JP2023519007A - Ａｒｅｇに対する抗体及びその用途 - Google Patents
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Abstract
腎線維症、肝線維症、肺線維症、特にＩＰＦを含むがこれらに限定されない線維症疾患の治療、診断又は予防に用いられる、抗ＡＲＥＧ抗体又はその免疫反応性断片を提供する。前記抗体をコードするポリヌクレオチド又は核酸分子、発現ベクター、宿主細胞及び前記抗体を製造するための方法をさらに提供する。前記抗ＡＲＥＧ抗体は、ＥＧＦ様ドメイン中にある結合残基を介してＡＲＥＧと特異的に結合し、ＡＲＥＧの機能を遮断する。
Description
繊維化は、損傷による結合組織の肥厚及び瘢痕によって形成され、繊維芽細胞の過剰増殖及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の蓄積を特徴とする。このような疾患は一般的に肺、肝臓及び腎臓等の器官に見られ、組織構造系の破壊を引き起こし、臓器機能に深刻な損傷を与える可能性がある。
肺線維症（ＰＦ）は、健康な肺組織が過剰な細胞外マトリックスに置換された時に生じる肺疾患である。ＰＦ肺の肺胞構造が破壊され、これにより肺のコンプライアンスが低下し、ガス交換が損なわれ、最終的に呼吸不全及び死亡に至る。肺線維症の共通の特徴は肺の気嚢（肺胞）周囲の線維芽細胞が過剰増殖することである（Ｂａｒｋａｕｓｋａｓ及びＮｏｂｌｅ、２０１４）。最も一般的な肺線維症タイプは特発性肺線維症（ＩＰＦ）である。ＩＰＦは重度の進行性肺機能喪失を伴う原因不明の間質性肺疾患である。それは５０歳～７０代の高齢者に最も一般的に見られる。ＩＰＦは致命的な疾患であり、診断時からの生存時間の中央値は２～４年（Ｓｔｅｅｌｅ及びＳｃｈｗａｒｔｚ、２０１３）だけであり、最終的に呼吸不全に至る可能性がある。肺線維症の発症メカニズムは従来、未解決の謎であり、臨床治療は非常に限られている。現在、ＩＰＦの治療用としては、ＦＤＡに許可された市販薬であるニンテダニブ及びピルフェニドンの２種のみである。しかしながら、この２種の薬物は１年以内の強制肺活量の低下率を改善しただけで、それらはいずれも患者の生存率を顕著に向上させることができない。
以下に、抗ＡＲＥＧ抗体の先行技術を列挙する。
米国特許出願番号１０／７７４，０７６は、ＡＲＥＧ抗体、並びに、癌及び乾癬の治療におけるその用途に関する。保護を請求する抗体はヒト化ＰＡＲ３４である。
ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０５０３８９は、ＡＲＥＧ及びＨＢＥＧＦの両方と交差反応する抗体に関する。前記抗体は癌及び血管の発生に関連する疾患を治療する方法に用いることができる。保護を請求する抗体は２Ｆ７である。及び、
米国特許出願番号１５／２７１，５１５は、ＡＲＥＧ抗体及び癌の治療におけるその用途に関する。保護を請求する抗体はＡＲ３０、ＡＲ３７及びＡＲ５５８である。ここで、ＡＲ５５８は異種移植マウス腫瘍モデルにおいて最も優れる抗腫瘍活性が示されている。この３種類の抗体はいずれもヒト化抗体ではなくネズミ類抗体である。
米国特許出願番号１０／７７４，０７６は、ＡＲＥＧ抗体、並びに、癌及び乾癬の治療におけるその用途に関する。保護を請求する抗体はヒト化ＰＡＲ３４である。
ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０５０３８９は、ＡＲＥＧ及びＨＢＥＧＦの両方と交差反応する抗体に関する。前記抗体は癌及び血管の発生に関連する疾患を治療する方法に用いることができる。保護を請求する抗体は２Ｆ７である。及び、
米国特許出願番号１５／２７１，５１５は、ＡＲＥＧ抗体及び癌の治療におけるその用途に関する。保護を請求する抗体はＡＲ３０、ＡＲ３７及びＡＲ５５８である。ここで、ＡＲ５５８は異種移植マウス腫瘍モデルにおいて最も優れる抗腫瘍活性が示されている。この３種類の抗体はいずれもヒト化抗体ではなくネズミ類抗体である。
先行技術において、肺線維症、特に特発性肺線維症（ＩＰＦ）、特に肺ＡＴ２細胞におけるＡＲＥＧ信号伝達の重要な薬物標的について、決定的な報告が未だに発表されていない。本発明者らは、肺ＡＴ２細胞におけるＡＲＥＧ信号伝達と肺線維症、特にＩＰＦの発生との間の独特の関連性を特定し、肺ＡＴ２細胞におけるＡＲＥＧ信号伝達が肺線維症、特にＩＰＦの重要な薬物標的とすることができることを見出した。具体的には、正常なコントロール肺のＡＴ２細胞においてＡＲＥＧが検出されないが、全てのＩＰＦサンプルのＡＴ２細胞においていずれもＡＲＥＧが検出された。
また、本発明者らは、ＡＴ２細胞におけるＣｄｃ４２遺伝子がノックアウトされたＩＰＦの動物モデルを構築した。ＡＲＥＧはコントロール肺のＡＴ２細胞で検出することができないが、Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌル肺のＡＴ２細胞で検出することができる。これはＩＰＦの発病メカニズム及び進行を高度に模倣できる最初の動物モデルである。このような動物モデルを使用して、本発明者らは肺線維症の重要な治療標的としてＡＲＥＧを特定した。
上記の知見に基づいて、本発明者らは、腎線維症、肝線維症、肺線維症、特にＩＰＦを治療するために用いられる、ＡＲＥＧに対する抗体を製造、スクリーニングして取得した。
本発明は、腎線維症、肝線維症、肺線維症、特にＩＰＦを含むがこれらに限定されない線維症疾患の治療、診断又は予防に用いられる、抗ＡＲＥＧ抗体又はその免疫反応性断片を提供する。前記抗体をコードするポリヌクレオチド又は核酸分子、発現ベクター、宿主細胞及び前記抗体を製造するための方法をさらに提供する。前記抗体分子を含む医薬組成物をさらに提供する。本発明の抗ＡＲＥＧ抗体は、ＥＧＦ様ドメイン中にある結合残基を介してＡＲＥＧと特異的に結合し、ＡＲＥＧの機能を遮断する。本明細書に開示された抗ＡＲＥＧ抗体は、腎線維症、肝線維症、肺線維症、特にＩＰＦを含むがこれらに限定されない線維症疾患の治療、予防及び／又は診断に用いることができる。
一態様では、本発明は、線維症を抑制する能力を有する、単離された抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片を提供する。好ましくは、前記線維症は、腎線維症、肝線維症、肺線維症であり、特にＩＰＦである。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ＡＲＥＧと結合することができる。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ヒトＡＲＥＧ（ｈＡＲＥＧ）及びマウスＡＲＥＧ（ｍＡＲＥＧ）の両方と結合する。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ヒトＡＲＥＧ（ｈＡＲＥＧ）のみと結合し、マウスＡＲＥＧ（ｍＡＲＥＧ）と結合することができない。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ヒト抗ＡＲＥＧ抗体又はネズミ類抗ＡＲＥＧ抗体又はヒト化抗ＡＲＥＧ抗体又はキメラ抗ＡＲＥＧ抗体である。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、高い親和性でＡＲＥＧと結合し、その解離定数（ＫＤ）は約１０ｎＭより小さく、例えば１ｎＭ、０．１ｎＭ又は０．０１ｎＭより小さく、例えば１×１０-8－１×１０-11の範囲内にあり、好ましくは１×１０-9－１×１０-11の範囲内にある。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、可溶性形態のＡＲＥＧと結合することができる。好ましくは、前記抗ＡＲＥＧ抗体は、可溶性形態のＡＲＥＧのＥＧＦ様ドメインと結合することができる。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ヒトｐｒｏ－ＡＲＥＧの１０１～１８４残基と結合することができる。ヒトｐｒｏ－ＡＲＥＧのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５に示されるとおりである。
いくつかの実施形態において、前記抗ＡＲＥＧ抗体は、可溶性形態のＡＲＥＧのＥＧＦ様ドメイン内のＣ－末端と結合することができる。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ヒトｐｒｏ－ＡＲＥＧの１７１～１８４残基と結合することができる。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ネズミ類ｐｒｏ－ＡＲＥＧの９４～１７７残基と結合することができる。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ネズミ類ｐｒｏ－ＡＲＥＧの１３５～１７７残基のＥＧＦ様ドメインと結合することができる。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３～１３２のいずれかに示されるヒトｐｒｏ－ＡＲＥＧの１０１～１８４残基内、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３～１３２のいずれかに示されるヒトｐｒｏ－ＡＲＥＧの１４２～１８４残基内の例えば少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸と結合することができる。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ヒトｐｒｏ－ＡＲＥＧのＧｌｕ１４９及び／又はＨｉｓ１６４と相互作用することができる。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ネズミ類ｐｒｏ－ＡＲＥＧの９４－１７７残基内、好ましくは、ネズミ類ｐｒｏ－ＡＲＥＧの１３７－１７７残基内の例えば少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸と結合することができる。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、可溶性形態のＡＲＥＧと結合する抗体断片である。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、Ｆａｂ断片又はＦ（ａｂ）2断片である。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、重鎖相補決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含有する重鎖可変領域、及び軽鎖相補決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含有する軽鎖可変領域を含み、ここで、
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるＨＣＤＲ３、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＨＣＤＲ３、（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＨＣＤＲ３、（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるＨＣＤＲ３、（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるＨＣＤＲ３、（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ３、（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＨＣＤＲ３、（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されるＨＣＤＲ３、（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、及び、（１２）（１）－（１１）に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３であって、ただし、そのうちの少なくとも一つは１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の添加、欠失、保存的アミノ酸置換又はそれらの組み合わせを含むもの、から選択され、かつ、
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるＬＣＤＲ３、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ３、（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＬＣＤＲ３、（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ３、（１４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ３、（１５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示されるＬＣＤＲ３、（１６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に示されるＬＣＤＲ３、（１７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示されるＬＣＤＲ３、（１８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に示されるＬＣＤＲ３、（１９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるＬＣＤＲ３、（２０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるＬＣＤＲ３、及び、（２１）（１）～（２０）に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３であって、ただし、そのうちの少なくとも一つは１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の添加、欠失、保存的アミノ酸置換又はそれらの組み合わせを含むもの、から選択される。
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるＨＣＤＲ３、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＨＣＤＲ３、（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＨＣＤＲ３、（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるＨＣＤＲ３、（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるＨＣＤＲ３、（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ３、（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＨＣＤＲ３、（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されるＨＣＤＲ３、（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、及び、（１２）（１）－（１１）に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３であって、ただし、そのうちの少なくとも一つは１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の添加、欠失、保存的アミノ酸置換又はそれらの組み合わせを含むもの、から選択され、かつ、
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるＬＣＤＲ３、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ３、（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＬＣＤＲ３、（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ３、（１４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ３、（１５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示されるＬＣＤＲ３、（１６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に示されるＬＣＤＲ３、（１７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示されるＬＣＤＲ３、（１８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に示されるＬＣＤＲ３、（１９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるＬＣＤＲ３、（２０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるＬＣＤＲ３、及び、（２１）（１）～（２０）に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３であって、ただし、そのうちの少なくとも一つは１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の添加、欠失、保存的アミノ酸置換又はそれらの組み合わせを含むもの、から選択される。
一つの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、重鎖相補決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含有する重鎖可変領域、及び軽鎖相補決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含有する軽鎖可変領域を含み、ここで、
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるＬＣＤＲ３、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ３、（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＬＣＤＲ３、（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ３、（１４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ３、（１５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示されるＬＣＤＲ３、（１６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に示されるＬＣＤＲ３、（１７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示されるＬＣＤＲ３、（１８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に示されるＬＣＤＲ３、（１９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるＬＣＤＲ３、（２０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるＬＣＤＲ３、及び（２１）（１）～（２０）に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３であって、ただし、そのうちの少なくとも一つは１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の添加、欠失、保存的アミノ酸置換又はそれらの組み合わせを含むもの、から選択される。
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるＬＣＤＲ３、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ３、（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＬＣＤＲ３、（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ３、（１４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ３、（１５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示されるＬＣＤＲ３、（１６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に示されるＬＣＤＲ３、（１７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示されるＬＣＤＲ３、（１８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に示されるＬＣＤＲ３、（１９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるＬＣＤＲ３、（２０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるＬＣＤＲ３、及び（２１）（１）～（２０）に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３であって、ただし、そのうちの少なくとも一つは１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の添加、欠失、保存的アミノ酸置換又はそれらの組み合わせを含むもの、から選択される。
好ましくは、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＨＣＤＲ３、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＨＣＤＲ３、及び、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、並びに、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＬＣＤＲ３、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ３、及び、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、から選択されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＨＣＤＲ３、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＨＣＤＲ３、及び、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、並びに、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＬＣＤＲ３、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ３、及び、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、から選択されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
好ましくは、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＬＣＤＲ３、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ３、及び、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＬＣＤＲ３、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ３、及び、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、前記重鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７～６９から選択されるアミノ酸配列、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７～６９のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有するとともにエピトープ結合活性が保たれているアミノ酸配列を有し、
ここで、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０～８９から選択されるアミノ酸配列、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０～８９のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有するとともにエピトープ結合活性が保たれているアミノ酸配列を有する。
ここで、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０～８９から選択されるアミノ酸配列、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０～８９のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有するとともにエピトープ結合活性が保たれているアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５、（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６、（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７、（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８、（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９、（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０、（１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１、（１３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９、（１４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２、（１５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３、（１６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４、（１７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５、（１８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６、（１９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７、（２０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８、（２１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９、及び、（２２）それぞれ（１）～（２１）のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有するとともにエピトープ結合活性が保たれている２つのアミノ酸配列、から選択されるアミノ酸配列を有する。
好ましくは、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、前記重鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ、
前記軽鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５から選択されるアミノ酸配列を有する。
前記軽鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５から選択されるアミノ酸配列を有する。
好ましくは、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、及び（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５、から選択されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＤのアイソタイプである。いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のアイソタイプである。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ネズミ類ｍＡｂ、ヒト化ｍＡｂ又はキメラｍＡｂである。
好ましくは、本発明のヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－３に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１－２３に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び４に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、２２及び２４に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、２及び６に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５－２７に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のネズミ類モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７－９に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８－３０に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のネズミ類モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、１３及び１４に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６－３８に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のネズミ類モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７－１９に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、３７及び４９に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７－９に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８－３０に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１０及び９に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、３２及び３０に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８及び１１に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、３４及び３０に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８及び１２に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、３４及び３０に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、１３及び１４に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、４０及び３８に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、１３及び１４に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、４２及び３８に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、１３及び１４に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、４４及び３８に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、１５及び１６に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、４０及び３８に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、１５及び１６に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、４２及び４６に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、１５及び１６に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、４４及び４６に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、１８及び２０に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、４０及び５１に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、１８及び２０に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、４０及び５２に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、１８及び２０に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、４０及び５３に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、１８及び２０に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４、４２及び５５に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、１８及び２０に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、４４及び５５に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ヒト定常領域に由来する定常領域を含む。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、κ軽鎖定常領域に由来するヒト軽鎖定常領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４重鎖定常領域に由来するヒト重鎖定常領域を有する。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ＡＲＥＧとＥＧＦＲとの結合を遮断することができる。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ＥＧＦＲのリン酸化を抑制することができる。
別の態様では、本発明は、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド又は核酸を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは同一のポリヌクレオチド分子又は別個のポリヌクレオチド分子上に完全な重鎖可変領域又は完全な軽鎖可変領域又は両者をコードすることができる。又は、本発明に係るポリヌクレオチドは同一のポリヌクレオチド分子又は別個のポリヌクレオチド分子上に重鎖可変領域又は軽鎖可変領域又は両者の一部をコードすることができる。
いくつかの実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、重鎖可変領域をコードする配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１２、１１５及び１１７のいずれかに示されるＤＮＡ配列、及び／又は、軽鎖可変領域をコードする配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１８、１１９、１２０、１２１及び１２２のいずれかに示されるＤＮＡ配列を含む。
別の態様では、本発明は、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片をコードする一つ又は複数のポリヌクレオチドを含む、単離された細胞又はベクターを提供する。
いくつかの実施形態において、前記細胞は、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片を生成するハイブリドーマ細胞である。
別の態様では、本発明は、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片の、被検者におけるＡＲＥＧが過剰発現、上方調節又は活性化される障害を治療するための薬物の製造における用途を提供する。
前記被検者は、診断、予後又は治療を必要とする哺乳動物被検者であってもよい。哺乳動物被検者は、ヒト、馴養動物、農場動物、及び動物園、スポーツ又はペット動物を含み、例えば犬、猫、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、馬、牛、乳牛等である。
前記障害は線維症疾患であり、腎線維症、肝線維症、肺線維症、特にＩＰＦを含むがこれらに限定されない。
別の態様では、本発明は、被検者におけるＡＲＥＧが過剰発現、上方調節又は活性化される障害を治療するための方法を提供し、前記方法は、前記患者に本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片を投与することを含む。前記障害は線維症疾患であり、腎線維症、肝線維症、肺線維症、特にＩＰＦを含むがこれらに限定されない。
前記被検者は、診断、予後又は治療を必要とする哺乳動物被検者であってもよい。哺乳動物被検者は、ヒト、馴養動物、農場動物、及び動物園、スポーツ又はペット動物を含み、例えば犬、猫、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、馬、牛、乳牛等である。
