中，重组TCRβ在C末端处包含与N末端处的CD3ε和CD3γ的全部或部分长度的胞外域融合的全部或部分长度的TCRβ恒定区(tgCD3(ε-γ)-TRBC)。在一些实施方案中，重组TCRβ在C末端处包含与N末端处的CD3ε和CD3δ的全部或部分长度的胞外域融合的全部或部分长度的TCRβ恒定区(tgCD3(ε-δ)-TRBC)。在编码全长的TCRα或TCRβ恒定区的多核苷酸的一些实施方案中，该多核苷酸还包含在C末端处的聚A尾部。在编码部分长度的TCRα或TCRβ恒定区的多核苷酸的一些实施方案中，该多核苷酸的整合位于相应内源恒定区内的位点处并且与整合位点下游的TCRα或TCRβ恒定区的剩余内源序列符合读框，使得形成全长转基因/嵌合TRAC或TRBC，该全长转基因/嵌合TRAC或TRBC序列的一部分是外源/转基因的并且另一部分是内源的。
在一些其它实施方案中，当将第一多核苷酸和第二多核苷酸中的两者都引入细胞中时，重组TCRα由包含tgCD3(ε-δ)-TRAC的第一多核苷酸编码，并且重组TCRβ由包含tgCD3(ε-γ)-TRBC的第二多核苷酸编码；或者重组TCRα由包含tgCD3(ε-γ)-TRAC的第一多核苷酸编码，并且重组TCRβ由包含tgCD3(ε-δ)-TRBC的第二多核苷酸编码。因此，在所述实施方案中，可在细胞表面形成由一个多核苷酸编码的CD3ε和CD3δ之间的一个异源二聚体，以及由另一个多核苷酸编码的CD3ε和CD3γ之间的另一个异源二聚体。
在一些实施方案中，当将第一多核苷酸和第二多核苷酸中的仅一者引入细胞中时，另一个TCR亚基是野生型/内源的或经工程改造的，以包含仅一个恒定区(其内源可变区被去除，无论是否被定义可变区置换)：例如，图2A中的设计1的tgTRAC或tgTRBC(无可变区)，或图2A中的设计2的tgTCRα或tgTCRβ(具有定义可变区)。因此，如图2B的设计4中所示，在其中将包含tgCD3(ε-δ)-TRAC的第一多核苷酸引入细胞中以提供重组TCRα亚基的一个示例性实施方案中，还将包含tgTRBC或tgTCRβ的另一个多核苷酸引入细胞中以提供重组TCRβ亚基；使得在该实施方案中，可在细胞表面上形成由包含tgCD3(ε-δ)-TRAC的多核苷酸编码的内源CD3ε和内源CD3γ之间的一个异源二聚体以及CD3ε和CD3δ之间的另一个异源二聚体。在图2B的设计4的又一个示例性实施方案中，其中将包含tgCD3(ε-γ)-TRBC的第二多核苷酸引入细胞中以提供重组TCRβ亚基，还将包含tgTRAC或tgTCRα的另一个多核苷酸引入细胞中以提供重组TCRα亚基，使得可在细胞表面形成由包含tgCD3(ε-γ)-TRBC的多核苷酸编码的内源CD3ε和内源CD3δ之间的一个异源二聚体以及CD3ε和CD3γ之间的另一个异源二聚体。
在一些实施方案中，第一多核苷酸由TCRα的内源启动子驱动，而在一些其它实施方案中，第一多核苷酸由外源启动子驱动。在一些实施方案中，第二多核苷酸由TCRβ的内源启动子驱动，而在一些其它实施方案中，第二多核苷酸由外源启动子驱动。在一些实施方案中，重组TCRα或重组TCRβ的外源启动子包括组成性、诱导性、时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性启动子。在一些实施方案中，外源启动子包括CMV、EF1α、PGK、CAG或UBC中的一者。在一个实施方案中，外源启动子至少包括CAG。在一些实施方案中，编码TCRα恒定区的多核苷酸包含与示例性序列SEQ ID NO:1相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间任何百分比的同一性的至少一个序列。在一些实施方案中，编码TCRβ恒定区的多核苷酸包含与示例性序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间任何百分比的同一性的至少一个序列。在一些实施方案中，编码全部或部分长度的CD3ε胞外域的多核苷酸包含与示例性序列SEQ ID NO:25相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间任何百分比的同一性的至少一个序列。在一些实施方案中，编码全部或部分长度的CD3δ胞外域的多核苷酸包含与示例性序列SEQ IDNO:26相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间任何百分比的同一性的至少一个序列。在一些实施方案中，编码全部或部分长度的CD3γ胞外域的多核苷酸包含与示例性序列SEQ ID NO:27相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间任何百分比的同一性的至少一个序列。在一些实施方案中，该序列同一性为至少80％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少90％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少95％。在一些实施方案中，该序列同一性为100％。在编码全部或部分长度的CD3ε、CD3δ或CD3γ胞外域的多核苷酸的一些实施方案中，该多核苷酸还包含编码信号肽的核酸。在一些实施方案中，该信号肽包含SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30中的一者或所属领域中已知的任何其它信号肽。在编码全部或部分长度的CD3ε胞外域的多核苷酸的一些实施方案中，该多核苷酸还包含编码SEQ ID NO:28的信号肽的核酸。在编码全部或部分长度的CD3δ胞外域的多核苷酸的一些实施方案中，该多核苷酸还包含编码SEQ ID NO:29的信号肽的核酸。在编码全部或部分长度的CD3γ胞外域的多核苷酸的一些实施方案中，该多核苷酸还包含编码SEQ ID NO:30的信号肽的核酸。
SEQ ID NO:25
DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMD
(CD3ε胞外域)
SEQ ID NO:26
FKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGI YRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVA
(CD3δ胞外域)
SEQ ID NO:27
QSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATIS(CD3γ胞外域)
SEQ ID NO:28
MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQ
SEQ ID NO:29
MEHSTFLSGLVLATLLSQVSP
SEQ ID NO:30
MEQGKGLAVLILAIILLQGTLA
在编码tgCD3(ε-δ)-TRAC融合蛋白的多核苷酸的一些实施方案中，该多核苷酸包含与示例性序列SEQ ID NO:31相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间任何百分比的同一性的序列，其中包含在SEQ ID NO:31中的两个接头序列(SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34)中的每一者可被所属领域中已知的任何接头序列置换。在编码tgCD3(ε-γ)-TRBC融合蛋白的多核苷酸的一些实施方案中，该多核苷酸包含与示例性序列SEQ ID NO:32相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间任何百分比的同一性的序列，其中包含在SEQ ID NO:32中的两个接头序列(SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34)中的每一者可被所属领域中已知的任何接头序列置换。在一些实施方案中，该序列同一性为至少80％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少90％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少95％。在一些实施方案中，该序列同一性为100％。在如本文所提供的重组TCRα或TCRβ融合蛋白的一些实施方案中，该融合蛋白还包含所属领域中已知的信号肽。一个非限制性的示例性信号肽包含由SEQ ID NO:28表示的肽。
SEQ ID NO:31
DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVGSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGSFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMGGGGSGGGGSGGGGSIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
(N’-CD3ε-接头-CD3δ-G4S接头-TRAC-C’)
SEQ ID NO:32
DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVGSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGSQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMGGGGSGGGGSGGGGSDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
(N’-CD3ε-接头-CD3γ-G4S接头-TRBC-C’)
SEQ ID NO:33
GSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGS
SEQ ID NO:34
GGGGSGGGGSGGGGS
如本文所证明的，研究发现TCRα或TCRβ恒定区(其与CD3ε的胞外域以及CD3δ和CD3γ中的一者融合)能够与转基因TCRβ或TCRα恒定区(其与或不与CD3ε的胞外域以及CD3δ和CD3γ中的一者融合)缔合，以形成CD3ε/CD3δ和CD3ε/CD3γ异源二聚体。所缔合的转基因TCRα和TCRβ亚基能够进一步与内源CD3ζ缔合，以支持CD3胞外域(cs-CD3)的细胞表面表达和通过该内源CD3ζ的信号转导，同时不具有肽-MHC结合潜能。因此，考虑到设计4，本文提供了细胞或其群体，其中该细胞是iPSC、克隆iPSC、克隆iPS细胞系或由所述iPSC分化获得的衍生细胞；并且该细胞包含：内源TCRα恒定区和内源TCRβ恒定区中的每一者处的破坏，以及编码tgTCRα的第一外源多核苷酸中的至少一个外源多核苷酸，该tgTCRα包含融合的全部或部分长度的TCRα恒定区和CD3ε的全部或部分长度胞外域以及CD3δ和CD3γ中的一者(tgCD3(ε-δ/γ)-TRAC)；以及编码tgTCRβ的第二外源多核苷酸，该tgTCRβ包含融合的全部或部分长度的TCRβ恒定区和CD3ε的全部或部分长度的胞外域以及CD3δ和CD3γ中的一者(tgCD3(ε-γ/δ)-TRBC)；其中当表达时，CD3亚基的胞外域在细胞表面(cs-CD3)呈递。在各种实施方案中，当仅所述第一外源多核苷酸包含在细胞中时，该细胞还包含如本文所提供的tgTRBC或tgTCRβ；并且当仅所述第二外源多核苷酸包含在细胞中时，该细胞还包含如本文所提供的tgTRAC或tgTCRα。
设计5：CD3嵌合链(ccCD3)
如图2B所示，在该设计5中，细胞表面呈递的CD3(cs-CD3)呈CD3嵌合链(ccCD3)的形式，其被构建为包含全部或部分长度的CD3ε胞外域、CD3γ或CD3δ的全部或部分长度的胞外域和包含至少一个ITAM(基于免疫受体酪氨酸的激活基序)的CD3ζ的全部或部分长度的胞内域。包含编码所述CD3嵌合链的多核苷酸的细胞还可包含内源TCRα和TCRβ中的任一者或两者处的破坏。当基因组编辑工具被用于通过对TRAC和/或TRBC进行靶向编辑以产生TCRneg细胞时，在TCR敲除的同时或之后，将编码所述CD3嵌合链的至少一个多核苷酸引入细胞中。在一些实施方案中，将该多核苷酸引入TRAC或TRBC中，并分别由TCRα或TCRβ的内源启动子驱动；而在一些其它实施方案中，所引入的多核苷酸由外源启动子驱动。在一些实施方案中，外源启动子包括组成性、诱导性、时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性启动子。在一些实施方案中，外源启动子包括CMV、EF1α、PGK、CAG或UBC中的一者。在一个实施方案中，外源启动子至少包括CAG。
在一些实施方案中，CD3嵌合链包含全部或部分长度的CD3ε胞外域、CD3γ的全部或部分长度的胞外域和包含至少一个ITAM的CD3ζ的全部或部分长度的胞内域(tgCD3(ε-γ)-ζ)，其中CD3嵌合链是N末端处具有任一个胞外域的融合蛋白，并且其中这两个胞外域形成异源二聚体。在一些实施方案中，CD3嵌合链包含全部或部分长度的CD3ε胞外域、CD3δ的全部或部分长度的胞外域和包含至少一个ITAM的CD3ζ的全部或部分长度的胞内域(tgCD3(ε-δ)-ζ)，其中CD3嵌合链是N末端处具有任一个胞外域的融合蛋白，并且其中这两个胞外域形成异源二聚体。在CD3嵌合链的一些实施方案中，CD3ζ的胞内域包含两个ITAM。在CD3嵌合链的一些实施方案中，CD3ζ的胞内域包含所有三个ITAM。
在一些实施方案中，编码全部或部分长度的CD3ε胞外域的多核苷酸包含与示例性序列SEQ ID NO:25相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间任何百分比的同一性的至少一个序列。在一些实施方案中，编码全部或部分长度的CD3δ胞外域的多核苷酸包含与示例性序列SEQ ID NO:26相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间任何百分比的同一性的至少一个序列。在一些实施方案中，编码全部或部分长度的CD3γ胞外域的多核苷酸包含与示例性序列SEQ ID NO:27相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间任何百分比的同一性的至少一个序列。在编码全部或部分长度的CD3ε、CD3δ或CD3γ胞外域的多核苷酸的一些实施方案中，该多核苷酸还包含编码信号肽的核酸。在一些实施方案中，该信号肽包含SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30中的一者或所属领域中已知的任何其它信号肽。在编码全部或部分长度的CD3ε胞外域的多核苷酸的一些实施方案中，该多核苷酸还包含编码SEQ ID NO:28的信号肽的核酸。在编码全部或部分长度的CD3δ胞外域的多核苷酸的一些实施方案中，该多核苷酸还包含编码SEQ ID NO:29的信号肽的核酸。在编码全部或部分长度的CD3γ胞外域的多核苷酸的一些实施方案中，该多核苷酸还包含编码SEQ ID NO:30的信号肽的核酸。在一些实施方案中，编码全部或部分长度的CD3ζ胞内域的多核苷酸包含与示例性序列SEQ ID NO:35(其包含CD3ζITAM1、ITAM2和ITAM3(分别为SEQ ID NO:36-38))相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间任何百分比的同一性的至少一个序列。在一些实施方案中，该序列同一性为至少80％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少90％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少95％。在一些实施方案中，该序列同一性为100％。
SEQ ID NO:35
MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQN QLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLST ATKDTYDALHMQALPPR
(…ITAM1…ITAM2…ITAM3…)
SEQ ID NO:36
APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKR
SEQ ID NO:37
PRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGM
SEQ ID NO:38
ERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ
在CD3嵌合链的一些实施方案中，包含至少一个、两个或三个ITAM的CD3ζ的胞内域还包含用于信号转导和/或共刺激的2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγIL21R、IL-2Rβ(IL-15Rβ)、IL-2Rγ、IL-7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD3ζ1XX、CS1或CD8的一个或多个信号传导域。在CD3嵌合链的一个实施方案中，包含至少一个、两个或三个ITAM的CD3ζ的胞内域还包含CD28的至少一个信号传导域(tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ)。在包含CD28的信号传导域的CD3ζ胞内域的一些实施方案中，编码全部或部分长度的28ζ胞内域的多核苷酸包含与示例性序列SEQ ID NO:39相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间任何百分比的同一性的序列，可从该示例性序列中去除任何一个或两个CD3ζITAM。在CD3嵌合链的一些实施方案中，包含至少一个、两个或三个ITAM的CD3ζ的胞内域还包含4-1BB的信号传导域(tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ)。在包含4-1BB的信号传导域的CD3ζ胞内域的一些实施方案中，编码全部或部分长度的BBζ胞内域的多核苷酸包含与示例性序列SEQ ID NO:40相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间任何百分比的同一性的序列，可从该示例性序列中去除任何一个或两个CD3ζITAM。在CD3嵌合链的一些实施方案中，包含至少一个、两个或三个ITAM的CD3ζ的胞内域还包含CD28的信号传导域和4-1BB的信号传导域(tgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζ)。在包含CD28和4-1BB两者的信号传导域的CD3ζ胞内域的一些实施方案中，编码全部或部分长度的28BBζ胞内域的多核苷酸包含与示例性序列SEQ ID NO:41相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间任何百分比的同一性的序列，可从该示例性序列中去除任何一个或两个CD3ζITAM。在编码tgCD3(ε-γ)-(28/BB)ζ的多核苷酸的一个实施方案中，所编码的多肽包含与示例性序列SEQ ID NO:42相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间任何百分比的同一性的序列；可从该示例性序列中去除任何一个或两个CD3ζITAM，来自该示例性序列的接头序列可被所属领域中已知的任何其它接头序列置换，或者在又一些其它实施方案中，来自该示例性序列的CD28信号传导域可被4-1BB信号传导域置换或通过添加该4-1BB信号传导域而得到增强。在tgCD3(ε-δ)-(28/BB)ζ的一个实施方案中，所编码的多肽包含与示例性序列SEQ ID NO:43相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间任何百分比的同一性的序列；可从该示例性序列中去除任何一个或两个CD3ζITAM，来自该示例性序列的接头序列可被所属领域中已知的任何其它接头序列置换，或者在又一些其它实施方案中，来自该示例性序列的CD28信号传导域可被4-1BB信号传导域置换或经由进一步包含该4-1BB信号传导域而得到增强。在所编码的CD3嵌合链tgCD3(ε-γ)-(28/BB)ζ或tgCD3(ε-δ)-(28/BB)ζ的一些其它实施方案中，该多肽还包含SEQ ID NO:28的信号肽或所属领域中已知的任何其它信号肽。在一些实施方案中，该序列同一性为至少80％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少90％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少95％。在一些实施方案中，该序列同一性为100％。
SEQ ID NO:39
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGR REEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALH MQALPPR
(…ITAM1…ITAM2…ITAM3…)
SEQ ID NO:40
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLG RREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDAL HMQALPPR
(…ITAM1…ITAM2…ITAM3…)
SEQ ID NO:41
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
(…ITAM1…ITAM2…ITAM3…)
SEQ ID NO:42
DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVGSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGSQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQ KDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
(CD3ε-接头-CD3γ-CD28-CD3ζ(…ITAM1…ITAM2…ITAM3…))
SEQ ID NO:43
DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVGSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGSFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSE IGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
(CD3ε-接头-CD3δ-CD28-CD3ζ(…ITAM1…ITAM2…ITAM3…))
如本文所证明的，研究发现当在为TCRneg的细胞中表达时，如本文所提供的CD3嵌合链能够在细胞表面呈递嵌合CD3胞外域，其中该CD3嵌合链是包含以下的融合蛋白：全部或部分长度的CD3ε胞外域、CD3δ和CD3γ中的至少一者的全部或部分长度的胞外域，以及包含至少一个ITAM和任选的一个或多个信号传导域的CD3ζ胞内域。此外，CD3胞外域的细胞表面表达使得CD3结合能够通过融合的CD3ζ胞内域来触发信号转导，同时不具有肽-MHC结合潜能。
因此，考虑到设计5，本文提供了细胞或其群体，其中该细胞是iPSC、克隆iPSC、克隆iPS细胞系或由iPSC分化获得的衍生细胞；并且该细胞包含：内源TCRα恒定区和内源TCRβ恒定区中的至少一者处的破坏，以及编码CD3嵌合链融合蛋白(ccCD3)的至少一个外源多核苷酸，其中该融合蛋白包含CD3ε的全部或部分长度的胞外域、CD3δ和CD3γ中的任一者的全部或部分长度的胞外域，以及具有至少一个ITAM和任选的一个或多个信号传导域的CD3ζ的全部或部分长度的胞内域，其中当表达时，CD3嵌合链的胞外域在细胞表面(cs-CD3)呈递。
本文还提供了iPSC或iPSC衍生的细胞，其包含编码一种或多种外源蛋白的一种或多种多核苷酸以在表达时提供细胞表面CD3复合体或其一个或多个亚基或亚结构域(cs-CD3)，其中该细胞任选地为TCR阴性。当cs-CD3表达时，其作为与CD3相关的细胞表面触发受体发挥作用。在其中将与CD3相关的表面触发受体设置在TCRneg细胞中的一些实施方案中，该受体被包含在当表达时在效应细胞表面呈递的完整或部分内源CD3分子中，其中该内源CD3分子呈递即使在表达时也不会以其它方式发生在TCRneg细胞中，并且该过程通过使该受体与包含以下的重组TCR进行缔合来实现：如本文所提供的全部或部分长度的外源TCRα、外源TCRβ以及它们的任何变体中的一者或多者。在一些实施方案中，通过在所述细胞中另外表达至少一个重组TCR(包括非结合性重组TCR(nb-rTCR)、定义的重组TCR(d-rTCR)和/或重组前TCR)，可在TCRneg细胞中实现完整或部分内源CD3分子的细胞表面呈递。
在一些实施方案中，包含与CD3相关的表面触发受体的TCRneg细胞包含非结合性重组TCR(nb-rTCR)，其中该nb-rTCR包含tgTRAC(转基因TCRα恒定区)和tgTRBC(转基因TCRβ恒定区)中的一者或两者；因此，TCRneg iPSC或iPSC衍生的细胞包含编码tgTRAC和/或tgTRBC的一个或多个多核苷酸。在包含编码tgTRAC的多核苷酸的TCRneg细胞的一些实施方案中，将所述多核苷酸插入TRAC基因座中，其中所插入的多核苷酸破坏了内源TRAC的表达，从而导致内源TCR敲除，并且任选地其中所插入的多核苷酸由TRAC的内源启动子或异源启动子驱动。在包含编码tgTRBC的多核苷酸的TCRneg细胞的一些实施方案中，将所述多核苷酸插入TRBC基因座中，其中所插入的多核苷酸破坏了内源TRBC的表达，从而导致内源TCR敲除，并且任选地其中所插入的多核苷酸由TRBC的内源启动子或异源启动子驱动。
在一些实施方案中，包含与CD3相关的表面触发受体的TCRneg细胞包含定义的重组TCR(d-rTCR)，其中该d-rTCR包含tgTCRα(转基因TCRα)和tgTCRβ(转基因TCRβ)，其中tgTCRα和tgTCRβ中的每一者除了包含相应恒定区(即TRAC和TRBC)之外还包含相应的定义可变区；因此，TCRneg iPSC或iPSC衍生的细胞包含编码tgTCRα和/或tgTCRβ的一个或多个多核苷酸。在一些实施方案中，该定义可变区源自具有已知TCR特异性的T细胞的TCRα和TCRβ。在一些实施方案中，该定义可变区源自不变NKT细胞的TCRα和TCRβ。在包含编码tgTCRα的多核苷酸的TCRneg细胞的一些实施方案中，将所述多核苷酸插入TRAC基因座中，其中所插入的多核苷酸破坏了内源TRAC的表达，从而导致内源TCR敲除，并且任选地其中所插入的多核苷酸由TRAC的内源启动子或异源启动子驱动。在包含编码tgTCRβ的多核苷酸的TCRneg细胞的一些实施方案中，将所述多核苷酸插入TRBC基因座中，其中所插入的多核苷酸破坏了内源TRBC的表达，从而导致内源TCR敲除，并且任选地其中所插入的多核苷酸由TRBC的内源启动子或异源启动子驱动。
在一些实施方案中，包含与CD3相关的表面触发受体的TCRneg细胞包含重组前TCR(p-rTCR)，其中该p-rTCR包含tgpTCRα(转基因前TCRα)和任选的tgTRBC或tgTCRβ，其中该tgTCRβ包含定义可变区；因此，TCRneg iPSC或iPSC衍生的细胞包含编码tgpTCRα的至少一个多核苷酸。在包含编码tgpTCRα的多核苷酸的TCRneg细胞的一些实施方案中，将所述多核苷酸插入TRAC基因座中，其中所插入的多核苷酸破坏了内源TRAC的表达，从而导致内源TCR敲除，并且任选地其中所插入的多核苷酸由TRAC的内源启动子或异源启动子驱动。在包含除了编码tgpTCRα之外还编码tgTRBC或tgTCRβ的多核苷酸的TCRneg细胞的一些实施方案中，将所述编码tgTRBC或tgTCRβ的多核苷酸插入TRBC基因座中，其中所插入的多核苷酸破坏了内源TRBC的表达，从而导致内源TCR敲除，并且任选地其中所插入的编码tgTRBC或tgTCRβ的多核苷酸由TRBC的内源启动子或异源启动子驱动。
在TCRneg细胞中的与CD3相关的表面触发受体的一些实施方案中，该受体被包含在完整或部分CD3分子中，该完整或部分CD3分子包含来自CD3ε、CD3δ和CD3γ中的一者或多者的至少一个外源亚基或亚结构域。在一个实施方案中，用于TCRneg细胞中衔接子识别的与CD3相关的表面触发受体被包含在部分CD3分子中，该部分CD3分子至少包含CD3ε的全部或部分长度的胞外域。在一个实施方案中，用于TCRneg细胞中衔接子识别的与CD3相关的表面触发受体被包含在部分CD3分子中，该部分CD3分子至少包含CD3ε的全部或部分长度的胞外域，并且另外包含CD3γ或CD3δ的全部或部分长度的胞外域。在一个实施方案中，所述CD3分子至少包含CD3ε、CD3γ和/或CD3δ的全部或部分长度的胞外域，其中该全部或部分长度的胞外域是与TCRα或TCRβ的恒定区融合的，并且其中各自包含TRAC或TRBC的部分融合蛋白能够与内源CD3ζ形成异源二聚体。因此，在具有与CD3相关的表面触发受体的TCRneg iPSC或iPSC衍生的细胞的一个实施方案中，该细胞包含以下中的至少一者：(i)包含CD3ε和CD3δ的全部或部分长度的胞外域以及TCRα恒定区的转基因融合蛋白(tgCD3(ε-δ)-TRAC)；(ii)包含CD3ε和CD3γ的全部或部分长度的胞外域以及TCRβ恒定区的转基因融合蛋白(tgCD3(ε-γ)-TRBC)；(iii)包含CD3ε和CD3γ的全部或部分长度的胞外域以及TCRα恒定区的转基因融合蛋白(tgCD3(ε-γ)-TRAC)；和/或(iv)包含CD3ε和CD3δ的全部或部分长度的胞外域以及TCRβ恒定区的转基因融合蛋白(tgCD3(ε-δ)-TRBC)。在具有与CD3相关的表面触发受体的TCRneg细胞的一些实施方案中，该细胞包含异源二聚体，该异源二聚体包含两种转基因融合蛋白，其中一种转基因融合蛋白包含与至少CD3ε的全部或部分长度的胞外域融合的TCRα恒定区，另一种转基因融合蛋白包含与至少CD3ε的全部或部分长度的胞外域融合的TCRβ恒定区。
除了图2A至图2C的针对TCRneg细胞中的细胞表面CD3复合体或其一个或多个亚基或亚结构域(cs-CD3)的各种设计之外，如本文所述的基于CD3的CFR还可充当与CD3相关的细胞表面触发受体以用于结合分子，这些分子包括但不限于CD3特异性抗体、CD3-CAR和/或靶向CD3的衔接子，这些分子在下文进一步描述。如进一步提供的，包含编码CFR和TCRneg的多核苷酸的细胞或其群体还可包含以下中的一者或多者：cs-CD3；CD16或变体敲入；CAR；外源细胞因子或其融合变体；B2M敲除或敲落(例如，得到HLA-缺乏)；CIITA敲除或敲落(例如，得到HLA-II缺乏)；引入HLA-G或不可裂解的HLA-G；CD38敲除；以及本文所述的附加工程改造模式。本文还提供了主细胞库，其包含经单细胞分选和扩增的克隆工程改造的iPSC，该iPSC具有如本文所提供的至少一种表型，该至少一种表型包括但不限于CFR、TCRneg、CD16、CAR、CD38阴性、外源细胞因子或其融合变体、B2M-/-、CIITA-/-、HLA-G以及它们的任何组合。
3.CD16敲入
CD16已鉴别为两种异构体：Fc受体FcγRIIIa(CD16a；NM_000569.6)和FcγRIIIb(CD16b；NM_000570.4)。CD16a是由NK细胞表达的跨膜蛋白，其结合附接到靶细胞的单体IgG以激活NK细胞和促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。CD16b仅由人类嗜中性粒细胞表达。如本文所用，“高亲和力CD16”、“不可裂解的CD16”或“不可裂解的高亲和力CD16”是指各种CD16变体。野生型CD16具有低亲和力并且经历包括胞外域脱落的下调，这是一种蛋白水解裂解过程，该过程在NK细胞活化后调控白细胞上的多种细胞表面分子的细胞表面密度。F176V(在一些出版物中也被称为F158V)是具有高亲和力的示例性CD16多态性等位基因/变体；而S197P变体是基因工程改造的CD16的不可裂解型式的示例。包含F176V和S197P两者的工程改造的CD16变体具有高亲和力并且是不可裂解的，该变体被更详细地描述于国际公布号WO2015/148926中，该文献的完整公开内容以引用方式并入本文中。另外，CD16的胞外域基本上被CD64胞外域的至少一部分置换的嵌合CD16受体还可实现能够进行ADCC的CD16受体所需的高亲和力和不可裂解特征。在一些实施方案中，嵌合CD16的置换胞外域包含以下中的一种或多种：CD64的EC1、EC2和EC3外显子(UniPRotKB_P12314或其异构体或多态变体)。
因此，引入细胞的外源CD16的各种实施方案包括功能性CD16变体及其嵌合受体。在一些实施方案中，功能性CD16变体是不可裂解的高亲和力CD16受体(hnCD16)。在一些实施方案中，hnCD16包含F176V和S197P两者；并且在一些实施方案中包含F176V，并且消除了裂解区域。在一些其它实施方案中，hnCD16包含与示例性序列SEQ ID NO:7、8和9中的任一者相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间任何百分比的同一性的序列，这些示例性序列各自包含CD64胞外域的至少一部分。在一些实施方案中，该序列同一性为至少80％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少90％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少95％。在一些实施方案中，该序列同一性为100％。SEQ ID NO:7、8和9分别由例如SEQ ID NO:10-12编码。如本文和整个本申请中所用，考虑需要引入以对两个序列进行最佳比对的间隙数目和每个间隙的长度，两个序列之间的同一性百分比是序列共享的一致位置数目的函数(即，同一性％＝一致位置数/位置总数×100)。序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定可以使用所属领域中公认的数学算法实现。
SEQ ID NO:7：
MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPS YRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKF FHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGL QLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLQLPTPVWFHYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
(340个氨基酸基于CD64结构域的构造；CD16TM；CD16ICD)
SEQ ID NO:8
MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPS YRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKF FHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGL QLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
(336个氨基酸基于CD64外显子的构造；CD16TM；CD16ICD)
SEQ ID NO:9
MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNG
TATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPL
ALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAG
ISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSFYMGSKTLRGRN
TSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGFFPPGYQVSFCLVMVLLF
AVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
(335个氨基酸基于CD64外显子的构造；CD16TM；CD16ICD)
SEQ ID NO:10
/>
SEQ ID NO:11
SEQ ID NO:12
/>
因此，本文提供了效应细胞或iPSC，其经基因工程改造以在如本文所涵盖和描述的其它编辑中包含外源CD16或其变体，其中这些效应细胞是来自原代来源或衍生自iPSC分化的细胞，或者其中这些经基因工程改造的iPSC能够分化成衍生的效应细胞，这些衍生的效应细胞包含引入iPSC的外源CD16。在一些实施方案中，外源CD16是不可裂解的高亲和力CD16受体(hnCD16)。在一些实施方案中，外源CD16包含CD64胞外域的至少一部分。在一些实施方案中，外源CD16呈基于CD16的嵌合Fc受体(CFcR)的形式，该受体包含并非衍生自CD16的跨膜域、刺激域和/或信号传导域。
在一些实施方案中，包含外源CD16或其变体的原代来源或衍生的效应细胞是NK谱系细胞。在一些实施方案中，包含外源CD16或其变体的原代来源或衍生的效应细胞是T谱系细胞。在一些实施方案中，外源CD16包括hnCD16。在一些实施方案中，hnCD16包含全部或部分长度的CD64胞外域。在一些实施方案中，包含在iPSC或效应细胞中的外源CD16或其功能性变体在与配体结合时具有高亲和力，该配体在这种结合后触发下游信号传导。与外源CD16或其功能性变体结合的配体的非限制性示例不仅包括ADCC抗体或其片段，而且还包括识别所述外源CD16的CD16或CD64胞外结合域的双特异性、三特异性或多特异性衔接子或结合子。双特异性、三特异性或多特异性衔接子或结合子的示例进一步描述于本申请的下文中。因此，在本申请的各方面中的至少一个方面提供了衍生效应细胞或其细胞群，其通过使在效应细胞上表达的外源CD16以足以用于治疗如本申请中进一步详述的病况、疾病或感染的治疗用途的量来预负载有一种或多种预选ADCC抗体，其中所述外源CD16包含CD64的胞外结合域或包含具有F176V和S197P的CD16的胞外结合域。
在一些其它实施方案中，外源CD16包含基于CD16或其变体的CFcR。通过修饰或置换原生CD16转膜域/或胞内域，产生包含非原生跨膜域、非原生刺激域和/或非原生信号传导域的嵌合Fc受体(CFcR)。本文所用的术语“非原生”意指除了提供胞外域的受体之外，跨膜域、刺激域或信号传导域衍生自不同受体。在本文的说明中，基于CD16或其变体的CFcR不具有衍生自CD16的跨膜域、刺激域或信号传导域。在一些实施方案中，基于外源CD16的CFcR包含衍生自以下的非原生跨膜域：CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或T细胞受体多肽。在一些实施方案中，基于外源CD16的CFcR包含衍生自以下的非原生刺激域/抑制域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4或NKG2D多肽。在一些实施方案中，基于外源CD16的CFcR包含衍生自以下的非原生信号传导域：CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(4-1BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C或NKG2D多肽。在基于CD16的CFcR的一个实施方案中，所提供的嵌合Fc受体包括两者均衍生自以下中的一者的跨膜域和信号传导域：IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C或NKG2D多肽。基于CD16的嵌合Fc受体的一个特定示例性实施方案包含NKG2D的跨膜域、2B4的刺激域和CD3ζ的信号传导域；其中CFcR的胞外域衍生自CD64或CD16的胞外域的全长或部分序列，并且其中CD16的胞外域包含F176V和S197P。基于CD16的嵌合Fc受体的另一个示例性实施方案包含CD3ζ的跨膜域和信号传导域；其中CFcR的胞外域衍生自CD64或CD16的胞外域的全长或部分序列，并且其中CD16的胞外域包含F176V和S197P。
如上所述的基于CD16的嵌合Fc受体的各种实施方案能够以高亲和力结合到抗体或其片段的Fc区；或者结合到双特异性、三特异性或多特异性衔接子或结合子。结合后，嵌合受体的刺激域和/或信号传导域实现效应细胞的激活和细胞因子分泌，并且杀死抗体或具有肿瘤抗原结合性组分以及Fc区的所述双特异性、三特异性或多特异性衔接子或结合子靶向的肿瘤细胞。在不受理论限制的情况下，通过非原生跨膜域、刺激域和/或信号传导域，或通过结合于基于CD16的嵌合Fc受体的胞外域的衔接子，CFcR可有助于效应细胞的杀伤能力，同时提高效应细胞的增殖和/或扩增潜能。抗体和衔接子可使表达抗原的肿瘤细胞和表达CFcR的效应细胞紧密接近，这还有助于增强对肿瘤细胞的杀伤。双特异性、三特异性、多特异性衔接子或结合子的示例性肿瘤抗原包括但不限于B7H3、BCMA、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、PSMA、PAMA、P-钙粘素和ROR1。适于在攻击肿瘤细胞时接合表达基于CD16的CFcR的效应细胞的一些非限制性示例性双特异性、三特异性、多特异性衔接子或结合子包括CD16(或CD64)-CD30、CD16(或CD64)-BCMA、CD16(或CD64)-IL15-EPCAM和CD16(或CD64)-IL15-CD33。
不同于在NK细胞激活之后由细胞表面裂解的原代NK细胞表达的内源CD16，在衍生NK细胞中的CD16的以各种不可裂解型式避免CD16脱落并维持恒定表达。在衍生NK细胞中，不可裂解的CD16增加TNFα和CD107a的表达，表明细胞功能得到改善。不可裂解的CD16还增强了抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)以及双特异性、三特异性或多特异性衔接子的接合。ADCC是通过将CD16结合到抗体涂布的靶细胞的NK细胞介导的裂解的机制。在向需要细胞疗法的受试者施用细胞之前，衍生NK细胞中引入的hnCD16的另外高亲和力特性还允许通过hnCD16将ADCC抗体体外负载到NK细胞。如本文所提供的，hnCD16可在一些实施方案中包含F176V和S197P，或可包含源自如SEQ ID NO:7、8或9所示例的CD64的全部或部分长度的胞外域，或者还可包含非原生跨膜域、刺激域和信号传导域中的至少一者。如所公开，本申请还提供了衍生NK细胞或其细胞群，其以足以用于治疗如本申请中进一步详述的病况、疾病或感染的治疗用途的量来预负载有一种或多种预选ADCC抗体。
不同于原代NK细胞，来自原代来源(即，自然/原生来源，例如外周血、脐带血或其它供体组织)的成熟T细胞不表达CD16。出人意料的是，包含所表达的外源不可裂解的CD16的iPSC不损害T细胞发育生物学，并且能够分化成功能性衍生T谱系细胞，这些功能性衍生T谱系细胞不仅表达外源CD16，而且能够通过获得性ADCC机制执行功能。衍生T谱系细胞中的这种获得性ADCC可另外用作双重靶向和/或挽救伴随CAR-T细胞疗法常出现的抗原逃逸的方法，其中肿瘤随着靶向CAR-T的抗原表达或突变抗原表达减少或损失以避免被CAR(嵌合抗原受体)识别而复发。当所述衍生T谱系细胞通过外源CD16(包括功能性变体和基于CD16的CFcR)表达包含获得性ADCC时，并且当抗体靶向与CAR靶向的抗原不同的肿瘤抗原时，抗体可用于挽救CAR-T抗原逃逸并且减少或防止CAR-T治疗中常见的靶向肿瘤的复发或再现。减少和/或防止抗原逃逸同时实现双靶向的这一策略同样适用于表达一种或多种CAR的NK细胞。下文的进一步叙述可用于这一抗原逃逸减少和防止策略的各种CAR。
因此，本发明提供了包含外源CD16的衍生T谱系细胞。在一些实施方案中，包含在衍生T谱系细胞中的CD16是包含CD16胞外域的hnCD16，该CD16胞外域包含F176V和S197P。在一些其它实施方案中，包含在衍生T谱系细胞中的hnCD16包含源自如SEQ ID NO:7、8或9所例示的CD64的全部或部分长度的胞外域；或者还可包含非原生跨膜域、刺激域和信号传导域中的至少一者。如本文所解释，此类衍生T谱系细胞具有获得性机制以用由ADCC介导的单克隆抗体靶向肿瘤，从而增强抗体的治疗效果。如所公开，本申请还提供了衍生T谱系细胞或其细胞群，其以足以用于治疗如下文进一步详述的病况、疾病或感染的治疗用途的量来预负载有一种或多种预选ADCC抗体。
