CN109072191B - 用于蛋白生产和文库产生的哺乳动物细胞系 - Google Patents

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Abstract

根据本发明的第一方面，提供了产生细胞系的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供多个哺乳动物B细胞，其中所述多个B细胞中的每一个包含编码标志物蛋白的转基因基因组DNA序列，所述标志物蛋白插入到包含在所述B细胞中的内源性免疫球蛋白基因座中，并且其中所述转基因基因组DNA序列适合于被定点核酸酶、特别是Cas9切割；(b)用编码目标蛋白的第二转基因DNA序列替换编码标志物蛋白的转基因基因组DNA序列；(c)基于标志物蛋白的存在或不存在来分选B细胞；和(d)收集其中不存在标志物蛋白的B细胞。

Description

用于蛋白生产和文库产生的哺乳动物细胞系
本发明涉及工程化细胞系及其用于快速产生用于蛋白表达的稳定细胞和产生用于定向进化和蛋白工程的蛋白文库的用途。
背景技术
目前可用的用于从哺乳动物细胞产生蛋白的方法主要依赖于三种细胞系中的随机转基因整合：人胚胎肾293(HEK293)细胞、小鼠骨髓瘤细胞(Sp20和NS0)和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。这些方法既昂贵又耗时。用于治疗性蛋白生产的生物技术工业标准要求产生稳定的重组蛋白生产细胞系，当从冷冻的细胞储备恢复时，其能够几乎无限地生产蛋白。
通过定向进化工程化蛋白需要通过体外诱变方法(例如，易错PCR、简并引物PCR诱变、DNA改组(DNA shuffling)，然后克隆到表达宿主中并高通量筛选。可在哺乳动物细胞中产生的文库的大小由于差的转染效率而受到限制。因此，蛋白文库的高通量筛选通常采用正交表面展示平台，主要基于体外或微生物表达(例如，核糖体、噬菌体、酵母及细菌展示)。与哺乳动物细胞相比，这些宿主可能对蛋白折叠、糖基化模式和表达具有大的影响。然而，关键的是，标准系统不能有效地表达和筛选一些复杂的蛋白(例如，全长抗体)。另外，在治疗性蛋白的情况下，在体外或微生物系统中的文库筛选之后，经常需要将基因亚克隆到哺乳动物表达系统中以进行适当的表征。
本发明的基础问题是提供用于产生稳定哺乳动物细胞系的快速、可靠和廉价的方法，其可用于重组蛋白表达以及用于产生和筛选用于蛋白工程和定向进化应用的大蛋白文库。该问题通过独立权利要求的主题来解决。
定义
在本说明书的上下文中，术语“序列同一性”和“序列同一性百分比”是指通过比较两个对齐的序列而确定的值。用于比较的序列比对方法是本领域公知的。用于比较的序列的比对可如下进行：通过Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的全局对齐算法，通过Pearson和Lipman,Proc.Nat.Acad.Sci.85:2444(1988)的相似性检索方法，或通过这些算法的计算机化实施方式，包括但不限于：CLUSTAL、GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。用于执行BLAST分析的软件可公开获取，例如通过美国国家生物技术信息中心(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。
用于比较氨基酸序列的一个实例是BLASTP算法，其使用默认设置：预期阈值：10；字数：3；查询范围内的最大匹配：0；矩阵：BLOSUM62；空位成本：存在11，延伸1；合成调整：条件合成得分矩阵调整。用于比较核酸序列的一个这样的实例是BLASTN算法，其使用默认设置的：预期阈值：10；字数：28；查询范围内的最大匹配：0；匹配/错配得分：1.-2；空位成本：线性。除非另有说明，本文提供的序列同一性值是指分别使用用于蛋白和核酸比较的上述确定的默认参数，使用BLAST程序套件(Altschul等，J.Mol.Bio.215:403-410(1990))获得的值。
在本说明书的上下文中，术语"B细胞"是指已经通过V(D)J重组完成免疫球蛋白重链和轻链基因座的基因组重排的淋巴系细胞。
在本说明书的上下文中，术语"IgH基因座"指免疫球蛋白重链基因的基因座。
在本说明书的上下文中，术语"位点定向核酸内切酶"是指选自包括CRISPR相关核酸内切酶、锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活子样效应子的核酸酶(TALEN)和兆核酸酶(meganuclease)的组的核酸内切酶。
在本说明书的上下文中，术语"CRISPR相关核酸内切酶(Cas9)"指酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9核酸内切酶(SpyCas9)、SpyCas9的直系同源物或者SpyCas9的工程化蛋白变体或其直系同源物。
在本说明书的上下文中，术语"直系同源物(orthologue)"是指通过来自单个祖先基因的垂直继嗣进化的基因及其相应多肽。换句话说，直系同源基因/多肽共有一个共同的祖先，并且当一个物种分裂成两个独立的物种时被分开。然后将两个所产生的物种中的单个基因的拷贝称为直系同源物。为了确定两个基因是直系同源物，本领域技术人员可以通过比较所比对对齐的基因或多肽的核苷酸或氨基酸序列来进行基因谱系的系统发育分析。
在本说明书的上下文中，术语“抗体”以其在细胞生物学和免疫学领域中已知的含义使用；它是指全抗体，包括但不限于免疫球蛋白G型(IgG)、A型(IgA)、D型(IgD)、E型(IgE)或M型(IgM)、其任何抗原结合片段或单链及其相关或衍生的构建体。全抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两个重链(H)和两个轻链(L)的糖蛋白。每个重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每个轻链包括轻链可变区(此处缩写为VL)和轻链恒定区(CL)。轻链恒定区由一个结构域CL组成。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分。
本说明书上下文中的术语“抗体样分子”是指能够以高亲和力(Kd≤10E-8mol/l)特异性结合另一分子或靶标的分子。类似于抗体的特异性结合，抗体样分子与其靶标结合。术语抗体样分子包括重复蛋白，例如设计的锚蛋白重复蛋白(Molecular Partners，Zürich)、源自犰狳重复蛋白的多肽、源自富亮氨酸重复蛋白的多肽和源自三角形四肽(tetratricopeptide)重复蛋白的多肽。
术语“抗体样分子”还包括衍生自蛋白A结构域的多肽(蛋白A结构域衍生多肽)、衍生自纤连蛋白结构域FN3的多肽、衍生自共有纤连蛋白结构域的多肽、衍生自脂质运载蛋白的多肽、衍生自锌指的多肽、衍生自Src同源结构域2(SH2)的多肽、衍生自Src同源结构域3(SH3)的多肽、衍生自PDZ结构域的多肽、衍生自γ-晶状体蛋白的多肽、衍生自泛素的多肽、衍生自半胱氨酸结多肽的多肽以及衍生自打结素(knottin)的多肽。
术语“蛋白A结构域衍生多肽”是指作为蛋白A的衍生物并且能够特异性结合免疫球蛋白的Fc区和Fab区的分子。
术语“犰狳重复蛋白”是指包含至少一个犰狳重复序列的多肽，其中犰狳重复序列的特征在于形成发夹结构的一对α螺旋。
在本说明书的上下文中，术语“人源化骆驼抗体(camelid antibody)”是指仅由重链或重链的可变结构域(VHH结构域)组成的抗体，其氨基酸序列已被修饰以增加其与在人中天然产生的抗体的相似性，并因此当被施用于人类时显示降低的免疫原性。
Vincke等"General strategy to humanize a camelid single-domainantibody and identification of a universal humanized nanobody scaffold"，JBiol Chem.2009年1月30日；284(5):3273-3284和US2011165621A1中显示了人源化骆驼抗体的一般策略。
