RU2528737C2 - Растворимые антитела, содержащие только тяжелые цепи - Google Patents
Растворимые антитела, содержащие только тяжелые цепи Download PDFInfo
- Publication number
- RU2528737C2 RU2528737C2 RU2011142759/10A RU2011142759A RU2528737C2 RU 2528737 C2 RU2528737 C2 RU 2528737C2 RU 2011142759/10 A RU2011142759/10 A RU 2011142759/10A RU 2011142759 A RU2011142759 A RU 2011142759A RU 2528737 C2 RU2528737 C2 RU 2528737C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- domains
- heavy chains
- antibodies
- human
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 125
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 123
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 123
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 123
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 66
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 180
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 120
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 40
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 33
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 31
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 28
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 25
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 23
- 238000013459 approach Methods 0.000 claims description 22
- 210000002809 long lived plasma cell Anatomy 0.000 claims description 19
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 18
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 17
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 17
- 210000001806 memory b lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 17
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 15
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 14
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 102100035721 Syndecan-1 Human genes 0.000 claims description 11
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 2
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 claims 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 38
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 13
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 79
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 56
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 42
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 34
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 30
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 27
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 25
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 24
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 23
- 244000303258 Annona diversifolia Species 0.000 description 22
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 20
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 20
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 19
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 description 19
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 19
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 19
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 18
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 18
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 17
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 16
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 16
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 16
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 16
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 15
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 12
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 12
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 12
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 101150008942 J gene Proteins 0.000 description 10
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 10
- 101150097493 D gene Proteins 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 101000727061 Homo sapiens Complement receptor type 1 Proteins 0.000 description 9
- 238000001400 expression cloning Methods 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 7
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 6
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 102000046508 human CR1 Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 4
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 4
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 4
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 4
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 4
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 3
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 3
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 230000007720 allelic exclusion Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 3
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 2
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 208000012239 Developmental disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 2
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 2
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 2
- 208000014767 Myeloproliferative disease Diseases 0.000 description 2
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 2
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 2
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 2
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 2
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 2
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 2
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 description 2
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 102000003705 Syndecan-1 Human genes 0.000 description 2
- 108090000058 Syndecan-1 Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 2
- 208000037883 airway inflammation Diseases 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 2
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- -1 at position 13 Chemical class 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 2
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000009134 cell regulation Effects 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 2
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 2
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 2
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 2
- 210000003739 neck Anatomy 0.000 description 2
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 2
- 201000001282 rectum sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 210000005212 secondary lymphoid organ Anatomy 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 2
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 2
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 1
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 102100024153 Cadherin-15 Human genes 0.000 description 1
- 101100228196 Caenorhabditis elegans gly-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000762242 Homo sapiens Cadherin-15 Proteins 0.000 description 1
- 101000714553 Homo sapiens Cadherin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000840258 Homo sapiens Immunoglobulin J chain Proteins 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102100029571 Immunoglobulin J chain Human genes 0.000 description 1
- ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N L-Histidinol Natural products OCC(N)CC1=CN=CN1 ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N L-histidinol Chemical compound OC[C@@H](N)CC1=CNC=N1 ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100058506 Mus musculus Bloc1s5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 229940124691 antibody therapeutics Drugs 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000003320 cell separation method Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000003936 denaturing gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N hydrochloric acid Substances Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000004904 long-term response Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012514 monoclonal antibody product Substances 0.000 description 1
- 238000002625 monoclonal antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000021048 nutrient requirements Nutrition 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 210000001948 pro-b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 239000003087 receptor blocking agent Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002619 short lived plasma cell Anatomy 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010863 targeted diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
- A01K67/027—New breeds of vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
- C07K16/1271—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Micrococcaceae (F), e.g. Staphylococcus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/567—Framework region [FR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Abstract
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Раскрыт антиген-специфическое растворимое антитело с высокой аффинностью, содержащее только тяжелые цепи. Антитело не содержит характерные для верблюдовых замены аминокислот и содержит замены FR2, которые не найдены в антителах, которые содержат тяжелую и легкую цепи. Антитело обладает повышенной суммарной гидрофобностью в CDR1 и содержит увеличенное число заряженных аминокислот, присутствующих в CDR3, и содержит одну или более замен аминокислот в β-складчатом слое каркасной области, которые ведут к повышению суммарной гидрофобности в FR1 и к увеличению числа заряженных аминокислот, присутствующих в FR3. Также предоставлены домены VH, которые обладают теми же свойствами, генные сегменты для их получения, способы их получения и использование антитела доменов VH в терапии. 3 н. и 11 з.п. ф-лы, 26 ил., 9 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к усовершенствованным способам выделения из трансгенных млекопитающих, не относящихся к человеку, широкого репертуара функциональных растворимых антител, содержащих только тяжелые цепи, и растворимых доменов VH, полученных из них, которые структурно отличны от доменов VH, полученных из антител, содержащих тяжелые и легкие цепи. Предпочтительно, антитела, содержащие только тяжелые цепи, и растворимые домены VH получают из долгоживущих плазматических клеток или В-клеток памяти.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Моноклональные антитела или их варианты составляют большую часть новых лекарственных средств, выпущенных в XXI веке. Терапия моноклональным антителами уже принята в качестве предпочтительного пути лечения ревматоидного артрита и болезни Крона, а также имеет место впечатляющий прогресс в лечении злокачественных опухолей. Также в разработке находятся продукты на основе антител для лечения сердечнососудистых и инфекционных заболеваний. Большинство представленных на рынке продуктов моноклональных антител распознают и связывают один четко определенный эпитоп на целевом лиганде (например, TNFα).
Структура антител хорошо известна в данной области. Большинство природных антител являются тетрамерами и содержат две тяжелых цепи и две легких цепи. Тяжелые цепи соединены друг с другом через дисульфидные связи между шарнирными доменами, расположенными приблизительно посередине каждой тяжелой цепи. Легкая цепь связана с каждой тяжелой цепью на N-концевой стороне шарнирного домена. Каждая легкая цепь обычно связана с соответствующей ей тяжелой цепью дисульфидной связью рядом с шарнирным доменом.
Когда молекула антитела уложена правильно, каждая цепь уложена в определенное число отдельных глобулярных доменов, соединенных более линейной полипептидной последовательностью. Например, легкая цепь уложена в вариабельный (VL) и константный (CL) домены. Тяжелая цепь имеет один вариабельный домен (VH) рядом с вариабельным доменом (VL) легкой цепи, первый константный домен (СН1), шарнирный домен и еще два или три константных домена. Взаимодействие вариабельных доменов тяжелой (VH) и легкой (VL) цепей приводит к образованию антигенсвязывающей области (Fv).
Взаимодействие между тяжелыми и легкими цепями опосредовано первым константным доменом тяжелой цепи (СН1) и константным доменом (CL) легкой цепи. Однако также существует поверхность контакта между вариабельным доменом тяжелой цепи (VH) и вариабельным доменом легкой цепи (VL), которая участвует во взаимодействии между тяжелой цепью и легкой цепью.
Поскольку вариабельные домены имеют различные аминокислотные последовательности, разработана система нумерации аминокислотных остатков в этих доменах. Эта система нумерации описана авторами Kabat et al. ((1991) US Public Health Services, NIH publication 91-3242) и использована в настоящем описании. В вариабельном домене тяжелой цепи каркасная область 1 (FR1) содержит остатки с 1 до 30, каркасная область 2 (FR2) содержит остатки с 36 до 49, каркасная область 3 (FR3) содержит остатки с 66 до 94, а каркасная область 4 (FR4) содержит остатки с 103 до 113. Также в вариабельном домене тяжелой цепи определяющие комплементарность области (CDR) содержат остатки с 30 до 35 (CDR1), остатки с 50 до 65 (CDR2) и с 95 до 102 (CDR3).
Нормальные В-клетки человека содержат один локус тяжелой цепи на хромосоме 14, из которого посредством перестройки возникает ген, кодирующий тяжелую цепь. У мышей локус тяжелой цепи расположен на хромосоме 12. Нормальный локус тяжелой цепи содержит несколько генных сегментов V, несколько генных сегментов D и несколько генных сегментов J. Наибольшую часть домена VH кодирует генный сегмент V, но С-конец каждого домена VH кодирует генный сегмент D и генный сегмент J. Антигенсвязывающую специфичность каждого домена VH обеспечивает перестройка VDJ в В-клетках и последующее созревание аффинности. Анализ последовательностей нормальных тетрамерных антител демонстрирует, что источником разнообразия в основном является сочетание перестройки VDJ и соматической гипермутации (Xu and Davies, (2000) Immunity, 13, 37-45). Существует более 50 генных сегментов V человека, присутствующих в геноме человека, из которых только 39 функциональны. Среди нормальных диплоидных антителопродуцирующих В-клеток каждая клетка продуцирует тетрамерное антитело из одного набора локусов тяжелой и легкой цепей антитела. Другой набор локусов используется, но не продуктивно, в результате процесса, называемого аллельным исключением (см. Singh et al., (2003) J. Exp. Med., 197, 743-750 и Immunology 5th edition, R.Goldsby, T.Kindt, B.Osborne, J.Kuby (2003) W.H.Freeman and Company NY, NY и цитируемые в них источники).
Способность «помнить» встречу с патогеном является определяющим признаком иммунной системы высших позвоночных. По-видимому, вклад В-клеток в «память» является функцией двух отдельных популяций В-клеток, долгоживущих плазматических клеток и В-клеток памяти (обзор см. в Tangye and Tarlinton (2009) Eur. J. Immunol., (2009) 39, 2065-2075). Их образование происходит в результате начального первичного иммунного ответа (антигенный стимул) наивных В-клеток. Одна популяция представлена долгоживущими плазматическими клетками, В-клетками, которые продолжают секретировать высокие уровни нейтрализующих антител в течение длительных периодов (месяцев) после элиминации антигена. Плазматические клетки прошли окончательную дифференциацию и содержат перестроенные локусы иммуноглобулинов, прошедшие созревание аффинности, которые кодируют антиген-специфические антитела с высокой аффинностью. Они отличаются от короткоживущих плазматических клеток со сроком жизни в несколько дней, которые погибают в результате стресса, вызванного интенсивным синтезом антиген-специфического антитела (см. Radbruch et al. (2006) Nature Reviews Immunology, 6, 741-750). В отличие от этого, вторая популяция антиген-специфических В-клеток памяти представляет популяцию В-клеток, также содержащих перестроенные локусы иммуноглобулинов, прошедших созревание аффинности, которые кодируют антиген-специфические антитела с высокой аффинностью, но которые не секретируют антитела в больших количествах. В-клетки памяти обладают способностью к быстрому делению и дифференциации в секретирующие антитела плазматические клетки после повторного воздействия начального иммунизирующего антигена. Это ведет к быстрому обогащению пула антиген-специфических иммуноглобулинов, доступных для ответа на данный антигенный стимул. Работа по вакцинации против натуральной оспы демонстрирует ответ В-клеток памяти у иммунизированных индивидуумов в течение периода в 50 лет (Grotty et al. (2003) J. Immunology, 171, 4969-4973).
У человека В-клетки памяти персистируют во вторичных лимфоидных органах, содержат перестроенные соматически мутировавшие гены иммуноглобулинов и опосредуют вторичный иммунный ответ на повторную сенсибилизацию (см. Bernasconi et al. (2002) Science, 298, 2199-2202). По-видимому, селезенка человека является одним из основных мест локализации клеток памяти (обзор см. в Tangye and Tarlinton (2009) Eur. J. Immunol., (2009) 39, 2065-2075).
Долгоживущие секретирующие антитела плазматические клетки персистируют во вторичных лимфоидных органах и костном мозге в течение месяцев. Например, антигензависимые секретирующие иммуноглобулины клетки персистируют в селезенке и костном мозге человека (Ellyard et al. (2004) Blood, 103, 3805-3812).
По-видимому, у других млекопитающих, таких как мыши, первичный длительный ответ с образованием антител является функцией долгоживущих плазматических клеток. Таким образом, у мышей окончательно дифференцированные долгоживущие плазматические клетки, присутствующие в костном мозге и селезенке, персистируют и продолжают секретировать антитела в течение длительных периодов времени, превышающих один год (см. Slifka et al. (1998) Immunity, 8, 363-372; Maruyama et al. (2000) Nature, 407, 636-641). Хотя у различных млекопитающих еще нужно достоверно установить точное взаимоотношение между клетками памяти и окончательно дифференцированными долгоживущими плазматическими клетками, у млекопитающих существует два пула долгоживущих В-клеток, каждый содержит перестроенные локусы иммуноглобулинов, прошедшие созревание аффинности, которые кодируют антиген-специфические антитела с высокой аффинностью. Один обладает способностью к быстрому делению. Другой не делится, но сохраняет способность секретировать антитело в течение длительных периодов.
Антиген-специфические тетрамерные антитела человека, продуцируемые пациентами, являются потенциальным источником клинически и коммерчески значимых антиген-специфических антител. Также их можно получить непосредственно из трансформированных EBV В-клеток человека, предпочтительно из трансформированных EBV В-клеток памяти человека, необязательно трансформированных в присутствие поликлональных активаторов В-клеток (PCT/IB04/01071).
До сих пор клетки памяти и долгоживущие плазматические клетки не были использованы в качестве источника кодируемых трансгенами антител с высокой аффинностью, в частности, антител человека или гибридных антител, содержащих VH и VL домены человека.
Создание доменов VН и антител, содержащих только тяжелые цепи
Способность антител, содержащих только тяжелые цепи и лишенных легких цепей, связывать антиген, установлена в 1960-х (см. Jaton et al. (1968) Biochemistry, 7, 4185-4195). Тяжелые цепи иммуноглобулина, физически отделенные от легких цепей, сохраняют 8 0% антигенсвязывающей активности по отношению к тетрамерному антителу. Кроме того, активность связывания связывали с N-концевым фрагментом (Fd) тяжелой цепи. Пока в этих экспериментах использовали точно охарактеризованное антиген-специфическое поликлональное антитело кролика, они были репрезентативны для любой поликлональной популяции, которая содержит тетрамерное антитело, полученное у млекопитающего, включая человека. В димера тяжелых цепей сохранен связывающий домен СН1 легкой цепи.
Во многих публикациях 1980-х годов описаны манипуляции с генами тяжелых цепей in vitro с целью создания новых антител. Большинство этих работ основано на перестроенном гене µ антитела (IgM) мыши, который кодирует антитело, индуцированное против точно охарактеризованного антигена. Особенность этого антитела состоит в том, что известно, что антигенсвязывающую специфичность определяет домен VH, поскольку сборка и секреция с использованием несоответствующей легкой цепи показала сохранение связывания антигена (см. Neuberger and Williams (1986) Phil. Trans. R. Soc. Lond., A317, 425-432). Используя эту систему, было показано, что антиген-специфический связывающий домен VH мыши можно использовать для получения нового антитела, которое содержит константную область ε человека, слитую с антиген-специфическим доменом VH мыши. Полученное химерное IgE сохраняло антигенную специфичность и проявляло эффекторную активность, ожидаемую от IgE (см. Neuberger et al. (1985) Nature, 314, 268-270).
Другие опубликованные примеры создания тяжелой цепи включают получение химерного антитела мыши-человека, которое содержит VH мыши, слитый с константными областями IgA или IgG человека (см. Morrison et al. (1984) PNAS, 81, 6851-6855; Sun et al. (1987) PNAS, 84, 214-218); и Heinrich et al. (1989) J. Immunol, 143, 3589-97). Таким образом, к концу 19080-х годов концепция создания тяжелых цепей была успешно сформулирована. Любой охарактеризованный связывающий домен VH можно слить с любой константной областью антитела с сохранением антиген-специфической активности связывания. Эффекторную функцию определяет выбранная константная область тяжелой цепи (например, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE и т.д.). Итоговое экспрессируемое химерное антитело во всех случаях содержит тетрамерное антитело.
Для создания целой тяжелой цепи человека необходим источник доменов VH человека с установленной связывающей специфичностью. Эта проблема частично решена посредством разработки библиотек последовательностей связывающих доменов VH человека, полученных с использованием сочетаний сегментов V, D и J наивной зародышевой линии человека или прошедших созревание аффинности доменов VH, полученных из тетрамерных антител, источником которых служат лимфоциты человека. Затем можно выделить антиген-специфические домены VH с аффинностями связывания в диапазоне от 20 нМ до 100 нМ из библиотек дисплеев связывающих доменов VH, полученных из мРНК антителопродуцирующих В-клеток периферической крови человека (см. Ward et al. (1989) Nature, 341, 544-546) или из случайных последовательностей VDJ, полученных из ДНК наивной зародышевой линии человека (см. ЕР-А-0368684). Эти подходы предоставляют источник антиген-специфических доменов VH млекопитающих и, в частности, доменов VH человека.
Предполагают, что:
«Выделенные вариабельные (VH) домены могут представлять собой альтернативу моноклональным антителам и выполняют ключевую функцию в связывании антител человека с высокой аффинностью»;
«Соединяя вариабельные домены с константными доменами легких или подходящих тяжелых цепей и экспрессируя собранные гены в клетках млекопитающих, можно получить целые антитела, которые будут выполнять естественные эффекторные функции, такие как лизис комплимента»; и
«Этот подход может подтвердить ценность создания терапевтически значимых антител человека» (см. Ward et al. (1989) Nature, 341, 544-546 и EP-A-0368684).
При использовании альтернативного подхода Sitia et al. ((1990) Cell, 60, 781-790) продемонстрировано, что удаление домена СН1 из перестроенного гена µ мыши приводит к синтезу и секреции антитела, содержащего только тяжелые цепи и лишенного легких цепей, клетками млекопитающих в культуре. В этом случае секретируемая тяжелая цепь, содержащая связывающий домен VH и константную область, состоящую из гибкого шарнирного домена и константных доменов СН2, СН3 и СН4 из IgM, обеспечивает димеризацию и эффекторную функцию тяжелых цепей.
Таким образом, к 1990 году стали доступны основные инструменты для создания гомодимеров антитела человека, содержащих только тяжелые цепи, in vitro (иногда их обозначают как Dabs-Fc) с установленными специфичностями связывания VH и для выбора эффекторных областей тяжелых цепей, лишенных СН1.
С этим подходом связано две проблемы:
домены VH, выбранные посредством массовых подходов, обладали относительно низкой антигенсвязывающей аффинностью (20-100 нМ); и
домены VH в отсутствие легких цепей были «липкими», нерастворимыми и склонными к агрегации и поэтому не приспособленными для фармацевтического применения.
Склонность выделенных доменов VH к агрегации является следствием отсутствия легкой цепи. Когда легкая цепь отсутствует, обнажены определенные гидрофобные боковые цепи, которые обычно скрыты в поверхности контакта тяжелой/легкой цепи. Кроме того, нарушена термодинамическая стабильность, поскольку стабильность доменов VH зависит от контактов на поверхности контакта легкой цепи (см. Worn and Pluckthun (1999) Biochemistry, 38, 8739-8750).
Приведенное авторами Hamers-Casterman описание встречающегося в природе гомодимерного антитела IgG, содержащего только тяжелые цепи и лишенного легких цепей, которое циркулирует у верблюдовых, в дополнение к нормальным тетрамерным антителам верблюдовых (см. Hamers-Casterman et al. (1993) Nature, 363, 446-448) проливает свет на проблему растворимости. В соответствии с молекулой, созданной авторами Sitia et al. ((1990) Cell, 60, 781-790), функциональность CHI домена отсутствовала в антителах верблюдовых, содержащих только тяжелые цепи, в связи с сайтом альтернативного сплайсинга, который устраняет СН1 из процессированной мРНК тяжелой цепи антитела.
Домены VH антител верблюдовых, содержащих только тяжелые цепи (которые в соответствии с широким использованием далее в настоящем документе обозначают как домены VHH), полученные посредством сенсибилизации антигеном, проходили созревание аффинности в В-клетках in vivo, обладают аффинностями связывания в нижнем наномолярном диапазоне, растворимы и не склонны к агрегации (см. Ewert et al. (2002) Biochemistry, 41, 3628-3636). Как правило, домены VHH верблюдовых также проявляют повышенную тепловую стабильность по отношению к доменам VH, полученным из зародышевой линии и выделенным посредством подходов с использованием дисплеев, и в некоторой степени сохраняют активность связывания в присутствие денатурирующих средств, таких как детергенты и отбеливающие средства, а также после тепловой обработки (см. Dumoulin et al. (2002) Protein Science, 11, 500-511 и Dolk et al. (2005) Applied Environmental Microbiology, 71, 442-450).
