CN117858942A - 受保护的效应细胞及其用于同种异体过继性细胞疗法的用途 - Google Patents

受保护的效应细胞及其用于同种异体过继性细胞疗法的用途 Download PDF

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CN117858942A CN202280051751.9A CN202280051751A CN117858942A CN 117858942 A CN117858942 A CN 117858942A CN 202280051751 A CN202280051751 A CN 202280051751A CN 117858942 A CN117858942 A CN 117858942A
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R·比约达尔
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Abstract

本发明提供了用于获得通过对基因组工程改造的iPSC进行定向分化获得的功能上增强的衍生效应细胞的方法和组合物。本文提供的衍生细胞的实施方案具有递送改善的或增强的治疗效果的稳定且功能性基因组编辑。还提供了治疗性组合物和其用途,该治疗性组合物包括单独的所述功能上增强的衍生效应细胞或在组合疗法中功能上增强的衍生效应细胞与抗体或检查点抑制剂。

Description

受保护的效应细胞及其用于同种异体过继性细胞疗法的用途
相关申请
本申请要求2021年7月2日提交的美国临时申请序列号63/218,204、2021年12月9日提交的美国临时申请序列号63/265,190和2022年5月13日提交的美国临时申请序列号63/341,943的优先权,这些申请中的每一者的公开内容据此全文以引用方式并入。
通过引用并入序列表
于2022年7月1日创建且大小为16,198字节的标题为184143-635601_SequenceListing.xml的序列表据此全文以引用方式并入。
技术领域
本公开与现成的免疫细胞产物领域广泛地相关。更具体地说,本公开与研发能够体内递送治疗相关特性的多功能效应细胞的策略相关。根据本公开研发的细胞产物解决了患者来源的细胞疗法的关键限制。
背景技术
过继性细胞疗法领域目前的重点是使用患者来源的细胞和供体来源的细胞,这使得实现癌症免疫疗法的持续制造以及向所有可能从中受益的患者递送疗法尤其困难。还需要改善过继转移的淋巴细胞的功效和存留,以促进良好的患者结果。淋巴细胞(如T细胞和自然杀伤(NK)细胞)是有效的抗肿瘤效应子,其在先天性和适应性免疫中起重要作用。然而,将这些免疫细胞用于过继性细胞疗法仍然有挑战性,并且尚未满足改善的需求。因此,在过继性免疫疗法中,仍有大量机会来利用T细胞和NK细胞或其他淋巴细胞的全部潜能。
发明内容
需要功能上改善的效应细胞,以在以下范围内解决问题:从反应速率、细胞耗竭、输血细胞损失(存活和/或存留)、肿瘤经由标靶损失或谱系转换逃逸、肿瘤靶向精确度、脱靶毒性、肿瘤外效应到针对实体肿瘤的功效,即肿瘤微环境和相关免疫抑制、募集、运输和浸润。
本发明的实施方案的目的是用以产生由单一细胞衍生iPSC(诱导性多能干细胞)克隆系分化的衍生非多能细胞的方法和组合物,该iPSC系包含在其基因组中的一种或几种基因修饰。在一些实施方案中,所述一种或几种基因修饰包括DNA插入、缺失和取代,并且该修饰在分化、扩增、传代和/或移植后在随后衍生细胞中保留并且保持功能性。
本申请的iPSC衍生非多能细胞包括但不限于CD34+细胞、生血内皮细胞、HSC(造血干细胞和祖细胞)、造血多能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞和B细胞。本申请的iPSC衍生非多能细胞通过由包含相同基因修饰的iPSC分化在它们的基因组中包含一种或多种基因修饰。在一些实施方案中,用于获得基因工程改造的衍生细胞的工程改造的克隆iPSC分化策略受益于iPSC在定向分化中的发育潜能,该定向分化不会显著地受到iPSC中的工程改造模式的不利影响,并且也要求工程改造模式如预期那样在衍生细胞中起作用。此外,这一策略克服工程改造的原代淋巴细胞(例如由外周血获得的T细胞或NK细胞)的现有障碍,因此细胞难以工程改造,并且工程改造这类细胞通常缺乏再现性和均匀性,使得细胞展现伴随高细胞死亡和低细胞扩增的不良细胞存留。
因此,在一个方面,本发明提供了细胞或其群体,其中:(i)细胞是诱导多能细胞(iPSC)、克隆iPSC、iPS细胞系细胞或从分化iPSC获得的衍生细胞;(ii)细胞包含(a)HLA-I缺乏;(b)CD38敲除;以及任选地,(c)编码CD16或其变体的外源多核苷酸。在各种实施方案中,细胞或其群体还包含以下中的一者或多者:(i)编码细胞因子信号传导复合体的外源多核苷酸,该细胞因子信号传导复合体包含细胞表面表达的外源细胞因子和/或其受体的部分或全部肽;(ii)编码嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸;(iii)HLA-II缺乏;以及(iv)编码HLA-G、HLA-E或其变体的外源多核苷酸,其中细胞适合于CD38调节,其中细胞在并入CD38调节的过继性细胞疗法中在同种异体反应性宿主细胞的存在下具有改善的持久性。在各种实施方案中,细胞:(i)包含表1中列出的基因型中的至少一种基因型;(ii)包含CD58和CD54中的一者或两者的敲除;(iii)包含B2M、CIITA、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD25、CD69、CD44、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT中的至少一者的破坏;(iv)包含4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、TCR、Fc受体、抗体或其功能性变体或片段、检查点抑制剂、衔接子和用于与双特异性或多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体中的至少一者的引入;和/或(v)不包含编码HLA-G、HLA-E或其变体的外源多核苷酸。在一些实施方案中,HLA-I缺乏包含以下中的至少一者的破坏:B2M、TAP1、TAP2和TAP相关蛋白。在一些其他实施方案中,HLA-II缺乏包含以下中的至少一者的破坏:CIITA、RFX5、RFXAP和RFXANK。
在细胞或其群体的各种实施方案中,衍生细胞:(a)包含衍生CD34+细胞、衍生造血干细胞和祖细胞、衍生造血多能祖细胞、衍生T细胞祖细胞、衍生NK细胞祖细胞、衍生T细胞、衍生NKT细胞、衍生NK细胞或衍生B细胞;或者(b)用作同种异体效应细胞,其中效应细胞是具有以下特性中的至少一种特性的衍生NK细胞或衍生T细胞,该特性包括:与由外周血、脐带血或任何其他供体组织获得的其原生对应细胞相比,(i)改善的存留和/或存活;(ii)对活化的受体免疫细胞的增加的抗性;(iii)增加的细胞毒性;(iv)改善的肿瘤渗透;(v)增强或获取的ADCC;(vi)旁观者免疫细胞迁移到肿瘤部位和/或激活或募集到肿瘤部位的能力增强;(vii)降低肿瘤免疫抑制的能力增强;(viii)挽救肿瘤抗原逃逸的能力提高;以及(ix)减少的自相残杀。
在细胞或其群体的各种实施方案中,CD16或其变体包含以下中的至少一者:(a)高亲和力不可裂解的CD16(hnCD16)或其变体;(b)CD16的胞外域中的F176V和S197P;(c)源自CD64的全部或部分胞外域;(d)非原生(或非CD16)跨膜结构域;(e)非原生(或非CD16)胞内结构域;(f)非原生(或非CD16)信号传导结构域;(g)非原生刺激结构域;以及(h)并非源自CD16并且源自相同或不同多肽的跨膜结构域、信号传导结构域和刺激结构域。在某些实施方案中,(a)非原生跨膜结构域衍生自CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或T细胞受体(TCR)多肽;(b)非原生刺激结构域衍生自CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4或NKG2D多肽;(c)非原生信号传导结构域衍生自CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(4-1BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C或NKG2D多肽;或者(d)非原生跨膜域衍生自NKG2D,非原生刺激域衍生自2B4,并且非原生信号传导域衍生自CD3ζ。
在细胞或其群体的各种实施方案中,CAR是:(i)T细胞特异性或NK细胞特异性;(ii)双特异性抗原结合CAR;(iii)可切换的CAR;(iv)二聚化CAR;(v)分离CAR;(vi)多链CAR;(vii)诱导性CAR;(viii)任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中,与包含细胞表面表达的外源细胞因子和/或其受体的部分或完整肽的细胞因子信号传导复合体共表达;(ix)任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中,与检查点抑制剂共表达;和/或(x)任选地在TRAC或TRBC基因座处插入,和/或由TCR的内源启动子驱动,和/或TCR由CAR插入而敲除;安全港基因座;或旨在用于破坏的基因座。在细胞或其群体的各种实施方案中,CAR:(i)对CD19、BCMA、B7H3、MICA/B或MR1具有特异性;和/或(ii)对以下中的任一者具有特异性:ADGRE2、碳酸酐酶IX(CAIX)、CCR1、CCR4、癌胚抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、巨细胞病毒(CMV)感染的细胞的抗原、上皮糖蛋白2(EGP-2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、EGFRvIII、受体酪氨酸-蛋白激酶erb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB叶酸结合蛋白(FBP)、胎儿型乙酰胆碱受体(AChR)、叶酸受体α、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、人类表皮生长因子受体2(HER2)、人类端粒酶逆转录酶(hTERT)、ICAM-1、整合素B7、白细胞介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)、κ-轻链、激酶插入域受体(KDR)、路易斯A(CA19.9)、路易斯Y(LeY)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、LILRB2、黑色素瘤抗原家族A1(MAGE-A1)、粘蛋白1(Muc-1)、粘蛋白16(Muc-16)、间皮素(MSLN)、NKCSI、NKG2D配体、c-Met、癌症-睾丸抗原NY-ESO-1、癌胚抗原(h5T4)、PRAME、前列腺干细胞抗原(PSCA)、PRAME前列腺特异性膜抗原(PSMA)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、TIM-3、TRBC1、TRBC2、血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)、威尔姆斯肿瘤蛋白质(WT-1)和病原体抗原。
在细胞或其群体的各种实施方案中,细胞因子信号传导复合体包含:(a)细胞表面表达的外源细胞因子和/或其受体的部分或全部肽,包含IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21或其相应受体中的至少一者。或(b)以下中的至少一者:(i)在其间具有自裂解肽的IL15和IL15Rα的共表达;(ii)IL15和IL15Rα的融合蛋白;(iii)IL15Rα的胞内结构域截短的IL15/IL15Rα融合蛋白(IL15Δ);(iv)IL15和IL15Rα的膜结合的寿司结构域的融合蛋白;(v)IL15和IL15Rβ的融合蛋白;(vi)IL15和共同受体γC的融合蛋白,其中所述共同受体γC是原生的或经过修饰的;以及(vii)IL15Rβ的同源二聚体;其中(i)-(vii)中的任一者任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中与CAR共表达;以及任选地,(c)瞬时表达。
在细胞或其群体的各种实施方案中,细胞是衍生NK细胞或衍生T细胞,其中衍生NK细胞能够将T细胞募集和/或迁移到肿瘤部位,并且其中衍生NK细胞或衍生T细胞能够在一种或多种检查点抑制剂存在下降低肿瘤免疫抑制。在一些实施方案中,一种或多种检查点抑制剂是针对一种或多种检查点分子的拮抗剂,该检查点分子包含PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2AR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara(视黄酸受体α)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E或抑制性KIR。在特定实施方案中,一种或多种检查点抑制剂包含:(a)阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、伊匹单抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗和它们的衍生物或功能等效物中的一者或多者;或(b)阿特珠单抗、纳武单抗和帕博利珠单抗中的至少一者。
在细胞或其群体的各种实施方案中,该细胞包含:(i)整合在安全港基因座或旨在用于破坏的基因座中的一个或多个外源多核苷酸;或(ii)整合在不同安全港基因座或旨在用于破坏的基因座中的超过两个外源多核苷酸。在一些实施方案中,一个或多个安全港基因座包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、TCR或RUNX1中的至少一者;或者其中一个或多个旨在用于破坏的基因座包含B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD71、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT。
在细胞或其群体的各种实施方案中,CD38调节:(i)通过包含抗CD38抗体或与CD38特异性结合的CAR(CD38-CAR)的CD38拮抗剂;(ii)通过达雷木单抗、伊沙妥昔单抗或MOR202;(iii)通过达雷木单抗;(iv)包括在用于过继性细胞疗法的细胞或其群体的输注之前、期间或之后,将CD38拮抗剂施用于需要该疗法的受试者;(v)包括在输注预负载的细胞或其群体之前将CD38拮抗剂体外预负载到细胞或其群体;(vi)消除或减少同种异体反应性宿主细胞的数量;(vii)延迟宿主免疫重构和/或(viii)在需要过继性细胞疗法的受试者的同种异体反应性宿主细胞的存在下延长细胞或其群体的存活和存留。在细胞或其群体的各种实施方案中,同种异体反应性宿主细胞:(i)包含与细胞或其群体同种异体的原代T细胞、B细胞和/或NK细胞;(ii)对细胞或其群体的CD38调节敏感;和/或(iii)经由CD38拮抗剂以剂量依赖性方式通过CD38调节而消除。
在另一个方面,本发明提供了一种组合物,该组合物包含CD38拮抗剂和本文所述的细胞或其群体。在各种实施方案中,组合物还包含一种或多种治疗剂。在特定实施方案中,一种或多种治疗剂包含肽、细胞因子、检查点抑制剂、丝裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或其置换因子、包含一种或多种所关注多核酸的载体、抗体、化学治疗剂或放射性部分或免疫调节药物(IMiD)。在一些实施方案中,(i)检查点抑制剂包含:(a)检查点分子的一种或多种拮抗剂,该检查点分子包括PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2AR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxp1、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara(视黄酸受体α)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E或抑制性KIR;(b)阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、伊匹单抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗和它们的衍生物或功能等效物中的一者或多者;(c)阿特珠单抗、纳武单抗和帕博利珠单抗中的至少一者;或者(ii)该治疗剂包含维奈妥拉、阿扎胞苷和泊马度胺中的一者或多者。在一些实施方案中,抗体包含:(a)抗CD20抗体、抗HER2抗体、抗CD52抗体、抗EGFR抗体、抗CD123抗体、抗GD2抗体、抗PDL1抗体、抗CD25抗体、抗CD69抗体、抗CD71抗体或抗CD44抗体;或(b)利妥昔单抗、维妥珠单抗、奥法木单抗、乌妥昔单抗、奥卡妥珠单抗、奥妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、阿伦单抗、西妥昔单抗、迪妥昔单抗、阿维鲁单抗、达克利珠单抗、巴利昔单抗、M-A251、2A3、BC69、24204、22722、24212、MAB23591、FN50、298614、AF2359、CY1G4、DF1513、比伐珠单抗、RG7356、G44-26、7G3、CSL362、依托珠单抗和它们的人源化或经过Fc修饰的变体或片段和它们的功能等效物及其生物类似物中的一者或多者。
在组合物的各种实施方案中,CD38拮抗剂:(i)包含抗CD38抗体或CD38-CAR;(ii)包含达雷木单抗、伊沙妥昔单抗或MOR202;(iii)包含达雷木单抗;或(iv)在细胞或其群体的输注之前、期间或之后,被提供给需要过继性细胞疗法的受试者。在另一个方面,本发明提供了本文所述的组合物的治疗用途,该治疗用途通过将该组合物引入需要过继性细胞疗法的受试者体内,其中该受试者患有自身免疫性障碍、血液系统恶性肿瘤、实体瘤、癌症或病毒感染。
在又一个方面,本发明提供了在向有需要的受试者提供的过继性细胞疗法中减少或防止宿主细胞针对同种异体效应细胞的同种异体反应性的方法,其中同种异体效应细胞包括如本文所述的细胞或其群体,并且其中该方法包括CD38调节。在各种实施方案中,宿主细胞包括同种异体反应性免疫细胞,其包括原代T细胞、B细胞和/或NK细胞。在各种实施方案中,CD38调节:(i)包括在将同种异体效应细胞输注给受试者之前、期间或之后向受试者施用CD38拮抗剂;或(ii)包括在将同种异体效应细胞输注给受试者之前将CD38拮抗剂体外预负载到同种异体效应细胞;其中CD38调节(a)消除或减少同种异体反应性宿主细胞的数量;(b)将同种异体效应细胞的存活和存留延长至可由给定剂量的CD38拮抗剂控制的程度;和/或(c)延迟宿主免疫重构。在一些实施方案中,CD38拮抗剂包含:(i)抗CD38抗体或CD38-CAR;(ii)达雷木单抗、伊沙妥昔单抗或MOR202;和/或(iii)达雷木单抗。在一些实施方案中,同种异体反应性宿主细胞包含上调的CD38表达。
在过继性细胞疗法中减少或防止宿主细胞对同种异体效应细胞的同种异体反应性的方法的各种实施方案中,该方法还包括向受试者施用治疗剂。在一些实施方案中,治疗剂包括肽、细胞因子、检查点抑制剂、丝裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或其置换因子、包括一种或多种所关注多核酸的载体、抗体、化学治疗剂或放射性部分或免疫调节药物(IMiD)。在特定实施方案中,(i)检查点抑制剂包含:(a)检查点分子的一种或多种拮抗剂,该检查点分子包括PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2AR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxp1、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、视黄酸受体α(Rara)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E或抑制性KIR;(b)阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、伊匹单抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗和它们的衍生物或功能等效物中的一者或多者;或(c)阿特珠单抗、纳武单抗和帕博利珠单抗中的至少一者。或者(ii)该治疗剂包含维奈妥拉、阿扎胞苷和泊马度胺中的一者或多者。在一些实施方案中,该方法不需要或最少需要利用环磷酰胺和氟达拉滨(Cy/Flu)的组合进行的淋巴耗竭。在一些实施方案中,该方法不包括利用Cy/Flu进行的淋巴耗竭。
在另一个方面,本发明提供了治疗需要过继性细胞疗法的受试者的方法,其中该方法包括向受试者施用CD38拮抗剂以进行CD38调节并输注如本文所述的细胞或其群体。在各种实施方案中,CD38调节:(i)减少或防止宿主细胞对同种异体效应细胞的同种异体反应性;(ii)消除或减少同种异体反应性宿主细胞的数量;(iii)延长同种异体效应细胞的存活和存留;(iv)延迟宿主免疫重构;(v)经由HLA-G或HLA-E的过表达防止同种异体效应细胞对宿主细胞的同种异体反应性的渗漏保护;和/或(vi)增加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)可用性,减少NAD消耗相关的细胞死亡,并支持细胞再生。在一些实施方案中,该方法不需要或最少需要利用环磷酰胺和氟达拉滨(Cy/Flu)的组合进行的淋巴耗竭。在一些实施方案中,该方法不包括利用Cy/Flu进行的淋巴耗竭。
通过结合附图进行的以下描述,如本文所提供的组合物和方法的各个目的和优势将变得显而易见,在所述附图中借助于说明和实例阐述本发明的某些实施方案。
附图说明
图1A示出B2M WT和B2M KO效应细胞系之间的表型相似性。图1B示出B2M WT和B2MKO效应细胞系之间相似水平的抗体依赖性细胞毒性。
图2A示出iNK细胞被成功地工程改造,并通过流式细胞术评估了所有工程改造的元件。图2B示出HLA-I和HLA-II缺乏(dKO)对同种异体T细胞反应性是保护性的。
图3示出抑制性配体过表达不保护NK细胞的所有亚群,并且NK细胞的亚群对包括CD47和HLA-E信号传导的抑制途径有抗性。
图4示出pbNK对B2M KO效应细胞系的识别以及由抗CD38抗体调节介导的对效应细胞的保护作用。
图5A和图5B示出抗CD38抗体调节在体外保护iNK细胞不受pbNK同种异体排斥。从左到右的条组分别由从上到下的图例指示。
图6A和图6B示出单独培养的和用同种异体iNK细胞激发后的供体PBMC的CD38表达水平。
图7A和图7B示出抗CD38抗体调节对iPSC衍生的B2M KO细胞对同种异体宿主细胞(PBMC)的敏感性的剂量依赖性效应。
图8A至图8F示出缺乏CD38和B2M的iNK细胞在体外对同种异体T细胞和NK细胞攻击有抗性。
图9A至图9D示出B2M KO和抗CD38抗体调节抑制了与iNK细胞的共培养物中的活化的PBMC信号。
图10A至图10C示出具有B2M/CIITA dKO的组合的细胞的例示性结果。
图11A和图11B示出当与外周血NK细胞组合时,iT细胞中的CD38敲除消除抗CD38ADCC。
图12示出抗CD38抗体调节在NSG-IL15转基因小鼠模型中有效地耗尽pbNK细胞。
图13A至图13E示出使用IL15转基因NSG小鼠,抗CD38抗体在体内保护iNK细胞免受pbNK同种异体排斥。图13A示出当在有或没有抗CD38抗体的情况下单独输注时循环中的pbNK水平,而图13B示出当在没有pbNK的情况下输注时循环中的WT、B2M KO和B2M/CIITAdKO iNK水平。图13C示出当在存在和不存在达雷木单抗的情况下与pbNK共输注时循环中的WT iNK水平。图13D示出当在存在和不存在达雷木单抗的情况下与pbNK共输注时循环中的B2M KO iNK水平。图13E示出当在存在和不存在达雷木单抗的情况下与pbNK共输注时循环中的B2M/CIITA KO iNK水平。(n=5只小鼠/组;P值*<0.05,**<0.001,****<0.0001)。
图14A至图14C示出在达雷木单抗存在的情况下pbNK计数显著降低,这导致B2M KO和B2M/CIITA KO iNK在IL15转基因NSG小鼠的血、脾和骨髓中的存留。细胞计数针对无达雷木单抗组被归一化(n=5只小鼠/组;P值*<0.05,**<0.001,****<0.0001)。
图15示出在用工程改造的CD38KO hnCD16 iNK细胞与达雷木单抗组合治疗的患者中,向淋巴耗竭化学疗法(LDC)添加抗CD38抗体延迟了宿主免疫重构并延长了过继性细胞疗法的机会窗口。
图16示出用工程改造的iNK细胞与达雷木单抗组合治疗的一个受试者中淋巴细胞分布的均匀流形近似和投影(UMAP)可视化。
具体实施方式
iPSC(诱导性多能干细胞)的基因组修饰包括多核苷酸插入、缺失和取代。基因组工程改造的iPSC中的外源基因表达通常遇到问题,例如在初始基因组工程改造的iPSC长期克隆扩增之后、在细胞分化之后并且在来自衍生自基因组工程改造的iPSC的细胞的去分化细胞类型中基因沉默或基因表达减少。另一方面,直接工程改造例如T细胞或NK细胞的原代免疫细胞具有挑战性,并且对制备和递送用于过继性细胞疗法的工程改造的免疫细胞存在障碍。在各种实施方案中,本发明提供用于将一种或多种外源基因(包括自杀基因和其他功能模式)稳定地整合到iPSC衍生细胞中的有效的、可靠的和针对性的方法,所述一种或多种外源基因提供与移植、运输、归巢、迁移、细胞毒性、活力、维持、扩增、寿命、自我更新、存留和/或存活有关的有所改善的治疗特性,所述iPSC衍生细胞包括但不限于HSC(造血干细胞和祖细胞)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞。
定义
除非本文中另外定义,否则结合本申请使用的科学与技术术语将具有所属领域的技术人员通常了解的含义。另外,除非上下文另外需要,否则单数术语应包括复数,并且复数术语应包括单数。
应理解,本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等,并且因此可变化。本文所用的术语仅仅是出于描述特定实施方案的目的,并且并不意欲限制本发明的范围,本发明的范围只由权利要求书来界定。
如本文所用,冠词“一个”、“一种”和“该”在本文中是指一个或超过一个(即,至少一个)的该冠词的语法对象。例如,“一个要素”意指一个要素或多于一个要素。
替代方案(例如“或”)的使用应理解为意指替代方案中的任一个、两个或其任何组合。
术语“和/或”应理解为意指替代方案中的一者或两者。
如本文所用,术语“约”或“大约”是指与参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度相比,数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度变化多达15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。在一个实施方案中,术语“约”或“大约”是指关于参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度,数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度±15%、±10%、±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%或±1%的范围。
如本文所使用,术语“实质上”或“基本上”是指数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度为参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度的约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高。在一个实施方案中,术语“基本上相同”或“实质上相同”是指与参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度大约相同的数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度的范围。
如本文所用,术语“实质上不含”与“基本上不含”可互换地使用,并且当用于描述组合物(例如细胞群或培养基)时,是指不含所指定物质或其来源的组合物,例如95%不含、96%不含、97%不含、98%不含、99%不含所指定物质或其来源,或检测不到,如通过常规方式所测量。术语组合物中“不含”或“基本上不含”某种成分或物质也意指(1)组合物中不包括任何浓度的这类成分或物质,或(2)组合物中包括功能上惰性、低浓度的这类成分或物质。类似含义可以应用于术语“缺乏”,其是指组合物中物缺乏特定质或其来源。
在整个本说明书中,除非上下文另外要求,否则词语“包含”应理解成暗指包括所陈述步骤或要素或一组步骤或要素,但不排除任何其它步骤或要素或一组步骤或要素。在特定实施方案中,术语“包括”、“具有”、“含有”和“包含”同义地使用。
“由……组成”意在包括并且限于短语“由……组成”之后的任何事物。因此,短语“由……组成”指示所列要素是需要或必需的,并且不能存在其它要素。
所谓“基本上由……组成”打算包括短语后所列的任何要素,并且限于不干扰或影响本公开中指定的所列要素的活性或作用的其它要素。因此,短语“主要由……组成”指示所列要素是需要或必需的,但其它要素是任选的并且可视其是否影响所列要素的活性或作用而存在或不存在。
在整个本说明书中提及“一个实施方案”、“一实施方案”、“特定实施方案”、“相关实施方案”、“某个实施方案”、“附加实施方案”或“另外实施方案”或它们的组合意指结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括于本发明的至少一个实施方案中。因此,在整个本说明书中的各处出现的前述短语不一定全部指代同一实施方案。此外,在一个或多个实施方案中,特定特征、结构或特性可以任何合适方式组合。
术语“离体”一般是指在生物体外部发生的活动,例如在生物体外部的人工环境中,在活组织中或活组织上进行的实验或测量,优选地其中自然条件的变化最小。在特定实施方案中,“离体”程序涉及从生物体中获取活细胞或组织并且通常在无菌条件下在实验室设备中培养,并且通常培养几小时或长达约24小时,但包括长达48小时或72小时或更长,这视情况而定。在某些实施方案中,可以收集和冷冻这类组织或细胞,并且稍后解冻以便进行离体处理。使用活细胞或组织持续时间长于几天的组织培养实验或程序通常被视为“体外”,但在某些实施方案中,这个术语可以与离体互换使用。
术语“体内”一般是指在生物体内部进行的活动。
如本文所用,术语“重编程”或“去分化”或“提高细胞效能”或“提高发育效能”是指一种提高细胞效能或使细胞去分化成较低分化状态的方法。举例来说,具有提高的细胞效能的细胞具有与非重编程状态下相同细胞相比更大的发育可塑性(即,可分化成更多细胞类型)。换句话说,重编程细胞是与非重编程状态下相同细胞相比分化状态较低的细胞。
如本文所用,术语“分化”是未特化(“未专门化”)或弱特化细胞借以获得特化细胞(例如血细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化细胞或分化诱导性细胞是已处在细胞谱系内的更特化(“专门化”)位置的细胞。术语“专门化”在应用于分化过程时是指一种细胞,其在分化路径中已经行进到在正常情况下其将继续分化成特定细胞类型或细胞类型的亚群并且在正常情况下其不能分化成不同细胞类型或恢复为更弱分化细胞类型的时刻。如本文所用,术语“多能”是指细胞形成身体或胞体(即,胚胎本身)的所有谱系的能力。举例来说,胚胎干细胞是一种类型多能干细胞,其能够形成三种胚层:外胚层、中胚层和内胚层中的每一种的细胞。多能性是一种连续的发育效能,范围为不能产生完整生物体的不完全或部分多能细胞(例如外胚层干细胞或EpiSC)到能够产生完整生物体的更原始、更多能细胞(例如胚胎干细胞)。
如本文所用,术语“诱导性多能干细胞”或“iPSC”是指在体外使用重编程因子和/或小分子化学驱动方法由分化的成体、新生儿或胎儿细胞产生的干细胞,这些干细胞已被诱导或改变,即重编程为能够分化成所有三种胚层或真皮层:中胚层、内胚层和外胚层的组织的细胞。所产生的iPSC并非指如其在自然界中被发现的细胞。
如本文所用,术语“胚胎干细胞”是指胚胎囊胚的内部细胞团块中的天然存在的多能干细胞。胚胎干细胞是多能的并且在发育期间产生三种原代胚层:外胚层、内胚层和中胚层的所有衍生细胞。其对胚胎外膜或胎盘没有贡献(即,并非分化全能的)。
