PT2311874T - Moléculas de ligação - Google Patents

Description

DESCRIgAO "MOLÉCULAS DE LIGAQÁO"

Campo da Invengáo A presente invengáo refere-se a um método para a produgao de anticorpos apenas de cadeia pesada em ratinhos transgénicos.

Antecedentes da Invengáo

Os anticorpos monoclonais ou variantes dos mesmos representarao urna alta proporgáo dos novos medicamentos langados no século XXI. A terapia de anticorpo monoclonal já é aceite como urna via preferida para o tratamento de artrite reumatoide e doenga de Crohn e existe um progresso impressionante no tratamento do cancro. Também estáo em desenvolvimento produtos á base de anticorpos para o tratamento de doengas cardiovasculares e infecciosas. Os produtos de anticorpos monoclonais mais comercializados reconhecem e ligam um único epitopo bem definido no ligando alvo (por exemplo, TNFa). 0 fabrico de anticorpos monoclonais humanos para terapia permanece dependente da cultura de células de mamíferos. A montagem de um complexo constituido por duas cadeias pesadas e duas cadeias leves (o complexo H2L2) e os processos de glicosilagao pós- tradugao subsequentes impedem a utilizagao de sistemas bacterianos. Os custos de produgao e os custos de capital para o fabrico de anticorpos por cultura de células de mamífero sao elevados e ameagam limitar o potencial das terapias á base de anticorpos na ausencia de alternativas aceitáveis. Urna variedade de organismos transgénicos é capaz de expressar anticorpos totalmente funcionáis. Estes incluem plantas, insetos, galinhas, cabras e gado, mas nenhum aínda foi utilizado para o fabrico de produtos terapéuticos comercializados.

Os fragmentos de anticorpo funcionáis podem ser fabricados em E.coli, mas o produto tem geralmente baixa estabilidade no soro a menos que seja peguilado durante o processo de fabrico.

Os complexos de anticorpos biespecíficos sao concebidos em moléculas á base de Ig capazes de ligar dois epítopos diferentes no mesmo antigénio ou em antigénios diferentes. As proteínas de ligagao biespecíficas que incorporam anticorpos isolados ou em combinagao com outros agentes de ligagáo sao promissoras para modalidades de tratamento, onde as fungóes imunológicas humanas capturadas induzem um efeito terapéutico, por exemplo, a eliminagao de agentes patogénicos (Van Spriel et al., (1999) J. Infect. Diseases, 179, 661-669; Tacken et al, (2004) J. Immunol, 172, 4934-4940;US 5487890), o tratamento do cancro (Glennie e van der Winkel, (2003) Drug Discovery Today, 8, 503-5100); e imunoterapia (Van Spriel et al., (2000) Immunol.

Today, 21, 391-397; Segal et al., (2001) J. Immunol Methods, 248, 1-6; Lyden et al., (2001) Nat. Med., 7, 1194-1201).

Os problemas de fabrico aumentara quando um produto de anticorpo biespecífico se baseia em dois ou mais complexos H2L2. Por exemplo, a coexpressáo de dois ou mais conjuntos de genes de cadeias pesada e leve podem resultar na formagao de até 10 combinagoes diferentes, apenas urna das quais é o heterodímero desejado (Suresh et al., (1986) Methods Enzymol., 121,210-228). A fim de resolver este problema foi desenvolvida urna série de estratégias para a produgáo em células de mamíferos de formatos de IgG biespecífica de comprimento total (BsIgG) que mantém a fungáo efetora da cadeia pesada. As BsIgGs requerem cadeias pesadas manipuladas de "botao e buraco" para impedir a formagao de heterodímeros e a utilizagáo de cadeias L idénticas para evitar a nao complementaridade da cadeia L (Cárter, (2001) Immunol. Methods, 248, 7-15). Foram também descritas estratégias de reticulagáo química alternativas para a produgáo de complexos de fragmentos de anticorpos, em que cada um reconhece antigénios diferentes (Ferguson et al., (1995), Arthritis and Rheumatism, 38, 190-200) ou a reticulagáo de outras proteínas de ligagáo, por exemplo, colectinas, aos fragmentos de anticorpos (Tacken et al., (2004) J. Immunol., 172, 4934-4940). O desenvolvimento de diacorpos ou minianticorpos (BsAb) a que geralmente faltam as fungóes efetoras da cadeia pesada também supera a redundancia do heterodímero. Estes incluem anticorpos de cadeia simples minimos que incorporam sitios de ligagao VH e VL (scFv), que subsequentemente dobram e dimerizam para formar um anticorpo bivalente biespecifico monovalente para cada um dos seus antigénios alvo (Holliger et al., (1993) PNAS, 90, 6444-6448; Muller et al., (1998) FEBS Lett., 422, 259-264). Num exemplo, CHl e os dominios constantes de L foram utilizados como dominios de heterodimerizagao para a formagáo de minianticorpos biespecificos (Muller et al., (1998) FEBS Lett., 259-264). Foi desenvolvida urna variedade de métodos recombinantes que se baseiam em sistemas de expressáo de E. coli para a produgao de BsAbs (Hudson, (1999) Curr. Opin. Immunol., 11, 548-557), contudo, parece que o custo e a escala de produgao de material de anticorpo multivalente de grau clínico permanece o impedimento principal para o desenvolvimento clínico (Segal et al., (2001) J. Immunol. Methods, 248, 1-6).

Recentemente, o conceito de BsAb foi alargado para englobar Di-diacorpos, anticorpos biespecificos tetravalentes onde os dominios Vh e Vl em cada cadeia H e L foram substituidos por pares manipulados de dominios de ligagao de scFv. Estas construgóes, embora complexas de manipular, podem ser montadas em células de mamíferos em cultura na ausencia de redundancia do heterodímero (Lu et al., (2003) J. Immunol. Methods, 279, 219-232). A estrutura de imunoglobulinas é bem conhecida na técnica. A maioria das imunoglobulinas naturais compreende duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. As cadeias pesadas estao unidas urna á outra através de pontes de dissulfureto entre os dominios charneira localizados aproximadamente a meio caminho ao longo de cada cadeia pesada. A cadeia leve está associada a cada cadeia pesada do lado N-terminal do dominio charneira. Cada cadeia leve está normalmente ligada á respetiva cadeia pesada por urna ligagáo dissulfureto perto do dominio charneira.

Quando urna molécula de Ig está corretamente dobrada, cada cadeia dobra-se numa série de dominios globulares distintos ligados por urna sequéncia polipeptidica mais linear. Por exemplo, a cadeia leve dobra-se num dominio variável (Vl) e num constante (Cl) . As cadeias pesadas possuem um único dominio variável Vh, adjacente ao dominio variável da cadeia leve, um primeiro dominio constante, um dominio charneira e dois ou tres dominios constantes adicionáis. A interagáo dos dominios variáveis das cadeias pesada (VH) e leve (Vl) resulta na formagáo de urna regiáo de ligagáo ao antigénio (Fv) . Em geral, tanto a VH como a VL sao necessárias para a ligagáo ao antigénio, embora tinha sido demonstrado que os dimeros de cadeias pesadas e os fragmentos amino-terminais retém a atividade na ausencia de cadeia leve (Jaton et al., (1968) Biochemistry, 7, 4185- 4195).

Com a chegada de novas técnicas de biología molecular, a presenga de anticorpos apenas de cadeia pesada (desprovidos de cadeias leves) foi identificada em distúrbios proliferativos de células B no homem (doenga da cadeia pesada) e em sistemas de modelo de murino. A análise de doengas da cadeia pesada ao nivel molecular mostrou que mutagoes e supressoes ao nivel do genoma podem resultar na expressao inapropriada do dominio ChI da cadeia pesada, dando origem á expressao de anticorpos apenas de cadeia pesada que carecem da capacidade para se ligar á cadeia leve (ver Hendershot et al., (1987) J. Cell Biol., 104, 761-767; Brandt et al., (1984) Mol Cell Biol., 4, 1270-1277) .

Estudos separados em dominios Vh humanos isolados derivados de bibliotecas de fagos demonstraram a ligagáo específica para o antigénio de dominios Vh, mas estes dominios Vh provaram ser de baixa solubilidade. Além disso, foi sugerido que a selegao de dominios VH humanos com características de ligagáo específica apresentados em matrizes de fagos poderia formar blocos de construgáo para anticorpos manipulados (Ward et al., (1989) Nature, 341, 544-546 ) .

Estudos utilizando outras espécies de vertebrados mostraram que os camelídeos, como consequéncia de mutagoes naturais nos genes, produziam dímeros apenas de cadeia pesada de IgG2 e IgG3 funcionáis que eram incapazes de se ligar á cadeia leve, devido á ausencia da regiao de ligagáo de cadeia leve ChI (Hamers-Casterman et al., (1993) Nature, 363, 446-448) e que espécies, tais como o tubarao, produzem urna familia de proteínas de ligagao semelhantes a apenas de cadeia pesada, provavelmente, relacionada com o recetor de células T de mamífero ou a cadeia leve de imunoglobulina (Stanfield et al., (2004) Science, 305, 1770-1773).

Um aspeto caracterizante dos anticorpos apenas de cadeia pesada de camelídeos é o dominio Vh de camelídeos, que proporciona urna melhor solubilidade em relagáo ao dominio VH humano. O VH humano pode ser manipulado para melhorar as características de solubilidade (ver Davies e Riechmann, (1996) Protein Eng., 9 (6), 531-537; Lutz e

Muyldermans, (1999) J. Immuno. Methods, 231, 25-38) ou a solubilidade talvez possa ser adquirida por selegao natural in vivo (ver Tanha et al., (2001) J. Biol. Chem., 276, 24774-24780). No entanto, quando os dominios de ligagao Vh foram derivados de bibliotecas de fagos, as afinidades intrínsecas para o antigénio permanecem na gama de micromolar baixa a nanomolar elevada, apesar da aplicagáo de estratégias de melhoramento de afinidade que envolvem, por exemplo, aleatorizagáo de ponto quente de afinidade (Yau et al., (2005) J. Immunol. Methods, 297, 213-224).

Os anticorpos Vh de camelídeos caracterizam-se também por urna ansa de CDR3 modificada. Esta ansa de CDR3 é, em média, mais comprida do que as que se encontram em anticorpos de nao camelídeos e é urna característica que se considera que tem urna influencia importante na afinidade e especificidade globais para o antigénio, o que compensa a ausencia de um dominio VL ñas espécies de anticorpos apenas de cadeia pesada dos camelideos (Desmyter et al., (1996) Nat. Struct. Biol., 3, 803-811, Riechmann e Muyldermans, (1999) J. Immunol. Methods, 23, 25-28).

Estudos estruturais recentes sobre os anticorpos de camelideos sugerem que a diversidade de anticorpos é, em grande parte, impulsionada por processos de maturagao in vivo com dependencia em eventos de recombinagáo V(D)J e mutagáo somática (De Genst et al., (2005) J. Biol. Chem. 280 (14), 14114-14121).

