CN104640985A - 特异结合性或功能性蛋白的转座介导鉴定 - Google Patents

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Abstract

在此公开的方法描述了一种前所未有地高效、灵活、实用和高速的用于探索和优化具有期望的结合特异性和/或功能性的多肽(包括抗原结合分子，例如抗体及其片段)以获得期望的功能性和/或结合性表型的新型科技。该新方法基于：转座结构和克隆入转座载体的多样化DNA文库，及其通过功能性转座酶的共同瞬态表达对宿主细胞进行转染。这保证了高效稳定地将基于转座子的表达载体一步引入脊椎动物宿主细胞，随后筛选所述细胞中表达的蛋白的期望功能性或结合性表型，然后可以通过标准的克隆和DNA测序技术，鉴定所述表达蛋白的相关编码序列，包括抗体及其片段。

Description

特异结合性或功能性蛋白的转座介导鉴定
背景技术
技术领域
(a)用于鉴定特定功能性和结合性蛋白的技术
目标特异性蛋白的发现，包括抗体及其片段，带来了巨大的商业利益，这是因为选择高选择性功能蛋白或结合蛋白，包括抗体及其片段，有极高潜力可用于开发具有新治疗性质的新生物实体(NBEs)，所述生物实体可以极高特异性融入或干涉生物过程，从而据预测比传统新化学实体(NCEs)的副作用要低。基于此，尤其是对高目标特异性的治疗性抗体和基于抗体的治疗剂的发展，为效力提高的全新疗法铺平了道路。由此一来，在过去的十年中，治疗性单克隆抗体成为了新药开发中增长速度最快的部分，且目前产生的全球总收入为约500亿美元，是全球药物制品市场中的重要组成部分。
因此，迫切需要能够发现药效强且又耐受良好的治疗性蛋白、尤其是基于抗体的药物的新型高效技术。
为了识别具有期望功能性特异结合性质的蛋白，例如对于抗体而言，需要生成、功能性表达并筛选大型多样化蛋白质集合或文库，包括抗体及其片段，以获得期望的功能性质或靶向结合特异性。过去的20年间，发展出了许多技术，用于在宿主细胞或病毒和噬菌体颗粒中表达多样化蛋白文库，以及用于该文库的高通量筛选和/或盘选以获得期望功能性质或结合表型的方法。
用于识别目标特异性结合剂或具有期望功能性质的蛋白的最新标准技术包括，例如噬菌体展示、反转录病毒展示、酵母菌展示和各种哺乳动物细胞展示技术，并结合固体表面结合(盘选)和/或其他富集技术。所有这些技术都包含在各种专利和审查中的专利申请中。
虽然噬菌体和原核展示系统已经建立并广泛运用于生物技术产业和学术界中，用于鉴定目标特异性结合剂，包括抗体片段(Hoogenboom,NatureBiotechnology 23,1105-1116(2005))，但其具有多种缺陷，包括无法表达较大蛋白的全长(包括全长抗体)、缺乏适当的转录后修饰、缺乏脊椎动物分子伴侣的适当折叠，以及，对于抗体而言，人为进行的重链和轻链组合。因此，对于所述方法的抗体探索而言，要求“重组”为全长抗体并进行哺乳类细胞表达。由于上述缺陷的存在，这往往造成抗体中的不良生物物理性质(例如，低稳定性、聚集倾向、亲和性弱化)，限制了所述蛋白在医疗和诊断上的应用潜力。一方面，这导致所述方法开发生成的先导分子具有显著的损耗率，另一方面，要求耗费大量精力来修正蛋白的生物物理和分子性质，才能用于进一步的下游药物开发。
因此，已经使用低等真核细胞(例如酵母菌)开发蛋白质和抗体探索技术，且最近还使用了哺乳动物细胞表达体系来鉴定具有期望性质的蛋白，因为这些技术允许(i)表达较大的全长蛋白，包括全长抗体；(ii)更好或正常地进行翻译后修饰；以及(iii)对于抗体而言，进行适当的轻链-重链配对(Beerli&Rader,mAbs 2,365-378(2010))。综合来说，这用于选择在药物开发和治疗用途中潜力更高的具有优秀生物物理性质的蛋白质。
蛋白在脊椎动物细胞中的表达和筛选是最期望实现的，这是因为脊椎动物细胞(例如仓鼠CHO、人HEK-293或鸡DT40细胞)是生产较大医疗蛋白(例如抗体)的优选表达体系，但虽然如此，所述技术目前具有许多缺陷，使其在学术和工业应用中进展缓慢。
首先，脊椎动物细胞并不能像例如原核细胞或低等真核细胞(如酵母菌)一样被高效稳定地基因改造。因此，仍很难生成足够多样化(复杂)的基于脊椎动物细胞的蛋白质文库，并从中鉴定具有期望性质或最高结合亲和性的备选蛋白。其次，为了高效分离具有期望性质的蛋白，通常需要重复进行细胞富集。脊椎动物的表达，要么通过质粒瞬态转染(Higuchi et alJ.Immunol.Methods 202,193-204(1997))，要么通过瞬态病毒表达系统(例如辛德毕斯病毒或牛痘病毒(Beerli et al.PNAS 105,14336-14341(2008)和WO02102885))，并不允许进行所需的多轮细胞选择以对高特异性蛋白进行高效富集，因此，所述方法要么限于筛选预先富集的小型蛋白文库，或需要进行枯燥的病毒分离/细胞再感染循环。
为了获得结合蛋白和抗体在脊椎动物细胞中的稳定表达，从而允许基于稳定基因型-表型对应的多轮选择，开发出了使用重组酶(flp/frt重组酶体系，Zhouet al.mAbs 5,508-518(2010))，即反转录病毒载体(WO2009109368)。但是，该flp/frt重组对将基因稳定整合入脊椎动物宿主细胞而言是一种低效体系，因此仅能用于小型的预定文库，或选定蛋白或备选抗体的优化。
与flp/frt重组酶体系相比，反转录病毒载体能够更有效率地对脊椎动物宿主细胞进行稳定的基因改造并生成更加复杂的细胞文库。但是，(i)其受限于选定的获准细胞系；(ii)当使用人类细胞时，其带来生物安全性风险；(iii)由于反转录的低保真性，反转录病毒表达载体可能导致文库序列的不良致突变；(iv)由于载体包装如反转录病毒颗粒前的反转录病毒基因组剪接，反转录病毒载体不允许整合基因表达组件和完整内含子/外显子结构；(v)病毒基因组包装期间，反转录病毒可能导致文库序列不受控制的不良同源重组；(vi)可能受到反转录病毒沉默；以及(vii)枯燥的两步法包装-细胞转染/宿主细胞感染过程。所有这些缺陷都是重大挑战和局限，并给基于反转录病毒载体的方法在产生用于有效目标特异性蛋白或抗体探索方面的高质量/高复杂性的哺乳动物细胞文库带来了巨大的复杂性。
因此，显然需要一种更加有效率、可控制、简单易行的技术，用于生成表达蛋白(包括抗体及其片段)多样化文库的基于脊椎动物细胞的高质量、高复杂性的文库，从而从所述蛋白质文库中能够分离出具有高特异性功能和/或结合性质和高亲和性的蛋白质。
(b)转座酶/转座
转座子，或称转座因子(TEs)是能够稳定整合到宿主细胞基因组中的遗传因子，该过程称为转座(Ivics et al.Mobile DNA 1,25(2010)，在此以引用方式全文引入本申请)。Barbara McClintock在1950年代就已经在玉米基因研究中假设了TEs的存在，但转座的第一个功能模型(对细菌TEs)在1970年代末才在建立起来(Shapiro,PNAS 76,1933-1937(1979)，在此以引用方式全文引入本申请)。
同时，已知TEs存在于每个生物体的基因组汇总，且基因组测序已经揭示，人类基因组中约45％是源于转座子(国际人类基因组测序协会Nature 409:860-921(2001)，在此以引用方式全文引入本申请)。但是，与已识别出功能性(或自主性)TEs的无脊椎动物(图1a)相反，人和其他高等脊椎动物并不具有功能性TEs。据假设，进化选择压力淘汰了TEs的致突变潜力，进化在数百万年前就导致了TEs的功能失活。
自主TEs包括在2条末端反向重复序列(ITRs)之间编码转座酶的DNA，能被编码在ITRs之间的转座酶识别并催化TE转座进入任何双链DNA序列(图1a)。存在两种不同的转座子类型：I类，即反转录转座子，其通过RNA中间体和“复制-粘贴”机制进行移动(图2b)；以及II类，即DNA转座子，其通过剪切-整合，即“剪切-粘贴”机制进行移动(图2a)(Ivics et al.Nat.Methods 6,415-422(2009)，在此以引用方式全文引入本申请)。
细菌、低等真核生物(例如酵母菌)和无脊椎动物的转座子在很大程度上具有物种特异性，无法在脊椎动物细胞中进行有效的DNA转座。在通过序列改组对鱼类的失活TEs进行人工重建之后，才获得了第一个活性转座子(因此被称为“Sleeping Beauty(睡美人)”(Ivics et al.Cell 91,501-510(1997)，在此以引用方式全文引入本申请)。同时，还从不同物种中识别或重建了其他的功能性转座子，包括果蝇、青蛙及甚至人类基因组，所有这些转座子均能允许DNA转座进入脊椎动物和人类宿主细胞基因组(图3)。对于转座效率、表达稳定性、基因负载能力等方面而言，每个所述转座子均有利有弊。
到目前为止，现有技术中尚未公开过用于分离目标特异性、功能性结合蛋白(包括抗体和其片段)的转座子介导的脊椎动物宿主细胞蛋白(包括抗体及其片段)多样化文库表达技术。
发明内容
本发明的方法描述了一种前所未有地高效、灵活、实用和高速的用于探索和优化具有期望的结合特异性和/或功能性的多肽(包括抗原结合分子，例如抗体及其片段)以获得期望的功能性和/或结合性表型的新型科技。该新方法基于：转座结构和克隆入转座载体的多样化DNA文库，及其通过功能性转座酶的共同瞬态表达对宿主细胞进行转染。这保证了高效稳定地将基于转座子的表达载体一步引入脊椎动物宿主细胞，随后筛选所述细胞中表达的蛋白的期望功能性或结合性表型，然后可以通过标准的克隆和DNA测序技术，鉴定所述表达蛋白的相关编码序列，包括抗体及其片段。
在其中一个实施例中，本发明指向一种用于识别具有期望的结合特异性或功能性的多肽的方法，包括以下步骤：
(i)生成多核苷酸的多样化集合，优选为质粒载体或双链DNA PCR扩增子，所述多核苷酸编码具有不同结合特异性或功能性的多肽，其中所述多核苷酸包含编码位于第一和第二末端反向重复序列之间的多肽的序列，且所述第一和第二末端反向重复序列被至少一种转座酶识别并作用；
(ii)将(i)所述的多核苷酸的多样化集合引入宿主细胞中；
(iii)在所述宿主细胞中表达至少一种作用于所述末端反向重复序列的转座酶，从而令所述多样化多核苷酸集合被整合入所述宿主细胞基因组，以提供表达所述编码具有不同结合特异性或功能性的多肽的多样化多核苷酸集合的宿主细胞群；
(iv)筛选所述宿主细胞，以识别表达具有期望结合特异性或功能性的多肽的宿主细胞；以及
(v)从所述宿主细胞分离编码所述多肽的多核苷酸序列。
在优选实施例中，所述多核苷酸为DNA分子。在一个实施例中，所述多样化多核苷酸集合包括受体的配体结合序列，或结合分子的靶向结合序列。在优选实施例中，所述多核苷酸包括编码抗原结合分子(例如抗体VH或VL域，或其抗原结合片段，或全长抗体轻链或重链(即包含恒定区))的序列。在某些实施例中，所述多核苷酸可以包括编码VH区和VL区、或抗体重链和轻链的序列。在另一个实施例中，所述多核苷酸包含编码单链Fv或Fab域的序列。
在一个实施例中，所述多核苷酸多样化集合是通过在致突变条件下对V区基因序列进行PCR生成的，例如通过对来自脊椎动物B细胞的V区域细胞库进行PCR扩增。在另一个实施例中，所述多核苷酸多样化集合是通过基因合成生成(例如，通过对编码具有已知结合特异性和/或功能性的多肽的序列进行随机化)。在一个应用实施例中，所述多核苷酸的多样化集合包括质粒载体。在另一个应用实施例中，所述多样化多核苷酸集合包括双链DNA PCR扩增子。所述质粒载体可以包括编码标记基因的序列，例如荧光标记、细胞表面标记或选择性标记。所述标记基因序列可以位于编码具有结合特异性或功能性的多肽的序列的上游或下游，但位于末端反向重复序列之间。可选地，所述标记基因序列可以位于所述编码具有结合特异性或功能性的多肽的序列的下游并由内部核糖体进入位点隔开。
在一些实施例中，所述多核苷酸多样化集合编码多个脊椎动物抗原结合分子，例如哺乳动物，如人。
在一个实施例中，所述方法步骤(ii)包括向宿主细胞中引入含有编码免疫球蛋白VH或VL区、或其抗原结合片段的序列的多核苷酸，且其中所述VH和VL区序列分开编码在不同载体上。在又一个实施例中，本发明的方法步骤(ii)包括向宿主细胞中引入编码全长免疫球蛋白轻链或重链、或其抗原结合片段的多核苷酸，其中所述全长重链或轻链在同一载体上引入宿主细胞。当VH和VL区序列或全长抗体重链和轻链序列在不同载体上引入宿主细胞时，每个载体上的末端反向重复序列均可被不同转座酶识别并作用。
所述宿主细胞优选为脊椎动物细胞，优选为哺乳动物细胞，例如啮齿类或人细胞。淋巴细胞，例如B细胞，尤为有用。B细胞可以是B祖细胞或B前体细胞，例如阿贝尔森鼠白血病转化的B祖细胞或B前体细胞，以及早期免疫球蛋白无效EBV转化人B祖细胞和B前体细胞。其他有用的宿主细胞包括B细胞系，例如Sp2/0细胞系、NS0细胞系、X63细胞系和Ag8653细胞系，或常见哺乳动物细胞系，例如CHO细胞系、Per.C6细胞系、BHK细胞系和293细胞系。
本发明的方法的一个实施例中，所述表达步骤(iii)包括，向所述宿主细胞中引入编码能够识别并作用于多核苷酸中至少一个末端反向重复序列的转座酶的表达载体。所述编码转座酶的载体可以在所述多样化多核苷酸集合同时、之前或之后引入宿主细胞中。在一个实施例中，所述转座酶在所述宿主细胞中瞬态表达。可选地，所述表达步骤(iii)可以包括：对稳定整合在宿主细胞基因组中且可诱导的表达体系(例如，可用四环素或三苯氧胺诱导的体系)进行诱导。在一个优选实施例中，所述步骤(iii)包括在宿主细胞(群)中表达包括功能性Sleeping Beauty转座酶或功能性PiggyBac转座酶的载体。在一个可用实施例中，步骤(iii)包括在所述宿主细胞中表达包含SEQ ID NO:11的载体。在另一个可用实施例中，所述载体编码SEQ ID NO:12，或具有95％氨基酸序列一致性并具有相同或相似末端反向重复序列特异性的序列。
在另一个可用实施例中，步骤(iii)包括在所述宿主细胞中表达包含SEQ IDNO:17的载体。在另一个可用实施例中，所述载体编码SEQ ID NO:18，或具有95％氨基酸序列一致性并具有相同或相似末端反向重复序列特异性的序列。
在本发明的方法的一个实施例中，所述筛选步骤(iv)包含磁性激活细胞分选(MACS)、荧光激活细胞分选(FACS)、盘选固定于固体表面的分子、对与并入天然或人工重建的细胞磷脂双层膜的细胞膜相关分子的结合的选择，或以多孔形式对个体细胞克隆进行期望功能或结合性表型的高通量筛选。在一个实施例中，所述筛选步骤(iv)包括：筛选鉴定具有期望靶向结合特异性或功能性的多肽。在一个优选实施例中，所述筛选步骤(iv)包括：筛选鉴定具有期望的抗原特异性的抗原结合分子。在一个有用实施例中，所述筛选步骤进一步包括：筛选鉴定具有一个或多个期望功能性质的抗原结合分子。所述筛选步骤(iv)可以包括多个细胞富集循环，在所述细胞富集循环之间进行宿主细胞扩增。
在本发明的方法的一个实施例中，所述步骤(v)中所述从所述宿主细胞分离编码具有期望的结合特异性或功能性的多肽的多核苷酸序列，包括基因组扩增或RT-PCR扩增或下一代深度测序。在一个有用实施例中，所述步骤(v)中分离得到的多核苷酸序列进行亲和性优化。这可以通过在致突变条件下对分离的多核苷酸序列进行PCR或PT-PCR来达成。在又一个可用实施例中，所述致突变序列随后进一步经过本发明的方法的步骤(i)-(v)。在一个优选实施例中，所述步骤(v)中得到的所述多核苷酸序列包括编码抗体VH或VL区的序列，或其抗原结合片段，且其中所述抗体优化包括：将一个或多个突变引入所述VH或VL区的互补决定区或骨架区中。
在一个可用实施例中，所述末端反向重复序列来自PiggyBac转座子体系，并可由PiggyBac转座酶识别并作用。在一个实施例中，所述编码上游PiggyBac末端反向重复序列的序列包含SEQ ID NO:1。在另一个实施例中，所述编码下游PiggyBac末端反向重复序列的序列包含SEQ ID NO:2。
在另一个可用实施例中，所述末端反向重复序列来自Sleeping Beauty转座子体系，并可由Sleeping Beauty转座酶识别并作用。在一个实施例中，所述编码上游Sleeping Beauty末端反向重复序列的序列包含SEQ ID NO:14。在另一个实施例中，所述编码下游Sleeping Beauty末端反向重复序列的序列包含SEQ IDNO:15。
本发明的一个实施例中，所述多核苷酸包括编码来自人抗TNFα抗体的序列的VH或VL区序列。在一个实施例中，所述抗TNFα抗体为D2E7。
在一个可用实施例中，步骤(iii)包括向所述宿主细胞中引入包含编码功能性PiggyBac转座酶的序列的载体。在一个实施例中，所述载体包括SEQ IDNO:11。在另一个实施例中，所述载体编码SEQ ID NO:12，或具有95％氨基酸序列一致性并具有相同或相似末端反向重复序列特异性的序列。
在另一个可用实施例中，所述步骤(iii)包括：在所述宿主细胞中表达包含SEQ ID NO:17的载体。在另一个可用实施例中，所述载体编码SEQ ID NO:18，或具有95％氨基酸序列一致性并具有相同或相似末端反向重复序列特异性的序列。
