JP5679217B2 - T細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体の製造方法、T細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体を産生する遺伝子組換えカイコおよびその製造方法 - Google Patents
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Description
抗体にはIgG、IgM、IgA,IgDおよびIgEクラスが存在する。T細胞依存性抗原とT細胞依存性抗原では、それぞれの抗原に対して免疫応答により産生される抗体のクラスが異なる。T細胞依存性抗原に対する免疫応答では、免疫応答初期にはIgMクラスに属する抗体(以下、IgM型抗体ということもある)が産生される。その後、T細胞の助けを受けて、抗体のクラスがIgMからIgG等に変換されるクラススイッチが起こり、T細胞依存性抗原に対する免疫応答では、多くの場合、最終的にT細胞依存性抗原に対するIgGクラスに属する抗体(以下、IgG型抗体ということもある)が産生されるようになる。一方、T細胞非依存性抗原への免疫応答では、T細胞が免疫応答に関与しないため、IgG型抗体へのクラススイッチが起こらない。そのため、T細胞非依存性抗原に対する抗体を作成する場合、IgMクラスに属する抗体しか得られない。つまり、T細胞依存性抗原に対するIgG型抗体を得る場合と比較して、T細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体を作成することは困難である。
このシアリルLexを認識するモノクローナル抗体としてCSLEX1(以下、CSLEX1抗体ということもある)が知られている(特許文献1参照)。このCSLEX1抗体は、ハイブリドーマCSLEX1(寄託番号ATCC No.HB8580)により産生されるIgM型抗体である。このハイブリドーマから得られたCSLEX1抗体は、胃癌、結腸癌、肺癌、食道癌、卵巣癌、胸癌、膀胱癌、膵臓癌などの腫瘍組織に対して明瞭な陽性染色像を示すことが開示されている(特許文献1参照)。このCSLEX1抗体を用いると、癌患者血清中に含まれるシアリルLex量を、ELISA法で定量することが可能となる。特に、マイクロタイタープレートを用いた汎用性のあるシアリルLexのELISA測定系を用いることで、再発乳癌の発症や再発乳癌の術後経過観察を高い陽性率でスクリーニングをすることが可能とされている(非特許文献1参照)。そのため、このELISA測定キットは、現在、診断薬の分野で実用化され販売されている。
[1].T細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体の製造方法であって;
T細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体は、
(i)H鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、T細胞非依存性抗原に対するIgM型抗体のH鎖可変領域が有する相補性決定領域であるHCDR1、HCDR2およびHCDR3を含むH鎖可変領域と、
(ii)L鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、T細胞非依存性抗原に対するIgM型抗体のL鎖可変領域が有する相補性決定領域であるLCDR1、LCDR2およびLCDR3を含むL鎖可変領域と、
(iii)IgG型抗体のH鎖定常領域
とを有し;
該製造方法は、該抗体をコードするDNAが導入された遺伝子組換えカイコから生産される該抗体を回収して製造することを含む、T細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体の製造方法。
[2].前記T細胞非依存性抗原が腫瘍マーカー糖鎖抗原である[1]に記載の製造方法。
[3].前記T細胞非依存性抗原がシアリルルイスX(シアリルLex)である[1]に記載の製造方法。
[4].シアリルLexに対するIgG型抗体の製造方法であって;
シアリルLexに対するIgG型抗体は、
(i)H鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、HCDR1、HCDR2およびHCDR3がそれぞれ配列番号26、27および28に示されるアミノ酸配列、または、シアリルLexに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むH鎖可変領域と、
(ii)L鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、LCDR1、LCDR2およびLCDR3がそれぞれ配列番号29、30および31に示されるアミノ酸配列、または、シアリルLexに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むL鎖可変領域
とを有し;
該製造方法は、該抗体をコードするDNAが導入された遺伝子組換えカイコから生産される該抗体を回収して製造することを含む、シアリルLexに対するIgG型抗体の製造方法である、[3]に記載の製造方法。
[5].前記シアリルLexに対するIgG型抗体が、
(i)H鎖可変領域中に含まれるフレームワーク領域として、HFR1、HFR2、HFR3およびHFR4としてそれぞれ配列番号32、33、34および35に示されるアミノ酸配列、または、シアリルLexに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むH鎖可変領域と
(ii)L鎖可変領域中に含まれるLFR1、LFR2、LFR3およびLFR4として、それぞれ配列番号36、37、38および39に示されるアミノ酸配列、または、シアリルLexに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むL鎖可変領域
とを有する抗体である、[4]に記載の製造方法。
[6].前記遺伝子組換えカイコが、
(i)カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするDNA、および、
(ii)該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した前記T細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体をコードするDNA
が導入されたカイコである、[1]から[5]のいずれかに記載の製造方法。
[7].前記遺伝子組換えカイコが、
(i)カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするDNAが導入されたカイコと、
(ii)該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した前記T細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体をコードするDNAが導入されたカイコ
とを交配させることで得られたカイコである、[1]から[7]のいずれかに記載の製造方法。
[8].シアリルLexに対する抗体をコードするDNAであって;
シアリルLexに対する抗体は、
(i)H鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域としてHCDR1、HCDR2およびHCDR3がそれぞれ配列番号26、27および28に示されるアミノ酸配列、または、シアリルLexに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むH鎖可変領域と、
(ii)L鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域としてLCDR1、LCDR2およびLCDR3がそれぞれ配列番号29、30および31に示されるアミノ酸配列、または、シアリルLexに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むL鎖可変領域
とを有し;
かつ、該DNAが該抗体をコードするDNA。
[9].前記シアリルLexに対する抗体が、
(i)H鎖可変領域中に含まれるフレームワーク領域としてHFR1、HFR2、HFR3およびHFR4としてそれぞれ配列番号32、33、34および35に示されるアミノ酸配列、または、シアリルLexに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むH鎖可変領域と、
(ii)L鎖可変領域中に含まれるLFR1、LFR2、LFR3およびLFR4がそれぞれ配列番号36、37、38および39で表されるアミノ酸配列、または、シアリルLexに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むL鎖可変領域
とを有する抗体である、[8]に記載のDNA。
[10].配列番号21に示されるアミノ酸配列を含むH鎖可変領域と、配列番号25に示されるアミノ酸配列を含むL鎖可変領域とを有する抗体をコードするDNAである、[9]に記載のDNA。
[11].H鎖可変領域をコードする配列番号20に示される塩基配列と、L鎖可変領域をコードする配列番号24に示される塩基配列とを含む、[10]に記載のDNA。
[12].[8]から[11]のいずれかに記載のDNAのDNA配列を含む遺伝子組換えベクター。
[13].前記DNA配列が、カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合されている、[12]に記載の遺伝子組換えベクター。
[14].遺伝子組換えカイコであって、
(i)H鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、T細胞非依存性抗原に対するIgM型抗体のH鎖可変領域が有する相補性決定領域であるHCDR1、HCDR2およびHCDR3を含むH鎖可変領域をコードするDNAと、