Recentemente foram desenvolvidos métodos para a produgáo de anticorpos apenas de cadeia pesada em animáis transgénicos (ver WO02/085945 e WO02/085944) . Um anticorpo apenas de cadeia pesada funcional praticamente de qualquer classe (IgM, IgG, IgD, IgA ou IgE) e derivado de qualquer mamífero (incluindo o homem) pode ser produzido a partir de animáis transgénicos (ratinhos, de preferencia) em consequéncia de um estímulo de antigénio. O lócus da cadeia pesada da imunoglobulina normal compreende urna multiplicidade de segmentos de genes V, um número de segmentos de gene D e um número de segmentos de genes J. Cada segmento de gene V codifica desde quase a extremidade N-terminal até á extremidade C-terminal de um dominio V. A extremidade C-terminal de cada dominio V é codificada por um segmento do gene D e um segmento do gene J. 0 rearranjo VDJ em células B, seguido de maturagáo por afinidade proporciona dominios de ligagáo Vh que, em seguida, com dominios de ligagáo Vl, formam um local de reconhecimento ou ligagáo de antigénio. A interagáo das cadeias leves e pesadas é facilitada pela regiáo ChI da cadeia pesada e pela regiáo λ ou κ da cadeia leve.

Para a produgáo de anticorpos apenas de cadeia pesada, o lócus da cadeia pesada na linha germinal compreende segmentos de genes que codificam algumas ou todas as possiveis regioes constantes. Durante a maturagáo, um dominio de ligagáo Vh rearranjado é sujeito a excisáo-uniáo no segmento que codifica a regiáo constante Ch2 , para proporcionar um gene rearranjado que codifica urna cadeia pesada que carece de um dominio ChI e, por conseguinte, é incapaz de se associar a urna cadeia leve de imunoglobulina.

Os anticorpos monoclonais apenas de cadeia pesada podem ser recuperados a partir de células B do bago por tecnología padráo de clonagem ou recuperados a partir de ARNm de células B pela tecnología de apresentagáo em fagos (Ward et al., (1989) Nature, 341, 544-546). Os anticorpos derivados apenas de cadeia pesada de Camelídeos ou animáis transgénicos sáo de alta afinidade. A análise da sequéncia de tetrámeros H2L2 normáis demonstra que a diversidade resulta principalmente de urna combinagáo de rearranjo VDJ e hipermutagáo somática (Xu e Davies, (2000) Immunity, 13, 37-45) . A análise da sequéncia de ARNm de apenas de cadeia pesada expressa, quer produzida em camelideos ou animáis transgénicos, apoia esta observagáo (De Genst et al., (2005) J. Biol. Chem., 280, 14114-14121).

Urna característica importante e comum das regióes Vh de camelideos e humanos naturais é que cada regiáo se liga como um monómero sem dependencia da dimerizagáo com urna regiáo Vl para solubilidade e afinidade de ligagáo ideáis. Estas características foram anteriormente reconhecidas como sendo particularmente adequadas para a produgáo de agentes de bloqueio e agentes de penetragáo no tecido.

Os homo- ou heterodímeros também podem ser gerados por clivagem enzimática de anticorpos apenas de cadeia pesada ou por vías sintéticas (Jaton et al., (1968) Biochemistry, 7, 4185-4195 e US2003/0058074 Al) . No entanto, os beneficios de um dominio de ligagáo de anticorpo monomérico aínda tém de ser utilizados com vantagem na criagáo de proteínas multiméricas, como reagentes, agentes terapéuticos e agentes de diagnóstico. A Vh humana ou Vhh de camelídeo produzida pela tecnología de apresentagáo em fagos náo tem a vantagem de características melhoradas como resultado de mutagóes somáticas e a diversidade adicional fornecida pela recombinagáo da regiáo D e J na regiáo da CDR3 do local de ligagáo de anticorpo normal (Xu e Davies, (2000) Immunity, 13, 37-45) . A Vhh de camelídeo, embora apresente vantagens em termos de solubilidade em relagáo á VH humana, é antigénica no homem e deve ser gerada por imunizagáo dos camelídeos ou pela tecnología de apresentagáo em fagos. A incorporagáo de dominios de ligagáo Vh tem urna clara vantagem sobre a utilizagáo de scFv que devem ser manipulados a partir dos dominios Vh e VL com o potencial associado de perda de especificidade e avidez. Os dominios de ligagáo Vh derivados de familias de genes relacionados, tais como os recetores de células T ou a familia de imunoglobulina do tubaráo também proporcionam alternativas ao scFv para a geragáo de moléculas de ligagáo bi- ou multiespecificas. Outras proteínas de ligagáo que ocorrem naturalmente e os dominios das mesmas, incluindo, por exemplo, os fragmentos de recetores solúveis podem também ser utilizados.

As classes de anticorpos diferem na sua fungáo fisiológica. Por exemplo, a IgG desempenha um papel dominante na resposta imunológica madura. A IgM está envolvida na fixagáo do complemento e aglutinagáo. A IgA é a principal classe de Ig em secregóes - lágrimas, saliva, colostro, muco - e desempenha assim um papel importante na imunidade local. A inclusáo de regióes constantes de cadeia pesada de classe específica quando se concebe complexos de ligagáo multivalentes proporciona as vantagens terapéuticas da fungáo efetora in vivo dependente da funcionalidade requerida. A manipulagáo de regióes efetoras individuáis também pode resultar na adigáo ou supressao de funcionalidade (Van Dijk e van der Winkel, Curr. Opin. Chem. Biol., (2001) 5 de agosto (4), 368-374). Parece provável que a produgáo ideal e selegao de anticorpos da cadeia pesada apenas que compreendem dominios de ligagao VH de alta afinidade (seja humano ou de camelídeo ou de outra origem) iráo beneficiar de abordagens alternativas áquelas que dependem da selegao de bibliotecas de fagos aleatorizadas que nao facilitam a recombinagáo in vivo e a maturagáo de afinidade.

Assim, a inclusao da funcionalidade da regiao constante de IgA poderia proporcionar urna melhor fungáo da mucosa contra os agentes patogénicos (Leher et al., (1999) Exp. Eye Res., 69, 75-84 ), enquanto a presenga da funcionalidade da regiao constante de IgGl proporciona melhor estabilidade sérica in vivo. A presenga dos dominios constantes de cadeia pesada Ch2 e Ch3 proporciona a base para a dimerizagao estável como se ve nos anticorpos naturais e proporciona locáis de reconhecimento para a glicosilagao pós-tradugao. A presenga de Ch2 e Ch3 também permite o reconhecimento secundário do anticorpo quando sao usados complexos biespecíficos e multivalentes como reagentes e agentes de diagnóstico.

Sequéncias isoladas da regiao variável apenas de cadeia pesada de Camelídeos, pré-rearranjadas foram previamente clonadas em frente de urna regiao de charneira e do dominio efetor de IgGl humana, inseridas em vetores e expressas em células COS para gerar anticorpos. Os anticorpos expressos neste ambiente in vitro já sofreram os processos de comutagáo de classe (isotipo) e de maturagáo de afinidade (hipermutagao) in vivo no camelo e podem ligar-se ao antigénio (Riechmann e Muyldermans, (1999) J. Immunol. Methods, 231 , 25-38). A WO 2004/049794 descreve anticorpos de cadeia simples, um ratinho transgénico e os anticorpos de cadeia simples produzidos por um tal ratinho transgénico.

Continua a haver urna necessidade na técnica para gerar um repertorio funcional de anticorpos apenas de cadeia pesada humana específicos para a classe e dominios de ligagáo apenas de cadeia pesada Vh funcionáis que retém o potencial máximo de ligagáo ao antigénio para utilizagao em diversas aplicagoes clínicas, industriáis e de investigagáo.

Breve Resumo da Invengáo A presente invengao proporciona um método para a produgáo de um anticorpo apenas de cadeia pesada Vh que compreende: (a) a imunizagao de um ratinho transgénico que expressa um lócus heterólogo de cadeia pesada Vh, em que: (i) o lócus de cadeia pesada VH compreende urna regiao variável que compreende pelo menos um segmento do gene VH de ocorréncia natural, pelo menos um segmento do gene D, pelo menos um segmento do gene J e pelo menos urna regiao constante de cadeia pesada, e em que os segmentos dos genes V, D e J sao derivados de um humano; (ii) cada regiao constante nao codifica um dominio ChI; (iii) um segmento do gene Vh, um segmento do gene D e um segmento do gene J sao capazes de se recombinarem para formar urna sequéncia de codificagáo de VDJ; (iv) o lócus de cadeia pesada Vh recombinado, quando expresso, é capaz de formar um anticorpo apenas de cadeia pesada solúvel que compreende um dominio de ligagáo Vh especifico para o antigénio, solúvel e urna regiao efetora constante desprovida de um dominio ChI; (b) o isolamento de urna sequéncia de ácido nucleico que codifica o anticorpo apenas de cadeia pesada Vh a partir de células produtoras de anticorpo; e (c) a produgáo do anticorpo apenas de cadeia pesada VH utilizando técnicas de ADN recombinante.

Em certas formas de realizagáo, o método da invengáo compreende aínda a clonagem de um lócus Vh que codifica o dominio de ligagáo VH do anticorpo apenas de cadeia pesada Vh e a expressáo do dominio de ligagáo Vh num sistema de expressáo bacteriano, de levedura, mamífero ou alternativo.

De preferencia, o referido ratinho transgénico foi concebido para ter urna capacidade reduzida para produzir anticorpos que incluam caderas leves.

De preferencia, os loci de cadera pesada de imunoglobulina endógenos ao rato sao suprimidos ou silenciados. De preferencia, o lócus de cadera pesada VH compreende mais do que um segmento de gene V, mais do que um segmento do gene D e mais do que um segmento do gene J.

De preferencia, o segmento de gene V foi escolhido para apresentar características de solubilidade melhoradas. A regiao constante da cadera pesada do lócus de cadera pesada pode incluir um gene da regiao constante da cadera pesada Caí e/ou um Ca2, um C£, um C5, um Cy e/ou Cy. Além disso, a regiao constante da cadera pesada do lócus de cadera pesada pode compreender mais do que urna das seguintes regióes constantes da cadera pesada: Caí, Ca2, Ce, C5, Cy Cy. 0 lócus de cadera pesada VH compreende urna regiao variável que compreende pelo menos um segmento do gene V humano, pelo menos, um segmento D humano e, pelo menos, um segmento J humano, em que um segmento do gene V, um do gene D e um do gene J sao capazes de recombinar para formar urna sequéncia de codificagao de VDJ. 0 lócus de cadera pesada compreende, preferivelmente, vinte ou mais segmentos do gene D e/ou cinco ou mais segmentos do gene J. A ansa CDR3 é derivada utilizando segmentos dos genes D e J humanos. 0 lócus de cadeia pesada Vh pode também compreender urna sequéncia de recombinagáo (rss) capaz de recombinar um segmento do gene J diretamente com um gene da regiáo constante da cadeia pesada. A regiáo constante da cadeia pesada do lócus de cadeia pesada heteróloga é de origem humana ou de origem em vertebrados, por exemplo de origem em camelideos. Em alternativa, a regiáo constante pode náo ter origem na cadeia pesada de imunoglobulina. 0 método da invengáo resulta na maturaqáo de células B essencialmente normáis. 0 dominio de ligagao Vh pode náo ter urna ansa CDR3 prolongada semelhante a dos camelideos. A invengáo também proporciona um método de produgáo e selegáo de anticorpos apenas de cadeia pesada que compreende os passos de: (a) injetar um antigénio no mamífero transgénico como aqui descrito; b) isolar urna célula ou tecido que expressa um anticorpo apenas de cadeia pesada específico para o antigénio de interesse; e c) produzir um hibridoma a partir da célula ou tecido do passo (b) e d) clonar opcionalmente o ARNm do anticorpo apenas de cadeia pesada do referido hibridoma para produgáo subsequente num sistema de expressáo heterólogo tal como um sistema mamífero, vegetal, de inseto, microbiano, fúngico ou alternativo.

