MX2007000921A

MX2007000921A - Moleculas de union.

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Publication number: MX2007000921A
Application number: MX2007000921A
Authority: MX
Inventors: Roger Kingdon Craig; Franklin Gerardus Grosveld; Richard Wilhelm Janssens; Dubravka Drabek
Original assignee: Univ Erasmus Medical Ct
Priority date: 2004-07-22
Filing date: 2005-07-22
Publication date: 2007-11-09
Also published as: CN102659940B; KR101443473B1; ES2440990T5; CY1119561T1; CN102659941A; EP3272770B1; EP2311874B1; SI1776383T1; PT2311874T; CY1115762T1; JP5888893B2; AU2005263994B2; US20100197897A1; EP1864998A2; JP2008512987A; US20090285805A1; KR101151957B1; KR101457753B1; US20130345405A1; WO2006008548A3

Abstract

La presente invencion se refiere a la fabricacion de diversos repertorios de anticuerpos solamente cadena pesada funcionales que sufren maduracion por afinidad, y usos de los mismos; la invencion tambien se refiere a la fabricacion y uso de un repertorio diverso de anticuerpos solamente cadena pesada de clase especifica y a la fabricacion y uso de complejos de polipeptido multivalente con funcionalidad de cadena pesada de anticuerpo, preferiblemente funcionalidad de union de cadena pesada de anticuerpo, actividad efectora de region constante y, opcionalmente, funciones efectoras adicionales; la presente invencion tambien se refiere a un metodo de generacion de anticuerpos solamente cadena pesada totalmente funcionales en ratones transgenicos en respuesta a un desafio con antigenos, en particular, la presente invencion se refiere a un metodo para la generacion de anticuerpos solamente cadena pesada, de alta afinidad, de antigenos especificos de humano de cualquier clase, o mezcla de clases y aislamiento y expresion de dominios de union de antigeno VH totalmente funcional.

Description

MOLÉCULAS DE UNION CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con la fabricación de un repertorio diverso de anticuerpos con únicamente la cadena pesada funcional, que se somete a maduración por afinidad, y usos de los mismos. La invención también se relaciona con la fabricación y uso de un repertorio diverso de anticuerpos con únicamente la cadena pesada específica de la clase y con la fabricación y uso de complejos polipeptídicos multivalentes, con funcionalidad de la cadena pesada del anticuerpo, de manera preferida, funcionalidad de unión a la cadena pesada del anticuerpo, actividad del efector de la región constante y, opcionalmente, funciones del efector adicionales. La presente invención también se relaciona con un método para la generación de anticuerpos con únicamente la cadena pesada completamente funcional en ratones transgénicos, en respuesta a la exposición al antígeno. En particular, la presente invención se relaciona con un método para la generación de anticuerpos con únicamente la cadena pesada, con alta afinidad, específicos para el antígeno humano, de cualquier clase o mezclas de clases y el aislamiento o expresión de dominios de unión al antígeno VH completamente funcional.

La presente invención también se relaciona con la generación de complejos polipeptídicos multivalentes que comprenden la funcionalidad de la cadena pesada, de manera preferida, actividad del efector de la cadena pesada y otras funciones de unión y efectoras. Los anticuerpos con únicamente la cadena pesada y otros complejos de unión multivalentes generados utilizando los métodos de la presente invención y usos de los mismos, también se describen.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los anticuerpos monoclonales o variantes de los mismos, representarán una alta proporción de nuevas medicinas lanzadas en el siglo 21. La terapia con anticuerpos monoclonales ya está aceptada como una ruta preferida para el tratamiento de la artritis reumatoide y la enfermedad de Crohn y hay un progreso impresionante en el tratamiento del cáncer. Los productos basados en anticuerpo también están en desarrollo para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares e infecciosas. Los productos de anticuerpos monoclonales más comercializados reconocen y unen un solo epitopo bien definido en el ligando objetivo (por ejemplo, TNFa). La fabricación de anticuerpos monoclonales humanos para la terapia permanece siendo dependiente del cultivo de las células de mamífero. El montaje de un complejo que consiste de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras (el complejo H2L2) y los procesos de glucosilación postraduccional posteriores, excluyen el uso de sistemas bacterianos. Los costos de producción y los costos de capital para la fabricación de anticuerpos mediante el cultivo de células de mamífero son altos, y amenazan limitar el potencial de las terapias basadas en anticuerpos en ausencia de alternativas aceptables. Una variedad de organismos transgénicos son capaces de expresar anticuerpos completamente funcionales. Estos incluyen plantas, insectos, pollos, cabras y ganado, pero ninguno se ha utilizado hasta ahora para fabricar productos terapéuticos comercializados. Los fragmentos de anticuerpos funcionales pueden fabricarse en E. coli, pero el producto generalmente tiene una baja estabilidad en el suero a menos que se pegile durante el procedimiento de fabricación. Los complejos de anticuerpos biespecíficos son moléculas basadas en Ig diseñadas, capaces de unirse a dos diferentes epitopos en ya sea el mismo o diferentes antígenos. Las proteínas de unión biespecíficas que incorporan anticuerpos solos o en combinación con otros agentes de unión, muestran una promesa para las modalidades de tratamiento en donde las funciones inmunes humanas capturadas provocan un efecto terapéutico, por ejemplo, la eliminación de patógenos (Van Spriel et al, (1999) J. Infect. Diseases, 179, 661-669; Tacken et al, (2004) J. Immunol, 172, 4934-4940; US 5,487,890), el tratamiento del cáncer (Glennie y van der Winkel, (2003) Drug Discovery Today, 8, 503-5100); e inmunoterapia (Van Spriel et al, (2000) Immunol. Today, 21 , 391-397; Segal et al, (2001) J. Immunol. Methods, 248, 1-6; Lyden et al, (2001) Nat. Med., 7, 1194-1201 ).

Los aspectos de fabricación están compuestos, en donde un producto de anticuerpo biespecífico se basa en dos o más complejos H2L2. Por ejemplo, la coexpresión de dos o más conjuntos de genes de cadena pesada y ligera puede resultar en la formación de hasta 10 diferentes combinaciones, únicamente una de las cuales es el heterodímero deseado (Suresh et al, (1986) Methods Enzymol, 121 , 210-228). Para tratar este aspecto, se han desarrollado varias estrategias para la producción en células de mamífero de formatos de IgG biespecíficos (BsIgG) de longitud completa, que retienen la función efectora de la cadena pesada. Los BsIgG requieren cadenas pesadas diseñadas de "protuberancia y orificio", para evitar la formación del heterodímero y utilizan cadenas L idénticas para evitar el mal apareamiento de las cadenas L (Cárter, (2001 ) J. Immunol. Methods, 248, 7-15). También se han descrito estrategias de reticulación química alterna para la producción de complejos de fragmentos de anticuerpo, cada uno que reconoce diferentes antígenos (Ferguson et al, (1995) Arthritis and Rheumatism, 38, 190-200), o la reticulación de otras proteínas de unión, por ejemplo, colectinas a fragmentos de anticuerpo (Tacken et al, (2004) J. Immunol., 172, 4934-4940). El desarrollo de diacuerpos o minianticuerpos (BsAb), generalmente que carecen de las funciones efectoras de la cadena pesada, también supera la redundancia del heterodímero. Estos comprenden anticuerpos de una sola cadena mínima que incorporan los sitios de unión VH y VL (scFv), que posteriormente se pliegan y dimerizan para formar un anticuerpo biespecífico divalente, monovalente para cada uno de sus antígenos objetivo (Holliger et al, (1993) PNAS, 90, 6444-6448; Muller et al., (1998) FEBS Lett, 422, 259-264). En un caso, los dominios CH1 y L constantes, se han utilizado como dominios de heterodimerización para la formación de minianticuerpos biespecíficos (Muller et al, (1998) FEBS Lett., 259-264). Se han desarrollado una variedad de métodos recombinantes, basados en sistemas de expresión de E. coli para la producción de BsAbs (Hudson, (1999) Curr. Opin. Immunol., 11, 548-557), aunque parecería que el costo y escala de producción del material del anticuerpo multivalente grado clínico permanece siendo el impedimento principal para el desarrollo clínico (Segal et al., (2001) J. Immunol. Methods, 248, 1-6). Recientemente, el concepto de BsAb se ha extendido para abarcar Di-diacuerpos, anticuerpos biespecíficos tetravalentes, en donde los dominios VH y VL en cada cadena H y L se han reemplazado por pares diseñados de dominios de unión scFv. Tales constructos, aunque complejos de diseñar, pueden montarse en células de mamífero en cultivo en ausencia de redundancia del heterodímero (Lu et al, (2003) J. Immunol. Methods, 279, 219-232). La estructura de las inmunoglobulinas es bien conocida en la técnica. La mayoría de las inmunoglobulinas naturales comprenden dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Las cadenas pesadas se unen una con la otra vía enlaces de disulfuro entre dominios de articulación localizados aproximadamente a la mitad de lo largo de cada cadena pesada. Una cadena ligera está asociada con cada cadena pesada en el lado N terminal del dominio de articulación. Cada cadena ligera está unida normalmente a su cadena pesada respectiva por un enlace disulfuro cerca del dominio de la articulación. Cuando una molécula de Ig está plegada de manera correcta, cada cadena se pliega en un número de distintos dominios globulares unidos por una secuencia polipeptídica más lineal. Por ejemplo, la cadena ligera se pliega en un dominio variable (V ) y uno constante (C ). Las cadenas pesadas tienen un dominio variable VH, adyacente al dominio variable de la cadena ligera, un primer dominio constante, un dominio de la articulación y dos o tres dominios constantes adicionales. La interacción de los dominios variables de la cadena pesada (VH) y la cadena ligera (VL), resulta en la formación de una región de unión al antígeno (Fv). Generalmente, se requieren ambos de VH y V para la unión al antígeno, aunque los dímeros de cadena pesada y los fragmentos amino terminales han mostrado retener la actividad en ausencia de la cadena ligera (Jaton et al, (1968) Biochemistry, 7, 4185-4195). Con el advenimiento de nuevas técnicas de biología molecular, la presencia de un anticuerpo con únicamente la cadena pesada (desprovisto de ia cadena ligera), se identificó en trastornos proliferativos de los linfocitos B en el hombre (Enfermedad de la Cadena Pesada) y en modelos murinos. El análisis de la enfermedad de la cadena pesada a nivel molecular, mostró que las mutaciones y supresiones a nivel del genoma podrían resultar en una expresión inapropiada del dominio CH1 de cadena pesada, dando lugar a la expresión del anticuerpo con únicamente la cadena pesada que carece de la capacidad para unirse a la cadena ligera (véase, Hendershot et al, (1987) J. Cell Biol, 104, 761-767; Brandt et al, (1984) Mol. Cell. Biol, 4, 1270-1277). Los estudios separados de dominios VH humanos aislados derivados de bibliotecas de fago, demostraron una unión específica del antígeno de los dominios VH, pero estos dominios VH probaron ser de baja solubilidad. Además, se sugirió que la selección de los dominios V humanos con característ¡eas~de unión específicas mostradas en los arreglos dél fago, podrían formar los bloques de construcción para anticuerpos diseñados (Ward et al, (1989) Nature, 341 , 544-546). Los estudios que utilizan otras especies de vertebrados han mostrado que los camélidos, como un resultado de mutaciones génicas naturales, producen dímeros con cadena pesada únicamente de lgG2 y lgG3 funcionales, que son incapaces de unirse a la cadena ligera debido a la ausencia de la región de unión a la cadena ligera CH1 (Hamers-Casterman et al, (1993) Nature, 363, 446-448), y que las especies tales como tiburón producen una familia de proteínas de unión similar a las que únicamente tienen la cadena pesada, relacionada probablemente con el receptor de los linfocitos T de mamíferos o la cadena ligera de la ¡nmunoglobulina (Stanfield et al, (2004) Science, 305, 1770-1773). Un rasgo caracterizante del anticuerpo con únicamente la cadena pesada de camélido, es el dominio VH de camélido, que proporciona una solubilidad mejorada con relación al dominio VH humano. El VH humano puede diseñarse para tener características de solubilidad mejoradas (véase, Davies y Riechmann, (1996) Protein Eng., 9 (6), 531-537; Lutz y Muyldermans, (1999) J. Immuno. Methods, 231 , 25-38), o la solubilidad puede adquirirse mediante selección natural in vivo (véase, Tanha et al., (2001) J. Biol. Chem., 216, 24114-24180). Sin embargo, en donde los dominios de unión VH se han derivado de bibliotecas de fago, las afinidades intrínsecas para el antígeno permanecen en el intervalo de bajo micromolar a alto nanomolar, a pesar de la aplicación de estrategias de mejora de la afinidad que involucran, por ejemplo, aleatorización del punto caliente de la afinidad (Yau et al, (2005) J. Immunol Methods, 291 , 213-224). Los anticuerpos V de camélido también están caracterizados por una espira CDR3 modificada. Esta espira CDR3 es, en promedio, más larga que aquéllas encontradas en los anticuerpos que no son de camélidos y es una característica considerada como una influencia principal en la afinidad y especificidad totales del antígeno, que se compensan por la ausencia de un dominio V en las especies de anticuerpo con únicamente la cadena pesada de camélidos (Desmyter et al, (1996) Nat. Struct. Biol, 3, 803-811 , Riechmann y Muyldermans, (1999) J. Immunol. Methods, 23, 25-28). Los estudios estructurales recientes en el anticuerpo de camélidos sugieren que la diversidad del anticuerpo es dirigida en gran medida por procesos de maduración in vivo que dependen de los eventos de recombinación V(D)J y la mutación somática (De Genst et al,. (2005) J. Biol. Chem., 280 (14), 14114-14121).

Recientemente, se han desarrollado métodos para la producción de anticuerpos con únicamente la cadena pesada en mamíferos transgénicos (véase, la WO02/085945 y la WO02/085944). El anticuerpo con únicamente la cadena pesada funcional de potencialmente cualquier clase (IgM, IgG, IgD, IgA o IgE), se derivan de cualquier mamífero (incluyendo el hombre), pueden producirse de mamíferos transgénicos (de manera preferida, ratones), como resultado de la exposición al antígeno. Los sitios de cadena pesada de ¡nmunoglobulina normal comprenden una pluralidad de segmentos del gen V, un número de segmentos del gen D y un número de segmentos del gen J. Cada segmento del gen V codifica del extremo casi N terminal al extremo C terminal de un dominio V. El extremo C terminal de cada dominio V es codificado por un segmento del gen D y un segmento del gen J. El rearreglo VDJ en los linfocitos B después de la maduración por afinidad, proporciona los dominios de unión VH que a continuación, con los dominios de unión V , forman un sitio de reconocimiento de unión al antígeno. La interacción de las cadenas pesada y ligera se facilita por la región CH1 de la cadena pesada y la región K o ? de la cadena ligera. Para la producción del anticuerpo con únicamente la cadena pesada, los sitios de la cadena pesada en la línea germinal, comprenden segmentos del gen que codifican algunas o todas las posibles regiones constantes. Durante la maduración, un dominio de unión VH rearreglado, se empalma en un segmento que codifica la región constante C 2, para proporcionar un gen rearreglado que codifica una cadena pesada que carece de un dominio CH1 , y por lo tanto, es incapaz de asociarse con una cadena ligera de inmunoglobulina. Los anticuerpos monoclonales únicamente con cadena pesada pueden recuperarse de los linfocitos B del bazo mediante tecnología de clonación estándar o recuperarse del ARNm de los linfocitos B mediante tecnología de representación del fago (Ward et al., (1989) Nature, 341 , 544-546). Los anticuerpos con únicamente la cadena pesada derivados de camélidos o animales transgénicos son de alta afinidad. Los análisis de la secuencia de los tetrámeros H2L2 normales, demostró que la diversidad resulta principalmente del rearreglo de VDJ y la hipermutación somática (Xu y Davies, (2000) Immunity, 13, 37-45). El análisis de la secuencia del ARNm con únicamente la cadena pesada expresada, ya sea producida en camélidos o animales transgénicos, apoya esta observación (De Genst et al., (2005) J. Biol. Chem., 280, 14114-14121 ). Una característica importante y común de las regiones VH naturales de camélido y humano, es que cada región se une como un monómero sin dependencia en la dimerización con una región VL para la solubilidad y afinidad de unión óptimas. Estas características se han reconocido previamente como particularmente adecuadas para la producción de agentes bloqueadores y agentes para la penetración del tejido. Los homo o heterodímeros también pueden generarse mediante escisión enzimática de los anticuerpos con únicamente la cadena pesada o mediante rutas sintéticas (Jaton et ah, (1968) Biochemistry, 7, 4185-4195 y US2003/0058074 A1 ). Sin embargo, los beneficios de un dominio de unión al anticuerpo monomérico aún tienen que utilizarse para tomar ventaja en el diseño de proteínas multiméricas como reactivos, agentes terapéuticos y de diagnóstico. El VH humano o el VHH de camélido producido mediante tecnología de representación del fago, carece de la ventaja de las características mejoradas como resultado de las mutaciones somáticas y la diversidad adicional proporcionada por la recombinación de la región D y J en la región CDR3 del sitio de unión al anticuerpo normal (Xu y Davies, (2000) Immunity, 13, 37-45). El VHH de camélido, aunque muestra beneficios en la solubilidad con relación al VH humano, es antigénico en el hombre y debe generarse mediante inmunización de camélidos o mediante tecnología de representación del fago. La incorporación de dominios de unión VH tiene una clara ventaja sobre el uso de scFv que deben diseñarse de los dominios VH y VL con en potencial de pérdida de especificidad y afinidad. Los dominios de unión VH derivados de familias de genes relacionadas, tales como receptores de los linfocitos T de la familia de inmunoglobulina de tiburón también proporcionan alternativas a scFv para la generación de moléculas de unión bi o multiespecíficas. Otras proteínas de unión que aparecen naturalmente y dominios de las mismas, que incluyen, por ejemplo, fragmentos del receptor soluble, también pueden utilizarse.