(ii)L鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、T細胞非依存性抗原に対するIgM型抗体のL鎖可変領域が有する相補性決定領域であるLCDR1、LCDR2およびLCDR3を含むL鎖可変領域をコードするDNAと、
(iii)IgG型抗体のH鎖定常領域をコードするDNA
とを含むT細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体をコードするDNAが導入され、かつ、前記T細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体を生産する遺伝子組換えカイコ。
[15].前記T細胞非依存性抗原が腫瘍マーカー糖鎖抗原である[14]に記載の遺伝子組換えカイコ。
[16].前記T細胞非依存性抗原がシアリルLexである[14]に記載の遺伝子組換えカイコ。
[17].[8]から[11]のいずれかに記載のシアリルLexに対する抗体をコードするDNAが導入され、かつ、シアリルLexに対するIgG型抗体を生産する遺伝子組換えカイコである、[16]に記載の遺伝子組換えカイコ。
[18].(i)カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするDNAと、
(ii)該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した前記T細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体をコードするDNA
とが導入された、[14]から[17]のいずれかに記載の遺伝子組換えカイコ。
[19].遺伝子組換えカイコの製造方法であって、
(i)H鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、T細胞非依存性抗原に対するIgM型抗体のH鎖可変領域が有する相補性決定領域であるHCDR1、HCDR2およびHCDR3を含むH鎖可変領域をコードするDNAと、
(ii)L鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、T細胞非依存性抗原に対するIgM型抗体のL鎖可変領域が有する相補性決定領域であるLCDR1、LCDR2およびLCDR3を含むL鎖可変領域をコードするDNAと、
(iii)IgG型抗体のH鎖定常領域をコードするDNAと
を含むT細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体をコードするDNAをカイコに導入することを含む、T細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体を生産する遺伝子組換えカイコの製造方法。
[20].前記T細胞非依存性抗原が腫瘍マーカー糖鎖抗原である[19]に記載の遺伝子組換えカイコの製造方法。
[21].前記T細胞非依存性抗原がシアリルLexである[19]に記載の遺伝子組換えカイコの製造方法。
[22].[8]から[11]のいずれかに記載のシアリルLexに対する抗体をコードするDNAをカイコに導入することを含む、シアリルLexに対するIgG型抗体を生産する遺伝子組換えカイコの製造方法である、[21]に記載の遺伝子組換えカイコの製造方法。
[23].(i)カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするDNAと、
(ii)該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した前記T細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体をコードするDNA
とをカイコに導入することを含む、[19]から[22]のいずれかに記載の遺伝子組換えカイコの製造方法。
[24].(i)カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするDNAが導入されたカイコと、
(ii)該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した前記T細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体をコードするDNAが導入されたカイコ
とを交配させてDNAを導入することを含む、[23]に記載の遺伝子組換えカイコの製造方法。
本発明のT細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体の製造方法により、既存のまたは新たに作成されもしくは見出されるT細胞非依存性抗原に対するIgM型抗体を、精製が容易で純度を高めやすいIgG型抗体に変換して効率的に生産することができる。そのため、複数の疾病マーカーを組み合わせて行われる癌等の診断では複数種類の抗体が高純度でかつ多量に必要になる場合があるが、本発明の効率的な抗体の製造方法は、T細胞非依存性抗原に対する抗体の癌等の診断での利用を促進することができる。
本発明におけるT細胞非依存性抗原としては、例えば、糖鎖(多糖類、オリゴ糖類または単糖類)、脂質、糖脂質、リン脂質、リポ多糖類、キャリヤーコンジュゲートおよびファージを挙げることができる。腫瘍マーカーとしての機能を有する抗原が多いことから、本発明におけるT細胞非依存性抗原は、糖鎖抗原であることが好ましく、腫瘍マーカー糖鎖抗原であることがさらに好ましい。なお、本発明における糖鎖抗原は、通常、生体内でタンパク質または脂質等に結合して存在する。また、本発明における糖鎖抗原には、シアル酸またはフコース等で修飾された糖鎖が含まれる。
ここで、T細胞非依存性抗原IgM型抗体の相補性決定領域は、例えば、そのアミノ酸配列を解析し、複数の抗体のアミノ酸配列との間で配列比較を行うことで決定することができる。
本発明の抗体の製造方法により得られるT細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体としては、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4といったサブクラスに属する抗体が挙げられるが、好ましくは、IgG1サブクラスに属する抗体(以下、IgG1型抗体ということもある)である。なぜなら、IgG1型抗体であれば、Protein A、Protein G、rProtein A、rProtein Gのいずれかをリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーを利用することで、抗体の精製を容易に行うことができるからである。
本発明の抗体の製造方法により得られるT細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体は、L鎖に関しては、κ鎖、λ鎖のいずれでもよい。
本発明の抗体の製造方法により得られるT細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体の「抗体のサブクラス」としては、IgG1が好ましい。なぜなら、前述の通り、IgG1型抗体であれば、その精製が容易だからである。
したがって、本発明の抗体の製造方法により得られるT細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体のH鎖定常領域としては、好ましくは、IgG1型抗体のH鎖定常領域、例えば、マウスIgG1型抗体のH鎖定常領域が挙げられ、配列番号41に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが具体的な一態様として挙げられる。
一方、本発明の抗体の製造方法により得られるT細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体のL鎖定常領域は、任意の生物のIgG型抗体のL鎖定常領域から選択可能であるが、H鎖定常領域の由来生物種と同一の生物種のIgG型抗体のL鎖定常領域であることが好ましい。また、κ鎖定常領域、λ鎖定常領域のいずれでもよいが、例えば、配列番号55に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。
本発明の抗体の製造方法により得られるT細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体のH鎖定常領域またはL鎖定常領域は、配列番号41または55に挙げられるアミノ酸配列において、機能的に同等な限りにおいて、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。ここで、一定の相同性としては、例えば、70%以上の相同性が挙げられ、好ましくは80%以上の相同性、より好ましくは90%以上の相同性が挙げられる。
ここで「機能的に同等」とは、変異を有しないアミノ酸配列からなるタンパク質/ポリペプチドと、変異を有するアミノ酸配列からなるタンパク質/ポリペプチドとが、同様の生物学的あるいは生化学的性質を有することを意味する。より具体的には、そのような変異を有するアミノ酸配列からなるタンパク質/ポリペプチドを用いて本発明の製造方法により得られる、T細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体が、T細胞非依存性抗原に対して意図する反応性や特異性において同様の性質を有することを意味する。
この本発明の抗体の製造方法により得られるT細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体のL鎖に用いられる連結領域は、配列番号53に挙げられるアミノ酸配列において、機能的に同等な限りにおいて、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。ここで、一定の相同性としては、例えば、70%以上の相同性が挙げられ、好ましくは80%以上の相同性、より好ましくは90%以上の相同性が挙げられる。
