JP5158816B2

JP5158816B2 - キメラ抗体の一段階作製方法

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Publication number: JP5158816B2
Application number: JP2010234110A
Authority: JP
Inventors: 邦史太田; ワカリン
Original assignee: University of Tokyo NUC; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: University of Tokyo NUC; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2009-10-19
Filing date: 2010-10-19
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2030-10-19
Also published as: JP2011103876A

Description

本発明は、抗体の作製方法に関する。より詳細には、キメラ抗体及び該抗体を産生するキメラＢ細胞の作製方法に関する。

抗体は、生体物質の同定や機能解析などを行う上で欠くことのできない重要なツールである。とりわけ、近年では、疾患の治療において抗体の果たす役割には目覚ましいものがあり、抗体医薬の分野は急激な進歩を遂げている。生体内において、抗体は、特定の抗原と結合して、様々な生体内防御反応、例えば、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）活性や、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）活性を惹起して、癌細胞など生体において異物として認識される物の除去を行っている。このような抗体の能力に着目し、抗体医薬の研究が精力的に行われるようになってきた。多種多様な疾患の治療に対して抗体医薬を利用するためには、あらゆるタイプの疾患原因抗原に対し、迅速かつ簡便に、そして、所望の結合特性を備えた抗体を大量に供給する技術が必要となる。

従来、所望の物理的、生理的特徴を備えた抗体群を調製する技術として、モノクローナル抗体の作製技術が用いられていた。モノクローナル抗体を作製する場合、一般的には、生体内免疫によって生じたＢ細胞をミエローマと融合させるハイブリドーマ法が用いられる。しかし、この方法には、生体内免疫の利用によって生じる免疫寛容の問題の他、最終的な所望の抗体を取得するまでに時間と労力が掛かることなど、多くの難点が存在している。そこで、免疫寛容の問題を克服する技術として、生体内免疫を利用しない方法が開発された。この方法は、ファージ粒子に種々の抗体遺伝子を埋め込み、抗体遺伝子産物をファージ上に提示させ、このファージによる抗体ライブラリーから所望の抗体を取得する方法で、ファージディスプレイ法と呼ばれている。この技術は、免疫寛容を回避する点では優れているが、ファージライブラリーから得られる抗体は完全体ではないため、さらに、組換えＤＮＡ技術等により、完全体の調製を行う必要がある。従って、時間と労力の点においては、生体内免疫による方法と比較して、格段に進展したとまでは言い難い。

上記の伝統的なモノクローナル抗体作製技術の課題を克服した方法として、ＡＤＬｉｂ法（特許文献１及び非特許文献１）及びＡＤＬｉｂ法をさらに改良した方法（特許文献２）が知られている。ＡＤＬｉｂ法は、あらゆるタイプの抗原に対して、所望の結合特性を備えた抗体を大量かつ簡便に調製することが可能な技術である。この方法は、自律的に抗体遺伝子の多様化が進行したニワトリＢ細胞由来ＤＴ４０細胞によって構築される抗体ライブラリーから、所望の抗体を選択的に取得する技術である。ＡＤＬｉｂ法は、インビトロ系の利点である免疫寛容の回避が可能である点、１段階でＩｇＭ型の完全抗体が得られる点において、従来の技術と比較して優れている。しかし、上述の抗体の医薬用途における使用において、ＩｇＭ以外のクラス、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどを調製することが必要である。また、抗体を医薬として生体に投与する場合には、投与対象の体内において、できるだけ免疫原性を低く抑える必要があるため、少なくとも、抗原性の高い抗体の定常領域は、投与対象である動物種由来の物にする必要がある。そこで、上記ＡＤＬｉｂ法などを利用する場合においても、所望の動物種の定常部を備えた任意のクラスの抗体を、調製する技術が必要となってくる。

抗体のクラスを変換する技術としては、例えば、上述のＡＤＬｉｂシステムによって取得したＩｇＭ型の抗体の重鎖可変領域をＩｇＧの重鎖定常領域と遺伝子工学的に連結させ、ＣＨＯ細胞などで発現させる方法が開示されている（特許文献３）。この方法は、定常領域をＩｇＧに変換した多様な抗体を取得できるという点において優れている。しかし、完全体の抗体遺伝子を細胞外において人工的に操作し、可変領域と定常領域が連結したキメラ抗体を発現させる場合、得られるキメラ抗体の一部において、所与の抗原特異性が失われることがあり、また、キメラ抗体遺伝子を本来発現している細胞とは異なる細胞において発現させるため、期待される発現量が得られない場合もある。

異なる動物種間のキメラ抗体を作製する技術もこれまでに多く報告されているが、これらの方法の多くは、異なる動物種由来の可変領域及び定常領域遺伝子を発現ベクターに組み込んだ後、このベクターをＣＨＯ細胞などの宿主細胞内で発現させた後、取得する方法である（例えば、特許文献４及び特許文献５）。このような方法では、複雑な遺伝子工学的操作が必要となる上、多くの種類の抗体を迅速かつ簡便に作製することは難しい。

特許４２１４２３４号ＷＯ２００８／０４７４８０ＷＯ２００８／０３５４６３特開２００１−２３８６７６特開２００５−２４５３３７

Ｓｅｏら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．２３：７３１-７３５，２００５

本発明は、キメラ抗体を迅速かつ簡便に作製する方法、及び該方法によって作製されるキメラ抗体、並びに、該キメラ抗体を産生するキメラＢ細胞を作製する方法の提供を目的とする。
また、本発明は、抗体のクラスを変換する方法の提供を目的とする。

本発明者らは、抗体産生Ｂ細胞の染色体上のＶＤＪ領域下流に所望の動物由来の所望のクラスの抗体重鎖定常領域遺伝子（又はその一部）を挿入した染色体改変型Ｂ細胞から、通常発現する抗体に加え、所望の抗体重鎖定常領域を有するキメラ抗体が選択的スプライシングにより同時に産生されることを偶然に見出し、本発明を完成させた。
抗体は、５つのクラス（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＡ）に分類されるが、抗体医薬を含む様々な用途において最もよく利用されているのはＩｇＧである。そのため、いかに結合特性にすぐれた抗体が得られたとしてもそのクラスが例えば、ＩｇＭであると、その利用範囲はある程度限られてしまう。また、抗体を生体へ投与し十分な機能を発揮させるためには、抗体の定常部を投与対象動物由来のもので構築し、できるだけ該抗体の免疫原性を低く抑える必要がある。従来、定常領域が異なる動物種又はクラスに由来する抗体は、予め所望のキメラ抗体をコードする遺伝子を挿入した発現ベクターを構築し、このベクターから抗体分子を適当な宿主細胞中で発現させることにより取得されていた。しかし、この方法は、多くの複雑な操作が必要である上、調製された抗体も、定常領域を置換する前と同じ結合特性を保持しているとは限らなかった。
発明者らは、抗体産生Ｂ細胞の染色体上の適当な位置に、所望の抗体重鎖定常領域遺伝子を挿入し、Ｂ細胞内における抗体産生メカニズムの研究を行った。従来の知見によると、抗体重鎖定常領域遺伝子は、複数のエクソンの選択的スプライシングによって生じるが、そのスプライシングの位置は、ターミネーターなどのシスエレメントの有無には依存せず、そのパターンの予測は難しいと考えられている（Peterson et al., Mol. Cell. Biol., 1994, 14:77-86）。また、一般に、スプライシングの生じる位置も頻度も動物種によって異なるため（例えば、ヒトやマウスに比べるとトリのスプライシング頻度は低い（Chacko et al., BMC Genomics 2009, 10:S5 1-10））、異なる動物由来の抗体重鎖定常領域遺伝子が所望の位置でスプライシングされるとの保証はない。

