JP2006517109A - アンフィレグリン抗体ならびに癌および乾癬を処置するためのその使用 - Google Patents
アンフィレグリン抗体ならびに癌および乾癬を処置するためのその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006517109A JP2006517109A JP2006503535A JP2006503535A JP2006517109A JP 2006517109 A JP2006517109 A JP 2006517109A JP 2006503535 A JP2006503535 A JP 2006503535A JP 2006503535 A JP2006503535 A JP 2006503535A JP 2006517109 A JP2006517109 A JP 2006517109A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- seq
- antibodies
- amino acid
- acid sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
- A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/475—Assays involving growth factors
- G01N2333/485—Epidermal growth factor [EGF] (urogastrone)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本発明は抗AR抗体(好ましくは、本明細書中に開示されるアミノ酸配列を有するヒト化モノクローナル抗体)に関する。本発明は、そのような抗体を含む薬学的組成物を包含する。本発明は、そのような抗体を被験体に投与することを含む、癌細胞の成長を阻害する方法を包含する。本発明はまた、そのような抗体を治療効果的な量で被験体に投与することによって、そのような処置を必要としている前記被験体における癌または乾癬を処置する方法を提供する。
Description
(発明の分野)
本発明は免疫学の分野に関する。具体的には、本発明は、アンフィレグリン(AR)のアンタゴニスト(好ましくは、抗AR抗体)、および、そのようなアンタゴニストを使用することによる癌または乾癬の検出または処置に関する。
本発明は免疫学の分野に関する。具体的には、本発明は、アンフィレグリン(AR)のアンタゴニスト(好ましくは、抗AR抗体)、および、そのようなアンタゴニストを使用することによる癌または乾癬の検出または処置に関する。
(発明の背景)
アンフィレグリンは、ホルボールエステルで処理されたMCF−7ヒト乳癌細胞から最初に精製された約20kDaのヘパリン結合性の糖タンパク質である。この因子はEGFファミリーの増殖因子に属し、(ケラチノサイトおよびいくつかの繊維芽細胞細胞株を含む)数種の細胞タイプの増殖を刺激し、一方で、(多くの癌腫細胞株を含む)他の細胞の増殖を阻害する(Shoyabら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85、6528〜6532(1988);Shoyabら、Science、243、1074〜1076(1989))。様々な研究により、ARは主要なケラチノサイト自己分泌因子であることが解明されている(Cookら、Mol.Cell.Biol.、11、2547〜2557(1991);Cookら、In Vitro Cell.Dev.Biol.28A、218〜222(1992);Piepkornら、J.Cell.Physiol.、159、114〜120(1994))。ARの特別な特徴は、その生物学的活性がヘパリン硫酸の存在下で完全に遮断されることである。ARは、この性質を示す唯一の増殖因子であることが報告されている(Cookら、Mol.Cell.Biol.、11、2547〜2557(1991);Cookら、In Vitro Cell.Dev.Biol.28A、218〜222(1992);Piepkornら、J.Cell.Physiol.、159、114〜120(1994))。単離されたARが米国特許第5,115,096号に開示される(本明細書中に引用されるこの米国特許ならびにすべての他の米国特許および特許出願は本明細書によりそれらの全体が参考として組み込まれる)。
アンフィレグリンは、ホルボールエステルで処理されたMCF−7ヒト乳癌細胞から最初に精製された約20kDaのヘパリン結合性の糖タンパク質である。この因子はEGFファミリーの増殖因子に属し、(ケラチノサイトおよびいくつかの繊維芽細胞細胞株を含む)数種の細胞タイプの増殖を刺激し、一方で、(多くの癌腫細胞株を含む)他の細胞の増殖を阻害する(Shoyabら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85、6528〜6532(1988);Shoyabら、Science、243、1074〜1076(1989))。様々な研究により、ARは主要なケラチノサイト自己分泌因子であることが解明されている(Cookら、Mol.Cell.Biol.、11、2547〜2557(1991);Cookら、In Vitro Cell.Dev.Biol.28A、218〜222(1992);Piepkornら、J.Cell.Physiol.、159、114〜120(1994))。ARの特別な特徴は、その生物学的活性がヘパリン硫酸の存在下で完全に遮断されることである。ARは、この性質を示す唯一の増殖因子であることが報告されている(Cookら、Mol.Cell.Biol.、11、2547〜2557(1991);Cookら、In Vitro Cell.Dev.Biol.28A、218〜222(1992);Piepkornら、J.Cell.Physiol.、159、114〜120(1994))。単離されたARが米国特許第5,115,096号に開示される(本明細書中に引用されるこの米国特許ならびにすべての他の米国特許および特許出願は本明細書によりそれらの全体が参考として組み込まれる)。
ARの多数の可溶性の活性なイソタイプが、膜に固定されたAR前駆体のタンパク質分解的切断によって産生する。これらの活性なイソタイプには、AR78、AR81、AR84、AR87、AR92およびAR98などがある(Shoyabら、Science、243、1074〜1076(1989);Plowmanら、Mol.Cell.Biol.、10、1969〜1981(1990);Thompson,S.A.et al.、J.Biol.Chem.、271(30):17927〜31(1996))。可溶性の分泌型ARは、そのチロシンリン酸化および分裂促進作用を、主に170kDaのEGFRへの結合およびその活性化によって発揮する(Johnson,G.R.et al.、J.Biol.Chem.、268:2924〜2931(1993))。
免疫標識分析およびノーザン分析では、ARが正常な成体表皮において低い〜検出不能であり、(付属器腫瘍、紫外線角化症、疣贅および扁平上皮癌を含む)表皮のいくつかの新生物過増殖性障害および非新生物過増殖性障害において顕著に過剰発現していることが示されている(Piepkornら、Am.J.Dermatol.、18:165〜171(1996))。様々な研究により、ARがヒト結腸癌において自己分泌増殖因子として作用することが明らかにされている。ARに対する中和抗体の基底外側での投与は結腸癌細胞の基礎的DNA複製を低下させる(Damstrup,L.et al.、Br.J.Cancer、80(7):1012〜9(1999))。
ARのmRNA発現が乾癬皮膚において劇的に上昇することが報告されている(Cookら、Cancer Res.、52:3224〜3227(1992))。強いAR染色が、正常な皮膚におけるケラチノサイトの核に限定されたまばらで、限局的な標識化とは対照的に、乾癬表皮を伴うケラチノサイトの細胞質に存在する。ケラチノサイト特異的な遺伝子組換え発現により、ヒト乾癬に対する顕著な生物学的類似性を有する病変がもたらされている(Cookら、J.Clin.Invest.、100:2286〜2294(1997))。
公開された特許出願明細書EP1249237A1には、AR発現阻害剤および老化皮膚に対する改善剤としてのその使用が開示される。
国際特許出願公開WO90/14069および米国特許第5,262,298号には、ARの一致したアミノ酸配列を有するケラチノサイト自己分泌因子(KAF)の単離が開示される。これら2つの参考文献では一般に、KAF活性の阻害剤の投与が乾癬ならびに扁平上皮癌などの状態に有益であることが議論されている。
米国特許第5,830,995号および米国特許第6,204,359号には、ARに対する抗体が開示される。
本発明は、開示されたアミノ酸配列または結合特徴(これらは上記の刊行物には開示されてない)を有する中和抗AR抗体に関する。乾癬および癌を処置するための様々なそのような抗AR抗体のインビボ効力が本発明において調べられている。これらの抗体は、被験体において、癌細胞の成長を阻害すること、創傷治癒、皮膚の性状を高めること、または/および、乾癬を処置することのための使用が見出される。本発明はまた、ARの任意のアンタゴニスト(好ましくは抗AR抗体、より好ましくは、本明細書中において請求される抗体)を用いて乾癬または表皮癌および膵臓癌を処置する方法に従う。
(発明の概要)
本発明は、治療目的のために有用である抗AR抗体を提供する。例えば、本発明の抗体は、癌および/または他の増殖性状態(これには、良性の増殖性状態が含まれる)を有することが疑われる患者、あるいは、癌および/または他の増殖性状態(これには、良性の増殖性状態が含まれる)と診断されている患者を処置するために治療的に使用することができる。好ましい実施形態において、本発明の抗AR抗体は、乾癬と診断された患者を処置するために使用することができる。代わりの実施形態において、本発明の抗AR抗体は、細胞傷害性薬剤と結合し、ARを発現する腫瘍細胞に対して使用することができる。1つの態様において、本発明の抗AR抗体は、AR発現細胞に関連する任意の増殖性障害を処置するために使用することができる。
本発明は、治療目的のために有用である抗AR抗体を提供する。例えば、本発明の抗体は、癌および/または他の増殖性状態(これには、良性の増殖性状態が含まれる)を有することが疑われる患者、あるいは、癌および/または他の増殖性状態(これには、良性の増殖性状態が含まれる)と診断されている患者を処置するために治療的に使用することができる。好ましい実施形態において、本発明の抗AR抗体は、乾癬と診断された患者を処置するために使用することができる。代わりの実施形態において、本発明の抗AR抗体は、細胞傷害性薬剤と結合し、ARを発現する腫瘍細胞に対して使用することができる。1つの態様において、本発明の抗AR抗体は、AR発現細胞に関連する任意の増殖性障害を処置するために使用することができる。
本発明はARタンパク質(例えば、配列番号1)について高親和性の抗体を提供する。1つの実施形態において、本発明は、PAR34、PAR80およびHuPAR34からなる群から選択されるAR抗体に対するARポリペプチドの結合を競合的に阻害する抗体を提供する。この実施形態において有用であり得る他の選択された抗体が図2に開示される。
他の実施形態において、本発明は、エフェクター部分またはエフェクター成分に結合された抗体を提供する。エフェクター部分は標識(例えば、蛍光標識、エフェクタードメイン、例えば、MicA)であってもよく、または細胞傷害性薬剤(例えば、放射性同位体または細胞傷害性の化学物質)が可能である。1つの好ましい実施形態において、本発明の抗体は、細胞傷害性薬剤オーリスタチン。他の実施形態において、抗体は、腫瘍細胞の成長を阻害するために単独で使用することができる。本発明の別の好ましい実施形態において、抗体は抗体依存的な細胞毒性を媒介する。
本発明によって提供される抗AR抗体には、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体が含まれる。いくつかの実施形態において、本発明は、霊長類患者を処置するための霊長類化抗AR抗体を提供する。本発明は、完全な抗体である抗AR抗体、ならびに抗AR抗体フラグメントを提供する。好ましい実施形態において、抗体フラグメントには、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fvフラグメント、rIgG、二重特異性抗体、単鎖抗体および多重特異性抗体が含まれる。
本発明の抗AR抗体には、配列番号2〜5、配列番号8〜12、配列番号14〜19として開示されるVH領域およびVL領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に対する相同性が95%以上である抗体が含まれる。1つの好ましい実施形態において、本発明は、配列番号2、配列番号4および配列番号12から選択されるVH領域アミノ酸配列、ならびに/または、配列番号3、配列番号5および配列番号14から選択されるVL領域アミノ酸配列を含む抗AR抗体を提供する。1つの実施形態において、本発明は、配列番号2および/または配列番号3(これらはPAR34のVH領域およびVL領域にそれぞれ対応する)を含む抗体を提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号4および/または配列番号5(これらはPAR80のVH領域およびVL領域にそれぞれ対応する)を含む抗体を提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号12および/または配列番号14(これらはHuPAR34のVH領域およびVL領域にそれぞれ対応する)を含む抗体を提供する。
別の実施形態において、本発明は、配列番号2、配列番号4および配列番号12から選択されるアミノ酸配列を有する成熟型重鎖可変領域(VH)、ならびに/または、配列番号3、配列番号5および配列番号14から選択されるアミノ酸配列を有する成熟型軽鎖可変領域(VL)を含む抗体を提供する。
本発明はまた、ARタンパク質のアミノ酸配列(配列番号1)に対して少なくとも80%の相同性(好ましくは98%の相同性)を有する配列を含むポリペプチドと結合するモノクローナル抗体(またはその抗体フラグメント)を提供する。いくつかの実施形態において、本発明のARモノクローナル抗体は、キメラ型、ヒト化型またはヒト型である。好ましくは、モノクローナル抗体は、AR表面のリガンド結合部位について競合し、より好ましくは、表皮細胞または腫瘍細胞(これらの細胞は、ARを発現する腫瘍細胞である)の増殖をインビボで阻害する。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、細胞傷害性薬剤(例えば、オーリスタチン)などのエフェクター部分に結合される。さらなる実施形態において、本発明は、抗体依存的な細胞の細胞傷害性を媒介するモノクローナル抗体を提供する。
別の実施形態において、本発明は、PAR34、PAR80およびHuPAR34からなる群から選択される抗AR抗体が結合するエピトープと同じARエピトープに結合するモノクローナル抗体を提供する。
別の実施形態において、本発明は、配列番号2〜5、配列番号12および配列番号14からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
別の実施形態において、本発明は、配列番号8、配列番号10、配列番号16および配列番号18からなる群から選択される核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
別の実施形態において、本発明は、配列番号8、配列番号10、配列番号16および配列番号18からなる群から選択される核酸配列を含むベクターを提供する。
別の実施形態において、本発明は、PAR34、PAR80およびHuPAR34からなる群から選択される抗AR抗体を産生することができる宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞はハイブリドーマである。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、配列番号8、配列番号10、配列番号16および配列番号18からなる群から選択される核酸配列を含む。好ましい実施形態において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、大腸菌、酵母細胞および昆虫細胞からなる群から選択される。
本発明はまた、薬学的に受容可能な賦形剤と、ARアンタゴニストとを含む薬学的組成物を提供する。1つの実施形態において、本発明は、抗AR抗体および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む組成物を提供する。1つの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、配列番号2、配列番号4および配列番号12から選択されるアミノ酸配列を有する成熟型重鎖可変領域(VH)、ならびに/または、配列番号3、配列番号5および配列番号14から選択されるアミノ酸配列を有する成熟型軽鎖可変領域(VL)を含む抗AR抗体を含む。別の好ましい実施形態において、抗AR抗体は、PAR34、PAR80およびHuPAR34からなる群から選択される。
薬学的組成物のいくつかの実施形態において、抗AR抗体はエフェクター部分またはエフェクター成分に結合される。エフェクター成分は標識(例えば、蛍光標識)であってもよく、または細胞傷害性薬剤(例えば、放射性同位体または細胞傷害性の化学物質部分)が可能である。本発明は、抗AR抗体に結合され得る様々な細胞傷害性薬剤を提供し、これらには、ジフテリアA鎖、エキソトキシンA鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、ネオマイシンおよびオーリスタチンが含まれる。薬学的組成物における抗AR抗体は完全な抗体であり得るか、または抗体フラグメントであり得る(これには、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fvフラグメント、rIgG、二重特異性抗体、単鎖抗体および多重特異性抗体が含まれる)。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、キメラ抗AR抗体、ヒト化抗AR抗体、またはヒト抗AR抗体を含む。
本発明はまた、癌関連細胞の増殖を阻害する方法を提供する。この方法は、細胞を本発明の抗AR抗体と接触させることを含む。好ましい実施形態において、抗AR抗体は、ARアミノ酸配列(例えば、配列番号1)に対する少なくとも80%の相同性を有するアミノ酸配列に結合することができる。いくつかの実施形態において、抗AR抗体はエフェクター部分(例えば、細胞傷害性薬剤)と結合することができる。ほとんどの実施形態において、癌関連細胞は患者(代表的にはヒト)に存在する。いくつかの実施形態において、患者は、転移癌と診断され、転移癌を処置するための治療的療法を受け続けてもよく、または、癌を有することが単に疑われることがある。
別の実施形態において、本発明は、そのような処置を必要としている被験体における癌を処置する方法で、配列番号2、配列番号4および配列番号12から選択されるアミノ酸配列を有する成熟型重鎖可変領域(VH)、ならびに/または、配列番号3、配列番号5および配列番号14から選択されるアミノ酸配列を有する成熟型軽鎖可変領域(VL)を含む抗AR抗体の薬学的に効果的な量を前記被験体に投与することによる方法を提供する。
代わりの実施形態において、本発明の処置方法は、抗AR抗体および治療効果的な量の細胞傷害性薬剤を患者に投与することを含む。この場合、抗体および細胞傷害性薬剤は同時に投与することができ、またはいずれか一方を他方の前に投与することができる。別の代替形態において、細胞傷害性薬剤が抗体に結合され、それにより同時に投与される。
別の実施形態において、本発明は、そのような処置を必要としている被験体における乾癬を処置する方法で、ARのアンタゴニストの治療効果的な量を前記被験体に投与することを含む方法を提供する。1つの好ましい実施形態において、投与されるアンタゴニストは、ARアミノ酸配列(例えば、配列番号1)に対して少なくとも80%の相同性を有するアミノ酸配列に結合することができる抗AR抗体である。より好ましくは、アンタゴニストは、配列番号2、配列番号4および配列番号12から選択されるアミノ酸配列を有する成熟型重鎖可変領域(VH)、ならびに/または、配列番号3、配列番号5および配列番号14から選択されるアミノ酸配列を有する成熟型軽鎖可変領域(VL)を含む抗AR抗体である。特に好ましい実施形態において、ARアンタゴニストは、PAR34、PAR80およびHuPAR34からなる群から選択される。
本発明はさらに、本明細書中に開示される様々な抗AR抗体を用いる診断試験および免疫アッセイを提供する。好ましい実施形態において、これらの方法では、生物学的サンプルを本発明の抗AR抗体と接触させることによって、患者由来の生物学的サンプルにおける乾癬または癌細胞を検出することを含む。いくつかの実施形態において、抗体は、蛍光標識または放射性同位体などの標識に結合される。
1つの好ましい実施形態において、本発明は、哺乳動物において乾癬または癌を診断する方法で、抗AR抗体を、哺乳動物から得られた試験サンプルと接触させること、および、抗体と試験サンプルのポリペプチドとの間での複合体の形成を検出することを含む方法を提供する。この場合、抗体は、ARのアミノ酸配列(例えば、配列番号1)に対して少なくとも80%の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドと結合する。この方法の好ましい実施形態において、試験サンプルは、新生物細胞の成長または増殖を有することが疑われる個体から、あるいは、癌または乾癬有することが疑われる個体から得られる。
(発明の詳細な説明)
(定義:)
本明細書中で使用される「抗体」は、特定の抗原との免疫学的反応性を有する免疫グロブリン分子に対する参照を包含し、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を包含する。この用語にはまた、遺伝子操作された形態、例えば、キメラ抗体(例えば、ヒト化されたマウス抗体)、およびヘテロコンジュゲート抗体(例えば、二重特異性抗体)などが含まれる。用語「抗体」にはまた、抗体の様々な抗原結合性形態が含まれ、これらには、抗原結合能力を有するフラグメント(例えば、Fab’、F(ab’)2、Fab、FvおよびrIgG)が含まれる。Pierce Catalog and Handbook、1994〜1995(Pierce Chemical Co.、Rockford、IL)もまた参照のこと。例えば、Kuby,J.、Immunology、3rd Ed.、W.H.Freeman&Co.、New York(1998)もまた参照のこと。この用語はまた、組換え単鎖Fvフラグメント(scFv)を示す。抗体の用語にはまた、二価分子または二重特異性分子、二重特異性抗体、トリアボディーおよびテトラボディーが含まれる。二価分子および二重特異性分子が、例えば、Kostelnyら(1992)、J Immunol、148:1547;Pack and Pluckthun(1992)、Biochemistry、31:1579;Hollingerら、1993、supra;Gruberら(1994)、J Immunol:5368;Zhuら(1997)、Protein Sci、6:781;Huら(1996)、Cancer Res.、56:3053;Adamsら(1993)、Cancer Res.、53:4026;およびMaCartneyら(1995)、Protein Eng.、8:301に記載される。
(定義:)
本明細書中で使用される「抗体」は、特定の抗原との免疫学的反応性を有する免疫グロブリン分子に対する参照を包含し、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を包含する。この用語にはまた、遺伝子操作された形態、例えば、キメラ抗体(例えば、ヒト化されたマウス抗体)、およびヘテロコンジュゲート抗体(例えば、二重特異性抗体)などが含まれる。用語「抗体」にはまた、抗体の様々な抗原結合性形態が含まれ、これらには、抗原結合能力を有するフラグメント(例えば、Fab’、F(ab’)2、Fab、FvおよびrIgG)が含まれる。Pierce Catalog and Handbook、1994〜1995(Pierce Chemical Co.、Rockford、IL)もまた参照のこと。例えば、Kuby,J.、Immunology、3rd Ed.、W.H.Freeman&Co.、New York(1998)もまた参照のこと。この用語はまた、組換え単鎖Fvフラグメント(scFv)を示す。抗体の用語にはまた、二価分子または二重特異性分子、二重特異性抗体、トリアボディーおよびテトラボディーが含まれる。二価分子および二重特異性分子が、例えば、Kostelnyら(1992)、J Immunol、148:1547;Pack and Pluckthun(1992)、Biochemistry、31:1579;Hollingerら、1993、supra;Gruberら(1994)、J Immunol:5368;Zhuら(1997)、Protein Sci、6:781;Huら(1996)、Cancer Res.、56:3053;Adamsら(1993)、Cancer Res.、53:4026;およびMaCartneyら(1995)、Protein Eng.、8:301に記載される。
特定の抗原との免疫学的反応性を有する抗体は、ファージベクターまたは類似するベクターにおける組換え抗体のライブラリーの選択などの組換え方法(例えば、Huseら、Science、246:1275〜1281(1989);Wardら、Nature、341:544〜546(1989);およびVaughanら、Nature Biotech.、14:309〜314(1996)を参照のこと)によって、あるいは、抗原で動物を免疫化するか、または抗原をコードするDNAで動物を免疫化することによって作製することができる。
