TWI404727B - 對偶基因排除 - Google Patents

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TWI404727B
TWI404727B TW096102903A TW96102903A TWI404727B TW I404727 B TWI404727 B TW I404727B TW 096102903 A TW096102903 A TW 096102903A TW 96102903 A TW96102903 A TW 96102903A TW I404727 B TWI404727 B TW I404727B
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Richard Wilhelm Janssens
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Univ Erasmus Medical Ct
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Description

對偶基因排除
本發明係關於用於在轉殖基因非人類哺乳動物體內製造多種對抗原攻擊起反應之親和力成熟之只有重鏈的功能抗體譜之改良方法及其用途。本發明亦係關於自多個基因座製造多種類別特異性之只有重鏈的抗體譜。
詳言之，本發明係關於一種用於產生人類抗原特異性之高親和性之只有重鏈的任一類別抗體或類別混合物且分離且表現完整功能VH 抗原結合域之方法。
亦描述使用本發明之方法所產生之只有重鏈的抗體。
在下列描述中，所有胺基酸殘基位置號係根據Kabat等人設計之編號系統[1]給出。
 抗體
抗體結構在此項技術中熟知。大部分天然抗體為包含兩條重鏈及兩條輕鏈之四聚體。重鏈經由沿各重鏈約半路定位之鉸鏈結構域之間的雙硫鍵彼此接合。輕鏈在鉸鏈結構域之N末端側上與各重鏈相連。各輕鏈通常藉由接近鉸鏈結構域之雙硫鍵來結合各自重鏈。
當抗體分子恰當折疊時，各鏈折疊成由更多線性多肽序列接合之大量不同球狀結構域。舉例而言，輕鏈折疊成可變(VL )及恆定(CL )結構域。重鏈具有單一可變結構域VH 、第一恆定結構域(CH 1)、鉸鏈結構域及兩個或三個其他恆定結構域。重鏈恆定結構域與鉸鏈結構域一起形成一般所稱之抗體重鏈恆定區。重鏈(VH )與輕鏈(VL )可變結構域之相互作用導致抗原結合區(Fv)之形成。重鏈與輕鏈之相互作用由重鏈之CH 1結構域及輕鏈之C或Cλ結構域推動。一般而言，雖然曾顯示重鏈二聚體及胺基末端片段在輕鏈缺乏下可保持活性[2]，但抗原結合需要VH 及VL 。
在重鏈(VH )及輕鏈(VL )之可變結構域內，某些短的多肽區段顯示異常可變性。此等片段稱為超變區或互補判定區(CDR)。插入區段稱為構架區(FR)。在VH 及VL 結構域之每一者中，存在三個CDR(CDR1－CDR3)。
在哺乳動物體內存在五類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其中四類IgG及兩類IgA亞類在人類體內存在。
抗體類別之生理功能不同。舉例而言，IgG在成熟免疫反應中起顯著作用。IgM涉及補體固定及凝集。IgA係分泌物(眼淚、唾液、初乳、黏液)中之主要類別抗體且因此在局部免疫性上起作用。天然抗體之效應功能由重鏈恆定區提供。
IgA可在含有黏液之區域中(例如在內臟、呼吸道或生殖泌尿道中)找到且藉由病原體防止黏膜區域移生。IgD主要充當B細胞上之抗原受體。IgE結合過敏原且引發組胺酸自肥大細胞釋放(過敏之根本機制)以及提供保護以防寄生蟲(蠕蟲)。IgG(在其四種同型中)提供抗入侵病原體之基於抗體之免疫性的大部分。IgM表現於B細胞表面上以及呈具有非常高親和力之分泌形式以消除B細胞介導之免疫性之早期(亦即在存在足以消除病原體之IgG前)中的病原體。
通常人類B細胞含有在染色體14上之單一重鏈基因座，編碼重鏈之基因藉由重排自該基因座產生。在小鼠體內，重鏈基因座位於染色體12上。通常重鏈基因座包含複數個V基因區段、大量D基因區段及大量J基因區段。雖然大部分VH 結構域藉由V基因區段編碼，但各VH 結構域之C末端藉由D基因區段及J基因區段編碼。B細胞中VDJ重排繼而親和力成熟使各VH 結構域具有其抗原結合特異性。通常H2 L2 四聚體之序列分析證明多樣性主要源自VDJ重排及體細胞超突變之組合[3]。在人類基因組中存在超過50個人類基因區段，其中僅39個係功能性的。
完全人類抗體(H2 L2 )現可衍生自對抗原攻擊起反應之轉殖基因小鼠。該等轉殖基因小鼠包含單獨人類重鏈基因座及單獨輕鏈基因座。缺失或抑制類似小鼠重鏈及輕鏈基因座使得在缺乏小鼠抗體下僅產生人類抗體([4－10])。
隨著新分子生物技術之出現，鑑別出只有重鏈的抗體(無輕鏈)存在於人類(重鏈疾病)及鼠科動物模型系統之B細胞增生性病症中。分子層級下對重鏈疾病之分析說明基因組程度之突變及缺失可導致重鏈CH 1結構域不適當表現，引起缺乏結合輕鏈能力之只有重鏈的抗體表現[11,12]。
顯示由於天然基因突變，駱駝科動物產生功能IgG2與IgG3只有重鏈之二聚體，該等二聚體由於介導結合輕鏈之CH 1結構域之缺乏而不能結合輕鏈[13]。駱駝科動物之只有重鏈抗體之特徵係駱駝科動物VH 結構域之特定子集，其提供相對於人類及正常駱駝科動物VH 結構域改良之溶解性。此特定子集中駱駝科動物VH 結構域常稱為VHH 結構域。
亦顯示諸如鯊魚之物種產生類似只有重鏈之結合蛋白家族，可能涉及哺乳動物T細胞受體或抗體輕鏈[14]。
為產生駱駝科動物之只有重鏈的抗體，駱駝科動物生殖系中重鏈基因座包含編碼某些或所有可能重鏈恆定區之基因區段。成熟期間，經重排之VHH DJ結合域剪接至編碼鉸鏈結構域之基因區段之5'末端以提供編碼缺乏CH 1結構域且因此不能結合輕鏈之重鏈的重排基因。
駱駝科動物VHH 結構域在37、44、45及47位上含有大量特徵胺基酸[49]。認為此等保守胺基酸對給與只有重鏈的抗體溶解性而言係重要的。只有某些駱駝科動物VH 結構域為具有改良之溶解性特徵的VHH 結構域。其限於VH 亞科且因此僅對限定範圍之抗原生產性起反應。
只有重鏈的單株抗體可藉由標準選殖技術自駱駝科動物脾之B細胞或藉由噬菌體呈現技術或其他呈現技術自B細胞mRNA回收[18]。衍生自駱駝科動物之只有重鏈的抗體具有高親和力。對編碼只有重鏈的抗體之mRNA之序列分析證明多樣性主要源自VHH DJ重排與體細胞超突變之組合[49]，亦如在正常四聚體抗體之產生中所觀測到的。
天然駱駝科動物及人類VH 結構域之重要及一般特徵為各結構域作為單體在不依賴二聚作用下結合VL 結構域以達成最佳溶解性及結合親和力。
近來，已發展用於在轉殖基因非人類哺乳動物體內產生只有重鏈的抗體之方法(參見WO 02/085945及WO 02/085944)。潛在任一類別(IgM、IgG、IgD、IgA或IgE)且衍生自任一哺乳動物之只有重鏈的功能抗體可自轉殖基因非人類哺乳動物(較佳為小鼠)由於抗原攻擊而產生。此等最初研究視兩駱駝V基因區段之用途而定且遭受有限譜系之抗體反應。
Janssens等人[15]已發展用於在轉殖基因小鼠體內衍生只有重鏈的抗體之方法。此等只有重鏈的抗體由於抗體在B細胞中成熟而具有高結合親和力，可由於抗原攻擊而衍生且使用確定之融合瘤技術來選擇，且可在輕鏈缺乏下作為任一類別抗體(例如IgG、IgA、IgM)或單獨作為VH 結合域產生。此等只有重鏈的抗體係衍生自含有偶合所有人類D及J基因區段及編碼所有人類恆定區之基因區段之兩駱駝VHH (類別3)基因區段的生殖系(亦即未重排)構型中之抗體重鏈基因座。編碼各恆定區之基因區段缺失CH 1結構域以防止結合輕鏈。此外，基因座含有在3'末端之抗體LCR以確保在B譜系細胞中高含量表現。藉由顯微注射受精卵將此基因座引入小鼠體內。
基於抗體之產物的產生
藉由基因工程產生基於抗體之產物、尤其產生人類或人源化基於抗體之產物已導致新類別之醫學、診斷學及試劑及同時新工業、職業及財富創造之機會的產生。(參見www.drugresearcher.com,www.leaddiscovery.co.uk)。基於抗體之產物通常係衍生自天然四聚體抗體。存在多個關於產生基於抗體之產物的專利及申請案。此等專利及申請案係關於衍生途徑(例如，自轉殖基因小鼠)、製造途徑及產物特異性之相關物質。該等基於抗體之產物自完整四聚體抗體經由抗體片段變化至單鏈Fv(scFv)分子。
基於抗體之產物代表21世紀開始之高比例新醫學。單株抗體療法已公認為治療類風濕性關節炎及克羅恩病(Crohn's disease)之較佳途徑且在癌症治療中存在重大進展。基於抗體之產物亦處於治療心臟血管及感染疾病之發展中。大部分市售之基於抗體之產物識別且結合靶配位體上良好界定之單個抗原決定基(例如，TNFα)。
近來，高親和力VH 結構域已選自呈現庫中隨機人類VH 結構域或衍生自天然產生自駱駝科動物之抗原攻擊之只有重鏈的抗體或衍生自產生自駱駝科動物之VH 結構域文庫。此等高親和力VH 結構域已併入基於抗體之產物中。此等VH 結構域(亦稱為VHH 結構域)展示與標準VH 結構域之大量差異，尤其確保在輕鏈缺乏下重鏈之改良溶解性及穩定性的大量突變。在此等改變中最顯著的係在45位上帶電胺基酸之存在[16]。
大量團體已致力於衍生自天然四聚體抗體之只有重鏈的抗體之產生。Jaton等人[2及其中所引用之其他文獻]描述親和力純化之明確特性化之兔抗體的經還原重鏈組份之分離，繼而個別重鏈之隨後復原。復原重鏈之免疫特徵證明無輕鏈之單獨重鏈同質二聚體能夠結合抗原。
Later Ward等人[18]明確證明當在大腸桿菌(E.coli)表現系統中表現為可溶蛋白單體時經選殖之鼠科動物VH 區保留以高親和力結合抗原之能力。Ward等人[18]描述VH 結構域之分離及特徵且闡明當與傳統單株抗體生產(參見上一段)相比時此方法之潛在商業優點。其亦認識到自通常與輕鏈結合之重鏈分離的VH 結構域缺乏天然四聚體抗體之溶解性。Hence Ward等人[18J使用術語"黏性的"來描述此等分子且提出此"黏性"可經由設計具有改良之溶解性之VH 結構域來解決。
