CN110662421B - 来自具有多个重链免疫球蛋白基因座的转基因啮齿类动物的人抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及可用于最佳地产生具有人独特型的功能性免疫球蛋白的转基因动物。
Description
技术领域
本发明涉及可用于在啮齿类动物中产生具有人独特型的免疫球蛋白的转基因动物，及所述转基因动物的制备方法。本发明还涉及使用来自细菌人工染色体上被修饰的大区域的多核苷酸及其组合的串联整合来产生人源化和全人抗体的组合物和方法。独立获得的转基因动物的杂交育种允许使用许多不同的、可能全部的人VH、D和JH区段表达高度多样化的人抗体库。通过统一调节单独的整合位点来体内管控表达，以例如获得VH基因多样性和选择而不受干扰。
背景技术
人单克隆抗体(呈具有常规大小的IgG、单链或结构域模块的形式)已被证明在治疗应用中极为有用(Chan和Carter Nature reviews.Immunology 10，301-316(2010)；Enever等，Current opinion in biotechnology 20，405-411(2009))。尽管取得了成功，但所述人单克隆抗体的产生仍然存在重大缺陷，其产生要么依赖于对可用人类材料的特异性选择和后续对单个产品的修饰，要么依赖于对有限可用的转基因动物的免疫化(Brüggemann等，第I部分：Selecting and shaping the antibody molecule，SelectionStrategies III:Transgenic mice，in Handbook of Therapeutic Antibodies.Ed.Dübel，S.Wiley-VHC，69-93(2007))。
人免疫球蛋白(Ig)基因在转基因动物中的DNA重排和表达是20多年前通过在种系构型中稳定地插入重链基因而开创的(Bruggemann，M.PNAS 86，6709-6713(1989))。与非人免疫球蛋白的治疗应用相关的一个问题是所述非人免疫球蛋白在人类患者中具有潜在免疫原性。为了降低此类制剂的免疫原性，已经开发出了各种用于产生嵌合抗体、部分人抗体(人源化抗体)和全人抗体的策略。嵌合抗体包含人恒定区和由非人V基因编码的结合区。在非人动物中产生具有人独特型的转基因抗体的能力是特别理想的，因为抗原结合决定簇位于独特型区域内，并且非人独特型被视为有助于当前抗体治疗剂的免疫原性。就单克隆抗体治疗剂而言，人类独特型是一种特别重要的考虑因素，所述单克隆抗体治疗剂由以相对高的浓度递送的单一独特型组成，而不是由通过多克隆抗体混合物以较低浓度递送的多种独特型组成。
使得人Ig的表达水平提高和排他性产生的主要改进措施结合了以下两种新的策略：胚胎干(ES)细胞中的基因敲除(Kitamura等，Nature 350，423-426(1991))和人工染色体上的基因座延伸(Davies等，Nucleic acids research 21，767-768(1993))。在ES细胞中通过基因打靶使内源性Ig基因沉默产生了几种无活性的小鼠品系，所述失活的小鼠品系无法重排它们的IgH和IgL基因座，或者不产生全功能的IgH、IgK或IgL产物。最近，锌指核酸酶(ZFN)被设计成在Ig基因中产生位点特异性双链断裂，这允许通过缺失和非同源DNA修复来破坏基因。将ZFN质粒注入受精卵中产生具有IgH和IgL破坏的Ig沉默型大鼠和兔(Geurts，A.M.等，Science 325，433(2009)；Menoret，S.等，European journal of immunology 40，2932-2941(2010)；Flisikowska，T.等，PloS one 6，e21045(2011))。
在非人动物中产生人源化转基因抗体的许多现有技术方法遇到的一个重大技术挑战涉及同一动物中重复Ig基因座之间的明显竞争，例如，现有或内源性Ig基因座和引入转基因动物中的外源性或人工基因座。历史上，在不存在有效敲除的情况下，就抗体产生而言内源性基因座竞争超越了外源性基因座，使得重复基因座得到有效沉默(Lonberg等，NatBio，23，1117，2005；Nicholson等，J Immunol，163，6898，1999；Brüggemann等，AITE 63，101，2015)。因此，就此而言，现有技术没有说明或解决整合在不同染色体位点的重复Ig基因座在同一宿主动物中的转基因抗体产生中是否可以协同地起作用，并且事实上将会合理地向本领域技术人员暗示事实正好相反。
在非人动物中产生具有人独特型的转基因抗体遇到的另一个技术挑战是难以提供用于产生人抗体的人免疫球蛋白VDJ或VJ基因区段的完整补体。一些人已经尝试通过从人重链和κ轻链基因座引入兆碱基大小的片段来解决这个问题。然而，这种方法仅在约80％的包含在种系构型中的人免疫球蛋白基因的情况下被证实是成功的，并且依赖于使用原生质体来用酵母人工染色体(YAC)系统递送相关染色体的大片段(US 5,939,598)。
尽管为了最大限度地提高抗体多样性，已经在转基因动物中利用了广泛重叠的VHD JH区的整合，所述整合使得能够例如维持IgH基因座的全部功能并且对于DNA重排而言是必需的，但是对重叠整合的报道主要见于小得多的区域(<100kb)(Wagner等，Genomics 35，405-414(1996)；Bruggemann等，European journal of immunology 21，1323-1326(1991))或但在单一整合位点仍具有有限库的较大区域(WO2014/093908；Bruggemann等)。在提出申请时，本领域的共同理解是，BAC或YAC混合物的扩散或多重整合较为罕见并且将会对纯合性育种不利。此外，更常见的是将大的YAC费力地整合到干细胞中，并且随后从中获得动物(Mendez等，Nature genetics 15，146-156(1997)；Davies等，Biotechnology(N Y)11，911-914(1993))。
使用具有人V基因的完整互补序列的转基因动物，优化免疫球蛋白或抗体的产生，从而最大限度地提高具有人独特型的抗体的多样性，对于在广泛的疾病领域中产生对于治疗应用较新颖的特异性仍然是一个挑战。
发明内容
本发明通过提供包含多个整合在不同的染色体位点的包含重复/重叠人免疫球蛋白VDJ或VJ基因区段的人工Ig重链基因座，并且缺乏产生内源性免疫球蛋白的能力的转基因动物解决了本领域的上述不确定问题。用于产生这些转基因动物的包括在两个不同染色体上的两个不同位置插入两个不同基因座的方法令人惊讶地产生了功能性B细胞，所述方法有利地避免了等位基因排斥，并且由于整合到转基因动物基因组中的人免疫球蛋白VDJ重链基因区段的完整互补序列而增加了抗体多样性。
在本发明的一个方面，公开了新颖多核苷酸，其包含编码嵌合免疫球蛋白链、特别是用于产生转基因动物的嵌合重链的核酸序列。本发明的多核苷酸有利地提供最佳表达，这至少部分地是由3'增强子的纳入所致，因为缺乏该3'增强子的转基因座导致同种型转换受损和IgG表达减少。因此，在优选的实施方案中，本发明提供了嵌合多核苷酸，其包含大鼠3'增强子序列、Ig恒定区基因和至少一个人免疫球蛋白(Ig)连接(J)区基因。在优选的实施方案中，大鼠3'增强子序列包含如SEQ ID NO:1所述的序列或其一部分。
在一个实施方案中，本文所述的嵌合多核苷酸可进一步包含至少一个人可变(V)基因、至少一个多样性(D)基因或其组合。在一个实施方案中，嵌合多核苷酸的恒定区基因选自由人恒定区基因和大鼠恒定区基因组成的组。在一个优选的实施方案中，恒定区基因是大鼠恒定区基因。在另一个优选的实施方案中，恒定区基因选自由Cμ和Cγ组成的组。
在一个实施方案中，嵌合多核苷酸包含与本文公开的细菌人工染色体(BAC)Annabel(例如，SEQ ID NO:10或其一部分)基本上同源的核酸序列，并且可任选地还包含可从BAC6-VH3-11和BAC3构建体和/或BAC9和BAC14/5构建体中分离的至少一个人可变Ig基因。在一个优选的实施方案中，本文涵盖的嵌合多核苷酸以5'至3'顺序包含核酸序列(a)和(b)：(a)人Ig可变区，其包含可从BAC6-VH3-11和BAC3构建体和/或BAC9和BAC14/5构建体中分离的呈天然构型的人V基因的；和(b)人Ig连接区，其包含可从BAC Annabel中分离的呈天然构型的人J基因。在另一实施方案中，如本文所公开的嵌合多核苷酸的人Ig可变区、人Ig多样性区、人Ig连接区、Ig恒定区和大鼠3'增强子区中的每一个均处于如图1a中所示的相对位置。在另一实施方案中，所公开的嵌合多核苷酸具有包含如SEQ ID NO:2所述的序列或其一部分或与所述序列或其一部分基本上同源的序列。在另一实施方案中，所公开的嵌合多核苷酸具有包含如SEQ ID NO:11所述的序列或其一部分或与所述序列或其一部分基本上同源的序列。在另一实施方案中，如本文所公开的嵌合多核苷酸包含重排的V-D-J区，其中所述重排的V-D-J区编码重链可变结构域外显子。
在一个实施方案中，转基因动物还包含嵌合多核苷酸，其中所述人Ig V区包含可从BAC9和/或BAC14/5中分离的至少一个人V区基因。在一个优选的实施方案中，嵌合多核苷酸以5'至3'顺序包含核酸序列(a)和(b)：(a)人Ig可变区，其包含来自BAC9和/或BAC14/5的以天然构型使用(或重排)的人V区基因；和(b)人Ig连接区，其包含来自细菌人工染色体(BAC)Annabel的以天然构型使用(或重排)的人J区基因。在另一实施方案中，人免疫球蛋白可变区(基因)、人免疫球蛋白多样性区(区段)、人免疫球蛋白连接区(区段)、免疫球蛋白恒定区基因和大鼠3'增强子中的每一个处于如图1b所示的位置。在另一实施方案中，所公开的嵌合多核苷酸具有包含如图6中所述的序列或与所述序列基本上同源的序列。在另一实施方案中，所公开的嵌合多核苷酸具有包含如图7中所述的序列或其一部分或与所述序列或其一部分基本上同源的序列。在另一实施方案中，如本文所公开的嵌合多核苷酸可包含重排的V-D-J，其中所述重排的基因区段来自上述SEQ ID NO和图。
本文还公开了编码人κ轻链基因的多核苷酸。在一个实施方案中，如本文所公开的多核苷酸具有包含选自由RP11-1156D9(如SEQ ID NO:3所述)和RP11-1134E24(如SEQ IDNO:4所述)组成的组的核酸序列或与所述核酸序列基本上同源的核酸序列。在另一实施方案中，所分离的多核苷酸以5'至3'顺序包含核酸序列(a)和(b)：(a)人Ig可变区，其包含可从细菌人工染色体(BAC)RP11-156D9和/或RP11-1134E24分离的呈天然构型的人V基因；(b)人Ig连接区，其包含可从细菌人工染色体(BAC)RP11-1134E24和/或RP11-344F17(如SEQ IDNO:5所述)分离的呈天然构型的人J基因。在一个优选的实施方案中，人Ig可变区、人Ig连接区和人Ig恒定区中的每一个处于如图2所示的相对位置。在另一实施方案中，所公开的嵌合多核苷酸具有包含如SEQ ID NO:6所述的序列或其一部分或与所述序列或其一部分基本上同源的序列。
本文还提供了一种啮齿类动物细胞，其包含一种或多种本发明多核苷酸。例如，本文提供了一种啮齿类动物细胞，其包含如本文所公开的多核苷酸，所述多核苷酸优选地包含编码嵌合重链的核酸序列(例如编码大鼠3'增强子序列的核酸序列)、Ig恒定区基因和至少一个人J区基因，并且任选地，包含与选自由RP11-1156D9、RP11-1134E24及其一部分组成的组的核酸序列基本上同源的核酸序列。本文所涵盖的啮齿类动物细胞可进一步包含编码功能性轻链的多核苷酸，所述多核苷酸例如具有包含选自由以下组成的组的核酸序列或与所述核酸序列基本上同源的核酸序列：如图2a中所示的序列(如SEQ ID NO:6所述)、如图2b中所示的序列(如SEQ ID NO:7所述)及其部分。在一个实施方案中，将一种或多种多核苷酸整合至啮齿类动物细胞基因组中。
在本发明的另一个方面，提供了一种转基因动物，其包含至少一个失活的内源性Ig基因座和多个人工转基因Ig重链基因座，所述多个人工转基因Ig重链基因座整合在动物基因组中不同的染色体位点。在一个实施方案中，具有多个人工Ig重链基因座的转基因动物包含(i)具有至少一个编码种系或超突变的人V区氨基酸序列的人V基因区段的V区；(ii)一个或多个J基因区段；及(iii)一个或多个恒定区基因区段，其中所述人工Ig重链基因座是功能性的并且能够发生基因重排并协同地起作用以产生人工免疫球蛋白库。在另一实施方案中，转基因动物包含人可变重链区的完整互补序列。在其它各个实施方案中，转基因动物i)具有包含重叠的重链基因区段的人工重链基因座、ii)缺乏功能性内源性Ig轻链基因座和/或iii)缺乏功能性内源性Ig重链基因座。在再一实施方案中，转基因动物表达多样化的抗体库，所述抗体由位于不同染色体位点的转基因免疫球蛋白基因座的V基因编码。
在一些实施方案中，转基因动物缺乏功能性Ig轻链基因座并且能够产生仅重链抗体(heavy chain-only antibody)。
在另一实施方案中，具有至少两个人工Ig重链基因座的转基因动物的至少一个人工Ig重链基因座包含至少一个人免疫球蛋白(Ig)连接(J)区基因、Ig恒定区基因和大鼠3'增强子。在这些转基因动物中，大鼠3'增强子可包含如SEQ ID NO:1所述的序列。在上述实施方案中描述的转基因动物可进一步包含至少一个人Ig可变(V)区基因和/或人Ig多样性(D)区基因。在本发明的其它实施方案中，恒定区基因选自由人恒定区基因和大鼠恒定区基因组成的组。在某些实施方案中，恒定区基因包含选自由Cμ和Cγ组成的组的恒定区基因。在各个实施方案中，转基因动物包含与细菌人工染色体(BAC)Annabel或其一部分基本上同源的核酸序列。