別の態様では、本発明は、ＡＲＥＧタンパク質の存在を特定する方法を提供し、前記方法は、ＡＲＥＧタンパク質を含むと疑われる細胞を、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片に暴露し、前記抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片と前記細胞との結合を特定することを含む。
前記方法は、被検者におけるＡＲＥＧが過剰発現、上方調節又は活性化される障害を診断するための方法であってもよい。前記障害は線維症疾患であり、腎線維症、肝線維症、肺線維症、特にＩＰＦを含むがこれらに限定されない。
前記被検者は、診断、予後又は治療を必要とする哺乳動物被検者であってもよい。哺乳動物被検者は、ヒト、馴養動物、農場動物、及び動物園、スポーツ又はペット動物を含み、例えば犬、猫、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、馬、牛、乳牛等である。
別の態様では、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３～１３２のいずれかに示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３～１３２のいずれかと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、単離されたＡＲＥＧタンパク質を提供する。
前記単離されたＡＲＥＧタンパク質は、エピトープとして本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片を生成するために用いられる。
本発明に係る単離されたＡＲＥＧタンパク質は、ネズミ類ＡＲＥＧと交差反応性がないか又は弱い交差反応性を有する抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片を同定することに用いることができる。
２つのアミノ酸（１４９Ｅ及び１６４Ｈ、ｈＡＲＥＧ番号に基づく）は、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片がｍＡＲＥＧではなくｈＡＲＥＧと結合する重要なエピトープ残基であると同定される。ｍＡＲＥＧにおけるアミノ酸１４９Ｋ及び１６４Ｎ（ｈＡＲＥＧ番号に基づく）は、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片がｍＡＲＥＧとの交差反応性を欠く原因となる残基であり、１６４Ｎ残基は最も重要である。
好ましくは、前記単離されたＡＲＥＧタンパク質は、アミノ酸Ｇｌｕ１４９（ｈＡＲＥＧ番号を使用する）及び／又はＨｉｓ１６４（ｈＡＲＥＧ番号を使用する）を有する。
別の態様では、本発明は、ｈＡＲＥＧと結合するとともにｍＡＲＥＧに対して交差反応性がないか又は弱い交差反応性を有する抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片を同定するために用いられる、本発明に係る単離されたＡＲＥＧタンパク質の用途を提供する。
定義：
本明細書で使用される際に、用語「ＡＲＥＧ」及び「Ａｒｅｇ」は、「アンフィレグリン」（Ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）又はアンフィレグリンをコードする遺伝子を意味し、交換して使用することができる。「ＡＲＥＧ（Ａｒｅｇ）」は上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーのメンバーであり、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）の低親和性リガンドである。明細書において特に断りのない限り、「ＡＲＥＧ（Ａｒｅｇ）」はヒトＡＲＥＧ（Ａｒｅｇ）を意味する。ＥＧＦＲがＡＲＥＧに結合すると、細胞の生存、増殖及び運動を制御する主な細胞内のシグナル伝達カスケードが活性化される。ＡＲＥＧタンパク質は２５２個のアミノ酸の膜貫通前駆体（ｐｒｏ－ＡＲＥＧ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５）から合成され、前記前駆体はその細胞外ドメイン内に膜プロテアーゼ、主にＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７によってタンパク質分解的に切断され、それにより２種類の可溶性形態のＡＲＥＧタンパク質が放出され、そのうちの大きい方はｐｒｏ－ＡＲＥＧの１０１～１８４残基（ＳＶＲＶＥＱＶＶＫＰＰＱＮＫＴＥＳＥＮＴＳＤＫＰＫＲＫＫＫＧＧＫ ＮＧＫＮＲＲＮＲＫＫＫＮＰＣＮＡＥＦＱＮＦＣＩＨＧＥＣＫＹＩＥＨＬＥＡＶＴＣＫＣＱＱＥＹＦＧＥＲＣＧＥＫ）に対応し、短い方はｐｒｏ－ＡＲＥＧの１０７－１８４残基（長さが７８個の残基）に対応する。ＡＲＥＧタンパク質はヘパリン結合ドメイン（ｐｒｏ－ＡＲＥＧの１０１－１４３残基に対応し、ＳＶＲＶＥＱＶＶＫＰＰＱＮＫＴＥＳＥＮＴＳＤＫＰＫＲＫＫＫＧＧＫＮ ＧＫＮＲＲＮＲＫ）及びＥＧＦ様ドメイン（ｐｒｏ－ＡＲＥＧの１４４－１８４残基に対応し、ＫＫＮＰＣＮＡＥＦＱＮＦＣＩＨＧＥＣＫＹＩＥＨ ＬＥＡＶＴＣＫＣＱＱＥＹＦＧＥＲＣＧＥＫ）を含有する。Ｐｒｏ－ＡＲＥＧは接触分泌モードで隣接する細胞上のＥＧＦＲを活性化し、可溶性形態のＡＲＥＧは自己分泌又は傍分泌モードでＥＧＦＲを活性化する。
本明細書で使用される際に、用語「ＡＲＥＧ」及び「Ａｒｅｇ」は、「アンフィレグリン」（Ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）又はアンフィレグリンをコードする遺伝子を意味し、交換して使用することができる。「ＡＲＥＧ（Ａｒｅｇ）」は上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーのメンバーであり、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）の低親和性リガンドである。明細書において特に断りのない限り、「ＡＲＥＧ（Ａｒｅｇ）」はヒトＡＲＥＧ（Ａｒｅｇ）を意味する。ＥＧＦＲがＡＲＥＧに結合すると、細胞の生存、増殖及び運動を制御する主な細胞内のシグナル伝達カスケードが活性化される。ＡＲＥＧタンパク質は２５２個のアミノ酸の膜貫通前駆体（ｐｒｏ－ＡＲＥＧ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５）から合成され、前記前駆体はその細胞外ドメイン内に膜プロテアーゼ、主にＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７によってタンパク質分解的に切断され、それにより２種類の可溶性形態のＡＲＥＧタンパク質が放出され、そのうちの大きい方はｐｒｏ－ＡＲＥＧの１０１～１８４残基（ＳＶＲＶＥＱＶＶＫＰＰＱＮＫＴＥＳＥＮＴＳＤＫＰＫＲＫＫＫＧＧＫ ＮＧＫＮＲＲＮＲＫＫＫＮＰＣＮＡＥＦＱＮＦＣＩＨＧＥＣＫＹＩＥＨＬＥＡＶＴＣＫＣＱＱＥＹＦＧＥＲＣＧＥＫ）に対応し、短い方はｐｒｏ－ＡＲＥＧの１０７－１８４残基（長さが７８個の残基）に対応する。ＡＲＥＧタンパク質はヘパリン結合ドメイン（ｐｒｏ－ＡＲＥＧの１０１－１４３残基に対応し、ＳＶＲＶＥＱＶＶＫＰＰＱＮＫＴＥＳＥＮＴＳＤＫＰＫＲＫＫＫＧＧＫＮ ＧＫＮＲＲＮＲＫ）及びＥＧＦ様ドメイン（ｐｒｏ－ＡＲＥＧの１４４－１８４残基に対応し、ＫＫＮＰＣＮＡＥＦＱＮＦＣＩＨＧＥＣＫＹＩＥＨ ＬＥＡＶＴＣＫＣＱＱＥＹＦＧＥＲＣＧＥＫ）を含有する。Ｐｒｏ－ＡＲＥＧは接触分泌モードで隣接する細胞上のＥＧＦＲを活性化し、可溶性形態のＡＲＥＧは自己分泌又は傍分泌モードでＥＧＦＲを活性化する。
本明細書で使用される際に、具体的な数のない指示対象（「ａ」及び「ａｎ」）は、一つ又は一つを超えた（例えば少なくとも一つ）の指示対象物を意味する。
文脈上明らかに別段の指示がない限り、用語「又は」は本明細書において用語「及び／又は」を意味するために用いられ、それと交換して使用することができる。
「約」及び「ほぼ」は、一般的には、所定の測定特性や精度がある場合に測定された量の許容誤差の程度を意味する。例示的な誤差の程度は、所定値又は値範囲の２０パーセント（％）以内であり、一般的には１０％以内であり、より一般的には５％以内である。
本明細書において、細胞、ポリヌクレオチド例えばＤＮＡ又はＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドを指示する場合、「単離された」という用語は、その原始又は元来の環境（例えば、天然に存在するものであれば、天然環境とされる）から取り出された材料を意味する。例えば、生きている動物に存在する天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されないが、人間の介入により天然システムにおけるいくつか又は全ての共存材料から分離された同一のポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されたものである。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であってもよく、及び／又は、このようなポリヌクレオチド又はポリペプチドは組成物の一部であってもよく、しかも依然として単離されたものであり、したがって、このようなベクター又は組成物はそれが自然界においてその中に存在する環境の一部ではない。単離されたポリヌクレオチドはそれぞれ前記大分子の天然由来に存在する他のＤＮＡ又はＲＮＡと分離された分子を意味する。単離されたポリペプチドは精製及び組換えのポリペプチドの両方を含むことを意図する。
本明細書に開示された製品及び方法は、指定された配列又は前記指定された配列と同一又は類似する配列、例えばそれと少なくとも約８５％又は９５％の配列同一性（同一の）配列を有するポリペプチド及びポリヌクレオチドを含む。アミノ酸配列の場合、「８５％又は９５％の配列同一性（同一の）」という用語は、本明細書において、第１のアミノ酸配列が第２のアミノ酸配列中の整列されたアミノ酸残基ｉ）と同じであるか又はｉｉ）保存的に置換された十分な数又は最少数のアミノ酸残基を含有することにより、前記第１のアミノ酸配列及び第２のアミノ酸配列が共通のドメイン及び／又は共通の機能活性を有することができることを指示するために用いられる。例えば、共通のドメインを含有するアミノ酸配列と参照配列、例えば本明細書に提供される配列は少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。
ヌクレオチド配列の場合、「８５％又は９５％の配列同一性（同一の）」という用語は、本明細書において、第１の核酸配列が第２の核酸配列中の整列されたヌクレオチドと同じである十分な数又は最少数のヌクレオチドを含有することにより、前記第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列が共通の機能活性を有するポリペプチドをコードしたり、共通の構造性ポリペプチドドメイン又は共通の機能性ポリペプチド活性をコードしたりすることを指示するために用いられる。例えば、ヌクレオチド配列と参照配列、例えば本明細書に提供される配列は少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。
２つのアミノ酸配列又は核酸配列の同一性パーセントを特定するために、最適な比較の目的で前記配列を整列させる（例えば、最適な整列のために、第１のアミノ酸又は核酸配列及び第２のアミノ酸又は核酸配列のうちの一方又は両方にギャップを導入することができ、しかも比較の目的で非相同配列を無視することができる）。好ましい実施形態において、比較の目的で、整列された参照配列の長さは前記参照配列の長さの少なくとも３０％であり、例えば少なくとも４０％、５０％、６０％であり、例えば少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書において交換して使用することができ、任意の長さのアミノ酸ポリマーを意味する。
「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」又は「ポリヌクレオチド配列」及び「ポリヌクレオチド」は交換して使用することができる。
本明細書で使用される際に、「抗体又は抗体分子」という用語は、少なくとも一つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質を意味し、例えば免疫グロブリン鎖又はその断片である。「抗体分子」という用語は、例えば、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する全長抗体を含む）を含む。一実施形態において、抗体分子は全長抗体又は全長免疫グロブリン鎖を含む。一実施形態において、抗体分子は全長抗体又は全長免疫グロブリン鎖の抗原結合又は機能性断片を含む。本明細書で使用される際に、抗体分子は抗原と「結合」し、このような結合は当業者に理解される。一実施形態において、抗体は抗原と結合し、その解離定数（ＫＤ）は約１×１０-5Ｍ以下であり、１×１０-6Ｍ以下であり、又は１×１０-7Ｍ以下であり、１×１０-8Ｍ以下であり、１×１０-9Ｍ以下であり、１×１０-10Ｍ以下であり、１×１０-11Ｍ以下である。
例えば、抗体分子は重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列（本明細書においてＶＨと略称する）及び軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列（本明細書においてＶＬと略称する）を含むことができる。一実施形態において、抗体分子は重鎖及び軽鎖を含み、又はそれらで構成される。別の実施形態において、抗体分子は２つの重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列及び２つの軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列を含み、それにより２つの抗原結合部位、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、単一可変ドメイン抗体、ダイアボディ（Ｄａｂ）（二価及び二重特異性）及びキメラ（例えばヒト化）抗体が形成され、それらは完全な抗体又は組換えＤＮＡ技術を使用して合成された抗体の修飾により生成することができる。これらの機能性抗体断片は、それらに対応する抗原又は受容体と特異的に結合する能力が保たれている。抗体及び抗体断片は、任意の種類の抗体に由来してもよく、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥを含むがこれらに限定されず、かつ任意の抗体サブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）に由来してもよい。抗体分子の製造物は、モノクローナル又はポリクローナルであってもよい。抗体分子は、ヒト、ヒト化、ＣＤＲ移植又はインビトロで生成された抗体であってもよい。前記抗体は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域を有していてもよい。前記抗体は、例えばκ又はλから選択される軽鎖を有していてもよい。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書において、「抗体」という用語と交換して使用することができる。
本明細書で使用される際に、「抗体断片」又は「抗原結合断片」という用語は抗体の一部であり、例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等である。抗体断片は、完全抗体により認識される同一の抗原と結合する。「抗体断片」という用語にはアプタマー、スピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）及びダイアボディが含まれる。また、「抗体断片」という用語には、特定の抗原と結合して複合体を形成することにより、抗体と同様に作用する合成または遺伝子工学的に改造されたタンパク質も含まれる。
抗体分子の抗原結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片であって、ＶＬ、ＶＨ、ＣＫ及びＣＨドメインで構成された一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）2断片であって、ヒンジ領域にジスルフィド結合によって接続された２つのＦａｂ断片の二価断片を含むもの、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片であって、ＶＨ及びＣＨドメインで構成されるもの、（ｉｖ）Ｆｖ断片であって、抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインで構成されるもの、（ｖ）ダイアボディ（ｄＡｂ）断片であって、ＶＨドメインで構成されるもの、（ｖｉ）ラクダ又はラクダ化（ｃａｍｅｌｉｄ ｏｒ ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）可変ドメイン、（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、（ｖｉｉｉ）単一ドメイン抗体が含まれる。これらの抗体断片は当業者に知られている一般的な技術を含む任意の適切な方法で得ることができ、前記断片は完全な抗体と同じ方式で用途をスクリーニングすることができる。また、「抗体断片」という用語には、特定の抗原と結合して複合体を形成することにより、抗体と同様に作用する任意の合成または遺伝子工学的に改造されたタンパク質も含まれる。
「一本鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」は、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質を意味する。いくつかの場合、前記領域は１０個～約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドで連結される。前記リンカーはグリシンに富むことにより柔軟性が得られ、セリン又はトレオニンに富むことにより溶解性が得られ、そしてＶＨのＮ－末端とＶＬのＣ－末端を接続することができ、逆にもよい。定常領域を除去するとともにリンカーを導入したが、このようなタンパク質は元の免疫グロブリンの特異性が保持されている。ＳｃＦｖ分子は当分野において既知である。
軽鎖と重鎖とは、「定常」領域と「可変」領域とに分けられる。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）部分の両方の可変ドメインは抗原識別及び特異性を決定する。逆に、軽鎖（ＣＫ）及び重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的性質を提供する。Ｎ－末端部分は可変領域であり、Ｃ－末端部分は定常領域である。ＣＨ３及びＣＫドメインは実際にそれぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシル末端を含む。
可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に識別するとともに特異的に結合することを許容する。抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメイン又は相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットの組み合わせにより、三次元抗原結合部位を定義する可変領域が形成される。この四次抗体構造は、各Ｙアームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、各ＶＨ及びＶＫ鎖上の三つのＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）により定義される。
本明細書で使用される際に、「相補性決定領域」及び「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変領域内において抗原特異性及び結合親和性を付与するアミノ酸配列を意味する。いくつかの実施形態において、各重鎖可変領域に三つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）が存在し、各軽鎖可変領域に三つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）が存在する。
特定のＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔら（１９９１）、『免疫学的に重要なタンパク質の配列』（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤに記述された手段（「Ｋａｂａｔ」番号付け手段）を含む、任意の周知の手段を使用して特定することができる。
各ＶＨ及びＶＬは、一般的に、三つのＣＤＲ及び四つのＦＲを含み、それらはアミノ基端からカルボキシル基端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で配列される。
「被検者」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」は、診断、予後又は治療を必要とする任意の被検者、特に哺乳動物被検者を意味する。哺乳動物被検者は、ヒト、馴養動物、農場動物、及び動物園、スポーツ又はペット動物を含み、例えば犬、猫、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、馬、牛、乳牛等である。
本明細書で使用される際に、例えば「治療を必要とする患者」又は「治療を必要とする被検者」という語句は、例えば、検出、診断手順及び／又は治療のための本開示の抗体又は組成物の投与から利益を得た被検者、例えば哺乳動物被検者を含む。
本明細書で使用される際に、「エピトープ」という用語は、抗原（例えば、ヒトＡＲＥＧ（ｈＡＲＥＧ））における、抗体分子と特異的に相互作用する構成部分を意味する。このような構成部分、本明細書においてエピトープ決定基とも呼ばれ、一般的に、アミノ酸側鎖又は糖側鎖のような素子、又は前記素子の一部を含む。エピトープ決定基は、本分野で知られているか又は本明細書に開示されている方法によって、例えば結晶学又は突然変異誘発によって定義することができる。エピトープ決定基と特異的に相互作用する抗体分子上の少なくとも一つ又はいくつかの構成部分は一般的にＣＤＲ上に位置する。一般的に、エピトープは特定の三次元構造特徴を有する。一般的に、エピトープは特定の電荷特徴を有する。いくつかのエピトープは線状エピトープであり、他のエピトープはコンフォメーションエピトープである。
本明細書で使用される際に、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成物の抗体調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性と親和性を示す。モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術によって、又はハイブリドーマ技術を使用しない方法（例えばライブラリー選択及びスクリーニング又は組換え方法）によって製造することができる。
前記抗体分子は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体であってもよい。他の実施形態において、前記抗体は組換えて生成することができ、例えば酵母ディスプレイ、ファージディスプレイ又はコンビナトリアル法によって生成される。
一実施形態において、前記抗体は、完全ヒト抗体（例えば酵母ディスプレイにより生成された抗体、ファージディスプレイにより生成された抗体又は遺伝子工学によって改造されてヒト免疫グロブリン配列から抗体を生成するマウスで製造された抗体）、又は非ヒトんｇ抗体例えばネズミ類（マウス又はラット）、ヤギ、霊長動物（例えばサル）又はラクダ抗体である。げっ歯動物抗体を生成する方法は当分野で知られている。
ヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫グロブリン遺伝子を持つトランスジェニックマウスを使用して生成することができる。関心のある抗原で免疫されたこれらのランスジェニックマウスからの脾臓細胞を使用して、ヒトタンパク質からのエピトープに対して特異的親和性を有するヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマを生成する。
抗体は、可変領域又はその一部、例えばＣＤＲが非ヒト生体、例えばラット又はマウスにおいて生成される抗体であってもよい。キメラ、ＣＤＲグラフト及びヒト化抗体は本発明の範囲内にある。非ヒト生体、例えばラット又はマウスにおいて生成され、その後に、例えば可変フレームワーク又は定常領域で修飾されることによりヒトにおける抗原性を低下させる抗体は、本発明の範囲内にある。
ヒト化又はＣＤＲグラフト抗体は、少なくとも一つ又は二つ、一般的には全ての三つの受容体ＣＤＲ（免疫グロブリン重鎖又は軽鎖）がドナーＣＤＲに置き換えられる。前記抗体は、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で置き換えられてもよく、又はいくつかのＣＤＲのみが非ヒトＣＤＲで置き換えられてもよい。ヒト化抗体とＡＲＥＧとの結合に必要な数のＣＤＲを置き換えればよい。いくつかの実施形態において、ドナーは、ネズミ類抗体、例えばラット又はマウス抗体であり、受容体はヒトフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークである。一般的に、前記ＣＤＲを提供する免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、前記フレームワークを提供する免疫グロブリンは「受容体」と呼ばれる。一実施形態において、前記ドナー免疫グロブリンは非ヒト（例えばネズミ類）である。前記受容体フレームワークは天然に存在する（例えばヒト）フレームワーク又はコンセンサスフレームワークであり、又はそれと約８５％又はそれ以上例えば９０％、９５％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列である。
抗体は、当分野で知られている方法によりヒト化することができる。ヒト化又はＣＤＲグラフト抗体はＣＤＲグラフト又はＣＤＲ置換により生成することができ、ここで、免疫グロブリン鎖の１つ、２つ又は全てのＣＤＲを置換することができる。
本発明の範囲内には、特定のアミノ酸が置換、欠失又は添加されたヒト化抗体がさらに含まれる。ドナーからアミノ酸を選択する標準はＵＳ ５，５８５，０８９、例えばＵＳ５，５８５，０８９の第１２－１６欄に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。抗体をヒト化するための他の技術は１９９２年１２月２３日に出版されたＰａｄｌａｎら、ＥＰ ５１９５９６ Ａ１に記載されている。
他の実施形態において、前記抗体分子は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ及びＩｇＥの重鎖定常領域、特に、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４（例えばヒト）の重鎖定常領域から選択される重鎖定常領域を有する。
抗体定常領域を変更する方法は、当分野において知られている。変更された機能、例えばエフェクターリガンド例えば細胞上のＦｃＲや補体のＣ１成分に対して変更された親和性を有する抗体は、抗体の定常部分中の少なくとも一つのアミノ酸残基を異なる残基で置き換えることにより生成することができる（例えば、ＥＰ ３８８，１５１ Ａ１、米国特許番号５，６２４，８２１及び米国特許番号５，６４８，２６０を参照、全てのこれらの文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる）。抗体構造を安定させるアミノ酸の突然変異、例えばヒトＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ（Ｅｕ番号）も想定されている。
本発明の分子は、それらの機能に有意な影響を及ぼさない追加の保存的又は非必須のアミノ酸置換を有する可能性があることが理解されるであろう。
「保存的」アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられた置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは本分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β－分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。保存的アミノ酸置換は以下のとおりである。
特定の実施形態及び実施例の説明は、限定ではなく例示として挙げられるものである。当業者であれば、実質的に類似した結果を生成するように変更又は修正された様々な異なる非重要なパラメータを容易に認識することができる。
実施例
実施例
実施例１．ファージライブラリーからのＡＲＥＧに対するヒトｍＡｂの生成
１．ライブラリーの選択及びスクリーニングに用いられる可溶性ＡＲＥＧタンパク質又はペプチドの製造
３つの形態のＡＲＥＧタンパク質（以下に列挙される）をコードするＤＮＡ配列を原核発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ）にクローニングし、Ｎ－末端タグ（Ｈｉｓ6、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼ切断部位及びＡｖｉタグ）付きの融合タンパク質として発現させる。前記タンパク質は、ＩＰＴＧ誘導により大腸菌（ＴｒａｎｓＢ）で発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡビーズを使用して細胞ライセートの上清から精製し、ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼで切断し、その後にＢｉｒＡ酵素でビオチン化する。
前記３つのＡＲＥＧタンパク質は以下のとおりである。
・ｈＡＲＥＧ：ヒトｐｒｏ－ＡＲＥＧの１０１～１８４残基を含みかつＮ－末端ＡＶＩタグ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）付きのヒトＡＲＥＧ。ｈＡＲＥＧの１０１～１８４残基のアミノ酸配列は、ＳＶＲＶＥＱＶＶＫＰＰＱＮＫＴＥＳＥＮＴＳＤＫＰＫＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＮＲＲＮＲＫＫＫＮＰＣＮＡＥＦＱＮＦＣＩＨＧＥＣＫＹＩＥＨＬＥＡＶＴＣＫＣＱＱＥＹＦＧＥＲＣＧＥＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２９）である。
・ｍＡＲＥＧ：マウスｐｒｏ－ＡＲＥＧの９４～１７７残基を含みかつＮ－末端ＡＶＩタグ付きのマウスＡＲＥＧ。アミノ酸配列は、ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＧＧＧＧＳＧ ＧＳＶＲＶＥＱＶＩＫＰＫＫＮＫＴＥＧＥＫＳＴＥＫＰＫＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＧＲＲＮＫＫＫＫＮＰＣＴＡＫＦＱＮＦＣＩＨＧＥＣＲＹＩＥＮＬＥＶＶＴＣＮＣＨＱＤＹＦＧＥＲＣＧＥＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３０）である。
・ｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ：マウスＡＲＥＧのＥＧＦ様ドメインであり、それはマウスＰｒｏ－ＡＲＥＧの１３５～１７７残基を含みかつＮ－末端ＡＶＩタグが付いている。ｍＡｒｅｇの１３５～１７７残基のアミノ酸配列は、ＫＫＮＰＣＴＡＫＦＱＮＦＣＩＨＧＥＣＲＹＩＥＮＬＥＶＶＴ ＣＮＣＨＱＤＹＦＧＥＲＣＧＥＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３１）である。
また、ビオチン化ペプチドＣ１８（北京中科亜光生物科技有限公司（Ｓｃｉｌｉｇｈｔ－ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ））が合成された。Ｃ１８は、ヒトＡＲＥＧのＣ－末端の１４個のアミノ酸（１７１～１８４残基）を含みかつＮ－末端にリンカー（残基ＧＳＳＧ）を含む。Ｃ１８の配列は、ＧＳＳＧＫＣＱＱＥＹＦＧＥＲＣＧＥＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３２）である。
１．ライブラリーの選択及びスクリーニングに用いられる可溶性ＡＲＥＧタンパク質又はペプチドの製造
３つの形態のＡＲＥＧタンパク質（以下に列挙される）をコードするＤＮＡ配列を原核発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ）にクローニングし、Ｎ－末端タグ（Ｈｉｓ6、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼ切断部位及びＡｖｉタグ）付きの融合タンパク質として発現させる。前記タンパク質は、ＩＰＴＧ誘導により大腸菌（ＴｒａｎｓＢ）で発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡビーズを使用して細胞ライセートの上清から精製し、ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼで切断し、その後にＢｉｒＡ酵素でビオチン化する。
前記３つのＡＲＥＧタンパク質は以下のとおりである。
・ｈＡＲＥＧ：ヒトｐｒｏ－ＡＲＥＧの１０１～１８４残基を含みかつＮ－末端ＡＶＩタグ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）付きのヒトＡＲＥＧ。ｈＡＲＥＧの１０１～１８４残基のアミノ酸配列は、ＳＶＲＶＥＱＶＶＫＰＰＱＮＫＴＥＳＥＮＴＳＤＫＰＫＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＮＲＲＮＲＫＫＫＮＰＣＮＡＥＦＱＮＦＣＩＨＧＥＣＫＹＩＥＨＬＥＡＶＴＣＫＣＱＱＥＹＦＧＥＲＣＧＥＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２９）である。
・ｍＡＲＥＧ：マウスｐｒｏ－ＡＲＥＧの９４～１７７残基を含みかつＮ－末端ＡＶＩタグ付きのマウスＡＲＥＧ。アミノ酸配列は、ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＧＧＧＧＳＧ ＧＳＶＲＶＥＱＶＩＫＰＫＫＮＫＴＥＧＥＫＳＴＥＫＰＫＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＧＲＲＮＫＫＫＫＮＰＣＴＡＫＦＱＮＦＣＩＨＧＥＣＲＹＩＥＮＬＥＶＶＴＣＮＣＨＱＤＹＦＧＥＲＣＧＥＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３０）である。
・ｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ：マウスＡＲＥＧのＥＧＦ様ドメインであり、それはマウスＰｒｏ－ＡＲＥＧの１３５～１７７残基を含みかつＮ－末端ＡＶＩタグが付いている。ｍＡｒｅｇの１３５～１７７残基のアミノ酸配列は、ＫＫＮＰＣＴＡＫＦＱＮＦＣＩＨＧＥＣＲＹＩＥＮＬＥＶＶＴ ＣＮＣＨＱＤＹＦＧＥＲＣＧＥＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３１）である。
また、ビオチン化ペプチドＣ１８（北京中科亜光生物科技有限公司（Ｓｃｉｌｉｇｈｔ－ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ））が合成された。Ｃ１８は、ヒトＡＲＥＧのＣ－末端の１４個のアミノ酸（１７１～１８４残基）を含みかつＮ－末端にリンカー（残基ＧＳＳＧ）を含む。Ｃ１８の配列は、ＧＳＳＧＫＣＱＱＥＹＦＧＥＲＣＧＥＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３２）である。
２．ファージディスプレイ抗体ライブラリーからの抗体の選択及び更なる特徴付け
ファージディスプレイ抗体ライブラリー
９３人の健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からヒト非免疫ｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）抗体ライブラリーを構築した。前記ライブラリーは合計で１．１×１０10個のメンバーの大きさを有する（Ｌｉら、２０１７）。
ファージディスプレイ抗体ライブラリー
９３人の健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からヒト非免疫ｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）抗体ライブラリーを構築した。前記ライブラリーは合計で１．１×１０10個のメンバーの大きさを有する（Ｌｉら、２０１７）。
ファージ抗体ライブラリーの選択及びスクリーニング
前記ライブラリーからｓｃＦｖを表面に発現するファージ粒子（ファージ－ＳｃＦｖ）を製造し、それをビオチン化されたＡＲＥＧタンパク質及びペプチドを含む標的抗原に対してｓｃＦｖｓを選択するために用いる。前記抗原をストレプトアビジンで結合された磁性Ｍ－２８０ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に捕捉し、その後に前記ライブラリーから調製された５×１０12個のファージ粒子とインキュベートする。各可溶性ＡＲＥＧタンパク質又はペプチド（抗原、Ａｂ）に対して、２ラウンドの選択を行う。ｈＡＲＥＧ及びｍＡＲＥＧの両者を識別する交差反応性ヒトｍＡｂを取得するために、ｈＡＲＥＧとｍＡＲＥＧをそれぞれ１ラウンド目と２ラウンド目の選択に用いる。２ラウンド目の選択後、ＥＬＩＳＡを使用して、ｈＡＲＥＧ及びｍＡＲＥＧの両者に対する交差結合活性について約４００個のファージ－Ａｂクローンをスクリーニングし、交差結合活性を有するか又はｈＡＲＥＧに対して高い結合親和性を有するクローンを選択して配列決定分析に用いて、重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）可変領域を含む異なる抗体配列を有するクローンを同定する。その後にいくつかのファージ－ＡｂをヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）又はマウスＩｇＧ２ａフォーマットに変換し、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又はＢｉａｃｏｒｅを使用してｈＡＲＥＧ及びｍＡＲＥＧの両者との結合を分析する。
前記ライブラリーからｓｃＦｖを表面に発現するファージ粒子（ファージ－ＳｃＦｖ）を製造し、それをビオチン化されたＡＲＥＧタンパク質及びペプチドを含む標的抗原に対してｓｃＦｖｓを選択するために用いる。前記抗原をストレプトアビジンで結合された磁性Ｍ－２８０ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に捕捉し、その後に前記ライブラリーから調製された５×１０12個のファージ粒子とインキュベートする。各可溶性ＡＲＥＧタンパク質又はペプチド（抗原、Ａｂ）に対して、２ラウンドの選択を行う。ｈＡＲＥＧ及びｍＡＲＥＧの両者を識別する交差反応性ヒトｍＡｂを取得するために、ｈＡＲＥＧとｍＡＲＥＧをそれぞれ１ラウンド目と２ラウンド目の選択に用いる。２ラウンド目の選択後、ＥＬＩＳＡを使用して、ｈＡＲＥＧ及びｍＡＲＥＧの両者に対する交差結合活性について約４００個のファージ－Ａｂクローンをスクリーニングし、交差結合活性を有するか又はｈＡＲＥＧに対して高い結合親和性を有するクローンを選択して配列決定分析に用いて、重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）可変領域を含む異なる抗体配列を有するクローンを同定する。その後にいくつかのファージ－ＡｂをヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）又はマウスＩｇＧ２ａフォーマットに変換し、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又はＢｉａｃｏｒｅを使用してｈＡＲＥＧ及びｍＡＲＥＧの両者との結合を分析する。