隨後使用隨機及定點之組合方法使用噬菌體呈現解決VH 溶解性之改良問題。舉例而言，Davies及Riechmann[17]及其他人(參見WO 92/01047)結合噬菌體呈現併入自駱駝科動物之只有重鏈的抗體之VH 結構域的某些特徵以改良溶解性，同時保留結合特異性。
對衍生自噬菌體文庫之經分離人類VH 結構域的研究證明VH 結構域之抗原特異性結合但證明此等VH 結構域具有低溶解性。此外，表明選擇具有噬菌體陣列所呈現之特異性結合特徵之人類VH 結構域可形成工程抗體之架構基塊[18]。
人類VH 結構域可針對改良之溶解性特徵進行工程處理[19,20]或溶解性可藉由活體內天然選擇來獲得[21]。然而，在VH 結合域衍生自噬菌體文庫之情況下，儘管應用親和力改良策略(包括例如親和力熱點隨機化)，但抗原之固有親和力保留在低微莫耳至高奈莫耳之範圍[22]。
由於體細胞突變及藉由D及J基因區段在正常抗體結合位點之CDR3區重組所提供之額外多樣性，藉由噬菌體或另一呈現技術產生之人類VH 或駱駝科動物VH 結構域缺乏改良特徵之優點。某些駱駝科動物VH (VHH )結構域在顯示相對於人類VH 之溶解性益處同時可證明在人體內係抗原性的，且此外經受駱駝科動物VH 必須藉由免疫駱駝科動物或藉由噬菌體呈現技術來產生之缺點。
噬菌體衍生之人類VH 區難以使用係因為其需要多輪淘洗及隨後突變以達成高親和力結合特徵。當自噬菌體或類似呈現庫分離時駱駝科動物VHH 結構域需要同樣費力程序或需要免疫大型動物(亦產生標準抗體之駱駝(llama或camel))(不服從傳統融合瘤技術)。此外，駱駝科動物結合域可證明具抗原性且需要人源化。
由於抗原攻擊而在轉殖基因非人類哺乳動物體內產生之只有重鏈的抗體(參見WO 02/085945及WO 02/085944)克服多個此等問題。
然而，此項技術中仍需要最大化只有重鏈的抗體之多樣性及活體內B細胞反應，且尤其產生類別特異性之只有重鏈的人類功能抗體譜系及保留最大抗原結合潛力之只有VH 重鏈的功能結合域以用於多種臨床、工業及研究應用中。
本發明之發明者已令人驚奇地克服先前技術之限制且顯示抗體譜反應可藉由增加存在於用以產生類別特異性之只有重鏈的抗體之轉殖基因非人類哺乳動物中之只有重鏈的基因座數來大大地增加。
本發明取決於發現在轉殖基因非人類哺乳動物具有多個只有重鏈的基因座之情況下此等基因座經受對偶基因排除。因此，僅隨機選擇一個基因座且成功將其重組，導致只有重鏈的抗體之產生。因此，多個VH 重鏈基因座可用於相同轉殖基因非人類哺乳動物中以最大化可自哺乳動物獲得之抗體譜及多樣性。當抗原攻擊時，轉殖基因非人類哺乳動物"選擇"包含V基因區段之基因座，V基因區段最適於應答針對其餘基因座排除之特異性抗原攻擊。
由於一般在缺乏擴大之CDR3環下轉殖基因非人類哺乳動物能"選"自一系列基因座(V、D及J基因區段重排及體細胞突變可發生於該等基因座)，所以可藉由本發明之方法產生之只有重鏈的抗體顯示高結合親和力。觀測到基本上正常B細胞成熟，其中經分離之血漿中存在高含量之只有重鏈的抗體(其限制條件為CH 1結構域已自存在於重組基因座之所有抗體類別中消除)。B細胞成熟及裝配二聚體(例如IgG)或多聚體(例如IgM)之分泌不依賴於輕鏈基因之存在或表現。
因此，在本發明之第一態樣中，提供一種用於在轉殖基因非人類哺乳動物體內產生只有VH 重鏈的抗體之方法，該方法包含在該哺乳動物體內提供一個以上異源VH 重鏈基因座(其中每一VH 重鏈基因座包含一或多個V基因區段、一或多個D基因區段、一或多個J基因區段及一編碼當表現時不包括CH 1結構域之重鏈恆定區之基因區段)以及自該等基因座之至少一者表現只有VH 重鏈的抗體之步驟。
每一VH 重鏈基因座較佳包含一或多個V基因區段，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50或60個V基因區段，其可衍生自任一脊椎動物物種。
在一實施例中，各基因座可僅包含V基因區段。在此實施例之一替代實施例中，各V基因區段不同於所有其他V基因區段。在第二替代實施例中，各V基因區段類似於所有其他V基因區段。在此第二替代實施例中，各基因座中其餘基因區段可相同或可不同於所有其他基因座中之其餘基因區段。
因此，設想非人類哺乳動物可含有多個單獨VH 重鏈基因座之複本。此具有最優化B細胞中生產性重排發生之機會，因此使得適用之只有重鏈的抗體產生之優點。
若非人類哺乳動物含有大量不同VH 重鏈基因座，則此進一步最優化獲得具有所需特異性之只有重鏈的抗體之機會。
在另一實施例中，各基因座包含多個V基因區段。在此實施例中，任一基因座中之V基因區段均可衍生自相同物種之生物，例如所有V基因區段可來源於人類。或者，任一基因座中之V基因區段可衍生自不同物種之生物，例如某些V基因區段來自人類且其他來自駱駝科動物或來自鯊魚。
V基因區段較佳來源於人類。
術語"V基因區段"包含衍生自脊椎動物(包括駱駝科動物及人類)之所有天然產生之V基因區段。V基因區段必須能夠與D基因區段、J基因區段及編碼重鏈恆定(效應)區(其可包含若干外顯子但排除CH 1外顯子)之基因區段重組以在核酸表現時產生只有VH 重鏈的抗體。
V基因區段亦包括其範疇內編碼能夠與D基因區段、J基因區段及編碼重鏈恆定區(包含一或多個外顯子但非CH 1外顯子)之基因區段重組以產生如本文所述之只有重鏈的抗體之同系物、衍生物或蛋白片段的任一基因序列。例如V基因區段可衍生自T細胞受體基因座或免疫球蛋白輕鏈基因座。
本發明之多個重鏈基因座較佳包含任一數量或組合之39個功能人類V基因區段及具有橫跨多個基因座分佈之改良溶解性之其工程變異體。此等可為任一數量之基因座，例如包含8個V基因區段之4個基因座加上包含7個基因區段之1個基因座；包含4個V基因區段之7個基因座加上包含3個V基因區段之1個基因座；或各包含1個V基因區段之39個基因座。
人類V基因分成7個家族VH 1至VH 7，且算入各家族內個別基因。各基因使用之頻率視特定免疫反應之不同需要而定。舉例而言，當對細菌抗原起反應時，與家族VH 5之基因相比，家族VH 3之基因可優先使用。因此，在本發明之另一較佳實施例中，已顯示適用於產生抗特異性抗原之抗體反應的V基因區段群分成轉殖基因非人類哺乳動物之單獨細胞株。V基因區段可根據家族分類或其可根據個別功能分類。舉例而言，若顯示家族VH 3之V基因適用於產生抗細菌抗原之免疫反應，則繼而此等V基因可用以產生尤其適用於產生抗細菌抗原之只有重鏈的抗體之轉殖基因非人類哺乳動物。或者，若顯示自家族VH 3及VH 5之若干個別基因適用於產生抗細菌抗原之免疫反應，則繼而此等基因可分類在一起且用以產生尤其適用於產生抗細菌抗原之只有重鏈的抗體之轉殖基因非人類哺乳動物。
在本發明之內容中，術語"異源"意謂非內源於所定位之哺乳動物的如本文所述之核苷酸序列或基因座。
在本發明之內容中"VH 重鏈基因座"係關於編碼包含一或多個V基因區段、一或多個D基因區段及一或多個J基因區段(操作上連接一或多個編碼重鏈效應區(各缺乏CH 1結構域)之基因區段)之VH 結構域之最小微基因座。抗體譜可變性之主要來源較佳係藉由選擇V、D及J基因區段及藉由V－D及D－J接合形成之CDR3。
本發明之優點在於可經由在相同轉殖基因非人類哺乳動物中使用多個VH 重鏈基因座最大化在重排VH 基因序列中所獲得之抗體譜及多樣性。Janssens等人，2006[15]已顯示在重排及對偶基因排除方面如上所述之轉殖基因座行為類似於正常免疫球蛋白基因座。此打開在相同動物體內(在不同染色體上)具有多個基因座以藉由使用對偶基因排除來最大化可能VH 重組數量的可能性。轉殖基因座之每一者將含有1個至40個以上之VH 區。對偶基因排除之過程(其隨機選擇一個基因座開始重組，若第一重組為非生產性則繼而下一基因座等，直至自一個基因座產生生產性重組)確保存在於組合基因座中之所有VH 區實際上為全部重組過程之部分。
Janssens等人[15]亦已令人驚奇地發現在相同轉殖基因非人類哺乳動物中之多個重鏈基因座串聯於相同染色體上之情況下生產性重排及抗體表現繼而可出現自多個重鏈基因座。在該等狀況下，隨後融合瘤純系為多株的。熟習此項技術者應瞭解此係增加抗體多樣性之另一機制。
因此，在本發明之另一態樣中提供如本文所述之方法，其中轉殖基因非人類哺乳動物中之至少兩個或兩個以上VH 重鏈基因座串聯存在於相同染色體上，繼而生產性重排及抗體表現可同時出現自兩個或兩個以上基因座。
大量重鏈基因座較佳首先單獨引至轉殖基因非人類哺乳動物中，產生具有單獨重鏈基因座之轉殖基因非人類哺乳動物。接著雜交此等動物以產生具有多個重鏈基因座之子代以最大化VH 區數量，從而導致最大多樣性。基因座亦可經由新一輪基因轉殖來添加。將新基因座注射至衍生自已包含一或多個異源VH 重鏈基因座之非人類哺乳動物之卵中。新的異源VH 重基因座之穩定整合導致可用VH 區增加且因此多樣性增加。在ES細胞技術可藉由胚胎融合及囊泡注射用於基因轉殖之情況下，用額外異源VH 重鏈基因座穩定轉染衍生自包含異源VH 重鏈基因座之非人類轉殖基因哺乳動物之ES細胞提供增加非人類哺乳動物(例如小鼠)多樣性之另一途徑。
每一不同重鏈基因座較佳以單一複本存在於轉殖基因非人類哺乳動物之基因組中。
此外，使用多個V、D及J基因區段提供可得之抗體譜及多樣性進一步增加。同時使用最小基因座(微基因座)而不需VL 及LC (輕鏈)抗體基因座來達成隨後體細胞突變。
在本發明之內容中，術語"D基因區段"及"J基因區段"包括天然產生之D及J基因區段序列。D及J基因區段較佳衍生自相同於衍生V基因區段之脊椎動物的脊椎動物。舉例而言，若V基因區段衍生自人類，則如需要溶解或工程處理，D及J基因區段亦較佳衍生自人類。或者V基因區段可衍生自(例如)駱駝科動物且D及J基因區段衍生自人類，或V基因區段可衍生自(例如)人類且D及J基因區段衍生自駱駝科動物。
