TWI714895B - 抗csf-1r抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 - Google Patents
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Abstract
本發明關於一種抗CSF-1R抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途。進一步地，本發明關於包含所述抗CSF-1R抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，以及包含人抗CSF-1R抗體及其抗原結合片段的藥物組合物，以及其作為抗癌藥物的用途。尤其地，本發明關於一種人源化的抗CSF-1R抗體，在製備用於治療CSF-1R介導的疾病或病症的藥物中的用途。
Description
本申請要求申請日為2017年10月26日的中國專利申請CN201711015488.5的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
本發明係關於一種對人CSF-1R受體具有免疫反應性的抗CSF-1R抗體，以及其抗原結合片段，包含所述抗CSF-1R抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，以及包含人抗CSF-1R抗體及其抗原結合片段的藥物組合物，以及其作為抗癌藥物的用途。
這裡的陳述僅提供與本發明有關的背景信息，而不必然地構成現有技術。
腫瘤免疫治療是腫瘤治療領域的長期熱點，其中T細胞腫瘤免疫治療又處於核心位置。腫瘤逃逸是腫瘤免疫治療面臨的一個巨大障礙，大部分腫瘤表現可不同程度地被宿主免疫系統識別的抗原，但在許多情況下，由於免疫細胞低效活化而引發不充分的免疫反應，因此腫瘤細胞利用其自身對免疫系統的抑制作用促進了腫瘤的瘋狂生長。腫瘤免疫治療即是通過免疫檢查點抑制、直接活化、腫瘤微環境活化等各種方式，充分利用並調動了腫瘤患者體內的各類免疫細胞，對腫瘤進行殺傷作用。
巨噬細胞（macrophages）是抗腫瘤免疫調節過程中的一種重要細胞群，可以直接殺傷腫瘤細胞。但近年來研究證實，巨噬細胞分為M1和M2兩類，腫瘤組織間質中的巨噬細胞，即腫瘤相關巨噬細胞（TAM）屬於M2類，並非如同M1類巨噬細胞發揮抗腫瘤作用，而是參與腫瘤發生、生長、侵襲和轉移的過程。TAM由淋巴循環中的單核細胞或組織中殘留的巨噬細胞衍生而來，是浸潤許多種腫瘤基質的白細胞的主要類型。一旦被活化，TAM往往成為腫瘤微環境中的細胞因子、生長因子和蛋白酶的主要來源，促進腫瘤生長、增殖、血管生成、侵襲、轉移及化療抵抗。
CSF-1R（集落刺激因子-1受體，又稱為FMS、C-FMS和CD115等），是一種帶有N端胞外結構域（以重複Ig域為特徵）和酪胺酸激酶活性的C端胞內結構域的單程跨膜受體。CSF-1或白細胞介素-34（IL-34）配體與CSF-1R的結合導致受體二聚化和酪胺酸激酶活性上調、CSF-1R酪胺酸殘基磷酸化和下游訊息傳導等事件。CSF-1和IL-34兩種配基都能夠刺激單核細胞存活、增殖以及分化成為巨噬細胞。CSF-1R主要在單核細胞譜系的細胞上及在女性生殖道和胎盤中表現。
許多腫瘤細胞分泌CSF-1。CSF-1通過CSF-1R活化單核細胞/M2巨噬細胞。腫瘤內的CSF-1程度與腫瘤內的TAM程度有關，而高程度的TAM則與較差的患者預後有關。已經發現在小鼠的人乳癌異種移植物中，CSF-1促進腫瘤生長和發展成轉移。另一方面，CSF-1和其受體也與各種炎症性和自體免疫性疾病有關。CSF-1R刺激促進分化的骨髓系細胞的增殖、存活、活化和成熟，且在病理學環境中刺激促進分化的骨髓系細胞介導疾病病理學的能力。因此，有關CSF-1R受體訊號傳導的各類拮抗劑，包括單株抗體等，可通過阻斷單核細胞活化為M2巨噬細胞而用於治療各種CSF-1R介導的相關性疾病，如癌症、炎症性病狀和自體免疫性疾病等。
目前有多家跨國製藥公司在研發針對CSF-1R的單株抗體，可通過拮抗CSF1-R抑制腫瘤微環境中的TAM達到對腫瘤細胞進行殺傷的目的，或用於相關巨噬細胞介導的自身免疫疾病等。Sheer，C.J.等人描述了抑制CSF-1活性的抗CSF-1R的抗體（Sherr，C.J.等人，1989，Blood73:1786-1793）。W02009/026303公開了結合人CSF-1R的抗CSF-1R抗體和使用抗鼠CSF-1R抗體的體內小鼠腫瘤模型。W02011/123381公開了內化CSF-1R並具有ADCC活性的抗CSF-1R抗體。W02011/123381還公開了使用抗鼠CSF-1R抗體的體內小鼠腫瘤模型。W02011/140249公開了阻斷CSF-1與CSF-1R的結合的抗CSF-1R抗體，其被認為在治療癌症中是有用的。W02009/112245公開了抑制CSF-l結合CSF-IR的抗CSF-IR IgGl抗體，其被認為在治療癌症、炎性腸病和類風濕性關節炎中是有用的。W02011/131407公開了抑制CSF-l結合CSF-IR的抗CSF-IR抗體，其被認為在治療骨質流失和癌症中是有用的。W02011/107553公開了抑制CSF-l結合CSF-IR的抗CSF-IR抗體，其被認為在治療骨質流失和癌症中是有用的。W02011/070024公開了結合人CSF-IR片段deID4的抗CSF-IR抗體。雖然先前己描述了抗CSF-IR抗體在治療某些癌症中的治療應用，但仍然存在開發新型、更適於臨床應用的抗體的需要。
本發明一些實施方案提供一種抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段，其包含： 抗體輕鏈可變區，所述的抗體輕鏈可變區包含至少1個選自如以下序列所示的LCDR：SEQ ID NO: 6，SEQ ID NO: 7，SEQ ID NO: 8，SEQ ID NO: 14，SEQ ID NO: 15，SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 96；和 抗體重鏈可變區，所述的抗體重鏈可變區包含至少1個選自如以下序列所述的HCDR：SEQ ID NO: 3，SEQ ID NO: 4，SEQ ID NO: 5，SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 12，SEQ ID NO: 13，SEQ ID NO: 95，SEQ ID NO: 97或SEQ ID NO: 98。
在另一些實施方案中，上述抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段，其包含抗體輕鏈可變區和抗體重鏈可變區，其中： a) 所述的抗體輕鏈可變區包含選自在如SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43和SEQ ID NO: 44所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的LCDR變體；所述的抗體重鏈可變區包含選自在如SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40和SEQ ID NO: 41所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的HCDR變體； b) 所述的抗體輕鏈可變區包含選自在如SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51和SEQ ID NO: 52所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的LCDR變體；所述的抗體重鏈可變區包含選自在如SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48和SEQ ID NO: 49所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的HCDR變體； c) 所述的抗體輕鏈可變區包含選自在如SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59和SEQ ID NO: 60所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的LCDR變體；所述的抗體重鏈可變區選自在如SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 57所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的HCDR變體； d) 所述的抗體輕鏈可變區包含選自在如SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67和SEQ ID NO: 68所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的LCDR變體；所述的抗體重鏈可變區包含選自在如SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64和SEQ ID NO: 65所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的HCDR變體； e) 所述的抗體輕鏈可變區包含選自在如SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75和SEQ ID NO: 76所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的LCDR變體；所述的抗體重鏈可變區包含選自在如SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72和SEQ ID NO: 73所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的HCDR變體； f) 所述的抗體輕鏈可變區包含選自在如SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83和SEQ ID NO: 84所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的LCDR變體；所述的抗體重鏈可變區包含選自在如SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 80和SEQ ID NO: 81所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的HCDR變體； g) 所述的抗體輕鏈可變區包含選自在如SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91和SEQ ID NO: 92所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的LCDR變體；所述的抗體重鏈可變區包含選自在如SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88和SEQ ID NO: 89所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的HCDR變體； h) 所述的抗體輕鏈可變區包含選自在如SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的LCDR變體；所述的抗體重鏈可變區包含選自在如SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的HCDR變體； i) 所述的抗體輕鏈可變區包含選自在如SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的LCDR變體；所述的抗體重鏈可變區包含選自在如SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的HCDR變體； j) 所述的抗體輕鏈可變區包含選自在如SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的LCDR變體；抗體重鏈可變區包含選自在如：SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的HCDR變體； k) 所述的抗體輕鏈可變區包含選自在如SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的LCDR變體；抗體重鏈可變區包含選自在如：SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 97和SEQ ID NO: 13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的HCDR變體； l) 所述的抗體輕鏈可變區包含選自在如SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的LCDR變體；抗體重鏈可變區包含選自在如：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的HCDR變體； m) 所述的抗體輕鏈可變區包含選自在如SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的LCDR變體；抗體重鏈可變區包含選自在如：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 95和SEQ ID NO: 5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的HCDR變體； n) 所述的抗體輕鏈可變區包含選自在如SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的LCDR變體；抗體重鏈可變區包含選自在如：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 95和SEQ ID NO: 5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的HCDR變體；或者 o) 所述的抗體輕鏈可變區包含選自在如：SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的LCDR變體；抗體重鏈可變區包含選自在如：SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 97和SEQ ID NO: 13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的HCDR變體。