３．全長抗体の製造
ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬコード配列をそれぞれ抗体重鎖（ＨＣ）発現ベクター（プラスミド）及び軽鎖（ＬＣ）発現ベクター（プラスミド）にサブクローニングする。全長抗体を製造するために、２９３Ｆ細胞を２種類の発現プラスミド（ＨＣ＋ＬＣプラスミド）で１：１の比率で一過性に同時トランスフェクトする。トランスフェクションの６日後、細胞培養上清を採取し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより抗体を精製する。
ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬコード配列をそれぞれ抗体重鎖（ＨＣ）発現ベクター（プラスミド）及び軽鎖（ＬＣ）発現ベクター（プラスミド）にサブクローニングする。全長抗体を製造するために、２９３Ｆ細胞を２種類の発現プラスミド（ＨＣ＋ＬＣプラスミド）で１：１の比率で一過性に同時トランスフェクトする。トランスフェクションの６日後、細胞培養上清を採取し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより抗体を精製する。
４．ＥＬＩＳＡ測定
リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ、４μｇ／ｍＬ）を１ウェル当たり１００μＬの量でＵ底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、ＭａｘｉＳｏｒｐTM）に４℃で一晩又は３７℃で１時間コーティングする。次いで、約０．５μｇ／ｍＬのＡＲＥＧタンパク質又はペプチドを１ウェル当たり１００μＬの量で、３０℃で１時間インキュベートすることによりプレートに捕捉する。ファージ－ｓｃＦｖに基づくＥＬＩＳＡについては、１ウェル当たり１００μＬの量で各ウェルに２％の無脂肪乳を含有するＰＢＳに段階希釈されたファージ－ｓｃＦｖを添加する。ＨＲＰ結合マウス抗Ｍ１３抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を添加して３０℃で３０ｍｉｎインキュベートすることにより、特異的に結合したファージ－ｓｃＦｖを検出する。各インキュベーションステップの間に、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴ溶液（０．０５％のツイーン２０を含有するＰＢＳ）で１ウェル当たり３００μＬの量で６回洗浄する。ＨＲＰ結合抗体のインキュベーション後、ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ）と３０℃で５－１０ｍｉｎインキュベートすることによりＥＬＩＳＡシグナルを生成し、次いで１ウェル当たり５０μＬの２Ｍ Ｈ2ＳＯ4を使用して反応を停止させる。マイクロプレートリーダ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で４５０ｎｍでの吸光度を読み取り、校正波長を６３０ｎｍに設定する。ＩｇＧに基づくＥＬＩＳＡについては、方法は基本的に上記のファージ－ｓｃＦｖの説明と同じであり、相違点は結合された抗体がＨＲＰ結合マウス抗Ｆｃ第二抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により検出されることである。
リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ、４μｇ／ｍＬ）を１ウェル当たり１００μＬの量でＵ底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、ＭａｘｉＳｏｒｐTM）に４℃で一晩又は３７℃で１時間コーティングする。次いで、約０．５μｇ／ｍＬのＡＲＥＧタンパク質又はペプチドを１ウェル当たり１００μＬの量で、３０℃で１時間インキュベートすることによりプレートに捕捉する。ファージ－ｓｃＦｖに基づくＥＬＩＳＡについては、１ウェル当たり１００μＬの量で各ウェルに２％の無脂肪乳を含有するＰＢＳに段階希釈されたファージ－ｓｃＦｖを添加する。ＨＲＰ結合マウス抗Ｍ１３抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を添加して３０℃で３０ｍｉｎインキュベートすることにより、特異的に結合したファージ－ｓｃＦｖを検出する。各インキュベーションステップの間に、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴ溶液（０．０５％のツイーン２０を含有するＰＢＳ）で１ウェル当たり３００μＬの量で６回洗浄する。ＨＲＰ結合抗体のインキュベーション後、ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ）と３０℃で５－１０ｍｉｎインキュベートすることによりＥＬＩＳＡシグナルを生成し、次いで１ウェル当たり５０μＬの２Ｍ Ｈ2ＳＯ4を使用して反応を停止させる。マイクロプレートリーダ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で４５０ｎｍでの吸光度を読み取り、校正波長を６３０ｎｍに設定する。ＩｇＧに基づくＥＬＩＳＡについては、方法は基本的に上記のファージ－ｓｃＦｖの説明と同じであり、相違点は結合された抗体がＨＲＰ結合マウス抗Ｆｃ第二抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により検出されることである。
５．親和性及び可溶性を向上させるためのＥ１Ｌ２抗体のエンジニアリング改造
Ｅ１Ｌ２抗体の親和性を向上させるために、Ｅ１Ｌ２のＶＨ－ＣＤＲ３及びＶＬ－ＣＤＲ３に対してそれぞれエンジニアリング改造を行う。ＶＨ－ＣＤＲ３については、Ｅ１Ｌ２のＨＣＤＲ３に対してランダムな突然変異を有するファージディスプレイサブライブラリーを構築した。抗体サブライブラリーの選択及びスクリーニングは、ＡＲＥＧに対する抗体ライブラリーのスクリーニングについて上述したのと同様に行った。高親和性ヒットを得るために、Ｅ１Ｌ２全長ｍＡｂによる競合的溶出を使用した。次いで、単一のクローンを選び出し救出し、細菌培養上清にファージ－ｓｃＦｖを生成し、ｈＡＲＥＧとの結合をスクリーニングするために用いられる。Ｅ１Ｌ２よりも結合親和性の高いヒットのみを保留する。ＶＬ－ＣＤＲ３については、構造モデリングに基づく特定のアミノ酸変異を使用してエンジニアリング改造を行う。可溶性を向上させるために、前記エンジニアリング改造されたＥ１Ｌ２のＶＬ ＣＤＲをヒトＩＧＬＶ１－４４＊０１生殖系列にグラフトした。
Ｅ１Ｌ２抗体の親和性を向上させるために、Ｅ１Ｌ２のＶＨ－ＣＤＲ３及びＶＬ－ＣＤＲ３に対してそれぞれエンジニアリング改造を行う。ＶＨ－ＣＤＲ３については、Ｅ１Ｌ２のＨＣＤＲ３に対してランダムな突然変異を有するファージディスプレイサブライブラリーを構築した。抗体サブライブラリーの選択及びスクリーニングは、ＡＲＥＧに対する抗体ライブラリーのスクリーニングについて上述したのと同様に行った。高親和性ヒットを得るために、Ｅ１Ｌ２全長ｍＡｂによる競合的溶出を使用した。次いで、単一のクローンを選び出し救出し、細菌培養上清にファージ－ｓｃＦｖを生成し、ｈＡＲＥＧとの結合をスクリーニングするために用いられる。Ｅ１Ｌ２よりも結合親和性の高いヒットのみを保留する。ＶＬ－ＣＤＲ３については、構造モデリングに基づく特定のアミノ酸変異を使用してエンジニアリング改造を行う。可溶性を向上させるために、前記エンジニアリング改造されたＥ１Ｌ２のＶＬ ＣＤＲをヒトＩＧＬＶ１－４４＊０１生殖系列にグラフトした。
６．ヒトｍＡｂ親和性のＳＰＲ測定
ヒトｍＡｂの親和性を評価するために、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用してＳＰＲ測定を行った。ｍＡｂを抗ヒトＦｃ ＣＭ５バイオセンサチップの表面に捕捉し、ｍＦｃタグと融合したｈＡＲＥＧ（１４２～１８４のアミノ酸）又はｍＡＲＥＧ（１３５～１７７のアミノ酸）のＥＧＦドメイン（ｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃ又はｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃ）と前記ｍＡｂとの結合を調べた。段階希釈された融合タンパク質を抗体が結合された表面に注入し、続いて解離段階である。１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡ評価ソフトウェア、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して結合速度（Ｋａ）及び解離速度（Ｋｄ）を計算する。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｄ／ｋａの比率として算出される。
ヒトｍＡｂの親和性を評価するために、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用してＳＰＲ測定を行った。ｍＡｂを抗ヒトＦｃ ＣＭ５バイオセンサチップの表面に捕捉し、ｍＦｃタグと融合したｈＡＲＥＧ（１４２～１８４のアミノ酸）又はｍＡＲＥＧ（１３５～１７７のアミノ酸）のＥＧＦドメイン（ｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃ又はｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃ）と前記ｍＡｂとの結合を調べた。段階希釈された融合タンパク質を抗体が結合された表面に注入し、続いて解離段階である。１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡ評価ソフトウェア、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して結合速度（Ｋａ）及び解離速度（Ｋｄ）を計算する。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｄ／ｋａの比率として算出される。
７．結果
ファージライブラリーからＡＲＥＧに対するヒトｍＡｂ Ｅ１Ｌ２及びＰ７を生成する
上記ファージ抗体ライブラリーの選択及びＥＬＳＩＡスクリーニングを使用することにより、本発明者らはＣ１、Ｅ１Ｌ２、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７及びＰ１０抗ＡＲＥＧヒトｍＡｂを同定した。具体的には、それぞれ１ラウンド目及び２ラウンド目のライブラリー選択において大腸菌で発現したビオチン化ｈＡＲＥＧ及びｍＡＲＥＧタンパク質を使用することにより、本発明者らはＣ１抗体を同定した。１ラウンド目及び２ラウンド目にそれぞれビオチン化されたｈＡＲＥＧとビオチン化されたｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ（大腸菌で発現された）を使用することにより、本発明者らはＥ１Ｌ２抗体を同定した。ｈＡＲＥＧ由来のＣ１８ペプチドを２ラウンドのライブラリー選択の標的として使用することにより、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７及びＰ１０を同定した。このライブラリー選択からＥ１Ｌ２もスクリーニングした。これらの抗体のうち、結合特異性と、ｈＡＲＥＧ及びｍＡＲＥＧの両者に対する親和性に基づいて、Ｅ１Ｌ２及びＰ７抗体を選択してさらなる特徴付けに用いる。
ファージライブラリーからＡＲＥＧに対するヒトｍＡｂ Ｅ１Ｌ２及びＰ７を生成する
上記ファージ抗体ライブラリーの選択及びＥＬＳＩＡスクリーニングを使用することにより、本発明者らはＣ１、Ｅ１Ｌ２、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７及びＰ１０抗ＡＲＥＧヒトｍＡｂを同定した。具体的には、それぞれ１ラウンド目及び２ラウンド目のライブラリー選択において大腸菌で発現したビオチン化ｈＡＲＥＧ及びｍＡＲＥＧタンパク質を使用することにより、本発明者らはＣ１抗体を同定した。１ラウンド目及び２ラウンド目にそれぞれビオチン化されたｈＡＲＥＧとビオチン化されたｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ（大腸菌で発現された）を使用することにより、本発明者らはＥ１Ｌ２抗体を同定した。ｈＡＲＥＧ由来のＣ１８ペプチドを２ラウンドのライブラリー選択の標的として使用することにより、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７及びＰ１０を同定した。このライブラリー選択からＥ１Ｌ２もスクリーニングした。これらの抗体のうち、結合特異性と、ｈＡＲＥＧ及びｍＡＲＥＧの両者に対する親和性に基づいて、Ｅ１Ｌ２及びＰ７抗体を選択してさらなる特徴付けに用いる。
向上した親和性及び可溶性を有するＥ１Ｌ２由来の抗体Ｅ１Ｈ３Ｌ４の生成
ＶＨ－ＣＤＲ３及びＶＬ－ＣＤＲ３のエンジニアリング改造によりＥ１Ｌ２の結合親和性をさらに向上させた。エンジニアリング改造されたＥ１Ｌ２の可溶性はそのＶＬ－ＣＤＲをヒトＩＧＬＶ１－４４＊０１生殖系列にグラフトすることにより向上し、それにより抗体Ｅ１Ｈ３Ｌ４を生成した。Ｅ１Ｌ２と比較して、Ｅ１Ｈ３Ｌ４はＶＨ－ＣＤＲ３において３つのアミノ酸の変化があり、ＶＬ－ＣＤＲ３において４つのアミノ酸の変化がある。具体的には、Ｅ１Ｈ３Ｌ４のＶＨ－ＣＤＲ３における正確な１００－１００c位置（Ｋａｂａｔシステム）でのアミノ酸はＧＹＤＹであり、Ｅ１Ｌ２抗体においてそれらはＳＹＮＮである。Ｅ１Ｈ３Ｌ４のＶＬ－ＣＤＲ３における９３－９５a位置（Ｋａｂａｔシステム）でのアミノ酸はＫＮＮＫであり、Ｅ１Ｌ２抗体においてそれらはＳＧＬＮである。Ｅ１Ｌ２、Ｅ１Ｈ３Ｌ４及びＰ７のＣＤＲを表１に示す。Ｅ１Ｌ２、Ｅ１Ｈ３Ｌ４及びＰ７のＶＨ及びＶＬのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を表２に示す。
ＶＨ－ＣＤＲ３及びＶＬ－ＣＤＲ３のエンジニアリング改造によりＥ１Ｌ２の結合親和性をさらに向上させた。エンジニアリング改造されたＥ１Ｌ２の可溶性はそのＶＬ－ＣＤＲをヒトＩＧＬＶ１－４４＊０１生殖系列にグラフトすることにより向上し、それにより抗体Ｅ１Ｈ３Ｌ４を生成した。Ｅ１Ｌ２と比較して、Ｅ１Ｈ３Ｌ４はＶＨ－ＣＤＲ３において３つのアミノ酸の変化があり、ＶＬ－ＣＤＲ３において４つのアミノ酸の変化がある。具体的には、Ｅ１Ｈ３Ｌ４のＶＨ－ＣＤＲ３における正確な１００－１００c位置（Ｋａｂａｔシステム）でのアミノ酸はＧＹＤＹであり、Ｅ１Ｌ２抗体においてそれらはＳＹＮＮである。Ｅ１Ｈ３Ｌ４のＶＬ－ＣＤＲ３における９３－９５a位置（Ｋａｂａｔシステム）でのアミノ酸はＫＮＮＫであり、Ｅ１Ｌ２抗体においてそれらはＳＧＬＮである。Ｅ１Ｌ２、Ｅ１Ｈ３Ｌ４及びＰ７のＣＤＲを表１に示す。Ｅ１Ｌ２、Ｅ１Ｈ３Ｌ４及びＰ７のＶＨ及びＶＬのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を表２に示す。
ＣＤＲは、Ｋａｂａｔシステムを使用して定義される。
８．Ｅ１Ｈ３Ｌ４及びＰ７ｍＡｂのさらなる特徴付け
Ｅ１Ｈ３Ｌ４及びＰ７とｍＡＲＥＧとの結合を比較すると、Ｅ１Ｈ３Ｌ４はＰ７より僅かに強いｍＡＲＥＧとの結合を示す。予想されるように、前記２種類の抗体はいずれもＥＧＦドメイン内のＣ－末端ペプチド（Ｃ１８、１７１～１８４のアミノ酸）に結合され、前記Ｃ１８ペプチドがライブラリーの選択に使用される標的であるためである（図１）。
Ｅ１Ｈ３Ｌ４及びＰ７とｍＡＲＥＧとの結合を比較すると、Ｅ１Ｈ３Ｌ４はＰ７より僅かに強いｍＡＲＥＧとの結合を示す。予想されるように、前記２種類の抗体はいずれもＥＧＦドメイン内のＣ－末端ペプチド（Ｃ１８、１７１～１８４のアミノ酸）に結合され、前記Ｃ１８ペプチドがライブラリーの選択に使用される標的であるためである（図１）。
実施例２．マウスハイブリドーマ法を用いたＡＲＥＧに対するｍＡｂの生成及び前記マウスｍＡｂのヒト化
１．マウスの免疫またはＳＰＲ分析のための抗原の製造
ヒトＩｇＧ１又はマウスＩｇＧ２ａのＦｃ断片と融合したヒトＡＲＥＧ（ｈＡＲＥＧ）のＥＧＦ様ドメインを２９３Ｆにおいて融合タンパク質として発現させ、それぞれｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｈＦｃ及びｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃと命名する。トランスフェクトの７２時間後、細胞培養上清を回収し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによるＦｃ－融合体ＡＲＥＧタンパク質を精製するために用いられる。
１．マウスの免疫またはＳＰＲ分析のための抗原の製造
ヒトＩｇＧ１又はマウスＩｇＧ２ａのＦｃ断片と融合したヒトＡＲＥＧ（ｈＡＲＥＧ）のＥＧＦ様ドメインを２９３Ｆにおいて融合タンパク質として発現させ、それぞれｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｈＦｃ及びｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃと命名する。トランスフェクトの７２時間後、細胞培養上清を回収し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによるＦｃ－融合体ＡＲＥＧタンパク質を精製するために用いられる。
２．抗ｈＡＲＥＧ ＥＧＦドメインモノクローナル抗体の生成
５０μｇのｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃを含有する１：１の抗原／アジュバントエマルジョン１００μｌで皮下投与することにより、６週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）に対して免疫を行った。初期免疫については、完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）を使用した。追加免疫については、不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）を使用した。追加免疫は２週間ごとに行われた。３回目の追加免疫後、毎回免疫後の１週間にＥＬＩＳＡによりマウス血清とビオチンｈＡＲＥＧとの結合を評価した。高力価の抗ｈＡＲＥＧ抗体を有するマウスを、アジュバントを含まない５０μｇのｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃで腹膜内追加免疫した。追加免疫の３日後に、脾臓細胞を分離し、標準的なハイブリドーマ融合方法に従ってそれをＳＰ２／０細胞と融合させた。
５０μｇのｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃを含有する１：１の抗原／アジュバントエマルジョン１００μｌで皮下投与することにより、６週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）に対して免疫を行った。初期免疫については、完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）を使用した。追加免疫については、不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）を使用した。追加免疫は２週間ごとに行われた。３回目の追加免疫後、毎回免疫後の１週間にＥＬＩＳＡによりマウス血清とビオチンｈＡＲＥＧとの結合を評価した。高力価の抗ｈＡＲＥＧ抗体を有するマウスを、アジュバントを含まない５０μｇのｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃで腹膜内追加免疫した。追加免疫の３日後に、脾臓細胞を分離し、標準的なハイブリドーマ融合方法に従ってそれをＳＰ２／０細胞と融合させた。
ハイブリドーマクローンの上清とビオチン化ｈＡＲＥＧとの結合活性をＥＬＩＳＡにより調べた。高い結合活性を有するクローンを選択してその後のサブクローンのために増幅し、ＥＬＩＳＡ及びＳＰＲにより前記サブクローンの上清を分析する。前記ＳＰＲ分析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行った。希釈された上清を抗ｍＦｃ ＣＭ５バイオセンサチップに捕捉し、次いで移動相における２００ｎＭ ｈＡＲＥＧ ＥＧＦドメイン－ｈＦｃを通過させる。高い親和性を有するサブクローンをＲＮＡ抽出用に増幅した。細胞をＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁させ、取扱説明書に従って全ＲＮＡを抽出した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔTMＲＴマスターミックス（ＴａＫａＲａ）を使用してサブクローニングされたｃＤＮＡを合成した。マウス抗体可変遺伝子に対する特異的ＰＣＲプライマーのセットを使用して各抗体のＶＨ及びＶＬ遺伝子を増幅した。配列決定のために、ＰＣＲ産物をＰＣＲ配列決定ベクターにクローニングした。
３．抗ｈＡＲＥＧ ＥＧＦ様モノクローナル抗体のヒト化
ＡＲＥＧ ｍＡｂをヒト化するために、ネズミ類ｍＡｂの配列を使用して相同なヒト生殖系列ＩｇＧ遺伝子を検索することにより、ネズミ類ｍＡｂと高い相同性を有するヒト生殖系列遺伝子（９Ｃ１２、２３Ｈ８及び１Ｈ９）を同定し、その後にそれらをヒト化のためのテンプレートとして選択した。ヒト化は相補性決定領域（ＣＤＲ）のグラフトにより、具体的には、ネズミ類ｍＡｂのＣＤＲを選択されたヒト生殖系列遺伝子テンプレートのヒト受容体フレームワークにグラフトすることにより行われた。このヒト化過程も各抗体のシミュレーションされた３Ｄ構造によって指導され、抗体全体とＣＤＲループの構造及びＡＲＥＧ結合親和性を維持するために、ヒトフレームワーク残基をネズミ類残基に戻すように変異させた。
ＡＲＥＧ ｍＡｂをヒト化するために、ネズミ類ｍＡｂの配列を使用して相同なヒト生殖系列ＩｇＧ遺伝子を検索することにより、ネズミ類ｍＡｂと高い相同性を有するヒト生殖系列遺伝子（９Ｃ１２、２３Ｈ８及び１Ｈ９）を同定し、その後にそれらをヒト化のためのテンプレートとして選択した。ヒト化は相補性決定領域（ＣＤＲ）のグラフトにより、具体的には、ネズミ類ｍＡｂのＣＤＲを選択されたヒト生殖系列遺伝子テンプレートのヒト受容体フレームワークにグラフトすることにより行われた。このヒト化過程も各抗体のシミュレーションされた３Ｄ構造によって指導され、抗体全体とＣＤＲループの構造及びＡＲＥＧ結合親和性を維持するために、ヒトフレームワーク残基をネズミ類残基に戻すように変異させた。
４．親和性を向上させるためのｈｕ９Ｃ１２ｖ１抗体サブライブラリーの構築及び選択
抗体の親和性を向上させるために、ＮＮＫ縮重コドンによりｈｕ９Ｃ１２ｖ１のＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ１のランダム突然変異を有する２つのファージディスプレイサブライブラリーを構築した。抗体サブライブラリーの選択及びスクリーニングは、ＡＲＥＧに対する抗体ライブラリーのスクリーニング及びＥ１Ｌ２抗体の親和性向上について上述したのと同様に行った。スクリーニング後に、ｈｕｃ９Ｃ１２ｖ１よりも結合親和性の高いヒットのみを保留した。
抗体の親和性を向上させるために、ＮＮＫ縮重コドンによりｈｕ９Ｃ１２ｖ１のＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ１のランダム突然変異を有する２つのファージディスプレイサブライブラリーを構築した。抗体サブライブラリーの選択及びスクリーニングは、ＡＲＥＧに対する抗体ライブラリーのスクリーニング及びＥ１Ｌ２抗体の親和性向上について上述したのと同様に行った。スクリーニング後に、ｈｕｃ９Ｃ１２ｖ１よりも結合親和性の高いヒットのみを保留した。
５．ｍＡｂの親和性のＳＰＲ測定
異なるマウスハイブリドーマｍＡｂ又はそれらのヒト化及びエンジニアリング改造されたバリアントの親和性を評価するために、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用してＳＰＲ測定を行った。ｍＡｂを抗ヒトＦｃ ＣＭ５バイオセンサチップの表面に捕捉し、段階希釈されたｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃ、ｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃ又はｈＡＲＥＧ－９８ａａ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈから購入され、カタログ番号が１００－５５Ｂである）を抗体が結合された表面に注入し、続いて解離段階である。１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡ評価ソフトウェア、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して結合速度（Ｋａ）及び解離速度（Ｋｄ）を計算する。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｄ／ｋａの比率として算出される。
異なるマウスハイブリドーマｍＡｂ又はそれらのヒト化及びエンジニアリング改造されたバリアントの親和性を評価するために、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用してＳＰＲ測定を行った。ｍＡｂを抗ヒトＦｃ ＣＭ５バイオセンサチップの表面に捕捉し、段階希釈されたｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃ、ｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃ又はｈＡＲＥＧ－９８ａａ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈから購入され、カタログ番号が１００－５５Ｂである）を抗体が結合された表面に注入し、続いて解離段階である。１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡ評価ソフトウェア、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して結合速度（Ｋａ）及び解離速度（Ｋｄ）を計算する。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｄ／ｋａの比率として算出される。
６．結果
抗ｈＡＲＥＧ ＥＧＦドメインモノクローナル抗体の生成
従来のハイブリドーマ融合技術に基づいて抗ｈＡＲＥＧ ｍＡｂを生成した。ＥＬＩＳＡ及びＳＰＲ測定において高い結合活性を有するＭａｂを選択してさらなる特徴づけに用いる。数千個のハイブリドーマクローンをスクリーニングすることにより、本発明者らはｈＡＲＥＧに対して高い結合親和性を有する一組のｍＡｂを同定した。ユニークな配列、結合親和性及び組換え抗体生成の高収率に基づいて、上位３つのｍＡｂ、すなわち９Ｃ１２、２３Ｈ８及び１Ｈ９を選択してさらに分析するために用いられる。これらの抗体を組換え発現によりｍＩｇＧ１又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプのマウス抗体又はキメラ抗体（マウス可変領域がヒトＩｇＧ１定常領域にグラフトされた）に製造した。
抗ｈＡＲＥＧ ＥＧＦドメインモノクローナル抗体の生成
従来のハイブリドーマ融合技術に基づいて抗ｈＡＲＥＧ ｍＡｂを生成した。ＥＬＩＳＡ及びＳＰＲ測定において高い結合活性を有するＭａｂを選択してさらなる特徴づけに用いる。数千個のハイブリドーマクローンをスクリーニングすることにより、本発明者らはｈＡＲＥＧに対して高い結合親和性を有する一組のｍＡｂを同定した。ユニークな配列、結合親和性及び組換え抗体生成の高収率に基づいて、上位３つのｍＡｂ、すなわち９Ｃ１２、２３Ｈ８及び１Ｈ９を選択してさらに分析するために用いられる。これらの抗体を組換え発現によりｍＩｇＧ１又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプのマウス抗体又はキメラ抗体（マウス可変領域がヒトＩｇＧ１定常領域にグラフトされた）に製造した。
９Ｃ１２のヒト化、又はｈＡＲＥＧ又はｍＡＲＥＧに対して結合親和性が向上するとともに物理化学的性質が改善されたヒト化抗体バリアントの作成
ＣＤＲグラフト及び構造モデリングを使用して、ヒト化９Ｃ１２の最初のバージョンであるｈｕ９Ｃ１２ｖ１を生成し、それはキメラ抗体ｃｈ９Ｃ１２（９Ｃ１２の可変領域及びヒトＩｇＧ１の定常領域を有する）に匹敵するｈＡＲＥＧに対する親和性を有する。ｈｕ９Ｃ１２ｖ１のｈＡＲＥＧに対する親和性を向上させるために、それぞれＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３領域内にランダムな突然変異を有する２つのファージディスプレイサブライブラリーを構築した。厳密なバイオパニング選択の後、親和性が向上した抗体の小さなパネルが得られた。この抗体パネルの配列に基づいて、３種類のｍＡｂ、すなわちｈｕ９Ｃ１２ｖ４、ｈｕ９Ｃ１２ｖ５及びｈｕ９Ｃ１２ｖ６を生成することにより、ｈＡＲＥＧ又はｍＡＲＥＧとの結合親和性が向上するとともにそれらの物理化学的性質が改善された。ｈｕ９Ｃ１２ｖ１と比較して、ｈｕ９Ｃ１２ｖ４はＶＨ－ＣＤＲ２において１つのアミノ酸差異を有し、ＶＫ－ＣＤＲ１において６つのアミノ酸差異を有し、ＶＫ－ＣＤＲ２において２つのアミノ酸差異を有する。ｈｕ９Ｃ１２ｖ５は、ＶＨ－ＣＤＲ３において５つのアミノ酸差異を有し、ＶＫ－ＣＤＲ１において５つのアミノ酸差異を有し、ＶＫ－ＣＤＲ２において１つのアミノ酸差異を有する。ｈｕ９Ｃ１２ｖ６は、ＶＨ－ＣＤＲ３において２つのアミノ酸差異を有し、ＶＫ－ＣＤＲ１において５つのアミノ酸差異を有し、ＶＫ－ＣＤＲ２において１つのアミノ酸差異を有する。３種類のｍＡｂのＣＤＲとネズミ類抗体との比較は表３に示されるとおりである。３種類のｍＡｂ及びネズミ類抗体のＶＨ及びＶＬのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を表４に示す。３種類のｍＡｂとｈＡＲＥＧ又はｍＡＲＥＧのＳＰＲにより特定された結合親和性を表５－６に示す。
ＣＤＲグラフト及び構造モデリングを使用して、ヒト化９Ｃ１２の最初のバージョンであるｈｕ９Ｃ１２ｖ１を生成し、それはキメラ抗体ｃｈ９Ｃ１２（９Ｃ１２の可変領域及びヒトＩｇＧ１の定常領域を有する）に匹敵するｈＡＲＥＧに対する親和性を有する。ｈｕ９Ｃ１２ｖ１のｈＡＲＥＧに対する親和性を向上させるために、それぞれＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３領域内にランダムな突然変異を有する２つのファージディスプレイサブライブラリーを構築した。厳密なバイオパニング選択の後、親和性が向上した抗体の小さなパネルが得られた。この抗体パネルの配列に基づいて、３種類のｍＡｂ、すなわちｈｕ９Ｃ１２ｖ４、ｈｕ９Ｃ１２ｖ５及びｈｕ９Ｃ１２ｖ６を生成することにより、ｈＡＲＥＧ又はｍＡＲＥＧとの結合親和性が向上するとともにそれらの物理化学的性質が改善された。ｈｕ９Ｃ１２ｖ１と比較して、ｈｕ９Ｃ１２ｖ４はＶＨ－ＣＤＲ２において１つのアミノ酸差異を有し、ＶＫ－ＣＤＲ１において６つのアミノ酸差異を有し、ＶＫ－ＣＤＲ２において２つのアミノ酸差異を有する。ｈｕ９Ｃ１２ｖ５は、ＶＨ－ＣＤＲ３において５つのアミノ酸差異を有し、ＶＫ－ＣＤＲ１において５つのアミノ酸差異を有し、ＶＫ－ＣＤＲ２において１つのアミノ酸差異を有する。ｈｕ９Ｃ１２ｖ６は、ＶＨ－ＣＤＲ３において２つのアミノ酸差異を有し、ＶＫ－ＣＤＲ１において５つのアミノ酸差異を有し、ＶＫ－ＣＤＲ２において１つのアミノ酸差異を有する。３種類のｍＡｂのＣＤＲとネズミ類抗体との比較は表３に示されるとおりである。３種類のｍＡｂ及びネズミ類抗体のＶＨ及びＶＬのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を表４に示す。３種類のｍＡｂとｈＡＲＥＧ又はｍＡＲＥＧのＳＰＲにより特定された結合親和性を表５－６に示す。
ＣＤＲは、Ｋａｂａｔシステムを使用して定義される。
２３Ｈ８のヒト化
本発明者らはＣＤＲグラフト及び構造モデリングを使用してヒト化２３Ｈ８ｍＡｂを生成した。ヒトＶＨ生殖系列遺伝子ＩＧＨＶ３－２１をＶＨ－ＣＤＲグラフトに用いた。ヒトＶＫ生殖系列遺伝子ＩＧＫＶ７－３、ＩＧＫＶ１－３９及びＩＧＫＶ４－１をＶＫ－ＣＤＲグラフトに用い、３つのバージョンのヒト化２３Ｈ８ＶＫ鎖を生成した。本発明者らは、ヒト化ＶＨと３種類のヒト化ＶＫとを組み合わせることにより、それぞれｍＡｂ ｈｕ２３Ｈ８ｖ１、ｈｕ２３Ｈ８ｖ２及びｈｕ２３Ｈ８ｖ３を生成した。この３種類のヒト化ｍＡｂはキメラ２３Ｈ８（ネズミ類可変領域及びヒトＩｇＧ１定常領域）に近いｈＡＲＥＧに対する親和性を有し、２３Ｈ８のＶＫ－ＣＤＲが３種類の異なるヒトＶＫ生殖系列バックボーンへのグラフトがいずれも成功することを示す。前記ヒト化ｍＡｂにいくつかの追加の突然変異を導入して潜在的な意図しない翻訳後修飾又は免疫原性を除去し、他の３種類のバリアントであるｈｕ２３Ｈ８ｖ４、－ｖ５及び－ｖ６を生成した。これらのｍＡｂのＣＤＲとネズミ類抗体との比較は表７に示されるとおりである。これらのｍＡｂのＶＨ及びＶＬ ＣＤＲのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は表８に示されるとおりである。これらのｍＡｂとｈＡＲＥＧのＳＰＲで特定された結合親和性を表９－１０に示す。
本発明者らはＣＤＲグラフト及び構造モデリングを使用してヒト化２３Ｈ８ｍＡｂを生成した。ヒトＶＨ生殖系列遺伝子ＩＧＨＶ３－２１をＶＨ－ＣＤＲグラフトに用いた。ヒトＶＫ生殖系列遺伝子ＩＧＫＶ７－３、ＩＧＫＶ１－３９及びＩＧＫＶ４－１をＶＫ－ＣＤＲグラフトに用い、３つのバージョンのヒト化２３Ｈ８ＶＫ鎖を生成した。本発明者らは、ヒト化ＶＨと３種類のヒト化ＶＫとを組み合わせることにより、それぞれｍＡｂ ｈｕ２３Ｈ８ｖ１、ｈｕ２３Ｈ８ｖ２及びｈｕ２３Ｈ８ｖ３を生成した。この３種類のヒト化ｍＡｂはキメラ２３Ｈ８（ネズミ類可変領域及びヒトＩｇＧ１定常領域）に近いｈＡＲＥＧに対する親和性を有し、２３Ｈ８のＶＫ－ＣＤＲが３種類の異なるヒトＶＫ生殖系列バックボーンへのグラフトがいずれも成功することを示す。前記ヒト化ｍＡｂにいくつかの追加の突然変異を導入して潜在的な意図しない翻訳後修飾又は免疫原性を除去し、他の３種類のバリアントであるｈｕ２３Ｈ８ｖ４、－ｖ５及び－ｖ６を生成した。これらのｍＡｂのＣＤＲとネズミ類抗体との比較は表７に示されるとおりである。これらのｍＡｂのＶＨ及びＶＬ ＣＤＲのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は表８に示されるとおりである。これらのｍＡｂとｈＡＲＥＧのＳＰＲで特定された結合親和性を表９－１０に示す。
ＣＤＲは、Ｋａｂａｔシステムを使用して定義される。
１Ｈ９のヒト化
２３Ｈ８のヒト化と類似し、ヒトＶＨ生殖系列遺伝子ＩＧＨＶ３－２１をＶＨ－ＣＤＲグラフトに用いた。ヒトＶＫ生殖系列遺伝子ＩＧＫＶ７－３、ＩＧＫＶ１－３９及びＩＧＫＶ４－１をＶＫ－ＣＤＲグラフトに用いた。これらのｍＡｂのＣＤＲとネズミ類抗体との比較は表１１に示されるとおりである。これらのｍＡｂのＶＨ及びＶＬ ＣＤＲのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は表１２に示されるとおりである。これらのｍＡｂとｈＡＲＥＧのＳＰＲで特定された結合親和性は表１３に示されるとおりである。
２３Ｈ８のヒト化と類似し、ヒトＶＨ生殖系列遺伝子ＩＧＨＶ３－２１をＶＨ－ＣＤＲグラフトに用いた。ヒトＶＫ生殖系列遺伝子ＩＧＫＶ７－３、ＩＧＫＶ１－３９及びＩＧＫＶ４－１をＶＫ－ＣＤＲグラフトに用いた。これらのｍＡｂのＣＤＲとネズミ類抗体との比較は表１１に示されるとおりである。これらのｍＡｂのＶＨ及びＶＬ ＣＤＲのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は表１２に示されるとおりである。これらのｍＡｂとｈＡＲＥＧのＳＰＲで特定された結合親和性は表１３に示されるとおりである。
ＣＤＲは、Ｋａｂａｔシステムを使用して定義される。
実施例３．抗ＡＲＥＧ ｍＡｂの活性分析
１．抗ｈＡＲＥＧ抗体のインビトロ活性分析に用いられるＡＲＥＧタンパク質の製造
Ｃ－末端にＨｉｓ6及びＡｖｉタグが融合されたヒト又はマウスＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするｃＤＮＡを、ビオチン化のためのＢｉｒＡ－ｈＦｃをコードするプラスミドと共に２９３Ｆ細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションのの７２時間後、細胞培養上清を回収し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによるｈＥＧＦＲＥＣＤ Ｈｉｓ６－Ａｖｉ－ビオチン融合タンパク質又はｍＥＧＦＲ ＥＣＤ Ｈｉｓ６－Ａｖｉ－ビオチン融合タンパク質（ｈＥＦＧＲ－ＥＣＤ、ｍＥＧＦＲ－ＥＣＤ）を精製するために用いられる。
１．抗ｈＡＲＥＧ抗体のインビトロ活性分析に用いられるＡＲＥＧタンパク質の製造
Ｃ－末端にＨｉｓ6及びＡｖｉタグが融合されたヒト又はマウスＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするｃＤＮＡを、ビオチン化のためのＢｉｒＡ－ｈＦｃをコードするプラスミドと共に２９３Ｆ細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションのの７２時間後、細胞培養上清を回収し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによるｈＥＧＦＲＥＣＤ Ｈｉｓ６－Ａｖｉ－ビオチン融合タンパク質又はｍＥＧＦＲ ＥＣＤ Ｈｉｓ６－Ａｖｉ－ビオチン融合タンパク質（ｈＥＦＧＲ－ＥＣＤ、ｍＥＧＦＲ－ＥＣＤ）を精製するために用いられる。
Ｃ－末端に４つの追加残基（ＤＬＬＡ）を有するヒト又はマウスＡＲＥＧ ＥＧＦドメインをｍＦｃ融合タンパク質として２９３Ｆ細胞に発現させた。トランスフェクションの７２時間後、細胞培養上清を回収し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによるｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ＤＬＬＡ－ｍＦｃ（ｈＡＲＥＧ－ＤＬＬＡ）又はｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ＤＬＬＡ－ｍＦｃ（ｍＡＲＥＧ－ＤＬＬＡ）融合タンパク質を精製するために用いられる。
２．競合ＥＬＩＳＡによるｈＡＲＥＧとＥＧＦＲとの結合の抑制への分析
簡単に言えば、ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ、５μｇ／ｍＬ）をＵ底９６ウェルプレートにコーティングし、次に１００ｎＭビオチン化されたｈＥＧＦＲ－ＥＣＤ又はｍＥＧＦＲ－ＥＣＤを１ウェルあたり１００μＬの量でプレートに捕捉した。段階希釈された濃度の異なる抗体を５ｎＭ ｈＡＲＥＧ－ＤＬＬＡ又は５０ｎＭ ｍＡＲＥＧ－ＤＬＬＡタンパク質と混合してＥＬＩＳＡプレートに添加した。ＨＲＰ結合マウス抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により、ｈＡＲＥＧ－ＤＬＬＡとｈＥＧＦＲ－ＥＣＤとの結合又はｍＡＲＥＧ－ＤＬＬＡとｍＥＧＦＲ－ＥＣＤとの結合を検出した。