在某些实施方案中，转基因动物的人Ig V区包含可从BAC6-VH3-11和/或BAC3中分离的至少一个人V区基因。在一个特定实施方案中，转基因动物包含以5'至3'的顺序具有以下的核酸：(a)人Ig可变区，其包含可从BAC6-VH3-11和/或BAC3中分离的呈天然构型的人V区基因；和(b)人Ig连接区，其包含可从细菌人工染色体(BAC)Annabel中分离的呈天然构型的人J区基因。在一个实施方案中，人免疫球蛋白可变区、人免疫球蛋白多样性区、人免疫球蛋白连接区、免疫球蛋白恒定区和大鼠3'增强子中的每一个均处于图1a所示的相对位置。在另一实施方案中，转基因动物具有与如SEQ ID NO:2所述的核酸序列基本上同源的核酸序列。在再一实施方案中，转基因动物具有与如SEQ ID NO:11所述的核酸序列基本上同源的核酸序列。在一些实施方案中，转基因动物具有V-D-J区，所述V-D-J区经重排并形成编码重链可变结构域的完整外显子。
在某些其它实施方案中，转基因动物具有人Ig V区，所述Ig V区包含可从BAC9-VH3-53和/或BAC14/5中分离的至少一个人V区基因。在一个特定实施方案中，这些转基因动物包含以5'至3'的顺序具有以下的核酸：(a)人Ig可变区，其包含可从BAC9-VH3-53和/或BAC14/5中分离的呈天然构型的人V区基因；(b)人Ig连接区，其包含可从细菌人工染色体(BAC)Annabel中分离的呈天然构型的人J区基因。在一个实施方案中，人免疫球蛋白可变区、人免疫球蛋白多样性区、人免疫球蛋白连接区、免疫球蛋白恒定区和大鼠3'增强子中的每一个均处于图1b所示的相对位置。在另一实施方案中，转基因动物具有与图6中所述的核酸序列基本上同源的核酸序列。在再一实施方案中，转基因动物具有与图7中所述的核酸序列基本上同源的核酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种产生抗体的方法，所述方法包括用免疫原对如上所述的转基因动物实施免疫。在一个实施方案中，产生多克隆抗血清组合物，其中所述抗血清包含由位于不同染色体位点的转基因免疫球蛋白基因座编码的V基因编码的抗原特异性抗体。在另一实施方案中，产生单克隆抗体的方法包括(i)用免疫原对上述转基因动物实施免疫，(ii)从所述转基因动物中分离产生单克隆抗体的细胞，其中所述产生单克隆抗体的细胞产生特异性地结合至所述免疫原的单克隆抗体；和(iii)使用所述产生单克隆抗体的细胞产生所述特异性地结合至所述免疫原的单克隆抗体，或使用所述产生单克隆抗体的细胞产生产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞，并使用所述杂交瘤细胞产生所述单克隆抗体。
在另一实施方案中，产生单克隆抗体的方法包括(i)用免疫原对上述转基因动物实施免疫，(ii)从所述转基因动物中分离产生单克隆抗体的细胞，其中所述产生单克隆抗体的细胞产生特异性地结合至所述免疫原的单克隆抗体；(iii)从所述产生单克隆抗体的细胞中分离编码特异性地结合至所述免疫原的所述单克隆抗体的单克隆抗体核酸；和(iv)使用所述单克隆抗体核酸产生所述特异性地结合至所述免疫原的单克隆抗体。在某些实施方案中，单克隆抗体具有人独特型。
在再一实施方案中，产生完全人单克隆抗体的方法包括(i)用免疫原对上述转基因动物实施免疫，(ii)从所述转基因动物中分离产生单克隆抗体的细胞，其中所述产生单克隆抗体的细胞产生特异性地结合至所述免疫原的单克隆抗体；(iii)从所述产生单克隆抗体的细胞中分离编码特异性地结合至所述免疫原的所述单克隆抗体的单克隆抗体核酸；(iv)修饰所述单克隆抗体核酸以产生编码完全人单克隆抗体的重组核酸；和(v)使用所述编码完全人单克隆抗体的重组核酸产生编码的完全人单克隆抗体。
本发明的另一方面是通过上述方法产生的单克隆抗体。
在另一个方面，提供了一种用于中和人体组分中的抗原实体的方法，其包括使所述身体组分与如上所述的多克隆抗血清组合物接触，其中所述多克隆抗血清组合物包含特异性地结合并中和所述抗原性实体的免疫球蛋白分子。在一个实施方案中，用于中和人体组分中的抗原性实体的方法包括使身体组分与根据上述的单克隆抗体接触，其中所述单克隆抗体特异性地结合并中和所述抗原性实体。
附图简述
图1：整合的嵌合(人、大鼠)和完全人Ig基因座的概述。2个嵌合的人-大鼠IgH区(HC14和HC30)各自含有3个重叠的BAC，所述BAC具有≥22个不同且具有潜在功能的人VH区段。在HC14中，已用VH3-11对BAC6-3进行了扩展以提供与BAC3的10.6kb重叠，所述BAC6-3通过VH6-1与C区BAC Hu-大鼠Annabel(A)重叠11.3kb，并且在HC30中，BAC9提供与BAC14/5的4.6kb重叠，所述BAC9通过添加VH3-43、然后添加一部分BAC5并配备与Hu-大鼠Annabel(B)的6.1kb重叠来扩展。后者是嵌合的，并且前后含有所有人D和JH区段及具有完整增强子序列的大鼠C区。箭头指示HC14、HC30和HC14/HC30组合中的VH基因使用。条带越模糊指示VH基因的表达越不频繁。通过无偏RT-PCR和NGS获得序列。
图2：(A)具有12个Vk和所有Jk的人Igk BAC在Vk区中提供约14kb重叠并且在Ck中提供约40kb以包括KDE。(B)具有17个Vl和所有J-Cl、包括3'增强子的人Ig1区来自YAC(Vincent-Fabert，C.等，Blood 116，1895-1898(2010))。
图3：绘示了HC14基因座整合到染色体6中以及HC30基因座整合到染色体15中。
图4：通过ELISA对来自HC30和HC14/HC30动物的血清中的IgM和IgG浓度进行的分析。每个点(HC30)或正方形(HC14/HC30)代表一只动物的滴度(μg/ml)。进一步分析IgG的IgG1和IgG2b的含量。
图5：通过ELISA对来自HC30和HC14/HC30的抗β-gal特异性抗体进行的分析。每个点(HC30)或正方形(HC14/HC30)代表一只动物的血清滴度(在比较稀释中)。
图6：BAC 9序列。
图7：BAC 14/5序列。
实施方式
本文提供了编码重组或人工免疫球蛋白链或基因座的嵌合多核苷酸。如上所述，本文公开的嵌合多核苷酸可用于转化啮齿类动物以包括人Ig基因且可用于使用此类啮齿类动物产生具有人独特型的免疫球蛋白或抗体。如本文进一步提供的，产生包含至少三种不同的转基因构建体的转基因动物，所述转基因构建体具有串联整合至转基因动物基因组中的人免疫球蛋白VDJ重链基因区段的完整互补序列，从而确保种系构型中的全部人免疫球蛋白基因在内源性免疫球蛋白基因或基因座完全失活的背景下均可用。出乎意料的是，如本文第一次所证明的，包含不同V基因的多个转基因基因座可以在人源化和完全人转基因抗体的表达中协同地起作用。
定义
免疫球蛋白是指由实质上由免疫球蛋白基因编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。公认的人免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因以及无数的免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白“轻链”(约25Kd或214个氨基酸)通常在NH2末端包含由包含一个或多个可变区基因和一个或多个连接区基因的外显子编码的可变结构域(约110个氨基酸)，并且在COOH末端包含由κ或λ恒定区基因编码的恒定结构域。全长免疫球蛋白“重链”(约50Kd或446个氨基酸)类似地包含(1)可变结构域(约116个氨基酸)，其由包含一个或多个可变区基因、一个或多个多样性区基因和一个或多个连接区基因的外显子编码；和(2)上述恒定结构域之一，其包含一个或多个恒定区基因，例如α、γ、δ、ε或μ(编码约330个氨基酸)。免疫球蛋白重链恒定区基因编码抗体类别，即同种型(例如，IgM或IgG1)。
如本文所用，术语“抗体”是指包含至少一个、优选两个重(H)链可变结构域(本文中缩写为VH)和至少一个、优选两个轻(L)链可变结构域(本文中缩写为VL)的蛋白质。普通技术人员将会认识到免疫链的可变结构域编码在必须首先进行体细胞重组以形成编码可变结构域的完整外显子的基因区段中。有以下三种类型的区域或基因区段经历重排以形成可变结构域：包含可变基因的可变区、包含多样性基因的多样性区(在免疫球蛋白重链的情况下)，和包含连接基因的连接区。VH和VL结构域可进一步细分为高变区(称为“互补决定区”(“CDR”))，其间散布着更为保守的区域(称为“框架区”(“FR”))。已经精确定义了FR和CDR的程度(参见，Kabat等，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242；和Chothia等，(1987)J.Mol.Biol.196:901-17，其以引用方式并入本文)。各个VH和VL结构域通常由从氨基末端到羧基末端按下列顺序排列的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。如本文所用，抗体的抗原结合片段(或简称“抗体部分”或“片段”)是指全长抗体中保留特异性地结合至抗原(例如，CD3)的能力的一个或多个片段。
术语抗体的“抗原结合片段”所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，一种包含两个在铰链区通过二硫桥连接的Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，其由抗体的单一臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341:544-46)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是所述两个结构域可以使用重组方法通过合成接头连接起来，从而使得所述两个结构域能够作为单一蛋白质链来制备，其中VL区和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等，(1988)Science 242:423-26；和Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-83)。预期此类单链抗体也涵盖在抗体的术语“抗原结合片段”内。使用本领域的技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且针对效用以与完整抗体相同的方式对所述片段进行筛选。
抗体还可包括重链和/或轻链恒定结构域，从而分别形成重链和轻链免疫球蛋白链。在一个实施方案中，抗体是两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的四聚体，其中所述免疫球蛋白重链和轻链例如通过二硫键相互连接。重链恒定结构域包括三个基因区段，即CH1、CH2和CH3。轻链恒定结构域包括一个基因CL。重链和/或轻链的可变结构域含有与抗原发生相互作用的结合结构域。抗体的恒定结构域通常介导抗体与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
编码人工免疫球蛋白基因座或人工免疫球蛋白链的多核苷酸意指包含多个免疫球蛋白区域的重组多核苷酸，所述免疫球蛋白区域例如包含V基因的可变(V)区或基因区段、包含J基因的连接(J)基因区或基因区段、在重链基因座的情况下包含D基因的多样性(D)区或基因区段，和/或至少一个包含至少一个C基因的恒定(C)区。优选地，可变结构域的每个区域(例如V区、D区或J区)包含或跨越至少两个相同类型的基因。例如，如本文所用的可变区包含至少两个可变基因，连接区包含至少两个连接基因，多样性区包含两个多样性基因。恒定区可能仅包含一个恒定基因(例如κ基因或λ基因)或多个基因(例如CH1、CH2和CH3)。
如本文所用的“增强子序列”或“增强子”是指已经通过核酸酶消化和对降解的超敏性在许多活性基因附近鉴定出来的序列。超敏位点可以在启动子序列之前，并且它们的活性强度与DNA序列相关。如果存在增强子功能，则与报告基因的连锁显示转录升高(Mundt等，J.Immunol，166，3315[2001])。在IgH基因座中，已鉴定出两个重要的转录或表达调节因子，Eμ和位于基因座末端的3'E(Pettersson等，Nature，344，165[1990])。在小鼠中，整个3'调节区(含有hs3a、hs1,2、hs3b和hs4)的去除允许正常的早期B细胞发育，但废除了类别转换重组(Vincent-Fabert等，Blood，116，1895[2010])并且可能阻止体细胞超突变的优化(Pruzina等，Protein Engineering，Design and Selection，1，[2011])。当使用转基因人IgH基因时，实现最佳同种型表达的调节功能是特别理想的。具有不完全3'E区(通常仅提供hs1,2元件)的转基因构建体导致转基因小鼠中的表达水平令人失望，即便是在内源性IgH基因座被敲除时也是如此。因此，从过去20年中产生的构建体中仅分离出少数抗原特异性完全人IgG(Lonberg等.，Nature 368，856[1994]；Nicholson等.，J.Immunol.，163，6898[1999]；Davis等人，Cancer Metastasis Rev.18，421[1999]；Pruzina等，ProteinEngineering，Design and Selection，1，[2011])。在大鼠IgH基因座中，对3'E区的分析一直都很不充分。小鼠和大鼠序列的比较不允许鉴定hs4，该hs4是关键的第4元件，其在更远的下游具有其它重要的调控序列(Chatterjee等，J.Biol.Chem.，286，29303[2011])。本发明的多核苷酸有利地提供最佳表达，这至少部分地是由大鼠3'增强子的纳入所致，因为缺乏该3'增强子的嵌合多核苷酸导致同种型转换受损和IgG表达减少。在一个实施方案中，大鼠3'增强子具有包含如SEQ ID NO:1所述的序列或其一部分或与所述序列或其一部分基本上同源的序列。