在另一些實施方案中，如上所述的抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段，其包含抗體輕鏈可變區和抗體重鏈可變區，其中： p) 所述的抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43和SEQ ID NO: 44所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述的抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40和SEQ ID NO: 41所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3； q) 所述的抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51和SEQ ID NO: 52所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述的抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48和SEQ ID NO: 49所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3； r) 所述的抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59和SEQ ID NO: 60所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述的抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 57所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3； s) 所述的抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67和SEQ ID NO: 68所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述的抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64和SEQ ID NO: 65所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3； t) 所述的抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75和SEQ ID NO: 76所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述的抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72和SEQ ID NO: 73所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3； u) 所述的抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83和SEQ ID NO: 84所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述的抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 80和SEQ ID NO: 81所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3； v) 所述的抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91和SEQ ID NO: 92所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述的抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88和SEQ ID NO: 89所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3； w) 所述的抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述的抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3； x) 所述的抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述的抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3； y) 所述的抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3； z) 所述的抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO15和SEQ ID NO: 16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 97和SEQ ID NO: 13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3； aa) 所述的抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3； ab) 所述的抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 95和SEQ ID NO: 5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3； ac) 所述的抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 95和SEQ ID NO: 5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3； ad) 所述的抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 97和SEQ ID NO: 13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在另一些實施方案中，如上所述的抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段，其中所述的抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體或者嵌合抗體。
在另一些實施方案中，如上所述的抗體或抗原結合片段，其中 a) 所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO: 38所示，所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：37所示；或者 b) 所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO: 46所示，所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：45所示；或者 c) 所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO: 54所示，所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：53所示；或者 d) 所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO: 62所示，所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：61所示；或者 e) 所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO: 70所示，所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：69所示；或者 f) 所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO: 78所示，所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：77所示；或者 g) 所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO: 86所示，所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：85所示；或者 h) 所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO: 2所示或者其變體，所述變體優選在輕鏈可變區有0-10的胺基酸突變，最優選的胺基酸突變為N37T，所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示或者其變體，所述變體優選在重鏈可變區有0-10的胺基酸突變，優選的胺基酸突變為N55T；或者 i) 所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO: 10所示，所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示或者其變體，所述變體優選在輕鏈可變區有0-10的胺基酸突變，優選的突變為M34I、N55T或其組合的胺基酸突變。
在另一些實施方案中，如上所述抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段，其中所述的抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或其抗原結合片段。
在另一些實施方案中，如上所述抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段，其中所述人源化抗體輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列，來源於如SEQ ID NO: 22所示的人種系輕鏈IGkV4-1序列；或來源於如SEQ ID NO: 24所示的人種系輕鏈IGkV1-13序列； 和/或，所述人源化抗體重鏈可變區進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈FR區，優選包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈FR區，更優選包含人源IgG1或IgG4重鏈FR區；較佳地，所述人源化抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列，來源於如SEQ ID NO: 21所示的人種系重鏈IGHV1-46序列；或來源於如SEQ ID NO: 23所示的人種系重鏈IGHV1-2序列。
在另一些實施方案中，如上所述抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段，其中所述人源化抗體輕鏈可變區序列為如SEQ ID NO: 30或SEQ ID NO: 34所示的序列或其變體；所述的變體優選在輕鏈可變區有0-10的胺基酸突變，其中SEQ ID NO: 30最優選的胺基酸突變為S31N、T37N；SEQ ID NO: 34最優選的胺基酸突變為F87A、F91Y或其組合； 和/或，所述人源化抗體重鏈可變區序列為如SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 100或SEQ ID NO: 33所示的序列或其變體；所述變體優選在重鏈可變區有0-10的胺基酸突變，其中SEQ ID NO: 26優選的胺基酸突變為S30T、T55N、L70M或其組合，最優選的胺基酸突變為T55N；SEQ ID NO: 33優選的胺基酸突變為Q1E、M34I、T55N、E89D或其組合，最優選的胺基酸突變為M34I、T55N或其組合的胺基酸突變； 較佳地，所述重鏈可變區的序列為SEQ ID NO: 31、32、33或100，且所述輕鏈可變區的序列為SEQ ID NO: 34、35或36； 或者，所述重鏈可變區的序列為SEQ ID NO: 25、26、27或28，且所述輕鏈可變區的序列為SEQ ID NO: 29或30。
在另一些實施方案中，如上所述抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段，其中所述嵌合抗體或人源化抗體進一步包括輕鏈和/或重鏈的恆定區，所述輕鏈恆定區序列如SEQ ID NO: 102所示，和/或所述重鏈恆定區序列如SEQ ID NO: 101所示。
在另一些實施方案中，如上所述抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段，其中所述人源化抗體： 包含序列如SEQ ID NO: 19所示的重鏈，和序列如SEQ ID NO: 20所示的輕鏈； 包含序列如SEQ ID NO: 17所示的重鏈，和序列如SEQ ID NO: 18所示的輕鏈；或者包含序列如SEQ ID NO: 99所示的重鏈，和序列如SEQ ID NO: 20所示的輕鏈。