在一个优选实施例中，所述末端反向重复序列被以下至少一个转座酶识别并对其有功能：PiggyBac、Sleeping Beauty、Frog Prince、Himar1、Passport、Minos、hAT、Tol1、Tol2、Ac/Ds、PIF、Harbinger、Harbinger3-DR和Hsmar1。
本发明进一步指向一种编码具有不同结合特异性或功能性的多肽的多核苷酸分子文库，包括：多个多核苷酸分子，优选为质粒或双链DNA PCR扩增子，其中所述多核苷酸分子包含编码具有结合特异性或功能性且位于末端反向重复序列之间的多肽的序列，所述末端反向重复序列可被至少一个转座酶识别和起作用。优选地，所述多核苷酸是DNA分子，并包括受体的配体结合序列或结合性分子的靶向结合序列。在一个特别优选的实施例中，所述文库包括多核苷酸，其中每个多核苷酸包括编码抗体的抗原结合序列的序列。在一个实施例中，所述文库包括编码抗体的VH或VL区或其抗原结合片段的多核苷酸。可选地，所述多核苷酸可以编码VH和VL区。在一个优选实施例中，所述文库的多核苷酸包括编码全长抗体重链或轻链的序列(即，包括恒定区)或其抗原结合片段。可选地，所述多核苷酸可以编码全长免疫球蛋白重链和轻链。在其他实施例中，所述文库的多核苷酸包括编码单链Fv或Fab域的序列。在优选实施例中，所述文库的多核苷酸的形式为质粒或双链DNA PCR扩增子。在某些实施例中，所述文库的质粒包括标记基因。在另外的实施例中，所述质粒包括编码能够识别并作用于末端反向重复序列的转座酶的序列。在另一个实施例中，本发明的所述文库包括编码包含抗体重链天然内含子/外显子结构的全长免疫球蛋白重链的多核苷酸。所述全长免疫球蛋白重链可以包含内源膜锚定域。
本发明还指向一种用于生成编码具有不同结合特异性或功能性的多肽的可转座多核苷酸的方法，包括：生成包含编码具有不同结合特异性或功能性的多肽的序列的多核苷酸的多样化集合，其中所述多核苷酸包含编码具有结合特异性或功能性并位于末端反向重复序列之间的多肽的序列，所述末端反向重复序列可被至少一个转座酶识别并作用。
本发明还指向一种包含编码抗体的VH或VL区、或其抗原结合部分的序列的载体，所述序列位于末端反向重复序列之间并可被至少一个转座酶识别并作用。在某些实施例中，所述载体编码免疫球蛋白的全长重链或轻链。优选地，所述编码VH或VL区或重链或轻链的序列，是由例如致突变条件下的PCR扩增，或基因合成，所生成的随机化序列。在一个实施例中，所述载体包含可由PiggyBac转座酶识别并作用的末端反向重复序列。在另一个实施例中。所述末端反向重复序列可由Sleeping Beauty转座酶识别并起作用。在一个实施例中，所述载体包含来自抗TNFα抗体，例如D2E7的VH或VL区序列。在某些实施例中，所述载体包含至少一个选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、and SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40和SEQ ID NO:41的序列。
本发明还指向包含本发明的上述载体的宿主细胞。在优选实施例中，所述宿主细胞进一步包括含有编码转座酶的序列的表达载体，所述转座酶识别并作用于编码所述VH和VL区序列的载体中的至少一个末端反向重复序列。
本发明还进一步指向包含权利要求1的方法制得的抗原结合分子，例如抗体。
本发明还指向一种用于生成能够表达具有不同结合特异性或功能性的多肽的宿主细胞群的方法，包括：
(i)生成多核苷酸的多样化集合，其中所述多核苷酸包含编码具有不同结合特异性或功能性的多肽的序列，其中所述多核苷酸包含一种编码具有结合特异性或功能性的多肽的序列，该序列位于末端反向重复序列之间，所述末端反向重复序列被至少一种转座酶识别并作用；
(ii)将所述多核苷酸的多样化集合引入宿主细胞中。
附图说明
图1：a)本图展示了能转座或“跳跃”到任何目标DNA序列中的自主转座因子(TE)的结构。TE的关键元件是能够识别位于转座酶序列自身上游和下游侧翼的末端反向重复序列(ITRs)的活性转座酶。TEs催化TE的复制或剪切以及在无关的目标DNA序列中的整合。b)本图展示了转座子载体体系的结构，其中活性转座酶的表达受到未连接到TE自身的表达载体的影响。TE可以包含克隆在上游和下游ITRs之间的任何期望序列或基因。若转座酶表达是反式的(例如在此所述地，通过分开的转座酶表达结构)，包含任何期望序列或基因(例如编码蛋白质文库的DNA文库)的TE的整合，可以是整合到无关目标DNA序列中。
图2：本图展示了TEs“跳跃”或转座到无关目标DNA中的两种不同方式。a)对于组II的转座子，步骤1中，转座酶识别转座因子的ITRs并催化TE从DNA的剪切。步骤2中，同样在转座酶的催化下，剪切下的TE插入无关目标DNA序列中。由此即为“剪切-粘贴”的转座机制。b)对于组I的转座子，首先复制TE的编码信息(例如，在反转录转座子的情况下，转录和反转录)，随后，在转座酶催化下，复制的TE整合到无关目标DNA的序列中。由此即为“复制-粘贴”的转座机制。
图3：本图提供了从休眠无活性TEs中鉴定和/或重建、并能够在如表所示的多种脊椎动物和人类细胞中转座的活性转座酶的概观。所述表格改编自出版物Ni et al.Briefings Functional Genomics Proteomics 7,444-453(2008)的表1，该文章以引用的方式全文并入本申请。
图4：本图概括了本发明中用于分离具有期望功能(例如与期望目标结合的)蛋白质(包括抗体及其片段)编码信息的方法的原理。所述期望基因，例如编码蛋白(包括抗体多肽链或其片段)的多样化转座DNA文库，克隆在转座结构的末端反向重复序列(ITRs)之间，与活性转座酶表达载体(见上图)一同引入脊椎动物宿主细胞。转座酶在所述宿主细胞中反式表达，克隆在ITRs之间的期望基因的存在能够被该转座酶辨识，由此允许以ITR为侧翼的期望基因稳定整合入宿主细胞基因组中，从而令所述宿主细胞能够稳定表达由期望基因编码的期望蛋白。表达期望基因的细胞文库随后可以进行筛选，以得到表达期望功能的蛋白，例如但不限于，与期望靶蛋白的结合性。通过本领域已知的细胞分离技术，例如MACS或FACS，可以对表达具有期望表型的期望蛋白由此具有相应基因型的细胞进行分离，并通过本领域已知克隆技术，例如但不限于基因组PCR克隆，从分离细胞中提取期望基因的编码信息。
图5：本图概括了如实施例1中所述的，生成可转座的人免疫球蛋白(Ig)к轻链(LC)表达载体的克隆策略。a)展示了来自PiggyBac转座子的5’-和3’-ITRs插入已含有强力哺乳动物细胞启动子元件pCMV(IE)(CMV立即早期启动子)、强力哺乳动物宿主细胞表达的内含子/polyA信号的哺乳动物表达载体pIRES-EGFP(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)的克隆策略。此外，在包含可供期望基因克隆插入的多克隆位点的ClaI、EcoRV、NotI、EcoRI的下游处，pIRES-EGFP包含了内部核糖体进入位点(IRES)，其下游处带有增强绿色荧光蛋白(EGFP)ORF，能够影响克隆在IRES上游的期望基因的表达偶联。图中还展示了用于在E.coli中扩增和选择质粒的细菌功能元件(氨苄青霉素抗性基因，ampR)和细胞复制起点(Col E1)。所得的含有质粒的PiggyBac ITRs命名为pIRES-EGFP-T1T2。b)展示了基因合成的人IgкLC插入pIRES-EGFP-T1T2的特有EcoRV限制酶位点，这将人IgкLC置于IRES-EGFP组件的上游，从而将人IgкLC的表达与EGFR标记基因的表达偶联在一起。人IgкLC的插入，产生了可转座的人IgкLC表达载体pIRES-EGFP-T1T2-IgL。图中选择性地展示了质粒中独有限制性酶位点，以及选择性地展示了克隆步骤所得的复制位点。
图6：本图概括了可转座人免疫球蛋白(Ig)γ1重链(HC)表达载体的克隆，这可以是通过人IgкLC开放阅读框(ORF)与人Igγ1HC ORF交换生成的。最终的Igγ1HC ORF设计相似，设计有独有的Eco47III限制酶位点，用于将可变(V)区从恒定(C)编码区分离，这允许单抗体V编码区与抗体V编码区的多样化文库的交换，如实施例3中所示。
图7：本图展示了如实施例4中所述的，使用pCDNA3.1(+)潮霉素作为哺乳动物表达载体的骨架，将哺乳动物PiggyBac转座酶表达载体克隆入pCDNA3.1(+)潮霉素的特有EcoRV限制酶位点，得到PiggyBac转座子表达载体pCDNA3.1(+)潮霉素-PB。本图中还显示了其他哺乳动物功能元件(CMV-IE启动子、BGH-polyA信号、SV40-polyA片段、潮霉素B ORF)和细菌功能元件(氨苄青霉素抗性基因ampR、复制起点ColE1)的相对位置，以及选定的相关限制酶识别位点。
图8：本图显示了如实施例5所述的Sleeping Beauty可转座人免疫球蛋白к轻链(Ig-кLC)表达载体的克隆。所述克隆可以通过将PiggyBac 5’和3’ITRs依序替换为结构pIRES-EGFP-T1T2-IgL Sleeping Beauty 5’和3’ITRs。本图还显示了其他哺乳动物功能元件(CMV-IE启动子、BGH-polyA信号、SV40-polyA片段、潮霉素B ORF)和细菌功能元件(氨苄青霉素抗性基因ampR、复制起点ColE1)的相对位置，以及选定的相关限制酶识别位点。
图9：本图展示了如实施例6所述的对哺乳动物Sleeping Beauty转座酶表达载体的克隆，其中，使用pCDNA3.1(+)潮霉素作为哺乳动物表达载体骨架，来自Sleeping Beauty转座酶的基因合成ORF克隆到pCDNA3.1(+)潮霉素的特有EcoRV限制性酶位点中，得到Sleeping Beauty转座酶表达载体pCDNA3.1(+)潮霉素-SB。此外，本图显示了其他哺乳动物功能性元件(CMV-IE启动子、BGH-polyA信号、SV40-polyA片段、潮霉素B ORF)和细菌功能性元件(氨苄青霉素抗性基因ampR、复制起点ColE1)的相对位置，以及选定的相关限制性酶识别位点。
图10：本图展示了实施例4中用于克隆能使用PiggyBac或Sleeping Beauty转座酶进行转座的“空”IgH链表达载体的基因合成DNA片段1)和2)中的功能性元件和排列和选定特有限制性酶位点的位置。所述功能性元件的起点的详情公开于实施例的描述中。
图11：本图显示了人膜结合Igγ1重链(左图)和人Igк轻链(有图)可转座表达载体的最终设计和质粒图谱。对于IgH表达载体，可以使用该载体中作为VH编码区域侧翼的特有限制性酶位点NotI和NheI，将VH编码区域替换为任意其他单克隆抗体的VH编码区域或VH基因文库。对于IgL表达载体，可以使用该载体中作为VL编码区域侧翼的特有限制性酶位点NotI和BsiWI，将VL编码区域替换为任意其他单克隆抗体的VL编码区域或VL基因文库。PiggyBac和Sleeping Beauty可转座IgH和IgL载体的8种载体结构的构建，详情公开于实施例4中，其均共享该一般设计。本图所展示的2种载体图谱是pPB-EGFP-HC-Ac10(左图)和pPB-EGFP-LC-Ac10(右图)的载体图谱，且下方表格中提供了含有PiggyBac或Sleeping ITRs的hBU12重链(HC)或轻链(LC)的其他载体。本图中所有载体的序列均公开于实施例4中。
图12：本图展示了二维FACS点图，其中，在源于RAG-2缺陷小鼠的63-12A-MuLV转化鼠B祖细胞的表面上，检测到了转染后和转座后IgHC和IgLC表达载体的人IgG的表面表达。d2post TF指的是在载体结构转染到63-12细胞中2天后进行FACS分析。左栏的FACS图是转染的阴性对照和阳性对照。NC＝无质粒DNA细胞的模拟电穿孔。pEGFP-N3＝pEGFP-N3对照载体的转染对照，其以令转染细胞变绿而作为转染效率对照。左起第二栏展示了以PiggyBac-转座酶载体pPB-EGFP-HC-Ac10、pPB-EGFP-LC-Ac10载体(顶行)或PiggyBac-转座酶载体pPB-EGFP-HC-hBU12、pPB-EGFP-LC-hBU12载体(中行)或SleepingBeauty--转座酶载体pSB-EGFP-HC-Ac10、pSB-EGFP-LC-Ac10载体(底行)共转染的63-12细胞的FACS图。左二栏标记为"d2post TF"，显示的是以上述载体共转染后2天，在细胞表面表达IgG(Y轴)和EGFP(X轴)的细胞的分析结果。表面IgG和EGFP双阳性细胞以FACS分选，如矩形门控所示。右二栏标记为"d91x sorted"，显示的是转染后第二天进行分选的细胞群表面IgG和EGFP表达以相同方式进行分析的结果。第二FACS分选的分选门控也提供为矩形门控。最右栏标记为“d16 2x sorted”，显示了转染后第9天进行再分选的细胞群，以与上述实验中分析表面IgG和EGFP表达的相同方式进行对表面IgG和EGFP表达的分析的结果。
图13：本图展示了细胞表面表达CD30-特异性IgG的63-12B祖细胞能够以CD30抗原染色和检测，且CD30-特异性细胞可以从在表面表达无关特异性的IgG的大群细胞中被检测和再分离，其中以递减频率对CD30-特异性细胞加标。顶部的FACS点图表示了对阳性对照细胞(稳定转座的63-12细胞，且分选2次以得到细胞表面表达人抗CD30IgG和克隆Ac10的细胞)表面的IgG的检测(通过抗кLC染色)和CD30结合(通过CD30-抗原染色)。正如预期，FACs点图右上角可检测到相当纯的IgG-阳性/CD30-反应性细胞群(97.3％)。每幅FACS-图顶部的数字表示了每次实验中所得的基于FSC/SSC门控的活细胞数目。中间一行展示了IgG阳性/CD19特异性细胞背景下可检测到的IgG-阳性/CD30反应性细胞的FACS分析。事件数目上方的数字表示用于制备抗CD19mAb IgG阳性细胞背景下的“加标”抗CD30mAb IgG阳性细胞群的抗CD30特异性IgG阳性细胞稀释因子。图中标明了用于在加标细胞群中特异性分离IgG-阳性/CD30反应性细胞的特异性分离分选门控。需要获得较大数目的事件来允许对稀释度较高的IgG-阳性/CD30反应性细胞进行检测和分离。FACS图的底行展示了在细胞以相同参数(IgG-表达&CD30抗原特异性)扩增12天后，对分选后细胞的再分析。
图14：本图展示了对人Ig-γ1重链(HC)的基因组组态转座载体的克隆。顶部线性片段是人Ig-γ1-HC外显子和内含子，以添加的允许连接到Ig-γ1HC cDNA载体pPB-EGFP-HC-Ac10的NheI和BstBI限制性位点为侧翼。H指的是铰链区外显子，M1和M2是编码在表面表达的Ig重链的跨膜区的外显子。以简单的一步连接法，将转座人重链载体的cDNA C-γ1区域替换为其基因组对应物，如图所示。使用该策略，将VH编码区域框内连接到人C-γ1的CH1编码外显子上。
图15：本图展示了к轻链文库的序列和整体设计。CDR3编码区域以下划线标记。有用的限制位点亦已标明。
图16：本图展示了γ-重链文库的序列和整体设计，图中展示的是使用NNK4随机化策略进行随机化的所述文库片段的一个例子。使用NNK6、NNK8和NNK10随机化策略进行随机化的γ-重链文库片段，仅在HCDR3区中的随机化氨基酸残基数目上有所不同。HCDR3编码区域以下划线标记。ARG密码子编码了赖氨酸和精氨酸。有用的限制位点亦已标明。
图17：本图展示了以引物进行扩增前对PCR模版进行消化。(A)以限制性内切酶ScaI消化pUC57_Jkappa2-Ckappa得到适用于以引物LCDR3-NNK6-F来引导的平头末端DNA片段。(B)以限制性内切酶DrdI消化pUC57_JH4得到适用于以引物HCDR3-NNK4-F、HCDR3-NNK6-F、HCDR3-NNK8-F、HCDR3-NNK10-F来引导的DNA片段。
图18：本图展示了分别如实施例12和13中所述，为了通过NNK-6途径多样化Vк的LCDR3区域(A)和通过NNK4-途径多样化VH的HCDR3区域而生成的跨PCR扩增子的随机化LCDR3和HCDR3区的电泳图。
具体实施方式
定义
本申请所称的“多样化集合(diverse collection)”指的是多个编码核苷酸序列或初级氨基酸序列具有差异的特定功能蛋白和结合蛋白的变体或突变体，其限定了不同的功能性或结合性质。
本申请所称的“文库(library)”指的是编码具有不同结合特异性和/或功能性的多肽的多个多核苷酸。在某些实施例中，所述文库可以包括编码至少102、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108或至少109个独有多肽的多核苷酸，例如，全长抗体重链或轻链，或VH或VL域。