Os dominios de ligagáo Vh podem ser depois produzidos identificando e isolando um dominio Vh especifico para o antigénio a partir do ARNm clonado do passo c).

Os dominios de ligagáo Vh podem ser também produzidos por: (a) injegáo de um antigénio no mamífero transgénico aquí descrito; b) isolamento de urna célula ou tecido que expressa, um anticorpo apenas de cadeia pesada específico para o antigénio de interesse; c) clonagem do lócus VH a partir do ARNm derivado a partir da célula ou tecido isolado; d) apresentagao da proteína codificada usando um fago ou biblioteca semelhante; e) identificagáo de dominio(s) VH específico(s) para o antigénio; e f) expressáo do(s) dominio(s) VH isoladamente ou como urna proteína de fusáo em sistemas de expressáo bacterianos, de levedura ou alternativos.

DESCRIQÁO DETALHADA DA INVENQAO

Os presentes inventores conseguiram ultrapassar as limitagoes da técnica anterior e mostraram que animáis transgénicos, em particular ratinhos, podem ser gerados utilizando "micro loci" para produzir anticorpos apenas de cadeia pesada específicos para a classe, ou urna mistura de diferentes classes de anticorpos apenas de cadeia pesada que sao segregados por plasma ou por células B. Estes podem ser entáo utilizados para gerar um fornecimento fidedigno de anticorpo apenas de cadeia pesada específicos para a classe utilizando tecnología de hibridoma estabelecida ou como urna fonte de dominios de ligagáo apenas de cadeia pesada VH funcionáis, de preferencia um dominio de ligagáo apenas de cadeia pesada VH solúvel, que sáo livres de fungóes efetoras, mas que retém a fungáo de ligagáo.

Os anticorpos apenas de cadeia pesada que podem ser gerados pelo método da invengáo mostram afinidade de ligagáo elevada, que resulta de rearranjos dos segmentos dos genes V, D e J e de mutagoes somáticas, geralmente na ausencia de urna ansa CDR3 aumentada. Essencialmente, observa-se maturagáo de células B normáis com níveis elevados de anticorpo apenas de cadeia pesada presentes no plasma isolado (desde que o dominio ChI tenha sido eliminado de todas as classes de anticorpos presentes no lócus recombinante). A maturagáo de células B e a secregáo de dimeros (por exemplo, IgG) ou multimeros (por exemplo, IgM) montados nao tem nenhuma dependencia em relagáo a presenga ou expressáo de genes de cadeia leve. A análise da sequéncia de nucleótidos do ARNm especifico para o antigénio que codifica urna cadeia pesada específica para o antigénio isolado a partir de hibridomas derivados de ratinhos transgénicos demonstrou que a diversidade de anticorpos de cadeia pesada é essencialmente urna fungáo da recombinagao de VDJ. Além disso, os presentes inventores demonstraram que a diversidade de anticorpos é gerada na regiao CDR3 do dominio de ligagáo ao antigénio funcional do anticorpo apenas de cadeia pesada, com urna contribuigao mais limitada de mutagoes somáticas nos dominios VH. Usando os métodos aquí descritos, os dominios Vh funcionáis podem ser clonados e expressos em sistemas bacterianos para gerar dominios de ligagáo Vh com retengao completa da ligagáo ao antigénio, especificidade e afinidade.

Mostra-se que os ratinhos transgénicos podem ser programados para produzir as classes preferidas de anticorpos apenas de cadeia pesada em resposta ao desafio com o antigénio, por exemplo, apenas IgG contra apenas IgM ou, por exemplo, misturas de IgA, IgG e IgM.

Os inventores descreveram anteriormente (ver WO02/085945 e WO02/085944) a geragáo de ratinhos transgénicos que expressam um lócus mínimo de regido constante de cadeia pesada de IgG humana desprovido do exáo de ChI e ligado por segmentos D e J humanos com dois genes de VHH de lama. Estes produzem anticorpos apenas de cadeia pesada de IgG específicos para o antigénio, de alta afinidade, funcionáis quando desafiados com antigénio. Podem ser obtidas misturas de classes de anticorpos apenas de cadeia pesada (IgM e IgG) por troca de classe in vivo, através da utilizagáo de construgóes de genes que incorporam as regióes constantes da cadeia pesada em tándem (desde que a todos os genes da regiáo constante caregam de um dominio ChI e, quando presente, um dominio Ch4) .

Os aperfeigoamentos aquí descritos mostram que um ratinho construido com o mesmo lócus da regiáo constante de IgG ligado por segmentos D e J humanos com dois genes de Vhh de lama e um lócus de regiáo constante de IgM humana desprovido de um exáo de ChI ligados pelos mesmos segmentos de genes D e J humanos com dois segmentos de genes de Vhh de lama, também produz um anticorpo apenas de cadeia pesada de IgM de elevado peso molecular (multimérico) e um anticorpo apenas de cadeia pesada de IgG (dímero). Surpreendentemente, a maturagáo de células B essencialmente normal e a produgáo de anticorpos é dependente da ausencia total de sequéncias ChI de cada regiáo constante de cadeia pesada presente no lócus transgénico. Além disso, nao existe qualquer requisito para a remogáo do exáo CH4, se presente.

Assim, por exemplo, um animal transgénico que tem um lócus de cadeia pesada de IgM humana com um exao de ChI funcional ligado pelos mesmos segmentos dos genes D e J humanos a dois segmentos do gene V de lama, e o lócus da regiáo constante de cadeia pesada de IgG desprovido do exao de ChI ligado pelos mesmos segmentos dos genes D e J humanos a dois segmentos do gene V de lama, produz níveis muito baixos de anticorpo apenas de cadeia pesada e nao mostra nenhuma evidencia para a maturagáo de células B.

Outros dominios efetores, que incluem o dominio Ch4, podem ser incorporados ou nao, consoante desejado, para introduzir ou eliminar características efetoras do anticorpo apenas de cadeia pesada resultante.

Os inventores descobriram que a expressáo produtora de anticorpo (isto é, a maturagáo de células B) pode resultar da utilizagáo de qualquer segmento do gene V presente na construgáo. 0 isolamento e a sequenciagáo do ARNm do anticorpo derivado de células B mostram que ocorre recombinagao dos segmentos dos genes D e J para gerar diversidade de CDR3. A comparagao das sequéncias dos dominios Vh resultantes revela mutagóes somáticas, o que indica que ocorreram eventos de maturagáo de afinidade nos segmentos dos genes D e J recombinados e também no dominio VH do ARNm do anticorpo expresso resultante.

As construgoes preferidas incorporam segmentos do gene V selecionados para urna melhor solubilidade e ligados a um grupo de cadeia D e J para recombinagáo e geragáo de CDR3. De preferencia, as sequéncias de VDJ estao ligadas ao(s) dominio(s) efetor(es) constante(s) de eleigao, em tándem, cada um desprovido de um exáo de ChI ·

Os dominios Vh resultantes nao podem compreender urna ansa CDR3 alargada semelhante á dos camelideos. Isto resulta num dominio Vh que exibe diversidade de CDR3 e maturagáo de afinidade operacionalmente ligado a urna regiáo constante efetora. Esta última assegura a secregáo funcional e, opcionalmente, montagem no rato parental.

Estas observagdes tém implicagdes importantes para a manipulagao aperfeigoada e simplificada de anticorpos apenas de cadeia pesada específicos para a classe e a derivagao de dominios Vh solúveis de alta afinidade, que incorporam a maturagáo da afinidade através da mutagáo somática. A incorporagáo de fungoes efetoras selecionadas da regiáo constante da cadeia pesada (desprovida de ChI) ou misturas das mesmas permite a produgáo de qualquer classe de anticorpos apenas de cadeia pesada ou qualquer mistura de anticorpos apenas de cadeia pesada sem o requisito de manipulagáo adicional dos anticorpos. Os dominios Vh podem ser expressos por si só ou em sistemas bacterianos ou de outros microrganismos ou como dominios efetores que incorporara anticorpos apenas de cadeia pesada funcionáis segregados por hibridomas ou células transfetadas em cultura. Os anticorpos ou dominios de ligagáo Vh de origem humana tém urna grande gama de aplicagóes na área da saúde como medicamentos, agentes de diagnóstico e reagentes, com aplicagóes agrícolas, ambientáis e industriáis paralelas.

As moléculas efetoras de cadeia pesada podem ser manipuladas para serem livres de dominios funcionáis, por exemplo os dominios Ch4 da extremidade carboxi-terminal, desde que a manipulagáo nao afete os mecanismos secretores impedindo a montagem da superficie da célula e, consequentemente, a maturagáo de células B. Os exóes de ChI isolados sao suprimidos do lócus heterólogo ou estáo ausentes do lócus. Podem ser manipuladas características adicionáis no lócus, por exemplo, para melhorar a glicosilagáo ou adicionar fungóes.

De preferencia, o lócus heterólogo, quando expresso, é capaz de formar moléculas de IgA, IgE, IgG, IgD ou IgM funcionáis, ou isotipos das mesmas. Podem ser também produzidas classes de anticorpos individuáis ou misturas de classes de anticorpos ou isotipos das mesmas.

Por conseguinte, o lócus de cadeia pesada heterólogo é concebido para produzir classes preferidas ou misturas de anticorpos apenas de cadeia pesada dependendo da(s) classe(s) de anticorpos requerida, com a maturagáo das células B essencialmente normáis. A utilizagáo de segmentos dos genes V, D e J humanos, que compreendem segmentos do gene V selecionados aleatoriamente, ou selecionados para solubilidade aumentada, irá produzir anticorpos apenas de cadeia pesada humana funcionáis.

Os anticorpos obtidos no processo da invengáo tém a vantagem sobre os da técnica anterior na medida em que sao substancialmente de qualquer classe única ou conhecida de origem humana. Os anticorpos sao de alta afinidade, resultante de urna combinagáo de recombinagáo de VDJ e de maturagáo de afinidade in vivo. Os anticorpos e fragmentos dos mesmos podem ser isolados, caracterizados e fabricados utilizando métodos conhecidos bem estabelecidos dos peritos na técnica. Lócus de Cadeia Pesada Heteróloga

No contexto da presente invengáo, o termo "heterólogo" designa urna sequéncia de nucleótidos ou um lócus, tal como aquí descrito, que nao é endógeno ao mamífero em que está implantado.

Um "lócus de cadeia pesada Vh", no contexto da presente invengáo refere-se a um micro-lócus mínimo que codifica um dominio VH que compreende um ou mais segmentos do gene V, um ou mais segmentos do gene D e um ou mais segmentos do gene J, operacionalmente ligados a urna ou mais regióes efetoras de cadeia pesada (cada urna desprovida de um dominio ChI) . De preferencia, a fonte principal de variabilidade do repertorio de anticorpos é a regiao CDR3 formada pela selegáo de segmentos dos genes D e J pelas jungóes V-D e D-J. A vantagem da presente invengáo é que o repertorio de anticorpos e a diversidade obtida ñas sequéncias de genes Vh reamanjadas podem ser maximizados através do uso de vários segmentos dos genes D e J. A mutagao somática subsequente é conseguida enquanto se usa um lócus mínimo (micro-lócus), sem a necessidade de um grande número de segmentos do gene V ou de loci de VL e Le (cadeia leve) de imunoglobulinas.

De preferencia, o lócus de cadeia pesada VH compreende de dois a cinco segmentos do gene V (2, 3, 4 ou 5) .

Os segmentos do gene V sao de origem humana, opcionalmente selecionados para melhorar a solubilidade.