シグナル配列とは、分泌タンパク質や膜内在性タンパク質が、小胞体膜結合性のリボソーム上で合成された後に、脂質2重層を通り抜けるのに必要な、タンパク質のN末端に存在するアミノ酸残基であり、本発明においては、この機能を有する配列であれば特に限定されるものではない。本発明の抗体の製造方法により得られるT細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体をコードするDNAが含みうるシグナル配列をコードするDNAとしては、例えば、動物由来のシグナル配列や動物抗体由来のシグナル配列をコードするDNAが挙げられる。ここで、動物としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギ、ウマ、トリ、イヌ、ネコ、酵母、昆虫が挙げられる。シグナル配列としては、例えば、IgM型CSLEX1抗体のシグナル配列、ヒト酸性フォスファターゼのシグナル配列、マウスイムノグロブリンκ鎖のシグナル配列、および、マウスIgG1型抗体のシグナル配列が挙げられる。シグナル配列の具体的な一態様としては、H鎖に関するシグナル配列としては配列番号19で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、一方、L鎖に関するシグナル配列としては配列番号23に表されるアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。ここで、これらのシグナル配列を有することで、遺伝子組換えカイコにおいて、抗体の分泌組織、例えば、絹糸腺や脂肪体、への移行が促進される。
配列番号19で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、L鎖に関するシグナル配列は配列番号23に表されるアミノ酸配列を含むペプチドとしては、さらに、これらの配列において、機能的に同等であれば、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有してもよい。なお、その他のシグナル配列のアミノ酸配列は各種文献に記載され公知である。
Fabは、IgG型抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、H鎖のN末端側約半分とL鎖全体がジスルフィド(S−S)結合で結合した分子量約5万Daの抗原に対する特異的結合能力を有する抗体断片である。
F(ab’)2は、IgG型抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Fabがヒンジ領域のS−S結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約10万Daの抗原に対する特異的結合能力を有する抗体断片である。
Fab’は、前記F(ab’)2に還元剤ジチオスレイトール処理等を行い、前記F(ab’)2のヒンジ領域のS−S結合を切断した分子量約5万Daの抗原に対する特異的結合能力を有する抗体断片である。
なお、配列番号26〜31に示される相補性決定領域は、シアリルLexに対するIgM型抗体であるCSLEX1抗体が有する相補性決定領域である。
前記H鎖可変領域中のHCDR1、HCDR2およびHCDR3は、配列番号26、27および28に示されるアミノ酸配列において、シアリルLexに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と高い相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
ここで、「シアリルLexに対する特異的結合能力を失わない」とは、前記変異を有するアミノ酸配列に由来するCDRを有するシアリルLexに対するIgG型抗体が、変異を有さないアミノ酸配列に由来するCDRを有するシアリルLexに対するIgG型抗体と同様にシアリルLexに特異的に結合することを意味する。なお、変異を有するアミノ酸配列に由来するCDRを有するシアリルLexに対するIgG型抗体が、変異を有さないアミノ酸配列に由来するCDRを有するシアリルLexに対するIgG型抗体よりも高いシアリルLexへの反応性を有することを妨げない。実際に、CDRおよびFRへの変異により結合親和性が大幅に向上する場合があることは当業者には容易に理解し得る技術的事項である。
また、前記高い相同性としては、例えば、90%以上の相同性が挙げられ、より好ましくは95%以上の相同性が挙げられる。なぜなら、CDRは抗体の抗原認識能を決定する残基であるから、許容される変異が通常は限定されるからである。
前記H鎖可変領域中のHFR1、HFR2、HFR3およびHFR4は、配列番号32、33、34および35に示されるアミノ酸配列において、シアリルLexに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。ここで、一定の相同性としては、例えば、70%以上の相同性が挙げられ、好ましくは80%以上の相同性、より好ましくは90%以上の相同性が挙げられる。
前記H鎖可変領域は、配列番号21に示されるアミノ酸配列において、シアリルLexに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。ここで、一定の相同性としては、例えば、70%以上の相同性が挙げられ、好ましくは80%以上の相同性、より好ましくは90%以上の相同性が挙げられる。
前記L鎖可変領域中のLCDR1、LCDR2およびLCDR3は、配列番号29、30および31に示されるアミノ酸配列において、シアリルLexに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくも1種の変異を有し、かつ、該配列と高い相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。ここで、高い相同性としては、例えば、90%以上の相同性が挙げられ、より好ましくは95%以上の相同性が挙げられる。
前記L鎖可変領域中のLFR1、LFR2、LFR3およびLFR4は、配列番号36、37、38および39に示されるアミノ酸配列において、シアリルLexに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくも1種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。ここで、一定の相同性としては、例えば、70%以上の相同性が挙げられ、好ましくは80%以上の相同性、より好ましくは90%以上の相同性が挙げられる。
前記L鎖可変領域は、配列番号25に示されるアミノ酸配列において、シアリルLexに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくも1種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。ここで、一定の相同性としては、例えば、70%以上の相同性が挙げられ、好ましくは80%以上の相同性、より好ましくは90%以上の相同性が挙げられる。
本発明の製造方法により得られるシアリルLexに対するIgG型抗体のH鎖またはL鎖としては、配列番号43、57、59もしくは61に挙げられるアミノ酸配列において、機能的に同等な限りにおいて、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。ここで、一定の相同性としては、例えば、70%以上の相同性が挙げられ、好ましくは80%以上の相同性、より好ましくは90%以上の相同性、さらに好ましくは95%以上の相同性が挙げられる。
したがって、本発明の製造方法に用いられるT細胞非依存性抗原に対する抗体をコードするDNA中のH鎖定常領域をコードするDNAとしては、好ましくは、IgG1型抗体のH鎖定常領域をコードするDNA、例えば、マウスIgG1型抗体のH鎖定常領域をコードするDNAが挙げられ、その具体的な一態様としては、配列番号41に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするDNAが挙げられる。配列番号41に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするDNAとしては、配列番号40に示されるDNA配列を含むDNAが挙げられる。
一方、本発明の抗体の製造方法により得られるT細胞非依存性抗原に対する抗体のIgG型抗体のL鎖定常領域をコードするDNAは、任意の生物のIgG型抗体のL鎖定常領域をコードするDNAから選択可能であるが、H鎖定常領域の由来生物種と同一の生物種のIgG型抗体のL鎖定常領域をコードするDNAであることが好ましい。また、κ鎖定常領域をコードするDNA、λ鎖定常領域をコードするDNAのいずれでもよい。本発明の製造方法に用いられるT細胞非依存性抗原に対する抗体をコードするDNA中のL鎖定常領域をコードするDNAとして、例えば、配列番号55に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするDNAが挙げられる。配列番号55に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするDNAとしては、配列番号54に示すDNA配列を含むDNAが挙げられる。
本発明の製造方法に用いられるT細胞非依存性抗原に対する抗体をコードするDNA中のH鎖定常領域、もしくは、L鎖定常領域をコードするDNAとして、さらには、それぞれ配列番号40もしくは54に示されるDNA配列を含むDNAがコードするアミノ酸配列において、機能的に同等な限りにおいて、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられる。ここで、一定の相同性としては、例えば、70%以上の相同性が挙げられ、好ましくは80%以上の相同性、より好ましくは90%以上の相同性が挙げられる。