Las clases de anticuerpos difieren en su función fisiológica. Por ejemplo, la IgG juega un papel dominante en una respuesta inmune madura. La IgM está involucrada en la fijación y aglutinación del complemento. La IgA es la clase principal de Ig en las secreciones, lágrimas, saliva, calostro, moco, y juega un papel en la inmunidad local. La inclusión de regiones constantes de cadena pesada específicas de la clase cuando se diseñan complejos de unión multivalentes, proporciona el beneficio terapéutico de la función efectora in vivo que depende de la funcionalidad requerida. El diseño de regiones efectoras individuales también puede resultar en la adición o supresión de funcionalidad (Van Dijk y van der Winkel, Curr. Opin. Chem. Biol., (2001 ) Aug 5 (4), 368-374). Parece probable que la producción y selección óptimas de los anticuerpos con únicamente la cadena pesada que comprenden dominios de unión VH de alta afinidad (ya sean de origen humano o de camélido o de otro origen), se beneficiarán de los procedimientos alternos a aquéllos que dependen de la sección de bibliotecas de fago aleatorizadas que no facilitan la recombinación y saturación por afinidad in vivo. Así, la inclusión de una funcionalidad de una región constante de IgA proporcionaría una función mucosa mejorada contra los patógenos (Leher et al., (1999) Exp. Eye. Res., 69, 75-84), mientras que la presencia de una funcionalidad de la región constante de lgG1 proporciona una estabilidad en suero mejorada in vivo. La presencia de ios dominios constantes CH2 y CH3 de cadena pesada, proporciona las bases para una dimerización estable como se observa en los anticuerpos naturales, y proporciona sitios de reconocimiento para la glucosilación postraduccional. La presencia de CH2 y CH3 también permite el reconocimiento del anticuerpo secundario cuando se utilizan complejos biespecíficos y multivalentes como reactivos y elementos de diagnóstico. Las secuencias de la región variable con únicamente la cadena pesada de camélido, aisladas, prearreg ladas, se han clonado previamente en la parte frontal de una articulación y el dominio efector de lgG1 humana, insertado en vectores y expresado en células COS para generar anticuerpos. Los anticuerpos expresados en este medio in vitro ya se han sometido a los procedimientos de conmutación de clase (isotipo) y maduración por afinidad (hipermutación) in vivo en el camello, y pueden unirse al antígeno (Riechmann y Muyldermans, (1999) J. Immunol. Methods, 231 , 25-38). Existe la necesidad en la técnica para maximizar la diversidad de los anticuerpos con únicamente la cadena pesada y la respuesta de los linfocitos B in vivo y, en particular, generar un repertorio funcional de anticuerpos con únicamente la cadena pesada humanos específicos de la clase, y dominios de unión con únicamente la cadena pesada VH funcional, que mantengan el potencial de unión máximo de unión al antígeno para utilizarse en diversas aplicaciones clínicas, industriales y de investigación. También existe la necesidad en la técnica de producir un complejo de unión al polipéptido bivalente o multivalente, soluble, que comprende al menos parte de una cadena pesada del anticuerpo, solo o en combinación con una cadena efectora (ligera), que es fisiológicamente estable y tiene una función efectora.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para la producción de un anticuerpo con únicamente la cadena pesada VH o un anticuerpo con únicamente la cadena pesada VH de camélido (VHH) en un mamífero transgénico, que comprende el paso de expresar un sitio de la cadena pesada VH heterólogo o VH de camélido (VHH) en el mamífero, en donde el sitio de cadena pesada de VH o de VH de camélido (VHH) comprende una región constante de cadena pesada que no codifica un dominio CH1 y sitio el cual, cuando se expresa, es capaz de formar anticuerpos con únicamente la cadena pesada de una clase o clases definidas. El sitio de la cadena pesada VH O VH de camélido (VHH), puede comprender uno o más segmentos del gen V de camélido o no de camélido. De manera preferida, el segmento del gen V se ha seleccionado o diseñado para mostrar características de solubilidad mejoradas. De manera preferida, el segmento del gen V se deriva de un humano. La región constante de cadena pesada de los sitios de la cadena pesada, puede comprender un gen de la región constante de cadena pesada Caí y/o Ca2, Ce, Cd, C? y/o Cµ. Además, la región constante de la cadena pesada de los sitios de la cadena pesada puede comprender más de una de las regiones constantes de cadena pesada siguientes: Ca-i, Ca2, Ce, Cd, C? Cµ. De manera preferida, el sitio de la cadena pesada VH comprende una región variable que comprende al menos un segmento del gen V humano o de camélido, al menos un segmento D y al menos un segmento J, en donde un segmento del gen V de humano o camélido, un segmento del gen D y un segmento del gen J, son capaces de recombinarse para formar una secuencia codificante VDJ. El sitio de la cadena pesada de manera preferida, comprende veinte o más segmentos del gen D y/o cinco o más segmentos del gen J. De manera preferida, los segmentos D y J son de origen vertebrado, de manera preferida humano. La espira CDR3 puede derivarse utilizando los segmentos D y J derivados de cualquier vertebrado y son de manera preferida, segmentos del gen D y J humano. El sitio de la cadena pesada VH también puede comprender una secuencia de recombinación (rss), capaz de recombinar un segmento del gen J directamente con un gen de la región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada del sitio heterólogo de la cadena pesada es de origen humano o de origen vertebrado, por ejemplo, de origen de camélido. De manera alterna, la región constante puede no ser de origen de la cadena pesada de inmunoglobulina. De manera preferida, los métodos de la invención resultan en una maduración de los linfocitos B esencialmente normal. La presente invención también proporciona un anticuerpo con únicamente la cadena pesada, o un fragmento del mismo, o una mezcla de clases de anticuerpos con únicamente la cadena pesada obtenidos o que se pueden obtener de acuerdo con un método de la invención. Este anticuerpo con únicamente la cadena pesada puede ser un anticuerpo monoclonal, o un fragmento del mismo, tal como dominio de unión VH humano o de camélido. El dominio de unión VH de la invención puede carecer de una espira CDR3 extendida similar a la del camélido o, de manera alterna, puede comprender una espira CDR3 extendida similar a la del camélido. La presente ¡nvención también proporciona un vector que comprende un sitio heterólogo de la cadena pesada de la invención, y una célula hospedera transformada con tal vector. La ¡nvención también proporciona un mamífero transgénico que expresa un sitio heterólogo de la cadena pesada descrito en la presente. De manera preferida, el mamífero transgénico de la ¡nvención tiene una capacidad reducida para producir anticuerpos que incluyen cadenas ligeras. También se proporciona el uso de un anticuerpo con únicamente la cadena pesada, o un fragmento del mismo, de acuerdo con la ¡nvención en la preparación de un medicamento para la ¡nmunoterapia. Los anticuerpos con únicamente la cadena pesada de la invención, también pueden utilizarse como elementos de diagnóstico, reactivos, abzimas o agentes inhibidores. También se proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo con únicamente la cadena pesada o un fragmento del mismo de acuerdo con la ¡nvención, y un portador farmacológicamente apropiado.

La invención también proporciona un método de producción y selección de anticuerpos con únicamente la cadena pesada, que comprende los pasos de: a) inyectar un antígeno en el mamífero transgénico como se describe en la presente; b) aislar una célula o tejido que expresa un anticuerpo con únicamente la cadena pesada, específico del antígeno de interés; y c) producir uñ Rib idoma dé la célula o tejido del paso (b) y d) opcionalmente, clonar el ARNm del anticuerpo con únicamente la cadena pesada del hibridoma para la producción posterior en un sistema de expresión heterólogo, tal como un sistema de mamífero, de planta, insecto, microbiano, micótico o alterno. Los dominios de unión VH pueden producirse entonces identificando y aislando un dominio VH específico del antígeno del ARNm clonado del paso c). Los dominios de unión VH de la invención también pueden producirse mediante: a) inyectar un antígeno en el mamífero transgénico descrito en la presente; b) aislar una célula o tejido que expresa un anticuerpo con únicamente la cadena pesada, específico del antígeno de interés; c) clonar el sitio VH del ARNm derivado de la célula o tejido aislado; d) representar la proteína codificada utilizando una biblioteca de fago o una similar; e) identificar lo dominios VH específico del antígeno; y f) expresar los dominios VH solos o como una proteína de fusión en sistemas de expresión bacterianos, de levadura o alternos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los presentes inventores han superado las limitaciones de la técnica anterior y mostrado que los animales transgénicos, en particular ratones, pueden generarse utilizando "micrositios" para producir anticuerpos con únicamente la cadena pesada específicos de la clase, o una mezcla de diferentes clases de anticuerpos con únicamente la cadena pesada que se secretan por el plasma o los linfocitos B. Estos pueden utilizarse a continuación para generar un suministro confiable de un anticuerpo con únicamente la cadena pesada, específico de la clase, utilizando tecnología de hibridoma establecida o como una fuente de dominios de unión VH de camélido (VHH), funcionales, o dominios de unión con únicamente la cadena pesada V , de manera preferida, dominios de unión con únicamente la cadena pesada VH solubles, de origen humano, que están libres de las funciones efectoras, pero que mantienen la función de unión. Los anticuerpos con únicamente la cadena pesada (¡ncluyendo los anticuerpos de camélido), que pueden generarse mediante los métodos de la invención, muestran alta afinidad de unión, que resultan de los rearreglos del segmento del gen V, D y J y de mutaciones somáticas, generalmente en la ausencia de una espira CDR3 amplificada. La maduración de los linfocitos B esencialmente normal, se observa con altos niveles de anticuerpos con únicamente la cadena pesada presentes en el plasma aislado (con la condición de que el dominio CH1 sea eliminado de todas las clases de anticuerpos presentes en el sitio recombinante). La maduración de los linfocitos B y la secreción de los dímeros montados (por ejemplo, IgG) o multímeros (por ejemplo, IgM), no depende de la presencia o expresión de los genes de cadena ligera. En análisis de la secuencia nucleotídica del ARNm específico del antígeno que codifica una cadena pesada específica del antígeno aislada de hibridomas derivados de ratones transgénicos, ha demostrado que la diversidad del anticuerpo de cadena pesada es principalmente una función de la recombinación VDJ. Además, los presentes inventores han mostrado que la diversidad del anticuerpo se genera en la región CDR3 del dominio de unión del antígeno funcional del anticuerpo con únicamente la cadena pesada con una contribución más limitada de las mutaciones somáticas en los dominios VH. Utilizando los métodos descritos en la presente, los dominios VH funcionales pueden clonarse y expresarse en sistemas bacterianos para generar dominios de unión VH con una retención completa de la unión, especificidad y afinidad al antígeno. Además, los dímeros y multímeros de cadena pesada específicos de la clase, pueden secretarse por las líneas celulares del hibridoma en cultivo. La invención también enseña que los ratones transgénicos pueden programarse para producir clases preferidas del anticuerpo con únicamente la cadena pesada en respuesta a la exposición al antígeno, por ejemplo, únicamente IgG en oposición a únicamente IgM o, por ejemplo, mezclas de IgA, IgG e IgM. Los inventores han descrito previamente (véase la WO02/085945 y la WO02/085944), la generación de ratones transgénicos que expresan un sitio de la región constante de la cadena pesada IgG humana mínima, desprovisto del exón CH1 y enlazados por segmentos D y J humanos con dos genes VHH de llama. Esto produce un anticuerpo con únicamente la cadena pesada de IgG específico del antígeno de alta afinidad, funcional, cuando se expone con un antígeno. Las mezclas de las clases de anticuerpos con únicamente la cadena pesada (IgM e IgG), pueden obtenerse mediante la conmutación de la clase in vivo a través de la utilización de constructos de genes que incorporan las regiones constantes de cadena pesada en cascada (con la condición de que todos los genes de la región constante carezcan de un dominio CH1 y, cuando está presente, un dominio CH4). Las mejoras descritas en la presente muestran que un ratón construido con el mismo sitio de la región constante IgG enlazado por segmento D y J humanos con dos genes VHH de llama y un sitio de la región constante IgM humana, desprovisto de un exón CH1 enlazado por los mismos segmentos del segmento D y J humanos con dos genes VHH de llama, también produce un anticuerpo con únicamente la cadena pesada IgG (multimérico) de alto peso molecular y un anticuerpo con únicamente la cadena pesada de IgG (dímero). De manera sorprendente, la maduración de los linfocitos B esencialmente normal y la producción del anticuerpo depende en la ausencia completa de las secuencias CH1 de cada región constante de la cadena pesada presente en el sitio transgénico. Además, no hay requisito de la eliminación del exón CH4 si está presente. Así, por ejemplo, un animal transgénico que porta un sitio de la cadena pesada IgG humana con un exón CH1 funcional enlazado por los mismos segmentos del gen D y J humanos a dos segmentos del gen V de llama, y un sitio de la región de cadena pesada constante IgG desprovisto del exón CH1 enlazado por los mismos segmentos del gen D y J humanos a dos segmentos del gen V de llama, produce niveles muy bajos de anticuerpos con únicamente la cadena pesada y no muestran evidencia de la maduración de los linfocitos B. Otros dominios efectores, incluyendo el dominio CH4, puede incorporarse o no, conforme se desee, para introducirse a, o eliminarse de las caracteristicas efectoras del anticuerpo con únicamente la cadena pesada resultante. Los inventores han encontrado que la expresión productiva del anticuerpo (es decir, maduración de los linfocitos B), puede resultar del uso de cualquier segmento del gen V presente en el constructo. El aislamiento y el secuenciamiento del ARNm del anticuerpo derivado de los linfocitos B, muestra que la recombinación del segmento del gen D y J ocurre para generar la diversidad de CDR3. La comparación de la secuencia de los dominios VH resultantes revela mutaciones somáticas, indicando que han ocurrido eventos de maduración por afinidad en los segmentos del gen D y J recombinados y también en el dominio VH del ARNm del anticuerpo expresado resultante. Los constructos preferidos incorporan segmentos del gen V seleccionados o diseñados para una solubilidad mejorada y enlazados a una acumulación de la cadena D y J para la recombinación y generación de CDR3. De manera preferida, las secuencias VDJ están enlazadas a un dominio de efector constante de elección en cascada, cada uno desprovisto del exón CH1. La ¡nvención no está limitada a la derivación y producción de dominios de unión VH humanos o anticuerpos con únicamente la cadena pesada, específicos de la clase humanos o de camélidos (de manera preferida, dominios de unión VH solubles) (solos o enlazados al dominio efector de elección), sino que abarca la producción de combinaciones quiméricas de cualquier segmento del gen V de origen vertebrado (opcionalmente diseñado para mejorar las características de solubilidad), enlazados al segmentos del gen D y J. De manera preferida, los segmentos del gen V son de origen humano y no son segmentos del gen V derivados de un camélido. Los dominios VH resultantes pueden no comprender una espira CDR3 similar a la del camélido, amplificada, a menos que los segmentos D y J se hayan derivado de un camélido. Esto resulta en un dominio VH que exhibe diversidad y maduración por afinidad de CDR3 enlazada de manera operativa a una región constante del efector. Lo último asegura la secreción funcional y opcionalmente el montaje en el vertebrado transgénico original de elección, y también proporciona una función efectora seleccionable posterior si esto se requiere. Estas observaciones tienen importantes implicaciones para el diseño mejorado y simplificado de anticuerpos con únicamente la cadena pesada, específicos de la clase, y la derivación de dominios VH solubles, con alta afinidad, que incorporan la maduración por afinidad vía la mutación somática. La incorporación de funciones seleccionadas efectoras de la región constante de cadena pesada (desprovista de CH1 ) O mezclas de los mismos, permite la producción de cualquier clase de anticuerpos con únicamente la cadena pesada o cualquier mezcla de anticuerpos con únicamente la cadena pesada sin el requisito de un diseño adicional del anticuerpo. Los dominios VH pueden expresarse solos o en sistemas bacterianos o de otros microorganismos o como un anticuerpo con únicamente la cadena pesada funcional que incorpora dominios efectores secretados por hibridomas o células transfectadas en cultivo. Los anticuerpos y los dominios de unión V de origen humano tienen una amplia gama de aplicaciones en el campo del cuidado de la salud, como medicinas, elementos de diagnóstico y reactivos, con aplicaciones paralelas en agricultura, medio ambiente e industriales.

Así, en un primer aspecto, la presente ¡nvención proporciona un método para la producción de un anticuerpo con únicamente la cadena pesada VH en un mamífero transgénico, que comprende el paso de expresar un sitio de la cadena pesada VH heterólogo en el mamífero. De manera preferida, el sitio de la cadena pesada VH comprende una región constante de cadena pesada que no codifica el dominio CH1 y sitio el cual es capaz de formar un repertorio diverso de anticuerpos completos con únicamente la cadena pesada cuando se expresa. El primer aspecto de la presente invención también proporciona un método para la producción de un anticuerpo con únicamente la cadena pesada VH de camélido en un mamífero transgénico, que comprende el paso de expresar un sitio de la cadena pesada VH de camélido en ese mamífero, en donde el sitio de la cadena pesada VH comprende una región constante de cadena pesada que no codifica un dominio CH1 y sitio el cual, cuando se expresa, es capaz de formar un repertorio diverso de anticuerpos completos con únicamente la cadena pesada, que incorpora el rearrego VDJ y la afinidad por maduración en respuesta a la exposición al antígeno. Las moléculas efectoras de cadena pesada pueden diseñarse para que estén libres de dominios funcionales, por ejemplo, los dominios CH4 carboxi terminales, con la condición de que el diseño no afecte los mecanismos secretores que evitan el montaje de la superficie celular y, en consecuencia, la maduración de los linfocitos B. Los exones CH1 solos, son suprimidos del sitio heterólogo o están ausentes del sitio. Pueden diseñarse características adicionales en el sitio, por ejemplo, para mejorar la glucosilación o agregar una función. De manera preferida, el sitio heterólogo, cuando se expresa, es capaz de formar moléculas funcionales de IgA, IgE, IgG, IgD o IgM o isotipos de las mismas. Las clases de anticuerpos individuales o las mezclas de clases o ¡sotipos de anticuerpos de los mismos, también pueden producirse. En consecuencia, el sitio heterólogo de la cadena pesada se diseña para producir clases preferidas o mezclas de anticuerpo con únicamente la cadena pesada, dependiendo de las clases de anticuerpo requeridas, con una maduración de los linfocitos B esencialmente normal. El uso de segmentos del gen V, D y J de camélido, y una región efectora del camélido producirá anticuerpos de camélido con características peculiares a los camélidos, tales como espiras CDR3 amplificadas. El uso de los segmentos del gen V, D y J humanos, que comprenden los segmentos del gen V, seleccionados de manera aleatoria o seleccionados o diseñados para mejorar la solubilidad, producirán anticuerpos humanos con únicamente la cadena pesada, funcionales. Los anticuerpos obtenidos de acuerdo con la invención, tienen la ventaja con respecto a aquéllos de la técnica anterior, en que son de sustancialmente cualquier clase única o conocida, y de manera preferida de origen humano. Los anticuerpos son de una alta afinidad que resulta de una combinación de la recombinación de VDJ y la maduración por afinidad in vivo.

Los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden aislarse, caracterizarse y fabricarse utilizando métodos bien establecidos, conocidos por aquellos con experiencia en la técnica.

El sitio heterólogo de la cadena pesada En el contexto de la presente invención, el término "heterólogo", significa una secuencia nucleotídica o un sitio como se describe en la presente, que no es endógeno al mamífero en el cual se localiza. Un "sitio de la cadena pesada VH" en el contexto de la presente invención, se relaciona con un micrositio mínimo que codifica un dominio VH que comprende uno o más segmentos del gen V, uno o más segmentos del gen D y uno o más segmentos del gen J, enlazados de manera operativa a una o más regiones efectoras de la cadena pesada (que carecen de un dominio CH1 ). De manera preferida, la fuente primaria de la variabilidad del repertorio del anticuerpo es la región CDR3 formada por la selección de los segmentos del gen D y J por las uniones V-D y D-J. La ventaja de la presente invención es que el repertorio y la diversidad del anticuerpo obtenidos en las secuencias del gen VH rearregladas, pueden maximizarse a través del uso de múltiples segmentos del gen D y J. La mutación somática posterior se logra aunque utilizando un sitio mínimo (micrositio), sin la necesidad de un gran número de segmentos del gen V o los sitios de inmunoglobulina VL y Lc (cadena ligera).

De manera preferida, el sitio de la cadena pesada VH comprende de dos a cinco segmentos del gen V (2, 3, 4 ó 5), derivados de cualquier especie de vertebrados. De manera preferida, los segmentos del gen V son de origen humano, seleccionados o diseñados opcionalmente para una solubilidad mejorada. De manera preferida, el sitio de la cadena pesada VH comprende de dos a cuarenta (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 40) o más segmentos del gen D. Los segmentos del gen D pueden derivarse de cualquier especie de vertebrados, pero de manera preferida, los segmentos del gen D son segmentos del gen D humano (normalmente 25 segmentos del gen D funcionales). De manera preferida, el sitio de la cadena pesada VH comprende de dos a veinte (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 ó 20) o más segmentos del gen J. El segmento del gen J pueden derivarse de cualquier especie vertebrada, pero de manera preferida, los segmentos del gen J son segmentos del gen J humano (normalmente 6 segmentos del gen J). De manera preferida, el sitio de la cadena pesada VH comprende dos o más segmentos del gen V, veinticinco segmentos del gen D humano funcionales y 6 segmentos del gen J humano. El término "segmento del gen V" abarca un segmento del gen V natural, derivado de un vertebrado, incluyendo camélidos y humanos, que se ha seleccionado, mutado o diseñado opcionalmente para características mejoradas, tales como solubilidad. Los segmentos del gen V también se encuentran en otras especies tales como el tiburón (véase, Kokubu et al, (1988) EMBO. J., 7, 3413-3422), o han evolucionado para proporcionar diversas familias similares a VH de proteínas de unión ejemplificadas, por ejemplo, en la evolución del repertorio VL de la cadena ligera de la inmunoglobulina o el repertorio VH del receptor de los linfocitos T. Los métodos preferidos para mejorar la solubilidad de un dominio VH, incorporan medios racionales, en oposición con únicamente aleatorios, y se ejemplifican en Davies y Reichmann, (1996) Protein Eng., 9 (6), 531-537 y en Riechmann y Muyidermans, (1999) J Immunol. Methods, 231 , 25-38. La selección natural también puede ocurrir in vivo a través de la maduración por afinidad y la incorporación de mutaciones favorables en el gen VH después del rearreglo VDJ. El segmento del gen V debe ser capaz de recombinarse con un segmento del gen D, un segmento del gen J y una región constante de cadena pesada (efectora) (que puede comprender varios exones, pero excluye un exón C 1), de acuerdo con la presente invención, para generar un anticuerpo con únicamente la cadena pesada VH cuando el ácido nucleico se expresa. Un segmento del gen V de acuerdo con la presente invención, también incluye dentro de su alcance cualquier secuencia génica que codifique un fragmento homólogo, derivado o de proteína, que es capaz de recombinarse con un segmento del gen D, un segmento del gen J y una región constante de cadena pesada (que comprende uno o más exones, pero no un exón CH1) de acuerdo con la presente invención, para generar un anticuerpo con únicamente la cadena pesada como se definió en la presente. Así, las secuencias que codifican a VH pueden derivarse de una fuente natural o pueden sintetizarse utilizando métodos familiares para aquellos con experiencia en la técnica. Un "dominio VH" en el contexto de la presente invención, se refiere a un producto de expresión del gen V cuando se recombina con un segmento del gen D y un segmento del gen J como se definió anteriormente. De manera preferida, el dominio VH como se utiliza en la presente, permanece en solución y es activo en un medio fisiológico sin la necesidad de ningún otro factor para mantener la solubilidad. De manera preferida, la capacidad del dominio V soluble para unirse al antígeno se ha mejorado por la recombinación de VDJ y la mutación somática. No hay dependencia de la presencia o ausencia de la espira CDR3 amplificada peculiar a las especies de camélidos. El dominio V es capaz de unirse al antígeno como un monómero y, cuando se combina con las regiones constantes efectoras, pueden producirse en formas monoespecíficas, biespecíficas, multiespecíficas, bivalentes o multivalentes, dependiendo de la elección y el diseño de las moléculas efectoras utilizadas (por ejemplo, IgG, IgA, IgM, etc.), o los mecanismos alternos de dimerización y multimerización. Cualquier probabilidad de unirse con un dominio V cuando se expresa como parte de un complejo de anticuerpo con únicamente la cadena pesada soluble, se ha eliminado por el retiro dei exón CH1 (véase, Sitia et al, (1990) Cell, 60, 781-790). El dominio VH solo también puede diseñarse con diversos dominios de proteína para producir proteínas de fusión para propósitos terapéuticos y de diagnóstico seleccionados, por ejemplo, con toxinas, enzimas y agentes para la formación de imágenes. En el contexto de la presente invención, los términos "un segmento del gen D" y "un segmento del gen J" ¡ncluyen secuencias naturales de los segmentos del gen D y J. De manera preferida, los segmentos del gen D y J se derivan del mismo vertebrado del cual se deriva el segmento del gen V. Por ejemplo, si un segmento del gen V se deriva de un humano y a continuación se solubiliza o diseña, los segmentos del gen D y J de manera preferida, también se derivan de un humano. De manera alterna, los segmentos del gen V pueden derivarse, por ejemplo, del camello, y los segmentos del gen D y J de un humano o viceversa. Los términos segmento del gen D y segmento del gen J, también incluyen dentro de su alcance, derivados, homólogos y fragmentos de los mismos, siempre que el segmento resultante pueda recombinarse con los componentes restantes de un sitio del anticuerpo de cadena pesada como se describe en la presente, para generar un anticuerpo con únicamente la cadena pesada como se describe en la presente. Los segmentos del gen D y J pueden derivarse de fuentes naturales o pueden sintetizarse utilizando métodos familiares para aquellos con experiencia en la técnica y descritos en la presente. Los segmentos del gen V, D y J, son capaces de recombinación y, de manera preferida, se someten a mutación somática. Los segmentos del gen V, D y J se derivan, de manera preferida, de una sola especie de vertebrados. Esta puede ser cualquier especie de vertebrado, pero de manera preferida es un humano. Además, un sitio heterólogo de la cadena pesada de acuerdo con la presente invención comprende una región de ADN que codifica una región constante de cadena pesada que proporciona funciones efectoras in vivo (por ejemplo, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD o isotipos de las mismas). La invención también proporciona un anticuerpo con únicamente la cadena pesada, específico del antígeno obtenido o que se puede obtener mediante los métodos de la presente invención.

