CN111690063A - 一种抗gm-csf纳米抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗GM‑CSF纳米抗体及其制备方法和应用，该纳米抗体含有由SEQ ID NO：1～3分别所示的CDR1～3，由SEQ ID NO：4～7分别所示的FR1～4。该纳米抗体的解离平衡常数KD值达到2.95×10‑8mol/L，呈现较强的亲和力，可用于检测样本中GM‑CSF含量，进一步可应用于诊断和/或治疗炎症的药物开发，具有体积小、稳定性高、能够穿过血脑屏障、成本低廉、免疫原性低等优点，具有良好的临床应用前景。

Description

一种抗GM-CSF纳米抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学和免疫学技术领域，具体涉及一种抗GM-CSF纳米抗体及其制备方法和应用。
背景技术
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)是集落刺激因子(colony-stimulating factor，CSF)家族中的重要成员。GM-CSF是第一个被鉴定为可诱导粒细胞和巨噬细胞增殖分化的生长因子，由127个氨基酸组成，分子质量约为14.5kDa左右，在机体细胞免疫和体液免疫中都发挥着重要作用。
GM-CSF不仅能够增强MHC I、MHC II类分子及协同刺激分子的表达，促进抗原呈递，还可以促进树突细胞(dendritic cells，DC)的增值分化和成熟，在提高DC数量的基础上调节其在体内的分布和抗原的呈递等功能，激发机体的抗肿瘤免疫应答，诱导抗肿瘤抗体的产生。同时，GM-CSF也是一种炎症因子，与类风湿关节炎和多发性硬化症等炎症疾病的发生有关，近年来，GM-CSF已逐渐成为治疗炎症疾病的新型靶点，制备相应的抗体对于相关炎症疾病的检测和治疗具有重要意义。
目前针对GM-CSF的特异性抗体多为传统单克隆抗体，而关于抗GM-CSF纳米抗体的制备目前尚未见报道。而单克隆抗体存在以下不足：1)生产周期长、制备成本高；2)较高的免疫原性，在机体内不易被清除；3)穿透力弱。
纳米抗体是一种仅存在于骆驼科动物(羊驼、单双峰骆驼及美洲驼)和一些软骨鱼(鲨鱼和银鲛)体内天然缺失轻链的单域重链抗体，是最小的功能性抗原结合片段。相比于应用广泛的传统单克隆抗体，纳米抗体的分子量小，其分子质量仅为传统单克隆抗体的1/10左右，约为15kDa左右，且可实现在微生物体内的可溶性表达，从而大大缩短生产周期、降低制备成本。而且还具有较低的免疫原性、较高的耐热、耐酸碱以及耐极性试剂及细胞穿透的能力，在疾病检测和治疗方面具有很大的潜力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗GM-CSF纳米抗体及其制备方法和应用，该纳米抗体对GM-CSF有高亲和力，可用于诊断和/或治疗炎症药物的开发，具有良好的临床应用前景。
为此，本发明的第一方面提供了一种抗GM-CSF纳米抗体，其含有由SEQ ID NO：1所示的CDR1，由SEQ ID NO：2所示的CDR2，由SEQ ID NO：3所示的CDR3，由SEQ ID NO：4所示的FR1，由SEQ ID NO：5所示的FR2，由SEQ ID NO：6所示的FR3，由SEQ ID NO：7所示的FR4。
进一步，所述抗GM-CSF纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
进一步，所述抗GM-CSF纳米抗体可带有标记，所述标记例如酶标记(如辣根过氧化物酶标记、碱性磷酸酶标记)、光学标记(化学发光标记)、同位素标记等。
本发明的第二方面提供一种基因，其编码本发明所述的抗GM-CSF纳米抗体。
进一步，所述基因包含SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。
本发明所述的基因可以是DNA、cDNA、mRNA，除了编码序列以外，还可包括非编码序列，例如5’UTR、3’UTR等。
本发明的第三方面提供一种核酸构建体，其包含本发明所述的基因。
本发明所述核酸构建体，可以为阅读框、表达盒、操纵子、质粒、粘粒、噬菌体载体等。
本发明的第四方面提供一种宿主，其表达本发明所述的抗GM-CSF纳米抗体，和/或包含本发明所述的基因或核酸构建体。
进一步，所述宿主可以为基因工程领域常用的宿主，包括原核宿主、真核宿主。所述原核宿主包括但不限于大肠杆菌，所述真核宿主包括但不限于酵母菌(如毕赤酵母菌、酿酒酵母菌)、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞等。
本发明的第五方面提供一种生产抗GM-CSF纳米抗体的方法，包括：在允许表达所述抗GM-CSF纳米抗体的条件下培养本发明所述的宿主；和，从所得培养物中纯化抗体。
本发明的第六方面提供所述抗GM-CSF纳米抗体在制备用于检测样品中GM-CSF含量的检测试剂盒或诊断试剂盒中的应用。
