KR101323563B1

KR101323563B1 - 항체를 생산하는 트랜스제닉 누에와 그의 제조방법

Info

Publication number: KR101323563B1
Application number: KR1020087011688A
Authority: KR
Inventors: 도시키 다무라; 이사오 고바야시; 도시오 간다; 게이로 우치노; 가쯔히로 가타야마; 다쯔야 오하시; 이와오 기요카와; 히사에 아라이; 노리유키 후나하시
Original assignee: 니토 보세키 가부시기가이샤; 독립행정법인농업생물자원연구소
Priority date: 2005-10-18
Filing date: 2006-10-18
Publication date: 2013-10-29
Also published as: US8952215B2; EP1947180A4; WO2007046439A1; EP1947180A1; JP2013230155A; US20110021757A1; CN101331228B; JPWO2007046439A1; CN101331228A; JP5760273B2; KR20080083111A; EP1947180B1

Abstract

견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에로서, 상기 재조합 항체를 견사선에 분비하는 트랜스제닉 누에를 제작하였다. 이 트랜스제닉 누에의 견사선으로부터 생산된 재조합 항체는 활성을 갖는 것이 확인되었다.

Description

항체를 생산하는 트랜스제닉 누에와 그의 제조방법{Antibody-producing transgenic silkworms and methods for producing the same}

본 발명은 포유류가 만드는 항체에 가까운 항체를 대량으로 생산하는 것이 가능한, 누에를 이용한 재조합 항체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 재조합 항체를 생산하는 트랜스제닉 누에에 관한 것이다.

최근, 의약품이나 진단제 분야에 있어서, 병의 치료나 진단에 특이성이 높은 항체가 대량으로 필요해지고 있다. 항체는 일반적으로, 마우스나 랫트, 토끼 등의 포유동물을 사용하여 제작되나, 최근, 미생물이나 포유류의 세포, 재조합 동물, 재조합 식물 등에 의한 항체의 생산이 행해지도록 되어 왔다. 재조합 항체에는, 같은 품질의 것을 대량으로 제작할 수 있고, 바이러스 등의 병이 유입되지 않으므로 안전하다는 등의 특징이 있어, 향후 중요성이 증가할 것으로 생각되고 있다.

그러나 그 한편으로, 문제점도 많이 내포하고 있다. 예를 들면, 대장균 등의 미생물에 있어서는 항체의 일부밖에 생산되지 않고, 또한, 제작된 항체 자체도 당사슬이나 인산화가 불충분하므로, 의약품이나 진단제 용도로서는 충분히 적절하다고는 할 수 없다. 또한, 인간의 항체는 일반적으로, 대장균 등으로 만드는 경우는 불용화하는 것이 알려져 있다. 이로 인해, 정제에 있어서는, SDS 등의 변성제로 단 백질을 가용화시키는 공정이나, 용액 중의 변성제를 투석 등으로 서서히 제거하여 단백질로서의 활성을 되돌리게 하는 공정이 필요하다.

또한, 포유류의 세포를 사용하면 생산비용이 높아지므로, 대량생산은 곤란한 상황이다. 이로 인해, 재조합 동물이나 식물 등을 사용한 항체 생산이 시도되고 있으나, 모두 연구단계에 그치고 있다. 다른 진핵생물의 세포 등을 사용한 경우에도, 세포 외에 분비시키기 위해, 특수한 시그널이 필요하다.

누에는 견사선(絹絲腺)이라는 기관을 갖고, 한 마리당 최대 0.5 g의 단백질을 만드는 능력이 있다. 최근, 재조합 누에의 제작기술이 개발되고, 외래 유전자의 도입법이나 도입 유전자의 발현 제어법의 개발이 진행되어서, 견사선에서 도입 유전자를 발현시켜, 재조합 단백질을 생산하는 것이 가능해져 왔다. 누에는 진핵생물이므로, 대장균 등의 미생물이나 식물과 비교하면, 포유류에 가까운 형태의 단백질을 만들 수 있다. 또한, 인공사료를 사용한 청정사육이 가능하고, 수만 마리 레벨의 대량사육을 용이하게 행할 수 있다.

특허문헌 1: 일본국 특허공개 제2006-137739 다무라 도시키, 세즈츠 히데키, 고바야시 이사오, 고지마 가츠라, 간다 도시오, 우치노 게이로(2005) 누에 중부 견사선 특이적 유전자 발현계를 이용한 단백질의 제조방법. 출원일: 2005년 3월 15일. 출원인: 농업 생물자원 연구소

비특허문헌 1: 다무라 도시키(1999) 트랜스포존(transposon)을 이용한 형질전환 누에의 제작방법. 제7회 곤충기능연구회 강연 요지, p10-22.

비특허문헌 2: Tamura, T., Thibert, C., Royer, C., Kanda, T., Abraham, E., Kamba, M., Komoto, N., Thomas, J.-L., Mauchamp, B., Chavancy, G., Shirk, P., Fraser, M., Prudhomme, J.-C., and Couble, P.(2000) A piggyBac element-derived vector efficiently promotes germ-line transformation in the silkworm Bombyx mori L. Nature Biotechnology 18, 81-84

비특허문헌 3: Tomita M, M. H., Sato T, Adachi T, Hino R, Hayashi M, Shimizu K, Nakamura N, Tamura T, Yoshizato K.(2003) Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. Nat Biotechnol 21, 52-56

비특허문헌 4: 다무라 도시키(2000) 트랜스제닉 누에: 현상과 전망. 일본 누에잡지(日蠶雜) 69, 1-12.

비특허문헌 5: 다무라 도시키(2000) 누에 발생에 있어서의 유용 유전자 도입. 제21회 기초 육종 심포지엄 보고: 동식물 분자 육종에 있어서의 발생공학적 수법의 전개. p23-29.

비특허문헌 6: Tamura, T., Quan, G.X., Kanda, T., and Kuwabara, N.(2001) Transgenic silkworm research in Japan: Recent progress and future. Proceeding of Joint International Symposium of Insect COE Research Program and Insect Factory Research Project. p77-82.

비특허문헌 7: Imamura, M., Nakai, J., Inoue, S., Quan, G-X., Kanda T., and Tamura, T.(2003) Targeted gene expression using the Gal4/UAS system in the silkworm Bombyx mori. Genetics, 165, 1329-1340.

비특허문헌 8: 다무라 도시키(2004) 재조합체 누에를 이용한 유용물질의 생산계의 개발과 그의 전망. 바이오 인더스트리 20(3), 28-35.

비특허문헌 9: 다무라 도시키·우치노 게이로·간다 도시오·고바야시 이사오·고지마 가츠라(2004) 효모의 GAL4/UAS계를 이용한 중부 견사선 특이적 유전자의 발현계의 제작. 일본 누에 강요(日蠶講要) 74, p51.

비특허문헌 10: 다무라 도시키(2004) 트랜스제닉 누에 제작법이 확립! 새로운 기능을 갖는 섬유의 생산에 기대. 화학과 생물 42, 634-635.

비특허문헌 11: 다무라 도시키(2004) 트랜스제닉 누에의 제작과 유용물질의 생산. 바이오 로직스: 생체 유래 물질을 사용한 제품개발(고분자학회편) pp45-68.

비특허문헌 12: 우에다 가츠미(2004) 항체 엔지니어링의 최전선. p122. CMC 출판, 도쿄

비특허문헌 13: I. Kiyokawa, I. Kobayashi, K. Uchino, H. Sezutsu, T. Kanda, T. Tamura, T. Miura, T. Ohashi, K. Katayama(2006) Production of hexokinase and anti-human transferrin antibody for clinical diagnostic reagent using transgenic silkworm. Abstracts of the 7th International Workshop on the Molecular Biology and Genetics of the Lepidoptera, p94.

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

이와 같이, 재조합 항체의 중요성이 증가하고 있음에도 불구하고, 재조합 항체의 제조에는 수많은 과제가 있다. 본 발명은 이와 같은 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 재조합 누에를 이용하여, 포유류가 만드는 항체에 가까운 재조합 항체를 대량으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 행하였다. 구체적으로는, 견사선 특이적으로 발현하는 유전자의 상류를 프로모터 영역으로서 사용하고, 이것을 GAL4 유전자의 상류에 삽입하였다. 추가적으로, 재조합 누에 제작용의 벡터 플라스미드에 이 융합 유전자를 삽입하였다. 재조합 누에의 제작은 다무라들(2000)의 방법에 의해 행하였다. 얻어진 재조합 누에를, 다무라들(2003)의 방법으로 제작된 GAL4의 표적 서열 UAS 하류에 트랜스페린(Transferrin)과 반응하는 scFv형 항체 유전자를 갖는 UASFvaTf 계통과 교배하였다. 교배에 의해 얻어진 재조합 누에의 토사기(吐絲期)의 견사선으로부터 추출한 샘플에 대해서, 웨스턴 블로팅을 행한 결과, 견사선에서 항체가 생산되고 있는 것이 확인되었다. 또한, 동일하게 얻어진 추출 샘플을 항원과 반응시킨 결과, 견사선 추출물의 양이 증가하는데 수반하여 항원과의 반응물의 양이 증가하여, 항체로서의 활성을 갖고 있는 것을 알 수 있었다.

즉 본 발명은, 누에의 견사선에 있어서 재조합 단백질의 제조방법에 관한 것으로, 이하의 [1]~[49]를 제공하는 것이다.

[1] 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 재조합 항체의 제조방법;

(a) 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA가 도입된 트랜스제닉 누에를 제조하는 공정,

(b) 제조된 트랜스제닉 누에로부터, 상기 재조합 항체를 회수하는 공정.

[2] 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 재조합 항체의 제조방법;

(a) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에로서, 상기 재조합 항체를 견사선에 분비하는 트랜스제닉 누에를 제조하는 공정,

[3] 트랜스제닉 누에가, 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에인 [2]에 기재의 방법;

(i) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA,

(ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA.

[4] 트랜스제닉 누에가, 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 트랜스제닉 누에를 교배시킴으로써 제조되는 [2]에 기재의 방법;

(i) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합하는 전사제어인자를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에,

(ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에.

[5] 전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인 [3] 또는 [4]에 기재의 방법.

[6] 견사선이 중부 견사선 또는 후부 견사선인 [2]~[5] 중 어느 하나에 기재의 방법.

[7] 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 세리신(sericin) 1 단백질 또는 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 [6]에 기재의 방법.

[7-1] 세리신 1 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 이하의 (a) 또는 (b)인 [7]에 기재의 방법;

(a) 서열번호: 16에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA,

(b) 서열번호: 16에 기재의 염기서열에 있어서 1 또는 복수의 염기가 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입된 염기서열을 포함하는 DNA.

[7-2] 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 이하의 (a) 또는 (b)인 [7]에 기재의 방법;

(a) 서열번호: 17에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA,

(b) 서열번호: 17에 기재의 염기서열에 있어서 1 또는 복수의 염기가 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입된 염기서열을 포함하는 DNA.

[8] 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 피브로인(fibroin) 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 [6]에 기재의 방법.

[8-1] 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 이하의 (a) 또는 (b)인 [8]에 기재의 방법;

(a) 서열번호: 18에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA,

(b) 서열번호: 18에 기재의 염기서열에 있어서 1 또는 복수의 염기가 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입된 염기서열을 포함하는 DNA.

[9] 시그널 서열을 갖는 재조합 항체.

[9-1] 시그널 서열이 동물 유래인 [9]에 기재의 항체.

[9-2] 시그널 서열이 동물 항체 유래인 [9]에 기재의 항체.

[9-3] 시그널 서열이 인간 산성 포스파타아제의 시그널 서열, 마우스 면역글로불린 L 사슬 κ의 시그널 서열, 또는 마우스 IgG1의 시그널 서열인 [9]에 기재의 항체.

[10] 전장 항체 또는 저분자 항체인 [9]에 기재의 항체.

[10-1] 저분자화 항체가 scFv형 항체인 [10]에 기재의 항체.

[10-2] 단일 사슬 폴리펩티드의 N 말단측을 기점으로서, 시그널 서열, VH, 링커, VL, 또는 시그널 서열, VL, 링커, VH의 순으로 나열되어 있는 것을 특징으로 하는 [10-1]에 기재의 scFv형 항체.

[10-3] 항원이 트랜스페린, CRP, IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, 알부민, 프리알부민, 보체 C3, 보체 C4, α-1 마이크로글로불린, β-2 마이크로글로불린, AFP, CA 19-9, CA 15-3, PSA, 아포리포프로테인, 종양괴사인자, 인터류킨, 인터페론, 오스테오폰틴, HBs 항원, RF, HCG, 콜라겐, Hb, HbA1c, HCV 항체, 트로포닌, 미오글로빈, FDP, CEA, c-erbB-2, 합토글로빈(haptoglobin)인 [10]에 기재의 scFv형 항체.

[10-4] VH, 링커, VL이 각각, 서열번호: 6, 9, 12에 기재의 아미노산 서열을 포함하는 [10-3]에 기재의 scFv형 항체.

[10-5] 시그널 서열이 서열번호: 3, 21, 및 29 중 어느 하나에 기재의 아미노산 서열을 포함하는, [10-3]에 기재의 scFv형 항체.

[10-6] 서열번호: 15에 기재의 아미노산 서열을 포함하는 scFv형 항체.

[10-7] 시그널 서열로서 서열번호: 3, 21, 및 29 중 어느 하나에 기재의 아미노산 서열을 갖는 L 사슬, 및 시그널 서열로서 서열번호: 3, 21, 및 29 중 어느 하나에 기재의 아미노산 서열을 갖는 H 사슬을 포함하는 항체.

[10-8] 시그널 서열로서 서열번호: 3, 21, 및 29 중 어느 하나에 기재의 아미노산 서열, L 사슬 가변영역으로서 서열번호: 23에 기재의 아미노산 서열, Jκ 세그먼트로서 서열번호: 25에 기재의 아미노산 서열, κ 사슬 정상영역으로서 서열번호: 27에 기재의 아미노산 서열을 갖는 L 사슬, 및 시그널 서열로서 서열번호: 3, 21, 및 29 중 어느 하나에 기재의 아미노산 서열, H 사슬 가변영역으로서 서열번호: 31에 기재의 아미노산 서열, CH1으로서 서열번호: 33에 기재의 아미노산 서열, 힌지영역으로서 서열번호: 35에 기재의 아미노산 서열, CH2로서 서열번호: 37에 기재의 아미노산 서열, CH3로서 서열번호: 39에 기재의 아미노산 서열을 갖는 H 사슬을 포함하는 항체.

[10-9] 서열번호: 49에 기재의 아미노산 서열을 갖는 L 사슬, 및 서열번호: 51에 기재의 아미노산 서열을 갖는 H 사슬을 포함하는 항체.

[11] [9]~[10-9] 중 어느 하나에 기재의 항체를 코드하는 DNA.

[11-1] 시그널 서열로서 서열번호: 2, 20, 및 28 중 어느 하나에 기재의 염기서열, VH로서 서열번호: 5에 기재의 염기서열, 링커로서 서열번호: 8에 기재의 염기서열, VL로서 서열번호: 11에 기재의 염기서열을 포함하는, scFv형 항체를 코드하는 DNA.

[11-2] 시그널 서열로서 서열번호: 1, 20, 및 28 중 어느 하나에 기재의 염기서열, VH로서 서열번호: 4에 기재의 염기서열, 링커로서 서열번호: 7에 기재의 염기서열, VL로서 서열번호: 10에 기재의 염기서열을 포함하는, scFv형 항체를 코드하는 DNA.

[11-3] 서열번호: 14에 기재의 염기서열을 포함하는, scFv형 항체를 코드하는 DNA.

[11-4] 서열번호: 13에 기재의 염기서열을 포함하는, scFv형 항체를 코드하는 DNA.

[11-5] 시그널 서열로서 서열번호: 1, 2, 20, 및 28 중 어느 하나에 기재의 염기서열을 갖는 DNA로서 항체 L 사슬을 코드하는 DNA, 및 시그널 서열로서 서열번호: 1, 2, 20, 및 28 중 어느 하나에 기재의 염기서열을 갖는 DNA로서 항체 H 사슬을 코드하는 DNA를 포함하는 DNA.

[11-6] 시그널 서열로서 서열번호: 1, 2, 20, 및 28 중 어느 하나에 기재의 염기서열, L 사슬 가변영역으로서 서열번호: 22에 기재의 염기서열, Jκ 세그먼트로서 서열번호: 24에 기재의 염기서열, κ 사슬 정상영역으로서 서열번호: 26에 기재의 염기서열을 갖는 DNA로서 항체 L 사슬을 코드하는 DNA, 및 시그널 서열로서 서열번호: 1, 2, 20, 및 28 중 어느 하나에 기재의 염기서열, H 사슬 가변영역으로서 서열번호: 30에 기재의 염기서열, CH1으로서 서열번호: 32에 기재의 염기서열, 힌지영역으로서 서열번호: 34에 기재의 염기서열, CH2로서 서열번호: 36에 기재의 염기서열, CH3로서 서열번호: 38에 기재의 염기서열을 갖는 DNA로서 항체 H 사슬을 코드하는 DNA를 포함하는 DNA.

[11-7] 항체 L 사슬로서 서열번호: 48에 기재의 염기서열을 갖는 DNA, 및 항체 H 사슬로서 서열번호: 50에 기재의 염기서열을 갖는 DNA를 포함하는 DNA.

[12] [11]~[11-7] 중 어느 하나에 기재의 DNA를 갖는 벡터.

[13] [12]에 기재의 벡터를 보유하는 세포.

[14] 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 누에알을 제조하는 공정을 포함하는, 상기 재조합 항체를 분비하는 트랜스제닉 누에의 제조방법.

[15] 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 누에알을 제조하는 공정을 포함하는, 상기 재조합 항체를 견사선에 분비하는 트랜스제닉 누에의 제조방법.

[16] 트랜스제닉 누에가, 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에인 [15]에 기재의 방법;

[17] 트랜스제닉 누에가, 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 트랜스제닉 누에를 교배시킴으로써 제조되는 [15]에 기재의 방법;

(i) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에,

[18] 전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인 [16] 또는 [17]에 기재의 방법.

[19] 견사선이 중부 견사선 또는 후부 견사선인 [15]~[18] 중 어느 하나에 기재의 방법.

[20] 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 세리신 1 단백질 또는 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 [19]에 기재의 방법.

[20-1] 세리신 1 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 이하의 (a) 또는 (b)인 [20]에 기재의 방법;

(a) 서열번호: 16에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA,

[20-2] 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 이하의 (a) 또는 (b)인 [20]에 기재의 방법;

(a) 서열번호: 17에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA,

[21] 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 [19]에 기재의 방법.

[21-1] 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 이하의 (a) 또는 (b)인 [21]에 기재의 방법;

(a) 서열번호: 18에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA,

[22] 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에로서, 상기 재조합 항체를 분비하는 트랜스제닉 누에.

