CN115515977A - 针对areg的抗体及其用途 - Google Patents

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武慧娟
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Abstract

提供了用于治疗、诊断或预防纤维化疾病包括但不限于肾纤维化、肝纤维化、肺纤维化特别是IPF的抗AREG抗体或其免疫反应性片段。还提供了编码所述抗体的多核苷酸或核酸分子、表达载体、宿主细胞和用于制备所述抗体的方法。所述抗AREG抗体通过位于EGF样结构域中的结合残基与AREG特异性结合并阻断AREG的功能。

Description

针对AREG的抗体及其用途
背景技术
纤维化，可由损伤引起的结缔组织的增厚和瘢痕形成，以成纤维细胞的过度增殖和细胞外基质(ECM)组分的积累为特征。这种疾患常见于肺、肝和肾等器官，会引起组织结构体系破坏，并导致器官功能的严重损伤。
肺纤维化(PF)是当健康的肺组织被过量的细胞外基质代替时发生的一种肺部疾病。PF肺的肺泡结构被破坏，这导致肺顺应性降低，气体交换受损，并最终导致呼吸衰竭和死亡。肺纤维化的共同特点是肺的气囊(肺泡)周围的成纤维细胞过度增殖(Barkauskas和Noble，2014)。最常见的肺纤维化类型是特发性肺纤维化(IPF)。IPF是一种原因不明且肺功能严重进行性丧失的间质性肺病。它最常见于50岁至70岁的老年人中。IPF是一种致命性疾病，从诊断之时起的存活时间中位数仅为2～4年(Steele和Schwartz，2013)，并且最终可导致呼吸衰竭。肺纤维化的发病机制一直是个未解之谜，临床治疗非常有限。目前仅有两种可商购的FDA批准的药物尼达尼布和吡非尼酮用于IPF的治疗。然而，这两种药物只能在1年内改善用力肺活量的降低速率，但它们都不能显著提高患者的生存率。
下面列出了抗AREG抗体的现有技术：
美国专利申请号10/774,076涉及AREG抗体及其治疗癌症和银屑病的用途。要求保护的抗体是人源化PAR34；
PCT申请号PCT/GB2009/050389涉及与AREG和HBEGF两者交叉反应的抗体。所述抗体可用于治疗癌症和与血管发生相关的疾病的方法中。要求保护的抗体是2F7；和
美国专利申请号15/271,515涉及AREG抗体及其治疗癌症的用途。要求保护的抗体是AR30、AR37和AR558。其中，AR558在异种移植小鼠肿瘤模型中显示出最佳的抗肿瘤活性。这三种抗体全都是鼠类抗体而不是人源化抗体。
发明内容
在现有技术中，关于肺纤维化、特别是特发性肺纤维化(IPF)、尤其是肺AT2细胞中的AREG信号传导的关键药物靶点，尚未发表确定性报道。本发明的发明人在肺AT2细胞中的AREG信号传导与肺纤维化、特别是IPF的发生之间确立了独特联系，并发现肺AT2细胞中的AREG信号传导可以作为肺纤维化、特别是IPF的关键药物靶点。具体来说，在正常对照肺的AT2细胞中未检测到AREG，但在所有IPF样本的AT2细胞中均检测到AREG。
此外，本发明的发明人构建了一种IPF的动物模型，其中将AT2细胞中的Cdc42基因敲除。AREG不能在对照肺的AT2细胞中检测到，但是可以在Cdc42 AT2敲除肺的AT2细胞中检测到。这是可以高度模拟IPF的发病机制和进展的第一个动物模型。使用这种动物模型，我们鉴定了AREG是肺纤维化的关键治疗靶点。
基于上述知识，本发明的发明人制备、筛选并获得了针对AREG的抗体，用于治疗肾纤维化、肝纤维化、肺纤维化，特别是IPF。
本发明提供了抗AREG抗体或其免疫反应性片段，用于治疗、诊断或预防纤维化疾病，包括但不限于肾纤维化、肝纤维化、肺纤维化，特别是IPF。还提供了编码所述抗体的多核苷酸或核酸分子、表达载体、宿主细胞和用于制备所述抗体的方法。还提供了包含所述抗体分子的药物组合物。本发明的抗AREG抗体通过位于EGF样结构域中的结合残基与AREG特异性结合并阻断AREG的功能。本文公开的抗AREG抗体可用于治疗、预防和/或诊断纤维化疾病，包括但不限于肾纤维化、肝纤维化、肺纤维化，特别是IPF。
一方面，本发明提供了一种分离的抗AREG抗体或其片段，其具有抑制纤维化的能力。优选地，所述纤维化是肾纤维化、肝纤维化、肺纤维化，特别是IPF。
在某些实施方案中，根据本发明的抗AREG抗体或其片段能够结合AREG。
在某些实施方案中，根据本发明的抗AREG抗体或其片段与人类AREG(hAREG)和小鼠AREG(mAREG)两者结合。
在某些实施方案中，根据本发明的抗AREG抗体或其片段仅与人类AREG(hAREG)结合而不能结合小鼠AREG(mAREG)。
在某些实施方案中，根据本发明的抗AREG抗体或其片段是人类抗AREG抗体或鼠类抗AREG抗体或人源化抗AREG抗体或嵌合抗AREG抗体。
在某些实施方案中，根据本发明的抗AREG抗体或其片段以高亲和力与AREG结合，其解离常数(KD)小于约10nM，例如小于1nM、0.1nM或0.01nM，例如在1×10-8-1×10-11的范围内，优选地在1×10-9-1×10-11的范围内。
在某些实施方案中，根据本发明的抗AREG抗体或其片段能够与可溶形式的AREG结合。优选地，所述抗AREG抗体能够与可溶形式的AREG的EGF样结构域结合。
在某些实施方案中，根据本发明的抗AREG抗体或其片段能够与人类pro-AREG的第101～184位残基结合。人类pro-AREG的氨基酸序列如SEQ ID NO:135所示。
在某些实施方案中，所述抗AREG抗体能够与可溶形式的AREG的EGF样结构域内的C-末端结合。
在某些实施方案中，根据本发明的抗AREG抗体或其片段能够与人类pro-AREG的第171～184位残基结合。
在某些实施方案中，根据本发明的抗AREG抗体或其片段能够与鼠类pro-AREG的第94～177位残基结合。
在某些实施方案中，根据本发明的抗AREG抗体或其片段能够与鼠类pro-AREG的第135～177位残基的EGF样结构域结合。
在某些实施方案中，根据本发明的抗AREG抗体或其片段能够结合由SEQ ID NO:123～132中的任一者所示的人类pro-AREG的第101～184位残基内、优选地由SEQ ID NO:123～132中的任一者所示的人类pro-AREG的第142～184位残基内的例如至少1个、2个、3个、4个或5个氨基酸。
在某些实施方案中，根据本发明的抗AREG抗体或其片段能够与人类pro-AREG的Glu149和/或His164相互作用。
在某些实施方案中，根据本发明的抗AREG抗体或其片段能够结合鼠类pro-AREG的第94-177位残基内、优选地鼠类pro-AREG的第137-177位残基内的例如至少1个、2个、3个、4个或5个氨基酸。
在某些实施方案中，根据本发明的抗AREG抗体或其片段是与可溶形式的AREG结合的抗体片段。
在某些实施方案中，根据本发明的抗AREG抗体或其片段是Fab片段或F(ab)2片段。
在某些实施方案中，根据本发明的抗AREG抗体或其片段包括：含有重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，和含有轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，其中：
HCDR1、HCDR2和HCDR3选自：(1)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:2所示的HCDR2，由SEQ ID NO:3所示的HCDR3；(2)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:2所示的HCDR2，由SEQ ID NO:4所示的HCDR3；(3)由SEQ ID NO:5所示的HCDR1，由SEQ ID NO:2所示的HCDR2，由SEQ ID NO:6所示的HCDR3；(4)由SEQ ID NO:7所示的HCDR1，由SEQ ID NO:8所示的HCDR2，由SEQ ID NO:9所示的HCDR3；(5)由SEQ ID NO:7所示的HCDR1，由SEQ IDNO:10所示的HCDR2，由SEQ ID NO:9所示的HCDR3；(6)由SEQ ID NO:7所示的HCDR1，由SEQID NO:8所示的HCDR2，由SEQ ID NO:11所示的HCDR3；(7)由SEQ ID NO:7所示的HCDR1，由SEQ ID NO:8所示的HCDR2，由SEQ ID NO:12所示的HCDR3；(8)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:13所示的HCDR2，由SEQ ID NO:14所示的HCDR3；(9)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:15所示的HCDR2，由SEQ ID NO:16所示的HCDR3；(10)由SEQ ID NO:17所示的HCDR1，由SEQ ID NO:18所示的HCDR2，由SEQ ID NO:19所示的HCDR3；(11)由SEQ IDNO:17所示的HCDR1，由SEQ ID NO:18所示的HCDR2，由SEQ ID NO:20所示的HCDR3；和(12)如(1)～(11)中所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，但其中的至少一者包括1个、2个、3个、4个或5个氨基酸的添加、缺失、保守氨基酸替换或其组合；并且
LCDR1、LCDR2和LCDR3选自：(1)由SEQ ID NO:21所示的LCDR1，由SEQ ID NO:22所示的LCDR2，由SEQ ID NO:23所示的LCDR3；(2)由SEQ ID NO:21所示的LCDR1，由SEQ ID NO:22所示的LCDR2，由SEQ ID NO:24所示的LCDR3；(3)由SEQ ID NO:25所示的LCDR1，由SEQ IDNO:26所示的LCDR2，由SEQ ID NO:27所示的LCDR3；(4)由SEQ ID NO:28所示的LCDR1，由SEQID NO:29所示的LCDR2，由SEQ ID NO:30所示的LCDR3；(5)由SEQ ID NO:31所示的LCDR1，由SEQ ID NO:32所示的LCDR2，由SEQ ID NO:30所示的LCDR3；(6)由SEQ ID NO:33所示的LCDR1，由SEQ ID NO:34所示的LCDR2，由SEQ ID NO:30所示的LCDR3；(7)由SEQ ID NO:35所示的LCDR1，由SEQ ID NO:34所示的LCDR2，由SEQ ID NO:30所示的LCDR3；(8)由SEQ ID NO:36所示的LCDR1，由SEQ ID NO:37所示的LCDR2，由SEQ ID NO:38所示的LCDR3；(9)由SEQ IDNO:39所示的LCDR1，由SEQ ID NO:40所示的LCDR2，由SEQ ID NO:38所示的LCDR3；(10)由SEQ ID NO:41所示的LCDR1，由SEQ ID NO:42所示的LCDR2，由SEQ ID NO:38所示的LCDR3；(11)由SEQ ID NO:43所示的LCDR1，由SEQ ID NO:44所示的LCDR2，由SEQ ID NO:38所示的LCDR3；(12)由SEQ ID NO:39所示的LCDR1，由SEQ ID NO:40所示的LCDR2，由SEQ ID NO:38所示的LCDR3；(13)由SEQ ID NO:45所示的LCDR1，由SEQ ID NO:42所示的LCDR2，由SEQ IDNO:46所示的LCDR3；(14)由SEQ ID NO:47所示的LCDR1，由SEQ ID NO:44所示的LCDR2，由SEQ ID NO:46所示的LCDR3；(15)由SEQ ID NO:48所示的LCDR1，由SEQ ID NO:37所示的LCDR2，由SEQ ID NO:49所示的LCDR3；(16)由SEQ ID NO:50所示的LCDR1，由SEQ ID NO:40所示的LCDR2，由SEQ ID NO:51所示的LCDR3；(17)由SEQ ID NO:50所示的LCDR1，由SEQ IDNO:40所示的LCDR2，由SEQ ID NO:52所示的LCDR3；(18)由SEQ ID NO:50所示的LCDR1，由SEQ ID NO:40所示的LCDR2，由SEQ ID NO:53所示的LCDR3；(19)由SEQ ID NO:54所示的LCDR1，由SEQ ID NO:42所示的LCDR2，由SEQ ID NO:55所示的LCDR3；(20)由SEQ ID NO:56所示的LCDR1，由SEQ ID NO:44所示的LCDR2，由SEQ ID NO:55所示的LCDR3；和(21)如(1)～(20)中所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3，但其中的至少一者包括1个、2个、3个、4个或5个氨基酸的添加、缺失、保守氨基酸替换或其组合。
在一个实施方案中，根据本发明的抗AREG抗体或其片段包括：含有重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，和含有轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，其中：
HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3选自：(1)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:2所示的HCDR2，由SEQ ID NO:3所示的HCDR3，由SEQ ID NO:21所示的LCDR1，由SEQ ID NO:22所示的LCDR2，由SEQ ID NO:23所示的LCDR3；(2)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:2所示的HCDR2，由SEQ ID NO:4所示的HCDR3，由SEQ ID NO:21所示的LCDR1，由SEQ ID NO:22所示的LCDR2，由SEQ ID NO:24所示的LCDR3；(3)由SEQ ID NO:5所示的HCDR1，由SEQ ID NO:2所示的HCDR2，由SEQ ID NO:6所示的HCDR3，由SEQ ID NO:25所示的LCDR1，由SEQ ID NO:26所示的LCDR2，由SEQ ID NO:27所示的LCDR3；(4)由SEQ ID NO:7所示的HCDR1，由SEQ ID NO:8所示的HCDR2，由SEQ ID NO:9所示的HCDR3，由SEQ ID NO:28所示的LCDR1，由SEQ ID NO:29所示的LCDR2，由SEQ ID NO:30所示的LCDR3；(5)由SEQ IDNO:7所示的HCDR1，由SEQ ID NO:10所示的HCDR2，由SEQ ID NO:9所示的HCDR3，由SEQ IDNO:31所示的LCDR1，由SEQ ID NO:32所示的LCDR2，由SEQ ID NO:30所示的LCDR3；(6)由SEQID NO:7所示的HCDR1，由SEQ ID NO:8所示的HCDR2，由SEQ ID NO:11所示的HCDR3，由SEQID NO:33所示的LCDR1，由SEQ ID NO:34所示的LCDR2，由SEQ ID NO:30所示的LCDR3；(7)由SEQ ID NO:7所示的HCDR1，由SEQ ID NO:8所示的HCDR2，由SEQ ID NO:12所示的HCDR3，由SEQ ID NO:35所示的LCDR1，由SEQ ID NO:34所示的LCDR2，由SEQ ID NO:30所示的LCDR3；(8)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:13所示的HCDR2，由SEQ ID NO:14所示的HCDR3，由SEQ ID NO:36所示的LCDR1，由SEQ ID NO:37所示的LCDR2，由SEQ ID NO:38所示的LCDR3；(9)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:13所示的HCDR2，由SEQ ID NO:14所示的HCDR3，由SEQ ID NO:39所示的LCDR1，由SEQ ID NO:40所示的LCDR2，由SEQ ID NO:38所示的LCDR3；(10)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:13所示的HCDR2，由SEQ IDNO:14所示的HCDR3，由SEQ ID NO:41所示的LCDR1，由SEQ ID NO:42所示的LCDR2，由SEQ IDNO:38所示的LCDR3；(11)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:13所示的HCDR2，由SEQID NO:14所示的HCDR3，由SEQ ID NO:43所示的LCDR1，由SEQ ID NO:44所示的LCDR2，由SEQID NO:38所示的LCDR3；(12)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:15所示的HCDR2，由SEQ ID NO:16所示的HCDR3，由SEQ ID NO:39所示的LCDR1，由SEQ ID NO:40所示的LCDR2，由SEQ ID NO:38所示的LCDR3；(13)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:15所示的HCDR2，由SEQ ID NO:16所示的HCDR3，由SEQ ID NO:45所示的LCDR1，由SEQ ID NO:42所示的LCDR2，由SEQ ID NO:46所示的LCDR3；(14)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:15所示的HCDR2，由SEQ ID NO:16所示的HCDR3，由SEQ ID NO:47所示的LCDR1，由SEQ ID NO:44所示的LCDR2，由SEQ ID NO:46所示的LCDR3；(15)由SEQ ID NO:17所示的HCDR1，由SEQID NO:18所示的HCDR2，由SEQ ID NO:19所示的HCDR3，由SEQ ID NO:48所示的LCDR1，由SEQID NO:37所示的LCDR2，由SEQ ID NO:49所示的LCDR3；(16)由SEQ ID NO:17所示的HCDR1，由SEQ ID NO:18所示的HCDR2，由SEQ ID NO:20所示的HCDR3，由SEQ ID NO:50所示的LCDR1，由SEQ ID NO:40所示的LCDR2，由SEQ ID NO:51所示的LCDR3；(17)由SEQ ID NO:17所示的HCDR1，由SEQ ID NO:18所示的HCDR2，由SEQ ID NO:20所示的HCDR3，由SEQ ID NO:50所示的LCDR1，由SEQ ID NO:40所示的LCDR2，由SEQ ID NO:52所示的LCDR3；(18)由SEQID NO:17所示的HCDR1，由SEQ ID NO:18所示的HCDR2，由SEQ ID NO:20所示的HCDR3，由SEQID NO:50所示的LCDR1，由SEQ ID NO:40所示的LCDR2，由SEQ ID NO:53所示的LCDR3；(19)由SEQ ID NO:17所示的HCDR1，由SEQ ID NO:18所示的HCDR2，由SEQ ID NO:20所示的HCDR3，由SEQ ID NO:54所示的LCDR1，由SEQ ID NO:42所示的LCDR2，由SEQ ID NO:55所示的LCDR3；(20)由SEQ ID NO:17所示的HCDR1，由SEQ ID NO:18所示的HCDR2，由SEQ ID NO:20所示的HCDR3，由SEQ ID NO:56所示的LCDR1，由SEQ ID NO:44所示的LCDR2，由SEQ IDNO:55所示的LCDR3；和(21)如(1)～(20)中所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，但其中的至少一者包括1个、2个、3个、4个或5个氨基酸的添加、缺失、保守氨基酸替换或其组合。
优选地，根据本发明的抗AREG抗体或其片段包含选自下述的HCDR1、HCDR2和HCDR3：
(1)由SEQ ID NO:5所示的HCDR1，由SEQ ID NO:2所示的HCDR2，由SEQ ID NO:6所示的HCDR3；
(2)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:2所示的HCDR2，由SEQ ID NO:4所示的HCDR3；和
(3)由SEQ ID NO:7所示的HCDR1，由SEQ ID NO:10所示的HCDR2，由SEQ ID NO:9所示的HCDR3；以及
选自下述的LCDR1、LCDR2和LCDR3：
(1)由SEQ ID NO:25所示的LCDR1，由SEQ ID NO:26所示的LCDR2，由SEQ ID NO:27所示的LCDR3；
(2)由SEQ ID NO:21所示的LCDR1，由SEQ ID NO:22所示的LCDR2，由SEQ ID NO:24所示的LCDR3；和
(3)由SEQ ID NO:31所示的LCDR1，由SEQ ID NO:32所示的LCDR2，由SEQ ID NO:30所示的LCDR3。
优选地，根据本发明的抗AREG抗体或其片段包含选自下述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：
(1)由SEQ ID NO:5所示的HCDR1，由SEQ ID NO:2所示的HCDR2，由SEQ ID NO:6所示的HCDR3，由SEQ ID NO:25所示的LCDR1，由SEQ ID NO:26所示的LCDR2，由SEQ ID NO:27所示的LCDR3；
(2)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:2所示的HCDR2，由SEQ ID NO:4所示的HCDR3，由SEQ ID NO:21所示的LCDR1，由SEQ ID NO:22所示的LCDR2，由SEQ ID NO:24所示的LCDR3；和
(3)由SEQ ID NO:7所示的HCDR1，由SEQ ID NO:10所示的HCDR2，由SEQ ID NO:9所示的HCDR3，由SEQ ID NO:31所示的LCDR1，由SEQ ID NO:32所示的LCDR2，由SEQ ID NO:30所示的LCDR3。
在某些实施方案中，根据本发明的抗AREG抗体或其片段包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区具有选自SEQ ID NO:57～69的氨基酸序列和与SEQ ID NO:57～69中的任一者具有至少95％序列同一性并保留表位结合活性的氨基酸序列，