La región constante de cadena pesada Operacionalmente, una región constante de cadena pesada se codifica por un segmento del gen natural o diseñado que es capaz de recombinarse con un segmento del gen V, un segmento del gen D y un segmento del gen J en un linfocito B. De manera preferida, la región constante de cadena pesada se deriva de un sitio de inmunoglobulina. De acuerdo con este aspecto de la invención, cada región constante de cadena pesada comprende esencialmente al menos un gen de la región constante de cadena pesada, que se expresa sin un dominio CH1 funcional, de manera que puede ocumir la generación de un anticuerpo con únicamente la cadena pesada. Cada región constante de cadena pesada puede también comprender uno o más exones de la región constante de cadena pesada, adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste de Cd, C??- , Cµ, Ce y Ca-1-2, con la condición de que los genes de la región constante de cadena pesada adicionales tampoco expresen un dominio CH1 funcional. Los segmentos del gen de la región constante de cadena pesada se seleccionan dependiendo de la clase preferida o mezcla de clases de anticuerpos requerida. Opcionalmente, el sitio heterólogo de la cadena pesada es deficiente en Cµ y Cd. Por ejemplo, las moléculas de Ig de la clase M, se conocen por jugar un papel importante en la activación de los macrófagos y la trayectoria del complemento. Debido a la proximidad cercana de sus sitios de unión, IgM tiene una alta afinidad por los patógenos, incluyendo los virus. Sin embargo, IgM también se conoce por ser difícil de utilizar en técnicas de inmunoensayo rápido, mientras que la Ig de clase G puede utilizarse fácilmente en estas técnicas. Para tales usos, sería útil seleccionar la clase del anticuerpo preferido, es decir, IgG o IgM. La expresión de todo o parte de un sitio heterólogo C? de la cadena pesada desprovisto de CH1 , producirá opcionalmente algunos o todos isotipos de IgG, dependiendo de los isotipos lgG1 , lgG2, lgG3 e lgG4 presentes en el sitio IgG heterólogo. De manera alterna, las cadenas pesadas pueden comprender los genes Ce. La molécula de IgE resultante puede también utilizarse en terapia.

De manera alterna, pueden obtenerse mezclas seleccionadas de anticuerpos. Por ejemplo, puede obtenerse IgA e IgM cuando la región constante de cadena pesada comprende un gen Ca y uno Cµ. De manera preferida, la región constante de cadena pesada de acuerdo con la presente invención, es de origen humano, en particular cuando el anticuerpo de cadena pesada se va a utilizar para aplicaciones terapéuticas en humanos. En donde los anticuerpos de cadena pesada se van a utilizar para propósitos de diagnóstico o veterinarios, la región constante de cadena pesada se deriva de manera preferida del organismo, vertebrado o mamífero objetivo en o sobre el cual se va a realizar el diagnóstico o la terapia veterinaria. Cuando se expresa, la región constante de cadena pesada carece de un dominio CH1 funcional. El exón CH1 y, opcionalmente, las regiones constantes Cµ y Cd pueden mutarse, suprimirse o sustituirse. De manera preferida, el exón CH1 se suprime. La presencia, por ejemplo, de IgM con un dominio CH1 funcional, inhibe la maduración de los linfocitos B y en consecuencia, limita la expresión productiva de IgG únicamente con cadena pesada (desprovista de CH1 ) dentro del mismo sitio, puesto que la maduración de los linfocitos B se inhibe. Un "exón de la región constante de cadena pesada" ("exón CH") como se describe en la presente, ¡ncluye las secuencias de exones CH de vertebrados naturales, pero especialmente de mamífero. Esto varía de una manera específica de la clase. Por ejemplo, IgG e IgA están desprovistas naturalmente de un dominio CH4. El término "exón CH" también incluye dentro de su alcance, derivados, homólogos y fragmentos de los mismos, en la medida en que el exón CH es capaz de formar un anticuerpo con únicamente la cadena pesada funcional, como se define en la presente, cuando es un componente de una región constante de la cadena pesada. Opcionalmente, cuando está presente, el dominio C 4 u otros dominios funcionales pueden diseñarse o suprimirse dentro del transgen, con la condición de que tal proceso no inhiba el proceso secretorio intracelular, la maduración de los linfocitos B o la actividad de unión del polipéptido del anticuerpo resultante.

Mamíferos El mamífero transgénico utilizado en los métodos de la invención no es un humano. El mamífero transgénico es de manera preferida un roedor tal como un conejo, cobayo, rata o ratón. Los ratones son especialmente preferidos. También pueden emplearse mamíferos alternativos tales como cabras, ovejas, gatos, perros u otros animales. Los animales transgénicos de manera preferida se generan utilizando una tecnología establecida de inyección del oocito y, en donde está establecido, tecnología de la célula ES o clonación. De manera ventajosa, los sitios de la cadena pesada y opcionalmente la ligera de inmunoglobulina, endógenos al mamífero se suprimen o silencian cuando un anticuerpo con únicamente la cadena pesada se expresa de acuerdo con los métodos de la invención. Este procedimiento de generar anticuerpos con únicamente la cadena pesada como se describió anteriormente, pueden ser de uso particular en la generación de anticuerpos para uso terapéutico humano, puesto que con frecuencia la administración de anticuerpos a especies de vertebrados que es de un origen diferente de la fuente de los anticuerpos, resulta en el inicio de una respuesta inmune contra aquellos anticuerpos administrados. Por lo tanto, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un mamífero transgénico que expresa un sitio heterólogo de la cadena pesada de acuerdo con la presente invención. El mamífero transgénico puede diseñarse para tener una capacidad reducida para producir anticuerpos que incluyan las cadenas ligeras. Las células que producen anticuerpos pueden derivarse de animales transgénicos de acuerdo con la presente invención y utilizarse, por ejemplo, en la preparación de hibridomas para la producción de anticuerpos con únicamente la cadena pesada como se definió en la presente. De manera adicional o alterna, las secuencias de ácido nucleico pueden aislarse de mamíferos transgénicos de acuerdo con la presente invención, y utilizarse para producir anticuerpos de cadena con únicamente cadena pesada del dominio VH O complejos biespecíficos/bifuncionales de los mismos, utilizando técnicas de ADN recombinante que son familiares para aquellos con experiencia en la técnica. De manera alterna o adicional, los anticuerpos con únicamente la cadena pesada específica del antígeno puede generarse mediante inmunización de un animal transgénico de acuerdo con la preseníe invención. Así, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para la producción de anticuerpos con únicamente la cadena pesada, inmunizando un mamífero transgénico de acuerdo con la presente invención con un antígeno. En una modalidad preferida de este aspecto de la ¡nvención, el mamífero es un ratón.

Anticuerpos con únicamente la cadena pesada y fragmentos de los mismos En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo con únicamente la cadena pesada que se puede obtener de acuerdo con un método de la presente invención y fragmentos y derivados funcionales de los mismos. Los fragmentos que abarcan el dominio de unión VH pueden derivarse mediante escisión enzimática o escisión con bromuro de cianógeno de un anticuerpo con únicamente la cadena pesada de ia ¡nvención, es decir, desprovisto de las cadenas ligeras (Jaton et al, (1968) Biochemistry, 7, 4185-4195).

Un fragmento funcional preferido es un dominio de unión con únicamente la cadena pesada, específico del antígeno, es decir, un dominio de unión VH, como se expresa por el sitio VH como resultado de la recombinación entre los únicos segmentos del gen V, D y J, seguido posteriormente por una mutación somática. De acuerdo con este aspecto de la invención, los sitios VH pueden clonarse de, por ejemplo, ARNm aislado de una célula que produce un anticuerpo de un animal transgénico inmunizado como se describió anteriormente. Las secuencias clonadas pueden a continuación, representarse utilizando un fago (Ward et al., (1989) Nature, 341 , 544-546) o bibliotecas de representación similares, por ejemplo, utilizando sistemas basados en levadura (Boder y Wittrup, (1997) Nat. Biotechnol., 15, 553-7), y los dominios de unión VH específicos del antígeno identificados. Los dominios de unión a la cadena pesada específicos del antígeno pueden fabricarse ya sea solos o como proteínas de fusión en sistemas de expresión escalables, bacterianos, de levadura o alternos. Las secuencias que codifican los dominios de unión VH también pueden clonarse de hibridomas caracterizados derivados mediante procedimientos clásicos de ratones transgénicos inmunizados. Estos también pueden utilizarse para la producción de dominios de unión V y derivados de los mismos, incluyendo el diseño de las clases de anticuerpo definidas (por ejemplo, IgE o IgA), y variantes de las mismas, con funciones efectoras diferentes. En consecuencia, la invención también proporciona un método para producir un dominio de unión VH que comprende los pasos de: a) aislar una célula o tejido que expresa un anticuerpo con únicamente la cadena pesada específica del antígeno de interés (de manera preferida, un anticuerpo con únicamente la cadena pesada específica del antígeno, soluble, de interés); b) clonar la secuencia que codifica el dominio de unión V del ARNm derivado de la célula o tejido aislado; c) representar la proteína codificada utilizando una biblioteca de fago o una similar; d) identificar los dominios de unión V específicos del antígeno, y e) expresar los dominios de unión VH solos o como una proteína de fusión en sistemas de expresión bacterianos, de levadura, de mamífero o alternos. De manera alterna, los fragmentos que contienen el dominio VH pueden generarse de anticuerpos con únicamente la cadena pesada de la invención, utilizando tecnología de escisión enzimática o química y la separación posterior del fragmento que contiene el dominio VH U otros productos escindidos. En donde el dominio de unión VH está aislado de un hibridoma caracterizado, la secuencia del dominio de unión VH clonada derivada del ARNm puede clonarse directamente en un vector de expresión sin recurrir a pasos de selección adicionales utilizando un fago y otros sistemas de representación.

Los sistemas de producción para el anticuerpo con únicamente la cadena pesada que incorpora las regiones efectoras, incluyen células de mamífero en cultivo (por ejemplo, células CHO), plantas (por ejemplo, maíz), cabras, conejos, ganado, ovejas, pollos y larvas de insectos transgénicos, adecuados para la tecnología de crianza masiva. Otros sistemas de producción, incluyendo infección por virus (por ejemplo, baculovirus en larvas y líneas celulares de insecto), son alternativas al cultivo celular y los procedimientos de la línea germinal. Otros métodos de producción también serán familiares para aquellos con experiencia en la técnica. En donde hay un requisito por un montaje de IgA o IgM con únicamente la cadena pesada, la coexpresión de una "cadena J" es benéfica. Los métodos adecuados para la producción del anticuerpo con únicamente la cadena pesada de camélido o los dominios de unión VH solos, se conocen en la técnica. Por ejemplo, los dominios de unión V de camélido se han producido en sistemas bacteriano y los homodímeros con únicamente la cadena pesada de camélidos, se han producido en hibridomas o células de mamífero transfectadas (véase, Reichmann y Muyidermans, (1999) J. Immunol. Methods, 231 , 25-38). También están bien establecidos métodos para la expresión de los dominios de unión VH humanos derivados utilizando la tecnología de representación del fago (Tanha et al, (2001 ) J. Biol. Chem., 276, 24774-24780 y referencias en las mismas). Las larvas de insectos de líneas de moscas transgénicas han mostrado producir fragmentos de anticuerpo con únicamente la cadena pesada funcional en la hemolinfa con características indistinguibles del mismo anticuerpo producido por las células de mamífero (PCT/GB2003/0003319). La presente invención también proporciona un dominio de unión VH monomérico o dimérico específico del antígeno que se puede obtener de acuerdo con el método de este aspecto de la presente ¡nvención. La presente invención también proporciona una secuencias polinucleotídica que consiste de un sitio de cadena pesada heteróloga, un polinucleótido aislado que codifica un cuerpo con únicamente la cadena pesada de la invención y un vector que comprende un sitio heterólogo de la cadena pesada, o un fragmento del mismo, o un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo con únicamente la cadena pesada de acuerdo con la presente invención. La presente invención también proporciona una célula hospedera transformada con un sitio heterólogo de la cadena pesada, o un fragmento del mismo, o un polinucleótido aislado que codifica el anticuerpo con únicamente la cadena pesada o un fragmento de anticuerpo, de acuerdo con la presente invención. En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un complejo polipeptídico que comprende un dominio de unión VH específico del antígeno de acuerdo con la presente invención, que tiene unido al mismo una porción efectora que proporciona actividad efectora. Esta actividad efectora puede ser adicional a aquélla proporcionada por la región constaníe de cadena pesada y puede siíuarse en el término amino o carboxi de la molécula.

Estos complejos polipeptídicos retienen la función fisiológica conferida por el dominio de unión VH específico del antígeno en combinación con la selección adicional o las funciones efectoras de las porciones efectoras. Tales complejos polipeptídicos pueden estar en la forma de monómeros funcionales o, dependiendo del diseño o interacción de las porciones efectoras, dímeros, tetrámeros, pentámeros, multímeros u otros complejos que incorporan diferentes dominios de unión VH, impartiendo por lo tanto multivalencia y multiespecificidad. Los dominios de unión VH pueden estar presentes en el término amino o carboxi de la molécula de unión (véase la Figura 1 para el ejemplo dimérico). Si la porción efectora comprende un dominio de unión, puede tener una especificidad diferente del dominio de unión V específico del antígeno. La ventaja de este arreglo es que el complejo polipeptídico puede facilitar la reticulación de diferentes objetivos. Por ejemplo, un complejo polipeptídico biespecífico puede utilizarse para mejorar las interacciones célula-célula y las interacciones célula/patógeno. En esta modalidad, los complejos polipeptídicos de la invención pueden utilizarse, por ejemplo, para formar un puente entre dos tipos de células, tales como un patógeno y un macrófago (véase, Biburger et al, (2005) J. Mol. Biol, 346, 1299-1311 ). El uso de dominios de unión VH es preferible al uso de dominios de unión scFV en tales diseños biespecíficos. Los dominios de unión VH tienen una alta afinidad de unión y pueden incorporarse en tales complejos polipeptídicos con una construcción mínima del vector y en la ausencia de consideraciones de diseño necesarias para mantener la especificidad y la afinidad de los scFV con relación a su molécula original tetramérica. En donde los complejos polipeptídicos diméricos o multiméricos están considerados, se incorporan dominios de dimerización, por ejemplo, la inclusión de los dominios CH2 y CH3 derivados de las regiones constantes de la cadena pesada de ¡nmunoglobulina (véase la Figura 2). El término "porción efectora", como se utiliza en la presente, ¡ncluye cualquier porción que medía un efecto biológico deseado en una célula. La porción efectora es de manera preferida soluble y puede ser un péptido, polipéptido o proteína o puede ser una estructura no peptídica. Por ejemplo, la porción efectora puede ser una enzima, hormona, citocina, fármaco, profármaco, toxina, en particular una toxina de proteína, un radionúclido en una estructura quelante, un dominio de unión, un dominio dimerizante o de interacción, un agente para la formación de imágenes, albúmina o un agente inhibidor. La albúmina puede utilizarse como una porción efectora para incrementar la estabilidad o las propiedades farmacocinéticas y/o farmacodinámicas del dominio de unión VH específico del antígeno (Sung et al, (2003) J. Interferon Cytokine Res., 23 (1): 25-36). De manera alterna, la porción efectora puede ser una estructura PEGilada o una estructura glucosilada naturalmente para mejorar las propiedades farmacodinámicas. La porción efectora puede estar unida por un péptido al dominio de unión VH específico del antígeno o puede estar unidad químicamente al dominio VH pesado específico del antígeno, por ejemplo, utilizando una estrucíura enlazante química tal como un enlazante de maleimida. De manera alterna, los complejos polipeptídicos de la invención pueden expresarse como proteínas de fusión. Por lo tanto, la presente invención también abarca una secuencia polinucleotídica que consiste del sitio heterólogo de la cadena pesada, o un polinucleótido aislado que codifica el anticuerpo con únicamente la cadena pesada, de la presente invención, en donde el polinucleótido comprendé además, en un marco de lectura, uno o más exones que codifican una porción efectora. Este exón puede estar en el extremo 5' ó 3' del polinucleótido. Por ejemplo, el polinucleótido puede comprender, en el siguiente orden y en el marco de lectura, un dominio de unión y VH/segmento del gen de la porción efectora. En el caso de las fusiones genéticas, la unión de los varios dominios puede lograrse utilizando un constructo de ADN recombinante que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión, con el ADN que codifica los varios dominios colocados en el mismo marco de lectura. Tales constructos son de valor como elementos de diagnóstico y terapéuticos. Como elementos de diagnóstico, el dominio efector puede ser una proteína fluorescente (por ejemplo, GFP) o enzima (por ejemplo, ß-gal) fluorescente. De manera alterna, el dominio efector puede ser una marca para una unión mejorada a un sustrato (por ejemplo, polihistidina o una biotina), un antígeno para proporcionar un sitio de unión para los anticuerpos secundarios o una cremallera de leucina o un motivo de unión similar que puede servir como un sitio de unión para los marcadores fluorescentes.