[23] 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에로서, 상기 재조합 항체를 견사선에 분비하는 트랜스제닉 누에.

[24] 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 DNA를 갖는 [23]에 기재의 트랜스제닉 누에;

[25] 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 트랜스제닉 누에를 교배시킴으로써 제조되는 [23]에 기재의 트랜스제닉 누에;

[26] 전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인 [24] 또는 [25]에 기재의 트랜스제닉 누에.

[27] 견사선이 중부 견사선 또는 후부 견사선인 [23]~[26] 중 어느 하나에 기재의 트랜스제닉 누에.

[28] 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 세리신 1 단백질 또는 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 [27]에 기재의 트랜스제닉 누에.

[28-1] 세리신 1 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 이하의 (a) 또는 (b)인 [28]에 기재의 트랜스제닉 누에;

(a) 서열번호: 16에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA,

[28-2] 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 이하의 (a) 또는 (b)인 [28]에 기재의 트랜스제닉 누에;

(a) 서열번호: 17에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA,

[29] 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 [27]에 기재의 트랜스제닉 누에.

[29-1] 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 이하의 (a) 또는 (b)인 [29]에 기재의 트랜스제닉 누에;

(a) 서열번호: 18에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA,

[30] 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에.

[31] 전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인 [30]에 기재의 트랜스제닉 누에.

[32] 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 재조합 항체의 제조방법;

(a) 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에로서, 상기 재조합 항체를 지방체(脂肪體)에 분비하는 트랜스제닉 누에를 제조하는 공정,

[33] 트랜스제닉 누에가, 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에인 [32]에 기재의 방법;

(i) 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA,

[34] 트랜스제닉 누에가, 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 트랜스제닉 누에를 교배시킴으로써 제조되는 [32]에 기재의 방법;

(i) 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에,

[35] 전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인 [33] 또는 [34]에 기재의 방법.

[35-1] 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 이하의 (a) 또는 (b)인 [35]에 기재의 방법;

(a) 서열번호: 19에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA,

(b) 서열번호: 19에 기재의 염기서열에 있어서 1 또는 복수의 염기가 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입된 염기서열을 포함하는 DNA.

[36] 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 누에알을 제조하는 공정을 포함하는, 상기 재조합 항체를 지방체에 분비하는 트랜스제닉 누에의 제조방법.

[37] 트랜스제닉 누에가, 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에인 [36]에 기재의 방법;

[38] 트랜스제닉 누에가, 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 트랜스제닉 누에를 교배시킴으로써 제조되는 [36]에 기재의 방법;

[39] 전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인 [37] 또는 [38]에 기재의 방법.

[39-1] 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 이하의 (a) 또는 (b)인 [39]에 기재의 방법;

(a) 서열번호: 19에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA,

[40] 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에로서, 상기 재조합 항체를 지방체에 분비하는 트랜스제닉 누에.

[41] 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 DNA를 갖는 [40]에 기재의 트랜스제닉 누에;

[42] 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 트랜스제닉 누에를 교배시킴으로써 제조되는 [40]에 기재의 트랜스제닉 누에;

[43] 전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인 [41] 또는 [42]에 기재의 트랜스제닉 누에.

[43-1] 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 이하의 (a) 또는 (b)인 [43]에 기재의 방법;

(a) 서열번호: 19에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA,

[44] 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 생체 중 트랜스페린의 양을 측정하는 방법;

(a) [9]~[10-9] 중 어느 하나에 기재의 항체, 또는 [1]~[8-1], [32]~[35-1], [50]~[57-1] 또는 [76]~[79-1] 중 어느 하나에 기재의 방법에 따라 제조된 항체와, 피험자 유래의 생체시료를 접촉시키는 공정,

(b) 생체시료 중 트랜스페린과 항체의 결합을 검출하는 공정.

[45] 정상인 대조와 비교해서 트랜스페린의 양이 많을 때, 당뇨병성 신증(腎症)에 이환(罹患)되어 있거나, 또는 이환 위험이 높다고 판정되는 것을 특징으로 하는, 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 당뇨병성 신증을 진단하는 방법;

(a) [9]~[10-9] 중 어느 하나에 기재의 항체, 또는 [1]~[8-1], [32]~[35-1], [50]~[57-1] 또는 [76]~[79-1] 중 어느 하나에 기재의 방법에 따라 제조된 항체와, 피험자로부터 얻은 생체시료를 접촉시키는 공정,

(b) 생체시료 중 트랜스페린과 결합한 항체를 검출하는 공정.

[46] 당뇨병성 신증에 이환되어 있는 것이 명확한 대조와 비교해서 트랜스페린의 양이 동 정도일 때, 당뇨병성 신증에 이환되어 있거나, 또는 이환 위험이 높다고 판정되는 것을 특징으로 하는, 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 당뇨병성 신증을 진단하는 방법;

[47] 정상인 대조와 비교해서 트랜스페린의 양이 적을 때, 영양장애의 위험이 높거나, 또는 영양장애에 빠져 있다고 판정되는 것을 특징으로 하는, 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 영양상태를 평가하는 방법;

[48] [9]~[10-9] 중 어느 하나에 기재의 항체, 또는 [1]~[8-1], [32]~[35-1], [50]~[57-1] 또는 [76]~[79-1] 중 어느 하나에 기재의 방법에 따라 제조된 항체를 유효성분으로서 함유하는, 당뇨병성 신증의 진단제.

[49] [9]~[10-9] 중 어느 하나에 기재의 항체, 또는 [1]~[8-1], [32]~[35-1], [50]~[57-1] 또는 [76]~[79-1] 중 어느 하나에 기재의 방법에 따라 제조된 항체를 유효성분으로서 함유하는, 영양상태를 평가하기 위한 시약.

[50] 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 재조합 항체의 제조방법;

(a) 재조합 항체를 코드하는 DNA가 도입된 트랜스제닉 누에를 제조하는 공정,

[51] 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 재조합 항체의 제조방법;

(a) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에로서, 상기 재조합 항체를 견사선에 분비하는 트랜스제닉 누에를 제조하는 공정,

[52] 트랜스제닉 누에가, 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에인 [51]에 기재의 방법;

(ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 재조합 항체를 코드하는 DNA.

[53] 트랜스제닉 누에가, 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 트랜스제닉 누에를 교배시킴으로써 제조되는 [51]에 기재의 방법;

(ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에.

[54] 전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인 [52] 또는 [53]에 기재의 방법.

[55] 견사선이 중부 견사선 또는 후부 견사선인 [51]~[54] 중 어느 하나에 기재의 방법.

[56] 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 세리신 1 단백질 또는 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 [55]에 기재의 방법.

[56-1] 세리신 1 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 이하의 (a) 또는 (b)인 [56]에 기재의 방법;

(a) 서열번호: 16에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA,

[56-2] 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 이하의 (a) 또는 (b)인 [56]에 기재의 방법;

(a) 서열번호: 17에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA,

[57] 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 [55]에 기재의 방법.

[57-1] 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 이하의 (a) 또는 (b)인 [57]에 기재의 방법;

(a) 서열번호: 18에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA,

[58] 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 누에알을 제조하는 공정을 포함하는, 상기 재조합 항체를 분비하는 트랜스제닉 누에의 제조방법.

[59] 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 누에알을 제조하는 공정을 포함하는, 상기 재조합 항체를 견사선에 분비하는 트랜스제닉 누에의 제조방법.

[60] 트랜스제닉 누에가, 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에인 [59]에 기재의 방법;

[61] 트랜스제닉 누에가, 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 트랜스제닉 누에를 교배시킴으로써 제조되는 [59]에 기재의 방법;

[62] 전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인 [60] 또는 [61]에 기재의 방법.

[63] 견사선이 중부 견사선 또는 후부 견사선인 [59]~[62] 중 어느 하나에 기재의 방법.

[64] 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 세리신 1 단백질 또는 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 [63]에 기재의 방법.

[64-1] 세리신 1 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 이하의 (a) 또는 (b)인 [64]에 기재의 방법;

(a) 서열번호: 16에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA,

[64-2] 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 이하의 (a) 또는 (b)인 [64]에 기재의 방법;

(a) 서열번호: 17에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA,

[65] 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 [63]에 기재의 방법.

[65-1] 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 이하의 (a) 또는 (b)인 [65]에 기재의 방법;

(a) 서열번호: 18에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA,

[66] 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에로서, 상기 재조합 항체를 분비하는 트랜스제닉 누에.

[67] 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에로서, 상기 재조합 항체를 견사선에 분비하는 트랜스제닉 누에.

[68] 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 DNA를 갖는 [67]에 기재의 트랜스제닉 누에;

[69] 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 트랜스제닉 누에를 교배시킴으로써 제조되는 [67]에 기재의 트랜스제닉 누에;

[70] 전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인 [68] 또는 [69]에 기재의 트랜스제닉 누에.

[71] 견사선이 중부 견사선 또는 후부 견사선인 [67]~[70] 중 어느 하나에 기재의 트랜스제닉 누에.

[72] 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 세리신 1 단백질 또는 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 [71]에 기재의 트랜스제닉 누에.

[72-1] 세리신 1 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 이하의 (a) 또는 (b)인 [72]에 기재의 트랜스제닉 누에;

(a) 서열번호: 16에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA,

[72-2] 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 이하의 (a) 또는 (b)인 [72]에 기재의 트랜스제닉 누에;

(a) 서열번호: 17에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA,

[73] 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 [71]에 기재의 트랜스제닉 누에.

[73-1] 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 이하의 (a) 또는 (b)인 [73]에 기재의 트랜스제닉 누에;

(a) 서열번호: 18에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA,

[74] 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에.

[75] 전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인 [74]에 기재의 트랜스제닉 누에.

[76] 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 재조합 항체의 제조방법;

(a) 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에로서, 상기 재조합 항체를 지방체에 분비하는 트랜스제닉 누에를 제조하는 공정,

[77] 트랜스제닉 누에가, 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에인 [76]에 기재의 방법;

[78] 트랜스제닉 누에가, 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 트랜스제닉 누에를 교배시킴으로써 제조되는 [76]에 기재의 방법;

[79] 전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인 [77] 또는 [78]에 기재의 방법.

[79-1] 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 이하의 (a) 또는 (b)인 [79]에 기재의 방법;

(a) 서열번호: 19에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA,

[80] 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 누에알을 제조하는 공정을 포함하는, 상기 재조합 항체를 지방체에 분비하는 트랜스제닉 누에의 제조방법.

[81] 트랜스제닉 누에가, 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에인 [80]에 기재의 방법;

[82] 트랜스제닉 누에가, 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 트랜스제닉 누에를 교배시킴으로써 제조되는 [80]에 기재의 방법;

[83] 전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인 [81] 또는 [82]에 기재의 방법.

[83-1] 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 이하의 (a) 또는 (b)인 [83]에 기재의 방법;

(a) 서열번호: 19에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA,

[84] 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에로서, 상기 재조합 항체를 지방체에 분비하는 트랜스제닉 누에.

[85] 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 DNA를 갖는 [84]에 기재의 트랜스제닉 누에;

[86] 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 트랜스제닉 누에를 교배시킴으로써 제조되는 [84]에 기재의 트랜스제닉 누에;

[87] 전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인 [85] 또는 [86]에 기재의 트랜스제닉 누에.

[87-1] 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 이하의 (a) 또는 (b)인 [87]에 기재의 방법;

(a) 서열번호: 19에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA,

[88] [1]~[8-1], [32]~[35-1], [50]~[57-1] 또는 [76]~[87-1] 중 어느 하나에 기재의 방법에 의해 제조된 항체.

도면의 간단한 설명

도 1은 재조합 누에 제작을 위한 벡터 pUASFvaTf의 구조 및 그의 구축순서를 나타내는 도면이다.

도 2는 Ser1GAL4 계통과 UASFvaTf 계통의 교배에 의한 항체 발현 누에의 제작을 나타내는 도면이다.

도 3은 GAL4 유전자를 갖는 개체와 UAS를 갖는 개체의 실체 형광현미경 사진이다.

도 4는 RT-PCR에 의한 교잡계통에 있어서 FvaTf 유전자의 전사 확인을 나타내는 사진이다.

도 5는 웨스턴 블로팅에 의한 항체 단백질의 동정(同定)을 나타내는 사진이다.

도 6은 ELISA에 의한 재조합 항체의 항원에 대한 활성의 측정결과를 나타내는 도면이다.

도 7은 재조합 누에 제작을 위한 항체 유전자의 L 사슬을 코드하는 플라스미드 벡터 pBacN/lox p UASIgL SV40의 구조 및 그의 구축순서를 나타내는 도면이다.

도 8은 재조합 누에 제작을 위한 항체 유전자의 H 사슬을 코드하는 플라스미드 벡터 pDNA/UAS IgH SV40의 구조 및 그의 구축순서를 나타내는 도면이다.

도 9는 항체 유전자 재조합 누에 제작을 위한 벡터 pBacN/lox p UASIgL UASIgH의 구조 및 그의 구축순서를 나타내는 도면이다.

도 10은 Ser1GAL4 계통과 UASIgH 계통의 교배에 의한 항체 발현 누에의 제작을 나타내는 도면이다.

도 11은 GAL4 유전자를 갖는 개체와 UAS를 갖는 개체의 실체 형광현미경 사진이다.

도 12는 RT-PCR에 의한 교잡계통에 있어서의 IgL 유전자 및 IgH 유전자의 전사 확인을 나타내는 사진이다.

도 13은 교잡계통이 발현한 재조합 항체가 IgG1이고 또한 L 사슬로서의 면역원성이 kappa인 것을 나타내는 사진이다.

도 14는 ELISA에 의한 재조합 항체의 항원에 대한 활성의 측정결과를 나타내는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명은 누에를 이용한 재조합 항체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은, 본 발명자들상기 재조합 누에의 체내에 있어서 활성을 갖는 항체를 생산시키는 것에 성공한 것을 토대로 한다. 즉 본 발명은 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 재조합 항체의 제조방법을 제공한다.

(a) 재조합 항체를 코드하는 DNA가 도입된 트랜스제닉 누에를 제조하는 공정.

또한 본 발명은 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 재조합 항체의 제조방법을 제공한다.

(a) 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA가 도입된 트랜스제닉 누에를 제조하는 공정.

본 발명의 재조합 항체의 제조방법 중 하나의 구체적인 태양에 있어서는, 재조합 항체는 누에의 견사선에서 생산되는 것을 특징으로 한다. 즉 본 발명은 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 재조합 항체의 제조방법에 관한 것이다.

(a) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에로서, 상기 재조합 항체를 견사선에 분비하는 트랜스제닉 누에를 제조하는 공정.

또한 본 발명은 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 재조합 항체의 제조방법에 관한 것이다.

(a) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에로서, 상기 재조합 항체를 견사선에 분비하는 트랜스제닉 누에를 제조하는 공정.

본 발명의 트랜스제닉 누에를 제조하는 공정에 있어서는, 먼저, 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 재조합 항체(바람직하게는 시그널 서열을 갖는 재조합 항체)를 코드하는 DNA를 갖는 누에알을 제조한다. 이어서, 제조된 누에알로부터 생성된 누에 중에서, 상기 재조합 항체를 견사선에 분비하는 트랜스제닉 누에를 선택한다.

본 발명에 있어서, 트랜스제닉 누에를 선택하는 데에는, 예를 들면 선택 마커를 사용하여 행할 수 있다. 본 발명에 있어서의 선택 마커로서는, 당업자에 있어서 일반적으로 사용되는 마커, 예를 들면 CFP, GFP, YFP, DsRed 등의 형광단백질을 사용할 수 있다. 이들 마커를 사용함으로써, 실체 형광현미경으로 관찰하는 것만으로 트랜스제닉 누에를 검출할 수 있다. 또한, 형광색이 상이하므로 복수의 마커를 동시에 사용하는 것도 가능하다.

본 발명의 방법에 의해 제조하는 것이 가능한 항체에는, 전장 항체(whole antibody, 예를 들면 whole IgG 등) 및 저분자화된 항체 양쪽이 포함된다. 본 발명에 있어서, 전장 항체의 유래는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 당나귀, 염소, 말, 새, 개, 고양이 등에 유래하는 항체를 제조하는 것이 가능하다. 또한 항체의 아이소타입(isotype)도 한정되지 않아, 예를 들면 인간의 경우, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM의 아이소타입 항체를 제조하는 것이 가능하다. 본 발명의 전장 항체는, 실시예 및 도 13에 나타내는 바와 같이, 정상영역, 예를 들면 보체 의존성 세포장애활성이나 항체의존성 세포장애활성을 갖는 정상영역, 및 도 14에 나타내는 바와 같이 항원을 인식하는 가변영역을 포함하는 항체이다.

한편 본 발명의 저분자화 항체는 전장 항체의 일부분이 결손되어 있는 항체 단편을 포함하고, 항원으로의 결합능을 갖고 있으면 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 항체 단편은 전장 항체의 일부분이면 특별히 한정되지 않으나, 중쇄가변영역(VH) 또는/및 경쇄가변영역(VL)을 포함하고 있는 것이 바람직하다. VH 또는 VL의 아미노산 서열은 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입이 되어 있어도 된다. 추가적으로 항원으로의 결합능을 갖는 한, VH 또는/및 VL의 일부를 결손시켜도 된다. 또한, 가변영역은 키메라화나 인간화되어 있어도 된다. 항체 단편의 구체예로서는, 예를 들면 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 등을 들 수 있다. 또한, 저분자화 항체의 구체예로서는, 예를 들면 Fab, Fab', Fv, F(ab')2, scFv(single chain Fv), 디아바디(Diabody), sc(Fv)2(single chain(Fv)2) 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서 특히 바람직한 저분자화 항체는 scFv 항체이다.

여기서 「Fv」 단편은 최소의 항체 단편으로, 완전한 항원 인식부위와 결합부위를 포함한다. 「Fv」 단편은 1개의 VH 및 VL이 비공유 결합에 의해 강하게 연결된 다이머(VH-VL 다이머)이다. 각 가변영역의 3개의 상보성 결정영역(complementarity determining region; CDR)이 상호작용하여, VH-VL 다이머의 표면에 항원 결합부위를 형성한다. 6개의 CDR이 항체에 항원 결합부위를 부여하고 있다. 그러나, 1개의 가변영역(또는, 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)이어도, 전(全) 결합부위보다도 친화성은 낮으나, 항원을 인식하고, 결합하는 능력을 갖는다.

scFv에는 항체의 VH 및 VL이 포함되고, 이들의 영역은 단일의 폴리펩티드 사슬 중에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 추가적으로 VH 및 VL 사이에 폴리펩티드 링커를 포함하고 있고, 이에 의해 scFv는 항원결합을 위해 필요한 구조를 형성할 수 있다(scFv의 총설에 대해서는, Pluckthun 『The Pharmacology of Monoclonal Antibodies』 Vol.113(Rosenburg and Moore ed(Springer Verlag, New York) pp.269-315, 1994)을 참조). 본 발명에 있어서의 링커는, 그 양쪽 말단에 연결된 항체 가변영역의 발현을 저해하는 것이 아니라면 특별히 한정되지 않는다.