本申请所称的“末端反向重复序列”或“ITR”指的是被识别于转座因子的5’或3’端的序列，其能被转座酶识别，且介导ITRs的转座，包括介入从一个DNA结构或位点向另一DNA结构或位点的信息编码。
本申请所称的“转座酶”指的是能够识别并结合ITRs，并介导转座因子从一个靶DNA序列向另一个靶DNA序列移动。
本申请所称的“抗原结合分子”指的是一种广义上与抗原决定簇特异性结合的分子。抗原结合分子的非限制性示例之一，是抗体或其保有抗原特异结合性的片段。“特异性结合”指的是，该结合具有抗原选择性，且能与不需要的或非特异性相互作用区分开。
本申请所称的“抗体”意在包含所有抗体分子，包括单克隆抗体、多克隆抗体和多特异性(例如双特异性)抗体，以及具有Fc区并保有结合特异性的抗体片段，以及包含等同于免疫球蛋白Fc区的区域、并保有结合特异性的融合蛋白。还涵盖保有结合特异性的抗体片段，包括但不限于：VH片段、VL片段、Fab片段、F(ab’)2片段、scFv片段、Fv片段、微小抗体、双特异抗体、三特异抗体和四特异抗体(例如参见Hudson and Souriau,Nature Med.9:129-134(2003)，在此以引用方式全文并入本申请)
本发明在此公开的一个实施例，是一种用于识别特异功能性或结合性多肽(包括但不限于抗体链或其片段(图4))的方法，包括：
i.对在源自转座因子并可由至少一种转座酶识别并作用的末端反向重复序列(ITRs)之间编码蛋白(包括抗体多肽链或其片段)的多样化可转座DNA文库进行克隆；
ii.以本领域已知方法，将步骤(i)中的一个或多个多样化转座DNA文库引入脊椎动物宿主细胞；
iii.在所述脊椎动物宿主细胞中反式地提供至少一个功能转座酶，使所述一个或多个多样化转座DNA文库稳定整合入脊椎动物宿主细胞基因组中，从而提供一种稳定表达蛋白(包括抗体链或其片段)多样化文库的脊椎动物宿主细胞群；
iv.以本领域已知方法，在所述稳定表达蛋白(包括抗体或其片段)的多样化细胞文库中筛选期望功能或结合表型；
v.可选地，包括对稳定基因改造脊椎动物宿主细胞进行重复富集循环，以得到期望的结合或功能表型；以及
vi.使用本领域所知的标准克隆方法，例如但不限于，使用所述一种或多种转座DNA文库结构的特异性引物的PCR(聚合酶链式反应)，从所述编码期望结合或功能表型的富集宿主细胞中分离相关基因。
步骤(i)的一个优选实施例中，通过基因合成或使用适当引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增多样化蛋白编码区域，生成多样化转座DNA文库，并通过本领域已知方法生成包含各种结合蛋白(包括抗体及其片段)的DNA模版。
对于多样化抗体文库的生成，可以用标准基因合成来生成抗体重链和轻链序列的多样化集合，其中V区编码序列可以在某些位置上随机化，例如但不限于，抗体轻链或重链V区的互补决定区(CDRs)。该多样性可限制为V区的个体CDRs或特定或若干骨架位置，和/或一个或多个CDR区中的特定位置。如上所述的带有设计变型的V区，可以合成为编码以至少对一个期望转座酶具有功能性的末端重复序列为侧翼的抗体全长重链或轻链片段。优选地，生成包含编码抗体重链或轻链V区的多样化可变域的所述DNA文库，并以适当克隆位点为侧翼，包括但不限于，与抗体重链或轻链表达载体中的克隆位点兼容的限制性酶识别位点。可用于本发明中的方法的适用转座子表达体系包括，例如，如美国专利6218185、6551825、6962810、7105343、和7932088中所述的上述PiggyBac转座子体系(各专利在此以引用方式全文并入本申请)，以及如美国专利6489458、7148203、7160682、US 2011 117072、US 2004 077572和US2006 252140所述的Sleeping Beauty转座子体系(各专利在此以引用方式全文并入本申请)。
还可以从期望的脊椎动物物种，优选为人类，优选为从包含B细胞的细胞区室中分离的B细胞群中，获得多样化抗体重链和轻链文库，包括但不限于，外周或脐带血，以及淋巴器官，如骨髓、脾脏、扁桃体和淋巴结组织。在此情况下，可以使用RT-PCR或基因组PCR，通过能够与V区骨架上游或其中的前导序列上游或其中的同源序列结合、从而扩增大多数V区家族的抗体重链和轻链特异性简并PCR引物对，以及通过能与可变域编码区的J连接基因片段下游或其中、或抗体重链或轻链的恒定区中的编码区域的下游或其中的同源区结合的下游引物，分离抗体重链和轻链的多样化抗体V区序列。
用于扩增多样化可变编码区的PCR引物组可以是以适当的克隆位点为侧翼，例如但不限于，能够与抗体重链或轻链表达载体的克隆位点相兼容的限制性酶识别位点。
步骤(i)中编码多样性蛋白(包括抗体及其抗体片段)的可转座DNA文库可以提供为质粒文库的形式，其中使用如上所述的适当克隆位点来克隆基因合成或PRC扩增的可转座DNA文库。可选地，编码结合蛋白(如抗体及其片段)多样化文库的可转座DNA文库，可以直接提供为DNA合成所得或PCR扩增所得的线性、双链DNA结构的形式。将可转座DNA文库提供为尚未克隆入表达载体或质粒的线性双链DNA PCR扩增子的后一种方式，(与所有其他脊椎动物细胞表达体系相比)优点在于，保持了可转座DNA文库的最大分子复杂度，且不会因进入表达载体的克隆或连接效率受限而受损。相反，以连接或其他方式克隆到质粒表达或穿梭载体中，是所有其他基于质粒或基于病毒载体的脊椎动物细胞表达体系的必要中间体。
但是，使用基于质粒的含有编码多样化结合蛋白(包括抗体及其抗体片段)的多样化转座DNA文库的转座子表达载体，其优点在于，所述表达载体可以改造为包含其他功能元件，用于允许在稳定转座的脊椎动物宿主细胞中筛选，或，可选地，选择稳定整合在转座后的脊椎动物宿主细胞中的转座子表达载体。
为达成此目的，向多样化可转座DNA文库以可操作连接提供(即以反式向转座子表达载体中克隆)：标记基因表达组件，包括但不限于荧光标记蛋白(例如本领域已知的绿、黄、红或蓝色荧光蛋白及其增强形式)；或者细胞表面标记表达组件，包括但不限于，CD标记，可使用针对所述CD标记的特异性诊断抗体或其他诊断工具。
可选地，可以向多样化可转座DNA文库以可操作连接提供(即以反式向转座子表达载体中克隆)允许在转座后的脊椎动物宿主细胞中选择抗生素抗性(包括但不限于：对嘌呤霉素、潮霉素B、博来霉素、新霉素的抗性)的可选择标记的表达组件。
为形成可操作连接，可以将所述标记基因或抗生素抗性标记的表达组件克隆到包含所述多样化可转座DNA文库编码区域的上游或下游，但应位于所述转座子载体的末端反向重复序列中。
可选地，为形成可操作链接，可以将所述标记基因或抗生素抗性标记的编码区域克隆到包含所述多样化可转座DNA文库编码区域的下游，但以内部核糖体进入位点(IRES)序列间隔开，以保证所述多样化可转座DNA文库与所述标记基因或抗生素抗性基因的表达的转录偶联，由此允许筛选或选择稳定转座的脊椎动物宿主细胞。
本申请所公开的方法的步骤(ii)中，编码多样性蛋白质文库(包括抗体及其片段)的所述多样化可转座DNA文库，通过本领域已知的跨脊椎动物细胞膜转移DNA的有效方法引入期望的脊椎动物宿主细胞中，所述方法包括但不限于：脂质体DNA转染、磷酸钙、DEAE-右旋糖酐、聚乙烯亚胺(PEI)磁珠，或通过原生质体融合、机械转染(包括物理性或冲击性方法如基因枪)，或通过核转染。任一上述方法和其他将DNA转移到脊椎动物宿主细胞中的方法均可单独或联合用于本申请公开的方法的步骤(ii)中。
对于二聚蛋白，包括但不限于抗体及其片段，本申请所公开的方法的一个有用实施例中，引入了多样化可转座DNA文库和/或分别以不同可转座载体包含抗体重链或轻链且可独立引入脊椎动物宿主细胞的转座子载体。这允许抗体重链或轻链的多样化可转座DNA文库相继引入所述细胞，或允许其抗体重链或轻链的多样化可转座DNA文库同时引入所述细胞，无论何种情况，均允许所述至少2个不同多样化可转座DNA文库所编码的任一抗体重链和任一抗体轻链的随机改组。
上一实施例的另一有用实施例是对抗体重链和轻链分别使用不同的转座子载体和/或多样化可转座DNA文库，其中所述结构或文库包含在可由不同转座酶识别的可转座载体上(图3)。这允许抗体重链和抗体轻链结构独立转座，而不会干涉两个不同的转座酶，因为各转座载体仅有其特定转座酶识别和转座。对于编码抗体重链或轻链的可转座载体或DNA文库的相继转座，使用具有不同ITR序列的不同转座酶的优点在于，当发生第二次转座时，已经稳定进行第一次转座的结构不会再发生进一步转座而移动。
该实施例还允许通过导向筛选法来发现抗体(Guo-Qiang et al.Methods Mol.Biol.562,133-142(2009)，在此以引用的方式全文并入)。导向筛选可以用于，例如，将具有期望靶向/表位特异性且具有期望功能性的任何非人抗体转化为全人抗体，并保留相同靶向/表位特异性和功能性。导向筛选法的原理涉及：表达参照抗体(“导向”抗体)的抗体单链(重链或轻链)，同时表达互补抗体链(即轻链或重链)的多样化文库，并筛选具有期望功能性或结合性表型的所述重链-轻链组合。由此一来，第一抗体链对从多样化文库中筛选具有期望功能性或结合性表型的一个或多个互补抗体链进行了“导向”。所述一个或多个新型互补抗体链一旦分离，则可在表达载体中克隆，再次用于对多样化抗体链文库中筛选第二互补链进行“导向”。该二步法的最终结果是，参照抗体的原始抗体重链和轻链均被来自所述多样化文库的无关新型抗体链序列所取代，但该新型抗体重链-轻链组合表现出与原始参考抗体相同或相似的功能性或结合性性质。因此，该方法要求具备在脊椎动物宿主细胞中独立表达抗体重链和轻链结构或文库的能力，而这可以通过优选实施例来达成，以提供可由不同转座酶识别的不同可转座载体体系中的抗体轻链和重链表达组件。
但是，多样化可转座DNA文库还可以通过一种方式构建，其中多亚基蛋白(包括抗体及其片段)的编码区域包含在相同转座子载体中，亦即，所述多聚体蛋白的至少2种不同亚基(例如VH和VL区，或全长重链和轻链)的表达，由各表达组件或编码区域可操作地连接在同一可转座载体中。
可用于引入步骤(ii)的可转座结构和/或可转座DNA文库的脊椎动物宿主细胞，是能够或已经永生化且能够以本领域已知条件在适当的细胞培养基中培养的脊椎动物细胞，包括但不限于，例如，来自青蛙、鱼、鸟类的细胞，但优选为来自哺乳动物，包括但不限于来自啮齿类、反刍动物、非人灵长类和人的细胞，其中优选为来自啮齿类或人源的细胞。
上述种类的可用类型包括但不限于，能够高密度悬浮培养的淋巴谱系，优选为B-系来源细胞，因其可内源性地表达所有需要的蛋白、因子、分子伴侣和允许众多蛋白尤其是抗体或基于抗体的蛋白优化表达的翻译后酶。在B-谱系来源脊椎动物细胞中，优选地，使用呈现出早分化阶段且已知为B前体细胞或B祖细胞的细胞，这是因为所述B前体细胞或B祖细胞在大多数情况下不会内源性地表达出可能干扰本发明方法中的外源或异源抗体链表达的内源抗体链。
来源于啮齿类的可用B前体细胞和B祖细胞为阿贝尔森鼠白血病病毒(A-MuLV)转化的B前体细胞和B祖细胞(Alt et al.Cell 27,381-390(1981)，在此以引用方式全文并入)，该细胞能够表达用于抗体表达及其适当表面沉淀的全部必要成分，包括B细胞受体成分Ig-α(CD79a，或mb-1)和Ig-β(CD79b，或B-79)(Hombach et al.Nature 343,760-762(1990)，在此以引用方式全文并入)，但如上所述，该细胞通常不表达内源性抗体或免疫球蛋白链。在此，A-MuLV转化的B前体细胞和B祖细胞优选为来源于小鼠突变体，包括但不限于，缺失重组激活基因-1(RAG-1)或重组激活基因-2(RAG-2)的小鼠突变体，或携带V(D)J重组所需的其他基因突变(例如XRCC4、DNA-连接酶IV、Ku70或Ku80、Artemis蛋白、DNA依赖性蛋白激酶、催化亚基(DNA-PKcs))因而不能正常表达内源性抗体多肽的动物。
B前体细胞和B祖细胞的其他可用类型为早期免疫球蛋白无效(Ig-无效)EBV转化的B前体细胞和B祖细胞(Kubagawa et al.PNAS 85,875-879(1988)，在此以引用方式全文并入)，所述细胞也表达用于外源抗体的表达、翻译后修饰和表面表达所需的全部因子(包括CD79a和CD79b)。
还可以使用处于B细胞系浆细胞分化阶段的其他B谱系宿主细胞，优选为，但不限于，Ig无效的骨髓瘤细胞西，例如Sp2/0、NSO、X63、Ag8653和本领域所知的其他骨髓瘤和浆细胞瘤。可选地，当需要外源表达抗体的优化表面沉淀时，所述细胞系可以稳定转染或以转染之外的方法稳定地基因改造，以过度表达B细胞受体成分Ig-α(CD79a，或mb-1)和Ig-β(CD79b，或B-79)。
本申请公开的方法中，还可以使用其他非淋巴系的哺乳动物细胞系，包括但不限于工业标准的抗体表达宿主细胞(包括但不限于CHO细胞、Per.C6细胞、BHK细胞和293细胞)，且可选地，当需要外源表达抗体的优化表面沉淀时，每种所述细胞也可以稳定转染或稳定地基因改造，以过度表达B细胞受体成分Ig-α(CD79a，或mb-1)和Ig-β(CD79b，或B-79)。
基本上，本申请所公开的方法可以使用任何可转染的脊椎动物宿主细胞，这与任何病毒表达体系(例如但不限于牛痘病毒、反转录病毒、腺病毒或辛德毕斯病毒表达体系)相比均为重大优点，因为本发明的方法不存在对某些物种或细胞种类的病毒趋向性导致的宿主细胞限制，且进一步地，还可使用所有脊椎动物细胞，包括最低安全等级的人细胞，这提高了其一般效用。
本申请所公开的方法的步骤(iii)通过暂时或瞬态表达功能性转座酶，以步骤(ii)的转染转座结构对期望的脊椎动物宿主细胞进行稳定基因修饰，从而产生表达由所述结构编码的多样性蛋白质文库的稳定脊椎动物宿主细胞群。
步骤(iii)的可用实施例之一中，将编码功能性转座酶和所述至少一个多样性可转座DNA文库的脊椎动物表达载体，瞬态引入宿主细胞中，优选为通过上述共转染。应当理解，转座表达载体的瞬态共转染或共整合可以同时进行，或在转座结构和/或多样化可转座DNA文库转移入脊椎动物宿主细胞之前或之后不久进行，从而使得瞬态表达转座酶能够优化地使用步骤(ii)中瞬态进入的转座载体，将可转座DNA文库整合到脊椎动物宿主细胞基因组中。
步骤(iii)的又一可用实施例中，通过已经稳定整合到脊椎动物宿主细胞基因组中的本领域已知诱导表达体系，瞬态表达功能性转座酶，使得步骤(ii)引入的转座载体和/或转座DNA文库稳定整合。所述功能性转座酶的诱导瞬态表达，可以通过例如本领域已知的四环素诱导(四环素-有/四环素-无)或他莫昔芬诱导启动子体系来达成。在此情况下，仅所述一个或多个可转座载体或DNA文库需要被引入宿主细胞基因组中，而所述结构的稳定转座和所述一个或多个可转座载体或DNA文库所编码的蛋白的稳定表达，是由宿主细胞中的功能性转座酶的瞬态启动表达达成的。
本申请所公开的方法的步骤(iv)中，分离了表达期望功能性或结合性表型的蛋白的转座脊椎动物宿主细胞。
步骤(iv)的一个优选实施例中，通过标准的细胞分离技术，例如本领域已知的磁性激活细胞分选(MACS)或高速荧光激活细胞分选(FACS)，筛选并分离步骤(iii)中表达期望蛋白(包括抗体及其片段)的转座后宿主细胞。特别地，在对特定的转座后脊椎动物宿主细胞群的第一富集步骤中，需要处理大量细胞，优选地，采用基于MACS的技术从大量非特异性细胞中分离目标特异性细胞。
特别地，对于额外的重复细胞富集循环，优选为FACS富集，因为需要处理的潜在细胞数量较少，且多通道流式细胞术允许对包括但不限于与多种类目标特异性结合的功能性的同时富集，或在FACS筛选中使用表为特异性竞争抗体对特定表位进行特异性筛选。
若要探索的是与可溶性结合伴侣相互作用的蛋白质(包括抗体及其片段)，则所述结合伴侣优选为用特异性标记或标签来标记，例如但不限于，本领域已知的生物素、原癌基因myc或HA-标记，其能够被二级试剂所检测，例如但不限于，以磁性(基于MACS的细胞富集)标记或以荧光色素(基于FACS的细胞富集)标记的链霉亲和素或抗体，从而可以应用细胞分离技术。
若要探索的是不能如可溶蛋白般容易表达的针对膜结合蛋白的蛋白质(包括抗体及其片段)，例如但不限于，四跨膜蛋白、7-跨膜受体(例如G偶联蛋白受体)或离子通道，这些可以表达在病毒颗粒中，或在特定细胞系中过度表达，然后用于本领域已知的标记或盘选方法，以富集表达来自转座结构的蛋白的脊椎动物宿主细胞(包括抗体及其片段)。
由于稳定转座的脊椎动物宿主细胞群中存在稳定对应的基因型-表型，步骤(v)的一个有用实施例中，针对期望功能性或结合性表型的细胞进行重复富集循环，直到获得期望功能性或结合性表型相关的显著细胞群。可选地，可以通过例如但不限于流式细胞术单细胞分选或有限稀释法来分离个体细胞克隆，以便从期望功能性或结合性表型相关的个体细胞克隆中回收转座DNA信息。
为了鉴定功能目标特异性抗体，通常优选地，不仅筛选和选择特定结合性表型，还额外筛选目标特异性抗体的额外功能性质，尤其是以生物实验筛选拮抗性或激动性效果。
因此，需要有效地将脊椎动物宿主细胞中的细胞膜结合抗体表达“转换”为足量的分泌抗体表达，以产生足量的特定抗体克隆，用于功能性分析。