其中所述轻链可变区具有选自SEQ ID NO:70～89的氨基酸序列和与SEQ ID NO:70～89中的任一者具有至少95％序列同一性并保留表位结合活性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，根据本发明的抗AREG抗体或其片段包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区和所述轻链可变区具有选自下述的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:70；(2)SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:71；(3)SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:72；(4)SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:73；(5)SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:74；(6)SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:75；(7)SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:76；(8)SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:77；(9)SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:78；(10)SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:79；(11)SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:80；(12)SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:81；(13)SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:79；(14)SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:82；(15)SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:83；(16)SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:84；(17)SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:85；(18)SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:86；(19)SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:87；(20)SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:88；(21)SEQ IDNO:69和SEQ ID NO:89；和(22)分别与(1)～(21)中的任一者具有至少95％序列同一性并保留表位结合活性的两个氨基酸序列。
优选地，根据本发明的抗AREG抗体或其片段包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区具有选自SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:62的氨基酸序列，并且
所述轻链可变区具有选自SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:75的氨基酸序列。
优选地，根据本发明的抗AREG抗体或其片段包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区和所述轻链可变区具有选自下述的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:59和SEQID NO:72；(2)SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:71；和(3)SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:75。
在某些实施方案中，根据本发明的抗AREG抗体或其片段是IgG、IgM、IgA、IgE或IgD的同种型。在某些实施方案中，根据本发明的抗AREG抗体或其片段是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的同种型。
在某些实施方案中，本发明的抗体是人类单克隆抗体(mAb)、鼠类mAb、人源化mAb或嵌合mAb。
优选地，本发明的人类单克隆抗体(mAb)具有包含由SEQ ID NO:1-3所示的三个CDR中的至少两者的重链区，和/或包含由SEQ ID NO:21-23所示的三个CDR中的至少两者的轻链区。
优选地，本发明的人类单克隆抗体(mAb)具有包含由SEQ ID NO:1、2和4所示的三个CDR中的至少两者的重链区，和/或包含由SEQ ID NO:21、22和24所示的三个CDR中的至少两者的轻链区。
优选地，本发明的人类单克隆抗体(mAb)具有包含由SEQ ID NO:5、2和6所示的三个CDR中的至少两者的重链区，和/或包含由SEQ ID NO:25-27所示的三个CDR中的至少两者的轻链区。
优选地，本发明的鼠类单克隆抗体(mAb)具有包含由SEQ ID NO:7-9所示的三个CDR中的至少两者的重链区，和/或包含由SEQ ID NO:28-30所示的三个CDR中的至少两者的轻链区。
优选地，本发明的鼠类单克隆抗体(mAb)具有包含由SEQ ID NO:1、13和14所示的三个CDR中的至少两者的重链区，和/或包含由SEQ ID NO:36-38所示的三个CDR中的至少两者的轻链区。
优选地，本发明的鼠类单克隆抗体(mAb)具有包含由SEQ ID NO:17-19所示的三个CDR中的至少两者的重链区，和/或包含由SEQ ID NO:48、37和49所示的三个CDR中的至少两者的轻链区。
优选地，本发明的人源化单克隆抗体(mAb)具有包含由SEQ ID NO:7-9所示的三个CDR中的至少两者的重链区，和/或包含由SEQ ID NO:28-30所示的三个CDR中的至少两者的轻链区。
优选地，本发明的人源化单克隆抗体(mAb)具有包含由SEQ ID NO:7、10和9所示的三个CDR中的至少两者的重链区，和/或包含由SEQ ID NO:31、32和30所示的三个CDR中的至少两者的轻链区。
优选地，本发明的人源化单克隆抗体(mAb)具有包含由SEQ ID NO:7、8和11所示的三个CDR中的至少两者的重链区，和/或包含由SEQ ID NO:33、34和30所示的三个CDR中的至少两者的轻链区。
优选地，本发明的人源化单克隆抗体(mAb)具有包含由SEQ ID NO:7、8和12所示的三个CDR中的至少两者的重链区，和/或包含由SEQ ID NO:35、34和30所示的三个CDR中的至少两者的轻链区。
优选地，本发明的人源化单克隆抗体(mAb)具有包含由SEQ ID NO:1、13和14所示的三个CDR中的至少两者的重链区，和/或包含由SEQ ID NO:39、40和38所示的三个CDR中的至少两者的轻链区。
优选地，本发明的人源化单克隆抗体(mAb)具有包含由SEQ ID NO:1、13和14所示的三个CDR中的至少两者的重链区，和/或包含由SEQ ID NO:41、42和38所示的三个CDR中的至少两者的轻链区。
优选地，本发明的人源化单克隆抗体(mAb)具有包含由SEQ ID NO:1、13和14所示的三个CDR中的至少两者的重链区，和/或包含由SEQ ID NO:43、44和38所示的三个CDR中的至少两者的轻链区。
优选地，本发明的人源化单克隆抗体(mAb)具有包含由SEQ ID NO:1、15和16所示的三个CDR中的至少两者的重链区，和/或包含由SEQ ID NO:39、40和38所示的三个CDR中的至少两者的轻链区。
优选地，本发明的人源化单克隆抗体(mAb)具有包含由SEQ ID NO:1、15和16所示的三个CDR中的至少两者的重链区，和/或包含由SEQ ID NO:45、42和46所示的三个CDR中的至少两者的轻链区。
优选地，本发明的人源化单克隆抗体(mAb)具有包含由SEQ ID NO:1、15和16所示的三个CDR中的至少两者的重链区，和/或包含由SEQ ID NO:47、44和46所示的三个CDR中的至少两者的轻链区。
优选地，本发明的人源化单克隆抗体(mAb)具有包含由SEQ ID NO:17、18和20所示的三个CDR中的至少两者的重链区，和/或包含由SEQ ID NO:50、40和51所示的三个CDR中的至少两者的轻链区。
优选地，本发明的人源化单克隆抗体(mAb)具有包含由SEQ ID NO:17、18和20所示的三个CDR中的至少两者的重链区，和/或包含由SEQ ID NO:50、40和52所示的三个CDR中的至少两者的轻链区。
优选地，本发明的人源化单克隆抗体(mAb)具有包含由SEQ ID NO:17、18和20所示的三个CDR中的至少两者的重链区，和/或包含由SEQ ID NO:50、40和53所示的三个CDR中的至少两者的轻链区。
优选地，本发明的人源化单克隆抗体(mAb)具有包含由SEQ ID NO:17、18和20所示的三个CDR中的至少两者的重链区，和/或包含由SEQ ID NO:54、42和55所示的三个CDR中的至少两者的轻链区。
优选地，本发明的人源化单克隆抗体(mAb)具有包含由SEQ ID NO:17、18和20所示的三个CDR中的至少两者的重链区，和/或包含由SEQ ID NO:56、44和55所示的三个CDR中的至少两者的轻链区。
优选地，本发明的人源化单克隆抗体(mAb)包含源自于人类恒定区的恒定区。
优选地，本发明的人源化单克隆抗体(mAb)具有源自于κ轻链恒定区的人类轻链恒定区。
优选地，本发明的人源化单克隆抗体(mAb)具有源自于人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区的人类重链恒定区。
在某些实施方案中，根据本发明的抗AREG抗体或其片段能够阻断AREG与EGFR的结合。
在某些实施方案中，根据本发明的抗AREG抗体或其片段能够抑制EGFR磷酸化。
另一方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸或核酸，其编码根据本发明的抗AREG抗体或其片段。
在某些实施方案中，根据本发明的多核苷酸可以在同一多核苷酸分子上或分开的多核苷酸分子上编码完整重链可变区或完整轻链可变区或两者。或者，根据本发明的多核苷酸可以在同一多核苷酸分子上或分开的多核苷酸分子上编码重链可变区或轻链可变区或两者的一部分。
在某些实施方案中，根据本发明的多核苷酸包括：编码重链可变区的由序列SEQID NO:90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、112、115和117中的任一者所示的DNA序列，和/或编码轻链可变区的由序列SEQ ID NO:91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、110、111、113、114、116、118、119、120、121和122中的任一者所示的DNA序列。
另一方面，本发明提供了一种分离的细胞或载体，其包含编码根据本发明的抗AREG抗体或其片段的一个或多个多核苷酸。
在某些实施方案中，所述细胞是产生根据本发明的抗AREG抗体或其片段的杂交瘤细胞。
另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含根据本发明的抗AREG抗体或其片段以及可药用载体。
另一方面，本发明提供了根据本发明的抗AREG抗体或其片段在制备用于治疗受试者中的障碍的药物中的用途，其中所述障碍中AREG被过表达、上调或激活。
所述受试者可以是需要诊断、预后或治疗的哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人类、驯养动物、农场动物，和动物园、运动或宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。
所述障碍是纤维化疾病，包括但不限于肾纤维化、肝纤维化、肺纤维化，特别是IPF。
另一方面，本发明提供了一种用于治疗受试者中的障碍的方法，其中所述障碍中AREG被过表达、上调或激活，所述方法包括向所述患者施用根据本发明的抗AREG抗体或其片段。所述障碍是纤维化疾病，包括但不限于肾纤维化、肝纤维化、肺纤维化，特别是IPF。
所述受试者可以是需要诊断、预后或治疗的哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人类、驯养动物、农场动物，和动物园、运动或宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。
另一方面，本发明提供了一种确定AREG蛋白的存在的方法，所述方法包括将怀疑含有AREG蛋白的细胞暴露于根据本发明的抗AREG抗体或其片段，并确定所述抗AREG抗体或其片段与所述细胞的结合。
所述方法可以是用于诊断受试者中的障碍的方法，其中所述障碍中AREG被过表达、上调或激活。所述障碍是纤维化疾病，包括但不限于肾纤维化、肝纤维化、肺纤维化，特别是IPF。
所述受试者可以是需要诊断、预后或治疗的哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人类、驯养动物、农场动物，和动物园、运动或宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。
另一方面，本发明提供了一种分离的AREG蛋白，其具有SEQ ID NO:123～132中的任一者所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:123～132中的任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列。
所述分离的AREG蛋白可以作为表位用于产生根据本发明的抗AREG抗体或其片段。
根据本发明的分离的AREG蛋白可用于鉴定与鼠类AREG没有交叉反应性或具有弱交叉反应性的抗AREG抗体或其片段。
两个氨基酸(E149和H164，基于hAREG编号)被鉴定为是根据本发明的抗AREG抗体或其片段与hAREG但不是mAREG结合的关键表位残基。mAREG中的氨基酸K149和N 164(基于hAREG编号)是导致根据本发明的抗AREG抗体或其片段缺少与mAREG的交叉反应性的残基，并且164N残基是最关键的。
优选地，所述分离的AREG蛋白具有氨基酸Glu149(使用hAREG编号)和/或His164(使用hAREG编号)。
另一方面，本发明提供了根据本发明的分离的AREG蛋白的用途，其用于鉴定与hAREG结合并且对mAREG没有交叉反应性或具有弱交叉反应性的抗AREG抗体或其片段。
定义：
当在本文中使用时，术语“AREG”和“Areg”是指“双调蛋白”(Amphiregulin)或编码双调蛋白的基因，并且可互换使用。“AREG(Areg)”是表皮生长因子(EGF)家族的一个成员，并且是EGF受体(EGFR)的一种低亲和力配体。除非在说明书中另有说明，否则“AREG(Areg)”是指人类AREG(Areg)。EGFR与AREG的结合激活控制细胞存活、增殖和运动的主要细胞内信号传导级联。AREG蛋白从252个氨基酸的跨膜前体(pro-AREG)(SEQ ID NO:135)合成，所述前体在其胞外域内被细胞膜蛋白酶、主要是TACE/ADAM17进行蛋白水解切割，从而释放出两种可溶形式的AREG蛋白，其中较大者对应于pro-AREG的第101～184位残基(SVRVEQVVKPPQNKTESENTSDKPKRKKKGGK NGKNRRNRKKKNPCNAEFQNFCIHGECKYIEHLEAVTCKCQQEYFGERCGEK)，并且较短者对应于pro-AREG的第107-184位残基(长度为78个残基)。AREG蛋白含有肝素结合结构域(对应于pro-AREG的第101-143位残基，SVRVEQVVKPPQNKTESENTSDKPKRKKKGGKNGKNRRNRK)和EGF样结构域(对应于pro-AREG的第144-184位残基，KKNPCNAEFQNFCIHGECKYIEH LEAVTCKCQQEYFGERCGEK)。Pro-AREG以近分泌模式激活相邻细胞上的EGFR，而可溶形式的AREG以自分泌或旁分泌模式激活EGFR。
当在本文中使用时，没有具体数目的指称(“一”和“一种/一个”)是指一个或超过一个(例如至少一个)指称物。
除非上下文另有明确指示，否则术语“或”在本文中用于意味着术语“和/或”，并且可以与其互换使用。
“约”和“大约”通常意味着在给定测量性质或精度的情况下测量到的量的可接受的误差程度。示例性的误差程度在给定值或值范围的百分之20(％)以内，通常在10％以内，更通常在5％以内。
当在本文中用于指称细胞、多核苷酸例如DNA或RNA、蛋白质或多肽时，术语“分离的”是指从其原始或本源环境(例如如果是天然存在的，则是天然环境)中取出的材料。例如，存在于活动物中的天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，但通过人类的干预与在天然系统中的一些或所有共存材料分离开的相同多核苷酸或多肽则是分离的。此类多核苷酸可以是载体的一部分和/或此类多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并且仍然是分离的，因此此类载体或组合物不是它在自然界中存在于其中的环境的一部分。分离的多核苷酸是指分别与存在于所述大分子的天然来源中的其他DNA或RNA分开的分子。分离的多肽意在涵盖纯化的和重组的多肽两者。
本文公开的产品和方法包含具有指定序列或与所述指定序列同一的或相似的序列、例如与其具有至少约85％或95％序列同一性(同一的)序列的多肽和多核苷酸。在氨基酸序列的情形中，术语“85％或95％序列同一性(同一的)”在本文中用于指称第一氨基酸序列含有足够或最少数量的与第二氨基酸序列中的对齐氨基酸残基i)相同或ii)保守替换的氨基酸残基，使得所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列可以具有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如，含有共同结构域的氨基酸序列与参比序列例如本文中提供的序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在核苷酸序列的情形中，术语“85％或95％序列同一性(同一的)”在本文中用于指称第一核酸序列含有足够或最少数量的与第二核酸序列中的对齐核苷酸相同的核苷酸，使得所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列编码具有共同的功能活性的多肽，或编码共同的结构性多肽结构域或共同的功能性多肽活性。例如，核苷酸序列与参比序列例如本文中提供的序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
为了确定两个氨基酸序列或核酸序列的百分同一性，出于最佳比较的目的将所述序列对齐(例如可以在第一氨基酸或核酸序列和第二氨基酸或核酸序列中的一者或两者中引入空位用于最佳对齐，并且出于比较目的可以无视非同源序列)。在优选实施方案中，出于比较目的，对齐的参比序列的长度为所述参比序列长度的至少30％，例如至少40％、50％、60％，例如至少70％、80％、90％、100％。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸聚合物。
术语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”和“多核苷酸”可互换使用。
当在本文中使用时，术语“抗体或抗体分子”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“抗体分子”包括例如单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)。在一个实施方案中，抗体分子包含全长抗体或全长免疫球蛋白链。在一个实施方案中，抗体分子包含全长抗体或全长免疫球蛋白链的抗原结合或功能性片段。当在本文中使用时，抗体分子与抗原“结合”，这种结合为本领域技术人员所理解。在一个实施方案中，抗体与抗原结合，其解离常数(KD)为约1×10-5M或更低，1×10-6M或更低，或1×10-7M或更低，1×10-8M或更低，1×10-9M或更低，1×10-10M或更低，1×10-11M或更低。
例如，抗体分子可以包括重(H)链可变结构域序列(在本文中缩写为VH)和轻(L)链可变结构域序列(在本文中缩写为VL)。在一个实施方案中，抗体分子包括重链和轻链，或由它们组成。在另一个实施方案中，抗体分子包括两个重(H)链可变结构域序列和两个轻(L)链可变结构域序列，从而形成两个抗原结合部位，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc、Fd、Fd’、Fv、单链抗体(例如scFv)、单可变结构域抗体、双体抗体(Dab)(二价和双特异性)和嵌合(例如人源化)抗体，它们可以通过完整抗体或使用重组DNA技术从头合成的抗体的修饰来产生。这些功能性抗体片段保留了与它们相应的抗原或受体特异性结合的能力。抗体和抗体片段可以来自于任何类别的抗体包括但不限于IgG、IgA、IgM、IgD和IgE，并且可以来自于任何抗体亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。抗体分子的制备物可以是单克隆或多克隆的。抗体分子也可以是人类、人源化、CDR移植或体外产生的抗体。所述抗体可以具有选自例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。所述抗体也可以具有选自例如κ或λ的轻链。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中可以与术语“抗体”互换使用。
当在本文中使用时，术语“抗体片段”或“抗原结合片段”是抗体的一部分，例如F(ab')2、F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFv等。抗体片段与被完整抗体所识别的相同的抗原结合。术语“抗体片段”包括适体、镜像体(spiegelmer)和双体抗体。术语“抗体片段”还包括通过与特定抗原结合形成复合体而与抗体作用相似的任何合成或遗传工程改造的蛋白质。
抗体分子的抗原结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CK和CH结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含在铰链区通过二硫键相连的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体的单一臂的VL和VH结构域组成，(v)双体抗体(dAb)片段，其由VH结构域组成；(vi)骆驼或驼源化可变结构域；(vii)单链Fv(scFv)；(viii)单域抗体。这些抗体片段可以使用任何适合的方法、包括本领域技术人员已知的常规技术来获得，并且所述片段可以以与完整抗体相同的方式筛选用途。术语“抗体片段”还包括通过与特定抗原结合形成复合体而与抗体作用相似的任何合成的或遗传工程改造的蛋白质。
“单链可变片段”或“scFv”是指免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。在某些情况下，所述区域使用10个至约25个氨基酸的短连接肽相连。所述连接物可以富含甘氨酸以获得柔性，并富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解性，并且可以将VH的N-末端与VL的C-末端相连，反之亦可。尽管移除了恒定区并引入了连接物，但这种蛋白质保留了原始免疫球蛋白的特异性。ScFv分子在本领域中是已知的。