VH와 VL의 순서는 특별히 상기 배치에 한정되지 않고, 어떤 순서로 나열되어 있어도 된다. 예를 들면 이하와 같은 배치를 들 수 있다.

N 말단-시그널 서열-[VH]-링커-[VL]-C 말단

N 말단-시그널 서열-[VL]-링커-[VH]-C 말단

본 발명의 scFv 항체는, 1개의 VH 및 1개의 VL이, 단일 사슬 펩티드의 N 말단측을 기점으로서 VH, VL([VH]링커[VL])의 순서로 나열되어 있는 것을 특징으로 하는 항체가 바람직하다. 본 발명의 scFv는, 전장 항체나 다른 저분자화 항체와 비교해서, 특히 높은 항체활성을 나타낸다.

항체의 가변영역을 결합하는 링커로서는, 유전자공학에 의해 도입할 수 있는 임의의 펩티드 링커, 또는 합성화합물 링커(예를 들면, Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996에 개시되는 링커 등)를 사용할 수 있으나, 본 발명에 있어서는 펩티드 링커가 바람직하다. 펩티드 링커의 길이는 특별히 한정되지 않고, 목적에 따라 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하나, 통상 1~100 아미노산, 바람직하게는 3~50 아미노산, 더욱 바람직하게는 5~30 아미노산, 특히 바람직하게는 12~18 아미노산(예를 들면, 15 아미노산)이다. 본 발명에 있어서의 링커로서는, 예를 들면 서열번호: 9에 기재의 아미노산 서열을 포함하는 링커를 들 수 있다.

또한, 본 발명 재조합 항체의 바람직한 태양으로서, 인간 항체, 마우스 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 인간 및 마우스 이외의 항체 등의 개변 항체를 들 수 있다.

키메라 항체는, 상이한 동물 유래의 서열을 조합해서 제작되는 항체로서, 예를 들면 마우스 항체의 중쇄, 경쇄의 가변영역과 인간 항체의 중쇄, 경쇄의 정상영역으로 되는 항체 등이다. 키메라 항체의 제작은 공지의 방법을 사용하여 행할 수 있고, 예를 들면 항체 V영역을 코드하는 DNA와 인간 항체 C영역을 코드하는 DNA를 연결하고, 이것을 발현벡터에 삽입하고 숙주에 도입하여 생산시킴으로써 얻어진다.

인간화 항체는, 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 칭해지고, 이것은 인간 이외의 포유동물, 예를 들면 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDR: complementarity determining region)을 인간 항체의 상보성 결정영역으로 이식한 것으로, 그 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다(유럽특허 출원공개번호 EP 125023호 공보, WO 96/02576호 공보 참조).

구체적으로는, 마우스 항체의 CDR과 인간 항체의 프레임워크 영역(framework region; FR)을 연결하도록 설계한 DNA 서열을, CDR 및 FR 양쪽의 말단영역에 오버랩하는 부분을 갖도록 제작한 수개의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하여 PCR법에 의해 합성한다(WO 98/13388호 공보에 기재의 방법을 참조).

CDR을 매개로 하여 연결되는 인간 항체의 프레임워크 영역은, 상보성 결정영역이 양호한 항원 결합부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라서, 재구성 인간 항체의 상보성 결정영역이 적절한 항원 결합부위를 형성하도록, 항체의 가변영역에 있어서 프레임워크 영역의 아미노산을 치환해도 된다(Sato, K. et al., Cancer Res.(1993) 53, 851-856).

키메라 항체 및 인간화 항체의 정상영역에는, 인간 항체의 것이 사용되고, 예를 들면 H 사슬에서는 Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4를, L 사슬에서는 Cκ, Cλ을 사용할 수 있다. 또한, 항체 또는 그의 생산 안정성을 개선하기 위해, 인간 항체 정상영역을 수식해도 된다.

일반적으로, 키메라 항체는 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 가변영역과 인간 항체 유래의 정상영역으로 된다. 한편, 인간화 항체는 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 상보성 결정영역과, 인간 항체 유래의 프레임워크 영역 및 정상영역으로 된다.

또한, 키메라 항체나 인간화 항체를 제작한 후에, 가변영역(예를 들면, FR)이나 정상영역 중의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환 등 해도 된다.

키메라 항체에 있어서의 가변영역, 또는 인간화 항체에 있어서의 CDR 유래는 특별히 한정되지 않고, 어느 동물 유래여도 된다. 예를 들면, 마우스 항체, 랫트 항체, 토끼 항체, 낙타 항체 등의 서열을 사용하는 것이 가능하다. 본 발명에 있어서는, 이것에 한정하는 것은 아니나, 바람직하게는 항체로서 마우스 항체를 들 수 있다.

본 발명에 있어서 제조되는 항체(전장 항체, 저분자 항체)가 결합하는 항원도, 특별히 한정되는 것은 아니다. 당업자이면, 주지의 기술을 사용하여 목적의 항원에 결합하는 항체를 설계하는 것이 가능하다. 본 발명은, 이와 같이 주지의 기술에 의해 목적의 항원에 결합하도록 설계된 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 이 방법에 의해 제조되는 항체에 관한 것이다.

또한 본 발명에 있어서는, 하나의 예로서 인간 트랜스페린에 결합하는 항체를 제조하였다. scFv형 항 인간 트랜스페린 항체의 H 사슬 가변영역의 아미노산 서열을 서열번호: 6에, scFv형 항 인간 트랜스페린 항체의 L 사슬 가변영역의 아미노산 서열을 서열번호: 12에 나타내었다. 또한, IgG1 항체의 H 사슬 가변영역의 아미노산 서열을 서열번호: 31에, L 사슬 가변영역의 아미노산 서열을 서열번호: 23에 나타내었다. 이와 같은 항체는 후술하는 바와 같이, 예를 들면 당뇨병성 신증의 진단제, 생체 중 트랜스페린의 양의 측정, 영양 어세스먼트의 평가 등 질환의 진단 등의 용도에 사용할 수 있다.

한편, 본 발명에 있어서 제공되는 항체의 다른 태양 중 하나의 예로서, CEA(carcinoembryonic antigen)에 결합하는 항체를 드는 것도 가능하다. CEA는 현재, 종양 마커로서 널리 사용되고 있다. 종양 마커 스펙트럼은 위암, 식도암 등의 소화기계 종양뿐 아니라, 폐암 등의 호흡기 순환기계 종양 등 다양한 장기에 발현한다. 따라서 CEA에 결합하는 항체는 종양 재발의 발견이나 치료경과 관찰에 유용하다. 그 외에, c-erbB-2에 결합하는 항체를 드는 것도 가능하다. c-erbB-2는 유약화(blastogenesis)된 선조직의 종양세포에 발현한다. 이것에 결합하는 항체는 병리 조직학적으로 종양을 검출하는데 유용하다. 또한, 합토글로빈에 결합하는 항체를 드는 것도 가능하다. 합토글로빈은 간장으로부터 혈액 중에 분비되는 단백질의 일종이다. 이 단백질은 유리상태의 헤모글로빈(free hemoglobin)과 결합한다. 따라서 합토글로빈과 결합하는 항체는 혈장 중 합토글로빈의 측정에 유용하다. 본 발명에서 제작되는 항체는, 예를 들면 CRP, IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, 알부민, 프리알부민, 보체 C3, 보체 C4, α-1 마이크로글로불린, β-2 마이크로글로불린, AFP, CA 19-9, CA 15-3, PSA, 아포리포프로테인, 종양괴사인자, 인터류킨, 인터페론, 오스테오폰틴, HBs 항원, RF, HCG, 콜라겐, Hb, HbA1c, HCV 항체, 트로포닌, 미오글로빈, FDP에 대한 항체를 들 수 있으나, 여기서 예로 들고 있는 것뿐 아니라, 의료 분야에 응용할 수 있는 물질과 결합하는 항체라면 특별히 제한되지는 않는다. 또한, 단백질에 결합하는 항체에 한정되지 않고, 환경호르몬 등 저분자 화합물에 대한 항체도 포함된다. 실시예에 기재의 인간 트랜스페린에 결합하는 항체의 H 사슬 또는 L 사슬의 가변영역이나 초(超)가변영역을 적절히 변경함으로써, 목적의 항원에 결합하는 항체를 제작하는 것이 가능하다.

또한 본 발명에 있어서는, 생산되는 재조합 항체의 활성을 보유하기 위해 또는 분비를 촉진하여 회수량을 늘리기 위해 분비 시그널(시그널 서열)을 사용하는 것이 바람직하다. 분비 단백질이나 막 내재성 단백질은, 소포체 막 결합성의 리보솜 상에서 합성된 후에, 지질 이중층을 통과해야만 한다. 시그널 서열이란, 이때 필요한, 단백질의 N 말단에 존재하는 아미노산 잔기이다.

본 발명에 있어서 시그널 서열은, 상기 기능을 갖는 서열이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 일례로서는, 예를 들면 동물 유래의 시그널 서열을 들 수 있다. 또한, 동물 항체 유래의 시그널 서열을 들 수 있다. 여기서 동물로서는 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 당나귀, 염소, 말, 새, 개, 고양이, 효모, 곤충을 들 수 있다.

또한 본 발명의 바람직한 시그널 서열로서, 예를 들면 산성 포스파타아제의 시그널 서열을 들 수도 있다. 산성 포스파타아제의 유래는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 당나귀, 염소, 말, 새, 개, 고양이, 효모, 곤충 유래의 산성 포스파타아제를 들 수 있다.

본 발명에 있어서 특히 바람직한 시그널 서열은, 인간 포스파타아제의 시그널 서열, 마우스 면역글로불린 L 사슬 κ의 시그널 서열, 또는 마우스 IgG1의 시그널 서열이다. 이들의 시그널 서열을 사용함으로써, 발현한 재조합 항체의 견사선 내강(內腔)으로의 이행을 촉진시킬 수 있다. 이와 같이 본 발명에 있어서는 시그널 서열을 사용하는 것이 바람직하다.

시그널 서열을 사용하는 경우, 본 발명에 있어서 바람직한 인간 산성 포스파타아제의 시그널 서열로서, 서열번호: 3에 기재의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 들 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 바람직한 마우스 면역글로불린 L 사슬 κ의 시그널 서열로서, 서열번호: 21에 기재의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 들 수 있다. 추가적으로, 본 발명에 있어서 바람직한 마우스 IgG1의 시그널 서열로서, 서열번호: 29에 기재의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 들 수 있다. 또한, 서열번호: 3, 21, 및 29 중 어느 하나에 기재의 단백질과 동등한 활성을 갖는 것이면, 서열번호: 3, 21, 및 29 중 어느 하나에 기재의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입되어 있어도 된다. 여기서 「기능적으로 동등」이란, 대상이 되는 단백질이 서열번호: 3, 21, 및 29 중 어느 하나에 기재의 아미노산 서열로 되는 단백질과 동일한 생물학적 또는 생화학적 활성을 갖는 것을 가리킨다.

본 발명에 있어서의 시그널 서열은, 이것에 제한되는 것은 아니나, 재조합 항체의 N 말단에 결합하고 있는 것이 바람직하다.

이상으로부터, 본 발명에 있어서 특히 바람직한 항체의 태양으로서, 트랜스페린 또는 CEA, c-erbB-2, 합토글로빈에 결합하는 항체로서, 인간 산성 포스파타아제, 마우스 면역글로불린 L 사슬 κ, 또는 마우스 IgG1의 시그널 서열을 갖는 항체를 들 수 있다. 그 중에서도 특히, 트랜스페린에 결합하는 인간 산성 포스파타아제의 시그널 서열을 갖는 scFv형 마우스 항체가, 본 발명의 항체로서 특히 바람직하다. 이와 같은 항체는, 서열번호: 15에 기재의 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 또한, 서열번호: 15에 기재의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입되고, 서열번호: 15에 기재의 아미노산 서열을 포함하는 항체와 동등한 활성을 갖는 항체도, 본 발명의 항체로서 바람직하다.

또한, 본 발명에 있어서는, 트랜스페린 또는 CEA, c-erbB-2, 합토글로빈에 결합하는 항체로서, 마우스 면역글로불린 L 사슬 κ의 시그널 서열을 갖는 L 사슬, 및 마우스 IgG1의 시그널 서열을 갖는 H 사슬을 포함하는 항체도 특히 바람직하다. 이와 같은 항체는, 서열번호: 49에 기재의 아미노산 서열을 갖는 L 사슬, 및 서열번호: 51에 기재의 아미노산 서열을 갖는 H 사슬을 포함하는 항체이다. 또한, 서열번호: 49에 기재의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입되고, 서열번호: 49에 기재의 아미노산 서열을 포함하는 항체와 동등한 활성을 갖는 L 사슬, 및 서열번호: 51에 기재의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입되며, 서열번호: 51에 기재의 아미노산 서열을 포함하는 항체와 동등한 활성을 갖는 H 사슬을 포함하는 항체도, 본 발명의 항체로서 특히 바람직하다.

또한, 트랜스페린에 결합하는 인간 산성 포스파타아제의 시그널 서열을 갖는 scFv형 마우스 항체를 코드하는 DNA의 바람직한 태양으로서는, 서열번호: 13, 보다 바람직하게는 서열번호: 14에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA를 들 수 있다. 또한, 서열번호: 13(보다 바람직하게는 서열번호: 14)에 기재의 염기서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입되고, 서열번호: 13(보다 바람직하게는 서열번호: 14)에 기재의 DNA와 동등한 기능을 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 들 수 있다.

또한, 트랜스페린에 결합하는 항체의 L 사슬을 코드하는 DNA로서, 마우스 면역글로불린 L 사슬 κ의 시그널 서열을 갖는 L 사슬을 코드하는 DNA의 바람직한 태양으로서는, 서열번호: 48에 기재의 염기서열을 갖는 DNA를 들 수 있다, 또한, 서열번호: 48에 기재의 염기서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입되고, 서열번호: 48에 기재의 DNA와 동등한 기능을 갖는 DNA를 들 수 있다.

추가적으로, 트랜스페린에 결합하는 항체의 H 사슬을 코드하는 DNA로서, 마우스 IgG1의 시그널 서열을 갖는 H 사슬을 코드하는 DNA의 바람직한 태양으로서는, 서열번호: 50에 기재의 염기서열을 갖는 DNA를 들 수 있다. 또한, 서열번호: 50에 기재의 염기서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입되고, 서열번호: 50에 기재의 DNA와 동등한 기능을 갖는 DNA를 들 수 있다.

본 발명에 있어서 항체(바람직하게는 시그널 서열을 갖는 항체)를 코드하는 DNA는, 이 DNA를 설계하는데 있어서, 코돈을 곤충형으로 변환하는 것이 바람직하다. 코돈을 곤충형으로 변환함으로써, 재조합 항체의 발현량을 증가시키는 것이 가능해진다. 예로서, 인간 산성 포스파타아제의 시그널 서열을 갖는 scFv형 마우스 항체의 경우에 있어서, 시그널 서열의 코돈 변환 전의 염기서열을 서열번호: 1에, 코돈 변환 후의 염기서열을 서열번호: 2에 나타내었다. 동일하게, H 사슬 가변영역(VH)의 코돈 변환 전의 염기서열을 서열번호: 4에, 코돈 변환 후의 염기서열을 서열번호: 5에, L 사슬 가변영역(VL)의 코돈 변환 전의 염기서열을 서열번호: 10에, 코돈 변환 후의 염기서열을 서열번호: 11에, 링커 서열의 염기서열을 서열번호: 7에, 코돈 변환 후의 염기서열을 서열번호: 8에, 항체 전장의 코돈 변환 전의 염기서열을 서열번호: 13에, 코돈 변환 후의 염기서열을 서열번호: 14에 나타내었다.

본 발명에 있어서 인간의 트랜스페린에 대한 scFv형 마우스 항체에 있어서는, 항체의 H 사슬과 L 사슬 영역의 코돈을 척추동물인 마우스의 그것으로부터, 곤충에서 사용되고 있는 그것으로 변환하였다. 보다 구체적으로는, 본 발명에 있어서는, 인간의 트랜스페린에 대한 scFv형 마우스 항체의 코돈을 누에와 동일한 곤충인 담배거세미나방(Spodoptera litura)의 근연종(近緣種) 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)에 있어서 사용빈도가 높은 코돈으로 적합화하였다. 또한 scFv형 항체의 링커 부분에도 스포도프테라 프루기페르다에 있어서 사용빈도가 높은 코돈을 사용하였다.

보다 구체적으로는, 본 발명에 있어서는, 인간 및 마우스 유래의 코돈 및 링커 부분의 코돈에 있어서, 표 1에 기재된 바와 같이, 전부 153 아미노산에 대응하는 코돈을 담배거세미나방의 근연종 스포도프테라 프루기페르다에서 사용빈도가 높은 코돈으로 변환하였다(변환 전의 서열은 서열번호: 13, 변환 후의 서열은 서열번호: 14에 대응한다. 또한, 표 1 중 「1st 코돈」이란, 코돈 중 1번째 염기가 서열번호: 13의 염기서열에 있어서 몇 번째의 염기에 해당하는지를 의미한다. 예를 들면 1st 코돈 「13」이라는 것은, 서열번호: 13의 13~15번째의 염기로 구성되는 코돈이 변환되어 있다(이 경우, 15번째의 G가 C로 변환되어 있다)는 것을 의미한다). 본 발명의 항체를 코드하는 DNA는 이들 코돈의 변환 중, 1개 이상의 코돈의 변환을 행한 DNA가 포함된다. 또한 본 발명에 있어서는 초파리, 누에, 꿀벌 등에서 사용빈도가 높은 코돈으로 변환하는 것도 가능하고, 이들 곤충에 있어서 사용빈도가 높은 코돈으로 변환된 DNA도 또한 본 발명에 포함된다. 이들 곤충에 있어서 사용빈도가 높은 코돈은 주지이다. 이와 같이 본 발명에 있어서는, 인간 산성 포스파타아제의 시그널 서열을 갖는 scFv형 마우스 항체를 코드하는 DNA를 설계하는데 있어서, 코돈이 곤충형으로 변환된 DNA도 포함된다.

본 발명에 있어서는, 상기 재조합 항체는 견사선에 분비된다. 견사선이란 누에의 체내에 2개 한 쌍으로서 존재하는 기관으로, 견사 단백질의 합성기관이다. 견사선은 후부 견사선, 중부 견사선, 전부 견사선으로 나누어지고, 견 단백질의 합성은 후부 견사선 및 중부 견사선에서 행해진다. 본 발명에 있어서 바람직한 견사선은 중부 견사선 및 후부 견사선이다.

또한, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 항체는, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 한 어떤 한정도 되지 않고, 시그널 서열을 갖고 있어도, 갖고 있지 않아도 된다. 즉, 본 발명의 항체의 제조방법에 의해 제조되는 항체에는 시그널 서열을 갖고 있는 항체, 시그널 서열을 갖고 있지 않은 항체 양쪽이 포함된다.