本申请中另外提供了主细胞库，其包含经单细胞分选和扩增的克隆工程改造的iPSC，该iPSC具有如本文所提供的至少一种表型，该至少一种表型包括但不限于外源CD16，其中该细胞库提供了用于附加iPSC工程改造的平台和用于制造现成的、工程改造的、同质的细胞疗法产品的可再生来源，包括但不限于衍生NK细胞和T细胞，该衍生NK细胞和T细胞在组成上是明确定义的且均一的，并且可以成本有效的方式大规模生产。
4.嵌合抗原受体(CAR)表达
适用于基因工程改造的iPSC和其衍生效应细胞的可以是所属领域中已知的任何CAR设计。CAR是融合蛋白，其通常包含胞外域、跨膜域和胞内域，该胞外域包含抗原识别区。在一些实施方案中，胞外域还可包括信号肽或前导序列和/或间隔子。在一些实施方案中，胞内域还可包含信号传导肽，其活化表达CAR的效应细胞。在一些实施方案中，抗原识别结构域可特异性结合抗原。在一些实施方案中，抗原识别结构域可特异性结合与疾病或病原体相关的抗原。在一些实施方案中，与疾病相关的抗原是肿瘤抗原，其中该肿瘤可以是液体瘤或实体瘤。在一些实施方案中，CAR适于激活表达所述CAR的T谱系细胞或NK谱系细胞。在一些实施方案中，CAR是对包含NK特异性信号传导组分具有特异性的NK细胞。在某些实施方案中，所述T细胞衍生自表达CAR的iPSC，并且衍生T谱系细胞可包含T辅助细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调控T细胞、自然杀伤T细胞、αβT细胞、γδT细胞或它们的组合。在某些实施方案中，所述NK细胞衍生自表达CAR的iPSC。
在某些实施方案中，所述抗原识别区包含鼠抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼Ig、只有重链的鲨鱼抗体(VNAR)、Ig NAR、嵌合抗体、重组抗体或它们的抗体片段。抗体片段的非限制性示例包括Fab、Fab′、F(ab′)2、F(ab′)3、Fv、单链抗原结合性片段(scFv)、(scFv)2、二硫键稳定的Fv(dsFv)、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、单域抗原结合性片段(sdAb，纳米抗体)、只有重链的重组抗体(VHH)和维持全部抗体的结合特异性的其它抗体片段。可由CAR靶向的抗原的非限制性示例包括ADGRE2、碳酸酐酶IX(CAIX)、CCR1、CCR4、癌胚抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CD269(BCMA)、CDS、CLEC12A、巨细胞病毒(CMV)感染的细胞的抗原(例如，细胞表面抗原)、上皮糖蛋白-2(EGP-2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、EGFRvIII、受体酪氨酸-蛋白激酶erb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB叶酸结合性蛋白(FBP)、胎儿型乙酰胆碱受体(AChR)、叶酸受体α、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、人类表皮生长因子受体2(HER2)、人类端粒酶逆转录酶(hTERT)、ICAM-1、整合素B7、白细胞介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)、κ-轻链、激酶插入结构域受体(KDR)、Lewis A(CA19.9)、Lewis Y(LeY)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、LILRB2、黑色素瘤抗原家族A1(MAGE-A1)、MICA/B、粘蛋白1(Muc-1)、粘蛋白16(Muc-16)、间皮素(MSLN)、NKCSI、NKG2D配体、c-Met、癌症-睾丸抗原NY-ESO-1、癌胚抗原(h5T4)、PRAME、前列腺干细胞抗原(PSCA)、PRAME前列腺特异性膜抗原(PSMA)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、TIM-3、TRBC1、TRBC2、血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)、威尔姆斯肿瘤蛋白(WT-1)和所属领域中已知的各种病原体抗原。病原体的非限制性示例包括能够引起疾病的病毒、细菌、真菌、寄生虫和原虫。
在一些实施方案中，CAR的跨膜域包含CD3D、CD3E、CD3G、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或T细胞受体多肽的原生或修饰的跨膜区的全长或至少一部分。
在一些实施方案中，胞内域(endodomain/intracellular domain)的信号传导肽包含CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(4-1BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C或NKG2D的多肽的全长或至少一部分。在一个实施方案中，CAR的信号传导肽包含与CD3ζ的至少一种ITAM(基于免疫受体酪氨酸的激活基序)具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述胞内域还包含至少一个共刺激信号传导区。所述共刺激信号传导区可包含CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4或NKG2D或它们的任何组合的多肽的全长或至少一部分。
在一个实施方案中，适用于本文所提供的细胞的CAR包含衍生自CD28的共刺激域和包含原生或修饰的CD3ζ的ITAM1的信号传导域，该CD3ζ由与SEQ ID NO:13具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列表示。在另一个实施方案中，包含衍生自CD28的共刺激域和CD3ζ的原生或修饰的ITAM1的CAR还包含衍生自CD28的铰链域和跨膜域，其中scFv可通过该铰链连接到该跨膜域，并且CAR包含与SEQ IDNO:14具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该序列同一性为至少80％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少90％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少95％。在一些实施方案中，该序列同一性为100％。
SEQ ID NO:13
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQ
LYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGE
RRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR
(153个氨基酸CD28共刺激+CD3ζITAM)
SEQ ID NO:14
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVA
FIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAY
QQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSE
IGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR
(219个氨基酸CD28铰链+CD28 TM+CD28共刺激+CD3ζITAM)
在另一个实施方案中，适用于本文所提供的细胞的CAR包含衍生自NKG2D的跨膜域、衍生自2B4的共刺激域和包含原生或修饰的CD3ζ的信号传导域，该CD3ζ由与SEQ ID NO:15具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列表示。包含衍生自NKG2D的跨膜域、衍生自2B4的共刺激域和包含原生或修饰的CD3ζ的信号传导域的所述CAR还可包含CD8铰链，其中此类结构的氨基酸序列与SEQ ID NO:16具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性。在一些实施方案中，该序列同一性为至少80％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少90％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少95％。在一些实施方案中，该序列同一性为100％。
SEQ ID NO:15
SNLFVASWIAVMIIFRIGMAVAIFCCFFFPSWRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKT
RRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNS
TIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRR
EEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGL
YQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
(263个氨基酸的NKG2D TM+2B4+CD3ζ)
SEQ ID NO:16
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDSNLFVASWIAVMIIF
RIGMAVAIFCCFFFPSWRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGS
TIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTIYEVIGKSQPKAQN
PARLSRKELENFDVYSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPE
MGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDAL
HMQALPPR
(308个氨基酸的CD8铰链+NKG2D TM+2B4+CD3ζ)
非限制性CAR策略还包括：异源二聚体，其通过使一对胞内域二聚化而有条件地激活CAR(参见例如，美国专利号9,587,020)；分离CAR，其中使抗原结合域、铰链域和胞内域进行同源重组以生成CAR(参见例如，美国公布号2017/0183407)；多链CAR，其允许分别连接到抗原结合域和信号传导域的两个跨膜域之间的非共价连接(参见例如，美国公布号2014/0134142)；CAR，其具有双特异性抗原结合域(参见例如，美国专利号9,447,194)，或具有识别相同或不同抗原或表位的一对抗原结合域(参见例如，美国专利号8,409,577)，或串联CAR(参见例如，Hegde等人，J Clin Invest.2016年；第126卷，第8期，第3036-3052页)；诱导性CAR(参见例如，美国公布号2016/0046700、2016/0058857、2017/0166877)；可切换的CAR(参见例如，美国公布号2014/0219975)；以及所属领域中已知的任何其它设计。
因此，本发明的各方面提供了由基因组工程改造的iPSC分化获得的衍生细胞，其中iPSC和衍生细胞两者都包含一种或多种CAR以及另外的经修饰模式。本申请中另外提供了主细胞库，其包含经单细胞分选和扩增的克隆工程改造的iPSC，该iPSC具有至少CFR、CAR以及TCRneg和外源CD16中的一者或两者，其中该细胞库提供了用于附加iPSC工程改造的平台和用于制造现成的、工程改造的、同质的细胞疗法产品的可再生来源。
在另一个实施方案中，包含CFR和CAR的iPSC及其衍生效应细胞具有插入到TCR恒定区中的CAR，导致TCR敲除，从而将CAR表达置于内源TCR启动子的控制下。附加插入位点包括但不限于AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT。在一些实施方案中，衍生自工程改造的iPSC的TCRneg/CAR/CFR T细胞还包含外源CD16，该外源CD16具有对于CD16原生的胞外域(F176V和/或S197P)或衍生自CD64的胞外域，以及原生或非原生跨膜域、刺激域和信号传导域。在另一个实施方案中，iPSC及其衍生NK细胞包含CFR和CAR，其中该CAR被插入到NKG2A基因座或NKG2D基因座中，导致NKG2A或NKG2D敲除，从而将CAR表达置于内源NKG2A或NKG2D启动子的控制下。
5.外源引入的细胞因子和/或细胞因子信号传导
通过避免全身性高剂量施用临床上相关细胞因子，降低了由于这种实践导致的剂量限制性毒性的风险，同时建立了细胞因子介导的细胞自主性。为了在不需要另外施用可溶性细胞因子的情况下实现淋巴细胞自主性，可将IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21和/或它们的相应受体中的一者或多者的部分或全长肽引入细胞中，以在有或没有表达细胞因子本身的情况下实现细胞因子信号传导，从而维持或改善细胞生长、增殖、扩增和/或效应功能，并且降低细胞因子毒性的风险。在一些实施方案中，在细胞表面上表达用于细胞因子信号传导的所引入细胞因子和/或其相应原生或修饰的受体。在一些实施方案中，组成性地激活细胞因子信号传导。在一些实施方案中，细胞因子信号传导的激活是诱导性的。在一些实施方案中，细胞因子信号传导的激活是瞬时的和/或暂时的。
图3示出了IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18或IL21的几种构建体设计，使用IL15作为说明性示例。图3中的设计中的任一种设计的跨膜(TM)域对于IL15受体可以是原生的，或可被任何其它膜结合的蛋白的跨膜域修饰或置换。
如图3所示，设计1提供了IL15和IL15Rα通过使用自裂解肽共表达，模拟IL15的反式呈递而不消除IL15的顺式呈递。
如图3的设计2所示，IL15Rα通过接头在C端与IL15融合，模拟反式呈递而不消除IL15的顺式呈递并且确保IL15膜结合。
如图3的设计3所示，具有截短胞内域的IL15Rα在C端通过接头与IL15融合，模拟反式呈递IL15，维持IL15膜结合，并且另外消除由正常IL15R通过其胞内域介导的顺式呈递和/或任何其它潜在信号转导途径。IL15Rα的胞内域已被认为对于在IL15响应细胞中表达并且对于响应细胞扩增和起作用的受体是关键的。这类截短构建体包含与SEQ ID NO:17具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列，其可由SEQ ID NO:18表示的示例性核酸序列编码。在截短IL15/IL15Rα的一个实施方案中，构建体不包含SEQ ID NO:17的最后4个氨基酸残基“KSRQ”，并且包含与SEQ ID NO:21具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该序列同一性为至少80％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少90％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少95％。在一些实施方案中，该序列同一性为100％。
SEQ ID NO:17
MDWTWILFLVAAATRVHSGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDA
TLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTES
GCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITC
PPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKC
IRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLM
PSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTV
LLCGLSAVSLLACYLKSRQ
(379个氨基酸；信号传导和接头肽带下划线)
SEQ ID NO:18
ATGGACTGGACCTGGATTCTGTTCCTGGTCGCGGCTGCAACGCGAGTCCATAGCGGTATC
CATGTTTTTATTCTTGGGTGTTTTTCTGCTGGGCTGCCTAAGACCGAGGCCAACTGGGTA
AATGTCATCAGTGACCTCAAGAAAATAGAAGACCTTATACAAAGCATGCACATTGATGCT
ACTCTCTACACTGAGTCAGATGTACATCCCTCATGCAAAGTGACGGCCATGAAATGTTTC
CTCCTCGAACTTCAAGTCATATCTCTGGAAAGTGGCGACGCGTCCATCCACGACACGGTC
GAAAACCTGATAATACTCGCTAATAATAGTCTCTCTTCAAATGGTAACGTAACCGAGTCA
GGTTGCAAAGAGTGCGAAGAGTTGGAAGAAAAAAACATAAAGGAGTTCCTGCAAAGTTTC
GTGCACATTGTGCAGATGTTCATTAATACCTCTAGCGGCGGAGGATCAGGTGGCGGTGGA
AGCGGAGGTGGAGGCTCCGGTGGAGGAGGTAGTGGCGGAGGTTCTCTTCAAATAACTTGT
CCTCCACCGATGTCCGTAGAACATGCGGATATTTGGGTAAAATCCTATAGCTTGTACAGC
CGAGAGCGGTATATCTGCAACAGCGGCTTCAAGCGGAAGGCCGGCACAAGCAGCCTGACC
GAGTGCGTGCTGAACAAGGCCACCAACGTGGCCCACTGGACCACCCCTAGCCTGAAGTGC
ATCAGAGATCCCGCCCTGGTGCATCAGCGGCCTGCCCCTCCAAGCACAGTGACAACAGCT
GGCGTGACCCCCCAGCCTGAGAGCCTGAGCCCTTCTGGAAAAGAGCCTGCCGCCAGCAGC
CCCAGCAGCAACAATACTGCCGCCACCACAGCCGCCATCGTGCCTGGATCTCAGCTGATG
CCCAGCAAGAGCCCTAGCACCGGCACCACCGAGATCAGCAGCCACGAGTCTAGCCACGGC
ACCCCATCTCAGACCACCGCCAAGAACTGGGAGCTGACAGCCAGCGCCTCTCACCAGCCT
CCAGGCGTGTACCCTCAGGGCCACAGCGATACCACAGTGGCCATCAGCACCTCCACCGTG
CTGCTGTGTGGACTGAGCGCCGTGTCACTGCTGGCCTGCTACCTGAAGTCCAGACAGTGA
(1140个核酸)
SEQ ID NO:21
MDWTWILFLVAAATRVHSGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDA
TLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTES
GCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITC
PPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKC
IRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLM
PSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTV
LLCGLSAVSLLACYL
(375个氨基酸；信号传导和接头肽带下划线)
所属领域的普通技术人员将理解，上述信号肽和接头序列是说明性的，并且绝不限制适用作信号肽或接头的其变体。存在许多所属领域的技术人员已知和可用的合适信号肽或接头序列。应当理解，信号肽和/或接头序列可被另一序列取代而不改变由信号肽引导或由接头连接的功能肽的活性。
由于设计3的构建体被证明在促进效应细胞存活和扩增中发挥作用，因此图3的设计4证明可省略IL15Rα的胞质域，而不会对此类设计中配备有IL15的效应细胞的自主特征产生负面影响。因此，设计4是提供了设计3的另一可行替代方案的构建体，该构建体除寿司域以外基本上去除了整个IL15Rα，其在一端与IL15融合，并且在另一端(mb-寿司)与跨膜域融合，任选地利用寿司域与跨膜域之间的接头。融合IL15/mb-寿司通过任何膜结合的蛋白的跨膜域在细胞表面上表达。在例如设计4的构建体的情况下，在只保留所期望的IL15的反式呈递时，消除通过IL15Rα的不必要的信号传导，包括顺式呈递。在一些实施方案中，包含与寿司域融合的IL15的组分包含与SEQ ID NO:19具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列，其可由SEQ ID NO:20表示的示例性核酸序列编码。在一些实施方案中，该序列同一性为至少80％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少90％。在一些实施方案中，该序列同一性为至少95％。在一些实施方案中，该序列同一性为100％。
SEQ ID NO:19
MDWTWILFLVAAATRVHSGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDA
TLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTES
GCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITC
PPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKC
IR
(242个氨基酸信号传导和接头肽带下划线)
SEQ ID NO:20
ATGGACTGGACCTGGATTCTGTTCCTGGTCGCGGCTGCAACGCGAGTCCATAGCGGTATC
CATGTTTTTATTCTTGGGTGTTTTTCTGCTGGGCTGCCTAAGACCGAGGCCAACTGGGTA
AATGTCATCAGTGACCTCAAGAAAATAGAAGACCTTATACAAAGCATGCACATTGATGCT
ACTCTCTACACTGAGTCAGATGTACATCCCTCATGCAAAGTGACGGCCATGAAATGTTTC
CTCCTCGAACTTCAAGTCATATCTCTGGAAAGTGGCGACGCGTCCATCCACGACACGGTC
GAAAACCTGATAATACTCGCTAATAATAGTCTCTCTTCAAATGGTAACGTAACCGAGTCA
GGTTGCAAAGAGTGCGAAGAGTTGGAAGAAAAAAACATAAAGGAGTTCCTGCAAAGTTTC
GTGCACATTGTGCAGATGTTCATTAATACCTCTAGCGGCGGAGGATCAGGTGGCGGTGGA
AGCGGAGGTGGAGGCTCCGGTGGAGGAGGTAGTGGCGGAGGTTCTCTTCAAATAACTTGT
CCTCCACCGATGTCCGTAGAACATGCGGATATTTGGGTAAAATCCTATAGCTTGTACAGC
CGAGAGCGGTATATCTGCAACAGCGGCTTCAAGCGGAAGGCCGGCACAAGCAGCCTGACC
GAGTGCGTGCTGAACAAGGCCACCAACGTGGCCCACTGGACCACCCCTAGCCTGAAGTGC
ATCAGA
(726个核酸)
所属领域的普通技术人员将理解，上述信号肽和接头序列是说明性的，并且绝不限制适用作信号肽或接头的其变体。存在许多所属领域的技术人员已知和可用的合适信号肽或接头序列。应当理解，信号肽和/或接头序列可被另一序列取代而不改变由信号肽引导或由接头连接的功能肽的活性。
如图3的设计5所示，原生或修饰的IL15Rβ通过接头在C端与IL15融合，实现组成性信号传导并且维持IL15膜结合和反式重呈递。
如图3的设计6所示，原生或修饰的共同受体γC通过接头在C端与IL15融合以用于细胞因子的组成性信号传导和膜结合的反式呈递。共同受体γC也被称为共同γ链或CD132，也称为IL2受体亚基γ或IL2RG。γC是细胞因子受体亚基，其与受体复合体共用以用于许多白细胞介素受体，包括但不限于IL2、IL4、IL7、IL9、IL15和IL21受体。
如图3的设计7所示，在不存在IL15的情况下形成同源二聚体的工程改造的IL15Rβ适用于产生细胞因子的组成性信号传导。
在一些实施方案中，可使用图3所示的设计中的一种或多种设计将细胞因子IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18和IL21和/或它们的受体中的一种或多种引入iPSC中，并且在iPSC分化后引入其衍生细胞中。在一些实施方案中，IL2或IL15细胞表面表达和信号传导是通过图3的设计1-7中的任一种中所说明的构建体。在一些实施方案中，IL4、IL7、IL9或IL21细胞表面表达和信号传导是通过图3的设计5、6或7中所说明的构建体，通过使用共同受体或细胞因子特异性受体。在一些实施方案中，IL7表面表达和信号传导是通过图3的设计5、6或7中所说明的构建体，通过使用共同受体或细胞因子特异性受体诸如IL4受体。图3中的设计中的任一种的跨膜(TM)域对于相应细胞因子受体可以是原生的，或可用任何其它膜结合的蛋白的跨膜域修饰或置换。
除了诱导的多能干细胞(iPSC)之外，还提供了包含至少一种如本文所公开的工程改造模式的克隆iPSC、克隆iPS细胞系或iPSC衍生的细胞。还提供了主细胞库，其包含具有至少如本章节所述的外源引入的细胞因子和/或细胞因子受体信号传导的单细胞分选和扩增的克隆工程改造的iPSC，其中该细胞库提供用于附加iPSC工程改造的平台和用于制造现成的、工程改造的、同质的细胞疗法产品的可再生来源，这些细胞疗法产品在组成上是明确定义的和均一的，并且可以成本有效的方式大规模生产。在包含CAR和外源细胞因子两者和/或细胞因子受体信号传导的iPSC和其衍生细胞中，CAR和IL可在单独构建体中表达，或可在包含CAR和IL两者的双顺反子构建体中共表达。在一些其它实施方案中，呈图3中的构建体设计中的任一种表示的形式的IL15可通过自切割2A编码序列连接到CAR表达构建体的5'端或3'端，该自切割2A编码序列说明为例如CAR-2A-IL15或IL15-2A-CAR。如此，IL15和CAR可在单一开放阅读框(ORF)中。在一个实施方案中，CAR-2A-IL15或IL15-2A-CAR构建体包含IL15，如图3的设计3所示。在另一个实施方案中，CAR-2A-IL15或IL15-2A-CAR构建体包含IL15，如图3的设计4所示。在又一个实施方案中，CAR-2A-IL15或IL15-2A-CAR构建体包含IL15，如图3的设计7所示。当表达CAR-2A-IL15或IL15-2A-CAR时，自裂解2A肽允许所表达的CAR和IL15解离，然后可在细胞表面呈递解离的IL15。CAR-2A-IL15或IL15-2A-CAR双顺反子设计在时间和数量上允许配位的CAR和IL15表达，并且在可选择以并入例如诱导性启动子以表达单ORF的相同控制机制下。自裂解肽发现于小核糖核酸病毒科的成员中，包括口疮病毒属(aphthoviruses)，诸如口蹄疫病毒(FMDV)、马鼻炎A病毒(ERAV)、明脉扁刺蛾病毒(TaV)和猪捷申病毒1(PTV-I)(Donnelly,ML等人，《普通病毒学期刊(J.Gen.Virol)》，第82卷，第1027-1101页(2001年)；Ryan,MD等人，《普通病毒学期刊》，第72卷，第2727-2732页(2001年))，以及心病毒属(cardioviruses)，诸如泰勒病毒(例如，泰勒鼠类脑脊髓炎)和脑心肌炎病毒。源自FMDV、ERAV、PTV-I和TaV的2A肽有时也分别称为“F2A”、“E2A”、“P2A”和“T2A”。
也涵盖用于IL15的如本文所公开的双顺反子CAR-2A-IL15或IL15-2A-CAR实施方案以用于表达本文所提供的任何其它细胞因子，例如IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL18和IL21。在一些实施方案中，IL2细胞表面表达和信号传导是通过图3的设计1-7中的任一种中所说明的构建体。在一些实施方案中，IL4、IL7、IL9或IL21细胞表面表达和信号传导通过图3的设计5、6或7中所说明的构建体，通过使用共同受体和/或细胞因子特异性受体。
在包含CAR和外源细胞因子和/或细胞因子受体信号传导两者的iPSC及其衍生细胞中，包括但不限于IL15，iPSC和衍生细胞可还包含CFR、TCRneg和/或外源CD16。
6.HLA-I缺乏和HLA-II缺乏
必须在同种异体受体中匹配多种HLA I类和II类蛋白，以获得组织相容性，从而避免同种异体排斥反应问题。本文提供一种iPSC细胞系及其由其分化的衍生细胞，其具有消除或实质上降低的HLA I类和HLA II类蛋白的表达。HLA I类缺乏可通过使HLA I类基因座(染色体6p21)的任何区域发生功能缺失或通过使HLA I类相关基因(包括不限于β-2微球蛋白(B2M)基因、TAP1基因、TAP2基因和TAP相关蛋白)缺失或表达水平降低来实现。例如，B2M基因编码所有HLA I类异源二聚体的细胞表面表达所必要的共同亚基。B2M阴性细胞是HLA-I缺乏的。HLA II类缺乏可以通过使HLA-II相关基因(包括不限于RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP)发生功能缺失或降低来实现。CIITA是转录共激活子，通过II类蛋白表达所需的转录因子RFX5的激活起作用。CIITA阴性细胞是HLA-II缺乏的。本文提供同时具有HLA-I缺乏和HLA-II缺乏(例如，缺乏B2M和CIITA两者)的iPSC系和其衍生细胞，其中所得衍生效应细胞通过消除MHC(主要组织相容性复合体)匹配的需要允许同种异体细胞疗法，并且通过宿主(同种异体)T细胞避免识别和杀伤。
对于一些细胞类型，HLA I类表达的缺乏引起NK细胞的裂解。为解决该“自我缺失”反应，HLA-G可任选地敲入以避免NK细胞识别和杀伤衍生自工程改造iPSC的HLA-I缺乏的效应细胞。在一个实施方案中，HLA-I缺乏的iPSC及其衍生细胞还包含HLA-G敲入。在一些实施方案中，所提供的HLA-I缺乏的iPSC及其衍生细胞还包含CD58敲除和CD54敲除中的一者或两者。CD58(或LFA-3)和CD54(或ICAM-1)是启动信号依赖性细胞相互作用并促进细胞(包括免疫细胞)迁移的粘附蛋白。已显示CD58敲除在降低同种异体NK细胞激活方面比CD54敲除具有更高的效率；而CD58和CD54两者的双敲除具有最强的NK细胞激活的降低。在一些观察中，CD58和CD54双敲除在克服“自我缺失”效应方面甚至比HLA-I缺乏的细胞的HLA-G过表达更有效。
如上文所提供的，在一些实施方案中，HLA-I和HLA-II缺乏的iPSC及其衍生细胞具有编码HLA-G的外源多核苷酸。在一些实施方案中，HLA-I和HLA-II缺乏的iPSC及其衍生细胞是CD58剔除的。在一些其它实施方案中，HLA-I和HLA-II缺乏的iPSC及其衍生细胞是CD54剔除的。在又一些其它实施方案中，HLA-I和HLA-II缺乏的iPSC及其衍生细胞是CD58和CD54剔除的。
7.CD38敲除
细胞表面分子CD38在多种血液恶性病中高度上调，该血液恶性病衍生自淋巴和骨髓谱系两者，包括多发性骨髓瘤和CD20阴性B细胞恶性肿瘤，其使用以使癌细胞耗竭的抗体治疗剂成为吸引人的靶标。抗体介导的癌细胞耗竭通常可归因于免疫效应机制(例如ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性))的直接细胞凋亡诱导和激活的组合。除ADCC之外，免疫效应机制与治疗抗体一起还可包括抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
除在恶性细胞上高效表达外，CD38也在浆细胞上以及NK细胞和激活的T细胞和B细胞上表达。在造血期间，CD38在CD34+干细胞和淋巴、红细胞系和骨髓的谱系专门化祖细胞上并且在一直持续到浆细胞阶段的成熟的最终阶段期间表达。作为II型跨膜糖蛋白，CD38既作为受体，又作为参与核苷酸代谢产物产生的多功能酶发挥细胞功能。作为酶，CD38催化从NAD+到ADP-核糖的反应的合成和水解，从而产生二级信使CADPR和NAADP，其刺激钙从内质网和溶酶体中释放，这对于过程是钙依赖性的细胞粘附过程至关重要。作为受体，CD38识别CD31并且调控激活的NK细胞中的细胞因子释放和细胞毒性。还报道了CD38与脂筏中的细胞表面蛋白缔合，从而调控细胞质Ca2+流量，并且介导淋巴细胞和骨髓细胞的信号转导。
在恶性肿瘤治疗中，全身性地使用CD38抗原结合受体转导的T细胞已展示裂解CD34+造血祖细胞、单核细胞、NK细胞、T细胞和B细胞的CD38+部分，导致因为受体免疫效应细胞功能受损而使得治疗反应不完全并且功效降低或消除。另外，在用达雷木单抗、CD38特异性抗体治疗的多发性骨髓瘤患者中，尽管其它免疫细胞类型(例如T细胞和B细胞)不管其CD38表达如何都不受影响，但观测到骨髓和外周血两者中NK细胞减少(Casneuf等人，《血液研究进展(Blood Advances.)》2017年；第1卷，第23期，第2105-2114页)。不受理论的限制，本申请案提供一种通过经由自残克服CD38特异性抗体和/或CD38抗原结合域诱导的效应细胞耗竭或减少来充分利用CD38靶向癌症治疗的全部潜能的策略。另外，因为通过在同种异体效应细胞的受体中使用CD38特异性抗体(例如达雷木单抗)抑制这些受体淋巴细胞的活化使CD38在活化的淋巴细胞(例如T细胞或B细胞)上上调，所以针对这些效应细胞的同种异体排斥将被减少和/或防止，从而增加效应细胞存活和存留。因此，本申请还提供通过针对受体T细胞和B细胞的活化使用CD38特异性抗体、分泌的CD38特异性接合体或CD38CAR(嵌合抗原受体)(即，活化的T细胞和B细胞的淋巴耗竭)，通常在过继细胞转移之前，减少或防止同种排斥从而增强效应细胞存留和/或存活的策略。具体地，所提供的策略包括产生CD38敲除iPSC系、包含单细胞分选和扩增的克隆CD38阴性iPSC的主细胞库，以及通过经工程改造的iPSC系的定向分化获得CD38阴性(CD38neg)衍生效应细胞，其中当CD38靶向治疗部分与效应细胞一起使用时，这些衍生效应细胞被保护免受自相残杀和同种排斥等优点。此外，抗CD38单克隆抗体疗法显著耗竭患者的激活免疫系统，而不会对患者的造血干细胞区室产生不利影响。CD38阴性衍生细胞具有抵抗CD38抗体介导的耗竭的能力，并且可在不使用毒性调理剂的情况下与抗CD38或CD38-CAR有效地组合施用，并且因此减少和/或替代基于化疗的淋巴耗竭。
在如本文所提供的一个实施例中，iPSC系中的CD38敲除是双等位基因敲除。如本文所公开的，所提供的CD38阴性iPSC系还包含至少一种CFR，以及任选地TCRneg、hnCD16、CAR、外源细胞因子或其融合变体和HLA-I缺乏和/或HLA-II缺乏中的一者或多者；并且所述iPSC能够定向分化产生功能性衍生造血细胞，包括但不限于免疫效应细胞。在一些实施方案中，当抗CD38抗体用于诱导ADCC或抗CD38 CAR用于靶细胞杀伤时，CD38neg iPSC和/或其衍生效应细胞不被抗CD38抗体、抗CD38 CAR或受体活化的T细胞或B细胞消除，从而在这类治疗部分存在下和/或暴露于这类治疗部分之后增加iPSC和其效应细胞存留和/或存活。在一些实施方案中，在这类治疗部分存在下和/或暴露于这类治疗部分之后效应细胞在体内具有增加的存留和/或存活。
8.另外的修饰
在一些实施方案中，包含CFR以及TCRneg、CD16、CAR、IL、HLA-I缺乏和/或HLA-II缺乏和CD38-/-中的一者或多者的iPSC及其衍生效应细胞可另外包含：TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP、RAG1以及染色体6p21区域中的任何基因中的至少一者的破坏；HLA-E、4-1BBL、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、TCR、Fc受体、抗体、衔接子以及用于与双特异性、多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体中的至少一者的引入。
双特异性或多特异性衔接子是由不同抗体的两个或更多个单链可变片段(scFv)或其它功能性变体组成的融合蛋白，其中至少一个scFv结合于效应细胞表面分子或表面触发受体，并且至少另一个经由肿瘤特异性表面分子结合于肿瘤细胞。在一些实施方案中，表面触发受体促进效应细胞与特定靶细胞(例如，肿瘤细胞)之间发生双特异性或多特异性抗体接合，不依赖于效应细胞的自然受体和细胞类型。在一些其它实施方案中，可使用本文所提供的方法和组合物将一种或多种外源表面触发受体引入效应细胞中，即通过工程改造iPSC，任性地产生包含单细胞分选和扩增的克隆工程改造的iPSC的主细胞库，然后将iPSC的分化引向T细胞、NK细胞或任何其它效应细胞，其包含相同基因型作为源iPSC。
使用这种方法，还可以产生包含通用表面触发受体的iPSC，然后使这类iPSC分化成表达通用表面触发受体的各种效应细胞类型的群。在一些实施方案中，具有相同肿瘤靶向特异性的衔接子用于与不同的通用表面触发受体偶联。在一些实施方案中，具有不同肿瘤靶向特异性的衔接子用于与相同的通用表面触发受体偶联。因而，可使一种或多种效应细胞类型接合，从而在一些情况下杀死一种特定类型的肿瘤细胞并且在一些其它情况下杀死两种或更多种类型的肿瘤。表面触发受体通常包含用于效应细胞活化的共刺激域和对衔接子的表位而言有特异性的抗表位，或反之亦然，表面触发受体包含对衔接子的抗表位而言可识别或有特异性的表位。例如，双特异性衔接子对位于一端的表面触发受体的表位具有特异性，并且对位于另一端的肿瘤抗原具有特异性。衔接子的示例包括但不限于双特异性T细胞衔接子(BiTE)、双特异性杀伤细胞衔接子(BiKE)、三特异性杀伤细胞衔接子(TriKE)、多特异性杀伤细胞衔接子，或与多种免疫细胞类型相容的通用衔接子。TriKE的非限制性示例描述于美国公布号2018/0282386中，其以引用方式并入本文中。
如本文所提供的，除其它功能外，所公开的各种形式的CFR可适合用作细胞表面触发受体以用于识别衔接子。此外，如本文所提供的，各种形式的细胞表面呈递的CD3分子，包括如所公开的基于CD3的CFR，除其它功能外，还适合用作CD3相关细胞表面触发受体以用于衔接子识别，这在TCR阴性的细胞中是特别有用的，使得尽管表达，但所表达的CD3分子不存在于细胞表面上。
除CFR或cs-CD3外，可用于双特异性或多特异性衔接子识别或偶联或结合的另外的效应细胞表面分子或表面触发受体包括但不限于如本文公开的CD28、CD5、CD16、CD64、CD32、CD33、CD89、NKG2C、NKG2D或其任何功能性变体或嵌合受体形式。在一些实施方案中，在效应细胞的表面上表达以用于衔接子识别的CD16是hnCD16，其包含如本文所述的CD16(含有F176V和任选的S197P)或CD64胞外域以及原生或非原生跨膜域、刺激域和/或信号传导域。在一些实施方案中，在效应细胞的表面上表达以用于衔接子识别的CD16是基于CD16的嵌合Fc受体(CFcR)。在一些实施方案中，基于CD16的CFcR包含NKG2D的跨膜域、2B4的刺激域和CD3ζ的信号传导域；其中CD16的胞外域衍生自CD64或CD16胞外域的全长或部分序列；并且任选地，其中CD16的胞外域包含F176V和任选S197P。
用于双特异性或多特异性衔接子识别的示例性肿瘤细胞表面分子包括但不限于B7H3、BCMA、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、PSMA、PAMA、P-钙粘素和ROR1。
考虑到上述情况，在一个实施方案中，为了将CD3结合到效应细胞上，双特异性抗体是CD3-CD19；在另一个实施方案中，双特异性抗体是CD3-CD33。为了将CD16结合到效应细胞上，双特异性抗体是CD16-CD30或CD64-CD30。在另一个实施方案中，双特异性抗体是CD16-BCMA或CD64-BCMA。在又一实施方案中，双特异性抗体在效应细胞与肿瘤细胞抗原结合域之间还包含接头，例如修饰的IL15可用作用于效应NK细胞以促进效应细胞扩增的接头(在一些公布中称为TriKE，或三特异性杀伤细胞衔接子)。在一个实施方案中，TriKE是CD16-IL15-EPCAM或CD64-IL15-EPCAM。在另一个实施方案中，TriKE是CD16-IL15-CD33或CD64-IL15-CD33。在又一个实施方案中，TriKE是NKG2C-IL15-CD33。TriKE中的IL15也可源自其它细胞因子，包括但不限于IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL18和IL21。
9.本文提供的基因工程改造的iPSC系和iPSC衍生细胞
根据上述内容，本申请提供了至少包含编码CFR的多核苷酸的细胞或其群体，其中该细胞是真核细胞、动物细胞、人细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、iPSC衍生的效应细胞、免疫细胞或饲养细胞。还提供了主细胞库，其包含具有如本文所述表型的单细胞分选和扩增的克隆工程改造的iPSC，其中该细胞库提供用于制造现成的、工程改造的、同质的细胞疗法产品的可再生来源，这些细胞疗法产品在组成上是明确定义的和均一的，并且可以成本有效的方式大规模生产。在一些实施方案中，iPSC衍生细胞是造血细胞，包括但不限于具有永久性生血内皮细胞(HE)潜能的中胚层细胞、永久性HE、CD34造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多能祖细胞(MPP)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、骨髓细胞、嗜中性粒细胞祖细胞和/或与T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞共有的特征。在一些实施方案中，iPSC衍生的造血细胞包含至少表达CFR的免疫效应细胞。本文还提供了包含编码CFR的多核苷酸以及以下中的一者或多者的细胞：TCRneg；外源CD16；靶特异性CAR；HLA-I缺乏和/或HLA-II缺乏；细胞因子传导复合体，其包含细胞因子和/或其受体或其变体；以及CD38敲除，其中iPSC能够定向分化以产生功能性衍生造血细胞。在一些实施方案中，功能性衍生造血细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，功能性衍生免疫效应细胞与NK细胞和/或T细胞共有特征。在一些实施方案中，与NK细胞和/或T细胞共有特征的功能性衍生免疫效应细胞不是NK细胞或T细胞。
在至少包含编码CFR的多核苷酸的细胞的一些实施方案中，该细胞是TCRneg。如本文所用，TCRneg也称为TCR阴性、TCR-/-、“TCR剔除”或TCR敲除，其包括通过以下方式获得的没有内源TCR表达的细胞：天然(例如，NK细胞或iPSC衍生的NK细胞)，通过基因表达调控，或通过对iPSC细胞(例如，iPSC、从T细胞重编程的iPSC(TiPSC))或T细胞的基因组编辑以敲除内源TCR或其一个或多个亚基，或通过从敲除了TCR的iPSC分化获得的TCR阴性衍生细胞。因此，如所公开的细胞中敲除的TCR是内源TCR复合体。破坏TCR的TCRα或TCRβ的恒定区在细胞中的表达是敲除细胞的内源TCR复合体的众多方法之一。据发现，尽管所有CD3亚基在TCRneg细胞中表达，但是TCRneg细胞不能将CD3复合体呈递至细胞表面，这不利地影响需要细胞表面CD3识别、结合和/或信号传导的细胞功能。在包含编码CFR的多核苷酸的TCRneg细胞的一些实施方案中，CFR是基于CD3的。在一些实施方案中，包含编码CFR的多核苷酸的TCRneg细胞在表达时还包含细胞表面CD3复合体，或其一个或多个亚基或亚结构域(cs-CD3)。在具有CFR TCRneg cs-CD3基因型的细胞的一些实施方案中，CFR不是基于CD3的。在具有CFR TCRnegcs-CD3基因型的细胞的一些其它实施方案中，CFR是基于CD3的。除了基于CD3的CFR之外，如本文所公开的，TCRneg细胞中的细胞表面CD3复合体或其一个或多个亚基或亚结构域(cs-CD3)可充当CD3相关细胞表面触发受体，用于与分子结合，这些分子包括但不限于如本文所述的抗体或其功能性变体和/或衔接子。