本发明的第七方面提供所述抗GM-CSF纳米抗体在制备用于诊断和/或治疗炎症的药物中的应用。
在本发明的研究中，纳米抗体文库的库容量和多样性是淘选出高特异性、高亲和力纳米抗体的关键。为了克服大肠杆菌BL21感受态细胞转化率低的问题，研究过程中进行了12次电击转化，最终文库库容量达到1.37×109cfu，保证了文库的多样性。本发明采用固相淘选的方式对噬菌体展示纳米抗体文库进行生物淘选，淘选过程中，GM-CSF的纯度、GM-CSF的包被浓度、封闭液的种类和浓度、PBST的浓度、噬菌体投入量、结合时间以及洗脱时间等因素都会影响噬菌体颗粒的富集情况。本发明采用3％BSA和3％OVA交替封闭、逐渐加大洗涤强度等方式来提高生物淘选的特异性，通过优化淘选条件以获得具有高特异性、高亲和力的纳米抗体。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明提供的抗GM-CSF纳米抗体的解离平衡常数KD值达到2.95×10-8mol/L，呈现较强的亲和力，为后续推进体外细胞和体内水平上炎症治疗的应用奠定了坚实的基础。
(2)本发明提供的抗GM-CSF纳米抗体有着较长的抗原结合互补区CDR1区和CDR3区，与传统单克隆抗体相比，具有更强的抗原结合能力；另外，单克隆抗体具有组织渗透性差、体内不易被清除、制备成本高的缺点，而本发明提供的抗GM-CSF纳米抗体的分子量仅为单克隆抗体的1/10，体积小、稳定性高、能够穿过血脑屏障，还可在原核生物中大量表达，具有成本低廉、免疫原性低、在细胞中易被清除等优点，具有良好的临床应用前景。
(3)本发明提供的抗GM-CSF纳米抗体可用于进一步的炎症抗体药物开发。不同疾病或者同一疾病不同阶段，患者体内的血清GM-CSF含量不同，可通过检测抗GM-CSF纳米抗体相关反应强度，以实现临床疾病诊断、患者的危险分层、以及疾病进程和治疗反应的预测。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
图1为第一轮PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果；
图2为第二轮PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果；
图3为噬菌体阳性克隆的鉴定结果；
图4为纳米抗体G1亲和力测定结果；
图5为纳米抗体G1的氨基酸序列；FR1、FR2、FR3、FR4为四个框架区，CDR1、CDR2、CDR3为三个互补决定区。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1抗GM-CSF噬菌体展示纳米抗体文库的构建
(1)动物免疫：
采集免疫前的羊驼血液用作阴性对照，以GM-CSF为免疫原采用颈部多点注射的方式对羊驼进行免疫，共进行四轮免疫。以PBS溶液为溶剂，溶解750μg GM-CSF于500μL PBS溶液中，再与等体积弗氏完全佐剂乳化后进行第一轮免疫，免疫剂量为750μg/只。三周后进行第二轮免疫，之后每隔2周加强免疫一次，将375μg GM-CSF溶于500μL PBS溶液中，与等体积弗氏不完全佐剂乳化后分别进行第二、三、四轮免疫，免疫剂量为375μg/只。每次免疫后第7d，采集羊驼颈静脉血液。采用间接ELISA方法测定每轮免疫后羊驼抗血清效价。
(2)总RNA的提取和VHH目的基因的扩增：
取第四轮免疫后的羊驼颈静脉血液，经淋巴细胞分离液分离后得到淋巴细胞，采用Trizol总RNA抽提试剂盒提取淋巴细胞中的总RNA，并用紫外分光光度计ND-1000测定其含量。以RNA为模板进行RT-PCR，获得VHH目的基因，再通过巢式PCR扩增VHH基因片段，并通过1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行验证，用凝胶回收试剂盒回收VHH目的基因。结果如图1和图2所示，经过巢式第一轮PCR和第二轮PCR，最终得到约500bp大小的VHH基因条带。
实施例2抗GM-CSF噬菌体展示纳米抗体文库的淘选与鉴定
(1)抗GM-CSF噬菌体展示纳米抗体文库的淘选：
按照结合、洗涤、洗脱、扩增的方式，对上述噬菌体展示纳米抗体文库进行亲和淘选，采用3％BSA和3％OVA交替封闭的方法来降低非特异性吸附，GM-CSF的包被浓度逐轮降低，依次为100、50、25、12.5μg/mL。淘选的具体步骤为：向96孔酶标板中加入相应浓度的GM-CSF，100μL/孔，4℃包被过夜；弃去上清，0.05％PBST洗板3次，加入3％BSA溶液(或3％OVA溶液)，300μL/孔，37℃封闭2h；弃去封闭液，0.05％PBST洗板3次，加入噬菌体悬液，100μL/孔，37℃条件下震荡孵育2h；弃上清，0.1％PBST洗板10～15次，加入0.1mol/L Gly-HCl洗脱缓冲溶液(pH 2.2)进行洗脱，100μL/孔，室温震荡10min后加入1mol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH8.8)进行中和，15μL/孔，混匀，吸出中和后的洗脱液，取10μL测定滴度，剩余的进行扩增后用于下一轮淘选。