본 발명에 있어서 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적으로 발현 제어되는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 누에알로서는, 예를 들면 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 재조합 항체를 코드하는 DNA가 기능적으로 결합한 DNA를 갖는 누에알을 들 수 있다. 이와 같은 누에알은, 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 재조합 항체를 코드하는 DNA가 기능적으로 결합한 DNA를 누에알에 도입함으로써 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 간접적으로 발현 제어되는 재조합 항체 단백질을 코드하는 DNA를 갖는 누에알로서는, 예를 들면 (i) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 전사제어인자를 코드하는 DNA가 기능적으로 결합한 DNA, 및 (ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 재조합 항체를 코드하는 DNA가 기능적으로 결합한 DNA를 갖는 누에알을 들 수 있다.

또한 본 발명에 있어서는, 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 재조합 항체를 코드하는 DNA는, 항체의 분비를 촉진하여 회수량을 늘리기 위해 시그널 서열을 갖는 것이 바람직하다. 시그널 서열의 구체적인 태양은 전술한 바와 같다.

상기 「기능적으로 결합한」이란, 프로모터에 전사제어인자가 결합함으로써, 프로모터 하류에 존재하는 DNA의 발현이 유도되도록, 상기 프로모터와 상기 DNA가 결합하고 있는 것을 말한다. 따라서, 이 DNA가 다른 유전자와 결합하고 있고, 다른 유전자 산물과의 융합 단백질을 형성하는 경우에도, 상기 프로모터에 전사제어인자가 결합함으로써, 상기 융합 단백질의 발현이 유도되는 것이라면, 상기 「기능적으로 결합한」의 의미에 포함된다.

상기 전사제어인자와 표적서열의 조합으로서는, GAL4와 UAS, TetR과 TRE 등을 들 수 있다. GAL4와 UAS, 또는 TetR과 TRE를 사용함으로써, 목적으로 하는 유전자의 발현부위나 시기, 양을 정확하게 제어할 수 있어, 많은 조직에서 용이하게 발현시킬 수 있다. 또한, 발현시키는 유전자가 치사성의 유전자여도 계통의 제작이 가능하다.

상기 누에알을 제조하는 방법으로서는, 각종 방법을 선택할 수 있다. 예를 들면, 상기 (i) 및 (ii)의 DNA를 각각의 누에알에 도입한다. 양쪽의 DNA를 갖는 누에알은 각각의 DNA가 도입된 누에알로부터 생성된 트랜스제닉 누에끼리를 교배시킴으로써 얻을 수 있다. 이 경우, 전사제어인자에 의해, 발현하는 조직, 시기, 양 등을 결정할 수 있으므로, 발현시키고자 하는 유전자를 도입한 계통과 교배함으로써, 많은 계통을 만들지 않고, 각 조직이나 시기, 양 등을 바꿀 수 있다는 이점이 있다. 또한, 목적 유전자를 발현시킨 경우, 불임이 되는 경우에도 실험이 가능하다. 추가적으로, 단독의 프로모터를 사용한 경우보다, 도입 유전자로부터의 생산물의 양이 증가한다는 이점도 있다. 또한, 상기 (i) 및 (ii)의 DNA를 갖는 누에알은, 한쪽의 DNA가 도입된 트랜스제닉 누에가 산란한 알에, 다른 한쪽의 DNA를 인위적으로 도입함으로써 얻는 것도 가능하다. 또한, 상기 (i)의 DNA와 상기 (ii)의 DNA를 같은 알에 도입함으로써도, 양쪽의 DNA를 갖는 누에알을 얻는 것이 가능하다(Imamura, M., Nakai, J., Inoue, S., Quan, G.-X., Kanda, T. and Tamura, T.(2003) Targeted gene expression using the GAL4/UAS system in the silkworm Bombyx mori. Fourth International Workshop on Transgenesis and Genomics of Invertegrate Organisms, Asilomar, p.53).

누에알로의 DNA의 도입은, 예를 들면 누에의 발생 초기 알에, 트랜스포존(transposon)을 벡터로서 주사하는 방법(Tamura, T., Thibert, C., Royer ,C., Kanda, T., Abraham, E., Kamba, M., Komoto, N., Thomas, J.-L., Mauchamp, B., Chavancy, G., Shirk, P., Fraser, M., Prudhomme, J.-C. and Couble, P., 2000, Nature Biotechnology 18, 81-84)에 따라 행할 수 있다. 예를 들면, 트랜스포존의 역위(逆位) 말단 반복서열(Handler AM, McCombs SD, Fraser MJ, Saul SH.(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95(13): 7520-5)의 사이에 상기 DNA를 삽입한 벡터와 함께, 트랜스포존 전이효소를 코드하는 DNA를 갖는 벡터(헬퍼 벡터)를 누에알에 도입한다. 헬퍼 벡터로서는 pHA3PIG(Tamura, T., Thibert, C., Royer, C., Kanda, T., Abraham, E., Kamba, M., Komoto, N., Thomas, J.-L., Mauchamp, B., Chavancy, G., Shirk, P., Fraser, M., Prudhomme, J.-C. and Couble, P., 2000, Nature Biotechnology 18, 81-84)를 들 수 있으나, 이것에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 트랜스포존으로서는 piggyBac이 바람직하나, 이것에 한정되는 것은 아니고, 마리너(mariner), 미노스(minos) 등을 사용하는 것도 가능하다(Shimizu, K., Kamba, M., Sonobe, H., Kanda, T., Klinakis, A. G., Savakis, C. and Tamura, T.(2000) Insect Mol. Biol., 9, 277-281; Wang W, Swevers L, Iatrou K.(2000) Insect Mol Biol 9(2): 145-55).

또한, 본 발명에서는 베큘로바이러스 벡터를 사용함으로써 트랜스제닉 누에를 제작하는 것도 가능하다(Yamao, M., N. Katayama, H. Nakazawa, M. Yamakawa, Y. Hayashi et al., 1999, Genes Dev 13: 511-516).

또한 본 발명에 있어서 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터로서는, 중부 견사선에 있어서는, 예를 들면 세리신 1 단백질 또는 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터를 들 수 있다. 세리신 1 단백질 또는 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터로서는, 서열번호: 16 또는 17에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA를 들 수 있다. 서열번호: 16 또는 17에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA로서는, 서열번호: 16 또는 17에 기재의 염기서열로 되는 DNA, 서열번호: 16 또는 17에 기재의 염기서열로 되는 DNA의 상류역이나 하류역을 포함하는 DNA 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 서열번호: 16 또는 17에 기재의 염기서열로 되는 DNA의 상류역이나 하류역은, 문헌(Okamoto, H., Ishikawa, E. and Suzuki, Y.(1982) Structural analysis of sericin genes. Homologies with fibroin gene in the 5' flanking nucleotide sequences. J Biol Chem, 257, 15192-15199., Garel, A., Deleage, G. and Prudhomme, J. C.(1997) Structure and organization of the Bombyx mori sericin 1 gene and of the sericins 1 deduced from the sequence of the Ser 1B cDNA. Insect Biochem Mol Biol, 27, 469-477., Michaille, J. J., Garel, A. and Prudhomme, J. C.(1990) Cloning and characterization of the highly polymorphic Ser2 gene of Bombyx mori. Gene, 86, 177-184.)에 개시되어 있다.

또한, 본 발명에 있어서 중부 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터로서는, 서열번호: 16 또는 17에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA와 구조적으로 유사하고, 또한 서열번호: 16 또는 17에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA와 동등 또는 개선된 프로모터 활성능을 갖는 DNA도 들 수 있다. 이와 같은 DNA로서는, 예를 들면 서열번호: 16 또는 17에 기재의 염기서열에 있어서 1 또는 복수의 염기가 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입된 염기서열을 포함하는 DNA를 예시할 수 있다. 이 DNA는 하이브리다이제이션 기술이나 폴리머라아제 연쇄반응(PCR) 기술, 특정 부위 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis)법, DNA 합성 등의 방법에 의해 조제하는 것이 가능하다. 조제된 DNA가 프로모터 활성을 갖는지의 여부는, 당업자에 있어서는 리포터 유전자를 사용한 주지의 리포터 어세이 등에 의해 검토하는 것이 가능하다.

이 리포터 유전자로서는, 그 발현이 검출 가능한 것이라면 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 당업자에 있어서 일반적으로 사용되는 CAT 유전자, lacZ 유전자, 루시페라아제 유전자, β-글루쿠로니다아제 유전자(GUS) 및 GFP 유전자 등을 들 수 있다. 리포터 유전자의 발현레벨은 이 리포터 유전자의 종류에 따라서, 당업자에 공지의 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들면, 리포터 유전자가 CAT 유전자인 경우에는, 이 유전자 산물에 의한 클로람페니콜의 아세틸화를 검출함으로써, 리포터 유전자의 발현레벨을 측정할 수 있다. 리포터 유전자가 lacZ 유전자인 경우에는, 이 유전자 발현산물의 촉매작용에 의한 색소화합물의 발색을 검출함으로써, 또한, 루시페라아제 유전자인 경우에는, 이 유전자 발현산물의 촉매작용에 의한 형광화합물의 형광을 검출함으로써, 또한, β-쿠로니다아제 유전자(GUS)인 경우에는, 이 유전자 발현산물의 촉매작용에 의한 글루쿠론(Glucuron)(ICN사)의 발광이나 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-글루쿠로나이드(X-Gluc)의 발색을 검출함으로써, 추가적으로, GFP 유전자인 경우에는, GFP 단백질에 의한 형광을 검출함으로써, 리포터 유전자의 발현레벨을 측정할 수 있다.

한편, 본 발명에 있어서 후부 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터로서, 예를 들면 피브로인 L 사슬 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터를 들 수 있다. 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터로서는, 서열번호: 18에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA를 들 수 있다. 서열번호: 18에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA로서는, 서열번호: 18에 기재의 염기서열로 되는 DNA, 서열번호: 18에 기재의 염기서열로 되는 DNA의 상류역이나 하류역을 포함하는 DNA 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 서열번호: 18에 기재의 염기서열로 되는 DNA의 상류역이나 하류역은, 문헌(KIKUCHI, Y., K. MORI, S. SUZUKI, K. YAMAGUCHI and S. MIZUNO, 1992 Structure of the Bombyx mori fibroin light-chain-encoding gene: upstream sequence elements common to the light and heavy chain. Gene 110: 151-158.)에 개시되어 있다.

또한, 본 발명에 있어서 후부 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터로서는, 서열번호: 18에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA와 구조적으로 유사하고, 또한, 서열번호: 18에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA와 동등 또는 개선된 프로모터 활성능을 갖는 DNA도 들 수 있다. 이들 프로모터는, 전술의 방법에 의해 조제하는 것이 가능하다.

본 발명의 재조합 항체의 제조방법은 누에 체내에서 합성된 항체를 회수하는 공정을 포함한다. 합성된 항체는 불용화하지 않고, 활성이 있는 상태에서, 중부 견사선 또는 후부 견사선에 분비된다. 따라서, 재조합 항체는 중부 견사선 또는 후부 견사선으로부터 회수하는 것이 가능하다. 재조합 항체를 중부 견사선 또는 후부 견사선으로부터 회수하는 방법으로서는, 예를 들면 토사기(spinning stage)가 된 누에를 해부하고, 중부 견사선 또는 후부 견사선을 20 mM Tris-HCl pH 7.4 중에 적출하여, 견사선을 핀셋이나 메스로 상처를 냄으로써 견사선 중의 재조합 항체를 회수할 수 있다.

또한, 본 발명의 재조합 항체는, 예를 들면 트랜스제닉 누에가 토사한 고치로부터 회수하는 것도 가능하다. 회수방법으로서는, 당업자에 주지의 방법, 예를 들면 고치를 60% LiSCN에서 용해하고, 20 mM Tris, 5 M urea에서 투석함으로써 회수하는 방법(Inoue, S., Tsuda, H., Tanaka, H., Magoshi, Y and Mizuno(2001) Sericologia 4, 157-163.)을 사용할 수 있다. 또한, 그 외의 단백질 회수법으로서는, 예를 들면 계면활성제를 사용하는 방법이나 수용액으로 용해하는 방법 등이 가능하다.

또한, 본 발명에 있어서 누에로서는, 특별히 제한은 없으나, 재조합 항체의 대량생산을 위해서는, 피브로인 단백질 등의 견사를 구성하는 단백질을 코드하는 DNA 영역(코드 영역, 프로모터 영역, 비번역 영역을 포함한다)의 변이에 의해, 견사를 구성하는 단백질의 생산이 억제되어 있는 누에를 사용하는 것이 바람직하다. 이와 같은 누에로서는, 견사를 구성하는 단백질을 코드하는 DNA 영역의 변이에 따라서 견사를 구성하는 단백질의 생산이 억제되어 있는 돌연변이 계통의 누에, 바람직하게는 이 변이에 의해 견사를 구성하는 단백질의 생산이 억제되어 있는 나용(extrate pupae) 계통의 누에, 보다 바람직하게는 Nd-s^D를 들 수 있으나, 견사를 구성하는 단백질 생산억제의 원인이 인위적인지의 여부, 또한 자연계에 있어서 발생한 변이에 의존하는지의 여부에 관계없이, 견사를 구성하는 단백질의 생산이 억제되고 있는 누에이면 된다.

이와 같은 누에 중 하나의 태양은, 세리신 누에로서 당업자에는 주지의 누에이다. 세리신 누에를 이용함으로써, 중부 견사선에 있어서 재조합 항체의 대량생산이 가능해지고, 염색체에 도입된 재조합 항체를 코드하는 DNA로부터 합성되는 항체의 정제도 용이해진다. 또한, 후부 견사선에 있어서 재조합 항체를 생산시킬 때에도, 생산량의 측면에서 세리신 누에를 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 있어서의 누에로서는, 비휴면란을 산란하는 성질을 갖는 누에, 휴면란을 산란하는 성질을 갖는 누에(예를 들면 실용품종인 군마, 200, 순레이, 쇼게츠, 긴슈, 쇼와 등)를 사용할 수 있다. 여기서, 휴면란이란 산란 후 배(胚) 발생이 일시적으로 정지하는 알을 말하고, 비휴면란이란 산란 후 배 발생이 정지하지 않고, 유충이 부화되는 알을 말한다.

휴면란을 산란하는 성질을 갖는 누에를 사용하는 경우는, 비휴면란을 산란시키고, 이 비휴면란에 DNA를 도입한다. 비휴면란을 산란시키는 방법으로서는, 예를 들면 군마에 있어서는, 휴면란을 15℃~21℃에서 배양함으로써 이 휴면란으로부터 생성된 성충에 비휴면란을 산란시키는 방법, 바람직하게는 휴면란을 16℃~20℃에서 배양함으로써 이 휴면란으로부터 생성된 성충에 비휴면란을 산란시키는 방법, 보다 바람직하게는 휴면란을 18℃에서 배양함으로써 이 휴면란으로부터 생성된 성충에 비휴면란을 산란시키는 방법, 가장 바람직하게는 휴면란을 18℃에서 배양함으로써 이 휴면란으로부터 생성된 유충을 전명(全明, continuous light)에서 사육하여, 생육한 성충에 비휴면란을 산란시키는 방법을 들 수 있다. 또한, 200에 있어서는, 휴면란을 15℃~21℃에서 배양함으로써 이 휴면란으로부터 생성된 성충에 비휴면란을 산란시키는 방법, 바람직하게는 휴면란을 16℃~20℃에서 배양함으로써 이 휴면란으로부터 생성된 성충에 비휴면란을 산란시키는 방법, 보다 바람직하게는 휴면란을 18℃에서 배양함으로써 이 휴면란으로부터 생성된 성충에 비휴면란을 산란시키는 방법, 또는 휴면란으로부터 생성된 유충을 전명에서 사육하여, 생육한 성충에 비휴면란을 산란시키는 방법, 가장 바람직하게는 휴면란을 25℃에서 배양함으로써 이 휴면란으로부터 생성된 유충을 전명에서 사육하여, 생육한 성충에 비휴면란을 산란시키는 방법을 들 수 있다.

알(卵)의 배양은, 예를 들면 18℃~25℃의 인큐베이터, 또는 정온(定溫)의 방에 넣음으로써 행할 수 있고, 유충의 사육은 20℃~29℃의 사육실에서 인공사료를 사용하여 행할 수 있다.

본 발명의 상기 휴면란의 배양은 당업자에 있어서는, 일반적인 누에알의 배양법에 따라 행할 수 있다. 예를 들면, 「문부성(1978) 누에종 제조. pp193, 직쿄슛판샤, 도쿄」에 기재의 방법에 따라 배양을 행한다. 또한, 본 발명에 있어서 누에 유충의 사육은 당업자에 있어서는 주지의 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 「문부성(1978) 누에종 제조. pp193, 직쿄슛판샤, 도쿄」에 기재의 방법에 따라 사육을 행한다.

본 발명에 있어서, 산란된 알이 비휴면난인지의 여부는 알의 색으로 판정할 수 있다. 일반적으로, 휴면란은 짙은 다갈색으로 착색되고, 비휴면란은 황백색인 것이 알려져 있다. 따라서, 본 발명에 있어서는, 짙은 다갈색이 아닌 것, 보다 바람직하게는 황백색인 것을 가지고 산란된 알이 비휴면란이라고 판정한다.

이하, 누에알로의 DNA 도입방법의 구체예를 기술하나, 본 발명에 있어서 누에알로의 DNA 도입방법은 이 방법에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 누에알로 DNA 주입용 관을 사용하여 직접 알 내로 DNA를 도입하는 것이 가능하나, 바람직한 태양으로서는, 사전에 물리적 또는 화학적으로 난각(卵殼)에 구멍을 뚫어, 이 구멍으로부터 DNA를 도입한다. 이때, DNA 주입용 관을 삽입각도가 이 알의 복측(腹側) 측면에 대해서 거의 수직이 되도록 이 구멍으로부터 알 내에 삽입할 수 있다.