かかる状況において、発明者らは、ニワトリのＢ細胞由来のＤＴ４０細胞染色体上のＶＤＪ領域下流に存在する抗体重鎖遺伝子のエクソン１とエクソン２の間にヒト由来ＩｇＧ１重鎖遺伝子を挿入し、得られたキメラＢ細胞から抗体の産生を試みた。その結果、定常領域がヒトＩｇＧ１由来のトリ−ヒトキメラＩｇＧ１抗体の産生に成功した。さらに、驚くべきことに、該キメラ抗体の他、ＤＴ４０細胞から本来産生している分泌型ＩｇＭ及び膜結合型ＩｇＭも同時に産生されることも確認された。ここで、産生される抗体が膜結合型となるか分泌型となるかは、Ｂ細胞内での選択的スプライシングによって決定されることであり、また、キメラ抗体が産生されるか否かについても、このスプライシングによって決定されることである。よって、同一のＤＴ４０細胞が、上記３種類の抗体を産生するということは、本発明当時の当該業者の予想を越えた重要な新知見である。さらに、ここで重要なことは、膜結合型の抗体が産生されることである。仮に、所望のキメラ抗体の産生が確認できたとしても、キメラ抗体産生細胞が分泌型抗体のみしか産生していない場合には、所望のキメラ抗体を産生している細胞についてフローサイトメトリーや磁気ビーズ分画方などで膜結合型抗体の有無を同定する術がなく、莫大な抗体産生細胞群のライブラリーから、所望の抗体産生細胞を効率的に分離することは困難である。実際、従来の技術においては、目的の抗体を産生する細胞を取得するために、最初に、膜結合型の抗体が産生する発現ベクターを使用して目的の抗体の産生細胞を同定したのち、再度、分泌型の抗体産生用のベクターを構築し直して、分泌型抗体を産生する細胞を取得するといった複雑な工程が必要であった（Akamatsu et al., J Immunol. Methods 2007 327 40-52）。この点に関しても、発明者らが今回見出した知見は、１段階の工程により迅速かつ簡便に所望のキメラ抗体を取得できる点において、格段の進歩性を提供するものである。
さらに、本発明者らは、上記キメラ抗体産生細胞内で、前駆体ｍＲＮＡのポリアデリニル化に関与する因子を過剰発現させると、所望のキメラ抗体の産生量が増大することも見出した。
以上の発明者らによる知見に基づき、本発明は以下のように構成される。

すなわち、本発明の以下の（１）〜（１７）である。
（１）抗体産生Ｂ細胞の染色体上のＶＤＪ領域下流に存在する任意のイントロンに、以下の（ａ）又は（ｂ）の遺伝子もしくはその一部を挿入したキメラＢ細胞。
（ａ）該Ｂ細胞が由来する動物とは異なる動物の抗体重鎖定常領域遺伝子、
（ｂ）該Ｂ細胞が産生する抗体とは異なるクラスの抗体重鎖定常領域遺伝子
（２）ポリアデニル化に関与する因子又はポリアデニル化に関与する因子の補充に関与する転写伸長・活性化因子を過剰発現している上記（１）に記載のキメラＢ細胞。
（３）前記ポリアデニル化に関与する因子が、ＣｓｔＦ又はＣｓｔＦ−６４サブユニットである上記（２）に記載のキメラＢ細胞。
（４）前記ポリアデニル化に関与する因子の補充に関与する転写伸長・活性化因子が、ＥＬＬ２である上記（２）に記載のキメラＢ細胞。
（５）前記キメラＢ細胞の細胞表面上に抗体が発現していることを特徴とする上記（１）乃至（４）のいずれかに記載のキメラＢ細胞。
（６）前記キメラＢ細胞の抗体可変領域遺伝子に、多様な変異を導入することを特徴とする上記（１）乃至（５）のいずれかに記載のキメラＢ細胞。
（７）前記多様な変異の導入が、前記抗体産生Ｂ細胞又は前記キメラＢ細胞中のヒストン脱アセチル化酵素遺伝子の機能を低下又は喪失させることによって達成される上記（６）に記載のキメラＢ細胞。
（８）前記ヒストン脱アセチル化酵素が、ＨＤＡＣ２であることを特徴とする上記（７）に記載のキメラＢ細胞。
（９）前記多様な変異の導入が、前記キメラＢ細胞をＨＤＡＣ阻害剤で処理することで達成される上記（６）に記載のキメラＢ細胞。
（１０）前記異なるクラスがＩｇＧである上記（１）乃至（９）のいずれかに記載のキメラＢ細胞。
（１１）前記異なる動物が、ヒト、マウス、ウサギのいずれかである上記（１）乃至（１０）のいずれかに記載のキメラＢ細胞。
（１２）前記抗体産生Ｂ細胞が、ＤＴ４０細胞である上記（１）乃至（１１）のいずれかに記載のキメラＢ細胞。
（１３）前記任意のイントロンが、前記抗体産生Ｂ細胞染色体上の抗体重鎖定常領域遺伝子のエクソン１とエクソン２の間に位置することを特徴とする上記（１２）に記載のキメラＢ細胞。
（１４）上記（１）乃至（１３）のいずれかに記載のキメラＢ細胞からなる抗体産生細胞ライブラリー。
（１５）上記（１）乃至（１３）のいずれかに記載のキメラＢ細胞からキメラ抗体を作製する方法。
（１６）上記（１５）に記載の方法により取得されるキメラ抗体。
（１７）上記（１）乃至（１３）のいずれかに記載のキメラＢ細胞又は上記（１６）に記載のキメラ抗体を作製するためのキット。

本発明によれば、目的のキメラ抗体を産生するキメラＢ細胞を簡易かつ迅速に作製することができる（従来のキメラ抗体を作製する技術では、キメラ抗体の作製に数ヶ月程度かかっていたが、本発明の方法によれば２週間程度で所望のキメラ抗体を取得することができる）。

また、本発明によれば、本発明により作製されるキメラＢ細胞中の抗体可変領域の多様性を高めることにより、多様な抗体産生特性を獲得した細胞集団からなる抗体産生細胞ライブラリーを構築することができる。