(2)阳性克隆的鉴定：
从测定滴度的平板上随机挑取单菌落进行噬菌体的拯救纯化，之后采用间接ELISA方法进行阳性克隆的鉴定。具体步骤为：用PBS溶液稀释GM-CSF至10μg/mL，加入96孔酶标板中，100μL/孔，4℃包被过夜；PBST洗板3次，加入3％的脱脂牛奶，300μL/孔，37℃封闭2h；PBST洗板3次，加入扩增后的噬菌体悬液，100μL/孔，37℃孵育45min；PBST洗板6次，加入HRP标记的抗M13噬菌体单克隆抗体，100μL/孔，37℃孵育45min；PBST洗板3次，加入TMB显色液，100μL/孔，37℃孵育10min；加入2mol/L的H2SO4溶液，50μL/孔，终止反应，立即用酶标仪读取OD450nm值。如图3所示，取阴性对照OD450nm值的3倍以上为阳性克隆，共有20个克隆呈阳性，将其全部送去测序，得到插入片段的DNA序列，其编码针对GM-CSF的纳米抗体，具体如下(SEQ ID NO：9)：
G1:
CAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGAGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGACGCCCCTCAAATGTCTACGACATGGGCTGGTTCCGCCGGGTTCCAGGGAAGGAAAGTCGCCTTATGGCTTATATTAACTGGAGTCGTGGTAGCACATACTATGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACACCAACAACACAGTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCAGCACGTGCCGGTCCCGGGACACCTGCATATAATTCCTGGGGCCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：8，对其氨基酸序列进行分析，具有典型的纳米抗体的稳定结构，如图5所示，其框架区FR区和互补决定区CDR区的氨基酸序列分别如下：
CDR1如SEQ ID NO：1所示，CDR2如SEQ ID NO：2所示，CDR3如SEQ ID NO：3所示，FR1如SEQ ID NO：4所示，FR2如SEQ ID NO：5所示，FR3如SEQ ID NO：6所示，FR4如SEQ ID NO：7所示。
实施例3纳米抗体的表达和纯化
将上述碱基序列插入到pET 26b质粒上，构建表达载体。取2μL构建好的pET 26b质粒加入到50μL的大肠杆菌BL 21感受态细胞中，冰上放置30min然后放入到42℃水浴中热激90s，冰上放置10min，向悬液中加入800μL LB液体培养基，混匀后37℃，150rpm摇床振荡孵育1h，3500rpm常温离心4min，小心吸弃700μL上清，留约200μL培养基，反复吹打悬浮菌体，涂布于LB-Kana固体平板上；将平板置于37℃恒温培养箱，正放培养10min后倒置培养过夜。第二天从过夜培养的平板上挑取单克隆，置于10mL LB-Kana液体培养基中，37℃，250rpm摇床震荡孵育8h，将离心管菌液加入1L LB-Kana液体培养基，37℃，200rpm摇床振荡培养至菌液OD600约为0.6，加入1mL 0.1mol/L的IPTG，32℃，220rpm/min诱导表达8h；第二天将菌液离心收集用80mL PBS溶液重悬菌体后进行超声破碎，条件为200w，破碎3s，间歇3s。然后4℃，8000g离心收集上清，过镍柱，纳米抗体吸附到镍柱上，用洗涤液(10mM咪唑溶液)洗去杂蛋白，加入洗脱液(250mM咪唑溶液)洗脱纳米抗体，在得到的纳米抗体溶液中加入PBS进行超滤(3600rpm/min，12min，重复3次)，得到的纳米抗体是溶在PBS中，测定浓度后加入20％的甘油-80℃保存备用。经SDS-PAGE分析纯化后的纳米抗体，结果表明纳米抗体相对分子质量约为15kDa，与理论分子质量相符，且纯化后的条带无明显杂带，表明纳米抗体G1纯度较高。
实施例4抗GM-CSF纳米抗体结合力的测定
将GM-CSF蛋白稀释到10μg/mL(每孔200μL)，将纯化后的纳米抗体稀释到1000nmol、500nmol及250nmol(每孔200μL)，稀释液为PBS+0.1％的吐温-20+0.1％BSA，其加样顺序如表1所示。
表1
实验组 对照组
平衡液 PBST+BSA PBST+BSA
传感器包被液 GM-CSF+PBST+BSA GM-CSF+PBST+BSA
平衡液 PBST+BSA PBST+BSA
反应液 PBST+BSA+纳米抗体 PBST+BSA