본 발명에 있어서, 생리적으로 난각에 구멍을 뚫는 방법으로서는, 예를 들면 침, 미소 레이저 등을 사용하여 구멍을 뚫는 방법을 들 수 있다. 적합하게는 침을 사용한 방법에 의해 난각에 구멍을 뚫을 수 있다. 이 침은, 누에의 난각에 구멍을 뚫을 수 있는 것이면, 그 침의 재질, 강도 등은 특별히 제한되지 않는다. 또한, 본 발명에 있어서 침이란, 통상 선단이 뾰족한 봉형상의 침을 가리키나, 이 형상에 한정되지 않고, 난각에 구멍을 뚫을 수 있는 것이면, 전체의 형상은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 선단이 뾰족한 피라미드형 물질, 또는 선단이 뾰족한 삼각뿔 형상의 물질도 또한, 본 발명의 「침」에 포함된다. 본 발명에 있어서는 텅스텐 침을 적합하게 사용할 수 있다. 본 발명의 침의 굵기(직경)는 후술의 캐필러리가 통과 가능한 구멍을 뚫을 수 있는 정도의 굵기이면 되고, 통상 2~20 ㎛, 바람직하게는 5~10 ㎛이다. 한편, 화학적으로 난각에 구멍을 뚫는 방법으로서는, 예를 들면 약품(차아염소산 등) 등을 사용하여 구멍을 뚫는 방법을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 구멍을 뚫는 위치로서는, 이 구멍으로부터 DNA 주입용 관을 삽입한 경우에 알의 복측 측면에 대한 삽입각도를, 거의 수직이 될 수 있는 위치라면 특별히 제한은 없으나, 바람직하게는 복측 측면 또는 그의 반대측이고, 보다 바람직하게는 복측 측면이며, 더욱 바람직하게는 알의 복측 측면의 약간 후단(後端) 쪽 중앙부이다.

본 발명에 있어서, 「거의 수직」이란, 70°~120°를 의미하고, 바람직하게는 80°~90°를 의미한다. 본 발명에 있어서, 「장래적으로 생식세포가 되는 위치」로서는, 통상 알의 복측 난표(卵表)에 가까운 위치(통상, 난표로부터 0.01 ㎜~0.05 ㎜의 위치)이고, 바람직하게는 알의 복측 중앙의 난표에 가까운 위치에서 약간 후극(後極) 쪽 위치이다.

본 발명의 DNA 주입용 관은 그 관의 재질, 강도, 내경 등은 특별히 제한되지 않으나, DNA 주입용 관을 삽입하기 전에, 물리적 또는 화학적으로 난각에 구멍을 뚫는 경우는, 뚫어진 구멍을 통과할 수 있는 굵기(외경)인 것이 바람직하다. 본 발명의 DNA 주입용 관으로서는, 예를 들면 글래스 캐필러리 등을 들 수 있다.

본 발명의 DNA 도입방법에 있어서, 바람직한 태양으로서는, 상기의 누에알에 물리적 또는 화학적으로 구멍을 뚫고, DNA 주입용 관을 삽입각도가 이 알의 복측 측면에 대해 거의 수직이 되도록 이 구멍으로부터 알 내에 삽입하여, DNA를 주입하는 공정을, 침과 DNA 주입용 관이 일체형이 된 머니퓰레이터(manipulator)를 사용하여 행한다. 통상, 이 머니퓰레이터를 구성요소 중 하나로 하는 장치를 사용하여 본 발명은 적합하게 실시된다.

이와 같은 장치로서는, 해부현미경, 조명장치, 가동식 스테이지, 현미경에 금구로 고정한 조동(粗動) 머니퓰레이터, 이 머니퓰레이터에 부착한 마이크로 머니퓰레이터, DNA를 주사하기 위한 공기압을 조정하는 인젝터로 구성되어 있다. 인젝터에 사용하는 압력은 질소 봄베로부터 공급되고, 압력 스위치는 풋스위치에 의해 넣을 수 있다. 주사는 슬라이드글라스 등의 기판 상에 고정한 알에 대해서 행하고, 알의 위치는 이동식 스테이지에 의해 결정한다. 또한, 마이크로 머니퓰레이터의 글래스 캐필러리는 4개의 튜브로 연결된 조작부로써 조작한다. 실제 순서는, 알에 대한 텅스텐 침의 위치를 조동 머니퓰레이터로 결정하고, 스테이지의 레버로 수평방향으로 알을 움직여 구멍을 뚫는다. 계속해서, 마이크로 머니퓰레이터의 조작부의 레버를 조작하여, 구멍의 위치에 글래스 캐필러리의 선단을 유도하고, 다시 스테이지의 레버로 캐필러리를 알에 삽입한다. 이 경우, 알의 복측 측면에 대해 수직으로 글래스 캐필러리가 삽입될 필요가 있다. 풋스위치를 넣어 DNA를 주사하고, 레버를 조작하여 알으로부터 캐필러리를 뺀다. 뚫린 구멍을 순간접착제 등으로 막고, 일정한 온도 및, 일정한 습도의 인큐베이터에서 보호한다. 본 발명에 사용되는 장치로서는, 적합하게는 일본국 특허 제1654050호에 기재의 장치 또는 이 장치를 개량한 장치를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 태양에 있어서는, DNA의 도입에 사용하는 누에알이 기판에 고정되어 있는 것이 바람직하다. 본 발명의 기판으로서, 예를 들면 슬라이드 글래스, 플라스틱판 등을 사용할 수 있으나, 이들에 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 상기 태양에 있어서는, 누에알 내의 장래적으로 생식세포가 되는 위치에 정확하에 DNA를 주사하기 위해, 알의 방향을 맞춰서 고정하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 태양에 있어서는, 기판으로 고정하는 누에알의 수에는, 특별히 제한은 없다. 또한, 복수개의 누에알을 사용하는 경우, 누에알을 기판으로 고정하는 방향성으로서는, 바람직하게는 배복(背腹)의 방향이 일정해지는 방향이다. 본 발명의 상기 누에알의 기판으로의 고정은, 예를 들면 수성의 풀을 사전에 도포한 시판의 대지(cards)(다양한 종대지-various egg cards) 상에 산란시키고, 대지에 물을 첨가하여 알을 박리, 이어서 젖은 상태의 알을 기판에 정렬시키고, 풍건함으로써 행한다. 알은 슬라이드 글래스 상에 알의 방향을 맞춰서 고정하는 것이 바람직하다. 또한, 알의 기반(基盤)으로의 고정은 양면 테이프나 접착제 등을 사용함으로써도 가능하다.

누에알에 DNA가 도입되었는지의 여부는, 예를 들면 주사한 DNA를 알으로부터 재차 추출하여 측정하는 방법(Nagaraju, J., Kanda, T., Yukuhiro, K., Chavancy, G., Tamura, T. and Couble, P.(1996) Attempt of transgenesis of the silkworm(Bombyx mori L) by egg-injection of foreign DNA. Appl. Entomol. Zool., 31, 589-598)이나, 주사한 DNA의 알 내에서의 발현을 보는 방법(Tamura, T., Kanda, T., Takiya, S., Okano, K. and Maekawa, H.(1990) Transient expression of chimeric CAT genes injected into early embryos of the domesticated silkworm, Bombyx mori. Jpn. J. Genet., 65, 401-410) 등에 의해 확인할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법에 있어서 회수된 재조합 항체와 의약상 허용되는 담체를 혼합함으로써, 의약 조성물을 제조하는 것도 가능하다. 상기 담체로서는, 예를 들면 계면활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 들 수 있으나, 이들에 제한되지 않고, 그 외 상용의 담체를 적절히 사용할 수 있다. 구체적으로는, 경질 무수규산, 젖당, 결정 셀룰로오스, 만니톨, 전분, 카르멜로오스칼슘, 카르멜로오스나트륨, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 중쇄 지방산 트리글리세리드, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 백당, 카르복시메틸셀룰로오스, 콘스타치, 무기염류 등을 들 수 있다.

본 발명 재조합 항체의 제조방법의 다른 구체적인 태양에 있어서는, 재조합 항체는 누에의 지방체에 있어서 생산되는 것을 특징으로 한다. 즉 본 발명은, 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 재조합 항체의 제조방법에 관한 것이다.

(a) 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에로서, 상기 재조합 항체를 지방체에 분비하는 트랜스제닉 누에를 제조하는 공정.

또한 본 발명은, 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 재조합 항체의 제조방법에 관한 것이다.

(a) 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에로서, 상기 재조합 항체를 지방체에 분비하는 트랜스제닉 누에를 제조하는 공정.

본 발명의 트랜스제닉 누에를 제조하는 공정에 있어서는, 먼저 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 누에알을 제조한다. 이어서, 제조된 누에알로부터 생성된 누에 중에서, 상기 재조합 항체를 지방체에 분비하는 트랜스제닉 누에를 선택한다. 트랜스제닉 누에의 선택은 전술의 방법에 따라 행할 수 있다.

본 발명에 있어서 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적으로 발현 제어되는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 누에알로서는, 예를 들면 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 재조합 항체를 코드하는 DNA가 기능적으로 결합한 DNA를 갖는 누에알을 들 수 있다. 이와 같은 누에알은, 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 재조합 항체를 코드하는 DNA가 기능적으로 결합한 DNA를 누에알에 도입함으로써 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 간접적으로 발현 제어되는 재조합 항체 단백질을 코드하는 DNA를 갖는 누에알로서는, 예를 들면 (i) 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 전사제어인자를 코드하는 DNA가 기능적으로 결합한 DNA, 및 (ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 재조합 항체를 코드하는 DNA가 기능적으로 결합한 DNA를 갖는 누에알을 들 수 있다. 「기능적으로 결합한」의 정의는 전술한 바와 같다. 또한, 전사제어인자와 표적서열의 조합도 전술의 것을 들 수 있다.

누에알의 제조는 전술의 방법에 의해 행하는 것이 가능하다. 예를 들면, 상기 (i) 및 (ii)의 DNA를 각각의 누에알에 도입한다. 양쪽의 DNA를 갖는 누에알은, 각각의 DNA가 도입된 누에알로부터 생성된 트랜스제닉 누에끼리를 교배시킴으로써 얻을 수 있다. 또한, 상기 (i) 및 (ii)의 DNA를 갖는 누에알은, 한쪽의 DNA가 도입된 트랜스제닉 누에가 산란한 알에, 다른 한쪽의 DNA를 인위적으로 도입함으로써 얻을 수 있다. 더 나아가서는, 상기 (i)의 DNA와 상기 (ii)의 DNA를 같은 알에 도입함으로써도, 양쪽의 DNA를 갖는 누에알을 얻을 수 있다.

누에알로의 DNA의 도입도, 전술의 방법에 의해 행할 수 있다. 또한, 누에의 지방체에 있어서 재조합 항체를 생산하는 경우에 있어서도, 베큘로바이러스 벡터를 사용함으로써 트랜스제닉 누에를 제작하는 것도 가능하다(Yamao, M., N. Katayama, H. Nakazawa, M. Yamakawa, Y. Hayashi et al., 1999, Genes Dev. 13: 511-516).

상기 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터로서는, 서열번호: 19에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA를 들 수 있다. 서열번호: 19에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA로서는, 서열번호: 19에 기재의 염기서열로 되는 DNA, 서열번호: 19에 기재의 염기서열로 되는 DNA의 상류역이나 하류역을 포함하는 DNA 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 있어서 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터로서, 서열번호: 19에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA와 구조적으로 유사하고, 또한 서열번호: 19에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA와 동등 또는 개선된 프로모터 활성능을 갖는 DNA도 들 수 있다. 이들의 프로모터도 또한, 전술의 방법에 의해 조제하는 것이 가능하다. 서열번호: 19에 기재의 염기서열로 되는 DNA의 상류역이나 하류역은, 문헌(MANGE, A., E. JULIEN, J. C. PRUDHOMME and P. COUBLE, 1997 A strong inhibitory element down-regulates SRE-stimulated transcription of the A3 cytoplasmic actin gene of Bombyx mori. J. Mol. Biol. 265: 266-274.)에 개시되어 있다.

상기 전사제어인자와 표적서열의 조합은 전술의 것을 사용하는 것이 가능하다. 또한, 세포질 액틴을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에 GAL4 유전자를 연결한 것을 누에 게놈에 삽입한 트랜스제닉 누에(상기 (i)의 DNA를 갖는 누에알로부터 제작된 트랜스제닉 누에)의 구체적인 태양 및 제작방법은, 문헌(IMAMURA, M., J. NAKAI, S. INOUE, G. X. QUAN, T. KANDA et al., 2003 Targeted gene expression using the GAL4/UAS system in the silkworm Bombyx mori. Genetics 165: 1329-1340.)에 개시되어 있다.

또한 본 발명에 있어서는, 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 재조합 항체를 코드하는 DNA는, 시그널 서열을 갖는 것이 바람직하다. 시그널 서열의 구체적인 태양은 전술한 바와 같다.

상기의 방법에 의해 생산되는 재조합 항체는, 예를 들면 지방체로부터 회수할 수 있다. 지방체로부터의 재조합 항체의 회수는, 당업자이면 공지의 방법, 예를 들면 유충 체내로부터 지방체를 적출하고, 단백질 추출을 위한 완충액으로 호모지나이즈하는 것이나 지방체로부터 체액으로 분비시켜, 체액을 분취함으로써 행하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 항체는, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 한 어떤 한정도 되지 않고, 시그널 서열을 갖고 있어도, 갖고 있지 않아도 된다. 즉, 본 발명의 항체의 제조방법에 의해 제조되는 항체에는, 시그널 서열을 갖고 있는 항체, 시그널 서열을 갖고 있지 않은 항체 양쪽이 포함된다.

본 발명은 또한, 재조합 항체를 코드하는 DNA에 관한 것이다. 본 발명은 더욱 바람직하게는, 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 인간의 산성 포스파타아제를 갖는 scFv 항체를 코드하는 DNA에관한 것이다. 이와 같은 DNA로서는, 서열번호: 13에 기재의 DNA 또는 서열번호: 14에 기재의 DNA를 들 수 있다. 또한, 서열번호: 13 또는 14에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산에 의해 코드되는 단백질로서, 서열번호 15에 기재의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 DNA를 들 수 있다.

본 발명은 또한, 마우스 면역글로불린 L 사슬 κ의 시그널 서열을 갖는 L 사슬 및 마우스 IgG1의 시그널 서열을 갖는 H 사슬을 포함하는 항체를 코드하는 DNA에 관한 것이다. 마우스 면역글로불린 L 사슬 κ의 시그널 서열을 갖는 L 사슬을 코드하는 DNA로서는, 서열번호: 48에 기재의 DNA를 들 수 있다. 또한, 서열번호: 48에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산에 의해 코드되는 단백질로서, 서열번호: 48에 기재의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 DNA를 들 수 있다. 한편, 마우스 IgG1의 시그널 서열을 갖는 H 사슬을 코드하는 DNA로서는, 서열번호: 50에 기재의 DNA를 들 수 있다. 추가적으로, 서열번호: 50에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산에 의해 코드되는 단백질로서, 서열번호: 50에 기재의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 DNA를 들 수 있다.

본 발명은 재조합 항체를 코드하는 DNA를 포함하는 벡터 및 형질전환세포를 제공한다. 또한 본 발명은, 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 포함하는 벡터 및 형질전환세포를 제공한다. 본 발명에 있어서 사용되는 벡터로서는, 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들면 M13계 벡터, pUC계 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등을 들 수 있다. 또한, cDNA의 서브 클로닝, 절단을 목적으로 한 경우, 상기 벡터 외에, 예를 들면 pGEM-T, pDIRECT, pT7 등을 들 수 있다. 본 발명의 항체를 생산하는 목적에 있어서 벡터를 사용하는 경우에는, 특히 발현벡터가 유용하다. 발현벡터로서는, 예를 들면 숙주를 JM109, DH5α, HB101, XL1-Blue 등의 대장균으로 한 경우에 있어서는, 벡터가 대장균에서 증폭되는 상기 특징을 갖는 외에, 대장균에서 효율적으로 발현할 수 있는 프로모터, 예를 들면 lacZ 프로모터(Ward들, Nature(1989) 341, 544-546; FASEB J.(1992) 6, 2422-2427), araB 프로모터(Better들, Science(1988) 240, 1041-1043), 또는 T7 프로모터 등을 갖고 있는 것이 불가결이다. 이와 같은 벡터로서는, 상기 벡터 외에 pGEX-5X-1(파마시아사제), 「QIAexpress system」(퀴아젠사제), pEGFP, 또는 pET 등을 들 수 있다.

또한, 벡터에는 폴리펩티드 분비를 위한 시그널 서열이 포함되어 있는 것이 바람직하다. 폴리펩티드 분비를 위한 시그널 서열로서는, 대장균의 페리플라즘에 생산시키는 경우, pelB 시그널 서열(Lei, S. P. et al. J. Bacteriol.(1987) 169, 4379)을 사용하면 된다. 숙주세포로의 벡터의 도입은, 예를 들면 염화칼슘법, 일렉트로포레이션법을 사용하여 행할 수 있다.

대장균 이외에도, 예를 들면 본 발명의 항체를 제조하기 위한 벡터로서는, 포유동물 유래의 발현벡터(예를 들면, pcDNA3(인비트로젠사제)나, pEGF-BOS(Nucleic Acids Res. 1990, 18(17), p.5322), pEF, pCDM8), 곤충세포 유래의 발현벡터(예를 들면 「Bac-to-BAC baculovirus expression system」(깁코 BRL사제), pBacPAK8), 식물 유래의 발현벡터(예를 들면 pMH1, pMH2), 동물 바이러스 유래의 발현벡터(예를 들면 pHSV, pMV, pAdexLcw), 레트로바이러스 유래의 발현벡터(예를 들면 pZIPneo), 효모 유래의 발현벡터(예를 들면 「Pichia Expression Kit」(인비트로젠사제), pNV11, SP-Q01), 고초균 유래의 발현벡터(예를 들면 pPL608, pKTH50) 등을 들 수 있다.

CHO 세포, COS 세포, NIH3T3 세포 등의 동물세포에서의 발현을 목적으로 한 경우에는, 세포 내에서 발현시키기 위해 필요한 프로모터, 예를 들면 SV40 프로모터(Mulligan들, Nature(1979) 277, 108), MMLV-LTR 프로모터, EF1α 프로모터(Mizushima들, Nucleic Acids Res.(1990) 18, 5322), CMV 프로모터 등을 갖고 있는 것이 불가결하고, 세포로의 형질전환을 선발하기 위한 유전자(예를 들면, 약제(네오마이신, G418 등)에 의해 판별할 수 있는 약제 내성 유전자)를 가지면 더욱 바람직하다. 이와 같은 특성을 갖는 벡터로서는, 예를 들면 pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13 등을 들 수 있다.

재조합 항체를 코드하는 DNA의 세포로의 도입은, 당업자에 있어서는 공지의 방법, 예를 들면 전기천공법(일렉트로포레이션법) 등에 의해 실시할 수 있다.

또한, 본 발명은, 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에로서, 상기 재조합 항체를 분비하는 트랜스제닉 누에에 관한 것이다. 구체적으로는, 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에로서, 재조합 항체를 견사선에 분비하는 트랜스제닉 누에에 관한 것이다. 또는, (i) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA, 및 (ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에, 또는 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 재조합 항체를 코드하는 DNA가 기능적으로 결합한 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에를 제공한다.

또한 본 발명에 있어서는, 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터에 의해서 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 재조합 항체를 코드하는 DNA는, 항체의 분비를 촉진하여 회수량을 늘리기 위해 시그널 서열을 갖고 있는 것이 바람직하다. 시그널 서열의 구체적인 태양은 전술한 바와 같다.