如本文所用,术语“多潜能干细胞”是指具有分化成一种或多种胚层(即,外胚层、中胚层和内胚层)、但非全部三种胚层的细胞的发育潜能的细胞。因此,多潜能细胞也可以称为“部分分化细胞”。多潜能细胞在所属领域中是众所周知的,并且多潜能细胞的示例包括成体干细胞,例如造血干细胞和神经干细胞。“多潜能”表示细胞可以形成指定谱系内的许多类型的细胞,而非其它谱系的细胞。举例来说,多潜能造血细胞能够形成许多不同类型的血细胞(红细胞、白细胞、血小板等),但其不能形成神经元。因此,术语“多潜能性”是指细胞状态,其发育潜能的程度低于分化全能和多能。
多能性可部分地通过评定细胞的多能性特性确定。多能性特性包括但不限于:(i)多能干细胞形态;(ii)无限自我更新的潜能;(iii)多能干细胞标记物的表达,该标记物包括但不限于SSEA1(仅小鼠)、SSEA3/4、SSEA5、TRA1-60/81、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/prominin、CD140a、CD56、CD73、CD90、CD105、OCT4、NANOG、SOX2、CD30和/或CD50;(iv)分化成所有三种体细胞谱系(外胚层、中胚层和内胚层)的能力;(v)由三种体细胞谱系组成的畸胎瘤形成;以及(vi)由来自三种体细胞谱系的细胞组成的类胚胎体的形成。
先前已描述两种类型的多能性:“激发”或“亚稳定”的多能性状态等效于后期囊胚的外胚层干细胞(EpiSC),并且“初始”或“基础”的多能性状态等效于早期/植入前囊胚的内部细胞团块。尽管两种多能状态都展现如上所述的特性,但初始或基础状态进一步表现出:(i)雌性细胞中的X染色体的预先失活或再激活;(ii)在单细胞培养期间,克隆性和存活率改善;(iii)DNA甲基化总体减少;(iv)发育调控基因启动子上的H3K27me3抑制性染色质标记沉积减少;以及(v)相对于激发状态的多能细胞,分化标记物的表达减少。通常发现细胞重编程标准方法(其中将外源多能性基因引入体细胞中,表达,并且然后沉默或从所得多能细胞中去除)具有多能性激发状态的特性。在标准多能细胞培养条件下,除非维持外源转基因表达(其中观察到基础状态的特性),否则这类细胞保持激发状态。
如本文所用,术语“多能干细胞形态”是指胚胎干细胞的经典形态特点。正常胚胎干细胞形态的特征是小圆形形状,细胞核与细胞质比例高,明显存在核仁,和典型的细胞间间距。
如本文所用,术语“受试者”是指任何动物,优选地是人类患者、牲畜或其它驯养动物。
“多能性因子”或“重编程因子”是指一种试剂,其能够单独或与其它试剂组合来增强细胞的发育效能。多能性因子包括但不限于能够提高细胞发育效能的多核苷酸、多肽和小分子。示例性多能性因子包括例如转录因子和小分子重编程剂。
“培养”或“细胞培养”是指细胞在体外环境中维持、生长和/或分化。“细胞培养基”、“培养基”(在各种情况下,为单数形式“培养基(medium)”)、“补充剂”和“培养基补充剂”是指培育细胞培养物的营养组合物。
“培育”或“维持”是指细胞在组织或身体外部(例如在无菌塑料(或经涂布的塑料)细胞培养皿或烧瓶中)维持、繁殖(生长)和/或分化。“培育”或“维持”可以使用培养基作为有助于细胞繁殖和/或维持的营养、激素和/或其它因子来源。
如本文所用,术语“中胚层”是指三种胚层之一,其出现于早期胚胎发生期间并且产生各种特化细胞类型,包括循环系统、肌肉、心脏、真皮、骨骼和其它支持和结缔组织的血细胞。
如本文所用,术语“永久性生血内皮细胞”(HE)或“多能干细胞衍生永久性生血内皮细胞”(iHE)是指在称为内皮细胞向造血细胞转变的过程中产生造血干细胞和祖细胞的内皮细胞亚群。胚胎中的造血细胞发育依序进行:从侧板中胚层到成血管细胞到永久性生血内皮细胞和造血祖细胞。
术语“造血干细胞和祖细胞”、“造血干细胞”、“造血祖细胞”或“造血前驱细胞”是指向造血谱系专门化、但能够进一步向造血分化的细胞,并且包括多潜能造血干细胞(血胚细胞)、骨髓祖细胞、巨核细胞祖细胞、红细胞祖细胞和淋巴祖细胞。造血干细胞和祖细胞(HSC)是多潜能干细胞,其产生所有血细胞类型,包括骨髓(单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞)和淋巴谱系(T细胞、B细胞、NK细胞)。如本文所用,术语“永久性造血干细胞”是指CD34+造血细胞,其能够产生成熟骨髓细胞类型和淋巴细胞类型,包括T谱系细胞、NK谱系细胞和B谱系细胞。造血细胞还包括原始造血细胞的多种亚群,其产生原始红细胞、巨核细胞和巨噬细胞。
如本文所用,术语“T淋巴细胞”和“T细胞”可互换地使用并且是指白血细胞的主要类型,其在胸腺中完成成熟并且在免疫系统中具有多种作用,包括鉴别体内的特异性外来抗原以及以MHC I类受限方式使其它免疫细胞激活和去激活。T细胞可以是任何T细胞,例如培养的T细胞,例如原代T细胞,或来自培养的T细胞系的T细胞,例如Jurkat、SupT1等,或获自哺乳动物的T细胞。T细胞可以是CD3+细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞并且可以处于任何发育阶段,包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞(例如Th1和Th2细胞)、CD8+T细胞(例如细胞毒性T细胞)、外周血单核细胞(PBMC)、外周血白细胞(PBL)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、记忆T细胞、初始T细胞、调控T细胞、gamma delta T细胞(γδT细胞)等等。其它类型的辅助T细胞包括例如Th3(Treg)、Th17、Th9或Tfh细胞的细胞。其它类型的记忆T细胞包括例如中枢记忆T细胞(Tcm细胞)、效应记忆T细胞(Tem细胞和TEMRA细胞)的细胞。术语“T细胞”还可以指基因工程改造的T细胞,例如经过修饰可表达T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。T细胞或T细胞样效应细胞还可由干细胞或祖细胞(“衍生的T细胞”或“衍生的T细胞样效应细胞”,或统称为“衍生的T谱系细胞”)分化。衍生的T细胞样效应细胞在一些方面可具有T细胞谱系,但同时具有一种或多种不存在于原代T细胞中的功能特征。在本申请中,将T细胞、T细胞样效应细胞、衍生的T细胞、衍生的T细胞样效应细胞或衍生T谱系细胞统称为“T谱系细胞”。
“CD4+T细胞”是指T细胞的亚群,其在其表面上表达CD4并且与细胞介导的免疫反应相关。其特征在于刺激后的分泌概况,其可能包括分泌细胞因子,例如IFN-γ、TNF-α、IL2、IL4和IL10。“CD4”分子是最初被定义为T淋巴细胞上的分化抗原,但也发现于包括单核细胞/巨噬细胞的其它细胞上的55-kD的糖蛋白。CD4抗原是免疫球蛋白超基因家族成员并且表明为主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex;MHC)II类限制的免疫反应中的相关识别元件。在T淋巴细胞上,其界定了辅助/诱导因子亚群。
“CD8+T细胞”是指T细胞的亚群,其在其表面上表达CD8,受限于MHC I类,并且充当细胞毒性T细胞。“CD8”分子是发现于胸腺细胞上和细胞毒性和抑制性T淋巴细胞上的分化抗原。CD8抗原是免疫球蛋白超基因家族成员并且主要组织相容性复合体I类限制的相互作用中的相关识别元件。
如本文所用,术语“NK细胞”或“自然杀伤细胞”是指外周血淋巴细胞的亚群,其根据CD56或CD16的表达和T细胞受体(CD3)的缺乏来定义。NK细胞可以是任何NK细胞,诸如培养的NK细胞,例如原代NK细胞,或来自培养的或扩增的NK细胞或细胞系NK细胞的NK细胞,例如NK-92,或得自健康的或具有疾病状况的哺乳动物的NK细胞。如本文所用,术语“适应性NK细胞”与“记忆NK细胞”可互换并且是指NK细胞的亚群,其表型为CD3-和CD56+,表达NKG2C和CD57和任选的CD16中的至少一者,但缺乏以下一者或多者的表达:PLZF、SYK、FceRγ和EAT-2。在一些实施方案中,分离的CD56+NK细胞亚群包含CD16、NKG2C、CD57、NKG2D、NCR配体、NKp30、NKp40、NKp46、激活的和抑制性KIR、NKG2A和/或DNAM-1的表达。CD56+可以是较弱或较强的表达。NK细胞或NK细胞样效应细胞可由干细胞或祖细胞(“衍生的NK细胞”或“衍生的NK细胞样效应细胞”,或统称为“衍生的NK谱系细胞”)分化。衍生的NK细胞样效应细胞在一些方面可具有NK细胞谱系,但同时具有一种或多种不存在于原代NK细胞中的功能特征。在本申请中,将NK细胞、NK细胞样效应细胞、衍生的NK细胞、衍生的NK细胞样效应细胞或衍生NK谱系细胞统称为“NK谱系细胞”。
如本文所用,术语“NKT细胞”或“自然杀伤T细胞”是指受限于CD1d的T细胞,其表达T细胞受体(TCR)。不同于常规T细胞检测由常规主要组织相容性(MHC)分子呈递的肽抗原,NKT细胞识别由CD1d(一种非经典MHC分子)呈递的脂质抗原。识别两种类型的NKT细胞。恒定型或I型NKT细胞表达非常有限的TCR谱系:典型α链(人类中为Vα24-Jα18)与有限光谱的β链(人类中为Vβ11)的结合。第二个NKT细胞群,称为非经典或非恒定II型NKT细胞,显示更不均匀的TCRαβ利用率。I型NKT细胞被认为适于免疫疗法。适应性或恒定(I型)NKT细胞可以由以下标记物中的一者或多者的表达来鉴别:TCR Va24-Ja18、Vb11、CD1d、CD3、CD4、CD8、αGalCer、CD161和CD56。
术语“效应细胞”一般适用于在免疫系统中响应于刺激和/或激活而执行特定活性的某些细胞,或者适用于在激活时实现特定功能的细胞。如本文所用,术语“效应细胞”包括免疫细胞、“分化的免疫细胞”以及被编辑和/或调节以响应于刺激和/或激活而执行特定活性的原代或分化的细胞,并且这些术语在一些情况下可互换。效应细胞的非限制性示例包括原代来源的或iPSC衍生的T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞。
如本文所用,术语“分离”等是指一种细胞或细胞群,其已与其初始环境中分离,即,分离细胞的环境实质上不含如存在“未分离”参考细胞的环境中所发现的至少一种组分。所述术语包括从一些或所有组分去除的细胞,如同其在其自然环境中发现,例如与组织或活检样品分离。所述术语还包括从至少一种、一些或所有组分中去除的细胞,如同所述细胞在非天然存在的环境中发现,例如与细胞培养物或细胞悬浮液分离。因此,“分离细胞”部分地或完全地与至少一种组分(包括其他物质、细胞或细胞群体)分离,如同其在自然界中发现或如同其在非天然存在的环境中生长、储存或生存。分离细胞的特定实例包括部分纯细胞组合物、实质上纯细胞组合物和非天然存在的培养基中培养的细胞。分离细胞可以通过将所期望的细胞或其群与环境中的其它物质或细胞分离或通过从环境中去除一个或多个其它细胞群或亚群来获得。
如本文所用,术语“纯化”等是指提高的纯度。举例来说,纯度可以提高到至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%。
如本文所用,术语“编码”是指多核苷酸中的核苷酸的特异性序列(例如基因、cDNA或mRNA)的固有特性,以充当生物过程中合成其它聚合物和大分子的模板,所述其它聚合物和大分子具有定义的核苷酸序列(即,rRNA、tRNA和mRNA)或定义的氨基酸序列和由其获得的生物特性。因此,如果与一种基因对应的mRNA的转录和转译在细胞或其它生物系统中产生一种蛋白质,那么所述基因编码所述蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列一致并且通常提供于序列表中)与非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以称为“编码”该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
“构建体”是指包含待体外或体内传递给宿主细胞中的多核苷酸的大分子或分子复合体。如本文所用,“载体”是指能够引导外来遗传物质递送或转移到靶细胞的任何核酸构建体,在靶细胞中,所述核酸构建体能够复制和/或表达。因此,术语“载体”包含待递送的构建体。载体可以是线性或环形分子。载体可以是整合或非整合载体。载体的主要类型包括但不限于质粒、游离型载体、病毒载体、粘粒和人工染色体。病毒载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体等。
所谓“整合”意指构建体的一个或多个核苷酸稳定插入细胞基因组中,即,共价连接至细胞染色体DNA内的核酸序列。所谓“靶向整合”意指构建体的核苷酸在预选位点或“整合位点”插入细胞染色体或线粒体DNA中。如本文所用,术语“整合”进一步是指一种过程,其涉及在内源序列或核苷酸缺失或不缺失的情况下在整合位点插入构建体的一个或多个外源序列或核苷酸。在插入位点存在缺失的情况下,“整合”还可包含用一个或多个所插入核苷酸置换缺失的内源序列或核苷酸。
如本文所用,术语“外源”旨在意指参考分子或参考活性引入宿主细胞中,或对于宿主细胞是非原生的。所述分子可以通过例如将编码核酸引入宿主遗传物质中来引入,例如整合于宿主染色体中,或作为非染色体遗传物质,例如质粒。因此,所述术语当关于编码核酸的表达使用时是指编码核酸以可表达形式引入细胞中。术语“内源”是指存在于宿主细胞中的参考分子或活性。类似地,所述术语当关于编码核酸的表达使用时,是指细胞内所含而非外源引入的编码核酸的表达。
如本文所用,“所关注基因”或“所关注多核苷酸序列”是当放置在适当调控序列的控制下时体内转录成RNA并且在一些情况下转译成多肽的DNA序列。所关注基因或多核苷酸可以包括但不限于原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列和合成DNA序列。例如,所关注基因可以编码miRNA、shRNA、原生多肽(即,自然界中发现的多肽)或它们的片段;变体多肽(即,与原生多肽具有小于100%的序列同一性的原生多肽的突变体)或其片段;工程改造的多肽或肽片段、治疗肽或多肽、成像标记物、可选标记物等。
如本文所用,术语“多核苷酸”是指具有任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的聚合物形式或其类似物。多核苷酸序列由四个核苷酸碱基构成:腺嘌呤(A);胞嘧啶(C);鸟嘌呤(G);胸腺嘧啶(T);以及尿嘧啶(U)(当多核苷酸是RNA时,尿嘧啶代替胸腺嘧啶)。多核苷酸可以包括基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。“多核苷酸”还指双链和单链分子。
如本文所用,术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换地使用并且是指氨基酸残基通过肽键共价连接的分子。多肽必须含有至少两个氨基酸,并且多肽的氨基酸最大数目不受限制。如本文所用,所述术语是指短链(在所属领域中通常也称为例如肽、寡肽和寡聚物)和较长链(在所属领域中通常称为多肽或蛋白质)。“多肽”包括例如生物活性片段、实质上同源多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽变体、经过修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白以及其它。所述多肽包括自然多肽、重组多肽、合成多肽或其组合。
如本文所用,术语“亚基”是指蛋白质复合体的每条单独的多肽链,其中每条单独的多肽链可由自身形成稳定的折叠结构。许多蛋白质分子由多于一个亚基构成,其中氨基酸序列对于每个亚基可以是一致的,或相似的,或完全不同的。例如,CD3复合体由CD3α、CD3ε、CD3δ、CD3γ和CD3ζ亚基构成,其形成CD3ε/CD3γ、CD3ε/CD3δ和CD3ζ/CD3ζ二聚体。在单个亚基内,多肽链的连续部分经常折叠成紧凑的、局部的、半独立的单元,称为“结构域”。许多蛋白质结构域还可包含独立的“结构亚基”,也称为亚结构域,该亚结构域有助于结构域的共同功能。因此,如本文所用,术语“亚结构域”是指较大结构域内的蛋白质结构域,例如,细胞表面受体的胞外域内的结合结构域;或者细胞表面受体的胞内域的刺激结构域或信号传导结构域。
“可操作地连接(operably linked/operatively linked与operably connected/operatively connected可互换使用)”是指与单一核酸片段(或具有多个结构域的多肽中的氨基酸)上的核酸序列的缔合,使得一者的功能受另一者影响。举例来说,当启动子能够影响编码序列或功能RNA表达(即,所述编码序列或功能RNA处于启动子的转录控制下)时,所述启动子与所述编码序列或功能RNA可操作地连接。编码序列可以按照有义或反义定向可操作地连接至调控序列。作为另一个示例,受体结合结构域可与胞内信号传导结构域可操作地连接,使得受体与配体的结合转导响应于所述结合的信号。
如本文所用,“融合蛋白”或“嵌合蛋白”是通过基因工程改造产生的蛋白,用于连接编码单独蛋白的两个或更多个部分或全部多核苷酸编码序列,并且这些连接的多核苷酸的表达产生具有衍生自原始蛋白或其片段中的每一者的功能特性的单个肽或多个多肽。在融合蛋白中不同来源的两个相邻多肽之间,可添加接头(或间隔区)肽。
如本文所用,术语“遗传印记”是指对源细胞或iPSC的优选治疗属性有贡献的遗传或表观遗传信息,并且能保留于源细胞衍生iPSC和/或iPSC衍生造血谱系细胞中。如本文所用,“源细胞”是一种可以用于通过重编程来产生iPSC的非多能细胞,并且源细胞衍生iPSC可以进一步分化成特定细胞类型,包括任何造血谱系细胞。视上下文而定,源细胞衍生iPSC和其分化细胞有时统称为“衍生(derived或derivative)细胞”。例如,如在整个本申请中所使用,衍生效应细胞或衍生的NK细胞或衍生T细胞与得自自然/原生来源(诸如外周血、脐带血或其他供体组织)的其原代对应细胞相比是由iPSC分化的细胞。如本文所用,赋予优选治疗属性的遗传印记是通过使对供体、疾病或治疗反应具有特异性的所选源细胞重编程或通过使用基因组编辑将基因修饰模式引入iPSC来并入iPSC中。在从特别选择的供体、疾病或治疗背景获得的源细胞的方面,对优选治疗属性有贡献的遗传印记可包括任何背景特异性基因或表观基因修饰,这些表观基因修饰表现出可保留的表型,即优选的治疗属性,该表型被传递给所选源细胞的衍生细胞,无论潜在分子事件是否得到鉴别。对供体、疾病或治疗反应具有特异性的源细胞可以包括可保留在iPSC和衍生造血谱系细胞中的遗传印记,该遗传印记包括但不限于预排列的单特异性TCR,例如来自病毒特异性T细胞或恒定型自然杀伤T(iNKT)细胞;可跟踪和期望的遗传多态性,例如对编码所选供体中的高亲和力CD16受体的点突变来说为同型;和预定的HLA需求,即,所选的HLA匹配供体细胞随着群增大而表现出单倍型。如本文所用,优选治疗属性包括衍生细胞的移植、运输、归巢、活力、自更新、存留、免疫反应调控和调节、存活和细胞毒性改善。优先治疗属性还可涉及抗原靶向受体表达;HLA呈递或其缺乏;对肿瘤微环境的抗性;旁邻免疫细胞的诱导和免疫调节;随着肿瘤外效应降低,靶上特异性改善;对诸如化学疗法等治疗的抗性。当具有一种或多种治疗属性的衍生细胞通过分化具有遗传印记的iPSC而获得时,此类衍生细胞也被称为“合成细胞”,该遗传印记赋予了整合到iPSC中的优先治疗属性。例如,如在整个本申请中所使用,合成效应细胞或合成NK细胞或合成T细胞与从自然/原生来源(诸如外周血、脐带血或其他供体组织)获得的其原代对应细胞相比是由基因组修饰的iPSC分化的细胞。在一些实施方案中,当与其最接近的对应原代细胞相比时,合成细胞具有一种或多种非原生细胞功能。
如本文所用,术语“增强的治疗特性”是指细胞的治疗特性与相同一般细胞类型的典型免疫细胞相比增强。举例来说,与典型的、未修饰的和/或天然存在的NK细胞相比,具有“增强的治疗特性”的NK细胞将具有增强、改善和/或强化的治疗特性。免疫细胞的治疗特性可以包括但不限于细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留、免疫反应调控和调节、存活和细胞毒性。免疫细胞的治疗特性也通过以下来体现:抗原靶向受体表达;HLA呈递或其缺乏;对肿瘤微环境的抗性;旁邻免疫细胞的诱导和免疫调节;随着肿瘤外效应降低,靶上特异性改善;对诸如化学疗法等治疗的抗性。
如本文所用,术语“衔接子”是指分子,例如融合多肽,其能够使免疫细胞(例如,T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞)与肿瘤细胞之间形成连接;并且激活免疫细胞。衔接子的示例包括但不限于双特异性T细胞衔接子(BiTE)、双特异性杀伤细胞衔接子(BiKE)、三特异性杀伤细胞衔接子(TriKE)或多特异性杀伤细胞衔接子,或与多种免疫细胞类型相容的通用衔接子。
如本文所用,术语“表面触发受体”是指一种能够触发或启动免疫反应(例如,细胞毒性反应)的受体。表面触发受体可以加以工程改造,并且可以在效应细胞(例如T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞)上表达。在一些实施方案中,表面触发受体促进效应细胞与特定靶细胞(例如,肿瘤细胞)之间发生双特异性或多特异性抗体接合,不依赖于效应细胞的自然受体和细胞类型。使用这种方法,可以产生包含通用表面触发受体的iPSC,并且然后使这类iPSC分化成表达通用表面触发受体的各种效应细胞类型的群。“通用”意指表面触发受体可表达于任何效应细胞中并且激活任何效应细胞(不论细胞类型)并且表达通用受体的所有效应细胞可与表面触发受体可识别的具有相同抗原决定基的衔接子偶联或连接(不论衔接子的肿瘤结合特异性)。在一些实施方案中,具有相同肿瘤靶向特异性的衔接子用于与通用表面触发受体偶联。在一些实施方案中,具有不同肿瘤靶向特异性的衔接子用于与通用表面触发受体偶联。因而,可使一种或多种效应细胞类型接合,从而在一些情况下杀死一种特定类型的肿瘤细胞并且在其它情况下杀死两种或更多种类型的肿瘤。表面触发受体通常包含用于效应细胞激活的共刺激域和对衔接子的抗原决定基具有特异性的抗抗原决定基。双特异性衔接子对位于一端的表面触发受体的抗抗原决定基具有特异性,并且对位于另一端的肿瘤抗原具有特异性。
如本文所用,术语“安全开关蛋白质”是指一种工程改造的蛋白质,其经设计以防止细胞疗法的潜在毒性或以其它方式防止副作用。在一些情况下,安全开关蛋白质表达受到有条件的控制,以解决所移植的工程改造的细胞的安全问题,该细胞已经将编码安全开关蛋白质的基因永久性地并入其基因组中。这种条件性调控可以是可变的并且可能包括通过小分子介导的转译后激活和组织特异性和/或时间转录调控来进行控制。安全开关蛋白可以介导对凋亡的诱导、对蛋白合成或DNA复制的抑制、生长阻滞、转录和转录后遗传调节和/或抗体介导的耗竭。在一些情况下,安全开关蛋白由外源分子例如前药激活,该外源分子在被激活时触发了治疗细胞的凋亡和/或细胞死亡。安全开关蛋白的示例包括但不限于自杀基因,诸如胱天蛋白酶9(或胱天蛋白酶3或7)、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、B细胞CD20、经修饰的EGFR和它们的任何组合。在这种策略中,在发生不良事件时施用的前药由自杀基因产物激活并且杀死转导的细胞。
如本文所用,术语“医药学活性蛋白质或肽”是指能够对生物体实现生物学和/或医药作用的蛋白质或肽。医药学活性蛋白质具有针对疾病的治愈性或姑息性特性,并且可以施用以改善、缓解、减缓、逆转或减轻疾病严重程度。医药学活性蛋白质还具有预防特性并且用于防止疾病发作或减轻这类疾病或病理病况在其显现时的严重强度。“医药学活性蛋白质”包括完整蛋白质或肽或其医药学活性片段。该术语还包括蛋白质或肽的医药学活性类似物或蛋白质或肽的片段的类似物。术语医药学活性蛋白质还指以协作或协同方式发挥作用以提供治疗效益的多种蛋白质或肽。医药学活性蛋白质或肽的示例包括但不限于受体、结合性蛋白、转录和转译因子、肿瘤生长抑制蛋白质、抗体或其片段、生长因子和/或细胞因子。
如本文所用,术语“信号传导分子”是指调节、参与、抑制、激活、减少或增加细胞信号转导的任何分子。“信号转导”是指分子信号以化学修饰形式传递,其通过沿着最终触发细胞中的生物化学事件的路径募集蛋白质复合体来实现。信号转导路径在所属领域中是众所周知的,并且包括但不限于G蛋白偶联受体信号传导、酪氨酸激酶受体信号传导、整合素信号传导、TG点信号传导、配体门控离子通道信号传导、ERK/MAPK信号传导路径、Wnt信号传导路径、cAMP依赖性路径和IP3/DAG信号传导路径。
如本文所用,术语“靶向模式”是指分子(例如,多肽)以基因方式并入细胞中以促进抗原和/或表位特异性,其包括但不限于i)抗原特异性(当其涉及独特嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)时);ii)衔接子特异性(当其涉及单克隆抗体或双特异性衔接子时);ⅲ)靶向转化细胞;iv)靶向癌症干细胞,和v)在缺乏特异性抗原或表面分子的情况下的其他靶向策略。
如本文所用,与非特异性或非选择性结合相比,术语“特异性(specific/specificity)”可以用于指分子(例如,受体或衔接子)能够选择性地结合到靶分子。
如本文所用,术语“过继性细胞疗法”是指一种基于细胞的免疫疗法,其涉及自体或同种异体淋巴细胞(例如,T细胞、B细胞和/或NK细胞)的输注,该淋巴细胞在所述输注之前已离体扩增,无论是否经过遗传修饰。
如本文所用,“淋巴耗竭”和“淋巴调节”可互换使用,是指通常在免疫疗法之前对淋巴细胞和T细胞的破坏。在施用过继性细胞疗法之前的淋巴调节的目的是促进效应细胞的稳态增殖以及消除调节性免疫细胞和免疫系统中的竞争稳态细胞因子的其他竞争元件。因此,淋巴调节通常通过在第一剂量的过继性细胞疗法之前向受试者施用一种或多种化学治疗剂来完成。在各种实施方案中,淋巴调节先于第一剂量的过继性细胞疗法几小时至几天。可用于淋巴调节的示例性化学治疗剂包括但不限于环磷酰胺(CY)、氟达拉滨(FLU)和下文所述的那些。然而,通过抗CD38 mAb的充分淋巴耗竭可提供用于本发明的iNK细胞疗法的替代调节方法,而不需要或最少需要基于CY/FLU的淋巴调节过程,如本文进一步描述的。
如本文所用,“归巢”或“运输”是指细胞主动导航(迁移)至靶位点(例如,细胞、组织(例如,肿瘤)或器官)。“归巢分子”是指将细胞导向靶位点的分子。在一些实施方案中,归巢分子的功能是识别和/或启动细胞与靶位点的相互作用。
如本文所用,“治疗上足够的量”在其含义内包含无毒但足够和/或有效量的其所指代的用于提供期望的治疗效果的特定治疗剂和/或药物组合物。所需精确量将随各受试者而变化,这取决于诸如患者总体健康状况、患者年龄和正在治疗的病况的分期和严重强度等因素。在特定实施方案中,“治疗上足够的量”足以和/或有效地使与所治疗的受试者的疾病或病况相关的至少一种症状改善、减少和/或好转。
多能干细胞的分化需要改变培养系统,例如改变培养基中的刺激剂或细胞的物理状态。大部分常规策略是使用类胚胎体(EB)的形成作为启动谱系特异性分化的共同和关键中间步骤。“类胚胎体”是三维团簇,其已表明可模拟胚胎发育,因为其在其三维区域内产生多种谱系。通过分化过程,通常为几小时到几天,简单的EB(例如,经过诱发可分化的聚集多能干细胞)继续成熟并且发育成囊性EB,此时,通常进一步将其处理数日到几周以继续分化。EB形成通过使多能干细胞在三维多层细胞团簇中彼此紧密接近来启动。通常,这通过若干种方法中的一种方法来实现,包括允许多能细胞在液滴中沉降、使细胞在“U”形底孔板中沉降或通过机械搅拌。为了促进EB发育,多能干细胞聚集体需要进一步分化提示,原因是多能培养维持性培养基中所维持的聚集体不形成适当EB。因而,多能干细胞聚集体需要转移到分化培养基中,所述分化培养基向所选谱系提供诱发提示。通过在EB细胞团簇内适度增殖,多能干细胞的基于EB的培养通常引起分化细胞群(即,外胚层、中胚层和内胚层胚层)产生。虽然经证实可促进细胞分化,然而,EB产生了分化状态可变的异质细胞,原因是三维结构中的细胞不一致地暴露于环境内的分化提示。另外,EB的形成和维持麻烦。此外,通过EB进行的细胞分化伴随适度细胞扩增,这也导致分化效率降低。
相比之下,与“EB形成”不同的“聚集体形成”可以用于扩增多能干细胞衍生细胞群。举例来说,在基于聚集体的多能干细胞扩增期间,选择可维持增殖和多能性的培养基。细胞增殖通常增加聚集体的尺寸,从而形成更大聚集体,这些聚集体可通过机械或酶方式解离成更小聚集体,从而维持培养物内的细胞增殖并且增加细胞数目。不同于EB培养,维持培养基的聚集体内所培养的细胞维持多能性标记。多能干细胞聚集体需要进一步分化提示来诱导分化。
如本文所用,“单层分化”是关于分化方法的术语,其不同于通过三维多层细胞团簇进行的分化,即,“EB形成”。除了本文公开的其它优点之外,单层分化避免了启动分化需要EB形成。由于单层培养不模拟胚胎发育,诸如在EB形成的情况下,因此相较于EB形成中的所有三种胚层分化,向特定谱系的分化被认为是最少的。
如本文所用,“解离细胞”或“单个解离细胞”是指已实质上与其它细胞或表面(例如,培养板表面)分离或纯化的细胞。举例来说,细胞可通过机械或酶方法从动物或组织中解离。可替代地,在体外聚集的细胞可以彼此酶促地或机械地解离,诸如通过解离到团簇、单一细胞或单一细胞与团簇的混合物的悬浮液中。在又一个替代实施方案中,粘着细胞可从培养板或其它表面解离。因此,解离可能涉及破坏与胞外基质(ECM)和衬底(例如培养表面)的细胞相互作用,或破坏细胞之间的ECM。
如本文所用,“主细胞库”或“MCB”是指克隆主工程改造iPSC系,其为iPSC的克隆群体,这些iPSC已经过工程改造以包括一种或多种治疗属性,已经过表征、测试、定性和扩增,并且已被证明作为起始细胞材料可靠地起作用,以用于在制备环境中通过定向分化来生产基于细胞的治疗剂。在各种实施方案中,将MCB维持、储存和/或冷冻保存在多个容器中,以通过减少和/或消除iPS细胞系在制造过程中传代、解冻或处理的总次数来防止遗传变异和/或潜在污染。
如本文所用,“饲养细胞”或“饲养层”是描述与第二类型的细胞共培养以提供第二类型的细胞可在其中生长、扩增或分化的环境的一种类型的细胞的术语,因为饲养细胞为支持第二细胞类型提供刺激、生长因子和营养。饲养细胞任选地来自与其支持的细胞不同的物种。例如,某些类型的人类细胞,包括干细胞,可以由小鼠胚胎成纤维细胞或永生化小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养物支持。在另一个示例中,外周血衍生细胞或转化的白血病细胞支持自然杀伤细胞的扩增和成熟。饲养细胞在与其它细胞共培养时,可以通常通过照射或用抗有丝分裂剂(例如丝裂霉素(mitomycin))处理来失活,以防止其生长超出其支持的细胞。饲养细胞可以包括内皮细胞、基质细胞(例如上皮细胞或成纤维细胞)和白血病细胞。不限于前述,一种特定的饲养细胞类型可以是人类饲养层,例如人类皮肤成纤维细胞。另一饲养细胞类型可以是小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。一般来说,多种饲养细胞可部分地用于维持多能性、朝向某一谱系的定向分化,增强增殖能力并且促进向特化细胞类型(例如效应细胞)的成熟。
如本文所用,“无饲养层”(FF)环境是指一种环境,例如培养条件、细胞培养物或培养基,其基本上不含饲养层或基质细胞,和/或尚未通过培育饲养细胞加以预调节。“预调节”培养基是指饲养细胞在培养基内已培育一段时间(诸如至少一天)之后所收集的培养基,并且因此包含多种介体物质,包括在培养基中培育的饲养细胞所分泌的生长因子和细胞因子。在一些实施方案中,无饲料环境不含饲养层或基质细胞,并且也不通过培育饲养细胞进行预调节。
如在iPSC和由其分化的衍生非多能细胞的基因组编辑或修饰或非多能细胞和由其重编程的衍生iPSC的基因组编辑或修饰的上下文中所用的“功能”是指(1)在基因层面—成功的敲入、敲除、降低基因表达、转基因或受控基因表达,诸如期望的细胞发育阶段处的诱导性或暂时表达,这通过直接的基因组编辑或修饰或通过“传递”,经由最初进行基因组工程改造的起始细胞的分化或重编程来实现;或者(2)在细胞层面—成功的去除、添加或改变细胞功能/特性,这经由以下实现:(i)在所述细胞中通过直接基因组编辑而获得的基因表达修饰,(ii)在所述细胞中通过“传递”,经由从最初进行基因组工程改造的起始细胞的分化或重编程而维持的基因表达修饰;(iii)在所述细胞中作为基因表达修饰的结果的下游基因调控,该基因表达修饰仅出现于所述细胞的较早发育阶段或仅出现于经由分化或重编程而产生所述细胞的起始细胞中;或者(iv)成熟细胞产物内所呈现的增强的或新获得的细胞功能或属性,该成熟细胞产物最初来源于在iPSC、祖细胞或去分化细胞来源处进行的基因组编辑或修饰。
“HLA缺乏”,包括HLA I类缺乏、HLA II类缺乏或两者,是指缺乏或不再维持包含HLA I类蛋白质异源二聚体和/或HLA II类异源二聚体的完整MHC复合体的表面表达或表面表达的水平降低,使得减弱或降低的水平低于被其他细胞天然可检测到的或被合成方法可检测到的水平。
如本文所用,“缺乏HLA的已修饰的iPSC”是指缺乏HLA的iPSC,其另外通过引入基因表达蛋白质而被修饰,该蛋白质与以下有关但不限于:改善的分化潜能、抗原靶向、抗原呈递、抗体识别、存留、免疫逃避、抑制抗性、增殖、共刺激、细胞因子刺激、细胞因子产生(自分泌或旁分泌)、趋化性和细胞毒性,例如非经典HLA I类蛋白质(例如HLA-E和HLA-G)、嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、CD16 Fc受体、BCL11b、NOTCH、RUNX1、IL15、4-1BB、DAP10、DAP12、CD24、CD3ζ、4-1BBL、CD47、CD113和PDL1。“缺乏HLA的已修饰的”细胞还包括除iPSC之外的细胞。