如本文所用，具有包含第二序列(例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2等)的一部分(例如，少于全部)或与所述部分基本上同源的序列的多核苷酸优选保留第二序列的生物活性(例如，保留3'增强子的生物活性以提供免疫球蛋白的最佳表达和/或同种型转换，能够发生重排以提供人源化嵌合重链等)。在一个实施方案中，包括包含SEQ ID NO:1的一部分或与所述部分基本上同源的序列的核酸包含与SEQ ID No:1基本上同源的连续核酸的至少8kB、优选至少10kB。在另一实施方案中，包括包含SEQ ID NO:59或60的一部分或与所述部分基本上同源的序列的第二核酸包含与SEQ ID No:59或60基本上同源的连续核酸的至少8kB、优选至少10kB。
如本文所用的“人工Ig基因座”可以指(例如，包含V区、D区和/或J区(在重链的情况下)或包含V区和/或J区(在轻链的情况下)以及任选的恒定区(在重链和轻链中的任一条或两条的情况下)的序列)未重排、部分地重排或重排的多核苷酸。人工Ig基因座包括人工Ig轻链基因座和人工Ig重链基因座。在一个实施方案中，本发明的人工免疫球蛋白基因座是功能性的并且能够发生重排并且产生免疫球蛋白链的库。在一个优选的实施方案中，本文公开的多核苷酸的可变结构域或其一部分包含呈天然构型的基因，即人Ig基因区段的天然存在序列、人Ig基因区段的天然存在序列的简并形式，以及编码与由人Ig基因区段的天然存在的序列编码的多肽基本一致的多肽序列的合成序列。在另一优选的实施方案中，多核苷酸包含在人类中发现的呈天然构型的可变结构域或其一部分。例如，如本文所公开的编码人工Ig重链的多核苷酸可以在天然构型中包含至少两个人V基因、至少两个D基因、至少两个J基因或其组合。
在一个优选的实施方案中，人工Ig基因座包含非人C区基因，并且能够产生包括具有非人C区的嵌合免疫球蛋白在内的免疫球蛋白库。在一个实施方案中，人工Ig基因座包含人C区基因，并且能够产生包括具有人C区的免疫球蛋白在内的免疫球蛋白库。在一个实施方案中，人工Ig基因座包含“人工恒定区基因”，这意味着恒定区基因包含来自人和非人恒定区基因的核苷酸序列。例如，示例性人工C恒定区基因是编码人IgG CH1结构域和大鼠IgGCH2和CH3结构域的恒定区基因。
在一些实施方案中，人工Ig重链基因座缺乏CH1或允许所得免疫球蛋白避开典型免疫球蛋白:伴护蛋白缔合的等效序列。此类人工基因座使得缺乏功能性Ig轻链基因座且因此不表达功能性Ig轻链的转基因动物中产生仅重链抗体。在本文所设想的方法中使用此类人工Ig重链基因座，以产生缺乏功能性Ig轻链基因座且包含人工Ig重链基因座的转基因动物，所述动物能够产生仅重链抗体。或者，可以原位操纵人工Ig基因座来破坏CH1或等效区域，并产生提供仅重链抗体产生的人工Ig重链基因座。关于轻链缺陷型小鼠中仅重链抗体的产生，参见例如Zou等，JEM，204:3271-3283，2007。
“人独特型”意指存在于由免疫球蛋白V基因区段编码的人抗体上的多肽序列。如本文所用术语“人独特型”既包括人抗体的天然存在序列，也包括与天然存在的人抗体中发现的多肽基本上一致的合成序列。“基本上”意指氨基酸序列一致性的程度为至少约85％-95％。优选地，氨基酸序列一致性的程度大于90％、更优选大于95％。
“嵌合抗体”或“嵌合免疫球蛋白”意指包含人免疫球蛋白多肽序列(或由人Ig基因区段编码的多肽序列)的一部分和非人免疫球蛋白多肽序列的一部分的免疫球蛋白分子。本发明的嵌合免疫球蛋白分子是具有非人Fc区或人工Fc区和人独特型的免疫球蛋白。此类免疫球蛋白可以从已被工程改造以产生嵌合免疫球蛋白分子的本发明动物中分离。
“人工Fc区”意指由人工恒定区基因编码的Fc区。
如本文所用术语“Ig基因区段”是指编码Ig分子各个部分的DNA区域，其存在于非人动物和人的种系中，并其在B细胞中聚集在一起以形成重排的Ig基因。因此，如本文所用的Ig基因区段包括V基因区段、D基因区段、J基因区段和C基因区段。
如本文用术语“人Ig基因区段”包括人Ig基因区段的天然存在序列、人Ig基因区段的天然存在序列的简并形式，以及编码与由人Ig基因区段的天然存在序列编码的多肽基本上一致的多肽序列的合成序列。“基本上”意指氨基酸序列一致性的程度为至少约85％-95％。优选地，氨基酸序列一致性的程度大于90％、更优选大于95％
与本发明相关的多核苷酸可以包含DNA或RNA，并且可以全部或部分地合成。除非上下文另有要求，否则对如本文所述核苷酸序列的提及涵盖具有指定序列的DNA分子，并且涵盖具有指定序列的RNA分子(其中用U取代T)。
两条序列之间“同源性”或“序列一致性”(所述术语在本文中可互换使用)的计算如下进行。为了最佳的比较目的对所述序列进行比对(例如，为了最佳的比对，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一条或两条中引入空位，并且为了比较目的可以忽略非同源序列)。在一个优选的实施方案中，为比较目的比对的参考序列的长度是参考序列长度的至少30％、优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少60％，并且甚至更优选至少70％、80％、90％、100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的一个位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么该位置处的分子是一致的(如本文所用，氨基酸或核酸“一致性”等效于氨基酸或核酸“同源性”)。两条序列之间的一致性百分比随所述序列共享的一致位置的数量而变化，考虑了两条序列的最佳比对需要引入的空位的数量和每一空位的长度。
两条序列之间序列的比较和序列一致性百分比的确定可以使用数学算法来完成。在一个优选的实施方案中，两条氨基酸序列之间的一致性百分比是使用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-53)算法确定的，该算法已被并入GCG软件包的GAP程序(可在gcg.com在线获得)中，该GAP程序使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和16、14、12、10、8、6或4的空位权重或1、2、3、4、5或6的长度权重。在再一优选的实施方案中，两条核苷酸序列之间的一致性百分比是使用GCG软件包中的GAP程序(可在www.gcg.com获得)来确定的，该GAP程序使用NWSgapdna.CMP矩阵及40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。特别优选的参数集(以及如果实践者不确定应该应用什么参数来确定分子是否在本发明的序列一致性或同源性限制内时应该使用的参数集)是空位罚分为12、空位延伸罚分为4并且移码空位罚分为5的Blossum 62评分矩阵。两条氨基酸或核苷酸序列之间的一致性百分比也可以使用Meyers和Miller的算法((1989)CABIOS 4:11-17)来确定，该算法已经并入ALIGN程序(2.0版)，该ALIGN程序使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分。
人工Ig基因座
本发明还涉及Ig基因座及其在制备能够产生具有人独特型的免疫球蛋白的转基因动物中的用途。每个人工Ig基因座包含多个免疫球蛋白基因区段，所述多个免疫球蛋白基因区段包括至少一个V区基因区段、一个或多个J基因区段、一个或多个D基因区段(在重链基因座的情况下)以及一个或多个恒定区基因。在本发明中，至少一个V基因区段编码种系或超突变的人V区氨基酸序列。因此，此类转基因动物能够产生多样化的免疫球蛋白分子库，所述免疫球蛋白分子包括具有人独特型的抗体。在重链基因座中，人或非人来源的D基因区段可以包含在人工Ig基因座中。此类基因座中的基因区段彼此以未重排构型(或“种系构型”)或部分或完全重排的构型并置。人工Ig基因座能够在受试动物中发生基因重排(如果基因区段没有完全重排)，从而产生具有人独特型的多样化的免疫球蛋白库。
调控元件(如启动子、增强子、转换区、重组信号等)可以是人来源或非人来源的。需要的是所述元件在相关动物物种中是可操作的，以便使得人工基因座具有功能。本文更详细地描述了优选的调控元件。
在一个方面，本发明提供了转基因构建体，其含有能够在宿主动物中发生基因重排的人工重链基因座，从而产生具有人独特型的多样化的重链库。转基因的人工重链基因座含有具有至少一个人V基因区段的V区。优选地，V区包括至少约5-100个人重链V(或“VH”)基因区段。在优选的实施方案中，V区包括大于20、大于25、大于30、大于35或大于40个VH基因区段。如上所述，人VH区段涵盖人VH基因区段的天然存在序列、人VH基因区段的天然存在序列的简并形式，以及编码与人重链V结构域多肽基本上(即，至少约85％-95％)一致的多肽序列的合成序列。
在一个优选的实施方案中，人工重链基因座含有至少一个或几个大鼠恒定区基因，例如Cδ、Cμ和Cγ(包括Cγ子类中的任一者)。
在另一优选的实施方案中，人工重链基因座含有人工恒定区基因。在一个优选实施方案中，此类人工恒定区基因编码人CH1结构域和大鼠CH2 CH3结构域，或人CH1和大鼠CH2、CH3和CH4结构域。具有人CH1结构域的杂交重链有效地与全人轻链配对。
在一个优选的实施方案中，人工Ig基因座包含3’增强子序列，包括hs1,2、hs3a、hs3b和大鼠Calpha与3’hs3b之间的序列。
在另一优选的实施方案中，人工重链基因座含有缺少CH1结构域的人工恒定区基因。在一个优选的实施方案中，此类人工恒定区基因编码缺少CH1结构域但包含CH2和CH3或CH1、CH2、CH3和CH4结构域的被截短的IgM和/或IgG。缺乏CH1结构域的重链不能与Ig轻链有效配对且形成仅重链抗体。
在另一方面，本发明提供了转基因构建体，其含有能够在宿主动物中发生基因重排的人工轻链基因座，从而产生具有人独特型的多样化的轻链库。转基因的人工轻链基因座含有具有至少一个人V基因区段的V区，例如具有至少一个人VL基因和/或至少一个重排的人VJ区段的V区。优选地，V区包括至少约5-100个人轻链V(或“VL”)基因区段。一致地，人VL区段涵盖人VL基因区段的天然存在序列、人VL基因区段的天然存在序列的简并形式，以及编码与人轻链V结构域多肽基本上(即，至少约85％-95％)一致的多肽序列的合成序列。在一个实施方案中，人工轻链Ig基因座包含具有至少一个大鼠C基因(例如，大鼠Cλ或Cκ)的C区。
本发明的另一方面涉及制备含有人工Ig基因座的转基因载体的方法。此类方法涉及分离Ig基因座或其片段，以及将所述Ig基因座或其片段与一个或几个包含编码人V区元件的序列的DNA片段组合。通过连接或同源重组将Ig基因区段插入人工Ig基因座或其一部分中，以便保持基因座在受试动物中发生有效基因重排的能力。
优选地，通过筛选质粒、粘粒、YAC或BAC等的文库来分离非人Ig基因座，所述文库由所述质粒、粘粒、YAC或BAC等的基因组DNA制备。YAC克隆可以携带高达2兆碱基的DNA片段，因此可以在一个YAC克隆中分离出整个动物重链基因座或其一大部分，或者将其重构为包含在一个YAC克隆中。BAC克隆能够携带较小大小(约50-500kb)的DNA片段。然而，可以分开改变含有Ig基因座重叠片段的多个BAC克隆，随后将其一起注射至动物受体细胞中，其中重叠片段在受体动物细胞中重组以产生连续的Ig因座。
可以通过多种方法将人Ig基因区段整合至载体(例如，BAC克隆)上的Ig基因座中，所述方法包括连接DNA片段，或通过同源重组插入DNA片段。人Ig基因区段的整合方式使得人Ig基因区段可操作地连接至转基因中的宿主动物序列，以产生功能性的人源化Ig基因座，即能够发生基因重排从而导致产生具有人独特型的多样化的抗体库的Ig基因座。同源重组可以在细菌、酵母和其它具有高频率同源重组事件的细胞中进行。工程改造后的YAC和BAC可以很容易地从细胞中分离出来，并用于制备转基因动物
包含人工Ig基因座并且能够产生具有人独特型的抗体的转基因动物
在一个方面，本发明提供了能够产生具有人独特型的免疫球蛋白的转基因动物，及所述转基因动物的制备方法。所用的转基因动物选自啮齿类动物(例如，大鼠、仓鼠、小鼠和天竺鼠)。
用于本发明中的人源化抗体产生的转基因动物在内源性Ig基因座中携带种系突变。在一个优选的实施方案中，转基因动物就突变的内源性Ig重链和/或内源性Ig轻链基因而言是纯合的。此外，这些动物携带至少两个人工重链loc Ig基因座，所述两个人工重链loc Ig基因座是功能性的，并且能够在转基因动物中产生免疫球蛋白分子库。本发明中使用的人工Ig基因座包括至少一个人V基因区段。
在一个优选的实施方案中，转基因动物携带至少两个Ig重链基因座和至少一个Ig轻链基因座，所述基因座各自具有功能性并且能够在转基因动物中产生免疫球蛋白分子库，该免疫球蛋白分子库包括具有人独特型的抗体。在一个实施方案中，使用包括至少一个非人C基因的人工基因座，并且提供能够产生具有人独特型和非人恒定区的嵌合抗体的动物。在一个实施方案中，使用包括至少一个人C基因的人工基因座，并且提供能够产生具有人独特型和人恒定区的抗体的动物。
在另一优选的实施方案中，转基因动物携带至少两个人工Ig重链基因座，并且缺乏功能性Ig轻链基因座。此类动物可用于产生仅重链抗体。
此类转基因动物的产生涉及将至少两个人工重链Ig基因座和一个或多个人工轻链Ig基因座整合至转基因动物的具有至少一个内源性Ig基因座的基因组中，所述内源性Ig基因座已经或将要因一种或多种大范围核酸酶的作用而失活。优选地，转基因动物就内源性Ig重链和/或内源性Ig轻链而言是基因位点缺合的，因此不能产生内源性免疫球蛋白。不管染色体的位置如何，本发明的人工Ig基因座都能发生基因重排，从而产生多样化的免疫球蛋白分子库。能发生基因重排的Ig基因座在本文中也被称为“功能性”Ig基因座，并且由功能性Ig基因座产生的具有多样性的抗体在本文中也被称为“功能性”抗体或“功能性”抗体库。