在天然B系细胞中，从膜结合抗体到分泌抗体表达的转换，是通过可变剪接的机制发生的，其中，在B前体细胞和B细胞中，优选地，将位于最后一个重链恒定区外显子的3’端附近的可变剪接供体剪接到该重链恒定区外显子下游的膜锚定外显子剪接受体上。由此一来，B细胞中产生了具有延长C端跨膜域的抗体重链，所述跨膜域能够将重链以及包含重链轻链的整个抗体锚定在细胞膜中。该C端跨膜域还与跨膜因子Ig-α(CD79a或mb-1)和Ig-β(CD79b或B29)非共价地相互作用，由此可能在B系细胞中形成更好的膜锚定和更高的表面免疫球蛋白表达。
一旦B细胞进一步分化到浆细胞阶段，则不再发生可变剪接，且最后一个重链恒定区外显子的3’端附近的可变剪接供体也不再被识别或利用，mRNA模版终止于重链恒定区终止子下游，并翻译出分泌抗体的重链。
为了利用这可变剪接的天然机制，将表达抗体的膜结合表达“转换”到分泌表达，本发明的方法的一个有用实施例中，构建了能够保持恒定抗体重链的天然内含子/外显子结构(包括编码跨膜域的外显子)的编码蛋白(包括抗体及其片段)的转座载体和多样性DNA文库。该实施例相对于逆转录病毒表达体系具有明显的优势，因为逆转录病毒载体基因组在包装到逆转录病毒颗粒中稳定转染到宿主细胞基因组之前已经剪接。
其他病毒载体体系中，可以并入载体的DNA插入件长度可能受到限制，由此妨碍了较大基因组区域克隆进入所述表达载体，阻碍了使用膜结合抗体表达通过可变剪接天然地“转换”到分泌抗体表达。某些转座子(例如Tol2，参见图3)，据鉴定，能够有效地将大于10kb DNA片段转座到脊椎动物宿主细胞中，而不会损失转座效率(Kawakami Genome Biol.8,Suppl I,S7(2007)，在此以引用方式全文并入)。因此，在本发明的方法的一个有用实施例中，构建了包含基因组外显子/内含子结构、能够更好更适当地进行表达且从膜结合表达转换到分泌表达的转座表达载体。本发明的方法可用于将至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb的DNA片段转座到宿主细胞基因组中。
可以通过B细胞分化因子，例如但不限于CD40/IL4触发，或者通过分裂素刺激，例如但不限于脂多糖(LPS)，或其他多克隆激活素、金黄色葡萄球菌(SAC)菌株激活素、CpG核苷酸，或其任意组合，来诱导从倾向于膜结合抗体表达的早期B谱系分化阶段到倾向于分泌抗体表达的浆细胞阶段的分化。
优选地，该分化在转化后细胞中达成，可以人为抑制所述细胞的增殖，从而可以再次发生适当的B细胞分化，如在A-MuLV转化后的鼠科B前体细胞中，使用酪氨酸抑制剂格列卫(Gleevec，Muljo et al.Nat.Immunol 4,31-37(2003)，在此以引用方式全文并入)特异性抑制阿贝尔森酪氨酸激酶。因此，在一个优选的实施例中，本方法使用Ig-无效的A-MuLV转化后的鼠科B前体细胞，该细胞通过Gleevec处理，能够再次分化为更多的成熟B细胞阶段，包括浆细胞，所述浆细胞随后可分泌出足量分泌抗体，用于其他基于基因组重链表达结构的可变剪接的功能性测试。本发明的方法的一个优选实施例中，进一步通过稳定过度表达本领域已知的抗凋亡因子，包括但不限于bcl-2或bcl-xL，来改进B谱系细胞分化
步骤(iv)后，对转座后脊椎动物宿主细胞如上所述地进行富集，可选地，可以根据上述方法进行额外的细胞富集(步骤(v))，知道分离了表达具有期望的功能性和/或结合性性质的蛋白质(包括抗体及其片段)的细胞群或个体细胞。
随后，执行本发明的方法的步骤(vi)，以从根据期望的功能性和/或结合性性质而分离的转座后脊椎动物宿主细胞中，分离所含的相关编码信息。
步骤(vi)的一个有用实施例中，分离克隆并测序，以获得包含在分离后的细胞中的期望功能性或结合性蛋白(包括抗体及其片段)的相关编码信息，其中以针对包含在转座后DNA结构中的相关编码信息的特异性引物对，进行基因组或RT-PCR扩增，并直接或在亚克隆至本领域已知的测序载体(包括但不限于TA或Gateway-克隆载体)后，对基因组或RT-PCR扩增子进行测序。
如上所述经由基因组或RT-PCR扩增来对期望功能性或结合性蛋白(包括抗体及其片段)的相关编码信息进行的克隆和测序，还可以用可转座IgH和IgL表达载体来进行，由此结合蛋白编码区域不仅可以被识别，还能在稳定转座到脊椎动物宿主细胞后进行表达，如本文所述。对于分泌抗体的表达，这仅需要使用缺乏IgH跨膜编码区域的可转座Ig重链表达载体。
步骤(vi)的另一有用实施例中，对步骤(iv)或(v)富集后的、呈现出期望功能性或结合性表型的细胞群进行下一代(“深度”)测序(Reddy et al.Nat.Biotech.28,965-969(2010)，在此以引用方式全文并入)，以直接一步得到转座后DNA结构中所含编码信息的数千种序列的代表性集合。根据针对富集后细胞群中鉴定所得的序列的相对频率的生物信息学分析，能够预测何种序列编码了功能性或结合性蛋白，包括抗体及其片段(Reddy et al.Nat.Biotech.28,965-969(2010)，在此以引用方式全文并入)。对于统计意义上过多的序列进行再合成，并克隆到表达载体中作为重组蛋白、抗体或其片段进行表达，以鉴定其功能性和结合性性质。该方法能够显著加快对表达功能性或目标特异性性质蛋白的功能性和表型富集细胞群中相关序列的鉴定。
本发明的方法的又一个实施例中，使用转座介导的脊椎动物细胞表达蛋白(包括抗体及其片段)，以进行期望蛋白的诱变和优化，包括对抗体及其片段的亲和性优化。
这可以通过根据步骤(iv)所公开的方法(包括但不限于，在本领域已知的致突变条件下进行基因组PCR或RT-PCR扩增)，从已对期望功能性或结合性表型进行富集的转座后脊椎动物细胞群中分离编码所述蛋白(包括抗体及其片段)的基因来达成。随后，诱变处理序列可再克隆到转座载体中，然后再次转座到脊椎动物宿主细胞中，以根据本申请所公开的方法进行筛选，以改进期望功能性或结合性性质。
该方法的一个有用实施例中，使用的特异性引物能够对包含侧翼ITRs的完全转座后结构进行致突变条件下的PCR扩增。
通过该方法，可以从根据功能或表型筛选的转座后细胞中，生成包含限定平均频率的随机突变的诱变PCR扩增子。带有原模版受控突变(变异)的所述PCR扩增子，此时可以根据步骤(ii)中所公开的可用方法的优选实施例，直接再转座到新的脊椎动物宿主细胞中。
本方法相对于用于对脊椎动物细胞进行基因改造的其他方法的主要优点在于，使用该技术，不需要耗费时间对诱变PCR扩增子进行再克隆，也无需耗费时间对诱变序列进入表达载体进行质量控制，而在所有其他基于质粒或病毒表达体系中，如需对诱变序列进行又一轮的筛选时，这却是必需要求。
由于DNA转座仅需要期望基因编码区域侧翼存在ITRs，PCR扩增后的诱变PCR扩增子，可直接再引入、再转座到新脊椎动物宿主细胞中进行表达，并筛选具有改进性质和/或亲和性的成熟变体。
综上所述，本申请所公开的方法，使用TEs，以可转座结构和/或编码蛋白(包括抗体及其片段)的多样化可转座DNA文库对脊椎动物宿主细胞进行稳定基因修饰，为探索和优化具有最优期望功能性或结合性表型的所述蛋白提供了独一无二的高效、灵活、实用和便捷。
实施例
实施例1：与转座酶PiggyBac相配、用于人抗体к轻链的基础PiggyBac转座轻链表达载体的克隆说明
可以通过从人免疫球蛋白к轻链表达组件上游和下游的PiggyBac转座子克隆ITRs，来生成用于人к轻链的基础可转座表达载体。
为此，第一步骤中，可以从pXLBacII(发表于US 7,105,343，在此以引用方式全文并入)衍生出PiggyBac转座子的上游和下游ITRs的最小序列，并以侧翼限制酶位点进行基因合成，用于克隆到哺乳动物表达载体pIRES-EGFP(PT3157-5,序列号#6064-1,Invitrogen-Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)中。
带有5’端重复的上游PiggyBac ITR序列必须以侧翼MunI限制酶位点进行基因合成，所述MunI限制酶位点能与pIRES-EGFP中独有的MunI限制酶位点相配，且具有允许适当限制酶消化的额外4个随机核苷酸(小写字母)。该序列如Seq-ID1所述。
带有3’端重复的下游PiggyBac ITR序列必须以侧翼XhoI限制酶位点进行基因合成，所述XhoI限制酶位点能与pIRES-EGFP中独有的XhoI限制酶位点相配，且具有允许适当限制酶消化的额外4个随机核苷酸(小写字母)。该序列如Seq-ID2所述。基因合成的Seq-ID1经过MunI限制酶消化后，可以根据本领域所知的标准方法将DNA片段可以连接到MunI线性化pIRES-EGFP中，生成pIRES-EGFP-TR1。可以通过诊断性限制性酶消化，和/或通过克隆结构的DNA测序，来验证适当的插入件的适当定向(图5a)。
下一步骤中，合成并由XhoI消化的DNA片段Seq-ID2可以通过本领域已知标准技术连接到XhoI线性化pIRES-EGFP-T1(图5a)，以生成在IRES-EGFP表达组件上游和下游均包含PiggyBac ITRs的pIRES-EGFP-T1T2(图5b)。可以通过诊断性限制性酶消化，和/或通过克隆结构的DNA测序，来验证适当的插入件的适当定向(图5b)。
对于将人免疫球蛋白к轻链克隆到载体pIRES-EGFP-T1T2中，可以合成来自人抗TNF-α特异性抗体D2E7的人Igк轻链，其可以来自欧洲专利申请EP1285930A2(在此以引用方式全文并入)。
人抗TNF-α特异性抗体D2E7的人Igк轻链的编码区域中，D2E7的V区骨架与Vk1-27前导序列(Genbank索引号:X63398.1，为D2E7的最接近种系基因V-к家族成员V-к)和人к恒定区(Genbank索引号:J00241)相融合，所述编码区域具有如下Seq-ID3中所提供的核苷酸序列。
Seq-ID3的核苷酸序列翻译而成的氨基酸序列为Seq-ID4。编码D2E7Igк轻链的DNA片段Seq-ID3，能够进行基因合成，并以本领域所知的方法经由平头末端连接直接连接到独有的EcoRV限制性每位点(也是平头切酶)，得到结构pIRES-EGFP-T1T2-IgL(图5b)。
Seq-ID3经改造而在V-к和C-к编码区域(以粗体和下划线标明)中包含了独有的Eco47III限制酶位点，允许使用该结构V-к编码区域上游的独有限制酶和Eco47III，将该结构中的V-к区域替换为其他V-к区域或V-к文库。可以通过诊断性限制性酶消化，和/或通过克隆结构的DNA测序，来验证
к轻链插入件的适当定向(图5b)。
可转座人抗体к轻链载体pIRES-EGFP-T1T2-IgL的全序列如Seq-ID5所示。
实施例1中所引用的序列：
Seq-ID1(327bp长度的PiggyBac 5'-ITR序列。各端的MunI限制性酶位点以下划线和粗体字标明，末端添加的随机核苷酸为小写字母)
Seq-ID2(264bp长度的PiggyBac 3'-ITR序列。各端的XhoI限制性酶位点以下划线和粗体字标明，末端添加的随机核苷酸为小写字母)
Seq-ID3(711bp长度的抗TNF-α-特异性mAb D2E7Ig-кLC编码区域)
Seq-ID4(236氨基酸长度的抗TNF-α-特异性mAb D2E7序列)
Seq-ID5(6436bp长度的PiggyBac可转座Ig-к-LC表达载体pIRES-EGFP-T1T2-IgL的DNA序列)
实施例2：用于跨膜人抗体γ1重链的基础PiggyBac可转座轻链表达载体的克隆说明
为了克隆可转座Ig重链表达载体，须将pIRES-EGFP-T1T2-IgL(Seq-ID5)中的к轻链ORF与编码全人IgG1重链编码区域的ORF进行交换。
为了将pIRES-EGFP-T1T2-IgL载体中的人к轻链ORF替换为人免疫球蛋白γ1重链，可以合成对人TNF-α具有特异性的抗体D2E7的VH区(参见EP1285930A2，在此以引用方式全文并入)。为此，令近缘种系VH3-区家族成员的前导序列与抗体D2E7的VH区进行骨架融合，后者再与包含跨膜外显子(Genbank:X52847)的人γ1恒定区(Genbank:J00228)的编码区域进行骨架融合。为了能够替换pIRES-EGFP-T1T2-IgL中的人Igк轻链，需要在该序列(下划线)的5’端和3’端分别存在独有的ClaI和NotI限制性酶位点。此外，限制性酶位点侧翼的4个核苷酸(以序列末端的小写字母标示)允许基因合成的DNA片段按照标准方法，进行适当的限制性酶消化并连接到ClaI-NotI线性化的pIRES-EGFP-T1T2-IgL骨架上。需要基因合成的序列如Seq-ID6所示。
从Seq-ID6(粗体标明)的位点11的启动子开始，将该核苷酸序列翻译为抗TNF-α特异性克隆D2E7的人IgG1重链(参见EP1285930A2，在此以引用方式全文并入)，但包括了人γ1跨膜外显子M1和M2。Seq-ID6翻译所得的蛋白质如Seq-ID7所示。然后，可以用ClaI和NotI限制性酶对编码D2E7Igγ1重链的DNA片段Seq-ID6进行双重消化，并直接连接到ClaI-NotI线性化的pIRES-EGFP-T1T2-IgL上，得到结构pIRES-EGFP-T1T2-IgH(图6)。
Seq-ID6还经改造而在V-重链可变区和C-γ1恒定编码区域(以粗体和下划线标明)中包含了独有的Eco47III限制酶位点，允许使用该结构V-重链编码区域上游的独有限制酶和Eco47III，将该结构中的V-重链区域替换为其他V-重链区域或V-重链文库。可以通过诊断性限制性酶消化，和/或通过克隆结构的DNA测序，来验证
к轻链插入件的适当定向(图6)
可转座人抗体γ1重链载体pIRES-EGFP-T1T2-IgH的全序列如Seq-ID8所示。
实施例1和2提供了克隆用于人к轻链和人γ1重链(膜结合形式)以及全长膜结合人IgG1的基础PiggyBac可转座表达载体的克隆说明，可用于将本发明付诸实施。
实施例2中引用的序列：
Seq-ID6(1642bp长度的包含编码抗TNF-α-特异性mAb D2E7的膜结合IgG1-HC的编码区域的DNA片段)
Seq-ID7(539氨基酸长度的抗TNF-α抗体的膜结合Ig-G1-HC序列)
Seq-ID8(7341bp长度的PiggyBac可转座人IgG1-膜-HC表达载体pIRES-EGFP-T1T2-IgH的DNA序列)
实施例3：与Sleeping Beauty转座酶相配的人抗体к轻链基础可转座轻链表达载体的克隆说明
为了将包含在可转座载体中的人免疫球蛋白重链和轻链表达载体独立转座到宿主细胞中，可以构建带有不同末端反向重复序列(ITR)序列、能被SleepingBeauty转座酶所识别的可转座免疫球蛋白轻链结构。
为此，可以使用实施例1中的人IgK轻链表达载体pIRES-EGFP-T1T2-IgL(Seq-ID-5)，将PiggyBac转座子体系中载体所含的5’端和3’端的ITRs替换为Sleeping Beauty转座子体系中的5’端和3’端的ITRs。可由Sleeping Beauty转座酶识别并作用的Sleeping Beauty的5’端ITR和3’端ITR序列，可以来自专利文件US7160682B1/US2003154500A1。
带有5’端重复序列的上游Sleeping BeautyITR序列，可以用侧翼MunI限制性酶序列进行基因合成，从而能够将实施例1所述的结构pIRES-EGFP-T1T2-IgL(Seq-ID-5)中的以MunI为侧翼的PiggyBac 5’端ITR用Sleeping Beauty 5’端ITR序列所替换。该序列如下本实施例末尾的Seq-ID14所示。
具有3’端末端重复序列的下游Sleeping Beauty ITR序列(亦公开于US7160682B1/US2003154500A1中)必须以侧翼的XhoI限制酶序列进行基因合成，允许将实施例1所述的结构pIRES-EGFP-T1T2-IgL(Seq-ID-5)中的以XhoI为侧翼的PiggyBac 3’端ITR用Sleeping Beauty 3’端ITR序列所替换。该序列如下本实施例末尾的Seq-ID15所示(XhoI限制性酶位点以粗体字表示，且允许基因合成片段进行适当的限制性酶消化的4个额外侧翼随机核苷酸以小写字母表示)。
在第一步骤中，以Sleeping Beauty 5’端ITR替换结构pIRES-EGFP-T1T2-IgL(Seq-ID-5)中以MunI为侧翼的PiggyBac 5’端ITR，这必须通过以MunI限制性酶消化pIRES-EGFP-T1T2-IgL(Seq-ID-5)和将MunI消化的Seq-ID-14基因合成片段连接到MunI线性化的pIRES-EGFP-T1T2-IgL(Seq-ID-5)载体骨架上。可以通过诊断性限制酶消化和/或DNA测序来检查Sleeping Beauty 5’端ITR的正确定向。所得质粒称为pIRES-EGFP-sbT1-pbT2-IgL(图8)。