术语“配体”是指与靶分子形成复合体以通过与该靶上的位点结合产生信号的物质。配体可以是能够与靶标特异性结合的天然或人工物质。配体可以是蛋白质、肽、抗体、抗体复合体、缀合物、核酸、脂质、多糖、单糖、小分子、纳米颗粒、离子、神经递质或任何能够与靶特异性结合的其它分子实体的形式。与配体结合的靶可以是蛋白质、核酸、抗原、受体、蛋白质复合体或细胞。与靶结合并改变靶的功能从而触发应答的配体被称为“激动性”或“激动剂”。与靶标结合并阻断或减少信号传导反应的配体被称为“拮抗性”或“拮抗剂”。
术语“抗体”在本文中以最广义使用,并且通常是指含有与靶标特异性结合的至少一个结合位点的产生免疫应答的分子,其中该靶标可以是抗原或能够与某些抗体相互作用的受体。例如,NK细胞可通过抗体或抗体的Fc区与其Fc-γ受体(FcγR)的结合而被活化,从而触发ADCC(抗体依赖性细胞毒性)介导的效应细胞活化。与抗体结合的抗原或受体或靶的特定片段或部分通常被称为表位或抗原决定簇。术语“抗体”包括但不限于原生抗体及其变体、原生抗体及其变体的片段、肽体及其变体,以及模拟抗体或其特定片段或部分(包括单链抗体及其片段)的结构和/或功能的抗体模拟物。抗体可以是鼠抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼IgG、单可变新抗原受体(VNAR)、鲨鱼重链抗体(Ig-NAR)、嵌合抗体、重组抗体、单域抗体(dAb)、抗独特型抗体、双特异性抗体、多特异性抗体或多聚体抗体,或它们的抗体片段。抗独特型抗体对与另一种抗体的独特型结合具有特异性,其中该独特型是抗体的抗原决定簇。双特异性抗体可以是BiTE(双特异性T细胞衔接子)或BiKE(双特异性杀伤细胞衔接子),多特异性抗体可以是TriKE(三特异性杀伤细胞衔接子)。抗体片段的非限制性示例包括Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab')3、Fv、Fabc、pFc、Fd、单链可变区片段(scFv)、串联scFv(scFv)2、单链Fab(scFab)、二硫键稳定的Fv(dsFv)、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、单域抗原结合性片段(sdAb)、骆驼重链IgG和片段、只有重链的重组抗体(VHH)和维持抗体的结合特异性的其它抗体片段。
“Fc受体”(缩写为FcR)是基于其识别的抗体类型而分类。举例来说,结合最常见类别的抗体(IgG)的受体称为Fc-γ受体(FcγR),结合IgA的受体称为Fc-α受体(FcαR)并且结合IgE的受体称为Fc-ε受体(FcεR)。FcR的类别也通过表达其(巨噬细胞、粒细胞、自然杀伤细胞、T细胞和B细胞)的细胞和每种受体的信号传导特性来区分。Fc-γ受体(FcγR)包括若干成员:FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b),其因其分子结构不同而对其抗体具有不同亲和力。
“嵌合受体”是用于描述工程改造的、人工的或杂合的受体蛋白分子的通用术语,该受体蛋白分子被制备成包含源自至少两种不同蛋白的氨基酸序列的两个或更多个部分。嵌合受体蛋白已被工程改造成赋予细胞在激动剂配体与受体结合后启动信号转导和执行下游功能的能力。示例性“嵌合受体”包括但不限于嵌合抗原受体(CAR)、嵌合融合受体(CFR)、嵌合Fc受体(CFcR)以及两种或更多种受体的融合。
“嵌合Fc受体”缩写为CFcR,是用于描述其原生跨膜和/或胞内信号传导结构域被非原生跨膜和/或胞内信号传导结构域修饰或置换的工程改造的Fc受体的术语。在嵌合Fc受体的一些实施方案中,除非原生的跨膜和信号传导结构域中的一者或两者之外,可将一种或多种刺激结构域引入工程改造的Fc受体的胞内部分中以在触发受体后增强细胞激活、扩增和功能。不同于含有与靶抗原的抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR),嵌合Fc受体结合于Fc片段、或抗体的Fc区、或包含于衔接子或结合性分子中并且在使靶细胞接近或不接近附近的情况下激活细胞功能的Fc区。例如,可工程改造Fcγ受体以将所选跨膜、刺激和/或信号传导结构域包含在对在胞外结构域结合IgG有反应的胞内区域中,从而产生CFcR。在一个示例中,CFcR由工程改造的CD16、Fcγ受体通过置换其跨膜结构域和/或胞内结构域来产生。为了进一步提高基于CD16的CFcR的结合性亲和力,可合并CD64或CD16的高亲和力变体(例如F176V)的胞外结构域。在涉及高亲和力CD16胞外域的CFcR的一些实施方案中,位置197处包含丝氨酸的蛋白水解裂解位点被消除或置换,使得受体的胞外域不可裂解,即不经历脱落,从而获得基于hnCD16的CFcR。
FcγR受体CD16已鉴别为具有两种异构体:Fc受体FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb(CD16b)。CD16a是由NK细胞表达的跨膜蛋白,其结合附接到靶细胞的单体IgG以激活NK细胞和促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。如本文所用,“高亲和力CD16”、“不可裂解的CD16”或“不可裂解的高亲和力CD16(缩写为hnCD16)”是指天然或非天然的CD16变体。野生型CD16具有低亲和力并且经历胞外域脱落,这是一种蛋白分解裂解过程,其在NK细胞激活后调控白细胞上的多种细胞表面分子的细胞表面密度。F176V和F158V是具有高亲和力的示例性CD16多态变体。在接近膜的区域(位置189-212)中改变或消除裂解位点(位置195-198)的CD16变体不经历脱落。裂解位点和接近膜的区域详细地描述于WO2015/148926中,其完整公开内容以引用方式并入本文中。CD16 S197P变体是工程改造的CD16的不可裂解型式。包含F158V和S197P的CD16变体具有高亲和力,并且不可裂解。另一示例性高亲和力和不可裂解的CD16(hnCD16)变体是包含源自CD64胞外域的3个外显子中的一个或多个的胞外域的工程改造的CD16。
“T细胞受体”,缩写为“TCR”,通常是指在T细胞表面发现的蛋白复合体,并且负责识别与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的抗原肽的片段。TCR与抗原肽的结合启动了TCR-CD3胞内活化、大量信号传导分子的募集以及信号传导路径的分支和整合,从而导致对基因表达以及典型T细胞生长和功能获取重要的转录因子的动员。典型的TCR包含两条高度可变的蛋白链(α和β),其中每条链包含接近细胞膜的恒定区和与肽/MHC结合的可变区(即结合结构域)。
I.适用于具有增强特性的过继性细胞疗法的细胞和组合物
本文提供一种策略,其系统地工程改造克隆iPSC的调控回路,并且不影响分化效能以及iPSC和其衍生细胞的细胞发育生物学,同时增强从iPSC分化的衍生细胞的治疗特性。在iPSC水平上通过基因工程改造引入细胞中的选择性模式组合之后,iPSC衍生细胞在功能上得到改善,并且适于过继性细胞疗法。尚不清楚的是,包含一种或多种所提供的基因编辑的改变的iPSC是否仍具有介入细胞发育的能力和/或在保留修饰活性和/或特性的同时使功能分化细胞成熟和产生的能力。从iPSC定向细胞分化期间的意外失败归因于包括但不限于以下的方面:发育阶段特定的基因表达或缺乏基因表达、HLA复合体呈递的需求、所引入表面表达模式的蛋白质脱落和实现细胞中表型和/或功能变化的分化方案重配置的需要。本申请已展示,如本文所提供的一种或多种所选基因组修饰不会对iPSC分化效能产生负面影响,并且衍生自工程改造的iPSC的功能效应细胞具有增强的和/或获得的治疗特性,这可归因于在iPSC分化之后保留在效应细胞中的单独的或组合的基因组修饰。此外,如可在iPSC和iPSC衍生的效应细胞的上下文中描述的所有基因组修饰及其组合适用于原代来源的细胞,包括原代免疫细胞诸如T细胞、NK细胞或免疫调节细胞,无论是培养的还是扩增的,其修饰产生用于过继性细胞疗法的工程改造免疫细胞。
本文还提供了使用衍生自工程改造的iPSC的效应细胞在现成同种异体过继性细胞疗法环境中进行同种异体排斥控制的解决方案。据信必须在同种异体受体中匹配多种HLA I类和II类蛋白,以获得组织相容性,从而避免同种异体排斥反应问题。在没有MHC匹配的情况下,在同种异体过继细胞疗法中研究的一种方法是消除或基本上降低HLA I类和HLAII类蛋白的表达。HLA I类缺乏可通过使HLA I类基因座(染色体6p21)的任何区域发生功能缺失或破坏或者通过使HLA I类相关基因(包括但不限于β-2微球蛋白(B2M)基因、TAP1基因、TAP2基因和TAP相关蛋白)缺失或破坏或表达水平降低来实现。举例来说,B2M基因编码所有HLA I类异源二聚体的细胞表面表达所必要的共同亚单位。B2M阴性细胞是HLA-I缺乏的。HLA II类缺乏可以通过使HLA II相关基因(包括但不限于RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP)功能缺失或破坏或降低来实现。CIITA是转录共激活子,通过II类蛋白表达所需的转录因子RFX5的激活起作用。CIITA阴性细胞是HLA-II缺乏的。
然而,缺乏HLA I类表达增加了对NK细胞裂解的敏感性。此外,HLA-I和HLA-II两者的缺乏仍然不能防止由除同种异体过继细胞的MHC以外的同种异体抗原介导的同种异体排斥。此外,HLA-I依赖性NK细胞教育过程(诸如许可、布防或解除布防)被认为对针对同种异体细胞的先天免疫应答具有影响,这可能导致受体NK细胞针对同种异体供体细胞的反应性或部分反应性,即使当那些供体细胞是HLA-I足够的时。
本申请提供了通过消除或显著降低同种异体效应细胞中HLA I类和HLA II类蛋白中的一者或两者的表达并修饰这些细胞以用于CD38调节来进行同种异体排斥控制的策略。此外,本申请解决了在HLA-E、HLA-G或其他非经典HLA-I蛋白的外源性或增加的表达中存在的技术问题,目的是避免HLA-I缺乏的同种异体过继效应细胞的受体原代NK细胞裂解。发现由于识别HLA-E和HLA-G的抑制性受体在原代NK细胞中随机表达(即,它们不被所有原代NK细胞表达),所以HLA-E/G不向HLA-I缺乏的同种异体细胞提供对基于原代NK细胞的识别的完全保护,使得在HLA-E/G传达的针对NK细胞裂解的保护中存在渗漏。此外,在原代NK细胞上存在识别HLA-E(和可能的HLA-G)的对应活化受体,这可引起HLA-I缺乏和HLA-E/G表达过继性细胞的加速排斥。如本申请中所示,适用于/适合于CD38调节(例如,通过使用CD38拮抗剂诸如抗CD38抗体或CD38-CAR)的修饰的HLA-I缺乏的效应细胞更好地被保护以免于同种异体排斥,并且因此在过继性细胞疗法中具有更高的治疗价值。本文提供的同种异体排斥控制的策略避免了在HLA-I缺乏的同种异体效应细胞中增加或外源表达HLA-E/G的需要,以在过继性细胞疗法中改善和/或更完全地保护以免同种异体排斥。此外,本申请提供另外的基因组工程改造方面以实现效应细胞的增强的功能性,如本文所详述。
1.HLA-I缺乏和HLA-II缺乏
如上文所讨论的,必须在同种异体受体中匹配多种HLA I类和II类蛋白,以获得组织相容性,从而避免同种异体排斥反应问题。本文提供一种iPSC细胞系,其具有消除或实质上降低的HLA I类和HLA II类蛋白中的一者或两者的表达。HLA I类缺乏可通过使HLA I类基因座(染色体6p21)的任何区域发生功能缺失或通过使HLA I类相关基因(包括不限于β-2微球蛋白(B2M)基因、TAP1基因、TAP2基因和TAP相关蛋白)缺失、破坏或表达水平降低来实现。举例来说,B2M基因编码所有HLA I类异源二聚体的细胞表面表达所必要的共同亚单位。B2M阴性细胞是HLA-I缺乏的。HLA II类缺乏可以通过使HLA-II相关基因(包括不限于RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP)功能缺失、破坏或降低来实现。CIITA是转录共激活子,通过II类蛋白表达所需的转录因子RFX5的激活起作用。CIITA阴性细胞是HLA-II缺乏的。本文提供了例如通过B2M敲除和任选地CIITA敲除而缺乏HLA-I和任选地缺乏HLA-II的iPSC系和其衍生细胞,其中所得衍生效应细胞通过消除MHC(主要组织相容性复合体)匹配的需要实现同种异体细胞疗法,并且通过宿主(同种异体)T细胞避免识别和杀伤。
对于一些细胞类型,HLA I类表达的缺乏引起NK细胞的裂解。为解决该“自我缺失”反应,HLA-G或HLA-E可任选地敲入以避免NK细胞识别和杀伤衍生自工程改造iPSC的HLA-I缺乏的效应细胞。可替代地,敲除CD58(或LFA-3)和CD54(或ICAM-1)(它们是启动信号依赖性细胞相互作用并促进细胞(包括免疫细胞)迁移的粘附蛋白)中的一者或两者已经显示降低同种异体NK细胞活化。因此,在一个实施方案中,所提供的HLA-I缺乏的iPSC及其衍生细胞还包含HLA-G敲入。在一个实施方案中,所提供的HLA-I缺乏的iPSC及其衍生细胞还包含HLA-E敲入。然而,如本文所述,识别HLA-E和HLA-G的抑制性受体是随机表达的,即它们不被所有细胞表达,并且因此HLA-E/G的敲入不提供对基于原代NK细胞的识别的完全程保护。另外,存在可识别HLA-E(和可能的HLA-G)的对应活化受体,其可引起HLA-I缺乏的效应细胞的加速排斥。
因此,在一些实施方案中,本发明提供了一种策略,其通过生成HLA-I和/或HLA-II缺乏来减少或防止同种异体排斥而增强效应细胞存留和/或存活,而不会不利地影响iPSC的分化潜力和衍生的效应细胞(包括衍生的T和NK细胞)的功能。在一些实施方案中,在如本文所述的各种治疗剂存在下和/或暴露于各种治疗剂之后效应细胞在体内具有增加的存留和/或存活。如所提供的,策略包括生成包含B2M敲除的iPSC系,以及通过工程改造的iPSC系的定向分化获得包含B2M阴性(B2M-/-)的衍生效应细胞。
在一些实施方案中,在治疗剂存在下和/或暴露于治疗剂之后效应细胞在体内具有增加的存留和/或存活。因此,在一些实施方案中,iPSC及其衍生细胞是HLA-I缺乏的(例如,B2M阴性(B2M-/-))。在一些实施方案中,iPSC及其衍生细胞是HLA-I缺乏的和HLA-II缺乏的(例如,B2M-/-和CIITA阴性(CIITA-/-))。在一些实施方案中,包含B2M-/-的效应细胞是衍生自iPSC的NK细胞。在一些实施方案中,包含B2M-/-CIITA-/-的效应细胞是衍生自iPSC的NK细胞。在一些实施方案中,包含B2M-/-的效应细胞是衍生自iPSC的T细胞。在一些实施方案中,包含B2M-/-CIITA-/-的效应细胞是衍生自iPSC的T细胞。在一些实施方案中,iPSC及其衍生细胞包含如本文所述的一种或多种附加基因组编辑,包括但不限于CD38阴性、外源CD16或其变体、CAR表达、细胞因子/细胞因子受体表达以及附加模式,而不会不利地影响iPSC的分化潜力和衍生的效应细胞(包括衍生的T细胞和NK细胞)的功能。
2.CD38敲除
细胞表面分子CD38在多种血液恶性病中高度上调,该血液恶性病衍生自淋巴和骨髓谱系两者,包括多发性骨髓瘤和CD20阴性B细胞恶性肿瘤,其使用以使癌细胞耗竭的抗体治疗剂成为吸引人的靶标。抗体介导的癌细胞耗竭通常可归因于免疫效应机制(例如ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性))的直接细胞凋亡诱导和激活的组合。除ADCC之外,免疫效应机制与治疗抗体一起还可包括抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
除在恶性细胞上高效表达外,CD38也在浆细胞上以及NK细胞和激活的T细胞和B细胞上表达。在造血期间,CD38在CD34+干细胞和淋巴、红细胞系和骨髓的谱系专门化祖细胞上并且在一直持续到浆细胞阶段的成熟的最终阶段期间表达。作为II型跨膜糖蛋白,CD38既作为受体,又作为参与核苷酸代谢产物产生的多功能酶发挥细胞功能。作为酶,CD38催化从NAD+到ADP-核糖的反应的合成和水解,从而产生二级信使CADPR和NAADP,其刺激钙从内质网和溶酶体中释放,这对于过程是钙依赖性的细胞粘附过程至关重要。作为受体,CD38识别CD31并且调控激活的NK细胞中的细胞因子释放和细胞毒性。还报道了CD38与脂筏中的细胞表面蛋白缔合,从而调控细胞质Ca2+流量,并且介导淋巴细胞和骨髓细胞的信号转导。
在恶性肿瘤治疗中,全身性地使用CD38抗原结合受体转导的T细胞已展示裂解CD34+造血祖细胞、单核细胞、NK细胞、T细胞和B细胞的CD38+部分,导致因为受体免疫效应细胞功能受损而使得治疗反应不完全并且功效降低或消除。另外,在用达雷木单抗、CD38特异性抗体治疗的多发性骨髓瘤患者中,尽管其它免疫细胞类型(诸如T细胞和B细胞)不管其CD38表达如何都不受影响,但观测到骨髓和外周血两者中NK细胞减少(Casneuf等人,《血液研究进展(Blood Advances.)》2017;第1卷,第23期,第2105-2114页)。不受理论的限制,本申请提供了一种策略,其通过HLA缺乏和CD38调节减少对同种异体效应细胞的同种异体排斥,由此增加效应细胞存活和存留,从而利用CD38靶向癌症治疗的全部潜力。因此,本申请还提供了一种策略,其通过针对受体T细胞和B细胞的活化使用CD38拮抗剂(诸如抗CD38抗体或CD38-CAR(嵌合抗原受体))减少或防止同种异体排斥而增强效应细胞存留和/或存活,在一些实施方案中,该CD38拮抗剂可用作在过继细胞转移之前使用化学疗法(诸如Cy/Flu(环磷酰胺/氟达拉滨))的淋巴耗竭的替代物。在一些实施方案中,在本申请中还公开了当在存在抗CD38抗体或CD38抑制剂的情况下使用hnCD16a+/CD38-效应细胞靶向CD38+T和pbNK效应细胞时,CD38+同种异体反应性细胞的耗竭增加了NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,CD38的底物)可用性并且减少了NAD消耗相关的细胞死亡,除了其他优点之外,这增强了免疫抑制性肿瘤微环境中的效应细胞反应并且支持衰老、退化或炎性疾病中的细胞再生。
因此,如本文提供的策略还包括生成包含B2M-/-、CD38敲除和任选地CIITA-/-的iPSC系,生成包含单细胞分选和扩增的克隆iPSC的主细胞库,以及通过工程改造的iPSC系的定向分化获得包含B2M-/-CD38阴性(CD38-/-)的衍生效应细胞或包含B2M-/-CIITA-/-CD38-/-的衍生效应细胞,其中当将CD38靶向的治疗部分与效应细胞一起使用时,衍生效应细胞被保护以免自相残杀和同种异体排斥,以及其他优点,包括改善的代谢适应性、增加的对氧化应激的抗性和在效应细胞中诱导增强细胞活化和效应功能的蛋白表达程序。此外,抗CD38单克隆抗体疗法显著耗竭患者的激活免疫系统,而不会对患者的造血干细胞区室产生不利影响。CD38阴性衍生细胞具有抵抗CD38抗体介导的耗竭的能力,并且可在不使用毒性调理剂的情况下与抗CD38抗体或CD38-CAR有效地组合施用,并且因此减少和/或替代基于化疗的淋巴耗竭。在一个实施方案中,iPSC系中的CD38敲除是双等位基因敲除。
如本文所公开,包含B2M-/-CD38-/-以及任选地CIITA-/-的所提供的iPSC系能够定向分化以产生功能性衍生造血细胞,包括但不限于具有永久性生血内皮细胞(HE)潜能的中胚层细胞、永久性HE、CD34+造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多潜能祖细胞(MPP)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、骨髓细胞、嗜中性粒细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞。在一些实施方案中,当抗CD38抗体用于诱导ADCC或CD38-CAR用于靶细胞杀伤时,包含B2M-/-CD38-/-的iPSC和/或包含B2M-/-CIITA-/-CD38-/-的iPSC和/或其衍生效应细胞不被抗CD38抗体或CD38-CAR消除,从而在这类治疗部分存在下和/或暴露于这类治疗部分之后增加iPSC和其效应细胞存留和/或存活。在一些实施方案中,在这类治疗部分存在下和/或暴露于这类治疗部分之后效应细胞在体内具有增加的存留和/或存活。在一些实施方案中,衍生的效应细胞是衍生自iPSC的NK细胞。在一些实施方案中,包含B2M-/-CD38-/-的效应细胞是衍生自iPSC的T细胞。在一些实施方案中,包含B2M-/-CIITA-/-CD38-/-的效应细胞是衍生自iPSC的T细胞。在一些实施方案中,包含B2M-/-CD38-/-的iPSC和/或包含B2M-/-CIITA-/-CD38-/-的iPSC和/或其衍生细胞包含如本文所述的一种或多种附加基因组编辑,包括但不限于外源CD16表达、CAR表达、细胞因子/细胞因子受体表达以及附加模式。
3.CD16敲入
CD16已鉴别为两种异构体:Fc受体FcγRIIIa(CD16a;NM_000569.6)和FcγRIIIb(CD16b;NM_000570.4)。CD16a是由NK细胞表达的跨膜蛋白,其结合附接到靶细胞的单体IgG以激活NK细胞和促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。CD16b仅由人类嗜中性粒细胞表达。如本文所用,“高亲和力CD16”、“不可裂解的CD16”或“不可裂解的高亲和力CD16”是指各种CD16变体。野生型CD16具有低亲和力并且经历胞外域脱落,这是一种蛋白水解裂解过程,该过程在NK细胞活化后调控白细胞上的多种细胞表面分子的细胞表面密度。F176V(在一些公布中也被称为F158V)是具有高亲和力的示例性CD16多态性变体;而S197P变体是基因工程改造的CD16的不可裂解型式的示例。包含F176V和S197P两者的工程改造的CD16变体具有高亲和力,并且不可裂解,其更详细地描述于WO2015/148926中,其完整公开内容以引用方式并入本文中。另外,CD16的胞外域基本上被CD64胞外域的至少一部分置换的嵌合CD16受体还可实现能够进行ADCC的CD16受体所需的高亲和力和不可裂解特征。在一些实施方案中,嵌合CD16的置换胞外域包含以下中的一种或多种:CD64的EC1、EC2和EC3外显子(UniPRotKB_P12314或其异构体或多态变体)。
因此,引入细胞的外源CD16的各种实施方案包括功能性CD16变体及其嵌合受体。在一些实施方案中,功能性CD16变体是不可裂解的高亲和力CD16受体(hnCD16)。在一些实施方案中,hnCD16包含F176V和S197P两者;并且在一些实施方案中包含F176V,并且消除了裂解区域。在一些其他实施方案中,hnCD16包含与示例性序列SEQ ID NO:1、2和3中的任一者相比具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%或其间任何百分比的同一性的序列,这些示例性序列各自包含CD64胞外结构域的至少一部分。如本文和整个本申请中所用,考虑需要引入以对两个序列进行最佳比对的间隙数目和每个空隙的长度,两个序列之间的同一性百分比是序列共用的一致位置数目的函数(即,同一性%=一致位置数/位置总数×100)。序列的比较和两个序列之间一致性百分比的确定可以使用所属领域中公认的数学算法实现。
SEQ ID NO:1
MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPS YRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKF FHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGL QLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLQLPTPVWFHYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
(340个氨基酸基于CD64结构域的构造;CD16TM;CD16ICD)
SEQ ID NO:2MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWF LNGTATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYN VLYYRNGKAFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLS CETKLLLQRPGLQLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
(336个氨基酸基于CD64外显子的构造;CD16TM;CD16ICD)
SEQ ID NO:3
MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPS YRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKF FHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGL QLYFSFYMGSKTLRGRNSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
(335个氨基酸基于CD64外显子的构造;CD16TM;CD16ICD)
因此,本文提供克隆iPSC,其经过基因工程改造以在如本文所涵盖和描述的其它编辑中包含外源CD16(即,不可裂解的高亲和力CD16受体(hnCD16)),其中基因工程改造iPSC能够分化成包含引入iPSC中的hnCD16的效应细胞。在一些实施方案中,包含B2M-/-CD38-/-和外源CD16的衍生效应细胞是NK细胞。在一些实施方案中,包含B2M-/-CIITA-/-CD38-/-和外源CD16的衍生效应细胞是NK细胞。在一些实施方案中,包含B2M-/-CD38-/-和外源CD16的衍生效应细胞是T细胞。在一些实施方案中,包含B2M-/-CIITA-/-CD38-/-和外源CD16的衍生效应细胞是T细胞。在一些实施方案中,衍生的NK细胞预负载有抗体。在一些实施方案中,衍生的NK细胞与抗体一起用于组合疗法中。在一些实施方案中,组合疗法中或预负载有衍生的NK细胞的抗体特异性地靶向CD38。在一些实施方案中,组合疗法中或预负载有衍生的NK细胞的抗体特异性地靶向不同于CD38的抗原。在一些实施方案中,抗CD38抗体是达雷木单抗。
在iPSC或其衍生细胞中表达的外源性hnCD16在不仅结合于ADCC抗体或其片段,而且结合于识别所述hnCD16的CD16或CD64胞外结合性结构域的双特异性、三特异性或多特异性衔接子或结合子中具有高亲和力。双特异性、三特异性或多特异性衔接子或结合子进一步描述于本申请的下文中。因此,本申请提供衍生效应细胞或其细胞群,其通过与在衍生效应细胞上表达的hnCD16的胞外结构域的高亲和力结合,以对于治疗如以下进一步详述的病况、疾病或感染的治疗用途足够的量预负载有一种或多种预选ADCC抗体,其中所述hnCD16包含CD64或具有F176V和S197P的CD16的胞外结合性结构域。
在一些其他实施方案中,在iPSC或其衍生细胞中表达的外源CD16包含基于CD16或其变体的CFcR。通过修饰或置换原生CD16转膜域/或胞内域,产生包含非原生跨膜结构域、非原生刺激结构域和/或非原生信号传导结构域的嵌合Fc受体(CFcR)。本文所用的术语“非天然”意指除提供胞外结构域的受体外,跨膜结构域、刺激性结构域或信号传导结构域源自不同受体。在本文的说明中,基于CD16或其变体的CFcR不具有源自CD16的跨膜结构域、刺激性结构域或信号传导结构域。在一些实施方案中,基于外源CD16的CFcR包含衍生自以下的非原生跨膜结构域:CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或T细胞受体多肽。在一些实施方案中,基于外源CD16的CFcR包含衍生自以下的非原生刺激性/抑制域:CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4或NKG2D多肽。在一些实施方案中,基于外源CD16的CFcR包含衍生自以下的非原生信号传导结构域:CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(4-1BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C或NKG2D多肽。在基于CD16的CFcR的一些实施方案中,所提供的嵌合Fc受体包括两者均衍生自以下中的一者的跨膜结构域和信号传导结构域:IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C或NKG2D多肽。基于CD16的嵌合Fc受体的一个特定示例性实施方案包含NKG2D的跨膜结构域、2B4的刺激结构域和CD3ζ的信号传导结构域;其中CFcR的胞外结构域衍生自CD64或CD16的胞外结构域的全长或部分序列,并且其中CD16的胞外结构域包含F176V和S197P。基于CD16的嵌合Fc受体的另一个示例性实施方案包含CD3ζ的跨膜结构域和信号传导结构域;其中CFcR的胞外结构域衍生自CD64或CD16的胞外结构域的全长或部分序列,并且其中CD16的胞外结构域包含F176V和S197P。
如上所述的基于CD16的嵌合Fc受体的各种实施方案能够以高亲和力结合到抗体或其片段的Fc区;或者结合到双特异性、三特异性或多特异性衔接子或结合子。结合后,嵌合受体的刺激结构域和/或信号传导结构域实现效应细胞的激活和细胞因子分泌,并且杀死抗体或具有肿瘤抗原结合性组分以及Fc区的所述双特异性、三特异性或多特异性衔接子或结合子靶向的肿瘤细胞。在不受理论限制的情况下,通过非原生跨膜结构域、刺激结构域和/或信号传导结构域,或通过结合于基于CD16的嵌合Fc受体的胞外域的衔接子,CFcR可有助于效应细胞的杀伤能力,同时提高效应细胞的增殖和/或扩增潜能。抗体和衔接子可使表达抗原的肿瘤细胞和表达CFcR的效应细胞紧密接近,这也有助于增强肿瘤细胞的杀伤。双特异性、三特异性、多特异性衔接子或结合子的示例性肿瘤抗原包括但不限于B7H3、BCMA、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、PSMA、PAMA、P-钙粘素和ROR1。适于在攻击肿瘤细胞时接合表达基于CD16的CFcR的效应细胞的一些非限制性示例性双特异性、三特异性、多特异性衔接子或结合子包括CD16(或CD64)-CD30、CD16(或CD64)-BCMA、CD16(或CD64)-IL15-EPCAM和CD16(或CD64)-IL15-CD33。
不同于在NK细胞激活之后由细胞表面裂解的原代NK细胞表达的内源CD16,在衍生NK细胞中的CD16的以各种不可裂解型式避免CD16脱落并维持恒定表达。在衍生NK细胞中,不可裂解的CD16增加TNFα和CD107a的表达,表明细胞功能得到改善。不可裂解的CD16还增强了抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)以及双特异性、三特异性或多特异性衔接子的接合。ADCC是通过将CD16结合到抗体涂布的靶细胞的NK细胞介导的裂解的机制。在向需要细胞疗法的受试者施用细胞之前,衍生NK细胞中引入的hnCD16的另外高亲和力特性也允许通过hnCD16将ADCC抗体体外负载到NK细胞。如本文所提供的,在一些实施方案中,hnCD16可包含F176V和S197P,或者可包含源自CD64的全部或部分长度的胞外结构域,或者还可包含非原生跨膜结构域、刺激结构域和信号传导结构域中的至少一者。如所公开,本申请还提供了衍生NK细胞或其细胞群,其以足以用于治疗如本申请中进一步详述的病况、疾病或感染的治疗用途的量来预负载有一种或多种预选ADCC抗体。在一些实施方案中,预负载抗体是抗CD38抗体。在一个特定实施方案中,抗CD38抗体是达雷木单抗。
不同于原代NK细胞,来自原代来源(即,自然/原生来源,例如外周血、脐带血或其它供体组织)的成熟T细胞不表达CD16。出人意料的是,包含所表达的外源不可裂解的CD16的iPSC不损害T细胞发育生物学,并且能够分化成功能性衍生T谱系细胞,这些功能性衍生T谱系细胞不仅表达外源CD16,而且能够通过获得性ADCC机制执行功能。衍生T谱系细胞中的这种获得性ADCC可另外用作双重靶向和/或挽救伴随CAR-T细胞疗法常出现的抗原逃逸的方法,其中肿瘤随着靶向CAR-T的抗原表达或突变抗原表达减少或损失以避免被CAR(嵌合抗原受体)识别而复发。当所述衍生T谱系细胞通过外源CD16(包括功能性变体和基于CD16的CFcR)表达包含所获ADCC时,并且当抗体靶向与CAR靶向的抗原不同的肿瘤抗原时,抗体可用于挽救CAR-T抗原逃逸并且减少或防止CAR-T治疗中常见的靶向肿瘤的复发或再现。减少和/或防止抗原逃逸同时实现双靶向的这一策略同样适用于表达一种或多种CAR的NK细胞。以下进一步叙述可用于这一抗原逃逸减少和防止策略的各种CAR。
4.嵌合抗原受体(CAR)表达
适用于基因工程改造的iPSC和其衍生效应细胞的可以是所属领域中已知的任何CAR设计。CAR是融合蛋白,其通常包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域,该胞外结构域包含抗原识别结构域。在一些实施方案中,胞外域还可包括信号肽或前导序列和/或间隔子。在一些实施方案中,胞内域还可包含信号传导肽,其激活表达CAR的效应细胞。在一些实施方案中,胞内域还可包含信号传导结构域,其中信号传导结构域源自对T和/或NK细胞活化或发挥功能具有特异性的信号转导蛋白的细胞质结构域。在一些实施方案中,抗原识别结构域可特异性结合抗原。在一些实施方案中,抗原识别结构域可特异性结合与疾病或病原体相关的抗原。在一些实施方案中,疾病相关的抗原是肿瘤抗原,其中肿瘤可以是液体或实体瘤。在一些实施方案中,CAR适于激活表达所述CAR的T谱系细胞或NK谱系细胞。在一些实施方案中,CAR是对包含NK特异性信号传导组分具有特异性的NK细胞。在某些实施方案中,所述T细胞衍生自表达CAR的iPSC,并且衍生T谱系细胞可包含T辅助细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调控T细胞、自然杀伤T细胞、αβT细胞、γδT细胞或它们的组合。在某些实施方案中,所述NK细胞衍生自表达CAR的iPSC。