本文还提供了iPSC或iPSC衍生的细胞，其包含编码一种或多种外源蛋白的一种或多种多核苷酸以在表达时提供细胞表面CD3复合体或其一个或多个亚基或亚结构域(cs-CD3)，其中该细胞任选地为TCR阴性。当cs-CD3表达时，其充当与CD3相关的细胞表面触发受体。在将与CD3相关的表面触发受体设置在TCRneg细胞中的一些实施方案中，该受体被包含在当表达时在效应细胞表面呈递的完整或部分内源CD3分子中，其中该内源CD3分子呈递即使在表达时也不会以其它方式发生在TCRneg细胞中，并且该过程通过使该受体与包含以下的重组TCR进行缔合来实现：如本申请所提供的全部或部分长度的外源TCRα、外源TCRβ以及它们的任何变体中的一者或多者。在一些实施方案中，通过在所述细胞中另外表达至少一个重组TCR(包括非结合性重组TCR(nb-rTCR)、定义的重组TCR(d-rTCR)和/或重组前TCR)，可在TCRneg细胞中实现完整或部分内源CD3分子的细胞表面呈递。
在一些实施方案中，包含与CD3相关的表面触发受体的TCRneg细胞包含非结合性重组TCR(nb-rTCR)，其中该nb-rTCR包含tgTRAC(转基因TCRα恒定区)和tgTRBC(转基因TCRβ恒定区)中的一者或两者；因此，TCRneg iPSC或iPSC衍生的细胞包含编码tgTRAC和/或tgTRBC的一个或多个多核苷酸。在包含编码tgTRAC的多核苷酸的TCRneg细胞的一些实施方案中，将所述多核苷酸插入TRAC基因座中，其中所插入的多核苷酸破坏了内源TRAC的表达，从而导致内源TCR敲除，并且任选地其中所插入的多核苷酸由TRAC的内源启动子或异源启动子驱动。在包含编码tgTRBC的多核苷酸的TCRneg细胞的一些实施方案中，将所述多核苷酸插入TRBC基因座中，其中所插入的多核苷酸破坏了内源TRBC的表达，从而导致内源TCR敲除，并且任选地其中所插入的多核苷酸由TRBC的内源启动子或异源启动子驱动。
在一些实施方案中，包含与CD3相关的表面触发受体的TCRneg细胞包含定义的重组TCR(d-rTCR)，其中该d-rTCR包含tgTCRα(转基因TCRα)和tgTCRβ(转基因TCRβ)，其中tgTCRα和tgTCRβ中的每一者除了包含相应恒定区(即TRAC和TRBC)之外还包含相应的定义可变区；因此，TCRneg iPSC或iPSC衍生的细胞包含编码tgTCRα和/或tgTCRβ的一个或多个多核苷酸。在一些实施方案中，该定义可变区源自具有已知TCR特异性的T细胞的TCRα和TCRβ。在一些实施方案中，该定义可变区源自不变NKT细胞的TCRα和TCRβ。在包含编码tgTCRα的多核苷酸的TCRneg细胞的一些实施方案中，将所述多核苷酸插入TRAC基因座中，其中所插入的多核苷酸破坏了内源TRAC的表达，从而导致内源TCR敲除，并且任选地其中所插入的多核苷酸由TRAC的内源启动子或异源启动子驱动。在包含编码tgTCRβ的多核苷酸的TCRneg细胞的一些实施方案中，将所述多核苷酸插入TRBC基因座中，其中所插入的多核苷酸破坏了内源TRBC的表达，从而导致内源TCR敲除，并且任选地其中所插入的多核苷酸由TRBC的内源启动子或异源启动子驱动。
在一些实施方案中，包含与CD3相关的表面触发受体的TCRneg细胞包含重组前TCR(p-rTCR)，其中该p-rTCR包含tgpTCRα(转基因前TCRα)和任选的tgTRBC或tgTCRβ，其中该tgTCRβ包含定义可变区；因此，TCRneg iPSC或iPSC衍生的细胞包含编码tgpTCRα的至少一个多核苷酸。在包含编码tgpTCRα的多核苷酸的TCRneg细胞的一些实施方案中，将所述多核苷酸插入TRAC基因座中，其中所插入的多核苷酸破坏了内源TRAC的表达，从而导致内源TCR敲除，并且任选地其中所插入的多核苷酸由TRAC的内源启动子或异源启动子驱动。在包含除了编码tgpTCRα之外还编码tgTRBC或tgTCRβ的多核苷酸的TCRneg细胞的一些实施方案中，将所述编码tgTRBC或tgTCRβ的多核苷酸插入TRBC基因座中，其中所插入的多核苷酸破坏了内源TRBC的表达，从而导致内源TCR敲除，并且任选地其中所插入的编码tgTRBC或tgTCRβ的多核苷酸由TRBC的内源启动子或异源启动子驱动。
在TCRneg细胞中的与CD3相关的表面触发受体的一些实施方案中，该受体被包含在完整或部分CD3分子中，该完整或部分CD3分子包含来自CD3ε、CD3δ和CD3γ中的一者或多者的至少一个外源亚基或亚结构域。在一个实施方案中，用于TCRneg细胞中衔接子识别的与CD3相关的表面触发受体被包含在部分CD3分子中，该部分CD3分子至少包含CD3ε的全部或部分长度的胞外域。在一个实施方案中，用于TCRneg细胞中衔接子识别的与CD3相关的表面触发受体被包含在部分CD3分子中，该部分CD3分子至少包含CD3ε的全部或部分长度的胞外域，并且另外包含CD3γ或CD3δ的全部或部分长度的胞外域。在一个实施方案中，所述CD3分子至少包含CD3ε、CD3γ和/或CD3δ的全部或部分长度的胞外域，其中该胞外域的全部或部分长度是与TCRα或TCRβ的恒定区融合的，并且其中各自包含TRAC或TRBC的部分融合蛋白能够与内源CD3ζ形成异源二聚体。因此，在具有与CD3相关的表面触发受体的TCRneg iPSC或iPSC衍生的细胞的一个实施方案中，该细胞包含以下中的至少一者：(i)包含CD3ε和CD3δ的全部或部分长度的胞外域以及TCRα恒定区的转基因融合蛋白(tgCD3(ε-δ)-TRAC)；(ii)包含CD3ε和CD3γ的全部或部分长度的胞外域以及TCRβ恒定区的转基因融合蛋白(tgCD3(ε-γ)-TRBC)；(iii)包含CD3ε和CD3γ的全部或部分长度的胞外域以及TCRα恒定区的转基因融合蛋白(tgCD3(ε-γ)-TRAC)；和/或(iv)包含CD3ε和CD3δ的全部或部分长度的胞外域以及TCRβ恒定区的转基因融合蛋白(tgCD3(ε-δ)-TRBC)。在具有与CD3相关的表面触发受体的TCRneg细胞的一些实施方案中，该细胞包含异源二聚体，该异源二聚体包含两种转基因融合蛋白，其中一种转基因融合蛋白包含与至少CD3ε的全部或部分长度的胞外域融合的TCRα恒定区，另一种转基因融合蛋白包含与至少CD3ε的全部或部分长度的胞外域融合的TCRβ恒定区。
在TCRneg细胞中的与CD3相关的表面触发受体的一些实施方案中，该受体被包含在完整或部分CD3分子中，该完整或部分CD3分子包含来自CD3ε、CD3δ、CD3γ和/或CD3ζ中的一者或多者的至少一个外源亚基或亚结构域，以及任选地用于信号转导和/或共刺激的2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγIL21R、IL-2Rβ(IL-15Rβ)、IL-2Rγ、IL-7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD3ζ1XX、CS1或CD8的一个或多个信号传导域，其中所有亚基或亚结构域(包括信号传导域)融合以形成嵌合链。在一个实施方案中，用于TCRneg细胞中衔接子识别的与CD3相关的表面触发受体被包含在CD3嵌合链中，该CD3嵌合链至少包含CD3ε的全部或部分长度的胞外域、CD3δ和CD3γ中的一者或两者的全部或部分长度的胞外域和CD3ζ的全部或部分长度的胞内域。在一个实施方案中，用于TCRneg细胞中衔接子识别的与CD3相关的表面触发受体被包含在CD3嵌合链中，该CD3嵌合链包含CD3ε的全部或部分长度的胞外域、CD3δ和CD3γ中的一者或两者的全部或部分长度的胞外域、CD3ζ的全部或部分长度的胞内域，并且还包含CD28和4-1BBL中的一者或两者的胞质信号传导域。因此，在具有与CD3相关的表面触发受体的TCRneg iPSC或iPSC衍生的细胞的一个实施方案中，该细胞包含以下中的至少一者：(i)包含CD3ε和CD3γ的全部或部分长度的胞外域以及CD3ζ的全部或部分长度的胞内域的转基因融合蛋白[tgCD3(ε-γ)-ζ]；(ii)包含CD3ε和CD3δ的全部或部分长度的胞外域以及CD3ζ的全部或部分长度的胞内域的转基因融合蛋白[tgCD3(ε-δ)-ζ]；(iii)包含CD3ε的全部或部分长度的胞外域的转基因融合蛋白、包含CD3γ或CD3δ的全部或部分长度的胞外域、CD3ζ的全部或部分长度的胞内域和CD28的信号传导域的转基因融合蛋白[tgCD3(ε-γ/δ)-28ζ]；(iv)包含CD3ε的全部或部分长度的胞外域的转基因融合蛋白、包含CD3γ或CD3δ的全部或部分长度的胞外域、CD3ζ的全部或部分长度的胞内域和4-1BB的信号传导域的转基因融合蛋白[tgCD3(ε-γ/δ)-BBζ]；和/或(v)包含CD3γ或CD3δ的全部或部分长度的胞外域、CD3ζ的全部或部分长度的胞内域、CD28的信号传导域和4-1BB的信号传导域的转基因融合蛋白[tgCD3(ε-γ/δ)-(28-BB)ζ]。
本文还提供了包含编码CFR的多核苷酸以及以下中的一者或多者的iPSC：TCRneg；外源CD16；靶特异性CAR；HLA-I缺乏和/或HLA-II缺乏；细胞因子传导复合体，其包含细胞因子和/或其受体或其变体；以及CD38敲除，其中iPSC能够定向分化以产生功能性衍生造血细胞。
在一些实施方案中，包含CFR的细胞是TCRneg。在一些实施方案中，包含CFR的细胞包含插入TCR恒定区中的CAR。在一些实施方案中，包含CFR的细胞是TCRneg并且包含插入TCR恒定区中的CAR，并且CAR的表达由内源TCR启动子驱动。在一些实施方案中，包含CFR的细胞包含IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21或它们的任何组合的外源细胞因子信号传导。在一些实施方案中，外源细胞因子信号传导是细胞膜结合的。在一些实施方案中，外源细胞因子信号传导包含引入的细胞因子和/或其相应受体或其突变或截短变体的部分或完整肽。在一些实施方案中，组成性地激活细胞因子信号传导。在一些实施方案中，细胞因子信号传导的激活是诱导性的。在一些实施方案中，细胞因子信号传导的激活是瞬时的和/或暂时的。在一些实施方案中，细胞表面细胞因子信号传导的瞬时/暂时表达是通过逆转录病毒、仙台病毒、腺病毒、游离基因体、小环或包括mRNA的RNA。在一些实施方案中，外源细胞表面细胞因子信号传导使得能够进行IL7信号传导。在一些实施方案中，外源细胞表面细胞因子信号传导使得能够进行IL10信号传导。在一些实施方案中，外源细胞表面细胞因子信号传导使得能够进行IL15信号传导。在一些实施方案中，包含CFR的细胞还包含外源CD16或其功能性变体或嵌合受体。在一些实施方案中，外源CD16包含胞外域，该胞外域包含F176V和S197P。在一些实施方案中，外源CD16包含CD64的全部或部分长度的胞外域。在一些其它实施方案中，外源CD16包含嵌合Fc受体。外源CD16能够通过ADCC杀死细胞，从而为表达例如CAR的效应细胞提供双重靶向机制。
在一些实施方案中，包含CFR的细胞还包含CD38敲除。细胞表面分子CD38在多种血液恶性病中高度上调，该血液恶性病衍生自淋巴和骨髓谱系两者，包括多发性骨髓瘤和CD20阴性B细胞恶性肿瘤，其使用以使癌细胞耗竭的抗体治疗剂成为吸引人的靶标。除在恶性细胞上高效表达外，CD38也在浆细胞上以及NK细胞和激活的T细胞和B细胞上表达。在一些实施方案中，为CD38-/-的效应细胞可避免CD38诱导的自相残杀。在一些实施方案中，当抗CD38抗体、CD38结合CAR、包含抗CD38 scFV的CD3衔接子用于诱导ADCC和/或肿瘤细胞靶向时，CD38-/-iPSC和/或其衍生效应细胞可靶向CD38表达(肿瘤)细胞而不会引起效应细胞消除，即，表达CD38的效应细胞的减少或耗竭，从而增加iPSC和其效应细胞的存留和/或存活。
在包含编码CFR的多核苷酸的细胞的一些实施方案中，该细胞还包含HLA-I缺乏(例如，B2M敲除)和/或HLA-II缺乏(例如，CIITA敲除)，以及任选地，编码HLA-G或HLA-E的多核苷酸。
鉴于上述情况，本文提供了iPSC，该iPSC包含编码CFR以及任选地编码以下中的一者、两者、三者或更多者或全部的多核苷酸：TCRneg、外源CD16或变体、CAR、外源IL、CD38敲除和B2M/CIITA敲除；其中当B2M被敲除时，任选地引入编码HLA-G的多核苷酸，或者CD58和CD54敲除中的一者或两者，并且其中该iPSC能够定向分化以产生功能性衍生造血细胞。
因此，本申请提供iPSC和其功能性衍生造血细胞，其包含表1中的以下基因型中的任一者。本文还提供了包含单细胞分选和扩增的克隆工程改造的iPSC的主细胞库，这些iPSC包含表1中的以下基因型中的任一者，即具有CFR，以及TCRneg、外源CD16或变体、CAR、外源IL、CD38敲除和HLA-I缺乏和/或HLA-II缺乏中的一者或多者，而不会不利地影响iPSC的分化潜能和衍生的效应细胞的功能。所述细胞库为额外的iPSC工程改造提供了平台，以及用于制造现成的、工程改造的、同质的细胞疗法产品的可再生来源。
如表1所提供的，视选择哪种特异性细胞因子/受体或组合表达而定，“IL”表示IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18和IL21中的一者。例如，当选择IL15时，"IL"代表IL15相关的信号传导复合体，包括IL15Δ。在图3中展示为“IL15Rα(ΔICD)融合”和“IL5/mb-寿司”，这些实施方案在整个本申请中进一步统称为IL15Δ。在一些实施方案中，IL15Δ是缺少胞内域并且包含与SEQ ID NO:17、19或21具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列的截短IL15/IL15Rα融合蛋白。在一些实施方案中，缺少胞内域的截短IL15/IL15Rα融合蛋白包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些实施方案中，缺少胞内域的截短IL15/IL15Rα融合蛋白包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，缺少胞内域的截短IL15/IL15Rα融合蛋白包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。此外，当iPSC和其功能性衍生造血细胞具有包含CAR和IL两者的基因型时，该CAR和IL可任选地包含于包含2A序列的双顺反子表达盒中。相比而言，在一些其它实施方案中，CAR和IL在包含于iPSC和其功能性衍生造血细胞中的单独表达盒中。
表1：提供的细胞的适用基因型：
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10.用于免疫疗法的抗体
在一些实施方案中，除如本文所提供的基因组工程改造的效应细胞之外，包含靶向与病况、疾病或适应症相关的抗原的抗体或抗体片段的另外治疗剂可在组合疗法中与这些效应细胞一起使用。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是人源化抗体、人源化单克隆抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体或抗体片段特异性结合于病毒抗原。在其它实施方案中，抗体或抗体片段特异性结合于肿瘤抗原。在一些实施方案中，肿瘤或病毒特异性抗原激活所施用的iPSC衍生效应细胞以增强其杀伤能力。在一些实施方案中，适用于作为另外治疗剂与所施用的iPSC衍生效应细胞的组合治疗的抗体包括但不限于抗CD20(利妥昔单抗、维妥珠单抗、奥法木单抗、乌妥昔单抗、奥卡妥珠单抗、奥妥珠单抗、异贝莫单抗、奥瑞珠单抗)、抗CD22(奥英妥珠单抗、莫塞妥单抗、依帕珠单抗)、抗HER2(曲妥珠单抗、帕妥珠单抗)、抗CD52(阿伦单抗)、抗EGFR(西妥昔单抗)、抗GD2(迪妥昔单抗)、抗PDL1(阿维鲁单抗)、抗CD38(达雷木单抗、伊沙妥昔单抗、MOR202)、抗CD123(7G3、CSL362)、抗SLAMF7(依托珠单抗)；和其人源化或Fc修饰的变体或片段或其功能等效物和生物类似物。在一些实施方案中，适用于作为另外治疗剂与所施用的iPSC衍生效应细胞的组合治疗的抗体还包括双特异性或多特异性抗体，该双特异性或多特异性抗体靶向靶细胞上的多于一种抗原或表位，或者在靶向靶细胞的同时向靶细胞募集效应细胞(例如，T细胞、NK细胞或巨噬细胞)。此类双特异性或多特异性抗体充当能够将效应细胞(例如，T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞和/或嗜中性粒细胞)引导至肿瘤细胞并激活免疫效应细胞的衔接子，并且已经显示出使抗体疗法的益处最大化的巨大潜能。衔接子对至少一种肿瘤抗原具有特异性，并且对免疫效应细胞的至少一种表面触发受体具有特异性。衔接子的示例包括但不限于双特异性T细胞衔接子(BiTE)、双特异性杀伤细胞衔接子(BiKE)、三特异性杀伤细胞衔接子(TriKE)或多特异性杀伤细胞衔接子，或与多种免疫细胞类型相容的通用衔接子。
在一些实施方案中，iPSC衍生效应细胞包含造血谱系细胞，其包含表1中所列的基因型。在一些实施方案中，iPSC衍生效应细胞包含NK细胞，其包含表1中所列的基因型。在一些实施方案中，iPSC衍生效应细胞包含T细胞，其包含表1中所列的基因型。在适用于治疗液体瘤或实体瘤的组合的一些实施方案中，该组合包含有至少包含TCRneg cs-CD3的iPSC衍生的NK细胞或T细胞，以及结合具有细胞表面CD3的细胞的双特异性或多特异性抗体。在一些实施方案中，CD3衔接子至少包含结合cs-CD3的第一可变区段和结合抗原的第二可变区段，该抗原包含以下中的至少一者：ADGRE2、碳酸酐酶IX(CAIX)、CCR1、CCR4、癌胚抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、巨细胞病毒(CMV)感染的细胞的抗原、上皮糖蛋白2(EGP-2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、EGFRvIII、受体酪氨酸-蛋白激酶erb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB叶酸结合蛋白(FBP)、胎儿型乙酰胆碱受体(AChR)、叶酸受体a、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、人类表皮生长因子受体2(HER2)、人类端粒酶逆转录酶(hTERT)、ICAM-1、整合素B7、白细胞介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)、κ-轻链、激酶插入域受体(KDR)、路易斯A(CA19.9)、路易斯Y(LeY)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、LILRB2、黑色素瘤抗原家族A1(MAGE-A1)、MICA/B、粘蛋白1(Muc-1)、粘蛋白16(Muc-16)、间皮素(MSLN)、NKCSI、NKG2D配体、c-Met、癌症-睾丸抗原NY-ESO-1、癌胚抗原(h5T4)、PRAME、前列腺干细胞抗原(PSCA)、PRAME前列腺特异性膜抗原(PSMA)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、TIM-3、TRBC1、TRBC2、血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)、威尔姆斯肿瘤蛋白质(WT-1)和/或病原体抗原。在包含本文所提供的iPSC衍生细胞和结合具有细胞表面CD3的细胞的至少一种双特异性或多特异性抗体(即，为衔接子)的组合疗法的一些其它实施方案中，所述抗体不由iPSC衍生细胞或在iPSC衍生细胞中产生，并且在施用具有表1中所列的基因型的iPSC衍生细胞之前、同时或之后另外施用。
在CD3衔接子的一些实施方案中，该衔接子至少包含结合cs-CD3的第一可变区段和结合抗原的第二可变区段，该抗原包含BCMA、CD19、CD20、CD33、CD38、CD52、CD123、CEA、EGFR、EpCAM、GD2、GPA33、HER2、MICA/B、PDL1和/或PSMA中的至少一者。在CD3衔接子的另一些其它实施方案中，该衔接子包含与抗原结合的第二可变区段，该抗原包含CD19、CD33、CD123、CEA、EpCAM、GPA33、HER2和/或PSMA中的至少一者。在CD3衔接子的又一些其它实施方案中，该衔接子是博纳吐单抗、卡妥索单抗、厄妥索单抗、RO6958688、AFM11、MT110/AMG110、MT111/AMG211/MEDI-565、AMG330、MT112/BAY2010112、MOR209/ES414、MGD006/S80880、MGD007和/或FBTA05中的至少一者。在一个实施方案中，该组合包含含有TCRneg cs-CD3和hnCD16的CD3衔接子和iPSC衍生的NK细胞。在一个实施方案中，该组合包含含有TCRneg cs-CD3和hnCD16的CD3衔接子和iPSC衍生的NK细胞。在一些其它实施方案中，包含在与CD3衔接子的组合中的iPSC衍生的NK细胞包含TCRneg cs-CD3、hnCD16、IL15和靶向CD19、BCMA、CD20、CD22、CD38、CD123、HER2、CD52、EGFR、GD2和PDL1之一的CAR；其中IL15与CAR共同或分开表达；并且IL15是图3的构建体设计1至7中呈现的任何一种形式。在一些特定实施方案中，当IL15与CAR共同或分开表达时，其呈图3的构建体设计3、4或7的形式。
11.检查点抑制剂
检查点是细胞分子，通常是细胞表面分子，能够在未被抑制时抑制或下调免疫反应。现在清楚的是，肿瘤选择某些免疫检查点途径作为免疫抗性的主要机制，尤其是针对对肿瘤抗原具有特异性的T细胞。检查点抑制剂(CI)是能够减少检查点基因表达或基因产物，或降低检查点分子的活性，从而阻断抑制性检查点，并且恢复免疫系统功能的拮抗剂。检查点抑制剂靶向PD1/PDL1或CTLA4的发展转变了肿瘤学前景，这些试剂提供多种适应症的长期缓解。但是，许多肿瘤亚型对检查点阻断疗法具有抗性，并且复发仍然是一个大问题。因此，本申请的一个方面提供了一种通过包括如本文在与CI的组合疗法中所提供的基因组工程改造的功能性iPSC衍生细胞来克服CI抗性的治疗方法。在组合疗法的一个实施方案中，iPSC衍生细胞是NK细胞。在组合疗法的另一个实施方案中，iPSC衍生细胞是T细胞。除了表现出直接的抗肿瘤能力外，本文提供的衍生NK细胞还显示出抵抗PDL1-PD1介导的抑制作用，并且具有增强T细胞迁移、将T细胞募集到肿瘤微环境并且增强肿瘤部位处的T细胞激活的能力。因此，由功能上有效的基因组工程改造的衍生NK细胞促进的T细胞的肿瘤浸润表明，所述NK细胞能够与T细胞靶向的免疫疗法(包括检查点抑制剂)协同作用，以缓解局部免疫抑制并且减少肿瘤负荷。
在一个实施方案中，用于检查点抑制剂组合疗法的衍生的TCRneg NK细胞包含cs-CD3，以及任选地以下的一者、两者、三者、四者或更多者：外源CD16、B2M/CIITA敲除、CAR表达、CD38敲除以及外源细胞表面细胞因子和/或受体表达；其中当敲除B2M时，任选地包括编码HLA-G或敲除CD58和CD54中的一者或两者的多核苷酸。在一些实施方案中，衍生NK细胞包含表1中所列的基因型中的任一者。在一些实施方案中，上述衍生NK细胞另外包含：TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP、RAG1以及染色体6p21区域中的任何基因中的至少一者的破坏；或者HLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、Fc受体、衔接子以及用于与双特异性、多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体中的至少一者的引入。
在另一个实施方案中，用于检查点抑制剂组合疗法的衍生的TCRneg T细胞包含cs-CD3，以及任选地以下的一者、两者、三者、四者或更多者：外源CD16、B2M/CIITA敲除、CAR表达、CD38敲除以及外源细胞表面细胞因子和/或受体表达；其中当敲除B2M时，任选地包括编码HLA-G或敲除CD58和CD54中的一者或两者的多核苷酸。在一些实施方案中，衍生效应细胞包含表1中所列的基因型中的任一者。在一些实施方案中，上述衍生效应细胞另外包含：TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP、RAG1以及染色体6p21区域中的任何基因中的至少一者的破坏；或者HLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、Fc受体、衔接子以及用于与双特异性、多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体中的至少一者的引入。
在各种实施方案中，衍生效应细胞获自分化iPSC克隆系，该克隆系包含TCRneg cs-CD3，以及任选地以下的一者、两者、三者、四者或更多者：外源CD16、B2M/CIITA敲除、CAR表达、CD38敲除以及外源细胞表面细胞因子表达；其中当敲除B2M时，任选地引入编码HLA-G或敲除CD58和CD54中的一者或两者的多核苷酸。在一些实施方案中，上述iPSC克隆系还包含：TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP、RAG1以及染色体6p21区域中的任何基因中的至少一者的破坏；或者HLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、Fc受体、衔接子以及用于与双特异性、多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体中的至少一者的引入。
适用于与如本文所提供的衍生NK细胞或T细胞的组合疗法的检查点抑制剂包括但不限于PD-1(Pdcdl、CD279)、PDL-1(CD274)、TIM-3(Havcr2)、TIGIT(WUCAM和Vstm3)、LAG-3(Lag3、CD223)、CTLA-4(Ctla4、CD152)、2B4(CD244)、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、A2AR、BATE、BTLA、CD39(Entpdl)、CD47、CD73(NT5E)、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、视黄酸受体α(Rara)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E和抑制性KIR(例如2DL1、2DL2、2DL3、3DL1和3DL2)的拮抗剂。
在一些实施方案中，抑制以上检查点分子中的任一种的拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，检查点抑制性抗体可以是鼠类抗体、人类抗体、人源化抗体、骆驼Ig、只有重链的鲨鱼抗体(VNAR)、Ig NAR、嵌合抗体、重组抗体或它们的抗体片段。抗体片段的非限制性示例包括Fab、Fab′、F(ab′)2、F(ab′)3、Fv、单链抗原结合性片段(scFv)、(scFv)2、二硫键稳定的Fv(dsFv)、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、单域抗原结合性片段(sdAb，纳米抗体)、只有重链的重组抗体(VHH)和维持全部抗体的结合特异性的其它抗体片段，其比起全部抗体可以更有成本效益地产生、更易于使用或更敏感。在一些实施方案中，一种、或两种、或三种、或更多种检查点抑制剂包含以下中的至少一者：阿特珠单抗(抗PDL1mAb)、阿维鲁单抗(抗PDL1 mAb)、度伐单抗(抗PDL1 mAb)、曲美木单抗(tremelimumab)(抗CTLA4mAb)、伊匹单抗(抗CTLA4 mAb)、IPH4102(抗KIR)、IPH43(抗MICA)、IPH33(抗TLR3)、利瑞木单抗(抗KIR)、莫纳利珠单抗(抗NKG2A)、纳武单抗(抗PD1 mAb)、帕博利珠单抗(抗PD1mAb)和其任何衍生物、功能等效物或生物类似物。
在一些实施方案中，抑制以上检查点分子中的任一种的拮抗剂是基于微RNA的，因为发现许多miRNA作为控制免疫检查点的表达的调控因子(Dragomir等人，《癌症生物医学(Cancer Biol Med.)》，2018年，第15卷，第2期，第103-115页)。在一些实施方案中，检查点拮抗性miRNA包括但不限于miR-28、miR-15/16、miR-138、miR-342、miR-20b、miR-21、miR-130b、miR-34a、miR-197、miR-200c、miR-200、miR-17-5p、miR-570、miR-424、miR-155、miR-574-3p、miR-513和miR-29c。
与所提供的iPSC衍生NK细胞或T细胞的组合疗法的一些实施方案包含至少一种检查点抑制剂以靶向至少一种检查点分子；其中iPSC衍生的细胞具有表1中所列的基因型。具有所提供的衍生NK细胞或T细胞的组合疗法的一些其它实施方案包含两种、三种或更多种检查点抑制剂，使得靶向两种、三种或更多种检查点分子。在包含至少一种检查点抑制剂和具有表1中所列的基因型的iPSC衍生细胞的组合疗法的一些实施方案中，所述检查点抑制剂是抗体、或人源化或Fc修饰的变体或片段、或其功能等效物或生物类似物，并且所述检查点抑制剂通过表达编码所述抗体或其片段或变体的外源多核苷酸序列由iPSC衍生细胞产生。在一些实施方案中，编码抑制检查点的抗体或其片段或变体的外源多核苷酸序列在单独构建体中或在包含CAR和编码抗体或其片段的序列两者的双顺反子构建体中与CAR共表达。在一些其它实施方案中，编码抗体或其片段的序列可通过自裂解2A编码序列连接到CAR表达构建体的5'端或3'端，该自裂解2A编码序列说明为例如CAR-2A-CI或CI-2A-CAR。因此，检查点抑制剂和CAR的编码序列可在单一开放阅读框(ORF)中。当通过能够浸润肿瘤微环境(TME)的衍生效应细胞将检查点抑制剂递送、表达和分泌为有效负载时，其在接合TME后抵消抑制性检查点分子，允许通过例如CAR或激活受体的激活模式激活效应细胞。在一些实施方案中，与CAR共表达的检查点抑制剂抑制以下检查点分子中的至少一者：PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2AR、BATE、BTLA、CD39(Entpdl)、CD47、CD73(NT5E)、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、视黄酸受体α(Rara)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E和抑制性KIR。在一些实施方案中，在具有表1中所列的基因型的衍生细胞中与CAR共表达的检查点抑制剂选自包含以下的组：阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、曲美木单抗、伊匹单抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗和它们的人源化或Fc修饰的变体、片段和它们的功能等效物或生物类似物。在一些实施方案中，与CAR共表达的检查点抑制剂是阿特珠单抗或其人源化或Fc修饰的变体、片段或它们的功能等效物或生物类似物。在一些其它实施方案中，与CAR共表达的检查点抑制剂是纳武单抗或其人源化或Fc修饰的变体、片段或它们的功能等效物或生物类似物。在一些其它实施方案中，与CAR共表达的检查点抑制剂是帕博利珠单抗或其人源化或Fc修饰的变体、片段或它们的功能等效物或生物类似物。
在包含本文所提供的iPSC衍生细胞和至少一种抑制检查点分子的抗体的组合疗法的一些其它实施方案中，所述抗体不由iPSC衍生细胞或在iPSC衍生细胞中产生，并且在施用具有表1中所列的基因型的iPSC衍生细胞之前、同时或之后另外施用。在一些实施方案中，在与所提供的衍生NK细胞或T细胞的组合疗法中施用一种、两种、三种或更多种检查点抑制剂是同时或依序的。在包含具有表1中所列的基因型的衍生NK细胞或T细胞的组合治疗的一个实施方案中，治疗中包括的检查点抑制剂是阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、曲美木单抗、伊匹单抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗和其人源化或Fc修饰的变体、片段和其功能等效物或生物类似物中的一者或多者。在包含具有表1中所列的基因型的衍生NK细胞或T细胞的组合治疗的一些实施方案中，治疗中包括的检查点抑制剂是阿特珠单抗或其人源化或Fc修饰的变体、片段和其功能等效物或生物类似物。在包含具有表1中所列的基因型的衍生NK细胞或T细胞的组合治疗的一些实施方案中，治疗中包括的检查点抑制剂是纳武单抗或其人源化或Fc修饰的变体、片段或其功能等效物或生物类似物。在包含具有表1中所列的基因型的衍生NK细胞或T细胞的组合治疗的一些实施方案中，治疗中包括的检查点抑制剂是帕博利珠单抗或其人源化或Fc修饰的变体、片段和其功能等效物或生物类似物。
II.在iPSC中所选基因座处进行靶向基因组编辑的方法
如本文中可互换使用，基因组编辑或基因编辑是一种类型的基因工程，其中在靶细胞的基因组中进行DNA插入、缺失和/或置换。靶向基因组编辑(可与“靶向基因组编辑”或“靶向基因编辑”互换)能够在基因组中的预选位点实现插入、缺失和/或取代。当在靶向编辑期间使内源序列在插入位点缺失时，可以敲除包含受影响序列的内源基因或因序列缺失而降低。因此，靶向编辑还可以用于精确地中断内源基因表达。本文中类似地使用术语“靶向整合”，其是指一种涉及在使内源序列在插入位点缺失或不缺失的情况下插入一个或多个外源序列的方法。相比之下，随机整合的基因经历位置效应和静默，以致其表达不可靠并且不可预测。例如，着丝点和亚端粒区域特别容易发生转基因沉默。相反，新整合的基因可以影响周围内源基因和染色质，潜在地改变细胞特性或有利于细胞转化。因此，将外源DNA插入预选基因座(诸如安全港基因座或基因组安全港(GSH))对于安全、效率、拷贝数控制以及可靠的基因反应控制来说是重要的。
靶向编辑可以通过核酸酶非依赖性方法或通过核酸酶依赖性方法实现。在核酸酶非依赖性靶向编辑方法中，同源重组是通过宿主细胞的酶机制、通过同源序列侧接待插入的外源多核苷酸而引导。
可替代地，靶向编辑可以通过利用特异性稀有切割核酸内切酶特异性引入双链断裂(DSB)以更高频率来实现。这类核酸酶依赖性靶向编辑是利用DNA修复机制，包括非同源末端连接(NHEJ)，其响应于DSB而发生。不使用含有外源遗传物质的供体载体，NHEJ通常引起少量的内源核苷酸的随机插入或缺失(插入/缺失)。相比之下，当含有与一对同源臂侧接的外源遗传物质的供体载体存在时，可以在同源性定向修复(HDR)期间通过同源重组将外源遗传物质引入基因组中，从而产生“靶向整合”。在一些情况下，靶向整合位点旨在在所选基因的编码区内，并且因此靶向整合可能破坏基因表达，从而导致在一个单一编辑步骤中同时敲入和敲除(KI/KO)。
可实现在所关注基因座(GOI)中将一个或多个转基因插入在所选位置处以同时敲除该基因。适于同时敲入和敲除(KI/KO)的基因座包含但不限于B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区(TRAC或TRBC)、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT。利用用于位置选择性插入的相应的位点特异性靶向同源臂，允许转基因在内源启动子下，在该位点处表达，或在包括在构建体中的外源启动子下表达。当将两个或更多个转基因插入所选位置处(例如，CD38基因座中)时，将例如2A接头或IRES的连接序列置于任何两个转基因之间。2A接头编码衍生自FMDV、ERAV、PTV-I或TaV的自裂解肽(分别称为“F2A”、“E2A”、“P2A”和“T2A”)，使得可由单次转译产生单独的蛋白质。在一些实施方案中，构建体中包括绝缘子以降低转基因和/或外源启动子沉默的风险。外源启动子可以是CAG或其它组成性、诱导性、时间特异性、组织特异性和/或细胞类型特异性的启动子，包括但不限于CMV、EF1α、PGK和UBC。
能够引入特异性和靶向DSB的可用核酸内切酶包括但不限于锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)、RNA引导的CRISPR(簇聚的规则间隔的短回文重复序列)系统。另外，利用phiC31和Bxb1整合酶的DICE(双整合酶盒交换)系统也是靶向整合的一种有前景的工具。
ZFN是靶向核酸酶，其包含与锌指DNA结合域融合的核酸酶。“锌指DNA结合域”或“ZFBD”意指按照序列特异性方式、通过一个或多个锌指结合DNA的多肽域。锌指是锌指结合域内的约30个氨基酸的结构域，其结构通过锌离子的配位而稳定化。锌指的示例包括但不限于C2H2锌指、C3H锌指和C4锌指。“设计”的锌指域是一种不存在于自然界中的结构域，其设计/组成主要来源于合理准则，例如应用取代规则和计算机化算法来处理存储现有ZFP设计和结合数据信息的数据库中的信息。参见例如美国专利号6,140,081，6,453,242，以及6,534,261，还参见国际公布号WO98/53058，WO98/53059，WO98/53060，WO02/016536和WO03/016496，其全部公开内容以引用方式并入本文。“所选”锌指域是一种在自然界中未发现的结构域，其产生主要来源于经验方法，例如噬菌体呈现、相互作用截留或杂交选择。ZFN更详细地描述于美国专利第7,888,121号和美国专利第7,972,854号中，其完整公开内容以引入的方式并入本文中。ZFN在所属领域中的最公认示例是FokI核酸酶与锌指DNA结合域的融合物。
TALEN是靶向核酸酶，其包含与TAL效应子DNA结合域融合的核酸酶。“转录激活子样效应子DNA结合域”、“TAL效应子DNA结合域”或“TALE DNA结合域”意指负责TAL效应蛋白结合到DNA的TAL效应蛋白的多肽域。TAL效应蛋白由黄单胞菌属(Xanthomonas)植物病原体在感染期间分泌。这些蛋白质进入植物细胞的核，通过其DNA结合域结合效应子特异性DNA序列，并且通过其反式激活域在这些序列处激活基因转录。TAL效应子DNA结合域特异性取决于不完美的34个氨基酸重复的效应子可变数目，其包含所选重复位置处的多态性，称为重复可变双残基(RVD)。TALEN更详细地描述于美国公布号2011/0145940，该申请以引用方式并入本文。TALEN在所属领域中的最公认示例是FokI核酸酶与TAL效应子DNA结合域的融合多肽。
用于本发明方法中的靶向核酸酶的另一示例是靶向Spo11核酸酶，一种包括Spo11多肽的多肽，该多肽具有与DNA结合域(例如对所关注DNA序列具有特异性的锌指DNA结合域、TAL效应子DNA结合域等)融合的核酸酶活性。
适用于本发明的靶向核酸酶的其它示例包括但不限于Bxb1、phiC31、R4、PhiBT1和Wβ/SPBc/TP901-1，无论是单独使用还是组合使用。
靶向核酸酶的其它非限制性示例包括天然存在的和重组的核酸酶；CRISPR相关核酸酶来自包括以下的家族：cpf、cse、csy、csn、csd、cst、csh、csa、csm和cmr；限制性内切核酸酶；大范围核酸酶；归巢核酸内切酶等。
作为示例性示例，CRISPR/Cas9需要两种主要组分：(1)Cas9核酸内切酶和(2)crRNA-tracrRNA复合体。共表达时，所述两种组分形成募集到靶标DNA序列的复合体，包含PAM和靠近PAM的接种区域。crRNA与tracrRNA可以组合而形成嵌合向导RNA(gRNA)以引导Cas9靶向所选序列。这两种组分然后可以通过转染或转导递送到哺乳动物细胞。当使用CRISPR/Cpf系统时，需要Cpf内切核酸酶(例如，Cpf1、MAD7和本领域已知的许多)和(2)gNA(其通常不需要tracrRNA)来引导Cpf内切核酸酶靶向所选序列。
DICE介导的插入利用一对重组酶(例如，phiC31和Bxb1)来提供外源DNA的单向整合，其严格局限于每种酶自身的小attB和attP识别位点。由于这些att靶点并非天然存在于哺乳动物基因组中，因此必须首先将其引入基因组中的所期望整合位点。参见例如美国公布号2015/0140665，其公开内容以引用方式并入本文中。
本发明的一个方面提供一种构建体，其包含一个或多个用于靶向基因组整合的外源多核苷酸。在一个实施方案中，构建体还包含对所期望的整合位点具有特异性的一对同源臂，并且靶向整合方法包括将构建体引入细胞中以允许细胞宿主酶机制实现定点同源重组。在另一个实施方案中，在细胞中实现靶向整合的方法包含将包含一个或多个外源多核苷酸的构建体引入细胞中，和将包含对所期望的整合位点具有特异性的DNA结合域的ZFN表达盒引入细胞中以实现ZFN介导的插入。在又一个实施方案中，在细胞中实现靶向整合的方法包含将包含一个或多个外源多核苷酸的构建体引入细胞中，和将包含对所期望的整合位点具有特异性的DNA结合域的TALEN表达盒引入细胞中以实现TALEN介导的插入。在另一个实施方案中，在细胞中实现靶向整合的方法包括将包含一个或多个外源多核苷酸的构建体引入细胞中，将Cas9表达盒和包含对所期望的整合位点具有特异性的向导序列的gRNA引入细胞中以实现Cas9介导的插入。在再一个实施方案中，在细胞中实现靶向整合的方法包括将包含一对DICE重组酶的一个或多个att位点的构建体引入细胞中的所期望的整合位点，将包含一个或多个外源多核苷酸的构建体引入细胞中，以及将DICE重组酶的表达盒引入以实现DICE介导的靶向整合。
有望用于靶向整合的位点包括但不限于安全港基因座或基因组安全港(GSH)，其是人类基因组的基因内或基因外区域，在理论上，其能够容纳新整合的DNA的可预测表达而不会对宿主细胞或生物体产生不利影响。适用的安全港必须允许转基因表达足以产生由载体编码的蛋白质或非编码RNA的所期望水平。安全港还不得使细胞容易发生恶性转化，也不得改变细胞功能。为了使整合位点成为潜在的安全港基因座，理想地需要满足包括但不限于以下的准则：如通过序列注释所判断，调控元件或基因没有中断；是基因密集区域中的基因间区域，或沿相反方向转录的两种基因之间的汇聚位置；保持距离以使载体编码的转录激活子与相邻基因(特别是癌症相关和微RNA基因)的启动子之间的长程相互作用的可能性最小化；并且具有明显普遍存在的转录活性，如通过按较宽空间和时间表达的序列标签(EST)表达模式所反映的，其指示普遍存在的转录活性。这个后一特点在干细胞中特别重要，其中在分化期间，染色质重塑通常引起一些基因座的沉默和其它基因座的潜在激活。在适于外源插入的区域内，选用于插入的确切基因座应所述不含重复元件和保守序列并且可以针对其容易地设计出用于扩增同源臂的引物。
适用于人类基因组编辑或具体地说靶向整合的位点包括但不限于腺相关病毒位点1(AAVS1)、趋化因子(CC基元)受体5(CCR5)基因座和小鼠ROSA26基因座的人类直系同源物。另外，小鼠H11基因座的人类直系同源物也可以是使用本文所公开的靶向整合组合物和方法进行插入的合适位点。另外，也可以使用胶原蛋白和HTRP基因座作为靶向整合的安全港。然而，每个所选位点的验证已表明是必需的，特别是在特异性整合事件的干细胞中，并且通常需要优化插入策略，包括启动子选择、外源基因序列和配置，以及构建体设计。
用于靶向插入/缺失的编辑位点通常包含于其表达和/或功能旨在是中断的内源基因中。在一个实施方案中，包含靶向插入/缺失的内源基因与免疫反应调控和调节相关。在一些其它实施方案中，包含靶向插入/缺失的内源基因与以下相关：靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药物靶标候选物、免疫反应调控和调节，或抑制干细胞和/或祖细胞和其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。
因此，本发明的另一个方面提供一种在所选基因座中进行靶向整合的方法，所选基因座包括基因组安全港或已知或证实安全的预选基因座并且经充分调控以实现连续或暂时基因表达，例如如本文所提供的B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、TRAC或CD38基因座。在一个实施方案中，靶向整合方法用的基因组安全港包含一个或多个所期望的整合位点，包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、CD38、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足基因组安全港准则的其它基因座。在一些实施方案中，靶向整合位于其中期望作为整合的结果的基因敲减或敲除的一个或多个基因座，其中此类基因座包括但不限于B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区(TRAC或TRBC)、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT。