可変領域をコードするDNA配列と定常領域をコードするDNA配列との連結方法としては、例えば、連結領域を介して、または、連結領域を介さずに2つのDNA配列が連結された配列を設計し、設計された配列を全合成する方法、一のDNA配列を遺伝子組換えベクターに挿入した後に、該DNA配列と連続的な位置にまたは適切な間隔を空けて、もう一方のDNA配列を挿入する方法が挙げられる。
本発明の製造方法に用いられるT細胞非依存性抗原に対する抗体をコードするDNAにおいて、例えば、H鎖をコードするDNAに関しては、前記H鎖可変領域をコードするDNAと前記H鎖定常領域をコードするDNAとが連結される。一方、L鎖に関しては、例えば、可変領域をコードするDNAと定常領域をコードするDNA配列とが、配列番号53に示されるアミノ酸配列を含む連結領域をコードするDNA配列を介して連結される。配列番号53に示されるアミノ酸配列を含む連結領域をコードするDNA配列としては、配列番号52に示されるDNA配列が挙げられる。
本発明の製造方法に用いられるT細胞非依存性抗原に対する抗体をコードするDNA中のL鎖定常領域をコードするDNAにおいて、L鎖可変領域とL鎖定常領域とを連結する領域をコードするDNAとして、さらには、配列番号52に示されるDNA配列を含むDNAがコードするアミノ酸配列において、機能的に同等な限りにおいて、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられる。ここで、一定の相同性としては、例えば、70%以上の相同性が挙げられ、好ましくは80%以上の相同性、より好ましくは90%以上の相同性が挙げられる。
ここで動物としては、前記したように、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギ、ウマ、トリ、イヌ、ネコ、酵母、昆虫が挙げられる。シグナル配列としては、例えば、IgM型CSLEX1抗体のシグナル配列をコードするDNA、ヒト酸性フォスファターゼのシグナル配列をコードするDNA、マウスイムノグロブリンκ鎖のシグナル配列をコードするDNA、およびマウスIgG1型抗体のシグナル配列をコードするDNAが挙げられる。具体的な一態様として、H鎖に関するシグナル配列としては配列番号19で表されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードするDNA、一方、L鎖に関するシグナル配列としては配列番号23に表されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードするDNAが挙げられる。配列番号19で表されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードするDNAとしては、配列番号18で表されるDNA配列を含むDNAが挙げられ、一方、配列番号23に表されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードするDNAとしては、配列番号22に表されるDNA配列を含むDNAが挙げられる。ここで、これらのシグナル配列を有することで、遺伝子組換えカイコにおいて、抗体の分泌組織、例えば絹糸腺や脂肪体、への移行が促進される。
本発明の製造方法に用いられるT細胞非依存性抗原に対する抗体をコードするDNA中のシグナル配列をコードするDNAとして、さらには、それぞれ配列番号18もしくは22に示されるDNA配列を含むDNAがコードするアミノ酸配列において、機能的に同等な限りにおいて、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられる。ここで、一定の相同性としては、例えば、70%以上の相同性が挙げられ、好ましくは80%以上の相同性、より好ましくは90%以上の相同性が挙げられる。
本発明の抗体の製造方法に用いられるシアリルLexに対する抗体をコードするDNA中のH鎖可変領域をコードするDNAとして、さらには、配列番号20に示されるDNA配列を含むDNAがコードするアミノ酸配列において、シアリルLexに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられる。ここで、一定の相同性としては、例えば、70%以上の相同性が挙げられ、好ましくは80%以上の相同性、より好ましくは90%以上の相同性が挙げられる。
本発明で提供されるシアリルLexに対する抗体をコードするDNA中のL鎖可変領域をコードするDNAとして、さらには、配列番号14に示されるDNA配列を含むDNAがコードするアミノ酸配列において、シアリルLexに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられる。ここで、一定の相同性としては、例えば、70%以上の相同性が挙げられ、好ましくは80%以上の相同性、より好ましくは90%以上の相同性が挙げられる。
本発明で提供されるシアリルLexに対する抗体をコードするDNAにおいて、シアリルLexに対する抗体のH鎖可変領域を含むH鎖をコードするDNAと、L鎖可変領域を含むL鎖をコードするDNAとは、連結されていても、連結されていなくてもよい。なお、これらのDNAが連結される場合には、2つのDNA間にこれら以外のDNA配列を含んでもよい。
本発明で提供されるシアリルLexに対する抗体をコードするDNA中のH鎖可変領域をコードするDNAとして、さらには、配列番号20に示されるDNA配列を含むDNAがコードするアミノ酸配列において、シアリルLexに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられる。ここで、一定の相同性としては、例えば、70%以上の相同性が挙げられ、好ましくは80%以上の相同性、より好ましくは90%以上の相同性が挙げられる。
本発明で提供されるシアリルLexに対する抗体をコードするDNA中のL鎖可変領域をコードするDNAとして、さらには、配列番号14に示されるDNA配列を含むDNAがコードするアミノ酸配列において、シアリルLexに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられる。ここで、一定の相同性としては、例えば、70%以上の相同性が挙げられ、好ましくは80%以上の相同性、より好ましくは90%以上の相同性が挙げられる。
一方、本発明で提供されるシアリルLexに対する抗体をコードするDNA中のL鎖定常領域をコードするDNAは、任意の生物のIgG型抗体のL鎖定常領域をコードするDNAから選択可能であるが、H鎖定常領域の由来生物種と同一の生物種のIgG型抗体のL鎖定常領域をコードするDNAであることが好ましい。また、κ鎖定常領域をコードするDNA、λ鎖定常領域をコードするDNAのいずれでもよい。本発明で提供されるシアリルLexに対する抗体をコードするDNA中のL鎖定常領域をコードするDNAとしては、例えば、配列番号55に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするDNAが挙げられる。配列番号55に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするDNAとしては、配列番号54に示すDNA配列を含むDNAが挙げられる。
本発明で提供されるシアリルLexに対する抗体をコードするDNA中のH鎖定常領域、もしくは、L鎖定常領域をコードするDNAとして、さらには、それぞれ配列番号40もしくは54に示されるDNA配列を含むDNAがコードするアミノ酸配列において、機能的に同等な限りにおいて、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられる。ここで、一定の相同性としては、例えば、70%以上の相同性が挙げられ、好ましくは80%以上の相同性、より好ましくは90%以上の相同性が挙げられる。
可変領域をコードするDNA配列と定常領域をコードするDNA配列との連結方法としては、例えば、連結領域を介して、または、連結領域を介さずに2つのDNA配列が連結された配列を設計し、設計された配列を全合成する方法、一のDNA配列を遺伝子組換えベクターに挿入した後に、該DNA配列と連続的な位置にまたは適切な間隔を空けて、もう一方のDNA配列を挿入する方法が挙げられる。
本発明で提供されるシアリルLexに対する抗体をコードするDNAにおいて、例えば、H鎖をコードするDNAに関しては、前記H鎖可変領域をコードするDNAと前記H鎖定常領域をコードするDNAとが連結される。一方、L鎖に関しては、例えば、可変領域をコードするDNAと定常領域をコードするDNA配列とが、配列番号53に示されるアミノ酸配列を含む連結領域をコードするDNA配列を介して連結される。配列番号53に示されるアミノ酸配列を含む連結領域をコードするDNA配列としては、配列番号52に示されるDNA配列が挙げられる。
本発明で提供されるシアリルLexに対する抗体をコードするDNA中のL鎖定常領域をコードするDNAにおいて、L鎖可変領域とL鎖定常領域とを連結する領域をコードするDNAとして、さらには、配列番号52に示されるDNA配列を含むDNAがコードするアミノ酸配列において、機能的に同等な限りにおいて、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられる。ここで、一定の相同性としては、例えば、70%以上の相同性が挙げられ、好ましくは80%以上の相同性、より好ましくは90%以上の相同性が挙げられる。