在某些实施方案中,所述抗原识别区/域包含鼠抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼Ig、单可变新抗原受体(VNAR)、鲨鱼重链抗体(Ig NAR)、嵌合抗体、重组抗体或它们的抗体片段。抗体片段的非限制性示例包括Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab')3、Fv、单链抗原结合性片段(scFv)、(scFv)2、二硫键稳定的Fv(dsFv)、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、单域抗原结合性片段(sdAb,纳米抗体)、只有重链的重组抗体(VHH)和维持全部抗体的结合特异性的其它抗体片段。在一些实施方案中,CAR的抗原识别区源自靶向肿瘤相关抗原(TAA)的T细胞受体(TCR)的结合结构域。
可由CAR靶向的抗原的非限制性示例包括ADGRE2、B7H3、碳酸酐酶IX(CAIX)、CCR1、CCR4、癌胚抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、巨细胞病毒(CMV)感染的细胞的抗原、上皮糖蛋白-2(EGP-2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、EGFRvIII、受体酪氨酸-蛋白激酶erb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB叶酸结合性蛋白(FBP)、胎儿型乙酰胆碱受体(AChR)、叶酸受体α、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、人表皮生长因子受体2(HER2)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、ICAM-1、整合素B7、白介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)、κ-轻链、激酶插入结构域受体(KDR)、Lewis A(CA19.9)、Lewis Y(LeY)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、LILRB2、黑色素瘤抗原家族A1(MAGE-A1)、MICA/B、MR1、粘蛋白1(Muc-1)、粘蛋白16(Muc-16)、间皮素(MSLN)、NKCSI、NKG2D配体、c-Met、NY-ESO-1、癌胚抗原(h5T4)、PDL1、PRAME、前列腺干细胞抗原(PSCA)、PRAME前列腺特异性膜抗原(PSMA)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、TIM-3、TRBC1、TRBC2、血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)、威尔姆斯肿瘤蛋白(WT-1)和所属领域中已知的各种病原体抗原。病原体的非限制性示例包括能够引起疾病的病毒、细菌、真菌、寄生虫和原虫。
因此,在一些实施方案中,遗传工程改造的iPSC及其衍生细胞包含编码CAR的外源多核苷酸,其中CAR包含CD19-CAR、BCMA-CAR、B7H3-CAR、MICA/B-CAR、HER2-CAR或MR1-CAR。
在一些实施方案中,CAR的跨膜结构域包含CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD16、CD27、CD28、CD28H、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA4、PD1、LAG3、2B4、BTLA、DNAM1、DAP10、DAP12、FcERIγ、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、CS1或T细胞受体多肽的原生或修饰的跨膜区的全长或至少一部分。
在一些实施方案中,胞内结构域(或胞内结构域)的信号传导肽包含2B4(自然杀伤细胞受体2B4)、4-1BB(肿瘤坏死因子受体超家族成员9)、CD16(IgG Fc区受体III-A)、CD2(T细胞表面抗原CD2)、CD28(T细胞特异性表面糖蛋白CD28)、CD28H(含跨膜和免疫球蛋白结构域的蛋白2)、CD3ζ(T细胞表面糖蛋白CD3ζ链)、CD3ζ1XX(CD3ζ变体)、DAP10(造血细胞信号传导器)、DAP12(TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白)、DNAM1(CD226抗原)、FcERIγ(高亲和性免疫球蛋白ε受体亚单位γ)、IL21R(白介素-21受体)、IL-2Rβ/IL-15RB(白介素-2受体亚单位β)、IL-2Rγ(细胞因子受体通用亚单位γ)、IL-7R(白介素-7受体亚单位α)、KIR2DS2(杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DS2)、NKG2D(NKG2-DII型整合膜蛋白)、NKp30(天然细胞毒性触发受体3)、NKp44(天然细胞毒性触发受体2)、NKp46(天然细胞毒性触发受体1)、CS1(SLAM家族成员7)和CD8(T细胞表面糖蛋白CD8α链)的肽的全长或至少一部分。
在一些实施方案中,CAR的胞内域还包含第二信号传导结构域和任选的第三信号传导结构域,其中第一信号传导结构域、第二信号传导结构域和第三信号传导结构域中的每一者不同。在特定实施方案中,第二信号传导结构域和/或第三信号传导结构域包含2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγIL21R、IL-2Rβ(IL-15Rβ)、IL-2Rγ、IL-7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD3ζ1XX、CS1或CD8的细胞质结构域或其部分。在某些实施方案中,胞内域还包含至少一个共刺激信号传导区。所述共刺激信号传导区可包含CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4或NKG2D或它们的任何组合的多肽的全长或至少一部分。
在一些实施方案中,适用于本文所提供的细胞的CAR包含衍生自CD28的共刺激结构域和包含原生或修饰的CD3ζ的ITAM1的信号传导结构域,该CD3ζ由与SEQ ID NO:4具有至少约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列表示。在另外的实施方案中,包含衍生自CD28的共刺激结构域和CD3ζ的原生或修饰的ITAM1的CAR还包含衍生自CD28的铰链结构域和跨膜结构域,其中scFv可通过该铰链连接至该跨膜结构域,并且CAR包含与SEQ ID NO:5具有至少约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR
(153个氨基酸CD28共刺激+CD3ζITAM)
SEQ ID NO:5
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR
(219个氨基酸CD28铰链+CD28 TM+CD28共刺激+CD3ζITAM)
在各种实施方案中,适用于本文所提供的细胞的CAR包含衍生自NKG2D的跨膜结构域、衍生自2B4的共刺激结构域和包含原生或修饰的CD3ζ的信号传导结构域,该CD3ζ由与SEQ ID NO:6具有至少约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列表示。包含衍生自NKG2D的跨膜结构域、衍生自2B4的共刺激结构域和包含原生或修饰的CD3ζ的信号传导结构域的所述CAR还可包含CD8铰链,其中此类结构的氨基酸序列与SEQ ID NO:7具有至少约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性。
SEQ ID NO:6
SNLFVASWIAVMIIFRIGMAVAIFCCFFFPSWRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
(263个氨基酸的NKG2D TM+2B4+CD3ζ)
SEQ ID NO:7
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDSNLFVASWIAVMIIFRIGMAVAIF CCFFFPSWRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
(308个氨基酸的CD8铰链+NKG2D TM+2B4+CD3ζ)
非限制性CAR策略还包括:异源二聚体,其通过使一对胞内域二聚化而有条件地激活CAR(参见例如,美国专利号9,587,020);分离CAR,其中使抗原结合结构域、铰链结构域和胞内结构域进行同源重组以生成CAR(参见例如,美国公布号2017/0183407);多链CAR,其允许分别连接至抗原结合结构域和信号传导结构域的两个跨膜结构域之间的非共价连接(参见例如,美国公布号2014/0134142);CAR,其具有双特异性抗原结合结构域(参见例如,美国专利号9,447,194),或具有识别相同或不同抗原或表位的一对抗原结合结构域(参见例如,美国专利号8,409,577),或串联CAR(参见例如,Hegde等人,J Clin Invest.2016;第126卷,第8期,第3036-3052页);诱导性CAR(参见例如,美国公布号2016/0046700、2016/0058857、2017/0166877);可切换的CAR(参见例如,美国公布号2014/0219975);以及所属领域中已知的任何其它设计。
因此,本发明的各方面提供了由基因组工程改造的iPSC分化获得的衍生细胞,其中iPSC和衍生细胞两者都包含一种或多种CAR以及另外的经修饰模式,如表1中提供的。在一些实施方案中,包含B2M-/-CD38-/-CAR的效应细胞是衍生自iPSC的NK细胞。在一些实施方案中,包含B2M-/-CIITA-/-CD38-/-CAR的效应细胞是衍生自iPSC的NK细胞。在一些实施方案中,包含B2M-/-CD38-/-CAR的效应细胞是衍生自iPSC的T细胞。在一些实施方案中,包含B2M-/-CIITA-/-CD38-/-CAR的效应细胞是衍生自iPSC的T细胞。在一些实施方案中,iPSC及其衍生细胞包含如本文所述的一种或多种附加基因组编辑,包括但不限于外源CD16表达和/或细胞因子/细胞因子受体表达以及附加模式,而不会不利地影响iPSC的分化潜力和衍生的效应细胞(包括衍生的T细胞和NK细胞)的功能。
5.外源引入的细胞因子信号传导复合体
通过避免全身性高剂量施用临床上相关细胞因子,由于这类实践的剂量限制性毒性的风险降低,同时建立细胞因子介导的细胞自主性。为了实现淋巴细胞自主性而不需要另外施用可溶性细胞因子,将包含IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21和/或它们的相应受体中的一者或多者的部分或全部肽的细胞因子信号传导复合体引入细胞中以在有或无表达细胞因子本身的情况下允许细胞因子信号传导,从而维持或改善细胞生长、增殖、扩增和/或效应功能,并且降低细胞因子毒性的风险。在一些实施方案中,在细胞表面上表达用于细胞因子信号传导(信号传导复合体)的所引入细胞因子和/或其相应原生或修饰的受体。在一些实施方案中,组成性地激活细胞因子信号传导。在一些实施方案中,细胞因子信号传导的激活是可诱导的。在一些实施方案中,细胞因子信号传导的激活是瞬时的和/或暂时的。
本文提供了用于将用于细胞因子信号传导的细胞因子信号传导复合体引入细胞的各种构建体设计,该细胞因子包括但不限于IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18和IL21。在其中细胞因子信号传导复合体用于IL15的实施方案中,跨膜(TM)结构域对于IL15受体可以是原生的,或者可被任何其他膜结合的蛋白的跨膜结构域修饰或置换。在一些实施方案中,IL15和IL15Rα通过使用自裂解肽共表达,模拟IL15的反式呈递而不消除IL15的顺式呈递。在其它实施方案中,IL15Rα通过接头在C末端与IL15融合,模拟反式呈递而不消除IL15的顺式呈递并且确保IL15膜结合。在其它实施方案中,具有截短胞内结构域的IL15Rα在C末端通过接头与IL15融合,模拟反式呈递IL15,维持IL15膜结合,并且通过另外消除由正常IL15R通过其胞内结构域介导的顺式呈递和/或任何其它潜在信号转导途径。
这种截短构建体包含与SEQ ID NO:8具有至少75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列。在截短IL15/IL15Rα的一个实施方案中,构建体不包含SEQ ID NO:8的最后4个氨基酸残基(KSRQ),并且包含与SEQ ID NO:9具有至少75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8
MDWTWILFLVAAATRVHSGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQ
(379个氨基酸;信号传导和接头肽带下划线)
SEQ ID NO:9MDWTWILFLVAAATRVHSGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYL
(375个氨基酸;信号传导和接头肽带下划线)
在其它实施方案中,可省略IL15Rα的胞质域,而不会负面影响装备有IL15的效应细胞的自主特征。在其它实施方案中,除寿司结构域以外基本上去除了整个IL15Rα,其在一端与IL15融合,并且在另一端(mb-寿司)与跨膜结构域融合,任选地利用寿司结构域与跨膜结构域之间的接头。融合IL15/mb-寿司通过任何膜结合的蛋白的跨膜结构域在细胞表面上表达。因此,在只保留所期望的IL15的反式呈递时,消除通过IL15Rα的不必要的信号传导,包括顺式呈递。在一些实施方案中,包含与寿司结构域融合的IL15的组分包含与SEQ IDNO:10具有至少75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10
MDWTWILFLVAAATRVHSGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
(242个氨基酸信号传导和接头肽带下划线)
在细胞因子信号传导复合体的其他实施方案中,原生或修饰的IL15Rβ通过接头在C末端与IL15融合,实现组成性信号传导并且维持IL15膜结合和反式重呈递。在其它实施方案中,原生或修饰的共同受体γC通过接头在C末端与IL15融合以用于细胞因子的组成性信号传导和膜结合的反式呈递。共同受体γC也被称为共同γ链或CD132,也称为IL2受体亚基γ或IL2RG。γC是细胞因子受体亚基,其与受体复合体共用以用于许多白介素受体,包括但不限于IL2、IL4、IL7、IL9、IL15和IL21受体。在其它实施方案中,在缺乏IL15的情况下形成同源二聚体的工程改造的IL15Rβ适用于产生细胞因子的组成性信号传导。
所属领域的普通技术人员将理解,上述信号肽和接头序列是说明性的,并且绝不限制适用作信号肽或接头的其变体。存在许多所属领域已知和可用的合适信号肽或接头序列,并且所属领域的技术人员理解,信号肽和/或接头序列可以取代另一序列而不改变由信号肽引导或由接头连接的功能肽的活性。
在包含CAR和包含细胞因子和/或细胞因子受体信号传导(“IL”)的外源信号传导复合体两者的iPSC和其衍生细胞中,CAR和IL可在单独构建体中表达,或可在包含CAR和IL两者的双顺反子构建体中共表达。在一些实施方案中,iPSC及其衍生效应细胞包含一种基因型,该基因型包含一种或多种属性,包括B2M-/-、CIITA-/-、CD38-/-、CD16+、CAR+和IL+,该基因型还可包含表1中的附加属性中的任一种附加属性。
在一些实施方案中,包含B2M-/-CD38-/-IL+的效应细胞是衍生自iPSC的NK细胞。在一些实施方案中,包含B2M-/-CIITA-/-CD38-/-IL+的效应细胞是衍生自iPSC的NK细胞。在一些实施方案中,包含B2M-/-CD38-/-IL+的效应细胞是衍生自iPSC的T细胞。在一些实施方案中,包含B2M-/-CIITA-/-CD38-/-IL+的效应细胞是衍生自iPSC的T细胞。在一些实施方案中,iPSC及其衍生细胞包含如本文所述的一种或多种附加基因组编辑,而不会不利地影响iPSC的分化潜力和衍生的效应细胞(包括衍生的T细胞和NK细胞)的功能。
因此,在各种实施方案中,细胞因子IL15和/或其受体可使用上述构建体设计中的一种或多种构建体设计引入iPSC,并且在iPSC分化后引入其衍生细胞。除了诱导多能细胞(iPSC)之外,还提供了包含至少一种如本文所公开的工程改造模式的克隆iPSC、克隆iPS细胞系或iPSC衍生细胞。还提供了主细胞库,其包含具有至少如本章节所述的包含细胞因子和/或细胞因子受体信号传导的外源引入的信号传导复合体的单细胞分选和扩增的克隆工程改造的iPSC,其中该细胞库提供用于附加iPSC工程改造的平台和用于制造现成的、工程改造的、同质的细胞疗法产品的可再生来源,这些细胞疗法产品在组成上是明确定义的和均一的,并且可以成本有效的方式大规模生产。
6.衔接子
衔接子是由不同抗体或其片段的两个或更多个单链可变片段(scFv)或其他功能变体组成的融合蛋白,其中至少一个scFv结合于效应细胞表面分子或表面触发受体,并且至少另一者经由靶细胞特异性表面分子结合于靶细胞。衔接子的示例包括但不限于双特异性T细胞衔接子(BiTE)、双特异性杀伤细胞衔接子(BiKE)、三特异性杀伤细胞衔接子(TriKE)、多特异性杀伤细胞衔接子,或与多种免疫细胞类型相容的通用衔接子。衔接子可以是双特异性或多特异性的。此类双特异性或多特异性衔接子能够将效应细胞(例如,T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞和/或嗜中性粒细胞)引导至肿瘤细胞并激活免疫效应细胞,并且已经显示出使CAR-T细胞疗法的益处最大化的巨大潜力。
在一些实施方案中,衔接子通过同时或连续施用与本文所述的效应细胞群体组合使用,其中效应细胞包含被衔接子识别的表面分子或表面触发受体。在一些其他实施方案中,衔接子是由衍生效应细胞通过如本文所述的基因工程改造iPSC和经工程改造的iPSC的定向分化表达的双特异性抗体。可用于双特异性或多特异性衔接子识别或其偶联的示例性效应细胞表面分子或表面触发受体包括但不限于CD3、CD28、CD5、CD16、NKG2D、CD64、CD32、CD89、NKG2C和如本文所公开的嵌合Fc受体。在一些实施方案中,在衍生效应细胞的表面上表达以用于衔接子识别的外源CD16是hnCD16,其包含如本文所述的CD16(含有F176V和任选的S197P)或CD64胞外结构域以及原生或非原生跨膜结构域、刺激结构域和/或信号传导结构域。在一些实施方案中,在效应细胞的表面上表达以用于衔接子识别的CD16是基于CD16的嵌合Fc受体(CFcR)。在一些实施方案中,基于CD16的CFcR包含NKG2D的跨膜结构域、2B4的刺激结构域和CD3ζ的信号传导结构域;其中CD16的胞外结构域衍生自CD64或CD16胞外结构域的全长或部分序列;其中CD16的胞外域包含F176V和任选S197P。
在一些实施方案中,衔接子的靶细胞是肿瘤细胞。用于双特异性或多特异性衔接子识别的示例性肿瘤细胞表面分子包括但不限于B7H3、BCMA、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、PSMA、PAMA、P-钙粘素、ROR1。在一个实施方案中,双特异性衔接子是对CD3和CD19(CD3-CD19)有特异性的双特异性抗体。在另一个实施方案中,双特异性抗体是CD16-CD30或CD64-CD30。在另一个实施方案中,双特异性抗体是CD16-BCMA或CD64-BCMA。在再另一个实施方案中,双特异性抗体是CD3-CD33。
在又一个实施方案中,双特异性抗体还包含在效应细胞和肿瘤细胞抗原结合域之间的接头。例如,修饰的IL15可用作效应NK细胞的接头以促进细胞扩增(在一些出版物中称为TriKE或三特异性杀伤衔接子)。在一个实施方案中,TriKE是CD16-IL15-EPCAM或CD64-IL15-EPCAM。在另一个实施方案中,TriKE是CD16-IL15-CD33或CD64-IL15-CD33。在又另一个实施方案中,TriKE是NKG2C-IL15-CD33。TriKE中的IL15也可源自其它细胞因子,包括但不限于IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL18和IL21。
在一些实施方案中,用于双特异性或多特异性衔接子的表面触发受体对于效应细胞可以是内源的,有时视细胞类型而定。在一些其他实施方案中,可使用本文所提供的方法和组合物将一种或多种外源表面触发受体引入效应细胞中,例如通过包含表1中所列的基因型的iPSC的附加工程改造,然后将iPSC的分化引向T细胞、NK细胞或任何其他效应细胞,其包含相同基因型和表面触发受体作为源iPSC。
7.用于免疫疗法的抗体
在一些实施方案中,除如本文所提供的基因组工程改造的效应细胞之外,包含靶向与病况、疾病或适应症相关的抗原的抗体或抗体片段的另外治疗剂可在组合疗法中与这些效应细胞一起使用。在一些实施方案中,抗体通过同时或连续施用于受试者而与本文所述的效应细胞群体组合使用。在其他实施方案中,此类抗体或其片段可通过使用编码所述抗体或其片段的外源多核苷酸序列基因工程改造iPSC并且引导工程改造的iPSC的分化而由效应细胞表达。在一些实施方案中,效应细胞表达外源CD16变体,其中效应细胞的细胞毒性经由ADCC被抗体增强。在一些实施方案中,抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中,抗体是人源化抗体、人源化单克隆抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中,抗体或抗体片段特异性结合于病毒抗原。在其它实施方案中,抗体或抗体片段特异性结合于肿瘤抗原。在一些实施方案中,肿瘤或病毒特异性抗原激活所施用的iPSC衍生效应细胞以增强其杀伤能力。在一些实施方案中,适用于作为另外治疗剂与所施用的iPSC衍生效应细胞的组合疗法的抗体包括但不限于抗CD20(利妥昔单抗、维妥珠单抗、奥法木单抗、乌布里图昔单抗、奥卡拉珠单抗、奥比珠单抗)、抗HER2(曲妥珠单抗、帕妥珠单抗)、抗CD52(阿仑单抗)、抗EGFR(西妥昔单抗)、抗GD2(迪努妥昔单抗)、抗PDL1(阿维鲁单抗)、抗CD38(达雷木单抗、艾沙妥昔单抗、MOR202)、抗CD123(7G3、CSL362)、抗SLAMF7(埃罗妥珠单抗);以及它们的人源化或Fc修饰的变体或片段,或它们的功能等效物和生物类似物。
在一些实施方案中,iPSC衍生效应细胞包含造血谱系细胞,其包含表1中所列的基因型。在一些实施方案中,iPSC衍生效应细胞包含NK细胞,其包含表1中所列的基因型。在一些实施方案中,iPSC衍生效应细胞包含T细胞,其包含表1中所列的基因型。在可用于治疗液体或实体肿瘤的组合的一些实施方案中,该组合包含至少包含CD38阴性和B2M阴性的iPSC衍生的NK细胞或T细胞。在一个实施方案中,该组合包含iPSC衍生的NK细胞,其包含CD38阴性、B2M阴性和外源CD16;以及抗CD38抗体、达雷木单抗、伊沙妥昔单抗和MOR202中的一者。在一个实施方案中,该组合包含iPSC衍生的NK细胞,其包含B2M阴性、CD38阴性、外源CD16和达雷木单抗。在一些另外的实施方案中,包含在与达雷木单抗的组合中的iPSC衍生的NK细胞包含B2M阴性、CD38阴性、外源CD16、IL15,以及任选地,CIITA阴性和CAR中的一者或多者;其中IL15与CAR共同或分开表达;并且IL15是本文所述的形式中的任一种形式。在一些特定实施方案中,IL15与CAR共同或分开表达。
8.检查点抑制剂
检查点是细胞分子,通常是细胞表面分子,能够在未被抑制时抑制或下调免疫反应。现在清楚的是,肿瘤选择某些免疫检查点途径作为免疫抗性的主要机制,尤其是针对对肿瘤抗原具有特异性的T细胞。检查点抑制剂(CI)是能够减少检查点基因表达或基因产物,或降低检查点分子的活性,从而阻断抑制性检查点,并且恢复免疫系统功能的拮抗剂。检查点抑制剂靶向PD1/PDL1或CTLA4的发展转变了肿瘤学前景,这些试剂提供多种适应症的长期缓解。但是,许多肿瘤亚型对检查点阻断疗法具有抗性,并且复发仍然是一个大问题。本申请的一个方面提供了一种通过包括如本文中在与CI的组合疗法中所提供的基因组工程改造的功能性衍生细胞来克服CI抗性的治疗方法。在一些实施方案中,检查点抑制剂通过同时或连续将本文所述的效应细胞群体施用于受试者而与该效应细胞群体组合使用。在一些其他实施方案中,检查点抑制剂通过使用编码所述检查点抑制剂或其片段或变体的外源多核苷酸序列基因工程改造iPSC并且引导工程改造的iPSC的分化而由效应细胞表达。与本文所述的效应细胞的组合疗法的一些实施方案包含至少一种检查点抑制剂以靶向至少一种检查点分子;其中衍生细胞具有表1中所列的基因型。
在一些实施方案中,编码检查点抑制剂或其片段的外源多核苷酸序列与CAR在单独的构建体中或在双顺反子构建体中共表达。在一些另外实施方案中,编码检查点抑制剂或其片段的序列可通过自裂解2A编码序列连接到CAR表达构建体的5'端或3'端,该自裂解2A编码序列示出为例如CAR-2A-CI或CI-2A-CAR。因此,检查点抑制剂和CAR的编码序列在单一开放阅读框(ORF)中。当通过能够浸润肿瘤微环境(TME)的衍生效应细胞将检查点抑制剂递送、表达和分泌为有效负载时,其在接合TME后抵消抑制性检查点分子,允许通过例如CAR或激活受体的激活模式激活效应细胞。在组合疗法的一个实施方案中,衍生效应细胞是NK谱系细胞。在组合疗法的另一个实施方案中,衍生效应细胞是T谱系细胞。
适用于与本文所提供的衍生效应细胞的组合疗法的检查点抑制剂包括但不限于PD-1(Pdcdl、CD279)、PDL-1(CD274)、TIM-3(Havcr2)、TIGIT(WUCAM和Vstm3)、LAG-3(Lag3、CD223)、CTLA-4(Ctla4、CD152)、2B4(CD244)、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、A2AR、BATE、BTLA、CD39(Entpdl)、CD47、CD73(NT5E)、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、视黄酸受体α(Rara)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E和抑制性KIR(例如2DL1、2DL2、2DL3、3DL1和3DL2)的拮抗剂。
在一些实施方案中,抑制以上检查点分子中的任一种的拮抗剂是抗体。在一些实施方案中,检查点抑制性抗体可以是鼠类抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼Ig、单可变新抗原受体(VNAR)、鲨鱼重链抗体(Ig NAR)、嵌合抗体、重组抗体或它们的抗体片段。抗体片段的非限制性示例包括Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab')3、Fv、单链抗原结合性片段(scFv)、(scFv)2、二硫键稳定的Fv(dsFv)、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、单域抗原结合性片段(sdAb,纳米抗体)、只有重链的重组抗体(VHH)和维持全部抗体的结合特异性的其它抗体片段,其比起全部抗体可以更有成本效益地产生、更易于使用或更敏感。在一些实施方案中,检查点抑制剂包含以下中的至少一种:阿特珠单抗(抗PDL1 mAb)、阿维鲁单抗(抗PDL1mAb)、度伐单抗(抗PDL1 mAb)、曲美木单抗(tremelimumab)(抗CTLA4 mAb)、伊匹单抗(抗CTLA4 mAb)、IPH4102(抗KIR)、IPH43(抗MICA)、IPH33(抗TLR3)、利瑞木单抗(抗KIR)、莫纳利珠单抗(抗NKG2A)、纳武单抗(抗PD1 mAb)、帕博利珠单抗(抗PD1mAb)和它们的任何衍生物、功能等效物或生物类似物。
在一些实施方案中,抑制以上检查点分子中的任一种的拮抗剂是基于微RNA的,因为发现许多miRNA作为控制免疫检查点的表达的调控因子(Dragomir等人,《癌症生物医学(Cancer Biol Med.)》,2018年,第15卷,第2期,第103-115页)。在一些实施方案中,检查点拮抗性miRNA包括但不限于miR-28、miR-15/16、miR-138、miR-342、miR-20b、miR-21、miR-130b、miR-34a、miR-197、miR-200c、miR-200、miR-17-5p、miR-570、miR-424、miR-155、miR-574-3p、miR-513和miR-29c。
在一些实施方案中,检查点抑制剂与CAR共表达并且抑制以下检查点分子中的至少一者:PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2AR、BATE、BTLA、CD39(Entpdl)、CD47、CD73(NT5E)、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、视黄酸受体α(Rara)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E和抑制性KIR。在一些实施方案中,在具有表1中所列的基因型的衍生细胞中与CAR共表达的检查点抑制剂选自包含以下的组:阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、曲美木单抗、伊匹单抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗和它们的人源化或Fc修饰的变体、片段和它们的功能等效物或生物类似物。在一些实施方案中,与CAR共表达的检查点抑制剂是阿特珠单抗或其人源化或Fc修饰的变体、片段或它们的功能等效物或生物类似物。在一些其它实施方案中,与CAR共表达的检查点抑制剂是纳武单抗或其人源化或Fc修饰的变体、片段或它们的功能等效物或生物类似物。在一些其它实施方案中,与CAR共表达的检查点抑制剂是帕博利珠单抗或其人源化或Fc修饰的变体、片段或它们的功能等效物或生物类似物。
在包含本文所提供的衍生效应细胞和至少一种抑制检查点分子的抗体的组合疗法的一些其他实施方案中,所述抗体不由衍生细胞或在衍生细胞中产生,并且在施用如本文所提供的衍生细胞之前、同时或之后另外施用。在一些实施方案中,在与所提供的衍生NK谱系细胞或T谱系细胞的组合疗法中施用一种、两种、三种或更多种检查点抑制剂是同时或依序的。在组合治疗的一个实施方案中,治疗中包括的检查点抑制剂是阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、曲美木单抗、伊匹单抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗和它们的人源化或Fc修饰的变体、片段和它们的功能等效物或生物类似物中的一者或多者。在组合治疗的一些实施方案中,治疗中包括的检查点抑制剂是阿特珠单抗或其人源化或Fc修饰的变体、片段和其功能等效物或生物类似物。在组合治疗的一些实施方案中,治疗中包括的检查点抑制剂是纳武单抗或其人源化或Fc修饰的变体、片段或其功能等效物或生物类似物。在组合治疗的一些实施方案中,治疗中包括的检查点抑制剂是帕博利珠单抗或其人源化或Fc修饰的变体、片段和其功能等效物或生物类似物。
9.本文提供的基因工程改造的iPSC系和衍生细胞
根据上述内容,本申请提供了包含B2M-/-CD38-/-和任选地CIITA-/-、编码外源CD16的外源多核苷酸、编码细胞因子信号传导复合体(IL)的外源多核苷酸、编码CAR的外源多核苷酸、编码抗体的外源多核苷酸以及如表1中所示的附加模式中的一者或多者的iPSC、iPS细胞系细胞、或其衍生细胞,其中衍生细胞是从工程改造的iPSC的分化获得的功能效应细胞,该iPSC包含B2M-/-、CD38-/-(任选地CIITA-/-)、编码外源CD16、IL、CAR、抗体中的一者或多者的外源多核苷酸以及如表1中所示的任何其他模式。在一些实施方案中,衍生细胞是造血谱系细胞,包括但不限于具有永久性生血内皮细胞(HE)潜能的中胚层细胞、永久性HE、CD34造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多能祖细胞(MPP)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、骨髓细胞、嗜中性粒细胞祖细胞、T谱系细胞、NKT谱系细胞、NK谱系细胞、B谱系细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞。在一些实施方案中,功能性衍生造血细胞包括效应细胞,该效应细胞具有一种或多种功能特征,该一种或多种功能特征不存在于对应的原代T细胞、NK细胞、NKT细胞和/或B细胞中。