轻链和重链被分成“恒定”区和“可变”区。轻链(VL)和重链(VH)部分两者的可变结构域决定了抗原识别和特异性。相反，轻链(CK)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域提供了重要的生物学性质例如分泌、经胎盘迁移、Fc受体结合、补体结合等。N-末端部分是可变区，C-末端部分是恒定区；CH3和CK结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。
可变区允许抗体选择性识别并特异性结合抗原上的表位。抗体的VL结构域和VH结构域或互补决定区(CDR)的子集组合，以形成定义了三维抗原结合部位的可变区。这种四级抗体结构形成存在于每个Y臂末端处的抗原结合部位。更具体来说，抗原结合部位由每个VH和VK链上的三个CDR(即HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3)定义。
当在本文中使用时，术语“互补决定区”和“CDR”是指抗体可变区内赋予抗原特异性和结合亲和力的氨基酸序列。在某些实施方案中，在每个重链可变区中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且在每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
特定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用任何熟知的方案来确定，包括在Kabat等(1991)，《免疫学重要的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD中描述的方案(“Kabat”编号方案)。
每个VH和VL通常包括三个CDR和四个FR，它们从氨基端到羧基端按下述顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意味着需要诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人类、驯养动物、农场动物，和动物园、运动或宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。
当在本文中使用时，短语例如“向需要治疗的患者”或“需要治疗的受试者”包括将从用于例如检测、诊断程序和/或治疗的本公开的抗体或组合物的施用中获益的受试者，例如哺乳动物受试者。
当在本文中使用时，术语“表位”是指抗原(例如人类AREG(hAREG))的与抗体分子特异性相互作用的组成部分。此类组成部分、在本文中也被称为表位决定簇，通常包含诸如氨基酸侧链或糖侧链的元件，或者是所述元件的一部分。表位决定簇可以通过本领域中已知或本文中公开的方法来定义，例如通过晶体学或突变。抗体分子上与表位决定簇特异性相互作用的至少一个或一些组成部分通常位于CDR上。通常，表位具有特定三维结构特征。通常，表位具有特定电荷特征。某些表位是线性表位，而其他表位是构象表位。
当在本文中使用时，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单分子组成的抗体制备物。单克隆抗体组合物对特定表位表现出单一结合特异性和亲和力。单克隆抗体可以通过杂交瘤技术或通过不使用杂交瘤技术的方法(例如文库选择和筛选或重组方法)来制备。
所述抗体分子可以是多克隆或单克隆抗体。在其他实施方案中，所述抗体可以重组产生，例如通过酵母展示、噬菌体展示或通过组合方法来产生。
在一个实施方案中，所述抗体是完全人类抗体(例如通过酵母展示产生的抗体、通过噬菌体展示产生的抗体或在已被遗传工程改造以从人类免疫球蛋白序列产生抗体的小鼠中制备的抗体)，或者是非人类抗体例如鼠类(小鼠或大鼠)、山羊、灵长动物(例如猴)或骆驼抗体。产生啮齿动物抗体的方法在本领域中是已知的。
人类单克隆抗体可以使用携带人类免疫球蛋白基因而不是小鼠系统的转基因小鼠来产生。使用来自于用感兴趣的抗原免疫的这些转基因小鼠的脾细胞，来产生分泌对来自于人类蛋白的表位具有特定亲和力的杂交瘤。
抗体可以是其中可变区或其一部分(例如CDR)在非人类生物体(例如大鼠或小鼠)中产生的抗体。嵌合、CDR移植和人源化抗体在本发明的范围之内。在非人类生物体例如大鼠或小鼠中产生，然后例如在可变构架或恒定区中进行修饰以降低在人类中的抗原性的抗体，在本发明的范围之内。
人源化或CDR移植抗体具有至少一个或两个、但通常所有三个受体CDR(免疫球蛋白重链或轻链的)被供体CDR代替。所述抗体可以用非人类CDR的至少一部分代替，或者可以将仅仅某些CDR用非人类CDR代替。只需要替换人源化抗体与AREG的结合所需的数量的CDR。在某些实施方案中，供体是鼠类抗体例如大鼠或小鼠抗体，并且受体是人类构架或人类共有构架。通常，所述提供CDR的免疫球蛋白被称为“供体”，并且所述提供构架的免疫球蛋白被称为“受体”。在一个实施方案中，所述供体免疫球蛋白是非人类(例如鼠类)的。所述受体构架是天然存在的(例如人类)构架或共有构架，或与其具有约85％或更高例如90％、95％、99％或更高同一性的序列。
抗体可以通过本领域中已知的方法人源化。人源化或CDR移植抗体可以通过CDR移植或CDR替换来产生，其中可以替换免疫球蛋白链的1个、2个或所有CDR。
在本发明的范围内还包括其中特定氨基酸已被替换、缺失或添加的人源化抗体。从供体选择氨基酸的标准描述于US 5,585,089中，例如US 5,585,089的第12-16栏中，其内容通过参考并入本文。用于将抗体人源化的其他技术描述于1992年12月23日出版的Padlan等，EP 519596 A1中。
在其他实施方案中，所述抗体分子具有选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区，特别是选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的(例如人类)重链恒定区的重链恒定区。
用于改变抗体恒定区的方法在本领域中是已知的。功能改变的抗体，例如对效应配体例如细胞上的FcR或补体的C1组分具有改变的亲和性的抗体，可以通过将抗体的恒定部分中的至少一个氨基酸残基用不同的残基代替来产生(参见例如EP 388,151 A1、美国专利号5,624,821和美国专利号5,648,260，所有这些文献的内容通过参考并入本文)。也设想了使抗体结构稳定的氨基酸突变，例如人类IgG4中的S228P(Eu编号)。
应该理解，本发明的分子可能采用对它们的功能没有显著影响的额外的保守或非必需氨基酸替换。
“保守”氨基酸替换是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基代替的替换。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已被定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。保守氨基酸替换如下：
原始残基 示例性替换 优选的替换
Ala Val，Leu，Ile Val
Arg Lys，Gln，Asn Lys
Asn Gln Gln
Asp Glu Glu
Cys Ser，Ala Ser
Gln Asn Asn
Glu Asp Asp
Gly Pro，Ala Ala
His Asn，Gln，Lys，Arg Arg
Ile Leu，Val，Met，Ala，Phe，正亮氨酸 Leu
Leu 正亮氨酸，Ile，Val，Met，Ala，Phe Ile
Lys Arg，1,4二氨基-丁酸，Gln，Asn Arg
Met Leu，Phe，Ile Leu
Phe Leu，Val，Ile，Ala，Tyr Leu
Pro Ala Gly
Ser Thr，Ala，Cys Thr
Thr Ser Ser
Trp Tyr，Phe Tyr
Tyr Trp，Phe，Thr，Ser Phe
Val Ile，Met，Leu，Phe，Ala，正亮氨酸 Leu
附图说明
图1示出了E1H3L4和P7与hAREG、mAREG和hAREG-C18的结合。
图2示出了在表达hEGFR的表皮样癌细胞中抗AREG mAb对EGFR磷酸化的抑制活性。
图3示出了通过将hAREG-EGFd的5个不同位点处的每个氨基酸改变成mAREG-EGFd的对应氨基酸而产生的5种hAREG-EGFd变体。
图4示出了产生其中AT2细胞中的Cdc42基因被特异性缺失的小鼠株系的方案。其中AT2细胞中的Cdc42基因的外显子2倍特异性缺失的小鼠被命名为Cdc42AT2敲除小鼠。
图5示出了AT2细胞中Cdc42的丧失在PNX处理的小鼠中导致进行性肺纤维化。
图6示出了抗AREG抗体(P7)在IPF样肺纤维化小鼠模型中有效治疗肺纤维化。
图7示出了在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中抗AREG抗体(E1H3L4)治疗可以加速小鼠的恢复。
图8示出了抗AREG抗体(E1H3L4)在IPF样肺纤维化小鼠模型中有效治疗肺纤维化。
图9示出了在IPF样肺纤维化小鼠模型中抗AREG抗体hu9C12v4显著延长纤维化小鼠的预期寿命。
具体实施方式
特定实施方案和实施例的描述以说明而不是限制的方式提供。本领域技术人员将会容易地认识到可以被改变或修改以产生基本上相似的结果的各种不同的非关键性参数。
实施例
实施例1.从噬菌体文库产生针对AREG的人类mAb
1.用于文库选择和筛选的可溶性AREG蛋白或肽的制备
将编码三种形式的AREG蛋白(下文列出)的DNA序列克隆到原核表达载体(pETDuet)中，并表达为带有N-末端标签(His6、硫氧还蛋白(TRX)、HRV3C蛋白酶切割位点和Avi标签)的融合蛋白。所述蛋白质通过IPTG诱导在大肠杆菌(TransB)中表达，并使用Ni-NTA珠子从细胞裂解物的上清液纯化，用HRV3C蛋白酶切割，然后用BirA酶生物素化。
所述三种AREG蛋白是：
·hAREG：包含人类pro-AREG的第101～184位残基并带有N-末端AVI标签(GLNDIFEAQKIEWHE)的人类AREG。hAREG的第101～184位残基的氨基酸序列是：SVRVEQVVKPPQNKTESENTSDKPKRKKKGGKNGKNRRNRKKKNPCNAEFQNFCIHGECKYIEHLEAVTCKCQQEYFGERCGEK(SEQ ID NO:129)
·mAREG：包含小鼠pro-AREG的第94～177位残基并带有N-末端AVI标签的小鼠AREG。氨基酸序列是：GLNDIFEAQKIEWHEGGGGSGGSVRVEQVIKPKKNKTEGEKSTEKPKRKKKGGKNGKGRRNKKKKNPCTAKFQNFCIHGECRYIENLEVVTCNCHQDYFGERCGEK(SEQ ID NO:130)
·mAREG-EGFd：小鼠AREG的EGF样结构域，其包含小鼠Pro-AREG的第135～177位残基并带有N-末端AVI标签。mAreg的第135～177位残基的氨基酸序列是：KKNPCTAKFQNFCIHGECRYIENLEVVT CNCHQDYFGERCGEK(SEQ ID NO:131)。
此外，合成了一种生物素化的肽C18(北京中科亚光生物科技有限公司(Scilight-peptide,Beijing,China))。C18包含人类AREG的C-末端的14个氨基酸(第171～184位残基)并在N-末端处包含连接物(残基GSSG)。C18的序列是GSSGKCQQEYFGERCGEK(SEQ ID NO:132)。
2.从噬菌体展示抗体文库选择抗体和进一步表征
噬菌体展示抗体文库
从93位健康供体的外周血单核细胞(PBMC)构建了人类非免疫scFv(单链可变片段)抗体文库。所述文库具有总共1.1×1010个成员的大小(Li等，2017)。
噬菌体抗体文库的选择和筛选
从所述文库制备在表面上表达scFv的噬菌体颗粒(噬菌体-ScFv)，并将其用于筛选针对包括生物素化的AREG蛋白和肽在内的靶抗原的scFv抗体。将所述抗原捕获在链霉亲和素偶联的磁性M-280
Figure BDA0003867130330000201
(Life Technologies)上，然后与从所述文库制备的5×1012个噬菌体颗粒孵育。对于每种可溶性AREG蛋白或肽(抗原，Ab)来说，进行两轮选择。为了获得识别hAREG和mAREG两者的交叉反应性人类单克隆抗体，将hAREG和mAREG分别用于第一轮和第二轮选择。在第二轮选择后，使用ELISA筛选约400个噬菌体抗体克隆对hAREG和mAREG两者的交叉结合活性，并选择具有交叉结合活性或对hAREG具有高结合亲和性的克隆用于测序分析，以鉴定具有不同的包括重链(VH)和轻链(VL)可变区在内的抗体序列的克隆。随后将一些噬菌体-抗体转变成人类IgG1(hIgG1)或小鼠IgG2a形式，并使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)或Biacore分析与hAREG和mAREG的结合。
3.全长抗体的制备
将scFv的VH和VL编码序列分别亚克隆到抗体重链(HC)表达载体(质粒)和轻链(LC)表达载体(质粒)中。为了制备全长抗体，将293F细胞用两种表达质粒(HC+LC质粒)以1:1的比率瞬时共转染。在转染后6天，收获细胞培养上清液，通过蛋白A亲和层析纯化抗体。
4.ELISA测定
将含链霉亲和素(Sigma，4μg/mL)的磷酸盐缓冲液(PBS)，以每孔100μL的量在U形底96孔板(Nunc，MaxiSorpTM)中4℃包被过夜或在37℃包被1小时。然后将约0.5μg/mL的AREG蛋白或肽以每孔100μL的量，通过在30℃温育1小时捕获在板上。对于基于噬菌体-scFv的ELISA来说，以每孔100μL的量向每个孔添加在含有2％脱脂奶的PBS中连续稀释噬菌体-scFv。通过添加HRP偶联的小鼠抗M13抗体(GE Healthcare)，并在30℃温育30min，检测特异性结合的噬菌体-scFv。在每个温育步骤之间，将ELISA板用PBST溶液(含有0.05％吐温20的PBS)以每孔300μL的量清洗6次。在HRP偶联的抗体温育后，通过与TMB底物(Sigma)在30℃温育5-10min产生ELISA信号，然后使用每孔50μL的2M H2SO4终止反应。通过微孔板读板器(Bio-Rad)读取450nm处的吸光值，并将校正波长设定在630nm。对于基于IgG的ELISA来说，方法基本上与上文为噬菌体-scFv描述的相同，区别在于结合的抗体通过HRP偶联的小鼠抗Fc的二抗(Thermo Fisher Scientific)来检测。
5.E1L2抗体工程化改造以提高亲和性和可溶性
为了提高E1L2抗体的亲和力，对E1L2的VH-CDR3和VL-CDR3分别进行工程化改造。对于VH-CDR3来说，构建对于E1L2的HCDR3来说具有随机突变的噬菌体展示子文库。抗体子文库的选择和筛选与上文为针对AREG的抗体文库的筛选所述方法相似。为了获得高亲和力抗体，使用了利用E1L2全长单克隆抗体的竞争性洗脱。随后，挑取单克隆并进行噬菌体拯救，以在细菌培养上清液中产生噬菌体-scFv，用于筛选与hAREG的结合。只保留具有比E1L2更高的结合亲和力的抗体。对于VL-CDR3来说，使用基于结构建模的特定氨基酸突变对其进行工程化改造。为了提高可溶性，将所述工程化改造的E1L2的VL CDR移植到人类IGLV1-44*01种系。
6.人类单克隆抗体的亲和力的SPR测量
为了评估人类单克隆抗体的亲和力，使用Biacore T200仪器进行了SPR测定。将单克隆抗体捕获在抗人类Fc CM5生物传感器芯片表面上，检查与mFc标签融合的hAREG(第142～184位氨基酸)或mAREG(第135～177位氨基酸)的EGF结构域(hAREG-EGFd-mFc或mAREG-EGFd-mFc)与所述单克隆抗体的结合。将连续稀释的融合蛋白进样到结合有抗体的表面上，然后是解离阶段。使用1：1朗缪尔(Langmuir)结合模型(BIA分析软件，GE Life Sciences)计算结合速率(Ka)和解离速率(Kd)。平衡解离常数(KD)计算为kd/ka的比率。
7.结果
从噬菌体文库产生针对AREG的人类单克隆抗体E1L2和P7
通过使用上述噬菌体抗体文库选择和ELSIA筛选，我们鉴定到C1、E1L2、P5、P6、P7和P10抗AREG人类单克隆抗体。具体来说，通过分别在第一轮和第二轮文库选择中使用大肠杆菌表达的生物素化hAREG和mAREG蛋白，我们鉴定到C1抗体。通过分别在第一轮和第二轮中使用生物素化的hAREG和生物素化的mAREG-EGFd(在大肠杆菌中表达的)，我们鉴定到E1L2抗体。通过使用hAREG来源的C18肽作为两轮文库选择的靶标，我们鉴定到P5、P6、P7和P10；从这个文库选择中也筛选出了E1L2。在这些抗体中，在结合特异性和对hAREG和mAREG两者的亲和力的基础上，选择了E1L2和P7抗体用于进一步鉴定。
具有更高亲和力和可溶性的E1L2来源的抗体E1H3L4的产生
通过VH-CDR3和VL-CDR3工程化改造进一步提高了E1L2的结合亲和力。工程化改造的E1L2的可溶性通过将它的VL-CDR移植到人类IGLV1-44*01种系得以提高，由此产生了抗体E1H3L4。与E1L2相比，E1H3L4在VH-CDR3中具有三个氨基酸变化并在VL-CDR3中具有四个氨基酸变化。具体来说，在E1H3L4的VH-CDR3中的第100-100c位(Kabat系统)处的氨基酸是GYDY，而在E1L2抗体中它们是SYNN；在E1H3L4的VL-CDR3中第93-95a位(Kabat系统)处的氨基酸是KNNK，而在E1L2抗体中它们是SGLN。E1L2、E1H3L4和P7的CDR列于表1中。E1L2、E1H3L4和P7的VH和VL的核苷酸序列和氨基酸序列列于表2中。
表1
Figure BDA0003867130330000221
Figure BDA0003867130330000231
E1L2与E1H3L4之间的差异以下划线标示。
使用Kabat系统来定义CDR。
表2
抗体名称 VH(核苷酸序列) VH(氨基酸序列) VL(核苷酸序列) VL(氨基酸序列)
E1L2 SEQ ID NO:90 SEQ ID NO:57 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:70
E1H3L4 SEQ ID NO:92 SEQ ID NO:58 SEQ ID NO:93 SEQ ID NO:71
P7 SEQ ID NO:94 SEQ ID NO:59 SEQ ID NO:95 SEQ ID NO:72
8.E1H3L4和P7单克隆抗体的进一步鉴定
比较E1H3L4和P7与mAREG的结合，E1H3L4与P7相比显示出略微更强的与mAREG的结合。正如预期，所述两种抗体均结合到EGF结构域内的C-末端肽(C18，第171～184位氨基酸)，因为所述C18肽是在文库选择中使用的靶蛋白(图1)。
实施例2.使用小鼠杂交瘤方法产生针对AREG的单克隆抗体和所述小鼠单克隆抗体的人源化
1.用于免疫小鼠或SPR分析的抗原的制备
将与人类IgG1或小鼠IgG2a的Fc片段融合的人类AREG(hAREG)EGF样结构域在293F中作为融合蛋白表达，分别命名为hAREG-EGFd-hFc和hAREG-EGFd-mFc。在转染后72小时，收获细胞培养上清液，用于通过蛋白A亲和层析纯化Fc-融合体AREG蛋白。
2.抗hAREG EGF结构域单克隆抗体的产生
通过用100μl的含有50μg hAREG-EGFd-mFc的1:1抗原/佐剂乳液皮下给药，对6周龄Balb/c小鼠(来自于北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫。对于初免来说，使用完全弗氏佐剂(Sigma)。对于加强免疫来说，使用不完全弗氏佐剂(Sigma)。加强免疫每两周进行。在第3次加强免疫后，在每次免疫后一周通过ELISA评估小鼠血清与生物素hAREG的结合。将具有高滴度的抗hAREG抗体的小鼠用50μg不含佐剂的hAREG-EGFd-mFc腹膜内加强。在加强后3天，分离脾细胞，并遵照标准的杂交瘤融合方法将其与SP2/0细胞融合。
通过ELISA检查杂交瘤克隆的上清液与生物素化hAREG的结合活性。选择具有高结合活性的克隆并扩增，用于后续的亚克隆，并通过ELISA和SPR分析所述亚克隆的上清液。所述SPR分析使用Biacore T200仪器(GE Life Sciences)进行。将稀释的上清液捕获在抗mFcCM5生物传感器芯片上，然后使流动相中的200nM hAREG EGF结构域-hFc流过。扩增具有高亲和力的亚克隆用于RNA提取。将细胞重悬浮在TRIzol(Life Technologies)中，并遵照说明手册提取总RNA。使用PrimeScriptTMRT主混合物(TaKaRa)合成亚克隆的cDNA。使用一组特异性针对小鼠抗体可变基因的PCR引物扩增每个抗体的VH和VL基因。将PCR产物克隆到PCR测序载体中用于测序。
3.抗hAREG EGF样单克隆抗体的人源化
为了将AREG单克隆抗体人源化，使用鼠类单克隆抗体的序列搜索同源的人类种系IgG基因，以鉴定与鼠类单克隆抗体具有高同源性的人类种系基因(9C12、23H8和1H9)，然后选择它们作为用于人源化的模板。人源化通过互补决定区(CDR)移植，具体来说通过将鼠类单克隆抗体的CDR移植到所选人类种系基因模板的人类受体构架上来进行。这个人源化过程也通过每种抗体的模拟的3D结构来指导，并将人类构架残基回复突变成鼠类残基，以便维持整个抗体和CDR环的结构以及AREG结合亲和力。
4.用于提高亲和力的hu9C12v1抗体子文库的构建和选择
为了提高抗体的亲和力，通过NNK兼并密码子构建了具有hu9C12v1的HCDR3和LCDR1的随机突变的两个噬菌体展示子文库。抗体子文库的选择和筛选如上为针对AREG的抗体文库的筛选和E1L2抗体的亲和力提升所述相似地进行。在筛选后只保留具有比hu9C12v1更高的结合亲和力的命中物。
5.单克隆抗体的亲和力的SPR测量
为了评估不同小鼠杂交瘤单克隆抗体或它们的人源化和工程化改造的变体的亲和力，使用Biacore T200仪器进行了SPR测量。将单克隆抗体捕获在抗人类Fc CM5生物传感器芯片表面上，将连续稀释的hAREG-EGFd-mFc、mAREG-EGFd-mFc或hAREG-98aa(购自PeproTech，目录号100-55B)进样到结合有抗体的表面上，然后是解离阶段。使用1:1Langmuir结合模型(BIA评估软件，GE Life Sciences)计算结合速率(Ka)和解离速率(Kd)。平衡解离常数(KD)计算为kd/ka的比率。
6.结果
抗hAREG EGF结构域单克隆抗体的产生
在常规杂交瘤融合技术的基础上产生了抗hAREG单克隆抗体。选择在ELISA和SPR测定中具有高结合活性的单克隆抗体用于进一步表征。通过筛选数千个杂交瘤克隆，我们鉴定到一系列对hAREG具有高结合亲和力的单克隆抗体。在序列的独特性、结合亲和力和重组抗体产生的产率的基础上选择了前三的单克隆抗体即9C12、23H8和1H9用于进一步分析。通过重组表达将这些抗体制备成mIgG1或mIgG2a同种型的小鼠抗体或嵌合抗体(小鼠可变区移植到人类IgG1恒定区上)。
9C12的人源化或获得对hAREG或mAREG具有提高的结合亲和力和改进的物理化学 性质的人源化抗体变体
使用CDR移植和结构建模来产生人源化9C12的第一个版本hu9C12v1，其具有与嵌合抗体ch9C12(具有9C12的可变区和人类IgG1的恒定区)可比的对hAREG的亲和力。为了提高hu9C12v1对hAREG的亲和力，分别构建了在HCDR3和LCDR3区内具有随机突变的两个噬菌体展示子文库。在严格的生物淘选选择后，得到了一小部分亲和力提高的抗体。在这组抗体的序列的基础上，产生了三种单克隆抗体即hu9C12v4、hu9C12v5和hu9C12v6，以提高与hAREG或mAREG的结合亲和力并改进它们的物理化学性质。与hu9C12v1相比，hu9C12v4在VH-CDR2中具有一个氨基酸差异，在VK-CDR1中具有六个氨基酸差异，并在VK-CDR2中具有两个氨基酸差异；hu9C12v5在VH-CDR3中具有五个氨基酸差异，在VK-CDR1中具有五个氨基酸差异，并在VK-CDR2中具有一个氨基酸差异；hu9C12v6在VH-CDR3中具有两个氨基酸差异，在VK-CDR1中具有五个氨基酸差异，并在VK-CDR2中具有一个氨基酸差异。三种单克隆抗体的CDR与鼠类抗体的比较如表3所示。三种单克隆抗体和鼠类抗体的VH和VL的核苷酸序列和氨基酸序列在表4中列出。三种单克隆抗体与hAREG或mAREG的SPR确定的结合亲和力列于表5-6中。