代表的には、免疫グロブリンは重鎖および軽鎖を有する。それぞれの重鎖および軽鎖は定常領域および可変領域を含有する(これらの領域はまた「ドメイン」として知られている)。重鎖および軽鎖の可変領域は、3つの超可変領域(これらはまた「相補性決定領域」または「CDR」と呼ばれる)によって中断される4つの「フレームワーク」領域を含有する。フレームワーク領域およびCDRの大きさが明らかにされている。種々の軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は種内では比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち、構成的な軽鎖および重鎖の組み合わさったフレームワーク領域は、三次元空間においてCDRを配置し、アラインメントするために役立つ。
CDRは、抗原のエピトープに対する結合に主に関係している。それぞれの鎖のCDRは、代表的には、N末端から始まって順次番号が付けられたCDR1、CDR2およびCDR3として示され、これらもまた、代表的には、特定のCDRが存在する鎖によって特定される。従って、VHのCDR3は、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメインに存在し、これに対して、VLのCDR1は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメインに由来するCDR1である。
「VH」または「VH」に対する参照は抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を示し、これには、Fv、scFvまたはFabの重鎖が含まれる。「VL」または「VL」に対する参照は免疫グロブリン軽鎖の可変領域を示し、これには、Fv、scFvまたはFabの軽鎖が含まれる。
表現「単鎖Fv」または表現「scFv」は、従来の二鎖抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインが連結されて、1つの鎖を形成している抗体を示す。代表的には、リンカーペプチドが、活性な結合部位の適切な折り畳みおよび生成を可能にするために2つの鎖の間に挿入される。
天然に存在するクラスのIgG抗体の定常領域と実質的に同一である定常領域を有する抗体は、存在する任意の定常領域が、天然に存在するクラスのIgG抗体の定常領域のアミノ酸配列と実質的に同一である抗体、すなわち、天然に存在するクラスのIgG抗体の定常領域のアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも85%〜90%(好ましくは少なくとも95%)である抗体を示す。
本明細書中で使用される用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって作製される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、それが作製される方法ではなく、任意の真核生物クローン、原核生物クローンまたはファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体を示す。本発明に関して有用であるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術およびファージディスプレー技術、またはそれらの組合せの使用を含むこの分野で知られている広範囲の様々な技術を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、この分野で知られている技術、および、例えば、Harlow and Lane、“Antibodies:A Laboratory Manual”、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York(1988);Hammerlingら、“Monoclonal Antibodies and T−Cell Hybridomas”、Elsevier、New York(1981)、pp.563〜681(これらはともにその全体が参考として本明細書中に組み込まれる)に教示される技術を含むハイブリドーマ技術を使用して製造することができる。
用語「遺伝子改変された抗体」は、アミノ酸配列が天然抗体のアミノ酸配列から変化している抗体を意味する。本発明に対する組換えDNA技術の妥当性のために、抗体は、天然抗体に見出されるアミノ酸の配列に限定される必要はない。すなわち、抗体を、所望の特徴を得るために再設計することができる。可能な変化は多数であり、ほんの1個または数個のアミノ酸を変化させることから、例えば、可変領域または定常領域の完全な再設計にまで及び得る。定常領域における変化は、一般に、補体結合、膜との相互作用、および他のエフェクター機能などの特徴を改善するか、または変化させるために行われる。可変領域における変化は、抗原結合特徴を改善するために行われる。「遺伝子改変された抗体」の例には、キメラ抗体およびヒト化抗体が含まれる。
本発明の多くの好ましい使用において、これらには、癌または乾癬を処置するためのヒトにおける抗AR抗体のインビボ使用、またはインビトロ検出アッセイのための使用が含まれるが、キメラ抗体、霊長類化抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体を使用することが好ましい場合がある。
「キメラ抗体」は、(a)定常領域もしくはその一部が変化させられ、もしくは置換され、もしくは交換され、その結果、抗原結合部位(可変領域)が、異なるかもしくは変化したクラス、エフェクター機能および/もしくは生物種の定常領域に、または、新しい性質をキメラ抗体に付与する完全に異なる分子(例えば、酵素、トキシン、ホルモン、増殖因子、薬物など)に連結されている免疫グロブリン分子、あるいは(b)可変領域もしくはその一部が、異なるかもしくは変化した抗原特異性を有する可変領域を用いて変化させられ、または、そのような可変領域で置換され、またはそのような可変領域と交換されている免疫グロブリン分子である。キメラ抗体を作製するための様々な方法がこの分野では知られている。例えば、Morrison、Science、229:1202〜1207(1985);Oiら、BioTechniques、4;214〜221(1986);Gilliesら、J.Immunol.Methods、125:191〜202(1989);米国特許第5,807,715号、同第4,816,567号および同第4,816,397号を参照のこと(これらはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる)。
用語「ヒト化抗体」または用語「ヒト化免疫グロブリン」は、ヒトフレームワーク、非ヒト抗体に由来する少なくとも1つ(好ましくはすべての)相補性決定領域(CDR)を含む免疫グロブリンを示し、この場合、存在するいずれかの定常領域はヒト免疫グロブリンの定常領域と実質的に同一であり、すなわち、少なくとも約85%〜90%(好ましくは少なくとも95%)が同一である。従って、ヒト化免疫グロブリンのすべての部分が、おそらくはCDRを除いて、1つまたは複数の天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。従って、そのようなヒト化抗体は、実質的にはヒト可変ドメインの一部が、ヒト以外の生物種に由来する対応する配列によって置換されているキメラ抗体である(米国特許第4,816,567号)。多くの場合、ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基が、抗原結合性を変化させるために、好ましくは抗原結合性を改善するために、CDRドナー抗体に由来する対応する残基で置換される。これらのフレームワーク置換は、この分野で広く知られている方法によって、例えば、抗原結合のために重要なフレームワーク残基を同定するためにCDR残基とフレームワーク残基との相互作用をモデル化すること、および、非通常的なフレームワーク残基を特定の位置において同定するための配列比較によって同定される。例えば、Queenら、米国特許第5,530,101号、同第5,585,089号、同第5,693,761号、同第5,693,762号、同第6,180,370号(これらのそれぞれはその全体が参考として組み込まれる)を参照のこと。抗体は、この分野で知られている様々な技術を使用してヒト化することができ、そのような技術には、例えば、CDRグラフト化(欧州特許EP239,400;PCT国際特許出願公開WO91/09967;米国特許第5,225,539号、同第5,530,101号および同第5,585,089号)、張り合わせまたは再表面化(欧州特許EP592,106、欧州特許EP519,596;Padlan、Mol.Immunol.、28:489〜498(1991);Studnickaら、Prot.Eng.、7:805〜814(1994);Roguskaら、Proc.Natl.Acad.Sci.、91:969〜973(1994))、および鎖シャッフリング(米国特許第5,565,332号)が含まれる(これらのすべては本明細書によりその全体が参考として組み込まれる)。
完全な「ヒト」抗体はヒト患者の治療的処置のために望ましいと考えられる。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用する上記のファージディスプレー法を含む、この分野で知られている様々な方法によって作製することができる。米国特許第4,444,887号および同第4,716,111号;ならびに、PCT国際特許出願公開WO98/46645、同WO98/50433、同WO98/24893、同WO98/16654、同WO96/34096、同WO96/33735および同WO91/10741を参照のこと(これらのそれぞれはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる)。ヒト抗体はまた、機能的な内因性の免疫グロブリンを発現することができず、しかし、ヒトの免疫グロブリン遺伝子を発現することができる遺伝子組換えマウスを使用して作製することができる。ヒト抗体を作製するためのこの技術の概略については、Lonberg and Huszar、Int.Rev.Immunol.、13:65〜93(1995)を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのこの技術の詳細な議論、ならびにそのような抗体を作製するためのプロトコルについては、例えば、PCT国際特許出願公開WO98/24893、同WO92/01047、同WO96/34096、同WO96/33735;欧州特許第0598877号;米国特許第5,413,923号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、同第5,569,825号、同第5,661,016号、同第5,545,806号、同第5,814,318号、同第5,885,793号、同第5,916,771号および同第5,939,598号を参照のこと(これらはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる)。また、Abgenix,Inc.(Fremont、CA)およびMedarex(Princeton、NJ)などの企業は、上記に記載された技術に類似する技術を使用して、選択された抗原に対して向けられたヒト抗体を提供するために契約することができる。
選択されたエピトープを認識する完全なヒト抗体は、「誘導選抜」として示される技術を使用して作製することができる。この方法では、選択された非ヒトモノクローナル抗体(例えば、マウス抗体)が、同じエピトープを認識する完全なヒト抗体の選抜を誘導するために使用される(Jespersら、Biotechnology、12:899〜903(1988))。
用語「霊長類化抗体」は、サルの可変領域と、ヒトの定常領域とを含む抗体を示す。霊長類化抗体を作製するための様々な方法がこの分野では知られている。例えば、米国特許第5,658,570号、同第5,681,722号および同第5,693,780号を参照のこと(これらはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる)。
「エピトープ」または「抗原決定基」は、抗体が結合する抗原上の部位を示す。エピトープは、連続したアミノ酸、または、タンパク質の三次折り畳みによって並置される非連続のアミノ酸の両方から形成され得る。連続したアミノ酸から形成されるエピトープは、代表的には、変性溶媒にさらされたときに保持されており、これに対して、三次折り畳みによって形成されるエピトープは、代表的には、変性溶媒を用いた処理で失われる。エピトープは、代表的には、少なくとも3個のアミノ酸、より通常的には少なくとも5個または8個〜10個のアミノ酸を特徴的な空間的配座で含む。エピトープの空間的配座を決定する方法には、例えば、x線結晶学および2次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology、Vol.66、Glenn E.Morris,Ed(1996)を参照のこと。2つの抗体は、一方の抗体の結合を低下させるか、または排除するタンパク質内のアミノ酸変異がもう一方の抗体の結合をも低下させるか、または排除する場合、および/あるいは、2つの抗体がタンパク質に対する結合について競合する場合、すなわち、タンパク質に対する一方の抗体の結合がもう一方の抗体の結合を低下させるか、または排除する場合、タンパク質の同じエピトープに結合すると言われる。
「IgGクラス」の抗体は、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4の抗体を示す。重鎖および軽鎖におけるアミノ酸残基の番号付けはEUインデックスの番号付けである(Kabat,et al.、“Sequences of Proteins of Immunological Interest”、5th ed.、National Institutes of Health、Bethesda、MD(1991);EU番号付けスキームが本明細書中では使用される)。
用語「ポリペプチド」、用語「ペプチド」および用語「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを示すために本明細書中では交換可能に使用される。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマー、修飾された残基を含有する天然に存在するアミノ酸ポリマー、および天然に存在しないアミノ酸ポリマーだけでなく、1つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーに対して適用される。
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成されたアミノ酸、ならびに、天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体を示す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、ならびに、後で修飾されるそのようなアミノ酸(例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸およびO−ホスホセリン)である。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造(例えば、水素に結合しているα炭素、カルボキシル基、アミノ基およびR基)を有する化合物(例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム)を示す。そのようなアナログは、修飾されたR基(例えば、ノルロイシン)または修飾されたペプチド骨格を有することができ、しかし、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化学化合物を示す。アミノ酸は、それらの一般的に知られている三文字記号、または、IUPAC−IUB生化学命名法委員会により勧告される一文字記号のいずれかによって本明細書中では示され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に認められている一文字記号によって示され得る。
「保存的に改変された改変体」はアミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードするそのような核酸を示すか、あるいは、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一であるか、または関連した、例えば、天然では連続した配列を示す。遺伝暗号の縮重性のために、非常に多数の機能的に同一の核酸により、ほとんどのタンパク質がコードされる。例えば、GCA、GCC、GCGおよびGCUのコドンはすべてが、アミノ酸のアラニンをコードする。従って、あるコドンによってアラニンが指定されるすべての位置において、そのコドンは、コードされるポリペプチドを変化させることなく、記載された対応するコドンの別のものに変えることができる。そのような核酸変化は「サイレントな変化」であり、これは、保存的に改変された変化の1つの種である。ポリペプチドをコードする本明細書中の核酸配列はどれもまた、核酸のサイレントな変化を記述する。当業者は、特定の状況では、核酸における各コドン(通常的にはメチオニンに対する唯一のコドンであるAUG、および、通常的にはトリプトファンに対する唯一のコドンであるTGGを除く)が、機能的に同一の分子を生じさせるために改変され得ることを認識している。従って、多くの場合、ポリペプチドをコードする核酸の様々なサイレントな変化が、実際のプローブ配列に関してではなく、発現産物に関しては、記載された配列には含まれる。
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列において1個のアミノ酸または少ない割合のアミノ酸を変化または付加または欠失する、核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加は、その変化が、化学的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす場合、「保存的に改変された改変体」であることを認識する。機能的に類似するアミノ酸を提供する様々な保存的置換の様々な表がこの分野では広く知られている。そのような保存的に改変された改変体は、本発明の多型改変体、種間ホモログおよび対立遺伝子に加えてであり、また、それらを除外しない。代表的には、相互についての保存的置換は下記の通りである:1)アラニン(A)、グリシン(G);2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);4)アルギニン(R)、リシン(K);5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W):7)セリン(S)、トレオニン(T);および8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton、Proteins(1984)を参照のこと)。
用語「AR」は、アンフィレグリンの核酸およびポリペプチドの多型改変体、対立遺伝子、変異体ならびに種間ホモログを示し、これらには、(1)配列番号1のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、好ましくは、少なくとも約25ヌクレオチド、50ヌクレオチド、100ヌクレオチド、200ヌクレオチド、500ヌクレオチド、1000ヌクレオチドまたはそれ以上の領域について、約60%を越えるヌクレオチド配列同一性、65%、70%、75%、80%、85%、90%、または、より好ましくは、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれ以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するもの;(2)配列番号1のアミノ酸配列およびその保存的に改変された改変体を含む免疫原に対して惹起された抗体(例えば、ポリクローナル抗体)に結合するもの;(3)配列番号1のアミノ酸配列およびその保存的に改変された改変体をコードする核酸配列またはその相補体にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもとで特異的にハイブリダイゼーションするもの;または(4)配列番号1のアミノ酸配列に対して、好ましくは、少なくとも約25アミノ酸、50アミノ酸、100アミノ酸、200アミノ酸またはそれ以上の領域について、約60%を越えるアミノ酸配列同一性、65%、70%、75%、80%、85%、90%、好ましくは、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するものが含まれる。ARポリヌクレオチド配列またはARポリペプチド配列は、代表的には、霊長類(例えば、ヒト)、齧歯類(例えば、ラット、マウス、ハムスター)、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジまたは他の哺乳動物(これらに限定されない)を含む哺乳動物に由来する。「ARポリペプチド」および「ARポリヌクレオチド」には、天然に存在する形態または組換え形態の両方が含まれる。
「全長」のARタンパク質またはAR核酸は、1つまたは複数の天然に存在する野生型のARポリヌクレオチド配列またはARポリペプチド配列に通常の場合には含有される要素のすべてを含有する卵巣癌ポリペプチド配列または卵巣癌ポリヌクレオチド配列またはそれらの改変体を示す。例えば、全長のAR核酸は、代表的には、全長の天然に存在するタンパク質をコードするエキソンのすべてを含む。「全長」は、翻訳後のプロセシングまたはスプライシング(選択的スプライシングを含む)の様々な段階の前またはその後であってもよい。
用語「生来的形態」は、細胞によって適切かつ自然に発現されたときに存在するようなポリペプチドの正しい三次元配座(すなわち、三次構造)を示す。
用語「同一の」またはパーセント「同一性」は、2つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関連して、同じである2つ以上の配列または部分配列、あるいは、BLASTもしくはBLAST2.0の配列比較アルゴリズムを下記のデフォルトパラメーターとともに使用して測定されたとき、または、手作業によるアライメントおよび目視検査によって、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの指定されたパーセント(すなわち、比較ウインドウまたは指定された領域にわたって最大限の一致を得るために比較およびアラインメントされたとき、指定された領域について約60%の同一性、好ましくは、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の同一性)を有する2つ以上の配列または部分配列を示す(例えば、NCBIウエブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTまたはその他を参照のこと)。その場合、そのような配列は「実質的に同一」であると言われる。この定義はまた、試験配列の補足部を示すか、または試験配列の補足部に対して適用され得る。この定義にはまた、置換を有する配列だけでなく、欠失および/または付加を有する配列、ならびに、天然に存在する、例えば、多型改変体または対立遺伝子改変体、および人工の改変体が含まれる。下記に記載されるように、好ましいアルゴリズムはギャップなどを明らかにすることができる。好ましくは、同一性は、長さが少なくとも約25個のアミノ酸またはヌクレオチドである領域について存在し、より好ましくは、長さが50個〜100個のアミノ酸またはヌクレオチドである領域について存在する。
「宿主細胞」は、天然に存在する細胞、あるいは、発現ベクターを含有し、発現ベクターの複製または発現を支持する形質転換された細胞である。宿主細胞は、培養細胞、外植片、およびインビボでの細胞などであり得る。宿主細胞は、大腸菌などの原核生物細胞、あるいは、酵母細胞、昆虫細胞、両生類細胞または哺乳動物細胞(例えば、CHOおよびHeLaなど)などの真核生物細胞であり得る(例えば、American Type Culture Collectionのカタログまたはウエブサイトwww.atcc.orgを参照のこと)。
用語「単離された」、用語「精製された」または用語「生物学的に純粋な」は、その天然の状態において見出されるような、通常の場合には伴う成分を実質的または本質的に含まない物質を示す。純度および均一度は、代表的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を使用して決定される。調製物に存在する主要な化学種であるタンパク質または核酸は実質的に精製されている。具体的には、単離された核酸は、天然の状態では遺伝子に隣接し、かつ、遺伝子によってコードされるタンパク質ではないタンパク質をコードするいくつかのオープンリーディングフレームから分離されている。用語「精製された」は、いくつかの実施形態では、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に1つのバンドを生じさせることを意味する。好ましくは、用語「精製された」は、核酸またはタンパク質が少なくとも85%純粋であり、より好ましくは少なくとも95%純粋であり、最も好ましくは少なくとも99%純粋であることを意味する。「純度」または「精製」は、他の実施形態では、精製される組成物から少なくとも1つの混入物を除去することを意味する。この意味において、精製は、精製された化合物が均質であること、例えば、100%純粋であることを要求しない。
本明細書中で使用される「生物学的サンプル」は、例えば、ARタンパク質、ARポリヌクレオチドまたはAR転写物の核酸またはポリペプチドを含有する生物学的な組織または流体のサンプルである。そのようなサンプルには、霊長類(例えば、ヒト)または齧歯類(例えば、マウス、およびラット)から単離された組織が含まれるが、これらに限定されない。生物学的サンプルにはまた、生検サンプルおよび検死解剖サンプルなどの組織の切片、組織学的目的のために採取された凍結切片、血液、血漿、血清、唾液、便、涙、粘液、体毛、皮膚などが含まれ得る。生物学的サンプルにはまた、患者の組織に由来する外植片ならびに初代細胞培養物および/または形質転換細胞培養物が含まれる。生物学的サンプルは、代表的には、真核生物から、最も好ましくは、哺乳動物、例えば、霊長類(例えば、チンパンジーまたはヒト)、ウシ、イヌ、ネコ、齧歯類(例えば、モルモット、ラット、マウス)、ウサギなど;または鳥類;ハ虫類;または魚類から得られる。