在本说明书的上下文中，术语“可结晶片段(Fc)区”以其在细胞生物学和免疫学领域中已知的含义使用；它是指包含由通过二硫键共价连接的CH2和CH3结构域组成的两个相同重链片段的抗体的级分。
本文中使用的术语的进一步定义在适当时在整个文本中给出。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了一种用于产生细胞系的方法，其包括以下步骤：
a.提供多个哺乳动物B细胞，其中所述多个B细胞中的每一个包含编码标志物蛋白的转基因基因组DNA序列，其中所述转基因基因组DNA序列插入到包含在所述B细胞中的内源性免疫球蛋白基因座、特别是IgH基因座中，并且其中所述转基因基因组DNA序列适合于被定点核酸酶、特别是CRISPR-相关核酸内切酶(Cas9)切割；
b.用编码目标蛋白的第二转基因DNA序列替换编码所述标志物蛋白的所述转基因基因组DNA序列；
c.基于所述标志物蛋白的存在或不存在来分选所述B细胞；和
d.收集其中不存在所述标志物蛋白的B细胞。
在某些实施方式中，标志物蛋白是荧光蛋白。在某些实施方式中，标志物蛋白是赋予对抗生素药物抗性的蛋白。
在某些实施方式中，所述标志物蛋白是荧光蛋白，并且所述分选通过流式细胞术进行。
在本说明书的上下文中，"用编码目标蛋白的第二转基因DNA序列替换编码所述标志物蛋白的所述转基因基因组DNA序列"的表述涉及DNA序列的实际替换和功能替换，其方式是不再表达标志物蛋白，而代以表达目标蛋白。
本领域技术人员知道，"[编码标志物蛋白的]所述转基因基因组DNA序列适合于被定点核酸酶切割"的表述包括编码标志物蛋白的DNA序列内的切割和紧邻3’和/或5’侧翼区内的切割。
在某些实施方式中，所述转基因基因组序列侧接5’侧翼序列区(flankingsequencetract)和3’侧翼序列区，其中所述5’侧翼序列区和/或所述3’侧翼序列区适合于被定点核酸酶切割。
在某些实施方式中，所述侧翼序列区包含0至1500个核苷酸，特别是0个核苷酸或1至700个核苷酸，更特别是0个核苷酸或1至100个核苷酸。
适合于被定点核酸酶、特别是Cas9切割的位点通常在编码标志物蛋白的序列的500个核苷酸内或在编码标志物蛋白的序列内。
在某些实施方式中，目标蛋白是抗体、抗体样分子、人源化骆驼抗体或免疫球蛋白抗原结合片段。
在稍后插入的目标基因是抗体的那些情况下，内源性免疫球蛋白VH基因被编码标志物蛋白的转基因基因组DNA序列替换或破坏。
在本说明书的上下文中，术语"VH基因"是指编码免疫球蛋白重链的可变区的DNA序列。
在本说明书的上下文中，术语"VL基因"是指编码免疫球蛋白轻链的可变区的DNA序列。
在某些实施方式中，所述多种B细胞选自包含原代B细胞、永生化B细胞、杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞、浆细胞瘤细胞和淋巴瘤细胞的组。
在某些实施方式中，标志物蛋白和/或目标蛋白在内源性免疫球蛋白启动子、特别是VH启动子的控制下表达。
在本说明书的上下文中，术语"VH启动子"是指"VH基因"的启动子。
在某些实施方式中，在所述多个B细胞中的每一个中内源性VH基因和内源性VL基因被破坏。这意味着B细胞既不能表达免疫球蛋白重链也不能表达免疫球蛋白轻链。
在某些实施方式中，对多个B细胞进行遗传修饰以组成型表达所述CRISPR相关核酸内切酶。
在某些实施方式中，多个B细胞经遗传修饰而以可诱导和可滴定的方式表达活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)。
在本说明书的上下文中，术语"活化诱导的胞苷脱氨酶"指能使基因组DNA内的胞嘧啶碱基脱氨基从而将它们转化为尿嘧啶(EC 3.5.4.38)的酶。
在某些实施方式中，多个B细胞包含安全港基因座，并且将包含编码CRISPR相关核酸内切酶的DNA序列的第一表达盒插入到所述安全港基因座中。
在本说明书的上下文中，术语"安全港基因座(safe harbour locus)"是指适合于整合转基因的染色体位置。整合在安全港基因座中的转基因稳定表达并且不干扰内源性基因的活性。安全港基因座的实例是鼠类Rosa26基因座或AAVS1基因座。
在某些实施方式中，插入到所述安全港基因座中的CRISPR相关核酸内切酶受组成型活性启动子、特别是CAG启动子、CBh启动子或CMV启动子的控制。
CAG启动子是由融合至鸡β-肌动蛋白启动子的巨细胞病毒增强子组成的杂交构建体(Jun-ichi等，Gene 79(2)：269-277)。CBh启动子是CBA(鸡β-肌动蛋白)启动子的杂交形式(Gray等，Hum Gene Ther.，2011，22(9)：1143-1153)。术语"CMV启动子"是指诸如人疱疹病毒5菌株Toledo(GenBank GU937742.2)等人疱疹病毒的人巨细胞病毒立即早期增强子和启动子序列。示例性CMV序列在GenBank中以参考号X03922.1、M64940.1、M64941.1、M64942.1、M64943.1、M64944.1和K03104.1保藏。
在某些实施方式中，所述多个B细胞包含安全港基因座，并且将包含编码所述活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)的DNA序列的第二表达盒插入所述安全港基因座中。
在某些实施方式中，第二表达盒包含适合于由激活子分子诱导型激活的调节序列。
在某些实施方式中，第二表达盒包含诱导型表达系统，特别是Tet-One诱导型表达系统。Tet-One诱导型表达系统包含反式激活蛋白(Tet-On)和诱导型启动子(PTRE3GS)。在抗生素强力霉素的存在下，Tet-On与PTRE3GS中的tetO序列结合并激活启动子下游基因(即，编码活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)的基因)的高水平转录。如果强力霉素浓度降低，则表达降低，从而产生AID表达和体细胞超突变的可滴定系统。
在本说明书的上下文中，术语"体细胞超突变(SHM)"是指产生多种基因组突变的细胞机制。SHM涉及通过酶活化诱导的胞嘧啶脱氨酶(AID)在DNA中使胞嘧啶脱氨基为尿嘧啶。所得到的碱基对错配(尿嘧啶-鸟苷，U:G)可导致基因组突变，例如,通过易错DNA聚合酶切除尿嘧啶碱基并填充空位，或通过期间尿嘧啶被当作为胸苷的DNA复制。
在本说明书的上下文中，术语"诱导型合成体细胞超突变(iSSHM)"指可通过激活来自诱导型表达系统的AID表达在所述多个B细胞中诱导的SHM。
在某些实施方式中，通过Cas9介导的位点定向DNA切割，和随后通过同源定向修复(HDR)或非同源末端连接(NHEJ)进行的所述第二转基因DNA序列的整合，从而介导所述转基因基因组DNA序列的所述替换。该方法包括提供引导RNA和替换DNA。
在本说明书的上下文中，引导RNA或gRNA是Cas9-结合所必需的序列和定义待修饰的基因组靶的约23个核苷酸的用户定义的"靶向序列"组成的短合成RNA(参见表2)。
这种引导RNA可以通过转染体外转录的RNA或商业合成的寡核苷酸RNA来提供。作为另选，可以通过将DNA序列转染或病毒转导到细胞中来提供引导RNA，其中所述DNA序列编码(并在细胞中表达)引导RNA。可以提供多个引导RNA以同时切割IgH基因座中的多个基因组位点(这提高了转基因插入的效率)。
替换DNA包含编码目标蛋白的所述第二转基因DNA序列。替换DNA可以通过环形或线性双链DNA(dsDNA)或单链DNA(ssDNA)(例如寡核苷酸)的转染或病毒转导来提供。
在本发明这一方面的某些实施方式中，所述目标蛋白是全长抗体。全长抗体可以基于合成的抗原结合片段(sFAb)构建体。为了重新引入新的全长抗体，同时避免免疫球蛋白重链基因座和免疫球蛋白轻链基因座的靶向，全长轻链和重链都可以从天然VH启动子表达为单一转录物(图2B)。
在某些实施方式中，所述多种B细胞是小鼠杂交瘤细胞。
在某些实施方式中，所述多个B细胞是小鼠杂交瘤细胞，并且用不同物种的CH区、特别是用人CH区替换鼠类CH区。这允许通过小鼠杂交瘤细胞产生人抗体。
在本说明书的上下文中，术语"CH区"是指编码免疫球蛋白重链恒定区的DNA序列。
在本发明该方面的某些实施方式中，所述第二转基因核酸序列包含多于一个的目标基因和另外的启动子。这样，可以通过本发明的方法产生稳定表达多个基因或整个合成遗传网络的细胞系。