在另一些實施方案中，如上所述的鼠源抗體或其片段，其抗體輕鏈可變區進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈FR區。
在另一些實施方案中，如上所述的鼠源抗體或其片段，其進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在另一些實施方案中，如上所述的鼠源抗體或其片段，其抗體重鏈可變區進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈FR區。
在另一些實施方案中，如上所述的鼠源抗體或其片段，其進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區。
在另一些實施方案中，如上所述的抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段，其中所述的抗體為嵌合抗體或其片段。
在另一些實施方案中，如上所述的CSF-1R嵌合抗體或其片段，其中所述的嵌合抗體輕鏈可變區序列為：SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 10。所述的變體優選在輕鏈可變區有0-10的胺基酸變化，最優選SEQ ID NO: 2的胺基酸突變為N37T。
在另一些實施方案中，如上所述的CSF-1R嵌合抗體或其片段，其中所述的嵌合抗體重鏈可變區序列為：SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 9，其中SEQ ID NO: 1優選的胺基酸突變為T55N；SEQ ID NO: 9優選的突變為M34I、T55N或其組合的胺基酸突變。在本發明一個優選的實施方案中，一種如上所述的CSF-1R嵌合抗體或其片段，其進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在另一些實施方案中，如上所述的CSF-1R嵌合抗體或其片段，其進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區。
在另一些實施方案中，如上所述的抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段，其中所述的抗體為人源化抗體或其抗原結合片段。
在另一些實施方案中，如上所述的CSF-1R人源化抗體或其片段，其人源化抗體輕鏈可變區進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈FR區。
在本發明一個優選的實施方案中，一種如上所述的CSF-1R人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體輕鏈可變區序列為如SEQ ID NO: 30或SEQ ID NO: 34所示的序列，或其變體。
在另一些實施方案中，如上所述的CSF-1R人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體輕鏈序列為如SEQ ID NO: 18 或SEQ ID NO: 20所示的序列，或其變體；所述人源化抗體變體優選在輕鏈可變區有0-10的胺基酸變化；其中SEQ ID NO: 18優選的胺基酸突變為S31N、T37N或其組合的胺基酸突變，最優選的胺基酸突變為T37N；SEQ ID NO: 20優選的胺基酸突變為F87A、F91Y或其組合的胺基酸突變。
在本發明一個優選的實施方案中，一種如上所述的CSF-1R人源化抗體或其片段，其進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在另一些實施方案中，如上所述的CSF-1R人源化抗體或其片段，其人源化抗體重鏈可變區進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈FR區。
在另一些實施方案中，如上所述的CSF-1R人源化抗體或其片段，其進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，優選包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區。更優選使用IgG4或胺基酸突變後消除ADCC（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用）毒性的IgG1。
另一方面，本發明的一些實施方案還提供一種分離的單株抗體或其抗原結合片段，其與如上所述的抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段競爭結合CSF-1R。
在本發明一個優選的實施方案中，一種如上所述的抗體（此處及以下所述的抗體為上述抗CSF-1R抗體或上述單株抗體）或其抗原結合片段，其中所述的抗原結合片段為Fab、Fv、sFv、F(ab’)2、線性抗體、單鏈抗體、奈米抗體、結構域抗體和多特異性抗體。
另一方面，本發明的一些實施方案還提供一種多特異性抗體，含有如上所述的抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區和/或重鏈可變區。
另一方面，本發明的一些實施方案還提供一種單鏈抗體，含有如上所述的抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區和/或重鏈可變區。
另一方面，本發明的一些實施方案還提供一種抗體-藥物偶聯物，其中所述的抗體含有如上所述的抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區和/或重鏈可變區。
另一方面，本發明的一些實施方案還提供一種編碼如上所述的抗體或其抗原結合片段、如上所述的多特異性抗體或者如上所述的單鏈抗體的核酸分子。
另一方面，本發明的一些實施方案還提供一種編碼如上所述的抗體或其抗原結合片段的DNA序列。
另一方面，本發明的一些實施方案還提供一種含有如上所述的DNA序列的表現載體。
在本發明的一些實施方案還提供一種用如上所述的表現載體轉化的宿主細胞。
在一些的實施方案中，一種如上所述的宿主細胞，所述的宿主細胞為細菌，優選為大腸桿菌。
在另一些實施方案中，一種如上所述的宿主細胞為酵母菌，優選為畢赤酵母。
在另一些實施方案中，一種如上所述的宿主細胞為哺乳動物細胞，優選為中國倉鼠卵巢（CHO）細胞、人胚腎（HEK）293細胞或NS0細胞。
另一方面，本發明的一些實施方案還提供一種抗體-藥物偶聯物，含有如前所述的輕鏈可變區和重鏈可變區。所述的抗體-藥物偶聯物是本領域習知的，其由抗體-接頭-藥物（毒素）相互連接形成，已知的接頭包括裂解接頭、分裂解接頭，例如接頭包括但不限於SMCC、SPDP等等；毒素也是本領域習知的，例如DM1、DM4、MMAE、MMAF等。
另一方面，本發明的一些實施方案還提供一種藥物組合物，其含有如上所述的抗體或其抗原結合片段和可藥用的緩衝劑、賦形劑、稀釋劑或載體。
在另一些實施方案中，一種如上所述的抗體或其片段、多特異性抗體、單鏈抗體、核酸分子或藥物組合物在癌症治療中施用，其中所述施用是在開始用另一種抗癌治療的療法之前、過程中、基本同時或之後施用的。
在另一些實施方案中，一種如上所述的CSF-1R人源化抗體或其片段，其中所述抗癌治療選自抗血管發生劑、化療劑、放射、腫瘤免疫療法或其組合。
在另一些實施方案中，一種如上所述的CSF-1R人源化抗體或其片段，其中所述化療劑選自：紫杉炕類（帕利他賽、多因他賽、經修飾的帕利他賽（Abraxane 和Opaxio））、多柔比星、經修飾的多柔比星（Caelyx或Doxil）、舒尼替尼、索拉非尼和其它多激酶抑制劑、奧沙利鉑、順鉑、卡鉑、依託泊苷、吉西他濱和長春鹼。
在另一些實施方案中，一種如上所述的CSF-1R人源化抗體或其片段，其中所述腫瘤免疫療法選自：T細胞接合劑（engaging agent）、靶向性免疫抑制、癌症疫苗/增強樹突細胞功能和過繼性細胞轉移。
在另一方面，本發明的一些實施方式進一步提供一種如上所述的抗體或其抗原結合片段在製備用於治療CSF-1R或CSF-1介導的疾病或病症的藥物中的用途；其中所述的疾病優選為癌症、自身免疫疾病、炎性疾病或溶骨性骨質缺失；所述的癌症最優選為乳癌、子宮內膜癌、鱗狀細胞癌、濾泡性淋巴瘤、腎細胞癌、葡萄膜黑色素瘤、子宮頸癌、頭頸癌、霍奇金氏病、星狀細胞癌、肺腺癌、間皮瘤、絨毛膜癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、腦癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、食管癌、宮頸癌、多發性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和膠質母細胞瘤；所述的自身免疫疾病最優選為自身免疫性腦脊髓炎、全身性紅斑狼瘡、多發性硬化、關節滑膜炎、牛皮癬、和類風濕關節炎；所述溶骨性骨質缺失選自骨質疏鬆、轉移誘導的溶骨性骨質流失和類風濕性關節炎誘導的骨質流失。本發明進一步提供一種治療和預防CSF-1R或CSF-1介導的疾病或病症的方法，該方法包括給予所需患者治療有效量的如上所述的抗體或其抗原結合片段、或包含其的藥物組合物；其中所述的疾病優選為癌症、自身免疫疾病、炎性疾病或溶骨性骨質流失；所述的癌症最優選為乳癌、子宮內膜癌、鱗狀細胞癌、濾泡性淋巴瘤、腎細胞癌、葡萄膜黑色素瘤、子宮頸癌、頭頸癌、霍奇金氏病、星狀細胞癌、肺腺癌、間皮瘤、絨毛膜癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、腦癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、食管癌、宮頸癌、多發性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和膠質母細胞瘤；所述的自身免疫疾病最優選為自身免疫性腦脊髓炎、全身性紅斑狼瘡、多發性硬化、關節滑膜炎、牛皮癬、和類風濕關節炎；所述溶骨性骨質流失選自骨質疏鬆、轉移誘導的溶骨性骨質流失和類風濕性關節炎誘導的骨質流失。
術語
為了更容易理解本發明，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本文件中的它處另有明確定義，否則本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J. Biol. Chem, 243, p3558(1968)中所述。
本發明所述的術語「抗體」指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈通過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為µ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈通過恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
在本發明中，本發明所述的抗體輕鏈可變區可進一步包含輕鏈恆定區，所述的輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。
在本發明中，本發明所述的抗體重鏈可變區可進一步包含重鏈恆定區，所述的重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1、2、3、4或其變體。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區（V區）；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區（C區）。可變區包括3個高變區（HVR）和4個序列相對保守的骨架區（FR）。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區（CDR）。每條輕鏈可變區（VL）和重鏈可變區（VH）由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。發明所述的抗體或抗原結合片段的VL區和VH區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的IMGT編號規則。
術語「抗原呈現細胞」或「APC」是在其表面上展示與MHC複合的外來抗原的細胞。T細胞利用T細胞受體(TCR)識別這種複合物。APC的實例包括但不限於樹突細胞(DC)、外周血單個核細胞(PBMC)、單核細胞、B淋巴母細胞和單核細胞衍生的樹突細胞(DC)。術語「抗原呈現」是指APC捕獲抗原和使它們能夠被T細胞識別的過程，例如作為MHC-I/MHC-II偶聯物的組分。
術語「CSF-1R」指集落刺激因子-1受體蛋白，是一種帶有N端胞外結構域和酪胺酸激酶活性的C端胞內結構域的單程跨膜受體。CSF-1R為含有免疫球蛋白(Ig)基序的RTK家族的一名成員，以受體的胞外部分中的重複Ig域為特徵。CSF-1R的活化由其配體M-CSF或白介素IL-34介導，其訊號在免疫反應、骨重建及在生殖系統中都具有重要的生理學作用。
術語「重組人抗體」包括通過重組方法製備、表現、創建或分離的人抗體，所涉及的技術和方法在本領域中是熟知的，諸如(1)從人免疫球蛋白基因的轉基因、轉染色體動物（例如小鼠）或由其製備的雜交瘤中分離的抗體；(2)從經轉化以表現抗體的宿主細胞如轉染瘤中分離的抗體；(3)從重組組合人抗體文庫中分離的抗體；以及(4)通過將人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列等方法製備、表現、創建或分離的抗體。此類重組人抗體包含可變區和恆定區，這些區域利用特定的由種系基因編碼的人種系免疫球蛋白序列，但也包括隨後諸如在抗體成熟過程中發生的重排和突變。
術語「鼠源抗體」在本發明中為根據本領域知識和技能製備的對人CSF-1R的單株抗體。製備時用CSF-1R抗原注射試驗對象，然後分離表現具有所需序列或功能特性的抗體的雜交瘤。在本發明一個優選的實施方案中，所述的鼠源CSF-1R抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區。