「生物学的サンプルを提供すること」は、本発明において記載された方法における使用のための生物学的サンプルを得ることを意味する。ほとんどの場合、これは、細胞のサンプルを動物から取り出すことによって行われるが、しかし、以前に単離された細胞(例えば、別人によって、別の時間で、かつ/または別の目的のために単離された細胞)を使用することによって、または、本発明の方法をインビボで行うことによってもまた達成することができる。処置または結果の履歴を有する保存組織は特に有用である。
「標識」または「検出可能な部分」は、分光分析的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、化学的手段または他の物理的手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識には、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素(例えば、ELISAにおいて一般的に使用されるような酵素)、ビオチン、ジゴキシゲニン、コロイド状金、発光性ナノ結晶(例えば、量子ドット)、ハプテンおよびタンパク質または他の実体が含まれ、これらは、例えば、放射性標識をペプチドに取り込むことによって検出可能にすることができ、または、ペプチドと特異的に反応し得る抗体を検出するために使用することができる。放射性同位体は、例えば、3H、14C、32P、35Sまたは125Iが可能である。場合により、本発明のタンパク質に対する抗体を特に使用することにより、放射性同位体は、下記において記載されるように、毒性成分として使用される。標識は、任意の位置において、GPR64核酸、タンパク質および抗体に取り込むことができる。抗体を標識に結合するためのこの分野で知られている方法はどれも用いることができ、これらには、Hunterら、Nature、144:945(1962);Davidら、Biochemistry、13:1014(1974);Painら、J.Immunol.Meth.、40:219(1981);およびNygren、J.Histochem.and Cytochem.、30:407(1982)によって記載されるそのような方法が含まれる。放射能標識されたペプチドまたは放射能標識された抗体組成物の寿命は、放射能標識されたペプチドまたは抗体を安定化させ、その分解から保護する物質の添加によって延ばすことができる。放射能標識されたペプチドまたは抗体を安定化させる任意の物質または物質の組合せを使用することができ、これらには、米国特許第5,961,955号に開示されるそのような物質が含まれる。
「エフェクター」または「エフェクター部分」または「エフェクター成分」は、抗体に対して、リンカーまたは化学結合によって共有結合的に、あるいは、イオン結合、ファンデルワールス結合、静電結合または水素結合によって非共有結合的に結合する(または連結または結合される)分子である。「エフェクター」は様々な分子が可能であり、これらには、例えば、放射性化合物を含む検出成分、蛍光性化合物、酵素または基質、タグ(例えば、エピトープタグなど)、毒素、活性化可能な成分、化学療法剤または細胞傷害性薬剤、化学誘因剤、リパーゼ;抗生物質;または放射性同位体を放出する「ハード」(例えば、ベータ線)が含まれる。
本明細書中で使用される用語「細胞傷害性薬剤」は、細胞の機能を阻害または防止し、かつ/あるいは細胞の破壊を引き起こす物質を示す。この用語は、放射性同位体(例えば、I131、I125、Y90およびRe186)、化学療法剤および毒素(例えば、細菌起源、菌類起源、植物起源または動物起源の酵素的に活性な毒素、あるいはそのフラグメントなど)を包含することが意図される。
「化学療法剤」は、癌の処置において有用な化学化合物である。化学療法剤の例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、5−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド(“Ara−C”)、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、トキソイド、例えば、パクリタキセル(タキソール、Bristol−Myers Squibb Oncology、Princeton、NJ)およびドキセタキセル(タキソテレ、Rhne−Poulenc Rorer、Antony、Rnace)、トキソテレ、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン類、エスペラマイシン類(米国特許第4,675,187号を参照のこと)、5−FU、6−チオグアニン、6−メルカプトプリン、アクチノマイシンD、VP−16、クロラムブチル、メルファランおよび他の関連するナイトロジェンマスタードが含まれる。この定義には、腫瘍に対するホルモン的作用を調節または阻害するように作用するホルモン剤(例えば、タモキシフェンおよびオナプリストンなど)もまた含まれる。
本明細書中で使用される「キャリア」には、用いられた投薬量および濃度でさらされている細胞または哺乳動物に対して非毒性である薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤が含まれる。多くの場合、生理学的に許容され得るキャリアは水性のpH緩衝化溶液である。生理学的に許容され得るキャリアの例には、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸を含む抗酸化剤;低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドンなど;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンなど;単糖、二糖および他の炭水化物、これには、グルコース、マンノースまたはデキストリンが含まれる;キレート化剤、例えば、EDTAなど;糖アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトールなど;塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウムなど;および/または非イオン性界面活性剤、例えば、TWEENTM、ポリエチレングリコール(PEG)およびPLURONICSTMが含まれる。
「薬学的に効果的」または「治療効果的」な量は、腫瘍の処置に関連して、下記の効果の1つまたは複数を生じさせることができる量を示す:(1)鈍化および完全な成長停止を含む、腫瘍成長のある程度の阻害;(2)腫瘍細胞数の減少;(3)腫瘍サイズの減少;(4)末梢器官への腫瘍細胞浸潤の阻害(すなわち、減少、鈍化または完全な停止);(5)転移の阻害(すなわち、減少、鈍化または完全な停止);(6)抗腫瘍免疫応答の強化、これは腫瘍の退行または拒絶を生じさせ得るが、しかし、腫瘍の退行または拒絶を生じさせる必要はない;および/または(7)障害に関連した1つまたは複数の症状のある程度の緩和。腫瘍を処置する目的のためのARアンタゴニストまたは抗AR抗体の「治療効果的な量」は、経験的に、また、日常的な様式で決定することができる。
「処置」は、治療的処置および予防的または防止的な対策の両方を示す。処置を必要としているものには、障害を既に有するもの、ならびに、障害を防止しなければならないものが含まれる。
「被験体」は脊椎動物(好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト)を示す。
用語「癌」は、調節されない細胞成長によって代表的には特徴づけられる、哺乳動物において見出される任意のタイプの生理学的状態(例えば、新生物または悪性腫瘍)を示し、これには、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫または造血系新生物障害が含まれる。癌の例には、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、頭頸部癌、内皮の癌、骨の癌、筋肉の癌、膵臓癌、横紋筋肉腫、原発性血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺癌、胃癌、結腸癌、腎臓癌、悪性の膵臓インスリノーマ、悪性の類癌腫、膀胱癌、黒色腫、前悪性の皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、食道癌、尿生殖路癌、悪性の高カルシウム血症、子宮頸癌、子宮内膜癌、表皮癌、副腎皮質癌、前立腺癌または子宮癌が含まれるが、これらに限定されない。癌細胞は任意のタイプの癌の癌性細胞であり、これは患者由来の癌組織の細胞であり得るか、または確立された癌細胞株の細胞であり得る。
本明細書中で使用される「腫瘍」は、悪性または良性であっても、すべての新生物細胞の成長および増殖、ならびに、すべての前癌性および癌性の細胞および組織を示す。
(I.アンフィレグリン(AR)ポリペプチド)
用語「アンフィレグリン」および用語「アンフィレグリンポリペプチド」は本明細書中では交換可能に使用され、これらは全長のARタンパク質またはその機能的に活性なフラグメントもしくは誘導体を示す。アンフィレグリンの様々な活性な形態が内膜タンパク質前駆体の内部切断産物から作製される。これらの活性な形態の例には、AR84、AR87またはAR98がある。ヒトARの252アミノ酸の配列(GenBankアクセション番号NP_001648)は下記の通りである:
用語「アンフィレグリン」および用語「アンフィレグリンポリペプチド」は本明細書中では交換可能に使用され、これらは全長のARタンパク質またはその機能的に活性なフラグメントもしくは誘導体を示す。アンフィレグリンの様々な活性な形態が内膜タンパク質前駆体の内部切断産物から作製される。これらの活性な形態の例には、AR84、AR87またはAR98がある。ヒトARの252アミノ酸の配列(GenBankアクセション番号NP_001648)は下記の通りである:
機能的に活性なARフラグメントまたは誘導体は、全長の野生型ARタンパク質に関連する1つまたは複数の機能的な活性(例えば、抗原性活性または免疫原性活性、天然の細胞基質と結合する能力など)を示す。ARタンパク質、誘導体およびフラグメントの機能的活性は、当業者に知られている様々な方法によってアッセイすることができる(Current Protocols in Protein Science、Coliganら,eds.、John Wiley&Sons,Inc.、Somerset、New Jersey(1998))。本明細書中における目的のために、機能的に活性なフラグメントにはまた、ARポリペプチドの1つまたは複数の構造的ドメイン(例えば、結合ドメインなど)を含むそのようなフラグメントが含まれる。タンパク質ドメインは、PFAMプログラム(Bateman A.et al.、Nucleic Acids Res.、27:260〜2(1999))を使用して同定することができる。
ARポリペプチド誘導体は、代表的には、配列番号1またはそのフラグメントとのある程度の配列同一性または配列類似性を有する。AR誘導体は、制限酵素による切断または変異誘発などの、この分野で知られている様々な方法によって作製することができる。
(II.ARのアンタゴニスト)
ARのアンタゴニストには、ARの生物学的活性を直接的または間接的に妨害し、または低下させ、または阻害する任意の分子が含まれる。好ましい実施形態において、ARのアンタゴニストは、EGFRなどのそれらの受容体に対するARの結合と競合するか、または、好ましくは、EGFRなどのそれらの受容体に対するARの結合を阻止する。アンタゴニストは、ARの少なくとも1つの生物学的活性(例えば、受容体結合、チロシンリン酸化、下流側のシグナル伝達、分裂促進活性、乾癬病変における細胞の増殖)を妨害し、または低下させ、または阻害しなければならない。
ARのアンタゴニストには、ARの生物学的活性を直接的または間接的に妨害し、または低下させ、または阻害する任意の分子が含まれる。好ましい実施形態において、ARのアンタゴニストは、EGFRなどのそれらの受容体に対するARの結合と競合するか、または、好ましくは、EGFRなどのそれらの受容体に対するARの結合を阻止する。アンタゴニストは、ARの少なくとも1つの生物学的活性(例えば、受容体結合、チロシンリン酸化、下流側のシグナル伝達、分裂促進活性、乾癬病変における細胞の増殖)を妨害し、または低下させ、または阻害しなければならない。
好ましい態様において、アンタゴニストはARと直接的に相互作用する。好ましくは、アンタゴニストはタンパク質である。より好ましくは、そのようなタンパク質はARに結合する。さらにより好ましくは、アンタゴニストは、ARに結合して、ARの少なくとも1つの生物学的活性を中和する抗体フラグメントを含む抗体である。
別の態様において、アンタゴニストは、ARの活性を阻害するが、ARと直接的には相互作用しない任意のポリペプチドまたはペプチドである。1つの態様において、これらのアンタゴニストは、EGFRなどのその受容体に対するARの結合を阻止する。例えば、アンタゴニストは、変異したAR分子、例えば、末端短縮化またはアミノ酸置換によって野生型ARに由来する優勢ネガティブな変異体などであり得る。好ましくは、そのような変異したARはARのシグナル伝達分子に対する結合能力を保持しているが、ARの下流側のシグナル伝達を開始させる能力を失っている。その結果、変異したAR分子は野生型ARと競合することができ、従って、野生型ARの活性を阻止することができる。標準的な変異誘発技術および分子クローニング技術により、末端短縮化およびアミノ酸置換を達成することができる。変異したAR分子は、この分野で知られている標準的な送達手段によって、例えば、脂質トランスフェクションまたはウイルストランスフェクションなどによって標的細胞に投与することができる。さらなる例として、ARの受容体の、ARとのリガンド結合部位を阻止する抗体または他のペプチド遮断剤がある。例示的な抗体には、EGFRに対する抗体である。
あるいは、アンタゴニストはARシグナル伝達経路の上流側成分または下流側成分と相互作用し、それらを調節して、ARの活性を間接的に低下させる。例えば、ARの様々な活性が、EGF受容体に対するARの結合のときに受容体チロシンキナーゼ経路によって媒介されることが知られている。従って、この経路を調節することができる分子はどれも、EGF受容体シグナル伝達経路の成分がこの分野で知られているならば、結合および活性を阻止する抗体または他のアンタゴニスト(これらに限定されない)を含めて、候補のアンタゴニストであり得る。酵母ツーハイブリッドスクリ−ニングおよび改変体スクリ−ニングは、ARシグナル伝達経路の内因性のさらなる相互作用タンパク質を同定するための好ましい方法を提供する(Finley,R.I.et al.、DNA Cloning−Expression Systems;A Practical Approarch、eds.Glover D.&Hames B.D.(Oxford University Press、Oxford、England)、pp.169〜203(1990);Fashema S.F.et al.、Gene、250:1〜14(2000);Drees B.L.、CUK Opin Chem Biol、3:64〜70(1999);Vidal M.and Legrain P.、Nucleic Acids.Res.、27:9191〜29(1999);および米国特許第5,928,868号)。質量分析は、タンパク質複合体を解明するための代わりの方法である(例えば、Pandley A and Mann M、Nature、405:837〜846(2000);Yates JR 3rd、Trends Genet、16:5〜8(2000)に総説される)。
さらに別の態様において、アンタゴニストはARのタンパク質発現を阻害しなければならない。AR発現は、例えば、ARの転写因子の調節因子などによって転写のレベルで、あるいはmRNAスプライシングまたは翻訳または翻訳後のレベルで調節することができる。
アンタゴニストはまた、ARの一部またはすべてをコードするか、あるいはARの実質的な配列類似性を有する核酸配列のアンチセンス核酸(これに限定されない)を含む核酸であり得る。ARのDNA配列は、この分野では知られており、また、本明細書中に開示される。続いて、AR DNAのアンチセンス核酸プローブ、およびアンチセンス阻止の最適な条件を、分子生物の分野における当業者に知られている関連した技術を使用することによって開発することができる。同様に、核酸試薬は、ミクロRNA(miRNA)、短いヘアピンRNA(shRNA)または短い干渉RNA(siRNA)のクラスに属し得る(例えば、Ambros、Cell、113:673(2003);Bartel and Bartel、Plant Physiol.、132:709(2003);およびPalatnikら、Nature、425:257(2003)を参照のこと)。
本発明のアンタゴニストにはまた、酵素機能を有するタンパク質の機能を多くの場合には調節し、かつ/またはタンパク質相互作用ドメインを含有する小分子が含まれる。化学的薬剤は、この分野では「小分子」化合物と呼ばれるが、代表的には、分子量が10,000未満(好ましくは5,000未満、より好ましくは1,000未満、最も好ましくは500未満)である有機の非ペプチド分子である。このクラスのアンタゴニストには、化学合成された分子、例えば、コンビナトリアル化学ライブラリーに由来する化合物が含まれる。合成化合物は、ARタンパク質の知られている性質または推測される性質に基づいて合理的に設計または同定することができ、あるいは、化合物ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。このクラスの代わりの適切なアンタゴニストは天然産物(特に、植物または菌類などの生物に由来する二次代謝産物)であり、これらもまた、AR調節活性について化合物ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。化合物を作製し、得るための様々な方法がこの分野では広く知られている(Schreiber SL、Science、151:1964〜1969(2000);Radmann J and Gunther J、Science、151:1947〜1948(2000))。
(III.ARに対する抗体)
本発明の、ARに対する抗体(すなわち、抗AR抗体)は、ポリクローナル形態またはモノクローナル形態が可能であるが、AR(好ましくはヒトAR、より好ましくは、ARのヒトの生物学的に活性な形態の少なくとも1つ)の少なくとも1つのエピトープに結合しなければならない。抗体は、a)部分ARタンパク質もしくは全長ARタンパク質、またはb)その機能的に活性なフラグメントもしくは誘導体に結合しなければならない。抗体には、定常領域のすべてのタイプを有する抗体(これには、IgM、IgG、IgD、IgAおよびIgEが含まれる)、および、任意のイソタイプ(これには、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3およびIgG4が含まれる)が含まれる。軽鎖はκ軽鎖またはλ軽鎖であり得る。
本発明の、ARに対する抗体(すなわち、抗AR抗体)は、ポリクローナル形態またはモノクローナル形態が可能であるが、AR(好ましくはヒトAR、より好ましくは、ARのヒトの生物学的に活性な形態の少なくとも1つ)の少なくとも1つのエピトープに結合しなければならない。抗体は、a)部分ARタンパク質もしくは全長ARタンパク質、またはb)その機能的に活性なフラグメントもしくは誘導体に結合しなければならない。抗体には、定常領域のすべてのタイプを有する抗体(これには、IgM、IgG、IgD、IgAおよびIgEが含まれる)、および、任意のイソタイプ(これには、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3およびIgG4が含まれる)が含まれる。軽鎖はκ軽鎖またはλ軽鎖であり得る。
好ましい態様において、抗AR抗体は好ましくは、少なくとも106M−1、107M−1、108M−1、109M−1または1010M−1の結合親和性でARエピトープに結合する。
より好ましい態様において、本発明の抗体はARの少なくとも1つの生物学的活性(例えば、受容体結合活性、シグナル伝達および細胞応答など)を中和する。これらの中和抗体はARのその受容体に対する結合と競合することができ、または、ARのその受容体に対する結合を完全に阻止する。これらの抗体は、シグナル伝達活性、および/または細胞応答の誘導(例えば、チロシンリン酸化)、および/またはAR媒介による細胞増殖を阻害または完全に中和するはずである。1つの例において、中和抗体は、ARが内因的に発現するタイプの細胞(例えば、マウス3T3細胞およびヒトHEKn細胞など)の増殖を阻害することができる。好ましくは、0.005μg/ml、0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/mlまたは100μg/mlの濃度の抗体により、特に、ARもまたこれらの濃度の1つで使用されるとき、あるいは、0.005、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5または1.0であるモル濃度の抗体の濃度において、EGFRに対するARの結合またはAR媒介細胞増殖の少なくとも10%、25%、50%、90%、95%、99%または本質的には100%が阻止される。
例示的な中和抗体には、これらもまた下記の実施例に記載され、また、図2に示される表に列挙されるが、下記のモノクローナル抗体が含まれる:PAR2、PAR5、PAR15、PAR19、PAR22、PAR23、PAR26、PAR29、PAR31、PAR34、PAR44、PAR46、PAR51、PAR67、PAR79、PAR80、PAR81およびPAR84。これらの抗体は、細胞表面に発現しているARに結合する。それらのほとんどすべてが、マウス3T3細胞またはヒトHEKn細胞のAR媒介による増殖を阻害するか、または完全に阻止さえする。PAR34およびPAR80は最も強力な中和能力を有する。0.072μg/mlもの少量のPAR34およびPAR80により、AR媒介の3T3細胞の増殖が約50%阻害される。PAR2、PAR5、PAR15、PAR23、PAR46、PAR84もまた、非常に強力な中和抗体である。PAR34の成熟型重鎖可変領域および成熟型軽鎖可変領域のアミノ酸配列が本明細書では配列番号2および配列番号3にそれぞれに表される。PAR80の成熟型重鎖可変領域および成熟型軽鎖可変領域のアミノ酸配列が本明細書では配列番号4および配列番号5にそれぞれに表される。
本発明は、配列番号2、配列番号4および配列番号12から選択されるアミノ酸配列を含む成熟型重鎖可変領域を含む抗AR抗体を提供する。これらの抗体はさらに、配列番号3、配列番号5および配列番号14から選択されるアミノ酸配列を含む成熟型軽鎖可変領域を含むことができる。本発明には、これらの抗体の同じエピトープに結合する抗体が含まれる。エピトープタイプの決定は、この分野で知られている方法によって、例えば、競合アッセイ(これは、例えば、フローサイトメトリーによって測定されるような蛍光強度の変化によって検出され得る)などによって達成される。2つの抗体のエピトープが類似している場合、抗原結合部位が第1の抗体によって占められ、第2の抗体のコンジュゲートは細胞と結合することができない。これにより、このコンジュゲートのシグナルの喪失がもたらされ、その結果、蛍光強度が減少する。
本発明には、本明細書中に記載される抗体のアナログが含まれる。好ましいアナログには、配列番号2、配列番号4および配列番号12の少なくとも60%または80%または90%〜95%のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域、ならびに/あるいは、配列番号3、配列番号5および配列番号14の少なくとも60%または80%または90%〜95%のアミノ酸配列同一性を有する成熟型軽鎖可変領域を含む抗体が含まれる。
パーセント同一性を決定する様々な方法がこの分野では知られている。指定された対象配列またはその指定された部分に関する「パーセント(%)配列同一性」は、デフォルト値に設定された検索パラメーターを用いてプログラムWU−BLAST−2.0a19(Altschulら、J.Mol.Biol.、215:403〜410(1997);http://blast.wustl.edu/blast/README.html)によって作製されるような最大のパーセント配列同一性を達成するために必要であるならば、配列をアラインメントし、ギャップを導入した後での、対象配列(またはその指定された部分)におけるヌクレオチドまたはアミノ酸と同一である候補派生配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の百分率として定義することができる。HSP SおよびHSP S2のパラメーターは動的な値であり、目的とする配列が検索されている特定の配列の組成および特定のデータベースの組成に依存して、プログラム自身によって確立される。任意の2つの抗体配列は、Kabat(“Sequences of Proteins of Immunological Interest”、Kabat,E.et al.、U.S.Department of Health and Human Service(1983))における番号付けスキームを使用することによって一方向でアラインメントされ得るだけである。従って、抗体の場合、パーセント同一性は一義的かつ十分に定義された意味を有する。「%同一性値」は、パーセント同一性が報告されている配列長さによって除された、一致する同一のヌクレオチドまたはアミノ酸の数によって決定される。