Антиген-специфические антитела, содержащие только тяжелые цепи, можно получить, используя мРНК В-клеток верблюдовых в стандартных способах клонирования или способами фаговых или других дисплеев (см. Riechmann and Muyldermans (1999) J. Immunol. Methods, 231, 25-38). Антитела, содержащие только тяжелые цепи, полученные из верблюдовых, обладают высокой аффинностью. Анализ последовательностей мРНК, кодирующей антитело, содержащее только тяжелые цепи, демонстрирует, что источником разнообразия в первую очередь является сочетание перестройки VHHDJ и соматической гипермутации, что также наблюдают при образовании нормальных тетрамерных антител. Однако остается необходимым установить, образуют ли нормальные В-клетки верблюдовых антитела, содержащие только тяжелые цепи, в противоположность тетрамерным антителам. В действительности известно немногое о развитии пре-В клеток у верблюдовых (см. WO 2004/049794 и Zou et al. (2005) J. Immunology, 175, 3769-3779). Кроме того, остается необходимым установить, участвуют ли антитела верблюдовых, содержащие только тяжелые цепи, подобно тетрамерам иммуноглобулинов, содержащим тяжелые и легкие цепи, в длительном ответе с образованием антител посредством клеток памяти или посредством долгоживущих плазматических клеток.
Специфическим признаком антител верблюдовых, содержащих только тяжелые цепи, является то, что в домене VHH мутации подвергаются некоторые аминокислотные остатки, которые в нормальном домене VH взаимодействуют с VL доменом. Таким образом, лейцин в положении 45 в 98% VH последовательностей человека и мыши подвергается мутации. Предполагают, что эти мутации у верблюдовых, консервативные в зародышевой линии, согласуются с поддержанием растворимости VHH при отсутствии легкой цепи. Также описаны другие характерные мутации аминокислот в доменах VHH верблюдовых по сравнению с нормальными доменами VH. Среди них самые распространенные и важные изменения происходят в четырех положениях (тетрада VHH) во второй каркасной области, которые отвечают за снижение гидрофобности упомянутой поверхности контакта с легкой цепью. Как правило, выявляют Glu-44 и Arg-45 на месте менее гидрофильных Gly-44 и Leu-45, представленных в нормальных доменах VH, тогда как повышение гидрофильности в положении 4 7 происходит за счет замены Тyr на остатки меньшего размера. Четвертое изменение состоит в замене Val-37 на Phe или Тyr. Структурный анализ показывает, что это формирует малое гидрофобное ядро, типично включающее Tyr-91, Trp-103, Arg-45 и гидрофобные остатки, присутствующие в петле CDR3 домена VHH. Эти изменения повышают гидрофильность упомянутой поверхности контакта с легкой цепью посредством прямой замены на более гидрофильные боковые цепи или посредством извлечения гидрофобных боковых цепей из растворителя посредством взаимодействия между CDR3 и каркасными остатками (см. Bond et al. (2003) J. Mol. Biol., 332, 643-655).
В домене VHH петля CDR3 увеличена по отношению к той, что присутствует в тетрамерных антителах верблюдовых и других точно охарактеризованных тетрамерных антителах человека и мыши (см. Riechmann and Muyldermans (1999) J. Immunol. Methods, 231, 25-38). Роль ключевых гидрофобных остатков, присутствующих в петле CDR3 VHH, например, в домене VHH ламы, демонстрирует структурную роль CDR3 в стабильности и растворимости доменов VHH (см. Bond et al. (2003) J. Mol. Biol, 332, 643-655). В совокупности структурные исследования доменов VHH демонстрируют, что стабильность и растворимость этих доменов зависят, в дополнение к каркасным остаткам, от CDR3, а также что требования к ключевым гидрофобным остаткам накладывает значительные ограничения на тип петли CDR3, совместимой с благоприятными биофизическими характеристиками доменов VHH по отношению к доменам VH (см. Barthelemy et al. (2008) J. Biol. Chem., 283, 3639-3654).
Однако несмотря на высокую степень консервативности между последовательностями верблюдовых и человека, домены VHH верблюдовых сохраняют родство с верблюдовыми и поэтому являются потенциально антигенными для человека. Гуманизация in vitro может снизить этот риск, но ценой возможного снижения аффинности и растворимости в результате использования способов создания in vitro.
Связывающие домены УН человека и проблема растворимости
Плохие биофизические характеристики доменов VH человека и других млекопитающих, полученных из последовательностей зародышевой линии или из нормальных тетрамерных антител, по сравнению с доменами VHH верблюдовых, в частности, склонность к агрегации, в настоящее время ограничивают их полезность в качестве реактивов, диагностических и лекарственных средств (см. Rosenberg (2006) The AAPS Journal, 8(3), Article 59 E501-E507 и Fahrner et al. (2001) Biotechnol. Gen. Eng. Rev., 18, 301-327).
Первые попытки решить проблему растворимости были основаны на введении камелизирующих аминокислотных последовательностей в выбранные связывающие VH области человека на поверхности контакта VH/VL. Доказана несостоятельность этого подхода, поскольку на стабильность и растворимость нельзя повлиять посредством «камелизации» в положении 45 поверхности контакта VH/VL в отдельности (см. Domantis submissions, датированные 18-м мая 2007 года и 5-м июня 2007 года, в противовес ЕР-В-0656946). Действительно, введения направленных «камелизирующих» мутаций не достаточно для того, чтобы решить проблему «слипания» у выделенных доменов VH человека (см. Riechmann and Muyldermans (1999) J. Immunol. Methods, 231, 25-38). Введение камелизирующих мутаций ведет к деформации β-складчатого слоя каркасной области, которая возможно отвечает за пониженную стабильность белка, наблюдаемую в результате этих экспериментов (см. Riechmann (1996) J. Mol. Biol., 259, 957-969). Кроме того, роль CDR3, содержащей ключевые гидрофобные остатки, в поддержании структурной стабильности и растворимости доменов VHH в отсутствие легкой цепи, добавляет сложности, что потенциально ограничивает разнообразие последовательностей CDR3 теми, что совместимы с каркасной областью верблюдовых (см. Barthelemy et al. (2008) J. Biol. Chem., 283, 3639-3654).
Таким образом, домены VH млекопитающих, включая полученные у человека, которые получены из прошедших созревание аффинности природных тетрамерных антител или из последовательностей наивных сегментов VDJ зародышевой линии, в отсутствие легких цепей, относительно нерастворимым и подвержены агрегации. У таких доменов VH отсутствуют необходимые биофизические характеристики растворимого домена VH, подходящего для использования в качестве лекарственного средства.
Антитела, содержащие только тяжелые цепи, и растворимые домены УН человека, полученные трансгенезом in vivo.
Растворимые связывающие домены VH для фармацевтического применения предпочтительно получены у человека и обладают признаками, такими как высокая антигенсвязывающая аффинность и растворимость при физиологических условиях при отсутствии агрегации. Такие растворимые связывающие домены VH также можно использовать в качестве диагностических средств и реактивов и они получат широкое распространение в промышленном и сельскохозяйственном применениях.
Альтернативный подход к получению антиген-специфических антител, содержащих только тяжелые цепи, состоит в использовании трансгенных мышей, которые содержат локусы тяжелых цепей, лишенных функциональности СН1 (см. Janssens et al. (2006) PNAS, 103:15130-5 и WO 02/085944).
Вначале не было известно, будут ли нормальные В-клетки мыши активироваться и секретировать антитела, содержащие только тяжелые цепи, в результате сенсибилизации антигеном или такие антитела будут обладать растворимостью. Кроме того, не было известно, необходимы ли IgM или, как у верблюдовых, ограничена ли экспрессия классами антител Igγ2 и Igγ3, или нормальные В-клетки мыши могут секретировать даже потенциально нерастворимые домены VH.
Авторы Janssens et al. ((2006) PNAS, 103:15130-5) описали локус гена химерной тяжелой цепи, который содержит два VHH генных сегмента ламы, все генные сегменты D и J человека и сочетания генных сегментов, кодирующих константные области Сµ и Сγ2 и Сγ3 человека, у которых отсутствует функциональность СН1. Выбор генных сегментов VHH ламы обеспечил то, что мутации каркасной области зародышевой линии, сохраняемые у верблюдовых на поверхности контакта VH/VL, также присутствуют в экспрессируемом камелизованном локусе человека с тем, чтобы увеличить возможность того, что полученный «камелизованный» домен VH может сохранять характеристики растворимости и стабильности, проявляемые VHH верблюдовых, таким образом повышая вероятность функционального ответа на сенсибилизацию антигеном даже в отсутствие петли CDR3, полученной у верблюдовых.
В результате было показано, что экспрессия трансгена антитела, содержащего только тяжелую цепь, происходит специфичным для В-клеток образом, что происходит размножение В-клеток и что в отсутствие функциональности СН1 присутствие любого функционального гена легкой цепи нецелесообразно. Трансгены, содержащие только тяжелые цепи, подвергаются перестройке VDJ, за которой следует активация В-клеток и созревание аффинности в ответ на сенсибилизацию антигеном. Также происходит переключение класса между IgM и IgG, содержащими только тяжелые цепи, равно как и переключение изотипа Сγ. В отсутствие Сµ в локусе, использование Сγ происходит с равным успехом. Специфичность антител в значительной степени определяется перестройкой VDJ (CDR3), тогда как анализ соматических мутаций показывает, что это происходит на всем протяжении области VH, предпочтительно в областях CDR1 и CDR2 экспрессируемого генного сегмента VHH ламы. Среди ограниченного числа охарактеризованных камелизованных антител человека, содержащих только тяжелые цепи, для всех подтвердили растворимость, будь они получены из В-клеток селезенки посредством фагового дисплея доменов VH или гибридомной селекцией, несмотря на тот факт, что петля CDR3, которую получали полностью из последовательностей человека, меньше тех, что найдены в доменах VHH верблюдовых.
Лучшие гибридные антитела ламы/человека, содержащие только тяжелые цепи, из этой ограниченной серии обладали аффинностями в диапазоне 1-3 нМ. Организм мыши также использует трансген в качестве другого локуса тяжелой цепи в этом размножении В-клеток, а селезенка имеет по существу нормальную структуру даже в отсутствие перестройки легкой цепи (см. Janssens et al. (2006) PNAS, 103:15130-5). Кроме того, механизмы аллельного исключения определяют продуктивную экспрессию эндогенного локуса тяжелой цепи мыши или трансгена тяжелой цепи, у которой отсутствует функциональность СН1 (см. WO 2007/09677).
К удивлению, наблюдения Janssens et al. ((2006) PNAS, 103:15130-5) указывают на то, что стабильные растворимые камелизованные антитела, содержащие только тяжелые цепи, можно получить с использованием каркасной области верблюдовых даже в отсутствие последовательностей верблюдовых, содержащих петлю CDR3.
В качестве расширения этих экспериментов (см. WO 2006/008548) созданы дополнительные линии трансгенных мышей, которые содержат полностью человеческие локусы генов только тяжелых цепей, у которых, таким образом, отсутствует последовательность, кодирующая каркасную область VHH верблюдовых, и которые, кроме того, содержат петли CDR3, полученные не из последовательностей верблюдовых.
В этом подходе вводили четыре естественных генных сегмента VH зародышевой линии человека (естественный локус V4), таким образом, полагаясь полностью на естественную селекцию посредством созревания аффинности для образования антигенной специфичности и структурной стабильности полученных растворимых доменов VH человека. Оба локуса содержат все генные сегменты D и J человека, генные сегменты Сγ2 и Сγ3 константной области человека, у каждого отсутствует СН1, энхансерные регуляторные элементы иммуноглобулина человека и, предпочтительно, LCR тяжелой цепи антитела.
Локус V4 человека функционален и антитела человека, содержащие только тяжелые цепи, циркулируют в плазме животных, которых не сенсибилизировали антигеном. После сенсибилизации антигеном, определяют антиген-специфические антитела человека, используя стандартный анализ ELISA. Локусы человека, содержащие сконструированные генные сегменты V (локус V17) (также см. WO 2008/035216), также функциональны (также см. Antibody Engineering and Antibody Therapeutics Meeting. F. Grosveld presentation, San Diego Antibody Meeting, December 3-4, 2007).
Кроме того, к удивлению сенсибилизация антигеном трансгенных мышей, содержащих локусы 44, позволяет выделить и охарактеризовать растворимые антиген-специфические домены VH человека с высокой аффинностью в отсутствие характерных мутаций каркасной области зародышевой линии верблюдовых и петли CDR3, похожей на петлю CDR3 верблюдовых, типичной для доменов VHH верблюдовых. Кроме того, домены VH, полученные из антиген-специфических антител человека, содержащих только тяжелые цепи, растворимы (см. WO 2006/008548). После сенсибилизации антигеном, перестройки VDJ и последующего размножения В-клеток, структура селезенки у мышей, содержащих локус V4 человека, по существу схожа с гуморальным ответом мышей дикого типа на сенсибилизацию антигеном. Световая микроскопия выявляет расщепление кластеризации Т-клеток в периартериолярном слое лимфоцитов (PALS), окруженном областями, богатыми В-клетками, включая фолликулы и краевые зоны, присутствующие на наружных границах белой пульпы. Также существуют структуры, схожие с терминальным центрами в В-клеточных фолликулах вторичных лимфоидных тканей, сопоставимые с мышами дикого типа в ходе Т-клеточно-зависимого гуморального ответа
Альтернативный подход к идентификации и конструированию синтетических доменов VH человека с использованием дисплея, который не зависит от прогностического анализа естественных последовательностей доменов VHH верблюдовых, также демонстрирует, что автономные домены VH со структурными свойствами, не входящие в спектр природных каркасных областей, можно получить, используя неприродные мутации, которые отличаются от тех, что выявлены у верблюдовых (см. Barthelemy et al. (2008) J. Biol. Chem., 283, 3639-3654 и патентную заявку США №11/102,502). Однако данные ничего не говорят о том, сохраняют ли такие домены VH биофизические характеристики растворимости при физиологических условиях при отсутствии агрегации в сочетании с аффинностями связывания в нижнем наномолярном диапазоне.
Несмотря на элегантность, подходы к идентификации и конструированию синтетических доменов VH человека посредством дисплея являются трудоемкими и ограничены объемом доступности доменов VH человека и трехмерной структурной информации о VHH верблюдовых. Тонкие различия возникают в зависимости от используемых сочетаний VDJ, которые ограничивают разработку библиотек VH на основе синтетических последовательностей с использованием разнообразий CDR3, не ограниченных структурными требованиями, которые обеспечивают связывание антигена с высокой аффинностью. В то время как результаты показывают, что в отличие от доменов VHH верблюдовых, растворимые стабильные конформации доменов VH человека не зависят от взаимодействий между петлей CDR3 и характерными заменами аминокислот верблюдовых в упомянутой поверхности контакта с легкой цепью, данные ограничены биофизическими, характеристиками. Например, в контексте этих изменений не учитывали сохранение связывания антигена с высокой аффинностью.
Изобретение
В настоящем изобретении описаны новые растворимые антитела с высокой аффинностью, содержащие только тяжелые цепи, и растворимые домены VH, структурно отличные от доменов VH, получаемых из нормальных тетрамерных антител или последовательностей зародышевой линии, подходящие для использования в качестве лекарственных средств, и предпочтительные пути для выделения таких новых антител, содержащих только тяжелые цепи, и растворимых доменов VH из трансгенных животных после сенсибилизации антигеном.
Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к новому антиген-специфическому растворимому антителу с высокой аффинностью, содержащему только тяжелые цепи, которое:
не содержит характерные замены аминокислот верблюдовых и содержит замены FR2, которые обнаружены в нормальных тетрамерных антителах;
обладает повышенной суммарной гидрофобностью в CDR1 и содержит увеличенное число заряженных аминокислот, присутствующих в CDR3; и
содержит одну или более замен аминокислот в β-складчатом слое каркасной области, которые ведут к повышению суммарной гидрофобности в FR1 и увеличению числа заряженных аминокислот, представленных в FR3.
Антитело, содержащее только тяжелые цепи, предпочтительно представляет собой антитело человека. Антитело человека, содержащее только тяжелые цепи, не содержит характерные для верблюдовых замены аминокислот и содержит замены FR2, которые не найдены в нормальных тетрамерных антителах человека.
Антитело, содержащее только тяжелые цепи, предпочтительно имеет аффинность связывания 10 нМ или лучше и ведет себя как растворимый мономер при гель-фильтрации при физиологических буферных условиях.
Настоящее изобретение также относится к антиген-специфическому растворимому домену VH с высокой аффинностью, который:
не содержит характерные для верблюдовых замены аминокислот и содержит замены FR2, которые не найдены в нормальных тетрамерных антителах;
обладает повышенной суммарной гидрофобностью в CDR1 и содержит увеличенное число заряженных аминокислот, присутствующих в CDR3; и
содержит одну или более замен аминокислот в β-складчатом слое каркасной области, которые выдут к повышению гидрофобности в FR1 и увеличению числа заряженных аминокислот, присутствующих в FR3.
Растворимый домен VH предпочтительно получен у человека. Растворимый домен VH человека не содержит характерные для верблюдовых замены аминокислот и содержит замены FR2, которые не найдены в нормальных тетрамерных антителах человека.
Растворимый домен VH предпочтительно имеет аффинность связывания 10 нМ или лучше и ведет себя как растворимый мономер при гель-фильтрации при физиологических буферных условиях.
Настоящее изобретение дополнительно относится к генному сегменту V, который после рекомбинации с генным сегментом D и генным сегментом J и последующего созревания аффинности, кодирует растворимый домен VH в соответствии с изобретением.
Необязательно, последовательность генного сегмента V можно сконструировать посредством по меньшей мере одной замены, вставки или делеции или их сочетания по отношению к естественной последовательности зародышевой линии генного сегмента V с тем, чтобы он содержал кодон(ы), кодирующие аминокислотные остатки или аминокислотные последовательности, которые отличны от последовательности зародышевой линии животного-хозяина, не представляют собой характерные для верблюдовых замены аминокислот, и могут представлять собой замены FR2, которые, как правило, не обнаруживают в нормальных тетрамерных антителах. Такие изменения могут содержать замены, вставки или делеции или их сочетание в областях CDR1 и/или CDR2 генного сегмента V с тем, чтобы увеличить разнообразие аминокислот, доступных для связывания антигена, по сравнению с последовательностями зародышевой линии.
Настоящее изобретение дополнительно относится к генному сегменту D, который после рекомбинации с генным сегментом V в соответствии с изобретением и генным сегментом J. кодирует домен VH в соответствии с изобретением.
Необязательно последовательность генного сегмента D можно сконструировать посредством по меньшей мере одной замены, вставки или делеции или их сочетания по отношению к естественной последовательности генного сегмента D зародышевой линии. Такая замена, вставка или делеция, или их сочетание, такова, что генный сегмент D может содержать кодоны, которые кодируют аминокислотные остатки, для которых установлено, что они содействуют сохранению растворимости и стабильности растворимого домена VH, включая последовательности, которые кодирует генный сегмент D, или альтернативно могут увеличивать разнообразие генного сегмента D в любой получаемой петле CDR3 по сравнению с последовательностями зародышевой линии.
Также настоящее изобретение дополнительно относится к генному сегменту J, который после рекомбинации с генным сегментом V в соответствии с изобретением и генным сегментом D, кодирует растворимый домен VH в соответствии с изобретением.
Необязательно последовательность генного сегмента J можно сконструировать посредством по меньшей мере одной замены, вставки или делеции, или их сочетания, по отношению к естественной последовательности генного сегмента J зародышевой линии. Такая замена, вставка или делеция, или их сочетание, такова, что генный сегмент J может содержать кодоны, которые кодируют аминокислотные остатки, для которых установлено, что они содействуют сохранению растворимости и стабильности домена VH, включая последовательность, кодируемую генным сегментом J, или альтернативно могут увеличивать разнообразие генного сегмента J в любой получаемой петле CDR3 по сравнению с последовательностями зародышевой линии.