本発明のキメラＢ細胞又は本発明の抗体産生細胞ライブラリーを使用すれば、所望の抗原に対し、所望の結合特性を保持したキメラ抗体を迅速に作製することが可能となる。

本発明は、キメラ抗体の産生量をさらに増大させる方法も提供する。

トリ−ヒトキメラＩｇＧ１重鎖を作製するための導入遺伝子の構成及びキメラ抗体が作製さる過程の概要を模式的に示した図である。Ｂｓｄ：ブラストサイジン選択マーカー作製したキメラＢ細胞から産生される抗体をウェスタンブロット法により解析した結果を示す。ＡとＢはキメラＢ細胞の細胞抽出液に対して、抗トリＩｇＭ抗体（Ａ）又は抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｂ）を用いて、ウェスタンブロット解析を行った結果である。Ｃは、培養上清に対して、抗ヒトＩｇＧ抗体を用いてウェスタンブロット解析を行った結果である。キメラＢ細胞上に膜結合型トリＩｇＭが存在することをＦＡＣＳ解析により確認した結果である。得られたキメラＢ細胞（１３．２９クローン）に対し、抗体可変領域の多様化を促進する処理を施した後、得られたキメラＢ細胞の可変領域の配列解析を行い、可変領域配列の変異の状況を調べた結果である。抗体可変領域を多様化したキメラＢ細胞ライブラリーからアポフェリチンを抗原として認識する抗体産生細胞の選択及び産生抗体の確認をＥＬＩＳＡ法により行った結果である。図中、○を付している候補クローンは、アポフェリチンに高い反応を示すトリＩｇＭの他ヒトキメラＩｇＧの反応も確認された。なお、本ＥＬＩＳＡ法によって検出された抗体は培養上清に存在するものであることから、ここで得られた細胞クローンは、分泌型のトリＩｇＭも産生していることが明らかとなった。Ａは、図５に示される候補１３のクローンから産生されるキメラＩｇＧ１を、プロテインＧカラムを使用して精製した結果を示す。Ｂは、精製したアポフェリチン特異的なキメラＩｇＧのトリＩｇＭに対する相対的結合親和性を競合ＥＬＩＳＡ法により測定した結果である。グラフは、２つの異なる抗アポフェリチン抗体クローン（図５の＃４と＃１３）を用いた４回の実験から得られた値の平均標準偏差値を示したものである。グラフから算出したＩＣ５０値は、キメラＩｇＧ＝１．７ｎＭ、トリＩｇＭ＝１．８ｎＭである。１段階目のＥＬＩＳＡスクリーニングにおいて低反応性キメラ抗体を排除した場合の効果を示す。ＣｓｔＦ−６４の過剰発現がキメラＩｇＧ及びＩｇＭの発現に及ぼす影響について検討した結果である。Ａは、定量的ＥＬＩＳＡ法により決定した培養上清中のキメラＩｇＧ濃度を縦軸に示した。実験は、培養開始時の細胞濃度を０．５×１０^６（細胞／ｍｌ）、１×１０^６（細胞／ｍｌ）及び２×１０^６（細胞／ｍｌ）として各々行った。バーは、同じ実験条件において、異なる２つのクローンに対し２回行った実験値の平均標準偏差を示す。Ｂは、定量的ＥＬＩＳＡ法により決定した培養上清中のトリＩｇＭ濃度を縦軸に示した。実験は、培養開始時の細胞濃度を１×１０^６（細胞／ｍｌ）として行った。バーは、同じ実験条件において、異なる２つのクローンに対し２回行った実験値の平均標準偏差を示す。Ａ及びＢ中、ＣＸ１３はＣｓｔＦ−６４を発現させていないキメラＩｇＧ産生細胞のことであり、ＣｓｔＦ−６４^＋は、ＣｓｔＦ−６４を過剰発現させたキメラＩｇＧ産生細胞のことである。

本発明の実施形態の１つは、抗体産生Ｂ細胞の染色体上のＶＤＪ領域下流に存在する任意のイントロンに、以下の（ａ）又は（ｂ）の遺伝子もしくはその一部を挿入したキメラＢ細胞である。
（ａ）該Ｂ細胞が由来する動物とは異なる動物の抗体重鎖定常領域遺伝子、
（ｂ）該Ｂ細胞が産生する抗体とは異なるクラスの抗体重鎖定常領域遺伝子
本発明で使用される抗体産生Ｂ細胞は、特に限定されるものではなく、いかなる動物種由来の細胞であってもよい。株化されたものでも、されていないものでも使用可能であるが、株化された細胞が好ましい。抗体産生Ｂ細胞としては、例えば、ヒト由来のＮａｌｍ６細胞やニワトリ由来のＤＴ４０細胞を挙げることができ、特に好ましくは、ＤＴ４０細胞である。
本明細書中においては、「キメラ」なる用語は、通常使用される意味よりも広い意味で使用される。つまり、本来保持していない遺伝情報を保持した、例えば、染色体、細胞、遺伝子、タンパク質などについて、キメラ染色体、キメラ細胞、キメラ遺伝子、キメラタンパク質（キメラ抗体など）のように使用することとする。

本実施形態で作製されるキメラＢ細胞は、目的のキメラ抗体を産生することができる。本発明で作製されるキメラ抗体は、その可変部は、使用する抗体産生Ｂ細胞に由来する遺伝子によってコードされるものであり、後述するように、必要に応じて変異が導入されていてもよい。作製されるキメラ抗体の定常部は、所望の動物種由来又は所望のクラスの抗体に由来する定常部をコードする抗体重鎖定常領域遺伝子（又はその一部）によってコードされる。キメラ抗体を産生するキメラＢ細胞を作製するためには、使用する抗体産生Ｂ細胞の染色体上に存在するＶＤＪ領域下流の任意のイントロンに、所望の定常部をコードする遺伝子を挿入する必要がある。この任意のイントロンとは、ＶＤＪ領域下流の重鎖定常部コード領域に存在するイントロンであればどの位置に存在するものであっても良いが、好ましくは、使用するＢ細胞に元来存在する重鎖定常領域遺伝子の上流又はエクソン１−２間が好ましい。

抗体産生Ｂ細胞の染色体上に挿入する抗体重鎖定常領域遺伝子は、該遺伝子が由来する動物種は限定されることなく、作製するキメラ抗体の使用目的によって適宜選択することができる。例えば、キメラ抗体をヒトへの投与目的に使用する場合には、ヒト由来の抗体重鎖定常領域遺伝子を選択するであろうし、または、マウスへの投与を意図する場合には、マウス由来の抗体重鎖定常遺伝子を選択することができる。従って、当該遺伝子が由来する動物は、限定されるものではなく、あらゆる動物が含まれが、特に例示するならば、例えば、ヒト、サル（霊長類の他、原猿などの非霊長類も含む）、マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ウマ、ウシ、トリ、イヌ、ネコなどである。特に好ましくは、ヒト、マウス、ウサギなど、抗体投与対象となる頻度の高い動物である。また、抗体産生Ｂ細胞の染色体上に挿入する抗体重鎖定常領域遺伝子のクラスも特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ，ＩｇＥ、ＩｇＡから適宜選択することができる。
これらの抗体重鎖定常領域遺伝子は、公のデータベースなどから遺伝子情報を取得し、取得した情報に基づいて、所望の動物由来のゲノムＤＮＡなどからＰＣＲ法によって、増幅、単離することができる。得られた抗体重鎖定常領域遺伝子は、公知の遺伝子導入技術（遺伝子ターゲティング技術）を利用して、染色体上の目的の位置に挿入することができる。これら一連の技術は、当業者であれば容易に実施することができ、適宜、市販のキットなどを利用して行ってもよい。

本実施形態で作製されるキメラＢ細胞は、キメラ抗体の他、使用した抗体産生Ｂ細胞が元来産生していた抗体の膜結合型及び分泌型の抗体も同時に産生することができる。これらの抗体は、異なる選択的スプライシングによって生じるものであり、この選択的スプライシングの様式は、使用する抗体産生Ｂ細胞の種によって異なる可能性が考えられる。用いる抗体産生Ｂ細胞によっては、キメラ抗体は産生しても、膜結合型の従来型の抗体を産生しないキメラＢ細胞が産生される可能性も考えられる。このような細胞であっても、キメラ抗体を産生するものであれば、本発明の範囲に含まれるものであるが、迅速かつ簡便にキメラ抗体を作製する目的に対しては、膜結合型の抗体を産生するキメラＢ細胞が好ましい。