Complejos polipeptídicos Los presentes inventores también se han dado cuenta que es posible producir un complejo polipeptídico bivalente o multivalente que comprende al menos parte de una cadena pesada del anticuerpo, sola o en combinación con una cadena efecíora separada (ligera), que comprende un dominio del montaje complementario, y que tiene actividad efectora adicional. Los complejos polipeptídicos de acuerdo con la presente invención, retienen la función fisiológica conferida por la región constante de cadena pesada en combinación con las funciones de la porción efectora adicional asociada con la cadena efectora (Figura 3). Por lo tanto, en un tercer aspecto, el complejo polipeptídico comprende cadenas pesadas en combinación con una o más cadenas efectoras (cadenas ligeras). El segundo aspecto de la presente ¡nvención proporciona un complejo polipeptídico que comprende un par de cadenas pesadas y un par de cadenas efectoras, en donde: el par de cadenas pesadas están asociadas una con la otra; una de las cadenas efectoras está asociada con una de las cadenas pesadas y la otra de las cadenas efectoras está asociada con la otra de las cadenas pesadas; cada cadena pesada comprende un dominio de unión, una dominio de dimerización, de manera preferida, que comprende al menos los dominios de la región constante CH2, CH3 y, opcionalmente, CH4, y una porción efectora capaz de unirse a un dominio del montaje complementario de la cadena efectora; y la cadena efectora comprende un dominio del montaje complementario que tiene unido al mismo una porción efectora, en donde el dominio de montaje y el dominio del montaje complementario se asocian uno con el otro a través de iníeracciones no covaleníes. De manera preferida, la porción efectora en la cadena pesada es diferente a la porción efectora en la cadena efectora. Opcionalmente, el complejo polipeptídico incluye un dominio similar a una articulación flexible en el término carboxilo del dominio C 3 (o el dominio CH4, si está presente), enlazándolo al dominio de montaje. De manera preferida, el complejo polipeptídico incluye un dominio de articulación natural o un dominio similar a una articulación flexible diseñado, entre el dominio de unión y el dominio CH2. La presencia de las regiones de articulación facilita la función independiente de los dominios de unión y las porciones efecíoras en los complejos polipeptídicos resultantes. La porción efectora en la primera cadena pesada polipeptídica opcionalmente tiene una especificidad diferente de la especificidad de la porción efectora en la segunda cadena pesada polipeptídica. De acuerdo con la presente invención, la porción efectora del complejo polipeptídico puede reemplazarse mediante un dominio de unión. De manera preferida, el dominio de unión comprende un dominio VH (como se definió en el primer aspecto de la invención), o un dominio de unión al receptor de la célula. La proteína de unión dimérica teíravaleníe resulíaníe (complejo polipepíídico), puede comprender hasta cuatro diferentes porciones efectoras. De manera preferida, las porciones efectoras en el extremo amino íerminal de la cadena pesada son idénticas, y aquéllas en el extremo carboxiló terminal son idéníicas (pero reconocen un antígeno o epitopo diferente a aquél del extremo amino terminal), facilitando el montaje de un solo homodímero. Tal molécula puede probar ser veníajosa para la caplura de patógenos, la funcionalidad efectora se proporciona por la inclusión de los dominios funcionales de cadena pesada apropiados (por ejemplo, IgA o IgM). Un complejo polipeptídico ejemplar de acuerdo con un tercer aspecto de la ¡nvención, es úíil para métodos de terapia de marcado citoquímico, de selección. Por ejemplo, si la molécula efecfora comprende un dominio de unión VH específico del aníígeno que selecciona un marcador de la superficie celular del cáncer y una porción efecíora que comprende un dominio de unión específico para una enzima que convierte el profármaco (la cadena efecíora). El dominio de unión VH específico del antígeno se une al objetivo y lleva la porción efectora en proximidad estrecha con el objetivo, de manera que con la unión, la cadena efectora puede ejercer un efecto biológico en el objetivo en la presencia del profármaco (por ejemplo, nitrorreducíasa con CB 1954). La inclusión de la función efeclora de la cadena pesada de inmunoglobulina como el dominio de dimerización íambién puede ser benéfica en la eliminación de la célula objetivo.

La cadena efecíora La cadena efecíora comprende un dominio de unión complemeníario y una porción efecíora, que se asocia con una cadena pesada a íravés dé la porción éfeclora de cadena pesada para formar el complejo de unión polipepíídico monlado. El dominio del moníaje complemeníario de la cadena efecíora puede ser un componeníe iníegral de la porción efecíora o una proíeína o un ligando alíerno fusionado o enlazado químicamente a la porción efectora. Las cadenas pesadas del complejo de unión polipepíídíco moníado se unen al objeíivo y llevan a la porción de ia cadena efecíora (ligera) en proximidad esírecha con el objeíivo, de manera que puede ejercer un efecío biológico en el objeíivo.

La porción efecíora El íérmino "porción efectora", como se utiliza en la preseníe, incluye cualquier porción que media un efecío biológico deseado en una célula. El dominio efeclor puede ser una célula, por ejemplo, un linfociío T, un péptido, polipéptido o una proteína o puede ser una estrucíura no pepíídica. Por ejemplo, el dominio efector puede ser una enzima, fármaco, profármaco, toxina, en particular una toxina de proíeína, un radionúciido en una estructura quelante o un dominio de unión. La porción efecíora asociada con el dominio del monfaje complemeníario puede ser de naturaleza celular, proteinácea, orgánica o inorgánica, dependiendo del efecto deseado. El lérmino "dominio de unión", como se uíiliza en la preseníe con respecto a todos los aspectos anteriores de la presente invención, incluye cualquier dominio polipeptídico que es activo en un medio fisiológico. Tal dominio de unión también debe tener la estabilidad para unirse a un objetivo bajo condiciones fisiológicas. Tales dominios de unión incluyen dominios que pueden mediar la unión o adhesión a una superficie celular. Los dominios adecuados que pueden utilizarse en los complejos polipeptídicos de la invención son moléculas de adhesión de células de mamífero, procarióíicas y virales, citocinas, factores de crecimienío, antagonistas o agonistas del recepíor, ligandos, recepíores de la superficie celular, facíores reguladores, proteínas y péptidos estructurales, proteínas de suero, proteínas secretadas, proteínas asociadas con el plasmalema, antígenos virales, antígenos bacterianos, antígenos de protozoarios, antígenos parasitarios, lipoproteínas, glucoproteínas, hormonas, neuoroíransmisores, facíores de coagulación, Fvs de cadena única diseñados y lo similar. De manera preferida, el dominio de unión es un dominio VH de vertebrado, de manera más preferida, un dominio de VH de mamífero, íal como un dominio VH humano. Un dominio de unión puede comprender un dominio VH de camélido (V H) o puede comprender un dominio VH obíenido de un no camélido. De manera preferida, el dominio de unión es un dominio VH humano. Los dominios de unión VH son de manera preferida de origen de los linfociíos B derivados de animales o camélidos íransgénicos (como se describió anteriormente), en oposición a los dominios VH derivados de bibliotecas de fago sintélicos, puesto que los primeros serán de una afinidad más alia debido a su generación en respuesía a una exposición al aníígeno in vivo vía el rearreglo VDJ y la muíación somática. ~Spa"porcion efectora comprende un dominio de unión, de manera preferida tiene una especificidad diferente del dominio de unión en la cadena pesada. La ventaja de este arreglo, es que el complejo polipeptídico puede facilitar la reticulación de diferentes objetivos o unirse a difereníes aníígenos en una célula seleccionada (por ejemplo, patógeno). El dominio de unión en la primera cadena pesada puede lener una especificidad difereníe de aquélla del dominio de unión en la segunda cadena pesada. De esía manera, el complejo polipepíídico será al menos bivalente y será capaz de reticular diferentes objeíivos y el dominio efector será capaz de ejercer su efecío en ambos objeíivos. Puede crearse un complejo polipepíídico mulíivaleníe a íravés de la asociación de esías cadenas pesadas íeíravalentes, con cadenas efectoras que comprenden dominios efectores, con especificidades y funcionalidades diferentes. También, la porción efectora en la primera cadena pesada puede tener una especificidad diferente de la porción efectora en la segunda cadena pesada, permitiendo la capíura de más de una cadena efecíora, cada una que porta una funcionalidad diferenle.

El dominio del montaje complementario se une a una porción efectora Cuando una cadena pesada se asocia con una cadena efecíora, los términos "porción efectora" y "dominio del moníaje complementario", como se utilizan en la presente, incluyen cualesquier porciones que pueden formar al menos una unión no covalente unas con oirás. Por ejemplo, la porción efecíora y el dominio del montaje complementario puede ser una proíeína, fragmenío peplídico o secuencia de consenso capaz de formar una inieracción proíeína-proíeína, íal como aquélla observada eníre: el dominio CH1 de una cadena pesada de inmunoglobulina y la región constante de una cadena ligera de inmunoglobulina; cremalleras de leucina; VCAM y VLA-4; integrinas y proteínas de la matriz extracelular; integrinas y moléculas de la superficie celular, íales como CD54 o CD102; dominios ALCAM y SRCR; un scFv y un aníígeno o un dominio de unión VH y un antígeno.

Las cadenas pesadas En donde los dominios de dimerización de las cadenas pesadas comprenden regiones constaníes de la cadena pesada de inmunoglobulina, las regiones constantes (exones CH), pueden proporcionar una funcionalidad fisiológica adicional al complejo de unión polipepíídico. En particular, los dominios consíaníes de la cadena pesada de ¡nmunoglobulina pueden proporcionar, inter alia, fijación del complemento, acíivación del macrófago y unión a los receptores Fc, dependiendo de la clase o subclase de los dominios consíaníes del aníicuerpo. Como se discutió anteriormeníe, esíá bien documeníado que la clase de cadena pesada expresada íiene un papel principal en la función efecíora in vivo. Una línea celular establecida puede producir un complejo polipeptídico que tiene un efecto de selección y biológico útil, pero la región constante de cadena pesada puede ser de una clase que es diagnóstica o terapéuticamente indeseable, o puede no ser secretada en cantidades útiles. En consecuencia, los dominios constantes de la cadena pesada de los complejos polipeplídicos de la invención pueden ser alterados de manera específica o parcialmente, u omiíirse compleíameníe para iníroducir o eliminar componeníes de las cadenas pesadas de inmunoglobulina. Por ejemplo, las moléculas de Ig de la clase M son conocidas por jugar un papel importaníe en la activación de los macrófagos y la trayectoria del complemento. Debido a la proximidad esírecha de sus sitios de unión, la lgM íiene una alia afinidad por lo patógenos, incluyendo los virus. Sin embargo, la IgM íambién se conoce por ser difícil de uíilizar en técnicas de inmunoensayos rápidos, mientras que la Ig de la clase G puede utilizarse fácilmente en estas técnicas. Para íales usos, sería úíil conmular la clase de la cadena pesada de los dominios µ a los ?.

La expresión del siíio C? solo de la cadena pesada, producirá IgG, ¡ncluyendo los isoíipos lgG1 , lgG2, lgG3 e lgG4, algunos de los cuales lambién acíivarán el complemento. Los anticuerpos de IgG se unen y activan a los macrófagos y los granulociíos, y pueden cruzar la placenía. Las aplicaciones adicionales de varias clases de aníicuerpos se han disculido previameníe. Las regiones consíantes de las cadenas pesadas de los complejos polipeptídicos de la presente invención, pueden ser de origen humano, de conejo, de raía o ratón, como se definió en la preseníe. De manera preferida, son de origen humano. Los complejos polipepíídicos de la preseníe invención lambién pueden uíilizarse únicamente para bloquear la unión de los ligandos a sus receptores, utilizando los dominios de dimerización que no proporcionan funciones efectoras. Pueden bloquearse múltiples receptores mediante un complejo polipeptídico multiespecífico. En un cuarto aspecto de la invención, la molécula efectora puede comprender un dominio de dimerización, de manera que la molécula efectora puede asociarse con una molécula efectora separada. Esíe dominio de dimerización puede comprender uno o más de los dominios de la región consíaníe del aníicuerpo C 2, C 3 o CH4 y/o una cadena J. En esía modalidad de la invención, dos o más moléculas efecíoras pueden asociarse para producir un dímero o mullímero de una molécula efecíora. Las moléculas efectoras pueden ser las mismas (permiíiendo la producción de un homodímero o un homomultímero de una molécula efectora) o diferentes (permitiendo la producción de un heterodímero o un heteromulfímero de una molécula efecíora). De manera preferida, el dímero o múllimero de la molécula efectora es bivalente o multivalenfe. De manera preferida, las regiones constantes para las dos o más moléculas efectoras (es decir, los dominios de dimerización) son idénticas, reduciendo así la posibilidad de heterogeneidad del producto. De acuerdo con un cuarto aspecto de la preseníe invención, se proporciona un complejo polipeplídico que comprende un dímero que consiste de una primera cadena pesada polipeptídica y una cadena pesada polipeptídica, en donde: cada cadena pesada polipeptídica comprende un dominio de unión y un dominio de dimerización, que comprenden opcionalmente al menos los dominios de la región constante del anticuerpo CH2, CH3 y, opcionalmente, CH4; y, opcionalmente, una porción efectora, en donde, de manera preferida: el dominio de unión en la primera cadena pesada polipeptídica tiene la misma especificidad que el dominio de unión en la segunda cadena pesada polipeptídica; y las regiones constantes (dominios de dimerización) para las dos cadenas pesadas polipeptídicas son idénticos. De manera preferida, la primera y segunda cadenas tienen la misma porción efectora.

De manera preferida, el dominio de dimerización comprende al menos los dominios de la región consíaníe del aníicuerpo CH2, C 3 y, opcionalmente, CH4. El cuarto aspecío de la preseníe invención lambién proporciona un complejo polipepíídico que comprende una pluralidad de dímeros de la cadena pesada polipeptídica y una cadena J, en donde: la pluralidad de los dímeros de la cadena pesada polipeptídica se montan por la cadena J; cada cadena pesada polipeptídica comprende un dominio de unión y dominios idénticos µ, e, a o ? CH2, CH3 y, opcionalmente, CH4; y hay al menos dos dominios de unión que tienen diferentes especificidades en el complejo polipepíídico (véanse las Figuras 4 y 5). Como se definió en el primer aspecto de la invención en los anterior, cada región constante de cadena pesada comprende de manera preferida al menos un gen de la región constaníe de cadena pesada, que se expresa sin un dominio CH1 funcional, de manera que puede ocurrir la generación del anlicuerpo con únicamente la cadena pesada. Cada región constante de cadena pesada puede comprender también uno o más genes de la región constante de cadena pesada adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste de Cd, Oy^; Cµ, Ce y Ca^, con la condición de que los genes de la región constante de cadena pesada adicionales tampoco expresen un dominio CH1 funcional. Los genes de la región constante de cadena pesada se seleccionan dependiendo de la clase preferida o mezcla de clases de anticuerpos requeridos. De manera preferida, hay únicamente dos dominios de unión de diferentes especificidades en la IgA e IgM expresadas. En una modalidad, las cadenas pesadas incluyen cada una un dominio CH4, los dominios constantes son dominios a y el complejo polipeptídico incluye una cadena J. En otra modalidad, las cadenas pesadas incluyen cada una un dominio CH4, los dominios consíantes son dominios µ y el anticuerpo incluye una cadena J.

Montaje del complejo polipepíídico El arreglo del dominio modular de los complejos polipeptídicos de la presente invención les permite consíruirse en un gran número de posibles permulaciones. Tales alteraciones en la arquiíeclura del dominio y la secuencia de aminoácidos del complejo polipepíídico pueden lograrse medianíe una muíación adecuada por la síníesis parcial y el reemplazo de las regiones apropiadas de las secuencias que codifican el ADN correspondiente. Los dominios sustiluidos o adicionales pueden obíenerse de las secuencias de ADN recombinante compalibles. Por ejemplo, las cadenas pesadas pueden incluir una articulación natural o un dominio polipeptídico flexible diseñado, ambos entre el dominio de unión y el íérmino amino del dominio CH2 y enlre el dominio efecíor y el exíremo C íerminal de la cadena pesada (CH3 o CH4). Las cadenas pesadas en el complejo polipeplídico de la invención, se expresan como proleínas de fusión. Las cadenas efecloras en el complejo polipeptídico de este aspecto de la ¡nvención, pueden expresarse como proteínas de fusión o pueden montarse mediante medios químicos o, si son de naturaleza celular, pueden aislarse de sangre o tejido, o capturarse in vivo (por ejemplo, albúmina). En el caso de las fusiones genéticas, la unión de los varios dominios puede lograrse utilizando un constructo de ADN recombinante que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión, con el ADN que codifica los varios dominios colocados en el mismo marco de lecíura. La porción efectora, si está presente como parte de una proteína de fusión, puede localizarse en el término amino o carboxi del dominio del montaje complemenlario. De manera alterna, los dominios en la cadena efectora pueden montarse mediante métodos químicos peptídicos normales, como ya se conoce en la técnica, más que sintelizarse como una proteína de fusión. El enlace puede ser a través de un enlace peptídico o a través de un enlace químico. Por ejemplo, ia porción efectora puede ser un péptido unido al dominio del montaje complementario o puede estar unida químicamente al dominio del montaje complemeníario, por ejemplo, utilizando una estructura enlazante química tal como un enlazante de maleimida.

La porción efectora puede colocarse en cualquier ubicación en la cadena pesada. Por ejemplo, la porción efectora puede situarse en el extremo C terminal de la cadena pesada o entre el dominio de unión y el dominio CH2 o el dominio de la articulación del complejo polipeptídico. Se prefiere que el dominio de montaje no esté situado entre los dominios CH2 y CH3, puesto que esto puede interferir con una función efecíora y los dominios de dimerización. De manera preferida, la porción efecíora se une al exíremo amino terminal o carboxi de la cadena pesada, vía un enlazante flexible pepíídico o una región similar a una articulación, para facilitar la unión independiente/función de las porciones efecíoras.

Secuencias polínucleoíídicas, vectores y células hospederas La preseníe ¡nvención también proporciona una secuencia polinuclecleotídica que codifica una cadena pesada de cualquiera de los complejos polipepiídicos de la preseníe ¡nvención, un vector que comprende una o más de las secuencias polinucleoíídicas referidas anteriormente y una célula hospedera transformada con un vector que codifica la cadena pesada de un complejo polipepíídico de la preseníe ¡nvención. Los polinucleóíidos ¡ncluyen, de manera preferida, secuencias que permitirán que las cadenas pesadas expresadas se secreten como homodímeros en el medio en el cual la célula hospedera se está cultivando. La célula hospedera puede ser de cualquier origen, incluyendo células bacterianas y de levadura, pero es de manera preferida una célula de hospedero vertebrado, de manera más preferida, una de hospedero de mamífero. La íransfección de la misma célula hospedera con un segundo vector que codifica una cadena pesada que comprende un dominio de unión con especificidad para un dominio diferente, resulta en la coexpresión de los dos construclos y el moníaje de una mezcla de homodímeros y heíerodímeros. Los homodímeros moslrarán especificidad por el antígeno análogo y los heterodímeros se unirán a ambos antígenos. La presente invención también proporciona una célula hospedera íransformada con un vecíor que codifica al menos una cadena efeclora de un complejo polipepíídico de la preseníe invención. La célula hospedera puede ser de cualquier origen, incluyendo una célula bacíeriana o de levadura, pero es de manera preferida, una célula hospedera de vertebrado, de manera más preferida, una célula hospedera de mamífero. De manera alterna, la cadena efecíora puede siníeíizarse uíilizando méíodos que son conocidos en la técnica. La presente invención íambién proporciona una célula hospedera íransformada con un veclor que codifica al menos una cadena pesada de un complejo polipepíídico de ia preseníe invención. La célula hospedera puede ser de cualquier origen, incluyendo una célula bacteriana o de levadura, pero es de manera preferida, una célula hospedera de vertebrado, de manera más preferida, una célula hospedera de mamífero. De manera alterna, la cadena pesada puede sintetizarse utilizando métodos que son conocidos en la técnica. La presente invención íambién proporciona una célula hospedera transformada con un vector que codifica al menos una cadena pesada y al menos una cadena efectora de un complejo polipeptídico de la presente invención. La célula hospedera puede ser de cualquier origen, incluyendo una célula bacíeriana o de levadura, pero es de manera preferida, una célula hospedera de vertebrado, de manera más preferida, una célula hospedera de mamífero. De manera alterna, las cadenas pueden siníeíizarse de manera independiente y monlarse ulilizando méíodos que son conocidos en la íécnica. Además, la presente invención proporciona un organismo transgénico que expresa al menos un complejo polipeptídico homo o heíerodimérico de cadena pesada de la preseníe ¡nvención. El organismo transgénico puede ser un vertebrado o mamífero no humano, una planta o un insecto. La presente invención también proporciona un método para la producción de anticuerpos con únicamente la cadena pesada específica de la clase y dominios V de los mismos, de acuerdo con el primer aspecto de la invención, inmunizando un organismo transgénico de la presente invención con un antígeno. En una modalidad preferida de este aspecto de la invención, el organismo es un ratón.

La producción de aníicuerpos y complejos polipepíídicos para aplicaciones del cuidado de la salud, requieren sistemas de fabricación a gran escala, los ejemplos de los cuales se discuten con deíalle anteriormente. Tales sisíemas incluyen plañías (por ejemplo, maíz), ganado y ovejas fransgénicos, pollos y larvas de insecto adecuadas para la tecnología de crianza masiva. Oíros sistemas de producción, ¡ncluyendo infección con virus (por ejemplo, baculovirus en larvas y líneas celulares de insecto), como una allernaíiva para el culíivo celular y los procedimientos de línea germinal, también serán familiares para aquellos con experiencia en la técnica. Estos métodos, y otros métodos adecuados conocidos en la técnica, pueden ulilizarse para la producción de los complejos de unión polipepíídicos de la invención. La producción de los homodímeros y/o heterodímeros, puede lograrse utilizando eslos méíodos.