解离液 PBST+BSA PBST+BSA
具体检测步骤时间设定如下：
(1)PBST平衡阶段，SA传感器在200μL平衡液中反应60s；
(2)Loading阶段，SA传感器在200μL蛋白稀释液中反应200s；
(3)Association阶段，SA传感器在200μL纳米抗体梯度稀释液中反应200s；
(4)Dissociation阶段，SA传感器在200μL解离液中反应200s。
以上操作均在30℃，1000rpm条件下进行。结合力测定结果如图4所示，其解离平衡常数KD＝9.37×10-8mol/L，表明纳米抗体G1与GM-CSF的结合力达到了纳摩尔级，具有较强的亲和力。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 北京大学
<120> 一种抗GM-CSF纳米抗体及其制备方法和应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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1 5
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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1 5 10
<210> 4
<211> 25
<212> PRT
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<400> 4
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser
20 25
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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1 5 10 15
Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Thr Asn Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 8
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Arg Pro Ser Asn Val Tyr
20 25 30
Asp Met Gly Trp Phe Arg Arg Val Pro Gly Lys Glu Ser Arg Leu Met
35 40 45
Ala Tyr Ile Asn Trp Ser Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Asn Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Ala Gly Pro Gly Thr Pro Ala Tyr Asn Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cagttgcagc tcgtggagtc tggaggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag tctctggacg cccctcaaat gtctacgaca tgggctggtt ccgccgggtt 120
ccagggaagg aaagtcgcct tatggcttat attaactgga gtcgtggtag cacatactat 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acaccaacaa cacagtgtat 240
ctgcaaatga acagtctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtgc agcacgtgcc 300
ggtcccggga cacctgcata taattcctgg ggccagggaa cccaggtcac cgtctcctca 360

Claims (10)

1.一种抗GM-CSF纳米抗体，其特征在于，其含有由SEQ ID NO：1所示的CDR1，由SEQ IDNO：2所示的CDR2，由SEQ ID NO：3所示的CDR3，由SEQ ID NO：4所示的FR1，由SEQ ID NO：5所示的FR2，由SEQ ID NO：6所示的FR3和由SEQ ID NO：7所示的FR4。
2.如权利要求1所述的抗GM-CSF纳米抗体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