術語D基因區段及J基因區段亦包括其範疇內之衍生物、同系物及其片段，只要所得區段可與如本文所述之重鏈抗體基因座之其餘組份重組以產生如本文所述之只有重鏈的抗體。D及J基因區段可衍生自天然產生之來源或其可使用熟習此項技術者熟悉且本文所述之方法來合成。V、D及J基因區段能夠重組且較佳經歷體細胞突變。
D及J基因區段較佳衍生自單一脊椎動物物種。雖然此可為任一脊椎動物物種，但較佳為人類。
各VH 重鏈基因座較佳包含1至40個(2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30或40)或40個以上之D基因區段。雖然D基因區段可衍生自任一脊椎動物物種，但D基因區段最佳為人類D基因區段(通常25個功能D基因區段)。
各VH 重鏈基因座較佳包含1至20個(2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20)或20個以上之J基因區段。雖然J基因區段可衍生自任一脊椎動物物種，但J基因區段最佳為人類J基因區段(通常6個J基因區段)。
各VH 重鏈基因座可含有相同D及J基因區段。或者，各VH 重鏈基因座可含有不同組合之D及J基因區段。舉例而言，在各VH 重鏈基因座僅含有1個V基因區段且此區段在各基因座中相同之情況下，繼而有利地使用各基因座中不同組合之D及J基因區段來進一步最優化獲得生產性重排之機會。然而，在各VH 重鏈基因座含有一或多個不同V基因區段之狀況下，可有利地使用各基因座中相同組合之D及J基因區段。
VH 重鏈基因座較佳包含一或多個V基因區段、25個功能人類D基因區段及6個人類J基因區段。
編碼重鏈恆定區之各基因區段可包含Cδ、Cγ1－4 、Cμ、Cε或Cα1－2 類別之一或多個重鏈恆定區外顯子，其限制條件為重鏈恆定區基因區段不表現CH 1結構域。視所需抗體類別之較佳類別或混合物來選擇重鏈恆定區基因區段。異源重鏈基因座視情況缺乏Cμ及Cδ。
因此，各VH 重鏈基因座可包含編碼至少一個提供活體內效應功能之重鏈恆定區(例如IgG、IgM、IgA、IgE或IgD或其同型)之基因區段，其中各恆定區不包括CH 1結構域。各基因座可僅含有一個編碼一特定恆定區之基因區段。若需要某些效應功能則此為有利。或者，各基因座可包含一個以上基因區段，各基因區段編碼不同恆定區。若無需特定效應功能，則此為有利，因為此使得大量類別之只有重鏈的抗體產生。
各基因座可含有編碼恆定區之相同基因區段或各基因座可具有不同或不同組合之編碼恆定區之基因區段。
操作上而言，重鏈恆定區藉由能夠在B細胞中與V基因區段、D基因區段及J基因區段重組之天然產生或工程處理之基因區段編碼。
在各只有重鏈的抗體中，恆定區在無CH 1結構域下表現使得可發生只有重鏈的抗體之產生。CH 1外顯子可缺失使得如上所述之只有VH 重鏈的抗體之恆定區不含有功能CH 1結構域。
當工程處理多價結合複合物時，類別特異性重鏈恆定區之納入可提供視所需功能性而定之活體內效應功能的治療效益。個別效應區之工程處理亦可導致功能性之添加或缺失[23]。因此，IgA恆定區功能性之納入可提供改良之抗病原體黏膜功能[24]，同時IgG1恆定區功能性之存在可提供活體內增強之血清穩定性。重鏈CH 2及CH 3恆定結構域之存在可為如天然抗體中可見之穩定二聚作用提供基礎且可為轉譯後糖基化提供識別位點。當使用雙特異性及多價複合物作為試劑及診斷劑時，CH 2及CH 3之存在亦容許進行二次抗體之識別。
例如，已知IgM抗體在巨噬細胞及補體途徑之活化中起重要作用。歸因於其結合位點之密切接近，IgM具有對包括病毒之病原體的高親和力。然而，亦已知IgM難以用於快速免疫檢定技術，而IgG抗體可易於用於此等技術。針對該等用途，適於針對較佳抗體類別(亦即IgG或IgM)來選擇。
缺乏CH 1之異源重鏈Cγ 基因座之全部或部分表現將視情況產生某些或所有之IgG同型，此視存在於該異源IgG基因座中之IgG1、IgG2、IgG3及IgG4同型而定。或者，重鏈可包含Cε基因。所得之IgE分子亦可用於治療中。
或者，可獲得經選擇之抗體混合物。舉例而言，當重鏈恆定區包含Cα及Cμ基因時，可獲得IgA及IgM。
該重鏈恆定區較佳來源於人類，尤其是在欲將該只有重鏈的抗體用於人類之治療應用時。在欲將該只有重鏈的抗體用於獸醫目的之情況下，該重鏈恆定區較佳係衍生自該獸醫治療所欲實施之靶生物、脊椎動物或哺乳動物。
表現時，各重鏈恆定區缺乏CH 1結構域。CH 1外顯子較佳係經缺失。Cμ及Cδ恆定區視情況可經突變、缺失或取代。舉例而言，具有功能CH 1結構域之IgM的存在會抑制B細胞之成熟且因此限制只有重鏈的IgG(缺乏CH 1)在相同基因座內之生產性表現。
如本文所定義之"重鏈恆定區外顯子"("CH 外顯子")包括天然產生之脊椎動物、但尤其哺乳動物CH 外顯子序列。此以類別特異性方式變化。例如，IgG及IgA天然缺乏CH 4結構域。術語"CH 外顯子"亦包括其範疇內之衍生物、同系物及其片段，只要當CH 外顯子為重鏈恆定區之組份時其能形成如本文所定義之只有重鏈的功能抗體。
當存在時，CH 4或其他功能結構域可視情況在轉基因內經工程處理或缺失，只要該過程不抑制細胞內分泌過程、B細胞成熟或所得抗體之結合活性。
重鏈效應分子可經工程處理而無功能結構域，例如碳末端之CH 4結構域，只要工程處理不影響防止細胞表面裝配之分泌機制及因此B細胞成熟。額外特徵可經工程處理至基因座(例如)以改良糖基化或添加功能。
因此，設計異源重鏈基因座以產生視所需抗體類別而定之只有重鏈的抗體之較佳類別或混合物，伴隨基本上正常之B細胞成熟。利用駱駝科動物V、D及J基因區段及駱駝科動物效應區產生具有對駱駝科動物抗體而言特有之特徵(諸如擴大之CDR3環)的駱駝科動物抗體。使用人類V、D及J基因區段產生缺乏擴大CDR3環之只有重鏈的人類抗體。
在本發明之內容中，"VH 結構域"係指當V基因區段與如上文所定義之D基因區段及J基因區段重組時V基因區段之表現產物。由於VDJ重組及體細胞突變，因此VH 結構域較佳具有改良之結合抗原能力。不視駱駝科動物物種特有之擴大之CDR3環的存在或缺乏而定。VH 結構域能以單體結合抗原。當表現為只有重鏈的可溶性抗體複合物之部分時，與VL 結構域組合之任一可能性藉由CH 1外顯子之移除而消除(參見[25])。
為達成目標治療及診斷之目的，例如在毒素、酶及顯像劑下單獨VH 結構域亦可經不同蛋白結構域工程處理以產生融合蛋白。
編碼序列之VH 結構域可衍生自天然產生之來源或可使用熟習此項技術者所熟悉之方法來合成。
VH 結構域之性質可藉由選擇或工程處理編碼具有所需特徵之序列的V、D及/或J基因區段來改變或改良。如上文所示，39個功能人類VH 區之某些可能不適於產生只有重鏈的抗體。在先前技術中已進行若干研究以嘗試改良各種抗體特徵[2629]。關於特異性VH 區特徵，Dolk等人[30]使用噬菌體呈現技術來產生在結合抗頭皮屑之洗髮精之苛刻條件下顯示改良穩定性之只有重鏈的抗體。
轉殖基因非人類哺乳動物較佳為齧齒動物，諸如兔、豚鼠、大鼠或小鼠。小鼠尤其較佳。亦可使用其他哺乳動物，諸如山羊、綿羊、貓、狗或其他動物。哺乳動物較佳為小鼠。
較佳單獨使用確定之卵母細胞注射技術來產生轉殖基因非人類動物。在確定之情況下，亦可使用ES細胞技術或選殖。
有利地，當根據本發明之方法表現只有重鏈的抗體時，內源於哺乳動物之抗體重鏈及視情況輕鏈基因座缺失或沉默。
產生如本發明以上態樣中所述之只有重鏈的抗體之方法可尤其用以產生用於人類治療用途之抗體，如抗體投與來源與抗體來源不同之脊椎動物物種常導致對抗所投與之彼等抗體之免疫反應的發作。根據本發明產生之抗體具有超越先前技術之抗體之優點，因為該等抗體實質上為單一或已知之類別且較佳來源於人類。抗體具有源自VDJ重組及活體內親和力成熟之組合的高親和力。
因此，本發明之另一態樣提供包含一個以上如上所定義之異源VH 重鏈基因座之轉殖基因非人類哺乳動物。轉殖基因非人類哺乳動物較佳可經工程處理以具有減少之產生包括輕鏈之抗體的能力。
產生抗體之細胞可衍生自如本文所定義且例如製備用以產生如本文所定義之只有重鏈的抗體之融合瘤中所用之轉殖基因非人類哺乳動物。另外或其他，使用熟習此項技術者所熟悉之重組DNA技術，核酸序列可自此等轉殖基因非人類哺乳動物分離且用以產生只有VH 結構域重鏈鏈抗體或其雙特異性/雙功能複合物。
其他或另外，抗原特異性之只有重鏈的抗體可藉由免疫如本文所定義之轉殖基因非人類哺乳動物來產生。
因此，本發明亦提供一種用於藉由用抗原免疫如上定義之轉殖基因非人類哺乳動物來產生只有重鏈的抗體之方法。使用熟習此項技術者所知之公認方法可將抗體及其片段分離、特徵化且製造。此等抗體尤其用於PCT/GB2005/00292所述之方法中。
在涉及下列圖之以下實施方式中，現僅藉助於實例來描述本發明。
 實例 實例1－只有重鏈的抗體基因座在小鼠體內功能完整且對對偶基因排除敏感
如上所論述，Janssens等人[15]已發展用於在轉殖基因小鼠體內衍生只有重鏈的抗體之方法。關於本文所述之方法及實驗之詳情，熟習者應參考以引用的方式併入本文之Janssens等人[15]。
方法
構築體 使用標準方法自駝羊(Lama Glama )之外周血細胞製成基因組黏質體文庫。基於兩種不同生殖系VHH 之序列(無終止密碼子及根據Lefranc編號方式[32]之42、50及52位上親水性胺基酸密碼子不存在之開放閱讀框架，且一種在49位上具有親水性胺基酸且一種在49位上不具有親水性胺基酸)來對其進行選擇。一種與IGHV1S1(寄存編號AF305944)相同且另一種與IGHV1S3(寄存編號AF305946)具有94%之一致性。兩種純系係選自人類基因組Pac文庫RPCI－11(BACPAC Recource Center,USA)：含有人類重鏈D及J區、Cμ及Cδ之純系1065 N8及含有C γ3基因之純系1115 N15。來自不同人類基因組文庫(Incyte Genomics,CA,USA)之Bac純系11771用作Cγ2基因及Ig重鏈LCR之來源[33]。使用標準技術，Cγ3及Cγ2基因分別次選殖至pFastBac(Invitrogen)。藉由同源重組[35]達成CH 1外顯子之單點突變(G至A)[34]或完全缺失。類似地，將frt及lox P位點引至Cμ交換區前且第二lox P位點置放在Cγ2交換區前，導致MGS或MG△。