Usos de los aníicuerpos con únicamente la cadena pesada y los complejos polipeptídicos de la ¡nvención Los anticuerpos con únicamente la cadena pesada y los complejos de unión polipeptídicos de la ¡nvención tienen un gran número de aplicaciones. Por ejemplo, los anticuerpos con únicamente la cadena pesada y los complejos polipeptídicos de la ¡nvención comprenden complejos polipepíídicos bi y mulliespecíficos. Estos complejos son particularmente veníajosos, por ejemplo, como ageníes íerapéuíicos para el tratamiento y prevención de enfermedades infecciosas. Los anticuerpos con únicamente la cadena pesada y los complejos de unión polipepíídicos de la invención, son úíiles para marcado ciíoquímico, méíodos de selección, lerapia y diagnóstico. En la terapia con un monoanticuerpo, la evasión del patógeno, por ejemplo, debido a una mutación que conduce a la pérdida de un solo sitio de unión, anulará el efecto íerapéuíico del anficuerpo. La producción de complejos polipepíídicos helerodiméricos que reconocen difereníes anlígenos del mismo patógeno, puede superar esíe problema. El uso de al menos dos dominios de unión que tienen diferentes especificidades en los complejos polipeptídicos de la invención, también puede utilizarse para mejorar las interacciones célula-célula y las interacciones célula/patógeno. En esía modalidad, los complejos polipepíídicos de la ¡nvención pueden uíilizarse, por ejemplo, para formar un pueníe entre los complejos polipeptídicos entre dos tipos de células, íales como un patógeno y un macrófago, o una célula de íumor y un linfocilo T. De manera alterna, el complejo polipeptídico puede reconocer dos o más epitopos en el mismo patógeno con la función efectora proporcionada por la región constante de cadena pesada sola. De manera alterna, los complejos de unión polipeptídicos biespecíficos pueden uíilizarse para seleccionar células y tejidos in vivo, a continuación posteriormente, para caplurar las moléculas efecíoras circuíanles o los agenles para la formación de imágenes. Por ejemplo, los agentes que seleccionan un tumor, biespecíficos, pueden utilizarse para capturar los complejos que convierten el profármaco para la conversión localizada posterior del profármaco a un agente reactivo. Los complejos de unión bi y multiespecíficos en combinación con los agentes efectores pueden utilizarse también para unir y destruir uno o más patógenos, dependiendo de la selección de los dominios de unión. De manera alterna, la presencia de dos o más dominios de unión que reconocen diferentes antígenos en el mismo patógeno, proporciona ventajas clínicas y reduce la posibilidad de que el patógeno se evada y la redundancia del fármaco como resultado de la mutación dentro del patógeno. La presente ¡nvención proporciona anticuerpos con únicamente la cadena pesada o fragmentos de los mismos, de acuerdo con el primer aspecto de la ¡nvención, cadenas polipeptídicas y complejos de acuerdo con el segundo aspecto de la ¡nvención; y cadenas efectoras y complejos polipeptídicos de acuerdo con el tercer aspecto de la invención. Todos son adecuados para el uso farmacéutico en humanos, y por lo tanto, la ¡nvención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo con únicamente la cadena pesada, una cadena polipeptídica, una cadena efectora o un complejo polipeptídico de la presente invención. La invención también proporciona el uso de un anticuerpo con únicamente la cadena pesada, una cadena polipeptídica, una cadena efectora o un complejo polipeptídico de la presente ¡nvención en la preparación de un medicamenío para la profilaxis y/o tratamiento de la enfermedad. Las cadenas pesadas y efectoras pueden formularse juntas o de manera separada, dependiendo de la manera de administración y acción del medicamento. Las composiciones farmacéuticas y medicamentos se formularán típicamente antes de la adminisíración a los pacientes. Por ejemplo, los aníicuerpos con únicameníe la cadena pesada o los complejos polipepíídicos pueden mezclarse con eslabilizantes, particularmenle si se van a liofilizar. La adición de azúcares (por ejemplo, manitol, sacarosa o trehalosa), es típica para proporcionar estabilidad durante la liofilización, y un estabilizante preferido es el manitol. La seroalbúmina humana (de manera preferida, recombinante), lambién puede agregarse como un estabilizante. Las mezclas de azúcares también pueden utilizarse, por ejemplo, sacarosa y manitol, trehalosa y manitol, etc. Puede agregarse un amortiguador a la composición, por ejemplo, un amortiguador de Tris, un amortiguador de histidina, un amortiguador de glicina, o de manera preferida, un amortiguador de fosfato (por ejemplo, que contiene fosfato diácido de sodio y fosfato ácido disódico). La adición del amortiguador para proporcionar un pH entre 7.2 y 7.8 se prefiere, y en particular un pH de aproximadamente 7.5. Para la reconstitución después de la liofilización, puede utilizarse agua estéril para inyección. También es posible reconstituir una torta liofilizada con una composición acuosa que comprende seroalbúmina humana (de manera preferida, recombinante).

Generalmente, los anticuerpos con únicamente la cadena pesada y los complejos polipeptídicos, se utilizarán en forma purificada junto con los portadores farmacológicamente apropiados. La invención proporciona así un método para tratar un paciente, que comprende administrar una composición farmacéutica de la invención al paciente. El paciente es, de manera preferida, un humano, y puede ser un niño (por ejemplo, un niño pequeño o un infante), un adolescente o un adulto, pero generalmente será un adulto. La invención también proporciona anticuerpos con únicamente la cadena pesada, cadenas polipeptídicas, cadenas efectoras o un complejo polipeptídico de la invención para utilizarse como un medicamento. La invención también proporciona el uso de aníicuerpos con únicamente la cadena pesada, cadenas polipepíídicas, cadenas efecíoras o compiejos polipeptídicos de cadena de la invención, en la fabricación de un medicamento para tratar un paciente. Estos usos, métodos y medicameníos son, de manera preferida, para el íraíamienío de una de las siguieníes enfermedades o trastornos: curación de heridas, traslornos proliferativos de las células, ¡ncluyendo neoplasma, melanoma, íumores de pulmón, colorrecíales, osteosarcoma, rectal, de ovario, sarcoma, cervical, esofágico, de mama, de páncreas, de vejiga, cabeza y cuello y otros tumores sólidos; trastornos mieloproliferativos, tales como leucemia, linfoma de no de Hodgkin, leucopenia, trombocitopenia, trastorno de la angiogénesis, sarcoma de Kaposi; trasíornos aufoinmunes/inflamaforios, ¡ncluyendo alergia, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis, soriasis e inflamación del tracto respiratorio, asma, inmunotrasfornos y rechazo del fransplanfe de órganos; írastornos cardiovasculares y vasculares, incluyendo hipertensión, edema, angina, aíerosclerosis, írombosis, sepsis, choque, lesión por reperfusión e isquemia; trastornos neurológicos, incluyendo enfermedad del sistema nervioso central, enfermedad de Alzheimer, lesión del cerebro, esclerosis lateral amiotrófica y dolor; trastornos del desarrollo; traslornos metabólicos ¡ncluyendo diabetes melliíus, osteoporosis y obesidad, SIDA y enfermedad renal; infecciones, incluyendo infección viral, infección bacteriana, infección micótica e infección parasitaria, condiciones patológicas asociadas con la placenta y otras condiciones patológicas y para uso en inmunoíerapia. En un aspecto adicional, la preseníe invención proporciona el uso de un anlicuerpo con únicameníe la cadena pesada o un complejo de unión polipepíídico de la presente invención como un agente de diagnóstico, pronóstico o terapéuíico para la formación de imágenes. Además, la presente invención proporciona ei uso de un homo o helerod ímero de cadena pesada de la preseníe invención, solo o en combinación con una o más cadenas efecloras (ligera) de la presente invención, como un agente terapéutico para la formación de imágenes, un reactivo ciíoquímico o un ageníe de diagnósíico. La preseníe invención proporciona el uso de un anlicuerpo con únicameníe la cadena pesada o un fragmento del mismo como se describe en la presente, como un reacíivo de unión iníracelular o una abzima. Los fragmentos de aníicuerpo con únicameníe la cadena pesada preferidos son dominios de unión VH específicos del aníígeno solubles. La presente invención íambién proporciona el uso de un anticuerpo de cadena única, específico dei antígeno o un dominio de unión VH de acuerdo con la presente invención, como un inhibidor de la enzima o un bloqueador del receptor. Los fragmentos del anticuerpo con únicamente la cadena pesada preferidos, son dominios de unión VH específicos del antígeno solubles. La presente invención íambién proporciona el uso de un dominio VH fusionado a una molécula efecíora para ulilizarse como un ageníe terapéutico, agente para la formación de imágenes, de diagnósíico, abzima o reacíivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1A y 1B: muesíran un complejo polipepíídico que comprende un dominio de unión (VH), un dominio de dimerización (opcionalmente CH2, CH3 y CH4) y una porción efectora (EM). Los dominios de unión y las porciones efectoras pueden colocarse en los extremos amino o carboxi terminales de los dominios de dimerización. Los enlazantes flexibles (<-) y las regiones de articulación ( f) se indican.

Figura 2A y 2B: muesíran difereníes configuraciones de dominios de unión y el reemplazo de la porción efecíora mediante los dominios de unión adicionales. A. La opción preferida desde que los homodímeros se producen.

No se requiere separación de los producios. B. Se produce una mezcla de homodímeros y heterodímeros. Se requiere la separación de los productos. Figura 3: muestra un complejo polipepíídico de cadena pesada en asociación con una cadena efecfora. La cadena efectora comprende un dominio de unión complemeníario (CBDjyuna porción efectora (EM). El CBD se reconoce por la EM de la cadena pesada. El CBD esíá fusionado a o parte del efecíor, por ejemplo, enzima, toxina, quelanle, agenle para la formación de imágenes. La cadena efectora puede sintetizarse de manera separada de la cadena pesada. La Figura 4 muestra una IgA secretora bivalente en asociación con una cadena J. La Figura 5 muestra un complejo polipeptídico similar a IgM con únicamente la cadena pesada, mulíivalente, montado vía una cadena J. Figura 6: muestra la estrategia para la generación de ratones transgénicos que expresan un sitio IgG y la generación funcional de anticuerpos con únicamente la cadena pesada y dominios VH como un resultado de la exposición al antígeno. Figura 7: muestra la estrategia para la generación de ratones transgénicos que expresan un sitio IgM y la generación funcional de anticuerpos con únicamente la cadena pesada y dominios VH como resultado de la exposición al aníígeno. Figura 8: muestra la estrategia para la expresión de ratones transgénicos que expresan un sitio IgA y la generación funcional de anticuerpos con únicamente la cadena pesada y dominios VH como resultado de la exposición al antígeno. Figura 9: Alineación de la secuencia para los producios de la PCR obíenidos del ADNc de médula ósea utilizando los cebadores VHH1 y VHH2 en combinación con el cebador C?2 humano de ratones que contienen un sitio con regiones constantes que tienen una mutación de empalme de camélido para eliminar CH1 • Los resultados muestran que CH1 no se elimina. Figuras 10-13: Estructura de los constructos VH/VH de camélido (VHH)- -n significa cualquier número de genes VH, o segmentos D o J. El complemento normal del sitio humano es 51 genes V, 25 segmentos D funcionales (más 2 no funcionales) y 6 segmentos J. En el caso de una región Cµ (para IgM) o Ce (para IgE), no hay una región H y hay un exón C 4 adicional entre CH3 y M1. Los genes VH han mutado para proporcionar solubilidad como se describió en el dominio público. Los genes VH, los segmentos D y J y los exones C son de manera preferida humanos, pero pueden ser de cualquier otra especie, incluyendo camélidos. En el último caso, los genes VH de camélido (VHH), no mutarían, puesto que son solubles de manera natural.

Figura 14: Programa de inmunización del ratón y ensayo con aníicuerpos para la generación de IgG con únicameníe la cadena pesada conlra E. coli HSP70. Figura 15: Análisis de ciíomelría de flujo y resultados de la inmunohisíoquímica para células del bazo derivadas de ratones transgénicos. Figura 16: Resultados del análisis ELISA de ratones transgénicos inmunizados con DKTP y análisis de la secuencia de la biblioteca de! aníicuerpo resulíanle. Figura 17: Ejemplos de muíaciones somáticas y rearreglo VDJ observado en los ratones íransgénicos inmunizados. Figura 18A y 18B: Resulíados del ensayo de inmunoíinción en una línea celular Tet-on transfeclada con el plásmido de respuesía que contienen el anticuerpo A5. Figura 19A y 19B: Resultados del análisis Western bloí del suero de líneas de ratones íransgénicos. Figura 20: Fraccionamiento por íamaños de IgM humana mezclada con lgM de una sola cadena humana producida medianíe ratones con el siíio IgM más IgG. Figura 21 : Resulíado del análisis de ELISA de los aníicuerpos de IgM e IgG de una sola cadena, culíivados coníra TNFa humano. Figura 22: muestra una estrategia para la generación de un plásmido homodimérico con afinidad de unión por HSP70 y aGAG.

Figura 23: Expresión funcional del complejo polipeptídico homodimérico en células CHO. Figura 24: demuestra la unión funcional y simultánea del complejo polipeptídico homodimérico a alfa aGAG y HSP70. Represeníación esquemáíica de un aníicuerpo biespecífico bivalente. Una segunda región variable (VHH2 dirigida contra gag), se clona en el extremo carboxi terminal de un anticuerpo con únicamente la cadena pesada que contiene la olra especificidad (VHH1 dirigido confra HSP70). La región de articulación eníre CH3 y V H se ha reemplazado por una región enlazante en donde todas las cisíeínas se han reemplazado por prolinas (flechas). La placa de ELISA recubierta con Gag, bloqueada con leche al 1 %/BSA al 1 % en PBS, se incuba primero con medio de diacuerpo (dilución 1 :2), y a coníinuación con lisado celular BI21 (que coníiene HSP70) (dilución 1 :2). Las proleínas se unen al eluaío con un amortiguador de muestra = 2-mercaptoetanol y se corren en gel al 8%. Tinción con anticuerpos poli/monoclonales contra Gag, diacuerpo y HSP70. a Gag: Policlonal de conejo/a conejo-AP de cerdos (azul), a HSP70: monoclonal/lgG-HRP a humano de cabra (marrón), Diacuerpo a: IgG-HRP a humano de cabra (marrón). Carril 1 : Gag/Diacuerpo/lisado celular B121. Carril 2: Gag/medio de cultivo (es el Diacuerpo de control negativo)/BI21. Carril 3: -leche-BSA/Diacuerpo/BI21. Carril 4: -leche-BS A medio de culíivo/BI21. Carril 5: Gag/Diacuerpo/-leche-BSA. Carril 6: Gag/medio de cultivo/-leche-BSA.

Figura 25: muestra la estrategia para la generación de complejos polipeptídicos homodiméricos, opcionalmente en asociación con cadenas efectoras que portan la función efecíora de IgA. Figura 26: muesíra la eslrategia para la generación de los complejos polipeptídicos homodiméricos, opcionalmente en asociación con las cadenas efectoras que portan la función efectora de IgA.

Técnicas generales A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien con experiencia ordinaria en la técnica (por ejemplo, en técnicas de cultivo celular, genética molecular, química de ácidos nucleicos, de hibridación y bioquímica). Las técnicas estándar se utilizan para los métodos moleculares, genéticos y bioquímicos (véanse, generalmente, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., y Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4a Ed., John Wiley & Sons, Inc.), y los métodos químicos. Además, Harlow & Lañe, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N. Y., se refiere para las Técnicas Inmunológicas estándar. Cualquier técnica de ADN recombinante adecuada puede uíilizarse en la producción de los complejos polipeptídicos bi y multivaleníes, los aníicuerpos con una sola cadena pesada y fragmentos de los mismos, de la presente invención. Los vectores de expresión íípicos, íales como plásmidos, se conslruyen para que comprendan secuencias de ADN que codifican para cada una de las cadenas del complejo polipepíídico o anlicuerpo. Cualesquier técnicas establecidas adecuadas para la fragmentación enzimática y química de las inmunoglobulinas y la separación de los fragmentos resultantes pueden utilizarse. La presente invención también proporciona vectores que incluyen constructos para la expresión délos anticuerpos con únicamente la cadena pesada en ratones transgénicos y la construcción y expresión de los complejos polipeptídicos de la preseníe invención. Se apreciará que puede consíruirse un solo vecíor que contenga las secuencias de ADN que codifiquen para más de una cadena polipepíídica. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican dos cadenas pesadas diferentes, pueden insertarse en diferentes posiciones en el mismo plásmido. De manera alterna, la secuencia de ADN que codifica cada cadena polipeplídica, puede insertarse de manera individual en un plásmido, produciendo así un número de plásmidos consíruidos, cada uno que codifica una cadena polipepíídica particular. De manera preferida, los plásmidos en los cuales se insertan las secuencias son compatibles. Cada plásmido se utiliza a continuación para transformar una célula hospedera, de manera que cada célula hospedera contiene secuencias de ADN que codifican para cada una de las cadenas polipeptídicas en el complejo polipeptídico.

Los vectores de expresión adecuados que pueden uíilizarse para la clonación en sistemas bacíerianos ¡ncluyen plásmidos, lales como Col E1 , pcR1 , pBR322, pACYC 184 y RP4, ADN de fago o derivados de cualquiera de ésíos. Para utilizarse en la clonación en sistemas de levadura, los vectores de expresión adecuados ¡ncluyen plásmidos basados en un origen de 2 mieras. Cualquier plásmido que contenga una secuencia promotora del gen de mamífero apropiado, puede utilizarse en la clonación en sistemas de mamífero. Pueden utilizarse secuencias promotoras de insecto o baculovirus para la expresión del gen en las células de insecto. Tales vectores incluyen plásmidos derivados de, por ejemplo, pBR322, virus del papiloma bovino, retrovirus, ADN virus y vaccinia virus. Las células hospederas adecuadas que pueden utilizarse para la expresión del complejo polipeptídico o el anticuerpo ¡ncluyen células de bacterias, levaduras y eucarióticas, tales como líneas celulares de insecto o mamífero, plantas transgénicas, insectos, sistemas de expresión de mamíferos u otros invertebrados o vertebrados.

Complejos polipepíídicos y aníicuerpos de una sola cadena pesada de la presente invención Se entenderá que el íérmino "complejo polipepíídico", "un aníicuerpo con únicamente la cadena pesada" y "sitio heterólogo de la cadena pesada" de la presente ¡nvención, también incluyen a homólogos polipeptídicos y secuencias de ácidos nucleicos obtenidos de cualquier fuente, por ejemplo, homólogos celulares relacionados, homólogos de otras especies y variantes o derivados de los mismos. Así, la presente invención abarca variantes, homólogos o derivados de los complejos polipeptídicos y anticuerpos como se describen en la preseníe. En el contexto de la preseníe ¡nvención, una secuencia homologa se toma para incluir una secuencia de aminoácidos que es al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9% idéntica, de manera preferida al menos 98 ó 99% idéntica a nivel de aminoácidos con respecío a al menos 30, de manera preferida 50, 70, 90 ó 100 aminoácidos. Aunque la homología íambién puede considerarse en íérminos de similiíud (es decir, residuos de aminoácidos que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención, se prefiere expresar la homología en términos de identidad de la secuencia. La preseníe invención lambién incluye vectores de expresión construidos y células hospederas transformadas para utilizarse en la producción de complejos polipeptídicos y anticuerpos de la presente invención. Después de la expresión de las cadenas individuales en la misma célula hospedera, pueden recuperarse para proporcionar el complejo polipeptídico completo o el anticuerpo con únicamente la cadena pesada en la forma activa. Se considera que, en las formas preferidas de la invención, las cadenas pesadas individuales se procesarán mediante la célula hospedera para formar el complejo polipeptídico completo o el anticuerpo que se secreta de manera ventajosa de la misma. De manera preferida, la cadena efectora se produce de manera separada ya sea para una célula hospedera o mediante medios sintéticos. Las técnicas para la preparación de complejos polipeptídicos de anticuerpos recombinantes, se describen en las referencias anteriores y también en, por ejemplo, la EP-A-O 623 679; EP-A-O 368 684 y la EP-A-O 436 597.

Inmunización de un organismo transgénico En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para la producción de los anticuerpos de la presente ¡nvención, que comprende administrar un antígeno a un organismo transgénico de la presente invención.