Настоящее изобретение предпочтительно относится к гетерологичному локусу, содержащему только тяжелую цепь, который содержит один или более генных сегментов V в соответствии с изобретением, один или более генных сегментов D в соответствии с изобретением, один или более генных сегментов J в соответствии с изобретением и один или более генных сегментов константных эффекторных областей, каждая из которых кодирует константную эффекторную область антитела, у которой отсутствует функциональность СН1, где генные сегменты расположены так, что генные сегменты V, D и J и генный сегмент константной области можно рекомбинировать для того, чтобы получить перестроенный ген, кодирующий антиген-специфическое растворимое антитело с высокой аффинностью, содержащее только тяжелые цепи, в соответствии с изобретением.
Локус, содержащий только тяжелую цепь, содержит константную эффекторную область(и) тяжелой цепи позвоночного, которая предпочтительно получена у млекопитающего, более предпочтительно, получена от человека, мыши, крысы или верблюдового.
Предпочтительно локус тяжелой цепи устроен так, чтобы получить антитело, содержащее только тяжелые цепи, которое содержит растворимый домен VH человека и константную эффекторную область, полученную у млекопитающего.
Также изобретение дополнительно относится к трансгенному млекопитающему, не относящемуся к человеку, которое содержит гетерологичный локус тяжелой цепи в соответствии с изобретением. Предпочтительно млекопитающим является грызун, наиболее предпочтительно мышь или крыса. Предпочтительно, функциональность эндогенного локуса тяжелой цепи трансгенного млекопитающего, не относящегося к человеку, ослабляют любым известным в данной области способом или вводят делецию, которая переводит ген в молчащее состояние (см. US 5591669; US 6162963; US 5877397; Kitamura and Rajewsky (1992) Nature, Mar 12; 356(6365):154-6). Альтернативно можно удалить В-клетки, которые, в противоположность трансгенам, экспрессируют эндогенные гены иммуноглобулинов. Эндогенные гены легких цепей k и λ могут сохранять функциональность или необязательно можно сделать нефункционирующими или удалить (ЕР 139959). Менее предпочтительно трансген может представлять собой локус нормальной тяжелой цепи антитела, который содержит функциональность СН1 при том, что в генотипе организма-хозяина отсутствует функциональность генов эндогенной тяжелой или легкой цепей (см. ЕР 139959 и Zou et al. J. Exp. Med., 204, 3271-3283).
Трансген иммуноглобулина, содержащего только тяжелые цепи, также может содержать локусы гена эндогенной тяжелой цепи иммуноглобулина, которые сконструированы для того, чтоб устранить функциональность СН1, и необязательно, кроме того, сконструированы для того, чтобы ввести или заменить один или более эндогенных генных сегментов V, D и J на альтернативные генные сегменты V, D и J, предпочтительно полученные у человека.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения антиген-специфического растворимого антитела с высокой аффинностью, содержащего только тяжелые цепи, который включает стимуляцию антигеном трансгена млекопитающего, не относящегося к человеку, в соответствии с изобретением. Предпочтительно, растворимое антитело, содержащее только тяжелые цепи, относится к человеку.
Предпочтительно, способ включает стадию иммортализации антителопродуцирующих клеток млекопитающего. Клетки можно иммортализовать посредством слияния с миеломной клеткой или можно иммортализовать посредством трансформации вирусом, таким как EBV.
Предпочтительно, способ дополнительно содержит стадию выделения или растворимого домена VH или нуклеиновой кислоты, которая кодирует растворимый домен VH, из В-клетки или иммортализованной клеточной линии, которая продуцирует антитело, содержащее только тяжелые цепи, с желаемой антигенной специфичностью.
Альтернативно, способ может дополнительно содержать стадию выделения или растворимого домена VH или нуклеиновой кислоты, которая кодирует растворимый домен VH, из клетки, продуцирующей антитело, содержащее только тяжелые цепи, полученной у млекопитающего или из иммортализованной клетки, продуцирующей антитело, содержащее только тяжелые цепи, полученной у млекопитающего или подхода с использованием дисплея.
Настоящее изобретение также относится к использованию растворимого домена VH или нуклеиновой кислоты, кодирующей растворимый домен VH, полученный способом по изобретению, в получении антитела, содержащего только тяжелые цепи, VH интраантитела, VH полипротеина, комплекса с доменом VH или слитого VH.
Настоящее изобретение дополнительно относится к антителу, содержащему только тяжелые цепи, VH интраантителу, VH полипротеину, комплексу с доменом VH или слитому VH, которые содержат по меньшей мере один растворимый домен VH в соответствии с изобретением.
Также настоящее изобретение дополнительно относится к антителу, содержащему только тяжелые цепи, VH интраантителу, VH полипротеину, комплексу с доменом VH или слитому VH, которые содержат по меньшей мере один растворимый домен VH в соответствии с изобретением для использования в терапии.
Настоящее изобретение также относится к использованию антитела, содержащего только тяжелые цепи, VH интраантитела, VH полипротеина, комплекса с доменом VH или слитого VH, которые содержат по меньшей мере один растворимый домен VH в соответствии с изобретением, в получении лекарственного средства для использования в лечении заболеваний или нарушений, включая в качестве неограничивающих примеров: заживление ран, нарушения клеточной пролиферации, включая новообразования, меланому, остеосаркому легких, ободочной и прямой кишки, саркому прямой кишки, яичника, солидные опухоли шейки матки, пищевода, груди, поджелудочной железы, мочевого пузыря, головы и шеи и другие; миелопролиферативые нарушения, такие как лейкемия, неходжкинская лимфома, лейкопения, тромбоцитопения, нарушение ангиогенеза, саркома Капоши; аутоиммунные/воспалительные нарушения, включая аллергию, воспалительное заболевание кишечника, артрит, псориаз и воспаление дыхательных путей, астму, иммунные нарушения и отторжение трансплантата органа; сердечнососудистые и сосудистые нарушения, включая гипертензию, отек, стенокардию, атеросклероз, тромбоз, сепсис, шок, реперфузионное повреждение и ишемию; неврологические нарушения, включая заболевания центральной нервной системы, болезнь Альцгеймера, травму головного мозга, амиотрофический боковой склероз и боль; нарушения развития; нарушения метаболизма, включая сахарный диабет, остеопороз и ожирение, СПИД и почечную недостаточность; инфекции, включая вирусную инфекцию, бактериальную инфекцию, грибковую инфекцию и паразитарную инфекцию, патологические состояния, связанные с плацентой и другие патологические состояния, а также для использования в иммунотерапии.
Также настоящее изобретение дополнительно относится к кассете для получения растворимого домена VH в соответствии с изобретением, которая содержит последовательности генов, которые кодируют FR1, FR2 и FR3, где последовательности генов, кодирующих FR1 и FR2 и FR2 и FR3, разделены последовательностями, которые позволяют вводить подходящие последовательности, кодирующие CDR1 и CDR2, а на 3'-конце последовательности, кодирующей FR3, она содержит последовательность, которая позволяет вводить последовательность, которая кодирует подходящие последовательности, кодирующие CDR3.
В изобретении используют способность естественных механизмов В-клеток млекопитающего в трансгенном млекопитающем, не относящемся к человеку, предпочтительно в мыши или крысе, генерировать новые растворимые антитела с высокой аффинностью, содержащие только тяжелые цепи, в ответ на сенсибилизацию антигеном. Растворимые антитела по изобретению, содержащие только тяжелые цепи, обладают аффинностями связывания 10 нм или лучше.
Анализ последовательностей растворимых связывающих доменов VH человека, полученных из антиген-специфических антител человека с высокой аффинностью, содержащих только тяжелые цепи и лишенных легких цепей, к удивлению, показывает, что отсутствуют все характерные консенсусные аминокислотные последовательности, типичные для доменов VHH верблюдовых. Действительно, естественная селекция не компенсирует селекцию последовательностей, характерных для верблюдовых, в результате созревания аффинности. Таким образом, когда в зародышевой линии отсутствуют характерные для верблюдовых последовательности, различные механизмы, действующие in vivo, компенсируют отсутствие легкой цепи с тем, чтобы сохранить структурную стабильность и растворимость домена VH человека.
Наиболее удивительное отличие состоит не только в том, что растворимы антиген-специфические антитела человека с высокой аффинностью, содержащие только тяжелые цепи и лишенные легких цепей, но и в том, что антигенсвязывающие области (CDR) должны принимать участие в структурной стабильности и растворимости в дополнение к связыванию антигена, и что характерные консенсусные замены аминокислот в каркасной области, кодируемые VHH зародышевой линии верблюдовых, которые компенсируют отсутствие легкой цепи на упомянутой поверхности контакта с легкой цепью, не только отсутствуют в трансгенных локусах, содержащих только тяжелые цепи, но также не вставлены в результате созревания аффинности для того, чтобы компенсировать растворимость, во время процесса естественной селекции. В кодируемых трансгенами растворимых доменах VH человека после созревания аффинности альтернативные замены аминокислот могут иметь место во всех трех каркасных областях. Мутации каркасных областей могут находиться преимущественно, но не исключительно, в β-складчатом слое на упомянутой поверхности контакта с легкой цепью, таким образом компенсируя отсутствие легкой цепи.
Сравнительный анализ суммарных заряда и гидрофобности каркасной области и областей CDR антигенсвязывающих доменов VH человека, полученных в присутствие и отсутствие легкой цепи, выявляет значительные изменения в отсутствие легких цепей. В отсутствие легких цепей повышена суммарная гидрофобность аминокислот, присутствующих в CDR1, и повышено число заряженных аминокислот, присутствующих в CDR3. Замены аминокислот в β-складчатых слоях каркасной области ведут к снижению общей гидрофобности и повышению числа заряженных аминокислот, присутствующих в каркасной области 3. В каркасной области 1 увеличено число заряженных аминокислот и повышена гидрофобность, а в каркасной области 2 немного снижена гидрофобность. Это несколько отличается от доменов VHH верблюдовых, таких как лама, где сравнительный анализ выявляет признаки, общие с доменом VH человека в отсутствие легкой цепи, а также отличия. У верблюдовых, таких как лама, в каркасной области 2 значительно снижена суммарная гидрофобность, сопоставимая с повышенной гидрофильностью, введенной характерными заменам аминокислот в упомянутой поверхностью контакта с легкой цепью, и повышенным суммарным зарядом в CDR3.
Таким образом, после сенсибилизации антигеном, В-клетки компенсируют отсутствие легкой цепи, даже когда в зародышевой линии отсутствуют необходимые замены аминокислот, которые найдены у верблюдовых, таких как ламы и родственные виды.
В отсутствие последовательностей зародышевой линии, которые компенсируют отсутствие легкой цепи, найдены различные решения in vivo, все они ведут к образованию стабильных растворимых антител с высокой аффинностью, содержащих только тяжелые цепи, и растворимых доменов VH в отсутствие легкой цепи.
Эти наблюдения согласуются с основной функцией антигенсвязывающих областей (CDR), которая, в дополнение к связыванию антигена, состоит в стабилизации домена VH. Дополнением этому служат последующие редкие или новые замены аминокислот в каркасной область, в частности, в β-складчатом слое на упомянутой поверхности контакта с легкой цепью. В растворимых доменах VH, полученных не у верблюдовых, а посредством трансгенеза in vivo, отсутствуют характерные для верблюдовых замены аминокислот, которые играют важную для растворимости и стабильности VHH роль.
Антиген-специфические антитела не верблюдовых, содержащие только тяжелые цепи и эти признаки, растворимы и не подвержены агрегации при нормальных физиологических условиях. Кроме того, растворимые домены VH, выделенные из этих, сохраняют благоприятные признаки в отношении стабильности и растворимости домена VH. После сенсибилизации антигеном эти антитела, содержащие только тяжелые цепи, и полученные из них растворимые домены VH развиваются посредством естественных механизмов селекции специфическим для В-клеток образом. Антитела с высокой аффинностью (10 нм или лучше), получаемые посредством той же перестройки VDJ, как правило, содержат больше замен каркасной области, чем наблюдают у антител с более низкой аффинностью, содержащих только тяжелые цепи.
Таким образом, антигенсвязывающие домены (CDR) и β-складчатый слой каркасной области вносят вклад в общую стабильность, растворимость и аффинность связывания этих антител, содержащих только тяжелые цепи и лишенных легких цепей, или полученных из них растворимых доменов VH.
Анализ последовательностей стабильных антиген-специфических растворимых связывающих доменов VH с высокой аффинностью показывает, что:
селекция и созревание аффинности в антигенсвязывающих областях (CDR) соответствует общему увеличению гидрофобности и заряда, что ведет к специфичности и аффинности связывания антигена и структурной стабильности;
мутации, присутствующие в каркасных областях 2 и 3 вокруг упомянутой поверхности контакта с легкой цепью, соответствуют усовершенствованным растворимости и стабилизации домена VH и, таким образом, усовершенствованной аффинности связывания антигена;
мутации с каркасными областями 1 и 3 соответствуют компенсаторным структурным мутациям, которые повышают общую стабильность домена VH.
Таким образом, в отсутствие легкой цепи антитела, В-клетка млекопитающего может компенсировать свойственную нестабильность и нерастворимость связывающего домена VH тяжелой цепи посредством созревания аффинности и селекции, при этом сохраняя аффинность связывания антигена.
Анализа авторов настоящего изобретения показывает, что естественные механизмы, по-видимому, действуют независимо от используемых генных сегментов V. Таким образом, массовое секвенирование доменов VH человека, генерируемых в селезенке мыши, содержащей трансген V4 человека, в отсутствие легкой цепи позволяет провести сравнительный анализ частоты мутаций. Самую высокую мутационную нагрузку наблюдали в CDR1 и CDR2. Однако участки с повышенной мутационной нагрузкой можно различить в каркасной области 1, каркасной области 2 и по всей каркасной области 3. Возникающий общий паттерн для конкретного использованного генного сегмента V не носит специфического характера, поскольку в этой серии экспериментов антитела с высокой аффинностью получали, используя V3-23, V3-11 и V1-46 со схожими возникающими паттернами мутационной нагрузки.
Аналогичным образом, в CDR3 преобладает J4, но использовали не только этот сегмент.
По-видимому, В-клеточные механизмы созревания аффинности имеют множество функций в процессинге и секреции растворимых доменов VH в отсутствие легких цепей. Гипермутация в CDR в первую очередь отражает аффинность связывания антигена, а также, по-видимому, играет роль в структурной стабильности. Гипермутация в каркасных областях компенсирует отсутствие легкой цепи, но также, по-видимому, повышает стабильность и, таким образом, растворимость домена VH, а также посредством этого максимизирует аффинность связывания антигена. Авторы настоящего изобретения исходят из того, что растворимость и стабильность антител, содержащих только тяжелые цепи и не содержащих легкие цепи, являются условием для эффективного внутриклеточного транспорта к клеточной поверхности, презентации и последующего размножения В-клеток.
Благоприятные мутации каркасной области также можно встроить в новые локусы антител, содержащих только тяжелые цепи, относящиеся к зародышевой линии, которые содержат сконструированные сегменты V человека, каждый из которых содержит предпочтительные замены аминокислот.
Аналогичным образом, предпочтительные замены аминокислот можно встроить в генные сегменты J и D для того, чтобы дополнительно повысить растворимость и стабильность доменов VH после перестройки VDJ.
Таким образом, предоставлены растворимые антитела человека с высокой аффинностью, содержащие только тяжелые цепи, в которых отсутствуют характерные для верблюдовых замены аминокислот и которые имеют повышенную гидрофобность в CDR1 и увеличенное число заряженных аминокислот в CDR3 по отношению к доменам VH, найденным в нормальных тетрамерных антителах человека. Растворимые антитела человека с высокой аффинностью, содержащие только тяжелые цепи, также содержат одну или более замен аминокислот в β-складчатом слое каркасной области, которые ведут к повышению общей гидрофобности в каркасной области 1, снижению гидрофобности в каркасной области 3 и увеличению числа заряженных аминокислот, присутствующих в каркасной области 3 по отношению к нормальным тетрамерным антителам человека.
Подход позволяет осуществлять естественную селекцию новых антител, содержащих только тяжелые цепи. Растворимые домены VH, полученные из таких антител, содержат мутации, которые редко или вообще не встречаются среди наблюдаемых в естественных тетрамерных антителах, где растворимость VH зависит' от взаимодействия VL доменом легких цепей к или А иммуноглобулина. В отсутствие легких цепей наблюдаемые замены аминокислот придают предпочтительные биофизические характеристики получаемым антиген-специфическим антителам, содержащим только тяжелые цепи, и растворимым доменам VH. В частности, антитела, содержащие только тяжелые цепи, и растворимые домены VH, полученные этим способом, не имеют склонности к «липкости», относительной нерастворимости и агрегации, которой обладают естественные домены VH, полученные из последовательностей зародышевой линии или естественных тетрамерных антител. Эти антитела, содержащие только тяжелые цепи, и растворимые домены VH по изобретению обладают высокой аффинностью (10 нМ или лучше), растворимы при отсутствии агрегации и подходят, в частности, для использования в качестве лекарственных средств
Наложение замен аминокислот, найденных в растворимых VH антигенсвязывающих доменах человека с высокой аффинностью на известную трехмерную структуру домена VH человека, присутствующую в нормальном тетрамерном антителе, проливает свет на положение и функциональное влияние определяемых замен аминокислот. Например:
Наблюдали замены в каркасной области 1 с 13-й до 15-й аминокислоты, преимущественно в положении 13, которые ведут к общему повышению гидрофобности. Изменения в положении 13, расположенные в малой петле, ведут к локальному повышению гидрофильности;
В β-складчатом слое на упомянутой поверхности контакта с легкой цепью могут происходить замены в каркасной области 2, сосредоточенные вокруг положений 35 и 50; и
По-видимому, в каркасной области 3 замены преобладают в участках контакта каркасной области/CDR, например, в конце CDR2 (положения 56 и 57) и в начале CDR3 (положение 93).
Изобретение необязательно относится ко вставкам или заменам аминокислот в предпочтительных новых каркасных областях, которые встроены в природные генные сегменты V для использования в оптимизированных трансгенных локусах антител, содержащих только тяжелые цепи, для получения антител с высокой аффинностью, содержащих только тяжелые цепи, и доменов VH с предпочтительными биофизическими характеристиками, включая растворимость при отсутствии агрегации.
Таким образом, предоставлены выбранные растворимые домены VH человека с предпочтительными биофизическими характеристиками, такими как растворимость при отсутствии агрегации. Это предоставляет источник природных каркасных областей тяжелых цепей, которые, после объединения с одним или более CDR, предусматривают дальнейшее образование библиотек связывающих белков VH, источник новых антигенсвязывающих белков (см. патентные заявки США №№11/102502 и 11/745644).
Также авторы настоящего изобретения с удивлением обнаружили, что экспрессировать кодируемые трансгенами антитела, содержащие только тяжелые цепи, также могут долгоживущие плазматические клетки мышей или В-клетки памяти, выделенные из вторичных лимфатических желез, костного мозга и селезенки трансгенных животных, сенсибилизированных антигеном, которые содержат локусы генов только тяжелых цепей. Кроме того, разработаны значительно более высокоэффективные способы, для которых не нужны гибридомы или классические подходы с использованием дисплеев для получения антиген-специфических антител, содержащих только тяжелые цепи, или растворимых доменов VH.
Предпочтительно клонированную кДНК, кодирующую антитело, содержащее только тяжелые цепи, или растворимые домены VH, полученные из выделенной из популяций плазматических клеток или клеток памяти сенсибилизированных антигеном трансгенных животных, может экспрессировать любая предпочитаемая клеточная линия, которая способна экспрессировать, накапливать, секретировать и представлять слитый белок домена VH или антитело, содержащее только тяжелые цепи, на клеточной поверхности. Предпочтительно выбирают линии бактериальных клеток или линии клеток млекопитающих, подходящие для производства веществ для клинического применения.