3.一种基因，其特征在于，其编码权利要求1或2所述的抗GM-CSF纳米抗体。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因包含由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。
5.一种核酸构建体，其特征在于，其包含权利要求3或4所述的基因。
6.一种宿主，其特征在于，其表达权利要求1或2所述的抗GM-CSF纳米抗体，和/或包含权利要求3或4所述的基因或权利要求5所述的核酸构建体。
7.如权利要求6所述的宿主，其特征在于，所述宿主为原核宿主或真核宿主。
8.一种生产抗GM-CSF纳米抗体的方法，包括：在允许表达权利要求1或2所述抗GM-CSF纳米抗体的条件下培养权利要求6或7所述的宿主；和，从所得培养物中纯化抗体。
9.权利要求1或2所述抗GM-CSF纳米抗体在制备用于检测样品中GM-CSF含量的检测试剂盒或诊断试剂盒中的应用。
10.权利要求1或2所述抗GM-CSF纳米抗体在制备用于诊断和/或治疗炎症的药物中的应用。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006096815A2 (en) * 2005-03-09 2006-09-14 Board Of Regents, The University Of Texas System NOVEL hTMC PROMOTER AND VECTORS FOR THE TUMOR-SELECTIVE AND HIGH-EFFICIENT EXPRESSION OF CANCER THERAPEUTIC GENES
EP1999152A1 (en) * 2006-03-27 2008-12-10 Medimmune Limited Binding member for gm-csf receptor
WO2009112245A1 (en) * 2008-03-14 2009-09-17 Transgene S.A. Antibody against the csf-1 r
CN101932603A (zh) * 2008-01-15 2010-12-29 卡罗拜奥斯制药公司 使用gm-csf拮抗剂治疗骨质流失病症的方法
CN102014958A (zh) * 2008-04-29 2011-04-13 米克罗麦特股份公司 用于治疗的gm-csf和il-17抑制剂
CN108341870A (zh) * 2018-01-02 2018-07-31 北京大学 一种抗bsa纳米抗体、其生产方法及应用
CN110913894A (zh) * 2017-10-26 2020-03-24 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗csf-1r抗体、其抗原结合片段及其医药用途

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006096815A2 (en) * 2005-03-09 2006-09-14 Board Of Regents, The University Of Texas System NOVEL hTMC PROMOTER AND VECTORS FOR THE TUMOR-SELECTIVE AND HIGH-EFFICIENT EXPRESSION OF CANCER THERAPEUTIC GENES
EP1999152A1 (en) * 2006-03-27 2008-12-10 Medimmune Limited Binding member for gm-csf receptor
CN101932603A (zh) * 2008-01-15 2010-12-29 卡罗拜奥斯制药公司 使用gm-csf拮抗剂治疗骨质流失病症的方法
WO2009112245A1 (en) * 2008-03-14 2009-09-17 Transgene S.A. Antibody against the csf-1 r
CN102014958A (zh) * 2008-04-29 2011-04-13 米克罗麦特股份公司 用于治疗的gm-csf和il-17抑制剂
CN110913894A (zh) * 2017-10-26 2020-03-24 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗csf-1r抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CN108341870A (zh) * 2018-01-02 2018-07-31 北京大学 一种抗bsa纳米抗体、其生产方法及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
郭鹏利等: "抗GM-CSF纳米抗体的筛选与鉴定", 《生物技术通讯》 *

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