在一些实施方案中,衍生细胞包含NK谱系细胞或T谱系细胞。包含B2M-/-、CD38-/-、和任选地CIITA-/-以及细胞因子信号传导复合体(IL)、外源CD16和CAR中的一者或多者的iPSC衍生NK谱系细胞或T谱系细胞适用于通过组合抗体与CAR靶向治疗克服或减少与只有CAR-T的疗法中观察到的肿瘤抗原逃逸相关的肿瘤复发,其限制条件为抗体和CAR对肿瘤的不同抗原具有特异性。表达hnCD16的衍生CAR-T细胞已获得ADCC,除了CAR靶向外,还为肿瘤杀伤提供额外机制。在一些实施方案中,衍生细胞包含NK谱系细胞。包含B2M-/-、CD38-/-、和任选地CIITA-/-以及细胞因子信号传导复合体(IL)、外源CD16和CAR中的一者或多者的iPSC衍生NK细胞具有增强的细胞毒性,在募集包括T细胞的旁观者细胞以浸润和杀死肿瘤细胞中有效。
在一些实施方案中,当抗CD38抗体用于诱导CD16介导的增强的ADCC时,iPSC和/或其衍生效应细胞可靶向CD38表达(肿瘤)细胞而不会引起效应细胞消除,即,表达CD38的效应细胞的减少或耗竭,从而增加iPSC和其效应细胞的存留和/或存活。在一些实施方案中,在可以是抗CD38抗体的抗CD38治疗剂存在下效应细胞在体内具有增加的存留和/或存活。在一些实施方案中,抗CD38抗体是达雷木单抗、伊沙妥昔单抗或MOR202。此外,由于CD38在活化淋巴效应细胞诸如T细胞或B细胞上被上调,因此可将CD38特异性抗体用于淋巴耗竭,从而消除那些活化淋巴细胞,克服同种异体排斥,增加CD38阴性效应细胞的存活和存留,而在同种异体效应细胞疗法的受体中没有自相残杀。
在一些实施方案中,效应细胞包括T谱系细胞。包含B2M阴性和CD38阴性的iPSC衍生T谱系细胞在抗CD38抗体的存在下经历减少的细胞耗竭;获取了ADCC,从而为T细胞介导的肿瘤杀伤提供附加机制。在一些实施方案中,效应细胞包含NK谱系细胞。包含B2M阴性和CD38阴性的iPSC衍生NK谱系细胞在抗CD38抗体存在下具有增强的细胞毒性并且具有减少的NK细胞自相残杀。
本文提供了包含B2M敲除、CD38敲除和任选地CIITA敲除的iPSC,其中iPSC能够定向分化以产生功能性衍生效应细胞。在包含衍生自工程改造的iPSC的B2M阴性/CD38阴性的效应细胞的一些实施方案中,细胞在HLA-II中是完整的,并且仍然经受活化的受体T细胞、B细胞和NK细胞的同种异体排斥。在一些实施方案中,包含B2M敲除和CD38敲除的iPSC及其衍生效应细胞还包含CIITA敲除。在一些实施方案中,包含B2M敲除(和任选地CIITA敲除)和CD38敲除的iPSC及其衍生效应细胞包含CAR,其中CAR可以或可以不靶向CD38。在一些实施方案中,包含B2M阴性、CD38阴性和任选地CIITA阴性的表达CAR的衍生效应细胞还包含外源CD16,并且可以与抗CD38抗体一起使用以诱导ADCC而不引起效应细胞消除,从而增加iPSC及其效应细胞的存留和/或存活。在一些实施方案中,效应细胞在组合治疗中在体内具有增加的存留和/或存活。
另外提供包含B2M敲除、CD38敲除和任选地:CIITA敲除、CAR中的一者或多者的iPSC以及编码至少一种外源细胞因子信号传导复合体(IL)的多核苷酸以实现促进细胞存活、存留和/或扩增的细胞因子信号传导,其中iPSC系能够造血分化以产生具有改善的存活、存留、扩增和效应功能的功能性衍生效应细胞。外源引入的细胞因子信号传导复合体包含IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18和IL21中的任一者、两者或更多者的信号传导。在一些实施方案中,用于细胞因子信号传导的细胞因子和/或其相应受体的所引入部分或全部肽在细胞表面上表达。在一些实施方案中,组成性地激活细胞因子信号传导。在一些实施方案中,细胞因子信号传导的激活是可诱导的。在一些实施方案中,细胞因子信号传导的激活是瞬时的和/或暂时的。在一些实施方案中,细胞表面细胞因子/细胞因子受体的瞬时/暂时表达是通过逆转录病毒、仙台病毒、腺病毒、游离基因体、小环或包括mRNA的RNA。在一些实施方案中,包含在包含B2M-/-CD38-/-(和任选地CIITA-/-)IL的iPSC或其衍生细胞中的外源细胞表面细胞因子和/或受体实现IL7信号传导。在一些实施方案中,包含在包含B2M-/-CD38-/-(和任选地CIITA-/-)IL的iPSC或其衍生细胞中的外源细胞表面细胞因子和/或受体实现IL10信号传导。在一些实施方案中,包含在包含B2M-/-CD38-/-(和任选地CIITA-/-)IL的iPSC或其衍生细胞中的外源细胞表面细胞因子和/或受体实现IL15信号传导。在包含B2M-/-CD38-/-(和任选地CIITA-/-)IL的所述iPSC的一些实施方案中,IL15表达通过如本文所述的构建体。上述实施方案的包含B2M-/-CD38-/-(和任选地CIITA-/-)IL的所述iPSC和其衍生细胞能够自主地维持或改善细胞生长、增殖、扩增和/或效应功能而不另外体外或体内接触所供应的可溶性细胞因子。在一些实施方案中,包含B2M-/-CD38-/-IL的iPSC及其衍生效应细胞在HLA-II中是完整的,并且在活化的受体T细胞、B细胞和NK细胞的存在下具有协同增加的存留和/或存活。当抗CD38抗体与所述衍生效应细胞一起用于组合疗法时,所述细胞具有协同增加的存留、存活和效应功能。
还提供了包含B2M敲除、CD38敲除和任选地CIITA敲除、IL、CAR和hnCD16中的一者或多者的iPSC,其中iPSC能够定向分化以产生功能性衍生造血细胞而不需要HLA-G和/或HLA-E表达来克服同种异体反应性NK细胞。在一些实施方案中,衍生造血细胞包括但不限于具有永久性生血内皮(HE)潜能的中胚层细胞、永久性HE、CD34+造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多能祖细胞(MPP)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、骨髓细胞、嗜中性粒细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞。iPSC及其衍生的效应细胞可与抗CD38抗体一起使用以诱导ADCC而不引起效应细胞消除或活化的受体T细胞、B细胞和NK细胞的同种异体排斥,从而增加iPSC及其效应细胞的存留和/或存活。在一些实施方案中,效应细胞在体内具有增加的存留和/或存活。
本文还提供了如上所讨论的iPSC或iPSC衍生细胞,其中iPSC或iPSC衍生细胞还包含IL15和IL15Rα的截短的融合蛋白,其中融合蛋白不包含胞内结构域。在一些实施方案中,缺少胞内结构域的截短IL15/IL15Rα融合蛋白包含与SEQ ID NO:8、9或10具有至少75%、80%、85%、90%、95%或99%一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中,缺少胞内结构域的截短IL15/IL15Rα融合蛋白包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中,缺少胞内结构域的截短IL15/IL15Rα融合蛋白包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在一些实施方案中,缺少胞内结构域的截短IL15/IL15Rα融合蛋白包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在又一些其他实施方案中,包含缺少胞内结构域的截短IL15/IL15Rα融合蛋白(IL15Δ)的iPSC或iPSC衍生的细胞进一步包含以下中的一者或多者:B2M敲除、CIITA敲除、CD38敲除、hnCD16、CAR和外源细胞因子信号传导复合体,并且其中iPSC能够定向分化以产生功能性衍生造血细胞,并且其中衍生造血细胞包括但不限于具有永久性生血内皮细胞(HE)潜能的中胚层细胞、永久性HE、CD34+造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多潜能祖细胞(MPP)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、骨髓细胞、嗜中性粒细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、巨噬细胞、或具有一种或多种功能特征的衍生效应细胞,该一种或多种功能特征不存在于对应的原代T细胞、NK细胞、NKT细胞和/或B细胞中。
因此,本申请提供iPSC和其功能性衍生造血细胞,其包含表1中的以下基因型中的任一种。除非指定为IL15Δ,如表1中所提供的,视选择哪种特异性细胞因子信号传导复合体表达而定,“IL”代表IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18和IL21中的任一者。此外,当iPSC和其功能性衍生造血细胞具有包含CAR和IL两者的基因型时,CAR和IL可包含于包含2A序列的双顺反子表达盒中。相比而言,在一些其他实施方案中,CAR和IL在包含于iPSC和其功能性衍生造血细胞中的单独表达盒中。在一个特定实施方案中,包含于表达CAR和IL的iPSC和其功能性衍生效应细胞中的是IL15,其中IL15构建体包含于具有CAR或与CAR分开的表达盒中。
表1:提供的细胞的适用的示例性基因型
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7.另外的修饰
在一些实施方案中,基因修饰模式包含以下中的一者或多者:安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物靶标候选物;或者促进iPSC或其衍生细胞的移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留、免疫反应调控和调节和/或存活的蛋白质。在一些实施方案中,基因修饰的iPSC和其衍生细胞包含表1中所列的基因型。在一些实施方案中,包含表1中的基因型中的任一种基因型的iPSC及其衍生效应细胞可另外包含B2M、CIITA、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD25、CD69、CD44、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT中的至少一者的缺失或破坏;或HLA-E、HLA-G、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、TCR、Fc受体、抗体或其功能性变体或片段、检查点抑制剂、以及用于与双特异性、多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体中的至少一者的引入。
II.在iPSC中选定基因座处进行靶向基因组编辑的方法
如本文中可互换使用,基因组编辑或基因编辑是一种类型的基因工程,其中在靶细胞的基因组中进行DNA插入、缺失和/或置换。靶向基因组编辑(可与“靶向基因组编辑”或“靶向基因编辑”互换)能够在基因组中的预选位点实现插入、缺失和/或取代。当在靶向编辑期间使内源序列在插入位点缺失时,可以敲除包含受影响序列的内源基因或因序列缺失而降低。因此,靶向编辑还可以用于精确地中断内源基因表达。本文中类似地使用术语“靶向整合”,其是指一种涉及在使内源序列在插入位点缺失或不缺失的情况下插入一个或多个外源序列的方法。相比之下,随机整合的基因经历位置效应和静默,以致其表达不可靠并且不可预测。举例来说,着丝点和亚端粒区域特别容易发生转基因沉默。相反,新整合的基因可以影响周围内源基因和染色质,潜在地改变细胞特性或有利于细胞转化。因此,将外源DNA插入预选基因座(诸如安全港基因座或基因组安全港(GSH))对于安全、效率、拷贝数控制以及可靠的基因反应控制来说是重要的。
靶向编辑可以通过核酸酶非依赖性方法或通过核酸酶依赖性方法实现。在核酸酶非依赖性靶向编辑方法中,同源重组是通过宿主细胞的酶机制、通过同源序列侧接待插入的外源多核苷酸而引导。
可替代地,靶向编辑可以通过利用特异性稀有切割核酸内切酶特异性引入双链断裂(DSB)以更高频率来实现。这类核酸酶依赖性靶向编辑是利用DNA修复机制,包括非同源末端连接(NHEJ),其响应于DSB而发生。不使用含有外源遗传物质的供体载体,NHEJ通常引起少量的内源核苷酸的随机插入或缺失(插入/缺失)。相比之下,当含有与一对同源臂侧接的外源遗传物质的供体载体存在时,可以在同源性定向修复(HDR)期间通过同源重组将外源遗传物质引入基因组中,从而产生“靶向整合”。在一些情况下,靶向整合位点旨在在选定基因的编码区内,并且因此靶向整合可能破坏基因表达,从而导致在一个单一编辑步骤中同时敲入和敲除(KI/KO)。
可实现在所关注基因座(GOI)中将一个或多个转基因插入在所选位置处以同时敲除该基因。适于同时敲入和敲除(KI/KO)的基因座包括但不限于B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD71、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT。利用用于位置选择性插入的相应的位点特异性靶向同源臂,允许转基因在内源启动子下,在该位点处表达,或在包括在构建体中的外源启动子下表达。当将两个或更多个转基因插入CD38基因座中的所选位置处时,将例如2A接头或IRES的连接序列置于任何两个转基因之间。2A接头编码衍生自例如FMDV、ERAV、PTV-I或TaV的自裂解肽(分别称为“F2A”、“E2A”、“P2A”和“T2A”),使得可由单次转译产生单独的蛋白质。在一些实施方案中,构建体中包括绝缘子以降低转基因和/或外源启动子沉默的风险。在各种实施方案中,外源启动子可以是CAG或其他组成性、诱导性、时间特异性、组织特异性和/或细胞类型特异性的启动子,包括但不限于CMV、EF1α、PGK和UBC。
能够引入特异性和靶向DSB的可用核酸内切酶包括但不限于锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)、RNA引导的CRISPR(簇聚的规则间隔的短回文重复序列)系统。另外,利用phiC31和Bxb1整合酶的DICE(双整合酶盒交换)系统也是靶向整合的有前景的工具。
ZFN是靶向核酸酶,其包含与锌指DNA结合结构域融合的核酸酶。“锌指DNA结合结构域”或“ZFBD”意指按照序列特异性方式、通过一个或多个锌指结合DNA的多肽结构域。锌指是锌指结合结构域内的约30个氨基酸的结构域,其结构通过锌离子的配位而稳定化。锌指的示例包括但不限于C2H2锌指、C3H锌指和C4锌指。“设计”的锌指域是一种不存在于自然界中的结构域,其设计/组成主要来源于合理准则,例如应用取代规则和计算机化算法来处理存储现有ZFP设计和结合数据信息的数据库中的信息。参见例如美国专利号6,140,081,6,453,242,以及6,534,261,也参见WO 98/53058,WO 98/53059,WO 98/53060,WO 02/016536和WO 03/016496,其全部公开内容以引用方式并入本文。“所选”锌指域是一种在自然界中未发现的结构域,其产生主要来源于经验方法,例如噬菌体呈现、相互作用截留或杂交选择。ZFN更详细地描述于美国专利第7,888,121号和美国专利第7,972,854号中,其完整公开内容以引入的方式并入本文中。ZFN在所属领域中的最公认示例是FokI核酸酶与锌指DNA结合结构域的融合物。
TALEN是靶向核酸酶,其包含与TAL效应子DNA结合结构域融合的核酸酶。“转录激活子样效应子DNA结合域”、“TAL效应子DNA结合域”或“TALE DNA结合域”意指负责TAL效应蛋白结合到DNA的TAL效应蛋白的多肽结构域。TAL效应蛋白由黄单胞菌属(Xanthomonas)植物病原体在感染期间分泌。这些蛋白质进入植物细胞的核,通过其DNA结合结构域结合效应子特异性DNA序列,并且通过其反式激活域在这些序列处激活基因转录。TAL效应子DNA结合结构域特异性取决于不完美的34个氨基酸重复的效应子可变数目,其包含所选重复位置处的多态性,称为重复可变双残基(RVD)。TALEN更详细地描述于美国专利申请第2011/0145940号,所述申请以引用的方式并入本文中。TALEN在所属领域中的最公认示例是FokI核酸酶与TAL效应子DNA结合结构域的融合多肽。
用于本发明方法中的靶向核酸酶的另一示例是靶向Spo11核酸酶,一种包括Spo11多肽的多肽,该多肽具有与DNA结合结构域(例如对所关注DNA序列具有特异性的锌指DNA结合结构域、TAL效应子DNA结合结构域等)融合的核酸酶活性。
适用于本发明的实施方案的靶向核酸酶的附加示例包括但不限于Bxb1、phiC31、R4、PhiBT1和Wβ/SPBc/TP901-1,不论单独地或组合地使用。
靶向核酸酶的其它非限制性示例包括天然存在的和重组的核酸酶;CRISPR相关核酸酶来自包括以下的家族:cpf、cse、csy、csn、csd、cst、csh、csa、csm和cmr;限制性内切核酸酶;大范围核酸酶;归巢核酸内切酶等。
使用Cas9作为示例,CRISPR/Cas9需要两种主要组分:(1)Cas9核酸内切酶和(2)crRNA-tracrRNA复合体。共表达时,所述两种组分形成募集到标靶DNA序列的复合体,包含PAM和靠近PAM的接种区域。crRNA与tracrRNA可以组合而形成嵌合向导RNA(gRNA)以引导Cas9靶向所选序列。这两种组分然后可以通过转染或转导递送到哺乳动物细胞。
DICE介导的插入是利用一对重组酶(例如phiC31和Bxb1)来提供外源DNA的单向整合,其严格局限于每种酶自身的小attB和attP识别位点。由于这些att靶点并非天然存在于哺乳动物基因组中,因此必须首先将其引入基因组中的所期望整合位点。参见例如美国公布号2015/0140665,其公开内容以引用方式并入本文中。
本发明的一个方面提供一种构建体,其包含一个或多个用于靶向基因组整合的外源多核苷酸。在一个实施方案中,构建体还包含对所期望的整合位点具有特异性的一对同源臂,并且靶向整合方法包括将构建体引入细胞中以允许细胞宿主酶机制实现定点同源重组。在另一个实施方案中,在细胞中实现靶向整合的方法包含将包含一个或多个外源多核苷酸的构建体引入细胞中,和将包含对所期望的整合位点具有特异性的DNA结合结构域的ZFN表达盒引入细胞中以实现ZFN介导的插入。在又另一个实施方案中,在细胞中实现靶向整合的方法包含将包含一个或多个外源多核苷酸的构建体引入细胞中,和将包含对所期望的整合位点具有特异性的DNA结合结构域的TALEN表达盒引入细胞中以实现TALEN介导的插入。在另一个实施方案中,在细胞中实现靶向整合的方法包括将包含一个或多个外源多核苷酸的构建体引入细胞中,将Cas9表达盒和包含对所期望的整合位点具有特异性的向导序列的gRNA引入细胞中以实现Cas9介导的插入。在再一个实施方案中,在细胞中实现靶向整合的方法包括将包含一对DICE重组酶的一个或多个att位点的构建体引入细胞中的所期望的整合位点,将包含一个或多个外源多核苷酸的构建体引入细胞中,以及将DICE重组酶的表达盒引入以实现DICE介导的靶向整合。
有望用于靶向整合的位点包括但不限于安全港基因座或基因组安全港(GSH),其是人类基因组的基因内或基因外区域,在理论上,其能够容纳新整合的DNA的可预测表达而不会对宿主细胞或生物体产生不利影响。适用的安全港必须允许转基因表达足以产生由载体编码的蛋白质或非编码RNA的所期望水平。安全港还不得使细胞容易发生恶性转化,也不得改变细胞功能。为了使整合位点成为潜在的安全港基因座,理想地需要满足包括但不限于以下的准则:如通过序列注释所判断,调控元件或基因没有中断;是基因密集区域中的基因间区域,或沿相反方向转录的两种基因之间的汇聚位置;保持距离以使载体编码的转录激活子与相邻基因(特别是癌症相关和微RNA基因)的启动子之间的长程相互作用的可能性最小化;并且具有明显普遍存在的转录活性,如通过按较宽空间和时间表达的序列标签(EST)表达模式所反映的,其指示普遍存在的转录活性。这个后一特点在干细胞中特别重要,其中在分化期间,染色质重塑通常引起一些基因座的沉默和其它基因座的潜在激活。在适于外源插入的区域内,选用于插入的确切基因座应所述不含重复元件和保守序列并且可以针对其容易地设计出用于扩增同源臂的引物。
适用于人类基因组编辑或具体地说靶向整合的位点包括但不限于腺相关病毒位点1(AAVS1)、趋化因子(CC基元)受体5(CCR5)基因座和小鼠ROSA26基因座的人类直系同源物。另外,小鼠H11基因座的人类直系同源物也可以是使用本文所公开的靶向整合组合物和方法进行插入的合适位点。另外,也可以使用胶原蛋白和HTRP基因座作为靶向整合的安全港。然而,每个所选位点的验证已表明是必需的,特别是在特异性整合事件的干细胞中,并且通常需要优化插入策略,包括启动子选择、外源基因序列和配置,以及构建体设计。
用于靶向插入/缺失的编辑位点通常包含于其表达和/或功能旨在是中断的内源基因中。在一些实施方案中,包含靶向插入/缺失的内源基因与免疫反应调控和调节相关。在一些其它实施方案中,包含靶向插入/缺失的内源基因与以下相关:靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药物标靶候选物、免疫反应调控和调节,或抑制干细胞和/或祖细胞和其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。
因此,本发明的一个方面提供一种在所选基因座中进行靶向整合的方法,所选基因座包括基因组安全港或已知或证实安全的预选基因座并且经充分调控以实现连续或暂时基因表达,诸如如本文所提供的TRAC和TRBC基因座。在一个实施方案中,靶向整合方法用的基因组安全港包含一个或多个所期望的整合位点,包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、TCR(TRAC或TRBC)或RUNX1,或满足基因组安全港准则的其他基因座。在一个实施方案中,在细胞中进行靶向整合的方法包含:将包含一个或多个外源多核苷酸的构建体引入细胞中,和将包含对所期望的整合位点具有特异性的一对同源臂和一个或多个外源序列的构建体引入,以通过细胞宿主酶机制实现定点同源重组,其中所期望的整合位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、TCR或RUNX1,或满足基因组安全港准则的其他基因座。附加整合位点包括旨在用于破坏(诸如减少或敲除)的内源基因座,其包含B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD71、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT。
在另一个实施方案中,细胞中的靶向整合的方法包括向细胞引入包括一种或多种外源多核苷酸的构建体,以及向细胞引入包括对期望整合位点具有特异性的DNA结合域的ZFN表达盒,以实现ZFN介导的插入,其中期望的整合位点包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、tap相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD25、CD38、CD44、CD54、CD56、CD58、CD69、CD71、OX40、4-1BB、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT。在又一个实施方案中,细胞中的靶向整合的方法包括向细胞引入包括一种或多种外源多核苷酸的构建体,以及向细胞引入包括对期望整合位点具有特异性的DNA结合域的TALEN表达盒,以实现TALEN介导的插入,其中期望的整合位点包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、tap相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD25、CD38、CD44、CD54、CD56、CD58、CD69、CD71、OX40、4-1BB、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT。在另一个实施方案中,细胞中的靶向整合的方法包括向细胞引入包括一种或多种外源多核苷酸的构建体,向细胞引入Cas9表达盒以及包括对期望整合位点具有特异性的引导序列的gRNA,以实现Cas9介导的插入,其中期望的整合位点包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、tap相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD25、CD38、CD44、CD54、CD56、CD58、CD69、CD71、OX40、4-1BB、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT。在再一个实施方案中,细胞中的靶向整合的方法包括向细胞中的期望整合位点引入包括一对DICE重组酶的一个或多个att位点,向细胞引入包括一个或多个外源多核苷酸的构建体,以及引入DICE重组酶的表达盒,以实现DICE介导的靶向整合,其中期望的整合位点包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、tap相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD25、CD38、CD44、CD54、CD56、CD58、CD69、CD71、OX40、4-1BB、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT。
另外,如本文所提供,用于靶向整合于安全港的上述方法是用于插入所关注的任何多核苷酸,例如编码以下的多核苷酸:安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物,和促进干细胞和/或祖细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些其它实施方案中,包含一个或多个外源多核苷酸的构建体还包含一个或多个标记物基因。在一个实施方案中,本发明的构建体中的外源多核苷酸是编码安全开关蛋白质的自杀基因。适用于诱导细胞死亡的自杀基因系统包括但不限于胱天蛋白酶9(或胱天蛋白酶3或7)和AP1903;胸苷激酶(TK)和更昔洛韦(GCV);胞嘧啶脱氨酶(CD)和5-氟胞嘧啶(5-FC)。另外,一些自杀基因系统对细胞类型具有特异性,例如使用B细胞分子CD20对T淋巴细胞进行基因修饰允许其在施用mAb利妥昔单抗后消除。另外,当基因工程改造细胞暴露于西妥昔单抗时,含有被西妥昔单抗识别的抗原决定基的修饰的EGFR可以用于耗尽该细胞。因此,本发明的一个方面提供一种靶向整合一个或多个编码安全开关蛋白质的自杀基因的方法,该安全开关蛋白质选自胱天蛋白酶9(胱天蛋白酶3或7)、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、修饰的EGFR和B细胞CD20。
在一些实施方案中,通过本文中所述的方法整合的一个或多个外源多核苷酸是通过用于靶向整合的构建体中包含的可操作连接的外源启动子驱动。所述启动子可以是可诱导的或结构性的,并且可以是时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性的。适用于本发明方法的结构性启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)、延伸因子1α(EF1α)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、杂交CMV增强子/鸡肉β-肌动蛋白(CAG)和泛素C(UBC)启动子。在一个实施方案中,外源启动子是CAG。
通过本文中的方法整合的外源多核苷酸可以通过宿主基因组中的内源启动子在整合位点驱动。在一个实施方案中,本文所述的方法是用于使一个或多个外源多核苷酸靶向整合在细胞基因组中的AAVS1基因座。在一个实施方案中,至少一种整合的多核苷酸是由内源AAVS1启动子驱动。在另一个实施方案中,本文所述的方法是用于靶向整合在细胞基因组中的ROSA26基因座。在一个实施方案中,至少一种整合的多核苷酸是由内源ROSA26启动子驱动。在再一个实施方案中,本文所述的方法是用于靶向整合在细胞基因组中的H11基因座。在一个实施方案中,至少一种整合的多核苷酸是由内源H11启动子驱动。在另一个实施方案中,本文所述的方法是用于靶向整合在细胞基因组中的胶原蛋白基因座。在一个实施方案中,至少一种整合的多核苷酸是由内源胶原蛋白启动子驱动。在再一个实施方案中,本文所述的方法是用于靶向整合在细胞基因组中的HTRP基因座。在一个实施方案中,至少一种整合的多核苷酸是由内源HTRP启动子驱动。理论上,只有正确插入所期望位置才能实现由内源启动子驱动的外源基因的基因表达。
在一些实施方案中,靶向整合方法用的构建体中包含的一个或多个外源多核苷酸是由一个启动子驱动。在一些实施方案中,构建体包含一个或多个位于由同一个启动子驱动的两个相邻多核苷酸之间的接头序列,以使得各部分之间的物理间距更大并且使酶机制可行性最大化。接头序列的接头肽可以由为了使各部分(外源多核苷酸,和/或由其编码的蛋白质或肽)之间产生物理间距而选择的氨基酸组成,视相关功能而定,其较柔软或较硬。接头序列可以通过蛋白酶裂解或以化学方式裂解以产生单独的部分。接头中的酶裂解位点示例包括蛋白水解酶(例如肠激酶、因子Xa、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和凝血酶)的裂解位点。在一些实施方案中,所述蛋白酶是由宿主天然产生的蛋白酶或其通过外源引入。可替代地,接头中的裂解位点可以是在暴露于所选化学物质(例如溴化氰、羟胺或低pH)后能够裂解的位点。任选存在的接头序列可以服务于除提供裂解位点之外的目的。接头序列应允许该部分相对于另一相邻部分有效定位,以便该部分正确地发挥功能。接头还可以是长度足以防止所述部分之间出现任何空间位阻的简单氨基酸序列。另外,接头序列可以实现转译后修饰,包括但不限于例如磷酸化位点、生物素化位点、硫酸化位点、γ-羧基化位点等等。在一些实施方案中,接头序列是柔软的,以便使生物活性肽不能保持单一非期望的构形。接头可以主要包含具有小侧链的氨基酸,例如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸,以提供柔性。在一些实施方案中,接头序列中的约80或90%或更多包含甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基,尤其是甘氨酸和丝氨酸残基。在若干实施方案中,G4S接头肽将融合蛋白的末端处理域和核酸内切酶结构域分隔。在其它实施方案中,2A接头序列允许单次转译产生两种单独的蛋白质。合适的接头序列能容易凭经验鉴别。另外,接头序列的合适尺寸和序列也能通过常规计算机建模技术确定。在一个实施方案中,接头序列编码自裂解肽。在一个实施方案中,自裂解肽是2A。在一些其它实施方案中,接头序列提供内部核糖体入口序列(IRES)。在一些实施方案中,任何两个相邻的接头序列是不同的。
将包含待靶向整合的外源多核苷酸的构建体引入细胞中的方法可以使用本来已知的将基因转移到细胞的方法实现。在一个实施方案中,所述构建体包含病毒载体,例如腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体的骨架。在一些实施方案中,质粒载体用于将外源多核苷酸递送到靶细胞中和/或使外源多核苷酸在靶细胞中表达(例如pAl-11、pXTl、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)等。在一些其它实施方案中,游离型载体用于将外源多核苷酸递送到靶细胞。在一些实施方案中,重组腺相关病毒(rAAV)可用于基因工程以通过同源重组来引入插入、缺失或取代。不同于慢病毒,rAAV不整合到宿主基因组中。另外,游离型rAAV载体介导同源定向的基因,其相较于常规靶向质粒的转染以高得多的比例靶向。在一些实施方案中,AAV6或AAV2载体用于在iPSC的基因组中的标靶位点引入插入、缺失或取代。在一些实施方案中,使用本文所述的方法和组合物获得的基因组修饰的iPSC和其衍生细胞包含表1中所列的至少一种基因型。
III.获得和维持基因组工程改造的iPSC的方法
在各种实施方案中,本发明提供一种获得和维持基因组工程改造iPSC的方法,该方法包括在一个或多个所期望的位点进行的一个或多个靶向编辑,其中一个或多个靶向编辑在扩增的基因组工程改造iPSC或iPSC衍生非多能细胞中、在相应所选编辑位点处保持完整和功能。靶向编辑将iPSC和其衍生细胞插入、缺失和/或取代引入基因组中(即,在所选位点引入靶向整合和/或插入/缺失)。与直接工程改造患者源的外周血起源原代效应细胞相比,通过编辑和分化如本文所提供的iPSC获得基因组工程改造的衍生细胞的许多益处包括但不限于:工程改造的效应细胞的来源不受限制;无需重复操纵效应细胞,尤其在涉及多种工程改造的模式时;所获得的效应细胞因具有伸长端粒和经历较少耗竭而再生;效应细胞群关于编辑位点、拷贝数和缺乏等位基因变体、随机突变和表达杂色是均匀的,主要是由于如本文所提供的工程改造的iPSC中能够进行克隆选择。