在一个实施方案中，细胞中的靶向整合的方法包括向细胞引入包括一个或多个外源多核苷酸的构建体，以及引入包括对期望整合位点具有特异性的一对同源臂和一个或多个同源序列的构建体，以通过细胞宿主酶机制实现位点特异性同源重组，其中期望的整合位点包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区(TRAC或TRBC)、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT。
在另一个实施方案中，细胞中的靶向整合的方法包括向细胞引入包括一个或多个外源多核苷酸的构建体，以及向细胞引入包括对期望整合位点具有特异性的DNA结合域的ZFN表达盒，以实现ZFN介导的插入，其中期望的整合位点包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区(TRAC或TRBC)、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT。在又一个实施方案中，细胞中的靶向整合的方法包括向细胞引入包括一个或多个外源多核苷酸的构建体，以及向细胞引入包括对期望整合位点具有特异性的DNA结合域的TALEN表达盒，以实现TALEN介导的插入，其中期望的整合位点包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区(TRAC或TRBC)、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT。在另一个实施方案中，细胞中的靶向整合的方法包括向细胞引入包括一个或多个外源多核苷酸的构建体，向细胞引入Cas9表达盒以及包括对期望整合位点具有特异性的引导序列的gRNA，以实现Cas9介导的插入，其中期望的整合位点包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区(TRAC或TRBC)、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT。在又一个实施方案中，细胞中的靶向整合的方法包括向细胞中的期望整合位点引入包括一对DICE重组酶的一个或多个att位点的构建体，向细胞引入包括一个或多个外源多核苷酸的构建体，以及引入DICE重组酶的表达盒，以实现DICE介导的靶向整合，其中期望的整合位点包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区(TRAC或TRBC)、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT。
另外，如本文所提供，用于靶向整合于安全港的上述方法是用于插入所关注的任何多核苷酸，例如编码以下的多核苷酸：安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物靶标候选物，和促进干细胞和/或祖细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些其它实施方案中，包含一个或多个外源多核苷酸的构建体还包含一个或多个标记物基因。在一个实施方案中，本发明的构建体中的外源多核苷酸是编码安全开关蛋白质的自杀基因。适用于诱导细胞死亡的自杀基因系统包括但不限于胱天蛋白酶9(或胱天蛋白酶3或7)和AP1903；胸苷激酶(TK)和更昔洛韦(GCV)；胞嘧啶脱氨酶(CD)和5-氟胞嘧啶(5-FC)。另外，一些自杀基因系统对细胞类型具有特异性，例如使用B细胞分子CD20对T淋巴细胞进行基因修饰允许其在施用mAb利妥昔单抗后消除。另外，当基因工程改造细胞暴露于西妥昔单抗时，含有被西妥昔单抗识别的表位的修饰的EGFR可以用于耗尽该细胞。因而，本发明的一个方面提供一种靶向整合一个或多个编码安全开关蛋白质的自杀基因的方法，该安全开关蛋白质选自胱天蛋白酶9(胱天蛋白酶3或7)、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、修饰的EGFR和B细胞CD20。
在一些实施方案中，通过本文中的方法整合的一个或多个外源多核苷酸通过用于靶向整合的构建体中包含的可操作地连接的外源启动子驱动。这些启动子可以是诱导性的或组成性的，并且可以是时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性的。适用于本发明方法的组成性启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)、延伸因子1α(EF1α)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、杂交CMV增强子/鸡肉β-肌动蛋白(CAG)和泛素C(UBC)启动子。在一个实施方案中，外源启动子是CAG。
通过本文提供的方法整合的外源多核苷酸可通过宿主基因组中的内源启动子在整合位点驱动。在一个实施方案中，本发明的方法用于使一个或多个外源多核苷酸靶向整合于细胞基因组中的AAVS1基因座。在一个实施方案中，至少一种整合的多核苷酸是由内源AAVS1启动子驱动。在另一个实施方案中，本发明的方法用于靶向整合于细胞基因组中的ROSA26基因座。在一个实施方案中，至少一种整合的多核苷酸是由内源ROSA26启动子驱动。在又一个实施方案中，本发明的方法用于靶向整合于细胞基因组中的H11基因座。在一个实施方案中，至少一种整合的多核苷酸是由内源H11启动子驱动。在另一个实施方案中，本发明的方法用于靶向整合于细胞基因组中的胶原蛋白基因座。在一个实施方案中，至少一种整合的多核苷酸是由内源胶原蛋白启动子驱动。在又一个实施方案中，本发明的方法用于靶向整合于细胞基因组中的HTRP基因座。在一个实施方案中，至少一种整合的多核苷酸是由内源HTRP启动子驱动。理论上，只有正确插入所期望位置才能实现由内源启动子驱动的外源基因的基因表达。
在一些实施方案中，靶向整合方法用的构建体中包含的一个或多个外源多核苷酸是由一个启动子驱动。在一些实施方案中，构建体包含一个或多个位于由同一个启动子驱动的两个相邻多核苷酸之间的接头序列，以使得各部分之间的物理间距更大并且使酶机制可行性最大化。接头序列的接头肽可以由为了使各部分(外源多核苷酸，和/或由其编码的蛋白质或肽)之间产生物理间距而选择的氨基酸组成，视相关功能而定，其较柔软或较硬。接头序列可以通过蛋白酶裂解或以化学方式裂解以产生单独的部分。接头中的酶裂解位点示例包括蛋白水解酶(例如肠激酶、因子Xa、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和凝血酶)的裂解位点。在一些实施方案中，所述蛋白酶是由宿主天然产生的蛋白酶或其通过外源引入。可替代地，接头中的裂解位点可以是在暴露于所选化学物质或条件(例如溴化氰、羟胺或低pH)后能够裂解的位点。任选存在的接头序列可以服务于除提供裂解位点之外的目的。接头序列应允许该部分相对于另一相邻部分有效定位，以便该部分正确地发挥功能。接头还可以是长度足以防止所述部分之间出现任何空间位阻的简单氨基酸序列。另外，接头序列可以实现转译后修饰，包括但不限于例如磷酸化位点、生物素化位点、硫酸化位点、γ-羧基化位点等等。在一些实施方案中，接头序列是柔软的，以便使生物活性肽不能保持单一非期望的构象。接头可以主要包含具有小侧链的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，以提供柔性。在一些实施方案中，接头序列中的约80％或90％或更多包含甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基，尤其是甘氨酸和丝氨酸残基。在若干实施方案中，G4S接头肽将融合蛋白的末端处理域和核酸内切酶结构域分隔。在其它实施方案中，2A接头序列允许单次转译产生两种单独的蛋白质。合适的接头序列能容易凭经验鉴别。另外，接头序列的合适尺寸和序列也能通过常规计算机建模技术确定。在一个实施方案中，接头序列编码自裂解肽。在一个实施方案中，自裂解肽是2A。在一些其它实施方案中，接头序列提供内部核糖体入口序列(IRES)。在一些实施方案中，任何两个相邻的接头序列是不同的。
将包含待靶向整合的外源多核苷酸的构建体引入细胞中的方法可使用本来已知的将基因转移到细胞的方法实现。在一个实施方案中，该构建体包含病毒载体诸如腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体或仙台病毒载体的骨架。在一些实施方案中，质粒载体用于将外源多核苷酸递送到靶细胞中和/或使外源多核苷酸在靶细胞中表达(例如pAl-11、pXTl、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)等。在一些其它实施方案中，游离型载体用于将外源多核苷酸递送到靶细胞。在一些实施方案中，重组腺相关病毒(rAAV)可用于基因工程以通过同源重组来引入插入、缺失或取代。不同于慢病毒，rAAV不整合到宿主基因组中。另外，游离型rAAV载体介导同源定向的基因，其相较于常规靶向质粒的转染以高得多的比例靶向。在一些实施方案中，AAV6或AAV2载体用于在iPSC的基因组中的靶位点引入插入、缺失或取代。在一些实施方案中，使用本文中的方法和组合物获得的基因组修饰的iPSC和其衍生细胞包含表1中所列的至少一种基因型。
III.获得和维持基因组工程改造的iPSC的方法
本发明提供一种获得和维持基因组工程改造的iPSC的方法，该方法包括在一个或多个所期望的位点进行的一个或多个靶向编辑，其中该靶向编辑在扩增的基因组工程改造的iPSC或iPSC衍生非多能细胞中、在相应所选编辑位点处保持完整和功能。靶向编辑将iPSC和其衍生细胞插入、缺失和/或取代引入基因组中(即，在所选位点引入靶向整合和/或插入/缺失)。与直接工程改造患者源的外周血起源原代效应细胞相比，通过编辑和分化如本文所提供的iPSC获得基因组工程改造的iPSC衍生细胞的许多益处包括但不限于：工程改造的效应细胞的来源不受限制；无需重复操纵效应细胞，尤其在涉及多种工程改造的模式时；所获得的效应细胞因具有伸长端粒和经历较少耗竭而再生；效应细胞群关于编辑位点、拷贝数和缺乏等位基因变体、随机突变和表达杂色是均匀的，主要是由于如本文所提供的工程改造的iPSC中能够进行克隆选择。
在特定实施方案中，包含在一个或多个所选位点进行一个或多个靶向编辑的基因组工程改造iPSC作为单一细胞在表2所示的作为命运维持培养基(FMM)的细胞培养基中长期维持、传代和扩增，其中该iPSC在所选位点保留靶向编辑和功能修饰。培养基的组分可以表2中所示的最优范围内的量存在于培养基中。FMM中培养的iPSC已表明继续维持其未分化和基础或初始轮廓；基因组稳定性，而不需要培养物清洁或选择；并且经由体外类胚胎体或单层分化(不形成类胚胎体)；以及体内畸胎瘤形成的分化容易产生所有三种体细胞谱系。参见例如国际公布号WO2015/134652，其公开内容以引用方式并入本文。
表2：用于iPSC重编程和维持的例示性培养基
在一些实施方案中，包含一种或多种靶向整合和/或插入/缺失的基因组工程改造的iPSC在包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂并且不含或基本上不含TGFβ受体/ALK5抑制剂的培养基中维持、传代和扩增，其中iPSC在所选位点保留完整和功能性靶向编辑。
本发明的另一个方面提供了一种产生基因组工程改造的iPSC的方法，其通过iPSC的靶向编辑；或者首先通过靶向编辑来产生基因组工程改造非多能细胞，并且然后将所选/分离的基因组工程改造非多能细胞重编程，以获得包含与非多能细胞相同的靶向编辑的iPSC。本发明的另一个方面提供基因组工程改造的非多能细胞，其通过将靶向整合和/或靶向插入/缺失引入细胞中而同时经历重编程，其中所接触的非多能细胞处于足以用于重编程的条件下，并且其中重编程条件包含使非多能细胞与一种或多种重编程因子和小分子接触。在同时进行基因组工程改造和重编程的方法的各种实施方案中，可以在启动重编程之前或基本上同时，通过使非多能细胞与一种或多种重编程因子和任选的小分子接触而将靶向整合和/或靶向插入/缺失引入非多能细胞中。
在一些实施方案中，为了对非多能细胞同时进行基因组工程改造和重编程，还可在通过使非多能细胞与一种或多种重编程因子和小分子接触而启动多日重编程工艺之后，将靶向整合和/或插入/缺失引入非多能细胞中，并且其中携带构建体的载体是在重编程细胞呈现一种或多种内源多能基因(包括但不限于SSEA4、Tra181和CD30)的稳定表达之前引入。
在一些实施方案中，重编程是通过使非多能细胞与至少一种重编程因子和任选TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂与ROCK抑制剂的组合(FRM；表2)来维持和扩增。在一些实施方案中，通过上述任何方法产生的基因组工程改造iPSC进一步使用包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的组合的混合物(FMM；表2)来维持和扩增。
在产生基因组工程改造iPSC的方法的一些实施方案中，该方法包括：对iPSC进行基因组工程改造，其通过将一个或多个靶向整合和/或插入/缺失引入iPSC中以获得具有至少一种表1中所列的基因型的基因组工程改造iPSC。可替代地，产生基因组工程改造的iPSC的方法包括：(a)将一个或多个靶向编辑引入非多能细胞中，以获得包含位于所选位点的靶向整合和/或插入/缺失的基因组工程改造非多能细胞，以及(b)使基因组工程改造非多能细胞与一种或多种重编程因子和任选小分子组合物接触，以获得包含位于所选位点的靶向整合和/或插入/缺失的基因组工程改造iPSC，该小分子组合物包含TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂。可替代地，产生基因组工程改造的iPSC的方法包括：(a)使非多能细胞与一种或多种重编程因子和任选小分子组合物接触，以启动非多能细胞重编程，该小分子组合物包含TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂；(B)将一种或多种靶向整合和/或插入/缺失引入用于基因组工程改造的重编程非多能细胞中；以及(c)获得包含位于所选位点的靶向整合和/或插入/缺失的基因组工程改造的iPSC。上述方法中的任一种方法还可包括对基因组工程改造的iPSC的单细胞分选以获得克隆iPSC。通过该基因组工程改造的iPSC的克隆扩增，产生主细胞库以包含具有至少一种如本文表1提供的表型的单细胞分选和扩增的克隆工程改造的iPSC。主细胞库随后被冷冻保存，从而提供用于附加iPSC工程改造的平台，以及用于制造现成的、工程改造的、同质的细胞疗法产品的可再生来源，该细胞疗法产品在组成上是明确定义的和均一的，并且可以以成本有效的方式大规模生产。
重编程因子选自由以下组成的组：OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C-MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、SV40LT、HESRG、CDH1、TDGF1、DPPA4、DNMT3B、ZIC3、L1TD1和它们的任何组合，如国际公布号WO2015/134652和WO2017/066634中所公开，其公开内容以引用方式并入本文。一种或多种重编程因子可呈多肽形式。重编程因子也可呈多核苷酸形式，从而通过载体(诸如逆转录病毒、仙台病毒、腺病毒、游离基因体、质粒和小环)引入非多能细胞中。在特定实施方案中，通过慢病毒载体引入编码至少一种重编程因子的一种或多种多核苷酸。在一些实施方案中，通过游离型载体引入一种或多种多核苷酸。在各种其它实施方案中，通过仙台病毒载体引入一种或多种多核苷酸。在一些实施方案中，通过质粒的组合引入一种或多种多核苷酸。参见例如国际公布号WO2019/075057，其公开内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，非多能细胞利用包含不同外源多核苷酸和/或不同启动子的多种构建体、通过用于在相同或不同所选位点进行靶向整合的多种载体进行转移。这些外源多核苷酸可以包含自杀基因，或编码靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物靶标候选物的基因，或编码蛋白质的基因，该蛋白质促进iPSC或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活。在一些实施方案中，外源多核苷酸编码RNA，包括但不限于siRNA、shRNA、miRNA和反义核酸。这些外源多核苷酸可以由一个或多个启动子驱动，该启动子选自由以下组成的组：组成性启动子、诱导性启动子、时间特异性启动子和组织或细胞类型特异性启动子。因此，当在例如在诱导剂存在下或在特定分化细胞类型中激活启动子的条件下时，多核苷酸是可表达的。在一些实施方案中，多核苷酸在iPSC中和/或在由iPSC分化的细胞中表达。在一个实施方案中，一个或多个自杀基因由组成性启动子驱动，例如Capase-9由CAG驱动。可以同时或连续将包含不同外源多核苷酸和/或不同启动子的这些构建体转移到非多能细胞中。经历多个构建体的靶向整合的非多能细胞可同时接触一个或多个重编程因子以与基因组工程改造同时启动重编程，从而获得在同一细胞池中包含多个靶向整合的基因组工程改造的iPSC。因此，这一稳固方法实现同时重编程和工程改造策略，从而得到具有整合到一个或多个所选靶位点的多种模式的克隆的基因组工程改造hiPSC。在一些实施方案中，使用本文中的方法和组合物获得的基因组修饰的iPSC和其衍生细胞包含表1中所列的至少一种基因型。
IV.通过分化基因组工程改造的iPSC获得基因工程改造的效应细胞的方法
本发明的另一方面提供一种通过畸胎瘤形成体内分化基因组工程改造的iPSC的方法，其中通过基因组工程改造的iPSC体内衍生的分化细胞保留完整和功能性靶向编辑，其包括在所期望的位点处的靶向整合和/或插入/缺失。在一些实施方案中，基因组工程改造的iPSC经由畸胎瘤体内衍生的分化细胞包含在一个或多个期望位点整合的一个或多个诱导性自杀基因，该一个或多个期望位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、CD38、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足基因组安全港准则的其它基因座。在一些其它实施方案中，基因组工程改造iPSC经由畸胎瘤体内衍生的分化细胞包含编码靶向模式或编码促进干细胞和/或祖细胞的运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质的多核苷酸。在一些实施方案中，基因组工程改造的iPSC经由畸胎瘤体内衍生的分化细胞包含一个或多个诱导性自杀基因，在与免疫反应调控和介导相关的内源基因中还包含一个或多个插入/缺失。在一些实施方案中，插入/缺失包含在一个或多个内源检查点基因中。在一些实施方案中，插入/缺失包含在一个或多个内源T细胞受体基因中。在一些实施方案中，插入/缺失包含在一个或多个内源MHC I类抑制基因中。在一些实施方案中，插入/缺失包含在与主要组织相容性复合体相关的一个或多个内源基因中。在一些实施方案中，插入/缺失包括在一个或多个内源基因中，该一个或多个内源基因包括但不限于AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区(TRAC或TRBC)、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT。在一个实施方案中，在所选位点包含一个或多个外源多核苷酸的基因组工程改造iPSC在B2M(β-2-微球蛋白)编码基因中还包含靶向编辑。
在特定实施方案中，包含如本文所提供的一种或多种基因修饰的基因组工程改造的iPSC用于体外衍生造血细胞谱系或任何其它特定细胞类型，其中衍生非多能细胞保留功能性基因修饰，包括在所选位点处的靶向编辑。在一些实施方案中，用于体外衍生造血细胞谱系或任何其它特定细胞类型的基因组工程改造的iPSC是就在其使用前冷冻保存并解冻的主细胞库细胞。在一个实施方案中，基因组工程改造的iPSC衍生细胞包括但不限于具有永久性生血内皮细胞(HE)潜能的中胚层细胞、永久性HE、CD34造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多能祖细胞(MPP)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、骨髓细胞、嗜中性粒细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞，其中衍生自基因组工程改造iPSC的这些细胞保留功能性基因修饰，包括在所期望的位点处的靶向编辑。
适用于获得iPSC衍生造血细胞谱系的分化方法和组合物包括例如国际公布号WO2017/078807中描绘的分化方法和组合物，该公布的公开内容以引用方式并入本文中。如所提供，用于产生造血细胞谱系的方法和组合物是在无血清、无饲养层和/或无基质的条件下并且在可扩展和单层培养平台中在无需EB形成的情况下通过衍生自多能干细胞(包括hiPSC)的永久性生血内皮细胞(HE)。可以根据所提供的方法分化的细胞的范围是多能干细胞到专门化为特定末端分化细胞和转分化细胞的祖细胞、和直接转向造血命运而不经历多能中间体的多种谱系细胞。类似地，干细胞分化而产生的细胞的范围是多潜能干细胞或祖细胞到末端分化细胞，和所有中间造血细胞谱系。
在一些实施方案中，用于在单层培养中分化和扩增来自多能干细胞的造血谱系细胞的方法包括使多能干细胞与BMP路径活化剂和任选的bFGF接触。如所提供，无需由多能干细胞形成类胚胎体便获得并且扩增多能干细胞衍生中胚层细胞。然后使中胚层细胞与BMP路径活化剂、bFGF和WNT路径活化剂接触，以获得具有永久性生血内皮细胞(HE)潜能的扩增中胚层细胞，而无需由多能干细胞形成类胚胎体。通过随后与bFGF和任选存在的ROCK抑制剂和/或WNT路径活化剂接触，具有永久性HE潜能的中胚层细胞分化成永久性HE细胞，在分化期间，所述永久性HE细胞还得以扩增。
在一些实施方案中，本文所提供的用于获得造血谱系细胞的方法优于EB介导的多能干细胞分化，原因在于：EB形成产生了适度到最低限度的细胞扩增；不允许单层培养，而单层培养对于需要细胞在群体中均匀扩增和均匀分化的许多应用来说是重要的；并且费力、效率低。
在一些实施方案中，所提供的单层分化平台促进向永久性生血内皮细胞分化，从而得到造血干细胞和分化后代，例如T细胞、B细胞、NKT细胞和NK细胞。单层分化策略实现了增强的分化效率与大规模扩增的组合，从而能够在不同治疗应用中递送治疗上相关数目个多能干细胞衍生造血细胞。此外，使用本文所提供的方法进行的单层培养产生了功能造血谱系细胞，其实现了全范围的试管内分化、体外调节和体内长期造血自我更新、重构和移植。如所提供，iPSC衍生造血谱系细胞包括但不限于永久性生血内皮细胞、造血多能祖细胞、造血干细胞和祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞。
在一些实施方案中，用于使多能干细胞定向分化成永久性造血谱系细胞的方法包括：(i)使多能干细胞与包含BMP活化剂和任选bFGF的组合物接触，以启动从多能干细胞分化和扩增中胚层细胞；(ii)使中胚层细胞与包含BMP活化剂、bFGF和GSK3抑制剂的组合物接触，以启动从中胚层细胞分化和扩增具有永久性HE潜能的中胚层细胞，其中该组合物任选地不含TGFβ受体/ALK抑制剂；(iii)使具有永久性HE潜能的中胚层细胞与组合物接触，以启动从具有永久性生血内皮细胞潜能的多能干细胞衍生中胚层细胞分化和扩增永久性生血内皮细胞，该组合物包含ROCK抑制剂；选自由bFGF、VEGF、SCF、IGF、EPO、IL6和IL11组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子；以及任选Wnt路径活化剂，其中该组合物任选地不含TGFβ受体/ALK抑制剂。
在一些实施方案中，所述方法还包含：使多能干细胞与包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的组合物接触，以接种和扩增多能干细胞，其中组合物不含TGFβ受体/ALK抑制剂。在一些实施方案中，多能干细胞是iPSC、或初始iPSC、或包含一个或多个遗传印记的iPSC；并且iPSC中包含的一种或多种遗传印记保留在由其分化的造血细胞中。在用于使多能干细胞定向分化成造血谱系细胞的一些实施方案中，多能干细胞分化成造血谱系细胞不产生类胚胎体，并且呈单层培养形式。
在上述方法的一些实施方案中，所得多能干细胞衍生永久性生血内皮细胞是CD34+。在一些实施方案中，所得永久性生血内皮细胞是CD34+CD43-。在一些实施方案中，永久性生血内皮细胞是CD34+CD43-CXCR4-CD73-。在一些实施方案中，永久性生血内皮细胞是CD34+CXCR4-CD73-。在一些实施方案中，永久性生血内皮细胞是CD34+CD43-CD93-。在一些实施方案中，永久性生血内皮细胞是CD34+CD93-。
在上述方法的一些实施方案中，该方法还包括(i)使多能干细胞衍生永久性生血内皮细胞与组合物接触以启动永久性生血内皮细胞分化成前T细胞祖细胞，该组合物包含ROCK抑制剂；选自由VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、TPO和IL7组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子；以及任选BMP活化剂；以及任选地，(ii)使前T细胞祖细胞与组合物接触以启动前T细胞祖细胞分化成T细胞祖细胞或T细胞，该组合物包含选自由SCF、Flt3L和IL7组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子，但不含VEGF、bFGF、TPO、BMP活化剂和ROCK抑制剂中的一者或多者。在该方法的一些实施方案中，多能干细胞衍生T细胞祖细胞是CD34+CD45+CD7+。在该方法的一些实施方案中，多能干细胞衍生T细胞祖细胞是CD45+CD7+。
在用于使多能干细胞定向分化成造血谱系细胞的上述方法的又一些实施方案中，该方法还包括：(i)使多能干细胞衍生永久性生血内皮细胞与组合物接触以启动永久性生血内皮细胞分化成前NK细胞祖细胞，该组合物包含ROCK抑制剂；选自由VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、TPO、IL3、IL7和IL15组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子；以及任选BMP活化剂；以及任选地，(ii)使多能干细胞衍生前NK细胞祖细胞与组合物接触以启动前NK细胞祖细胞分化成NK细胞祖细胞或NK细胞，该组合物包含选自由SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子，其中培养基不含VEGF、bFGF、TPO、BMP活化剂和ROCK抑制剂中的一者或多者。在一些实施方案中，多能干细胞衍生NK祖细胞是CD3-CD45+CD56+CD7+。在一些实施方案中，多能干细胞衍生NK细胞是CD3-CD45+CD56+，以及任选地进一步由NKp46+、CD57+和CD16+定义。
因此，使用上述分化方法，可以获得一种或多种iPSC衍生造血细胞群：(i)CD34+HE(iCD34)，使用一种或多种选自iMPP-A、iTC-A2、iTC-B2、iNK-A2和iNK-B2的培养基；(ii)永久性生血内皮细胞(iHE)，使用一种或多种选自iMPP-A、iTC-A2、iTC-B2、iNK-A2和iNK-B2的培养基；(iii)永久性HSC，使用一种或多种选自iMPP-A、iTC-A2、iTC-B2、iNK-A2和iNK-B2的培养基；(iv)多潜能祖细胞(iMPP)，使用iMPP-A；(v)T细胞祖细胞(ipro-T)，使用一种或多种选自iTC-A2和iTC-B2的培养基；(vi)T细胞(iTC)，使用iTC-B2；(vii)NK细胞祖细胞(ipro-NK)，使用一种或多种选自iNK-A2和iNK-B2的培养基；和/或(viii)NK细胞(iNK)，和iNK-B2。在一些实施方案中，所述培养基：
a.iCD34-C包含ROCK抑制剂、选自由bFGF、VEGF、SCF、IL6、IL11、IGF和EPO组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子，以及任选Wnt路径活化剂；并且不含TGFβ受体/ALK抑制剂；
b.iMPP-A包含BMP活化剂、ROCK抑制剂以及选自由TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6、Flt3L和IL11组成的组一种或多种生长因子和的细胞因子；
c.iTC-A2包含ROCK抑制剂；选自由SCF、Flt3L、TPO和IL7组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子；以及任选BMP活化剂；
d.iTC-B2包含选自由SCF、Flt3L和IL7组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子；
e.iNK-A2包含ROCK抑制剂和选自由SCF、Flt3L、TPO、IL3、IL7和IL15组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子；以及任选BMP活化剂，以及
f.iNK-B2包含选自由SCF、Flt3L、IL7和IL15组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子。
在一些实施方案中，通过以上方法获得的基因组工程改造iPSC衍生细胞包括在一个或多个期望整合位点处整合的一个或多个诱导性自杀基因，该一个或多个期望整合位点包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区(TRAC或TRBC)、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT或满足基因组安全港准则的其它基因座。在一些其它实施方案中，基因组工程改造的iPSC衍生细胞包含编码以下的多核苷酸：安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物靶标候选物或促进干细胞和/或祖细胞的运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些实施方案中，包含一个或多个自杀基因的基因组工程改造的iPSC衍生细胞还包含一个或多个内源基因中所包含的一种或多种插入/缺失，该内源基因与免疫反应调控和介导相关，包括但不限于检查点基因、内源T细胞受体基因和MHC I类抑制基因。在一个实施方案中，包含一个或多个自杀基因的基因组工程改造iPSC衍生细胞在B2M基因中还包含插入/缺失，其中敲除B2M。
另外，可应用于获得第一命运的基因组工程改造造血细胞到第二命运的基因组工程改造造血细胞的去分化方法和组合物包括例如公布号WO2011/159726中所描绘的方法和组合物，其公开内容以引用方式并入本文中。其中提供的方法和组合物通过以下方式允许部分地将起始非多能细胞重编程为非多能中间细胞：在重编程期间限制内源Nanog基因表达；以及使非多能中间细胞经历用于使中间细胞分化成期望细胞类型的条件。在一些实施方案中，使用本文中的方法和组合物获得的基因组修饰的iPSC和其衍生细胞包含表1中所列的至少一种基因型。
V.具有由基因工程改造iPSC分化的功能模式的衍生免疫细胞的治疗用途
在一些实施方案中，本发明提供一种组合物，其包含功能上增强的衍生免疫细胞的分离的群体或亚群，这些免疫细胞使用所公开的方法和组合物由基因组工程改造iPSC分化。在一些实施方案中，该组合物的iPSC包含一种或多种靶向基因编辑(诸如表1中所列的那些靶向基因编辑)，其能在iPSC衍生免疫细胞中保留，其中基因工程改造iPSC和其衍生细胞适于基于细胞的过继性疗法。在一个实施方案中，该组合物的基因工程改造免疫细胞的分离的群体或亚群包含iPSC衍生CD34细胞。在一个实施方案中，该组合物的基因工程改造免疫细胞的分离的群体或亚群包含iPSC衍生HSC细胞。在一个实施方案中，该组合物的基因工程改造免疫细胞的分离的群体或亚群包含iPSC衍生proT细胞或T细胞。在一个实施方案中，该组合物的基因工程改造免疫细胞的分离的群体或亚群包含iPSC衍生proNK细胞或NK细胞。在一个实施方案中，该组合物的基因工程改造免疫细胞的分离的群体或亚群包含iPSC衍生免疫调控细胞或骨髓衍生抑制性细胞(MDSC)。在该组合物的一些实施方案中，iPSC衍生基因工程改造免疫细胞进一步离体调节以改善治疗潜能。在该组合物的一个实施方案中，已源自iPSC的基因工程改造免疫细胞的分离的群体或亚群包含增加的数目或比例的初始T细胞、干细胞记忆T细胞和/或中枢记忆T细胞。在该组合物的一个实施方案中，已源自iPSC的基因工程改造免疫细胞的分离的群体或亚群包含增加的数目或比例的I型NKT细胞。在该组合物的另一个实施方案中，已源自iPSC的基因工程改造免疫细胞的分离的群体或亚群包含增加的数目或比例的适应性NK细胞。在该组合物的一些实施方案中，源自iPSC的基因工程改造CD34细胞、HSC细胞、T细胞、NK细胞或骨髓衍生抑制性细胞的分离群体或亚群是同种异体的。在该组合物的一些其它实施方案中，源自iPSC的基因工程改造CD34细胞、HSC细胞、T细胞、NK细胞或MDSC的分离的群体或亚群是自体的。
在该组合物的一些实施方案中，用于分化的iPSC包含被选择以在效应细胞中传达所期望的治疗属性的遗传印记，其限制条件为分化期间的细胞发育生物学不中断，并且其限制条件为遗传印记在源自所述iPSC的分化的造血细胞中保留并且起作用。
在该组合物的一些实施方案中，多能干细胞中的遗传印记包含(i)在将非多能细胞重编程为iPSC期间或之后通过在多能细胞基因组中进行基因组插入、缺失或取代而获得的一种或多种基因修饰模式；或者(ii)对供体特异性、疾病特异性或治疗反应特异性的来源特异性免疫细胞的一种或多种可保留治疗属性，并且其中多能细胞是由来源特异性免疫细胞重编程，其中iPSC保留来源治疗属性，iPSC衍生的造血谱系细胞中也包含该来源治疗属性。
在该组合物的一些实施方案中，基因修饰模式包含以下中的一者或多者：安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物靶标候选物；或者促进iPSC或其衍生细胞的移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留、免疫反应调控和调节和/或存活的蛋白质。在该组合物的一些实施方案中，基因修饰的iPSC和其衍生细胞包含表1中所列的基因型。在该组合物的一些其它实施方案中，包含表1中所列的基因型的经遗传修饰的iPSC及其衍生细胞还包含另外的经遗传修饰的模式，这些模式包括(1)TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5或RFXAP、RAG1以及染色体6p21区域中的任何基因中的一者或多者的破坏；以及(2)HLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、Fc受体或用于与双特异性、多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体的引入。
在该组合物的一些其它实施方案中，造血谱系细胞包含与以下中的至少两者的组合相关的来源特异性免疫细胞的治疗属性：(i)一种或多种抗原靶向受体的表达；(ii)经修饰的HLA；(iii)对肿瘤微环境的抗性；(iv)募集旁观者免疫细胞和免疫调节；(v)随着肿瘤外效应降低，靶上特异性改善；以及(vi)改善的归巢、存留、细胞毒性或抗原逃逸挽救。
在该组合物的一些实施方案中，iPSC衍生造血细胞包含表1中所列的基因型，这些细胞表达至少一种细胞因子和/或其受体，包含IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18或IL21或其任何被修饰的蛋白质，并且至少表达CAR。在一些实施方案中，细胞因子和CAR的工程改造表达具有NK细胞特异性。在该组合物的一些其它实施方案中，细胞因子和CAR的工程改造表达具有T细胞特异性。在一个实施方案中，CAR包含CD38结合域。在一些实施方案中，iPSC衍生造血效应细胞对抗原具有特异性。在一些实施方案中，抗原特异性衍生效应细胞靶向液体肿瘤。在一些实施方案中，抗原特异性衍生效应细胞靶向实体瘤。在一些实施方案中，抗原特异性iPSC衍生效应细胞能够挽救肿瘤抗原逃逸。
多种疾病可通过向适合于过继性细胞疗法的受试者引入根据本发明的一些实施方案的免疫细胞或组合物而得到改善。在一些实施方案中，所提供的iPSC衍生造血细胞或组合物用于同种异体过继性细胞疗法。另外，在一些实施方案中，本发明通过以下方式提供了上述免疫细胞或治疗组合物的治疗用途：将细胞或组合物引入适于过继性细胞疗法的受试者，其中受试者患有自身免疫性障碍；血液系统恶性肿瘤；实体瘤；或与HIV、RSV、EBV、CMV、腺病毒或BK多瘤病毒相关联的感染。血液系统恶性肿瘤的示例包括但不限于急性和慢性白血病(急性骨髓性白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML))、淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、霍奇金氏病、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合症。实体癌的示例包括但不限于脑癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、子宫癌、皮肤癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、卵巢癌、睾丸癌、膀胱癌、肾癌、头癌、颈癌、胃癌、子宫颈癌、直肠癌、喉癌和食道癌。多种自身免疫性障碍的示例包括但不限于斑秃、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、皮肌炎、糖尿病(1型)、幼年型特发性关节炎的一些形式、肾小球肾炎、格雷夫斯病(Graves’disease)、吉兰-巴雷综合症(Guillain-Barrésyndrome)、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、心肌炎的一些形式、多发性硬化症、天疱疮/类天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、类风湿性关节炎、硬皮病/全身性硬化症、薛格连氏综合症(s syndrome)、全身性红斑狼疮、甲状腺炎的一些形式、葡萄膜炎的一些形式、白癜风、肉芽肿性多血管炎(韦格纳氏病(Wegener’s))。病毒感染的示例包括但不限于HIV(人类免疫缺陷病毒)、HSV(单纯疱疹病毒)、KSHV(卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒)、RSV(呼吸道合胞病毒)、EBV(EB病毒)、CMV(巨细胞病毒)、VZV(水痘带状疱疹病毒)、腺病毒、慢病毒、BK多瘤病毒相关障碍。
使用本文所公开的实施方案的衍生造血谱系细胞或本文提供的组合物的治疗可在症状后进行或用于防止复发。术语“治疗(treatment、treating)”等在本文中一般用于意指获得所期望的药理学和/或生理学作用。对于疾病和/或可归因于所述疾病的不良作用，所述作用就完全或部分预防疾病来说，可以是防治性的，和/或就部分或完全治愈来说，可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对受试者疾病的任何干预，并且包括：防止可能易患疾病、但尚未被诊断患有其的受试者出现该疾病；抑制该疾病，即，阻滞其发展；或者缓解该疾病，即，引起疾病的消退。可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用治疗剂或组合物。发展中的疾病的治疗也是备受关注的，其中治疗稳定或减少患者的不期望的临床症状。在特定实施方案中，需要治疗的受试者患有可以通过细胞疗法使至少一种相关症状得以含有、改善和/或好转的疾病、病况和/或损伤。某些实施方案预期需要细胞疗法的受试者包括但不限于骨髓或干细胞移植候选者、已接受化学疗法或照射疗法的受试者、患有或处于产生过度增殖障碍或癌症(例如过度增殖障碍或造血系统癌症)的风险下的受试者、患有肿瘤(例如实体瘤)或处于罹患肿瘤的风险下的受试者、患有病毒感染或与病毒感染相关的疾病或处于患有病毒感染或与病毒感染相关的疾病的风险下的受试者。
在评估对包含本文中所公开的实施方案的衍生造血谱系细胞的治疗的反应性时，反应可由包含以下中的至少一者的准则来测量：临床效益率、直到死亡的存活期、病理性完全反应、病理性反应的半定量测量、临床完全缓解、临床部分缓解、临床稳定疾病、无再现存活、无转移存活、无疾病存活、循环肿瘤细胞减少、循环标记物反应和实体瘤的反应评估准则(Response Evaluation Criteria In Solid Tumors；RECIST)。
可在其它治疗之前、期间和/或之后在受试者中施用包含如本文所公开的衍生造血谱系细胞的治疗组合物。因此，组合疗法的方法可涉及在使用另外治疗剂之前、期间和/或之后施用或制备iPSC衍生免疫细胞。如上文所提供，一种或多种附加治疗剂包含肽、细胞因子、检查点抑制剂、衔接子、丝裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或其置换因子、包含一种或多种所关注多核酸的载体、抗体、化学治疗剂或放射性部分或免疫调节药物(IMiD)。施用iPSC衍生免疫细胞与施用另外治疗剂可以在时间上间隔几小时、几天或甚至几周。另外地或可替代地，施用可与其它生物活性剂或模式组合，所述生物活性剂或模式例如但不限于抗肿瘤剂、非药物疗法，例如手术。
在组合细胞疗法的一些实施方案中，治疗组合包含本文所提供的iPSC衍生造血谱系细胞和另外治疗剂，该另外治疗剂是抗体或抗体片段。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体可以是人源化抗体、人源化单克隆抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体或抗体片段特异性结合于病毒抗原。在其它实施方案中，抗体或抗体片段特异性结合于肿瘤抗原。在一些实施方案中，肿瘤或病毒特异性抗原激活所施用的iPSC衍生造血谱系细胞以增强其杀伤能力。在一些实施方案中，适用于作为另外治疗剂与所施用的iPSC衍生造血谱系细胞的组合疗法的抗体包括但不限于抗CD20(例如利妥昔单抗、维妥珠单抗、奥法木单抗、乌妥昔单抗、奥卡妥珠单抗、奥妥珠单抗、异贝莫单抗、奥瑞珠单抗)、抗CD22(奥英妥珠单抗、莫塞妥单抗、依帕珠单抗)、抗HER2(例如曲妥珠单抗、帕妥珠单抗)、抗CD52(阿伦单抗)、抗EGFR(例如西妥昔单抗)、抗GD2(例如迪妥昔单抗)、抗PDL1(例如阿维鲁单抗)、抗CD38(例如达雷木单抗、伊沙妥昔单抗、MOR202)、抗CD123(例如7G3、CSL362)、抗SLAMF7(依托珠单抗)和它们的人源化或Fc修饰的变体或片段或它们的功能等效物和生物类似物。在一些实施方案中，本发明提供了治疗组合物，该治疗组合物包含具有表1中所列且本文提供的基因型的iPSC衍生造血谱系细胞和另外的治疗剂，该另外的治疗剂是如上所述的抗体或抗体片段。
在一些实施方案中，附加治疗剂包含一种或多种检查点抑制剂。检查点是指细胞分子，通常是细胞表面分子，在不被抑制时能够抑制或下调免疫反应。检查点抑制剂是能够减少检查点基因表达或基因产物或降低检查点分子活性的拮抗剂。适用于与如本文所提供的衍生效应细胞(包括NK细胞或T细胞)的组合疗法的检查点抑制剂包括但不限于PD-1(Pdcdl、CD279)、PDL-1(CD274)、TIM-3(Havcr2)、TIGIT(WUCAM和Vstm3)、LAG-3(Lag3、CD223)、CTLA-4(Ctla4、CD152)、2B4(CD244)、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、A2AR、BATE、BTLA、CD39(Entpdl)、CD47、CD73(NT5E)、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、视黄酸受体α(Rara)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E和抑制性KIR(例如2DL1、2DL2、2DL3、3DL1和3DL2)的拮抗剂。
包含所提供的衍生效应细胞的组合疗法的一些实施方案还包含至少一种靶向检查点分子的抑制剂。具有所提供的衍生效应细胞的组合疗法的一些其它实施方案包含两种、三种或更多种抑制剂，以使得靶向两种、三种或更多种检查点分子。在一些实施方案中，用于如本文所述的组合疗法的效应细胞是如所提供的衍生NK谱系细胞。在一些实施方案中，用于如本文所述的组合疗法的效应细胞是衍生T谱系细胞。在一些实施方案中，如本文所提供，用于组合疗法的衍生NK谱系细胞或T谱系细胞在功能上增强。在一些实施方案中，两种、三种或更多种检查点抑制剂可以在施用衍生效应细胞同时、之前或之后在组合疗法中施用。在一些实施方案中，两种或更多种检查点抑制剂同时或一次一个地(依序)施用。在一些实施方案中，本发明提供了治疗组合物，该治疗组合物包含具有表1中所列且本文提供的基因型的iPSC衍生效应细胞和如上所述的一种或多种检查点抑制剂。