Los aníicuerpos y los complejos polipepíídicos producidos d animales íransgénicos de la preseníe invención, ¡ncluyen aníicuerpos policlonales y monoclonales y fragmentos de los mismos. Si se desean aníicuerpos policlonales, el animal íransgénico (por ejemplo ratón, conejo, cabra, caballo, etc.), puede inmunizarse con un antígeno y el suero del animal inmunizado, recolectarse y traíarse medianíe procedimientos conocidos. Si el suero que contiene los anticuerpos policlonales contiene anticuerpos a otros antígenos, los anticuefos policlonales de interés pueden purificarse mediante cromatografía por inmunoafinidad y técnicas similares, que serán familiares para aquellos con experiencia en la íécnica. Las íécnicas para producir y procesar el antisuero policlonal son conocidas en la técnica.

Usos de los complejos de unión polipepíídicos y los anticuerpos de la presente ¡nvención Los complejos polipepíídicos y los aníicuerpos que incluyen fragmentos de los mismos de la presente invención, pueden emplearse en: aplicaciones terapéuticas y profilácticas in vivo, aplicaciones de diagnóstico in vitro e in vivo, aplicaciones de ensayo y reacíivos in vitro y lo similar. Los usos terapéuticos y profilácticos de los complejos polipepíídicos y aníicuerpos de la invención, involucran la adminisíración de lo aníerior a un mamífero receplor, íal como un humano. Los complejos polipepíídicos sustancialmente puros y los anticuerpos que incluyen fragmentos de los mismos de al menos 90 a 95% de homogeneidad, se prefieren para la administración a un mamífero, y de 98 a 99% o más de homogeneidad es la más preferida para usos farmacéuticos, especialmente cuando el mamífero es un humano. Una vez purificados, parcialmente o a la homogeneidad que se desee, los complejos polipepíídicos y los aníicuerpos con únicamente la cadena pesada como se describen en la presente, pueden utilizarse de manera de diagnóstico o terapéuíica (incluyendo extracorporalmente), o para desarrollar y realizar procedimientos de ensayo utilizando métodos conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Generalmente, los complejos polipeptídicos y los anticuerpos de la presente invención, se utilizarán en forma purificada junto con portadores farmacológicamente apropiados. Típicamente, estos portadores incluyen soluciones acuosas o alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, que pueden incluir un medio salino y/o amortiguado. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio y de Ringer lactada. Los adyuvantes fisiológicamente aceptables adecuados, si es necesario mantener un complejo polipeptídico en suspensión, pueden elegirse de espesantes tales como carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, gelatina y alginatos. Los vehículos intravenosos incluyen abastecedores de fluidos y nuírientes y abastecedores de electrolitos, íales como aquéllos basados en dexírosa de Ringer. También pueden esíar présenles conservadores y oíros aditivos, íales como ageníes aníimicrobianos, aníioxidantes, quelaníes y gases inertes (Mack (1982) Reminglon's Pharmaceuíical Sciences, 16a Edición). Los complejos polipepíídicos y los anticuerpos, incluyendo fragmentos de los mismos de la presente invención, pueden utilizarse como composiciones administradas de manera separada o en conjunto con otros agentes. Estos pueden incluir varios fármacos inmunoterapéuticos, tales como ciclosporina, metotrexato, adriamicina, cisplatina o una inmunotoxina. De manera alterna, los complejos polipeptídicos pueden utilizarse en conjunto con enzimas para la conversión de los profármacos a su sitio de acción. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir "cócteles" de varios agentes citotóxicos u otros agentes, en conjunto con los anticuerpos seleccionados de la presente invención, o incluso combinaciones de los anticuerpos seleccionados de la presente invención. La ruta de administración de las composiciones farmacéuticas de la invención, pueden ser cualesquiera de aquéllas conocidas comúnmente para aquellos con experiencia ordinaria en la técnica. Para terapia, incluyendo sin limitación inmunoterapia, los complejos polipeptídicos o anticuerpos de la invención pueden administrarse a cualquier paciente de acuerdo con las técnicas estándar. La administración puede ser mediante cualquier modo apropiado, incluyendo la ruta parenteral, ¡níravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, vía la ruta pulmonar o también, si es de manera apropiada, mediante infusión directa con un catéter. La dosificación y frecuencia de administración dependerá de la edad, sexo y condición del paciente, la administración concurrente de otros fármacos, contraindicaciones y otros parámelros para lomarse en cuenta por el clínico. Los complejos polipeptídicos y anticuerpos de esta invención pueden liofilizarse para el almacenamiento y reconstituirse en un portador adecuado antes del uso. Pueden emplearse técnicas conocidas de liofilización y reconstitución. Se apreciará por aquellos con experiencia en la en la técnica que la liofilización y reconstitución puede conducir a varios grados de pérdida de actividad funcional y que los niveles de uso pueden tener que ajustarse hacia delante para compensar. Además, los complejos polipeptídicos y los anticuerpos de la presente invención pueden uíilizarse para propósitos de diagnóstico. Por ejemplo, los aníicuerpos como se describe en la preseníe, pueden generarse o cultivarse coníra aníígenos que se expresan de manera específica durante estados de enfermedad o cuyos niveles cambian durante esíados de enfermedad dados. Para ciertos propósitos, íales como propósitos de diagnóstico o de rasíreo, pueden agregarse marcas. Las marcas adecuadas incluyen, de manera no exclusiva, cualquiera de los siguientes: marcas radioactivas, marcas de espín de RMN y marcas fluorescentes. Los medios para la detección de las marcas serán familiares para aquellos con experiencia en la técnica.

Las composiciones que coníienen los complejos polipepíídicos y los aníicuerpos de la preseníe ¡nvención o un cóctel de los mismos, pueden adminisírarse para íraíamieníos profilácíicos y/o íerapéuíicos. Una composición que coníiene uno o más complejos polipepíídicos o aníicuerpos de la preseníe invención, puede utilizarse en entornos profilácíicos y terapéuticos para ayudar en la alteración, inacíivación, desírucción o eliminación de una población de células objeíivo seleccionadas en un mamífero. Además, los repertorios seleccionados de complejos polipepíídicos y aníicuerpos descritos en la presente, pueden utilizarse extracorporalmente o in vitro selectivamente para destruir, empobrecer o eliminar de otra manera efectivamente una población celular objetivo de una colección heterogénea de células.

EJEMPLO 1 En experimentos preliminares, se prepararon ratones íransgénicos para expresar un siíio de la cadena pesada, en donde dos exones VHH de llama se enlazaron a los segmentos de diversidad (D) y (J) de la cadena pesada humana, seguida por los genes de la región conslanle humana Cµ, Cd, C?2, C?3 y la inmunoglobulina de cadena pesada humana 3' LCR. Los genes C?2 y C?3 humanos coníienen una muíación de empalme G a A. La presencia del siíio Frt permitió la generación de un raíón transgénico de una sola copia de un arreglo de transgenes con múltiples copias mediante la recombinación mediada por Flp. Sin embargo, las secuencias de los sitios transgénicos con una muíación de empalme G a A, mosíró un empalme aberrante, pero una eliminación incompleía de CH1 (Figura 9).

Construcíos Para superar esíe problema, se seleccionó una biblioteca de cósmidos genómicos para la clonas que contienen los genes VH utilizando métodos estándar. Una (o más) VH de líneas germinales diferentes se eligieron de manera aleatoria basándose en su secuencia (cinco clases generales en el caso de VH humano). Los codones de los aminoácidos hidrofílicos se inírodujeron en las posiciones 42, 49, 50 y 52 de acuerdo con la numeración IMGT (Lefranc el al. (1999)). Los genes VH se combinaron en un veclor BAC mediante procedimientos estándar, tales como clonación directa utilizando recombinación con enlazantes u homólogos hechos a la medida. Se seleccionaron dos clonas de la biblioteca Pac genómica humana RPCI-11 (BACPAC Recource Ceníer, EUA): la clona 1065 N8 que contiene los segmentos D y J de la cadena pesada humana, Cµ (IgM) y Cd (IgD), y la clona 1115 N15 que coníiene los genes C?3 (lgG3). La clona Bac 11771 de una biblioteca genómica humana diferente (Incyte Genomics, CA, EUA), se utilizó como una fuente del gen C?2 (lgG2) y LCR de la cadena pesada de inmunoglobulina (Mills et al. (1997) J. Exp Med., 15; 186(6):845-58).

Utilizando técnicas eslándar, los genes C?3 y C?2 se subclonaron de manera separada en el vecíor pFasíBac (Inviírogen). De manera similar, cualquiera de las regiones consfaníes de Ig puede clonarse de eslos BAC (IgA, IgE). Se logró una supresión compleía del exón CH1 medianle la recombinación homologa (Imam et al. (2001 )), utilizando secuencias que flanquean el exón CH1 de cada región constante. Un sitio frt puede introducirse opcionalmente en la parte frontal de conmutación Cµ para permitir la generación de un sitio de una sola copia de un sitio de múltiples copias mediante el tratamiento con la flp recombinasa in vivo mediante medios estándar, por ejemplo, mediante la crianza a ratones rosa-flp (Figura 10). Los genes VH separados, los segmentos D y J y los exones C y LCR se clonaron en un BAC ya sea mediante digestión con restricción de ligaciones convencionales, o mediante recombinación homologa (o una mezcla de ambos), o mediante cualquier otra técnica. Pueden crearse a continuación constructos adicionales.

Sitio de sólo IgM Con el fin de obtener el construclo de IgM (Figura 11 ), uno o más genes V (de manera preferida, genes VH humanos diseñados para proporcionar solubilidad o genes V H de camélido), seguido por los segmentos de la cadena pesada D y J humanas y Cµ, se clonaron en un BAC. Para la metodología, véase lo aníerior. En este caso, únicamente la región Cµ se clonó en el BAC final.

Siíio IgM más IgG (Cd es opcional) Con el fin de obíener el consírucío de IgM más IgG (Figura 12), uno o más genes VH (de manera preferida, segmentos VH humanos diseñados para proporcionar solubilidad o genes VHH de camélido), seguidos por los segmeníos de la cadena pesada D y J humanos, Cµ (sin CH1 pero con el exón CH4), (Cd opcional) y los genes C?2 y C?3 humanos modificados y 3' LCR se clonaron en un BAC. Con el fin de generar un sitio con sólo igG, los sitios loxP se inlrodujeron medianíe los pasos de clonación eslándar (descritos anteriormente), y el BAC se cultiva en una cepa de E. coli 294 Cre (Buscholz et al.), y la recombinación mediada por cre, proporciona bacterias que producen un sitio de solo IgG. Para los detalles adicionales de la construcción, véase lo anterior.

Sitio IqM más IgG (Cd es opcional) Con el fin de obtener el constructo de IgM más lgG (Figura 13), uno o más genes Vp_(de manera preferida, genes VH humanos diseñados para proporcionar solubilidad o genes VHH de camélido), seguidos por los segmentos de la cadena pesada D y J humanos, Cµ (con CH1 y CH4) (Cd opcional) y los genes C?2 y C?3 humanos modificados y 3' LCR se clonaron en un BAC. Con el fin de generar un sitio con sólo IgG, los sitios loxP se introdujeron durante los pasos de clonación estándar (descritos anteriormente), y el BAC se cultivó en una cepa de E. coli 294 Cre (Buscholz et al.), y la recombinación mediada por cre, proporcionó bacterias que producen un sitio con sólo IgG.

Raíones íransgénicos, crianza y genotipificación El BAC final se introdujo en ratones transgénicos mediante microinyección estándar de huevos fertilizados o vía la tecnología de iransfección de las células germinales embriónicas. Los silios transgénicos se verificaron para la integridad y el número de copias mediante análisis Southern blot del ADN de la cola (Southern 1975), utilizando sondas de los sitios del extremo 5' y 3'. Los fundadores se criaron como líneas en el fondo µMT-/-. La fenotipificación se hizo mediante análisis de PCR estándar utilizando cebadores para cada una de las regiones diferentes del sitio. El análisis de la secuencia de los productos de RT-PCR derivados del ADNc BM de ratones transgénicos, en donde el exón CH1 completo de C?2 y C?3 se ha suprimido (uno con (líneas HLL) y uno sin los genes Cµ y Cd, mostraron que los sitios transgénicos no son sólo capaces de la recombinación VDJ, sino que los transcriptos de IgG se parecen a aquéllos encontrados en los HCAbs de llama y camello.

Inmunohistoquímica Los bazos se incluyeron en compuesto OCT. Secciones congeladas del criostato de 5 µm se fijaron en acetona y se marcaron de manera sencilla o doble como se describió previamente (Leenen et al. 1998).

Los anticuerpos monoclonales anti B220/RA3-6B2, anti-CD11 c/N418 (Steinman et al., 1997), se aplicaron como sobrenadantes del cultivo del hibridoma. La IgG antihumana de cabra acoplada a peroxidasa y la IgM antihumana, fueron de Sigma. Los reactivos del segundo paso fueron Ig anti-rata de cabra marcada con peroxidasa (DAKO5 Glostrup, Dinamarca) o Ig anti-hámster (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA), y fosfatasa alcalina Ig anti-rata de cabra (Southern Biotechnology, Birmingam, AL, EUA). La Figura 15 muestra el análisis inmunohistoquímico de secciones congeladas de 5 µm de bazos de ratones transgénicos µMT7", WT y HLL y HLL-MD en el fondo µMT?. Las secciones se tiñeron con anti-B220 (azul) para los linfocitos B y anti-CD11c/N418 (marrón) para las células dendríticas. Las flechas indican la ubicación de pequeñas acumulaciones de linfocitos B.

Análisis de citometría de flujo Las suspensiones celulares únicas se prepararon de órganos linfoides en PBS, como se describió previameníe (Slieker eí al. 1993). Aproximadamente 1x106 células se incubaron con anticuerpos en PBS/seroalbúmina bovina (BSA) al 0.5% en placas de 96 pozos durante 30 minutos a 4°C. Las células se lavaron dos veces en PBS/BSA al 0.5%. Para cada muestra, se calificaron 3x104 eventos utilizando un analizador FACScan (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA). Los datos de FACS se analizaron utilizando el programa para compuíadora CelIQuesí versión 1.0. Se realizaron cuaíro análisis de color en un Becíon Dickinson FACS Calibur. Los siguieníes mAbs se obiuvieron de BD Pharmingen (San Diego, CA): aníi-B220-RA3-6B2 conjugado con FITC, aníi-CD 19 conjugado con PE. Los daíos de FACS sean en las células del bazo, teñidas con aníi-CD 19 y aníi-B220, se muesíran en el panel inferior de la Figura 15. En la izquierda de la Figura esíá una represeníación de la recombinación Flp in vivo medianíe la crianza de" líneas HLL a una línea transgénica FlpeR y los datos de FACS sean de apoyo en las células del bazo del recombinante, mueslran el rescate de los linfocitos B como se observa en las líneas HLL-MD originales generadas directamente. A la derecha está una representación de la recombinación Cre in vivo medianíe la crianza a la línea íransgénica Cag Cre y los datos FACS de las células del bazo del recombinanle de una sola copia.

Inmunización y producción del hibridoma (Figura 14) Se criaron raíones íransgénicos que coníienen un sitio del anticuerpo con únicamente la cadena pesada que consiste de dos dominios VHH de llama, las regiones D y J humanas y las regiones constantes lgG2 y 3 (sin un dominio CH1 ). Raíones de 8 semanas se inmunizaron con una proíeína de choque por calor de E. coli 70 (hsp70). 20 µg o 5 µg del aníígeno con adyuvante Specol (IDDLO, Lelysíadí, NL), se inyecíaron respectivameníe s.c. en los días 0, 14, 28, 42 e i.p. en el día 50. La sangre se tomó en el día 0, 14 y 45. Después de tres refuerzos, se detectó un íííulo bajo de aníicuerpos específicos del aníígeno en 1 de 3 HLL-MD1 inmunizados con Hsp70 (Figura 14). Se realizó una fusión de las células del bazo estándar con una línea celular de mieloma para generar un anticuerpo monoclonal que resulta en una línea celular de hibridoma monoclonal contra la proteína hsp70. El HCAb anti-HSP~70 consiste del segmento VHH de llama más cercano a la región D (V H 2), recombinado al segmento lgHD3-10 humano (número de acceso X13972), y el segmento lgHJ4-02 humano (número de acceso X86355). Aunque no a una alta frecuencia, los VHH tienen unas pocas mutaciones que dan lugar a las alteraciones de aminoácidos observadas en la Figura 9A cuando se compara con la configuración de la línea germinal. El análisis RT-PCR también mostró únicamente un trascripto de IgH reductivo en el hibridoma, sugiriendo que no hay otros transcriptos hechos. El anticuerpo de lgG2 aHSP70, se secreta como un dímero con únicamente la cadena pesada (Western blots bajo condiciones de gel desnaturalizante (dímero) y gel no desnaturalizante (monómero), Figura 14). Las células del bazo se fusionaron con las células del mieloma Sp2-O-Ag14 (obsequio de R. Haperen) en el día 56, utilizando un equipo ClonalCelITM-HY (SíemCell Technologies, RU), de acuerdo con las inslrucciones del fabricante. Los raíones íransgénicos que contienen un sitio del aníicuerpo con únicamente la cadena pesada que consiste de dos dominios VHH de llama, las regiones D y J humanas, una IgM humana y las regiones consíaníes de lgG2 y 3 humanas (todas sin un dominio CH1 , Figura 12), se inmunizaron con TNFa para obtener los anticuerpos HC-IgM. Uno de tres ratones mostró un suero posiíivo en los ensayos ELISA esíándar. Una fusión del mieloma esíándar proporcionó un hibridoma IgM posiíivo (Figura 16). Después de la filtración con gel en Sepharose 6B bajo condiciones no reductoras, cada fracción en la columna se cargó a un gel bajo condiciones reductoras y se detecíó medianíe IgM-HRP a humana (Figura 20). El fraccionamiento bajo condiciones no reductoras, mostró que el HC-lgM se secrete como un anticuerpo mulíimérico con el mismo íamaño que una IgM de control humana (después de la sustracción del peso molecular de las cadenas ligeras y el C 1 que están ausentes de HC-lgM). El fraccionamiento con gel de cada fracción de la columna bajo condiciones reducíoras mosíró el monómero esperado de (Figura 20).

ELISA de Ig en suero La sangre de raíones de 15-25 semanas se recolectó en íubos recubiertos con EDTA, se cenírifugó durante 15 minutos a temperatura ambiente (TA), y el sobrenadante se diluyó 1 :5 en PBS. Una placa de 96 pozos se recubrió durante 2 horas con 5 mg/ml de una IgG anti-humana de cabra (YES Biotechnology), o con IgM anti-humana de cabra (Sigma), se lavó con PBS, se bloqueó durante 1 hora a temperatura ambiente con solución de bloqueo (BSA al 1.5%/leche en polvo al 1.5%/tween 20 al 0.1%/PBS), y se lavó tres veces con PBS. Las series de la dilución de las muesíras de suero y los esiándares (lgG2 humana o IgM humana (Sigma, Zwijndrechl, NL)), se cargaron e incubaron durante 2-4 horas, y las placas se lavaron 6 veces con PBS antes de la adición de un aníicuerpo secundario (IgG aníi-humana de cabra diluida 1:2000 o IgM anti-humana de cabra acoplada a HRP (Sigma, Zwijndrecht, NL)). Todas las diluciones se hicieron en una solución de bloqueo. Después de una incubación de 1-2 horas a temperatura ambiente y lavado en PBS", se agregó' el sustfatd OD (Roche). El ELISA para la detección de los sdAbs solubles específicos del antígeno de la biblioteca del fago de lgG2, se muestra en la Figura 16. Los sdAb solubles se utilizaron como aníicuerpos primarios en las placas recubiertas con anlígeno, seguido por el anticuerpo a-myc de raíón y anticuerpo a de raíón de cabra conjugado con HRP. Se uíilizó POD como sustrato. El panel inferior muestra las huellas de las clonas con la enzima de restricción Hinf I, mostrando 5 insertos diferentes que codifican a sdAb conlra B. Pertusis.

Construcción y selección de la biblioteca del anticuerpo El ARN toíal se aisló de los bazos de raíones con sólo IgG de una sola copa inmunizados con DKTP (Figura 12 después del tratamiento con cre), utilizando un sistema de aislamiento de ARN Ultraspec (Biotecx Laboratories Inc, Houston, Texas, EUA). El ADNc se hizo utilizando oligo dT.

Los fragmentos de ADN que codifican los fragmentos VHHDJ se amplificaron mediante PCR uíilizando cebadores específicos: cebador Sfi 1 posterior vh1 (Dekker eí al., 2003), en combinación con el cebador hlgG2hingrev (5'-AATCTGGGCAGCGGCCGCCTCGACACAACATTTGCGCTC-3'). Los VHHDJ amplificados (~ 400 pb), se digirieron con Sfi l/Nof I, se purificaron en gel y se clonaron en un vecíor pHEN-1 de fagémido digerido con Sfi l/Noí I. La íransformación en células elecírocompeíeníes TG1 proporcionó una biblioteca del aníicuerpo del dominio único humano. Se realizaron dos rondas de selección uíilizando la íécnica dé" toma panorámica en los aníígenos de la vacuna adsorbidos en plásíico (inmunoíubos recubiertos con vacuna no diluida). Los análisis de reslricción y el secuenciamienío fueron esíándar.