ここで動物としては、前記したように、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギ、ウマ、トリ、イヌ、ネコ、酵母、昆虫が挙げられる。シグナル配列としては、例えば、IgM型CSLEX1抗体のシグナル配列をコードするDNA、ヒト酸性フォスファターゼのシグナル配列をコードするDNA、マウスイムノグロブリンκ鎖のシグナル配列をコードするDNA、およびマウスIgG1型抗体のシグナル配列をコードするDNAが挙げられる。具体的な一態様として、H鎖に関するシグナル配列としては配列番号19で表されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードするDNA、一方、L鎖に関するシグナル配列としては配列番号23に表されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードするDNAが挙げられる。配列番号19で表されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードするDNAとしては、配列番号18で表されるDNA配列を含むDNAが挙げられ、一方、配列番号23に表されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードするDNAとしては、配列番号22に表されるDNA配列を含むDNAが挙げられる。ここで、これらのシグナル配列を有することで、遺伝子組換えカイコにおいて、抗体の分泌組織、例えば絹糸腺や脂肪体、への移行が促進される。
本発明で提供されるシアリルLexに対する抗体をコードするDNA中のシグナル配列をコードするDNAとして、さらには、それぞれ配列番号18もしくは22に示されるDNA配列を含むDNAがコードするアミノ酸配列において、機能的に同等な限りにおいて、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられる。ここで、一定の相同性としては、例えば、70%以上の相同性が挙げられ、好ましくは80%以上の相同性、より好ましくは90%以上の相同性が挙げられる。
本発明で提供されるシアリルLexに対する抗体をコードするDNAとして、さらには、それぞれ配列番号42、56、58もしくは60に示されるDNA配列を含むDNAがコードするアミノ酸配列において、シアリルLex結合抗原に対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられる。ここで、一定の相同性としては、例えば、70%以上の相同性が挙げられ、好ましくは80%以上の相同性、より好ましくは90%以上の相同性が挙げられる。
好ましい態様として、例えば、カイコ由来の絹糸腺に特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするDNAと、該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した前述の本発明の抗体の製造方法に用いられるT細胞非依存性抗原に対する抗体のH鎖またはシグナル配列を有するH鎖をコードするDNA、および、該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した前述の本発明の抗体の製造方法に用いられるT細胞非依存性抗原に対する抗体のL鎖またはシグナル配列を有するL鎖をコードするDNAが挙げられる。これらのT細胞非依存性抗原に対する抗体のH鎖またはシグナル配列を有するH鎖をコードするDNAと、L鎖またはシグナル配列を有するL鎖をコードするDNAとは、直接連結していてもよく、また、他の遺伝子を介して連結していてもよい。
カイコに導入されるシアリルLexに対する抗体をコードするDNAの具体的な一態様としては、カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするDNA、該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した配列番号58または42に記載された配列を含むDNA、および、該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した配列番号60または56に記載された配列を含むDNAが挙げられる。
さらに、配列番号で例示されるDNAに代えて、これらの配列番号の配列を含むDNAがコードするアミノ酸配列において、機能的に同等な限りにおいて、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするDNAを用いてもよい。ここで、一定の相同性としては、例えば、70%以上の相同性が挙げられ、好ましくは80%以上の相同性、より好ましくは90%以上の相同性が挙げられる。
ここで、「機能的に結合した」とは、プロモーターに転写制御因子が結合することにより、プロモーターの下流に存在するDNAの発現が誘導されるように、該プロモーターと該DNAが結合していることをいう。従って、該DNAが他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、該プロモーターに転写制御因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、前記「機能的に結合した」の意味に含まれる。
この方法により、単独のプロモーターを使った場合より、導入遺伝子からの発現生産物の量が増えるという利点がある。
一方、本発明において用いられるプロモーターとしては、カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターに代えて、カイコ由来の脂肪体特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターを用いてもよく、脂肪体特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターとしては、例えば、細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターが挙げられる。ここで、脂肪体は、カイコにおいて多量にタンパク質を発現させる器官であり、目的タンパク質を脂肪体において発現させることで目的タンパク質を多量に得ることが可能となる。
本発明においてDNAが導入されるカイコとしては、非休眠卵を産下する性質を有するカイコ、休眠卵を産下する性質を有するカイコ(例えば実用品種であるぐんま、200、春嶺、鐘月、錦秋、鐘和等)を使用することができる。ここで、休眠卵とは産卵後胚発生が一時的に停止する卵を言い、非休眠卵とは産卵後胚発生が停止せず、幼虫が孵化する卵を言う。
前記ヘルパーベクターとしては、pHA3PIG(Tamura,T.et al.,Nat.Biotechnol.,18,81−84,2000)が挙げられるが、これに限定されるものではない。
前記トランスポゾンとしては、piggyBacが好ましいが、これに限定されるものではなく、mariner、minos等を用いることもできる。
例えば、一のカイコに、前述の本発明においてカイコに導入されるDNAのうち、カイコ由来の絹糸腺または脂肪体特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするDNAを前述の方法で導入し、もう一つのカイコに、前述の本発明においてカイコに導入されるDNAのうち、該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した本発明の抗体の製造方法に用いられるT細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体をコードするDNA中のH鎖またはシグナル配列を有するH鎖をコードするDNA、および、該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した本発明の抗体の製造方法に用いられるT細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体をコードするDNA中のL鎖またはシグナル配列を有するL鎖をコードするDNAを導入し、これらのカイコ卵から得られる2種類の成体カイコ同士を交配させることで、前述の本発明においてカイコに導入されるDNAが全て導入された遺伝子組換えカイコを得ることができる。
本発明において遺伝子組換えカイコを得るために行われるカイコの交配を伴うDNA導入の具体的一態様としては、一のカイコは、絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合したGAL4をコードするDNAが導入されたカイコであり、もう一つのカイコは、UAS配列の下流に機能的に結合した配列番号58または42に記載された配列を含むDNA、および、UAS配列の下流に機能的に結合した配列番号60または56に記載された配列を含むDNAが導入されたカイコである。
この方法では、一のカイコに転写制御因子を導入し、この転写制御因子により発現する組織、時期、量などを決めることができるため、発現させたい遺伝子を導入した系統と交配させることにより、多くの系統を作ることなく、各組織や時期、量などを変えることができる利点がある。また、目的遺伝子を発現させることで遺伝子組換えカイコが不妊になる場合でも系統作出が可能である。さらに、単独のプロモーターを使った場合より、導入遺伝子からの生産物の量が増えるという利点もある。
なお、前述の本発明においてカイコに導入されるDNAを分割して導入する方法としては、前記のカイコを交配させる方法以外に、例えば、片方のDNAが導入されたカイコが産卵した卵に、もう片方のDNAを前述の方法で人為的に導入する方法、および、分割されたDNAのうち両方を、前述の方法で同じ卵に導入する方法が挙げられる。
もしくは、前記遺伝子組換えカイコの選択は、前述の本発明においてカイコに導入されるDNAとともに、適切なプロモーター、例えば、胚の単眼や蛾の複眼、神経由来の組織での発現を促すプロモーターである3xP3タンパク質、または、アクチンプロモーター、をその遺伝子領域の上流に有する公知のマーカー遺伝子を導入し、このマーカーの存在を確認することにより行うこともできる。前述のカイコを交配させることでDNA導入を行う場合においては、交配させる2種類のカイコに、それぞれ異なる公知のマーカー遺伝子を、それぞれに導入するDNAとともに導入してもよい。