簡単に言えば、ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ、５μｇ／ｍＬ）をＵ底９６ウェルプレートにコーティングし、次に１００ｎＭビオチン化されたｈＥＧＦＲ－ＥＣＤ又はｍＥＧＦＲ－ＥＣＤを１ウェルあたり１００μＬの量でプレートに捕捉した。段階希釈された濃度の異なる抗体を５ｎＭ ｈＡＲＥＧ－ＤＬＬＡ又は５０ｎＭ ｍＡＲＥＧ－ＤＬＬＡタンパク質と混合してＥＬＩＳＡプレートに添加した。ＨＲＰ結合マウス抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により、ｈＡＲＥＧ－ＤＬＬＡとｈＥＧＦＲ－ＥＣＤとの結合又はｍＡＲＥＧ－ＤＬＬＡとｍＥＧＦＲ－ＥＣＤとの結合を検出した。
３．ＥＧＦＲ受容体のリン酸化の抑制
Ａ４３１（ヒト類表皮癌細胞株）細胞を１時間血清飢餓状態にし、続いて単独のｈＡＲＥＧ－ＤＬＬＡ（２．５ｎＭ）で処理するか又はｈＡＲＥＧと抗ＡＲＥＧ抗体の混合物で１時間処理した。各処理において６ウェルプレートに約１－２×１０5細胞／ウェルを使用した。処理された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ＲＩＰＡバッファを使用して氷上で溶解させた。次に細胞溶解物にＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、次にウェスタンブロッティングを行った。それぞれ抗ホスホチロシンｍＡｂ（Ａｂｃａｍ、ＥＰ７７４Ｙ）及びウサギポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃２２３２）を使用してリン酸化形式のＥＧＦＲ（チロシン１０６８）及び総ＥＧＦＲを検出した。抗α－チューブリンｍＡｂ（クローンＢ－５－１－２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して細胞溶解物中のα－チューブリン発現を検出し、ウェスタンブロッティング解析のローディングコントロールとした。
Ａ４３１（ヒト類表皮癌細胞株）細胞を１時間血清飢餓状態にし、続いて単独のｈＡＲＥＧ－ＤＬＬＡ（２．５ｎＭ）で処理するか又はｈＡＲＥＧと抗ＡＲＥＧ抗体の混合物で１時間処理した。各処理において６ウェルプレートに約１－２×１０5細胞／ウェルを使用した。処理された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ＲＩＰＡバッファを使用して氷上で溶解させた。次に細胞溶解物にＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、次にウェスタンブロッティングを行った。それぞれ抗ホスホチロシンｍＡｂ（Ａｂｃａｍ、ＥＰ７７４Ｙ）及びウサギポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃２２３２）を使用してリン酸化形式のＥＧＦＲ（チロシン１０６８）及び総ＥＧＦＲを検出した。抗α－チューブリンｍＡｂ（クローンＢ－５－１－２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して細胞溶解物中のα－チューブリン発現を検出し、ウェスタンブロッティング解析のローディングコントロールとした。
４．エピトープ マッピング
抗ＡＲＥＧ ｍＡｂのエピトープを同定するために、ｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄとｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄとの間で異なるとともに異なる物理的性質を有する５つのアミノ酸を突然変異用に選択した。ｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄの５つの異なる部位でのアミノ酸をそれぞれｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄの対応するアミノ酸に変更することにより、５つのｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄバリアントを生成した。また、ｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄの２つの異なる部位でのアミノ酸をそれぞれｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄの対応するアミノ酸に変更することにより、２つのｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄバリアントを生成した。次にＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）を使用してこれらのバリアントと抗ＡＲＥＧ ｍＡｂとの結合を調べた。
抗ＡＲＥＧ ｍＡｂのエピトープを同定するために、ｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄとｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄとの間で異なるとともに異なる物理的性質を有する５つのアミノ酸を突然変異用に選択した。ｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄの５つの異なる部位でのアミノ酸をそれぞれｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄの対応するアミノ酸に変更することにより、５つのｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄバリアントを生成した。また、ｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄの２つの異なる部位でのアミノ酸をそれぞれｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄの対応するアミノ酸に変更することにより、２つのｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄバリアントを生成した。次にＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）を使用してこれらのバリアントと抗ＡＲＥＧ ｍＡｂとの結合を調べた。
５．結果
抗ＡＲＥＧ ｍＡｂは、ＡＲＥＧとＥＧＦＲとの結合を遮断する
ヒトＡＲＥＧのＥＧＦドメインのＣ－末端に４つのアミノ酸（ＤＬＬＡ）を付加すると、組換え発現したＥＧＦドメインの生物学的活性を大幅に向上させることが以前に示されている（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９６）。競合ＥＬＩＳＡアッセイを容易にするために、本発明者らはｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ＤＬＬＡ－ｍＦｃ（ｈＡＲＥＧ－ＤＬＬＡ）又はｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ＤＬＬＡ－ｍＦｃ（ｍＡＲＥＧ－ＤＬＬＡ）を前記測定法においてＥＧＦＲと結合するためのリガンドとして使用した。その結果は、Ｅ１Ｈ３Ｌ４、Ｐ７及びｈｕ９Ｃ１２ｖ４はいずれもｍＡＲＥＧ－ＤＬＬＡと競合してｍＥＧＦＲ－ＥＣＤと結合することを示した。この３種類のｍＡｂにおいて、ｈｕ９Ｃ１２ｖ４は最も高い活性を示した。競合ＥＬＩＳＡにおいてｈＩｇＧ１形式を採用するｈｕ９Ｃ１２ｖ４、ｈｕ９Ｃ１２ｖ６、ｈｕ２３Ｈ８ｖ５、ｈｕ２３Ｈ８ｖ６及びｈｕ１Ｈ９ｖ３についてもテストした。それらはいずれも、サブナノモルのＩＣ５０で、ｈＡＲＥＧ－ＤＬＬＡと競合してｈＥＧＦＲ－ＥＣＤと結合する面で強力な活性を示した。
抗ＡＲＥＧ ｍＡｂは、ＡＲＥＧとＥＧＦＲとの結合を遮断する
ヒトＡＲＥＧのＥＧＦドメインのＣ－末端に４つのアミノ酸（ＤＬＬＡ）を付加すると、組換え発現したＥＧＦドメインの生物学的活性を大幅に向上させることが以前に示されている（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９６）。競合ＥＬＩＳＡアッセイを容易にするために、本発明者らはｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ＤＬＬＡ－ｍＦｃ（ｈＡＲＥＧ－ＤＬＬＡ）又はｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ＤＬＬＡ－ｍＦｃ（ｍＡＲＥＧ－ＤＬＬＡ）を前記測定法においてＥＧＦＲと結合するためのリガンドとして使用した。その結果は、Ｅ１Ｈ３Ｌ４、Ｐ７及びｈｕ９Ｃ１２ｖ４はいずれもｍＡＲＥＧ－ＤＬＬＡと競合してｍＥＧＦＲ－ＥＣＤと結合することを示した。この３種類のｍＡｂにおいて、ｈｕ９Ｃ１２ｖ４は最も高い活性を示した。競合ＥＬＩＳＡにおいてｈＩｇＧ１形式を採用するｈｕ９Ｃ１２ｖ４、ｈｕ９Ｃ１２ｖ６、ｈｕ２３Ｈ８ｖ５、ｈｕ２３Ｈ８ｖ６及びｈｕ１Ｈ９ｖ３についてもテストした。それらはいずれも、サブナノモルのＩＣ５０で、ｈＡＲＥＧ－ＤＬＬＡと競合してｈＥＧＦＲ－ＥＣＤと結合する面で強力な活性を示した。
また、本発明者らは、ヒトＩｇＧ１形式を採用する以前に報告された２種類の抗体ｈｕＰＡＲ３４（米国特許出願番号２００４／０２１００４０）及びＡＲ５５８（ＵＳ２０１７０００２０６８Ａ１）をさらにテストした。この２種類の抗体もｈＡＲＥＧ－ＤＬＬＡと競合してｈＥＧＦＲ－ＥＣＤと結合する面で強力な活性を示した。
抗ＡＲＥＧ ｍＡｂがＥＧＦＲのリン酸化を抑制する
ｈＥＧＦＲを発現する類表皮癌細胞Ａ４３１においてＥＧＦＲリン酸化に対する抗ＡＲＥＧ ｍＡｂの抑制活性をテストした。低濃度の前記抗体はＡＲＥＧにより誘導されたＡ４３１細胞のＥＧＦＲのリン酸化を遮断することに十分であった。１．２ｎＭの２３Ｈ８又は１Ｈ９は、ｈＡＲＥＧに誘導されたＥＧＦＲのリン酸化を完全に遮断した。２３Ｈ８及び１Ｈ９と比較して、９Ｃ１２は相対的に弱い遮断活性を示した（図２）。
ｈＥＧＦＲを発現する類表皮癌細胞Ａ４３１においてＥＧＦＲリン酸化に対する抗ＡＲＥＧ ｍＡｂの抑制活性をテストした。低濃度の前記抗体はＡＲＥＧにより誘導されたＡ４３１細胞のＥＧＦＲのリン酸化を遮断することに十分であった。１．２ｎＭの２３Ｈ８又は１Ｈ９は、ｈＡＲＥＧに誘導されたＥＧＦＲのリン酸化を完全に遮断した。２３Ｈ８及び１Ｈ９と比較して、９Ｃ１２は相対的に弱い遮断活性を示した（図２）。
エピトープ マッピング
抗ＡＲＥＧ ｍＡｂのエピトープを同定するために、ｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄの５つの異なる部位でのアミノ酸をそれぞれｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄの対応するアミノ酸に変更することにより、５つのｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄバリアントを生成した（図３）。次にＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）を使用して前記バリアントと抗ＡＲＥＧ ｍＡｂとの結合を調べた。２つのアミノ酸（Ｇｌｕ１４９及びＨｉｓ１６４）が前記ｍＡｂがｈＡＲＥＧと結合する重要なエピトープ残基であることを同定した。Ｂｉａｃｏｒｅの分析で明らかになったように、ｈｕ９Ｃ１２ｖ４、ｈｕ９Ｃ１２ｖ６、ｈｕ２３Ｈ８及びｈｕ１Ｈ９ ｍＡｂについては、ｈＡＲＥＧ－Ｈ１６４ＮバリアントはｍＡｂとの結合能力が完全に失われ、ｈＡＲＥＧ－Ｅ１４９Ｋバリアントはわずかに低下した結合活性を有し、他の３種類のｈＡＲＥＧバリアントはｍＡｂとの結合に影響を与えず、Ｈｉｓ１６４が本発明の抗ＡＲＥＧ ｍＡｂの結合にとって最も重要なエピトープ残基であることを確認した。ｈｕＰＡＲ３４については、Ｅ１４９Ｋ及びＨ１６４Ｎバリアントは低下した結合活性を有し、他の３つの残基の変更は影響がないか又は影響が小さかった。ＡＲ５５８については、Ｅ１４９Ｋバリアントは結合活性が完全に失われ、他の４つの残基の変更はｈＡＲＥＧとＡＲ５５８の結合に影響がないか又は影響が小さく、Ｇｌｕ１４９がＡＲ５５８にとって最も重要なエピトープ残基であることを示した。
抗ＡＲＥＧ ｍＡｂのエピトープを同定するために、ｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄの５つの異なる部位でのアミノ酸をそれぞれｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄの対応するアミノ酸に変更することにより、５つのｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄバリアントを生成した（図３）。次にＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）を使用して前記バリアントと抗ＡＲＥＧ ｍＡｂとの結合を調べた。２つのアミノ酸（Ｇｌｕ１４９及びＨｉｓ１６４）が前記ｍＡｂがｈＡＲＥＧと結合する重要なエピトープ残基であることを同定した。Ｂｉａｃｏｒｅの分析で明らかになったように、ｈｕ９Ｃ１２ｖ４、ｈｕ９Ｃ１２ｖ６、ｈｕ２３Ｈ８及びｈｕ１Ｈ９ ｍＡｂについては、ｈＡＲＥＧ－Ｈ１６４ＮバリアントはｍＡｂとの結合能力が完全に失われ、ｈＡＲＥＧ－Ｅ１４９Ｋバリアントはわずかに低下した結合活性を有し、他の３種類のｈＡＲＥＧバリアントはｍＡｂとの結合に影響を与えず、Ｈｉｓ１６４が本発明の抗ＡＲＥＧ ｍＡｂの結合にとって最も重要なエピトープ残基であることを確認した。ｈｕＰＡＲ３４については、Ｅ１４９Ｋ及びＨ１６４Ｎバリアントは低下した結合活性を有し、他の３つの残基の変更は影響がないか又は影響が小さかった。ＡＲ５５８については、Ｅ１４９Ｋバリアントは結合活性が完全に失われ、他の４つの残基の変更はｈＡＲＥＧとＡＲ５５８の結合に影響がないか又は影響が小さく、Ｇｌｕ１４９がＡＲ５５８にとって最も重要なエピトープ残基であることを示した。
また、本発明者らは、２つのｍＡＲＥＧバリアントを使用し、ｍＡＲＥＧ－Ｋ１４９Ｅ／Ｎ１６４Ｈ（ｈＡＲＥＧ番号を使用する）バリアントが抗ｈＡＲＥＧ抗体との完全な結合親和性を取得したことを発見し、前記抗ｈＡＲＥＧ抗体はｍＡＲＥＧとの交差反応性がないか又は非常に弱いものであった。ｍＡＲＥＧ－Ｎ１６４Ｈバリアントは前記抗体との部分的な結合能力を取得した。これらの結果は、ｍＡＲＥＧ中のアミノ酸Ｌｙｓ１４９及びＡｓｎ１６４は、ｍＡｂ（ｈｕ９Ｃ１２ｖ６、ｈｕ２３Ｈ８、ｈｕ１Ｈ９、ｈｕＰＡＲ３４及びＡＲ５５８）とｍＡＲＥＧとの交差反応性の欠如の原因となる残基であることを示した。
実施例４．動物研究
１．動物モデルの確立
肺胞ＩＩ型細胞（ＡＴ２細胞）においてＣｄｃ４２遺伝子を特異的にノックアウトすることによりＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスを生成する
ＡＴ２細胞におけるＣｄｃ４２遺伝子を特異的に欠失するために、Ｓｐｃ－ＣｒｅＥＲノックイン対立遺伝子を持つマウスをＣｄｃ４２ ｆｌｏｘｅｄ（Ｃｄｃ４２flox/flox）マウスと交配させた（図４Ａ）。Ｃｄｃ４２flox/floxマウスにおいて、Ｃｄｃ４２遺伝子の翻訳開始エクソンを含有するＣｄｃ４２遺伝子のエクソン２のフランキングは２つのｌｏｘｐ部位を有する。Ｓｐｃ－ＣｒｅＥＲ；Ｃｄｃ４２flox/floxマウスにおいて、タモキシフェンで処理した後に、Ｃｒｅ／ｌｏｘｐを介した組換えによってＡＴ２細胞におけるＣｄｃ４２遺伝子のエクソン２を特異的に欠失させた（図４Ｂ）。Ｓｐｃ－ＣｒｅＥＲ；Ｃｄｃ４２flox/floxマウスはＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスと命名される。Ｃｄｃ４２遺伝子のエクソン２の欠失前後のＣｄｃ４２ＤＮＡ配列の断片は以下のとおりである。これらの全てのマウスは、動物小屋で特定の病原体のない条件下で維持されている。
１．動物モデルの確立
肺胞ＩＩ型細胞（ＡＴ２細胞）においてＣｄｃ４２遺伝子を特異的にノックアウトすることによりＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスを生成する
ＡＴ２細胞におけるＣｄｃ４２遺伝子を特異的に欠失するために、Ｓｐｃ－ＣｒｅＥＲノックイン対立遺伝子を持つマウスをＣｄｃ４２ ｆｌｏｘｅｄ（Ｃｄｃ４２flox/flox）マウスと交配させた（図４Ａ）。Ｃｄｃ４２flox/floxマウスにおいて、Ｃｄｃ４２遺伝子の翻訳開始エクソンを含有するＣｄｃ４２遺伝子のエクソン２のフランキングは２つのｌｏｘｐ部位を有する。Ｓｐｃ－ＣｒｅＥＲ；Ｃｄｃ４２flox/floxマウスにおいて、タモキシフェンで処理した後に、Ｃｒｅ／ｌｏｘｐを介した組換えによってＡＴ２細胞におけるＣｄｃ４２遺伝子のエクソン２を特異的に欠失させた（図４Ｂ）。Ｓｐｃ－ＣｒｅＥＲ；Ｃｄｃ４２flox/floxマウスはＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスと命名される。Ｃｄｃ４２遺伝子のエクソン２の欠失前後のＣｄｃ４２ＤＮＡ配列の断片は以下のとおりである。これらの全てのマウスは、動物小屋で特定の病原体のない条件下で維持されている。
Ｃｄｃ４２遺伝子のエクソン２を欠失させる前のＣｄｃ４２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３に示されるとおりである。Ｃｄｃ４２遺伝子のエクソン２を欠失させた後のＣｄｃ４２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４に示されるとおりである。
ＰＮＸ処理後のＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺における進行性線維性変化
Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウス及びコントロールマウスに対して、左葉切除術（肺切除術、ＰＮＸ）を行った。ＰＮＸ処理後の異なる時点でＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウス及びコントロールマウスの肺を分析した（図５Ａ）。本発明者らは、ＰＮＸ後の２１日目に、いくつかのＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスが顕著な体重軽減及び呼吸率向上を示すことを発見した。実際に、ＰＮＸ後の６０日目に、ほぼ５０％のＰＮＸ処理されたＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスは、エンドポイント安楽死の所定の健康状態標準に達し（図５Ｂ）、ＰＮＸ後の１８０日目に、７０％を超えたＰＮＸ処理されたＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウス（ｎ＝３３）はそれらのエンドポイントに達した（図５Ｂ）。Ｈ＆Ｅ染色は、偽手術処理及びＰＮＸ処理のコントロールマウスの肺が線維性変化が示されていないことを示した（図５Ｃ）。Ｈ＆Ｅ染色は、エンドポイントでＰＮＸ処理されたＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺葉全体はいずれも緻密な線維性変化を有することを示した（図５Ｄ）。
Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウス及びコントロールマウスに対して、左葉切除術（肺切除術、ＰＮＸ）を行った。ＰＮＸ処理後の異なる時点でＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウス及びコントロールマウスの肺を分析した（図５Ａ）。本発明者らは、ＰＮＸ後の２１日目に、いくつかのＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスが顕著な体重軽減及び呼吸率向上を示すことを発見した。実際に、ＰＮＸ後の６０日目に、ほぼ５０％のＰＮＸ処理されたＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスは、エンドポイント安楽死の所定の健康状態標準に達し（図５Ｂ）、ＰＮＸ後の１８０日目に、７０％を超えたＰＮＸ処理されたＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウス（ｎ＝３３）はそれらのエンドポイントに達した（図５Ｂ）。Ｈ＆Ｅ染色は、偽手術処理及びＰＮＸ処理のコントロールマウスの肺が線維性変化が示されていないことを示した（図５Ｃ）。Ｈ＆Ｅ染色は、エンドポイントでＰＮＸ処理されたＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺葉全体はいずれも緻密な線維性変化を有することを示した（図５Ｄ）。
ＰＮＸ後の２１日目に、Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺は、線維性変化を示し始めた。Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌル肺は、すでに肺の縁に緻密な線維性変化を示した（図５Ｄ）。Ｈ＆Ｅ染色は、Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌル肺の線維性領域の組織学的変化がヒトＩＰＦ肺の組織学的変化を再現することを示した。
ＰＮＸ後の２１日目に、コントロール及びＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスから収集された肺を抗コラーゲンＩ抗体で染色した（図５Ｅ）。コントロールの肺に比較して、Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺における緻密な線維性領域においてコラーゲンＩの強力な免疫蛍光シグナルを検出した。ＰＮＸ後の２１日目からＰＮＸ後の６０日目まで、Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺における緻密なコラーゲンＩの面積が徐々に増加した（図５Ｆ）。ｑＰＣＲ分析は、ＰＮＸ後の２１日目からＰＮＸ後の６０日目まで、Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺におけるコラーゲンＩのｍＲＮＡの発現レベルが徐々に向上することを示した（図５Ｇ）。呼吸機能分析は、ＰＮＸ後の２１日目からＰＮＸ後の６０日目まで、Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺のコンプライアンスが徐々に低下することを示した（図５Ｈ）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１，スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ）ｔ検定。
これはＩＰＦの発症メカニズム及び進行を高度に模倣できる最初のマウスモデルである。したがって、以下、ＩＰＦ様肺線維症マウスモデルと呼ばれる。このような動物モデルを使用して、本発明者らはＡＲＥＧが肺線維症の潜在的な治療標的であると同定した。
ブレオマイシン誘発肺線維症マウスモデル
ブレオマイシン誘発肺線維症は、ヒト肺線維症の一般的な実験研究モデルである。各群における野生型ＦＶＢ／Ｎマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に単回用量のＢＬＭ（１Ｕ／１ＫＧ体重、Ｈ２００５５８８３、Ｈａｉ Ｚｈｅｎｇ Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ）を気管内注入した。ブレオマイシン投与後の異なる時点で、全ての群におけるＢＬＭ処理されたマウスに対して閉鎖監視を行った。
ブレオマイシン誘発肺線維症は、ヒト肺線維症の一般的な実験研究モデルである。各群における野生型ＦＶＢ／Ｎマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に単回用量のＢＬＭ（１Ｕ／１ＫＧ体重、Ｈ２００５５８８３、Ｈａｉ Ｚｈｅｎｇ Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ）を気管内注入した。ブレオマイシン投与後の異なる時点で、全ての群におけるＢＬＭ処理されたマウスに対して閉鎖監視を行った。
これは急性肺損傷誘発性肺線維症、例えば肺炎後の肺線維症又はＩＬＤ（間質性肺疾患）を再現できる動物モデルである。ブレオマイシンは、酸化を介したＤＮＡ断片化により肺損傷を誘発し、肺胞上皮細胞の死亡（損傷後１－３日）及び急性炎症反応（損傷後３－９日）を引き起こす。そして、肺線維症は、損傷後の１０－２１日目に肺で発症する。
本発明者らは、本発明のＩＰＦ様マウスモデル及びブレオマイシン誘発肺線維症マウスモデルを採用して本発明のＡＲＥＧ抗体の治療効果を調べた。また、本発明者らは、さらにニンテダニブ及びピルフェニドンの２種類の薬物の治療効果を比較することにより、ＡＲＥＧ抗体と従来のＦＤＡ承認薬物の潜在的な治療効果を全面的に評価した。
２．マウスモデルにおいて肺線維症を治療するための動物研究の設計及び分析
１）ＩＰＦ様肺線維症マウスモデル：体重が近い（～３０ｇ）生後３ヶ月のオスのＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスを前記実験用に選択した。１日おきに合計４回、タモキシフェン（用量：７５ｍｇ／ｋｇ）でマウスに腹膜内注射した。最後の注射後の２週間後、ＰＮＸでマウスを処理した。ＰＮＸ後の１４日目は、線維症の発症の時点であった。ＰＮＸ後の１４日目に、ＰＮＸ処理されたマウスを秤量して治療した。
１）ＩＰＦ様肺線維症マウスモデル：体重が近い（～３０ｇ）生後３ヶ月のオスのＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスを前記実験用に選択した。１日おきに合計４回、タモキシフェン（用量：７５ｍｇ／ｋｇ）でマウスに腹膜内注射した。最後の注射後の２週間後、ＰＮＸでマウスを処理した。ＰＮＸ後の１４日目は、線維症の発症の時点であった。ＰＮＸ後の１４日目に、ＰＮＸ処理されたマウスを秤量して治療した。
２）ブレオマイシン誘発性肺線維症マウスモデル：体重が近い（～３０ｇ）生後３ヶ月のオスのＦＶＢ／Ｎマウスをブレオマイシン処理用に選択した。具体的には、気管内チューブを麻酔されたマウスの気管に挿入し、その後にブレオマイシン溶液（用量：１Ｕ／ｋｇ）を送達した。次に、ブレオマイシン送達の１日後に、マウスを秤量して治療した。
３）治療群：マウスを対照群、抗ＡＲＥＧ抗体群、ニンテダニブ群及びピルフェニドン群の異なる群に分けた。各群の全てのマウスは、年齢が一致し、体重が一致した。対照群については、マウスをアイソタイプが一致した抗抗体で治療した。対照抗体又は抗ＡＲＥＧ抗体を１０－１５ｍｇ／ｋｇの量で５日ごとに腹膜内に投与した。また、対照群中のマウスは、１日１回、強制経口投与により０．５％のメチルセルロースナトリウム溶液で治療した。ニンテダニブ群中のマウスは、１日１回、強制経口投与によりニンテダニブ（６０ｍｇ／ｋｇ）で治療した。ピルフェニドン治療群のマウスは、１日１回、強制経口投与によりピルフェニドン（１００ｍｇ／ｋｇ）で治療した。ニンテダニブ群及びピルフェニドン群のマウスも５日ごとにＰＢＳ溶液で腹膜内治療した。
４）動物研究
ａ）１日おきに、全ての群におけるマウスの体重をモニタリングした。１日２回で全ての群におけるマウスの全体的な健康状態を密に監視した。
ｂ）人道的エンドポイントは、総体重の軽減（初期体重の３０％）により定義される。
動物研究は、承認された施設内の動物管理および使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）のプロトコルの下で行われた。研究のエンドポイントで肺組織を収集した。ヒドロキシプロリンキット（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＭＡＫ００８）により、各マウスの肺中のヒドロキシプロリン含有量を測定した。組織学的分析を使用して肺線維症スケールを評価した。肺組織を４％ＰＦＡで固定し、切片にして Ｈ＆Ｅで染色した。肺のそれぞれの異なる領域を分析することにより、最終的な組織学的線維症スコアを割り当てた。
ａ）１日おきに、全ての群におけるマウスの体重をモニタリングした。１日２回で全ての群におけるマウスの全体的な健康状態を密に監視した。
ｂ）人道的エンドポイントは、総体重の軽減（初期体重の３０％）により定義される。
動物研究は、承認された施設内の動物管理および使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）のプロトコルの下で行われた。研究のエンドポイントで肺組織を収集した。ヒドロキシプロリンキット（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＭＡＫ００８）により、各マウスの肺中のヒドロキシプロリン含有量を測定した。組織学的分析を使用して肺線維症スケールを評価した。肺組織を４％ＰＦＡで固定し、切片にして Ｈ＆Ｅで染色した。肺のそれぞれの異なる領域を分析することにより、最終的な組織学的線維症スコアを割り当てた。
３．結果
１）抗ＡＲＥＧ抗体（Ｐ７）：本発明者らの結果は、抗ＡＲＥＧ（Ｐ７）抗体がＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの体重減少を顕著に遅らせ、Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの生存時間を延長することができることを示した（図６Ａ－６Ｃ）。また、抗ＡＲＥＧ抗体（Ｐ７）はＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺におけるヒドロキシプロリン含有量を顕著に低減することができる（図６Ｄ）。図６Ａは治療及びサンプリング手順の一般化されたスキームを示しており、図６Ｂは抗ＡＲＥＧ抗体（Ｐ７）がＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの生存時間を延長することができることを示しており、図６Ｃは抗ＡＲＥＧ抗体（Ｐ７）がＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの体重減少を顕著に遅らせることができることを示しており、図６Ｄはブランク抗体で治療されたマウスと比較して、抗ＡＲＥＧ抗体（Ｐ７）がＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺におけるヒドロキシプロリン含有量を顕著に低減することができる（＊，Ｐ＜０．０５，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定）を示した。
１）抗ＡＲＥＧ抗体（Ｐ７）：本発明者らの結果は、抗ＡＲＥＧ（Ｐ７）抗体がＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの体重減少を顕著に遅らせ、Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの生存時間を延長することができることを示した（図６Ａ－６Ｃ）。また、抗ＡＲＥＧ抗体（Ｐ７）はＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺におけるヒドロキシプロリン含有量を顕著に低減することができる（図６Ｄ）。図６Ａは治療及びサンプリング手順の一般化されたスキームを示しており、図６Ｂは抗ＡＲＥＧ抗体（Ｐ７）がＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの生存時間を延長することができることを示しており、図６Ｃは抗ＡＲＥＧ抗体（Ｐ７）がＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの体重減少を顕著に遅らせることができることを示しており、図６Ｄはブランク抗体で治療されたマウスと比較して、抗ＡＲＥＧ抗体（Ｐ７）がＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺におけるヒドロキシプロリン含有量を顕著に低減することができる（＊，Ｐ＜０．０５，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定）を示した。
２）抗ＡＲＥＧ抗体（Ｅ１Ｈ３Ｌ４）：本発明者らの結果は、ブレオマイシンで処理されたマウスにおいて、抗ＡＲＥＧ抗体（Ｅ１Ｈ３Ｌ４）は線維症の解消を加速し、体重の回復を促進することができることを示した（図７Ｂ）。図７Ａはブレオマイシン誘発性肺線維症マウスモデルにおいて、ブランク抗体で治療されたマウスと抗ＡＲＥＧ抗体（Ｅ１Ｈ３Ｌ４）で治療されたマウスの生存率に顕著な差がないことを示した。しかしながら、図７Ｂはブランク抗体治療群のマウスと比較して、抗ＡＲＥＧ抗体（Ｅ１Ｈ３Ｌ４）治療群のマウスの回復がより良好であることを示した。
また、抗ＡＲＥＧ（Ｅ１Ｈ３Ｌ４）抗体治療は、Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの生存時間を顕著に延長することができる（図８Ａ－８Ｂ）。Ｈ＆Ｅ染色分析により、Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺において、抗ＡＲＥＧ抗体（Ｅ１Ｈ３Ｌ４）治療群のマウス肺線維症の面積が顕著に減少することを示した（図８Ｃ）。図８Ａは治療及びサンプリング手順の一般化されたスキームを示した。図８Ｂは抗ＡＲＥＧ抗体（Ｅ１Ｈ３Ｌ４）がＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの生存時間を顕著に延長することができることを示しており、図８ＣはＨ＆Ｅ染色分析により、対照群のマウスと比較して、抗ＡＲＥＧ抗体（Ｅ１Ｈ３Ｌ４）治療群のマウスの肺線維症が顕著に減少することを示した。
３）抗ＡＲＥＧ抗体（ｈｕ９Ｃ１２ｖ４）：本発明者らの結果は、抗ＡＲＥＧ抗体（ｈｕ９Ｃ１２ｖ４）がＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの生存時間を顕著に延長することができ（図９Ａ－９Ｂ）、ニンテダニブ及びピルフェニドンはＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの生存時間を顕著に延長しない。Ｈ＆Ｅ染色分析により、Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺において、抗ＡＲＥＧ抗体（ｈｕ９Ｃ１２ｖ４）治療群におけるマウス肺線維症の面積が顕著に減少することを示した（図９Ｃ）。具体的には、図９Ａは治療及びサンプリング手順の一般化されたスキームを示しており、図９Ｂは抗ＡＲＥＧ抗体（ｈｕ９Ｃ１２ｖ４）治療がＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの生存時間を顕著に延長することができることを示しており、図９ＣはＨ＆Ｅ染色分析により、対照群、ニンテダニブ群及びピルフェニドン群のマウスと比較して、抗ＡＲＥＧ抗体（ｈｕ９Ｃ１２ｖ４）治療群のマウスの肺線維症が顕著に減少することを示した。
まとめると、これらの結果は、本発明の抗ＡＲＥＧモノクローナル抗体が肺線維症の治療に有効であることを確認した。
参考文献：
1．Barkauskas, C.E.及びNoble, P.W.（2014）、組織線維症の細胞メカニズム．７．肺線維症細胞メカニズムに対する新たな知見（Cellular mechanisms of tissue fibrosis. 7. New insights into the cellular mechanisms of pulmonary fibrosis）、American journal of physiology Cell physiology 306, C987-996.
2．Li, D., He, W., Liu, X., Zheng, S., Qi, Y., Li, H., Mao, F., Liu, J., Sun, Y., Pan, L.等、（2017）、有効なヒト中和抗体は確立されたHBV 感染を Fc 依存的に減少させる（A potent human neutralizing antibody Fc-dependently reduces established HBV infections）、eLife 6: e26738.
3．Steele, M.P. 及びSchwartz, D.A.（2013）、進行性特発性肺線維症における分子メカニズム（Molecular mechanisms in progressive idiopathic pulmonary fibrosis），Annual review of medicine 64, 265-276.
4．Thompson, S.A., Harris, A., Hoang, D., Ferrer, M. 及びJohnson, G.R.（1996）、天然由来の成長因子に匹敵する生物学的活性を有するカルボキシル末端延長組換えアンフィレグリン（COOH-terminal extended recombinant amphiregulin with bioactivity comparable with naturally derived growth factor）、The Journal of biological chemistry 271, 17927-17931.
1．Barkauskas, C.E.及びNoble, P.W.（2014）、組織線維症の細胞メカニズム．７．肺線維症細胞メカニズムに対する新たな知見（Cellular mechanisms of tissue fibrosis. 7. New insights into the cellular mechanisms of pulmonary fibrosis）、American journal of physiology Cell physiology 306, C987-996.
2．Li, D., He, W., Liu, X., Zheng, S., Qi, Y., Li, H., Mao, F., Liu, J., Sun, Y., Pan, L.等、（2017）、有効なヒト中和抗体は確立されたHBV 感染を Fc 依存的に減少させる（A potent human neutralizing antibody Fc-dependently reduces established HBV infections）、eLife 6: e26738.
3．Steele, M.P. 及びSchwartz, D.A.（2013）、進行性特発性肺線維症における分子メカニズム（Molecular mechanisms in progressive idiopathic pulmonary fibrosis），Annual review of medicine 64, 265-276.
4．Thompson, S.A., Harris, A., Hoang, D., Ferrer, M. 及びJohnson, G.R.（1996）、天然由来の成長因子に匹敵する生物学的活性を有するカルボキシル末端延長組換えアンフィレグリン（COOH-terminal extended recombinant amphiregulin with bioactivity comparable with naturally derived growth factor）、The Journal of biological chemistry 271, 17927-17931.