用于从稳定的哺乳动物细胞表达重组蛋白的现有技术方法需要至少8-10周的时间来开发，商业实体收费10,000美元/蛋白以上。用于工业治疗目的的稳定细胞系的产生需要长达一年。
通常，由于不同的蛋白生产效率，需要分析多个克隆。影响克隆生产力的因素是整合的数量和整合位点，因为已知基因沉默在一些整合位点随时间发生。
根据本发明的第二方面，提供了产生蛋白变体文库的方法。该方法包括根据本发明的第一方面或其上述任何实施方式的方法，随后进行以下额外步骤：用随机化核酸序列(通过供体dsDNA或ssDNA上的随机化区域)修饰转基因DNA的区域。因此，通过定点诱变在目标蛋白内产生基因组突变。
根据本发明的该方面的替代方案，用于产生蛋白变体文库的方法包括根据本发明的第一方面或其任何上述实施方式的方法，随后进行以下额外步骤：
a.诱导活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)的表达，从而通过诱导型合成体细胞超突变(iSSHM)在目标蛋白内产生多个基因组突变，或
b.用随机化的核酸序列修饰所述转基因DNA的区域，从而通过定点诱变在目标蛋白内产生基因组突变。
根据本发明的第三方面，提供了产生蛋白变体文库的方法。该方法包括根据本发明的第一方面的方法，随后进行诱导活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)的表达的额外步骤，从而通过诱导型合成体细胞超突变(iSSHM)在目标蛋白内产生多个基因组突变。
AID在免疫球蛋白(IgH或IgK或IgL)基因座内产生突变方面特别有效。因此，对于iSSHM有利的是，编码目标蛋白的DNA序列被插入到免疫球蛋白基因座，例如IgH基因座中。
在某些实施方式中，对转基因基因组DNA序列的所述区域的所述修饰是通过Cas9介导的位点定向DNA切割所介导的，并且：
a.随后通过同源定向修复(HDR)或非同源末端连接(NHEJ)整合所述随机转基因DNA序列，或
b.随后通过由NHEJ修复转基因DNA序列来插入或缺失核苷酸。
该方法包括以与本发明的第一方面类似的方式提供引导RNA和替换DNA。引导RNA和随机化核酸序列可以通过包含简并核苷酸或三核苷酸密码子的dsDNA或ssDNA的转染或病毒转导来提供。为了提高ssDNA的HDR效率，在5’和3’末端以及整个ssDNA寡核苷酸中引入硫代磷酸酯键。硫代磷酸酯键是磷酸酯主链的非桥氧更换为硫原子。磷酸酯骨架中的硫原子增加ssDNA对核酸酶降解的抗性。
在本说明书的上下文中，术语"简并核苷酸"是指编码任何混合核苷酸组合物的DNA序列的位置。
在本说明书的上下文中，术语"三核苷酸"或三聚体亚磷酰胺是指编码任何混合氨基酸组合物的DNA序列的三个连续核苷酸。
本领域技术人员知道，根据本发明第二方面的蛋白变体文库的产生包括细胞系文库的产生。
在目标蛋白是抗体的那些情况下，就改进的或新的抗原结合而言筛选突变的抗体。将荧光标记的抗原加入到细胞中，并通过FACS筛选细胞。作为另选，初始筛选步骤可通过使用缀合至抗原的磁珠的磁缔合细胞分选(MACS)来进行。
可以进行几轮筛选和iSSHM或定点诱变以继续构建抗体或蛋白。
在某些实施方式中，标志物蛋白是荧光蛋白。
作为非限制性实例，这样的荧光蛋白可以选自来自维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白(GFP)及其衍生物，例如：
-增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)、增强型蓝色荧光蛋白2(EBFP2)、Azurite、mKalama1、Sirius
-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、emerald、superfolder avGFP、T-sapphire
-黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、citrine、venus、YPet、topaz、SYFP、mAmetine
-增强型青色荧光蛋白(ECFP)、mTurquoise、mTurquoise2、Cerulean、CyPet、SCFP。
用于实施本发明的荧光蛋白也可以选自由来自海葵(Discosoma striata)的荧光蛋白及其衍生物组成的组：
-mTagBFP、
-TagCFP、AmCyan、Midoriishi Cyan、mTFP1
-Azami Green、mWasabi、ZsGreen、TagGFP、TagGFP2、TurboGFP、CopCFP、AceGFP
-TagYFP、TurboYFP、ZsYellow、PhiYfP
-Kusabira Orange、Kusabira Orange2、mOrange、mOrange2、dTomato、dTomato-Tandem、DsRed、DsRed2、DsRed-Express(T1)、DsRed-Express2、DsRed-Max、DsRed-Monomer、TurboRFP、TagRFP、TagRFP-T
-mRuby、mApple、mStrawberry、AsRed2、mRFP1、JRed、mCherry、eqFP611、tdRFP611、HcRed1、mRaspberry
-tdRFP639、mKate、mKate2、katushka、tdKatushka、HcRed-Tandem、mPlum、AQ143。
荧光蛋白还包括衍生自来自蓝细菌红海束毛藻(Trichodesmium erythraeum)的α-别藻蓝蛋白的蛋白，例如小的超红荧光蛋白(smURFP)。
本领域技术人员知道，根据本发明的第一方面的方法也可以采用未包括在上述列表中的其它荧光蛋白来进行。
本发明的另一方面提供了包含表达的转基因基因组DNA序列的人B细胞系，所述表达的转基因基因组DNA序列插入到包含在通过根据本发明的第一、第二或第三方面的方法获得的所述B细胞中的内源性免疫球蛋白基因座中。
根据本发明的又一方面，提供了通过根据本发明的第一、第二或第三方面的方法获得的蛋白。
根据本发明的又一方面，提供了通过根据本发明的第一、第二或第三方面的方法获得的蛋白变体文库。
根据本发明的又一方面，提供了哺乳动物B细胞，其中
a.将编码标志物蛋白的转基因基因组DNA序列插入到包含在所述B细胞中的内源性免疫球蛋白基因座、特别是IgH基因座中，其中所述标志物基因编码荧光蛋白，并且其中，
b.所述转基因基因组序列适合于被定点核酸酶、特别是CRISPR相关核酸内切酶(Cas9)切割。
在某些实施方式中，哺乳动物B细胞是人细胞。
本发明的另一方面涉及多个哺乳动物B细胞，每个细胞编码转基因蛋白的变体。所述多个哺乳动物B细胞在其整体上构成这种变体的文库。包含在所述多个B细胞中的多个B细胞的每个成员包含编码目标蛋白的变体的转基因基因组DNA序列。将转基因基因组DNA序列插入到包含在所述B细胞中的内源性免疫球蛋白基因座、特别是IgH基因座中，并且由所述多个B细胞的成员编码的每个变体不同于由所述多个B细胞的另一个成员编码的任何其它变体。
本领域技术人员理解，多个B细胞的每个成员可能由多于一个个体细胞表示，即，一个克隆的几个细胞可以构成一个成员。这里的重要方面在于，变体对于一个成员是相同的，并且大量(在某些实施例中，等于或大于≥100、≥1000、≥10000或甚至≥100000)的不同变体可以存在于所述多个B细胞中。
在本发明的该方面的某些实施方式中，多个B细胞中所编码的每个变体在其氨基酸序列的一个至五个位置上与另一变体不同。
在本发明的该方面的某些实施方式中，每个变体具有与由所述多个B细胞的成员编码的任何另一变体至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性。换句话说，变体可以在个体成员之间共享其序列的重要部分，并且仍代表非常宽的变体谱。
在本发明这一方面的某些实施方式中，所述多种B细胞选自包含原代B细胞、永生化B细胞、杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞、浆细胞瘤细胞和淋巴瘤细胞的组。
虽然用于单个可分离特征的替代方案在本文称之为"实施方式"，应当理解这些替代方案可以被自由地组合以形成本文公开的本发明的分立实施方式。