術語「人抗體」包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗體。本發明的人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基（如通過體外隨機或位點特異性誘變或通過體內體細胞突變所引入的突變）。然而，術語「人抗體」不包括這樣的抗體，即其中已將衍生自另一種哺乳動物物種（諸如小鼠）種系的CDR 序列移植到人骨架序列上（即「人源化抗體」）。
術語「人源化抗體（humanized antibody）」，也稱為CDR移植抗體（CDR-grafted antibody），是指將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量小鼠蛋白成分，從而誘導的強烈的免疫反應。為避免在免疫原性下降的同時引起活性的下降，可對所述的人抗體可變區可進行最少反向突變，以保持活性。
術語「嵌合抗體（chimeric antibody）」，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫反應。建立嵌合抗體，要選建立分泌鼠源性特異性單抗的雜交瘤，然後從小鼠雜交瘤細胞中複製可變區基因，再據需要複製人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入人載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中表現嵌合抗體分子。人抗體的恆定區可選自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，優選包含人源IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變後無ADCC（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用）毒性的IgG1。
術語「抗原結合片段」是指抗體的抗原結合片段及抗體類似物，其通常包括至少部分母體抗體（parental antibody）的抗原結合區或可變區 （例如一個或多個CDR）。抗體片段保留母體抗體的至少某些結合特異性。通常，當基於摩爾來表示活性時，抗體片段保留至少10%的母體結合活性。優選地，抗體片段保留至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更多的母體抗體對靶標的結合親和力。抗原結合片段實例包括但不限於：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、線性抗體（linear antibody）、單鏈抗體、奈米抗體、結構域抗體和多特異性抗體。工程改造的抗體變體綜述於Holliger和Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23：1126-1136中。
「Fab片段」由一條輕鏈和一條重鏈的CH1及可變區組成。Fab分子的重鏈不能與另一個重鏈分子形成二硫鍵。
「Fc」區含有包含抗體的CH1和CH2 結構域的兩個重鏈片段。兩個重鏈片段由兩個或多個二硫鍵並通過CH3結構域的疏水作用保持在一起。
「Fab’片段」含有一條輕鏈和包含VH結構域和CH1結構域以及CH1和CH2 結構域之間區域的一條重鏈的部分，由此可在兩個Fab’片段的兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab’)2分子。
「F(ab’)2片段」含有兩條輕鏈和兩條包含CH1和CH2結構域之間的恆定區的部分的重鏈，由此在兩條重鏈間形成鏈間二硫鍵。因此，F(ab’)2片段由通過兩條重鏈間的二硫鍵保持在一起的兩個Fab’片段組成。
「Fv區」包含來自重鏈和輕鏈二者的可變區，但缺少恆定區。
術語「多特異性抗體」按其最廣義使用，涵蓋具有多表位特異性的抗體。這些多特異性抗體包括但不限於：包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的抗體，其中該VH-VL單元具有多表位特異性；具有兩個或多個VL和VH區的抗體，每個VH-VL單元與不同的靶點或同一個靶點的不同表位結合；具有兩個或更多個單可變區的抗體，每個單可變區與不同的靶點或同一個靶點的不同的表位結合；全長抗體、抗體片段、雙抗體（diabodies）、雙特異性雙抗體和三抗體（triabodies）、己共價或非共價連接在一起的抗體片段等。
術語「單鏈抗體」是由抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)通過一段連接肽連接而成的單鏈重組蛋白，它是具有完全抗原結合位點的最小抗體片段。
術語「結構域抗體片段」是僅含有重鏈可變區或輕鏈可變區鏈的具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。在某些情況下，兩個或多個VH區與肽接頭共價連接以形成二價結構域抗體片段。二價結構域抗體片段的兩個VH區可靶向相同或不同抗原。
本發明的術語「與CSF-1R結合」，指能與人CSF-1R相互作用。本發明的術語「抗原結合位點」指抗原上不連續的，由本發明抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。
在類似「具有3、2、1或0個胺基酸突變」中「胺基酸突變」是指相較於原蛋白質或多肽，變體蛋白質或多肽存在胺基酸的突變，包括在原蛋白質或多肽的基礎上發生相應數目胺基酸的插入、缺失或替換。
在類似「在如SEQ ID NO: X、SEQ ID NO: Y和SEQ ID NO: Z所示的CDR1、CDR2和CDR3的基礎上分別具有3、2、1或0個胺基酸突變的CDR變體」的描述中，示例性的解釋是對CDR的突變可以包含3個、2個、1個或0個胺基酸的突變，CDR1、CDR2和CDR3之間可以任選地選擇相同或不同數目的胺基酸殘基進行突變，例如在如SEQ ID NO: X、SEQ ID NO: Y和SEQ ID NO: Z所示的CDR1、CDR2和CDR3的基礎上，對CDR1進行1個胺基酸的突變，對CDR2和CDR3進行0個胺基酸突變。當對某個CDR進行0個胺基酸突變時，則該具有0個胺基酸突變的CDR變體仍是該CDR本身。
術語「表位」是指抗原上與免疫球蛋白或抗體特異性結合的位點。表位可以由相鄰的胺基酸、或通過蛋白質的三級折疊而並列的不相鄰的胺基酸形成。由相鄰的胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑後保持，而通過三級折疊形成的表位通常在變性溶劑處理後喪失。表位通常以獨特的空間構形包括至少3-15個胺基酸。確定什麼表位由給定的抗體結合的方法在本領域中是熟知的，包括免疫印漬術和免疫沉澱檢測分析等。確定表位的空間構形的方法包括本領域中的技術和本文所述的技術，例如X射線晶體分析法和二維核磁共振等。
本發明所用的術語「特異性結合」、「選擇性結合」是指抗體與預定的抗原上的表位結合。通常，當使用重組人CSF-1R作為分析物並使用抗體作為配體，在儀器中通過表面等離子體共振(SPR)技術測定時，抗體以大約低於10-7M或甚至更小的平衡解離常數(KD)與預定的抗原結合，並且其與預定抗原結合的親和力是其與預定抗原或緊密相關的抗原之外的非特異性抗原（如BSA等）結合的親和力的至少兩倍。術語「識別抗原的抗體」在本文中可以與術語「特異性結合的抗體」互換使用。
當術語「競爭」用於競爭相同表位的抗原結合蛋白（例如中和抗原結合蛋白或中和抗體）的情況中時，意指在抗原結合蛋白之間競爭，其通過以下測定法來測定：在所述測定法中，待檢測的抗原結合蛋白（例如抗體或其抗原結合片段）防止或抑制（例如降低）參考抗原結合蛋白（例如配體或參考抗體）與共同抗原的特異性結合。眾多類型的競爭性結合測定可用於確定一種抗原結合蛋白是否與另一種競爭，這些測定例如：固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭測定（參見例如Stahli等，1983，Methodsin Enzymology 9：242-253）；固相直接生物素-親和素EIA（參見例如Kirkland等，1986，J.Immunol.137：3614-3619）、固相直接標記測定、固相直接標記夾心測定（參見例如Harlow和Lane，1988，Antibodies，A Laboratory Manual（抗體，實驗室手冊），Cold Spring Harbor Press）；用I-125標記物的固相直接標記RIA（參見例如Morel等，1988，Molec.Immunol.25：7-15）；固相直接生物素-親和素EIA（參見例如Cheung，等，1990，Virology176：546-552）；和直接標記的RIA（Moldenhauer等，1990，Scand.J.Immunol.32：77-82）。通常所述測定法涉及使用能與帶有未標記的檢測抗原結合蛋白及標記的參考抗原結合蛋白結合的純化抗原（所述抗原在固態表面或細胞表面）。在待測抗原結合蛋白存在下，測量結合於固態表面或細胞的標記的量，來測量競爭性抑制。通常，待測抗原結合蛋白是過量存在的。由競爭性測定（競爭抗原結合蛋白）鑑定的抗原結合蛋白包括：結合與參考抗原結合蛋白同一表位的抗原結合蛋白；和結合充分接近參考抗原結合蛋白的結合表位的鄰近表位的抗原結合蛋白，所述兩個表位在空間上互相妨礙發生結合。在本公開實施例中提供關於用於測定競爭性結合的方法的其它詳細資料。通常當競爭的抗原結合蛋白過量存在時，其將抑制（例如降低）至少40-45%、45-50%、50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或75%或更多參考抗原結合蛋白與共同抗原的特異性結合。在某些情況下，結合被抑制至少80-85%、85-90%、90-95%、95-97%或97%或更多。
術語「交叉反應」是指本發明的抗體與來自不同物種的CSF-1R結合的能力。例如，結合人CSF-1R的本發明的抗體也可以結合另一物種的CSF-1R。交叉反應性是通過在結合測定（例如SPR和ELISA）中檢測與純化抗原的特異性反應性，或與生理表現CSF-1R的細胞的結合或功能性相互作用來測量。確定交叉反應性的方法包括如本文所述的標準結合測定，例如表面等離子體共振(SPR)分析，或流式細胞術。
術語「宿主細胞」是指已向其中引入了表現載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科（enterobacteriaceae）的成員，例如大腸桿菌（Escherichia coli）或沙門氏菌（Salmonella）的菌株；芽孢桿菌科（Bacillaceae）例如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；肺炎球菌（Pneumococcus）；鏈球菌（Streptococcus）和流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）。適當的微生物包括釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和畢赤酵母（Pichia pastoris）。適當的動物宿主細胞系包括CHO（中國倉鼠卵巢細胞系）、HEK293細胞（非限制性示為HEK293E細胞）和NS0 細胞。
術語「抑制」或「阻斷」可互換使用，並涵蓋部分和完全抑制/阻斷這兩者。配體的抑制/阻斷優選地降低或改變無抑制或阻斷的情況下發生配體結合時出現活性的正常程度或類型。抑制和阻斷也旨在包括與抗CSF-1R抗體接觸時，與未與抗CSF-1R抗體接觸的配體相比，任何可測量的配體結合親和力降低。
術語「抑制生長」（例如涉及細胞）旨在包括細胞生長任何可測量的降低。
術語「誘導免疫反應」和「增強免疫反應」可互換使用，並指免疫反應對特定抗原的剌激（即，被動或適應性的）。針對誘導CDC或ADCC的術語「誘導」是指剌激特定的直接細胞殺傷機制。
本發明中所述的「ADCC」，即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用，是指表現Fc受體的細胞通過識別抗體的Fc段直接殺傷被抗體包覆的靶細胞。可通過對IgG上Fc段的修飾，增強或降低或消除抗體的ADCC效應功能。所述的修飾指在抗體的重鏈恆定區進行突變。
生產和純化抗體和抗原結合片段的方法在現有技術中熟知和能找到，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。如，老鼠可以用人CSF-1R或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人FR區。人FR種系序列可以從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站https://imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
本發明工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。相應抗體的cDNA序列可以複製並重組至GS表現載體。重組的免疫球蛋白表現載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表現系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端。通過表現與人源抗原特異性結合的抗體得到穩定的複製。陽性的複製在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化、收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
本發明的抗體指單株抗體。本發明所述的單株抗體（mAb），指由單一的複製細胞株得到的抗體，所述的細胞株不限於真核的，原核的或噬菌體的複製細胞株。單株抗體或抗原結合片段可以用如雜交瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術，合成技術（如CDR-grafting），或其它現有技術進行重組得到。