De preferencia, o lócus de cadeia pesada VH compreende de dois a quarenta (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30 ou 40) ou mais dos segmentos do gene D (normalmente 25 segmentos funcionáis do gene D humano).

De preferencia, o lócus de cadeia pesada Vh compreende de dois a vinte (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 ou 20) ou mais segmentos do gene J (normalmente 6 segmentos do gene J humano).

De preferencia, o lócus de cadeia pesada Vh compreende dois ou mais segmentos do gene V humano, vinte e cinco segmentos funcionáis do gene D humano e 6 segmentos de gene J humano. O termo "segmento do gene V" abrange um segmento do gene V de ocorréncia natural derivado de um ser humano, que foi opcionalmente selecionado para características melhoradas, tais como solubilidade.

Os métodos preferidos para melhorar a solubilidade de um dominio Vh incorporam meios racionáis, em oposigao a apenas aleatorios, e sao exemplificados em Davies e Reichmann, (1996) Protein Eng., 9 (6), 531-537 e Riechmann e Muyldermans, (1999) J. Immunol. Methods, 231, 25-38. A selegáo natural também pode ocorrer in vivo por meio de maturagáo de afinidade e de incorporagao de mutagóes favoráveis no gene Vh após rearranjo de VDJ. O segmento do gene V deve ser capaz de recombinagao com um segmento do gene D, um segmento do gene J e urna regiáo (efetora) constante de cadeia pesada (que pode compreender vários exóes mas excluí um exao de ChI) de acordo com a presente invengao para gerar um anticorpo apenas de cadeia pesada Vh quando o ácido nucleico é expresso.

Assim as sequéncias de codificagáo de Vh podem ser derivadas de urna fonte que ocorre naturalmente ou podem ser sintetizadas utilizando métodos familiares aos peritos na técnica.

Um "dominio Vh" no contexto da presente invengao refere-se a um produto de expressáo de um segmento do gene V quando recombinado com um segmento do gene D e um segmento do gene J, como definido acima. 0 dominio Vh, como aquí utilizado, permanece em solugao e é ativo num meio fisiológico, sem a necessidade de qualquer outro fator para a manter a solubilidade. De preferencia, a capacidade do dominio Vh solúvel para ligar o antigénio foi melhorada por recombinagáo de VDJ e mutagáo somática. Nao há nenhuma dependencia em relagáo á presenga ou auséncia da ansa CDR3 alargada peculiar para as espécies camelideas. 0 dominio Vh é capaz de se ligar ao antigénio como um monómero e, quando combinado com as regióes constantes efetoras, pode ser produzido em formas monoespecificas, biespecificas, multiespecificas, bivalentes ou multivalentes, dependendo da escolha e da manipulagáo das moléculas efetoras utilizadas (por exemplo, IgG, IgA IgM, etc) ou de mecanismos alternativos de dimerizagao e multimerizagáo. Qualquer probabilidade de se ligarem com um dominio Vl, quando expresso como parte de um complexo de anticorpo apenas de cadeia pesada solúvel, foi eliminada pela remogáo do exáo de ChI (ver Sitia et al., (1990) Cell, 60, 781-790) . O dominio VH sozinho também pode ser manipulado com diferentes dominios de proteínas para produzir proteínas de fusáo para fins terapéuticos e de diagnóstico direcionados, por exemplo, com toxinas, enzimas e agentes de imagem. O lócus de cadeia pesada heteróloga compreende urna regiao de ADN que codifica urna regiao constante da cadeia pesada que proporciona fungóes efetoras in vivo (por exemplo, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD ou isotipos das mesmas). Ά regiao constante da cadeia pesada

Operacionalmente, urna regiao constante de cadeia pesada é codificada por um segmento de gene que ocorre naturalmente ou manipulado que é capaz de recombinagao com um segmento do gene V, um segmento do gene D e um segmento do gene J numa célula B. De preferencia, a regiao constante da cadeia pesada é derivada de um lócus de imunoglobulina.

Cada regiao constante da cadeia pesada compreende essencialmente, pelo menos, um gene da regiao constante de cadeia pesada, que é expresso sem um dominio CH1 funcional de modo que possa ocorrer a geragao de anticorpos apenas de cadeia pesada. Cada regiao constante da cadeia pesada também pode compreender um ou mais exóes da regiao constante da cadeia pesada adicionáis, os quais sao selecionados de entre o grupo que consiste em C5, Cyi-4, Cy,

Cs e Cai-2 com a condigáo de que os genes da regiao constante de cadeia pesada adicionáis também nao expressem um dominio ChI funcional. Os segmentos dos genes da regiao constante da cadeia pesada sao selecionados dependendo da classe preferida ou mistura de classes de anticorpos necessária. Opcionalmente, o lócus de cadeia pesada heteróloga é deficiente em Cy e C5.

Por exemplo, as moléculas de Ig de classe M sao conhecidas por desempenharem um papel importante na ativagáo de macrófagos e na vía do complemento. Devido á proximidade dos seus locáis de ligagáo, a IgM tem urna avidez elevada para agentes patogénicos, incluindo virus. No entanto, a IgM também é conhecida por ser difícil de utilizar em técnicas rápidas de imunoensaio enquanto a Ig de classe G pode ser prontamente utilizada nestas técnicas. Para estas utilizagóes, seria útil selecionar a classe de anticorpo preferida, ou seja, IgG ou IgM. A expressáo da totalidade ou parte de um lócus Cy da cadeia pesada heteróloga desprovido de ChI irá produzir opcionalmente alguns ou todos os isotipos de IgG, dependendo dos isotipos de IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4 presentes no lócus de IgG heteróloga. Em alternativa, as cadeias pesadas podem conter genes de Ce. A molécula de IgE resultante também pode ser utilizada em terapia.

Alternativamente, podem ser obtidas misturas selecionadas de anticorpos. Por exemplo, a IgA e a IgM podem ser obtidas quando a regiáo constante da cadeia pesada compreende um gene de Ca e um gene de Cy. A regiáo constante da cadeia pesada pode ser de origem humana, em particular quando o anticorpo de cadeia pesada é para ser utilizado para aplicagóes terapéuticas em seres humanos. Quando os anticorpos de cadeia pesada sao para ser usados para fins de diagnóstico ou veterinários, a regiáo constante da cadeia pesada é de preferencia derivada do organismo, vertebrado ou mamífero alvo ou sobre a qual o diagnóstico ou terapia veterinária vai ser executada.

Quando expressa, a regiáo constante da cadeia pesada carece de um dominio ChI funcional. 0 exáo de ChI e, opcionalmente, as regióes constantes Cy e C5, podem ser mutadas, suprimidas ou substituidas. De preferencia, o exáo de ChI é suprimido. A presenga, por exemplo, de IgM com um dominio ChI funcional inibe a maturagáo das células B e, por conseguinte, limita a expressáo produtiva da IgG apenas da cadeia pesada (desprovida de ChI) no mesmo lócus, já que a maturagáo de células B está inibida. 0 "exáo da regiáo constante de cadeia pesada" (exáo de "Ch") tal como aqui definido incluí as sequéncias de ocorréncia natural de um vertebrado, mas especialmente exóes de Ch de mamíferos. Isto varia de um modo específico para a classe. Por exemplo, a IgG e a IgA sáo naturalmente desprovidas de um dominio Ch4 . 0 termo "exáo de Ch" também incluí dentro do seu ámbito, os derivados, homólogos e fragmentos dos mesmos, na medida em que o exao de Ch se ja capaz de formar um anticorpo apenas de cadeia pesada funcional, como aqui definido, quando é um componente de urna regiao constante de cadeia pesada.

Opcionalmente, quando presente, o Ch4 ou outros dominios funcionáis podem ser manipulados ou suprimidos dentro do transgene, desde que esse processo nao iniba o processo de secregao intracelular, a maturagao de células B ou a atividade de ligagáo do polipéptido de anticorpo resultante.

Ratos 0 mamífero transgénico utilizado nos métodos da invengao é um rato.

De preferencia, os ratos transgénicos sao gerados utilizando a tecnología de injegáo de oócitos estabelecida e, quando estabelecida, a tecnología de células ES ou clonagem.

De um modo vantajoso, os loci de cadeia pesada e, opcionalmente, de cadeia leve de imunoglobulina endógenos ao rato sao suprimidos ou silenciados quando um anticorpo apenas de cadeia pesada é expresso de acordo com os métodos da invengao.

Esta abordagem de produgao de anticorpos apenas de cadeia pesada, como descrita acima, pode ser de utilizagao particular na produgao de anticorpos para utilizagao terapéutica em seres humanos, já que frequentemente a administragao de anticorpos a urna espécie de vertebrados que é de origem diferente da fonte dos anticorpos resulta no aparecimento de urna resposta imunitária contra os anticorpos administrados. 0 rato transgénico pode ser concebido para ter urna capacidade reduzida de produzir anticorpos que incluam cadeias leves.

As células produtoras de anticorpos podem ser derivadas de ratos transgénicos de acordo com a presente invengao e utilizadas, por exemplo, na preparagáo de hibridomas para a produgao de anticorpos apenas de cadeia pesada, como aqui definidos. Adicional ou alternativamente, as sequéncias de ácidos nucleicos podem ser isoladas de ratos transgénicos de acordo com a presente invengao e utilizadas para produzir anticorpos apenas de cadeia pesada do dominio Vh ou complexos biespecificos/bifuncionais dos mesmos, utilizando técnicas de ADN recombinante que sao familiares para os peritos na técnica.

Alternativa ou adicionalmente, os anticorpos apenas de cadeia pesada específicos para o antigénio podem ser gerados por imunizagáo de um rato transgénico de acordo com a presente invengao.

Assim, num outro aspeto, a presente invengáo proporciona um método para a produgáo de anticorpos apenas de cadeia pesada através da imunizagáo de um rato transgénico de acordo com a presente invengáo com um antigénio.

Anticorpos apenas de cadeia pesada e seus fragmentos 0 dominio especifico de ligagáo apenas de cadeia pesada para o antigénio, ou seja, um dominio de ligagáo VH, é expresso pelo lócus Vh como consequéncia da recombinagáo entre segmentos dos genes V, D e J únicos, seguido posteriormente de mutagao somática. De acordo com este aspeto da invengáo, os loci Vh podem ser clonados a partir de, por exemplo, o ARNm isolado a partir de urna célula produtora de anticorpos de um rato transgénico imunizado, como descrito acima. As sequéncias clonadas podem ser, em seguida, apresentadas usando um fago (Ward et al., (1989) Nature, 341, 544-546) ou bibliotecas de apresentagao semelhantes, por exemplo, utilizando sistemas á base de levedura (Boder e Wittrup (1997) Nat. Biotechnol. 15, 553-7) e dominios de ligagáo Vh específicos para o antigénio identificado. Os dominios de ligagáo de cadeia pesada específicos para o antigénio podem ser entáo fabricados isoladamente ou como proteínas de fusáo em sistemas de expressáo escaláveis bacterianos, de levedura ou alternativos. As sequéncias que codificam os dominios de ligagáo Vh também podem ser clonadas a partir de hibridomas caracterizados derivados por métodos clássicos a partir de ratinhos transgénicos imunizados. Estes podem ser, entáo, utilizados para a produgao de dominios de ligagáo Vh e derivados dos mesmos, incluindo a manipulagao de classes de anticorpos definidas (por exemplo, IgE ou IgA) e as suas variantes com diferentes fungoes efetoras.