例示された抗体のさらなる好ましいアナログは、例示された抗体とは保存的アミノ酸置換によって異なる。アミノ酸置換を保存的または非保存的として分類する目的のために、アミノ酸は下記のようにグループ分けすることができる:グループI(疎水性側鎖):met、ala、val、leu、ile;グループII(中性の親水性側鎖):cys、ser、thr;グループIII(酸性側鎖):asp、glu;グループIV(塩基性側鎖):asn、gln、his、lys、arg;グループV(鎖の配向に影響する残基):gly、pro;およびグループVI(芳香族側鎖):trp、tyr、phe。保存的置換では、同じクラス内のアミノ酸同士の置換が伴う。非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスのメンバーに交換することである。
すべての生物種に由来するARに対する抗体が本発明に含まれる。非限定的な例示の天然抗体には、ヒト、ニワトリ、ヤギ、および齧歯類(例えば、ラット、マウス、ハムスターおよびウサギ)、ならびに、ヒト抗体を産生させるために遺伝子操作された遺伝子組換え齧歯類(例えば、Lonbergら、国際特許出願公開WO93/12227;米国特許第5,545,806号;およびKucherlapatiら、国際特許出願公開WO91/10741;米国特許第6,150,584号を参照のこと、これらはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる)に由来する抗体が含まれる。天然抗体は、宿主動物によって産生される抗体である。好ましい実施形態において、抗体は、ARに結合するか、またはARを中和する単離されたモノクローナル抗体である。
モノクローナル抗体は、この分野で知られている従来のハイブリドーマ方法論によって作製される。Kohler and Milstein、Nature、256:495〜7(1975);Eur.J.Immunol.、6:511(1976)によって初めて記載されたハイブリドーマ技術が、多くの特定の抗原に対する高レベルのモノクローナル抗体を分泌するハイブリッド細胞株を作製するために広く適用されている。
抗AR抗体のポリクローナル形態もまた本発明に含まれる。好ましくは、これらの抗体はARの少なくとも1つの活性を中和するか、または本発明において、記載されたモノクローナル抗体が結合するエピトープに結合する。ポリクローナル抗体は、宿主動物をARまたはそのフラグメントで免疫化することによって作製することができる。ポリクローナル抗体は血流中に分泌され、知られている技術を使用して回収することができる。これらの抗体の精製された形態は、当然のことではあるが、好ましくは、プロテインAまたは抗免疫グロブリンまたは抗原自体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを含む標準的な精製技術によって容易に調製することができる。どのような場合でも、免疫化の成功をモニターするために、抗原に対する血清中の抗体レベルが、ELISAおよびRIAなどの標準的な技術を使用してモニターされる。
ARに対する遺伝子改変された(すなわち、組換え)抗体もまた本発明に含まれる。これらの組換え抗体は、本発明においては、天然抗体と同じアミノ酸配列を有するか、または、天然抗体の変化したアミノ酸配列を有する。組換え抗体は、原核生物発現システムもしくは真核生物発現システムの両方を含む任意の発現システムにおいて、または、ファージディスプレー法を使用して作製することができる(例えば、Dowerら、国際特許出願公開WO91/17271およびMcCaffertyら、国際特許出願公開WO92/01047;米国特許第5,969,108号を参照のこと、これらはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる)。
遺伝子改変された抗AR抗体は上記の天然抗体および組換え抗体と機能的に等価でなければならない。改善された安定性および/または治療効力をもたらす改変された抗体が好ましい。改変された抗体の例には、アミノ酸残基の保存的置換を有するもの、および、抗原結合利用性を著しく有害に変化させないアミノ酸の1つまたは複数の欠失または付加を有するものが含まれる。置換は、治療的利用性が維持される限り、1つまたは複数のアミノ酸残基を変化または改変することから、領域の完全な再設計にまで及び得る。本発明の抗体は翻訳後に修飾され得る(例えば、アセチル化およびリン酸化)か、または、合成的に修飾され得る(例えば、細胞傷害性薬剤などの標識基の結合)。好ましい遺伝子改変された抗体はキメラ抗体およびヒト化抗体である。
本発明には、マウスに由来する可変領域と、ヒトに由来する定常領域とを含み、その結果、ヒト被験体に投与されたとき、より長い半減期を有し、かつ免疫原性がより少ないキメラ抗体が含まれる。1つの実施形態において、マウスの可変領域は、下記の非限定的な例を含む本明細書中に記載されるモノクローナル抗体のいずれか1つに由来する:a)配列番号2および配列番号4から選択されるアミノ酸配列を含む成熟型重鎖可変領域、ならびに/または、配列番号3および配列番号5から選択されるアミノ酸配列を含む成熟型軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体;b)a)の同じエピトープに結合する抗体;またはc)a)のアナログ。
本発明には、マウスに由来する可変領域と、ヒトに由来する定常領域とを含み、その結果、ヒト被験体に投与されたとき、より長い半減期を有し、かつ免疫原性がより少ないキメラ抗体が含まれる。1つの実施形態において、マウスの可変領域は、下記の非限定的な例を含む本明細書中に記載されるモノクローナル抗体のいずれか1つに由来する:a)配列番号2および配列番号4から選択されるアミノ酸配列を含む成熟型重鎖可変領域、ならびに/または、配列番号3および配列番号5から選択されるアミノ酸配列を含む成熟型軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体;b)a)の同じエピトープに結合する抗体;またはc)a)のアナログ。
キメラ抗体を作製するために、2つの異なる生物種に由来する部分(例えば、ヒトの定常領域、およびマウスの可変領域または結合領域)を従来の技術によって化学的に連結することができ、または、遺伝子操作技術を使用して1つの連続したタンパク質として調製することができる。キメラ抗体の軽鎖部分および重鎖部分の両方のタンパク質をコードするDNA分子を連続したタンパク質として発現させることができる。キメラ抗体を作製する方法が、米国特許第5,677,427号、米国特許第6,120,767号および米国特許第6,329,508号に開示される(これらのそれぞれはその全体が参考として組み込まれる)。
本発明の遺伝子改変された抗体にはまた、ARに結合するか、またはARを中和するヒト化抗体が含まれる。ヒト化抗体を作製する様々な方法が、米国特許第5,530,101号、同第5,585,089号、同第5,693,761号、同第5,693,762号および同第6,180,370号に開示される(これらのそれぞれはその全体が参考として組み込まれる)。本発明の1つの実施形態において、ヒト化抗体は、マウスのドナー免疫グロブリンのCDRと、ヒトのアクセプター免疫グロブリンの重鎖フレームワークおよび軽鎖フレームワークとを含む。例えば、a)配列番号2または配列番号4のアミノ酸配列を含む成熟型重鎖可変領域、および/あるいは、配列番号3または配列番号5のアミノ酸配列を含む成熟型軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体;b)a)の同じエピトープに結合する抗体;またはc)a)のアナログのヒト化体。本明細書中に開示される実施例6では、配列番号12および配列番号14を含むアミノ酸配列を有するHuPAR34を生じさせるためのモノクローナル抗体PAR34のヒト化が記載される。
抗ARの霊長類化抗体または完全なヒト抗体もまた本発明に含まれる。本発明の好ましい実施形態において、前記の霊長類化抗体または完全なヒト抗体は、本明細書中に記載されるARの活性を中和する。
ARに対する完全なヒト抗体は様々な技術によって作製される。1つの例がトリオーマ方法論である。その基本的な方法、および、この方法において使用される例示的な細胞融合パートナーSPAZ−4が、Oestbergら、Hybridoma、2:361〜367(1983);Oestberg、米国特許第4,636,664号;およびEnglemanら、米国特許第4,634,666号によって記載されている(これらのそれぞれはその全体が参考として組み込まれる)。
ARに対するヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のセグメントを少なくともコードする導入遺伝子を有する非ヒト遺伝子組換え動物から作製することができる。これらの性質を有する動物の作製および性質が、例えば、Lonbergら、国際特許出願公開WO93/12227;米国特許第5,545,806号;およびKucherlapatiら、国際特許出願公開WO91/10741;米国特許第6,150,584号によって詳しく記載される(これらを参照のこと)(これらはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる)。
様々な組換え抗体ライブラリー技術もまた、完全なヒト抗体を作製するために利用することができる。例えば、1つの方法は、Huseら、Science、246:1275〜1281(1989)によって概略される一般的なプロトコルに従って、ヒトB細胞に由来するDNAライブラリーをスクリーニングすることである。ARまたはそのフラグメントと結合する抗体が選択される。次いで、そのような抗体(または結合性フラグメントを含む)をコードする配列がクローン化および増幅される。Huseによって記載されたプロトコルは、ファージディスプレー技術との組合せにおいてより効率的にされる。例えば、Dowerら、国際特許出願公開WO91/17271およびMcCaffertyら、国際特許出願公開WO92/01047;米国特許第5,969,108号を参照のこと(これらのそれぞれはその全体が参考として組み込まれる)。これらの方法では、メンバーが異なる抗体をその外側表面に呈示するファージライブラリーが作製される。抗体は、通常、FvまたはFabフラグメントとして呈示される。所望する特異性を有する抗体を呈示するファージが、ARまたはそのフラグメントに対するアフィニティー濃縮によって選択される。
真核生物のリボソームもまた、Coia Gら、J.Immunol.Method.、1:254(1−2):191〜7(2001);Hanes J.et al.、Nat.Biotechnol.、18(12):1287〜92(2000);Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、95(24):14130〜5(1998);Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、94(10):4937〜42(1997)(これらのそれぞれはその全体が参考として組み込まれる)に記載されるように、抗体のライブラリーを呈示し、かつ、標的抗原(例えば、ARなど)に対するスクリーニングによって結合性のヒト抗体を単離するための手段として使用することができる。
酵母システムもまた、哺乳動物の細胞表面タンパク質または分泌タンパク質(例えば、抗体など)をスクリーニングするために好適である。抗体ライブラリーを、標的抗原に対するヒト抗体を得る目的のために、酵母細胞の表面に呈示させることができる。この方法は、Yeungら、Biotechnol.Prog.、18(2):212〜20(2002);Boeder,E.T.et al.、Nat.Biotechnol.、15(6):553〜7(1997)によって記載される(これらのそれぞれはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる)。あるいは、ヒト抗体ライブラリーを、酵母ツーハイブリッドシステム(国際特許出願公開WO0200729A2、これはその全体が参考として組み込まれる)によって細胞内で発現させ、スクリーニングすることができる。
抗AR抗体のフラグメントは、ARに対する結合特異性を保持しており、これらもまた本発明に含まれる。例には、本明細書中に記載される任意の抗AR抗体の部分的もしくは完全な重鎖もしくは軽鎖、可変領域またはCDR領域が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の好ましい実施形態において、抗体フラグメントは、(カルボキシル端において短縮化された)短縮化鎖である。好ましくは、これらの短縮化された鎖は1つまたは複数の免疫グロブリン活性(例えば、補体結合活性)を有する。短縮化された鎖の例には、Fabフラグメント(これは、VLドメイン、VHドメイン、CLドメインおよびCH1ドメインからなる);Fdフラグメント(これは、VHドメインおよびCH1ドメインからなる);Fvフラグメント(これは抗体の単一鎖のVLドメインおよびVHドメインからなる);dabフラグメント(これはVHドメインからなる);単離されたCDR領域;(Fab’)2フラグメント、二価フラグメント(これは、ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結された2つのFabフラグメントを含む)が含まれるが、これらに限定されない。短縮化された鎖は、それぞれがこの分野では知られている従来の生化学的技術(例えば、酵素切断など)または組換えDNA技術によって作製することができる。これらのポリペプチドフラグメントは、この分野で広く知られている様々な方法による無傷な抗体のタンパク質分解的切断によって、あるいは、停止コドンを、部位特異的変異誘発を使用してベクター内の所望の位置において、例えば、Fabフラグメントを作製するためにCH1の後に、または、(Fab’)2フラグメントを作製するためにヒンジ領域の後に挿入することによって作製することができる。単鎖抗体を、VLコード領域およびVHコード領域を、VLタンパク質フラグメントおよびVHタンパク質フラグメントをつなぐペプチドリンカーをコードするDNAと連結することによって作製することができる。
免疫グロブリン関連遺伝子は離れた機能的領域を含有し、それぞれが1つまたは複数の異なった生物学的活性を有するので、抗体フラグメントの遺伝子は、他の遺伝子に由来する機能的領域(例えば、酵素、米国特許第5,004,692号、これはその全体が参考として組み込まれる)に融合して、融合タンパク質(例えば、免疫トキシン)、または新規な性質を有するコンジュゲートを作製することができる。
本発明は、免疫トキシン(これに限定されない)を含む様々なエフェクター部分に結合された抗AR抗体の使用を含む。抗体を含む免疫トキシンである様々なコンジュゲート体がこの分野では広く記載されている。トキシンは、従来のカップリング技術によって抗体にカップリングすることができ、または、タンパク質のトキシン部分を含有する免疫トキシンを融合タンパク質として作製することができる。本発明のコンジュゲート体は、そのような免疫トキシンを得るための対応する方法で使用することができる。そのような免疫トキシンの例示として、Byers,B.S.et al.、Seminars Cell Biol.、2:59〜70(1991)によって、また、Fanger,M.W.et al.、Immunol.Today、12:51〜54(1991)によって記載される免疫トキシンがある。
組換えDNA技術を、組換え抗AR抗体、ならびに、キメラ抗AR抗体またはヒト化抗AR抗体または任意の他の抗AR遺伝子改変抗体およびそのフラグメントもしくはコンジュゲート体を任意の発現システム(これには、細菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞(例えば、NSO細胞)などの原核生物発現システムおよび真核生物発現システムの両方が含まれる)において作製するために使用することができる。
作製されると、本発明の完全な抗体、それらのダイマー、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態を、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィーおよびゲル電気泳動などを含むこの分野の標準的な手順に従って精製することができる(一般的には、Scopes,R.、Protein Purification(Springer−Verlag、N.Y.、1982)を参照のこと)。医薬用途のためには、少なくとも約90%〜95%の均一性を有する実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、98%〜99%またはそれ以上の均一性が最も好ましい。所望に応じて部分的または均一に精製されると、その後、ポリペプチドは、(体外を含めて)治療的に使用することができ、または、アッセイ手法および免疫蛍光染色などを開発および実施する際に使用することができる(一般的には、Immunological Methods、Vols.I and II(Lefkovits and Pernis,eds.、Academic Press、NY、1979 and 1981)を参照のこと)。
(IV.治療方法)
ARアンタゴニスト(好ましくは、抗AR抗体)は癌の防止または処置において有用である。1つの好ましい態様において、本発明は、癌細胞を本明細書中に記載されるARアンタゴニスト(好ましくは、本明細書中に記載される抗AR抗体)と接触させることを含む、癌細胞の増殖を阻害する方法を提供する。アンタゴニストは、癌細胞と、(例えば、被験体において、好ましくは哺乳動物において、より好ましくはヒトにおいて)インビトロ、エキソビボまたはインビボで接触する。好ましくは、本発明は、ARアンタゴニスト(好ましくは、抗AR抗体)を薬学的に効果的な量で被験体に投与することを含む、被験体における癌細胞の成長を阻害する方法を提供する。1つの例において、癌細胞は膵臓癌細胞および/または表皮癌細胞である。抗AR抗体には、本発明の抗体、抗体フラグメントおよび抗体コンジュゲート体(好ましくは、強力な中和活性を有する抗体、例えば、本明細書中に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、およびそのキメラ体またはヒト化体など)が含まれる。そのような阻害は癌細胞の増殖を少なくとも10%、30%、50%、70%、80%または90%低下させる。
ARアンタゴニスト(好ましくは、抗AR抗体)は癌の防止または処置において有用である。1つの好ましい態様において、本発明は、癌細胞を本明細書中に記載されるARアンタゴニスト(好ましくは、本明細書中に記載される抗AR抗体)と接触させることを含む、癌細胞の増殖を阻害する方法を提供する。アンタゴニストは、癌細胞と、(例えば、被験体において、好ましくは哺乳動物において、より好ましくはヒトにおいて)インビトロ、エキソビボまたはインビボで接触する。好ましくは、本発明は、ARアンタゴニスト(好ましくは、抗AR抗体)を薬学的に効果的な量で被験体に投与することを含む、被験体における癌細胞の成長を阻害する方法を提供する。1つの例において、癌細胞は膵臓癌細胞および/または表皮癌細胞である。抗AR抗体には、本発明の抗体、抗体フラグメントおよび抗体コンジュゲート体(好ましくは、強力な中和活性を有する抗体、例えば、本明細書中に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、およびそのキメラ体またはヒト化体など)が含まれる。そのような阻害は癌細胞の増殖を少なくとも10%、30%、50%、70%、80%または90%低下させる。
癌細胞の増殖に対する抗体の阻害は、細胞に基づくアッセイによって、例えば、ブロモデオキシウリジン(BRDU)取り込み(Hoshinoら、Int.J.Cancer、38、369(1986);Campanaら、J.Immunol.Meth.、107:79(1988));[3H]−チミジン取り込み(Chen,J.、Oncogene、13:1395〜403(1996);Jeoung、J.、J.Biol.Chem.、270:18367〜73(1995);色素Alamar Blue(Biosource Internationalから入手可能である)(Voytik−Harbin SLら、In Vitro Cell Dev Biol Anim、34:239〜46(1998));軟寒天におけるコロニー形成アッセイ(Sambrookら、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor、1989)などによって測定するすることができる。
阻害はまた、腫瘍形成性アッセイによって評価される。1つの例において、異種移植片は、以前から存在する腫瘍に由来するヒト細胞、または腫瘍細胞株に由来するヒト細胞を含む。様々な腫瘍異種移植片アッセイがこの分野では知られている(例えば、Ogawa Kら、Oncogene、19:6043〜6052(2000)を参照のこと)。別の好ましい実施形態において、腫瘍形成性が、米国特許第5,698,413号(これはその全体が参考として組み込まれる)に記載される中空繊維アッセイを使用してモニターされる。
本発明の上記の方法は、前記被験体において、癌細胞の増殖もしくは転移を阻害もしくは逆転させ、または癌のサイズを減少させる。
本明細書中に開示される実施例3〜5および実施例7では、抗AR抗体によるAR活性の阻害(細胞増殖および異種移植片腫瘍成長に対する影響を含む)を明らかにするアッセイが例示される。
別の好ましい態様において、アンタゴニスト(好ましくは、本発明の抗体)は乾癬の処置のために使用することができる。乾癬は、最も一般的な皮膚疾患の1つであり、世界人口の2パーセントまでが罹患している。乾癬は、紅斑性の、境界が明確な丘疹、および、銀色の雲母様の鱗片によって覆われる円形プラークによって臨床的には特徴づけられる慢性的な炎症性皮膚疾患である。乾癬の皮膚病変部は一定しない掻痒性である。外傷を受けた領域は乾癬の病変を発達させることが多い(Koebner現象または同型現象)。また、感染症、ストレスおよび薬物療法(例えば、リチウム、β遮断薬および抗マラリア薬物療法)を含む他の外的要因は感染を悪化させ得る(Harrison’s Principles of Internal Medicine、14th Edition、pp.300(1998))。乾癬の重篤度は乾癬領域重篤度指標(PASI)(例えば、Fleischerら(1999)、J.Dermatol.、26:210〜215、およびTanewら(1999)、Arch Dermatol.、135:519〜524を参照のこと)または様々な乾癬広域評価スコア(例えば、乾癬を処置する分野の当業者には広く知られているPhysician’s Global Assessment(PGA)など)によって測定される。
本発明は、そのような処置を必要としている被験体における乾癬を処置する方法で、薬学的に効果的な量のARアンタゴニストを前記被験体に投与することを含む方法を提供する。好ましくは、前記アンタゴニストは抗AR抗体であり、より好ましくは、本明細書中に開示される抗体および抗体フラグメントおよびコンンジュゲート体である。
本明細書中に開示される実施例8では、抗AR抗体(HuPAR34)が、SCIDマウスにおける乾癬皮膚移植片を処置するために使用されるインビボ研究が例示される。
本発明の別の態様において、アンタゴニスト、好ましくは、本明細書中に記載される抗体が、創傷治癒のために、または皮膚の性状を高めるために、または、ARの異常な活性亢進によって引き起こされる何らかの他の障害に対して利益を提供するために使用することができる。
治療的方法は、通常、ヒト患者に適用されるが、他の哺乳動物にも適用され得る。
アンタゴニスト(例えば、本発明の抗体)を投与する様々な方法が存在する。非経口投与が好ましい。抗体は、患者に、ボーラス剤として静脈内投与によって、または、所定の期間にわたる連続注入によって、あるいは、筋肉内経路、皮下経路、腹腔内経路または脳脊髄内経路によって投与することができる。当業者に知られている経口経路、局所的経路、吸入経路または他の送達手段もまた本発明に含まれる。
本発明の薬学的組成物は、一般に、アンタゴニスト(例えば、抗体)の溶液、または、受容可能なキャリア(好ましくは、水性キャリア)に溶解されたそのカクテルを含む。すなわち、抗体は、患者を処置するための医薬品の製造において使用することができる。様々な水性キャリアを使用することができ、例えば、注射用水(WFI)、あるいは、pHを代表的には5.0〜8.0(ほとんどの場合には6.0〜7.0)に、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩などで緩衝化され、かつ/または、等張性にするために塩(例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムなど)を含有する水を使用することができる。キャリアはまた、活性なタンパク質を保護するために、ヒト血清アルブミン、ポリソルベート80、糖またはアミノ酸などの賦形剤を含有することができる。これらの配合におけるアンタゴニスト(例えば、抗体)の濃度は約0.1mg/mlから100mg/mlまで広範囲に変化するが、多くの場合、1mg/ml〜10mg/mlの範囲にある。配合されたモノクローナル抗体は非経口投与のために特に好適であり、静脈内注入物として、あるいは、皮下注射、筋肉内注射または静脈内注射によって投与することができる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の様々な方法が、当業者には知られており、または当業者には明らかであり、より詳しくは、例えば、Remington’s Pharmaceutical Science(15th Ed.、Mack Publishing Company、Easton、Pa.、1980)(これは参考として本明細書中に組み込まれる)に記載される。本発明は、ARに結合する抗体(好ましくは、本明細書中に記載される抗体の1つ)を含む薬学的組成物を提供する。
組成物は予防的処置および/または治療的処置のために投与することができる。所望される効果を達成するために十分な量が「薬学的に効果的な量」として定義される。アンタゴニスト(例えば、抗体など)は単回投与または反復投与によって患者に送達することができる。乾癬のための薬物の用量は、許容され得ない副作用を生じさせることなく疾患を緩和するために十分な量(「薬学的に効果的な用量」)で、代表的には、0.01mg〜100mgのアンタゴニスト(例えば、抗体または融合タンパク質)を含有するが、ほとんどの場合には、体重1キログラムあたり、または単位用量物として、0.1mg〜1mg、または、1mg、2mgもしくは5mg〜20mgを含有する。抗体薬物は、疾患の性質および重篤度に依存して、1回または複数回、例えば、1日あたり、1週間あたり、または1ヶ月あたり、1回、2回または3回で、1日〜数日、1週間〜数週間、1ヶ月〜数ヶ月間または1年〜数年間にわたって、あるいは長期間、投与することができる。