用于产生此类转基因动物的人工基因座各自包括多个免疫球蛋白基因区段，其包括至少一个V区基因区段、一个或多个J基因区段、一个或多个D基因区段(在重链基因座的情况下)以及一个或多个恒定区基因。在本发明中，至少一个V基因区段编码种系或超突变的人V区氨基酸序列。因此，此类转基因动物能够产生多样化的免疫球蛋白分子库，所述免疫球蛋白分子包括具有人独特型的抗体。
在一个实施方案中，所用的人工基因座包含至少一个非人C区基因区段。因此，此类转基因动物能够产生多样化的免疫球蛋白分子库，所述免疫球蛋白分子包括具有人独特型的嵌合抗体。
在一个实施方案中，所用的人工基因座包含至少一个人C区基因区段。因此，此类转基因动物能够产生多样化的免疫球蛋白分子库，所述免疫球蛋白分子包括具有人独特型和人恒定区的抗体。
在一个实施方案中，所用的人工基因座包含至少一个人工恒定区基因。例如，示例性人工C恒定区基因是编码人IgG CH1结构域和大鼠IgG CH2和CH3结构域的恒定区基因。因此，此类转基因动物能够产生多样化的免疫球蛋白分子库，所述免疫球蛋白分子包括具有人独特型和包含人和非人组分的人工恒定区的抗体。
将含有人工Ig基因座的转基因载体引入一个或多个受体细胞中，然后通过随机整合或靶向整合整合至所述一个或多个受体细胞的基因组中。
对于随机整合，可以通过标准转基因技术将含有人工Ig基因座的转基因载体引入受体细胞中。例如，可以将转基因载体直接注射至受精卵母细胞的原核中。也可以通过在卵母细胞受精前将精子与转基因载体共孵育来引入转基因载体。转基因动物可以由受精的卵母细胞发育而来。引入转基因载体的另一方法是转染胚胎干细胞或其它多能细胞(例如原始生殖细胞)，随后将遗传修饰的细胞注射至发育中的胚胎中。或者，转基因载体(裸载体或与促进试剂结合)可以直接注射到发育中的胚胎中。最后，嵌合转基因动物由胚胎产生，所述胚胎含有整合在转基因动物的至少一些体细胞的基因组中的人工Ig转基因。在另一实施方案中，将转基因载体引入细胞基因组中，通过核移植克隆从转染的细胞中获得动物。
在一个优选的实施方案中，将含有人工Ig基因座的转基因随机整合至受体细胞(例如受精的卵母细胞或发育中的胚胎)的基因组中。在一个优选的实施方案中，获得了就内源性Ig重链和/或Ig轻链而言基因位点缺合并且因此不能产生内源性免疫球蛋白并且能够产生转基因免疫球蛋白的后代。
对于靶向整合，可以将转基因载体引入合适的受体细胞(诸如胚胎干细胞、其它多能细胞或已经分化的体细胞)中。然后，可以通过标准方法选出转基因已经整合至动物基因组中的细胞。然后，可使选出的细胞与去核的核移植单位细胞融合，所述去核的核移植单位细胞例如卵母细胞或胚胎干细胞，其是全能的并且能够形成功能性的新生儿。融合是根据公认的传统技术进行的。参见例如，Cibelli等，Science(1998)280:1256；Zhou等，Science(2003)301:1179。卵母细胞去核和核移植也可以通过显微手术使用显微注射针进行。(参见例如，Wakayama等，Nature(1998)394：369)。然后将所得细胞在合适的培养基中培养，并将其转移至同期处理的受体中用于产生转基因动物。或者，可以将选出的遗传修饰细胞注射至发育中的胚胎中，随后使所述胚胎发育成嵌合动物。
在一个实施方案中，使用大范围核酸酶通过双链DNA裂解来增加靶位点同源重组的频率。为了整合至特定位点中，可以使用位点特异性大范围核酸酶。在一个实施方案中，使用靶向内源性Ig基因座的大范围核酸酶来增加同源重组的频率，并用人工Ig基因座或其部分替换内源性Ig基因座或其部分。在一个实施方案中，转基因动物缺乏功能性的Ig轻链基因座，并且包含人工Ig重链基因座。
使用YAC和BAC并在二者之间相互交换来整合人Ig基因区段的优选实施方案，在通过重叠同源性来制备大区域的构建体时，具有速度和能检查完整性两方面的优点。具有重叠区域的构建体的串联整合具有整合(例如维持全部功能)的能力，这对于DNA重排是至关重要的。本发明的优选实施方案不仅通过同源性具有所需的整合，而且产生串联整合作为常见事件。这大大简化了转基因技术，因为不必费力地将大YAC整合至干细胞中并随后从所述干细胞中衍生动物。此外，也是通过DNA注射进行的ZFN技术(Geurts等，Science 325，433(2009)；Menoret等，European journal of immunology 40，2932-2941(2010))，易于产生Ig KO品系，并且很可能成为未来基因破坏和替换的首选技术。OmniRatsTM(含有人-大鼠IgH和人IgL基因座)中沉默的内源性Ig基因表达的优势在于干扰性或不需要的大鼠Ig均不会产生混合产物。
在小鼠中，Cα下游的增强子区域在类别转换重组中起到至关重要的作用_(Vincent-Fabert等，Blood 116，1895-1898(2010))，并且该区域中的元件可能会促进超突变(Pruzina等，Protein engineering，design&selection:PEDS 24，791-799(2011))。这可能是为什么在即使携带大的全人基因座的小鼠中也会难以出现免疫应答和高频率产生多样化杂交瘤的原因(Davis等，Cancer metastasis reviews 18，421-425(1999)；LonbergCurrent opinion in immunology 20，450-459(2008))。由于在OmniRats中，嵌合的人-大鼠IgH基因座有利于接近wt的分化和表达水平，因此可以得出如下结论：内源性大鼠C区并且实际上是Cα3’约30kb的增强子序列提供了对表达人VH基因并使其成熟的最佳基因座控制。已经从嵌合的C区BAC中去除了具有3’控制基序簇的另一区域Cδ(Mundt等，J Immunol166，3315-3323(2001))，因为IgD的沉默或缺乏显示并不会减少免疫功能(Chen ImmunolRev 237，160-179(2010))。正常情况下，成熟的IgM+IgD+B细胞在抗原接触时下调IgD，从而启动类别转换重组(Id)。因此，在没有IgD控制的情况下，转换可能会增加，我们的如下发现支持了这一点：当Cδ区保留在转基因构建体中时，IgG转录物和血清水平显著降低(数据未显示)。
OmniRatsTM中特异性IgG的产生特别令人鼓舞，因为我们发现在各种免疫中，与wt对照中产生的相当，序列和表位多样化的mAb可以通过脾和淋巴结融合分离出来。V基因、D和J的多样性与预期的一样，并且发现几乎所有的区段都如预测的那样得到了有效利用(Lefranc&Lefranc The immunoglobulin factsbook.FactsBook Series，AcademicPress，GB，45-68(2001))。这与携带全人转基因座的小鼠形成了鲜明对比，在所述小鼠中，少数前体B细胞的克隆扩增产生的多样性极少(Pruzina等，Protein engineering，design&selection:PEDS 24，791-799(2011))。由于移植的V基因的数量仅为人类所用数量的一半，因此我们预料在将OmniRats与wt动物进行比较时会发现免疫应答有限且多样性有限。然而，情况并非如此，并且对1000多个克隆(可以提供序列)中CDR3多样性的比较揭示，OmniRats与wt动物中的连接差异同样广泛。少数一致的基因区段组合通过VH-D和/或D-JH连接处的N序列增加或缺失以及通过超突变而得到进一步多样化。因此，很明显，大鼠C区序列在控制人VHDJH的DNA重排和表达方面是高效的。在所引入的人Igκ和Igλ基因座中也观察到了广泛的多样性，这与先前在小鼠中显示的情况类似(Nicholson等，J Immunol 163，6898-6906(1999)；Pruzina等，Protein engineering，design&selection:PEDS 24，791-799(2011)；Popov等，The Journal of experimental medicine 189，1611-1620(1999))。因此，OmniRatsTM已经克服了在小鼠中产生人抗体效率会大大降低的问题(Lonberg，N.Naturebiotechnology 23，1117-1125(2005))，所述OmniRatsTM通过类别转换和超突变可靠且广泛地使重排的H链多样化，从而大量而不是偶尔地产生高亲和力抗体。转基因IgG的产量和超突变水平，令人印象深刻地用于抗原特异性mAb，表明OmniRatsTM与wt动物之间的克隆多样化和产生水平类似。通过不同的单一免疫甚至实现了亚纳摩尔范围内高亲和力特异性的常规产生，而且与wt动物相比是有利的；由全人基因座产生人抗体库的转基因小鼠方面的结果尚未显示(Mendez等，Nature genetics 15，146-156(1997))。
总之，为了最大限度地提高人抗体的产生，使用人基因用于抗体特异性但使用啮齿类动物基因用于控制分化和高表达的IgH基因座应被视为是必要的。L链的灵活性是一个额外的好处，因为它即便是在wt Ig存在时也会允许高效的人IgH/IgL组装。对于治疗应用，通过C基因替换可以将嵌合的H链容易地转变为全人Ab，而不损害特异性。
具有人独特型的免疫球蛋白
一旦制备出能够产生具有人独特型的免疫球蛋白的转基因动物，就可以通过用抗原对该动物实施免疫而容易地获得针对该抗原的免疫球蛋白和抗体制剂。如本文所用“多克隆抗血清组合物”包括亲和纯化的多克隆抗体制剂。
多种抗原均可用于对转基因动物实施免疫。此类抗原包括但不限于微生物(例如活的、减毒的或死亡的病毒和单细胞生物体(诸如细菌和真菌))、微生物的片段或从微生物中分离的抗原性分子。
用于对动物实施免疫的优选细菌抗原包括来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的纯化抗原(诸如5型和8型荚膜多糖)、毒力因子的重组型式(诸如α-毒素)、粘附素结合蛋白、胶原结合蛋白和纤连蛋白结合蛋白。优选的细菌抗原还包括金黄色葡萄球菌(S.aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、肠球菌(enterococcus)、肠杆菌(enterobacter)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的减毒型式，或来自这些细菌细胞的培养上清液。可用于免疫的其它细菌抗原包括纯化的脂多糖(LPS)、荚膜抗原、荚膜多糖，和/或外膜蛋白、纤连蛋白结合蛋白、内毒素和来自铜绿假单胞菌、肠球菌、肠杆菌和肺炎克雷伯菌的外毒素的重组型式。
用于产生抗真菌抗体的优选抗原包括真菌或其外膜蛋白的减毒型式，所述真菌包括但不限于白色念珠菌(Candida albicans)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、热带念珠菌(Candida tropicalis)和新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)。
用于免疫以便产生抗病毒抗体的优选抗原包括包膜蛋白和病毒的减毒型式，所述病毒包括但不限于呼吸道合胞病毒(RSV)(特别是F蛋白)、C型肝炎病毒(HCV)、B型肝炎病毒(HBV)、巨细胞病毒(CMV)、EBV和HSV。
癌症特异性抗体可以通过用分离的肿瘤细胞或肿瘤细胞系以及肿瘤相关抗原对转基因动物实施免疫来产生，所述肿瘤相关抗原包括但不限于Her-2-neu抗原(针对所述抗原的抗体可用于治疗乳腺癌)；CD20、CD22和CD53抗原(针对所述抗原的抗体可用于治疗B细胞淋巴瘤)、前列腺特异性膜抗原(PMSA)(针对所述抗原的抗体可用于治疗前列腺癌)和17-1A分子(针对所述分子的抗体可用于治疗结肠癌)。
抗原在含或不含佐剂的情况下可以以任何方便的方式施用给转基因动物，并且可以按照预定的时间表施用。
为了制备单克隆抗体，从免疫后的转基因动物中分离脾细胞，并以与转化的细胞系一起形成的细胞融合物的形式使用以产生杂交瘤，或者通过标准分子生物学技术克隆编码抗体的cDNA，并使其在转染的细胞中表达。本领域中已经充分确立了制备单克隆抗体的程序。参见例如欧洲专利申请0 583 980 A1(“Method For Generating MonoclonalAntibodies From Rabbits”)、美国专利号4,977,081(“Stable Rabbit-Mouse HybridomasAnd Secretion Products Thereof”)、WO 97/16537(“Stable Chicken B-cell Line AndMethod of Use Thereof”)和EP 0 491 057 B1(“Hybridoma Which Produces AvianSpecific Immunoglobulin G”)，所述专利的公开内容以引用方式并入本文。Andris-Widhopf等的J Immunol Methods 242:159(2000)和Burton Immunotechnology 1:87(1995)已经描述了从克隆的cDNA分子体外产生单克隆抗体的方法。
一旦产生了具有人独特型的嵌合单克隆抗体，此类嵌合抗体就可以使用标准分子生物学技术容易地转变为全人抗体。全人单克隆抗体在人类中没有免疫原性，适合用于人类受试者的治疗性治疗。
本发明的抗体包括仅重链抗体
在一个实施方案中，用抗原对缺乏功能性Ig轻链基因座并且包含至少两个人工重链基因座的转基因动物实施免疫，以产生特异性地结合至抗原的仅重链抗体。