本実施形態で作製されるキメラＢ細胞には、所望の重鎖定常部を有するのみならず、その染色体上の抗体可変領域に多種多様な変異を持つキメラＢ細胞も含まれる。抗体の多様性は、可変領域が再編成され、非常に多くの異なる抗原認識特性を獲得する結果生じる。よって、本実施形態で作製されるキメラＢ細胞は、染色体上の適切な位置への抗体重鎖定常領域遺伝子等の挿入前後において、可変領域の再編成に必要な多様な変異を導入する処理が施されたキメラＢ細胞も含まれる。ここで、可変領域の再編成に必要な変異を導入する方法は、ＸＲＣＣ２及びＸＲＣＣ３を欠失させたＢ細胞を使用する方法（例えば、Cumber et al., Nature Biotech. 204:1129-1134 2002又は特開2003-503750など）、ＡＩＤ遺伝子の発現を制御する方法（例えば、Kanayama et al., Nucleic Acids Res. 34:e10.,2006又は特開2004-298072など）、あるいは、相同組換え機構を利用する方法（例えば、特許文献１、特許文献２又は非特許文献１など）など、当該技術分野で公知の方法を利用することができる。とりわけ、好ましい方法は、相同組換え機構を利用する方法である。好ましい相同組換え機構を利用する方法として、免疫細胞に内在するヒストン脱アセチル化酵素活性を何らかの方法で阻害して、該免疫細胞内での体細胞遺伝子変換を著しく促進させる方法をあげることができる（詳細は、上記特許文献１、特許文献２又は非特許文献１などを参照のこと）。細胞に内在するヒストン脱アセチル化酵素の活性を阻害する方法として、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で、本発明のキメラＢ細胞を処理する方法（特許文献１又は非特許文献１を参照）や本発明のキメラＢ細胞又はこれが由来する抗体産生Ｂ細胞中のヒストン脱アセチル化酵素遺伝子の機能を低下又は喪失させる方法（特許文献２を参照）などを使用することができる。使用可能なヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、特に限定されるものではなく、例えば、トリコスタチンＡ、ブチル酸、バルプロ酸などをあげることができる。その他、可能であれば、活性阻害の対象であるヒストン脱アセチル化酵素の不活性型タンパク質（ドミナントネガティブ）などを阻害物質として使用してもよい。
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）遺伝子の機能を低下又は喪失させる場合、遺伝子機能を低下又は喪失させる対象となるＨＤＡＣのアイソフォームは、使用する抗体産生Ｂ細胞によっても異なるが、好ましくは、ＨＤＡＣ２遺伝子である（詳細は、特許文献２を参照のこと）。

さらに、本発明のキメラＢ細胞は、その細胞中において前駆体ｍＲＮＡのポリアデニル化に関与する因子、又はそれらの補充に関与する転写伸長・活性化因子を過剰発現していてもよい。
本発明のキメラＢ細胞から産生されるキメラ抗体の産生量を増大させるために、該キメラＢ細胞から元来産生される抗体（例えば、トリＢ細胞のＩｇＭ）に対する所望のキメラ抗体（例えば、キメラＩｇＧ）の産生比率を高める必要がある。
これまでに、Ｂ細胞中において、膜結合型ＩｇＭと分泌型ＩｇＭが同時に発現される場合、これら両抗体の発現量は、ＲＮＡの切断−ポリアデニル化とＲＮＡスプライシング反応とのバランスによってコントロールされていることが知られている（Peterson et al., Mol. Cell. Biol. 9 726-738 1989）。すなわち、選択的スプライシングが行われずにプロモーターに近いポリＡサイトが使用されると分泌型ＩｇＭが産生され、選択的スプライシング後に末端のポリＡサイトが使用されると膜結合型ＩｇＭが産生される。
また、Ｂ細胞が成熟型プラズマ細胞に分化する際、プロモーターに近いポリＡサイトに、ポリアデニル化に関与する因子（例えば、ＣｓｔＦ、ＣＰＳＦ）や、それらの補充に関与する転写伸長・活性化因子（例えば、ＥＬＬ２、ＰＣ４）が結合し（Takagi et al., Cell, 87, 941-952 1996; Edwalds-Gilbert et al., Nucleic Acids Symp. Ser., 33, 229-293 1995; Shell et al., J. Immunol., 179(11), 7663-7673 2007）、特にＣｓｔＦとＥＬＬ２の過剰発現によりポリＡサイトの使用が増強され、分泌型ＩｇＭの産生が膜結合型ＩｇＭよりも増大することが知られている（Takagi et al., Cell, 87, 941-952 1996; Martincic et al., Nat. Immunol., 10, 1102-1109 2009）。逆に未成熟型Ｂ細胞では、ＲＮＡスプライシング反応を促進する因子（例えば、Ｕ１Ａ、ｈｎＲＮＰＦ）の発現によりポリアデニル化因子の補充が抑制され、分泌型ＩｇＭより膜結合型ＩｇＭの生産が優先されることが知られている（MA et al., RNA, 12(1), 122-132 2006; Veraldi et al., Mol. Cell. Biol, 21(4), 1228-1238 2001）。
そこで、本発明のキメラＢ細胞は、その細胞中において前駆体ｍＲＮＡのポリアデニル化に関与する因子、例えば、ＣｓｔＦ（Cleavage stimulation factor:切断促進因子）、ＣＰＳＦ（Cleavage-polyadenylation specificity factor:切断−ポリアデニル化特異因子）の過剰発現、又はそれらの補充に関与する転写因子、例えば、ＥＬＬ２（Elongation factor RNA polymerase II:RNAポリメラーゼII伸長因子）、ＰＣ４（Positive cofactor4: 転写補助活性化因子）、の過剰発現、又はそれらの補充を妨げるスプライシング因子、例えばＵ１Ａ（Spliceosomal protein U1A：スプライセオソームたんぱく質）、ｈｎＲＮＰＦ（Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein F：ヘテロ核リボヌクレオタンパク質）の発現抑制をしていてもよく、特に、ＣｓｔＦの過剰発現が好ましい。
ここで、ＣｓｔＦは、７７ｋＤａ（ＣｓｔＦ−７７）、６４ｋＤａ（ＣｓｔＦ−６４）及び５０ｋＤａ（ＣｓｔＦ−５０）のサブユニットからなり、各サブユニットいずれのサブユニットを単独で過剰発現させてもよいが、各々を組み合わせて発現させてもよく、特に、好ましくは、ＣｓｔＦ−６４を過剰発現させることである。「過剰発現」とは、目的タンパク質（ここでは、ＣｓｔＦ−６４など）の発現量が、野生型の細胞株における該タンパク質の発現量よりも多い状態のことである。過剰発現は、内在性の目的タンパク質が何らかの要因で過剰に発現されている状態であってもよく、外来性の目的タンパク質を発現させた状態のいずれでもよいが、好ましくは、外来性の目的タンパク質を発現させた状態である。外来性の目的タンパク質の発現は、当業者おいて容易に実施することができ、目的タンパク質を構成的（構成的プロモーターの使用）に発現させてもよく、あるいは、必要な時期に一過的に発現誘導（誘導的プロモーターの使用）を行ってもよい。

前記実施形態に関連した本発明の実施形態として、本発明には、本発明のキメラＢ細胞からなる抗体産生細胞ライブラリーも含まれる。本発明の抗体産生細胞ライブラリーは、異なる抗原を認識する多様な抗体を産生する細胞集団からなる。

本発明の他の実施形態は、本発明のキメラＢ細胞からキメラ抗体を調製する方法、及び調製されたキメラ抗体である。
本発明のキメラＢ細胞は、所望の抗体重鎖定常部を有するキメラ抗体を産生することができる。このキメラＢ細胞を、当該細胞に適した培養条件にて培養を行うと、キメラ抗体と共に、当該キメラ抗体と同一の抗原性を持つ膜結合型抗体を同時に発現させることができる。そこで、膜結合型抗体と目的の抗原との結合性を指標にして、目的の抗原を認識するキメラ抗体を産生するキメラＢ細胞を選択し、該キメラＢ細胞をクローン化すれば、該クローン化したキメラＢ細胞から所望のキメラ抗体を継続的に取得することが可能となる。ここで、作製したキメラＢ細胞の中から、所望の抗原特異性を示すキメラ抗体を産生するキメラＢ細胞を選択するために、ＡＤＬｉｂ法を利用することができる。ＡＤＬｉｂ法は、多様な抗体を調製するための方法として上述した中の相同組換え機構を利用する方法であり、多様な抗体を産生するＢ細胞ライブラリーを構築してその中から所望の抗体産生細胞を選択する一連の方法である（特許文献１又は非特許文献１を参照のこと）。