在特定实施方案中,包含在一个或多个所选位点进行一个或多个靶向编辑的基因组工程改造iPSC作为单一细胞在表2所示的作为命运维持培养基(FMM)的细胞培养基中长期维持、传代和扩增,其中iPSC在所选位点保留靶向编辑和功能修饰。培养基的组分可以表2中所示的最优范围内的量存在于培养基中。FMM中培养的iPSC已表明继续维持其未分化和基础或初始轮廓;提供基因组稳定性,而不需要培养物清洁或选择;并且经由体外类胚胎体或单层分化(不形成类胚胎体);以及体内畸胎瘤形成的分化容易产生所有三种体细胞谱系。参见例如国际公布号WO2015/134652,其公开内容以引用方式并入本文。
表2:用于iPSC重编程和维持的例示性培养基
在一些实施方案中,包含一个或多个靶向整合和/或插入/缺失的基因组工程改造的iPSC在包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂并且不含或基本上不含TGFβ受体/ALK5抑制剂的培养基中维持、传代和扩增,其中iPSC在所选位点保留完整和功能性靶向编辑。
本发明的另一个方面提供了一种产生基因组工程改造的iPSC的方法,其通过iPSC的靶向编辑;或者首先通过靶向编辑来产生基因组工程改造非多能细胞,并且然后将所选/分离的基因组工程改造非多能细胞重编程,以获得包含与非多能细胞相同的靶向编辑的iPSC。本发明的另一个方面提供基因组工程改造的非多能细胞,其通过将靶向整合和/或靶向插入/缺失引入细胞中而同时经历重编程,其中所接触的非多能细胞处于足以用于重编程的条件下,并且其中重编程条件包含使非多能细胞与一种或多种重编程因子和小分子接触。在同时进行基因组工程改造和重编程的方法的各种实施方案中,可以在启动重编程之前或基本上同时,通过使非多能细胞与一种或多种重编程因子和任选一种或多种小分子接触而将靶向整合和/或靶向插入/缺失引入非多能细胞中。
在一些实施方案中,为了对非多能细胞同时进行基因组工程改造和重编程,还可在通过使非多能细胞与一种或多种重编程因子和小分子接触而启动多日重编程过程之后,将靶向整合和/或插入/缺失引入非多能细胞中,并且其中携带构建体的载体是在重编程细胞呈现一种或多种内源多能基因(包括但不限于SSEA4、Tra181和CD30)的稳定表达之前引入。
在一些实施方案中,重编程是通过使非多能细胞与至少一种重编程因子和任选TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂与ROCK抑制剂的组合(FRM;表2)来维持和扩增。在一些实施方案中,通过上述任何方法产生的基因组工程改造iPSC进一步使用包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的组合的混合物(FMM;表2)来维持和扩增。
在产生基因组工程改造的iPSC的方法的一些实施方案中,该方法包括:对iPSC进行基因组工程改造,其通过将一个或多个靶向整合和/或插入/缺失引入iPSC中以获得具有至少一种表1中所列的基因型的基因组工程改造的iPSC。可替代地,产生基因组工程改造的iPSC的方法包括:(a)将一种或多种靶向编辑引入非多能细胞中,以获得包含位于所选位点的靶向整合和/或插入/缺失的基因组工程改造非多能细胞,以及(b)使基因组工程改造非多能细胞与一种或多种重编程因子和任选小分子组合物接触,以获得包含位于所选位点的靶向整合和/或插入/缺失的基因组工程改造iPSC,该小分子组合物包含TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂。可替代地,产生基因组工程改造的iPSC的方法包括:(a)使非多能细胞与一种或多种重编程因子和任选小分子组合物接触,以启动非多能细胞重编程,该小分子组合物包含TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂;(b)将一种或多种靶向整合和/或插入/缺失引入用于基因组工程改造的重编程非多能细胞中;以及(c)获得包含位于所选位点的靶向整合和/或插入/缺失的克隆基因组工程改造的iPSC。上述方法中的任一种方法还可包括基因组工程改造的iPSC的单细胞分选以获得克隆iPSC,和/或在基因组工程改造的iPSC中筛选脱靶编辑和异常核型。通过基因组工程改造的iPSC的克隆扩增,产生主细胞库以包含具有至少一种如本文提供的表型的单细胞分选和扩增的克隆工程改造的iPSC。主细胞库随后被冷冻保存,从而提供用于附加iPSC工程改造的平台,以及用于制造现成的、工程改造的、同质的细胞疗法产品的可再生来源,该细胞疗法产品在组成上是明确定义的和均一的,并且可以以成本有效的方式大规模生产。
重编程因子选自由以下组成的组:OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C-MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、SV40LT、HESRG、CDH1、TDGF1、DPPA4、DNMT3B、ZIC3、L1TD1和它们的任何组合,如国际公布号WO2015/134652和WO 2017/066634中所公开,其公开内容以引用方式并入本文。一种或多种重编程因子可以呈多肽形式。重编程因子也可以呈编码重编程因子的多核苷酸形式,并且因此可通过载体(例如逆转录病毒、仙台病毒、腺病毒、游离基因体、质粒和小环)引入非多能细胞中。在特定实施方案中,通过慢病毒载体引入编码至少一种重编程因子的一种或多种多核苷酸。在一些实施方案中,通过游离型载体引入一种或多种多核苷酸。在各种其它实施方案中,通过仙台病毒载体引入一种或多种多核苷酸。在一些实施方案中,通过质粒的组合引入一种或多种多核苷酸。参见例如国际公布号WO2019/075057A1,其公开内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中,非多能细胞利用包含不同外源多核苷酸和/或不同启动子的多种构建体、通过用于在相同或不同所选位点进行靶向整合的多种载体转染。这些外源多核苷酸可以包含自杀基因,或编码靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物的基因,或编码蛋白质的基因,所述蛋白质促进iPSC或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活。在一些实施方案中,外源多核苷酸编码RNA,包括但不限于siRNA、shRNA、miRNA和反义核酸。这些外源多核苷酸可以由一个或多个启动子驱动,该启动子选自由以下组成的组:组成性启动子、诱导性启动子、时间特异性启动子和组织或细胞类型特异性启动子。因此,当在例如在诱导剂存在下或在特定分化细胞类型中激活启动子的条件下时,多核苷酸是可表达的。在一些实施方案中,多核苷酸在iPSC中和/或在由iPSC分化的细胞中表达。在一个实施方案中,一个或多个自杀基因由组成性启动子驱动,例如Capase-9由CAG驱动。可以同时或连续将包含不同外源多核苷酸和/或不同启动子的这些构建体转染到非多能细胞中。经历多个构建体的靶向整合的非多能细胞可同时接触一个或多个重编程因子以与基因工程改造同时启动重编程,从而获得在同一细胞池中包含多个靶向整合的基因组工程改造的iPSC。因此,该稳固方法实现同时重编程和工程改造策略,从而得到具有整合到一个或多个所选靶点的多种模式的克隆的基因组工程改造的hiPSC。在一些实施方案中,使用本文中的方法和组合物获得的基因组修饰的iPSC和其衍生细胞包含表1中所列的至少一种基因型。
IV.通过分化基因组工程改造的iPSC获得基因工程改造的效应细胞的方法
本发明的另一方面提供一种通过畸胎瘤形成体内分化基因组工程改造的iPSC的方法,其中通过基因组工程改造的iPSC体内衍生的分化细胞保留完整和功能性靶向编辑,其包括在所期望的位点处的靶向整合和/或插入/缺失。在一些实施方案中,基因组工程改造的iPSC经由畸胎瘤形成体内衍生的分化细胞包含在一个或多个所期望的位点整合的一个或多个诱导性自杀基因,该位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、CD38、GAPDH、TCR或RUNX1,或满足基因组安全港准则的其他基因座。在一些其他实施方案中,基因组工程改造的iPSC经由畸胎瘤形成体内衍生的分化细胞包含编码靶向模式或编码促进干细胞和/或祖细胞的运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质的多核苷酸。在一些实施方案中,基因组工程改造的iPSC经由畸胎瘤形成体内衍生的分化细胞包含一个或多个诱导性自杀基因,在与免疫反应调控和介导相关的内源基因中还包含一个或多个插入/缺失。在一些实施方案中,插入/缺失包含在一个或多个内源检查点基因中。在一些实施方案中,插入/缺失包含在一个或多个内源T细胞受体基因中。在一些实施方案中,插入/缺失包含在一个或多个内源MHC I类抑制基因中。在一些实施方案中,插入/缺失包含在与主要组织相容性复合体相关的一个或多个内源基因中。在一些实施方案中,插入/缺失包括在一个或多个内源基因中,该一个或多个内源基因包括但不限于AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、tap相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD25、CD38、CD44、CD54、CD56、CD58、CD69、CD71、OX40、4-1BB、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT中的至少一者。在一个实施方案中,在所选位点包含一个或多个外源多核苷酸的基因组工程改造的iPSC在B2M(β-2-微球蛋白)编码基因中还包含靶向编辑。
在特定实施方案中,包含如本文所提供的一种或多种基因修饰的基因组工程改造的iPSC用于体外衍生造血细胞谱系或任何其它特定细胞类型,其中衍生非多能细胞保留功能性基因修饰,包括在所选位点处的靶向编辑。在一个实施方案中,基因组工程改造的iPSC衍生细胞包括但不限于具有永久性生血内皮细胞(HE)潜能的中胚层细胞、永久性HE、CD34+造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多能祖细胞(MPP)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、骨髓细胞、嗜中性粒细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞,其中衍生自基因组工程改造的iPSC的细胞保留功能性基因修饰,包括在所期望的位点处的靶向编辑。
适用于获得iPSC衍生造血细胞谱系的分化方法和组合物包括例如国际公布号WO2017/078807中描绘的分化方法和组合物,该公布的公开内容以引用方式并入本文中。如所提供,用于产生造血细胞谱系的方法和组合物是在无血清、无饲养层和/或无基质的条件下并且在可扩展和单层培养平台中在无需EB形成的情况下通过衍生自多能干细胞(包括iPSC)的永久性生血内皮细胞(HE)。可以根据所提供的方法分化的细胞的范围是多能干细胞到专门化为特定末端分化细胞和转分化细胞的祖细胞、和直接转向造血命运而不经历多能中间体的多种谱系细胞。类似地,干细胞分化而产生的细胞的范围是多潜能干细胞或祖细胞到末端分化细胞,和所有中间造血细胞谱系。
用于在单层培养中分化和扩增来自多能干细胞的造血谱系细胞的方法包含使多能干细胞与BMP路径活化剂和任选的bFGF接触。如所提供,无需由多能干细胞形成类胚胎体便获得并且扩增多能干细胞衍生中胚层细胞。然后使中胚层细胞与BMP路径活化剂、bFGF和WNT路径活化剂接触,以获得具有永久性生血内皮细胞(HE)潜能的扩增中胚层细胞,而无需由多能干细胞形成类胚胎体。通过随后与bFGF和任选存在的ROCK抑制剂和/或WNT路径活化剂接触,具有永久性HE潜能的中胚层细胞分化成永久性HE细胞,在分化期间,所述永久性HE细胞还得以扩增。
本文所提供的用于获得造血谱系细胞的方法优于EB介导的多能干细胞分化,原因在于:EB形成产生了适度到最低限度的细胞扩增;不允许单层培养,而单层培养对于需要细胞在群中均匀扩增和均匀分化的许多应用来说是重要的;并且费力并且效率低。
所提供的单层分化平台促进向永久性生血内皮细胞分化,从而得到造血干细胞和分化后代,例如T细胞、B细胞、NKT细胞和NK细胞。单层分化策略实现了增强的分化效率与大规模扩增的组合,并且能够在不同治疗应用中递送治疗上相关数目个多能干细胞衍生造血细胞。此外,使用本文所提供的方法进行的单层培养产生了功能造血谱系细胞,其实现了全范围的试管内分化、体外调节和体内长期造血自我更新、重构和移植。如所提供,iPSC衍生造血谱系细胞包括但不限于永久性生血内皮细胞、造血多能祖细胞、造血干细胞和祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞。
因此,在各种实施方案中,用于引导多能干细胞分化成永久性造血谱系细胞的方法包括:(i)使多能干细胞与包含BMP活化剂和任选bFGF的组合物接触,以启动从多能干细胞分化和扩增中胚层细胞;(ii)使中胚层细胞与包含BMP活化剂、bFGF和GSK3抑制剂的组合物接触,以启动从中胚层细胞分化和扩增具有永久性HE潜能的中胚层细胞,其中该组合物任选地不含TGFβ受体/ALK抑制剂;(iii)使具有永久性HE潜能的中胚层细胞与组合物接触,以启动从具有永久性生血内皮细胞潜能的多能干细胞衍生中胚层细胞分化和扩增永久性生血内皮细胞,该组合物包含ROCK抑制剂;选自由bFGF、VEGF、SCF、IGF、EPO、IL6和IL11组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子;以及任选Wnt路径活化剂,其中该组合物任选地不含TGFβ受体/ALK抑制剂。
在一些实施方案中,所述方法进一步包含:使多能干细胞与包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的组合物接触,以接种和扩增多能干细胞,其中组合物不含TGFβ受体/ALK抑制剂。在一些实施方案中,多能干细胞是iPSC、或初始iPSC、或包含一个或多个遗传印记的iPSC;并且iPSC中包含的一种或多种遗传印记保留在由其分化的造血细胞中。在用于引导多能干细胞分化成造血谱系细胞的一些实施方案中,多能干细胞分化成造血谱系细胞缺乏产生类胚胎体,并且呈单层培养形式。
在上述方法的一些实施方案中,所得多能干细胞衍生永久性生血内皮细胞是CD34+。在一些实施方案中,所得永久性生血内皮细胞是CD34+CD43-。在一些实施方案中,永久性生血内皮细胞是CD34+CD43-CXCR4-CD73-。在一些实施方案中,永久性生血内皮细胞是CD34+CXCR4-CD73-。在一些实施方案中,永久性生血内皮细胞是CD34+CD43-CD93-。在一些实施方案中,永久性生血内皮细胞是CD34+CD93-
在上述方法的一些实施方案中,该方法还包括(i)使多能干细胞衍生永久性生血内皮细胞与组合物接触以启动永久性生血内皮细胞分化成前T细胞祖细胞,该组合物包含ROCK抑制剂;选自由VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、TPO和IL7组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子;以及任选BMP活化剂;以及任选地,(ii)使前T细胞祖细胞与组合物接触以启动前T细胞祖细胞分化成T细胞祖细胞或T细胞,该组合物包含选自由SCF、Flt3L和IL7组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子,但不含VEGF、bFGF、TPO、BMP活化剂和ROCK抑制剂中的一者或多者。在该方法的一些实施方案中,多能干细胞衍生T细胞祖细胞是CD34+CD45+CD7+。在该方法的一些实施方案中,多能干细胞衍生T细胞祖细胞是CD45+CD7+
在用于引导多能干细胞分化成造血谱系细胞的上述方法的又一些实施方案中,该方法还包括:(i)使多能干细胞衍生永久性生血内皮细胞与组合物接触以启动永久性生血内皮细胞分化成前NK细胞祖细胞,该组合物包含ROCK抑制剂;选自由VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、TPO、IL3、IL7和IL15组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子;以及任选BMP活化剂;以及任选地,(ii)使多能干细胞衍生前NK细胞祖细胞与组合物接触以启动前NK细胞祖细胞分化成NK细胞祖细胞或NK细胞,该组合物包含选自由SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子,其中培养基不含VEGF、bFGF、TPO、BMP活化剂和ROCK抑制剂中的一者或多者。在一些实施方案中,多能干细胞衍生NK祖细胞是CD3-CD45+CD56+CD7+。在一些实施方案中,多能干细胞衍生NK细胞是CD3-CD45+CD56+,以及任选地进一步由NKp46+、CD57+和CD16+定义。
因此,使用上述分化方法,可以获得一种或多种iPSC衍生造血细胞群:(i)CD34+HE(iCD34),使用一种或多种选自iMPP-A、iTC-A2、iTC-B2、iNK-A2和iNK-B2的培养基;(ii)永久性生血内皮细胞(iHE),使用一种或多种选自iMPP-A、iTC-A2、iTC-B2、iNK-A2和iNK-B2的培养基;(iii)永久性HSC,使用一种或多种选自iMPP-A、iTC-A2、iTC-B2、iNK-A2和iNK-B2的培养基;(iv)多潜能祖细胞(iMPP),使用iMPP-A;(v)T细胞祖细胞(ipro-T),使用一种或多种选自iTC-A2和iTC-B2的培养基;(vi)T细胞(iTC),使用iTC-B2;(vii)NK细胞祖细胞(ipro-NK),使用一种或多种选自iNK-A2和iNK-B2的培养基;和/或(viii)NK细胞(iNK),和iNK-B2。在一些实施方案中,所述培养基:
a.iCD34-C包含ROCK抑制剂、选自由bFGF、VEGF、SCF、IL6、IL11、IGF和EPO组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子,以及任选Wnt路径活化剂;并且不含TGFβ受体/ALK抑制剂;
b.iMPP-A包含BMP活化剂、ROCK抑制剂以及选自由TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6、Flt3L和IL11组成的组一种或多种生长因子和的细胞因子;
c.iTC-A2包含ROCK抑制剂;选自由SCF、Flt3L、TPO和IL7组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子;以及任选BMP活化剂;
d.iTC-B2包含选自由SCF、Flt3L和IL7组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子;
e.iNK-A2包含ROCK抑制剂和选自由SCF、Flt3L、TPO、IL3、IL7和IL15组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子;以及任选BMP活化剂,以及
f.iNK-B2包含选自由SCF、Flt3L、IL7和IL15组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子。
在一些实施方案中,通过以上方法获得的基因组工程改造iPSC衍生细胞包括在一个或多个期望整合位点处整合的一个或多个诱导性自杀基因,该一个或多个期望整合位点包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、tap相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD25、CD38、CD44、CD54、CD56、CD58、CD69、CD71、OX40、4-1BB、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT,或满足基因组安全港准则的其他基因座。在一些其它实施方案中,基因组工程改造的iPSC衍生细胞包含编码以下的多核苷酸:安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物或促进干细胞和/或祖细胞的运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些实施方案中,包含一个或多个自杀基因的基因组工程改造的iPSC衍生细胞还包含一个或多个内源基因中所包含的一种或多种插入/缺失,该内源基因与免疫反应调控和介导相关,包括但不限于检查点基因、内源T细胞受体基因和MHC I类抑制基因。在一个实施方案中,包含一个或多个自杀基因的基因组工程改造iPSC的衍生细胞在B2M基因中还包含插入/缺失,其中敲除B2M。
另外,可应用于获得第一命运的基因组工程改造造血细胞到第二命运的基因组工程改造造血细胞的去分化方法和组合物包括例如公布号WO2011/159726中所描绘的方法和组合物,其公开内容以引用方式并入本文中。其中提供的方法和组合物通过以下方式允许部分地将起始非多能细胞重编程为非多能中间细胞:在重编程期间限制内源Nanog基因表达;以及使非多能中间细胞经历用于使中间细胞分化成期望细胞类型的条件。在一些实施方案中,使用本文中的方法和组合物获得的基因组修饰的iPSC和其衍生细胞包含表1中所列的至少一种基因型。
V.具有由基因工程改造iPSC分化的功能模式的衍生免疫细胞的治疗用途
在一些实施方案中,本发明提供一种组合物,其包含功能上增强的衍生免疫细胞的分离的群体或亚群,所述免疫细胞使用所公开的方法和组合物由基因组工程化iPSC分化。在一些实施方案中,iPSC包含一种或多种可保留在iPSC衍生效应细胞中的靶向基因编辑,其中基因工程改造的iPSC和其衍生细胞适用于基于细胞的过继性疗法。在一个实施方案中,基因工程改造的效应细胞的分离的群体或亚群包含iPSC衍生CD34+细胞。在一个实施方案中,基因工程改造的效应细胞的分离的群体或亚群包含iPSC衍生HSC细胞。在一个实施方案中,基因工程改造的效应细胞的分离的群体或亚群包含iPSC衍生的proT细胞或T细胞。在一个实施方案中,基因工程改造的效应细胞的分离的群体或亚群包含iPSC衍生的proNK细胞或NK细胞。在一个实施方案中,基因工程改造的效应细胞的分离的群体或亚群包含iPSC衍生免疫调控细胞或骨髓衍生抑制细胞(MDSC)。在一些实施方案中,iPSC衍生基因工程改造的效应细胞进一步离体调节以改善治疗潜能。在一个实施方案中,已源自iPSC的基因工程改造的效应细胞的分离的群体或亚群包含增加的数目或比例的初始T细胞、干细胞记忆T细胞和/或中枢记忆T细胞。在一个实施方案中,已源自iPSC的基因工程改造的效应细胞的分离的群体或亚群包含增加的数目或比例的I型NKT细胞。在另一个实施方案中,已源自iPSC的基因工程改造的效应细胞的分离的群体或亚群包含增加的数目或比例的适应性NK细胞。在一些实施方案中,衍生自iPSC的基因工程改造的CD34+细胞、HSC细胞、T细胞、NK细胞或骨髓衍生抑制细胞的分离的群体或亚群是同种异体的。在一些其他实施方案中,衍生自iPSC的基因工程改造的CD34+细胞、HSC细胞、T细胞、NK细胞或MDSC的分离的群体或亚群是自体的。
在一些实施方案中,用于分化的iPSC包含被选择以在衍生效应细胞中传达所期望的治疗属性的遗传印记,其限制条件为分化期间的细胞发育生物学不中断,并且其限制条件为遗传印记在源自所述iPSC的分化的造血细胞中保留并且起作用。
在一些实施方案中,多能干细胞中的遗传印记包含(i)在将非多能细胞重编程为iPSC期间或之后通过在多能细胞基因组中进行基因组插入、缺失或取代而获得的一种或多种基因修饰模式;或者(ii)对供体特异性、疾病特异性或治疗反应特异性的来源特异性免疫细胞的一种或多种可保留治疗属性,并且其中多能细胞是由来源特异性免疫细胞重编程,其中iPSC保留来源治疗属性,iPSC衍生的造血谱系细胞中也包含该来源治疗属性。
在一些实施方案中,基因修饰模式包含以下中的一者或多者:安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物靶标候选物;或者促进iPSC或其衍生细胞的移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留、免疫反应调控和调节和/或存活的蛋白质。在一些实施方案中,基因修饰的iPSC和其衍生细胞包含表1中所列的基因型。在一些其他实施方案中,包含表1中所列的基因型的经遗传修饰的iPSC及其衍生细胞还包含另外的经遗传修饰的模式,这些模式包括(1)NLRC5、PD1、LAG3和TIM3的缺失或破坏中的一者或多者;以及(2)HLA-E、HLA-G、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、TCR、Fc受体或用于与双特异性、多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体的引入。
在再一些其他实施方案中,iPSC衍生的造血谱系细胞包含与以下中的至少两者的组合相关的来源特异性免疫细胞的治疗属性:(i)一种或多种抗原靶向受体的表达;(ii)经修饰的HLA;(iii)对肿瘤微环境的抗性;(iv)募集旁邻免疫细胞和免疫调节;(iv)随着肿瘤外效应降低,靶上特异性改善;以及(v)改善的归巢、存留、细胞毒性或抗原逃逸挽救。
在一些实施方案中,iPSC衍生造血细胞包含表1中所列的基因型,并且所述细胞表达至少一种细胞因子和/或其受体,包含IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18或IL21或其任何被修饰的蛋白质,并且至少表达CAR。在一些实施方案中,细胞因子和CAR的工程改造表达具有NK细胞特异性。在一些其他实施方案中,细胞因子和CAR的工程改造表达具有T细胞特异性。在一些实施方案中,iPSC衍生造血效应细胞对抗原具有特异性。在一些实施方案中,抗原特异性衍生效应细胞靶向液体肿瘤。在一些实施方案中,抗原特异性衍生效应细胞靶向实体瘤。在一些实施方案中,抗原特异性iPSC衍生造血效应细胞能够挽救肿瘤抗原逃逸。
具体地,本申请提供了在过继性细胞疗法中减少或防止受体活化的免疫细胞对同种异体效应细胞的同种异体排斥的方法,其中该方法包括施用组合疗法,其中该组合疗法包含本文所述的衍生效应细胞和抗CD38治疗剂。在各种实施方案中,衍生效应细胞是B2M-/-CD38-/-(和任选地CIITA-/-)并且还包含外源CD16、IL、CAR、抗体和任何其他模式中的一者或多者,如表1中所示。在各种实施方案中,组合疗法的抗CD38治疗剂是抗CD38抗体或其片段。在一些实施方案中,抗CD38抗体是达雷木单抗、伊沙妥昔单抗或MOR202。在一些实施方案中,抗CD38治疗剂在施用衍生效应细胞同时、之前或之后施用。因此,在一些实施方案中,抗体通过同时或连续施用于受试者而与本文所述的效应细胞群体组合使用。在其他实施方案中,此类抗体或其片段可通过使用编码所述抗体或其片段的外源多核苷酸序列基因工程改造iPSC并且引导工程改造的iPSC的分化而由效应细胞表达,如本文所述。在该方法的一些实施方案中,同种异体效应细胞是iPSC衍生的造血细胞。在该方法的一些实施方案中,同种异体效应细胞是iPSC衍生的T细胞、NK细胞或NKT细胞。
在减少或防止同种异体效应细胞在过继性细胞疗法中被受体活化的免疫细胞同种异体排斥的方法的另外的实施方案中,该方法还包括施用对CAR靶向的相同或不同上调的表面蛋白特异性的抗体,和/或一种或多种附加治疗剂。在该方法的一些实施方案中,抗体包含抗CD20、抗HER2、抗CD52、抗EGFR、抗CD123、抗GD2、抗PDL1、抗CD38抗体、抗CD25抗体、抗CD69抗体、抗CD71抗体、抗CD44抗体、或它们的任何人源化或Fc修饰的变体或片段、功能等效物或生物类似物中的至少一者。在用于该方法中的治疗剂的一些实施方案中,治疗剂包含肽、细胞因子、检查点抑制剂、丝裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或其置换因子、包含一种或多种所关注多核酸的载体、抗体、化学治疗剂或放射性部分或免疫调节药物(IMiD)。
多种疾病可以通过向适合于过继性细胞疗法的受试者引入本发明的衍生效应细胞而得到改善。在一些实施方案中,如本文所提供的iPSC衍生造血细胞用于同种异体过继性细胞疗法。另外,在一些实施方案中,本发明通过以下方式提供了上述治疗组合物和/或组合疗法的治疗用途:将组合物引入适于过继性细胞疗法的受试者,其中受试者患有自身免疫障碍;血液系统恶性肿瘤;实体瘤;或与HIV、RSV、EBV、CMV、腺病毒或BK多瘤病毒相关联的感染。
血液系统恶性肿瘤的示例包括但不限于急性和慢性白血病(急性骨髓性白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML))、淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、霍奇金氏病、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合症。实体癌的实例包括但不限于脑癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、子宫癌、皮肤癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、卵巢癌、睾丸癌、膀胱癌、肾癌、头癌、颈癌、胃癌、子宫颈癌、直肠癌、喉癌和食道癌。多种自身免疫障碍的示例包括但不限于斑秃、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、皮肌炎、糖尿病(1型)、幼年型特发性关节炎的一些形式、肾小球肾炎、格雷夫斯病(Graves’disease)、吉兰-巴雷综合症(Guillain-Barrésyndrome)、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、心肌炎的一些形式、多发性硬化症、天疱疮/类天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、类风湿性关节炎、硬皮病/全身性硬化症、薛格连氏综合症(syndrome)、全身性红斑狼疮、甲状腺炎的一些形式、葡萄膜炎的一些形式、白癜风、肉芽肿性多血管炎(韦格纳氏病(Wegener’s))。病毒感染的示例包括但不限于HIV(人类免疫缺陷病毒)、HSV(单纯疱疹病毒)、KSHV(卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒)、RSV(呼吸道合胞病毒)、EBV(EB病毒)、CMV(巨细胞病毒)、VZV(水痘带状疱疹病毒)、腺病毒、慢病毒、BK多瘤病毒相关障碍。
使用本文所公开的实施方案的衍生造血谱系细胞的治疗可在症状呈现后进行或用于防止复发。术语“治疗”等在本文中一般用于意指获得所期望的药理学和/或生理学作用。对于疾病和/或可归因于所述疾病的不良作用,所述作用就完全或部分预防疾病来说,可以是防治性的,和/或就部分或完全治愈来说,可以是治疗性的。如本文所用,“治疗”涵盖对受试者疾病的任何干预,并且包括:防止可能易患疾病、但尚未被诊断患有其的受试者出现该疾病;以及抑制该疾病,即,阻滞其发展;或者缓解该疾病,即,引起疾病的消退。可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用治疗剂或组合物。发展中的疾病的治疗也是备受关注的,其中治疗稳定或减少患者的不期望的临床症状。在特定实施方案中,需要治疗的受试者患有可以通过细胞疗法使至少一种相关症状得以含有、改善和/或好转的疾病、病况和/或损伤。某些实施方案预期需要细胞疗法的受试者包括但不限于骨髓或干细胞移植候选者、已接受化学疗法或照射疗法的受试者、患有或处于产生过度增殖障碍或癌症(例如过度增殖障碍或造血系统癌症)的风险下的受试者、患有肿瘤(例如实体瘤)或处于罹患肿瘤的风险下的受试者、患有病毒感染或与病毒感染相关的疾病或处于患有病毒感染或与病毒感染相关的疾病的风险下的受试者。
在评估对包含本文中所公开的实施方案的衍生造血谱系细胞的治疗的反应性时,反应可由包含以下中的至少一者的准则来测量:临床效益率、直到死亡的存活期、病理性完全反应、病理性反应的半定量测量、临床完全缓解、临床部分缓解、临床稳定疾病、无再现存活、无转移存活、无疾病存活、循环肿瘤细胞减少、循环标记物反应和RECIST(实体瘤的反应评估)标准。
可在其它治疗之前、期间和/或之后向受试者施用包含如本文所公开的iPSC衍生造血谱系细胞的治疗组合物。因此,组合疗法的方法可涉及在使用另外治疗剂之前、期间和/或之后施用或制备iPSC衍生效应细胞。如上文所提供,一种或多种附加治疗剂包含肽、细胞因子、检查点抑制剂、丝裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或其置换因子、包含一种或多种所关注多核酸的载体、抗体、化学治疗剂或放射性部分或免疫调节药物(IMiD)。施用iPSC衍生免疫细胞与施用另外治疗剂可以在时间是间隔几小时、几天或甚至几周。另外地或可替代地,施用可与其它生物活性剂或模式组合,所述生物活性剂或模式例如但不限于抗肿瘤剂、非药物疗法,例如手术。