表3
Figure BDA0003867130330000251
Ab之间的差异以下划线标示。
使用Kabat系统来定义CDR。
表4
抗体名称 VH(核苷酸序列) VH(氨基酸序列) VL(核苷酸序列) VL(氨基酸序列)
m9C12 SEQ ID NO:96 SEQ ID NO:60 SEQ ID NO:97 SEQ ID NO:73
hu9C12v1 SEQ ID NO:98 SEQ ID NO:61 SEQ ID NO:99 SEQ ID NO:74
hu9C12v4 SEQ ID NO:100 SEQ ID NO:62 SEQ ID NO:101 SEQ ID NO:75
hu9C12v5 SEQ ID NO:102 SEQ ID NO:63 SEQ ID NO:103 SEQ ID NO:76
hu9C12v6 SEQ ID NO:104 SEQ ID NO:64 SEQ ID NO:105 SEQ ID NO:77
表5
Figure BDA0003867130330000261
表6
Figure BDA0003867130330000262
23H8的人源化
我们使用CDR移植和结构建模来产生人源化23H8 mAb。将人类VH种系基因IGHV3-21用于VH-CDR移植。将人类VK种系基因IGKV7-3、IGKV1-39和IGKV4-1用于VK-CDR移植，并产生了三个版本的人源化23H8 VK链。通过将人源化VH与三种人源化VK组合，我们分别产生了单克隆抗体hu23H8v1、hu23H8v2和hu23H8v3。这三种人源化单克隆抗体具有与嵌合23H8(鼠类可变区和人类IgG1恒定区)相近的对hAREG的亲和力，表明23H8的VK-CDR向三种不同人类VK种系骨架的移植都是成功的。在所述人源化单克隆抗体中引入了几个额外的突变以除去潜在的不理想的翻译后修饰或免疫原性，并产生了另外三种变体hu23H8v4、-v5和-v6。这些单克隆抗体的CDR与鼠类抗体的比较如表7所示。这些单克隆抗体的VH和VL CDR的核苷酸序列和氨基酸序列如表8所示。这些单克隆抗体与hAREG的SPR确定的结合亲和力列于表9-10中。
表7
Figure BDA0003867130330000271
Ab之间的差异以下划线标示。
使用Kabat系统来定义CDR。
表8
抗体名称 VH(核苷酸序列) VH(氨基酸序列) VL(核苷酸序列) VL(氨基酸序列)
23H8 SEQ ID NO:106 SEQ ID NO:65 SEQ ID NO:107 SEQ ID NO:78
hu23H8v1 SEQ ID NO:108 SEQ ID NO:66 SEQ ID NO:109 SEQ ID NO:79
hu23H8v2 SEQ ID NO:108 SEQ ID NO:66 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:80
hu23H8v3 SEQ ID NO:108 SEQ ID NO:66 SEQ ID NO:111 SEQ ID NO:81
hu23H8v4 SEQ ID NO:112 SEQ ID NO:67 SEQ ID NO:113 SEQ ID NO:82
hu23H8v5 SEQ ID NO:112 SEQ ID NO:67 SEQ ID NO:103 SEQ ID NO:76
hu23H8v6 SEQ ID NO:112 SEQ ID NO:67 SEQ ID NO:114 SEQ ID NO:83
表9
Figure BDA0003867130330000272
Figure BDA0003867130330000281
表10
Figure BDA0003867130330000282
1H9的人源化
类似于23H8的人源化，将人类VH种系基因IGHV3-21用于VH-CDR移植；将人类VK种系基因IGKV7-3、IGKV1-39和IGKV4-1用于VK-CDR移植。这些单克隆抗体的CDR与鼠类抗体的比较如表11所示。这些单克隆抗体的VH和VL CDR的核苷酸序列和氨基酸序列如表12所示。这些单克隆抗体与hAREG的SPR确定的结合亲和力列于表13中。
表11
Figure BDA0003867130330000283
Ab之间的差异以下划线标示。
使用Kabat系统来定义CDR。
表12
Figure BDA0003867130330000284
Figure BDA0003867130330000291
表13
Figure BDA0003867130330000292
实施例3.抗AREG单克隆抗体的活性分析
1.用于抗hAREG抗体的体外活性分析的AREG蛋白的制备
将在C-末端融合有His6和Avi标签的编码人类或小鼠EGFR细胞外结构域(ECD)的cDNA，与编码用于生物素化的BirA-hFc的质粒共转染到293F细胞中。在转染后72小时，收获细胞培养上清液，用于通过蛋白A亲和层析纯化hEGFR ECD His6-Avi-生物素融合蛋白或mEGFR ECD His6-Avi-生物素融合蛋白(hEFGR-ECD，mEGFR-ECD)。
将在C-末端处带有四个额外残基(DLLA)的人类或小鼠AREG EGF结构域作为mFc融合蛋白在293F细胞中表达。在转染后72小时，收获细胞培养上清液，用于通过蛋白A亲和层析纯化hAREG-EGFd-DLLA-mFc(hAREG-DLLA)或mAREG-EGFd-DLLA-mFc(mAREG-DLLA)融合蛋白。
2.通过竞争ELISA分析hAREG与EGFR的结合的抑制
简单来说，将链霉亲和素(Sigma，5μg/mL)包被在U形底96孔板中，然后将100nM生物素化的hEGFR-ECD或mEGFR-ECD以每孔100μL的量捕获在板上。将具有连续稀释的浓度的不同抗体与5nM hAREG-DLLA或50nM mAREG-DLLA蛋白混合并添加到ELISA板。通过HRP偶联的小鼠抗小鼠IgG Fc抗体(Thermo Fisher)检测hAREG-DLLA与hEGFR-ECD的结合或mAREG-DLLA与mEGFR-ECD的结合。
3.EGFR受体磷酸化的抑制
将A431(人类表皮样癌细胞系)细胞血清饥饿1小时，随后用单独的hAREG-DLLA(2.5nM)处理或用hAREG和抗AREG抗体的混合物处理1小时。在每种处理中在6孔板中使用大约1-2×105细胞/孔。将处理过的细胞用PBS清洗两次，然后使用RIPA缓冲液在冰上裂解。然后对细胞裂解物进行SDS-PAGE，然后进行免疫(Western)印迹。分别使用抗磷酸酪氨酸单克隆抗体(Abcam,EP774Y)和兔多克隆抗体(Cell Signaling technology,#2232)检测磷酸化形式的EGFR(Tyr1068)和总EGFR。使用抗α-微管蛋白单克隆抗体(克隆B-5-1-2，Sigma-Aldrich)检测细胞裂解物中的α-微管蛋白表达，并充当Western印迹分析的上样对照。
4.表位鉴定
为了鉴定我们的抗AREG单克隆抗体的表位，选择在hAREG-EGFd与mAREG-EGFd之间不同并具有不同物理性质的五个氨基酸用于突变。通过将hAREG-EGFd的五个不同位点处的氨基酸各自改变成mAREG-EGFd的相应氨基酸，产生了五个hAREG-EGFd变体。此外，通过将mAREG-EGFd的两个不同位点处的氨基酸各自改变成hAREG-EGFd的相应氨基酸，产生了两个mAREG-EGFd变体。然后使用SPR(Biacore T200)检查这些变体与抗AREG单克隆抗体的结合。
5.结果
抗AREG单克隆抗体阻断AREG与EGFR的结合
之前的报道显示，向人类AREG的EGF结构域的C-末端添加四个氨基酸(DLLA)极大提高了重组表达的EGF结构域的生物活性(Thompson等，1996)。为了便于竞争ELISA测定，我们使用了hAREG-EGFd-DLLA-mFc(hAREG-DLLA)或mAREG-EGFd-DLLA-mFc(mAREG-DLLA)作为在所述测定法中用于与EGFR结合的配体。结果显示，E1H3L4、P7和hu9C12v4都与mAREG-DLLA竞争与mEGFR-ECD的结合。在这三种单克隆抗体中，hu9C12v4显示出最好的活性。也在竞争ELISA中测试了采取hIgG1形式的hu9C12v4、hu9C12v6、hu23H8v5、hu23H8v6和hu1H9v3，它们在与hAREG-DLLA竞争与hEGFR-ECD的结合方面均显示出强大活性，具有亚纳摩尔的IC50。
此外，我们还测试了采取人类IgG1形式的两种以前报道的抗体huPAR34(美国专利申请号2004/0210040)和AR558(US20170002068A1)。这两种抗体在与hAREG-DLLA竞争与hEGFR-ECD的结合方面也显示出强大活性。
抗AREG单克隆抗体抑制EGFR磷酸化
在表达hEGFR的表皮样癌细胞A431中测试了抗AREG单克隆抗体对EGFR磷酸化的抑制活性。低浓度的所述抗体足以阻断AREG诱导的A431细胞的EGFR的磷酸化。1.2nM的23H8或1H9完全阻断hAREG诱导的EGFR的磷酸化。与23H8和1H9相比，9C12显示出相对较弱的阻断活性(图2)。
表位鉴定
为了鉴定我们的抗AREG单克隆抗体的表位，通过将hAREG-EGFd的五个不同位点处的氨基酸各自改变成mAREG-EGFd的相应氨基酸，产生了五个hAREG-EGFd变体(图3)。然后使用SPR(Biacore T200)检查所述变体与抗AREG单克隆抗体的结合。鉴定到两个氨基酸(Glu149和His164)是所述单克隆抗体与hAREG结合的关键表位残基。正如通过Biacore分析揭示的，对于hu9C12v4、hu9C12v6、hu23H8和hu1H9单克隆抗体来说，hAREG-H164N变体完全丧失与单克隆抗体的结合能力，hAREG-E149K变体具有略微降低的结合活性，并且其他三种hAREG变体对与单克隆抗体的结合没有影响，证实了His164对于我们的抗AREG单克隆抗体的结合来说是最关键的表位残基。对于huPAR34来说，E149K和H164N变体具有降低的结合活性，其他三个残基的改变没有影响或影响很小。对于AR558来说，E149K变体完全丧失结合活性，其他四个残基的改变对hAREG与AR558的结合没有影响或影响很小，并表明Glu149对于AR558来说是最关键的表位残基。
此外，使用两个mAREG变体，我们发现mAREG-K149E/N164H(使用hAREG编号)变体获得了与抗hAREG抗体的完全结合亲和力，所述抗hAREG抗体与mAREG没有或具有非常弱的交叉反应性；mAREG-N164H变体获得了与所述抗体的部分结合能力。这些结果表明mAREG中的氨基酸Lys149和Asn164是导致单克隆抗体(hu9C12v6、hu23H8、hu1H9、huPAR34和AR558)与mAREG缺少交叉反应性的残基。
实施例4.动物研究
1.建立动物模型
通过在肺泡II型细胞(AT2细胞)中特异性敲除Cdc42基因产生Cdc42 AT2敲除小鼠
为了特异性缺失AT2细胞中的Cdc42基因，将带有Spc-CreER敲入等位基因的小鼠与Cdc42 floxed(Cdc42flox/flox)小鼠杂交(图4A)。在Cdc42flox/flox小鼠中，含有Cdc42基因的翻译起始外显子的Cdc42基因的外显子2侧翼带有两个loxp位点。在Spc-CreER；Cdc42flox /flox小鼠中，在他莫昔芬处理后通过Cre/loxp介导的重组特异性缺失AT2细胞中的Cdc42基因的外显子2(图4B)。Spc-CreER；Cdc42flox/flox小鼠被命名为Cdc42 AT2敲除小鼠。在缺失Cdc42基因的外显子2之前和之后Cdc42 DNA序列的片段如下所示。所有这些小鼠均维持在动物房中无特定病原体的条件下。
在缺失Cdc42基因的外显子2之前的Cdc42序列如SEQ ID NO:133所示。在缺失Cdc42基因的外显子2之后的Cdc42序列如SEQ ID NO:134所示。
在PNX处理后Cdc42 AT2敲除小鼠的肺发生进行性纤维化改变
对Cdc42 AT2敲除小鼠和对照小鼠进行了左肺叶切除术(肺切除术，PNX)。在PNX处理后不同时间点分析Cdc42 AT2敲除小鼠和对照小鼠的肺(图5A)。我们发现，在PNX后第21天，一些Cdc42 AT2敲除小鼠显示出显著的体重减轻和呼吸率提高。事实上，在PNX后第60天，几乎50％的PNX处理的Cdc42 AT2敲除小鼠达到终点安乐死的预定健康状况标准(图5B)，并且到PNX后第180天，超过70％的PNX处理的Cdc42 AT2敲除小鼠(n＝33)达到它们的终点(图5B)。H&E染色显示出假手术处理和PNX处理的对照小鼠的肺未显示出纤维化改变(图5C)。H&E染色显示，在终点时PNX处理的Cdc42 AT2敲除小鼠的整个肺叶均具有致密的纤维化改变(图5D)。
在PNX后第21天，Cdc42 AT2敲除小鼠的肺开始显示出纤维化改变。Cdc42 AT2敲除肺已在肺的边缘处显示出致密的纤维化改变(图5D)。H&E染色显示，Cdc42 AT2敲除肺的纤维化区域的组织学变化重演了人类IPF肺的组织学变化。
将在PNX后第21天从对照和Cdc42 AT2敲除小鼠收集的肺用抗胶原蛋白I抗体染色(图5E)。与对照肺相比，在Cdc42 AT2敲除小鼠的肺的致密纤维化区域中检测到胶原蛋白I的更强的免疫荧光信号。从PNX后第21天到PNX后第60天，Cdc42 AT2敲除小鼠的肺中致密胶原蛋白I的面积逐渐增加(图5F)。qPCR分析显示从PNX后第21天到PNX后第60天，Cdc42 AT2敲除小鼠的肺中胶原蛋白I mRNA的表达水平逐渐提高(图5G)。呼吸功能分析显示，从PNX后第21天到PNX后第60天，在Cdc42 AT2敲除小鼠中肺的顺应性逐渐降低(图5H)。*P<0.05，***P<0.001；****P<0.0001，学生(Student’s)t检验。
这是可以高度模拟IPF的发病机制和进展的第一个小鼠模型。因此，在后文中被称为IPF样肺纤维化小鼠模型。使用这种动物模型，我们鉴定到AREG是肺纤维化的潜在治疗靶点。
博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型
博来霉素诱导的肺纤维化是人类肺纤维化的一种常用实验研究模型。将每个组中的野生型FVB/N小鼠(Charles River)用单剂BLM(1U/1KG体重，H20055883，Hai ZhengPfizer Inc)气管内滴注。在博来霉素给药后的不同时间点，对所有组中的博来霉素(BLM)处理的小鼠进行封闭监测。
这是一种可以重演急性肺损伤诱导的肺纤维化例如肺炎后肺纤维化或ILD(间质性肺病)的动物模型。博来霉素通过氧化介导的DNA断裂诱导肺损伤，导致肺泡上皮细胞死亡(损伤后1-3天)和急性炎症反应(损伤后3-9天)。并且在损伤后第10-21天在肺中发生肺纤维化。
我们采用了我们的IPF样小鼠模型和博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型来探索我们的AREG抗体的治疗效果。此外，我们还比较了两种药物尼达尼布和吡非尼酮的治疗效果，以便全面评估AREG抗体与现有FDA批准药物的潜在治疗效果。2.在小鼠模型中治疗肺纤维化的动物研究设计和分析
1)IPF样肺纤维化小鼠模型：选择体重相近(～30g)的三月龄雄性Cdc42 AT2敲除小鼠用于所述实验。每隔一日用他莫昔芬(剂量：75mg/kg)对小鼠进行腹膜内注射，共4次。在最后一次注射后两周，用PNX处理小鼠。PNX后第14天是纤维化开始的时间点。在PNX后14天，对PNX处理的小鼠称重并进行治疗。
2)博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型：选择体重相近(～30g)的三月龄雄性FVB/N小鼠用于博来霉素处理。具体来说，将气管内插管插入到麻醉小鼠的气管中，然后递送博来霉素溶液(剂量：1U/kg)。然后在博来霉素递送后1天，对小鼠称重并进行治疗。
3)治疗组：将小鼠分成不同的组：对照组、抗AREG抗体组、尼达尼布组和吡非尼酮组。每个组中的所有小鼠年龄匹配并且体重匹配。对于对照组来说，将小鼠用同种型匹配的对抗抗体治疗。对照抗体或抗AREG抗体以10-15mg/kg的量每5天腹腔内给药。此外，将对照组中的小鼠每天一次通过口饲管用0.5％甲基纤维素钠溶液治疗。尼达尼布组中的小鼠每天一次通过口饲管用尼达尼布治疗(60mg/kg)。吡非尼酮治疗组中的小鼠每天一次通过口饲管用吡非尼酮治疗(100mg/kg)。尼达尼布组和吡非尼酮组中的小鼠也每5天用PBS溶液腹腔内治疗。
4)动物研究
a)每隔一天监测所有组中的小鼠的体重。每天两次密切监测所有组中的小鼠的总体健康状况。
b)人道终点通过总体重的减轻(初始体重的30％)来定义。
动物研究在批准的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Careand Use Committee)方案下进行。在研究终点时收集肺组织。通过羟脯氨酸试剂盒(Sigma，目录号MAK008)测量每个小鼠肺中的羟脯氨酸含量。使用组织学分析来评估肺纤维化量表。将肺组织用4％PFA固定，切片并进行H&E染色。通过分析肺的各个不同区域来指派最终的组织学纤维化评分。
3.结果
1)抗AREG抗体(P7)：我们的结果显示，抗AREG(P7)抗体可以显著减缓Cdc42 AT2敲除小鼠的体重减轻，并且可以延长Cdc42 AT2敲除小鼠的存活时间(图6A-6C)。此外，抗AREG抗体(P7)可以显著降低Cdc42 AT2敲除小鼠肺中的羟脯氨酸含量(图6D)。图6A示出了治疗和取样程序的概括方案，图6B示出了抗AREG抗体(P7)可以延长Cdc42 AT2敲除小鼠的存活时间，图6C示出了抗AREG抗体(P7)可以显著减缓Cdc42 AT2敲除小鼠的体重减轻，图6D示出了与用空白抗体治疗的小鼠相比，抗AREG抗体(P7)可以显著降低Cdc42 AT2敲除小鼠肺中的羟脯氨酸含量(*，P<0.05，Student’s t检验)。
2)抗AREG抗体(E1H3L4)：我们的结果显示，在博来霉素处理的小鼠中，抗AREG抗体(E1H3L4)可以加速纤维化的消解并促进体重恢复(图7B)。图7A示出了在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中，使用空白抗体治疗的小鼠和使用抗AREG抗体(E1H3L4)治疗的小鼠的存活率没有显著差异。然而，图7B示出了与空白抗体治疗组中的小鼠相比，抗AREG抗体(E1H3L4)治疗组中的小鼠恢复更好。
此外，抗AREG(E1H3L4)抗体治疗可以显著延长Cdc42 AT2敲除小鼠的存活时间(图8A-8B)。H&E染色分析显示，在Cdc42 AT2敲除小鼠的肺中，抗AREG抗体(E1H3L4)治疗组中小鼠肺纤维化的面积显著减小(图8C)。图8A示出了治疗和取样程序的概括方案。图8B示出了抗AREG抗体(E1H3L4)可以显著延长Cdc42 AT2敲除小鼠的存活时间，图8C通过H&E染色分析显示，与对照组中的小鼠相比，抗AREG抗体(E1H3L4)治疗组中的小鼠的肺纤维化显著减少。
3)抗AREG抗体(hu9C12v4)：我们的结果显示，抗AREG抗体(hu9C12v4)可以显著延长Cdc42 AT2敲除小鼠的存活时间(图9A-9B)，而尼达尼布和吡非尼酮未显著延长Cdc42AT2敲除小鼠的存活时间。H&E染色分析显示，在Cdc42 AT2敲除小鼠的肺中，抗AREG抗体(hu9C12v4)治疗组中的小鼠肺纤维化的面积显著减小(图9C)。具体来说，图9A示出了治疗和取样程序的概括方案，图9B示出了抗AREG抗体(hu9C12v4)治疗可以显著延长Cdc42 AT2敲除小鼠的存活时间，并且图9C通过H&E染色分析显示，与对照组、尼达尼布组和吡非尼酮组中的小鼠相比，抗AREG抗体(hu9C12v4)治疗组中的小鼠的肺纤维化显著减少。
综上，这些结果证实了我们的抗AREG单克隆抗体对治疗肺纤维化有效。
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1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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<220>
<223> 人工序列
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<220>
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Gly
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<223> 人工序列
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Gly
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<220>
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Gly
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Gly
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Gly
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<223> 人工序列
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<220>
<223> 人工序列
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<223> 人工序列
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<223> 人工序列
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<220>
<223> 人工序列
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Ser Thr Trp Asp Lys Asn Asn Lys Ser Val Val
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<223> 人工序列
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Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn
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<220>
<223> 人工序列
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<223> 人工序列
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Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Asp Gly Gln Asp Gly Thr Tyr Leu His
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<223> 人工序列