Таким образом, согласно второму аспекту по изобретению, антитела, содержащие только тяжелые цепи, и растворимые домены VH по первому аспекту изобретения получают из В-клеток памяти или долгоживущих плазматических клеток организма-хозяина. Второй аспект изобретения относится к способу получения антитела, содержащего только тяжелые цепи, которое специфично связывает антиген, способ содержит:
(a) иммунизация трансгенного млекопитающего, не относящегося к человеку, антигеном, где млекопитающее экспрессирует антитела, содержащие только тяжелые цепи, у которых отсутствует функциональность СН1 в транскрибируемой и процессируемой мРНК тяжелой цепи;
(b) выделение долгоживущих плазматических клеток или В-клеток памяти из иммунизированного млекопитающего;
(c) выделение популяции мРНК из клеток, полученных на стадии (b);
(d1) клонирование популяции кДНК, полученных из мРНК, выделенных на стадии (с), в экспрессионный вектор и экспрессия кДНК в предпочитаемой клеточной линии;
(e1) выбор по меньшей мере одной клеточной линии, которая продуцирует антитело, содержащее только тяжелые цепи, которое специфично связывает антиген;
или
(d2) клонирование популяции кДНК, содержащих домены VH, полученные из мРНК, выделенных на стадии (с), в предпочитаемый экспрессионный вектор так, чтобы слитый белок VH, который может содержать эффекторную область тяжелой цепи, экспрессировать в предпочитаемой клеточной линии;
(е2) выбор по меньшей мере одной клеточной линии, которая продуцирует слитый белок VH, который специфично связывается с антигеном.
Предпочитаемая клеточная линия предпочтительно получена у млекопитающего, но может быть получена и из дрожжей или любого организма, способного накапливать или секретировать антитела, содержащие только тяжелые цепи, и слитые белки домена VH или данные указанные антитела, содержащие только тяжелые цепи, и слитые белки домен VH на клеточной поверхности.
Способ подходит для выделения антител, содержащих только тяжелые цепи, которые получены или естественным путем в организме-хозяине, таком как лама, или в результате экспрессии трансгенного локуса в организме-хозяине, не относящемся к человеку.
Предпочтительно, предпочитаемая клеточная линия млекопитающего, например, клетки СНО, подходит для получения вещества для клинического применения.
Способ прост, высокоэффективен и хорошо подходит для автоматизации, поскольку антитела, содержащие только тяжелые цепи, являются гомодимерами, а не комплексными тетрамерами. Нет необходимости в поиске родственной легкой цепи, что представляет собой проблему, которая значительно усложняет получение антиген-специфических тетрамерных антител из популяций клеток памяти и плазматических клеток (см. Meijer et al. (2009) Therapeutic Antibodies: Methods and Protocols, 525, 261-277).
Популяции В-клеток, обогащенные долгоживущими плазматическими клетками или клетками памяти, можно выделить из организма-хозяина многими способами, которые хорошо отлажены в данной области. Предпочтительным организмом-хозяином является мышь. У мышей популяции В-клеток подробно охарактеризованы, а для того, чтобы различать различные субпопуляции, можно использовать поверхностные клеточные маркеры. Например, плазматические клетки мыши экспрессируют CD138 (Syndecan-1) на клеточной поверхности. Экспрессия CD138 на клетках линии дифференцировки В-клеток соответствует стадии развития, локализации и адгезии (см. Sanderson et al. (1989) Cell Regulation, 1, 27-35; Kim et al (1994) Mol. Biol. Cell., 5, 797-805). Плазматические клетки CD138+выявлены преимущественно в селезенке, лимфатических железах и костном мозге. Плазматические клетки дополнительно можно отличить от популяций наивных В-клеток, В-клеток памяти и не В-клеток мыши, поскольку они положительны по CD138, слабо положительны/отрицательны по CD4 5R (В220) и слабо положительны/отрицательны по CD19.
Доступность антител, распознающих поверхностные клеточные маркеры, позволяет отделять плазматические клетки от других популяций В-клеток посредством сортировки флуоресцентно-активированных клеток или хорошо отлаженными способами разделения клеток, которые широко доступны в наборах на основе, например, процедур разделения на магнитах, колонках или в центрифуге с использованием антител, конъюгированных с твердой подложкой, что позволяет отделить связыванием одну клеточную популяцию от другой. Таким образом, например магнитные бусы, содержащие антитела против CD45R (когда-то известные как В220), будут устранять большинство не плазматических клеток из смешанной популяции В-клеток. Последующая инкубация с магнитными бусами, содержащими антитела против CD138, будут захватывать высокообогащенную популяцию плазматических клеток (см. набор для магнитной сортировки для выделения CD138+ плазматических клеток мыши компании Miltenyi Biotec). Также можно использовать другие поверхностные клеточные маркеры для выделения этих клеток (например, Anderson et al. (2007) J. Exp. Med., 204, 2103-14). Также исходную клеточную популяцию можно получать из лимфатических желез и/или Пейеровых бляшек.
Когда не доступны смеси антител, которые позволяют дифференцировать данные линии дифференцировки В-клеток хозяина, тогда можно использовать комбинацию выделения В-клеток из костного мозга и лимфатических узлов с последующей очисткой В-клеток с использованием антитела против общего поверхностного маркера В-клеток, что позволяет получить высокообогащенную популяцию плазматических клеток.
В частности, это уместно для таких видов, как корова, кролик, овца и т.п., и даже человек, где поверхностные клеточные маркеры, такие как CD138, могут быть недоступны. Для других видов доступны маркеры для выбора конкретных популяций В-клеток (например, http://www.miltenvibiotec.com/en/PG_91_625_CD138_Plasma_Cell_Iso lation_Kit.aspx; Klein et al., Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+peripheral blood B-cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated (memory) В cells, (1998) J. Exp. Med., 188, (9), 1679-89; Denham et al., Monoclonal antibodies putatively identifying porcine В cells, (1998) Vet Immunol Immunopathol. 30;60(3-4):317-28; Boersma et al., Summary of workshop findings for porcine B-cell markers, (2001) Vet. Immunol Immunopathol., 80, (1-2), 63-78; Naessens, Surface Ig on В lymphocytes from cattle and sheep, (1991) Int. Immunol., 9, (3), 349-54; Sehgal et al., Distinct clonal Ig diversification patterns in young appendix compared to antigen-specific splenic clones, (2002) J. Immunol., 168, (11), 5424-33).
После выделения мРНК из выделенных популяций плазматических клеток или клеток памяти, кДНК (которая представляет или антитело, содержащее только тяжелые цепи, или отдельно домены VH) клонируют в предпочитаемый экспрессионный вектор, и вектором трансфицируют популяцию клеток-мишеней для экспрессии антител, содержащих только тяжелые цепи, или слитые белки VH. Клетки, экспрессирующие антиген-специфические антитела, содержащие только тяжелые цепи, можно отобрать, например, стандартным ELISA в 96-луночном формате или в формате миркочипа или сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) для получения клеточных линий.
Предпочтительно для того, чтобы максимизировать эффективность процесса, экспрессионным вектором сначала трансфицируют бактерии, а колонии, содержащие клонируемую кДНК в экспрессионном векторе, собирают в 96-луночном формате (или используют в другом высокопроизводительном автоматизированном способе), растят в 96-луночном формате и выделяют ДНК. Плазмидной ДНК впоследствии трансфицируют в том же формате экспрессирующие клетки (например, клетки НЕК или клетки дрожжей и т.п.), а трансформанты растят в том же 96-луночном формате. Затем супернатант клеток тестируют в том же формате (или в другом, предпочтительно высокоплотном, формате, таком как микрочип, использующем меньшее количество антигена) на связывание антигена. Затем можно дополнительно размножать антиген-положительные клетки, экспрессирующие антитела, содержащие только тяжелые цепи, и положительные кДНК, непосредственно доступные из исходного 96-луночного формата, в котором ДНК получали для дальнейшей характеризации, такой как анализ последовательностей, или соответствующий домен VH можно непосредственно клонировать на другом остове, например, в другой константной области от того же вида или от другого вида. ДНК также можно использовать непосредственно для трансфекции клеток других типов для создания других клеточных линий.
Затем можно размножать клеточные линии, экспрессирующие антитела с высокой аффинностью, создавать банки клеток и использовать их в качестве источника целевых антител, содержащих только тяжелые цепи, для исследовательских целей или, возможно, для доклинических и клинических исследований. Таким образом, способ дополнительно содержит стадию поддержания выбранной клеточной линии, которая продуцирует антитело, содержащее только тяжелые цепи, или слитый белок VH, который специфично связывает антиген мишени.
Этот способ направленного клонирования также будет полезен для нормальных тетрамерных антител, полученных посредством трансгенов, где в каждой лунке используют отдельные CD138+ клетки. (Избыточную) мРНК, которая кодирует тяжелые и легкие цепи, раздельно амплифицируют посредством ПЦР с использованием праймеров со специфичностью к цепи и затем клонируют в экспрессионный вектор. Совместная трансфекция двумя векторами приведет к экспрессии тетрамерного антитела, которое можно идентифицировать таким же образом, как описано для антитела, содержащего только тяжелые цепи.
Предпочитаемые экспрессионные векторы известны специалисты в данной области и разработаны для осуществления эффективной экспрессии антитела, содержащего только тяжелые цепи, или слитого белка VH в предпочитаемом типе клеток. Когда предусмотрена секреция, вектор будет содержать сигнальный пептид на N-конце. Когда предусмотрена экспрессия на клеточной поверхности, тогда также будет иметь место гидрофобная пептидная последовательность на С-конце. Предпочтительно, но не по существу, такие N- и С-концевые пептиды можно получить из тяжелых цепей иммуноглобулинов млекопитающего. Векторы конструируют в формате кассеты так, чтобы растворимые домены VH, клонированные из антигенспецифических антител, содержащие только тяжелые цепи, можно было получать в виде слитых белков. Получаемый слитый белок может представлять собой антитело, содержащее только тяжелые цепи, и содержит растворимый домен VH и предпочитаемый эффекторный домен тяжелой цепи. Если растворимый домен VH и предпочитаемый эффекторный домен получены у человека, то полученный слитый белок представляет собой антитело человека, содержащее только тяжелые цепи, которое принадлежит к классу (и субтипу), определяемому посредством выбора эффекторной области (например, IgM, IgG, IgA, IgE или IgD). В любом антителе, содержащем только тяжелые цепи, растворимый домен VH и константные эффекторные области связаны шарнирной областью. Предпочтительно, но не по существу, она представляет собой естественную шарнирную область тяжелой цепи иммуноглобулина, полученную из соответствующего класса или субтипа.
Преимущество указанного выше способа относительно других способов, таких как фаговый дисплей или гибридомы с использованием веществ, полученных из цельной селезенки, состоит в том, что способ позволяет отбирать антитела с высокой аффинностью, содержащие только тяжелые цепи, (10 нм или лучше), продуцируемые плазматическими клетками или клетками памяти после все еще не известного процесса селекции in vivo. Такие популяции В-клеток продуцируют антитела, содержащие только тяжелые цепи, которые растворимы и не накапливаются во внутриклеточных компартментах (в ином случае такое накопление будет вести к апоптозу). Такие антитела, содержащие только тяжелые цепи, можно эффективно экспрессировать с использованием стандартных экспрессирующих систем, в частности, в созданных линиях клеток млекопитающих, таких как НЕК или СНО. Затем трансфицированные клетки можно упорядочить, используя налаженную технологию, типично автоматизированный микролуночный формат (например, 96 лунок). Затем те клетки, которые экспрессируют антигенсвязывающие антитела с высокой аффинностью, содержащие только тяжелые цепи, или альтернативно клетки, которые экспрессируют антитела, содержащие только тяжелые цепи, которые связывают антиген в определенном диапазоне аффинностей, можно отобрать для дальнейшего анализа. Альтернативно связывающие средства с высокой аффинностью можно отобрать посредством анализа FACS. Использование клеток памяти или плазматических клеток, полученных из одного или более сенсибилизированных антигеном трансгенных животных, не относящихся к человеку, например, из мыши, которая экспрессирует антиген-специфические антитела, содержащие только тяжелые цепи, в качестве источника мРНК антитела, содержащего только тяжелые цепи, предоставляет чрезвычайно эффективный путь для селекции антител, содержащих только тяжелые цепи, который позволяет осуществлять селекцию потенциально миллионов клеток, продуцирующих антитела, содержащие только тяжелые цепи, для последующего анализа. Затем прошедшие селекцию клетки, экспрессирующие антигенсвязывающие антитела с высокой аффинностью, содержащие только тяжелые цепи, можно размножать в культуре, обеспечивая источник клеток, которые продуцируют антитела, содержащие только тяжелые цепи, в отсутствие дополнительных стадий клонирования.
Необязательно, выделенные долгоживущие плазматические клетки или В-клетки памяти можно иммортализовать перед выделением мРНК и клонированием антиген-специфических антител, содержащих только тяжелые цепи, или доменов VH.
Настоящее изобретение также относится к трансгенному млекопитающему, не относящемуся к человеку, которое содержит трансгенный локус тяжелой цепи или локус, содержащий только тяжелую цепь (отсутствует функциональность СН1), который содержит доминантный селекционный маркерный ген. Также предусмотрено введение более чем одного селективного маркера, каждый маркер связан с отдельным локусом или группой локусов, что допускает предпочтительный отбор гибридом, экспрессирующих один в отличие от другого локуса или группы локусов, способных экспрессировать антитела, содержащие только тяжелые цепи.
Использование нескольких селективных маркеров в различных локусах основано на обнаружении того, что когда трансгенное млекопитающее, не относящееся к человеку, содержит несколько локусов, содержащих только тяжелые цепи, эти локусы подвержены аллельному исключению (PCT/IB2007/001491). Следовательно, после сенсибилизации антигеном происходит случайный выбор только одного локуса и успешная рекомбинация, которая ведет к образованию антитела, содержащего только тяжелые цепи. Следовательно можно использовать несколько VH локусов, содержащих только тяжелые цепи, в одном и том же трансгенном млекопитающем, не относящемся к человеку, чтобы максимизировать репертуар и разнообразие антител, которые можно получить у млекопитающего. После сенсибилизации антигеном, трансгенное млекопитающее, не относящееся к человеку, будет осуществлять случайные рекомбинации в локусе за локусом, не отдавая предпочтения какому-либо данному локусу, пока одна из рекомбинаций не будет «защитной», т.е. не приведет к образованию антитела. Происходит остановка дальнейшей рекомбинации и тем самым «исключение» других аллелей (локусов). Клетки, которые продуцируют антитело с высокой аффинностью, предпочтительно размножают.
Типично доминантные селективные маркерные гены получают у прокариотов и выбирают из группы, которая или придает устойчивость к токсическим лекарственным средствам, таким как пуромицин, гигромицин и G418, или содержит гены, которые устраняют определенные требования к питательной среде, так что их экспрессия превращает токсичный субстрат в незаменимую аминокислоту, например, превращает индол в триптофан или превращает гистидинол в гистидин. Необходимое требование состоит в том, что если используют доминантный селективный маркер, то происходит его совместная экспрессия с желаемым аллелем иммуноглобулина, содержащим только тяжелые цепи, таким образом гарантируя В-клеточную экспрессию и интеграцию сайт-независимой экспрессии трансгенного локуса. Альтернативно, ген устойчивости к лекарственному средству можно встроить в эндогенный или экзогенный (трансгенный) локус иммуноглобулина с использованием гомологичной рекомбинации в сочетании с клетками ES или подходов, основанных на ядерной передаче.
Таким образом, предоставлен способ получения моноклонального антитела, который требует осуществления селекции линии гибридомы или трансформированных В-клеток, предпочтительно полученных из клеток памяти или плазматических клеток, экспрессирующих определенный локус иммуноглобулина, содержащего только тяжелые цепи, содержащих один из нескольких локусов генов, содержащих только тяжелые цепи, которые присутствуют в трансгенном млекопитающем, не относящемся к человеку, указанный локус содержит совместно экспрессируемый доминантный селективный маркерный ген, вставленный в указанный локус.
Предпочтительно, этот локус представляет собой локус, содержащий только тяжелую цепь, доминантный селективный маркерный ген, этот локус экспрессирует антитело, содержащее только тяжелые цепи. Предпочтительно, антитело, содержащее только тяжелые цепи, получают из эндогенного локуса, содержащего только тяжелую цепь, который сконструирован без функциональности СН1, или из введенного трансгена тяжелой цепи, у которого отсутствует функциональность СН1, необязательно в отсутствие экспрессии гена легкой цепи иммуноглобулина. Указанный локус также может содержать доминантный селективный маркер и локус тяжелой цепи в отсутствие локусов легких цепей, указанный ген тяжелой цепи, во время экспрессии, спонтанно повышает уровень мРНК транскрипта, у которого отсутствует функциональность СН1, что ведет к экспрессии антитела, содержащего только тяжелые цепи, зависимым от В-клеток образом.
Согласно третьему аспекту по изобретению, когда для иммортализации плазматических клеток или клеток памяти предусмотрены подходы с использованием гибридом или трансформации В-клеток, тогда включение функционального доминантного селективного маркерного гена в каждый локус тяжелой цепи позволяет осуществлять последовательную селекцию и стабильное поддержание гибридомы или трансформированных линий В-клеток, экспрессирующих локус, представляющий интерес, после сенсибилизации антигеном, и при этом теряются все гибридомные клетки или трансформированные В-клетки, которые не экспрессируют этот локус, представляющий интерес. Для цели по изобретению можно использовать любой доминантный селективный маркерный ген при условии, что экспрессия гена обеспечивает гибридомы селективным преимуществом в присутствие селективного стимула, например, токсического стимула (см. Vara et al. (1986) NAR5 14, 4617-4624; Santerre et al. (1984) Gene, 30, 147-156; Colbere-Garapin et al. (1981) 150, 1-14; Hartmann and Mulligan (1988) PNAS, 85, 8047-8051).
Гетерологичный локус, содержащий только тяжелую цепь
В контексте настоящего изобретения термин «гетерологичный» обозначает нуклеотидную последовательность или локус, как описано в настоящем документе, который не является эндогенным для млекопитающего, в котором он расположен, или эндогенный локус, модифицированный посредством замены или удаления эндогенной последовательности.
«Локус, содержащий только тяжелую цепь» в контексте настоящего изобретения относится к локусу, который кодирует домен VH, содержащий один или более генных сегментов V, один или более генных сегментов D и один или более генных сегментов J, которые функционально связаны с одной или более эффекторными областями тяжелых цепей (у каждой отсутствует функциональность СН1 домена).
Сложность генного сегмента V можно повысить путем увеличения числа генных сегментов V, присутствующих в локусе, или путем использования различных локусов, каждый из которых содержит различные генные сегменты V.
Предпочтительно локус, содержащий только тяжелую цепь, содержит от пяти до двадцати различных генных сегментов V, полученных у любого вида позвоночных.
Предпочтительно генные сегменты V получены у человека, необязательно прошли селекцию или получены конструированием для повышения растворимости.
Предпочтительно локус, содержащий только тяжелую цепь, содержит от двух до сорока (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30 или 40) или более генных сегментов D. Генные сегменты D можно получить из любого вида позвоночных, но наиболее предпочтительно генные сегменты D представляют собой генные сегменты D человека (в норме 25 функциональных генных сегментов D).
Предпочтительно, локус, содержащий только тяжелую цепь, содержит от двух до двадцати (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 или 20) или более генных сегментов J. Генные сегменты J можно получить из любого вида позвоночных, наиболее предпочтительно генные сегменты J представляют собой генные сегменты J человека (в норме 6 генных сегментов J).
Предпочтительно локус, содержащий только тяжелую цепь, содержит два или более генных сегмента V, двадцать пять функциональных генных сегментов D человека и 6 генных сегментов J человека.
Термин «генный сегмент V» охватывает встречающийся в природе генный сегмент V, полученный у позвоночного, включая верблюдовых и человека, который необязательно прошел селекцию, созревание или получен конструированием для повышения характеристик, таких как растворимость. Генные сегменты V также обнаружены у других видов позвоночных, таких как акула (см. Kokubu et al. (1988) EMBO J., 7, 3413-3422), или эволюционировали для того, чтобы предоставить разнообразные VH-подобные семейства связывающих белков, примером чего служит, например, эволюция репертуара VL легких цепей антител или репертуара VH Т-клеточного рецептора.
Генный сегмент V должен быть способен к рекомбинации с генным сегментом D, генным сегментом J и константной (эффекторной) областью тяжелой цепи (которая может содержать несколько экзонов, но не содержит экзон СН1) в соответствии с настоящим изобретением для создания антитела, содержащего только тяжелые цепи, когда экспрессируют нуклеиновую кислоту.