더욱이 본 발명은, 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에로서, 재조합 항체를 지방체에 분비하는 트랜스제닉 누에에 관한 것이다. 구체적으로는 (i) 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA, 및 (ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에, 또는 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 재조합 항체를 코드하는 DNA가 기능적으로 결합한 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에를 제공한다.

또한, 본 발명에 있어서는, 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 재조합 항체를 코드하는 DNA는, 항체의 분비를 촉진하여 회수량을 늘리기 위해 시그널 서열을 갖고 있는 것이 바람직하다. 시그널 서열의 구체적인 태양은 전술한 바와 같다.

이들 트랜스제닉 누에는 전술의 방법에 의해 제작할 수 있다. 또한 본 발명의 트랜스제닉 누에의 상태에 특별히 제한은 없고, 예를 들면 알의 상태여도 된다. 본 발명의 트랜스제닉 누에를 사용함으로써, 목적의 재조합 항체를 대량으로 생산할 수 있다.

또한, 본 발명은, 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에도 제공한다. 전사제어인자, 표적 프로모터로서는, 전술의 것을 들 수 있다. 이와 같은 누에는, 상기 (i) 및 (ii)의 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에의 제조나, 그 알의 제조에 이용할 수 있다.

또한 본 발명에 있어서는, 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 재조합 항체를 코드하는 DNA는, 항체의 분비를 촉진하여 회수량을 늘리기 위해, 시그널 서열을 갖고 있는 것이 바람직하다. 시그널 서열의 구체적인 태양은 전술한 바와 같다.

추가적으로, 본 발명은, 본 발명의 트랜스제닉 누에에 의해 토사된 고치를 제공한다. 이와 같은 고치는 목적의 재조합 항체를 대량으로 함유하는 고치로서 유용하다. 또한, 본 발명은, 이 고치로부터 제조되는 견사로서, 재조합 항체를 포함하는 견사를 제공한다. 또한, 공지의 수법에 의해, 본 발명의 견사를 함유하는 견직물, 예를 들면 재조합 항체를 함유하는 견직물을 제작할 수 있다. 본 발명은 이와 같은 견직물도 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 DNA를 제공한다. 이와 같은 DNA로서는, (a) 세리신 또는 피브로인을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA, (b) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 재조합 항체를 코드하는 DNA, (c) 세리신 또는 피브로인을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 재조합 항체를 코드하는 DNA가 기능적으로 결합한 DNA 등을 들 수 있고, 이들의 조합으로 되는 키트로서 제공해도 된다. 또한, 본 발명은, 트랜스포존의 역위 말단 반복서열의 사이에, (a)~(c)의 DNA를 삽입한 벡터를 제공한다. 또한, 이 벡터와 트랜스포존 전이효소를 코드하는 DNA를 갖는 벡터(헬퍼 벡터)를 포함하는 키트를 제공한다.

또한, 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 재조합 항체를 코드하는 DNA, 및 세리신 또는 피브로인을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 재조합 항체를 코드하는 DNA가 기능적으로 결합한 DNA는, 항체의 분비를 촉진하여 회수량을 늘리기 위해, 시그널 서열을 갖고 있는 것이 바람직하다. 시그널 서열의 구체적인 태양은 전술한 바와 같다.

추가로 본 발명은, 본 발명의 항체의 제조방법에 의해 얻어지는 재조합 항 트랜스페린 항체를 유효성분으로서 함유하는, 당뇨병성 신증의 진단제 및 영양상태를 평가하기 위한 시약에 관한 것이다. 본 발명의 항체의 제조방법에 의해 얻어지는 재조합 항 트랜스페린 항체에는, 시그널 서열을 갖고 있는 항체와, 갖고 있지 않은 항체 양쪽이 포함된다. 시그널 서열을 사용한 경우, 그의 바람직한 예는 전술한 바와 같다.

또한, 본 발명의 항 트랜스페린 항체에는 전장 항체 및 저분자화 항체 양쪽이 포함된다. 전장 항체의 구체예로서는, 시그널 서열로서 서열번호: 3, 21, 및 29 중 어느 하나에 기재의 아미노산 서열, L 사슬 가변영역으로서 서열번호: 23에 기재의 아미노산 서열, Jκ 세그먼트로서 서열번호: 25에 기재의 아미노산 서열, κ 사슬 정상영역으로서 서열번호: 27에 기재의 아미노산 서열을 갖는 L 사슬, 및 시그널 서열로서 서열번호: 3, 21, 및 29 중 어느 하나에 기재의 아미노산 서열, H 사슬 가변영역으로서 서열번호: 31에 기재의 아미노산 서열, CH1으로서 서열번호: 33에 기재의 아미노산 서열, 힌지영역으로서 서열번호: 35에 기재의 아미노산 서열, CH2로서 서열번호: 37에 기재의 아미노산 서열, CH3로서 서열번호: 39에 기재의 아미노산 서열을 갖는 H 사슬을 포함하는 항체를 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 서열번호: 49에 기재의 아미노산 서열을 갖는 L 사슬, 및 서열번호: 51에 기재의 아미노산 서열을 갖는 H 사슬을 포함하는 항체를 들 수 있다.

한편 저분자화 항체의 구체예로서는, 전술한 바와 같이, 예를 들면 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv(single chain Fv), Diabody, sc(Fv)2(single chain(Fv)2) 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서 특히 바람직한 저분자화 항체는 scFv 항체이다. scFv 항체에 있어서, 시그널 서열, VL, 링커, VH는 단일 사슬 폴리펩티드의 N 말단을 기점으로서, 이 순서로 나열되어 있는 것이 바람직하다. VL, 링커, VH의 구체적인 태양은 각각, 서열번호: 6, 9, 12에 나타내는 바와 같다. 따라서, 본 발명에 있어서 특히 바람직한 항 트랜스페린 항체는, 서열번호: 15에 기재의 아미노산 서열을 포함하는, 인간 산성 포스파타아제의 시그널 서열을 갖는 scFv 항체이다.

또한 본 발명은, 피험자로부터 얻은 생체시료 중에 있어서 트랜스페린의 양을 측정하는 방법에 관한 것이다. 트랜스페린은 혈액이나 뇨 등에 포함되는 분자량 79,000의 단백질로서, 철 대사와 조혈의 중요한 지표이다. 생체 중 트랜스페린의 양은 소화기, 신장 등의 질환 및 종양이나 염증 등의 병태 생리를 반영하므로, 트랜스페린의 양을 측정하면, 그들 질환의 진단을 행할 수 있다.

본 발명의 생체시료 중 트랜스페린의 측정방법에 있어서는, 먼저 트랜스페린의 양을 측정하고자 하는 피험자로부터 생체시료를 얻는다. 그리고, 이 생체시료와 본 발명의 항 트랜스페린 항체를 접촉시킨다. 본 발명의 측정방법에 있어서 생체시료는 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들면 혈액(혈청), 뇨 등을 들 수 있다. 본 발명의 측정방법에 있어서 바람직한 항체의 태양은 전술한 바와 같다. 본 발명의 측정에 있어서는, 다음으로 생체시료 중 트랜스페린과 항체의 결합을 검출한다. 트랜스페린과 항체의 결합은, 이들에 한정되는 것은 아니나, 예를 들면 ELISA법이나 EIA법 등, 당업자에 주지의 방법에 의해 행할 수 있다. 본 발명의 측정방법은, 생체시료 중 트랜스페린과 항체의 결합을 검출함으로써, 상기 시료 중 트랜스페린의 양을 측정하는 것을 특징으로 한다. 즉, 트랜스페린과 항체의 결합이 전혀 검출되지 않으면, 상기 생체시료 중에는 트랜스페린이 존재하지 않는다고 판정된다. 반대로, 트랜스페린과 항체의 결합이 검출되면, 상기 생체시료 중에 트랜스페린이 존재하고 있다고 판정된다. 또한, 당업자이면, 검출되는 트랜스페린과 항체의 결합 정도에 따라서, 생체시료 중 트랜스페린의 양을 판정하는 것이 가능하다. 이와 같이, 본 발명에 있어서 트랜스페린의 양의 측정에는, 생체시료 중 트랜스페린 유무의 측정뿐 아니라, 결합 정도에 따라 생체시료 중 트랜스페린의 양을 정량화하는 것도 포함된다.

본 발명은 더욱이, 당뇨병성 신증을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 진단방법에 있어서는, 먼저, 전술한 트랜스페린의 양을 측정하는 방법에 기재된 방법에 따라, 생체시료 중 트랜스페린의 양을 측정한다. 다음으로, 측정된 트랜스페린의 양을, 당뇨병성 신증에 이환되어 있지 않은 것이 명확한 피험자에 유래하는 생체시료 중 트랜스페린의 양과 비교한다. 정상인 대조와 비교해서, 측정된 트랜스페린의 양이 많을 때, 상기 생체시료를 제공한 피험자가 당뇨병성 신증에 이환되어 있거나, 또는 장래 당뇨병성 신증에 이환될 위험이 높다고 판정된다.

또한, 본 발명의 당뇨병성 신증을 진단하는 방법에 있어서는, 측정된 트랜스페린의 양을, 당뇨병성 신증에 이환되어 있는 것이 명확한 피험자에 유래하는 생체시료에 있어서의 트랜스페린의 양과 비교해도 좋다. 비교의 결과, 트랜스페린의 양이 당뇨병성 신증에 이환되어 있는 것이 명확한 피험자의 생체시료 중 그것과 동 정도이면, 상기 생체시료를 제공한 피험자가 당뇨병성 신증에 이환되어 있다고 판정된다. 여기서 동 정도란, 트랜스페린의 양이 완전히 동일한 경우뿐 아니라, 실질적으로 동일한 경우도 포함된다. 실질적으로 동일한지의 여부는, 당업자이면, 피험자의 병상이나 그 외의 특징에 따라 적절히 판단하는 것이 가능하다. 이와 같은 판정의 기준이 기재된 문헌의 예로서는, 예를 들면 이하의 것을 들 수 있다.

야마구치 데츠시: 일본 임상, 53(증간호), 227-229(1995)

안도 야스오: 호르몬과 임상, 42(6), 91-95(1994)

곤노 미노루: 의약과 약학, 32(3), 555-565(1994)

이시바시 후카시: 당뇨병, 35(12), 949-954(1992)

아오키 요시카즈: 임상병리 리뷰 특집 제127호, 12-16, (2003, 10)

사쿠라바야시 이쿠노스케 야마다 도시유키 외: 월간 Medical Technology 별책 임상 검사항 사전, (2003)

히가시 다카시 고토 히로미치 외: Medical Technology Vol 30 906-911 No 8(2002.8)

본 발명의 당뇨병성 신증을 진단하는 방법은, 그 단독으로 사용해도, 기타 각종 당뇨병성 신증의 진단방법과 조합해서, 보조적으로 사용해도 된다. 기타 각종 당뇨병성 신증의 진단방법과 조합해서 사용함으로써, 당뇨병성 신증의 진단을 보다 확실, 또한 효과적으로 행하는 것이 가능해진다. 이와 같이, 본 발명의 당뇨병성 신증의 진단방법에 의해 얻어지는 소견은, 당뇨병성 신증의 환자에 특유한 각종 임상적 소견과 함께, 종합적으로 사용되는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한, 피험자의 영양상태를 평가하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 영양상태를 평가하는 방법에 있어서는, 피험자의 트랜스페린의 양이 정상인 대조와 비교해서 감소하고 있을 때에, 영양장애의 위험이 높고, 또한 영양장애에 이환되어 있다고 판정된다. 본 발명에 있어서는, 트랜스페린의 양의 감소의 정도가 현저하면 현저할수록, 영양장애의 위험이 높고, 또한 심각한 영양장애에 이환되어 있다고 판정된다. 당업자이면, 트랜스페린의 양의 감소의 정도로부터, 피험자의 영양장애의 위험이나 영양장애의 정도를 판정하는 것이 가능하다. 예를 들면, 피험자에 있어서 트랜스페린이 전혀 검출되지 않거나, 또는 실질적으로 검출되지 않는 것과 동등한 경우는, 피험자가 심각한 영양장애에 이환되어 있다고 판정된다.

본 발명의 영양상태를 평가하는 방법에 있어서도, 먼저, 생체시료 중 트랜스페린의 양을 측정한다. 다음으로, 측정된 트랜스페린의 양을, 정상인 대조와 비교한다. 생체시료 중 트랜스페린의 양의 측정은 전술의 방법에 따라 행하는 것이 가능하다. 또한, 영양장애의 위험이 높은지의 여부, 또는 영양장애에 이환되어 있는지의 판정도 또한, 전술한 바와 같이, 당업자가 통상 채용하는 기준에 따라 행하는 것이 가능하다.

발명에 있어서 영양상태를 평가하는 방법은 임상 검사, 신체 계측, 식사 조사 등과 조합해서, 종합적으로 개인 또는 특정 집단의 영양상태를 평가·판정하는 것(영양 어세스먼트(「임상 영양」 임시 증간호 제99권 5호, 「실천 영양 어세스먼트」)에 사용하는 것이 가능하다. 본 발명의 영양상태를 평가하는 방법에 있어서, 피험자는 임의의 개인이어도 되고, 임의의 집단이어도 된다. 본 발명의 영양상태를 평가하는 방법을 실시함으로써, 개인 또는 집단의 영양상태를 측정하는 것이 가능해진다. 전술한 바와 같이, 당업자이면, 측정된 결과로부터 피험자의 영양장애의 유무 또는 정도를 판정하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명에 있어서 영양장애란, 특정의, 또는 수종의 영양소가 결핍된 상태, 과잉이 된 상태, 또는 영양소 상호의 균형이 무너진 상태를 의미한다.

본 발명의 영양상태를 평가하는 방법의 실시의 일례로서, 예를 들면 입원중인 피험자에 대해서, 본 발명의 영양상태를 평가하는 방법을 실시하는 것을 들 수 있다. 예를 들면, 입원중인 피험자에 유래하는 시료 중 트랜스페린의 측정값이, 상기 피험자 개인의 정상시에 있어서 트랜스페린의 측정값(어떤 변동폭을 갖고 있는 경우는 그것을 고려하여)과 비교해서 감소하고 있는 경우에, 상기 피험자는 영양장애의 위험이 높고, 또한 영양장애에 이환되어 있다고 판정하는 것이 가능하다.

본 발명의 제조방법에 의해서 생산되는 항체는, 재조합 항체 추출물에 목적의 항체 이외의 항체가 포함될 가능성이 없다. 이에 따라, 교차반응이 발생할 가능성이 낮고, 목적으로 하는 항원과 반응한 항체만을 정확하게 측정하는 것이 가능해진다. 이와 같이, 본 발명의 생체시료 중 트랜스페린의 양을 측정하는 방법, 당뇨병성 신증의 진단하는 방법, 영양상태를 평가하는 방법에 있어서는, 트랜스페린의 양을 정확하게 측정하는 것이 가능하다.

또한 본 발명에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은, 참조로서 본 명세서에 포함된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하나 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1]

재료 및 방법

1. 플라스미드 벡터의 구축

본 연구에서는 인간 트랜스페린과 반응하는 마우스 항 인간 트랜스페린 항체의 scFv형 항체(scFv형 anti transferrin antibody: 이하 aTf)를 재조합 누에에서 생산하기 위해, 플라스미드 벡터 pUASFvaTf(도 1)를 제작하였다. 상기 재조합 누에 제작을 위한 벡터는, 효모의 전사제어인자 GAL4의 존재하에서 유전자 발현을 촉진하는 프로모터 UAS와 융합한 항체 단백질 유전자 FvaTf를, 트랜스포존 piggyBac의 역위 말단 반복서열의 사이에 삽입한 것이다.

scFv형 항 인간 트랜스페린 항체는 이하와 같이 설계하였다. 인간의 산성 포스파타아제의 분비성 시그널 서열 하류에 항체의 H 사슬 가변영역(VH), 이어서 플렉시블이 있는 링커 펩티드(Linker), 그리고 항체의 L 사슬 가변영역(VL)을 연결한 구조를 갖는 DNA를 설계하였다. VH-Linker-VL의 아미노산 서열은, 각 유전자의 연결도 포함하여, 공지의 서열을 사용하였다. 본 실험에서 사용한 scFv형 항체의 유전자 염기서열(코돈 변환 전후) 및 이 염기서열로부터 생성되는 아미노산 서열과 서열번호의 관계는 표 2에 나타내는 바와 같다. 또한, 유전자 코돈은 곤충에서의 발현에 적합한 코돈으로 변환하였다(pUC57/FvaTf).

GAL4/UAS 시스템에 있어서 유전자 플라스미드는 도 1에 나타내는 순서에 따라 구축하였다. 즉, 제한효소 Bln I으로 소화한 도너 벡터 pBluescript II/UAS-SV40에 pUC57/FvaTf로부터 제한효소 Spe I으로 소화한 FvaTf 프래그먼트를 삽입하였다(pBluescript II/UAS-FvaTf-SV40UTR).

이 유전자를 목적 부위에 발현시키기 위해, 이미 계통화되어 있는 Ser1GAL4/3XP3DsRed 계통의 누에(다무라들, 2004)를 사용하였다. 상기 재조합 누에에서는 중부 견사선에서만 GAL4 유전자가 발현하고, UAS에 제어되는 도입 유전자를 발현시키는 것이 확인되고 있다(다무라들, 2004). 도입한 항체 유전자를 발현시키기 위해, 얻어진 항체 유전자를 갖는 UASFvaTf 계통을 상기의 GAL4 계통과 교배하였다(도 2).

또한, 이 플라스미드 벡터는 재조합 누에를 동정하기 위한 마커 유전자로서, 배의 홑눈이나 나방의 겹눈, 신경 유래 조직에서의 발현을 촉진하는 프로모터를 갖는 녹색 형광단백질 유전자 3XP3GFP를 갖고 있다(Horn, C., and E. A. Wimmer,(2000) Dev. Genes Evol. 210: 630-637; Murizio et al.(1994) Protein Science, 3: 1476-1484).