在一些实施方案中，抑制以上检查点分子中的任一种的拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，检查点抑制性抗体可以是鼠类抗体、人类抗体、人源化抗体、骆驼Ig、只有重链的鲨鱼抗体(VNAR)、Ig NAR、嵌合抗体、重组抗体或它们的抗体片段。抗体片段的非限制性示例包括Fab、Fab′、F(ab′)2、F(ab′)3、Fv、单链抗原结合性片段(scFv)、(scFv)2、二硫键稳定的Fv(dsFv)、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、单域抗原结合性片段(sdAb，纳米抗体)、只有重链的重组抗体(VHH)和维持全部抗体的结合特异性的其它抗体片段，其比起全部抗体可以更有成本效益地产生、更易于使用或更敏感。在一些实施方案中，一种、或两种、或三种、或更多种检查点抑制剂包含阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、伊匹单抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗和它们的衍生物或功能等效物中的至少一者。
包含衍生效应细胞和一种或多种检查点抑制剂的组合疗法适用于治疗液体和实体癌，其包括但不限于皮肤T细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、蕈样真菌病、帕哲样网状细胞增生症、塞氏综合症、肉芽肿性皮肤松弛、淋巴瘤样丘疹病、慢性苔癣样糠疹、急性苔癣痘疹样糠疹、CD30+皮肤T细胞淋巴瘤、继发性皮肤CD30+大细胞淋巴瘤、非蕈样真菌病CD30皮肤大T细胞淋巴瘤、多形性T细胞淋巴瘤、伦纳特淋巴瘤、皮下T细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤、母细胞NK细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(HL)、头颈部肿瘤；鳞状细胞癌、横纹肌肉瘤、路易斯肺癌(LLC)、非小细胞肺癌、食管鳞状细胞癌、食道腺癌、肾细胞癌(RCC)、结肠直肠癌(CRC)、急性骨髓白血病(AML)、乳腺癌、胃癌、前列腺小细胞神经内分泌癌(SCNC)、肝癌、成胶质细胞瘤、肝癌、口腔鳞状细胞癌、胰腺癌、甲状腺乳头状癌、肝内胆管细胞癌、肝细胞癌、骨癌、转移癌和鼻咽癌。
在一些实施方案中，除如本文所提供的衍生效应细胞外，用于治疗用途的组合包含一种或多种另外治疗剂，其包含化学治疗剂或放射性部分。化学治疗剂是指细胞毒性抗肿瘤剂，即优先杀死肿瘤细胞或中断快速增殖细胞的细胞循环，或发现其根除癌症干细胞并且在治疗上使用其以预防或减少肿瘤细胞生长的化学试剂。化学治疗剂有时也被称作抗肿瘤或细胞毒性药物或药剂，并且在所属领域中是众所周知的。
在一些实施方案中，化学治疗剂包含蒽环霉素、烷基化剂、烷基磺酸盐、氮丙啶、乙烯亚胺、甲基三聚氰胺、氮芥、亚硝基脲、抗生素、抗代谢物、叶酸类似物、嘌呤类似物、嘧啶类似物、酶、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、含铂剂、干扰素和白细胞介素。示例性化学治疗剂包括但不限于烷基化剂(环磷酰胺、二氯甲二乙胺、马法兰(mephalin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、六甲基三聚氰胺、噻替派(thiotepa)、白消安(busulfan)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine))、抗代谢物(甲胺喋呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他汀(pentostatin))、长春花生物碱(vinca alkaloid)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine))、表鬼臼毒素(依托泊苷(etoposide)、依托泊苷邻苯醌(etoposideorthoquinone)和替尼泊苷(teniposide))、抗生素(道诺霉素(daunorubicin)、小红莓(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、双蒽、放线菌素D、普卡霉素(plicamycin)、嘌呤霉素(puromycin)和短杆菌肽D(gramicidine D))、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、秋水仙碱(colchicine)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、吐根素(emetine)、美登素(maytansine)和安吖啶(amsacrine)。附加药剂包括氨苯乙哌啶酮(gminoglutethimide)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、丝裂霉素、六甲蜜胺(altretamine)、环磷酰胺、洛莫司汀(CCNU)、卡莫司汀(BCNU)、伊立替康(CPT-11)、阿仑单抗、六甲蜜胺、阿那曲唑(anastrozole)、L-天冬酰胺酶、阿扎胞苷(azacitidine)、贝伐单抗(bevacizumab)、贝瑟罗汀(bexarotene)、博莱霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、白消安、二甲睾酮calusterone)、卡培他滨(capecitabine)、塞内昔布(celecoxib)、西妥昔单抗、克拉屈滨(clofurabine)、阿糖胞苷、达卡巴嗪(dacarbazine)、地尼白介素(denileukin diftitox)、己烯雌酚(diethlstilbestrol)、多西他赛(docetaxel)、甲雄烷醇酮(dromostanolone)、表柔比星(epirubicin)、埃罗替尼(erlotinib)、雌莫司汀(estramustine)、依托泊苷、乙炔基雌二醇、依西美坦(exemestane)、氟尿苷(floxuridine)、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨(fludarabine)、氟他胺(flutamide)、氟维司群(fulvestrant)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他滨(gemcitabine)、戈舍瑞林(goserelin)、羟基脲、异贝莫单抗(ibritumomab)、艾达霉素(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊马替尼(imatinib)、干扰素α(2a、2b)、伊立替康、来曲唑(letrozole)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、亮丙立德(leuprolide)、左旋咪唑(levamisole)、氮芥、甲地孕酮(megestrol)、马法兰、巯基嘌呤、甲胺喋呤、甲氧呋豆素(methoxsalen)、丝裂霉素C、米托坦(mitotane)、米托蒽醌、诺龙(nandrolone)、诺非单抗(nofetumomab)、奥沙利铂(oxaliplatin)、太平洋紫杉醇、帕米膦酸盐(pamidronate)、培美曲塞(pemetrexed)、培加酶(pegademase)、培门冬酶(pegasparagase)、喷司他汀(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡霉素(plicamycin)、聚苯丙生(polifeprosan)、卟吩姆(porfimer)、丙卡巴肼(procarbazine)、奎纳克林(quinacrine)、利妥昔单抗、沙格司亭(sargramostim)、链脲菌素(streptozocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷(teniposide)、睾内酯(testolactone)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、噻替派、拓扑替康(topetecan)、托瑞米芬(toremifene)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、维甲酸(tretinoin)、尿嘧啶芥(uracilmustard)、伐柔比星(valrubicin)、长春瑞宾(vinorelbine)和唑来膦酸盐(zoledronate)。其它合适药剂是批准用于人类用途的药剂，包括将批准作为化学治疗剂或放射治疗剂并且所属领域中已知的药剂。这类药剂可由多个标准医师和肿瘤学家参考文献(例如《古德曼和吉尔曼治疗学的药理学基础(Goodman&Gilman's The Pharmacological Basis ofTherapeutics)》，第9版，McGraw-Hill,N.Y.,1995)中的任一种或由国家癌症研究所网站(fda.gov/cder/cancer/druglistfrarne.htm)引用，两者都会不时更新。
例如沙立度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)和泊马度胺(pomalidomide)的免疫调节药物(IMiD)刺激NK细胞和T细胞两者。如本文所提供，IMiD可与iPSC衍生治疗性免疫细胞一起用于癌症治疗。
除治疗性组合物中包括的iPSC衍生造血谱系细胞的分离的群体外，适于向患者施用的组合物还可包括一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂(例如，药学上可接受的培养基，例如细胞培养基)或其它药学上可接受的组分。药学上可接受的载体和/或稀释剂部分地由所施用的特定组合物以及用于施用治疗组合物的特定方法决定。因此，本发明的治疗组合物存在多种合适的配方(参见例如《雷明顿氏医药科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)》第17版，1985年，其公开内容据此全文以引用方式并入)。
在一个实施方案中，治疗组合物包含利用本文中所公开的方法和组合物制造的iPSC衍生T细胞。在一个实施方案中，治疗组合物包含利用本文中所公开的方法和组合物制造的iPSC衍生NK细胞。在一个实施方案中，治疗组合物包含利用本文中所公开的方法和组合物制造的iPSC衍生CD34+HE细胞。在一个实施方案中，治疗组合物包含利用本文中所公开的方法和组合物制造的iPSC衍生HSC。在一个实施方案中，治疗组合物包含利用本文中所公开的方法和组合物制造的iPSC衍生MDSC。可通过静脉内、腹膜内、肠内或气管施用方法分开施用或与其它合适的化合物组合施用包含如本文所公开的iPSC衍生造血谱系细胞的群体的治疗组合物以实现所期望的治疗目标。
这些药学上可接受的载体和/或稀释剂可以按照足以使治疗组合物的pH维持在约3与约10之间的量存在。因而，缓冲剂可以占总组合物的高达约5％(重量/重量)。治疗组合物中还可以包括电解质，例如但不限于氯化钠和氯化钾。在一个方面，治疗组合物的pH在约4至约10的范围内。可替代地，治疗组合物的pH在约5至约9的范围内、在约6至约9的范围内或在约6.5至约8的范围内。在另一个实施方案中，治疗组合物包含pH在所述pH范围中的一种的缓冲液。在另一个实施方案中，治疗组合物的pH是约7。可替代地，治疗组合物的pH在约6.8至约7.4的范围内。在再一个实施方案中，治疗组合物的pH是约7.4。
本发明还部分地提供药学上可接受的细胞培养基在本发明的特定组合物和/或培养物中的用途。这类组合物适于向人类受试者施用。一般来说，支持根据本发明的实施方案的iPSC衍生免疫细胞的维持、生长和/或健康的任何培养基适合用作药物细胞培养基。在特定实施方案中，药学上可接受的细胞培养基是无血清和/或无饲养层的培养基。在各种实施方案中，无血清培养基是无动物成分的，并且可以任选地是无蛋白质的。任选地，所述培养基可以含有生物医药学上可接受的重组蛋白。无动物成分培养基是指其中所述组分来源于非动物来源的培养基。重组蛋白置换无动物成分培养基中的原生动物蛋白质并且营养是从合成、植物或微生物来源获得。相比之下，无蛋白质培养基定义为实质上不含蛋白质。所属领域的技术人员将了解，上述培养基示例具有说明性并且决不限制适用于本发明的培养基配方，存在许多已知的且可供所属领域的技术人员使用的合适培养基。
iPSC衍生造血谱系细胞可具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的T细胞、NK细胞、NKT细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞、HSC、B细胞、骨髓衍生抑制细胞(MDSC)、调控巨噬细胞、调控树突状细胞或间充质基质细胞。在一些实施方案中，分离的多能干细胞衍生造血谱系细胞具有约95％至约100％的T细胞、NK细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞或骨髓衍生抑制细胞(MDSC)。在一些实施方案中，本发明提供具有经纯化的T细胞或NK细胞的治疗组合物，例如具有约95％的T细胞、NK细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞或骨髓衍生抑制细胞(MDSC)的分离群的组合物以治疗需要细胞疗法的受试者。
在一个实施方案中，组合细胞疗法或其使用的组合物包含为CD3衔接子的治疗蛋白质或肽以及源自包括表1中所列的基因型的基因组工程改造iPSC的NK细胞群体，其中该衍生NK细胞包括TCRneg cs-CD3。在另一个实施方案中，组合细胞疗法或其使用的组合物包含为CD3衔接子的治疗蛋白质或肽以及源自包括表1中所列的基因型的基因组工程改造iPSC的T细胞群体，其中该衍生NK细胞包括TCRneg cs-CD3。在一些实施方案中，组合细胞疗法或其使用的组合物包含博纳吐单抗、卡妥索单抗、厄妥索单抗、RO6958688、AFM11、MT110/AMG 110、MT111/AMG211/MEDI-565、AMG330、MT112/BAY2010112、MOR209/ES414、MGD006/S80880、MGD007和/或FBTA05中的一者，以及源自包含表1中所列的基因型的基因组工程改造iPSC的NK细胞群或T细胞群，其中该衍生的NK细胞或T细胞包含TCRneg cs-CD3和任选的hnCD16。在另一些其它实施方案中，组合细胞疗法或其使用的组合物包含博纳吐单抗、卡妥索单抗和厄妥索单抗中的一者，以及源自包含表1中所列的基因型的基因组工程改造iPSC的NK细胞群或T细胞群，其中该衍生的NK细胞或T细胞包含TCRneg cs-CD3、外源CD16或其变体，以及靶向CD19、BCMA、CD38、CD20、CD22或CD123的CAR。在又一些另外的实施方案中，组合细胞疗法或其使用的组合物包含博纳吐单抗、卡妥索单抗和厄妥索单抗中的一者，以及源自包含表1中所列的基因型的基因组工程改造iPSC的NK细胞群或T细胞群，其中该衍生的NK细胞或T细胞包含TCRneg cs-CD3、外源CD16或其变体、CAR和一种或多种外源细胞因子。
如所属领域的普通技术人员将理解，基于本文提供的方法和组合物的源自iPSC的自体和同种异体造血谱系细胞两者可在如上所述的细胞疗法中使用。对于自体移植来说，衍生造血谱系细胞的分离群体相对于患者是完全或部分HLA匹配的。在另一个实施方案中，衍生造血谱系细胞不与受试者HLA匹配，其中衍生造血谱系细胞是HLA-I和/或HLA-II剔除的NK细胞或T细胞。
在一些实施方案中，治疗组合物中衍生造血谱系细胞的数目是每剂量至少0.1×105个细胞、至少1×105个细胞、至少5×105个细胞、至少1×106个细胞、至少5×106个细胞、至少1×107个细胞、至少5×107个细胞、至少1×108个细胞、至少5×108个细胞、至少1×109个细胞或至少5×109个细胞。在一些实施方案中，治疗组合物中的衍生造血谱系细胞的数目为每剂量约0.1×105个细胞至约1×106个细胞；每剂量约0.5×106个细胞至约1×107个细胞；每剂量约0.5×107个细胞至约1×108个细胞；每剂量约0.5×108个细胞至约1×109个细胞；每剂量约1×109个细胞至约5×109个细胞；每剂量约0.5×109个细胞至约8×109个细胞；每剂量约3×109个细胞至约3×1010个细胞，或其间的任何范围。一般来说，1×108个细胞/剂量转化为对于60kg的患者1.67×106个细胞/千克。
在一个实施方案中，治疗组合物中衍生造血谱系细胞的数目是部分或单一脐带血中的免疫细胞数目，或是至少0.1×105个细胞/千克体重、至少0.5×105个细胞/千克体重、至少1×105个细胞/千克体重、至少5×105个细胞/千克体重、至少10×105个细胞/千克体重、至少0.75×106个细胞/千克体重、至少1.25×106个细胞/千克体重、至少1.5×106个细胞/千克体重、至少1.75×106个细胞/千克体重、至少2×106个细胞/千克体重、至少2.5×106个细胞/千克体重、至少3×106个细胞/千克体重、至少4×106个细胞/千克体重、至少5×106个细胞/千克体重、至少10×106个细胞/千克体重、至少15×106个细胞/千克体重、至少20×106个细胞/千克体重、至少25×106个细胞/千克体重、至少30×106个细胞/千克体重、1×108个细胞/千克体重、5×108个细胞/千克体重或1×109个细胞/千克体重。
在一个实施方案中，向受试者递送一定剂量的衍生造血谱系细胞。在一个例示性实施方案中，向受试者提供的细胞的有效量是至少2×106个细胞/千克、至少3×106个细胞/千克、至少4×106个细胞/千克、至少5×106个细胞/千克、至少6×106个细胞/千克、至少7×106个细胞/千克、至少8×106个细胞/千克、至少9×106个细胞/千克或至少10×106个细胞/千克或更多个细胞/千克，包括所有介于中间的细胞剂量。
在另一个例示性实施方案中，向受试者提供的细胞的有效量是约2×106个细胞/千克、约3×106个细胞/千克、约4×106个细胞/千克、约5×106个细胞/千克、约6×106个细胞/千克、约7×106个细胞/千克、约8×106个细胞/千克、约9×106个细胞/千克或约10×106个细胞/千克或更多个细胞/千克，包括所有介于中间的细胞剂量。
在另一个例示性实施方案中，向受试者提供的细胞的有效量是约2×106个细胞/千克至约10×106个细胞/千克、约3×106个细胞/千克至约10×106个细胞/千克、约4×106个细胞/千克至约10×106个细胞/千克、约5×106个细胞/千克至约10×106个细胞/千克、2×106个细胞/千克至约6×106个细胞/千克、2×106个细胞/千克至约7×106个细胞/千克、2×106个细胞/千克至约8×106个细胞/千克、3×106个细胞/千克至约6×106个细胞/千克、3×106个细胞/千克至约7×106个细胞/千克、3×106个细胞/千克至约8×106个细胞/千克、4×106个细胞/千克至约6×106个细胞/千克、4×106个细胞/千克至约7×106个细胞/千克、4×106个细胞/千克至约8×106个细胞/千克、5×106个细胞/千克至约6×106个细胞/千克、5×106个细胞/千克至约7×106个细胞/千克、5×106个细胞/千克至约8×106个细胞/千克或6×106个细胞/千克至约8×106个细胞/千克，包括所有介于中间的细胞剂量。
在一些实施方案中，衍生造血谱系细胞的治疗用途是单剂量治疗。在一些实施方案中，衍生造血谱系细胞的治疗用途是多剂量治疗。在一些实施方案中，多剂量治疗是每天、每3天、每7天、每10天、每15天、每20天、每25天、每30天、每35天、每40天、每45天或每50天或期间任何天数一次剂量。在一些实施方案中，多剂量治疗包括每周三次、四次或五次、一次剂量。在一些实施方案中，包括每周三次、四次或五次、一次剂量的多剂量治疗还包括用于确定是否需要额外的单剂量或多剂量的观察期。
包含本发明的衍生造血谱系细胞群的组合物可以是无菌的，并且可以适于施用和备好施用(即，可以在不进行任何进一步处理的情况下施用)给人类患者。准备好用于施用的基于细胞的组合物意指所述组合物在移植或施用到受试者之前不需要任何另外的加工或操纵。在其它实施方案中，本发明提供在与一种或多种药剂一起施用之前扩增和/或调节的衍生造血谱系细胞的分离群体。对于被基因工程改造以表达重组TCR或CAR的衍生造血谱系细胞，可使用如例如美国专利号6,352,694中所述的方法活化和扩增细胞。
在某些实施方案中，可以利用不同方案向衍生造血谱系细胞提供主要刺激信号和共刺激信号。例如，提供每种信号的试剂可存在于溶液中或与表面偶联。与表面偶联时，所述试剂可以与相同表面(即，“顺式”形式)或个别表面(即，“反式”形式)偶联。可替代地，一种试剂可以与表面偶联并且另一种试剂存在于溶液中。在一个实施方案中，提供共刺激信号的试剂可以结合到细胞表面并且提供主要激活信号的试剂存在于溶液中或与表面偶联。在某些实施方案中，两种试剂都可以存在于溶液中。在另一个实施方案中，试剂可呈可溶形式，然后交联到表面，例如表达Fc受体的细胞或抗体或其它粘合剂，其将结合于例如美国公布号2004/0101519和2006/0034810中所公开的试剂以用于人工抗原呈递细胞(aAPC)，其预期在本发明的实施方案中用于激活和扩增T淋巴细胞。
剂量、频率和方案必然会出现一些变化，这取决于所治疗受试者的病况。负责施用的人员将在任何情况下确定单独的受试者的合适剂量、频率和方案。
实施例
以下实施例仅供说明，而非限制。
实施例1–材料和方法
为了在与不同安全港基因座整合策略组合的不同启动子的控制下有效选择和测试自杀系统，使用本申请人的一种专用的hiPSC平台，其能够完成单一细胞传代和高通量的基于96孔板的流式细胞术分选，以便得到具有单一或多种基因调节的克隆hiPSC。
hiPSC在小分子培养物中的维持：一旦培养物的融合度达到75％-90％，iPSC就作为单细胞传代。单一细胞解离时，hiPSC用PBS(Mediatech)洗涤一次并且在37℃下用阿库酶(Accutase)(Millipore)处理3-5分钟，随后移液以确保单一细胞解离。然后将单一细胞悬浮液与传统培养基等体积混合，在225×g下离心4分钟，再悬浮于FMM中并且接种于基质胶涂布的表面上。传代数通常为1:6-1:8，转移预先涂有基质胶的组织培养板在37℃下维持2-4小时并且每2-3天用FMM饲养。细胞培养物在设定为37℃和5％CO2的增湿培育箱中维持。
用ZFN、CRISPR进行人iPSC工程改造以靶向编辑所关注模式：使用ROSA26靶向插入作为示例，对于ZFN介导的基因组编辑，两百万个iPSC用2.5μg ZFN-L、2.5μg ZFN-R和5μg供体构建体的混合物转染以进行AAVS1靶向插入。对于CRISPR介导的基因组编辑，两百万个iPSC用5μg ROSA26-gRNA/Cas9和5μg供体构建体的混合物转染以进行ROSA26靶向插入。使用Neon转染系统(生命技术公司(Life Technologies))、使用参数1500V、10ms、3个脉冲进行转染。转染后第2天或第3天，如果所述质粒含有人工启动子驱动GFP和/或RFP表达盒，那么利用流式细胞术测量转染效率。转染后第4天，将嘌呤霉素按照开始7天0.1μg/ml和随后7天0.2μg/ml的浓度添加到培养基中以选择靶细胞。在嘌呤霉素选择期间，在第10天将细胞传代到基质胶涂布的新制孔上。在嘌呤霉素选择的第16天或更晚，通过流式细胞术分析存活细胞的GFP+iPS细胞百分比。
基因组编辑的iPSC的批量分选和克隆分选：嘌呤霉素选择20天之后，对使用ZFN或CRISPR-Cas9进行基因组靶向编辑的iPSC进行GFP+SSEA4+TRA181+iPSC的批量分选和克隆分选。将单一细胞解离的靶向iPSC池再悬浮于冷却的染色缓冲液中，该缓冲液含有汉克氏平衡盐溶液(MediaTech公司)、4％胎牛血清(英杰公司(Invitrogen))、1×青霉素/链霉素(Mediatech公司)和10mM Hepes(Mediatech公司)；新鲜制备以达到最优性能。向细胞溶液中添加所结合的一级抗体，包括SSEA4-PE、TRA181-Alexa Fluor-647(BD Biosciences)，并且在冰上培育15分钟。所有抗体都以每百万个细胞7μL/100μL染色缓冲液使用。所述溶液在染色缓冲液中洗涤一次，在225g下离心4分钟并且再悬浮于含有10μM噻唑维的染色缓冲液中并且在冰上维持以供流式细胞术分选。对FACS Aria II(BD Biosciences)进行流式细胞术分选。批量分选时，将GFP+SSEA4+TRA181+细胞门控和分选到装填有7ml FMM的15ml标准管中。对于克隆分选，使用100μM喷嘴，按照每孔3个事件的浓度，将分选出的细胞直接喷射到96孔板中。每个孔预装填有200μL FMM，该FMM补充有5μg/mL纤维结合蛋白和1×青霉素/链霉素(Mediatech公司)并且预先经5×基质胶涂布整夜。5×基质胶预涂布包括将一个基质胶等分试样添加到5mL DMEM/F12中，然后在4℃下培育整夜以允许适当再悬浮并且最终以每孔50μL添加到96孔板中，随后在37℃下培育整夜。紧接在将培养基添加到各孔之前抽吸5×基质胶。完成分选后，在培育之前，96孔板在225g下离心1分钟至2分钟。培养板保持不受干扰七天。第七天，从每个孔中去除150μL培养基并且用100μL FMM置换。分选后第10天，孔中再进料到另外100μL FMM中。早在第2天就检测出群落形成并且大部分群落在分选后第7天到第10天之间扩增。在第一次传代中，各孔用PBS洗涤且在37℃下用30μL阿库酶解离约10分钟。需要延长阿库酶处理反映了长期培养中已闲置的群落的紧密性。发现细胞解离之后，将200μL FMM添加到每个孔中并且吸移若干次以使群落破碎。将解离的菌落转移到此前涂布有5×基质胶的96孔培养板的另一孔，并且随后在培育之前在225g下离心2分钟。扩增之前，进行这种1:1传代以扩展早期群落。后续传代按常规方式用阿库酶处理3分钟-5分钟并且在FMM中、在预先涂有1×基质胶的较大孔中达到75％-90％融合度后以1:4-1:8扩增。分析每种克隆细胞系的GFP荧光水平和TRA1-81表达水平。选择近似100％GFP+和TRA1-81+的克隆系用于进一步PCR筛检和分析，并冷冻保存作为主细胞库。在Guava EasyCyte 8HT(Millipore)上进行流式细胞术分析并且使用Flowjo(FlowJo,LLC)分析。
实施例2—表达的CFR的设计
用于去除T细胞中TCR表达的TRAC或TRBC的双等位基因破坏是减轻GvHD风险的方法。然而，TCR表达的缺乏因此导致TCR阴性细胞中表面CD3表达的丧失。缺乏表面CD3表达(包括不表达CD3的NK细胞)限制了在生产阶段使用现有衔接子策略在无饲养细胞条件下分化、成熟和/或扩增效应细胞(原代的或iPSC衍生的)的潜能，以及在适当的细胞发育阶段或在肿瘤微环境中用诱导性或激动性配体激活效应细胞的潜能，这些配体包括但不限于治疗性抗体、BiTE或TriKE。
此处，公开了嵌合融合受体(CFR)策略，其用至少一种CFR武装效应细胞以启动适当的信号转导级联，从而增强效应细胞治疗属性，这些属性包括但不限于增加的活化和细胞毒性、获得的双重靶向能力、延长的持久性、改善的运输和肿瘤渗透、增强的活化或募集旁路免疫细胞至肿瘤部位的能力、增强的降低瘤免疫抑制的能力、改善的挽救肿瘤抗原逃逸的能力和/或受控的细胞代谢和凋亡。
所提供的CFR包含与跨膜域融合的胞外域，该跨膜域与胞内域连接，并且CFR不具有ER(内质网)滞留信号或胞吞信号。CFR的胞外域用于启动信号转导；跨膜域用于膜锚定；并且该胞内域提供至少一个细胞毒性结构域并活化一种或多种所选择的信号传导途径，该一种或多种信号传导途径增强细胞属性，包括但不限于存留、迁移、分化、代谢和/或凋亡，这导致CFR武装的效应细胞对肿瘤生长的长期控制。除了细胞毒性结构域之外，CFR的胞内域还可任选地包含共刺激域、持久性信号传导域、诱导死亡的信号传导域或所选择的信号传导路径域中的一者或多者。
适用于CFR的共刺激域包括但不限于CD28、4-1BB、CD27、CD40L、ICOS、CD2的胞内域或它们的组合。适用于CFR的持久性信号传导域包括但不限于细胞因子受体的胞内域，该细胞因子受体诸如IL2R、IL7R、IL15R、IL18R、IL12R、IL23R或它们的组合。当效应细胞通过掺入的CFR被活化时，诸如EGFR的酪氨酸激酶受体(RTK)或诸如FAS的肿瘤坏死因子受体(TNFR)的胞内域提供了额外的信号传导路径控制。此外，在CFR中消除ER滞留信号以在表达时允许其自身的细胞表面呈递，并且在CFR中消除胞吞信号以降低其内化和表面下调。重要的是，选择既不具有ER滞留信号也不具有胞吞信号的结构域组分，或者使用分子工程改造工具从CFR的所选组分中去除ER滞留信号或胞吞信号。此外，所提供的CFR的结构域是模块化的，这意味着对于给定的胞内域，CFR的胞外域是可切换的，这取决于与所述CFR一起使用的激动性抗体、BiTE或Trike的结合特异性；并且反之亦然，对于给定的胞外域和匹配的激动剂，胞内域是可切换的，这取决于待激活的期望信号传导路径。
对于概念证明，该示例中胞外域的选择考虑了可被现有的激动性配体识别的表面分子，诸如CD3或CD28抗体或BiTE。如图1和图4A所示，每个示例性CFR分别包含CD28或CD3亚基(CD3ε、CD3γ或CD3δ)的至少一个胞外部分；CD28、CD8、CD4、CD27、ICOS或CD3ε的跨膜域；以及CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD28、ICSO、CD27或其组合的胞内域，其中胞外域、TM域和/或胞内域的ER滞留基序和/或胞吞基序被消除。例如，CD3ε*包含R183S突变以从其WT序列的胞内域消除ER滞留基序；CD3δ*包含L142A和R169A突变以从其WT序列的胞内域消除胞吞基序和ER滞留基序；CD3γ*包含L131A和R158A突变以从其WT序列的胞内域消除ER滞留基序。在一些示例性设计中，CFR包含一个CD3亚基的胞外域；在一些其它设计中，CFR包含单链胞外域，其包含通过接头(也称为间隔区)与CD3δ或CD3γ的胞外域连接的CD3ε的胞外域。单链胞外域的接头类型、长度和序列可变化。
构建体的序列被排序为gBlock(IDT，Coralville，IA)并且在该示例中分别在5'末端和3'末端上含有NheI位点和EcoRI位点，但是在各种CFR设计中限制性酶位点可不同。gBlock序列含有由2A元件分隔的两种组分：构建体和标签，该标签任选地用于确定转导效率，如果需要，该标签包括mCherry、Thy 1.1或Thy 1.2。NheI和EcoRI用于切割gBlock序列和含有EF1α启动子和氨苄青霉素抗性基因的慢病毒载体骨架。使用Quick Ligation试剂盒(NEB，Ipswich，MA)将消化的DNA合并并连接；然后将连接的DNA转化到DH5α细胞中，并接种到含有羧苄青霉素的LB琼脂平板上。使用定点诱变试剂盒(NEB，Ipswich，MA)在跨膜域之后直接引入AvrII位点，以促进不同构建体设计的进一步克隆。对于慢病毒产生，将接种在10cm聚-D-赖氨酸包被的培养皿中的293T细胞在转染前培养24小时。慢病毒载体和包装质粒按照制造商指南用Lipofectamine 3000(ThermoFisher，Waltham，MA)转染。48和72小时后收获病毒，并通过超速离心浓缩。
实施例3—在TRAC剔除的细胞上的表面CFR表达
将NFAT-荧光素酶Jurkat报告基因细胞(Invivogen，San Diego，CA)解冻、洗涤并在37℃和5％CO2下培养，每周传代一次。对于工程改造CFR构建体的慢病毒转导，将细胞离心并以1×106个细胞/mL再悬浮于含有4μg/mL聚凝胺(MilliporeSigma，St.Louis，MO)的培养基中。将1mL细胞悬浮液置于12孔板中并加入浓缩病毒。然后将细胞离心1小时并再悬浮于新鲜培养基中。
对于表型分析，收获转导的细胞并用可固定的活力标记物和荧光团偶联抗体染色：CD3(SP34和OKT3)、CD5、CD7、CD8、CD45RA、CD62L、CCR7、CD27、CD28、PD1和TIM3(BDBiosciences，San Jose，CA；和BioLegend，San Diego，CA)。就在数据采集之前添加荧光绝对计数珠(Spherotech，Lake Forest，IL)。在BD FortessaTMX-20(BD Biosciences)上进行数据采集，并使用FlowJo软件(FlowJo，Ashland，OR)和Spotfire(Tibco，Boston，MA)分析数据。
为了测试该概念，在如图5所示的一个实验中，用一个或两个CFR转导Jurkat-TRACKO细胞：(A)3ε-28-3ε*+3γ-28-3γ*、(B)3ε-28-3ε*+3δ-28-3δ*、(C)3ε-28-[-]、(D)3ε-28-3ε*、(E)3ε-28-28或(F)28-28-3ε*。48小时后，对于用构建体(A)-(E)转导的细胞，用抗CD3抗体克隆SP34和OKT3染色细胞后，或者对于用构建体(F)转导的细胞，用抗CD28抗体克隆CD28.2染色细胞后，通过流式细胞术分析并确认CFR表面表达。CD3抗体SP34对CD3ε或其功能性变体具有特异性，而OKT3结合需要CD3ε与CD3δ或CD3γ的异源二聚体形成。正如所观察到的，TCR敲除细胞中的CD3表达通过CD3亚基胞内域中的ER滞留和胞吞基序突变得到挽救(与图6B相比)。
实施例4—通过激动性抗体刺激启动的CFR信号转导
为了证明CFR的信号转导能力，使用不同浓度的不可知抗体或双特异性抗体来启动激活NFAT的胞内信号传导路径，这将导致荧光素酶活性的产生和随后的检测。图6A和图7A分别示出了说明使用抗体刺激或BiTE交联的NFAT-荧光素酶报告基因测定原理的方案。
对于图6A所示的测定，使用了表达由NFAT反应元件(RE)驱动的荧光素酶报告基因的Jurkat T细胞系。为了检测CFR信号转导，将转导的细胞接种在96孔平底平板中，该平板具有可溶性或平板结合形式的激动性CD3抗体SP34或OKT3或激动性CD28抗体CD28.2。如图6B所示，在Jurkat-NFAT WT中存在细胞表面CD3和TCRαβ表达(左图)，其在TRAC KO细胞中大量缺失(右图)。在与抗CD3刺激物接触24小时后，内源CD3受体介导的信号传导诱导NFAT易位至细胞核并与NFAT RE相互作用，导致荧光素酶在Jurkat WT细胞而非TRAC KO细胞中表达(参见图6C)。图6D示出了在用克隆SP34或克隆OKT3抗体刺激24小时的各种CFR工程改造的Jurkat-TRAC KO细胞中的NFAT荧光素酶活性。如图所示，具有修饰的CD3ε胞内域的CFR能够诱导NFAT报告基因活性。此外，构建体3ε-28-3ε*+3γ-28-3γ*、3ε-28-3ε*+3δ-28-3δ*和3ε-28-3ε*在通过抗CD3抗体刺激的CFR信号转导中表现最佳，表明在具有共转导CFR的细胞中有协同的细胞活化作用。
对于BiTE实验，选择抗CD3×CD19 BiTE(Invivogen，San Diego，CA)作为将靶细胞上的CD19和效应细胞上的CD3与NFAT报告基因转基因结合的概念证明。NFAT-荧光素酶Jurkat(WT或CFR转导的)与Raji细胞在存在或不存在抗CD3×CD19 BiTE的情况下以3:1的效应物与靶(E:T)比例共培养。将细胞在37℃和约5％CO2下孵育过夜。之后，将平板轻轻混合，取出一些细胞混合物并与QUANTI-Luc(Invivogen，San Diego，CA)组合以检测荧光素酶活性。再次轻轻混合该平板并立即在SpectraMax微板读数器(Molecular Devices，SanJose，CA)上读数。在图7A所示的测定中，用单独3ε-28-3ε*的CFR(深灰色虚线)或3ε-28-3ε*与3γ-28-3γ*(黑线)或3δ-28-3δ*(深灰色线)组合的CFR转导的TRAC-KO报告基因细胞。在与靶细胞和抗CD3×CD19 BiTE共培养24小时后，测量NFAT活性。如图7B所示，将WT(浅灰色线)和TRAC KO(浅灰色虚线)NFAT报告基因细胞接种作为阳性对照或阴性对照，并且具有CFR 3ε-28-3ε*+3γ-28-3γ*或3ε-28-3ε*+3δ-28-3δ*的转导细胞具有更好的BiTE交联启动的信号转导。
实施例5—CFR结构域是模块化的
所提供的CFR设计包含模块化胞外域和胞内域。对于给定的胞内域，CFR的胞外域是可切换的，这取决于与所述CFR一起使用的激动性抗体、BiTE或Trike的结合特异性；并且对于给定的胞外域和匹配的激动剂，胞内域是可切换的，这取决于待激活的期望信号传导路径。为了说明，在激动性SP34或CD28.2抗体存在下培养24小时后，在CFR武装的JurkatTRAC KO细胞和未转导的对照中测量NFAT报告基因活性。如图8A至图8C所示，与相同的CD28ζ胞内域配对的CD3ε胞外域或CD28胞外域可导致足够的信号转导并引发适当的报告基因活性。为了进一步说明，显示了CD3ε*胞内域与CD3ε胞外域或CD28胞外域配对以转导信号并引发活性(图8C)。另一方面，对于相同的示例性CD3ε胞外域，当应用基于CD3的激动剂来结合CFR的CD3ε胞外域时，可诱导和激活任何所选的胞内域，包括但不限于CD28ζ胞内域和CD3ε*胞内域。对于另一个示例，当使用基于CD3的激动剂来结合CFR的CD3ε胞外域时，可诱导和激活相同的CD28胞外域、任何所选的胞内域(包括但不限于CD28ζ胞内域和CD3ε*胞内域)。
本文提供的CFR设计还可包含模块化的跨膜域。如图4A所示，CD3ε胞外域与CD28、CD3、CD4、ICOS或CD27的跨膜域融合，并且与(a)-(c)中相同的CD28ζ胞内域或ICOS-CD28ζ胞内域(d)或CD27-CD28ζ胞内域(e)连接。图4B和图4D分别示出了在CAR19-或CAR19+Jurkat-NFAT-TRAC KO细胞上图4A的CFR(a)-(e)中每一者的表面表达。图4C和图4E分别示出了在存在EpCAM+靶标和CD3ε×EpCAM BiTE的情况下反映CAR19-或CAR19+Jurkat-TRAC KO细胞中的CFR信号转导的NFAT报告基因活性。图4F示出了CAR在表达具有不同TM域的CFR的Jurkat-NFAT-TRAC KO-CAR19+细胞上的表面表达。在CD19+靶标接合的存在下，在表达CFR的TRACKO-CAR19+或TRAC KO-CAR19-Jurkat细胞中NFAT报告基因活性的差异将CAR依赖性报告基因活性表示为CAR依赖性CFR信号转导的反映。
实施例6—表达CFR的效应细胞在激动剂的存在下显示出改善的体外和体内功能
效应细胞(包括T细胞或NK细胞)的重要功能是特异性裂解表达同源抗原的靶细胞的能力。细胞毒性测定用于确定CFR是否为效应细胞提供了增强的靶细胞裂解能力。在该测定中，表达给定CFR的衍生T细胞(iT)与Nalm6-GFP细胞以不同的效应物与靶(E:T)比例在识别CFR的胞外域(诸如在该示例中分别为基于CD3或基于CD28的胞外域)的激动性抗体的存在下共培养。将细胞孵育过夜并收获一些细胞混合物用于流式细胞术分析。荧光绝对计数珠(Spherotech，Lake Forest，IL)在采集前加入，并用于测定过夜共培养后细胞混合物中存在的Nalm6和iT细胞的数量。
如图9A所示，在激动性抗CD3抗体的存在下与Nalm6靶细胞以指定的E:T比例共培养过夜之后，基于流动的测定测量用3ε-28-3ε*连同3δ-28-3δ*(黑色实线)或3γ-28-3γ*(黑色虚线)的CFR转导的CAR-iT细胞中的细胞毒性。在图9B中，在抗CD28抗体存在下与Nalm6靶细胞以指定的E:T比例共培养过夜之后，测量单独用28-28-28ζ(黑线)的CFR转导的CAR-iT细胞中的细胞毒性。未转导的CAR-iT细胞(图9A和图9B中的灰线)被包括在内，以显示每个实验中的基线细胞毒性，并且结果证明两种表达CFR的CAR-iT效应物都具有用激动性抗体改善的细胞毒性。特别是在较低的E:T比例下，表达CFR的CAR-iT效应物具有较高的杀伤效率。
在单独的实验中，本文提供的各种CFR设计在pro-CAR-iT阶段(大约在分化D10和D20之间)用慢病毒转导以确定CFR表达(使用3ε-28-3ε*作为示例)是否损害CAR-iT分化和功能。图10A示出了在分化期间的不同时间点使用T细胞表面标记物表达连同CAR和CD3ε表达的CFR+(CFR转导的)和CFR-(UNTR；未转导的)CAR-iT细胞的表型分析，显示CFR转导和未转导的CAR-iT细胞中的T细胞表型在分化期间通常是一致的，并且在分化过程结束(T4)时尤其如此。此外，xCELLLigence测定结果显示，CFR转导和未转导的CAR-iT细胞在3:1(图10B)或1:1(图10C)的E:T比例下针对抗原+靶细胞的CAR依赖性细胞溶解相当。总的来说，数据表明CFR设计和表达不损害效应细胞分化、表型或iT细胞的CAR功能。
实施例7—CFR提供了克服肿瘤抗原逃逸和受控细胞凋亡的策略
将表达CFR的CAR-iT效应细胞与衔接子(例如，BiTE)混合，以显示针对抗原-靶标的细胞毒性是否得到改善。图11A示出了示例性BiTE刺突进入模型，其中用于重组蛋白表达的真核细胞可被工程改造以用于BiTE产生。在该示例中，HEK293细胞用于BiTE产生以供展示。收集HEK293细胞的上清液并与表达CFR的CAR-iT效应细胞混合。如图11B和图9C所示，与灰色所示的所有对照(即，没有BiTE情况下CFR转导的，以及有或没有BiTE情况下CFR未转导的)相比，CAR-iT细胞在3:1(图11B)或1:1(图11C)的E:T比例下针对抗原-靶标的CFR依赖性细胞溶解改善了细胞溶解，并且在CFR转导(使用3ε-28-3ε*作为示例性说明)和BiTE存在的情况下保持几乎恒定。在E:T比例为1:1的BiTE上清液的存在下，表达CFR的CAR-iT效应细胞还显示出在混合肿瘤细胞群(抗原+:抗原-为1:1)中针对抗原+和抗原-肿瘤靶标具有增强的细胞溶解(图11D)，从而证实通过CFR表达掺入BiTE有效地减少了CAR靶向机制下的肿瘤抗原逃逸。在存在BiTE的情况下，用CFR转导的或未转导的CAR-iT细胞处理后，在混合的抗原+/抗原-靶细胞的测定结束表型分析中也进行了类似的观察。如图11E的左图(对照)所示，在有BiTE的情况下用CFR未转导的(UNTR)CAR-iT细胞处理后，在混合肿瘤细胞群中保留了显著更大部分的抗原-靶细胞。相比之下，将抗原+/抗原-混合肿瘤细胞群与表达CFR的CAR-iT效应细胞在BiTE的存在下共培养后，几乎相等部分的抗原+和抗原-肿瘤细胞(每个部分中的细胞数量较少)保留在混合的肿瘤细胞群中，这反映了逃避CAR定向的抗原特异性肿瘤靶向的抗原-肿瘤细胞的有效消除(图11E，右图)。
在单独的实验中，通过将源自CFR转导的iPSC系的iT效应细胞与由用细胞增殖染料eFluorTM450标记的Nalm6 CD19WT细胞和用细胞增殖染料eFluorTM670标记的Nalm6-CD19KO细胞组成的50:50靶细胞混合物共培养来评估表达CFR的效应细胞的细胞毒性。将混合的靶细胞接种在96孔U形底板中，并在有或没有抗CD19×CD3 BiTE(Invivogen，SanDiego，CA)或抗CD20×CD3 BiTE(G&P Biosciences，Santa Clara，CA)将各种浓度的效应细胞加入到每个孔中约4小时，以获得约0:1、1:1、3.16:1和10:1的期望的效应物与靶标比例(E:T)，随后通过流式细胞术分析。凋亡靶细胞的百分比基于eFluorTM450+Nalm6 CD19WT细胞中胱天蛋白酶3/7+细胞的百分比或eFluorTM670+Nalm6-CD19KO细胞中胱天蛋白酶3/7+细胞的百分比来确定。
观察到BiTE本身(抗CD19×CD3或抗CD20×CD3)不触发增强的靶细胞凋亡，而添加表达基于CD3的CFR的效应iT细胞增加肿瘤细胞的凋亡。因此，表达CFR的iT细胞在BiTE的存在下表现出增强的特异性细胞毒性。通过与两种细胞系中单独的效应iT细胞相比，在BiTE的存在下效应iT细胞的EC50降低，这进一步证明了效应细胞功能的改善。
此外，武装有CFR的表达CAR的细胞可通过CAR靶向肿瘤细胞的初级抗原，并在与CFR结合的合适的BiTE或TriKE的存在下靶向次级抗原。这种双重靶向策略还可用于在肿瘤细胞释放或减少CAR靶向的初级抗原的表达时克服肿瘤抗原逃逸。图12A和图12B提供了通过激动性BiTE(例如，与基于CD3的CFR匹配并且靶向肿瘤抗原CD20的抗CD20×CD3BiTE)对表达CFR的CD19-CAR-iT细胞进行活化的示例性说明，该激动性BiTE与靶细胞的次级肿瘤抗原结合，该次级肿瘤抗原通过失去表面初级抗原而逃避CAR-T细胞杀伤。
实施例8—表达CFR和BiTE的效应细胞显示靶依赖性信号传导和活化