繊維化は、損傷による結合組織の肥厚及び瘢痕によって形成され、繊維芽細胞の過剰増殖及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の蓄積を特徴とする。このような疾患は一般的に肺、肝臓及び腎臓等の器官に見られ、組織構造系の破壊を引き起こし、臓器機能に深刻な損傷を与える可能性がある。
肺線維症（ＰＦ）は、健康な肺組織が過剰な細胞外マトリックスに置換された時に生じる肺疾患である。ＰＦ肺の肺胞構造が破壊され、これにより肺のコンプライアンスが低下し、ガス交換が損なわれ、最終的に呼吸不全及び死亡に至る。肺線維症の共通の特徴は肺の気嚢（肺胞）周囲の線維芽細胞が過剰増殖することである（Ｂａｒｋａｕｓｋａｓ及びＮｏｂｌｅ、２０１４）。最も一般的な肺線維症タイプは特発性肺線維症（ＩＰＦ）である。ＩＰＦは重度の進行性肺機能喪失を伴う原因不明の間質性肺疾患である。それは５０歳～７０代の高齢者に最も一般的に見られる。ＩＰＦは致命的な疾患であり、診断時からの生存時間の中央値は２～４年（Ｓｔｅｅｌｅ及びＳｃｈｗａｒｔｚ、２０１３）だけであり、最終的に呼吸不全に至る可能性がある。肺線維症の発症メカニズムは従来、未解決の謎であり、臨床治療は非常に限られている。現在、ＩＰＦの治療用としては、ＦＤＡに許可された市販薬であるニンテダニブ及びピルフェニドンの２種のみである。しかしながら、この２種の薬物は１年以内の強制肺活量の低下率を改善しただけで、それらはいずれも患者の生存率を顕著に向上させることができない。
以下に、抗ＡＲＥＧ抗体の先行技術を列挙する。
米国特許出願番号１０／７７４，０７６は、ＡＲＥＧ抗体、並びに、癌及び乾癬の治療におけるその用途に関する。保護を請求する抗体はヒト化ＰＡＲ３４である。
ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０５０３８９は、ＡＲＥＧ及びＨＢＥＧＦの両方と交差反応する抗体に関する。前記抗体は癌及び血管の発生に関連する疾患を治療する方法に用いることができる。保護を請求する抗体は２Ｆ７である。及び、
米国特許出願番号１５／２７１，５１５は、ＡＲＥＧ抗体及び癌の治療におけるその用途に関する。保護を請求する抗体はＡＲ３０、ＡＲ３７及びＡＲ５５８である。ここで、ＡＲ５５８は異種移植マウス腫瘍モデルにおいて最も優れる抗腫瘍活性が示されている。この３種類の抗体はいずれもヒト化抗体ではなくネズミ類抗体である。
米国特許出願番号１０／７７４，０７６は、ＡＲＥＧ抗体、並びに、癌及び乾癬の治療におけるその用途に関する。保護を請求する抗体はヒト化ＰＡＲ３４である。
ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０５０３８９は、ＡＲＥＧ及びＨＢＥＧＦの両方と交差反応する抗体に関する。前記抗体は癌及び血管の発生に関連する疾患を治療する方法に用いることができる。保護を請求する抗体は２Ｆ７である。及び、
米国特許出願番号１５／２７１，５１５は、ＡＲＥＧ抗体及び癌の治療におけるその用途に関する。保護を請求する抗体はＡＲ３０、ＡＲ３７及びＡＲ５５８である。ここで、ＡＲ５５８は異種移植マウス腫瘍モデルにおいて最も優れる抗腫瘍活性が示されている。この３種類の抗体はいずれもヒト化抗体ではなくネズミ類抗体である。
先行技術において、肺線維症、特に特発性肺線維症（ＩＰＦ）、特に肺ＡＴ２細胞におけるＡＲＥＧ信号伝達の重要な薬物標的について、決定的な報告が未だに発表されていない。本発明者らは、肺ＡＴ２細胞におけるＡＲＥＧ信号伝達と肺線維症、特にＩＰＦの発生との間の独特の関連性を特定し、肺ＡＴ２細胞におけるＡＲＥＧ信号伝達が肺線維症、特にＩＰＦの重要な薬物標的とすることができることを見出した。具体的には、正常なコントロール肺のＡＴ２細胞においてＡＲＥＧが検出されないが、全てのＩＰＦサンプルのＡＴ２細胞においていずれもＡＲＥＧが検出された。
また、本発明者らは、ＡＴ２細胞におけるＣｄｃ４２遺伝子がノックアウトされたＩＰＦの動物モデルを構築した。ＡＲＥＧはコントロール肺のＡＴ２細胞で検出することができないが、Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌル肺のＡＴ２細胞で検出することができる。これはＩＰＦの発病メカニズム及び進行を高度に模倣できる最初の動物モデルである。このような動物モデルを使用して、本発明者らは肺線維症の重要な治療標的としてＡＲＥＧを特定した。
上記の知見に基づいて、本発明者らは、腎線維症、肝線維症、肺線維症、特にＩＰＦを治療するために用いられる、ＡＲＥＧに対する抗体を製造、スクリーニングして取得した。
本発明は、腎線維症、肝線維症、肺線維症、特にＩＰＦを含むがこれらに限定されない線維症疾患の治療、診断又は予防に用いられる、抗ＡＲＥＧ抗体又はその免疫反応性断片を提供する。前記抗体をコードするポリヌクレオチド又は核酸分子、発現ベクター、宿主細胞及び前記抗体を製造するための方法をさらに提供する。前記抗体分子を含む医薬組成物をさらに提供する。本発明の抗ＡＲＥＧ抗体は、ＥＧＦ様ドメイン中にある結合残基を介してＡＲＥＧと特異的に結合し、ＡＲＥＧの機能を遮断する。本明細書に開示された抗ＡＲＥＧ抗体は、腎線維症、肝線維症、肺線維症、特にＩＰＦを含むがこれらに限定されない線維症疾患の治療、予防及び／又は診断に用いることができる。
一態様では、本発明は、線維症を抑制する能力を有する、単離された抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片を提供する。好ましくは、前記線維症は、腎線維症、肝線維症、肺線維症であり、特にＩＰＦである。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ＡＲＥＧと結合することができる。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ヒトＡＲＥＧ（ｈＡＲＥＧ）及びマウスＡＲＥＧ（ｍＡＲＥＧ）の両方と結合する。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ヒトＡＲＥＧ（ｈＡＲＥＧ）のみと結合し、マウスＡＲＥＧ（ｍＡＲＥＧ）と結合することができない。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ヒト抗ＡＲＥＧ抗体又はネズミ類抗ＡＲＥＧ抗体又はヒト化抗ＡＲＥＧ抗体又はキメラ抗ＡＲＥＧ抗体である。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、高い親和性でＡＲＥＧと結合し、その解離定数（ＫＤ）は約１０ｎＭより小さく、例えば１ｎＭ、０．１ｎＭ又は０．０１ｎＭより小さく、例えば１×１０-8－１×１０-11の範囲内にあり、好ましくは１×１０-9－１×１０-11の範囲内にある。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、可溶性形態のＡＲＥＧと結合することができる。好ましくは、前記抗ＡＲＥＧ抗体は、可溶性形態のＡＲＥＧのＥＧＦ様ドメインと結合することができる。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ヒトｐｒｏ－ＡＲＥＧの１０１～１８４残基と結合することができる。ヒトｐｒｏ－ＡＲＥＧのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５に示されるとおりである。
いくつかの実施形態において、前記抗ＡＲＥＧ抗体は、可溶性形態のＡＲＥＧのＥＧＦ様ドメイン内のＣ－末端と結合することができる。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ヒトｐｒｏ－ＡＲＥＧの１７１～１８４残基と結合することができる。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ネズミ類ｐｒｏ－ＡＲＥＧの９４～１７７残基と結合することができる。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ネズミ類ｐｒｏ－ＡＲＥＧの１３５～１７７残基のＥＧＦ様ドメインと結合することができる。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３～１３２のいずれかに示されるヒトｐｒｏ－ＡＲＥＧの１０１～１８４残基内、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３～１３２のいずれかに示されるヒトｐｒｏ－ＡＲＥＧの１４２～１８４残基内の例えば少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸と結合することができる。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ヒトｐｒｏ－ＡＲＥＧのＧｌｕ１４９及び／又はＨｉｓ１６４と相互作用することができる。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ネズミ類ｐｒｏ－ＡＲＥＧの９４－１７７残基内、好ましくは、ネズミ類ｐｒｏ－ＡＲＥＧの１３７－１７７残基内の例えば少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸と結合することができる。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、可溶性形態のＡＲＥＧと結合する抗体断片である。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、Ｆａｂ断片又はＦ（ａｂ）2断片である。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、重鎖相補決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含有する重鎖可変領域、及び軽鎖相補決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含有する軽鎖可変領域を含み、ここで、
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるＨＣＤＲ３、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＨＣＤＲ３、（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＨＣＤＲ３、（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるＨＣＤＲ３、（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるＨＣＤＲ３、（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ３、（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＨＣＤＲ３、（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されるＨＣＤＲ３、（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、（１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６で示されるＨＣＤＲ３、及び、（１３）（１）－（１２）に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３であって、ただし、そのうちの少なくとも一つは１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の添加、欠失、保存的アミノ酸置換又はそれらの組み合わせを含むもの、から選択され、かつ、
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるＬＣＤＲ３、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ３、（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＬＣＤＲ３、（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ３、（１４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ３、（１５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示されるＬＣＤＲ３、（１６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に示されるＬＣＤＲ３、（１７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示されるＬＣＤＲ３、（１８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に示されるＬＣＤＲ３、（１９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるＬＣＤＲ３、（２０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるＬＣＤＲ３、及び、（２１）（１）～（２０）に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３であって、ただし、そのうちの少なくとも一つは１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の添加、欠失、保存的アミノ酸置換又はそれらの組み合わせを含むもの、から選択される。
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるＨＣＤＲ３、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＨＣＤＲ３、（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＨＣＤＲ３、（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるＨＣＤＲ３、（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるＨＣＤＲ３、（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ３、（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＨＣＤＲ３、（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されるＨＣＤＲ３、（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、（１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６で示されるＨＣＤＲ３、及び、（１３）（１）－（１２）に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３であって、ただし、そのうちの少なくとも一つは１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の添加、欠失、保存的アミノ酸置換又はそれらの組み合わせを含むもの、から選択され、かつ、
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるＬＣＤＲ３、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ３、（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＬＣＤＲ３、（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ３、（１４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ３、（１５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示されるＬＣＤＲ３、（１６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に示されるＬＣＤＲ３、（１７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示されるＬＣＤＲ３、（１８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に示されるＬＣＤＲ３、（１９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるＬＣＤＲ３、（２０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるＬＣＤＲ３、及び、（２１）（１）～（２０）に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３であって、ただし、そのうちの少なくとも一つは１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の添加、欠失、保存的アミノ酸置換又はそれらの組み合わせを含むもの、から選択される。
一つの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、重鎖相補決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含有する重鎖可変領域、及び軽鎖相補決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含有する軽鎖可変領域を含み、ここで、
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるＬＣＤＲ３、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ３、（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＬＣＤＲ３、（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ３、（１４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ３、（１５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示されるＬＣＤＲ３、（１６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に示されるＬＣＤＲ３、（１７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示されるＬＣＤＲ３、（１８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に示されるＬＣＤＲ３、（１９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるＬＣＤＲ３、（２０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるＬＣＤＲ３、及び（２１）（１）～（２０）に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３であって、ただし、そのうちの少なくとも一つは１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の添加、欠失、保存的アミノ酸置換又はそれらの組み合わせを含むもの、から選択される。
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるＬＣＤＲ３、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ３、（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＬＣＤＲ３、（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、（１３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ３、（１４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ３、（１５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示されるＬＣＤＲ３、（１６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に示されるＬＣＤＲ３、（１７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示されるＬＣＤＲ３、（１８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に示されるＬＣＤＲ３、（１９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるＬＣＤＲ３、（２０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるＬＣＤＲ３、及び（２１）（１）～（２０）に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３であって、ただし、そのうちの少なくとも一つは１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の添加、欠失、保存的アミノ酸置換又はそれらの組み合わせを含むもの、から選択される。
好ましくは、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＨＣＤＲ３、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＨＣＤＲ３、及び、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、並びに、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＬＣＤＲ３、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ３、及び、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、から選択されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＨＣＤＲ３、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＨＣＤＲ３、及び、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、並びに、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＬＣＤＲ３、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ３、及び、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、から選択されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
好ましくは、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＬＣＤＲ３、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ３、及び、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＬＣＤＲ３、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ３、及び、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、前記重鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７～６９から選択されるアミノ酸配列、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７～６９のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有するとともにエピトープ結合活性が保たれているアミノ酸配列を有し、
ここで、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０～８９から選択されるアミノ酸配列、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０～８９のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有するとともにエピトープ結合活性が保たれているアミノ酸配列を有する。
ここで、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０～８９から選択されるアミノ酸配列、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０～８９のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有するとともにエピトープ結合活性が保たれているアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５、（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６、（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７、（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８、（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９、（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０、（１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１、（１３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９、（１４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２、（１５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３、（１６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４、（１７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５、（１８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６、（１９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７、（２０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８、（２１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９、及び、（２２）それぞれ（１）～（２１）のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有するとともにエピトープ結合活性が保たれている２つのアミノ酸配列、から選択されるアミノ酸配列を有する。
好ましくは、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、前記重鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ、
前記軽鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５から選択されるアミノ酸配列を有する。
前記軽鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５から選択されるアミノ酸配列を有する。
好ましくは、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、及び（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５、から選択されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＤのアイソタイプである。いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のアイソタイプである。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ネズミ類ｍＡｂ、ヒト化ｍＡｂ又はキメラｍＡｂである。
好ましくは、本発明のヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－３に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１－２３に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び４に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、２２及び２４に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、２及び６に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５－２７に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のネズミ類モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７－９に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８－３０に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のネズミ類モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、１３及び１４に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６－３８に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のネズミ類モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７－１９に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、３７及び４９に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７－９に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８－３０に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１０及び９に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、３２及び３０に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８及び１１に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、３４及び３０に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８及び１２に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、３４及び３０に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、１３及び１３６に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、４０及び３８に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、１３及び１３６に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、４２及び３８に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、１３及び１３６に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、４４及び３８に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、１５及び１６に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、４０及び３８に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、１５及び１６に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、４２及び４６に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、１５及び１６に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、４４及び４６に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、１８及び２０に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、４０及び５１に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、１８及び２０に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、４０及び５２に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、１８及び２０に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、４０及び５３に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、１８及び２０に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４、４２及び５５に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、１８及び２０に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む重鎖領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、４４及び５５に示される三つのＣＤＲのうちの少なくとも両者を含む軽鎖領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ヒト定常領域に由来する定常領域を含む。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、κ軽鎖定常領域に由来するヒト軽鎖定常領域を有する。
好ましくは、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４重鎖定常領域に由来するヒト重鎖定常領域を有する。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ＡＲＥＧとＥＧＦＲとの結合を遮断することができる。
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片は、ＥＧＦＲのリン酸化を抑制することができる。
別の態様では、本発明は、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド又は核酸を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは同一のポリヌクレオチド分子又は別個のポリヌクレオチド分子上に完全な重鎖可変領域又は完全な軽鎖可変領域又は両者をコードすることができる。又は、本発明に係るポリヌクレオチドは同一のポリヌクレオチド分子又は別個のポリヌクレオチド分子上に重鎖可変領域又は軽鎖可変領域又は両者の一部をコードすることができる。
いくつかの実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、重鎖可変領域をコードする配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１２、１１５及び１１７のいずれかに示されるＤＮＡ配列、及び／又は、軽鎖可変領域をコードする配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１８、１１９、１２０、１２１及び１２２のいずれかに示されるＤＮＡ配列を含む。
別の態様では、本発明は、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片をコードする一つ又は複数のポリヌクレオチドを含む、単離された細胞又はベクターを提供する。
いくつかの実施形態において、前記細胞は、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片を生成するハイブリドーマ細胞である。
別の態様では、本発明は、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片の、被検者におけるＡＲＥＧが過剰発現、上方調節又は活性化される障害を治療するための薬物の製造における用途を提供する。
前記被検者は、診断、予後又は治療を必要とする哺乳動物被検者であってもよい。哺乳動物被検者は、ヒト、馴養動物、農場動物、及び動物園、スポーツ又はペット動物を含み、例えば犬、猫、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、馬、牛、乳牛等である。
前記障害は線維症疾患であり、腎線維症、肝線維症、肺線維症、特にＩＰＦを含むがこれらに限定されない。
別の態様では、本発明は、被検者におけるＡＲＥＧが過剰発現、上方調節又は活性化される障害を治療するための方法を提供し、前記方法は、前記患者に本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片を投与することを含む。前記障害は線維症疾患であり、腎線維症、肝線維症、肺線維症、特にＩＰＦを含むがこれらに限定されない。
前記被検者は、診断、予後又は治療を必要とする哺乳動物被検者であってもよい。哺乳動物被検者は、ヒト、馴養動物、農場動物、及び動物園、スポーツ又はペット動物を含み、例えば犬、猫、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、馬、牛、乳牛等である。
別の態様では、本発明は、ＡＲＥＧタンパク質の存在を特定する方法を提供し、前記方法は、ＡＲＥＧタンパク質を含むと疑われる細胞を、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片に暴露し、前記抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片と前記細胞との結合を特定することを含む。
前記方法は、被検者におけるＡＲＥＧが過剰発現、上方調節又は活性化される障害を診断するための方法であってもよい。前記障害は線維症疾患であり、腎線維症、肝線維症、肺線維症、特にＩＰＦを含むがこれらに限定されない。
前記被検者は、診断、予後又は治療を必要とする哺乳動物被検者であってもよい。哺乳動物被検者は、ヒト、馴養動物、農場動物、及び動物園、スポーツ又はペット動物を含み、例えば犬、猫、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、馬、牛、乳牛等である。
別の態様では、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３～１３２のいずれかに示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３～１３２のいずれかと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、単離されたＡＲＥＧタンパク質を提供する。
前記単離されたＡＲＥＧタンパク質は、エピトープとして本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片を生成するために用いられる。
本発明に係る単離されたＡＲＥＧタンパク質は、ネズミ類ＡＲＥＧと交差反応性がないか又は弱い交差反応性を有する抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片を同定することに用いることができる。
２つのアミノ酸（Ｅ１４９及びＨ１６４、ｈＡＲＥＧ番号に基づく）は、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片がｍＡＲＥＧではなくｈＡＲＥＧと結合する重要なエピトープ残基であると同定される。ｍＡＲＥＧにおけるアミノ酸Ｋ１４９及びＮ１６４（ｈＡＲＥＧ番号に基づく）は、本発明に係る抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片がｍＡＲＥＧとの交差反応性を欠く原因となる残基であり、１６４Ｎ残基は最も重要である。
好ましくは、前記単離されたＡＲＥＧタンパク質は、アミノ酸Ｇｌｕ１４９（ｈＡＲＥＧ番号を使用する）及び／又はＨｉｓ１６４（ｈＡＲＥＧ番号を使用する）を有する。
別の態様では、本発明は、ｈＡＲＥＧと結合するとともにｍＡＲＥＧに対して交差反応性がないか又は弱い交差反応性を有する抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片を同定するために用いられる、本発明に係る単離されたＡＲＥＧタンパク質の用途を提供する。
定義：
本明細書で使用される際に、用語「ＡＲＥＧ」及び「Ａｒｅｇ」は、「アンフィレグリン」（Ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）又はアンフィレグリンをコードする遺伝子を意味し、交換して使用することができる。「ＡＲＥＧ（Ａｒｅｇ）」は上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーのメンバーであり、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）の低親和性リガンドである。明細書において特に断りのない限り、「ＡＲＥＧ（Ａｒｅｇ）」はヒトＡＲＥＧ（Ａｒｅｇ）を意味する。ＥＧＦＲがＡＲＥＧに結合すると、細胞の生存、増殖及び運動を制御する主な細胞内のシグナル伝達カスケードが活性化される。ＡＲＥＧタンパク質は２５２個のアミノ酸の膜貫通前駆体（ｐｒｏ－ＡＲＥＧ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５）から合成され、前記前駆体はその細胞外ドメイン内に膜プロテアーゼ、主にＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７によってタンパク質分解的に切断され、それにより２種類の可溶性形態のＡＲＥＧタンパク質が放出され、そのうちの大きい方はｐｒｏ－ＡＲＥＧの１０１～１８４残基（ＳＶＲＶＥＱＶＶＫＰＰＱＮＫＴＥＳＥＮＴＳＤＫＰＫＲＫＫＫＧＧＫ ＮＧＫＮＲＲＮＲＫＫＫＮＰＣＮＡＥＦＱＮＦＣＩＨＧＥＣＫＹＩＥＨＬＥＡＶＴＣＫＣＱＱＥＹＦＧＥＲＣＧＥＫ）に対応し、短い方はｐｒｏ－ＡＲＥＧの１０７－１８４残基（長さが７８個の残基）に対応する。ＡＲＥＧタンパク質はヘパリン結合ドメイン（ｐｒｏ－ＡＲＥＧの１０１－１４３残基に対応し、ＳＶＲＶＥＱＶＶＫＰＰＱＮＫＴＥＳＥＮＴＳＤＫＰＫＲＫＫＫＧＧＫＮ ＧＫＮＲＲＮＲＫ）及びＥＧＦ様ドメイン（ｐｒｏ－ＡＲＥＧの１４４－１８４残基に対応し、ＫＫＮＰＣＮＡＥＦＱＮＦＣＩＨＧＥＣＫＹＩＥＨ ＬＥＡＶＴＣＫＣＱＱＥＹＦＧＥＲＣＧＥＫ）を含有する。Ｐｒｏ－ＡＲＥＧは接触分泌モードで隣接する細胞上のＥＧＦＲを活性化し、可溶性形態のＡＲＥＧは自己分泌又は傍分泌モードでＥＧＦＲを活性化する。