為獲得GS或G△構築體，含有兩種駱駝VHH 基因、繼而人類D及J重鏈區、Cμ、Cδ及經修飾之人類Cγ2及Cγ3基因及3'LCR之MGS或MG△載體(圖1)轉型為經由cre介導之重組產生GS或G△基因座之16 294 Cre大腸桿菌菌株44 (圖1)。M△G△藉由CμCH 1區缺失經由同源重組獲自MG△。
轉殖基因小鼠之產生、培育及基因分型 220 Kb MGS或MG△或M△G△片段、150Kb GS或G△片段(圖1)自載體序列純化且以2 ng/μl之濃度注射至已受精之FVB X B16/μMT－/－ 卵之生殖核中。藉由使用5'及3'末端探針南方墨點分析尾部DNA來檢查轉殖基因座之完整性及複本數。將轉殖基因μMT＋/－ 基質(founder)在μMT－/－ 背景中培育為細胞株。藉由PCR(在94℃下變性45 s，在60℃下退火30 s且在72℃下延長1 min 40 s，循環30次)使用下列引子進行基因分型：對HLL－MD而言Asp5'IgM fw：5'－GCGGGTACCGAATGGTGGCAGGGATGGCTC－3'(SEQ ID NO：1)與Asp 3'IgG2 rv：5'－CGCGGTACCCTGCGGTGTGGGACAGAGCTG－3'(SEQ ID NO：2)或對MGS而言Asp5'IgM fw：5'－GCGGGTACCGAATGGTGGCAGGGATGGCTC－3'(SEQ ID NO：1)與Asp3'IgM rv：5'－CGCGGTACCACGGCCACGGCCACGCTGCTCGATTC－3'(SEQ ID NO：3)及對於μMT基因型而言MIGMEMBINTRON1：fw：5'－CCAGTCAATACTACTCGCTAAGATTC－3'(SEQ ID NO：4)與MIGMEMBEXON1 rv：5'－CAGTGGTCCACAGTTTCTCAAAGC－3'(SEQ ID NO：5)。
RT－PCR 使用Ultraspec RNA分離系統(Biotecx Laboratories,Houston)分離全部RNA。使用逆轉錄酶(Superscript II,Life technology)及寡(dT)引子來合成cDNA。使用下列引子實施PCR：LVHHfw：5'－AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGG－3'(SEQ ID NO：6)與HINGEIgG2rv：5'CACTCGACACAACATTTGCGCTC－3'(SEQ ID NO：7)或hIgMCH2rv：CACTTTGGGAGGCAGCTCAGC－3'(SEQ ID NO：8)。在94℃下變性30 s，在60℃下退火30 s且在72℃下延長1 min，將擴增循環30次。將PCR產物選殖至pGEM T easy載體(Promega)中且使用T7或SP6引子定序。
流式細胞術分析： 如先前所述45 ，自PBS中淋巴器官製備單細胞懸浮液。於4℃下，在96孔盤中將約1×106 個細胞用抗體在PBS/0.5%牛血清白蛋白(BSA)中培育30 min。將細胞在PBS/0.5%BSA中洗滌兩次。針對每一樣品，使用FACScan分析儀(Becton Dickinson,Sunnyvale,CA)記錄3×104 個事件。使用CellQuest 1.0版電腦軟體分析FACS資料。在Becton Dickinson FACS Calibur上進行四色分析。已描述所用之大部分抗體[36]；FITC結合之抗人類IgG及抗人類IgM係購自Sigma(Zwijndrecht,NL)。
Ig基因重排分析 自wt小鼠M△G△及G△轉殖基因小鼠之脾及肝製得單細胞懸浮液。根據製造商之指示使用MACS CD45(B220)MicroBeads(Miltenyi Biotec,Germany)在Automacs分離器上確定選擇B細胞達約90%純度[37]。基因組DNA經Hind III消化且染上墨點至Hybond耐綸濾紙上。濾紙與32 P放射性標記之J探針(藉由PCR擴增自J1及J5區上基因組DNA獲得)及32 P放射性標記之碳酸酐酶II(CAII)探針雜交。對肝DNA進行實驗以顯示生殖系構型之信號(2.8 Kb帶)。將與4 kb帶雜交之CAII探針用作負載對照。在Tyfoon 9200(Amerscham Biosciences)上掃描濾紙。使用Image Quant 5.2軟體來定量生殖系J帶強度，標準化至負載對照之生殖系J帶強度且表示為對照肝DNA之百分比(100%)。用於融合瘤之基因組DNA上以供擴增不同重排事件之PCR引子如下：IGHJ1R：5'－CCAGTGCTGGAAGTATTCAGC－3'(SEQ ID NO：9)、IGHJ2R：5'－CAGAGATCGAAGTACCAGTAG－3'(SEQ ID NO：10)、IGHJ3R：5'－GGCCCCAGAYATCAAAAGCAT－3'(SEQ ID NO：11)、IGHJ4R：5'－GGCCCCAGTAGTCAAAGTAGT－3'(SEQ ID NO：12)、IGHJ5R：5'－CCCAGGRGTCGAACCAGTTGT－3'(SEQ ID NO：13)、IGHJ6R：5－CCAGAACGTCCATRYMGTAGTA－3'(SEQ ID NO：14)。
DNA FISH分析 靶DNA之製備：如Heiskanen[38]所述將單株融合瘤細胞在DMEM/10%FCS中培養且埋於瓊脂糖中。收集來自G△轉殖基因細胞株1之小鼠之肺且製成單細胞懸浮液。將所埋之細胞用蛋白酶K及核糖核酸酶H處理。使用微波烘箱在聚L－離胺酸切片(Sigma)及另一切片之邊緣上製備機械延長之DNA。
探針：為偵測G△轉基因之經重排及未經重排之複本，純化DNA片段。2.3 kB SpeI及3.6 kB SpeI－BssHII片段用於雜交VHH 與D之間的區結構域，且5.9 kB BamHI－SpeI片段或含有IgH 3'LCR(16 kB)之低複本Bluescript質體用於LCR偵測。藉由缺口轉譯作用將探針用生物素11－dUTP(Roche)或地高辛(digoxigenin)11－dUTP(Roche)標記。在將探針吸於切片上之前，藉由在90℃下5分鐘，冰上5分鐘且37℃下45分鐘來使其變性。原位雜交：雜交混合物含有50%甲醯胺、2×SSC、鮭魚精DNA(200 ng/μl)、5×Denhardt's、1 mM EDTA及50 mM磷酸鈉(pH 7.0)。探針雜交係藉由吸液25 μl混合物至切片上且用24×32 mm蓋波片覆蓋來進行。為變性探針及靶序列，將切片放在80℃加熱盤上2分鐘。探針在潮濕腔室中於37℃下雜交隔夜(濕潤劑為50%甲醯胺、2×SSC)。雜交後如所述進行洗滌[39]。
半抗原標記之探針的免疫偵測：用綿羊抗地高辛(1：500,Sigma)、螢光素結合之兔抗綿羊(1：500,Sigma)及螢光素結合之山羊抗兔(1：500,Sigma)來偵測地高辛探針。生物素探針係用德州紅(Texas Red)結合之抗生物素蛋白(1：500,Sigma)及生物素結合之山羊－抗－抗生物素蛋白(1：500,Sigma)偵測。重複此步驟兩次。所有培育及洗滌均如所述48 來實施。染色後，使切片在一系列分級乙醇(70、90及100%)中於室溫下脫水，每一步驟5分鐘。將細胞或DNA埋入25 μl防褪色包埋介質Vectashield(Vector Laboratories)中。用Leica DMRBE螢光顯微鏡使用100×物鏡進行觀測。
免疫及融合瘤產生 將8週大之小鼠用具有Specol佐劑(IDDLO,Lelystadt,NL)之5－20 μg抗原或用預調配之DKTP疫苗在第0、14、28、42天經皮下及在第50天腹膜內免疫。在第0、14及45天採血。在第56天使用ClonalCellTMHY套組(StemCell Technologies,Canada)根據製造商之指示將脾細胞與Sp2－O－Ag14骨髓瘤細胞株(自R.Haperen移植)融合。DKTP疫苗獲自Netherlands Vaccine Institute(Bilthoven,NL)。
sdAB文庫構型及篩檢 使用Ultraspec RNA分離系統(Biotecx Laboratories Inc,Houston,Texas,USA)自經DKTP免疫之單一複本G△小鼠及經TNF α免疫之M△G△小鼠的脾分離全部RNA。使用寡(dT)引子製成cDNA。編碼VHHDJ片段之DNA片段係使用以下特異性引子由PCR擴增：vh1後Sfi I引子與hIgG2hingrev引子(5'－AATCTGGGCAGCGGCCGCCTCGACACAACATTTGCGCTC－3'(SEQ ID NO：15))或CH2huIgMrev引子(5'－TGGGACGAAGACGGCCGCTTTGGGAGGCAGCTCGGCAAT－3'(SEQ ID NO：16))。經擴增之VHHDJ(約400 bp)經Sfi I/Not I消化，凝膠純化且選殖至經Sfi I/Not I消化之噬粒pHEN衍生之載體中。轉化成TG1電感受態細胞(Stratagene La Jolla,USA)產生人類單結構域抗體文庫。對吸收至可塑性(用未稀釋之疫苗塗佈之免疫管)或經純化之人類TNFα(Biosource International,USA)的DKTP疫苗抗原進行篩檢來實施兩輪選擇。
免疫細胞化學及西方墨點 使經對rtTA之存在起反應之標記質體轉染的tet－on細胞株之細胞於切片上生長。去氧羥四環素(doxycycline)誘發24 h後，將細胞固定於4%三聚甲醛/PBS中且在0.5%Triton－X－100/PBS中滲透。對抗rtTA之HCAb以1：50倍稀釋使用，繼而山羊抗人類IgG FITC染色(Sigma 1：500倍稀釋)。如先前所述51 來偵測標記蛋白。使用山羊抗人類IgG－HRP(Sigma,1/2500倍稀釋)、人類IgM－HRP(Sigma,1/2500倍稀釋)之西方墨點係標準的。