例えば、卵を通常の条件で催青し、孵化した蟻蚕を人工飼料等へ掃立てし、通常のカイコと同様な条件で飼育することで5令カイコまで飼育できる。
本発明の抗体の製造方法に用いられる遺伝子組換えカイコは、通常のカイコと同様に蛹化する。蛹の段階で雌雄を区別し、発蛾したのち雌雄を交尾させ、翌日採卵する。カイコ卵は通常のカイコ卵と同様に保存することが可能である。本発明の抗体の製造方法に用いられる遺伝子組換えカイコは、こうした飼育を繰り返すことで継代することが可能であり、また、大量に増やすことが可能である。
本発明の抗体の製造方法に用いられる遺伝子組換えカイコは人工飼料による清浄飼育が可能であり、大掛かりな設備がなくとも数万匹規模での大量飼育を容易に行うことができる。さらに自然界に豊富にある桑の葉を用いて遺伝子組換えカイコの安価な飼育も可能である。一方、例えば、哺乳動物細胞はその培養に大規模な培養設備や大量の培地を必要とし、安価な培養は困難である。したがって、製造コストの面から遺伝子組換えカイコを用いた抗体製造は哺乳動物細胞を用いた抗体製造よりも優れている。T細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体、特に腫瘍マーカー糖鎖抗原に対するIgG型抗体といった診断用途での大量の需要が見込まれる抗体の商業的製造には、遺伝子組換えカイコを用いた抗体製造が適している。
ここで、絹糸腺は、前部絹糸腺、中部絹糸腺、後部絹糸腺に分けられるが、本発明における絹糸腺としては、中部絹糸腺および後部絹糸腺がより好ましい。なぜなら、絹タンパク質の合成は、中部絹糸腺および後部絹糸腺にて行われ、これらの器官から目的タンパク質を多量に得ることができるからである。
さらに、本発明で用いられるカイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターとして、セリシンI遺伝子から合成されるタンパク質、もしくは、セリシンII遺伝子から合成されるタンパク質をコードするDNAのプロモーターを用いる場合には、本明細書における絹糸腺としては、中部絹糸腺が好ましく、フィブロインL鎖タンパク質をコードするDNAのプロモーターを用いる場合には、後部絹糸腺が好ましい。なぜなら、これらのプロモーターを用いて発現されるタンパク質は、それぞれの絹糸腺特異的に発現するからである。
一方、本発明の抗体の製造方法に用いられる遺伝子組換えカイコとは、前述のように本発明の製造方法により製造する抗体がその体内組織において生産される遺伝子組換えカイコのことをいう。
本発明のT細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体の製造方法において、該抗体を回収する方法としては、絹糸腺からの回収に関しては、例えば、吐糸期になったカイコを解剖し、絹糸腺を摘出した後、緩衝液中で、絹糸腺にピンセットやメスで傷を入れ、あるいは、絹糸腺をホモジナイズして、緩衝液中に放出される液状絹に含まれる該抗体を得る方法が挙げられる。また、遺伝子組換えカイコが吐糸した繭から回収する手法、界面活性剤を用いる手法、水溶液で溶かす等の当業者であれば公知の手法が挙げられる。一方、T細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体の脂肪体からの回収に関しては、幼虫体内から脂肪体を摘出し、タンパク質抽出のための緩衝液でホモジナイズすることや、脂肪体から体液に分泌させ、体液を分取する等の当業者であれば公知の手法が挙げられる。本発明におけるT細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体の回収方法の具体的一態様としては、例えば、吐糸期になったカイコを解剖し、絹糸腺を摘出した後、緩衝液中で、絹糸腺をホモジナイズする手法が挙げられる。
T細胞非依存性抗原に対するIgM型抗体には、抗体に対するアフィニティークロマトグラフィーとして最も一般的に用いられているProtein AやProtein Gをリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーへの親和性がなく、これらを用いた簡便な精製を行うことができなかった。これに対し、本発明の抗体の製造方法により得られるT細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体は、IgG型抗体の定常領域を有することによって、特にIgG1型抗体の定常領域を有することによって、前記のアフィニティークロマトグラフィーへの親和性が高くなり、簡便な精製が可能となる。一方、本発明の抗体の製造方法により得られるT細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体から前述した方法で抗体断片を作成した場合、該抗体断片は通常の抗体から分子量が変化するため、ゲルろ過クロマトグラフィー等の適用が可能となる。
この結果は、本発明の抗体の製造方法により得られるT細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体は、簡便な精製が可能でありかつIgM型抗体と同様の反応性を有することを示す。そのため、該抗体を用いたIgM型抗体の代替が可能なことを示唆している。
(1−1)CSLEX1抗体遺伝子5´末端領域のcDNAクローニングおよび配列決定
IgM型CSLEX1抗体遺伝子の5´末端から定常領域開始点までのcDNAをクローニングした。次いで、クローニングされたcDNAの塩基配列を決定した。この領域は、5´末端から順に、シグナル配列をコードする塩基配列と、H鎖可変領域をコードする塩基配列またはL鎖可変領域をコードする塩基配列との2つの連結された塩基配列領域により構成される。
IgM型CSLEX1抗体のH鎖およびL鎖のN末端アミノ酸配列を決定することで、前記(1−1)で得られた塩基配列からシグナル配列をコードする塩基配列と可変領域をコードする塩基配列とを分離し、H鎖可変領域およびL鎖可変領域を同定した。
CDR領域が既知の抗体のアミノ酸配列との比較から、CSLEX1抗体H鎖およびL鎖の相補性決定領域(CDR)を同定した。
NCBI IgBLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)を用いて、CSLEX1抗体H鎖可変領域およびL鎖可変領域の類似配列を検索したところ、前記全てのCDRが完全に一致する配列は認められず、CSLEX1抗体H鎖可変領域およびL鎖可変領域のCDRは新規なアミノ酸配列を有することを確認した。
(2−1)IgG1κ型抗体発現ベクターpUC57/CSLEXHおよびpUC57/CSLEXLの構築
前記(1−1)で決定した
IgM型CSLEX抗体のシグナル配列と可変領域からなる塩基配列と、マウスのIgG型抗体の定常領域を構成する塩基配列を連結してIgG型CSLEX抗体を構成した。
WO2007/046439号パンフレット記載のpBluescriptII/UAS−SV40UTRベクター、pBacN/loxPベクターおよびpDNR/UAS−SV40ベクターを用いて、前記(2−1)で作成したCSLEXHとCSLEXLとが導入された、遺伝子組換えカイコにおいて標的遺伝子を効率的に発現させるGAL4/UASシステム(Fischer,J.A.et al.,Nature,332,853−856,1988,Brand,A.H & Perrimon,N.,Development,118,401−415,1993)を構成するためのプラスミドベクターpBacN/loxP−UAS−CSLEXL−UAS−CSLEXH(図3参照)を構築した。
なお、BlnIとSpeIは相補的断片を生じる制限酵素である。
次いで、得られたpBluescriptII/UAS−CSLEXL−SV40UTRをSpeIで処理し、SpeI−UAS−CSLEXL−SV40―SpeI断片を得た(図1参照)。得られたSpeI−UAS−CSLEXL−SV40―SpeI断片と、BlnIで処理された直鎖状pBacN/loxPベクターとをライゲーションし、pBacN/loxP−UAS−CSLEXL−SV40UTRを得た(図1参照)。
一方、前記(2−1)で得られたpUC57/CSLEXHをSpeIで処理してSpeI−CSLEXH―SpeI断片を得た(図2参照)。得られたSpeI−CSLEXH―SpeI断片と、BlnIで処理された直鎖状ドナーベクターpDNR/UAS−SV40UTRとをライゲーションし、pDNR/UAS−CSLEXH−SV40UTRを得た(図2参照)。
続いて、Cre Recombinase(BD Biosciences Clontech)を用い、添付の使用説明書に基づいて、DNR/UAS−CSLEXH−SV40UTR内のUAS−CSLEX−SV40UTR断片をpBacN/loxP−UAS−CSLEXL―SV40UTRに導入して、pBacN/loxP−UAS−CSLEXL−UAS−CSLEXHベクターを得た(図3参照)。
(3−1)発現ベクターのカイコ卵へのインジェクション
特開2003−88273号公報記載のポリヌクレオチド導入方法に従って、前記(2−2)で作成したpBacN/loxP−UAS−CSLEXL−UAS−CSLEXHベクターと、転移酵素遺伝子をコードするヘルパープラスミドpA3PIG(Tamura,T.et al.,Nat.Biotechnol.,18,81−84,2000)とを同時に533粒の発生初期のカイコ卵に導入した。
前記(3−1)で発現ベクターが挿入された533粒のカイコ卵を孵化させ、得られた第1世代の成体を交配させることで得られた第2世代のカイコから、pBacN/loxP−UAS−CSLEXL−UAS−CSLEXHベクターが導入された2蛾区の遺伝子組換えカイコを選択した。その過程を表3に示す。