本発明の実施形態には、本発明のキメラＢ細胞又はキメラ抗体を作製するためのキットも含まれる。
キメラＢ細胞を作製するためのキットとしては、キメラＢ細胞の元細胞である抗体産生Ｂ細胞（例えば、ＤＴ４０細胞など）、該細胞を培養するために必要な培地や必要なサプリメントなどの他、染色体に挿入する抗体重鎖定常領域遺伝子（又はその一部）を含んだ遺伝子ターゲット用ベクターや遺伝子導入に必要な試薬類が含まれる。また、キメラＢ細胞の抗体可変領域の多様性を促進するために必要な要素、例えば、ＨＤＡＣ阻害剤やＨＤＡＣ遺伝子の機能低下又は喪失を行うのに必要な試薬類が含まれていてもよい。
キメラ抗体を作製するためのキットには、所望の抗原特異性を有する抗体を選択するための試薬類として、例えば、種々の抗原、磁気ビーズの他、磁気ビーズ調製用試薬、抗体選択に使用される標識抗体、ＥＬＩＳＡなどの検査に必要なプレートなど、キメラ抗体の作製に必要と考えられるものであれば、いかなる物が含まれていてもよい。

以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。

１．実験方法
１−１．細胞の培養条件
ニワトリＢ細胞由来のＤＴ４０細胞は、ＣＯ_２インキュベーターにて５％ＣＯ_２、３９．５℃で２×１０^５から１．５×１０^６細胞／ｍｌの濃度を保つように継代培養した。培地は、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、１０％ＦＢＳ、１％ニワトリ血清、ペニシリン１００単位／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ，２−メルカプトエタノール５５μＭを加えて使用した。キメラＩｇＧ精製直前の継代には、牛血清ＩｇＧなどの混入を抑えるため１０％ＦＢＳの代わりに１０％Ｕｌｔｒａ−ＬｏｗＩｇＧＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加えた培地を使用した。また、トリコスタチンＡ（和光純薬）は、メタノールに２ｍｇ／ｍＬに溶解したものをストックとし、２．５ｎｇ／ｍＬとなるように培地に希釈した。

１−２．ベクターの構築（図１を参照）
まず、ヒトＩｇＨＧ１（ＩｇＧ１重鎖）定常部の全長（エクソン：ＣＨ１、Ｈ（ヒンジ）、ＣＨ２、ＣＨ３、ポリアデニル化サイトを含む約３Ｋｂ断片）とトリＩｇＨＭ（ＩｇＭ重鎖）定常部のエクソン１-３を含む断片をＥｘｐａｎｄＬｏｎｇＲａｎｇｅＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲ増殖した。ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で精製後、それぞれのＰＣＲ産物断片をＴＯＰＯＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でメーカーの手順に従いｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターにクローニングした。その際、トリＩｇＨＭ定常部の断片を一度に増殖するのは困難なので、予めエクソン１-２断片とエクソン２−３断片をそれぞれクローニングし、ＰｍｌＩとＭｓｃＩ制限酵素で切り出したエクソン２-３断片をエクソン１-２に連結反応で繋げて（ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２．１、タカラバイオ社）、目的断片の全長をクローニングした。
ＰＣＲプライマー：
ヒトＩｇＨＧ１；
TGTGGTGACTGAGCCTCCAGA （配列番号１）/ GAGTGTTCACGTGTGCGAGGA（配列番号２）
トリＩｇＨＭエクソン1-2；
TCAAAGCGAAGGGAAAGAGA （配列番号３）/ GGCTGCCATTTTTGTACCAC（配列番号４）
トリＩｇＨＭエクソン2-3；
TTCCGCAACGCCTCCATCCTC（配列番号５） / TTCACCTTACACACGTAGCCATC（配列番号６）
クローニングしたそれぞれの断片はＡＢＩ３７３０ｘｌシーケンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて配列解析で確認した。
次に、ヒトＩｇＨＧ１定常部の下流のＥｃｏＲＶ制限酵素サイトにβ−アクチンプロモーター制御下のブラストサイジン耐性選択マーカーカセット（ｂｓｒ）を平滑末端連結で挿入し、ヒトＩｇＨＧ１エクソンＨ、ＣＨ２、ＣＨ３とｂｓｒマーカーを含む断片をＭｌｕＩとＸｈｏＩで切り出した。その挿入断片を、トリＩｇＨＭのエクソン１と２の間のイントロン内にあるＢｓｅＲＩ制限酵素サイトに平滑末端連結で挿入した。

ＣｓｔＦ−６４の過剰発現用コンストラクトについては、まず、野生型ＤＴ４０からＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）処理により、全ＲＮＡを抽出し、ＣｌａＩとＮｈｅＩ切断サイトで挟まれるＣｓｔＦ−６４ｃＤＮＡを逆転写ＰＣＲ（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩＯｎｅ-ＳｔｅｐＲＴ-ＰＣＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で増幅した。ここで使用したプライマー配列は以下の通りである。
ＣｓｔＦ−６４ｃＤＮＡのクローニング；
CCATCGATGCGGGGCTGTCGGTGCGCGAC（配列番号１３）/CTAGCTAGCTCAGGGTGCCCCTGTGGATTTC（配列番号１４）
増幅した配列解析による確認の後、ＣｌａＩ及びＮｈｅＩで切り出し、切り出したｃＤＮＡ断片を、ｐＩＲＥＳ−ｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）由来のベクターであるｐＩＥｎ−ＮＴベクター（但しｐＩＲＥＳ−ｎｅｏ中のＣＭＶ発現プロモーターをＣＡＧＧＳプロモーター（ＣＭＶエンハンサー及びトリβ−アクチンプロモーターを含む）で置換したベクター）に挿入した。

１−３．ＤＴ４０細胞の形質転換とキメラＩｇＧ発現細胞の選別
上記で構築したトリＩｇＨＭ／ヒトＩｇＨＧ１キメラベクター３０μｇを、ＮｃｏＩ制限酵素で直線化し、野生株のＤＴ４０（１×１０^７細胞）に電気穿孔で形質転換した（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ、０．４ｃｍｇａｐ、５５０Ｖ、２５μＦＤ）。ＣＯ_２インキュベーターにて５％ＣＯ_２、３７℃で２４時間培養後、単一クローンを単離するため、４枚の９６穴プレートでブラストサイジン２５μｇ／ｍｌを加えた培地で、１週間の培養を行い選択した。選択されたシングルコロニーを増殖後、Ｔｒｉｚｏｌ処理（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でＲＮＡを抽出し、逆転写ＰＣＲ（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩＯｎｅ-ＳｔｅｐＲＴ-ＰＣＲｗｉｔｈＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でトリＩｇＭ可変Ｖ領域からヒトＩｇＨＧ１エクソンＣＨ２までの配列を含むキメラＩｇＧ１重鎖ｍＲＮＡを発現するクローンを選別した（逆転写ＰＣＲプライマー：ACTCGTCTCCTCCCTCCTGC（配列番号７） / GCTGGGAGGGCTTTGTTGGAGAC（配列番号８））。さらに、キメラＩｇＧ１重鎖のｃＤＮＡ産物（トリ可変分Ｖ領域からヒトＩｇＨＧ１の終止コドンまで）の配列をＡＢＩ３７３０ｘｌシーケンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で確認した。
ここで得られたトリ／ヒトキメラＩｇＧ１ポジティブ株のことを、ここでは、ＣＸ１３と称することもある。
ＣｓｔＦ−６４の過剰発現用コンストラクトについては、上述の通り作成したプラスミド５０μｇをＰｖｕＩで直線化し、ＣＸ１３キメラ株（１×１０^７細胞）に形質転換し、安定なクローンを２ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含む培地中で選択を行った。