在组合细胞疗法的一些实施方案中,治疗组合包含本文所提供的iPSC衍生造血谱系细胞和另外治疗剂,该另外治疗剂是抗体或抗体片段。在一些实施方案中,抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中,抗体可以是人源化抗体、人源化单克隆抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中,抗体或抗体片段特异性结合于病毒抗原。在其它实施方案中,抗体或抗体片段特异性结合于肿瘤抗原。在一些实施方案中,肿瘤或病毒特异性抗原激活所施用的iPSC衍生造血谱系细胞以增强其杀伤能力。在一些实施方案中,适用于作为另外治疗剂与所施用的iPSC衍生造血谱系细胞的组合治疗的抗体包括但不限于抗CD20(例如利妥昔单抗、维妥珠单抗、奥法木单抗、乌布里图昔单抗、奥卡拉珠单抗、奥比珠单抗)、抗HER2(例如曲妥珠单抗、帕妥珠单抗)、抗CD52(阿仑单抗)、抗EGFR(例如西妥昔单抗)、抗GD2(例如迪努妥昔单抗)、抗PDL1(例如阿维鲁单抗)、抗CD38(例如达雷木单抗、艾沙妥昔单抗、MOR202)、抗CD123(例如7G3、CSL362)、抗SLAMF7(埃罗妥珠单抗)、抗CD25(例如,达克利珠单抗、巴利昔单抗、M-A251、2A3、BC69、24204、22722或24212)、抗CD69(例如,MAB23591、FN50、298614或AF2359)、抗CD71(例如,CY1G4或DF1513)、抗CD44(例如,比伐珠单抗、RG7356或G44-26)和它们的人源化或Fc修饰的变体或片段或它们的功能等效物和生物类似物。
在一些实施方案中,附加治疗剂包含一种或多种检查点抑制剂。检查点是指细胞分子,通常是细胞表面分子,在不被抑制时能够抑制或下调免疫反应。检查点抑制剂是能够减少检查点基因表达或基因产物或降低检查点分子活性的拮抗剂。上文提供了用于与衍生效应细胞组合疗法的合适的检查点抑制剂,该衍生效应细胞包括NK细胞或T细胞。
包含所提供的衍生效应细胞的组合疗法的一些实施方案进一步包含至少一种靶向检查点分子的抑制剂。具有所提供的衍生效应细胞的组合疗法的一些其它实施方案包含两种、三种或更多种抑制剂,以使得靶向两种、三种或更多种检查点分子。在一些实施方案中,用于如本文所述的组合疗法的效应细胞是如所提供的衍生NK细胞。在一些实施方案中,用于如本文所述的组合疗法的效应细胞是衍生T细胞。在一些实施方案中,如本文所提供,用于组合疗法的衍生NK细胞或T细胞在功能上增强。在一些实施方案中,两种、三种或更多种检查点抑制剂可以在施用衍生效应细胞同时、之前或之后在组合疗法中施用。在一些实施方案中,两种或更多种检查点抑制剂同时或一次一个地(依序)施用。
在一些实施方案中,抑制以上检查点分子中的任一种的拮抗剂是抗体。在一些实施方案中,检查点抑制性抗体可以是鼠类抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼Ig、单可变新抗原受体(VNAR)、鲨鱼重链抗体(Ig NAR)、嵌合抗体、重组抗体或它们的抗体片段。抗体片段的非限制性示例包括Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab')3、Fv、单链抗原结合性片段(scFv)、(scFv)2、二硫键稳定的Fv(dsFv)、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、单域抗原结合性片段(sdAb,纳米抗体)、只有重链的重组抗体(VHH)和维持全部抗体的结合特异性的其它抗体片段,其比起全部抗体可以更有成本效益地产生、更易于使用或更敏感。在一些实施方案中,一种、或两种、或三种、或更多种检查点抑制剂包含阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、伊匹单抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗和它们的衍生物或功能等效物中的至少一者。
包含衍生效应细胞和一种或多种检查点抑制剂的组合疗法适用于治疗液体和实体癌,其包括但不限于皮肤T细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、蕈样真菌病、帕哲样网状细胞增生症、塞氏综合症、肉芽肿性皮肤松弛、淋巴瘤样丘疹病、慢性苔癣样糠疹、急性苔癣痘疹样糠疹、CD30+皮肤T细胞淋巴瘤、继发性皮肤CD30+大细胞淋巴瘤、非蕈样真菌病CD30皮肤大T细胞淋巴瘤、多形性T细胞淋巴瘤、伦纳特淋巴瘤、皮下T细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤、母细胞NK细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(HL)、头颈部肿瘤;鳞状细胞癌、横纹肌肉瘤、路易斯肺癌(LLC)、非小细胞肺癌、食管鳞状细胞癌、食道腺癌、肾细胞癌(RCC)、结肠直肠癌(CRC)、急性骨髓白血病(AML)、乳腺癌、胃癌、前列腺小细胞神经内分泌癌(SCNC)、肝癌、成胶质细胞瘤、肝癌、口腔鳞状细胞癌、胰腺癌、甲状腺乳头状癌、肝内胆管细胞癌、肝细胞癌、骨癌、转移癌和鼻咽癌。
在一些实施方案中,除如本文所提供的衍生效应细胞外,用于治疗用途的组合包含一种或多种另外治疗剂,其包含化学治疗剂或放射性部分。化学治疗剂是指细胞毒性抗肿瘤剂,即优先杀死肿瘤细胞或中断快速增殖细胞的细胞循环,或发现其根除癌症干细胞并且在治疗上使用其以预防或减少肿瘤细胞生长的化学试剂。化学治疗剂有时也被称作抗肿瘤或细胞毒性药物或药剂,并且在所属领域中是众所周知的。
在一些实施方案中,化学治疗剂包含蒽环霉素、烷基化剂、烷基磺酸盐、氮丙啶、乙烯亚胺、甲基三聚氰胺、氮芥、亚硝基脲、抗生素、抗代谢物、叶酸类似物、嘌呤类似物、嘧啶类似物、酶、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、含铂剂、干扰素和白介素。示例性化学治疗剂包括但不限于烷基化剂(环磷酰胺、二氯甲二乙胺、马法兰(mephalin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、六甲基三聚氰胺、噻替派(thiotepa)、白消安(busulfan)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine))、抗代谢物(甲胺喋呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他汀(pentostatin))、长春花生物碱(vinca alkaloid)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine))、表鬼臼毒素(依托泊苷(etoposide)、依托泊苷邻苯醌(etoposideorthoquinone)和替尼泊苷(teniposide))、抗生素(道诺霉素(daunorubicin)、小红莓(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、双蒽、放线菌素D、普卡霉素(plicamycin)、嘌呤霉素(puromycin)和短杆菌肽D(gramicidine D))、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、秋水仙碱(colchicine)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、吐根素(emetine)、美登素(maytansine)和安吖啶(amsacrine)。附加药剂包括氨苯乙哌啶酮(gminoglutethimide)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、丝裂霉素、六甲蜜胺(altretamine)、环磷酰胺、洛莫司汀(CCNU)、卡莫司汀(BCNU)、伊立替康(CPT-11)、阿仑单抗、六甲蜜胺、阿那曲唑(anastrozole)、L-天冬酰胺酶、阿扎胞苷(azacitidine)、贝伐单抗(bevacizumab)、贝瑟罗汀(bexarotene)、博莱霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、白消安、二甲睾酮calusterone)、卡培他滨(capecitabine)、塞内昔布(celecoxib)、西妥昔单抗、克拉屈滨(clofurabine)、阿糖胞苷、达卡巴嗪(dacarbazine)、地尼白介素(denileukin diftitox)、己烯雌酚(diethlstilbestrol)、多西他赛(docetaxel)、甲雄烷醇酮(dromostanolone)、表柔比星(epirubicin)、埃罗替尼(erlotinib)、雌莫司汀(estramustine)、依托泊苷、乙炔基雌二醇、依西美坦(exemestane)、氟尿苷(floxuridine)、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨(fludarabine)、氟他胺(flutamide)、氟维司群(fulvestrant)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他滨(gemcitabine)、戈舍瑞林(goserelin)、羟基脲、异贝莫单抗(ibritumomab)、艾达霉素(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊马替尼(imatinib)、干扰素α(2a、2b)、伊立替康、来曲唑(letrozole)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、亮丙立德(leuprolide)、左旋咪唑(levamisole)、氮芥、甲地孕酮(megestrol)、马法兰、巯基嘌呤、甲胺喋呤、甲氧呋豆素(methoxsalen)、丝裂霉素C、米托坦(mitotane)、米托蒽醌、诺龙(nandrolone)、诺非单抗(nofetumomab)、奥沙利铂(oxaliplatin)、太平洋紫杉醇、帕米膦酸盐(pamidronate)、培美曲塞(pemetrexed)、培加酶(pegademase)、培门冬酶(pegasparagase)、喷司他汀(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡霉素(plicamycin)、聚苯丙生(polifeprosan)、卟吩姆(porfimer)、丙卡巴肼(procarbazine)、奎纳克林(quinacrine)、利妥昔单抗、沙格司亭(sargramostim)、链脲菌素(streptozocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷(teniposide)、睾内酯(testolactone)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、噻替派、拓扑替康(topetecan)、托瑞米芬(toremifene)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、维甲酸(tretinoin)、尿嘧啶芥(uracilmustard)、伐柔比星(valrubicin)、长春瑞宾(vinorelbine)和唑来膦酸盐(zoledronate)。其它合适药剂是批准用于人类用途的药剂,包括将批准作为化学治疗剂或放射治疗剂并且所属领域中已知的药剂。这类药剂可由多个标准医师和肿瘤学家参考文献(例如《古德曼和吉尔曼治疗学的药理学基础(Goodman&Gilman's The Pharmacological Basis ofTherapeutics)》,第9版,McGraw-Hill,N.Y.,1995)中的任一种或由国家癌症研究所网站(fda.gov/cder/cancer/druglistfrarne.htm)引用,两者都会不时更新。
例如沙立度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)和泊马度胺(pomalidomide)的免疫调节药物(IMiD)刺激NK细胞和T细胞两者。如本文所提供,IMiD可与iPSC衍生治疗性免疫细胞一起用于癌症治疗。
除治疗性组合物中包括的iPSC衍生造血谱系细胞的分离的群体外,适于向患者施用的组合物还可包括一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂(例如,药学上可接受的培养基,例如细胞培养基)或其他药学上可接受的组分。医药学上可接受的载体和/或稀释剂部分地由所施用的特定组合物以及用于施用治疗组合物的特定方法决定。因此,本发明的实施方案的治疗组合物存在多种合适的配方(参见例如《雷明顿氏医药科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》第17版,1985年,其公开内容据此全文以引用方式并入)。
在一个实施方案中,治疗组合物包含利用本文中所公开的方法和组合物制造的多能细胞衍生T细胞。在一个实施方案中,治疗组合物包含利用本文所公开的方法和组合物制备的多能细胞衍生的NK细胞。在一个实施方案中,治疗组合物包含利用本文中所公开的方法和组合物制造的多能细胞衍生CD34+HE细胞。在一个实施方案中,治疗组合物包含利用本文所公开的方法和组合物制备的多能细胞衍生的HSC。在一个实施方案中,治疗组合物包含利用本文所公开的方法和组合物制备的多能细胞衍生的MDSC。可以通过静脉内、腹膜内、肠内或气管施用方法分开施用或与其他合适的化合物组合施用包含如本文所公开的iPSC衍生造血谱系细胞的群体的治疗组合物以实现所期望的治疗目标。
这些医药学上可接受的载体和/或稀释剂可以按照足以使治疗组合物的pH维持在约3与约10之间的量存在。因此,缓冲剂可以占总组合物的高达约5%(重量/重量)。治疗组合物中还可以包括电解质,例如但不限于氯化钠和氯化钾。在一个方面中,治疗组合物的pH在约4到约10的范围内。可替代地,治疗组合物的pH在约5到约9的范围内、在约6到约9的范围内或在约6.5到约8的范围内。在另一个实施方案中,治疗组合物包括pH在所述pH范围中的一种的缓冲液。在另一个实施方案中,治疗组合物的pH是约7。可替代地,治疗组合物的pH在约6.8到约7.4的范围内。在再另一个实施方案中,治疗组合物的pH是约7.4。
本发明还部分地提供医药学上可接受的细胞培养基在本发明的实施方案的特定组合物和/或培养物中的用途。这类组合物适于向人类受试者施用。一般来说,支持根据本发明的实施方案的iPSC衍生效应细胞的维持、生长和/或健康的任何培养基适用作医药学细胞培养基。在特定实施方案中,医药学上可接受的细胞培养基是无血清和/或无饲养层的培养基。在各种实施方案中,无血清培养基是无动物成分的,并且可以任选地是无蛋白质的。任选地,所述培养基可以含有生物医药学上可接受的重组蛋白。无动物成分培养基是指其中所述组分来源于非动物来源的培养基。重组蛋白置换无动物成分培养基中的原生动物蛋白质并且营养是从合成、植物或微生物来源获得。相比之下,无蛋白质培养基定义为实质上不含蛋白质。所属领域的技术人员将了解,上述培养基实例具有说明性并且决不限制适用于本发明的培养基配方,存在许多已知的且可供所属领域的技术人员使用的合适培养基。
iPSC衍生造血谱系细胞可具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的T细胞、NK细胞、NKT细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞、HSC、B细胞、骨髓衍生抑制细胞(MDSC)、调控巨噬细胞、调控树突状细胞或间充质基质细胞。在一些实施方案中,iPSC衍生造血谱系细胞具有约95%到约100%的T细胞、NK细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞或骨髓衍生抑制细胞(MDSC)。在一些实施方案中,本发明提供具有经纯化的T细胞或NK细胞的治疗组合物,例如具有约95%的T细胞、NK细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞或骨髓衍生抑制细胞(MDSC)的分离群的组合物以治疗需要细胞疗法的受试者。
在一个实施方案中,组合细胞疗法包含抗CD38治疗蛋白或肽和衍生自基因组工程改造的包含表1中所列的基因型的iPSC的NK细胞群,其中衍生NK细胞包含B2M阴性和CD38阴性。在另一个实施方案中,组合细胞疗法包含抗CD38抗体治疗蛋白或肽和衍生自基因组工程改造的包含表1中所列的基因型的iPSC的T细胞群,其中衍生T细胞包含B2M阴性和CD38阴性。在一些实施方案中,组合细胞疗法包含达雷木单抗、艾沙妥昔单抗或MOR202以及衍生自基因组工程改造的包含表1中所列的基因型的iPSC的NK细胞群或T细胞群,其中衍生NK细胞或T细胞包含B2M阴性、CD38阴性和CIITA阴性。在又一些其他实施方案中,组合细胞疗法包含达雷木单抗以及源自包含表1中所列的基因型的基因组工程化iPSC的NK细胞或T细胞的群体,其中衍生NK细胞或T细胞包含B2M阴性、CIITA阴性、CD38阴性以及外源CD16和CAR中的一者或多者。在再一些附加实施方案中,组合细胞疗法包含达土木单抗、艾沙妥昔单抗或MOR202以及衍生自基因组工程改造的包含表1中所列的基因型的iPSC的NK细胞群或T细胞群,其中衍生NK细胞或T细胞包含B2M阴性、CD38阴性和CIITA阴性以及外源CD16、CAR和一种或多种外源细胞因子信号复合体中的一者或多者。
如所属领域的普通技术人员将理解,基于本文中的方法和组合物的源自iPSC的自体和同种异体造血谱系细胞两者可在如上所述的细胞疗法中使用。对于自体移植来说,衍生造血谱系细胞的分离群体相对于患者是完全或部分HLA匹配的。在另一个实施方案中,衍生造血谱系细胞不与受试者HLA匹配,其中衍生造血谱系细胞是包含HLA-I缺乏和任选地HLA-II缺乏的NK细胞或T细胞。
在一些实施方案中,治疗组合物中衍生造血谱系细胞的数目是每剂量至少0.1×105个细胞、至少1×105个细胞、至少5×105个细胞、至少1×106个细胞、至少5×106个细胞、至少1×107个细胞、至少5×107个细胞、至少1×108个细胞、至少5×108个细胞、至少1×109个细胞或至少5×109个细胞。在一些实施方案中,治疗组合物中的衍生造血谱系细胞的数目为每剂量约0.1×105个细胞至约1×106个细胞;每剂量约0.5×106个细胞至约1×107个细胞;每剂量约0.5×107个细胞至约1×108个细胞;每剂量约0.5×108个细胞至约1×109个细胞;每剂量约1×109个细胞至约5×109个细胞;每剂量约0.5×109个细胞至约8×109个细胞;每剂量约3×109个细胞至约3×1010个细胞,或其间的任何范围。一般来讲,1×108个细胞/剂量转化为对于60kg的患者/受试者1.67×106个细胞/千克。
在一个实施方案中,治疗组合物中衍生造血谱系细胞的数目是部分或单一脐带血中的免疫细胞数目,或是至少0.1×105个细胞/千克体重、至少0.5×105个细胞/千克体重、至少1×105个细胞/千克体重、至少5×105个细胞/千克体重、至少10×105个细胞/千克体重、至少0.75×106个细胞/千克体重、至少1.25×106个细胞/千克体重、至少1.5×106个细胞/千克体重、至少1.75×106个细胞/千克体重、至少2×106个细胞/千克体重、至少2.5×106个细胞/千克体重、至少3×106个细胞/千克体重、至少4×106个细胞/千克体重、至少5×106个细胞/千克体重、至少10×106个细胞/千克体重、至少15×106个细胞/千克体重、至少20×106个细胞/千克体重、至少25×106个细胞/千克体重、至少30×106个细胞/千克体重、1×108个细胞/千克体重、5×108个细胞/千克体重或1×109个细胞/千克体重。
在一个实施方案中,向受试者递送一定剂量的衍生造血谱系细胞。在一个例示性实施方案中,向受试者提供的细胞的有效量是至少2×106个细胞/千克、至少3×106个细胞/千克、至少4×106个细胞/千克、至少5×106个细胞/千克、至少6×106个细胞/千克、至少7×106个细胞/千克、至少8×106个细胞/千克、至少9×106个细胞/千克或至少10×106个细胞/千克或更多个细胞/千克,包括所有介于中间的细胞剂量。
在另一个例示性实施方案中,向受试者提供的细胞的有效量是约2×106个细胞/千克、约3×106个细胞/千克、约4×106个细胞/千克、约5×106个细胞/千克、约6×106个细胞/千克、约7×106个细胞/千克、约8×106个细胞/千克、约9×106个细胞/千克或约10×106个细胞/千克或更多个细胞/千克,包括所有介于中间的细胞剂量。
在另一个例示性实施方案中,向受试者提供的细胞的有效量是约2×106个细胞/千克至约10×106个细胞/千克、约3×106个细胞/千克至约10×106个细胞/千克、约4×106个细胞/千克至约10×106个细胞/千克、约5×106个细胞/千克至约10×106个细胞/千克、2×106个细胞/千克至约6×106个细胞/千克、2×106个细胞/千克至约7×106个细胞/千克、2×106个细胞/千克至约8×106个细胞/千克、3×106个细胞/千克至约6×106个细胞/千克、3×106个细胞/千克至约7×106个细胞/千克、3×106个细胞/千克至约8×106个细胞/千克、4×106个细胞/千克至约6×106个细胞/千克、4×106个细胞/千克至约7×106个细胞/千克、4×106个细胞/千克至约8×106个细胞/千克、5×106个细胞/千克至约6×106个细胞/千克、5×106个细胞/千克至约7×106个细胞/千克、5×106个细胞/千克至约8×106个细胞/千克或6×106个细胞/千克至约8×106个细胞/千克,包括所有介于中间的细胞剂量。
在一些实施方案中,衍生造血谱系细胞的治疗用途是单剂量治疗。在一些实施方案中,衍生造血谱系细胞的治疗用途是多剂量治疗。在一些实施方案中,多剂量治疗是每天、每3天、每7天、每10天、每15天、每20天、每25天、每30天、每35天、每40天、每45天或每50天或期间任何天数一次剂量。
包含本发明的衍生造血谱系细胞群的组合物可以是无菌的,并且可以适于施用和备好施用(即,可以在不进行任何进一步处理的情况下施用)给人类患者/受试者。准备好用于施用的基于细胞的组合物意指所述组合物在移植或施用到受试者之前不需要任何另外的加工或操纵。在其他实施方案中,本发明提供在与一种或多种包括小化学分子的药剂一起施用之前扩增和/或调节的衍生造血谱系细胞的分离群体。用于调节免疫细胞(包括iPSC衍生效应细胞)的组合物和方法更详细地描述于例如国际公布号WO2017/127755中,其相关公开内容以引用方式并入本文。对于被基因工程改造以表达重组TCR或CAR的衍生造血谱系细胞,可使用如例如美国专利6,352,694中所述的方法激活和扩增细胞。
在某些实施方案中,可以利用不同方案向衍生造血谱系细胞提供主要刺激信号和共刺激信号。举例来说,提供每种信号的试剂可以存在于溶液中或与表面偶联。与表面偶联时,所述试剂可以与相同表面(即,“顺式”形式)或个别表面(即,“反式”形式)偶联。可替代地,一种试剂可以与表面偶联并且另一种试剂存在于溶液中。在一个实施方案中,提供共刺激信号的试剂可以结合到细胞表面并且提供主要激活信号的试剂存在于溶液中或与表面偶联。在某些实施方案中,两种试剂都可以存在于溶液中。在另一个实施方案中,试剂可呈可溶形式,并且然后交联到表面,诸如表达Fc受体的细胞或抗体或其他粘合剂,其将结合于诸如美国公布号2004/0101519和2006/0034810(其公开内容以引用方式并入)中所公开的试剂以用于人工抗原呈递细胞(aAPC),其预期在本发明的实施方案中用于激活和扩增T淋巴细胞。
剂量、频率和方案必然会出现一些变化,这取决于所治疗受试者的病况。负责施用的人员将在任何情况下确定单独的受试者的合适剂量、频率和方案。
实施例
以下实例是为了说明,而非为了限制而提供。
实施例1–材料和方法
为了在与不同安全港基因座整合策略组合的不同启动子的控制下有效选择和测试自杀系统,使用本申请人的一种专用的hiPSC平台,其能够完成单一细胞传代和高通量的基于96孔板的流式细胞术分选,以便得到具有单一或多种基因调节的克隆hiPSC。
hiPSC在小分子培养物中的维持:一旦培养物的融合度达到75%-90%,hiPSC就作为单细胞常规传代。单一细胞解离时,hiPSC用PBS(联发科(Mediatech))洗涤一次并且在37℃下用阿库酶(Accutase)(密理博公司(Millipore))处理3-5分钟,随后移液以确保单一细胞解离。然后将单一细胞悬浮液与传统培养基等体积混合,在225×g下离心4分钟,再悬浮于FMM中并且接种于基质胶涂布的表面上。传代数通常为1:6-1:8,转移预先涂有基质胶的组织培养板在37℃下维持2-4小时并且每2-3天用FMM饲养。细胞培养物在设定为37℃和5%CO2的增湿培育箱中维持。
用ZFN、CRISPR进行人iPSC工程改造以靶向编辑所关注模式:使用ROSA26靶向插入作为示例,对于ZFN介导的基因组编辑,两百万个iPSC用2.5μg ZFN-L(FTV893)、2.5μg ZFN-R(FTV894)和5μg供体构建体的混合物转染以进行AAVS1靶向插入。对于CRISPR介导的基因组编辑,两百万个iPSC用5μg ROSA26-gRNA/Cas9(FTV922)和5μg供体构建体的混合物转染以进行ROSA26靶向插入。使用Neon转染系统(生命技术公司(Life Technologies))、使用参数1500V、10ms、3个脉冲进行转染。转染后第2天或第3天,如果所述质粒含有人工启动子驱动GFP和/或RFP表达盒,那么利用流式细胞术测量转染效率。转染后第4天,将嘌呤霉素按照开始7天0.1μg/ml和随后7天0.2μg/ml的浓度添加到培养基中以选择靶细胞。在嘌呤霉素选择期间,在第10天将细胞传代到基质胶涂布的新制孔上。在嘌呤霉素选择的第16天或更晚,通过流式细胞术分析存活细胞的GFP+iPS细胞百分比。
基因组编辑的iPSC的批量分选和克隆分选:嘌呤霉素选择20天之后,对使用ZFN或CRISPR-Cas9进行基因组靶向编辑的iPSC进行GFP+SSEA4+TRA181+iPSC的批量分选和克隆分选。将单一细胞解离的靶向iPSC池再悬浮于冷却的染色缓冲液中,该缓冲液含有汉克氏平衡盐溶液(联发科(Mediatech))、4%胎牛血清(英杰公司(Invitrogen))、1×青霉素/链霉素(联发科(Mediatech))和10mM Hepes(联发科(Mediatech));新鲜制备以达到最优性能。向细胞溶液中添加所结合的一级抗体,包括SSEA4-PE、TRA181-Alexa Fluor-647(BD生物科学公司(BD Biosciences)),并且在冰上培育15分钟。所有抗体都以每百万个细胞7μL/100μL染色缓冲液使用。所述溶液在染色缓冲液中洗涤一次,在225g下离心4分钟并且再悬浮于含有10μM噻唑维的染色缓冲液中并且在冰上维持以供流式细胞术分选。对FACS AriaII(BD生物科学公司(BD Biosciences))进行流式细胞术分选。批量分选时,将GFP+SSEA4+TRA181+细胞门控和分选到装填有7ml FMM的15ml标准管中。对于克隆分选,使用100μM喷嘴,按照每孔3个事件的浓度,将分选出的细胞直接喷射到96孔板中。每个孔预装填有200μLFMM,该FMM补充有5μg/mL纤维结合蛋白和1×青霉素/链霉素(联发科(Mediatech))并且预先经5×基质胶涂布整夜。5×基质胶预涂布包括将一个基质胶等分试样添加到5mL DMEM/F12中,然后在4℃下培育整夜以允许适当再悬浮并且最终以每孔50μL添加到96孔板中,随后在37℃下培育整夜。紧接在将培养基添加到各孔之前抽吸5×基质胶。完成分选后,在培育之前,96孔板在225g下离心1到2分钟。培养板保持不受干扰七天。第七天,从每个孔中去除150μL培养基并且用100μL FMM置换。分选后第10天,孔中再进料到另外100μL FMM中。早在第2天就检测出群落形成并且大部分群落在分选后第7天到第10天之间扩增。在第一次传代中,各孔用PBS洗涤且在37℃下用30μL阿库酶解离约10分钟。需要延长阿库酶处理反映了长期培养中已闲置的群落的紧密性。发现细胞解离之后,将200μL FMM添加到每个孔中并且吸移若干次以使群落破碎。将解离的菌落转移到此前涂布有5×基质胶的96孔培养板的另一孔,并且随后在培育之前在225g下离心2分钟。扩增之前,进行这种1:1传代以扩展早期群落。后续传代按常规方式用阿库酶处理3分钟-5分钟并且在FMM中、在预先涂有1×基质胶的较大孔中达到75%-90%融合度后以1:4-1:8扩增。分析每种克隆细胞系的GFP荧光水平和TRA1-81表达水平。选择具有接近100% GFP+和TRA1-81+的克隆系用于进一步筛选和分析,包括但不限于工程改造的iPSC的脱靶编辑和/或核型,然后将克隆群体冷冻保存并用作主细胞库。在Guava EasyCyte 8HT(密理博公司(Millipore))上进行流式细胞术分析并且使用Flowjo(FlowJo有限责任公司(FlowJo,LLC))分析。
实施例2-iPSC衍生的效应细胞中的HLA-I缺乏和CD16相容性
为了通过例如B2M敲除实现HLA复合体修饰,用靶向B2M的gRNA对转染iPSC系以进行CRISPR介导的编辑。随后对B2M编辑的iPSC进行遗传工程改造以敲除CD38并插入外源CD16,诸如hnCD16,从而生成包含B2M-/-、CD38-/-和CD16的修饰的iPSC。在iPSC克隆选择、转基因拷贝数验证和核型验证后,然后根据本文提供的方法使包含CD38-/-CD16的基因组编辑的HLA-I缺乏的克隆iPSC分化以生成具有CD38-/-CD16的HLA-I缺乏的效应细胞(HLA-I剔除CD38-/-CD16)。具有B2M野生型和CD38-/-CD16的iPSC衍生的效应细胞也类似地通过具有HLA-IWTCD38-/-CD16的iPSC获得,并且用作HLA-I缺乏的效应细胞的表型和功能分析的对照。
衍生自B2M野生型或B2M敲除iPSC背景的iNK被分化和扩增。对NK细胞标记使用流式细胞术分析的表型显示,来自两种背景的细胞对于典型的NK细胞标记共享高度相似的表面轮廓(图1A)。
衍生自B2M野生型或B2M敲除iPSC背景的iNK除CD38敲除外还包含hnCD16。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是通过将CD16结合到抗体涂布的靶细胞的NK细胞介导的裂解的机制。为了评估ADCC功能,将表达hnCD16的B2M-/-iNK细胞与Nalm-6白血病细胞系在存在和不存在抗CD38抗体(例如,达雷木单抗)的情况下共培养。共培养48小时的细胞的流式细胞术分析显示,与B2M WT iNK系相比,B2M-/-iNK系显示高度相似水平的ADCC活性(图1B)。因此,HLA-I缺乏不会负面影响B2M-/-CD16效应细胞中通过外源CD16的ADCC机制。
实施例3-HLA缺乏、CD38调节和对效应细胞的同种异体排斥保护
在该测定中,所用的iNK细胞包含B2M-/-CIITA-/-CD38-/-hnCD16,并且因此与HLA-I和HLA-II均完整的相同特异性供体背景的WT iNK相比,HLA-I和HLA-II均缺乏(图2A中的双敲除,“dKO”或“B2M/CIITA KO”)。所有细胞群体都显示缺乏CD38表达。将已经激发和扩增的同种异体供体T细胞(E)与dKO iNK和WT iNK细胞(T)中的每一者以1:1的E:T比率(同种异体T细胞:iNK)共培养。如图2B中所示,与针对B2MWT iNK细胞相比,同种异体T细胞显示出攻击这些HLA-I缺乏的iNK的能力降低。因此,HLA-I缺乏对同种异体T细胞反应性是保护性的,并且可促进在同种异体细胞疗法环境中更大的效应细胞存留。
以前,已经确定免疫抑制蛋白诸如HLA-E或HLA-G在HLA-I缺乏的效应细胞上的表达可以防止同种异体外周血NK(pbNK)细胞的增殖,并且因此降低pbNK细胞对效应细胞的识别和细胞毒性。另外,避免裂解的HLA-E或HLA-G的修饰型式可进一步增强HLA-I缺乏的效应细胞的存留。为了测试各种配体的抑制效果,将来自18个供体的pbNK细胞与表达所指示的抑制配体的K562靶细胞共培养,并且表达特异性HLA受体的NK细胞亚群的细胞毒性的所得倍数变化示于图3中。如图所示,表达HLA-E表面的效应细胞可以使表达抑制受体NKG2A的NK细胞失活,但也观察到HLA-E表面表达活化pbNK细胞的NKG2C,这导致不利影响,包括pbNK细胞识别和最终杀伤HLA-E表达细胞。数据表明,NK细胞亚群对包括CD47和HLA-E信号传导的抑制途径有抗性。因此,由于识别HLA-E和HLA-G的抑制性受体是随机表达的,即它们不被所有细胞表达,而且还存在识别HLA-E(和可能的HLA-G)的对应活化受体,该对应活化受体可能会导致加速排斥,因此HLA-E/G似乎不能提供对基于原代NK细胞的识别的完全保护。
为了避免HLA-E/G在HLA-I缺乏的细胞中对同种异体原代NK的渗漏保护,本申请提供了替代或附加方法,其提供更完全的保护以减少pbNK对HLA-I缺乏(例如,B2M KO)或HLA-I和HLA-II缺乏(例如,B2M/CIITA dKO)效应细胞的识别和细胞毒性。不需要HLA-E/G修饰的所述方法通过使用抗CD38抗体的CD38调节来去除由效应细胞活化的pBNK细胞,而不会由于它们缺乏CD38表达而对效应细胞造成不利影响。