在一个实施方案中，本发明提供了来自此类动物的产生单克隆抗体的细胞，以及来自所述细胞的核酸。还提供了来自所述细胞的杂交瘤。还提供了全人仅重链抗体以及来自所述全人重链抗体的编码核酸。
关于仅重链抗体的教导在本领域中已有发现。例如，参见PCT公布WO02085944、WO02085945、WO2006008548和WO2007096779。也参见US 5,840,526、US 5,874,541、US 6,005,079、US 6,765,087、US 5,800,988、EP 1589107、WO 9734103和US 6,015,695。
药物组合物
在本发明的另一实施方案中，将纯化的单克隆或多克隆抗体与适于患者施用的合适药物载体混合，以提供药物组合物。
用本发明药物组合物治疗的患者优选为哺乳动物，更优选为人，但兽医用途也涵盖在内。
可用于本发明药物组合物中的药学上可接受的载体可以是任一和所有的溶剂、分散介质、等渗剂等。除非任一常规介质、试剂、稀释剂或载体对接受者或所述任一常规介质、试剂、稀释剂或载体中所含抗体的治疗效果有害，否则其在本发明药物组合物中的使用是合适的。
载体可以是液体、半固体(例如膏糊)或固体载体。载体的实例包括油、水、生理盐水溶液、醇、糖、凝胶、脂质、脂质体、树脂、多孔基质、粘合剂、填充剂、包衣、防腐剂等，或其组合。
治疗方法
在本发明的另一方面，提供了治疗脊椎动物、优选哺乳动物、优选灵长类动物的疾病的方法，其中人受试者是特别优选的实施方案，所述方法是通过施用于治疗此类疾病理想的纯化的本发明抗体组合物进行的。
抗体组合物可用于结合并中和或调节人体组织中导致或促成疾病或引发不需要的或异常的免疫应答的抗原性实体。“抗原性实体”在本文中被定义为涵盖任何可溶性或细胞表面结合的分子(包括蛋白质)，以及至少能够结合至抗体并且优选地还能够刺激免疫应答的细胞或导致传染性疾病的生物体或试剂。
作为单一疗法或与化疗组合施用抗传染剂的抗体组合物可消除传染性粒子。单一施用抗体通常会将传染性粒子的数量减少10至100倍，更常见的是减少1000倍以上。类似地，在患有恶性疾病的患者中作为单一疗法或与化疗组合采用的抗体疗法通常可将恶性细胞的数量减少10至100倍，或超过1000倍。疗法可以长时间重复进行，以确保完全消除传染性粒子、恶性细胞等。在一些情况下，在不存在可检测量的传染性粒子或不良细胞的情况下，用抗体制剂的疗法将持续延长的时间。
类似地，使用抗体疗法调节免疫应答可由单次或多次施用治疗性抗体组成。在不存在任何疾病症状的情况下，疗法可以持续延长的时间。
受试者治疗可以足以抑制传染病或恶性病的剂量与化疗联用。在自身免疫性疾病患者或移植接受者中，抗体疗法可以足以抑制免疫应答的剂量与免疫抑制疗法联用。
实施例
在就人免疫球蛋白(Ig)基因座而言为转基因的小鼠中，全人抗体递送的次优功效归因于人膜IgH链恒定区与小鼠细胞信号传导机制之间的不完全相互作用。为了避免这个问题，我们在此描述了一种人源化大鼠品系(OmniRatTM)，其携带嵌合的人/大鼠IgH基因座[包含22个人VH、所有的人D和JH区段，具有种系基因间隔但连接至大鼠CH基因座]以及全人轻链基因座[12个连接至Jκ-Cκ的Vκ和16个连接至Jλ-Cλ的Vλ]。用设计的锌指核酸酶使内源性大鼠Ig基因座沉默。实施免疫后，OmniRats在产生高亲和力血清IgG方面表现得与正常大鼠一样高效。易于获得包含具有亚纳摩尔抗原亲和力的全人可变区并且携带广泛的体细胞突变的单克隆抗体，与来自正常大鼠的常规抗体产量相似。
材料和方法
在YAC和BAC上构建修饰的人Ig基因座
a)IgH基因座
人IgH V基因由以下2个BAC覆盖：含有从VH4-39跨越到VH3-23、随后VH3-11的真实区域的BAC6-VH3-11(自市售的BAC克隆3054M17 CITB进行修饰)以及含有从VH3-11跨越到VH6-1的真实区域的BAC3(811L16 RPCI-11)。被称为Annabel的BAC是通过将大鼠CH区基因连接至紧邻人VH6-1-D-JH区的下游构建的(图1)。含有人或大鼠IgH基因座的一部分的所有BAC克隆均购自Invitrogen。
BAC6-VH3-11与Annabel最初是在酿酒酵母(S.cerevisiae)中构建为环状YAC(cYAC)，并进行进一步检查并作为BAC在大肠杆菌(E.coli)中维持。
与YAC不同，BAC质粒制备物产生大量所需的DNA。为了将线性的YAC转变成cYAC或者为了将具有重叠端的DNA片段在酿酒酵母中组装成单一cYAC(其还可以作为BAC在大肠杆菌中维持)，构建了两个自我复制的酿酒酵母/大肠杆菌穿梭载体pBelo-CEN-URA和pBelo-CEN-HYG。简言之，将酿酒酵母CEN4作为AvrII片段从pYAC-RC中切出(Marchuk和Collins，Nucleic acids research 16，7743(1988))，并将其连接至SpeI线性化的pAP599(Kaur和Cormack，PNAS 104，7628-7633(2007))。所得质粒含有克隆在酿酒酵母URA3与潮霉素抗性表达盒(hygromycin-resistance expression cassette，HygR)之间的CEN4。从该质粒，将含有URA3随后CEN4的ApaLI-BamHI片段或者含有CEN4随后HygR的PmlI-SphI片段切出，并连接至ApaLI和BamHI或者HpaI和SphI双重消化的pBACBelo11(New England Biolabs)从而得到pBelo-CEN-URA和pBelo-CEN-HYG。
为了构建BAC6-VH3-11，首先将两个片段115kb NotI-PmeI和110kb RsrII-SgrAI从BAC克隆3054M17 CITB中切出。前一片段的3’端与后一片段的5’端重叠22kb。将NotI-PmeI片段连接至含有来自pYAC-RC的酿酒酵母CEN4以及TRP1/ARS1的NotI-BamHI YAC臂，并将RsrII-SgrAI片段连接至含有也来自pYAC-RC的酿酒酵母URA3的SgrAI-BamHI YAC臂。随后，通过原生质球转化，将连接混合物转化至酿酒酵母AB1380细胞中41，并且选择URA+TRP+酵母克隆。通过Southern印迹分析对含有从人VH4-39至VH3-23的线性区的被称为YAC6的克隆进行了确认。通过在VH3-23的3’添加10.6kb片段并转变为cYAC，将YAC6进一步延伸。该10.6kb延伸含有人VH3-11并且也出现在BAC3的5’端。为了YAC6的修饰，我们构建了pBeloHYG-YAC6+BAC3(5’)。简言之，通过PCR制备具有重叠端的3个片段：1)‘填充(stuff)’片段，其含有由HpaI位点侧接的酿酒酵母TRP1-ARS1，其中在YAC6中5’尾匹配VH4-39的上游序列并且3’尾匹配VH3-23的下游(使用长寡核苷酸561和562以及pYAC-RC作为模板)，2)10.6kb延伸片段，其具有如上所述的匹配VH3-23的下游序列的5’尾和处于它的3’端的独特AscI位点(使用长寡核苷酸570和412以及人基因组DNA作为模板)，以及3)pBelo-CEN-HYG载体，其具有下游与匹配10.6延伸片段的3’端的同源尾连接的CEN4以及上游与匹配如上所述的VH4-39的上游序列的尾连接的HygR(使用长寡核苷酸414和566以及pBelo-CEN-HYG作为模板)。随后，通过与原生质球转化相关的同源重组，将3个PCR片段组装至在酿酒酵母中赋予HYGR和TRP+的小cYAC，并将此cYAC进一步转变成BAC pBeloHYG-YAC6+BAC3(5’)。最后，使用HpaI消化的pBeloHYG-YAC6+BAC3(5’)来转化携带YAC6的酵母细胞，并通过同源重组产生仅赋予HYGR的cYAC BAC6-VH3-11。通过转化，参见以下，将此cYAC作为BAC引入大肠杆菌中。将BAC6-VH3-11中的人VH基因切出为约182kb AsiSI(天然存在于HygR中)-AscI片段，并将BAC3中的VH基因切出为约173kb NotI-片段(图1顶部)。
在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)与大肠杆菌中高效工作的被称为pCAU的自我复制穿梭载体是基于先前公布的pBelo-CEN-URA构建的。(Osborn等，J Immunol2013；190:1481-1490)简言之，使用引物878和879(所有引物序列均列在下面)从酿酒酵母基因组DNA中扩增出ARSH4，其中在任一个末端引入ApaLI位点，接着是AsiSI和SexAI。用ApaLI和SexAI消化该片段，并与用相同限制性酶消化的pBelo-CEN-URA连接以产生pCAU。该载体在pBeloBAC11骨架中含有酿酒酵母CEN4、URA3和ARSH4(New England BioLabs)。
来自人染色体14的三个BAC(CTD-2011A5(BAC9)、CTD-3148C6(BAC14)、CTD-2548B8(BAC5))的BAC购自Invitrogen/Thermo Fisher。BAC9中涵盖IgHV3-74至IgHV1-58的人基因组区域被分离为185kb NotI片段。BAC(14+5)由BAC14和BAC5构建而来。该BAC中的组合基因组区域被分离为210kb的BsiwI片段，从5’至3’包括：来自BAC14的含有与BAC9的NotI片段3’重叠的4.6kb序列的90.6kb区域，接着是涵盖IgHV5-51至IgHV1-45的86kb区域、将BAC14和BAC5与位于中心的IgHV3-43连接的1.7kb合成区域、来自BAC5的涵盖IgHV3-21至IgHV3-13的111.7kb区域，以及与Anabel(携带人Ig恒定区的BAC)的5’重叠的6.1kb区域。
BAC(14+5，也称为14/5)分三个步骤来构建，所有步骤均涉及通过酵母中的同源重组产生环状YAC(cYAC)以及如上所述将cYAC转变成BAC。首先，通过在酵母中组装以下3个重叠片段来产生BAC载体pCAU+GAP-BAC14,5：1.9kb的合成DNA(订购自ThermoFisher)，其从5’至3’含有与在中心处具有独特的RsrII位点的BAC14中所需区域的5’端和3’端重叠的116bp序列、1.6kb的IgHV3-43基因[包括1.0kb的5’非翻译区(UTR)和0.2kb的3’UTR]、与在中心处具有独特的PmeI位点的BAC5中所需区域的5’端和3’端重叠的106bp序列，以及与Anabel的5’端重叠的38bp序列；使用引物383和384合成的对应于Anabel 5’端的6.1kb的PCR片段；以及使用引物1066和1088扩增的pCAU载体。其次，用PmeI对pCAU+GAP-BAC14,5载体进行线性化，并将其与从BAC5中分离的154kb NotI片段一起共转化至酵母菌株AB1380中。所得BAC(长约128kb)通过同源重组将BAC5的所需区域并入BAC载体中，所述同源重组是通过PmeI线性化的载体中暴露的BAC5的同源性末端介导的。第三，用RsrII对来自第二步的携带BAC5的BAC进行线性化，以使同源性末端暴露于BAC14中的所需区域，并与从BAC14分离的114kbSnaBI片段一起共转化，以产生BAC(14+5)。
对于C区与VH重叠的组装，必须将人VH6-1-D-JH区与紧邻最后一个JH(随后为大鼠Cs)的下游的大鼠基因组序列连接，从而得到cYAC/BAC。为了实现这一点，制备了5个重叠限制以及PCR片段：人VH6-1 5’的6.1kb片段(使用寡核苷酸383和384以及人基因组DNA作为模板)；约78kb PvuI-PacI片段，其含有从BAC1(RP11645E6)切出的人VH6-1-D-JH区；8.7kb的片段，其将人JH6与紧邻最后一个JH的下游的大鼠基因组序列连接，并且含有大鼠μ编码序列的一部分(使用寡核苷酸488和346以及大鼠基因组DNA作为模板)合成的；约52kb NotI-PmeI片段，其含有从BAC M5(CH230-408M5)中切出的真实大鼠μ、δ和γ2c区；以及pBelo-CEN-URA载体，其具有所述的在下游与匹配大鼠γ2c区的3’端的同源尾连接的URA3以及在上游与匹配人VH6-1的5’区的尾连接的CEN4，其是使用长寡核苷酸385和550以及pBelo-CEN-URA作为模板合成的。通过PCR对在酿酒酵母中通过同源重组进行的正确组装进行分析，并将来自正确克隆的纯化的cYAC在大肠杆菌中转变成BAC。
对于Annabel的组装，使用以上cYAC/BAC中含有人VH6-1-D-JH、随后是真实大鼠μ、δ和γ2c区的部分，以及PCR片段。五个重叠片段含有如上所述的在人VH6-1的5’端处的6.1kb片段；约83kb SpeI片段，其包含人VH6-1-D-JH且之后紧随最后一个JH的下游大鼠基因组序列并且含有大鼠Cμ的一部分；5.2kb片段，其将大鼠μ的3’端与大鼠γ1的5’端连接，其是利用寡核苷酸490和534以及大鼠基因组DNA作为模板合成的；约118kb的NotI-SgrAI片段，其含有从BAC I8(CH230-162I08)切出的真实大鼠γ1、γ2b、ε、α和3’EIgH增强子区；以及pBelo-CEN-URA载体，其具有如上文所述的在下游与匹配大鼠3’E的3’端的同源尾连接的URA3以及在上游与匹配人VH6-1的5’端的尾连接的CEN4。在BAC3与Annabel中的人VH6-1区之间存在10.3kb重叠。可以将随后为大鼠CH区的人VH6-1-D-JH与Annabel中的酿酒酵母URA3一起切出为单一的约183kb的NotI片段(参见图1)。
通过限制分析和部分测序对BAC6-VH3-11、BAC3、BAC9和BAC(14+5)和Annabel进行广泛的真实性检查。
b)IgL基因座