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<223> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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<223> 人工序列
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<220>
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Lys Ser Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly His Ser Phe Leu Asn
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 44
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
<400> 46
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 47
Lys Ser Ser Gln Ser Val Asp Tyr Glu Gly His Ser Phe Leu Asn
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 48
Lys Ala Ser Gln Ser Ile Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Phe Leu Asn
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 49
His Gln Cys Asn Glu Asp Pro Tyr Met
1 5
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 50
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Phe Ile Asn
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 51
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 52
His Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 53
His Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Val
1 5
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 54
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Phe Leu Asn
1 5 10 15
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 55
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Val
1 5
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 56
Lys Ser Ser Gln Ser Ile Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Phe Leu Asn
1 5 10 15
<210> 57
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 57
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro Thr Ser Arg Tyr Ser Tyr Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 58
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 58
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro Thr Ser Arg Tyr Ser Tyr Ser Tyr Asn Asn Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 59
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 59
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Asp Thr Lys Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 60
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 60
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Thr Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Pro Ile Tyr Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 61
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Thr Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Pro Ile Tyr Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 62
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Thr Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gln Gly Pro Ile Tyr Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 63
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 63
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Thr Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Pro Ile Leu Arg Lys Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 64
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Thr Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gln Gly Pro Ile Tyr Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 65
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 65
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Thr Gly Gly Ser His Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
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100 105 110
Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 66
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Thr Gly Gly Ser His Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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115 120 125
<210> 67
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 67
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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115 120 125
<210> 68
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 68
Glu Val Lys Leu Met Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Thr Gly Ala Arg His Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Glu Gly Leu Arg Arg Gly Lys Tyr His Cys Ile Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 69
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 69
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Thr Gly Ala Arg His Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Glu Gly Leu Arg Arg Gly Lys Tyr His Ser Ile Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 70
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 70
Gln Ala Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Lys Gly Leu Arg Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Leu Thr Cys Thr Gly Asn Ser Asn Asn Val Gly Asp Gln
20 25 30
Gly Ala Val Trp Leu Gln Gln His Gln Gly His Pro Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ser Tyr Arg Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Ser Glu Arg Phe Ser
50 55 60
Ala Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Thr Trp Asp Ser Gly Leu
85 90 95
Asn Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 71
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 71
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Asn Ser Asn Asn Val Gly Asp Gln
20 25 30
Gly Ala Val Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Thr Trp Asp Lys Asn Asn
85 90 95
Lys Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 72
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 72
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Glu Val Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 73
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 73
Asp Ile Val Met Thr Gln Pro Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 74
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 74
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 75
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 75
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Asp Gly
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Glu Arg Phe Asp Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 76
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 76
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Asp Gly
20 25 30
Gln Asp Gly Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Asp Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 77
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Asn Gln
20 25 30
Glu Gly Glu Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Asp Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 78
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly His Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Leu Pro Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr
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100 105 110
<210> 79
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 79
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly His Ser Phe Ile Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Lys Asp Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr
85 90 95
Glu Asp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 80
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 80
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly His Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr
85 90 95
Glu Asp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 81
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 81
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly His Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr
85 90 95
Glu Asp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 82
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 82
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Glu
20 25 30
Gly His Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr
85 90 95
Glu Asn Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 83
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 83
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Asp Tyr Glu
20 25 30
Gly His Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr
85 90 95
Glu Asn Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 84
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 84
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Ile Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Cys Asn
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Glu Asp Pro Tyr Met Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg
100 105 110
<210> 85
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 85
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Ile Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Lys Asp Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys His Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Met Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 86
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 86
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Ile Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
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Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Lys Asp Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys His Gln Ser Asn
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Glu Asp Pro Tyr Leu Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 87
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 87
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
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Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Asp
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Gly Asp Ser Phe Ile Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
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Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys His Gln Ser Asn
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 88
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Tyr Asp
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Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
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100 105 110
<210> 89
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 89
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Ile Asp Tyr Asp
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Gly Asp Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
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Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp
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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