如图4所示,将B2MWTCD38-/-或B2M-/-CD38-/-iNK细胞与从健康供体分离的同种异体pbNK细胞共培养,并用IL15以1:5或1:1的E:T比率(pbNK:iNK)激发过夜。在0μg/ml达雷木单抗下,与对B2MWTCD38-/-iNK细胞的pbNK细胞毒性相比,对B2M-/-CD38-/-iNK细胞的pbNK细胞毒性水平更高,这与HLA-I缺乏细胞对NK细胞裂解的敏感性一致。然而,在达雷木单抗存在的情况下的共培养物降低了对B2M-/-CD38-/-iNK细胞的pbNK细胞毒性,该细胞适于通过CD38特异性抗体进行CD38调节。因此,CD38调节对HLA-I缺乏的细胞提供保护作用,否则HLA-I缺乏细胞会受到宿主原代NK细胞识别和细胞毒性的影响。
在单独的实验中,来自健康供体的同种异体pbNK细胞用不同浓度的达雷木单抗一式两份地预处理48小时,如图5A和图5B所示。48小时后,将B2MWTCD38-/-、B2M-/-CD38-/-或B2M-/-CIITA-/-CD38-/-iNK细胞以1:1(pbNK:iNK)的比率添加到适当的孔中,并将细胞培养另外48小时。如图5B中所示,用达雷木单抗预处理显著降低了共培养物中的pbNK计数,这显示为针对无达雷木单抗孔归一化,从而导致B2M KO和B2M/CIITA dKO计数的增加,这表明针对同种异体排斥的保护(图5A)。
在随后的测定中,来自不同健康供体的同种异体PBMC(外周血单核细胞,包括T细胞、NK细胞和其他免疫细胞)各自单独培养或与CD38-/-iNK细胞共培养。与单独培养时表达CD38的PBMC亚群的大小(图6A,第9天培养)相比,用同种异体CD38-/-iNK细胞激发并因此在共培养物中经历iNK细胞的同种异体识别的PBMC具有提高的CD38表达,导致表达CD38的同种异体反应性PBMC亚群的大小增加(图6B,第9天共培养)。这一观察结果表明,在同种异体效应细胞的输注期间或之后的CD38调节步骤(例如,抗CD38抗体输注)可有效促进过继效应细胞疗法中更大的效应细胞存留,前提条件是效应细胞不受CD38调节步骤中使用的CD38拮抗剂的攻击。
进一步分析包括混合淋巴细胞反应(MLR),其中同种异体PBMC与具有B2M-/-、CD38-/-、IL15RF和hnCD16的iPSC衍生的iNK细胞以5:1比率(在存在或不存在达雷木单抗的情况下)共培养(即,10μg,5μg,1μg,0.1μg,0.01μg,以及无达雷木单抗;图7A和图7B)。在每种达雷木单抗剂量条件下,在共培养的第11天收集PBMC计数和iNK细胞计数。如图7A所示,PBMC细胞计数在存在达雷木单抗的情况下以剂量依赖性方式降低。尽管HLA-I缺乏的效应细胞被保护免于T细胞介导的同种异体反应性(参见上文和图2),但PBMC中的pbNK细胞由于它们的HLA-I缺乏而呈现针对这些细胞的同种异体反应性,并导致HLA-I缺乏的效应细胞裂解(参见图7A和图7B的“无达雷木单抗”列)。因此,单独的HLA缺乏可能不足以延长同种异体效应细胞存活。在该测定中,观察到iPSC衍生的HLA-I缺乏细胞对同种异体PBMC反应性的敏感性在存在达雷木单抗的情况下得到挽救,并且更明显地,在高于约0.01μg的剂量水平下得到挽救。因此,观察到达雷木单抗对同种异体反应性宿主细胞的消除和供体iNK细胞的改善的存活的剂量依赖性作用。
将健康供体PBMC与HLA-I缺乏的iNK细胞(B2M-/-、CD38-/-、IL15RF和hnCD16)在存在或不存在达雷木单抗(例如,10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml,并且没有达雷木单抗)的情况下共培养的MLR测定结果也与供体PBMC与具有CD38-/-、IL15RF和hnCD16的iNK细胞(即,B2M WT iNK)共培养的MLR测定结果进行比较。在每种剂量水平的共培养过程中(>15天),达雷木单抗对同种异体反应性宿主细胞(PBMC)的消除和具有HLA-I缺乏和CD38敲除的供体iNK细胞在延长的时间段内改善存活的作用(图8A和8B),其中iNK细胞计数以达雷木单抗的剂量依赖性方式增加。WT iNK共培养物(图8C)中PBMC的绝对T细胞计数表明达雷木单抗防止T细胞扩增,并且在iNK上的B2M KO(图8D)足以防止T细胞扩增。WT iNK共培养物(图8E)和B2M KO iNK共培养物(图8E)两者中的PBMC的绝对pbNK细胞计数表明达雷木单抗也防止pbNK细胞扩增。在不受理论束缚的情况下,对效应iNK细胞针对同种异体反应性宿主细胞的保护的协同效应可能是由于多种原因,包括但不限于:(1)效应iNK细胞的HLA-I缺乏减少它们由于宿主同种异体反应性T细胞的消除;(2)同种异体效应细胞激发上调PBMC中同种异体反应性细胞的CD38表达,从而增加同种异体反应性宿主细胞对抗CD38的敏感性;(3)通过外源CD16增强的ADCC实现抗CD38抗体靶向;以及(4)效应细胞的CD38-/-表型避免了抗CD38抗体靶向,而抗体特异性地消除表达CD38的同种异体反应性宿主细胞。
如图9A至图9C所指示,通过流式细胞术分析以上关于图8A至图8F所述的相同共培养物的样品在HLA-A2+PBMC中CD25、4-1BB和CD38的表达(iNK为HLA-A2阴性)。数据显示iNK上的B2M KO足以降低PBMC中的CD38+CD25+、CD38+41BB+和CD25+41BB+活化(分别为图9A、图9B和图9C)。此外,达雷木单抗治疗减少了与WT iNK的培养物中的活化CD25+41BB+PBMC(图9D)。累积的数据进一步表明B2M KO和达雷木单抗的组合可以有效地抑制同种异体T细胞和NK细胞反应。此外,数据表明另外的或可选择的策略的潜力,其中4-1BB同种异体反应性细胞可以通过活化靶向同种异体防御受体(ADR)的4-1BB而被选择性地耗尽。一些示例性ADR描述于例如WO 2019/210081中,该专利以引用方式并入本文。
在单独的MLR测定中,将同种异体PBMC与具有B2M-/-、CIITA-/-、CD38-/-、IL15RF和hnCD16(B2M/CIITA dKO)的iPSC衍生的iNK细胞在存在或不存在达雷木单抗(在10μg,1μg,0.1μg,或无达雷木单抗)的情况下共培养。如图10A所示,与达雷木单抗共培养物以剂量依赖性方式保护与HLA错配的PBMC共培养的iNK细胞。绝对同种异体反应性NK细胞计数(图10B)表明,当B2M/CIITA dKO iNK细胞与HLA错配的PBMC共培养时,达雷木单抗也以剂量依赖性方式防止同种异体反应性NK细胞扩增。与具有完整HLA-I和HLA-II的B2M/CIITAWTiNK细胞(即具有CD38-/-、IL15RF和hnCD16的iNK细胞,示出为“WT iNK”)相比,B2M/CIITA dKO iNK细胞的流式细胞术分析表明当与HLA错配的PBMC共培养时,B2M/CIITA dKO iNK细胞不刺激CD4+和CD8+T细胞的扩增(图10C)。总之,这些数据支持B2M/CIITA dKO和达雷木单抗的组合可以有效地抑制同种异体T细胞和NK细胞反应。
实施例4-抗CD38抗体延长了效应细胞针对原代/宿主细胞的存活和存留
为了评价pbNK细胞与针对效应细胞的抗CD38抗体的组合通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)介导的自相残杀的程度,进行基于流动的胱天蛋白酶3/7杀伤测定。在该测定中,将iPSC衍生的CAR-T(CAR-iT)细胞与pbNK细胞在存在作为阴性对照的抗CD38单克隆抗体达雷木单抗或抗CD 20单克隆抗体利妥昔单抗的情况下共培养约3小时,该iPSC衍生的CAR-T细胞包含在TRAC基因座处引入的示例性CD19-CAR和CD38KO(“CD38KO iT”)或CD38野生型(“WT iT”)。将两种抗体以1:3从约30μg/ml连续稀释至0。以约1E5个细胞/孔接种CAR-iT细胞,并以3:1比率添加pbNK细胞。通过差异荧光标记区分iT细胞和pbNK细胞,并且通过流式细胞术使用胱天蛋白酶3/7活性的报告子独立地评估每种细胞类型的特异性细胞毒性(细胞死亡)。
pbNK细胞表达内源CD16和CD38,使得如图11A中所示,pbNK细胞在CD16介导的ADCC的存在下以抗CD38 mAb剂量依赖性方式经历抗CD38定向的自相残杀,而抗CD20 mAb(阴性对照)对这些细胞没有影响。图11B中示出的对iT细胞特异性的细胞毒性证明当与pbNK和抗CD38 mAb组合时,WT iT细胞而不是C38 KO iT细胞对ADCC敏感。表达CD16的pbNK细胞识别并杀死用抗CD38 mAb包被的WT iT细胞,而CD38 KO iT细胞对与抗CD38组合的pbNK细胞的ADCC有抗性,因为CD38特异性mAb不能结合CD38 KO iT细胞并经由CD16交联诱导pbNK活化。
为了在体内测试达雷木单抗是否可以耗尽pbNK细胞,在MLR测定中将pbNK细胞输注到NSG小鼠或IL15转基因NSG小鼠(NSG-ILtg)中,并且随着时间推移监测输注的pbNK细胞在外周血中的存留。简言之,将pbNK和iNK细胞单独或与一剂达雷木单抗一起输注。细胞计数针对无达雷木单抗组被归一化。如图12中所示,pbNK细胞在NSG-ILtg模型中存留(>第22天),而添加达雷木单抗逆转了细胞的存活,这与体外观察一致。
在该分析中的另一个观察结果是,抗CD38抗体的剂量可以被控制,并且因此可以在同种异体效应细胞的不利影响的情况下以可控制的方式逐渐减少或排除,使得效应细胞通过同种异体排斥被去除。此外,抗CD38抗体还可用作在输注同种异体效应细胞之前消除同种异体反应性细胞的预处理策略,并且因此可暂时与输注同种异体效应细胞分开。这些优点是通过将HLA-E/G整合到HLA-I缺乏效应细胞中以克服外周T细胞、NK细胞和其他同种异体反应性细胞的同种异体排斥所不能提供的优点,提供了治疗过程中的灵活性和在治疗期间响应患者反应的效应细胞数量的控制方式。
还在体内进一步评估了在原代NK细胞的存在下CD38调节对B2M KO iNK和B2M/CIITA dKO iNK细胞的存活和存留的影响。随后将WT iNK细胞、B2M KO iNK细胞和B2M/CIITA dKO iNK细胞与和不与达雷木单抗一起输注到NSG-ILtg小鼠中,并在约第14天评估和比较外周血、脾和骨髓中的iNK细胞的存留。当单独输注pbNK细胞时,在循环中检测到pbNK,但在存在达雷木单抗的情况下显著降低(图13A)。如图所示,当WT iNK细胞、B2M KOiNK细胞和B2M/CIITA dKO iNK细胞各自单独输注而没有pbNK细胞时,供体iNK细胞中的每一者以相似的水平在循环中存留(图13B)。与pbNK共输注的WT iNK细胞在存在和不存在达雷木单抗的情况下存留(图13C)。然而,与pbNK共输注的B2M KO iNK细胞和B2M/CIITA dKOiNK细胞在不存在达雷木单抗的情况下被pbNK排斥,而在存在达雷木单抗的情况下被保护免于pbNK同种异体排斥(图13D和图13E)。此外,在血液、脾和骨髓中,pbNK在存在达雷木单抗的情况下显著降低,这导致B2M KO和B2M/CIITA KO iNK的存留(图14A)。此外,达雷木单抗显著降低了CD38+pbNK的数量,这有助于保护INKPS免受PBNK同种异体排斥(图14B和图14C)。因此,与抗CD38抗体调节处理的共输注逆转了pbNK对HLA-I缺乏细胞的细胞毒性对B2M KO和B2M/CIITA dKO细胞的选择性耗竭,从而导致其改善的存活。
与B2M WT CD38KO hnCD16 IL15RF iNK细胞(示出为“WT”)相比,B2M KO CD38KOhnCD16 IL15RF iNK细胞(“B2M KO”和“B2M/CIITA dKO”)在存在抗CD38的情况下延长的寿命,以及相关联的从相应组织样品中清除CD38+亚群(外周NK细胞、活化的B细胞和T细胞)表明了抗CD38抗体通过靶向其上调的CD38来抑制活化的受体免疫细胞的能力,从而在B2M KO或B2M/CIITA dKO效应细胞的受体中减少针对不是抗CD38抗体靶标的同种异体效应细胞的同种异体排斥,如本文提供的。
在接受过继性细胞疗法的人类受试者中进一步评价CD38调节对宿主免疫重构的作用。如图15中所示,用CD38KO hnCD16 iNK效应细胞组合达雷木单抗治疗的四个多发性骨髓瘤患者(受试者A-D)的绝对淋巴细胞分布(由沿x轴的箭头指示)显示,使用达雷木单抗抑制淋巴耗竭化学疗法(LDC;受试者A-D))后的淋巴细胞恢复,与不接受达雷木单抗的患者(代表性受试者E)相反,其中淋巴细胞恢复在D4开始并继续至治疗周期结束。来自受试者A(其在LDC之前和之后每周接受达雷木单抗)的淋巴细胞数据进一步进行均匀流形近似和投影(UMAP)可视化。如图16所示,来自每个时间点的重叠淋巴细胞数据文件通过颜色示出了不同细胞类型的聚类。按时间点进行的单个UMAP可视化显示了筛选时内源CD4+T细胞、B细胞和NK细胞上的CD38表达。如图所示,达雷木单抗在LDC之前通过C1D-5消除了大部分表达CD38的淋巴细胞,并且在治疗周期期间维持对表达CD38的细胞的抑制。因此,在抗CD38抗体的存在下,观察到的CD38+亚群(外周NK细胞、活化的B细胞和T细胞)的清除进一步支持抗CD38抗体通过靶向其上调的CD38来抑制活化的受体免疫细胞的能力,从而减少针对本文提供的效应细胞的受体中的同种异体效应细胞的排斥,并延长过继性细胞疗法的机会窗口。
所属领域技术人员将容易地了解,本文所描述的方法、组合物和产物代表示例性实施方案,并且不预期限制本发明的范围。对于所属领域的技术人员显而易见的是,可以对本文所公开的本公开进行各种取代和修改而不脱离本发明的范围和实质。
本说明书中提到的所有专利和公开案都指示本公开所属领域的技术人员的技能水平。所有专利和公开案以引用的方式并入,其程度如同每一个别公开案专门并且单独指定为以引用的方式并入。
本文说明性描述的本公开可以在本文未特别公开的任何成分、限制不存在的情况下适当地实施。因此,例如,在本文中的每一种情况下,术语“包含”、“主要由……组成”和“由……组成”中的任一个可由其它两个术语中的任一个替换。已使用的术语和表述是作为描述而非限制的术语使用,并且使用这类术语和表述时,不希望排除所示和所述特点的任何等效物或其一部分,而是应认识到,在所要求的本公开的范围内可以存在各种修改。因此,应理解,虽然本公开已通过优选实施方案和任选存在的特点进行特别地公开,但所属领域的技术人员可以对本文中所公开的观点进行修改和变化形式,且这类修改和变化形式被视为属于如所附权利要求书限定的本发明范围内。

Claims (35)

1.一种细胞或其群体,其中:
(i)所述细胞是诱导性多能细胞(iPSC)、克隆iPSC、iPS细胞系细胞;或通过分化所述iPSC获得的衍生细胞;
(ii)所述细胞包含(a)HLA-I缺乏;(b)CD38敲除;以及任选地,(c)编码CD16或其变体的外源多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的细胞或其群体,其中所述细胞还包括以下中的一者或多者:
(i)编码细胞因子信号传导复合体的外源多核苷酸,所述细胞因子信号传导复合体包含细胞表面表达的外源细胞因子和/或其受体的部分或完整肽;
(ii)编码嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸;
(iii)HLA-II缺乏;以及
(iv)编码HLA-G、HLA-E或其变体的外源多核苷酸;
其中在结合CD38调节的过继性细胞疗法中,在同种异体反应性宿主细胞的存在下,所述细胞具有改善的存留。
3.根据权利要求1所述的细胞或其群体,其中所述细胞:
(i)包含表1中所列的基因型中的至少一者;
(ii)包含CD58和CD54中的一者或两者的敲除;
(iii)包含B2M、CIITA、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD25、CD69、CD44、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT中的至少一者的破坏;
(iv)包含4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、TCR、Fc受体、抗体或其功能性变体或片段、检查点抑制剂、衔接子和用于与双特异性或多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体中的至少一者的引入;
和/或
(v)不包含编码HLA-G、HLA-E或其变体的外源多核苷酸;
其中所述HLA-I缺乏包含以下中的至少一者的破坏:B2M、TAP1、TAP2和TAP相关蛋白;和/或
其中所述HLA-II缺乏包含以下中的至少一者的破坏:CIITA、RFX5、RFXAP和RFXANK。
4.根据权利要求1所述的细胞或其群体,其中所述衍生细胞:
(a)包含衍生CD34+细胞、衍生造血干细胞和祖细胞、衍生造血多能祖细胞、衍生T细胞祖细胞、衍生NK细胞祖细胞、衍生T细胞、衍生NKT细胞、衍生NK细胞或衍生B细胞;或者
(b)用作同种异体效应细胞,其中所述效应细胞是具有以下特性中的至少一种特性的衍生NK细胞或衍生T细胞,所述特性包括:与由外周血、脐带血或任何其他供体组织获得的其原生对应细胞相比,
(i)改善的存留和/或存活;
(ii)对活化的受体免疫细胞的增加的抗性;
(iii)增加的细胞毒性;
(iv)改善的肿瘤渗透;
(v)增强或获取的ADCC;
(vi)旁观者免疫细胞迁移到肿瘤部位和/或激活或募集到肿瘤部位的能力增强;
(vii)降低肿瘤免疫抑制的能力增强;
(viii)挽救肿瘤抗原逃逸的能力提高;以及
(ix)减少的自相残杀。
5.根据权利要求1所述的细胞或其群体,其中所述CD16或其变体包括以下中的至少一者:
(a)高亲和力不可裂解的CD16(hnCD16)或其变体;
(b)CD16的胞外域中的F176V和S197P;
(c)源自CD64的全部或部分胞外域;
(d)非原生(或非CD16)跨膜结构域;
(e)非原生(或非CD16)胞内结构域;
(f)非原生(或非CD16)信号传导结构域;
(g)非原生刺激结构域;以及
(h)并非源自CD16并且源自相同或不同多肽的跨膜结构域、信号传导结构域和刺激结构域。
6.根据权利要求5所述的细胞或其群体,其中:
(a)所述非原生跨膜结构域衍生自CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或T细胞受体(TCR)多肽;
(b)所述非原生刺激结构域衍生自CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4或NKG2D多肽;
(c)所述非原生信号传导结构域衍生自CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(4-1BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C或NKG2D多肽;或者
(d)所述非原生跨膜结构域衍生自NKG2D,所述非原生刺激结构域衍生自2B4,并且所述非原生信号传导结构域衍生自CD3ζ。
7.根据权利要求2所述的细胞或其群体,其中所述CAR是:
(i)T细胞特异性或NK细胞特异性的;
(ii)双特异性抗原结合CAR;
(iii)可切换的CAR;
(iv)二聚化CAR;
(v)分离CAR;
(vi)多链CAR;
(vii)诱导性CAR;
(viii)任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中,与包含细胞表面表达的外源细胞因子和/或其受体的部分或完整肽的细胞因子信号传导复合体共表达;
(ix)任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中,与检查点抑制剂共表达;和/或
(x)任选地在以下处插入:
(1)TRAC或TRBC基因座,和/或由TCR的内源启动子驱动,
和/或所述TCR由所述CAR插入而敲除;
(2)安全港基因座;或者
(3)旨在用于破坏的基因座。
8.根据权利要求2所述的细胞或其群体,其中所述CAR:
(i)对CD19、BCMA、B7H3、MICA/B或MR1具有特异性;和/或
(ii)对以下中的任一者具有特异性:ADGRE2、碳酸酐酶IX(CAIX)、CCR1、CCR4、癌胚抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、巨细胞病毒(CMV)感染的细胞的抗原、上皮糖蛋白2(EGP-2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、EGFRvIII、受体酪氨酸-蛋白激酶erb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB叶酸结合蛋白(FBP)、胎儿型乙酰胆碱受体(AChR)、叶酸受体α、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、人类表皮生长因子受体2(HER2)、人类端粒酶逆转录酶(hTERT)、ICAM-1、整合素B7、白细胞介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)、κ-轻链、激酶插入域受体(KDR)、路易斯A(CA19.9)、路易斯Y(LeY)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、LILRB2、黑色素瘤抗原家族A1(MAGE-A1)、粘蛋白1(Muc-1)、粘蛋白16(Muc-16)、间皮素(MSLN)、NKCSI、NKG2D配体、c-Met、癌症-睾丸抗原NY-ESO-1、癌胚抗原(h5T4)、PRAME、前列腺干细胞抗原(PSCA)、PRAME前列腺特异性膜抗原(PSMA)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、TIM-3、TRBC1、TRBC2、血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)、威尔姆斯肿瘤蛋白质(WT-1)和病原体抗原。
9.根据权利要求2所述的细胞或其群体,其中所述细胞因子信号传导复合体包含:
(a)细胞表面表达的外源细胞因子和/或其受体的部分或全部肽,其包含IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21或它们的相应受体中的至少一者;或者
(b)以下中的至少一者:
(i)在其间具有自裂解肽的IL15和IL15Rα的共表达;
(ii)IL15和IL15Rα的融合蛋白;
(iii)IL15Rα的胞内结构域截短的IL15/IL15Rα融合蛋白(IL15Δ);
(iv)IL15与IL15Rα的膜结合的寿司结构域的融合蛋白;
(v)IL15和IL15Rβ的融合蛋白;
(vi)IL15和共同受体γC的融合蛋白,其中所述共同受体γC是原生的或经修饰的;以及
(vii)IL15Rβ的同源二聚体,
其中(i)-(vii)中的任一者任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中与CAR共表达;
以及任选地,
(c)瞬时表达。
10.根据权利要求1所述的细胞或其群体,其中所述细胞是衍生NK细胞或衍生T细胞,其中所述衍生NK细胞能够将T细胞募集和/或迁移到肿瘤部位上,并且其中所述衍生NK细胞或所述衍生T细胞能够在一种或多种检查点抑制剂存在下降低肿瘤免疫抑制。
11.根据权利要求10所述的细胞或其群体,其中所述一种或多种检查点抑制剂是针对一种或多种检查点分子的拮抗剂,所述检查点分子包含PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2AR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara(视黄酸受体α)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E或抑制性KIR。
12.根据权利要求10所述的细胞或其群体,其中所述一种或多种检查点抑制剂包括:
(a)阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、伊匹单抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗以及它们的衍生物或功能等效物中的一者或多者;或者
(b)阿特珠单抗、纳武单抗和帕博利珠单抗中的至少一种。
13.根据权利要求1所述的细胞或其群体,其中所述细胞包括:
(i)整合在一个安全港基因座或旨在用于破坏的基因座中的一种或多种外源多核苷酸;或者
(ii)整合在不同安全港基因座或旨在用于破坏的基因座中的超过两个外源多核苷酸。
14.根据权利要求13所述的细胞或其群体,其中所述一个或多个安全港基因座包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、TCR或RUNX1中的至少一者;或者其中所述一个或多个旨在用于破坏的基因座包含B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD71、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT。
15.根据权利要求2所述的细胞或其群体,其中所述CD38调节:
(i)通过包含抗CD38抗体或与CD38特异性结合的CAR(CD38-CAR)的CD38拮抗剂;
(ii)通过达雷木单抗、伊沙妥昔单抗或MOR202;
(iii)通过达雷木单抗;
(iv)包括在用于所述过继性细胞疗法的所述细胞或其群体的输注之前、期间或之后,将CD38拮抗剂施用于需要所述疗法的受试者;
(v)包括在输注预负载的细胞或其群体之前将CD38拮抗剂体外预负载到所述细胞或其群体;
(vi)消除或减少同种异体反应性宿主细胞的数量;
(vii)延迟宿主免疫重构;和/或
(viii)在需要所述过继性细胞疗法的受试者的同种异体反应性宿主细胞的存在下延长所述细胞或其群体的存活和存留。
16.根据权利要求2所述的细胞或其群体,其中所述同种异体反应性宿主细胞:
(i)包含与所述细胞或其群体同种异体的原代T细胞、B细胞和/或NK细胞;
(ii)对所述细胞或其群体的CD38调节敏感;和/或
(iii)经由CD38拮抗剂以剂量依赖性方式通过CD38调节而消除。
17.一种组合物,包含CD38拮抗剂以及根据权利要求1至16中任一项所述的细胞或其群体。
18.根据权利要求17所述的组合物,还包含一种或多种治疗剂。
19.根据权利要求18所述的组合物,其中所述一种或多种治疗剂包含肽、细胞因子、检查点抑制剂、丝裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或其置换因子、包含一种或多种所关注多核酸的载体、抗体、化学治疗剂或放射性部分或免疫调节药物(IMiD)。
20.根据权利要求19所述的组合物,其中:
(i)所述检查点抑制剂包含:
(a)检查点分子的一种或多种拮抗剂,所述检查点分子包括PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2AR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxp1、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、视黄酸受体α(Rara)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E或抑制性KIR;
(b)阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、伊匹单抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗和它们的衍生物或功能等效物中的一者或多者;
(c)阿特珠单抗、纳武单抗和帕博利珠单抗中的至少一者;或者
(ii)所述治疗剂包含维奈妥拉、阿扎胞苷和泊马度胺中的一者或多者。
21.根据权利要求19所述的组合物,其中所述抗体包含:
(a)抗CD20抗体、抗HER2抗体、抗CD52抗体、抗EGFR抗体、抗CD123抗体、抗GD2抗体、抗PDL1抗体、抗CD25抗体、抗CD69抗体、抗CD71抗体或抗CD44抗体;或者
(b)利妥昔单抗、维妥珠单抗、奥法木单抗、乌妥昔单抗、奥卡妥珠单抗、奥妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、阿伦单抗、西妥昔单抗、迪妥昔单抗、阿维鲁单抗、达克利珠单抗、巴利昔单抗、M-A251、2A3、BC69、24204、22722、24212、MAB23591、FN50、298614、AF2359、CY1G4、DF1513、比伐珠单抗、RG7356、G44-26、7G3、CSL362、依托珠单抗和它们的人源化或经过Fc修饰的变体或片段和它们的功能等效物及其生物类似物中的一者或多者。
22.根据权利要求17所述的组合物,其中所述CD38拮抗剂:
(i)包含抗CD38抗体或CD38-CAR;
(ii)包含达雷木单抗、伊沙妥昔单抗或MOR202;
(iii)包含达雷木单抗;或者
(iv)在所述细胞或其群体的输注之前、期间或之后,被提供给需要过继性细胞疗法的所述受试者。
23.根据权利要求17至22中任一项所述的组合物通过将所述组合物引入到需要过继性细胞疗法的受试者来实现的治疗用途,其中所述受试者患有:自身免疫性障碍、血液系统恶性肿瘤、实体瘤、癌症或病毒感染。
24.一种在向有需要的受试者提供的过继性细胞疗法中减少或防止宿主细胞针对同种异体效应细胞的同种异体反应性的方法,其中所述同种异体效应细胞包括根据权利要求1至16中任一项所述的细胞或其群体,并且其中所述方法包括CD38调节。
25.根据权利要求24所述的方法,其中所述宿主细胞包括同种异体反应性免疫细胞,其包括原代T细胞、B细胞和/或NK细胞。
26.根据权利要求24所述的方法,其中所述CD38调节:
(i)包括在将所述同种异体效应细胞输注给所述受试者之前、期间或之后向所述受试者施用CD38拮抗剂;或者
(ii)包括在将所述同种异体效应细胞输注给所述受试者之前将CD38拮抗剂体外预负载到所述同种异体效应细胞;
其中所述CD38调节(a)消除或减少同种异体反应性宿主细胞的数量;(b)将所述同种异体效应细胞的存活和存留延长至可由给定剂量的所述CD38拮抗剂控制的程度;和/或(c)延迟宿主免疫重构。
27.根据权利要求26所述的方法,其中所述CD38拮抗剂包含:
(i)抗CD38抗体或CD38-CAR;
(ii)达雷木单抗、伊沙妥昔单抗或MOR202;和/或
(iii)达雷木单抗。
28.根据权利要求26所述的方法,其中同种异体反应性宿主细胞包含上调的CD38表达。
29.根据权利要求24所述的方法,其中所述方法还包括向所述受试者施用治疗剂。
30.根据权利要求29所述的方法,其中所述治疗剂包含肽、细胞因子、检查点抑制剂、丝裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或其置换因子、包含一种或多种所关注多核酸的载体、抗体、化学治疗剂或放射性部分或免疫调节药物(IMiD)。
31.根据权利要求30所述的方法,其中:
(i)所述检查点抑制剂包含:
(a)检查点分子的一种或多种拮抗剂,所述检查点分子包括PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2AR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxp1、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara(视黄酸受体α)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E或抑制性KIR;
(b)阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、伊匹单抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗和它们的衍生物或功能等效物中的一者或多者;或者
(c)阿特珠单抗、纳武单抗和帕博利珠单抗中的至少一者;或者
(ii)所述治疗剂包含维奈妥拉、阿扎胞苷和泊马度胺中的一者或多者。
32.根据权利要求24所述的方法,其中所述方法不需要或最少需要利用环磷酰胺和氟达拉滨(Cy/Flu)的组合进行的淋巴耗竭。
33.一种治疗需要过继性细胞疗法的受试者的方法,其中所述方法包括向所述受试者施用CD38拮抗剂以进行CD38调节并输注根据权利要求1至16中任一项所述的细胞或其群体。
34.根据权利要求33所述的方法,其中所述CD38调节:
(i)减少或防止宿主细胞对所述同种异体效应细胞的同种异体反应性;
(ii)消除或减少同种异体反应性宿主细胞的数量;
(iii)延长所述同种异体效应细胞的存活和存留;
(iv)延迟宿主免疫重构;
(v)经由HLA-G或HLA-E的过表达防止所述同种异体效应细胞对宿主细胞的同种异体反应性的渗漏保护;和/或
(vi)增加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)可用性,减少NAD消耗相关的细胞死亡,并支持细胞再生。
35.根据权利要求33所述的方法,其中所述方法不需要或最少需要利用环磷酰胺和氟达拉滨(Cy/Flu)的组合进行的淋巴耗竭。
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