在第二步骤中，仍包含在pIRES-EGFP-sbT1-pbT2-IgL中的所述结构以XhoI为侧翼的PiggyBac 3’端ITR，必须以Sleeping Beauty 3’端ITR进行替换，为此，以XhoI限制酶消化pIRES-EGFP-sbT1-pbT2-IgL并将XhoI消化的Seq-ID-15基因合成片段连接到的XhoI线性化的pIRES-EGFP-sbT1-pbT2-IgL载体骨架上。可以通过诊断性限制酶消化和/或DNA测序来检查Sleeping Beauty 3’端ITR的正确定向。所得质粒称为pIRES-EGFP-sbT1T2-IgL(图8)。
可以通过Sleeping Beauty转座酶进行转座的IgK LC表达载体pIRES-EGFP-sbT1T2-IgL的全场序列如实施例末尾的Seq-ID16所示。
实施例3中所引用的序列：
Seq-ID14(246bp长度的包含Sleeping Beauty转座子体系的5’端ITR的DNA片段。侧翼MunI限制性酶位点以粗体和下划线标明。)
Seq-ID15(248bp长度的包含Sleeping Beauty转座子体系的3’端ITR的DNA片段。)
Seq-ID16(6339bp长度的Sleeping Beauty转座IgK-LC表达载体pIRES-EGFP-sbT1T2-IgL的DNA序列)
实施例4：用于膜结合人IgG1的PiggyBac和Sleeping Beauty转座载体的克隆
除了上述实施例1和2中所提供的基础PiggyBac可转座IgH和IgL表达载体的克隆说明，实施例3中所提供的基础Sleeping Beauty可转座IgL表达载体的构建说明之外，还进行了对用于嵌合抗人CD30mAb和人源化抗人CD19mAb的改进PiggyBac和Sleeping Beauty转座IgH和IgL表达载体的克隆，以将本发明付诸实施。
为此，在第一步骤中，合成以下2种基因片段(委托Genscript,Piscataway,NJ,USA)：
1)包含表达组件的4975bp DNA片段，所述表达组件中，人膜结合IgG1重链的表达由EF1-α启动子(Clontech表达载体pEF1-α-IRES的1-1335碱基对,Cat-No.#631970)驱动，且Ig链的表达通过内部核糖体进入位点(IRES)连接到EGFP表达。IRES和EGFP区域的DNA序列源自pIRES-EGFP(分别为Clontech表达载体pIRES-EGFP(Cat.-No.#6064-1,Life Technologies)的1299-1884碱基对和1905-2621碱基对)。此外，合成的DNA片段包含了位于Ig恒定编码区和IRES序列之间的嵌合内含子，该内含子序列源自pCI哺乳动物表达载体(857-989碱基对，od Promega,Cat.-No.#E1731)。在表达组件的3’端，该合成片段包含了牛生长激素多腺苷酸化信号(BGH-polyA)，其序列源自pCDNA3.1-潮霉素(+)表达载体(1021-1235碱基对，Invitrogen-Life Technologies,Cat.-No.#V870-20)。该表达组件的上游和下游以Seq-ID1和Seq-ID2中已公开的PiggyBac转座子ITRs为侧翼。
图10中所示为基因合成DNA片段中的元件及其排列图，包括额外添加的能用于剪切或替换该表达组件的任一功能性元件的独有限制性酶位点。
该4975bp长度的基因合成片段的序列如下本实施例末尾处的Seq-ID20所示。
应当指出，Seq-ID20所示的人IgH链的基因合成表达组件特意没有包含VH区的编码区域，从而可使用该结构以独有限制性酶位点NotI和NheI来插入任一期望VH编码区域和/或VH编码基因文库。因此，该结构成为“空”IgG1-HC表达组件。
2)为了提供用于Seq-ID20的可转座表达组件的质粒骨架，通过基因合成得到含有细菌ColE1起始点和氨苄青霉素抗性基因的2774bp长度的DNA片段(由Genscript,Piscataway,NJ,USA执行)。所述质粒骨架组件的序列信息源自表达载体pCI(Promega,Cat.-No.#E1731)的质粒骨架。合成基因片段还包含分别如Seq-ID14和Seq-ID15所示的Sleeping Beauty转座子的5’端和3’端ITRs。由于ColE1起始点和氨苄青霉素抗性基因的存在，该片段需要作为自主质粒传递到E.coli中并繁殖。
基因合成DNA片段的元件及其排列图如图10所示，包括额外增加的可用于剪切或替换所述表达载体的任一功能元件的特有限制性酶位点的位置。
所述2774bp长度的基因合成片段的序列如本实施例末尾的Seq-ID21所示。
所述2种基因片段能够在以不同限制性酶消化后，进行连接反应，连接PiggyBac和Sleeping Beauty可转座载体的片段来构建所述载体，如下所述：
通过连接Seq-ID20和Seq-ID21所示的EcoRI-ClaI片段来克隆PiggyBac转座载体，从而令所得结构包含Seq-ID20所示的以ITR为侧翼的PiggyBac表达组件，以及骨架中不含如Seq-ID21所示的Sleeping Beauty ITRs的ColE1-amp。相反地，连接如Seq-ID20和Seq-ID21所示的所示的XbaI-MluI片段，便将不带PiggyBac ITRs的表达组件连接到了如Seq-ID21所示的仍包含Sleeping BeautyITRs的线性化质粒骨架中。使用XhoI-NheI-BamHI和PvuI限制性酶的混合物，通过诊断性限制性酶消化，分析两次连接所制备的少量质粒，以鉴定正确连接的质粒。从每次连接选取一个克隆，再转化到E.coli中以得到DNA大量提取，并使用能够对全长质粒序列进行测序的测序质粒进行DNA测序，以加以验证。
如上制得并以DNA测序验证的PiggyBac和Sleeping beauty转座载体的全场序列(包含“空”人G1-HC表达组件)如下本实施例末尾的Seq-ID22(PiggyBac转座载体)and Seq-ID23(Sleeping Beauty转座载体)所示。
嵌合抗人CD30抗体brentuximab(克隆Ac10)的VH和VL编码区域可以来自专利申请US2008213289A1的序列1和9，且分别如Seq-ID24和Seq-ID25所示。
人源化抗人CD19抗体hBU12的VH和VL编码区域可以分别来自专利申请US8242252B2的序列变体HF和LG，且分别如本实施例末尾的Seq-ID26和Seq-ID27所示。
为了能够构建最终的PiggyBac和Sleeping beauty可转座抗CD30和抗CD19IgHC表达载体，将VH区的DNA片段设计为具有侧翼NheI和NotI限制酶位点。所述编码抗CD30抗体brentuximab(克隆Ac10)VH区的核苷酸序列还改造为含有哺乳动物细胞表达前导序列。编码抗CD30和抗CD19mAbs VH区的NotI-NheI片段DNA序列如本实施例末尾的Seq-ID28和Seq-ID29所示。该DNA片段由GeneArt,Regensburg,Germany通过基因合成制得(NotI和NheI位点以下划线标出)。
为了制得可通过PiggyBac或Sleeping beauty转座酶进行转座的抗CD30和抗CD19IgH表达载体，将NotI-NheI消化的Seq-ID28和Seq-ID29片段分别连接到NotI-NheI线性化的载体(Seq-ID22和Seq-ID23)中。由此得到包含抗CD30mAb brentuximab(克隆Ac10)和抗CD19mAb hBU12的全功能性重链(HC)4个载体，且所述结构成为：pPB-EGFP-HC-Ac10、pPB-EGFP-HC-hBU12、pSB-EGFP-HC-Ac10、pSB-EGFP-HC-hBU12，且其载体图如图11所示。所述载体专门设计为允许重链的表面表达，且在共表达轻链后，允许表面IgG表达。但是，只要省略the Ig重链跨膜区编码序列就能得到分泌IgG的转座表达载体。
为了制得可通过PiggyBac或Sleeping beauty转座酶进行转座的抗CD30和抗CD19IgL表达载体，需将Seq-ID22和Seq-ID23中公开的IgH恒定区基因替换为抗CD30和抗CD19抗体的IgL链编码区域。为此，可以基因合成包含连接在人恒定к轻链编码区域上的如Seq-ID25和Seq-ID27所公开的VL编码区域的基因片段，其5’端具有前导序列，且以能够将NotI-BstBI消化的片段连接到如Seq-ID22和Seq-ID23所示的NotI-BstBI线性化载体上的NotI-BstBI克隆位点为侧翼，从而将Seq-ID22和Seq-ID23中公开的IgH恒定区基因替换为抗CD30mAbAc10和抗CD19mAb hBU1的IgL链编码区域。
含有抗CD30mAb Ac10和抗CD19mAb hBU1的IgL链编码区域、5’端具有前导序列且以NotI-BstBI克隆位点为侧翼的基因片段，如本实施例末尾的Seq-ID30和Seq-ID31所示。所述DNA片段的基因合成由Genscript(Piscataway,NJ,USA)执行。
为了制得可通过PiggyBac或Sleeping beauty转座酶进行转座的抗CD30和抗CD19IgL链表达载体，将NotI-BstBI消化的Seq-ID30和Seq-ID31片段分别连接到NotI-BstBI线性化的载体(Seq-ID22和Seq-ID23)中。所得4个载体分别称为pPB-EGFP-LC-Ac10、pPB-EGFP-LC-hBU12、pSB-EGFP-LC-Ac10、pSB-EGFP-LC-hBU12，且其载体图如图11所示。
PiggyBac和Sleeping beauty抗CD30和抗CD19IgH和IgL结构的全序列(8种组合)如本实施例末尾的Seq-ID-32(pPB-EGFP-HC-Ac10)、Seq-ID-33(pPB-EGFP-HC-hBU12)、Seq-ID-34(pSB-EGFP-HC-Ac10)、Seq-ID-35(pSB-EGFP-HC-hBU12)、Seq-ID-36(pPB-EGFP-LC-Ac10)、Seq-ID-37(pPB-EGFP-LC-hBU12)、Seq-ID-38pSB-EGFP-LC-Ac10)、Seq-ID-39(pSB-EGFP-LC-hBU12)所示。
本实施例中引用的序列：
Seq-ID20(4975bp长度的包含以PiggyBac ITR为侧翼的跨膜人Ig-γ1重链表达组件的DNA序列)
Seq-ID21(2774bp长度的包含载体骨架因子ColE1和氨苄青霉素抗性、以5'和3'SleepingBeautITRs为侧翼的DNA序列)
Seq-ID22(7242bp长度的PiggyBac转座“空”人γ1-HC载体序列)
Seq-ID23(7146bp长度的Sleeping Beauty转座“空”人γ1-HC载体序列)
SeqID-24(351bp长度的抗人CD30抗体brentuximab VH编码区域)
Seq-ID25(333bp长度的抗人CD30抗体brentuximab VL编码区域)
Seq-ID26(417bp长度的包括前导序列的抗人CD19mAb huB12VH编码区域)
Seq-ID27(375bp长度的包括前导序列的抗人CD19mAb huB12VL编码区域)
Seq-ID28(423bp长度的包含抗人CD30mAb brentuximab的VH域的以NotI-NheI为侧翼的VH编码区域DNA片段,)
Seq-ID29(432bp长度的包含抗人CD19mAb hBU12的VH域的以NotI-NheI为侧翼的VH编码区域DNA片段,)
Seq-ID30(733bp长度的包含抗CD30mAbAc10的IgL编码区域且以NotI和BstBI限制性酶位点为侧翼的DNA片段)
Seq-ID31(718bp长度的包含抗CD19mAbhBU12的IgL编码区域且以NotI和BstBI限制性酶位点为侧翼的DNA片段)
Seq-ID32(7645bp的pPB-EGFP-HC-Ac10序列)
Seq-ID33(7654bp的pPB-EGFP-HC-hBU12序列)
Seq-ID34(7549bp的pSB-EGFP-HC-Ac10序列)
Seq-ID35(7558bp的pSB-EGFP-HC-hBU12序列)
Seq-ID36(6742bp的pPB-EGFP-LC-Ac10长度序列)
Seq-ID37(6727bp的pPB-EGFP-LC-hBU12长度序列)
Seq-ID38(6646bp的pSB-EGFP-LC-Ac10长度序列)
Seq-ID39(6631bp的pSB-EGFP-LC-hBU12长度序列)
实施例5：PiggyBac转座酶表达载体的克隆说明
功能性PiggyBac转座酶的ORF可以来自美国专利US7105343B1(在此以引用方式全文并入)，如本实施例末尾的Seq-ID11所示。本实施例末尾还提供了Seq-ID11的DNA序列翻译而成的氨基酸序列Seq-ID12。
为了生成PiggyBac转座酶的脊椎动物细胞表达载体，该OFR可以通过基因合成制得，并以平头末端DNA的形式克隆到标准脊椎动物细胞表达载体pCDNA3.1-潮霉素(+)(索引号#V870-20,Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)的特有的平头剪切限制性酶位点EcoRV中。PiggyBac ORF相对于pCDNA3启动子的正确连接，可以通过诊断性限制酶消化和/或通过克隆的PiggyBac表达结构pCDNA3.1-潮霉素(+)-PB的DNA测序来验证(图7)。如上所述地构建PiggyBac表达载体，且通过诊断性限制酶消化和DNA测序来验证载体设计。
PiggyBac表达结构pCDNA3.1-潮霉素(+)-PB的序列如本实施例末尾的Seq-ID13所示。
实施例5中引用的序列：
Seq-ID11(PiggyBac转座酶的ORF)
Seq-ID12(PiggyBac转座酶的氨基酸序列)
Seq-ID13(pCDNA3.1-潮霉素(+)-PiggyBac表达载体)
实施例6：Sleeping Beauty转座酶表达载体的克隆说明
Sleeping Beauty转座酶表达载体的开放阅读框(ORF)可参见专利文献US7160682B1/US2003154500A1。该序列如本实施例末尾的Seq-ID17所示。Seq-ID17的DNA序列翻译而成的氨基酸序列Seq-ID18亦提供于本实施例末尾。
为了产生Sleeping Beauty转座酶的脊椎动物细胞表达载体，该ORF可以基因合成制得，并用本领域已知方法，以平头末端DNA的形式克隆到标准脊椎动物细胞表达载体pCDNA3.1-潮霉素(+)(索引号#V870-20,Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)的特有的平头剪切限制性酶位点EcoRV中。Sleeping Beauty ORF相对于pCDNA3启动子的正确连接，可以通过诊断性限制酶消化和/或通过克隆的Sleeping Beauty表达结构pCDNA3.1-潮霉素(+)-PB的DNA测序来验证(图9)。
Sleeping Beauty表达结构pCDNA3.1-潮霉素(+)-PB的序列如本实施例末尾的Seq-ID19所示。
如上所述地构建Sleeping Beauty表达载体，且通过诊断性限制酶消化和DNA测序来验证该载体设计。PiggyBac和Sleeping Beauty转座酶的编码区域由Genscript,Piscataway,NJ基因合成制得。有了PiggyBac和Sleeping Beauty转座酶的8种不同可转座IgH和IgL表达载体，以及PiggyBac和Sleeping Beauty转座酶的PiggyBac表达结构pCDNA3.1-潮霉素(+)表达载体，既已得到能够在哺乳动物细胞表面表达抗CD30和抗CD19抗体的所有载体。
实施例6中引用的序列：
Seq-ID17(Sleeping Beauty转座酶ORF)
Seq-ID18(Sleeping Beauty转座酶氨基酸序列)
Seq-ID19(Sleeping Beauty转座酶表达载体pCDNA3.1-潮霉素(+)-SB的DNA序列)。
实施例7：从稳定转座的表达载体生成稳定表达膜结合人IgG的鼠B前体细胞
为了展示人IgG抗体在哺乳动物细胞中的稳定表达，将可转座人IgH和IgL表达结构转染到阿贝尔森鼠白血病病毒(A-MuLV)转化的B前体细胞系63-12(起源自RAG-2缺陷小鼠因而无法触发V(D)J重组，Shinkai et al.(1992)Cell68,855-867)中。该宿主细胞系是表达优化膜结合抗体表达所需的全部细胞成分的B细胞谱系淋巴细胞类型，包括能与膜结合免疫球蛋白跨膜氨基酸相互作用的B细胞受体辅助因子Ig-α(CD79a或mb-1)和Ig-β(CD79b或B29)。因此，所述细胞将IgG分子最优地与细胞表面膜的跨膜区域锚定。63-12细胞以补充了2％FCS、0.03％PrimatoneTM RL-UF(Sheffield Bioscience)、2mM L-谷氨酰胺、50μM2-巯基乙醇的IMDM培养基中，在37℃、10％CO2的加湿培养箱中悬浮静置培养。对于可转座IgH和IgL表达载体(实施例4)与转座子表达载体(实施例5或6)的共转染，在转染前将细胞传代24小时，并以5x105细胞/ml的密度接种，以允许细胞进入对数生长期，直到转染时刻。