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Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 90
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 90
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaccaacc 300
tcaagataca gctatggtta cgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 91
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 91
caggcagggc tgactcagcc accctcggtg tccaagggct tgagacagac cgccacactc 60
acctgcactg ggaacagcaa caatgttggc gaccaaggag cagtttggct gcagcagcac 120
cagggccacc ctcccagact cctgtcctac aggaataaca accggccctc agggatctca 180
gagagattct ctgcatccag gtcaggaaac acagcctccc tgaccattac tggactccag 240
cctgaggacg aggctgacta ctactgctca acgtgggaca gcggcctcaa ttctgtggta 300
ttcggcggag ggacccagct gaccgtccta 330
<210> 92
<211> 361
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 92
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaccaacc 300
tcaagataca gctacagcta caacaactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
g 361
<210> 93
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 93
caggctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgtactg ggaacagcaa caatgttggc gaccaaggag cagtttggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat aggaataaca accggccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240
tctgaggatg aggctgatta ttactgttca acgtgggaca agaacaacaa gtctgtggta 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 94
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 94
gaagtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt catctttagc agccatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagtggac 300
accaaattcg acccctgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca 348
<210> 95
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 95
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaatactg taaactggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaataatc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240
tccgaggatg aggctgatta ttactgtgaa gtgtgggatg acagcctgaa tggtccggtg 300
ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta 330
<210> 96
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 96
gaggtgaagc tggtggaatc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatccca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtactg gtggtactta cacctactat 180
ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagacaaggc 300
ccgatctact atggtaacta ctactatgct atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 97
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 97
gacattgtga tgacacaacc tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtgatg gaaacaccta tttacattgg 120
tacctgcaga ggccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 98
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 98
gaggtgcagc tggtggaatc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatccca tgtcttgggt tcgccaggct 120
ccggggaagg ggctggagtg ggtctcaacc attagtactg gtggtactta cacctactat 180
ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctccctgtac 240
ctgcaaatga acagtctgag ggccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagacaaggc 300
ccgatctact atggtaacta ctactatgct atggactact ggggtcaagg aaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 99
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 99
gatattgtga tgacacaatc tccactctcc ctgcctgtca cccttggaca gccggcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtgatg gaaacaccta tttacattgg 120
taccagcaga ggccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgttggagtt tattactgct ctcaaagtac acatgttccg 300
tacacgttcg gaggggggac caaggtggag atcaaa 336
<210> 100
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 100
gaggtgcagc tggtggaatc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatccca tgtcttgggt tcgccaggct 120
ccggagaagg ggctggagtg ggtctcaacc attagtactg gtggtcggta cacctactat 180
ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctccctgtac 240
ctgcaaatga acagtctgag ggccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagacaaggc 300
ccgatctact atggtaacta ctactatgct atggactact ggggtcaagg aaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 101
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 101
gatattgtga tgacacaatc tccactctcc ctgcctgtca cccttggaga cccggcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagccttgta gatggggagg atgggaccta tttaaactgg 120
ttccagcaga ggccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc cgagcgattt 180
gacggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgttggagtt tattactgct ctcaaagtac acatgttccg 300
tacacgttcg gaggggggac caaggtggag atcaaa 336
<210> 102
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 102
gaggtgcagc tggtggaatc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatccca tgtcttgggt tcgccaggct 120
ccggagaagg ggctggagtg ggtctcaacc attagtactg gtggtactta cacctactat 180
cccgacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctccctgtac 240
ctgcaaatga acagtctgag ggccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagacaaggc 300
ccgatccttc ggaagaatta ctactatggc atggacgtgt ggggtcaagg aaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 103
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 103
gatgttgtga tgactcaatc tccactctcc ctgcctgtca cccttggaga cccggcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagccttgta gacggccagg acggcaccta tttacattgg 120
taccagcaga ggccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
gacggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgttggagtt tattactgct ctcaaagtac acatgttccg 300
tacacgttcg gacaggggac caagctggag atcaaa 336
<210> 104
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 104
gaggtgcagc tggtggaatc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatccca tgtcttgggt tcgccaggct 120
ccggagaagg ggctggagtg ggtctcaacc attagtactg gtggtactta cacctactat 180
cccgacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctccctgtac 240
ctgcaaatga acagtctgag ggccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagacaaggc 300
ccgatctact atggtaacta ctactatggc atggacgtgt ggggtcaagg aaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 105
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 105
gatgttgtga tgactcaatc tccactctcc ctgcctgtca cccttggaga cccggcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagccttgta aatcaggagg gtgagaccta tttacattgg 120
taccagcaga ggccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
gacggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgttggagtt tattactgct ctcaaagtac acatgttccg 300
tacacgttcg gacaggggac caagctggag atcaaa 336
<210> 106
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 106
gaggtgcagc ttcaggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggctt cactttcaat agctatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtactg gtggttctca cacctactat 180
ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctatac 240
ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagacacgga 300
tatctcctct atgatggtta ctacgaatgg tacttcgatg tctggggcgc agggaccacg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 107
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 107
gacattgttc tcacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctttagggca gagggccacc 60
atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtc atagttttct gaactggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct 180
gggctcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtactga ggatcctccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 108
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 108
gaggtgcagc tggtggaatc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcaac agctatgcca tgtcttgggt tcgccaggct 120
ccggggaagg ggctggagtg ggtctcaacc attagtactg gtggtagcca cacctactat 180
ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctccctgtac 240
ctgcaaatga acagtctgag ggccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagacacgga 300
tatctcctct atgatggtta ctacgaatgg tacttcgatt actggggtca aggaaccctg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 109
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 109
gacattgtgc tgacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctcccgggca gagggccacc 60
atcacctgcc gggccagcga gagtgttgat tatgatggtc atagttttat caactggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa taaggacacc 180
ggggtgccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatcaac 240
cctgtggagg ccgaggatac cgcaaactat tactgtcagc aaagtactga ggatcctccg 300
tacacgttcg gacaggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 110
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 110
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60
atcacctgcc gcgccagcca gagcgtggac tacgacggcc acagcttcct gaactggtac 120
cagcagaagc ccggcaaggc ccccaagctg ctgatctacg ccgccagcaa cctgcagagc 180
ggcgtgccca gccgcttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcagc 240
agcctgcagc ccgaggactt cgccacctac tactgccagc agagcaccga ggaccccccc 300
tacaccttcg gccagggcac caagctggag atcaag 336
<210> 111
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 111
gacatcgtga tgacccagag ccccgacagc ctggccgtga gcctgggcga gcgcgccacc 60
atcaactgca agagcagcca gagcgtggac tacgacggcc acagcttcct gaactggtac 120
cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgatctacg ccgccagcaa ccgcgagagc 180
ggcgtgcccg accgcttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcagc 240
agcctgcagg ccgaggacgt ggccgtgtac tactgccagc agagcaccga ggaccccccc 300
tacaccttcg gccagggcac caagctggag atcaag 336
<210> 112
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 112
gaggtgcagc tggtggaatc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagc agctatgcca tgtcttgggt tcgccaggct 120
ccggggaagg ggctggagtg ggtctcaacc attagtactg gtggtagcca cacctactat 180
ccagagagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctccctgtac 240
ctgcaaatga acagtctgag ggccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagacacgga 300
tatctcctct atgagggtta ctacgaatgg tacttcgatt actggggtca aggaaccctg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 113
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 113
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60
atcacctgcc gcgccagcca gagcgtggac tacgagggcc acagcttcct gaactggtac 120
cagcagaagc ccggcaaggc ccccaagctg ctgatctacg ccgccagcaa cctgcagagc 180
ggcgtgccca gccgcttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcagc 240
agcctgcagc ccgaggactt cgccacctac tactgccagc agagcaccga gaaccccccc 300
tacaccttcg gccagggcac caagctggag atcaag 336
<210> 114
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 114
gacatcgtga tgacccagag ccccgacagc ctggccgtga gcctgggcga gcgcgccacc 60