Объем генного сегмента V согласно настоящему изобретению также включает любую последовательность гена, кодирующую гомолог, производное или фрагмент белка, которая способна к рекомбинации с генным сегментом D, генным сегментом J и константной эффекторной областью тяжелой цепи (содержит один или более экзонов, но не функциональный экзон СН1) в соответствии с настоящим изобретением для создания антитела, содержащего только тяжелые цепи, как определено в настоящем документе. Константная эффекторная область тяжелой цепи может содержать СН1 домен в условиях, где локус тяжелой цепи иммуноглобулина экспрессируют у животного-хозяина с генотипом, лишенным экспрессии гена легкой цепи иммуноглобулина.
Таким образом, VH кодирующие последовательности можно получить из встречающегося в природе источника или их можно сконструировать или синтезировать, используя способы, известные специалистам в данной области.
«Растворимый домен VH» в контексте настоящего изобретения относится к продукту экспрессии генного сегмента V после рекомбинации с генным сегментом D и генным сегментом J, как определено выше. После естественной селекции и созревания аффинности родительского антитела, содержащего только тяжелые цепи, растворимый домен VH, как применяют в настоящем документе, после экспрессии и выделения остается в растворе при отсутствии агрегации и сохраняет активность в физиологической среде без необходимости в любом другом факторе для поддержания растворимости. Также можно сконструировать отдельно растворимый домен VH с использованием различных белковых доменов, чтобы получить слитые белки для целей таргетной терапии и диагностики, например с токсинами, ферментами или средствами для визуализации или с белками крови, такими как альбумин, чтобы фармакокинетикой управлять растворимого домена VH и распределением в тканях in vivo (см. US 5843440 и Smith et al. (2001) Bioconjugate Chem., 12, 750-756).
В контексте настоящего изобретения термины «генный сегмент D» и «генный сегмент J» содержат встречающиеся в природе последовательности генных сегментов D и J. Предпочтительно генные сегменты D и J получают у того же позвоночного, у которого получают генный сегмент V. Например, если генные сегмент V получают у человека и затем повышают его растворимость или используют в конструировании, то генные сегменты D и J предпочтительно также получают у человека. Альтернативно можно получить генные сегменты V, например, у крысы или мыши, а генные сегменты D и J у верблюда или человека.
Также объем терминов «генный сегмент D» и «генный сегмент J» включает их производные, гомологи и фрагменты при условии, что получаемый сегмент можно рекомбинировать с остальными компонентами локуса тяжелой цепи антитело, как описано в настоящем документе, для создания антитела, содержащего только тяжелые цепи, как описано в настоящем документе. Генные сегменты D и J можно получить из встречающихся в природе источников или их можно синтезировать, используя способы, известные специалистам в данной области и описанные в настоящем документе. Генные сегменты D и J могут содержать определенные дополнительные аминокислотные остатки или определенные замены аминокислот или делеции для того, чтобы повысить разнообразие CDR3.
Генные сегменты V, D и J способны к рекомбинации и предпочтительно подвержены соматическим мутациям.
Генные сегменты V, D и J предпочтительно получают у одного вида позвоночных. Он может представлять собой любой вид позвоночных, но предпочтительно он представляет собой человека.
Характерные последовательности представляют собой четыре точно определенные замены в аминокислотной последовательности, кодируемые зародышевой линией (тетрада VHH), представленные в доменах VHH верблюдовых, но не в растворимых доменах VH. Они все присутствуют во второй каркасной области и выполняют функцию снижения гидрофобности упомянутой поверхность контакта с легкой цепью. Glu-44 и Arg-45 обнаруживают вместо менее гидрофильных Gly-4 4 и Leu-4 5, которые присутствуют в доменах VH, тогда как гидрофильность в положении 4 7 повышают замены Тгр на остатки меньших размеров. Четвертый заряд требует замещения Val-37 на Phe или Туr.
Константная область тяжелой цепи
Функционально константную область тяжелой цепи кодирует встречающийся в природе или сконструированный генный сегмент, который способен к рекомбинации с генным сегментом V, генным сегментом D и генным сегментом J в В-клетке. Предпочтительно константную область тяжелой цепи получают из локуса антитела.
Каждая константная область тяжелой цепи по существу содержит по меньшей мере один ген константной области тяжелой цепи, который экспрессируется без функционального СН1 домена с тем, чтобы могло произойти образование антитела, содержащего только тяжелые цепи. Когда отсутствует экспрессия эндогенного гена легкой цепи иммуноглобулина, константная область тяжелой цепи может содержать функциональность СН1, которая может с низкой частотой спонтанно исчезать во время экспрессии гена тяжелой цепи. Каждая константная область тяжелой цепи также может содержать одну или более дополнительных экзонов константной области тяжелой цепи, которые выбирают из группы, состоящей из Сδ, Сγ1-4, Сµ, Сε и Сα1-2. Генные сегменты константной области тяжелой цепи выбирают в зависимости от предпочтительного класса или необходимой смеси классов антител. Необязательно, в гетерологичном локусе тяжелой цепи не достает Сµ и Сδ.
Например, экспрессия всего или части локуса Сγ гетерологичной тяжелой цепи, лишенной СН1, будет создавать необязательно некоторые или все изотипы IgG, в зависимости от изотипов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, присутствующих в гетерологичном локусе IgG.
Альтернативно можно получить выбранные смеси антител. Например, когда константная область тяжелой цепи содержит ген Сα и Сµ, можно получить IgA и IgM.
Константная область тяжелой цепи, присутствующая в трансгенном локусе, может быть получена у человека, но может быть такой же как или близкородственной к таковой млекопитающего-хозяина с тем, чтобы максимизировать ответ на антигены in vivo. Таким образом, для получения антител, содержащих только тяжелые цепи, или растворимых доменов VH для применения в терапии людей, гены VDJ, присутствующее в локусе, получают из необязательно модифицированных последовательностей зародышевой линии человека, а константные области можно получать у грызуна, если животным-хозяином является грызун, например, мышь. Затем прошедшие селекцию антитела, содержащие только тяжелые цепи, которые содержат растворимые связывающие домены VH человека и константные эффекторные области грызуна, можно клонировать и заменить эффекторные области грызуна предпочитаемыми константными эффекторными областями человека или растворимыми доменом VH, используемым в полученных альтернативных слитых белках VH, комплексах домена VH антитела и т.п.
Когда антитела, содержащие только тяжелые цепи, подлежат использованию в ветеринарных или альтернативных целях, генные сегменты V, D и J предпочтительно получают у позвоночного или млекопитающего, наилучшим образом подходящего для предполагаемой цели. Например, генные сегменты V и генные сегменты D и J можно получить у других млекопитающих (например, у мыши, крысы, свиньи, коровы, козы, овцы, верблюда и т.п.) в зависимости от предполагаемого использования, например, в ветеринарном, промышленном, сельскохозяйственном, диагностическом применении или применении в качестве реактива.
«Экзон константной области тяжелой цепи» («экзон СН»), как определено в настоящем документе, содержит последовательности встречающихся в природе экзонов СН позвоночных и, в особенности, млекопитающих. Они отличаются в зависимости от класса. Например, природные IgG и IgA лишены СН4 домена. Объем термина «экзон СН» также включает его производные, гомологи и фрагменты при условии, что экзон СН способен к формированию функционального антитела, содержащего только тяжелые цепи, как определено в настоящем документе, когда он является компонентом константной области тяжелой цепи.
Млекопитающие
Трансгенное млекопитающее, используемое в способах по изобретению, не является человеком. Трансгенными млекопитающими предпочтительно являются грызуны, такие как кролик, морская свинка, крыса или мышь. Мыши и крысы особенно предпочтительны. Также можно использовать альтернативных млекопитающих, таких как козы, свиньи, рогатый скот, овцы, кошки, собаки или другие животные.
Предпочтительно, трансгенных животных, содержащих гетерологичные локусы антител, содержащих только тяжелые цепи, интегрированные в зародышевую линию, создают с использованием налаженной технологии инъекции в ооцит и, если налажено, технологии клеток ES, технологии клеток iPS или технологии ядерной передачи (клонирования). Альтернативно локусы можно вводить в указанные выше клетки или непосредственно в оплодотворенные яйцеклетки с использованием нуклеаз, содержащих цинковые пальцы, (Reray et al. (2009) Transgenic Res., 2009 Sep 26. [электронная публикация до выхода в печать], Kandavelou et al. (2009) Biochem. Biophys. Res. Commun., 388, (1), 56-61) или технологии рекомбинантных ферментов (например, Sakurai et al. (2010) Nucleic Acids Res., Jan 13 [электронная публикация до выхода в печать] и цитируемые в них источники), такие как Сrе и т.д.
Стандартную гомологичную рекомбинацию в клетках ES также можно использовать для устранения функциональности СН1 из эндогенных генов тяжелых цепей и для замены элементов или последовательностей в эндогенных сегментах генов V или генных сегментах D и J, что ведет к образованию антител, содержащих только тяжелые цепи, из эндогенных локусов тяжелых цепей.
Предпочтительно усиливают трансгенную экспрессию гетерологичных локусов генов, содержащих только тяжелые цепи, где локусы тяжелых цепей антитела, эндогенные для млекопитающего, удаляют или переводят их молчащее состояние или они имеют сниженную способность к образованию эндогенных антител. Когда в эндогенных локусах тяжелых цепей организма-хозяина путем конструирования устраняют функциональность CH1, а VDJ и необязательно константные эффекторные области заменяют последовательностями других видов, предпочтительно человека, тогда добавление дополнительных трансгенных локусов тяжелых цепей не является необходимым.
Этот подход к созданию антител, содержащих только тяжелые цепи, и растворимые домены VH, как описано выше, может иметь особое значение при создании растворимых антител и комплексов антител, не образующих агрегаты, для терапевтического использования у человека. Следовательно, в дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к трансгенному млекопитающему, которое экспрессирует гетерологичный локус тяжелой цепи в соответствии с настоящим изобретением в ответ на сенсибилизацию антигеном.
Антителопродуцирующие клетки можно получить из трансгенных животных в соответствии с настоящим изобретением и использовать, например, в предпочтительном варианте осуществления, для получения клеток памяти или долгоживущих плазматических клеток, а также для получения антител, содержащих только тяжелые цепи, от гибридом или посредством массовых подходов, как определено в настоящем документе. Кроме того или альтернативно, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие антитела, содержащие только тяжелые цепи, и/или растворимые домены VH, можно выделять из В-клеток, в особенности, из клеток памяти или долгоживущих плазматических клеток трансгенных млекопитающих в соответствии с настоящим изобретением после сенсибилизации антигеном и использовать для получения растворимых антител с доменом VH, содержащих только тяжелые цепи, растворимых биспецифических/бифункциональных комплексов с доменом VH или растворимых полипротеинов доменов VH (см. WO 99/23221), используя способы рекомбинантной ДНК, которые известны специалистам в данной области.
Альтернативно или кроме того, поликлональные антиген-специфические антитела, содержащие только тяжелые цепи, можно создавать посредством иммунизации трансгенного животного в соответствии с настоящим изобретением.
Таким образом, в дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения антител с высокой аффинностью, содержащих только тяжелые цепи, посредством иммунизации трансгенного млекопитающего в соответствии с настоящим изобретением, с использованием антигена.
В предпочтительном варианте осуществления этого аспекта по изобретению млекопитающим является грызун, предпочтительно мышь или крыса.
Получение антител, содержащих только тяжелые цепи, и слитых белков растворимых доменов УН
Системы для получения антител, содержащих только тяжелые цепи, и слитых белков растворимых доменов VH включают клетки млекопитающих в культуре (например, клетки СНО), растения (например, маис), трансгенных коз, кроликов, рогатый скот, овец, кур и личинки насекомых, подходящие для технологий массового размножения. Другие системы для получения, включая вирусную инфекцию (например, бакуловирус в личинках насекомых и клеточных линиях), являются альтернативой для подходов с использованием клеточных культур и зародышевой линии. Другие способы получения также известны специалистам в данной области. Когда необходим сборка содержащих только тяжелые цепи IgA или IgM, совместная экспрессия «цепи J» может быть полезной. Подходящие способы получения антител, содержащих только тяжелые цепи, или растворимых связывающих доменов VH в отдельности или комплексов связывающих доменов VH известны в данной области. Например, в бактериальных системах получали связывающие домены VH и комплексы связывающих доменов VH, а в гибридомах и трансфицированных клетках млекопитающих получали гомодимеры, содержащие только тяжелые цепи, (см. Reichmann and Muyldermans, (1999) J. Immunol. Methods, 231, 25-38).
Также хорошо отлажены способы для экспрессии сконструированных связывающих доменов VH человека, полученных с использованием технологии фагового дисплея (Tanha et al. (2001) J. Biol. Chem., 276, 24774-24789 и цитируемые в них источники).
Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидной последовательности, состоящей из гетерологичного локуса тяжелой цепи, выделенного полинуклеотида, кодирующего антитело по изобретению, содержащее только тяжелые цепи, и к вектору, содержащему гетерологичный локус тяжелой цепи или его фрагмент или выделенный полинуклеотид, который кодирует антитело, содержащее только тяжелые цепи, в соответствии с настоящим изобретением. Изобретение также относится к полинуклеотидным последовательностям, которые кодируют растворимые домены VH и слитые белки доменов VH, и к вектору, содержащему такие последовательности.
Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, которую трансформировали гетерологичным локусом, содержащим только тяжелую цепь, или его фрагментом или выделенным полинуклеотидом, который кодирует антитело, содержащее только тяжелые цепи, растворимый домен VH или слитый белок домена VH в соответствии с настоящим изобретением.
Использование антител, содержащих только тяжелые цепи, растворимых доменов УН и полипептидных комплексов и полипротеинов доменов VН по изобретению
Растворимые антитела с высокой аффинностью, содержащие только тяжелые цепи, слитые белки доменов VH, полипептидные комплексы доменов VH и растворимые домены VH по настоящему изобретению, в частности, подходят для использования как в качестве парентеральных, так и в качестве непарентеральных лекарственных средств. В контексте изобретения предпочтительно их полностью получают у человека, но необязательно и менее предпочтительно они могут содержать генные сегменты V, D или J других видов.
Антитела, содержащие только тяжелые цепи, содержащие растворимые домены VH, выделенные растворимые домены VH и связывающие комплексы растворимых доменов VH и полипротеинов с повышенной растворимостью по изобретению особенно подходят для использования в качестве реактивов, а также, в дополнение к терапии, в качестве диагностических средств.
Все они подходят для фармацевтического использования у людей и, таким образом, изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит антитело, содержащее только тяжелые цепи, содержащие растворимые домены VH, выделенные растворимые домены VH, связывающие комплексы растворимых доменов VH или полипротеины растворимых доменов VH. Изобретение также относится к использованию антител, содержащих только тяжелые цепи, содержащих растворимые домены VH, выделенных растворимых доменов VH, связывающих комплексов растворимых доменов VH или полипротеинов растворимых домен VH по настоящему изобретению в получении лекарственного средства для профилактики и/или лечения заболевания.
Перед введением пациентам фармацевтические композиции и лекарственные средства имеют типичный состав.
Например, антитело, содержащее только тяжелые цепи, содержащие растворимые домены VH, выделенные растворимые домены VH, связывающие комплексы растворимых доменов VH или полипротеины растворимых доменов VH можно смешать со стабилизаторами, в частности, если они подлежат лиофилизации. Чтобы придать стабильность во время лиофилизации, типично добавляют сахара (например, маннит, сахарозу или трегалозу), а предпочтительным стабилизатором является маннит. В качестве стабилизатора также можно добавлять сывороточный альбумин человека (предпочтительно, рекомбинантный). Также можно использовать смеси сахаров, например, сахарозу и маннит, трегалозу и маннит и т.д.
В композицию можно добавлять буфер например, буфер Tris, гистидиновый буфер, глициновый буфер или предпочтительно фосфатный буфер (например, содержащий дигидрофосфат натрия и гидрофосфат динатрия). Предпочтительно добавляют буфер, чтобы получить pH между 7,2 и 7,8 и, в частности, pH приблизительно 7,5.
Для восстановления после лиофилизации можно использовать стерильную воду для инъекций. Также можно восстанавливать лиофилизат с использованием водных композиций, содержащих сывороточный альбумин человека (предпочтительно, рекомбинантный).
Как правило, антитела, содержащие только тяжелые цепи, содержащие растворимые домены VH, выделенные растворимые домены VH, связывающие комплексы растворимых доменов VH или полипротеины растворимых доменов VH используют в очищенной форме вместе с фармакологически приемлемыми носителями.
Таким образом, изобретение относится к способу лечения пациента, который содержит введение фармацевтической композиции по изобретению пациенту. Пациентом предпочтительно является человек и, возможно, ребенок (например, ребенок ясельного возраста или младенец), подросток или взрослый, но, как правило, взрослый.
Изобретение также относится к антителу, содержащему только тяжелые цепи, содержащие растворимые домены VH, выделенным растворимым доменам VH, связывающим комплексам растворимых доменов VH и к полипротеинам растворимых доменов VH по изобретению для применения в качестве лекарственного средства.
Изобретение также относится к использованию антител, содержащих только тяжелые цепи, содержащих растворимые домены VH, выделенных растворимых доменов VH, связывающих комплексов растворимых доменов VH и полипротеинов растворимых доменов VH по изобретению в производстве лекарственного средства для лечения пациента.
Эти применения, способы и лекарственные средства предпочтительно предназначены для лечения заболеваний или нарушений, которые включают в качестве неограничивающих примеров: заживление ран, нарушения клеточной пролиферации, включая новообразования, меланому, остеосаркому легких, ободочной и прямой кишки, саркому прямой кишки, яичника, солидные опухоли шейки матки, пищевода, груди, поджелудочной железы, мочевого пузыря, головы и шеи и другие; миелопролиферативые нарушения, такие как лейкемия, неходжкинская лимфома, лейкопения, тромбоцитопения, нарушение ангиогенеза, саркома Капоши; аутоиммунные/воспалительные нарушения, включая аллергию, воспалительное заболевание кишечника, артрит, псориаз и воспаление дыхательных путей, астму, иммунные нарушения и отторжение трансплантата органа; сердечнососудистые и сосудистые нарушения, включая гипертензию, отек, стенокардию, атеросклероз, тромбоз, сепсис, шок, реперфузионное повреждение и ишемию; неврологические нарушения, включая заболевания центральной нервной системы, болезнь Альцгеймера, травму головного мозга, амиотрофический боковой склероз и боль; нарушения развития; нарушения метаболизма, включая сахарный диабет, остеопороз и ожирение, СПИД и почечную недостаточность; инфекции, включая вирусную инфекцию, бактериальную инфекцию, грибковую инфекцию и паразитарную инфекцию, патологические состояния, связанные с плацентой и другие патологические состояния, а также для использования в иммунотерапии.
В еще одном дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к использованию антитела, содержащего только тяжелые цепи, содержащих растворимые домены VH, выделенных растворимых доменов VH, связывающих комплексов растворимых доменов VH или полипротеинов растворимых доменов VH по настоящему изобретению в качестве диагностического, прогностического средства или терапевтического средства для визуализации по отдельности или в сочетании с подходящими эффекторными средствами.
Настоящее изобретение относится к использованию антитела, содержащего только тяжелые цепи, содержащие растворимые домены VH, выделенные растворимые домены VH, связывающие комплексы растворимых доменов VH или полипротеинов растворимых доменов VH, как описано в настоящем документе, в качестве внутриклеточного связывающего реактива или абзима. Предпочтительны антигенспецифические растворимые связывающие домены VH, связывающие комплексы растворимых доменов VH и полипротеины растворимых доменов VH.
Настоящее изобретение также относится к использованию антигенспецифического антитела, содержащего только тяжелые цепи, или растворимого связывающего домен VH в соответствии с настоящим изобретением в качестве ингибитора фермента или блокатора рецептора. Предпочтительными фрагментами антител, содержащими только тяжелые цепи, являются антигенспецифические растворимые связывающие домены VH.
Настоящее изобретение также относится к использованию одного или более растворимых доменов VH, слитых с эффекторной молекулой, для применения в качестве терапевтического, диагностического средства, средства для визуализации, абзима или реактива.
Далее, только в качестве примера, приведено следующее подробное описание изобретения, относящееся к следующим фигурам.