通过将VλYAC与3个含Cλ的粘粒进行重组组装，获得在约410kb YAC上的人Igλ基因座(Popov等，Gene 177，195-201(1996))。在来自含有全人IgλYAC的一个拷贝的ES细胞的转基因小鼠中验证重排和表达(Popov等，The Journal of experimental medicine 189，1611-1620(1999))。通过产生去除了Vλ3-27 5’区的约100kb的环状YAC，将此IgλYAC缩短。用ClaI和BspEI对载体pYAC-RC进行消化以去除URA3，并与来自含有HYG的pAP 599的ClaI/NgoMIV片段连接。用5’端与Vλ3-27的5’区同源的引物(引物276)和在YAC臂中的ADE2标记基因内的引物(引物275)对含有来自新载体(pYAC-RC-HYG)的酵母着丝粒和潮霉素(hygromycin)标记基因的区实施PCR。使用高效乙酸锂转化法(Gietz和Woods，Methods inMicrobiology 26，53-66(1998))并在含有潮霉素的YPD板上选择，将PCR片段(3.8kb)整合至IgλYAC中。从克隆(Epicentre MasterPure酵母DNA纯化试剂盒)制备DNA，并通过PCR使用以下寡核苷酸：243+278和Hyg端R+238，进行正确连接分析。制备塞子(Peterson Natureprotocols 2，3009-3015(2007))，并通过PFGE(0.8％琼脂糖(PFC)(Biorad)凝胶[6V/cm，60秒脉冲时间持续10小时，10秒脉冲时间持续10小时，8℃)去除酵母染色体，使环状酵母人工染色体锁留在琼脂糖块中(Beverly，Nucleic acids research 16，925-939(1988))。将所述块去除并用NruI进行消化。简言之，用过量的1X最终浓度的限制酶缓冲液将块在冰上预孵育1小时。将过量的缓冲液去除，只留下足够覆盖塞子的缓冲液，添加限制酶，直至其最终浓度为100U/ml，并将试管在37℃下孵育4-5小时。通过PFGE使线性化的YAC从所述块中跑出，从凝胶中以条带切出，并如下所述进行纯化。
对于人Igκ基因座，选择3个BAC(RP11-344F17、RP11-1134E24和RP11-156D9，Invitrogen)，其覆盖从5’Vκ1-17至3’KDE大于300kb的区(Kawasaki等，European journalof immunology 31，1017-1028(2001))。在消化和序列分析中，鉴定出三个重叠片段：从Vκ1-17至Vκ3-7(150kb NotI有约14kb重叠)、从Vκ3-7至Cκ的3’(158kb NotI有约40kb重叠)以及从Cκ至KDE的3’(55kb PacI有40kb重叠)。重叠区在被共注入卵母细胞中时通常可有利于连接整合(Wagner等，Genomics 35，405-414(1996))。
凝胶分析和DNA纯化
通过限制消化和在常规0.7％琼脂糖凝胶上分离，对纯化的YAC和BAC DNA进行分析(Sambrook和Russell，Molecular Cloning.A laboratory Manual..Cold SpringHarbor Laboratory Press，NY(2001))。通过PFGE(Biorad Chef MapperTM)分离50-200kb的较大片段，所述PFGE是在80C，使用于0.5％TBE中的0.8％PFC琼脂糖，以2-20秒转换时间(持续16h)、6V/cm、10mA进行的。纯化允许对所得片段与从序列分析获得的预测大小进行直接比较。通过PCR和测序分析改变。
线性YAC、环状YAC和BAC片段在消化后，使用ElutrapTM(Schleicher和Schuell)(Gu等，Journal of biochemical and biophysical methods 24，45-50(1992))从自常规运行的0.8％琼脂糖凝胶或者自脉冲场凝胶电泳(PFGE)切下的条带中通过电洗脱进行纯化。DNA浓度通常为在约100μl体积中几ng/μl。对于多达约200kb的片段，使DNA沉淀并再溶解于显微注射缓冲液(10mM Tris-HCl(pH值7.5)、100mM EDTA(pH值8)和100mM NaCl，但不含精胺/亚精胺)中，达到所需的浓度。
使用Nucleobond AX基于二氧化硅的阴离子交换树脂(Macherey-Nagel，Germany)从酵母中纯化环状YAC。简言之，使用酵母溶壁酶(zymolyase)或溶壁酶(lyticase)制备原生质球并使其沉淀(Davies等，Human antibody repertoires in transgenic mice:Manipulation and transfer of YACs..IRL Oxford，59-76(1996))。然后对细胞进行碱溶解，结合至AX100柱，并按照在Nucleobond方法中所述洗脱低拷贝数质粒。使用Plamid-SafeTMATP-Dependent DNase(Epicentre Biotechnologies)将污染的酵母染色体的DNA水解，随后使用SureClean(Bioline)进行最终清除步骤。然后用环状YAC转化DH10电感受态细胞(Invitrogen)的等分试样以获得BAC克隆。对于显微注射，使用sepharose 4B-CL过滤步骤(Yang等，Nature biotechnology 15，859-865(1997))将插入DNA(150-200kb)从BAC载体DNA(约10kb)中分离。
大鼠来源和育种
将编码重组免疫球蛋白基因座的纯化的DNA重新悬浮于含有10mM精胺和10mM亚精胺的显微注射缓冲液中。将DNA以0.5至3ng/μl范围内的各个浓度注入受精的卵母细胞中。
将编码大鼠免疫球蛋白基因特异性ZFN的质粒DNA或mRNA以0.5至10ng/ul的范围内的各个浓度注入受精的卵母细胞中。
显微注射在Caliper Life Sciences设施上进行。在国际实验动物评估和认证委员会(AAALAC)认证的动物设施中，在经过批准的动物护理方案下，在标准微隔离笼中，对远亲杂交种SD/Hsd(WT)品系动物进行圈养。按照14-10h亮/暗循环，在随意进食和饮水的情况下，饲养大鼠。向4至5周龄的SD/Hsd雌性大鼠注射20-25 IU PMSG(Sigma-Aldrich)，接着在48小时后注射20-25 IU hCG(Sigma-Aldrich)，之后与远亲杂交种SD/Hsd雄性大鼠育种。将受精的1-细胞阶段胚胎收集用于后续显微注射。将经过处理的胚胎移植至假妊娠的SD/Hsd雌性大鼠从而携带至分娩。
在10-18周龄，对多特征人Ig大鼠(人IgH、Igκ和Igλ与大鼠J KO、κKO和λKO组合)和作为对照的WT进行分析。将所述动物在Charles River在无特定病原体的条件下进行饲养。
在分别的基因座上引入多个不同VH区的程序可以通过将这些不同的基因座插入分别的转基因大鼠(优选具有缺陷大鼠IgH基因座)中来实现，如上文实施例中所述。这些分别的基因座用于产生分别的转基因大鼠品系，随后将这些品系杂交以获得双转基因大鼠，所述双转基因大鼠将具有可用于重组过程的所有VH区。将这些大鼠杂交成就两个基因座而言为纯合将会使可用于重组的VH区的数量加倍(见图3染色体组型，其中一个基因座整合在6号染色体上，一个基因座整合在15号染色体上)。拥有整合的基因座的多个拷贝会使这个数量进一步增加。
通过结合一个恒定区阵列转移多个不同的VH区来分开引入不同基因座的程序，允许不连接的多基因座整合。在这之后通过育种产生自两个分开整合的基因座表达抗体的动物。
同样的程序也适用于轻链，其中制备一种具有κ基因座的动物品系，并且制备具有λ基因座的另一品系。所述基因座通过杂交育种在动物中组合。
PCR和RT-PCR
使用基因组DNA小试剂盒(Genomic DNA Mini Kid)(Bioline)，通过来自尾或耳夹DNA的PCR，对转基因大鼠进行鉴定。对于<1kb的IgH PCR，使用GoTaq Green Master混合物(Promega)在以下条件下进行：94℃2分钟，32x(94℃30秒，54-67℃(引物和特定退火温度参见表1)30秒，72℃1分钟)，72℃2分钟。对于大于1kb的IgH PCR，使用KOD聚合酶(Novagen)在以下条件下进行：95℃2分钟，32x(95℃20秒，56-62℃，表1)20秒，70℃90秒)，70℃2分钟。对于Igκ和IgλPCR(均<1kb)，使用上述条件，只是在72℃下延伸50秒。
使用RiboPure血液试剂盒(Ambion)从血液中提取RNA，并使用RNASpin小试剂盒(GE Healthcare)从脾、骨髓或淋巴结中提取RNA。使用Oligo dT和Promega反转录酶在42℃持续1小时来制备cDNA。GAPDH PCR反应(寡核苷酸429-430)测定浓度。
使用具有大鼠μCH2或大鼠γCH2引物的VH前导引物(表2)引发RT-PCR。用GoTaqGreen Master混合物进行扩增的条件是94℃2分钟，34x(94℃30秒，55-65℃30秒，72℃50-60秒)，72℃2分钟。将具有预期大小的PCR产物通过凝胶或QuickClean(Bioline)进行纯化，并进行直接测序或者克隆至pGemT(Promega)中。
用于检测人IgH和IgL整合和表达的PCR和RT-PCR测定的引物序列见表3。
通过下一代测序表征经过免疫的OmniRat动物中的抗体
用β-gal对总共6只OmniRat2动物实施免疫，并从引流淋巴结中分离出B细胞。使B细胞沉淀并去除上清液后，自淋巴结源性B细胞制备总RNA。对RNA进行反转录，并使用所得cDNA作为模板来扩增Ig重链重排基因座的整个可变区(VH区)。然后将这种扩增产物准备进行下一代测序(NGS)，并通过NGS确定每只动物的完整VH库。
在对原始NGS读数进行后处理和质量控制后，通过将每条独特的VH序列与种系V基因参考序列进行比对来确定每只动物的V基因使用情况。V基因使用百分比计算为使用特定V基因的VH序列数除以该动物中VH序列的总数。
蛋白质纯化
按照方案中所描述的，在抗IgM亲和基质(BAC B.V.，Netherlands，CaptureSelect编号2890.05)上纯化IgM。类似地，根据该方案，在抗L链亲和基质(CaptureSelect抗Igκ编号0833和抗Igλ编号0849)上纯化人Igκ和Igλ。
对于大鼠IgG纯化(Bruggemann等，J Immunol 142，3145-3150(1989))，使用蛋白A和蛋白G琼脂糖(Innova，Cambridge，UK，编号851-0024和编号895-0024)。将血清与树脂一起孵育，并在温和的混合下在0.1M磷酸钠(对于蛋白G pH值为7，对于蛋白A pH值为8)下促进结合。用该混合物填充Poly-prep柱(Bio-Rad)，并用PBS(pH值7.4)充分地洗涤。洗脱缓冲液是0.1M柠檬酸钠(pH值2.5)，中和缓冲液是1M Tris-HCl(pH值9)。
在4-15％SDS-PAGE上进行电泳，并且使用考马斯亮蓝进行染色。MW标准品是HyperPage预染蛋白质分子量标准(HyperPage Prestained Protein Marker)(编号BIO-33066，Bioline)。
流式细胞术分析和FISH
将细胞悬浮液清洗并在PBS-1％BSA-0.1％叠氮化物中调节至5x105个细胞/100μl。使用小鼠抗大鼠IgM FITC-标记的mAb(MARM 4，Jackson ImmunoresearchLaboratories)与抗B细胞CD45R(大鼠B220)-PE缀合的mAb(His 24，BD biosciences)或抗IgD-PE缀合的mAb(MARD-3，Abd Serotec)组合，鉴定不同的B细胞子集。使用FACS CantoII流式细胞仪和FlowJo软件(Becton Dickinson，Pont de Claix，France)进行分析。
使用所描述的纯化的IgH和IgL C-区BAC，在固定的血液淋巴细胞上实施荧光原位杂交。(Meisner和Johnson，Methods 45，133-141(2008))
免疫、细胞融合和亲和力测量
用125μg PG(于CFA中)、150μg hGHR(于CFA中)、200μg Tau/KLH(于CFA中)、150μgHEL(于CFA中)、150μg OVA(于CFA中)，在尾根处进行免疫，并如所述在22天后将髂内侧淋巴结细胞与小鼠P3X63Ag8.653骨髓瘤细胞融合(Kishiro等，Cell structure and function20，151-156(1995))。为了多重免疫，将蛋白125μg PG或HEL或者100μg hGHR或CD14在GERBU佐剂(www.Gerbu.com)中如下进行腹膜内施用：第0天、第14天、第28天和第41天没有佐剂，然后在4天后使脾细胞与P3x63Ag8.653细胞融合(Meisner和Johnson，Methods 45，133-141(2008))。
使用Biacore 2000通过表面等离子体共振对结合动力学进行分析，其中抗原按照所描述直接被固定(Pruzina等，Protein engineering，design&selection:PEDS 24，791-799(2011))。
通过ELISA检测抗原特异性抗体
使用抗原包被、抗IgG或IgM报告ELISA分析大鼠血清样品中的B-Gal IgG和IgM抗体和抗原滴度。将96孔板在2-6℃下用B-Gal包被过夜，用PBS-酪蛋白-封闭剂/稀释剂1X封闭，用ELISA洗涤缓冲液洗涤，与血清一起孵育，用ELISA洗涤缓冲液洗涤，与山羊抗大鼠IgG1-HRP、山羊抗大鼠IgG2a-HRP和山羊抗大鼠IgG2b-HRP(各自以1/5,000稀释)或山羊抗大鼠IgM(1/5,000稀释)的混合物一起孵育，用ELISA洗涤缓冲液洗涤，与TMB底物溶液一起孵育30分钟，并且将ELISA终止溶液添加至孔中。在450nm处测量平板孔中的吸光度。除非另有说明，否则孵育是在环境温度下进行1.5至2小时。