Por conseguinte, a invengao também proporciona um método de produgáo de um dominio de ligagáo Vh que compreende os passos de: a) isolar urna célula ou tecido que expressa um anticorpo apenas de cadeia pesada especifico para o antigénio de interesse (de preferencia um anticorpo apenas de cadeia pesada especifico para o antigénio, solúvel de interesse); b) clonar a sequéncia que codifica o dominio de ligagáo VH a partir do ARNm derivado da célula ou tecido isolado; c) apresentar a proteína codificada utilizando um fago ou biblioteca semelhante; d) identificar os dominios de ligagáo VH específicos para o antigénio, e e) expressar os dominios de ligagáo VH isoladamente ou como urna proteina de fusáo em sistemas de expressáo bacterianos, de levedura, mamíferos ou alternativos.

Alternativamente, os fragmentos que contém o dominio Vh podem ser gerados de anticorpos apenas de cadeia pesada da invengáo utilizando tecnología de clivagem enzimática ou química e separagáo subsequente do fragmento que contém o dominio VH dos outros produtos de clivagem.

Quando o dominio de ligagáo Vh é isolado a partir de um hibridoma caracterizado, a sequéncia do dominio de ligagáo Vh clonada derivada de ARNm pode ser diretamente clonada num vetor de expressáo sem recorrer a medidas adicionáis de selegáo usando fagos e outros sistemas de apresentagáo.

Os sistemas de produgáo para anticorpos apenas de cadeia pesada que incorporam regioes efetoras incluem as células de mamífero em cultura (por exemplo, células CHO), plantas (por exemplo, milho), cabras, coelhos, gado, ovelhas, galinhas e larvas de insetos transgénicos adequados para tecnología de criagáo em massa. Outros sistemas de produgáo, incluindo a infegáo por virus (por exemplo, baculovirus em larvas de insetos e linhas celulares) sáo alternativos á abordagem de cultura de células e linhas germináis. Outros métodos de produgáo seráo também familiares aos peritos na técnica. Quando há um requisito para a montagem de IgA ou IgM apenas de cadeia pesada, a coexpressáo de urna "cadeia J" é benéfica. Os métodos adequados para a produgáo de dominios de ligagáo VH por si só sáo conhecidos na técnica. Por exemplo, os dominios de ligagáo VH de camelideos foram produzidos em sistemas bacterianos e os homodimeros apenas de cadeia pesada de camelideos foram produzidos em hibridomas e células de mamífero transfetadas (ver Reichmann e Muyldermans, (1999) J. Immunol. Methods, 231, 25-38).

Encontram-se também bem estabelecidos métodos para a expressao de dominios de ligagáo Vh humanos manipulados derivados usando tecnología de apresentagáo em fagos (Tanha et al., (2001) J. Biol. Chem., 276, 24774-24780 e referencias nele contidas).

Foi demonstrado que as larvas de insetos de linhas de moscas transgénicas produzem fragmentos funcionáis de anticorpos apenas de cadeia pesada na hemolinfa com características indistinguíveis do mesmo anticorpo produzido por células de mamíferos (PCT/GB2003/0003319). O anticorpo produzido apenas de cadeia pesada pelo método da invengáo ou um fragmento do mesmo como aqui descrito pode ser utilizado como um reagente de ligagáo intracelular ou urna abzima. O anticorpo de cadeia simples ou o dominio de ligagáo VH específico para o antigénio produzido de acordo com o método da invengáo pode ser utilizado como um inibidor de enzima ou um bloqueador de recetor.

Um dominio Vh fundido com urna molécula efetora pode ser utilizado como um agente terapéutico, agente de imagem, agente de diagnóstico, abzima ou reagente.

Breve Descrigáo dos Desenhos

Figura 1: mostra a estratégia para a geragao de ratinhos transgénicos que expressam um lócus de IgG e a geragao funcional de anticorpos apenas de cadeia pesada e dominios VH como urna consequéncia do desafio com antigénio.

Figura 2: mostra a estratégia para a geragao de ratinhos transgénicos que expressam um lócus de IgM e a geragao funcional de anticorpos apenas de cadeia pesada e dominios VH como urna consequéncia do desafio com antigénio.

Figura 3: mostra a estratégia para a geragao de ratinhos transgénicos que expressam um lócus de IgA e a geragao funcional de anticorpos apenas de cadeia pesada e dominios VH como urna consequéncia do desafio com antigénio.

Figura 4: Alinhamento da sequéncia dos produtos de PCR obtidos a partir do ADNc de medula óssea utilizando iniciadores VhhI e VHh2 em combinagao com o iniciador 0γ2 humano a partir de ratinhos que contém um lócus com regióes constantes que tém urna mutagáo de excisao-uniao de camelideo para remover o CHl. Os resultados mostram que o CHl nao é removido.

Figuras 5-8: Estrutura de construgoes VH/VH de camelídeo (VHH). 1-n significa qualquer número de genes de VH, ou segmentos D ou J. 0 complemento normal do lócus humano é de 51 genes V, 25 segmentos D funcionáis (mais 2 nao funcionáis) e 6 segmentos J. No caso de urna regiáo Cy (para IgM) ou Cs (para IgE) nao existe regiao H e existe um exáo CH4 adicional entre CH3 e Mi. Os genes VH (s) foram mutados para fornecer proporcionar, tal como descrito no dominio público. Os genes VH, os segmentos D e J e os exoes de C sao de preferencia humanos, mas podem ser de qualquer outra espécie, incluindo camelideos. Neste último caso, os genes VH (VHH) de camelideo nao seriam mutados porque sao naturalmente solúveis.

Figura 9: Plano de imunizagáo dos ratinhos e pesquisa de anticorpos para a geragáo de IgG apenas de cadeia pesada contra E.coli HSP70.

Figura 10: Análise de citometria de fluxo e resultados de imuno-histoquímica para células do bago derivadas de ratinhos transgénicos.

Figura 11: Resultados da análise de ELISA de ratinhos transgénicos imunizados com DKTP e análise da sequéncia da biblioteca de anticorpos resultante.

Figura 12: Exemplos de mutagoes somáticas e rearranjo de VDJ visto em ratinhos transgénicos imunizados.

Figura 13: Resultados do ensaio de coloragáo imunológica em linha de células Tet transfetadas com o plasmídeo de resposta que contém o anticorpo A5.

Figura 14: Resultados da análise de transferencia de Western de soros de linhas de ratinhos transgénicos.

Figura 15: Fracionamento do tamanho de IgM humana misturada com urna IgM de cadeia simples humana produzida pelos ratinhos com lócus de IgM mais IgG.

Figura 16: Resultados da análise por ELISA de anticorpos de IgG e IgM de cadeia simples gerados contra o TNFa humano. Técnicas Gerais

A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos aquí utilizados tém o mesmo significado que o normalmente entendido por um vulgar perito na técnica (por exemplo, em cultura de células, genética molecular, química de ácidos nucleicos, técnicas de hibridagáo e bioquímica). Sao utilizadas técnicas padrao para os métodos moleculares, genéticos e bioquímicos (ver geralmente, Sambrook et al., Molecular Cloning: A

Laboratory Manual, 2nd Ed (1989) Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N. Y . e Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4a ed., John Wiley & Sons, Inc.) e métodos químicos. Além disso,

Harlow & Lañe, A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor, N. Y , é referido para as técnicas imunológicas convencionais.

Qualquer técnica de ADN recombinante adequada pode ser utilizada no método da presente invengáo. Sao construidos vetores de expressáo típicos, tais como plasmídeos, que compreendem sequéncias de ADN que codificam cada urna das cadeias do complexo de polipéptido ou anticorpo. Podem ser utilizadas quaisquer técnicas estabelecidas adequadas para a fragmentagáo enzimática e química de imunoglobulinas e para a separagáo dos fragmentos resultantes.

Os vetores de expressáo adequados que podem ser utilizados para clonagem em sistemas bacterianos incluem plasmídeos, tais como Col El, pCRl, pBR322, pACYC 184 e RP4, ADN de fago ou derivados de qualquer um destes.

Para utilizagáo na clonagem em sistemas de levedura, os vetores de expressáo adequados incluem plasmídeos baseados numa origem de 2 miera.

Qualquer plasmídeo que contém urna sequéncia promotora do gene de mamífero adequado pode ser usado na clonagem em sistemas de mamíferos. As sequéncias promotoras de insetos ou baculovirais podem ser usadas para a expressáo de genes em células de insetos. Tais vetores incluem plasmídeos derivados de, por exemplo, pBR322, virus do papiloma bovino, retrovírus, virus de ADN e virus vaccinia.

As células hospedeiras adequadas que podem ser utilizadas para a expressao do complexo de polipéptido ou do anticorpo incluem bactérias, leveduras e células eucarióticas, tais como as linhas de células de insetos ou de mamíferos, plantas transgénicas, insetos, mamíferos e outros sistemas de expressao de invertebrados ou vertebrados.

Exemplo 1

Em experiencias preliminares foram preparados ratinhos transgénicos para expressar um lócus de cadeia pesada, em que dois exoes de Vhh de lama foram ligados aos segmentos de diversidade da cadeia pesada humana (D) e de uniáo (J) , seguidos pelos genes das regióes constantes humanas Cp, C5, 0γ2, 0γ3 e 3' LCR da imunoglobulina de cadeia pesada humana. Os genes das 0γ3 0γ2 humanas contém urna mutagáo de excisáo-uniáo de G para A. A presenga do sitio Frt possibilitou a geragáo de urna única copia de rato transgénico a partir de urna matriz transgénica de múltiplas copias por recombinagáo mediada por Flp. No entanto, as sequéncias do lócus transgénico com urna mutagáo de excisao-uniáo de G para A mostraram excisáo-uniáo aberrante mas remogáo incompleta de CHl (Figura 4).

Construmóes

Para ultrapassar este problema, urna biblioteca genómica de cosmídeos foi pesquisada quanto a clones que contenham os genes de VH, utilizando métodos padrao. Urna (ou mais) VHs de linha germinativa diferente foi escolhida aleatoriamente com base na sua sequéncia (cinco classes de géneros, no caso das VHs humanas). Foram introduzidos codaos de aminoácidos hidrofílicos ñas posigóes 42, 49, 50 e 52 de acordo com a numeragáo IMGT (Lefranc et al. (1999)) . Os genes de VH foram combinados num vetor BAC por procedimentos padrao, tais como clonagem direta usando ligantes feitos á medida ou recombinagáo homologa.

Foram selecionados dois clones a partir da biblioteca genómica humana Pac RPCI-11 (BACPAC recource Center, EUA): o clone 1065 N8 que continha os segmentos D e J de cadeia pesada humana, Cp (IgM) e C5 (IGD) e o clone 1115 N15 que continha os genes Ογ3 (IgG3) . O clone Bac 11771 a partir de urna biblioteca genómica humana diferente (Incyte Genomics, CA, EUA) foi usado como urna fonte do gene de Cy2 (IgG2) e da LCR da cadeia pesada de imunoglobulina (Mills et al. (1997) J. Exp Med, 15; 186 (6):845-58).

Usando técnicas padrao, os genes de 0γ3 e Cy2 foram subclonados separadamente no vetor pFastBac (Invitrogen). De modo semelhante, qualquer urna das outras regióes constantes de Ig pode ser clonada a partir destes BACs (IgA, IgE) . Urna supressáo completa do exáo de CHl foi realizada por recombinagáo homologa (Imam et al.(2001)), usando as sequéncias que flanqueiam o exao de CHl de cada regiáo constante. Um local frt poderia ser opcionalmente introduzido na frente da regiáo de troca de Cp para permitir a geragáo loci de urna única copia a partir de loci de múltiplas copias por tratamento com a recombinase flp in vivo por meios padráo, por exemplo por meio de cruzamento de ratinhos rosa-flp (Figura 5).