Superose 6凝膠過濾 使用具有在200 mM KCl/20 mM HEPES－KOH pH7.9/1 mM MgCl2 /0.5 mM EGTA/20%甘油中平衡之SuperoSe 6 10/30管柱之AKTA FPLC裝置(Amersham Biosciences,Piscataway NJ)實施M△G△小鼠血清及人類對照血清之尺寸分級分離。使用100 μl/min之流量，收集500 μl溶離份，用100%三氯乙酸沉澱且藉由SDS－PAGE(在還原條件下)繼而西方免疫墨點法分析。
BIAcore量測 在BIAcore 3000表面電漿共振生物感測器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)上實施實驗。以製造商提供之標準NHS－EDC套組將經純化之蛋白固定於CM5感測器晶片上至3000共振單元(RU，任意結合反應單元)之程度。抗體以10 mMHepes(pH 7.4)、150 mM NaCl、2 mM EDTA、0.005%Tween 20中每毫升40微克之恆定流動速率通過經固定之抗原。使用製造商之BIA評估軟體，記錄平衡時之反應且使用曲線擬合來獲得平衡解離常數。
結果
類駱駝科動物CH1剪接突變不足以人類重鏈基因座中外顯子跳躍 不知道駱駝科動物中HCAb(IgG2及IgG3)之產生是否包括IgM＋中間步驟。因此首先產生兩個雜交人類基因座，在μMT背景[43]下一個基因座(MGS)具有人類Cμ、Cδ、Cγ2及Cγ3恆定區且一個基因座僅具有Cγ2及Cγ3(圖1)。首先誘變Cγ區以含有駱駝科動物CH 1剪接突變5 。產生MGS係因為已顯示由於μ鏈基因之橫跨膜結構域缺失[43]而幾乎完全缺乏B細胞之μMT動物具有少量B細胞，在缺乏膜IgM下產生功能IgG、IgA及IgE[44－46]，表明(某些)B細胞在無IgM表面表現下發展。代替突變人類VH 結構域以改良VH 溶解性[47,48]，引入駱駝來源之兩個VHH 。駱駝科動物VHH 結構域在42、49、50及52位上含有大量特徵胺基酸[52]。首先，VHH 1含有所有此等VHH 特徵胺基酸，但測試主要實驗證據自中溶解性之重要性；其次，VHH 2缺乏此等關鍵"溶解性"胺基酸之一者，在49位上以Gln(Q)代替Glu(E)。選擇49而非50位(Arg,R)係因為咸信此對可變輕鏈(VL)配對而言尤為重要21 。基因座亦含有所有5個人類重鏈D及J區及在基因座之3'末端之基因座控制區(LCR)(圖8)。令人驚奇地，剪接突變未導致轉殖基因小鼠中正確CH 1外顯子跳躍及人類Ig表現之缺乏(圖8)。
含有缺乏C H 1區之人類基因座之轉殖基因小鼠的分析 為克服CH 1剪接問題，產生3個新的構築體(圖1)，所有均含有缺失CH 1之Cγ2及Cγ3，一個具有Cμ及Cδ(MG△)，一個不具有Cμ及Cδ(G△)且一個具有CH 1缺失之Cμ區段(M△G△)。具有不同複本數(1－5個複本)之三個MG△、六個G△及四個M△G△轉殖基因小鼠細胞株在μMT背景中獲得。在骨髓(BM)及脾中分析B細胞發展。具有不同複本數之小鼠產生相同結果。
G△及M△G△之表現拯救μMT小鼠中B細胞發展 在μMT背景中MG△小鼠不能拯救B細胞發展，而G△及M△G△構築體有效拯救B細胞發展。在不同淋巴間隙中獨立於複本數之B220/CD19陽性細胞之拯救在30－100%之間(圖2A)。此藉由BM流式細胞儀使用B220與人類IgM或人類IgG染色之關係曲線來證實(圖2B)。M△G△小鼠在野生型或μMT小鼠中缺乏之BM中含有產生人類IgM之細胞。適當地，此等細胞未經歷類別轉換，因為其不含有人類IgG。G△小鼠僅含有表現人類IgG之B細胞。雖然MG△小鼠含有非常少(如有任何)之在細胞表面上表現人類Ig的B細胞，但有趣地是一定比例之B220細胞表現細胞內IgM而非IgG(圖2B)。與M△G△及G△In小鼠相比(參見下文)，MG△小鼠表現小鼠Ig輕鏈(圖6G)。此等結果顯示在不同構築體中表現Cμ及Cγ基因且強烈表明缺乏CH 1對基於VHH 之抗體的細胞表面表現而言係關鍵。
在BM中B細胞發展期間人類HCAb IgG及IgM功能上替換鼠科動物(前)BCR 在大循環發展為小的靜止前B細胞之進程期間，特異性細胞表面標記之表現以前BCR依賴型方式下調[36]。為研究人類HCAb功能上替換前BCR之能力，藉由FACS分析各種標記之表現。祖B細胞表現高含量之在前BCR表現後下調且在成熟B細胞中缺乏之細胞質SLC、IL－7R及CD43(圖2C，比較自μMT小鼠之祖B細胞及wt小鼠之表面IgM－祖B/前B細胞部分及表面IgM＋ B細胞部分)。
取自M△G△/μMT或G△/μMT小鼠之人類Ig＋B細胞具有低含量之SLC及IL－7R，其指出人類單鏈IgG及IgM受體在SLC及IL－7R之下調中對該鼠科動物之前BCR進行了功能上之替換。對CD43而言，此似乎僅為G△小鼠中之狀況，但M△G△小鼠中之持續CD43表現可能係與此等小鼠中所發現之B－1 B細胞分化增加相關。類似地，CD2及II類MHC之表現亦獲得誘發，如在正常前BCR信號轉導中般。在前B細胞階段瞬時誘發之IL－2R/CD25含量在成熟之M△G△或G△/μMT B細胞上極低且與成熟wtB細胞之IL－2R/CD25含量相當(圖2C)。此外，ic Ig之表現在成熟之M△G△或G△/μMT B細胞中未偵測得見(圖2C)，且在5天之IL－7＋培養後於IL－7撤出時，其亦未在活體外之BM培養基中誘發(未圖示)。最終，在M△G△或G△轉殖基因小鼠中，表現人類HCAb之B細胞種群部分係由BM中產生之細胞(HSAhigh 及AA4.1/CD93high )組成且部分係由在外周中成熟及再循環之細胞(HSAlow 及CD93low )組成，與正常小鼠中之發現相當。
此等結果共同說明，人類HCAb IgG及IgM在關於經發展調節之標記表現的B細胞發展期間皆功能上替換鼠科動物(前)BCR。Ig L鏈並未受到誘發(見下文)。BM RNA之cDNA分析展示兩VHH 區段對VDJ重組、對CH1缺乏、以及，重要地，對CDR3區中之廣泛多樣性之用途(圖2D)。
多重重排及對偶基因排除 在免疫後，自M△G△及G△細胞株製得諸多融合瘤，特別是該五複本G△細胞株1(見下文)。序列分析說明在該多複本G△基因座中可發生一個以上之重排。在所分析之5個不同5複本融合瘤中，一融合瘤(G20)重排一框內複本；兩個融合瘤(T7及T12)各具有兩個重排，兩個重排中各有一重排在框外；一融合瘤(T3)具有兩個框內重排(J2及J4)；而一融合瘤(T1)具有4個重排，其中2個重排(J2及J4)框內。
T1及T3表現兩個生產性mRNA，該等mRNA藉由準確符合該cDNA之分泌抗體之質譜證實(未圖示)。使用偵測各複本之LCR探針及僅偵測未重排複本之位於VHH 與D區段之間的探針，亦在兩不同融合瘤G20(1個重排)及T1(4個重排)上實施DNA伸展纖維FISH及正常DNA FISH(圖3A－E)。對照肺細胞顯示符合南方墨點基因定位(未圖示)之5個完整複本加上在每一末端處之半個轉基因(圖3A)，而該等融合瘤亦的確分別顯示在G20及T1中之1個及4個重排複本(圖3B、C－E)。因此，多個複本可在相同之等位基因上成功重排。接著提出疑問：該HCAb基因座是否具有優(劣)於正常鼠科動物基因座之任一優點(缺點)及是否存在基因座之對偶基因排除。在wt背景下分析G△細胞株1轉殖基因小鼠之B220/CD19陽性BM細胞的人類IgG及小鼠IgM表現。該等G△B細胞清楚表現小鼠Ig或人類Ig(圖3F)，展示對偶基因排除。
G△、M△G△及MG△轉殖基因小鼠中脾B細胞 為測定在μMT小鼠中轉基因對B細胞分化之作用，藉由流式細胞儀使用CD21/CD23曲線來檢測脾B細胞亞群尺寸(圖4A)。在G△小鼠中，CD21low CD23low 未成熟B細胞之比例在正常範圍內，且表現人類單鏈IgG之細胞均能分化成濾泡(FO；CD21＋CD23＋)B細胞及緣區(MZ；CD21high CD23low )B細胞。在M△G△小鼠中，未成熟B細胞部分增加，此表明表現HCAb IgM之細胞分化成FO及MZ 8 B細胞略微削弱。在此等脾中，CD23表現減少伴隨CD43及CD5之表面表現含量增加，此表明分化成B－1 B細胞譜系。存在於MG△轉殖基因小鼠中之少量表現人類IgM的B細胞(亦表現小鼠輕鏈，參見圖6)表明FO/MZ分佈類似於M△G△轉殖基因小鼠中之FO/MZ分佈。M△G△及G△而非MG△小鼠具有顯示T細胞分離之正常脾結構，T細胞群集在由含有存在於白髓之外邊界之濾泡及緣區的富含B細胞區包圍之動脈周圍淋巴鞘(PALS)中(圖4B)。
在T細胞依賴型抗體反應期間，亦在與wt相當之次級淋巴組織(未圖示)之B細胞濾泡中形成胚生長中心。此等生長中心為記憶形成及歸因於體細胞超突變之基於親和力之選擇的位點。在G△小鼠中，在此等胚生長中心中偵測到人類IgG陽性細胞。藉由自存在於派伊爾結中之B細胞的cDNA分析證實人類IgG基因之超突變(圖4C)。VHH 1及VHH 2均使用。總而言之，此等發現證明在G△及M△G△轉殖基因小鼠中自BM轉移之未成熟B細胞能夠在脾中分化成FO及MZB細胞且在抗原攻擊後經歷體細胞超突變。
單複本基因座有效拯救且C H 1缺乏為基本 G△細胞株1小鼠(圖2A)含有5複本G△基因座且因此存在有效拯救與基因座複本數相關之可能性。然而，藉由Flp重組經由用FlpeR細胞株培育23 ，自5複本G△細胞株1獲得之單複本轉殖基因細胞株拯救B細胞發展至類似程度(圖4D、圖2A)。藉由導致單複本G△細胞株之Cre重組(培育成cre表現細胞株)自未拯救之單複本細胞株MG△(細胞株3)消除Cμ及Cδ區，藉此證實基因之單複本足夠拯救，且具有CH 1區之Cμ恆定區的存在具有抑制性。先前未拯救之基因座現給出與其他G△細胞株相同之B細胞發展9 。因此，複本數不影響拯救且Cμ區中CH 1之存在抑制B細胞拯救(亦參見下文)。