转染时，通过离心收集63-12细胞，并以5x106细胞/ml的密度重悬浮在不含任何补充物质或血清的RPMI1640培养基中。取400μl该细胞悬浮液(对应于2x106细胞)转移到0.4cm细胞电击管(BioRad索引号#165-2081)中，并与400μl含期望质粒DNA(或质粒混合物)的RPMI 1640培养基混合。然后，进行细胞转染，使用950μF/300V设置的BioRad Gene Pulser II电穿孔仪进行单次电穿孔冲击，然后在室温下培养5分钟。然后，将细胞转移到5ml基于IMDM的生长培养基中，并对细胞离心一次，以去除电穿孔造成的细胞碎片和DNA，然后将细胞转移到基于IMDM的生长培养基中回复并表达转染后质粒的蛋白质。
电穿孔设置的根据是作为A-MuLV转化B祖细胞系63-12的最优转染条件，通常得到的瞬态转染效率在30-40％范围之间。所述电穿孔转染的结果记录在图12素食的FACS分析图中，其中左图为转染2天后的转染对照样。阴性对照(标记为NC)，无DNA并模拟电穿孔，预料之中地未显示任何绿色荧光细胞，而以15μg pEGFP-N3质粒(Clontech,序列号#6080-1)转染对照，通过检测表达增强绿色荧光蛋白的细胞(参见右下角的细胞)，揭示了38.8％的细胞得到了瞬态转染。正如预期，转染对照并未显示出任何Ig-к信号，因为所述转染对照无一经过Ig-表达结构转染。
对于IgH和IgL表达载体的转座，也通过电穿孔，以每种可转座IgH表达载体各5μg、5μg可转座IgL表达载体和5μg允许表达能够介导IgH和IgL表达载体转座的转座酶的表达载体，来对63-12细胞进行转染。该转染的结果也如图12所示。
用链霉亲和素-别藻蓝素(strep-APC)(Affymetrix,ebioscience,序列号#17-4317-82)检测生物素化抗人к轻链特异性抗体(Affymetrix,ebioscience,序列号#13-9970-82)，来检测在细胞表面的表达的人IgG。如图10中所示，左起第二栏所示的测量值是在电穿孔2天后，对以IgH+IgL+转座酶表达载体转染的细胞(标记为"d2post TF")的分析。转染两天后的FACS分析表明，1.8％-2.8％之间的细胞在细胞表面上表达了人IgH+IgL，因为仅在IgH链与IgL在细胞中共表达时，才能检测到IgL在细胞表面的表达，由此可以在细胞表面表达完整的IgG。
从该数据可以推论，若约38％的细胞瞬态转染，则所述细胞中约5-7.5％时以IgH和IgL表达载体共转染的。从该实验可以得出结论，可转座IgH和IgL表达结构能够在鼠A-MuLV转化的B祖细胞表面高水平表达人IgG，其与通过以相同抗体染色剂对人外周B淋巴细胞染色所得的表面IgG信号相仿。
不出所料，表达IgG的细胞也表达了EGFP，因为EGFP表达的转录通过IRES序列与IgH或IgL表达相关联。但是，与pEGFP-N3对照质粒中的EGFP表达相比，EGFP表达显著较低，这也是预料之中的，因为pEGFP-N3的EGFP表达直接由强组成型启动子驱动，而可转座IgH和IgL表达载体的EGFP表达，则是通过内部核糖体进入位点(IRES)与IgH和IgL编码区域的转录偶联。尽管如此，不出所料地，表现出更高IgG表达的细胞也表现出更高的EGFP信号(导致了略倾斜的Ig-к+/EGFP+群)，这清楚地表明两种表达水平的偶联。
若在转染1周后不经细胞分选就进行分析，则无法再检测到pEGFP-N3对照转染中的EGFP信号(数据未显示)，这表明细胞未以显著频率稳定整合表达载体。相反，以可转座IgH&IgL载体与转座酶表达载体共转染的细胞中，保留的IgG-EGFP双阳性细胞群低至约1-2％，这表明瞬态转染细胞中约3-6％的细胞同时将可转座IgH和IgL表达载体稳定整合在其基因组中(数据未显示)。
为了富集所述稳定转座的细胞，在转染2天后，按照所示的分选门控(左起第二栏FACS点图中的黑色三角形)对Ig-к轻链和EGFP双阳性细胞进行FACS分选。进入该门控的带有抗CD30mAb Ac10(顶行)和抗CD19mAb hBU12(中行)的IgH&IgL的PiggyBac转座细胞各分选5000个，带有抗CD30mAb Ac10(底行)的IgH&IgL的Sleeping Beauty转座细胞分选3000个，如图12所示。
FACS分选的细胞扩增1周(即转染后9天)，然后如上所述地以抗к轻链抗体检测IgG，从而再次分析表面IgG表达。如图10(右起第二栏)所示，超过30％、50％和5％的单次分选细胞在细胞表面稳定表达了IgG，同时，这些细胞还意料之中地表达了EGFP阳性。这表明，IgH&IgL瞬态共转染细胞中有显著百分比稳定保有IgG表达。该实验设置中，PiggyBac介导的转座的效率比Sleeping Beauty介导转座高约6-10倍。
从该转座实验可以得到若干其他结论：首先，在转染后2天分选得到的IgG/EGFP双阳性细胞中，约75％的细胞仍稳定保留了PiggyBac转座子中的EGFP+，且约40％和30％的PB-Ac10和PB-hBU12转座产生了缺乏IgG表面表达的EGFP+细胞。这些细胞很可能仅稳定转座了IgH和IgL两种可转座表达载体中的一种，从而不能在表面表达IgG，但足以使得这些细胞成为EGFP+。这还表明，在约38％起初瞬态转染的细胞中，至少5％稳定转染了至少一种可转座Ig表达载体。
Sleeping Beauty转座的稳定转座细胞数量低于PiggyBac转座细胞，且对IgH+IgL+转座酶共转染细胞的第一轮FACS分选，仅获得5％稳定表达IgG的细胞。但是，若还考虑到稳定的EGFP阳性细胞，则对Sleeping Beauty转座酶的第一轮FACS分选后约9％稳定转座细胞。
对所述稳定IgG阳性和IgH/IgL转座细胞再次FACS分选后，获得了超过99％的稳定表达IgG的细胞(图12，右栏)，且所述稳定表达表型保持了超过4个星期，没有发生IgG+细胞的百分比变化(数据未显示)。因此，可以认定，本发明中所公开的人IgH和IgL链的转座表达载体是功能性的且能够高效稳定整合在哺乳动物宿主细胞基因组中。
实施例8：通过特异性抗原结合富集稳定转座并表达IgG的细胞
为了展示了以上述实施例7中的IgH和IgL表达载体转座生成的人IgG表达B祖细胞能够用于抗原特异性细胞的分离，将表达抗CD30mAb(参见图12中d16,2x分选,63-12+PB-Ac10)的B祖细胞系63-12，以递减数目与表达抗CD19mAb(参见图12中d16,2x分选,63-12+PB-hBU12)B祖细胞系63-12以10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的比例混合(参加图13)。对含总数为107的细胞的1ml补充2％FCS的PBS，以下列试剂在冰上染色30分钟：
0.1μg 6x His标记的重组人CD30(Sino Biological Inc.,Bejing,China,产品号#10777-H08H)，以及
10μl鼠抗人Ig-кLC-APC标记抗体(Life Technologies,Invitrogen,产品号#MH10515)。
通过离心再以含2％FCS的PBS洗涤将所述初级试剂从细胞移除后，再在1ml补充2％FCS的PBS中，以下列次级试剂在冰上染色30分钟：
0.1μg生物素化抗His-标记抗体(IBA Life Sciences,Germany,产品号#2-1590-001)；
通过离心再以含2％FCS的PBS洗涤将所述次级试剂从细胞移除后，再在1ml补充2％FCS的PBS中，以下列次级试剂在冰上染色30分钟，以检测CD30-6xHis/抗His标记-生物素组合：
1/500稀释的链霉亲和素-藻红蛋白(strep-PE)试剂(Affymetrix ebioscience,产品号#12-4317-87)。
最终的FACS染色后，再次以含2％FCS的冰冷PBS洗涤细胞2次，然后以1ml补充2％FCS的PBS重悬浮，然后对细胞进行FACS分析，分选Ig-кLC/CD30阳性细胞(参见图13)。
如图13所公开的结果所示，右上方的阳性对照FACS图中，检测到IgG阳性和抗CD30反应性细胞的特异性种群，且预料之中地，表面IgG的FACS信号强度(通过抗Igк-APC检测)与抗CD30的FACS信号相关联，该细胞群表现出对角线染色模式。
抗CD30mAb表达细胞和抗CD19mAb表达细胞的混合物中，特异性抗CD30mAb表达细胞的稀释水平很好地反映在CD30右上角的CD30抗原特异性细胞频率和严格限定的FACS分选门控(右上角的黑色方块)中。随着特异性细胞稀释水平的递增(1:10'000,1:100'000,1:1'000'000)，CD30-反应性/IgG阳性细胞的极稀少发生很难在FACS-点图打印输出上看出，哪怕发生数目增加，如各点图中所示。但是，可检测CD30细胞与从其稀释因子所预期的频率关联良好。从结果可知，通过如上所述地转座介导在哺乳动物和B祖细胞表面表达人IgG，能够可靠地对表达抗原特异性抗体进行显示和抗原特异性检测。
图13中的FACS点图的底行，展示了对FACS分选后细胞的不同加标稀释实验再分析。如实验结果所示，1:100、1:1'000和1:10'000稀释的FACS分选后细胞的再分析结果表明，富集所得的细胞群几乎是相同的，这代表约90-95％抗原反应性细胞。对1：100000稀释比例FACS分选的细胞含有少量未落入IgG-阳性/CD30反应性细胞门控的另一细胞群，但在该实验中，约85％FACS分选细胞为抗原特异性IgG表达细胞。令人吃惊地，CD30反应性和IgG表达的最高纯度细胞来自FACS分选，其中仅1000000中的一个具有CD30抗原特异性，且仅分选出约14个细胞。这只能解释为，应当考虑到克隆效应，由此该分类并非IgG阳性-CD30反应性细胞的混合物，而是均为IgG阳性-CD30反应性细胞克隆的少量克隆。
尽管如此，特异性抗原介导染色、表达抗原特异性抗体细胞的鉴定及其通过FACS介导的细胞分选的成功富集，表明了本发明公开的方法用于分离表达期望结合性表型抗体的细胞的可行性。
实施例9：可用于从膜结合抗体转换到分泌抗体表达的可转座IgH表达载体的制备和使用说明
实施例1-4中公开的可转座Ig表达载体仅能够在哺乳动物细胞表面表达人IgG，从而抗体的结合性表型能够容易地通过如实施例8中所述的FACS法与细胞的抗原结合，或通过细胞盘选或批富集法(例如磁珠激活细胞分选，MACS)，来鉴定和富集。但是，通常需要对细胞表现出的分泌抗体形式的指定抗体的抗原结合性质在溶液中进行迅速分析。虽然可以对克隆到表达载体中以产生分泌IgG表达的抗原特异性细胞克隆相关VH和VL编码区域进行PCR扩增，但该方法耗费许多时间和劳力。
本发明的详细描述中，已经公开了可转座IgH表达结构能够用于通过基因组IgH链结构的可变剪接，将膜结合抗体表达天然“转换”为分泌抗体表达。
从膜结合抗体表达抗体表达转换到分泌抗体表达，可以如下达成：
人IgG1基因位点的原始基因组组建克隆到如上实施例4所公开的IgH表达载体中，而非人IgG1重链的基于cDNA表达组件。种系结构中的免疫球蛋白基因位点全长序列可以从人基因组工程的序列叠连群(contig)NT_010168中得到，该序列叠连群覆盖了位于染色体14上的人Ig重链位点。人IgG1重链基因位点从CH1域5’端的第一个氨基酸开始，直到第二跨膜外显子G1-M2的3’端的最后一个终止子下游500bp处结束，长度为5807个碱基对，不存在任何内部NheI或BstBI位点。因此，该基因位点可以用用于定向克隆的侧翼NheI和BstBI位点合成。所述基因合成片段可以直接用于替代pPB-EGFP-HC-Ac10(Seq-ID32)中的膜结合G1-恒定编码区中的cDNA编码区。
需合成的基因组人IgG1片段的DNA序列如下实施例末尾的Seq-ID40所示(5’-NheI和3’-BstBI位点以粗体字标出)。
人IgG1重链种系位点的外显子和内含子的结构，包括其跨膜外显子M1和M2，如图14所示。留在其原始基因组结构中的该基因组基因片段的编码和非编码区理应包括允许IgG1mRNA根据B谱系细胞分化阶段进行可变剪接的所有需要的顺式-调控元件，其中mRNA经过处理(Peterson et al.(2002)Mol.Cell.Biol.22,5606-5615)。将片段Seq-ID40克隆到可转座IgG1HC表达载体，可以通过以NheI和BstBI限制酶消化pPB-EGFP-HC-Ac10，并将Seq-ID40的基因组片段作为NheI-BstBI消化的片段连接到pPB-EGFP-HC-Ac10的NheI-BstBI线性化载体片段中，来替换pPB-EGFP-HC-Ac10中的C-G1编码区域。
该连接的结果如图14中的示意图所示，且该结构的序列如本实施例末尾的Seq-ID41所示。
A-MuLV转化的B祖细胞，例如63-12细胞，是一种利用基因组Ig-G1HC结构可变剪接天然机制的一种适合细胞系，因为，若Abl-激酶转化活性被抑制，其能够使得这些细胞的表型分化为更成熟的B谱系细胞。这尤其能够以Abl-激酶抑制剂格列卫(亦称为伊马替尼或STI-571)(Muljo and Schlissel(2003)NatureImmunol.4,31-37)来达成。但是，若以格列卫处理，A-MuLV转化的B祖细胞，其不仅抑制向更成熟B谱系节段的表型分化，该过程还关联到对凋亡的诱导(未发表数据)。这可以通过首先建立以bcl-2表达载体稳定转染的63-12A-MuLV转化的细胞系来预防。
小鼠bcl-2mRNA序列可以如NCBI-Genbank索引号NM_009741所示，且具有如本实施例末尾的序列Seq-ID42所示的序列。该开放阅读框翻译而成的氨基酸序列为Seq-ID43，也提供于本实施例末尾。
为了生成哺乳动物bcl-2表达载体，可以用不存在于bcl-2编码区域中的侧翼KpnI和XhoI限制酶位点来对鼠bcl-2编码区域进行基因合成，且可以将KpnI-XhoI双重消化的基因合成DNA片段连接到如上所述的pCDNA3.1-潮霉素(+)上，以生成能够稳定转染到63-12中的bcl-2哺乳动物表达载体，以选择bcl-2稳定转染子。
pCDNA3.1-潮霉素(+)表达载体的全场序列包含插入多克隆位点的KpnI和XhoI限制位点的鼠bcl-2基因，如本实施例末尾的Seq-ID44所示。
为了促进稳定转染子的生成，可以例如使用能令细菌氨苄青霉素抗性基因载体线性化的FspI酶，将该载体线性连接在bcl-2或潮霉素B表达组件外。可以取20μg所述线性化载体，以如上所述用于转染可转座载体的950μF/300V电穿孔，来将其转染到2x10663-12细胞中。电穿孔后，可以用100ml生长培养基稀释细胞，然后接种到5个96孔板上，每孔200μl，则接种为约4x103细胞/孔。
然后，可以在转染后48小时，添加800μg/ml潮霉素B，来筛选稳定转染子。2-3周后，所述实验中预期可获得约20-100个个体稳定转染细胞克隆。通过测量个体克隆接触0.1-1nM格列卫(伊马替尼或STI-571)的存活率的功能性测试，稳定bcl-2转染细胞克隆预防细胞凋亡功能性最佳。一旦鉴定出对格列卫(伊马替尼或STI-571)具有高抗性的63-12稳定bcl-2转染子，则该克隆可以用作宿主细胞，用于表达来自可转座基因组Ig-G1HC和Ig-K LC表达载体中的人IgG，例如，利用Seq-ID41和Seq-ID36所示的载体。
所述载体可以以PiggyBac表达载体(Seq-ID13)共转染到稳定Bcl-2转染的63-12细胞中，且可如上所述地建立稳定转座、表达IgG的细胞(等同与实施例7)。由于B祖细胞处于分化阶段，其中内源免疫球蛋白边大伟膜结合免疫球蛋白，可以预期，来自基因组结构的可转座Ig-G1HC表达载体所表达的Ig-HC也将表达为膜结合形式。
但是，若以0.1-1nM格列卫(伊马替尼或STI-571)处理所述细胞，则A-MuLV编码的Abl-激酶被特异性抑制，所述细胞不再被转化，而继续其内在程序向更成熟的B细胞分化阶段分化。在体外，该分化独立于功能性表达的Ig蛋白(Grawunder et al.(1995)Int.Immunol.7,1915-1925)。据发现，未转化B祖细胞的体外分化，使其对源自抗IL4和CD40刺激的T细胞做出应答，由此所述细胞甚至分化到进行类转换重组的浆细胞阶段细胞，且此时其可以与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤(Rolink et al.(1996)Immunity 5,319-330)。