实施例
通过以下实施例和附图进一步说明本发明，从这些实施例和附图可以得到进一步的实施方式和优点。这些实施例旨在说明本发明，但不限制其范围。
为了实现本发明，发明人已经产生了即插即示(plug-and-(dis)play(PnP))型哺乳动物细胞系。发明人使用小鼠B淋巴细胞(杂交瘤细胞)，其用作抗体蛋白的生产工厂。PnP细胞系由以下组分组成：
1)IgH基因座中的内源性VH基因被荧光蛋白(mRuby，最初称为mRuby2，源自Addgene.org质粒#:40260(Lam等，Nat Methods 2012，9:1005-1012))替代。这通过如下实现：用具有引导RNA(gRNA)的CRISPR-Cas9质粒(pX458)(Addgene.org质粒#:48138)(Cong等，Science 2013，339:819-823)转染WT杂交瘤细胞，所述引导RNA靶向VH和IgG基因之间的内含子。此外还共转染了由mRuby基因和对应于WT杂交瘤细胞IgH基因座的同源臂组成的供体DNA构建体。CRISPR-Cas9系统在WT细胞的DNA中引入靶向双链断裂(DSB)，其促进同源定向修复(HDR)或非同源末端连接(NHEJ)的DNA修复机制，导致mRuby基因代替VH基因的位点特异性整合。使用天然IgH启动子表达mRuby(图1a-1d)。
2)使IgK基因座中的内源性VL基因缺失以产生轻链敲除细胞系。这通过用具有gRNA的pX458转染杂交瘤细胞(如1中所述)来完成，所述gRNA靶向侧接在IgK基因座中的VL基因的两个位点。这导致杂交瘤细胞中VL基因的缺失和内源性轻链表达的敲除(图1e-1g)。
所得到的细胞被称为PnP-mRuby细胞。
3)PnP-mRuby细胞被转化为表达新抗体的细胞，这些细胞被称为PnP-IgG细胞。这通过用具有靶向mRuby基因的gRNA(现在整合在IgH基因座中)的pX458转染PnP-mRuby细胞来完成。此外还共转染了具有对应于IgH基因座的同源臂的合成抗体片段(sFAb)的供体DNA构建体。类似于1)，CRISPR-Cas9促进DSB和HDR或NHEJ，这导致sFAb靶向整合到IgH基因座中。其结果是全长抗体(IgK和IgH)从IgH基因座表达为单个RNA转录物(图2)。
PnP-mRuby细胞可以利用单一转染和选择步骤转化为稳定的表达重组蛋白的哺乳动物细胞系(例如PnP-IgG)(图3,4)。
4)PnP-mRuby细胞被工程化以用于构成型表达Cas9(PnP-mRuby-Cas9细胞)。这是通过在组成型活性启动子(例如，CAG启动子或CMV启动子)(Addgene.org质粒#48139)的控制下用具有靶向ROSA26的安全港基因座中的位点的gRNA的pX458和由Cas9-2A-嘌呤霉素组成的供体DNA构建体来转染PnP-mRuby细胞来实现的(Platt等，CELL 2014，159：440-455；RAN等，Nat Protoc 2013，8:2281-2308)。这些细胞的优点在于，它们消除了用CRISPR-Cas9质粒(pX458)转染及因此将PnP-mRuby细胞转化为表达重组蛋白(例如PnP-IgG)的细胞系的需要，仅需要转染gRNA(体外转录或商业合成)和供体构建体(替换DNA，例如，sFab)，这提高了效率(图5A)。
通过使用由T7启动子、编码gRNA的定制间隔区和反式激活区组成的模板DNA以依照pX458设计的方式进行gRNA的体外转录。该构建体充当T7转录试剂盒(Thermo，AM1334)的模板，由此体外转录产生嵌合的单个gRNA。本规程改编自：https://www.protocols.io/view/In-vitro-transcription-of-guide-RNAs-d4w8xd？step＝3。
5)在VH基因(CDR-H3)的互补决定区3中进一步修饰表达HEL的抗原特异性抗体的PnP-IgG细胞(PnP-HEL23)，以通过定点诱变产生大的蛋白变体文库，然后可以就增加的抗原亲和力或新的抗原结合而言筛选其。这通过以下方式完成：
将PnP-HEL23细胞的sFAb基因进行修饰以敲除抗体表达。通过用含有靶向CDR-H3的引导RNA的pX458载体转染这些细胞，通过经由NHEJ修复而插入或缺失核苷酸来敲除抗体表达。核苷酸的插入或缺失引起移码突变，并随后改变残留在基因中的所有下游氨基酸。抗体表达阴性的单细胞克隆可通过流式细胞术分离并扩增。然后通过表型和基因型特征选择合适的克隆(PnP-HEL23-IgH-)。然后可以通过随机核酸的整合从所述细胞克隆衍生蛋白变体的文库。
抗体的亲和成熟可通过转染或病毒转导来提供靶向CDR-H3的引导RNA和替换DNA来完成，其中替换DNA包含三个随机化核酸的区域，所述三个随机化核酸对应于在原始CDR-H3内发现的每个位置处的单个氨基酸(图11)。
用于发现新的抗原特异性抗体的蛋白文库也可以通过以与用于抗体亲和成熟所述的方法类似的方式完全替换CDR-H3而产生。靶向CDR-H3的引导RNA和替换DNA通过转染或病毒转导提供，其中替换DNA含有包含对应于CDR-H3可变长度的3至69个随机化核酸的区域(图11)。
在这两种情况下，通过流式细胞术筛选并分选产生针对靶抗原的功能性抗体的细胞。
6)将该即插即示型(PnP)哺乳动物细胞系进一步工程化，使得它们能够通过诱导型合成体细胞超突变iSSHM产生大的蛋白变体库，其然后可以用于定向进化和高通量筛选(PnP-iAID细胞)。这以以下方式完成：
用含有靶向安全港基因座ROSA26的sgRNA和供体构建体(替换DNA)的pX458载体转染PnP-mRuby2细胞。供体构建体包含Tet-One系统(Clontech)(Heinz等，HumanGeneTherapy，2011，22：166-176)，其由以下组分组成(图5b)：
i.在正向，人磷酸甘油酯激酶1(hPGK)启动子，其提供Tet-On 3G蛋白的组成型表达；
ii.在正向，Tet-On 3G反式激活蛋白的编码序列，该蛋白是与VP16激活结构域(rtTA)连接的rTetR的融合蛋白；
iii.在反向，PTRE3GS诱导型启动子，PTRE3G的修饰版本，其由修饰的tet响应元件(TRE)组成并且包含与最小CMV启动子连接的7个tet操纵基因的直接重复；
iv.目标基因(GOI)，其表达由PTRE3GS启动子驱动，并且其包含编码以下的DNA序列：
i.荧光报告蛋白(例如，GFP或蓝色荧光蛋白(BFP))；
ii."自切割"2A肽；
iii.活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)；
v.对应于Rosa 26基因座的同源臂(>500bp)。
作为另选，可以使用没有同源臂的供体构建体。在这些情况下，供体构建体可以通过NHEJ整合。
在另一种方法中，使用PnP-mRuby-Cas9细胞作为创建PnP-iAID细胞系的起始平台。在这种情况下，用靶向ROSA26的安全港基因座中的正交位点的体外转录gRNA和供体构建体(替换DNA)转染PnP-mRuby-Cas9细胞。供体包括在上文4)中描述的相同组分。
在另一种方法中，用靶向小鼠的天然AID基因组基因座的体外转录gRNA转染PnP-mRuby-Cas9细胞。在这种情况下，供体构建体由上文4)中描述的相同元件组成，但不同之处在于在iv)中仅存在编码活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)的基因的第一内含子(图5c)。
在抗生素强力霉素(Dox)的存在下，Tet-On与PTRE3GS中的tetO序列结合并激活高水平的转录。然而，在Dox的量减少的情况下，表达减少，从而产生AID表达和SHM的可滴定系统。PnP-iAID细胞可以用Dox长期培养，以便在IgH基因座中产生大的蛋白变体文库。然后，通过流式细胞术的高通量筛选可以完成蛋白的定向进化和工程化(图5d)。
附图说明