Os genes de VH separados, os segmentos D e J e os exoes de C e LCR foram clonados num BAC, quer por digestáo de restrigáo e ligagóes convencionais quer por recombinagao homologa (ou urna mistura de ambos), ou qualquer outra técnica de clonagem.

Outras construgoes poderiam ser entao criadas.

Lócus apenas de IgM A fim de obter a construgáo de IgM (Figura 6), um ou mais genes de VHs, seguidos por segmentos de cadeia pesada D e J humana e Cp, foram clonados num BAC. Ver acima para a metodología. Neste caso, apenas a regiáo de Cp foi clonada no BAC final. Lócus de IgM mais IgG, (C5 é opcional) A fim de se obter a construgáo de IgM mais IgG (Figura 7), um ou mais genes de VHs, seguidos por segmentos de cadeia pesada D e J humana, Cp (sem CHl mas com o exao de CH4) , (C5 opcional) e os genes de Cy2 e Cy3 humanos modificados e 3' LCR foram clonados no BAC. A fim de gerar um lócus apenas de IgG, foram introduzidos locáis loxP durante os passos de clonagem padráo (descrito acima) e o BAC é crescido na estirpe de E. coli 294 Cre (Buscholz et al.) e a recombinagáo mediada por cre produz bactérias que produzem um lócus apenas de IgG. Ver acima para mais detalhes sobre a construgáo. Lócus de IgM mais IgG (C5 é opcional) A fim de se obter a construgao de IgM mais IgG (Figura 8), um ou mais genes de VHs, seguidos por segmentos de cadeia pesada D e J humana, Cp (sem CHl e CH4), (C5 opcional) e os genes de Cy2 e Cy3 humanos modificados e 3' LCR foram clonados num BAC. A fim de gerar um lócus apenas de IgG, foram introduzidos locáis loxP durante os passos de clonagem padráo (descrito acima) e o BAC é crescido na estirpe de E. coli 294 Cre (Buscholz et al.) e a recombinagáo mediada por cre produziu bactérias que produzem um lócus apenas de IgG.

Ratos transgénicos, crescimento e genotipagem 0 BAC final foi introduzido em ratinhos transgénicos por microinjegáo padráo de ovos fertilizados ou através da tecnología de transfecgáo de células estaminais embrionárias.

Os loci transgénicos foram verificados quanto a integridade e ao número de copias por análise de transferencia de Southern do ADN da cauda (Southern 1975), utilizando sondas da extremidade 5' e 3' do lócus. Os fundadores foram criados como linhas no ambiente μΜΤ-/-. A genotipagem foi realizada por análise de POR padrao utilizando iniciadores para cada urna das diferentes regióes do lócus. A análise da sequéncia dos produtos de RT-PCR derivados de ADNc BM de ratinhos transgénicos onde todo o exáo de CHl, tanto da 0γ2 como da 0γ3, foi suprimido (um com (linhas HLL) e outra sem os genes de Ομ e C5, mostrou que os loci transgénicos nao só sao capazes de recombinagáo VDJ, mas que as transcrigóes de IgG se assemelham ás encontradas nos HCAbs de lama e camelo.

Imuno-histoquimica

Os bagos foram embebidos em composto OCT. Secgóes criostáticas de 5pm congeladas foram fixadas em acetona e marcadas de forma simples ou dupla, como descrito anteriormente (Leenen et al. 1998). Os anticorpos monoclonais anti-B220/RA3-6B2, anti-CDllc/N418 (Steinman et al., 1997), foram aplicados como sobrenadantes de cultura de hibridomas. A IgG anti-humana e a IgM anti-humana de cabra acopladas a peroxidase foram da Sigma. Os reagentes da segunda etapa foram Ig anti-rato (DAKO, Glostrup, Dinamarca) ou Ig anti-hamster (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) de cabra marcadas com peroxidase e Ig anti-rato de cabra com fosfatase alcalina (Southern Biotechnology, Birmingam, AL, EUA). A Figura 10 mostra a análise imuno-histoquímica de secgóes congeladas de 5ym de bagos de μΜΤ_/_, WT e ratinhos transgénicos HLL e HLL-MD no ambiente μΜΤ~/_. As secgóes foram coradas com anti-B220 (azul) para as células B e anti-CDllc/N418 (castanho) para as células dendriticas. As setas indicam a localizagáo de pequeños aglomerados de células B.

Análises de Citometria de Fluxo

Foram preparadas suspensóes de células únicas de órgáos linfoides em PBS, como descrito anteriormente (Slieker et al. 1993) . Aproximadamente lxlO6 células foram incubadas com anticorpos em PBS/0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) em placas de 96 pogos durante 30 min a 4 °C. As células foram lavadas duas vezes em PBS/BSA a 0,5%. Para cada amostra, 3xl04 eventos foram classificados com um analisador FACScan (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA) . Os dados de FACS foram analisados usando o software de computador CellQuest versáo 1.0. A análise de quatro cores foi realizada num FACS Calibur Becton Dickinson. Os seguintes mAbs foram obtidos a partir de BD Pharmingen (San Diego, CA) : anti-B220-RA3-6B2 conjugado com FITC, anti-CD 19 conjugado com PE. Os dados de varrimento FACS de células do bago, coradas com anti-CDl9 e anti-B220 sao apresentados no painel inferior da Figura 10.

No lado esquerdo da figura está urna representagáo da recombinagáo Flp in vivo por meio de cruzamento de linhas da HLL com urna linha transgénica FlpeR e que apoia os dados de varrimento FACS sobre as células do bago do recombinante, o que mostra o resgate de células B como pode ser visto ñas linhas HLL-MD origináis geradas diretamente. Á direita está urna representagáo da recombinagao Cre in vivo por meio de cruzamento da linha transgénica Cag Cre e os dados FACS em células do bago do recombinante de copia única.

Imunizagáo e produgáo de hibridomas (Figura 9)

Foram criados ratinhos transgénicos que continham um lócus de anticorpo apenas de cadeia pesada que consistía em dois dominios VHH de lama, regioes D e J humanas e regioes constantes de IgG2 e 3 (sem um dominio CHl).

Os ratinhos com 8 semanas de idade foram imunizados tanto com a proteína de choque térmico de E. coli 70 (hsp70). Foi injetado 20 pg ou 5 pg de antigénio com adjuvante Specol (IDDLO, Lelystadt, Países Baixos) respetivamente se nos dias 0, 14, 28, 42 e ip no dia 50. Foi colhido sangue no dia 0, 14 e 45. Depois de tres reforgos foi detetado um título baixo de anticorpos específicos para o antigénio em 1 de 3 ratinhos HLL-MDl imunizados com Hsp70 (Figura 9).

Foi realizada urna fusáo padráo de células de bago com urna linha de células de mieloma para gerar um anticorpo monoclonal, o que resulta numa linha de células de hibridoma monoclonal contra a proteína hsp70. 0 HCAb anti-HSP-70 consiste no segmento VHH de lama mais próximo da regiao D (VHH 2) recombinado com o segmento IgHD3-10 humano (número de acesso X13972) e o segmento IgHJ4-02 humano (número de acesso X86355) . Apesar de nao ser em alta frequéncia, as VHHs tém algumas mutagóes que dáo origem as alteragóes de aminoácidos observadas na Figura 4A, quando comparadas com a configuragao da linha germinal. A análise por RT-PCR mostrou também apenas urna transcrigáo de IgH produtiva no hibridoma, o que sugere que nao há outras transcrigóes feitas. 0 anticorpo de IgG2 aHSP70 é segregado como um dímero apenas de cadeia pesada (transferencias de Western sob condigóes de gel desnaturante (dímero) e gel nao desnaturante (de monómeros) Figura 9). As células do bago foram fundidas com células de mieloma Sp2-0-Agl4 (oferta de R. Haperen) no dia 56, utilizando um kit ClonalCellTM-HY (StemCell Technologies, Reino Unido) de acordo com as instrugóes do fabricante.

Ratinhos transgénicos que continham um lócus de anticorpo apenas de cadeia pesada que consistía em dois dominios VHH de lama, regióes D e J humanas, urna IgM humana e regióes constantes de IgG2 e 3 (todas sem um dominio CHl, Figura 7) foram imunizados com TNFa para obter anticorpos HC-IgM. Um em cada tres ratos mostrou soros positivos em análises ELISA padráo. Urna fusáo de mieloma padreo originou um hibridoma de IgM positivo (Figura 11) . Após filtragáo em gel em Sepharose 6B em condigoes nao-reduzidas cada fragao da coluna foi carregada num gel sob condigoes redutoras e detetada por IgM-HRP «humana (Figura 15) . 0 fracionamento em condigoes nao redutoras mostrou que a HC-IgM é segregada como um anticorpo multimérico com o mesmo tamanho que urna IgM humana de controlo (após subtragáo do peso molecular das cadeias leves e do dominio CHl que estáo ausentes da HC-IgM) . 0 fracionamento em gel de cada fragao da coluna sob condigoes redutoras mostrou o monómero esperado (Figura 15). ELISA da Ig Sérica

Sangue de ratinhos com 15-25 semanas de idade foi colhido em tubos revestidos com EDTA, centrifugado durante 15' á temperatura ambiente (TA) e o sobrenadante diluido a 1:5 em PBS. Urna placa de 96 pogos foi revestida durante 2 horas com 5 mg/mL de urna IgG de cabra anti-humana (YES Biotechnology) ou urna IgM de cabra anti-humana (Sigma), lavada com PBS, bloqueada durante 1 hora á TA com solugáo de bloqueio (1,5% de BSA/1,5 % de leite em pó/0,1% de Tween 20/PBS) e lavada tres vezes com PBS. Diluigóes sucessivas de amostras de soro e padróes (IgG2 humana ou IgM humana (Sigma, Zwijndrecht, Países Baixos)) foram carregados e incubados durante 2-4 horas e as placas foram lavadas 6 vezes com PBS antes da adigáo de um anticorpo secundário (IgG de cabra anti-humana ou IgM de cabra anti-humana acoplada com HRP (Sigma, Zwijndrecht, Países Baixos) diluida a 1:2000). Todas as diluigóes foram realizadas numa solugáo de bloqueio. Após 1-2 h de incubagáo á TA e lavagem em PBS, foi adicionado o substrato POD (Roche). 0 ELISA para a detegáo de sdAbs solúveis específicos para o antigénio a partir da biblioteca de fagos de IgG2 é mostrado na Figura 11. Os sdAbs solúveis foram usados como anticorpos primários ñas placas revestidas com antigénio, seguido de anticorpo de ratinho contra α-myc e anticorpo de cabra contra α-rato conjugado com HRP. Foi utilizado POD como um substrato. O painel inferior mostra as impressóes digitais de clones com a enzima de restrigáo Hinf I, que mostra 5 insergóes diferentes que codificam o sdAb contra B.Pertusis.