这还意味着，通过稳定表达bcl-2获得凋亡抗性的A-MuLV转化63-12细胞，能够在格列卫处理同时以10μg/ml抗CD40抗体和100U/ml重组IL4培养(正如Rolink et al.(1996)Immunity 5,319-330所述)后分化为浆细胞阶段细胞。
该处理将诱导细胞分化程序的变化，将细胞可变剪接程序从膜结合IgG表达改变为基因组结构的Ig HC表达结构中的分泌IgG表达。这将允许分泌来自复制细胞克隆并以表面显示和抗原结合鉴定和分离的抗体，而无需再克隆选定细胞克隆的VH和VL编码区域，也无需将其连接到表达载体上才能分泌IgG抗体。这是无法容易地进入大多数哺乳动物细胞表达体系，尤其是基于病毒的表达体系的载体的功能性特征，其中所述延长基因组表达载体无法轻易插入。
实施例9中引用的序列：
Seq-ID40(5812bp长度的基因组人Igγ1重链基因)
Seq-ID41(基因组组态的可转座Ig-γ1-HC表达载体)
Seq-ID42(鼠bcl-2编码区域)
Seq-ID43(鼠bcl-2蛋白的氨基酸序列)
Seq-ID44(pCDNA3.1-潮霉素(+)-bcl2哺乳动物表达载体)
实施例10：PiggyBac转座载体形式的编码基础人抗体重链和轻链文库的载体的制备说明
为了制备编码人抗体重链和轻链的DNA文库的简单转座载体，仅需要分别替换实施例2的pIRES-EGFP-T1T2-IgL转座载体和实施例3的pIRES-EGFP-T1T2-IgH转座载体中的VL和VH区。为此，可以用ClaI和Eco47III限制性酶位点基因，以及通过允许某些HCDR和LCDR位点中的核苷酸变异，基因合成人VL和VH编码区域，如本实施例末尾提供的编码重链可变域文库的Seq-ID9和编码轻链可变域文库的Seq-ID10所示。所述两个序列的HCDR3(粗体)和L CDR3(粗体)中均分别包括一大片N序列。Seq-ID9和Seq-ID10两个序列的侧翼均分别为ClaI和Eco47III限制酶(下划线)，包括作为限制酶位点侧翼的4个核苷酸(以序列末尾的小写字母强调)，允许所述基因合成DNA片段的适当限制酶消化和分别定向连接至ClaI-Eco47III线性化pIRES-EGFP-T1T2-IgH和pIRES-EGFP-T1T2-IgL骨架上。
由此一来，可以制备在不同载体上编码抗体重链和轻链的多样化可转座DNA文库，其中抗体链的表达在转录水平上可操作性地连接到绿色荧光标记蛋白。
Seq-ID9(LCDR3编码位点处具有可变N-序列变异的VL域编码区域)
Seq-ID10(HCDR3编码位点处具有可变N-序列变异的VH域编码区域)
实施例11：基础Sleeping Beauty转座人Ig-к轻链表达文库的制备说明
为了制备编码人抗体轻链文库的多样化Sleeping Beauty转座DNA文库，实施例5的Sleeping Beauty转座载体pIRES-EGFP-sbT1T2-IgL的VL区需要替换为多样化VL基因库。为此，可以基因合成以ClaI和Eco47III限制酶位点为侧翼的人VL编码区，以及允许某些HCDR和LCDR位点上存在核苷酸变异来达成，如上述Seq-ID-10所示。所述Seq-ID-10序列以允许定向连接至ClaI-Eco47III线性化pIRES-EGFP-sbT1T2-IgL上的ClaI和Eco47III限制性酶为侧翼。由此一来，可以生成编码多样化人抗体轻链的Sleeping Beauty转座DNA文库。
由此一来，可以制备在不同载体上编码抗体重链和轻链的多样化可转座DNA文库，其中抗体链的表达在转录水平上可操作性地连接到绿色荧光标记蛋白。
实施例12：克隆转座IgL链表达文库
如下构建带随机化LCDR3区的V-к轻链文库。随机化6个氨基酸残基，即以密码子NNK(N＝任意核苷酸；K＝T或G)编码，所述密码子提供所有20个氨基酸。所述文库基于种系人Vк1-5和Jк2基因片段，且如下地随机化于框架3区域末尾的保守半胱氨酸和基于Jк2的框架4区域之间：Gln-Gln-(NNK)6-Thr。所述к轻链文库的序列和整体设计如图15所示。
编码к轻链文库的线性DNA分子由PCR生成。为此，通过基因全合成(执行：GenScript,Piscataway,NJ,USA)制备2个模版。另一方面，制备了包含克隆在pUC57(Genscript产品号#SD1176)的EcoRV位点的Vк1-5基因片段的合成结构，即pUC57_Vк1-5(SEQ-ID45)；另一方面，制备了包含融合在克隆到pUC57的EcoRV位点的Cк编码区域的Jк2基因片段的合成结构，即pUC57_Jк2-Cк(SEQ-ID46)。
包含Vк1-5基因片段的第一线性DNA是使用引物pUC57-1(5’-CGT TGTAAA ACG ACG GCC AG-3’)和LCDR3-B(5’-CTG TTG GCA GTA ATA AGTTGC-3’)从pUC57_Vк1-5进行PCR扩增而来。包含随机化CDR3区域(Gln-Gln-(NNK)6-Thr)、Jк2基因片段和Cк恒定区的第二线性DNA是使用引物LCDR3-NNK6-F(5’-GCA ACT TAT TAC TGC CAA CAG NNK NNK NNK NNKNNK NNK ACT TTT GGC CAG GGG ACC AAG-3’)和pUC57-2(5’-TCA CACAGG AAA CAG CTA TG-3’)从pUC57_Jк2-Cк扩增而来。为了防止由于引物LCDR3-NNK6-F的随机化区域而在pUC57_Jк2-Cк中引入序列偏移，该质粒首先通过用限制性酶ScaI消化来线性化(图17A)。
制得的DNA分子(SEQ-ID47和SEQ-ID48)具有21bp重叠，且使用引物pUC57-1和pUC57-2以PCR重叠延伸来组装，生成包含以NotI和AsuII(＝BstBI)限制行为点为侧翼的к轻链文库的DNA分子，如图15所示。所述Vк轻链文库的PCR扩增子进行PCR片段测序，结果如图18所示，通过随机化位点的重叠电泳图谱信号可知，的确如LCDR3位点设计那样地引入了期望多样性。该PCR片段以限制性内切酶NotI和BstBI(AsuII的同裂酶)进行消化，然后克隆到PiggyBac-转座载体pPB-EGFP_HC-g1(SEQ-ID049)中，得到由5.2x 107独立克隆组成的文库。该文库的大小可以容易地通过连接反应比例放大10倍。
包含不同随机化设计或包含除本实施例中所用以外的Vк和Jк基因片段的轻链文库，可以按相同方式制备。相似地，本申请所述方法可用于制备Vλ轻链文库。
实施例12中引用的DNA序列
SEQ-ID45(pUC57_Vк1-5)
SEQ-ID46(pUC57_Jк2-C-к)
SEQ-ID47(Vк1-5PCR产物)
SEQ-ID48(NNK6-Jк2-C-кPCR产物)
实施例13：不同HCDR3长度的转座IgH链表达文库的克隆
如下构建带有随机化HCDR3区域的人G1重链文库。随机化数个氨基酸残基，即以密码子NNK(N＝任意核苷酸；K＝T或G)编码，所述密码子提供所有20个氨基酸。所述文库基于VH3-30和JH4基因片段，且如下地随机化于框架3区域末尾的保守半胱氨酸残基和基于JH4的框架4区域之间：Ala-Lys/Arg-(NNK)n-Asp-NNK。以n＝4、6、8或10(NNK4、NNK6、NNK8和NNK10随机化)测试不同的HCDR3长度。所述γ重链文库的序列和整体设计如图16所示。
编码重链可变域(VH)文库的线性DNA分子由PCR生成。为此，通过基因全合成(执行：GenScript,Piscataway,NJ,USA)制备2个模版。另一方面，制备了包含克隆在pUC57的EcoRV位点的VH3-30基因片段的合成结构，即pUC57_VH3-30(SEQ-ID49)；另一方面，制备了包含融合在克隆到pUC57的EcoRV位点的JH4基因片段的合成结构，即pUC57_JH4(SEQ-ID50)。
包含VH3-30基因片段的第一线性DNA是使用引物VH3-30-F(5’-GAT ATCCAA TGC GGC CGC ATG-3’)和HCDR3-B(5’-CGC ACA GTA ATA CAC AGCCGT G-3’)从pUC57_VH3-30进行PCR扩增而来。包含融合在JH4基因片段上的随机化HCDR3区域(Ala-Lys/Arg-(NNK)4-Asp-NNK、Ala-Lys/Arg-(NNK)6-Asp-NNK、Ala-Lys/Arg-(NNK)8-Asp-NNK或Ala-Lys/Arg-(NNK)10-Asp-NNK)的另一线性DNA，是分别使用引物HCDR3-NNK4-F(5’-CAC GGC TGT GTA TTA CTG TGC GAR GNN KNN KNNKNN KGA CNN KTG GGG CCA AGG AAC CCT GGT C-3’)、HCDR3-NNK6-F(5’-CAC GGC TGT GTA TTA CTG TGC GAR GNN KNN KNN KNN KNN KNNKGA CNN KTG GGG CCA AGG AAC CCT GGT C-3’)、HCDR3-NNK8-F(5’-CAC GGC TGT GTA TTA CTG TGC GAR GNN KNN KNN KNN KNN KNNKNN KNN KGA CNN KTG GGG CCA AGG AAC CCT GGT C-3’)或HDR3-NNK10-F(5’-CAC GGC TGT GTA TTA CTG TGC GAR GNN KNN KNNKNN KNN KNN KNN KNN KNN KNN KGA CNN KTG GGG CCA AGG AACCCT GGT C-3’)，结合引物pUC57-3(5’-CAG GTT TCC CGA CTG GAA AG-3’)，从pUC57_JH4扩增而来。为了防止由于引物HCDR3-NNK4-F、HCDR3-NNK6-F、HCDR3-NNK8-F和HCDR3-NNK10-F的随机化区域的引导而在pUC57_JH4中引入序列偏移，该质粒首先通过用限制性酶DrdI消化来线性化(图17B)。
制得的VH3-30PCR产物(SEQ-ID51)与NNK4-JH4、NNK6-JH4、NNK8-JH4和NNK10-JH4PCR产物(SEQ-ID52to 55)具有21bp重叠，且各使用引物VH3-30-F和pUC57-3以4步单独反应的PCR重叠延伸来组装，生成包含以NotI和NheI限制行为点为侧翼的VH文库的DNA分子，如图16所示。使用NNK4-JH4、NNK6-JH4、NNK8-JH4and NNK10-JH4简并寡核苷酸通过PCRs所得的所有PCR扩增子，进行直接DNA测序，证实了如预期般地得到了设计性随机化的HCDR3位点。这如图18(B)所示的实施例所述，其中提供了跨HCDR3区域的电泳图谱。随机化位点展现出预期的序列峰值叠加图，表明了这些位点上的核苷酸多样性(图18)。以等摩尔比值混合4种不同的VH文库DNAs，以限制性内切酶NotI和NheI消化，并克隆到PiggyBac转座载体pPB-EGFP_HC-γ1(SEQ-ID22)中，γ1重链恒定区的上游，得到由3.7x 107独立克隆组成的文库。该文库的大小可以容易地通过连接反应比例放大10倍。
包含不同随机化设计或包含除本实施例中所用以外的VH和JH基因片段的重链文库，可以按相同方式制备。
实施例13中引用的DNA序列：
SEQ-ID49(pUC57_VH3-30)
SEQ-ID50(pUC57_JH4)
SEQ-ID51(VH3-30PCR产物)
SEQ-ID52(NNK4-JH4PCR产物)
SEQ-ID53(NNK6-JH4PCR产物)
SEQ-ID54(NNK8-JH4PCR产物)
SEQ-ID55(NNK10-JH4PCR产物)
实施例14：从富集后的抗原反应性稳定转座宿主细胞中鉴定可变轻链和重链编码区域
由于编码抗体重链和轻链的可转座表达载体在宿主细胞中的稳定整合，重链和轻链可变编码区可以用标准PCR扩增法和PCR扩增子直接测序法来直接再分离，或者再克隆后，从再克隆质粒载体中再分离。为此，分离所得的表达抗原特异性抗体的细胞或细胞克隆以1200x g离心5分钟。使用TRIzol试剂(Sigma-Aldrich)从所述细胞中分离总RNA。第一链cDNA可以用PowerScript(Clontech-Life Technologies)以寡核苷酸-dT引物合成。然后，可以使用引物SP-F(5’-GAG GAG GAG GCG GCC GCC ATG AAT TTT GGA C-3’)和CK-rev(5’-GAG GAG GAG TTC GAA AGC GCT AAC ACT CTC-3’)，用PCR扩增轻链编码区域，得到约740bp的扩增子，取决于PCR扩增子中包含的V-к区的长度。根据需要，可以用限制性内切酶NotI和BstBI来消化该PCR扩增子，并克隆到载体pPB-EGFP_HC-g1(Seq-ID22)中，以亚克隆PCR扩增子的个体克隆，用于进一步的序列鉴定。然后，个体V-к区克隆使用与克隆的V编码区域上游的EF1-α启动子结合的引物pPB-seq13(5’-GGC CAG CTT GGC ACT TGA TG-3’)进行测序。
可以用如上所述制得的cDNA，用引物SP-F(5’-GAG GAG GAG GCG GCCGCC ATG AAT TTT GGA C-3’)和CG-revseq-1(5’-GTT CGG GGA AGT AGTCCT TG-3’)来PCR扩增重链可变域，得到期望大小为约530bp的PCR扩增子，取决于该PCR扩增子中所含的VH域长度。根据需要，可以用限制性内切酶NotI和NheI消化限制性内切酶，并将其克隆到载体pPB-EGFP_HC-g1(Seq-ID22)中。各克隆然后使用与克隆V-编码区域上游的EF1-α启动子结合的引物pPB-seq13(5’-GGC CAG CTT GGC ACT TGA TG-3’)进行VH区域测序。
本发明的实施例
1.一种用于识别具有期望的结合特异性或功能性的多肽的方法，包括以下步骤：
(i)生成多核苷酸的多样化集合，所述多核苷酸编码具有不同结合特异性或功能性的多肽，其中所述多核苷酸包含一种编码位于第一和第二末端反向重复序列之间的多肽的序列，且所述第一和第二末端反向重复序列被至少一种转座酶识别并作用；
(ii)将(i)所述的多核苷酸的多样化集合引入宿主细胞中；
(iii)在所述宿主细胞中表达至少一种作用于所述末端反向重复序列的转座酶，从而令所述多样化多核苷酸集合被整合入所述宿主细胞基因组，以提供表达所述编码具有不同结合特异性或功能性的多肽的多样化多核苷酸集合的宿主细胞群；
(iv)筛选所述宿主细胞，以识别表达具有期望结合特异性或功能性的多肽的宿主细胞；以及
(v)从所述宿主细胞分离编码所述多肽的多核苷酸序列。
2.根据1所述的方法，其中所述多核苷酸为DNA分子。
3.根据1所述的方法，其中所述多核苷酸包括受体的配体结合序列或结合性分子的目标结合序列。
4.根据1所述的方法，其中所述多核苷酸包括抗体的抗原结合序列
5.根据1所述的方法，其中所述多核苷酸包括编码抗体的VH或VL区、或其抗原结合片段的序列。
6.根据1所述的方法，其中所述多核苷酸包括编码抗体VH区和抗体VL区的序列。
7.根据1所述的方法，其中所述多核苷酸包括编码全长免疫球蛋白重链或轻链，或其抗原结合片段的序列。
.8根据1所述的方法，其中所述多核苷酸包括编码单链Fv或Fab域的序列。
9.根据1所述的方法，其中所述生成所述多样化多核苷酸集合，包括：在诱变处理条件下，对V区基因序列进行PCR。
10.根据1所述的方法，其中所述生成所述多核苷酸多样化集合包括基因合成。
11.根据1所述的方法，其中所述生成所述多核苷酸多样化集合包括对脊椎动物B细胞的V区库的PCR扩增。
12.根据1所述的方法，其中所述多核苷酸多样化集合包括质粒载体。
13.根据1所述的方法，其中所述多核苷酸多样化集合包括双链DNA PCR扩增子。
14.根据1所述的方法，其中所述抗原结合序列来自脊椎动物。
15.根据1所述的方法，其中所述抗原结合序列来自哺乳动物。
16.根据1所述的方法，其中所述抗原结合序列来自人。
17.根据12所述的方法，其中所述质粒载体进一步编码标记基因。
18.根据17所述的方法，其中所述标记选自：荧光标记、细胞表面标记和选择性标记。
19.根据17所述的方法，其中所述标记基因位于编码具有结合特异性或功能性的多肽的序列的上游或下游，但位于末端反向重复序列之间。
20.根据17所述的方法，其中所述标记基因序列可以位于所述编码具有结合特异性或功能性的多肽的序列的下游并由内部核糖体进入位点隔开。
21.根据1所述的方法，其中所述步骤(ii)包括向所述宿主细胞引入多核苷酸，所述多核苷酸包含的序列编码：免疫球蛋白VH或VL区，或其抗原结合片段，且其中所述VH和VL区序列分开编码在各自的载体上。
22.根据1所述的方法，其中所述步骤(ii)包括向所述宿主细胞引入多核苷酸，所述多核苷酸包含的序列编码：全长免疫球蛋白重链或轻链，或其抗原结合片段的序列，其中所述全长重链和轻链序列分别位于各自的载体上。
23.根据21所述的方法，其中包括VH序列的所述载体和包括VL序列的所述载体同时引入所述宿主细胞。