2. 웨스턴 블로팅

웨스턴 블로팅은 다음과 같이 하여 행하였다. Ser1GAL4/3XP3DsRed 계통과 UASFvaTf 계통을 교배하여 얻어진 차세대의 산란 후 6일째의 알을 실체 형광현미경으로 관찰하고, GAL4/UAS 개체를 동정하였다(도 3). 양쪽의 유전자를 갖는 개체만 사육하고, 5령 토사 0일째, 5령 토사 1일째, 5령 토사 2일째의 누에로부터 견사선을 적출하고, 세포층을 2% 도데실 황산리튬 5 mM EDTA 50 mM Tris-HCl pH 7.4로 단백질을 추출하였다. 동일하게, 음성 대조로서 UASFvaTf를 갖지 않는 Ser1GAL4 계통의 5령 토사 0일째의 누에에 대해서도 견사선을 적출하여 단백질을 추출하였다. 이 추출시료 2용량에 대해 SDS 샘플 완충용액(sample buffer)(6% SDS, 24% 글리세롤, 12% 2-메르캅토에탄올, 0.1% BPB)를 1용량 첨가하고, SuperSep 5-20%(와코 순약공업사)로 SDS-PAGE 후, 이하와 같이 웨스턴 블롯을 행하였다. SDS-PAGE 종료 후, PVDF막(밀리포어사제)에 0.8 ㎃/㎠, 1시간 통전(通電)함으로써 단백질을 전사하고, 블록 에이스(다이닛폰 제약사)를 사용하여 블로킹을 행하였다. 이것을 PBS-T(0.05% Tween, 150 mM NaCl, 10 mM 인산 완충용액, pH 7.4)로 세정한 후, 토끼 항 마우스 Ig-HRP 표지 항체(아머샴 바이오사이언스사)를 블록 에이스로 100배 희석한 용액을 제작하고, 6시간 실온에서 진탕하였다. 토끼 항 마우스 Ig-HRP 표지 항체반응 후, 전술과 동일한 세정 조작을 행하고, POD 면역염색 세트(immunostain set)(와코 순약공업사)로 검출하였다.

3. RT-PCR

RT-PCR은 이하와 같이 행하였다. 전술한 바와 같이, GAL4/UAS의 양쪽의 유전자를 갖는 개체를 사육하고, 5령 토사 0일째, 5령 토사 1일째, 5령 토사 2일째의 누에로부터 중부 견사선을 적출하였다. 동일하게, 음성 대조로서 UASFvaTf를 갖지 않는 Ser1GAL4 계통의 5령 토사 0일째의 누에에 대해서도 견사선을 적출하였다. 계속해서 적출한 중부 견사선을 글래스 호모지나이저(WHEATON사)로 옮기고, ISOGEN(닛폰 진사)을 사용하여 total RNA를 추출하였다. 이 total RNA를 DEPC수로 50 ㎍/20 ㎕로 조제하고, First-strand cDNA Synthesis Kit(아머샴 바이오사이언스사)를 사용하여, 첨부문서에 따라 cDNA로의 역전사를 행하였다. 이 역전사 산물을 주형(template)으로서 이하의 PCR을 행하였다. KODplus(도요보사)에 첨부의 10×PCR 완충용액을 5 ㎕, 150 μM의 프라이머(서열번호: 16), 150 μM의 프라이머(서열번호: 17), 1 mM MgSO₄, 0.2 mM dNTPs, 2 단위 KODplus가 되도록 각 시약을 첨가하고, 전량 50 ㎕로 하여, eppendorf사의 DNA 써멀 사이클러로 94℃ 2 min 1회, 94℃ 15 sec, 62℃ 15 sec, 72℃ 30 sec의 사이클을 35회, 72℃ 1 min 1회의 신장반응을 행하였다. 또한 PCR의 양성 대조에는 플라스미드 벡터 pUASFvaTf를 주형에 사용하였다.

4. 재조합 항체의 활성측정

ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)에 의한 재조합 항체의 항원에 대한 활성의 측정은 이하의 순서로 행하였다. Ser1GAL4/UASFvaTf 계통과 UASFvaTf를 갖지 않는 Ser1GAL4 계통의 5령 토사 0일째의 누에로부터 중부 견사선을 적출하고, 적출한 조직 200 ㎎당 1 ㎖의 트리스 완충용액(Tris buffer)(20 mM Tris-HCl pH 7.4)를 첨가하였다. 이것을 글래스 호모지나이저로 분쇄하고, 추가적으로 14,000 rpm 20분간의 원심 후, 상청을 트리스 완충용액으로 5배(40 ㎎/㎖)와 10배(20 ㎎/㎖)로 희석하였다. 이들 및 무희석의 시료(원배(原倍); 200 ㎎/㎖)를 ELISA 측정용 시료로 하였다. 또한, 음성 대조로서 Ser1GAL4 계통의 누에에 대해서도 동일한 조작으로 ELISA 측정용 시료를 조제하였다. 사전에 트랜스페린(Biogenesis사)을 100 ㎍/well로 감작한 마이크로타이터 플레이트(눈크사)에 상기에서 제작한 ELISA 측정용 시료의 100 μL를 분주(分注)하고, 실온에서 2시간, 진탕시켰다. 이어서, ELISA 측정용 시료를 웰(well)로부터 버리고 200 μL의 PBS-T에서 웰을 3회 세정하고, 사전에 토끼 항 마우스 Ig-HRP 표지 항체를 PBS(150 mM NaCl, 10 mM 인산 완충용액, pH 7.4)로 100배 희석한 용액을 웰에 100 μL 분주하여, 실온에서 6시간, 진탕시켰다. 계속해서 세정 조작을 행하여 100 μL의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(닛폰 로슈사)을 첨가하여 발색시켰다. 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘을 첨가하고부터 정확하게 3분 후에 1 N 황산을 100 μL 분주하고, 발색을 정지시켰다. 발색 정지 후, 모델 550 마이크로플레이트 리더(BioRad)로 450 ㎚의 흡광도를 측정하였다.

결과 및 고찰

상기의 방법으로 제작한 플라스미드와, 전이효소 유전자를 코드하는 헬퍼 플라스미드 pA3PIG(Tamura et al., 2000)를 함께 약 1,000알(粒)의 발생 초기의 누에알에 주사하고, 차세대의 배의 홑눈에 있어서 GFP의 발현을 조사하였다. 그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 2 나방구(蛾區, moth broods)에 있어서 GFP를 발현하는 개체가 출현하였다.

이들의 재조합 누에를 사육한 결과, 1 계통에 대해서만 계통화하는데 성공하였다. 얻어진 UASFvaTf/3XP3GFP 계통을 Ser1GAL4/3XP3DsRed 계통과 교배하고, 차세대에 있어서 각 형광단백질 유전자를 갖는 개체의 분리비를 표 4에 나타내었다.

이 값은 어떤 유전자도 헤테로에 갖는 개체끼리를 교배한 경우의 이론값과 일치하는 점으로부터, 양쪽의 유전자는 다른 염색체 상에 삽입되어 있어, 각각 독립 유전하는 것을 알 수 있었다. 이 경우, 3XP3GFP나 3XP3DsReD 및 양쪽의 유전자를 갖는 재조합 누에는 도 3에 나타내는 바와 같이 배기(胚期)에 있어서, 실체 형광현미경으로 관찰하면 홑눈이나 신경 유래의 조직이 형광을 갖는 점으로부터, 용이하게 동정할 수 있었다.

다음으로, 이와 같이 하여 3XP3GFP 및 3XP3DsRed 유전자를 갖는 개체를 UASFvaTf과 Ser1GAL4 유전자의 양쪽을 갖는 개체로서 사육하고, 토사기의 유충의 중부 견사선으로부터 추출한 샘플의 웨스턴 블로팅을 행하였다. 그 결과, 도 5에 나타내는 바와 같이, 견사선에 있어서 항체가 생산되고 있는 것이 확인되었다. 또한 동일하게 얻어진 추출을 항체반응시킨 결과, 도 6에 나타내는 바와 같이 견사선 추출물의 양이 증가하는데 수반하여 항원과의 반응물의 양이 증가하고, 항체로서의 활성을 갖고 있는 것을 알 수 있었다.

웨스턴 블로팅과 동일하게 토사기의 중부 견사선으로부터 total RNA를 추출하고, RT-PCR을 행하였다. 그 결과, 도 4에 나타내는 바와 같이 5령 5일에서 가장 도입 유전자의 전사가 많고, 경시적으로 전사가 억제되어 가는 것을 알 수 있었다. 따라서, 5령 5일째에 유전자의 전사가 활발해지고, 이어서 토사기에 단백질로 번역되어 중부 견사선에 존재하는 것이 명확해졌다.

[실시예 2]

재료 및 방법

1. 플라스미드 벡터의 구축

본 연구에서는 인간 트랜스페린과 반응하는 IgG형 마우스 항 인간 트랜스페린 항체를 재조합 누에에서 생산하기 위해, 플라스미드 벡터 pBacN/lox p UASIgL UASIgH(도 7~9)를 제작하였다. 상기 재조합 누에 제작을 위한 벡터는, 효모의 전사제어인자 GAL4의 존재하에서 유전자 발현을 촉진하는 프로모터 UAS와 융합한 항체 단백질 유전자의 L 사슬 및 H 사슬을 트랜스포존 piggyBac의 역위 말단 반복서열의 사이에 삽입한 것이다.

IgG형 마우스 항 인간 트랜스페린 항체의 L 사슬은 이하와 같이 설계하였다. 먼저, 항체의 L 사슬은 마우스의 면역글로불린 L 사슬 κ의 시그널 펩티드 하류에 항 인간 트랜스페린 항체의 Lκ 사슬 가변영역, 이어서 마우스의 L 사슬 J 세그먼트, 마우스의 Lκ 사슬 정상영역을 연결한 구조(IgL)를 갖는 DNA를 설계하였다. 계속해서, IgG형 마우스 항 인간 트랜스페린 항체의 H 사슬은, 마우스 IgG의 시그널 펩티드 하류에 항 인간 트랜스페린 항체의 H 사슬 가변영역, 이어서 마우스 IgG1의 H 사슬 정상영역 1(CH1), 마우스 IgG1의 힌지영역, 마우스 IgG1의 H 사슬 정상영역 2(CH2), 마우스 IgG1의 H 사슬 정상영역 3(CH3)를 연결한 구조(IgH)를 갖는 DNA를 설계하였다. 본 실험에서 설계한 IgG형 항체의 서브클래스는 IgG1이고, 또한 κ 사슬의 항원성을 가지며, L 사슬 및 H 사슬의 아미노산 서열은 공지의 서열을 연결하였다. 여기서 사용한 유전자의 염기서열 및 이 염기서열로부터 생성되는 아미노산 서열과 서열번호의 관계는, 표 5에 나타내는 바와 같다.

2. 플라스미드 벡터의 구축

GAL4/UAS 시스템에 있어서 유전자 플라스미드는 도 7~9에 나타내는 순서에 따라 구축하였다. 즉, 제한효소 Bln I으로 소화한 도너 벡터 pBluescript II UAS-SV40로 pUC57/IgL로부터 제한효소 Nhe I으로 소화한 IgL 프래그먼트를 삽입하여, pBluescript II/UAS IgL SV40를 얻었다. 이어서, 제한효소 Bln I으로 소화한 플라스미드 벡터 pBacN/lox p로 pBluescript II/UAS IgL SV40로부터 제한효소 Spe I으로 소화한 UAS IgL SV40UTR 프래그먼트를 삽입하여, pBacN/lox p UAS IgL SV40를 얻었다(도 7). 또한, 제한효소 Bln I으로 소화한 도너 벡터 pDNR/UAS-SV40로 pUC57/IgH로부터 제한효소 Nhe I으로 소화한 IgH 프래그먼트를 삽입하여, pDNR/UAS IgH SV40를 얻었다(도 8). 이어서, Cre Recombinase를 사용하여 UAS IgH SV40UTR 프래그먼트를 pBacN/lox p UAS IgL SV40로 삽입하였다(도 9: pBacN/loxp UASIgL UASIgH).

3. 재조합 단백질 발현계통의 수립

이 유전자를 목적부위에 발현시키기 위해, 이미 계통화되어 있는 Ser1GAL4/3xP3DsRed 계통의 누에(다무라들, 2004)를 사용하였다. 상기 재조합 누에에서는 중부 견사선에서만 GAL4 유전자가 발현하고, UAS에 제어되는 도입 유전자를 발현시키는 것이 확인되고 있다(다무라들, 2004). 도입한 IgG형 항 인간 트랜스페린 항체를 발현시키기 위해, 얻어진 IgG형 항 인간 트랜스페린 항체 유전자를 갖는 UASIgL-UASIgH 계통을 상기의 GAL4 계통과 교배하였다(도 10).

또한, 이 플라스미드 벡터는 재조합 누에를 동정하기 위한 마커 유전자로서, 배의 홑눈이나 나방의 겹눈, 신경 유래 조직에서의 발현을 촉진하는 프로모터를 갖는 녹색 형광단백질 유전자 3xP3GFP를 갖고 있다(Horn, C., and E. A. Wimmer, (2000) Dev. Genes Evol. 210: 630-637; Murizio et al. (1994) Protein Science, 3: 1476-1484).

4. RT-PCR

RT-PCR은 이하와 같이 행하였다. 전술한 바와 같이, GAL4/UAS의 양쪽의 유전자를 갖는 개체를 사육하고, 5령 토사기 직전의 누에로부터 중부 견사선을 적출하였다. 계속해서 적출한 중부 견사선을 글래스 호모지나이저(WHEATON사)로 옮기고, ISOGEN(닛폰 진사)을 사용하여 total RNA를 추출하였다. 이 total RNA를 DEPC수로 50 ㎍/20 ㎕로 조제하고, First-strand cDNA Synthesis Kit(GE 헬스케어 바이오사이언스사)를 사용하여, 첨부문서에 따라 cDNA로의 역전사를 행하였다. 이 역전사 산물을 주형으로서, 표 6에 나타내는 프라이머의 조합으로 IgL, IgH, GAL4, 세포 내 액틴에 대해서 이하의 PCR을 행하였다. TaKaRa Ex Taq Hot Start Version(다카라 바이오사)에 첨부의 10×PCR 완충용액을 5 ㎕, 100 μM의 포워드 프라이머(Forward primer)(표 6), 100 μM의 리버스 프라이머(Reverse primer)(표 6), 0.2 μM dNTP, 2.5 단위 TaKaRa Ex Taq Hot Start Version이 되도록 각 시약을 첨가하고, 전량 50 ㎕로 하여, eppendorf사의 써멀 사이클러로, 94℃ 2 min 1회, 94℃ 15 sec, 60℃ 15 sec, 72℃, 30 sec의 사이클을 40회, 72℃ 1 min의 신장반응을 행하였다.

5. IgG1형 항체의 검출

IgG형 마우스 항체의 검출은 다음과 같이 하여 행하였다. Ser1GAL4/3xP3DsRed 계통과 UASIgL-UASIgH 계통을 교배하여 얻어진 차세대의 산란 후 6일째의 알을 실체 형광현미경으로 관찰하고, GAL4/UAS 개체를 동정하였다(도 11). 양쪽의 유전자를 갖는 개체만을 사육하고, 5령 토사기의 누에로부터 견사선을 적출하여, 20 mM Tris-HCl pH 7.4(트리스 완충용액)로 견사선의 단백질을 추출하였다. 이 단백질 용액에 대해서, 마우스 단일클론항체 아이소타이핑 키트(Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit)(GE 헬스케어 바이오사이언스사)를 사용하여 항체를 검출하였다. 구체적으로는 누에의 견사선으로부터 추출한 단백질 용액에 타이핑 스틱(Typing stick)을 침지하고, 실온에서 18시간 진탕하였다. 이어서, 첨부문서대로 세정 조작 후, 퍼옥시다아제 표지 항마우스 항체(Peroxidase-labeled anti-mouse antibody)를 첨가하고, 실온에서 6시간 진탕하였다. 계속해서, 세정 조작을 행한 후, 기질 용액에 침지하여 밴드를 확인하였다.

6. 재조합 항체의 항원과의 반응성 시험

ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)에 의한 재조합 IgG형 항체의 항원에 대한 반응성의 측정은 이하의 순서로 행하였다. Ser1GAL4/UASIgL-UASIgH 계통과 UASIgL-UASIgH를 갖지 않는 Ser1GAL4 계통의 토사기의 누에로부터 중부 견사선을 적출하고, 3 ㎖의 트리스 완충용액을 첨가하였다. 이것을 글래스 호모지나이저로 분쇄하고, 추가적으로 12,000 rpm 20분간의 원심 후, 상청을 중부 견사선 추출시료의 원액으로 하였다. 이 원액을 트리스 완충용액으로 2배와 4배로 희석하였다. 이들 및 무희석의 시료(원액)를 ELISA 측정용 시료로 하였다. 또한, 음성 대조로서 Ser1GAL4 계통의 누에에 대해서도 같은 조작으로 ELISA 측정용 시료를 조제하였다. 또한, Ser1GAL4/UASIgL-UASIgH 계통 및 Ser1GAL4 계통의 원액시료에 대해서, Bradford법(Quick Start 프로테인 어세이 염색액: BIO-RAD사)으로 단백질을 정량하였다(표 7).

사전에 트랜스페린(Biogenesis사)을 1 ㎍/well로 감작한 마이크로타이터 플레이트(눈크사)에 상기에서 제작한 ELISA 측정용 시료의 100 ㎕를 분주하고, 실온에서 3시간, 진탕시켰다. 이어서, ELISA 측정용 시료를 웰로부터 버리고 200 ㎕의 PBS-T로 웰을 3회 세정하였다. 계속해서, 퍼옥시다아제 표지 항 마우스 면역글로불린·염소 다중클론항체(다코사)의 100 ㎕를 분주하고, 실온에서 4시간, 진탕시킨 후, 200 ㎕의 PBS-T로 웰을 5회 세정하였다. 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(닛폰 로슈)을 첨가하여 발색시켰다. 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘을 첨가하고부터 정확하게 4분 후에 1 N 황산을 100 μL 분주하고, 발색을 정지시켰다. 발색 정지 후, 모델 550 마이크로플레이트 리더(BioRad사)로 450 ㎚의 흡광도를 측정하였다.

결과 및 고찰

상기의 방법으로 제작한 플라스미드와, 전이효소 유전자를 코드하는 헬퍼 플라스미드 pA3PIG(Tamura et al., 2000)를 함께 약 700알의 발생 초기의 누에알에 주사하고, 차세대의 배의 홑눈에 있어서 GFP의 발현을 조사하였다. 그 결과, 표 8에 나타낸 바와 같이, 7 나방구에 있어서의 GFP를 발현하는 개체가 출현하였다.

이들의 재조합 누에를 사육한 결과, 3 계통에 대해서 계통화하는 것에 성공하였다. 또한 계통화된 UASIgL-IgH 계통 중에서 1 계통을 Ser1GAL4 계통과 교배하여, 차세대에 있어서 각 형광단백질 유전자를 갖는 개체의 분리비를 표 9에 나타내었다.

이 값은 어떤 유전자도 헤테로에 갖는 개체끼리를 교배한 경우의 이론값과 일치하는 점으로부터, 양쪽의 유전자는 다른 염색체 상에 삽입되어 있어, 각각 독립 유전하는 것을 알 수 있었다. 이 경우, 3xP3GFP나 3xP3DsRed 및 양쪽의 유전자를 갖는 재조합 누에는 도 11에 나타내는 바와 같이 초기 배에 있어서, 실체 형광현미경으로 관찰하면 홑눈이나 신경 유래 조직이 형광을 갖는 점으로부터, 용이하게 동정할 수 있었다.