１−４．自律多様化ライブラリーの作製と抗体可変領域遺伝子の配列解析
選択したキメラＩｇＧ１発現クローンを、ＴＳＡ（トリコスタチンＡ）を加えた１２ｍｌの培地で４週間、更に５０ｍｌの培地で２週間継代培養した。１×１０^６細胞からゲノムＤＮＡを抽出し（ＩｌｌｕｓｔｒａＧｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐＭｉｎｉＳｐｉｎＫｉｔ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、その２００分の１（５０００細胞分）を鋳型として抗体遺伝子の軽鎖と重鎖それぞれの可変部（Ｖ領域）をＰＣＲ増殖した（ＰＣＲプライマー：軽鎖＝CACACCTCAGGTACTCGTTGCG （配列番号９）/ TCAGCGACTCACCTAGGACGG（配列番号１０）、重鎖＝ACTCGTCTCCTCCCTCCTGC（配列番号１１） / AGGCGGAGGAGACGATGACTTCGGTC（配列番号１２））。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で精製後、ＴＯＰＯＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でクローニングし、ＡＢＩ３７３０ｘｌシーケンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で軽鎖１５クローン、重鎖２４クローンの配列解析を行った。培養前の元株の遺伝子配列と比べ、遺伝子変換又は点変異などによる異なる配列を持つクローンの比率を測定した。

１−５．タンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）とウェスタン解析
解析するＤＴ４０の各クローンにつき、約１×１０６細胞を２００μｌのＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％トリトンＸ-１００、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、５０ｍＭトリスｐＨ８．０）で溶解し、３０分４℃で回転子にて撹拌後、１０分、２００００ｇで遠心して上清を細胞抽出液として回収した。２〜５μｌの細胞抽出液、又は無処置の培養上清を同量のＬａｅｍｍｌｉ（２×）緩衝液（４％ドデシル硫酸ナトリウム、１０％２-メルカプトエタノール、２０％グリセロール、０．００４％ブロモフェノールブルー、０．１２５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ６．８）で希釈し、９５℃で５分変性させ、１０％アクリルアミドゲルで通常の手順に従いＸＣｅｌｌＳｕｒｅＬｏｃｋＭｉｎｉ-Ｃｅｌｌ装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ-ＥＣＬ、ＧＥ-Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にブロッティングしたものに、１００００分の１希釈したＨＲＰ抱合型抗ヒトＩｇＧ-Ｆｃ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社）を反応させ、化学発光（ＥＣＬＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇＤｅｔｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔｓ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で検出した。Ｎ結合型糖鎖を切断したタンパク質を準備するには、メーカーの手順に従いＰＮＧａｓｅＦ（ＮＥＢ社）酵素処理を行った。対象ＩｇＧ１タンパク質にはヒトＩｇＧ１Ｋａｐｐａ（Ｓｉｇｍａ社）を０．１μｇ／ｍｌにリン酸緩衝食塩水又は培地に希釈したものを使用した。

１−６．ＦＡＣＳ（蛍光励起セルソーター）解析
細胞膜表面における膜結合型トリＩｇＭの発現の確認は、ＤＴ４０約１×１０^６細胞を回収し、染色緩衝液（０．３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝食塩水）で洗浄、懸濁し、４μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ蛍光標識抱合型抗トリＩｇＭ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社）と５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（死細胞染色試薬）で染色した。ＣｙｔｏｍｉｃｓＦＣ５００フローサイトメーター（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社）を用いてＦＩＴＣシグナル強度の定量で膜表面にＩｇＭを発現する細胞の割合を測定した。

１−７．抗原の磁気ビーズへの固定化
磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ社Ｍ２８０Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ）懸濁液（磁気ビーズ密度＝２．０×１０^９）を１．５ｍｌチューブ内に２０μＬ分取し、磁気スタンド上にて１分程度静置して磁気ビーズを集積した後、上清を除去した。緩衝液Ａ（０．１ＭＮａ-リン酸緩衝液ｐＨ７．４）を４０μＬ添加してボルテックスミキサーで懸濁し、上記同様に磁気スタンドに静置した後、上清を除去した。この洗浄操作を合計で２回繰り返し、最終的に沈殿状態として磁気ビーズを回収した。アポフェリチンを緩衝液Ａ４０μＬに溶解し、上述の沈殿状態の磁気ビーズと混合し、懸濁した。混合物を３７℃下、ローテーターにて終夜反応させた。その後緩衝液Ｃ（０．１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝食塩水ｐＨ７．４）４０μＬで１回洗い、後緩衝液Ｄ（０．１％ＢＳＡを含む０．２ＭＴｒｉｓ-ＨＣｌｐＨ８．５）４０μＬを加えて懸濁した。この懸濁液を２５℃下、ローテーターにて終夜反応させた。その後緩衝液Ｃ４０μＬで２回洗い、最終的に、磁気ビーズを０．０２％アザイドを加えた緩衝液Ｃ４０μＬに懸濁した。

１−８．抗体産生細胞のセレクション
セレクション緩衝液（１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝食塩水＝１５０ｍＭ塩化ナトリウム，１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４）１ｍＬに、上述の抗原化合物を結合させた磁気ビーズ懸濁液５μＬを添加して混合し、磁気スタンドにて２分間静置の後、上清を除去した。これを３回繰り返し、最終的にセレクション緩衝液１ｍＬに懸濁し、氷冷した。
その後は、ＡＤＬｉｂシステムの標準手法に従ってキメラＩｇＧ１抗体産生細胞のスクリーニングを実施した。具体的には、キメラＩｇＧ１抗体産生細胞の自律多様化ライブラリー５０ｍＬをチューブに回収し、１９０×ｇ、１０分、４℃で遠心し、上清を除去した。次にセレクション緩衝液１０ｍＬで細胞を懸濁し、１５ｍＬチューブに移した。１９０×ｇ、１０分、４℃で遠心し、上清を除去したセレクション緩衝液１ｍＬで細胞を懸濁し、１．５ｍＬチューブに移した。これを１１００×ｇ、５分、４℃で遠心して上清を除去した。この細胞沈殿物に前述の氷冷しておいた抗原付き磁気ビーズ懸濁液１ｍＬを添加して懸濁した。この懸濁液を、ローテーターを用い、３０分間４℃で反応させた後、ピペッティングで懸濁してから磁気スタンドにチューブを立て、氷上で５分間静置させた。上清を除去し、セレクション緩衝液１ｍＬで懸濁し、再度磁気スタンドに立て、氷上で３分間静置させた。この操作を５回繰り返した。その後、最終的にセレクション緩衝液０．５ｍＬで懸濁した。コーニング社製リザーバーに３７℃に温めておいた培地３０ｍＬを添加し、その培地中にこの０．５ｍＬの懸濁液を全量投入し、ピペッティングで良く混合した。その後、９６穴プレートの各ウェルにこの細胞懸濁液を３００μＬ／ウェルずつ播種した。この際、７ウェルにバックグラウンド用コントロールとして培地のみを３００μＬずつ添加しておく。その後、３９．５℃で１週間ＣＯ_２インキュベーターで培養した。

１−９．ＥＬＩＳＡ
目的抗原と対照抗原をそれぞれリン酸緩衝食塩水で５μｇ／ｍＬ（スキムミルク添加の場合は５％）になるように希釈し、１００μＬずつ９６穴イムノプレート（Ｕ底Ｍａｘｉｓｏｒｐイムノプレート、Ｎｕｎｃ社）に入れ、４℃で終夜反応させた。その後、液をよく切り、ブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝食塩水）２００μＬを入れ、室温で３０分間以上反応させた。その後、洗浄液（１％ＢＳＡ、０．０５％ｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝食塩水）２００μＬで３回洗浄した。洗浄後、液をよく切り、培養上清１００μＬずつを入れ、室温で１時間反応させた。その後、さらに洗浄液２００μＬで５回洗浄した。次に、二次抗体としてＨＲＰ抱合型抗トリＩｇＭ抗体、又はＨＲＰ抱合型抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｂｅｔｙｌ社）をブロッキング緩衝液で１０，０００倍、又は２，０００倍希釈した溶液１００μＬを入れ、室温で４５分間反応させた。その後、反応液を切り、洗浄液２００μＬで５回洗浄し、残余の溶液をできる限り除去した。最後に３，３'，５，５'-ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）溶液（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社）１００μＬを５秒ごとに各レーンに添加し、室温で３分反応させた。その後、２０倍希釈硫酸（１Ｎ）１００μＬを、５秒ごとに各レーンに入れ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。