RT-PCR en el siíio con únicameníe la cadena pesada Se investigó a coníinuación si el sitio HLL-MD funciona como un sitio normal en la producción de un repertorio diverso de aníicuerpos mediante el secuenciamienío de los producios de la RT-PCR, obíenida utilizando los cebadores específicos de lgG2 e lgG3 en el ADNc de parches de Peyer. La Figura 17 muestra algunos ejemplos de las mutaciones somáticas de las clonas de ratones no inmunizados (panel izquierdo) y ratones inmunizados (panel derecho). Los ratones fueron del sitio con sólo IgG, inmunizados con E. Coli hsp70, lisado de tos ferina, toxoide tetánico. En sombreado gris, está la región de articulación de lgG2 que inicia con ERKCCV.

Aunque los análisis de RT-PCR en los parches de Peyer mosíraron que se utilizaron ambos VH, lodos los aníicuerpos secuenciados rearreglaron el VH2. La fuente de la variabilidad del repertorio es la región CDR3 formada por la selección de los segmentos D y J y por las juntas V-D y D-J. El uso de segmentos J humanos es similar a aquél observado en los rearreglos humanos, con los segmentos JH4 y JH6 siendo utilizados de manera más frecuente. Estos análisis muestran que ambos V^rci ¡ferentes segmentos D humanos y todos los segmeníos J humanos se utilizan, para coníribuir al repertorio diverso del aníicuerpo. También se muesíra que la presencia de lgG3 conmutó los linfocitos B y la aparición de mutaciones somáticas medianíe la comparación de cada gen rearreglado con su coníraparte de la línea germinal, es decir, el VH original en el consírucío íransgénico (véase la Figura 17). Por lo lanío, el receptor del antígeno de IgG con únicamente la cadena pesada humano, puede proporcionar las señales necesarias para la maduración de los linfocitos B.

Inmunotinción La Figura 18 muestra los resultados de la ¡nmunotinción de una línea celular Tet-on transfecíada adicionalmeníe con el plásmido de respuesía que contienen el anticuerpo A5 (Dekker et al., 2003). El panel superior muestra la producción del anticuerpo A5 inducida por doxiciclina (rojo) en el citoplasma y la tinción nuclear de las células con DAPI (azul). El panel inferior muestra que las células que expresan rtTA en el núcleo son las que producen el A5 Iras la inducción (panel superior). La tinción se hizo con uno de los HCAb humanos coníra rtTA (verde) con la secuencia mosfrada a continuación. La IgG anti-humana de cabra conjugada con FITC se utilizó como un paso secundario. A5 se detectó como se describió previamente por Dekker et al., 2003. El anticuerpo rTTA fue una lgG3 con la siguieníe secuencia: 241 AGACTCT 80 RL 301 CCTGTGCAGCCTCTGGAAGCATCTTCAGTATCAATGCCATGGGCTGG TACCGCCAGGCTC 100 SCAASGSIFSINAMGWYRQA 361 CAGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTCGCAGCTATTACTAGTGGTGGTAG CACAAGGTATGCAG 120 PGKQRELVAAITSGGSTRYA 421 ACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAA CACGGTGTATCTGC 140 DSVKGRFTISRDNAKNTVYL 481 AAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTTTG ATCTCTATGGTTC 160 QMNSLKPEDTAVYYCLISMV 541 GGGGAGCCCGTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGT CTCCTCAGAGCTCA 180 RGARFDYWGQGTLVTVSSEL 601 AAACCCCACTT 200 K T P L La articulación de lgG3 inicia en el aminoácido 198 ELKTPL.

Para una comparación, véase la región de articulación de lgG2 en la Figura 17.

Análisis wesíern bloí La Figura 19 muesíra los Western bloí de suero de diferentes líneas de ratones íransgénicos que coníienen el siíio IgM más IgG (Figura 10), después del íralamiento con cre (es decir, IgM suprimida, sólo IgG dejada). El suero se purificó mediante prot G y gel fraccionado bajo condiciones reducloras (Figura 19, panel derecho) y no reductoras (Figura 19, panel izquierdo). Los controles fueron los ratones KO de fondo y una muestra de suero humano normal. Nótese la diferencia de tamaño entre los dos geles, que muestra que la IgG con únicamente la cadena pesada humana es un dímero. La señal mostrada en la Figura 19 se detectó con un anticuerpo IgG antihumano mediante procedimientos estándar.

Fraccionamiento de tamaño de la IgM humana producida por el ratón con el siíio IgM más IgG El suero de los ratones con IgM más IgG (Figura 13), se fraccionó mediante filtración con gel bajo condiciones no reductoras después de mezclar con una muestra de suero humano como un control. Los resultados se muesíran en la Figura 20. Los pesos moleculares de los complejos en la columna disminuyen con cada carril (represeníando cada fracción de izquierda a derecha). Las fracciones (cada carril), se analizaron mediante eleclroforesis con gel bajo condiciones reducíoras. Se realizaron análisis ELISA en varios hibridomas hechos de ratones que coníienen el siíio IgM más IgG (Figura 13) inmunizados con TNFa humano. Los resullados se muesíran en la Figura 21. La parte superior de dos hileras en la Figura 21 se analizaron con IgG aníi-humana, las siguieníes dos hileras con una IgM anti-humana. Las muesíras de suero (flechas), muestran que el ratón ha generado ambos aníicuerpos aníi-TNFa de IgG e IgM. La única flecha muesíra un hibridoma de IgM positivo. Las paredes se recubrieron con TNFa humano comercialmente disponible. Todos los procedimientos fueron esfándar.

EJEMPLO 2 El anticuerpo bivalente biespecífico se generó combinando dos aníicuerpos monoespecíficos con únicameníe la cadena pesada. El primer anticuerpo forma el pueníe de la cadena principal en la primera especificidad y las funciones efecloras (la región variable y la región conslaníe, respectivamente). Esío se combinó con el segundo anticuerpo con la segunda especificidad, vía una articulación diseñada recientemente. Esla articulación fue similar a la secuencia de articulación de lgG2 existente, pero estaba alterada reemplazando las cisteínas con prolinas para evitar la reticulación de las cisteínas en el dímero del anticuerpo y proporcionando flexibilidad adicional vía las prolinas para evitar que el segundo anticuerpo se restrinja espacialmente, que de otra manera puede tener inhibida su función. El anticuerpo de la cadena principal inicial fue un anticuerpo cultivado contra la proteína HSP70 de E. coli. El antígeno HSP70 se inyectó a ratones transgénicos que contenían un sitio del anticuerpo con únicameníe la cadena pesada como se describe en (véase la Figura 14 aníerior). Un aníicuerpo monoclonal se cultivó de estos animales mediante tecnología de fusión del hibridoma estándar (véase lo anterior). El ADNc que codifica el aHSP-anticuerpo, se clonó posíeriormeníe mediante méíodos de ADN recombinaníe con RT-PCR esíándar, resulfando en un plásmido que coníiene un ADNc de longitud completa que incluye del extremo 5' al extremo 3' (en la proíeína del íérmino N al íérmino COOH), el codón de inicio ATG, la secuencia pepíídica de la señal, el dominio variable V H1 (véase, Janssens ef al.), la región D y J recombinada y la región consfanle de C?2 (que carece de una región CH1 ), pero consíruye el condón de paro y el siíio poliA (Figura 22, parte superior izquierda). El ADNc que codifica para el aníicuerpo aHSP70 se amplificó mediante PCR para la clonación utilizando un cebador hacia delante y un cebador inverso. El cebador hacia delante fue: CTGGAATTCTCAACC^ gGAGCTGGGGCTGAGC, proporcionando un sitio EcoRI para propósitos de clonación (subrayado), una secuencia de inicio de la íraducción eficiente (negrillas) y el codón de inicio normal (sombreado gris). El cebador inverso fue: GA AAGCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC, proporcionando un sitio de clonación Hindlll (subrayado), y dejando el codón de paro normal. La amplificación conduce por lo tanto a un fragmento EcoRI/HindIII que contiene un sitio EcoRI (subrayado), una secuencia de inicio de la traducción eficiente (negrillas), y el codón de inicio normal del gen del anticuerpo aHSP (sombreado gris, véase también la Figura 22). El cebador del exlremo 3' inverso fue: GACAAGCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC, proporcionan un siíio de clonación Hindlll (subrayado), y eliminando el codón de paro normal. Esto resulíó en un fragmento (Figura 22, segundo de la izquierda desde la parte superior) con un siíio EcoRI para clonar en una secuencia promotora y un sitio Hindlll para clonar el extremo 5' en el plásmido de expresión y el exíremo 3' en una secuencia de articulación novedosa (véase a coníinuación). Finalmente, el fragmenío se cortó con EcoRI y Hindlll para proporcionar los exíremos con una sola hebra apropiados para la clonación.

El segundo aníicuerpo clonado que lleva la segunda especificidad comprendió el dominio VHH de un aníicuerpo de llama coníra el aníigen gag de reírovirus de cerdo (PERV) (Dekker eí al., (2003) J Virol, 11 (22): 12132-9, Figuras 22, parte superior derecha). El agag se amplificó vía la amplificación mediante PCR estándar, utilizando los siguientes cebadores: Hacia delante: GTC^CGTgGCCCAGGTCCAACTGCAGGAGTCTG, y el cebador inverso GTCGAATTCTCATTCCGAGGAGACGGTGACCTGGGTC. Esto proporciona el fragmento amplificado (Figura 22, segundo a la derecha desde la parte superior), con un sitio Xhol (sombreado gris), para clonar el exlremo 5' en el marco con la articulación novedosa (véase a conlinuación), y un siíio EcoRI (subrayado) para clonar el exlremo 3' en el plásmido de expresión (Figura 22, derecha a la mitad). Finalmente, el fragmento se cortó con EcoRI y Xhol para generar los exíremos de una sola hebra para la clonación. Las dos secuencias del anticuerpo se combinaron en una secuencia de diacuerpo vía la articulación novedosa. La articulación novedosa se generó de dos oligonucleótidos que forman juntos un oligonucleótido de doble hebra con salientes 5' y 3' (respectivameníe compatibles con Hindlll y Xhol) para propósitos de clonación. Se diseñó para esíar en el marco con el extremo de la secuencia aHSP70 y el inicio de la secuencia agag. La formación de los puentes de sulfuro normalmente presentes en la articulación lgG2 humana, se evitó reemplazando las cisíeínas (sombreado gris) con prolinas (subrayado). Las prolinas agregaron flexibilidad adicional a la articulación para permiíir el funcionamiento apropiado del segundo dominio del aníicuerpo que se conecía al íérmino COOH del primer anticuerpo vía la articulación. La secuencia de articulación de IgG normal (codones de cisteína en sombreado gris, codones de prolina subrayados) GAGCGCAAATG 5gFC TCGAGjGCCCACCGO"dQCCA, y su complemento se reemplazaron mediante AGCTTCTGAGCGCAAACCACCAGTCGAGCCACCACCGCCACCAC y su complemento TCGAGTGGTGGCGGTGGTGGCTCGACTGGTGGTTTGCGCTCAGA). Esío fambién proporcionó el fragmento (articulación en recuadro blanco, Figura 22, centro), con dos extremos de una sola hebra compatibles con los sitios Hindlll (negrillas) y Xhol (iíálica) para propósitos de clonación. Los íres fragmentos (aHSP70 lgG2, articulación y agag), se ligaron posteriormente en un plásmido de expresión bluescripl (PbluescripfH sk+), que coníiene un promoíor de acíina de pollo y una secuencia mejoradora de CMV (Figura 22, plásmido de expresión), mediante tecnología de ADN recombinante estándar. Cuando el plásmido se expresa (véase a continuación), resulía en el diacuerpo mosírado en la parte inferior de la Figura 22. El plásmido de expresión del diacuerpo se cultivó y coíransfecíó con el plásmido pGK-hygro (para permitir la selección de las células íransfecíadas), medianíe méíodos esíándar (Superfecí), en las células CHO (Figura 23). Las clonas positivas se seleccionaron en higromicina que coníiene medio y se identificaron de manera positiva como que expresan el diacuerpo realizando un ELISA de a gag eslándar (Dekker eí al., J.Virol. 2003) del medio de cullivo que contiene el diacuerpo secretado mediante las células CHO, utilizando una detección de IgG-HPR a humana. Las pruebas positivas para la actividad de a-gag hace más probable que una clona dada exprese todo el diacuerpo, debido a que la especificidad de gag está en el extremo posterior (término COOH) del diacuerpo. Un ELISA posterior para HSP70 también fue positivo. Los western blot de estas clonas seleccionadas mediante ELISA bajo condiciones reductoras y no reductoras, se realizaron con el fin de mostrar que la proteina expresada del plásmido fue un dímero de 110 kD (como se muestra en la parte ¡nferior de la Figura 23), en comparación con el monómero de 55 kD (condiciones no reductoras y reductoras y Western blots, Figura 23, derecha). Así, el ELISA y el Western blot juntos muestran que el diacuerpo es expresado y secretado en el medio como un dímero mediante las células CHO transfectadas (a >70 ng/ml), y que el anticuerpo puede unirse al HSP70 y a los antígenos gag. Sin embargo, no muestra que la misma molécula de diacuerpo dimérico pueda unirse a ambos antígenos al mismo tiempo. Por lo tanío, se llevó a cabo un experimenío de seguimiento.

Primero, el aníígeno gag se fijó a la parte inferior de un pozo de plástico (primer pozo, Figura 24, centro). El diacuerpo (Figura 24, parte superior), se capturó posteriormente mediante el primer antígeno (gag) después de la aplicación del sobrenadante de las células CHO de la clona 1 (segundo pozo, Figura 24, ceníro). Esto se siguió medianíe un lavado extenso y a coníinuación la aplicación del segundo aníígeno (HSP 70, Figura 24, cenlro, tercer pozo), nuevamente seguido por un lavado extenso. Si una molécula de diacuerpo puede unirse a ambos anfígenos al mismo fiempo, debe ser capíurada en la parte inferior del pozo uniéndose al primer antígeno (gag), y a continuación capturar el segundo antígeno (HSP70). Cuando todo el complejo se eíuyó posteriormente del pozo (Figura 24, centro, pozo derecho), tanto el diacuerpo como los antígenos fueron visibles en un Western blot (Figura 24, parte inferior). Con el fin de recolectar el diacuerpo secreíado, las clonas CHO se cultivaron bajo las mismas condiciones estándar y en medio (medio para hibridoma, libre de suero de SIGMA), utilizado para la recolección de anticuerpos de hibridomas. Métodos: Los pozos de una placa Nunc-lmmuno (Maxisorp), se recubrieron con proteína gag recombinanle purificada (12.5 µg/µl en PBS) O/N 4C. Se bloqueó durante dos horas con leche al 1 %/BSA al 1% en PBS. El medio de la clona 1 CHO-DB diluido a 1/2 en PBS-Leche-BSA (o controles), se incubaron durante 3 horas a temperatura ambiente (TA). El lisado celular B121 bacteriano (que contiene la proteína HSP70) diluidos a 1/2 en PBS-Leche-BSA, se incubó durante 3 horas a temperatura ambiente y se lavó. Las proteínas unidas se eluyeron con ún amortiguador de mueslra Laemmli que coníiene 2-Mercaploetanol. Las muestras se analizaron mediante Western blot y por lo tanto se corrieron en un SDS-PAGE al 10%, y se transfirieron en una membrana de nitrocelulosa. La transferencia se bloqueó durante dos horas con PBS-Leche-BSA, y se incubó con anticuerpos primarios. Los productos se visualizaron mediante métodos esíándar uíilizando anticuerpos secundarios acoplados a las enzimas que permiten la tinción visual. Los reacíivos uíilizados fueron: a Gag: Policlonal de conejo (1 :2000) 2 horas a temperatura ambiente a Diacuerpo: IgG-HRP a humana de cabra (1 :2500) 2 horas a temperatura ambiente a HSP70: Medio G20-380 monoclonal (1:2) 2 horas a temperatura ambiente. Los anticuerpos secundarios fueron: conejo-AP a de cabra (1 :2000) 2 horas a temperatura ambiente e IgG-HRP a Humana de cabra (1 :2500) 2 horas a temperatura ambiente contra el HSP70 monoclonal. Para visualizar las bandas de la proteína se utilizó el primer sustrato NBT/BCIP (púrpura), que reacciona con fosfatasa alcalina (AP) y el segundo sustrato DAB (marrón), que reacciona con la peroxidasa de rábano picante (HRP). Todos los pasos de lavado se hicieron con PBS-Tween 20 al 0.05%. Los controles se llevaron a cabo dejando uno de los componentes o agregando medio de las células CHO que no producen diacuerpos (Figura 24), es decir, que carecen de alguna aplicación del diacuerpo (medio de células CO no íransfecíadas), y lienen por lo íanto, únicamente gag (carril 2); que carecen de gag en el fondo del pozo (reemplazado mediante proteína de leche) y por lo tanío, no íiene ninguno de los productos (carril 3); que carece de gag y el diacuerpo y no debe tener ninguno de los productos (carril 4); que carece de antígeno de HSP70 (reemplazado mediante antígeno de leche), y por lo tanto debe tener únicamente el diacuerpo y gag (carril 5); que carece de HSP70 y el diacuerpo y debe tener únicamente gag (carril 6). El hecho de que los tres componentes (el diacuerpo más ambos aníígenos) esíén solo presentes en el pozo del carril 1 que recibió los Ires componeníes (véase íambién la leyenda de la parte inferior de la Figura 24), mueslra que el diacuerpo único se una a ambos anlígenos al mismo tiempo.

Generación de IgA biespecífica o IgM multiespecífica La generación de IgA biespecífica se describe esencialmente para la IgG (anterior), pero utilizando además de Vhsol, D y J, la región constante Ca que conduce a la generación de IgA (Figura 25). La generación de IgM es bastante similar, pero ofrece una posibilidad adicional debido a que las moléculas de IgM pueden formar multímeros grandes (con o sin cadenas J). Así, además de las moléculas similares a aquéllas descritas anteriormente (Figura 26, parte inferior derecha, después de la eliminación de las secuencias de multimerización), uno también puede generar multímeros simplemente coexpresando las IgM con diferentes especificidades (Figura 26, parte inferior izquierda).

EJEMPLO 3 Un vector de expresión que codifica un complejo polipeptídico que comprende: una cadena pesada que incluye un dominio de unión que se une a PSCA (antígeno de las células germinales de la próstata), un dominio de montaje que consiste del motivo de cremallera de leucina de Jun y la articulación del anticuerpo, los dominios CH2 y CH3; y una cadena ligera que incluye un dominio del montaje complementario que consiste del motivo de cremallera de leucina de Fos, se construye utilizando técnicas de biología molecular como se describe en Sambrook et al ((1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). El vector de expresión se transfiere a coníinuación a una célula hospedera adecuada medianíe íécnicas convencionales para producir una célula hospedera íransfeclada para la expresión optimizada del vector. La célula hospedera transfecíada o íransformada se cultiva a coníinuación utilizando cualquier íécnica adecuada conocida por aquellos con experiencia en la íécnica, para producir el complejo polipeptídico de la invención. Una vez producidos, los complejos polipeptídicos se purificaron mediante los procedimientos estándar de la técnica, ¡ncluyendo filtración con flujo cruzado, precipitación con sulfato de amonio y cromatografía en columna por afinidad (por ejemplo, proteína A). El dominio efector soluble que consiste de 3,3'-diindolilmeíano (DIM), se fusiona a continuación al dominio del montaje complementario utilizando técnicas conocidas por aquellos con experiencia en la técnica.

EJEMPLO 4 Un vector de expresión que codifica la cadena pesada del complejo polipeptídico de la presente ¡nvención que comprende; un dominio de unión VHH soluble que se une a AFP (Alfa-Fetoproteína), y un dominio de montaje que consiste del motivo de cremallera de leucina de Jun, y la articulación del anticuerpo, los dominios CH2 y CH3 se construye utilizando técnicas de biología molecular como se describe en Sambrook et al. Un segundo vector de expresión que codifica la cadena ligera del complejo polipepíídico de la preseníe invención íambién se conslruye. Esíe comprende un dominio del moníaje complemeníario que consisíe del moíivo de cremallera de leucina de Fos. Los vectores de expresión se íransfieren a coníinuación a una célula hospedera adecuada medianíe técnicas convencionales, para producir una célula hospedera coíransfecíada para la expresión optimizada del vecíor.

La célula hospedera íransfeclada o íransformada se cultiva a continuación utilizando cualquier técnica adecuada conocida por aquellos con experiencia en la técnica, para producir el complejo polipeptídico de la invención. Una vez producidos, los complejos polipeptídicos se purificaron mediante los procedimientos estándar de la técnica, incluyendo filtración con flujo cruzado, precipitación con sulfato de amonio y cromatografía en columna por afinidad (por ejemplo, proteína A). El dominio efector soluble que consiste de 3,3'-diindolilmeíano (DIM), se fusiona a continuación al dominio del montaje complementario utilizando técnicas conocidas por aquellos con experiencia en la técnica.