Construgáo da biblioteca de anticorpos e triagem

Isolou-se o ARN total dos bagos de ratinhos apenas com urna copia única de IgG imunizados com DKTP (Figura 7 após tratamento com ere) utilizando o sistema de isolamento de ARN Ultraspec (Biotecx Laboratories Inc., Houston, Texas, EUA) . 0 ADNc foi feito utilizando oligo dT. Os fragmentos de ADN que codificam fragmentos VHHDJ foram amplificados por PCR utilizando iniciadores específicos: iniciador Sfil inverso de vhl (Dekker et al. 2003), em combinagáo com iniciador hIgG2hingrev (5'— AATCTGGGCAGCGGCCGCCTCGACACAACATTTGCGCTC-3' ) . Os VHHDJs amplificados (~ 400 pb) foram digeridos com Sfi I/Not I, purificados em gel e clonados no vetor fagemídico pHEN-1 digerido com Sfil/Notl. A transíormagáo em células eletrocompetentes TG1 resultou numa biblioteca de anticorpos de dominio único humanos. Foram realizadas duas rondas de selegáo utilizando pesquisa sobre antigénios vacinais adsorvidos sobre plástico (imunotubos revestidos com vacina nao diluida). A análise de restrigáo e sequenciamento foram padráo. RT-PCR de lócus apenas de cadela pesada

Foi entao investigado se as fungóes de lócus HLL-MD como um lócus normal para produzir um repertorio de anticorpos diversificado pelo sequenciamento dos produtos de RT-PCR obtidos usando iniciadores específicos para IgG2 e IgG3 em ADNc de placas de Peyer. A Figura 12 mostra alguns exemplos de mutagóes somáticas de clones a partir de ratinhos nao imunizados (painel esquerdo) e ratinhos imunizados (painel direito). Os ratinhos foram de loci apenas de IgG, imunizados com hsp70 de E. coli, Usado de Pertussis, toxoide tetánico. Em tom de cinza encontra-se a regiáo charneira de IgG2 a comegar com ERKCCV

Embora, a análise de RT-PCR em placas de Peyer mostré que sao usadas ambas as Vh, todos os anticorpos sequenciados rearranjaram a VH2. A fonte de variabilidade do repertorio é a regiáo CDR3 formada pela selegáo de segmentos D e J e pelas jungóes V-D e D-J. A utilizagao de segmentos J humanos é semelhante á observada em rearranjos humanos, sendo os segmentos JH4 e JH6 os mais frequentemente usados.

Esta análise mostrou que ambas as VHs, os diferentes segmentos D humanos e todos os segmentos J humanos sao utilizados para contribuir para um repertorio de anticorpos diversificado. Também mostrou a presenga de células B com IgG3 trocada e a ocorréncia de mutagóes somáticas por comparagáo de cada gene reamanjado com o seu homólogo da linha germinal, ou seja, a Vh original na construgáo transgénica (ver Figura 12). Portanto, o recetor do antigénio de IgG apenas de cadera pesada humana pode fornecer os sinais necessários para a maturagao de células B.

Imunocoloragáo A Figura 13 mostra os resultados de imunocoloragáo de urna linha de células Tet adicionalmente transfetada com o plasmídeo de resposta que continha o anticorpo A5 (Dekker et al. 2003). O painel superior mostra a produgáo de anticorpos A5 induzida por doxiciclina (vermelho) no citoplasma e a coloragáo nuclear de células com DAPI (azul) . O painel inferior mostra que as células que expressam rtTA no núcleo sao aquelas que produzem o A5 após indugao (painel superior). A coloragáo foi feita com um dos HCAb humanos contra rtTA (verde) com a sequéncia mostrada abaixo. A IgG de cabra anti-humana conjugada com FITC foi utilizada como um passo secundário. O A5 foi detetado como descrito anteriormente por Dekker et al. 2003. O anticorpo contra rTTA foi urna IgG3 com a seguinte sequéncia:

241 AGACTCT 80 R L 301 cctgtgcagcctctggaagcatcttcagtatcaatgccatgggctggtaccgccaggctc

100SCAASG SIFS1NAMGWYRQA 3 61 CAGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTCGCAGCTATTACTAGTGGTGGTAGCACAAGGTATGC AG 120 P G K Q RELVAA IT S GGS T R YA 421 ACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGC 140DSVKGRFT I S RDN AKNTVYL 481 AAATGA AC AGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTTTGATCTCTATGGTTC 160 Q Μ N S L K P E D TAVYYCL I S MV 541 GGGGAGCCCGTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGAGCTCA 180 R G A RFDYWGQG T LV TVSS E L 601 AAACCCCACTT 200 K T P L A charneira de IgG3 comega no aminoácido 198 ELKTPL. Para comparagáo ver a regiao charneira da IgG2 na Figura 12.

Análises de transferéncla de Western A Figura 14 mostra a transferencia de Western dos soros de diferentes linhas de ratinhos transgénicos que contém o lócus IgM mais IgG (Figura 5) após tratamento com ere (isto é, IgM suprimida, apenas deixada a IgG) . Os soros foram purificados por prot G e fracionados em gel sob condigoes redutoras (Figura 14, painel da direita) e nao redutoras (Figura 14, painel da esquerda). Os controlos foram ratinhos KO de base e urna amostra de soro humano normal. Note-se a diferenga de tamanho entre os dois geles, o que mostra que a IgG apenas de cadeia pesada humana é um dimero. 0 sinal mostrado na Figura 14 foi detetado com um anticorpo anti-IgG humano por procedimentos padráo.

Fracionamento do tamanho da IgM humana produzida pelos ratinhos de lócus de IgM mais IgG 0 soro dos ratinhos de IgM mais IgG (Figura 8) foi fracionado por filtragao em gel sob condigoes nao redutoras, após mistura com urna amostra de soro humano como um controlo. Os resultados sao mostrados na Figura 15. Os pesos moleculares dos complexos na coluna diminuiam de pista para pista (que representam cada fragao) da esquerda para a direita. As fragoes (cada pista) foram analisadas por eletrofórese em gel sob condigoes redutoras.

Foi realizada análise de ELISA sobre um número de hibridomas feitos a partir de ratinhos que continham o lócus de IgM mais IgG (Figura 8) imunizados com TNFa humano. Os resultados sao mostrados na Figura 16. As duas linhas superiores na Figura 16 foram analisadas com urna IgG anti-humana, as duas linhas seguintes com urna IgM antihumana. As amostras de soro (setas) mostram que o rato gerou anticorpos anti-TNFa tanto de IgG como de IgM. A seta simples mostra um hibridoma positivo para IgM. Os pogos foram revestidos com TNFa humano disponivel comercialmente. Todos os procedimentos foram padrao.

LISTA DE SEQUÉNCIAS

<110> ERASMUS UNIVERSITY MEDICAL CENTER ROTTERDAM <110> CRAIG, Roger Kingdon

<120> MOLÉCULAS DE LIGAQAO

<130> P055642EP <150> GB0416392.9 <151> 2004-07-22 <150> GB0511881.5 <151> 2005-06-10 <150> EP05766644.8 <151> 2005-07-22 <160> 35 <170> SeqWin99, versáo 1.02

<210> 1 <211> 39 <212> ADN <213> Sequéncia Artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR <4 0 0> 1 aatctgggca gcggccgcct cgacacaaca tttgcgctc 39

<210> 2 <211> 106 <212> ADN <213> HCAb Humano (IgG3) contra rtTA <400> 2 agactctcct gtgcagcctc tggaagcatc ttcagtatca atgccatggg ctggtaccgc GC caggctccag ggaagcagcg cgagttggtc gcagctatta ctagtggtgg tagcacaagg 120 tatgaagact ccgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaacgccaa gaacacggtg 160 tatctgcaaa tgaacagcct gaaacctgag gacacggccg tctattactg tttgatc.tct 240 atggttcggg gagcccgttt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtotcctca 300 gagctcaaaa ccccactt 318

<210> 3 <211> 106 <212> PRT <213> HCAb Humano (IgG3) contra rtTA <400> 3

Arg Leu Ser Cys A_a A_a Ser G_y Ser _le Phe Ser lie Asn Ala Met 15 10 15

Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Ala 20 25 30 lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 35 40 45

Phe Ghr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met 50 55 60

Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Leu lie Ser 65 70 75 80

Met Val Arg Gly Ala Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 85 90 95

Thr Val Ser Ser Glu Leu Lys Thr Pro Leu 100 105

<210> 4 <211> 33 <212> ADN <213> Sequéncia Artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR <400> 4 ctggaattct caaccatgga gctggggctg age 33

<210> 5 <211> 30 <212> ADN <213> Sequéncia Artificial <22 0>

<223> Iniciador de PCR <4O0> 5 gacaagcttt acccggagac agggagaggc 30

<210> 6 <211> 30 <212> ADN <213> Sequéncia Artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR <4 0 0> 6 gacaagcttt acccggagac agggagaggc 30

<210> 7 <211> 34 <212> ADN <213> Sequéncia Artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR <400> 7 gtcctcgagg cccaggtcca actgcaggag tctg 34

<210> 8 <211> 37 <212> ADN <213> Sequéncia Artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR <400> 8 gtcgaattct cattccgagg agacggtgac ctgggtc 37

<210> 9 <211> 36 <212> ADN <213> Sequéncia Charneira de IgG <400> 9 gagcgcaaat gttgtgtcga gtgcccaccg tgccca 36

<210> 10 <211> 44 <212> ADN <213> Sequéncia charneira de IgG de substituigáo <4 0 0> 10 agcttctgag cgcaaaccac cagtcgagcc accaccgcca ccac 44

<210> 11 <211> 44 <212> ADN <213> Complemento da sequéncia charneira de IgG de substituigáo <400> 11 tcgagtggtg gcggtggtgg ctcgactggt ggtttgcgct caga 44 <210> 12 <211> 404 <212> ADN <213> VDJg*1 <4 0 0> 12 gacacggccg tgtagtatct gtaaggcaga tggggtagta ctatggttcg gggagtccac 60 cactgcggct agaggggcca gggaacactg gtcgcggtgt catcagcctc caccaagggc 120 ccatcggtot tccccctggc gccctgctcc aggagoacct cccagagcac agcggccctg 180 ggctgcctgg tcaagcacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgct 240 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccagct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 300

agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcaac ttcggcaccc agacctacac ctgcaacgta 3SO gatcacaagc ccagcaacac caagagcgca aatgttgtgt cgag 404 <210> 13 <211> 352 <212> ADN <213> VDJg*2 <4 0 0> 13 qacattccca cttcqatctc tgggqccqtq qcaccctqqt cactqtctcc acaqcctcca 60 ccaagggccc atcggtottc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc gagagcacag 120 cggccctggg ctgcctggtc aaggagtact tccccgaacc ggtgacggtg gcggggaaot 180 caggcgctcg gaccagcggc gtgcacacct tcccagctgt cctacagtcc gcaggactct 240 actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcaactt cggcacccag accaacacct 300 gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca agaqcgcaaa tgttgtgtcg ag 352 <210> 14 <211> 394 <212> ADN <213> VDJg*3 <400> 14

gacacggccg tctattactg taacgccact acgatatttt gactggttat tatagacgct SO actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctcagcctc cgccaagggc ccatcggtct 120 tccccctggc gccctcctcc aggagcacct ccgagagcac agcggccctg ggctgcctgg 180 tcaagqacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgct ctgaccaqcg 240 gcgtgcacac cttcccagct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg 300 tgaccgtgcc ctccaccaac ttcggcaccc agacctacac ctccaacgta gatcacaagc 360 ccagcaacac caagaccgca aatgttgtgt cgag 394 <210> 15 <211> 380 <212> ADN <213> VDJg*4 <400> 15

gacacggccg tccaatcgga tacagctatg gttacgtact ttcactactg gggccaggga SO accctggtca ccgtctcctc agcctccacc aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc 120 tgctccagga gcacctccga gagcacagcg gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc 180 cccgaaccgg tgacgctgtc gtggaactca ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc 240 ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcctggtgac cgtgccctcc 300 agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc aacgtagatc acaagcccag caacaccaag 3*50 agcgcaaatg ttgtgtcgag 380 <210> 16 <211> 417 <212> ADN <213> VDJg*5 <4 0 0> 16

gacacggccg tctattactg taacgcagat gtattactat ggttcgggga gcctatagcc SO ttactactac tacggtatgg aogcctgggg ccaagggacc acggtcacog tctcctcagc 120 ctccaccaag ggcccatcgg totcccccct ggcgccctgc tccaggagca cctccgagag 180 cacagcggcc ctgggctgcc tggccaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg 240 gaactcaggc gctctgacca goggcgtgca caccttccca gctgtcctac agtcctcagg 300 actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc aacttcggca cccagaccta 360 cacctgcaac gtagatcaoa agcccagcaa caccaagagc gcaaatgttg tgtcgag 417

<210> 17 <211> 108 <212> PRT <213> alfa-B.pertussis 1 <4 0 0> 17

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser lie Asn Ala Met 1 5 10 15

Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Ala 20 25 30 lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 35 40 45

Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Glu MeL 5 0 5 5 G 0

Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Lys 65 70 75 80

Gly Pro lie Thr His Val Arg Gly Val His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 85 90 95

Leu VaL Thr Val Ser Ser Glu Arg Lys Cys Cys Val 100 105

<210> 18 <211> 108 <212> PRT <213> alfa-B.pertussis 2 <4 0 0> 18

Mg Ifeá Y '.y::: SÍ ¿i' Má .f::·: Hy 3 Jlé Íhíi 3:éC lié: AiV:'j Klí* J,.........-5............... :1S............. íp.....