ФИГУРЫ
Фиг.1. Два локуса иммуноглобулинов человека, содержащих только тяжелые цепи, один несет 4 генных сегмента VH, другой несет 18 генных сегментов VH. Локусы, содержащее генные сегменты 18VH, содержат константные эффекторные области мыши (-СН1), которые покрывают более чем 90% используемых генных сегментов VH в нормальных тетравалентных антителах человека.
Фиг.2. Протокол иммунизации и выделения для домена VH человека посредством фагового дисплея или антител человека, содержащих только тяжелые цепи, посредством стандартной гибридомной технологии.
Фиг.3. ELISA (вверху) и вестерн-блоттинг (внизу) иммунизированной сыворотки Luk-sPV (V4 в сравнении с нормальными мышами дикого типа) и вестерн-блоттинг отдельно выделенных доменов VH с использованием электрофореза белка Lulc-sPV в геле, его блоттинга и определения с использованием различных положительных клонов из скрининга фагового дисплея.
Фиг.4. Пример двух последовательностей домена VH после иммунизации с использованием Luks-PV, который показывает, что получены как IgG2, так и IgG3 (переключение класса), и что одна и та же перестройка VDJ ведет к различным мутациям.
Фиг.5. Последовательности домена VH, полученные с использованием генного сегмента V3-23 после иммунизации с использованием CR1 человека, которые показывают, что получены как IgG2, так и IgG3 (переключение класса), и что та же перестройка VDJ ведет к различным мутациям, когда сравнивают с последовательностью сегмента V3-23 зародышевой линии, который представлен вверху. Части последовательностей получали посредством гибридом, а остальные посредством библиотек дисплеев.
Фиг.6. Последовательности домена VH, полученные с использованием генного сегмента V3-11 после иммунизации с использованием CR1 человека, которые показывают, что получены как IgG2, так и IgG3 (переключение класса), и что та же перестройка VDJ ведет к различным мутациям, когда сравнивают с последовательностью сегмента V3-11 зародышевой линии, представленной вверху. Части последовательностей получали посредством гибридом (стрелки), а остальные посредством библиотек дисплеев.
Фиг.7. Пример электрофореза в геле (слева) доменов VH (αCR1) после очистки и экспрессии в системе гибридного белка SUMO (InVitrogen). В примере показаны домены VH трех различных длин с правильной молекулярной массой. Дорожка с маркером расположена слева. В средней части представлен профиль элюции доменов VH на системе Sephadex 75 Smart. Правая часть содержит аналогичную информацию, но для полного IgG, содержащего только тяжелые цепи, на Sephadex 200. В нижней части представлены профили элюции двух других доменов VH, сконцентрированных до >4 мг/мл.
Фиг.8. А. График светорассеяния и В. Тепловая стабильность доменов VH.
Фиг.9. Измерения аффинности нескольких антител против αCR1, содержащих только тяжелые цепи, (слева) и профили связывании и диссоциации одного из антител на системе Octet, чтобы получить аффинность связывания.
Фиг.10. Растворимость нескольких доменов VH против CR1.
Фиг.11. Массовое параллельное секвенирование для определения предпочтительных мутаций.
Фиг.12. Анализ коробчатой диаграммы для каркасной области 1 (FR1) и области CDR1 антител человека, содержащих только тяжелые цепи, в сравнении с теми же областями тяжелых цепей нормальных тетрамерных антител верблюда, ламы и человека, которые содержат тяжелые/легкие цепи. Суммарный заряд определяли по уравнению Хендерсона-Хассельбаха при pH=7,4; суммарную гидрофобность определяли по индексу Коана-Уиттакера при pH=7,5. Числа, расположенные ниже различных антител, представляют собой число уникальных входных последовательностей.
Фиг.13. Анализ коробчатой диаграммы каркасной области 2 (FR2) и области CDR2 антител человека, содержащих только тяжелые цепи, в сравнении с теми же областями тяжелых цепей нормальных тетрамерных антител верблюда, ламы и человека, которые содержат тяжелые/легкие цепи. Суммарный заряд определяли по уравнению Хендерсона-Хассельбаха при pH=7,4; суммарную гидрофобность определяли по индексу Коана-Уиттакера при pH=7,5. Числа, расположенные ниже различных антител, представляют собой число уникальных входных последовательностей.
Фиг.14. Анализ коробчатой диаграммы каркасной области 3 (FR3) и области CDR3 антител человека, содержащих только тяжелые цепи, в сравнении с теми же областями тяжелых цепей нормальных тетрамерных антител верблюда, ламы и человека, которые содержат тяжелые/легкие цепи. Суммарный заряд определяли по уравнению Хендерсона-Хассельбаха при pH=7,4; суммарную гидрофобность определяли по индексу Коана-Уиттакера при pH=7,5. Числа, расположенные ниже различных антител, представляют собой число уникальных входных последовательностей
Фиг.15. Трехмерная структура доменов VH, связывающих или CR1 человека или Luk-sPV стафилококка. Антигенсвязывающий участок приведен в верхнем правом положении, а упомянутый VL домен взаимодействия обращен к читателю. Изменения аминокислот в трехмерной структуре показаны цветом.
Фиг.16. Различия в средней гидрофобности в каждом положении домена VH (за исключением CDR3), которые указывают на сдвиг в сторону повышения гидрофобности антител, содержащих только тяжелые цепи, в частности в N-конце домена VH. Множество горячих точек в отношении различий гидрофобности видны в положениях 4 9, 62 и 72 по сравнению с усредненным тетрамерным VH человека.
Фиг.17. Протокол иммунизации и выделения антитела человека, содержащего только тяжелые цепи, посредством сортировки CD138 положительных клеток и непосредственного экспрессионного клонирования в НЕК клетки.
Фиг.18. Вектор для экспрессии антитела, содержащего только тяжелые цепи, в клетке млекопитающего. Вектор имеет стандартный остов pUC (не показан) с геном устойчивости к ампициллину и геном устойчивости млекопитающего (гигромицин). Соответствующая часть содержит стандартный энхансер CMV и промотор β-актина курицы (InVitrogen), за которым идет участок связывания рибосомы Козака, за которым следует сигнальная последовательность VH3-23. Задний конец кассеты состоит из константной области IgG2 или IgG3, которая начинается с шарнирного и СН2 доменов. После амплификации с использованием праймеров, показанных стрелками, кДНК VH клонируют между этими двумя областями.
Фиг.19. Пример и краткое изложение непосредственного экспрессионного клонирования антитела, содержащего только тяжелые цепи, в клетки НЕК. Слева вверху представлен стандартный ELISA для определения той иммунизированной мыши, которая положительно отвечала на иммунизацию антигеном НА (мышей, обозначенных красным, использовали для экспрессионного клонирования в клетках НЕК). Справа вверху представлены два примера ELISA, который осуществляли для трансфицированных клеток НЕК в 96-луночном формате.
Фиг.20. Анализ последовательностей ELISA-положительного антитела, содержащего только тяжелые цепи, полученные из последовательности VH 3-11 зародышевой линии.
Фиг.21. Анализ последовательностей ELISA-положительного антитела, содержащего только тяжелые цепи, полученные из последовательности VH 3-23 зародышевой линии.
Фиг.22. Профиль элюции полных IgG, содержащих только тяжелые цепи, на колонках Sephadex 200 Smart.
Фиг.23. Измерения аффинности двух антител против НА, содержащих только тяжелые цепи, на Octet.
Фиг.24. Аминокислоты по всей VH области антител против НА, содержащих только тяжелые цепи, в сравнении с тем, что наблюдают в антителах человека против CR1, которые содержат только тяжелые цепи, (см. выше), тетрамерных антителах человека и ламы, содержащих только тяжелые цепи.
Фиг.25. Протокол иммунизации и выделения антител человека, содержащих только тяжелые цепи, после одноклеточной сортировки и непосредственного экспрессионного клонирования в клетки НЕК.
Фиг.26. Протокол иммунизации и выделения нормальных тетрамерных антител человека, содержащих тяжелые и легкие цепи, после одноклеточной сортировки и непосредственного экспрессионного клонирования в клетки НЕК.
Пример 1. Создание антител против Luk-sFV
Осуществляли иммунизацию трансгенных мышей, содержащих локус тяжелой цепи антитела, полностью полученный у человека, белком Luks-PV из Staph А, как описано в WO 2006/008548. Эти мыши несли по 4 VH сегмента человека, все из областей D тяжелой цепи человека, все из областей JH человека и областей Сγ2 и Сγ3 человека (фиг.1).
СН1 домены удаляли из константных областей Су человека для того, чтобы сделать возможным получение антител человека, содержащих только тяжелые цепи, как описано (Janssens et al. (2006) PNAS, 103, 15130-15135). Мышей иммунизировали, используя стандартные протоколы, и выделяли антитела, как показано на схеме на фиг.2.
Мышей иммунизировали четыре раза, используя стандартные протоколы, и проверяли сыворотку на положительный ответ посредством стандартного ELISA (фиг.3).
После иммунизации собирали клетки селезенки и стандартными способами осуществляли обратную транскрипцию и амплификацию мРНК в кДНК, используя специфичные к доменам VH праймеры (см., например, Janssens et al. (2006) PNAS, 103, 15130-15135). Полученные фрагменты VH клонировали в вектор фагового дисплея. После 3 раундов скрининга и пэннинга по стандартным протоколам для способов с использованием дисплеев, домены VH (VH-D-J) клонировали в бактериальный экспрессионный вектор. Положительные клоны подтверждали вестерн-блоттингом, а клонированную ДНК затем секвенировали стандартными способами, в результате чего определяли аминокислотную последовательность области домена VH, которая показана фиг.4.
Альтернативно, антитела можно получать с помощью стандартной гибридомной технологии. Домены VH, полученные посредством технологии фагового дисплея, можно встроить обратно в предпочитаемую константную эффекторную область тяжелой цепи (лишенную функциональности СН1) стандартными способами клонирования, чтобы получить предпочитаемое целое антитело, содержащее только тяжелые цепи, в отношении константной области (например, Сα, а не Сγ). Аналогичным образом, антитела, содержащие только тяжелые цепи, полученные посредством гибридомной технологии, можно клонировать посредством стандартных технологий кДНК и ПЦР. Это позволяет отдельно выделять домены VH. Таким образом, оба подхода можно использовать для получения антиген-специфических доменов VH или антиген-специфических антител, содержащих только тяжелые цепи.
Пример 2. Создание антител против CR1 человека
Пример 2 очень схож с примером 1 за тем исключением, что иммунизацию осуществляли, используя в качестве антигена белок CR1, который в норме экспрессируют на своей поверхности красные клетки крови человека. Иммунизацию также осуществляли введением красных клеток крови мыши, которые экспрессируют CR1 человека на своей клеточной поверхности. Результат других иммунизации очень схож. Осуществляли иммунизацию трансгенных мышей, содержащих локус тяжелой цепи антитела, полностью полученный у человека, как описано в WO 2006/008548. Эти мыши несли по 4 VH сегмента человека, все из областей D тяжелой цепи человека, все из областей JH человека и областей Сγ2 и Сγ3 человека (фиг.1).
Области СН1 удаляли из константных областей Сγ человека для того, чтобы сделать возможным получение антител человека, содержащих только тяжелые цепи, как описано (Janssens et al. (2006) PNAS, 103, 15130-15135). Мышей иммунизировали, используя стандартные протоколы, и выделяли антитела, как показано на схеме на фиг.2.
После иммунизации собирали клетки селезенки и стандартными способами осуществляли обратную транскрипцию и амплификацию мРНК в кДНК, используя специфичные к доменам VH праймеры (см., например, Janssens et al (2006) PNAS, 103, 15130-15135). Полученные фрагменты VH клонировали в вектор фагового дисплея. После 3 раундов скрининга и пэннинга по стандартным протоколам для способов с использованием дисплеев, домены VH (VH-D-J) клонировали в бактериальный экспрессионный вектор. Затем клонированную последовательность секвенировали стандартными способами, в результате чего получали область домена VH, представленную на фиг.5 и 6. Альтернативно, антитела можно получать с помощью стандартной гибридомной технологии (фигуры 5 и 6). Домены VH, полученные посредством технологии фагового дисплея, можно встроить обратно в предпочитаемую константную эффекторную область тяжелой цепи (лишенную функциональности СН1) стандартными способами клонирования, чтобы получить целое антитело, содержащее только тяжелые цепи, в отношении константной области (например, Сα, а не Сγ). Аналогичным образом, антитела, содержащие только тяжелые цепи, полученные посредством гибридомной технологии, можно клонировать посредством стандартных технологий кДНК и ПЦР, что позволяет отдельно выделять домены VH. Таким образом, оба подхода можно использовать для получения антиген-специфических доменов VH или антиген-специфических антител, содержащих только тяжелые цепи.
Пример 3. Экспрессия доменов VН и антител, содержащих только тяжелые цепи, аффинность и растворимость
Домены VH из примеров 1 и 2 можно экспрессировать в системе бактериальной экспрессии для того, чтобы получать большие количества очищенных доменов VH. Например, домен VH можно экспрессировать в бактериях в виде гибридного белка, используя систему гибридной экспрессии SUMO (InVitrogen). После очистки, в денатурирующем электрофорезе в геле он идет как один фрагмент (фиг.7). После прохождения через хроматографическую систему Smart Sephadex при неденатурирующих условиях эти домены VH преимущественно идут в виде одного основного пика правильной молекулярной массы (фиг.7), с небольшими признаками растворимых агрегатов.
Антитело, содержащее только тяжелые цепи, полученное из супернатанта гибриды, также преимущественно идет в виде одного основного пика, с признаками небольшой доли димеров антитела на переднем фронте пика.
Один пик доменов VH указывает на то, что они представляют собой растворимые мономеры, что подтверждали графиком рассеяния при прохождении (фиг.8А), поскольку пик светорассеяния совпадает с пиком поглощения белка во время прохождения. Наконец, при нагревании домены VH стабильны при температуре до 55°С, как измеряли посредством стандартного анализа кругового дихроизма (фиг.8В).
Наконец, растворимые домены VH и антитела, содержащие только тяжелые цепи, тестировали на их аффинность связывания, используя системы BiaCore и Octet. Полученные аффинности находились в нижнем наномолярном диапазоне или лучше (фиг.9).
Также концентрировали несколько доменов VH, полученных из антител, содержащих только тяжелые цепи, посредством вакуумного центрифугирования и удаляли коллоид посредством высокоскоростного центрифугирования. Получали значения растворимости, которые представляют собой минимальные оценки, поскольку малые количества образцов препятствовали дальнейшему концентрированию. Все тестируемые домены VH обладали растворимостью более 4 мг/мл (фиг.10).
Пример 4. Массовое секвенирование для определения паттернов мутаций
После проверки всех последовательностей, полученных из антител, связывающих Luk-sPV, CR1 и другие антигены, становится ясно, что рекомбинация VDJ и созревание (гипермутация) растворимых доменов VH человека, полученных из трансгенов антител, содержащих только тяжелые цепи, экспрессируемых в В-клетках мыши, значительно отличалась от наблюдаемой в доменах VHH верблюда и ламы или доменах VH человека, полученных из нормальных тетрамерных антител, содержащих тяжелые и легкие цепи. Поэтому осуществляли массовое параллельное секвенирование (секвенатор Roche 454), повторяя процесс от рекомбинации до гипермутации. Это использовали для того, чтобы подтвердить, что процесс действительно отличается, и понять, какие параметры и часть(и) антитела важны для создания растворимого антитела человека с высокой аффинностью, содержащего только тяжелые цепи, после начального выбора конкретной рекомбинации VDJ. Результаты дают общее представление о том, как протекает процесс (фиг.11).
Этот анализ показывает, что организм мыши может вводить множество разнообразных замен аминокислот по всему домену VH экспрессируемого трансгена. Большинство расположено в положении CDR1 и CDR2. Однако замены также видны в FR1 и FR2 и распределены вдоль FR3. Области контакта CDR/FR выглядели как горячие точки для замен. Из этого анализа ясно, что процесс мутации в отношении положений и замен аминокислот сильно отличается от наблюдаемого в доменах VHH верблюдовых и доменах VH, присутствующих в нормальных тетрамерных антителах человека.
Пример 5. Сравнительный анализ отдельной каркасной области и областей CDR, присутствующих в растворимых доменах VН, доменах VHH и доменах VН, полученных из тетрамерных антител
Все мутации растворимых антигенсвязывающих доменов VH человека вносили в таблицы и анализировали различные области (FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3), сравнивая с доменами VHH из антител верблюдовых, содержащих только тяжелые цепи, антител лам, содержащих только тяжелые цепи, и с доменами VH человека, полученными из нормальных тетрамерных антител человека.
Это сравнение включало 10 известных последовательностей доменов VHH верблюда, 58 известных последовательностей доменов VHH ламы и более чем 4000 известных последовательностей доменов VH человека, полученных из нормальных тетрамерных антител, все получены из литературы и публичных баз данных об антителах.
Область FR1 растворимых доменов VH человека (фиг.12) показывает увеличение суммарного заряда по сравнению с верблюдом и ламой и повышение гидрофобности по сравнению с верблюдом, ламой и доменами VH, полученными из нормальных тетрамерных антител человека, несмотря на увеличение числа заряженных аминокислот.
Область CDR1 (фиг.12) имеет очень маленькое изменение суммарного заряда (незначительно снижен по сравнению с ламой) и повышение гидрофобности по отношению к эквивалентному домену VH из тетрамерных антител человека, доменов VHH ламы и верблюда. Число заряженных аминокислот имеет небольшое значимое отличие.
Область FR2 растворимого домена VH человека (фиг.13) не имеет отличий суммарного заряда по сравнению с доменами VHH верблюда и ламы и имеет существенное повышение гидрофобности по сравнению с доменами VHH верблюда и ламы, несмотря на то, что число заряженных аминокислот снижено по сравнению с доменами VHH верблюда и ламы. В обоих аспектах это похоже на домены VH человека, полученные из тетрамерных антител. Область CDR2 (фиг.13) имеет суммарный заряд, схожий с ламой, который выше, чем у тетрамерных антител верблюда и человека, и гидрофобность, очень схожую с другими, несмотря на то, что число заряженных аминокислот схоже с доменами VH человека, полученными из тетрамерных антител, но несколько ниже, чем у других.
Область FR3 растворимого домена VH человека (фиг.14) показывает увеличение суммарного заряда по сравнению с доменами VH человека, полученными из тетрамерных антител, и снижение гидрофобности по сравнению с доменами VH человека, полученными из тетрамерных антител, несмотря на то, что число заряженных аминокислот повышено по сравнению с доменами VH человека, полученными из тетрамерных антител. Во всех аспектах это схоже с доменами VHH верблюда и ламы. Область CDR3 растворимых доменов VH человека (фиг.14.) имеет сниженный суммарный заряд по отношению к доменам VHH ламы и верблюдовых и доменам VH человека, полученным из тетрамерных антител, хотя число заряженных аминокислот повышено по сравнению со всеми остальными. Область CDR3 растворимых доменов VH человека имеет очень схожую гидрофобность с VHH ламы, но ниже, чем наблюдаемая в доменах VH, присутствующих в нормальных тетрамерных антителах человека и нормальных тетравалентных антителах верблюда.
Результаты показывают, что среди начальной рекомбинации VDJ происходит селекция событий рекомбинации с более высоким числом заряженных аминокислот по сравнению с тетрамерными (CDR3) антителами человека. За этим следует созревание аффинности в областях CDR1 и CDR2 и во всех трех каркасных областях (FR1, FR2, FR3). Это ведет к образованию антител человека, содержащих только тяжелые цепи, с растворимыми доменами VH, которые имеют повышенную гидрофобность в FR1, но пониженную в FR3 по сравнению с доменами VH, полученными из тетрамерных антител человека. Имеет место очень небольшое различие в областях FR2 или CDR1 и CDR2. Следовательно, общий паттерн показывает, что гидрофобность распространена по-разному на протяжении растворимого домена VH (сдвинута в сторону FR1 и от FR3 и CDR3) по отношению к доменам VH, полученным из тетрамерных антител, которые менее растворимы и обладают склонностью к агрегации. Этот анализ не показывает, есть ли конкретные мутации в конкретных положениях или областях домена VH (см. пример 6), но показывает, что есть признаки, связанные с распределением заряда и гидрофобностью по всему растворимому домену VH человека, которые отличают его от доменов VHH ламы и верблюдовых и доменов VH человека, полученных из тетрамерных антител.