１−１０．キメラＩｇＧ１の精製／濃縮
選択したクローンを１０％Ｕｌｔｒａ−ＬｏｗＩｇＧＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加えた３０ｍｌの培地中、約２×１０^６細胞／ｍｌの最終濃度で２４時間培養した。１０分、１９０ｇで遠心し、上清を２２μｍフィルターで濾過した。その上清をプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＭａｂＴｒａｐＫｉｔ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社）でメーカーの手順どおりに精製し、３ｍｌの最終緩衝液に溶出した（約１０倍濃縮）。

１−１１．定量的サンドイッチＥＬＩＳＡ
抗ヒトＩｇＧ-Ｆｃ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社）を１０μｇ／ｍＬにリン酸緩衝食塩水に希釈し、１００μＬずつ９６穴イムノプレート（Ｕ底Ｍａｘｉｓｏｒｐイムノプレート、Ｎｕｎｃ社）に入れ、室温下１時間で反応させた。その後、上記のＥＬＩＳＡの手法と同じくブロッキング緩衝液で３０分間反応、３回洗浄、培養上清１００μＬを室温で１時間反応、５回洗浄、二次抗体（（ＨＲＰ抱合型抗ヒトＩｇＧ抗体２０，０００倍希釈、Ｂｅｔｈｙｌ社）１００μＬを室温で４５分間反応した。更に５回洗浄後、ＴＭＢ溶液１００μＬを室温で３分反応させ、２０倍希釈硫酸（１Ｎ）１００μＬで反応停止後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。標準のヒトＩｇＧ１Ｋａｐｐａ（Ｓｉｇｍａ社）１μｇ／ｍｌを１から１２８倍まで培地又はリン酸緩衝食塩水に希釈したものを用いて作製した標準曲線を元に、各サンプルに付き最低２点の測定で精製前と精製後におけるキメラＩｇＧ１の濃度を定量した（通常、Ｏ．Ｄ．が０．６〜１．２の範囲内で測定）。

１−１２．競合ＥＬＩＳＡ
まず、培養上清を新鮮な培地で連続的に希釈し、上述のＥＬＩＳＡ法のように、適定を行い、最大Ｏ．Ｄ．＝０．７となるようにした。次いで、０．０５ｎＭ〜５００ｎＭの範囲でアポフェリチンを希釈し、室温で培養上清を共に一晩インキュベートした。その後、混合液をＥＬＩＳＡ法で解析し、フリーな抗体による最大結合量を５０％に阻害する抗原濃度を算出した。

２．実験結果
構築したベクター（図１）を用いてトリＤＴ４０培養細胞を形質転換した結果、トリ／ヒトキメラＩｇＧ１重鎖の発現を確認できるクローンの選択に成功した（キメラ１３．２９）。ヒトＩｇＨＧ１断片の下流には終始コドン・ターミネーターを配置していたが、ヒト重鎖第３エクソン（ＣＨ３）よりもさらに下流に配置されたエクソン（例えば、トリ重鎖第３及び第４エクソン）を含んだトリＩｇＭ重鎖全長のｍＲＮＡも検出された。選択されたクローン１３．２９の細胞抽出液中にトリＩｇＭとキメラＩｇＧ１の存在が確認され（図２Ａ及びＢ）、培養上清中においても、分泌型のトリＩｇＭ（図５）とキメラＩｇＧ１（図２Ｃ）の存在が確認された。トリＩｇＭ重鎖定常部エクソン１の配列には、Ｎ結合型糖鎖結合サイトが含まれるため、トリＩｇＭ重鎖及びその定常部エクソン１を含むキメラ抗体重鎖の見かけの分子量は標準のヒトＩｇＧ１に比べて著しく大きくなっている（図２Ｂ、「標準ヒトＩｇＧ１κ」のレーンと「キメラＩｇＧ１算出クローン」のレーンを比較）。この点については、本実施例で得られたトリＩｇＭ重鎖及びヒトキメラＩｇＧ１重鎖をＮ結合糖鎖切断処理したところ、予測分子量になることを確認している（トリＩｇＭ約６０ＫＤａ、キメラＩｇＧ約５０ＫＤａ）。また、キメラ１３．２９クローンの膜結合型抗体に関し、ＦＡＣＳ解析を行ったところ、標準のＤＴ４０細胞と同じように膜結合型トリＩｇＭが発現していることを確認した（図３）。従って、キメラ１３．２９クローンは、トリ−ヒトキメラＩｇＧを分泌する他、トリ膜結合型ＩｇＭとトリ分泌型ＩｇＭの３種類の抗体を産生していることが明らかとなった。

本実施例で取得したキメラ１３．２９クローンをＴＳＡ（トリコスタチンＡ）含有培地で６週間培養し、可変領域遺伝子配列の多様化を促進した後、多様化の状況を配列解析で確認した（図４）。その結果、軽鎖の可変領域は１００％、重鎖では５４％の配列が培養前の元クローンと異なる配列パターンを示し、トリＩｇＭのみ発現する野生株ＤＴ４０と同等の高い効率で多様化が促進されていることが確認された。従って、キメラ１３．２９クローンの可変領域を多様化する結果、該キメラＢ細胞が自律的に種々の抗体を産生する細胞集団を形成し、抗体産生細胞ライブラリーが構築されることが明らかとなった。

１３．２９クローンから構築した抗体産生細胞ライブラリーを用いて、アポフェリチンを固定した磁気ビーズにより、ＡＤＬｉｂシステムに従って抗アポフェリチン抗体産生細胞のセレクションを行った。その結果、Ｏ．Ｄ．４５０値が０．５００以上でアポフェリチンに反応を示す分泌型トリＩｇＭと共に、目的のキメラＩｇＧ１抗体を産出する細胞クローンの候補を、複数取得することができた（図５）。キメラＩｇＧ１については、上清に分泌される抗体の濃度がトリＩｇＭより薄いため、反応強度が低くめに現れるので、Ｏ．Ｄ．４５０値が０．２００以上のものを陽性として選択した。

上記セレクションで得られた抗アポフェリチン抗体を発現するクローンの一つ（候補＃１３）を一例として選択し、該候補クローンを増殖させた後、プロテインＧアフィニティーカラムでキメラＩｇＧ１抗体の精製／濃縮を行った。精製後、アポフェリチンに対して高い反応と特異性を示すキメラＩｇＧ１抗体が得られた（図６Ａ）。定量的サンドイッチＥＬＩＳＡで測定したキメラＩｇＧ１抗体の上清中濃度は、精製前：０．４５μｇ／ｍｌ、精製後：４．４３μｇ／ｍｌで、約１０倍濃縮されていることを確認した。
次に、競合ＥＬＩＳＡ法を用いて、トリＩｇＭとキメラＩｇＧのアポフェリチンに対する親和性の比較を行った。競合抗原量に対する抗体結合量の割合をプロットし、溶液中のフリーな抗体の結合を５０％阻害するのに必要な競合抗原の量（ＩＣ５０）を決定した（図６Ｂ）。ＩＣ５０は、抗体の解離定数と関連する値である。２つの異なるクローンの平均のＩＣ５０値（図５候補クローン＃４と＃１３）は、トリＩｇＭ（１．８ｎＭ）とキメラＩｇＧ（１．７ｎＭ）で近似していた。この結果から、抗原特異的なトリＩｇＭを指標としてキメラＢ細胞を選択することで、トリＩｇＭと同等の特異性及び親和性を持つキメラＩｇＧを選択できることが示された。