다음으로, 이와 같이 하여 3xP3GFP 및 3xP3DsRed 유전자를 갖는 개체를 UASIgL UASIgH 유전자와 Ser1GAL4 유전자의 양쪽을 갖는 개체로서 사육하고, 토사기의 유충의 견사선으로부터 추출한 샘플에 IgG1형 항체가 포함되는지를 마우스 단일클론항체 아이소타이핑 키트로 확인을 행하였다. 그 결과, 도 13에 나타내는 바와 같이, 견사선에 있어서, κ 사슬을 갖는 마우스 IgG1형 항체가 생산되고 있는 것이 명확해졌다. 또한, 동일하게 이 견사선으로부터 추출한 샘플을 항원과 반응시킨 결과, 도 14에 나타내는 바와 같이, 재조합 누에가 생산한 재조합 단백질이 항체로서 작용하고 있는 것이 명확해졌다.

IgG1형 항체의 검출과 동일하게, 중부 견사선으로부터 total RNA를 추출하고, RT-PCR을 행하였다. 그 결과, 도 12에 나타내는 바와 같이, 항체의 L 사슬 및 H 사슬의 양쪽의 유전자가 전사되어 있는 것을 알 수 있었다.

본 발명에 의해, 누에를 이용한 재조합 항체의 제조방법이 제공되었다. 곤충은 항체분자를 갖지 않는다. 따라서, 누에를 이용하여 재조합 항체를 제조하는 이점으로서, 재조합 항체의 추출물에 목적의 항체 이외의 항체가 포함될 가능성이 없 는 점을 들 수 있다. 이것은 마우스 등의 포유동물과 달리, 녹아웃 개체를 제작할 필요가 없는 것을 의미한다. 포유동물 유래의 배양세포 등을 사용한 경우, 제조되는 재조합 항체의 정제품에 동물세포 유래의 항체가 포함될 가능성이 있다. 이것은 교차반응의 원인이 되어, 항원의 정확한 양의 측정을 방해한다. 누에 유래의 재조합 항체에서는 교차반응이 일어날 가능성이 낮아, 목적으로 하는 항원과 반응한 항체만을 정확하게 측정하는 것이 가능해진다. 또한, 누에를 이용함으로써, 대량의 항체를 제조하는 것이 가능해진다. 본 발명은, 특이성이 높은 항체가 대량으로 필요로 되는, 의약품이나 진단제 분야에 있어서 특히 유용하다.

SEQUENCE LISTING <110> NATIONAL INSTITUTE OF AGROBIOLOGICAL SCIENCES NITTO BOSEKI CO., LTD. UNITECH CO., LTD <120> Transgenic silkworms producing antibodies and use thereof <130> MOA-A0503P <150> JP 2005-302906 <151> 2005-10-18 <160> 51 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 57 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggacatgt ggacggcgct gctcatcctg caagccttgt tgctaccctc cctggct 57 <210> 2 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificial synthesized nucleotide sequence <400> 2 atggacatgt ggaccgctct gctcatcctg caagctctgc tcctgccctc cctggct 57 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Asp Met Trp Thr Ala Leu Leu Ile Leu Gln Ala Leu Leu Leu Pro 1 5 10 15 Ser Leu Ala <210> 4 <211> 363 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 4 ctcgaggtcc agctgcagga gtcgggacct gacctggtga aaccttctca gtcactttca 60 ctcacctgca ctgtcactgg ctactccatc accagtggtt atagctggca ctggattcgg 120 cagtttccag aaaacaaact ggaatggctg ggctacatac actccagtgg tgccactaac 180 tacagcccat ctctcaaaag tcgattctct atcactagag acacatccaa gaaccagttc 240 ttcctgcagt tgaactctgt gactactgag gacacagcca catattactg 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catacagtaa caaattgttt taacttaaat ctaatacatc 720 ggatttcccg gttcagtgat cagcgtgtcc tgtgacacat aggcctcttc cagctgcttt 780 catttttctc tattggtagc ttttcttgac cagattgtct ctccaatcat cttgatatcg 840 tctgtccatc ttctagcttg cctggctctt ttcctttaaa ccaggggtcg tgaattcaat 900 cctcacagga agccgggatt aggtgggaga atatagttcc gatgttttga atgctttata 960 ttttctgtgg tcgaaaatga tactagagct acgcgtcgac aattgaatat tatgctaact 1020 accctctatt tattaaaaga cttttacgat tcatttcgca cagaaccaat cgactgggtt 1080 tagaggttta gcagtttgtt gaatgaactc gttttcatct tcacgattag aggatcccag 1140 gtgttaggta aaggatattc tagattgcag gagatttttc ataaataatc acgcgatgga 1200 gcggtaatca gccaacatag tcgatcggca tcattattgg agaccaaaca acacttcagt 1260 tatccaagcg cgtcttaagt cgcattcgga taatcttgaa tagcctggaa gtgaattttt 1320 aaaaagtttg tctcgaacaa acatcaatta ctttgtaatt gaaccgaaaa aagaggataa 1380 acattattag cattcgttgt aatgaaatat aatgttgaca cagtttgacc gacgtgcact 1440 gtcttttgtg gcaccggcta tataaaggtg gtctgtccgt tctgagccac acgagtcatc 1500 atgaagatcc catacgtctt gctgttcctt 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actttatttt 300 cattaaattt atttcttttt ttttatttca attttaatca atttgaaaaa aaatcgaata 360 aacaacatcc tcaaacatgc atattggaca tcccttttct tgacatcgta taaattcggt 420 aattctcggt acggttcgta aagttcacct gcggctatat tccgactcgc caagttacgt 480 cagtcgtatt gtaatgagcg atttagtggg caacttcatt ctgttaattt tgtgtcacgg 540 tgcgcgcgca tcgtaaaact tcactctcat agatttttca taacgcgcct aaagaagtat 600 aacttcaata atttaaattt aaaaaaaaac atgcatagaa taattatatg aattatttaa 660 aatgtcattt accgacattg acataacaga cgacgttaac actacaaaac attttaattc 720 cacattgtta catattcaac agttaaattt gcgttaattc tcgatgcgaa caaatataag 780 aacaatcgga tcaattagat cgctttgttt cgaacaacac ttagtttaac tagaggcgta 840 cacctcaaga aatcatcttc attagaaact aaaccttaaa atcgcaataa taaagcatag 900 tcaattttaa ctgaaatgca aagtcttttg aacgttagat gctgtcagcg ttcgttggta 960 cagttgtttg atatttattt taattgtctt tttatatata aatagtggaa cattaatcac 1020 ggaatcc 1027 <210> 19 <211> 1892 <212> DNA <213> Bombyx mori <400> 19 gaattcgaaa aagcaaaaac ttaaataaat aaaacattca atttattcta aagtggcgca 60 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cgagctgata gcgtgcgcgt taccatatat ggtgacaaaa actgagtcag 1800 cccgcgattg gtggaaaaac aaactggagc cgatactgtg taaattgtga taacggctct 1860 tttatatagt ttatcctcac gagtcggttc tc 1892 <210> 20 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 20 atggatttac aggtgcagat tatcagcttc ctgctaatca ttgtcacagt c 51 <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Met Asp Leu Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ile Val Thr 1 5 10 15 Val <210> 22 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 22 attgagctca cccagtctcc atcctcccta gctgtgtcag ttggagagaa ggttactatg 60 acctgcaagt ccagtcagag ccttttatat agtaccaatc aaaagaacta cttggcctgg 120 taccagcaga aaccagggca gtctcctaaa ctgctgattt actgggcatc cactagggaa 180 tctggggtcc ctgatcgctt cacaggcagt ggatctggga cagatttcac tctcaccatc 240 agcagtgtga aggctgaaga cctgtcagtt tattactgtc agcaatatta tagctatcct 300 cccacgttcg gctcgggcac caagctggaa atcaaa 336 <210> 23 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly Glu 1 5 10 15 Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Thr 20 25 30 Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ser Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 85 90 95 Tyr Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 24 <211> 39 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 24 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgg 39 <210> 25 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 26 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 26 gctgatgctg caccaactgt atccatcttc ccaccatcca gtgagcagtt aacatctgga 60 ggtgcctcag tcgtgtgctt cttgaacaac ttctacccca aagacatcaa tgtcaagtgg 120 aagattgatg gcagtgaacg acaaaatggc gtcctgaaca gttggactga tcaggacagc 180 aaagacagca cctacagcat gagcagcacc ctcacgttga ccaaggacga gtatgaacga 240 cataacagct atacctgtga ggccactcac aagacatcta cttcacccat tgtcaagagc 300 ttcaacagga atgagtgt 318 <210> 27 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 1 5 10 15 Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln 35 40 45 Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg 65 70 75 80 His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro 85 90 95 Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 100 105 <210> 28 <211> 57 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 28 atgggatgga gctggatctt tctctttctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt cctctct 57 <210> 29 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val Leu Ser <210> 30 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 30 gtccagctgc aggagtcggg acctgacctg gtgaaacctt ctcagtcact ttcactcacc 60 tgcactgtca ctggctactc catcaccagt ggttatagct ggcactggat ccggcagttt 120 ccagaaaaca aactggaatg gctgggctac atacactcca gtggtgccac taactacagc 180 ccatctctca aaagtcgatt ctctatcact cgagacacat ccaagaacca gttcttcctg 240 cagttgaatt ctgtgactac tgaggacaca gccacatatt actgtgcaag ggatggttac 300 tcccctccct atgctatgga ctattggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctca 357 <210> 31 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 31 Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser 1 5 10 15 Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr 20 25 30 Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Glu Asn Lys Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Tyr Ile His Ser Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Tyr Ser Pro Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 291 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 32 gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 60 tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 120 tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct ggagtctgac 180 ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagcc ctcggcccag cgagaccgtc 240 acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat t 291 <210> 33 <211> 97 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33 Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala 1 5 10 15 Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Glu Ser Asp Leu Tyr Thr Leu 50 55 60 Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ser Glu Thr Val 65 70 75 80 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 Ile <210> 34 <211> 39 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 34 gtgcccaggg attgtggttg taagccttgc atatgtaca 39 <210> 35 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35 Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr 1 5 10 <210> 36 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 36 gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt 60 actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc 120 cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag gtgcacacag ctcagacgca accccgggag 180 gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg 240 ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag 300 aaaaccatct ccaaaaccaa a 321 <210> 37 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37 Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 1 5 10 15 Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp 20 25 30 Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp 35 40 45 Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 50 55 60 Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp 65 70 75 80 Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro 85 90 95 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys 100 105 <210> 38 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 38 ggcagaccga aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca gatggccaag 60 gataaagtca gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag 120 tggcagtgga atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat catgaacacg 180 aatggctctt acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga 240 aatactttca cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc 300 ctctcccact ctcctggtaa a 321 <210> 39 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 39 Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu 1 5 10 15 Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe 20 25 30 Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala 35 40 45 Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr 50 55 60 Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His 85 90 95 Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 40 gcagattatc agcttcctgc t 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 41 gacaggtctt cagccttcac a 21 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 42 ggaactgcag gtgtcctctc 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 43 aggggagtaa ccatcccttg 20 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 44 ctcgtccttc agtgatagca g 21 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 45 cgcttaacat gatggagcat cg 22 <210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 46 tacaatgagc tgcgtgtcg 19 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 47 cgggcgtgtt gaatgtttc 19 <210> 48 <211> 744 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 48 atggatttac aggtgcagat tatcagcttc ctgctaatca ttgtcacagt cattgagctc 60 acccagtctc catcctccct agctgtgtca gttggagaga aggttactat gacctgcaag 120 tccagtcaga gccttttata tagtaccaat caaaagaact acttggcctg gtaccagcag 180 aaaccagggc agtctcctaa actgctgatt tactgggcat ccactaggga atctggggtc 240 cctgatcgct tcacaggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtgtg 300 aaggctgaag acctgtcagt ttattactgt cagcaatatt atagctatcc tcccacgttc 360 ggctcgggca ccaagctgga aatcaaatgg acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc 420 aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc atcttcccac catccagtga gcagttaaca 480 tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg aacaacttct accccaaaga catcaatgtc 540 aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag 600 gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat 660 gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc actcacaaga catctacttc acccattgtc 720 aagagcttca acaggaatga gtgt 744 <210> 49 <211> 248 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 49 Met Asp Leu Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ile Val Thr 1 5 10 15 Val Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 20 25 30 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 35 40 45 Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 50 55 60 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ser Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 Tyr Tyr Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125 Lys Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp 130 135 140 Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr 145 150 155 160 Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys 165 170 175 Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly 180 185 190 Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 195 200 205 Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn 210 215 220 Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val 225 230 235 240 Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 245 <210> 50 <211> 1386 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 50 atgggatgga gctggatctt tctctttctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt cctctctgtc 60 cagctgcagg agtcgggacc tgacctggtg aaaccttctc agtcactttc actcacctgc 120 actgtcactg gctactccat caccagtggt tatagctggc actggatccg gcagtttcca 180 gaaaacaaac tggaatggct gggctacata cactccagtg gtgccactaa ctacagccca 240 tctctcaaaa gtcgattctc tatcactcga gacacatcca agaaccagtt cttcctgcag 300 ttgaattctg tgactactga ggacacagcc acatattact gtgcaaggga tggttactcc 360 cctccctatg ctatggacta ttggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcagccaaa 420 acgacacccc catctgtcta tccactggcc cctggatctg ctgcccaaac taactccatg 480 gtgaccctgg gatgcctggt caagggctat ttccctgagc cagtgacagt gacctggaac 540 tctggatccc tgtccagcgg tgtgcacacc ttcccagctg tcctggagtc tgacctctac 600 actctgagca gctcagtgac tgtcccctcc agccctcggc ccagcgagac cgtcacctgc 660 aacgttgccc acccggccag cagcaccaag gtggacaaga aaattgtgcc cagggattgt 720 ggttgtaagc cttgcatatg tacagtccca gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca 780 aagcccaagg atgtgctcac cattactctg actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac 840 atcagcaagg atgatcccga ggtccagttc agctggtttg tagatgatgt ggaggtgcac 900 acagctcaga cgcaaccccg ggaggagcag ttcaacagca ctttccgctc agtcagtgaa 960 cttcccatca tgcaccagga ctggctcaat ggcaaggagt tcaaatgcag ggtcaacagt 1020 gcagctttcc ctgcccccat cgagaaaacc atctccaaaa ccaaaggcag accgaaggct 1080 ccacaggtgt acaccattcc acctcccaag gagcagatgg ccaaggataa agtcagtctg 1140 acctgcatga taacagactt cttccctgaa gacattactg tggagtggca gtggaatggg 1200 cagccagcgg agaactacaa gaacactcag cccatcatga acacgaatgg ctcttacttc 1260 gtctacagca agctcaatgt gcagaagagc aactgggagg caggaaatac tttcacctgc 1320 tctgtgttac atgagggcct gcacaaccac catactgaga agagcctctc ccactctcct 1380 ggtaaa 1386 <210> 51 <211> 462 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val Leu Ser Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro 20 25 30 Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr 35 40 45 Ser Gly Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Glu Asn Lys Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Tyr Ile His Ser Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Ser Pro 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ser Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln 85 90 95 Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Pro Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro 130 135 140 Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met 145 150 155 160 Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu Glu Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His 210 215 220 Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys 225 230 235 240 Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe 245 250 255 Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro 260 265 270 Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val 275 280 285 Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr 290 295 300 Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu 305 310 315 320 Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys 325 330 335 Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro 355 360 365 Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile 370 375 380 Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly 385 390 395 400 Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn 405 410 415 Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp 420 425 430 Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His 435 440 445 Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 450 455 460

Claims

삭제
이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 재조합 항체의 제조방법;

(a) 견사선(絹絲腺) 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에로서, 상기 재조합 항체를 견사선에 분비하는 트랜스제닉 누에를 제조하는 공정,

(b) 제조된 트랜스제닉 누에로부터, 상기 재조합 항체를 회수하는 공정.
제2항에 있어서, 트랜스제닉 누에가, 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에인 방법;

(i) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA,

(ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA.
제2항에 있어서, 트랜스제닉 누에가, 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 트랜스제닉 누에를 교배시킴으로써 제조되는 방법;

(i) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에,

(ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에.
제3항 또는 제4항에 있어서, 전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인 방법.
제2항에 있어서, 견사선이 중부 견사선 또는 후부 견사선인 방법.
제6항에 있어서, 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 세리신 1 단백질 또는 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 방법.
제6항에 있어서, 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 방법.
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견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 누에알을 제조하는 공정을 포함하는, 상기 재조합 항체를 견사선에 분비하는 트랜스제닉 누에의 제조방법.
제15항에 있어서, 트랜스제닉 누에가, 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에인 방법;

(i) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA,

(ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA.
제15항에 있어서, 트랜스제닉 누에가, 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 트랜스제닉 누에를 교배시킴으로써 제조되는 방법;

(i) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에,

(ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에.
제16항 또는 제17항에 있어서, 전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인 방법.
제15항에 있어서, 견사선이 중부 견사선 또는 후부 견사선인 방법.
제19항에 있어서, 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프 로모터가, 세리신 1 단백질 또는 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 방법.
제19항에 있어서, 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 방법.
삭제
견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에로서, 상기 재조합 항체를 견사선에 분비하는 트랜스제닉 누에.
제23항에 있어서, 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에;

(i) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA,

(ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA.
제23항에 있어서, 이하의 (i) 및 (ii)에 기재의 트랜스제닉 누에를 교배시킴으로써 제조되는 트랜스제닉 누에;

(i) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에,

(ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 시그널 서열을 갖는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에.
제24항 또는 제25항에 있어서, 전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인 트랜스제닉 누에.
제23항에 있어서, 견사선이 중부 견사선 또는 후부 견사선인 트랜스제닉 누에.
제27항에 있어서, 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 세리신 1 단백질 또는 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 트랜스제닉 누에.
제27항에 있어서, 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 트랜스제닉 누에.
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이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 재조합 항체의 제조방법;

(a) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에로서, 상기 재조합 항체를 견사선에 분비하는 트랜스제닉 누에를 제조하는 공정,

(b) 제조된 트랜스제닉 누에로부터, 상기 재조합 항체를 회수하는 공정.
제45항에 있어서, 견사선이 중부 견사선 또는 후부 견사선인 방법.
제46항에 있어서, 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 세리신 1 단백질 또는 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 방법.
제46항에 있어서, 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 방법.
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견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 누에알을 제조하는 공정을 포함하는, 상기 재조합 항체를 견사선에 분비하는 트랜스제닉 누에의 제조방법.
제50항에 있어서, 견사선이 중부 견사선 또는 후부 견사선인 방법.
제51항에 있어서, 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 세리신 1 단백질 또는 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 방법.
제51항에 있어서, 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 방법.
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견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 재조합 항체를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에로서, 상기 재조합 항체를 견사선에 분비하는 트랜스제닉 누에.
제55항에 있어서, 견사선이 중부 견사선 또는 후부 견사선인 트랜스제닉 누에.
제56항에 있어서, 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 세리신 1 단백질 또는 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 트랜스제닉 누에.
제56항에 있어서, 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 트랜스제닉 누에.
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