本明細書で使用される際に、用語「ＡＲＥＧ」及び「Ａｒｅｇ」は、「アンフィレグリン」（Ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）又はアンフィレグリンをコードする遺伝子を意味し、交換して使用することができる。「ＡＲＥＧ（Ａｒｅｇ）」は上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーのメンバーであり、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）の低親和性リガンドである。明細書において特に断りのない限り、「ＡＲＥＧ（Ａｒｅｇ）」はヒトＡＲＥＧ（Ａｒｅｇ）を意味する。ＥＧＦＲがＡＲＥＧに結合すると、細胞の生存、増殖及び運動を制御する主な細胞内のシグナル伝達カスケードが活性化される。ＡＲＥＧタンパク質は２５２個のアミノ酸の膜貫通前駆体（ｐｒｏ－ＡＲＥＧ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５）から合成され、前記前駆体はその細胞外ドメイン内に膜プロテアーゼ、主にＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７によってタンパク質分解的に切断され、それにより２種類の可溶性形態のＡＲＥＧタンパク質が放出され、そのうちの大きい方はｐｒｏ－ＡＲＥＧの１０１～１８４残基（ＳＶＲＶＥＱＶＶＫＰＰＱＮＫＴＥＳＥＮＴＳＤＫＰＫＲＫＫＫＧＧＫ ＮＧＫＮＲＲＮＲＫＫＫＮＰＣＮＡＥＦＱＮＦＣＩＨＧＥＣＫＹＩＥＨＬＥＡＶＴＣＫＣＱＱＥＹＦＧＥＲＣＧＥＫ）に対応し、短い方はｐｒｏ－ＡＲＥＧの１０７－１８４残基（長さが７８個の残基）に対応する。ＡＲＥＧタンパク質はヘパリン結合ドメイン（ｐｒｏ－ＡＲＥＧの１０１－１４３残基に対応し、ＳＶＲＶＥＱＶＶＫＰＰＱＮＫＴＥＳＥＮＴＳＤＫＰＫＲＫＫＫＧＧＫＮ ＧＫＮＲＲＮＲＫ）及びＥＧＦ様ドメイン（ｐｒｏ－ＡＲＥＧの１４４－１８４残基に対応し、ＫＫＮＰＣＮＡＥＦＱＮＦＣＩＨＧＥＣＫＹＩＥＨ ＬＥＡＶＴＣＫＣＱＱＥＹＦＧＥＲＣＧＥＫ）を含有する。Ｐｒｏ－ＡＲＥＧは接触分泌モードで隣接する細胞上のＥＧＦＲを活性化し、可溶性形態のＡＲＥＧは自己分泌又は傍分泌モードでＥＧＦＲを活性化する。
本明細書で使用される際に、具体的な数のない指示対象（「ａ」及び「ａｎ」）は、一つ又は一つを超えた（例えば少なくとも一つ）の指示対象物を意味する。
文脈上明らかに別段の指示がない限り、用語「又は」は本明細書において用語「及び／又は」を意味するために用いられ、それと交換して使用することができる。
「約」及び「ほぼ」は、一般的には、所定の測定特性や精度がある場合に測定された量の許容誤差の程度を意味する。例示的な誤差の程度は、所定値又は値範囲の２０パーセント（％）以内であり、一般的には１０％以内であり、より一般的には５％以内である。
本明細書において、細胞、ポリヌクレオチド例えばＤＮＡ又はＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドを指示する場合、「単離された」という用語は、その原始又は元来の環境（例えば、天然に存在するものであれば、天然環境とされる）から取り出された材料を意味する。例えば、生きている動物に存在する天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されないが、人間の介入により天然システムにおけるいくつか又は全ての共存材料から分離された同一のポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されたものである。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であってもよく、及び／又は、このようなポリヌクレオチド又はポリペプチドは組成物の一部であってもよく、しかも依然として単離されたものであり、したがって、このようなベクター又は組成物はそれが自然界においてその中に存在する環境の一部ではない。単離されたポリヌクレオチドはそれぞれ前記大分子の天然由来に存在する他のＤＮＡ又はＲＮＡと分離された分子を意味する。単離されたポリペプチドは精製及び組換えのポリペプチドの両方を含むことを意図する。
本明細書に開示された製品及び方法は、指定された配列又は前記指定された配列と同一又は類似する配列、例えばそれと少なくとも約８５％又は９５％の配列同一性（同一の）配列を有するポリペプチド及びポリヌクレオチドを含む。アミノ酸配列の場合、「８５％又は９５％の配列同一性（同一の）」という用語は、本明細書において、第１のアミノ酸配列が第２のアミノ酸配列中の整列されたアミノ酸残基ｉ）と同じであるか又はｉｉ）保存的に置換された十分な数又は最少数のアミノ酸残基を含有することにより、前記第１のアミノ酸配列及び第２のアミノ酸配列が共通のドメイン及び／又は共通の機能活性を有することができることを指示するために用いられる。例えば、共通のドメインを含有するアミノ酸配列と参照配列、例えば本明細書に提供される配列は少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。
ヌクレオチド配列の場合、「８５％又は９５％の配列同一性（同一の）」という用語は、本明細書において、第１の核酸配列が第２の核酸配列中の整列されたヌクレオチドと同じである十分な数又は最少数のヌクレオチドを含有することにより、前記第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列が共通の機能活性を有するポリペプチドをコードしたり、共通の構造性ポリペプチドドメイン又は共通の機能性ポリペプチド活性をコードしたりすることを指示するために用いられる。例えば、ヌクレオチド配列と参照配列、例えば本明細書に提供される配列は少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。
２つのアミノ酸配列又は核酸配列の同一性パーセントを特定するために、最適な比較の目的で前記配列を整列させる（例えば、最適な整列のために、第１のアミノ酸又は核酸配列及び第２のアミノ酸又は核酸配列のうちの一方又は両方にギャップを導入することができ、しかも比較の目的で非相同配列を無視することができる）。好ましい実施形態において、比較の目的で、整列された参照配列の長さは前記参照配列の長さの少なくとも３０％であり、例えば少なくとも４０％、５０％、６０％であり、例えば少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書において交換して使用することができ、任意の長さのアミノ酸ポリマーを意味する。
「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」又は「ポリヌクレオチド配列」及び「ポリヌクレオチド」は交換して使用することができる。
本明細書で使用される際に、「抗体又は抗体分子」という用語は、少なくとも一つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質を意味し、例えば免疫グロブリン鎖又はその断片である。「抗体分子」という用語は、例えば、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する全長抗体を含む）を含む。一実施形態において、抗体分子は全長抗体又は全長免疫グロブリン鎖を含む。一実施形態において、抗体分子は全長抗体又は全長免疫グロブリン鎖の抗原結合又は機能性断片を含む。本明細書で使用される際に、抗体分子は抗原と「結合」し、このような結合は当業者に理解される。一実施形態において、抗体は抗原と結合し、その解離定数（ＫＤ）は約１×１０-5Ｍ以下であり、１×１０-6Ｍ以下であり、又は１×１０-7Ｍ以下であり、１×１０-8Ｍ以下であり、１×１０-9Ｍ以下であり、１×１０-10Ｍ以下であり、１×１０-11Ｍ以下である。
例えば、抗体分子は重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列（本明細書においてＶＨと略称する）及び軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列（本明細書においてＶＬと略称する）を含むことができる。一実施形態において、抗体分子は重鎖及び軽鎖を含み、又はそれらで構成される。別の実施形態において、抗体分子は２つの重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列及び２つの軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列を含み、それにより２つの抗原結合部位、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、単一可変ドメイン抗体、ダイアボディ（Ｄａｂ）（二価及び二重特異性）及びキメラ（例えばヒト化）抗体が形成され、それらは完全な抗体又は組換えＤＮＡ技術を使用して合成された抗体の修飾により生成することができる。これらの機能性抗体断片は、それらに対応する抗原又は受容体と特異的に結合する能力が保たれている。抗体及び抗体断片は、任意の種類の抗体に由来してもよく、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥを含むがこれらに限定されず、かつ任意の抗体サブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）に由来してもよい。抗体分子の製造物は、モノクローナル又はポリクローナルであってもよい。抗体分子は、ヒト、ヒト化、ＣＤＲ移植又はインビトロで生成された抗体であってもよい。前記抗体は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域を有していてもよい。前記抗体は、例えばκ又はλから選択される軽鎖を有していてもよい。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書において、「抗体」という用語と交換して使用することができる。
本明細書で使用される際に、「抗体断片」又は「抗原結合断片」という用語は抗体の一部であり、例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等である。抗体断片は、完全抗体により認識される同一の抗原と結合する。「抗体断片」という用語にはアプタマー、スピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）及びダイアボディが含まれる。また、「抗体断片」という用語には、特定の抗原と結合して複合体を形成することにより、抗体と同様に作用する合成または遺伝子工学的に改造されたタンパク質も含まれる。
抗体分子の抗原結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片であって、ＶＬ、ＶＨ、ＣＫ及びＣＨドメインで構成された一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）2断片であって、ヒンジ領域にジスルフィド結合によって接続された２つのＦａｂ断片の二価断片を含むもの、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片であって、ＶＨ及びＣＨドメインで構成されるもの、（ｉｖ）Ｆｖ断片であって、抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインで構成されるもの、（ｖ）ダイアボディ（ｄＡｂ）断片であって、ＶＨドメインで構成されるもの、（ｖｉ）ラクダ又はラクダ化（ｃａｍｅｌｉｄ ｏｒ ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）可変ドメイン、（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、（ｖｉｉｉ）単一ドメイン抗体が含まれる。これらの抗体断片は当業者に知られている一般的な技術を含む任意の適切な方法で得ることができ、前記断片は完全な抗体と同じ方式で用途をスクリーニングすることができる。また、「抗体断片」という用語には、特定の抗原と結合して複合体を形成することにより、抗体と同様に作用する任意の合成または遺伝子工学的に改造されたタンパク質も含まれる。
「一本鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」は、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質を意味する。いくつかの場合、前記領域は１０個～約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドで連結される。前記リンカーはグリシンに富むことにより柔軟性が得られ、セリン又はトレオニンに富むことにより溶解性が得られ、そしてＶＨのＮ－末端とＶＬのＣ－末端を接続することができ、逆にもよい。定常領域を除去するとともにリンカーを導入したが、このようなタンパク質は元の免疫グロブリンの特異性が保持されている。ＳｃＦｖ分子は当分野において既知である。
軽鎖と重鎖とは、「定常」領域と「可変」領域とに分けられる。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）部分の両方の可変ドメインは抗原識別及び特異性を決定する。逆に、軽鎖（ＣＫ）及び重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的性質を提供する。Ｎ－末端部分は可変領域であり、Ｃ－末端部分は定常領域である。ＣＨ３及びＣＫドメインは実際にそれぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシル末端を含む。
可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に識別するとともに特異的に結合することを許容する。抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメイン又は相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットの組み合わせにより、三次元抗原結合部位を定義する可変領域が形成される。この四次抗体構造は、各Ｙアームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、各ＶＨ及びＶＫ鎖上の三つのＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）により定義される。
本明細書で使用される際に、「相補性決定領域」及び「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変領域内において抗原特異性及び結合親和性を付与するアミノ酸配列を意味する。いくつかの実施形態において、各重鎖可変領域に三つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）が存在し、各軽鎖可変領域に三つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）が存在する。
特定のＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔら（１９９１）、『免疫学的に重要なタンパク質の配列』（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤに記述された手段（「Ｋａｂａｔ」番号付け手段）を含む、任意の周知の手段を使用して特定することができる。
各ＶＨ及びＶＬは、一般的に、三つのＣＤＲ及び四つのＦＲを含み、それらはアミノ基端からカルボキシル基端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で配列される。
「被検者」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」は、診断、予後又は治療を必要とする任意の被検者、特に哺乳動物被検者を意味する。哺乳動物被検者は、ヒト、馴養動物、農場動物、及び動物園、スポーツ又はペット動物を含み、例えば犬、猫、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、馬、牛、乳牛等である。
本明細書で使用される際に、例えば「治療を必要とする患者」又は「治療を必要とする被検者」という語句は、例えば、検出、診断手順及び／又は治療のための本開示の抗体又は組成物の投与から利益を得た被検者、例えば哺乳動物被検者を含む。
本明細書で使用される際に、「エピトープ」という用語は、抗原（例えば、ヒトＡＲＥＧ（ｈＡＲＥＧ））における、抗体分子と特異的に相互作用する構成部分を意味する。このような構成部分、本明細書においてエピトープ決定基とも呼ばれ、一般的に、アミノ酸側鎖又は糖側鎖のような素子、又は前記素子の一部を含む。エピトープ決定基は、本分野で知られているか又は本明細書に開示されている方法によって、例えば結晶学又は突然変異誘発によって定義することができる。エピトープ決定基と特異的に相互作用する抗体分子上の少なくとも一つ又はいくつかの構成部分は一般的にＣＤＲ上に位置する。一般的に、エピトープは特定の三次元構造特徴を有する。一般的に、エピトープは特定の電荷特徴を有する。いくつかのエピトープは線状エピトープであり、他のエピトープはコンフォメーションエピトープである。
本明細書で使用される際に、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成物の抗体調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性と親和性を示す。モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術によって、又はハイブリドーマ技術を使用しない方法（例えばライブラリー選択及びスクリーニング又は組換え方法）によって製造することができる。
前記抗体分子は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体であってもよい。他の実施形態において、前記抗体は組換えて生成することができ、例えば酵母ディスプレイ、ファージディスプレイ又はコンビナトリアル法によって生成される。
一実施形態において、前記抗体は、完全ヒト抗体（例えば酵母ディスプレイにより生成された抗体、ファージディスプレイにより生成された抗体又は遺伝子工学によって改造されてヒト免疫グロブリン配列から抗体を生成するマウスで製造された抗体）、又は非ヒトんｇ抗体例えばネズミ類（マウス又はラット）、ヤギ、霊長動物（例えばサル）又はラクダ抗体である。げっ歯動物抗体を生成する方法は当分野で知られている。
ヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫グロブリン遺伝子を持つトランスジェニックマウスを使用して生成することができる。関心のある抗原で免疫されたこれらのランスジェニックマウスからの脾臓細胞を使用して、ヒトタンパク質からのエピトープに対して特異的親和性を有するヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマを生成する。
抗体は、可変領域又はその一部、例えばＣＤＲが非ヒト生体、例えばラット又はマウスにおいて生成される抗体であってもよい。キメラ、ＣＤＲグラフト及びヒト化抗体は本発明の範囲内にある。非ヒト生体、例えばラット又はマウスにおいて生成され、その後に、例えば可変フレームワーク又は定常領域で修飾されることによりヒトにおける抗原性を低下させる抗体は、本発明の範囲内にある。
ヒト化又はＣＤＲグラフト抗体は、少なくとも一つ又は二つ、一般的には全ての三つの受容体ＣＤＲ（免疫グロブリン重鎖又は軽鎖）がドナーＣＤＲに置き換えられる。前記抗体は、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で置き換えられてもよく、又はいくつかのＣＤＲのみが非ヒトＣＤＲで置き換えられてもよい。ヒト化抗体とＡＲＥＧとの結合に必要な数のＣＤＲを置き換えればよい。いくつかの実施形態において、ドナーは、ネズミ類抗体、例えばラット又はマウス抗体であり、受容体はヒトフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークである。一般的に、前記ＣＤＲを提供する免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、前記フレームワークを提供する免疫グロブリンは「受容体」と呼ばれる。一実施形態において、前記ドナー免疫グロブリンは非ヒト（例えばネズミ類）である。前記受容体フレームワークは天然に存在する（例えばヒト）フレームワーク又はコンセンサスフレームワークであり、又はそれと約８５％又はそれ以上例えば９０％、９５％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列である。
抗体は、当分野で知られている方法によりヒト化することができる。ヒト化又はＣＤＲグラフト抗体はＣＤＲグラフト又はＣＤＲ置換により生成することができ、ここで、免疫グロブリン鎖の１つ、２つ又は全てのＣＤＲを置換することができる。
本発明の範囲内には、特定のアミノ酸が置換、欠失又は添加されたヒト化抗体がさらに含まれる。ドナーからアミノ酸を選択する標準はＵＳ ５，５８５，０８９、例えばＵＳ５，５８５，０８９の第１２－１６欄に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。抗体をヒト化するための他の技術は１９９２年１２月２３日に出版されたＰａｄｌａｎら、ＥＰ ５１９５９６ Ａ１に記載されている。
他の実施形態において、前記抗体分子は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ及びＩｇＥの重鎖定常領域、特に、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４（例えばヒト）の重鎖定常領域から選択される重鎖定常領域を有する。
抗体定常領域を変更する方法は、当分野において知られている。変更された機能、例えばエフェクターリガンド例えば細胞上のＦｃＲや補体のＣ１成分に対して変更された親和性を有する抗体は、抗体の定常部分中の少なくとも一つのアミノ酸残基を異なる残基で置き換えることにより生成することができる（例えば、ＥＰ ３８８，１５１ Ａ１、米国特許番号５，６２４，８２１及び米国特許番号５，６４８，２６０を参照、全てのこれらの文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる）。抗体構造を安定させるアミノ酸の突然変異、例えばヒトＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ（Ｅｕ番号）も想定されている。
本発明の分子は、それらの機能に有意な影響を及ぼさない追加の保存的又は非必須のアミノ酸置換を有する可能性があることが理解されるであろう。
「保存的」アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられた置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは本分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β－分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。保存的アミノ酸置換は以下のとおりである。
特定の実施形態及び実施例の説明は、限定ではなく例示として挙げられるものである。当業者であれば、実質的に類似した結果を生成するように変更又は修正された様々な異なる非重要なパラメータを容易に認識することができる。
実施例
実施例
実施例１．ファージライブラリーからのＡＲＥＧに対するヒトｍＡｂの生成
１．ライブラリーの選択及びスクリーニングに用いられる可溶性ＡＲＥＧタンパク質又はペプチドの製造
３つの形態のＡＲＥＧタンパク質（以下に列挙される）をコードするＤＮＡ配列を原核発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ）にクローニングし、Ｎ－末端タグ（Ｈｉｓ6、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼ切断部位及びＡｖｉタグ）付きの融合タンパク質として発現させる。前記タンパク質は、ＩＰＴＧ誘導により大腸菌（ＴｒａｎｓＢ）で発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡビーズを使用して細胞ライセートの上清から精製し、ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼで切断し、その後にＢｉｒＡ酵素でビオチン化する。
前記３つのＡＲＥＧタンパク質は以下のとおりである。
・ｈＡＲＥＧ：ヒトｐｒｏ－ＡＲＥＧの１０１～１８４残基を含みかつＮ－末端ＡＶＩタグ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）付きのヒトＡＲＥＧ。ｈＡＲＥＧの１０１～１８４残基のアミノ酸配列は、ＳＶＲＶＥＱＶＶＫＰＰＱＮＫＴＥＳＥＮＴＳＤＫＰＫＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＮＲＲＮＲＫＫＫＮＰＣＮＡＥＦＱＮＦＣＩＨＧＥＣＫＹＩＥＨＬＥＡＶＴＣＫＣＱＱＥＹＦＧＥＲＣＧＥＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２９）である。
・ｍＡＲＥＧ：マウスｐｒｏ－ＡＲＥＧの９４～１７７残基を含みかつＮ－末端ＡＶＩタグ付きのマウスＡＲＥＧ。アミノ酸配列は、ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＧＧＧＧＳＧ ＧＳＶＲＶＥＱＶＩＫＰＫＫＮＫＴＥＧＥＫＳＴＥＫＰＫＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＧＲＲＮＫＫＫＫＮＰＣＴＡＫＦＱＮＦＣＩＨＧＥＣＲＹＩＥＮＬＥＶＶＴＣＮＣＨＱＤＹＦＧＥＲＣＧＥＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３０）である。
・ｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ：マウスＡＲＥＧのＥＧＦ様ドメインであり、それはマウスＰｒｏ－ＡＲＥＧの１３５～１７７残基を含みかつＮ－末端ＡＶＩタグが付いている。ｍＡｒｅｇの１３５～１７７残基のアミノ酸配列は、ＫＫＮＰＣＴＡＫＦＱＮＦＣＩＨＧＥＣＲＹＩＥＮＬＥＶＶＴ ＣＮＣＨＱＤＹＦＧＥＲＣＧＥＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３１）である。
また、ビオチン化ペプチドＣ１８（北京中科亜光生物科技有限公司（Ｓｃｉｌｉｇｈｔ－ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ））が合成された。Ｃ１８は、ヒトＡＲＥＧのＣ－末端の１４個のアミノ酸（１７１～１８４残基）を含みかつＮ－末端にリンカー（残基ＧＳＳＧ）を含む。Ｃ１８の配列は、ＧＳＳＧＫＣＱＱＥＹＦＧＥＲＣＧＥＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３２）である。
１．ライブラリーの選択及びスクリーニングに用いられる可溶性ＡＲＥＧタンパク質又はペプチドの製造
３つの形態のＡＲＥＧタンパク質（以下に列挙される）をコードするＤＮＡ配列を原核発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ）にクローニングし、Ｎ－末端タグ（Ｈｉｓ6、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼ切断部位及びＡｖｉタグ）付きの融合タンパク質として発現させる。前記タンパク質は、ＩＰＴＧ誘導により大腸菌（ＴｒａｎｓＢ）で発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡビーズを使用して細胞ライセートの上清から精製し、ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼで切断し、その後にＢｉｒＡ酵素でビオチン化する。
前記３つのＡＲＥＧタンパク質は以下のとおりである。
・ｈＡＲＥＧ：ヒトｐｒｏ－ＡＲＥＧの１０１～１８４残基を含みかつＮ－末端ＡＶＩタグ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）付きのヒトＡＲＥＧ。ｈＡＲＥＧの１０１～１８４残基のアミノ酸配列は、ＳＶＲＶＥＱＶＶＫＰＰＱＮＫＴＥＳＥＮＴＳＤＫＰＫＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＮＲＲＮＲＫＫＫＮＰＣＮＡＥＦＱＮＦＣＩＨＧＥＣＫＹＩＥＨＬＥＡＶＴＣＫＣＱＱＥＹＦＧＥＲＣＧＥＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２９）である。
・ｍＡＲＥＧ：マウスｐｒｏ－ＡＲＥＧの９４～１７７残基を含みかつＮ－末端ＡＶＩタグ付きのマウスＡＲＥＧ。アミノ酸配列は、ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＧＧＧＧＳＧ ＧＳＶＲＶＥＱＶＩＫＰＫＫＮＫＴＥＧＥＫＳＴＥＫＰＫＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＧＲＲＮＫＫＫＫＮＰＣＴＡＫＦＱＮＦＣＩＨＧＥＣＲＹＩＥＮＬＥＶＶＴＣＮＣＨＱＤＹＦＧＥＲＣＧＥＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３０）である。
・ｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ：マウスＡＲＥＧのＥＧＦ様ドメインであり、それはマウスＰｒｏ－ＡＲＥＧの１３５～１７７残基を含みかつＮ－末端ＡＶＩタグが付いている。ｍＡｒｅｇの１３５～１７７残基のアミノ酸配列は、ＫＫＮＰＣＴＡＫＦＱＮＦＣＩＨＧＥＣＲＹＩＥＮＬＥＶＶＴ ＣＮＣＨＱＤＹＦＧＥＲＣＧＥＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３１）である。
また、ビオチン化ペプチドＣ１８（北京中科亜光生物科技有限公司（Ｓｃｉｌｉｇｈｔ－ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ））が合成された。Ｃ１８は、ヒトＡＲＥＧのＣ－末端の１４個のアミノ酸（１７１～１８４残基）を含みかつＮ－末端にリンカー（残基ＧＳＳＧ）を含む。Ｃ１８の配列は、ＧＳＳＧＫＣＱＱＥＹＦＧＥＲＣＧＥＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３２）である。
２．ファージディスプレイ抗体ライブラリーからの抗体の選択及び更なる特徴付け
ファージディスプレイ抗体ライブラリー
９３人の健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からヒト非免疫ｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）抗体ライブラリーを構築した。前記ライブラリーは合計で１．１×１０10個のメンバーの大きさを有する（Ｌｉら、２０１７）。
ファージディスプレイ抗体ライブラリー
９３人の健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からヒト非免疫ｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）抗体ライブラリーを構築した。前記ライブラリーは合計で１．１×１０10個のメンバーの大きさを有する（Ｌｉら、２０１７）。
ファージ抗体ライブラリーの選択及びスクリーニング
前記ライブラリーからｓｃＦｖを表面に発現するファージ粒子（ファージ－ＳｃＦｖ）を製造し、それをビオチン化されたＡＲＥＧタンパク質及びペプチドを含む標的抗原に対してｓｃＦｖｓを選択するために用いる。前記抗原をストレプトアビジンで結合された磁性Ｍ－２８０ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に捕捉し、その後に前記ライブラリーから調製された５×１０12個のファージ粒子とインキュベートする。各可溶性ＡＲＥＧタンパク質又はペプチド（抗原、Ａｂ）に対して、２ラウンドの選択を行う。ｈＡＲＥＧ及びｍＡＲＥＧの両者を識別する交差反応性ヒトｍＡｂを取得するために、ｈＡＲＥＧとｍＡＲＥＧをそれぞれ１ラウンド目と２ラウンド目の選択に用いる。２ラウンド目の選択後、ＥＬＩＳＡを使用して、ｈＡＲＥＧ及びｍＡＲＥＧの両者に対する交差結合活性について約４００個のファージ－Ａｂクローンをスクリーニングし、交差結合活性を有するか又はｈＡＲＥＧに対して高い結合親和性を有するクローンを選択して配列決定分析に用いて、重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）可変領域を含む異なる抗体配列を有するクローンを同定する。その後にいくつかのファージ－ＡｂをヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）又はマウスＩｇＧ２ａフォーマットに変換し、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又はＢｉａｃｏｒｅを使用してｈＡＲＥＧ及びｍＡＲＥＧの両者との結合を分析する。
前記ライブラリーからｓｃＦｖを表面に発現するファージ粒子（ファージ－ＳｃＦｖ）を製造し、それをビオチン化されたＡＲＥＧタンパク質及びペプチドを含む標的抗原に対してｓｃＦｖｓを選択するために用いる。前記抗原をストレプトアビジンで結合された磁性Ｍ－２８０ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に捕捉し、その後に前記ライブラリーから調製された５×１０12個のファージ粒子とインキュベートする。各可溶性ＡＲＥＧタンパク質又はペプチド（抗原、Ａｂ）に対して、２ラウンドの選択を行う。ｈＡＲＥＧ及びｍＡＲＥＧの両者を識別する交差反応性ヒトｍＡｂを取得するために、ｈＡＲＥＧとｍＡＲＥＧをそれぞれ１ラウンド目と２ラウンド目の選択に用いる。２ラウンド目の選択後、ＥＬＩＳＡを使用して、ｈＡＲＥＧ及びｍＡＲＥＧの両者に対する交差結合活性について約４００個のファージ－Ａｂクローンをスクリーニングし、交差結合活性を有するか又はｈＡＲＥＧに対して高い結合親和性を有するクローンを選択して配列決定分析に用いて、重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）可変領域を含む異なる抗体配列を有するクローンを同定する。その後にいくつかのファージ－ＡｂをヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）又はマウスＩｇＧ２ａフォーマットに変換し、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又はＢｉａｃｏｒｅを使用してｈＡＲＥＧ及びｍＡＲＥＧの両者との結合を分析する。
３．全長抗体の製造
ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬコード配列をそれぞれ抗体重鎖（ＨＣ）発現ベクター（プラスミド）及び軽鎖（ＬＣ）発現ベクター（プラスミド）にサブクローニングする。全長抗体を製造するために、２９３Ｆ細胞を２種類の発現プラスミド（ＨＣ＋ＬＣプラスミド）で１：１の比率で一過性に同時トランスフェクトする。トランスフェクションの６日後、細胞培養上清を採取し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより抗体を精製する。
ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬコード配列をそれぞれ抗体重鎖（ＨＣ）発現ベクター（プラスミド）及び軽鎖（ＬＣ）発現ベクター（プラスミド）にサブクローニングする。全長抗体を製造するために、２９３Ｆ細胞を２種類の発現プラスミド（ＨＣ＋ＬＣプラスミド）で１：１の比率で一過性に同時トランスフェクトする。トランスフェクションの６日後、細胞培養上清を採取し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより抗体を精製する。
４．ＥＬＩＳＡ測定
リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ、４μｇ／ｍＬ）を１ウェル当たり１００μＬの量でＵ底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、ＭａｘｉＳｏｒｐTM）に４℃で一晩又は３７℃で１時間コーティングする。次いで、約０．５μｇ／ｍＬのＡＲＥＧタンパク質又はペプチドを１ウェル当たり１００μＬの量で、３０℃で１時間インキュベートすることによりプレートに捕捉する。ファージ－ｓｃＦｖに基づくＥＬＩＳＡについては、１ウェル当たり１００μＬの量で各ウェルに２％の無脂肪乳を含有するＰＢＳに段階希釈されたファージ－ｓｃＦｖを添加する。ＨＲＰ結合マウス抗Ｍ１３抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を添加して３０℃で３０ｍｉｎインキュベートすることにより、特異的に結合したファージ－ｓｃＦｖを検出する。各インキュベーションステップの間に、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴ溶液（０．０５％のツイーン２０を含有するＰＢＳ）で１ウェル当たり３００μＬの量で６回洗浄する。ＨＲＰ結合抗体のインキュベーション後、ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ）と３０℃で５－１０ｍｉｎインキュベートすることによりＥＬＩＳＡシグナルを生成し、次いで１ウェル当たり５０μＬの２Ｍ Ｈ2ＳＯ4を使用して反応を停止させる。マイクロプレートリーダ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で４５０ｎｍでの吸光度を読み取り、校正波長を６３０ｎｍに設定する。ＩｇＧに基づくＥＬＩＳＡについては、方法は基本的に上記のファージ－ｓｃＦｖの説明と同じであり、相違点は結合された抗体がＨＲＰ結合マウス抗Ｆｃ第二抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により検出されることである。
リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ、４μｇ／ｍＬ）を１ウェル当たり１００μＬの量でＵ底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、ＭａｘｉＳｏｒｐTM）に４℃で一晩又は３７℃で１時間コーティングする。次いで、約０．５μｇ／ｍＬのＡＲＥＧタンパク質又はペプチドを１ウェル当たり１００μＬの量で、３０℃で１時間インキュベートすることによりプレートに捕捉する。ファージ－ｓｃＦｖに基づくＥＬＩＳＡについては、１ウェル当たり１００μＬの量で各ウェルに２％の無脂肪乳を含有するＰＢＳに段階希釈されたファージ－ｓｃＦｖを添加する。ＨＲＰ結合マウス抗Ｍ１３抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を添加して３０℃で３０ｍｉｎインキュベートすることにより、特異的に結合したファージ－ｓｃＦｖを検出する。各インキュベーションステップの間に、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴ溶液（０．０５％のツイーン２０を含有するＰＢＳ）で１ウェル当たり３００μＬの量で６回洗浄する。ＨＲＰ結合抗体のインキュベーション後、ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ）と３０℃で５－１０ｍｉｎインキュベートすることによりＥＬＩＳＡシグナルを生成し、次いで１ウェル当たり５０μＬの２Ｍ Ｈ2ＳＯ4を使用して反応を停止させる。マイクロプレートリーダ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で４５０ｎｍでの吸光度を読み取り、校正波長を６３０ｎｍに設定する。ＩｇＧに基づくＥＬＩＳＡについては、方法は基本的に上記のファージ－ｓｃＦｖの説明と同じであり、相違点は結合された抗体がＨＲＰ結合マウス抗Ｆｃ第二抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により検出されることである。
５．親和性及び可溶性を向上させるためのＥ１Ｌ２抗体のエンジニアリング改造
Ｅ１Ｌ２抗体の親和性を向上させるために、Ｅ１Ｌ２のＶＨ－ＣＤＲ３及びＶＬ－ＣＤＲ３に対してそれぞれエンジニアリング改造を行う。ＶＨ－ＣＤＲ３については、Ｅ１Ｌ２のＨＣＤＲ３に対してランダムな突然変異を有するファージディスプレイサブライブラリーを構築した。抗体サブライブラリーの選択及びスクリーニングは、ＡＲＥＧに対する抗体ライブラリーのスクリーニングについて上述したのと同様に行った。高親和性ヒットを得るために、Ｅ１Ｌ２全長ｍＡｂによる競合的溶出を使用した。次いで、単一のクローンを選び出し救出し、細菌培養上清にファージ－ｓｃＦｖを生成し、ｈＡＲＥＧとの結合をスクリーニングするために用いられる。Ｅ１Ｌ２よりも結合親和性の高いヒットのみを保留する。ＶＬ－ＣＤＲ３については、構造モデリングに基づく特定のアミノ酸変異を使用してエンジニアリング改造を行う。可溶性を向上させるために、前記エンジニアリング改造されたＥ１Ｌ２のＶＬ ＣＤＲをヒトＩＧＬＶ１－４４＊０１生殖系列にグラフトした。
Ｅ１Ｌ２抗体の親和性を向上させるために、Ｅ１Ｌ２のＶＨ－ＣＤＲ３及びＶＬ－ＣＤＲ３に対してそれぞれエンジニアリング改造を行う。ＶＨ－ＣＤＲ３については、Ｅ１Ｌ２のＨＣＤＲ３に対してランダムな突然変異を有するファージディスプレイサブライブラリーを構築した。抗体サブライブラリーの選択及びスクリーニングは、ＡＲＥＧに対する抗体ライブラリーのスクリーニングについて上述したのと同様に行った。高親和性ヒットを得るために、Ｅ１Ｌ２全長ｍＡｂによる競合的溶出を使用した。次いで、単一のクローンを選び出し救出し、細菌培養上清にファージ－ｓｃＦｖを生成し、ｈＡＲＥＧとの結合をスクリーニングするために用いられる。Ｅ１Ｌ２よりも結合親和性の高いヒットのみを保留する。ＶＬ－ＣＤＲ３については、構造モデリングに基づく特定のアミノ酸変異を使用してエンジニアリング改造を行う。可溶性を向上させるために、前記エンジニアリング改造されたＥ１Ｌ２のＶＬ ＣＤＲをヒトＩＧＬＶ１－４４＊０１生殖系列にグラフトした。
６．ヒトｍＡｂ親和性のＳＰＲ測定
ヒトｍＡｂの親和性を評価するために、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用してＳＰＲ測定を行った。ｍＡｂを抗ヒトＦｃ ＣＭ５バイオセンサチップの表面に捕捉し、ｍＦｃタグと融合したｈＡＲＥＧ（１４２～１８４のアミノ酸）又はｍＡＲＥＧ（１３５～１７７のアミノ酸）のＥＧＦドメイン（ｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃ又はｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃ）と前記ｍＡｂとの結合を調べた。段階希釈された融合タンパク質を抗体が結合された表面に注入し、続いて解離段階である。１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡ評価ソフトウェア、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して結合速度（Ｋａ）及び解離速度（Ｋｄ）を計算する。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｄ／ｋａの比率として算出される。
ヒトｍＡｂの親和性を評価するために、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用してＳＰＲ測定を行った。ｍＡｂを抗ヒトＦｃ ＣＭ５バイオセンサチップの表面に捕捉し、ｍＦｃタグと融合したｈＡＲＥＧ（１４２～１８４のアミノ酸）又はｍＡＲＥＧ（１３５～１７７のアミノ酸）のＥＧＦドメイン（ｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃ又はｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃ）と前記ｍＡｂとの結合を調べた。段階希釈された融合タンパク質を抗体が結合された表面に注入し、続いて解離段階である。１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡ評価ソフトウェア、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して結合速度（Ｋａ）及び解離速度（Ｋｄ）を計算する。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｄ／ｋａの比率として算出される。