「給予」和「處理」當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。「給予」和「處理」可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中所述流體與細胞接觸。「給予」和「處理」還意指通過試劑、診斷、結合組合物或通過另一種細胞體外和離體處理例如細胞。「處理」當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
「治療」意指給予患者內用或外用治療劑，諸如包含本發明的任一種結合化合物的組合物，所述患者具有一種或多種疾病症狀，而已知所述治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，無論是通過誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量（也稱作「治療有效量」）可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。通過醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。盡本發明的實施方案（例如治療方法或製品）在緩解每個患者都有的目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗（H檢驗）、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
整個說明書和權利要求書中使用的術語「基本上由……組成」或其變形表示包括所有所述元件或元件組，並且任選包括與所述元件類似或不同性質的其它元件，所述其它元件非顯著改變指定給藥方案、方法或組合物的基本性質或新性質。作為非限制性例子，基本上由所提及的胺基酸序列組成的結合化合物還可以包括一種或多種胺基酸，其不顯著影響結合化合物的性質。
本發明所述的應用於某個對象的術語「天然存在的」是指這樣的事實，即該對象可在自然界中發現。例如存在於可從自然界來源分離得到的生物體（包括病毒）、且未經人工在實驗室中有意修飾的多肽序列或多核苷酸序列即是天然存在的。
「有效量」包含足以改善或預防醫學病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
「外源性」指根據背景在生物、細胞或人體外產生的物質。「內源性」指根據背景在細胞、生物或人體內產生的物質。
「同源性」是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼所述分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100%的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列60%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。
本文使用的表述「細胞」、「細胞系」和「細胞培養物」可互換使用，並且所有這類名稱都包括其後代。因此，單詞「轉化體」和「轉化細胞」包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。
「任選」或「任選地」意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，「任選包含1-3個抗體重鏈可變區」意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
「藥物組合物」表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。藥物組合物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
本發明提供有著高親和力、高選擇性、高生物活性的抗CSF-1R抗體，用於腫瘤或自身免疫疾病的單株抗體免疫療法及其相關應用，以及其它相關用於CSF-1R陽性腫瘤或自身免疫疾病治療的藥物、組合物以及方法。
具體實施方式
以下結合實施例用於進一步描述本發明，但這些實施例並非限制著本發明的範圍。本發明實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子複製手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例1 免疫抗原、篩選抗原的序列及製備
編碼帶His-Tag標籤的人CSF-1R序列、編碼帶huFc標籤的人CSF-1R序列由Integrated DNA Technology (IDT)公司合成，分別複製到pTT5載體上（Biovector）。重組的CSF-1R蛋白在293T細胞（ATCC，CRL-3216TM）表現後進行純化。純化的蛋白可用於下述各實施例實驗中。
Human CSF-1R ECD-His的序列： MGSTAILGLLLAVLQGGRAIPVIEPSVPELVVKPGATVTLRCVGNGSVEWDGPPSPHWTLYSDGSSSILSTNNATFQNTGTYRCTEPGDPLGGSAAIHLYVKDPARPWNVLAQEVVVFEDQDALLPCLLTDPVLEAGVSLVRVRGRPLMRHTNYSFSPWHGFTIHRAKFIQSQDYQCSALMGGRKVMSISIRLKVQKVIPGPPALTLVPAELVRIRGEAAQIVCSASSVDVNFDVFLQHNNTKLAIPQQSDFHNNRYQKVLTLNLDQVDFQHAGNYSCVASNVQGKHSTSMFFRVVESAYLNLSSEQNLIQEVTVGEGLNLKVMVEAYPGLQGFNWTYLGPFSDHQPEPKLANATTKDTYRHTFTLSLPRLKPSEAGRYSFLARNPGGWRALTFELTLRYPPEVSVIWTFINGSGTLLCAASGYPQPNVTWLQCSGHTDRCDEAQVLQVWDDPYPEVLSQEPFHKVTVQSLLTVETLEHNQTYECRAHNSVGSGSWAFIPISAGAHTHPPDEGSHHHHHHHH SEQ ID NO: 93
Human CSF-1R-huFc的序列： MGSTAILGLLLAVLQGGRAIPVIEPSVPELVVKPGATVTLRCVGNGSVEWDGPPSPHWTLYSDGSSSILSTNNATFQNTGTYRCTEPGDPLGGSAAIHLYVKDPARPWNVLAQEVVVFEDQDALLPCLLTDPVLEAGVSLVRVRGRPLMRHTNYSFSPWHGFTIHRAKFIQSQDYQCSALMGGRKVMSISIRLKVQKVIPGPPALTLVPAELVRIRGEAAQIVCSASSVDVNFDVFLQHNNTKLAIPQQSDFHNNRYQKVLTLNLDQVDFQHAGNYSCVASNVQGKHSTSMFFRVVESAYLNLSSEQNLIQEVTVGEGLNLKVMVEAYPGLQGFNWTYLGPFSDHQPEPKLANATTKDTYRHTFTLSLPRLKPSEAGRYSFLARNPGGWRALTFELTLRYPPEVSVIWTFINGSGTLLCAASGYPQPNVTWLQCSGHTDRCDEAQVLQVWDDPYPEVLSQEPFHKVTVQSLLTVETLEHNQTYECRAHNSVGSGSWAFIPISAGAHTHPPDEGSGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 94
實施例2 CSF-1R重組蛋白製備
1、帶His標籤的CSF-1R重組蛋白的純化步驟： 將HEK293細胞表現的上清樣品高速離心去除雜質，並將緩衝液置換為磷酸緩衝液（PBS），加入咪唑至終濃度為5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡鎳柱，沖洗2-5倍柱體積。將置換後的上清樣品上柱。用含有5mM咪唑的PBS溶液沖洗柱子，至A280讀數降至基線。後用PBS+10mM咪唑沖洗層析柱，除去非特異結合的雜蛋白，並收集流出液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液洗脫目的蛋白，並收集洗脫峰。
收集的洗脫液用離子交換（SP柱）進一步純化。配置A液：0.01M PB，pH8.0。配置B液：A液+1M NaCl。先將咪唑的PBS溶液洗脫目的蛋白置換到A液，並使用A液平衡SP柱，上樣，B液濃度梯度0-100%，10倍柱體積洗脫，收集各洗脫峰。所得到的蛋白經電泳，肽圖，經液相色譜-質譜聯用（LC-MS）鑑定後分裝備用。
2、帶Fc標籤的CSF-1R重組蛋白（h-CSF-1R-Fc）的純化步驟： 將HEK293細胞表現的上清樣品高速離心去除雜質，並將緩衝液置換為PBS。用含有10mM磷酸緩衝液平衡Protein A親和力柱，沖洗2-5倍柱體積。將置換後的上清樣品上柱。用含有25倍柱體積緩衝液沖洗柱子，至A280讀數降至基線。再用pH 3.5的0.8%醋酸緩衝液洗脫目的蛋白，並收集洗脫峰，分裝後立刻加入1M Tris-Cl pH8.0緩衝液中和，然後使用Millipore’s Amico-15濾柱置換溶液為PBS pH6.9。所得到的蛋白經電泳，肽圖，LC-MS鑑定後分裝備用。
3、表現人CSF-1R抗原的CHO穩轉細胞株製備： 編碼人CSF-1R蛋白（huCSF-1R）的全長序列由Integrated DNA Technology (IDT)公司合成，分別複製到pcDNA3.1載體上，pcDNA3.1/puro（Invitrogen #V79020）。CHO-S（ATCC）細胞於CD-CHO培養基（Life Technologies, #10743029）內培養至0.5Í106
/ml。將10μg編碼huCSF-1R或基因的載體與50ulLF-LTX（Life Technologies, #A12621）在1ml Opti-MEM培養基（Life Technologies, #31985088）中混合，室溫孵育20分鐘後，加入CHO細胞培養液中並放入二氧化碳培養箱培養。24小時後更換新培養基並加入10μg/ml嘌呤黴素。之後每2-3天更換一次新培養液，經過10-12天篩選後得到穩定CHO-S細胞池。
4、食蟹獼猴CSF-1R-His（cynoCSF-1R-His）和小鼠CSF-1R-His蛋白均購自AcroBiosciences公司。
實施例3抗體的製備
抗人CSF-1R單株抗體通過免疫小鼠產生。實驗用Swiss Webster白小鼠，雌性，6周齡（Charles River公司）。飼養環境：SPF級。小鼠購進後，實驗室環境飼養1周，12/12小時光/暗週期調節，溫度20-25℃；濕度40-60 %。免疫抗原為帶Fc標籤的人CSF-1R重組蛋白（huCSF-1R-Fc）。用Titermax （sigma Lot Num：T2684）為佐劑。抗原與佐劑（titermax）比例為1:1，抗原乳化後進行接種，時間為第0、21、35、49、63天。第0天腹膜內(IP)注射15μg+爪墊（footpad）25/只的乳化後抗原。21,35,49,63天腹膜內(IP)注射15μg+爪墊（footpad）15/只的乳化後抗原, 在進行脾細胞融合前3天加強免疫，腹膜內(IP)注射15μg+爪墊（footpad）15/只的生理鹽水配製的抗原溶液。於第42, 56, 70天進行血檢，用酶聯免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）及螢光活化細胞分離儀（fluorescence activated cell sorter，FACS）方法檢測小鼠血清，確定小鼠血清中的抗體滴度。在第5次免疫以後，選擇血清中抗體滴度高並且滴度趨於平臺的小鼠進行脾細胞融合，採用優化的電融合步驟將脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0細胞 (ATCC® CRL-8287™)進行融合得到雜交瘤細胞。
融合後的雜交瘤細胞30,000-50,000細胞/孔，培養7-14天後，取培養基上清，如實施例4所描述，使用CSF-1R重組蛋白，ELISA實驗對雜交瘤上清進行抗體篩選，得到的陽性抗體株進一步使用穩轉表現CSF-1R的CHO-S細胞，對比空白CHO-S細胞以排除非特異性結合抗體雜交瘤株，用流式分選方法進行篩選，從而確定約400株結合重組蛋白且也結合細胞表現抗原的雜交瘤。隨後如實施例5所描述，使用基於CSF-1R穩轉細胞的CSF-1配基阻斷功能實驗篩選，鑑定出約50株具備阻斷劑功能的雜交瘤並將其亞複製，然後收集純化抗體進行基於CSF-1R穩轉細胞的IL-34配基阻斷功能實驗篩選，鑑定到11株具備CSF-1和IL-34雙阻斷功能的抗體亞複製。收集對數生長期雜交瘤亞複製細胞，用Trizol（Invitrogen,15596-018）提取RNA並反轉錄（PrimeScript™ Reverse Transcriptase，Takara #2680A）。將反轉錄得到的cDNA採用mouse Ig-Primer Set（Novagen, TB326 Rev.B 0503）進行PCR擴增後測序，排除CDR區域重複序列後，最終得到九株鼠源抗體的序列C11、C19、C6、C8、C16、C18、C2、C27和C30。
鼠單抗C11的重鏈和輕鏈可變區序列如下：
C11 HCVR EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFSNYYMNWVNQRHGERLEWIGEMNPNNGDSSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRSPWWFFDVWGPGTTVIVSS SEQ ID NO：1
C11 LCVR DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNSLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQTEDLAVYYCQNDYTYPFTFGTGTKLEIK SEQ ID NO：2
其含有下列CDR序列： 
C19的重鏈和輕鏈可變區序列如下：
C19 HCVR EVQLQQSGPELVKPGASVKISCTASAITFTDYYMNWVKQSPGKGLEWIGDIYPNNGGTTYNQKFKGKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCAREKITMEYYYAMDYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO：9