所望の抗原特異性を示すキメラ抗体を選択する場合、キメラ化を行うことで、得られたキメラ抗体と抗原との反応性に少なからず影響が現れる。キメラ化によっても反応性を保持したキメラ抗体を効率よく取得するには、１段階目のＥＬＩＳＡによる選択の際に抗ヒトＩｇＧ二次抗体による選択（抗ヒトＩｇＧ二次抗体によるアッセイで高めのＥＬＩＳＡ反応値を示すクローンを選択する）も同時に行い、早い段階で、所望の反応性を備えたキメラ抗体を選択することが重要である（図７）。図７に示すクローンＡは、最初のＥＬＩＳＡによるスクリーニングの段階で抗ヒトＩｇＧ二次抗体と高い反応性を示し、クローンＢは低めの反応性を示していた（図５候補クローン＃１３と＃１１）。これら２クローンは抗トリＩｇＭ二次抗体とは同等の反応性を示していた（図７左図）。これら２クローンについて、各々、プロテインＧによりキメラＩｇＧを精製濃縮すると、クローンＡの抗ヒトＩｇＧ二次抗体に対する反応性は高い値を示し、クローンＢの反応性はかなり低い値を示す結果となった（図７右図）。なお、これら２クローンのキメラＩｇＧ１の濃度には顕著な差は無いことも定量的サンドイッチＥＬＩＳＡで確認しており（精製前クローンＡ：０．３２μｇ／ｍｌ、クローンＢ：０．３８μｇ／ｍｌ、精製後クローンＡ：５．５μｇ／ｍｌ、クローンＢ：６．２μｇ／ｍｌ）、上記の反応性の違いは濃度の違いでなく、キメラ化の影響によるものであることが示された。

次に、キメラＩｇＧの産生量を増加させるために、培養上清中のＩｇＧ濃度がより高くなるように、ＩｇＭに対するＩｇＧの発現割合を変えることができないかどうか検討を行った。前述のように、Ｂ細胞が成熟型プラズマ細胞に分化する際、プロモーターに近いポリＡサイトの使用が、ＣｓｔＦなどのポリアデニル化に関与する因子の過剰発現により増強され、分泌型ＩｇＭの産生が膜結合型ＩｇＭよりも増大することが知られている。本発明で構築した抗体発現コンストラクトはヒトＩｇＨＧ１インサートの下流にポリＡサイトを含んでいるため、ポリアデニル化に関与する因子の１つであるＣｓｔＦの６４ｋＤａサブユニット（ＣｓｔＦ−６４）をキメラ抗体産生株に導入して過剰発現させることで、キメラＩｇＧの産生量が増大するのではないかと予想し、以下のように検討を行った。
まず、キメラＩｇＧの発現量の変化を検討するにあたり、細胞の成長のばらつきによる影響を排除するために、異なる初期細胞密度（０．５×１０^６、１×１０^６、２×１０^６）により培養を開始したクローンを２クローン用いて実験を行った。各細胞密度培養１６時間後に上清を回収した。ＣｓｔＦ−６４を過剰発現させたキメラ抗体産生株（図８Ａ、ＣｓｔＦ−６４^＋）の培養上清中のキメラＩｇＧ濃度は、ＣｓｔＦ−６４を過剰発現させていない由来を同じくする株（図８Ａ、ＣＸ１３）のキメラＩｇＧ濃度より２〜３倍高かった（図８Ａ）。これに対し、ＣｓｔＦ−６４を過剰発現させたキメラ抗体産生株の培養上清中のＩｇＭ濃度は劇的に減少し、少なくとも１／１０程度になっていた（図８Ｂ）
この結果から、キメラＩｇＧ産生細胞中でポリアデニル化因子のＣｓｔＦ−６４を過剰発現させると、ＩｇＭの発現が停止し、相対的にＩｇＧの合成が増大することが分かる（ＩｇＧ：ＩｇＭの比率が、約１：５から約４：１に変動した）。

本発明は、キメラ抗体を産生するキメラＢ細胞の迅速かつ簡便な作製方法を提供するものである。抗体医薬の重要性に鑑み、今後の創薬、医療の分野において、所望の薬効を示す抗体医薬の開発に際し、本発明が提供する技術は、極めて重要な役割を担うものとして期待される。

Claims

抗体産生Ｂ細胞の染色体上のＶＤＪ領域下流に存在する抗体重鎖遺伝子のエクソン１とエクソン２の間に、以下の（ａ）又は（ｂ）の遺伝子もしくはその一部を挿入したキメラＢ細胞。
（ａ）該Ｂ細胞が由来する動物とは異なる動物の抗体重鎖定常領域遺伝子、
（ｂ）該Ｂ細胞が産生する抗体とは異なるクラスの抗体重鎖定常領域遺伝子
ポリアデニル化に関与する因子又はポリアデニル化に関与する因子の補充に関与する転写伸長・活性化因子を過剰発現している請求項１に記載のキメラＢ細胞。
前記ポリアデニル化に関与する因子が、ＣｓｔＦ又はＣｓｔＦ−６４サブユニットである請求項２に記載のキメラＢ細胞。
前記ポリアデニル化に関与する因子の補充に関与する転写伸長・活性化因子が、ＥＬＬ２である請求項２に記載のキメラＢ細胞。
前記キメラＢ細胞の細胞表面上に抗体が発現していることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のキメラＢ細胞。
前記キメラＢ細胞の抗体可変領域遺伝子に、多様な変異を導入することを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載のキメラＢ細胞。
前記多様な変異の導入が、前記抗体産生Ｂ細胞又は前記キメラＢ細胞中のヒストン脱アセチル化酵素遺伝子の機能を低下又は喪失させることによって達成される請求項６に記載のキメラＢ細胞。
前記ヒストン脱アセチル化酵素が、ＨＤＡＣ２であることを特徴とする請求項７に記載のキメラＢ細胞。
前記多様な変異の導入が、前記キメラＢ細胞をＨＤＡＣ阻害剤で処理することで達成される請求項６に記載のキメラＢ細胞。
前記異なるクラスがＩｇＧである請求項１乃至９のいずれかに記載のキメラＢ細胞。
前記異なる動物が、ヒト、マウス、ウサギのいずれかである請求項１乃至１０のいずれかに記載のキメラＢ細胞。
前記抗体産生Ｂ細胞が、ＤＴ４０細胞である請求項１乃至１１のいずれかに記載のキメラＢ細胞。
請求項１乃至１２のいずれかに記載のキメラＢ細胞からなる抗体産生細胞ライブラリー。
請求項１乃至１２のいずれかに記載のキメラＢ細胞からキメラ抗体を作製する方法。
前記抗体産生Ｂ細胞のＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３遺伝子領域中のＣＨ１遺伝子領域とＣＨ２遺伝子領域の間に前記異なる動物の抗体重鎖定常領域遺伝子又は異なるクラスの抗体重鎖定常領域遺伝子が配置された核酸配列が挿入された遺伝子ターゲット用ベクターを含む、請求項１乃至１２のいずれかに記載のキメラＢ細胞を作製するためのキット。
請求項１４に記載の方法により取得されるキメラ抗体であって、抗体産生Ｂ細胞の抗体重鎖可変領域及びＣＨ１領域と、該Ｂ細胞が由来する動物とは異なる動物の抗体重鎖定常領域若しくはその一部、あるいは、該Ｂ細胞が産生する抗体とは異なるクラスの抗体重鎖定常領域若しくはその一部からなる抗体重鎖、及び当該抗体産生Ｂ細胞の抗体軽鎖を含む、キメラ抗体。