atcaactgca agagcagcca gagcgtggac tacgagggcc acagcttcct gaactggtac 120
cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgatctacg ccgccagcaa ccgcgagagc 180
ggcgtgcccg accgcttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcagc 240
agcctgcagg ccgaggacgt ggccgtgtac tactgccagc agagcaccga gaaccccccc 300
tacaccttcg gccagggcac caagctggag atcaag 336
<210> 115
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 115
gaggtgaagc tgatggaatc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgtag cctctggatt cactttcagt gggtatccca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtactg gtgctaggca cacctactat 180
ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagacatgaa 300
gggttacgac gagggaaata tcactgtatt atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 116
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 116
gatattttgc tgactcagtc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca aggccagtca aagtattgat tatgatggtg atagtttttt gaactggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct 180
gggatcccag ccaggtttag tggcagtgga tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcatc aatgtaatga ggatccgtac 300
atgttcggag gggggaccaa gctggaaata aga 333
<210> 117
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 117
gaggtgcagc tggtggaatc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagc ggctatccca tgtcttgggt tcgccaggct 120
ccggggaagg ggctggagtg ggtctcaacc attagtactg gtgccaggca cacctactat 180
ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctccctgtac 240
ctgcaaatga acagtctgag ggccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagacacgaa 300
gggttacgac gagggaaata tcacagtatt atggattact ggggtcaagg aaccctggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 118
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 118
gacattgtgc tgacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctcccgggca gagggccacc 60
atcacctgcc gggccagcga gagtgttgat tatgatggtg acagttttat caactggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa taaggacacc 180
ggggtgccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatcaac 240
cctgtggagg ccgaggatac cgcaaactat tactgtcatc aaagtaatga ggatccgtac 300
atgttcggac aggggaccaa gctggaaata aaa 333
<210> 119
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 119
gacattgtgc tgacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctcccgggca gagggccacc 60
atcacctgcc gggccagcga gagtgttgat tatgatggtg acagttttat caactggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa taaggacacc 180
ggggtgccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatcaac 240
cctgtggagg ccgaggatac cgcaaactat tactgtcatc aaagtaatga ggatccgtac 300
ctgttcggac aggggaccaa gctggaaata aaa 333
<210> 120
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 120
gacattgtgc tgacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctcccgggca gagggccacc 60
atcacctgcc gggccagcga gagtgttgat tatgatggtg acagttttat caactggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa taaggacacc 180
ggggtgccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatcaac 240
cctgtggagg ccgaggatac cgcaaactat tactgtcatc aaagtaatga ggatccgtat 300
gtgttcggac aggggaccaa gctggaaata aaa 333
<210> 121
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 121
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60
atcacctgcc gcgccagcca gagcatcgac tacgacggcg acagcttcct gaactggtac 120
cagcagaagc ccggcaaggc ccccaagctg ctgatctacg ccgccagcaa cctgcagagc 180
ggcgtgccca gccgcttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcagc 240
agcctgcagc ccgaggactt cgccacctac tactgccagc agagcaacga ggacccctac 300
gtgttcggcc agggcaccaa gctggagatc aag 333
<210> 122
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 122
gacatcgtga tgacccagag ccccgacagc ctggccgtga gcctgggcga gcgcgccacc 60
atcaactgca agagcagcca gagcatcgac tacgacggcg acagcttcct gaactggtac 120
cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgatctacg ccgccagcaa ccgcgagagc 180
ggcgtgcccg accgcttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcagc 240
agcctgcagg ccgaggacgt ggccgtgtac tactgccagc agagcaacga ggacccctac 300
gtgttcggcc agggcaccaa gctggagatc aag 333
<210> 123
<211> 43
<212> PRT
<213> 智人Homo sapiens
<400> 123
Lys Lys Asn Pro Cys Asn Ala Glu Phe Gln Asn Phe Cys Ile His Gly
1 5 10 15
Glu Cys Lys Tyr Ile Glu His Leu Glu Ala Val Thr Cys Lys Cys Gln
20 25 30
Gln Glu Tyr Phe Gly Glu Arg Cys Gly Glu Lys
35 40
<210> 124
<211> 43
<212> PRT
<213> 小鼠Mus musculus
<400> 124
Lys Lys Asn Pro Cys Thr Ala Lys Phe Gln Asn Phe Cys Ile His Gly
1 5 10 15
Glu Cys Arg Tyr Ile Glu Asn Leu Glu Val Val Thr Cys Asn Cys His
20 25 30
Gln Asp Tyr Phe Gly Glu Arg Cys Gly Glu Lys
35 40
<210> 125
<211> 43
<212> PRT
<213> 智人Homo sapiens
<400> 125
Lys Lys Asn Pro Cys Asn Ala Lys Phe Gln Asn Phe Cys Ile His Gly
1 5 10 15
Glu Cys Lys Tyr Ile Glu His Leu Glu Ala Val Thr Cys Lys Cys Gln
20 25 30
Gln Glu Tyr Phe Gly Glu Arg Cys Gly Glu Lys
35 40
<210> 126
<211> 43
<212> PRT
<213> 智人Homo sapiens
<400> 126
Lys Lys Asn Pro Cys Asn Ala Glu Phe Gln Asn Phe Cys Ile His Gly
1 5 10 15
Glu Cys Lys Tyr Ile Glu Asn Leu Glu Ala Val Thr Cys Lys Cys Gln
20 25 30
Gln Glu Tyr Phe Gly Glu Arg Cys Gly Glu Lys
35 40
<210> 127
<211> 43
<212> PRT
<213> 小鼠Mus musculus
<400> 127
Lys Lys Asn Pro Cys Thr Ala Glu Phe Gln Asn Phe Cys Ile His Gly
1 5 10 15
Glu Cys Arg Tyr Ile Glu Asn Leu Glu Val Val Thr Cys Asn Cys His
20 25 30
Gln Asp Tyr Phe Gly Glu Arg Cys Gly Glu Lys
35 40
<210> 128
<211> 43
<212> PRT
<213> 小鼠Mus musculus
<400> 128
Lys Lys Asn Pro Cys Thr Ala Glu Phe Gln Asn Phe Cys Ile His Gly
1 5 10 15
Glu Cys Arg Tyr Ile Glu His Leu Glu Val Val Thr Cys Asn Cys His
20 25 30
Gln Asp Tyr Phe Gly Glu Arg Cys Gly Glu Lys
35 40
<210> 129
<211> 84
<212> PRT
<213> 智人Homo sapiens
<400> 129
Ser Val Arg Val Glu Gln Val Val Lys Pro Pro Gln Asn Lys Thr Glu
1 5 10 15
Ser Glu Asn Thr Ser Asp Lys Pro Lys Arg Lys Lys Lys Gly Gly Lys
20 25 30
Asn Gly Lys Asn Arg Arg Asn Arg Lys Lys Lys Asn Pro Cys Asn Ala
35 40 45
Glu Phe Gln Asn Phe Cys Ile His Gly Glu Cys Lys Tyr Ile Glu His
50 55 60
Leu Glu Ala Val Thr Cys Lys Cys Gln Gln Glu Tyr Phe Gly Glu Arg
65 70 75 80
Cys Gly Glu Lys
<210> 130
<211> 106
<212> PRT
<213> 小鼠Mus musculus
<400> 130
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Val Arg Val Glu Gln Val Ile Lys Pro
20 25 30
Lys Lys Asn Lys Thr Glu Gly Glu Lys Ser Thr Glu Lys Pro Lys Arg
35 40 45
Lys Lys Lys Gly Gly Lys Asn Gly Lys Gly Arg Arg Asn Lys Lys Lys
50 55 60
Lys Asn Pro Cys Thr Ala Lys Phe Gln Asn Phe Cys Ile His Gly Glu
65 70 75 80
Cys Arg Tyr Ile Glu Asn Leu Glu Val Val Thr Cys Asn Cys His Gln
85 90 95
Asp Tyr Phe Gly Glu Arg Cys Gly Glu Lys
100 105
<210> 131
<211> 43
<212> PRT
<213> 小鼠Mus musculus
<400> 131
Lys Lys Asn Pro Cys Thr Ala Lys Phe Gln Asn Phe Cys Ile His Gly
1 5 10 15
Glu Cys Arg Tyr Ile Glu Asn Leu Glu Val Val Thr Cys Asn Cys His
20 25 30
Gln Asp Tyr Phe Gly Glu Arg Cys Gly Glu Lys
35 40
<210> 132
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 132
Gly Ser Ser Gly Lys Cys Gln Gln Glu Tyr Phe Gly Glu Arg Cys Gly
1 5 10 15
Glu Lys
<210> 133
<211> 1128
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 133
tgttctattt taaagtacag gtaatcatgc atgagaagtc aaaaccttta aaactgtcaa 60
acagtgggct gctgtgtgtg gcatttgctg ccaaccatga caacctaagt tcaacttaag 120
agcccaacaa tggaaaaaga ccccttcaag ttgtcctctg ccatctacac atacaccaaa 180
gcaggacaca ggtatgtaca gaattcataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 240
gttcgaacga agttcctatt ctctagaaag tataggaact tcgctagact agtacgcgtg 300
tacaccttgt aattgctgct ctgagcaagt tgccattttt tctttttaga ggttttcagt 360
catagcagta atgctagttc tggtttgagt ggctgagcct gttgctaggg gaaaaaagta 420
tggatttaaa cataaatcaa taaaataatt gtctttaatt tcttcttagg acaagatcta 480
atttgaaata ttaaaagtgg atacaaaact gtttccgaaa tgcagacaat taagtgtgtt 540
gttgttggtg atggtgctgt tggtaaaaca tgtctcctga tatcctacac aacaaacaaa 600
ttcccatcgg aatatgtacc aactgtaagt ataaaggctt tttactagca aaagattgta 660
atgtagtgtc tgtccattgg aaaacacttg gcctgcctgc agtatttttg actgtcttgc 720
cctttaaaaa aaattaaatt ttactacctt tattactttg tggggtgtgt gttataactt 780
cgtataatgt atgctatacg aagttatggt accgaattca gtttctggac cttgttgttt 840
tgtcttaagt atcaaagtag aacagtgacc gatatattcc ttttattttt ttttttcttc 900
cctgagactg ggtttctctg tgtagccctt gctgttctgt aactcactct gtgagtggcc 960
tcaaactcag agatccgcct gccttgggca aggaaggtgc tataaaaaga gtctcgtgtg 1020
gtatatgaag tatagtttgt gaaagctgct tcagtgtgag cacacacgca ttatatgcaa 1080
gaccaattgc agcccgaaga atactctaaa aaatgactca ctgcccag 1128
<210> 134
<211> 561
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 134
tgttctattt taaagtacag gtaatcatgc atgagaagtc aaaaccttta aaactgtcaa 60
acagtgggct gctgtgtgtg gcatttgctg ccaaccatga caacctaagt tcaacttaag 120
agcccaacaa tggaaaaaga ccccttcaag ttgtcctctg ccatctacac atacaccaaa 180
gcaggacaca ggtatgtaca gaattcataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 240
ggtaccgaat tcagtttctg gaccttgttg ttttgtctta agtatcaaag tagaacagtg 300
accgatatat tccttttatt tttttttttc ttccctgaga ctgggtttct ctgtgtagcc 360
cttgctgttc tgtaactcac tctgtgagtg gcctcaaact cagagatccg cctgccttgg 420
gcaaggaagg tgctataaaa agagtctcgt gtggtatatg aagtatagtt tgtgaaagct 480
gcttcagtgt gagcacacac gcattatatg caagaccaat tgcagcccga agaatactct 540
aaaaaatgac tcactgccca g 561
<210> 135
<211> 252
<212> PRT
<213> 智人Homo sapiens
<400> 135
Met Arg Ala Pro Leu Leu Pro Pro Ala Pro Val Val Leu Ser Leu Leu
1 5 10 15
Ile Leu Gly Ser Gly His Tyr Ala Ala Gly Leu Asp Leu Asn Asp Thr
20 25 30
Tyr Ser Gly Lys Arg Glu Pro Phe Ser Gly Asp His Ser Ala Asp Gly
35 40 45
Phe Glu Val Thr Ser Arg Ser Glu Met Ser Ser Gly Ser Glu Ile Ser
50 55 60
Pro Val Ser Glu Met Pro Ser Ser Ser Glu Pro Ser Ser Gly Ala Asp
65 70 75 80
Tyr Asp Tyr Ser Glu Glu Tyr Asp Asn Glu Pro Gln Ile Pro Gly Tyr
85 90 95
Ile Val Asp Asp Ser Val Arg Val Glu Gln Val Val Lys Pro Pro Gln
100 105 110
Asn Lys Thr Glu Ser Glu Asn Thr Ser Asp Lys Pro Lys Arg Lys Lys
115 120 125
Lys Gly Gly Lys Asn Gly Lys Asn Arg Arg Asn Arg Lys Lys Lys Asn
130 135 140
Pro Cys Asn Ala Glu Phe Gln Asn Phe Cys Ile His Gly Glu Cys Lys
145 150 155 160
Tyr Ile Glu His Leu Glu Ala Val Thr Cys Lys Cys Gln Gln Glu Tyr
165 170 175
Phe Gly Glu Arg Cys Gly Glu Lys Ser Met Lys Thr His Ser Met Ile
180 185 190
Asp Ser Ser Leu Ser Lys Ile Ala Leu Ala Ala Ile Ala Ala Phe Met
195 200 205
Ser Ala Val Ile Leu Thr Ala Val Ala Val Ile Thr Val Gln Leu Arg
210 215 220
Arg Gln Tyr Val Arg Lys Tyr Glu Gly Glu Ala Glu Glu Arg Lys Lys
225 230 235 240
Leu Arg Gln Glu Asn Gly Asn Val His Ala Ile Ala