疾患を治療する目的のために、アンタゴニスト(例えば、抗体)の適切な投薬量は、疾患の重篤度および経過、患者の臨床的履歴および臨床的応答、抗体の毒性、ならびに主治医の裁量に依存する。アンタゴニストは、好適には、一度に、または一連の処置の間中、患者に投与される。最初の候補投薬量が患者に投与されることがある。適正な投薬量および処置療法を、当業者に知られている従来の技術を使用して治療の進行をモニターすることによって確立することができる。
また、アンタゴニスト(例えば、抗体など)は、当業者に知られているように、実質的に純粋な形態で単独で、または、様々な治療剤と一緒に利用することができる(例えば、Cancer:Principles and Practice of Oncology、5th ed.、Devitaら、Lippincott−Ravel Publishers、1997を参照のこと)。抗体を用いた処置と一緒に使用され得る他の治療には、アンチセンス核酸分子または生物学的製剤(例えば、さらなる治療用抗体など)の投与が含まれる。従って、本発明の処置は、処置が、癌または乾癬の処置のために、連続的に、または別の薬剤との組合せで施されることを可能にする様式で定められる。乾癬を処置する場合、抗体は、多くの場合、1つまたは複数の他の免疫抑制薬物または他の治療(例えば、コルチコステロイド、シクロスポリン、メトトレキサート、光線療法(PUVAを伴うか、またはPUVAを伴わない))の後で、あるいは、それらとの組合せで投与される。癌を処置する場合、癌治療のための従来の治療的方法(例えば、化学療法、放射線療法および手術など)をアンタゴニストと一緒に使用することができる。
(V.診断方法)
本明細書中に開示される抗体は、疾患および障害(特に、AR発現に関連する癌または乾癬)の診断的評価および予後評価において有用である。疾患の各段階において、モノクローナル抗体を、診断の正確性を改善するために、また、処置の決定を容易にするために使用することができる。
本明細書中に開示される抗体は、疾患および障害(特に、AR発現に関連する癌または乾癬)の診断的評価および予後評価において有用である。疾患の各段階において、モノクローナル抗体を、診断の正確性を改善するために、また、処置の決定を容易にするために使用することができる。
診断の様々な方法を、患者から得られた細胞サンプル(例えば、血液サンプル、リンパ節生検または組織)を使用してインビボで行うことができ、または、インビボ画像化によって行うことができる。
特定の実施形態において、本発明は、本発明の抗体が診断画像化剤に結合されている抗体コンジュゲート体を提供する。本発明の抗体を含む組成物は、例えば、放射免疫アッセイ、ELISA、FACSなどによってARを検出するために使用することができる。1つまたは複数の標識化成分を抗体に結合することができる。例示的な標識化成分には、特に放射線画像化技術または磁気共鳴画像化技術における診断的価値を有する放射線不透過性色素、放射線造影剤、蛍光分子、スピン標識された分子、酵素、または他の標識化成分が含まれる。
本発明は、癌または乾癬を検出する方法で、そのような検出を必要としている被験体において前記癌細胞または乾癬細胞におけるARのmRNAまたはタンパク質の示差的な発現を検出することを含む方法を提供する。
1つの例示的な実施形態において、癌を検出する方法は、a)患者からサンプルを単離すること;b)前記サンプルの細胞を本発明の抗体と接触させること;c)前記サンプル細胞の同じタイプの細胞の非癌性細胞を本発明の抗体と接触させること;およびd)非癌性細胞との前記サンプル細胞におけるARの発現の差を検出し、比較することを含む。
別の例示的な実施形態において、乾癬を検出する方法は、a)患者から皮膚サンプルを単離すること;b)前記皮膚サンプルの細胞を本発明の抗体と接触させること;c)正常な皮膚細胞を本発明の抗体と接触させること;およびd)前記正常な皮膚細胞との前記皮膚サンプル細胞におけるARの発現の差を検出し、比較することを含む。
癌または乾癬を前疾患状態または早期疾患状態において検出することに加えて、本発明の抗体はまた、乾癬を処置する方法などの治療的方法の処置効力を評価するために使用することができる。抗体は、特定の処置の前および後においてARの発現レベルを検出するために利用される。AR発現レベルの低下はその処置の有効性の指標であり得る。
本発明の抗体はまた、研究目的のためにインビトロアッセイのための検出剤として使用することができる。例えば、抗体は、この分野で知られている方法によって、例えば、タンパク質発現ライブラリーをスクリーニングすることなどによって、ARに対する新規な受容体または他の結合性タンパク質を同定または単離するために使用することができる。
本発明はまた、抗AR抗体を含む診断キットを提供する。そのような診断キットはさらに、所定量での試薬の包装された組合せを、診断アッセイを行うための説明書とともに含む。抗体が酵素で標識される場合、キットは、酵素によって要求される基質および補因子を含む。また、安定化剤および緩衝剤などの他の添加剤を含めることができる。これらの様々な試薬の相対的な量は、アッセイの感度を実質的に最適化するこれらの試薬の溶液中の濃度を規定するために広範囲に変化させることができる。特に、試薬は、適切な濃度を有する試薬溶液を溶解時に提供する、賦形剤を含む、通常の場合には凍結乾燥された乾燥粉末として提供され得る。
本発明の抗体は主にヒト被験体の処置に関係しているが、本発明の抗体はまた、獣医学的目的のために他の哺乳動物被験体(例えば、イヌおよびネコなど)の処置のためにも用いることができる。
下記の実施例は、限定としてではなく、例示として提供される。本明細書におけるすべての引用物の開示はその全体が参考として本明細書中に特に組み込まれる。
(実施例1:可溶性ARタンパク質の作製)
本実施例では、ARの可溶性タンパク質の作製が記載される。様々な構築物がヒトARの組換え発現のために作製された。野生型の全長ヒトARポリペプチド(配列番号1)および他のクローン化されたAR形態がPCRによってクローン化された。
本実施例では、ARの可溶性タンパク質の作製が記載される。様々な構築物がヒトARの組換え発現のために作製された。野生型の全長ヒトARポリペプチド(配列番号1)および他のクローン化されたAR形態がPCRによってクローン化された。
3つの構築物を、抗ヒトアンフィレグリンモノクローナル抗体のさらなる特長づけを助けるために作製した。これらの構築物には、可溶性AR、可溶性ヒトIgG3Fc融合タンパク質、および細胞表面発現のための哺乳動物発現プラスミドが含まれた。細胞表面発現の場合、ARのC末端がGP1膜アンカーと融合されるように、プラスミド構築物が作製された。
PCR反応が、ヒト特異的プライマー、テンプレートとしてのヒトcDNA、およびクローン化されたpfu DNAポリメラーゼ(Roche)を製造者の説明書に従って使用して行われた。その後、ヒトARをコードする得られたPCR DNAフラグメントを発現ベクターのpDL174(可溶性)、pDL182(ヒトIgG3Fc融合タンパク質)およびpDL301(細胞表面)(PDL)と連結して、pDL389、pDL390およびpDL391をそれぞれ作製した。これらのプラスミドのそれぞれにおけるAR部分のヌクレオチド配列をDNA配列決定によって確認した。
293H細胞株およびCos−7細胞株を供給者の説明書(ATCC)に従って成長させた。AR発現タンパク質のプラスミドDNAを、分泌型タンパク質のために、TransIT−293(Fisher)トランスフェクション試薬を製造者の説明書に従って使用して293H細胞にトランスフェクションした。培養培地を3日後〜5日後に集め、発現したAR融合タンパク質をアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって精製した。細胞表面発現のためのプラスミドDNAを、Lipofectamine2000(Life Technologies)を使用してCos−7細胞にトランスフェクションした。細胞を表面発現について分析し、クローン化した。
可溶性AR融合タンパク質を、作製された抗AR抗体の1つ(PAR5抗体)を使用するアフィニティーカラムによって、トランスフェクションされた細胞の上清から精製した。ヒトIgG3融合タンパク質は、プロテインGカラムを使用して精製された。
(実施例2:抗ARモノクローナル抗体の作製)
本実施例では、抗ARモノクローナル抗体の製造が記載される。
本実施例では、抗ARモノクローナル抗体の製造が記載される。
(ARのための免疫原)
組換えヒトARをR&D Systemsから購入し、Balb/cマウスを使用して、腹腔内経路または肉趾経路のいずれかによって免疫化した。簡単に記載すると、マウスを、20μlの総最終体積において5μg〜20μgのタンパク質を等体積のRibiアジュバントとともに使用して腹腔内または後足の肉趾において免疫化した。肉趾免疫化は4日または5日の間隔で4回行われた。腹腔内免疫化は2週間間隔での4回の免疫化を伴った。
組換えヒトARをR&D Systemsから購入し、Balb/cマウスを使用して、腹腔内経路または肉趾経路のいずれかによって免疫化した。簡単に記載すると、マウスを、20μlの総最終体積において5μg〜20μgのタンパク質を等体積のRibiアジュバントとともに使用して腹腔内または後足の肉趾において免疫化した。肉趾免疫化は4日または5日の間隔で4回行われた。腹腔内免疫化は2週間間隔での4回の免疫化を伴った。
(ELISA:免疫化前および免疫化後)
血清力価が、標準的な抗体捕捉ELISAアッセイおよびペルオキシダーゼ媒介検出を使用して、ヒト組換えARに対するELISAによって測定された。免疫化前血清および免疫化後血清の両方の連続希釈物が捕捉タンパク質とインキュベーションされ、抗原−抗体複合体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG二次抗体および発色試薬を使用して検出した。タンパク質特異的な血清力価の定量が分光光度法的に測定された(A415)。
血清力価が、標準的な抗体捕捉ELISAアッセイおよびペルオキシダーゼ媒介検出を使用して、ヒト組換えARに対するELISAによって測定された。免疫化前血清および免疫化後血清の両方の連続希釈物が捕捉タンパク質とインキュベーションされ、抗原−抗体複合体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG二次抗体および発色試薬を使用して検出した。タンパク質特異的な血清力価の定量が分光光度法的に測定された(A415)。
血清はまた、免疫応答の特異性を明らかにするために、EGFおよびHB−EGR(R&D Systems)に対する反応性についても調べられた。
(融合)
AR融合タンパク質に対する血清力価が非常に大きいマウス、ならびに、EGFおよびHB−EGFに対する検出可能な反応性を有しないマウスを屠殺した。膝窩、大腿部および仙骨のリンパ節が肉趾免疫化マウスから取り出され、脾臓が腹腔内免疫化マウスから取り出された。リンパ球をこれらの組織から単離し、ハイブリドーマを標準的な手順によって作製した。簡単に記載すると、ハイブリドーマを、リンパ球とマウス骨髄腫細胞株(NSO細胞)とのポリエチレングリコール(PEG)1500媒介融合によって作製した。融合細胞を96ウエルプレートにプレートあたり105細胞の密度で置床した。融合細胞の選択が、HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)培地を使用して達成された。
AR融合タンパク質に対する血清力価が非常に大きいマウス、ならびに、EGFおよびHB−EGFに対する検出可能な反応性を有しないマウスを屠殺した。膝窩、大腿部および仙骨のリンパ節が肉趾免疫化マウスから取り出され、脾臓が腹腔内免疫化マウスから取り出された。リンパ球をこれらの組織から単離し、ハイブリドーマを標準的な手順によって作製した。簡単に記載すると、ハイブリドーマを、リンパ球とマウス骨髄腫細胞株(NSO細胞)とのポリエチレングリコール(PEG)1500媒介融合によって作製した。融合細胞を96ウエルプレートにプレートあたり105細胞の密度で置床した。融合細胞の選択が、HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)培地を使用して達成された。
(ハイブリドーマのスクリーニング)
ハイブリドーマにより分泌された抗体の特異性が、上記に記載されるようなヒト組換えARを使用するELISAによって最初に明らかにされた。ハイブリドーマウエルからの上清を、組換えヒトARで被覆されたウエルにおいてインキュベーションした。抗原−抗体相互作用の検出および定量が、上記に記載されたのと同じ方法を使用して達成された。陽性ウエルの検出を、ヒトARについて特異性を有する可能性のあるモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマとして解釈した。
ハイブリドーマにより分泌された抗体の特異性が、上記に記載されるようなヒト組換えARを使用するELISAによって最初に明らかにされた。ハイブリドーマウエルからの上清を、組換えヒトARで被覆されたウエルにおいてインキュベーションした。抗原−抗体相互作用の検出および定量が、上記に記載されたのと同じ方法を使用して達成された。陽性ウエルの検出を、ヒトARについて特異性を有する可能性のあるモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマとして解釈した。
ヒトARに対する抗体の特異性が、ARに対する結合について陽性であるすべての上清をELISAによってEGFおよびHB−EGFとの反応性について調べることによって確認された。どの上清も、ARのようにEGFファミリーのメンバーであるこれらのタンパク質との反応性を示さなかった。天然の立体配座で発現していると考えられるARタンパク質との抗体の反応性が、PMA刺激されたMCF−7細胞の上清(これは可溶性の天然のヒトARを含有する)とインキュベーションされていた、ヤギ抗ヒトAR抗体で被覆されたELISAプレートでハイブリドーマ上清を試験することによってさらに明らかにされた。捕捉されたMCF−7由来ARに対する結合により、天然の哺乳動物細胞由来のヒトARとの反応性が明らかにされた。「生来的」な細胞表面ARについてELISA陽性上清の特異性が、全長の細胞表面ヒトARでトランスフェクションされたCHO細胞株に対する標準的なフローサイトメトリー方法を使用して評価された。
フローサイトメトリーが、この分野で知られているプロトコルを使用することによって行われた。具体的には、表面ARを発現するCHOトランスフェクタント(2x105個)が、氷上で1時間、10μL〜100μLのハイブリドーマ上清とともに50μLの氷冷PBSに再懸濁された。徹底的な洗浄の後、細胞を、マウスIgGについて特異的なフィコエリトリン結合ヤギ抗体と氷上で60分間インキュベーションした。細胞を再び洗浄し、細胞表面の結合した抗体を、Becton Dickinson FACScanを使用するフローサイトメトリーによって検出した。標的抗原について陽性であると見なされたハイブリドーマは、バックグラウンド陰性コントロールを越える蛍光における少なくとも1の対数変化を生じさせるハイブリドーマとして解釈された。図3に示されるように、PAR2、PAR32、PAR34およびPAR80などの抗体は、ARの天然の形態に結合することができる。
3つのハイブリドーマ融合体の様々なELISAおよびフローサイトメトリー分析を用いたさらなるスクリーニングが行われ(肉趾免疫化マウスについて2つ、腹腔内免疫化マウスについて1つ)、ヒトARについて84個の陽性クローンを得た。図2に示される表には、陽性のモノクローナル抗体の一部、それらのイソタイプ、結合特徴、および中和能力がまとめられる。
(実施例3:抗AR抗体阻害アッセイ)
本実施例では、ARとEGF受容体との結合の抗AR抗体阻害が記載される。
本実施例では、ARとEGF受容体との結合の抗AR抗体阻害が記載される。
ヒト組換えAR(2μg/ml)を、ヒトARに対する結合がELISAによって以前に明らかにされたハイブリドーマ細胞の上清と氷上で30分間インキュベーションした。その後、この混合物を1x106個のA431細胞(これは高レベルのEGF−Rを発現する)に加え、氷上でさらに60分間インキュベーションした。その後、細胞を洗浄し、ヒトARについて特異的なビオチン標識のヤギ抗体と氷上で30分間インキュベーションした。細胞を洗浄し、フィコエリトリン結合アビジンとインキュベーションし、そして氷上でさらに30分間インキュベーションした。細胞を再び洗浄し、細胞表面の結合した抗体を、Becton Dickinson FACScanを使用するフローサイトメトリーによって検出した。PAR抗体ヒトAR混合物とインキュベーションされた細胞の蛍光プロフィルを、ARおよびコントロール抗体とインキュベーションされた細胞のプロフィルと比較した。ARおよびPAR抗体と比較して、ARおよびコントロール抗体とインキュベーションされた細胞の間での蛍光レベルの減少により、A431細胞の表面でのARおよびEGFRの相互作用の阻害が示された。図2に示される表において示されるように、10を越える抗体が試験され、AR−EGFR相互作用の阻害を示した。また、図4に示されるように、多数のPARモノクローナル抗体がAR媒介の活性を中和することができた。
(実施例4:AR媒介細胞増殖のインビトロ阻害アッセイ)
本実施例では、アンフィレグリン誘導による細胞増殖の抗体中和が記載される。
本実施例では、アンフィレグリン誘導による細胞増殖の抗体中和が記載される。
1つのタイプの実験において、Balb/3T3繊維芽細胞(これはAR誘導の増殖を行うことができる)を104細胞/ウエルで96ウエルプレートに0日目に置床した。1日目に、ウエルを無血清培地(Life Technology)において洗浄し、無血清培地において一晩インキュベーションした。2日目に、組換えヒトAR(R&D Systems)を100ng/mlの最終濃度でウエルに加えた。その後、PAR抗体を様々な濃度(0.03μg/ml〜10μg/mlの最終濃度)で加えた。3日目に、BrdUが6時間〜8時間にわたって加えられ、その後、増殖を、比色測定によるELISA型アッセイ(Roche Diagnostics)を使用してBrdU取り込みによって評価した。
別の増殖アッセイでは、HEKn(ヒト表皮ケラチノサイト−新生児)細胞(Cascade Biologics)が利用された。この細胞は、内因的に合成されたARに対して増殖する。HEKn細胞を3x103細胞/ウエルで96ウエルの黒色ウエルプレート(Costar)に0日目に置床した。1日目に、ウエルを増殖因子非含有培地(EpiLife)(Cascade Biologics)で徹底的に洗浄した。その後、PAR抗体を様々な濃度(0.01μg/ml〜3μg/ml)で加えた。48時間後〜72時間後、内因性アンフィレグリン誘導の増殖の阻害を、発光生存細胞アッセイ(CellTiter−Glo)(Promega Corp.)を使用してATPを定量することによって評価した。
研究がまた、抗ARモノクローナル抗体とともにアンフィレグリンにより誘導される癌細胞の増殖のインビトロ阻害を試験するために行われた。様々な癌細胞株(AsPC−1、PC−3、A549、HCT−116)が5x103細胞/ウエルで96ウエルプレートに0日目に置床された。1日目に、ウエルを無血清培地(Life Technology)において洗浄し、無血清培地において8時間インキュベーションした。その後、ウエルを再び無血清培地で洗浄し、PAR抗体を10μg/mlの最終濃度で加えた。72時間後、増殖の阻害を、BrdU取り込み(上記参照)を使用して評価した。
図2に示されるように、列記されたPAR抗体はすべてが、細胞表面に発現しているARに結合することができる。これらのPAR抗体はEGFまたはHB−EGFに対する結合を示さなかった。ほとんどすべての列記されたPAR抗体は、3T3細胞およびHEKn細胞におけるAR媒介の細胞増殖を阻害することができる。PAR34およびPAR80は最も強力な中和能力を有する。PAR34は、3T3細胞の増殖を0.072ug/mlもの少ない量で50%阻害することができ、HEKnの細胞の増殖を0.041ug/mlもの少ない量で阻害することができる。PAR80は、3T3細胞の増殖を0.072ug/mlもの少ない量で50%阻害することができ、HEKnの細胞の増殖を0.2ug/mlもの少ない量で阻害することができる。他の強力な抗体には、PAR2、PAR5、PAR15、PAR23、PAR29、PAR31、PAR46およびPAR84が含まれる。これらのPAR抗体の細胞増殖に対する阻害のIC50%値およびIC90%値もまた、図2に示される表において列記された。
(実施例5:AR中和mAbの2つのインビボ効力のアッセイ)
本実施例では、AsPC−1ヒト膵臓癌腫およびA431類表皮癌腫の異種移植片モデルにおける2つのAR中和mAb(PAR80(IgG2a)およびPAR34(IgG2b))のインビボでの試験効力が記載される。
本実施例では、AsPC−1ヒト膵臓癌腫およびA431類表皮癌腫の異種移植片モデルにおける2つのAR中和mAb(PAR80(IgG2a)およびPAR34(IgG2b))のインビボでの試験効力が記載される。
(AsPC−1ヒト膵臓癌腫における処置モデル)
10x106個のAsPC−1腫瘍細胞を5週齢のメスのヌードマウスにs.c.接種した。マウスは、腫瘍の平均体積が100mm3に達したとき、異なる処置群にランダムに分けられた。8匹のマウスからなる一群が、PAR80抗体を用いて、マウスあたり3mgの総用量についてIV注射によって、最初に100μlのPBSにおける500μgの負荷用量で、次いで、1週間あたり3回での10回の投薬について100μlのPBSにおける250μgで処置された。それぞれが8匹のマウスからなる2つのコントロール群には、IgGまたは生理的食塩水が同様に与えられた。8匹のマウスからなる別の一群がゲムシタビンで処置された。ゲムシタビンは、膵臓癌のための標準的な化学療法処置であると考えられる用量で使用され、従って、陽性コントロールとして役立つ。最後の投薬の2週間後に、効力が下記の基準に従って決定された:
この処置モデルのために使用された効力終了点は下記の通りであった:
・部分的退行:処置開始重量の50%への腫瘍重量の減少。
・抗腫瘍活性はコントロール群と比較されなければならない(統計学的に分析される)
・毒性:全身的毒性としての10%の体重の喪失
図5に示されるように、PAR80を用いた処置は、規定食塩水またはIgGコントロールを用いた処置と比較して、低下した腫瘍体積をもたらし、しかし、体重の喪失に基づく関連した全身的毒性を有しなかった(データは示されず)。
10x106個のAsPC−1腫瘍細胞を5週齢のメスのヌードマウスにs.c.接種した。マウスは、腫瘍の平均体積が100mm3に達したとき、異なる処置群にランダムに分けられた。8匹のマウスからなる一群が、PAR80抗体を用いて、マウスあたり3mgの総用量についてIV注射によって、最初に100μlのPBSにおける500μgの負荷用量で、次いで、1週間あたり3回での10回の投薬について100μlのPBSにおける250μgで処置された。それぞれが8匹のマウスからなる2つのコントロール群には、IgGまたは生理的食塩水が同様に与えられた。8匹のマウスからなる別の一群がゲムシタビンで処置された。ゲムシタビンは、膵臓癌のための標準的な化学療法処置であると考えられる用量で使用され、従って、陽性コントロールとして役立つ。最後の投薬の2週間後に、効力が下記の基準に従って決定された:
この処置モデルのために使用された効力終了点は下記の通りであった:
・部分的退行:処置開始重量の50%への腫瘍重量の減少。
・抗腫瘍活性はコントロール群と比較されなければならない(統計学的に分析される)
・毒性:全身的毒性としての10%の体重の喪失
図5に示されるように、PAR80を用いた処置は、規定食塩水またはIgGコントロールを用いた処置と比較して、低下した腫瘍体積をもたらし、しかし、体重の喪失に基づく関連した全身的毒性を有しなかった(データは示されず)。
(AsPC−1ヒト膵臓癌腫およびA431類表皮癌腫を使用する防止モデル)
マウス(n=12)を、体重に基づいて、異なる処置群にランダムに分けた(群あたり12匹のマウス)。5x106個のAsPC−1腫瘍細胞またはA431腫瘍細胞が5週齢のメスのヌードマウスに0日目にs.c.接種され、抗体の投薬が、マウスあたり3mgの総用量についてIV注射によって、500μg/100μlのPBSの最初の負荷用量で1日目に開始され、次いで、1週間あたり3回での、250μg/100μlのPBSの10回の他の投薬を用いて続けられた。最後の投薬の2週間後、効力が決定された。効力エンドポイント:10%の体重の喪失によって定義されるような関連した全身的毒性を伴うことなく、処置マウス対コントロールマウスにおける腫瘍の低下したサイズによって抗腫瘍活性が明らかにされた。
マウス(n=12)を、体重に基づいて、異なる処置群にランダムに分けた(群あたり12匹のマウス)。5x106個のAsPC−1腫瘍細胞またはA431腫瘍細胞が5週齢のメスのヌードマウスに0日目にs.c.接種され、抗体の投薬が、マウスあたり3mgの総用量についてIV注射によって、500μg/100μlのPBSの最初の負荷用量で1日目に開始され、次いで、1週間あたり3回での、250μg/100μlのPBSの10回の他の投薬を用いて続けられた。最後の投薬の2週間後、効力が決定された。効力エンドポイント:10%の体重の喪失によって定義されるような関連した全身的毒性を伴うことなく、処置マウス対コントロールマウスにおける腫瘍の低下したサイズによって抗腫瘍活性が明らかにされた。
図6に示されるように、AsPC−1防止モデルでは、PAR34およびPAR80の両方が、腫瘍体積の減少における効力を、体重の喪失に基づく関連した全身的毒性を有することなく明らかにした(データは示されず)。
図7に示されるように、A431防止モデルでは、PAR80が、腫瘍体積の実質的な減少を、体重の喪失に基づく関連した全身的毒性を有することなく明らかにした(データは示されず)。
(実施例6:抗AR抗体のヒト化)