大鼠血清中IgM和IgG浓度的测定。
还使用双抗体ELISA夹心测定形式分析了大鼠血清样品中总大鼠IgG1、大鼠IgG2b和大鼠IgM的浓度。使用分别针对每种同种型生成的标准曲线来计算总大鼠IgG1、大鼠IgG2b和大鼠IgM浓度。将96孔在2-6℃下用各自的同种型特异性捕获抗体(小鼠抗大鼠IgG1、小鼠抗大鼠IgG2b或山羊抗大鼠IgM)包被过夜，用PBS-酪蛋白-封闭剂/稀释剂1X封闭，用ELISA洗涤缓冲液洗涤，与血清一起孵育，用ELISA洗涤缓冲液洗涤，与各自的检测抗体(小鼠抗大鼠IgG或山羊抗大鼠IgM)一起孵育，用ELISA洗涤缓冲液洗涤，与TMB底物溶液一起孵育30分钟，并将ELISA终止溶液加至孔中。在450nm处测量平板孔中的吸光度。除非另有说明，否则孵育是在环境温度下进行1.5至2小时。
表1
检测人IgH和IgL整合和表达的PCR*条件
| IgH | 引物 | 退火温度(Tm-5) | 片段大小 |
| Hyg(5’BAC6) | Hyg 3’F-459 | 54℃ | 约400bp |
| V4-34(BAC6) | 205-206 | 65℃ | 约1kb |
| V4-28(BAC6) | 203-204 | 65℃ | 约1kb |
| V3-11(重叠BAC6-BAC3) | 448-461 | 60℃ | 约500bp |
| V1-8(BAC3) | 371-372 | 60℃ | 约300bp |
| V4-4(BAC3) | 393-396 | 60℃ | 约750bp |
| V6-1(BAC3-Annabel) | 359-360 | 65℃ | 约350bp |
| JH(Annabel) | 368-369 | 62℃ | 约250bp |
| μ-γ1(Annabel) | 583-535 | 62℃ | 约3kb |
| Ura(3’Annabel) | 241-253 | 56℃ | 约3kb |
| Igκ | 引物 | 退火温度(Tm-5) | 片段大小 |
| KDE | 313-314 | 66℃ | 约600bp |
| cκ | 307-308 | 64℃ | 约600bp |
| V4-1 | 333-334 | 60℃ | 约300bp |
| V1-5 | 329-330 | 64℃ | 约400bp |
| V1-6 | 331-332 | 60℃ | 约300bp |
| V3-7 | 309-310 | 66℃ | 约700bp |
| V3-15 | 311-312 | 66℃ | 约500bp |
| Igλ | 引物 | 退火温度(Tm-5) | 片段大小 |
| V3-27 | 215-216 | 67℃ | 约400bp |
| V3-19 | 213-214 | 67℃ | 约700bp |
| V2-14 | 211-212 | 67℃ | 约400bp |
| V中 | 168-169 | 65℃ | 约500bp |
| Jλ | 162-163 | 67℃ | 约800bp |
| cλ | 170-171 | 67℃ | 约500bp |
| 增强子 | 172-173 | 67℃ | 约400bp |
*对于从耳和尾夹中提取DNA，使用基因组DNA小试剂盒(Bioline)。对于大小为1kb或更小的PCR，使用GoTaq Green Master混合物(Promega)在以下条件下进行：94℃2分钟，32x(94℃30秒，Tm-5(以下)30秒，72℃1分钟[对于Igκ/λ为50秒])，72℃2分钟。将退火温度设定为最低引物Tm-5℃(www.sigmagenosys.com/calc/DNACalc.asp)。对于>1kb的PCR，使用KOD聚合酶(Novagen)在以下条件下进行：95℃2分钟，32x(95℃20秒，Tm-5 20秒，70℃90秒)，70℃2分钟。
表2
检测人IgH和IgL整合和表达的RT-PCR**条件
| Igκ | 引物 | 退火温度(Tm-5) | 片段大小 |
| HuVK1前导序列 | 400/474 | 63℃ | ↓ |
| HuVK3前导序列 | 401/475 | 63℃ | ↓ |
| HuVK4前导序列 | 476 | 63℃ | ↓ |
| HuVK5前导序列 | 477 | 63℃ | ↓ |
| HuκC区 | 402 | ↑ | 约600bp |
**使用RiboPure血液试剂盒(Ambion)从血液中提取RNA。使用RNASpin小试剂盒(GEHealthcare)从脾、骨髓或淋巴结中提取RNA。使用Oligo dT和Promega反转录酶在42℃持续1小时来制备cDNA。对使用GoTaq Green Master混合物的PCR设定如下：94℃2分钟，34x(94℃30秒，Tm-5 30秒，72℃1分钟[对于Igκ/λ为50秒])，72℃2分钟。
表3
引物序列
结果
人IgH和IgL基因座
人Ig基因座的构建采用已确立的技术来使用YAC和BAC组装大DNA区段(Davies等，Nucleic acids research 20，2693-2698(1992)；Davies等，Biotechnology(N Y)11，911-914(1993)；Wagner等，Genomics 35，405-414(1996)；Popov等，Gene 177，195-201(1996)；Mundt等，J Immunol 166，3315-3323(2001))。由于大肠杆菌中的多重BAC修饰通常使重复区(诸如转换序列和增强子)缺失，因此开发了一种方法用以将酿酒酵母中具有重叠端的序列组装为环状YAC(cYAC)，随后将此类cYAC转变成BAC。YAC的优点包括它们的大小较大、易于在酵母宿主中同源改变以及具有序列稳定性，而在大肠杆菌中增殖的BAC提供易于制备和高收率的优点。另外，与在YAC中相比，在BAC中可以更好地实现详细的限制性内切酶图谱和测序分析。
序列分析和消化鉴定了所关注的基因簇，并确保了基因座的完整性和功能性，从而确保了DNA的重排和广泛区内的转换，如图1所示。如前所述，重叠区域在共注入卵母细胞中时通常可有利于连接整合(Wagner等，Genomics 35，405-414(1996))。因此，BAC6-VH3-11(一个182kb的AsiSI-AscI片段)与BAC3(一个173kb的NotI片段)和BAC3-1N12M5I8(Hu-大鼠Annabel)(一个193kb的NotI片段)的插入，导致在大鼠基因组中重建全功能性的转基因IgH基因座(HC14)。类似地，BAC9、BAC(14+5)和BAC3-1N12M5I8的注入导致在大鼠基因组中重建全功能性的转基因IgH基因座(HC30)。
类似地，通过同源重叠对人Igκ基因座进行整合。将人Igλ基因座以约300kb的YAC形式完整分离，并将其完全插入大鼠染色体中。通过转录分析来鉴定整合成功，该转录分析显示从注入基因座的最5’端至最3’端的V(D)J C重组。通过qPCR(未显示)鉴定出多个拷贝，并且很可能发生了头尾整合。在所有情况下，通过育种产生具有单一位点整合的转基因动物。
育种为纯合性
通过DNA显微注入卵母细胞中产生转基因大鼠、所述大鼠的育种和免疫与小鼠相当。然而，获得基因敲除的ZFN技术直到最近才被报道(Geurts等，Science 325，433(2009)；Flisikowska等，PloS one 6，e21045(2011))。使用ZFN KO技术通过JH缺失使大鼠IgH基因座沉默已经有描述(Menoret等，European journal of immunology 40，2932-2941(2010))，并且描述大鼠IgL基因座的沉默、Cκ的靶向和J-Cλ基因的缺失的原稿正在准备中。我们获得了多个具有整合的人Ig基因座和沉默的内源性Ig产生的创始者(founder)；通过PCR和FISH对所有创始者进行分析，并且对完全转基因座整合进行选择和品种间杂交(表4)。几只创始者大鼠携带低转基因座拷贝数；如通过Cμ和Cα产物的qPCR(未显示)所确定，OmniRatTM中的大鼠C基因BAC可能以5个拷贝被完全整合。通过在许多品系中单一位置插入的FISH鉴定，证实BAC混合物的散布或多重整合是罕见的；实现了育种为纯合性的优点。
表4：产生的大鼠品系：转基因整合、敲除和基因使用
携带人单个转基因座IgH、Igκ和Igλ的大鼠与Ig基因座KO大鼠成功地杂交为纯合性。这产生了一种高效的新型多特征品系(OmniRatsTM)，其具有含有22个功能性VH的400kb以上的人VH-D-JH区以及约116kb的大鼠C区。不同创始者之间的DNA重排、表达水平、类别转换和超突变非常相似，并且与wt大鼠相当。这很可能是由相关的大鼠恒定区容纳几个C以及3’E(增强子控制)区呈真实构型所致。使携带HC14重链基因座的OmniRat动物与携带HC30基因座的OmniRat动物一起育种以产生OmniRat2。OmniRat2动物含有两个重链基因座，内含43个功能性VH。
在敲除背景下的B细胞发育
为了评价所引入的人Ig基因座是否能够重建正常的B细胞发育，进行流式细胞术分析。在脾和骨髓淋巴细胞中，对特定的分化阶段进行分析(Osborn等，J Immunol 2013；190:1481-1490)，这之前显示在JKO/JKO大鼠中缺乏B细胞发育(Menoret等，Europeanjournal of immunology 40，2932-2941(2010))，并且在κKO/κKO中以及在λKO/λKO动物中没有相应的IgL表达(数据未显示)。最突出的是，与wt动物相比，在OmniRats中B细胞发育得到完全恢复，其中在骨髓和脾中具有类似数量的B220(CD45R)+淋巴细胞。很大一部分CD45R+B细胞中的IgM表达标志着完全重建的免疫系统。在OmniRatsTM与wt动物之间，脾细胞的大小和形状分离无法区别，因此在表达具有大鼠C区的人独特型的转基因大鼠中得到成功恢复。此外，OmniRats中存在小的sIgG+淋巴细胞群(Osborn等，J Immunol 2013；190：1481-1490)。
对其他OmniRat淋巴细胞组织的分析表明它们与wt对照无法区分，例如，T-细胞子集被完全保留(数据未显示)，这进一步支持最佳免疫功能已经完全恢复的观点。
血清中的Ig水平
为了获得关于抗体产生的明确信息，我们对来自HC30和HC14/HC30动物的血清Ig的质量和数量进行了比较(图4)。结果表明，与具有两个重链基因座(HC14和HC30)的动物相比，具有一个Ig基因座(HC30)的动物血清中所表达的IgM和IgG的量类似。
对经过免疫的具有一个HC基因座(HC30)或两个HC基因座(HC14和HC30)的OmniRat动物的血清进行的ELISA分析揭示了此类动物中抗βgal IgM和IgG的滴度类似(图5)。
多样化的人H链和L链转录物
使用来自具有功能性内源性Ig基因座的转基因大鼠的血液淋巴细胞或脾细胞，实施全面转录分析。从特定的人VH组正向至Cμ或Cγ反向引物的RT-PCR表明人VHDJH的使用。对于L链分析组，特定的人Vκ或Vλ正向引物与Cκ或Cλ反向引物一起使用。
另外，收集动物的B细胞，制备RNA并进行反向转录，并且使用所得cDNA作为模板来扩增Ig重链重排基因座的全可变区(VH区)。然后将这种扩增产物准备进行下一代测序(NGS)，并通过NGS确定每只动物的完整VH库。在对原始NGS读数进行后处理和质量控制后，通过将每条独特的VH序列与种系V基因参考序列进行比对来确定每只动物的V基因使用情况。V基因使用百分比计算为使用特定V基因的VH序列数除以该动物中VH序列的总数。在OmniRat2转基因上引入的总共43个人V基因中，我们检测到在重排的IgG转录物中33个V基因以大于0.1％的水平表达。
RT-PCR VH基因表达分析和NGS库分析的结果总结见图1。这些结果显示所有被视为功能性的整合的人VH基因的使用情况(Lefranc和Lefranc，The immunoglobulinfactsbook.FactsBook Series，Academic Press，GB，45-68(2001))与D区段和所有JH区段的多样化使用相结合。
所述结果清楚地表明，由两个基因座(HC14+HC30)提供的更多可变区的添加产生更广泛的抗体库。总之，我们已经证明了在具有一个或两个Ig重链基因座的转基因动物中可以产生潜在任一类别的抗原特异性高亲和力Ab。该技术将允许因应抗原攻击而产生任一类别的全人Ab或其片段，从而用作人的治疗剂或诊断剂。通过使用不同的基因座，我们的技术还允许从啮齿类动物中产生高亲和力的成熟抗体，从而用作人的试剂、诊断或治疗。
讨论
人和大鼠基因组合以组装新颖IgH基因座已引起具有人独特型的抗体的接近正常的高效表达。此外，人Igκ和Igγ基因座的整合揭示，易于产生具有全人特异性的嵌合Ig，并且大鼠C区与人L链的缔合没有不利影响。使用大鼠IgH基因座的一部分的优点在于，物种特异性C区和增强子控制元件保持呈它们的天然构型，其中基本上仅仅移植多样化的人VH DJH区。此外，具有大鼠Fc区的抗体的表达允许正常的B细胞受体组装以及最佳地活化引发高效免疫应答所必需的下游信号传导途径。具体而言，对抗原攻击的免疫应答的质量依赖于许多受体相关的信号传导和调节组分的联合作用(参见：www.biocarta.com/pathfiles/hbcrpathway.asp)。