C19 LCVR DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVSSHDIHLIHWYQQKPGQSPKLLIYAASSLESGVPARFSGSGSATDFTLNIHPVEEEDAATYFCQQSIEDPPTFGGGTKLEIK SEQ ID NO：10
其含有下列CDR序列： 
鼠單抗C6的重鏈和輕鏈可變區序列如下：
C6HCVR EVRLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTGYYMHWVKQSPEKSLEWIGEINPNTGSCTYNQKFTGKATLTVDKSSSTAYMQLTSLTSEDSAVYYCARLNYYWYFDVWGAGTTVTVSS SEQID NO：37
C6LCVR DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQTLLNSNDQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRDSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVQTEDLAVYYCQQDYSTPFTFGSGTKLEIQ SEQID NO：38
其含有下列CDR序列： 
鼠單抗C8的重鏈和輕鏈可變區序列如下：
C8HCVR QVQLQQSGTELVQPGASVKMTCKTSGYTFTNYWIAWVKQRPGQGLEWIGEMYPGGGGDNHHEKFKNKASLTVDMSSSTAYMQLSRLTFEDSAVYYCARRDYGNPCFDYWGQGTSLTVSS SEQID NO：45
C8LCVR DIVLTQSPASLIVSLGQRATISCRASQGVTTSSHSYMHWYQQKLGQSPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQHSWEIPYTFGGGTKLEIK SEQID NO：46
其含有下列CDR序列： 
鼠單抗C16的重鏈和輕鏈可變區序列如下：
C16HCVR QVQLQQSGPELVKPGASVKLSCKASGYTFTTYDINWVKQRPGQGLEWIGWVYPRDGSTKYNEKFKGKATLTVDTSSRTVYMEFHSLTSEDSAVYFCARSGLTGSPFAYWGQGTLVTVSA SEQID NO：53
C16LCVR KIVLTQSPASLAVSLRQRATISCRASESFDSYGNTFMHWFQQKSGQPPKLLIYRASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNEYPLTFGSGTKLELK SEQID NO：54
其含有下列CDR序列： 
鼠單抗C18的重鏈和輕鏈可變區序列如下：
C18HCVR EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASAITFTDYYMNWVKQSPGKGLEWIGDINPNNGGTTYNQKFKGKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCAREKISMEYYYAMDYWGQGTSVTVSS SEQID NO：61
C18LCVR DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVSSHDIHLMHWYQQKPGQSPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSATDFTLNIHPVEEEDAATYFCQQSIEDPPTFGGGTKLEIK SEQID NO：62
其含有下列CDR序列： 
鼠單抗C23的重鏈和輕鏈可變區序列如下：
C23HCVR EVQLQQSGPELVKPGTSVKISCQASGYTFTVYYMNWVKQSHGKSLEWIGDIDPNTGDSTYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARYDGYIDYWGQGTTLTVSS SEQID NO：69
C23LCVR DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNRHTYLEWYLQKPGQSLKLLIYGVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDMGIYYCFQGTHVPLTFGAGTKLELK SEQID NO：70
其含有下列CDR序列： 
鼠單抗C27的重鏈和輕鏈可變區序列如下：
C27HCVR EVQLQQSGAELVRPGALVKLSCKASGFNIKDYYMHWVKQRPEQGLEWIGRFDPENGDTIYDWKFQDKAIITSDTSSNTAYLHLSSLTSEDTAVYYCARSGDYMFDYWGQGTLVTVSA SEQID NO：77
C27LCVR ETTVTQSPASLSMAIGEKVTIRCITSTGVDDDFNWYQQRPGEPPKLLISEGNTLRPGVPSRFSSSGYGTDFVFTIENMLSEDVADYFCLQSDHLPFTFGSGTKLEIK SEQID NO：78
其含有下列CDR序列： 
鼠單抗C30的重鏈和輕鏈可變區序列如下：
C30HCVR QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARNYDGSLYPMDYWGQGTSVTVSS SEQID NO：85
C30LCVR DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRTSESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSETDFTLNIHPVEEEDAATYFCQQSIEDPPTFGGGTKLEIK SEQID NO：86
其含有下列CDR序列： 
將每株鼠抗的重鏈和輕鏈可變區分別複製進入含人IgG4重鏈恆定區和κ輕鏈恆定區的pTT載體質粒（Biovector），然後瞬轉轉染入HEK293細胞，得到了抗CSF-1R的各個嵌合抗體（C11C、C19C、C6C、C8C、C16C、C18C、C23C、C27C和C30C），按實施例2（帶Fc標籤蛋白純化）所描述的方法純化、鑑定，並進行相關結合與功能活性檢測。
實施例4抗體的體外結合活性測定
用PBS pH7.4緩衝液將用於和生物素結合的中和親和素稀釋至1µg/ml，以100µl/孔的體積加於96孔板中，於4℃放置16h-20h。用PBST（PH7.4 PBS 含0.05% Tween-20）緩衝液洗板1次後，加入120µl/孔 PBST/1%脫脂奶，室溫孵育1h進行封閉。PBST緩衝液洗板1次後，加入用PBST/1%脫脂奶稀釋的1µg/ml的生物素標記h-CSF-1R-his（或猴、鼠CSF-1R蛋白等待測樣），置室溫孵育1h。PBST緩衝液洗板3次後，加入用PBST/1% milk稀釋至合適濃度的待測CSF-1R抗體（鼠抗體/嵌合抗體/人源化抗體），置室溫孵育1.5h。移去反應體系，用PBST洗板3次後，以100µl/孔加入用PBST/1%脫脂奶稀釋辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）標記的抗鼠抗體二抗或抗人抗體二抗（The Jackson Laboratory），室溫孵育1h。PBST洗板3次後，加入100µl/孔TMB，於室溫孵育5-10min。加入100µl/孔1M H2
SO4
終止反應，在450nm處讀取吸收值，計算ELISA結合EC50
值。
將高表現huCSF-1R的CHO-S細胞以1000 rpm的轉速離心5分鐘，收集沉澱並用10-15 ml的預冷的流式緩衝液懸浮，細胞計數。用50ml的離心管中以1000 rpm的轉速離心5分鐘收集細胞，丟掉上清，沉澱用預冷封閉緩衝液重懸，密度為0.5-1.0×107
細胞/毫升。4℃孵育30分鐘後，重懸以每孔100µl加入到96孔板。96孔板在1500rpm的轉速下離心5分鐘後，棄上清。向每個孔加入100µl待測抗體，濃度梯度為0.085nM至670nM，將細胞重懸，4℃避光孵育60分鐘。離心棄上清，加入100µl的l:400稀釋的FITC標記二抗（BD Biosciences）。將細胞重懸，4℃避光孵育60分鐘。用流式緩衝液洗兩次細胞，並用1%的多聚甲醛重懸細胞進行固定，進行流式檢測。
同樣的ELISA方法，使用CSF-1R-His蛋白檢測各抗體與食蟹猴CSF-1R的交叉結合，結果數據如圖1所示，除C27C與猴抗原蛋白無結合，其餘抗體及FPA008參照都有與猴CSF-1R很強的交叉結合活性。
實施例5抗體的體外阻斷功能測定實驗
1、抗CSF-1R抗體在CSF-1R/CHO細胞上對CSF-1或IL-34結合的阻斷實驗
將濃度梯度的抗CSF-1R抗體（0.01nM - 670nM）與CSF-1R/CHO細胞共孵育，再加入生物素化的CSF-1蛋白或APC標籤的IL-34蛋白孵育結合。其中與CSF-1的實驗再進一步加入鏈黴親和素-PE標籤結合。PBS洗後，將以上細胞使用流式細胞檢測方法檢測CSF-1或IL-34對應的螢光訊號強度。
2、抗CSF-1R抗體對CSF-1或IL-34誘導的人源單核細胞增殖阻斷實驗
首先使用Ficoll-Paque梯度分離試劑盒（GE Healthcare Bio-Sciences）分離提取健康人血中的外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC），再用Percoll試劑盒（GE Healthcare Bio-Sciences）純化提取PBMC中的單核細胞。然後將分離得到的單核細胞在空白無抗體或濃度梯度的抗CSF-1R抗體中使用人CSF-1或IL-34（R&D Systems）刺激，37℃下於二氧化碳培養箱中培養3天。使用CellTiter-Glo試劑盒（Promega）測量各個待測培養樣品中的ATP含量，並依據其與活化單核細胞數量的線性正相關來最終測算出單核細胞的對應增殖程度。
30株亞複製鼠抗及FivePrime公司的參照抗體FPA008的結合及初步功能篩選實驗結果彙總見下表。測序後選定的9株鼠源抗體以粗體顯示。 
嵌合抗體阻斷功能數據如下表所示，9株抗體均能有效阻斷CSF-1或IL-34刺激單核細胞增殖，其中C11C、C19C、C23C和C27C等嵌合抗體具有很低的IC50，阻斷效果相當或優於參照抗體FPA008。 
實施例6體外結合親和力和動力學實驗
本實驗採用表面等離子共振（SPR）方法測定。利用由Biacore 提供的試劑盒，採用標準胺基偶聯法將抗人IgG多複製抗體共價連接至CM5（GE）芯片上，然後用此抗體將本發明待測的嵌合抗體或人源化抗體抗體捕捉至固定相。將稀釋於同樣緩衝液中的25-800nM濃度梯度的h-CSF-1R-His蛋白（實施例1）於前後各個循環進樣，進樣後均以試劑盒內配再生試劑再生。追蹤抗原-抗體結合動力學3分鐘並追蹤解離動力學10分鐘。使用GE的BIAevaluation軟體以1:1（Langmuir）結合模型分析所得數據，以此法測定各個嵌合抗體的ka
(kon
)、kd(koff
)和KD
值顯示如下表。 
實施例7小鼠抗體人源化實驗
鼠源抗人CSF-1R單株抗體人源化如本領域許多文獻公示的方法進行。簡言之，使用人恆定結構域替代親本（鼠源抗體）恆定結構域，根據鼠源抗體和人抗體的同源性選擇人種抗體序列，本發明將綜合功能活性與序列特異性、成藥性等各方面評價確定的最優兩株候選分子C11和C19進行人源化。
在所獲得的鼠源抗體VH/VL CDR典型結構的基礎上，將重、輕鏈可變區序列與人源抗體種系數據庫比較，獲得同源性高的人種系模板。其中人類種系輕鏈框架區來自人κ輕鏈基因，人類種系重鏈框架區來自人重鏈，本發明抗體優選以下所示的人種系抗體模版。
C11優選人種系重鏈模版IGHV1-46（SEQ ID NO: 21）： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
C11優選人種系輕鏈模板IGkV4-1（SEQ ID NO: 22）： DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVP.DRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTP
C19優選人種系重鏈模版IGHV1-2（SEQ ID NO: 23）： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR
C19優選人種系輕鏈模板IGkV1-13（SEQ ID NO: 24）： AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLES GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYP
將鼠源抗體C11和C19的CDR區移植到選擇好的相應人源化模板上，替換人源化可變區，再與IgG恆定區（優選重鏈為IgG4，輕鏈為κ）重組。然後，以鼠源抗體的三維結構為基礎，對包埋殘基、與CDR區有直接相互作用的殘基，以及對VL和VH的構象有重要影響的殘基進行回復突變，並對CDR區化學不穩定天冬醯胺殘基突變優化，其中鼠抗體C11的HCDR2：EMNPNNGDSSYNQKFKG（SEQID NO：4）優化為：EMNPNTGDSSYNQKFKG（SEQID NO：95），LCDR1：KSSQSLLNSGNQKNSLT（SEQID NO：6）優化為：KSSQSLLNSGNQKTSLT（SEQID NO：96）；鼠抗體C19的HCDR2：DIYPNNGGTTYNQKFKG（SEQID NO：12）優化為：DIYPNTGGTTYNQKFKG（SEQID NO：97）。從而設計並檢測了由如下人源化輕重鏈可變區序列組合而成的抗體。
huC11-VH-a（SEQ ID NO: 25）： EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMNWVRQAPGQRLEWMGEMNPNTGDSSYNQKFKGKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRSPWWFFDVWGQGTMVTVSS
huC11-VH-b（SEQ ID NO: 26）： EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSNYYMNWVRQAPGQGLEWMGEMNPNTGDSSYNQKFKGRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRSPWWFFDVWGQGTMVTVSS
huC11-VH-c（SEQ ID NO: 27）： EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSNYYMNWVRQAPGQGLEWMGEMNPNTGDSSYNQKFKGRVTMTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRSPWWFFDV WGQGTMVTVSS
huC11-VH-d（SEQ ID NO: 28）： EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSNYYMNWVRQAPGQGLEWMGEMNPNTGDSSYNQKFKGRVTMTRDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRSPWWFFDVWGQGTMVTVSS
huC11-VL-a（SEQ ID NO: 29）： DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKTSLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPFTFGQGTKLEIK
huC11-VL-b（SEQ ID NO: 30）： DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLSSGNQKTSLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPFTFGQGTKLEIK
huC19-VH-a（SEQ ID NO: 31）： EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASAITFTDYYMNWVKQAPGQGLEWIGDIYPNTGGTTYNQKFKGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREKITMEYYYAMDYWGQGTLVTVSS
huC19-VH-b（SEQ ID NO: 32）： EVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASAITFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDIYPNTGGTTYNQKFKGRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREKITMEYYYAMDYWGQGTLVTVSS
huC19-VH-c（SEQ ID NO: 33）： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASAITFTDYYMNWVKQAPGQGLEWIGDIYPNTGGTTYNQKFKGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCAREKITMEYYYAMDYWGQGTLVTVSS
huC19-VL-a（SEQ ID NO: 34）： DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSSHDIHLIHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQSIEDPPTFGGGTKVEIK
huC19-VL-b（SEQ ID NO: 35）： DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSSHDIHLIHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQQSIEDPPTFGGGTKVEIK
huC19-VL-c（SEQ ID NO: 36）： DIQLTQSPSSLSASVGDRVTISCRASESVSSHDIHLIHWYQQKPGKSPKLLIYAASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQSIEDPPTFGGGTKVEIK
根據以上各人源化抗體輕鏈和重鏈的胺基酸序列合成cDNA片段，插入到pcDNA3.1表現載體（Life Technologies Cat. No. V790-20）中。將表現載體和轉染試劑PEI（Polysciences, Inc. Cat. No. 23966）以1:2的比例轉染HEK293細胞（Life Technologies Cat. No. 11625019），並置於CO2
孵育箱中孵育4-5天。表現的抗體通過離心回收後，按實施例2方法（帶Fc標籤蛋白純化）進行抗體純化，得到本發明的人源化抗體蛋白。
經表現測試和回復突變數量對比，選擇出最終的人源化huC11（使用VH-b重鏈和VL-b輕鏈）和huC19抗體分子（使用VH-c重鏈和VL-a輕鏈）。
進一步地，對於huC19人源化抗體，將其HCDR1：AITFTDYYMN （SEQ ID NO: 11）突變為：AITFTDYYIN（SEQ ID NO: 98）從而去除了化學不穩定的甲硫胺酸殘基位點，最終得到人源化抗體huC19I，huC19I重鏈可變區序列如SEQ ID NO: 100所示。huC11、huC19和huC19I的各自全長序列如SEQ ID NO: 17-20和SEQ ID NO: 99所示。
huC19-VH-d QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASAITFTDYYINWVKQAPGQGLEWIGDIYPNTGGTTYNQKFKGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCAREKITMEYYYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 100
huC11 HC EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSNYYMNWVRQAPGQGLEWMGEMNPNTGDSSYNQKFKGRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRSPWWFFDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO：17
huC11 LC DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLSSGNQKTSLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO：18
huC19 HC QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASAITFTDYYMNWVKQAPGQGLEWIGDIYPNTGGTTYNQKFKGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCAREKITMEYYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO：19
huC19 LC/huC19I LC DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSSHDIHLIHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQSIEDPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO：20
huC19I HC QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASAITFTDYYINWVKQAPGQGLEWIGDIYPNTGGTTYNQKFKGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCAREKITMEYYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO：99
其中，人源化抗體的重鏈恆定區序列（SEQ ID NO：101） ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人源化抗體的輕鏈恆定區序列（SEQ ID NO：102） RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
實施例8人源化抗體活性測定
對huC11和huC19抗體在體外進行了以下實驗測定：
1、細胞結合實驗（方法步驟同實施例4），結果如圖2所示，人源化後的抗體huC11和huC19與高表現CSF-1R的CHO細胞均有陽性結合，且結合能力與對應的嵌合抗體C11C和C19C相當，而C19的嵌合抗體及各人源化抗體版本均強於C11對應版本。
2、親和力動力學實驗（方法步驟同實施例6），結果如下表所示，最終優選的人源化抗體huC11和huC19對人CSF-1R抗原蛋白均保有很強的親和力，其中huC19的親和力比參照抗體FPA008更強。 
3.體外阻斷功能活性實驗（方法步驟同實施例6），結果如圖3、圖4和下表所示，人源化後的抗體huC11、huC19及其突變體huC19I在對CSF-1和IL-34誘導的單核細胞增殖功能上都顯示出很強的阻斷功能，且其中huC19的阻斷功能活性比FPA008參照抗體相當或略優，而其突變體huC19I稍有下降至與FPA008相近。 huC11的體外阻斷功能活性實驗 
huC19及其突變體huC19I的體外阻斷功能活性實驗 
實施例9抗CSF1R抗體在人源化腫瘤模型中的藥效
取正常人外周血，用密度梯度離心法分離健康人PBMC。用CD14+
microbeads試劑盒分選單核細胞，按照試劑盒所提供的protocol進行CD14+
單核細胞的分離，即每107
個細胞加入20ul Anti-CD14 microbeads，4℃孵育15分鐘。然後，將細胞加入磁柱中，洗三次後，收集磁柱中的細胞，即CD14+
單核細胞。CD14+
單核細胞中加入含100ng/ml M-CSF的RPMI 1640培養液培養6天，進行巨噬細胞的誘導培養，剩餘的細胞加入經Mitomycin C處理的MDA-MB-231細胞中，PBMC與MDA-MB-231共培養6天，培養液為含IL-2和10% FBS的RPMI 1640培養液。
6天後收集巨噬細胞，取1×105
個細胞，CD68，CD115，CD163，CD206染色，FACS分析是否成功誘導巨噬細胞。將PBMC細胞、巨噬細胞和新鮮消化下來的MDA-MB-231細胞（ATCC ）按6.25: 1:50 比例混合，接種於每隻NCG小鼠（南京大學-南京生物醫藥研究院，適應性飼養5天）皮下。實驗動物均飼養于恆溫恆濕的獨立通風盒內，飼養室溫度18.0-26.0 ℃，濕度40-70%，10-20次/小時換氣，晝夜明暗交替時間12h/12h。
實驗分為人IgG1抗體對照組，參照抗體FPA8，和huC19I，給藥劑量均為20 mg/kg。每組6隻小鼠，每兩天一次，腹腔注射給藥，給藥10次（見表1）。給藥後每天監測動物日常行為表現，共進行24天。整個實驗過程中，用遊標卡尺每週測量2次腫瘤長徑和寬徑，腫瘤體積（mm3
）= 0.5 ×（腫瘤長徑 × 腫瘤短徑2
）計算。相對腫瘤抑制率TGI（%）：TGI%=（1-T/C）× 100%。T/C % 為相對腫瘤增值率，即在某一時間點，治療組和對照組相對腫瘤體積或瘤重的百分比值。T和C分別為治療組和IgG1對照組在某一特定時間點的腫瘤體積（TV）或瘤重（TW）。所有數據均採用Mean±SEM表示，用student’s t test比較治療組腫瘤體積和瘤重與對照組相比有無顯著性差異，p＜0.05為具有顯著性差異。
如圖5，圖6所示，在Macrophage-PBMC-MDA-MB-231腫瘤模型中，CSF1R抗體huC19I表現出抗腫瘤作用，各組終末平均腫瘤體積分別為：294.32 mm3
、230.46 mm3
、131.19 mm3
、；FPA8組和huC19I組抑瘤率（TGI）分別為22.62%和55.95%。各給藥組均沒有出現明顯的NCG小鼠體重下降情況，表明NCG小鼠對該劑量下的CSF1R抗體耐受性良好。
實驗分組及給藥方案見下表： 
無
圖1：九株CSF-1R嵌合抗體的ELISA體外結合實驗，顯示除C27C外，其餘各株抗體均與食蟹猴CSF-1R蛋白有很強的交叉結合。 圖2：人源化抗體與高表現CSF-1R的CHO細胞體外結合活性實驗。人源化的抗體huC11和huC19分別與其原嵌合抗體C11C及C19C的細胞結合強度相當。 圖3：人源化抗體huC11阻斷單核細胞增殖的功能實驗。(A). 抗體阻斷IL-34刺激的單核細胞增殖。(B). 抗體阻斷CSF-1刺激的單核細胞增殖。 圖4：人源化抗體huC19阻斷單核細胞增殖的功能實驗。(A). 抗體阻斷IL-34刺激的單核細胞增殖。(B). 抗體阻斷CSF-1刺激的單核細胞增殖。 圖5：人源化抗體huC19I體內藥效實驗。抗體抑制MDA-MB-231腫瘤細胞的增長。 圖6：人源化抗體huC19I體內藥效實驗。同對照組相比，抗CSF1R抗體對動物體重沒有顯著影響。
<110> 江蘇恒瑞醫藥股份有限公司(JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO.,LTD.)；上海恒瑞醫藥有限公司(SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO.,LTD.)