本実施例では、マウス抗アンフィレグリンモノクローナル抗体PAR34のヒト化が記載される。
本実施例では、マウス抗アンフィレグリンモノクローナル抗体PAR34のヒト化が記載される。
PAR34のヒト化が、本質的にはQueen,C.et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86:10029〜10033(1989))の手順に従って行われた。最初に、PAR34のVHアミノ酸配列およびVLアミノ酸配列に対する大きい相同性をそれぞれ有するヒトVHセグメントおよびヒトVLセグメントを同定した。次いで、CDRの構造を維持するために重要であるフレームワークアミノ酸とともにCDR配列を、選択されたヒトフレームワーク配列の中につないだ。また、対応するV領域亜群において希であることが見出されたヒトフレームワークアミノ酸を、潜在的な免疫原性に低下させるために、コンセンサスなアミノ酸配列で置換した。得られたヒト化モノクローナル抗体(HuPAR34)をマウス骨髄腫細胞株NS0において発現させた。精製されたPAR34抗体およびHuPAR34抗体を用いた競合的結合アッセイを使用して、ヒトアンフィレグリンに対するHuPAR34の親和性がPAR34の親和性よりも約1.8倍低いことが示された。
(PAR34可変領域cDNAのクローニングおよび配列決定)
総RNAを、TRIzol試薬(Life Technologies,Inc.、Rockville、MD)を使用して、PAR34を発現する約107個のハイブリドーマ細胞から抽出し、ポリ(A)+RNAを、PolyATract mRNA単離システム(Promega Corporation、Madison、WI)を供給者の説明書に従って用いて単離した。二本鎖cDNAを、SMART RACE cDNA増幅キット(BD Biosciences Clontech、Palo Alto、CA)を供給者の説明書に従って使用して合成した。重鎖および軽鎖に対する可変領域cDNAを、マウスのγ鎖およびκ鎖のC領域にそれぞれアニーリングする3’プライマーと、SMART RACE cDNA増幅キットにおいて提供される5’ユニバーサルプライマーとを使用するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅した。VHのPCRについては、3’プライマーは下記の配列を有する:5’−GCCAGTGGATAGACTGATGG−3’(配列番号6)。VLのPCRについては、3’プライマーは下記の配列を有する:5’−GATGGATACAGTTGGTGCAGC−3’(配列番号7)。VHおよびVLのcDNAを配列決定のためにpCR4Blunt−TOPOベクター(Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA)にサブクローン化した。DNA配列決定は、蛍光ジデオキシ鎖停止剤(Applied Biosystems、Foster City、CA)を製造者の説明書に従って用いたPCRサイクル配列決定反応によって行われた。
総RNAを、TRIzol試薬(Life Technologies,Inc.、Rockville、MD)を使用して、PAR34を発現する約107個のハイブリドーマ細胞から抽出し、ポリ(A)+RNAを、PolyATract mRNA単離システム(Promega Corporation、Madison、WI)を供給者の説明書に従って用いて単離した。二本鎖cDNAを、SMART RACE cDNA増幅キット(BD Biosciences Clontech、Palo Alto、CA)を供給者の説明書に従って使用して合成した。重鎖および軽鎖に対する可変領域cDNAを、マウスのγ鎖およびκ鎖のC領域にそれぞれアニーリングする3’プライマーと、SMART RACE cDNA増幅キットにおいて提供される5’ユニバーサルプライマーとを使用するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅した。VHのPCRについては、3’プライマーは下記の配列を有する:5’−GCCAGTGGATAGACTGATGG−3’(配列番号6)。VLのPCRについては、3’プライマーは下記の配列を有する:5’−GATGGATACAGTTGGTGCAGC−3’(配列番号7)。VHおよびVLのcDNAを配列決定のためにpCR4Blunt−TOPOベクター(Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA)にサブクローン化した。DNA配列決定は、蛍光ジデオキシ鎖停止剤(Applied Biosystems、Foster City、CA)を製造者の説明書に従って用いたPCRサイクル配列決定反応によって行われた。
数個の重鎖クローンおよび軽鎖クローンを2つの独立したPCR反応から配列決定した。マウスの代表的な重鎖可変領域および軽鎖可変領域に対して相同的な特有の配列が同定された。PAR34の重鎖および軽鎖のV領域のcDNA配列、ならびに推定されるアミノ酸配列が図8および図9にそれぞれ示されている。
(HuPAR34の可変領域の設計)
抗体可変領域(すなわち、「V」領域)のヒト化が、Queen,C.et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86:10029〜10033(1989))によって概略されるように行われた。最初に、PAR34の可変領域の分子モデルを、コンピュータープログラムのABMODおよびENCAD(Levitt,M.、J.Mol.Biol.、168:595〜620(1983))の助けをかりて構築した。次に、ヒトのVセグメント配列およびJセグメント配列に対する相同性検索に基づいて、ゲノムのVHセグメントDP−3(Tomlinson,I.M.et al.、J.Mol.Biol.、227:776〜789(1992))およびJセグメントJH−4(Ravetch,J.V.et al.、Cell、27:583〜591(1981))を、HuPAR34の重鎖可変領域のためのフレームワークを提供するために選択した。HuPAR34の軽鎖可変領域については、ゲノムのVLセグメントL1(Cox,J.P.L.et al.、Eur,J.Immunol.、24:827〜836(1994))およびJセグメントJK4(Hieter,P.A.et al.、J.Biol.Chem.、257:1516〜1522(1982))を使用した。PAR34のVHと、アクセプターのヒトDP−3セグメントおよびヒトJH4セグメントとの間でのフレームワークアミノ酸の同一性は68%であり、一方、PAR34のVLと、アクセプターのヒトL1セグメントおよびヒトJK4セグメントとの間での同一性は80%であった。
抗体可変領域(すなわち、「V」領域)のヒト化が、Queen,C.et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86:10029〜10033(1989))によって概略されるように行われた。最初に、PAR34の可変領域の分子モデルを、コンピュータープログラムのABMODおよびENCAD(Levitt,M.、J.Mol.Biol.、168:595〜620(1983))の助けをかりて構築した。次に、ヒトのVセグメント配列およびJセグメント配列に対する相同性検索に基づいて、ゲノムのVHセグメントDP−3(Tomlinson,I.M.et al.、J.Mol.Biol.、227:776〜789(1992))およびJセグメントJH−4(Ravetch,J.V.et al.、Cell、27:583〜591(1981))を、HuPAR34の重鎖可変領域のためのフレームワークを提供するために選択した。HuPAR34の軽鎖可変領域については、ゲノムのVLセグメントL1(Cox,J.P.L.et al.、Eur,J.Immunol.、24:827〜836(1994))およびJセグメントJK4(Hieter,P.A.et al.、J.Biol.Chem.、257:1516〜1522(1982))を使用した。PAR34のVHと、アクセプターのヒトDP−3セグメントおよびヒトJH4セグメントとの間でのフレームワークアミノ酸の同一性は68%であり、一方、PAR34のVLと、アクセプターのヒトL1セグメントおよびヒトJK4セグメントとの間での同一性は80%であった。
コンピューターモデルにより、CDRとの著しい接触が示唆されたフレームワーク位置において、PAR34のV領域に由来するアミノ酸が元のヒトフレームワークアミノ酸の代わりに使用された。これは、重鎖の残基28、残基48、残基67、残基68、残基70、残基72、残基74および残基98において行われた(図10)。軽鎖については、置換が、残基46、残基69および残基71において行われた(図11)。対応するヒトV領域亜群におけるそれらのそれぞれの位置において希にしか存在しないフレームワーク残基が、それらの位置においてヒトのコンセンサスアミノ酸で置換された。これは、重鎖の残基17、残基38および残基77において行われた(図10)。PAR34、設計されたHuPAR34、およびヒトアクセプターアミノ酸配列の、VHおよびVLについてのアラインメントが図10および図11にそれぞれ示されている。
(HuPAR34のVH遺伝子およびVL遺伝子の構築)
HuPAR34のVHおよびVLのそれぞれをコードする遺伝子を、シグナルペプチドと、スプライスドナーシグナルと、哺乳動物発現ベクターへのその後のクローニングのための適切な制限酵素部位とを含むミニエキソンとして構築した。VHミニエキソンおよびVLミニエキソンにおけるスプライスドナーシグナルは、対応するヒト生殖系列のJH配列およびJK配列にそれぞれ由来した。HuPAR34のVHミニエキソンおよびVLミニエキソンにおけるシグナルペプチド配列は、対応するPAR34のVH配列およびVL配列にそれぞれ由来した。HuPAR34のVH遺伝子およびVL遺伝子のヌクレオチド配列、ならびに推定されるアミノ酸配列が図12および図13にそれぞれ示される。
HuPAR34のVHおよびVLのそれぞれをコードする遺伝子を、シグナルペプチドと、スプライスドナーシグナルと、哺乳動物発現ベクターへのその後のクローニングのための適切な制限酵素部位とを含むミニエキソンとして構築した。VHミニエキソンおよびVLミニエキソンにおけるスプライスドナーシグナルは、対応するヒト生殖系列のJH配列およびJK配列にそれぞれ由来した。HuPAR34のVHミニエキソンおよびVLミニエキソンにおけるシグナルペプチド配列は、対応するPAR34のVH配列およびVL配列にそれぞれ由来した。HuPAR34のVH遺伝子およびVL遺伝子のヌクレオチド配列、ならびに推定されるアミノ酸配列が図12および図13にそれぞれ示される。
HuPAR34のVH遺伝子およびVL遺伝子を、図14に例示されるように、長さが約60塩基から80塩基に及ぶ8個の重なる合成オリゴヌクレオチドプライマーの伸張、およびPCR増幅によって構築した(He,X.−Y.et al.、J.Imunol.、160:1029〜1035(1998))。オリゴヌクレオチドプライマーの1および2、3および4、5および6、ならびに7および8を別個にアニリーニングし、DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメントを用いて伸長させた。得られた二本鎖DNAセグメントのAおよびB、ならびにCおよびDを別個に混合し、変性し、アニリーニングし、伸長させて、DNAフラグメントのEおよびFをそれぞれ得て、その後、これらを混合して、3回目のアニーリングおよび伸長の工程で完全なミニエキソン(G)を作製した。ミニエキソンを、Expand High Fidelity PCRシステム(Roche Diagnostics Corporatrion、Indianapolis、IN)を使用する、プライマー9およびプライマー10を用いたPCRによって増幅した。HuPAR34のVH遺伝子の合成のために使用されたプライマー1〜10(配列番号20〜29)、およびVL遺伝子の合成のために使用されたプライマー1〜10(配列番号30〜39)が表15および表16にそれぞれ示されている。
PCR増幅フラグメントをゲル精製して、MluIおよびXbaIで消化した。HuPAR34のVH遺伝子を、ヒトγ1遺伝子がヒトγ2遺伝子の代わりの使用されるpVg1.D.Tt(重鎖発現ベクターpVg2.D.Tt(Cole,M.S.et al.、J.Immunol.、159:3613〜3621(1997))の誘導体)にサブクローン化した。HuPAR34のVL遺伝子を、pHuCkappa.rgpt.dE(κ軽鎖発現ベクターpOKT3.Vk.rg(Cole,M.S.et al.、J.Immunol.、159:3613〜3621(1997))の誘導体)にサブクローン化した。配列確認の後、完全な重鎖転写ユニットを含有するEcoRIフラグメントを、Kostenly,S.A.et al.(Int.J.Cancer、93:556〜565(2001))に記載されるような軽鎖発現ベクター内の特徴的なEcoRI部位にサブクローン化して、重鎖および軽鎖を発現させるための1個のベクターを構築した。HuPAR34をIgG1形態で発現させるための得られたベクターは、pHu1D10.IgG1.rgpt.dE(Kostelny,S.A.et al.、Int.J.Cancer、93:556〜565(2001))の構造と類似した構造を有しており、pHuPAR34−IgG1と名付けられた。pHuPAR34−IgG1の概略的な構造が図17に示される。
(HuPAR34の発現)
HuPAR34を安定的に産生する細胞株を得るために、発現ベクターpHuPAR34−IgG1をマウス骨髄腫細胞株の染色体にエレクトロポレーションによって導入した。
HuPAR34を安定的に産生する細胞株を得るために、発現ベクターpHuPAR34−IgG1をマウス骨髄腫細胞株の染色体にエレクトロポレーションによって導入した。
マウス骨髄腫細胞株NS0(European Collection of Animal Cell Cultures、Salisbury、Wiltshire、UK)が、10%のFBS(HyClone)および0.1mMの非必須アミノ酸(Invitrogen Corporation)が補充されたDME培地(HyClone、Logan、UT)において、37℃で、7.5%CO2インキュベーターにおいて維持された。NS0への安定的なトランスフェクションが、本質的にはBebbington,C.R.et al.、Bio/Technology、10:169〜175(1992)に記載されるようにエレクトロポレーションによって行われた。トランスフェクションの前に、pHuPAR34−IgG1を、FspIを使用して線状化した。約107個の細胞が20μgの線状化プラスミドでトランスフェクションされた。トランスフェクションされた細胞を、10%のFBS(HyClone)および0.1mMの非必須アミノ酸を含有するDME培地(HyClone)に懸濁して、数枚の96ウエルプレートに置床した。48時間後、選択培地(10%のFBS、0.1mMの非必須アミノ酸、HT培地補充物、0.25mg/mlのキサンチンおよび1μg/mlのミコフェノール酸を含有するDME)を加えた。選択を開始した約10日後、培養上清を抗体の産生についてアッセイした。
HuPAR34の発現をサンドイッチELISAにより測定した。MaxiSorp ELISAプレート(Nunc Nalge International、Rochester、NY)を0.2Mの炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.4)における1μg/mlのヤギ抗ヒトIgG Fc−γ鎖特異的ポリクローナル抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.、West Grove、PA)の100μl/ウエルを用いて4℃で一晩被覆し、洗浄緩衝液(0.1%のTween20を含有するPBS)で洗浄し、200μl/ウエルのSuperBlockブロッキング緩衝液/TBS(Pierce Chemical Company、Rockford、IL)を用いて室温で15分間ブロッキング処理した。洗浄緩衝液による洗浄の後、HuPAR34を含有するサンプルをELISA緩衝液(1%のBSAおよび0.1%のTween20を含有するPBS)に適切に希釈して、100μl/ウエルをELISAプレートに加えた。標準として、ヒト化抗CD33IgG1/κモノクローナル抗体HuM195(Co,M.S.et al.、J.Immunol.、148:1149〜1154(1992))を使用した。プレートを室温で1時間インキュベーションし、洗浄緩衝液で洗浄した後、結合した抗体を、100μl/ウエルの1:1000希釈物のHRP結合ヤギ抗ヒトκ鎖ポリクローナル抗体(SouthernBiotech、Birmingham、AL)を使用して検出した。室温で0.5時間インキュベーションし、洗浄緩衝液で洗浄した後、発色を、100μl/ウエルのABTS基質(KPL,Inc.、Gaithersburg、MD)を加えることによって行った。発色を、50μl/ウエルの2%シュウ酸を加えることによって停止させた。吸光度を、VersaMaxマイクロプレートリーダー(Molecular Devices Corporation、Sunnyvale、CA)を使用して415nmにおいて読み取った。
高レベルのHuPAR34を産生するNS0の安定なトランスフェクタントの1つ(クローンv1#2)をタンパク質非含有基礎培地−1(PFBM−1)(Protein Design Labs,Inc.)に適合化し、タンパク質非含有基礎培地−1(PFBM−1)において拡大培養し、タンパク質非含有供給培地−2(PFFM−2)(Protein Design Labs,Inc.)が補充されたPFBM−1において拡大培養して、なくなるまで成長させた。遠心分離およびろ過の後、培養上清をプロテインAセファロースカラムに負荷した。カラムをPBSで洗浄して、抗体を0.1Mグリシン−HCl(pH2.8)/0.1M NaClを用いて溶出した。1MのTris−HCl(pH8)で中和した後、溶出されたタンパク質はPBSに対して透析され、0.2μmでろ過されて、4℃で保存された。抗体濃度が、280nmにおける吸光度を測定することによって決定された(1mg/ml=1.4A280)。精製された抗体は、標準的な手順に従ったSDS−PAGE分析によって特徴づけられた。非還元条件下での分析では、HuPAR34は約150kD〜160kDの分子量を有することが示された。還元条件下での分析では、HuPAR34は、約50kDの分子量を有する重鎖と、約25kDの分子量を有する軽鎖とから構成されることが示された。抗体の純度は95%を越えるようであった。
(HuPAR34の結合特性)
ヒトアンフィレグリンに対するHuPAR34の親和性を競合ELISAによって分析した。MaxiSorp ELISAプレート(Nalge Nunc International)を0.2M炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.4)における0.5μg/mlの組換え可溶性ヒトアンフィレグリンの100μl/ウエルを用いて4℃で一晩被覆し、洗浄緩衝液(0.1%のTween20を含有するPBS)で洗浄し、200μl/ウエルのSuperBlockブロッキング緩衝液/TBS(Pierce Chemical Company)を用いて室温で15分間ブロッキング処理した。洗浄緩衝液による洗浄の後、100μl/ウエルのELISA緩衝液におけるビオチン化PAR34(0.125μg/mlの最終濃度)および競合剤抗体(75μg/mlの最終濃度から始まり、3倍づつ連続希釈されたPAR34またはHuPAR34)の混合物を三連で加えた。コントロールとして、ELISA緩衝液における75μg/mlのヒト化抗CD33IgG1/κモノクローナル抗体HuM195(Co,M.S.et al.、J.Immunol.、148:1149〜1154(1992))の100μl/ウエルを使用した。競合剤非含有コントロールとして、100μl/ウエルのELISA緩衝液を使用した。プレートを1時間インキュベーションし、洗浄緩衝液で洗浄した後、結合した抗体を、ELISA緩衝液における1μg/mlのHRP結合ストレプトアビジン(Pierce Chemical Company)の100μl/ウエルを使用して検出した。室温で0.5時間インキュベーションし、洗浄緩衝液で洗浄した後、発色を、100μl/ウエルのABTS基質(KPL,Inc.)を加えることによって行った。発色を、100μl/ウエルの2%シュウ酸を加えることによって停止させた。吸光度を415nmにおいて読み取った。
ヒトアンフィレグリンに対するHuPAR34の親和性を競合ELISAによって分析した。MaxiSorp ELISAプレート(Nalge Nunc International)を0.2M炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.4)における0.5μg/mlの組換え可溶性ヒトアンフィレグリンの100μl/ウエルを用いて4℃で一晩被覆し、洗浄緩衝液(0.1%のTween20を含有するPBS)で洗浄し、200μl/ウエルのSuperBlockブロッキング緩衝液/TBS(Pierce Chemical Company)を用いて室温で15分間ブロッキング処理した。洗浄緩衝液による洗浄の後、100μl/ウエルのELISA緩衝液におけるビオチン化PAR34(0.125μg/mlの最終濃度)および競合剤抗体(75μg/mlの最終濃度から始まり、3倍づつ連続希釈されたPAR34またはHuPAR34)の混合物を三連で加えた。コントロールとして、ELISA緩衝液における75μg/mlのヒト化抗CD33IgG1/κモノクローナル抗体HuM195(Co,M.S.et al.、J.Immunol.、148:1149〜1154(1992))の100μl/ウエルを使用した。競合剤非含有コントロールとして、100μl/ウエルのELISA緩衝液を使用した。プレートを1時間インキュベーションし、洗浄緩衝液で洗浄した後、結合した抗体を、ELISA緩衝液における1μg/mlのHRP結合ストレプトアビジン(Pierce Chemical Company)の100μl/ウエルを使用して検出した。室温で0.5時間インキュベーションし、洗浄緩衝液で洗浄した後、発色を、100μl/ウエルのABTS基質(KPL,Inc.)を加えることによって行った。発色を、100μl/ウエルの2%シュウ酸を加えることによって停止させた。吸光度を415nmにおいて読み取った。
ELISA競合実験の代表的な結果が図18に示される。PAR34およびHuPAR34はともに、濃度依存的な様式でビオチン化PAR34と競合した。表1(下記)に示されるように、PAR34およびHuPAR34の平均IC50値(これは、コンピューターソフトウエアのGraphPad Prism(GraphPad Software Inc.、San Diego、CA)を使用して得られた)は、それぞれ1.07μg/mlおよび1.90μg/mlであった。ヒトアンフィレグリンに対するHuPAR34の結合はPAR34の結合よりも約1.8倍低かった。これらの結果は、マウス抗アンフィレグリンモノクローナル抗体PAR34のヒト化が成功していたことを示している。HuPAR34はヒトアンフィレグリンに対する結合親和性を保持していた。
(表1 ELISA競合実験の要旨)
BIAcore分析は下記のプロトコルに従って行うことができる。PAR34またはHuPAR34が、標準的なアミンカップリングキット(BIAcore)を使用してPioneer F1チップに固定化される。表面プラズモン共鳴が24℃において50μl/分の流速で測定される。AR(会合相)の注入が180秒間行われる。続いて、解離が3時間にわたってモニターされる。結合の速度論(kaおよびkd)が、BIA評価プログラムを使用して、分析物の5つの異なる濃度(320nM、160nM、80nM、40nM、20nM)で得られたデータから計算される。2回の参照が、参照表面および緩衝液のみのコントロールからの応答を除くために適用される。結合親和性KDが、分析物の濃度系列から得られるセンサーグラムの会合相および解離相を同時に近似することによって得られる。
BIAcore分析を使用して決定された結合パラメーターが下記の表2に示される。BIAcoreの結果から、HuPAR34がPAR34の2倍以内のARに対する親和性を有することが示される。
(表2:抗体結合のBIAcore分析)
3T3細胞におけるAR媒介増殖のHuPAR34阻害およびPAR34阻害のインビトロアッセイを、実施例4において一般的に記載されたように行った。ヒト化IgG1およびマウスIgG2bはまたコントロールとして使用された。図19に示される結果によって示されるように、HuPAR34(IC50=0.055μg/ml)はPAR34(IC50=0.025μg/ml)の2倍以内の抗増殖能を有する。
(実施例8:SCIDマウス移植片モデルでのHuPAR34効力のインビボアッセイ)
本実施例では、ヒト乾癬皮膚−SCIDマウス移植片モデル(Zeiglerら、Lab Invest、81(9):1253〜61(2001))における抗AR抗体(HuPAR34)の効力を明らかにするインビボ研究が記載される。
本実施例では、ヒト乾癬皮膚−SCIDマウス移植片モデル(Zeiglerら、Lab Invest、81(9):1253〜61(2001))における抗AR抗体(HuPAR34)の効力を明らかにするインビボ研究が記載される。
免疫抑制マウス(ヌードマウスまたは重症複合型免疫不全[SCID]マウスのいずれか)へのヒト皮膚の移植は乾癬の研究に対する方法を提供する(Krueger、J.Invest.Dermatol.、64:307〜312(1975);Kreugerら、J.Clin.Invest.、68:1548〜1557(1981);Bakerら、Brit.J.Dermatol.、126:105〜110(1992);Nickoloffら、Amer.J.Pathol.、146:580〜588(1995);Wrone−Smith and Nickoloff、J.Clin.Invest.、98:1878〜1887(1996);Ellisら、Arch.Dermatology、136:609〜616(1999))。この方法を使用して、この疾患の表現型特徴(すなわち、表皮肥厚、広範囲の突起網形成、および炎症性細胞の存在)が移植皮膚において長期間にわたって維持される(Nickoloffら、Amer.J.Pathol.、146:580〜588(1995))。