前記(3−2)で作出した2蛾区のUAS−CSLEXL−UAS−CSLEXH系統の遺伝子組換えカイコと、既に系統化されている絹糸腺特異的に発現するセリシンI遺伝子から合成されるタンパク質のDNAの下流に機能的に結合したGAL4遺伝子をもつSer1−GAL4系統の遺伝子組換えカイコとを交配させ、GAL4/UASシステム(Fischer,J.A.et al.,Nature,332,853−856,1988,Brand,A.H & Perrimon,N.,Development,118,401−415,1993)によりCSLEX1抗体を絹糸腺に発現させるSer1−GAL4/UAS−CSLEXL−UAS−CSLEXH系統を樹立した。
前記(3−3)で得られたSer1−GAL4/UAS−CSLEXL−UAS−CSLEXH系統の遺伝子組換えカイコの絹糸腺において、IgG型CSLEX1抗体が発現されていることを確認した。
(4−1)絹糸腺抽出液の前処理
前記(3−3)で得られたSer1−GAL4/UAS−CSLEXL−UAS−CSLEXH系統の遺伝子組換えカイコから、CSLEX1抗体が含まれる精製サンプルを調整した。
前記(4−1)で得られた精製サンプルからIgG型CSLEX1抗体を、第1段階目にアフィニティークロマトグラフィーを用い、第2段階目にイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した。この際、シアリルLexに対する反応性を評価して、IgG型CSLEX1抗体が含まれるフラクションを回収した。
図4に示すように、2段階の簡便な精製によってIgG型CSLEX1抗体を含むピークが明確に分離可能なことを確認した。
前記(4−2)で精製されたIgG型CSLEX1抗体の癌細胞中に含まれるシアリルLexに対する反応性を評価した。特に、抗体の定量的な用途を示唆する抗原抗体反応の抗原濃度依存性を評価した。また、公知のIgM型CSLEX1抗体の反応性との比較を行った。
前記IgG型CSLEX1抗体が固相化されたウェル毎に、前記濃度を調整した試料の一を100μl加え、37℃で2時間振とうして、IgG型CSLEX1抗体と試料中のシアリルLex間で抗原抗体反応をさせた。その後、洗浄液で3回洗浄し、固相化されたCSLEX1抗体に結合していないシアリルLexを除去した。
なお、シアリルLexは多価抗原であるため、共通の抗体可変領域をもち、それゆえ同一のエピトープをもつIgG型CSLEX1抗体またはIgM型CSLEX1抗体とHRP標識されたIgM型CSLEX1抗体とを用いたサンドイッチアッセイが可能である。
図5に示すように、本発明により製造されたIgG型CSLEX1抗体による抗原抗体反応において、抗原濃度依存的に吸光度が変化することを確認した。同時に、前記(4−2)に示した簡便な精製法により得られたIgG型CSLEX1抗体が、煩雑な工程により精製された公知のIgM型CSLEX1抗体と同程度の反応性を示すことを確認した。
配列番号2−人工配列の説明:合成DNA
配列番号3−人工配列の説明:合成DNA
配列番号4−人工配列の説明:合成DNA
配列番号5−人工配列の説明:合成DNA
配列番号6−人工配列の説明:合成DNA
配列番号7−人工配列の説明:合成DNA
配列番号8−人工配列の説明:合成DNA
配列番号9−人工配列の説明:合成DNA
配列番号10−人工配列の説明:合成DNA
配列番号11−人工配列の説明:合成DNA
配列番号12−シグナル配列が連結されたシアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のH鎖可変領域をコードするDNA
配列番号13−シグナル配列が連結されたシアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のH鎖可変領域
配列番号14−シグナル配列が連結されたシアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のL鎖可変領域をコードするDNA
配列番号15−シグナル配列が連結されたシアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のL鎖可変領域
配列番号16−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のH鎖可変領域のN末端5残基
配列番号17−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のL鎖可変領域のN末端5残基
配列番号18−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のH鎖可変領域に連結するシグナル配列をコードするDNA
配列番号19−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のH鎖可変領域に連結するシグナル配列
配列番号20−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のH鎖可変領域をコードするDNA
配列番号21−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のH鎖可変領域
配列番号22−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のL鎖可変領域に連結するシグナル配列をコードするDNA
配列番号23−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のL鎖可変領域に連結するシグナル配列
配列番号24−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のL鎖可変領域をコードするDNA
配列番号25−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のL鎖可変領域
配列番号26−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のHCDR1
配列番号27−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のHCDR2
配列番号28−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のHCDR3
配列番号29−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のLCDR1
配列番号30−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のLCDR2
配列番号31−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のLCDR3
配列番号32−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のHFR1
配列番号33−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のHFR2
配列番号34−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のHFR3
配列番号35−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のHFR4
配列番号36−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のLFR1
配列番号37−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のLFR2
配列番号38−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のLFR3
配列番号39−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のLFR4
配列番号40−マウスのIgG1型抗体のH鎖定常領域をコードするDNA
配列番号41−マウスのIgG1型抗体のH鎖定常領域
配列番号42−シグナル配列が連結されたシアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のH鎖可変領域をコードするDNAとマウスのIgG1型抗体のH鎖定常領域をコードするDNAとが連結されてなるDNA
配列番号43−シグナル配列が連結されたシアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のH鎖可変領域とマウスのIgG1型抗体のH鎖定常領域とが連結されてなるポリペプチド
配列番号44−マウスのIgG1型抗体のH鎖定常領域の定常領域ドメイン1をコードするDNA
配列番号45−マウスのIgG1型抗体のH鎖定常領域の定常領域ドメイン1
配列番号46−マウスのIgG1型抗体のH鎖定常領域のヒンジ領域をコードするDNA
配列番号47−マウスのIgG1型抗体のH鎖定常領域のヒンジ領域
配列番号48−マウスのIgG1型抗体のH鎖定常領域の定常領域ドメイン2をコードするDNA
配列番号49−マウスのIgG1型抗体のH鎖定常領域の定常領域ドメイン2
配列番号50−マウスのIgG1型抗体のH鎖定常領域の定常領域ドメイン3をコードするDNA
配列番号51−マウスのIgG1型抗体のH鎖定常領域の定常領域ドメイン3
配列番号52−マウスのJκセグメントをコードするDNA
配列番号53−マウスのJκセグメント
配列番号54−マウスのκ鎖定常領域をコードするDNA
配列番号55−マウスのκ鎖定常領域
配列番号56−シグナル配列が連結されたシアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のL鎖可変領域をコードするDNAとマウスの抗体のL鎖定常領域をコードするDNAとが連結されてなるDNA
配列番号57−シグナル配列が連結されたシアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のL鎖可変領域とマウスの抗体のL鎖定常領域とが連結されてなるポリペプチド