７．結果
ファージライブラリーからＡＲＥＧに対するヒトｍＡｂ Ｅ１Ｌ２及びＰ７を生成する
上記ファージ抗体ライブラリーの選択及びＥＬＳＩＡスクリーニングを使用することにより、本発明者らはＣ１、Ｅ１Ｌ２、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７及びＰ１０抗ＡＲＥＧヒトｍＡｂを同定した。具体的には、それぞれ１ラウンド目及び２ラウンド目のライブラリー選択において大腸菌で発現したビオチン化ｈＡＲＥＧ及びｍＡＲＥＧタンパク質を使用することにより、本発明者らはＣ１抗体を同定した。１ラウンド目及び２ラウンド目にそれぞれビオチン化されたｈＡＲＥＧとビオチン化されたｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ（大腸菌で発現された）を使用することにより、本発明者らはＥ１Ｌ２抗体を同定した。ｈＡＲＥＧ由来のＣ１８ペプチドを２ラウンドのライブラリー選択の標的として使用することにより、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７及びＰ１０を同定した。このライブラリー選択からＥ１Ｌ２もスクリーニングした。これらの抗体のうち、結合特異性と、ｈＡＲＥＧ及びｍＡＲＥＧの両者に対する親和性に基づいて、Ｅ１Ｌ２及びＰ７抗体を選択してさらなる特徴付けに用いる。
ファージライブラリーからＡＲＥＧに対するヒトｍＡｂ Ｅ１Ｌ２及びＰ７を生成する
上記ファージ抗体ライブラリーの選択及びＥＬＳＩＡスクリーニングを使用することにより、本発明者らはＣ１、Ｅ１Ｌ２、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７及びＰ１０抗ＡＲＥＧヒトｍＡｂを同定した。具体的には、それぞれ１ラウンド目及び２ラウンド目のライブラリー選択において大腸菌で発現したビオチン化ｈＡＲＥＧ及びｍＡＲＥＧタンパク質を使用することにより、本発明者らはＣ１抗体を同定した。１ラウンド目及び２ラウンド目にそれぞれビオチン化されたｈＡＲＥＧとビオチン化されたｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ（大腸菌で発現された）を使用することにより、本発明者らはＥ１Ｌ２抗体を同定した。ｈＡＲＥＧ由来のＣ１８ペプチドを２ラウンドのライブラリー選択の標的として使用することにより、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７及びＰ１０を同定した。このライブラリー選択からＥ１Ｌ２もスクリーニングした。これらの抗体のうち、結合特異性と、ｈＡＲＥＧ及びｍＡＲＥＧの両者に対する親和性に基づいて、Ｅ１Ｌ２及びＰ７抗体を選択してさらなる特徴付けに用いる。
向上した親和性及び可溶性を有するＥ１Ｌ２由来の抗体Ｅ１Ｈ３Ｌ４の生成
ＶＨ－ＣＤＲ３及びＶＬ－ＣＤＲ３のエンジニアリング改造によりＥ１Ｌ２の結合親和性をさらに向上させた。エンジニアリング改造されたＥ１Ｌ２の可溶性はそのＶＬ－ＣＤＲをヒトＩＧＬＶ１－４４＊０１生殖系列にグラフトすることにより向上し、それにより抗体Ｅ１Ｈ３Ｌ４を生成した。Ｅ１Ｌ２と比較して、Ｅ１Ｈ３Ｌ４はＶＨ－ＣＤＲ３において３つのアミノ酸の変化があり、ＶＬ－ＣＤＲ３において４つのアミノ酸の変化がある。具体的には、Ｅ１Ｈ３Ｌ４のＶＨ－ＣＤＲ３における正確な１００－１００c位置（Ｋａｂａｔシステム）でのアミノ酸はＳＹＮＮであり、Ｅ１Ｌ２抗体においてそれらはＧＹＤＹである。Ｅ１Ｈ３Ｌ４のＶＬ－ＣＤＲ３における９３－９５a位置（Ｋａｂａｔシステム）でのアミノ酸はＫＮＮＫであり、Ｅ１Ｌ２抗体においてそれらはＳＧＬＮである。Ｅ１Ｌ２、Ｅ１Ｈ３Ｌ４及びＰ７のＣＤＲを表１に示す。Ｅ１Ｌ２、Ｅ１Ｈ３Ｌ４及びＰ７のＶＨ及びＶＬのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を表２に示す。
ＶＨ－ＣＤＲ３及びＶＬ－ＣＤＲ３のエンジニアリング改造によりＥ１Ｌ２の結合親和性をさらに向上させた。エンジニアリング改造されたＥ１Ｌ２の可溶性はそのＶＬ－ＣＤＲをヒトＩＧＬＶ１－４４＊０１生殖系列にグラフトすることにより向上し、それにより抗体Ｅ１Ｈ３Ｌ４を生成した。Ｅ１Ｌ２と比較して、Ｅ１Ｈ３Ｌ４はＶＨ－ＣＤＲ３において３つのアミノ酸の変化があり、ＶＬ－ＣＤＲ３において４つのアミノ酸の変化がある。具体的には、Ｅ１Ｈ３Ｌ４のＶＨ－ＣＤＲ３における正確な１００－１００c位置（Ｋａｂａｔシステム）でのアミノ酸はＳＹＮＮであり、Ｅ１Ｌ２抗体においてそれらはＧＹＤＹである。Ｅ１Ｈ３Ｌ４のＶＬ－ＣＤＲ３における９３－９５a位置（Ｋａｂａｔシステム）でのアミノ酸はＫＮＮＫであり、Ｅ１Ｌ２抗体においてそれらはＳＧＬＮである。Ｅ１Ｌ２、Ｅ１Ｈ３Ｌ４及びＰ７のＣＤＲを表１に示す。Ｅ１Ｌ２、Ｅ１Ｈ３Ｌ４及びＰ７のＶＨ及びＶＬのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を表２に示す。
ＣＤＲは、Ｋａｂａｔシステムを使用して定義される。
８．Ｅ１Ｈ３Ｌ４及びＰ７ｍＡｂのさらなる特徴付け
Ｅ１Ｈ３Ｌ４及びＰ７とｍＡＲＥＧとの結合を比較すると、Ｅ１Ｈ３Ｌ４はＰ７より僅かに強いｍＡＲＥＧとの結合を示す。予想されるように、前記２種類の抗体はいずれもＥＧＦドメイン内のＣ－末端ペプチド（Ｃ１８、１７１～１８４のアミノ酸）に結合され、前記Ｃ１８ペプチドがライブラリーの選択に使用される標的であるためである（図１）。
Ｅ１Ｈ３Ｌ４及びＰ７とｍＡＲＥＧとの結合を比較すると、Ｅ１Ｈ３Ｌ４はＰ７より僅かに強いｍＡＲＥＧとの結合を示す。予想されるように、前記２種類の抗体はいずれもＥＧＦドメイン内のＣ－末端ペプチド（Ｃ１８、１７１～１８４のアミノ酸）に結合され、前記Ｃ１８ペプチドがライブラリーの選択に使用される標的であるためである（図１）。
実施例２．マウスハイブリドーマ法を用いたＡＲＥＧに対するｍＡｂの生成及び前記マウスｍＡｂのヒト化
１．マウスの免疫またはＳＰＲ分析のための抗原の製造
ヒトＩｇＧ１又はマウスＩｇＧ２ａのＦｃ断片と融合したヒトＡＲＥＧ（ｈＡＲＥＧ）のＥＧＦ様ドメインを２９３Ｆにおいて融合タンパク質として発現させ、それぞれｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｈＦｃ及びｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃと命名する。トランスフェクトの７２時間後、細胞培養上清を回収し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによるＦｃ－融合体ＡＲＥＧタンパク質を精製するために用いられる。
１．マウスの免疫またはＳＰＲ分析のための抗原の製造
ヒトＩｇＧ１又はマウスＩｇＧ２ａのＦｃ断片と融合したヒトＡＲＥＧ（ｈＡＲＥＧ）のＥＧＦ様ドメインを２９３Ｆにおいて融合タンパク質として発現させ、それぞれｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｈＦｃ及びｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃと命名する。トランスフェクトの７２時間後、細胞培養上清を回収し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによるＦｃ－融合体ＡＲＥＧタンパク質を精製するために用いられる。
２．抗ｈＡＲＥＧ ＥＧＦドメインモノクローナル抗体の生成
５０μｇのｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃを含有する１：１の抗原／アジュバントエマルジョン１００μｌで皮下投与することにより、６週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）に対して免疫を行った。初期免疫については、完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）を使用した。追加免疫については、不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）を使用した。追加免疫は２週間ごとに行われた。３回目の追加免疫後、毎回免疫後の１週間にＥＬＩＳＡによりマウス血清とビオチンｈＡＲＥＧとの結合を評価した。高力価の抗ｈＡＲＥＧ抗体を有するマウスを、アジュバントを含まない５０μｇのｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃで腹膜内追加免疫した。追加免疫の３日後に、脾臓細胞を分離し、標準的なハイブリドーマ融合方法に従ってそれをＳＰ２／０細胞と融合させた。
５０μｇのｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃを含有する１：１の抗原／アジュバントエマルジョン１００μｌで皮下投与することにより、６週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）に対して免疫を行った。初期免疫については、完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）を使用した。追加免疫については、不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）を使用した。追加免疫は２週間ごとに行われた。３回目の追加免疫後、毎回免疫後の１週間にＥＬＩＳＡによりマウス血清とビオチンｈＡＲＥＧとの結合を評価した。高力価の抗ｈＡＲＥＧ抗体を有するマウスを、アジュバントを含まない５０μｇのｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃで腹膜内追加免疫した。追加免疫の３日後に、脾臓細胞を分離し、標準的なハイブリドーマ融合方法に従ってそれをＳＰ２／０細胞と融合させた。
ハイブリドーマクローンの上清とビオチン化ｈＡＲＥＧとの結合活性をＥＬＩＳＡにより調べた。高い結合活性を有するクローンを選択してその後のサブクローンのために増幅し、ＥＬＩＳＡ及びＳＰＲにより前記サブクローンの上清を分析する。前記ＳＰＲ分析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行った。希釈された上清を抗ｍＦｃ ＣＭ５バイオセンサチップに捕捉し、次いで移動相における２００ｎＭ ｈＡＲＥＧ ＥＧＦドメイン－ｈＦｃを通過させる。高い親和性を有するサブクローンをＲＮＡ抽出用に増幅した。細胞をＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁させ、取扱説明書に従って全ＲＮＡを抽出した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔTMＲＴマスターミックス（ＴａＫａＲａ）を使用してサブクローニングされたｃＤＮＡを合成した。マウス抗体可変遺伝子に対する特異的ＰＣＲプライマーのセットを使用して各抗体のＶＨ及びＶＬ遺伝子を増幅した。配列決定のために、ＰＣＲ産物をＰＣＲ配列決定ベクターにクローニングした。
３．抗ｈＡＲＥＧ ＥＧＦ様モノクローナル抗体のヒト化
ＡＲＥＧ ｍＡｂをヒト化するために、ネズミ類ｍＡｂの配列を使用して相同なヒト生殖系列ＩｇＧ遺伝子を検索することにより、ネズミ類ｍＡｂと高い相同性を有するヒト生殖系列遺伝子（９Ｃ１２、２３Ｈ８及び１Ｈ９）を同定し、その後にそれらをヒト化のためのテンプレートとして選択した。ヒト化は相補性決定領域（ＣＤＲ）のグラフトにより、具体的には、ネズミ類ｍＡｂのＣＤＲを選択されたヒト生殖系列遺伝子テンプレートのヒト受容体フレームワークにグラフトすることにより行われた。このヒト化過程も各抗体のシミュレーションされた３Ｄ構造によって指導され、抗体全体とＣＤＲループの構造及びＡＲＥＧ結合親和性を維持するために、ヒトフレームワーク残基をネズミ類残基に戻すように変異させた。
ＡＲＥＧ ｍＡｂをヒト化するために、ネズミ類ｍＡｂの配列を使用して相同なヒト生殖系列ＩｇＧ遺伝子を検索することにより、ネズミ類ｍＡｂと高い相同性を有するヒト生殖系列遺伝子（９Ｃ１２、２３Ｈ８及び１Ｈ９）を同定し、その後にそれらをヒト化のためのテンプレートとして選択した。ヒト化は相補性決定領域（ＣＤＲ）のグラフトにより、具体的には、ネズミ類ｍＡｂのＣＤＲを選択されたヒト生殖系列遺伝子テンプレートのヒト受容体フレームワークにグラフトすることにより行われた。このヒト化過程も各抗体のシミュレーションされた３Ｄ構造によって指導され、抗体全体とＣＤＲループの構造及びＡＲＥＧ結合親和性を維持するために、ヒトフレームワーク残基をネズミ類残基に戻すように変異させた。
４．親和性を向上させるためのｈｕ９Ｃ１２ｖ１抗体サブライブラリーの構築及び選択
抗体の親和性を向上させるために、ＮＮＫ縮重コドンによりｈｕ９Ｃ１２ｖ１のＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ１のランダム突然変異を有する２つのファージディスプレイサブライブラリーを構築した。抗体サブライブラリーの選択及びスクリーニングは、ＡＲＥＧに対する抗体ライブラリーのスクリーニング及びＥ１Ｌ２抗体の親和性向上について上述したのと同様に行った。スクリーニング後に、ｈｕｃ９Ｃ１２ｖ１よりも結合親和性の高いヒットのみを保留した。
抗体の親和性を向上させるために、ＮＮＫ縮重コドンによりｈｕ９Ｃ１２ｖ１のＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ１のランダム突然変異を有する２つのファージディスプレイサブライブラリーを構築した。抗体サブライブラリーの選択及びスクリーニングは、ＡＲＥＧに対する抗体ライブラリーのスクリーニング及びＥ１Ｌ２抗体の親和性向上について上述したのと同様に行った。スクリーニング後に、ｈｕｃ９Ｃ１２ｖ１よりも結合親和性の高いヒットのみを保留した。
５．ｍＡｂの親和性のＳＰＲ測定
異なるマウスハイブリドーマｍＡｂ又はそれらのヒト化及びエンジニアリング改造されたバリアントの親和性を評価するために、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用してＳＰＲ測定を行った。ｍＡｂを抗ヒトＦｃ ＣＭ５バイオセンサチップの表面に捕捉し、段階希釈されたｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃ、ｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃ又はｈＡＲＥＧ－９８ａａ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈから購入され、カタログ番号が１００－５５Ｂである）を抗体が結合された表面に注入し、続いて解離段階である。１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡ評価ソフトウェア、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して結合速度（Ｋａ）及び解離速度（Ｋｄ）を計算する。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｄ／ｋａの比率として算出される。
異なるマウスハイブリドーマｍＡｂ又はそれらのヒト化及びエンジニアリング改造されたバリアントの親和性を評価するために、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用してＳＰＲ測定を行った。ｍＡｂを抗ヒトＦｃ ＣＭ５バイオセンサチップの表面に捕捉し、段階希釈されたｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃ、ｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ｍＦｃ又はｈＡＲＥＧ－９８ａａ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈから購入され、カタログ番号が１００－５５Ｂである）を抗体が結合された表面に注入し、続いて解離段階である。１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡ評価ソフトウェア、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して結合速度（Ｋａ）及び解離速度（Ｋｄ）を計算する。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｄ／ｋａの比率として算出される。
６．結果
抗ｈＡＲＥＧ ＥＧＦドメインモノクローナル抗体の生成
従来のハイブリドーマ融合技術に基づいて抗ｈＡＲＥＧ ｍＡｂを生成した。ＥＬＩＳＡ及びＳＰＲ測定において高い結合活性を有するＭａｂを選択してさらなる特徴づけに用いる。数千個のハイブリドーマクローンをスクリーニングすることにより、本発明者らはｈＡＲＥＧに対して高い結合親和性を有する一組のｍＡｂを同定した。ユニークな配列、結合親和性及び組換え抗体生成の高収率に基づいて、上位３つのｍＡｂ、すなわち９Ｃ１２、２３Ｈ８及び１Ｈ９を選択してさらに分析するために用いられる。これらの抗体を組換え発現によりｍＩｇＧ１又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプのマウス抗体又はキメラ抗体（マウス可変領域がヒトＩｇＧ１定常領域にグラフトされた）に製造した。
抗ｈＡＲＥＧ ＥＧＦドメインモノクローナル抗体の生成
従来のハイブリドーマ融合技術に基づいて抗ｈＡＲＥＧ ｍＡｂを生成した。ＥＬＩＳＡ及びＳＰＲ測定において高い結合活性を有するＭａｂを選択してさらなる特徴づけに用いる。数千個のハイブリドーマクローンをスクリーニングすることにより、本発明者らはｈＡＲＥＧに対して高い結合親和性を有する一組のｍＡｂを同定した。ユニークな配列、結合親和性及び組換え抗体生成の高収率に基づいて、上位３つのｍＡｂ、すなわち９Ｃ１２、２３Ｈ８及び１Ｈ９を選択してさらに分析するために用いられる。これらの抗体を組換え発現によりｍＩｇＧ１又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプのマウス抗体又はキメラ抗体（マウス可変領域がヒトＩｇＧ１定常領域にグラフトされた）に製造した。
９Ｃ１２のヒト化、又はｈＡＲＥＧ又はｍＡＲＥＧに対して結合親和性が向上するとともに物理化学的性質が改善されたヒト化抗体バリアントの作成
ＣＤＲグラフト及び構造モデリングを使用して、ヒト化９Ｃ１２の最初のバージョンであるｈｕ９Ｃ１２ｖ１を生成し、それはキメラ抗体ｃｈ９Ｃ１２（９Ｃ１２の可変領域及びヒトＩｇＧ１の定常領域を有する）に匹敵するｈＡＲＥＧに対する親和性を有する。ｈｕ９Ｃ１２ｖ１のｈＡＲＥＧに対する親和性を向上させるために、それぞれＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３領域内にランダムな突然変異を有する２つのファージディスプレイサブライブラリーを構築した。厳密なバイオパニング選択の後、親和性が向上した抗体の小さなパネルが得られた。この抗体パネルの配列に基づいて、３種類のｍＡｂ、すなわちｈｕ９Ｃ１２ｖ４、ｈｕ９Ｃ１２ｖ５及びｈｕ９Ｃ１２ｖ６を生成することにより、ｈＡＲＥＧ又はｍＡＲＥＧとの結合親和性が向上するとともにそれらの物理化学的性質が改善された。ｈｕ９Ｃ１２ｖ１と比較して、ｈｕ９Ｃ１２ｖ４はＶＨ－ＣＤＲ２において１つのアミノ酸差異を有し、ＶＫ－ＣＤＲ１において６つのアミノ酸差異を有し、ＶＫ－ＣＤＲ２において２つのアミノ酸差異を有する。ｈｕ９Ｃ１２ｖ５は、ＶＨ－ＣＤＲ３において５つのアミノ酸差異を有し、ＶＫ－ＣＤＲ１において５つのアミノ酸差異を有し、ＶＫ－ＣＤＲ２において１つのアミノ酸差異を有する。ｈｕ９Ｃ１２ｖ６は、ＶＨ－ＣＤＲ３において２つのアミノ酸差異を有し、ＶＫ－ＣＤＲ１において５つのアミノ酸差異を有し、ＶＫ－ＣＤＲ２において１つのアミノ酸差異を有する。３種類のｍＡｂのＣＤＲとネズミ類抗体との比較は表３に示されるとおりである。３種類のｍＡｂ及びネズミ類抗体のＶＨ及びＶＬのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を表４に示す。３種類のｍＡｂとｈＡＲＥＧ又はｍＡＲＥＧのＳＰＲにより特定された結合親和性を表５－６に示す。
ＣＤＲグラフト及び構造モデリングを使用して、ヒト化９Ｃ１２の最初のバージョンであるｈｕ９Ｃ１２ｖ１を生成し、それはキメラ抗体ｃｈ９Ｃ１２（９Ｃ１２の可変領域及びヒトＩｇＧ１の定常領域を有する）に匹敵するｈＡＲＥＧに対する親和性を有する。ｈｕ９Ｃ１２ｖ１のｈＡＲＥＧに対する親和性を向上させるために、それぞれＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３領域内にランダムな突然変異を有する２つのファージディスプレイサブライブラリーを構築した。厳密なバイオパニング選択の後、親和性が向上した抗体の小さなパネルが得られた。この抗体パネルの配列に基づいて、３種類のｍＡｂ、すなわちｈｕ９Ｃ１２ｖ４、ｈｕ９Ｃ１２ｖ５及びｈｕ９Ｃ１２ｖ６を生成することにより、ｈＡＲＥＧ又はｍＡＲＥＧとの結合親和性が向上するとともにそれらの物理化学的性質が改善された。ｈｕ９Ｃ１２ｖ１と比較して、ｈｕ９Ｃ１２ｖ４はＶＨ－ＣＤＲ２において１つのアミノ酸差異を有し、ＶＫ－ＣＤＲ１において６つのアミノ酸差異を有し、ＶＫ－ＣＤＲ２において２つのアミノ酸差異を有する。ｈｕ９Ｃ１２ｖ５は、ＶＨ－ＣＤＲ３において５つのアミノ酸差異を有し、ＶＫ－ＣＤＲ１において５つのアミノ酸差異を有し、ＶＫ－ＣＤＲ２において１つのアミノ酸差異を有する。ｈｕ９Ｃ１２ｖ６は、ＶＨ－ＣＤＲ３において２つのアミノ酸差異を有し、ＶＫ－ＣＤＲ１において５つのアミノ酸差異を有し、ＶＫ－ＣＤＲ２において１つのアミノ酸差異を有する。３種類のｍＡｂのＣＤＲとネズミ類抗体との比較は表３に示されるとおりである。３種類のｍＡｂ及びネズミ類抗体のＶＨ及びＶＬのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を表４に示す。３種類のｍＡｂとｈＡＲＥＧ又はｍＡＲＥＧのＳＰＲにより特定された結合親和性を表５－６に示す。
ＣＤＲは、Ｋａｂａｔシステムを使用して定義される。
２３Ｈ８のヒト化
本発明者らはＣＤＲグラフト及び構造モデリングを使用してヒト化２３Ｈ８ｍＡｂを生成した。ヒトＶＨ生殖系列遺伝子ＩＧＨＶ３－２１をＶＨ－ＣＤＲグラフトに用いた。ヒトＶＫ生殖系列遺伝子ＩＧＫＶ７－３、ＩＧＫＶ１－３９及びＩＧＫＶ４－１をＶＫ－ＣＤＲグラフトに用い、３つのバージョンのヒト化２３Ｈ８ＶＫ鎖を生成した。本発明者らは、ヒト化ＶＨと３種類のヒト化ＶＫとを組み合わせることにより、それぞれｍＡｂ ｈｕ２３Ｈ８ｖ１、ｈｕ２３Ｈ８ｖ２及びｈｕ２３Ｈ８ｖ３を生成した。この３種類のヒト化ｍＡｂはキメラ２３Ｈ８（ネズミ類可変領域及びヒトＩｇＧ１定常領域）に近いｈＡＲＥＧに対する親和性を有し、２３Ｈ８のＶＫ－ＣＤＲが３種類の異なるヒトＶＫ生殖系列バックボーンへのグラフトがいずれも成功することを示す。前記ヒト化ｍＡｂにいくつかの追加の突然変異を導入して潜在的な意図しない翻訳後修飾又は免疫原性を除去し、他の３種類のバリアントであるｈｕ２３Ｈ８ｖ４、－ｖ５及び－ｖ６を生成した。これらのｍＡｂのＣＤＲとネズミ類抗体との比較は表７に示されるとおりである。これらのｍＡｂのＶＨ及びＶＬ ＣＤＲのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は表８に示されるとおりである。これらのｍＡｂとｈＡＲＥＧのＳＰＲで特定された結合親和性を表９－１０に示す。
本発明者らはＣＤＲグラフト及び構造モデリングを使用してヒト化２３Ｈ８ｍＡｂを生成した。ヒトＶＨ生殖系列遺伝子ＩＧＨＶ３－２１をＶＨ－ＣＤＲグラフトに用いた。ヒトＶＫ生殖系列遺伝子ＩＧＫＶ７－３、ＩＧＫＶ１－３９及びＩＧＫＶ４－１をＶＫ－ＣＤＲグラフトに用い、３つのバージョンのヒト化２３Ｈ８ＶＫ鎖を生成した。本発明者らは、ヒト化ＶＨと３種類のヒト化ＶＫとを組み合わせることにより、それぞれｍＡｂ ｈｕ２３Ｈ８ｖ１、ｈｕ２３Ｈ８ｖ２及びｈｕ２３Ｈ８ｖ３を生成した。この３種類のヒト化ｍＡｂはキメラ２３Ｈ８（ネズミ類可変領域及びヒトＩｇＧ１定常領域）に近いｈＡＲＥＧに対する親和性を有し、２３Ｈ８のＶＫ－ＣＤＲが３種類の異なるヒトＶＫ生殖系列バックボーンへのグラフトがいずれも成功することを示す。前記ヒト化ｍＡｂにいくつかの追加の突然変異を導入して潜在的な意図しない翻訳後修飾又は免疫原性を除去し、他の３種類のバリアントであるｈｕ２３Ｈ８ｖ４、－ｖ５及び－ｖ６を生成した。これらのｍＡｂのＣＤＲとネズミ類抗体との比較は表７に示されるとおりである。これらのｍＡｂのＶＨ及びＶＬ ＣＤＲのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は表８に示されるとおりである。これらのｍＡｂとｈＡＲＥＧのＳＰＲで特定された結合親和性を表９－１０に示す。
ＣＤＲは、Ｋａｂａｔシステムを使用して定義される。
１Ｈ９のヒト化
２３Ｈ８のヒト化と類似し、ヒトＶＨ生殖系列遺伝子ＩＧＨＶ３－２１をＶＨ－ＣＤＲグラフトに用いた。ヒトＶＫ生殖系列遺伝子ＩＧＫＶ７－３、ＩＧＫＶ１－３９及びＩＧＫＶ４－１をＶＫ－ＣＤＲグラフトに用いた。これらのｍＡｂのＣＤＲとネズミ類抗体との比較は表１１に示されるとおりである。これらのｍＡｂのＶＨ及びＶＬ ＣＤＲのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は表１２に示されるとおりである。これらのｍＡｂとｈＡＲＥＧのＳＰＲで特定された結合親和性は表１３に示されるとおりである。
２３Ｈ８のヒト化と類似し、ヒトＶＨ生殖系列遺伝子ＩＧＨＶ３－２１をＶＨ－ＣＤＲグラフトに用いた。ヒトＶＫ生殖系列遺伝子ＩＧＫＶ７－３、ＩＧＫＶ１－３９及びＩＧＫＶ４－１をＶＫ－ＣＤＲグラフトに用いた。これらのｍＡｂのＣＤＲとネズミ類抗体との比較は表１１に示されるとおりである。これらのｍＡｂのＶＨ及びＶＬ ＣＤＲのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は表１２に示されるとおりである。これらのｍＡｂとｈＡＲＥＧのＳＰＲで特定された結合親和性は表１３に示されるとおりである。
ＣＤＲは、Ｋａｂａｔシステムを使用して定義される。
実施例３．抗ＡＲＥＧ ｍＡｂの活性分析
１．抗ｈＡＲＥＧ抗体のインビトロ活性分析に用いられるＡＲＥＧタンパク質の製造
Ｃ－末端にＨｉｓ6及びＡｖｉタグが融合されたヒト又はマウスＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするｃＤＮＡを、ビオチン化のためのＢｉｒＡ－ｈＦｃをコードするプラスミドと共に２９３Ｆ細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションのの７２時間後、細胞培養上清を回収し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによるｈＥＧＦＲＥＣＤ Ｈｉｓ６－Ａｖｉ－ビオチン融合タンパク質又はｍＥＧＦＲ ＥＣＤ Ｈｉｓ６－Ａｖｉ－ビオチン融合タンパク質（ｈＥＦＧＲ－ＥＣＤ、ｍＥＧＦＲ－ＥＣＤ）を精製するために用いられる。
１．抗ｈＡＲＥＧ抗体のインビトロ活性分析に用いられるＡＲＥＧタンパク質の製造
Ｃ－末端にＨｉｓ6及びＡｖｉタグが融合されたヒト又はマウスＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするｃＤＮＡを、ビオチン化のためのＢｉｒＡ－ｈＦｃをコードするプラスミドと共に２９３Ｆ細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションのの７２時間後、細胞培養上清を回収し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによるｈＥＧＦＲＥＣＤ Ｈｉｓ６－Ａｖｉ－ビオチン融合タンパク質又はｍＥＧＦＲ ＥＣＤ Ｈｉｓ６－Ａｖｉ－ビオチン融合タンパク質（ｈＥＦＧＲ－ＥＣＤ、ｍＥＧＦＲ－ＥＣＤ）を精製するために用いられる。
Ｃ－末端に４つの追加残基（ＤＬＬＡ）を有するヒト又はマウスＡＲＥＧ ＥＧＦドメインをｍＦｃ融合タンパク質として２９３Ｆ細胞に発現させた。トランスフェクションの７２時間後、細胞培養上清を回収し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによるｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ＤＬＬＡ－ｍＦｃ（ｈＡＲＥＧ－ＤＬＬＡ）又はｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ＤＬＬＡ－ｍＦｃ（ｍＡＲＥＧ－ＤＬＬＡ）融合タンパク質を精製するために用いられる。
２．競合ＥＬＩＳＡによるｈＡＲＥＧとＥＧＦＲとの結合の抑制への分析
簡単に言えば、ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ、５μｇ／ｍＬ）をＵ底９６ウェルプレートにコーティングし、次に１００ｎＭビオチン化されたｈＥＧＦＲ－ＥＣＤ又はｍＥＧＦＲ－ＥＣＤを１ウェルあたり１００μＬの量でプレートに捕捉した。段階希釈された濃度の異なる抗体を５ｎＭ ｈＡＲＥＧ－ＤＬＬＡ又は５０ｎＭ ｍＡＲＥＧ－ＤＬＬＡタンパク質と混合してＥＬＩＳＡプレートに添加した。ＨＲＰ結合マウス抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により、ｈＡＲＥＧ－ＤＬＬＡとｈＥＧＦＲ－ＥＣＤとの結合又はｍＡＲＥＧ－ＤＬＬＡとｍＥＧＦＲ－ＥＣＤとの結合を検出した。
簡単に言えば、ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ、５μｇ／ｍＬ）をＵ底９６ウェルプレートにコーティングし、次に１００ｎＭビオチン化されたｈＥＧＦＲ－ＥＣＤ又はｍＥＧＦＲ－ＥＣＤを１ウェルあたり１００μＬの量でプレートに捕捉した。段階希釈された濃度の異なる抗体を５ｎＭ ｈＡＲＥＧ－ＤＬＬＡ又は５０ｎＭ ｍＡＲＥＧ－ＤＬＬＡタンパク質と混合してＥＬＩＳＡプレートに添加した。ＨＲＰ結合マウス抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により、ｈＡＲＥＧ－ＤＬＬＡとｈＥＧＦＲ－ＥＣＤとの結合又はｍＡＲＥＧ－ＤＬＬＡとｍＥＧＦＲ－ＥＣＤとの結合を検出した。
３．ＥＧＦＲ受容体のリン酸化の抑制
Ａ４３１（ヒト類表皮癌細胞株）細胞を１時間血清飢餓状態にし、続いて単独のｈＡＲＥＧ－ＤＬＬＡ（２．５ｎＭ）で処理するか又はｈＡＲＥＧと抗ＡＲＥＧ抗体の混合物で１時間処理した。各処理において６ウェルプレートに約１－２×１０5細胞／ウェルを使用した。処理された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ＲＩＰＡバッファを使用して氷上で溶解させた。次に細胞溶解物にＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、次にウェスタンブロッティングを行った。それぞれ抗ホスホチロシンｍＡｂ（Ａｂｃａｍ、ＥＰ７７４Ｙ）及びウサギポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃２２３２）を使用してリン酸化形式のＥＧＦＲ（チロシン１０６８）及び総ＥＧＦＲを検出した。抗α－チューブリンｍＡｂ（クローンＢ－５－１－２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して細胞溶解物中のα－チューブリン発現を検出し、ウェスタンブロッティング解析のローディングコントロールとした。
Ａ４３１（ヒト類表皮癌細胞株）細胞を１時間血清飢餓状態にし、続いて単独のｈＡＲＥＧ－ＤＬＬＡ（２．５ｎＭ）で処理するか又はｈＡＲＥＧと抗ＡＲＥＧ抗体の混合物で１時間処理した。各処理において６ウェルプレートに約１－２×１０5細胞／ウェルを使用した。処理された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ＲＩＰＡバッファを使用して氷上で溶解させた。次に細胞溶解物にＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、次にウェスタンブロッティングを行った。それぞれ抗ホスホチロシンｍＡｂ（Ａｂｃａｍ、ＥＰ７７４Ｙ）及びウサギポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃２２３２）を使用してリン酸化形式のＥＧＦＲ（チロシン１０６８）及び総ＥＧＦＲを検出した。抗α－チューブリンｍＡｂ（クローンＢ－５－１－２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して細胞溶解物中のα－チューブリン発現を検出し、ウェスタンブロッティング解析のローディングコントロールとした。
４．エピトープ マッピング
抗ＡＲＥＧ ｍＡｂのエピトープを同定するために、ｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄとｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄとの間で異なるとともに異なる物理的性質を有する５つのアミノ酸を突然変異用に選択した。ｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄの５つの異なる部位でのアミノ酸をそれぞれｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄの対応するアミノ酸に変更することにより、５つのｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄバリアントを生成した。また、ｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄの２つの異なる部位でのアミノ酸をそれぞれｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄの対応するアミノ酸に変更することにより、２つのｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄバリアントを生成した。次にＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）を使用してこれらのバリアントと抗ＡＲＥＧ ｍＡｂとの結合を調べた。
抗ＡＲＥＧ ｍＡｂのエピトープを同定するために、ｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄとｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄとの間で異なるとともに異なる物理的性質を有する５つのアミノ酸を突然変異用に選択した。ｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄの５つの異なる部位でのアミノ酸をそれぞれｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄの対応するアミノ酸に変更することにより、５つのｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄバリアントを生成した。また、ｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄの２つの異なる部位でのアミノ酸をそれぞれｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄの対応するアミノ酸に変更することにより、２つのｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄバリアントを生成した。次にＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）を使用してこれらのバリアントと抗ＡＲＥＧ ｍＡｂとの結合を調べた。
５．結果
抗ＡＲＥＧ ｍＡｂは、ＡＲＥＧとＥＧＦＲとの結合を遮断する
ヒトＡＲＥＧのＥＧＦドメインのＣ－末端に４つのアミノ酸（ＤＬＬＡ）を付加すると、組換え発現したＥＧＦドメインの生物学的活性を大幅に向上させることが以前に示されている（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９６）。競合ＥＬＩＳＡアッセイを容易にするために、本発明者らはｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ＤＬＬＡ－ｍＦｃ（ｈＡＲＥＧ－ＤＬＬＡ）又はｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ＤＬＬＡ－ｍＦｃ（ｍＡＲＥＧ－ＤＬＬＡ）を前記測定法においてＥＧＦＲと結合するためのリガンドとして使用した。その結果は、Ｅ１Ｈ３Ｌ４、Ｐ７及びｈｕ９Ｃ１２ｖ４はいずれもｍＡＲＥＧ－ＤＬＬＡと競合してｍＥＧＦＲ－ＥＣＤと結合することを示した。この３種類のｍＡｂにおいて、ｈｕ９Ｃ１２ｖ４は最も高い活性を示した。競合ＥＬＩＳＡにおいてｈＩｇＧ１形式を採用するｈｕ９Ｃ１２ｖ４、ｈｕ９Ｃ１２ｖ６、ｈｕ２３Ｈ８ｖ５、ｈｕ２３Ｈ８ｖ６及びｈｕ１Ｈ９ｖ３についてもテストした。それらはいずれも、サブナノモルのＩＣ５０で、ｈＡＲＥＧ－ＤＬＬＡと競合してｈＥＧＦＲ－ＥＣＤと結合する面で強力な活性を示した。
抗ＡＲＥＧ ｍＡｂは、ＡＲＥＧとＥＧＦＲとの結合を遮断する
ヒトＡＲＥＧのＥＧＦドメインのＣ－末端に４つのアミノ酸（ＤＬＬＡ）を付加すると、組換え発現したＥＧＦドメインの生物学的活性を大幅に向上させることが以前に示されている（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９６）。競合ＥＬＩＳＡアッセイを容易にするために、本発明者らはｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ＤＬＬＡ－ｍＦｃ（ｈＡＲＥＧ－ＤＬＬＡ）又はｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄ－ＤＬＬＡ－ｍＦｃ（ｍＡＲＥＧ－ＤＬＬＡ）を前記測定法においてＥＧＦＲと結合するためのリガンドとして使用した。その結果は、Ｅ１Ｈ３Ｌ４、Ｐ７及びｈｕ９Ｃ１２ｖ４はいずれもｍＡＲＥＧ－ＤＬＬＡと競合してｍＥＧＦＲ－ＥＣＤと結合することを示した。この３種類のｍＡｂにおいて、ｈｕ９Ｃ１２ｖ４は最も高い活性を示した。競合ＥＬＩＳＡにおいてｈＩｇＧ１形式を採用するｈｕ９Ｃ１２ｖ４、ｈｕ９Ｃ１２ｖ６、ｈｕ２３Ｈ８ｖ５、ｈｕ２３Ｈ８ｖ６及びｈｕ１Ｈ９ｖ３についてもテストした。それらはいずれも、サブナノモルのＩＣ５０で、ｈＡＲＥＧ－ＤＬＬＡと競合してｈＥＧＦＲ－ＥＣＤと結合する面で強力な活性を示した。
また、本発明者らは、ヒトＩｇＧ１形式を採用する以前に報告された２種類の抗体ｈｕＰＡＲ３４（米国特許出願番号２００４／０２１００４０）及びＡＲ５５８（ＵＳ２０１７０００２０６８Ａ１）をさらにテストした。この２種類の抗体もｈＡＲＥＧ－ＤＬＬＡと競合してｈＥＧＦＲ－ＥＣＤと結合する面で強力な活性を示した。
抗ＡＲＥＧ ｍＡｂがＥＧＦＲのリン酸化を抑制する
ｈＥＧＦＲを発現する類表皮癌細胞Ａ４３１においてＥＧＦＲリン酸化に対する抗ＡＲＥＧ ｍＡｂの抑制活性をテストした。低濃度の前記抗体はＡＲＥＧにより誘導されたＡ４３１細胞のＥＧＦＲのリン酸化を遮断することに十分であった。１．２ｎＭの２３Ｈ８又は１Ｈ９は、ｈＡＲＥＧに誘導されたＥＧＦＲのリン酸化を完全に遮断した。２３Ｈ８及び１Ｈ９と比較して、９Ｃ１２は相対的に弱い遮断活性を示した（図２）。
ｈＥＧＦＲを発現する類表皮癌細胞Ａ４３１においてＥＧＦＲリン酸化に対する抗ＡＲＥＧ ｍＡｂの抑制活性をテストした。低濃度の前記抗体はＡＲＥＧにより誘導されたＡ４３１細胞のＥＧＦＲのリン酸化を遮断することに十分であった。１．２ｎＭの２３Ｈ８又は１Ｈ９は、ｈＡＲＥＧに誘導されたＥＧＦＲのリン酸化を完全に遮断した。２３Ｈ８及び１Ｈ９と比較して、９Ｃ１２は相対的に弱い遮断活性を示した（図２）。
エピトープ マッピング
抗ＡＲＥＧ ｍＡｂのエピトープを同定するために、ｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄの５つの異なる部位でのアミノ酸をそれぞれｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄの対応するアミノ酸に変更することにより、５つのｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄバリアントを生成した（図３）。次にＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）を使用して前記バリアントと抗ＡＲＥＧ ｍＡｂとの結合を調べた。２つのアミノ酸（Ｇｌｕ１４９及びＨｉｓ１６４）が前記ｍＡｂがｈＡＲＥＧと結合する重要なエピトープ残基であることを同定した。Ｂｉａｃｏｒｅの分析で明らかになったように、ｈｕ９Ｃ１２ｖ４、ｈｕ９Ｃ１２ｖ６、ｈｕ２３Ｈ８及びｈｕ１Ｈ９ ｍＡｂについては、ｈＡＲＥＧ－Ｈ１６４ＮバリアントはｍＡｂとの結合能力が完全に失われ、ｈＡＲＥＧ－Ｅ１４９Ｋバリアントはわずかに低下した結合活性を有し、他の３種類のｈＡＲＥＧバリアントはｍＡｂとの結合に影響を与えず、Ｈｉｓ１６４が本発明の抗ＡＲＥＧ ｍＡｂの結合にとって最も重要なエピトープ残基であることを確認した。ｈｕＰＡＲ３４については、Ｅ１４９Ｋ及びＨ１６４Ｎバリアントは低下した結合活性を有し、他の３つの残基の変更は影響がないか又は影響が小さかった。ＡＲ５５８については、Ｅ１４９Ｋバリアントは結合活性が完全に失われ、他の４つの残基の変更はｈＡＲＥＧとＡＲ５５８の結合に影響がないか又は影響が小さく、Ｇｌｕ１４９がＡＲ５５８にとって最も重要なエピトープ残基であることを示した。
抗ＡＲＥＧ ｍＡｂのエピトープを同定するために、ｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄの５つの異なる部位でのアミノ酸をそれぞれｍＡＲＥＧ－ＥＧＦｄの対応するアミノ酸に変更することにより、５つのｈＡＲＥＧ－ＥＧＦｄバリアントを生成した（図３）。次にＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）を使用して前記バリアントと抗ＡＲＥＧ ｍＡｂとの結合を調べた。２つのアミノ酸（Ｇｌｕ１４９及びＨｉｓ１６４）が前記ｍＡｂがｈＡＲＥＧと結合する重要なエピトープ残基であることを同定した。Ｂｉａｃｏｒｅの分析で明らかになったように、ｈｕ９Ｃ１２ｖ４、ｈｕ９Ｃ１２ｖ６、ｈｕ２３Ｈ８及びｈｕ１Ｈ９ ｍＡｂについては、ｈＡＲＥＧ－Ｈ１６４ＮバリアントはｍＡｂとの結合能力が完全に失われ、ｈＡＲＥＧ－Ｅ１４９Ｋバリアントはわずかに低下した結合活性を有し、他の３種類のｈＡＲＥＧバリアントはｍＡｂとの結合に影響を与えず、Ｈｉｓ１６４が本発明の抗ＡＲＥＧ ｍＡｂの結合にとって最も重要なエピトープ残基であることを確認した。ｈｕＰＡＲ３４については、Ｅ１４９Ｋ及びＨ１６４Ｎバリアントは低下した結合活性を有し、他の３つの残基の変更は影響がないか又は影響が小さかった。ＡＲ５５８については、Ｅ１４９Ｋバリアントは結合活性が完全に失われ、他の４つの残基の変更はｈＡＲＥＧとＡＲ５５８の結合に影響がないか又は影響が小さく、Ｇｌｕ１４９がＡＲ５５８にとって最も重要なエピトープ残基であることを示した。
また、本発明者らは、２つのｍＡＲＥＧバリアントを使用し、ｍＡＲＥＧ－Ｋ１４９Ｅ／Ｎ１６４Ｈ（ｈＡＲＥＧ番号を使用する）バリアントが抗ｈＡＲＥＧ抗体との完全な結合親和性を取得したことを発見し、前記抗ｈＡＲＥＧ抗体はｍＡＲＥＧとの交差反応性がないか又は非常に弱いものであった。ｍＡＲＥＧ－Ｎ１６４Ｈバリアントは前記抗体との部分的な結合能力を取得した。これらの結果は、ｍＡＲＥＧ中のアミノ酸Ｌｙｓ１４９及びＡｓｎ１６４は、ｍＡｂ（ｈｕ９Ｃ１２ｖ６、ｈｕ２３Ｈ８、ｈｕ１Ｈ９、ｈｕＰＡＲ３４及びＡＲ５５８）とｍＡＲＥＧとの交差反応性の欠如の原因となる残基であることを示した。
実施例４．動物研究
１．動物モデルの確立
肺胞ＩＩ型細胞（ＡＴ２細胞）においてＣｄｃ４２遺伝子を特異的にノックアウトすることによりＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスを生成する