乾癬皮膚の2名のヒト提供者および正常な皮膚の2名の提供者が研究のために募集された。組織が8匹のSCIDマウス(CB−17系統;Taconic Farms Inc.、Germantown、NY)に移植された:4匹が正常な皮膚の移植片を受け、4匹が乾癬皮膚の移植片を受けた。正常なヒト皮膚および乾癬病変プラーク皮膚が被移植SCIDマウスの背側表面に移植され、マウスは一般には、Zeiglerら、Lab Invest、81(9):1253〜61(2001)に記載される手順に従って処置された。簡単に記載すると、1つのパンチ生検組織サンプルを下記のようにマウスに移植した。マウスをナトリウムペントバルビタール(Butler Co.、Columbus、Ohio、25gmマウスあたり0.2mlにおいて1.8mgの用量で)の腹腔内注射によって麻酔した後、各マウスの背側領域の毛を剃った。マウスの皮膚を所定のサイズに手術により除去し、ヒト組織で置き換えた。この組織は吸収性縫合糸(4−0Dexon“S”、Davis−Geck、Manati、Puerto Rico)でマウスの背中に固定された。その後、移植片を、5日間、Xeroformワセリン包帯(Kendall Company、Mansfield、MA)で処置した。動物は、準備段階および処置段階を通して無菌環境において維持された。皮膚移植片は、1週間〜2週間、癒合させられ、その後、処置が開始された。移植を受けたマウスは2つの処置群のいずれかにランダムに割り当てられた。
組織を癒合させた後、HuPAR34およびIgG2bコントロール抗体がSCIDマウスに対する処置について試験された。抗体の正体は、研究の継続期間中は隠されたままであった。処置プロトコルは、合計で8回の投薬について24日間にわたって3日毎に動物あたり抗体の1mg/ml溶液の200μlの腹腔内注射からなった(21日の処置期間)。マウスは、体重が抗体投与の初日および最終日に測定された。処置期間が終了したとき、マウスを屠殺し、移植されたヒト組織(および少量の周囲のマウス皮膚)を手術により取り出して、10%緩衝化ホルマリンにおいて固定処理した。
組織をパラフィンに包埋した後、多数の5ミクロン切片をそれぞれの組織片から切断し、顕微鏡用スライドガラスに載せ、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。表皮領域を、NIH画像分析ソフトウエアを使用して単位長さあたりの表皮厚さの変化の関数として測定した。具体的には、組織切片を10Xの倍率での光学顕微鏡観察によって視覚化した。このレベルの倍率で、それぞれの皮膚切片の表皮領域全体が、等しいセグメント(通常的には、代表的な組織切片にわたって3セグメント〜4セグメント)において「捕捉」され、各セグメントの領域が、NIH画像分析ソフトウエアを使用して定量された。それぞれの移植片からの多数の領域が、大きなn値を提供するためにこのように定量された。これらの値から平均表皮領域を求めた。移植前に、それぞれの提供者からの小さい組織片が10%緩衝化ホルマリンにおいて固定処理され、表皮厚さのゼロ時間での評価のために使用された。
定量的評価に加えて、皮膚移植片はまた組織学的に評価された。皮膚肥厚、増大した突起網形成、ならびに、リンパ球、マクロファージおよび好中球による皮膚浸潤および/または表皮内浸潤を含む乾癬の特徴が得られた。
(結果)
表3には、本研究から得られたデータが示される。
表3には、本研究から得られたデータが示される。
(表3:SCIDマウスでの移植および処置の前および後における正常なヒト皮膚および乾癬ヒト皮膚の表皮厚さ)
正常な皮膚は生検直後において乾癬プラーク皮膚よりもはるかに薄かった。以前の皮膚移植片研究(例えば、Ellisら、2000;Zeiglerら、2001を参照のこと)と一致していたが、正常な皮膚は、移植後、過増殖応答を受けていた。
乾癬皮膚は、移植後の期間を通して、また処置期間中、過増殖表現型を維持した。
最も顕著なことには、Ig2bコントロール(試薬A)ではなく、HuPAR34(試薬B)が、移植された正常な皮膚および移植された乾癬プラーク皮膚の両方において過増殖状態を劇的に抑制した。図20Cおよび図20Dは、Ig2b(図20C)またはHuPAR34(図20D)による処置の後での移植された正常な皮膚の組織切片の光学顕微鏡観察像を示す。図21Aおよび図21Bは、Ig2b(図21A)またはHuPAR34(図21B)による処置の後での移植された乾癬皮膚の組織切片の光学顕微鏡観察像を示す。
図20および図21における像によって明らかにされるように、HuPAR34は、コントロール抗体を用いた処置と比較したとき、正常な皮膚の移植片および乾癬皮膚の移植片の両方におけるケラチノサイトの増殖を劇的に抑制している。
(実施例9:単層培養におけるヒト表皮ケラチノサイトおよび皮膚繊維芽細胞に対するHuPAR34の影響のインビトロアッセイ)
Ig2bコントロールではなく、HuPAR34を用いた処置により、表皮の厚さが著しく低下した上記の実施例8の結果に基づいて、単層培養におけるケラチノサイトの増殖に対するこれらの同じ2つの試薬の影響を評価することが提案された。
Ig2bコントロールではなく、HuPAR34を用いた処置により、表皮の厚さが著しく低下した上記の実施例8の結果に基づいて、単層培養におけるケラチノサイトの増殖に対するこれらの同じ2つの試薬の影響を評価することが提案された。
正常なヒト表皮ケラチノサイトおよびヒト皮膚繊維芽細胞を、以前の記載(Varaniら、Arch Dermatolo Res、286:443〜7(1994))のようにヒト皮膚から単離した。標準的なインビトロアッセイ手法を使用して、本発明者らは、両方の細胞タイプの増殖および皮膚繊維芽細胞集団におけるI型プロコラーゲンの合成に対する試薬A(Ig2b)および試薬B(HuPAR34)の影響を評価した。インビトロアッセイが、以前の報告(Bhagavathulaら、J Invest Dermatol、122:130〜139(2004))に記載されるように行われた。
(結果)
図22に示されるグラフによって示されるように、HuPAR34(“Ab B”)については、ケラチノサイトの増殖が著しく減少し、一方、IgG2bコントロール抗体(“Ab A”)については、減少は観測されなかった。
図22に示されるグラフによって示されるように、HuPAR34(“Ab B”)については、ケラチノサイトの増殖が著しく減少し、一方、IgG2bコントロール抗体(“Ab A”)については、減少は観測されなかった。
パラレル研究において、同じ2つの抗体(HuPAR34およびIg2b)が、ヒト皮膚繊維芽細胞の増殖に対するそれらの影響についてアッセイされた。図23に示される上段のグラフによって示されるように、Ig2b(“Ab A”)またはHuPAR34(“Ab B”)のいずれも皮膚繊維芽細胞の増殖に影響しなかった。同様に、図23に示される下段のグラフに示されるように、Ig2bまたはHuPAR34のいずれも、ヒト皮膚繊維芽細胞によるI型プロコラーゲンの同化に影響しなかった。
まとめると、実施例8および実施例9に記載される結果は、ヒト皮膚移植片を有するSCIDマウスへのHuPAR34の腹腔内注射は、ヒト皮膚における表皮過形成を抑制することにおいて効果的であったことを明らかにしている。このことは、SCIDマウスにおける移植および維持の関数として過形成になる正常な皮膚においてだけでなく、移植前に過形成であった乾癬プラーク皮膚において観測された。Ig2bが表皮ケラチノサイトの増殖を抑制しなかったという事実は、HuPAR34に対する応答に関連する特異性を示唆している。
HuPAR34とは対照的に、Tリンパ球の機能に影響を及ぼすと考えられる2つの異なる薬剤、すなわち、シクロスポリンA、およびCD11bに対する抗体は、乾癬に関連する過形成応答を低下させるが、移植された正常な皮膚の過形成を阻害しなかった。
他方で、特異性がより広い薬剤(例えば、合成コルチコステロイドおよびPPAR−γリガンド)は、乾癬皮膚の増殖を阻害するようであるが、移植された正常な皮膚における表皮増殖を付随的に抑制する(Ellisら、Arch.Dermatology、136:609〜616(2000);Zeiglerら、Lab.Invest.、81:1253〜1261(2001))。これらの知見の1つの解釈は、乾癬皮膚のみを標的とする薬剤は、おそらくは、疾患の免疫基盤に対して作用することによってそのように抑制し、一方、コルチコステロイドおよびトログリタゾン(PPAR−γリガンド)などの広特異性薬剤はケラチノサイトの自己分泌増殖経路において下流側の事象に影響を及ぼすと考えられるということである。
移植された正常な皮膚における表皮過形成応答を抑制するその能力、および、単層培養における自己分泌ケラチノサイト成長を抑制するその能力にもかかわらず、HuPAR34は、表皮の増殖を抑制する用量で使用されたとき、繊維芽細胞の機能に影響を及ぼさないようである。この点において、HuPAR34の作用機構はコルチコステロイドと著しく異なるようである。なぜなら、強力なステロイドは表皮および真皮の両方の機能を抑制するからである。皮膚繊維芽細胞の機能に対する有害な影響を伴うことなく表皮の過形成を効果的に抑制するHuPAR34の能力のために、HuPAR34は、乾癬を含む様々な過増殖状態を処置するための有用な薬剤となる。
本発明が好ましい実施形態を参照して記載されているが、様々な改変が、本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることを理解しなければならない。
すべての刊行物、特許、特許出願およびウエブサイトは、それぞれの個々の刊行物、特許、特許出願またはウエブサイトが、その全体が参考として組み込まれるように具体的かつ個々に示されているかのようにそれと同じ程度に、その全体が参考として本明細書中に組み込まれる。
Claims (45)
- ARポリペプチドが抗体に結合する工程を競合的に阻害する抗体であって、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号12および配列番号14からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、抗体。
- 前記抗体が、配列番号2、配列番号4および配列番号12から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号3、配列番号5および配列番号14のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体が、PAR34、PAR80およびHuPAR34からなる群より選択される、請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体が、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体が、抗体フラグメントである、請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体フラグメントが、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fvフラグメント、rIgG、二重特異性抗体、単鎖抗体および多重特異性抗体からなる群より選択される、請求項5に記載の抗体。
- 前記抗体が、エフェクター部分に結合される、請求項1に記載の抗体。
- 前記ARポリペプチドが、癌細胞上に存在する、請求項1に記載の抗体。
- 前記ARポリペプチドが、皮膚細胞上に存在する、請求項1に記載の抗体。
- 配列番号2、配列番号4および配列番号12から選択される配列に対する同一性が少なくとも60%であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ならびに、配列番号3、配列番号5および配列番号14から選択される配列に対する同一性が少なくとも60%であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗体。
- 前記抗体が、キメラ抗体である、請求項10に記載の抗体。
- 前期抗体が、ヒト化される、請求項10に記載の抗体。
- 薬学的に受容可能な賦形剤および請求項1に記載の抗体を含有する、薬学的組成物。
- 前記抗体がエフェクター部分に結合される、請求項13に記載の薬学的組成物。
- 前記抗体が配列番号12および配列番号14を含む、請求項13に記載の薬学的組成物。
- 前記抗体がHuPAR34である、請求項13に記載の薬学的組成物。
- 前記抗体がエフェクター部分に結合される、請求項13に記載の薬学的組成物。
- ポリペプチドに結合するモノクローナル抗体であって、該ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列に対する相同性が少なくとも80%である配列を含む、モノクローナル抗体。
- 前記相同性が少なくとも98%である、請求項18に記載のモノクローナル抗体。
- 前記抗体が、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fvフラグメント、rIgG、二重特異性抗体、単鎖抗体および多重特異性抗体からなる群より選択される抗体フラグメントである、請求項18に記載のモノクローナル抗体。
- 前記抗体が、腫瘍細胞の増殖を阻害する、請求項18に記載のモノクローナル抗体。
- 前記抗体が、ARを発現する腫瘍細胞のインビボ増殖を阻害する、請求項18に記載のモノクローナル抗体。
- 前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項18に記載のモノクローナル抗体。
- 前記抗体が、エフェクター部分に結合される、請求項18に記載のモノクローナル抗体。
- 前記抗体が、ARのリガンドのリガンド結合部位に対する結合について競合する、請求項18に記載のモノクローナル抗体。
- 前記抗体が、PAR34、PAR80およびHuPAR34からなる群より選択される抗体が結合するエピトープと同じARエピトープに結合する、請求項18に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項18に記載の抗体を産生する宿主細胞であって、該宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、大腸菌、酵母細胞および昆虫細胞からなる群より選択される、宿主細胞。
- 請求項18に記載されるモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ。
- 配列番号2〜5、配列番号12および配列番号14からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号8、配列番号10、配列番号16および配列番号18からなる群より選択される核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号8、配列番号10、配列番号16および配列番号18からなる群より選択される核酸配列を含む、ベクター。
- 配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号12および配列番号14から選択される配列を含む、ポリペプチド。
- 被験体における癌細胞増殖を阻害する方法であって、ARのアンタゴニストの治療的に有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
- 前記癌細胞が表皮癌細胞または膵臓癌細胞である、請求項33に記載の方法。
- 前記ARのアンタゴニストが抗AR抗体である、請求項33に記載の方法。
- 前記抗体がエフェクター部分に結合される、請求項33に記載の方法。
- 被験体における乾癬を処置する方法であって、ARのアンタゴニストの治療的に有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
- 前記ARのアンタゴニストが抗AR抗体である、請求項7に記載の方法。
- 前記抗体が、ヒト化抗体、完全なヒト抗体、キメラ抗体、または、Fabフラグメント、(Fab’)2フラグメントもしくはFvフラグメントである、請求項38に記載の方法。
- 前記抗体が、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号12および配列番号14から選択されるアミノ酸配列を含む抗体のエピトープと同じエピトープに結合する、請求項38に記載の方法。
- 前記抗体が、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号12および配列番号14から選択される配列に対して少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記アンタゴニストが、ARをコードする核酸配列に対して相補的な核酸である、請求項38に記載の方法。
- 哺乳動物における乾癬または癌を診断する方法であって、該方法は、以下:
a.抗AR抗体を、該哺乳動物から得られた試験サンプルと接触させる工程;および
b.該抗体と該試験サンプルのポリペプチドとの間の複合体の形成を検出する工程;
を包含し、
ここで、該抗体は、ARタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドと結合する、
方法。 - 乾癬を検出する方法であって、該方法は、以下:
a.患者から皮膚サンプルを単離する工程;
b.該皮膚サンプルの細胞を抗AR抗体と接触させる工程;
c.正常な皮膚細胞を抗AR抗体と接触させる工程;
d.該正常な皮膚細胞を有する該皮膚サンプル細胞におけるARの発現の差を検出し、比較する工程;
を包含する、方法。 - 前記抗AR抗体が、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号12および配列番号14から選択されるアミノ酸配列を含む抗体である、請求項44に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US44564003P | 2003-02-07 | 2003-02-07 | |
US53390103P | 2003-12-30 | 2003-12-30 | |
PCT/US2004/004176 WO2004068931A2 (en) | 2003-02-07 | 2004-02-06 | Amphiregulin antibodies and their use to treat cancer and psoriasis |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006517109A true JP2006517109A (ja) | 2006-07-20 |
JP2006517109A5 JP2006517109A5 (ja) | 2007-03-29 |
Family
ID=32853408
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006503535A Pending JP2006517109A (ja) | 2003-02-07 | 2004-02-06 | アンフィレグリン抗体ならびに癌および乾癬を処置するためのその使用 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7223393B2 (ja) |
EP (1) | EP1608684A2 (ja) |
JP (1) | JP2006517109A (ja) |
CA (1) | CA2515081A1 (ja) |
WO (1) | WO2004068931A2 (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007135581A (ja) * | 2005-10-20 | 2007-06-07 | Japan Science & Technology Agency | 自己免疫性血小板減少性紫斑病(itp)患者の血液細胞特異的遺伝子群 |
JP2009513515A (ja) * | 2003-07-04 | 2009-04-02 | マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ | ストレス誘導性リガンド依存性egfr活性化の阻害 |
JP2010505934A (ja) * | 2006-10-11 | 2010-02-25 | フージョン アンティボディーズ リミテッド | 併用療法 |
JP2013537424A (ja) * | 2010-08-14 | 2013-10-03 | アッヴィ・インコーポレイテッド | アミロイドベータ結合タンパク質 |
JP2023519007A (ja) * | 2020-03-27 | 2023-05-09 | ナショナル インスティテュート オブ バイオロジカル サイエンシズ,ベイジン | Aregに対する抗体及びその用途 |
Families Citing this family (52)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6346510B1 (en) | 1995-10-23 | 2002-02-12 | The Children's Medical Center Corporation | Therapeutic antiangiogenic endostatin compositions |
DE10303974A1 (de) | 2003-01-31 | 2004-08-05 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
EP1449538A1 (en) * | 2003-02-21 | 2004-08-25 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Inhibition of TACE or amphiregulin for the modulation of EGF receptor signal transactivation |
DE102004010050A1 (de) * | 2004-03-02 | 2005-09-22 | Bayer Healthcare Ag | Spezifische monoklonale und polyklonale Antikörper für Repinotan und dessen ringoffene Form |
EP1773392A4 (en) * | 2004-05-27 | 2009-03-18 | Genentech Inc | METHOD FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF MAST-CELL-DISORDED DISEASES |
EP1778652A2 (en) * | 2004-08-20 | 2007-05-02 | EntreMed, Inc. | Compositions and methods comprising proteinase activated receptor antagonists |
TWI671403B (zh) | 2005-03-31 | 2019-09-11 | 中外製藥股份有限公司 | 控制組裝之多肽的製造方法 |
DK1976877T4 (en) | 2005-11-30 | 2017-01-16 | Abbvie Inc | Monoclonal antibodies to amyloid beta protein and uses thereof |
KR20080090408A (ko) | 2005-11-30 | 2008-10-08 | 아보트 러보러터리즈 | 항-Aβ 글로불로머 항체, 이의 항원-결합 잔기, 상응하는하이브리도마, 핵산, 벡터, 숙주 세포, 당해 항체의 제조방법, 당해 항체를 포함하는 조성물, 당해 항체의 용도 및당해 항체의 사용 방법 |
JP2009521219A (ja) * | 2005-12-21 | 2009-06-04 | メディミューン,エルエルシー | 親和性最適化EphA2アゴニスト抗体およびその使用法 |
WO2007114325A1 (ja) | 2006-03-31 | 2007-10-11 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法 |
US11046784B2 (en) * | 2006-03-31 | 2021-06-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies |
US8455626B2 (en) | 2006-11-30 | 2013-06-04 | Abbott Laboratories | Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies |
US20100311767A1 (en) | 2007-02-27 | 2010-12-09 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Method for the treatment of amyloidoses |
HUE035762T2 (en) * | 2007-03-13 | 2018-05-28 | Univ Zuerich | Monoclonal Human Tumor-Specific Antibody |
JP2010235447A (ja) * | 2007-07-30 | 2010-10-21 | Igaku Seibutsugaku Kenkyusho:Kk | 炎症性サイトカインの抑制剤 |
MX369784B (es) | 2007-09-26 | 2019-11-21 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Metodo de modificacion del punto isoelectrico de anticuerpos mediante la sustitucion de aminoacidos en region de determinacion de complementariedad (cdr). |