小鼠Ig輕鏈基因座在M△G△及G△轉殖基因小鼠中未重排 藉由血清之西方墨點(未圖示，但參見圖2C及6A)或藉由FACS未在M△G△及G△小鼠中偵測到鼠科動物Ig輕鏈蛋白，此表明鼠科動物輕鏈基因未重排。此藉由南方墨點分析來比較自分類之脾B220＋細胞部分及肝細胞之DNA中Ig基因座生殖系信號之密度證實(圖5A及B)，說明小鼠輕鏈未重排且仍為生殖系構型。相比之下，在MG△/μMT小鼠中少量表現人類Ig之細胞中偵測到輕鏈(參見圖6G)。
因此，在BM中早期B細胞發展中人類HCAb之表現無法提供導致輕鏈重排之信號。在此情形下，HCAb模仿BCR而非前BCR，此很可能與HCAb無法在CH 1缺乏下結合假輕鏈相關[61]。
G△/μMT及M△G△/μMT小鼠之血清分析 人類IgM存在於M△G△血清中且人類IgG既存在於M△G△小鼠血清中亦存在於G△小鼠血清中。在未經免疫之成熟動物中，人類IgM(<50 μg/ml)及IgG(200－1000 μg/ml)以與在攜帶正常人類IgH基因座之正常小鼠或轉殖基因小鼠中可見之人類IgM及IgG含量相當的含量存在[65]。所有6隻G△小鼠之血清之凝膠電泳揭示在非還原條件下HCAb IgG具有約70 kD之MW且在還原條件下具有約35 kD之MW，符合缺乏輕鏈之重鏈二聚體及缺乏CH 1外顯子之各重鏈(圖6A、B)。
M△G△小鼠之血清含有多聚之只有重鏈的人類IgM。在還原條件下(圖6C)，所有四細胞株含有MW為人類對照IgM之MW減去CH 1之MW後的MW之IgM鏈。在非還原條件下亦將血清分級分離(圖6D水平部分)，此後在還原條件下藉由凝膠電泳分析各部分10 (圖6D垂直色帶)。當與人類血清五聚體900 kD IgM對照相比時，轉殖基因IgM在600 kD下分級分離，與其亦為多聚體且缺乏輕鏈及CH 1相符。因此在血清中，M△G△小鼠產生HCAb多聚體IgM及二聚體IgG，而G△產生二聚體IgG。
MG△小鼠之血清分析 在MG△/μMT細胞株之外周及脾中，幾乎無B220陽性細胞(<1%之野生型)且僅偶然之小B細胞簇在脾中可見(圖4B)。純化後，在血清中偵測到少量人類IgM及IgG(圖6E、F)。在還原條件下此等小鼠中人類IgM為正常尺寸，而循環人類IgG更短(明顯MW為35 kD，與缺失CH 1相符)。有趣地，亦偵測到可能與人類IgM相關之小鼠輕鏈(圖6G)。
在定量ELISA檢定中人類IgM及IgG在偵測含量以下，但吾人仍測試MG△/μMT小鼠是否可對免疫起反應。將小鼠用人類腫瘤壞死因子－α(TNF－α)免疫且wt小鼠發展強烈TNF－α特異性抗體反應，而在所用兩隻MG△細胞株3小鼠中，抗原特異性人類IgG不能藉由ELISA或西方墨點分析偵測到(未圖示)。
M△G△及G△小鼠之免疫導致抗原特異性Ab產生 用大腸桿菌hsp70、DKTP(白喉類毒素(Diphteria toxoid )、百日咳博德氏桿菌(Bordetella Pertussis )之全部細胞溶解產物、破傷風類毒素(Tetanus toxoid)及1、2及3型經鈍化之脊髓灰質炎病毒)及rtTA免疫G△/μMT小鼠，而用人類TNFα免疫M△G△小鼠。藉由ELISA自具有陽性血清之小鼠，使用融合瘤或單結構域Ab(sdAb)藉由噬菌體呈現庫分離個別完整抗體。
抗體RNA之RTPCR後定序αhsp70、破傷風類毒素及rtTA特異性單株(圖7A)。此顯示產生IgG2(7/8)及IgG3(1/8)抗體(sdAb自IgG2文庫分離)。使用不同D及J區。雖然不在高頻率下，但自11 HCAb之VHH 經超突變。三個hTNFα特異性抗體(一個陽性IgM融合瘤，圖6 α－hTNFα #1及兩個sdAb α－hTNFα #2 & 3)均具有在CDR2區之不同超突變。當比較所有14個抗體之序列時，顯然雖然使用所有J區，但例如在人類中JH 4使用最頻繁。令人驚奇地，所有抗體含有駱駝VHH 2(在49位上具有麩醯胺酸(Q)而非原始型麩胺酸)。最後無疑CDR3區提供大部分多樣性27 。其長度在10與20個胺基酸之間變化(平均13.6 aa)，極類似於常在駱駝及人類中所見之長度。接著在常規檢定中測試此等HCAb是否如融合瘤上清液及sdAb之細菌周質部分具有功能性(圖7)。所有抗體在ELISA中為陽性且所有抗體在西方墨點上抗原偵測中為陽性(例如α－DKTP及α－rtTA血清及融合瘤培養基及α－百日咳博德氏菌sdAb，圖7B)。亦使用經rtTA表現質體轉染之細胞株在免疫細胞化學中測試α－rtTA IgG(圖7C、D)。rtTA HC－IgG給出非常清楚且特異之核染色。雖然某些抗體(尤其sdAb)之親和力極低，但大量抗體之親和力係高的。舉例而言，免疫細胞化學中所用之α－rtTA抗體(圖7C、D)為如BiaCore上所測定之約3 nM(圖7E)。
結論
本文報道在μMT小鼠中拯救B細胞發展，導致產生功能性HCAb之經修飾HCAb基因座之表現。此等小鼠可經免疫以產生抗原特異性HCAb。如在駱駝科動物中，雖然CH 1之移除對HCAb分泌而言係關鍵，但在3'CH 1/內含子邊界上之單個駱駝科動物(評論30 )剪接突變不足以消除CH 1，因此至少在人類基因座中需要更多此單點突變。具有結合VHH 之CH 1的IgM阻斷B細胞發展，可能由前BCR之情形下IgM表面分子之無效裝配引起。相比之下，表現類HCD人類μ蛋白之小鼠在獨立於λ5之SCID背景[54]中發展正常CD43前B細胞。截短之Cμ蛋白在無相關L鏈下表現於B細胞表面上且認為其經由自體凝集來模仿前BCR信號轉導[55]。
通常BiP藉由結合隨後參與鏈內接觸之Ig鏈的疏水性表面來伴隨抗體分子之折疊及裝配31 。親水性胺基酸在VHH 之FR2中之存在最可能阻止BiP結合VHH ，VHH 無需(替代)輕鏈來變得可溶。同時，CH 1與計劃固持ER中重鏈之BiP相互作用直至裝配(以輕鏈代替BiP)完成。在前B細胞受體之程度上，結果表明當含有CH 1結構域之μ重鏈連接VHH 時，轉殖基因μ重鏈與Vpre蛋白(作為與λ5蛋白非共價結合之替代輕鏈(SLC)之部分)之配對不能發生。因此，MGS及MG△轉殖基因小鼠中人類IgM在此點上類似不完整之類前BCR複合物，已知該複合物對信號增生性擴大及發展進程而言不足夠。此可解釋為何BM中僅30%之B220陽性細胞具有細胞內IgM(圖2B)。此等小鼠之脾中少量成熟B細胞之存在可由含有μ重鏈但缺乏任一SLC或習知輕鏈之近來所述之新穎受體複合物來解釋[58]。
當Cγ2及3缺乏CH 1且IgM自基因座移除時，存在B細胞發展之拯救，展示IgG在功能上可代替IgM。自祖B細胞階段起表現之IgG1受體能夠在支持Rag2－/－小鼠[59]中成熟CD21＋ B細胞發展上代替IgM。近來亦顯示在μMT(及C△－/－)背景13 下在1/2轉殖基因小鼠中預先重排之駱駝科動物IgG2a可部分拯救B細胞發展。在吾人之狀況下，在全部獨立轉殖基因小鼠細胞株中缺乏CH 1之IgM或IgG拯救B細胞發展。此外，未觀測到輕鏈重排且推斷B細胞進一步分化無需輕鏈表現。由於吾人之構築體上包括LCR，所以本文所獲得之結果與Zou等人[60]之結果的差異可藉由重鏈基因座之表現含量(且因此信號轉導)來解釋。吾人之結果證實缺乏CH 1[61]或VH 及CH 1[62]之截短之μ重鏈蛋白不能與SLC相聯且無法激活基因重排。
5複本G△細胞株1(及其他多複本細胞株)在與整合在基因組中相同位置上之單複本細胞株相同之程度上拯救B細胞發展。有趣地是，在多複本轉殖基因座中發生一或多個重排(圖3)。源自兩個單脾細胞之兩個融合瘤產生兩生產性HCAb轉錄物及蛋白。此結果證實兩種抗體在相同B細胞中之表現為非毒性的[63]。然而，在抗原攻擊下產生雙抗體之B細胞與產生單抗體之細胞競爭鬆散之預測37 未藉由吾人發現自抗原攻擊後獲得之5融合瘤的表現2雙抗體之細胞之結果來證實。
野生型小鼠中，(多複本)基因座經受對偶基因排除，此係因為BM細胞在細胞表面上表現小鼠或人類Ig。無顯著量之在細胞表面上表現之細胞(圖3F，頂部圖)。最有趣的可能係表現小鼠Ig對人類Ig之細胞數量。在wt/5複本G△小鼠中，存在三種可能用於重排之等位基因，具有一個Ig基因座之兩個小鼠等位基因及具有五個人類HCAb基因座之一個等位基因。若推測選擇，則僅1/3次選擇人類等位基因。
若計數基因座數量，則人類基因座首先在5/7細胞中重排。然而，內源性小鼠及轉殖基因人類HCAb幾乎同等表現(44/38，圖3F底部圖)。雖然此等數量忽略隨機使用V區之可能誤差及影響轉殖基因座之可能位置，但此等數量強烈表明第一選擇為等位基因之推測選擇繼而每一等位基因可能重排多個基因。
此與吾人常觀測到之G△基因座之多個重排一致。通常生產性重排下調重組以預防其他等位基因之重排。然而，轉殖基因等位基因上多個複本存在於相同開放基因座上且明顯可在RAG下調前重組。此可能因為多個重排同時發生或若基因座涉及空間組份("隔間")則當基因座在RAG下調前關閉時存在足夠時間在基因座中重排另一基因。
僅當wt小鼠中重排為非生產性時(無信號轉導且RAG繼續停留)，對第二基因座而言存在足夠時間進行活化、代替第一基因座且進行重排。支持此論點的係觀測到具有相同染色體上多個基因座之其他物種具有更多表現兩個Ab之細胞[64]。
重要地，此等實驗顯示HCAb基因座可在小鼠中成功表現。抗原攻擊導致視基因座組成而定之不同類別之高親和力抗原特異性人類HCAb的產生。此等抗體以與正常小鼠或其他"正常"人類IgH轉殖基因小鼠中之含量相當之含量[65]表現。僅兩個可變區用於實驗中，而具有各種特異性之高親和力抗體成功分離至幾乎所有所測試之完全無關蛋白，此證明藉由CDR3產生之多樣性的效率及功效[66]。因此，V(D)J重組及活體內選擇提供優於使用噬菌體呈現自噬粒文庫產生人類單鏈抗體片段之關鍵性優點39 。融合瘤可易於產生，此使得完整人類HCAb或sdAb片段直接選殖及表現而無需噬菌體呈現及進一步篩檢。