ＡＴ２細胞におけるＣｄｃ４２遺伝子を特異的に欠失するために、Ｓｐｃ－ＣｒｅＥＲノックイン対立遺伝子を持つマウスをＣｄｃ４２ ｆｌｏｘｅｄ（Ｃｄｃ４２flox/flox）マウスと交配させた（図４Ａ）。Ｃｄｃ４２flox/floxマウスにおいて、Ｃｄｃ４２遺伝子の翻訳開始エクソンを含有するＣｄｃ４２遺伝子のエクソン２のフランキングは２つのｌｏｘｐ部位を有する。Ｓｐｃ－ＣｒｅＥＲ；Ｃｄｃ４２flox/floxマウスにおいて、タモキシフェンで処理した後に、Ｃｒｅ／ｌｏｘｐを介した組換えによってＡＴ２細胞におけるＣｄｃ４２遺伝子のエクソン２を特異的に欠失させた（図４Ｂ）。Ｓｐｃ－ＣｒｅＥＲ；Ｃｄｃ４２flox/floxマウスはＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスと命名される。Ｃｄｃ４２遺伝子のエクソン２の欠失前後のＣｄｃ４２ＤＮＡ配列の断片は以下のとおりである。これらの全てのマウスは、動物小屋で特定の病原体のない条件下で維持されている。
１．動物モデルの確立
肺胞ＩＩ型細胞（ＡＴ２細胞）においてＣｄｃ４２遺伝子を特異的にノックアウトすることによりＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスを生成する
ＡＴ２細胞におけるＣｄｃ４２遺伝子を特異的に欠失するために、Ｓｐｃ－ＣｒｅＥＲノックイン対立遺伝子を持つマウスをＣｄｃ４２ ｆｌｏｘｅｄ（Ｃｄｃ４２flox/flox）マウスと交配させた（図４Ａ）。Ｃｄｃ４２flox/floxマウスにおいて、Ｃｄｃ４２遺伝子の翻訳開始エクソンを含有するＣｄｃ４２遺伝子のエクソン２のフランキングは２つのｌｏｘｐ部位を有する。Ｓｐｃ－ＣｒｅＥＲ；Ｃｄｃ４２flox/floxマウスにおいて、タモキシフェンで処理した後に、Ｃｒｅ／ｌｏｘｐを介した組換えによってＡＴ２細胞におけるＣｄｃ４２遺伝子のエクソン２を特異的に欠失させた（図４Ｂ）。Ｓｐｃ－ＣｒｅＥＲ；Ｃｄｃ４２flox/floxマウスはＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスと命名される。Ｃｄｃ４２遺伝子のエクソン２の欠失前後のＣｄｃ４２ＤＮＡ配列の断片は以下のとおりである。これらの全てのマウスは、動物小屋で特定の病原体のない条件下で維持されている。
Ｃｄｃ４２遺伝子のエクソン２を欠失させる前のＣｄｃ４２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３に示されるとおりである。Ｃｄｃ４２遺伝子のエクソン２を欠失させた後のＣｄｃ４２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４に示されるとおりである。
ＰＮＸ処理後のＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺における進行性線維性変化
Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウス及びコントロールマウスに対して、左葉切除術（肺切除術、ＰＮＸ）を行った。ＰＮＸ処理後の異なる時点でＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウス及びコントロールマウスの肺を分析した（図５Ａ）。本発明者らは、ＰＮＸ後の２１日目に、いくつかのＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスが顕著な体重軽減及び呼吸率向上を示すことを発見した。実際に、ＰＮＸ後の６０日目に、ほぼ５０％のＰＮＸ処理されたＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスは、エンドポイント安楽死の所定の健康状態標準に達し（図５Ｂ）、ＰＮＸ後の１８０日目に、７０％を超えたＰＮＸ処理されたＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウス（ｎ＝３３）はそれらのエンドポイントに達した（図５Ｂ）。Ｈ＆Ｅ染色は、偽手術処理及びＰＮＸ処理のコントロールマウスの肺が線維性変化が示されていないことを示した（図５Ｃ）。Ｈ＆Ｅ染色は、エンドポイントでＰＮＸ処理されたＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺葉全体はいずれも緻密な線維性変化を有することを示した（図５Ｄ）。
Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウス及びコントロールマウスに対して、左葉切除術（肺切除術、ＰＮＸ）を行った。ＰＮＸ処理後の異なる時点でＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウス及びコントロールマウスの肺を分析した（図５Ａ）。本発明者らは、ＰＮＸ後の２１日目に、いくつかのＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスが顕著な体重軽減及び呼吸率向上を示すことを発見した。実際に、ＰＮＸ後の６０日目に、ほぼ５０％のＰＮＸ処理されたＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスは、エンドポイント安楽死の所定の健康状態標準に達し（図５Ｂ）、ＰＮＸ後の１８０日目に、７０％を超えたＰＮＸ処理されたＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウス（ｎ＝３３）はそれらのエンドポイントに達した（図５Ｂ）。Ｈ＆Ｅ染色は、偽手術処理及びＰＮＸ処理のコントロールマウスの肺が線維性変化が示されていないことを示した（図５Ｃ）。Ｈ＆Ｅ染色は、エンドポイントでＰＮＸ処理されたＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺葉全体はいずれも緻密な線維性変化を有することを示した（図５Ｄ）。
ＰＮＸ後の２１日目に、Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺は、線維性変化を示し始めた。Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌル肺は、すでに肺の縁に緻密な線維性変化を示した（図５Ｄ）。Ｈ＆Ｅ染色は、Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌル肺の線維性領域の組織学的変化がヒトＩＰＦ肺の組織学的変化を再現することを示した。
ＰＮＸ後の２１日目に、コントロール及びＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスから収集された肺を抗コラーゲンＩ抗体で染色した（図５Ｅ）。コントロールの肺に比較して、Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺における緻密な線維性領域においてコラーゲンＩの強力な免疫蛍光シグナルを検出した。ＰＮＸ後の２１日目からＰＮＸ後の６０日目まで、Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺における緻密なコラーゲンＩの面積が徐々に増加した（図５Ｆ）。ｑＰＣＲ分析は、ＰＮＸ後の２１日目からＰＮＸ後の６０日目まで、Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺におけるコラーゲンＩのｍＲＮＡの発現レベルが徐々に向上することを示した（図５Ｇ）。呼吸機能分析は、ＰＮＸ後の２１日目からＰＮＸ後の６０日目まで、Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺のコンプライアンスが徐々に低下することを示した（図５Ｈ）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１，スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ）ｔ検定。
これはＩＰＦの発症メカニズム及び進行を高度に模倣できる最初のマウスモデルである。したがって、以下、ＩＰＦ様肺線維症マウスモデルと呼ばれる。このような動物モデルを使用して、本発明者らはＡＲＥＧが肺線維症の潜在的な治療標的であると同定した。
ブレオマイシン誘発肺線維症マウスモデル
ブレオマイシン誘発肺線維症は、ヒト肺線維症の一般的な実験研究モデルである。各群における野生型ＦＶＢ／Ｎマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に単回用量のＢＬＭ（１Ｕ／１ＫＧ体重、Ｈ２００５５８８３、Ｈａｉ Ｚｈｅｎｇ Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ）を気管内注入した。ブレオマイシン投与後の異なる時点で、全ての群におけるＢＬＭ処理されたマウスに対して閉鎖監視を行った。
ブレオマイシン誘発肺線維症は、ヒト肺線維症の一般的な実験研究モデルである。各群における野生型ＦＶＢ／Ｎマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に単回用量のＢＬＭ（１Ｕ／１ＫＧ体重、Ｈ２００５５８８３、Ｈａｉ Ｚｈｅｎｇ Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ）を気管内注入した。ブレオマイシン投与後の異なる時点で、全ての群におけるＢＬＭ処理されたマウスに対して閉鎖監視を行った。
これは急性肺損傷誘発性肺線維症、例えば肺炎後の肺線維症又はＩＬＤ（間質性肺疾患）を再現できる動物モデルである。ブレオマイシンは、酸化を介したＤＮＡ断片化により肺損傷を誘発し、肺胞上皮細胞の死亡（損傷後１－３日）及び急性炎症反応（損傷後３－９日）を引き起こす。そして、肺線維症は、損傷後の１０－２１日目に肺で発症する。
本発明者らは、本発明のＩＰＦ様マウスモデル及びブレオマイシン誘発肺線維症マウスモデルを採用して本発明のＡＲＥＧ抗体の治療効果を調べた。また、本発明者らは、さらにニンテダニブ及びピルフェニドンの２種類の薬物の治療効果を比較することにより、ＡＲＥＧ抗体と従来のＦＤＡ承認薬物の潜在的な治療効果を全面的に評価した。
２．マウスモデルにおいて肺線維症を治療するための動物研究の設計及び分析
１）ＩＰＦ様肺線維症マウスモデル：体重が近い（～３０ｇ）生後３ヶ月のオスのＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスを前記実験用に選択した。１日おきに合計４回、タモキシフェン（用量：７５ｍｇ／ｋｇ）でマウスに腹膜内注射した。最後の注射後の２週間後、ＰＮＸでマウスを処理した。ＰＮＸ後の１４日目は、線維症の発症の時点であった。ＰＮＸ後の１４日目に、ＰＮＸ処理されたマウスを秤量して治療した。
１）ＩＰＦ様肺線維症マウスモデル：体重が近い（～３０ｇ）生後３ヶ月のオスのＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスを前記実験用に選択した。１日おきに合計４回、タモキシフェン（用量：７５ｍｇ／ｋｇ）でマウスに腹膜内注射した。最後の注射後の２週間後、ＰＮＸでマウスを処理した。ＰＮＸ後の１４日目は、線維症の発症の時点であった。ＰＮＸ後の１４日目に、ＰＮＸ処理されたマウスを秤量して治療した。
２）ブレオマイシン誘発性肺線維症マウスモデル：体重が近い（～３０ｇ）生後３ヶ月のオスのＦＶＢ／Ｎマウスをブレオマイシン処理用に選択した。具体的には、気管内チューブを麻酔されたマウスの気管に挿入し、その後にブレオマイシン溶液（用量：１Ｕ／ｋｇ）を送達した。次に、ブレオマイシン送達の１日後に、マウスを秤量して治療した。
３）治療群：マウスを対照群、抗ＡＲＥＧ抗体群、ニンテダニブ群及びピルフェニドン群の異なる群に分けた。各群の全てのマウスは、年齢が一致し、体重が一致した。対照群については、マウスをアイソタイプが一致した抗抗体で治療した。対照抗体又は抗ＡＲＥＧ抗体を１０－１５ｍｇ／ｋｇの量で５日ごとに腹膜内に投与した。また、対照群中のマウスは、１日１回、強制経口投与により０．５％のメチルセルロースナトリウム溶液で治療した。ニンテダニブ群中のマウスは、１日１回、強制経口投与によりニンテダニブ（６０ｍｇ／ｋｇ）で治療した。ピルフェニドン治療群のマウスは、１日１回、強制経口投与によりピルフェニドン（１００ｍｇ／ｋｇ）で治療した。ニンテダニブ群及びピルフェニドン群のマウスも５日ごとにＰＢＳ溶液で腹膜内治療した。
４）動物研究
ａ）１日おきに、全ての群におけるマウスの体重をモニタリングした。１日２回で全ての群におけるマウスの全体的な健康状態を密に監視した。
ｂ）人道的エンドポイントは、総体重の軽減（初期体重の３０％）により定義される。
動物研究は、承認された施設内の動物管理および使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）のプロトコルの下で行われた。研究のエンドポイントで肺組織を収集した。ヒドロキシプロリンキット（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＭＡＫ００８）により、各マウスの肺中のヒドロキシプロリン含有量を測定した。組織学的分析を使用して肺線維症スケールを評価した。肺組織を４％ＰＦＡで固定し、切片にして Ｈ＆Ｅで染色した。肺のそれぞれの異なる領域を分析することにより、最終的な組織学的線維症スコアを割り当てた。
ａ）１日おきに、全ての群におけるマウスの体重をモニタリングした。１日２回で全ての群におけるマウスの全体的な健康状態を密に監視した。
ｂ）人道的エンドポイントは、総体重の軽減（初期体重の３０％）により定義される。
動物研究は、承認された施設内の動物管理および使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）のプロトコルの下で行われた。研究のエンドポイントで肺組織を収集した。ヒドロキシプロリンキット（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＭＡＫ００８）により、各マウスの肺中のヒドロキシプロリン含有量を測定した。組織学的分析を使用して肺線維症スケールを評価した。肺組織を４％ＰＦＡで固定し、切片にして Ｈ＆Ｅで染色した。肺のそれぞれの異なる領域を分析することにより、最終的な組織学的線維症スコアを割り当てた。
３．結果
１）抗ＡＲＥＧ抗体（Ｐ７）：本発明者らの結果は、抗ＡＲＥＧ（Ｐ７）抗体がＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの体重減少を顕著に遅らせ、Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの生存時間を延長することができることを示した（図６Ａ－６Ｃ）。また、抗ＡＲＥＧ抗体（Ｐ７）はＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺におけるヒドロキシプロリン含有量を顕著に低減することができる（図６Ｄ）。図６Ａは治療及びサンプリング手順の一般化されたスキームを示しており、図６Ｂは抗ＡＲＥＧ抗体（Ｐ７）がＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの生存時間を延長することができることを示しており、図６Ｃは抗ＡＲＥＧ抗体（Ｐ７）がＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの体重減少を顕著に遅らせることができることを示しており、図６Ｄはブランク抗体で治療されたマウスと比較して、抗ＡＲＥＧ抗体（Ｐ７）がＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺におけるヒドロキシプロリン含有量を顕著に低減することができる（＊，Ｐ＜０．０５，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定）を示した。
１）抗ＡＲＥＧ抗体（Ｐ７）：本発明者らの結果は、抗ＡＲＥＧ（Ｐ７）抗体がＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの体重減少を顕著に遅らせ、Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの生存時間を延長することができることを示した（図６Ａ－６Ｃ）。また、抗ＡＲＥＧ抗体（Ｐ７）はＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺におけるヒドロキシプロリン含有量を顕著に低減することができる（図６Ｄ）。図６Ａは治療及びサンプリング手順の一般化されたスキームを示しており、図６Ｂは抗ＡＲＥＧ抗体（Ｐ７）がＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの生存時間を延長することができることを示しており、図６Ｃは抗ＡＲＥＧ抗体（Ｐ７）がＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの体重減少を顕著に遅らせることができることを示しており、図６Ｄはブランク抗体で治療されたマウスと比較して、抗ＡＲＥＧ抗体（Ｐ７）がＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺におけるヒドロキシプロリン含有量を顕著に低減することができる（＊，Ｐ＜０．０５，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定）を示した。
２）抗ＡＲＥＧ抗体（Ｅ１Ｈ３Ｌ４）：本発明者らの結果は、ブレオマイシンで処理されたマウスにおいて、抗ＡＲＥＧ抗体（Ｅ１Ｈ３Ｌ４）は線維症の解消を加速し、体重の回復を促進することができることを示した（図７Ｂ）。図７Ａはブレオマイシン誘発性肺線維症マウスモデルにおいて、ブランク抗体で治療されたマウスと抗ＡＲＥＧ抗体（Ｅ１Ｈ３Ｌ４）で治療されたマウスの生存率に顕著な差がないことを示した。しかしながら、図７Ｂはブランク抗体治療群のマウスと比較して、抗ＡＲＥＧ抗体（Ｅ１Ｈ３Ｌ４）治療群のマウスの回復がより良好であることを示した。
また、抗ＡＲＥＧ（Ｅ１Ｈ３Ｌ４）抗体治療は、Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの生存時間を顕著に延長することができる（図８Ａ－８Ｂ）。Ｈ＆Ｅ染色分析により、Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺において、抗ＡＲＥＧ抗体（Ｅ１Ｈ３Ｌ４）治療群のマウス肺線維症の面積が顕著に減少することを示した（図８Ｃ）。図８Ａは治療及びサンプリング手順の一般化されたスキームを示した。図８Ｂは抗ＡＲＥＧ抗体（Ｅ１Ｈ３Ｌ４）がＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの生存時間を顕著に延長することができることを示しており、図８ＣはＨ＆Ｅ染色分析により、対照群のマウスと比較して、抗ＡＲＥＧ抗体（Ｅ１Ｈ３Ｌ４）治療群のマウスの肺線維症が顕著に減少することを示した。
３）抗ＡＲＥＧ抗体（ｈｕ９Ｃ１２ｖ４）：本発明者らの結果は、抗ＡＲＥＧ抗体（ｈｕ９Ｃ１２ｖ４）がＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの生存時間を顕著に延長することができ（図９Ａ－９Ｂ）、ニンテダニブ及びピルフェニドンはＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの生存時間を顕著に延長しない。Ｈ＆Ｅ染色分析により、Ｃｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの肺において、抗ＡＲＥＧ抗体（ｈｕ９Ｃ１２ｖ４）治療群におけるマウス肺線維症の面積が顕著に減少することを示した（図９Ｃ）。具体的には、図９Ａは治療及びサンプリング手順の一般化されたスキームを示しており、図９Ｂは抗ＡＲＥＧ抗体（ｈｕ９Ｃ１２ｖ４）治療がＣｄｃ４２ ＡＴ２ヌルマウスの生存時間を顕著に延長することができることを示しており、図９ＣはＨ＆Ｅ染色分析により、対照群、ニンテダニブ群及びピルフェニドン群のマウスと比較して、抗ＡＲＥＧ抗体（ｈｕ９Ｃ１２ｖ４）治療群のマウスの肺線維症が顕著に減少することを示した。
まとめると、これらの結果は、本発明の抗ＡＲＥＧモノクローナル抗体が肺線維症の治療に有効であることを確認した。
参考文献：
1．Barkauskas, C.E.及びNoble, P.W.（2014）、組織線維症の細胞メカニズム．７．肺線維症細胞メカニズムに対する新たな知見（Cellular mechanisms of tissue fibrosis. 7. New insights into the cellular mechanisms of pulmonary fibrosis）、American journal of physiology Cell physiology 306, C987-996.
2．Li, D., He, W., Liu, X., Zheng, S., Qi, Y., Li, H., Mao, F., Liu, J., Sun, Y., Pan, L.等、（2017）、有効なヒト中和抗体は確立されたHBV 感染を Fc 依存的に減少させる（A potent human neutralizing antibody Fc-dependently reduces established HBV infections）、eLife 6: e26738.
3．Steele, M.P. 及びSchwartz, D.A.（2013）、進行性特発性肺線維症における分子メカニズム（Molecular mechanisms in progressive idiopathic pulmonary fibrosis），Annual review of medicine 64, 265-276.
4．Thompson, S.A., Harris, A., Hoang, D., Ferrer, M. 及びJohnson, G.R.（1996）、天然由来の成長因子に匹敵する生物学的活性を有するカルボキシル末端延長組換えアンフィレグリン（COOH-terminal extended recombinant amphiregulin with bioactivity comparable with naturally derived growth factor）、The Journal of biological chemistry 271, 17927-17931.
1．Barkauskas, C.E.及びNoble, P.W.（2014）、組織線維症の細胞メカニズム．７．肺線維症細胞メカニズムに対する新たな知見（Cellular mechanisms of tissue fibrosis. 7. New insights into the cellular mechanisms of pulmonary fibrosis）、American journal of physiology Cell physiology 306, C987-996.
2．Li, D., He, W., Liu, X., Zheng, S., Qi, Y., Li, H., Mao, F., Liu, J., Sun, Y., Pan, L.等、（2017）、有効なヒト中和抗体は確立されたHBV 感染を Fc 依存的に減少させる（A potent human neutralizing antibody Fc-dependently reduces established HBV infections）、eLife 6: e26738.
3．Steele, M.P. 及びSchwartz, D.A.（2013）、進行性特発性肺線維症における分子メカニズム（Molecular mechanisms in progressive idiopathic pulmonary fibrosis），Annual review of medicine 64, 265-276.
4．Thompson, S.A., Harris, A., Hoang, D., Ferrer, M. 及びJohnson, G.R.（1996）、天然由来の成長因子に匹敵する生物学的活性を有するカルボキシル末端延長組換えアンフィレグリン（COOH-terminal extended recombinant amphiregulin with bioactivity comparable with naturally derived growth factor）、The Journal of biological chemistry 271, 17927-17931.
Claims (35)
- 線維症を抑制する能力を有し、好ましくは、前記線維症は、腎線維症、肝線維症、肺線維症であり、特にＩＰＦである、単離された抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片。
- ＡＲＥＧと結合することができ、好ましくは、ヒトＡＲＥＧと結合する、請求項１に記載の抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片。
- ヒト抗ＡＲＥＧ抗体又はネズミ類抗ＡＲＥＧ抗体又はヒト化抗ＡＲＥＧ抗体又はキメラ抗ＡＲＥＧ抗体であり、好ましくは、ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ネズミ類ｍＡｂ、ヒト化ｍＡｂ又はキメラｍＡｂである、請求項１に記載の抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片。
- 高い親和性でＡＲＥＧと結合し、その解離定数（ＫＤ）は、好ましくは１０ｎＭより小さく、好ましくは１ｎＭ、０．１ｎＭ又は０．０１ｎＭより小さく、好ましくは１×１０-8～１×１０-11の範囲内にあり、より好ましくは１×１０-9～１×１０-11の範囲内にある、請求項１に記載の抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片。
- 可溶性形態のＡＲＥＧと結合することができ、好ましくは、可溶性形態のＡＲＥＧのＥＧＦ様ドメインと結合することができ、より好ましくは、可溶性形態のＡＲＥＧのＥＧＦ様ドメイン内のＣ－末端と結合することができる、請求項１に記載の抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片。
- ヒトｐｒｏ－ＡＲＥＧの１０１～１８４残基と結合することができ、及び／又は、ヒトｐｒｏ－ＡＲＥＧの１７１～１８４残基と結合することができ、及び／又は、ネズミ類ｐｒｏ－ＡＲＥＧの９４～１７７残基と結合することができ、及び／又は、ネズミ類ｐｒｏ－ＡＲＥＧの１３５～１７７残基と結合することができる、請求項１に記載の抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３～１３２のいずれかに示されるヒトｐｒｏ－ＡＲＥＧの１０１～１８４残基内、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３～１３２のいずれかに示されるヒトｐｒｏ－ＡＲＥＧの１４２～１８４残基内の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸と結合することができる、請求項１に記載の抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片。
- ヒトｐｒｏ－ＡＲＥＧのＧｌｕ１４９及び／又はＨｉｓ１６４と相互作用することができる、請求項１に記載の抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片。
- 可溶性形態のＡＲＥＧと結合する抗体断片であり、好ましくはＦａｂ断片又はＦ（ａｂ）2断片である、請求項１に記載の抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片。
- 重鎖相補決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含有する重鎖可変領域、及び軽鎖相補決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含有する軽鎖可変領域を含み、ここで、
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるＨＣＤＲ３、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＨＣＤＲ３、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＨＣＤＲ３、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるＨＣＤＲ３、
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるＨＣＤＲ３、
（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ３、
（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＨＣＤＲ３、
（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されるＨＣＤＲ３、
（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、及び、
（１２）（１）～（１１）に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３であって、ただし、そのうちの少なくとも一つは１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の添加、欠失、保存的アミノ酸置換又はそれらの組み合わせを含むものから選択され、かつ、
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるＬＣＤＲ３、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ３、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＬＣＤＲ３、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、
（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、
（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、
（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、
（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、
（１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、
（１３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ３、
（１４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ３、
（１５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示されるＬＣＤＲ３、
（１６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に示されるＬＣＤＲ３、
（１７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示されるＬＣＤＲ３、
（１８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に示されるＬＣＤＲ３、
（１９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるＬＣＤＲ３、
（２０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるＬＣＤＲ３、及び、
（２１）（１）～（２０）に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３であって、ただし、そのうちの少なくとも一つは１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の添加、欠失、保存的アミノ酸置換又はそれらの組み合わせを含むものから選択される、請求項１に記載の抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片。 - 重鎖相補決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含有する重鎖可変領域、及び軽鎖相補決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含有する軽鎖可変領域を含み、ここで、
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるＬＣＤＲ３、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ３、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＬＣＤＲ３、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＬＣＤＲ３、
（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、
（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、
（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、
（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、
（１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＬＣＤＲ３、
（１３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ３、
（１４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ３、
（１５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示されるＬＣＤＲ３、
（１６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に示されるＬＣＤＲ３、
（１７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示されるＬＣＤＲ３、
（１８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に示されるＬＣＤＲ３、
（１９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるＬＣＤＲ３、
（２０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるＬＣＤＲ３、及び
（２１）（１）～（２０）に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３であって、ただし、そのうちの少なくとも一つは１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の添加、欠失、保存的アミノ酸置換又はそれらの組み合わせを含むものから選択される、請求項１に記載の抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片。 - 重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
ここで、前記重鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７～６９から選択されるアミノ酸配列、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７～６９のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有するとともにエピトープ結合活性が保たれているアミノ酸配列を有し、
ここで、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０～８９から選択されるアミノ酸配列、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０～８９のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有するとともにエピトープ結合活性が保たれているアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片。 - 重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５、
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６、
（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７、
（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８、
（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９、
（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０、
（１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１、
（１３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９、
（１４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２、
（１５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３、
（１６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４、
（１７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５、
（１８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６、
（１９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７、
（２０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８、
（２１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９、及び、
（２２）それぞれ（１）～（２１）のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有するとともにエピトープ結合活性が保たれている２つのアミノ酸配列、から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片。 - ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＤのアイソタイプであり、好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のアイソタイプである、請求項１に記載の抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片。
- ＡＲＥＧとＥＧＦＲとの結合を遮断することができ、及び／又は、ＥＧＦＲのリン酸化を抑制することができる、請求項１に記載の抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片。
- 請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド又は核酸。
- 同一のポリヌクレオチド又は別個のポリヌクレオチド上に、完全な重鎖可変領域又は完全な軽鎖可変領域又は両者をコードする、請求項１６に記載の単離されたポリヌクレオチド又は核酸。
- 同一のポリヌクレオチド又は別個のポリヌクレオチド上に、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域又は両者の一部をコードする、請求項１６に記載の単離されたポリヌクレオチド又は核酸。
- 重鎖可変領域をコードする配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１２、１１５及び１１７のいずれかに示されるＤＮＡ配列、及び／又は、
軽鎖可変領域をコードする配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１８、１１９、１２０、１２１及び１２２のいずれかに示されるＤＮＡ配列を含む、請求項１６に記載の単離されたポリヌクレオチド又は核酸。 - 請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片をコードする一つ又は複数のポリヌクレオチドを含む、単離された細胞又はベクター。
- 前記細胞はハイブリドーマ細胞である、請求項２０に記載の単離された細胞又はベクター。
- 請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片及び薬学的に許容される担体を含む組成物。
- 請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片の、被検者におけるＡＲＥＧが過剰発現、上方調節又は活性化される障害を治療するための薬物の製造における用途。
- 前記被検者は、診断、予後又は治療を必要とする哺乳動物被検者であり、好ましくは、前記哺乳動物被検者は、ヒト、馴養動物、農場動物、及び動物園、スポーツ又はペット動物を含み、例えば犬、猫、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、馬、牛及び乳牛である、請求項２３に記載の用途。
- 前記障害は線維症疾患であり、腎線維症、肝線維症、肺線維症、特にＩＰＦを含むがこれらに限定されない、請求項２４に記載の用途。
- 被検者におけるＡＲＥＧが過剰発現、上方調節又は活性化される障害を治療するための方法であって、前記方法は、前記被検者に請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片を投与することを含む。
- 前記障害は線維症疾患であり、腎線維症、肝線維症、肺線維症、特にＩＰＦを含むがこれらに限定されない、請求項２６に記載の方法。
- 前記被検者は、診断、予後又は治療を必要とする哺乳動物被検者であり、好ましくは、前記哺乳動物被検者は、ヒト、馴養動物、農場動物、及び動物園、スポーツ又はペット動物を含み、例えば犬、猫、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、馬、牛及び乳牛である、請求項２６に記載の方法。
- ＡＲＥＧタンパク質の存在を特定する方法であって、前記方法は、ＡＲＥＧタンパク質を含むと疑われる細胞を、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片に暴露し、前記抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片と前記細胞との結合を特定することを含む。
- 被検者におけるＡＲＥＧが過剰発現、上方調節又は活性化される障害を診断するための方法である、請求項２９に記載の方法。
- 前記障害は線維症疾患であり、腎線維症、肝線維症、肺線維症、特にＩＰＦを含むがこれらに限定されない、請求項３０に記載の方法。
- 前記被検者は哺乳動物被検者であり、好ましくは、ヒト、馴養動物、農場動物、及び動物園、スポーツ又はペット動物を含み、例えば犬、猫、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、馬、牛及び乳牛である、請求項３０に記載の方法。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３～１３２のいずれかに示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３～１３２のいずれかと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、単離されたＡＲＥＧタンパク質。
- 請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗ＡＲＥＧ抗体又はその断片を生成するために用いられるエピトープである、請求項３３に記載の単離されたＡＲＥＧタンパク質。
- アミノ酸Ｇｌｕ１４９及び／又はＨｉｓ１６４を有する、請求項３３に記載の単離されたＡＲＥＧタンパク質。
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