图1显示了PnP-mRuby细胞的生成。(a)示意性显示表达抗体的野生型(WT)杂交瘤细胞将被转化为PnP-mRuby。(B)显示了WT IgH基因组基因座的靶向性，其注释如下：前导序列(L)、mRNA剪接位点(SS)、VH和IgG恒定重区(CH1)。CRISPR-Cas9gRNA靶位点(黑色)在VH和CH1之间的内含子中。该供体构建体由mRuby基因组成，其终止密码子侧接732bp和711bp的两个同源臂。PnP-mRuby IgH基因座通过用CRISPR-Cas9质粒(pX458)和供体构建体转染WT细胞而产生，这将导致VH区域与mRuby的基于HDR的交换。(C)流式细胞术斑点图显示WT细胞仅为IgH-阳性和mRuby-阴性，其中PnP-mRuby细胞仅为mRuby-阳性和IgH-阴性。(D)使用5’HA中的正向引物和3’HA外部的反向引物对来自WT和PnP-mRuby细胞的基因组DNA进行PCR。琼脂糖凝胶显示预期的条带大小。提取来自PnP-mRuby细胞的条带，Sanger测序证实VH区的mRuby交换。(E)显示了WT杂交瘤IgK基因座的靶向性，其注释如下：VL和IgK恒定轻区(CK)，其它注释与(A)中所示的相同。使用两个gRNA靶位点以使VL区缺失。(F)流式细胞术斑点图显示WT细胞是强IgH-和IgK-阳性的，其中PnP-mRuby细胞是仅IgH-和IgK-阴性的。(E)使用gRNA-F位点5’的正向引物和gRNA-H位点3’的反向引物对来自WT和PnP-mRuby细胞的基因组DNA进行PCR。琼脂糖凝胶显示WT细胞的预期条带大小，并且几乎没有PnP-mRuby细胞系的扩增产物。在整个图中，WT细胞对应于克隆WEN1.3，PnP-mRuby细胞对应于克隆1E9.C3(见表1)。
图2显示了PnP-mRuby杂交瘤的产生，其被重新编程以表面表达和分泌新抗体。(A)示意性显示表达mRuby的PnP-mRuby细胞将被转化回通过sFAb表达新抗体的杂交瘤中。(B)显示sFAb供体构建体的简化设计(完整的设计细节见图S8)。(C)显示PnP-mRuby IgH基因座，其中gRNA-J靶位点在mRuby基因中。用pX458.2和sFAb供体转染的PnP-mRuby细胞将导致HDR驱动的mRuby基因组替换。然后，新的抗体将在单个mRNA转录物上表达。(D)流式细胞术斑点图显示用pX458和sFAb供体转染PnP-mRuby后出现的不同群体。分选IgH表达阳性的细胞。(E)流式细胞术斑点图显示来自(D)中的经分选的IgH阳性群体的PnP-mRuby细胞和所得细胞(PnP-HEL23)的初始群体，其现在对于IgH和IgK表达是强阳性的。(F)图显示杂交瘤培养物上清液的夹心ELISA结果(捕获抗IgK、一级检测抗IgH)，PnP-HEL23显示与WT相似的IgG分泌水平。(G)使用(C)中所示的引物，对WT、PnP-mRuby、PnP-HEL23细胞的基因组DNA进行PCR。来自基因组PCR的琼脂糖凝胶显示PnP-HEL23中预测的条带大小。(H)来自mRNA的RT-PCR导致以仅存在于PnP-HEL23中的正确大小存在的可见条带。提取PnP-HEL23的条带，Sanger测序证实PnP-sFAb构建体的正确整合。在整个图中，WT细胞对应于克隆WEN1.3，PnP-mRuby细胞对应于克隆1E9.C3，PnP-HEL23对应于克隆Y(见表1)。
图3显示表面表达并分泌抗原特异性抗体的PnP-HEL23细胞。(A)流式细胞术直方图显示PnP-HEL23细胞表面表达对同源抗原HEL具有特异性的抗体。(B)ELISA数据显示PnP-HEL23细胞分泌对HEL具有特异性的抗体。WT细胞对应于克隆WEN1.3，PnP-mRuby细胞对应于克隆1E9.C3，PnP-IgG细胞对应于克隆Y(见表1)。
图4显示产生PnP抗体的细胞的快速和可重复地产生。(A)流式细胞术斑点图显示用pX458.2和不同PnP-sFAb供体构建体转染后的PnP-mRuby。针对IgH表达来分选细胞。(B)流式细胞术斑点图显示，在(A)中分选后，所有三个PnP细胞系均表达IgH和IgK。(C)同图2G和2H，分别对基因组DNA和mRNA进行PCR和RT-PCR。(D，E)与(A)和(B)相似的是PnP-HEL3.2细胞的流式细胞术斑点图，不同之处在于省略了Cas9分选步骤。PnP-HyHEL10对应于克隆U，PnP-EBV-2G4对应于克隆AA，PnP-EBV-4G7对应于克隆AB，PnP-HEL23对应于克隆AC(见表1)。
图5显示了表达Cas9和AID的PnP杂交瘤细胞的产生。(a)显示了PnP-mRubyRosa 26基因座的CRISPR-Cas9靶向性。供体构建体将为Cas9基因提供2A肽和嘌呤霉素抗性基因。整合到该基因座将在所有PnP-mRuby细胞中提供Cas9的组成型表达。(b)和(c)显示了诱导型AID基因座通过整合到ROSA26基因座或整合到天然AID基因座而整合到PnP-mRuby-Cas9细胞中。(d)示意性显示了通过经表达AID的诱导型合成体细胞超突变将产生大的文库。这些文库然后可用于通过流式细胞术的定向进化和高通量筛选。
图6显示对CRISPR-Cas9靶向杂交瘤细胞的免疫球蛋白基因座的验证。(A)流式细胞仪斑点图显示用pX458转染后WEN1.3细胞中的Cas9-2A-GFP表达。(B)Surveyor结果证实在IgH基因座中的CRISPR-Cas9靶向(测试的所有gRNA位点的琼脂糖凝胶)。(C)Surveyor结果证实在IgK基因座中的CRISPR-Cas9靶向(测试的所有gRNA位点的琼脂糖凝胶)。
图7显示CRISPR-Cas9靶向ROSA26基因座。(A)鉴定出CRISPR靶的ROSA26基因座(小鼠染色体6)；还显示了用于切割分析的片段扩增的引物。(B)来自Surveyor测定的DNA凝胶显示所有4个测试的引导物诱导成功的CRISPR切割。片段与预期的大小相匹配，如(A)所示。
图8显示PnP-Cas9细胞系的设计和验证。(A)ROSA26基因座靶向CRISPR-Cas9诱导的组成型Cas9盒的HDR整合。盒中包含两个独立的基因。带有牛生长激素(bCGh)的SpCas9-2A-嘌呤霉素基因，GFP基因在类鼠pPGK启动子的转录控制下。5’和3’同源臂也存在于构建体中。1：SV40pA；2：AID；3：F2A；4：GFP；5：TRE3Gs启动子；6：hPGK启动子；7：Tet-On 3G；8：SV40pA；9：同源臂；10：pCAG启动子；11：SpCas9；12：T2A；13：嘌呤霉素；14：bGH pA；15：mPGK启动子；16：GFP；17：同源臂。(B)Cas9供体构建体的放大图，显示了GFP或pPGK内的引导RNA靶位点，其用于随后通过Cas9诱导的NHEJ来使GFP失活。(C)在PnPCas9中引入引导RNA之前或之后的Sanger测序结果。(D)T7E1测定证实在引导RNA存在下的PnP-Cas9细胞导致Cas9诱导的GFP细胞的NHEJ。(E)流式细胞术图显示，在PnP-mRuby-Cas9细胞中，靶向mRuby的gRNA的添加导致几乎所有细胞中mRuby表达的敲除。
图9显示PnP-iAID-mRuby细胞系的产生和选择。(A)显示iSSHM供体盒(在Dox诱导型启动子系统下的GFP-2A-AID构建体)的整合通过Cas9诱导的HDR整合到杂交瘤细胞的Rosa26基因座中。杂交瘤细胞在其重编程IgH基因座中表达mRuby。(B)对表达Cas9的细胞(2A-BFP)进行分选，然后在存在(或对于阴性对照而言不存在)Dox的情况下，对GFP阳性细胞进行单细胞分选并扩增。(C)在来自B的单细胞分选集落中有或没有Dox的GFP表达的表征。
图10显示PnP-iAID-IgG细胞系的产生和选择。(A)显示iSSHM供体盒(在Dox诱导型启动子系统下的GFP-2A-AID构建体)的整合通过Cas9诱导的HDR整合到杂交瘤细胞的ROSA26基因座中。杂交瘤细胞在其重编程IgH基因座中通过sFAB表达IgG。(B)对表达Cas9的细胞(2A-BFP)进行分选，然后在存在(或对于阴性对照而言不存在)Dox的情况下，对GFP阳性细胞进行单细胞分选并扩增。(C)在来自B的单细胞分选集落中有或没有Dox的GFP表达的表征。