为了避免与全身性施用BiTE相关的毒性，决定测试CFR是否可响应于同一细胞的局部BiTE分泌而被激活。为了证明通过BiTE启动CFR信号转导，用编码CD3×EpCAM BiTE的慢病毒颗粒转导表达CFR-(CD3ε-CD28-CD3ε，也称为3ε-28-3ε*)武装的NFAT-荧光素酶的Jurkat，以产生CFR+BiTE+荧光素酶报告基因Jurkat。然后将细胞在存在或不存在EpCAM+靶细胞的情况下在37℃和5％CO2下培养过夜，之后测定CFR的功能(图13A)。
然后，将20μL每种样品与50μL(Invivogen，San Diego，CA)测定溶液在96孔透明底黑色或白色板中混合，在/>微板读数器(MolecularDevices，San Jose，CA)上读取荧光素酶活性(图13B)，这证明了在靶细胞存在下CFR阳性细胞中NFAT活性的诱导。通过流式细胞术对活化标记物的分析显示在与靶细胞共培养的CFR+BiTE+细胞中CD69和HLA-DR阳性细胞的比例增加(图13C)。这些数据表明，同时表达CFR和匹配的BiTE(例如，基于CD3的CFR和识别CD3的BiTE，或基于CD28的CFR和识别CD28的BiTE等)的细胞可表现出导致效应细胞激活的靶依赖性信号传导。
为了进一步探索同一细胞的局部BiTE分泌，以及作为将BiTE引入表达CFR的CAR-iT细胞的环境中以增强肿瘤杀伤效应的BiTE刺突进入方法的替代，将表达CFR的CAR-iT细胞进行工程改造以自表达分泌的BiTE(参见例如，图14A中的BiTE自分泌模型)。为了确定BiTE慢病毒转导至CAR-iT细胞后BiTE自产生是否影响效应细胞功能，TRAC敲除的iT细胞中CFR(在该示例中对CD3ε和mCherry染色)、BiTE(在该实施例中对Thy1.1染色)和CAR的表达示于图14B中，并且表面CD3ε的表达与CFR的表达相关或依赖于CFR的表达。图14C示出了在3:1的E:T比例下针对抗原-靶标的CFR依赖性BiTE诱导性细胞溶解。如图14D所示，在E:T比例为1:1时且在具有自分泌的BiTE的情况下，CFR+/CAR+iT细胞针对抗原+/抗原-混合靶标显示增强的细胞溶解。
实施例9—iPSC和iPSC衍生效应细胞的逐步基因组工程改造
除了TCR阴性和CFR转导之外，诱导性多能干细胞也被连续工程改造以包含外源CD16或其变体，包括但不限于不可裂解的高亲和力CD16表达、通过例如敲除B2M基因失去HLA-I、通过例如敲除CIITA失去HLA-II、非经典HLA分子HLA-G的过表达，以及例如通过融合蛋白构建体的重组细胞因子信号传导复合体。在每个工程改造步骤之后，在下一个工程改造步骤之前对iPSC进行分选以获得所期望的表型。工程改造的iPSC然后可以维持在体外或用于衍生细胞产生。已经证明，在造血分化期间维持这些基因工程改造模式，而不会干扰细胞的体外定向发育为所期望的细胞命运。
用慢病毒转导T细胞衍生的iPSC以组成性表达一种或多种基于CD3的CFR，在该iPSC中CAR构建体已被靶向TRAC基因座，导致TCR敲除(TCRαKO或TCRneg)。转导的构建体任选地包括Thy1.1作为示例性报告基因，用于通过细胞分选测定转导效率和富集。然后将所得iPSC系与野生型(WT)和TRAC靶向的CAR对照细胞系一起分化成iPSC衍生的CD34+造血祖细胞(iCD34)并随后分化成衍生的T谱系细胞(iT)。
然后通过细胞外流式细胞术测定来自对照和转导细胞系的iPSC的(i)多能性标记物SSEA4和TRA181，和(ii)构建报告基因Thy1.1。如多能性标记物所示，用CFR转导不影响iPSC同一性。然后使用本文所述的组合物和方法将对照和转导的iPSC分化成iCD34造血祖细胞，并通过流式细胞术针对CFR和Thy1.1进行测定。用CFR转导的细胞系维持Thy1.1表达，由于去除了ER滞留和胞吞基序而具有可检测的细胞表面CD3。在WT iPSC衍生的iCD34中未观察到CD3和TCRαβ，表明iTCRα或iTCRαβ转导在iCD34细胞阶段不表达或导致细胞表面上的CD3表达。
使用本文所述的组合物和方法将iCD34细胞进一步分化成衍生的T谱系细胞(iT)，并在CFR表达的分化过程期间的不同时间点(细胞发育阶段)通过流式细胞术测定。如预期的那样，CD3和TCRαβ表达在TCR KO细胞系中不存在。另外，WT和基于CD3的CFR转导细胞系之间的CD3平均荧光强度(MFI)是类似的。
端粒随着细胞老化而缩短并且与干细胞功能障碍和细胞衰老相关。如图15所示，成熟iNK细胞维持相较于成体外周血NK细胞更长的端粒。在针对G0/1细胞的DNA指数进行校正的情况下使用1301个T细胞白血病系作为对照(100％)，通过流式细胞术来测定iPSC、成体外周血NK细胞和iPSC衍生NK细胞的端粒长度。如图15中进一步所示，当与成体外周血NK细胞(p＝.105，ANOVA)相比，iPSC衍生NK细胞维持显著更长的端粒长度，这表示iPSC衍生NK细胞中更大的增殖率、存活率和存留潜能。与从外周血获得的原代T细胞相比，在iPSC衍生的T细胞中进行了类似的观察。
实施例10—来自CFR胞内域的细胞因子受体信号传导
细胞因子信号传导可以是正确激活效应细胞的重要部分，并且CFR可用于在正确的时间提供这些信号。为了测试具有细胞因子胞内域的CFR是否是功能性的，如上所述的TRAC敲除Jurkat细胞被慢病毒转导以表达嵌合融合受体，该嵌合融合受体包含与IL-2受体β(IL2Rb)胞内域融合的CD28胞外域和跨膜域(图16A；28-28-IL2Rb)。该嵌合融合受体构建体允许使用激动性配体，诸如抗CD28抗体或BiTE，以在与CD28胞外域结合时启动信号传导，导致Jak1的激活和STAT5的磷酸化。
通过用抗CD28的抗体对细胞进行染色并通过流式细胞术分析细胞来测量CFR的表达。与未转导的TRAC KO Jurkat(其对CD28的阳性率为15.5％)相比，CFR转导的TRAC KOJurkat对CD28的表面表达的阳性率为97.5％(图16B)，表明CD28胞外域CFR转基因的成功表达。为了测试来自IL-2受体β胞内域的信号转导，将未转导的和CFR转导的(28-28-IL2Rb)Jurkat在存在或不存在激动性抗CD28抗体的情况下培养2小时。
对磷酸化的STAT5 Y694(pSTAT5)进行细胞内染色并分析细胞(图16C)。简而言之，在存在或不存在激动剂的情况下，通过细胞内流式细胞术分析对照和CFR武装的细胞中的磷酸化STAT5。用BD固定缓冲液(BD Biosciences，San Jose，CA)固定细胞，然后用BD/>透化缓冲液(BD Biosciences，San Jose，CA)透化。Alexa/>647偶联的抗STAT5(pY694)(BD Biosciences，San Jose，CA)用于细胞内磷酸化的STAT5染色。
对于表型分析，收获细胞并用可固定的活力标记物(BD Biosciences)染色，然后在冰上用APC-抗-CD69和BV711-抗-HLA-DR(BD Biosciences，San Jose)抗体表面染色30分钟。在BD FortessaTMX-20(BD Biosciences)上进行数据采集，并使用软件(FlowJo，Ashland，OR)和/>(Tibco，Boston，MA)分析数据。
在不存在激动性抗体的情况下，CFR转导的细胞与未转导的对照相比具有略高比例的pSTAT5阳性细胞，分别为8％和3％。加入激动性抗CD28后，CFR转导的细胞显示出pSTAT5阳性细胞比例的显著增加，而在未转导的细胞中该比例没有变化。该结果证明，细胞因子受体胞内域诸如IL-2受体β可用于嵌合融合受体的背景中，其中信号转导通过激动剂(诸如激动性抗体或BiTE及其功能等效物)诱导。
所属领域技术人员将容易地了解，本文所描述的方法、组合物和产物代表示例性实施方案，并且不预期限制本发明的范围。对于所属领域的技术人员显而易见的是，可以对本文所公开的本公开进行各种取代和修改而不脱离本发明的范围和实质。
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序列表
<110> 菲特治疗公司
<120> 工程改造的iPSC和武装的免疫效应细胞
<130> 184143-629601
<160> 59
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含TCR-β恒定区（TRBC）的构建体
<400> 1
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
1 5 10 15
Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn
20 25 30
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val
35 40 45
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
50 55 60
Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile
65 70 75 80
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val
85 90 95
Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln
100 105 110
Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly
115 120 125
Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 2
<211> 176
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含TCR-β恒定区（TRBC1）的构建体
<400> 2
Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser
1 5 10 15
Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala
20 25 30
Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly
35 40 45
Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu
50 55 60
Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg
65 70 75 80
Asn His Phe Arg Cys Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Gln
85 90 95
Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg
100 105 110
Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala
115 120 125
Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala
130 135 140
Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val
145 150 155 160
Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe
165 170 175
<210> 3
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBC2
<400> 3
Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Lys Val Ala Val Phe Glu Pro Ser
1 5 10 15
Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala
20 25 30
Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly
35 40 45
Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu
50 55 60
Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg
65 70 75 80
Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln
85 90 95
Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg
100 105 110
Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala
115 120 125
Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala
130 135 140
Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val
145 150 155 160
Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser
165 170 175
Arg Gly
<210> 4
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含TCR-β恒定区（tgTRBC）-CD8asp的构建体的示例性信号肽
<400> 4
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala
<210> 5
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含TCR-β恒定区（tgTRBC）-IgKsp的构建体的示例性信号肽
<400> 5
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg
20
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含TCR-β恒定区（tgTRBC）-FLAG
的构建体的示例性接头肽
<400> 6
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 7
<211> 340
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 340个氨基酸的基于CD64结构域的构造
<400> 7
Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln
1 5 10 15
Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser
20 25 30
Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu
35 40 45
Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln
50 55 60
Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser
65 70 75 80
Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile
85 90 95
Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg
100 105 110
Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys
115 120 125
Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe
130 135 140
Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile
145 150 155 160
Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr
165 170 175
Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro
180 185 190
Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val
195 200 205
Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn
225 230 235 240
Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly
245 250 255
Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg
260 265 270
Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr Pro
275 280 285
Val Trp Phe His Tyr Gln Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu
290 295 300
Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg
305 310 315 320
Ser Ser Thr Arg Asp Trp Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp
325 330 335
Pro Gln Asp Lys
340
<210> 8
<211> 336
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 336个氨基酸的基于CD64外显子的构造
<400> 8
Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln
1 5 10 15
Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser
20 25 30
Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu
35 40 45
Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln
50 55 60
Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser
65 70 75 80
Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile
85 90 95
Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg
100 105 110
Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys
115 120 125
Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe
130 135 140
Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile
145 150 155 160
Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr
165 170 175
Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro
180 185 190
Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val
195 200 205
Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn
225 230 235 240
Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly
245 250 255
Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg
260 265 270
Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Phe Phe Pro Pro Gly
275 280 285
Tyr Gln Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp
290 295 300
Thr Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg
305 310 315 320
Asp Trp Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
325 330 335
<210> 9
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 335个氨基酸的基于CD64外显子的构造
<400> 9
Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln
1 5 10 15
Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser
20 25 30
Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu
35 40 45
Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln
50 55 60
Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser
65 70 75 80
Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile
85 90 95
Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg
100 105 110
Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys
115 120 125
Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe
130 135 140
Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile
145 150 155 160
Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr
165 170 175
Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro
180 185 190
Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val
195 200 205
Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn
225 230 235 240
Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly
245 250 255
Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg
260 265 270
Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Phe Phe Pro Pro Gly Tyr
275 280 285
Gln Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr
290 295 300
Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp
305 310 315 320
Trp Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
325 330 335
<210> 10
<211> 1032
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 举例说明编码340个氨基酸的基于CD64
结构域的构造的序列
<400> 10
cttggagaca acatgtggtt cttgacaact ctgctccttt gggttccagt tgatgggcaa 60
gtggacacca caaaggcagt gatcactttg cagcctccat gggtcagcgt gttccaagag 120
gaaaccgtaa ccttgcattg tgaggtgctc catctgcctg ggagcagctc tacacagtgg 180
tttctcaatg gcacagccac tcagacctcg acccccagct acagaatcac ctctgccagt 240
gtcaatgaca gtggtgaata caggtgccag agaggtctct cagggcgaag tgaccccata 300
cagctggaaa tccacagagg ctggctacta ctgcaggtct ccagcagagt cttcacggaa 360
ggagaacctc tggccttgag gtgtcatgcg tggaaggata agctggtgta caatgtgctt 420
tactatcgaa atggcaaagc ctttaagttt ttccactgga attctaacct caccattctg 480
aaaaccaaca taagtcacaa tggcacctac cattgctcag gcatgggaaa gcatcgctac 540
acatcagcag gaatatctgt cactgtgaaa gagctatttc cagctccagt gctgaatgca 600
tctgtgacat ccccactcct ggaggggaat ctggtcaccc tgagctgtga aacaaagttg 660
ctcttgcaga ggcctggttt gcagctttac ttctccttct acatgggcag caagaccctg 720
cgaggcagga acacatcctc tgaataccaa atactaactg ctagaagaga agactctggg 780
ttatactggt gcgaggctgc cacagaggat ggaaatgtcc ttaagcgcag ccctgagttg 840
gagcttcaag tgcttggcct ccagttacca actcctgtct ggtttcatta ccaagtctct 900
ttctgcttgg tgatggtact cctttttgca gtggacacag gactatattt ctctgtgaag 960
acaaacattc gaagctcaac aagagactgg aaggaccata aatttaaatg gagaaaggac 1020
cctcaagaca aa 1032
<210> 11
<211> 1020
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 举例说明编码336个氨基酸的基于CD64外显子的构造的序列
<400> 11
cttggagaca acatgtggtt cttgacaact ctgctccttt gggttccagt tgatgggcaa 60
gtggacacca caaaggcagt gatcactttg cagcctccat gggtcagcgt gttccaagag 120
gaaaccgtaa ccttgcattg tgaggtgctc catctgcctg ggagcagctc tacacagtgg 180
tttctcaatg gcacagccac tcagacctcg acccccagct acagaatcac ctctgccagt 240
gtcaatgaca gtggtgaata caggtgccag agaggtctct cagggcgaag tgaccccata 300
cagctggaaa tccacagagg ctggctacta ctgcaggtct ccagcagagt cttcacggaa 360
ggagaacctc tggccttgag gtgtcatgcg tggaaggata agctggtgta caatgtgctt 420
tactatcgaa atggcaaagc ctttaagttt ttccactgga attctaacct caccattctg 480
aaaaccaaca taagtcacaa tggcacctac cattgctcag gcatgggaaa gcatcgctac 540
acatcagcag gaatatctgt cactgtgaaa gagctatttc cagctccagt gctgaatgca 600
tctgtgacat ccccactcct ggaggggaat ctggtcaccc tgagctgtga aacaaagttg 660
ctcttgcaga ggcctggttt gcagctttac ttctccttct acatgggcag caagaccctg 720
cgaggcagga acacatcctc tgaataccaa atactaactg ctagaagaga agactctggg 780
ttatactggt gcgaggctgc cacagaggat ggaaatgtcc ttaagcgcag ccctgagttg 840
gagcttcaag tgcttggttt gttctttcca cctgggtacc aagtctcttt ctgcttggtg 900
atggtactcc tttttgcagt ggacacagga ctatatttct ctgtgaagac aaacattcga 960
agctcaacaa gagactggaa ggaccataaa tttaaatgga gaaaggaccc tcaagacaaa 1020
<210> 12
<211> 1005
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 举例说明编码335个氨基酸的基于CD64
外显子的构造的序列
<400> 12
atgtggttct tgacaactct gctcctttgg gttccagttg atgggcaagt ggacaccaca 60
aaggcagtga tcactttgca gcctccatgg gtcagcgtgt tccaagagga aaccgtaacc 120
ttgcactgtg aggtgctcca tctgcctggg agcagctcta cacagtggtt tctcaatggc 180
acagccactc agacctcgac ccccagctac agaatcacct ctgccagtgt caatgacagt 240
ggtgaataca ggtgccagag aggtctctca gggcgaagtg accccataca gctggaaatc 300
cacagaggct ggctactact gcaggtctcc agcagagtct tcacggaagg agaacctctg 360
gccttgaggt gtcatgcgtg gaaggataag ctggtgtaca atgtgcttta ctatcgaaat 420
ggcaaagcct ttaagttttt ccactggaac tctaacctca ccattctgaa aaccaacata 480
agtcacaatg gcacctacca ttgctcaggc atgggaaagc atcgctacac atcagcagga 540
atatctgtca ctgtgaaaga gctatttcca gctccagtgc tgaatgcatc tgtgacatcc 600
ccactcctgg aggggaatct ggtcaccctg agctgtgaaa caaagttgct cttgcagagg 660
cctggtttgc agctttactt ctccttctac atgggcagca agaccctgcg aggcaggaac 720
acatcctctg aataccaaat actaactgct agaagagaag actctgggtt atactggtgc 780
gaggctgcca cagaggatgg aaatgtcctt aagcgcagcc ctgagttgga gcttcaagtg 840
cttggcttct ttccacctgg gtaccaagtc tctttctgct tggtgatggt actccttttt 900
gcagtggaca caggactata tttctctgtg aagacaaaca ttcgaagctc aacaagagac 960
tggaaggacc ataaatttaa atggagaaag gaccctcaag acaaa 1005
<210> 13
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 153个氨基酸的CD28共刺激+CD3-ζ-ITAM
<400> 13
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
35 40 45
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
50 55 60
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
65 70 75 80
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
85 90 95
Glu Gly Leu Phe Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Phe
100 105 110
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
115 120 125
Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala
130 135 140
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
145 150
<210> 14
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 219个氨基酸的CD28铰链+CD28 TM+CD28共刺激+CD3-ζ-ITAM
<400> 14
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
65 70 75 80
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
85 90 95
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser
100 105 110
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
115 120 125
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
130 135 140
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
145 150 155 160
Pro Gln Glu Gly Leu Phe Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
165 170 175
Ala Phe Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
180 185 190
His Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe
195 200 205
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
210 215
<210> 15
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 263个氨基酸的NKG2D TM+2B4+CD3ζ
<400> 15
Ser Asn Leu Phe Val Ala Ser Trp Ile Ala Val Met Ile Ile Phe Arg
1 5 10 15
Ile Gly Met Ala Val Ala Ile Phe Cys Cys Phe Phe Phe Pro Ser Trp
20 25 30
Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe
35 40 45
Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His
50 55 60
Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met
65 70 75 80
Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr
85 90 95
Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg
100 105 110
Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys
115 120 125
Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu
130 135 140
Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
145 150 155 160
Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
165 170 175
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
180 185 190
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
195 200 205
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
210 215 220
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
225 230 235 240
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
245 250 255
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
260
<210> 16
<211> 308
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 308个氨基酸的CD8铰链+NKG2D TM+2B4+CD3ζ
<400> 16
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ser Asn Leu
35 40 45
Phe Val Ala Ser Trp Ile Ala Val Met Ile Ile Phe Arg Ile Gly Met
50 55 60
Ala Val Ala Ile Phe Cys Cys Phe Phe Phe Pro Ser Trp Arg Arg Lys
65 70 75 80
Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe Leu Thr Ile
85 90 95
Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His Glu Gln Glu
100 105 110
Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met Ile Gln Ser
115 120 125
Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr Leu Tyr Ser
130 135 140
Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg Asn His Ser
145 150 155 160
Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys Ser Gln Pro
165 170 175
Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu Glu Asn Phe
180 185 190
Asp Val Tyr Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
195 200 205
Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
210 215 220
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
225 230 235 240
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
245 250 255
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
260 265 270
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
275 280 285
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
290 295 300
Leu Pro Pro Arg
305
<210> 17
<211> 379
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 模拟IL15的反式呈递的构建体（设计3）
<400> 17
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu
20 25 30
Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys
35 40 45
Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr
50 55 60
Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe
65 70 75 80
Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile
85 90 95
His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser
100 105 110
Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu
115 120 125
Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val
130 135 140
Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Gln Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp
180 185 190
Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser
195 200 205
Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu
210 215 220
Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys
225 230 235 240
Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr
245 250 255
Val Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser
260 265 270
Gly Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala
275 280 285
Thr Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser
290 295 300
Pro Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly
305 310 315 320
Thr Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala
325 330 335
Ser His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr
340 345 350
Val Ala Ile Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val
355 360 365
Ser Leu Leu Ala Cys Tyr Leu Lys Ser Arg Gln
370 375
<210> 18
<211> 1140
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码模拟IL15的反式呈递的构建体的示例性
核酸序列（设计3）
<400> 18
atggactgga cctggattct gttcctggtc gcggctgcaa cgcgagtcca tagcggtatc 60
catgttttta ttcttgggtg tttttctgct gggctgccta agaccgaggc caactgggta 120
aatgtcatca gtgacctcaa gaaaatagaa gaccttatac aaagcatgca cattgatgct 180
actctctaca ctgagtcaga tgtacatccc tcatgcaaag tgacggccat gaaatgtttc 240
ctcctcgaac ttcaagtcat atctctggaa agtggcgacg cgtccatcca cgacacggtc 300
gaaaacctga taatactcgc taataatagt ctctcttcaa atggtaacgt aaccgagtca 360
ggttgcaaag agtgcgaaga gttggaagaa aaaaacataa aggagttcct gcaaagtttc 420
gtgcacattg tgcagatgtt cattaatacc tctagcggcg gaggatcagg tggcggtgga 480
agcggaggtg gaggctccgg tggaggaggt agtggcggag gttctcttca aataacttgt 540
cctccaccga tgtccgtaga acatgcggat atttgggtaa aatcctatag cttgtacagc 600
cgagagcggt atatctgcaa cagcggcttc aagcggaagg ccggcacaag cagcctgacc 660
gagtgcgtgc tgaacaaggc caccaacgtg gcccactgga ccacccctag cctgaagtgc 720
atcagagatc ccgccctggt gcatcagcgg cctgcccctc caagcacagt gacaacagct 780
ggcgtgaccc cccagcctga gagcctgagc ccttctggaa aagagcctgc cgccagcagc 840
cccagcagca acaatactgc cgccaccaca gccgccatcg tgcctggatc tcagctgatg 900
cccagcaaga gccctagcac cggcaccacc gagatcagca gccacgagtc tagccacggc 960
accccatctc agaccaccgc caagaactgg gagctgacag ccagcgcctc tcaccagcct 1020
ccaggcgtgt accctcaggg ccacagcgat accacagtgg ccatcagcac ctccaccgtg 1080
ctgctgtgtg gactgagcgc cgtgtcactg ctggcctgct acctgaagtc cagacagtga 1140
<210> 19
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合的IL15/mb-寿司构建体（设计4）
<400> 19
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu
20 25 30
Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys
35 40 45
Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr
50 55 60
Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe
65 70 75 80
Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile
85 90 95
His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser
100 105 110
Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu
115 120 125
Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val
130 135 140
Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Gln Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp
180 185 190
Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser
195 200 205
Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu
210 215 220
Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys
225 230 235 240
Ile Arg
<210> 20
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码融合的IL15/mb-寿司构建体的示例性
核酸序列（设计4）
<400> 20
atggactgga cctggattct gttcctggtc gcggctgcaa cgcgagtcca tagcggtatc 60
catgttttta ttcttgggtg tttttctgct gggctgccta agaccgaggc caactgggta 120
aatgtcatca gtgacctcaa gaaaatagaa gaccttatac aaagcatgca cattgatgct 180
actctctaca ctgagtcaga tgtacatccc tcatgcaaag tgacggccat gaaatgtttc 240
ctcctcgaac ttcaagtcat atctctggaa agtggcgacg cgtccatcca cgacacggtc 300
gaaaacctga taatactcgc taataatagt ctctcttcaa atggtaacgt aaccgagtca 360
ggttgcaaag agtgcgaaga gttggaagaa aaaaacataa aggagttcct gcaaagtttc 420
gtgcacattg tgcagatgtt cattaatacc tctagcggcg gaggatcagg tggcggtgga 480
agcggaggtg gaggctccgg tggaggaggt agtggcggag gttctcttca aataacttgt 540
cctccaccga tgtccgtaga acatgcggat atttgggtaa aatcctatag cttgtacagc 600
cgagagcggt atatctgcaa cagcggcttc aagcggaagg ccggcacaag cagcctgacc 660
gagtgcgtgc tgaacaaggc caccaacgtg gcccactgga ccacccctag cctgaagtgc 720
atcaga 726
<210> 21
<211> 375
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由SEQ ID NO. 17进一步修饰的蛋白质构建体
<400> 21
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu
20 25 30
Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys
35 40 45
Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr
50 55 60
Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe
65 70 75 80
Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile
85 90 95
His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser
100 105 110
Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu
115 120 125
Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val
130 135 140
Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Gln Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp
180 185 190
Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser
195 200 205
Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu
210 215 220
Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys
225 230 235 240
Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr
245 250 255
Val Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser
260 265 270
Gly Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala
275 280 285
Thr Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser
290 295 300
Pro Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly
305 310 315 320
Thr Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala
325 330 335
Ser His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr
340 345 350
Val Ala Ile Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val
355 360 365
Ser Leu Leu Ala Cys Tyr Leu
370 375
<210> 22
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含tgpTCR-α的构建体的非限制性
示例性信号肽
<400> 22
Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala
1 5 10 15
Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly
20
<210> 23
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含tgpTCR-α（具有TM的tgpTCR-α）
的构建体的示例性序列
<400> 23
Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro Ile Met Leu Leu Val Asp Gly
1 5 10 15
Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu Val Leu Asp Val Ala Pro Pro
20 25 30
Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu
35 40 45
Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr
50 55 60
Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu
65 70 75 80
Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly Ala Glu Gly His Ser Arg Ser
85 90 95
Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys
100 105 110
Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Gly Cys Gly Leu Leu Arg Ala Pro Glu
115 120 125
Arg Phe Leu Leu Ala Gly Thr Pro Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val
130 135 140
Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr
145 150 155 160
Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr
165 170 175
Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr
180 185 190
Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg
195 200 205
Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro Pro Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro
210 215 220
Val Trp Gly Glu Gly Ser Tyr Leu Ser Ser Tyr Pro Thr Cys Pro Ala
225 230 235 240
Gln Ala Trp Cys Ser Arg Ser Ala Leu Arg Ala Pro Ser Ser Ser Leu
245 250 255
Gly Ala Phe Phe Ala Gly Asp Leu Pro Pro Pro Leu Gln Ala Gly Ala
260 265 270
Ala
<210> 24
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含tgpTCR-α（具有TM的截短的tgpTCR-α）
的构建体的部分长度
<400> 24
Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro Ile Met Leu Leu Val Asp Gly
1 5 10 15
Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu Val Leu Asp Val Ala Pro Pro
20 25 30
Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu
35 40 45
Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr
50 55 60
Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu
65 70 75 80
Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly Ala Glu Gly His Ser Arg Ser
85 90 95
Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys
100 105 110
Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Gly Cys Gly Leu Leu Arg Ala Pro Glu
115 120 125
Arg Phe Leu Leu Ala Gly Thr Pro Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val
130 135 140
Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr
145 150 155 160
Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr
165 170 175
Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr
180 185 190
Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg
195 200 205
Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro Pro Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro
210 215 220
Val
225
<210> 25
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含全部或部分长度的CD3-ε胞外域的构建体
的示例性序列
<400> 25
Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val
1 5 10 15
Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly
20 25 30
Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu
35 40 45
Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu
50 55 60
Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly
65 70 75 80
Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val
85 90 95
Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp
100
<210> 26
<211> 84
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含全部或部分长度的CD3-δ胞外域的构建
体的示例性序列
<400> 26
Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val Asn Cys
1 5 10 15
Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu Ser
20 25 30
Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro Arg Gly
35 40 45
Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu Ser Thr
50 55 60
Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys Val Glu Leu Asp Pro
65 70 75 80
Ala Thr Val Ala
<210> 27
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含全部或部分长度的CD3-γ胞外域的构
建体的示例性序列
<400> 27
Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys Val Tyr Asp Tyr Gln Glu
1 5 10 15
Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala Glu Ala Lys Asn Ile Thr
20 25 30
Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe Leu Thr Glu Asp Lys Lys
35 40 45
Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp Pro Arg Gly Met Tyr Gln
50 55 60
Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro Leu Gln Val Tyr Tyr Arg
65 70 75 80
Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala Ala Thr Ile Ser
85 90
<210> 28
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于包含全部或部分长度的CD3-ε胞外域的构建体的信号肽
<400> 28
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln
20
<210> 29
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于包含全部或部分长度的CD3-δ胞外域的构建体的信号肽
<400> 29
Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Gln Val Ser Pro
20
<210> 30
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于包含全部或部分长度的CD3-γ胞外域的构建体的信号肽
<400> 30
Met Glu Gln Gly Lys Gly Leu Ala Val Leu Ile Leu Ala Ile Ile Leu
1 5 10 15
Leu Gln Gly Thr Leu Ala
20
<210> 31
<211> 348
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含tgCD3(ε-δ)-TRAC融合蛋白的示例性序列
<400> 31
Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val
1 5 10 15
Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly
20 25 30
Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu
35 40 45
Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu
50 55 60
Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly
65 70 75 80
Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val
85 90 95
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala
100 105 110
Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Gly Ser Phe Lys Ile Pro Ile Glu
115 120 125
Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp
130 135 140
Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp
145 150 155 160
Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly
165 170 175
Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg
180 185 190
Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
195 200 205
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
210 215 220
Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn
225 230 235 240
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val
245 250 255
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
260 265 270
Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile
275 280 285
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val
290 295 300
Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln
305 310 315 320
Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly
325 330 335
Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
340 345
<210> 32
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含tgCD3(ε-δ)-TRAC融合蛋白的示例性序列
<400> 32
Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val
1 5 10 15
Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly
20 25 30
Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu
35 40 45
Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu
50 55 60
Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly
65 70 75 80
Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val
85 90 95
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala
100 105 110
Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Gly Ser Gln Ser Ile Lys Gly Asn
115 120 125
His Leu Val Lys Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu
130 135 140
Thr Cys Asp Ala Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys
145 150 155 160
Met Ile Gly Phe Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser
165 170 175
Asn Ala Lys Asp Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn
180 185 190
Lys Ser Lys Pro Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Gly Gly Gly Gly Ser
195 200 205
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Leu Asn Lys Val Phe
210 215 220
Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His
225 230 235 240
Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp
245 250 255
His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly
260 265 270
Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp
275 280 285
Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp
290 295 300
Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu
305 310 315 320
Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln
325 330 335
Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser
340 345 350
Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile
355 360 365
Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val
370 375 380
Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe
385 390
<210> 33
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与包含tgCD3(ε-δ)-TRAC融合
蛋白的序列的接头序列（G4S接头）
<400> 33
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala
1 5 10 15
Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Gly Ser
20 25
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与包含tgCD3(ε-δ)-TRAC融合
蛋白的序列的接头序列（G4S接头）
<400> 34
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 35
<211> 163
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含全部或部分长度的CD3-
ζ胞内域的示例性序列
<400> 35
Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu
1 5 10 15
Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala
35 40 45
Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
100 105 110
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
115 120 125
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
130 135 140
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
145 150 155 160
Pro Pro Arg
<210> 36
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ITAM1序列
<400> 36
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
1 5 10 15
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
20 25
<210> 37
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ITAM2序列
<400> 37
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
1 5 10 15
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
20 25
<210> 38
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ITAM3序列
<400> 38
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
1 5 10 15
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
20 25
<210> 39
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可从中去除任何一个或两个CD3-ζ ITAM的示
例性序列
<400> 39
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
35 40 45
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
50 55 60
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
65 70 75 80
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
85 90 95
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
100 105 110
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
115 120 125
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
130 135 140
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
145 150
<210> 40
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有41BB信号传导域并且可从中去除任何一个或两个CD3-ζ ITAM的示例性序列CD3嵌合链
<400> 40
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
35 40 45
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
50 55 60
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
65 70 75 80
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
85 90 95
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
100 105 110
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
115 120 125
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
130 135 140
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
145 150
<210> 41
<211> 195
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含全部或部分长度的28BB-ζ胞内域的示例性序列
<400> 41
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
35 40 45
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
50 55 60
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
65 70 75 80
Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
85 90 95
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
100 105 110
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
115 120 125
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
130 135 140
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
145 150 155 160
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
165 170 175
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
180 185 190
Pro Pro Arg
195
<210> 42
<211> 426
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含全部或部分长度的28BB-ζ胞内域的示例性序列
<400> 42
Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val
1 5 10 15
Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly
20 25 30
Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu
35 40 45
Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu
50 55 60
Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly
65 70 75 80
Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val
85 90 95
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala
100 105 110
Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Gly Ser Gln Ser Ile Lys Gly Asn
115 120 125
His Leu Val Lys Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu
130 135 140
Thr Cys Asp Ala Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys
145 150 155 160
Met Ile Gly Phe Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser
165 170 175
Asn Ala Lys Asp Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn
180 185 190
Lys Ser Lys Pro Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Arg Ala Ala Ala Ile
195 200 205
Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly
210 215 220
Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe
225 230 235 240
Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
245 250 255
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
260 265 270
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
275 280 285
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
290 295 300
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg
305 310 315 320
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
325 330 335
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
340 345 350
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
355 360 365
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
370 375 380