EJEMPLO 5 VCAM y VLA-4 Un vector de expresión que codifica un complejo polipeptídico que comprende: una cadena pesada que ¡ncluye un dominio de unión que se una a PSCA (antígeno de las células germinales de la prósíaía), un dominio de moníaje que consisíe de VCAM y la articulación del anticuerpo, los dominios CH2 y CH3; y una cadena ligera que incluye un dominio del moníaje complemeníario que consiste de VLA-4 fusionado a la toxina ricina A, se construye utilizando técnicas de biología molecular como se describe en Sambrook et al. El vector de expresión se íransfiere a continuación a una célula hospedera adecuada mediante íécnicas convencionales para producir una célula hospedera íransfecíada para la expresión optimizada del veclor. La célula hospedera íransfectada o transformada se cultiva a continuación utilizando cualquier técnica adecuada conocida por aquellos con experiencia en la técnica, para producir el complejo polipeptídico de la invención. Una vez producidos, los complejos polipeptídicos se purificaron mediante los procedimientos estándar de la técnica, ¡ncluyendo filtración con flujo cruzado, precipitación con sulfato de amonio y cromatografía en columna por afinidad (por ejemplo, proteína A).

EJEMPLO 6 Un vector de expresión que codifica un complejo polipeptídico que comprende: una cadena pesada que incluye un dominio de unión que se une a PSCA (antígeno de las células germinales de la próstala), un dominio de moníaje que consisíe del moíivo de cremallera de leucina de Jun y la articulación del aníicuerpo, los dominios CH2 y CH3; y una cadena ligera que incluye un dominio del montaje complementario que consiste del motivo de cremallera de leucina de Fos y un dominio efector soluble que codifica la purina nucleósido fosforilasa (PNP), se construye utilizando técnicas de biología molecular como se describe en Sambrook et al. El vecíor de expresión se íransfiere a coníinuación a una célula hospedera adecuada mediante íécnicas convencionales para producir una célula hospedera íransfeclada para la expresión optimizada del vector. La célula hospedera transfecíada o íransformada se culíiva a coníinuación uíilizando cualquier íécnica adecuada conocida por aquellos con experiencia en la íécnica, para producir el complejo polipeptídico de la invención. Una vez producidos, los complejos polipeptídicos se purificaron mediante los procedimientos estándar de la técnica, incluyendo filíración con flujo cruzado, precipiíación con sulfato de amonio y cromatografía en columna por afinidad (por ejemplo, proíeína A). La P P convierte la fludarabina al mefáboliío- tóxico de 2-fluoroadenina que deslruye las células que comprenden la enzima PNP y además se difunde para deslruir las células no infecladas circundantes, un efecto especíador local.

EJEMPLO 7 Un vector de expresión que codifica una primera cadena pesada del complejo polipeptídico de la presente invención que comprende; un dominio de unión VHH soluble que se una a la región V3-PND del antígeno de la glucoproteína gp120 y un dominio de montaje que consiste del moíivo de cremallera de leucina de Jun y la articulación del anticuerpo, los dominios CH2 y CH3, se construye utilizando técnicas de biología molecular como se describe en Sambrook eí al. Un segundo vector de expresión que codifica una segunda cadena pesada del complejo polipepíídico de la presente invención, íambién se construye, que comprende: un dominio de unión VHH soluble que se une a GP-41 , un dominio de montaje que consiste del motivo de cremallera de leucina de Jun y la articulación del anticuerpo, los dominios CH2 y CH3. Un tercer vector de expresión que codifica la cadena ligera del complejo polipeplídico de la presente invención íambién se consíruye. Esíe comprende un dominio del moníaje complemeníario que consisíe del moíivo de cremallera de leucina de Fos. Los vectores de expresión se íransfieren a coníinuación a una célula hospedera adecuada medianíe íécnicas convencionales para producir una célula hospedera colransfeclada para la expresión opíimizada del vector. La célula hospedera transfecíada o íransformada se cultiva a coníinuación uíilizando cualquier íécnica adecuada conocida por aquellos con experiencia en la lécnica, para producir el complejo polipeptídico de la invención. Una vez producidos, los complejos polipeptídicos se purificaron mediante los procedimientos estándar de la técnica, incluyendo fillración con flujo cruzado, precipitación con sulfato de amonio y cromatografía en columna por afinidad (por ejemplo, proteína A). El dominio efector soluble que consiste del inmunógeno peptídico HIV-1 MN V3 (PND), se fusiona a continuación al dominio del montaje complementario utilizando técnicas conocidas por aquellos con experiencia en la técnica.

EJEMPLO 8 Un vector de expresión que codifica una primera cadena pesada del complejo polipeptídico de la presente invención que comprende: un dominio de unión VHH soluble que se une a la región V3-PND del antígeno de glucoproteína se construye utilizando técnicas de biología molecular como se describe en Sambrook et al ((1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Un segundo vector de expresión que codifica una segunda cadena pesada del complejo polipeptídico de la presente ¡nvención, también se construye, que comprende: un dominio de unión V H soluble que se une a GP-41. Las dos cadenas pesadas están caracterizadas en que las regiones constantes para las dos cadenas pesadas comprenden los dominios µ, CH2, C 3 y C 4 idénticos. Los vectores de expresión se transfieren a continuación a una célula hospedera que expresa de manera constitutiva una cadena J mediante técnicas convencionales, para producir una célula hospedera cotransfectada para la expresión optimizada del vector. La célula hospedera transfectada o transformada se cultiva a continuación utilizando cualquier técnica adecuada conocida por aquellos con experiencia en la técnica, para producir el complejo polipeptídico de la invención.

Una vez producidos, los complejos polipepíídicos se purificaron medianíe los procedimientos estándar de la íécnica, ¡ncluyendo filíración con flujo cruzado, precipiíación con sulfaío de amonio y cromaíografía en columna por afinidad (por ejemplo, proteína A). El dominio efecíor soluble que consiste del inmunógeno pepíídico HIV-1 MN V3 (PND), se fusiona a continuación al dominio del monlaje complemenlario utilizando técnicas conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. Todas las publicaciones mencionadas en la especificación anterior se incorporan en la presente como referencia. Varias modificaciones y variaciones de los métodos y el sistema descritos de la presente ¡nvención serán evideníes para aquellos con experiencia en la íécnica sin apartarse del alcance y espirite de la presente invención. Aunque la presente invención se ha descrito con relación a modalidades preferidas específicas, se entenderá que la invención como se reclama, no debe limitarse de manera indebida a tales modalidades específicas. En realidad, varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención, que son obvios para aquellos con experiencia en bioquímica, biología molecular y biotecnología o campos relacionados, pretenden estar dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para la producción de un anticuerpo con únicamente la cadena pesada VH en un mamífero transgénico, que comprende el paso de expresar un sitio de la cadena pesada VH heterólogo en el mamífero, en donde el sitio de la cadena pesada VH comprende una región consíante de cadena pesada que no codifica un dominio CH1 y sitio el cual, cuando se expresa, es capaz de formar aníicuerpos con únicamente la cadena pesada de una clase o clases definidas.

2.- Un método para la producción de un anticuerpo con únicamente la cadena pesada VH de camélido (VHH) en un mamífero transgénico, que comprende el paso de expresar un sitio de la cadena pesada VH de camélido (VHH) en el mamífero, en donde el sitio de la cadena pesada VHH comprende una región de cadena pesada constante que no codifica un dominio CH1 y sitio el cual, cuando se expresa, es capaz de formar aníicuerpos con únicamente la cadena pesada de una clase o clases definidas.

3.- El méíodo de conformidad con la reivindicación 1 y 2, caraclerizado además porque el siíio de la cadena pesada VH o VH de camélido (VHH), comprende uno o más segmentos del gen V.

4.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones previas, caracterizado además porque el o cada segmento del gen V se ha seleccionado o diseñado para mostrar características de solubilidad mejoradas.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 4 en donde el o cada segmento del gen V se deriva de un humano.

6.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caractefizadola emás porque la región consíante de cadena pesada comprende uno o más iosotipos de un gen de región consíanle de cadena pesada Ca.

7.- El méíodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracíerizado además porque la región consíaníe de cadena pesada comprende uno o más isolipos de un gen de la región constante de cadena pesada Ce.

8.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque la región consfanle de cadena pesada comprende uno o más ¡solipos de un gen de la región consíante de cadena pesada Cd.

9.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque la región constaníe de cadena pesada comprende uno o más isoíipos de un gen de la región conslaníe de cadena pesada C?.

10.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracíerizado además porque la región consfaníe de cadena pesada comprende uno o más isoíipos de un gen de la región constaníe de cadena pesada Cµ.

11.- El méíodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado además porque la región constaníe de cadena pesada comprende más de una de las siguientes regiones constantes de cadena pesada: Ca, Ce, Cd, C?, Cµ.

12.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el sitio de la cadena pesada VH comprende una región variable que comprende al menos un segmento del gen V de camélido o no de camélido, al menos un segmento del gen D y al menos un segmento del gen J, en donde un segmento del gen V, un segmento del gen D y un segmento del gen J, son capaces de recombinarse para formar una secuencia codificante VDJ.

13.- El mélodo de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque los sitios de la cadena pesada comprenden veinte o más segmentos del gen D.

14.- El método de conformidad con ia reivindicación 12 o la reivindicación 13, caracterizado además porque los sitios de la cadena pesada comprenden cinco o más segmentos del gen J.

15.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, caracterizado además porque al menos un segmento del gen D y al menos un segmento del gen J se derivan de un camélido.

16.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, caracterizado además porque al menos un segmento del gen D y al menos un segmento del gen J se deriva de un vertebrado que no es camélido.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque al menos un segmento del gen D y al menos un segmento del gen J se deriva de un mamífero.

18.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, caracterizado además porque los segmentos del gen D y J se derivan de un humano.

19.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado además porque la espira CDR3 se deriva de una sola especie de origen vertebrado.

20.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque la espira CDR3 se deriva de un camélido o un humano.

21.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el sitio de la cadena pesada VH O VH de camélido (VHH) comprende además una secuencia de recombinación (rss) capaz de recombinar un segmento del gen J directamente con un gen de la región constante de cadena pesada.

22.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el gen de la región constante de cadena pesada del sitio de la cadena pesada heteróloga es de origen de camélido.

23.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 , caracterizado además porque el gen de la región consíante de cadena pesada del siíio de la cadena pesada heteróloga es de origen vertebrado, no de camélido.

24.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el gen de la región consíante de cadena pesada del siíio de la cadena pesada heíeróloga es de origen humano.

25.- El méíodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 , caracterizado además porque la región constante no es de origen de la cadena pesada.

26.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque la maduración de los linfocitos B es esencialmente normal.

27.- Un aníicuerpo con únicameníe la cadena pesada, o un fragmenío del mismo o mezcla de clases de aníicuerpos con únicameníe la cadena pesada obtenidos o que se pueden obtener de conformidad con el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.

28.- El aníicuerpo con únicameníe la cadena pesada de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque es un aníicuerpo monoclonal o un fragmenío del mismo. 29.- El fragmento de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque es un dominio de unión V o VH de camélido

(VHH).

30.- El dominio de unión VH de conformidad con la reivindicación 29, que carece de una espira CDR3 similar a la de camélido, extendida.

31.- El dominio de unión VH de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque comprende una espira CDR3 similar a la de camélido, extendida.

32.- Un vector que comprende un sitio de cadena pesada heteróloga, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.

33.- Una célula hospedera transformada con un vector de conformidad con la reivindicación 32.

34.- Un mamífero íransgénico que expresa un siíio de la cadena pesada heteróloga, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.

35.- El mamífero íransgénico de conformidad con la reivindicación 34, caracíerizado además porque tiene una capacidad reducida para expresar los genes del anticuerpo endógeno.

36.- El uso de un anticuerpo con únicamente la cadena pesada, o un fragmento del mismo, como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31 , en la preparación de un medicamento útil para la inmunoterapia.

37.- El uso de un anticuerpo con únicamente la cadena pesada, o un fragmento del mismo, como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31 como un agente de diagnóstico, un reactivo, una abzima o un agente inhibidor.

38.- Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo con únicamente lá cadena pesada o un fragmento del mismo, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31 y un portador farmacológicamente apropiado.

39.- Un método para la producción y selección de aníicuerpos con únicamente la cadena pesada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31 , que comprende los pasos de: (a) inyectar un antígeno en el mamífero transgénico de la reivindicación 34 o la reivindicación 35; (b) aislar una célula o tejido que expresa un anticuerpo con únicamente la cadena pesada, específico del antígeno de interés; (c) producir un hibridoma de la célula o tejido del paso (b); (d) opcionalmeníe, clonar el ARNm del anticuerpo con únicameníe la cadena pesada del hibridoma para la producción posíerior en un sisíema de expresión helerólogo, íal como un sisíema de mamífero, plañía, insecfo, microbiano, micóíico o alterno, (e) clonar el dominio VH del paso (c); f) expresar los dominios VH solos o como una proteína de fusión en un sistema de expresión bacteriano, de levadura o alterno.

40.- Un método para la producción y selección de un dominio de unión VH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31 , que comprende los pasos de: (a) inyectar un antígeno en el mamífero íransgénico de la reivindicación 34 o la reivindicación 35; (b) aislar una célula o lejido que expresa un anticuerpo con únicamente la cadena pesada específica del antígeno de interés; (c) clonar el sitio VH del ARNm derivado de la célula o tejido aislado; (d) representar la proteína codificada utilizando una biblioteca de fago o una similar; (e) identificar el dominio VH específico del antígeno; y (f) expresar los dominio VH solos o como una proteína de fusión en sistemas de expresión bacterianos, de levadura o alternos.

41.- Un complejo polipeptídico de unión que comprende un dímero de una primera cadena pesada y una segunda cadena pesada, en donde: cada cadena pesada comprende un dominio de unión, una porción efeclora y un dominio de dimerización; el dominio de unión en la primera cadena pesada puede ser de la misma especificidad o de una especificidad diferente de la especificidad del dominio de unión en la segunda cadena pesada; la porción efectora en la primera cadena pesada puede tener la misma función o una función diferente de la porción efectora en la segunda cadena pesada.

42.- El complejo polipeptídico de unión de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque los dominios de dimerízación son idénticos.

43.- El complejo polipeptídico de unión de conformidad con la reivindicación 41 o la reivindicación 42, caracterizado además porque el o cada dominio de dimerización comprende al menos los dominios constantes del anticuerpo CH2, CH3 y opcionalmente CH4, derivados de cualquier clase de gen de la cadena pesada de inmunoglobulina.

44.- Un complejo polipeptídico que comprende un par de cadenas pesadas y un par de cadenas efectoras (ligeras), en donde: el par de cadenas pesadas están asociadas una con la otra; una de las cadenas efectoras (ligera) está asociada con una de las cadenas pesadas y la otra de las cadenas efectoras (ligera), está asociada con la otra de las cadenas pesadas; cada cadena pesada comprende un dominio de unión, un dominio de dimerización y una porción efectora; la cadena efectora (ligera) comprende un dominio del montaje complementario, que tiene unido al mismo una porción efectora; y el dominio efector de la cadena pesada y el dominio del montaje complementario de la cadena efectora (ligera), se asocia uno con el otro a través de interacciones no covalentes.

45.- El complejo polipeptídico de unión de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque el dominio de dimerización comprende al menos las regiones constantes del anticuerpo CH2, CH3 y opcionalmente CH4, derivados de cualquier clase de gen de la cadena pesada de inmunoglobulina.

46.- El complejo polipeptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 45, caracterizado además porque una porción efectora de la cadena efectora (ligera) es una enzima, toxina, dominio de unión, agente que estabiliza el suero, célula o un agente para la formación de imágenes.

47.- El complejo polipeptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 46, caracterizado además porque la porción efectora de la cadena pesada es una enzima, toxina, dominio de unión, un agente que estabiliza el suero o un agente para la formación de imágenes.

48.- El complejo polipeptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 47, caracterizado además porque la porción efectora está unida con un péptido al dominio del montaje complementario.

49.- El complejo polipeptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 48, caracterizado además porque los dominios constantes de la cadena pesada son los dominios ?, los dominios e, los dominios a o los dominios µ.

50.- El complejo polipeptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 49, caracterizado además porque las cadenas pesadas incluyen cada una un dominio CH4, los dominios constantes son dominios a y el complejo polipeptídico incluye una cadena J.

51.- El complejo polipeptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 49, caracterizado además porque las cadenas pesadas ¡ncluyen cada una un dominio CH4, los dominios constantes son dominios µ y el complejo polipeptídico ¡ncluye una cadena J.

52.- Un complejo polipeptídico de unión que comprende una pluralidad de dímeros de la cadena pesada y una cadena J, en donde: la pluralidad de dímeros de la cadena pesada se montan por la cadena J; cada cadena pesada comprende un dominio de unión soluble y dominios µ CH2, CH3 y CH4 idénticos; y hay al menos dos dominios de unión solubles que tienen diferentes especificidades en el complejo polipeptídico de unión.

53.- El complejo polipeptídico de unión de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado además porque hay únicamente dos dominios de unión de diferente especificidad.

54.- El complejo polipeptídico de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 53, caracterizado además porque cada cadena pesada ¡ncluye además un dominio de la articulación entre el dominio de unión y el dominio de dimerización y un dominio similar a una articulación entre la porción efectora y el dominio de dimerización.

55.- El complejo polipeptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 54, caracterizado además porque el o cada dominio de unión es un dominio VHH-

56.- El complejo polipeptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 54, caracterizado además porque el dominio de unión es un dominio VH modificado de cualquier organismo.

57.- El complejo polipeptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 54, caracterizado además porque el dominio de unión es un complejo polipeptídico de adhesión a una célula de mamífero, un complejo polipeptídico de adhesión a una célula procariótica o un complejo polipeptídico de adhesión a una célula viral.

58.- El complejo polipeptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 54, caracterizado además porque el dominio de unión es una citocina, un factor de crecimiento, un antagonista o agonista del receptor o un ligando.

59.- Un polinucleótido aislado que codifica una de las cadenas de un complejo polipeptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 58.

60.- Un vector de clonación o expresión que contiene el polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 59.

61.- El vector de clonación o expresión que contiene un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque codifica una primera cadena pesada y un polinucleótido aislado de la reivindicación 59, que codifica una segunda cadena pesada, en donde el dominio de unión soluble en la primera cadena pesada íiene una especificidad diferente del dominio de unión soluble en la segunda cadena pesada.

62.- El vector de clonación o expresión que contiene un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque codifica una cadena pesada de un complejo polipeptídico de la reivindicación 44 y un polinucleótido aislado de la reivindicación 59, que codifica una cadena ligera de un complejo polipeptídico de la reivindicación 44.

63.- Una célula hospedera transformada con un vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60 a 62.

64.- Un método para la producción del complejo polipeptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 58, caracterizado además porque comprende cultivar la célula hospedera de la reivindicación 63 y aislar el complejo polipeptídico.

65.- El método para producir un complejo polipeptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 58, caracterizado además porque comprende: transformar una célula hospedera con un primer polinucleótido que codifica una primera cadena pesada y un segundo polinucleótido que codifica una segunda cadena pesada; cultivar la célula hospedera bajo condiciones que permiten la expresión de las secuencias codificantes de los dos polinucleótidos; y recolectar el complejo polipeptídico de la célula hospedera.

66.- El método de conformidad con la reivindicación 64 o la reivindicación 65, caracterizado además porque comprende transformar la célula hospedera con un polinucleótido que codifica una cadena ligera.

67.- El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado además porque comprende transformar la célula hospedera con un primer polinucleótido que codifica una primera cadena ligera y un segundo polinucleótido que codifica una segunda cadena ligera, en donde el dominio efector soluble en la primera cadena ligera es diferente del dominio efector soluble en la segunda cadena ligera.

68.- Un método para la producción del complejo polipeptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 58, caracterizado además porque la cadena efectora se produce mediante una ruta sintética, tal como química o conjugación peptídica.

69.- Una composición farmacéutica que comprende un complejo de unión polipeptídico de conformidad con cualquiera de lásYeivindicaciones 41 a 58.

70.- El uso de un complejo de unión polipeptídico como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 41 a 58, en la preparación de un medicamento útil para la profilaxis o tratamiento de la enfermedad.

71.- Una cadena pesada y una cadena efectora de un complejo de unión polipeptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 58 para la administración combinada, separada o secuencial útil en inmunoterapia.

72.- El uso de un complejo de unión polipeptídico como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 41 a 58 como un agente de diagnóstico, un reactivo, una abzima, un agente inhibidor, un reactivo citoquímico o un agente de diagnóstico.