因此，此等小鼠完全打開用於產生人類HCAb之新的可能性以達成臨床或其他目的，尤其考慮到HCAb可識別對習知抗體幾乎不具有抗原性之抗原決定基(諸如酶之活性位點)。有限數量之可變區可解釋為何不識別所有抗原；脊髓灰質炎及白喉蛋白在G△小鼠中未產生反應，而在wt對照小鼠中產生反應。令人驚奇地，所有抗體均具有駱駝VHH 2區。與具有一個保守胺基酸且應更可溶之VHH 1對比，此不包括49位上之保守胺基酸[67]。
然而，期望在基因座中添加更多可變區導致甚至更廣泛譜系。雖然較佳避免在單個等位基因上基因座之多個複本，但有利的係產生含有多個等位基因之小鼠，各等位基因包含單複本之不同VH 區以增加多樣性。在該等新基因座中，可使用天然產生(人類)之VH 區或經工程處理以增加溶解性18 及輕鏈配對之VH 區。
總之，證明潛在任一類別之抗原特異性高親和力HCAb可在小鼠中產生。此技術允許任一類別之完整人類HCAb或其片段對抗原攻擊起反應而產生以在人體內用作治療或診斷劑。藉由使用不同脊椎動物基因座，吾人之技術亦慮及高親和力成熟抗體自任一脊椎動物產生以用作試劑、診斷劑或用於治療動物。
實例2
Janssens等人(2006)已說明轉殖基因VH 基因座適當重組以產生基因轉殖上經編碼之只有重鏈的抗體及該基因座在內源性(小鼠)重鏈免疫球蛋白基因座存在下對對偶基因排除敏感。為說明用於產生只有重鏈的抗體之VH 轉殖基因座之數量可藉由使用對偶基因排除之方法來增加，將含有只有重鏈的不同基因座之兩隻轉殖基因小鼠雜交，導致含有兩種基因座之後代產生。一小鼠含有MG△基因座(IgM及IgG基因座，Janssens等人，2006)，而另一小鼠含有G△基因座(僅IgG基因座，Janssens等人，2006)，兩小鼠均具有μMT背景。融合瘤衍生自來自雙轉殖基因後代之B細胞且藉由標準方法在培養基中生長。藉由PCR及南方墨點分析大量所得個別單株細胞株，顯示含有經生產性重排之MG△基因座之細胞株亦含有未經重排之G△基因座或未經生產性重排之G△基因座。相反地，含有經生產性重排之G△基因座之細胞株亦含有未經重排或未經生產性重排之MG△基因座。因此，總的可用VH 區係用於重組方法中。
實例3及4：
在本發明之第一態樣之較佳實施例中，功能人類VH 區之總數藉由使用先前實例所述且此項技術中已知之彼等方法(Janssens等人2006)選殖人類VH 區(或其變異體)至含有完整DH 區、完整JH 區及Cμ、Cγ2、Cγ3及Cα區與3'LCR之組合之經修飾之多個人類基因座上來增加。此程序可使用單獨基因座上多個類似VH 區或單獨基因座上不同VH 區來實施。不同基因座可含有相同重鏈區或不同重鏈區。實例3係針對具有在具有不同重鏈區組合之基因座上相同VH 區的基因座，實例4係針對兩個具有相同重鏈恆定區但不同VH 區之基因座。在兩個實例中顯然可添加額外基因座。
實例3
人類VH 區藉由人類基因組DNA之PCR擴增使用特異性針對自可能39個功能人類VH 區之各經選擇之VH 的引子來分離(或者可使用或添加人類VL 區或TCR V區或藉由突變形成所衍生之所有此等之變異體)。成套選殖人類VH 區至以上實例所述之基因座上(圖9)，亦即包含人類DH 加JH (或其他D及J區)及各均缺乏CH 1之Cμ、Cγ2、Cγ3加3'LCR之基因座。缺乏CH 1加變換區之Cα區單獨選殖在G△基因座中(圖10)。此G△基因座為原始基因座之變異體，因為其不含有lox位點且駱駝VHH 區藉由標準同源重組移除，留下獨特PI－PspI位點(圖10)。
功能VH 區可一起選殖，其中在各基因座上具有任一多個功能VH 區。最初，每套組2個經選殖之基因開始將17個功能人類VH 區選殖成一套組。藉由習知方法(例如使用XhoI－SalI限制消化/連接，XhoI及SalI相容位點之連接將其兩者破壞)添加第二套組至此等原始構築體之每一者。含有4、4、4、3及2之套組連接至BAC載體中一套組17個基因中。顯然此程序可藉由組合含有其他若干基因之套組來實施。以上方法可在任一點終止以達成所需VH 區數目或延伸以達成更高數目之VH 區。
將整套(例如，17個基因)選殖至在獨特PI－PspI位點中經修飾之G△基因座。將Cα區選殖至此基因座之I－CeuI位點，導致能夠產生Igα及IgG之A△G△基因座(圖10)。或者可選殖其他重鏈區。
接著將此等最終基因座引入如以上實例所述之單獨轉殖基因小鼠(較佳具有缺陷小鼠IgH基因座，諸如μMT)中。此等單獨基因座係用以產生單獨小鼠細胞株，僅產生IgG之細胞株及產生IgA及/或IgG之細胞株。隨後雜交此等小鼠以使兩個不同基因座上可用VH 區之總數達34。雜交此等小鼠達成兩基因座之純合性使得68個VH 區可用於重組。然而具有多個複本之經整合基因座進一步增加此數量。對自此等小鼠之B細胞製成之融合瘤的分析用以展示當生產性重排基因座存在時其他同種繁殖之基因座由於藉由標準程序之對偶基因排除而未經重排或未經生產性重排。
實例4
將類似分離至以上所述區之不同套組之一或多個VH 區(或藉由突變形成所衍生之其變異體)藉由如上所述之相同方法選殖至兩個單獨基因座上。此導致兩個不同G△基因座(或諸如添加Cα之其變異體)。將此等基因座引至單獨小鼠中，導致單獨轉殖基因細胞株(例如各具有10VH 結構域之兩個基因座，圖11)。隨後雜交此等小鼠以獲得具有可用於重組過程之所有VH 區之雙轉殖基因小鼠。雜交此等小鼠達到兩基因座之純合性將使可用於重組之VH 區的數目加倍(圖12，一基因座整合在染色體1且一基因座整合在染色體8上之核型)。然而具有多個複本之經整合基因座進一步增加此數目。對自此等小鼠之B細胞製成之融合瘤的分析用以展示當生產性重排基因座存在時其他同種繁殖之基因座由於對偶基因排除而未經重排或未經生產性重排。
以上過程可在任一點終止以達成所需數目之VH 區。將D、JH 及恆定區添加至此等VH 區。接著將此等最終基因座引入如以上實例所述之單獨轉殖基因小鼠(較佳具有缺陷小鼠IgH基因座)中。或者lox位點之位置使得個別恆定區消除以產生含有單獨Cμ(IgM)或單獨Cγ2及Cγ3(IgG2及IgG3)或單獨Cα(IgA)或其組合之單獨基因座。此等單獨基因座用以產生製成單獨人類IgM或單獨IgG或單獨IgA或其組合之單獨小鼠細胞株。
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圖1： 用以產生轉殖基因小鼠之DNA片段的圖示。將兩個駱駝VHH 外顯子連接人類重鏈多樣性(D)及接合(J)基因區段，繼而Cμ、Cδ、Cγ2及Cγ3人類恆定區基因及人類重鏈Ig 3' LCR。人類Cγ2及Cγ3基因之修飾係CH 1外顯子完全缺失於構築體MG△及G△中Cγ2及Cγ3基因或亦缺失於構築體M△G△中Cμ。相同方向上兩個Lox P位點(紅色)之存在使Cμ及Cδ基因能夠在Cre介導之重組後移除。Frt位點(綠色)之存在使單一複本轉殖基因小鼠能夠藉由Flp介導之重組自多複本轉基因陣列產生。
圖2： 圖A：B淋巴細胞之流式細胞術分析之表，表示為不同器官中總細胞之B220/CD19陽性細胞之百分比。圖B：BM中wt、μMT、MG△/μMT、M△G△/μMT及G△/μMT小鼠之B細胞數量之流式細胞術分析。以前分散及側分散為基礎來門控淋巴細胞且畫出B220及人類IgM或IgG之表面表現。資料展示為點陣圖。針對MG△ μMT小鼠，門控B220＋部分且分析細胞內(ic)人類Ig μ及γ H鏈之表現，展示為柱狀覆蓋圖(紅線)，用自μMT小鼠之B220＋細胞(黑線)的背景染色作為對照。指示陽性細胞之百分比。圖C：M△G△或G△轉基因之表現拯救前BCR及BCR功能。自μMT小鼠之總CD19＋部分(祖B細胞)、自野生型小鼠之CD19＋表面IgM部分(祖B/前B細胞)及CD19＋表面IgM＋部分(B細胞)、自M△－G△ μMT小鼠之CD19＋表面人類IgM＋部分(B細胞)及自G△ μMT小鼠之CD19＋表面人類IgG＋部分(B細胞)中之指示標記的表現曲線。ic－Ig＝細胞內IgL鏈。流式細胞術資料展示為柱狀圖。所示資料代表每組內所檢測之3－8個動物。圖D：使用VHH 1及VHH 2特異性引子結合人類Cγ2引子自BM cDNA獲得之PCR產物的序列對準，顯示VDJ重組。序列來自G△。綠色展示序列一致性。
圖3： 圖A－E：五複本人類G△基因座之DNA FISH。圖A：自攜帶G△基因座之五個完整複本(1－5)的G△細胞株1轉殖基因小鼠之肺細胞之伸展染色質纖維，側面為一半基因座含有LCR(紅色)且一半基因座載運VHH 至J區(綠色)。圖B：衍生自其中一個複本已重排(白色箭頭)之G△細胞株1B細胞的融合瘤(G20)之伸展染色質纖維FISH。圖C：具有LCR探針(紅色)之融合瘤T1之DNA FISH未伸展。圖D：與C相同，其中探針(綠色)在VHH 與D之間。圖E：圖C及E之交疊圖。注意，T1具有四個重排，該等重排可視作與無損失之紅信號相比的4個綠信號損失。圖F：保存G△轉殖基因小鼠中對偶基因排除。流式細胞術分析鼠科動物表面或細胞內(ic)μH鏈及自指示小鼠之總BM CD19＋細胞部分上轉殖基因人類IgG。資料展示為點陣圖且細胞百分比在所指示之象限內給出。所示資料代表每組內所檢測之4隻小鼠。
圖4： 分析wt、μMT、G△、M△G△及MG△小鼠之脾中B細胞數量。所示資料代表每組內所檢測之4－8隻小鼠。圖A：頂部，針對小鼠IgM、人類IgG、人類IgM染色之脾細胞之FACS資料與B220關係曲線。底部，流式細胞術分析脾中B細胞數量。以前分散及側分散為基礎來門控淋巴細胞，且B220及所指示之Ig(最高部分)或CD21/CD23曲線之表面表現展示為點陣圖，且給出所指示門內之細胞百分比。CD21low CD23low ：未成熟B細胞；CD21＋CD23＋：濾泡細胞；CD21high CD23low ：緣區B細胞。圖B：wt、μMT、G△/μMT、M△G△/μMT及MG△/μMT小鼠之脾之組織結構。免疫組織化學分析；針對B細胞，將5 μm冷凍切片用抗B220(藍色)染色，且針對樹突狀細胞，將5 μm冷凍切片用抗CD11c/N418(棕色)染色。箭頭指示MG△脾中小叢B細胞之位置。圖C：使用VHH 1及VHH 2特異性引子結合人類Cγ2引子自派伊爾結(Payer's patches)cDNA獲得之PCR產物的序列對準，顯示轉殖基因座在CDR1及2區經歷超突變。序列來自CH 1缺失之轉殖基因座G△。圖D：頂部：脾細胞之FACS資料，用抗CD19及抗B220染色。底部左邊：藉由培育FlpeR轉殖基因細胞株之活體內Flp重組及衍生自五複本G△細胞株1之單一複本重組體的脾細胞上FACS資料之圖示。底部右邊：藉由培育MG△細胞株為CAGCre轉殖基因細胞株且支持關於重組體之脾細胞之FACS掃描資料之活體內Cre重組的圖示，顯示如直接產生之初始G△細胞株中可見之B細胞拯救。