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
385 390 395 400
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
405 410 415
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
420 425
<210> 43
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含构建体tgCD3(ε-δ)-(28/BB)-ζ的多肽
<400> 43
Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val
1 5 10 15
Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly
20 25 30
Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu
35 40 45
Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu
50 55 60
Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly
65 70 75 80
Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val
85 90 95
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala
100 105 110
Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Gly Ser Phe Lys Ile Pro Ile Glu
115 120 125
Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp
130 135 140
Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp
145 150 155 160
Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly
165 170 175
Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg
180 185 190
Met Arg Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp
195 200 205
Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu
210 215 220
Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu
225 230 235 240
Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val
245 250 255
Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His
260 265 270
Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys
275 280 285
His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
290 295 300
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
305 310 315 320
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
325 330 335
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
340 345 350
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
355 360 365
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
370 375 380
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
385 390 395 400
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
405 410 415
<210> 44
<211> 276
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
Met Lys Lys His Leu Thr Thr Phe Leu Val Ile Leu Trp Leu Tyr Phe
1 5 10 15
Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Gln Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser Leu
20 25 30
Ile Ile Leu Glu Gly Lys Asn Cys Thr Leu Gln Cys Asn Tyr Thr Val
35 40 45
Ser Pro Phe Ser Asn Leu Arg Trp Tyr Lys Gln Asp Thr Gly Arg Gly
50 55 60
Pro Val Ser Leu Thr Ile Met Thr Phe Ser Glu Asn Thr Lys Ser Asn
65 70 75 80
Gly Arg Tyr Thr Ala Thr Leu Asp Ala Asp Thr Lys Gln Ser Ser Leu
85 90 95
His Ile Thr Ala Ser Gln Leu Ser Asp Ser Ala Ser Tyr Ile Cys Val
100 105 110
Val Ser Asp Arg Gly Ser Thr Leu Gly Arg Leu Tyr Phe Gly Arg Gly
115 120 125
Thr Gln Leu Thr Val Trp Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val
130 135 140
Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe
145 150 155 160
Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp
165 170 175
Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe
180 185 190
Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys
195 200 205
Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro
210 215 220
Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu
225 230 235 240
Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg
245 250 255
Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg
260 265 270
Leu Trp Ser Ser
275
<210> 45
<211> 289
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Met Thr Ile Arg Leu Leu Cys Tyr Met Gly Phe Tyr Phe Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Leu Met Glu Ala Asp Ile Tyr Gln Thr Pro Arg Tyr Leu Val Ile
20 25 30
Gly Thr Gly Lys Lys Ile Thr Leu Glu Cys Ser Gln Thr Met Gly His
35 40 45
Asp Lys Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Asp Pro Gly Met Glu Leu His Leu
50 55 60
Ile His Tyr Ser Tyr Gly Val Asn Ser Thr Glu Lys Gly Asp Leu Ser
65 70 75 80
Ser Glu Ser Thr Val Ser Arg Ile Arg Thr Glu His Phe Pro Leu Thr
85 90 95
Leu Glu Ser Ala Arg Pro Ser His Thr Ser Gln Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
115 120 125
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
130 135 140
Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
145 150 155 160
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
165 170 175
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu
180 185 190
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
195 200 205
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
210 215 220
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
225 230 235 240
Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser
245 250 255
Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala
260 265 270
Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp
275 280 285
Phe
<210> 46
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn
1 5 10 15
Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu
20 25 30
Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys
35 40 45
Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr
50 55 60
Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile
85 90 95
Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly
100 105 110
Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe
115 120 125
Pro Gly Pro Ser Lys Pro
130
<210> 47
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 48
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr
20
<210> 49
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile
1 5 10 15
Gly Leu Gly Ile Phe Phe
20
<210> 50
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala
1 5 10 15
Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro
20 25 30
Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser
35 40 45
Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
50 55
<210> 51
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala
1 5 10 15
Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro
20 25 30
Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser
35 40 45
Gly Leu Asn Gln Ser Arg Ile
50 55
<210> 52
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Gly His Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu
1 5 10 15
Leu Arg Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala
20 25 30
Gln Tyr Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys
35 40 45
<210> 53
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
Gly His Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Ala
1 5 10 15
Leu Arg Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala
20 25 30
Gln Tyr Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Ala Asn Lys
35 40 45
<210> 54
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp
20 25 30
Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly Asn Gln Leu Arg Arg Asn
35 40 45
<210> 55
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Ala
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp
20 25 30
Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly Asn Gln Leu Ala Arg Asn
35 40 45
<210> 56
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 57
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val
1 5 10 15
Thr
<210> 58
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val
1 5 10 15
Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly
20 25 30
Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu
35 40 45
Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu
50 55 60
Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly
65 70 75 80
Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val
85 90 95
Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys
100 105 110
Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp
115 120 125
Gly Ser Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val
130 135 140
Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu
145 150 155 160
Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro
165 170 175
Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu
180 185 190
Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys Val Glu Leu
195 200 205
Asp Pro Ala Thr Val Ala
210
<210> 59
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val
1 5 10 15
Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly
20 25 30
Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu
35 40 45
Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu
50 55 60
Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly
65 70 75 80
Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val
85 90 95
Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys
100 105 110
Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp
115 120 125
Gly Ser Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys Val Tyr Asp Tyr
130 135 140
Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala Glu Ala Lys Asn
145 150 155 160
Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe Leu Thr Glu Asp
165 170 175
Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp Pro Arg Gly Met
180 185 190
Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro Leu Gln Val Tyr
195 200 205
Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala Ala Thr Ile Ser
210 215 220

Claims (42)

1.一种嵌合融合受体(CFR)，其中所述CFR包含胞外域、跨膜域和胞内域，并且其中所述胞外域、所述跨膜域和所述胞内域不包含任何内质网(ER)滞留信号或胞吞信号。
2.根据权利要求1所述的嵌合融合受体，其中所述胞外域不是抗体的scFv(单链可变片段)；其中所述胞外域在与所选激动剂结合后启动信号转导；其中所述胞内域包含至少一个信号传导域，所述至少一个信号传导域激活所选信号传导路径以增强细胞治疗特性；其中
所述CFR在表达时是细胞表面呈递的；并且其中所述CFR减少了内化和表面下调。
3.根据权利要求1所述的嵌合融合受体，其中所述胞内域和所述胞外域是模块化的；或者其中对于所述CFR的给定胞内域，所述胞外域是可切换的，这取决于所选激动剂的结合特异性；或者其中对于给定的胞外域，所述胞内域是可切换的，这取决于用于调控的所选信号传导路径。
4.根据权利要求1或2所述的嵌合融合受体，其中所述胞外域包含信号传导蛋白的全部或部分长度的胞外部分，所述信号传导蛋白包括以下中的至少一者：CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD28、CD5、CD16、CD64、CD32、CD33、CD89、NKG2C、NKG2D、它们的任何功能性变体以及它们的组合或嵌合体。
5.根据权利要求2所述的嵌合融合受体，其中所选激动剂是包含以下的激动性配体：(i)抗体或其功能性变体或片段；或(ii)衔接子；并且其中所选激动剂包含对所述CFR的所述胞外域的一部分具有特异性的至少一个结合域。
6.根据权利要求5所述的嵌合融合受体，其中所选激动剂包含对
CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD28、CD5、CD16、CD64、CD32、CD33、CD89、NKG2C、NKG2D或它们的任何功能性变体的胞外部分具有特异性的至少一个结合域；或者其中所选激动剂是还包含对至少一种肿瘤抗原具有特异性的结合域的衔接子，所述至少一种肿瘤抗原包括B7H3、BCMA、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、PSMA、PAMA、P-钙粘素或ROR1。
7.根据权利要求5所述的嵌合融合受体，其中：
(i)所述胞外域包含以下项的全部或部分长度的胞外部分：(a)CD3ε、CD3γ、CD3δ、它们的任何功能性变体或者组合或嵌合形式；(b)CD3ε和CD3γ的异源二聚体；或(c)CD3ε和CD3δ的异源二聚体；并且
(ii)所选激动剂对CD3的所述胞外域具有结合特异性；或者其中所选激动剂包括以下中的至少一者：CD3×CD19、CD3×CD20、CD3×CD33、博纳吐单抗、卡妥索单抗、厄妥索单抗、RO6958688、AFM11、MT110/AMG 110、MT111/AMG211/MEDI-565、AMG330、MT112/BAY2010112、MOR209/ES414、MGD006/S80880、MGD007和FBTA05。
8.根据权利要求5所述的嵌合融合受体，其中：
(i)所述胞外域包含NKG2C或其任何功能性变体的全部或部分长度的胞外部分；并且
(ii)所选激动剂对NKG2C的所述胞外域具有结合特异性；或者其中所选激动剂包括以下中的至少一者：NKG2C-IL15-CD33TriKE、NKG2C-IL15-CD19 TriKE和NKG2C-IL15-CD20TriKE。
9.根据权利要求5所述的嵌合融合受体，其中：
(i)所述胞外域包含CD28或其任何功能性变体的全部或部分长度的胞外部分；并且
(ii)所选激动剂对CD28的所述胞外域具有结合特异性；或者其中所选激动剂包括以下中的至少一者：15E8、CD28.2、CD28.6、YTH913.12、37.51、9D7(TGN1412)、5.11A1、ANC28.1/5D10和37407。
10.根据权利要求5所述的嵌合融合受体，其中：
(i)所述胞外域包含CD16、CD64或它们的任何功能性变体或组合/嵌合形式的全部或部分长度的胞外部分；
(ii)所选激动剂对CD16或CD64的所述胞外域具有结合特异性；或者其中所选激动剂包括以下中的至少一者：IgG抗体、CD16×CD30、CD64×CD30、CD16×BCMA、CD64×BCMA、CD16-IL-EpCAM或CD64-IL-EpCAM、CD16-IL-CD33和CD64-IL-CD33；并且其中所述IL包含至少一种细胞因子的全部或一部分，所述至少一种细胞因子包括IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21或它们的任何功能性变体或嵌合形式。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的嵌合融合受体，其中所述CFR的所述跨膜域：
(i)没有ER滞留或胞吞信号，或者通过工程改造去除ER滞留和胞吞信号；并且
(ii)包含以下项的跨膜域的全部或一部分：
(a)跨膜蛋白或膜蛋白；
(b)包含以下项的蛋白质：CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、
CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、
CD84、CD137、CD166、FcεRIγ、4-1BB、OX40、
ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、
BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、
KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、
NKG2D、T细胞受体、烟碱型乙酰胆碱受体、GABA受体或它们的组合；或者
(c)CD28、CD8、CD3ε或CD4。
12.根据权利要求1所述的嵌合融合受体，其中所述胞内域包含至少一个细胞毒性结构域和任选的以下中的一者或多者：共刺激域、持久性信号传导域、诱导死亡的信号传导域、肿瘤细胞控制信号传导域、以及它们的任何组合。
13.根据权利要求12所述的嵌合融合受体，其中所述胞内域包含细胞毒性结构域，所述细胞毒性结构域至少包含CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(4-1BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C或NKG2D多肽的全长或一部分；并且任选地，其中所述胞内域还包含以下中的一者或多者：
(i)共刺激域，所述共刺激域包含CD2、CD27、CD28、CD40L、
4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4或NKG2D多肽或它们的任何组合的全长或一部分；
(ii)共刺激域，所述共刺激域包含CD28、4-1BB、CD27、CD40L、ICOS、CD2或它们的任何组合的全长或一部分；
(iii)持久性信号传导域，所述持久性信号传导域包含细胞因子受体的胞内域的全长或一部分，所述细胞因子受体包含IL2R、IL7R、IL15R、IL18R、IL12R、IL23R或它们的任何组合；和/或
(iv)受体酪氨酸激酶(RTK)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、EGFR或FAS受体的全部或部分胞内部分。
14.一种细胞或其群体，其中所述细胞包含编码根据权利要求1至13中任一项所述的嵌合融合受体(CFR)的多核苷酸，其中所述细胞是真核细胞、动物细胞、人细胞、免疫细胞、饲养细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、克隆iPSC或它们的衍生效应细胞。
15.根据权利要求14所述的细胞或其群体，其中所述效应细胞还包含以下中的一者或多者：
(i)具有靶向特异性的CAR；
(ii)CD16或其变体；
(iii)CD38敲除；
(iv)细胞表面表达的外源细胞因子和/或其受体的部分或完整肽；
(v)HLA-I缺乏和任选的HLA-II缺乏；
(vi)HLA-G或不可裂解的HLA-G的引入，或CD58和CD54中的一者或两者的敲除；
(vii)表1中所列的基因型中的至少一者；
(viii)B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD25、CD69、CD44、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT中的至少一者的缺失或破坏；或者
(ix)HLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD16、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、抗原特异性TCR、Fc受体、抗体或其功能性变体或片段、检查点抑制剂、衔接子和用于与激动剂偶联的表面触发受体中的至少一者的引入。
16.根据权利要求15所述的细胞或其群体，其中与从外周血、脐带血或任何其它供体组织获得的其对应原代细胞相比，所述细胞具有包括以下中的一者或多者的治疗特性：
(i)增加的细胞毒性；
(ii)改善的存留和/或存活；
(iii)增强的将旁邻免疫细胞迁移到肿瘤部位以及/或者激活或募集旁邻免疫细胞的能力；
(iv)改善的肿瘤渗透；
(v)增强的降低肿瘤免疫抑制的能力；
(vi)提高的挽救肿瘤抗原逃逸的能力；
(vii)控制的凋亡；
(viii)增强或获得的ADCC；和
(ix)避免自相残杀的能力。
17.根据权利要求15所述的细胞或其群体，其中所述CD16或其变体包括以下中的至少一者：
(a)不可裂解的高亲和力CD16(hnCD16)；
(b)CD16的胞外域中的F176V和S197P；
(c)源自CD64的全部或部分胞外域；
(d)非原生(或非CD16)跨膜域；
(e)非原生(或非CD16)胞内域；
(f)非原生(或非CD16)信号传导域；
(g)非原生刺激域；和
(h)并非源自CD16并且源自相同或不同多肽的跨膜域、信号传导域和刺激域。
18.根据权利要求15所述的细胞或其群体，其中所述CAR是：
(i)T细胞特异性或NK细胞特异性的；
(ii)双特异性抗原结合CAR；
(iii)可切换的CAR；
(iv)二聚化CAR；
(v)分离CAR；
(vi)多链CAR；
(vii)诱导性CAR；
(viii)任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中，与细胞表面表达的外源细胞因子和/或其受体的部分或完整肽共表达；
(ix)任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中，与检查点抑制剂共表达；
(x)对CD19、BCMA、CD20、CD22、CD38、CD123、HER2、CD52、EGFR、GD2、MICA/B、MSLN、VEGF-R2、PSMA和PDL1中的至少一者具有特异性；以及/或者
(xi)对以下中的任一者具有特异性：ADGRE2、碳酸酐酶IX(CAIX)、CCR1、CCR4、癌胚抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、巨细胞病毒(CMV)感染的细胞的抗原、上皮糖蛋白2(EGP-2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、EGFRvIII、受体酪氨酸-蛋白激酶erb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB叶酸结合蛋白(FBP)、胎儿型乙酰胆碱受体(AChR)、叶酸受体α、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、人类表皮生长因子受体2(HER2)、人类端粒酶逆转录酶(hTERT)、ICAM-1、整合素B7、白细胞介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)、κ-轻链、激酶插入域受体(KDR)、路易斯A(CA19.9)、路易斯Y(LeY)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、LILRB2、黑色素瘤抗原家族A1(MAGE-A1)、MICA/B、粘蛋白1(Muc-1)、粘蛋白16(Muc-16)、间皮素(MSLN)、NKCSI、NKG2D配体、c-Met、癌症-睾丸抗原NY-ESO-1、癌胚抗原(h5T4)、PRAME、前列腺干细胞抗原(PSCA)、PRAME前列腺特异性膜抗原(PSMA)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、TIM-3、TRBC1、TRBC2、血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)、威尔姆斯肿瘤蛋白质(WT-1)和病原体抗原；并且
任选地，其中(i)至(xi)中任一项所述的CAR插入在TCR基因座处以及/或者由TCR的内源启动子驱动，以及/或者所述TCR通过所述CAR插入而被敲除。
19.根据权利要求15所述的细胞或其群体，其中所述细胞还包括细胞表面表达的外源细胞因子和/或其受体的部分或完整肽，并且其中所述外源细胞因子或其受体：
(a)包含IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21和其相应受体中的至少一者；或者
(b)包含以下中的至少一者：
(i)通过使用自裂解肽进行IL15和IL15Rα的共表达；
(ii)IL15和IL15Rα的融合蛋白；
(iii)IL15Rα的胞内域截短或消除的IL15/IL15Rα融合蛋白；
(iv)IL15与IL15Rα的膜结合的寿司域的融合蛋白；
(v)IL15和IL15Rβ的融合蛋白；
(vi)IL15和共同受体γC的融合蛋白，其中所述共同受体γC是原生的或经修饰的；和
(vii)IL15Rβ的同源二聚体,
其中(i)至(vii)中的任一者都可在单独构建体中或在双顺反子构建体中与CAR共表达；
以及任选地，
(c)瞬时表达。
20.根据权利要求15所述的细胞或其群体，其中所述检查点抑制剂是针对一种或多种检查点分子的拮抗剂，所述一种或多种检查点分子包括PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2AR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara(视黄酸受体α)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E或抑制性KIR；或者
其中所述衔接子包括双特异性T细胞衔接子(BiTE)或三特异性杀伤细胞衔接子(TriKE)。
21.根据权利要求15所述的细胞或其群体，其中所述衍生效应细胞能够将T细胞募集和/或迁移到肿瘤部位，并且其中所述衍生效应细胞能够在一种或多种检查点抑制剂存在下降低肿瘤免疫抑制。
22.根据权利要求14所述的细胞或其群体，其中所述细胞包括：
(i)整合在安全港基因座或所选基因座中的一个或多个外源多核苷酸；或者
(ii)整合在不同安全港基因座或两个或更多个所选基因座中的超过两个外源多核苷酸。
23.根据权利要求22所述的细胞或其群体，其中所述安全港基因座包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH或
RUNX1中的至少一者；并且其中所选基因座是B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT中的一者；并且/或者其中所述外源多核苷酸的整合敲除了所述基因座中的所述基因的表达。
24.根据权利要求23所述的细胞或其群体，其中所述TCR基因座是TCRα和/或TCRβ的恒定区。
25.根据权利要求14所述的细胞或其群体，其中所述衍生效应细胞包括衍生CD34细胞、衍生造血干细胞和祖细胞、衍生造血多能祖细胞、衍生T细胞祖细胞、衍生NK细胞祖细胞、衍生T谱系细胞、衍生NKT谱系细胞、衍生NK谱系细胞、衍生B谱系细胞或具有一种或多种功能特征的衍生免疫效应细胞，所述一种或多种功能特征不存在于对应的原代T细胞、NK细胞、NKT细胞和/或B细胞中。
26.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求14至25中任一项所述的细胞或其群体。
27.一种主细胞库(MCB)，所述主细胞库包括根据权利要求14至25中任一项所述的克隆iPSC。
28.一种用于治疗用途的组合物，所述组合物包含根据权利要求14至25中任一项所述的细胞或其群体以及一种或多种治疗剂。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述治疗剂包括肽、细胞因子、检查点抑制剂、抗体或其功能性变体或片段、衔接子、丝裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或其置换因子、包含一种或多种所关注多核酸的载体、化学治疗剂或放射性部分或免疫调节药物(IMiD)。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中：
(a)所述检查点抑制剂包含：
(i)一种或多种拮抗剂检查点分子，所述一种或多种拮抗剂检查点分子包括PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、
CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2AR、BATE、
BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、
CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、
Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、
MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara(视黄酸受体α)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E或抑制性KIR；
(ii)阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、伊匹单抗、
IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、
纳武单抗、帕博利珠单抗以及它们的衍生物或功能等效物中的一者或多者；或者
(iii)阿特珠单抗、纳武单抗和帕博利珠单抗中的至少一者；或者
(b)所述治疗剂包含维奈妥拉、阿扎胞苷和泊马度胺中的一者或多者；或者
(c)所述衔接子包括双特异性T细胞衔接子(BiTE)或三特异性杀伤细胞衔接子(TriKE)。
31.根据权利要求29所述的组合物，其中所述抗体或其功能性变体或片段包含：
(a)抗CD20、抗CD22、抗HER2、抗CD52、抗EGFR、抗CD123、抗GD2、抗PDL1和/或抗CD38抗体；
(b)利妥昔单抗、维妥珠单抗、奥法木单抗、乌妥昔单抗、奥卡妥珠单抗、奥妥珠单抗、异贝莫单抗、奥瑞珠单抗、奥英妥珠单抗、莫塞妥单抗、依帕珠单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、阿伦单抗、西妥昔单抗、迪妥昔单抗、阿维鲁单抗、达雷木单抗、伊沙妥昔单抗、MOR202、7G3、CSL362、依托珠单抗和它们的人源化或经Fc修饰的变体或片段以及它们的功能等效物和生物类似物中的一者或多者；或者
(c)达雷木单抗，并且其中所述衍生效应细胞包含CD38敲除，以及任选地CD16或其变体的表达。
32.根据权利要求28至31中任一项所述的组合物通过将所述组合物引入到适于过继性细胞疗法的受试者来实现的治疗用途，其中所述受试者患有：自身免疫性障碍、血液系统恶性肿瘤、实体瘤、癌症或病毒感染。
33.一种制备包含根据权利要求1至13中任一项所述的CFR的衍生效应细胞的方法，其中所述方法包括分化经基因工程改造的iPSC，其中所述iPSC包含编码所述CFR的多核苷酸，以及任选地一种或多种编辑，所述一种或多种编辑产生：
(i)CD38敲除；
(ii)HLA-I缺乏和任选的HLA-II缺乏；
(iii)HLA-G或不可裂解的HLA-G的引入，或CD58和CD54中的一者或两者的敲除；
(iv)CD16或其变体；
(v)具有靶向特异性的CAR；
(vi)细胞表面表达的外源细胞因子和/或其受体的部分或完整肽；
(vii)表1中所列的基因型中的至少一者；
(viii)B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD25、CD69、CD44、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT中的至少一者的缺失或破坏；或者
(ix)HLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD16、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、抗原特异性TCR、Fc受体、抗体或其功能性变体或片段、检查点抑制剂、衔接子和用于与激动剂偶联的表面触发受体中的至少一者的引入。
34.根据权利要求33所述的方法，还包括对克隆iPSC进行基因组工程改造以敲入编码所述CFR的多核苷酸；以及任选地：
(i)敲除CD38，
(ii)敲除B2M和/或CIITA，
(iii)敲除CD58和CD54中的一者或两者，以及/或者
(iv)引入HLA-G或不可裂解的HLA-G、不可裂解的高亲和力CD16或其变体、CAR和/或细胞表面表达的外源细胞因子或其受体的部分或完整肽。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述基因组工程改造包括靶向编辑。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述靶向编辑包括缺失、插入或插入/缺失，并且其中所述靶向编辑通过CRISPR、ZFN、TALEN、归巢核酸酶、同源重组或这些方法的任何其它功能性变型进行。
37.一种CRISPR介导的克隆iPSC的编辑，其中所述编辑包括敲入编码根据权利要求1至13中任一项所述的CFR的多核苷酸。
38.根据权利要求37所述的CRISPR介导的编辑：
(a)其中所述克隆iPSC的编辑还包括敲除TCR，或者
(b)其中所述CFR插入到包含以下的基因座中的一者中：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT；并且其中所述插入敲除了所述基因座中的所述基因的表达。
39.一种治疗疾病或病况的方法，所述方法包括向对其有需要的受试者施用包含根据权利要求1至13中任一项所述的CFR的细胞和对所述CFR具有特异性的激动剂。
40.根据权利要求39所述的方法，其中包含所述CFR的所述细胞表达对所述CFR具有特异性的抗体或其功能性变体或片段，或衔接子。
41.根据权利要求39所述的方法，其中包含所述CFR的所述细胞是iPSC衍生的效应细胞，所述iPSC衍生的效应细胞还包含以下中的一者或多者：
(i)CD38敲除；
(ii)TCRneg；
(iii)外源CD16或其变体；
(iv)HLA-I缺乏和/或HLA-II缺乏；
(v)HLA-G或不可裂解的HLA-G的引入，或CD58和CD54中的一者或两者的敲除；
(vi)CAR的引入；和/或
(vii)细胞表面表达的外源细胞因子和/或其受体的部分或完整肽。
42.根据权利要求39所述的方法，其中与从外周血、脐带血或任何其它供体组织获得的其对应原代细胞相比，所述细胞的施用导致以下中的一者或多者：
(i)增加的细胞毒性；
(ii)改善的存留和/或存活；
(iii)增强的将旁邻免疫细胞迁移到肿瘤部位以及/或者激活或募集旁邻免疫细胞的能力；
(iv)改善的肿瘤渗透；
(v)增强的降低肿瘤免疫抑制的能力；(vi)提高的挽救肿瘤抗原逃逸的能力；(vii)控制的凋亡；
(viii)增强或获得的ADCC；和
(ix)避免自相残杀的能力。
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