24.根据21所述的方法，其中所述包含VH序列的载体和包含VL序列的载体先后引入所述宿主细胞中。
25.根据1所述的方法，其中所述步骤(ii)包括向所述宿主细胞引入包含编码抗体的VH和VL链的序列的载体。
26.根据1所述的方法，其中所述步骤(ii)包括向所述宿主细胞引入包含编码全长免疫球蛋白重链和全长免疫球蛋白轻链的序列的载体。
27.根据1所述的方法，其中包含VH序列的所述载体包括末端反向重复序列，且识别所述末端反向重复序列的转座酶与包含VL序列的载体中的末端反向重复序列的转座酶不同。
28.根据1所述的方法，其中步骤(ii)的宿主细胞为脊椎动物细胞。
29.根据28所述的方法，其中所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
30.根据29所述的方法，其中所述宿主细胞为人或啮齿类细胞。
31.根据28所述的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞为淋巴细胞。
32.根据31所述的方法，其中所述宿主细胞为B细胞。
33.根据32所述的方法，其中所述宿主细胞为B祖细胞或B前体细胞。
34.根据33所述的方法，其中所述宿主细胞选自：阿贝尔森-鼠白血病病毒转化的B前体细胞或B祖细胞，以及早期免疫球蛋白无效EBV转化的人B祖细胞和B前体细胞。
35.根据32所述的方法，其中所述宿主细胞选自：Sp2/0细胞、NS0细胞、X63细胞、Ag8653细胞。
36.根据29所述的方法，其中所述宿主细胞选自CHO细胞、Per.C6细胞、BHK细胞和293细胞。
37.根据1所述的方法，其中所述表达步骤(iii)包括向所述宿主细胞引入编码转座酶的表达载体，所述转座酶识别并作用于至少一个末端反向重复序列。
38.根据37所述的方法，其中所述编码所述转座酶的载体在所述多样化多核苷酸集合同时、之前或之后引入所述载体细胞。
39.根据37所述的方法，其中所述转座酶在所述宿主细胞中瞬态表达。
40.根据1所述的方法，其中所述表达步骤(iii)包括引入稳定整合在宿主细胞中的诱导表达体系。
41.根据40所述的方法，其中所述诱导表达体系是四环素-诱导或他莫昔芬诱导体系。
42.根据1所述的方法，其中所述筛选步骤(iv)包含磁性激活细胞分选(MACS)、荧光激活细胞分选(FACS)、盘选固定于固体表面的分子、对与并入天然或人工重建的细胞磷脂双层膜的细胞膜相关分子的结合的选择，或以多孔形式对个体细胞克隆进行期望功能或结合性表型的高通量筛选。
43.根据1所述的方法，其中所述筛选步骤(iv)包括筛选鉴定具有期望靶向结合特异性或功能性的多肽。
44.根据1所述的方法，其中所述筛选步骤(iv)包括筛选鉴定具有期望抗原特异性的抗原结合分子。
45.根据44所述的方法，其中所述筛选步骤进一步包括筛选鉴定具有一种或多种期望功能性质的抗原结合分子。
46.根据1所述的方法，其中所述筛选步骤(iv)包括多个细胞富集循环，且单次细胞循环之间进行宿主细胞扩增。
47.根据1所述的方法，其中所述步骤(v)中所述从所述宿主细胞分离编码具有期望的结合特异性或功能性的多肽的多核苷酸序列，包括基因组扩增或RT-PCR扩增或下一代深度测序。
48.根据1所述的方法，进一步包括(vi)对(v)中获得的多核苷酸序列进行亲和性优化。
49.根据48所述的方法，其中所述亲和性优化包括诱变条件下的基因组PCR或RT-PCR。
50.根据49所述的方法，进一步包括令诱变序列经过权利要求1的步骤(i)-(v)。
51.根据1所述的方法，其中所述末端反向重复序列来自PiggyBac转座子体系。
52.根据51所述的方法，其中编码上游PiggyBac末端反向重复序列的序列包括SEQ ID NO:1。
53.根据51所述的方法，其中编码下游PiggyBac末端反向重复序列的序列包括SEQ ID NO:2。
54.根据5所述的方法，其中所述VH或VL区序列编码源自人抗TNFα抗体的序列。
55.根据54所述的方法，其中所述人抗TNFα抗体为D2E7。
56.根据55所述的方法，其中D2E7的VH和VL区由不同的转座载体编码。
57.根据1所述的方法，其中编码VL区序列的所述载体包括SEQ ID NO:5。
58.根据56所述的方法，其中编码VH区序列的所述载体包括SEQ IDNO:8。
59.根据56所述的方法，其中编码所述VH区序列的所述载体包括如SEQID NO:9所示的随机化序列。
60.根据56所述的方法，其中编码所述VL区序列的所述载体包括如SEQ IDNO:10所示的随机化序列。
61.根据1所述的方法，其中步骤(iii)包括，向所述宿主细胞引入包含编码功能性PiggyBac转座酶或Sleeping Beauty转座酶的序列的载体。
62.根据61所述的方法，其中所述载体包括SEQ ID NO:11。
63.根据61所述的方法，其中所述载体编码SEQ ID NO:12，或具有至少95％氨基酸序列同源性并具有相同或相似的末端反向重复序列特异性的序列
64.根据1所述的方法，其中所述末端反向重复序列被以下至少一个转座酶识别并对其有功能：PiggyBac、Sleeping Beauty、Frog Prince、Himar1、Passport、Minos、hAT、Tol1、Tol2、Ac/Ds、PIF、Harbinger、Harbinger3-DR和Hsmar1。
65.编码具有不同结合特异性或功能性的多肽的多核苷酸分子文库，包括：多个多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子包含编码具有结合特异性或功能性且位于末端反向重复序列之间的多肽的序列，所述末端反向重复序列可被至少一个转座酶识别并作用。
66.根据65所述的文库，其中所述多核苷酸为DNA分子。
67.根据65所述的文库，其中所述多核苷酸包括受体的配体结合序列或结合性分子的靶向结合序列。
68.根据65所述的文库，其中所述多核苷酸包括至少一个编码抗体的抗原结合序列的序列。
69.根据65所述的文库，其中所述多核苷酸包括编码抗体的VH或VL区、或其抗原结合片段的序列。
70.根据65所述的文库，其中所述多核苷酸包括编码抗体VH区和抗体VL区的序列。
71.根据65所述的文库，其中所述多核苷酸包括编码全长免疫球蛋白重链或轻链，或其抗原结合片段的序列。
72.根据65所述的文库，其中所述多核苷酸包括编码单链Fv或Fab域的序列。
73.根据65所述的文库，其中所述多核苷酸分子为质粒。
74.根据65所述的文库，其中所述多核苷酸分子为双链DNA PCR扩增子。
75.根据73所述的文库，其中所述质粒还包括编码标记基因的序列。
76.根据73所述的文库，其中所述质粒或双链DNA PCR扩增子进一步包含编码识别并作用于所述末端反向重复序列的转座酶的序列。
77.用于生成编码具有不同结合特异性或功能性的多肽的可转座的多核苷酸的方法，包括：
(i)生成包含编码具有不同结合特异性或功能性的多肽的序列的多核苷酸的多样化集合，其中所述多核苷酸包含编码具有结合特异性或功能性并位于末端反向重复序列之间的多肽的序列，所述末端反向重复序列可被至少一个转座酶识别并作用。
78.包含编码抗体的VH或VL区、或其抗原结合部分的序列的载体，所述序列位于末端反向重复序列之间并可被至少一个转座酶识别并作用。
79.根据78所述的载体，包括编码免疫球蛋白全长轻链或重链的序列。
80.根据78所述的载体，其中所述VH或VL区序列是随机化的。
81.根据78所述的载体，其中所述末端反向重复序列由PiggyBac转座酶识别并作用。
82.根据78所述的载体，其中所述VH或VL区域序列源自抗TNFα抗体。
83.根据82所述的载体，其中所述抗体为D2E7。
84.根据78所述的载体，包括至少一个选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19的序列。
85.含有上述第78-84项中任一项所述的载体的宿主细胞。
86.根据85所述的宿主细胞，包括含有编码能够识别并作用于至少一个编码所述VH或VL区序列的末端反向重复序列的转座酶的序列的表达载体。
87.由包含第1项的方法所制得的抗体。
88.根据1所述方法，其中所述末端反向重复序列来自Sleeping Beauty转座子体系。
89.根据88所述方法，其中编码上游Sleeping Beauty末端反向重复序列的序列包括SEQ ID NO:14。
90.根据88所述方法，其中编码下游Sleeping Beauty末端反向重复序列的序列包括SEQ ID NO:15。
91.根据88所述方法，其中步骤(iii)包括在所述宿主细胞中表达含有SleepingBeauty功能性转座子的载体。
92.根据48所述方法，其中步骤(v)中所得的多核苷酸序列包括编码抗体VH或VL区、或其抗原结合片段的序列，且其中所述载体优化包括向所述VH或VL的互补决定区或骨架区中引入一个或多个突变。
93.根据71所述的文库，其中所述全长免疫球蛋白重链包括抗体重链的天然内含子/外显子结构。
94.根据93所述的文库，其中所述全长免疫球蛋白重链包括内源膜锚定域。
95.用于生成能够表达具有不同结合特异性或功能性的多肽的宿主细胞群的方法，包括：
(i)生成多核苷酸的多样化集合，所述多核苷酸包含编码具有不同结合特异性或功能性的多肽的序列，其中所述多核苷酸包含一种编码具有结合特异性或功能性、并位于末端反向重复序列之间的多肽的序列，所述末端反向重复序列被至少一种转座酶识别并作用；
(ii)将所述多核苷酸的多样化集合引入宿主细胞中。
96.根据78所述的载体，其中由Sleeping Beauty转座酶识别并作用于所述末端反向重复序列。
97.根据91所述的方法，其中步骤(iii)包括在所述宿主细胞中表达包含SEQ ID NO:17的载体。
98.根据91所述的方法，其中所述载体编码了SEQ ID NO:18，或具有至少95％氨基酸序列同源性并具有相同或相似的末端反向重复序列特异性的序列。

Claims (20)

1.一种用于识别具有期望的结合特异性或功能性的多肽的方法，包括以下步骤：
(i)生成多核苷酸的多样化集合，优选为质粒载体或双链DNA PCR扩增子，所述多核苷酸编码具有不同结合特异性或功能性的多肽，其中所述多核苷酸包含编码位于第一和第二末端反向重复序列之间的多肽的序列，且所述第一和第二末端反向重复序列被至少一种转座酶识别并作用；
(ii)将(i)所述的多核苷酸的多样化集合引入宿主细胞中；
(iii)在所述宿主细胞中表达至少一种作用于所述末端反向重复序列的转座酶，从而令所述多核苷酸的多样化集合被整合到所述宿主细胞基因组中，以提供表达所述编码具有不同结合特异性或功能性的多肽的多核苷酸的多样化集合的宿主细胞群；
(iv)筛选所述宿主细胞，以识别表达具有期望的结合特异性或功能性的多肽的宿主细胞；以及
(v)从所述宿主细胞分离出编码所述多肽的多核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸包括：
a)受体的配体结合序列或结合性分子的目标结合序列；
b)抗体的抗原结合序列；
c)编码抗体的VH或VL区、或其抗原结合片段的序列；
d)编码抗体VH区和抗体VL区的序列；
e)编码全长免疫球蛋白重链或轻链，或其抗原结合片段的序列，和/或
f)编码单链Fv或Fab域的序列。
3.根据前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，生成多核苷酸的多样化集合包括：在诱变处理条件下，对V区基因序列进行PCR。
4.根据前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述步骤(ii)包括向所述宿主细胞中引入多核苷酸，所述多核苷酸包含的序列编码：
a)免疫球蛋白VH或VL区，或其抗原结合片段，且其中所述VH和VL区序列分开编码在各自的载体上，和/或
b)全长免疫球蛋白重链或轻链，或其抗原结合片段的序列，其中所述全长重链和轻链序列位于分离的载体上；
c)包含编码抗体的VH和VL链的序列的载体；
d)包含编码全长免疫球蛋白重链和全长免疫球蛋白轻链的序列的载体。
5.根据前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述表达步骤(iii)包括向所述宿主细胞中引入编码转座酶的表达载体，所述转座酶识别并作用于至少一个末端反向重复序列，其中所述转座酶优选为在所述宿主细胞中瞬态表达。
6.根据前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述筛选步骤(iv)包含磁性激活细胞分选(MACS)、荧光激活细胞分选(FACS)、盘选固定于固体表面的分子、对与并入天然或人工重建的细胞磷脂双层膜的细胞膜相关分子的结合的选择，或以多孔形式对个体细胞克隆进行期望功能或结合性表型的高通量筛选。
7.根据前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，分离出编码具有期望的结合特异性或功能性的多肽的多核苷酸序列的所述步骤(v)包括基因组扩增或RT-PCR扩增或下一代深度测序。
8.根据前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于：
a)所述末端反向重复序列来自PiggyBac转座子体系或Sleeping Beauty转座子体系，和/或
b)步骤(iii)包括向所述宿主细胞中引入包含编码功能性PiggyBac转座酶或Sleeping Beauty转座酶的序列的载体。
9.根据前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述末端反向重复序列被以下至少一个转座酶识别并作用：PiggyBac、Sleeping Beauty、Frog Prince、Himar1、Passport、Minos、hAT、Tol1、Tol2、Ac/Ds、PIF、Harbinger、Harbinger3-DR和Hsmar1。
10.编码具有不同结合特异性或功能性的多肽的多核苷酸分子文库，包括：多个多核苷酸分子，优选为质粒或双链DNA PCR扩增子，其中所述多核苷酸分子包含编码具有结合特异性或功能性且位于末端反向重复序列之间的多肽的序列，所述末端反向重复序列可被至少一个转座酶识别并作用。
11.根据权利要求10所述的文库，其特征在于，所述多核苷酸包括：
a)编码抗体的抗原结合序列的至少一个序列；
b)编码抗体的VH或VL区、或其抗原结合片段的序列；
c)编码抗体VH区和抗体VL区的序列；
d)编码全长免疫球蛋白重链或轻链、或其抗原结合片段的序列，和/或
e)编码单链Fv或Fab域的序列。
12.根据权利要求10或11所述的文库，其特征在于，所述质粒或双链DNAPCR扩增子进一步包含编码识别并作用于所述末端反向重复序列的转座酶的序列。
13.用于生成编码具有不同结合特异性或功能性的多肽的可转座的多核苷酸的方法，包括：生成包含编码具有不同结合特异性或功能性的多肽的序列的多核苷酸的多样化集合，其中所述多核苷酸包含编码具有结合特异性或功能性并位于末端反向重复序列之间的多肽的序列，所述末端反向重复序列可被至少一个转座酶识别并作用。
14.包含编码抗体的VH或VL区、或其抗原结合部分的序列的载体，所述序列位于末端反向重复序列之间并可被至少一个转座酶识别并作用。
15.包含权利要求14所述的载体的宿主细胞。
16.按照权利要求1-9中任一项所述的方法制得的抗体。
17.用于生成能够表达具有不同结合特异性或功能性的多肽的宿主细胞群的方法，包括：
(i)生成多核苷酸的多样化集合，所述多核苷酸包含编码具有不同结合特异性或功能性的多肽的序列，其中所述多核苷酸包含一种编码具有结合特异性或功能性并位于末端反向重复序列之间的多肽的序列，所述末端反向重复序列被至少一种转座酶识别并作用；
(ii)将所述多核苷酸的多样化集合引入宿主细胞中。
18.根据前述任一项权利要求所述的方法、载体或抗体，其特征在于，所述VH或VL区序列编码来自人抗TNFα抗体的序列，优选为来自D2E7，且其中所述D2E7的VH和VL区优选为由分开的转座载体编码。
19.根据前述任一项权利要求所述的方法或载体，其特征在于，所述载体包含含有末端反向重复序列的VH序列，所述末端反向重复序列与包含VL序列的载体中的末端反向重复序列相比，可由不同的转座酶识别。
20.根据前述任一项权利要求所述的方法或宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为脊椎动物细胞，优选为哺乳动物细胞，更优选为人或啮齿类动物细胞，更优选为淋巴细胞，更优选为B细胞，更优选为B祖细胞或B前体细胞，尤其优选为阿贝尔森鼠白血病病毒转化的B祖细胞或B前体细胞，以及免疫球蛋白无效EBV转化的人B祖细胞或B前体细胞。
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