PH12018501459A1 (en) | 2007-09-26 | 2019-11-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Modified antibody constant region |
EP2236604B1 (en) | 2007-12-05 | 2016-07-06 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-nr10 antibody and use thereof |
GB0807018D0 (en) | 2008-04-17 | 2008-05-21 | Fusion Antibodies Ltd | Antibodies and treatment |
TWI440469B (zh) | 2008-09-26 | 2014-06-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Improved antibody molecules |
JP5787446B2 (ja) | 2009-03-19 | 2015-09-30 | 中外製薬株式会社 | 抗体定常領域改変体 |
JP5717624B2 (ja) | 2009-03-19 | 2015-05-13 | 中外製薬株式会社 | 抗体定常領域改変体 |
AR076875A1 (es) | 2009-05-15 | 2011-07-13 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anticuerpo contra receptor de la tirosina quinasa (anti-axl) |
WO2010137012A1 (en) | 2009-05-25 | 2010-12-02 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Peptide therapy for amphiregulin mediated diseases |
EP2481752B1 (en) | 2009-09-24 | 2016-11-09 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Modified antibody constant regions |
JP5889181B2 (ja) | 2010-03-04 | 2016-03-22 | 中外製薬株式会社 | 抗体定常領域改変体 |
JP2013523182A (ja) | 2010-04-15 | 2013-06-17 | アボット・ラボラトリーズ | アミロイドベータ結合タンパク質 |
KR101857310B1 (ko) | 2010-09-29 | 2018-05-11 | 가부시키가이샤 에누비 켄코우겡큐쇼 | 인간 프로스타글란딘 e2 수용체 ep4 에 대한 항체 |
EP2644698B1 (en) | 2010-11-17 | 2018-01-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Multi-specific antigen-binding molecule having alternative function to function of blood coagulation factor viii |
BR112013021526B1 (pt) | 2011-02-25 | 2021-09-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Polipeptídio variante, métodos para manter ou diminuir as atividades de ligação a fcgriia (tipo r) e fcgriia (tipo h) e aumentar a atividade de ligação a fcgriib de um polipeptídio e para a supressão da produção de um anticorpo contra um polipeptídio compreendendo a região fc do anticorpo, métodos para a produção do referido polipeptídio com atividades de ligação mantidas ou diminuídas e aumentada e para a produção suprimida de um anticorpo, composição farmacêutica e uso de um polipeptídio |
TW201817745A (zh) | 2011-09-30 | 2018-05-16 | 日商中外製藥股份有限公司 | 具有促進抗原清除之FcRn結合域的治療性抗原結合分子 |
JP6322411B2 (ja) | 2011-09-30 | 2018-05-09 | 中外製薬株式会社 | 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子 |
WO2013070433A1 (en) * | 2011-11-09 | 2013-05-16 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Targeting an amphiregulin-derived cell surface neo-epitope |
EP2888283B1 (en) | 2012-08-24 | 2018-09-19 | The Regents of The University of California | Antibodies and vaccines for use in treating ror1 cancers and inhibiting metastasis |
RU2758952C1 (ru) | 2013-09-27 | 2021-11-03 | Чугаи Сейяку Кабусики Кайся | Способ получения полипептидного гетеромультимера |
MA40764A (fr) | 2014-09-26 | 2017-08-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité |
LT3233921T (lt) | 2014-12-19 | 2021-12-10 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-c5 antikūnai ir panaudojimo būdai |
JP6227191B1 (ja) | 2014-12-19 | 2017-11-08 | 中外製薬株式会社 | 抗ミオスタチン抗体、変異Fc領域を含むポリペプチド、および使用方法 |
KR102605798B1 (ko) | 2015-02-05 | 2023-11-23 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, Fc 영역 개변체, IL-8에 결합하는 항체, 및 그들의 사용 |
TWI805046B (zh) | 2015-02-27 | 2023-06-11 | 日商中外製藥股份有限公司 | Il-6受體抗體用於製備醫藥組成物的用途 |
IL237852A0 (en) * | 2015-03-19 | 2016-03-24 | Yeda Res & Dev | Antibodies against amphigoline, medical preparations containing them and their use |
WO2016159213A1 (ja) | 2015-04-01 | 2016-10-06 | 中外製薬株式会社 | ポリペプチド異種多量体の製造方法 |
JP7141336B2 (ja) | 2015-12-25 | 2022-09-22 | 中外製薬株式会社 | 抗ミオスタチン抗体および使用方法 |
KR20180091918A (ko) | 2015-12-28 | 2018-08-16 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | Fc 영역 함유 폴리펩타이드의 정제를 효율화하기 위한 방법 |
CA3016424A1 (en) | 2016-03-14 | 2017-09-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy |
US10688181B2 (en) | 2016-06-27 | 2020-06-23 | The Regents Of The University Of California | Cancer treatment combinations |
JP6527643B2 (ja) | 2016-08-05 | 2019-06-05 | 中外製薬株式会社 | Il−8関連疾患の治療用又は予防用組成物 |
US11851486B2 (en) | 2017-05-02 | 2023-12-26 | National Center Of Neurology And Psychiatry | Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils |
EP3806888B1 (en) | 2018-06-12 | 2024-01-31 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy |
WO2021202798A1 (en) * | 2020-04-02 | 2021-10-07 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Antigen binding proteins to class 5 etec adhesins |
US11933781B2 (en) | 2020-12-09 | 2024-03-19 | The Regents Of The University Of Colorado | Fibrosis model and methods of use thereof |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02104596A (ja) * | 1988-01-25 | 1990-04-17 | Oncogen | アムフイレグリン |
JP2000504206A (ja) * | 1995-12-22 | 2000-04-11 | イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ | 新規形態のアンフィレグリン、その製造方法および使用方法、ならびにそれを含む組成物 |
WO2001045697A1 (fr) * | 1999-12-21 | 2001-06-28 | Kanebo, Limited | Agents et medicaments a usage cutane externe |
Family Cites Families (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4668629A (en) * | 1980-07-18 | 1987-05-26 | The Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University | Human hybridomas, precursors and products |
US5115096A (en) | 1988-04-15 | 1992-05-19 | Oncogen | Amphiregulin: a bifunctional growth modulating glycoprotein |
AU5816990A (en) | 1989-05-12 | 1990-12-18 | State of Oregon, acting by and through The State Board of Education on behalf of The Oregon Health Sciences University, The | Keratinocyte autocrine factor |
US5262298A (en) | 1989-05-12 | 1993-11-16 | The State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Education On Behalf Of The Oregon Health Sciences University | Method to assess the ability of a substance to inhibit or stimulate keratinocyte autocrine factor production |
US5855885A (en) * | 1993-01-22 | 1999-01-05 | Smith; Rodger | Isolation and production of catalytic antibodies using phage technology |
WO1996012019A2 (en) | 1994-10-14 | 1996-04-25 | Bristol-Myers Squibb Company | Her4 human receptor tyrosine kinase or the epidermal growth factor receptor family |
WO1999038972A2 (en) | 1998-01-28 | 1999-08-05 | Chiron Corporation | Human genes and gene expression products ii |
HUP0101160A2 (hu) * | 1998-04-03 | 2001-08-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Humán szöveti faktor (TF) elleni humanizált antitest és eljárás előállítására |
EP1074617A3 (en) | 1999-07-29 | 2004-04-21 | Research Association for Biotechnology | Primers for synthesising full-length cDNA and their use |
CA2402596A1 (en) | 2000-03-16 | 2001-09-27 | Genentech, Inc. | Anti-tissue factor antibodies with enhanced anticoagulant potency |
AU4592601A (en) | 2000-03-21 | 2001-10-03 | Millennium Predictive Medicine | Novel genes, compositions, kits, and method for identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer |
AU2001266790A1 (en) | 2000-06-09 | 2001-12-24 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of colon cancer |
EP1305450A2 (en) | 2000-07-28 | 2003-05-02 | Compugen Inc. | Oligonucleotide library for detecting rna transcripts and splice variants that populate a transcriptome |
US20020156263A1 (en) | 2000-10-05 | 2002-10-24 | Huei-Mei Chen | Genes expressed in breast cancer |
AU2002239717A1 (en) | 2000-10-20 | 2002-06-03 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of colon cancer |
NZ525336A (en) | 2000-10-20 | 2006-03-31 | Expression Diagnostics Inc | Leukocyte expression profiling |
US20020192666A1 (en) | 2000-10-31 | 2002-12-19 | Yongming Sun | Compositions and methods relating to colon specific genes and proteins |
US20030087855A1 (en) | 2001-09-13 | 2003-05-08 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of protein kinase R expression |
WO2003008583A2 (en) | 2001-03-02 | 2003-01-30 | Sagres Discovery | Novel compositions and methods for cancer |
JP2004519247A (ja) | 2001-03-20 | 2004-07-02 | オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド | 発現プロファイルおよび使用法 |
AU2002307466A1 (en) | 2001-04-20 | 2002-11-05 | Millennium Pharmaceutical, Inc. | Method for detecting breast cancer cells |
US7416849B2 (en) | 2001-05-11 | 2008-08-26 | Oscient Pharmaceuticals Corporation | HBM variants that modulate bone mass and lipid levels |
JP2005508887A (ja) | 2001-08-03 | 2005-04-07 | コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション | Egf受容体の結晶構造に基づいたスクリーニング方法 |
-
2004
- 2004-02-06 EP EP04709544A patent/EP1608684A2/en not_active Withdrawn
- 2004-02-06 JP JP2006503535A patent/JP2006517109A/ja active Pending
- 2004-02-06 CA CA002515081A patent/CA2515081A1/en not_active Abandoned
- 2004-02-06 US US10/774,076 patent/US7223393B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-06 WO PCT/US2004/004176 patent/WO2004068931A2/en active Application Filing
-
2007
- 2007-05-23 US US11/752,825 patent/US20080226632A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02104596A (ja) * | 1988-01-25 | 1990-04-17 | Oncogen | アムフイレグリン |
JP2000504206A (ja) * | 1995-12-22 | 2000-04-11 | イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ | 新規形態のアンフィレグリン、その製造方法および使用方法、ならびにそれを含む組成物 |
WO2001045697A1 (fr) * | 1999-12-21 | 2001-06-28 | Kanebo, Limited | Agents et medicaments a usage cutane externe |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009513515A (ja) * | 2003-07-04 | 2009-04-02 | マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ | ストレス誘導性リガンド依存性egfr活性化の阻害 |
JP2011084580A (ja) * | 2003-07-04 | 2011-04-28 | Max-Planck-Ges Zur Foerderung Der Wissenschaften Ev | ストレス誘導性リガンド依存性egfr活性化の阻害 |
JP2007135581A (ja) * | 2005-10-20 | 2007-06-07 | Japan Science & Technology Agency | 自己免疫性血小板減少性紫斑病(itp)患者の血液細胞特異的遺伝子群 |
JP2010505934A (ja) * | 2006-10-11 | 2010-02-25 | フージョン アンティボディーズ リミテッド | 併用療法 |
JP2013537424A (ja) * | 2010-08-14 | 2013-10-03 | アッヴィ・インコーポレイテッド | アミロイドベータ結合タンパク質 |
JP2017048194A (ja) * | 2010-08-14 | 2017-03-09 | アッヴィ・インコーポレイテッド | アミロイドベータ結合タンパク質 |
JP2023519007A (ja) * | 2020-03-27 | 2023-05-09 | ナショナル インスティテュート オブ バイオロジカル サイエンシズ,ベイジン | Aregに対する抗体及びその用途 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US7223393B2 (en) | 2007-05-29 |
CA2515081A1 (en) | 2004-08-19 |
EP1608684A2 (en) | 2005-12-28 |
WO2004068931A2 (en) | 2004-08-19 |
WO2004068931A3 (en) | 2005-03-24 |
US20080226632A1 (en) | 2008-09-18 |
US20040210040A1 (en) | 2004-10-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7223393B2 (en) | Amphiregulin antibodies and their use to treat cancer and psoriasis | |
JP2006517109A5 (ja) | ||
US20180369269A1 (en) | Antibodies that specifically block the biological activity of a tumor antigen | |
JP2021120382A (ja) | 部位特異的抗体コンジュゲーション方法および組成物 | |
JP7003036B2 (ja) | グリコシル化pd-1に対して特異的な抗体およびその使用方法 | |
KR102618312B1 (ko) | 항muc16 항체 및 그의 용도 | |
US7399469B2 (en) | Anti-LFL2 antibodies for the diagnosis, prognosis and treatment of cancer | |
KR20170008202A (ko) | 흑색종에 사용하기 위한 항-dll3 항체 및 약물 접합체 | |
JP2016538318A (ja) | 新規sez6モジュレーターおよび使用方法 | |
JP2015501639A (ja) | 抗cd98抗体およびその使用方法 | |
JP2019516705A (ja) | 神経内分泌移行のリスクのある腫瘍を治療するための抗dll3薬物コンジュゲート | |
JP7165193B2 (ja) | ヒト組織因子を標的とするヒト化抗体 | |
US11104740B2 (en) | Antibodies and assays for detection of CD37 | |
WO2011054112A1 (en) | Antibodies that specifically block the biological activity of kidney associated antigen 1 | |
EP4054635A1 (en) | Brain-specific angiogenesis inhibitor 1 (bai1) antibodies and uses thereof | |
US20220411532A1 (en) | Antibodies targeting an amphiregulin-derived cell surface neo-epitope | |
JPWO2012124334A1 (ja) | 抗体、乳がんの治療に用いられる医薬組成物、腫瘍検査方法、及び、腫瘍検査用試薬 | |
NZ626513B2 (en) | Anti-cd98 antibodies and methods of use thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20070205 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070205 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100112 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100617 |