Пример 6. Трехмерные структуры
Анализ из примера 4 показывает, что изменения в каркасных областях (FR1, FR2, FR3) растворимого домена VH человека после начальной перестройки VDJ в значительной мере сфокусированы в конкретных положениях, когда их размещают на трехмерной структуре домена VH человека, полученного из тетрамерного антитела (фиг.15).
В растворимом домене VH человека мутации FR1 наблюдали в аминокислотах 13-18, преимущественно изменения в положении 13, ведущие к повышению гидрофобности, даже если повышено число заряженных аминокислот, но не суммарный заряд. Важно, что изменения вокруг положения 13 расположены в малой петле, у которой повышена гидрофильность, которая предположительно повышает растворимость.
В FR2 растворимых доменов VH человека имеет место четкий фокус вокруг положения 35 и еще один вокруг положения 50, без общего изменения гидрофобности по сравнению с доменами VH, полученными из тетрамерных антител человека.
Изменения в FR3 растворимых доменов VH по отношению к доменам VH, полученным из тетрамерных антител человека, совпадают с концом области CDR2 и области рядом с концом FR3 (непосредственно после CDR3).
Когда эти изменения, наблюдаемые в растворимых доменах VH человека, полученных из антител, содержащих только тяжелые цепи, накладывают на трехмерную структуру домена VH, сразу становится ясно, что мутации FR2 происходят в β-складчатых слоях, которые в норме образуют поверхность взаимодействия VH с VL доменом в тетрамерных антителах. В FR1 изменения также приводят к повышению гидрофобности домена. Результаты указывают на то, что N-концевая половина домена VH имеет повышенную гидрофобность для повышения стабильности/растворимости домена VH и компенсации отсутствия легкой цепи. В отличие от этого, С-концевая половина менее гидрофобна. Наиболее важными изменениями являются «перераспределение» паттерна гидрофобности (N-конец более гидрофобный, С-конец менее гидрофобный, фиг.16) и мутации каркасной области, которые влияют на упомянутую поверхность контакта с легкой цепью.
Общий сдвиг гидрофобности и изменения в специфических мотивах, которые осуществляет иммунная система мыши, позволяют создавать растворимые антитела с высокой аффинностью, содержащие только тяжелые цепи, и растворимые домены VH со структурными признаками, которые отличают их от доменов VH, склонных к агрегации, которые получены из тетрамерных антител человека.
Пример 7. Создание и экспрессионное клонирование антител человека против НА
В примере 7 использовали процедуры иммунизации, как описано в примерах 1 и 2, за исключением того, что иммунизацию осуществляли, используя НА гриппа (H3N2) в качестве антигена. Иммунизацию осуществляли посредством инъекции белка трансгенным мышам, содержащим локус тяжелой цепи антитела, полностью полученный у человека, как описано в Janssens et al. (2006) PNAS, 103, 15130-15135. Эти мыши несли по 4 VH сегмента человека, все из областей D тяжелой цепи человека, все из областей JH человека и областей Сγ2 и Сγ3 человека (фиг.1).
Области СН1 удаляли из константных областей Сγ человека для того, чтобы сделать возможным получение антител человека, содержащих только тяжелые цепи, как описано (Janssens et al. (2006) PNAS, 103, 15130-15135). Мышей иммунизировали, используя стандартные протоколы, и выделяли антитела, как показано на схеме на фиг.17.
После иммунизации собирали плазматические клетки и сортировали (FACS) по наличию антигена CD138 и отсутствию маркеров линии дифференцировки стандартными способами (см. Sanderson et al. (1989) Cell Regulation 1, 27-35; Kim et al. (1994) Mol.Biol. Cell, 5, 797-805 и см. набор для магнитной сортировки для выделения CD138+ плазматических клеток мыши компании Miltenyi Biotec). Клетки собирали и осуществляли обратную транскрипцию и амплификацию мРНК в кДНК с использованием специфичных к доменам VH праймеров стандартными способами (например, Janssens et al (2006) PNAS, 103, 15130-15135). На 5'-конце использовали праймеры, которые сконструированы для введения сайта PvuII для целей клонирования (фиг.18). На 31-конце использовали праймеры из шарнирной области СН2 IgG2 или IgG3, которые сконструированы с сайтом BstEII. Если это невозможно, праймер для IgG3 содержал сайт Sad для целей клонирования (фиг.18). Получаемые фрагменты VH надлежащим образом клонировали в два экспрессионных вектора млекопитающих, содержащие энхансер CMV и промотор β-актина курицы, за которыми следует последовательность Козака и сигнальная последовательность из VH3-23, граничащая с ее сайтом PvuII в VH сегменте. В первом векторе (фиг.18) за этим следовал IgG2 человека, начиная с шарнирной области (с сайта BstEli) СН2 с СН2, СН3, стоп-кодоном и полиадениловой последовательностью. Во втором векторе все последовательности IgG2 заменяли эквивалентными последовательностями IgG3 человека. Последнее позволяет клонировать антитела, содержащие только тяжелые цепи, которые не содержат сайт BstEII, используя сайт Sad в качестве альтернативы. Остальная часть плазмиды содержала стандартный селективный маркер для клеток млекопитающих, такой как кассета устойчивости к гигромицину в плазмиде на основе pUC. Очевидно, что IgG2 или 3 человека можно заменить любой другой СН1-дефицитной константной областью, полученной у человека или любого другого вида. В равной мере очевидно, что аналогичное справедливо для VH части вектора. Затем кДНК клонировали между сайтами PvuII и BstEII (или PvuII и Sad) и вектором трансфицировали Е.coli стандартными способами. Колонии собирали в 96-луночные (или 384-луночные) микротитровальные планшеты, содержащие бактериальную среду для выращивания. Планшеты (типично >10) инкубировали так, чтобы позволить бактериям расти, и в каждой лунке выделяли ДНК. Затем ДНК из каждой лунки, т.е. из каждого целого планшета, добавляли в новый 96-луночный планшет, содержащий клетки НЕК млекопитающего (или другие клетки для экспрессионных целей), для трансформации с помощью стандартных способов и реактивов для трансфекции. Трансформированные клетки растили в селекционных условиях на основе присутствия селекционного маркера на экспрессионной плазмиде (например, гигромицина). Затем среду, содержащую экспрессируемое антитело, анализировали на присутствие антигенспецифического антитела, содержащего только тяжелые цепи, посредством стандартных анализов ELISA. Их можно осуществлять в том же 96-луночном формате, но также можно осуществлять в других форматах, например, посредством микрочипов, чтобы уменьшить расходуемое количество антигена. Положительные лунки непосредственно указывают на плазмиды, которые содержат антитела человека, содержащие только тяжелые цепи, которые кодируют антиген-специфические антитела, содержащие только тяжелые цепи. На фиг.19 показан ELISA для сывороток мышей, которых иммунизировали, и примеры ELISA для трансфицированных клеток НЕК в 96-луночном формате. На ней также обобщен эксперимент по клонированию НА, менее одного миллиона кДНК использовали в эксперименте с использованием в целом 960 лунок. Тем самым получили 28 различных антигенспецифических антител, отнесенных к 13 группам посредством анализа последовательностей, полученных из двух областей VH - VH3-11 (фиг.21) и VH3-23 (фиг.22). Использовали как IgG2 (SSERKCCVE), так и IgG3 (SSELKTPLG), области VH подвергались гипермутации и, подобно человеку, область J4 использовали наиболее часто, хотя другие также использовали. Секретируемые антитела, содержащие только тяжелые цепи, растворимы и представляют собой мономеры, как определяли по их профилям элюции на стандартной колонке SMART (фиг.23). Аффинности антител находились в диапазоне от наномолярных до субнаномолярных значений, как определяли по стандартным профилям связывания и диссоциации в анализе на Octet (фиг.24) или BiaCore. Анализ мутаций и сравнение с другими последовательностями иммуноглобулинов (фиг.25) выявил такие же свойства различных областей, которые показаны на фиг.11-13.
Как описано выше, растворимые домены VH можно выделить из растворимых антител, содержащих только тяжелые цепи, полученных из плазматических клеток.
Пример 8. Создание и экспрессионное клонирование антител человека, содержащих только тяжелые цепи, из отдельных клеток
Вариант схемы, описанной выше посредством клонирования в клетки НЕК, состоит в сортировке CD138+ клеток негативной линии дифференцировки и получении кДНК из отдельных клеток, которые можно клонировать непосредственно в клетки НЕК или другие клетки млекопитающих (фиг.26). Это можно анализировать очень похожими способами, как описано выше.
Пример 9. Создание и экспрессионное клонирование нормальных (тетрамерных) антител человека, содержащих тяжелые и легкие цепи, из отдельных клеток
Вариант способа, описанного в примере 8, также можно использовать для клонирования трансгенных экспрессируемых нормальных тетрамерных антител непосредственно посредством экспрессионного клонирования в клетки НЕК или другие клетки млекопитающих. В этом варианте отдельные клетки снова выделяли сортировкой. РНК выделяли из отдельных клеток и VH и VL домены клонировали посредством ПЦР амплификации в экспрессионный вектор тяжелой и легкой цепи, аналогичный тому, что описано выше. Индивидуальным сочетанием клонируемых экспрессионных плазмид тяжелых и легких цепей совместно трансфицировали клетки НЕК или другие клетки млекопитающих. Форматы, скрининг и анализ полностью аналогичны описанному выше для 96-луночного формата для антител, содержащих только тяжелые цепи, (примеры 8 и 9).
Claims (14)
1. Способ получения антитела, содержащего только тяжелые цепи, которое специфично связывает антиген, где способ включает:
(a) иммунизацию трансгенного млекопитающего, не относящегося к человеку, антигеном, где млекопитающее экспрессирует антитела, содержащие только тяжелые цепи, у которых отсутствует функциональность СН1 в транскрибируемой и процессируемой мРНК тяжелой цепи;
(b) выделение долгоживущих плазматических клеток или В-клеток памяти из иммунизированного млекопитающего;
(c) выделение популяции мРНК из клеток, полученных на стадии (b);
(d) клонирование популяции кДНК, полученных из мРНК, выделенных на стадии (с), в экспрессионный вектор и экспрессирование указанного экспрессионного вектора в клеточной линии; и
(e) отбор, по меньшей мере, одной клеточной линии, которая продуцирует антитело, содержащее только тяжелые цепи, которое специфично связывает антиген.
(a) иммунизацию трансгенного млекопитающего, не относящегося к человеку, антигеном, где млекопитающее экспрессирует антитела, содержащие только тяжелые цепи, у которых отсутствует функциональность СН1 в транскрибируемой и процессируемой мРНК тяжелой цепи;
(b) выделение долгоживущих плазматических клеток или В-клеток памяти из иммунизированного млекопитающего;
(c) выделение популяции мРНК из клеток, полученных на стадии (b);
(d) клонирование популяции кДНК, полученных из мРНК, выделенных на стадии (с), в экспрессионный вектор и экспрессирование указанного экспрессионного вектора в клеточной линии; и
(e) отбор, по меньшей мере, одной клеточной линии, которая продуцирует антитело, содержащее только тяжелые цепи, которое специфично связывает антиген.
2. Способ по п.1, где указанные антитела, содержащие только тяжелые цепи, экспрессируются из трансгенного локуса в указанном млекопитающем, не относящемся к человеку.
3. Способ по п.1, где любой локус антитела, содержащего только тяжелые цепи, содержит, по меньшей мере, один доминантный селективный маркерный ген.
4. Способ по п.1, который дополнительно включает стадию выделения растворимого домена VH из клетки, продуцирующей антитело, содержащее только тяжелые цепи, которая продуцирована млекопитающим, или из иммортализованной клетки, продуцирующей антитело, содержащее только тяжелые цепи, которая продуцирована млекопитающим, с помощью подхода, основанного на дисплее.
5. Способ получения растворимого домена VH, который специфично связывает антиген, где способ включает:
(a) иммунизацию трансгенного млекопитающего, не относящегося к человеку, антигеном, где млекопитающее экспрессирует антитела, содержащие только тяжелые цепи, у которых отсутствует функциональность СH1 в транскрибируемой и процессируемой мРНК тяжелой цепи;
(b) выделение долгоживущих плазматических клеток или В-клеток памяти из иммунизированного млекопитающего;
(c) выделение популяции мРНК из клеток, полученных на стадии (b);
(d) клонирование популяции кДНК, содержащей кДНК, которые кодируют домены VH, полученные из мРНК на стадии (c), в экспрессионный вектор так, чтобы в клеточной линии экспрессировался домен VH или домен VH, слитый с эффекторной областью тяжелой цепи;
(e) отбор, по меньшей мере, одной клеточной линии, которая продуцирует домен VH или домен VH, слитый с эффекторной областью тяжелой цепи, которые специфично связываются с антигеном.
(a) иммунизацию трансгенного млекопитающего, не относящегося к человеку, антигеном, где млекопитающее экспрессирует антитела, содержащие только тяжелые цепи, у которых отсутствует функциональность СH1 в транскрибируемой и процессируемой мРНК тяжелой цепи;
(b) выделение долгоживущих плазматических клеток или В-клеток памяти из иммунизированного млекопитающего;
(c) выделение популяции мРНК из клеток, полученных на стадии (b);
(d) клонирование популяции кДНК, содержащей кДНК, которые кодируют домены VH, полученные из мРНК на стадии (c), в экспрессионный вектор так, чтобы в клеточной линии экспрессировался домен VH или домен VH, слитый с эффекторной областью тяжелой цепи;
(e) отбор, по меньшей мере, одной клеточной линии, которая продуцирует домен VH или домен VH, слитый с эффекторной областью тяжелой цепи, которые специфично связываются с антигеном.
6. Способ по п.1 или 5, где указанное сенсибилизированное антигеном млекопитающее, не относящееся к человеку, представляет собой мышь, и указанные долгоживущие плазматические клетки или В-клетки памяти выделяют из вторичных лимфатических желез, костного мозга или селезенки указанной мыши.
7. Способ по п.1 или 5, где долгоживущие плазматические клетки или В-клетки памяти очищают с использованием поверхностных клеточных маркеров на клетках.
8. Способ по п.7, где указанное сенсибилизированное антигеном млекопитающее, не относящееся к человеку, представляет собой мышь, и указанный поверхностный клеточный маркер представляет собой маркер CD138.
9. Способ по п.1 или 5, где клеточная линия представляет собой микробную клеточную линию или линию клеток млекопитающего.
10. Способ по п.1 или 5, где стадия (d) включает трансфицирование указанного экспрессионного вектора в бактерии в высокопроизводительном автоматизируемом формате, амплифицирование указанных бактерий, выделение указанного экспрессионного вектора и трансфицирование указанного экспрессионного вектора в экспрессионные клетки.
11. Способ по п.1 или 5, где выделенные долгоживущие плазматические клетки или В-клетки памяти иммортализуют перед выделением мРНК.
12. Способ по п.11, где клетки иммортализуют слиянием с миеломной клеткой.
13. Способ по п.11, где клетки иммортализуют посредством трансформации с использованием вируса, такого как EBV.