Sl«· US Sk .Ára Síy %%&amp;. SI» Αΐξ» δία /¡Asa 'Sia, tía; M ;S5· 3Í lie TU Tér .Síy ;í5Iy Sar Téa Asa 'Tai Sis Asp. SAI -¾¾]. til; Tiy Aití

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•ACA. Ceu LuL ; :ya . pt\y G1 u Acg 1 hr ΑΊΑ·· 345.1: Tyr ·: y r Cys Asr; A_lpi· LyV

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Wr feo i le .Thr IVrV 1:1¾ -Arg: Áiy Val Vis Vi a Try O i.y iGlh' VL;y. Tiir 7 i ' * Sí) ' ' Ai

<210 > 19 <211> 108 <212> PRT <213> alfa-B.pertussis 3 <400> 19

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser lie Asn Ala Met 1 b 10 Ib

Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Ala 2(3 2b 30 lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 3b 40 4b

Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met bO bb 60

Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ale. Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Arg 6b 70 7b 80

Thr Pro lie Thr Val Val Arg Gly Val His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 85 90 95

Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Arg Lys Cys Cys Val 100 105

<210> 20 <211> 108 <212> PRT <213> alfa-B.pertussis 4 <400> 20

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser He Asn Ala Met 1 5 10 15

Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Ala SO 2 5 50 lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 35 40 45

Phe Thr lie Ser Arg Asp Lys Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met 50 55 60

Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Arg Thr 65 70 75 80

Gly Pro lie Thr Ilis Val Arg Gly Val Asp Tyr Tro Gly Arg Gly Thr 85 90 " 95

Leu Val Thr Val Se- Ser Gln Arg T,ys Cys Cys Val 100 105

<210> 21 <211> 108 <212> PRT <213> alfa-B.pertussis 5 <400> 21

Arg T,eu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Tle Phe Ser Tle Asn Ala Met 1 5 10 15

Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Gln Leu Val Ala Ala 20 25 30 lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn His Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 35 40 45

Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met 50 55 60

Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu 65 70 75 80

Ser Pro He Thr Lys Val Arg Gly Val Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 85 90 95

Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Arg Lys Cys Cys Val 100 105

<210> 22 <211> 59 <212> PRT <213> neVHHl original <4O0> 22

Arg Leu Ser Cys Ala ALLa Ser Gly Phe Thr Leu Asp Lyr Tyr Ala lie 1 " 5 10 15

Gly Trp Phe Arg Gln AAa Glu Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser Cys 20 25 30 lie Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 35 40 45

Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 5 0 3 3

<210> 23 <211> 59 <212> PRT <213> neVHHl clone 1 <400> 23

Arg Leu Ser Cys ALa ALa Ser GLy Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr ALa ILe 1 5 10 15

Gly Trp Phe Arg Gln Ala Glu Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser Cys 20 25 30 lie Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 35 40 45

Arg Phe Thr Tle Se~ Arg Asp Asn Ala Lys Asn 50 55

<210> 24 <211> 59 <212> PRT <213> neVHHl clone 2 <400> 24

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr Val lie 1 5 10 15

Gly Trp Phe Arg Gln Ala Glu Gly Lys Gilí Arg Glu Gly Val Ser Cys

20 2 5 SO lie Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Aso Ser Val Lys Gly 35 40 45

Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 5 0 5 5

<210> 25 <211> 59 <212> PRT <213> neVHHl clone 3 <400> 25

Arg T,eu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala He 1 5 10 15

Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gln Arg Gln Gly Val Ser Cys 20 25 30

Tle Ser Ser Se'- Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly 35 40 45

Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Lys Ala Lys Asn 50 55

<210> 26 <211> 58 <212> PRT <213> neVHH2 original <400> 26

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser lie Asn Ala Met 15 13 15

Gly Trp Tyr Arg Gln A_a Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Ala 20 25 30

Ilc Thr Ser CLy CLy Ser Thr Asn Tyr ALa Asp Ser VaT Lys CLy Arg 35 40 45

Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 50 55

<210> 27 <211> 58 <212> PRT <213> neVHH2 clone 1 <400> 27

Arg T,en Ser Cys Ala Ala Ser G1 y Ser Tle Phe Ser Tle Asn Ala Met 1 5 10 15

Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lyo Gln Arg Gln Leu Val Ala Ala 20 25 30

Tle Thr Ser Gly Gly Ser Thr T,ys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 35 40 45

Phe Thr lie Ser Arg Aop Aon Ala Lyo Aon 50 55

<210> 28 <211> 58 <212> PRT <213> neVHH2 clone 2 <400> 28

Arg T,eu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Tle Phe Ser Tle Asn Val Met 1 5 10 15

Gly Trp Tyr Arg Gln Pro Dro Gly Lys Gln Arg G1 u Leu Val Ala Gly 20 25 30

Val Thr Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 35 40 45

Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 50 55 <210> 29 <211> 58

<212> PRT <213> neVHH2 clone 3 <400> 29

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser lie Asn Ala Met 1 "5 10 15

Gly Trp Tyr Arg Glri Ala Pro Gly Lys Glri Arg Glu Leu Val Ala Pro 20 25 30 lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 35 40 45

Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 50 55

<210> 30 <211> 78 <212> PRT <213> VHH2 linha germinal <400> 30

Arg Leu Ser cys Ale Ale Ser Gly Ser lie Phe Ser lie Asn Ale iiet 15 10 15

Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Ala 20 25 30 lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 35 40 45

Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr leu Gln Meo 50 55 60

Asn Ser leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 6b 70 7b

<210> 31 <211> 105 <212> PRT <213> alfa-Tetanus 1 <4O0> 31

Arg Leu Ser Cys Ala. Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser lie Asn Ala Met 1 5 10 15

Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Ala 20 25 50 lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 35 40 45

Phc Thr Ilc Ser Arg Asp Aon Ala Lys Aon Thr Val Tyr Leu Gln Met 50 55 60

Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu 65 70 75 80

Arg Ala Gly Asp Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 85 00 95

Val Ser Ser Glu Arg Lys Cys Cys Val 100 105

<210> 32 <211> 108 <212> PRT <213> alfa-Tetanus 2 <400> 32

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser lie Asn Ala Met 1 5 10 15

Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Ala 20 25 30 lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 35 40 45

Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met 50 55 60

Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Val Leu 65 70 75 80

Trp Phe Gly Glu Leu Ser Asp Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 85 90 95

Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Arg Lys Cys Cys Val 100 105 <210> 33 <211> 108

<212> PRT <213> alfa-Tetanus 3 <4O0> 33

Arg Leí: Ser Cys Ala A_a ñer Gly Ser lie Phe Ser lie Asn Ala Met 5 1 O Ί 5

Gly Trp Tyr Arg Gln A_a Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Ala 20 25 30 lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 35 40 45

Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met 5 0 5 j 60

Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Asp 65 70 75 80

Cys Trp Gly Ser Arg Trp Tyr Phe Asp His Tyr Trp Gly Arg Gly Thr 85 90 95

Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Arg Lys Cys Cys Val 100 105

<210> 34 <211> 111 <212> PRT <213> alfa-Tetanus 4 <400> 34

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser lie Asn Ala Met 1 5 10 15

Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Ala 20 25 30 lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 35 40 45

Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met 50 55 60

Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Asp 65 70 75 80

Thr Ser Pro Pro Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 85 90 95

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Arg Lys Cys Cys Val 100 105 110 <210> 35 <211> 112 <212> PRT <213> alfa-hsp70 <4Ο0> 35

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn Ala Met 1 5 10 15

Gly Trp Ser Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Ala 20 25 30 lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 35 40 45

Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Hls Leu Gln MeL 5 0 5 5 G 0

Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Gly 65 70 75 80

Asn Thr Met Val Arg Gly Val lie lie Lys Tyr Arg Phe Asp Tyr Trp 85 90 95

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Arg Lys Cys Cys Val 100 105 110

Claims (5)

1. REIVINDICACÓES

   1. Método para a produgao de um anticorpo apenas de cadeia pesada VH que compreende: (a) a imunizagáo de um rato transgénico que expressa um lócus heterólogo de cadeia pesada VH, em que: (i) o lócus de cadeia pesada VH compreende urna regiao variável que compreende pelo menos um segmento do gene de Vh de ocorréncia natural, pelo menos um segmento do gene D, pelo menos um segmento do gene J e pelo menos urna regiao constante de cadeia pesada, e em que os segmentos dos genes V, D e J sao derivados de um humano; (ii) cada regiao constante nao codifica um dominio CH1; (iii) um segmento do gene de VH, um segmento do gene D e um segmento do gene J sao capazes de se recombinarem para formar urna sequéncia de codificagáo de VDJ; (iv) o lócus de cadeia pesada VH recombinado, quando expresso, é capaz de formar um anticorpo apenas de cadeia pesada solúvel que compreende um dominio de ligagao Vh especifico para o antigénio, solúvel e urna regiao efetora constante desprovida de um dominio ChI; (b) o isolamento de urna sequéncia de ácido nucleico que codifica o anticorpo apenas de cadeia pesada Vh a partir de células produtoras de anticorpo; e (c) a produgáo do anticorpo apenas de cadeia pesada Vh utilizando técnicas de ADN recombinante.
2. 2. Método da reivindicagáo 1, compreende aínda a clonagem de um lócus Vh que codifica o dominio de ligagáo Vh do anticorpo apenas de cadeia pesada VH e a expressáo do dominio de ligagáo Vh num sistema de expressáo bacteriano, de levedura, mamífero ou alternativo.
3. 3. Método da reivindicagáo 1 ou da reivindicagáo 2, em que o referido rato transgénico foi manipulado para ter urna capacidade reduzida para produzir anticorpos que incluam cadeias leves.
4. 4. Método de qualquer urna das reivindicagoes 1 a 3, em que os loci da cadeia pesada de imunoglobulina endógenos ao rato sáo suprimidos ou silenciados.
5. 5. Método de qualquer urna das reivindicagoes anteriores, em que o lócus da cadeia pesada VH compreende mais do que um segmento do gene de VH, mais do que um segmento do gene D e mais do que um segmento do gene J. Lisboa, 18 de agosto de 2017