使用YAC和BAC并在二者之间相互交换的方法，在通过重叠同源性制备具有大区域的构建体时，具有速度和能检查完整性两方面的优点。几只创始者大鼠携带低转基因座拷贝数；如通过Cμ和Cα产物的qPCR(未显示)所确定，OmniRat中的大鼠C基因BAC可能以5个拷贝被完全整合。通过在许多品系中单一位置插入的FISH鉴定，证实BAC混合物的散布或多重整合是罕见的；实现了育种为纯合性的优点。人们对于广泛重叠区是否可进行DNA重排所必需的整合以便(例如)维持全部功能知之甚少。先前，已报道了重叠整合，然而是针对小得多的区域(<100kb)报道的(Wagner等，Genomics 35，405-414(1996)；Bruggemann等，Europeanjournal of immunology 21，1323-1326(1991))，并且我们的结果表明通过同源性或呈串联的所需的整合是频发事件。这大大简化了转基因技术，因为不必费力地将大YAC整合至干细胞中并随后从所述干细胞中衍生动物。(Mendez等，Nature genetics 15，146-156(1997)；Davies等，Biotechnology(N Y)11，911-914(1993))。另外，也是通过DNA注射进行的ZFN技术(Geurts等，Science 325，433(2009)；Menoret等，European journal ofimmunology 40，2932-2941(2010))，易于产生Ig KO品系，并且很可能成为未来基因破坏和替换的首选技术。OmniRats(含有人-大鼠IgH和人IgL基因座)中沉默的内源性Ig基因表达的优势在于干扰性或不需要的大鼠Ig均不会产生混合产物。有趣的是，在仍然产生wt Ig的OmniRats中进行的免疫和杂交瘤产生揭示，许多产物是全人、人-大鼠IgH和人IgL，然而是不完全的Ig KO。在此，尽管存在众多wt V基因，但值得注意的是，所引入的人基因易于扩增，因此表明为高效的表达竞争物。这与所有整合的转基因的表达水平普遍良好从而有利于与内源性基因座竞争的观察结果一致。先前，由于在释放wt Ig时发现人产物有少量表达，因此在表达人抗体库的小鼠中，Ig KO是必需的(Bruggemann等，PNAS 86，6709-6713(1989)；Mendez等，Nature genetics 15，146-156(1997))。
由于品系特异性顺式作用序列是高水平表达所需的，因此即便是在Ig KO小鼠中产生全人Ig基因座也可能是次优的。在小鼠中，Cα下游的增强子区在类别转换重组中起到至关重要的作用(Vincent-Fabert等，Blood 116，1895-1898(2010))，并且该区中的元件可能会促进超突变(Pruzina等，Protein engineering，design&selection:PEDS 24，791-799(2011))。这可能是为什么在即使携带大的全人基因座的小鼠中也会难以出现免疫应答和高频率产生多样化杂交瘤的原因(Davis等，Cancer metastasis reviews 18，421-425(1999)；Lonberg Current opinion in immunology 20，450-459(2008))。由于在OmniRats中，嵌合的人-大鼠IgH基因座有利于接近wt的分化和表达水平，因此可以得出如下结论：内源性大鼠C区并且实际上是Cα3'约30kb的增强子序列提供了对表达人VH基因并使其成熟的最佳基因座控制。已经从嵌合的C区BAC中去除了具有3'控制基序簇的另一区域Cδ(Mundt等，J Immunol 166，3315-3323(2001))，因为IgD的沉默或缺乏显示并不会减少免疫功能37。正常情况下，成熟的IgM+IgD+B细胞在抗原接触时下调IgD，从而启动类别转换重组(ChenImmunol Rev 237，160-179(2010))。因此，在没有IgD控制的情况下，转换可能会增加，我们的如下发现支持了这一点：当Cδ区保留在转基因构建体中时，IgG转录物和血清水平显著降低(数据未显示)。
OmniRats中特异性IgG的产生特别令人鼓舞，因为我们发现在各种免疫中，与wt对照中产生的相当，序列和表位多样化的mAb可以通过脾和淋巴结融合分离出来。V基因、D和J的多样性与预期的一样，并且发现几乎所有的区段都如预测的那样得到了有效利用(Lefranc和Lefran The immunoglobulin factsbook.FactsBook Series，AcademicPress，GB，45-68(2001))。这与携带全人转基因座的小鼠形成了鲜明对比，在所述小鼠中，少数前体B细胞的克隆扩增产生的多样性极少(Pruzina等，Protein engineering，design&selection:PEDS 24，791-799(2011))。由于移植的V基因的数量仅为人类所用数量的一半，因此我们预料在将OmniRats与wt动物进行比较时会发现免疫应答有限且多样性有限。然而，情况并非如此，并且对1000多个克隆中CDR3多样性的比较揭示，OmniRats与wt动物中的连接差异同样广泛。少数一致的基因区段组合通过VH-D和/或D-JH连接处的N序列增加或缺失以及通过超突变而得到进一步多样化。因此，很明显，大鼠C区序列在控制人VHDJH的DNA重排和表达方面是高效的。在所引入的人Igκ和Igγ基因座中也观察到了广泛的多样性，这与先前在小鼠中显示的情况类似(Nicholson等，J Immunol 163，6898-6906(1999)；Pruzina等，Protein engineering，design&selection:PEDS 24，791-799(2011)；Popov等，TheJournal of experimental medicine 189，1611-1620(1999))。因此，OmniRats已经克服了在小鼠中产生人抗体效率会大大降低的问题(Lonberg Nature biotechnology 23，1117-1125(2005))，所述OmniRats通过类别转换和超突变可靠且广泛地使重排的H链多样化，从而大量而不是偶尔地产生高亲和力抗体。转基因IgG的产量和超突变水平，令人印象深刻地用于抗原特异性mAb，表明OmniRats与wt动物之间的克隆多样化和产生水平类似。通过不同的单一免疫甚至实现了亚纳摩尔范围内高亲和力特异性的常规产生，而且与wt动物相比是有利的；由全人基因座产生人抗体库的转基因小鼠方面的结果尚未显示。(Mendez等，Nature genetics 15，146-156(1997))
总之，为了最大限度地提高人抗体的产生，使用人基因用于抗体特异性但使用啮齿类动物基因用于控制分化和高表达的IgH基因座应被视为是必要的。L链的灵活性是一个额外的好处，因为它即便是在wt Ig存在时也会允许高效的人IgH/IgL组装。对于治疗应用，通过C基因替换可以将嵌合的H链容易地转变为全人Ab，而不损害特异性。
本文提及的所有专利和专利公布均以引用的方式并入本文中。
本领域技术人员在阅读以上说明时将会想到某些修改和改进。应当理解，为了简明和可读性，本文已经删除了所有此类修改和改进，但是这些修改和改进合理地在以下权利要求的范围内。
Claims (19)
1.一种产生抗体的方法，其包括用免疫原对转基因动物实施免疫，其中所述转基因动物包含至少一个失活的内源性Ig基因座和多个人工转基因Ig重链基因座，所述多个人工转基因Ig重链基因座整合在动物基因组中不同的染色体位点处，
其中所述多个人工Ig重链基因座包含第一人工转基因Ig重链基因座，其中所述多个人工Ig重链基因座的第一人工转基因Ig重链基因座是HC30并且是通过重叠3种细菌人工染色体(BAC)的区域在动物的基因组中重建的，其中所述第一人工转基因Ig重链基因座包含：
(i)人重链V基因区段IgHV3-74、IgHV3-73、IgHV3-72、IgHV2-70、IgHV1-69、IgHV3-66、IgHV3-64、IgHV4-61、IgHV4-59、IgHV1-58、IgHV3-53、IgHV5-51、IgHV3-49、IgHV3-48、IgHV1-46、IgHV1-45、IgHV3-43、IgHV3-21、IgHV3-20、IgHV1-18、IgHV3-15、IgHV3-13和IgHV6-1，
(ii)人重链D区段，
(iii)人重链JH1-6基因区段，以及
(iv)从Eμ跨越至大鼠3’增强子序列的大鼠恒定区，
其中所述转基因动物是大鼠。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述3种BAC包含：i)第一BAC，其包含BAC9的185kbNotI片段，包含IgHV3-74至IgHV1-58；ii)第二BAC，其包含紧邻人VH6-1-D-JH区的下游的大鼠CH基因；和iii)第三BAC，其包含BsiwI片段，所述BsiwI片段包含来自BAC14的与BAC9重叠的90.6kb区域，涵盖IgHV5-51至IgHV1-45的86kb区域，包含位于中心的IgHV3-43的1.7kb合成片段，来自BAC5的包含IgHV3-21至IgHV3-13的111.7kb片段，以及与ii)的BAC重叠的6.1kb区域。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述多个人工转基因Ig重链基因座的第二人工转基因Ig重链基因座是HC14，其中HC14包含：
(i)人重链V基因区段IgHV4-39、IgHV3-38、IgHV3-35、IgHV4-34、IgHV3-33、IgHV4-31、IgHV3-30、IgHV4-28、IgHV2-26、IgHV1-24、IgHV3-23、IgHV3-22-2、IgHV3-11、IgHV3-9、IgHV1-8、IgHV3-7、IgHV2-5、IgHV7-4、IgHV4-4、IgHV1-3、IgHV1-2和IgHV6-1；
(ii)人重链D区段；
(iii)人重链JH1-6基因区段；以及
(iv)从Eμ跨越至大鼠3’增强子序列的大鼠恒定区。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述第二人工转基因Ig重链基因座通过重叠3种BAC的区域在动物的基因组中重建，所述3种BAC包含：i)第一BAC，其包含从VH4-39跨越到VH3-23、随后是VH3-11的真实区域；ii)第二BAC，其包含紧邻人VH6-1-D-JH区的下游的大鼠CH基因；和iii)第三BAC，其包含从VH3-11跨越到VH6-1的真实区域。
5.如权利要求3或4所述的方法，其中所述转基因动物包含如SEQ ID NO:2所述的核酸序列。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述转基因动物包含如SEQ ID NO:11所述的核酸序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述多个人工转基因Ig重链基因座在它们之间包含人可变重链区的完整互补序列。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述转基因动物缺乏功能性的内源性Ig轻链基因座。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述转基因动物缺乏功能性的内源性Ig重链基因座。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述大鼠3'增强子包含如SEQ ID NO:1所述的序列。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述恒定区基因包含选自由Cμ和Cγ组成的组的恒定区基因。
12.一种通过如权利要求1-11中任一项所述的方法产生的多克隆抗血清组合物，其中所述抗血清包含由位于不同染色体位点的转基因免疫球蛋白基因座编码的V基因编码的抗原特异性抗体。
13.如权利要求1-11中任一项所述的方法，所述方法还包括(ii)从所述转基因动物中分离产生单克隆抗体的细胞，其中所述产生单克隆抗体的细胞产生特异性地结合至所述免疫原的单克隆抗体；及(iii)使用所述产生单克隆抗体的细胞产生所述特异性地结合至所述免疫原的单克隆抗体，或使用所述产生单克隆抗体的细胞生成产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞，并使用所述杂交瘤细胞产生所述单克隆抗体。
14.如权利要求1-11中任一项所述的方法，所述方法还包括(ii)从所述转基因动物中分离产生单克隆抗体的细胞，其中所述产生单克隆抗体的细胞产生特异性地结合至所述免疫原的单克隆抗体；(iii)从所述产生单克隆抗体的细胞中分离出编码所述特异性地结合至所述免疫原的单克隆抗体的单克隆抗体核酸；及(iv)使用所述单克隆抗体核酸产生所述特异性地结合至所述免疫原的单克隆抗体。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述单克隆抗体具有人独特型。
16.如权利要求1-11中任一项所述的方法，所述方法还包括(ii)从所述转基因动物中分离产生单克隆抗体的细胞，其中所述产生单克隆抗体的细胞产生特异性地结合至所述免疫原的单克隆抗体；(iii)从所述产生单克隆抗体的细胞中分离出编码所述特异性地结合至所述免疫原的单克隆抗体的单克隆抗体核酸；(iv)修饰所述单克隆抗体核酸以产生编码全人单克隆抗体的重组核酸；及(v)使用所述编码全人单克隆抗体的重组核酸产生所编码的全人单克隆抗体。
17.一种通过根据权利要求13-16中任一项所述的方法产生的多样化的单克隆抗体组。
18.如权利要求12所述的多克隆抗血清组合物在制备用于中和人体组分中抗原性实体的制备物中的用途，其中所述多克隆抗血清组合物包含特异性地结合并中和所述抗原性实体的免疫球蛋白分子。
19.如权利要求17所述的多样化的单克隆抗体组在制备用于中和人体组分中的抗原性实体的制备物中的用途，其中所述单克隆抗体组中的至少一种单克隆抗体特异性地结合并中和所述抗原性实体。
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