图11示出了优化ssODN诱导的HDR和构建具有CDRH3遗传多样性的合成抗体(sAb)文库的一般流程图。(A)A.I：在重链基因基因座中具有CDRH3sgRNA位点的PnP-HEL23sAb构建体在用Cas9载体pX458转染后被Cas9直接切割。Cas9诱导的双链断裂通过导致移码突变和功能失调的蛋白表达的NHEJ在切割位点附近引入插入/缺失(InDel)。分解图中所示的序列是SEQ ID No.17。A.IIa：然后可以通过具有CDRH3密码子重排的供体ssODN启动的HDR恢复抗体表达。A.IIb：通过简并ssODN的HDR并入sAb盒的CDRH3中的额外遗传多样性(NNK随机化)。分选结果：左上：A1上图；右上：A1下图(上图)；左下：A.IIa下图；A.IIb下图。(B)通过用荧光标记的抗原标记经由流式细胞分析估计HDR百分比。显示的百分比是已经恢复了针对HEL的抗原特异性抗体表达的细胞。所呈现的数据代表筛选转染阳性(GFP+)细胞后n＝2实验。1：Cas9质粒；2：Cas9RNP；3：Cas9RNP+修饰的ssODN；4：Cas9细胞+修饰的ssODN。
图12：诱导型AID的突变活性的评价。(a)实验大纲。通过Dox(1μg/ml，每天重新诱导)诱导针对整合TetOne-AID选择(通过GFP-2A)的PnP-mRuby细胞72小时，并针对高(未改变)或低(降低)mRuby荧光对其进行FACS分选。从两个群体中提取基因组DNA(gDNA)，克隆mRuby基因并进行Sanger测序。(b)从左至右显示以下的FACS图：分选时的细胞(所显示的门和百分比不是原始的门和百分比，而是为了说明目的而重新创建的后分析)；恢复后的两个经分选的群体：针对高mRuby表达分选的PnP-mRuby-AID Red-high，和针对降低的mRuby表达分选的PnP-mRuby-AIDRed-low；PnP-mRuby细胞用作阳性对照。分离基因组DNA以用于测序分析。(c)将序列映射到mRuby并研究突变的存在。该图显示了每个样品的突变集落的百分比。“大缺失”指的是大于1个核苷酸的任何缺失。产生具有大缺失的克隆的唯一样品是PnP-mRuby-AID Red-low。柱顶部的值报告了群组中的实际频率(在％转化之前)。(d)在分析的克隆中每kb的突变。对于四个样品/群组中的每一个，对所有分析的克隆的测序核苷酸(仅mRuby ORF，711bp)进行求和，并因此计算每kb的突变核苷酸的频率。值得注意的是，在缺失的情况下，每个缺失的核苷酸被计算为突变的核苷酸。注：在(c)和(d)中报告的数据没有说明单个nt取代的编码或非编码(沉默)结果。
表1.杂交瘤克隆的总结
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表2.gRNA列表
该表中列出的序列(SEQ ID NO 01至SEQ ID NO 18)是指编码各个gRNA的靶向序列的DNA序列。
方法
杂交瘤细胞培养条件
WT杂交瘤细胞系(Wen 1.3)为Annette Oxenius教授(ETH Zürich)惠赠。将所有杂交瘤细胞系在补充有10％热灭活胎牛血清[(FBS),Thermo,10082-147)]、100U/ml青霉素/链霉素(Thermo,15140-122)、2mM谷氨酰胺(Sigma-Aldrich,G7513)、10mM HEPES缓冲液(Thermo,15630-056)和50μM 2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich,M3148)的高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基[(DMEM),Thermo Fisher Scientific(Thermo),11960-044]中培养。将所有杂交瘤细胞在37℃和5％CO2保持在培养箱中。通常将杂交瘤以10ml培养物保持在T-25烧瓶(Thermo，NC-156367)中，并每48/72小时分裂一次。
CRISPR-Cas9靶向构建体的克隆和组装
除非另有说明，CRISPR-Cas9质粒和HDR供体构建体的克隆通过采用GibsonMaster Mix(NEB，E2611S)(Gibson等，Nat Methods 2009，6:343-345)的Gibson组装和克隆来进行。必要时，用KAPA HiFi HotStart Ready Mix[KAPA Biosystems(KAPA)，KK2602]扩增用于Gibson组装克隆的片段。所有的gRNA都从Integrated DNA Technologies(IDT)作为通过标准脱盐纯化的单链5’-磷酸化寡核苷酸获得。CRISPR-Cas9实验的基础依赖于质粒pSpCas9(BB)-2A-GFP(pX458)，其获自Feng Zhang的馈赠(Addgene质粒#48138)(Ran等，Nat Protoc 2013，8：2281-2308)。通过用BPF(TagBFP变体)替换GFP(eGFP变体)产生pX458的替代版本(pX458.2或pSpCas9(BB)-2A-BFP)。为了克隆gRNA，用BbsI[NewEngland BioLabs(NEB)，R0539S]消化两种版本的pX458，将gRNA寡核苷酸用DNA T4连接酶(NEB，M0202S)连接到质粒中。mRuby的基因(mRuby2变体)衍生自质粒pcDNA3-mRuby2，质粒pcDNA3-mRuby2是来自Michael Lin的馈赠(Addgene质粒#40260)(Lam等，Nat Methods2012，9:1005-1012；Jinek等，eLife 2013，2:e00471-e00471)。在获自Genewiz的pUC57(Kan)-HDR质粒中克隆HDR供体(mRuby和抗体构建体)。根据注释的小鼠基因组序列(GRCm38)设计具有同源臂的载体。获得作为合成基因片段(gBlocks，IDT)的2A抗体构建体。HDR供体载体通过PCR用KAPA HiFi HotStart ReadyMix(KAPABiosystems，KK2602)线性化。作为最终纯化步骤，对所有质粒和线性形式的HDR供体以及pX458和pX458-BFP进行乙醇沉淀。
CRISPR-Cas9构建体的杂交瘤转染
用程序CQ-104使用SF细胞系X Kit L(Lonza，V4XC-2024)用4D-NucleofectorTM系统(Lonza)转染杂交瘤细胞。如下制备细胞：分离106个细胞并在90×G离心5分钟，用1ml />I还原血清培养基(Thermo，31985-062)洗涤，并用相同参数再次离心。最后将细胞重悬在100μl总体积的核转染混合物中，其含有在SF缓冲液中稀释的载体(根据试剂盒制造商指南)。对于VH基因座的交换，将5μgpX458(或pX458-BFP)与gRNA-E(靶向VH)或gRNA-J(靶向mRuby)以及5μg环状或线性化的HDR供体构建体核转染到细胞中。对于VL缺失，将各自为5μg的pX458与gRNA-F和gRNA-H共转染到细胞中。转染后，通常在24孔板(Thermo，NC-142475)中的1ml生长培养基中培养细胞。当观察到显著的细胞扩增时，24小时后用0.5ml～1.0ml新鲜生长培养基补充细胞。在分选后，通常在转染后48小时，将细胞回收到24孔板中，并在扩增后逐渐移入6孔板(Thermo，NC-140675)和T-25烧瓶中。用mRuby替换VH后，将细胞在U形底96孔板(Sigma-Aldrich，M0812)中以100μl的回收体积进行单细胞分选。克隆最终在24孔板、6孔板和T-25烧瓶中扩增。
靶向CRISPR-Cas9的基因组和转录物分析
通常从106个细胞中回收杂交瘤细胞系的基因组DNA，通过离心(250×G，5分钟)用PBS洗涤，并重悬在QuickExtractTM DNA提取溶液(Epicentre，QE09050)中。然后将细胞在68℃温育15分钟，95℃温育8分钟。对于转录物分析，从106-5×106细胞中分离总RNA。用试剂(Thermo，15596-026)溶解细胞，并用Direct-zolTMRNA MiniPrep试剂盒(ZymoResearch，R2052)提取总RNA。使用Maxima逆转录酶(Thermo，EP0742)从总RNA进行cDNA合成(Taq DNA聚合酶与/>缓冲液，NEB，M0267S)。基因组DNA和cDNA均用作下游PCR反应的模板。
靶向WT IgH和IgK基因座的gRNA以及mRuby最初通过30次NHEJ诱导来测试它们的活性。用KAPA2G Fast ReadyMix(KAPA，KK5121)对靶向片段通过PCR进行扩增，并用Surveyor核酸酶消化PCR产物以检测错配(突变检测试剂盒，IDT，706020)。对于HDR评价，使用在同源臂内部和外部结合的引物对基因组和cDNA进行PCR，然后在DNA琼脂糖凝胶上进行片段大小分析。对选择的PCR产物进行Sanger测序。