配列番号58−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のH鎖可変領域をコードするDNAとマウスのIgG1型抗体のH鎖定常領域をコードするDNAとが連結されてなるDNA
配列番号59−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のH鎖可変領域とマウスのIgG1型抗体のH鎖定常領域とが連結されてなるポリペプチド
配列番号60−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のL鎖可変領域をコードするDNAとマウスの抗体のL鎖定常領域をコードするDNAとが連結されてなるDNA
配列番号61−シアリルLexに対するIgM抗体CSLEX1のL鎖可変領域とマウスの抗体のL鎖定常領域とが連結されてなるポリペプチド
配列番号62−Leyに対するIgM型抗体B5のHCDR1
配列番号63−Leyに対するIgM型抗体B5のHCDR2
配列番号64−Leyに対するIgM型抗体B5のHCDR3
配列番号65−Leyに対するIgM型抗体B5のLCDR1
配列番号66−Leyに対するIgM型抗体B5のLCDR2
配列番号67−Leyに対するIgM型抗体B5のLCDR3
配列番号68−Leyに対するIgM型抗体B5のH鎖可変領域(WO1996/013594号パンフレット図16参照)
配列番号69−Leyに対するIgM型抗体B5のL鎖可変領域(WO1996/013594号パンフレット図16参照)
配列番号70−Leyに対するIgM型抗体MSL5のHCDR1
配列番号71−Leyに対するIgM型抗体MSL5のHCDR2
配列番号72−Leyに対するIgM型抗体MSL5のHCDR3
配列番号73−Leyに対するIgM型抗体MSL5のLCDR1
配列番号74−Leyに対するIgM型抗体MSL5のLCDR2
配列番号75−Leyに対するIgM型抗体MSL5のLCDR3
配列番号76−Leyに対するIgM型抗体MSL5のH鎖可変領域(GenBank ID:AAA93034参照)
配列番号77−Leyに対するIgM型抗体MSL5のL鎖可変領域(GenBank ID:AAA93033参照)
配列番号78−デキストランに対するIgM型抗体MOPC104EのHCDR1
配列番号79−デキストランに対するIgM型抗体MOPC104EのHCDR2
配列番号80−デキストランに対するIgM型抗体MOPC104EのHCDR3
配列番号81−デキストランに対するIgM型抗体MOPC104EのLCDR1
配列番号82−デキストランに対するIgM型抗体MOPC104EのLCDR2
配列番号83−デキストランに対するIgM型抗体MOPC104EのLCDR3
配列番号84−デキストランに対するIgM型抗体MOPC104EのH鎖可変領域(SwissProt ID:P01756参照)
配列番号85−デキストランに対するIgM型抗体MOPC104EのL鎖可変領域(SwissProt ID:P01724参照)
配列番号86−ラクトテトラオシルセラミドに対するIgM型抗体11−50のHCDR1
配列番号87−ラクトテトラオシルセラミドに対するIgM型抗体11−50のHCDR2
配列番号88−ラクトテトラオシルセラミドに対するIgM型抗体11−50のHCDR3
配列番号89−ラクトテトラオシルセラミドに対するIgM型抗体11−50のLCDR1
配列番号90−ラクトテトラオシルセラミドに対するIgM型抗体11−50のLCDR2
配列番号91−ラクトテトラオシルセラミドに対するIgM型抗体11−50のLCDR3
配列番号92−ラクトテトラオシルセラミドに対するIgM型抗体11−50のH鎖可変領域(GenBank ID:CAA51274参照)
配列番号93−ラクトテトラオシルセラミドに対するIgM型抗体11−50のL鎖可変領域(GenBank ID:CAA51276参照)
Claims (18)
- (i)アミノ酸配列59で示されるH鎖をコードする塩基配列を含むDNAと、
(ii)アミノ酸配列61で示されるL鎖をコードする塩基配列を含むDNAを含む、シアリルルイスX(シアリルLex)に対するIgG型抗体をコードするDNA。 - 前記アミノ酸配列59で示されるH鎖をコードする塩基配列が配列番号58で示され、前記アミノ酸配列61で示されるL鎖をコードする塩基配列が配列番号60で示される、請求項1に記載のDNA。
- 請求項1又は2に記載のDNAのDNA配列を含む遺伝子組換えベクター。
- 前記DNA配列が、UASプロモーターの下流に機能的に結合されている、請求項3に記載の遺伝子組換えベクター。
- 遺伝子組換えカイコの製造方法であって、
(i)アミノ酸配列59で示されるH鎖をコードする塩基配列を含むDNAと、
(ii)アミノ酸配列61で示されるL鎖をコードする塩基配列を含むDNA、
をカイコに導入することを含む、シアリルルイスX(シアリルLex)に対するIgG型抗体を生産する遺伝子組換えカイコの製造方法。 - H鎖をコードする塩基配列が配列番号58であり、L鎖をコードする塩基配列が配列番号60である、請求項5に記載の遺伝子組換えカイコの製造方法。
- (i)カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするDNAと、
(ii)該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した、前記H鎖及びL鎖をコードする塩基配列を含むDNA
をカイコに導入することを含む、請求項5又は6に記載の遺伝子組換えカイコの製造方法。 - (i)カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするDNAが導入されたカイコと、
(ii)該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した、前記H鎖及びL鎖をコードする塩基配列を含むDNAが導入されたカイコとを交配させてDNAを導入することを含む、請求項5から7のいずれかに記載の遺伝子組換えカイコの製造方法。 - 前記絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターがSer1であり、前記転写因子がGAL4であり、前記プロモーターがUASである、請求項7又は8に記載の遺伝子組換えカイコの製造方法。
- 遺伝子組換えカイコであって、
(i)アミノ酸配列59で示されるH鎖をコードする塩基配列を含むDNAと、
(ii)アミノ酸配列61で示されるL鎖をコードする塩基配列を含むDNA、
が導入され、かつ、シアリルルイスX(シアリルLex)に対するIgG型抗体を生産する遺伝子組換えカイコ。 - H鎖をコードする塩基配列が配列番号58であり、L鎖をコードする塩基配列が配列番号60である、請求項10に記載の遺伝子組換えカイコ。
- (i)カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするDNAと、
(ii)該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した、前記H鎖及びL鎖をコードする塩基配列を含むDNA
が導入された、請求項10又は11に記載の遺伝子組換えカイコ。 - 前記絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターがSer1であり、前記転写因子がGAL4であり、前記プロモーターがUASである、請求項12に記載の遺伝子組換えカイコ。
- シアリルルイスX(シアリルLex)に対するIgG型抗体の製造方法であって;
シアリルルイスX(シアリルLex)に対するIgG型抗体は、
(i)アミノ酸配列59で示されるH鎖と、
(ii)アミノ酸配列61で示されるL鎖
とを有し;
該製造方法は、該H鎖をコードする塩基配列を含むDNAと該L鎖をコードする塩基配列を含むDNAが導入された遺伝子組換えカイコから生産される該抗体を回収して製造することを含む、シアリルルイスX(シアリルLex)に対するIgG型抗体の製造方法。 - H鎖をコードする塩基配列が配列番号58であり、L鎖をコードする塩基配列が配列番号60である、請求項14に記載の製造方法。
- 前記遺伝子組換えカイコが、
(i)カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするDNA、および、
(ii)該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した、前記H鎖及びL鎖をコードする塩基配列を含むDNA
が導入されたカイコである、請求項14又は15に記載の製造方法。 - 前記遺伝子組換えカイコが、
(i)カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするDNAが導入されたカイコと、
(ii)該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した、前記H鎖及びL鎖をコードする塩基配列を含むDNAが導入されたカイコ
とを交配させることで得られたカイコである、請求項14から16のいずれかに記載の製造方法。 - 前記絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターがSer1であり、前記転写因子がGAL4であり、前記プロモーターがUASである、請求項16又は17に記載の製造方法。
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JPN6010071252; NAKAMURA, K., et al.: 'Chimeric anti-ganglioside GM2 antibody with antitumor activity.' Cancer Res. vol.54, no.6, 19940315, p.1511-1516 * |
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