圖5： 顯示在G△/μMT(圖A)及M△G△/μMT(圖B)轉殖基因細胞株中輕鏈重排之缺乏的南方墨點。自一隻wt小鼠及兩隻G△或四隻M△G△轉殖基因小鼠之肝DNA(L)及B細胞DNA(B)經Hind III消化且用32 P放射性標記之J探針及碳酸酐酶II(CAII)探針探測。將與4 kb帶雜交之CAII探針用作負載對照。對肝DNA進行實驗以顯示生殖系構型(2.8 Kb帶)。僅wt B細胞顯示基因座重排，量測為2.8 kb片段之強度減少(當與肝相比時丟失30%信號)。
圖6： 在非還原(A)及還原條件(B－G)下進行之μMT背景中6個不同G△細胞株(A、B)、4個不同M△G△細胞株(C)及2個不同MG△細胞株(E－G)之經Prot G或concavalin純化之血清樣品。轉殖基因人類IgG(圖B、F)及IgM(圖C、D)之尺寸符合CH 1缺失及輕鏈缺乏。小鼠輕鏈為正常尺寸(G)。將人類血清用作正性對照。圖D：在非還原條件下在人類IgM對照中混合後M△G△血清之Superose 6尺寸分級分離。在還原條件下藉由凝膠電泳法分析各溶離份。自Superose 6管柱收集之溶離份係自左(高MW)至右(低MW)。對照組為混合於人類IgM對照血清中之前的單獨人類血清(左邊第一色帶)及小鼠血清(色帶M△G△血清)。指示尺寸標記。
圖7： 圖A：特異於破傷風類毒素、HSP70、rtTA及人類TNFα之單株抗體cDNA之序列。頂部序列係生殖系VHH 2序列。CDR1、2及3及鉸鏈區指示於序列上方。不同同型及類別藉由右邊之不同顏色指示。所用之J區指示於右邊。圖B：使用不同只有重鏈的抗體(融合瘤、血清及sdAd)之西方墨點的實例。左圖：抗rtTA血清及融合瘤培養基分別稀釋1/100及1/250倍。中間圖：自wt及G△小鼠之抗DKTP血清分別稀釋1/200及1/100倍。右圖，對抗含有百日咳博德氏菌(B.Pertussis)抗原(DKTP)或缺乏其(DTP，因為不能購得純百日咳博德氏菌抗原)之疫苗的抗百日咳博德氏菌sdAd。圖C及D：額外用標記質體(藉由在細胞質中表現標記蛋白來對存在之rtTA起反應51 )轉染之Tet－on細胞株之一的免疫染色。圖C顯示表現rtTA之細胞核(綠色)。圖D顯示標記蛋白在細胞質中經去氧羥四環素對rtTA起反應誘發之表現(紅色)，經DAPI染色之細胞核(藍色)。圖E：抗rtTA抗體之BiaCore分析之實例。指示親和力。
圖8： 圖A：具有類駱駝科動物之剪接突變之Ig基因座之圖示。兩個人類IgG恆定區(Cγ2及Cγ3)首先藉由改變剪接G＋1 至A＋1 來突變，咸信導致駱駝科動物IgG HCAbs(描述為Gγ2－S及Gγ3－S)中CH 1外顯子跳躍。基因座含有兩個駱駝VHH 區、所有人類D及JH 區及人類Cμ、Cδ及Cγ2及Cγ3及LCR(亦參見正文)。將此等基因座引至μMT轉殖基因小鼠體內且分析人類基因座之表現。圖B：來自GS小鼠之骨髓(BM)人類IgG cDNA之定序顯示兩VHH 均與不同人類D及J區段重組且用Cγ2恆定區轉錄。然而，CH 1外顯子仍存在，保存經剪接出之最後16 bp。在進行中，歸因於內含子1之4位之A至G轉變[31]，CH 1外顯子中相同隱藏剪接位點報導於白血病患者中。MGS或GS細胞株中無一者拯救μMT小鼠中B細胞發展(未圖示)。雖然小鼠B細胞轉錄/轉譯機構可加工經重排之單峰駱駝VHH －γ2a[34,60]，但資料顯示除G至A突變外，其他特徵對CH 1外顯子跳躍係重要的。
圖9： 將人類VH 區選殖至如實例3及4中所述之各種基因座的圖示。
圖10及11： 含有多個VH 基因區段、完整D區、完整JH 區、Cγ2、Cγ3及Cx區及3'LCR之重鏈基因座之實例。
圖12： 顯示具有整合在染色體1上之一基因座及整合在染色體8上之一基因座的核型。
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Claims (32)

  1. 一種用於在轉殖基因非人類哺乳動物體內產生只有VH 重鏈的抗體之方法，該方法包含下列步驟：在該哺乳動物體內提供存在於不同染色體上之一種以上異源VH 重鏈基因座，其中各VH 重鏈基因座包含一或多個V基因區段、一或多個D基因區段、一或多個J基因區段及一編碼當表現時不包括CH 1結構域之重鏈恆定區之基因區段，且其中經抗原攻擊後，於B細胞中僅有一個基因座為生產性重排，並因此生產只有VH 重鏈的抗體；以及自該生產性重排基因座表現只有VH 重鏈的抗體。
  2. 如請求項1之方法，其中每一基因座僅包含一V基因區段。
  3. 如請求項2之方法，其中每一V基因區段不同於所有其他V基因區段。
  4. 如請求項2之方法，其中每一V基因區段與所有其他V基因區段相同。
  5. 如請求項4之方法，其中每一基因座中該等其餘基因區段與所有其他基因座中彼等其餘基因區段相同。
  6. 如請求項4之方法，其中每一基因座中該等其餘基因區段不同於所有其他基因座中彼等其餘基因區段。
  7. 如請求項1之方法，其中每一基因座包含多個V基因區段。
  8. 如請求項7之方法，其中任一基因座中該等V基因區段均 衍生自相同物種之生物。
  9. 如請求項7之方法，其中任一基因座中該等V基因區段衍生自不同物種之生物。
  10. 如請求項8之方法，其中該等V基因區段來源於人類。
  11. 如請求項1之方法，其中該多個重鏈基因座包含一或多個基因區段，該基因區段係選自39個功能人類V基因區段及具有橫跨該多個基因座分佈之改良溶解性之其基因工程變異體。
  12. 如請求項1之方法，其中每一不同重鏈基因座以單複本存在於該轉殖基因非人類哺乳動物之基因組中。
  13. 如請求項1之方法，其中每一VH 重鏈基因座包含1至40個D基因區段。
  14. 如請求項1之方法，其中該等D基因區段為人類D基因區段。
  15. 如請求項1之方法，其中每一VH 重鏈基因座包含1至20個J基因區段。
  16. 如請求項15之方法，其中該等J基因區段為人類J基因區段。
  17. 如請求項1之方法，其中每一VH 重鏈基因座含有相同之D及J基因區段。
  18. 如請求項1之方法，其中每一VH 重鏈基因座含有不同組合之D及J基因區段。
  19. 如請求項1之方法，其中每一VH 重鏈基因座包含一或多個V基因區段、25個功能人類D基因區段及6個人類J基因 區段。
  20. 如請求項1之方法，其中每一VH 重鏈基因座包含編碼提供活體內效應功能之至少一個重鏈恆定區之基因區段，其中當表現時在該抗體中該恆定區不包括CH 1結構域。
  21. 如請求項20之方法，其中每一基因座僅含有一編碼一特定恆定區之基因區段。
  22. 如請求項20之方法，其中每一基因座包含一個以上之基因區段，每一基因區段編碼不同之恆定區。
  23. 如請求項20之方法，其中每一基因座含有編碼恆定區之相同基因區段。
  24. 如請求項20之方法，其中每一基因座具有不同或不同組合之編碼恆定區之基因區段。
  25. 如請求項20之方法，其中編碼重鏈恆定區之每一基因區段包含Cδ、Cγ1-4 、Cμ、Cε或Cα1-2 類別之一或多個重鏈恆定區外顯子，其限制條件為該等重鏈恆定區基因區段不表現CH 1結構域。
  26. 如請求項20之方法，其中該重鏈恆定區係來源於人類。
  27. 如請求項1之方法，其中該轉殖基因非人類哺乳動物為齧齒動物。
  28. 如請求項27之方法，其中該齧齒動物為小鼠。
  29. 一種製造轉殖基因非人類哺乳動物之方法，該轉殖基因非人類哺乳動物包含存在於不同染色體上之一種以上之異源VH 重鏈基因座；其中各VH 重鏈基因座包含一或多個V基因區段、一或多個D基因區段、一或多個J基因區段 及一編碼當表現時不包括CH 1結構域之重鏈恆定區之基因區段；且其中經抗原攻擊後，於B細胞中僅有一個基因座為生產性重排，並因此生產只有VH 重鏈的抗體；其中該方法包含：(i)單獨引進異源VH 重鏈基因座至非人類哺乳動物中；及(ii)雜交此等哺乳動物以產生子代。
  30. 一種製造轉殖基因非人類哺乳動物之方法，該轉殖基因非人類哺乳動物包含存在於不同染色體上之一種以上之異源VH 重鏈基因座；其中各VH 重鏈基因座包含一或多個V基因區段、一或多個D基因區段、一或多個J基因區段及一編碼當表現時不包括CH 1結構域之重鏈恆定區之基因區段；且其中經抗原攻擊後，於B細胞中僅有一個基因座為生產性重排，並因此生產只有VH 重鏈的抗體；其中該方法包含：注射VH 重鏈基因座至衍生自非人類哺乳動物之卵或ES細胞，且該卵或ES細胞已包含一或多個異源VH 重鏈基因座。
  31. 一種用於產生只有重鏈的抗體之方法，該方法包含如請求項29或30之方法製造一種轉殖基因非人類哺乳動物，其中該轉殖基因非人類哺乳動物包含存在於不同染色體上之一種以上之異源VH 重鏈基因座，並係用抗原免疫該轉殖基因非人類哺乳動物。
  32. 一種產生高親和力之抗原特異性之只有VH 重鏈的抗體之方法，該方法包含：如請求項29或30之方法製造一種轉殖基因非人類哺乳 動物，其中該轉殖基因非人類哺乳動物包含存在於不同染色體上之一種以上之異源VH 重鏈基因座；用抗原免疫如該轉殖基因非人類哺乳動物；產生B細胞融合瘤；選擇表現抗原特異性之只有重鏈的抗體之細胞；且分離抗原特異性之經重組之親和力成熟的只有VH 重鏈之抗體。
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