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<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 89
<210> 90
<211> 15
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 90
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 91
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 92
<210> 93
<211> 522
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> Human CSF-1R ECD-His的序列
<400> 93
<210> 94
<211> 745
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> Human CSF-1R-huFc的序列
<400> 94
<210> 95
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> C11HCDR2優化後
<400> 95
<210> 96
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> C11LCDR1優化後
<400> 96
<210> 97
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> C19HCDR2優化後
<400> 97
<210> 98
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> huC19I HCDR1
<400> 98
<210> 99
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> huC19I HC
<400> 99
<210> 100
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> C19人源化抗體輕鏈d
<400> 100
<210> 101
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人源化抗體的重鏈恆定區
<400> 101
<210> 102
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人源化抗體的輕鏈恆定區
<400> 102
Claims (27)
- 一種抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段，其包含抗體輕鏈可變區和抗體重鏈可變區，其中：x)所述的抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述的抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；y)所述的抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；z)所述的抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者ad)所述的抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
- 如請求項1所述的抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段，其中所述的抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體、嵌合抗體、或者人源化抗體或其抗原結合片段。
- 如請求項2所述的抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段，其中 i)所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示或者其變體，所述變體有M34I、N55T或其組合的胺基酸突變。
- 如請求項2所述的抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段，其中所述人源化抗體輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列，來源於如SEQ ID NO：22所示的人種系輕鏈IGkV4-1序列；或來源於如SEQ ID NO：24所示的人種系輕鏈IGkV1-13序列；和/或，所述人源化抗體重鏈可變區進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈FR區。
- 如請求項4所述的抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段，其中所述人源化抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列，來源於如SEQ ID NO：21所示的人種系重鏈IGHV1-46序列；或來源於如SEQ ID NO：23所示的人種系重鏈IGHV1-2序列。
- 如請求項4所述的抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段，其中所述人源化抗體輕鏈可變區序列為如SEQ ID NO：34所示的序列或其變體；所述的變體有F87A、F91Y或其組合的胺基酸突變；和/或，所述人源化抗體重鏈可變區序列為如SEQ ID NO：33所示的序列或其變體或如SEQ ID NO：100所示的序列；所述變體有Q1E、M34I、T55N、E89D或其組合的胺基酸突變。
- 如請求項6所述的抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段，其中SEQ ID NO：33所示的序列的變體有M34I、T55N或其組合的胺基酸突變。
- 如請求項6所述的抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的序列為SEQ ID NO：31、32、33或100，且所述輕鏈可變區的序列為SEQ ID NO：34、35或36。
- 如請求項2-8中任一項所述的抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段，其中所述嵌合抗體或人源化抗體進一步包括輕鏈和/或重鏈的恆定區，所述輕鏈恆定區序列如SEQ ID NO：102所示，和/或所述重鏈恆定區序列如SEQ ID NO：101所示。
- 如請求項9所述的抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段，其中所述人源化抗體：包含序列如SEQ ID NO：19所示的重鏈，和序列如SEQ ID NO：20所示的輕鏈；或者包含序列如SEQ ID NO：99所示的重鏈，和序列如SEQ ID NO：20所示的輕鏈。
- 一種多特異性抗體，含有如請求項1-10中任一項所述的抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區和重鏈可變區。
- 一種單鏈抗體，含有如請求項1-10中任一項所述的抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區和重鏈可變區。
- 一種抗體-藥物偶聯物，其中所述的抗體含有如請求項1-10中任一項所述的抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區和重鏈可變區。
- 一種編碼如請求項1-10中任一項所述的抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段、如請求項11所述的多特異性抗體或者如請求項12所述的單鏈抗體的核酸分子。
- 一種含有如請求項14所述的核酸的表現載體。
- 一種用如請求項15所述的表現載體轉化的宿主細胞。
- 如請求項16所述的宿主細胞，其中所述的宿主細胞為細菌；或者，所述的宿主細胞為酵母菌；或者，所述的宿主細胞為動物細胞。
- 如請求項17所述的宿主細胞，其中所述的細菌為大腸桿菌；所述的酵母菌為畢赤酵母；所述的動物細胞為中國倉鼠卵巢細胞、人胚腎293細胞或NS0細胞。
- 一種用於製備請求項1-10中任一項所述的抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段、如請求項11所述的多特異性抗體或者如請求項12所述的單鏈抗體的方法，包括在請求項16-18中任一項所述的宿主細胞中表現所述抗體或其抗原結合片段、所述多特異性抗體或者所述單鏈抗體，並自該宿主細胞中分離所述抗體或其抗原結合片段、所述多特異性抗體或者所述單鏈抗體。
- 一種藥物組合物，其含有如請求項1-10中任一項所述的抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段、如請求項11所述的多特異性抗體或者如請求項12所述的單鏈抗體以及可藥用的緩衝劑、賦形劑、稀釋劑或載體。
- 一種如請求項1-10中任一項所述的抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段、如請求項11所述的多特異性抗體、如請求項12所述的單鏈抗體、如請求項13所述的抗體-藥物偶聯物、如請求項14所述的核酸分子或者如請求項20所述的藥物組合物在製備用於抗癌治療中的藥物的用途，其中所述的抗體或其抗原結合片段、所述的多特異性抗體、所述的單鏈抗體、所述的抗體-藥物偶聯物、 所述的核酸分子或者所述的藥物組合物是在開始用另一種抗癌治療的療法之前、過程中、基本同時或之後施用的。
- 如請求項21所述的用途，其中所述另一種抗癌治療的療法選自抗血管發生劑、化療劑、放射、腫瘤免疫療法或其組合。
- 如請求項22所述的用途，其中所述化療劑選自：紫杉烷類、多柔比星、經修飾的多柔比星、舒尼替尼、索拉非尼和其它多激酶抑制劑、奧沙利鉑、順鉑、卡鉑、依託泊苷、吉西他濱和長春鹼中的一種或多種；和/或所述腫瘤免疫療法選自：T細胞接合劑、靶向性免疫抑制、癌症疫苗/增強樹突細胞功能和過繼性細胞轉移。
- 如請求項23所述的用途，其中所述紫杉烷類選自紫杉醇注射液、多西他賽和紫杉醇白蛋白；經修飾的多柔比星為Caelyx或Doxil。
- 一種如請求項1-10中任一項所述的抗CSF-1R抗體或其抗原結合片段、如請求項11所述的多特異性抗體、如請求項12所述的單鏈抗體、如請求項13所述的抗體-藥物偶聯物、如請求項14所述的核酸分子或者如請求項20所述的藥物組合物在製備用於治療CSF-1R或CSF-1介導的疾病或病症的藥物中的用途。
- 如請求項25所述的用途，其中所述的疾病為癌症、自身免疫疾病、炎性疾病或溶骨性骨質流失。
- 如請求項26所述的用途，其中所述的癌症為子宮內膜癌、鱗狀細胞癌、濾泡性淋巴瘤、腎細胞癌、葡萄膜黑色素瘤、子宮頸癌、頭頸癌、霍奇金氏病、星狀細胞癌、肺腺癌、間皮瘤、絨毛膜癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、腦癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱 癌、食管癌、宮頸癌、多發性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和膠質母細胞瘤；所述的自身免疫疾病為自身免疫性腦脊髓炎、全身性紅斑狼瘡、多發性硬化、關節滑膜炎、牛皮癬、和類風濕關節炎；所述溶骨性骨質流失選自骨質疏鬆、轉移誘導的溶骨性骨質流失和類風濕性關節炎誘導的骨質流失。
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