14. Применение растворимого домена VH, полученного способом по п.5, в получении антитела, содержащего только тяжелые цепи.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB0905023.8A GB0905023D0 (en) | 2009-03-24 | 2009-03-24 | Binding molecules |
GB0905023.8 | 2009-03-24 | ||
PCT/GB2010/000500 WO2010109165A2 (en) | 2009-03-24 | 2010-03-19 | Binding molecules |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2011142759A RU2011142759A (ru) | 2013-04-27 |
RU2528737C2 true RU2528737C2 (ru) | 2014-09-20 |
Family
ID=40640054
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011142759/10A RU2528737C2 (ru) | 2009-03-24 | 2010-03-19 | Растворимые антитела, содержащие только тяжелые цепи |
Country Status (24)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8883150B2 (ru) |
EP (1) | EP2411408B2 (ru) |
JP (1) | JP5836927B2 (ru) |
KR (1) | KR20120068757A (ru) |
CN (1) | CN102482342B (ru) |
BR (1) | BRPI1012694A2 (ru) |
CA (1) | CA2756171C (ru) |
CY (1) | CY1117203T1 (ru) |
DK (1) | DK2411408T4 (ru) |
ES (1) | ES2563321T5 (ru) |
FI (1) | FI2411408T4 (ru) |
GB (1) | GB0905023D0 (ru) |
HR (1) | HRP20160158T4 (ru) |
HU (1) | HUE026473T2 (ru) |
MX (1) | MX2011010027A (ru) |
PL (1) | PL2411408T5 (ru) |
PT (1) | PT2411408E (ru) |
RU (1) | RU2528737C2 (ru) |
SG (1) | SG174510A1 (ru) |
SI (1) | SI2411408T2 (ru) |
SM (1) | SMT201600044B (ru) |
TW (1) | TW201040264A (ru) |
WO (1) | WO2010109165A2 (ru) |
ZA (1) | ZA201106983B (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2816994C2 (ru) * | 2017-06-20 | 2024-04-09 | Тенеобио, Инк. | Антитела к bcma, содержащие только тяжелую цепь |
Families Citing this family (100)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1864998B2 (en) | 2004-07-22 | 2022-06-22 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Binding molecules |
JP5184374B2 (ja) * | 2006-01-25 | 2013-04-17 | エラスムス・ユニヴァーシティ・メディカル・センター・ロッテルダム | 対立遺伝子排除 |
NZ592308A (en) | 2008-09-30 | 2012-11-30 | Ablexis Llc | Non-human mammals for the production of chimeric antibodies |
CN112680475A (zh) | 2008-12-18 | 2021-04-20 | 伊拉兹马斯大学鹿特丹医学中心 | 表达人源化抗体的非人转基因动物及其用途 |
US20120204278A1 (en) | 2009-07-08 | 2012-08-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
US9445581B2 (en) | 2012-03-28 | 2016-09-20 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
EP2564695B1 (en) | 2009-07-08 | 2015-04-15 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
PT2954779T (pt) | 2009-12-10 | 2019-05-29 | Regeneron Pharma | Ratinhos que produzem anticorpos de cadeia pesada |
NZ601171A (en) | 2010-03-31 | 2014-11-28 | Ablexis Llc | Genetic engineering of non-human animals for the production of chimeric antibodies |
NZ707327A (en) | 2010-08-02 | 2017-01-27 | Regeneron Pharma | Mice that make binding proteins comprising vl domains |
US20130310281A1 (en) * | 2011-02-02 | 2013-11-21 | Glaxo Group Limited | Novel antigen binding proteins |
ES2758974T5 (es) | 2011-02-25 | 2023-06-08 | Regeneron Pharma | Ratones ADAM6 |
MY172718A (en) | 2011-08-05 | 2019-12-11 | Regeneron Pharma | Humanized universal light chain mice |
WO2013041844A2 (en) | 2011-09-19 | 2013-03-28 | Kymab Limited | Antibodies, variable domains & chains tailored for human use |
JP2014531452A (ja) | 2011-09-19 | 2014-11-27 | カイマブ・リミテッド | 動物、レパートリーおよび方法 |
WO2013045916A1 (en) | 2011-09-26 | 2013-04-04 | Kymab Limited | Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb |
ES2906462T3 (es) | 2011-10-17 | 2022-04-18 | Regeneron Pharma | Ratones de cadena pesada de inmunoglobulina restringida |
GB2496375A (en) | 2011-10-28 | 2013-05-15 | Kymab Ltd | A non-human assay vertebrate comprising human antibody loci and human epitope knock-in, and uses thereof |
GB201122047D0 (en) | 2011-12-21 | 2012-02-01 | Kymab Ltd | Transgenic animals |
US9253965B2 (en) | 2012-03-28 | 2016-02-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
KR101924805B1 (ko) | 2011-12-20 | 2018-12-04 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 인간화 경쇄 마우스 |
WO2013144567A1 (en) | 2012-03-28 | 2013-10-03 | Kymab Limited | Transgenic non-human vertebrate for the expression of class - switched, fully human, antibodies |
GB2502127A (en) | 2012-05-17 | 2013-11-20 | Kymab Ltd | Multivalent antibodies and in vivo methods for their production |
US10251377B2 (en) | 2012-03-28 | 2019-04-09 | Kymab Limited | Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies |
KR102381716B1 (ko) * | 2012-06-12 | 2022-04-01 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 제한된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 가지는 인간화된 비-인간 동물 |
WO2014130690A1 (en) | 2013-02-20 | 2014-08-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals with modified immunoglobulin heavy chain sequences |
ES2829376T3 (es) | 2013-03-14 | 2021-05-31 | Univ Erasmus Med Ct Rotterdam | Mamífero no humano transgénico para la producción de anticuerpos |
WO2014141192A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Erasmus University Medical Center | Generation of heavy chain-only antibodies |
GB2584364A (en) | 2013-03-15 | 2020-12-02 | Abvitro Llc | Single cell bar-coding for antibody discovery |
US9788534B2 (en) | 2013-03-18 | 2017-10-17 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
US11707056B2 (en) | 2013-05-02 | 2023-07-25 | Kymab Limited | Animals, repertoires and methods |
US9783593B2 (en) | 2013-05-02 | 2017-10-10 | Kymab Limited | Antibodies, variable domains and chains tailored for human use |
GB201316644D0 (en) | 2013-09-19 | 2013-11-06 | Kymab Ltd | Expression vector production & High-Throughput cell screening |
DE112014004537T5 (de) | 2013-10-01 | 2016-07-21 | Kymab Limited | Tiermodelle und therapeutische Moleküle |
EP3119398A1 (en) * | 2014-03-20 | 2017-01-25 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Pharmaceutical formulation comprising a substitued phenyl- (1, 3-dihydro-isoindol-2-yl) -methanone |
SG11201607015VA (en) | 2014-03-21 | 2016-09-29 | Regeneron Pharma | V<sb>L</sb> ANTIGEN BINDING PROTEINS EXHIBITING DISTINCT BINDING CHARACTERISTICS |
SG11201607203XA (en) | 2014-03-21 | 2016-09-29 | Regeneron Pharma | Non-human animals that make single domain binding proteins |
SG11201702060VA (en) | 2014-09-15 | 2017-04-27 | Abvitro Inc | High-throughput nucleotide library sequencing |
EP3209699A1 (en) * | 2014-10-22 | 2017-08-30 | Crescendo Biologics Limited | Vh scaffold |
WO2016062989A1 (en) * | 2014-10-22 | 2016-04-28 | Crescendo Biologics Limited | Human vh domain scaffolds |
CN104710528B (zh) * | 2015-03-13 | 2019-02-15 | 西北农林科技大学 | 一种特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9纳米抗体及其应用 |
CA2979702A1 (en) | 2015-03-19 | 2016-09-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen |
WO2016150845A1 (en) * | 2015-03-20 | 2016-09-29 | Ablynx Nv | Glycosylated immunoglobulin single variable domains |
WO2016161446A1 (en) * | 2015-04-03 | 2016-10-06 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Composition and methods of genome editing of b-cells |
CN107849126B (zh) | 2015-07-29 | 2022-04-08 | 阿勒根公司 | 仅有重链的抗ang-2抗体 |
WO2017030909A1 (en) | 2015-08-14 | 2017-02-23 | Allergan, Inc. | Heavy chain only antibodies to pdgf |
JP2018535655A (ja) | 2015-09-29 | 2018-12-06 | アムジエン・インコーポレーテツド | Asgr阻害剤 |
CN105777894A (zh) * | 2016-03-12 | 2016-07-20 | 长春力太生物技术有限公司 | 通过转基因啮齿类动物制备人源化驼类单域抗体的方法 |
CN109072191B (zh) * | 2016-04-04 | 2024-03-22 | 苏黎世联邦理工学院 | 用于蛋白生产和文库产生的哺乳动物细胞系 |
AU2017281034B2 (en) | 2016-06-21 | 2024-03-14 | Teneobio, Inc. | CD3 binding antibodies |
KR20190052006A (ko) * | 2016-08-24 | 2019-05-15 | 테네오바이오, 인코포레이티드 | 변형된 중쇄-단독 항체를 생산하는 형질전환 비-인간 동물 |
WO2018052503A1 (en) | 2016-09-14 | 2018-03-22 | Teneobio, Inc. | Cd3 binding antibodies |
WO2018069480A1 (en) * | 2016-10-14 | 2018-04-19 | Institut Curie | New anti-lsp1 antibody |
CN109906030B (zh) * | 2016-11-04 | 2022-03-18 | 安健基因公司 | 用于产生仅重链抗体的经基因修饰的非人动物和方法 |
EP4215548A1 (en) | 2016-12-21 | 2023-07-26 | Teneobio, Inc. | Anti-bcma heavy chain-only antibodies |
US11267904B2 (en) * | 2016-12-28 | 2022-03-08 | Sysmex Corporation | Method for controlling affinity of antibody for antigen, antibody whose affinity for antigen has been altered, and its production method |
SG11201906540WA (en) * | 2017-01-19 | 2019-08-27 | Open Monoclonal Tech Inc | Human antibodies from transgenic rodents with multiple heavy chain immunoglobulin loci |
AU2018288803A1 (en) * | 2017-06-20 | 2020-02-06 | Teneoone, Inc. | Anti-BCMA heavy chain-only antibodies |
WO2018237037A2 (en) | 2017-06-20 | 2018-12-27 | Teneobio, Inc. | HEAVY CHAIN ANTIBODY ONLY ANTI-BCMA |
CA3075399A1 (en) | 2017-09-13 | 2019-03-21 | Teneobio, Inc. | Heavy chain antibodies binding to ectoenzymes |
CN111655728B (zh) * | 2017-12-20 | 2022-02-22 | 和铂医药(上海)有限责任公司 | 结合ctla-4的抗体及其用途 |
SG11202005880XA (en) | 2017-12-22 | 2020-07-29 | Teneobio Inc | Heavy chain antibodies binding to cd22 |
KR20200104333A (ko) | 2017-12-28 | 2020-09-03 | 난징 레전드 바이오테크 씨오., 엘티디. | Tigit에 대한 단일-도메인 항체 및 이의 변이체 |
JP2021516954A (ja) * | 2018-03-21 | 2021-07-15 | クリスタル バイオサイエンス インコーポレイテッドCrystal Bioscience Inc. | ヒト型抗体を産生するトランスジェニックニワトリ |
EP3774917A4 (en) | 2018-03-30 | 2022-01-19 | Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. | SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AGAINST LAG-3 AND USES THEREOF |
WO2019240998A1 (en) * | 2018-06-13 | 2019-12-19 | Crystal Bioscience Inc. | Production of antibodies by modification of an autonomous heavy chain variable domain by gene conversion |
JP2021526830A (ja) * | 2018-06-13 | 2021-10-11 | クリスタル バイオサイエンス インコーポレイテッドCrystal Bioscience Inc. | 複数のジスルフィド架橋によって安定化され、遺伝子変換によって多様化された長いcdr−h3sで抗体を作製するトランスジェニックニワトリ |
CN116769032A (zh) | 2018-07-20 | 2023-09-19 | 坦尼奥第二公司 | 与cd19结合的重链抗体 |
GB2576914A (en) | 2018-09-06 | 2020-03-11 | Kymab Ltd | Antigen-binding molecules comprising unpaired variable domains produced in mammals |
CN112955467A (zh) | 2018-10-26 | 2021-06-11 | 特尼奥生物股份有限公司 | 与cd38结合的重链抗体 |
CN113874394B (zh) | 2019-02-20 | 2024-01-19 | 和铂抗体有限公司 | 抗体 |
JOP20210253A1 (ar) | 2019-04-05 | 2023-01-30 | Teneobio Inc | أجسام مضادة ذات سلسلة ثقيلة ترتبط بـ psma |
US20220259329A1 (en) | 2019-06-07 | 2022-08-18 | Amgen Inc. | Bispecific binding constructs |
JP2022537931A (ja) | 2019-06-14 | 2022-08-31 | テネオバイオ, インコーポレイテッド | Cd22及びcd3に結合する多重特異性重鎖抗体 |
AU2020405183A1 (en) | 2019-12-18 | 2022-06-09 | TeneoFour, Inc. | Heavy chain antibodies binding to CD38 |
GB202003632D0 (en) | 2020-03-12 | 2020-04-29 | Harbour Antibodies Bv | SARS-Cov-2 (SARS2, COVID-19) antibodies |
TW202330622A (zh) | 2020-04-29 | 2023-08-01 | 美商泰尼歐生物公司 | 具有經修飾重鏈恆定區之多特異性重鏈抗體 |
BR112022021690A2 (pt) | 2020-04-29 | 2022-12-20 | Teneobio Inc | Anticorpos de cadeia pesada multispecíficos com regiões constantes de cadeia pesada modificadas |
EP4161969A1 (en) | 2020-06-04 | 2023-04-12 | Amgen Inc. | Bispecific binding constructs |
WO2022006316A1 (en) | 2020-06-30 | 2022-01-06 | Teneobio, Inc. | Multi-specific antibodies binding to bcma |
BR112022026114A2 (pt) | 2020-06-30 | 2023-01-17 | Harbour Biomed Us Inc | Anticorpo biespecífico e uso do mesmo |
WO2022002033A1 (zh) | 2020-06-30 | 2022-01-06 | 和铂医药(上海)有限责任公司 | 具有H2L2与HCAb结构的结合蛋白 |
AU2021342159A1 (en) | 2020-09-11 | 2023-03-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Identification and production of antigen-specific antibodies |
GB202017555D0 (en) | 2020-11-06 | 2020-12-23 | Harbour Antibodies Bv | Antibody-conjugated nanoparticles |
TW202233684A (zh) | 2020-11-18 | 2022-09-01 | 美商泰尼歐生物公司 | 結合於葉酸受體α之重鏈抗體 |
KR20230117397A (ko) | 2020-12-03 | 2023-08-08 | 암젠 인크 | 다중 결합 도메인을 갖는 분자 |
WO2021115497A2 (zh) | 2020-12-08 | 2021-06-17 | 和铂医药(上海)有限责任公司 | 蛋白-药物偶联物和定点偶联方法 |
IL303529A (en) * | 2020-12-09 | 2023-08-01 | Trianni Inc | Heavy chain antibodies only |
WO2022132943A1 (en) | 2020-12-16 | 2022-06-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mice expressing humanized fc alpha receptors |
CN117500835A (zh) | 2021-02-25 | 2024-02-02 | 特尼奥生物股份有限公司 | 抗psma抗体及car-t结构 |
WO2022183101A1 (en) | 2021-02-26 | 2022-09-01 | Teneobio, Inc. | Anti-muc1-c antibodies and car-t structures |
TW202304994A (zh) | 2021-04-02 | 2023-02-01 | 美商泰尼歐生物公司 | 促效性抗il-2r抗體及使用方法 |
CR20230474A (es) | 2021-04-06 | 2023-11-23 | Teneobio Inc | Anticuerpos anti-cd19 y estructuras car-t |
CN117337303A (zh) | 2021-04-16 | 2024-01-02 | 特尼奥生物股份有限公司 | 抗cd20抗体及car-t结构 |
WO2022271987A1 (en) | 2021-06-23 | 2022-12-29 | TeneoFour, Inc. | Anti-cd38 antibodies and epitopes of same |
WO2023004197A1 (en) | 2021-07-23 | 2023-01-26 | Teneoten, Inc. | Heavy chain antibodies binding to hepatitis b surface antigen |
WO2023036982A1 (en) | 2021-09-10 | 2023-03-16 | Harbour Antibodies Bv | Anti-sars2-s antibodies |
GB202112935D0 (en) | 2021-09-10 | 2021-10-27 | Harbour Antibodies Bv | Sars-cov-2 (sars2, covid-19) heavy chain only antibodies |
WO2023246578A1 (zh) * | 2022-06-24 | 2023-12-28 | 成都科伦精准生物科技有限公司 | 特异性结合gpc3的嵌合抗原受体及其应用 |
WO2024077044A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-11 | Amgen Inc. | Combination therapies comprising t-cell redirecting therapies and agonistic anti-il-2r antibodies or fragments thereof |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060246477A1 (en) * | 2005-01-31 | 2006-11-02 | Ablynx N.V. | Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies |
RU2335507C2 (ru) * | 2001-06-13 | 2008-10-10 | Генмаб А/С | Человеческие моноклональные антитела к рецептору эпидермального фактора роста (egfr), способ их получения и их использование, гибридома, трансфектома, трансгенное животное, экспрессионный вектор |
Family Cites Families (32)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3333941A1 (de) | 1983-09-20 | 1985-04-04 | Karl Kässbohrer Fahrzeugwerke GmbH, 7900 Ulm | Fraese |
KR0184860B1 (ko) | 1988-11-11 | 1999-04-01 | 메디칼 리써어치 카운실 | 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법) |
US5175384A (en) | 1988-12-05 | 1992-12-29 | Genpharm International | Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice |
US6150584A (en) * | 1990-01-12 | 2000-11-21 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US6673986B1 (en) | 1990-01-12 | 2004-01-06 | Abgenix, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
US5877397A (en) | 1990-08-29 | 1999-03-02 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
US5843440A (en) | 1990-10-03 | 1998-12-01 | Redcell Canada, Inc. | Cellular and serum protein anchors for modulating pharmacokinetics |
ES2162823T5 (es) | 1992-08-21 | 2010-08-09 | Vrije Universiteit Brussel | Inmunoglobulinas desprovistas de cadenas ligeras. |
US6670453B2 (en) | 1997-10-27 | 2003-12-30 | Unilever Patent Holdings B.V. | Multivalent antigen-binding proteins |
US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
US20030022240A1 (en) * | 2001-04-17 | 2003-01-30 | Peizhi Luo | Generation and affinity maturation of antibody library in silico |
GB0110029D0 (en) | 2001-04-24 | 2001-06-13 | Grosveld Frank | Transgenic animal |
GB0115256D0 (en) | 2001-06-21 | 2001-08-15 | Babraham Inst | Mouse light chain locus |
JP2005289809A (ja) * | 2001-10-24 | 2005-10-20 | Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) | 突然変異重鎖抗体 |
GB0228210D0 (en) | 2002-12-03 | 2003-01-08 | Babraham Inst | Single chain antibodies |
EP1597280B2 (en) * | 2003-02-26 | 2016-08-24 | Institute for Research in Biomedicine | Monoclonal antibody production by ebv transformation of b cells |
US7785903B2 (en) | 2004-04-09 | 2010-08-31 | Genentech, Inc. | Variable domain library and uses |
EP1864998B2 (en) † | 2004-07-22 | 2022-06-22 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Binding molecules |
NZ563392A (en) * | 2005-05-20 | 2009-12-24 | Ablynx Nv | Improved Nanobodies(TM) for the treatment of aggregation-mediated disorders |
DE202005011297U1 (de) | 2005-07-18 | 2005-11-03 | Trw Automotive Electronics & Components Gmbh & Co. Kg | Fahrzeug-Haltegriff |
JP5184374B2 (ja) | 2006-01-25 | 2013-04-17 | エラスムス・ユニヴァーシティ・メディカル・センター・ロッテルダム | 対立遺伝子排除 |
GB0618345D0 (en) * | 2006-09-18 | 2006-10-25 | Univ Erasmus | Binding molecules |
CA2651567A1 (en) | 2006-05-09 | 2007-11-22 | Genentech, Inc. | Binding polypeptides with optimized scaffolds |
MX2008014804A (es) † | 2006-06-02 | 2009-01-27 | Regeneron Pharma | Anticuerpos de afinidad elevada a receptor de il-6 humano. |
US7731969B1 (en) * | 2006-12-06 | 2010-06-08 | Neoclone Biotechnology International, Llc | Methods for developing and producing antigen-specific antibody-producing cells |
EP2152880B1 (en) | 2007-06-01 | 2011-08-31 | Omt, Inc. | Compositions and methods for inhibiting endogenous immunoglobulin genes and producing transgenic human idiotype antibodies |
WO2009013620A2 (en) | 2007-06-11 | 2009-01-29 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Homologous recombination |
CN101821289A (zh) † | 2007-09-07 | 2010-09-01 | 西福根有限公司 | 重组制造抗rsv抗体的方法 |
PT2954779T (pt) | 2009-12-10 | 2019-05-29 | Regeneron Pharma | Ratinhos que produzem anticorpos de cadeia pesada |
ES2758974T5 (es) | 2011-02-25 | 2023-06-08 | Regeneron Pharma | Ratones ADAM6 |
WO2012122512A1 (en) | 2011-03-10 | 2012-09-13 | Hco Antibody, Inc. | Recombinant production of mixtures of single chain antibodies |
WO2016208410A1 (ja) | 2015-06-22 | 2016-12-29 | 株式会社日立国際電気 | 電力増幅装置 |
-
2009
- 2009-03-24 GB GBGB0905023.8A patent/GB0905023D0/en not_active Ceased
-
2010
- 2010-03-19 DK DK10711069.4T patent/DK2411408T4/da active
- 2010-03-19 US US13/259,472 patent/US8883150B2/en active Active
- 2010-03-19 KR KR1020117025003A patent/KR20120068757A/ko not_active Application Discontinuation
- 2010-03-19 RU RU2011142759/10A patent/RU2528737C2/ru active
- 2010-03-19 HR HRP20160158TT patent/HRP20160158T4/hr unknown
- 2010-03-19 WO PCT/GB2010/000500 patent/WO2010109165A2/en active Application Filing
- 2010-03-19 HU HUE10711069A patent/HUE026473T2/en unknown
- 2010-03-19 EP EP10711069.4A patent/EP2411408B2/en active Active
- 2010-03-19 JP JP2012501368A patent/JP5836927B2/ja active Active
- 2010-03-19 ES ES10711069T patent/ES2563321T5/es active Active
- 2010-03-19 PL PL10711069.4T patent/PL2411408T5/pl unknown
- 2010-03-19 CA CA2756171A patent/CA2756171C/en active Active
- 2010-03-19 PT PT107110694T patent/PT2411408E/pt unknown
- 2010-03-19 SI SI201031110T patent/SI2411408T2/sl unknown
- 2010-03-19 FI FIEP10711069.4T patent/FI2411408T4/fi active
- 2010-03-19 CN CN201080023562.8A patent/CN102482342B/zh active Active
- 2010-03-22 MX MX2011010027A patent/MX2011010027A/es not_active Application Discontinuation
- 2010-03-22 BR BRPI1012694A patent/BRPI1012694A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2010-03-22 SG SG2011068418A patent/SG174510A1/en unknown
- 2010-03-24 TW TW099108753A patent/TW201040264A/zh unknown
-
2011
- 2011-04-23 ZA ZA2011/06983A patent/ZA201106983B/en unknown
-
2013
- 2013-03-15 US US13/815,812 patent/US9365655B2/en active Active
-
2016
- 2016-02-12 SM SM201600044T patent/SMT201600044B/it unknown
- 2016-02-17 CY CY20161100136T patent/CY1117203T1/el unknown
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2335507C2 (ru) * | 2001-06-13 | 2008-10-10 | Генмаб А/С | Человеческие моноклональные антитела к рецептору эпидермального фактора роста (egfr), способ их получения и их использование, гибридома, трансфектома, трансгенное животное, экспрессионный вектор |
US20060246477A1 (en) * | 2005-01-31 | 2006-11-02 | Ablynx N.V. | Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JANSSENS R. et al., " Generation of heavy-chain-only antibodies in mice", Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Oct 10;103(41):15130-5. Epub 2006 Oct 2. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2816994C2 (ru) * | 2017-06-20 | 2024-04-09 | Тенеобио, Инк. | Антитела к bcma, содержащие только тяжелую цепь |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2528737C2 (ru) | Растворимые антитела, содержащие только тяжелые цепи | |
JP7229153B2 (ja) | 改変された重鎖のみの抗体を産生するトランスジェニック非ヒト動物 | |
JP5184374B2 (ja) | 対立遺伝子排除 | |
US10993420B2 (en) | Production of heavy chain only antibodies in transgenic mammals | |
AU2012233037B2 (en) | Generation of binding molecules | |
AU2005263994B2 (en) | Binding molecules | |
US20090271880A1 (en) | Binding molecules | |
WO2008122886A2 (en) | Transgenic non-human mammal with homodimeric vh binding complex | |
AU2010227291B2 (en) | Soluble "heavy-chain only " antibodies | |
GB2576914A (en) | Antigen-binding molecules comprising unpaired variable domains produced in mammals |