流式细胞仪分析和分选杂交瘤
分别使用BD LSR FortessaTM和BD FACS AriaTM III(BD Biosciences)进行基于流式细胞术的分析和细胞分离。在转染后24小时，收获约100μl细胞，以250×G离心5分钟，重悬在PBS中并分析Cas9的表达(通过2A-GFP/-BFP)。转染后48小时，收获所有转染的细胞并将其重悬在Sorting Buffer(SB)中：补充有2mM EDTA和0.1％BSA的PBS。当需要标记时，用PBS洗涤细胞，在冰上与标记抗体或抗原温育30分钟，避光，再次用PBS洗涤并分析或分选。标记试剂和工作浓度描述于下表3中。对于不同于106的细胞数目，按比例调整抗体/抗原和温育体积。
表3.流式细胞术标记试剂及其工作浓度
抗体分泌的ELISA测定
用夹心ELISA法测定来自杂交瘤细胞的IgG分泌。用在PBS(Thermo，10010-015)中浓度为4μg/ml的对Vk轻链具有特异性的捕获多克隆抗体(山羊抗小鼠，JacksonImmunoResearch，115-005-174)包被板。然后用补充有2％w/v牛奶(AppliChem，A0830)和0.05％v/v(AppliChem，A1389)的PBS(PBSMT)封闭板。然后将来自细胞培养物的上清液(106个细胞/样品，体积标准化至最低浓度的样品)在补充有2％w/v牛奶的PBS(PBSM)中连续稀释(比例为1:3)。作为阳性对照，使用纯化的小鼠IgG2b，κ同种型对照(BioLegend，401202)，起始浓度为5ng/μl(在杂交瘤生长培养基中稀释)，并如上清液连续稀释。封闭后，上清液和阳性对照在RT或在4℃于O/N温育1小时，随后进行采用补充有TWEEN-20 0.05％v/v的PBS(PBST)的3次洗涤步骤。使用在PBSM中浓度为1.7μg/ml的对小鼠Fc区特异的HRP缀合二抗(山羊抗小鼠，Sigma-Aldrich，A2554)，然后用PBST进行3次洗涤步骤。使用1-StepTM Ultra TMB-ELISA底物溶液(Thermo，34028)作为HRP底物进行ELISA检测。用/>200PRO NanoQuant(Tecan)读取450nm处的吸光度。对于抗原特异性测量，用在PBS中浓度为4μg/ml的纯化的鸡蛋溶菌酶(Sigma-Aldrich，62971-10G-F)包被板。类似于前述方法进行封闭、洗涤和上清培养步骤，不同之处在于以1:5的比例连续稀释上清液。使用浓度为0.7μg/ml的对Vk轻链特异的HRP-缀合二抗(大鼠抗小鼠，Abcam，AB99617)。如前所述进行通过HRP底物的ELISA检测和吸光度读数。
靶向ROSA26基因座
从Wen1.3细胞扩增小鼠安全港基因座ROSA26并进行Sanger测序，并将获得的序列用于设计DNA盒同源臂。引导RNA靶序列(gRNA-L至gRNA-P)通过Surveryor测定单独验证(图7)。该基因座被靶向用于创建PnP-mRuby-AID、PnP-IgG-AID和PnP-mRuby-Cas9细胞系。
针对在创建PnP-mRuby-AID和PnP-mRuby-Cas9细胞系时的ROSA26的靶向，因其高切割效率而选择gRNA-O和gRNA-P。
AID细胞系的产生和通过强力霉素的诱导
以三个步骤进行用于诱导型AID(iSSHM)系统的供体盒的克隆。(1)Tet-OneTM诱导型表达系统购自Takara Clontech(634301)；获得GFP-2A-AID作为合成基因片段(gBlocks，IDT)，并通过Gibson组装克隆将其克隆到pTetOne载体中。(2)通过基因组DNA PCR获得杂交瘤ROSA26基因座的同源臂(829bp和821bp)，并将其克隆到pUC57(Kan)质粒中。(3)最后，将先前克隆的(见第(1)条)Tet-One-GFP-2A-AID构建体(其包含：在正向：人磷酸甘油酯激酶1启动子(hPGK)、Tet-On 3G反式激活蛋白和SV40poly-A信号；在反向：PTRE3GS诱导型启动子、GFP-2A-AID构建体和SV40poly-A信号)通过Gibson组装克隆插入同源臂之间。通过用酶AjuI(Thermo，ER1951)限制性消化的PCR将HDR供体线性化。获得gRNA-O并如前所述在pX458-BFP中克隆。作为另选的NHEJ插入设计，将TetOne-GFP-2A-AID构建体线性化而没有同源臂。为引入TetOne-iSSHM系统而工程化改造的细胞系是：PnP-mRuby-pA(具有bGHpoly-A尾部的PnP-mRuby)；PnP-HEL23-IgH-(在HCDR3敲除抗体表达中具有移码插入的PnP-HEL23——参见后续小节)。对于这些细胞的流程如图9和10所示。
a.细胞系的产生
从转染阶段起，将细胞保持在无Tet的GM中：补充有Tet System Approved FBS的常规生长培养基，US源(Takara Clontech，631105)。用约2.5μg具有gRNA-O的px458-BFP和2.5μg线性化的pTetOne-HDR供体转染PnP-HEL23-IgH-和PnP-mRuby-pA细胞(见前面小节)。转染48小时后，将细胞针对BFP进行分选并使其生长用于回收。一旦回收，进行诱导实验以验证系统的功能性：将强力霉素(TakaraClontech，631311)以1mg/ml溶解在无核酸酶H2O中，无菌过滤并在需要时在即刻使用前在无Tet GM中稀释。测试了1ng/ml至2μg/ml范围内的浓度，其中1μg/ml被证明是最有效的。通过在37℃温育24或48小时诱导细胞；然而，24小时温育得到最好的结果，并且被选择作为检查阳性整合和诱导效率的主要条件。
诱导24小时后分选细胞：从GFP阳性群体中分离、生长和表征单细胞克隆。进行初始筛选以选择在Dox诱导后最阳性克隆：每个样品以1μg Dox/105细胞/1ml培养物接种，并在24小时后针对GFP筛选。
将来自初始筛选步骤的表现最佳的克隆(对于PnP-HEL23-IgH-为9，对于PnP-mRuby-pA为4)用于基因组DNA提取、基因座特异性扩增和Sanger测序。根据基因组序列，为每个细胞系选择一个最终克隆。
b.诱导优化
在为每个转染的细胞系选择最佳克隆之后，以500ng/ml至1.5μg/ml的浓度进行第二次和更严格的滴定，并在不同的时间点测量诱导(理想的是：24小时；48小时；72小时；96小时。由于强力霉素的半衰期为24小时，按照制造商(Clontech)的建议，每48小时在培养物中更换一次。
对于每个时间点，通过以下方法评估诱导：
●FACS分析(GFP)
●RT-PCR(mRNA/cDNA)
●Western印迹
用HiFi HotStart Ready Mix从cDNA扩增AID。对于Western印迹，使用补充有HaltTM蛋白酶抑制剂混合液(Thermo，78430)的M-PERTM哺乳动物蛋白提取试剂(Thermo，78501)来从培养的杂交瘤(通常106个细胞)获得裂解物。使用纯化的抗人/小鼠活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)(eBioscience，14-5959-80)作为用于经由WB进行AID检测的一抗。
c.iSSHM(AID活性)评估
对于PnP-mRuby-pA-AID细胞系，首先通过FACS分析和对mRuby荧光降低的检测来评估超突变活性。为了更彻底地评估，从cDNA中扩增mRuby基因，并使用分子扩增指纹法通过Sanger或下一代测序(NGS)分析(图12)。
对于PnP-HEL23-IgH--AID细胞系，使用抗IgG2C和抗IgK(通过随机突变产生的任何阳性)和HEL-647(重新获得的HEL阳性)标记细胞后(参见之前章节)，通过流式细胞术评价恢复的抗体表达和/或抗原特异性。