245 250

Claims (35)

1.一种分离的抗AREG抗体或其片段，其具有抑制纤维化的能力，优选地所述纤维化是肾纤维化、肝纤维化、肺纤维化，更优选为IPF。
2.权利要求1所述的抗AREG抗体或其片段，其能够与AREG结合，优选地与人类AREG结合。
3.权利要求1所述的抗AREG抗体或其片段，其是人类抗AREG抗体或鼠类抗AREG抗体或人源化抗AREG抗体或嵌合抗AREG抗体，优选地是人类单克隆抗体(mAb)、鼠类mAb、人源化mAb或嵌合mAb。
4.权利要求1所述的抗AREG抗体或其片段，其以高亲和力与AREG结合，其解离常数(KD)优选地小于约10nM，优选地小于1nM、0.1nM或0.01nM，优选地在1×10-8～1×10-11范围内，更优选地在1×10-9～1×10-11范围内。
5.权利要求1所述的抗AREG抗体或其片段，其能够与可溶形式的AREG结合，优选地能够与可溶形式的AREG的EGF样结构域结合，更优选地能够与可溶形式的AREG的EGF样结构域内的C-末端结合。
6.权利要求1所述的抗AREG抗体或其片段，其能够与人类pro-AREG的第101～184位残基，和/或人类pro-AREG的第171～184位残基，和/或鼠类pro-AREG的第94～177位残基，和/或鼠类pro-AREG的第135～177位残基结合。
7.权利要求1所述的抗AREG抗体或其片段，其能够结合由SEQ ID NO:123～132中的任一者所示的人类pro-AREG的第101～184位残基内、优选地由SEQ ID NO:123～132中的任一者所示的人类pro-AREG的第142～184位残基内的至少1个、2个、3个、4个或5个氨基酸。
8.权利要求1所述的抗AREG抗体或其片段，其能够与人类pro-AREG的Glu149和/或His164相互作用。
9.权利要求1所述的抗AREG抗体或其片段，其是与可溶形式的AREG结合的抗体片段，优选为Fab片段或F(ab)2片段。
10.权利要求1所述的抗AREG抗体或其片段，其包括：含有重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，和含有轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，其中：
HCDR1、HCDR2和HCDR3选自：
(1)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:2所示的HCDR2，由SEQ ID NO:3所示的HCDR3；
(2)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:2所示的HCDR2，由SEQ ID NO:4所示的HCDR3；
(3)由SEQ ID NO:5所示的HCDR1，由SEQ ID NO:2所示的HCDR2，由SEQ ID NO:6所示的HCDR3；
(4)由SEQ ID NO:7所示的HCDR1，由SEQ ID NO:8所示的HCDR2，由SEQ ID NO:9所示的HCDR3；
(5)由SEQ ID NO:7所示的HCDR1，由SEQ ID NO:10所示的HCDR2，由SEQ ID NO:9所示的HCDR3；
(6)由SEQ ID NO:7所示的HCDR1，由SEQ ID NO:8所示的HCDR2，由SEQ ID NO:11所示的HCDR3；
(7)由SEQ ID NO:7所示的HCDR1，由SEQ ID NO:8所示的HCDR2，由SEQ ID NO:12所示的HCDR3；
(8)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:13所示的HCDR2，由SEQ ID NO:14所示的HCDR3；
(9)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:15所示的HCDR2，由SEQ ID NO:16所示的HCDR3；
(10)由SEQ ID NO:17所示的HCDR1，由SEQ ID NO:18所示的HCDR2，由SEQ ID NO:19所示的HCDR3；
(11)由SEQ ID NO:17所示的HCDR1，由SEQ ID NO:18所示的HCDR2，由SEQ ID NO:20所示的HCDR3；和
(12)如(1)～(11)中所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，但其中的至少一者包括1个、2个、3个、4个或5个氨基酸的添加、缺失、保守氨基酸替换或其组合；并且
LCDR1、LCDR2和LCDR3选自：
(1)由SEQ ID NO:21所示的LCDR1，由SEQ ID NO:22所示的LCDR2，由SEQ ID NO:23所示的LCDR3；
(2)由SEQ ID NO:21所示的LCDR1，由SEQ ID NO:22所示的LCDR2，由SEQ ID NO:24所示的LCDR3；
(3)由SEQ ID NO:25所示的LCDR1，由SEQ ID NO:26所示的LCDR2，由SEQ ID NO:27所示的LCDR3；
(4)由SEQ ID NO:28所示的LCDR1，由SEQ ID NO:29所示的LCDR2，由SEQ ID NO:30所示的LCDR3；
(5)由SEQ ID NO:31所示的LCDR1，由SEQ ID NO:32所示的LCDR2，由SEQ ID NO:30所示的LCDR3；
(6)由SEQ ID NO:33所示的LCDR1，由SEQ ID NO:34所示的LCDR2，由SEQ ID NO:30所示的LCDR3；
(7)由SEQ ID NO:35所示的LCDR1，由SEQ ID NO:34所示的LCDR2，由SEQ ID NO:30所示的LCDR3；
(8)由SEQ ID NO:36所示的LCDR1，由SEQ ID NO:37所示的LCDR2，由SEQ ID NO:38所示的LCDR3；
(9)由SEQ ID NO:39所示的LCDR1，由SEQ ID NO:40所示的LCDR2，由SEQ ID NO:38所示的LCDR3；
(10)由SEQ ID NO:41所示的LCDR1，由SEQ ID NO:42所示的LCDR2，由SEQ ID NO:38所示的LCDR3；
(11)由SEQ ID NO:43所示的LCDR1，由SEQ ID NO:44所示的LCDR2，由SEQ ID NO:38所示的LCDR3；
(12)由SEQ ID NO:39所示的LCDR1，由SEQ ID NO:40所示的LCDR2，由SEQ ID NO:38所示的LCDR3；
(13)由SEQ ID NO:45所示的LCDR1，由SEQ ID NO:42所示的LCDR2，由SEQ ID NO:46所示的LCDR3；
(14)由SEQ ID NO:47所示的LCDR1，由SEQ ID NO:44所示的LCDR2，由SEQ ID NO:46所示的LCDR3；
(15)由SEQ ID NO:48所示的LCDR1，由SEQ ID NO:37所示的LCDR2，由SEQ ID NO:49所示的LCDR3；
(16)由SEQ ID NO:50所示的LCDR1，由SEQ ID NO:40所示的LCDR2，由SEQ ID NO:51所示的LCDR3；
(17)由SEQ ID NO:50所示的LCDR1，由SEQ ID NO:40所示的LCDR2，由SEQ ID NO:52所示的LCDR3；
(18)由SEQ ID NO:50所示的LCDR1，由SEQ ID NO:40所示的LCDR2，由SEQ ID NO:53所示的LCDR3；
(19)由SEQ ID NO:54所示的LCDR1，由SEQ ID NO:42所示的LCDR2，由SEQ ID NO:55所示的LCDR3；
(20)由SEQ ID NO:56所示的LCDR1，由SEQ ID NO:44所示的LCDR2，由SEQ ID NO:55所示的LCDR3；和
(21)如(1)～(20)中所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3，但其中的至少一者包括1个、2个、3个、4个或5个氨基酸的添加、缺失、保守氨基酸替换或其组合。
11.权利要求1所述的抗AREG抗体或其片段，其包括：含有重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，和含有轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，其中：
HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3选自：
(1)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:2所示的HCDR2，由SEQ ID NO:3所示的HCDR3，由SEQ ID NO:21所示的LCDR1，由SEQ ID NO:22所示的LCDR2，由SEQ ID NO:23所示的LCDR3；
(2)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:2所示的HCDR2，由SEQ ID NO:4所示的HCDR3，由SEQ ID NO:21所示的LCDR1，由SEQ ID NO:22所示的LCDR2，由SEQ ID NO:24所示的LCDR3；
(3)由SEQ ID NO:5所示的HCDR1，由SEQ ID NO:2所示的HCDR2，由SEQ ID NO:6所示的HCDR3，由SEQ ID NO:25所示的LCDR1，由SEQ ID NO:26所示的LCDR2，由SEQ ID NO:27所示的LCDR3；
(4)由SEQ ID NO:7所示的HCDR1，由SEQ ID NO:8所示的HCDR2，由SEQ ID NO:9所示的HCDR3，由SEQ ID NO:28所示的LCDR1，由SEQ ID NO:29所示的LCDR2，由SEQ ID NO:30所示的LCDR3；
(5)由SEQ ID NO:7所示的HCDR1，由SEQ ID NO:10所示的HCDR2，由SEQ ID NO:9所示的HCDR3，由SEQ ID NO:31所示的LCDR1，由SEQ ID NO:32所示的LCDR2，由SEQ ID NO:30所示的LCDR3；
(6)由SEQ ID NO:7所示的HCDR1，由SEQ ID NO:8所示的HCDR2，由SEQ ID NO:11所示的HCDR3，由SEQ ID NO:33所示的LCDR1，由SEQ ID NO:34所示的LCDR2，由SEQ ID NO:30所示的LCDR3；
(7)由SEQ ID NO:7所示的HCDR1，由SEQ ID NO:8所示的HCDR2，由SEQ ID NO:12所示的HCDR3，由SEQ ID NO:35所示的LCDR1，由SEQ ID NO:34所示的LCDR2，由SEQ ID NO:30所示的LCDR3；
(8)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:13所示的HCDR2，由SEQ ID NO:14所示的HCDR3，由SEQ ID NO:36所示的LCDR1，由SEQ ID NO:37所示的LCDR2，由SEQ ID NO:38所示的LCDR3；
(9)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:13所示的HCDR2，由SEQ ID NO:14所示的HCDR3，由SEQ ID NO:39所示的LCDR1，由SEQ ID NO:40所示的LCDR2，由SEQ ID NO:38所示的LCDR3；
(10)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:13所示的HCDR2，由SEQ ID NO:14所示的HCDR3，由SEQ ID NO:41所示的LCDR1，由SEQ ID NO:42所示的LCDR2，由SEQ ID NO:38所示的LCDR3；
(11)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:13所示的HCDR2，由SEQ ID NO:14所示的HCDR3，由SEQ ID NO:43所示的LCDR1，由SEQ ID NO:44所示的LCDR2，由SEQ ID NO:38所示的LCDR3；
(12)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:15所示的HCDR2，由SEQ ID NO:16所示的HCDR3，由SEQ ID NO:39所示的LCDR1，由SEQ ID NO:40所示的LCDR2，由SEQ ID NO:38所示的LCDR3；
(13)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:15所示的HCDR2，由SEQ ID NO:16所示的HCDR3，由SEQ ID NO:45所示的LCDR1，由SEQ ID NO:42所示的LCDR2，由SEQ ID NO:46所示的LCDR3；
(14)由SEQ ID NO:1所示的HCDR1，由SEQ ID NO:15所示的HCDR2，由SEQ ID NO:16所示的HCDR3，由SEQ ID NO:47所示的LCDR1，由SEQ ID NO:44所示的LCDR2，由SEQ ID NO:46所示的LCDR3；
(15)由SEQ ID NO:17所示的HCDR1，由SEQ ID NO:18所示的HCDR2，由SEQ ID NO:19所示的HCDR3，由SEQ ID NO:48所示的LCDR1，由SEQ ID NO:37所示的LCDR2，由SEQ ID NO:49所示的LCDR3；
(16)由SEQ ID NO:17所示的HCDR1，由SEQ ID NO:18所示的HCDR2，由SEQ ID NO:20所示的HCDR3，由SEQ ID NO:50所示的LCDR1，由SEQ ID NO:40所示的LCDR2，由SEQ ID NO:51所示的LCDR3；
(17)由SEQ ID NO:17所示的HCDR1，由SEQ ID NO:18所示的HCDR2，由SEQ ID NO:20所示的HCDR3，由SEQ ID NO:50所示的LCDR1，由SEQ ID NO:40所示的LCDR2，由SEQ ID NO:52所示的LCDR3；
(18)由SEQ ID NO:17所示的HCDR1，由SEQ ID NO:18所示的HCDR2，由SEQ ID NO:20所示的HCDR3，由SEQ ID NO:50所示的LCDR1，由SEQ ID NO:40所示的LCDR2，由SEQ ID NO:53所示的LCDR3；
(19)由SEQ ID NO:17所示的HCDR1，由SEQ ID NO:18所示的HCDR2，由SEQ ID NO:20所示的HCDR3，由SEQ ID NO:54所示的LCDR1，由SEQ ID NO:42所示的LCDR2，由SEQ ID NO:55所示的LCDR3；
(20)由SEQ ID NO:17所示的HCDR1，由SEQ ID NO:18所示的HCDR2，由SEQ ID NO:20所示的HCDR3，由SEQ ID NO:56所示的LCDR1，由SEQ ID NO:44所示的LCDR2，由SEQ ID NO:55所示的LCDR3；和
(21)如(1)～(20)中所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，但其中的至少一者包括1个、2个、3个、4个或5个氨基酸的添加、缺失、保守氨基酸替换或其组合。
12.权利要求1所述的抗AREG抗体或其片段，其包括重链可变区和轻链可变区，
其中所述重链可变区具有选自SEQ ID NO:57～69的氨基酸序列，和与SEQ ID NO:57～69中的任一者具有至少95％序列同一性并保留表位结合活性的氨基酸序列，
其中所述轻链可变区具有选自SEQ ID NO:70～89的氨基酸序列和与SEQ ID NO:70～89中的任一者具有至少95％序列同一性并保留表位结合活性的氨基酸序列。
13.权利要求1所述的抗AREG抗体或其片段，其包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区和所述轻链可变区具有选自下述的氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:70；
(2)SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:71；
(3)SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:72；
(4)SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:73；
(5)SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:74；
(6)SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:75；
(7)SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:76；
(8)SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:77；
(9)SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:78；
(10)SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:79；
(11)SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:80；
(12)SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:81；
(13)SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:79；
(14)SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:82；
(15)SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:83；
(16)SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:84；
(17)SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:85；
(18)SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:86；
(19)SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:87；
(20)SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:88；
(21)SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:89；和
(22)分别与(1)～(21)中的任一者具有至少95％序列同一性并保留表位结合活性的两个氨基酸序列。
14.权利要求1所述的抗AREG抗体或其片段，其是IgG、IgM、IgA、IgE或IgD的同种型，优选为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的同种型。
15.权利要求1所述的抗AREG抗体或其片段，其能够阻断AREG与EGFR的结合和/或抑制EGFR磷酸化。
16.一种分离的多核苷酸或核酸，其编码根据权利要求1至15中的任一项所述的抗AREG抗体或其片段。
17.权利要求16所述的分离的多核苷酸或核酸，其在同一多核苷酸上或分开的多核苷酸上，编码完整的重链可变区或完整的轻链可变区或两者。
18.权利要求16所述的分离的多核苷酸或核酸，其在同一多核苷酸上或分开的多核苷酸上，编码重链可变区或轻链可变区或两者的一部分。
19.权利要求16所述的分离的多核苷酸或核酸，其包括：
编码重链可变区的由序列SEQ ID NO:90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、112、115和117中的任一者所示的DNA序列；和/或
编码轻链可变区的由序列SEQ ID NO:91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、110、111、113、114、116、118、119、120、121和122中的任一者所示的DNA序列。
20.一种分离的细胞或载体，其包含编码根据权利要求1至15中的任一项所述的抗AREG抗体或其片段的一个或多个多核苷酸。
21.权利要求20所述的分离的细胞或载体，其中所述细胞是杂交瘤细胞。
22.一种组合物，其包含根据权利要求1至15中的任一项所述的抗AREG抗体或其片段以及可药用载体。
23.权利要求1至15中的任一项所述的抗AREG抗体或其片段在制备用于治疗受试者的障碍的药物中的用途，其中所述障碍中AREG被过表达、上调或激活。
24.权利要求23所述的用途，其中所述受试者是需要诊断、预后或治疗的哺乳动物受试者，优选地所述哺乳动物受试者包括人类、驯养动物、农场动物，和动物园、运动或宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛和奶牛。
25.权利要求24所述的用途，其中所述障碍是纤维化疾病，包括但不限于肾纤维化、肝纤维化、肺纤维化，特别是IPF。
26.一种用于治疗受试者的障碍的方法，其中所述障碍中AREG被过表达、上调或激活，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至15中的任一项所述的抗AREG抗体或其片段。
27.权利要求26所述的方法，其中所述障碍是纤维化疾病，包括但不限于肾纤维化、肝纤维化、肺纤维化，特别是IPF。
28.权利要求26所述的方法，其中所述受试者是需要诊断、预后或治疗的哺乳动物受试者，优选地所述哺乳动物受试者包括人类、驯养动物、农场动物，和动物园、运动或宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛和奶牛。
29.一种确定AREG蛋白的存在的方法，所述方法包括，将怀疑含有AREG蛋白的细胞暴露于根据权利要求1至15中的任一项所述的抗AREG抗体或其片段，并确定所述抗AREG抗体或其片段与所述细胞的结合。
30.权利要求29所述的方法，其是用于诊断受试者的障碍的方法，其中所述障碍中AREG被过表达、上调或激活。
31.权利要求30所述的方法，其中所述障碍是纤维化疾病，包括但不限于肾纤维化、肝纤维化、肺纤维化，特别是IPF。
32.权利要求30所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物受试者，优选地包括人类、驯养动物、农场动物，和动物园、运动或宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛和奶牛。
33.一种分离的AREG蛋白，其具有SEQ ID NO:123～132中的任一者所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:123～132中的任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列。
34.权利要求33所述的分离的AREG蛋白，其是用于产生根据权利要求1至15中的任一项所述的抗AREG抗体或其片段的表位。
35.权利要求33所述的分离的AREG蛋白，其具有氨基酸Glu149和/或His164。
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