为了更明确地评估和优化系统，对于表达功能性抗体的细胞系(由两个起始平台中的任一个获得)重复进行iSSHM流程。为了达到这种境况，转染PnP-mRuby-pA细胞以用sAb供体交换mRuby；转染PnP-HEL23-IgH--AID细胞以将敲除的HEL23sAb更换为具有相同或另一种特异性的功能性HEL23sAb；在另选的设置中，用含有原始HCDR3的密码子突变版本的120ssODN通过HDR恢复HEL23框架。在没有先前测试的结合物的情况下，通常选择具有已知和可测试的抗原的抗体来评估亲和成熟。
一旦获得PnP-sAb-AID细胞系，如前面描述的那样诱导AID(ON)。诱导48至96小时后，将强力霉素从系统中收回(OFF)。为了评估亲和成熟，如前所述进行FACS标记，但抗原浓度降低(通常为1μg/ml至0.001μg/ml，每一轮分析/亲和成熟循环降低10倍)。对阳性细胞进行分选并进行进一步的iSSHM循环；根据需要重复该循环。对于亲和力成熟的每个阶段，在从系统中收回强力霉素之后，通过FACS监测GFP荧光来评估有效开关OFF。一旦处于OFF状态，就从cDNA扩增VL和VH区，并且使用分子扩增指纹法通过NGS评价iSSHM。
PnP-mRuby2-Cas9细胞系的产生
以三个步骤进行用于组成型表达Cas9蛋白的供体盒的克隆。(1)从Addgene(分别为质粒#48139、#11375)获得pSpCas9(BB)-2A-Puro载体(pX459)和MDH1-PGK-GFP_2.0载体。通过PCR(KAPA HiFi HotStart ReadyMix)从其对应载体获得Cas9-2A-Puro和GFP基因片段，并用Gibson组装克隆组装在一起。(2)通过基因组DNA PCR获得杂交瘤的ROSA26基因座的同源臂(1,000bp和976bp)，并通过Gibson组装克隆与pUC57(Kan)质粒骨架组装。(3)最后，将先前组装的片段(见第(1)和(2)点)通过Gibson组装克隆组装。HDR供体通过用XhoI和MluI限制性核酸内切酶限制性消化然后凝胶电泳纯化而线性化。如前所述在pX458(BFP)中克隆gRNA-P。对于另选的NHEJ插入设计，将Cas9-2A-Puro-GFP构建体线性化而没有同源臂。
用Cas9-2A-Puro-GFP供体转染后，分选并扩增GFP+细胞。然后在单细胞分离、生长和PCR表征之前，通过在补充有2.5μg/mL的嘌呤霉素(Thermo，A1113802)的常规生长培养基中培养至多一周来选择细胞以稳定整合供体构建体。在鉴定具有正确整合的Cas9-2A-Puro-GFP盒的单个克隆之后，通过转染靶向GFP的引导RNA来验证细胞内的Cas9活性。Cas9切割活性通过T7E1测定和PCR扩增子的Sanger测序来验证(图8)。通过流式细胞术确认GFP敲除有效性。
经工程化用于组成型Cas9表达的细胞系为：PnP-mRuby-pA；PnP-HEL23-IgH-。设计了更全面的细胞系以整合组成型Cas9和诱导型AID两者；由于构建体与ROSA26基因座的两个不同区域具有同源性，因此可以将它们如图8A所示串联结合。这允许将通过组成式表达Cas9实现的高HDR效率与iSSHM流程合并。
Cas9细胞-引导RNA或合成寡核苷酸(IDT)的体外转录
用10个合适的HDR供体和已经转录的引导RNA转染组成型表达Cas9的PnP-mRuby-Cas9细胞系。上述引导RNA作为来自IDT的寡核苷酸或经体外转录获得。在体外转录的情况下，前文所述的引导DNA寡脱氧核苷酸(参见CRISPR-Cas9靶向构建体的克隆和组装一节)充当T7转录试剂盒(Thermo，AM1334)的模板。修改的规程如上文所述(https://www.protocols.io/view/In-vitro-transcription-of-guide-RNAs-d4w8xd？step＝3，2017年2月21日访问)。/>

Claims (15)

1.一种用于产生哺乳动物B细胞系的方法，其包括以下步骤：
a.提供多个哺乳动物B细胞，其中所述多个哺乳动物B细胞中的每一个包含编码标志物蛋白并且含有两个对应于内源性IgH基因座的同源臂的转基因基因组DNA序列，其中使用CRISPR-相关核酸内切酶(Cas9)系统将所述转基因基因组DNA序列插入到包含在所述多个哺乳动物B细胞的每一个中的内源性IgH免疫球蛋白基因座中，并且其中所述转基因基因组DNA序列包含引导RNA靶位点；
b.用编码目标蛋白或其变体的转基因DNA序列替换编码所述标志物蛋白的所述转基因基因组DNA序列，其中通过CRISPR-相关核酸内切酶Cas9介导的位点定向DNA切割，和随后通过同源定向修复(HDR)或非同源末端连接(NHEJ)进行的所述转基因DNA序列的整合，从而介导所述转基因基因组DNA序列的所述替换；
c.基于所述标志物蛋白的存在或不存在来分选所述多个哺乳动物B细胞；和
d.选择和收集其中不存在所述标志物蛋白的哺乳动物B细胞，
其中所述标志物蛋白、所述目标蛋白或其变体对于哺乳动物B细胞而言不是内源性的。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个哺乳动物B细胞选自包含原代B细胞、永生化B细胞、杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞、浆细胞瘤细胞和淋巴瘤细胞的组。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述标志物蛋白或所述目标蛋白在内源性免疫球蛋白启动子的控制下表达。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述标志物蛋白或所述目标蛋白在VH启动子的控制下表达。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述多个哺乳动物B细胞中的每一个中，内源性VH基因和内源性VL基因被破坏。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多个哺乳动物B细胞经遗传修饰以组成型表达所述CRISPR相关核酸内切酶(Cas9)。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述多个哺乳动物B细胞包含安全港基因座，并且其中包含编码所述CRISPR相关核酸内切酶的DNA序列的第一表达盒插入到所述安全港基因座中。
8.根据权利要求1或7所述的方法，其中所述多个哺乳动物B细胞经遗传修饰而以可诱导和可滴定的方式表达活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述多个哺乳动物B细胞包含安全港基因座，并且其中包含编码所述活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)的DNA序列的第二表达盒插入到所述安全港基因座中。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述目标蛋白是全长抗体。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述目标蛋白是包含合成抗原结合片段(sFAb)构建体的全长抗体。
12.一种产生目标蛋白变体文库的方法，其包括根据前述权利要求中任一项的方法，随后进行以下额外步骤：用随机化核酸序列通过供体dsDNA或ssDNA上的随机化区域修饰编码所述目标蛋白的所述转基因DNA序列。
13.一种产生目标蛋白变体文库的方法，其包括根据前述权利要求7至12中任一项所述的方法，随后进行以下额外步骤：诱导活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)的表达，从而通过诱导型合成体细胞超突变(iSSHM)在编码所述目标蛋白的所述转基因DNA内产生多种基因组突变。
14.根据权利要求1、2、12或13所述的方法，其中所述标志物蛋白是荧光蛋白。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中每个变体在其氨基酸序列的一个至五个位置上与另一变体不同，并且其中每个变体与由所述多个哺乳动物B细胞的成员编码的任何另一变体具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性。
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